(57)【要約】【課題】  検出精度の優れた、２以上のプローブ領域を有する核酸検出用プローブ、および、そのようなプローブを用いる検出方法の提供する。【解決手段】  本発明による核酸検出用プローブは、ｎ個（ここでｎは２以上である）の核酸性のプローブ領域と、（ｎ−１）個の非核酸性のスペーサー領域とを含んでなる、核酸検出用プローブであって、プローブ領域とプローブ領域とが非核酸性スペーサー領域を介して接続されてなることを特徴とするものである。このプローブは、例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、Ｔ細胞受容体遺伝子、赤血球型決定遺伝子、およびＲｈ抗原遺伝子の検出に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｎ個（ここでｎは２以上である）の核酸性のプローブ領域と、（ｎ−１）個の非核酸性のスペーサー領域とを含んでなる、核酸検出用プローブであって、
プローブ領域とプローブ領域とが非核酸性スペーサー領域を介して接続されてなることを特徴とする、核酸検出用プローブ。
【請求項２】
プローブ領域が、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、または、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）により構成されてなる、請求項１に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項３】
スペーサー領域を構成するスペーサーが、アルキル鎖、エーテル鎖、ペプチド鎖、および糖鎖からなる群より選択される１種以上のものである、請求項１または２に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項４】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、赤血球型決定遺伝子、およびＲｈ抗原遺伝子からなる群より選択される遺伝子の検出に用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項５】
各プローブ領域が、標的核酸配列中に存在するｎ個の標的領域に、それぞれ相補的であり、かつ、
前記標的領域がいずれも同一鎖に存在する場合には、標的核酸との間で特異的なハイブリッドを形成するように構成されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項６】
プローブ領域の数（ｎ）が２である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブ。
【請求項７】
検体核酸中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法であって、
（ａ）  標的核酸配列が含まれている可能性のある検体核酸と、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブとを、ハイブリッド形成条件下にて、接触させる工程、
ここで、核酸検出用プローブにおける各プローブ領域は、標的核酸配列中に存在するｎ個の標的領域に、それぞれ相補的であり、かつ、
核酸検出用プローブは、前記標的領域がいずれも同一鎖に存在する場合には、標的核酸との間で特異的なハイブリッドを形成するように構成されてなり、および
（ｂ）  核酸検出用プローブと、標的核酸との間で形成される特異的なハイブリッドの有無によって、検体核酸中の標的核酸配列の存在を判定する工程
を含んでなる、方法。
【請求項８】
標的核酸が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、赤血球型決定遺伝子、およびＲｈ抗原遺伝子からなる群より選択される遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の前に、検体中の検体核酸を増幅させる工程をさらに含んでなる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブを少なくとも２種含んでなる、核酸検出用プローブセット。
【請求項１１】
検体核酸中の標的核酸配列の存在を検出するためのキットであって、
（ｉ）  請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸検出用プローブ、および
（ii）  検体核酸を増幅させるために用いられるプライマー
を含んでなる、キット。
【請求項１２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、赤血球型決定遺伝子、およびＲｈ抗原遺伝子からなる群より選択される遺伝子の検出に用いられる、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の変異、または多型を検出するためのプローブに関する。詳しくは、本発明は、同一の核酸中に存在する２ヶ所以上の不連続な領域に含まれる遺伝情報を同時に識別することができる核酸検出用プローブ、および核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解読が終了して、ヒト染色体の全配列が明らかとなっており、今後は個々の遺伝子のもつ情報についての研究が精力的に進められると予想される。これまでに、多くの疾患と、遺伝子変異および多型との関係が研究が行われており、単一遺伝子疾患、および多因子疾患と、原因遺伝子との関係が次々と明らかにされている。多くの遺伝子について多型が報告されており、これらは個人識別や病因遺伝子の探索において有用なマーカーとなっている。また、赤血球のＡＢＯ型多型やＨＬＡ遺伝子に見られる多型は、輸血または骨髄移植の適合性判断に有用であることが報告されている。
【０００３】
このような情況の中で、目的の遺伝子、またはそれを含む領域内に存在する遺伝子変異、もしくは遺伝子多型を簡便かつ正確に検出する技術が求められている。
遺伝子変異または多型を検出する方法として、多くの方法が報告されている。例えば、目的とするフラグメント全体の配列情報に基づいて遺伝子の変異または多型を検出する方法が挙げられる。このような方法としては、具体的には、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766 (1989)（非特許文献１）を参照）、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（例えば、Nucl. Acids Res. 22, 1541- (1994)（非特許文献２）を参照）、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 232 (1989)（非特許文献３）を参照）、ＰＣＲ−ＲＳＣＡ法、および、Sequencing法等が挙げられる。これらの方法では、理論的には、フラグメント内のいかなる領域に変異または多型が存在しても、１本鎖の構造の違い、アニーリングの仕方の違い、変性の仕方の違い、ヘテロ２本鎖の構造、または解読された配列自体に変化を与えてその違いを検出することによって、変異または多型を検出することができる。
