(57)【要約】【課題】  マイクロアレイを用いた実験では、異種組織間においてコントロール遺伝子のシグナル強度に許容範囲以上の差が生じる場合がしばしばある。これは特にオリゴヌクレオチドマイクロアレイの場合において顕著であり、中には全くシグナル強度が得られない場合もある。コントロール配列のシグナル強度が大きく変化する、またはシグナル強度が得られない等の結果になると、マイクロアレイ全体のシグナル強度の定量化・データ解析の信頼性が損なわれることとなる。【解決手段】  複数の異なる組織において一定のシグナル強度が得られるコントロール遺伝子のオリゴヌクレオチド配列を決定し、当該配列のオリゴヌクレオチドを搭載したマイクロアレイを提供する。【選択図】  図１
2005102515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１〜４からなる群より選択される１つの配列の中の、連続する20塩基以上からなる配列を含むオリゴヌクレオチドであって、マウスの複数の異なる組織において一定以上のシグナル強度を呈するオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかに90％、好ましくは95％、さらに好ましくは98％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドであって、複数の異なる組織に由来するサンプルにおいて、一定以上のシグナル強度が得られるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６で示されるオリゴヌクレオチド配列のうちの１つ以上を搭載したマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに関する。また、オリゴヌクレオチドを搭載したマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マイクロアレイの解析における標準化の方法として、例えば下記特許文献１に記載のものが知られている。
【０００３】
マイクロアレイは網羅的遺伝子プロファイルを得るツールとして広く利用されている。目的組織から得られた、cDNAまたはRNAを蛍光色素で標識し、調査したい遺伝子（cDNAまたはオリゴヌクレオチド）が搭載されているマイクロアレイとハイブリダイズさせた後に蛍光読取装置で画像をスキャンし、解析ソフトでシグナル強度を定量化することにより、目的遺伝子の発現量、あるいは異なる組織間での発現差を知ることができる。定量化の前には、必ずコントロール遺伝子を利用した標準化を行う。標準化とは、１つ以上のコントロール遺伝子を基準として他の遺伝子のシグナル強度を補正することである。従って、コントロール遺伝子として利用されるためには、どの組織でも一定以上のシグナル強度が得られ、目的とする組織間でのそのシグナル強度の差が小さいことが条件となる。
【０００４】
コントロール遺伝子としては一般にハウスキーピング遺伝子が用いられる。ハウスキーピング遺伝子の転写量は異なった組織・細胞・発達段階および病態において比較的一定に保存されると言われているからである。
【０００５】
【特許文献１】特許公表２００３−５１６１６６公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、実際のマイクロアレイを用いた実験では、異なる組織間においてコントロール遺伝子のシグナル強度に許容範囲以上の差が生じる場合がしばしばある。これは特にオリゴヌクレオチドマイクロアレイの場合において顕著であり、中には全くシグナル強度が得られない場合もある。
【０００７】
一般にオリゴヌクレオチドマイクロアレイに搭載されるオリゴヌクレオチドは20〜80塩基の長さである。従来のcDNAマイクロアレイと比較すると、マイクロアレイに搭載される配列が短い（従来のcDNAマイクロアレイでは1000〜2000塩基程度）。配列の短さに加えて、塩基組成（GC含量）もハイブリダイゼーションに大きな影響を与えるので、短い配列は長い配列に比べてGC含量のばらつきが大きくなる傾向にあるため、オリゴヌクレオチドマイクロアレイではシグナル強度が変動する可能性がcDNAマイクロアレイより大きい。
【０００８】
よって、同じ遺伝子配列から設計されたオリゴヌクレオチド配列を同じ組織でハイブリダイゼーションした場合であっても、その長さと塩基組成によって、得られるシグナル強度が異なる場合がある。
【０００９】
コントロール配列は、マイクロアレイ上に搭載された目的の遺伝子のシグナル強度を測定したり、異なる組織間における目的遺伝子のシグナル強度比を算出したりする際の基準となるので、コントロール配列のシグナル強度が大きく変化する、またはシグナル強度が得られない等の結果になると、マイクロアレイ全体のシグナル強度の定量化・データ解析の信頼性が損なわれることとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、上記目的を達成するために異なる組織に由来するサンプルにおいて、一定以上のシグナル強度が得られるコントロール遺伝子のオリゴヌクレオチド配列を決定し、さらに当該オリゴヌクレオチドを搭載したマイクロアレイを提供する。
【００１１】
本発明は、モデル動物として医学生物学的産業分野で多用されている動物であるマウスについて、オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおけるコントロール遺伝子オリゴヌクレオチド配列として、配列番号１〜４に示す配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
