(57)【要約】【課題】  標識物質の使用量をできるだけ抑え、かつ効率良く標識物質を検体（検出対象としてのターゲット核酸）に取り込ませることのできる核酸標識方法を提供することにある。【解決手段】  検体中に含まれるターゲット核酸配列をＰＣＲで増幅しつつ標識化する際に、ＡＴＣＧの４種の基質のうちの少なくとも１種を標識化する基質として選択し、選択された基質の濃度を選択しなかった基質のそれぞれの濃度よりも低くし、かつ選択された基質に標識化されたものを少なくとも用いる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識基質を取り込みながらＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なう核酸標識方法において、
ＡＴＣＧの４種の基質のうち、１種類から３種類の基質を選択し、選択されなかった残りの基質に比べて前記選択された基質の濃度を少なくし、かつ前記選択された基質として標識なしデオキシヌクレオチドと標識付きのデオキシヌクレオチドが含まれていることを特徴とする、核酸標識方法。
【請求項２】
前記選択された基質としての、標識なしデオキシヌクレオチドと標識付きデオキシヌクレオチドをあわせた総濃度が、前記選択されなかった基質の濃度よりも低い請求項1に記載の核酸標識方法。
【請求項３】
前記選択された基質の濃度を前記選択されなかった基質の濃度の5％から80％の間に調整する請求項1または２に記載の核酸標識方法。
【請求項４】
前記選択された基質の濃度を前記選択されなかった基質の濃度の10％から40％の間に調整する請求項1または２に記載の核酸標識方法。
【請求項５】
前記選択されなかった基質の濃度を150μＭ〜300μＭとする請求項3または4のいずれかに記載の核酸標識方法。
【請求項６】
前記選択された基質としての標識付きデオキシヌクレオチドの濃度を20μＭ以上とする請求項３または４に記載の核酸標識方法。
【請求項７】
前記選択された基質としての標識付きデオキシヌクレオチドの標識なしデオキシヌクレオチドに対する割合が0.25以上であるように調整する請求項６に記載の核酸標識方法。
【請求項８】
前記選択された基質としての標識付きデオキシヌクレオチドの標識なしデオキシヌクレオチドに対する割合が1以上であるように調製することを特徴とする、請求項６に記載の核酸標識方法。
【請求項９】
標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の核酸標識方法。
【請求項１０】
蛍光物質がＣｙ3またはＣｙ5である請求項９に記載の核酸標識方法。
【請求項１１】
標識物質がビオチンである請求項１から８のいずれかに記載の核酸標識方法。
【請求項１２】
標識物質がアミノアリル系化合物である請求項１から８のいずれかに記載の核酸標識方法。
【請求項１３】
前記選択された基質が１種類である請求項１に記載の核酸標識方法。
【請求項１４】
前記選択された１種類の基質がＴである請求項１３に記載の核酸標識方法。
【請求項１５】
ターゲット核酸を含む検体を固相上に固定されたプローブと反応させ、固相上のプローブとハイブリダイズした前記ターゲット核酸を標識を用いて検出するターゲット核酸の検出方法において、
前記検体に請求項１〜１５のいずれかに記載の核酸標識方法により該検体中に含まれるターゲット核酸を標識を施したＰＣＲ産物としてから前記固相上のプローブと反応させることを特徴とするターゲット核酸の検出方法。
【請求項１６】
前記プローブがＤＮＡマイクロアレイとして固相上に配置されている請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡマイクロアレイにおける前記プローブを含むスポットの面積は平方メートル以下であることを特徴とする、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
ＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なった前記検体からのＰＣＲ産物の塩基長が100〜2000bpである請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１９】
標識基質を取り込みながらＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なう場合のＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチドを含む液組成物であって、
１種類から３種類のデオキシヌクレオチドを選択し、選択されなかった残りのデオキシヌクレオチドに比べて前記選択されたデオキシヌクレオチドの濃度を少なくし、前記選択されたデオキシヌクレオチドに対して標識付きのデオキシヌクレオチドが含まれることを特徴とする、液組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップに供する標識ＰＣＲに関するものであり、試料核酸への標識方法および核酸標識用液組成物に関するものである。さらにかかる発明は検体の検出における高感度化に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子の関連が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量(発現量)を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。
