(57)【要約】 【解決手段】  本発明は、薬剤候補の代謝安定性を特徴付ける方法であって、薬剤候補に存在するＮＭＲ活性核種の核分極を高め（以下、「過分極」という。）、薬剤候補を肝細胞又は細胞小器官と接触させ、ＮＭＲ分析を行うことを含んでなる方法に関する。【効果】  本方法は迅速で簡単なインビトロアッセイであり、多数の薬剤候補のスクリーニングに特に適している。本発明の方法では、アッセイ材料からの薬剤候補及び／又はその代謝物の単離を必要としない。本発明の方法では、過分極させた薬剤候補を使用するので、通常のＮＭＲ式アッセイよりも感度に優れており、そのため従来のＮＭＲでは検出できないごく微量の代謝物の検出が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の薬剤候補の代謝安定性をインビトロで特徴付ける方法であって、薬剤候補を過分極させ、これを肝細胞又は肝細胞小器官と接触させて混合物を形成し、混合物のＮＭＲスペクトルを取得することを含んでなる方法。
【請求項２】
１種類の薬剤候補を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
２種以上の薬剤候補を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１種以上の薬剤候補が同位体濃縮されている、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
１種以上の薬剤候補が該分子の一部位でのみ同位体濃縮されている、請求項４記載の方法。
【請求項６】
１種以上の薬剤候補が１３Ｃ又は１５Ｎで濃縮されている、請求項４又は請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種以上の薬剤候補が１３Ｃで濃縮されている、請求項６記載の方法。
【請求項８】
過分極が動的核分極（ＤＮＰ）で実施される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
過分極させた１種以上の薬剤候補を肝細胞と接触させる前に、該薬剤候補を溶液又は懸濁液に加える、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
肝細胞が肝臓組織、肝臓組織由来の初代細胞培養物又は肝細胞株の形態であり、肝細胞小器官が肝ミクロソーム、肝ミトコンドリア又は肝Ｓ９画分である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
得られるＮＭＲスペクトルが１次元又は２次元ＮＭＲスペクトル、好ましくは１次元ＮＭＲスペクトルである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ＮＭＲスペクトルが単一スキャンで取得される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ＮＭＲスペクトルが数回のスキャンで取得される、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤候補の代謝安定性をインビトロで特徴付ける方法であって、薬剤候補に存在するＮＭＲ活性核種の核分極を高め（以下、「過分極」という。）、薬剤候補を肝細胞と接触させ、ＮＭＲ分析を行うことを含んでなる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体が薬剤を吸収、輸送、変換（代謝）し、最終的に生体から除去する能力は、特定の生体又は個体においてその薬剤がいかによく効くかに極めて重要である。新薬の臨床試験のみならず、薬剤の治療効果には、ヒト個人又はヒト集団における薬剤の動態に関する理解を高めることが重要である。
【０００３】
