(57)【要約】【課題】    目的物質、特にタンパク質やDNA等の生体試料の定量に適用する場合に、公知の質量分析プローブよりも測定精度を高くすることができる新規な質量分析用プローブを提供すること。【解決手段】  下記一般式[I]  R1-X-A-R2（ただし、R1は溶媒中でイオンとなる構造から成るマスプローブ部、Ｘは光照射により開裂する構造から成る光開裂部、Ａは、存在してもしなくてもよく、存在する場合には任意の構造から成るスペーサー部、R2は他の物質と結合し得る構造から成る結合部を示す）で表される構造を有する質量分析用プローブを提供した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式[I]
R1-X-A-R2
（ただし、R1は溶媒中でイオンとなる構造から成るマスプローブ部、Ｘは光照射により開裂する構造から成る光開裂部、Ａは、存在してもしなくてもよく、存在する場合には任意の構造から成るスペーサー部、R2は他の物質と結合し得る構造から成る結合部を示す）
で表される構造を有する質量分析用プローブ。
【請求項２】
前記光開裂部が下記一般式 [II]、 [III]又は[IV]で表される２価の構造を有する請求項１記載のプローブ。
【化１】
2005140755.tif 000041
【化２】
2005140755.tif 000042
【化３】
2005140755.tif 000043
（ただし、一般式 [II]ないし [IV]において、R3及びR4は互いに独立に、水素、低級アルコキシル基又はカルボキシ低級アルキル基を示す）。
【請求項３】
前記一般式[II]において、R3及びR4が水素であり、前記一般式[III]において、R3及びR4が、(1)共に水素又は (2)ニトロ基を２位として4,5-ジメトキシ、前記一般式[IV]において、R3及びR4が、(1) ニトロ基を２位として4,5-ジメトキシ又は(2)水素及びニトロ基を２位としてカルボキシメチル基である請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
前記光開裂部が前記一般式[II]（ただし、R3及びR4は水素である）で表される請求項３記載のプローブ。
【請求項５】
前記マスプローブ部が、下記一般式[V]、[VI]又は[VII]で表される構造を、光開裂部と結合する側と反対側の端部に有する請求項１ないし４のいずれか１項に記載のプローブ。
【化４】
2005140755.tif 000044
【化５】
2005140755.tif 000045
【化６】
2005140755.tif 000046
（ただし、一般式[V]ないし[VII]において、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素又は任意の基を示す）。
【請求項６】
前記マスプローブ部が、前記一般式[V]で表される構造を、光開裂部と結合する側と反対側の端部に有する請求項５記載のプローブ。
【請求項７】
一般式[V]ないし[VII]において、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素又は炭素数１〜６のアルキル基である請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
前記一般式[I]中のR2が
【化７】
2005140755.tif 000047
【化８】
2005140755.tif 000048
【化９】
2005140755.tif 000049
【化１０】
2005140755.tif 000050
SCN-、ClO2S-、BrH2C-、ClOC-、CH3CH(NH2)=CH-、-CH2ONH2-HCl、-NH2、-NHNH2又は-CH2Iである請求項１ないし７のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項９】
前記一般式[I]中のR2が
【化１１】
2005140755.tif 000051
である請求項８記載のプローブ。
【請求項１０】
下記一般式[VIII]
【化１２】
2005140755.tif 000052
（ただし、ｎ及びｍは、互いに１〜６の整数、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素又は任意の基を示す）
で表される構造を有する請求項１記載のプローブ。
【請求項１１】
前記一般式[VIII]中のR5、R6及びR7が、水素又は炭素数１〜６のアルキル基である請求項１０記載のプローブ。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のプローブを、プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に目的物質と結合させ、プローブと目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することを含む質量分析方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のプローブであって、各プローブの前記マスプローブ部の質量が異なる少なくとも２種類のプローブを、各プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に各目的物質と結合させ、各プローブと各目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記各プローブの前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することを含む、複数の目的物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便で高感度に各種物質を質量分析することが可能な新規な質量分析用プローブ及びそれを用いた質量分析方法に関する。本発明は、タンパク質やDNA等の解析、とりわけ、複数種類のタンパク質やDNA等の網羅的な解析に有用である。
【背景技術】
【０００２】
現在、最も高感度、高精度に検体中の試料を定量することができる方法として質量分析測定法が挙げられる。質量分析法を用いて液状試料を測定するにあたり重要なことは、化合物の性質に合わせたイオン化法を選択することである。例えば化合物の不安定要因によって使い分ける場合、大きく分けてハードイオン化とソフトイオン化の２種類に分けられる。前者の方法としては、電子イオン化法、化学イオン化法及び大気圧イオン化法が挙げられ、後者の方法としてはエレクトロスプレーイオン化法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法及び高速原子衝撃イオン化法が挙げられる。
【０００３】
一方、最近では高速液体クロマトグラフィーで分離した試料をオンラインで質量分析を用いて同定を行う手法(LC/MS)が化学、生物学の分野で頻繁に利用されている。この場合、液体クロマトグラフィーと相性の良いイオン化法は、キャピラリー先端から流出する溶液試料を直接イオン化する方法であるため、先に記した方法のうち、後者の方法が該当する。中でもエレクトロスプレーイオン化質量分析装置と高速液体クロマトグラフィーをオンラインで接続した装置は現在最も汎用されており、タンパク質、糖質をはじめとした生体に不可欠な物質から、近年問題とされている環境ホルモン物質の同定にその威力を十分に発揮している。エレクトロスプレーイオン化の場合、試料の分子イオンピークが検出されることは極めて低く、通常ナトリウムなどが加算された擬分子イオンピークとして観察されるか、あるいはLC/MSでは移動相に酢酸アンモニウム、ギ酸、酢酸などのプロトン性溶媒を混入することにより、試料のイオン化を助ける方法が採られている。
【０００４】
液状試料の質量分析の際のイオン化を助ける手段として、液体クロマトグラフィーの移動相にプロトン性溶媒を添加する手法がLC/MSでは一般的となっている。しかし、i)酢酸アンモニウムは負イオンモードの場合、試料のイオンとアンモニウムイオンがペアとなって感度が低下する、ii)トリフルオロ酢酸は正イオンモードの場合、サンプルイオンとトリフルオロ酢酸イオンがペアとなって感度が低下し、負イオンモードの場合、一部例外を除きイオン化を妨害する、iii)アセトニトリルでは必ず酸を添加しなければならない、またこの際、酢酸アンモニウムでは溶解しないので用いることができない、等の欠点も指摘されている。
【０００５】
