(57)【要約】      （修正有）【課題】触媒等に応用するに十分な性質を具備するアミノペプチダーゼを提供する。【解決手段】至適反応ｐＨ７．５〜１０．５、Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ、Ｌ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｌ−Ａｌａ−ｐＮＡ及びＬ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに対する加水分解活性、至適反応温度約７５℃、５０％熱不活性化温度約７８℃の熱安定性、カルシウムイオンにより、触媒活性に実質的に影響なしの性質を示すアミノペプチダーゼ、ストレプトマイセス由来の特定の塩基配列又はその変異体核酸、組換えアミノペプチダーゼ、その製造方法、その発現用担体、該核酸を保持した形質転換細胞、該核酸を検出するためのプローブ、該核酸若しくはその一部を増幅するためのプライマー対、該プローブ及び／又は該プライマー対を用いるアミノペプチダーゼの検索方法、並びに該アミノペプチダーゼ又は該組換えアミノペプチダーゼに対する抗体又はその断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記性質：
（１）至適反応ｐＨ：
ｐＨ７．５〜１０．５
（２）基質特異性：
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド及びＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに対して加水分解活性を示す、
（３）至適反応温度：
約７５℃、
（４）熱安定性：
５０％熱不活性化温度として、約７８℃
（５）カルシウムイオンによる触媒活性の影響が実質的にない、
を有するアミノペプチダーゼ。
【請求項２】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９５）により産生されるものである、請求項１記載のアミノペプチダーゼ。
【請求項３】
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すものである、アミノペプチダーゼをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３記載の核酸を含有してなる、アミノペプチダーゼの発現用担体。
【請求項５】
請求項３記載の核酸を保持してなる形質転換細胞。
【請求項６】
１）請求項５記載の形質転換細胞を培養して、培養物を得る工程、及び
２）前記工程１）で得られた培養物からアミノペプチダーゼを回収する工程、
を含む、組換えアミノペプチダーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項３記載の核酸によりコードされる組換えアミノペプチダーゼ。
【請求項８】
（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、又は
（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、
を含有してなる、請求項３記載の核酸を検出するためのプローブ。
【請求項９】
Ａ．  （Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列、又は
（ＩＩ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（Ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列、
を含有したオリゴヌクレオチドと、
Ｂ．  配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中、前記Aのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド残基離れたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列に対する実質的に相補的な配列を含有したオリゴヌクレオチドと
からなる、請求項３記載の核酸若しくはその一部を増幅するためのプライマー対。
【請求項１０】
請求項８記載のプローブを用いたハイブリダイゼーション及び／又は請求項９記載のプライマー対を用いたＰＣＲにより、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列中の該プローブに対応する領域及び／又は該プライマー対を用いて得られたＰＣＲ増幅産物に対応する領域を検出し、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すアミノペプチダーゼをスクリーニングすることを特徴とする、アミノペプチダーゼの検索方法。
【請求項１１】
請求項１若しくは２記載のアミノペプチダーゼ又は請求項４若しくは５記載の組換えアミノペプチダーゼに対する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノペプチダーゼに関する。さらに詳しくは、本発明は、単離されたアミノペプチダーゼ、該アミノペプチダーゼをコードする核酸、該核酸を含有した発現ベクター、該核酸を保持した形質転換体、組換えアミノペプチダーゼ、該アミノペプチダーゼに対する抗体、該核酸を検出するためのプローブ及び該核酸を増幅するプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノペプチダーゼは、ペプチド又はタンパク質基質のＮ末端からのアミノ酸残基の加水分解を触媒する。
【０００３】
前記アミノペプチダーゼは、調味料の製造時の反応の触媒〔特許文献１〜３を参照のこと〕、タンパク質の配列決定における分子ツール、エンドペプチダーゼのｔｗｏ−ｓｔａｇｅアッセイにおける添加剤〔非特許文献１を参照のこと〕、組換えタンパク質及び融合産物のプロセシングにおけるキュアリング試薬〔非特許文献２を参照のこと〕、光学活性アミノ酸製造〔非特許文献３を参照のこと〕として用いられている。
【０００４】
しかしながら、従来用いられているアミノペプチダーゼは、安定性、反応性、補因子の要求性、基質特異性等の点から、使用条件が限定される場合があるという欠点がある。
【特許文献１】特開２００２−３５５０４７号公報
【特許文献２】特開２０００−３２５０９０号公報
【特許文献３】特開２０００−２３２８８５号公報
【非特許文献１】オロウスキー（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ， Ｍ．）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，４９４２−４９５０（１９８１）
【非特許文献２】ベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ， Ａ．）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，７５１−７５７（１９８７）
【非特許文献３】ヤムスコフ（Ｉ．Ａ．Ｙａｍｓｋｏｖ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３７−１４０（１９８１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の１つの側面は、触媒等に応用するに十分に高い熱安定性を有すること、触媒等に応用するに十分に高い至適反応温度を有すること、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示すこと、カルシウムイオンにより反応性に影響が見られず、カルシウムイオンの非存在下においても高い基質特異性を示すこと、触媒等に応用するに適した基質特異性を示すこと、加水分解活性により種々の産物を得ること等の少なくとも１つを解決しうる、アミノペプチダーゼを提供することにある。
【０００６】
また、本発明の別の側面は、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させること、前記アミノペプチダーゼを大量に供給すること、前記アミノペプチダーゼの性質を改変させること、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出すること、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ること等の少なくとも１つを解決しうる、アミノペプチダーゼをコードする核酸を提供することにある。
【０００７】
さらに、本発明の他の側面は、実質的に高い純度であること、触媒等に応用するに十分に高い熱安定性を有すること、触媒等に応用するに十分に高い至適反応温度を有すること、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示すこと、触媒等に応用するに適した基質特異性を示すこと、加水分解活性により種々の産物を得ること等の少なくとも１つを解決しうる、組換えアミノペプチダーゼを提供することにある。
【０００８】
また、本発明の別の側面は、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出すること、前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出すること等の少なくとも１つを解決しうる、プローブ及びプライマー対を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の他の側面は、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出すること、前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出すること等の少なくとも１つを解決しうる、アミノペプチダーゼの検索方法を提供することにある。
【００１０】
また、本発明の別の側面は、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出すること、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼの機能を阻害すること等の少なくとも１つを解決しうる、抗体又はその断片を提供することにある。
【００１１】
さらに、本発明の他の側面は、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させること、前記アミノペプチダーゼを大量に供給すること、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ること、アミノペプチダーゼの製造に適した細胞に前記核酸を導入すること、前記核酸を効率よく導入すること等の少なくとも１つを解決しうる、前記アミノペプチダーゼの発現用担体を提供することにある。
【００１２】
また、本発明は、前記アミノペプチダーゼを大量に供給すること、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ること等の少なくとも１つを解決しうる形質転換細胞を提供することにある。
【００１３】
さらに、本発明の他の側面は、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させること、前記アミノペプチダーゼを大量に供給すること、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ること等の少なくとも１つを解決しうる、前記アミノペプチダーゼの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明は、
〔１〕  下記性質：
（１）至適反応ｐＨ：
ｐＨ７．５〜１０．５
（２）基質特異性：
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド及びＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに対して加水分解活性を示す、
（３）至適反応温度：
約７５℃、
（４）熱安定性：
５０％熱不活性化温度として、約７８℃
（５）カルシウムイオンによる触媒活性の影響が実質的にない、
を有するアミノペプチダーゼ、
〔２〕  ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９５）により産生されるものである、前記〔１〕記載のアミノペプチダーゼ、
〔３〕  （Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すものである、アミノペプチダーゼをコードする核酸、
〔４〕  前記〔３〕記載の核酸を含有してなる、アミノペプチダーゼの発現用担体、
〔５〕  前記〔３〕記載の核酸を保持してなる形質転換細胞、
