(57)【要約】【課題】  高活性カタラーゼの遺伝子を提供すること、および該遺伝子を用いて高活性カタラーゼを製造する方法を提供することである。【解決手段】  新菌株イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）から分離した特定の塩基配列を有する高活性カタラーゼの遺伝子、および該遺伝子を用いて高活性カタラーゼを製造する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするカタラーゼ遺伝子。
(a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるカタラーゼ遺伝子。
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)(a)の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載の遺伝子を保有する組み換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項５】
以下の(a)又は(b)のカタラーゼ。
(a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
請求項４記載の形質転換体を培地中で培養し、請求項５記載のカタラーゼを製造することを特徴とする該カタラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は細菌イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）(FERM P-18203) 由来のカタラーゼ遺伝子と、この遺伝子の発現産物であるカタラーゼ（以下、「EOカタラーゼ」と記載する場合がある）に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、過酸化水素が含まれる産業廃水の浄化に有用な新規カタラーゼと、このカタラーゼをコードする遺伝子、並びにこの遺伝子発現のための遺伝子工学材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過酸化水素は、好気性生物における酸素代謝の過程でごく普通に発生するが、細胞にとっては毒性に作用するため（例えば細胞膜、タンパク質、ＤＮＡ等への障害作用）、ほとんどの動植物細胞にはこの過酸化水素を水と酸素に分解するための酵素（カタラーゼ）が広く分布している。
【０００３】
過酸化水素はまた、例えば食品や各種化合物等の脂質酸化等による変性の原因物質であり、あるいは工場排水等における有毒な汚染物質でもある。このため、この過酸化水素を分解するためのカタラーゼは、酸化防止剤や汚染水／土壌等の浄化剤として有望視されており、牛肝臓カタラーゼ標品が市販されているほか、ミクロコッカス（Miorococcus luteus (lysodeikticus)）等のバクテリア由来のカタラーゼも知られている。（非特許文献１）
【０００４】
またこれまでに高濃度の過酸化水素を含む工場排水から過酸化水素に対して耐性を有する新菌株イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）を単離し、その細胞抽出液が他の一般的な微生物のものと比較して遙かに強いカタラーゼ活性を有することが見いだされている。（特許文献1）
【０００５】
一方、本発明者らは、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）の同酵素遺伝子由来の精製酵素が、大腸菌や枯草菌のカタラーゼよりも遙かに強い活性を有するカタラーゼ活性を産生することを見い出した。
【０００６】
【特許文献１】特開2002-253215号公報
【非特許文献１】Murshudov GN, Melik-Adamyan WR, Grebenko AI, Barynin VV, Vagin AA, Vainshtein BK, Dauter, Z, Wilson, KS (1992) Three-dimensional structure of catalase from Micrococcuslysodeikticus at 1.5 A resolution. FEBS Lett 312, 127-131.
【非特許文献２】Claiborne, A., Malinowski, DP, Fridovich, I. (1979) Purification and characterization of hydroperoxidase II of Escherichia coli B. J Biol Chem 254, 11664-11668.
