(57)【要約】【課題】  内皮細胞の遊走を促進する因子を提供すること。【解決手段】  次の（ａ）〜（ｆ）の性質：（ａ）  ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養することにより、培養上清中に得られる；（ｂ）  ケモタキセルアッセイにおいて正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の遊走を有意に促進する；（ｃ）  正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を実質的に促進しない；（ｄ）  分子量１０，０００以下；（ｅ）  ６０℃２０分間のインキュベートにより実質的に失活しない；（ｆ）  トリプシンの存在下で３７℃で２時間インキュベートしたときに実質的に失活しない；を有する化合物が開示される。本発明の化合物は、血管新生促進剤として、ならびに血管新生阻害剤の標的分子として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｆ）の性質：
（ａ）  ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養することにより、培養上清中に得られる；
（ｂ）  ケモタキセルアッセイにおいて正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の遊走を有意に促進する；
（ｃ）  正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を実質的に促進しない；
（ｄ）  分子量１０，０００以下；
（ｅ）  ６０℃２０分間のインキュベートにより実質的に失活しない；
（ｆ）  トリプシンの存在下で３７℃で２時間インキュベートしたときに実質的に失活しない；
を有する化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物を含む内皮細胞遊走促進用組成物。
【請求項３】
ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養した培養上清を含む内皮細胞遊走促進用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生を促進する因子、特に内皮細胞の遊走を促進する因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌が増殖および転移するためには、癌組織の周囲に血管新生が生ずることが必須である。癌細胞の誘導する血管新生は、癌細胞の増殖後血管新生促進因子を産生することから始まり、周皮細胞の解離、基底膜、細胞外基質の分解、内皮細胞の増殖、遊走、管空形成、などの段階がある。血管新生を促進する因子には、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ＦＧＦ、ＥＧＦなどがある。これらの血管新生因子の受容体としては、ＶＥＧＦＲやＭｅｔが知られている。また、血管内皮細胞が血管壁から外に出て遊走・増殖する際には、血管の基底膜および細胞外マトリクスを分解するマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が作用し、さらに、管腔の形成においては、αγβ３インテグリンなどの接着因子が作用することが明らかになっている。
【０００３】
しかし、腫瘍細胞と血管内皮細胞との相互作用や、血管内皮細胞の遊走および増殖のメカニズムにはまだ不明な点が多い。したがって、血管新生促進剤および血管新生阻害剤を開発するために、血管新生の作用メカニズムの解明、ならびに、新規な血管新生因子およびその受容体の発見が求められている。
【０００４】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【非特許文献１】Bruce R. Zetter ; Angiogenesis and tumor metastasis. Annu. Rev. Med. 1989, 49. 407-424.
【非特許文献２】Hayashi et al., Potential role of hepatocyte growth factor, a novel angiogenic growth factor, in peripheral arterial disease: downregulation of HGF in response to hypoxia in vascular cells. Circulation. 1999 Nov 9;100(19 Suppl):II301-8.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、内皮細胞の遊走を促進する因子を提供することを目的とする。このような物質は、血管新生促進剤として、ならびに血管新生阻害剤の標的分子として有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、次の（ａ）〜（ｆ）の性質：
（ａ）  ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養することにより、培養上清中に得られる；
（ｂ）  ケモタキセルアッセイにおいて正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の遊走を有意に促進する；
（ｃ）  正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖を実質的に促進しない；
（ｄ）  分子量１０，０００以下；
（ｅ）  ６０℃２０分間のインキュベートにより実質的に失活しない；
（ｆ）  トリプシンの存在下で３７℃で２時間インキュベートしたときに実質的に失活しない；
