(57)【要約】      （修正有）【課題】  真核細胞におけるユビキノン生合成系に関与する新規な遺伝子を提供する。さらに、当該新規遺伝子を欠損することによって得られるユビキノン生合成欠損株及びその製造方法を提供する。【解決手段】  以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。（ａ）特定の配列で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）上記の配列で表されるアミノ酸において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項３】
請求項１又は２の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項４】
宿主細胞を請求項１又は２の遺伝子により形質転換してなる形質転換体。
【請求項５】
請求項１又は２の遺伝子を欠損したユビキノン生合成欠損株。
【請求項６】
サッカロマイセス・セルビシエであることを特徴とする請求項５記載のユビキノン生合成欠損株。
【請求項７】
ユビキノン生合成能を有する細胞における請求項１又は２の遺伝子を欠損させる工程を含む、ユビキノン生合成欠損株の作製方法。
【請求項８】
上記細胞はサッカロマイセス・セルビシエであることを特徴とする請求項７記載のユビキノン生合成欠損株の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬用途等において有用な物質として知られるユビキノンの生合成に関与する新規遺伝子、ユビキノン生合成欠損株及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキノンは、補酵素（ＣｏＱ）とも称される重要な役割を果たしている生体成分である。ユビキノンは、動植物の組織、微生物の菌体成分として広く生物界に存在し、電子伝達系の必須成分として生理的、生化学的に重要な機能を果たしている。天然には側鎖のイソプレノイド単位の数により主にユビキノン６からユビキノン１０までの同族体が存在している。
【０００３】
ユビキノンは、その薬理、臨床効果についても研究され、うっ血性心不全、筋ジストロフィー、貧血症等に効果があるとされ、医薬品としても価値の高い物質である。ところが、ユビキノンの生合成経路は、大腸菌等の原核生物と酵母やヒト等の真核生物とでは一部異なっていると考えられている。図４に大腸菌におけるユビキノン生合成系と酵母におけるユビキノン生合成系とを示す。図４において、化合物1はisopentenyl diphosphateであり、化合物2はdimethylallyl diphosphateであり、化合物3はpolyprenyl diphosphateであり、化合物4は4-hydroxybenzoateであり、化合物5は3-polyprenyl-4-hydroxybenzoateであり、化合物6は2-polyprenylphenolであり、化合物7は2-polyprenyl-6-hydroxyphenolであり、化合物8は3,4-dihydroxy-5-polyprenylbenzoateであり、化合物9は3-methoxy-4-hydroxy-5-polyprenylbenzoateであり、化合物10は2-polyprenyl-6-methoxyphenolであり、化合物11は2-polyprenyl-6-methoxy-1,4-benzoquinoneであり、化合物12は2-polyprenyl-3-methyl-6-methoxy1,4-benzoquinoneであり、化合物13は2-polyprenyl-3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinoneであり、化合物14はubiquinone-nである。
【０００４】
図４に示すように、大腸菌におけるユビキノン生合成系では化合物5から化合物6、その後化合物7に進むのに対して、酵母におけるユビキノン生合成系では化合物5から化合物8、その後化合物9に進む。このように、大腸菌におけるユビキノン生合成系と酵母におけるユビキノン生合成系とは異なっていると考えられており、大腸菌のユビキノン生合成系に関する研究で得られた知見を、酵母のユビキノン生合成系に関する研究に直接適応することはできない。
【０００５】
大腸菌及びサッカロマイセス酵母において、ユビキノン生合成系に関与する遺伝子としては、表１に示す遺伝子及びこれら以外に、機能未確定の遺伝子として、Coq4、Coq8が現在知られている。
【０００６】
【表１】
2005204595.tif 000002
表１に示すように、サッカロマイセス酵母に代表される酵母においては、ユビキノン生合成系に関与する遺伝子として未解明の遺伝子が少なくない。
【０００７】
ところで、ユビキノン１０はヒトの補酵素Q(CoQ)と側鎖長が同一であることより、例えばパラコッカス・デニトリフィカンスから工業的に抽出され、医薬品として利用されている。ユビキノン１０は以前より慢性心臓疾患に対し有効であることが知られており、抗不整脈剤としても有効であるため、アントラサイクリン抗ガン剤投与による不整脈防止等にも利用されている(非特許文献１)。
【０００８】
ユビキノン１０の生合成について述べた先行文献としては、特許文献１及び２を挙げることができる。しかしながら、これら特許文献１及び２に開示された方法は、真核細胞のユビキノン生合成系に関与する新規遺伝子を提供するものではなく、また、ユビキノン１０以外のユビキノンの生合成については記載されていない。
【非特許文献１】Fujioka, T. et al., Tohoku J. Exp. Med. (1983) 141 suppl. 453-463
【特許文献１】特開平８−１０７７８９号公報
【特許文献２】ＷＯ０１／０２７２８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、真核細胞におけるユビキノン生合成系に関与する新規な遺伝子を提供することを目的とし、さらに、当該新規遺伝子を欠損することによって得られるユビキノン生合成欠損株及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
(1)  以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質
(2)  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNA
【００１１】
また、本発明は、上記(1)又は(2)の遺伝子を含む組換えベクター、宿主細胞を上記(1)又は(2)の遺伝子により形質転換してなる形質転換体、上記(1)又は(2)の遺伝子を欠損したユビキノン生合成欠損株もまた提供する。ユビキノン生合成欠損株としては、サッカロマイセス・セルビシエ由来であることが好ましい。
【００１２】
さらに、本発明は、ユビキノン生合成能を有する細胞における上記(1)又は(2)の遺伝子を欠損させる工程を含むユビキノン生合成欠損株の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、真核細胞におけるユビキノン生合成経路に関与する新規な遺伝子が提供される。当該遺伝子によって、未解明な部分を含む真核細胞におけるユビキノン生合成経路の解明に大きく寄与することができる。また、本発明により、当該新規遺伝子を欠損してなる新規なユビキノン生合成欠損株を提供することができる。当該ユビキノン生合成欠損株によれば、ユビキノン生合成経路の解明に寄与するだけでなく、ヒト疾患研究のモデル細胞としても使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
