(57)【要約】【課題】処置を行った腫瘍のみならず、転移巣の治療および腫瘍の転移抑制にも有効な、新しい免疫遺伝子治療方法、および該方法を実施するために使用する抗腫瘍薬、キットを提供する。【解決手段】（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入し、抗腫瘍免疫応答を誘導することを特徴とする、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する方法、および抗腫瘍薬、キット、並びに抗腫瘍用の医薬を製造するための、上記細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入し、抗腫瘍免疫応答を誘導することを特徴とする、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する方法。
【請求項２】
細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に上記導入する方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法である請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、からなる群から選択される少なくとも一種のサイトカインの遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、からなる群から選択される少なくとも一種のサイトカインの遺伝子である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子である、請求項２記載の方法。
【請求項７】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍化学療法剤である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍化学療法剤である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍性抗生物質および／または少なくとも一種の白金製剤である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍性抗生物質および／または少なくとも一種の白金製剤である、請求項２記載の方法
【請求項１１】
上記細胞障害剤が、ブレオマイシンおよび／またはシスプラチンである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
上記細胞障害剤が、ブレオマイシンおよび／またはシスプラチンである、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子であり、上記細胞障害剤が、ブレオマイシンである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子であり、上記細胞障害剤が、ブレオマイシンである、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を有効成分として含有する抗腫瘍薬。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法による投与用である請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項１７】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、からなる群から選択される少なくとも一種のサイトカインの遺伝子である、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項１８】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、からなる群から選択される少なくとも一種のサイトカインの遺伝子である、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項１９】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子である、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項２０】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子である、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項２１】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍化学療法剤である、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項２２】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍化学療法剤である、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項２３】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍性抗生物質および／または少なくとも一種の白金製剤である、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項２４】
上記細胞障害剤が、少なくとも一種の抗腫瘍性抗生物質および／または少なくとも一種の白金製剤である、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項２５】
上記細胞障害剤が、ブレオマイシンおよび／またはシスプラチンである、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項２６】
上記細胞障害剤が、ブレオマイシンおよび／またはシスプラチンである、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項２７】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子であり、上記細胞障害剤が、ブレオマイシンである、請求項１５記載の抗腫瘍薬。
【請求項２８】
上記サイトカイン遺伝子が、ＩＬ−１２遺伝子であり、上記細胞障害剤が、ブレオマイシンである、請求項１６記載の抗腫瘍薬。
【請求項２９】
請求項１記載の方法を実施するための（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子を分離して含む製剤のキット。
【請求項３０】
請求項２記載の方法を実施するための（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子を分離して含む製剤のキット。
【請求項３１】
（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入することにより、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する医薬を製造するための、上記細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の使用。
【請求項３２】
腫瘍細胞内に（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）サイトカイン遺伝子を導入する方法がｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法である、請求項３１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞傷害剤とＴｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入することにより、抗腫瘍免疫応答を誘導し、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する方法に関するものである。さらに抗腫瘍薬および上記方法に使用されるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
悪性腫瘍に対する既存の治療法として、化学療法があるが、全身的な化学療法剤の投与は骨髄抑制などの副作用が強く、ドーズが制限されるため十分な効果が得られないことが多い。
【０００３】
全身的な副作用を軽減し、腫瘍の殺傷効果を高める目的で、抗癌剤を腫瘍局所に注入したのち、電気穿孔法を施行して薬剤を細胞内に取り込ませる治療が、すでに臨床応用されている。
【０００４】
電気穿孔法は、細胞に高電圧の電気衝撃を与えて形質膜の透過性を増加させ、分子量が大きいため、あるいは静電的・物理化学的な性状により、細胞内に十分には浸透できない薬剤を細胞内に導入することができる。従って、化学療法剤を腫瘍細胞内に局所的及び効果的に投与することが可能になり、高用量の化学療法剤による重篤な副作用を避けることが可能である。
