(57)【要約】【課題】  本発明は、光学活性な２級アルコール等の合成に用いられ得る、新規な２級アルコール脱水素酵素、それをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換体細胞を、提供することにある。【解決手段】  ゴルドニア属に属する微生物に由来し、ＮＡＤ＋を補酵素として、２−ブタノールを酸化する３種類の新規なアルコール脱水素酵素。及びそれをコードするＤＮＡ，該ＤＮＡを含む形質転換体。【選択図】    なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素：
（１）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過法により６７，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３６，０００、
（３）至適温度：２−プロパノールの酸化時３０℃。
【請求項２】
さらに以下の理化学的性質を有する請求項１記載の２級アルコール脱水素酵素：
（４）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ６、
（５）基質特異性：２−ブタノールの（Ｓ）体を優先的に酸化して２−プロパノンを生成する、および、エタノールの酸化活性を有する、
（６）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が４．４ｍＭ、
（７）Ｎ末端アミノ酸配列：ＭＲＡＶＱＶＶＧＹＨＤＫＬＱＬＮＥＩＰＤ。
【請求項３】
ゴルドニア属に属する微生物由来である請求項１または２記載の２級アルコール脱水素酵素。
【請求項４】
ゴルドニア属に属する微生物が、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項１〜３のいずれかに記載の２級アルコール脱水素酵素。
【請求項５】
ゴルドニア属に属し、請求項１記載の２級アルコール脱水素酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項６】
ゴルドニア属に属する微生物が、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物から２級アルコール脱水素酵素を採取することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項１２】
次の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素：
（８）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（９）分子量：ゲル濾過法により７２，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３７，０００、
（１０）至適温度：２−プロパノールの酸化時７５℃。
【請求項１３】
さらに以下の理化学的性質を有する請求項１２記載の２級アルコール脱水素酵素：
（１１）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ４、
（１２）基質特異性：１，２−プロパンジオールの（Ｒ）体を優先的に酸化してアセトールを生成する、および、エタノールの酸化活性を有する、
（１３）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が０．０２４ｍＭ、
（１４）Ｎ末端アミノ酸配列：ＭＫＡＬＶＦＨＧＰＧＱＫＡＷＥＤＶＰＤＰ。
【請求項１４】
ゴルドニア属に属する微生物由来である請求項１２または１３記載の２級アルコール脱水素酵素。
【請求項１５】
ゴルドニア属に属する微生物が、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項１４記載の２級アルコール脱水素酵素。
【請求項１６】
ゴルドニア属に属し、請求項１２記載の２級アルコール脱水素酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項１７】
ゴルドニア属に属する微生物が、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項１６記載の製造方法。
【請求項１８】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペプチド：
（Ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項１９】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ｃ）配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号６で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項２０】
請求項１９記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項２２】
請求項２１記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物からアルコール脱水素酵素を採取することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２３】
次の理化学的性質を有する２級アルコール脱水素酵素：
（１５）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（１６）分子量：ゲル濾過法により１００，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により５５，０００、
（１７）至適温度：２−プロパノールの酸化時６０℃。
【請求項２４】
さらに以下の理化学的性質を有する請求項２４記載のアルコール脱水素酵素：
（１８）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ５．５、
（１９）基質特異性：２−ヘプタノールの酸化活性、および、２−オクタノールの酸化活性を有する、
（２０）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が４．３ｍＭ、
（２１）Ｎ末端アミノ酸配列：ＴＶＹＡＫＰＧＴＥＧＳＶＭＳＦＥＳＲＹＤ。
【請求項２５】
ゴルドニア属に属する微生物由来である請求項２３または２４記載の２級アルコール脱水素酵素。
【請求項２６】
ゴルドニア属に属する微生物がゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項２５記載のアルコール脱水素酵素。
【請求項２７】
ゴルドニア属に属し、請求項２３記載の２級アルコール脱水素酵素を産生する微生物を培養し、培養物から該酵素を取得することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項２８】
ゴルドニア属に属する微生物が、ゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０）である請求項２７記載の製造方法。
【請求項２９】
以下の（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチド：
（Ｅ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｆ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３０】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡ：