以上の問題点を解決し、液状試料の質量分析の際のイオン化法において、移動相にプロトン性溶媒を添加することなく、試料を効率的にイオン化する手段として、国際公開番号WO 02/04936 A1（特許文献１）には、溶媒中でイオンとなるイオン性官能基と、他の物質と結合し得る構造とがスペーサー部を介して連結された質量分析用プローブが開示されている。このプローブを用いることにより、目的物質（試料化合物）を効率的にイオン化し、質量分析の感度及び精度を大きく向上させることが可能である。
【０００６】
特許文献１のプローブは優れているが、目的物質の定量に適用する場合に、このプローブよりもさらに測定精度を高めることが可能なプローブが提供されれば有利であることは言うまでもない。また、特許文献１に記載の質量分析用プローブも含め、公知の質量分析用プローブでは、固相に結合された物質の定量を行なうことができなかった。もし、固相に結合された目的物質の定量を可能とする質量分析用プローブが得られれば、これまでの免疫測定等における標識の測定を、質量分析により行うことができるようになり、測定精度が向上すると考えられる。
【０００７】
【特許文献１】国際公開番号WO 02/04936 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、目的物質、特にタンパク質やDNA等の生体試料の定量に適用する場合に、公知の質量分析プローブよりも測定精度を高くすることができる新規な質量分析用プローブを提供することである。また、本発明の目的は、固相に結合した物質の定量にも利用可能な新規な質量分析用プローブを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、プローブ中に、他の物質と結合可能な構造と、溶媒中でイオンになる構造との間に光を照射すると開裂する構造を設け、目的物質とプローブとを直接的又は間接的に結合させた後、光を照射してプローブ分子の一部分を遊離させ、このプローブ分子の一部分のみを質量分析すると、質量分析に供される分子は、構造及びイオン化効率が揃っており、また、分子は遊離されているためにほぼ全量を回収することができるので、高精度の測定が可能になることに想到し、また、このような構成とすることにより固相に結合した物質の定量も可能になることに想到し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記一般式[I]
R1-X-A-R2
（ただし、R1は溶媒中でイオンとなる構造から成るマスプローブ部、Ｘは光照射により開裂する構造から成る光開裂部、Ａは、存在してもしなくてもよく、存在する場合には任意の構造から成るスペーサー部、R2は他の物質と結合し得る構造から成る結合部を示す）
で表される構造を有する質量分析用プローブを提供する。また、本発明は、上記本発明のプローブを、プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に目的物質と結合させ、プローブと目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することを含む質量分析方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のプローブであって、各プローブの前記マスプローブ部の質量が異なる少なくとも２種類のプローブを、各プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に各目的物質と結合させ、各プローブと各目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記各プローブの前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することを含む、複数の目的物質の測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、目的物質、特にタンパク質やDNA等の生体試料の定量に適用する場合に、公知の質量分析プローブよりも測定精度を高くすることができる新規な質量分析用プローブが提供された。本発明のプローブでは、プローブと目的物質とを直接又は間接的に結合させたのち、この結合体を分離し、光照射して光開裂部分を開裂させ、開裂により遊離した、前記マスプローブ部を含む分子（以下、「マスプローブ部含有分子」）を質量分析に供することができるので、質量分析に供される分子は、構造及びイオン化効率が揃っており、また、分子は遊離されているためにほぼ全量を回収することができるので、高精度の測定が可能になった。公知のプローブを用いてタンパク質等の生体高分子そのものの質量解析を行なうことは、分子量が大きいので、１タンパク質由来のピークが多数出現してしまい、またタンパク質によってイオン化効率が異なるので定量は難しい。しかもタンパク質と相互作用をしている物質を切離すのは容易ではなく、また切離す反応を行なうには、タンパク質そのものを分解してしまい、１つのタンパク質から複数のペプチド鎖が発生し、結局同定はできない場合が多い。そこでタンパク質を固相化し、容易に（光の照射のみによって）切り離すことができる部位があって、それのみで、同定と定量性が得られれば有利である（ちなみに後の実施例から分る様に光開裂は効率がほぼ１００％と非常に高い）。また、本発明のプローブでは、前記マスプローブ部の質量が異なる少なくとも２種類のプローブを、各プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に各目的物質と結合させ、各プローブと各目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記各プローブの前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することにより、複数の物質が定量可能になる。このように本発明のプローブを用いれば、種々のタンパク質やDNAを同時に定量する、網羅的な定量分析が可能になる。さらに、本発明のプローブを用いれば、光照射により遊離するマスプローブ部含有分子を測定するので、目的物質が固相に固定化されている場合でも、マスプローブを目的物質と直接的又は間接的に結合させ、未結合の分子等を洗浄除去後、光照射して遊離したマスプローブ含有分子を質量分析することにより、固相に結合された目的物質の定量分析も可能になる。このように、本発明のプローブを用いれば、公知のプローブでは全くできなかった固相結合物質の定量も可能になり、種々のタンパク質やDNAがチップ上に固定化されたペプチドチップやDNAチップ等を用いる場合でも、定量を質量分析で行うことが可能となり、従来の標識測定よりも高精度の定量が可能になると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の質量分析用プローブは、上記一般式[I]で表されるものである。一般式[I]において、R1は、溶媒中でイオンとなる構造から成るマスプローブ部である。ここで、「マス」とは質量のことであり、後で詳しく説明するように、本発明では、この部分の質量を目印として目的物質の定量を行なうので、この部分の質量（「マス」）がプローブとして働くという意味で、「マスプローブ部」と呼んでいる。質量分析の測定感度を高めるために、マスプローブ部は、溶媒中、好ましくは水中でイオンとなる構造から成る。このような構造としては、使用する溶媒中でイオン化される基であればいずれの構造であってもよく、正に帯電するものでも負に帯電するものでもよい。R1の例として、アミン、カルボン酸若しくはその塩、スルホン酸若しくはその塩などを挙げることができるが、好ましい例として、下記一般式[V]、[VI]又は[VII]で表される構造を、光開裂部と結合する側と反対側の端部に有するものを挙げることができる。
【００１３】
【化１】
2005140755.tif 000002
【００１４】
【化２】
2005140755.tif 000003
【００１５】
【化３】
2005140755.tif 000004
（ただし、一般式[V]ないし[VII]において、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素又は任意の基を示す）
【００１６】
R5、R6及びR7は、好ましくは、水素、ハロゲン、又は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分枝状アルキル基であり、さらに好ましくは水素又は炭素数１〜６の低級アルキル基（本明細書において、特に断りがない限り、「低級アルキル基」は、炭素数１〜６の直鎖上又は分枝状アルキル基を意味する）である。これらのうち、上記一般式[V]で示される第４級アミンが特に好ましく、中でもR5、R6及びR7が水素又は低級アルキル基であるものが好ましい。R5、R6及びR7のアルキル鎖の鎖長は、容易に伸長することができるので、種々のアルキル鎖長、ひいては、種々の質量のマスプローブ部を容易に調製することができ、後述のように本発明のプローブを複数種類の目的物質の同時定量分析に用いる場合に好都合である。