【非特許文献３】Loewen PC, Switala, J. (1987) Purification and characterization of catalase-1 from Bacillus subtilis. Biochem Cell Biol 65, 939-947.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明の課題は、従来の大腸菌や枯草菌のカタラーゼよりも顕著に強い活性を有するカタラーゼの遺伝子をクローニングし、該遺伝子を提供すること、および該遺伝子を用いて高活性カタラーゼを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かかる課題を達成すべく鋭意検討を行った結果、発明者らが単離した新菌株イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）を用いることにより本発明を完成するに至った。なお、この菌株は精製酵素において約1,000,000 U/mg protein の活性値を示すものである。
【０００９】
即ち、本発明は、次の内容を要旨とするものである。
（１）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするカタラーゼ遺伝子。
(a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
（２）以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるカタラーゼ遺伝子。
(a)配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)(a)の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１１】
（３）（１）又は（２）記載の遺伝子を保有する組み換えベクター。
（４）（３）記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
（５）以下の(a)又は(b)のカタラーゼ。
(a)配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)アミノ酸配列(a)において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカタラーゼ活性を有するタンパク質
【００１２】
（６）（４）記載の形質転換体を培地中で培養し、（５）記載のカタラーゼを製造することを特徴とする該カタラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、高活性カタラーゼの遺伝子を提供し、そして、該遺伝子を用いて高活性カタラーゼを効率的且つ高収量で製造することを可能とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
この発明のイグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）（FERM P-18203）由来のカタラーゼ遺伝子（以下、「ektA」と記載する場合がある）は配列番号１に示した1,476bpの塩基配列からなり、491アミノ酸残基からなるektAをコードする単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。この発明のEOカタラーゼは、遺伝子ektAの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素である。そしてこの菌株は精製酵素において約1,000,000 U/mg protein の活性値を示すものである。因みに大腸菌や枯草菌のカタラーゼはそれぞれ8,900 U/mg protein及び170,000 U/mg proteinである（非特許文献２及び非特許文献３）。
【００１５】
遺伝子ektAは、後記する実施例の方法によりイグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）より単離・同定された遺伝子である。従って、この遺伝子ektAは、後記の実施例と同一の方法により取得することができる。
【００１６】
あるいは、この遺伝子ektAは、この出願によって提供されるDNA配列（配列番号１）に基づいて作成したプローブを用い、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacteriumoxidotolericum）のゲノムライブラリー等をスクリーニングすることによって取得することもできる。しかし後述する様に、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacteriumoxidotolericum）のカタラーゼ遺伝子取得においてはゲノムライブラリー等をスクリーニングすることによって取得することは出来なかった。
【００１７】
この発明の遺伝子ektAは、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供される遺伝子ektAを用いて組み換えDNA技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組み換えDNA技術によって遺伝子ektAを取得する場合には、この発明の遺伝子ektAを有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことにより、遺伝子ektAを得ることができる。また、遺伝子ektAを公知の方法により適当な発現ベクターに組み換え、この組み換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体で遺伝子ektAを大量に発現させることができる。さらに、細胞外へタンパク質を分泌する能力を持つベクターとektA遺伝子を共存させることにより、EOカタラーゼを菌体外酵素として大量に調製することができる。
【００１８】
