(57)【要約】      （修正有）【課題】治療法を提供することを目的とする。【解決手段】患者の該疾患、異常または状態に対して有効なプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩の有効量を必要とする患者に投与することを含む、（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態の治療方法を記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の該疾患、異常または状態に対して有効なプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩の有効量を必要とする患者に投与することを含む、（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態の治療方法。
【請求項２】
（ｉ）該神経変性疾患がパーキンソン病、ハンチントン病または筋萎縮性脊髄側索硬化症であり；（ｉｉ）該痴呆がアルツハイマー病またはローリー体痴呆、血管性痴呆、及びパーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部外傷またはＨＩＶ感染による痴呆から選択された非アルツハイマー痴呆であり；（ｉｉｉ）該精神または感情の異常がうつ病、憂鬱症、双極性感情障害、躁鬱精神病、精神分裂病または単純精神病、分裂症様状態、感情分裂状態、及び妄想状態からなる群から選択された精神分裂病関連状態であり；（ｉｖ）該薬物依存がアルコール依存、麻薬依存、コカイン依存、アンフェタミン依存、幻覚剤依存、またはフェンシクリジン使用及びそれらによる禁断症状であり；（ｖ）該記憶喪失が健忘症またはアルツハイマー型痴呆、非アルツハイマー型痴呆、またはパーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部外傷、ＨＩＶ感染、甲状腺機能低下症及びビタミンＢ１２欠乏からなる群から選択された疾患または障害に伴う記憶喪失であり；（ｖｉ）該急性神経学的外傷性疾患または神経外傷が頭部外傷または脊髄外傷であり；（ｖｉｉ）該脱髄性疾患が多発性硬化症であり；（ｖｉｉｉ）該発作性疾患がてんかんであり；（ｉｘ）該脳血管性疾患が脳虚血または卒中であり；（ｘ）該行動異常が神経学的原因によるもの、及び過剰活動性症候群または注意力欠乏状態であり；（ｘｉ）該神経毒性障害が神経毒によるものであり、そして該神経毒が神経ガスまたは毒蛇、魚または動物の毒物発射系であり；（ｘｉｉ）該心血管系疾患がうっ血性心不全、心肥大、心筋梗塞、心筋虚血、心筋虚血後再潅流または不整脈である、請求項１に記載の治療方法。
【請求項３】
患者における脳虚血または卒中を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を必要とする患者に投与することを含む脳虚血または卒中の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者における頭部外傷を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を必要とする患者に投与することを含む頭部外傷の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項５】
患者における脊髄外傷を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を投与することを含む脊髄外傷の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項６】
患者における神経外傷を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む神経外傷の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項７】
患者における神経変性疾患を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む神経変性疾患に罹患した患者の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項８】
該神経変性疾患がパーキンソン病である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
患者における痴呆を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む痴呆に罹患した患者の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
該痴呆がアルツハイマー病である請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
患者における神経毒障害を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む神経毒障害を受けた患者の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
該神経毒障害が神経ガスによるものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
患者におけるうつ病を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含むうつ病に罹患した患者の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
該心血管系疾患を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む、その治療を必要とする患者における心血管系疾患の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
該心血管系疾患がうっ血性心不全である請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
患者における心肥大を治療するのに有効量のプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を患者に投与することを含む心肥大の治療のための請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態を治療するための医薬組成物を調製するためにプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を使用すること。
【請求項１８】
該医薬組成物がプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を含み、そして該包装資材が（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態を治療するのに有効であることを示すラベルを含む、包装資材及び包装資材中に入れられた医薬組成物を含む製造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はプロパルギルアミンを含む医薬組成物及び神経変性性、脱髄性、心血管性、行動性及びそのほかの疾患、異常または状態の治療方法に関するものである。
【０００２】
略語：Ａβ：アミロイド−β；Ａβ１−４２：アミロイド原性Ａβペプチド；ＡＤ：アルツハイマー病；ＡＰＰ：アミロイド前駆タンパク；ＣｈＥ：コリンエステラーゼ；ＥＲＫ：細胞外シグナル制御キナーゼ；ＭＡＯ：モノアミンオキシダーゼ；ＭＡＰＫ：マイトージェン活性化プロテインキナーゼ；ＰＫＣ：プロテインキナーゼＣ；ｓＡＰＰα：可溶性アミロイド−α前駆タンパク。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
いくつかのプロパルギルアミン誘導体はモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ｂ及び／またはＭＡＯ−Ａ活性を選択的に阻害するので、パーキンソン病及びアルツハイマー病のような神経変性性疾患の治療に適することが示されている。さらに、これらの化合物はアポトーシスを防ぐことにより神経変性を防御することも示されている。
【０００４】
ＭＡＯ−Ｂを選択的に阻害することが認められた最初の化合物はＲ−（−）−Ｎ−メチル−Ｎ−（プロピ−２−イニル）−２−アミノフェニルプロパンであり、Ｌ−（−）−デプレニル、Ｒ−（−）−デプレニル、またはセレギリンとしても知られている。パーキンソン病に加えて、セレギリンが有用であるとして開示されているそのほかの病気としては以下のものが含まれる：薬物禁断症状（ＷＯ９２／２１３３３、精神興奮薬、オピエート、麻酔薬、及びバルビツレートを含む）；うつ病（ＵＳ４，８６１，８００）；アルツハイマー病及びパーキンソン病、特に軟膏、クリーム及びパッチを含む経皮投与形態の使用による；斑状変性（ＵＳ５，２４２，９５０）；腎機能及び空間学習能力により確認される認識機能を含む年齢依存変性（ＵＳ５，１５１，４４９）；ヒト及び非ヒトにおける下垂体依存カッシング病（ＵＳ５，１９２，８０８）；ヒト（ＵＳ５，３８７，６１５）及び動物（ＵＳ５，２７６，０５７）の免疫系異常；哺乳動物における年齢依存体重減少（ＵＳ５，２２５，４４６）；精神分裂症（ＵＳ５，１５１，４１９）；及び乳腺及び下垂体腫瘍のような癌を含む種々の新生物。ＷＯ９２／１７１６９は、神経筋及び神経変性疾患の治療及び低酸素、低血糖、虚血発作または外傷による中枢神経系障害の治療にセレギリンを使用することを開示している。さらに、セレギリンの神経細胞に対する生化学的効果は詳細に検討されている（例えば、Ｔａｔｔｏｎ，１９９３，及びＴａｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，１９９１）。ＵＳ６，５６２，３６５はセレギリンが有効な病気や状態にデスメチルセレギリンの使用を開示している。
【０００５】
ＵＳ５，１６９，８６８，ＵＳ５，８４０，９７９及びＵＳ６，２５１，９５０には、選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害薬、神経保護薬及び細胞救助薬として脂肪族プロパルギルアミンが開示されている。リード化合物、（Ｒ）−Ｎ−（２−ヘプチル）メチル−プロパルギルアミン（Ｒ−２ＨＭＰ）は強力なＭＡＯ−Ｂ阻害薬及び抗アポトーシス薬であることが示されている（Ｄｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００６】
ラサギリン、Ｒ（＋）−Ｎ−プロパルギル−１−アミノインダン、非常に強力な選択的不可逆的モノアミンオキシダーゼ  （ＭＡＯ）−Ｂ阻害薬、抗−パーキンソン病薬（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ）は細胞培養及びインビボにおいて種々の障害に対する神経保護作用及び抗アポトーシス効果を示すことが認められている（Ｙｏｕｄｉｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００２ａ）。
【０００７】
ドパミン作動性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＰＣ１２細胞の培養において、Ｎ−メチル（Ｒ）サルソリノール、パーオキシ亜硝酸ドナー、ＳＩＮ−１（Ｎ−モルホリノ−シドノニミン）、６−ヒドロキシドパミン、及び血清及び神経増殖因子（ＮＧＦ）除去により誘発されるアポトーシスに対するラサギリンによる神経保護作用の基となる機序について研究された（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ；Ａｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，２００２；Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ，２００１ｂ，２００２）。
【０００８】
ラサギリン及びその医薬として受容しうる塩は最初米国特許ＵＳ５，３８７，６１２，ＵＳ５，４５３，４４６，ＵＳ５，４５７，１３３，ＵＳ５，５７６，３５３，ＵＳ５，６６８，１８１，ＵＳ５，７８６，３９０，ＵＳ５，８９１，９２３，及びＵＳ６，６３０，５１４にパーキンソン病、記憶障害、アルツハイマー型の痴呆、うつ病、及び過剰活動症候群の治療に有用であるとして開示された。４−フルオロ−、５−フルオロ−、及び６−フルオロ−Ｎ−プロパルギル−１−アミノインダン誘導体は同じ目的でＵＳ５，４８６，５４１に開示されている。
【０００９】
