(57)【要約】【課題】  本発明は、葉緑体における植物の障害、特に活性酸素による障害を防御するための方法、及びこのような防御機構を供えた植物体を提供する。【解決手段】  本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入、より詳細には、植物の葉緑体ゲノムに外来のメタロチオネイン遺伝子が導入して当該植物を形質転換することからなる植物に酸化ストレス耐性を付与する方法、外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入するためのベクター、及び外来のメタロチオネイン遺伝子が導入されて形質転換された植物に関する。さらに本発明は、植物由来のメタロチオネインを含有してなる抗酸化剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来のメタロチオネイン遺伝子が導入された形質転換植物。
【請求項２】
外来遺伝子の導入が葉緑体ゲノムである請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項３】
メタロチオネイン遺伝子が、植物由来のものである請求項１又は２に記載の形質転換植物。
【請求項４】
植物由来のメタロチオネイン遺伝子が、野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)由来のＣＬＭＴ２である請求項３に記載の形質転換植物。
【請求項５】
メタロチオネイン遺伝子が、動物由来のものである請求項１又は２に記載の形質転換植物。
【請求項６】
動物由来のメタロチオネイン遺伝子が、ヒト由来のものである請求項５に記載の形質転換植物。
【請求項７】
形質転換される植物が、栽培植物である請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項８】
形質転換植物が、酸化ストレス耐性を有するものである請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
【請求項９】
外来のメタロチオネイン遺伝子を、植物の葉緑体ゲノムに導入するために、外来のメタロチオネイン遺伝子の両側に葉緑体ゲノムと相同組換え可能な塩基配列を有する外来のメタロチオネイン遺伝子導入用のベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の外来のメタロチオネイン遺伝子導入用のベクターを用いて、植物に外来のメタロチオネイン遺伝子を導入する方法。
【請求項１１】
外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入して、当該植物を形質転換することからなる植物に酸化ストレス耐性を付与する方法。
【請求項１２】
外来のメタロチオネイン遺伝子を、植物の葉緑体ゲノムに導入する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
植物由来のメタロチオネインを含有してなる抗酸化剤。
【請求項１４】
植物由来のメタロチオネインが、野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)由来のＣＬＭＴ２である請求項１１に記載の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入、より詳細には、植物の葉緑体ゲノムに外来のメタロチオネイン遺伝子が導入して当該植物を形質転換することからなる植物に酸化ストレス耐性を付与する方法、外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入するためのベクター、及び外来のメタロチオネイン遺伝子が導入されて形質転換された植物に関する。さらに本発明は、植物由来のメタロチオネインを含有してなる抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の生産性は、水分（乾燥）や、温度（高温や低温）や、塩害など、様々な環境要因によって大きく抑制されている。とりわけ植物の光合成は、温度や乾燥に大きく影響されている。低温や高温、また乾燥などの悪環境条件下では、植物は気孔を閉鎖するために、ＣＯ２の供給が抑制され、また光合成の各種の酵素の活性も低下するために、光合成が十分に行えないにもかかわらず、過剰な受光により、活性酸素の生成量が増大し、植物は大きな酸化ストレスに曝されることになる。これらの活性酸素に対して、植物はその体内にスーパーオキシド・ジスムターゼや、アスコルビン酸ペルオキシダーゼなどの活性酸素消去系酵素群や、グルタチオンやアスコルビン酸などの抗酸化物質を備えている。しかしながら、このような悪環境条件が継続する場合には、これらの防御機構により処理しきれないほどの活性酸素が植物体内に発生し、タンパク質・ＤＮＡ・脂質などの生体構成分子を酸化して機能を失わせ、細胞・組織そして植物体に深刻な傷害を与えてしまう。そして、ついには植物自体が枯れることになる。
【０００３】
植物の中には、このような悪条件に備えて各種の防御機能を供えている。例えば、アフリカ・ボツワナ共和国原産の野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)は、一般に乾燥強光ストレスに弱いとされているＣ３型光合成代謝を営むウリ科植物の一種であるが、乾燥した環境の中で生育できる植物である。このような過酷な乾燥・強光・高温ストレスに曝されるカラハリ砂漠に自生している。この野生のスイカは、ストレス下において極めて特殊なアミノ酸代謝制御を行い、葉内にアルギニン生合成経路の中間体である新規適合溶質シトルリンを約３００ｍＭまで高蓄積することができる。このシトルリンは、反応性の高い活性酸素種であるヒドロキシルラジカルを消去する能力に優れている。また、この野生のスイカは、乾燥ストレスに際して他の植物とは異なるシグナル情報伝達を行う。
