(57)【要約】【課題】本発明は、化学物質、特に血液中、唾液中又は尿中の生体関連物質を迅速かつ簡便に測定することのできるセンサを提供する。【解決手段】容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室と、第１の隔室内に配置され、（生）  化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが内部に充填されており、その刺激応答性ゲルの体積変化を外部に伝達しうる第２の隔室と、第１の隔室に繋がる液体用通路と、第２の隔室と外部と連通する検体供給用通路よりなり、第１の隔室及び液体用通路に液体が充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化により、液体用通路内を液体が移動するようになされていることを特徴とするセンサ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室と、第１の隔室内に配置され、（生）  化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが内部に充填されており、その刺激応答性ゲルの体積変化を外部に伝達しうる第２の隔室と、第１の隔室に繋がる液体用通路と、第２の隔室と外部と連通する検体供給用通路よりなり、第１の隔室及び液体用通路に液体が充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化により、液体用通路内を液体が移動するようになされていることを特徴とするセンサ。
【請求項２】
（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが充填されている、容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室と、第１の隔室内に配置され、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルの体積変化を内部に伝達しうる第２の隔室と、第１の隔室と外部と連通する検体供給用通路と、第２の隔室に繋がる液体用通路よりなり、第２の隔室及び液体用通路に液体が充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化により、液体用通路内を液体が移動するようになされていることを特徴とするセンサ。
【請求項３】
検体供給用通路に、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が配置されていることを特徴とする請求項１又は２記載のセンサ。
【請求項４】
隔膜が、（生）化学的刺激物選択透過性隔膜であることを特徴とする請求項３項記載のセンサ。
【請求項５】
（生）化学的刺激物選択透過性隔膜が、グルコース透過性隔膜であり、刺激応答性ゲルがグルコース感応型刺激応答性ゲルであることを特徴とする請求項４記載のセンサ。
【請求項６】
隔膜に、（生）化学的刺激変換反応に関与する受容体が固定されていることを特徴とする請求項３記載のセンサ。
【請求項７】
刺激応答性ゲルが、（生）化学的刺激により体積変化するゲルの微小体の集合体、多孔性刺激応答性ゲル又は複数の刺激応答性ゲルシートと濾紙の積層体であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項８】
刺激応答性ゲルが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドーアクリル酸共重合体又はＮ−イソプロピルアクリルアミドー１−ビニルイミダゾール−アクリル酸共重合体と水よりなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項９】
刺激応答性ゲルに、（生）化学的刺激変換反応に関与する受容体が固定されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項１０】
受容体は（生）化学的刺激物を内包するマイクロカプセルに結合しており、検出対象物と受容体が結合するとマイクロカプセルが崩壊するようになされて、固定されていることを特徴とする請求項９記載のセンサ。
【請求項１１】
マイクロカプセルがリポソームであり、（生）化学的刺激物が酵素であり、受容体が抗体であって、補体と共に固定されていることを特徴とする請求項１０記載のセンサ。
【請求項１２】
受容体が、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた１種もしくはこれらの混合物であることを特徴とする請求項６、９又は１０項記載のセンサ。
【請求項１３】
液体が着色されていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項記載のセンサ。
【請求項１４】
