(57)【要約】【課題】タンパク質を効率的に固定化することができ、タンパク質分析方法（例えば、免疫学的分析方法）などにおけるＢＦ分離操作を効率的に実施することができ、特に、時間分解蛍光測定に好適に使用可能なスルホン酸基導入ポリスチレン製担体、パートナータンパク質担持ポリスチレン製担体、及び分析方法を提供する。【解決手段】スルホン酸基導入ポリスチレン製担体は、表面にスルホン酸基を導入したことを特徴とし、相互に特異的結合可能なパートナータンパク質の一方の固定化用である。パートナータンパク質担持ポリスチレン製担体は、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体に、パートナータンパク質の一方を接触させて固定化し、非固定化パートナータンパク質を洗浄し、ブロッキング剤で処理したことを特徴とする。分析方法は、前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体を用いる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にスルホン酸基を導入したことを特徴とする、相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せの一方であるタンパク質を固定化するためのポリスチレン製担体。
【請求項２】
時間分解蛍光測定用である、請求項１に記載のポリスチレン製担体。
【請求項３】
平面状チップ基板である、請求項１又は２に記載のポリスチレン製担体。
【請求項４】
前記のスルホン酸基導入処理が、ポリスチレン製担体の表面に濃度４０％以上の硫酸水溶液を接触させる表面処理である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリスチレン製担体。
【請求項５】
相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せが、分析対象物質と、分析対象物質に特異的結合が可能なパートナータンパク質との組合せである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリスチレン製担体。
【請求項６】
相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せが、抗原と抗体若しくはその断片との組合せ、又はリガンドとレセプター若しくはその断片との組合せである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリスチレン製担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体に、パートナータンパク質の組合せの一方であるタンパク質を接触させて固定化し、非固定化パートナータンパク質を洗浄除去することを特徴とする、パートナータンパク質担持ポリスチレン製担体。
【請求項８】
非固定化パートナータンパク質を洗浄除去した後に、ブロッキング剤で処理する工程を更に実施した、請求項７に記載のパートナータンパク質担持ポリスチレン製担体。
【請求項９】
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に、分析対象物質に対して特異的に結合可能な第１のパートナータンパク質を固定化する工程；
（２）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質と、前記分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナータンパク質を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナータンパク質とを接触させる工程；
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質に結合した前記分析対象物質と未反応の標識化第２パートナータンパク質をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（５）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質に結合した前記分析対象物質に結合した標識化第２パートナータンパク質の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
【請求項１０】
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させ、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に分析対象物質を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質に対して特異的に結合可能で、標識化されたパートナータンパク質とを接触させる工程；
（３）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質と未反応の標識化パートナータンパク質をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質に結合した標識化パートナータンパク質の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
【請求項１１】
（１）請求項１〜６のいずれか一項に記載のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させ、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に分析対象物質を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質に対して特異的に結合可能な第１のパートナータンパク質とを接触させる工程；
（３）前記分析対象物質を固定化して担持し、更に第１パートナータンパク質に接触させたスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記第１パートナータンパク質に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナータンパク質とを接触させる工程；
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質に結合した前記第１パートナータンパク質と未反応の標識化第２パートナータンパク質をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（５）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質に結合した前記第１パートナータンパク質に結合した標識化第２パートナータンパク質の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体、パートナータンパク質担持ポリスチレン製担体、及び分析方法に関する。本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体は、タンパク質を効率的に固定化することができ、免疫学的分析方法などのタンパク質分析方法におけるＢＦ分離操作を効率的に実施することができ、特に、時間分解蛍光測定に好適に使用可能である。本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ヘテロジニアスアッセイと称される測定法があり、その測定法では、測定対象物質に対して結合活性をもつ抗体などの物質を固相化した担体を用いる。担体の材料としては、シリカや炭素等の粉末、セファロースやセファデックス等の樹脂、あるいはガラス、プラスチック、又は金属等が用いられ、反応後に、担体を含む部分と担体を含まない部分とを分離し、担体に結合した標識物からの信号を測定する。
