(57)【要約】【課題】２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で連続して、かつ、毎分ナノリットル領域の一定流量で、分析装置に送液可能なグラジエント送液装置を実現する。【解決手段】送液圧力が時間と共に変化する溶出液混合用配管を、送液圧力を一定に保持すべきイソクラティックポンプ１１から送液され、分析部１７に連結される第１のループに接続するか、廃液すべき第２のループに接続するかを切り替える１０方バルブ６を備える。第２のループに接続されているときの溶出液混合用配管圧力値と、イソクラティックポンプ１１からの送液圧力値との差をコントローラ１８が算出する。１０方バルブ６による第１のループへの切り替え時に、上記圧力差に基づくイソクラティックポンプ送液速度を求めバルブ切り替えに、同期して、上記送液速度となるようにイソクラティックポンプ１１を制御する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、
毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、
上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、
上記グラジエントポンプの送液圧力を検出する第１の圧力センサと、
上記イソクラティックポンプの送液圧力を検出する第２の圧力センサと、
上記第１の圧力センサの検出圧力と上記第２の圧力センサの検出圧力との差を算出し、算出した圧力差に基づいたイソクラティックポンプの送液圧力を抽出し、上記グラジエントポンプから送られる溶液が上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するように、上記切り替えバルブを切り替え、この切り替えに合わせて、上記イソクラティックポンプの送液圧力が上記抽出した圧力値となるように、上記イソクラティックポンプの動作を制御する制御部と、
を備えることを特徴とするグラジエント送液装置。
【請求項２】
毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、
毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、
上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、
上記グラジエントポンプの送液圧力を検出する第１の圧力センサと、
上記イソクラティックポンプの送液圧力を検出する第２の圧力センサと、
上記第１の圧力センサの検出圧力と上記第２の圧力センサの検出圧力との差を算出し、算出した圧力差が０に近づくように、上記グラジエントポンプの動作を制御する制御部と、
を備えることを特徴とするグラジエント送液装置。
【請求項３】
毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、
毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、
上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、
時間の経過とともに変化する上記グラジエントポンプの圧力値と、上記イソクラティックポンプの送液圧力値との差が記憶されたメモリと、
上記メモリに記憶された圧力差に基づいたイソクラティックポンプの送液圧力を抽出し、上記グラジエントポンプから送られる溶液が上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するように、上記切り替えバルブを切り替え、この切り替えに合わせて、上記イソクラティックポンプの送液圧力が上記抽出した圧力値となるように、上記イソクラティックポンプの動作を制御する制御部と、
を備えることを特徴とするグラジエント送液装置。
【請求項４】
請求項１、２、３、４のうちのいずれか一項記載のグラジエント送液装置をサンプル導入部として有し、マイクロボアカラムと、液体クロマトグラフ用検出器とを備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離分析技術に係わり、特に、毎分ナノリットル（１０−９ L/min）領域の流量での分離分析を行うためのグラジエント送液装置及びそれを用いた分離分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎分ナノリットル領域の流量でのグラジエント溶出を行い混合成分の分離分析を行うクロマトグラフ装置として、これまで複数の方式が提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１、特許文献２に記載された技術は、一分析に要するグラジエント溶液を、予め、一つあるいは複数の流路に充填しておいて、これらの溶液を一定流量で送液可能なポンプを用いて順次送液する方法である。
【０００４】