新規遺伝子
先ず、本発明に係る新規遺伝子について説明する。本発明に係る新規遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１５】
ここで、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、従来機能未知であり、本願発明によって初めてユビキノンの生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として同定されたものである（後述の実施例参照）。例えば、サッカロマイセス・セルビシエから単離された新規遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列からなるDNAを含んでいる。
【００１６】
本発明に係る新規遺伝子は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に完全に一致しないアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、相同タンパク質と称する。）であっても、ユビキノン生合成に関与する機能を有するタンパク質をコードするものであればよい。
【００１７】
相同タンパク質としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸において、1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。複数のアミノ酸とは、２〜３０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２〜１０個のアミノ酸を意味する。特に、欠失、置換若しくは付加するアミノ酸は、本タンパク質におけるユビキノン生合成活性に関与する領域を除く領域のアミノ酸であることが好ましい。
【００１８】
相同タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞から単離することができる。サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞としては、酵母細胞、例えばキャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)。糸状菌細胞、例えばポドスポラ・アンセリナ(Podospora anserina)。昆虫細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスター(Dorosophila melanogaster)。線虫細胞、例えばセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabitis elegans)。植物細胞、例えばアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)。魚細胞、例えばゼブラフィッシュ。両生類細胞、例えばアフリカツメガエル。鳥類細胞、例えばニワトリ。爬虫類細胞、例えばヘビ。哺乳類細胞、例えばヒト、サル、ウサギ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット。および、これらの細胞から樹立された細胞株、例えばHeLa細胞、VELO細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、MDCK細胞を挙げることができる。
【００１９】
サッカロマイセス・セルビシエ以外の真核細胞から本発明に係る新規遺伝子を単離するには、例えば、対象の真核細胞に由来するcDNAライブラリーを定法に従って作製し、当該cDNAライブラリーから目的とする新規遺伝子をスクリーニングする方法を挙げることができる。スクリーニングの際には、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプローブ或いはプライマーを用いることができる。当該プローブを用いてスクリーニングする際には、ストリンジェントな条件で当該プローブとハイブリダイズするcDNAを選抜する。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。より具体的にストリンジェントな条件は、例えば、ナトリウム濃度が300〜2000mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が40〜75℃、好ましくは55〜65℃での条件をいう。
【００２０】
換言すれば、本発明に係る新規遺伝子は、配列番号１で表す塩基配列からなるDNAを含むものに限定されず、例えば、配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子（以下、相同型新規遺伝子と称する。）も含まれる。
【００２１】
相同型新規遺伝子としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を挙げることができる。複数の塩基とは、２〜６０個の塩基、好ましくは２〜４０個の塩基、より好ましくは２〜２０個の塩基を意味する。特に、欠失、置換若しくは付加する塩基は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を改変しないものであっても良いし、改変するものであっても良い。欠失、置換若しくは付加する塩基としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を改変する場合にはユビキノン生合成活性に関与する領域を除く領域のアミノ酸のコード領域であることが好ましい。
【００２２】
さらに、相同型新規遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、ユビキノン生合成に必須な機能を有するタンパク質をコードするDNAを含む遺伝子を挙げることができる。ここで相同性とは、例えば、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシムマッチング法のコマンドを実行することにより求められ値である。
【００２３】
さらにまた、本発明に係る新規遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列を含むDNAに変異を導入することで作製される変異型の遺伝子も含まれる。なお、DNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（TaKaRa社製））などを用いて、あるいはTaKaRa社のLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて変異を導入することができる。
【００２４】
相同タンパク質及び相同型新規遺伝子並びに変異型の遺伝子において、ユビキノン生合成に関与する機能とは、具体的に、イソペンテニル二リン酸を出発物質として最終的にユビキノンを合成する過程に含まれる化学反応に直接的に又は間接的に関与し、当該反応を正に制御する機能を意味する。したがって、ある遺伝子が本発明に係る新規遺伝子に含まれるか否かは、当該検査対象の遺伝子を発現もしくは機能的に破壊した細胞株を作製し、当該細胞株におけるユビキノン生合成を検討することによって判定することができる。
【００２５】