この担体表面に生理活性物質を固定化する方法には、物理吸着法と化学結合法が知られている。化学結合法は、結合活性をもつ官能基を担体の表面に生じさせて、生理活性物質のアミノ基などと共有結合させて固定化する。物理吸着法は、生理活性物質と担体とが相互に物理的に引きつけられる現象を利用するもので、それにはファンデルワールス力、疎水結合力、イオン結合力、又は水素結合力等が関与しているとされる。
【０００３】
化学結合法は、結合力が強固であり解離しにくい点や、結合部分を選択することができる点等にメリットを有するが、物理吸着に比べて絶対的結合量が少ない点、結合反応性官能基をもたない生理活性物質を結合することができない点、結合操作が複雑である点がデメリットである。
一方、物理吸着法は、結合操作が簡単であるという大きなメリットがあるが、剥がれる可能性があることや、生理活性物質の種類によって吸着力が異なるために結合量の制御が困難であるなどのデメリットをもつ。
【０００４】
生理活性物質を固定化させる担体としては、アフィニティーカラムに用いられる担体のように、固定化の目的だけに用いられる場合もあるが、信号（シグナル）分析用容器と共用される場合がある。すなわち、反応容器として被検試料（サンプル）から分析対象物質だけを取り出し、そこに標識・付加した信号を測定するための容器にも用いることができる便利さを有している。この固定化担体かつ測定容器という目的を満足させる一つの例にプラスチック容器がある。ＥＬＩＳＡプレートのように、プラスチックウェルに物理吸着あるいは化学結合法で抗体などを結合し、被検試料中の抗原などを結合反応させた後、酵素標識抗体等で抗原をラベルして洗浄した後、基質を加えて発色、発光、又は蛍光などを生じさせて酵素活性を分析する際、測定容器としてこのウェルを用いている。この目的にはポリスチレンが多く用いられている。
【０００５】
最近、ＤＮＡチップ、又はプロテインチップという概念が広まってきており、平板の上に多くのＤＮＡやタンパク質をドット状に固定化し、被検試料中の多種類に及ぶＤＮＡやタンパク質を、特異的結合性をもつそれぞれのドットに固定化してそれぞれのドットに固定化された標識物量を測定して多くの情報を一度に得ようとする考え方である。この考え方は、固定化担体機能をもつ測定容器に、更に集積化という３つ目の要素が加わったものといえる。
このようなタンパク質チップ用標識剤には蛍光物質が多く用いられている。蛍光物質は、ＤＮＡやタンパク質に容易に結合することができる点、ドットごとのシグナルを別々に認識することができる点、測定時溶液を必要としない点等で、チップシステムに適した性質を多く有しているためである。しかし、大きな問題点として、蛍光物質の検出感度が低いという点がある。そこで、最近、検出感度の高い標識物質も検討され、ユーロピウムキレートを封入した粒子と時間分解蛍光測定との組合せなどによる高感度化が進んでいる（特許文献１）。
【特許文献１】ＷＯ０２／０９７４３６Ａ１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
時間分解蛍光測定法を用いて検出感度を通常の蛍光測定の１０００倍程度あるいはそれ以上に向上させ、なおかつ近傍に共存させても蛍光消光を起こさないユーロピウムキレート分子の数万個を粒子内部に封入して感度を格段に向上させた標識物を用いるタンパク質チップシステムには、それに適した測定容器が必要となる。すなわち、固定化担体機能をもつと共に集積化された測定容器である。多種類の異なる等電点や異なる疎水性をもつタンパク質を容易にドット状に固定化することができ、かつ時間分解蛍光測定を妨害しない測定容器という性質が必要となる。しかしながら、従来は、こうした要求を満足することのできる測定容器は開発されていない。
ポリスチレンは、タンパク質を物理吸着する性質も有しているため、従来から、固定化担体機能をもつ測定容器の材質として選択され、例えば、ＥＬＩＳＡプレートの素材などに広く用いられている。また、時間分解蛍光測定用容器としての採用を考えた場合も、ポリスチレンそれ自体の蛍光時間は短いため、一定のラグタイムを設けて測定を実施すれば大きな悪影響がなく、蛍光消光時間の長い添加剤にさえ注意すれば、充分に適用可能である。しかしながら、ポリスチレンは、異なる等電点や異なる疎水性をもつタンパク質の吸着力に差があるため、任意のタンパク質に関して、分析に必要な量を固定化することができるわけではなく、適用が制限されるという重大な欠点があった。
従って、本発明の目的は、任意のタンパク質に関して、分析に必要な量を高密度で固定化することが可能であり、更に、任意のタンパク質に関して固定化担体機能をもつと共に、集積化が可能で、測定容器としての併用が可能であるため、例えば、時間分解蛍光測定用容器としても使用可能な担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の課題は、本発明により、
表面にスルホン酸基を導入したことを特徴とする、相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せの一方であるタンパク質を固定化するためのポリスチレン製担体によって解決することができる。
本発明によるポリスチレン製担体の好ましい態様は、時間分解蛍光測定用である。
また、本発明によるポリスチレン製担体の別の好ましい態様は、平面状チップ基板である。
更にまた、本発明によるポリスチレン製担体の別の好ましい態様においては、前記のスルホン酸基導入処理が、ポリスチレン製担体の表面に濃度４０％以上の硫酸水溶液を接触させる表面処理である。
更にまた、本発明によるポリスチレン製担体の別の好ましい態様においては、相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せが、分析対象物質と、分析対象物質に特異的結合が可能なパートナータンパク質との組合せである。
更にまた、本発明によるポリスチレン製担体の別の好ましい態様においては、相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せが、抗原と抗体若しくはその断片との組合せ、又はリガンドとレセプター若しくはその断片との組合せである。
【０００８】
本発明は、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体に、パートナータンパク質の組合せの一方であるタンパク質を接触させて固定化し、非固定化パートナータンパク質を洗浄除去することを特徴とする、パートナータンパク質担持ポリスチレン製担体にも関する。
また、本発明によるパートナータンパク質担持ポリスチレン製担体の好ましい態様は、非固定化パートナータンパク質を洗浄除去した後に、ブロッキング剤で処理する工程を更に実施したパートナータンパク質担持ポリスチレン製担体である。
【０００９】
本発明は、また、
（１）前記のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に、分析対象物質に対して特異的に結合可能な第１のパートナータンパク質を固定化する工程；
（２）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質と、前記分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１パートナータンパク質を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナータンパク質とを接触させる工程；