〔６〕  １）前記〔５〕記載の形質転換細胞を培養して、培養物を得る工程、及び
２）前記工程１）で得られた培養物からアミノペプチダーゼを回収する工程、
を含む、組換えアミノペプチダーゼの製造方法、
〔７〕  前記〔３〕記載の核酸によりコードされる組換えアミノペプチダーゼ、
〔８〕  （ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも１００ヌクレオチド残基からなる塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、又は
（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、
を含有してなる、前記〔３〕記載の核酸を検出するためのプローブ、
〔９〕  Ａ．  （Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列、又は
（ＩＩ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（Ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列、
を含有したオリゴヌクレオチドと、
Ｂ．  配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中、前記Aのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド残基離れたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列に対する実質的に相補的な配列を含有したオリゴヌクレオチドと
からなる、前記〔３〕記載の核酸若しくはその一部を増幅するためのプライマー対、
〔１０〕  前記〔８〕記載のプローブを用いたハイブリダイゼーション及び／又は前記〔９記載のプライマー対を用いたＰＣＲにより、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列中の該プローブに対応する領域及び／又は該プライマー対を用いて得られたＰＣＲ増幅産物に対応する領域を検出し、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すアミノペプチダーゼをスクリーニングすることを特徴とする、アミノペプチダーゼの検索方法、並びに
〔１１〕  前記〔１〕若しくは〔２〕記載のアミノペプチダーゼ又は前記〔４〕若しくは〔５〕記載の組換えアミノペプチダーゼに対する抗体又はその断片、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアミノペプチダーゼによれば、触媒等に応用するに十分に高い熱安定性及び至適反応温度で用いることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のアミノペプチダーゼは、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示し、カルシウムイオンの非存在下においても高い基質親和性を示し、カルシウムイオンによる触媒活性の影響が実質的になく、触媒等に応用するに適した基質特異性を示すという優れた効果を奏する。さらに、本発明のアミノペプチダーゼによれば、加水分解活性により種々の産物を得ることができるという優れた効果を奏する。
【００１６】
また、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させ、大量に供給することができ、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼの性質を改変させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出することができるという優れた効果を奏する。
【００１７】
さらに、本発明の組換えアミノペプチダーゼは、実質的に高い純度であるという優れた性質を発現する。本発明の組換えアミノペプチダーゼによれば、触媒等に応用するに十分な高い熱安定性、高い至適反応温度を示すという優れた性質を発現する。また、本発明の組換えアミノペプチダーゼによれば、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示し、カルシウムイオンの非存在下においても高い基質親和性を示し、カルシウムイオンによる触媒活性の影響が実質的にないという優れた性質を発現する。さらに、本発明の組換えアミノペプチダーゼによれば、触媒等に応用するに適した基質特異性を示すという優れた性質を発現する。したがって、本発明の組換えアミノペプチダーゼによれば、適した条件下で解析を行なうことができ、加水分解活性により種々の産物を得ることができるという優れた効果を奏する。
【００１８】
また、本発明のプローブ及びプライマー対によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出でき、前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができるという優れた効果を奏する。
【００１９】
さらに、本発明のアミノペプチダーゼの検索方法によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出でき、前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができるという優れた効果を奏する。
【００２０】
また、本発明の抗体又はその断片によれば、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出できるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の抗体又はその断片によれば、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼの機能を阻害することができるという優れた効果を奏する。
【００２１】
さらに、本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体によれば、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを大量に供給することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体によれば、アミノペプチダーゼの製造に適した細胞に前記核酸を効率よく導入し、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体によれば、前記核酸を効率よく導入することができるという優れた効果を奏する。
【００２２】
また、本発明の形質転換細胞によれば、前記アミノペプチダーゼを実質的に高い純度で大量に供給することができるという優れた効果を奏する。
【００２３】
さらに、本発明のアミノペプチダーゼの製造方法によれば、前記アミノペプチダーゼを実質的に高い純度で大量に供給することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のアミノペプチダーゼの製造方法によれば、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の１つの側面は、アミノペプチダーゼである。
【００２５】
本発明のアミノペプチダーゼは、カルシウムイオンの非存在下であっても、基質に対する親和性が高く、カルシウムイオンによる触媒活性への影響が実質的にないという性質を有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のアミノペプチダーゼによれば、反応に際して、カルシウムイオンに由来する沈殿の発生、白濁化等を抑制することができるという優れた効果が発揮される。そのため、解析、触媒等への応用に好適である。
【００２６】
本発明のアミノペプチダーゼの活性測定、具体的には、加水分解活性の測定は、例えば、測定対象の酵素を含む反応液〔組成：８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕に、最終濃度  ３．２ｍＭとなるように基質としてアミノアシル−ｐ−ニトロアニリドを添加し、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定を行なって、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより行なわれうる。酵素反応の初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定されうる。なお、本明細書において、アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義される。
【００２７】
本発明のアミノペプチダーゼの活性測定に用いられる基質としては、例えば、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）、Ｌ−ファニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ）、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ-Ｌｙｓ-ｐＮＡ）、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−Ｍｅｔ−ｐＮＡ）等が挙げられる。
【００２８】
本発明のアミノペプチダーゼは、ｐＨ６〜１０．５、好ましくは、ｐＨ７〜１０、より好ましくは、ｐＨ８〜９、さらに好ましくは、約ｐＨ８．０の至適反応ｐＨを有することに１つの大きな特徴がある。本発明のアミノペプチダーゼは、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示す。また、本発明のアミノペプチダーゼは、広い範囲のｐＨ条件下で加水分解が可能であるため、合成基質を用いたプロテアーゼの検出、光学活性化合物の合成等に有用であるという優れた性質を発揮する。なお、前記至適反応ｐＨは、前記アミノペプチダーゼの活性測定において、反応液に用いられる８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの代わりに、適宜、緩衝能に応じた緩衝液を用いることにより、活性を測定することにより評価されうる。
【００２９】
本発明のアミノペプチダーゼは、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド及びＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに対して加水分解活性を示すという基質特異性を示すことに１つの大きな特徴がある。また、本発明のアミノペプチダーゼは、例えば、５、５−ジメチル−１、３−４  アゾリジン、４−カルボキシリックアシッド−メチルエステル（ＤＭＴＡメチルエステル）、ε−ポリリジン、これらの誘導体等に対しても加水分解活性を示す。したがって、本発明のアミノペプチダーゼは、触媒等に応用するに好適である。さらに、本発明のアミノペプチダーゼは、前記基質特異性を呈するため、加水分解活性により種々の産物を得るのに用いられうる。本発明のアミノペプチダーゼは、アミド以外にもメチルエステル等に対し、加水分解が可能であるため、医薬の中間体化合物の合成、高付加価値化合物の合成等に有用であるという優れた性質を発揮する。さらに、本発明のアミノペプチダーゼは、基質特異性が広く、特に塩基性アミノ酸への触媒反応を効率よく行なうことができるという点に１つの大きな特徴がある。なお、前記基質特異性は、前記アミノペプチダーゼの活性測定と同様に活性を測定することにより評価されうる。
【００３０】
本発明のアミノペプチダーゼは、至適反応温度が、１０℃以上、好ましくは、２５℃以上、より好ましくは、３７℃以上、さらに好ましくは、７０〜７５℃、よりさらに好ましくは、約７５℃であることに１つの大きな特徴がある。本発明のアミノペプチダーゼは、解析、触媒等に応用するに適した高い反応温度で用いることができる。本発明のアミノペプチダーゼは、低温条件（例えば、１０℃以上）下においても触媒活性を保持しているため、熱に不安定な化合物の加水分解、熱に不安定なプロテアーゼの合成基質を用いた検出等に有用であるという優れた性質を発揮する。なお、前記至適反応ｐＨは、前記アミノペプチダーゼの活性測定において、反応温度３７℃を適宜変化させ、活性を測定することにより評価されうる。
【００３１】
本発明のアミノペプチダーゼは、５０％熱不活性化温度として、約７８℃であり、１００％熱不活性化温度として、約９０℃であり、低温から約７０℃までの範囲で、未処理の場合の活性の１００％を保持できるという熱安定性を示すことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のアミノペプチダーゼは高い熱安定性を有するため、触媒等を安定して行なうことができる。なお、前記熱安定性は、前記アミノペプチダーゼの活性測定に先立って、種々の温度で、３０分間、アミノペプチダーゼをインキュベーションし、得られたアミノペプチダーゼを用いて、活性を測定することにより評価されうる。