【０００３】
検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されているが、その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無や量を調べることにより、その有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列(プローブ)を用意し、検体とプローブがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。
【０００４】
ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、反応用の媒体として、固相、液相を問わず用いることが可能である。例えば、固相上でハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質の信号を測定することにより検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したチップ、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。固相上のハイブリダイゼーションが好まれる理由は、B/F分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能であること、固相ゆえにその取り扱いや応用が容易に出来るからである。
【０００５】
例えば、米国特許第6410229号明細書において開示されているように、平面基板上に合成されたオリゴDNAに対し、標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーションを蛍光検出により測定することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量を検出している。また、特開2001-128683号公報で開示されているように、あらかじめアミノ基が導入された基板を用いてDNAアレイを作製し、これを用いて標識された22merの一本鎖DNAを検出している。
【０００６】
ところで、上記のようなハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法では、検体が標識されている必要がある。このような目的において、検体に標識物質を取り込む方法としては、PCRにおいて標識付きデオキシヌクレオチド(例えば、Cy3-dUTPなど)を付加する方法がある。
【０００７】
また、基質となるATCGの４種のデオキシヌクレオチド(dATP、dCTP、dGTP、dTTP：総称してdNTP)と標識付きデオキシヌクレオチド(例えば、Cy3-dUTP)をそれぞれ調製して、各dNTPの終濃度をそろえるという方法もある。特許第3001919号明細書で開示されているように、4種の基質ヌクレオチドのうち一種の基質について蛍光標識されたヌクレオチドに置換し、標識物質の取り込みを行なっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
固相上のハイブリダイゼーションを利用した検出方法は従来技術の中にも記載したように、他の検出方法に比べて高感度であるという長所はあるが、微少量の核酸検出に対するニーズはそれ以上に高く、より高感度かつ高特異的な検出をするためのさらなる改良が求められている。検出性能の向上に対応するために、様々な角度から改善が試みられている。改善方法としては、例えばターゲットを捕らえるプローブのTm値を高くし、プローブとターゲットとの結合力を高める方法がある。また、ターゲットに対して強い信号を出す標識物質を結合させる、あるいは標識物質そのものを複数の標識物質で多重増幅(増感剤)するといった方法が取られている。
【０００９】
しかし、プローブのターゲットに対する結合力を高める方法は、非特異的な吸着や結合を引き起こし、特異性を大きく低下させる場合があり、その効果は限定的である。また、標識物質からの信号を増幅する方法は、S/N比や定量性を著しく低下させる場合があり、その効果は限定的である。
【００１０】
従って、核酸検出においてより効果的となる、効率良く標識物質を取り込む方法の開発が強く望まれていた。従来技術の中に記載した標識物質の取り込み方法では、PCRの際に標識付きデオキシヌクレオチドを付加するだけだと、基質としての「標識なしデオキシヌクレオチド」が潤沢にあるために、増幅産物にはあまり標識物質が取り込まれておらず、合成量の多さに対してハイブリダイゼーションによる検出量が一致しない場合が生じた。
【００１１】
また、各dNTPの終濃度をそろえる取り込み方法では、ある程度標識付きデオキシヌクレオチドを多くすれば効率良く標識物質が取り込まれるが、標識付きデオキシヌクレオチドは非常に高価であり、その適用範囲が限定される場合がある。
【特許文献１】米国特許第6410229号明細書
【特許文献２】特開2001-128683号公報