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質に結合した前記分析対象物質と未反応の標識化第２パートナータンパク質をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（５）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１パートナータンパク質に結合した前記分析対象物質に結合した標識化第２パートナータンパク質の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の分析方法にも関する。
【００１０】
本発明は、更にまた、
（１）前記のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と分析対象物質を含む可能性のある被検試料とを接触させ、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に分析対象物質を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質に対して特異的に結合可能で、標識化されたパートナータンパク質とを接触させる工程；
（３）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質と未反応の標識化パートナータンパク質をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質に結合した標識化パートナータンパク質の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質の分析方法にも関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体においては、ポリスチレン基板表面に、スルホン酸基が、例えば硫酸処理によって導入されているので、基板表面が一定のイオン性をもち、等電点の異なる種々のタンパク質を結合することができる。従って、本発明のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体に、種々のタンパク質をドット状に配置するだけで充分な一定量を吸着して、固定化担体機能をもつ集積化された測定容器とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体は、従来公知のポリスチレン製担体（すなわち、硫酸処理などによるスルホン酸基の導入が行われていないポリスチレン製担体）の表面に対してスルホン酸基導入処理を実施することによって製造することができる。スルホン酸基導入処理の対象となる被処理出発担体としては、ポリスチレン製担体であれば特に限定されないが、例えば、平板状ポリスチレン製チップ、又はＥＬＩＳＡ用ポリスチレン製プレートを挙げることができる。
【００１３】
スルホン酸基導入処理には、４０％硫酸水溶液を用いることができ、７０％〜９５％硫酸水溶液を用いるのがより好ましい。スルホン酸基導入処理は、好ましくは３０〜９０℃で実施する。このスルホン酸基導入処理によって、ポリスチレン側鎖の各ベンゼン核にスルホン酸基が導入されるので、タンパク質に対する吸着性が向上する。また、スルホン酸基は発煙硫酸又は無水硫酸を一定条件下でポリスチレン製担体と反応させることによって導入することができる。あるいは、クロロ硫酸を反応させた後、ポリスチレン製担体に導入されたクロロスルホニル基を加水分解することによってスルホン酸基に変えることもできる。
【００１４】
こうして得られた本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体には、相互に特異的結合が可能なパートナータンパク質の組合せの一方であるタンパク質を固定化することができる。この組合せは、例えば、分析対象物質と、分析対象物質に特異的結合が可能なパートナータンパク質との組合せであり、従って、本発明のスルホン酸基導入ポリスチレン製担体には、分析対象物質を固定化するか、又は分析対象物質に特異的結合が可能なパートナータンパク質を固定化することができる。また、前記の組合せは、例えば、任意の免疫学的パートナー、すなわち、抗原抗体反応によって相互に特異的に結合することのできる抗原及び抗体若しくはその断片（前記抗体と同様の免疫学的活性を有する断片）の組合せ、あるいはリガンドとレセプター若しくはその断片（前記レセプターと同様のレセプター活性を有する断片）との組合せである。
【００１５】
具体的には、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体に、パートナータンパク質の一方を含む水溶液を接触させてパートナータンパク質の一方を前記担体表面に固定化し、続いて、非固定化パートナータンパク質を洗浄して除去する。更に、必要によりブロッキング剤で処理することができる。
【００１６】
前記の洗浄液としては、例えば、緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水、又は界面活性剤を含んだ前記緩衝液、蒸留水、若しくは生理食塩水を用いることができる。また、ブロッキング剤としては、例えば、牛血清アルブミン、又はスキムミルクを用いることができる。パートナータンパク質を担持したポリスチレン製担体をブロッキング剤で処理することにより、前記のパートナータンパク質以外のタンパク質の吸着を防止することができる。
【００１７】
こうして得られたパートナータンパク質担持ポリスチレン製担体は、タンパク質チップとして用いることができる。例えば、担持させるパートナータンパク質として、食品に対する抗体を選択して食品中のアレルギー誘発物質の分析用タンパク質チップを提供することができる。
【００１８】
また、本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体を用いて、タンパク質の分析方法、例えば免疫学的分析方法を実施することもできる。例えば、免疫学的分析方法の一つの態様は、
（１）本発明による前記ポリスチレン製担体上に、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して免疫学的に特異的に結合可能な第１の免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化する工程；
（２）ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）と、前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させる工程；
（３）前記第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）を固定化して担持し、更に前記被検試料に接触させたポリスチレン製担体と、前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して免疫学的に特異的に結合可能で、標識化された第２の免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して未反応の標識化第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）をポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（５）ポリスチレン製担体上に固定化された前記第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）に結合した前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に結合した標識化第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）の免疫学的分析方法である。
【００１９】