ことろで、本発明に係る新規遺伝子を所望のベクターに挿入してなる組換えベクターも本発明に含まれる。組換えベクターは、宿主中に導入可能なものであれば特に限定されず、また、宿主中で複製不可能なものや複製可能なもののいずれも含まれる。例えば、本発明に係る新規遺伝子を挿入するためのベクターとしては、ベクター自体に宿主中での複製能を持たず、ゲノムDNA挿入目的に用いられるDNA、例えば酵母ゲノム挿入用のpRS404やトランスポゾン配列を含むベクターなどが挙げられる。また、本発明に係るDNAを挿入するためのベクターとしては、宿主中で自律複製可能なベクター、例えばプラスミドベクター、シャトルベクター、ウイルスベクター(ファージベクター)などが挙げられる。
【００２６】
プラスミドベクターとしては、E. coli由来のプラスミド（例えばpET30bなどのpET系、pBR322及びpBR325などのpBR系、pUC118、pUC119、pUC18及びpUC19などのpUC系、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、pYES2などのYEp系、YCp50、pRS414などのYCp系等)などが挙げられる。またファージベクターとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルス、又はバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２７】
本発明に係る組換えベクターは、さらに転写プロモーター、リボソーム結合配列、転写ターミネーター及び本発明に係るDNAにより構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。転写プロモーターとしては、例えば恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターが挙げられる。ここで、恒常発現型プロモーターとは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーターを意味し、どの生育条件でも転写活性を有するプロモーターである。一方、誘導発現型プロモーターとは、特定の生育条件で転写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。本発明に係るDNAコンストラクトに含むことができる転写プロモーターは、本発明に係るDNAコンストラクトが導入される宿主細胞中で活性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば、宿主細胞が酵母である場合には、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、TDH3(GAP)プロモーター、ADH1プロモーター、TEF2プロモーター等を用いることができる。また、宿主細胞がE. coliである場合には、trp、lac、trc、tacなどのプロモーターを用いることができる。
【００２８】
また、転写ターミネーターは、本発明に係る新規遺伝子が導入される宿主細胞中で活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来する転写ターミネーターを用いてもよい。例えば宿主細胞が酵母である場合には、ADH1ターミネーター、CYC1ターミネーター等を用いることができる。また、宿主細胞がE. coliである場合には、rrnBターミネーターを用いることができる。
【００２９】
さらに、本発明に係る組換えベクターは、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを含むことができる。なお、選択マーカーとしては、URA3、LEU2、TRP1、HIS3などの栄養非要求性の表現型を指標とするマーカー遺伝子や、Ampr、Tetr、Cmr、Kmr、AUR1-C等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００３０】
また、本発明に係る組換えベクターは、宿主細胞がバクテリアである場合には、遺伝子発現のため、効率的翻訳のためのリボソーム結合部位として開始コドン上流にSD配列 (5'-AGGAGG-3'で代表される)を組み込むこともできる。
【００３１】
ベクターに新規遺伝子を挿入するには、当該新規遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、次いで適当なベクターDNAの制限酵素部位に挿入してベクターに連結する方法が用いられる。
【００３２】
本発明に係る組換えベクターを用いて形質転換体を得ることができる。宿主細胞としては、特に限定されるものではなく、酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、原核生物(バクテリアとアーキア)、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００３３】
真菌としては、変形菌類(Myxomycota)、藻菌類(Phycomycetes)、子嚢菌類(Ascomycota)、担子菌類(Basidiomycota)、不完全菌類(Fungi Imperfecti)が挙げられる。なお、真菌として、工業上利用上重要な酵母が良く知られている。そこで、宿主細胞として、例えば、子嚢菌類の子嚢菌酵母、担子菌類の担子菌酵母又は不完全菌類の不完全菌酵母等を用いることができる。より具体的には、子嚢菌酵母、特に、S. cerevisiae、クルヴェロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の出芽酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等の分裂酵母が挙げられる。酵母の株は、プレニルアルコールを生産することができる限り特に限定されるものではない。S. cerevisiaeの場合、例えばA451、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、ATCC28382などが挙げられる。
【００３４】
バクテリアとしては、大腸菌(Escherichia coli）等のエシェリキア属、バシラス・サティラス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)やアグロバクテリウム・リゾジェネス(Agrobacterium rhizogenes)等のアグロバクテリウム属、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacerium glutamicum)等のコリネバクテリウム属、ラクトバシラス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)等のラクトバシラス属、アクチノマイセス属(Actinomyces)やストレプトマイセス属(Storeptomyces)等の放線菌類(Actinomycetes)が挙げられる。
【００３５】
また、アーキアとしては、メタノバクテリウム属(Metanobacterium)などのメタン生産菌、ハロバクテリウム属(Halobacterium)などの好塩菌、スルフォロバス属(Sulfolobus)等の好熱好酸性菌が挙げられる。
【００３６】
本発明に係る細胞を得るためには、上記宿主細胞のいずれも用いることができるが、特に酵母、その中でも出芽酵母、特にS. cerevisiaeが好ましい。
【００３７】
ユビキノン生合成欠損株