【特許文献３】特許第3001919号明細書  本発明の目的は、上記問題点を解決すべく、標識物質の使用量をできるだけ抑え、かつ効率良く標識物質を検体（検出対象としてのターゲット核酸）に取り込ませることのできる核酸標識方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため研究を重ねた結果、標識付きデオキシヌクレオチドを入れる基質に関しては標識なしデオキシヌクレオチドの濃度をその他の塩基に比べて低く調製し、標識付きデオキシヌクレオチドが占める割合を大きくすることで、効率良く標識物質を取り込むことができることを見出した。
【００１３】
本発明にかかる核酸標識方法は、標識基質を取り込みながらＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なう核酸標識方法において、ＡＴＣＧの４種の基質のうち、１種類から３種類の基質を選択し、選択されなかった残りの基質に比べて前記選択された基質の濃度を少なくし、かつ前記選択された基質として、標識なしデオキシヌクレオチドと標識付きのデオキシヌクレオチドが含まれていることを特徴とする、核酸標識方法である。
【００１４】
また、本発明にかかるターゲット核酸の検出方法は、ターゲット核酸を含む検体を固相上に固定されたプローブと反応させ、固相上のプローブとハイブリダイズした前記ターゲット核酸を標識を用いて検出するターゲット核酸の検出方法において、
前記検体に上記の核酸標識方法により該検体中に含まれるターゲット核酸を標識を施したＰＣＲ産物としてから前記固相上のプローブと反応させることを特徴とするターゲット核酸の検出方法である。
【００１５】
更に、本発明にかかる核酸標識のためのＰＣＲ用の液組成物は、標識基質を取り込みながらＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なう場合のＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチドを含む液組成物であって、１種類から３種類のデオキシヌクレオチドを選択し、選択されなかった残りのデオキシヌクレオチドに比べて前記選択されたデオキシヌクレオチドの濃度を少なくし、前記選択されたデオキシヌクレオチドに対して標識付きのデオキシヌクレオチドが含まれることを特徴とする、液組成物である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の核酸標識方法により、標識基質を取り込みながらＰＣＲ法によってターゲット核酸の増幅を行なう場合において、標識付きデオキシヌクレオチドを入れる基質に関しては濃度を低く調製することで、効率良く標識物質を取り込むことができる。そして、本発明のターゲット核酸の検出方法によれば、固相ハイブリダイゼーションによるターゲット核酸の検出感度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明による核酸標識方法は、標識基質を取り込みながらＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)法によってターゲット核酸の増幅を行なう場合において、Ａ(アデニン)・Ｔ(チミン)・Ｃ(シトシン)・Ｇ(グアニン)の４種のデオキシヌクレオチドからなる基質のうち、１種類から３種類の基質を標識を付与するものとして選択し、選択されなかった残りの基質に比べて選択された基質の濃度を少なくし、かつ、選択された基質に標識付きのデオキシヌクレオチドが含まれていることを特徴とする。選択された基質としての「標識なしデオキシヌクレオチド」と「標識付きデオキシヌクレオチド」をあわせた総濃度は、選択されなかった各基質のそれぞれの濃度に比べて低くすることを特徴とする。このような標識化の条件を用いたＰＣＲ増幅を介して検体を調製することによって、ターゲット核酸は増幅過程において効率良く標識物質を取り込むことが可能となる。
【００１８】
また、標識付きデオキシヌクレオチドの濃度が高いほど標識物質の取り込みには有利に働く。選択された基質としてのうちの標識付きデオキシヌクレオチドはPCR反応液中での濃度を20μＭ以上に調整すると本発明はさらに効果的に働く。選択されなかった塩基のPCR反応液中でのデオキシヌクレオチドの濃度を150〜300μＭとし、選択された基質の濃度は選択されなかった基質の5〜80％（モル数基準）とし、選択された基質としての標識付きデオキシヌクレオチドの選択された基質としての標識なしデオキシヌクレオチドに対する割合（モル数基準）が0.25以上であるように調製することが好ましい。より望ましくは、選択された基質は選択されなかった基質の10〜40％（モル数基準）に調製すると良い。さらに望ましくは、選択された基質としての標識付きデオキシヌクレオチドの標識なしデオキシヌクレオチドに対する割合（モル数基準）が1以上であるように調製する。このような条件で検体調製を行なうと、少ない標識付きデオキシヌクレオチドでも効率良くターゲット核酸に標識物質を取り込むことができる。
【００１９】
標識物質としては、どのような標識物質でも特に制限なく本発明に用いることが可能であるが、一般に高感度な検出が可能な蛍光物質等を用いる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ(アマシャムバイオサイエンス社製)は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において特に有効である。また、ビオチン、アミノアリル系化合物等の核酸標識用物質も本発明の検体調製方法には有効である。