【００３２】
また、本発明のアミノペプチダーゼは、各ｐＨ条件下で３０分間インキュベーションした場合、ｐＨ５〜１０の幅広いｐＨ条件下においても、未処理の場合と同等の活性を示すため、様々な条件での化合物の加水分解等に有用であるという優れた性質を発揮する。
【００３３】
本発明のアミノペプチダーゼとしては、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼが挙げられる。
【００３４】
なお、前記ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９５（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている。
【００３５】
本発明のアミノペプチダーゼは、１つの側面では、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過ＡＫＴＡ  ファスト（ｆａｓｔ）タンパク質液体クロマトグラフィーシステム〔ファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕による分子量として、約３０ｋＤａ、１５重量％ポリアクリルアミドを含むゲル上、変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量として、約３３ｋＤａである酵素である。
【００３６】
本発明のアミノペプチダーゼは、他の側面では、例えば、アミノ末端（Ｎ末端）アミノ酸配列：ＡＧＡＰＡＩＰＶＡＮＶＫＡＨＬＮＱＬ（配列番号：２中、アミノ酸番号：６５〜８０に対応；配列番号：３）、トリプシン分解部分ペプチドのＮ末端アミノ酸配列：ＡＧＰＧＩＮＤＮ（配列番号：２中、アミノ酸番号：１５５〜１６１に対応；配列番号：４）を有する酵素である。
【００３７】
本発明のアミノペプチダーゼは、特に限定されないが、例えば、４℃で、下記ステップ：
−  前記ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２を、培地〔組成：０．５重量％  グルコース、０．５重量％  クエン酸、０．２重量％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキス〕中２８℃で７２時間、定常期になるまで、好気的に培養し、
−  得られた培養物を、４００００×ｇ、１０分間の遠心分離若しくは濾紙で濾過して、培地濾過物（上清）を得、
−  得られた培地濾過物を、撹拌しながら、６５℃で３０分間加熱し、生じた沈殿を除去し、
−  得られた溶液を、緩衝液Ａ〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０〕に対して透析し、
−  透析後の溶液を緩衝液Ａで平衡化した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、具体的には、ＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）カラム（内径１．６×１０ｃｍ、２０ｍｌ）に負荷し、結合したタンパク質を、緩衝液０−０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジェントで平均流速２ｍｌ／ｍｌで溶出させ、
−  得られた溶出画分のうち、高比活性を示す画分を集め、８０％  飽和硫酸アンモニウムによる塩析でタンパク質を沈殿させ、
−  得られた沈殿物を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶解させ、得られた溶液を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析し、
−  透析後に得られた溶液を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、具体的には、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム〔ファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製、内径１．６×６０ｃｍ、６０ｍｌ〕に負荷し、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａにより、平均流速１ｍｌ／分でタンパク質を溶出させること
を行なうことにより得られうる。
【００３８】
なお、本発明のアミノペプチダーゼは、ストレプトマイセス  グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のアミノペプチダーゼとの配列同一性が、約７０％であるにもかかわらず、カルシウムイオンによる活性化、安定化等の影響を実質的に受けず、基質親和性が高く熱に安定であるという予想外の性質を有する。
【００３９】
また、本発明のアミノペプチダーゼは、アミノペプチダーゼに対する慣用の阻害剤に対して親和性が低い、すなわち、阻害剤による影響が小さいという点に１つの大きな特徴がある。
【００４０】
本発明の他の側面は、前記アミノペプチダーゼ、すなわち、前記性質を有するアミノペプチダーゼをコードする核酸である。
【００４１】
本発明のアミノペプチダーゼをコードする核酸としては、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列が挙げられる。
【００４２】
前記（Ａ）において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列は、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２より産生されるアミノペプチダーゼのアミノ酸配列である。
【００４３】
前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の一例としては、具体的には、（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列が挙げられる。なお、本発明においては、配列番号：１に示される塩基配列と縮重を介して異なる塩基配列も含まれる。
【００４４】
また、本発明においては、コードされるポリペプチドが、前記（Ａ）又は（Ｂ）の核酸によりコードされるアミノペプチダーゼと同等の活性、具体的には、アミノペプチダーゼ活性を示すものであり、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、カルシウムイオンによる影響を実質的に受けず、加水分解活性を示すものであれば、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を含有する核酸のバリアントであってもよい。
【００４５】
なお、バリアントの核酸によりコードされるポリペプチドのアミノペプチダーゼ活性、具体的には、カルシウムイオンの非存在下での加水分解活性は、前記アミノペプチダーゼの活性測定に従って評価されうる。
【００４６】
本明細書においては、前記「アミノペプチダーゼと同等の活性」は、基質として、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを用いた場合、前記（Ａ）又は（Ｂ）の核酸によりコードされるアミノペプチダーゼと同じ活性又は少なくとも１０〜１００％の活性、好ましくは、前記（Ａ）又は（Ｂ）の核酸によりコードされるアミノペプチダーゼと同じ活性又は少なくとも５０〜１００％の活性であればよい。また、前記「アミノペプチダーゼと同等の活性」は、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示す性質を少なくとも有することをも包含する。
【００４７】
前記バリアントの塩基配列としては、１つの側面では、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
が挙げられる。
【００４８】
本明細書において、「置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列」とは、天然由来の変異を有する塩基配列であってもよく、人為的な変異を導入された塩基配列であってもよい。
【００４９】
また、本明細書において、「少なくとも１つ」とは、１若しくは複数個、又はそれ以上、好ましくは、１個又は数個をいう。
【００５０】
前記（Ｃ）において、「ヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入」は、慣用の部位特異的変異導入法等で前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸に対して生じさせうる。得られた塩基配列を含有した核酸が、前記アミノペプチダーゼの活性測定により、コードされるポリペプチドが、前記（Ａ）又は（Ｂ）の核酸によりコードされるアミノペプチダーゼと同等の活性を示すものであればよい。
【００５１】
前記（Ｃ）の塩基配列を含有した核酸は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、保存的置換を有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。前記「保存的置換」とは、類似した性質（すなわち疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴）を有するアミノ酸との置換；本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸との置換を包含することを意味する。保存的置換としては、例えば、１つの特定のアミノ酸を、下記グループＩ〜ＶＩ：
Ｉ．  グリシン、アラニン；
ＩＩ．  バリン、イソロイシン、ロイシン；
ＩＩＩ．  アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン；
ＩＶ．  セリン、スレオニン；
Ｖ．  リジン、アルギニン；及び
ＶＩ．  フェニルアラニン、チロシン
のそれぞれグループ内の他のアミノ酸に置換することが挙げられる。
【００５２】
前記（Ｃ）の核酸の具体例としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：８１のセリンがスレオニンであるアミノ酸配列、アミノ酸番号：２３４のチロシンがフェニルアラニンであるアミノ酸配列等が挙げられる。
【００５３】
また、前記バリアントの塩基配列としては、他の側面では、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列
が挙げられる。
【００５４】
前記（Ｄ）において、「ストリンジェントな条件」とは、中ストリンジェンシーの条件、好ましくは、高ストリンジェンシーの条件をいい、具体的には、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第３版及び第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．（２００１発行）、２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９発行））等に記載された条件が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、プローブとともに６５℃で一晩インキュベーションするという条件が挙げられる。なお、前記「ストリンジェントな条件」下におけるハイブリダイゼーションにおいて、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を含有した核酸のＴｍ値（８０〜９０）の２５℃下、よりストリンジェントには、２２℃下、さらにストリンジェントには、２０℃下、よりさらにストリンジェントには、１０℃下、特にストリンジェントには、５℃下等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、６×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、前記Ｔｍ値の５５℃下、よりストリンジェントには、５０℃下、さらにストリンジェントには、３０℃下、よりさらにストリンジェントには、２５℃下等の条件下での洗浄等を行なうことにより、例えば、前記配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも７５％、よりストリンジェントには、８０％以上、さらにストリンジェントには、８５％以上、よりさらにストリンジェントには、９０％以上、より一層ストリンジェントには、９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を得ることが可能になる。
