(57)【要約】【課題】  ドコサヘキサエン酸生産能の高い微生物を提供すること。【解決手段】  ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株。
【請求項２】
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することを含む、ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項４】
ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株である、請求項３に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項５】
培養時のｐＨが８．０以上９．０以下である、請求項３又は４に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項６】
培養時の種菌量が培養培地１リットル当り８０ｇ以上である、請求項３から５の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項７】
培養時の種菌量が培養培地１リットル当り１００ｇ以上である、請求項６に記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項８】
炭素源濃度が４％以上７％以下の培地で培養した後、炭素源濃度が１３％以上２０％以下の培地で引き続き培養する、請求項３から７の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法。
【請求項９】
油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有する、ドコサヘキサエン酸含有油脂。
【請求項１０】
油脂中に全脂肪酸あたりドコサヘキサエン酸を５０重量％以上の量で含有する、請求項９に記載の油脂。
【請求項１１】
ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である、請求項９又は１０に記載の油脂。
【請求項１２】
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である、請求項９から１１の何れかに記載の油脂。
【請求項１３】
菌株の培養物から採取することによって得られる油脂を精製することによって得られる油脂である、請求項９から１２の何れかに記載の油脂。
【請求項１４】
油脂が、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、又は培養終了時の培養液若しくはその殺菌した培養液、又はそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物、またはその培養液若しくはその菌体から該油脂を採取した後の残渣に含まれるものである、請求項９から１３の何れかに記載の油脂。
【請求項１５】
請求項３から８の何れかに記載の製造方法により得られるドコサヘキサエン酸含有油脂又は請求項９から１４の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂から、ドコサヘキサエン酸を単離することを含む、ドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項１６】
ドコサヘキサエン酸含有油脂をリパーゼで処理した後に、ドコサヘキサエン酸を単離する、請求項１５に記載のドコサヘキサエン酸の製造方法。
【請求項１７】
請求項３から８の何れかに記載の製造方法により得られるドコサヘキサエン酸含有油脂、請求項９から１４の何れかに記載のドコサヘキサエン酸含有油脂、又は請求項１５又は１６に記載の方法により得られるドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことを含む、ベヘン酸の製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベヘン酸を含むベヘン酸銀を用いる、写真感光材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産能を有する新規微生物、並びに該微生物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドコサヘキサエン酸は、動物の脳や網膜に特異的に存在する高度不飽和脂肪酸であり、それらの器官における重要な生理的役割を果たすとともに、抗炎症作用、血中コレステロール低下作用などの生理活性をも有する。そのようなことから、ドコサヘキサエン酸は、医薬、食品分野における利用が注目されている有用物質であり、近年、健康食品や乳児用ミルクなど、機能性食品分野においても利用が広がっている。
【０００３】
ドコサヘキサエン酸は、青魚に属する魚油中に含まれ、特にイワシやマグロ由来の油には20％前後含まれている。魚由来のドコサヘキサエン酸含有油脂を食品分野において利用する場合の大きな問題は、魚臭を取り除くために多大な操作を必要とすることである。また、魚由来のドコサヘキサエン酸含有油脂には、アラキドン酸やイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）など各種の高度不飽和脂肪酸が含まれるため、酸化され易く、安定した品質の油脂を得ることが困難である。さらに、ドコサヘキサエン酸を医薬品等の分野で利用する場合には、ドコサヘキサエン酸含有油脂からドコサヘキサエン酸を分離精製することが必要であるが、ドコサヘキサエン酸に構造が類似した各種高度不飽和脂肪酸が含まれているため、分離精製は困難である。特に乳児用ミルクの調合においては、イコサペンタエン酸含有割合の低いドコサヘキサエン酸含有油脂が望ましいが、供給源が魚油の場合、イコサペンタエン酸のみを効率的に除くことはきわめて困難である。
