(57)【要約】【課題】  ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ．１．２．１．１）の工業的生産に有用な製造方法を提供する。【解決手段】  ホルムアルデヒド脱水素酵素（ＥＣ．１．２．１．１）をコードする遺伝子を組み込んだ組換えプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、形質転換された大腸菌を適当な条件下で培養し、発現したホルムアルデヒド脱水素酵素を回収する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法であって、
配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を、該核酸を発現することが可能なベクターに組み込んで発現ベクターを得、
該発現ベクターで大腸菌を形質転換して大腸菌の形質転換体を得、
該大腸菌の形質転換体を、該核酸の発現に適当な条件下で培養し、
発現したホルムアルデヒド脱水素酵素を、該大腸菌の形質転換体またはその培養液から単離することを含む、製造方法。
【請求項２】
前記配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸をプラスミドｐＱＥ３０に組み込んで発現ベクターを得る、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記発現ベクターにおいて、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸が、互いに異なる２つの制限酵素部位の間に組み込まれている、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記互いに異なる２つの制限酵素部位の一方がＢａｍＨＩであり、他方がＳｐｈＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、Ｓａ１Ｉ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
大腸菌においてホルムアルデヒド脱水素酵素を発現することが可能な、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだ発現ベクター。
【請求項６】
前記発現ベクターが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだプラスミドｐＱＥ３０である、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
互いに異なる２つの制限酵素部位の間に配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだ、請求項５または６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記互いに異なる２つの制限酵素部位の一方がＢａｍＨｌであり、他方がＳｐｈＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、Ｓａ１Ｉ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩからなる群から選択される、請求項５〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された大腸菌の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法によって製造される、配列番号２のアミノ酸配列を有するホルムアルデヒド脱水素酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術を利用したホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルムアルデヒドは、シックハウス症候群等の慢性的なアレルギー症状を引き起こす原因物質の１つである。ホルムアルデヒド脱水素酵素（以下、ＦＤＨと称する）は、ホルムアルデヒドを分解・除去するための手段として、空気の浄化など、環境技術の分野における応用が期待されている。
【０００３】
なかでも、ＩＵＢＭＢ命名法に基づいてＥＣ １.２.１.１と称されるＦＤＨは、ギ酸やメタノール等の揮発性の臭気物質を分解産物として生じない点で特に有用である。この酵素は、ＮＡＤ+を補酵素とするグルタチオン依存性のＦＤＨである。この酵素は、ホルムアルデヒドがグルタチオンに抱合されて不揮発性のＳ−ホルミルグルタチオンが生じる反応を触媒する（反応式１）。
反応式１：
ＨＣＨＯ＋グルタチオン＋ＮＡＤ+ → Ｓ−ホルミルグルタチオン＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【０００４】