一方、野生型細胞における上述した新規遺伝子を欠損させることによって、ユビキノン生合成欠損株を作製することができる。例えば、野生型の酵母において、上述した新規遺伝子を欠損させることによって、ユビキノン生合成欠損酵母を作出することができる。
【００３８】
ここで、上述した新規遺伝子を欠損させるとは、当該遺伝子の発現を転写レベルで抑制すること、当該遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制すること、当該遺伝子がコードするタンパク質のユビキノン生合成系に関与する機能を欠失又は低下させることを含む意味である。
【００３９】
新規遺伝子の発現を転写レベルで抑制するには、宿主ゲノムにおける新規遺伝子の上流に位置するプロモーター領域を欠失、不活性化する方法を例示できる。また、新規遺伝子の上流に転写を抑制する配列を含むDNA断片を挿入することによっても、新規遺伝子の発現を転写レベルで抑制することができる。さらに、RNAデコイをコードする核酸を宿主内に導入することによって、新規遺伝子の発現を転写レベルで抑制することができる。当該RNAデコイとは、転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するRNAを指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものをいう。
【００４０】
遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制するには、新規遺伝子が転写されてなるmRNAの一部又は全部にハイブリダイズするアンチセンスRNAを導入するか、当該アンチセンスRNAを配点するDNA断片を宿主ゲノムに導入することを含む意味である。アンチセンスRNAとは、対象となるmRNAに相補的な塩基配列を有し、これと２本鎖を形成することによって該mRNAにコードされる遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制するものをいう。なお、アンチセンスRNAの代わりに、アンチセンスDNAを使用することによって、新規遺伝子の発現を転写レベルで抑制することもできる。何れの場合であってもアンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意の核酸物質を使用することができる。例えば、DNA、RNA、又は任意の核酸擬似物が挙げられる。従って、発現を抑制させようとする新規遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンス核酸（オリゴヌクレオチド）配列を設計すればよい。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体も使用することができる。分子類似体は、高安定性、分布特異性などを有するものである。分子類似体には、化学的に反応性である基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものが挙げられる。
【００４１】
さらにまた、リボザイムを使用することによって新規遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制することができる。リボザイムとは、特定のタンパク質のmRNAを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、FEBS Letter, 228; 228-230(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のmRNAを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。
【００４２】
さらにまた、RNA干渉を利用することによって新規遺伝子の発現を翻訳レベルで抑制することができる。RNA干渉とは、二本鎖を形成しているRNA（以下、「二本鎖RNA」又は「dsRNA」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのRNAの塩基配列に相同的な内在性のmRNAが分解される結果、当該mRNAからの遺伝子発現が特異的に抑制される現象である。RNA干渉は、RNAインターフェアランス、RNAiとも称される。RNA干渉の原理を利用するための遺伝子としては、ヘアピン型dsRNA等の宿主内で二本鎖RNAを形成するように、発現を抑制したい遺伝子の塩基配列に基づいて設計される。
【００４３】
一方、遺伝子がコードするタンパク質のユビキノン生合成系に関与する機能を欠失又は低下させるには、例えば、部位特異的突然変異法や遺伝子組換え技術を利用する方法等を挙げることができる。部位特異的突然変異法によれば、上述した新規遺伝子の所望の領域に突然変異を導入することができ、ユビキノン生合成系に関与する機能を欠失又は低下した変異遺伝子を構築することができる。そして、構築した変異遺伝子をゲノムに戻すことによってユビキノン生合成欠損株を作製することができる。また、例えば制限酵素処理等により上述した遺伝子の一部を欠失したDNA断片を構築し、当該DNA断片を用いた遺伝子組換え技術によって、ユビキノン生合成欠損株を作製することができる。
【００４４】
ユビキノン生合成欠損株を作製する際に、新規遺伝子における上記機能が欠失しているか否かは、当該欠損株を培養し、培養後の菌体を集菌して高速液体クロマトグラフィー等の分析装置によって判定することができる。
【００４５】
また、もととなる細胞株としては、特に限定されないが、子嚢菌酵母、特に、S. cerevisiae、クルヴェロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastoris)等の出芽酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等の分裂酵母が好ましい。これら細胞株を使用することによってユビキノン生合成欠損酵母を作出することができる。
【００４６】
また、上述した以外でも、細胞株としては、糸状菌細胞、例えばポドスポラ・アンセリナ(Podospora anserina)を使用することができる。また、昆虫細胞、例えばドロソフィラ・メラノガスター(Dorosophila melanogaster)を使用することができる。さらに、線虫細胞、例えばセノラブディティス・エレガンス(Caenorhabitis elegans)を使用することができる。植物細胞としては、例えばアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)を使用することができる。魚細胞としては、例えばゼブラフィッシュを使用することができる。両生類細胞としては、例えばアフリカツメガエルを使用することができる。鳥類細胞としては、例えばニワトリを使用することができる。爬虫類細胞としては、例えばヘビを使用することができる。哺乳類細胞としては、例えばヒト、サル、ウサギ、イヌ、ハムスター、マウス、ラット、及びこれらの細胞から樹立された細胞株、例えばHeLa細胞、VELO細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、MDCK細胞等を使用することができる。
【００４７】
一般にユビキノン生合成系は、細胞系統によって異なると考えられている。任意の細胞系統においてユビキノン生合成欠損株を作製することができれば、当該細胞系統におけるユビキノン生合成系を研究するツールとして非常に有用であると言える。本発明に係るユビキノン生合成欠損株は、従来、ユビキノン生合成に関与することが知られていない新規遺伝子を欠損させているため、ユビキノン生合成系の研究ツールとしての非常に有効である。