【０００４】
魚油以外のドコサヘキサエン酸の供給源として、微生物による生産方法が考えられている。ドコサヘキサエン酸含有油脂を生産する微生物としては、深海から分離された細菌ビブリオ マリナス(Vibrio marinus)や深海魚の腸内から分離されたビブリオ属細菌、鞭毛菌類であるスラウストキトリウム アウレウム(Thraustochytrium aureum) 、ジャポノキトリウム(Japonochytrium sp.)、微細藻類であるシクロテラ クリプティカ(Cyclotella cryptica) などが知られており、これらの微生物を利用した培養法によるドコサヘキサエン酸含有油脂の生産も検討されてきた(特許文献１)。しかしながら、従来公知の微生物による方法によれば、培地１リットル当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の生産量が100〜700mg程度と少なく、ドコサヘキサエン酸の生産量としても非常に低かった。
【０００５】
また、特許文献２および特許文献３には、シゾキトリウム属菌株（ＳＲ２１）を用いてドコサヘキサエン酸を生産することが記載されているが、生産量が少ない、培養に特別な培地を必要とする、製造設備に新たな設備投資が必要となる、などの問題点が指摘されている。
さらに、特許文献４には、ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸含有油脂を生産する能力を有するウルケニア属に属する微生物の培養物から該油脂を採取できることが記載されているが、上記と同様の問題点がある。
【０００６】
一方、写真感光材料に必要な長鎖飽和脂肪酸［Ｃ２２：０ベヘン酸］の生産原料にはナタネの種子油が多用されている。ナタネはＣ２２成分を含まない品種が好まれるようになり、品種改良が進み、供給量が減少傾向にある。さらに、ナタネ種子油の硬化油には炭素数の近接した脂肪酸が含まれるために、高純度なベヘン酸を生産するためには精製の手間とコストが大きな問題となっている。従って、DHA並びにベヘン酸を安価に安定的に高純度に供給することができる有用脂質生産技術を開発することが求められている。
【０００７】
【特許文献１】特開平１−１９９５８８号公報
【特許文献２】特開平１０−７２５９０号公報
【特許文献３】特許第２７６４５７２号公報
【特許文献４】特表２０００−５１３５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ドコサヘキサエン酸生産能の高い微生物を提供することにある。また、本発明の課題は、ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物を用いてドコサヘキサエン酸含有油脂を高収率でしかも複雑な工程を要せずきわめて効率よく製造する方法を提供することにある。更に、本発明の課題は、ドコサヘキサエン酸を効率よく製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を高純度で生産する微生物（菌株）を見出した。この微生物は、培養が容易でＤＨＡ含量の多い油脂を生産することができ、またこの油脂から容易にＤＨＡを高純度で採取することができる。この微生物が生産する油脂の不飽和脂肪酸Ｃ２２成分を水素添加、及び加水分解することにより高純度のベヘン酸を取り出すことができる。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株が提供される。
好ましくは、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株が提供される。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することを含む、ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造方法が提供される。
好ましくは、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株が、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株である。
好ましくは、培養時のｐＨは８．０以上９．０以下である。好ましくは、培養時の種菌量は、培養培地１リットル当り８０ｇ以上、さらに好ましくは１００ｇ以上である。好ましくは、炭素源濃度が４％以上７％以下の培地で培養した後、炭素源濃度が１３％以上２０％以下の培地で引き続き培養する。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有する、ドコサヘキサエン酸含有油脂が提供される。好ましくは、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、ドコサヘキサエン酸を３０重量％以上、及びイコサペンタエン酸を４重量％以下の量で含有する、ドコサヘキサエン酸含有油脂が提供される。
好ましくは、本発明の油脂は、油脂中に全脂肪酸あたりドコサヘキサエン酸を５０重量％以上の量で含有する。
【００１３】
好ましくは、本発明の油脂は、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である。
好ましくは、本発明の油脂は、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管）、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって得られる油脂である。
【００１４】
好ましくは、本発明の油脂は、菌株の培養物から採取することによって得られる油脂を精製することによって得られる油脂である。