（ｅ）配列番号１２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号１２で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３１】
請求項３０記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項３２】
請求項３１記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項３３】
請求項３２記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物からアルコール脱水素酵素を採取することを特徴とする２級アルコール脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール脱水素酵素およびその製造方法、さらにはこれらの酵素をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換体細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が産生するアルコール脱水素酵素のうち、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と略す）を要求するアルコール脱水素酵素については数多くの報告がある。このうち、２−プロパノールを基質とする酵素としては、ピキア・エスピー（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８、およびシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２１４３９、および、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＰＮＫｂ１由来の酵素が知られている。
【０００３】
上記の酵素のうち、ピキア・エスピー  ＮＲＲＬ−Ｙ−１１３２８およびシュードモナス・エスピー  ＡＴＣＣ２１４３９由来の酵素は、ゲル濾過法およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による酵素蛋白質の分子量の測定値から、いずれも分子量約４８，０００のサブユニットからなる二量体であり、その基質特異性においては２−プロパノールの（Ｒ）体を優先的に酸化してアセトンを生成することを特徴とする。また、これらの酵素が２−プロパノールを酸化する際の至適ｐＨは８−９と報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
また、ロドコッカス・ロドクロウス  ＰＮＫｂ１由来の酵素は、プロパンの資化性を有する微生物が生産する酵素であるが、分子量約４０，０００の同一サブユニットからなる四量体である。本酵素の２−プロパノールを酸化する際のＫｍ値は１８ｍＭと報告されている（非特許文献３）。
【０００５】
このほかに、プロパンの資化性を有する微生物が生産するアルコール脱水素酵素として、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−１２４４の生産するＮＡＤ＋依存性アルコール脱水素酵素は四量体であると報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
２−プロパノールのような２級アルコール化合物に作用するアルコール脱水素酵素は、カルボニル化合物の立体的還元反応による光学活性２級アルコール化合物の合成や、ラセミ体の２級アルコール化合物を立体選択的に酸化させ、光学活性２級アルコール化合物を合成する上で有用な酵素である。
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，４０１−４０６（１９７９）
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，３５９−３６４（１９８１）
【非特許文献３】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８８，２１−２６（１９９０）
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４６，９８−１０５（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光学活性な２級アルコール化合物の合成に用いられ得る、新規な２級アルコール脱水素酵素、それをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換体細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意に研究を行なった結果、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する微生物が、３種類の新規な２級アルコール脱水素酵素を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明はゴルドニア属に属する微生物に由来する新規な２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ１、Ａｄｈ２、及びＡｄｈ３である。
【００１０】
また、本発明は、これら２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、及び当該組換えベクターを含む形質転換体でもある。
【００１１】
更に、本発明は、前記２級アルコール脱水素酵素を産生する能力を有するゴルドニア属に属する微生物、若しくは前記形質転換体を培養し、培養物から当該２級アルコール脱水素酵素を取得することを特徴とする、２級アルコール脱水素酵素の製造法でもある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規なアルコール脱水素酵素、その遺伝子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを含む形質転換体及び新規なアルコール脱水素酵素の製法が提供される。そして、新規なアルコール脱水素酵素を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について記述する。本発明でいう２級アルコール脱水素酵素とは、骨格が同一の１級アルコールおよび２級アルコールに対する活性を比較した場合、２級アルコールに対する活性の方が高い酵素を指す。具体的には、同一条件において２−プロパノールに対する酸化活性が１−プロパノールに対する酸化活性より高い脱水素酵素である。
【００１４】
本発明の２級アルコール脱水素酵素は、プロパンの資化性を有する微生物、好ましくはゴルドニア属に属する微生物、さらに好ましくはゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５株から得ることができる。
【００１５】
上記ゴルドニア・エスピー  ＴＹ−５株は、本発明者らが自然界から分離、採取し、平成１５年９月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託したものであり、寄託番号はＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４０である。上記菌株の菌学的性質は以下のとおりである。
（１）細胞形態：桿菌  ｒｏｄ−ｃｏｃｃｕｓ  ｃｙｃｌｅあり。
培養２４時間（０．８−１．０  ｘ  １．５−５．０μｍ）
培養７２時間（０．８  ｘ  ０．８−１．０μｍ）
（２）グラム染色：陽性
（３）胞子形成：陰性
（４）運動性：陰性
