(57)【要約】【課題】選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を得る方法を提供する。【解決手段】目的とする標識糖鎖が、分枝構造を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する糖鎖であり、前記目的の標識糖鎖の前記末端糖残基を有しない前駆体糖鎖を原料に用いて、前記前駆体糖鎖の前記特定の分枝の末端に、前記末端糖残基に相当する糖の同位体標識体を導入することによって、選択的に特定の分枝の末端糖残基が同位体標識された前記目的とする糖鎖を得る、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。【選択図】図１
2005218336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする標識糖鎖が、分枝構造を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する糖鎖であり、
前記目的の標識糖鎖の前記末端糖残基を有しない前駆体糖鎖を原料に用いて、前記前駆体糖鎖の前記特定の分枝の末端に、前記末端糖残基に相当する糖の同位体標識体を導入することによって、選択的に特定の分枝の末端糖残基が同位体標識された前記目的とする糖鎖を得る、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項２】
前記末端糖残基が、前記特定の分枝以外の他の分枝における末端糖残基と同じである、請求項１に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項３】
前記末端糖残基がガラクトース残基である、請求項１又は２に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項４】
前記ガラクトースの同位体標識体のリン酸化反応によって標識ガラクトース−１−リン酸を得て、前記標識ガラクトース−１−リン酸のウリジン酸転移反応によってＵＤＰ−標識ガラクトースを得て、前記ＵＤＰ−標識ガラクトースの糖転移反応によって前記糖鎖試料に標識ガラクトース残基を導入する、請求項３に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項５】
前記リン酸化反応にアデノシン５´−三リン酸及びガラクトキナーゼを用いる、請求項４に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項６】
前記ウリジン酸転移反応にウリジン二リン酸−グルコース及びガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼを用いる、請求項４又は５に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項７】
前記糖転移反応を、前記糖転移反応によって生じるＵＤＰの加リン酸化反応、前記ウリジン酸転移反応によって生じるグルコース−１−リン酸への加リン酸化と前記ＵＤＰの加リン酸化反応によって生じるＵＴＰの脱リン酸化とを行うための加リン酸化分解反応、及び前記加リン酸化分解反応によって生じた二リン酸の脱リン酸化反応とともに行う、請求項４〜６のいずれか１項に記載の糖鎖の選択的糖残基同位体標識法。
【請求項８】
ガラクトシルトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カリウム、ピルビン酸キナーゼ、無機ピロリン酸、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを用いる、請求項７に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析装置又は核磁気共鳴分析装置を用いた糖鎖構造解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖の構造解析が、糖鎖の安定同位体標識技術によって進展している。例えば、Glycobiology, vol. 4, no. 4, pp. 485-489, 1994には、糖タンパク質のin situにおける糖鎖の構造及びダイナミクスの解析のための13Ｃ同位体標識法について記載されている。また、蛋白質 核酸 酵素、vol. 48、No. 8、(2003)には、本発明者らによって安定同位体を利用したＮＭＲによる糖鎖構造解析について記載されている。
【０００３】
また、The Journal of Biological Chemistry, vol. 265, no. 11, pp. 6009-6018, 1990には、ガラクトース転移酵素（ガラクトシルトランスフェラーゼ）が基質となる分枝糖鎖においてManα1-3結合枝とManα1-6結合枝とのガラクトシル化効率に特異性があることについて記載されている。さらに、Journal of Biomolecular NMR, vol. 12, pp. 385-394, 1998には、ガラクトース転移酵素のManα1-3結合枝とManα1-6結合枝とのガラクトシル化効率の特異性を利用して、２分枝糖鎖のManα1-3結合側の枝を優先的に13Cガラクトース標識することについて記載されている。
【０００４】
