(57)【要約】【課題】  新規な細胞増殖抑制剤又は抗リウマチ剤の提供。【解決手段】  式（Ｉ）（式中、ｎは１〜３の整数である）で示される化合物、並びにこの化合物を含んで成る、細胞増殖抑制剤、アポトーシス誘導剤及びプラスタグランジン産生抑制剤の提供。    【化１】2005232101.tif 000008【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（Ｉ）：
【化１】
2005232101.tif 000006
（式中、ｎは１〜３の整数である）
により表される、N-(アミノアルキル)-4-〔5-(4-トリル)-3-(トリフルオロメチル-1H-ピラソール-1-イル〕-ベンゼンスルホンアミド。
【請求項２】
下記式（II）：
【化２】
2005232101.tif 000007
により表される、n-(2-アミノエチル)-4-〔5-(4-トリル)-3-(トリフルオロメチル-1H-ピラソール-1-イル〕-ベンゼンスルホンアミド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含んで成る、細胞増殖阻害剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物を含んで成る、アポトーシス誘導剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の化合物を含んで成る、プロスタグランジン産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレコキシブ（Celecoxib）の新規なアミノアルキル誘導体、並びにその製造方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記式（III ）：
【化１】
2005232101.tif 000002
【０００３】
により示される化合物は、セレコキシブ（celecoxib）と称され、炎症性サイトカインの産生において重要な働きを持つ酵素であるシクロオキシゲナーゼ(COX)-2（cyclooxygenase(COX)-2）をより選択的に阻害する抗炎症化合物として（Kato M. et al, J. Pharm. Pharmacol. 2001 Dec；53(12)：1679-85）、米国食品医薬品局（FDA）の承認を受けた薬物である。この薬物は米国では既に市販され、我が国においても現在臨床試験が進行中である。また、その抗炎症作用の他に、ヒト関節リウマチ患者滑膜細胞（Kusunoki N., et al, Arthritis Rheum 2002；46(12)：3159-3167）および種々の腫瘍細胞における増殖抑制効果も報告されており（Yamazaki R., et al, FEBS Lett. 2002 531(2)：278-284）、家族性大腸ポリポーシス治療に関してもその適応がFDAにより承認されている。
【０００４】
【非特許文献１】Kato M. et. al, J Pharm Pharmacol. 2001; 53(12): 1679-85
【非特許文献２】Kusunoki N. et al, Arthritis Rheum. 2002; 46(12)：3159-3167
【非特許文献３】Yamazaki R, et al, FEBS Lett 2002; 531(2)：278-284
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記のセレコキシブを基にして、更に高い細胞増殖抑制作用を有する化合物、及びその用途を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記のセレコキシブに比べてはるかに強力な細胞増殖抑制作用を有する化合物を提供すべく種々検討した結果、セレコキシブのスルホンアミド基にアミノアルキル基を結合させることにより、セレコキシブに比べて10倍以上の細胞増殖抑制活性を有する化合物を合成することに成功し、本発明を完成した。従って、本発明は、下記式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
2005232101.tif 000003
【０００８】
（式中、ｎは１〜３の整数である）
により表される、N-(アミノアルキル)-4-〔5-(4-トリル)-3-(トリフルオロメチル-1H-ピラソール-1-イル〕-ベンゼンスルホンアミドを提供する。上記式（Ｉ）に示される化合物の内、特に下記式（II）：
