(57)【要約】【課題】  例えば体液中に含まれるコレステロールのような、試料中に含まれる微量成分を、簡易な装置構成で、簡便に、高感度で測定可能な濃度測定方法および濃度測定装置を提供する。【解決手段】  疎水性多孔質膜に、微量成分を含む試料を載置し、この試料を乾燥した後、溶媒により微量成分を展開し、次いで、この微量成分を展開した疎水性多孔質膜と染色物質とを接触させ、得られた該微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定し、この測定結果に基づいて該微量成分を定量する。【選択図】  図１
2005274545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性多孔質膜に、微量成分を含む試料を載置し、この試料を乾燥した後、溶媒により微量成分を展開し、次いで、この微量成分を展開した疎水性多孔質膜と染色物質とを接触させ、得られた該微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定し、この測定結果に基づいて該微量成分を定量することを特徴とする微量成分の濃度測定方法。
【請求項２】
疎水性多孔質膜が、疎水性樹脂を用いて形成された多孔質膜であることを特徴とする請求項１に記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項３】
疎水性樹脂が、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルおよびナイロンから選ばれることを特徴とする請求項２に記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項４】
疎水性多孔質膜における広幅の試料載置部に前記試料を載置し、次いで、試料載置部に溶媒を接触させて、試料載置部よりも狭幅に形成された展開部へ微量成分を導入するとともに展開部の長手方向に展開することにより、該微量成分を他成分から分離することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項５】
微量成分を展開した疎水性多孔質膜を水性の染料溶液に浸漬して該微量成分と染料とを接触させた後、疎水性多孔質膜を極性溶媒で洗浄することにより該微量成分の染色バンドを得ることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項６】
濃度測定を行う微量成分がコレステロールであることを特徴とする請求項５に記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項７】
染料がナイルブルーであることを特徴とする請求項６に記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項８】
コレステロールの染色バンドの吸光度を測定し、この測定結果に基づいてコレステロールを定量することを特徴とする請求項７に記載の微量成分の濃度測定方法。
【請求項９】
微量成分を含む試料を載置し、この試料を乾燥した後、溶媒により微量成分を展開する疎水性多孔質膜と、
この微量成分を展開した疎水性多孔質膜と染色物質とを接触させて得られた該微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定する手段とを備えることを特徴とする微量成分の濃度測定装置。
【請求項１０】
疎水性多孔質膜が、疎水性樹脂を用いて形成された多孔質膜であることを特徴とする請求項９に記載の微量成分の濃度測定装置。
【請求項１１】
疎水性樹脂が、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルおよびナイロンから選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の微量成分の濃度測定装置。
【請求項１２】
疎水性多孔質膜が、前記試料を載置する広幅の試料載置部と、
この試料載置部から延出し、試料載置部よりも狭幅に形成された、微量成分を長手方向に展開して他成分から分離する展開部とを有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の微量成分の濃度測定装置。
【請求項１３】
微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定する手段が、吸光光度計であることを特徴とする請求項９〜１２のいずれかに記載の微量成分の濃度測定装置。
