(57)【要約】【課題】画像歪みが低減され、かつ鮮明な画質で、性能が高い２次元表面プラズモン共鳴装置を実現する【解決手段】  金属薄膜面の裏側に斜めからｐ波偏光した平行光束を照射する投光手段と、金属薄膜の表側に被測定物質を２次元に接触させる接液手段と、金属薄膜面の裏面からの反射光強度を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、前記受光手段の中に、２次元の歪みを低減する光学レンズを有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属薄膜面の裏側に斜めからｐ波偏光した平行光束を照射する投光手段と、金属薄膜の表側に被測定物質を２次元に接触させる接液手段と、金属薄膜面の裏面からの反射光強度を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、前記受光手段の中に、２次元の歪みを低減する光学レンズを有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置。
【請求項２】
前記光学レンズが、テレセントリックレンズを使用したことを特徴とする請求項１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学測定分野の中で、金属薄膜の表面プラズモン現象を利用した測定装置で、さらに詳しくは２次元表面プラズモン共鳴装置の性能向上技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質間の相互作用を評価する試みが数多くなされている。その多くは一方の分子を固相に固定化し、その分子と相互作用するであろう物質を与えることで、相互作用を観察する。相互作用するであろう物質には蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質を結合させ、ラベル物質を検出することで生体分子あるいは分子集合体間の相互作用を評価する。一般的なＤＮＡチップは蛍光などのラベル物質を用いて相互作用をスクリーニングする。しかし、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠ける。また、相互作用をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。
【０００３】
そこで、ラベルが不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが注目を集めている。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を、共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する方法である。
【０００４】
一般的なＳＰＲセンサーにおいては、特許文献１にみられるように単一波長であるレーザー光を光源として用いる。レーザー光は直進性に優れており、光学研究には非常に使い易い光源である。しかし、光は一点に集中したビームであり、光の当たる部分の面積は非常に小さい。よって、相互作用を評価できる物質は基本的に一つであり、ＤＮＡチップのように複数の物質をスクリーニングすることは非常に難しい。
【０００５】
この問題を解決する手段として、ＮｅｌｓｏｎらはＳＰＲの光源としてハロゲンランプを採用し、その光源を凸レンズやピンホールを組み合わせた空間フィルタで平行光にして、偏光板を通したのち、ＳＰＲに適当な角度で入射させて、１８×１８ｍｍの金蒸着スライドの照射し、さらにその反射光を波長フィルタに通してからＣＣＤカメラで撮影した、いわゆる２次元表面プラズモン共鳴装置で複数の物質の同時測定を実現した（非特許文献１）。
【０００６】
しかし従来技術では、使用されているカメラ用レンズは、一般のＣＣＴＶレンズや凸レンズ１枚の単レンズ構成であるため、２次元撮影自体は可能であるが、レンズ収差に伴う球面収差、ディストーション、像面湾曲などによる歪みやピントずれ、さらには金属薄膜面を斜めから撮影していることも相まっての、いわゆる遠近効果による画像の台形上歪みやピントずれが発生するなど、目的の２次元ＳＰＲ画像は歪みが大きく、不鮮明である。
【０００７】
またこのような２次元表面プラズモン共鳴装置では、観察したい物質と相互作用を有している物質をそれぞれ金薄膜上の予め決められた領域に固定（以下スポット）されているので、各ＳＰＲシグナルを測定する場合は測定前に撮影した画像を基に、被測定物質ごとに観察したい領域を指定する、いわゆるマスク作業を行う必要がある。通常各スポットは同一形状、同一面積で、等間隔で配置されることが多いが、前記のように従来の技術では撮影された画像は歪みが大きく、原型を忠実に再現できていない。そのためマスク作業は等間隔処理による一括指定ができず、すべての領域をひとつひとつ指定していく必要があり、スポット数が多い場合は非常に煩雑であった。のみならずピントずれが発生することで、ＳＰＲシグナルのバラツキが大きくなる問題があり、精度確保のためにはある程度のスポット面積を必要とするため、スポット面積を小さくし、高密度にすることが困難である。