この発明のEOカタラーゼをインビトロ翻訳で生産させる場合には、この発明の遺伝子ektAをRNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組み換え、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pT7Blue、pBluescript II、pZero II、pET-23(+)などが例示できる。
【００１９】
また、この発明の遺伝子ektAを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明の遺伝子ektAを組み換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すればよい。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパクとして発現させることもできる。この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的とするEOカタラーゼのみを取得することもできる。大腸菌発現ベクターとしては、pUC系、例えばpBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。
【００２０】
この発明の遺伝子ektAを真核細胞で発現させる場合には、この発明の遺伝子ektAを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（A）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組み換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２１】
上記の方法により原核細胞や真核細胞でカタラーゼを発現させた後、培養物から目的タンパク質を単利精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、超音波処理、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
【００２２】
イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）には様々な変異株が存在するがそれらはいずれも高活性カタラーゼ(精製酵素の比活性が700,000 U/mg protein 以上)を産生する。従って、配列番号２において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子あっても、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様のカタラーゼ高活性を有する限りそれらの遺伝子はこの発明のカタラーゼ遺伝子に含まれる。同様に、これらの塩基の変異によって生じる、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているカタラーゼも、配列番号２のアミノ酸配列を有するカタラーゼの活性を有する限り、この発明に含まれる。なお、上記変異は、例えば部位特異変異法により得られるものである。
【００２３】
また、配列番号１からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するカタラーゼの活性を有する限りこの発明に含まれる。なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、本発明の遺伝子ektAに対し高い相同性（相同性が90%以上、好ましくは95%以上）を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、この様な条件は、0.5〜1MのNaCl存在下42〜68℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC(saline sodium citrate)溶液を用いて室温〜68℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）  カタラーゼ遺伝子ektAのクローニング
（1）プローブの調整
イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）の培養物から採取したEOカタラーゼをQ-Sepharose Fast Flow陰イオン交換カラム（Pharmacia社製）およびSephacryl S-300ゲル分画カラム（Pharmacia社製）を用いて精製した。さらに、この精製カタラーゼ（1.6 μg）をポリアクリルアミド電気泳動したのち、ポリフッ化ビニリデン製メンブレン（Millipore社製）にブロットし、クマシーブリリアントブルーで染色した。メンブレンからカタラーゼのバンドを切り出し、タンパク質自動シークエンサー（Applied Biosystem 491：Perkin-Elmer社製）によりEOカタラーゼのN末端アミノ酸配列を決定した。
【００２６】
以上の通りにして決定したN末端アミノ酸配列からオリゴヌクレオチドを合成し、さらに決定したN末端アミノ酸配列と他種の細菌のカタラーゼのアミノ酸配列を比較し、保存性の高いアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドを合成した。そして、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacteriumoxidotolericum）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。
【００２７】
PCR反応溶液（全量100 μl）の組成は以下の通りである。
10xPCRバッファー（Takara社製）：10 μl
10 mM デオキシヌクレオシド三リン酸塩混合液（Takara社製）：4 μl
ゲノムDNA：0.6 μg
オリゴヌクレオチドプライマー：各100 pmol
TaqDNAポリメラーゼ（Roshe社製）：2.5 U