【００１７】
上記した一般式[V]ないし[VII]で表されるような、溶媒中でイオンになる基は、後述する光開裂部に直接結合していてもよいし、アルキレン基のようなスペーサー領域を介して光開裂部に結合していてもよい。このようなスペーサー領域の構造としては特に限定されるものではなく、例えば、炭素数１〜６のアルキレン基等を挙げることができる。なお、このようなスペーサー領域も、光開裂後の遊離の分子に含まれるので、マスプローブ部の一部である。
【００１８】
上記一般式[I]中において、Ｒ２は、他の物質と結合し得る構造を示す。Ｒ２の好ましい一群の例として、他の物質中の官能基と反応して共有結合し得る官能基を挙げることができる。この場合、Ｒ２としては、他の物質中の官能基と反応して共有結合し得る官能基であれば、いかなる官能基であってもよい。液状で質量分析により分析される試料は、タンパク質や糖等の生体物質である場合が多いので、これらに含まれることが多い官能基、すなわち、−ＮＨ２基、−ＳＨ基、−ＣＯＯＨ基、−ＯＨ基、−ＣＨＯ基等と反応して共有結合する官能基が好ましい。このような官能基の例として、
【００１９】
【化４】
2005140755.tif 000005
【００２０】
【化５】
2005140755.tif 000006
【００２１】
【化６】
2005140755.tif 000007
【００２２】
【化７】
2005140755.tif 000008
【００２３】
SCN-, ClO2S-, BrH2C, ClOC-, CH3CH(NH2)=CH-, -CH2ONH2-HCl, -NH2, -NHNH2及び-CH2I等を挙げることができる。
【００２４】
これらの官能基と反応する他の物質中の官能基(R') 及び該反応の結果形成される結合を下記表１に示す（なお、R2が-NH2の場合は、表１に示される、他の物質中の官能基(R')が-NH2の場合のR2と表１に記載のように結合できる）。
【００２５】
【表１】
2005140755.tif 000009
【００２６】
好ましいＲ２として、さらに、一般式[IX]
【００２７】
【化８】
2005140755.tif 000010
（ただし、Halはハロゲンを示す）、
【００２８】
【化９】
2005140755.tif 000011
【００２９】
及び一般式[X]
2005140755.tif 000012
（ただし、ｎは１〜５の整数を示す）
で表される基を挙げることができる。一般式[IX]中、ハロゲンとしては、好ましくは臭素である。
【００３０】
上記一般式[X]で示されるＲ２は、他の物質中のシトシンと反応して次のように結合する。
【００３１】
【化１０】
2005140755.tif 000013
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３２】
このＲ２は、他の物質中のシトシン部分と結合することができるので、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸及びデオキシシチジン三リン酸並びにシトシンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３３】
Ｒ２が上記
【００３４】
【化１１】
2005140755.tif 000014
の場合は、他の物質中のグアニンと反応して次のように結合する。
【００３５】
【化１２】
2005140755.tif 000015
（ただし、式中、Ｒは、例えばヌクレオチドや核酸の糖部分のような任意の基を示す）
【００３６】
このＲ２は、他の物質中のグアニン部分と結合することができるので、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン二リン酸及びデオキシグアノシン三リン酸並びにグアニンを含むＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸と結合できる。
【００３７】
Ｒ２が上記一般式[X]で示される基である場合は、他の物質中のリン酸エステル部分と反応して次のように結合する（ただし、下記の例ではｎが２の場合について示す）。
【００３８】
【化１３】
2005140755.tif 000016
【００３９】
なお、この反応式では、他の物質がデオキシアデノシン一リン酸（すなわち、ヌクレオチド中の塩基がアデニンで、糖がデオキシリボース）の場合を示しているが、Ｒ２は、リン酸エステル部分と結合するので、塩基は、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのようなアデニン以外の他の塩基であってもよいし、糖はデオキシリボースでもリボースでもよい。また、リン酸エステルの数は、上記反応式では１個であるが、Ｒ２は、末端のリン酸エステルと結合するので、縮合しているリン酸エステルの数は１個〜３個のいずれであってもよい。従って、一般式[X]で示されるＲ２はあらゆる種類のヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸及びヌクレオシド三リン酸と結合することが可能である。さらに、核酸の末端には遊離のリン酸エステルが存在するので、一般式[X]で示されるＲ２はＤＮＡやＲＮＡのような核酸と結合することも可能である。
【００４０】
なお、Ｒ２は、他の物質の官能基と反応して共有結合し得る官能基に限定されるものではなく、他の物質とインターカレート又は配位結合により結合する基もＲ２として用いることができる。
【００４１】
すなわち、Ｒ２の例として、二本鎖核酸にインターカレートする構造を有するものを挙げることができる。このようなＲ２の具体例として下記一般式[XI]で表される基を挙げることができる。
【００４２】
【化１４】
2005140755.tif 000017
（ただし、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜５のN,N-ジアルキルアミノ基を示す）
【００４３】
このようなＲ２は、二本鎖核酸にインターカレートして結合するので、このようなＲ２を有するプローブは二本鎖核酸の測定に好ましく用いることができる。
【００４４】
さらに、Ｒ２としては、他の物質と配位結合する、例えばEDTAのような錯体形成性化合物から水素原子が１個離脱した基等も用いることができる。
【００４５】
一般式[I]中、Ａは任意のスペーサー部である。Ａは必須的なものではなく、上記R2が後述する光開裂部に直接結合していてもよい。本発明のプローブは、Ｒ２により他の物質と結合させ、光照射により光開裂部Ｘを開裂させた後、マスプローブ部含有分子を質量分析するものであるから、Ｒ１とＸの間に位置するＡは、任意の構造をとり得るものである。もっとも、水系媒体中での使用を想定する場合には、アミド、エーテル、アミン、ケトン等の親水性基を含ませることが好ましい。従って、水系媒体中での使用を想定する場合には、炭素数１〜６程度のアルキレン基（以下、低級アルキレン基）にアミド、エーテル、アミン、ケトン等を挿入又は付加した構造が好ましい。例えば、後述の実施例では、スペーサー部は、-C2H4-CO-NH-CH2-であり、プロピレン基にアミド基-CO-NH-を挿入したものになっている。疎水性を付与したい場合には、低級アルキレン基にアリール基（フェニル等）を導入することができる。疎水性部と親水性部の両方を設けて両親媒性にすることもできる。
【００４６】
一般式[I]中、Ｘは光照射により開裂する構造から成る光開裂部である。光開裂部は、光照射により開裂する構造であれば、特に限定されない。好ましい光開裂部として下記一般式 [II]、 [III]又は[IV]で表される２価の構造を挙げることができる。
【００４７】
【化１５】
2005140755.tif 000018
【００４８】
【化１６】
2005140755.tif 000019
【００４９】
【化１７】
2005140755.tif 000020
【００５０】
（ただし、一般式 [II]ないし [IV]において、R3及びR4は互いに独立に、水素、低級アルコキシル基又はカルボキシ低級アルキル基を示す）。
【００５１】
これらの中でも、前記一般式[II]において、R3及びR4が水素であり、前記一般式[III]において、R3及びR4が、(1)共に水素又は (2)ニトロ基を２位として4,5-ジメトキシ、前記一般式[IV]において、R3及びR4が、(1) ニトロ基を２位として4,5-ジメトキシ又は(2)水素及びニトロ基を２位としてカルボキシメチル基であるものが特に好ましく、さらには、一般式[II]で示される構造でR3及びR4が共に水素であるものがとりわけ好ましい。