請求項１又は２記載のセンサが複数個並列に設置されていることを特徴とする集積型センサ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質、特に、血液中、唾液中、尿中等の生体関連物を迅速且つ簡単に測定することのできるセンサであり、特にディスポーザブルなセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、幾つかの化学物質を定量できるバイオセンサが実用化されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。そのうち最も広く使われているのは、グルコースセンサである。グルコースセンサの主な用途は医療用途であり、糖尿病患者の診断に広く用いられている。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００３−１４６８７号公報
【特許文献２】
特開平１０−２６２６４５号公報
【０００４】
血糖値の測定は糖尿病の診断に非常に重要であるため、ディスポーザブル血糖値センサを装着できる携帯型血糖測定器が既に実用化され、これは一般のユーザーも容易に入手することができるものである。
【０００５】
ディスポーザブル血糖値センサとしては主に光学的なものと電気化学的なものとが実用化されている。光学的なものは、酵素反応の前後での反応・生成物の吸光度や発光度を測定することによる。また、電気化学的なものとしては、例えば、下記式に示す反応で生成する過酸化水素を測定し、グルコース濃度を求めるものが挙げられる。
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ＋Ｏ２  →Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｏ−δ−ｌａｃｔｏｎｅ＋Ｈ２  ・Ｏ２
【０００６】
今後、このようなバイオセンサの需要はますます増大することが予想されるが、これに伴い、より安価に入手可能なものが求められると予想される。上記の市販されている携帯型血糖値測定器では、血糖値を測定するための上記ディスポーザブルバイオセンサの他、この信号を増幅して処理するためのアンプが必要である。
【０００７】
センサチップ自体は比較的安価に入手することができるが、アンプは必ずしもそうではない。このため、アンプを必要とせず、チップだけで機能するものが得られれば、全体として格段の低価格化が実現でき、例えば血糖のみならず尿糖の測定等にも気軽に使えるようになる。
【０００８】
化学センサやバイオセンサは、医療、環境、食品等の多くの分野で用いられており、その重要性は今後ますます高まりつつある。このうち、特に、医療関係では、ヘルスケア、在宅医療等の関係で、今後ますますその需要が増大するものと思われる。
【０００９】
当該分野では、特に一般家庭のユーザーが、例えば血糖値又は尿糖値を測定するために、煩雑な操作を必要とせずに簡便に使用でき、しかも安価に入手できることが求められる。同様のことは、環境分野や食品分野でも要求されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、化学物質、特に血液中、唾液中又は尿中の生体関連物質を迅速かつ簡便に測定することのできるセンサを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載のセンサは、容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室と、第１の隔室内に配置され、（生）  化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが内部に充填されており、その刺激応答性ゲルの体積変化を外部に伝達しうる第２の隔室と、第１の隔室に繋がる液体用通路と、第２の隔室と外部と連通する検体供給用通路よりなり、第１の隔室及び液体用通路に液体が充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化により、液体用通路内を液体が移動するようになされていることを特徴とする。
【００１２】
上記（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルとは、ｐＨ、グルコース、化学物質の吸脱着、酸化・還元等の生化学的刺激又は化学的刺激を受けた際に体積変化するゲルである。
【００１３】
上記（生）化学的刺激に対して体積が変化するゲルは、水又は電解質水溶液とポリマーとからなり、ポリマーの網目状構造体中に水又は電解質水溶液を取り込んでなるものであり、（生）化学的刺激に応じて、水を取り込んで膨潤し、水を放出して収縮するゲルである。
【００１４】