【００４８】
また、ユビキノン生合成欠損株を医薬品のスクリーニングに使用することができる。ユビキノンは医薬品として有効性の高い物質である。しかしながら、脂溶性が高く水溶液にはほとんど溶解しないという物性を有するために、体内への吸収性が劣るともいわれ、製剤化するためには乳化処理を必要とする場合もある。そこで、このような物性を克服するようなユビキノンの修飾方法、もしくはユビキノンにかわる新薬の登場が待たれるところである。ユビキノン生合成欠損株はこのような新薬を含めた、ユビキノン様の生理活性を有する新薬候補化合物のスクリーニングに使用できる。
【００４９】
例えば以下のような候補化合物のスクリーニング法が考えられる。まず、野生型サッカロマイセス・セルビシエから作出したユビキノン生合成欠損酵母を、グリセロールもしくはエターノール等のいわゆる非発酵性の化合物を唯一の炭素源とする培地に播種し、ここに新薬の候補化合物を添加する。ユビキノンを欠いた酵母株は細胞の呼吸鎖が機能しないため、非発酵性炭素源を資化できず、増殖できない。ところが、添加した候補化合物がユビキノンと同様の生理活性を持つ場合は、この化合物がユビキノン欠損を相補することができるため、呼吸鎖機能が回復し酵母は増殖することができる。従って、このような条件下で、ユビキノン生合成欠損酵母を増殖させる活性を持つ遺伝子を選択すれば、ユビキノン様の生理活性を持ち、なおかつ所望の物性を有する化合物を効率よく選抜することが可能である。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において使用した培地等の組成は以下の通りである。
ＹＰＤ培地
グルコース（和光純薬社製）    ２０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）  １０ｇ／Ｌ
ＹＰＤＡ培地
グルコース（和光純薬社製）    ２０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）  １０ｇ／Ｌ
寒天（フナコシ社製）          ２０ｇ／Ｌ
ＹＰＧＤＡ培地
グルコース（和光純薬社製）        １ｇ／Ｌ
グリセロール（ナカライテスク社製）３０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）    ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）      １０ｇ／Ｌ
寒天（フナコシ社製）              ２０ｇ／Ｌ
ＹＰＧ培地
グリセロール（ナカライテスク社製）３０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）    ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）      １０ｇ／Ｌ
ＹＰＧＡ培地
グリセロール（ナカライテスク社製）３０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）    ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）      １０ｇ／Ｌ
寒天（フナコシ社製）              ２０ｇ／Ｌ
ＹＰＥ培地
エタノール（ナカライテスク社製）３０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）  ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）    １０ｇ／Ｌ
ＹＰＥＱ培地
エタノール（ナカライテスク社製）３０ｇ／Ｌ
ポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）  ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）    １０ｇ／Ｌ
コエンザイムＱ６（シグマ社製）    ８．９ｍｇ／Ｌ
【００５１】
ＳＤ（−ＴＲＰ）培地
ＳＤ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＲＰ（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）  ２７．４ｇ／Ｌ
ＳＤＡ（−ＴＲＰ）培地
ＳＤ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＲＰ（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）  ２７．４ｇ／Ｌ
寒天（フナコシ社製）  ２０ｇ／Ｌ
ＳＤ（−ＵＲＡ）培地
ＳＤ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＵＲＡ（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）  ２７．４ｇ／Ｌ
ＳＤ（−ＴＲＰ、−ＵＲＡ）培地
ＳＤ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＲＰ−ＵＲＡ（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）  ２７．４ｇ／Ｌ
ＳＤＡ（−ＴＲＰ、−ＵＲＡ）培地
ＳＤ  Ｍｅｄｉｕｍ−ＴＲＰ−ＵＲＡ（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）  ２７．４ｇ／Ｌ
寒天（フナコシ社製）  ２０ｇ／Ｌ
【００５２】
〔実施例１〕  ユビキノン生合成関連遺伝子の単離
（１）ユビキノン生合成遺伝子欠損株のスクリーニング
イースト・デリーション・プールズ（Ｙｅａｓｔ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｏｏｌｓ：Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  Ｄｉｐｌｏｉｄ、インビトロジェン社製）５μＬを２００ｍｇ／ＬのＧ４１８（ギブコＢＲＬ社製）を含む５ｍLのＹＰＤ培地に加え、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養後、培養液５０μＬを別の２００ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む５ｍＬのＹＰＤ培地に加え、更に３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体を無菌水１ｍＬに懸濁、洗浄後５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。ここに無菌水１ｍＬを加えて懸濁し菌液とした。菌液１００μＬを無菌水で１０倍に希釈し、６００ｎｍの濁度を測定した。６００ｍｍにおける濁度が１のとき、菌体濃度が１ｘ１０７個／ｍＬであると見積もって、菌５００個／プレートとなるように無菌水で希釈し、ＹＰＧＤＡ培地に菌液を塗布した。菌液を塗布したＹＰＧＤＡ培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。
【００５３】
