(57)【要約】【課題】  構造容易にして且つ電気泳動などの長時間を要す工程を必要とせずに目的のＤＮＡ等の増幅を目視判定することのできる廉価な装置を提供し、判定までの時間を著しく短縮するとともに経済的負担を軽減して装置の普及を図り、以ってこの種の検査を遍く迅速に行えるようにしようとするものである。【解決手段】  本発明は恒温槽の器体内の一側に、ＤＮＡ等試料液および増幅したＤＮＡ等検出用蛍光物質を注化した試料容器の挿し立て部を設け、該挿し立て部の一面に設ける光の出入孔を挟んで励起光源を配して該蛍光物質に励起光を照射して該試料容器から蛍光を発せしめ、該蛍光を前記器体の上面に設ける目視用の窓部に反射等により到達させ,且つ蛍光の反射等の際に光学フィルター等にて目視に有害な紫外線などを除去し、蛍光の有無または濃淡からＤＮＡ等の増幅を目視により判定を可能にしたＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽にある。【選択図】図１
2005201859.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
恒温槽の器体内の一側に、判定対象のＤＮＡ等試料液および増幅したＤＮＡ等検出用蛍光物質を注化したマイクロチューブ等の試料容器の挿し立て部を設け、該挿し立て部の一面に設ける光の出入孔を挟んで上方または下方に励起光源を配して該蛍光物質に適合する波長の励起光を照射し、主として励起光が直接当たる面における蛍光を該試料容器から発せしめ、該蛍光を前記器体の上面に設ける目視用の窓部に屈折または反射により到達させるようにし,且つ蛍光の屈折または反射の際に光学フィルター等にて目視に有害な紫外線などを除去して、蛍光の有無または濃淡からＤＮＡ等の増幅を目視により判定を可能にしたことを特徴とするＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽。
【請求項２】
励起光の照射により試料容器から発する蛍光を器体の上面の目視用の窓部に屈折または反射到達させるためのプリズムあるいは反射ミラーに紫外線など蛍光以外の波長をカットする光学フィルターを設ける請求項１記載のＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽。
【請求項３】
器体の上部の目視用の窓部とプリズムまたは反射ミラー間を暗室にして蛍光の明暗を強調させる請求項１または２に記載のＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽。
【請求項４】
光の出入孔とプリズムまたは反射ミラー間に光ファイバー，誘導孔等にて蛍光の散乱を防止する部材または構造を設ける請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＤＮＡやＲＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を持つ恒温槽に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスや細菌等のＤＮＡやＲＮＡ等の存在の有無を確認する検査や試験は、判定対象となる微量なＤＮＡ等を増幅する工程とその検出とにより行われている。
【０００３】
従来は、増幅する工程を経たＤＮＡやＲＮＡ等の試料を電気泳動等の装置にかけて分離し、分離したＤＮＡ等の試料は紫外線の吸収や蛍光試薬の注加により生ずる蛍光を精密な光センサーやカメラによって画像データ等としてコンピュータで解析するという手法や核酸の反応系に光学的に連係させた精密な光センサーによって核酸増幅の様子をモニタリングする等の手法が採られている。例えば、核酸増幅反応混合物からの光シグナルを光学的に連係された検出器により測定し、各光学シグナルの核酸増幅過程における変化を測定する装置を開示している（例えば、特許文献３参照）。
【０００４】
しかしながら、増幅の工程後に電気泳動や精密な光センサ等による検出及び解析等の行程を別途要することは試験の迅速性を損なうとともに、画像データの取込み装置，解析用のコンピュータ，精密な光センサ等を備えた装置は一定の設置空間が必要のうえ設備費用も高額なものとなって、試験に必要な数を適所に揃えることは経済的・空間的な負担がかかるという問題がある。これらのことは、例えばベッドサイドや屋外等の現場での迅速かつ簡便な検査や試験を困難にしている要因ともなっている。
【特許文献１】特開２００２−３５５０９２号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５０９７号公報