上記ｐＨ変化に対して体積が変化するポリマーとしては、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸の架橋物やその金属塩、（メタ）アクリル酸と（メタ）アクリルアミド、Ｎ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、マレイン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリビニルスルホン酸の架橋物やビニルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリビニルベンゼンスルホン酸の架橋物やその金属塩、ビニルベンゼンスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸の架橋物やその金属塩、アクリルアミドアルキルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドの架橋物やその４級塩、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドと（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物やその金属塩や４級塩、ポリジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドとポリビニルアルコールとの複合体の架橋物やその４級塩、ポリビニルアルコールとポリ（メタ）アクリル酸との複合体の架橋物やその金属塩、カルボキシアルキルセルロース金属塩の架橋物、ポリ（メタ）アクリロニトリルの架橋物の部分加水分解物やその金属塩などが挙げられ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸との共重合体及びＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸と１−ビニルイミダゾールとの共重合体が好ましい。
【００１５】
上記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸との共重合体からなるゲルは、中性領域で膨潤状態にあり、酸性領域で収縮する。一方、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸と１−ビニルイミダゾールとの共重合体からなるゲルは、中性領域で収縮状態にあり、酸性領域、アルカリ性領域で膨潤する。
【００１６】
又、ポリ（メタ）アクリル酸とポリ（メタ）アクリルアミドの相互侵入網目状高分子（ＩＰＮ）もｐＨ変化に対して体積が変化するので使用可能である（例えば、特許文献３、４参照。）。
【００１７】
【特許文献３】
米国特許第５４０３８９３号
【特許文献４】
米国特許第５５８０９２９号
【００１８】
上記グルコースによって体積が変化するポリマーとしては、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸の共重合体を架橋した網目状高分子鎖中にグルコースオキシダーゼを包括固定したケモメカニカル材料が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１９】
レクチンや免疫グロブリン等の生体分子をリガンドとした生体分子インプリント法により、上記ｐＨ変化に対して体積が変化するポリマーに固定した、糖や抗原により体積変化をするポリマーが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【００２０】
【非特許文献１】
第４３回高分子学会年次大会予稿集  １２１３頁（１９９４年）
【非特許文献２】
関西大学先端科学技術シンポジウム講演集（Ｖｏｌ．６ｔｈ、３３〜３８頁、２００２年）
【００２１】
上記化学物質の吸脱着によって体積が変化するポリマーとしては、強イオン性高分子ゲルが好ましく、例えば、ポリビニルスルホン酸の架橋物やビニルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリビニルベンゼンスルホン酸の架橋物やビニルベンゼンスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物、ポリアクリルアミドアルキルスルホン酸の架橋物やアクリルアミドアルキルスルホン酸と（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸アルキルエステルなどとの共重合体の架橋物などが挙げられ、これらとｎ−ドデシルピリジニウムクロライドなどのアルキルピリジニウム塩、アルキルアンモニウム塩、フェニルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウムクロライドなどのホスホニウム塩などカチオン性界面活性剤とを組み合わせることで使用される。
【００２２】
上記酸化・還元によって体積が変化するポリマーとしては、カチオン性高分子ゲルが挙げられ、電子受容性化合物と組み合わせてＣＴ錯体（電荷移動錯体）として好ましく使用される。カチオン性高分子ゲルとしては、例えば、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどポリアミノ置換（メタ）アクリルアミドの架橋物、ポリジメチルアミノエチル（  メタ）  アクリレート、ポリジエチルアミノエチル（  メタ）  アクリレートやポリジメチルアミノプロピル（  メタ）  アクリレートなどのポリ（メタ）アクリル酸アミノ置換アルキルエステルの架橋物、ポリスチレンの架橋物、ポリビニルピリジンの架橋物、ポリビニルカルバゾールの架橋物、ポリジメチルアミノスチレンの架橋物などが挙げられる。また、電子受容性化合物としてベンゾキノン、７，７，８，８−テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）、過塩素酸テトラブチルアンモニウム、テトラシアノエチレン、クロラニル、トリニトロベンゼン、無水マレイン酸やヨウ素などが挙げられる。