４日間静置培養を行った後にＹＰＧＤＡ培地上に形成されたコロニーのうち、比較的大きさの小さいコロニー（プチコロニー）を楊枝の先でピックアップし、ＹＰＤＡ培地に塗布した。コロニーを塗布したＹＰＤＡ培地を３０℃で３日間静置培養した後、ＹＰＧＡ培地にレプリカし、レプリカしたＹＰＧＡ培地を３０℃で４日間静置培養した。培養後、ＹＰＤＡ培地で良好な生育を示し、ＹＰＧＡ培地で生育しない株を選抜した。
【００５４】
このようにして選抜した株を２００ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む５ｍLのＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、各菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した各菌体を無菌水１ｍＬに懸濁、洗浄後５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。ここに無菌水１ｍＬを加えて懸濁し菌液とした。各菌液１００μＬを無菌水で１０倍に希釈し、６００ｎｍの濁度を測定した。この各菌液を濁度６００ｎｍが０．２となるように希釈し、各２ｍＬのＹＰＥ培地およびＹＰＥＱ培地に加えた。３０℃、１３０ｒｐｍで５日間振とう培養した後、ＹＰＥＱ培地で生育し、ＹＰＥ培地で生育しない株として６株を選抜した。
【００５５】
（２）スクリーニング株の欠損遺伝子の特定
上記のようにして選抜した６株を２００ｍｇ／ＬのＧ４１８を含む５ｍLのＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、各菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した各菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。
【００５６】
このようにして単離した各株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、Ｕ１：５’−ＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＣＴＣＴ−３’（配列番号３）とＤ１：５’−ＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧ−３’（配列番号４）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  ＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分３０秒のサイクルを３０回実施し、染色体ＤＮＡ上の遺伝子欠損部位の増幅を行った。増幅した遺伝子断片をＤＮＡ精製キット（ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて精製した。
【００５７】
次に、精製した遺伝子断片の塩基配列を決定した。塩基配列決定には、ＫａｎＢ：５’−ＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＡＡＴ−３’（配列番号５）もしくはＫａｎＣ：５’−ＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡ−３’（配列番号６）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。
【００５８】
このようにして決定した染色体上の遺伝子欠損部位の配列から、欠損遺伝子の目印として挿入されているバーコードオリゴ（２０塩基）の配列を確認し、サッカロマイセス  ゲノム  デリーション  プロジェクトのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＹＤＰＭ／ＹＤＰＭ  ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）記載の対照表と照らし合わせて、欠損遺伝子の決定を行った。結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2005204595.tif 000003
表２に示すように、欠損遺伝子としてＹＧＲ２５５Ｃ、ＹＮＲ０４１Ｃ、ＹＬＲ２０２Ｃ、ＹＬＲ２０１Ｃ、ＹＮＲ０４２Ｗ及びＹＭＬ１１０Ｃの６種の遺伝子を同定した。同定した遺伝子のうち、ＹＧＲ２５５Ｃ、ＹＮＲ０４１Ｃ及びＹＭＬ１１０ＣはそれぞれＣｏｑ６，Ｃｏｑ２及びＣｏｑ５遺伝子であり、いずれも既知のユビキノン生合成経路遺伝子であった。ところが、ＹＬＲ２０２Ｃ、ＹＬＲ２０１Ｃ及びＹＮＲ０４２Ｗはユビキノン生合成経路の既知遺伝子ではなく、機能未知遺伝子であった。
【００６０】
〔実施例２〕  ＹＬＲ２０１Ｃ欠損酵母の作製
実施例１で同定した機能未知遺伝子の中でＹＬＲ２０１Ｃについて更に検討した。すなわち、本実施例では、先ず、野生型の酵母から単離したＹＬＲ２０１Ｃを基にしてＹＬＲ２０１Ｃ破壊用遺伝子断片を作製し、次にＹＬＲ２０１Ｃ破壊用遺伝子断片を用いてＹＬＲ２０１Ｃ欠損酵母を作製した
（１）ＹＬＲ２０１Ｃ破壊用遺伝子断片の作製
先ず、酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より購入）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。
【００６１】
このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＹＬＲ２０１Ｃ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号７）とＹＬＲ２０１ＣｄＴＡＡ／Ｒ：５‘−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  ＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃２分の変性反応後、９４℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃５０秒のサイクルを２５回実施しＹＬＲ２０１ＣｄＴＡＡの増幅を行った。増幅した遺伝子断片はキアゲン社製ＤＮＡ精製キットを用いて精製した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。
【００６２】
得られたＹＬＲ２０１ＣｄＴＡＡ／ｐＴ７Ｂｌｕｅを制限酵素ＭｕｎＩおよびＢｓｔ１１０７Ｉ（宝酒造社製）によって切断し、切断した間に、両端にＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩサイトを有するＴＲＰ１遺伝子を挿入した。このようにしてｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅを作製した（図１参照）。
【００６３】
次に、作製したｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅを鋳型とし、ＹＬＲ２０１Ｃ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号７）とＹＬＲ２０１ＣｄＴＡＡ／Ｒ：５‘−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号８）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ  ｐｌｕｓを用いた。ＰＣＲ条件は９４℃２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分のサイクルを２５回実施しｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１断片の増幅を行った。このようにしてＹＬＲ２０１Ｃ破壊用遺伝子断片を作製した。この結果を図１に示す。