前記の前記第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）及び第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。両者がモノクローナル抗体である場合は、前記第１免疫学的パートナーと第２免疫学的パートナーとで異なるモノクローナル抗体を用いる。
分析対象物質が抗体（Ｘ）である場合には、前記第１免疫学的パートナーとして前記抗体（Ｘ）に対して免疫学的に特異的に結合可能な抗原（Ｙ）を用い、更に、前記第２免疫学的パートナーとして、前記抗体（Ｘ）に対して免疫学的に特異的に結合可能な抗体（Ｚ）を用いることができる。なお、抗体としては、その抗体と同じ免疫学的活性を有する断片を用いることもできる。
【００２０】
更に、本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体を用いて、別の態様のタンパク質分析方法、例えば免疫学的分析方法を実施することもできる。その態様は、
（１）本発明による前記ポリスチレン製担体と分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させ、ポリスチレン製担体上に分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して免疫学的に特異的に結合可能で、標識化された免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）とを接触させる工程；
（３）ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）と未反応の標識化免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）をポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（４）ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に結合した標識化免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）の免疫学的分析方法である。
前記の前記免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。分析対象物質が抗体（Ｘ）である場合には、前記免疫学的パートナーとして前記抗体（Ｘ）に対して免疫学的に特異的に結合可能な抗原（Ｙ）を用いることができる。なお、抗体としては、その抗体と同じ免疫学的活性を有する断片を用いることもできる。
【００２１】
更にまた、本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体を用いて、更に別の態様のタンパク質分析方法、例えば免疫学的分析方法を実施することもできる。その態様は、
（１）本発明による前記ポリスチレン製担体と分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を含む可能性のある被検試料とを接触させ、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に対して特異的に結合可能な第１のパートナータンパク質（例えば、抗体Ｂ）とを接触させる工程；
（３）前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）を固定化して担持し、更に第１パートナータンパク質（例えば、抗体Ｂ）に接触させたスルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記第１パートナータンパク質（例えば、抗体Ｂ）に対して特異的に結合可能で、標識化された第２のパートナータンパク質（例えば、抗体Ｃ）とを接触させる工程；
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に結合した前記第１パートナータンパク質（例えば、抗体Ｂ）と未反応の標識化第２パートナータンパク質（例えば、抗体Ｃ）をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（５）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、抗原Ａ）に結合した前記第１パートナータンパク質（例えば、抗体Ｂ）に結合した標識化第２パートナータンパク質（例えば、抗体Ｃ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質（例えば、抗原Ａ）の分析方法である。
前記の第１免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｂ）及び第２免疫学的パートナー（例えば、抗体Ｃ）は、ポリクローナル抗体であるかあるいはモノクローナル抗体であることができる。なお、抗体としては、その抗体と同じ免疫学的活性を有する断片を用いることもできる。
【００２２】
更にまた、本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体を用いて、更に別の態様のタンパク質分析方法を実施することもできる。その態様は、
（１）本発明による前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と分析対象物質（例えば、リガンドＡ）を含む可能性のある被検試料とを接触させ、スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に分析対象物質（例えば、リガンドＡ）を固定化する工程；
（２）前記被検試料に接触させた前記スルホン酸基導入ポリスチレン製担体と、前記分析対象物質（例えば、リガンドＡ）に対して特異的に結合可能で、標識化されたパートナータンパク質（例えば、レセプターＢ）とを接触させる工程；
（３）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、リガンドＡ）と未反応の標識化パートナータンパク質（例えば、レセプターＢ）をスルホン酸基導入ポリスチレン製担体上から除去する工程；及び
（４）スルホン酸基導入ポリスチレン製担体上に固定化された前記分析対象物質（例えば、リガンドＡ）に結合した標識化パートナータンパク質（例えば、レセプターＢ）の標識に由来する信号を分析する工程
を含むことを特徴とする、分析対象物質（例えば、リガンドＡ）の分析方法である。
分析対象物質がレセプター（Ｘ）である場合には、前記パートナータンパク質として前記レセプター（Ｘ）に対して特異的に結合可能なリガンド（Ｙ）を用いることができる。なお、レセプターとしては、そのレセプター活性を有する断片を用いることもできる。
【００２３】
前記の各タンパク質分析方法、例えば各免疫学的分析方法は、前記の通り、公知の時間分解蛍光測定法によって実施するのが好ましい。時間分解蛍光測定法においては、公知の蛍光性希土類金属錯体を標識として用いることができ、例えば、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を標識として用いることができる。前記の蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子は、水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコア−シェル型粒子であり、そのコア部分に蛍光性希土類金属錯体が封入されている。
【００２４】
以下、時間分解蛍光測定法で用いる蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子について説明する。
コア部分に蛍光性希土類金属錯体を封入することができるコア−シェル型粒子は、例えば、