【請求項１４】
濃度測定を行う微量成分がコレステロールであることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の微量成分の濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば体液中に含まれるコレステロールのような、試料中の微量成分を定量するための濃度測定方法および濃度測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多くの病院の臨床検査室では、血清中のコレステロール濃度を測定するためにコレステロールオキシダーゼ法（COD法）を用いた自動分析装置が使用されている。このCOD法では、試料にコレステロールオキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成し、ペルオキシダーゼの作用により、例えば3,5-ジメトキシ-N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-アニリンナトリウム（DAOS）と4-アミノアンチピリンとを酸化縮合させて色素を生成させた後、吸光度を測定することにより試料中のコレステロールを定量する。
【０００３】
血清中のコレステロール濃度を測定する他の方法としては、いわゆる酵素サイクリング法が提案されている（特許文献１、２を参照）。この方法では、コレステロールデヒドロナーゼと、酸化型補酵素と、還元型補酵素による酵素サイクリング反応を形成し、この反応に基づいて試料中のコレステロール量を定量する。
【特許文献１】特開平８−１０３２９８号公報
【特許文献２】特開平１１−０１８７９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
コレステロールは血液以外に、唾液などにも微量含まれており、この微量のコレステロールを測定できれば血液を採取せずにコレステロール検査が可能となる。しかし、臨床検査室で通常使用されているCOD法を用いた自動検査装置は、血清中のコレステロールを測
定することを目的として製造されているため、唾液のような他の体液中に含まれる低濃度のコレステロールをこの装置で測定するのは困難である。
【０００５】
例えば唾液中のコレステロールでは1mg/dL以下、尿中のコレステロールでは5mg/dL以下で定量することが求められ、血清のＨＤＬ（高密度リポタンパク質）分画中におけるコレステロールでは50mg/dL以下で定量することが求められるが、通常臨床検査室で使用され
ている検査装置では約100mg/dL以上のコレステロールを定量するように最適化されているため、上記のような低濃度での測定に対応するためには検査装置の測定系を大幅に変更する必要がある。
【０００６】
また、COD法および酵素サイクリング法では、コレステロールと特異的に反応する酵素
、メディエーター、補酵素などのように比較的高価な酵素、試薬を使用する必要がある。
本発明は上記した従来技術における問題点を解決するためになされたものであり、例えば体液中に含まれるコレステロールのような、試料中に含まれる微量成分を、簡易な装置構成で、簡便に、高感度で測定可能な濃度測定方法および濃度測定装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、特定の樹脂を用いて形成した疎水性多孔質膜を使用し、コレステロールを含む試料をこの疎水性多孔質膜で溶媒により展開した後、水性の染料溶液に浸漬させ、次いで極性溶媒で洗浄することにより、他成分から分離されたコレステロールによる鋭い染色バンドが得られ、この染色バンドを光学的に検出することにより高感度にコレステロールの濃度を測定できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００８】
さらに、このように特定の疎水性多孔質膜を使用して微量成分を含む試料を展開し、この疎水性多孔質膜を染色物質と接触させて染色バンドを得た後、この染色バンドを光学的に検出する方法によれば、コレステロールに限らず他の微量成分においても高感度にその濃度を測定できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の微量成分の濃度測定方法は、疎水性多孔質膜に、微量成分を含む試料を載置し、この試料を乾燥した後、溶媒により微量成分を展開し、次いで、この微量成分を展開した疎水性多孔質膜と染色物質とを接触させ、得られた該微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定し、この測定結果に基づいて該微量成分を定量することを特徴としている。