【００５５】
すなわち、前記（Ｄ）の塩基配列を含有した核酸は、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸を用いて、前記「ストリンジェントな条件」下にハイブリダイゼーションを行なうことによりハイブリダイズし、かつ得られた塩基配列を含有した核酸が、前記アミノペプチダーゼの活性測定により、コードされるポリペプチドが、前記（Ａ）又は（Ｂ）の核酸によりコードされるアミノペプチダーゼと同等の活性を示すものであればよい。
【００５６】
前記バリアントの塩基配列としては、別の側面では、
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
が挙げられる。
【００５７】
なお、本明細書において、「配列同一性」とは、２つの分子間の残基の配列類似性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定されうる。ここで、比較対象の分子は、２つの配列の最適なアラインメントのための参考配列（例えば、コンセンサス配列等）と比べて、付加又は欠失（例えば、ギャップ等）を有していてもよい。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。なお、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰとして、ウェブページアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおいて、一般に利用可能である。
【００５８】
前記配列同一性は、少なくとも７５％、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、よりさらに好ましくは、９０％以上、より一層好ましくは、９５％以上であればよい。
【００５９】
本発明の核酸は、本発明のアミノペプチダーゼをコードしているため、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させ、大量に供給することができ、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを得ることができる。
【００６０】
また、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼの性質を改変させることができる。また、本発明の核酸によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出することができる。
【００６１】
本発明の核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づき、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２のゲノムＤＮＡから、慣用の手段、例えば、適切なプローブを用いたハイブリダイゼーション、適切なプライマー対を用いたＰＣＲ等により単離することができる。
【００６２】
本発明の核酸の供給源としては、特に限定されないが、例えば、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２、他の微生物、具体的には、特に限定されないが、例えば、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  アヴェルミティリス等、植物、動物等が挙げられる。
【００６３】
本発明の別の側面は、組換えアミノペプチダーゼである。
【００６４】
本発明の組換えアミノペプチダーゼは、本発明の核酸によりコードされる酵素である。
【００６５】
より具体的には、本発明の組換えアミノペプチダーゼは、例えば、
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：２において、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する、アミノペプチダーゼ活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列
、及び
（ｃ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、よりさらに好ましくは、９０％以上、より一層好ましくは、９５％以上であるアミノ酸配列
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有してなり、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すポリペプチドが挙げられる。
【００６６】
本発明の組換えアミノペプチダーゼは、他のアミノペプチダーゼが実質的に含まれない高い純度である。また、本発明の組換えアミノペプチダーゼは、本発明のアミノペプチダーゼと同様に、触媒等に応用するに十分な高い熱安定性、高い至適反応温度を示し、解析、触媒等に応用するに適した条件下で反応性を示し、カルシウムイオンの非存在下に反応性を示す。さらに、本発明の組換えアミノペプチダーゼは、解析、触媒等に応用するに適した基質特異性を示す。したがって、本発明の組換えアミノペプチダーゼによれば、適した条件下で解析を行なうことができ、加水分解活性により種々の産物を得ることができる。
【００６７】
本発明の組換えアミノペプチダーゼは、例えば、
−  本発明の核酸を、アミノペプチダーゼを発現させる対象となる細胞への導入に適した担体に保持させ、
−  得られた担体（以下、アミノペプチダーゼの発現用担体）を前記細胞に導入し、
−  得られた形質転換細胞を培養し、
−  得られた培養物から、適切な手段でアミノペプチダーゼを回収すること
により製造することができる。
【００６８】
すなわち、本発明の他の側面は、アミノペプチダーゼの発現用担体、形質転換細胞、及び組換えアミノペプチダーゼの製造方法である。
【００６９】
本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体は、本発明の核酸を含有する。したがって、本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体によれば、実質的に高い純度の前記アミノペプチダーゼを大量に供給することができ、アミノペプチダーゼの製造に適した細胞に前記核酸を効率よく導入し、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させることができる。また、本発明のアミノペプチダーゼの発現用担体によれば、前記核酸を効率よく導入することができる。
【００７０】
本発明の発現用担体は、具体的には、アミノペプチダーゼを発現させる対象となる細胞への導入に適した担体に、本発明の核酸が保持されたものである。
【００７１】
前記細胞としては、例えば、慣用の宿主細胞が挙げられ、具体的には、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌等の細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。より具体的には、前記大腸菌としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９等が挙げられる。前記細胞のなかでは、精製の容易化、大量調製、安全性等の観点から、好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９が望ましい。
【００７２】
前記担体としては、生物担体、具体的には、前記細胞に適したベクター等、非生物担体、例えば、金粒子、デキストラン等が挙げられる。
【００７３】
前記「細胞に適したベクター」としては、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すればよく、プラスミドベクター、ファージベクター等が挙げられる。導入対象となる細胞が、大腸菌の細胞である場合、前記「細胞に適したベクター」としては、例えば、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＱＥ３２、ｐＥＴＫｍＳ２〔ミシマ（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｎ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，１３，８４６〜８６８（１９９７）〕等が挙げられる。かかるベクターには、プロモーター（具体的には、例えば、誘導可能なプロモーター、構成的プロモーター等）、選択用マーカー遺伝子、ターミネーター等の転写エレメントを適宜有していてもよい。
【００７４】
誘導可能なプロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター等が挙げられる。
【００７５】
選択用マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が挙げられる。
【００７６】
かかるベクターには、アミノペプチダーゼの精製を容易にするための因子、例えば、細胞外分泌シグナル、融合パートナー（Ｈｉｓタグ、ｐｅｌＢシグナル等）等を含有してもよい。
【００７７】
担体が、前記「細胞に適したベクター」である場合、本発明の発現用担体は、前記ベクター上の制限酵素部位（例えば、クローニングサイト等）に、本発明の核酸を作動可能に連結させることにより作製されうる。
【００７８】
担体が、前記非生物担体である場合、必要に応じて、本発明の核酸を、前記プロモーターの制御下に作動可能に連結させて得られた核酸構築物を、該非生物担体に担持させることにより作製されうる。なお、前記核酸構築物は、複製開始起点、ターミネーター等をさらに含有してもよい。
【００７９】
なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現が、転写エレメントによる制御下に生物学的活性を示す状態で発現するように連結されていることを意味する。
【００８０】
本発明の形質転換細胞は、本発明の核酸を保持する細胞である。本発明の形質転換細胞によれば、本発明の核酸を保持し、該核酸から組換えアミノペプチダーゼを発現するため、前記アミノペプチダーゼを実質的に高い純度で大量に供給することができる。
【００８１】
本発明の形質転換細胞は、本発明の発現用担体を、前記細胞に導入して、該細胞を形質転換することにより得られうる。
【００８２】
細胞への発現用担体の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が挙げられる。
【００８３】
本発明の組換えアミノペプチダーゼの製造方法は、１）本発明の形質転換細胞を培養して、培養物を得る工程、及び
２）前記工程１）で得られた培養物からアミノペプチダーゼを回収する工程、
を含む方法である。本発明のアミノペプチダーゼの製造方法によれば、本発明の形質転換細胞を用いているため、本発明のアミノペプチダーゼの製造方法によれば、前記アミノペプチダーゼを効率よく発現させることができ、前記アミノペプチダーゼを実質的に高い純度で大量に供給することができる。
【００８４】
前記工程１）において、形質転換細胞は、用いた細胞、担体、転写エレメント等に応じた培養条件下、必要により、発現誘導条件下に培養すればよい。
【００８５】
前記工程２）において、本発明の形質転換細胞が、組換えアミノペプチダーゼを細胞内に蓄積する場合、前記工程１）で得られた培養物を遠心分離等に供して、形質転換細胞を回収すればよい。この場合、得られた形質転換細胞から、慣用のタンパク質精製法、例えば、超音波破砕法、溶菌法、凍結破砕法、遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、アミノペプチダーゼ活性測定、タンパク質定量、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ等による純度検定等を行なうことにより、組換えアミノペプチダーゼを実質的に単離することができる。
【００８６】
一方、前記工程２）において、本発明の形質転換細胞が、組換えアミノペプチダーゼを細胞外に分泌する場合、前記工程１）で得られた培養物から、遠心分離、濾過等により培養上清を回収すればよい。この場合、用いた細胞により異なるが、得られた培養上清を、熱処理、前記タンパク質精製法等を適宜組み合わせ、アミノペプチダーゼ活性測定、タンパク質定量、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ等による純度検定等を行なうことにより、組換えアミノペプチダーゼを実質的に単離することができる。例えば、大腸菌、枯草菌等の中温性細菌を用いた場合、得られた培養上清を熱処理することにより、組換えアミノペプチダーゼを実質的に単離することができる。