（５）コロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色
（培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ、培養２４時間、３０℃）
（６）カタラーゼ：陽性
（７）オキシダーゼ：陰性
（８）酸／ガス産生：陰性／陰性
（９）Ｏ／Ｆテスト：陰性／陰性
以上の菌学的性状は、ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍの性状に属すると考えられる。また、本菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、ＦＥＳＴＡによりその相同性の解析を行なった結果、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属への帰属が示唆された。従って、ＴＹ−５株はゴルドニア・エスピー（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）に属することが判明した。
【００１６】
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離および／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドはコードするヌクレオチド配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程、このヌクレオチド配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、およびこの組換え微生物を培養して、本発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。
【００１７】
以下に、ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５株より、本発明の酵素を取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
【００１８】
まず、本発明のアルコール脱水素酵素を生産する微生物を適切な培地で培養する。培養方法としては、その微生物が増殖する限り、通常の炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地が用いられ得る。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４−８で振とうもしくは通気することで行い得る。
【００１９】
培養液から菌体を遠心分離した後、菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、該菌体をガラスビーズ等の物理的手法、酵素などの生化学的手法などを用いて破砕または溶解し、更に遠心分離により該溶液中の固形物を除去することにより、酵素の粗酵素液を得ることができる。あるいは、培養液から、上記と同様の精製法で粗酵素液を得ることができる。また、粗酵素液を当業者が通常用いる手法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、透析、クロマトグラフィー等の方法を単独でまたは組み合わせて更に精製することができる。クロマトグラフィーは、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを単独で、または組み合わせて用いることもできる。
【００２０】
なお、一旦精製した酵素が取得できれば、当業者であれば公知の方法により、該酵素をコードするＤＮＡを取得することができる。このＤＮＡを他の微生物に導入して組換え微生物を取得し、これを培養して本発明の酵素を取得し得る。
【００２１】
上記の操作により、ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５株から、本発明の３種類の２級アルコール脱水素酵素（Ａｄｈ１、Ａｄｈ２、及びＡｄｈ３）を取得することができる。以下に各酵素の理化学的性質を記す。
【００２２】
なお、酵素の酸化活性は、例えば、１００ｍＭの基質、１ｍＭのＮＡＤ＋、０．２Ｍの硫酸アンモニウムおよび酵素液を含む２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌの反応液を、３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行ない得る。また、還元活性は、１００ｍＭの基質、０．２５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２Ｍの硫酸アンモニウムおよび酵素液を含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）の反応液を、３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行い得る。
【００２３】
酵素の分子量の測定は、例えばＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムを用いたゲル濾過分析により、標準蛋白質の相対溶出時間から算出することにより決定しうる。また、サブユニットの分子量は、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白質の相対移動度から算出することにより決定しうる。
【００２４】
また、酵素の至適ｐＨ、至適温度は、例えば、上記活性測定系において反応ｐＨ、反応温度を変えて活性を測定することによって決定し得る。
【００２５】
本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ１は以下の（１）−（７）の理化学的性質を有する酵素である：
（１）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（２）分子量：ゲル濾過法により６７，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３６，０００、
（３）至適温度：２−プロパノールの酸化時３０℃、
（４）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ６、
（５）基質特異性：２−ブタノールの（Ｓ）体を優先的に酸化して２−プロパノンを生成する、および、エタノールの酸化活性を有する、
（６）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が４．４ｍＭ、
（７）Ｎ末端アミノ酸配列：ＭＲＡＶＱＶＶＧＹＨＤＫＬＱＬＮＥＩＰＤ。
【００２６】
ここで、「エタノールの酸化活性を有する」とは、上記の活性測定系にてエタノールを基質として測定した場合、２−プロパノールを基質とした場合の５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上の活性を示すことを表す。
【００２７】
本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ２は以下の（８）−（１４）の理化学的性質を有する酵素である：
（８）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（９）分子量：ゲル濾過法により７２，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により３７，０００、
（１０）至適温度：２−プロパノールの酸化時７５℃、
（１１）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ４、