好ましくは、本発明の油脂は、菌体培養によって油脂を製造する途中の培養液若しくはその殺菌した培養液、又は培養終了時の培養液若しくはその殺菌した培養液、又はそれぞれから集菌した培養菌体若しくはその乾燥物、またはその培養液若しくはその菌体から該油脂を採取した後の残渣に含まれるものである。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の製造方法により得られるドコサヘキサエン酸含有油脂から、ドコサヘキサエン酸を単離することを含む、ドコサヘキサエン酸の製造方法が提供される。好ましくは、ドコサヘキサエン酸含有油脂をリパーゼで処理した後に、ドコサヘキサエン酸を単離する。
本発明のさらに別の側面によれば、上記したドコサヘキサエン酸含有油脂又はドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことを含む、ベヘン酸の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記したベヘン酸を含むベヘン酸銀を用いる、写真感光材料の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培養して油脂を生産することにより、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）及びベヘン酸を安価に安定的に高純度で供給することができる。即ち、本発明のスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を用いることにより、写真材料、飲食品、化粧品及び医薬品などの分野で有用なドコサヘキサエン酸含有量の高い油脂を高収率で効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の菌株
本発明の菌株は、ドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株であれば何れの菌株でもよい。好ましくは、菌株の培養物中に含まれる油脂中に、全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有することを特徴とする菌株である。
【００１８】
本発明の菌株は、例えば、次のようなスクリーニング法に従って選択することができる。先ず、採取した海水を０.４μmの滅菌フィルターを用いて濾過および集菌し、このフィルターを９０％天然海水、グルコース、酵母エキス、ペプトンよりなる寒天培地上に張り付け、２０〜３０℃で培養する。この寒天平板培地のフィルター上に形成したコロニーを、上記と同じ組成の寒天培地上で培養し、得られた菌体をスパーテルで採取し、常法に従って菌体から脂肪酸を直接メチルエステル化し、その組成をガスクロマトグラフィーで分析し、ドコサヘキサエン酸を産生している菌株を選択する。さらに、菌体内に油脂を乾燥菌体あたり１０重量％以上、好ましくは２０重量％以上の量で蓄積し、そして／または油脂中に全脂肪酸あたり、系ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有する菌株を選択することができる。
【００１９】
本発明の菌株の具体例としては、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。
【００２０】
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株は瀬戸内海から採取された菌株である。ＬＦＦ１株は適当な寒天培地（例えば、3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.5%ペプトン、2%人工海水を含む2%寒天培地）において，直径10〜20μmの球状の細胞から伸長した外質ネットを観察することができ、クロミスタ界（Kingdom Chromista）ラビリンチュラ綱（Class Labyrinthulea）ヤブレツボカビ科（Family Thraustochytriaceae）に属することが認められた。また、栄養細胞は運動性を示さず、細胞質分裂を伴わない核分裂を繰り返して多核状態となった後、遊走子を形成して、これを細胞外に放出した。このような生活史はトラウストキトリウム属（Genera Thraustochytrium）に特徴的である（Olive, L.S., The Mycetozoans. Academic Press, New York, USA, 1975; 本多大輔, ラビリンチュラ類の系統と分類. 海洋と生物 23:7-18, 2001）。
【００２１】
この分類は，ＬＦＦ１株の細胞内脂質中にヤブレツボカビ科に特徴的なドコサヘキサエン酸やドコサペンタエン酸が顕著量含まれることや，18S rRNAの塩基配列に基づく分子系統解析によってＬＦＦ１株がスラウストキトリウム属のクラスターに埋没したことからも明らかである。しかし、ヤブレツボカビ科の分類に関しては、形態や生活史に基づく分類体系と分子系統分類との整合性がとれておらず（Honda, D., et al., Molecular phylogeny of Labyrinthulids and Thraustochytrids based on the sequencing of 18S ribosomal RNA gene. Journal of Eukaryotic Microbiology 46:637-647, 1999）、ＬＦＦ１株の種を同定するには至らなかった。
【００２２】
本発明のスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１  中央第６）に平成１４年１２月１７日付で寄託し、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９を得ている。また、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９は、平成１５年１２月１０日に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８の下、国際寄託に移管された。
