(57)【要約】【課題】これまでの種々の検査手段では確実な検出が困難であった骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）あるいは白血病化ＭＤＳを確実に検出し、真正の急性骨髄性白血病（de novo AML）と白血病化ＭＤＳとの鑑別法を提供すること。【解決手段】ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することによって、ＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳを診断し、de novo AMLと鑑別する。  ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ４５が陰性であり、ＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率が同一検体中のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して明らかに低下しているＣＤ４５陰性芽球である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳの検出方法。
【請求項２】
検体が、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫学的方法を用いて、ＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、請求項１乃至２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ４５陰性芽球が以下のものである、請求項３に記載の方法：
ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更に
ＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下しているＣＤ４５陰性芽球。
【請求項５】
ＣＤ４５陰性芽球が、さらにＧＰＡ陰性かつＣＤ３８陰性であるＣＤ４５陰性芽球である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
フローサイトメトリーを用いることを特徴とする、請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
以下の（ア）から（エ）の工程を含む、急性骨髄性白血病（de novo AML）と白血病化ＭＤＳとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５陰性を検出する工程
（イ）赤芽球、血小板、形質細胞の混入を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較したＣＤ１３陽性率の低下を検出する工程
（エ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較したＣＤ３３陽性率の低下を検出する工程。
【請求項８】
ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄異形成症候群（Myelodysplastic syndromes:ＭＤＳ）の診断方法に関し、詳しくはＭＤＳに特異的な細胞集団の検出方法、これらの細胞集団を検出することを特徴とするＭＤＳの検出方法、真正（de novo）の急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia；ＡＭＬ）と白血病化したＭＤＳとの鑑別法、及び前記方法に用いる鑑別用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【０００３】
de novo ＡＭＬ及び白血病化ＭＤＳは、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo ＡＭＬは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。
【０００４】
ＭＤＳは貧血等の症状をきっかけに発見（診断）される場合もあるが、症状に乏しい場合も多く、白血病化の後に初めて発見されることも多い。白血病化の後に初めて発見された場合、それがＭＤＳより移行した白血病化ＭＤＳなのか、そうでないde novo AMLなのかを鑑別することは困難であり、現状では患者の過去の医療記録等で原因不明の血球減少等があれば白血病化ＭＤＳであろうと推測しているに過ぎない（非特許文献１参照）。
【０００５】
最近の疫学調査の結果によれば、ＭＤＳの発症頻度は骨髄系腫瘍の中で最多である（非特許文献２参照）。しかしながら、多くの研究にもかかわらず、未だ有用な治療法は確立されておらず、白血病化ＭＤＳは治療に不応性のことが多い。一方de novo AMLでは治療に良く反応することが多い。したがって、白血病化ＭＤＳであるか、de novo AMLであるかを早期に鑑別することは、その患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。