（１２）基質特異性：１，２−プロパンジオールの（Ｒ）体を優先的に酸化してアセトールを生成する、および、エタノールの酸化活性を有する。
（１３）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が０．０２４ｍＭ、
（１４）Ｎ末端アミノ酸配列：ＭＫＡＬＶＦＨＧＰＧＱＫＡＷＥＤＶＰＤＰ。
【００２８】
ここで、「エタノールの酸化活性を有する」とは、上記の活性測定系にてエタノールを基質として測定した場合、２−プロパノールを基質とした場合の５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上の活性を示すことを表す。
【００２９】
本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ３は以下の（８）−（７）の理化学的性質を有する酵素である：
（１５）作用：ＮＡＤ＋を補酵素として、２−プロパノールを酸化してアセトンを生成する、
（１６）分子量：ゲル濾過法により１００，０００、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により５５，０００、
（１７）至適温度：２−プロパノールの酸化時６０℃、
（１８）至適ｐＨ：２−プロパノールの酸化反応時ｐＨ１０、アセトンの還元反応時ｐＨ５．５、
（１９）基質特異性：２−ヘプタノールの酸化活性、および、２−オクタノールの酸化活性を有する、
（２０）Ｋｍ値：２−プロパノールに対するＫｍ値が４．３ｍＭ、
（２１）Ｎ末端アミノ酸配列：ＴＶＹＡＫＰＧＴＥＧＳＶＭＳＦＥＳＲＹＤ。
【００３０】
ここで、「２−ヘプタノールの酸化活性を有する」、あるいは、「２−オクタノールの酸化活性を有する」とは、上記の活性測定系にて２−ヘプタノールあるいは２−オクタノールを基質として測定した場合、２−プロパノールを基質とした場合の８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは１００％以上の活性を示すことを表す。
【００３１】
また、本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ１は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドであってもよい。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００３２】
本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ２は、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のポリペスチドであってもよい。
（Ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｄ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００３３】
また、本発明の２級アルコール脱水素酵素Ａｄｈ３は（Ｅ）又は（Ｆ）のポリペプチドであってもよい。
（Ｅ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｆ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ２級アルコール脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００３４】
次に、本発明の２級アルコール脱水素酵素（ポリペプチド）をコードするＤＮＡを取得する方法の例を記載するが、本発明はこれに限定されない。
【００３５】
まず、精製した酵素を適当なエンドペプチダーゼにより消化し、逆相ＨＰＬＣにより切断された断片を精製後、プロテインシークエンサーにより部分アミノ酸配列の一部を決定する。そして、得られた部分アミノ酸配列をもとにして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、該ＤＮＡの起源となる微生物より、通常のＤＮＡ単離法、例えばＭｕｒｒａｙ等の方法（Ｎｕｃｌ．，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４３２１−４３２５，１９８０）により、該微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該酵素をコードするＤＮＡの一部（コア配列）を増幅し、塩基配列決定を行う。塩基配列決定はジデオキシ・チェイン・ターミネーション法等により決定し得る。例えば、 ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行われ得る。コア配列の周辺領域の塩基配列を明らかにするためには、該微生物の染色体ＤＮＡとベクター、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、コア配列中にその認識配列が存在しない制限酵素により消化し、これらをライゲーションさせ、大腸菌に形質転換する。こうして得られたＤＮＡの塩基配列を明らかにすることにより、目的酵素の全コード領域のＤＮＡ配列を明らかにし得る。
【００３６】
本発明の２級アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡは、上記のＡｄｈ１、Ａｄｈ２、又はＡｄｈ３をコードするＤＮＡであれば、特に制限されないが、例えば、以下の３種類のＤＮＡ（ａｄｈ１、ａｄｈ２、及びａｄｈ３）を挙げることができる。
【００３７】
ａｄｈ１は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである：
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３８】
ａｄｈ２は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡである：
（ｃ）配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号６で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００３９】
ａｄｈ３は、以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡである：
（ｅ）配列番号１２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号１２で示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつ、２級アルコール脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００４０】
また、本発明では、上記ＤＮＡを導入された形質転換微生物を培養することにより、本発明の２級アルコール脱水素酵素を生産することができる。
【００４１】
本発明の酵素のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、それをその導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとしては、適切な宿主微生物内で該酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが用いられ得る。このようなベクターＤＮＡとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用され得る。このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に用いられ得る。例えば、ｐＥＴ−２３（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等が好適に用いられ得る。