【００１０】
本発明で使用する疎水性多孔質膜は、疎水性樹脂を用いて形成された多孔質膜であり、疎水性樹脂が、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルおよびナイロンから選ばれる樹脂であることが好ましい。
【００１１】
本発明の濃度測定方法は、前記の疎水性多孔質膜における広幅の試料載置部に前記試料を載置し、次いで、試料載置部に溶媒を接触させて、試料載置部よりも狭幅に形成された展開部へ微量成分を導入するとともに展開部の長手方向に展開することにより、該微量成分を他成分から分離することを特徴としている。
【００１２】
本発明の濃度測定方法は、前記微量成分を展開した疎水性多孔質膜を水性の染料溶液に浸漬して該微量成分と染料とを接触させた後、疎水性多孔質膜を極性溶媒で洗浄することにより該微量成分の染色バンドを得ることを特徴としている。
【００１３】
上記した本発明の濃度測定方法は、試料中に含まれる微量のコレステロールの定量に好適である。コレステロールを定量する場合、染料としてナイルブルーを使用することが好ましく、ナイルブルーにより染色して得られたコレステロールの染色バンドの吸光度を測定し、この測定結果に基づいてコレステロールの濃度を高感度に測定することができる。
【００１４】
本発明の微量成分の濃度測定装置は、微量成分を含む試料を載置し、この試料を乾燥した後、溶媒により微量成分を展開する疎水性多孔質膜と、
この微量成分を展開した疎水性多孔質膜と染色物質とを接触させて得られた該微量成分の染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定する手段とを備えることを特徴としている。
【００１５】
本発明の微量成分の濃度測定装置は、前記の疎水性多孔質膜が、前記試料を載置する広幅の試料載置部と、
この試料載置部から延出し、試料載置部よりも狭幅に形成された、微量成分を長手方向に展開して他成分から分離する展開部とを有することを特徴としている。
【００１６】
上記した本発明の濃度測定装置は、試料中に含まれる微量のコレステロールの定量に好適である。コレステロールを定量する場合、染色物質としてナイルブルーを使用し、コレステロールを展開した疎水性多孔質膜をナイルブルー水溶液に浸漬した後、疎水性多孔質膜を極性溶媒で洗浄することにより染色バンドを得ることが好ましく、染色バンドにおける染色の強さを光学的に測定する手段として吸光光度計を使用して吸光度を測定し、この測定結果に基づいてコレステロールの濃度を高感度に測定することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、試料中に含まれる微量成分を、簡易な装置構成で、簡便に、高感度で
測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。図１は、本発明の一実施形態における濃度測定方法に使用される疎水性多孔質膜の概略図である。本実施形態では、唾液、尿などの試料中に含まれる微量のコレステロールの濃度を測定する。図１の疎水性多孔質膜１は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＦＴ）からなり、毛細管作用により有機溶媒でコレステロールを展開可能な細孔が形成されている。
【００１９】
本発明では、疎水性多孔質膜として、疎水性樹脂を用いて形成された多孔質の膜体が使用される。この疎水性樹脂としては、例えばポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルおよびナイロンが挙げられる。コレステロールを定量する場合には、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレンを使用することが好ましい。また、微量成分を展開した疎水性多孔質膜を水性の染料溶液に浸漬して該微量成分と染料とを接触させ、次いで疎水性多孔質膜を極性溶媒で洗浄することにより該微量成分の染色バンドを得る場合には、使用する染料を極性溶媒で洗浄することにより疎水性多孔質膜から染料を充分に除去できるものを使用する必要がある。
【００２０】