【０００６】
de novo AMLとＭＤＳの鑑別を行う方法として、ＭＤＳに特異的な遺伝子D1kの発現を検出することによる分子診断法（特許文献１参照）が開示されている。しかし、この方法は、遺伝子発現又は発現産物のレベルを指標とし、DNAマイクロアレイや二次元電気泳動を使用する複雑な方法であり、感度も低い。
【０００７】
近年、ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノクローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメトリー（flow cytometry: FCM）により、造血器腫瘍細胞の検出、特に白血病の診断が可能となった。
【０００８】
ＦＣＭとは、個々に遊離した細胞を蛍光色素で染色した後に細い管を通過させる際、レーザー光線を当ててその細胞から発生する蛍光の強弱及び散乱光等の情報により、細胞の大きさ、相対的なタンパク量、抗原量、ＤＮＡ量等を測定する方法である。コンピュータを組合わせることにより、細胞の数と蛍光の強弱等の２つのパラメータによるヒストグラム、スキャッターグラム、３つのパラメータによる三次元表示等も行われる。浮遊細胞を測定するため、一度に多数の細胞の解析が可能である。
【０００９】
ＦＣＭで白血病細胞を分析する場合、白血病細胞が他の細胞とはっきり区別が出来る場合は問題が無いが、他の細胞のサイトグラムとオーバーラップして何処をゲーティングしてよいかわからない場合や、白血病細胞の数が減少している場合等は、白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣパラメーターdot-plotを用いたゲート設定法（ＣＤ４５blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる（非特許文献３参照）が、このときCD４５抗原に注目したのは、あくまでも白血病細胞を特定するために過ぎなかった。
【００１０】
さらに、ＣＤ４５以外の細胞表面抗原の発現パターンによって白血病細胞を検出する方法（特許文献２参照）も報告されている。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７４号公報
【特許文献２】特開２０００−２４１４２７号
【非特許文献１】Smith MT, Linet MS, Morgan GJ. Causative agents in the etiology of myelodysplastic syndromes and the acute myeloid leukemias. In "The Myelodysplastic Syndromes: Pathobiology and Clinical Management" edited by Bennett JM. Publisher: Marcel Dekker, Inc., 2002 pp29-63
【非特許文献２】Aul C, Giagounidis A, Germing U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer serveys and hospital-based statistics. Int J Hematol. 2001; 73(4): 405-10
【非特許文献３】Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、これまでの種々の検査手段では検出することができなかったか、確実な検出が困難であったＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳを確実に検出し、de novo AMLと白血病化ＭＤＳとの鑑別法を提供することである。更に、前記鑑別方法に使用するキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の存在を見出し、この細胞集団を検出することで、de novo AMLと白血病化ＭＤＳを鑑別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）検体中のＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳの検出方法。
（２）検体が、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者の末梢血又は骨髄細胞である、（１）に記載の方法。
（３）免疫学的方法を用いて、ＣＤ４５陰性芽球の存在を検出することを特徴とする、（１）乃至（２）のいずれかに記載の方法。
（４）ＣＤ４５陰性芽球が以下のものである、（３）に記載の方法：
ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更に
ＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下しているＣＤ４５陰性芽球。
（５）ＣＤ４５陰性芽球が、さらにＧＰＡ陰性かつＣＤ３８陰性であるＣＤ４５陰性芽球である、（４）に記載の方法。
（６）フローサイトメトリーを用いることを特徴とする、（３）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
（７）以下の（ア）から（エ）の工程を含む、急性骨髄性白血病（de novo AML）と白血病化ＭＤＳとの鑑別法：
（ア）ＣＤ４５陰性を検出する工程
（イ）赤芽球、血小板、形質細胞の混入を判定する工程
（ウ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較したＣＤ１３陽性率の低下を検出する工程
（エ）ＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較したＣＤ３３陽性率の低下を検出する工程。
（８）ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を用いれば、白血病化MDSとde novo AMLの鑑別を速やかに行うことができる。白血病化MDSとde novo AMLとでは治療方針が異なるため、両者の鑑別が速やかに行えれば、患者の予後推定、治療方針の決定等に非常に重要である。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の実施の形態】
【００１６】
本発明においてＭＤＳとは、造血幹細胞のクローン性異常による骨髄の機能異常を伴った骨髄異形成と血球減少によって特徴づけられる症候群である。血球減少（貧血、白血球減少、血小板減少等）を示す症例があれば、各血球系の形態異常（異形成）を確認し、骨髄または末梢血における芽球比率によって判断することが出来る。しかし、しばしば芽球比率が増加し、臨床検査では真正の急性骨髄性白血病（de novo ＡＭＬ）と区別がつかない白血病化ＭＤＳへと移行する。
【００１７】
一方、de novo ＡＭＬ及び白血病化ＭＤＳは、骨髄の造血幹細胞より前駆細胞にかけての未分化なクローン性腫瘍細胞の増殖が起こる白血病である。白血病細胞は正常な前駆細胞としての分化が止まっていたり、異常な分化を示したりする。これらは、腫瘍の増殖速度が速く、週日単位で臨床症状や検査結果等が変化する。そのため、臨床所見からは白血病化ＭＤＳかde novo AMLか判別がつかないが、白血病ＭＤＳとは異なりde novo ＡＭＬは薬剤に対する感受性が高く、速やかな治療が望まれている。
【００１８】
本発明において、ＭＤＳに罹患していることが疑われるとは、ＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかに罹患しているが、そのいずれに罹患しているのかは不明の状態であることをいう。
【００１９】
ＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なものは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体であって芽球に富むものであり、例えば、末梢血もしくは骨髄細胞等が挙げられる。
【００２０】
骨髄細胞、または末梢血の採取方法としては、患者への侵襲度の低い方法であればいかなる方法でも良い。例えば骨髄細胞の場合、局所麻酔の後、背中側の腸骨（骨盤骨）から骨盤穿刺針を用いて注射器で吸引する等、一般的な方法が用いられる。
【００２１】
検体採取時にはヘパリン等の抗凝固剤を加え、採取後速やかに用いることが好ましい。しかし、末梢血はそのまま、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊させ、４℃以下にて２４時間まで保存しておくことができる。また、４〜−８０℃、好ましくは−２０℃から−７０℃の低温条件下で２４時間以上保存しておくこともできる。保存に際しては、変性等を抑制するような保存剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を必要に応じて添加しても良い。
【００２２】
採取した検体はそのまま用いることもできるが、検体中の芽球比率が低い場合には、適切な試薬を用いて芽球比率を高めてから、解析に用いることができる。芽球比率を高めるための適当な試薬としては、例えば、本願発明者らが開発した芽球精製法に基づき商品化されたBlastretriever（登録商標）試薬（日本抗体研究所、高崎）等が挙げられる。検体中の芽球比率はサイトスピン標本を顕微鏡下に観察する等の方法によって測定することができる。芽球比率が低いとは、検体中の芽球の比率が一定以下、例えば全血球に対して芽球が３０％以下であることをいう。芽球比率が一定以上ある検体について、定法により、混入赤血球の溶血作業をおこなう。
【００２３】