【００２０】
本発明の検体調製を行なったターゲット核酸は、固相上ハイブリダイゼーションによって検出するのに用いることができる。本発明によるＰＣＲでは産物量は低下する場合があるものの、少ない検体を感度良く検出できる検出デバイスで特に効果を発揮する。中でも、ＤＮＡマイクロアレイに特に有効である。さらに、ＤＮＡマイクロアレイの一スポットあたりの面積は10-6平方メートル以下が望ましい。また、本発明は上記調製方法に用いる液組成物も提供するものである。スポット面積の下限は、目的とする分析用途に応じて用いられるスキャナなどの結果を測定するための機器の感度などに応じて設定でき、例えば、１０-12平方メートル程度まで小さくすることもできる。
【００２１】
本発明による核酸標識方法についてさらに詳しく説明する。
【００２２】
本発明により提供される核酸標識方法では、ターゲットとしての核酸配列をＰＣＲで増幅する際に用いる基質としてのＡＴＣＧ4種のデオキシヌクレオチドのうち、1種類から3種類の基質を選択し、選択されなかった基質に比べて、選択された基質の濃度を少なくし、かつ選択された基質として少なくとも標識付きのデオキシヌクレオチドを用いることによって実施される。特に、標識を付与するものとして選択した基質としては、標識付きのものと、標識を施さないものとを混合して用いることができ、標識を施さないものの濃度を、標識を施すものとして選択しなかったものの濃度よりも低く調整し、標識付きのものが占める割合を大きくすることで、効率良く標識物質を取り込むことができる。例えば、Ｔを標識すべき基質として選択した場合は、標識していないｄTTPと標識化ｄUTPを併用し、ｄTTPの量を標識化しないdATP、dCTP及びdGTPのそれぞれの濃度よりも低くする（ｄTTPの濃度＜（dATP、dCTPまたはdGTPの濃度））。
【００２３】
さらに、選択された基質の濃度を選択されなかった基質の濃度よりも低く調整することにより、さらなる効果が得られる。例えば、Ｔを標識すべき基質として選択した場合は、標識をしていないｄTTPと標識化ｄUTPを併用し、ｄTTPと標識化ｄUTPをの合計量を、標識化しないdATP、dCTP及びdGTPのそれぞれの濃度よりも低くする［（ｄTTP＋標識化ｄUTPの濃度）＜（dATP、dCTPまたはdGTPの濃度）］。
【００２４】
なお、選択された基質と選択されない基質との上記の関係及び後述する関係は、各基質についてそれぞれ独立して適用されるものである。例えば、選択された基質が２種の場合は、各１種それぞれについて、選択されなかった２種の基質のそれぞれについて濃度の関係が適用される。
【００２５】
なお、「基質」の表現は、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｃ」及び「Ｇ」というデオキシヌクレオチドの種類を示す。
【００２６】
ＰＣＲにおいて、酵素が効率良く働くデオキシヌクレオチドの濃度は、200μＭ程度とされている(TaKaRa 社製Ex Taq等)。酵素の基質特異性の観点から、本来標識付きデオキシヌクレオチドは取り込まれにくい。そこで、標識すべきものとして選択した基質に関しては、その全体の調製濃度を例えば100μＭくらいに低くし、標識付きデオキシヌクレオチドを例えばそのうちの50μＭに調整することが好ましい。その結果、得られるターゲット核酸の配列を含むＰＣＲ産物にはより多くの標識物質が取り込まれるようになる。標識すべきものとして選択された基質のうちの標識されていないデオキシヌクレオチドの量を少くしていることにより、反応が少し止まり、嵩高くて取り込まれにくい標識付きデオキシヌクレオチドを取り込みやすくする効果がある。また、デオキシヌクレオチドの量を30％程増減させても本発明の検体調製方法は有効である。
【００２７】
従って、標識化するものとして選択された各基質の濃度（標識化されたものと標識化されていないものとの合計濃度）を、標識化するものとして選択されなかった各基質の濃度の5％から80％（モル数基準）の間に調整することが好ましい。また、標識化するものとして選択された各基質の濃度（標識化されたものと標識化されていないものとの合計濃度）を、標識化するものとして選択されなかった各基質の濃度の10％から40％の間に調整することがより好ましい。また、標識化するものとして選択されなかった各基質の濃度を150μＭ〜300μＭとすることが好ましい。また、標識化するものとして選択された基質の濃度（標識化されたものと標識化されていないものとの合計濃度）を20μＭ以上とすることが好ましい。更に、標識化するものとして選択された基質の全量のうちの「標識付きデオキシヌクレオチド」の「標識なしデオキシヌクレオチド」に対する割合（モル数基準）が0.25以上、好ましくは１以上であるように調整することが好ましい。また、その上限は、50程度とすることが好ましい。
【００２８】
ターゲット核酸の塩基配列を有して増幅されたＰＣＲ産物の塩基長としては特に制限はないが、100から2000bpの間で特に有効である。
【００２９】
