(57)【要約】【課題】  生体分子の固定化量が高く、生体分子の結合強度が高い固体支持体を提供する。【解決手段】  基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体。
【請求項２】
基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種で表面処理されている請求項１に記載の固体支持体。
【請求項３】
静電層が、基板と共有結合していないアミノ基含有化合物を含む請求項１又は２に記載の固体支持体。
【請求項４】
静電層が、基板と共有結合しているアミノ基含有化合物で構成され、該アミノ基含有化合物が、基板と結合していない側の末端にアミノ基を有する請求項１又は２に記載の固体支持体。
【請求項５】
基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られる請求項１〜３のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項６】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られる請求項１〜４のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項７】
非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物がポリアリルアミンである請求項６に記載の固体支持体。
【請求項８】
生体分子がＤＮＡである請求項１〜７のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体に生体分子が固定化されてなる固定化生体分子。
【請求項１０】
基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることを特徴とする固体支持体の製造方法。
【請求項１１】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することを特徴とする固体支持体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせて、該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長する方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、標識した核酸の存在下で該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長させ、該相補的な核酸分子に取り込まれた標識核酸に由来するシグナルを読みとることを含む、核酸分子の検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、これをＰＣＲ反応に付すことにより、核酸分子を増幅する方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーにＤＮＡをハイブリダイズさせて、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと反応させることにより、該ＤＮＡを増幅する方法。
【請求項１６】
プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせた後に、該核酸分子を増幅する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ等を固定化するための支持体及び固定化核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、既存の配列から核酸配列を合成する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、目的とするＤＮＡを１組のプライマーで挟み、ＤＮＡポリメラーゼを作用させることを繰り返し、プライマーで挟んだ領域を無限に増幅させることができる方法である。
【０００４】
ＰＣＲによれば、目的とする配列のみをかなり正確に多数増幅させることができ、しかも短時間で効率よく増幅することができるので、現在、生化学、医療分野等の各種研究、試験、検査等に広く用いられている。
【０００５】
ＰＣＲ反応は加熱及び冷却の繰り返しにより進められている（サーマルサイクル）。すなわち、増幅対象である二本鎖ＤＮＡ分子を相補的一本鎖に高温変性させた後、冷却して該ＤＮＡの一部に相補するように選択されたプライマーを鎖にアニールさせ、再び加熱してＤＮＡポリメラーゼによりプライマーの後ろにＤＮＡを伸長させるという風に、変性、アニール、伸長のプロセスを１サイクルとして複数サイクル繰り返すことにより二本鎖ＤＮＡを多数増幅することができる。
【０００６】
具体的には、１）二本鎖ＤＮＡの水素結合をほどくために試料の温度を９５℃に上昇させる、２）次いでＤＮＡを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度を４５℃に下降させる、３）更に耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させてＤＮＡを複製させるために試料の温度を７４℃に上昇させる、といった１）〜３）のサーマルサイクルを幾度も繰り返す必要があった。このようなＤＮＡの増幅反応では、試料を合成樹脂の容器などに入れ、この容器をアルミニウムブロックに収容し前記サーマルサイクルを行っていた。
【０００７】
しかし、前記サーマルサイクルは多大な時間がかかり、目的とする量のＤＮＡを得るには数時間を要していた。また、加熱、冷却による温度制御により反応を進めると、一瞬にして温度を変化させるには限界があり、各段階への切り替えがスムーズにいかず、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的とする以外のＤＮＡも複製される場合も考えられた。また、迅速な温度変化をさせるためには、特別の装置や技術が必要となるため、設備投資等の経済的な問題や技術的な問題があった。