ＵＳ５，５１９，０６１，ＵＳ５，５３２，４１５，ＵＳ５，５９９，９９１，ＵＳ５，７４４，５００，ＵＳ６，２７７，８８６，ＵＳ６，３１６，５０４，ＵＳ１３３，ＵＳ５，５７６，３５３，ＵＳ５，６６８，１８１，ＵＳ５，７８６，３９０，ＵＳ５，８９１，９２３，及びＵＳ６，６３０，５１４にはＲ（＋）−Ｎ−プロパルギル−１−アミノインダン及びその医薬として受容しうる塩がそのほかの効能、すなわち、精神病、神経学的低酸素、神経変性疾患、神経毒性障害、虚血発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄外傷、精神分裂病、注意力欠乏症、多発性硬化症、及び禁断症状の治療に有効であるとして開示されている。
【００１０】
ＵＳ６，２５１，９３８にはＮ−プロパルギル−フェニルエチルアミン化合物が、そしてＵＳ６，３０３，６５０，ＵＳ６，４６２，２２２及びＵＳ６，５３８，０２５にはＮ−プロパルギル−１−アミノインダン及びＮ−プロパルギル−１−アミノテトラリン化合物が記述されており、うつ病、注意力欠乏症、注意力欠如過剰活動症、トーレット症候群、アルツハイマー病及び老年性痴呆、パーキンソン型の痴呆、血管性痴呆、及びローリー体痴呆のようなそのほかの痴呆の治療に有用であるといわれている。
【００１１】
本発明者らによる以前の研究では、ラサギリン及び関連プロパルギルアミン誘導体はミトコンドリアに始まるアポトーシス細胞死カスケードを抑制することが示されていた；これらは透過性変化及び続くアポトーシス過程の活性化：カスパーゼ３の活性化、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの核内転移、及びヌクレオソームＤＮＡフラグメンテーション、によるアポトーシス前ミトコンドリア膜ポテンシャルの低下（ΔΨｍ）を阻止する（Ｙｏｕｄｉｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００２ｂ）。単独及びＬ−ドーパどの併用による管理された試験により、ラサギリンの抗パーキンソン効果が示された。ラサギリンのパーキンソン病における第３相臨床試験は２００３年Ｔｅｖａ医薬品工業会社（Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａｈ，イスラエル）により成功裏に完結した。
【００１２】
最近、われわれは、ラサギリンのＭＡＯ阻害及び神経保護作用に、アルツハイマー病（ＡＤ）患者に有効であることが立証されている薬物であるリバスチグミンのコリンエステラーゼ（ＣｈＥ）阻害作用を組み合わせる目的で、カルバメート分子を含むラサギリンの同属体を２個合成した；ＴＶ３３２６［（Ｎ−プロパルギル−（３Ｒ）アミノインダン−５−イル）−エチルメチルカルバメート］、ＣｈＥ及びＭＡＯ−Ａ及びＢの阻害作用を有する、及びそのＳ−異性体、ＴＶ３２７９、ＣｈＥの阻害薬であるがＭＡＯは阻害しない（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，１９９９；Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓａｉ，２００１）。ラサギリンと同様に、これらの化合物は種々の侵襲に対して神経保護作用を有しており、これらはＣｈＥ及びＭＡＯ阻害作用に関係がなく、プロパルギル基に内在する薬理作用に由来するようである（Ｙｏｕｄｉｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００２ａ）。さらに、ＴＶ３３２６及びＴＶ３２７９は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を介して、神経栄養／神経保護性非アミロイド原性−可溶性アミロイド前駆タンパク（ｓＡＰＰβ）の放出を促進する（Ｙｏｇｅｖ−Ｆａｌａｃｈ，２００２）。このように、これらの薬物は潜在的アミロイド原性誘導体の形成に影響することができるので、ＡＤの治療のために臨床的に重要となりうる。
【００１３】
プロパルギルアミンは数年前に機序が解明された銅含有ウシ血漿アミンオキシダーゼ（ＢＰＡＯ）の阻害薬であることが報告されたが、強度は中程度であった。ＵＳ６，３９５，７８０は弱いグリシン開裂系阻害薬としてプロパルギルアミンを開示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要約
本発明は、患者の該疾患、異常または状態に対して有効なプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩の有効量を必要とする患者に投与することを含む、（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態の治療方法を提供する。
【００１５】
そのほかの態様において、上記（ｉ）から（ｘｉｉ）に規定した疾患、異常または状態の予防及び／または治療のために、本発明は医薬として受容しうる担体及びプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
そのほかの態様において、上記（ｉ）から（ｘｉｉ）に規定した疾患、異常または状態の予防及び／または治療のための医薬組成物を製造するために、本発明はプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を使用することに関係する。
【００１７】
さらにそのほかの態様において、該医薬組成物はプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を含み、そして該包装資材は該薬物が（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患；からなる群から選択された疾患、異常または状態の治療に有効であることを示すラベルを含んでいる包装資材及びその包装資材中に入れられた医薬組成物を含む製造物に関係する。
【００１８】
発明の詳細な説明
以前の予備的研究において、われわれは抗アルツハイマー病薬（Ｎ−プロパルギル−（３Ｒ）アミノインダン−５−イル）−エチルメチルカルバメート（ＴＶ３３２６）及びそのＳ−異性体（ＴＶ３２７９）のプロパルギルアミン分子は薬理的にＭＡＰＫ−依存ＡＰＰプロセッシングを生じていると推測した（Ｙｏｇｅｖ−Ｆａｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１９】
本発明にしたがって、ヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫及びラットフェオクローム細胞腫ＰＣ１２培養細胞を使用して、ＡＰＰプロセッシングの調節及び関係するシグナリング経路に対するラサギリン、そのＳ−光学異性体ＴＶＰ１０２２及びそれらの代謝物、アミノインダン（プロパギルアミン分子のないもの）、及びプロパルギルアミン自身の影響を測定した。ラサギリン及びプロパルギルアミンはいずれも細胞培養においてＭＡＰＫ−及びＰＫＣ−依存性機序により可溶性ＡＰＰの非アミロイド原性α−セクレターゼ型の放出を誘導することが示された。さらに、ラサギリン及びその誘導体はインビボにおいてＰＫＣ−関連機序及びＡＰＰプロセッシングを調節する。
【００２０】
ニューロンにおけるアポトーシスプログラムの主要分子成分の一つはＢｃｌ−２ファミリーのタンパクであり、一部（Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−ｗ，Ｍｃｌ−１，Ａ１／Ｂｆｌ−１）は細胞の生存を支持し、他のもの（Ｂａｘ，Ｂａｋ，Ｂｃｌ−Ｘｓ，Ｂａｄ，Ｂｉｄ，Ｂｉｋ，Ｈｒｋ，Ｂｏｋ）は細胞死を促進する。
【００２１】
Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーは相互に作用してホモ及びヘテロの二量体の間で動的平衡を形成しているように見える。反対の機能を持つメンバーが会合して互いの機能を中和しているように見えるので、特別な細胞型においてその相対的量がアポトーシスの閾値を決定するであろう。好生存的及び抗生存的Ｂｃｌ−２ファミリータンパクの競合作用が細胞を破壊するプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を調節する。
【００２２】
本発明にしたがって、われわれはさらに、ニューロンアポトーシスのモデルとして血清除去ラットフェオクローム細胞腫ＰＣ１２細胞系を使用して、ラサギリンおよびプロパルギルアミンの好生存効果をＢｃｌ−２ファミリータンパクが仲介するか否かを試験した。さらに、ラサギリン及びプロパルギルアミンによる神経保護過程におけるＰＫＣカスケードの関与を検討した。
【００２３】
このようにしてわれわれは本発明によりプロパルギルアミン自身が神経保護及び抗アポトーシス作用を示し、したがってプロパルギルアミンを含むラサギリン及び類似薬物の既知及び将来の用途に使用できることを確認した。
【００２４】
本発明は医薬として受容しうる担体及びプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
プロパルギルアミンの生理的に受容しうる塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メシラート、エシラート、トシラート、スルホン酸塩、リン酸塩、またはカルボキシル塩、の使用は本発明に包含される。より望ましい態様において、プロパルギルアミン塩酸塩及びプロパルギルアミンメシラートが本発明にしたがって使用される。
【００２６】
本発明により提供される医薬組成物は固体、半固体または液体の形態とすることができ、そしてさらに医薬として受容しうる充填剤、担体または希釈剤、及びその他の不活性成分及び賦形剤を含むことができる。組成物はいずれかの適当な経路により投与することができるが、錠剤またはカプセルとして経口的に投与することが望ましいであろう。投与量は患者の状態及び病気の重篤度によるであろうし、医師により適切に決定されるであろう。
【００２７】
その神経保護及び抗アポトーシス作用により、患者の該疾患、異常または状態に対して有効なプロパルギルアミンまたはその医薬として受容しうる塩の有効量を必要とする患者に投与することを含む、（ｉ）神経変性疾患；（ｉｉ）痴呆；（ｉｉｉ）精神または感情の異常；（ｉｖ）薬物依存；（ｖ）記憶喪失；（ｖｉ）急性神経学的外傷性疾患または神経外傷；（ｖｉｉ）脱髄性疾患；（ｖｉｉｉ）発作性疾患；（ｉｘ）脳血管性疾患；（ｘ）行動異常；（ｘｉ）神経毒性障害；（ｘｉｉ）心血管系疾患からなる群から選択された疾患、異常または状態の、予防を含む、治療にプロパルギルアミンを使用することができる。
【００２８】
一態様において、本発明は、限定はしないが、パーキンソン病、ハンチントン病及び筋萎縮性脊髄側索硬化症のような神経変性疾患の治療方法に関係する。
【００２９】
そのほかの態様において、本発明はアルツハイマー痴呆またはローリー体痴呆、血管性痴呆及びパーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部外傷またはＨＩＶ感染のようなそのほかの病気により生じる痴呆からなる群より選択された非アルツハイマー痴呆でありうる痴呆の治療方法に関係する。
【００３０】
そのほかの態様において、本発明は、限定はしないが、うつ病、憂鬱症、双極性感情障害、躁鬱精神病、精神分裂病または単純精神病、分裂症様状態、感情分裂状態、及び妄想状態からなる群から選択された精神分裂病関連状態の治療方法に関係する。
【００３１】
さらにそのほかの態様において、本発明は、限定はしないが、アルコール依存、麻薬依存、コカイン依存、アンフェタミン依存、幻覚剤依存、またはフェンシクリジン使用及びそれらによる禁断症状のような薬物使用及び依存の治療方法に関係する。
【００３２】
さらにそのほかの態様において、本発明は、健忘症またはアルツハイマー型痴呆、非アルツハイマー型痴呆、またはパーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、頭部外傷、ＨＩＶ感染、甲状腺機能低下症及びビタミンＢ１２欠乏からなる群から選択された疾患または障害に伴う記憶喪失のような記憶喪失状態の治療方法に関係する。
【００３３】
さらにそのほかの態様において、本発明は、急性神経学的外傷性障害または頭部外傷または脊髄外傷のような神経外傷の治療方法に関係する。
【００３４】
さらにそのほかの態様において、本発明は多発性硬化症、脱髄性疾患の治療方法に関係する。
【００３５】
そのほかの態様において、本発明はてんかんのような発作の治療方法に関係する。
【００３６】
そのほかの態様において、本発明は脳虚血または脳卒中のような脳血管性疾患の治療方法に関係する。
【００３７】
そのほかの態様において、本発明は過剰活動性症候群または注意力欠乏状態のような神経学的原因による行動異常の治療方法に関係する。
【００３８】
さらにそのほかの態様において、本発明は神経毒、例えば、化学兵器に使用されたような神経ガスまたは毒蛇、魚または動物の毒物発射系のような神経組織を損傷または破壊する能力を持つ物質として定義される神経毒による障害の治療方法に関係する。