このＦＤＨ（ＥＣ １.２.１.１）のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は公知である（GenBank Accesslon number：D38504）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＩＵＢＭＢ命名法に基づいてＥＣ １.２.１.１と称されるＦＤＨ（以下「本発明のＦＤＨ」とする）の製造方法に関する。従来、ＦＤＨの入手には、本酵素を大量に発現する微生物あるいは細胞を探索・同定し、これを大量培養した後、本酵素を単離・精製するという煩雑な工程を要し、生産に時間とコストがかかっていた。
【０００６】
したがって、本発明は、本発明のＦＤＨをより大量に且つより安価に生産することが可能な、工業的に有用な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するホルムアルデヒド脱水素酵素の製造方法であって、
配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を、該核酸を発現することが可能なベクターに組み込んで発現ベクターを得、
該発現ベクターで大腸菌を形質転換して大腸菌の形質転換体を得、
該大腸菌の形質転換体を、該核酸の発現に適当な条件下で培養し、
発現したホルムアルデヒド脱水素酵素を、該大腸菌の形質転換体またはその培養液から単離することを含む、製造方法；
（２）前記配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を発現することが可能なベクターが、プラスミドｐＱＥ３０である、上記（１）の製造方法；
（３）前記発現ベクターにおいて、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸が、互いに異なる２つの制限酵素部位の間に組み込まれている、上記（１）または（２）の製造方法；
（４）前記互いに異なる２つの制限酵素部位の一方がＢａｍＨＩであり、他方がＳｐｈＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＳａｌＩ、Ｐｓｔｌ、ＨｉｎｄｌｌＩからなる群から選択される、上記（１）、（２）または（３）の製造方法；
（５）大腸菌においてホルムアルデヒド脱水素酵素を発現することが可能な、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだ発現ベクター；
（６）前記発現ベクターが、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだプラスミドｐＱＥ３０である、上記（５）の発現ベクター；
（７）互いに異なる２つの制限酵素部位の間に配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を組み込んだ、上記（５）または（６）の発現ベクター；
（８）前記互いに異なる２つの制限酵素部位の一方がＢａｍＨＩであり、他方がＳｐｈＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、Ｓａ１Ｉ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩからなる群から選択される、上記（５）、（６）または（７）の発現ベクター；
（９）上記（５）〜（７）のいずれかの発現ベクターで形質転換された大腸菌の形質転換体；
（１０）上記（１）〜（４）のいずれかの製造方法によって製造される、配列番号２のアミノ酸配列を有するホルムアルデヒド脱水素酵素
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法によれば、ホルムアルデヒド脱水素酵素を大量且つ低コストで製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のＦＤＨの製造方法は、遺伝子組換え技術を利用したものである。本発明のＦＤＨをコードする遺伝子の単離、およびこの遺伝子を含む発現ベクターの作製、該発現ベクターで形質転換された宿主細胞の作製、並びに該宿主細胞の培養等は、当分野における常套的手段、例えば、モレキュラー・クローニング（コールドスプリングハーバー出版社、１９８９年）に記載されているような方法に準じて行うことができる。
【００１０】
本発明のＦＤＨは大腸菌由来の酵素である。したがって、本酵素の遺伝子情報を担うＤＮＡは、大腸菌から抽出されたゲノムＤＮＡより入手することができる。例えば、ＪＭ１０９株等の大腸菌を培養し、集菌した後、プロテアーゼ処理し、エタノール沈殿法によって大腸菌のゲノムＤＮＡを抽出する。
【００１１】