また、その他の技術としては、特許文献３に記載された技術があり、この技術は、送液ユニットを少なくとも２つ連通させ、第１の送液ユニットからの送液圧力を圧力センサで検出し、所望設定値で吐出する。そして、第１の送液ユニットの吐出圧力に対応して、第２の送液ユニットにより予加圧を行う。これにより、送液乱れの無い正確な送液を行おうとする技術である。
【０００５】
さらに、他の技術としては、毎分マイクロリットル（１０−６ L/min）領域の流量でグラジエント送液が可能なポンプで送液を行い、流路にスプリッターを用いて送液の一部を分割して毎分ナノリットル流量の送液を得る方法がある。
【０００６】
また、電気浸透流を利用したポンプを複数使用して、複数の溶液をそれぞれのポンプで送液し、溶液を直接混合しながらグラジエント送液を行う方法等がある。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−７１６５７号公報
【０００８】
【特許文献２】特開２００２−３６５２７２号公報
【０００９】
【特許文献３】特開２００３−９８１６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、毎分ナノリットル領域の流量でのグラジエント溶出を行い混合成分の分離分析を行うクロマトグラフ装置において、２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で、連続して、かつ正確な分析を行うという要請がある。２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で連続して、かつ正確な分析を行うことができれば、分析効率を向上することができるからである。
【００１１】
上記要請に対応するため、特許文献１、特許文献２に記載された技術のように、複数のグラジェント溶液を一つ又は複数の第１の流路に充填しておき、一定流量で送液可能なポンプが接続された第２の流路に、バルブを介して、上記第１の流路を接続し、バルブを切り替えながら、一定流量で溶出液を分析部に送出することが考えられる。
【００１２】
しかしながら、通常、第１の流路内の圧力は、第２の流路内の圧力に比べて高い為、バルブ切り替え時に、溶液圧力の相違により流路内に存在する溶液の圧縮が起こり、圧力変動が生じて、毎分ナノリットル領域での正確な一定流量での送液が困難である。
【００１３】
特許文献３記載の技術やその他の従来技術においても、グラジエント送液を行う第１の流路と、一定流量で送液する第２の流路とをバルブを介して接続する構成とした場合には、上述と同様に、バルブ切り替え時の圧力変動が生じ、毎分ナノリットル領域での正確な一定流量での送液が困難である。
【００１４】
本発明の目的は、２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で連続して、かつ、毎分ナノリットル領域の一定流量で、分析装置に送液可能なグラジエント送液装置を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明は次のように構成される。  
（１）本発明のグラジエント送液装置は、毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、上記グラジエントポンプの送液圧力を検出する第１の圧力センサと、上記イソクラティックポンプの送液圧力を検出する第２の圧力センサと、動作制御部とを備える。
【００１６】
動作制御部は、上記第１の圧力センサの検出圧力と上記第２の圧力センサの検出圧力との差を算出し、算出した圧力差に基づいたイソクラティックポンプの送液圧力を抽出する。そして、上記グラジエントポンプから送られる溶液が上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するように、上記切り替えバルブを切り替え、この切り替えに合わせて、上記イソクラティックポンプの送液圧力が上記抽出した圧力値となるように、上記イソクラティックポンプの動作を制御する。
【００１７】
（２）また、本発明のグラジエント送液装置は、毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、上記グラジエントポンプの送液圧力を検出する第１の圧力センサと、上記イソクラティックポンプの送液圧力を検出する第２の圧力センサと、動作制御部とを備える。
【００１８】
動作制御部は、上記第１の圧力センサの検出圧力と上記第２の圧力センサの検出圧力との差を算出し、算出した圧力差が０に近づくように、上記グラジエントポンプの動作を制御する。
【００１９】
（３）また、本発明のグラジエント送液装置は、毎分マイクロリットルの流量で複数の溶液を混合して送液が可能なグラジエントポンプと、毎分ナノリットルの流量で送液が可能なイソクラティックポンプと、上記グラジエントポンプから送られる溶液を、上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するか、廃液とするかを切り替える切り替えバルブと、時間の経過とともに変化する上記グラジエントポンプの圧力値と、上記イソクラティックポンプの送液圧力値との差が記憶されたメモリと、動作制御部とを備える。
【００２０】