上記検体を用いてＭＤＳに特異的な細胞集団を検出する。ＭＤＳに特異的な細胞集団は、検体に含まれる特定の芽球の集団であり、ＭＤＳとしての特異性はその芽球集団の抗原発現により特徴付けられる。具体的には、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ４５陰性の芽球（本明細書中でＣＤ４５陰性芽球と称する）である。
【００２４】
さらに、ＭＤＳに特異的な細胞集団は、ＣＤ１３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ１３陽性率と比較して低下しており、更にＣＤ３３陽性率が同一検体中に見られるＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団中のＣＤ３３陽性率と比較して低下している。本発明において、ＣＤ１３陽性率とは、解析対象の芽球集団中でＣＤ１３陽性芽球の占める比率をいう。ＣＤ３３陽性率についても同様である。すなわち、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の集団では、同一検体中のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して、ＣＤ１３陽性芽球及びＣＤ４５陽性芽球の占める比率がそれぞれ低下している。この比率がＣＤ４５陰性芽球の集団においてＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団よりも低い数値となっていれば低下していると判断されるが、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上低下していればより確実である。
【００２５】
赤芽球、血小板、形質細胞等の混入がない検体の場合においては、このようにＣＤ４５が陰性であり、さらにＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団におけるものと比較して低下しているということが、ＭＤＳに特異的な細胞集団として必要にして十分な特徴である。
【００２６】
ＣＤ４５陰性の細胞集団には、赤芽球、血小板、形質細胞が混入していることがあるため、確実な検出のためにはこれらの混入細胞の存在を確認しなければならない。そのためには、末梢血等赤芽球や形質細胞のほとんど含まれない検体を解析するか、以下の方法により、ＭＤＳに特異的な細胞をこれらの混入細胞と区別して解析するのがよい。
【００２７】
赤芽球や血小板はいずれもＣＤ４５陰性または弱陽性であるが、細胞の大きさや特徴的な抗原の相違を利用してＭＤＳに特異的な細胞と区別することができる。例えば、血小板は通常の細胞よりも小さいこと、特徴的な抗原として赤芽球に発現するＧＰＡ（Glycophorin A）や形質細胞に発現するＣＤ３８に着目することにより、ＭＤＳに特異的な細胞とこれらの混入細胞を区別することができる。具体的には、例えば、上述の、ＣＤ４５陰性かつＣＤ１３陽性率及びＣＤ３３陽性率がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団と比較して低下しているという特徴に加えてさらにＧＰＡとＣＤ３８が陰性であることをもって、ＭＤＳに特異的な細胞集団の特徴とすることができる。
【００２８】
このような抗原発現の特徴により、ＭＤＳに特異的な細胞集団を検出することができる。検出の方法としては、抗原の発現および細胞の大きさを判別することのできる方法である必要があるため、上述したＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８等のヒト造血系抗原に特異的な抗体を用いた免疫学的方法を用いるのがよい。
【００２９】
免疫学的方法としては、細胞を用いて抗原の存在を検出することのできる方法であれば特に限定はされないが、実際の臨床現場において、簡便にかつ迅速に多量の試料を同時に測定できるという利点から、好適にはＦＣＭを用いて複数の蛍光標識抗体を組合わせて検査を行うのが好ましい。
【００３０】
ＦＣＭの操作方法は公知の方法（例えば、野村和弘ら編「フローサイトメトリー〜手技と実際〜」1984年，蟹書房、河本圭司ら編「フローサイトメトリー入門」1989年，医学書院、河本圭司ら編「応用サイトメトリー」2000年，医学書院）に準じて行うことができる。
【００３１】
また、ＦＣＭで用いる蛍光標識には、ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）やＰＥ（phycoerythrin）、ＡＰＣ(Allophycocyanin)、ＰｅｒＣＰ（peridin chlorophyll）、ＥＣＤ（phycoerythrin-Texas Red）、ＰＣ５（phycoerythrin-cyanin5.1）、ＰＣ７（phycoerythrin-cyanin7）等一般的に市販されている蛍光標識を用いることが出来、これらの組み合わせは自由に行うことができる。
【００３２】
また、ＦＣＭは３カラー又は４カラー解析法によって行うことができるが、４カラー解析法によればより効率よく解析を行うことができる。