標識物質には蛍光物質等を用いることができる。中でも、Ｃｙ３、Ｃｙ５を代表とするＣｙＤｙｅ(アマシャムバイオサイエンス社製)は、核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において特に有効である。また、ビオチン、アミノアリル等も本発明の核酸標識方法には有効である。ビオチンはＣｙ３に比べて分子の大きさが小さいので、ＰＣＲの際の立体障害は比較的少ないが、本発明の方法により、より効果的に標識物質をＰＣＲ産物に取り込ませることが可能となる。標識されるデオキシヌクレオチドとしては、チミンが一般に良く用いられており、対応する標識試薬も多く市販されており、本発明はそれにも好適に用いることができる。
【００３０】
本発明の核酸標識方法により標識されたターゲット核酸は、固相上あるいは固相表面に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによって2本鎖を形成させ、このプローブと結合しているターゲット核酸の有する標識物質のシグナルを測定することによって高感度に検出することができる。固相ハイブリダイゼーションを利用した高感度な検出デバイスとしては、様々な物質、形態が知られているが、これらに対して本発明は制限なく適用可能である。このうち、ガラス基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイはその代表例であり、本発明の方法によって作成されたターゲット核酸の検出に特に好適である。固相に用いられる材質としてはその他にも、樹脂、金属、金属薄膜、繊維等がある。またその概観上の形態も、微粒子、光ファイバー先端、多孔質材料、繊維等がある。
【００３１】
固相へのプローブの結合様式としては吸着、化学結合等様々な方式が存在するが、いずれの結合様式でも、本発明のターゲット核酸の検出方法に適用可能である。例えば、イオン結合では、アミノ基をコートしてあるガラス基板或いは樹脂表面に対し、通常の核酸を供するだけでイオン的に結合させることができる。また、5'末端、3'末端にアミノ基、チオール基等の官能基を修飾した修飾オリゴヌクレオチドを用いて固定化することも可能である。例えばアミノ基を利用する場合、固相表面にアミノ基と効率的に反応するスクシイミド基をあらかじめ結合させておき、5'末端、もしくは3'末端にアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチドを固相表面に供給することにより、容易に共有結合を形成させることができ、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。またチオール基を用いる場合には、例えば固相にマレイミド基を結合させておくことにより、アミノ基の場合と同様、共有結合を容易に形成し、本発明のターゲット核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。固相への供給方法としては、インクジェット法によってＤＮＡ溶液を固相に印字する方法等がある。このインクジェット法で作製されたＤＮＡマイクロアレイは、プローブのスポットが小さいことが特長であり、検出にはＳ/Ｎ比も重要なファクターになるが、本発明の標識方法によって増幅されたターゲット核酸は、ターゲット当たりの標識量が多いためＳ/Ｎ比の向上の効果もあり、特に効果的である。
【００３２】
また、本発明の標識方法は、1種類のターゲットを増幅するシングルＰＣＲだけでなく、Multiplex PCRや、プライマーの濃度に差をつけ、どちらか一方の1本鎖を積極的に増幅させる非対称ＰＣＲにおいても有効である。
【００３３】
また、本発明の検体調製方法により見出したデオキシヌクレオチドを含む液組成物は、診断キット、ＰＣＲプレミックスとして提供することも可能である。液組成物は、例えばＰＣＲ用として利用できる適当な水を主体とする水性媒体中に、上記のデオキシヌクレオチドの組合わせに加えて、酵素が機能するために必要な成分及びプライマーがアニールするために必要な塩濃度を得るための各種添加剤等、具体的にはTris-Cl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2などを含有することができる。
【００３４】
従って、本発明の標識方法は、検体（試料）中に含まれる検出対象としてのターゲット核酸配列を標識しつつ増幅することができ、固相ハイブリダイゼーション法などの核酸試料側を標識してプローブとハイブリダイズさせる分析方法に供給する検体（試料）の調製方法として好適に利用できる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３６】
＜実施例１＞
Ｉ.ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
市販のＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）の塩基配列中より、後述する配列を有するプライマー２種を設計した。なお、ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。プライマーの設計にあたっては、ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの中の、所望の部分塩基配列がPCR増幅により特異的かつ効率的に増幅されるよう、配列、GC%、融解温度(Tm値)に充分配慮して設計を行った。
【００３７】