そこで本発明者らは、この野生スイカの優れた乾燥強光耐性を担う分子機構を明らかにするために、乾燥強光ストレスにより誘導される遺伝子を蛍光ディファレンシャルディスプレー法により解析した。その結果、ＤＲＩＰ−１、ＣＬＭＴ２などの新規な遺伝子が単離された。これらの遺伝子のなかのいくつかのものが、この野生のスイカのユニークなストレス耐性機構に関与しているとものと考えられる。そして、その中の一つＣＬＭＴ２が、他の植物のメタロチオネイン(ＭＴ)と高い配列相同性を示すことが明らかとなった（非特許文献１参照）。
【０００４】
メタロチオネイン(ＭＴ）は、銅やカドミウムなどの重金属を強固に結合することが知られており、生体内での主要な働きはそれらの金属解毒作用であると考えられていた。メタロチオネイン（ＭＴ）は、動物の分野では非常に研究が進んでおり、動物の典型的なＭＴは、６０個のアミノ酸残基の低分子タンパク質で、そのうち３分の１の２０個がシステイン残基であることが知られている。また、メタロチオネインは銅、亜鉛、カドミウムなどの重金属を結合することが知られており、その結合数は、タンパク質１分子あたり銅ならば１１個、亜鉛やカドミウムならば７個と報告されている。また、活性酸素ヒドロキシルラジカルの消去に驚異的に優れていることが報告されており、生理的には、重金属の恒常性維持や解毒作用の他に、酸化ストレス耐性に関与することが報告されている。また、ＭＴは部位特異的に発現したり、条件により発現することから、このプロモーターの利用が研究されている。例えば、ＨＩＶ遺伝子の発現用のプロモーターとしての利用（特許文献１及び２参照）、ターゲッティング遺伝子の発現用のプロモーターとしての利用（特許文献３参照）、トポイソメラーゼ遺伝子の発現用のプロモーターとしての利用（特許文献４参照）、酸素感受性の遺伝子の発現用のプロモーターとしての利用（特許文献５参照）、ヒトのＭＴプロモーター（特許文献６参照）などが報告されている。
【０００５】
また、近年になって、動物ＭＴが活性酸素ヒドロキシル・ラジカルの消去に驚異的に優れていることが明らかになった。ウサギＭＴとヒドロキシル・ラジカルとの２次反応速度定数は３×１０１２ Ｍ−１ｓ−１と報告されており、細胞内の主要な抗酸化物質であるグルタチオンやアスコルビン酸に比べ、１００倍から１，０００倍も優れていることが明らかにされてきた。このことから、動物においてＭＴが酸化ストレスからの防御を担うことが示唆されてきている。メタロチオネイン（ＭＴ）自体を、金属補足剤や抗酸化剤として使用する各種の組成物も報告されている。例えば、重金属の補足のための組成物（特許文献７参照）、抗酸化剤としての使用（特許文献８参照）、ヒスタミンの放出に関連する徴候を低減するための組成物（特許文献９参照）、皮膚外用剤におけるキレート剤としての使用（特許文献１０参照）などが報告されている。
【０００６】
一方、植物のメタロチオネイン（ＭＴ）は、タンパク質の大きさ、システインの含有率などは動物のＭＴに似ているが、両者のＭＴには有意な配列相同性はなくアライメントすることはできない。また、重金属を結合し得ること、ある種のストレスにより誘導されることなども報告されているが、ＭＴ自体の生理的意義が明確にされておらず、ＭＴ自体の利用性については検討されてきていなかったが、例えば、バナナの果実の発育時に発現していること（特許文献１１参照）、重金属を補足するために動物のＭＴを根粒菌に導入したもの（特許文献１２参照）などがあるに過ぎない。
植物のメタロチオネイン（ＭＴ）が、ある種のストレスにより誘導されることから、メタロチオネイン（ＭＴ）のプロモーターを利用してストレス状態における遺伝子の発現については各種の研究が行われてきている。例えば、イネのＭＴプロモーターを利用した方法（特許文献１３参照）、トウモロコシのＭＴプロモーターの利用（特許文献１４及び１５参照）、細胞壁の合成に関与する酵素の遺伝子の発現にＭＴプロモーターを用いるもの（特許文献１６参照）、熱ショック蛋白質の遺伝子の発現にＭＴプロモーターを用いるもの（特許文献１７参照）などが報告されている。
【０００７】
このように植物のＭＴについては、重金属との結合性などが報告されているに留まり、植物のメタロチオネイン分子の生化学的性質、特にラジカルの消去能力などについては、全く報告されていない。植物のＭＴにおいてはこれまで、活性酸素消去系としてのＭＴの生理的意義が報告されたことはなかった。
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５３３１２４号
【特許文献２】特表２００３−５２３７２１号
【特許文献３】特表平１０−５００５７０号
【特許文献４】特表２００１−５０７２４１号
【特許文献５】米国特許明細書第６４６８７８９号
【特許文献６】米国特許明細書第６２１８１７９号
【特許文献７】特開平６−１７９６２６号
【特許文献８】国際公開公報  ＷＯ  ０２／２２５７３号
【特許文献９】特開２００２−３５６４４４号
【特許文献１０】特開２００２−３６３０５８号
【特許文献１１】特表２００１−５１７４４６号
【特許文献１２】特開２００３−３２５１８０号
【特許文献１３】再公表公報  ＷＯ  ０１／０４０４７０号
【特許文献１４】特表２００２−５３３０５７号
【特許文献１５】特表２００２−５４０７５９号
【特許文献１６】米国特許明細書第６１８４４４０号
【特許文献１７】国際公開公報  ＷＯ  ０１／７０９２９号
【非特許文献１】２００３年植物生理学会