【００２３】
また、本発明の菌株は、前記スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１５９より移管））に限定されるものではなく、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株をも包含する。
【００２４】
上記ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、並びに上記ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、本明細書中上記した通り、適当な寒天培地（例えば、3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.5%ペプトン、2%人工海水を含む2%寒天培地）において性状を観察したり（直径10〜20μmの球状の細胞から伸長した外質ネットを観察することができる、など）、栄養細胞の性状（運動性を示さず、細胞質分裂を伴わない核分裂を繰り返して多核状態となった後、遊走子を形成して、これを細胞外に放出する、など）を観察することにより同定することができる。
【００２５】
また、上述したＬＦＦ１株、該ＬＦＦ１株と同一の種に属する菌株、または該ＬＦＦ１株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株の変異株または組換え株も本発明の範囲内のものである。
【００２６】
例えば、ドコサヘキサエン酸をさらに高水準で産生するように設計された変異株および組換え株は、全て本発明の範囲内にある。このような変異株または組換え株には、同じ基質を用いて培養したときに、元の野性株が産生する量と比べて、油脂中のドコサヘキサエン酸の量が多くなるように、または総油脂量が多くなるように、あるいはその両方を意図して設計されたものが含まれる。さらに、費用効果の優れた基質を効率よく用いて、対応する野性型と同量のドコサヘキサエン酸を含有する油脂を産生するように設計された菌株も含まれる。
【００２７】
（２）ドコサヘキサエン酸含有油脂の製造
上記した本発明のドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株を培地中で培養し、培養物からドコサヘキサエン酸含有油脂を採取することによって、ドコサヘキサエン酸含有油脂を製造することができる。
【００２８】
スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株（例えば、ＦＦ１株など）の増殖は、当該菌株を天然海水又は人工海水で調製した適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより行うころができる。培地に接種する種菌の量は特に限定されないが、好ましくは培養培地１リットル当り８０ｇ以上であり、さらに好ましくは培養培地１リットル当り１００ｇ以上である。このような条件で培養を行うことにより、油脂の生産量を増大させることができる。
【００２９】
培地としては、公知のものをいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、サッカロース、デンプンなどの炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが例示できる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０〜３００ｇの濃度で使用することができる。特に好ましい態様によれば、炭素源濃度の異なる２種類の培地を用いて培養を行うことができ、例えば、炭素源濃度が４％以上７％以下の培地で培養した後、炭素源濃度が１３％以上２０％以下の培地で引き続き培養を行うことができる。このような条件で培養を行うことにより、油脂の生産量を増大させることができる。
また、窒素源としては、酵母エキス、コーンスチープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素を使用することができる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【００３０】
また、ドコサヘキサエン酸の産生を促進するため、ドコサヘキサエン酸の前駆体を培地に添加することができる。前駆体としては、テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカンなどの炭化水素、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸などの脂肪酸、またはその塩(例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩)、脂肪酸エステル、または脂肪酸を構成成分として含む油脂(例えば、オリーブ油、大豆油、綿実油、ヤシ油)などを挙げることができるが、これらに限られるものではない。
【００３１】
上記の培地は、調製後、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０〜９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。
【００３２】
菌の培養温度は一般的には１０〜４５℃であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養温度は、目的油脂組成を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは一般的には３．５〜９．５であり、好ましくはｐＨ４．５〜９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには５．０〜８．０であるが、本発明者はｐＨを８．０〜９．０とすることによって油脂生産量は減少するものの、油脂中のドコサヘキサンエン酸含有率を高くなることを見出した。