次いで、抽出された大腸菌ゲノムＤＮＡをテンブレートとしてＰＣＲ反応を行い、本発明のＦＤＨをコードする遺伝子を増幅させる。ＰＣＲ反応に用いるプライマーは、本発明ＦＤＨの遺伝子情報（GenBank D38504）に基づいて、オープンリーディングフレーム（配列番号１のヌクレオチド）を増幅させるよう設計する。さらに、フォワード側とリバース側のプライマーには、増幅された断片の両端に特定の制限酵素部位が生じるよう適当なヌクレオチドを付加する。好ましくは、断片の両端に互いに異なる制限酵素部位が生じるよう、両プライマーに適当なヌクレオチドをそれぞれ付加し、断片をベクターに挿入する際に一定の向きで組み込まれるようにする。当業者は、慣用の試薬および反応条件を用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のＦＤＨをコードする遺伝子を増幅させることができる。
【００１２】
本発明のＦＤＨをコードする遺伝子を発現することが可能なベクターは、大腸菌での発現に適したものであれば特に限定されない。本発明において、「ベクター」とは、宿主に異種のＤＮＡを運搬するために用いられるＤＮＡを意味する。例えば、ｐＥＴ（東洋紡社製）、ｐＧＥＸ（アマシャム社製）、ｐＢＡＤ（インビトロジェン社製）、ｐＨＡＴ（クロンテック社製）、ｐＱＥ（キアゲン社製）等、当分野で慣用のプラスミドベクターが挙げられる。ｐＱＥは６個のヒスチジンを目的タンパク質に融合して発現させることが可能であり、タンパク質の発現後、このタグを利用したタンパク質精製を容易に行うことができるので、特に好ましい。
【００１３】
本発明のＦＤＨをコードする遺伝子のベクターヘの組込みは、慣用の方法に従って行うことができる。ＦＤＨをコードする遺伝子およびベクターを、それぞれ制限酵素を用いて切断し、適当な条件下でインキュベーションしてライゲーションさせる。本発明では特に、本発明のＦＤＨをコードする遺伝子が、宿主における発現が可能なように組み込まれたベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。
【００１４】
上記ライゲーションにより得られた発現ベクターを、コンピテントセル法、エレクトロポレーション等、慣用の形質転換法を用いて大腸菌に形質導入し、本発明のＦＤＨを発現し得る大腸菌の形質転換体を得る。このようにして得られた形質転換体は、この形質転換体の生育に適し且つ本発明のＦＤＨの発現に適した条件下で培養した後、集菌する。集菌した菌体は、超音波または凍結融解により細胞を破砕するか、またはリゾチームなどの酵素や適当な試薬等により溶菌した後、これを遠心分離することによって所望のＦＤＨタンパク質を含む上清を得る。さらに、この遠心上清を、市販のイオン交換樹脂、アフイニテイー樹脂、金属キレートカラム等を用いた慣用の精製手段に付すことにより、精製された本発明のＦＤＨタンパク質を得ることができる。
【００１５】
本発明を、以下の実施例によって具体的に説明する。
【実施例１】
【００１６】
本発明ＦＤＨ遺伝子の単離
１−１．大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出
大腸菌（ＪＭ１０９株）を、ＬＢ培地１．５mL中、３７℃にて一晩振とう培養した。培養後、培養液を５０００×ｇ、１０分間の遠心分離により集菌し、DNeasy Tissue Kit（キアゲン社）を用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを抽出した。すなわち、菌体ペレツトをバッファーＡＴＬ（キットに添付）１８０μLに再懸濁し、プロテイナーゼＫ（キットに添付）２０μＬを添加後、攪拌し、５５℃にて１時間インキュベーションした。バッファーＡＬ（キットに添付）２００μＬを添加後、攪拌し、７０℃で１０分間さらにインキュベーションした。次いで、エタノール（９９.５％）２００μＬを添加して攪拌したのち、これを２ｍＬ容コレクションチューブにセットしたDNeasyミニカラム（キットに添付）に移し、６０００×ｇで１分間遠心した。DNeasyミニカラムを新たな２ｍＬ容コレクションチューブに移して、バッファーＡＷ（キットに添付）５００μＬを添加後、６０００×ｇで１分間遠心した。さらに、DNeasyミニカラムを新たな２ｍＬ容コレクションチューブに移し、バッファーＡＷ２５００μＬを添加後、６０００×ｇで３分間遠心した。さらに、DNeasyミニカラムを新たな１．５ｍL容コレクションチューブに移して、バッファーＡＥ（キットに添付）２００μＬをカラム内のメンブレンに直接添加し、室温で１分間インキュベーションした。これを６０００×ｇで１分間遠心し、ＤＮＡを溶出した。この操作でおよそ４μｇ（２０μｇ／ｍＬ）の大腸菌ゲノムＤＮＡを回収することができた。
【００１７】
１−２．ＰＣＲによるＦＤＨ遺伝子の増幅