【００２３】
上記刺激応答性ゲルは、大きな一体的なゲルでもよいが、大きな一体的なものであると、検体中の（生）化学的刺激物が刺激応答性ゲル全体に作用するのに時間がかかるのに対し、不均化されていると検体との接触面積が広くなったり、滲み込み易くなり、刺激応答性が向上し測定時間が短縮できるので好ましい。不均化された刺激応答性ゲルの形態としては、全体として（生）化学的刺激により体積変化すれば任意の形態が可能であるが、（生）化学的刺激により体積変化するゲルの微小体の集合体、多孔性刺激応答性ゲル又は複数の刺激応答性ゲルシートと濾紙の積層体が好ましい。
【００２４】
上記ゲルの微小体及びその集合体の製造方法は、従来公知の任意の製造方法が採用されてよく、例えば、微小体の製造方法はポリマーを懸濁重合する、ブロック又はシート状のポリマーを作成し切断、破断する方法等が挙げられ、集合体の製造方法は得られた微小体を熱プレスする方法、得られた微小体の表面に溶剤や接着剤を薄く塗布しプレスする方法等が挙げられる。
【００２５】
ゲルの微小体の大きさは、特に限定されず、センサの大きさにより適宜決定されればよいが、一般に１μｍ〜２ｍｍである。
【００２６】
上記多孔性刺激応答性ゲルは、ゲル中に多数の連通孔が形成されているものであって、孔の直径は微細であるほど好ましい。多孔性刺激応答性ゲルの製造方法は任意の製造方法が採用されてよいが、例えば、ブロック状の刺激応答性ゲルを冷凍乾燥する方法が挙げられる。
【００２７】
複数の刺激応答性ゲルシートと濾紙の積層体は、刺激応答性ゲルのシートを作成し、濾紙と交互に積層することによって得られる。刺激応答性ゲルシートと濾紙の厚みは薄いほうが好ましく、積層数はセンサの大きさにより適宜決定されればよい。
尚、上記微小体や刺激応答性ゲルシートが多孔性の刺激応答性ゲルであってもよいことはいうまでもない。
【００２８】
刺激応答性ゲルは検体と直接接触してもよいが、刺激応答性ゲルと検体が直接接触せず、刺激応答性ゲルは検体中の（生）化学的刺激物だけと接触するように、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が配置されるのが好ましいので、検体供給用通路、特に、上記（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルに略接触するように、（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜が配置されているのが好ましい。
【００２９】
上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜とは、ｐＨ、グルコース、化学物質の吸脱着、酸化・還元等の（生）化学的刺激を与えうる（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜であり、一般に微細な連通孔を有する高分子樹脂フィルムが使用される。
【００３０】
上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜には、（生）化学的刺激反応に関与する受容体が固定されていてもよい。こうすることで、検体中の（生）化学的刺激物を受容体が捕捉し（生）化学的刺激変換反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物に変換することができ、バイオセンサが得られる。
【００３１】
上記受容体としては、検体中の（生）化学的刺激物を捕捉し（生）化学的刺激変換反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物への変換反応に関与することができる従来公知の任意の受容体が使用できる。
【００３２】
例えば、ｐＨ変化に対して体積が変化する刺激応答性ゲルを使用する場合は、ｐＨ変化を伴う反応を触媒する受容体が挙げられ、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、ＤＮＡの分子、ＲＮＡの分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた１種もしくはこれらの混合物が挙げられる（例えば、非特許文献３参照。）。
【００３３】
【非特許文献３】
バイオセンサー（軽部征夫監修、株式会社シーエムシー出版、２００２年５月２７日普及版第一刷発行）
【００３４】
上記酵素としては、測定対象物質がグルコースである場合はグルコースオキシダーゼ等が用いられるが、この場合、更に、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼとが併用されることが好ましい。グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼとが併用されることにより、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンからＤ−グルコン酸への加水分解反応がより促進される。