【０００５】
すでに、表在性腫瘍に対する、ブレオマイシンまたはシスプラチンを使用した電気穿孔法の治験が行われており、治療上の有効性がこれらの研究の多数で報告されている（非特許文献１、および２参照）。しかしながら、電気穿孔法で導入された化学療法剤は、導入された腫瘍細胞内でのみ殺腫瘍性の活性を示すため、局所での効果は期待できるが、転移巣への治療効果は期待できない。
【０００６】
一方で、抗腫瘍免疫応答を誘導ないし増強する目的で、サイトカインなどの遺伝子を、レトロウイルス・ベクター、アデノウイルスベクター、カチオニック・リポソーム、電気穿孔法等により導入することで、悪性腫瘍の治療が可能である。この方法の最大のメリットは、抗腫瘍免疫は全身的に働くので、転移巣に対しても効果が期待できる点である。サイトカインの副作用を減少させるためには、遺伝子を腫瘍内に正確に送達、および／または発現させなければならない。このような状況において、電気穿孔法は、サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に導入するために非常に好適である。すでに、ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＩＬ−１８をコードする遺伝子を、電気穿孔法を用いて腫瘍細胞内に導入する実験が行われ、その有効性及び安全性が実証されている。（非特許文献３、および４参照）
【０００７】
また、併用療法として、化学療法剤の全身投与とサイトカイン遺伝子治療の併用がすでに知られているが、化学療法剤の全身投与による副作用という問題が残る。
【０００８】
その他にも、細胞障害剤を腫瘍細胞内に導入した後、腫瘍細胞周辺にＩＬ−２遺伝子そのものではなく、ＩＬ−２産生細胞（ＩＬ−２遺伝子導入細胞）を注入する実験が行われている（非特許文献５参照）。
【０００９】
しかし、この方法では、細胞自身、あるいは培養に用いた培地・増殖因子・血清等からの感染の危険性があり、厳重な安全性検査が要求される。また、組織内でのサイトカインの産生量が少ないか、産生の持続が短いか、あるいはこの両方のため、完全な緩解を得るためには、一連の処置を複数回繰り返す必要があった。
【００１０】
また、化学療法剤とサイトカイン遺伝子の両者を電気穿孔法により腫瘍細胞内に導入する実験も行われている（非特許文献６参照）。
【００１１】
この実験は、Ｂ１６メラノーマを皮下に移植したマウスを用い、ブレオマイシンと、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２発現ベクターを、前後して腫瘍内に注入後、電気パルスを与えるものであり、その結果、皮下腫瘍の増殖抑制とマウスの延命効果を認めた。サイトカイン遺伝子は、サイトカイン産生細胞に比し、作製・保存・輸送とも、はるかに簡便かつ安価に取り扱うことができる。また、サイトカイン遺伝子と抗腫瘍剤は同日に腫瘍内に注入することができるため、患者への負担も少ないと考えられる。
【００１２】
しかしながら、この実験においては、ブレオマイシン単独、あるいはサイトカイン遺伝子単独に比し、両者の併用をしても相乗効果は得られず、若干の相加的な効果が認められたに過ぎない。また皮下移植腫瘍のみで実験が行われ、転移腫瘍または腫瘍の転移に対する治療効果は報告されていない。
【００１３】
【非特許文献１】
Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：  ９６４−９７１．
【非特許文献２】
Ｄｏｍｅｎｇｅ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｎｅｗ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７７：  ９５６−９６３．
【非特許文献３】
Ｋｉｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：  １２３４−１２４０．
【非特許文献４】
Ｌｕｃａｓ，  Ｍ．  Ｌ．，  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｌ．，  Ｃｏｐｐｏｌａ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｒ．  （２００２）．  ＩＬ−１２  ｐｌａｓｍｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｂ１６．Ｆ１０  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：  ６６８−６７５．
【非特許文献５】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：３０−３８，１９９５Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ，１７（１）．
【非特許文献６】
Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ  １０：  ５７７−５８３，  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｌ．，  Ｐｏｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｃ．，  Ｊａｒｏｓｚｅｓｋｉ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｒ．  （２０００）．
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、転移巣や術後残存腫瘍にも有効な、新しい免疫遺伝子治療のシステムが望まれていた。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために検討を重ねた結果、Ｔｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカインの遺伝子と抗腫瘍化学療法剤等の細胞傷害剤の両者を腫瘍細胞内に導入することによって、抗腫瘍免疫応答が相乗的に増強され、単独の治療に比し非常に強力な腫瘍抑制効果が得られるということを見出し、本発明を完成した。
【００１６】
すなわち、本発明は、（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入し、抗腫瘍免疫応答を誘導することを特徴とする、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する方法に関する。
【００１７】
本発明の原理は以下のように考えられる。細胞内に導入された抗腫瘍化学療法剤等の細胞傷害剤によって腫瘍細胞が傷害を受け、腫瘍抗原を細胞外に放出する。この腫瘍抗原は免疫系、とくに抗原提示細胞に捉えられる。あるいはこの腫瘍細胞は、貪食細胞に効率よく貪食、ないしは処理される。このようにして、細胞傷害剤の導入を受けていない場合に比し、腫瘍抗原が効率よくプロセシングされ提示される。
【００１８】
また近年、腫瘍細胞がアポトーシスを起こして死ぬことが、腫瘍特異抗原の提示を誘導するのに特に重要であることが示された。アポトーシス細胞は、樹状細胞（ＤＣｓ）によって効率的に貪食され、抗原処理される。抗原は、クラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示され、その結果、腫瘍特異的なＴ細胞応答が誘引される。
【００１９】
一方、腫瘍細胞内にＴｈ１を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子を導入した場合、そのサイトカインが、Ｔｈ１細胞を誘導、活性化する。すなわち、抗腫瘍化学療法剤等の細胞傷害剤とＴｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカイン遺伝子の共導入により、以下のことが予期される。▲１▼細胞傷害剤の導入により、腫瘍特異抗原の提示が促進され、その結果Ｔ細胞が刺激される。▲２▼Ｔ細胞は次に、Ｔｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカインの影響の下でＴｈ１に分化する。これら２つのプロセスが相乗的に作用して強力な細胞性免疫誘導と抗腫瘍免疫応答を引き出すと考えられる。
【００２０】
すなわち本発明の特徴は、細胞傷害剤とＴｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入することによって、予想されなかった複合的効果（転移腫瘍の抑制、細胞傷害性Ｔ細胞活性の著明な上昇等）が得られる点である。これはＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−２の遺伝子では得ることのできなかったものである。悪性腫瘍の遺伝子治療は転移性の腫瘍を治療することに主眼があるため、この複合的効果のもつ意義は非常に大きい。したがって、本発明は、単に既存の２つの方法を組み合わせて予想されるだけの効果が得られるというものではなく、予想をはるかに越える高い効果が、これまで知られていなかった相乗作用により導けるというものである。