上記で得られた大腸菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲにはExTaq Polymerase（宝酒造社製）を用いた。ＦＤＨ遺伝子を増幅させるためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを以下のように設計した。即ち、大腸菌ＦＤＨ遺伝子配列（GenBnak D38504）のオープンリーディングフレームの全長（配列番号１）を増幅し、フオワード側にはＢａｍＨＩ制限酵素部位を、リバース側にはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を付加するようプライマーを設計した。両プライマーの配列は以下のとおりである。プライマーの合成は、SIGMA Genosys社にて行った。
プライマー配列
フオワードプライマー：５'−cgggatccatgaaatcacgtgctgc−３'（配列番号３）
リバースプライマー  ：５'−cgaagctttcagtaagcaattacgg−３'（配列番号４）
【００１８】
ＰＣＲ反応は以下の条件を用いて行った。
反応サイクル：
（９４℃×３０秒＋６５℃×３０秒＋７２℃×６０秒）を３０サイクル
反応液組成:
テンプレートＤＮＡ        １０μL
１０×ＰＣＲバツフアー      ５μL
ｄＮＴＰs混合物             ４μL
フォワードプライマー        １μL
リバースプライマー          １μL
Ｈ2Ｏ                 ２８．５μL
ExTaq                   ０．５μL
【００１９】
ＰＣＲ反応終了後、反応液５μLを２％アガロースゲルで電気泳動し、目的とする１１２８ｂｐのバンドの増幅を確認した。残りの反応液は、GFX PCR DNA and Gel Band Purificatlon Kit（アマシャムバイオサイエンス社）を用い、残存プライマーおよび未反応成分を除去、精製した。すなわち、GFXカラムをコレクションチューブにセットし、キャプチャー・バッファー（キットに添付）５００μLを入れ、そこにＰＣＲ産物を添加し、ピペッテイングにより攪拌した。次いで、これを１００００×ｇで３０秒間遠心し、素通り画分を廃棄したのち、ウォツシュ・バッファー（キットに添付）５００μLをカラムに入れ、再度１００００×ｇにて３０秒間遠心して洗浄した。GFXカラムを新たなコレクションチューブにセットし、超純水５０μLをカラムに入れ、室温で１分間インキュベーションした後、１００００×ｇで１分間遠心し、精製されたＦＤＨ遺伝子のＰＣＲ産物を回収した。
【実施例２】
【００２０】
発現ベクターの作製および大腸菌形質転換体の作製
２−１．ベクターの準備および制限酵素処理
本発明のＦＤＨ遺伝子を発現させるベクターとしてプラスミドｐＱＥ３０（キアゲン社）を用いた。ｐＱＥ３０（ベクター）と上記実施例１で得られたＦＤＨ遺伝子のＰＣＲ産物（インサート）をそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ともに宝酒造社製）で切断した。
【００２１】
ｐＱＥ３０（ベクター）およびＦＤＨ遺伝子のＰＣＲ産物（インサート）を、それぞれ、３７℃で１時間インキュベーションした。ベククーに対しては、さらにＣＩＡＰバッファー５.５μＬとＣＩＡＰ２μＬ（ともに宝酒造社製）を加え、５０℃で３０分間インキュベーションすることにより、切断面の脱リン酸化を行った。
【００２２】
ベクター、およびＦＤＨ遺伝子のインサートに対して、フェノール／クロロホルム処理をそれぞれ３回行なった後、残存するフェノールを除去するため、Ｇ−２５スピンカラムにアプライし、５０μＬのＴＥバッファーで溶出した。この操作により、ベクター、およびＦＤＨ遺伝子のインサートがそれぞれ約１５０ｎｇ（３０ｎｇ／μＬ）回収された。
【００２３】
２−２．ライゲーションおよび形質転換
上記で得られたベクターとＦＤＨ遺伝子のインサートとを、以下の組成の溶液中、１６℃にて一晩インキュベーションし、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製）によりライゲーションさせた。
組成：
ベクター        ２μＬ
インサート      ２μＬ
２×バッファー  ５μＬ
Ｔ４リガーゼ    １μＬ
【００２４】
ライゲーションで得られた発現ベクターを用いて、大腸菌のコンピテント細胞を形質転換した。すなわち、氷上にて融解したコンピテント細胞（ＪＭ１０９株：東洋紡社製）２５μLに、上記で得られた発現ベクターを含むライゲーション溶液を２．５μL加え、静かに混和した。氷上にて３０分インキュベーションした後、４２℃で３０秒間ヒートショツクを加え、再度氷上に２分間置いた。ＳＯＬ培地を２５０μＬ添加し、３７℃にて１時間前培養した後、ＬＢ寒天プレート（アンピシリン入り）に播き、３７℃で一晩インキュベーションしてコロニーを形成させた。