【００６４】
（２）ＹＬＲ２０１Ｃ欠損酵母の作製
野生型酵母におけるＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子の破壊は、１ステップ遺伝子破壊法(大嶋泰治ら  蛋白質核酸酵素  Ｖｏｌ．３５  Ｎｏ．１４  ２５２３−２５４１（１９９０）)によって行った。まず、酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より購入）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにＹＬＲ２０１Ｃ破壊用遺伝子断片ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１  １μｇを加えた後、キット付属の手順書に従い調製した菌液をＳＤ（−ＴＲＰ）Ａ培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＴＲＰ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＹＬＲ２０１Ｃ欠損株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９株を作製した。
【００６５】
作製したＹＬＲ２０１Ｃ欠損株はＹＰＤＡ培地上では生育するものの、ＹＰＧＡ培地上では生育できない、呼吸欠損の表現型を示した。
【００６６】
〔実施例３〕  ＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入酵母の作製
本実施例では、実施例２で作製したＹＬＲ２０１Ｃ欠損株にＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクターを導入した形質転換体及び、その比較となるコントロールの形質転換体を作製した。
（１）ＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクターの作製
酵母ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社より購入）をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から染色体ＤＮＡを単離した。単離には「Ｇｅｎとるくん」（宝酒造社製）を使用した。
【００６７】
このようにして単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＹＬＲ２０１Ｃ／Ｆ：５‘−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号７）とＹＬＲ２０１Ｃ／Ｒ：５‘−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＣＣＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＴＡＣＣ−３’（配列番号９）をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼにはＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用い、サーマルサイクラーはＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  ＭＰ（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ条件は９４℃２分の変性反応後、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で５０秒のサイクルを２５回実施しＹＬＲ２０１Ｃの増幅を行った。増幅した遺伝子断片をＤＮＡ精製キット（ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、キアゲン社製）を用いて精製した後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（ノバジェン社製）にクローニングした。
【００６８】
このようにして作製したＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＴ７Ｂｌｕｅの塩基配列を決定した。塩基配列決定には、Ｔ７：５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１０）もしくはＵ１９：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ−３’（配列番号１１）をプライマーとして、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサー  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定した。
【００６９】
次にＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＴ７Ｂｌｕｅを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）によって切断した後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、両端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイトを有するＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子断片を分離し、当該断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩキット（Ｑ−ＢＩＯＧＥＮＥ社製）を用いてゲルから精製した。精製した当該断片を発現ベクターｐＲＳ４３６ＧＡＰ（特開２００２−１９９８８３号公報参照）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰベクターを作製した。この結果得られたベクターを図２に示す。
【００７０】
（２）ＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株の作製
実施例２で作製したＹＬＲ２０１Ｃ欠損株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９株をＳＤ（−ＴＲＰ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収した菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬに（１）で作製したＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰベクター  １μｇを加えた後、キット付属の手順書に従い調製した菌液を、ＳＤＡ（−ＴＲＰ  −ＵＲＡ）培地に塗布した。菌液を塗布したＳＤＡ（−ＴＲＰ  −ＵＲＡ）培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株を作製した。
【００７１】
（３）ｐＲＳ４３６ベクター導入株の作製