ＦＣＭを用いた場合、本発明において、ＣＤ４５陰性芽球とは以下のように同定した細胞をさす。すなわち、まず側方散乱（side scatter:ＳＳＣ）と前方散乱（forward scatter:ＦＳＣ）で展開したプロットにおいて、血小板や破砕細胞等を除外した所謂生細胞にゲートをかける(図１−１で言えばＲ１にあたる)。
【００３３】
これと平行して、ＣＤ４５に対する陰性コントロール抗体（Mouse IgG）でのみ染色した細胞検体を、ＣＤ４５とＳＳＣで展開した際に、少なくとも９５％以上、より好ましくは９７%以上の細胞がおさまるＣＤ４５の蛍光強度の範囲をＣＤ４５陰性と判定し、基準線を設定する。本発明においてＣＤ４５陰性（ＣＤ４５-）とはこの基準線より左側に位置することを意味し、ＣＤ４５陽性（ＣＤ４５+）とは右側に位置することを意味する。またＣＤ４５弱陽性（ＣＤ４５±）とはこの基準線上にまたがることを意味する。
【００３４】
次にＲ１ゲート内の細胞をＰｅｒＣＰ標識ＣＤ４５抗体（ＣＤ４５-ＰｅｒＣＰ）とＳＳＣで展開した際に検出される、ＳＳＣが低くかつＣＤ４５陰性（ＣＤ４５-）の細胞集団が、ＣＤ４５陰性芽球である。
【００３５】
ＭＤＳ患者から採取した検体におけるＣＤ４５陰性芽球のゲーティング例を図４−１に示す。ＳＳＣとＦＳＣで展開したプロットにおいてゲーティングされた解析対象の細胞集団がＲ１と表示されたクラスターである。Ｒ１に含まれる細胞を展開して同定されたＲ３と表示されたクラスターを、ＣＤ４５-またはＣＤ４５-/±の細胞集団として、さらに分離する。ＦＣＭで得た情報からＲ１およびＲ３を満たす情報をコンピューター上で抽出し解析することにより、ＭＤＳに特異的な細胞集団であるＣＤ４５陰性芽球の集団を同定できる。なお、Ｒ１およびＲ２を満たす情報がＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団の情報である。
【００３６】
このように、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した末梢血又は骨髄細胞を処理し、ＦＣＭを用いて適当な蛍光標識抗体を組合わせた検査を行い、同一症例の骨髄芽球の造血系抗原の発現と比較して判定することにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。
【００３７】
この判定は、以下のフローチャートに従って行うことができる。
【００３８】
【化１】
2005221323.tif 000002
【００３９】
Ｒ１のＣＤ４５とＳＳＣで展開した図において、ＣＤ４５-またはＣＤ４５-/±の細胞集団を認めた場合、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとして、次に赤芽球、血小板、形質細胞の混入をＧＰＡ、ＣＤ３８の発現や細胞の大きさ等により調べる。赤血球、血小板、形質細胞の混入が無いか軽度な検体であれば、そのままＣＤ１３とＣＤ３３のそれぞれの陽性率低下を同一症例のＣＤ４５陽性の骨髄芽球集団のＣＤ１３とＣＤ３３の発現と比較し、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性があると判定することができる。ＣＤ１３陽性率とＣＤ３３陽性率の低下は、通常ＣＤ３８陽性率の低下を伴う。ＣＤ１３陽性率低下とＣＤ３３陽性率低下が見られた場合は、ＭＤＳあるいは白血病化ＭＤＳの可能性ありとする。赤芽球、血小板、形質細胞の混入のある場合は、赤芽球、血小板、形質細胞以外の細胞集団について、ＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率低下を調べる。例えば、ＣＤ４５抗体としてＣＤ４５-ＰｅｒＣＰを用いた場合では、さらに細胞にＧＰＡ−ＦＩＴＣ、ＣＤ３８−ＦＩＴＣ、ＣＤ１３−ＰＥの３抗体を加え、ＦＩＴＣ陰性細胞のＣＤ１３の発現を評価する。同様にＣＤ１３−ＰＥの代わりにＣＤ３３−ＰＥを使用し、ＣＤ３３の発現を評価する。
【００４０】
上述のように、本発明の方法によりＭＤＳを検出するのに用いられる試料として好適なのは、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者から採取した検体である。しかしながら、実際の臨床現場においてはＭＤＳ（白血病化ＭＤＳを含む）あるいはde novo AMLのいずれかであろうと判断される以前の検体を扱う必要も生ずることがある。また、検体の採取状態によって、ＦＣＭ解析の邪魔をする物質が混入することもある。このような検体を用いた場合であっても、ＭＤＳに特異的な細胞集団を確実に検出するために、上記の抗体に加えて、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４４、ＣＤ７、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ等の一般的なマーカーを用いて解析を行ってもよい。これらの抗体を使用することにより、検出の精度を高め、より確実な診断をすることが可能となる。