【特許文献３】特許第３１３６１２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、判定対象のＤＮＡ等の増幅が十分或いは顕著である場合は請求項１に記載の工夫により溶液状態の増幅試料の蛍光を目視判定することを実現せしめることに着目して、簡易な構造にて増幅工程後に試料を別の装置類に移すことなく目的試料の有無を即座に目視判定することのできる機能付きの廉価な恒温槽を提供して、この種の検査や試験のかかえる時間的・経済的・空間的な課題を解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は恒温槽の器体内の一側に、判定対象のＤＮＡ等試料液および増幅したＤＮＡ等検出用蛍光物質を注化したマイクロチューブ等の試料容器の挿し立て部を設け、該挿し立て部の一面に設ける光の出入孔を挟んで上方または下方に励起光源を配して該蛍光物質に適合する波長の励起光を照射し、主として励起光が直接当たる面における蛍光を該試料容器から発せしめ、該蛍光を前記器体の上面に設ける目視用の窓部に屈折または反射により到達させるようにし,且つ蛍光の屈折または反射の際に光学フィルター等にて目視に有害な紫外線などを除去して、蛍光の有無または濃淡からＤＮＡ等の増幅を目視により判定を可能にして、かかる課題を解決するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は判定対象のＤＮＡ等試料の増幅を目視により確認するようにした簡易な恒温槽により迅速に目的試料の存在の有無を判別することができるという効果を生ずる。増幅行程後に別途の時間及び費用がかかる分離・解析手段を要しないので試験開始から確認までの時間を著しく短縮することができるほか、例えばベッドサイドや屋外等の現場での迅速かつ簡易な検査や試験を可能とする効果を生ずる。
【０００８】
励起光が当たる試料容器面から発する蛍光を直接該プリズムまたは該反射ミラーにより安全裡に目視観察することができるため、反応容器を挟んで励起光源との対面側から蛍光を観察する場合とは異なり、透過してくる励起光の影響や蛍光の減衰といった作用を受けることなく蛍光物質の発する蛍光のみを目視して正確に確認することができるという効果を生ずる。
【０００９】
試料容器等からの反射により微量ながらも励起光が蛍光に含まれる可能性を想定し、例えば励起光源に紫外線を用いた場合に人体には有害である紫外線は紫外線除去能のある素材から成るプリズム、または反射ミラーと組み合わせての紫外線等の蛍光以外の波長をカットする光学フィルターによりカットできるので、目視判定の際の有害紫外線による人体への影響を断絶することができるという効果を生ずる。
【００１０】
目視判定装置部の窓部と該プリズムまたは該反射ミラー間を暗室として蛍光の明暗を強調するようにしたので、通常の室内光下の環境においても目視による蛍光の確認を確実にすることができるという効果を生ずる。
【００１１】
ＤＮＡ等試料を充填したマイクロチューブ等試料容器と該プリズムまたは反射ミラー間に光ファイバーや誘導孔等による蛍光散乱防止のための部材もしくは構造を設けて反応容器内で発する蛍光を集約して該プリズムまたは該反射ミラーにより目視のための窓部へ屈折または反射誘導するようにしたので、散乱による光量の減衰を防いで目視による判定を正確に行うことができるという効果を生ずる。
【００１２】
増幅及び目視による判定が同一の恒温槽で行うことができ、また増幅の進行と平行しての目視判定も行うことができるので、試験開始よりＤＮＡ等試料の増幅の判定までに要する時間がさらに短縮でき、最短時間でＤＮＡ等の存否の確認をすることができるという効果を生ずる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は恒温槽の器体内の一側に、判定対象のＤＮＡ等試料液および増幅したＤＮＡ等検出用蛍光物質を注化したマイクロチューブ等の試料容器の挿し立て部を設け、該挿し立て部の一面に設ける光の出入孔を挟んで上方または下方に励起光源を配して該蛍光物質に適合する波長の励起光を照射し、主として励起光が直接当たる面における蛍光を該試料容器から発せしめ、該蛍光を前記器体の上面に設ける目視用の窓部に屈折または反射により到達させるようにし、且つ蛍光の屈折または反射の際に光学フィルター等にて目視に有害な紫外線などを除去して、蛍光の有無または濃淡からＤＮＡ等の増幅を目視により判定を可能にしたことを特徴とするＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す恒温槽にある。
【実施例１】
【００１４】