培養期間は、例えば３〜７日間とすることができ、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養で培養を行なうことができる。
【００３３】
このようにして、培養物中にドコサヘキサエン酸含有油脂を高濃度に蓄積した菌体が、培地１リットル当たり乾燥菌体重量で、一般的には４〜６０ｇ程度と、高い濃度で生産される。培養物から培養液と菌体とを分離する方法は、当業者に公知の常法により行なうことができ、例えば、遠心分離法や濾過などにより行なうことができ、特に遠心分離法が好適である。
【００３４】
上記の培養物から分離した菌体を、例えば、超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ドコサヘキサエン酸含有油脂を得ることができる。
乾燥菌体１００ｇ当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の含有量は、１０〜８０ｇ程度であり、培地１リットル当たりのドコサヘキサエン酸含有油脂の生産量は、０．４〜４８ｇ程度に達する。
【００３５】
また本発明の好ましい実施態様によれば、油脂の脂肪酸組成におけるドコサヘキサエン酸含有割合は、５０重量％以上と高濃度で含有される。したがって、培地１リットル当たりのドコサヘキサエン酸の生産量としては、０．２〜３８ｇ程度と極めて高い。
【００３６】
本発明のドコサヘキサエン酸生産能を有するスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株は、好ましくは、乾燥菌体あたり油脂を１０重量％以上蓄積することができ、さらに好ましくは２０重量％以上蓄積することができる。このような本発明の菌株を用いて生産される油脂は、油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上の量で含有し、好ましくはイコサペンタエン酸を４重量％以下の量で含有する、ドコサヘキサエン酸含有油脂である。このドコサヘキサエン酸含有油脂は、好ましくは、油脂中に全脂肪酸あたりドコサヘキサエン酸を５０重量％以上の量で含有する。
【００３７】
（３）ドコサヘキサエン酸の製造
ドコサヘキサエン酸含有油脂からドコサヘキサエン酸を分離するには、混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態で、常法により、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより行うことができる
また、ドコサヘキサエン酸含有量の高い油脂は、ドコサヘキサエン酸含有油脂から鎖長の短い脂肪酸を遊離除去することにより製造することができる。この反応はエステラーゼ、リパーゼ等各種加水分解酵素を利用できるが、特にリパーゼで処理することによることが好ましく、更に好ましくは１，３位選択的リパーゼで処理することが好ましい。
【００３８】
リパーゼは動物由来、植物由来、微生物由来の多くの種類が報告されている。植物由来リパーゼのヒマシリパーゼは位置選択性が低いことが知られている。また、微生物リパーゼではCandida cylindracea, Chromobacterium viscosum, Corynebacterium acnes, Geotrichum candium, Pseudomonas fragi, Pseudomanas fluorescens, Penicillium cyclopium,等は位置選択性が低いが、Rhizopus delemar, Rhizopus arrhizus,  Rhizopus niveus, Mucor miehei, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Penicillum roqueforti等は１，３位置選択性を示すといわれている。さらに、１，３位選択的リパーゼの例としては動物由来の膵臓リパーゼの活性がよく知られている。工業的に生産されかつ安価に安全に利用できる１，３位選択的リパーゼとして、上記微生物由来の1、3位置選択性リパーゼ及びブタ膵臓リパーゼ等を使用することができるが、特に好ましくはRhizopus oryzae, Aspergillus niger又はPenicillum roquefortiである。
【００３９】
リパーゼ処理反応は、pH4.0-9.0、20℃から60℃の範囲で行うことができる。
【００４０】
菌株としてスラウストキトリウム(Thraustochytrium)属菌株（例えば、ＬＦＦ１株など）を用いた場合、得られるドコサヘキサエン酸含有油脂の脂肪酸組成の特徴として、油脂中に全脂肪酸あたり、ドコサペンタエン酸を１０重量％以下、及びドコサヘキサエン酸を３０重量％以上（さらに好ましくは５０重量％以上）の量で含有することであり、好ましくはイコサペンタエン酸を４重量％以下の量で含有することである。このような油脂はドコサヘキサエン酸の濃縮分離の面で有利である。また、かかる油脂は、ドコサヘキサエン酸と生理活性が類似あるいは拮抗したそれらの脂肪酸をほとんど含まないことから、機能性食品や医薬品面での利用を目指す上でも好都合であり、特に写真感光材料で用いるベヘン酸の製造のために利用する上でも好都合である。
【００４１】
（４）油脂およびドコサヘキサエン酸の利用