動作制御部は、上記メモリに記憶された圧力差に基づいたイソクラティックポンプの送液圧力を抽出し、上記グラジエントポンプから送られる溶液が上記イソクラティックポンプからの送液により分析部に送液するように、上記切り替えバルブを切り替える。
【００２１】
そして、この切り替えに合わせて、上記イソクラティックポンプの送液圧力が上記抽出した圧力値となるように、上記イソクラティックポンプの動作を制御する。
【００２２】
（４）本発明の液体クロマトグラフ装置は、上記（１）、（２）、（３）、（４）のグラジエント送液装置をサンプル導入部として有し、マイクロボアカラムと、液体クロマトグラフ用検出器とを備える。
【発明の効果】
【００２３】
２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で連続して、かつ、毎分ナノリットル領域の一定流量で、分析装置に送液可能なグラジエント送液装置及びこれを用いた液体クロマトグラフ装置を実現することができる。
【００２４】
本発明のグラジエント送液装置によれば、連続して、かつ正確な分析を行うことができるので、分析効率を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。  
図１は、本発明の一実施形態であるグラジエント送液装置が用いられた液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。  
図１において、二つの溶出液２、３は、グラジエントポンプ１により、毎分マイクロリットルの流量で、その組成を変化させながら混合され、送液される。グラジエントポンプ１から送液された溶液は、圧力センサ４を通過後、ミキサ５で充分混合された後に、グラジエント溶液として１０方バルブ６に送られる。
【００２６】
１０方バルブ６には、２つのグラジエントループ７及び８が装着されており、グラジエント溶液はいずれか一方のグラジエントループ７又は８を通過後、バイパス９及び抵抗コイル１０を経て廃液として外部へ送られる。
【００２７】
一方、イソクラティックポンプ１１からは、毎分ナノリットルの流量で溶出液１２が送液され、圧力センサ１３を経て１０方バルブ６に装着されたもう一方のグラジエントループ内の溶液を押し出す。ここで、１０方バルブ６が一定時間毎にその流路が切り替えることにより、流量メータ１４及びサンプルインジェクタ１５に向かう流路には、グラジエントループ内に充填されたグラジエント溶液がイソクラティックポンプ１１に設定された流量で送られる構成としている。
【００２８】
グラジエントポンプ１で逐次組成の異なるグラジエント溶液を作成して送液されると、そのグラジエント溶液は連続的にサンプルインジェクタ１５、分析カラム１６、紫外可視吸光度検出器１７に送られる。その結果、連続的なグラジエント送液を行い、分析可能な液体クロマトグラフ装置が実現される。
【００２９】
この場合、グラジエントポンプ１には、液体クロマトグラフ用に一般に利用されるグラジエント方式のポンプが使用できる。また、毎分ナノリットル流量のイソクラティックポンプ１１には、例えばシリンジ方式のポンプを用いることができる。あるいは電気浸透流を用いたポンプが使用可能である。
【００３０】
ここで、図１に示した状態では、グラジエントループ７内の流路にかかる圧力は、主に抵抗コイル１０の内径及び長さにより決定されるが、そのとき送液されているグラジエント溶液の組成にも影響される。
【００３１】
通常、液体クロマトグラフでは、水と、アセトニトリルなどの有機溶媒を溶出液に用いることが多いが、その場合、有機溶媒の比率が変化すると送液圧力が変化する。そのため、測定開始時のグラジエント溶液組成でグラジエントループ内の圧力が一定になるように抵抗コイル１０を選択しても、一測定中にグラジエントループ内の圧力は変化する。
【００３２】
例えば、水１００％からアセトニトリル１００％までに溶液組成が変化するグラジエント送液を行う場合、グラジエントポンプ１に連結されているグラジエントループ（図１の状態ではグラジエントループ７）内にかかる圧力は、測定時間とともに低くなっていく。
【００３３】
一方、イソクラティックポンプ１１は、同じ溶出液１２を送液しており、送液圧力は一定になるため、イソクラティックポンプ１１に連結されているグラジエントループ（図１の状態ではグラジエントループ８）内の圧力とイソクラティックポンプ１１からの送液圧力との間に差が生じる。
【００３４】
その結果、何ら対策を講じていなければ、１０方バルブ６の切り替え直後には、イソクラティックポンプ１１からの流路の圧力が低くなる。毎分ナノリットル流量での送液では圧力が元に戻るのに時間がかかる為、正確なイソクラティック送液ができなくなる。
【００３５】
そこで、図２に示すように、１０方バルブ６の切り替えタイミングに合わせて、イソクラティックポンプ１１の送液用シリンジの移動速度を上げて、流路内の圧力低下を抑えることで流量の低下を抑え、一定流量の送液が行える制御を行う。
【００３６】