大半の薬剤は、肝臓に存在する酵素に依存する少数の代謝経路を介して代謝される。こうした酵素のうちの１つが肝細胞の小胞体に位置するチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）であり、薬剤の代謝に重要な役割を果たす。オキシダーゼのＣＹＰ４５０スーパーファミリーのメンバーは共通の触媒機構を示すが、個々のアイソザイムは多様な基質特異性を有する。肝臓に存在するその他の酵素は、例えば、フラビン−モノオキシゲナーゼ、カルボキシルエステラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、モノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）、ロダネーゼ、Ｎ−アシルトランスフェラーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼである。
【０００４】
潜在的薬剤候補の代謝安定性は、薬剤候補の治療有効性と密接に関連しているので、薬剤候補の選択のための重要な規準の１つである。潜在的薬剤候補の代謝安定性が劣る（つまり、効率的に代謝される）場合、定常状態の薬剤レベルは治療量未満であり、薬剤作用は全くもたらされない。そのため、かかる薬剤候補は最適治療薬ではない。
【０００５】
ヒトにおける新薬の臨床試験は費用と時間のかかるプロセスである。臨床試験に付される薬剤の約４０％が、不都合な薬剤動態特性、例えば代謝安定性が劣るために撤回される。候補薬剤が後で失敗すると、開発企業の収益性に多大な影響を与えるし、上市後に医薬品を回収することは、製薬会社の評価と評判にさらに深刻な打撃を与える。
【０００６】
そのため、潜在的薬剤候補を臨床試験に用いる前にその代謝安定性に関する情報を得ることのできる簡単な「スクリーニングタイプ」アッセイに多大な関心がもたれている。
【０００７】
ＮＭＲに基づく方法を代謝の研究に用いることは公知である。一般に、薬剤又は薬剤候補の代謝は、所定量の薬剤を投与した動物から血液や尿サンプルのようなサンプルを採取することによって動物モデルを用いてインビボで調べられている。サンプルから薬剤代謝物を単離してＮＭＲ分光法で同定する（例えば、Ｔ．Ｋｏｕｄｒｉａｋｏｖａ他，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  １９９６，  ２７９（３），  １３００−１３０９参照）。この方法の短所は、サンプルからの代謝物の単離が時間のかかるプロセスであることである。さらに、薬剤とその代謝物の回収率が低くなる可能性があり、ＮＭＲ分析で少量の代謝物を検出するのは困難となりかねない。その他の短所は、この研究がインビボで実施され、「スクリーニングタイプ」アッセイには向かないことである。
【０００８】
Ｋ．Ａｋｉｒａ他，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  ２９，  ２００１，  ９０３−９０７には、ＣＹＰ４５０アイソザイムによる１３Ｃ−標識アンチピリンの代謝の研究に１３Ｃ−ＮＭＲ分光法を用いることが記載されている。従来の１３Ｃ−ＮＭＲ分光法の感度が低いため、薬剤を大量に投与しなければならず、インビボモデルで薬の副作用を起す潜在的危険性を生じる。
【０００９】
国際公開第０１／９６８９５号パンフレットには、ＮＭＲ分析前に試験化合物に存在するＮＭＲ活性核種の核分極を促進すること（過分極）によって、生体系における試験化合物の運命に関する情報を得る方法が記載されている。
【００１０】
国際公開第０３／０８９６５７号パンフレットには、ヒト個体の表現型を分類する方法が記載されている。ヒト個体にプローブ化合物（薬剤）を投与し、個体からサンプルを採取し、これを次いで過分極させてＮＭＲで分析する。この方法は人間を必要とするので、その薬剤で臨床試験を実施するのが有用であるか否かを決定するための「スクリーニングタイプ」アッセイとしてこの方法を用いることは不可能である。
【特許文献１】国際公開第０１／９６８９５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８９６５７号パンフレット
【非特許文献１】Ｔ．  Ｋｏｕｄｒｉａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  １９９６，  ２７９（３），  １３００−１３０９
【非特許文献２】Ｋ．  Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  ２９，  ２００１，  ９０３−９０７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