【０００８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０３４１９２７号明細書
【特許文献２】国際公開第９３／１４３９３号パンフレット
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７１巻、３９２８−３９３４頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
２次元表面プラズモン共鳴装置において、画像歪みを低減し、かつピントずれが小さい鮮明な画像を得ることで、マスク処理の等分割一括指定による簡便化、ＳＰＲシグナルのバラツキ低減、高密度なＳＰＲ同時測定などを可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
【００１１】
１．金属薄膜面の裏側に斜めからｐ波偏光した平行光束を照射する投光手段と、金属薄膜の表側に被測定物質を２次元に接触させる接液手段と、金属薄膜面の裏面からの反射光強度を２次元で測定する受光手段を有している、表面プラズモン共鳴を利用した測定装置において、前記受光手段の中に、２次元の歪みを低減する光学レンズを有することを特徴とする２次元表面プラズモン共鳴装置。
２．前記光学レンズが、テレセントリックレンズを使用したことを特徴とする請求項１記載の装置。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の効果により、画像歪みが低減され、かつ鮮明な画質で、性能が高い２次元表面プラズモン共鳴装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。図３に示すように、２次元プラズモン共鳴装置を構成するものとして、まずｐ波変調した平行光束を入射する手段であるが、この平行光の平行精度および光束内照度の均一性はＳＰＲの性能において非常に重要である。そのためハロゲンランプを光源として、途中に凸レンズとピンホールを使用した、いわゆる空間フィルタを使用して生成する方式が好ましい。
【００１４】
次に金属薄膜面と被測定物質を２次元で接触させる手段であるが、光学プリズムと、金属薄膜がコートされた前記光学プリズムと同一の屈折率を有する光学スライドガラスを、それらと同一の屈折率を有するマッチングオイルを介して、金泊膜面とは反対側と接合し、さらに２次元の液空間が金属薄膜面との間に設けられるような凹部を有し、かつその液空間に接続された入出力ポートを有しているフローセルと、光学スライドガラスを接合する方式が好ましい。
【００１５】
本発明で使用する２次元の反射光強度を測定する手段としては、テレビカメラが好ましく、さらにはカメラの種類としては、単色を２次元に撮影できるものであれば、撮像管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラのいずれでもよいが、経済性と性能の両面からＣＣＤカメラがより好ましい。カメラサイズや画素数は、レンズを含めた解像力が目的の金属薄膜面の解像度以上になるようにすれば、特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明ではカメラ用レンズとして２次元の歪みを低減する光学レンズを使用する。２次元の歪みを低減する光学レンズとは、レンズを通して撮像した場合に、通常は遠くの対象物は小さく、近くの対象物は大きく写るが、このような現象を低減することの出来るレンズである。具体的な例としてはテレセントリックレンズ、あおり（シフト）レンズ等が挙げられるが、テレセントリックレンズが最も好ましい。ここでいうテレセントリックレンズとは、焦点位置に絞りを設けることで、主光線が光軸と平行になるようなレンズをいい、その中でも物体側テレセントリック性能を有するものである。像側テレセントリック性能を有するレンズもあるが、本発明ではその効果は無関係であるため、その有無は問わない。また通常のカメラレンズであるＣＣＴＶレンズであっても、物体側テレセントリック性能を有するものは、これに該当する。
テレセントリックレンズの作動距離（ＷＤ）は、長ければ画像の歪み率は小さく、また被写界深度が大きい、良質な画像が得られるが、反面装置の寸法が大きくなるデメリットがある。そのためＷＤは特に限定するものではないが、５０〜２００mmの範囲が好ましい。
また、被写界深度は、金属薄膜面の傾斜による距離差よりも大きいことが特に好ましいが、ＷＤが大きくなるデメリットもあるため、最低でも前記距離差の半分以上であることが好ましい。
【００１７】
ＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００１８】
本発明における表面プラズモン共鳴装置は、画像歪みがほとんどなく、かつ鮮明な画像が得られる、非常に性能の高い装置である。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２０】
［実施例１］