【００４１】
例えば、誤って急性リンパ性白血病の検体を検査した場合、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ２０等が陽性となり、ＭＤＳに罹患していることが疑われる患者ではないことが判明する。また、骨髄芽球のゲーティングが困難な試料においてもＣＤ３４を使用することで骨髄芽球を明確にゲーティングができる。また、血小板は色々な細胞に対して付着しやすい性質があるため、ＭＤＳに特異的な細胞に血小板が付着し、見かけ上血小板抗原（ＣＤ４１ａ等）陽性を示すことがある。この場合、さらに細胞の大きさ、ＣＤ４４の発現（血小板は陰性または弱陽性、ＭＤＳ特異的細胞は陽性を示す場合がある）等で、ＭＤＳ特異的細胞の存在を確認してもよい。
【００４２】
本発明はさらに、ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体を含むＭＤＳ又は白血病化ＭＤＳとde novo AMLの鑑別用キットを提供する。ＣＤ４５陰性芽球に特異的な抗体としては、上述のように、ＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８、ＣＤ４４等のヒト抗原に対するモノクローナル抗体を用いることができる。
【００４３】
検出法において標識剤として酵素を用いる場合には、本発明のキットは下記の構成試薬を含むことができる。
（１）酵素標識化モノクローナル抗体
（２）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
【００４４】
（１）モノクローナル抗体
（２）酵素標識化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
【００４５】
（１）ビオチン化モノクローナル抗体
（２）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（３）基質溶液
また、上記キットの変形としてサンドイッチELISA法及びビオチン−アビジン法を用いる場合には、本発明のキットは下記の試薬を含むことができる。
（１）モノクローナル抗体
（２）ビオチン化モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体
（３）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン
（４）基質溶液
本発明に使用するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の詳しい作製方法については公知の方法（例えば、富山朔二ら編「単クローン抗体実験マニュアル」1987年，講談社、右田俊介ら翻訳「免疫化学実験法」1992年，西村書店）に準じて行うことができる。
【００４６】
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
１．検体の採取
検体としては、ヒトの骨髄液または末梢血を用いた。これらの検体は、ＭＤＳまたはde novo AMLが疑われる患者に採取及び研究目的の使用について充分に説明を行い、同意を得られたあとに用いた。検体採取の際には抗凝固剤としてヘパリンを添加した。
【００４８】
２．検体の調製
末梢血はそのまま使用し、骨髄穿刺液は１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０で２〜３倍に希釈する。このとき、検体中の芽球比率が低い場合は、Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高めた。
【００４９】
Blastretriever（登録商標）試薬を用いて芽球比率を高める方法は、試薬の使用説明書に準じて行う。すなわち、ガラス試験管にBlastretriever（登録商標）試薬を入れ、ヘパリン加末梢血あるいは３−５倍に希釈したヘパリン加骨髄穿刺液を重層し、これを１０分間（550ｘｇ、室温）遠心分離し、中間層に残った細胞を回収した。
【００５０】
３．染色及び測定
検体を溶血剤（NH4Cl  8.26g、KHCO3  1.00g、EDTA−4NA／LWD  0.04g）を用いて室温にて5分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS：0.1％BSA、0.1％アジ化ナトリウム）にて細胞濃度を１×１０6／ｍｌに調製した。調製した検体を１００μｌずつＦＣＭ用チューブに分注し、以下の蛍光標識抗体の組合わせに準じ染色後、ＦＣＭでデータを収集した。
【００５１】