【００４２】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００４３】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、ＤＮＡが、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００４４】
本発明のＤＮＡを有するベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡは定法により宿主細胞に導入し得る。宿主細胞として大腸菌を用いた場合、例えば塩化カルシウム法により、本発明のＤＮＡを導入することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお。％は特に断らないかぎり重量％を表す。
【００４６】
（実施例１）Ａｄｈ１の精製
培養以外のすべての操作は４℃で実施した。また、酵素活性（酸化活性）の測定は、１００ｍＭの２−プロパノール、１．０ｍＭのＮＡＤ＋、０．２ｍＭの硫酸アンモニウム及び酵素液を含む２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌの反応液を３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより行ない、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。以降の実施例２以降も、特にことわりのない場合は、この条件で活性を測定した。
【００４７】
ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ）ＴＹ−５を、リン酸水素二カリウム０．４％、リン酸ニ水素カリウム０．２％、塩化アンモニウム０．２％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％、メタルソリューション１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２−プロパノール１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、ｐＨ７．０からなる培地で３０℃で振とう培養し、培養液１０ｌを得た。なお、メタルソリューションとは、１ｌ中に塩化カルシウム２水和物４００ｍｇ、ホウ酸５００ｍｇ、硫酸銅５水和物４０ｍｇ、ヨウ化カリウム１００ｍｇ、硫酸鉄７水和物２００ｍｇ、硫酸マンガン４水和物４００ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物４００ｍｇ、およびモリブデン酸二ナトリウム２水和物１００ｍｇを含む水溶液である。
【００４８】
培養液を遠心分離して菌体を集め、得られた菌体を５００ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、Ｒａｎｎｉｅ社製圧力破砕機を用いて圧力８０ＭＰａ下で菌体を破砕した。遠心分離により不溶物を除いた上清を無細胞抽出液とした。５００ｍｌの無細胞抽出液に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて生じた不溶蛋白質を、遠心分離により取り除いた。
【００４９】
その上清５６５ｍｌに対して８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて、生じた不溶蛋白質を遠心分離により回収した。回収した蛋白質を３０％飽和した硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再溶解し、１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍから０Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い、活性画分を回収した。
【００５０】
活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．２Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い、活性画分を回収した。活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供した。溶出した活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．１Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い、活性画分を回収した。この活性画分を精製酵素とした。以後、本酵素をＡｄｈ１と称する。
【００５１】
Ａｄｈ１を０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供し、分子量標準蛋白質を用いて精製酵素の分子量を測定したところ、約６７，０００であった。また、Ａｄｈ１をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一のバンドが見られた。また、分子量標準蛋白質との移動度の差から、その分子量は約３５，０００と算出された。従って、本菌の生産するＡｄｈ１は同一サブユニットからなる二量体であると考えられた。
【００５２】
（実施例２）Ａｄｈ２の精製
培養以外のすべての操作は４℃で実施した。ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５を、実施例１に示した方法により培養した。培養液１０ｌを遠心分離して菌体を集め、得られた菌体を５００ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、Ｒａｎｎｉｅ社製圧力破砕機を用いて圧力８０ＭＰａ下で菌体を破砕した。遠心分離により不溶物を除いた上清を無細胞抽出液とした。５００ｍｌの無細胞抽出液に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて生じた不溶蛋白質を、遠心分離により取り除いた。その上清５６５ｍｌに対して８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて、生じた不溶蛋白質を遠心分離により回収した。
【００５３】
回収した蛋白質を３０％飽和した硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再溶解し、１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍから０Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い、活性画分を回収した。
【００５４】
活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．２Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い、活性画分を回収した。
【００５５】
活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供した。溶出した活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．１Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行った。溶出した活性画分を７０℃において２０分間熱処理を行い、遠心分離により上清を得た。上清を精製酵素とした。以後、本酵素をＡｄｈ２と称する。
【００５６】
