(57)【要約】【課題】  短時間で核酸が折り畳まれ構造を取るか否かを決定できる方法を提供すること。【解決手段】  立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない標識核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせた後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法。立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせ、次いで、ハイブリダイズした核酸の標識を行った後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない標識核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせた後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法。
【請求項２】
標識核酸が蛍光色素又は放射性物質で標識されている核酸である請求項１記載の方法。
【請求項３】
立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせ、次いで、ハイブリダイズした核酸の標識を行った後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法。
【請求項４】
標識が蛍光色素又は放射性物質を用いて行われる請求項３記載の方法。
【請求項５】
立体構造が未知の核酸が基板上に固定されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
立体構造が未知の核酸が規則的に基板上に植え付けた塩基配列の異なる複数の核酸であり、折り畳まれ構造をとっていない核酸がランダム合成した核酸である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
折り畳まれ構造をとっていない核酸が基板上に固定されている請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
基板がＤＮＡチップ用の基板である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発生したシグナルをレーザースキャニングメーター、ＣＣＤカメラ又はシンチレーションカウンターで読み取り、読み取ったシグナルの強度をコンピュータで数値化する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の立体構造を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸（例えば、１本鎖核酸）が折り畳まれ構造を取るか否かを決定するには、立体構造が未知の核酸を同じ塩基長で折り畳まれ構造をとらない核酸とともにゲル中で電気泳動を行い、泳動する距離を比較して、折り畳まれ構造をとっているかどうかを推定していた。すなわち、核酸が分子内で塩基対を形成しないで、折り畳まれ構造をとらない場合には、ゲル中で泳動する距離は同じ塩基長で折り畳まれ構造をとらない核酸とほぼ同じになる。しかし、核酸が分子内で塩基対を形成して、折り畳まれ構造をとる場合には、ゲル中で泳動する距離は同じ塩基長で折り畳まれ構造をとらない核酸より短くなる。
【０００３】
従来の方法では、多数（例えば、４０００種類）の核酸の立体構造に関しての知見を得るためには多数のサンプルを用意し、なおかつサンプルの一つ一つについて電気泳動を行なわなければならず、非常に手間がかかっていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、短時間で、核酸が折り畳まれ構造を取るか否かを決定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、ストレプトアビジンでコートされたスライドガラス上に末端をビオチン標識した長さのそろった種々の配列の１本鎖ＤＮＡをスポットし、ＤＮＡチップを作成した。過剰量の蛍光標識した同じ長さのランダム合成ＤＮＡを用意し、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションさせた。ランダム合成したＤＮＡは折り畳まれ構造をとっていない１本鎖ＤＮＡに１００％ハイブリダイゼーションするが、折り畳まれ構造をとっている１本鎖ＤＮＡは立体障害が起こりハイブリダイゼーションしない。ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションの有無により電気泳動を行なわずに、網羅的にＤＮＡが折り畳まれ構造を取るか否かを決定することが可能となった。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
本発明は、立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない標識核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせた後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法を提供する。