【００３５】
測定対象物質が尿素である場合はウレアーゼが用いられる。尿素がウレアーゼに触媒されてアンモニアが生じｐＨが上昇し、ゲルの体積変化が起こる。
グルコースセンサを基礎として、グルコースまたはグルコース前駆体を生成する種々の生体反応物質もしくは生体活性を測ることもできる。例えば、本発明のグルコースセンサに水溶性デンプンとα−グルコシダーゼを包括固定化した多孔膜を積層すると、α−アミラーゼ活性センサを構成できる。
【００３６】
ｐＨを変化させる生体酵素反応やグルコースまたはグルコース前駆体を生成する生体酵素反応はこのほかにも多数知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【００３７】
【非特許文献４】
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（全２５巻）、シュプリンガー出版
【００３８】
上記微生物として、硝化菌を使用した場合は、アンモニアセンサが得られ、大腸菌を使用した場合は、グルタミン酸センサが得られる。
【００３９】
上記受容体として抗原や抗体を選ぶときには、酵素修飾した抗体によるサンドイッチ法又は競合法で、受容体にｐＨ変化またはグルコース生成を起こさせる機能を持たせることができ、任意の抗体もしくは抗原を検出することができる。
【００４０】
上記抗体断片とは、少なくともひとつのＦａｂフラグメントを含む抗体断片であって、Ｆａｂフラグメントは免疫グロブリンを酵素のパパインによってＹ形分子の枝の根元から切断することによって得られる。Ｆａｂフラグメントが、脂質の頭部群、炭化水素鎖、両機能形成架橋可能な分子及び膜タンパク質からなる群から選択される支持部に共有結合によって連結されたものが好ましい。
又、レクチンとは、糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成するタンパク質の総称である。
【００４１】
又、上記（生）化学的刺激物を透過しうる隔膜としては、特定の（生）化学的刺激物のみを透過しうる（生）化学的刺激物選択透過性隔膜も好ましい。
【００４２】
炭酸ガスを選択的に透過しうる選択透過性隔膜としては、例えば、ポリイミド膜、酢酸セルロース膜、ポリスルホン膜等が挙げられる。グルコース及びその他の多くの分子は透過しうるが、血球や細胞は透過できない選択透過性隔膜としては、例えば、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（例えば、デュポン社製、商品名「ナフィオン」）が知られている。
【００４３】
又、水、イオン及び乳酸塩は透過しうるが、グルコースは透過できないように特定の大きさの細孔を設けた膜も知られている。これは、直径０．６〜０．７４ｎｍの細孔を形成した膜であって、グルコースに対して半透性であると言われている。又、直径０．９ｎｍ台の細孔を形成した、グルコース分子がぎりぎり透過しうる膜も知られている。これらの細孔径を制御する方法としては、ロブスラリーヤン法により非対称膜を作成する方法が確立されている。
【００４４】
刺激応答性ゲルがグルコース感応型刺激応答性ゲルである場合は、（生）化学的刺激物選択透過性隔膜が、グルコース透過性隔膜であることが好ましい。
【００４５】
又、刺激応答性ゲルに、（生）化学的刺激変換反応を引き起こす受容体が固定されていてもよい。この場合、刺激応答性ゲルだけに受容体が固定されていてもよいし、刺激応答性ゲルと上記隔膜の両方に受容体が固定されていてもよい。特に、下記式に示すように検体中の（生）化学的刺激物を捕捉し２段階で（生）化学的刺激反応を行い、刺激応答性ゲルが体積変化するのに適した（生）化学的刺激物に変換する場合には刺激応答性ゲルと隔膜の両方に受容体が固定されているのが好ましい。
【００４６】
【化１】
2005003616.tif 000003
【００４７】
上記受容体としては、前述の受容体が使用可能である他に、（生）化学的刺激物を内包するマイクロカプセルに結合しており、検出対象物と受容体が結合するとマイクロカプセルが崩壊するようになされて、固定されている受容体も好適に使用され、マイクロカプセルがリポソームであり、（生）化学的刺激物が酵素であり、受容体が抗体であって、補体と共に固定されているのが好ましい。
【００４８】
上記リポソームは、リン脂質等の人工的に合成された脂質膜小胞を意味し、リン脂質としては、動物や微生物などの細胞膜に広く存在するリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類；天然の卵黄、牛脳や大豆などから得られるホスファチジルコリン等が挙げられる。
【００４９】
上記補体は、補体は動物血清中に含まれる成分で、一般に用いられるモルモット、ウサギ、ブタ、牛、馬などの新鮮血清あるいは人間の血清などあらゆる動物の血清が挙げられが、力価が高く、希釈倍率を著しく高くすることができ（１００〜２００倍）、経済的であるモルモット補体が好ましい。