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、乾燥や高温や低温などの各種のストレスから植物を防御するするための障害からの回避機構を有するストレス耐性が強化された形質転換植物、及びそのための方法を提供するものである。植物細胞において活性酸素の発生が最も著しく、従って最も傷害を受けやすいと考えられている部位は葉緑体であることから、本発明は、葉緑体における植物の障害、特に活性酸素による障害を防御するための方法、及びこのような防御機構を供えた植物体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、植物のＭＴ、特に野生スイカの誘導型ＭＴが、乾燥強光ストレス下において (１)活性酸素ヒドロキシル・ラジカルの直接的な消去、あるいは(２)遊離状態の遷移金属を隔離することによるヒドロキシル・ラジカルの発生抑制、といった作用を有することを見出し、さらに植物細胞において活性酸素の発生が最も著しく、従って最も傷害を受けやすいと考えられている部位は葉緑体である。そこで、ＭＴの遺伝子を葉緑体ゲノムに導入し、ＭＴタンパク質を葉緑体内に過剰に蓄積させた形質転換植物を作成することにより、乾燥強光などの悪環境に対して耐性を獲得する植物を製造することができることを見出した。
【００１１】
本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子が導入された形質転換植物、より詳細には、植物の葉緑体ゲノムに外来のメタロチオネイン遺伝子が導入された形質転換植物に関する。
また、本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子を、植物の葉緑体ゲノムに導入するために、外来のメタロチオネイン遺伝子の両側に葉緑体ゲノムと相同組換え可能な塩基配列を有する外来のメタロチオネイン遺伝子導入用のベクターに関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の外来のメタロチオネイン遺伝子導入用のベクターを用いて、植物に外来のメタロチオネイン遺伝子を導入する方法に関する。
また、本発明は、植物由来のメタロチオネインを含有してなる抗酸化剤、より詳細には、植物由来のメタロチオネインが、野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)由来のＣＬＭＴ２である抗酸化剤に関する。
また、本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子を植物に導入、より詳細には、植物の葉緑体ゲノムに外来のメタロチオネイン遺伝子が導入して当該植物を形質転換することからなる植物に酸化ストレス耐性を付与する方法に関する。
【００１２】
本発明者らは、アフリカ・ボツワナ共和国原産の野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)に着目した。このスイカは、一般に乾燥強光ストレスに弱いとされているＣ３型光合成代謝を営むウリ科植物の一種であるが、乾燥した環境の中で生育できる植物である。そして、このスイカの乾燥強光ストレスにより誘導される遺伝子を蛍光ディファレンシャルディスプレー法により解析した結果、ＤＲＩＰ−１、ＣＬＭＴ２などの新規な遺伝子が単離された。この中のＣＬＭＴ２が他の植物のメタロチオネイン(ＭＴ)と高い配列相同性を示していた。ＣＬＭＴ２は、７７個のアミノ酸からなる蛋白質であり、そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。そのｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列番号２に示す。ＣＬＭＴ２は７７個のアミノ酸のうちシステインを１４個有している。動物のＭＴのように３０％以上がシステインというわけではないが、比較的システイン含有量が多くなっている。得られたＣＬＭＴ２のアミノ酸配列を他の植物と比較した表を図１に示す。図１の１段目は本発明のＣＬＭＴ２を示し、２段目は大豆のＭＴ２（アミノ酸数７９）を示し、３段目はアイスプラント（マツバギク）のＭＴ２（アミノ酸数８０）を示し、４段目はシロウヌナズナのＭＴ２ａ（アミノ酸数８１）を示し、５段目はシロウヌナズナのＭＴ１ａ（アミノ酸数４９）をそれぞれ示す。これらは全体的に相同性が見られるが、とりわけシステインの位置が高い相同性を示している。
【００１３】
近年になって、動物のメタロチオネイン(ＭＴ)が活性酸素ヒドロキシル・ラジカルの消去に優れていることが報告されてきたことから、植物のＭＴ、特にこの野生スイカのＣＬＭＴ２が、乾燥強光ストレス下において (１)活性酸素ヒドロキシル・ラジカルの直接的な消去、あるいは(２)遊離状態の遷移金属を隔離することによるヒドロキシル・ラジカルの発生抑制という作用を有するのではないかと本発明者らは考えた。
そこで、当該ＣＬＭＴ２蛋白質の性質について詳細に検討した。
【００１４】
まず最初に、野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)から得られたＣＬＭＴ２の遺伝子を用いてＣＬＭＴ２の組換えタンパク質を製造した。ベクターとしてはＧＳＴ融合タンパク質発現用ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−３を用い、これにＣＬＭＴ２のｃＤＮＡを組み込み、大腸菌ＢＬ２１に導入して発現させた。発現した融合タンパク質をトロンビン切断処理により精製ＣＬＭＴ２を得た。
この精製タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより解析したところ、ＣＬＭＴ２組換えタンパク質と思われる単一のバンドを確認することができた。しかし、予測される分子量７．９ｋＤａよりも大きい約１４ｋＤａの位置にバンドが現れたので、このバンドがＣＬＭＴ２であることを確認するために、質量分析により分子量が７．９ｋＤａであることを確認した。これまでの報告でも、動物のメタロチオネインはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて異常な移動度を示すことが報告されており、本発明のＣＬＭＴ２も同様に異常な移動度を示したものと考えられる。