【０００４】
また、遺伝子変異または多型の検出方法として、例えば、非常に限られた領域における遺伝子変異または多型を検出する方法が挙げられる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などが挙げられる。これらの方法では、非常に限られた領域内に存在する変異または多型が、プライマー末端からの伸長反応、Cleavaseによる切断反応、制限酵素による切断反応に影響を及ぼすことを利用して、変異または多型を検出することができる。
【０００５】
他の方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｔａｑｍａｎ法、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ法等が挙げられる。これらの方法は、目的の領域に変異または多型を有するＤＮＡ分子と、目的領域に相当する配列を有する合成オリゴヌクレオチドとの親和性の違いを利用するものである。すなわち、これらの方法では、合成オリゴヌクレオチドの結合領域に変異または多型が存在した場合に、合成オリゴヌクレオチドとの親和性が変化し、それによってオリゴヌクレオチドプローブの結合、ポリメレースによる切断、または蛍光エネルギー転移の有無に変化を生じさせ、それを検出する。これによって変異または多型を検出することができる。
【０００６】
ＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen、ヒト白血球抗原）は、自己および非自己の認識に重要な役割を果たすものであり、その遺伝子としては非常に多くの多型が存在する。主な遺伝子としてはＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱがある。骨髄移植等の際に、骨髄供給者と被移植者の間でこれらの遺伝子の型を予め検査しておき、それを適合させることによって、骨髄移植等による治療効果を大幅に向上できる。
これまでに、それぞれの遺伝子について、数十から数百種にも及ぶ多型の種類が報告されている。しかしながら、これらの遺伝子のアレル（対立遺伝子）（allele）を決定することは容易ではない。特に、非血縁者の場合には適合した遺伝子型を持つ人を見つけることは非常に困難である。このため、一般的には、公的な骨髄バンクに登録された多くのドナーの中から、適合者を探す。
【０００７】
これらの遺伝子多型を決定する方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、Direct sequencing法等（例えば、今日の移植, vol.7 SUPPL (1994)（非特許文献４）を参照）がある。
このうちＰＣＲ−ＳＳＯ法は、多検体処理に適しており、最も広く用いられている。この方法は、各ＨＬＡ遺伝子内で多型を示す多数の領域に相当するオリゴヌクレオチドプローブを設定し、それらの反応様式から遺伝子型を決定するものである。しかしながら、ヒトの遺伝子は父親由来のものと母親由来のものの２セットからなり、しかもＨＬＡ遺伝子は非常に多型に富むために、しばしば従来のプローブを使用するＰＣＲ−ＳＳＯ法では遺伝子型を決定できないことがある。例えば、一方のアリルの２つの近接する位置＃１、＃２の塩基の配列がそれぞれＡとＴで、他方のアリルの相当する位置の塩基の配列がＴとＧの場合には、通常の方法では＃１の位置からはＡとＴが、＃２の位置からはＴとＧの塩基が検出されることになる。これは一方のアリルがそれぞれの位置にＡとＧを、他方のアリルがＴとＴを持つ場合と結果的に同じ塩基が検出されることになる。すなわち、物理的に連結した状態と、そうでない状態とは、通常のＰＣＲ−ＳＳＯ法では区別することはできない。連続した遺伝子から連続した蛋白が転写、翻訳されることが一般的であるため、各々のアリル単位で遺伝子の配列を知ることが重要である。前記したように、それぞれのアリル単位で配列が特定できない場合は、正確な多型決定を行うことはできない。
【０００８】
そこで、Ｓａｉｔｏらは、１つのプロ−ブ分子内に核酸塩基により互いを隔てた、２つの特異的な配列領域を有する核酸検出用プローブを提案している（国際公開公報ＷＯ ０３／０２７３０９号（特許文献１）を参照）。このプローブ中に存在する２ヶ所の特異的な配列領域はそれぞれ、ハイブリッド形成条件下において、検体核酸上の標的核酸配列と相補鎖を形成するものである。プローブ上の２カ所の特異的な領域に相補的な標的領域が、別々の鎖である検体核酸中に存在する場合は、２カ所の特異的な領域が、２本の鎖上に物理的に隔てられることなり、形成される相補鎖は、充分な強度の２本鎖とはならない。しかしながら、２カ所の特異的な領域に相補的な標的領域が、同一鎖に存在する場合には、形成される相補鎖は充分な強度の２本鎖となる。したがって、前記プローブを利用することによって、２ヶ所の特異的な配列領域に相補的な標的領域が、２本の鎖上に物理的に隔てられて存在している場合と、一本鎖上で物理的に近接して存在している場合とを、形成される２本鎖の強度に基づいて区別することができる。
【０００９】
しかしながら、前記検出用プローブにおいては、２ヶ所の特異的な配列領域を隔てるスペーサーが通常の核酸であるために、注意深くその配列を選んだとしても、検体核酸中の標的核酸配列以外の部分と何らかの相互作用を示すことがあり、その結果、予期しない２本鎖が形成されることがある。また、検出用プロ−ブ内の特異的な配列領域と、スペーサーとが水素結合して、プローブ自身が分子内または分子間で高次構造を形成して、検体核酸と充分な水素結合ができない場合もある。このような場合、検出用プローブと相補性のない核酸であっても、両者の間で非特異的な２本鎖が形成されたり、本来は相補的な配列を有して相補鎖を形成する配列が、充分な強度の二本鎖を形成できなかったりすることがある。その結果、核酸の検出精度が低下することがある。
したがって、遺伝子多型を決定する方法であって、簡便であって、かつ、検出精度をさらに向上させた方法が望まれていた。
【００１０】
なお上記記載中で挙げられた文献を下記に列記する。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ ０３／０２７３０９号
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2766 (1989)