【００８７】
なお、本発明の形質転換細胞の作製の際、細胞として、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用い、担体として、ｐＥＴＫｍＳ２〔ミシマ（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｎ．）ら、Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，１３，８６４−８６８（１９９７）〕を用いて得られた形質転換細胞は、該形質転換細胞の培養上清に本発明の組換えアミノペプチダーゼが分泌されるため、該培養上清を熱処理することにより、実質的に単離された組換えアミノペプチダーゼを簡便に得ることができる点で有利である。この場合、例えば、
−  上記形質転換細胞を、０．５重量％  ＫＨ2ＰＯ4、０．５％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．４４重量％  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．３重量％  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５重量％  グルコース、０．３重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００４重量％  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００４重量％  ＣａＣｌ2、０．０００２９重量％  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０００３重量％  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００００３６重量％  Ｎａ2ＭｏＯ・２Ｈ2Ｏ、０．００１重量％  Ｈ3ＢＯ3、０．００１重量％  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％  グリセロール及び５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む合成培地中、２６℃で１２時間培養し、
−  得られた培養物に、ＩＰＴＧを、終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、
−  培養物を、振とうしながら、１８℃で３６時間培養する
ことにより、組換えアミノペプチダーゼを発現させることができる。
【００８８】
本発明の他の側面は、本発明の核酸を検出するためのプローブ及び本発明の核酸若しくはその一部を増幅するためのプライマー対である。
【００８９】
本発明のプローブの１つの態様は、（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列
を含有したプローブ〔プローブ（ｉ）という〕である。かかるプローブによれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出できる。また、本発明のプローブによれば、前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができる。
【００９０】
本発明のプローブ（ｉ）においては、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含むことに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のプローブによれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼ及び前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができる。
【００９１】
ここで、「前記ヌクレオチド残基を含む連続した（塩基配列）」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列上、前記ヌクレオチド残基と、その隣接配列を意味する。
【００９２】
本発明のプローブ（ｉ）の長さは、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは、２０〜２００ヌクレオチド長、好ましくは、５０〜２００ヌクレオチド長、より好ましくは、１００〜２００ヌクレオチド長である。
【００９３】
本発明のプローブの他の態様は、
（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、
を含有したプローブ〔プローブ（ｉｉ）という〕。
【００９４】
ここで、本明細書において、「同等の相補性」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸との結合力が、比較対象となるオリゴヌクレオチドと同等であることをいう。前記結合力は、例えば、ハイブリダーゼーション、共鳴プラズモン相互作用解析等により評価されうる。ハイブリダーゼーションによる評価の場合、結合力は、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸と共に、６×ＳＳＣと０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００ｍｇ／ｍｌ  ニシン精子ＤＮＡとを含む溶液中、プローブとともに５５℃で１２時間インキュベーションし、５×ＳＳＣで１０分間の洗浄した後にも、該核酸とのハイブリッドが検出できる程度であればよい。
【００９５】
また、本明細書において、「実質的に相補的」とは、完全に相補的であることを意味する。
【００９６】
プローブ（ｉｉ）の長さも、前記プローブ（ｉ）と同様であればよい。
【００９７】
本発明のプローブの具体例としては、本発明の核酸の全長、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の塩基番号：２５９〜３０３、５３４〜５５８等が挙げられる。
【００９８】
本発明のプライマー対は、
Ａ．  （Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列、又は
（ＩＩ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（Ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列、
を含有したオリゴヌクレオチドと、
Ｂ．  配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中、前記Ａのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド残基離れたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列に対する実質的に相補的な配列を含有したオリゴヌクレオチドと
からなるプライマー対である。本発明のプライマー対によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼ及び前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができる。
【００９９】
本発明のプライマー対の各プライマーの長さは、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは、２０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは、２５〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは、２８〜３０ヌクレオチド長である。
【０１００】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中、Ａのオリゴヌクレオチドと、Ｂのオリゴヌクレオチドの距離は、前記Ａのオリゴヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド長、好ましくは、２００〜８００ヌクレオチド長、好ましくは、５００〜８００ヌクレオチド長、より好ましくは、７００〜８００ヌクレオチド長である。
【０１０１】
本発明のプライマー対の具体例としては、例えば、5'-CC(GC)GC(GC)ATCCC(GC)GT(GC)GC(GC)AACGT-3'（配列番号：５）に示される塩基配列を含有したプライマーと5'-CCGTTGTCGTTGAT(GC)CC(GC)GG(GC)CC-3'（配列番号：６）を含有したプライマーとからなるプライマー対、5'-CAAGGGCCACGTCAGGACCATGGCCGGCGC-3'（配列番号：７）に示される塩基配列を含有したプライマーと5'-CTTGAGGATCCGAGGTCAAACCCCGCAG-3'（配列番号：８）に示される塩基配列を含有したプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。
【０１０２】
本発明の別の側面は、アミノペプチダーゼの検索方法である。
【０１０３】
本発明のアミノペプチダーゼの検索方法は、本発明のプローブを用いたハイブリダイゼーション及び／又は本発明のプライマー対を用いたＰＣＲにより、前記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選ばれた塩基配列中の該プローブに対応する領域及び／又は該プライマー対を用いて得られたＰＣＲ増幅産物に対応する領域を検出し、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すアミノペプチダーゼをスクリーニングすることを１つの大きな特徴とする。したがって、本発明のアミノペプチダーゼの検索方法によれば、前記アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼ及び前記アミノペプチダーゼを有する生物供給源を検出することができる。
【０１０４】
本発明の検索方法において、被験試料としては、微生物、植物細胞、動物細胞等、それらの核酸試料等が挙げられる。
【０１０５】
本発明の検索方法において、ハイブリダーゼーションの条件は、前記「結合力」の評価のハイブリダイゼーション条件等が挙げられる。なお、本発明の検索方法においては、より精度を高める観点から、必要に応じて、より低イオン強度、例えば、６×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、５×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いるプローブのＴｍ値（８０〜９０）の１０℃下、よりストリンジェントには、５℃下等の条件下でのハイブリダイゼーション；より厳しい洗浄条件、具体的には、低イオン強度の緩衝液、例えば、６×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、２×ＳＳＣ等を使用し、より高い温度、例えば、前記Ｔｍ値の５５℃下、よりストリンジェントには、５０℃下、さらにストリンジェントには、３０℃下、よりさらにストリンジェントには、２５℃下等の条件下での洗浄等を行なってもよい。
【０１０６】
なお、前記ハイブリダイゼーション条件は、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を対照として用いて、設定してもよい。
【０１０７】
前記Ｔｍ値は、プローブの長さが、１８ヌクレオチド長以上である場合、例えば、下記の式：
Ｔm＝81.5−16.6(log10[Na+]＋0.41(%G＋C)−(600/N) 
（式中、Ｎはプローブの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはプローブ中のグアニン及びシトシン残基の含有量である）
により求められ、プローブの長さが１８ヌクレオチド長より短い場合、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔(A+T)×2+(G+C)×4〕により求められうる。
【０１０８】
前記ＰＣＲの条件は、用いるプライマーのＴｍ値等に応じて、適宜設定することができる。前記ＰＣＲの条件は、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸を対照として用いて、設定してもよい。
【０１０９】