【００２１】
また、Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子以外であっても、抗腫瘍免疫応答を誘導するいずれかのステップの一箇所、または複数箇所を増強するサイトカイン等の遺伝子を用いることによって、抗腫瘍免疫応答が相乗的に増強され、単独の治療に比し強力な腫瘍抑制効果が得られると考えられる。すなわち、以下のことが予見される。抗腫瘍化学療法剤等の細胞傷害剤によって腫瘍細胞が増殖抑制を受け、あるいは細胞周期が停止ないしは抑制され、あるいは蛋白合成等の代謝が抑制され、あるいは死ぬ際に、腫瘍抗原を細胞外に放出する。この腫瘍抗原は免疫系、とくに抗原提示細胞に捉えられる。あるいはこの腫瘍細胞は、貪食細胞に効率よく貪食、ないしは処理される。このようにして、細胞傷害剤を受けていない場合に比し、腫瘍抗原が効率よくプロセシングされ提示される。サイトカイン等は、これらステップの１カ所、または複数ヶ所を増強することにより、腫瘍抗原提示を亢進させる。すなわちサイトカイン等は、抗原提示細胞あるいは貪食細胞を、腫瘍局所に誘導し、あるいは腫瘍局所に留め、あるいは増殖させ、あるいは貪食・プロセシング等の活性を高め、あるいはサイトカイン、ケモカイン、過酸化ラジカル等の産生を高めるなどの効果を及ぼす。サイトカイン等はまた、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等のエフェクター細胞に働いて、腫瘍局所に誘導し、あるいは増殖させ、あるいは抗原認識・標的障害等の活性を高め、あるいはサイトカイン、ケモカイン、それらのレセプター等の発現を高めるなどの効果を及ぼす。どの免疫担当細胞にどのように働くかは、用いるサイトカイン等によって異なり、したがって目的に応じて適切なサイトカイン等遺伝子を選べばよい。このように抗腫瘍免疫能が増強すると、その結果さらなる腫瘍細胞のダメージ、ないしは死を導き、ポジティブ・フィードバックが形成されると考えられる。このようなサイトカイン等としては、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、に加えてインターフェロン（ＩＦＮ）−ａｌｐｈａ、ＩＦＮ−ｂｅｔａ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ｌＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９等が考えられる。これらはＴｈ１細胞の誘導・活性化に限らず、抗腫瘍免疫応答を誘導するいずれかのステップを増強することにより、相乗的な効果を発揮すると考えられる。増強するステップは、一箇所であっても、複数箇所であってもよい。
【００２２】
上記治療・抑制方法において、腫瘍細胞内に細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子を導入するための方法は、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法である。細胞傷害剤を細胞外から与えるのではなく、腫瘍細胞内に電気穿孔法等を用いて導入することで、分子量が大きいため、あるいは静電的・物理化学的な性状により、細胞内に十分には浸透できない薬剤も、働かせることができる。また、通常の投与では薬剤に耐性を獲得している腫瘍に対しても効果が期待できる。
【００２３】
Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子としては、例えば、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ、を挙げる事が出来、これらは一種のみで腫瘍細胞内に導入されてもよく、複数種が導入されてもよい。特に好ましいサイトカイン遺伝子はＩＬ−１２遺伝子である。ＩＬ−１２は、細胞性免疫応答の誘導において重要な役割を果たすサイトカインであり、ＮＫ細胞のみならずＣＴＬの増殖および傷害活性を増強する。ＩＬ−１２はＴｈ１細胞を強力に誘導、活性化し、Ｔｈ１応答を亢進し、インターフェロンγの産生を誘導する。従ってＩＬ−１２遺伝子と細胞傷害剤とを併用することにより、腫瘍に対する免疫応答を著明に増強させることができる。
【００２４】
上記細胞傷害剤は、好ましくは抗腫瘍化学療法剤であり、より好ましくは抗腫瘍性抗生物質、白金製剤である。また、一種のみで用いられてもよく、複数種が用いられてもよい。さらに好ましくは、ブレオマイシン、シスプラチンである。ブレオマイシンやシスプラチンは標的細胞にアポトーシスを誘導し得る。
【００２５】
また、上記方法を行うに際して、腫瘍細胞内に導入するサイトカイン遺伝子がＩＬ−１２遺伝子であり、細胞傷害剤がブレオマイシンであることがより好ましく、腫瘍細胞内に導入する方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法であればさらに好ましい。
【００２６】
また本発明は、（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を有効成分として含有する抗腫瘍薬に関する。また、上記抗腫瘍薬はｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法による投与用であることが好ましい。
【００２７】
また本発明は、上記の治療・抑制方法を実施するために用いる、（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子を分離して含む製剤のキットに関する。
【００２８】
さらに本発明は、（ａ）細胞傷害剤と（ｂ）Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入することにより、腫瘍または転移性腫瘍を治療し、または腫瘍の転移を抑制する医薬を製造するための、上記細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の使用に関する。
【００２９】
【発明の実施の形態】
細胞傷害剤とは、細胞を傷害する化学物質一般、例えば、コレラトキシンであり、好ましくは抗腫瘍化学療法剤、例えば、抗腫瘍性抗生物質、白金製剤、アルキル化剤、葉酸代謝拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗腫瘍性植物成分製剤などであり、より好ましくは抗腫瘍性抗生物質、白金製剤である。抗腫瘍性抗生物質としては、例えばマイトマイシン類、アントラサイクリン類、アクチノマイシン類、オーレラリック酸類などを挙げることができ、特に好ましくはブレオマイシンである。白金製剤としては、例えばカルボプラチンを挙げることができ、特に好ましくはシスプラチンである。また、これらの薬学的に許容される塩も含まれ、例えば本発明のブレオマイシンには、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン等が含まれる。
【００３０】
Ｔｈ１細胞を誘導および／または活性化するサイトカインとは、例えば、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａ等である。より好ましくは、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８であり、さらに好ましくはＩＬ−１２である。
【００３１】
本発明を適用し得る腫瘍には、悪性黒色腫、皮膚癌、頭頚部癌などの表在性の腫瘍のみならず、内視鏡的に到達可能な腫瘍（食道癌、胃癌、肺癌、大腸癌など）、超音波ガイド下に到達可能な腫瘍（前立腺癌、腎癌、肝癌、肺癌など）、手術中に操作可能な腫瘍（肝臓癌、膵癌、頭蓋内腫瘍など）等が含まれる。またこれらの腫瘍からさまざまな臓器に転移した転移性腫瘍、腹膜播種、胸膜播種等の治療にも用いることができる。さらに、様々な転移性腫瘍、あるいは手術後の残存腫瘍の治療にも用いることができる。また、転移が明らかでない場合、あるいは転移の予防に用いることができる。
【００３２】
抗腫瘍免疫応答とは、免疫や体防御に関与する細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、好中球など）、または物質（抗体、補体、サイトカイン、活性酸素など）が、腫瘍細胞に対し、特異的、または非特異的に細胞死、または増殖抑制をもたらす作用全般をさす。この過程で、樹状細胞などが腫瘍抗原を提示することもある。
【００３３】