また、配列番号１〜４からなる群より選択される１つの配列の中の、連続する20塩基、好ましくは30塩基、より好ましくは40塩基以上からなる配列を含むオリゴヌクレオチドであって、異なる組織において一定以上のシグナル強度が得られるオリゴヌクレオチドもまた、本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。さらに、これらのオリゴヌクレオチドのいずれかに90％、好ましくは95％、さらに好ましくは98％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドであって、異なる組織に由来するサンプルにおいて、一定以上のシグナル強度が得られるオリゴヌクレオチドもまた本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。
【００１３】
上記の本発明のオリゴヌクレオチドのうちの1種以上（例えば、配列番号１に示す配列を有するオリゴヌクレオチドのみ、または例えば配列番号１〜４に示す４つの配列を有するオリゴヌクレオチド）を搭載した、オリゴヌクレオチドマイクロアレイもまた、本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により提供されるマイクロアレイのコントロールとしてのオリゴヌクレオチドは、異種組織由来のサンプル間においてもシグナル強度が一定しているため、マイクロアレイ中のコントロールとして使用すると、マイクロアレイにより得られるデータの定量性、信頼性等が向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜４に示す配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号１〜４からなる群より選択される１つの配列の中の、連続する20塩基、好ましくは30塩基、より好ましくは40塩基以上からなる配列を含むオリゴヌクレオチドであって、異なる組織において一定以上のシグナル強度が得られるオリゴヌクレオチド、これらのオリゴヌクレオチドのいずれかに90％、好ましくは95％、さらに好ましくは98％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドであって、異なる組織において一定以上のシグナル強度が得られるオリゴヌクレオチドもまた本発明のオリゴヌクレオチド）からなる群より選択した1種以上のオリゴヌクレオチドを作製する。これは、合成機を用いるなどの公知技術により作製可能である。
【００１６】
作製したオリゴヌクレオチドは、マイクロアレイ基板にスポットし、本発明のオリゴヌクレオチドを搭載したマイクロアレイを作製する。マイクロアレイの作製法は、既に種々のものが公知であり、本発明に用いるマイクロアレイもまた、そのいずれによっても、またその変法等によっても、作製することができる。例えば、国際公開WO95/11995号、Lockhart, D. J.ら、Nat.Biotech.14：1675-1680 (1996)、Schena M. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 93：10614-10619 (1996)、および米国特許第5,700,637号を参照のこと。
【００１７】
マイクロアレイによる解析に供するRNAまたはDNAを、マウス組織より精製する。マウス組織は、血液、細胞（初代培養細胞を含む）、生検材料、組織片、またはマウス由来の培養細胞株等であってよい。これらの生物学的材料からRNAを単離・精製する方法、および単離したRNAからcDNAを作製する方法は、公知である。得られたRNA量が少量である場合は、逆転写反応により第1鎖cDNAを合成した後、第2鎖のcDNAを合成し、それを鋳型としてアンチセンス鎖のRNA（aRNA：増幅RNA）を増幅してもよい。
【００１８】
cDNAまたはaRNAのマイクロアレイ上のターゲットとのハイブリダイゼーションを検出するためには、これらを標識する必要がある。例えば、放射性同位元素、化学発光化合物、重金属原子、分光学マーカー、磁気マーカー、関連酵素、蛍光標識などで標識してもよい。それぞれの標識分子に応じたcDNAまたはaRNAの標識方法は、当業者であれば適宜選択できる。蛍光標識が最も好ましく、蛍光標識には、例えば、フルオレセイン、ジクロロ-フルオレセイン、BODIPY(商品名)、ROX、ローダミン、Cy2、IRD40など種々のものが公知であり、いずれも用いてもよいが、Cy3またはCy5が特に好ましい。Cy3またはCy5等による標識のためには、cDNAおよびaRNAのいずれの場合も、合成の際にアミノアリルdUTPを取り込ませることができる。
aRNAの場合は、標識後、さらに断片化してハイブリダイゼーションに用いる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションの条件、方法等は、当業者によく知られている。例えば、ハイブリダイゼーションバッファーは、5×SSC、0.5％SDS、4×Denhardt's solutionなどでよい。ハイブリダイゼーションは、35〜60℃、このましくは42℃〜50℃、さらにこのましくは45℃で、2時間以上、好ましくは一晩以上行うとよい。ハイブリダイゼーション条件は、標識分子の量または検出感度等を含む種々の要因に応じて、当業者が適宜設定することができる。ハイブリダイゼーション後、アレイを洗浄して、標識分子を読み取り、シグナルを可視化し、所望であれば定量化するとよい。
【００２０】
定量的または準定量的な検出を行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドについての標識分子のシグナル量に基づいて、補正することにより複数のサンプル間での定量値の信頼性を高めることができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド2種以上を同じマイクロアレイ上にてコントロールとして用いることにより、さらに上記信頼性を高めることができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施する場合の一形態を、図面を用いて具体的に説明する。
【００２２】