【００３９】
さらにそのほかの態様において、本発明は、限定するものではないが、うっ血性心不全、心肥大、心筋梗塞、心筋虚血、心筋虚血後再潅流、または不整脈のような心血管系疾患または病気の治療方法に関係する。
【００４０】
本発明を以下の非限定的例により説明する。
【００４１】
例
材料及び方法
（ｉ）  材料。ラサギリン［Ｎ−プロパルギル−（１Ｒ）−アミノインダン］及びプロパルギルアミンはＴｅｖａ医薬品工業会社（Ｐｅｔａｃｈ  Ｔｉｋｖａ，イスラエル）より供与された。電気泳動試薬はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）より入手した。ＰＫＣ阻害薬ＧＦ１０９２０３Ｘ及びＭＡＰＫ阻害薬ＰＤ９８０５９はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，米国）から入手し、ジメチルスルホキシドに（１ｘ１００）溶解して−２０℃で保存した。組織培養試薬はＢｅｔｈ−Ｈａｅｍｅｋ（イスラエル）から入手した。
【００４２】
ｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）に対する抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，米国）から入手し、そしてＰＫＣα及びＰＫＣεに対する抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）から購入した。モノクロナール抗体２２Ｃ１１（ＡＰＰのＮ末端に対する）はＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）から、そして６Ｅ１０（ＡＰＰのＡβの残基１−１７の中に存在する抗原決定基を認識する）はＳｅｎｅｔｅｋ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。抗−リン酸−ＭＡＰＫ及び抗−ＭＡＰＫ抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭＡ）から購入した。Ａβ１−４２はＢａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，スイス）から購入した。
【００４３】
β−アクチン抗体、Ｔｒｉ  ＲｅａｇｅｎｔＴＭ  ＲＮＡ単離試薬及びそのほかの化学物質は全てＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）から購入した。ＲＴ反応混合物、ランダムヘキサヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｉｎ阻害薬及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，米国）から購入した。ＤＮＡ増幅および検出のＰＣＲキット用のＦａｓｔＳｔａｒｔ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ調合済み混合物はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ＧｍＢＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）から購入した。
【００４４】
（ｉｉ）  細胞培養、生存能力測定及び実験処理。二つの異なる神経細胞系を使用した：ラットＰＣ１２およびヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞。これらはかなりのレベルのＡＰＰを構成的に発現し、かなりの量の毒性のない、非アミロイド原性可溶性ＡＰＰαを放出するために、両細胞ともにＡＰＰ調節に関する研究を含め神経学的及び神経化学的研究に広く使用されてきた。
【００４５】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１００−ｍｍ培養皿に播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ニスタチンを含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ；４５００ｍｇ／ｌグルコース）中で培養した。
【００４６】
ＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／ｌグルコース）を含むＴ７５フラスコ中でフェオクローム細胞腫に由来するＰＣ１２細胞をコンフルエンスまで増殖し、５％  ＦＣＳ、１０％  ウマ血清、及び１％  ペニシリン／ストレプトマイシン／ニスタチンを添加した。
【００４７】
細胞培養は３７℃において加湿５％  ＣＯ２−９５％  空気の環境下でインキュベートした。細胞生存能力検定では、０．１％  ＢＳＡを含む無血清培地中で細胞を種々の薬物で処理した。
【００４８】
実験では、細胞（２ｘ１０６）を１００−ｍｍプレート（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞用）またはＴ７５フラスコ（ＰＣ１２細胞用）で血清を十分に加えた培地に播種し、４８時間培養した。細胞を０．５％  ＦＣＳを含む新鮮培地に移して、さらに２４時間（コンフルエント未達培養）の後、実験を０．５％  ＦＣＳを含む新鮮培地中で３７℃において指定した時間実施した。種々の薬物とインキュベートした後、順化培地を採取し、３５００ｇ（１０ｍｉｎ，４℃）で遠心分離して細胞破片を除去し、透明上清を凍結乾燥により１０倍に濃縮した。
【００４９】
（ｉｉｉ）  細胞死の測定。ＰＣ１２細胞を強い水流ではがし、２００ｇで５分間遠心分離し、２％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁した。細胞を１．５−２ｘ１０４細胞／ウエルの密度にマイクロタイタープレート（９６ウエル）に播種し、処理前に２４時間置いて接着させた。トリパンブルー排出または細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，米国）をＡβ１−４２処理後のアポトーシスを検出するために使用した。ＥＬＩＳＡは、アポトーシスが進行している細胞の細胞質中のモノ及びオリゴヌクレオソームを検出するためのＤＮＡ及びヒストンを指向する抗体を使用して、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡに基づくメーカーのプロトコールに従って実施した。吸光度は、λ＝４０５／４９０ｎｍにおいてＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｅｌｉｓａ−Ｒｅａｄｅｒ（Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によりバックグランドを自動調整して測定した。結果は対照値のパーセンテージとして示した。さらに、神経細胞障害を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム  ブロミドを使用するミトコンドリア機能の分光検定により評価した（ＭＴＴ−試験）。吸光度は、λ＝５７０／６５０ｎｍにおいてＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｅｌｉｓａ−Ｒｅａｄｅｒによりバックグランドを自動調整して測定した。神経細胞障害は位相差顕微鏡により可視化した形態学的特徴による評価も行った。
【００５０】
（ｉｖ）  イムノブロット分析。ウエスタンブロット分析のために、接着細胞を一度冷ＰＢＳで洗い、次いで１ｘ非還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液次いで３−５分間煮沸して分解した。タンパク含量はＢｒａｄｆｏｒｄ法を使用して測定した。同量のタンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロットした。膜をブロッキング緩衝液（５％  ドライミルクを含むＰＢＳまたは５％  ドライミルク、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＴＢＳ）で処理した。第一抗体を５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳで希釈し、膜と２０時間４℃でインキュベートし、次いで同じ緩衝液中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした第二抗体とインキュベート（室温で１時間）した。抗体インキュベーションの後、膜を０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳまたはＴＢＳで洗った。検出はＥＣＬＴＭウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｒｔ  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，イギリス）を使用して実施した。結果の定量化は、コンピュータ画像プログラムＢｉｏ−ＩＤ（Ｉｍａｇｅｒ，ＢｉｏＩＤ  ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ，Ｍａｒｎｅ  Ｌａ  Ｖａｌｌｅｅ，フランス）を使用したスキャンニングレーザーデンシトメトリーによるオートラジオグラムから標識バンドの光学密度を測定して行った。測定値はβ−アクチンの強度レベルに対して正規化した。
【００５１】
（ｖ）  ＰＫＣ転移。細胞をコンフルエンスまで培養し、薬物なし（対照）、ホルボール  １２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（陽性対照）またはラサギリンで２時間処理した。洗った後細胞を回収し、遠心分離（５分間、１５００ｒｐｍ）で集め、プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，スエーデン）を含むホモジネーション緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．３２Ｍスクロース、２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）中で超音波処理（１２ｓ，２２μ）によりホモジナイズした。細胞質及び粒子状フラクションを超遠心分離（３０分間、１００，０００ｇ，４℃）によリ分離した。粒子状フラクションを得るために、タンパクを０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むホモジネーション緩衝液中氷上で４５分間インキュベーションして抽出した。次いで検体を１分間超音波処理してＰＡＧＥにより同量のタンパク（１５μｇ）を分離し、次いでニトロセルロース膜にブロットした。ウエスタンブロットはｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ），ＰＫＣα及びＰＫＣεに対する上記方法と本質的に同様に行った。
【００５２】
（ｖｉ）  総ＲＮＡ抽出。ＰＣ１２細胞を５％  ＦＣＳ及び１０％  ウマ血清を含むＤＭＥＭ中コンフルエンスまで培養した。実験の日に、培地を血清を含まない新鮮培地に置換し、そしてラサギリンまたはプロパルギルアミンを種々の濃度で２４時間投与した。培養終了時に培地を除去し、Ｔｒｉ  ＲｅａｇｅｎｔＴＭ抽出試薬を使用して総ＲＮＡの単離を行った。総ＲＮＡをＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）で３０分間３７℃において処理し、次いでフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回次いでクロロフォルムで１回抽出した。ＮａＯＡｃ（０．３Ｍ）及びエチルアルコールで沈殿した後、ＲＮＡペレットを８０％  エチルアルコール（１２，０００ｘｇ）で１０分間洗い、そして５０−１００μｌのジエチルピロカルボナート（ＤＥＰＣ）−処理水に再懸濁し、再懸濁を促進するために５−１０分間５６℃でインキュベートした。
【００５３】
（ｖｉ）  逆転写（ＲＴ）及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。特別製のｃＤＮＡ発現マイクロアレイによる結果を確認するために、２μｇの総ＲＮＡを変性し、ランダムヘキサヌクレオチド（０．５μｇ／μｌ）を使用して逆転写した。５分間７０℃でインキュベーションすることにより鋳型及びプライマー（合計１６μｌ）の二次構造を開き、直ちに氷上で冷却した。反応緩衝液、ｄＮＴＰ（各０．５ｍＭ）、ＲＮＡａｓｉｎＴＭＲＮＡａｓｅ阻害薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）（２５Ｕ）及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ）を含む反応混合物（９μｌ）を加えそして検体を３９℃で１時間インキュベートした。いずれのＲＮＡ調製品に対しても、ＲＴ段階を省いたＲＮＡの直接増幅からなる陰性対照を平行して操作した。酵素を不活化するために、検体を９２℃に１０分間置き、次いで４℃に冷却した。