を有する化合物を提供する。本発明はまた、上述の本発明の化合物を含む内皮細胞遊走促進用組成物を提供する。
【０００７】
別の観点においては、本発明は、ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養した培養上清を含む、内皮細胞遊走促進用組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の内皮細胞遊走促進因子は、ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で１−２日間培養することにより、培養上清中に得られる。ＥＢＭ培地とは、内皮細胞培養用の基本培地であり、例えば三光純薬株式会社（東京）から市販されている。ＥＢＭ（−）培地とは、ＥＢＭ培地に血清およびＥＧＦ、ＦＧＦ等の増殖因子を加えていない培地である。
【０００９】
本発明の内皮細胞遊走促進因子は、ケモタキセルアッセイにおいて正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の遊走を有意に促進することを特徴とする。ここで、「有意に促進する」とは、ネガティブ対照と比較して２００％以上高い遊走促進活性を示すことをいう。ケモタキセルアッセイとは、数μｍの孔を有するトランスウエルに細胞を含む培養液を加え、これを試験物質を含有する培養液の入ったチャンバに入れ、一定時間経過後にトランスウエルの孔を通って移動した細胞の数を測定することにより、試験物質が細胞の遊走を促進する能力を評価するアッセイ方法である。ケモタキセルアッセイの方法および条件は当該技術分野においてよく知られており、例えば、ＫＵＲＡＢＯ（倉敷紡績株式会社）の製品カタログに開示されている。
【００１０】
また、本発明の内皮細胞遊走促進因子は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞の遊走を促進するが、その増殖を実質的に促進しないことを特徴とする。ＨＵＶＥＣ細胞の増殖の促進は、本発明の化合物を含む培地中でＨＵＶＥＣを数時間から３日間培養した後に、生細胞数を計数することにより測定することができる。ここで、「実質的に促進しない」とは、ネガティブ対照と比較して１００％以下の増殖促進活性を示すことをいう。
【００１１】
本発明の内皮細胞遊走促進因子は、限外濾過により測定して、１０，０００以下の分子量を有する。また、本発明の化合物は、６０℃２０分間のインキュベートにより実質的に失活せず、トリプシンの存在下で３７℃で２時間インキュベートしたときに実質的に失活しないという性質を有する。ここで、「実質的に失活しない」とは、それぞれの処理により活性が５０％以上失われないことをいう。
【００１２】
本発明の内皮細胞遊走促進因子は、ＨｅＬａ細胞を通常の培養条件下で、例えば１０％ＦＣＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１−３日間培養した後に、培地を血清と増殖因子を含まないＥＢＭ（−）培地に交換し、３７℃で１−２日間培養することにより、培養上清中に得ることができる。この培養上清から、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの当該技術分野においてよく知られる精製方法を用いて、本発明の化合物を得ることができる。
【００１３】
あるいは、得られた培養上清をさらに精製することなく内皮細胞遊走促進剤として用いてもよい。すなわち、本発明の別の態様においては、ＨｅＬａ細胞をＥＢＭ（−）培地中で３７℃で１−２日間培養した培養上清を含む、内皮細胞遊走促進用組成物が提供される。好ましくは、得られた培養上清を低速で遠心分離して細胞の破片などの不純物を除いてもよい。また、培養上清を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した後、凍結保存することにより、長期間安定に保存することができる。
【００１４】
本発明の内皮細胞遊走促進因子は、内皮細胞の増殖を促進することなくその遊走を促進する活性を有するため、転移性癌のマーカーならびに癌の転移性の予測に有用である。また、閉塞性動脈硬化症、虚血性心疾患、骨折、歯周病などの、血管新生を促進することにより治療効果が期待できる疾患の治療薬として有用であると考えられる。さらに、本発明の内皮細胞遊走促進因子は、血管新生阻害剤の分子標的となることができる。すなわち、本発明の内皮細胞遊走促進因子の活性を阻害する物質を見いだすことにより、癌、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症などの、血管新生を阻害することにより治療効果が期待できる疾患の治療薬を開発することが可能である。
【００１５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
ＨｅＬａ細胞のコンディションドメディウム（ＣＭ）の調製
ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍディッシュに播き、１０％ＦＣＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。２０時間後、培地を血清と増殖因子を含まないＥＢＭ（−）培地に交換し、１日培養した。培地を遠心チューブに集め、２０００回転、４℃、５分間遠心し、上清を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した後、−２０℃で保存した。以下、この上清をコンディションドメディウム（ＣＭ）と称する。
【実施例２】
【００１７】
ＨＵＶＥＣの遊走活性の測定