細胞傷害剤及びサイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に導入する方法は、全身性の副作用を避けるため、腫瘍細胞に局所的に導入できる方法が好ましい。例えば、サイトカイン遺伝子を局所的に導入する方法としては、ｉｎ−ｖｉｖｏ電気穿孔法、遺伝子銃、超音波導入法、およびウイルスベクター、カチオニックリポソーム、カチオニックポリマーを用いて、あるいはｎａｋｅｄ  ＤＮＡとして腫瘍内に注入、または腫瘍血管内に注入する方法などがあり、細胞傷害剤を局所的に導入する方法としては、ｉｎ−ｖｉｖｏ電気穿孔法、あるいは、カチオニックリポソームを用いて腫瘍内・腫瘍血管内に注入する方法などがある。細胞傷害剤およびサイトカイン遺伝子の両者を導入できる、ｉｎ−ｖｉｖｏ電気穿孔法が特に好ましいが、２つ以上の導入法を組み合わせて、本発明の方法を行ってもよい。
【００３４】
電気穿孔法で細胞傷害剤を導入するに当たっては、高電圧（約１３５０Ｖ／ｃｍ）・ショートパルス（約１００μｓｅｃ）で通電を行うのが一般的であるが、遺伝子の導入に際しては、高電圧により遺伝子が突然変異をおこす可能性がある。従って、細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の両者を同時に、電気穿孔法で導入する際には低電圧（約１２５Ｖ／ｃｍ）・ロングパルス（約５０ｍｓｅｃ）を用いることが好ましい。細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子を別個に電気穿孔法で導入する場合には、細胞傷害剤の導入に高電圧・ショートパルスを用い、サイトカイン遺伝子の導入に低電圧・ロングパルスを用いてもよい。
【００３５】
本発明のサイトカイン遺伝子は、サイトカインをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。例えば、ゲノムＤＮＡ，ゲノムＤＮＡライブラリー、または、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞・組織由来のｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリーより公知の方法により単離されたもの、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡのいずれでもよい。また、アミノ酸配列を変えないように塩基配列を人為的に変更した遺伝子であってもよい。またアミノ酸配列は変わっても、サイトカインとしての機能を変えないように、塩基配列を人為的に変更した遺伝子であってもよい。またこれら遺伝子はＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。具体的には、ＧｅｎＢａｎｋなどに記載のｃＤＮＡを用いることが出来る。本発明のＩＬ−１２遺伝子はすでに公知であり、例えばヒトリンパ球由来ｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。これら遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により、例えばプラスミドベクターに挿入し大腸菌にトランスフォームするなどの方法によって調整できる。このようにして調整した遺伝子はまた、例えばイオン交換クロマトグラフィー法によっても精製可能である。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法、遺伝子銃、超音波法を用いて、サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に導入する際には、サイトカイン遺伝子を発現するプラスミドベクターを用いることが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えばｐＣＭＶ、ｐＲＳＶ、ｐＳＶ、ｐＣＡＧＧＳなどがある。プロモーターとしては、例えばサイトメガロウイルスＩ−Ｅプロモーター、ｂ−ａｃｔｉｎプロモーター、ＥＦ−１プロモーター等があり、標的とする腫瘍細胞の種類に対応して適切なプロモーターを選ぶことができる。より好ましいプラスミドベクターはＥＢＶ−ｂａｓｅｄ  プラスミドベクターであり、例えば図１に示すｐＧＥＧがある。また、サイトカイン遺伝子を腫瘍内に注入、または腫瘍血管内に注入して腫瘍細胞内に導入する場合には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＨＶＪベクターなどのウイルスベクター、あるいは人工ウイルス粒子を用いる事ができる。またサイトカイン遺伝子は、ＤＮＡの断片、またはＲＮＡの形で導入することもできる。
【００３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法を用いて本発明の方法を行う場合には、例えば、細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子を腫瘍内に注入した後に、電気穿孔法により両者を腫瘍細胞内に導入することができる。この際、細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の両者を同時に腫瘍内に注入してもよく、または、それぞれを単独で、連続してあるいは適当な間隔をおいて腫瘍内に注入することも可能である。患者への負担軽減の面からは、両者を同時に注入することが好ましい。単独で注入する場合は、細胞傷害剤を先に注入しても、サイトカイン遺伝子を先に注入してもよく、また両者を間隔をおいて注入する場合、間隔は、好ましくは１秒〜６週間であり、より好ましくは１分〜２週間、さらに好ましくは１分〜３日である。
【００３８】
さらに、細胞傷害剤および／またはサイトカイン遺伝子を塗布剤、または貼付剤として腫瘍に塗布・貼付し、その後電気穿孔法を行ってもよい。例えば、細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍に塗布・貼付し、その後に電気穿孔法を行なうことも可能である。また、サイトカイン遺伝子を、塗布剤、または貼付剤として腫瘍に塗布・貼付し、その前、またはその間、またはその後に、細胞傷害剤を腫瘍に注入、または腫瘍の血管内への注入などにより投与し、腫瘍に電場がかかるように電極を装着して電気穿孔法を行なってもよく、またはその逆に、細胞傷害剤を、腫瘍に塗布・貼付し、その前、またはその間、またはその後に、サイトカイン遺伝子を腫瘍に注入し、または腫瘍の血管内へ注入し、または静脈内注入などにより投与し、腫瘍に電場がかかるように電極を装着して電気穿孔法を行なってもよい。
【００３９】
また、電気穿孔法以外の方法を用いて、サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞内に導入することも可能である。例えば、細胞傷害剤を腫瘍内に注入し、あるいは塗布剤、または貼付剤として腫瘍に塗布・貼付して、電気穿孔法を行ない、その前、またはその間、またはその後に、サイトカイン遺伝子を電気穿孔法以外の方法で腫瘍細胞内に導入することもできる。例えば、サイトカイン遺伝子を遺伝子銃にて腫瘍に導入してもよく、サイトカイン遺伝子をマイクロバブルとともに腫瘍内に注入し、または腫瘍の血管内へ注入し、または静脈内注入などにより投与し、腫瘍を標的として超音波を当てることにより導入してもよく、あるいは、サイトカイン遺伝子を、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＨＶＪベクターなどのウイルスベクター、あるいは人工ウイルス粒子に組み込んで腫瘍内に注入、または腫瘍血管内に注入してもよい。
【００４０】
上記のように、両者を別々に腫瘍細胞内に導入すること、および異なる方法で導入することが可能である。また両者の導入を同じ方法で行う場合、例えばそれぞれを電気穿孔法で導入する場合、適宜バッファー、パルス条件を調節して行ってもよい。簡便さと患者への負担軽減の面からは、両者を同時に導入することが好ましい。
【００４１】
本発明のサイトカイン遺伝子および細胞傷害剤は、それぞれ１種類であってもよく、異なる２種以上であってもよい。例えば、２種以上のサイトカイン遺伝子および／または２種以上の細胞傷害剤を１度に導入してもよく、あるいは導入を複数回行う場合には、回ごとに異なるサイトカイン遺伝子および／または細胞傷害剤を導入してもよい。また、本発明のサイトカイン遺伝子以外のサイトカイン遺伝子を導入することもできる。用いるサイトカイン遺伝子および／または細胞傷害剤の種類・組み合わせは、腫瘍の種類、症状の程度等により、適宜選択することができる。また、複数回の導入を行う場合は、前回までの導入による治療効果、副作用等を考慮しつつ、適切な種類、組み合わせを決定することが可能である。
【００４２】