【非特許文献１】Ａ．Ｍ．ギレスピ−マスケット(A. M. Gilhespy-Muskett)、Ｊ．パトリッジ(J. Partridge)、Ｒ．ジェファリス(R. Jefferis)、及びＳ．Ｗ．ホマンス(S. W. Homans)著、糖タンパク質のin situにおける糖鎖の構造及びダイナミクスの解析のための新規13Ｃ同位体標識法(A novel 13C isotopic labelling strategy for probing the structure and dynamics of glycan chains in situ on glycoproteins)、「グライコバイオロジー(Glycobiology)」、（英国）、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス(Oxford University Press)、１９９４年、第４巻、第４号、ｐ．４８５−４８９
【非特許文献２】山口芳樹及び加藤晃一著、安定同位体利用ＮＭＲによる糖鎖構造解析、「蛋白質  核酸  酵素」、共立出版、２００３年、第４８巻、第８号、ｐ．１１８４−１１８９
【非特許文献３】フジイ・シゲル(Shigeru Fujii)、ニシウラ・テツオ(Tetsuo Nishiura)、ニシカワ・アツシ(Atsushi Nishikawa)、ミウラ・レツ(Retsu Miura)、及びタニグチ・ナオユキ(Naoyuki Taniguchi)著、免疫グロブリンＧにおける糖鎖の構造不均一性  免疫グロブリンＧ分子のコンホメーションと糖転移酵素の基質特異性(Structural heterogeneity of sugar chains in immunoglobulin G. Conformation of immunoglobulin G molecule and substrate specificities of glycosyltransferases)、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」、（米国）、アメリカン・ソサイエティー・フォー・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インコーポレイテッド(The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.)、１９９０年、第２６５巻、第１１号、ｐ．６００９−６０１８
【非特許文献４】山口芳樹(Yoshiki Yamaguchi)、加藤晃一(Koichi Kato)、新藤充(Mitsuru Shindo)、青木伸(Shin Aoki)、古荘久見子(Kumiko Furusho)、古賀憲司(Kenji Koga)、高橋禮子(Noriko Takahashi)、荒田洋治(Yoji Arata)、及び嶋田一夫(Ichio Shimada)著、糖鎖の選択的13Ｃ標識を利用した核磁気共鳴分光法による免疫グロブリンＧのＦｃ結合糖鎖のダイナミクスの研究(Dynamics of the carbohydrate chains attached to the Fc portion of immunoglobulin G as studied by NMR spectroscopy assisted by selective 13C labeling of the glycans)、「ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・エヌエムアール(Journal of Biomolecular NMR)」、（オランダ）、クルワー・アカデミック・パブリッシャー(Kluwer Academic Publishers)、１９９８年、第１２巻ｐ．３８５−３９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特に構造異性体を有する糖鎖の構造解析を行う際、分枝末端を同位体標識することは非常に有用であるが、それには各枝が完全に区別されて同位体標識されている必要がある。上記従来技術では分枝末端の糖残基の同位体標識を完全に枝を区別して行うことは不可能であった。そこで本発明の目的は、選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、同位体標識糖を導入したい分枝の末端糖が存在しない構造を有する糖鎖を原料に用いることによって上記本目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の発明を含む。
【０００７】
（１）目的とする標識糖鎖が、分枝構造を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する糖鎖であり、
前記目的の標識糖鎖の前記末端糖残基を有しない前駆体糖鎖を原料に用いて、前記前駆体糖鎖の前記特定の分枝の末端に、前記末端糖残基に相当する糖の同位体標識体を導入することによって、選択的に特定の分枝の末端糖残基が同位体標識された前記目的とする糖鎖を得る、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
（２）前記末端糖残基が、前記特定の分枝以外の他の分枝における末端糖残基と同じである、（１）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【０００８】
（３）前記末端糖残基がガラクトース残基である、（１）又は（２）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【０００９】