【０００７】
立体構造が未知の核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖などいかなる本数の鎖で構成されるものであってもよい。
【０００８】
立体構造が未知の核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない標識核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖などいかなる本数の鎖で構成されるものであってもよい。「立体構造が未知の核酸の塩基配列の一部に相補的な塩基配列」とは、立体構造が未知の核酸の塩基配列中に存在する少なくとも連続する２個の塩基に相補的である塩基からなる配列であるとよく、好ましくは、立体構造が未知の核酸の塩基配列中に存在する全塩基の９割以上に相補的である塩基からなる配列である。折り畳まれ構造をとっていない標識核酸は、立体構造が未知の核酸の塩基配列の全部に相補的な塩基配列を含むことが最も好ましい。
【０００９】
折り畳まれ構造をとっていない標識核酸は、蛍光色素（例えば、Cy5、Cy6など）又は放射性物質（例えば、32P、3Hなど）で標識されている核酸であるとよい。
【００１０】
立体構造が未知の核酸は標識されていなくてもよいが、この核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない標識核酸の標識と区別できるように標識されていてもよい。
【００１１】
また、本発明は、立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸とを基板上でハイブリダイゼーションさせ、次いで、ハイブリダイズした核酸の標識を行った後、発生したシグナルの強度を測定し、シグナル強度の大きさを指標として、立体構造が未知の核酸の立体構造を推定する方法を提供する。
【００１２】
立体構造が未知の核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖などいかなる本数の鎖で構成されるものであってもよい。
【００１３】
立体構造が未知の核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸は、１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖などいかなる本数の鎖で構成されるものであってもよい。「立体構造が未知の核酸の塩基配列の一部に相補的な塩基配列」とは、前記の通りである。折り畳まれ構造をとっていない核酸は、立体構造が未知の核酸の塩基配列の全部に相補的な塩基配列を含むことが最も好ましい。
【００１４】
標識に用いる物質としては、２本の核酸が形成する塩基対の間にインターカレーションするような化合物、例えば、エチジュウムブロマイド、ヘキスト、ＤＡＰＩ、ＰＩなどを例示することができる。
【００１５】
本発明の方法において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、それらの誘導体のいずれであってもよい。
【００１６】
本明細書において、「折り畳まれ構造」とは、核酸分子が分子内部で塩基対を形成して、安定化した構造をいう。核酸の折り畳まれ構造としては、分子内二重らせん（例えば、ヘアピン構造など）、三重らせん、四重らせん、ハンマーヘッド、ダンベルなどが知られている。
【００１７】
折り畳まれ構造をとっていない核酸（標識又は非標識核酸のいずれでもよい）は、核酸が折り畳まれ構造をとらない条件下で調製する（例えば、核酸の折り畳まれ構造の形成に寄与する金属イオン（例えば、K+、Na+、Mg2+、Ca2+など）が存在しない条件下の蒸留水中で、例えば、約９０℃の温度に、折り畳まれ構造をとっていない核酸を加熱してから、常温にさます）ことにより得られる。
【００１８】
また、折り畳まれ構造をとっていない核酸（標識又は非標識核酸のいずれでもよい）を基板上に固定するには、純水中でスポッティングすればよい。
【００１９】
本発明の方法において、立体構造が未知の核酸は基板上に固定されていてもよい。例えば、立体構造が未知の核酸が規則的に基板上に植え付けた塩基配列の異なる複数の核酸であり、折り畳まれ構造をとっていない核酸がランダム合成した核酸であってもよい。
【００２０】
本明細書において、「ランダム合成した核酸」とは、配列が一定の長さの核酸で、Ａ，Ｔ、Ｇ，Ｃ，若しくは必要とあれば、他の塩基（DNAの場合）又はＡ，Ｕ、Ｇ，Ｃ，若しくは必要とあれば、他の塩基（RNAの場合）をランダムに有するものをいう。
【００２１】
また、本発明において、折り畳まれ構造をとっていない核酸が基板上に固定されていてもよい。
【００２２】
基板は、ガラス、シリコン、プラスチックなどのいかなる材質であってもよく、平板、ビーズなどのいかなる形状であってもよい。例えば、基板として、ＤＮＡチップ用の基板を利用することができる。市販のＤＮＡチップ用の基板には、平板の形状のものとビーズの形状のものがあるが、どちらを利用してもよい。
【００２３】
基板の表面をストレプトアビジンでコートし、核酸（立体構造が未知のものと折り畳まれ構造をとっていないもののどちらでもよい）の5’末端をビオチン化しておけば、基板上に核酸の溶液をスポットすることにより、ビオチンとストレプトアビジンが結合し、核酸はその立体構造を崩すことなく、末端のみが基板上に固定される。なお、本発明において、核酸を基板上に固定する方法は上記の方法に限定されるわけではなく、公知のいかなる方法であってもよい。