イソクラティックポンプ１１の送液用シリンジの移動速度を変更する時間及び変更後の移動速度は、流路内にある圧力センサ１３の変動をコントローラ１８によりモニタして最適な移動速度をイソクラティックポンプ１１に送信することで決定することも可能であるが、切り替え前の圧力センサ４の検出圧力値と、圧力センサ１１の検出圧力値との差をコントローラ１８が算出し、その差に基づいた送液用シリンジの移動速度を予め決定し、バルブ６切り替えと同期して、送液用シリンジ移動速度を制御する。
【００３７】
そして、その後、圧力センサ１１の検出圧力値が所定の圧力となるように、送液用シリンジの移動速度をコントローラ１１が制御する（グラジエントプログラムに従い動作する）。
【００３８】
コントローラ１８は、内部にメモリを備えており、このメモリに、圧力センサ４と１１との圧力差毎に、バルブ６切り替え時の送液用シリンジの移動速度が記憶されている。このメモリに記憶される移動速度は、予め、実験等により求められた値である。
【００３９】
１０方バルブ６の切り替えにより、流路内で圧力低下が発生した場合、切り替え直後に大きく圧力が下がるため、シリンジの移動速度は切り替え直後に速くし、その後、圧力センサ１１の圧力をモニタしながら数段階に分けて元の移動速度まで戻す。これは、流路内圧力すなわち流量が設定値以上に大きくなる（オーバーシュートと呼ばれる現象）ことを抑える必要があるからである。
【００４０】
図２に示した例では、シリンジ移動速度を階段状に変化させているが、曲線状に変化させても同様の効果が期待できる。
【００４１】
図３は、シリンジの移動速度を一定にした場合と、１０方バルブ６の切り替えに合わせて移動速度を変化させた場合の各流路内の圧力変化を示すグラフである。
【００４２】
図３において、圧力センサ４の検出圧力値は、測定時間とともに減少しているが、圧力センサ１３の検出圧力値も、圧力センサ４の検出圧力値と同様に、一様に減少するように、シリンジの移動速度を制御する。なお、図３では、理解の容易のため、圧力センサ４の圧力値を上方向にずらして示しているが、実際の圧力値は、圧力センサ１３の値とほぼ同等の値を示す。
【００４３】
図３に破線で示すように、シリンジ移動速度を変化させることで、圧力センサ１３のモニタ圧力値の変動時間を短くすることが可能となり、その結果、図２に示したような、一定圧力を維持したグラジエント送液の流量を得ることが出来た。
【００４４】
それに対して、シリンジの移動速度を一定とした場合は、圧力バルブ６の切り替えタイミング毎に、大きな圧力変動が生じている。
【００４５】
１０方バルブ６の切り替え時の圧力ショックによる流量変動を完全には補正できないものの、液体クロマトグラフ測定に充分な送液安定性を維持することが可能である。なお、このようなナノリットル毎分の流量測定は、市販の液体マスフローメータを流量メータ１４に用いることで測定可能である。
【００４６】
図４は、本発明の一実施形態によるグラジエント送液装置を用いて、毎分２００ナノリットルの流量でグラジエント送液を行った場合の吸光度検出結果データを示すグラフである。
【００４７】
この図４に示すデータは、グラジエントポンプ１から毎分５０マイクロリットルの流量で、水と、アセトン０．２％を含むアセトニトリルのグラジエントを行い、イソクラティックポンプ１１からは水を毎分２００ナノリットル送液したとき、紫外可視吸光度検出器１７を用いて溶出液のグラジエント曲線を測定したものである。
【００４８】
図４に示すように、本発明のグラジエント送液装置を用いた場は、非常に滑らかなグラジエント曲線が得られていることが判る。
【００４９】
図５は、シリンジ移動速度を変化させない場合の吸光度検出結果データを示すグラフであり、本発明と比較するためのグラフである。シリンジ移動速度を変化させない場合は、グラジエント送液中の圧力変動により送液量が変動するため、１０方バルブ６の切り替えによる吸光度の周期的な変動がみられ、正確なグラジエント送液が出来ていないことがわかる。
【００５０】
以上のように、本発明の一実施形態によれば、送液圧力が時間と共に変化する溶出液混合用配管を、送液圧力を一定に保持すべきイソクラティックポンプから送液され分析部に連結される第１のループに接続するか、廃液すべき第２のループとに接続するかを切り替える１０方バルブを備え、第２のループに接続されているときの、溶出液混合用配管圧力値と、イソクラティックポンプからの送液圧力値との差を算出する。
【００５１】
そして、１０方バルブにより第１のループに接続を切り替えるときには、切り替え直前の上記圧力差に基づく、イソクラティックポンプ送液速度を求め、バルブ切り替えに、ほぼ同期して、求めたイソクラティックポンプ送液速度となるように、イソクラティックポンプを制御する。
【００５２】
そして、その後、第１ループが所定圧力となるように、圧力値を検出して、イソクラティックポンプを制御する。
【００５３】
したがって、２つ以上の溶出液成分の組成を変化させながら、一定時間間隔で連続して、かつ、毎分ナノリットル領域の一定流量で、分析装置に送液可能なグラジエント送液装置を実現することができる。
【００５４】
また、このグラジエント送液装置を用いた液体クロマトグラフ装置を実現することができる。
【００５５】