【００５０】
上記抗体結合リポソームの製造方法は、従来より種々提案されており（例えば、特許文献５参照。）、これら公知の任意の製造方法で製造されればよい。
【００５１】
【特許文献５】
特公平３−１０７５３６号公報
【００５２】
上記抗体結合リポソームは、フリーな抗体と検体とを共存させると、検体中の抗原と、リポソームに結合している抗体と、フリーな抗体とでサンドイッチ型の抗原抗体複合体を形成する。この複合体にて補体が活性化されて、捕体がリポソームを特異的に攻撃破壊する。破壊されたリポソームからは多量の（生）化学的刺激物が流出する。この流出した多量の（生）化学的刺激物が刺激応答性ゲルの体積を変化させるので、検体の検出感度が高くなる。更に、個々のリポソームに内包される（生）化学的刺激物の量の分散値が小さければ、比例性を確保でき検出精度も高くできる。
【００５３】
リポソームに内包する（生）化学的刺激物としては、ゲルが直接応答する（生）化学的刺激物であってもよいし、ゲルが直接応答する（生）化学的刺激物を生成する刺激変換反応に関与する酵素であってもよい。
【００５４】
例えば、グルコース感応型の刺激応答性ゲルに対し、抗体結合リポソームにグルコースを内包することもできるし、抗体結合リポソームにアミラーゼを内包しておいて、グルコース感応型のゲルとデンプンと共に用いてもよい。リポソームにグルコースオキシダーゼを内包しておき、ｐＨ感応型の刺激応答性ゲルとグルコースと共に用いることもできる。検体に対する検出感度の点からは、酵素を内包する方法の方が、酵素反応による増感効果が同時に期待できるので好ましい。
【００５５】
尚、抗体結合リポソームは、立体障害によりホモジニアスな測定系となるので既反応物と未反応物とを分離する洗浄操作、所謂Ｂ／Ｆ分離が不要である。
ウサギ由来の抗体はリポソーム表面に結合させた場合に非特異反応の原因となるために、リポソームに結合させる抗体としてヤギＩｇＧ抗体を且つフリーな抗体としてウサギＩｇＧ抗体を使用する方法が知られている。
【００５６】
しかし，コストの点からは、ウサギ抗体断片Ｆａｂ’をリポソームに結合させ且つフリーな抗体としてウサギＩｇＧ抗体を用いる方法、又は、マウスのモノクローナル抗体断片Ｆａｂ’をリポソームに結合させる抗体として且つフリーな抗体として前記のモノクローナル抗体とは抗原決定認識部位の異なるマウスモノクローナル抗体若しくはウサギＩｇＧ抗体を用いる方法の方が好ましい。
【００５７】
上記リポソームの破壊の理由については明らかでないが、抗原と抗体の複合体が補体を活性化させ、これが連鎖反応を起こすことにより破壊されるものと推定される。
【００５８】
尚、受容体をゲル中又は隔膜に固定化する方法としては、従来公知の任意の方法が採用されてよく、例えば、物理的吸着法、包括固定化法、イオン結合法、共有結合法（架橋法）及びこれらを複数を組み合わせた方法等が挙げられる。
【００５９】
上記液体は、第１の隔室及び液体用通路に充填され、刺激応答性ゲルの体積変化により通路内を移動するようになされており、刺激応答性ゲルの体積変化を液柱の変化として目視することにより、検体の測定結果を認識できるようになされている。
【００６０】
上記液体としては、例えば、水、アルコール、流動パラフィン、シリコンオイル、油脂、水銀等が挙げられ、肉眼による検知が容易なように着色されているのが好ましく、液体の先端に油相が添付され先端の油相のみが着色されていてもよい。  又、屈折率の差により、液体の先端が視認できるように、通路の断面形状が円形や三角形になされていてもよいし、通路の下面に凹凸が形成されていたり、印刷が施されていてもよい。
【００６１】
第１の隔室は、容積が外部圧力により実質的に変化しない部屋であるから、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、メチルメタクリレ−ト樹脂、ホトレジスト、ガラス、セラミックス、シリコンウエハ、金属等任意の材料よりなる基板に形成されるのが好ましく、第１の隔室に繋がる液体通路が形成される基板は透明性のガラス又は合成樹脂で構成されるのが好ましい。
【００６２】
又、第２の隔室は、第１の隔室内に配置され、その内部に刺激応答性ゲルが充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化を外部、即ち、液体に伝達するのであるから、刺激応答性ゲルの体積変化を外部へ伝達しうる材料で製造されていることが必要であり、このような材料としては、例えば、シリコーンゴム膜、ポリウレタン膜、アルミニウム薄膜等が挙げられる。
【００６３】
請求項２記載のセンサは、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが充填されている、容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室と、第１の隔室内に配置され、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルの体積変化を内部に伝達しうる第２の隔室と、第１の隔室と外部と連通する検体供給用通路と、第２の隔室に繋がる液体用通路よりなり、第２の隔室及び液体用通路に液体が充填されており、刺激応答性ゲルの体積変化により、液体用通路内を液体が移動するようになされていることを特徴とする。