上記（２）および（３）に記載した油脂およびドコサヘキサエン酸は、種々の飲食品、飼料、または餌料に添加して使用することができる。このような食品の例としては、例えば、栄養補助食品、乳幼児用または未熟児用調製乳、健康食品、機能性食品、幼児用食品、妊産婦用食品、および老人用食品などが挙げられる。飼料としては、豚および牛などの家畜用飼料、鶏などの家禽用飼料、犬又は猫用のペットフード、および養魚用の飼料などが挙げられる。餌料としては、例えば、魚貝類の養殖のために餌料として与える微小生物（いわゆる、動物プランクトン）のための餌料が挙げられる。特に、飼料および餌料用には、本発明の菌株の培養物、この培養物から集めた菌体、または油脂を採取した後の菌体の残渣を用いることが経済的に好ましい。
【００４２】
本発明の方法で製造した油脂およびドコサヘキサエン酸を飲食品に添加する場合、食品組成物は、固形もしくは液状の飲食品、または油脂を含む飲食品の形態でもよい。飲食中の油脂およびドコサヘキサエン酸の含量は、飲食品の性質に依存するが、好ましくは0.001重量％から50重量％程度である。
【００４３】
油脂を含む食品の例として、肉、魚、またはナッツ等の油脂を含む天然食品、スープ等の調理時に油脂を加える食品、ドーナッツ等の熱媒体として油脂を用いる食品、バター等の油脂食品、クッキー等の加工時に油脂を加える加工食品、あるいはハードビスケット等の加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布する食品等が挙げられる。本発明の油脂（あるいは分離されたドコサヘキサエン酸）はまた、油脂を含まない、農産食品、発酵食品、畜産食品、水産食品、または飲料に添加してもよい。
【００４４】
本発明の油脂およびドコサヘキサエン酸は、機能性食品に添加してもよい。機能性食品は、機能性食品は医薬製剤の形態であってもよく、または、タンパク質、糖類、脂質、微量元素、ビタミン類、乳化剤、または香料と本発明の油脂が配合された、経腸栄養剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ等の加工形態であってもよい。
【００４５】
さらに、本発明の油脂およびドコサヘキサエン酸は、化粧品または洗浄剤のための添加物として、あるいは医薬品として使用されるその誘導体を製造するための出発材料として使用することもできる。
【００４６】
化粧料の形態の例としては、特に限定されないが、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック、分散液、洗浄料等の化粧品とすることができる。化粧料の基剤としては、化粧料の形態に応じた基剤、例えば、精製水、低級アルコール類、多価アルコール類、油脂類、界面活性剤、各種美容成分、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、防腐剤、香料等を用いることができる。洗浄剤としては、薬用あるいは非薬用にかかわらず、身体を清浄に保つために一般に用いられる石鹸、シャンプー、フェイシアルクリーム、リンスなどが含まれ、さらに入浴剤や食器などの日常の家庭で用いる器具などの洗剤であってもよい。
【００４７】
なお、本発明の油脂およびドコサヘキサエン酸は、写真感光材料の成分であるベヘン酸銀の原料として特に有用であるが、これについては後述する。
【００４８】
（５）ベヘン酸の製造および該ベヘン酸を用いた写真感光材料の製造
本明細書中上記したドコサヘキサエン酸含有油脂、ドコサヘキサエン酸含有油脂、又はドコサヘキサエン酸に水素添加を行なうことによってベヘン酸を製造することができる。原料として油脂を用いる場合には、水素添加後に加水分解を行なうことによりベヘン酸を製造することができる。
【００４９】
本発明の方法で製造されるベヘン酸は、写真感光材料の一成分として用いられるベヘン酸銀を製造するために用いることができる。即ち、本発明の方法で製造されるベヘン酸を含むベヘン酸銀を用いて写真感光材料を製造する方法も本発明の範囲内のものである。
写真感光材料を製造の具体的手法は当業者に既知であり、例えば、特開２００２−３４１４８４号公報、特開２００２−３２８４４４号公報、特開２００２−３１８４３１号公報、特開２００２−３１１５３３号公報、特開２００２−３１１５３１号公報などに記載されている。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【実施例】
【００５０】
実施例１：ＬＦＦ１株の単離と同定
ＬＦＦ１株は瀬戸内海から採取された菌株である。ＬＦＦ１株は適当な寒天培地（3%グルコース、0.5%酵母エキス、0.5%ペプトン、2%人工海水を含む2%寒天培地）において，直径10〜20μmの球状の細胞から伸長した外質ネットを観察することができ、クロミスタ界（Kingdom Chromista）ラビリンチュラ綱（Class Labyrinthulea）ヤブレツボカビ科（Family Thraustochytriaceae）に属することが認められた。また、栄養細胞は運動性を示さず、細胞質分裂を伴わない核分裂を繰り返して多核状態となった後、遊走子を形成して、これを細胞外に放出した。このような生活史はトラウストキトリウム属（Genera Thraustochytrium）に特徴的である（Olive, L.S., The Mycetozoans. Academic Press, New York, USA,1975; 本多大輔, ラビリンチュラ類の系統と分類. 海洋と生物 23:7-18, 2001）。
【００５１】
実施例２：ＬＦＦ１株を用いた油脂の製造
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でＬＦＦ１株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
（１）培養条件
３Ｌファーメンタ使用
培養量：１．８Ｌカルチャー
培地組成
１０％  グルコース
３．３％酵母エキス
５０％  人工海水
０．１％  消泡剤
０．２％  酢酸アンモニウム
０．２％  リン酸二水素カリウム
【００５２】