【００２４】
本発明の方法において、立体構造が未知の核酸とその核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基配列を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸（標識又は非標識核酸のいずれでもよい）とを基板上でハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションは、核酸の配列と長さに応じて、適宜、適当な温度で適当な時間行うとよい。なお、ハイブリダイゼーションは、核酸が折り畳まれ構造をとらない条件下で行うとよい。核酸が折り畳まれ構造をとらない条件は上記の通りである。例えば、ハイブリダイゼーションを行うときに用いるバッファー中のカチオンとしては、核酸の折り畳まれ構造の形成に寄与する金属イオン（例えば、K+、Na+、Mg2+、Ca2+など）の代わりにベタインを用いるとよい。
【００２５】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーション後に発生したシグナルを測定する。この測定では、シグナルをレーザースキャニングメーター、ＣＣＤカメラ又はシンチレーションカウンターで読み取りし、読み取ったシグナルの強度をコンピュータで数値化するとよい。発生したシグナルを読み取るには、市販のレーザースキャニングメーター（例えば、GenePix4000A(Axon Instruments)、ScanArray5000(GSI Lumonics)など）、ＣＣＤカメラ（例えば、CRBIOIIe(日立ソフトウェアエンジニアリング)など)、シンチレーションカウンター（例えば、LSC-703（アロカ）、LS6500（ベックマン）、2300TR、TRI-CARB 2200CA（パッカード）など）を用いればよい。また、読み取ったシグナル強度を数値化するには、入手可能な解析ソフト（例えば、ScanAlyze(Stanford University)、ArrayAnalyzer(Molecularware)、DNASIS Array(日立ソフトウェアエンジニアリング)など)を用いればよい。
【００２６】
立体構造が未知の核酸が折り畳まれ構造をとっている場合は、その核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸（標識又は非標識核酸のいずれでもよい）とハイブリダイゼーションすることができないため、シグナルは検出されないか、弱いシグナルしか検出されない。しかし、立体構造が未知の核酸が折り畳まれ構造をとっていない場合は、その核酸の塩基配列の一部又は全部に相補的な塩基を含む折り畳まれ構造をとっていない核酸（標識又は非標識核酸のいずれでもよい）とハイブリダイゼーションすることができるため、強いシグナルが検出される。従って、シグナル強度の大きさを指標として、核酸の立体構造を推定する（すなわち、核酸が折り畳まれ構造を取るか否かを決定する）ことができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、短時間で核酸が折り畳まれ構造を取るか否かを決定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施する場合の形態の一例を図面を参照して具体的に説明する。
【００２９】
図1に従来のＤＮＡの機能解析の手法を示す。合成した２種類のＤＮＡ（Ｄｎａ−Ａ及びＤｎａ−Ｂ）を用意する。Ｄｎａ−Ａの配列はＧＣＡＡＡＡＣＧ、Ｄｎａ−Ｂの配列はＧＣＧＡＡＣＧＣの８塩基とすると、Ｄｎａ−Ａは通常の１本鎖ＤＮＡの構造をとるが、Ｄｎａ−Ｂは８塩基のうち３’末端側の３塩基と５’末端側の３塩基が相補鎖になっていることから、イオンが存在する溶媒中では同鎖内でハイブリダイゼーションを行い、結果としてヘアピン構造を有する。そのため、Ｄｎａ−ＡとＤｎａ−Ｂを同条件でアガロースゲルにＴＥバッファー中で電気泳動を行なうと、図１に示すように高次構造をとっているＤＮＡは結果として泳動する距離が短くなる。
【００３０】
この方法で４０００種類のＤＮＡに関しての測定結果を得るためにはサンプル４０００種類を調製して、４０００個の電気泳動を行なわなくてはならず、非常に時間がかかる。
【００３１】
本発明の一実施態様の概要を図２に示す。Ｄｎａ−ＡとＤｎａ−Ｂを合成する際に５’末端をビオチン化したＤＮＡを用意する。ビオチン化したＤＮＡはTrisバッファーに200μMに調整して溶解した後に、DMSOと等量混合した。このときのDMSOは溶液に粘性を持たせることでスライドガラスへのスポット形状を安定させるためであり、特に必須ではない。ストレプトアビジンでコートしたスライドガラス（グライナー製DNAチップ作製スライド“Streptavidin”）を使用しＤＮＡチップ作成用のスポッターでスライドガラスにＤＮＡ溶液をスポットした。ビオチン標識したＤＮＡはストレプトアビジンと結合するために、ＤＮＡはその構造を崩すことなく末端のみがスライドガラスに固定される。スライドガラスに固定されていないＤＮＡは純水で洗浄することで簡単に取り除くことができる。
【００３２】