【００１５】
得られた組換えＣＬＭＴ２タンパク質について、まず金属イオン結合能について検討した。無酸素状態で、精製した組換えＣＬＭＴ２タンパク質にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて結合している亜鉛を解離させ、遊離のＭＴ（アポ・メタロチオネイン）とした。これを中性条件で、銅、亜鉛、鉄などの種々の重金属溶液を、最終濃度がメタロチオネインの２０倍となるように加えた。この溶液をゲルろ過カラムに通して過剰の金属イオンを除き、金属結合型のメタロチオネインを得た。そして、これらに結合している金属を、ＩＣＰ発光分光元素分析装置により定量した。その結果、１分子のメタロチオネインあたり、銅の場合は約５個、亜鉛や鉄の場合は約３個を結合し得るということが明らかとなった。
【００１６】
次に、組換えＣＬＭＴ２タンパク質による活性酸素ヒドロキシル・ラジカルの消去活性を、サリチル酸をモニター試薬とした競争トラッピングアッセイ（competitive trapping assay）により検討した。この実験系の原理は、ヒドロキシルラジカルによるサリチル酸の酸化を、添加した抗酸化物質がどの程度抑制するのかを測定することによって、抗酸化物質のスカベンジャー能力を評価するものでる。ここでは、亜鉛結合型のＣＬＭＴ２を用いた場合の抗酸化能を検討した。比較としてヒドロキシル・ラジカルの消去に優れている野生スイカの適合溶質シトルリンを用いた。数μＭの低い濃度のシトルリンでは、５０μＭのサリチル酸を効果的に抑制することができなかったが、これに対して、本発明のＣＬＭＴ２の場合はこの低濃度において５０μＭのサリチル酸の酸化が大きく低下した。すなわちヒドロキシルラジカルを消去する活性が非常に高いということが示された。
【００１７】
この抗酸化活性を定量的に考察するために、ＣＬＭＴ２とヒドロキシルラジカルとの２次反応速度定数を求めた。その結果、ＣＬＭＴ２とヒドロキシルラジカルとの２次反応速度定数は、２．１×１０１１Ｍ−１ｓ−１という高い値が示された。この実験に用いた組換えＣＬＭＴ２タンパク質のＳＨ基の還元率を、エルマン法により定量したところ、７５％にとどまっていた。すなわち測定前に既に２５％程度が酸化されていた。
しかし、この値は、スイカの適合溶質シトルリンに比べると、５０倍も大きな値であるが、動物ＭＴで報告されている値に比べると、約１０分の１程度であるに過ぎなかった。この理由としては、動物のＭＴのシステイン残基数が２０個以上であるのに対して、スイカのＣＬＭＴ２の場合は１４個と少なく、従って消去活性が相対的に弱くなっているという可能性が考えられる。
完全な還元型のＣＬＭＴ２を調製し、より正確な２次反応速度定数を算出することも必要があるが、この実験により本発明のＣＬＭＴ２も動物のＭＴと同様に弱いながらも抗酸化作用があることがわかった。
【００１８】
以上の組換えＣＬＭＴ２タンパク質の生化学的解析から、本発明の乾燥誘導型ＣＬＭＴ２の野生スイカにおける生理的役割としては、第一に、遊離状態にある銅イオンなどの遷移金属を結合して隔離し、フェントン反応を抑制してヒドロキシルラジカルの生成を防ぐ役割、また第二として、実際に生じてしまったヒドロキシル・ラジカルを直接的に消去する役割を、植物の生体内で担っていると考えられる。これらにより、野生スイカの乾燥強光耐性に貢献していると考えられる。
【００１９】
ところで、これまでに知られている植物のＭＴは全て核ゲノムにコードされており、生合成されたタンパク質は細胞質に蓄積すると考えられている。しかしながら、植物細胞において活性酸素の発生が最も著しく、従って最も傷害を受けやすいと考えられている部位は葉緑体である。そこで、ＭＴの遺伝子を葉緑体ゲノムに導入し、ＭＴタンパク質を葉緑体内に過剰に蓄積させた形質転換植物を新規に作成すれば、乾燥強光などの悪環境に対して耐性を獲得するのではないかと考えられる。
そこで本発明者らは、ＭＴ遺伝子の例として、野生スイカのＣＬＭＴ２遺伝子と、ヒトＭＴ遺伝子の２種を選択し、これらの遺伝子を植物体の例としてタバコ葉緑体ゲノムに導入することで葉緑体内にＭＴタンパク質を過剰に蓄積させ、乾燥強光ストレスに対する耐性を評価することとした。野生スイカのＣＬＭＴ２と動物ＭＴでは、システインの数や位置は全く異なっているために生化学的性質が異なることが予想され、これらのＭＴを植物体に導入することで、表現型、および各種ストレスへの耐性に差が見られるかどうかを検討した。
【００２０】
そこで、以下の実施例に記載した手法により、ＣＬＭＴ２およびヒトＭＴ遺伝子を葉緑体ゲノムに導入したタバコを製造した。導入するＣＬＭＴ２遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示し、ヒトＭＴ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号３に示す。
ＣＬＭＴ２およびヒトＭＴ遺伝子を導入した葉緑体導入タバコを作製するために、葉緑体ゲノム導入用ベクターｐＬＤ２００−ＣＬＭＴ２とｐＬＤ２００−ヒトＭＴを構築した（図２及び図３参照）。図２は本発明のベクターｐＬＤ２００−ＭＴの構築を模式的に示したものである。図２の上の段は、ＣＬＭＴ２およびヒトＭＴ遺伝子を含有するクローンをそれぞれ示しており、中段の中間ベクターｐＬＤ５はこれらの遺伝子をそれぞれ組み込む模様を示している。下段は、前記の中間ベクターｐＬＤ５から誘導されるコントラクトを本発明のベクターｐＬＤ２００−ＭＴに組み込む模様を示している。図３は、得られた葉緑体ゲノム導入用ベクターｐＬＤ２００−ＣＬＭＴ２とｐＬＤ２００−ヒトＭＴにおける導入部分を拡大して示したものである。図３の上段は野生型スイカのＭＴ（ＣＬＭＴ２）の遺伝子を組み込んだ葉緑体ゲノム導入ベクターの部分を示し、下段はヒトＭＴの遺伝子を組み込んだ葉緑体ゲノム導入ベクターの部分を示す。これらのベクターを導入することにより葉緑体にて発現するＭＴのアミノ酸配列を、図３にそれぞれ示している。