【００５４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ及びＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ調合済みＰＣＲ混合物を使用する、定量的リアルタイムＰＣＲはメーカープロトコール（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）に従って実施した。ｃＤＮＡ（４０ｎｇ）を全容量２０μｌ中で増幅した。プライマーの配列及び産物のサイズは表１に記載する。結果はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの供給されたプログラムにより分析した。所与ｍＲＮＡの相対的発現レベルは自家保存遺伝子１８Ｓ−ｒＲＮＡにたいして正規化することにより評価し、対照の値と比較した。
【００５５】
（ｖｉｉ）  ｓＡＰＰの測定。細胞分解物のタンパク含量はＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して検定した。分解タンパクに対して調整した等量の順化培地をナトリウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）−ニトロセルロース膜に適用し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び１％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のＭＡｂ  ２２Ｃ１１または６Ｅ１０を使用した。免疫反応はＨＲＰを結合した抗−マウスＩｇＧ及び増強化学蛍光法（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，イギリス）を使用して検出した。ブロットを直線性反応の範囲内で種々の時間現像し、現像したフィルム上の免疫反応バンドの相対的強度をコンピュータデンシトメトリープログラム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，米国）により定量化した。
【００５６】
（ｖｉｉｉ）  細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性。ＥＲＫのキナーゼ活性はメーカープロトコールに従ってＭＡＰＫ検定キット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して測定した。要約すると、キナーゼ活性検定のために、ＰＣ１２細胞を６−ウエルプレート（５ｘ１０５細胞／ウエル）中で増殖した。実験の１８から２４時間前に、培地を０．５％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭに置換し、図に示すように処理した。実験処理は０．５％  ＦＣＳを含む１ｍｌの培地中で、溶媒または試験薬及び／または阻害薬と３７℃で、図に記述したように行った。処理後、細胞を氷上に置いて反応を停止し、培地を吸引した。細胞を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，及びプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害薬カクテル中に採取した。タンパク含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。前述（Ｙｏｇｅｖ−Ｆａｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）のように、３０μｇタンパクを含む各細胞分解物を４−１２％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分離し、イムノブロットを行い、リン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体またはｐ４４／４２ＭＡＰＫ抗体を使用して同定した。データは３から６回の独立した実験の結果を示す。
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鋳型は全て最初３分間９５℃で変性した。増幅は４５サイクル行った。産物の融解温度を調べるために、融解曲線分析を６５℃から９５℃にわたり０．１℃／秒の温度変化速度で行った。
【００５７】
例１．ラサギリンは血清欠乏細胞における生存能力喪失を防護する。
細胞生存能力を試験するために、ＰＣ１２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を無血清でインキュベートし、無処理またはラサギリン（０．１、１または１０μＭ）で２４時間処理した。
【００５８】
図１Ａ−１Ｂに示すように、非処理ＰＣ１２及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞の生存能力は血清除去後２４時間で著しく減少した。ラサギリンはＰＣ１２細胞（図１Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（図１Ｂ）において、アポトーシス細胞死検出ＥＬＩＳＡによって評価することにより、血清欠乏により生じる細胞死を有意に減少した。同様な結果はＭＴＴ減少分析によっても得られた（データは示さず）。ラサギリンの有意な生存効果は１及び１０μＭにおいても認められた。
【００５９】
そのアポトーシスに対する影響と一致して、ラサギリンはカスパーゼ−３の血清除去により誘発される切断と活性化を減少させ、このラサギリンによる抑制効果はＰＫＣ阻害薬ＧＦ１０９２０３Ｘにより消失した（データは示さず）。同様に、ラサギリンは血清除去により誘発される細胞死機構の重要な調節因子であるＢＡＤのレベルを低下させたが、この効果はＧＦ１０９２０３Ｘにより阻害された。これらのデータは、ラサギリンにより刺激される細胞生存能力にＰＫＣ依存経路が関与することを示している。
【００６０】
例２．ラサギリンはＰＫＣ活性化に影響する。
既にＰＫＣの活性化は細胞生存能力に影響し、神経細胞を保護することが示されていたので、ＰＫＣ活性化に対するラサギリンの効果を検討することに関心がもたれた。一つの実験において、ＰＣ１２細胞を無処置またはラサギリンの種々の濃度（０．１、１及び１０μＭ）で１時間処理した。他の実験では、ＰＣ１２細胞を溶媒のみまたは強力そして特異的で広範囲ＰＫＣ阻害薬であるＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）で予めインキュベートし、次いでラサギリン（１μＭ）またはＰＭＡ（１００ｎＭ）の非存在下または存在下に１時間インキュベートした。ウエスタンブロットにより細胞分解物中のＰＫＣのリン酸化を分析し、ｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）抗体で検出した。
【００６１】
図２Ａ−２Ｂに示す結果は、ＰＣ１２細胞のラサギリンによる短時間処理（１ｈ）は用量依存的にＰＫＣリン酸化を誘発し（２Ａ）、特異的広範囲ＰＫＣ阻害薬であるＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）による前処置はラサギリン誘発ＰＫＣリン酸化を著しく減少させる（２Ｂ）ことを示している。
【００６２】
次いでＰＫＣ活性化をさらに確認しそしてラサギリンの効果に関係するイソフォームに関するデータを得るために、ｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ），ＰＫＣα及びＰＫＣεの細胞内再分布に対するラサギリン処置の影響を検討した。活性化によるＰＫＣの膜フラクションへの転移及び膜局在化はＰＫＣ活性化のマーカーとしてよく使用される。
【００６３】
陽性対照としてＰＭＡを使用した予備的研究において、ＰＣ１２細胞をＰＭＡ（１００  ｎＭ）に２時間暴露するとｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ），ＰＫＣα及びＰＫＣε（それぞれ２１４％、１５７％及び２１２％）の局在化を明らかに誘発する。これ等のデータは先の研究と一致しており、ＰＭＡが時間依存的にＰＣ１２細胞におけるＰＫＣイソフォームの膜トランスロケーションを誘発することを示している。
【００６４】
ラサギリン（１μＭ）による刺激はｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）並びにＰＫＣα及びＰＫＣεの膜フラクションへの転移を生じるので（図２Ｃ）、これらのイソフォームはラサギリンにより活性化されることを示している。
【００６５】
例３．プロパルギルアミンは血清欠乏における細胞の生存能力喪失を防御する。
細胞生存能力を試験するために、ＰＣ１２細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を血清除去下に、無処置またはプロパルギルアミン（０．１、１または１０μＭ）で２４時間処理した。アポトーシス細胞死をＥＬＩＳＡにより検出し、値を対照に対するパーセンテージで示す。
【００６６】
図３Ａ−３Ｂに示すように、プロパルギルアミン（１及び１０μＭ）はＰＣ１２（３Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（３Ｂ）のいずれにおいても血清欠乏により誘発される細胞死を有意に減少させた。この結果と一致して、プロパルギルアミンは活性化カスパーゼ−３も減少させた（３Ｄ）。カスパーゼ−３の活性化は細胞死とほとんど同じであり、カスパーゼ−３切断は神経保護効果の本質的部分である。図３Ｃは、十分な血清の存在下で維持されたＰＣ１２細胞（ａ）、プロパルギルアミン非存在下の無血清培地中の細胞（ｂ）、プロパルギルアミン（１μＭ）存在下の無血清培地中の細胞（ｃ）、またはプロパルギルアミン（１０μＭ）存在下の無血清培地中の細胞（ｄ）の位相差顕微鏡により可視化された形態的特徴を示す。
【００６７】
例４．プロパルギルアミンはＰＫＣ活性化に作用する。
プロパルギルアミンのＰＫＣリン酸化／活性化に及ぼす影響について上記例２に記述したように検討した。結果は、図４Ａ−４Ｂに示すが、プロパルギルアミン濃度を増加させてＰＣ１２細胞を処理すると、ＰＫＣリン酸化（４Ａ）は有意に、用量依存的に増加し、そしてＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）で前処置するとプロパルギルアミンによるＰＫＣリン酸化の効果を阻害し、プロパルギルアミン誘発ＰＫＣリン酸化を有意に減少させた（４Ｂ）。
【００６８】
例５．ラサギリンはＢｃｌ−２ファミリーｍＲＮＡレベルを変化させる。
神経におけるプログラムされたアポトーシスの主要な分子成分の一つはＢｃｌ−２ファミリーのタンパクであり、その一部（Ｂｃｌ−２，Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−ｗ，Ｍｃｌ−１，Ａｌ／Ｂｆｌ−１）は細胞生存を支持し、そのほか（Ｂａｘ，Ｂａｋ，Ｂｃｌ−Ｘｓ，Ｂａｄ，Ｂｉｄ，Ｂｉｋ，Ｈｒｋ，Ｂｏｋ）は細胞死を促進する。好−及び抗−生存Ｂｃｌ−２ファミリータンパクの競合作用が、細胞を破壊するプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を調節している。
【００６９】
この実験において、神経アポトーシスのモデルとして血清欠乏ラットフェオクローム細胞腫ＰＣ１２細胞系を使用して、Ｂｃｌ−２ファミリータンパクがラサギリンの好−生存効果を仲介するか否かを調べた。ＰＣ１２細胞を十分な血清の存在下に維持するか（対照）、または無血清培地中で種々の濃度のラサギリン（０．００１、０．１、１及び１０μＭ）の非存在下または存在下に３時間または２４時間維持し、遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣにより測定した。このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは該ＰＣ１２細胞から単離したＲＮＡ検体を含む。この転写は外部因子の影響を受けにくいと報告されているので、各遺伝子発現は自家保存遺伝子、１８Ｓ−ｒＲＮＡに対して正規化した。
【００７０】