（４）前記ガラクトースの同位体標識体のリン酸化反応によって標識ガラクトース−１−リン酸を得て、前記標識ガラクトース−１−リン酸のウリジン酸転移反応によってＵＤＰ−標識ガラクトースを得て、前記ＵＤＰ−標識ガラクトースの糖転移反応によって前記前駆体糖鎖に標識ガラクトース残基を導入する、（３）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
（５）前記リン酸化反応にアデノシン５´−三リン酸及びガラクトキナーゼを用いる、（４）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
（６）前記ウリジン酸転移反応にウリジン二リン酸−グルコース及びガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼを用いる、（４）又は（５）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【００１０】
（７）前記糖転移反応を、前記糖転移反応によって生じるＵＤＰの加リン酸化反応、前記ウリジン酸転移反応によって生じるグルコース−１−リン酸への加リン酸化と前記ＵＤＰの加リン酸化反応によって生じるＵＴＰの脱リン酸化とを行うための加リン酸化分解反応、及び前記加リン酸化分解反応によって生じた二リン酸の脱リン酸化反応とともに行う、（４）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖の選択的糖残基同位体標識法。
（８）ガラクトシルトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カリウム、ピルビン酸キナーゼ、無機ピロリン酸、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを用いる、（７）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を得る方法を提供することができる。また、本発明によって得られた、末端に同位体標識された糖残基を有する糖鎖に、さらに糖を付加していくことによって、前記同位体標識された糖残基が糖鎖の内部に位置する糖鎖を得ることも可能である。このことにより、核磁気共鳴分析や質量分析において、糖鎖の構造に関するより有用な情報を得ることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を合成する方法である。すなわち本発明において目的とする糖鎖の構造は、分枝を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する。このような糖鎖を合成するための原料として、合成したい目的の糖鎖の特定の分枝における標識糖残基の位置に糖残基が存在しない構造を持つ前駆体糖鎖を用いる。なお、本明細書では、目的の標識糖鎖においては標識糖残基を有する分枝、原料の前駆体糖鎖においては標識糖残基が導入されるべき分枝を、特定の分枝と表記する。
【００１３】
上記の前駆体糖鎖に対し、同位体標識された糖を特定の分枝末端に導入する。このとき、同位体としては安定同位体や放射性同位体が用いられ、好ましくは13Cや2Hなどの安定同位体が用いられる。
【００１４】
また、導入すべき糖残基と、特定の分枝以外の他の分枝のうち少なくとも１本の分枝が末端に有する糖残基とが同じであっても良い。すなわち、標識された糖残基を導入することによって、標識か又は非標識かである以外は同じである糖残基を分枝末端に有するような目的の糖鎖が得られるように、原料となる前駆体糖鎖を設計することができる。
【００１５】
例えば、本発明において前駆体糖鎖として二分枝構造の糖鎖を用いる場合、上記前駆体糖鎖は、特定の一の分枝とそれ以外の他の分枝とを有し、他の分枝が末端に有する糖残基が、特定の一の分枝の末端において存在しない。さらに、特定の分枝末端に標識された糖残基を導入することによって、標識か非標識かである以外は互いに同じ糖配列の分枝を有するように、原料となる前駆体糖鎖を選択することが好ましい。
【００１６】
下記式（I）及び（II）で表されるＰＡ化糖鎖は、本発明によって合成することができる標識糖鎖の例である。以下、糖鎖の構造式において、PAはピリジルアミノ基、Galはガラクトース残基、Manはマンノース残基、GlcNAcはＮ−アセチルグルコサミン残基、及びFucはフコース残基を表す。また、下記式（I）及び（II）において、下線を付したGalは、［ｕ−13Ｃ6］ガラクトース残基を示す。
【００１７】
【化１】
2005218336.tif 000003
【００１８】
下記式（III）及び（IV）で表されるＰＡ化糖鎖は、本発明において原料として用いることができる前駆体糖鎖の例である。上記標識糖鎖（I）を得るためには前駆体糖鎖（III）、上記標識糖鎖（II）を得るためには前駆体糖鎖（IV）を用いる。
【００１９】
【化２】
2005218336.tif 000004
【００２０】
本発明においては、上述のような前駆体糖鎖を用い、in vitroにおいて反応を行うことが好ましい。本発明においては、存在しうるあらゆる糖転移酵素が関与する反応系を選択することができる。そして、使用する糖転移酵素の受容体糖鎖を適切に設計することによって、原料となる前駆体糖鎖の構造を適宜決定することができる。上述のような前駆体糖鎖を原料に用いることにより、選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を得ることができる。すなわち、従来の方法では不可能であった、分枝末端の糖残基の同位体標識を完全に枝を区別して行うことが可能となる。
【００２１】