継代培養用は、アガロース培地へストリーク後、２８℃で４日間静置培養し、
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
３％  グルコース
１％  酵母エキス
５０％人工海水
０．２％酢酸アンモニウム
０．２％リン酸二水素カリウム
１．５％アガロース
【００５３】
このコロニーをかきとり培地８０ｍｌで２８℃好気性下１６時間振とう前培養し、ファーメンタへ植菌した。４０時間通気下５００ｒｐｍで攪拌培養した。ｐＨは制御しない。１５００Ｇ３０分で集菌後、湿潤重量を測定した。−４０℃で凍結した後、凍結乾燥を一晩行い乾燥重量を求めた。
【００５４】
粉砕抽出条件
菌体の抽出は、クロロホルム：メタノール＝２：１を湿潤重量の１０倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で２回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
【００５５】
ガスクロサンプル調整
オイルをクロロホルムで溶解し、１０％ＫＯＨ（ａｑ）：エタノール＝１：１を加え、９５℃で２時間加水分解した。２ＮのＨＣｌで中和後、エーテルで抽出しＴＭＳジアゾメタンを加え室温で２時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。ガスクロマトグラフのチャートを図１に示す。
【００５６】
ガスクロマトグラフの条件
・カラム：ＤＢ−１７  ０．２５ｍｍ×３０ｍ
・キャリアーガス：Ｈｅ入口圧  ２５０ｋＰａ
・カラム温度：１００℃→２５０℃（昇温速度：１０℃／分）
・検出：ＦＩＤ
【００５７】
培養の結果を以下に示す。
培養時間：４０時間
乾燥菌体重量：２４．０ｇ／Ｌカルチャー
全油脂量：５．９５ｇ／Ｌカルチャー
油脂含有率：２４．８％（全油脂量／乾燥菌体重量）
ＤＨＡ量：３．５０ｇ／Ｌカルチャー
Ｃ２２脂質：３．６９ｇ／Ｌカルチャー
【００５８】
脂質組成
Ｃ１５：０            １．８％
Ｃ１６：０          １８．８％
Ｃ１７：０            ９．７％
Ｃ２０：５（ＥＰＡ）  ２．２％
Ｃ２２：５（ＤＰＡ）  ３．２％
Ｃ２２：６（ＤＨＡ）５８．８％
【００５９】
実施例３：ベヘン酸への改質
実施例２で生産し抽出した全油脂分であるラビリンチュラオイル抽出物１０ｇを安定化Ｎｉ触媒０．０５ｇを触媒とし、エタノール１００ｍＬ中でオートクレーブを用い１５０℃で２Ｍｐａで５時間反応させた。反応後、室温まで冷却しクロロホルム１００ｍＬを加え生成物を溶解した後、この溶液からＮｉ触媒をセライト濾過により除き、溶媒を減圧下流去した。
【００６０】
この水素添加反応物に１０％水酸化カリウム水溶液２５ｍＬ及びエタノール５０ｍＬを加え、攪拌下３０分間還流させた。室温まで冷却した後、生成した結晶を濾過し、エタノール２０ｍＬで洗浄した。
【００６１】
得られた結晶を水−エタノール（１：１）５０ｍＬに加え、１０％塩酸１０ｍＬを加え室温で１時間攪拌した。生成した結晶を濾過しエタノール２０ｍＬで洗浄した。この加水分解物を蒸留（０．５ｍｍＨｇ、１８５℃）することにより、純度９５％のベヘン酸５ｇを得ることができた。
【００６２】
実施例４
ＬＦＦ１株より抽出した脂質０．２ｇに０．０５Ｍ（ｐＨ７．０）リン酸緩衝液４．０ｍｌ及び１０％アラビアゴム溶液１．０ｍｌを加え、ハイフレックスホモジナイザーで１５０００ｒｐｍ、４分間処理して乳化させる。５００μｌずつ分注した後５０Ｕ／１００μｌのRhizopus oryzae（アマノリパーゼF-AP15）を加え、３７℃で振とうする。所定時間後エーテル１．０ｍｌを添加して反応を停止し、脂質混合物をエーテルで抽出する。これにＴＭＳジアゾメタン（東京化成）を加え室温で２時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフ（島津GC-2010、DB-17キャピラリーカラム）で解析した。ガスクロマトグラフ上で遊離した脂肪酸メチルエステルが検出された。表１に抽出脂質の脂肪酸組成を示す。油脂はＣ１６成分とＣ２２成分で組成の９０％以上を占める。また、反応初期から２時間後まで遊離脂肪酸に占めるＣ１６（パルミチン酸）とドコサヘキサエン酸の比を図２に示す。
【００６３】
【表１】
2005102680.tif 000002
【００６４】
反応初期ではＣ１６の遊離が圧倒的に多く、その結果油脂中に残存するＣ２２成分の比率が高くなる。例えば６０分の反応で加水分解率３２．５％に達するがその場合、脂質（グリセリド）として残存するＣ１６成分は２４％→１０％へ低下し、ＤＨＡ成分は６２％→８４％に増加する。
【００６５】
実施例２で生産し抽出した全油脂分であるラビリンチュラオイル抽出物１０ｇに０．０５Ｍ（ｐＨ７．０）リン酸緩衝液１００ｍｌ及び１０％アラビアゴム溶液２０ｍｌを加え、ハイフレックスホモジナイザーで１５０００ｒｐｍ、４分間処理して乳化させる。２０００単位のRhizopus oryzae（アマノリパーゼF-AP15）を加え、３７℃で６０分間振とうする。エタノール４００ｍｌを加え、冷却後不溶物をろ過しエタノールを濃縮することにより、ＤＨＡ含有量７９％の脂質が５．７ｇ得られた。
【００６６】
実施例５：ＬＦＦ１株を用いた油脂の製造（ｐＨ条件）
ジェーファーメンターを用いて、実施例２と同様の条件でＬＦＦ１株を培養し、油脂を製造した。但し、培養（４０時間、通気下５００ｒｐｍでの攪拌培養）は、ｐＨを４．５、７．５、又は８．０に制御して行った。また、製造した油脂を、実施例２と同様にガスクロマトグラフィにより組成分析した。
【００６７】
培養の結果を図３に示す。生産されたトリグリセリド中のDHA組成は特徴的な傾向を示し、pH7.5で培養すると４０％程度であるが、pH8.5で培養するとDHAが８０％以上と高組成になることが分かった。pH8.5の時のDHA収量は0.8g/L cultureとなった。