蒸留水
【００２８】
また、PCR条件は以下の通りとした。
（94℃：2分間、50℃：30秒間、72℃：2分間）ｘ1サイクル
（94℃：30秒間、50℃：30秒間、72℃：2分間）ｘ25サイクル
（94℃：30秒間、50℃：30秒間、72℃：6分間）ｘ1サイクル
【００２９】
以上の通りのPCRにより、プライマーP-N1（配列番号3）およびプライマーP-S1（配列番号4）を用いた場合のPCR産物（731bpDNA断片）の塩基配列が、ListeriaseeligeriおよびDeinococcus radioduransカタラーゼと高い相同性を示すことが確認された。このため、決定された配列からオリゴヌクレオチドP-N2（配列番号5）およびP-S2（配列番号6）を合成し、プライマーP-N2およびプライマーP-S2を用いた場合のPCR産物（630bpDNA断片：PP-630）をカタラーゼ遺伝子のクローニング用プローブとした。
【００３０】
（2）ライブラリーの構築とスクリーニング1
イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）の染色体DNAを制限酵素SalIで37℃1時間処置して切断し、アガロース電気泳動した。プローブPP-630がハイブリダイズした3kbDNA断片をゲルから切り出し、ライゲーションキット（Takara社製）を用いて、プラスミドpT7BlueのSalI部位にライゲーションし、この組み換えプラスミドによって大腸菌E. coli Dh5αを形質転換してライブラリーを構築した。
【００３１】
次いで、PP-630をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行ったが、陽性反応を示すコロニーは得られなかった。
【００３２】
（3）ライブラリーの構築とスクリーニング2
イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）の染色体DNAを制限酵素Sau3A Iで37℃、1時間処置して切断し、ライゲーションキット（Takara社製）を用いて、同様に制限酵素BamH Iで処置したLambda DASH II vector（Stratagene社製）にライゲーションした。次いで、この組み換えラムダファージDNAをGigapack III Gold（Stratagene社製）を用いてパッケージングを行い、大腸菌E. coli XL1-Blue MRA (P2)に感染させてライブラリーを構築した。
【００３３】
PP-630をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行い、プローブに対して陽性反応を示すプラークPla3およびPla4を得た。このプラークからラムダファージDNAを回収し、さらに制限酵素SalIで37℃、24時間処置して切断し、アガロース電気泳動した。次いで、プローブPP-630がハイブリダイズした1kbDNA断片をゲルから切り出し、ライゲーションキット（Takara社製）を用いてプラスミドPUC119のSal I部位にライゲーションし、大腸菌E. coli DH5αを形質転換した。この形質転換した大腸菌を培養して、菌体からプラスミドP-Pla3およびP-Pla4を抽出した。このP-Pla3およびP-Pla4のインサートDNA断片の一部塩基配列を、DNAシークエンサー（model 310：Perkin-Elmer社製）を用いて決定した。その結果、P-Pla3およびP-Pla4のインサート配列はカタラーゼの配列が同じ位置のSau3A I部位で切断され、他のSau3A I断片と繋がったものであることがわかり、この方法はイグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacteriumoxidotolericum）のカタラーゼ遺伝子のクローニングには適さないと判断した。
【００３４】
（4）インバースPCR
プローブPP-630の内部配列から4種類のオリゴヌクレオチドP-N3（配列番号7）、P-N4（配列番号8）、P-S3（配列番号9）およびP-S4（配列番号10）を合成した。オリゴヌクレオチドP-N3およびP-S3はそれぞれP-N4およびP-S4に対して内側の塩基配列となるようにした。そして、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacterium oxidotolericum）のゲノムDNAを制限酵素Xba Iで37℃、8時間処置して切断し、ライゲーションキット（Takara社製）を用いて自己ライゲーションを行った。次いで、オリゴヌクレオチドP-N3およびP-R3をプライマーとし、自己ライゲーションしたXbaI消化生成物を鋳型としてPCRを行った。
【００３５】
PCR反応溶液（全量50 μl）の組成は以下の通りである。
Mg2+ free 10xPCRバッファー（Takara社製）：5 μl
25 mM MgCl2：3 μl
2.5 mM デオキシヌクレオシド三リン酸塩混合液（Takara社製）：8 μl
ライゲーション溶液：1 μl
オリゴヌクレオチドプライマー：各50 pmol
LA TaqDNAポリメラーゼ（Takara社製）：2.5 U
蒸留水
【００３６】
また、PCR条件は以下の通りとした。
（96℃：2分間、55℃：30秒間、68℃：10分間）x1サイクル
（96℃：30秒間、55℃：30秒間、68℃：10分間）x25サイクル
【００３７】
以上の通りのPCRにより、プライマーP-N3およびP-S3を用いた場合のPCR産物（4.5kbpDNA断片：PP-4500）を得た。さらに、オリゴヌクレオチドP-N4およびP-S4をプライマーとし、PCR産物PP-4500を鋳型として同様にPCRを行った。この結果、PCR産物（4.5kbpDNA断片：PP-4500-）を得たことから、PCR産物PP-4500は間違いなくプローブPP-630の塩基配列に由来することを確認した。そこで、このPCR産物PP-4500-の塩基配列のカタラーゼ部分（配列番号1）をDNAシークエンサー（model 310：Perkin-Elmer社製）を用いて決定した。その結果、このDNA断片PP-4500-は、491アミノ酸配列（配列番号2）をコードする塩基数1473個のORFを含む全1476bpの配列（配列番号1）を含んでいることが確認された。