【非特許文献２】Nucl. Acids Res. 22, 1541- (1994)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 232 (1989)
【非特許文献４】今日の移植, vol.7 SUPPL (1994)
【発明の概要】
【００１１】
本発明者らは、今般、２以上のプローブ領域を有する検出用プローブにおいて、それらプローブ領域間のスペーサーとしてアルキル鎖等の非核酸構造のものを利用することによって、非特異的な２本鎖形成を抑制することができ、このため、スペーサーが核酸構造である場合に起こりうる検出精度低下の問題を飛躍的に抑制できることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１２】
よって、本発明は、検出精度の優れた、２以上のプローブ領域を有する核酸検出用プローブ、および、そのようなプローブを用いる検出方法の提供をその目的とする。
【００１３】
本発明による核酸検出用プローブは、ｎ個（ここでｎは２以上である）の核酸性のプローブ領域と、（ｎ−１）個の非核酸性のスペーサー領域とを含んでなる、核酸検出用プローブであって、プローブ領域とプローブ領域とが非核酸性スペーサー領域を介して接続されてなることを特徴とするものである。
【００１４】
本発明による検体核酸中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法は、
（ａ）  標的核酸配列が含まれている可能性のある検体核酸と、本発明による核酸検出用プローブとを、ハイブリッド形成条件下にて、接触させる工程、
ここで、核酸検出用プローブにおける各プローブ領域は、標的核酸配列中に存在するｎ個の標的領域に、それぞれ相補的であり、かつ、
核酸検出用プローブは、前記標的領域がいずれも同一鎖に存在する場合には、標的核酸との間で特異的なハイブリッドを形成するように構成されてなり、および
（ｂ）  核酸検出用プローブと、標的核酸との間で形成される特異的なハイブリッドの有無によって、検体核酸中の標的核酸配列の存在を判定する工程
を含んでなる。
【００１５】
本発明による核酸検出用プローブセットは、本発明による核酸検出用プローブを少なくとも２種含んでなる。
【００１６】
本発明による検体核酸中の標的核酸配列の存在を検出するためのキットは、
（ｉ）  本発明による核酸検出用プローブ、および
（ii）  検体核酸を増幅させるために用いられるプライマー
を含んでなる。
【００１７】
本発明の核酸検出用プローブによれば、同一鎖に２以上の標的領域を有する標的核酸を検出する場合において、プローブ−標的核酸間の非特異的反応を効果的に抑制することができ、このため、目的とする標的核酸の検出精度を従来に比べてさらに向上させることができる。本発明によれば、検体核酸の同一鎖中に存在する２以上の不連続な領域に含まれる遺伝情報を同時に識別することができる。したがって、本発明によるプローブは遺伝子診断技術に利用することができ、医療品または食品の検査に応用することもできる。
【発明の具体的説明】
【００１８】
核酸検出用プローブ
本発明による核酸検出用プローブは、前記したように、ｎ個の核酸性のプローブ領域と、（ｎ−１）個の非核酸性のスペーサー領域とを含んでなるものであって、プローブ領域とプローブ領域とが非核酸性スペーサー領域を介して接続されてなることを特徴とするものである。すなわち、本発明による核酸検出用プローブは、ｎ個のプローブ領域と、各プローブ領域を隔てる非核酸性スペーサー領域とを単一分子中に含んでなるものである。
【００１９】
ここで、ｎは２以上であり、好ましくは２〜１０であり、より好ましくは２〜５であり、特に好ましくは２である。
したがって、例えばｎが２である場合、本発明による核酸検出用プローブは、２個の核酸性のプローブ領域と、１個の非核酸性のスペーサー領域とを含んでなり、第１のプローブ領域と第２のプローブ領域とが非核酸性スペーサー領域を介して接続されてなることを特徴とするものである（図１）。
【００２０】
本発明による核酸検出用プローブは、検体中に存在し得る標的核酸の検出または検査対象となる核酸の同定に用いられる。本発明によるプローブの検出の対象となる核酸としては、同一鎖中に複数の標的領域を有する標的核酸であればいずれのものであってもよく、好ましくは、ヒト由来の遺伝子であり、より好ましくは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、Ｔ細胞受容体遺伝子、赤血球型決定遺伝子、またはＲｈ抗原遺伝子である。
【００２１】
ここで、「プローブ領域」とは、本発明による核酸検出用プローブにおいて、検出する対象となる標的核酸中の標的領域の配列と相補的である領域のことをいう。本発明においては、このプローブ領域と、標的領域との相補性を利用して、両者が特異的に結合し得ることを利用して、標的核酸の検出を行う。したがって、標的核酸配列中にｎ個の標的領域があり、それらを同時に検出する必要がある場合、それら標的領域のそれぞれに対して相補的であるプローブ領域が必要となる。プローブ領域は、検出する対象となる核酸に応じて、当業者であれば、その配列を適宜決定することができる。なお、複数存在するプローブ領域は、互いに同一のものであっても、異なっていてもよい。
【００２２】
本発明において、「プローブ領域」を構成する構造は、核酸性の構造である。ここで核酸性とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのようなオリゴヌクレオチドや、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等により配列が構成されてなることをいう。
本発明の好ましい態様によれは、プローブ領域は、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、または、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）により構成されてなる。本発明によるプローブ中に含まれるプローブ領域は、いずれもが同一のものから構成されていてもよく、また、それぞれが異なるものから構成されていてもよい。
プローブ領域配列は、当業者であれば、目的とする配列情報に基づいて、慣用の方法を適用することによって適宜合成することが可能である。
【００２３】
プローブ領域の長さは、特に制限はないが、例えば、５〜１００塩基の長さであり、好ましくは８〜３０塩基の長さである。
【００２４】
本発明において、「スペーサー領域」は、本発明によるプローブ中に存在する２つのプローブ領域の間に介在する領域のことを意味する。すなわち、本発明によるプローブにおいて、各プローブ領域はそれぞれ、スペーサー領域によりセパレートされており、それにより、本発明によるプローブは非環状の単一分子を構成する。したがって、本発明においては、プローブ領域がｎ個存在する場合、スペーサー領域は、（ｎ−１）個存在することとなる。このとき、複数存在するスペーサー領域は、互いに同一のものであっても、異なっていてもよい。