【０００８】
このような問題に鑑み、ＤＮＡを容易に固定化できて、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するために適する支持体として、基板の表面に、表面処理層、及び核酸分子と共有結合しうる官能基を有する化学修飾層を順次設けてなる固体支持体が開発されている（例えば、特許文献３〜５参照）。
【０００９】
しかしながら、前記固体支持体のＤＮＡの固定化量及びＤＮＡの結合強度は、必ずしも充分とはいえない。
【００１０】
また、ＤＮＡアレイ技術を、タンパク質解析のツールとして用いたものとしてプロテインチップが開発されている。プロテインチップの原理はＤＮＡチップと同じで、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用するタンパク質や核酸などを検出するものである。従来開発されたプロテインチップは、スライドガラス又はシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にタンパク質を固定化するものであるが、この方法では、タンパク質の固定化状態が不安定であり、洗浄工程において剥離するといった問題が生じるとともに、固定化されたタンパク質を長期間保存することも不可能であった。また、生体物質の非特異吸着や、タンパク質の機能失活、検出系ＵＶ不透明性等の問題もあった。従って、ＤＮＡまたはタンパク質の固定化量がより高く結合強度がより高い固体支持体の出現が望まれている。
【００１１】
この出願の発明に関する先行技術文献情報として次のものがある。
【特許文献１】特開平７−７５５４４号公報
【特許文献２】特開平７−３０３４６９号公報
【特許文献３】ＷＯ００／２２１０８
【特許文献４】ＷＯ０２／１２８９１
【特許文献５】特開２００２−８２１１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、生体分子の固定化量がより高く、生体分子の結合強度がより高い固体支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討の結果、基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を設けることにより、生体分子の固定化量及び生体分子の結合強度が著しく向上することを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）基板上に、生体分子を静電的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体。
（２）基板の表面がダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質及び炭化物から選ばれる少なくとも１種で表面処理されている（１）に記載の固体支持体。
（３）静電層が、基板と共有結合していないアミノ基含有化合物を含む（１）又は（２）に記載の固体支持体。
（４）静電層が、基板と共有結合しているアミノ基含有化合物で構成され、該アミノ基含有化合物が、基板と結合していない側の末端にアミノ基を有する（１）又は（２）に記載の固体支持体。
【００１５】
（５）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させて得られる（１）〜（３）のいずれかに記載の固体支持体。
（６）基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬して得られる（１）〜（４）のいずれかに記載の固体支持体。
（７）非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物がポリアリルアミンである（６）に記載の固体支持体。
【００１６】
（８）生体分子がＤＮＡである（１）〜（７）のいずれかに記載の固体支持体。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体に生体分子が固定化されてなる固定化生体分子。
【００１７】
（１０）基板上に、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることを特徴とする固体支持体の製造方法。
（１１）基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することを特徴とする固体支持体の製造方法。
（１２）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせて、該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長する方法。
【００１８】
（１３）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、標識した核酸の存在下で該核酸分子に相補的な核酸分子を伸長させ、該相補的な核酸分子に取り込まれた標識核酸に由来するシグナルを読みとることを含む、核酸分子の検出方法。
（１４）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせ、これをＰＣＲ反応に付すことにより、核酸分子を増幅する方法。
【００１９】
（１５）（１）〜（８）のいずれかに記載の固体支持体上にプライマーを固定化し、該プライマーにＤＮＡをハイブリダイズさせて、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼと反応させることにより、該ＤＮＡを増幅する方法。