（ａ）水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物を主成分とし、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなる。
【００２５】
コア部分を形成するのに用いることのできる水不溶性高分子化合物は、水に溶解しない高分子化合物であって、しかも、コア部分を形成した際に、その内部に蛍光性希土類金属錯体を封入することができる高分子化合物である限り、特に限定されるものではない。前記水不溶性高分子化合物としては、例えば、疎水性ポリマー［例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリイソプレン、ポリ塩化ビニル、ポリ乳酸、ポリラクトン、又はポリラクタムなど］、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリアリルアミン、又はポリアクリル酸など）の架橋ゲル、あるいは、水不溶性天然高分子化合物（例えば、ゼラチン又は多糖など）などを挙げることができる。
【００２６】
前記のコア部分は、前記の水不溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組合せから実質的に形成されていることができる。
【００２７】
前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には５ｎｍ〜５００ｎｍ程度である。
【００２８】
シェル部分を形成するのに用いることのできる水溶性高分子化合物は、直鎖状の高分子化合物であり、その一方の末端（結合末端）でコア部分の表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記コア部分の表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。本明細書において、「コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部」とは、シェル部が多数の直鎖状水溶性高分子化合物からなり、それら直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端でコア部分の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物とパートナータンパク質、例えば、免疫学的パートナー（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。また、これらのブラシ状の水溶性高分子化合物鎖の自由末端には、それぞれパートナータンパク質（例えば、免疫学的パートナー）と結合可能な反応性官能基が存在するので、シェル部分の最外殻は、多数の反応性官能基で覆われている。
【００２９】
前記水溶性高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルアミンなどを挙げることができ、ＰＥＧ又はポリビニルアルコールが好ましい。
【００３０】
シェル部を構成する水溶性高分子化合物鎖は、各水溶性高分子化合物鎖が前記の水溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の水不溶性高分子化合物２種類以上の組合せから実質的に形成されていることができる。また、それぞれの鎖の長さは同じである必要はなく、各水溶性高分子化合物鎖が１種類の水溶性高分子化合物のみから形成されている場合であっても、１種類の長さの鎖のみから実質的に形成されていることもできるし、あるいは、２種類以上の長さの鎖の組合せから実質的に形成されていることができる。更に、各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる水不溶性高分子化合物２種類以上の組合せから実質的に形成されている場合でも、それぞれ異なる鎖の長さを選択して組合せることも可能である。
【００３１】
前記シェル部分を構成する水溶性高分子化合物鎖は、前記のコア部分の全表面を実質的に完全に覆っているのが好ましい。また、前記シェル部分を構成する各水溶性高分子化合物鎖は、それぞれ、実質的に同じ長さである必要はないが、各水溶性高分子化合物鎖の自由末端によって大略球状又は大略楕球状のシェル部分外殻表面が形成されるのが好ましい。
【００３２】
前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
【００３３】
前記水溶性高分子化合物鎖の自由末端に存在する反応性官能基は、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記水溶性高分子化合物の一方の末端（結合末端）をコア部分表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入するができる。これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、前記蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を標識物質として使用する際のパートナータンパク質（例えば、免疫学的パートナー）と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではなく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、アミノ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はメタンスルホニル基などを挙げることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、又はマレイミド基が好ましい。
【００３４】
また、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を標識物質として使用する際のパートナータンパク質（例えば、免疫学的パートナー）の導入量を調節するために、自由末端に存在する反応性官能基を持たない水溶性高分子化合物鎖（例えば、水素原子、メチレン基、又は水酸基などを自由末端に有する水溶性高分子化合物鎖）を任意の割合で混合することも可能である。この場合、導入させるパートナータンパク質（例えば、免疫学的パートナー）と自由末端に存在する官能基の反応に干渉させないために、反応性官能基を持たない水溶性高分子化合物鎖の長さを、反応性官能基を持つ水溶性高分子化合物鎖より短くすることが望ましい。
【００３５】
水不溶性高分子化合物を主成分とするコア部分の表面に、表層に反応性官能基を有する水溶性高分子化合物ブラシを有するコア−シェル型粒子を調製する方法としては、これまで報告されている様々な公知方法が適用可能である。前記公知方法としては、例えば、
（１）（ａ）反応性官能基を有する親水性セグメントと疎水性セグメントとを結合したブロック共重合体（親−疎水型ブロック共重合体）と、（ｂ）疎水性ポリマーとを混合して粒子を調製するエマルジョン法；
（２）反応性官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、疎水性モノマーを重合させる分散重合法；又は
（３）ハイドロゲル粒子表面に水溶性高分子化合物ブラシを導入する方法
などを挙げることができる。
【００３６】
前記のエマルジョン法（１）で用いる親−疎水型ブロック共重合体の合成方法、及び前記の分散重合法（２）で用いる反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーの合成方法としては、例えば、既に本発明者及びその共同研究者が開発した方法（例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報、ＷＯ９９／５７１７４３号公報、特開平１１−３２２９１７号公報、又は特開２００１−３２４５０７号公報）を用いることができる。