コントロール遺伝子には従来から用いられる、β-アクチン(NM_007393)、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(NM_008084)、ユビキチンB(NM_011664)、リボゾームタンパク質 S18(NM_011296)を用いた（カッコ内はアクセッション番号）。これらの既知配列（525〜1892塩基対）からそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４の50塩基のオリゴヌクレオチド（センス鎖）を合成した。オリゴヌクレオチド配列を決定する際は、他の遺伝子との相補性の低さ、GC含量等を十分に考慮している。
これらのオリゴヌクレオチドを、精製水に溶解して5μMの濃度にし、マイクロアレイ作製装置でマイクロアレイ基板にスポットした。
【００２３】
次に、マイクロアレイにハイブリダイズさせるターゲットの調製方法について説明する。
目的に応じたマウスの組織から全RNAを抽出する。さらに全RNAからは逆転写反応によって、cDNAを合成する。逆転写反応の際にはdNTPとアミノアリルdUTPを一定の割合で混合したものを加えて、アミノアリルdUTPを取り込んだcDNAを合成した。
【００２４】
得られる全RNA量が少ない場合は、逆転写反応によりcDNAを合成した後、2本鎖のcDNAを合成し、それを鋳型としてアンチセンス鎖のRNAを増幅した（aRNA：増幅RNA）。RNA増幅の際にdNTPとアミノアリルdUTPを一定の割合で混合したものを加えることで、アミノアリルdUTPを取り込んだaRNAを合成した。
【００２５】
上記のcDNAまたはaRNAをエタノール沈殿した後、0.2M炭酸ナトリウムバッファー(NaHC03-Na2C03(pH9.0))に溶解した。DMSOに溶解した蛍光色素(Cy3またはCy5)を加えて、常法に従い、cDNAまたはaRNAに取り込ませておいたアミノアリルdUTPとカップリング反応させ、cDNAまたはaRNAを蛍光標識した。遊離の蛍光色素を精製により除去した後、aRNAについてはさらにフラグメンテーションバッファー(終濃度0.04M 酢酸トリアミノメタン (pH8.1)、0.1M酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム)を加えて95℃で15分間反応し、aRNAを断片化した。
【００２６】
次に、調製したcDNAまたはaRNAとマイクロアレイとのハイブリダイゼーションを行った。
cDNAまたはaRNAにハイブリダイゼーションバッファー(終濃度5×SSC、0.5％SDS、4×Denhardt's solution)を混合し、上記のマイクロアレイと45℃で一晩ハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、0.2×SSC-0.1％SDS溶液、0.1×SSC溶液で5分間ずつ洗浄したのち、蛍光読取装置にて画像をスキャンし、解析ソフト（QuantArray(R) Packard BioScience製）を用いてシグナル強度を定量化する。
【００２７】
図１は、配列番号１〜４に示すオリゴヌクレオチド溶液をスポットしたマイクロアレイ基板と、マウスの６種類の組織（肝臓・腎臓・大脳・小腸・心臓・肺）から得られたCy3標識cDNAとのハイブリダイゼーション後のスキャン画像から得られたシグナル強度をグラフに表したものである。図２は上記と同じ６種類の組織から得られたCy5標識cDNAを図１と同様にハイブリダイゼーションした結果である。図３は上記と同じ６種類の組織から得られたCy3またはCy5標識aRNAを図１と同様にハイブリダイゼーションした結果である。
【００２８】
図１、図２、図３からわかるように、配列番号１〜４に示すオリゴヌクレオチドは、複数の組織において一定以上のシグナル強度を示し、全くシグナル強度が得られないものはない。
【００２９】
また図４は当該オリゴヌクレオチド配列を設計した既知配列から、当該配列の他に２種類のオリゴヌクレオチド配列を設計し、当該オリゴヌクレオチドとともに１枚のマイクロアレイ基板にスポットし、上記の６種類の組織から得られたCy3標識cDNAとハイブリダイゼーション後、画像読取装置にてスキャンしたものである（＊印が、上からそれぞれ配列番号１〜４に示すオリゴヌクレオチドである）。図５は図４と同様のマイクロアレイ基板と上記の６種類の組織から得られたCy5標識cDNAをハイブリダイゼーションした結果、図６は図４と同様のマイクロアレイ基板と上記の６種類の組織から得られたCy3またはCy5標識cDNAをハイブリダイゼーションした結果である。
【００３０】
図４、図５、図６から、他のオリゴヌクレオチドではシグナル強度がほとんど得られないものもあるが、配列番号１〜４に示すオリゴヌクレオチドは全てシグナル強度が高いことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、Cy3標識cDNAターゲットを用いたときのマウスの組織６種類におけるシグナル強度を示す。
【図２】図２は、Cy5標識cDNAターゲットを用いたときのマウスの組織６種類におけるシグナル強度を示す。
【図３】図３は、Cy3またはCy5標識aRNAターゲットを用いたときのマウスの組織６種類におけるシグナル強度を示す。
【図４】図４は、マウス大脳cDNA(Cy3標識)とのハイブリダイゼーションの画像データを示す。
【図５】図５は、マウス大脳cDNA(Cy5標識)とのハイブリダイゼーションの画像データを示す。
【図６】図６は、マウス大脳aRNA(Cy3またはCy5標識)とのハイブリダイゼーションの画像データを示す。
【図１】
2005102515.tif 000003
【図２】
2005102515.tif 000004
【図３】
2005102515.tif 000005
【図４】
2005102515.tif 000006
【図５】
2005102515.tif 000007
【図６】
2005102515.tif 000008
【配列表】
2005102515000001.app