その後に乾燥した後にランダム合成したＤＮＡの５’末端に蛍光色素であるＣｙ３で標識を行なう。標識済みのＤＮＡ溶液は5xSSCなどの強イオン濃度の溶媒でＤＮＡチップとハイブリダイゼーションを行なう。
【００３３】
スライドガラス上の１本鎖ＤＮＡが折り畳まれ構造を形成していない場合は、すべての配列を含んでいるランダム合成した標識ＤＮＡとハイブリダイゼーションを行えば、レーザースキャンニングメーターやCCDカメラなどのスキャナーにて検出できるが、分子内二重らせん（例えば、ヘアピン構造など）、三重らせん、四重らせん、ハンマーヘッド、ダンベル等の立体構造を取っている場合は相補鎖を含むランダム合成した標識ＤＮＡもハイブリダイゼーションが不可能なため、スキャナーでの検出もできない。
【００３４】
例えば、図２に示したようなＤＮＡチップを作成し、ハイブリダイゼーションを行い、蛍光スキャナーで読み取りを行なった結果を図３に示す。黒のスポットは蛍光シグナルが強いことを示す。白のスポットは蛍光シグナルが弱いことを示す。図３の結果からＤｎａ−Ａは１本鎖ＤＮＡの状態であったことがわかるが、Ｄｎａ−Ｂは折り畳まれ構造を取っていることが読取り結果から推測される。
【００３５】
図４に実際に作成したＤＮＡの配列を示す。５’末端からＴＣＧＣＸＸＸＸＸＸＣＧＣ配列（13mer）（配列番号１）のＤＮＡを合成した。（シグマジェネシス）ビオチン化部分のＴは４塩基の中でもっとも塩基の部分が小さく、立体障害が少ないと考え採用した。ＣＧＣはハイブリ効率を上げるために４塩基の中で結合能の高いＣＧを採用した。
【００３６】
合成したビオチン化ＤＮＡ４０９６種（ＸＸＸＸＸＸの部分による４の６乗）をストレプトアビジンコートスライドガラスにスポットした後に、純水で洗浄し、未反応のビオチン化ＤＮＡを取り除いた。
【００３７】
ランダム合成を含むＧＣＧＮＮＮＮＮＮＧＣＧ（ＮはＡＴＣＧの混合塩基でランダム合成の部分を示す）（配列番号２）の５’末端を蛍光色素であるＣｙ３で標識を施したＤＮＡを３Ｍベタイン溶液に100μＭに調製し、ハイブリダイゼーション溶液とした。
【００３８】
1.5mlの容量をもつエッペンドルフチューブに調製したハイブリダイゼーション溶液を９５℃に設定したブロックインキュベーターに１分程度置いて完全に１本鎖にする。その後ハイブリダイゼーション溶液のうち50μｌを作成したＤＮＡチップに滴下し、カバーグラスを被せ、全体にハイブリダイゼーション溶液が行き渡るような状態にして５分間室温（２５℃）静置する。この際は湿箱の中におくことで、ハイブリダイゼーション溶液が乾燥するのを防ぐことができる。ハイブリダイゼーション完了後は300mlのビーカーに１ｘＳＳＣ溶液を用意し、カバーガラスごとＤＮＡチップを浸し、ＤＮＡチップを静かに上下に揺らすことでカバーグラスをはずす。５分間そのまま静置し、ハイブリダイゼーションしていない標識ＤＮＡを取り除いた。
【００３９】
ＤＮＡチップを自然乾燥した後に蛍光スキャナー（日立ソフト製  ＣＲＢＩＯIIe）で読み取りを行いソフト（日立ソフト製  ＤＮＡＳＩＳ  Ａｒｒａｙ）にて画像解析を行いスポット毎に数値化した。数値化した値をスポットされている部分のＤＮＡ配列と対比させた。数値化した結果を図５に示す。数値は図４の配列表と同じ場所の数値がその配列のハイブリダイゼーションシグナルを表している。
【００４０】
また、スキャナーで読取った結果は相対的なものであるから、人間にとって解釈しやすいように数値の強度ごとに色分けを行った結果を図６に示す。数値が高い（すなわち、シグナル強度が強い）部分は明度が高く、数値が低い（すなわち、シグナル強度が弱い）部分は明度が低い。
【００４１】
図６からＧＧＧ配列が存在すると、ハイブリダイゼーションのシグナル強度が著しく減衰しているのが判明する。この結果はＧＧＧ配列がイオン存在下では４量体を形成しやすいという事実に合致する。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の方法は、核酸の折り畳まれ構造の解析に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】従来のＤＮＡの構造解析を説明する図。
【図２】ＤＮＡチップの製造方法を説明する図。
【図３】ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションシグナルの読み取り結果。
【図４】ビオチン化ＤＮＡ配列一覧表。
【図５】ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションシグナル数値の一覧表。
【図６】ハイブリダイゼーションシグナルの強度毎に明度差をつけた一覧表。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
＜配列番号１＞
配列番号１は、合成したＤＮＡの塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、合成したＤＮＡの塩基配列を示す。
【図１】
2005185135.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005185135.tif 000006
【図６】
2005185135.tif 000007
【配列表】
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