実施例２で作製したＹＬＲ２０１Ｃ欠損株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９株をＳＤ（−ＴＲＰ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。同様に、ＹＰＨ４９９株をＹＰＤ培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養終了後、各菌体を５０００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収した。回収したそれぞれの菌体から、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット(ザイモリサーチ社製)を用いてコンピテントセルを作製した。作製したコンピテントセル１０μＬにｐＲＳ４３６ベクター  １μｇを加えた後、キット付属の手順書に従い調製した菌液を、ＹＬＲ２０１Ｃ欠損株の場合はＳＤＡ（−ＴＲＰ  −ＵＲＡ）培地に塗布し、ＹＰＨ４９９株の場合はＳＤＡ（−ＵＲＡ）培地に塗布した。菌液を塗布した培地は菌がコロニーを形成するまで４日間３０℃で静置培養した。このようにしてｐＲＳ４３６ベクター導入株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株およびＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株を作製した。
【００７２】
〔実施例４〕  ユビキノン６の分析
本実施例では、実施例３で作製したＹＬＲ２０１Ｃ発現ベクター導入株及びｐＲＳ４３６ベクター導入株におけるユビキノン生合成能を検討した。
（１）ユビキノン６の抽出
酵母のユビキノンの分析はＨａｇｅｒｍａｎらの方法（Ｈａｇｅｒｍａｎら  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９６、  １４１−１４３  （２００１））に若干の修正を加えて実施した。まず、ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株、ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株及びｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株をそれぞれ５ｍLのＳＤ（−ＵＲＡ）培地に播種し、３０℃、１３０ｒｐｍで１５時間振とう培養した。培養後、培養液０．５ｍＬを別の５０ｍＬのＳＤ（−ＵＲＡ）培地に加え、更に３０℃、１３０ｒｐｍで７０時間振とう培養した。培養終了後、菌体を３５００ｒｐｍ、５分の遠心操作によって回収し、菌体の湿重量を測定した。
【００７３】
回収した菌体に、菌体湿重量の１０倍量のガラスビーズ（シグマ社製）および水分含量が１．５ｍＬとなるように無菌水を加えた。更に内部標準物質として１００μＭのコエンザイムＱ９（シグマ社製）を７０μＬ添加し、ボルテックスミキサーで２分間攪拌した。攪拌後、９８％メタノール（ナカライテスク社製）６ｍＬとペンタン（ナカライテスク社製）４ｍＬを加え、更にボルテックスミキサーで３０秒間攪拌した。攪拌後、２０００ｒｐｍ、１０分の遠心操作によって有機相（上相）と水相（下相）に分離し、パスツールピペットを用いて、有機相を定量的に別の試験管に回収した。残った水相にペンタン４ｍＬを加え、同様の抽出操作によって有機相を回収し、これを先に回収した有機相に加えた。次に、スピードバックＳＣ２１０Ａ（サーバント社製）を用いて、回収した有機相を蒸発乾固した。
【００７４】
（２）ユビキノン６の分析
蒸発乾固させた有機相に含まれている抽出物を１ｍＬのジクロロメタン／ヘキサン（２．５／１）（共にナカライテスク社製）に再溶解した。この溶液を、シリカゲル６０Ａ（シグマ社製）０．３ｇを充填したマイクロバイオスピンエンプティーカラム（バイオラッド社製）に供し、ジクロロメタン／ヘキサン（２．５／１）６ｍＬで洗浄溶出し、ユビキノン６を含む画分を回収した。スピードバックを用いて、回収したユビキノン６を含む画分を蒸発乾固した後、メタノール／エタノール（９／１）（共にナカライテスク社製）０．５ｍＬで再溶解し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
【００７５】
ＨＰＬＣ分析装置としてはＨＰ１１００（ヒューレットパッカード社製）を使用し、分析用カラムにはデベロシルＯＤＳ−ＵＧ−３（野村化学社製）を用いた。移動相としてメタノール／ヘキサン（９／１）を１．０ｍＬ／分の流速で流通させ、ユビキノンの検出はＵＶ２７５ｎｍの吸収を追跡することによって行った。ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株、ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株およびｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株それぞれのユビキノン６の分析結果を図３に示す。
【００７６】
図３から分かるように、親株であるＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株は、ユビキノン６（ＵＱ−６）のピークが観察されたが、ＹＬＲ２０１Ｃ欠損株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株ではユビキノン６に相当するピークが消失していた。さらに、この株にＹＬＲ２０１Ｃを導入した株：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ＹＰＨ４９９［ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］株ではユビキノン６のピークが出現した。これらのことから、ＹＬＲ２０１Ｃがユビキノン生合成に必須の遺伝子であることとともに、ＹＬＲ２０１Ｃの欠損／発現を制御することによりユビキノンの生合成を制御可能であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】サッカロマイセス酵母のＹＬＲ２０１Ｃ遺伝子の破壊用プラスミド：ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１／ｐＴ７Ｂｌｕｅの構築を示す模式図である。
【図２】プラスミドｐＲＳ４３６ＧＡＰ及びＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰの構造を示す模式図である。
【図３】酵母組換え株ＹＰＨ４９９［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］、ｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１［ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］及びｙｌｒ２０１ｃΔＴＲＰ１［ＹＬＲ２０１Ｃ／ｐＲＳ４３６ＧＡＰ］から抽出したユビキノン６のＨＰＬＣクロマトグラムを示す特性図である。
【図４】大腸菌等の原核生物のユビキノン生合成経路および酵母等の真核生物のユビキノン生合成経路を示す反応経路図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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