今回、本発明者らは、薬剤候補を過分極させ、これを肝細胞と接触させ、薬剤候補／肝細胞混合物のＮＭＲスペクトルを取得することを含むＮＭＲに基づくインビトロアッセイが、その薬剤候補の代謝安定性を特徴付けるのに用いることができるという予想外の知見を得た。
【００１２】
そこで、本発明は、１種以上の薬剤候補の代謝安定性をインビトロで特徴付ける方法であって、薬剤候補を過分極させ、これを肝細胞又は肝細胞小器官と接触させて混合物を形成し、混合物のＮＭＲスペクトルを取得することを含んでなる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の方法が迅速で簡単なインビトロアッセイであることから、多数の潜在的薬剤候補のスクリーニングに特に適している。そこで、本発明の方法によって、不要で費用のかさむ臨床試験を防ぐことができる。本発明の方法の長所として、肝細胞又は細胞小器官での薬剤候補のインビトロ代謝によって、その薬剤候補のインビボ代謝の予測が可能になることも挙げられる。本発明の方法では、アッセイ材料からの薬剤候補及び／又はその代謝物の時間のかかる単離を必要としない。さらに、過分極させた薬剤候補を使用するので、本発明の方法の感度は「通常の」ＮＭＲ式アッセイよりも優れており、そのため従来のＮＭＲでは検出できないごく微量の代謝物の検出が可能となる。
【００１４】
本発明では、薬剤候補はどんな化学物質でもよいが、好ましくは比較的小さな有機分子、さらに好ましくは２００Ｄａ未満の小さな有機分子である。薬剤候補は、天然に由来する化学物質、例えば、天然又は遺伝子改変生物（例えば微生物、植物、動物又はヒト）からの単離で得ることのできる化学物質であってもよい。かかる天然由来の化学物質は、例えば酵素その他の化合物との反応によってさらに修飾されていてもよい。また、薬剤候補は合成又は半合成の化学物質であってもよい。
【００１５】
本発明の方法では、１種類の薬剤候補又は複数の薬剤候補の混合物のいずれを用いてもよい。薬剤候補混合物中の薬剤候補の数は重要ではない。ただし、複数の薬剤候補の混合物を用いる場合、薬剤候補は好ましくは、核種薬剤候補及びそれらの代謝物を明瞭に識別するため薬剤候補及びその代謝物が十分に離散したＮＭＲスペクトルを示すように選択される。
【００１６】
本発明の方法で用いる薬剤候補は、１種以上のＮＭＲ活性核種、すなわち、ゼロ以外の核スピンをもつ核種を含んでいなければならない。好ましい核種は１３Ｃ、１５Ｎ、３１Ｐ、１９Ｆ及び／又は１Ｈである。本方法では同位体濃縮薬剤候補、さらに好ましくは非放射性同位体で濃縮した薬剤候補を使用してもよい。同位体濃縮は、薬剤候補の代謝安定性に実質的に何の影響もなく、ＮＭＲ検出が強く促進される。ただし、同位体濃縮は、ハイスループットスクリーニングでの使用にはあまり実用的でないかもしれない。同位体濃縮には費用と時間がかかるからである。
【００１７】
薬剤候補を同位体濃縮する場合、濃縮は、薬剤候補分子内の１以上の部位の選択的濃縮でもよいし、すべての部位での均一な濃縮でもよい。好ましくは、薬剤候補は分子の１箇所の部位だけで同位体濃縮される。濃縮は例えば化学合成又は生物学的標識によって達成できる。好ましくは、本発明の方法に用いる薬剤候補は、分子の１箇所だけの位置で１０％以上、最も好適には２５％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上、理想的には１００％に近い濃縮度で同位体濃縮される。
【００１８】
薬剤候補を同位体濃縮する場合、薬剤候補は１３Ｃ及び／又は１５Ｎ、好ましくは１３Ｃ又は１５Ｎ、特に好ましくは１３Ｃで濃縮される。薬剤候補分子内の同位体濃縮に最適な位置は、ＮＭＲ活性核種の緩和時間に依存する。好ましくは、薬剤候補はＴ１緩和時間の長い位置で同位体濃縮される。好ましい実施形態では、カルボキシル、カルボニル又は第四Ｃ原子で濃縮された１３Ｃ濃縮薬剤候補を用いる。
【００１９】
本発明の方法で用いるＮＭＲ活性核種を過分極させる方法は幾つかあるが、好ましい方法は希ガスからの分極移動、「ブルートフォース」、パラ水素法、ＤＮＰ及びスピン凍結であり、以下、これらについて説明する。