本発明においては、一般的に、ガラクトース転移酵素が関与する系で反応を行うと良い。これにより、前駆体糖鎖に標識ガラクトース残基が導入される。図１に、ガラクトース転移酵素が導入された系における標識ガラクトースを用いた同位体標識糖鎖の調製について示す。図１中、ATPはアデノシン５´−三リン酸(adenosine 5’-triphosphate)、ADPはアデノシン５´−二リン酸(adenosine 5’-diphosphate)、UTPはウリジン５´−三リン酸(uridine 5’-triphosphate) 、UDPはウリジン５´−二リン酸(uridine 5’-diphosphate) 、PAはピリジルアミノ(pyridylamino)基、PEPはホスホエノールピルビン酸(phosphoenol pyruvate) 、PYRはピルビン酸(pyruvic acid)、PPiはピロリン酸（二リン酸）(pyrophosphate)、Piはリン酸 、PPaseはピロホスファターゼ(pyrophosphatase) 、PKはピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase)、Glcはグルコース(glucose) である。以下、ガラクトース転移酵素(galactosyltransferase)が導入された系で反応を行う場合を例に挙げ、本発明を説明する。
【００２２】
図１の反応系においては、上記のＰＡ化糖鎖（III）や（IV）を原料の前駆体糖鎖として用いると好適である。まず、ガラクトースの均一13Ｃ同位体標識体すなわち［ｕ−13Ｃ6］ガラクトース( [u-13C6] galactose)（以下、標識ガラクトースと表記する。）をリン酸化反応に供することによって標識ガラクトース−１−リン酸（［ｕ−13Ｃ6］ガラクトース−１−リン酸([u-13C6] galactose-1-phosphate)）を得る。得られた標識ガラクトース−１−リン酸をウリジン酸転移反応に供することによってＵＤＰ−標識ガラクトース（ＵＤＰ−［ｕ−13Ｃ6］ガラクトース(UDP-[u-13C6] galactose)）を得る。さらに、得られたＵＤＰ−標識ガラクトースを糖転移反応に供することによって、前駆体糖鎖のＰＡ化糖鎖(糖鎖−PA)に標識ガラクトース残基が導入された目的の糖鎖([u-13C6] galactose−糖鎖−PA)を得る。
【００２３】
上述の反応系によって、例えばＰＡ化前駆体糖鎖（III）は標識ＰＡ化糖鎖（I）へ、ＰＡ化前駆体糖鎖（IV）は標識ＰＡ化糖鎖（II）へ、それぞれ変換される。
【００２４】
原料の前駆体糖鎖には、塩化カリウム及び塩化マグネシウムを含む、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸(HEPES)緩衝液を溶媒として用いることができる。これら溶質の量は、当業者が適宜決定することができる。この溶媒のｐＨは７．３〜７．５に調整されていることが好ましく、例えば、ｐＨ７．４程度に調整して用いられる。前駆体糖鎖はこのような溶媒に溶解して適切な濃度で使用される。
【００２５】
標識ガラクトースのリン酸化反応においては、ATP及びガラクトキナーゼ(galactokinase)を用いると良い。これら試薬の量は、当業者が適宜決定することができる。この反応は、例えば３６〜３８℃、０．５〜１時間の条件で行うことができる。
【００２６】
標識ガラクトース−１−リン酸のウリジン酸転移反応においては、ＵＤＰ−グルコース・Ｎａ２及びガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ(galactose-1-phosphate uridyl transferase)を用いると良い。これら試薬の量は当業者が適宜決定することができる。この反応は、例えば３６〜３８℃、４〜６時間の条件で行うことができる。
【００２７】
ＵＤＰ−標識ガラクトースの糖転移反応においては、この糖転移反応によって生じるＵＤＰの加リン酸化反応、前記ウリジン酸転移反応によって生じるグルコース−１−リン酸(glucose-1-P)への加リン酸化と前記ＵＤＰの加リン酸化反応によって生じるＵＴＰの脱リン酸化とを行うための加リン酸化、及び前記加リン酸化分解反応によって生じた二リン酸の脱リン酸化反応とともに行うと良い。例えば、糖転移反応においてはMnCl2及びガラクトシルトランスフェラーゼ(galactosyltransferase)を、ＵＤＰの加リン酸化反応においてはホスホエノールピルビン酸カリウム(potassium phosphoenol pyruvate)及びpyruvate kinaseを、加リン酸化分解反応においてはＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ(UDP-Glc pyrophosphorylase)を、二リン酸の脱リン酸化反応においては無機ピロホスファターゼ(inorganic pyrophosphatase)をそれぞれ用いることができるが、これらの試薬を同時に加えて用いると良い。これら試薬の量は、当業者が適宜決定することができる。この反応は、例えば３６〜３８℃、３〜４日の条件で行うことができる。
【００２８】