【０００９】
下記式（II）：
【化３】
2005232101.tif 000004
により表される、n-(2-アミノエチル)-4-〔5-(4-トリル)-3-(トリフルオロメチル-1H-ピラソール-1-イル〕-ベンゼンスルホニルアミド（化合物Ａと称する）が好ましい。
【００１０】
本発明は更に、上記の化合物を含んで成る、細胞増殖阻害剤を提供する。
本発明は更に、上記の化合物を含んで成る、アポトーシス誘導剤を提供する。
本発明はまた、上記の化合物を含んで成る、プロスタグランジン産生阻害剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の式（Ｉ）の化合物において、ｎは１〜３の整数であり、従って、H2N-(CH2)n-は、アミノプロピル基、アミノエチル基またはアミノメチル基であり、ｎが２であるアミノエチル基が特に好ましい。
【００１２】
本発明の式（Ｉ）に属する化合物Ａは、例えば、次のようにして合成することが出来る。
【化４】
2005232101.tif 000005
【００１３】
本発明の化合物は、腫瘍細胞を含めて、各種の細胞に対して細胞増殖抑制作用を有する。例えば、細胞の増殖に必然的に伴うDNAの合成に際し、ブロモデオキシウリジン（bromo-deoxyuridine）(BrdU)を培地に添加して細胞にとり込ませ、各種被験物質によるBrdUの取り込み量の減少を観察することにより、当該被験物質の細胞増殖抑制作用を試験することが出来る。本発明の式（Ｉ）で示す化合物は、実施例２に示す通り、セレコキシブに比べて、腫瘍細胞に対して、約10倍の細胞増殖抑制作用を示す。従って、本発明の化合物は、腫瘍細胞増殖抑制剤として有用であり、より具体的には抗癌剤として有望である。
【００１４】
本発明の化合物はまた、アポトーシス誘導作用を有する。例えば、アポトーシスは培養細胞培養中のDNAの断片化を指標として観察することが出来る。本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、実施例３に示す通り、腫瘍細胞、及び関節リウマチ患者由来滑膜細胞に対して、セレコキシブに比べて約10倍のアポトーシス誘導作用を有する。従って、本発明の化合物はアポトーシス誘導剤として有用であり、また抗癌剤及びリウマチ治療剤として有望である。
【００１５】
本発明の化合物は、滑膜細胞に対してプロスタグランジンE2産生抑制作用を有する。これは、例えば、被験化合物の種々の濃度での存在下で滑膜細胞を培養し、被験化合物の濃度の上昇によるプロスタグランジンE2の産生の抑制を測定することにより確認することが出来る。実施例４から明らかな通り、本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、滑膜細胞に対して、プロスタグランジンE2産生抑制作用を有する。従って、本発明の化合物は、プロスタグランジン産生抑制剤として有用であり、具体的には、リウマチの治療剤として有望である。
【００１６】
本発明の化合物を医薬として使用する場合、経口的に、又は非経口的に、たとえば注射により投与することが出来る。これらの経路での投与のためには、それらの適する常用の剤形とすることが出来る。例えば、経口投与のためには、カプセル剤、錠剤、粉剤などとして投与することができる。また、非経口投与のためには、例えば皮下注射、筋肉注射、静脈注射、関節腔内注射などにより投与することができる。これら種々の投与剤は、医薬として許容される常用の賦形剤、増量剤、安定剤などを用いて、常法に従って形成することができる。
【実施例】
【００１７】
次に、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１. 式（II）の化合物（Ａ）の合成
550mgの化合物Ａを前記の合成ルートで合成した。その理化学的性質に次の通りであった。
元素分析：C19H19F3N4O2S・0.14CHCl3・0.4H2O（F.W.448.36）.
計算値：C,51.27;H,4.48;N,12.50;Cl,3.32;F,12.71;S,7.15.
測定値：C,51.27;H,4.33;N,12.67;Cl,3.12;F,12.52;S,7.02.
化学純度： >99%（HPLCによる）
HPLC条件：カラム：Ｌ−カラムODS（4.6ｘ150mm）；溶剤：MeCN/20mMリン酸緩衝法（pH            6.5）（35：65）, １ml/min；
サンプル：１mg/ml MeOH；検出答：254nm；保持時間：21.2min.