ハイブリダイゼーション及びＰＣＲにより検出された領域が、アミノペプチダーゼの部分断片をコードする核酸断片であった場合、かかる核酸断片を用いて、慣用の手法（例えば、コロニーアイブリダイゼーション）により全長のアミノ酸配列をコードする核酸を単離することができる。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション及びＰＣＲにより、アミノペプチダーゼの存在が示唆された場合、被験試料の供給源が本発明のアミノペプチダーゼを含むかどうかを評価すればよい。かかる評価は、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドを基質として、前記アミノペプチダーゼ活性測定を行なえばよい。活性測定の結果、加水分解活性を示す場合、被験試料の供給源が本発明のアミノペプチダーゼを含むことの指標となる。
【０１１１】
本発明のさらに他の側面は、本発明のアミノペプチダーゼ又は本発明の組換えアミノペプチダーゼに対する抗体又はその断片である。本発明の抗体又はその断片によれば、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼを検出できる。また、本発明の抗体又はその断片によれば、前記アミノペプチダーゼ又は該アミノペプチダーゼと同等の性質を有する他のアミノペプチダーゼの機能を阻害することができる。
【０１１２】
本発明の抗体は、本発明のアミノペプチダーゼ又は本発明の組換えアミノペプチダーゼに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。
【０１１３】
本発明の抗体は、慣用の方法により、例えば、本発明のアミノペプチダーゼ又は本発明の組換えアミノペプチダーゼの全部又は一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。本発明の抗体には、本発明のアミノペプチダーゼ又は本発明の組換えアミノペプチダーゼのある部分断片に特異的に結合しうる抗体、公知技術により修飾された抗体、抗体の誘導体等も含まれる。
【０１１４】
本発明の抗体の断片は、ペプチダーゼ等により処理することにより得られうる。本発明の抗体の断片の具体例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
【０１１５】
以下、実施例等により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。本明細書において、特に明記しない限り、各種操作は、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８９）〕に従って行なった。
【実施例１】
【０１１６】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２〔Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９５（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている〕〔ハギシタ（Ｈａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２，１５８７−１５９０（２０００）；畑中（Ｈａｔａｎａｋａ，Ｔ．）ら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，３１，２３３−２４１，（２００２）〕を、培地〔組成：０．５重量％  グルコース、０．５重量％  クエン酸、０．２重量％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキス〕中３４℃で２６時間好気的に培養した。培養中、経時的に培養物  １ｍｌを採取し、得られた培養物を遠心分離して、培地上清を得た。得られた培地上清を、ホスファチジル−パラ−ニトロフェノールの加水分解反応に供し、培地上清中における細胞外ホスホリパーゼＤを検出した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＰＬＤ抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションにより、培地上清中における細胞外ホスホリパーゼＤを解析した。
【０１１７】
その結果、培養開始から２０時間（ＯＤ660＝６）の時点以降、ホスホリパーゼＤが分解されることが見出された。したがって、かかる培地濾過物中に、タンパク質を分解する酵素が存在することが示唆された。
【０１１８】
そこで、７２時間培養後に得られた培地濾過物  ０．１ｍｌを、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を基質とし、反応液〔組成：８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕中、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより、アミノペプチダーゼ活性を測定した。
【０１１９】
酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。
【０１２０】
その結果、アミノペプチダーゼ活性が見出された。
【実施例２】
【０１２１】
以下の操作は、特に断りのない限り、４℃で行なった。
【０１２２】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２を、培地〔組成：０．５重量％  グルコース、０．５重量％  クエン酸、０．２重量％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキス〕中２８℃で７２時間、好気的に培養した。培養中、経時的に培養物  ０．１ｍｌを採取し、得られた培養物を濾紙で濾過し、培地濾過物（上清）を得た。
【０１２３】
培地濾過物（１０ｍｇ／ｍｌ  タンパク質溶液）を、時々撹拌しながら、６５℃で３０分間加熱した。沈殿を除去した後、得られた溶液を、緩衝液Ａ〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０〕に対して透析した。透析後の溶液を緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）カラム（内径１．６×１０ｃｍ、２０ｍｌ）に負荷した。結合したタンパク質を、緩衝液０−０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジェントで平均流速２ｍｌ／ｍｌで溶出させた。得られた溶出画分のうち、高比活性を示す画分を集めた。得られた画分に、８０％  飽和硫酸アンモニウムとなるように、硫酸アンモニウムを添加して、タンパク質を沈殿させた。得られた沈殿物を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに溶解させた。得られた溶液を、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析した。透析後に得られた溶液を、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム〔ファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製、内径１．６×６０ｃｍ、６０ｍｌ〕に負荷し、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａにより、平均流速１ｍｌ／分でタンパク質を溶出させた。タンパク質の溶出を２８０ｎｍでモニターした。
【０１２４】
なお、アミノペプチダーゼ活性は、３．２ｍＭ  Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡを基質とし、反応液〔組成：８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕中、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより測定した。
【０１２５】
酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。
【０１２６】
表１に精製表を示す。
【０１２７】
【表１】
2005218319.tif 000002
【０１２８】
また、精製タンパク質の分子量（未変性）を、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過ＡＫＴＡ  ファスト（ｆａｓｔ）タンパク質液体クロマトグラフィーシステム〔ファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕を用いて決定した。
【０１２９】
その結果、精製タンパク質の未変性状態における分子量は、分子量約３０ｋＤａであった。
【０１３０】
各精製段階で得られた試料を、１５重量％ポリアクリルアミドを含むゲル上、変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．，Ｋ．）、Ｎａｔｕｒｅ、１５，６８０−６８５（１９７０）〕で解析した。得られたゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した。図１に、各精製段階で得られた試料のＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１３１】
その結果、図１に示されるように、ゲル濾過後に得られたタンパク質（以下、アミノペプチダーゼ標品という）は、実質的に均一であることがわかる。また、図１のパネルＢに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製タンパク質の分子量は、約３３ｋＤａであることがわかる。したがって、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２のアミノペプチダーゼは、モノマーであることが示唆される。
【０１３２】
ついで、前記アミノペプチダーゼ標品  １０μｇ相当量に、トリプシンを添加し、１％  ＳＤＳ、ｐＨ８．０、３７℃の条件でインキュベーションした。得られた産物を、メンブランにブロッティングし、トリプシン分解部分ペプチドを得た。
【０１３３】
前記アミノペプチダーゼ標品及びトリプシン分解部分ペプチドのそれぞれのＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解により解析した。前記Ｎ末端アミノ酸配列の解析には、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製の商品名：ｓｅｑｕａｎａｔｏｒｓを用いた。
【０１３４】
その結果、アミノペプチダーゼのＮ末端アミノ酸配列は、ＡＧＡＰＡＩＰＶＡＮＶＫＡＨＬＮＱＬ（配列番号：３）であり、トリプシン分解部分ペプチドのＮ末端アミノ酸配列は、ＡＧＰＧＩＮＤＮ（配列番号：４）であった。以下、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２のアミノペプチダーゼを、ＳＳＡＰとも表記する。また、かかるアミノペプチダーゼをコードする遺伝子をＳｓａｐとも表記する。
【実施例３】
【０１３５】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２を、培地〔組成：０．５重量％  グルコース、０．５重量％  クエン酸、０．２重量％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキス〕中２８℃で７２時間、好気的に培養した。得られた培養物を、４００００×ｇ、１０分間遠心分離することにより、菌体を得た。
【０１３６】
得られた菌体から、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２  ゲノムＤＮＡをサイトウ・ミウラ法〔サイトウ（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２、６１９−６２９（１９６３）〕により調製した。
【０１３７】
配列番号：３に示されるＮ末端アミノ酸配列と配列番号：４に示されるトリプシン分解部分ペプチドのＮ末端アミノ酸配列とを用いて、フォワードプライマー（5'-CC(GC)GC(GC)ATCCC(GC)GT(GC)GC(GC)AACGT-3';配列番号：５）とリバースプライマー（5'-CCGTTGTCGTTGAT(GC)CC(GC)GG(GC)CC-3';配列番号：６）を設計し、合成した。
【０１３８】
前記ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２  ゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行なった。なお、ＰＣＲは、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９５℃３分  １サイクル、９５℃３０秒と５８℃３０秒と７２℃１分とを１サイクルとして１０サイクル、９５℃３０秒と５８℃３０秒と７２℃（２０秒からはじめ、１サイクルごとに５秒ずつ増加）とを１サイクルとする２０サイクル、７２℃７分  １サイクル、４℃の条件で行なった。得られたＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕に連結した。得られたプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【０１３９】