図５Ａ−５Ｂに示すように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ラサギリン処置の結果、時間及び濃度に依存した好−アポトーシス遺伝子発現の上方調節及び抗−アポトーシス遺伝子発現の下方調節が明らかにされた。抗−アポトーシスＢｃｌ−ｘＬ  ｍＲＮＡ発現は、無血清培地では下方調節されたＢｃｌ−ｘＬレベル（十分な血清が存在する場合の４０％）が観察されたのに対して、１０μＭラサギリン処理の３時間後に増加を始め（図５Ａ）、そしてさらに増加を続けて２４時間後に約２倍となった（図５Ｂ）。Ｂｃｌ−ｘＬの遅延した弱い誘発が２４時間インキュベーション後の１μＭラサギリンに観察され、十分な血清が存在する培地で認められる発現レベルにほぼ回復した。ラサギリン０．１、１及び１０μＭで処理後２４時間において、そのほかの抗−アポトシーシスメンバー、Ｂｃｌ−ＷのｍＲＮＡ発現にも有意な増強が認められた（無血清培養の１３５％）。無血清培地において好−アポトーシスＢａｘの発現レベルは著しく増加した（血清存在に比して２６０％）が、ラサギリンはＢａｘのｍＲＮＡレベルを有意に減少させた。同様に、好アポトーシス遺伝子、Ｂａｄは処置後３時間ですでに明らかなように１μＭラサギリンにより実質的に減少した（無血清処置に対して１．３５倍）（図５Ａ）。２４時間において、０．０１及び０．１μＭラサギリンは濃度依存的にＢａｄ発現を減少させた（無血清培養に対して約２．５倍）ので、Ｂａｄ遺伝子レベルは血清が存在するレベルに回復した（図５Ｂ）。遺伝子、Ｂｃｌ−Ｗ及びＢａｘはインキュベーション３時間後著しい変化をしなかった（データは示さず）。
【００７１】
例６．Ｂａｘ及びＢａｄ  ｍＲＮＡレベルに対するプロパルギルアミンの効果。
Ｂａｘ及びＢａｄ  ｍＲＮＡレベルに対するプロパルギルアミンの効果を上記例５に記述したのと同様に試験した。
【００７２】
図６Ａ−６Ｂに示すように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によりプロパルギルアミン（１μＭ）はＢａｘ及びＢａｄいずれの遺伝子発現レベルも十分に血清が存在するレベルに回復することが示された。
【００７３】
例７．Ａβ１−４２毒性に対するラサギリンの神経保護効果。
Ａβペプチドは種々の主要ニューロン及び神経細胞系に対して強い毒性を持つことが示されているので、われわれは、既に記述しているように（Ｙｏｇｅｖ−Ｆａｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＭＴＴ法を使用してＡβ１−４２ペプチドに対するＰＣ１２神経細胞の応答を明らかにした。ＰＣ１２細胞をＡβ１−４２（１−５０μＭ）で２４時間処理することにより、Ａβ１−４２１０μＭで最大となる用量依存的生存能力消失を生じた（データは示さず）。
【００７４】
ラサギリンはいくつかの神経毒に対して神経保護及び抗−アポトーシス活性をあらわすことが、既に示されていた（Ｙｏｕｄｉｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００２ａ）。ラサギリンはＡβ−誘発毒性も防ぐことができるか否かを評価するために、われわれはラサギリン（１及び１０μＭ）の非存在下または存在下にＰＣ１２細胞を予め１時間インキュベートし、次いでその細胞を２４時間凝集Ａβ１−４２（１０μＭ）と共にインキュベートし、細胞死を評価した。
【００７５】
結果を図７Ａ−７Ｃに示す。図７Ａでは、細胞生存能力はトリパンブルー色素排除法を使用して直接細胞を数えることにより評価した、そして図７Ｂでは、細胞死をＥＬＩＳＡにより評価した。両図において、値は対照において計数された生存細胞のパーセンテージで示した。図７Ｃは、（ａ）ラサギリンなし（対照）、（ｂ）ラサギリン（１μＭ）、（ｃ）ラサギリン（１０μＭ）、（ｄ）Ａβ１−４２（１０μＭ）、（ｅ）ラサギリン（１μＭ）プラスＡβ１−４２（１０μＭ）、及び（ｆ）ラサギリン（１０μＭ）プラスＡβ１−４２（１０μＭ）、で２４時間処理した後のＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡により可視化された形態的特徴を示す。図７Ａ−７Ｃに示す結果は、Ａβ１−４２は細胞生存能力を著しく減少させ（対照の６６％）、他方ラサギリンはＡβ１−４２神経毒性に対してＰＣ１２細胞を有意に（ｐ＜０．０５）保護することを示している。ラサギリン単独（１及び１０μＭ）でもＰＣ１２細胞の著しい生存能力改善を誘発し、これは血清減少または血清除去後の細胞生存に対する効果によるものと推測される（Ｔａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００７６】
例８．ｓＡＰＰαプロセッシングに対するラサギリン及びその誘導体の効果。
われわれは最近、アルツハイマー病の治療のためにラサギリンから合成した（Ｎ−プロパルギル−（３Ｒ）アミノインダン５−イル）−エチルメチルカルバメート（ＴＶ３３２６）がｓＡＰＰαの放出を促進することを報告した（Ｙｏｇｅｖ−Ｆａｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ラサギリン及びそのほかのプロパルギルアミン含有薬物がＡＰＰプロッセシングを調節するか否かは関心がもたれていた。この目的のために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を３時間１μＭの種々の薬物（ＴＶ３３２６及びそのＳ−異性体ＴＶ３２７９、ラサギリン及びそのＳ−異性体ＴＶＰ１０２２、セレギリン、アミノインダン）とインキュベートし、そして材料と方法に記述したように培地中のｓＡＰＰαを測定した。表２の結果は、アミノインダンを除く全ての試験化合物はｓＡＰＰα放出を誘発することを示している。
【００７７】
われわれはさらに、ＡＰＰプロセッシング及び関係するシグナリング経路に対するラサギリンの影響を詳細に調べた。このため、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を３時間ラサギリン無しまたはその濃度を増加させて（０．１，１及び１０μＭ）インキュベートし、そして材料と方法に記述したように培地中のｓＡＰＰαを測定した。図８の結果は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を増加濃度のラサギリンにより３時間処理することにより、培地中へのｓＡＰＰα放出は非処理対照のレベルに比較して増加することを示している。最大効果は１０μＭ濃度において得られ、ｓＡＰＰα分泌は基準よりも約３倍に増加した。種々の投与量のラサギリンで３時間処理したＰＣ１２細胞は濃度に依存したｓＡＰＰα放出を示し（図９）、最大促進効果は１０μＭの濃度において認められた。
【００７８】
例９．ラサギリンによるＭＡＰＫの活性化
ラサギリンのＭＡＰＫの活性化に対する影響を検討するために、ＰＣ１２細胞を０．５時間増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）で処理し、リン酸化ＭＡＰＫブロットの定量値を総ＭＡＰＫブロット使用により正規化するか、またはＰＣ１２細胞を予め１５分間溶媒のみまたはＰＤ９８０５９（３０μＭ）またはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）とインキュベートし、次いでラサギリン（１０μＭ）と０．５時間インキュベートした。細胞分解物の一部を免疫ブロット分析し、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ（上側ブロット）及び抗−ＭＡＰＫ（下側ブロット）により検出した。
【００７９】
図１０Ａに示すように、ラサギリンは用量依存的にＰＣ１２細胞中のリン酸化ＭＡＰＫの免疫活性を増加したが、ＭＡＰＫの総タンパクレベルには影響しなかった。活性化はラサギリンの０．１μＭにおいて生じ、１０μＭにおいて最大活性化を生じた。ＭＥＫリン酸化及び活性化の非競合的阻害薬の阻害活性を測定するために、ラサギリン誘発ＭＡＰＫリン酸化に対するＰＤ９８０５９の影響を調べた。図１０Ｂに示すように、ＰＤ９８０５９（３０μＭ）による前処置はラサギリン誘発ＭＡＰＫリン酸化を阻害した。
【００８０】
われわれは、特異的ＰＫＣ−阻害薬ＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）を使用して、ラサギリン刺激ＭＡＰＫ活性化におけるＰＫＣシグナリング経路の役割も調べた。図１０Ｂに示すように、ＧＦ１０９２０３ＸによるプレインキュベーションはＭＡＰＫ活性化に対するラサギリンの効果を消失させ、ラサギリン誘発ＭＡＰＫ活性化にＰＫＣの関与を示した。
【００８１】
例１０．ｓＡＰＰαプロセッシング及びＭＡＰＫ活性化に対するプロパルギルアミンの影響
ＡＰＰプッロセッシングにおける役割を調べるために、ｓＡＰＰα放出及びＭＡＰＫ活性化に対するプロパルギルアミンの効果を評価した。
【００８２】
ｓＡＰＰα放出については、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞またはＰＣ１２細胞を３時間増加濃度のプロパルギルアミン（０．１．１及び１０μＭ）と共にインキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法における記述に従って測定した。
【００８３】
ＭＡＰＫ活性化に対するプロパルギルアミンの効果については、ＰＣ１２細胞を０．５時間増加濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）で処理した。細胞分解物の一部を免疫ブロット分析し、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ及び抗−ＭＡＰキナーゼにより検出した。リン酸化−ＭＡＰＫの定量は総ＭＡＰＫブロットを使用して正規化した。
【００８４】
図１１Ａ−１１Ｂは、増加濃度のプロパルギルアミン（０．１．１及び１０μＭ）によるＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞及びＰＣ１２細胞の処理により、培地中のｓＡＰＰαは非処理対照におけるレベルに比較して有意に、用量依存的に増加することを示している。最大効果は１０μＭの濃度において得られた。さらに、図１２に示すように、抗−リン酸化−ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫによる免疫ブロット分析に基づいて、プロパルギルアミンはＰＣ１２細胞において用量依存的にＭＡＰＫリン酸化を誘発した。これらの知見は、ｓＡＰＰα放出及びＭＡＰＫ活性化のいずれに対するプロパルギルアミンの効果もラサギリン、ＴＶ３３２６及びＴＶ３２７９と同じであることを示している。しかし、ラサギリンの代謝物である、プロパルギル基のないアミノインダン（ＴＶＰ１３７６）はｓＡＰＰα放出（表２）にもＭＡＰＫ活性化（データは示さず）にもそのような効果を示さなかった。
2005232148.tif 000003
ａ  ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を種々の薬物無しまたは１μＭと３時間インキュベートし、そして順化培地中のｓＡＰＰαを測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を、ｓＡＰＰα基準放出の倍数として、また３回の独立した実験の平均±標準誤差として示した。
ｂ  ｐ＜０．００１  対対照
ｃ  ｐ＜０．０５
【００８５】
例１１．ラット脳モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）に対するプロパルギルアミンのインビトロ阻害活性。
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）、生体アミンの代謝分解に重要な役割を演じている酵素、は２種類の機能的形態で存在する：ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂ。この二つのイソ酵素は異なる基質及び阻害特異性を有している。選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害薬はパーキンソン病の治療に大きな可能性を有している。
【００８６】
ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂの活性を測定するために、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で適当に希釈したラット脳から調製した酵素（ＭＡＯ−Ｂ検定では７０μｇタンパク、ＭＡＯ−Ａ検定では１５０μｇ）に試験化合物を加えた。混合物を０．０５Ｍデプレニル／セレギリン、ＭＡＯ−Ｂの特異的阻害薬（ＭＡＯ−Ａの測定用）または０．０５Ｍクロルギリン、ＭＡＯ−Ａの特異的阻害薬（ＭＡＯ−Ｂ測定用）と共にインキュベートした。インキュベーションは３７℃で１時間行った後、ＭＡＯ−Ａの測定には１４Ｃ−５−ヒドロキシトリプタミン  ビオキザレート（１００Ｍ）またはＭＡＯ−Ｂの測定には１４Ｃ−フェニルエチルアミン（１００Ｍ）を加えて、それぞれ３０分または２０分インキュベーションを継続した。氷冷２Ｍクエン酸を加えて反応を停止し、そして代謝物を抽出し、液体シンチレーションカウンターによりｃｐｍ単位で測定した。