コレステロールを含む試料は、図１の試料載置部２に載置され、乾燥して水分を除去した後、疎水性多孔質膜１における試料載置部２側の端部を有機溶媒に浸漬して展開する。乾燥試料中のコレステロールおよび一部の他成分は試料載置部２から展開部３へ導入され、展開部３の長手方向に展開される。これによって、試料中の他の成分からコレステロールが分離される。
【００２１】
展開に使用する有機溶媒は、疎水性多孔質膜を形成する樹脂と、測定対象である微量成分を含む試料との組み合わせにより適宜選択される。本実施形態では2-プロパノールとアセトニトリルとの混合溶媒を使用している。
【００２２】
疎水性多孔質膜の形状は、図１に示したように、広幅の試料載置部２と、これよりも狭幅に形成された細い展開部３とを有していることが特に好ましい。本実施形態ではヒューズ型の形状を有する疎水性多孔質膜１を使用しており、広い面状の試料載置部２（幅：５ｍｍ）から、細い展開部３（幅：２ｍｍ）が長手方向に延出する形状となっている。また、展開部３の試料載置部２と反対側の端部にも広幅の面が形成され、展開部３からの溶媒を吸収する溶媒吸収部４を構成している。
【００２３】
展開部３は、測定対象である微量成分を他成分から分離するとともに、高感度検出が可能な鋭いバンドを得るために、長尺状に細く形成されている。一方、試料載置部２は、広幅に形成されているため試料５をスポットし易く、この上にスポットした試料５を乾燥して水分を除去した後、端部を展開溶媒に浸漬して狭幅の展開部３に導入することができる。
【００２４】
このようにコレステロールを含む試料を展開することにより、コレステロールは他成分から分離されるとともに、展開部３にコレステロールが濃縮された鋭いバンドが形成される。次いで、コレステロールを展開した疎水性多孔質膜１をナイルブルー水溶液に浸漬してこのバンドを染色する。所定時間浸漬した後、疎水性多孔質膜１を水、メタノールのような極性溶媒で洗浄して膜上の染料を除去することにより、図２に示したようにコレステロールの染色バンド６が得られる。
【００２５】
ナイルブルーによる染色バンドを得た後、吸光光度計を用いて、このバンドの反射吸光度を測定する。図２に示したように、染色バンドの近傍で展開部３の長手方向に、ナイル
ブルーの可視吸収波長に対応する測定光でスキャンすると、染色バンドの位置で吸光度の鋭いピーク７が得られる。予め、コレステロール濃度が既知である複数の標準試料を用いて同条件にて展開およびバンドの染色を行い、展開部３の同一箇所において得られた染色バンドによる吸光度のピーク部分の積分値（ピーク面積）とコレステロール濃度との検量線を作成しておき、濃度未知の試料について測定したピーク面積をこれと比較して濃度を定量する。
【００２６】
前述したように、唾液中のコレステロールでは1mg/dL以下、尿中のコレステロールでは5mg/dL以下で定量することが求められ、血清のＨＤＬ（高密度リポタンパク質）分画中におけるコレステロールでは50mg/dL以下で定量することが求められるが、本発明によれば
、疎水性多孔質膜と、吸光光度計のような染色バンドを検出する手段という簡易な装置構成で、このような高感度でのコレステロールの濃度測定が可能である。さらに、試料を疎水性多孔質膜に載置した後、膜上で発色させるまでの所要時間は、例えば３０分程度であり、比較的安価な染料を使用してバンドを染色するだけでよく、簡便な操作で効率的に測定することができる。このため、装置の自動化にも適しているとともに、従来のコレステロール濃度測定装置と比較して小型化が可能である。
【００２７】
本発明では、展開した微量成分を染色する染色物質として染料を使用し、水性の染料溶液に疎水性多孔質膜を浸漬することにより、染料と、定量する微量成分とを接触させて吸着させるとともに、疎水性多孔質膜上に付着した染料を極性溶媒によって洗浄除去することにより染色バンドを得ることが好ましいが、他の方法で染色物質と微量成分とを接触させてもよい。例えば、いわゆる酵素抗体法を適用し、濃度を測定する微量成分に対して直接または間接的に酵素を標識した抗体を反応させ、その酵素によって酸化還元色素を化学的に発色させるようにしてもよい。本発明では、試料を展開する基材として疎水性多孔質膜を使用しているので、試料によっては、濾紙によるペーパークロマトグラフ、あるいはシリカゲル、アルミナなどを用いた薄層クロマトグラフよりも微量成分の定量に適している。
【００２８】
本実施形態ではコレステロールの濃度を測定する例を示したが、本発明によれば、この他、遊離コレステロール、トリグリセリドおよびコレステロールエステルを分離して直接定量することができ、唾液中の中性脂質全体を測定して高コレステロール血症あるいは高トリグリセリド血症の検査に使用することができる。試料として血液を使用した系では、ＨＤＬ（高密度リポタンパク質）とＬＤＬ（低密度リポタンパク質）とを分離して定量することができる。