２種以上のサイトカイン遺伝子を導入する場合、例えば、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ｌＬ−２１、ＩＬ−２７、トランスフォーミング増殖因子−ｂｅｔａ、腫瘍壊死因子−ａｌｐｈａからなる群から選択される少なくとも一種のサイトカインの遺伝子以外にも、他のサイトカイン（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−ａｌｐｈａ、ＩＦＮ−ｂｅｔａ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ｌＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９等、あるいは、ＩＬ４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのＴｈ２を誘導および／または活性化するサイトカイン、免疫抑制性のサイトカイン、ＩＬ−１やＩＬ−６などの炎症性サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦやＧ−ＣＳＦなどの造血性サイトカイン、ＩＬ−２などの増殖因子等）の遺伝子の一種以上を腫瘍細胞内に導入してもよい。
【００４３】
細胞傷害剤・サイトカイン遺伝子の使用量、導入回数および導入間隔は、患者の性別・年齢・体重・腫瘍の種類・症状の重篤さ加減・治療効果等によって、適宜決定することができる。また、これらの使用量、導入回数および導入間隔は、投与する有効成分、剤形、投与方法によっても、適宜選択可能である。
【００４４】
使用量の例として、サイトカイン遺伝子の場合、１日当たりの使用量は、通常、１  ｐｍｏｌ〜１００  ｎｍｏｌ範囲であり、好ましくは１０  ｐｍｏｌ〜１０  ｎｍｏｌ、さらに好ましくは１００  ｐｍｏｌ〜３  ｎｍｏｌの範囲である。また、細胞傷害剤の１日あたりの使用量は、各薬剤の添付文書等に記載された用法・用量を考慮して、適切な量を決定する事ができるが、通常は、添付文書に記載された１日あたりの投与量の、約０．００２％〜１００％、好ましくは０．０２％〜１００％、より好ましくは約０．２％〜４０％、さらに好ましくは約２％〜１０％量を投与する。例えば、細胞傷害剤がブレオマイシンである場合、１日あたりブレオマイシンを０．３μｇ〜３０ｍｇの範囲で投与することが可能であり、好ましくは３μｇ〜３０ｍｇ、より好ましくは、３０μｇ〜１０ｍｇさらに好ましくは３００μｇ〜３ｍｇの範囲で投与可能である。上記サイトカイン遺伝子、細胞傷害剤を腫瘍内に注入する場合には、通常は適当な希釈液に溶解して使用するが、好ましくは高濃度で用いる。
【００４５】
また、導入回数は、通常、１回〜５回、好ましくは３回〜４回であり、導入間隔は、通常１〜２８日、好ましくは２〜７日であるが、これに限定されるわけではない。また、細胞傷害剤とサイトカイン遺伝子の投与回数が同じである必要はなく、治療の効果の程度、副作用の有無、患者の容体等を考慮しつつ、適宜調整可能である。
【００４６】
さらに、本発明の方法は、他の抗腫瘍療法と組み合わせて行うことが可能である。例えば、化学療法、手術、放射線療法、ホルモン療法などと同時期に、あるいはその前または後に行うことができる。例えば、手術後に、残存腫瘍の治療および／または腫瘍の転移の抑制のために行うことや、抗癌薬の経口投与等と併用して、より効率的に腫瘍を治療しおよび／または抗癌薬の使用量を低減させる目的で行うこと等も可能である。
【００４７】
さらに、本発明の方法は、副作用を低減するための薬剤の投与や、疼痛緩和のためのモルヒネの投与等の支持療法と平行して行うこともできる。
【００４８】
本発明の抗腫瘍薬は、医薬製剤の製造において一般的に用いられている公知の手段に従って、サイトカイン遺伝子および細胞傷害剤を、そのままあるいは薬学的に許容される担体と混合して製造することができる。例えば、各有効成分を水もしくはそれ以外の薬学的に許容しうる液剤と混合して無菌性溶液、ないし懸濁液剤とし、あるいは各有効成分を凍結乾燥して用時溶解用の固形状混合物とし、注射用剤として非経口的に用いることができる。本発明の抗腫瘍薬の形態としては、例えば注射用剤、塗布用剤、貼付用剤等がある。
【００４９】
本発明のキットは、細胞傷害剤およびサイトカイン遺伝子のそれぞれを個別に製剤化したものであって、例えば、各有効成分をそれぞれ固形状または水溶液としたもの、いずれかが水溶液で別の有効成分が固形状である注射用キットなどが挙げられる。また、個別に製剤化した各有効成分を、使用時に希釈剤などを用いて混合して投与するためのキット製品、個別に製剤化した各有効成分を、同時に、あるいは時間差をおいて、別々に、同一対象に投与するためのキット製品なども本発明のキットに含まれる。本発明のキットは、注射用に限られず、例えば各有効成分を使用時に混合し、塗布剤または貼付剤として用いるためのキット等も含む。本発明のキットに含まれる製剤は、医薬製剤の製造において一般的に用いられている公知の手段に従って製造することができる。
【００５０】
本発明の抗腫瘍薬、またはキットに含まれる製剤の製造に用いられてもよい薬学的に許容され得る担体としては、例えば固形製剤においては賦形剤等があり、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、等張化剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、懸濁化剤、無痛化剤等が挙げられる。溶剤としては、例えば注射用水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油などがあり、溶解補助剤としては、例えばヨウ化カリウム、安息香酸ナトリウム、ニコチン酸ナトリウムなどがあり、等張化剤としては、例えば食塩、ブドウ糖などがあり、緩衝剤としては、例えばクエン酸、酢酸、リン酸などのナトリウム塩があり、安定剤としては、例えばヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどがあり、保存剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノールなどがあり、懸濁化剤としては、例えばカルメロースナトリウム、ポビドンなどがあり、無痛化剤としては、例えば塩化ベンザルコニウム、塩酸カルボカインなどがある。また、塗布用剤においては、例えば、油脂性基剤・乳剤性基剤・水溶性基剤のような軟膏基剤、抗酸化剤・保存剤のような安定化剤、保湿剤等が挙げられ、貼付用剤においては、粘着剤、皮膚透過促進物質、安定化剤等が挙げられる。
【００５１】
投与方法が、上述のｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法である場合には、本発明にかかる抗腫瘍薬・キットの好ましい形態は注射用剤、塗布用剤、貼付用剤であるが、特に好ましくは注射用剤である。
【００５２】
本発明の抗腫瘍薬・キットは、それぞれ異なる２種以上の本発明の細胞傷害剤および／またはサイトカイン遺伝子を含んでいてもよい。その際、キットにおいては、１種ごとに製剤化されてもよく、または、混合されて、一剤の細胞傷害剤含有製剤・一剤のサイトカイン遺伝子含有製剤とされてもよい。
【００５３】
本発明の抗腫瘍薬およびキット中のサイトカイン遺伝子は、ＤＮＡの断片、またはＲＮＡの形で含まれてもよいが、当該抗腫瘍薬・キットの投与方法に適した遺伝子発現ベクターに組み込まれて含まれることが好ましい。例えばｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法、遺伝子銃、超音波法により腫瘍細胞内に導入される製剤の場合は、プラスミドベクターに組み込まれることが好ましい。また、腫瘍内または腫瘍血管内に注入することにより腫瘍細胞内に導入される製剤の場合には、ウイルス性ベクターや人工ウイルス粒子に組み込まれることが好ましく、またはプラスミドベクターと、カチオニックリピッド、カチオニックポリマーなどのキャリアーの複合体として含まれることがより好ましい。さらに腫瘍内または腫瘍血管内に注入することにより腫瘍細胞内に導入される製剤の場合には、プラスミドベクターと、カチオニックリピッド、カチオニックポリマーなどのキャリアーが別個に含まれたそれぞれの製剤であってもよい。また遺伝子銃による導入のための金粒子などのパーティクルに結合していても良く、また超音波導入のためのマイクロバブルと結合していてもよい。また、遺伝子銃による導入のためのプラスミドベクターと金粒子が別個に含まれたそれぞれの製剤であってもよい。また、超音波導入のためのプラスミドベクターとマイクロバブルが別個に含まれたそれぞれの製剤であってもよい。
【００５４】
本発明の抗腫瘍薬およびキットは、本発明の細胞傷害剤およびサイトカイン遺伝子の他に、他の医薬を含有してもよい。例えば、副作用を防止・低減する医薬、本発明のサイトカイン遺伝子以外のサイトカイン遺伝子等を含有してもよい。また、他の医薬は本発明の細胞傷害剤およびサイトカイン遺伝子と混合されて製剤化されていてもよく、あるいは単独で製剤化されて、本発明の抗腫瘍薬あるいはキットと組み合わされてもよい。
【００５５】
本発明の抗腫瘍薬およびキットは、局所投与用であることが好ましく、腫瘍組織局所投与用であることがより好ましい。特に好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法による腫瘍組織局所投与用である。
【００５６】