【００３７】
前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の式（ＩＡ）：
【化１】
2005164285.tif 000003
［式中、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、独立して、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アリールオキシ基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよい式：
−Ｏ−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＨ−Ｏ−
（ここでＲ’は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である）
で表されるエチレンジオキシであるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、オキシ（＝Ｏ）であり、
Ｌは、式：
−ＣＨ（Ｒ３Ａ）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ４Ａ）−
又は
−（ＣＨ２）ｒ−
で表される２価の基であり、ここで、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは、独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アリール基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であり、ｒは２〜５の整数であり、ｍＡは２〜１０，０００の整数であり、ｎＡは２〜１０，０００の整数であり、ｐＡは１〜５の整数であり、ｑは０又は１〜２０の整数であり、そして、ＺＡは、ｑが０であるとき、水素原子、アルカリ金属、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−メルカプトプロピオニル基、２−アミノプロピオニル基、アリル基、又はビニルベンジル基であり、ｑが１〜２０の整数であるとき、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキシルメルカプト基、又はアミノ基である］
で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーを挙げることができる。前記の式（ＩＡ）で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００３８】
また、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９９／５７１７４３号公報に記載の式（ＩＢ）：
【化２】
2005164285.tif 000004
（式中、Ａ’及びＢ’は、相互に独立して、有機シリル型のアミノ保護基を表すか、あるいは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を形成することのできる有機シリル型のアミノ保護基であり、
Ｙは、水素原子、アルカリ金属、又は適当な反応によりアルカリ金属に代えて導入可能な有機基であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、
ｎＢは１〜２０，０００の整数であり、そして、
ｍＢは０〜２０，０００の整数である）
で表されるポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＢ）で表されるポリオキシエチレン誘導体は、例えば、ＷＯ９９／５７１７４３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００３９】
また、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の式（ＩＣ）：
【化３】
2005164285.tif 000005
（式中、Ｒ１Ｃ、Ｒ２Ｃ、及びＲ３Ｃは、相互に独立して、直鎖若しくは分岐のアルキル基又はアラルキル基を表し、
ＺＣは、水素原子、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニルベンジル基、アリル基、パラトルエンスルホニル基、モノ−若しくはジ−低級アルキル置換アミノ基、カルボキシル基若しくはそのエステル基を有するアルキル基、アルデヒド基若しくはそのアセタール基を有するアルキル基、及びアルカリ金属からなる群より選ばれ、
ｍＣは０又は１であり、
ｎＣは０〜２０，０００の整数であり、そして、
ｐＣは正数２又は３であるが、
但し、ｍＣとｎＣは同時に０とならない）
で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＣ）で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体は、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００４０】
更に、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開２００１−３２４５０７号公報に記載の式（ＩＤ）：
Ａ−Ｌ１−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＤ−Ｌ２−（Ｂ）ｎＤ−Ｌ３−ＣＲ＝ＣＨ２    （ＩＤ）
［式中、Ａは官能基を表し、Ｂは、
【化４】
2005164285.tif 000006
のユニットを表し、Ｒ１は、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ２は、水素原子、メチル基、１−メチルエチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、２−ベンジルオキシカルボニルエチル基、又はベンジルオキシカルボニルメチル基であり、Ｌ１は、式：
−（ＣＨ２）ｑＤ−Ｏ−
（ここで、ｑＤは１〜６の整数である）の連結基を表し、Ｌ２は、原子価結合又は式：
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−
の連結基を表し、Ｌ３は、カルボニル基、メチレン基、
【化５】
2005164285.tif 000007
の基を表し、Ｒは、水素原子又はメチル基を表し、ｍＤは１０〜２０，０００の整数であり、そして、ｎＤは０〜１０，０００の整数である］
で表されるホモポリマー又はブロックコポリマーを挙げることができる。なお、官能基Ａは、特に限定されるものではないが、例えば、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、アミノ基（−ＮＨ２）、メルカプト基（−ＳＨ）、水酸基（−ＯＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を挙げることができる。前記の式（ＩＤ）で表されるホモポリマー又はブロックコポリマーは、例えば、特開２００１−３２４５０７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
【００４１】
コア−シェル型粒子の前記エマルジョン法（１）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、式（ＩＣ）、又は式（ＩＤ）で表される各化合物（すなわち、親−疎水型ブロック共重合体）と、疎水性ポリマーとを混合することにより、コア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）を調製することができる。