【００５２】
例えば、一般式[II]で示される構造でR3及びR4が共に水素であるものに光を照射すると、ニトロフェニル基が結合している炭素原子と、それに隣接する酸素原子の間が切断される。
【００５３】
以上説明した本発明のプローブの中でも特に好ましいものとして、下記一般式[VIII]で示すものを挙げることができる。
【００５４】
【化１８】
2005140755.tif 000021
（ただし、ｎ及びｍは、互いに１〜６の整数、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素又は任意の基を示し、好ましくは水素又は炭素数１〜６のアルキル基を示す）
【００５５】
本発明のプローブは、当業者が、公知の方法に基づいて容易に合成することができる。下記実施例にも、複数の好ましいプローブの製造方法が具体的に記載されている。
【００５６】
プローブと、プローブに結合すべき他の物質との結合反応は、プローブのＲ２と、当該他の物中の、Ｒ２と結合させるべき官能基の種類に応じて、公知の技術に基づき適宜の条件で行うことができる。下記実施例にも、好ましいプローブと他の物質との結合反応の条件が具体的に記載されている。
【００５７】
Ｒ２及び該Ｒ２と結合する他の物質中の官能基（Ｒ’）の上記した具体的な組合せのそれぞれについて、具体的な結合反応条件の例を以下に記載する。もっとも、これらは単なる例示であり、他の反応条件でもこれらの官能基同士を結合させることは可能であるので、結合反応条件が下記のものに限定されるものではないことは当業者にとって明らかである。また、ここに記載されていないＲ２についても、当業者が化学常識に従って容易に結合反応を行うことができる。
【００５８】
(1)  Ｒ２がＳＣＮ−、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に0.2 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン = 2 : 2 : 1 v/v)を加え減圧乾固した後、0.5 ml (エタノール : 水 :トリエチルアミン : プローブ = 7 : 7 : 1 : 1 v/v)を加え室温で20分間反応させる。溶媒を減圧留去した後、溶離液に溶解し試料溶液とする（B. A. Bidlingmeyer, et al, J. Chromatogr., 336, 93 (1984)参照）。
【００５９】
(2)  Ｒ２がＣｌＯ２Ｓ−で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
2〜3 mgの試料に500μＬの1M NaHCO3水溶液と200μＬの1 mg/mLプローブ/アセトン溶液を加え、60℃で30分間加熱する。アセトンを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Meffin, P. J., et al, J. Pharm. Sci., 66, 583 (1977)参照）。
【００６０】
(3)  Ｒ２が
【００６１】
【化１９】
2005140755.tif 000022
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【００６２】
1.5 mgの試料をTHF5.0 mLに溶解し、50 mgのプローブを加え、60℃で30分間加熱する。THFを留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupill, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【００６３】
(4)  Ｒ２が
【００６４】
【化２０】
2005140755.tif 000023
で、Ｒ’が−ＳＨの場合
【００６５】
2〜3 mgの試料を500μＬの水に溶解後、200μＬの1 mg/mLプローブ/アセトニトリル溶液を加え、60℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Nakashima K., et al, Talanta., 32, 167 (1985)参照）。
【００６６】
(5)  Ｒ２がＢｒＨ２Ｃ−又はＩＨ２Ｃ−で、Ｒ’が−ＣＯＯＨの場合
2〜3 mgの試料をアセトン500μＬに溶解し、200μＬの1 mg/mLプローブ/アセトン溶液およびK2CO31 mgを加え、60℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Dunges, W., Anal. Chem., 49, 442 (1977)参照）。
【００６７】
(6)  Ｒ２がＣｌＯＣ−で、Ｒ’が−ＯＨの場合
2〜3 mgの試料を0.5 mlのピリジンに溶解後、0.2 mLの1 mg/mLプローブ/ピリジン溶液を加え、40 ℃で1時間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Suzuki, A., et al., J. Biochem., 82, 1185 (1977)参照）。
【００６８】
(7)  Ｒ２が
【００６９】
【化２１】
2005140755.tif 000024
で、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
【００７０】
2〜3 mgの試料をメタノール1.0 ml、酢酸0.1 ml、0.2 mLの1mg/mLプローブ/メタノール溶液を加え、40 ℃で30分間加熱する。溶媒を留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【００７１】
(8)  Ｒ２が
【００７２】
【化２２】
2005140755.tif 000025
で、Ｒ’が−ＮＨ２の場合
【００７３】
試料のエタノール溶液(10-4 〜 10-3 M) 0.1 mLに、10 mg/mLのプローブ/エタノール溶液1.5 mLを加え、室温で5分間〜10分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Roth, M., Anal. Chem., 43, 880 (1971)参照）。
【００７４】
(9)  Ｒ２が−ＣＨ２ＯＮＨ２・ＨＣｌでＲ’が
【００７５】
【化２３】
2005140755.tif 000026
の場合
【００７６】
1〜5 mgの試料、トリエチルアミン2滴、プローブ50 mgを50℃で30分間加熱する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Jupille, T. H., Am. Lab., 8 (5), 85-92 (1976)参照）。
【００７７】
(10)  Ｒ２が−ＮＨＮＨ２、Ｒ’が−ＣＨＯの場合
1〜5 mgの試料を水0.5 mlに溶解後、30%HClO4水溶液に20mg/mLの割合でプローブを溶かした溶液を加え、室温で10分間撹拌した。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする（Newberg, C., et al., Anal. Chim. Acta, 7, 238 (1952)参照）。
【００７８】
(11)  Ｒ２が
【００７９】
【化２４】
2005140755.tif 000027
で、Ｒ’が
【００８０】
【化２５】
2005140755.tif 000028
の場合
【００８１】
0.1〜5.0μgの試料を、50μＬのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μＬの1mg/mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【００８２】
(12)  Ｒ２が
【００８３】
【化２６】
2005140755.tif 000029
で、Ｒ’が
【００８４】
【化２７】
2005140755.tif 000030
の場合
【００８５】
0.1〜5.0μgの試料を、50μＬのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μＬの1mg / mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)を加え、室温で5分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【００８６】
(13)  Ｒ２が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で、Ｒ’が