【００２９】
このように多成分を分離、定量する場合には、図３に示したように、２つの疎水性多孔質膜１ａ、１ｂの間に、これらの膜とは各成分を分離する特性が異なる他の分離膜８を介在させて、これらを繋いで展開用の膜体を形成してもよい。
【００３０】
また、疎水性膜の樹脂を適切に選択し、展開溶媒として水溶性溶媒を使用すれば、唾液中に含まれるストレスホルモンなどの微量成分を分離した後、酵素抗体法、ドットブロット法のような手法を用いて定量することができる。
【００３１】
このように本発明では、目的に応じて疎水性多孔質膜の材質、展開溶媒、染色物質、光学測定系などを適切に選択することで、各種の試料における微量成分の分離、定量が可能である。染色物質としては、蛍光染料、化学反応により発色する化合物なども使用することができる。また、染色バンドの染色の強さを光学的に測定する手段として、吸光光度計の他、使用する染料などに応じて蛍光光度計などを使用してもよい。
【００３２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
[実施例１]
図１に示したＰＶＤＦ多孔質膜（長手方向の長さ：３０ｍｍ、試料載置部の幅：５ｍｍ、展開部の幅：２ｍｍ）の試料載置部に、顎下線と耳下線から採取した唾液を１〜３μＬ載置して、乾燥した後、2-プロパノール／アセトニトリル混合溶媒（容量比３：２）を試料載置部の端部に浸漬して７分間展開した。
【００３３】
次いで、このＰＶＤＦ多孔質膜をナイルブルー染料（Ｃｈｒｏｍａ社製）の１％水溶液に10分間浸漬して染色した。染色後、多孔質膜を水とメタノールで数分間洗浄することによって、展開部の下流側にコレステロールの鋭い染色バンドを得た。
【００３４】
この染色バンドを含む領域について、市販の吸光光度計を用いて、ナイルブルーの吸収波長に対応する測定光で反射吸収を測定した。吸光度ＯＤ変換した濃度パターンは、図２に示したようにシャープなピークを有していた。
【００３５】
一方、予め、既知量のコレステロールを含む複数の標準試料を用いて、上記と同様にして展開、染色を行い、反射吸収を測定して得られた濃度パターンのピーク部分の積分値により、コレステロール量の検量線を作成したところ、図４に示したように良好な線形性が成り立ち、0.03mgの検出限界まで定量可能であった。
【００３６】
顎下線と耳下線から採取した上記の唾液試料について、この検量線に基づいてコレステロール量を測定した。７セットの測定の平均値で、顎下線から採取した試料が6.4mg/dL、耳下線から採取した試料が4.6mg/dLであった。
[比較例１]
シリカゲルを使用した通常の薄層クロマトグラフを用い、種々の濃度のコレステロール溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を薄層上にスポットし、展開溶媒（クロロホルム：メタノール＝８９：１１）で展開した。次いで、薄層表面に塩化第二鉄溶液（塩化第二鉄５０ｍｇ、酢酸５ｍｌ、濃硫酸５ｍｌ、蒸留水９０ｍｌ）を吹き付け、１１０℃で焼成スポットを発色させた。得られたスポットの反射吸収を測定したところ、検出限界は0.3mgであった。
[比較例２]
シリカゲルを使用した通常の薄層クロマトグラフで実施例１と同様に唾液試料を展開してコレステロールを分離した後、固定相を染料水溶液（ナイルブルー）で染色し、洗浄したが、固定相全体が染色されてしまい、コレステロールの染色バンドを得ることはできなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の一実施形態において使用される疎水性多孔質膜の概略図である。
【図２】図２は、図１の疎水性多孔質膜にコレステロールの染色バンドが形成された状態を示した図である。
【図３】図３は、本発明の他の実施形態において使用される疎水性多孔質膜の概略図である。
【図４】図４は、染色バンドによるピーク面積とコレステロール量との関係を示したグラフである。
【符号の説明】
【００３８】
１  疎水性多孔質膜
２  試料載置部
３  展開部
４  溶媒吸収部
５  試料
６  染色バンド
７  吸収ピーク
８  分離膜
【図１】
2005274545.tif 000003
【図２】
2005274545.tif 000004
【図３】
2005274545.tif 000005
【図４】
2005274545.tif 000006