【００８７】
このようにして、一つの実験では、５−（４−プロパルギルピペラジン−１−イルメチル）−８−ヒドロキシ−キノリン（ＨＬＡ２０）及びＭ３２と命名された８−ヒドロキシキノリン誘導体（いずれも国際出願ＰＣＴ／ＩＬ０３／００９３２に開示された鉄キレート薬）、及びプロパルギルアミン（Ｐ）（０．１，１，１０，１００μＭ）をラット脳ＭＡＯ−Ａに対して試験した。試験化合物を０．０５μＭデプレニルを含有する緩衝液に加えて、１４Ｃ−５−ヒドロキシトリプタミンを加える前に６０分３７℃で組織ホモジネートとインキュベーとした。結果を図１３Ａに示す。試験化合物存在下のＭＡＯ−Ａ活性は対照検体に対するパーセンテージで示した。平均値±標準誤差。
【００８８】
他の実験では、ラット脳ＭＡＯ−Ｂに対するプロパルギルアミン（Ｐ）のインビトロ阻害活性を試験した。プロパルギルアミン（０．１、１、１０、１００μＭ）を０．０５μＭクロルギリンを含む緩衝液に加え、１４Ｃ−５−フェニルエチルアミンを加える前に組織ホモジネートと６０分３７℃でインキュベートした。結果を図１３Ｂに示す。試験化合物存在下のＭＡＯ−Ｂ活性は対照検体に対するパーセンテージで示した。平均値±標準誤差。
【００８９】
図１３Ａ−Ｂに示すように、プロパルギルアミンはＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂのいずれも用量依存的に阻害し、そのＩＣ５０値はそれぞれ６６μＭ及び１０μＭであり、ＭＡＯ−Ｂに選択性の高い阻害を示した。
【００９０】
考察
われわれはここに始めて、抗−パーキンソン病プロパルギルアミン含有ＭＡＯ−Ｂ阻害薬、ラサギリンがＡβ誘発細胞毒性に対して神経保護特性を持つことを示す。さらに、われわれの結果は、ラサギリンがｓＡＰＰα放出及びＥＲＫ活性化を誘発することを示し、そしてその作用機序は分子中のプロパルギルアミンに基づくことを示している。
【００９１】
ラサギリンはＰＣ１２細胞において、血清及びＮＧＦ欠乏及び外因性神経毒Ｎ−メチル−Ｒ−サルソリノール（Ａｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ，２００１ｃ）；６−ヒドロキシドパミン（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ａ）；ＳＩＮ−１、パーオキシ亜硝酸供与体（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）；ラット海馬一次ニューロンにおけるグルタミン酸毒性（Ｆｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）；及びＮ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）、全体的虚血、及び頭部外傷（Ｓｐｅｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に対して強力な神経保護−抗アポトーシス活性を持つことが示されていた。薬物の抗アポトーシス活性は新しいタンパクの合成に依存しており、これは部分的に神経に分化したＰＣ１２細胞において、転写及び翻訳のそれぞれの阻害薬であるシクロヘキシミド及びアクチノマイシンにより阻止される（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００ｂ）。これらの神経毒に対するラサギリンの抗アポトーシス効果の機序及び抗アポトーシスタンパク合成の本質は、神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるラサギリンによる抗アポトーシスＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬの発現増強能力に関係することが示されている（Ａｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。したがって、既に示したように、ラサギリンは細胞生存能力のみならず細胞機能も保護する（Ｙｏｕｄｉｍ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，２００２）。
【００９２】
しかし、ＰＣ１２細胞はＭＡＯのタイプＢよりもタイプＡを含んでいるので（Ｙｏｕｄｉｍ，１９９１）、この神経保護効果はＭＡＯ−Ｂに関係しそうもなく、しかもこの実験に使用した濃度範囲はＭＡＯ−Ａを阻害するには十分でない（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ，２００１ｂ）。さらに、ＭＡＯ−Ａまたは−Ｂの阻害薬でないラサギリン、ＴＶＰ１０２２のＳ−異性体（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ａ，２００１ｂ）、もＡβ誘発アポトーシスからＰＣ１２を保護することは、作用機序がＭＡＯ阻害とは無関係であることを示している。これらの結果は、ラサギリン及びその誘導体による神経保護作用はＭＡＯ−Ｂ阻害によるものではなく（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ）、むしろミトコンドリアの細胞生存タンパクに作用する化合物中のプロパルギル基に内在する薬理作用によるものであることを示す明らかな根拠を提供した以前の報告と一致している。
【００９３】
われわれはこの中で非コリン作動性薬物であるラサギリンがＡＰＰプロセッシングも調節しうるかを検討し、その作用に関係するシグナリング経路を調べた。われわれの研究において、ラサギリンの短時間（３時間）処理によりＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞及びＰＣ１２細胞においてｓＡＰＰα放出を促進することによりＡＰＰ代謝に影響しうることを認めた。ｓＡＰＰα分泌の増加は、α−セクレターゼ−切断ＡＰＰを認識するｍＡｂ  ２２Ｃ１１、並びにｍＡｂ  ６Ｅ１０により検出され、そして増加は用量依存的であった。
【００９４】
タンパク分解的ＡＰＰプロセッシングを調節する機序の中で、ＰＫＣ及びＰＫＣ−共役受容体の活性化が認められ、α−セクレターゼ切断により生じるｓＡＰＰの生成が増加した。ここに示されたデータは、ラサギリンにより誘発されるｓＡＰＰβ放出がＰＫＣ及びＥＲＫ  ＭＡＰＫシグナリング経路の阻害薬により影響を受けることを示している。さらに、この阻害薬の研究を補う結果として、われわれは、ラサギリンがＰＣ１２細胞においてリン酸化ＭＡＰＫの免疫反応性を用量依存的に増加することを認めた。リン酸化ＭＡＰＫ特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析により、ラサギリンにより刺激された細胞においてＭＡＰＫリン酸化の濃度依存的増加が明らかにされた。ＭＥＫ阻害薬であるＰＤ９８０５９はＭＡＰＫ活性化に拮抗したことは、ラサギリンの存在下にＭＥＫがＭＡＰＫをリン酸化したことを示している。ＰＫＣシグナリング経路活性に関係することを示す特異的ＰＫＣ阻害薬であるＧＦ１０９２０３ＸはＭＡＰＫの活性化を著しく減弱した。
【００９５】
われわれはここに示した実験の中で、ラサギリン、そのＳ−異性体ＴＶＰ１０２２、及びプロパルギルアミン（これはコリン作動活性を持たない）がｓＡＰＰβ放出及びＭＡＰＫリン酸化を促進することを示したが、これらの効果はＣｈＥ−阻害活性から生じたものではないことを示す。さらに、ラサギリンの活性を、ＭＡＯ阻害薬として少なくとも１０００倍弱い（Ｙｏｕｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１ｂ）そのＳ−異性体ＴＶＰ１０２２と比較することにより、われわれはＭＡＯ−Ｂ阻害はＡβ毒性に対する神経保護効果またはｓＡＰＰβ放出のために必要条件ではないことを示すことができた。実際に、ラサギリン関連化合物の構造−活性相関は、ＡＰＰのプロセッシングに対するこれらの分子中のプロパルギル基の重要な役割を示している、なぜならばプロパルギルアミン自身がＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞及びＰＣ１２細胞の培養液中にｓＡＰＰから非アミロイド原性β−セクレターゼの分泌及びラサギリン及びその誘導体と同程度のＭＡＰＫリン酸化の有意な増加を誘発するからである。
【００９６】
われわれはさらにこの中の実験において、ラサギリンの神経保護効果は好−生存ＰＫＣ経路の活性化及びＢｃｌ−２ファミリーの抗−アポトーシス関連遺伝子の調節に関係するように見えることを示した。
【００９７】
ラサギリンの神経保護作用がＰＫＣ活性化の阻害によって抑制されるならば、神経細胞においてアポトーシスシグナルに対抗して薬物により活性化される神経保護機序におけるＰＫＣ活性化の役割を明白に支持する。阻害薬研究を補足する結果において、われわれは、ラサギリンは血清欠乏ＰＣ１２細胞においてＰＫＣα及びＰＫＣεを活性化することができ、細胞生存経路に本質的にイソフォームが関与していることを見出した。さらに、リアルタイムＰＣＲ分析は、血清欠乏ＰＣ１２細胞をラサギリンに暴露することによりＰＫＣα及びＰＫＣε遺伝子発現を著しく増加させることを明らかにした。
【００９８】
さらに、発明者らによる最近の研究は、ラサギリンは燐酸（ｐ）−ＰＫＣレベル及びマウス海馬におけるα及びεイソ酵素の発現を上方調節することを示した。実際、細胞死の調節におけるＰＫＣファミリーの役割を調べる研究は、これらのＰＫＣイソフォームの活性化はアポトーシスを防ぐことができることを示している。例えば、ＰＫＣαは抗アポトーシス機能が増加している部位においてＢｃｌ−２をリン酸化することが示され、ＰＫＣεの過剰発現はＢｃｌ−２の発現を増加し、そしてＰＫＣαの抑制はＢｃｌ−ＸＬの下方調節を介するアポトーシスを生じる。
【００９９】
さらに、多数の系においてアポトーシスを阻害することが示されているＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードはＰＫＣにより活性化することができる。このように、ＰＫＣαはＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の上流キナーゼであるｒａｆ−１のリン酸化及び活性化を行い、ＰＫＣε及びδはＥＲＫ−１及び−２の活性化を調節する；そしてＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナリングの薬理学的阻害はグルタミン酸毒性に対する神経細胞のホルボールエステル誘発保護作用を阻害する。したがって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードはラサギリンにより調節されることが最近発見された。
【０１００】
これに対して、ＰＫＣγ  ｍＲＮＡレベルは血清欠乏ＰＣ１２細胞において増加することが認められ、そしてラサギリンはこの誘導を明らかに抑制する。この結果を支持して、以前の研究ではＰＫＣγは虚血において増加し、免疫抑制脳保護薬、ＦＫ５０６により減少することを示していた。しかし、ＰＣ１２細胞はＭＡＯタイプＢよりもタイプＡを含んでおりそしてこの試験に使用した濃度範囲はＭＡＯ−Ａを阻害するには十分でないことから、その神経保護効果はＭＡＯ−Ｂ阻害には関係ないようである。さらに、ＭＡＯ−Ａまたは−Ｂの阻害薬でないラサギリンのＳ−異性体であるＴＶＰ１０２２も血清欠乏ＰＣ１２細胞を保護することは、その作用様式はＭＡＯ阻害に関係しないことを示している。これらの結果は、ラサギリン及びその誘導体による神経保護作用はＭＡＯ−Ｂ阻害によるものではなく、むしろミトコンドリアの細胞生存タンパクに作用する化合物中のプロパルギル基に内在する薬理作用によるものであることを示す明らかな根拠を提供した以前の報告と一致している。
【０１０１】
さらに、発明者らは、この中の実験において、ラサギリン中のプロパルギル基の重要な役割を示し、そしてプロパルギルアミン自身が血清欠乏細胞の生存能力を増強し、そしてラサギリンに近似した強度でＰＫＣ活性化を誘発することを本発明により示した。これらのデータと一致して、ラサギリン関連化合物の構造−活性相関に関する発明者らの研究はプロパルギル基の重要性を明らかにした。このように、ラサギリン及びその誘導体と同様に、プロパルギルアミンはｓＡＰＰαの分泌及びＭＡＰＫリン酸化の増加を誘発した。