HPLCスペクトル：図１
1H-NMRスペクトル：図２
【００１８】
実施例２. 細胞増殖抑制作用
（１）試験細胞の用意
（ａ）滑膜細胞の調製
組織の研究利用に同意した関節リウマチ患者から得た滑膜組織をコラゲナーゼ処置した。コラゲナーゼにより消化された滑膜組織をペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％FBSを含むRPMI1640に懸濁し、細胞培養用フラスコにまいた。このフラスコを37℃、5％CO2の条件下で培養し、フラスコに付着した細胞を滑膜細胞とした。
（ｂ）腫瘍細胞
HT-29、SW480およびHCT116細胞：ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％FBSを含むRPMI1640で培養した。
【００１９】
（２）BrdU取り込み試験
細胞増殖の程度は、DNA合成時に細胞に取り込まれるブロモデオキシウリジン（bromo-deoxyuridine）(BrdU)の量を指標に検討した。各種細胞を１ｘ104細胞/ウエルで96ウエルプレートにまき、セレコキシブ、本発明の式（II）の化合物A又はロフェコキシブ（rofecoxib）の存在下CO2インキュベーターにて24時間培養した。その後、BrdUを最終濃度10μMになるように培養液を加え、さらに18時間培養した。培養後、細胞内に取り込まれたBrdU量をCell Proliferation ELISA Kit (Roche Diagnostics社)を用いて測定し、薬物未処置のコントロールの取り込み量を100として、各条件での取り込み量を求め、細胞増殖の指標とした。なお、ロフェコキシブは、WO95/00501に記載の方法により合成した。
【００２０】
（３）結果
本発明の式（II）の化合物Ａは、検討した数種の腫瘍細胞（HT29、SW480、HCT116）、並びに関節リウマチ患者由来滑膜細胞の増殖を抑制した。薬物未処置条件でのBrdU取り込み量を100％としたときの、各薬物処置によるBrdU取り込み量を図３及び図４に示した。取り込み量が50％となる時の薬物濃度は、いずれの細胞においても３〜５μＭであった。セレコキシブも同様に、検討したいずれの細胞においても、その増殖を抑制したが、その50％抑制濃度は10〜20μＭであり、化合物Ａの方が強力であった。
【００２１】
実施例３. アポトーシスの誘導
（1）細胞の用意
細胞は、実施例１に記載した方法により用意した。
（２）アポトーシスの誘導
アポトーシス誘導作用は、断片化したDNAを指標に検討した。各種細胞を2ｘ104cells/wellで96wellプレートにまき、セレコキシブ、化合物Aおよびロフェコキシブの存在下CO2インキュベーターにて24時間培養した。その後、断片化したDNA量をCell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社)を用いて測定し、薬物未処置のコントロールの断片化DNA量を１として、各条件での断片化DNA量を求め、アポトーシス誘導の指標とした。
【００２２】
（３）結果
本発明の式（II）の化合物Aは、検討した数種の腫瘍細胞（HT-29、SW480およびHCT116）、並びに関節リウマチ患者由来滑膜細胞にアポトーシスを誘導し、その増殖を抑制した。その50％作用濃度（最大作用の50％を発現する薬物濃度）は、いずれの細胞においても、5μM前後であった。セレコキシブも同様に、検討したいずれの細胞においてもアポトーシスを誘導したが、その50％作用濃度は20μM前後であり、化合物Aの方が強力であった。結果を、図５及び図６に示す。
【００２３】
実施例４. プロスタグランジンE2の産生抑制
（１）細胞の用意
細胞は、実施例１に記載した方法により用意した。
（２）プロスタグランジン産生抑制実験
滑膜細胞を1ｘ105細胞/ウエルで24ウエルプレートにまきCO2インキュベーターにて24時間培養した。その後、細胞をPBSで洗い、本発明の式（II）の化合物の存在下、CO2インキュベーターにて1時間培養した。培養後、3μMになるようにアラキドン酸（Cayman Chemical社）を加え、30分間培養後に上清を回収した。培養上清中のPGE2量をELISA kit（Cayman Chemical社）によって測定した。
【００２４】
（３）結果
結果を図７に示す。この図から明らかな通り、本発明の式（II）の化合物は、活膜細胞によるプラスタグランジンE2の産生を抑制した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１で合成した本発明の化合物ＡのHPLCスペクトルを示す。
【図２】図２は、実施例１で合成した本発明の化合物Ａの1H-NMRスペクトルを示す。
【図３】図３は、腫瘍細胞HT-29（A）及びSW480（B）に対する、化合物Ａ、セレコキシブ及びロフェコキシブの増殖抑制効果を示すグラフである。
【図４】図４は、腫瘍細胞HCT-116（A）及び関節リウマチ患者の滑膜細胞（B）に対する、化合物Ａ、セレコキシブ及びロフェコキシブの増殖抑制効果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の式（II）の化合物、及びセレコキシブの、HCT116細胞（A）及びSW480細胞（B）に対するアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の式（II）の化合物、及びセレコキシブの、HT-29細胞（C）に対するアポトーシス誘導効果を示すグラフである。
【図７】図７は、滑膜細胞によるプラスタグランジンE2の産生に対する、本発明の式（II）の化合物の抑制作用を示すグラフである。
【図１】
2005232101.tif 000009
【図２】
2005232101.tif 000010
【図３】
2005232101.tif 000011
【図４】
2005232101.tif 000012
【図５】
2005232101.tif 000013
【図６】
2005232101.tif 000014
【図７】
2005232101.tif 000015