Ａｄｈ２を０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供し、分子量標準蛋白質を用いて精製酵素の分子量を測定したところ、約７２，０００であった。また、Ａｄｈ２をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、２本のバンドが見られた。この２本のバンドはＮ末端アミノ酸シーケンスにより同一の蛋白質であることが分かった。また、分子量標準蛋白質との移動度の差から、その分子量は約４０，０００と算出された。従って、本菌の生産すＡｄｈ２は同一サブユニットからなる二量体であると考えられた。
【００５７】
（実施例３）Ａｄｈ３の精製
培養以外のすべての操作は４℃で実施した。ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５を、実施例１に示した方法により培養した。培養液１０ｌを遠心分離して菌体を集め、得られた菌体を５００ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、Ｒａｎｎｉｅ社製圧力破砕機を用いて圧力８０ＭＰａ下で菌体を破砕した。遠心分離により不溶物を除いた上清を無細胞抽出液とした。５００ｍｌの無細胞抽出液に４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて生じた不溶蛋白質を、遠心分離により取り除いた。その上清５６５ｍｌに対して８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加えて、生じた不溶蛋白質を遠心分離により回収した。回収した蛋白質を３０％飽和した硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再溶解し、１．２Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中の硫酸アンモニウム濃度が１．２Ｍから０Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い活性画分を回収した。
【００５８】
活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．２Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い活性画分を回収した。
【００５９】
活性画分を限外濾過により脱塩、濃縮し、０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００カラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供した。溶出した活性画分を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に対して透析を行い、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の塩化カリウム濃度が０．１Ｍから０．５Ｍまでになるようにしたリニアグラジエントにて行い活性画分を回収した。溶出した活性画分を６０℃において２０分間熱処理を行い、遠心分離により上清を得た。上清を精製酵素とした。以後、本酵素をＡｄｈ３と称する。
【００６０】
Ａｄｈ３を０．１Ｍ塩化カリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）により平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２ＨＲカラムクロマトグラフィーによるゲル濾過に供し、分子量標準蛋白質を用いて精製酵素の分子量を測定したところ、約１００，０００であった。また、Ａｄｈ３をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、単一のバンドが見られた。また、分子量標準蛋白質との移動度の差から、その分子量は約５８，０００と算出された。従って、本菌の生産するＡｄｈ３は同一サブユニットからなる二量体であると考えられた。
【００６１】
（実施例４）基質特異性
１００ｍＭの各種基質、１０ｍＭＮＡＤ＋、０．２Ｍの硫酸アンモニウム及び酵素液を含む２０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１ｍｌの反応液を３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の増加を測定して酵素の酸化活性を測定した。
【００６２】
また、１００ｍＭの各種基質、０．２５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２Ｍの硫酸アンモニウムおよび酵素液を含む２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）の反応液を、３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の減少を測定して酵素の還元活性を測定した。
【００６３】
各種基質に対する酸化活性、還元活性を、２−プロパノールに対する酸化活性を１００とした相対活性で表し、結果を表１にまとめた。
【００６４】
【表１】
2005102511.tif 000002
【００６５】
（実施例５）要求する補酵素
実施例１に示した酵素活性測定条件で、ＮＡＤ＋をＮＡＤＰ＋に変えて酸化活性を測定したところ、ＮＡＤＰ＋による酵素反応は認められなかった。
【００６６】
（実施例６）ｐＨの影響
実施例１に示した酵素活性測定条件で、緩衝液のｐＨを変化させることにより酸化反応の至適ｐＨを求めた。また、１００ｍＭのアセトン、０．２５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２Ｍの硫酸アンモニウム及び酵素液を含む種々のｐＨの緩衝液１ｍｌの反応液を３０℃で１分間反応させ、その間の３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより還元反応の至適ｐＨを求めた。酸化反応時の至適ｐＨは、Ａｄｈ１でｐＨ１０、Ａｄｈ２でｐＨ１０、Ａｄｈ３でｐＨ１０、また、還元反応時の至適ｐＨは、Ａｄｈ１でｐＨ６、Ａｄｈ２でｐＨ４、Ａｄｈ３でｐＨ５．５であった。
【００６７】
（実施例７）温度の影響
実施例１に示した酵素活性測定条件で、反応温度を変化させることにより酸化反応の至適温度を求めた。その結果、Ａｄｈ１で３０℃、Ａｄｈ２で７５℃、Ａｄｈ３で６０℃であった。
【００６８】
（実施例８）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
実施例１〜３で得た各精製酵素標品のＮ末端アミノ酸配列を、フェニルチオヒダントインを用いるアミノ酸分析装置を装着したプロテインシークエンサーを用いて決定したところ、Ａｄｈ１のそれは、ＭＲＡＶＱＶＶＧＹＨＤＫＬＱＬＮＥＩＰＤ、Ａｄｈ２のそれは、ＭＫＡＬＶＦＨＧＰＧＱＫＡＷＥＤＶＰＤＰ、Ａｄｈ３のそれは、ＴＶＹＡＫＰＧＴＥＧＳＶＭＳＦＥＳＲＹＤであった。
【００６９】
（実施例９）Ａｄｈ１をコードする遺伝子のクローニング
実施例８に示したＡｄｈ１のＮ末端アミノ酸配列解析の結果、Ａｄｈ１はプロパンモノオキシゲナーゼクラスター下流に位置するアルコール脱水素酵素遺伝子のコードする蛋白質であることが明らかとなった。当該アルコール脱水素酵素遺伝子（以降、ａｄｈ１遺伝子と称する）は、プロパンモノオキシゲナーゼクラスターをコロニーハイブリダイゼイションによりクローニングした際に同時にクローニングした遺伝子である。
（染色体ＤＮＡの取得）
ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５の菌体から、Ｂｉｏｒａｄ社製Ａｑｕａｐｕｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔを用い、そのプロトコールに従って染色体ＤＮＡを抽出した。