これらのベクターのインサート領域には、ｒｒｎ遺伝子プロモーター、ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子ａａｄＡ、さらにｐｓｂＡ転写終結配列からなる植物選抜用ａａｄＡのスペクチノマイシン耐性カセットと、ｐｓｂＡ遺伝子プロモーター（ＰｓｂＡ−Ｐ）、翻訳促進配列ＳＤ、さらにｒｐｓ１６転写終結配列からなる外来遺伝子発現用カセットの２種の遺伝子を含んでおり、これらの外側に、葉緑体ゲノムとの相同組換えに必要な、タバコのｒｂｃＬ遺伝子のコード領域であるｒｂｃＬ、およびタバコのＯＲＦ５１２遺伝子のコード領域ＯＲＦ５１２配列を含んでいる。
【００２１】
これらのベクターＤＮＡを用いてパーティクルガンによりタバコ葉緑体へＭＴ遺伝子導入を行い、再生した植物体からＤＮＡを抽出し、ｐＬＤ２００用プライマーを用いたＰＣＲによりＭＴ遺伝子導入の確認を行った。ＭＴ遺伝子が導入されていると、ＭＴ遺伝子とベクターの導入される部分のサイズ分（約２ｋｂｐ）だけＰＣＲ産物が大きくなると考えられる。ＰＣＲの結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４のレーンＡ〜Ｃは組み換え体ｐＬＤ２００−ＣＬＭＴ２−１、２、及び３の場合を示し、レーンＰ１はベクターｐＬＤ２００−ＣＬＭＴ２を用いた陽性コントロールを示し、レーン１〜３は組換え体ｐＬＤ２００−ヒトＭＴ−１、２、及び３の場合を示し、レーンＰ２はベクターｐＬＤ２００−ヒトＭＴを用いた陽性コントロールを示し、レーンＷはタバコの野生型の場合をそれぞれ示す。この結果、ＣＬＭＴ２とヒトＭＴ遺伝子葉緑体導入タバコでそれぞれ３系統に遺伝子の導入が確認できた。
【００２２】
得られた形質転換植物の酸化ストレス耐性を検討した。酸化ストレス耐性試験には、パラコートを用いた。パラコートは、太陽光下の植物に対して強力な殺草効果を示す有名な除草剤である。パラコートは、植物の葉に散布されると体内に侵入して葉緑体に達し、太陽光下で光化学系Ｉの還元側から電子１個を受け取り、自らはパラコートフリーラジカルに還元される。このフリーラジカルは、酸素分子によって酸化を受けてパラコート自身に戻ると同時に、酸素分子は１電子還元されてスーパーオキシド・ラジカルとなる。このスーパーオキシド・ラジカルに起因するヒドロキシル・ラジカルなど、種々の活性酸素が生体内分子を攻撃して葉は短時間で変色して枯死に至る。
そこで、ＣＬＭＴ２とヒトＭＴ遺伝子を導入した形質転換タバコの葉を用いて、パラコートストレスへの耐性を解析した。野生型、ＣＬＭＴ２遺伝子を導入した形質転換タバコ、及びヒトＭＴ遺伝子を導入した形質転換タバコのそれぞれの葉に、０．２μＭのパラコートを暴露した。この結果を図５に図面に代わるカラー写真で示す。図５の左側は野生型の場合を示し、中側はＣＬＭＴ２遺伝子を導入した形質転換体の場合を示し、右側はヒトＭＴ遺伝子を導入した形質転換体の場合を示す。この結果、形質転換していないタバコは葉が褐色に変色して枯死したのに対し、形質転換タバコの葉はパラコートの影響をあまり受けなかった（図５参照）。また、形質転換タバコの中でも、ヒトＭＴの方がより葉の緑色が鮮やかだった。
【００２３】
このことから、ＭＴ遺伝子導入タバコの表現型に関して、以下の２つのメカニズムが考えられる。すなわち（１）パラコートにより生成されたスーパーオキシド・ラジカルあるいはそれに由来するヒドロキシルラジカルを、葉緑体に過剰蓄積させたＭＴが消去した、または（２）スーパーオキシド・ラジカルに由来する過酸化水素からヒドロキシルラジカルへの変換を触媒する遷移金属を、葉緑体に過剰蓄積させたＭＴが隔離し、結果としてヒドロキシルラジカルの産生量が減少したこと、が示唆された。これらの理由でＭＴ導入植物では活性酸素による被害が少なく、葉の緑色が保たれたと考えられる。
以上の結果から、ＭＴ遺伝子を植物の葉緑体ゲノムに導入し、ＭＴを過剰に発現させることによって、植物に顕著な酸化ストレス耐性を付与し得ることが示された。このＭＴ葉緑体蓄積植物は、悪環境地における食料増産・環境保全に寄与すると期待される。
【００２４】
本発明の外来のメタロチオネイン遺伝子としては、形質転換される植物以外のメタロチオネイン遺伝子であって、抗酸化作用を有するメタロチオネインをコードする遺伝子であれば動物由来であっても、植物由来のものであっても、また酵母、カビなどの微生物由来のものであってもよく、形質転換される植物において発現可能なものであればよい。
例えば、前記してきた野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)由来のＣＬＭＴ２、大豆由来のＭＴ２、藻類からのＭＴ２、シロイヌナズナ由来の各種のＭＴ、酵母由来のＭＴ、ニジマス、サル、ヒトなどの動物由来のＭＴなど各種の生物由来のＭＴなどが挙げられる。また、これらのメタロチオネインは、抗酸化作用を有する範囲において、全長の５０％以下、好ましくは３０％以下、２０％以下、１０％以下程度のアミノ酸基を欠失してもよく、また他のアミノ酸に置換してもよく、さらに他のアミノ酸が付加していてもよく、これらの改変が組み合わされて改変されたものであってもよい。さらに、抗酸化作用有する範囲において、メタロチオネインのアミノ酸配列がｎ個（ｎは２以上の整数）連結したポリメタロチオネインをコードする遺伝子（例えば、特開２０００−６０５６１号公報参照）を外来のメタロチオネイン遺伝子として使用することもできる。
【００２５】