抗ＣＤ４５抗体に２種の抗体を組合わせ３カラー解析法で解析する場合、分注した検体をそれぞれ異なる標識で染色を行う。今回は、peridin chlorophyll (PerCP)で標識した抗ＣＤ４５抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いたため、その他の抗体をfluorescein isothiocyanate (FITC)標識抗体とphycoerythrin (PE)標識抗体で染色した。用いるFITC標識抗体とPE標識抗体は、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ１０、ＣＤ１１７、ＧＰＡ等３種の抗体を、例えばＣＤ４５／ＣＤ３４／ＣＤ３８、ＣＤ４５／ＧＰＡ／ＣＤ１３、ＣＤ４５／ＣＤ１５／ＣＤ３３、ＣＤ４５／ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ／ＣＤ４１ａ、ＣＤ４５／ＣＤ４４／ＣＤ４１ａ等適宜組み合わせて測定を行った。
【００５２】
抗ＣＤ４５抗体に他の３種の抗体を組合わせ４カラーＦＣＭで解析する場合、抗ＣＤ４５抗体および検体の使用量をそれぞれ節約しつつ、同時に診断を行うことができる。
ＦＣＭによる測定は、FACScan（Becton Dickinson）を用いて定法に従って３カラー解析法で施行した。
【００５３】
４．フローサイトメトリーによるＣＤ４５陰性芽球の同定に基づくde novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別
次に、収集したＦＣＭデータをＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、以下の手順に従って、骨髄芽球の細胞集団の他にＭＤＳに特異的な細胞集団があるかどうかを判定した。
（１）ＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいて、骨髄芽球の細胞集団とは別に、よりＣＤ４５発現の弱い（通常ＣＤ４５陰性であるが、一部ごくわずかに陽性の場合もある）細胞集団（以降この細胞をＣＤ４５-/±細胞と称する）を確認する。
（２）ＣＤ４５-/±細胞集団は同一症例の骨髄芽球に比べ、必ずＣＤ１３とＣＤ３３の陽性率が低下している。また、通常ＣＤ３８の陽性率も低下している。
（３）ＣＤ４５-/±細胞集団はＴ細胞マーカー(ＣＤ２、ＣＤ３等)陰性、Ｂ細胞マーカー(ＣＤ１０、ＣＤ１９等)陰性である。
（４）ＣＤ４５-/±細胞集団には赤芽球、血小板、形質細胞が混入していることがあるため、ＣＤ４５-/±細胞集団にこれら以外に造血系抗原陰性芽球が存在することを確認する必要がある。そのためには、(A) 末梢血等赤芽球、形質細胞のほとんど含まれない検体を解析する、(B) ＧＰＡ（赤芽球に発現）、ＣＤ３８（形質細胞に発現）等に対する抗体に対する反応や細胞の大きさ（血小板は通常の細胞より小さい）をフローサイトメトリーで評価する、等が必要である。
【００５４】
De novo AMLではこの特異的細胞集団は存在しないか、あっても１％以下であることから、de novo AMLと白血病化ＭＤＳの鑑別を行うことができる。
５．フローサイトメトリーにより、ＭＤＳとde novo AMLを鑑別した結果
実際の症例において解析した例を図１〜図６に示す。
【００５５】
図１はde novo AMLの症例番号１のＦＣＭパターンである。図１−１がサイトグラムであり、図１−２がＣＤ４５陰性コントロールの図である。図１−３は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、図１−２の陰性コントロールによってＣＤ４５基準線を設定した。この基準線より右に位置するのがＣＤ４５陽性細胞となる。de novo AMLにおいては、ＣＤ４５陰性細胞集団は殆ど認められないが、ＭＤＳと比較するためにあえてＲ３としてターゲティングを行った。図２はde novo AMLにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析であり、図２−１が陰性コントロールの図である。この陰性コントロールによって、各抗原解析図の基準線を決定した。ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８のそれぞれの陽性率を図の下に表わした。また、図３は同様にde novo AMLにおけるＣＤ４５陰性領域細胞の抗原解析である。
【００５６】
図４はＭＤＳの症例番号７のＦＣＭパターンである。図１と同様に、図４−1がサイトグラムであり、図４−２がＣＤ４５陰性コントロールの図である。図４−３は、Ｒ１をＣＤ４５とＳＳＣで展開した図であり、図４−２の陰性コントロールによってＣＤ４５基準線を上記と同様に設定した。ＭＤＳにおいては、de novo AMLとは異なり、ＣＤ４５陰性細胞集団が認められる。図５はＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性骨髄芽球の抗原解析であり、図５−１が陰性コントロールの図である。図２と同様にこの陰性コントロールによって、各抗原解析図の基準線を決定した。ＣＤ１３、ＣＤ３３、ＧＰＡ、ＣＤ３８のそれぞれの陽性率を図の下に表わした。また、図６は同様にＭＤＳにおけるＣＤ４５陰性芽球の抗原解析である。