【００３８】
さらに、配列番号2の全491アミノ酸配列について、Listeriaseeligeri katカタラーゼおよび大腸菌E. coli HPII型カタラーゼKatEの対応するアミノ酸と比較した結果、図1Ａおよび図１Ｂに示した通り、3者間には高い相同性が認められたことから、配列番号1の塩基配列を有するDNA断片をカタラーゼ遺伝子として同定し、遺伝子ektAと命名した。
【００３９】
（実施例2）  遺伝子ektAの大腸菌での発現
実施例1で塩基配列を決定したカタラーゼ遺伝子ektAの前後の塩基配列（配列番号11）から、オリゴヌクレオチドP-N5（配列番号12）およびP-S5（配列番号13）を合成した。そして、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、イグジォバクテリウム・オキシドトレリカム（Exiguobacteriumoxidotolericum）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。
【００４０】
PCR反応溶液（全量50 μl）の組成は以下の通りである。
10xPCRバッファー（Takara社製）：5 μl
2.5 mM デオキシヌクレオシド三リン酸塩混合液（Takara社製）：4 μl
ゲノムDNA：0.1 μg
オリゴヌクレオチドプライマー：各10 pmol
PfuTurbo DNAポリメラーゼ（Stratagene社製）：2.5 U
蒸留水
【００４１】
また、PCR条件は以下の通りとした。
（95℃：2分30秒間、55℃：30秒間、72℃：3分間）x1サイクル
（95℃：30秒間、55℃：30秒間、72℃：3分間）x30サイクル
（94℃：30秒間、55℃：30秒間、72℃：10分間）x1サイクル
【００４２】
以上の通りのPCRにより、プライマーP-N5とP-S5を用いた場合のPCR産物（1546bpDNA断片：PP-kat）を得た。このPCR産物を、ライゲーションキット（Takara社製）を用いて、制限酵素EcoRVで処置したpZErO-2 vector（Invitrogen社製）にライゲーションし、大腸菌E. coli DH5αを形質転換した。この形質転換した大腸菌を硫酸カナマイシンを50 mg/Lの濃度で含むLB培地で培養してスクリーニングを行い、インサートを含む菌体からプラスミドを抽出した。さらに、このプラスミドを制限酵素HindIIIおよびXho Iで処置し、PP-katを含むDNA断片（1628bpDNA断片：pp-kat+）を得た。このDNA断片PP-kat+をライゲーションキット（Takara社製）を用いて、制限酵素HindIIIとXho Iで処置したpET-23(+)ベクター（Novagen社製）にライゲーションし、大腸菌E. coliBL21(DE3)を形質転換した。
【００４３】
次いで、菌体をアンピシリンを50 mg/lの濃度で含むLB液体培地に接種し37℃で12時間培養した。その後、1/100容の菌体培養液を新たに同様の液体培地に接種し37℃で2時間培養し、IPTGを0.5 mMの濃度になるように加えて8時間培養した。この結果、得られた菌体を遠心回収し、菌体を超音波破砕機により破砕し菌体の全タンパクを含む抽出液を得た。
【００４４】
得られた抽出液を常法に従いSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。その結果、ネイティブのカタラーゼと同じ位置に強いバンドが観測された。さらに、抽出液のカタラーゼ活性を測定したところ16000U/mgと極めて高い活性を示したことから、この発明のカタラーゼ遺伝子ektAを大腸菌で発現させることによって、この発明のEOカタラーゼを取得可能であることが確認された。
【００４５】
（実施例3）取得遺伝子の改変による高活性カタラーゼ遺伝子、その形質転換大腸菌の取得および高活性カタラーゼの製造
実施例1で得られた遺伝子ektAをpZERO II ベクターに組み替えたものを、プラスミドDNAにランダムに変異を導入することのできる大腸菌XL1-Red株ヒートショック法によって導入し、ランダムに変異の入ったektAを持つプラスミドを得た。変異を導入する前のektAを保持しているプラスミドと、変異を導入した後のektAを保持しているプラスミドを、それぞれ大腸菌XL1-Blueに導入して50 mg/lの濃度のカナマイシン、50μM の濃度IPTGを添加したLB液体培地にて培養した。それぞれの培養液から菌体を集菌し、それぞれから無細胞抽出液を調整してそれらのカタラーゼのタンパク質量（mg）あたりの活性を測定した。その結果、変異を導入する前のektAを持つプラスミドを保持している菌株のカタラーゼのタンパク質量あたりの活性は50.8 U/mg-proteinであったのに対して、変異を導入後のektAを持つプラスミドを保持している菌株のカタラーゼのタンパク質量当たりの活性は241.9 U/mg-proteinとおよそ5倍高い値を示した。これらの粗酵素液のカタラーゼ活性は実施例2よりかなり低いものであるが、この違いは発現ベクターのプロモーター活性の違いによる発現量の違いによるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】配列番号2のアミノ酸配列について、Listeriaseeligeri katカタラーゼおよび大腸菌E. coli HPII型カタラーゼKatEのアミノ酸配列との相同性を示す図。
【図１Ｂ】配列番号2のアミノ酸配列について、Listeriaseeligeri katカタラーゼおよび大腸菌E. coli HPII型カタラーゼKatEのアミノ酸配列との相同性を示す図。
【図１Ａ】
2005204559.tif 000002
【図１Ｂ】
2005204559.tif 000003
【配列表】
2005204559000001.app