本発明の植物としては、特に制限はないが、産業上の利用価値から栽培植物であることが好ましい。前記してきた例ではタバコを用いてきたが、これに限定されるものではなく、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、アワ、ヒエなどの穀物植物、ネギ、キュウリ、メロン、カボチャ、スイカ、ダイコン、ワサビ、キャベツ、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、ナス、ジャガイモ、トマト、シュンギク、ヒマワリ、レタス、サトウキビ、などの野菜や果物類などの植物、ユリ、チューリップ、カーネーションなどの観賞用植物、また、スギ科、マツ科、ヒノキ科などの森林植物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明のおける遺伝子の導入方法としては、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムを用いた方法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、シリコンカーバイド法などの公知の導入方法を適用することも可能であるが、好ましい導入方法としては、パーティクルガン法が挙げられる。遺伝子の導入の対象としては、種子、細胞、カルスなど植物に応じて適宜選択することができる。
遺伝子の導入に際して、構築される本発明のベクターとしては、プロモーター、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）などの導入した遺伝子の発現に必要な配列を有すると共に、形質転換体をスクリーニングするためのスペクチノマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を含有するのが好ましい。また、本発明の方法により導入される遺伝子は植物の葉緑体ゲノムであることが好ましく、葉緑体ゲノムに導入するための相同組換え用の配列を導入される遺伝子の両末端に有するものが好ましい。このような相同組換え用の遺伝子の配列としては、遺伝子を導入する植物の葉緑体ゲノムに存在する遺伝子の配列であれば特に制限はなく、例えば、タバコの例ではＯＲＦ５１２遺伝子、ｒｂｃＬ遺伝子などが挙げられる。
【００２７】
本発明の方法により形質転換された植物において、遺伝子の導入を確認する方法としては、例えば、前記してきたＰＣＲ法に限定されるものではなく、例えば、サザンハイブリダイゼーション法、ウエスタンブロット法などの公知の方法により行うことができる。
遺伝子が導入された本発明の形質転換植物は、通常の方法により発育させることができるが、形質転換植物の組織、例えば、葉や根を用い植物体を分化、再生するしてもよい。
【００２８】
本発明の方法により得られる形質転換植物は、酸化ストレス耐性を有するものであり、とりわけ葉緑体において、乾燥、高温、低温などの悪環境下における酸化ストレスが強化された植物である。このような植物は、野生型の植物では生育できないような悪環境下であっても、生育可能であり、季節や水分の変動に対して耐性を有することになる。また、パラコートのような農薬耐性を付与することも可能となる。
【００２９】
本発明は、植物由来のメタロチオネインを含有してなる抗酸化剤を提供するものである。本発明は、植物由来のメタロチオネインが抗酸化作用を有していることを初めて見出したものであり、動物由来のメタロチオネインと同様に、抗酸化剤として使用することができる。本発明の抗酸化剤は、植物由来であるために、動物由来のタンパク質を含有しておらず、極めて安全なものであり、医薬、化粧料、食品添加剤として広く使用することが可能である。本発明の抗酸化剤としてのメタロチオネインとしては、植物由来のものであれば特に制限はないが、一般に食糧として使用されている植物由来のものが安全性の点から好ましい。例えば、野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)由来のＣＬＭＴ２、大豆由来のＭＴ２、イネ由来のＭＴなどが挙げられる。
本発明の抗酸化剤は、メタロチオネインを単独で使用することもできるが、製薬上許容される医薬用の担体、化粧料用の担体、食品添加物用の担体などの各種の用途に応じた担体と混合して使用するのが好ましい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明は、ストレス耐性の強い野生スイカ(Citrullus lanatus sp.)に着目して、その原因を究明し、従来その生化学的性質が十分に解明されていなかった、植物由来のメタロチオネインの性質を解明し、これを応用するものである。即ち、本発明は、植物由来のメタロチオネインが抗酸化作用を有し、このために強いストレス耐性を植物に与えているという知見に基づいて、植物由来のメタロチオネインからなる抗酸化剤を提供するものである。本発明の抗酸化剤は、植物由来であり、安全性の高いものであるばかりでなく、強い抗酸化作用を有する。また、本発明は、外来のメタロチオネイン遺伝子が導入されてストレス耐性が強化された形質転換植物を提供するものである。本発明の形質転換植物は、特に酸化ストレスが強化されたものであり、乾燥、高温、低温などの悪環境下での生育も可能であるばかりでなく、酸化作用による農薬に対する耐性が付与された植物とすることも可能である。
【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
葉緑体ゲノム導入用コンストラクトの構築
野生スイカのｍＲＮＡディファレンシャル・ディスプレイ解析により単離されたＣＬＭＴ２遺伝子が、pBluescriptII SK-プラスミドベクターのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素サイト間にクローニングされたプラスミド（ＣＬＭＴ２−３−２）と、ゲノムプロジェクトにより得られたヒトメトタチオネイン遺伝子が、同じくpBluescriptII SK-プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ制限酵素サイト間にクローニングされたヒトメトタチオネイン遺伝子を含有するｈｌｆ０４４９６プラスミドを鋳型に用い、以下の合成プライマーを用いてＰＣＲ法によりメタロチオネイン遺伝子を増幅させた。