【０１０２】
Ｂｃｌ−２関連タンパクファミリー遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲは、好アポトーシスＢａｘ及びＢａｄのｍＲＮＡの減少及び抗アポトーシスＢｃｌ−Ｗ及びＢｃｌ−ＸＬのｍＲＮＡの増加を含むラサギリンによる多数のｍＲＮＡの調節の証拠を提供し、さらに、ラサギリンの強力な神経保護／抗アポトーシス特性を示した。これは、ラサギリンがＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＢｃｌ−２の発現を増加するという事実により、ラサギリンの神経保護にＢｃｌ−２が関与することを示した発明者らの最近の研究により支持される。
【０１０３】
これらの結果は、Ｂｃｌ−２関連タンパクファミリーはミトコンドリア膜透過性転移（ＰＴ）孔を調節し、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の消失を誘発し、チトクロームＣ及びアポトーシス誘発因子をミトコンドリア膜内腔から遊離するという事実及びそのほかの細胞死に至る下流事象に関係するであろう。事実、発明者らの以前のデータは、ラサギリンはミトコンドリアアポトシスカスケードと直接相互作用して細胞死を抑制すること、そしてアポトーシスに入りつつあるニューロンのラサギリン処理により認められた（ΔΨｍ）の維持に寄与する可能性を示していた。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１Ａ−１Ｂ】血清欠乏に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞（１Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（１Ｂ）を血清欠乏下にインキュベートし、無処理またはラサギリン（０．１，１，１０μＭ）で２４時間処理した。細胞死はＥＬＩＳＡにより検出し、値を対照のパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５  対非処理対照細胞、である。
【図２Ａ−２Ｃ】プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化に及ぼすラサギリンの効果を示す。（２Ａ）ＰＣ１２細胞を無処理または種々の濃度のラサギリン（０．１，１，及び１０μＭ）で１時間処理した。（２Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみ、強力なＰＫＣ選択的阻害薬であるＧＦ  １０９２０３Ｘ（２．５μＭ）、で予めインキュベートし、次いで薬物無しまたはラサギリン（１μＭ）またはＰＭＡ（１００ｎＭ）と１時間インキュベートした。ＰＫＣのリン酸化をウエスタンブロットにより分析し、ｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）抗体で検出した。レーン間のばらつきはβ−アクチンのレベルで正規化した。結果は３回の独立した実験から得た。（２Ｃ）非処理（対照）またはラサギリン（１μＭ）１時間処理のＰＣ１２細胞の膜フラクション中に存在するｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）及びＰＫＣα及びＰＫＣεイソ酵素の免疫活性。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３−５）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  対非処理対照細胞、である。
【図３Ａ−３Ｄ】血清欠乏に対するプロパルギルアミンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞（３Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（３Ｂ）を血清欠乏下にインキュベートし、非処理またはプロパルギルアミン（０．１，１，１０μＭ）で２４時間処理した。細胞死はＥＬＩＳＡにより検出し、値は対照に対するパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５  対非処理対照細胞、である。（３Ｃ）十分な血清存在（ａ）、またはプロパルギルアミンが存在しない無血清培地（ｂ）、またはプロパルギルアミン（１μＭ）が存在する無血清培地（ｃ）、またはプロパルギルアミン（１０μＭ）が存在する無血清培地（ｄ）に維持されたＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡により可視化された形態学的特徴。形態は位相差顕微鏡により可視化した。結果は写真により示した。同様な結果が３回繰り返して得られた。（３Ｄ）無血清培地で３日間インキュベートし、次いでプロパルギルアミン（１、１０μＭ）と共に４８時間インキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるカスパーゼ−３切断に対するプロパルギルアミンの効果。
【図４Ａ−４Ｂ】ＰＫＣリン酸化に対するプロパルギルアミンの効果を示す。（４Ａ）ＰＣ１２細胞を無処理または種々の濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）で１時間処理した。（４Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみまたはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）と３０分間予備インキュベートし、次いでプロパルギルアミン（１μＭ）と１時間インキュベートした。細胞分解物中のＰＫＣのリン酸化をｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。レーン間のばらつきはβ−アクチンのレベルで正規化した。結果は３回の独立した実験から得た。
【図５Ａ−５Ｂ】Ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子：Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−Ｗ，Ｂａｄ  Ｂａｘ、の発現に対するラサギリンの効果。ＰＣ１２細胞を十分な血清中で維持するか（対照）または無血清（ＳＦ）培地中で種々の濃度のラサギリン（０．００１，０．１，１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に３時間（５Ａ）または２４時間（５Ｂ）維持し、遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各産物の量は、自家保存遺伝子１８Ｓ−ｒＲＮＡに対して正規化し、任意に１と設定した対照に対する増加倍数として示した。結果は、繰り返して実施し、同じ結果を示した３回の独立した実験から得た。データは、平均±標準偏差、ｔ−検定（＃ｐ＜０．０５  対対照；＊ｐ＜０．０５  対ＳＦ）。
【図６Ａ−６Ｂ】Ｂａｄ（６Ａ）及びＢａｘ（６Ｂ）遺伝子レベルに対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を十分な血清中で維持するか（対照）または無血清（ＳＦ）培地中で種々の濃度のプロパルギルアミン（０．１，１，１０μＭ）の存在下または非存在下に２４時間維持し、遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各産物の量は、自家保存遺伝子１８Ｓ−ｒＲＮＡに対して正規化し、そして任意に１と設定した対照に対する増加倍数として示した。結果は、繰り返して実施し、同じ結果を示した３回の独立した実験から得た。データは、平均±標準偏差、ｔ−検定（＃ｐ＜０．０５  対対照；＊ｐ＜０．０５  対ＳＦ）。
【図７Ａ−７Ｃ】Ａβ誘発毒性に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞をラサギリン（１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に前処理し、次いで２４時間Ａβ１−４２（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。（７Ａ）細胞生存能力はトリパンブルー色素排除法を使用することにより直接細胞数を計数することにより評価した。値は対照の生存細胞数に対するパーセンテージとして示す。（７Ｂ）細胞死はＥＬＩＳＡで検出した。値は対照に対するパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対非処理対照、＃ｐ＜０．０５  対Ａβ１−４２−誘発細胞死。（７Ｃ）（ａ）ラサギリンなし（対照）、（ｂ）ラサギリン（１μＭ）、（ｃ）ラサギリン（１０μＭ）、（ｄ）Ａβ１−４２（１０μＭ）、（ｅ）ラサギリン（１μＭ）プラスＡβ１−４２（１０μＭ）、及び（ｆ）ラサギリン（１０μＭ）プラスＡβ１−４２（１０μＭ）、で２４時間処理したＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡により可視化された形態的特徴を示す。形態は位相差顕微鏡により可視化された。結果は反復３回の実験の写真を示す。
【図８】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるｓＡＰＰα放出に対するラサギリンの効果を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法の記述に従って測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図９】ＰＣ１２細胞におけるｓＡＰＰα放出に対するラサギリンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法の記述に従って測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ＭＡＰＫ活性化に対するラサギリンの効果を示す。（１０Ａ）ＰＣ１２細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と０．５時間処理した。リン酸化ＭＡＰＫブロットの定量は総ＭＡＰＫブロットを使用して正規化した。（１０Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみまたはＰＤ９８０５９（３０μＭ）またはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）と１５分間予備インキュベートし、次いでラサギリン（１０μＭ）とまたはなしで０．５時間インキュベートした。細胞分解物の一部について免疫ブロット分析を行い、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ抗体（上段ブロット）及び抗−ＭＡＰＫ抗体（下段ブロット）で検出した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ｓＡＰＰα放出に対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（１１Ａ）またはＰＣ１２細胞（１１Ｂ）を増加濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）またはなしと３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法に記述したように測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１２】ＭＡＰＫ活性化に対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を増加濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）と０．５時間処理した。次いで細胞分解物の一部の免疫ブロット分析を行い、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ抗体（上段ブロット）及び抗−ＭＡＰキナーゼ抗体（下段ブロット）で検出した。リン酸化−ＭＡＰＫの定量は総ＭＡＰＫブロットを使用して正規化した。データは、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１３Ａ−１３Ｂ】プロパルギルアミンはＭＡＯ−Ａ（１３Ａ）及びＭＡＯ−Ｂ（１３Ｂ）のいずれの活性も阻害するが、ＭＡＯ−Ｂに対して比較的選択性が高いことを示している。
【０１０５】
参考文献
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2005232148.tif 000005