薬理実験例の概要
１．マウスの皮下に固形腫瘍を形成させ、サイトカイン発現ベクターおよび／または細胞傷害剤をｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法で腫瘍細胞内に導入した後、血清サイトカイン濃度を測定して、遺伝子発現効率を検討する（図４参照）。
２．  １と同様にしてマウスの皮下に固形腫瘍を形成させ、サイトカイン発現ベクターおよび／または細胞傷害剤をｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法で腫瘍細胞内に導入した後、腫瘍を採取し、ホモゲナイズしたのち、腫瘍組織内サイトカイン濃度を測定し、マウス腫瘍での遺伝子発現効率を検討する（図５参照）。
３．抗腫瘍効果を検討する目的で、マウスの皮下に形成させた固形腫瘍にサイトカイン発現ベクターおよび／または細胞傷害剤をｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法で導入し、皮下腫瘍の体積を計測する（図６参照）。
４．３の各群のマウスの生存を毎日確認し、生存率を検討する。一方、細胞傷害剤とサイトカイン発現ベクターの両者の導入により、生存したマウスに対し、再度同じ腫瘍を移植し、同一の腫瘍に対する特異的免疫能の獲得の有無を検討する（図７参照）。
５．腫瘍の転移、または転移性腫瘍に対する治療効果を検討する目的で、肺転移マウスを作成し、サイトカイン発現ベクターおよび／または細胞傷害剤をｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法で腫瘍細胞内に導入した後、両側の肺を摘出し、転移巣の数をカウントする（図８参照）。
６．肺転移マウスの生存を毎日確認し、生存率を検討する（図９参照）。
７．皮下腫瘍マウスに、細胞傷害剤および／またはサイトカイン遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法で導入し、ＣＴＬアッセイ、およびＮＫアッセイを行ない、抗腫瘍免疫応答の誘導を解析する（図１０・１１参照）。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５８】
「実験に使用したベクター」
プラスミドベクターとして、ｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２を用いた（図１左）。これは非特許文献（Ｋｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８：１２３４−１２４０，  ２００１）に記載されているが、概略を説明すると、以下のコンポーネントからなるプラスミドベクターである。すなわち、ＣＡＧプロモーター、マウスＩＬ−１２  ｐ４０遺伝子ｃＤＮＡ、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  （ＩＲＥＳ）配列、マウスＩＬ−１２  ｐ３５遺伝子ｃＤＮＡ、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰ配列、ＥＢＶのＥＢＮＡ１遺伝子、ＣＡＧプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、およびｏｒｉ配列を有する。また、コントロールとしてｐＧＥＧ．ＧＬ３をも用いた（図１右）。これは非特許文献（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ８  （１９）：  １５０８−１５１３，  ２００１）に記載されているが、概略を説明すると、以下のコンポーネントからなるプラスミドベクターである。すなわち、ＣＡＧプロモーター、ルシフェラーゼＧＬ３遺伝子、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナル、ＥＢＶのｏｒｉＰ配列、ＥＢＶのＥＢＮＡ１遺伝子、ＣＡＧプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、およびｏｒｉ配列を有する。これらのプラスミドはいずれも、大腸菌ＨＢ１０１にトランスフォームして増幅したのち、キアゲン社製エンドフリー・プラスミド精製キットを用いて、そのマニュアルにしたがって精製した。
【００５９】
「ルシフェラーゼ遺伝子導入による導入条件の検討」
マウス腫瘍へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入の条件を検討する目的で、以下の実験を行なった。Ｃ５７ＢＬ６マウスの側腹部皮下に、Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０５個、注入することにより移植した．７日後，移植部位に固形腫瘍（平均７５ｍｍ３）が形成された（この日を第０日目とする）。マウスを無作為に３匹ずつ４群に分け、それぞれの腫瘍に以下の処理を行った。▲１▼Ｋ−ＰＢＳ（３０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １２０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ３  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  １．５  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を５０  ｍｌ注入した。▲２▼５．５  ｐｍｏｌのｐＧＥＧ．ＧＬ３（５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解したもの）を注入した。その後、それらマウスの腫瘍にピンセット型の電極を装着した（ネッパジーン社製、ステンレス鋼製、直径１．０  ｃｍ、電極間距離、０．２  ｃｍ）。電気穿孔装置、ＣＵＹ２１ネッパジーン社製）を用いて、電気パルスを与えた。電圧は、▲１▼は２５Ｖを、▲２▼はさらにマウスを４群に分け、各群に、０Ｖ、１２．５Ｖ、２５Ｖ、５０Ｖ、または７５Ｖを与えた（各群３匹づつ）。フリケンシーは毎秒１回、パルス幅は５０ミリ秒で、スクエア波を３回与えた後、極性を逆にして、さらに３回、パルスした。３日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。腫瘍に２００μＬのライシスバッファー（プロメガ社製）を加え、ソニケーターを用いてホモゲナイズした。２回凍結、融解したのち、エキストラクトを１４０００ｘｇで５分間遠心し、上清を回収した。ルシフェラーゼの活性は、プロメガ社製ルシフェラーゼアッセイキット（カタログ番号、Ｅ１４８３）を用いてプロトコールに準じて行なった。ルミノメーターを用いて１０秒間のフォトエミッションを計測した。また、おなじ腫瘍エキストラクト中の総たんぱく量を、ブラッフォードらの方法に準じて測定し、ルシフェラーゼの量は総たんぱくの量で補正した。その結果を図２に示す。ＰＢＳを注入後２５Ｖの電圧を掛けた腫瘍、およびｐＧＥＧ．ＧＬ３を注入後電圧を掛けなかった腫瘍では、どちらもルシフェラーゼの発現は測定限度以下であったが、２５〜７５Ｖを掛けた腫瘍ではルシフェラーゼの活性が認められた。異なる電圧間で比較すると、２５Ｖの群がもっとも高い発現を示した。このことから、上記電極を用いてフリケンシー毎秒１回、パルス幅５０ミリ秒で、スクエア波を計６回という条件で電気穿孔法を行なったとき、電圧は２５Ｖという低電圧ロングパルスがもっともプラスミドＤＮＡを導入するのに適した条件であることがわかった。
【００６０】
「低電圧ロングパルスによるブレオマイシンの導入」
上記のプラスミドの導入に最適の条件で、ブレオマイシンをも効率よく導入できるか否かを調べた。上記と同様に担癌マウスを作成し、▲１▼Ｋ−ＰＢＳ  ５０  ｍｌまたは▲２▼２０  μｇのブレオマイシン（５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解したもの）を注入した。上記と同様に、▲１▼には２５Ｖ、▲２▼はさらに２群に分け、それぞれ０Ｖ、または２５Ｖの電圧を掛けた（各群マウスは４匹ずつ）この最初の処理の日を第０日目とし、同様の処理をさらに第５日と第１０日に繰り返した。マウスの皮下腫瘍の体積を、以下の方法で計測した。デジタルキャリパーを用いて、２日おきに各腫瘍の長径（ａ）と短径（ｂ）を計測し、Ｖ＝ａ  ×  ｂ２／２として腫瘍の体積（Ｖ）を計算した。その結果を図３に示す。図中矢印が、電気穿孔法を行なった日を示す。また菱形、正方形、三角で表されたグラフが、それぞれ、ＰＢＳを注入し２５Ｖのパルスを加えた群菱形、ブレオマイシンを注入しパルスを与えなかった群（正方形）、ブレオマイシンを注入し２５Ｖのパルスを加えた群（三角）の３群の腫瘍の体積の平均とＳＤを表す。電気パルスとブレオマイシンのいずれか一方のみを与えた群では腫瘍著明な増大を示したが、両者を与えた群では腫瘍の増大は著しく抑制された。このことから、電気穿孔法を行わなかった場合にはこの腫瘍局所の化学療法は抗腫瘍効果を全く発揮しないこと、電気穿孔法を行なうことによりこの抗腫瘍化学療法剤が腫瘍の増殖を抑制したことが分かる。したがって、上記電極を用いて電圧２５Ｖ、フリケンシー毎秒１回、パルス幅５０ミリ秒で、スクエア波を計６回という条件で電気穿孔法を行なったとき、ブレオマイシンが腫瘍細胞に取り込まれたことが強く示唆された。