図１は本発明恒温槽の実施例におけるＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定装置部の基本構成を示す側面図で、蛍光目視判定装置部１の一側にマイクロチューブ２の挿し立て部３を設け、挿し立て部３の内側一面３ａの中間に挿し立て部３の外側から照射する光がマイクロチューブ２内に注填したＤＮＡ等の試料液Ｓに到達するようにして光の出入孔４を設ける。マイクロチューブ２に対して光の出入孔４を挟んだ上方位置に励起光である紫外線を照射する紫外線ランプ５を設けるとともに、水平方向の紫外線ランプ５を避けた位置に紫外線除去能のある素材から成るプリズム６を前面に備える。紫外線除去能のある素材から成るプリズム６の直上に周囲の光を遮断するように囲繞され装置部１の上面まで至る暗室７を設け、暗室７の上面に紫外線除去能のある素材から成るプリズム６により屈折された光を装置部１の上面から目視するための窓部８を設けるのである。
【００１５】
マイクロチューブ２内に判定対象のＤＮＡ等試料液Ｓと紫外線で励起される蛍光物質を適切な濃度で注加する。周知の通り蛍光物質の分子はＤＮＡ等試料が増幅した場合に蛍光強度が著しく増大することとなって、ＤＮＡ等が一定値以上に増幅されている場合、蛍光が観察できる強度になるが、この蛍光は本発明により肉眼で安全かつ容易、正確に確認することができることとなる。なおＤＮＡ等試料の増幅前は蛍光は観察されない。
【００１６】
よって挿し立て部３に挿し立てたマイクロチューブ２に向けて光の出入孔４から紫外線ランプ５を照射すると、判定を目的とするＤＮＡ等が存在し増幅したときは、増幅したＤＮＡ等を検出する蛍光物質は強く蛍光Ｋ１を発することとなるので、紫外線除去能のある素材から成る光学フィルターを兼ねたプリズム６により屈折された蛍光Ｋを目視判定装置部１の上面の窓部８から目視で判定することができることとなるのである。なおマイクロチューブ２等からの反射により蛍光物質の発する蛍光Ｋ１に含まれる可能性がある人体に有害な紫外線は紫外線除去能のある素材から成るプリズム６によって屈折する際にカットされ、無害の蛍光Ｋとなるので、蛍光Ｋを肉眼で見ても有害紫外線による人体への影響は全く生じないこととなる。また紫外線除去能のある素材から成るプリズム６により屈折された光は周囲の光を遮断する暗室７を経て装置部１の上面の窓部８まで達するようにしているので、周囲の明るさの影響を受けることなく蛍光を確認することができることとなる。なお窓部８は塵埃の侵入防止および蛍光Ｋをより確認しやすくするための適宜の色付きガラスやフィルム板などで覆うこともあり、焦点調整用のレンズを設けて蛍光の集中を図ることもある。
【実施例２】
【００１７】
図２（ａ）（ｂ）は他の実施例で、光の出入孔４と紫外線除去能のある素材から成るプリズム６間に光ファイバー９や光の誘導孔１０にてなる蛍光散乱防止部材１２を設けたもので、蛍光の散乱を防ぐことによって蛍光をより正確に窓部８まで導くことができることとなる。なお、紫外線除去機能のあるプリズムにかえて、光学フィルターと反射ミラー（図示してない）の組み合わせに置きかえることもある。
【実施例３】
【００１８】
図３乃至図５は本発明のＤＮＡ等試料の増幅の蛍光目視判定機能を有す卓上型恒温槽の全体例を示すもので、図３はその平面図、図４は正面図、図５は側面図であり、それぞれ要部を一部截断して示すものである。
【００１９】
恒温槽１２は器体１２ａの上面の一半に操作部１２ｂと表示部１２ｃを有し、他半に目視判定装置部１の窓部８とマイクロチューブ２を器体内部に設けた挿し立て部３に出し入れするための開閉蓋１３を備えている。１３ａは開閉蓋１３の爪掛部、１４はスイッチ、１５は電源コードである。
【００２０】
挿し立て部３は熱伝導のよいアルミニウムにて形成してなり、例では挿し立て部３を８本のマイクロチューブ２を挿し立てできるようにして形成している。挿し立て部３の底面下に温度調節機構の一部として加熱用のラバーヒータ１６を取付け、挿し立て部３内に温度センサ１７を埋込み取付けし、これらと接続する制御部（図示してない）により挿し立てたマイクロチューブ２内の判定対象のＤＮＡ等試料液Ｓを一定温度に温度管理して増幅するのである。挿し立て部３の内側一面の各マイクロチューブ２に対応する部分に光の出入孔４を設け、出入孔４を挟んで上方に紫外線ランプ５、水平方向に紫外線除去能のある素材から成るプリズム６、紫外線除去能のある素材から成るプリズム６の上方に暗室７と暗室７を経て増幅装置１２の器体１２ａの上面に目視用の窓部８を設けるようにした点は前例と同じである。窓部８は８本のマイクロチューブ２からの蛍光発光が到達する位置の脇に各チューブに対応する番号を付したフィルム板１８にて被覆している。
【００２１】