設計されたプライマーはフォワード側(F)、リバース側(R)それぞれ１種の計２種である。ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰをテンプレートとし、FとRの組み合わせでPCR増幅することにより、１３２４ｂｐのＰＣＲ産物が増幅されることになる。設計されたプライマーの塩基配列およびTm値を表１に示す。
【００３８】
【表１】
2005185183.tif 000002
【００３９】
またｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ全長における２種のプライマー（Ｆ及びＲ）とプローブ（Ｐ）の位置を図１に示す。なお、この図において矢印の示す方向は、各プライマー鎖において５’末端から３’末端に向かう方向を示している。
【００４０】
（２）プライマーの合成
実施例１の（１）で設計した２種のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、２種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。
【００４１】
（３）ＰＣＲ増幅反応
実施例１の（２）で合成した２種のプライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、ならびに、タカラバイオ株式会社製ＰＣＲキット  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。このＰＣＲキットにはdATP、dCTP、dTTP、dGTPの4種のデオキシヌクレオチドが含まれているdNTP Mixture(各2.5mM)が含まれているが、それぞれの濃度を調製するために、アマシャムバイオサイエンス社製のSequencing Grade Solution dNTPsを用いた。また、PCR産物を蛍光標識により標識するため、アマシャムバイオサイエンス社製のCy3dUTPを加えて、ＰＣＲ産物をCy3により標識した。なお、標識なしデオキシヌクレオチドに関しては、予め下記表２に示すような濃度に調製してdNTP Mixtureを作成した。ここで、比較のために従来の調製方法(STd.)も一緒に実施する。
【００４２】
【表２】
2005185183.tif 000003
【００４３】
フォワード・プライマーとリバース・プライマーは、（１）中に記載した組み合わせでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表３に示す組成の反応液の調製を表２に示すLow dT dNTP Mixture Mix0からMix6それぞれについて行った。
【００４４】
【表３】
2005185183.tif 000004
【００４５】
(※)濃度はMix1〜Mix6及びStd.それぞれで異なるので、別途表４に記す。
【００４６】
表３のように調製した反応溶液中のデオキシヌクレオチドの濃度を下記表４に示す。なお、ｄATP、dCTP、dGTPは各々表に記載の濃度（表４では２００μＭ）で用いた（以下の表においても同様である）。
【００４７】
【表４】
2005185183.tif 000005
【００４８】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表５の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００４９】
【表５】
2005185183.tif 000006
【００５０】
増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物は、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、７種のＰＣＲ産物それぞれにおいて所望の塩基長を有するバンドが出ていることを確認した。ＰＣＲ増幅産物の濃度を表６に示す。
【００５１】
【表６】
2005185183.tif 000007
【００５２】
表６に示すように、ＰＣＲ増幅産物の量としては、反応液中のdTTPの量が多いほど多くなっている。
【００５３】
II.ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計及び合成
上記、ＰＣＲ産物Ａに対して、プローブを設計した。設計はプライマーの設計と同様、設計した部分塩基配列を特異的に認識できるよう、配列、GC%、融解温度(Tm値)に充分配慮して設計を行った。
【００５４】
設計されたプローブの塩基配列およびTm値を表７に示す。
【００５５】
【表７】
2005185183.tif 000008
【００５６】
このプローブ設計においては、Rのプライマーから伸長したDNA鎖が、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成する。
【００５７】
（２）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。
【００５８】
（３）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【００５９】
一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６０】
（４）プローブ用ＤＮＡの合成
上記（１）で設計したプローブを合成した。