本発明の他の実施形態としては、イソクラティックポンプ１１の送液圧力を変化させる代わりに、グラジエントポンプ１のプランジャの移動速度、すなわちグラジエント送液の流量を変化させることで１０方バルブ６の切り替え時のグラジエントループ間の圧力差による流路の圧力変動を抑える例がある。
【００５６】
この場合、装置構成は図１に示した一実施形態と同様であるが、コントローラ１８によるポンプ制御方法が異なる。上述した一実施形態と同様に、通常の液体クロマトグラフではグラジエントポンプ１に用いる溶出液２及び３は、水と有機溶媒を用い、一測定中にその組成を変化させながら送液を行う。
【００５７】
そのため、グラジエント溶液中の有機溶媒の組成が変化すると、送液圧力が変化し、２つのグラジエントループ間の圧力差は一測定中に変動する。その結果、正確な流量でのグラジエント送液ができなくなる。
【００５８】
そこで、イソクラティックポンプ１１からの流路にある圧力センサ１３をコントローラ１８により常にモニタし、圧力センサ４の圧力と比較して２つのグラジエントループ７、８の圧力差を無くすように、グラジエントポンプ１のプランジャ移動速度を変化させる。
【００５９】
例えば、２つの溶出液２及び３に、水及びアセトニトリルを用いてアセトニトリルの比率を時間と共に高くしていく場合、グラジエント送液中の圧力センサ４の圧力は、図６に示す、プランジャ移動速度一定時の圧力センサ４の圧力のように、時間と共に低くなっていく。
【００６０】
これは、２つのグラジエントループ７、８への印加圧力が、一測定中に変化するということであり、１０方バルブ６の切り替え時に、イソクラティックポンプ１１による流路内の圧力が変化してしまうため、イソクラティックポンプ１１による正確な送液が出来なくなる。
【００６１】
このとき、圧力センサ１３の圧力をコントローラ１８によりモニタし、圧力センサ４の圧力が、圧力センサ１３の圧力に近づくようにグラジエントポンプ１の移動速度を逐次変化させることで、溶出液組成の条件が変化した場合でも常に圧力センサ４の圧力を一定にする（図６）。
【００６２】
その結果、２つの圧力センサの圧力差、すなわち２つのグラジエントループ間の圧力差は一測定中ほとんど無くすことが出来るため、１０方バルブ６を切り替えても正確なイソクラティック送液を実現することが出来る。
【００６３】
なお、図１に示した例においては、２つの圧力センサ４及び１１を設けるようにしたが、使用する溶出液が限定されている場合は、時間と共に変動する圧力は、圧力センサを設けずとも、予め予測可能である。
【００６４】
この場合、溶出液の種類、組み合わせ毎に、圧力の時間変化をコントローラ１８の内部メモリに記憶しておき、その変化に応じたシリンジの移動速度を算出し、バルブ６の切り替えタイミングに合わせて、シリンジの移動速度を制御することが可能である。
【００６５】
また、図１に示した分析カラム１６は、マイクロボアカラム（充填カラム、モノリスカラム、オープンチューブカラム）である。また、図１に示した例は、紫外可視吸光度検出器を用いた例であるが、紫外可視吸光度検出器の他に、蛍光検出器や大気圧イオン化部（大気圧化学イオン化又はエレクトロスプレーイオン化）とすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明の一実施形態であるグラジエント送液装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態におけるイソクラティックポンプのシリンジ移動速度の時間変動と、流量の変動とを示すグラフである。
【図３】本発明の一実施形態における流路内の圧力変動を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施形態を用いて得られた吸光度測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明との比較のための吸光度測定結果を示すグラフである。
【図６】本発明の他の実施形態における流路内の圧力変動を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６７】
１              グラジエントポンプ
２、３          溶出液
４、１３        圧力センサ
５              ミキサ
６              １０方バルブ
７、８          グラジエントループ
９              バイパス
１０            抵抗コイル
１１            イソクラティックポンプ
１２            溶出液
１４            流量メータ
１５            サンプルインジェクタ
１６            分析カラム
１７            紫外可視吸光度検出器
１８            コントローラ
【図１】
2005140659.tif 000003
【図２】
2005140659.tif 000004
【図３】
2005140659.tif 000005
【図４】
2005140659.tif 000006
【図５】
2005140659.tif 000007
【図６】
2005140659.tif 000008