光源にはハロゲンランプ（細渕電球社製）を用いた。光源から５０ｍｍの位置に直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）をレンズの平面側をランプに向けて設置し、光源からの光を平行光とした。前記球面平凸レンズからさらに３５ｍｍ離して、さらにもう一つ直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）の球面側を光源に向けて設置した。この球面平凸レンズによってレンズから５０ｍｍの位置に集光され、その位置に直径２００μｍのピンホール（シグマ光機社製ＰＡ−２００）を置いて光束をピンホールに通し、球面アロマティックレンズ（シグマ光機製ＤＬＢ−３０−５０ＰＭ）によって平行光とした後、有効径２４ｍｍφの近赤外偏光フィルター（シグマ光機社製ＳＰＦＮ−３０Ｃ−２６）によって２４ｍｍφの偏光平行光束を得た。この偏光平行光束は広範囲の領域を照射可能である。
【００２１】
１８ｍｍ四方で厚さ２ｍｍのＬａｋ１０スライド（ｎD＝１．７２０、松浪硝子工業社製）に３ｎｍクロムと４５ｎｍの金を蒸着した。末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた溶液を調製し、金蒸着スライドを３時間浸漬し、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
４ａｒｍＰＥＧの分子量は１０，０００であり、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基となっており、金に対する金属結合性を示す。
【００２２】
このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは透明な水晶上にクロムがパターン化されており、直径０．５ｍｍのクロムの貫通孔が１００個あいており、穴があいている部分でＵＶ光が透過してスライドに照射される。
次に、７−カルボキシヘプタンチオール（７−ＣＨＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭエタノール溶液を調製し、前記金蒸着スライドを浸漬し、ＵＶ照射部に７−ＣＨＴを吸着させ、パターン化チップを得た。このパターン化チップをテスト用チップ１として以下に用いた。
【００２３】
テスト用チップ１のガラス面にマッチングオイル（カーギル社製Ｍシリーズ、ｎD＝１．７２０）をつけ、一辺２５ｍｍの６０°分散プリズム（Ｏｒｉｅｌ社製４６１０６）と接触させ、本発明のＳＰＲ装置の偏光平行光束を導入した。テスト用チップの金蒸着面には水を接触させた。
【００２４】
金からの反射光束を８３０ｎｍの光干渉フィルタ（シグマ光機社製ＶＰＦ−２５Ｃ−１０−４５−８３０００）によって８３０ｎｍ近傍の波長光を取り出し、テレセントリック系ＣＣＴＶレンズ（モリテックス社製ＭＴＥ−５５）により、完全な平行光のみを取り出してから、白黒ＣＣＤカメラ（東京電子工業社製ＣＳ８３３０Ｂ）で撮影した。装置の概要は図３に示す。
【００２５】
観察した２次元表面プラズモン共鳴画像を図４に示す。カメラを９０°回転して設置しているため、画像も９０°回転して撮影されており、画像上が金薄膜面では遠方側に相当する。そこで画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は０．００％となり、前記遠近効果では歪みの生じない像が得られた。ここで歪み計算は以下の計算式を使用した。各パラメータの計測地点は図５に示す。図５の上図がチップ上のスポット位置に対応し、下図が画面上に映ったときの位置に対応する。
歪み（％）＝（｜Ｌb−Ｌu｜／Ｌb）×１００
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
【００２６】
さらにレンズ収差によるディストーション（歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は−０．１２％、横方向は＋０．２５％と、中心部分の変形が±０．３％以内に収まり、ほとんど歪んでいない像が得られた。ここで歪みの計算は以下の計算式を使用した。
【００２７】
縦方向ディストーション（％）＝（（Ｈm−（Ｈl＋Ｈr）／２）／Ｈm）×１００
Ｈl：最左列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈr：最右列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
Ｈm：中央列の最上スポット上端から最下スポット下端までの長さ
（中央列がない場合は、中央に最も近い左右二つの列を選択し、平均を中央列とする）
【００２８】
横方向ディストーション（％）＝（（Ｌm−（Ｌu＋Ｌb）／２）／Ｌm）×１００
Ｌu：最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌb：最下段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