【００８７】
【化２８】
2005140755.tif 000031
の場合
【００８８】
0.1〜5.0μgの試料を、50μＬのリン酸緩衝溶液(pH7.0)に溶解後、200μＬの1mg/mLのプローブ/リン酸緩衝溶液(pH7.0)および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを加え、室温で30分間撹拌する。溶媒を減圧留去後、溶離液に溶解し試料溶液とする。
【００８９】
本発明のプローブを用いて目的物質を定量する場合、上記一般式[I]のR2を目的物質と直接結合させてもよいが、後で詳しく説明するように、プローブを光開裂部位において開裂させ、遊離されたマスプローブ含有分子のみを質量分析するという、本発明のプローブの特徴を最大限に利用するためには、R2を、目的物質と特異的に結合する物質（以下、便宜的に「特異的対応物質」）に結合し、次いで、生成したプローブ−特異対応物質結合体を目的物質に特異的に結合させることが好ましい。ここで、「特異的に結合する」とは、抗原抗体反応、相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸同士のハイブリダイゼーション、ビオチン−ストレプトアビジンの結合反応、酵素−基質の結合反応等を意味し、必ずしも目的物質以外のものとは全く反応しないという意味ではない。例えば、他の抗原とも交差反応する抗体であっても、抗原抗体反応は「特異的結合反応」であると解釈する。
【００９０】
このような特異的対応物質を用いる場合、プローブは、特異的対応物質を介して目的物質に間接的に結合される。この場合には、一般式[I]のR2を、特異的対応物質に上記方法により結合させる。特異的対応物質の例としては、抗原、ハプテン、抗体、核酸、ストレプトアビジン、酵素等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。
【００９１】
次いで、プローブ−特異的対応物質結合体と、目的物質とを反応させ、特異的対応物質と目的物質とを結合させる。この反応は、それぞれの特異的対応物質と目的物質との結合反応に適した公知の反応条件を採用することにより容易に行うことができる。この結合反応により、プローブは、特異的対応物質を介して目的物質と結合される。
【００９２】
次いで、目的物質と間接的に結合されたプローブを、未結合のプローブをはじめ、他の無関係な物質から分離する。これは、目的物質が固相に固定化されている場合には、固相を洗浄することにより容易に行うことができる。また、目的物質が遊離している場合には、目的物質をプローブと間接的に結合させた後、目的物質を捕捉できる固相と反応させて固相上に目的物質を捕捉し、次いで固相を洗浄することにより達成することができる。これらのように、固相に結合された目的物質の定量が可能であるというのは、光開裂部を有する本発明のプローブを用いることにより得られる、顕著な効果である。なお、本発明のプローブを用いた目的物質の有利な測定方法についてはさらに後述する。
【００９３】
目的物質と結合したプローブを分離した後、光を照射してプローブ中の光開裂部を開裂させる。光照射の条件は、用いる光開裂部の種類等に応じて適宜選択できる。通常、紫外線が用いられ、その照射量は、適宜設定できるが、例えば、マイクロプレートのウェル内の溶液に対して行なう場合、通常、１００Ｗの市販の高圧水銀ランプを１分間〜１０分間程度照射すればよい。
【００９４】
光開裂により、プローブが光開裂部で開裂され、上記したマスプローブ部含有分子が遊離される。この遊離のマスプローブ含有分子を質量分析により測定する。マスプローブ含有分子の分子量は予めはっきりとわかっており、また、マスプローブが上記のようにイオン化されるので、予備的な精製を要することなく質量分析を行うことができる。
【００９５】
マスプローブ部含有分子の質量分析は、通常の液状試料の質量分析と全く同様にして行うことができる。本発明のプローブは、好ましい液状試料の質量分析方法の例として、エレクトロスプレーイオン化質量分析、大気圧化学イオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、パーティクルビーム質量分析、フリット高速原子衝撃質量分析等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、通常の質量分析のみならず、反応槽と一体化された分析装置中で行われる質量分析に適用することも可能である。例えば、ポストカラム反応方式の高速液体クロマトグラフィ装置や、フローインジェクション分析装置のように、分析装置に反応槽又は反応コイルが組み込まれた分析装置において、反応槽又は反応コイルの下流で行われる質量分析に本発明のプローブを適用することができる。この場合、プローブは、反応槽又は反応コイルの上流で試料と混合し、結合反応を反応槽又は反応コイル中で行うことができる。なお、質量分析自体は、市販の装置を用い、装置に添付された指示書に従って容易に行うことができる。
【００９６】
本発明のプローブは、光開裂部を有しているために、上記のような所定の反応後に光を照射して光開裂部を開裂させ、それによってマスプローブ部含有分子を遊離させることができるという際立った特徴を有しており、さらに、マスプローブ部の分子量を、例えば、一般式[V]ないし[VII]で示されるようなイオン性基中のアルキル基の鎖長を変化させる等の方法で、容易に変化させることが可能であるという特徴を有している。これらの際立った特徴を最大限に活用し、試料中の複数の目的物質を同時に定量分析することが可能になる。これは、各プローブの前記マスプローブ部の質量が異なる少なくとも２種類のプローブを、各プローブの前記結合部を介して直接的又は間接的に各目的物質と結合させ、各プローブと各目的物質との結合物を分離し、該結合物に光を照射して前記光開裂部を開裂させ、開裂により遊離した前記各プローブの前記マスプローブ部を含む分子を質量分析により測定することにより行うことができる。以下、例を挙げてこの方法をより具体的に説明する。
【００９７】
ヒト血清中の種々の抗アレルゲンIgE抗体のうち、抗ダニ抗体、抗花粉抗体及び抗卵白アルブミン抗体を定量する場合を例として説明する。先ず、マスプローブ部の分子量の異なる３種類の本発明のプローブを作製する。例えば、光開裂後のマスプローブ部含有分子の分子量が170, 180, 190となる３種類のプローブを作製したとする（各プローブを便宜的に「プローブ-170」、「プローブ-180」、「プローブ-190」と呼ぶ）。次いで、各プローブを各目的物質（すなわち、抗ダニ抗体、抗花粉抗体及び抗卵白アルブミン抗体）とそれぞれ特異的に反応する各対応抗原（すなわち、ダニ抗原、花粉抗原、卵白アルブミン）に別個に結合させる。すなわち、例えば、プローブ-170をダニ抗原に、プローブ-180を花粉抗原に、プローブ-190を卵白アルブミンに結合させる。一方、例えばビーズのような固相に抗ヒトIgE抗体を固定化したビーズを準備し、これを検体となるヒト血清と反応させ、洗浄する。そうすると、血清中のヒトIgE抗体が、抗原抗体反応によりビーズ上に固定化される。次いで、得られたビーズと、別途調製したプローブ-170−ダニ抗原結合体、プローブ-180−花粉抗原結合体及びプローブ-190−卵白アルブミン結合体とを反応させる。そうすると、プローブ-170−ダニ抗原結合体は、ビーズ上の抗ダニ抗体に結合し、プローブ-180−花粉抗原結合体はビーズ上の抗花粉抗体と結合し、プローブ-190−卵白アルブミン結合体は、ビーズ上の抗卵白アルブミン抗体と結合する。次いで、ビーズを洗浄して、ビーズに結合していない物質を除去する。その後、光を照射し、プローブの光開裂部を開裂させ、遊離されたマスプローブ部含有分子を質量分析にかける。そうすると、存在するマスプローブ部含有分子の量に応じた高さのピークが得られる。各マスプローブ部含有分子の質量は予めわかっているので、どの質量のマスプローブ部含有分子がどれだけの量存在するかということが質量分析により高精度に測定される。各プローブが間接的に結合していた抗体が何かということもわかっているので、上記質量分析により、ヒト血清中の３種類の抗アレルゲン抗体が高精度に定量できる。
【００９８】
上記した例において、各抗原を、それぞれ特有の塩基配列を有する核酸に変え、各目的物質をそれに相補的な塩基配列を有する核酸（物理吸着や共有結合によりチップ等の固相に固定化された核酸）に変えれば、全く同様にして、異なる塩基配列を有する３種類の目的核酸を同時に定量することが可能である。
【００９９】
このように、本発明のプローブを用いれば、複数の目的物質を網羅的に同時に定量分析するという、従来のプローブを用いたのでは全く不可能であった定量分析が可能になる。