なお、大腸菌形質転換体は、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンを含むＬＢ培地〔１％  ＮａＣｌ、１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス〕中３７℃で培養した。
【０１４０】
得られた形質転換体から、アルカリ抽出法〔バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，１５１３−１５２３（１９７９）〕でプラスミドを抽出した。
【０１４１】
得られたプラスミドの挿入断片を用い、ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ〔ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社製〕を用いて、（ＤＩＧ）−標識ＰＣＲプローブを合成した。
【０１４２】
また、前記ゲノムＤＮＡを、ＳａｃＩで部分消化し、ついで、４〜６ｋｂのＳａｃＩ制限断片を回収した。
【０１４３】
前記４〜６ｋｂのＳａｃＩ制限断片と、ＳａｃＩ−消化ｐＵＣ１９とを用いてゲノムライブラリーを構築した。
【０１４４】
ついで、（ＤＩＧ）−標識ＰＣＲプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより、前記ライブラリーをスクリーニングした。
【０１４５】
前記ゲノムライブラリーのコロニーを、メンブラン〔Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、商品名：Ｎｙｌｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｈｙｂｏｎｄ-Ｎ＋〕に移行させ、ついで、アルカリ変性液（組成：０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて、メンブラン上の核酸を変性させた。その後、中和液〔組成：０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ〕を用いて、メンブランを中和させた。
【０１４６】
前記メンブランを、商品名：ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（Ｒｏｃｈｅ社製）中、前記（ＤＩＧ）−標識ＰＣＲプローブと共に、５５℃で２４時間インキュベーションし、その後、２×ＳＳＣ；０．１％  ＳＤＳにより、メンブランを洗浄し、洗浄後のメンブランを、商品名：ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）、商品名：抗ジゴキシゲニンＡＰ標識抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）、商品名：ＮＢＴ−ＢＣＩＰ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、発色による検出を行なった。
【０１４７】
その結果、全長Ｓｓａｐ遺伝子（ｐＵＣ−ＳＳＡＰ）を有するプラスミド〔以下、ｐＵＣ−ＳＳＡＰ１という〕を保持する陽性コロニーが得られた。
【０１４８】
得られた陽性コロニーから、ｐＵＣ−ＳＳＡＰ１を抽出し、該ｐＵＣ−ＳＳＡＰ１の挿入断片の塩基配列を解析した。なお、塩基配列は、ダイデオキシチェーンターミネーション法〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７（１９７７）〕により決定した。
【０１４９】
その結果、ｐＵＣ−ＳＳＡＰ中におけるＳｓａｐ遺伝子の決定された塩基配列は、１つのオープンリーディングフレームを含んだ（図２）。精製ＳＳＡＰ及びトリプシン分解ペプチドのＮ末端解析により得られたアミノ酸配列を、推定アミノ酸配列中に示す（図２中の太字）。
【０１５０】
また、推定アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴプログラム〔アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７）〕を用い、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件で、データベース検索を行なった。
【０１５１】
その結果、図３に示されるように、ＳＳＡＰとストレプトマイセス  グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のアミノペプチダーゼ（以下、ＳＧＡＰともいう）との間の配列同一性が、７１％であり、ＳＳＡＰと他のストレプトマイセスアミノペプチダーゼとの間の配列同一性が、６５〜７０％であることが示された。
【０１５２】
また、図３に示されるように、２つの亜鉛原子の配位に関与するアスタリスクで印を付けられたＳＧＡＰの５つのアミノ酸残基が、ＳＳＡＰ及び他のストレプトマイセスアミノペプチダーゼに見出された。
【０１５３】
図１パネルＢ及び図３に示されるように、ＳＳＡＰのアミノ酸配列解析及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ＳＧＡＰと類似していることが示された。しかしながら、驚くべきことに、ＳＳＡＰは、カルシウムイオンにより全く活性化されなかった。
【実施例４】
【０１５４】
Ｓｓａｐ遺伝子産物の発現プラスミドを構築するため、ＰＣＲによりＳｓａｐ遺伝子上の推定転写開始コドンに、Ｎｃｏ  Ｉ部位とＢａｍ  ＨＩ部位とを導入した。推定シグナルペプチド領域を欠くＳｓａｐ遺伝子を、センスプライマー（5'-CAAGGGCCACGTCAGGACCATGGCCGGCGC-3'、配列番号：７）とアンチセンスプライマー（5'-CTTGAGGATCCGAGGTCAAACCCCGCAG-3'、配列番号：８）とを用いて、ＰＣＲにより増幅した。なお、ＰＣＲは、ＧＣ−ＲＩＣＨ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、９５℃３分  １サイクル、９５℃３０秒と５８℃３０秒と７２℃１分とを１サイクルとして１０サイクル、９５℃３０秒と５８℃３０秒と７２℃（２０秒からはじめ、１サイクルごとに５秒ずつ増加）とを１サイクルとする２０サイクル、７２℃７分  １サイクル及び４℃でのインキュベーションの条件で行なった。
【０１５５】
得られたＰＣＲ産物を、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕に連結した。得られたプラスミドについて、配列を確認した。ついで、得られたプラスミドの挿入断片を、ｐＥＴＫｍＳ２〔ミシマ（Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｎ．）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，１３，８６４−８６８（１９９７）〕に連結した。得られたプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を形質転換した。
【０１５６】
前記ｐＥＴ−ＳＳＡＰ１を保持する大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３細胞を、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢ培地  ３ｍｌ中、３７℃で１２時間培養した。培養後の細胞を、滅菌水で洗浄した。洗浄後の細胞を、０．５重量％  ＫＨ2ＰＯ4、０．５％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．４４重量％  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．３重量％  （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．５重量％  グルコース、０．３重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００４重量％  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００４重量％  ＣａＣｌ2、０．０００２９重量％  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．０００３重量％  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．００００３６重量％  Ｎａ2ＭｏＯ・２Ｈ2Ｏ、０．００１重量％  Ｈ3ＢＯ3、０．００１重量％  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２重量％  グリセロール及び５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む合成培地  １００ｍｌに播種した。その後、細胞を２６℃で１２時間培養し、得られた培養物に、ＩＰＴＧを、終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。ついで、培養物を、振とうしながら、１８℃で３６時間培養した。その結果、組換えＳＳＡＰは、全細胞外タンパク質の最大約５０％に相当する濃度まで細胞外画分に分泌された。
【０１５７】
得られた培養物を遠心分離して、細胞を除去し、得られた上清を６５℃で３０分間、必要により攪拌させながら６５℃で３０分間培養した。遠心分離により沈殿を除去した後、この溶液を限外濾過で濃縮し、緩衝液Ａに対して透析した。透析後の溶液を、以下の実施例において組換えＳＳＡＰ標品として用いた。
【０１５８】
図１のパネルＢに示されるように、組換えＳＳＡＰは、精製野生型ＳＳＡＰと全く同じく分子量約３３ｋＤａであった。また、商品名：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより、分子量約３０ｋＤａの１つのタンパク質ピークが見られたことから、ＳＳＡＰは、モノマー酵素であることが示唆された。
【実施例５】
【０１５９】
組換えアミノペプチダーゼ活性におけるｐＨの影響を調べた。
【０１６０】
ｐＨ４〜６．５の８０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５〜９．０の８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液及びｐＨ９．０〜１１．０の８０ｍＭ  炭酸緩衝液、それぞれを用い、Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡを基質とし、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより、アミノペプチダーゼ活性を測定した。なお、比較対照として、ＳＧＡＰを用いた。酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。結果を図４及び表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2005218319.tif 000003
【０１６２】
図４に示されるように、組換えＳＳＡＰは、至適反応ｐＨが、ｐＨ７．０付近であり、一方、ＳＧＡＰは、至適反応ｐＨが、ｐＨ８〜９付近であることがわかる。また、図４のパネルＡ及びパネルＣのＶ対ｐＨのプロット及びＶ／Ｋｍ対ｐＨ（Ｄｉｘｏｎプロット）から、表２に示されるように、４つのｐＫａが決定された。かかる結果より、酵素への基質の結合及び反応は、少なくとも２つのイオン性残基により制御されることが示唆される。
【実施例６】
【０１６３】
ｐＮＡ誘導体に対する組換えＳＳＡＰの加水分解活性を調べた。１〜２０００μｇ／ｍｌ  組換えＳＳＡＰ  ５０μｌと０．２−３．２ｍＭ  アミノアシル−ｐＮＡ  ５０μｌと１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）  ４００μｌとを含む反応液中、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することにより測定した。酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。
【０１６４】