【００２５】
本発明において、「スペーサー領域」は、非核酸性の構造である。ここで非核酸性とは、核酸または修飾核酸でないものであって、他の核酸塩基との間で塩基対を形成しないものであればいずれのものであってもよい。すなわち、スペーサー領域は、標的核酸中に存在する標的領域と標的領域の間の介在領域の塩基と、塩基対を形成しないものである。また「スペーサー領域」は、スペーサーにより構成されてなるものである。このとき、１つのスペーサー領域は、２以上のスペーサーにより構成されていてもよい。
スペーサーは、好ましくは、本発明による検出用プローブの水溶解性を著しく変化させないものであり、より好ましくは、通常の核酸合成機において使用可能なホスホアミダイト誘導体にすることができるものである。このような核酸合成の段階で導入可能なものとしては、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、ペプチド鎖、または、糖鎖が挙げられる。これらの鎖は、必要に応じて修飾されていてもよい。
【００２６】
したがって、本発明の好ましい態様によれば、スペーサー領域を構成するスペーサーは、アルキル鎖、エーテル鎖、ペプチド鎖、および糖鎖からなる群より選択される１種以上のものである。
【００２７】
本発明のより好ましい態様によれば、スペーサーは、−(Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｐ［ここでｐは１以上、好ましくは３〜１０である］、−(ＣＨ２)ｑ［ここでｑは１以上、好ましくは３〜３０である］、またはデオキシリボース鎖（好ましくは３〜１０の鎖）の構造を有する。本発明において、スペーサーの具体例としては、下記の構造を有するものが挙げられる：
【００２８】
【化１】
2005204558.tif 000002
［上記式中、
ＤＭＴは、ジメトキシトリチル基を示し、
ｉ−Ｐｒは、イソプロピル基を示し、
ＣＮＥｔは、シアノエチル基を示す］。
なお、上記スペーサーの具体例において、ＤＭＴは５’末端の水酸基の保護基であり、Ｐ(Ｏ-ＣＮＥｔ)Ｎ(i-Ｐｒ)２は、リン酸基の保護基である。
【００２９】
スペーサー領域の長さは、標的核酸配列中における標的領域間の距離に応じて、適宜設定することができる。スペーサー領域の長さは、好ましくは、炭素原子３個以上が結合している距離またはそれと同等の自由度を与えるものであり、より好ましくは、炭素原子６〜３０個が結合している距離またはそれと同等の自由度を与えるものである。
【００３０】
本発明において、「標的核酸」とは、検出を使用とする目的となる核酸のことをいい、この標的核酸は、その配列中に、その検出のために用いることができる標的領域を同一鎖中に複数有してなる。標的核酸配列中において、いずれの配列を標的とするかについては、入手可能な遺伝子変異または多型に関する遺伝子情報に基づいて、当業者であれば適宜決定することができる。
【００３１】
本発明の好ましい態様によれば、核酸検出用プローブは、含まれる各プローブ領域が、標的核酸配列中に存在するｎ個の標的領域に、それぞれ相補的であり、かつ、前記標的領域がいずれも同一鎖に存在する場合には、標的核酸との間で特異的なハイブリッドを形成するように構成されてなるものである。したがって、複数の標的領域が同一鎖でなく、それぞれ異なる鎖上に存在する場合には、プローブ内のプローブ領域がいずれも相補鎖を形成したとしても、本発明のプローブは、標的核酸との間では、安定したハイブリッドを形成しない。このように本発明のプローブが、特異的なハイブリッドを形成するように構成されてなるものであるために、プローブ内のプローブ領域の長さ、スペーサー領域の長さ、スペーサーの種類等を適宜選択することができる。
【００３２】
本発明において、プローブ領域と標的領域とが「相補的」であるとは、プローブ領域と標的領域とにおける対応する塩基がいずれも塩基対を形成し得る状態にあることをいうが、必要に応じて、検出する上で問題が生じない範囲において、その中に、１または数個のミスマッチを含んでいてもよい。存在しても良いミスマッチの数は、要求される検出精度、および、プローブ領域の長さに応じて制限される。なお、検出に際して、プローブと標的核酸とのハイブリッド形成条件を適宜変更することにより、ミスマッチが存在する場合を排除したり、許容できるミスマッチの数を調整することができる。
【００３３】
本発明によるプローブは、必要に応じて、検出操作において利用可能な標識物質を有する領域をさらに有していても良く、また、プローブとしての検出能に影響を及ぼさない範囲において、任意の配列または修飾物質をさらに含んでいてもよい。
【００３４】
核酸検出方法
本発明による検体核酸中に標的核酸配列が存在するか否かを検出する方法は、前記したように、
（ａ）  標的核酸配列が含まれている可能性のある検体核酸と、本発明による核酸検出用プローブとを、ハイブリッド形成条件下にて、接触させる工程、および
（ｂ）  核酸検出用プローブと、標的核酸との間で形成される特異的なハイブリッドの有無によって、検体核酸中の標的核酸配列の存在を判定する工程
を含んでなるものである。
【００３５】
ここで、「ハイブリッド形成条件」とは、使用するプローブおよび標的核酸等によって変化し得るが、一般的な条件は、当業者であれば容易に設定可能である。ハイブリッド形成条件の具体例としては、（１〜５）×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）であり、好ましくは、このときの温度は、２５〜８０℃である。
【００３６】
本発明による核酸の検出方法としては、通常の遺伝子検出法に用いられている慣用の方法を応用することが可能である。このような方法としては、例えば、下記（１）〜（５）のような方法が挙げられる：
（１）  本発明による検出用プローブを予め固相上に固定化しておき、検出可能な標識を有する検体核酸、または容易に標識を導入可能な検体核酸であって予め標識を導入しておいた検体核酸と、固定化したプローブとを、ハイブリッド形成条件下にて、塩基対形成反応させ、その後に、固相上に残存する標識を検出する方法；
（２）  検体核酸を予め固相上に固定化しておき、検出可能な標識を予め導入しておいた本発明によるプローブと、固定化した検体核酸とを、ハイブリッド形成条件下にて、塩基対形成反応させ、その後に、固相上に残存する標識を検出する方法；
（３）  本発明によるプローブと、検体核酸とを、それぞれ別々の懸濁可能な固相に結合させておき、これらをハイブリッド形成条件下にて接触させることにより、特異的な２本鎖形成による凝集反応を起こさせ、その凝集を確認する方法；