【０１００】
さらに、従来のプローブを用いて例えばタンパク質そのものの質量解析を行なう事は、タンパク質の分子量が大きすぎて、１タンパク質由来のピークが多数出現する。またものによってイオン化効率がことなるので、定量は難しい。しかもタンパク質と相互作用をしている物質を切離すのは容易ではなく、また切離す反応を行なうには、タンパク質そのものを分解してしまい、１つのタンパク質から複数のペプチド鎖が発生し、結局同定はできない場合が多い。これに対し、本発明によれば、本発明のプローブを用い、タンパク質を固相化すれば、マスプローブ部含有分子を容易に（光の照射のみによって）切り離すことができるので、マスプローブ含有分子の測定のみで、同定と定量性を得ることができ、本発明のプローブを用いれば、従来のプローブでは困難であった、タンパク質やDNAの生体高分子の定量も可能になる。
【０１０１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
試薬
使用した試薬や溶媒は和光純薬、東京化成、関東化学、Aldrich及びMerck社製の市販品特級のものを使用した。また、乾燥Dichloromethaneは工業用を蒸留し、乾燥モレキュラーシーブスを加えて水分を除去したものを使用した。なお、略号は以下のとおりである。
BO：(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス (ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロフォスフェート
4-DMAP：(4-ジメチルアミノピリジン)
DCC：(N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド)
【０１０３】
分離精製
カラムクロマトグラフィー
固定相にはMerck社製シリカゲル60 を用いた。移動相には一級相当のクロロホルム及びメタノールを用いた。
【０１０４】
化合物の同定方法
(1)  薄層クロマトグラフィー
固定相にはMerck社製TLC plates silica gel 60 F245 を用いた。移動相には一級相当のククロロホルム、メタノール及び酢酸エチルを用いた。化合物はヨウ素及びUV吸収 (254 nm)を用いて検出を行った。
【０１０５】
(2)  核磁気共鳴収分光器 (NMR)
NMR装置は日本電子社製LNM-LA 300 FT-NMR及びJNM-GSX 270 FT-NMRを使用した。重溶媒にはMerck社製重クロロホルム (クロロホルム-d1 )、重メタノール (メタノール-d4 )および重水 (Deuterium oxide-d2)を用い、内部標準としてテトラメチルシラン (TMS)を用いた。なお、シグナルの略称は次のようになっている。
s : singlet，d : doublet，t : triplet，q : quartet，m : multiplet
【０１０６】
質量分析計での測定条件
質量分析計のイオン化法はESI法、質量分析部はTOF-MSである。Applied Biosystems社のMariner Biospectrometry Workstationを用いた。TOFはリフレクター型である。
ESI-TOF MSの主な装置条件は次のようになっている。
スプレーティップポテンシャル: 3451.76 [V]
ノズルポテンシャル: 184.81 [V]
Quad RF電圧: 999.76 [V]
気体圧力: 0.5 〜0.6 [MPa]
溶媒: メタノール
流速: 11.5 μＬ／分
【０１０７】
スプレーティップポテンシャル、ノズルポテンシャル及びQuad RF電圧はそれぞれスプレーティップ、ノズル及びQuadrupoleにかかっている電位のことである。スプレーティップポテンシャルはキャピラリーの先端にかかって直接試料溶液のイオン化に影響してくる電位を表している。ノズルポテンシャルはフラグメントの大小やピークの安定性、感度に影響してくる。また、Quadrupoleは四重極のことで、 Quad RF電圧を変化させることにより検出可能な分子量の範囲を変化させることができる。
【０１０８】
光開裂のためのUV源
UV源は、理工科学産業株式会社の高圧水銀ランプ100 W UVL-100 HAを用いた。ランプの冷却は水道水の流水によって行った。
【０１０９】
合成方法
１．  1-[2-(2-ニトロ -フェニル)-2-オキソ -エチル]-3,5,7-トリアザ -1-アゾニア -トリシクロ [3.3.1.13,7]デカン; ブロミドの合成
【０１１０】
【化２９】
2005140755.tif 000032
【０１１１】
＜実験方法＞
Ar気流下で、200 ml三ツ口フラスコにヘキサメチレンテトラアミン (6.31 g, 45 mmol, 1.1 eq.)をクロロベンゼン(40ml)の懸濁液として入れた。系に2-ブロモ -2'-ニトロアセトフェノン (1 ; 10.0 g, 41.0 mmol, 1.0 eq.)のクロロベンゼン (35 ml)溶液を滴下し、室温で60 分間攪拌した後、50 ℃で3時間攪拌した。反応系を室温に戻して、吸引ろ過し、冷やしたエタノールを用いて結晶を3 回洗浄し、1-[2-(2-ニトロ -フェニル)-2-オキソ -エチル]-3,5,7-トリアザ-1-アゾニア-トリシクロ [3.3.1.13,7]デカン;ブロミド (2 ; 粗収量16.5 g)を白色固体として得た。
【０１１２】
1H-NMR (300 MHz, D2O, TMS, r. t.)δ：4.52 (6 H, s, -NCH2 N-), 4.60 (2 H, s, ArCOCH2-), 5.38 (6 H, s, -NCH2 N+-), 7.47 (1 H, J = 6.6 Hz, d, ArH), 7.67 (1 H, J = 8.0 Hz t, ArH), 7.78 (1 H, J = 7.7 Hz, t, ArH), 8.17 (1H, J = 8.4 Hz, d, ArH)
TLC; Rf = 0.2 (クロロホルム / メタノール = 5 / 1, v / v)
MS (ESI-TOF)
[M]+=304.3
【０１１３】
２．  2-アミノ-1-(2-ニトロ-フェニル)-エタノンの合成
【０１１４】
【化３０】
2005140755.tif 000033
【０１１５】
＜実験方法＞
500 mlナスフラスコに95％エタノール/濃HCl = 5 / 1 (v / v , 120 ml)を入れ、1-[2-(2-ニトロ-フェニル)-2-オキソ -エチル]-3,5,7-トリアザ -1-アザニア -トリシクロ [3.3.1.13,7]デカン; ブロミド (2, 15.8g, 41.0mmol ,1.0 eq )を溶解させ、室温で16時間攪拌した。反応系を氷浴で冷却した後、吸引ろ過により白色個体を得た。この白色固体をエタノールに加えて、室温で5分間攪拌し、氷浴で冷却した後、吸引ろ過により、2-アミノ-1-(2-ニトロ-フェニル)-エタノン (3 ; 7.1g, 収率95.7％)を白色固体として得た。
【０１１６】
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS, r. t.)δ：4.46 (2 H, s, ArCOCH2NH2), 7.75 (1 H, J = 7.5 Hz, d, ArH), 7.83 (1 H, J = 7.8 Hz, t, ArH), 7.91 (1 H, J = 7.5 Hz, t, ArH), 8.23 (1 H, J = 7.8 Hz, d, ArH)
TLC；Rf = 0.4 (クロロホルム / メタノール = 5 / 1, v / v)
MS (ESI-TOF)
[M+H]+ = 181.2
【０１１７】
３．  2-アミノ-1-(2-ニトロ-フェニル)-エタノールの合成
【０１１８】
【化３１】
2005140755.tif 000034
【０１１９】
＜実験方法＞
200 ml二口フラスコに2-アミノ-1-(2-ニトロ-フェニル)-エタノン (3 ; 5.0 g, 28 mmol, 1.0 eq.)をエタノール/H2O = 7 / 3 (v / v, 70 ml)の溶液として入れ、氷浴で攪拌しながらNaBH4 (4.2 g, 111 mmol, 4.0 eq.)を加え、60 分間攪拌した。反応系を室温に戻して5 時間攪拌した。
【０１２０】
懸濁液に多量のエタノールを加え、吸引ろ過し、ろ液を濃縮した。再び吸引ろ過し、ろ物を冷やしたエタノールを用いて結晶を3 回洗浄し、2-アミノ -1-(2-ニトロ -フェニル)-エタノール (4 ; 3.28 g、 収率64.8 %)を黄色固体として得た。 
【０１２１】