【００６１】
プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護を施している保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。
【００６２】
得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６３】
（５）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５質量％、チオジグリコール７．５質量％、尿素７．５質量％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０質量％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６４】
なお、前記バブルジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造バブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液の液滴を、約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００６５】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、各プローブごとに１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。
【００６６】
（６）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＡＮマイクロアレイ型ＤＮＡチップを得た。
III.ハイブリダイゼーション反応
上記のII項で作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてＩで作製したＰＣＲ増幅産物５種を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。
【００６７】
（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１質量％となるように、１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液にIIで作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む０．１×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  １５ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ6Ｈ5Ｎａ3・２Ｈ2Ｏ）  １．５ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。
【００６８】
（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
最終濃度が下記の構成となるよう、各ＰＣＲ産物に対しハイブリダイゼーション溶液を調製した。なお、各ＰＣＲ増幅産物溶液はそれぞれ2.0μl使用した。
【００６９】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表８に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００７０】
【表８】
2005185183.tif 000009
【００７１】
（４）  蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。ＰＣＲ増幅産物Std.、及びＡからＦの蛍光輝度を測定した結果を下記の表９に示す。輝度の算出にあたっては、ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。また測定は２回実施し、その平均値を示す。
【００７２】
【表９】
2005185183.tif 000010
【００７３】
(※)検出感度以下のため、No Data扱いとする。
表９に示された結果より、従来方法Std.に比べて他のＡ〜Ｅのサンプルの方がPCR増幅産物量は少ないものの、ハイブリダイゼーションによって検出された蛍光輝度値が高くなっている。すなわち、標識の取り込み効率が良いということがわかる。つまり、反応液中に加える標識物質の量が少なくても、標識付きの塩基に関してデオキシヌクレオチドの総濃度を他の塩基の濃度に比べて低く調製することによって、効率良く標識物質を取り込ませることが可能となる。ただし、標識なしデオキシヌクレオチドが0ではPCR増幅はほとんどされておらず、ハイブリダイゼーションでも検出されない(サンプルＦ)。以上より、標識付きデオキシヌクレオチドを加えない塩基のデオキシヌクレオチド(ここでは、dATP、dCTP、dGTP)の濃度に対し、標識付きデオキシヌクレオチドを加える塩基の標識なしデオキシヌクレオチド(ここでは、dUTP)の濃度を5から80モル％に調製することにより、効率良く核酸標識が行なわれることが示された。
【００７４】