【００３３】
ＣＬＭＴ２遺伝子用のプライマー
CLMT-ss1           5’-CAAGATCTATGTCGTGCTGTGGTGGAAAC-3’
CLMT-ss2           5’-AGCGAATTCTCATTTACAGTTGCATGGATC-3’
ヒトメトタチオネイン遺伝子用のプライマー
HsMT-ss1           5’-CAGAGATCTATGGATCCCAACTGCTCCTG-3’
HsMT-ss2           5’-CCCGAATTCAGGCGCAGCAGCTGCAC-3’
【００３４】
上流プライマーであるＣＬＭＴ−ｓｓ１とＨｓＭＴ−ｓｓ１は、それぞれ開始Metコドンより−８番目から＋２１番目、−９番目から＋２０番目の塩基配列に相当し、BglII制限酵素サイト(下線部)を含む。下流プライマーであるＣＬＭＴ−ｓｓ２とＨｓＭＴ−ｓｓ２は、それぞれ開始コドンより＋２１４番目から＋２４４番目、＋１６８番目から＋１９４番目の塩基配列に相当し、ストップコドンとＥｃｏＲＩの認識配列(下線部)を含む。
次に、増幅したメタロチオネイン遺伝子ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で精製した後、葉緑体ゲノム導入中間ベクターｐＬＤ５のＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素サイト間に連結させた（図２参照）。
葉緑体ゲノム導入中間ベクターｐＬＤ５は、プラスミドベクターpBluescriptIIのＮｏｔＩとＳａｌＩ制限酵素サイト間に、植物選抜用薬剤耐性マーカー遺伝子ａａｄＡの転写ユニットであるｒｒｎ−Ｐ−ａａｄＡ−ｐｓｂＡ−Ｔ断片と、外来導入遺伝子の転写ユニットであるｐｓｂＡ−Ｐ−ＳＤ−ｒｐｓ１６Ｔ断片の両者を含むものである。連結したベクターＤＮＡは、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５αに導入し、選抜薬剤アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩、３７℃で培養した。生じたそれぞれのコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素処理下後、ｐＬＤ５用プライマー
【００３５】
pLD5-Fwd              5’-TTGAATAACAAGCCTTCCAT-3’
pLD5-Rev              5’-TATATACAAATGACTACCCC-3’
【００３６】
を用いたシーケンスによりｐＬＤ５−ＣＬＭＴ２とｐＬＤ５−ヒトＭＴのサブクローニングを確認した。
さらに、作製した中間ベクターＤＮＡをＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で切断し、そのインサートＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した後、葉緑体ゲノム導入ベクターｐＬＤ２００のＮｏｔＩ−ＳａｌＩ制限酵素サイト間に連結させた（図２参照）。ｐＬＤ２００ベクターは、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ制限酵素サイト間に、タバコ葉緑体ゲノム上のｒｂｃＬ遺伝子断片１，７５５ｂｐと、ＯＲＦ５１２遺伝子断片１，１８２ｂｐをサブクローニングし、さらにそれら両遺伝子間にサブクローニング用にＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ−ＮｈｅＩ−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩマルチクローニングサイトを導入したものである。連結させたＤＮＡは、エレクトロポレーションにより大腸菌ＤＨ５αに導入し、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩、３７℃で培養した。生じたコロニーからプラスミドを抽出し、制限酵素処理によりサブクローニングを確認し、これを葉緑体ゲノム導入用ＤＮＡとして用いた。
【実施例２】
【００３７】
ＣＬＭＴ２およびヒトＭＴ遺伝子を葉緑体に導入したタバコの製造
タバコ(cv. Xanthi)の葉を表向きにして、０．１ｍｇ／ｌのナフタレン酢酸（napthalene acetic acid (NAA)）と１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（benzyl amino purine (BAP)）を含むＭＳ寒天培地に置き、一晩前培養した。パーティクルガン(PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System, BIO-RAD)に用いる金粒子は、１．０ミクロン径の金粒子６０ｍｇを１ｍｌの１００％エタノールで２分間攪拌し、８，０００ｇで１分間の遠心分離によりエタノールを取り除いた。この滅菌操作を３回繰り返し、最後にクリーンベンチ内で１ｍｌの滅菌水に懸濁し、１００μｌ(１ shot分)ずつ分注して４℃で保存した。この金粒子を８，０００ｇで３分間の遠心分離により滅菌水を取り除き、滅菌水２３０μｌを加えてボルテックスした。２．５ＭのＣａＣｌ２を２５０μｌ加えてボルテックスし、これに前記実施例１で構築した１μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡをそれぞれ２５μlずつ加えてボルテックスし、さらに０．