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS, r. t.)δ: 4.87 (2 H, J = 6.6 Hz, d, ArCH(OH)CH2NH2), 5.42 (1 H, J = 6.6 Hz, dd, ArCH(OH)CH2NH2), 7.58 (1 H, J = 7.7 Hz, t, ArH), 7.80 (1 H, J = 7.6 Hz, t, ArH), 8.00 (1 H, J = 7.8 Hz , d, ArH), 8.04 (1 H, J = 7.3 Hz , d, ArH)
TLC; Rf = 0.1 (クロロホルム/メタノール = 10 / 1, v / v)
MS (ESI-TOF)
[M + H]+ = 183.2
【０１２２】
４．  3-マレイミドプロピオン酸の合成
【０１２３】
【化３２】
2005140755.tif 000035
【０１２４】
＜実験方法＞
1Ｌナスフラスコに無水マレイン酸 (5 ; 50 g, 0.5 mol, 1.0 eq.)を酢酸 (300 ml)の懸濁液として入れ，攪拌しながら3-アミノプロピオン酸 (55 g, 0.6 mol, 1.2 eq.)を滴下し、140℃で4 時間攪拌した。
【０１２５】
減圧留去により、得られた結晶を冷やしたエタノールで洗浄し、3-マレイミドプロピオン酸 (6 ; 18 g, 収率21.0 %)を白色固体として得た。
【０１２６】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.)δ: 2.71 (2 H, J = 7.2 Hz, t, -COCH2CH2N-), 3.84 (2 H, J = 7.2 Hz, t, -COCH2CH2N-), 6.73 (2 H, s, NCOCH=CHCO-)
MS (ESI-TOF)
[M + H]+ = 170.4
【０１２７】
５．  3-(ジオキソ-2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-N-[2-ヒドロキシ -2-(2-ニトロ -フェニル)-エチル]-プロピオンアミドの合成
【０１２８】
【化３３】
2005140755.tif 000036
【０１２９】
＜実験方法＞
Ar気流下で、500 ml三口フラスコに2-アミノ-1-(2-ニトロ-フェニル)-エタノール (4 ; 2.1 g, 11.3 mmol, 1.0 eq.)のジクロロメタン (120 ml) 溶液を入れ、攪拌しながらトリエチルアミン (2.0 ml, 14.1 mmol, 1.3 eq.)，BOP (6.3 g, 14.1 mmol, 1.3 eq.)、3-マレイミドプロピオン酸 (3.1 g, 17.0 mmol, 1.5eq.)を加えた。24 時間後、減圧乾燥したモレキュラーシーブ4Aを加え、さらに 24 時間攪拌した。
【０１３０】
得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液; クロロホルム/メタノー= 40/1, v/v)で分離精製し、3-(ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1- イル)-N-[2-ヒドロキシ-2-(2-ニトロ-フェニル)-エチル]-プロピオンアミド (7 ; 1.7 g, 収率45.2 %)を黄色のシロップ状物質として得た。
【０１３１】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.)δ: 2.60 (2 H, J = 6.9 Hz, t, -NHCOCH2CH2-), 3.63 (2 H, J =  4.4 Hz, d, -CH(OH)CH2NHCO), 3.86 (2 H, J = 6.9Hz, t, -NHCOCH2CH2-), 4.72 (1 H, m, -CH(OH)CH2NHCO-), 6.73 (2 H, s, NCOCH=CHCO-), 7.45 (1 H, J = 7.8 Hz, t, ArH), 7.68 (1 H, J = 7.4 Hz, t, ArH), 7.91 (1 H, J = 7.8 Hz, d, ArH), 7.97 (1 H, J = 8.3 Hz, d, ArH)
TLC; Rf = 0.3 (クロロホルム / Ethyl acetate = 1 / 1 , v / v)
MS (ESI-TOF)
[M + Na]+ = 356.1
【０１３２】
６． 4-ブロモ -ブチリックアシッド2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステルの合成
【０１３３】
【化３４】
2005140755.tif 000037
【０１３４】
＜実験方法＞
Ar気流下で、50 ml二口フラスコに3-(ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-N-[2- ヒドロキシ-2-(2-ニトロ-フェニル)-エチル]-プロピオンアミド (7 ; 238 mg, 713μmol, 1.0 eq.)のジクロロメタン (10 ml)溶液を入れ、氷浴で攪拌しながらトリエチルアミン (200 μＬ, 1.4 mmol, 2.0 eq.)、4-ジメチルアミノピリジン (28.0 mg, 214μmol, 0.3 eq.)を加え、4-ブロモブチリルクロリド (85μＬ, 713μmol, 1.0 eq.)を滴下し、3 時間攪拌した。 
【０１３５】
得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液; クロロホルム/メタノール=40/1, v/v)で分離精製し、4-ブロモ-ブチリックアシッド 2-[3-(2,5-ジオキソ-2, 5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステル (12 ; 40 mg, 収率11.6 %)を黄色のシロップ状物質として得た。
【０１３６】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.)δ: 2.16 (2 H, J = 6.2 Hz, t, -COCH2CH2CH2-), 2.48-2.63 (2 H, m, -NHCOCH2-), 2.48-2.63 (2 H, m, -OCOCH2-), 3.41-3.48 (2 H, m, -OCOCH2CH2-), 3.70-3.90 (2 H, m , -NHCOCH2CH2-), 3.70-3.90 (2 H, m , -CONHCH2-), 6.33-6.37 (1 H, m, -CH(OH)CH2NHCO-), 6.71 (2 H, s, NCOCH=CHCO-), 7.48-7.52 (1 H, m, ArH), 7.65-7.67 (2 H, m, ArH), 8.01 (1 H, J = 8.1 Hz, d, ArH)
TLC; Rf = 0.3 (クロロホルム / メタノール = 30 / 1, v / v)
MS (ESI-TOF)
[M + Na]+ = 504.1, 506.1
【０１３７】
７．  4-ブロモ -ブチリックアシッド2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステルの合成
【０１３８】
【化３５】
2005140755.tif 000038
【０１３９】
＜実験方法＞
Ar気流下で、50 ml二口フラスコに3-(ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-N-[2- ヒドロキシ-2-(2-ニトロ-フェニル)-エチル]-プロピオンアミド (7 ; 1.0 g, 3.0mmol, 1.0 eq.)のジクロロメタン (15 ml)溶液を入れ、氷浴で攪拌しながら、DCC (930mg, 4.5mmol, 1.5 eq),4-ブロモブチリルアシッド (0.75 g, 4.5 mmol, 1.5 eq.)を加えた。 24 時間攪拌後、4-ジメチルアミノピリジン (73 mg, 0.6 mmol, 0.2 eq.)を加え、さらに24 時間攪拌した。 
【０１４０】
得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液; クロロホルム/メタノール=40/1, v/v)で分離精製し、4-ブロモ-ブチリックアシッド 2-[3-(2,5-ジオキソ-2,  5-ジヒドロ-ピロール-1-yl)-プロピルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステル (12 ; 683 mg, 収率47.1 %)を黄色のシロップ状物質として得た。