【００２５】
２−３．インサートの確認
形成されたコロニーをＬＢ培地３ｍL中で３７℃にて一晩培養し、集菌後、QIAprep Sp in Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてブラスミドを抽出した。得られたプラスミドのインサートの大きさを確認するためにＢａｍＨｌとＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を行い、１.５％アガロースゲル電気泳動を行ったところ、１１１０ｂｐの断片が確認でき、目的とするＦＤＨ遺伝子を組み込んだ大腸菌の形質転換体が得られたことが確認できた。
【実施例３】
【００２６】
ＦＤＨの発現および酵素活性の測定
３−１．発現したＦＤＨの抽出および精製
上記実施例２で得られた大腸菌の形質転換体を、ＬＢ培地中、３７℃にて一晩振とう培養した。タンパク質の発現を誘導するためにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度で１ｍＭになるように添加し、３７℃でさらに４時間培養した。３０００×ｇで１５分間遠心して集菌した後、菌体ペレツトを−４０℃の冷凍庫内で凍結させた。凍結後に取り出し、培養液の１／２０量のビーバー（登録商標）バクテリアタンパク質抽出試薬（ピアス社製）を加え、室温で１０分間インキュベーションし、菌体を溶解させた。２７０００×ｇで１５分間遠心し、不溶物を除去した上清に対し、酵素の安定性を保つためのグリセロール、および精製時に必要となる塩としてのＮaＣlを、それぞれ終濃度で４０％および３００ｍＭになるように加え、これを粗抽出液とした。
【００２７】
本発明のＦＤＨの精製にはＮｉ一ＮＴＡスピン・キット（キアゲン社）を使用し、スピンカラム１個あたり５００μＬの粗抽出液を用いて、２００μＬの溶出を２回行い、ＦＤＨの画分を回収した。
【００２８】
以上の工程により、５ｍＬの大腸菌終夜培養液から、およそ５０μｇのＦＤＨを回収することができた（収量:１０μｇ／１ｍＬ培養液）。
【００２９】
３−２．酵素活性測定
上記で得られた本発明ＦＤＨの活性は、J. Biochem., 85, 1165（1979）に記載の方法に準じて測定した。この酵素活性測定の原理は以下の反応式で示される。即ち、ＦＤＨの酵素反応によって生成したＮＡＤＨが、ＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）を介してＮＴＢ（二トロテトラゾリウムブルー）を還元し、ジホルムマザンが生じる。生じたジホルムマザンの量は、５７０ｎｍにおける吸光度の増加により測定する。１分間あたり１／２μｍｏ１のジホルマザンを生成する酵素量を１Ｕ（単位）とした。
反応式：
ＨＣＨＯ ＋ ＮＡＤ+ ＋ グルタチオン→ Ｓ−ホルミルグルタチオン ＋ ＮＡＤＨ＋Ｈ+
ＮＡＤＨ ＋ ＰＭＳ→ ＮＡＤ+ ＋ ＰＭＳ（レッド）
２ＰＭＳ（レッド）＋ＮＴＢ→ ２ＰＭＳ ＋ ジホルマザン
【００３０】
酵素活性の測定に用いた試薬は、以下のとおりである。
基質溶液：１０ｍＭ ＨＣＨＯ（５０ｍＭリン酸緩衝液中）＋０.５％（重量）TritonX-10,ｐＨ７.５
ＮＡＤ溶液：１．５％（重量）β−ＮＡＤ（Ｈ2Ｏ中）
ＧＳＨ溶液：２ｍｇ／ｍＬ（Ｈ2Ｏ中）
ＰＭＳ−ＮＢＴ溶液：０.１ｍｇ／ｍＬ ＰＭＳ＋１ｍｇ／ｍＬ ＮＢＴ（Ｈ2Ｏ中）
酵素溶液：精製した酵素画分を４０％（重量）グリセロールおよび３００ｍＭ ＮaＣlを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で適宜希釈。
【００３１】
活性の測定は以下の手順で行った。
（１）以下の組成で上記試薬を混和し、３７℃で５分間プレインキュベートする。
基質溶液              ５００μＬ
ＮＡＤ溶液            １００μＬ
ＧＳＨ溶液            １００μＬ
ＰＭＳ−ＮＢＴ溶液    １００μＬ
（２）この反応液に５００μＬの酵素溶液を加え反応を開始する。
（３）３７℃で２５分間反応させた後、３ｍＬの０．３Ｎ ＨＣlを加え反応を停止させる。
（４）溶液の５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、ブランクとの差をΔＯＤとして、以下の式より酵素活性の単位に換算する。
Ｕ／ｍＬ＝△ＯＤ×４.３（ｍＬ）×希釈倍率／２０.１／２５（分）／０.５（ｍＬ）※２０.１＝ジホルマザンの１／２mmol分子吸光係数
【００３２】
測定の結果、上記実施例で得られた本発明のＦＤＨは、４Ｕ／ｍLの活性を有していた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の製造方法は、ホルムアルデヒド脱水素酵素の工業的生産に利用することができる。
【配列表】
2005185138000001.app