【００４２】
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、式（ＩＣ）、又は式（ＩＤ）で表される各化合物（すなわち、水溶性高分子マクロモノマー）を分散剤として、疎水性モノマーを重合させることにより、コア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）を調製することができる。
【００４３】
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、蛍光性希土類金属錯体と疎水性モノマーを懸濁させた後に重合させることにより、蛍光性希土類金属錯体の封入とコア−シェル型粒子の調製を同時に行うことができる。更に、例えば、前記の式（ＩＡ）における基ＺＡ、式（ＩＢ）における基Ｙ、又は式（ＩＣ）における基ＺＣとして、蛍光性希土類金属と錯体を形成できる官能基であるカルボキシル基、β−ジケトン配位子、又はフェロイン系配位子を導入し、蛍光性希土類金属錯体を安定化した蛍光性希土類金属錯体の封入とコア−シェル型粒子を調製することも可能である。
【００４４】
時間分解蛍光測定において使用することのできる蛍光性希土類金属錯体は、コア−シェル型粒子のコア部分に封入した状態でも、そのシグナルをコア−シェル型粒子の外側から分析（検出及び測定を含む）することのできる物質である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ランタノイド（例えば、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウム）、イットリウム、又はスカンジウム等の各錯体を挙げることができ、ランタノイド錯体が好ましく、ユーロピウム、サマリウム、テルビウム、又はジスプロシウムの各錯体がより好ましい。
【００４５】
蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の直径も、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状の粒子の場合、１０ｎｍ〜１ｍｍ程度であることができる。
【００４６】
時間分解蛍光測定法で用いることのできる蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子は、例えば、公知の製造方法（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレットに記載の製造方法）により調製することができる。
【００４７】
例えば、国際公開第ＷＯ０２／０９７４３６号パンフレットに記載の製造方法では、例えば、先に説明した種々の公知方法により調製したコア−シェル型粒子（すなわち、蛍光性希土類金属錯体を封入する前の粒子）に、蛍光性希土類金属錯体を封入するのに、まず、コア−シェル型粒子のコア部分を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルエン等）が一定比率で含まれる溶液中に、前記コア−シェル型粒子及び蛍光性希土類金属錯体を浸漬させる。前記浸漬により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴って蛍光性希土類金属錯体がコア部分に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的な蛍光性希土類金属錯体はコア部分から外に出ることができず、コア部分に封入される。所望により、コア部分に取り込まれなかった蛍光性希土類金属錯体を除去することにより、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子を得ることができる。
【００４８】
前記製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレートなどにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。
【００４９】
また、コア部分を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、蛍光性希土類金属錯体が水不溶性高分子化合物に取り込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、４０〜６０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％であることができる。
【００５０】
時間分解蛍光測定法においては、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基に、更に、前記反応性官能基と反応可能な導入物として、分析対象物質に特異的な結合可能なパートナータンパク質（例えば、免疫学的パートナー）を結合させることができる。
【００５１】
前記パートナータンパク質は、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基と反応可能であって、しかも、分析対象物質に特異的な結合可能である限り、特に限定されない。
【００５２】
パートナータンパク質と、蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子の表面に存在する反応性官能基とを結合させる方法は、公知の結合方法の中から、前記導入物及び反応性官能基の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、反応性官能基がアルデヒド基である場合には、パートナータンパク質のアミノ基とシッフベースを形成させることにより、結合することができる。
【００５３】
また、反応性官能基がカルボキシル基である場合には、パートナータンパク質のアミノ基との間を、縮合剤（例えば、カルボジイミドなど）を用いて結合することができる。あるいは、予めカルボキシ基をスクシンイミド又はマレイミド等で活性化しておいて、その状態のまま、パートナータンパク質と混合することにより結合させることもできる。
【００５４】
蛍光性希土類金属錯体封入コア−シェル型粒子としては、これまで述べた種々の粒子を用いることができるが、寿命の長い蛍光を持つユーロピウムキレートを中心の核となるスチレン部分に多量に含み、外部表面は親水性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がブラシ状に生えていて親水性を持ち、ＰＥＧ末端の感能基に化学修飾によってパートナータンパク質を、活性を保ったまま結合することができるという性質を持った高機能性粒子が好ましい。
【００５５】
この粒子に３５０ｎｍ付近に波長特性を持つ励起光をパルスで照射し、マイクロ秒単位の時間をおいてから６１５ｎｍに波長特性を持つ蛍光を測定すると、まわりの蛍光に影響を受けず高いＳＮ比で検出することができる。また、この粒子は観測時に溶液を必要とせず、蛍光物質同様乾燥状態で測定することができる。一個のユーロピウムキレートでは測定感度に限界があるが、粒子にユーロピウムキレート分子を多数封入したこの試薬は酵素と発光基質を用いた検出系より高感度に測定することができる。この粒子をチップシステムの標識物として用いることで、今までの標識物がかかえていた問題を解決することができる。
【００５６】
時間分解蛍光測定法などによって本発明方法で分析可能な対象物（すなわち、分析対象物質）は、それに対して特異的に結合可能なパートナータンパク質が存在する限り、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質（例えば、抗原又は抗体、あるいはレセプター又はリガンド）である。また、時間分解蛍光測定法などによって本発明方法で分析可能な被検試料は、前記分析対象物質を含む可能性のある試料であれば、特に限定されず、特には生体試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、又は細胞若しくは組織破砕液などを挙げることができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５８】