【００６４】
請求項２記載のセンサは、第１の隔室と検体供給通路が連通され、第１の隔室に（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルが充填されていること及び第２の隔室と液体用通路が繋がり、第２の隔室に液体が充填されている以外は請求項１記載のセンサと同一である。
【００６５】
請求項１又は２記載のセンサは複数個並列に設置して集積型センサとされてもよく、各センサに異なる（生）化学的刺激により体積変化するゲルを充填したり、異なる（生）化学的刺激変換反応に関与する受容体を隔膜に固定することで複数の測定を一度に行うことができる。
【００６６】
【作用】
本発明のセンサの構成は上述の通りであるから、全血、リンパ液、血漿、血清、唾液、尿、大便、汗、粘液、涙、髄液、鼻分泌液、頸部または膣の分泌液、精液、胸膜液、羊水、腹水、中耳液、関節液、胃吸引液等の如き生体液を含む殆どの液体試料の分析に利用できる。
又、固体試料又は乾燥試料は、分析に適した液体混合物を与えるのに適した溶媒に溶解して分析できることは当然である。
【００６７】
【実施の形態】
次に、本発明の実施例を説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
先ず、本発明のセンサを図面を参照して説明する。図１は請求項１記載のセンサの１例を示す断面図である。図中１は上部基板であり、２は下部基板である。上部基板１には凹部１１と凹部１１内に検体供給用通路である貫通孔１２が形成されている。下部基板２には凹部２１と凹部２１に繋がる液体通路である溝２２が形成されている。上部基板１と下部基板２は凹部１１と凹部２１が向かい合うように積層され、凹部１１と凹部２１により、容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室３が形成されている。
【００６８】
４は（生）化学的刺激により体積変化するゲルの微球体の集合体であって、全体として（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルである。５は刺激応答性ゲル４が内部に充填されており、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルの体積変化を外部に伝達しうる第２の隔室であり、第１の隔室内に配置され、第２の隔室５の開口部は検体供給用通路１２に接続されている。又、検体供給用通路１２の入口付近には（生）化学的刺激物選択透過性膜６が開口部をふさぐように設置されており、第１の隔室３と液体通路２２には液体７が充填されている。
【００６９】
図２は請求項２記載のセンサの１例を示す断面図である。図中１３は上部基板であり、２３は下部基板である。上部基板１３には凹部１４と凹部１４内に検体供給用通路である貫通孔１５が形成されている。下部基板２３には凹部２４と凹部２４に繋がる液体通路である溝２５が形成されている。上部基板１３と下部基板２３は凹部１４と凹部２４が向かい合うように積層され、凹部１４と凹部２４により、容積が外部圧力により実質的に変化しない第１の隔室３１が形成されている。
【００７０】
４１は（生）化学的刺激により体積変化するゲルの微球体の集合体であって、全体として（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルである。５１は液体７１が内部に充填されており、（生）化学的刺激により体積変化する刺激応答性ゲルの体積変化を内部に伝達しうる第２の隔室であり、第１の隔室内に配置され、第２の隔室５１の開口部は液体通路２５に接続されている。又、検体供給用通路１５の入口付近には（生）化学的刺激物選択透過性膜６１が開口部をふさぐように設置されている。
【００７１】
（実施例１）
図１に示したセンサを作成した。
上部基板１及び下部基板２の作成  ホットスタンピング用の転写金型とその受け型が形成するキャビティにメチルメタクリレート樹脂を充填し、１５０℃で５分間予熱し、次いで１９０℃で３０分間加熱プレスすることにより、図１に示した凹部１１，２１、溝２２及び貫通孔１２を有する上部基板１及び下部基板２を得た。
【００７２】
刺激応答性ゲルの作製  ５０ｍｌビーカーに純水４０ｍｌを満たし、そこに、モノマーであるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）を３．５７ｇ、アクリル酸（ＡＡｃ）を２５３ｍｇ、架橋剤としてメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）を６７．５ｍｇ、促進剤としてテトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を２５０μｌ加え、攪拌しながら、このゲル前駆体溶液を窒素置換し、溶存酸素を取り除いた。
【００７３】