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2005232148.tif 000007
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月14日(2004.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
【図１Ａ−１Ｂ】血清欠乏に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞（１Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（１Ｂ）を血清欠乏下にインキュベートし、無処理またはラサギリン（０．１，１，１０μＭ）で２４時間処理した。細胞死はＥＬＩＳＡにより検出し、値を対照のパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５  対非処理対照細胞、である。
【図２Ａ−２Ｃ】プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化に及ぼすラサギリンの効果を示す。（２Ａ）ＰＣ１２細胞を無処理または種々の濃度のラサギリン（０．１，１，及び１０μＭ）で１時間処理した。（２Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみ、強力なＰＫＣ選択的阻害薬であるＧＦ  １０９２０３Ｘ（２．５μＭ）、で予めインキュベートし、次いで薬物無しまたはラサギリン（１μＭ）またはＰＭＡ（１００ｎＭ）と１時間インキュベートした。ＰＫＣのリン酸化をウエスタンブロットにより分析し、ｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）抗体で検出した。レーン間のばらつきはβ−アクチンのレベルで正規化した。結果は３回の独立した実験から得た。（２Ｃ）非処理（対照）またはラサギリン（１μＭ）１時間処理のＰＣ１２細胞の膜フラクション中に存在するｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）及びＰＫＣα及びＰＫＣεイソ酵素の免疫活性。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３−５）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１  対非処理対照細胞、である。
【図３Ａ】血清欠乏に対するプロパルギルアミンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞（３Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（３Ｂ）を血清欠乏下にインキュベートし、非処理またはプロパルギルアミン（０．１，１，１０μＭ）で２４時間処理した。細胞死はＥＬＩＳＡにより検出し、値は対照に対するパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５  対非処理対照細胞、である。
【図３Ｂ】血清欠乏に対するプロパルギルアミンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞（３Ａ）及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（３Ｂ）を血清欠乏下にインキュベートし、非処理またはプロパルギルアミン（０．１，１，１０μＭ）で２４時間処理した。細胞死はＥＬＩＳＡにより検出し、値は対照に対するパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）、＊ｐ＜０．０５  対非処理対照細胞、である。
【図３Ｃ】血清欠乏に対するプロパルギルアミンの神経保護効果を示す。（３Ｃ）十分な血清存在（ａ）、またはプロパルギルアミンが存在しない無血清培地（ｂ）、またはプロパルギルアミン（１μＭ）が存在する無血清培地（ｃ）、またはプロパルギルアミン（１０μＭ）が存在する無血清培地（ｄ）に維持されたＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡により可視化された形態学的特徴。形態は位相差顕微鏡により可視化した。結果は写真により示した。同様な結果が３回繰り返して得られた。
【図３Ｄ】血清欠乏に対するプロパルギルアミンの神経保護効果を示す。（３Ｄ）無血清培地で３日間インキュベートし、次いでプロパルギルアミン（１、１０μＭ）と共に４８時間インキュベートしたＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるカスパーゼ−３切断に対するプロパルギルアミンの効果。
【図４Ａ−４Ｂ】ＰＫＣリン酸化に対するプロパルギルアミンの効果を示す。（４Ａ）ＰＣ１２細胞を無処理または種々の濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）で１時間処理した。（４Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみまたはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）と３０分間予備インキュベートし、次いでプロパルギルアミン（１μＭ）と１時間インキュベートした。細胞分解物中のＰＫＣのリン酸化をｐ−ＰＫＣ（ｐａｎ）抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。レーン間のばらつきはβ−アクチンのレベルで正規化した。結果は３回の独立した実験から得た。
【図５Ａ−５Ｂ】Ｂｃｌ−２ファミリー遺伝子：Ｂｃｌ−ｘＬ，Ｂｃｌ−Ｗ，Ｂａｄ  Ｂａｘ、の発現に対するラサギリンの効果。ＰＣ１２細胞を十分な血清中で維持するか（対照）または無血清（ＳＦ）培地中で種々の濃度のラサギリン（０．００１，０．１，１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に３時間（５Ａ）または２４時間（５Ｂ）維持し、遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各産物の量は、自家保存遺伝子１８Ｓ−ｒＲＮＡに対して正規化し、任意に１と設定した対照に対する増加倍数として示した。結果は、繰り返して実施し、同じ結果を示した３回の独立した実験から得た。データは、平均±標準偏差、ｔ−検定（＃ｐ＜０．０５  対対照；＊ｐ＜０．０５  対ＳＦ）。
【図６Ａ−６Ｂ】Ｂａｄ（６Ａ）及びＢａｘ（６Ｂ）遺伝子レベルに対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を十分な血清中で維持するか（対照）または無血清（ＳＦ）培地中で種々の濃度のプロパルギルアミン（０．１，１，１０μＭ）の存在下または非存在下に２４時間維持し、遺伝子発現を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各産物の量は、自家保存遺伝子１８Ｓ−ｒＲＮＡに対して正規化し、そして任意に１と設定した対照に対する増加倍数として示した。結果は、繰り返して実施し、同じ結果を示した３回の独立した実験から得た。データは、平均±標準偏差、ｔ−検定（＃ｐ＜０．０５  対対照；＊ｐ＜０．０５  対ＳＦ）。
【図７Ａ】Ａβ誘発毒性に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞をラサギリン（１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に前処理し、次いで２４時間Ａβ1-42（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。（７Ａ）細胞生存能力はトリパンブルー色素排除法を使用することにより直接細胞数を計数することにより評価した。値は対照の生存細胞数に対するパーセンテージとして示す。
【図７Ｂ】Ａβ誘発毒性に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞をラサギリン（１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に前処理し、次いで２４時間Ａβ1-42（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。（７Ｂ）細胞死はＥＬＩＳＡで検出した。値は対照に対するパーセンテージとして示した。結果は、平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対非処理対照、＃ｐ＜０．０５  対Ａβ1-42−誘発細胞死。
【図７Ｃ】Ａβ誘発毒性に対するラサギリンの神経保護効果を示す。ＰＣ１２細胞をラサギリン（１及び１０μＭ）の存在下または非存在下に前処理し、次いで２４時間Ａβ1-42（１０μＭ）と共に２４時間インキュベートした。（７Ｃ）（ａ）ラサギリンなし（対照）、（ｂ）ラサギリン（１μＭ）、（ｃ）ラサギリン（１０μＭ）、（ｄ）Ａβ1-42（１０μＭ）、（ｅ）ラサギリン（１μＭ）プラスＡβ1-42（１０μＭ）、及び（ｆ）ラサギリン（１０μＭ）プラスＡβ1-42（１０μＭ）、で２４時間処理したＰＣ１２細胞の位相差顕微鏡により可視化された形態的特徴を示す。形態は位相差顕微鏡により可視化された。結果は反復３回の実験の写真を示す。
【図８】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるｓＡＰＰα放出に対するラサギリンの効果を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法の記述に従って測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図９】ＰＣ１２細胞におけるｓＡＰＰα放出に対するラサギリンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法の記述に従って測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ＭＡＰＫ活性化に対するラサギリンの効果を示す。（１０Ａ）ＰＣ１２細胞を増加濃度のラサギリン（０．１，１及び１０μＭ）と０．５時間処理した。リン酸化ＭＡＰＫブロットの定量は総ＭＡＰＫブロットを使用して正規化した。（１０Ｂ）ＰＣ１２細胞を溶媒のみまたはＰＤ９８０５９（３０μＭ）またはＧＦ１０９２０３Ｘ（２．５μＭ）と１５分間予備インキュベートし、次いでラサギリン（１０μＭ）とまたはなしで０．５時間インキュベートした。細胞分解物の一部について免疫ブロット分析を行い、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ抗体（上段ブロット）及び抗−ＭＡＰＫ抗体（下段ブロット）で検出した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ｓＡＰＰα放出に対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（１１Ａ）またはＰＣ１２細胞（１１Ｂ）を増加濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）またはなしと３時間インキュベートし、培地中のｓＡＰＰαを材料と方法に記述したように測定した。ウエスタンブロットのデンシトメトリー分析結果を基礎ｓＡＰＰα放出に対するパーセンテージとして示した。結果は、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３−５）である。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１２】ＭＡＰＫ活性化に対するプロパルギルアミンの効果を示す。ＰＣ１２細胞を増加濃度のプロパルギルアミン（０．１，１及び１０μＭ）と０．５時間処理した。次いで細胞分解物の一部の免疫ブロット分析を行い、抗−リン酸化−ＭＡＰＫ抗体（上段ブロット）及び抗−ＭＡＰキナーゼ抗体（下段ブロット）で検出した。リン酸化−ＭＡＰＫの定量は総ＭＡＰＫブロットを使用して正規化した。データは、独立した実験の平均±標準誤差（ｎ＝３）である。＊＊ｐ＜０．００１  対対照。
【図１３Ａ】プロパルギルアミンはＭＡＯ−Ａ（１３Ａ）及びＭＡＯ−Ｂ（１３Ｂ）のいずれの活性も阻害するが、ＭＡＯ−Ｂに対して比較的選択性が高いことを示している。
【図１３Ｂ】プロパルギルアミンはＭＡＯ−Ａ（１３Ａ）及びＭＡＯ−Ｂ（１３Ｂ）のいずれの活性も阻害するが、ＭＡＯ−Ｂに対して比較的選択性が高いことを示している。
【外国語明細書】
2005232148000001.pdf