【００６１】
「実施例１」  電気穿孔法による腫瘍へのＩＬ−１２発現ベクター導入実験▲１▼
（Ａ）マウス腫瘍へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入の効率を検討する目的で、以下の実験を行なった。Ｃ５７ＢＬ６マウスの側腹部皮下に、Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０５個、注入することにより移植した．７日後，移植部位に固形腫瘍（平均７５ｍｍ３）が形成された（この日を第０日目とする）。マウスを無作為に３匹ずつ４群に分け、それぞれの腫瘍に以下の処理を行った。▲１▼Ｋ−ＰＢＳ（３０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １２０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ３  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，  １．５  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を５０  ｍｌ注入した。▲２▼２０  μｇのブレオマイシン（５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解したもの）を注入した。▲３▼５．５  ｐｍｏｌのｐＧＥＧ．ＧＬ３（５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解したもの）を注入した。▲４▼２０μｇのブレオマイシンと５．５  ｐｍｏｌのｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２（５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解したもの）を注入した。その後、それらマウスの腫瘍にピンセット型の電極を装着した（ネッパジーン社製、ステンレス鋼製、直径１．０  ｃｍ、電極間距離、０．２  ｃｍ）。電気穿孔装置、ＣＵＹ２１ネッパジーン社製）を用いて、電気パルスを与えた。電圧は２５Ｖ、フリケンシーは毎秒１回、パルス幅は５０ミリ秒で、スクエア波を３回与えた後、極性を逆にして、さらに３回、パルスした。
（Ｂ）第２，４、または６日目にマウスを安楽死させ、血清を採取し、ＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。ＥＬＩＳＡにはＲ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  社製のマウスＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡキットを用いた。その結果を図４に示す。▲１▼、▲２▼群では有意な血清ＩＬ−１２濃度の上昇は認められなかったが、▲３▼、▲４▼群では導入２、４日目に４００  ｐｇ／ｍＬ以上の高濃度のＩＬ−１２が検出された。導入後第６日目ではＩＬ−１２濃度は低下していたが、非導入群と比べると有意に高値であった。この実験から、電気穿孔法による腫瘍へのＩＬ−１２発現ベクター導入が、非常に高いＩＬ−１２産生を導くこと、このＩＬ−１２産生はブレオマイシンの共導入により抑制されないことが分かった。
【００６２】
「実施例２」  電気穿孔法による腫瘍へのＩＬ−１２発現ベクター導入実験▲２▼
実施例１（Ａ）と同様の実験を行なったのち、４日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を採取した。ソニケーターを用いて腫瘍をホモゲナイズしたのち、その抽出液中のＩＬ−１２の濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。ＥＬＩＳＡにはＲ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  社製のマウスＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡキットを用いた。また、ＩＬ−１２濃度の補正のために、同じ抽出液中のたんぱく濃度をブラッドフォードらの方法に基づいて測定した。その結果を図５に示す。上記３と合致する結果として、▲１▼、▲２▼群では有意な血清ＩＬ−１２濃度の上昇は認められなかったが、▲３▼、▲４▼群では１５００  ｐｇ／ｍｇ総たんぱく以上の高濃度のＩＬ−１２が検出された。この実験から、電気穿孔法による腫瘍へのＩＬ−１２発現ベクター導入が、非常に高いＩＬ−１２産生を導くこと、このＩＬ−１２産生はブレオマイシンの共導入により抑制されないことがさらに確認された。
【００６３】
「実施例３」  抗腫瘍効果の検討
（Ａ）ブレオマイシンおよび／またはＩＬ−１２遺伝子の導入による抗腫瘍効果を検討する目的で、以下の実験を行なった。５−６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの側腹部皮下に、Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０５個移植した．７日後，移植部位に固形腫瘍（平均７５  ｍｍ３）が形成された（この日を第０日目とする）。第０日目に、マウスを４群に分け、それぞれの腫瘍に以下の処理を行った。▲１▼ｐＧＥＧ．ＧＬ３を５．５  ｐｍｏｌ、５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（７匹）。▲２▼ｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２を５．５  ｐｍｏｌ、５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（７匹）。▲３▼２０  μｇのブレオマイシンを５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（８匹）。▲４▼２０  μｇのブレオマイシンと５．５  ｐｍｏｌのｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２を５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（８匹）。その後、それらマウスの腫瘍にピンセット型の電極を装着した（ネッパジーン社製、ステンレス鋼製、直径１．０  ｃｍ、電極間距離、０．２  ｃｍ）。電気穿孔装置、ＣＵＹ２１ネッパジーン社製）を用いて、電気パルスを与えた。電圧は２５Ｖ、フリケンシーは毎秒１回、パルス幅は５０ミリ秒で、スクエア波を３回与えた後、極性を変えてさらに３回、パルスした。同様の処置を第５日目、１０日目にも行なった。
（Ｂ）（Ａ）のマウスの皮下腫瘍の体積を、以下の方法で計測した。デジタルキャリパーを用いて、２−３日おきに各腫瘍の長径（ａ）と短径（ｂ）を計測し、Ｖ＝ａ  Ｘ  ｂ２／２として腫瘍の体積（Ｖ）を計算した。その結果を図６に示す。図中矢印が、電気穿孔法を行なった日を示す。また菱形、正方形、三角、円で表されたグラフが、（Ａ）の▲１▼―▲４▼（▲１▼◆、▲２▼■、▲３▼▲、▲４▼●）の４群の腫瘍の体積の平均とＳＤを表す。ブレオマイシン導入のみ、またはＩＬ−１２遺伝子導入のみでは腫瘍増殖は抑制されるが、その抑制効果は完全ではない。一方、ブレオマイシンとＩＬ−１２発現ベクターの両者を導入した腫瘍では、非常に効率よく腫瘍増殖が抑制できたことが分かる。
【００６４】
「実施例４」  生存率・特異的免疫能の検討
実施例３（Ａ）の各群のマウスの生存率を毎日確認し、カプランマイアー解析を行なった。その結果を図７に示す。図中矢印が、電気穿孔法を行なった日を示す。また菱形、正方形、三角、円で表されたグラフが、実施例３（Ａ）の▲１▼―▲４▼（▲１▼◆、▲２▼■、▲３▼▲、▲４▼●）の４群の腫瘍の体積の平均とＳＤを表す。ＩＬ−１２遺伝子導入のみでは担癌マウスの生存率に有意な向上は認められなかった。ブレオマイシン導入のみの群では、生存率が有意に向上したが、すべてのマウスは４９日以内に死亡し、完全寛快は得られなかった。一方、化学療法剤とＩＬ−１２発現ベクターの両者を導入した腫瘍では、すべてのマウスが５０日以上生存し、８匹中３匹のマウス（３７．５％）は腫瘍を拒絶した。そこで１５０日目に、これら生存したマウスの側腹部（腫瘍を移植した部位とは対側）に、再びＢ１６を５  ｘ  １０４個移植した（図７、大きな矢印）。すべてのマウスが、その腫瘍を拒絶し、再移植後５０日以上に亘って生存した。したがって、ブレオマイシンとｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２の両者を電気穿孔法にて導入することにより、３７．５％のマウスが完全寛快し、しかも同一の腫瘍に対する特異的な免疫能を獲得したことがわかった。