（ａｄｈ１遺伝子を含む組換えベクターの作製）
大腸菌においてａｄｈ１遺伝子を発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ａｄｈ１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後にＳｍａＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。ａｄｈ１遺伝子の塩基配列に基づき、ａｄｈ１の構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩI部位（下線部）を付加したプライマー１（配列表の配列番号３）とａｄｈ１の構造遺伝子の終始コドン下流にＳｍａＩ部位（下線部）付加したプライマー２（配列表の配列番号４）とを合成した。
【００７０】
上記のプライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各１２．５ｐｍｏｌ、染色体ＤＮＡ２５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各５ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液２５μｌを調製し、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、１５分）を２５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。この増幅断片をＮｄｅＩI及びＳｍａＩで消化し、プラスミドｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７プロモーターの下流のＮｄｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入することにより、組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ１を得た。
（組換え大腸菌の作製）
上記で得た組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ１を用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製)を形質転換し、組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ１）を得た。本組換え大腸菌は、平成１５年９月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３７として寄託されている。
（組換え大腸菌におけるａｄｈ１遺伝子の発現）
上記で得た組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ１）を、バクト・トリプトン１．６％、バクト・イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）からなる２ｘＹＴ培地で、３７℃で１０時間培養し、集菌後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、０．１ｍｍのビーズ破砕により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＡｄｈ１活性を実施例１に示した方法により測定した。ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−２３ａ）では活性が認められなかったのに対し、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−ａｄｈ１）では、比活性が０．２１７ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００７１】
（実施例１０）Ａｄｈ２をコードする遺伝子のクローニング
（染色体ＤＮＡの取得）
実施例９と同様に、ゴルドニア・スピーシーズ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．）ＴＹ−５の菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
（Ａｄｈ２をコードする遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）
実施例８で決定したＡｄｈ２のＮ末端アミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、２種類のＰＣＲプライマー（プライマー３：配列表の配列番号７およびプライマー４：配列表の配列番号８）を合成した。プライマー２種（プライマー３及びプライマ４）各２５ｐｍｏｌ、染色体ＤＮＡ２５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各５ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液２５μｌを調製し、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、１５分）を２５サイクル行い、４℃で冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
（ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニング）
増幅ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を含めて７５３塩基からなっていた。以後この配列を「コア配列」と記す。
（逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列（プライマー５：配列表の配列番号９および３’側に近い部分の配列（プライマー６：配列表の配列番号１０）を作製した。
【００７２】
逆ＰＣＲの鋳型として、染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩにより消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物２５０ｎｇ、プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各１２．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各５ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液２５ｍｌを調製し、熱変性熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、５分）をサイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００７３】
増幅ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、Ａｄｈ２をコードするＤＮＡ（以降、ａｄｈ２遺伝子と称する）の全塩基配列を決定した。
（ａｄｈ２遺伝子を含む組換えベクターの作製）
実施例９と同様に、プラスミドｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ部位に、ａｄｈ２遺伝子を挿入することにより、組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ２を得た。
（組換え大腸菌の作製）