１Ｍのスペルミジン（spermidine）を５０μｌ加えてボルテックスし、氷上で１０分間静置(１分ごとに１０秒間ボルテックスを行う)した。８，０００ｇで１分間遠心分離を行って上清を取り除き、６００μｌの１００％エタノールを加えてボルテックスで洗浄し、８，０００ｇで１分間の遠心分離によりエタノールを取り除いた。この操作を２回繰り返し、最後に６０μｌの１００％エタノールに懸濁し、５．４μｌずつ９００psiの圧力でＤＮＡ断片を前培養したタバコ葉に打ち込んだ。打ち込み後、暗所で２日間培養した。このタバコ葉を５ｍｍ角に切り刻み、裏向けにＭＳ寒天培地（スペクチノマイシン（Ｓｐｅ）５００ｍｇ／ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｌ、ＢＡＰ１ｍｇ／ｌ含む）に置き、培養した。約１ヶ月でシュートが出てくるので、ＭＳ寒天培地（Ｓｐｅ含む）に移植した。導入が確認された形質転換タバコは、タバコ葉を５ｍｍ角に切り刻み、裏向けにＭＳ寒天培地（Ｓｐｅ、ＮＡＡ、ＢＡＰ含む）に置き再分化を繰り返し行い、葉緑体ゲノムにおける遺伝子置換の割合を高めた。その後、土への順化を行い、最終的に種子を獲得した。
【実施例３】
【００３８】
ＭＴ遺伝子導入の確認
前記の実施例２で育成したタバコの葉１００ｍｇに１００μｌのＤＮＡ抽出バッファー（０．３Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Tris-HCl ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、３０％(w/v) 尿素、５％フェノール）を加えてペレットミキサーで葉の形がなくなるまで磨り潰し、さらに４００μｌのＤＮＡ抽出バッファーを加えてボルテックスした。５００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(２５：２４：１)を加えてボルテックスし、５分間転倒混和した。１５，０００ｇで５分間の遠心分離を行い、上清(５００μｌ)を回収し、１００％エタノールを１ｍｌ加えて転倒混和、１分間静置した。１２，０００ｇで５分間の遠心分離を行い、沈殿を９００μｌの７０％エタノールで洗浄した。１２，０００ｇで５分間の遠心分離を行い、上静を取り除き、沈殿をＤＮＡ Speed Vac.で５分間乾燥し、これをゲノムＤＮＡとした。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ｐＬＤ２００用プライマー
【００３９】
pLD200-Fwd            5’-GGATTGAGCCGAATACAAC-3’
pLD200-Rev            5’-CAACACGGAACAAAGGGGAC-3’
【００４０】
を用いたＰＣＲによりＭＴ遺伝子導入の確認を行った。
結果を図４に示す。
【実施例４】
【００４１】
パラコート暴露による酸化ストレス耐性の解析
ＣＬＭＴ２およびヒトＭＴ遺伝子葉緑体導入タバコ、さらにコントロールとして形質転換していないタバコ(cv. Xanthi)を土に順化後、自然日長条件(温室)、２８℃、湿度４０％で６０日間生育させ、上から４枚目の葉からリーフディスクを採取した。リーフディスクを０．１％ツウィーン２０を含む０．２μＭパラコート溶液に浸し、５分間減圧を行い、減圧解除後、明期１６時間、暗期８時間の日長条件、４０μmol photons ｍ−２ｓ−１、２５℃で４日間培養した。培養後の視覚的変化を記録した。
結果を図５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、ストレス耐性、特に酸化ストレスが強化された形質転換植物を提供するものであり、本発明の方法による形質転換植物は、栽培植物のみならず、各種の有用な植物に適用することができ、食糧用の植物、鑑賞用の植物、材料用の植物などの産業上有用な形質転換植物を提供するものである。また、本発明の抗酸化剤は、安全性の高い抗酸化剤として医薬、化粧品、食品添加剤などの有効成分として産業上極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明のＣＬＭＴ２と他の植物由来のメタロチオネインのアミノ酸配列の相同性を比較したものである。
【図２】図２は、本発明の遺伝子導入用ベクターの構築を例示するものである。
【図３】図３は、本発明の遺伝子導入用ベクターにおける導入される部分の遺伝子の配列を例示するものである。各構造の下にメタロチオネイン遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示している。
【図４】図４は、ＰＣＲ法により本発明の形質転換植物に目的の遺伝子が導入されていることを確認した結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】図５は、メタロチオネイン遺伝子を導入したタバコにおける、パラコートによる酸化ストレス耐性を試験した結果を示す図面に代わるカラー写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１  ：  本発明のＣＬＭＴ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号２  ：  本発明のＣＬＭＴ２遺伝子の翻訳領域の塩基配列を示す。
配列番号３  ：  ヒトメタロチオネイン遺伝子の翻訳領域の塩基配列を示す。
【図１】
2005185123.tif 000002
【図２】
2005185123.tif 000003
【図３】
2005185123.tif 000004
【図４】
2005185123.tif 000005
【図５】
2005185123.tif 000006
【配列表】
2005185123000001.app