更に、表9のＣ、Ｄのサンプルの輝度値は、従来方法Std.に比べて約10倍にも及ぶ。すなわち、本発明の核酸標識方法は、標識付きデオキシヌクレオチドを加えない塩基のデオキシヌクレオチド(ここでは、dATP、dCTP、dGTP)の濃度に対し、標識付きデオキシヌクレオチドを加える塩基の標識なしデオキシヌクレオチド(ここでは、dUTP)の濃度を10から40モル％に調製することにより、最も効率良く核酸標識が行なわれる。なお、本実施例では1種類の塩基についてのみ標識物質を取り込ませたが、複数の塩基について標識物質を取り込ませても、同様の効果が得られる。
【００７５】
＜実施例２＞
実施例１の表６にあるようなＰＣＲ産物において、各ＰＣＲ産物が互いに等モルになるよう調製した上で、ＰＣＲ増幅産物溶液を用いて最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．４）
続いて、表８に示すハイブリダイゼーション条件及び手順でハイブリダイゼーション反応を行なった。また、実施例１の(４)蛍光測定に記述したように処理を行い、各ＤＮＡチップについて蛍光測定を行った。その平均値を表１０に示す。
【００７６】
【表１０】
2005185183.tif 000011
【００７７】
この結果から、１本のターゲットに対してＣ、Ｄのサンプルの方が、Ａに比べてより多くの標識物質が取り込まれていることがきちんと確認された。また、標識なしデオキシヌクレオチドに対する標識付きデオキシヌクレオチドの割合が1以上の方がより効果的であることがわかる。
【００７８】
＜実施例３＞
表１１に示すようなデオキシヌクレオチドの濃度になるように反応液を実施例１の表３に従って調製し、表５にあるような温度条件でＰＣＲ増幅反応を行なった。
【００７９】
【表１１】
2005185183.tif 000012
【００８０】
ＰＣＲ増幅産物の濃度を表１２に示す。
【００８１】
【表１２】
2005185183.tif 000013
【００８２】
ＰＣＲ増幅産物の量としては、反応液中のdTTPの量が多いほど多くなっている。
【００８３】
実施例１と同様の条件で、表１２にあるＰＣＲ産物において、最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。各ＰＣＲ増幅産物溶液は2.0μl使用した。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．４）
続いて、表８に示すハイブリダイゼーション条件及び手順でハイブリダイゼーション反応を行なった。また、実施例１の(４)蛍光測定に記述したように処理を行い、各ＤＮＡチップについて蛍光測定を行った。その平均値を表１３に示す。
【００８４】
【表１３】
2005185183.tif 000014
【００８５】
この結果から、Ｈが最も高い輝度値が得られることがわかる。標識なしデオキシヌクレオチドに対する標識付きデオキシヌクレオチドの割合が同じ１の場合でも、標識なしデオキシヌクレオチドの濃度が、他の塩基に比べて少ないＨ、Ｃの方がＧの条件に比べて検出感度が良く、少ない標識物質でより効果的に標識を取り込むことができていることがわかる。
【００８６】
＜実施例４＞
表１４に示すようなデオキシヌクレオチドの濃度になるように反応液を実施例1の表３に従って調製し、表５にあるような温度条件でＰＣＲ増幅反応を行なった。すなわち、標識付きデオキシヌクレオチドを使用しない塩基Ａ、Ｃ、Ｇに関して濃度条件を変えて核酸標識を行なう。
【００８７】
【表１４】
2005185183.tif 000015
【００８８】
ＰＣＲ増幅産物の濃度を表１５に示す。
【００８９】
【表１５】
2005185183.tif 000016
【００９０】
ＰＣＲ増幅産物の量としては、Ｉ(Mix９)が若干少ないが、どのサンプルでもほぼ同じである。
【００９１】
実施例１と同様の条件で、表１４にあるＰＣＲ産物において、最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。各ＰＣＲ増幅産物溶液は2.0μl使用した。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６×ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液
（６×ＳＳＰＥ：  ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．  ７．４）
続いて、表８に示すハイブリダイゼーション条件及び手順でハイブリダイゼーション反応を行なった。また、実施例１の(４)蛍光測定に記述したように処理を行い、各ＤＮＡチップについて蛍光測定を行った。その平均値を表１６に示す。
【００９２】
【表１６】
2005185183.tif 000017
【００９３】
この結果から、Ｉ以外のサンプル(Ｊ、Ｃ、Ｋ、Ｌ)でほぼ同じ輝度値が得られている。つまり、標識効率は標識付きデオキシヌクレオチドを使用しない塩基Ａ、Ｃ、Ｇの濃度には依存せず、150μMから300μMの間で調製することが妥当であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰにおいて、２つのプライマー、および１つのプローブを示した図である。矢印はそれぞれのプライマーにおいて５’から３’に向かう方向を示している。
【図１】
2005185183.tif 000018
【配列表】
2005185183000001.app