【００２０】
薬剤候補を過分極させる好ましい方法は、過分極した希ガスからの分極移動である。ゼロ以外の核スピンをもつ希ガスは過分極させることができ、例えば円偏光の使用によって平衡分極を超えるようにその分極を高めることができる。本発明に従って薬剤候補に存在するＮＭＲ活性核種の過分極を起こすのに、過分極希ガス、好ましくは３Ｈｅ又は１２９Ｘｅ或いはかかるガスの混合物を用いることができる。過分極は、人工的に濃縮した過分極希ガス、好ましくは３Ｈｅ又は１２９Ｘｅを用いることによっても達成し得る。過分極ガスは気相として存在してもよいし、液体に溶解してもよいし、或いは過分極ガス自体が溶媒として働くものでもよい。別法として、ガスを冷却固体表面に凝縮させ、その形態で使用してもよいし、或いは昇華させてもよい。これらの方法のいずれも、過分極ガスと過分極すべき分子との所要の均質な混合を起こすことができる。場合によっては、リポソーム又は微小気泡に過分極希ガスを封入してもよい。
【００２１】
薬剤候補を過分極させる別の好ましい方法は、極低温及び高磁場での熱力学的平衡によって薬剤候補内のＮＭＲ活性核種を分極させることである。ＮＭＲ分光計の動作磁場及び温度と比べて、過分極は極高磁場及び極低温（ブルートフォース）の使用によって達成される。用いる磁場強度はできるだけ高くすべきであり、好適には１Ｔ超、好ましくは５Ｔ超、さらに好ましくは１５Ｔ以上とし、特に好ましくは２０Ｔ以上とする。温度は極めて低くすべきであり、例えば、４.２Ｋ以下、好ましくは１.５Ｋ以下、さらに好ましくは１.０Ｋ以下、特に好ましくは１００ｍＫ以下とする。
【００２２】
薬剤候補を過分極させる別の好ましい方法は、パラ水素方法である。水素化可能な炭素−炭素二重結合又は三重結合を有する薬剤候補の不飽和前駆体を、適当な触媒の存在下でパラ水素濃縮水素ガスに曝す。すると濃縮水素が前駆体と反応して目標分子に非熱力学的スピン配置を与える。パラ水素法は、国際公開第９９／２４０８０号及び同第００／７１１６６号パンフレットに詳しく記載されており、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００２３】
薬剤候補を過分極させる別の好ましい方法は、ＤＮＰ（動的核分極）剤によって達成されるＤＮＰ法である。ＤＮＰメカニズムには、オーバーハウザー効果、いわゆる固体効果及び熱混合効果がある。ＤＮＰ剤としては、例えばクロム（Ｖ）イオンのような遷移金属、ニトロキシドラジカルやトリチルラジカルのような有機ラジカル（国際公開第９８／５８２７２号パンフレット）又は付随自由電子をもつ他の粒子など、多数の公知の常磁性化合物を使用し得る。好ましくは、低緩和性のラジカルをＤＮＰ剤として使用する。ＤＮＰ剤が常磁性ラジカルである場合、ラジカルは、分極直前のラジカル生成工程によって安定なラジカル前駆体からその場で簡便に調製し得るし、別法として電離放射線の使用によって簡便に調製し得る。ＤＮＰプロセスでは、エネルギーを通常はマイクロ波放射線の形態で与え、これによって最初に常磁性種を励起させる。基底状態に減衰する際に、目標物質のＮＭＲ活性核種への分極の移動がある。この方法では極低温で中乃至高磁場を利用でき、例えば液体ヘリウム中約１Ｔ以上の磁場でＤＮＰプロセスを実施できる。別法として、所望の研究が実施できるように十分なＮＭＲの増大が達成される温度及び中程度の磁場を使用し得る。この方法は、分極磁場を提供する第一の磁石とＭＲ分光法の一次磁場を提供する第二の磁石を用いて実施し得る。別法では、ＤＮＰ分極とＮＭＲ分光を単一の磁石で実施してもよい。
【００２４】
薬剤候補を過分極させる別の好ましい方法は、スピン凍結法である。この方法には、スピン凍結分極による固体化合物又は系のスピン分極がある。この系は、３次以上の対称軸をもつ結晶形のＮｉ２＋、ランタニド又はアクチニドイオンのような適当な常磁性物質でドープ又は均質混合される。機器は、共鳴励起磁場を印加しないので、均一磁場の必要がなく、ＤＮＰに要する機器よりも簡単である。このプロセスは、磁場方向に垂直な軸の周りに試料を物理的に回転させることによって実施される。この方法の前提条件は、常磁性種が高い異方性ｇ因子をもつことである。試料の回転の結果、電子常磁性共鳴が核スピンと接触し、核スピン温度が低下する。試料の回転は核スピン分極が新たな平衡に達するまで行われる。