【０１４１】
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.)δ: 2.16 (2 H, J = 6.2 Hz, t, -COCH2CH2CH2-), 2.48-2.63 (2 H, m, -NHCOCH2-), 2.48-2.63 (2 H, m, -OCOCH2-), 3.41-3.48 (2 H, m, -OCOCH2CH2-), 3.70-3.90 (2 H, m , -NHCOCH2CH2-), 3.70-3.90 (2 H, m , -CONHCH2-), 6.33-6.37 (1 H, m, -CH(OH)CH2NHCO-), 6.71 (2 H, s, NCOCH=CHCO-), 7.48-7.52 (1 H, m, ArH), 7.65-7.67 (2 H, m, ArH), 8.01 (1 H, J = 8.1 Hz, d, ArH)
TLC; Rf = 0.3 (クロロホルム / メタノール = 30 / 1, v / v)
MS (ESI-TOF)
[M + Na]+ = 504.1, 506.1
【０１４２】
８．  {3-[2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エトキシカルボニル]-プロピル}-ジエチル -メチル -アンモニウム; ブロミドの合成
【０１４３】
【化３６】
2005140755.tif 000039
【０１４４】
＜実験方法＞
Ar気流下で、30ml二口フラスコに4-ブロモ-ブチリックアシッド 2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステルのトルエン溶液を入れ、ジエチルメチルアミンを大過剰加え、50℃で12 時間攪拌した。減圧留去により、粗生成物の{3-[2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-プロピオニル-アミノ]-1-(2-ニトロ -フェニル)-エトキシカルボニル]-プロピル}-ジエチル-メチル-アンモニウム;ブロミドを黄色固体として得た。
【０１４５】
MS (ESI-TOF)
[M]+ = 489.3
【０１４６】
９． {3-[2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エトキシカルボニル]-プロピル}-トリエチル-アンモニウム;ブロミドの合成
【０１４７】
【化３７】
2005140755.tif 000040
【０１４８】
＜実験方法＞
30 mlナス型フラスコに4-ブロモ-ブチリックアシッド 2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ-ピロール-1-yl)-プロピオニルアミノ]-1-(2-ニトロ-フェニル)-エチルエステル (8 ; 150 mg, 0.31 mmol, 1.0 eq.)のトルエン (2.0 ml)溶液を入れ、トリエチルアミン (430μＬ, 3.1 mmol, 10 eq.)を滴下し，50 ℃のオイルバスで12 時間撹拌した。
【０１４９】
トルエンとトリエチルアミンを減圧留去後、逆相液体クロマトグラフィー(展開溶媒; メタノール)により精製し、{3-[2-[3-(2,5-ジオキソ -2,5-ジヒドロ -ピロール -1-イル)-プロピオニル - アミノ]-1-(2-ニトロ -フェニル)-エトキシカルボニル]-プロピル}-トリエチル-アンモニウム; ブロミド (10 ; 60.0 mg, 収率38.2 %)を白色固体として得た。
【０１５０】
MS (ESI-TOF)
[M]+ = 503.3
【実施例２】
【０１５１】
上記した反応式に示される９の化合物及び１０の化合物を以下KMP-174, KMP-188と呼ぶ。KMP-174及びKMP-188の光開裂実験を行なった。各化合物の濃度5, 15又は25μMの水溶液１５０μＬに、水銀キセノンランプ（浜松ホトニクス社製L8868、波長365nm, 強度を50%に設定）からの紫外線を１分間照射し、上記方法により質量分析を行なった。結果を図１及び図２に示す。予測した分子量に対応するピークが得られ、光開裂が起きていることが確認された。
【０１５２】
参考例１
目的物質との結合性の確認
本発明のプローブであるKMPシリーズはタンパク質を構成する分子に含まれるシステインと特異的に結合するマレイミド部位を有する。そこでD-システインを用い、実際の結合能を観察した．D-システインは塩酸塩の状態であったので，マレイミドがチオールと特異的に反応することのできるpH5 〜8 (実験ではpH7 )にするためにNaHCO3水溶液でpHを調製した。
【０１５３】
実験は，KMP - 174'（KMP-174の末端のジエチルメチルアミノメチル基がないもの）とD-システインの濃度がそれぞれ500 ，50 ，5 ，0.5 μMのときに，5 ，10 ，15 ，30 ，60 分において反応の進行具合を質量分析にて確認した。
【０１５４】
< 実験条件 >
溶媒：水
pH ：6〜7
反応温度：室温
【０１５５】
濃度が500、50μMにおいては、室温で5 分撹拌すればMSにおいて原料KMP - 174'のピークが消え、反応生成物KMP  174'-システインのピークが検出され、十分に反応が進行することが確認された（図３）。濃度が5 μMにおいても、15 分撹拌すれば反応が十分に進行することが確認された。一方、0.5 μMにおいては、60 分が経過してもMSにおいて反応生成物KMP  174'-システインのピーク (分子量531.48 )も検出されたものの、原料KMP - 174'のピークも検出され、室温での反応の進行は不十分であることを確認することができた。
【０１５６】
以上のことより、マレイミドとチオールとの反応は、数十μM以上の濃度で15 分程度撹拌を続けることによって、反応が十分進行することが分かった。
【実施例３】
【０１５７】
濃度測定
１０ｍMのKMP-188を１０mＭから３倍ずつ９段階に希釈を行い、それぞれ内部標準物質としてベンジルトリエチルアンモニウムブロミドを１０μMずつ加え、上記と同様に光開裂後に質量分析計で解析を行い、KMP-188由来のピーク面積と内部標準物質のピーク面積との比を基準とし、標準曲線の作成を行なった。縦軸に内部標準とのピーク面積比を、横軸にKMP-188の濃度を示したところ、相関係数０．９９を超え濃度測定に定量的に用いられることが示された（図４）。
【実施例４】
【０１５８】
混合物を用いた試料測定
KMP-17４及びKMP-188を混合した場合の定量性を確認するため、これらを一定量ずつ混合し、内部標準物質としてベンジルトリエチルアンモニウムブロミドを１０μMずつ加え、上記と同様に光開裂後に質量分析計で解析を行った。それぞれの分子由来のピーク面積と内部標準物質のピーク面積との比を基準とし、標準曲線を作製した。以下の図５及び図６はそれぞれKMP-174の濃度を変化させた場合と、KMP-188の濃度を変化させた場合を示す。いずれにおいても混合物であっても定量性は失われないことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-174を光開裂させた後に行なった質量分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-188を光開裂させた後に行なった質量分析の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-174の末端のジエチルメチルアミノメチル基がないものとシステインとの反応生成物の質量分析の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-188を系列希釈し、光開裂後に質量分析して作成した標準曲線を示す図である。
【図５】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-174及びKMP-188の混合物を系列希釈し、光開裂後に質量分析して作成したKMP-174の標準曲線を示す図である。
【図６】本発明の実施例で作製した本発明のプローブであるKMP-174及びKMP-188の混合物を系列希釈し、光開裂後に質量分析して作成したKMP-188の標準曲線を示す図である。
【図１】
2005140755.tif 000053
【図２】
2005140755.tif 000054
【図３】
2005140755.tif 000055
【図４】
2005140755.tif 000056
【図５】
2005140755.tif 000057
【図６】
2005140755.tif 000058