酵素（グルコースオキシダーゼ）を５ｍｇ（８００ｕｎｉｔ）とり、５００μｌの純水に溶かした酵素溶液に、上記ゲル前駆体溶液を５００μｌ加え、全体で１ｍｌの溶液とし、少し攪拌した後、０℃で１０分程冷却した。
【００７４】
冷却後、重合開始剤として、ペルオキソニ硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）１ｍｇを加え、更に０℃で２０分程冷却して刺激応答性ゲルを得た。得られた刺激応答性ゲルは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、冷蔵庫（４℃）で保存した。
得られた刺激応答性ゲルを細かく切断（約０．５ｍｍの立方体）し、それを集めてプレス成形して、刺激応答性ゲル集合体を得た。
【００７５】
刺激応答性ゲルの封入と、基板の積層  得られた刺激応答性ゲル集合体を、第２の隔室用の袋状のシリコーンゴムに充填し、その開口部を上部基板の貫通孔１２にゴム系接着剤で接着した。又、貫通孔１２に外側から（生）化学的刺激物選択透過性膜６として、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（デュポン社製、商品名「ナフィオン」）を接着剤で固定した。
【００７６】
下部基板２上にシリコーンゴム（信越化学工業社製、ＫＥ３４７５Ｔ）を滴下し、４０００ｒｐｍで５秒間スピンコーティングし、凹部１１と凹部２１が向かい合うように上部基板１と重ね合わせて接着し、第１の隔室３及び通路２２を形成し、次いで、第１の隔室３及び通路２２に流動パラフィンを注入することにより、本発明のグルコースセンサを得た。
【００７７】
上記刺激応答性ゲルに固定したグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は、下記式に示すグルコースの酸化反応に触媒作用をおよぼす酵素である。
【００７８】
【化２】
2005003616.tif 000004
【００７９】
ＧＯＤを包括固定化した刺激応答性ゲルがグルコース溶液に触れると、グルコースが刺激応答性ゲル内に浸透し、上記のような反応をおこす。そして、刺激応答性ゲル内にグルコン酸が生じて溶媒のｐＨが下がる。そのことにより、解離していた高分子鎖のカルボキシル基がプロトン化され、ＮＩＰＡＡｍ鎖間の疎水性相互作用による引力が支配的になり、刺激応答性ゲルが収縮する。
【００８０】
中性の状態で膨潤させておいた刺激応答性ゲルを、グルコースを含むサンプル溶液に接触させると、上記の反応により刺激応答性ゲルは収縮し、この変化は流路内の液体の液柱の変化としてとらえることができるため、この変化からグルコース濃度を求めることができる。尚、ここでは温度を一定にコントロールする必要があるが、これを行うには、センサの刺激応答性ゲル付近を手でつまみ、人間の体温を利用する等の手段が採りうる。
【００８１】
刺激応答性ゲルの収縮挙動は、図３に示したように、忠実に流路中の液柱の変化としてとらえることができる。収縮過渡状態においては、グルコース濃度によりその変化率の明瞭な差が認められるため、時間を定めて液柱の長さを測定すれば、これからグルコース濃度を求めることもできる。
【００８２】
（実施例２）
図２に示したセンサを作成した。
実施例１で行ったと同様にして上部基板１３と下部基板２３を得た。上部基板１３と下部基板２３を実施例１で行ったと同様にして積層して第１の隔室３１及び液体通路２５を形成すると共に、第２に隔室用の袋状のシリコーンゴムの開口部に液体通路２５に当接してゴム系接着剤で接着して第２の隔室５１を形成した。液体通路２５及び第２の隔室５１に流動パラフィンを注入した後、貫通孔１５から実施例１で得られた細かく切断（約０．５ｍｍの立方体）した刺激応答性ゲルを、凹部１４と凹部２４で形成された第１の隔室３１に充填した。
【００８３】
次に、貫通孔１５に外側から（生）化学的刺激物選択透過性膜６１として、パーフルオロスルフォン酸の重合体膜（デュポン社製、商品名「ナフィオン」）を接着剤で固定して本発明のグルコースセンサを得た。
【００８４】
【発明の効果】
本発明のセンサの構成は上述の通りであり、化学物質、特に、血液中、唾液中又は尿中の生体関連物質を迅速かつ簡便に測定することができる。又、小型化でき安価に大量に生産できるのでディスポーザブルセンサとして好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のセンサの１例を示す断面図である。
【図２】本発明のセンサの異なる例を示す断面図である。
【図３】濃度の異なる３種類のグルコースを含むサンプル溶液を、実施例１で得られたセンサを用いて測定した、時間と液柱の収縮状態を示すグラフである。
【符号の説明】
１、１３    上部基板
２、２３    下部基板
３、３１    第１の隔室
４、４１    刺激応答性ゲル
５、５１    第２の隔室
６、６１    （生）化学的刺激物選択透過性膜
７、７１    液体
１１、１４、２１、２４    凹部
１２、１５    検体供給用通路（貫通孔）
２２，２５    液体通路（溝）
【図１】
2005003616.tif 000005
【図２】
2005003616.tif 000006
【図３】
2005003616.tif 000007