【００２５】
ＤＮＰ法が、本発明において薬剤候補を過分極させる最も好ましい方法である。
【００２６】
上述の過分極法の幾つか、例えばＤＮＰ、ブルートフォース又はスピン凍結移動は、固体状態の試料に分極を移動させるときに有益である。薬剤候補試料が固体でない場合には、固体状態で実施する必要のあるいずれかの方法で過分極させる前に、適当な溶媒又は溶媒混合物中で凍結すればよい。溶媒混合物が特に適しており、特に混合物が非晶質ガラスを形成する（例えば、グリセロール、プロパンジオール又はグリコールを含む混合物）場合に適していることが判明した。かかる非晶質マトリックスは、固体内での薬剤候補の均一な分布を担保するため、ＤＮＰ過分極において好ましく使用される。
【００２７】
薬剤候補分子内のＮＭＲ活性核種の分極は、分光計の磁場及び温度での熱平衡と比較したその増強係数によって測定できる。好適には、増強係数は１０以上、好ましくは５０以上、さらに好ましくは１００以上である。
【００２８】
薬剤候補試料が固体状態であることを要する方法によって過分極を実施する場合、薬剤候補試料は好ましくは、過分極工程後に溶液又は懸濁液に加えられる。適当な溶媒は、薬剤候補と、その代謝に関与する肝細胞に存在する酵素との相互作用に干渉しない溶媒である。かかる溶媒は、リン酸緩衝液のような非重水素化緩衝液又は重水素化緩衝液であり、ＤＭＳＯやメタノールのような有機溶媒を少量含んでいてもよい。
【００２９】
過分極薬剤候補の量は重要ではない。ただし、本発明の方法の感度のため、薬剤候補の代謝安定性は、その薬剤候補の治療用量を用い、患者のインビボの状況を模擬して、決定できる。
【００３０】
本発明の方法では、過分極させた１種以上の薬剤候補を肝細胞又は肝細胞小器官と接触させて混合物を形成する。
【００３１】
好適には、本発明の方法で用いる肝細胞は、肝組織、肝組織由来の初代細胞培養物又は肝細胞株（例えば不死化肝実質細胞）の形態とし得る。本発明の方法では、ホモジナイズした形態の肝組織だけでなく、肝スライスを用いることができる。初代肝細胞培養物としては、初代肝実質細胞又はクッパー細胞が挙げられるが、肝実質細胞が好ましい。好ましい肝細胞小器官は、肝ミクロソーム、肝ミトコンドリア及び肝Ｓ９画分である。肝Ｓ９画分とは、ポストミトコンドリア上清画分を表す用語であり、サイトゾルとミクロソームとを含んでいる。ミクロソームは、Ｓ９画分の超遠心（１０４０００×ｇで１時間）で単離できる。好ましい実施形態では、本発明の方法で用いる肝細胞及び肝細胞小器官は、哺乳類由来のものであり、さらに好ましくはヒト肝細胞又は肝細胞小器官である。
【００３２】
肝細胞又は細胞小器官と１種以上の過分極薬剤候補との接触は、幾つかの方法で実施し得る。好適には、肝細胞をＮＭＲチューブに入れ、肝細胞に過分極薬剤候補を混ぜ入れる。ボルテックス処理、超音波処理、撹拌などの各種手段で混合を促進してもよい。別の好ましい実施形態では、過分極薬剤候補の溶液又は懸濁液に肝細胞又は細胞小器官を混ぜ入れる。
【００３３】
好ましい実施形態では、肝細胞又は細胞小器官と過分極薬剤候補の混合物を短時間（例えば約１０〜３０秒間）インキュベートする。
【００３４】
肝細胞又は細胞小器官と過分極薬剤候補の混合物から得るＮＭＲスペクトルは、１次元、２次元又は多次元ＮＭＲスペクトルのいずれでもよいが、好ましくは、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、３１Ｐ又は１Ｈのような選択に係る核種の１次元ＮＭＲスペクトルである。スペクトルは、抽出すべきＮＭＲパラメーターと取得すべき情報に応じて、ＲＦパルスと勾配パルスの任意の組合せで単一スキャン又は数回のスキャンで得ればよい。かかるパラメーターは、例えば化学シフト、線幅の広がり、双極子又はスカラー結合である。好ましい実施形態では、ＮＭＲスペクトルの生成には、低フリップ角を用いる。こうして、薬剤候補の時間依存性代謝分解を調べることができる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明の方法で薬剤候補から得たＮＭＲスペクトルを、次いで、肝細胞又は細胞小器官と接触させていない過分極薬剤候補（例えば代謝されていないもの）のＮＭＲスペクトル（参照スペクトル）と比較する。