（１６）プライマーに核酸分子をハイブリダイズさせた後に、該核酸分子を増幅する工程をさらに含む、（１３）に記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の固体支持体は、従来の固体支持体よりも核酸分子等の生体分子を大量に固定化することができることから、従来ＤＮＡアレイの課題であった検出感度と信頼性を改良することができ、また、核酸分子を固定化した状態で伸長反応を行ったり、ＰＣＲ反応を実施して核酸分子を増幅することもできるので、広くＤＮＡアレイの普及を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明に用いる基板の材料としては、例えば、シリコン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂(Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂)、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）が挙げられる。
【００２２】
基板の材料として前記のものを用いる場合には、表面処理層を施さなくてもよいが、生体分子を基板上に強固に固定化するために、表面処理を施すことがより好ましい。
【００２３】
表面処理には、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、又はそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。
【００２４】
表面処理された基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。
表面処理層の厚みは、１ｎｍ〜１００μｍであることが好ましい。
【００２５】
基板の表面処理層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ(Chemical Vapor Deposit)法、ＥＣＲＣＶＤ(Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、ＩＣＰ(Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ(Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ(Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。
【００２６】
本発明に用いる基板としては、前記のように表面処理層を形成した構造だけでなく、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）；前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記樹脂をバインダーとして混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられ、また、前記の材料の積層体や複合体（例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば２相体））であってもよい。
【００２７】
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅０．１〜１００ｍｍ、長さ０．１〜１００ｍｍ、厚み０．０１〜１０ｍｍ程度である。
【００２８】
また、基板の表面又は裏面に、反射層としてＴｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、Ｃｒ、ＴｉＣ、ＴｉＮ等の単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは１０ｎｍ以上、更に好ましくは１００ｎｍ以上である。
【００２９】
基板としてガラスを用いる場合、その表面は、Ｒａ（ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のＤＮＡプローブ等を高密度で固定化できる点で好都合である。
【００３０】
本発明の固体支持体には、核酸分子等の生体分子を静電的に引き寄せるために静電層が設けられている。
【００３１】
静電層としては、核酸分子等の生体分子を静電的に引き寄せ、生体分子の固定化量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。
【００３２】
前記アミノ基含有化合物としては、非置換のアミノ基（−ＮＨ２）、又は炭素数１〜６のアルキル基等で一置換されたアミノ基（−ＮＨＲ；Ｒは置換基）を有する化合物、例えばエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ｎ−プロピルアミン、モノメチルアミン、ジメチルアミン、モノエチルアミン、ジエチルアミン、アリルアミン、アミノアゾベンゼン、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン）、アクリノール、アミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、アニリン、又はこれらの重合体（例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン）や共重合体；４,４’,４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価アミン）が挙げられる。
【００３３】
静電層は、基板又は表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、基板又は表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
【００３４】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理層を製膜する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。製膜装置内に導入する化合物として、アンモニアガスを用いてもよい。また、表面処理層は、密着層を形成した後にアミノ基を含有する皮膜を形成するといった、複層であってもよく、この場合もアンモニアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。製膜は、例えばプラズマ法によって実施できる。