（４）  本発明によるプローブと、検体核酸とを、液相中において、ハイブリッド形成条件下にて、塩基対形成反応させ、その際、特異的な２本鎖形成が行われたときに生ずる蛍光エネルギー転移を検出することによる方法；および
（５）  前記（１）〜（４）を任意に組み合わせてなる方法。
【００３７】
本発明においては、前記（１）の方法が好ましい。前記（１）の方法においては、標的核酸は、固定化された本発明によるプローブに容易に捕獲され、それ以外の検体中の核酸は、捕獲されないので、固相上の標識レベルを測定することにより容易に標的核酸を検出することができる。
【００３８】
本発明による検出用プローブ、または検体核酸を、固相上に固定化する場合に使用される固相担体としては、本発明による検出用プローブまたは検体核酸が非特異的に吸着しうるもの、または、官能基が導入できその官能基と核酸との間で共有結合できるものであれば、いずれの材質またはいずれの形状のものであっても利用可能である。具体例としては、いわゆるポリマー製のマイクロプレート、チューブ、ビーズ形状のものが挙げられる。本発明おいては、マイクロプレート、またはビーズ形状を用いるのが、その機械化の容易性から好ましい。
【００３９】
固定化する方法としては、例えば、化学結合法が挙げられる〔Nucleic Acids Res., 15, 5373-5390 (1987)〕。具体例としては、カルボキシル基を導入した担体と、５’−末端にアミノヘキシル基を導入した核酸をＥＤＣなどの水溶性カルボジイミドのような架橋剤を用いて両者を結合させる方法が挙げられる。
【００４０】
また、吸着などの非特異的結合によって核酸を直接担体に固定することもできる。担体がポリスチレン製である場合は、紫外線照射または塩化マグネシウムの添加により吸着効率を上げることが可能である（特開昭６１−２１９４００号公報）。さらに、核酸とタンパク質を適当な方法によって化学結合または非特異的に吸着させ、そのタンパク質と担体との非特異的吸着を利用して固定化する方法なども有効である。
【００４１】
本発明によるプローブ、または検体核酸を標識する方法としては、例えば、
（Ａ）標識すべき核酸に標識物を直接導入する方法、
（Ｂ）標識化されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標識すべき核酸または標識すべき核酸と相補的な核酸を合成する方法、および
（Ｃ）標識された単位核酸の存在下、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標識すべき核酸または標識すべき核酸と相補的な核酸を合成する方法
などが挙げられる。
【００４２】
前記（Ａ）の方法としては、標識すべき核酸に光反応でビオチン誘導体を導入し酵素を結合したストレプトアビジンで検出する方法〔Nucleic Acids Res., 13, 745 (1985)〕、標識すべき核酸をスルホン化し酵素標識抗スルホン化抗体を用いて検出する方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3466-3470 (1984)〕などが挙げられる。
【００４３】
前記（Ｂ）および（Ｃ）の方法としては、特定の核酸配列を増幅する方法〔BIO/TECHNOLOGY, 8, 291 (1990) 〕を利用することができる。例えば、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350-1354 (1985)〕にあっては、標識したプライマーを利用するか、または、標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することにより、標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、Ｑβレプリカーゼを利用する増幅法〔BIO/TECHNOLOGY, 6, 1197 (1988)〕にあっては、同様に標識したモノヌクレオチドトリリン酸を利用することによって標識された伸長生成物または増幅生成物を得ることができる。また、前述した以外の核酸増幅法においても、伸長反応または増幅反応によって取り込まれるモノヌクレオチドトリリン酸やオリゴヌクレオチドを標識しておくことによって伸長生成物または増幅生成物を標識することができる。
【００４４】
ここで使用する標識物質は、ハイブリダイゼーション操作後にこの物質を検出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わない。取扱いの容易性、保存性、廃棄処理等の観点から、非放射性の標識物質が好ましい。
【００４５】
非放射性の標識物質としては、例えば、ビオチン、２，４−ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等のハプテン、フルオレセインおよびその誘導体〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等〕、ローダミンおよびその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド等〕、４−フルオロ−７‐ニトロベンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシルなどの蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が挙げられる。これらにより標的核酸または本発明によるプローブを標識する場合は、いずれも公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）により、標識化を行うことができる。
【００４６】
本発明において、本発明によるプローブと標的核酸との間で形成される特異的なハイブリッドの有無を検出する操作は、存在する標識の種類に応じて適宜選択され、決定されてよい。
【００４７】
ここで、標識が直接検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばラジオアイソトープ、蛍光物質、色素などである場合には、標識した核酸が固相に結合した状態で検出操作を行うかまたは標識物を核酸と結合したまま、あるいは標識物を核酸から切り放した状態で溶液中に遊離させた後、その標識に応じた方法によって検出操作を行なうことができる。また、標識が間接的に検出可能なものである場合、すなわち標識が例えばビオチン、ハプテンなどの特異的結合反応のリガンドである場合、一般的にそれらの検出に用いられているように、直接信号を発生する標識あるいは信号を発生する反応を触媒する酵素を結合した受容体（たとえばアビジンまたは抗体）を使用して検出操作を行うことができる。