【００６５】
「実施例５」  腫瘍の転移、または転移性腫瘍に対する治療効果の検討
（Ａ）腫瘍の転移、または転移性腫瘍に対する治療効果を検討する目的で、以下の実験を施行した。５−６週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの側腹部皮下に、Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０５個移植した．７日後，移植部位に固形腫瘍（平均７５  ｍｍ３）が形成された（第０日目）。第０日目に、５  ｘ  １０４個のＢ１６細胞を尾静脈から注入し、肺転移マウスを作成した。同じ日に、マウスを４群に分け分け、それぞれの腫瘍に以下の処理を行った▲１▼ＰＢＳを５０  ｍｌ注入した（コントロール群）（４匹）。▲２▼ｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２を５．５  ｐｍｏｌ、５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（５匹）。▲３▼２０  μｇのブレオマイシンを５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（４匹）。▲４▼２０  μｇのブレオマイシンと５．５  ｐｍｏｌのｐＧＥＧ．ｍＩＬ−１２を５０  ｍｌのＫ−ＰＢＳに溶解し、この溶液を注入した（５匹）。その後、それらマウスの腫瘍にピンセット型の電極を装着した（ネッパジーン社製、ステンレス鋼製、直径１．０  ｃｍ、電極間距離、０．２  ｃｍ）。電気穿孔装置、ＣＵＹ２１ネッパジーン社製）を用いて、電気パルスを与えた。電圧は２５Ｖ、フリケンシーは毎秒１回、パルス幅は５０ミリ秒で、スクエア波を３回与えた後、極性を変えてさらに３回、パルスした。同様の処置を第５日目、１０日目にも行なった。
（Ｂ）（Ａ）のマウスを、第１４日目に安楽死させ、両側の肺を摘出し、メラノーマの転移巣の数をカウントした。その結果を図８に示す。各実験群の転移巣数は平均とＳＤで表してある。この系では、ブレオマイシン単独治療では全くコントロールに比し有意な転移抑制は認められず、ＩＬ−１２遺伝子単独導入群と、ブレオマイシン＋ＩＬ−１２遺伝子共導入群で、同程度の抑制が認められた。これは腫瘍局所で発現したＩＬ−１２が抗腫瘍免疫を誘導し、その免疫が働くことにより、遠隔臓器への転移、および／または転移腫瘍の増殖が抑制されたことを示している。
【００６６】
「実施例６」  肺転移モデルにおける生存率の検討
（Ａ）実施例５（Ａ）と同一の実験を行なった。ただし実施例５（Ａ）とは異なる点として、▲１▼―▲４▼のすべての群で５匹のマウスを用いた。
（Ｂ）（Ａ）の各群のマウスの生存率を毎日確認し、カプランマイアー解析を行なった。その結果を図９に示す。図中矢印が、電気穿孔法を行なった日を示す。また菱形、正方形、三角、円で表されたグラフが、（Ａ）の▲１▼―▲４▼（▲１▼◆、▲２▼■、▲３▼▲、▲４▼●）の４群の腫瘍の体積の平均とＳＤを表す。ＩＬ−１２遺伝子導入のみ、およびブレオマイシン導入のみの群では、担癌マウスの生存率に有意な向上は認められなかった。一方、化学療法剤とＩＬ−１２発現ベクターの両者を導入した腫瘍では、生存率が有意に向上した。したがって、ブレオマイシン＋ＩＬ−１２遺伝子共導入が、もっとも治療効果があげられることがわかった。
【００６７】
「実施例７」  抗腫瘍免疫応答誘導効果の検討
（Ａ）ブレオマイシンおよび／またはＩＬ−１２遺伝子導入により誘導される抗腫瘍免疫応答を解析する目的で、ＣＴＬアッセイ、およびＮＫアッセイを行なった。このために、「実施例３」（Ａ）と同一の治療実験を行なった。ただし「実施例３」（Ａ）と異なる点として、▲１▼―▲４▼のすべての群で３匹のマウスを用いた。
（Ｂ）第１５日目にマウスを安楽死させ、脾臓を摘出し、脾細胞のサスペンジョンを調整後、赤血球をライシスした。洗浄後、生細胞数をトリパンブルー・ダイ・エクスクルージョン法にてカウントし、エフェクター細胞とした。一方、ターゲット細胞として、Ｂ１６細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、３７０  ｋＢｑのＮａ２５１ＣｒＯ４を加え、５％ＣＯ２／９５％飽和水蒸気を含む大気中で、６０分インキュベートした。このＢ１６細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄したのち、９６穴の培養プレート（Ｕ字底）に、各ウェル１０４個／１００  ｍｌ  ずつになるように撒いた。これらのウェルに、上記のエフェクター細胞を、１０６、５  ｘ  １０５、２．５  ｘ  １０５、または１．２５  ｘ  １０５  ／１００  ｍｌとなるように調整して加えた。コントロールとして、エフェクター細胞を含まない、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を１００  ｍｌ  、エフェクター細胞に加えたウェルも作成した。また、別のコントロールとして、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を１００  ｍｌ  、エフェクター細胞に加えたウェルも作成した。（以上のウェルは、すべてトリプリケートで作成した）。４時間後、各ウェルの上清を１００  ｍｌ  回収し、ガンマカウンターにてガンマ線の放射活性（クロームリリースに相当する）を測定した。％細胞傷害を以下の式に基づいて計算した。％細胞傷害＝１００  ｘ（各エフェクターを加えたウェルの上清のクロームリリース）−（エフェクターの代わりに１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えたウェルの上清のクロームリリース）／（エフェクターの代わりに０．１  ％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を加えたウェルの上清のクロームリリース）−（エフェクターの代わりに１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を加えたウェルの上清のクロームリリース）。図１０にその結果を示す。％細胞傷害は、ブレオマイシン＋ＩＬ−１２遺伝子共導入群でのみ有意に上昇しており、この治療によってＢ１６に特異的なＣＴＬ活性が増強したことが分かる。それに対して、ブレオマイシン単独導入、またはＩＬ−１２遺伝子単独導入群では、有意なＣＴＬ増強は認められなかった。
（Ｃ）（Ｂ）と同一の実験を行なった。ただし、ターゲット細胞として、Ｂ１６細胞の代わりにＮＫ感受性のリンパ腫細胞株であるＹＡＣ−１細胞を用いた。図１１にその結果を示す。ＮＫ活性は、ブレオマイシン＋ＩＬ−１２遺伝子共導入群では非常に増強していた。ＩＬ−１２遺伝子単独導入群では、統計学的に有意な増強は認めたが、その増強の程度は、ブレオマイシン＋ＩＬ−１２遺伝子共導入群に比し低かった。それに対して、ブレオマイシン単独導入群では、有意なＮＫ増強は認められなかった。
【００６８】
「結果」
本実施例により、ｉｎ  ｖｉｖｏ電気穿孔法を用いたサイトカイン遺伝子および細胞傷害剤の共導入が、特異的および非特異的抗腫瘍免疫応答を誘導し、その結果、マウスの皮下腫瘍および転移腫瘍に対して有意な治療上の効果が得られることが実証された。
【００６９】
【発明の効果】
細胞傷害剤とＴｈ１細胞を誘導・活性化するサイトカイン遺伝子の両者を腫瘍細胞内に導入することによって、導入した腫瘍の治療効果のみならず、転移腫瘍の抑制、細胞傷害性Ｔ細胞活性の著明な上昇等の効果が得られ、その結果マウスの生存率が有意に向上する。さらに、完全寛快したマウスは、同一の腫瘍に対する特異的な免疫能を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドのマップを示す。
【図２】腫瘍内でのルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す棒グラフである。
【図３】皮下腫瘍の増殖抑制効果を示す折れ線グラフである。
【図４】血清中ＩＬ−１２濃度を示す棒グラフである。
【図５】腫瘍組織中ＩＬ−１２濃度を示す棒グラフである。
【図６】皮下腫瘍の増殖抑制効果を示す折れ線グラフである。
【図７】皮下腫瘍移植マウスの生存率を示すグラフである。
【図８】肺転移巣数の減少効果を示す棒グラフである。
【図９】肺転移マウスの生存率を示すグラフである。
【図１０】ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。
【図１１】ＮＫ活性を示す折れ線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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