【００３５】
また、静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と基板又は表面処理層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させることが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はないが、例えば常温で気体であるメタン、エタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましく、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が０．１〜５０Ｐａ、そして加速電圧が２００〜１０００Ｖの範囲であることが好ましい。
【００３６】
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させて形成する場合には、例えば、基板又は表面処理層を施した基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有化合物のうち、例えば、ポリアリルアミン、ポリリシン、４,４',４”-トリアミノトリフェニルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
【００３７】
基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、生体分子の固定化量がより向上する。アミノ基含有化合物とともにシランカップリング剤が共存する溶液に基板を浸漬することにより、静電層を形成することもできる。
静電層の厚みは、１ｎｍ〜５００μｍであることが好ましい。
【００３８】
本発明において生体分子とは、生体内に存在する分子を意味し、本発明の固体支持体に固定化できる生体分子としては、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、ならびに糖鎖などが挙げられる。本発明の固体支持体は、核酸分子、特にＤＮＡの固定化に好適に用いられる。
【００３９】
ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸分子を固定化する場合、その塩基数は、通常１〜１０億、好ましくは５〜１００万である。また、ＤＮＡは一本鎖、二本鎖のいずれも固定化することができる。
【００４０】
本発明の固体支持体は、核酸分子、例えば、ＤＮＡの伸長反応に用いることができる。この場合、まず、固体支持体上にプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡ伸長反応によりプライマーにハイブリダイズしたＤＮＡと相補的なＤＮＡを伸長させる。
【００４１】
プライマーとしては、長さ及び配列が明らかな一本鎖又は二本鎖の核酸分子を使用する。長さは特に限定されないが、好ましくは５〜２００塩基、さらに好ましくは１０〜１００塩基である。プライマーの固定化方法としては、特に限定されないが、例えば、核酸分子をバッファーに溶解してプライマー溶液を作成し、これに本発明の固定化支持体を浸漬することによって、固体支持体表面にプライマーを固定化することができる。浸漬は、通常、０〜９８℃、好ましくは４℃〜５０℃で、通常、１分〜２４時間、好ましくは１０分〜１時間行うことによってプライマーを固定化できる。この場合、一定時間浸漬した後、固体支持体を洗浄することによって、固定化されていないプライマーを除去することができる。また、スポッターといわれる装置を使用することによって、多種類のプライマー溶液を固体支持体の表面に固定化できる。スポッターを用いる場合には、例えば、スポッターでプライマー溶液を固体支持体上にスポットした後、加熱したオーブン中で一定時間ベーキングを行い、その後洗浄によって固定していないプライマーを除去する。スポッター装置を用いることにより他種類のプライマーを固体支持体上の異なる位置に固定化できるため一度に多数の試験を実施することができ、膨大な試験を要する核酸検出の分野において有利である。
【００４２】
従来の固体支持体では、伸長反応における熱処理によってプライマーが剥離することがあるが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、プライマーを固体支持体に固定化した状態で伸長反応を進行させることができる。
【００４３】
この伸長反応の時に、標識した核酸を取り込ませ、伸長反応後、標識に由来するシグナルを読みとることによって、プライマーに特定のＤＮＡがハイブリダイズして伸長反応が進行したか否かを検出することができる。従って、試験した試料中に、固定化支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが含まれているかどうかを判定することができ、研究及び医療における有用な検出手段となりうる。
【００４４】
標識としては、核酸分子に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Ｃｙ３及びＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなど）、放射能標識（α−３２Ｐ、γ−３２Ｐ、３５Ｓなど）などが挙げられる。蛍光標識核酸を用いた場合は、伸長反応の後の固体支持体を蛍光撮影することにより、検出することができる。
【００４５】
本発明の固体支持体は、ＤＮＡの増幅反応に用いることができる。ＰＣＲ反応により増幅させる場合には、例えば、まず、固体支持体上にフォワードプライマーを固定化して、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡをハイブリダイズさせ、その後酵素反応で相補鎖ＤＮＡを伸長する。更にi)アニーリング、ii)ハイブリダイゼーション、iii)伸長反応という工程を連続で行うことによって、いわゆるＰＣＲ反応が進行する。
【００４６】