参照スペクトルを取得する条件は、本発明の方法によるＮＭＲスペクトルの生成条件と近似させるべきである。好ましくは、条件は、例えば溶媒の添加、ｐＨ、及びパルス長などのスペクトルパラメーターに関して同一である。参照スペクトルは、１次元、２次元又は多次元ＮＭＲスペクトルのいずれでもよいが、好ましくは、１３Ｃ、１５Ｎ、１９Ｆ、３１Ｐ又は１Ｈのような選択に係る核種の１次元ＮＭＲスペクトルである。スペクトルは、ＲＦパルスと勾配パルスの任意の組合せで単一スキャン又は数回のスキャンで得ればよい。
【００３６】
比較は、例えばピークの出現又は消失など、スペクトルの単なる視覚的アセスメントで実施し得る。好適には、比較は、コンピューター支援法で例えば本発明の方法で生成したＮＭＲスペクトルと参照スペクトルとのスペクトル差を算出することによって実施する。好ましくは、化学シフト変化、線幅の広がり、緩和時間の差、又はＮＯＥ効果の差をモニターしてもよい。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、薬剤候補の参照スペクトルを取得する必要はない。その情報は混合物から得られるスペクトルに含まれているからである。例えば、薬剤候補が完全には代謝されない場合、その薬剤候補は混合物中に存在しており、混合物から得たスペクトルにみることができる。
【実施例】
【００３８】
薬剤候補：１３Ｃ２−フマル酸ナトリウム
【００３９】
【化１】
2005181332.tif 000002
【００４０】
１．１．肝実質細胞懸濁液の調製
肝実質細胞の濃度は、ＲＰＭＩ１６４０培地の懸濁液中１×１０６細胞／ｍｌであった。この懸濁液１ｍｌを、底栓付きの１０ｍｍ  ＮＭＲチューブに入れ、有効容積を１１００μｌに減らした。チューブを、プローブ温度を３７℃に平衡化した９．４Ｔの磁石に入れた。過分極薬剤候補溶液が細胞懸濁液に注入できるように、ＮＭＲチューブの底にチューブを接続した。
【００４１】
１．２．薬剤候補の過分極及び細胞懸濁液／薬剤候補混合物の形成
１３Ｃ２−フマル酸ナトリウムを水に希釈して、４０ｍＭトリチルを含有するグリセロール溶液と混合した（ｗ／ｗ比１：１）。液体試料を液体窒素中で液滴として凍結させた。この試料８４．３ｍｇ（３．８４ｍｇの１３Ｃ２−フマル酸ナトリウム）を分極装置に入れ、９３．９４５ＧＨｚ及び１００ｍＷで２時間過分極させた（ＤＮＰ法）。１００ｍｇ／ｌのＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４、２０ｍＭ、６ｍｌ）で溶解を実施した。有効溶解容積は５．５ｍｌであり、試料は完全に回収した。１ｍｌシリンジを溶解１３Ｃ２フマル酸ナトリウム溶液で完全に満たし（容積：１１００μｌ）、この溶液の計１００μｌを液体ＮＭＲ磁石に素早く移し、細胞懸濁液に注入して、薬剤候補の総濃度を約０．４６ｍＭとした。
【００４２】
１．３．混合物のＮＭＲスペクトルの取得
１Ｄ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、３０秒のインキュベーション期間後に、１００．３９３ＭＨｚ（４００ＭＨｚ、１Ｈ）で、３７℃の１０ｍｍ  Ｖａｒｉａｎ直接検出プローブを用いて得た。ＮＭＲ取得パラメータは、スペクトル幅４０ｋＨｚ（４００ｐｐｍ）、取得時間１秒、パルス角９０°であった。１３Ｃ標識薬剤候補から１７４．８ｐｐｍに１本のＮＭＲシグナルが得られた。このシグナルは、この薬剤候補分子内の２箇所の標識位置に由来する。３本の追加のシグナルが観察されたが、その１本は１８２．３ｐｐｍ、２本は１８１．２ｐｐｍと１７９．９ｐｐｍであった。これらのシグナルは、薬剤候補の２種類の異なる代謝物、つまりコハク酸塩とリンゴ酸塩に由来する。リンゴ酸塩では、２箇所の標識炭素原子は同じ環境にはなく、異なる化学シフトを生じる。
【００４３】
本実施例では、スペクトル取得前に、３０秒のインキュベーション期間を保った。代謝物に関する情報を得る別の方法として、低フリップ角で一連のスペクトルを経時的に取得することである。
【外国語明細書】
2005181332000001.pdf