上述のようにして、特定の分枝の末端が同位体標識された糖鎖を得ることができる。また、このように末端に同位体標識された糖残基を有する糖鎖を得た後、さらに分枝の末端に糖を付加していくことで、前記同位体標識された糖残基が枝の内部に位置する糖鎖を得ることも可能である。この場合、さらなる糖の付加は、公知の方法によって行うことができる。このようにして得られる標識糖鎖においては、各枝が標識又は非標識の残基を有することによって区別されているため、標識又は非標識の違いから標識糖鎖の構造に関する情報を得ることができる。例えば、核磁気共鳴分析（MNR）や質量分析（特にMALDI）などにおいて有用に用いることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、PA化糖鎖（III）及び（IV）から、それぞれPA化糖鎖（I）及び（II）を得る形態を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３０】
［実施例１］
PA化糖鎖（III）を、２０mM KCl及び５mM MgCl2を含む１００mM HEPES緩衝液（pH７．４）に溶解して２pmol/μlとした溶液５０μlをチューブに入れ、１５mM ATP、２２mM [u-13C6]Gal、及び２mU/μlのガラクトキナーゼを加え、３７℃で３０分反応を行った。その後、１３mM UDP-Glc・Na2、０．３mU/μlガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼを加え、３７℃、４時間反応を行った。その後、５mM MnCl2、１mU/μlガラクトシルトランスフェラーゼ、３０mMホスホエノールピルビン酸カリウム、２０mU/μlピルビン酸キナーゼ、３mU/μl無機ピロホスファターゼ、及び１．５mU/μl UDP-Glcホスホリラーゼを加え、さらに、３７℃で３日間反応を行った。
【００３１】
上述のようにして反応させたチューブ内の反応液を９９℃にて１０分間加熱し、反応に使用した酵素を沈殿させた。沈殿物を１２，０００rpmで５分間遠心して取り除き、上澄みを遠心エバポレータにより乾固した。Shim-pack HRC-ODSカラム（島津製作所製）を用い、流速１ml/minにおけるPA−グルコースオリゴマー（グルコースの重合度が４−２０）の溶出プロファイルに基づいて、糖鎖の重合度と溶出時間との関係を求めた。目的のPA化糖鎖（I）は、１０mMリン酸ナトリウム緩衝液中で、ｎ−ブタノール濃度を６０分で０．１％から０．２５％まで直線グラジエントをかけ１４．１グルコースオリゴマーに相当するピークとして溶出させた。
【００３２】
このとき得られたPA化糖鎖（I）の模式的な構造とマススペクトルとを図２に示す。図２においては、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。PA化糖鎖（I）の理論質量（Na+付加体(Na+adducted)）はm/z=1893であり、図２のマススペクトルが示す測定結果と一致した。
【００３３】
［実施例２］
PA化糖鎖（III）のかわりにPA化糖鎖（IV）を用いた以外は実施例１と全く同じ方法を行うことにより、PA化糖鎖（II）を得た。
【００３４】
このとき得られたPA化糖（II）の模式的な構造とマススペクトルとを図３に示す。図３においては、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度(%Int.)を表す。PA化糖鎖（II）の理論質量（Na+付加体(Na+ adducted)）はm/z=1893であり、図３のマススペクトルが示す測定結果と一致した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ガラクトース転移酵素が導入された系における、標識ガラクトースを用いた同位体標識糖鎖の調製について示した図である。
【図２】本実施例で得られた標識ＰＡ化糖鎖の模式的な構造及びマススペクトルである。
【図３】本実施例で得られた標識ＰＡ化糖鎖の模式的な構造及びマススペクトルである。
【図１】
2005218336.tif 000005
【図２】
2005218336.tif 000006
【図３】
2005218336.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月16日(2005.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする標識糖鎖が、分枝構造を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する遊離の糖鎖であり、
前記目的の標識糖鎖の前記末端糖残基を有しない遊離の前駆体糖鎖を原料に用いて、前記遊離の前駆体糖鎖の前記特定の分枝の末端に、前記末端糖残基に相当する糖の同位体標識体を導入することによって、選択的に特定の分枝の末端糖残基が同位体標識された前記目的とする遊離の糖鎖を得る、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項２】
前記末端糖残基が、前記特定の分枝以外の他の分枝における末端糖残基と同じである、請求項１に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項３】
前記末端糖残基がガラクトース残基である、請求項１又は２に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項４】
前記ガラクトースの同位体標識体のリン酸化反応によって標識ガラクトース−１−リン酸を得て、前記標識ガラクトース−１−リン酸のウリジン酸転移反応によってＵＤＰ−標識ガラクトースを得て、前記ＵＤＰ−標識ガラクトースの糖転移反応によって前記前駆体糖鎖に標識ガラクトース残基を導入する、請求項３に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項５】