従来の固体支持体では、ＰＣＲ反応における熱処理によってプライマーが剥離したり、サーマルサイクルの制御がうまくいかないといった問題があったが、本発明の固体支持体では、熱を加えてもプライマーが剥離せず、さらに、反応を容器の中ではなく固体支持体上にＤＮＡを固定化した状態で行うため、ＰＣＲ反応における温度制御が正確で、増幅される核酸の配列の正確性に影響が出たり、目的外のＤＮＡが複製される可能性も低く、効率的にＤＮＡを増幅することができる。
【００４７】
本発明の固体支持体を上記のＰＣＲによるＤＮＡの増幅に使用する場合は、固体支持体の熱伝導率が０．１Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上であることが好ましい。さらに好ましくは熱伝導率が０．５Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上、最も好ましくは熱伝導率が１Ｗ／ｃｍ・Ｋ以上である。固体支持体の熱伝導率が高いと、ＰＣＲ反応を行う場合等において、加熱、冷却の追随性が優れているからである。
【００４８】
具体的には、固体支持体を製造するための基板として、熱伝導率の点からはダイヤモンド又は各種基板に表面処理層としてダイヤモンドを被覆した物等を使用するのが好ましい。
【００４９】
さらに、上記の標識核酸を用いた検出とＰＣＲによる増幅とを組み合わせることにより、固体支持体上のプライマーにハイブリダイズしうるＤＮＡが試料中に少量しか含まれていない場合であっても、上記のようにＤＮＡが複製され、結果的に多量のＤＮＡが固体支持体上のプライマーにハイブリダイズし、その相補鎖が伸長されるため、検出感度を増大させることが可能になる。
【００５０】
あるいは、伸長反応に使用する酵素として、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを選択し、リバースプライマーを加えることによって、サーマルサイクルを経ることなく定温で、ＤＮＡを固体支持体上で増幅することができる。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に二本鎖領域があった場合その鎖を解離しながら、相補鎖合成を継続できるＤＮＡ合成酵素である。
【００５１】
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ)、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(アマシャムバイオサイエンス)等が挙げられる。
【００５２】
本発明の別の態様においては、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを対象とすることにより、間接的ながらＲＮＡも対象となりうる。
【００５３】
この場合には、ｍＲＮＡから逆転写反応を利用してｃＤＮＡを得るが、ｃＤＮＡを得ると同時に固体支持体に固定化させることができる。まず、固体支持体の化学修飾部分に逆転写プライマーを結合させる。プライマーとしては、一般にオリゴｄＴプライマー、特定塩基配列に相補的なプライマー、ランダム６塩基プライマーが用いられるが、中でもＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）＋配列に対応させてＴ（チミン塩基）が１０〜２０個程度連なった配列からなるオリゴｄＴプライマーを用いることが望ましい。
【００５４】
オリゴｄＴプライマーを用いる場合には、鋳型となるＲＮＡの５’末端のｐｏｌｙ（Ａ）部分をアニーリングさせる。これに逆転写酵素を作用させ、鋳型ＲＮＡに対し相補的なｄＮＴＰをプライマーの３’末端に順々に重合させることで、５’から３’の方向にｃＤＮＡを合成する。この逆転写反応のプライマーの結合、アニーリング、逆転写酵素による相補鎖重合は、定法に従い温度制御（サーマルサイクル）を行うことによって実施できる。
【００５５】
このように逆転写反応を行うと同時に固体支持体への固定も可能であることから、本発明の方法によればいわゆるＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcript-PCR）を効率よく行うことができ、ｍＲＮＡの定量用としても有用である。
【００５６】
更に、本発明の支持体を用い、オリゴ核酸の末端塩基を固定化し、更に、このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリーチップとして用いることもできる。また、ＤＮＡの代わりに、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント等を固定化して、ライブラリーとすることもできる。
【００５７】
本発明の固体支持体を用いて上記のような検出を行うことにより、疾患の診断を行うこともできる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(実施例１）アンモニアプラズマによる静電層の導入
スライドグラスにイオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。その後、メタンガスと水素ガスの代わりにアンモニアガス雰囲気とし、プラズマ法により１０分間アミノ化し、固体支持体を作成した。
【００５９】
この固体支持体に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社）を使用して、λＤＮＡから増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌをスポットした。ＤＮＡ濃度は１μｇ／μｌ、スポット溶液は３×ＳＳＣである。
【００６０】
この固体支持体を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、遠心乾燥させた。
【００６１】
その後、蛍光スキャナーＦＬＡ−８０００（富士写真フィルム社）によって蛍光画像を観察し、蛍光強度を測定した。結果として、比較例１として用いた市販の静電結合型基板(コーニング社製ＧＡＰＳコートスライド)と比較して高い蛍光強度が得られた。