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の遊走活性は、ケモタキセルアッセイにより測定した。アッセイは、コラーゲンタイプＩＶでコートした孔径８μｍのトランスウエルを用いて行った。コラーゲンタイプＩＶは、生体内の基底膜の主要構成成分であり、ＨＵＶＥＣの接着を促す物質として知られている。ＨＵＶＥＣをＥＢＭ（−）中で６０００個／２００μｌでトランスウエルに播き、実施例１で調製したＣＭ５００μｌが入ったウエルに挿入して、３７℃でインキュベートした。所定の時間経過後に、トランスウエルの８μｍの孔を通って移動した細胞数を数え、これをＨＵＶＥＣ遊走活性とした。対照としては、ＥＢＭ（−）（血清および成長因子を含まない）およびＥＢＭ（＋）（Clonetics Corp. (San Diego, CA)；ＦＢＳおよび成長因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦなど）が補充されている）を用いた。
【００１８】
６時間後および２４時間後の結果を図１に示す。ＣＭは、ＥＢＭ（−）またはＥＢＭ（＋）と比較して有意にＨＵＶＥＣの遊走を促進した。このことから、ＣＭ中には、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦとは異なるＨＵＶＥＣ遊走促進因子が含まれていることが明らかになった。
【実施例３】
【００１９】
ＣＭ中に含まれるＨＵＶＥＣ遊走促進因子の特性決定
ＣＭ中に含まれるＨＵＶＥＣ遊走促進因子の特性をより詳細に調べるために、分子量分画、熱処理およびトリプシン処理の影響を測定した。
【００２０】
実施例１で調製したＣＭをＡｍｉｃｏｎ１０を用いて分子量分画を行い、分子量１０，０００以上の画分と分子量１０，０００以下の画分とに分離した。それぞれの画分について、コラーゲンタイプＩＶでコートしたトランスウエルを用いて、実施例２に記載の方法により６時間後のＨＵＶＥＣ遊走促進活性を測定したところ、分子量１０，０００以下の画分に活性が認められた（図２）。このことから、ＣＭ中に含まれるＨＵＶＥＣ遊走促進因子は、アンジオポエチン（分子量約７０，０００）またはマトリクスメタロプロテアーゼ（分子量数万）ではないことがわかった。次に、ＣＭを６０℃で２０分間インキュベートした後に活性を測定したところ、４℃で２０分間処理した場合とほとんど変わらない活性を維持していることが示された（図３）。このことから、ＣＭ中に含まれるＨＵＶＥＣ遊走促進因子は熱に対して安定であることが示唆される。また、ＣＭ１ｍｌ（約３０μｇのタンパク質を含む）に対し、トリプシン溶液（２５０μｇ／ｍｌ）を１００μｌ（２５μｇ）加え、３７℃で２時間反応し、反応後大豆トリプシンインヒビターを１００μｌ（１２μｇ）加え反応停止後、遊走活性を測定したところ、トリプシン処理によって活性が失われないことがわかった（図４）。また、ＣＭを３０％アセトニトリルを含む０．０５％トリフルオロ酢酸（ｐＨ２．０）溶液中で、約３時間室温で放置した場合にも、内皮細胞遊走促進活性が失われないことがわかった。
【００２１】
これらの結果から、ＣＭ中に含まれるＨＵＶＥＣ遊走促進因子は、分子量１０，０００以下であり、熱処理、トリプシン処理、酸処理、および有機溶媒処理に対して比較的安定であることが明らかになった。
【実施例４】
【００２２】
ＨＵＶＥＣの増殖に対するＨｅＬａ細胞ＣＭの効果
ＨＵＶＥＣを、ＣＭ、ＥＢＭ（−）（血清および成長因子を含まない）、ＥＢＭ（＋ＦＢＳ）、およびＥＢＭ（＋）（ＦＢＳおよび成長因子が補充されている）に播き、１−２日間培養した後に、ＭＴＴ法により生細胞数を測定した（図５）。この結果から、ＨｅＬａのＣＭはＨＵＶＥＣの増殖を促進する活性を有さず、むしろ阻害している可能性があることがわかった。
【実施例５】
【００２３】
ＨＰＬＣによるＨＵＶＥＣ遊走促進因子の精製
実施例１において得られたＣＭを、以下の条件でＨＰＬＣで分離した；カラム：Cosmosil 5C18；溶媒Ａ：０．０５％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：６０％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡ；勾配：溶媒Ａ（５分間）、溶媒Ａ→溶媒Ｂ（３０分間）、溶媒Ｂ（５分間）、溶媒Ｂ→溶媒Ａ（５分間）。
【００２４】
ＣＭを上述の条件で分画すると、２０のピークに分かれた（それぞれのピークをフラクション１−２０とし、Ｆ１−Ｆ２０として表示した）。それぞれの画分を濃縮し、ＥＢＭ（−）に溶解し、実施例２の方法により６時間後のＨＵＶＥＣ遊走活性を測定した。結果を図６に示す。図中、それぞれの画分の活性は棒線で表され、縦軸は遊走した細胞数を示す。対照としてはＥＢＭ（−）を用いた。フラクション３，６，８，１０，１３，１５，１７，１９は有意な活性はなかった。最も活性の高い画分はＦ１２（ＲＴ＝約１６．５分）であった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＨＵＶＥＣの遊走に対する本発明の内皮細胞遊走促進因子の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の内皮細胞遊走促進因子の分子量分画を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の内皮細胞遊走促進因子の活性に及ぼす熱処理の影響を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の内皮細胞遊走促進因子の活性に及ぼすトリプシン処理の影響を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の内皮細胞遊走促進因子のＨＵＶＥＣ増殖促進効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の内皮細胞遊走促進因子のＨＰＬＣによる精製を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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