【００４８】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による検出方法は、工程（ａ）の前に、検体中の検体核酸を増幅させる工程をさらに含んでなる。すなわち、本発明による検出方法において、検出に先立って、検体核酸を鋳型として、慣用の遺伝子増幅方法によって、検体核酸を増幅させておくことが好ましい。このような増幅法としては、ＰＣＲ法（Polymerease Chain reaction）のように温度変化を必要とするもの、および、ＬＡＭＰ法（Loop mediated amplification）のように等温で行われるものが挙げられる。
【００４９】
本発明の別態様によれば、前記したように、検体核酸中の標的核酸配列の存在を検出するためのキットであって、
（ｉ）  本発明による核酸検出用プローブ、および
（ii）  検体核酸を増幅させるために用いられるプライマー
を含んでなるキットが提供される。
【００５０】
本発明におけるキットは、さらに
（iii）  検体核酸を鋳型としてＰＣＲ等の遺伝子増幅反応を行うために必要な試薬、
（iv）  遺伝子増幅物と本発明によるプローブとのハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬、および／または
（ｖ）  遺伝子増幅物と本発明によるプローブとにより特異的なハイブリッドが形成されているか否かを判定するために必要な試薬
等をさらに含んでいてもよい。これらの試薬は、慣用のものを適宜使用することができる。例えば、ハイブリッドが形成されているか否かを判定するための試薬としては、二本鎖に特異的に反応するインターカレーター類などが挙げられる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を説明するがこれらは本発明を限定するものではない。
【００５２】
例１：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１と、ＤＲＢ１＊０４０１１およびＤＲＢ１＊０４０４との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１、ＤＲＢ１＊０４０１１、およびＤＲＢ１＊０４０４）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ７０−２Ｄおよび７０−２Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子のアミノ酸番号５３番〜５７番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、６８番〜７２番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。ここで、プローブ７０−２Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ７０−２Ｄｔ（配列番号６）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ７０−２Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ７０−２Ｄｔは、比較例に相当する。
【００５３】
使用したＨＬＡ−ＤＲ遺伝子としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１、ＤＲＢ１＊０４０１１、およびＤＲＢ１＊０４０４の各遺伝子を使用した（それぞれ配列番号１、２おおび３）。この内、ＤＲＢ１＊０４０１１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１のプローブ領域との間に２塩基、核酸検出用プローブの第２のプローブ領域との間に２塩基のミスマッチを有するものであった。同様に、ＤＲＢ１＊０４０４は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１のプローブ領域との間にのみ２塩基のミスマッチを有し、ＤＲＢ１＊１５０１１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１および第２のプローブ領域との間には、ミスマッチは存在しないものであった。なお、使用したプローブと、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子との配列上の関係を、図２に示した。
【００５４】
前記２種類のプローブを、常法に従って固相に固定化した。具体的には、固相担体として、カルボキシル化ポリスチレンビーズを用い、これに５’−アミノ化オリゴヌクレオチドをＥＤＣを用いてカップリングすることによって、前記プローブをそれぞれ固定した。
一方、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１の３種の遺伝子については、各遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型として、ビオチン識別プライマーを用いて、ＰＣＲ反応（ここで反応は９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／３０秒を１サイクルとして、これを３０サイクル実施した）を行い、増幅物を得た。
各遺伝子について得られたビオチン標識増幅物を、それぞれ、固定化したプローブとハイブリッド形成条件下にて、ハイブリダイズさせた。これにストレプトアビジン−フィコエリスリン（蛍光物質）を作用させ、洗浄後、ビーズ上に残存する蛍光強度を測定し、その相対値を結果の表中に示した。
【００５５】
結果は、表１に示されるとおりであった。
【００５６】
【表１】
2005204558.tif 000003
【００５７】
プローブ７０−２Ｄｔ（比較例）は、両方のプローブ領域にミスマッチのない場合に強い蛍光強度を与えたものの、片方の領域のみにミスマッチを有する場合（ＤＲＢ１＊０４０４の場合）に対しても強い蛍光強度を与えた。蛍光強度がこのような傾向を示したのは、核酸性のスペーサーと標的核酸領域とが非特異的に反応したことによると予想された。
これに対し、プローブ７０−２Ｄ（本発明）は、第１の領域と第２の領域の両方に共にミスマッチが存在しないＤＲＢ１＊１５０１１に対してのみ、強い蛍光強度を示した。これにより、ＤＲＢ１＊１５０１１のみを容易に識別することができた。
【００５８】