【００６２】
（実施例２）シランカップリング剤／ポリアリルアミンによる静電層の導入
スライドグラスを、シランカップリング剤とポリアリルアミンを９５％エタノールに溶解した溶液に１０分間浸漬した。このとき、シランカップリング剤は２％、ポリアリルアミンは０．１％になるように添加した。その後、エタノールで２回洗浄した後に遠心乾燥し、１００℃に設定したオーブンで１０分間加熱し、固体支持体を作成した。
【００６３】
この固体支持体に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社）を使用して、λＤＮＡから増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌをスポットした。ＤＮＡ濃度は１μｇ／μｌ、スポット溶液は３×ＳＳＣである。
【００６４】
この固体支持体を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、遠心乾燥させた。
【００６５】
その後、蛍光スキャナーＦＬＡ−８０００（富士写真フィルム社）によって蛍光画像を観察し、蛍光強度を測定した。結果として、比較例１として用いた市販の静電結合型基板(コーニング社製ＧＡＰＳコートスライド)と比較して高い蛍光強度が得られた。
【００６６】
また、X線光電子分光分析法(ＸＰＳ)により導入されたアミノ基由来のＮピーク強度を測定したところ、シランカップリング剤単独で処理した場合にはピーク強度が４０００、ポリアリルアミン単独で処理した場合にはピーク強度が７１００、本実施例のようにシランカップリング剤とポリアリルアミンが共存した場合にはピーク強度が１５２００となった。従って、本実施例の処理方法は、アミノ基を多く導入するのに有効である。
【００６７】
（実施例３）ポリアリルアミンによる静電層の導入
スライドグラスを、０．１％ポリアリルアミン水溶液に１０分間浸漬した。その後、超純水で２回洗浄した後に遠心乾燥し、１００℃に設定したオーブンで１０分間加熱して、固体支持体を作成した。
【００６８】
この固体支持体に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社）を使用して、λＤＮＡから増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌをスポットした。ＤＮＡ濃度は１μｇ／μｌ、スポット溶液は３×ＳＳＣである。
【００６９】
この固体支持体を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、遠心乾燥させた。
【００７０】
その後、蛍光スキャナーＦＬＡ−８０００（富士写真フィルム社）によって蛍光画像を観察し、蛍光強度を測定した。結果として、比較例１として用いた市販の静電結合型基板(コーニング社製ＧＡＰＳコートスライド)と比較して高い蛍光強度が得られた。
【００７１】
（実施例４）ＤＬＣ層を有する基板へ静電層の導入
２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドガラスに、イオン化蒸着法によって、メタンガス９５体積％と水素５体積％を混合したガスを原料として、加速電圧０．５ｋＶでＤＬＣ層を１０ｎｍの厚みに形成した。ＤＬＣ層を形成したスライドガラスを０．１％のポリアリルアミン溶液中に浸漬し、洗浄後乾燥することにより、固体支持体を作成した。
【００７２】
この固体支持体に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社）を使用して、λＤＮＡから増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌをスポットした。ＤＮＡ濃度は１μｇ／μｌ、スポット溶液は２０％ＰＥＧである。
【００７３】
この固体支持体を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、遠心乾燥させた。
【００７４】
その後、蛍光スキャナーＦＬＡ−８０００（富士写真フィルム社）によって蛍光画像を観察し、蛍光強度を測定した。結果として、比較例１として用いた市販の静電結合型基板(コーニング社製ＧＡＰＳコートスライド)と比較して高い蛍光強度が得られた。
【００７５】
（実施例５）シランカップリング剤、ポリアクリル酸、ポリアリルアミンの積層による静電層の導入
スライドグラスを、シランカップリング剤を９５％エタノールに溶解した溶液に１０分間浸漬した。このとき、シランカップリング剤は２％になるように添加した。その後、エタノールで２回洗浄した後に遠心乾燥し、１００℃に設定したオーブンで１０分間加熱した。その後、０．２５％に調整したポリアクリル酸水溶液に１０分間浸漬し、超純水で３回洗浄した。更に、ポリアリルアミンを０．１％になるようにエタノールに溶解した溶液に１０分間浸漬して、エタノール洗浄を行った後に遠心乾燥して、固体支持体を作成した。
【００７６】
この固体支持体に、マイクロアレイ用スポッターＳＰＢＩＯ２０００（日立ソフト社）を使用して、λＤＮＡから増幅した５００ｂｐのＣｙ３標識二本鎖ＤＮＡ約１ｎｌをスポットした。ＤＮＡ濃度は１μｇ／μｌ、スポット溶液は３×ＳＳＣである。
【００７７】
この固体支持体を８０℃のオーブンに１時間入れた後に、室温の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で１５分間洗浄を行った。その後、９５℃に加熱した２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、遠心乾燥させた。
【００７８】
その後、蛍光スキャナーＦＬＡ−８０００（富士写真フィルム社）によって蛍光画像を観察し、蛍光強度を測定した。結果として、比較例１として用いた市販の静電結合型基板(コーニング社製ＧＡＰＳコートスライド)と比較して高い蛍光強度が得られた。
実施例１〜５及び比較例１で測定した蛍光強度の結果を以下の表１に示す。
【００７９】
【表１】
2005195465.tif 000002