前記リン酸化反応にアデノシン５´−三リン酸及びガラクトキナーゼを用いる、請求項４に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項６】
前記ウリジン酸転移反応にウリジン二リン酸−グルコース及びガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼを用いる、請求項４又は５に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【請求項７】
前記糖転移反応を、前記糖転移反応によって生じるＵＤＰの加リン酸化反応、前記ウリジン酸転移反応によって生じるグルコース−１−リン酸への加リン酸化と前記ＵＤＰの加リン酸化反応によって生じるＵＴＰの脱リン酸化とを行うための加リン酸化分解反応、及び前記加リン酸化分解反応によって生じた二リン酸の脱リン酸化反応とともに行う、請求項４〜６のいずれか１項に記載の糖鎖の選択的糖残基同位体標識法。
【請求項８】
ガラクトシルトランスフェラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カリウム、ピルビン酸キナーゼ、無機ピロリン酸、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼを用いる、請求項７に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、質量分析装置又は核磁気共鳴分析装置を用いた糖鎖構造解析において有用な、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
特に構造異性体を有する糖鎖の構造解析を行う際、分枝末端を同位体標識することは非常に有用であるが、それには各枝が完全に区別されて同位体標識されている必要がある。上記従来技術では分枝末端の糖残基の同位体標識を完全に枝を区別して行うことは不可能であった。そこで本発明の目的は、選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された遊離の糖鎖を得る方法を提供することにある。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明者らは、同位体標識糖を導入したい分枝の末端糖が存在しない構造を有する遊離の糖鎖を原料に用いることによって上記本目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の発明を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
（１）目的とする標識糖鎖が、分枝構造を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する遊離の糖鎖であり、
前記目的の標識糖鎖の前記末端糖残基を有しない遊離の前駆体糖鎖を原料に用いて、前記遊離の前駆体糖鎖の前記特定の分枝の末端に、前記末端糖残基に相当する糖の同位体標識体を導入することによって、選択的に特定の分枝の末端糖残基が同位体標識された前記目的とする遊離の糖鎖を得る、糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
（２）前記末端糖残基が、前記特定の分枝以外の他の分枝における末端糖残基と同じである、（１）に記載の糖鎖の選択的末端糖残基同位体標識法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明によると、選択的に特定の分枝の末端が同位体標識された遊離の糖鎖を得る方法を提供することができる。また、本発明によって得られた、末端に同位体標識された糖残基を有する糖鎖に、さらに糖を付加していくことによって、前記同位体標識された糖残基が糖鎖の内部に位置する糖鎖を得ることも可能である。このことにより、核磁気共鳴分析や質量分析において、糖鎖の構造に関するより有用な情報を得ることが可能になる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明は、特定の分枝の末端が同位体標識された遊離の糖鎖を合成する方法である。すなわち本発明において目的とする遊離の糖鎖の構造は、分枝を有し且つ特定の分枝の末端において同位体標識された糖残基を有する。このような遊離の糖鎖を合成するための原料として、合成したい目的の糖鎖の特定の分枝における標識糖残基の位置に糖残基が存在しない構造を持つ遊離の前駆体糖鎖を用いる。なお、本明細書では、目的の標識糖鎖においては標識糖残基を有する分枝、原料の前駆体糖鎖においては標識糖残基が導入されるべき分枝を、特定の分枝と表記する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
上述のようにして、特定の分枝の末端が同位体標識された遊離の糖鎖を得ることができる。また、このように末端に同位体標識された糖残基を有する遊離の糖鎖を得た後、さらに分枝の末端に糖を付加していくことで、前記同位体標識された糖残基が枝の内部に位置する糖鎖を得ることも可能である。この場合、さらなる糖の付加は、公知の方法によって行うことができる。このようにして得られる標識糖鎖においては、各枝が標識又は非標識の残基を有することによって区別されているため、標識又は非標識の違いから標識糖鎖の構造に関する情報を得ることができる。例えば、核磁気共鳴分析（NMR）や質量分析（特にMALDI）などにおいて有用に用いることができる。