【００６８】
実施例６：ＬＦＦ１株を用いた油脂の製造（種菌の量の設定）
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でＬＦＦ１株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
（１）培養条件
３Ｌファーメンタ使用
培養量：１．5Ｌカルチャー
培地組成
１5％  グルコース
３．３％酵母エキス
５０％  人工海水
０．１％  消泡剤
０．２％  酢酸アンモニウム
０．２％  リン酸二水素カリウム
【００６９】
継代培養用は、アガロース培地へストリーク後、２８℃で４日間静置培養し、
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
３％  グルコース
１％  酵母エキス
５０％人工海水
０．２％酢酸アンモニウム
０．２％リン酸二水素カリウム
１．５％アガロース
【００７０】
このコロニーをかきとり、培地２０００ｍｌで２８℃好気性下24時間前培養し、ファーメンタ培地１リットル135ｇの種菌を植菌した。45時間通気下５００ｒｐｍで攪拌培養した。１５００Ｇ３０分で集菌後、湿潤重量を測定した。−４０℃で凍結した後、凍結乾燥を一晩行い乾燥重量を求めた。
【００７１】
粉砕抽出条件
菌体の抽出は、クロロホルム：メタノール＝２：１を湿潤重量の１０倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で２回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥
させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
【００７２】
ガスクロサンプル調整
オイルをクロロホルムで溶解し、１０％ＫＯＨ（ａｑ）：エタノール＝１：１を加え、９５℃で２時間加水分解した。２ＮのＨＣｌで中和後、エーテルで抽出しＴＭＳジアゾメタンを加え室温で２時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。
【００７３】
ガスクロマトグラフの条件
・カラム：ＤＢ−１７  ０．２５ｍｍ×３０ｍ
・キャリアーガス：Ｈｅ入口圧  ２５０ｋＰａ
・カラム温度：１００℃→２５０℃（昇温速度：１０℃／分）
・検出：ＦＩＤ
【００７４】
培養の結果、生産されたトリグリセリド中のDHA組成は32％であり、油脂の生産量は52ｇ/リットルカルチャーであり、DHAの収量は16.6ｇ/リットルカルチャーであることが分かった。
【００７５】
実施例７：ＬＦＦ１株を用いた油脂の製造（２種類の培地を使用）
ジェーファーメンターを用いて以下の条件でＬＦＦ１株を培養し、油脂を製造した。また、製造した油脂をガスクロマトグラフィにより組成分析した。
（１）培養条件
３Ｌファーメンタ使用
培養量：１．5Ｌカルチャー
【００７６】
培地組成１
6％  グルコース
３．３％酵母エキス
５０％  人工海水
０．１％  消泡剤
０．２％  酢酸アンモニウム
０．２％  リン酸二水素カリウム
培地組成２
15％  グルコース
３．３％酵母エキス
５０％  人工海水
０．１％  消泡剤
０．２％  酢酸アンモニウム
０．２％  リン酸二水素カリウム
【００７７】
継代培養用は、アガロース培地へストリーク後、２８℃で４日間静置培養し、
出現したコロニーを冷蔵保存した。
アガロース培地
３％  グルコース
１％  酵母エキス
５０％人工海水
０．２％酢酸アンモニウム
０．２％リン酸二水素カリウム
１．５％アガロース
【００７８】
このコロニーをかきとり培地40０ｍｌで２８℃好気性下24時間前培養し、ファーメンタにて培地組成１を用いて24時間、通気下５００ｒｐｍで攪拌培養した。その後この培地を除去し、引き続きファーメンタにて培地組成２を用いて45時間培養した。１５００Ｇ３０分で集菌後、湿潤重量を測定した。−４０℃で凍結した後、凍結乾燥を一晩行い乾燥重量を求めた。
【００７９】
粉砕抽出条件
菌体の抽出は、クロロホルム：メタノール＝２：１を湿潤重量の１０倍量、ガラスビーズを等倍量加え、高速掻き混ぜ機で水冷下攪拌した。濾過で粉砕菌体を分離し、等量の飽和食塩水で２回抽出洗浄を行なった後、硫酸ナトリウムで乾燥
させた。粗精製オイルは、エバポレーターで溶媒を除去し、重量を測定した。
【００８０】
ガスクロサンプル調整
オイルをクロロホルムで溶解し、１０％ＫＯＨ（ａｑ）：エタノール＝１：１を加え、９５℃で２時間加水分解した。２ＮのＨＣｌで中和後、エーテルで抽出しＴＭＳジアゾメタンを加え室温で２時間エステル化反応を行い、最後に酢酸を加えて反応を終了した。この反応液をガスクロマトグラフで解析した。
【００８１】
ガスクロマトグラフの条件
・カラム：ＤＢ−１７  ０．２５ｍｍ×３０ｍ
・キャリアーガス：Ｈｅ入口圧  ２５０ｋＰａ
・カラム温度：１００℃→２５０℃（昇温速度：１０℃／分）
・検出：ＦＩＤ
【００８２】
培養の結果、生産されたトリグリセリド中のDHA組成は34％であり、油脂の生産量は45ｇ/リットルカルチャーであり、DHAの収量は15.3ｇ/リットルカルチャーであることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属ＬＦＦ１株を用いて製造した油脂の脂質組成をガスクロマトグラフで分析した結果を示す。
【図２】図２は、アマノリパーゼF-AP15によるＬＦＦ１株産生油脂の加水分解の結果を遊離脂肪酸中のパルミチン酸とドコサヘキサエン酸の比として示す。
【図３】図３は、培養ｐＨとトリグリセリド中のＤＨＡ含量の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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