上記で得た組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ２を用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製)を形質転換し、組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ２）を得た。本組換え大腸菌は、平成１５年９月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３８として寄託されている。
（組換え大腸菌におけるａｄｈ２遺伝子の発現）
上記で得た組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ２）を、終濃度５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび終濃度３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む実施例１１に記載の２ｘＹＴ培地で、３７℃で一夜培養した。これを同培地組成からなる培地に植菌後、６１０ｎｍにおける濁度が０．８−１．０に達した時点で、ＩＰＴＧを終濃度が５ｍＭとなるように添加し、さらに５時間培養した。培養後、実施例１０に記載の方法により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＡｄｈ２活性を実施例１に示した方法により測定した。ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−２３ａ）では活性が認められなかったのに対し、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−ａｄｈ２）では、比活性が６．３０ｍｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミノゲル電気泳動に供したところ、目的蛋白質に相当する蛋白質の過剰発現が認められた。
【００７４】
（実施例１１）Ａｄｈ３をコードする遺伝子のクローニング
（染色体ＤＮＡの取得）
実施例９と同様に、ゴルドニア・スピーシーズ  ＴＹ−５（Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｓｐ．ＴＹ−５）の菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。
【００７５】
（Ａｄｈ３をコードする遺伝子のＰＣＲ法によるクローニング）
実施例８で決定したＡｄｈ３のＮ末端アミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、２種類のＰＣＲプライマー（プライマー７：配列表の配列番号１３およびプライマー８：配列表の配列番号１４）を合成した。プライマー２種（プライマー７及びプライマー８）各２５ｐｍｏｌ、染色体ＤＮＡ２５０ｎｇ、ｄＮＴＰ各５ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液２５ｍｌを調製し、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、２分）を２５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
（ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片のサブクローニング）
増幅ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を含めて１４１３塩基からなっていた。以後この配列を「コア配列」と記す。
（逆ＰＣＲ法によるコア配列周辺配列のクローニング）
コア配列の５’側に近い部分の相補配列（プライマー９：配列表の配列番号１５および３’側に近い部分の配列（プライマー１０：配列表の配列番号１６）を作製した。
【００７６】
逆ＰＣＲの鋳型として、染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｇｌＩＩにより消化し、消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物２５０ｎｇ、プライマー２種（プライマー９及びプライマー１０）各１２．５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各５ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）０．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液２５ｍｌを調製し、熱変性熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５７℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、５分）を２５サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。
【００７７】
増幅ＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、Ａｄｈ３をコードするＤＮＡ（以降、ａｄｈ３遺伝子と称する）の全塩基配列を決定した。
【００７８】
（ａｄｈ３遺伝子を含む組換えベクターの作製）
実施例９と同様に、プラスミドｐＥＴ−２３ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ部位に、ａｄｈ２遺伝子を挿入することにより、組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ３を得た。
【００７９】
（組換え大腸菌の作製）
上記で得た組換えベクターｐＥＴ−ａｄｈ３を用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製)を形質転換し、組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ３）を得た。本組換え大腸菌は、平成１５年９月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５３９として寄託されている。
【００８０】
（組換え大腸菌におけるａｄｈ３遺伝子の発現）
上記で得た組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ｐＥＴ−ａｄｈ３）を、実施例１１に記載の方法で培養した。培養後、実施例１０に記載の方法により無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＡｄｈ３活性をを実施例１に示した方法により測定した。ベクタープラスミドのみの形質転換体である大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−２３ａ）では活性が認められなかったのに対し、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ）（ｐＥＴ−ａｄｈ３）では、比活性が１４．３ｍｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミノゲル電気泳動に供したところ、目的蛋白質に相当する蛋白質の過剰発現が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】組換えプラスミドｐＥＴ−ａｄｈ２およびｐＥＴ−ａｄｈ３の構造を示す。
【図１】
2005102511.tif 000003
【配列表】
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