本願出願人の栄研化学株式会社が提唱する遺伝子増幅手法であるＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplificationの略）法のプロトコルに従って緩衝液及びプライマーや合成酵素の他、紫外線で励起される蛍光物質を適量注加した判定対象のＤＮＡ等試料液Ｓをマイクロチューブ２に注填して開閉蓋１３を開けてそれぞれ挿し立て部３に挿し立てて６０〜６５℃の一定温度で保温すると,判定対象となるＤＮＡもしくはＲＮＡが試料液中に含まれていれば二本鎖ＤＮＡ分子として１５分〜１時間でおよそ１億〜１０億倍に増幅することとなるので、増幅したＤＮＡ等を検出する蛍光物質が紫外線ランプ５から照射される紫外線に反応して蛍光を発することになる。その蛍光Ｋ１は紫外線除去能のある素材から成るプリズム６による屈折を経て器体１２ａ上面の窓部８に達し、それを外側から目視して蛍光Ｋの有無または濃淡より増幅工程の結果、すなわち判定対象のＤＮＡ等の有無を判定することができることとなる。窓部８を被覆したフィルム板１８に付した対応番号より各マイクロチューブ２の結果を特定し、増幅により存在の確認されたＤＮＡ等の入ったマイクロチューブ２を必要により次の検査へと回すのである。
【実施例４】
【００２２】
実施例３のＬＡＭＰ法のプロトコルに基づき、以下に示す反応組成条件のもとで増幅反応を行った。
【表１】
2005201859.tif 000003
【００２３】
ＬＡＭＰ法において使用されるプライマーは、標的核酸の塩基配列の計６領域から設計・作製されインナープライマー（ＦＩＰプライマーとＲＩＰプライマー）とアウタープライマー（Ｆ３プライマーとＲ３プライマー）と呼ばれる、少なくと４種類のオリゴヌクレオチドプライマーであり、本実施例で使用されたプライマーは、クローニングしたＰＳＡ（前立腺特異抗原）ｃＤＮＡフラグメントから設計された、以下の塩基配列を有するプライマーである。
・ＦＩＰプライマー：
5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'（配列番号１）
・ＲＩＰプライマー：
5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'（配列番号２）
・Ｆ３プライマー：
5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3'（配列番号３）
・Ｒ３プライマー：
5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3'（配列番号４）
【００２４】
前記ＬＡＭＰ用反応液に、ＭｎＣｌ２およびカルセインをそれぞれ０.５ｍＭ、２５μＭとなるように添加し、さらにＬＡＭＰ反応の鋳型としてＰＳＡ・ＤＮＡを６×１０−２０Ｍ添加したもの（以下「ポジティブ」）をマイクロチューブに入れ、該マイクロチューブを挿し立て部３に挿し立てて、一定の温度管理（６５℃）のもと６０分間の増幅反応を行った。なお、比較対照として、鋳型を添加しないもの（以下「ネガティブ」）も同様に行った。
【００２５】
その結果を図６に示す。図６は、器体１２aの上面に設けられた目視用窓部８から観察した図であり、図中の白地番号はフィルム板１８に付した対応番号で、１、８はマイクロチューブが非存在、２、４、６：ネガティブ、３、５、７はポジティブを表す。ネガティブは、鋳型ＤＮＡを添加してないため増幅せず、蛍光が観察されないのに対し、ポジティブでは、増幅反応に伴う蛍光が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は以上のようにして、緊急を要する検査等において迅速な結果を提供することを得、また簡易な構成により解析用コンピュータなどを備えた従来の検査装置に較べて著しく廉価にて提供することができるので、経済的負担を軽減して広範な普及を実現することができるものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（実施例１）目視判定装置部の基本構成を示す側面図
【図２】（実施例２）（ａ）（ｂ）は蛍光の散乱防止する構成を備えた装置部の側面図
【図３】（実施例３）恒温槽の全体例を示す一部断截した平面図
【図４】同、正面図
【図５】同、側面図
【図６】（実施例４）増幅装置１２を用いて蛍光の有無を観察した窓部の拡大図
【符号の説明】
【００２８】
１は器体
２はマイクロチューブ
３は挿し立て部
４は光の出入孔
５は紫外線ランプ
６は紫外線除去能のある素材から成るプリズム
７は暗室
８は窓部
９は光ファイバー
１０は光の誘導孔
１１は蛍光散乱防止部材
１２は増幅装置
１２ａは器体
１２ｂは操作部
１２ｃは表示部
１３は開閉蓋
１３ａは爪掛部
１４はスイッチ
１５は電源コード
１６はラバーヒータ
１７は温度センサ
１８はフィルム板
Ｓは判定対象のＤＮＡ等試料液
Ｋ１は有害紫外線を含んだ蛍光
Ｋは無害の蛍光
【図１】
2005201859.tif 000004
【図２】
2005201859.tif 000005
【図３】
2005201859.tif 000006
【図４】
2005201859.tif 000007
【図５】
2005201859.tif 000008
【図６】
2005201859.tif 000009
【配列表】
2005201859000001.app