例２：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＤＲＢ１＊１５０１１と、ＤＲＢ１＊１５０２１との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１、およびＤＲＢ１＊１５０２１）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ６９−２Ｄおよび６９−２Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４遺伝子およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子のアミノ酸番号５６番〜６０番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、６８番〜７１番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。ここで、プローブ６９−２Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ６９−２Ｄｔ（配列番号１６）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ６９−２Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ６９−２Ｄｔは、比較例に相当する。
【００５９】
使用したＨＬＡ−ＤＲ遺伝子としては、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１、および、ＤＲＢ１＊１５０２１（配列番号７）の各遺伝子を使用した。この内、ＤＲＢ１＊１５０２１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第２のプローブ領域との間にのみ２塩基のミスマッチを有するものであった。一方、ＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１および第２のプローブ領域との間は、完全にマッチングするものであった。なお、使用したプローブと、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子との配列上の関係を、図３に示した。
【００６０】
前記２種類のプローブを、常法に従って固相に固定化した。具体的には、例１の場合と同様にして、プローブの固定化を実施した。
ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１、ＤＲＢ１＊１５０２１の３種の遺伝子については、例１の場合と同様にして、ＰＣＲを実施し、それぞれについてＰＣＲ増幅物を得た。これを、例１の場合と同様にして、各遺伝子に蛍光標識した。
各遺伝子について得られた標識した増幅物を、それぞれ、固定化したプローブとハイブリッド形成条件下にて、例１の場合と同様にして、ハイブリダイズさせた。
固定化したプローブに捕獲された増幅物の蛍光強度を、例１の場合と同様にして測定した。
【００６１】
結果は、表２に示されるとおりであった。
【００６２】
【表２】
2005204558.tif 000004
【００６３】
プローブ６９−２Ｄｔ（比較例）は、両方のプローブ領域にミスマッチのないＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子の場合に強い蛍光強度を与えた。しかしながら、ＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子と同様であるにも拘わらず、両方のプローブ領域にミスマッチのないＤＲＢ１＊０４０４遺伝子の場合では、蛍光強度は低かった。一方、第２の領域にミスマッチを有するＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子の場合に、強い蛍光強度を示した。したがって、プローブ６９−２Ｄｔを用いた場合は、この例において標的とした領域の塩基配列の違い識別することができなかった。
これに対し、プローブ６９−２Ｄ（本発明）は、第１の領域と第２の領域の両方に共にミスマッチが存在しないＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子に対して、強い蛍光強度を示した。
【００６４】
例３：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２１と、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＤＲＢ１＊１５０２１、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ７０−１Ｄおよび７０−１Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子のアミノ酸番号５６番〜６０番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、６８番〜７１番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。
ここで、プローブ７０−１Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ７０−１Ｄｔ（配列番号２５）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ７０−１Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ７０−１Ｄｔは、比較例に相当する。
【００６５】
使用したＨＬＡ−ＤＲ遺伝子としては、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１、および、ＤＲＢ１＊１５０２１の各遺伝子を使用した。この内、ＤＲＢ１＊０４０１１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１のプローブ領域との間にのみ２塩基のミスマッチを有するものであった。ＤＲＢ１＊０４０４は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１のプローブ領域との間に２塩基、核酸検出用プローブの第２のプローブ領域との間に２塩基のミスマッチを有するものであった。ＤＲＢ１＊１５０１１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第２のプローブ領域との間にのみ２塩基のミスマッチを有するものであった。ＤＲＢ１＊１５０２１は、その標的領域と、核酸検出用プローブの第１および第２のプローブ領域との間には、ミスマッチは存在しないものであった。なお、使用したプローブと、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子との配列上の関係を、図４に示した。
【００６６】
ＰＣＲによる増幅物の調製、遺伝子の標識、ハイブリダイゼーション、蛍光強度の測定を、例１と同様にして実施した。