【００５７】
同じように臨床症状によってde novo AMLと診断された症例を５件、ＭＤＳと診断された症例６件においても同様にＦＣＭパターンを展開し、ＣＤ４５陰性芽球の検出を行った。これらの症例においては、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ７、ＣＤ５６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４１ａ、ＣＤ１２３、ＨＬＡ−ＤＲ等のヒト抗原に対する抗体による解析も行い、de novo AMLあるいは骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は白血病化ＭＤＳとしての特徴的な形質の存在を確認した。
【００５８】
各症例におけるＣＤ４５とＳＳＣプロットでのＣＤ４５陰性細胞集団の有無とそれぞれの抗体に対する判定結果及びそれらのデータより導かれるＣＤ４５陰性芽球の有無の判定結果を表１に示した。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
表１はde novo AMLと臨床症状から診断された症例６例と、ＭＤＳまたは白血病化ＭＤＳと臨床症状から診断された症例７例を示す。ＣＤ４５とＳＳＣプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団の存在を確認したときは○を、存在しなかったときは×を記載した。
【００６１】
また、表中のＣＤ１３及びＣＤ３３欄はＣＤ４５陽性骨髄芽球に比べてＣＤ４５陰性骨髄芽球のそれぞれの抗体に対する陽性率が高かったとき＋を、あまり変わらなかったときは±を、明らかに低かったときは−を記載した。
【００６２】
ＧＰＡ及びＣＤ３８はそれぞれ陽性であったときは＋を、境界上にあったときは±を、陰性であったときは−を記載した。
これらの測定結果から、ＣＤ４５陰性芽球の存在を確認できたときは○を、確認できなかったときは×を記載した。
【００６３】
de novo AMLではＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団が確認できなかったのに加え、あえて解析したＣＤ４５陰性領域の細胞はＣＤ４５陽性骨髄芽球に比べてＣＤ１３およびＣＤ３３の発現低下を示さなかった。
【００６４】
ＭＤＳではＣＤ４５とＳＳＣで展開したプロットにおいてＣＤ４５陰性細胞集団が確認でき、ＣＤ１３及びＣＤ３８の陽性率がＣＤ４５陽性骨髄芽球集団の陽性率と比較して低下していた。症例６において±と記載しているのは、ＣＤ３３の陽性率がＣＤ４５陽性骨髄芽球及びＣＤ４５陰性芽球の双方とも５以下ととても低く比較が難しかったためであり、細胞の表面形質は明らかに陰性であった。
【００６５】
以上の結果から、臨床症状等から明らかにde novo AMLと診断された症例においてはＣＤ４５陰性芽球は検出されず、ＭＤＳまたは白血病化ＭＤＳと診断された症例からはＣＤ４５陰性芽球を検出することが出来た。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の細胞集団はＭＤＳに特異的に現れることから、これを検出することで白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別することができる。白血病化ＭＤＳは治療に不応性であるが、de novo AMLでは治療に良く反応するため、この両者を鑑別することは患者の予後推定、治療方針の決定等に重要である。本発明の鑑別方法を用いることにより、診断の初期に白血病化ＭＤＳとde novo AMLを鑑別し、適切な治療戦略の構築が可能となる。本発明の鑑別方法をその他の診断方法と組み合わせて用いると鑑別をさらに確実なものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】フローサイトメトリ−により、de novo AMLを展開した図を示す。(症例番号：de novo AML 1)
【図２】de novo AMLにおけるＣＤ４５陽性の骨髄芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：de novo AML 1)
【図３】de novo AMLにおけるＣＤ４５陰性領域細胞集団の抗原解析図を示す。(症例番号：de novo AML 1)
【図４】フローサイトメトリーにより、ＭＤＳを展開した図を示す（症例番号：ＭＤＳ７）。
【図５】ＭＤＳにおけるＣＤ４５陽性の骨髄芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：ＭＤＳ７)
【図６】ＭＤＳにおけるＣＤ４５陰性芽球の抗原解析図を示す。(症例番号：ＭＤＳ７)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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