実施例１
（１）濃硫酸水溶液の調製
市販硫酸（和光純薬社製；硫酸含有率＝９５％）を蒸留水で希釈し、９３％〜６８％の６種の濃度の硫酸水溶液を調製した（具体的な濃度は後述の図１及び図２参照）。得られた硫酸水溶液を放置して室温に冷却してから、後述のスルホン酸基導入処理に使用した。
【００５９】
（２）ポリスチレン製マイクロプレート基板表面へのスルホン酸基導入
市販の９６穴ポリスチレン製マイクロタイタープレート（コースター社製；製品番号＝３６３１）に、実施例１（１）において調製した硫酸水溶液１００μＬを分注し、プレートカバーで蓋をした。次いで、マイクロタイタープレートを、７０℃に保温されたフラン器内に入れて静置し、スルホン酸基導入反応を行った。１５分間の反応後にフラン器から取り出し、硫酸水溶液を除去し、蒸留水でｐＨが中性になるまで洗浄した。最後に、ウェル内の水滴を乾燥させた。
【００６０】
（３）スルホン酸基導入ポリスチレン製ウェルへのアレルゲンの結合
実施例１（２）において調製したスルホン酸基導入ポリスチレンウェルへ、免疫反応の固定化量に充分な量のアレルゲンを含むダニアレルゲン水溶液又は小麦アレルゲン水溶液を５０μＬの量で分注し、４℃にて一夜静置し、アレルゲンを基板上に結合させた。結合反応の終了後、アレルゲン水溶液を除去し、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）２００μＬを分注し、３７℃で２時間インキュベーションし、ブロッキングを行った。ウェルはアッセイに用いるまで４℃で保存した。
【００６１】
評価例１：アレルゲン特異ＩｇＥ抗体の測定
（１）アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイ手順
前記実施例１で調製したアレルゲン固定化ウェルへ、検体（アレルゲン特異ＩｇＥ抗体陰性ヒト血清又はアレルゲン特異ＩｇＥ抗体陽性ヒト血清）１００μＬを分注し、室温で２時間静置した。検体を除去し、洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液）３００μＬで２回洗浄した後、抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬（後述）５０μＬを分注し、室温で１時間静置した。続いて、反応ウェルを上記洗浄液３００μＬで４回洗浄した後、抗原抗体反応によってウェルに結合したユーロピウム錯体の時間分解蛍光強度を測定し、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体を分析した。
【００６２】
（２）抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬の調製
前記の評価例１（１）で用いた抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子試薬の調製方法を以下に示す。
ユーロピウム錯体封入ナノ粒子懸濁液１ｍＬへ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＮ−サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）１０μＬを添加し、室温で１時間振とうし、ナノ粒子表面のアミノ基の一部をマレイミド基に変換した。反応液を、１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ−ＰＢ（ｐＨ７．０）で平衡化されたセファロースＣＬ６Ｂカラム（１．５×２０ｃｍ）にアプライし、余剰のＳＭＣＣを除いてマレイミド基導入ナノ粒子画分を得た。続いて、予め調製しておいた抗ヒトＩｇＥ抗体Ｆａｂ’〔１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ−ＰＢ（ｐＨ７．０）に調製〕溶液と混合し、ナノ粒子へＦａｂ’断片を結合させた。余剰のＦａｂ’断片は、０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）にて平衡化したセファロースＣＬ６Ｂカラム（１．５×９０ｃｍ）によって除き、抗ヒトＩｇＥ抗体標識ユーロピウム錯体封入ナノ粒子画分を得た。
【００６３】
（３）時間分解蛍光測定条件
アレルゲン特異ＩｇＥ抗体のイムノアッセイにおける時間分解蛍光測定は、時間分解蛍光検出器（ＤＥＬＦＩＡ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ；Ｗａｌｌａｃ社製）を使用し、以下の条件で実施した。
Ｆｌａｓｈ  Ｒａｔｅ              ：１．００ｍｓ
Ｄｅｌａｙ  Ｔｉｍｅ              ：０．２０ｍｓ
Ｗｉｎｄｏｗ  Ｔｉｍｅ            ：０．４０ｍｓ
Ｄｅａｄ  Ｔｉｍｅ                ：１０．０ｎｓ
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ    ：１
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ：１
【００６４】
（４）測定結果
９３％〜６８％の６種の濃度の硫酸水溶液でスルホン酸基導入処理を行ったポリスチレン製ウェルと、スルホン酸基導入処理を行っていない対照用ポリスチレン製ウェルとに関して、ダニ特異ＩｇＥ抗体を測定した結果を図１に示し、小麦特異ＩｇＥ抗体を測定した結果を図２に示す。
スルホン酸基導入処理を行ったポリスチレン製ウェルにおいては、硫酸濃度７３％〔図１（Ａ）〕及び硫酸濃度７８％〔図２（Ａ）〕で処理された場合に、アレルゲン特異ＩｇＥ抗体陰性血清の時間分解蛍光強度が低く、陽性血清の時間分解蛍光強度が高い結果が得られた。反応させる硫酸濃度が高いと、陽性血清の反応性の低下が認められ、逆に硫酸濃度が低いと、陰性血清の蛍光強度の上昇が認められた。
一方、無処理ポリスチレン製ウェルを用いて同様にアレルゲン特異ＩｇＥ抗体を測定した結果〔図１（Ｂ）及び図２（Ｂ）〕では、陰性血清の蛍光強度が高く、ラベル試薬のウェルへの非特異的結合が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によるスルホン酸基導入ポリスチレン製担体は、タンパク質を効率的に固定化することができ、タンパク質分析方法（例えば、免疫学的分析方法）などにおけるＢＦ分離操作を効率的に実施することができ、特に、時間分解蛍光測定に好適に使用可能である。時間分解蛍光測定に用いるランダニド錯体標識試薬のウェルへの非特異的結合を抑制することができる。また、ウェルへの結合において、タンパク質の性質の差に影響を受けにくい。ポリスチレン基板の硫酸処理は、安価に行うことができ、大量調製も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ポリスチレン製ウェルのスルホン酸基導入処理に使用した硫酸水溶液の濃度と、ダニアレルゲンタンパク質吸着量との関連を示すグラフであり、図１（Ａ）はスルホン酸基導入ポリスチレン製ウェルの結果を示し、図１（Ｂ）は無処理ポリスチレン製ウェルの結果を示す。
【図２】ポリスチレン製ウェルのスルホン酸基導入処理に使用した硫酸水溶液の濃度と、小麦アレルゲンタンパク質吸着量との関連を示すグラフであり、図１（Ａ）はスルホン酸基導入ポリスチレン製ウェルの結果を示し、図１（Ｂ）は無処理ポリスチレン製ウェルの結果を示す。
【図１】
2005164285.tif 000008
【図２】
2005164285.tif 000009