【００６７】
結果は、表３に示されるとおりであった。
【００６８】
【表３】
2005204558.tif 000005
【００６９】
プローブ７０−１Ｄｔ（比較例）は、第１の領域と第２の領域の両方に共にミスマッチが存在しないＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子に対する蛍光強度よりも、第２の領域にミスマッチを有するＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子に対する蛍光強度の方が、値が高くなった。したがって、プローブ７０−１Ｄｔの場合は、ＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子を正確に検出することはできなかった。これは、核酸検出用プローブ中のスペーサー領域と、標的核酸とが非特異的な何らかの相互作用を及ぼし合っているか、または、核酸検出用プローブ自身が何らかの高次構造を形成していることによると推定された。
これに対して、プローブ７０−１Ｄ（本発明）は、ＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子に対しする場合において最も強い蛍光強度を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明による核酸検出用プローブ（ｎ＝２の場合）を模式的に示した図である。
【図２】例１において用いたＨＬＡ−ＤＲ遺伝子と核酸検出用プローブとの関係を示す図である。
【図３】例２において用いたＨＬＡ−ＤＲ遺伝子と核酸検出用プローブとの関係を示す図である。
【図４】例３において用いたＨＬＡ−ＤＲ遺伝子と核酸検出用プローブとの関係を示す図である。
【図１】
2005204558.tif 000006
【図２】
2005204558.tif 000007
【図３】
2005204558.tif 000008
【図４】
2005204558.tif 000009
【配列表】
2005204558000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月21日(2004.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
例１：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１と、ＤＲＢ１＊０４０１１およびＤＲＢ１＊０４０４との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１、ＤＲＢ１＊０４０１１、およびＤＲＢ１＊０４０４）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ７０−２Ｄおよび７０−２Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子のアミノ酸番号６９番〜７２番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、８４番〜８７番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。ここで、プローブ７０−２Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ７０−２Ｄｔ（配列番号６）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ７０−２Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ７０−２Ｄｔは、比較例に相当する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
例２：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４およびＤＲＢ１＊１５０１１と、ＤＲＢ１＊１５０２１との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊１５０１１、およびＤＲＢ１＊１５０２１）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ６９−２Ｄおよび６９−２Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４遺伝子およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１１遺伝子のアミノ酸番号７２番〜７６番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、８４番〜８７番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。ここで、プローブ６９−２Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ６９−２Ｄｔ（配列番号１６）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ６９−２Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ６９−２Ｄｔは、比較例に相当する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
例３：  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２１と、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１との識別
本発明の核酸検出用プローブを使用してＨＬＡ−ＤＲ遺伝子（ＤＲＢ１＊１５０２１、ＤＲＢ１＊０４０１１、ＤＲＢ１＊０４０４、およびＤＲＢ１＊１５０１１）の識別を行った。
核酸検出用プローブとして、プローブ７０−１Ｄおよび７０−１Ｄｔを用意した。これらは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２１遺伝子のアミノ酸番号６９番〜７２番に相当する領域（第１のプローブ領域）と、８４番〜８７番に相当する領域（第２のプローブ領域）を認識するプローブ配列を有するものであった。
ここで、プローブ７０−１Ｄは、２つのプローブ領域の間のスペーサー領域が非核酸構造である「Ｓｐａｃｅｒ １８」であるのに対し、プローブ７０−１Ｄｔ（配列番号２５）は、前記スペーサー領域に対応する介在領域が４つの核酸構造のチミジル酸（ＴＴＴＴ）となっている点で、両プローブは異なるものであった。
なお、プローブ７０−１Ｄは、本発明によるプローブに相当し、プローブ７０−１Ｄｔは、比較例に相当する。