Ｌm：中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ
（中央段がない場合は、中央に最も近い上下２つの段を選択し、平均を中央段とする）
【００２９】
得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右上端スポットの３箇所を指定して、その間は縦および横を９等分に分割するように、マスク設定した画像を図６に示す。これにより、１０×１０の１００点スポットにおいても、わずか３点の位置指定で、１００点すべてのマスクが位置ずれ無く指定することができた。これらを総合すると、画像の歪みがほとんど生じない、そのためマスク指定も非常に簡便な２次元表面プラズモン共鳴装置を実現できた。
【００３０】
さらに画像の鮮明度や分解能を調査した結果を以下に示す。ここでは、図２に示す４象現型フォトマスクを用いてパターン化したチップを用いた。つまり右上四半域に上下とも空隙が２００μmで２００μm四方の貫通孔を、左上四半域に上下とも空隙が１５０μmで１５０μm四方の貫通孔を、左下四半域に上下とも空隙が１００μmで１００μm四方の貫通孔を、右下四半域に上下とも空隙が５０μmで５０μm四方の貫通孔を有するフォトマスクを使用して作製した。このパターン化チップをテスト用チップ２として以下に用いた。
図７がテスト用チップ２のＳＰＲ像である。その左下四半域を拡大したものを図８に示す。図８の全域に渡り各スポットが鮮明であることから、１００μｍ四方のスポットの光量識別が可能である２次元表面プラズモン共鳴装置を実現できた。１０ｍｍ四方全体に、上下とも空隙が１００μmで１００μm四方のスポットを作成した場合は、スポット数が２５００個になり、高密度な２次元表面プラズモン共鳴装置が実現できたことになる。
【００３１】
［比較例］
従来の方法の１例として、投光手段および接液手段は実施例と同様の構成で、受光手段のカメラレンズをテレセントリックレンズの代わりに、球面アロマティック凸レンズ（ダブレット凸レンズ）の単レンズ構成のレンズを使用したときの結果を示す。
【００３２】
前記実施例１と同様に、テストチップ１を観察した２次元表面プラズモン共鳴画像を図９に示す。同様に画面の上部のスポット間隔と画面下部のスポット間隔を比較すると、遠近効果による像の歪みを計算でき、その値は４．８％となり、画面上つまり遠方側が小さくなっている台形上の大きな歪みが生じていることが判る。
【００３３】
さらに実施例１と同様に、レンズ収差によるディストーション（歪曲）を計算するため、画面縦方向、および画面横方向それぞれについて、端部の間隔の平均と、中心部の間隔を比較すると、縦方向は１．４２％、横方向は０．７６％と、中心部分の変形が±１％以上になり、大きく歪んでいることが判る。ここで横方向のディストーション計算時には、一旦前記遠近効果による歪み４．８％を考慮して、長さＢ（中央段の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は、＋２．４％、長さＡ（最上段行の最左スポット左端から最右スポット右端までの長さ）は＋４．８％の補正を実施してから計算した。
【００３４】
また、得られた画像の左上端スポットと、左下端スポットと、右下端スポットの３箇所を指定して、その間は縦および横を９等分に分割するように、マスク設定した画像を図１０に示す。これにより、等間隔による簡易の３箇所スポット設定では大きくマスクがずれ、実用できないことが判る。
【００３５】
さらに実施例１と同様に、画像の鮮明度や分解能を調査した結果を以下に示す。図１１がテスト用チップ２のＳＰＲ像である。その左下四半域を拡大したものを図１２に示す。図１２を見ると周辺において著しくピントずれが発生し、各スポットが変形や重畳して、その大きさでのスポット認識能がないことが判る。また画質も非常に不鮮明であることも判る。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の効果により、画像歪みが低減され、かつ鮮明な画質で、性能が高い２次元表面プラズモン共鳴装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待され、産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例・比較例で用いた１００穴フォトマスク
【図２】実施例・比較例で用いた４象現型フォトマスク
【図３】２次元表面プラズモン共鳴装置の概観図
【図４】実施例における観察画像１
【図５】歪みおよびディストーションを計算する際の計測場所
【図６】実施例における等間隔マスク処理
【図７】実施例における観察画像２
【図８】実施例における観察画像拡大図
【図９】比較例における観察画像１
【図１０】比較例における等間隔マスク処理
【図１１】比較例における観察画像２
【図１２】比較例における拡大画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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