前記アミノアシル−ｐＮＡとして、Ｌ−ロイシン  ｐ−ニトロアニリド（Ｌｅｕ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、Ｌ−フェニルアラニン  ｐ−ニトロアニリド（Ｐｈｅ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、Ｌ−メチオニン  ｐ−ニトロアニリド（Ｍｅｔ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、Ｌ−リジン  ｐ−ニトロアニリド（Ｌｙｓ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、Ｌ−プロリン  ｐ−ニトロアニリド（ｐｒｏ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、Ｌ−アラニン  ｐ−ニトロアニリド（Ａｌａ−ｐＮＡ）〔シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕及びＬ−グルタミン酸  ｐ−ニトロアニリド（Ｇｌｕ−ｐＮＡ)〔ペプチド研究所製〕を用いた。
【０１６５】
なお、比較対照として、ＳＧＡＰを用いた。
【０１６６】
組換えＳＳＡＰ及びＳＧＡＰそれぞれについて、種々のアミノアシル−ｐＮＡの加水分解の触媒能を調べた結果を表３に示す。
【０１６７】
【表３】
2005218319.tif 000004
【０１６８】
その結果、ＳＳＡＰは、Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡに対して、最も高い加水分解活性を示した。ＳＳＡＰのｋｃａｔ／Ｋｍ値は、１２５ｍＭ-1・ｓ-1であり、ＳＧＡＰのｋｃａｔ／Ｋｍ値は、３４５ｍＭ-1・ｓ-1 であり、ＳＳＡＰとＳＧＡＰとの間に、顕著な差異が見られた。
【実施例７】
【０１６９】
組換えＳＳＡＰの熱安定性を調べた。酵素試料（５μｇ／ｍｌ  タンパク質）  １００μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で３０分間、３０℃〜８５℃の温度でインキュベーションした。その後、得られた酵素試料について、Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡを基質とし、反応液〔組成：８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０〕中、３７℃で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することによりアミノペプチダーゼ活性を測定した。酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。なお、比較対照として、ＳＧＡＰを用い同様に調べた。その結果を、図５に示す。図５中、数値は、最大値に対するパーセンテージ（残存活性）として示す。
【０１７０】
その結果、図５に示されるように、組換えＳＳＡＰの５０％熱不活性化温度は、約７８℃であり、一方、ＳＧＡＰの５０％熱不活性化温度は、１ｍＭ  ＣａＣｌ2非存在下で、約７０℃であり、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下で、約８０℃であった。
【０１７１】
ついで、組換えＳＳＡＰにおける温度の影響を調べた。Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡを基質とし、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、３０〜８５℃の温度範囲で、４０５ｎｍでの連続光学測定により、ｐ−ニトロアニリンの遊離を検出することによりアミノペプチダーゼ活性を測定した。酵素反応は、基質の添加により開始させた。初速度は、光学密度プロファイルの直線部分から決定した。アミノペプチダーゼ活性の１単位は、１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量として定義した。なお、比較対照として、ＳＧＡＰを用い、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で同様に活性測定を行ない、温度の影響を調べた。活性化エネルギー及びΔＨ値を、セゲル〔Ｓｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２７７−２８１（１９７６）〕に従って決定した。結果を図６に示す。
【０１７２】
その結果、図６のパネルＡに示されるように、組換えＳＳＡＰは、至適反応温度７５℃でベル型曲線を示した。また、図６のパネルＢに示されるように、３０〜７０℃の温度範囲におけるＬ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの加水分解のＡｒｒｈｅｎｉｕｓダイアグラムより、活性化エネルギーが、４６．６ｋＪ／ｍｏｌであることが算出された。図６のパネルＤに示されるように、２５〜５０℃の温度範囲における基質の加水分解に対するＫｍ値のＶａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆダイアグラム（図６のパネルＣ）より、ΔＨが−６１．９ｋＪ／ｍｏｌであることが算出された。
【０１７３】
一方、ＳＧＡＰは、図６のパネルＡに示されるように、至適反応温度が、６５℃付近であった。また、図６のパネルＢに示されるように、３０〜５０℃の温度範囲におけるＬ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの加水分解のＡｒｒｈｅｎｉｕｓダイアグラムより、活性化エネルギーが、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下では、３８．６ｋＪ／ｍｏｌであり、１ｍＭ  ＣａＣｌ2非存在下では、２７．７ｋＪ／ｍｏｌであることが算出された。図６のパネルＤに示されるように、２５〜５０℃の温度範囲で基質の加水分解のＫｍ値のＶａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆダイアグラム（図６のパネルＣ）により、ΔＨが、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下では、−３４．６ｋＪ／ｍｏｌであり、１ｍＭ  ＣａＣｌ2非存在下では、−４６．６ｋＪ／ｍｏｌであることが算出された。
【実施例８】
【０１７４】
各酵素（１μｇ／ｍｌ、３７℃）と、ＳＳＡＰについて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）溶解させたインヒビター、ＳＧＡＰについて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＣａＣｌ2に溶解させたインヒビターとを混合して、５分間、プレインキュベーションし、得られた混合物に基質を添加することにより、ベスタチン〔塩酸ベスタチン、シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）社製〕、アマスタチン〔ペプチド研究所製〕、Ｄ−Ｌｅｕ及びＬ−Ｌｅｕによる組換えＳＳＡＰ及びＳＧＡＰの阻害を決定した。全アッセイを、基質としてＬ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの濃度を変え、前記手順で行なった。結果を表４に示す。
【０１７５】
【表４】
2005218319.tif 000005
【０１７６】
表４に示されるように、アマスタチンは、ＳＧＡＰに対し、Ｋi＝０．０１１μＭ、ベスタチンは、Ｋi＝３．９μＭのより弱いインヒビターであることがわかる。組換えＳＳＡＰは、アマスタチン及びベスタチンによる阻害について、それぞれ、０．７９μＭ及び６５μＭであった。遊離Ｌ−Ｌｅｕの阻害定数は、組換えＳＳＡＰ及びＳＧＡＰで、それぞれ、１００ｍＭ以上及び２９ｍＭである。さらに、Ｄ−Ｌｅｕの阻害定数は、ＳＧＡＰについて、Ｋi＝４０ｍＭであった。対照的に、組換えＳＳＡＰについて、Ｄ−Ｌｅｕの阻害定数は、１００ｍＭ以上であった。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明によれば、適した条件下でのアミノ酸解析、種々のリード化合物の合成反応等の触媒等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、ＳＳＡＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＳＳＡＰの電気泳動図である。パネルＡは、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２の野生型アミノペプチダーゼの各精製段階における精製度を示す。パネルＢは、精製野生型ＳＳＡＰ、熱処理組換えＳＳＡＰ及びＳＧＡＰの電気泳動図である。マーカーは、低分子量マーカー（分子量：９４，０００、６７，０００、４３，０００、３０，０００、２０，１００及び１４，４００）である。
【０１７９】
【図２】図２は、ＳＳＡＰ遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。図中、塩基配列の下線部は、推定リボソーム結合部位（図中、「ｓ．ｄ．」）、−３５配列（図中、「−３５」）及び−１０配列（図中、「−１０」）のそれぞれを示し、アスタリスクは、終止コドンを示し、矢印は、転写終結因子を示す。また、精製アミノペプチダーゼ及びトリプシン分解部分ペプチドを用いて決定されたアミノ酸配列を、太字で示す。
【０１８０】
【図３】図３は、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２のアミノペプチダーゼ（ＳＳＡＰ）のアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。図中、「ＳＳＡＰ」は、ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２のアミノペプチダーゼ（配列番号：２）、「ＳＡＡＰ」は、ストレプトマイセス  アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）のアミノペプチダーゼ（配列番号：９）、「ＳＧＡＰ」は、ストレプトマイセス  グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）のアミノペプチダーゼ（配列番号：１０）、「ＳＣＡＰ」は、ストレプトマイセス  セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアミノペプチダーゼ（配列番号：１１）を示す。図中、アスタリスクは、亜鉛配位部位を示し、「Ｃ」は、カルシウム結合部位を示す。アラインメントには、商品名：ＧＥＮＥＴＩＸプログラムを、デフォルト値で用いた。
【０１８１】
【図４】図４は、組換えＳＳＡＰの活性におけるｐＨの影響を示す図である。比較対照として、ＳＧＡＰを用いた。パネルＡは、基質加水分解速度〔Ｖ（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）〕におけるｐＨの影響、パネルＢは、Ｋｍ（ｍＭ）におけるｐＨの影響、パネルＣは、Ｖ／Ｋｍ（μｍｏｌ／分／ｍｇ／ｍＭ）におけるｐＨの影響を示す。図中、白丸は、ＳＳＡＰ、白四角は、ＣａＣｌ2非存在下でのＳＧＡＰ、黒四角は、１ｍＭ  ＣａＣｌ2 存在下でのＳＧＡＰを示す。反応は、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０及び６．５のそれぞれでは、８０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５及び９．０のそれぞれでは、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０、９．５、１０．０、１０．５及び１１．０のそれぞれでは、８０ｍＭ  炭酸緩衝液を用い、３７℃で行なった。なお、ＳＧＡＰの反応の場合、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下でも反応を行なった。基質の加水分解速度（Ｖ）は、終濃度３．２ｍＭ  Ｌ−Ｌｅｕ−ｐＮＡで行なった。
【０１８２】
【図５】図５は、組換えＳＳＡＰの熱安定性を調べた結果を示す。比較対照として、ＳＧＡＰを用いた。図中、数値は、最大値に対するパーセンテージとして示す（組換えＳＳＡＰ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下でのＳＧＡＰ及びＣａＣｌ2非存在下でのＳＧＡＰのそれぞれの１００％＝０．２３、１．６０及び０．５３μＭ／分）。また、図中、白丸は、ＳＳＡＰ、白四角は、ＣａＣｌ2非存在下でのＳＧＡＰ、黒四角は、１ｍＭ  ＣａＣｌ2 存在下でのＳＧＡＰを示す。各酵素は、１μｇ／ｍｌで用いた。酵素活性は、各酵素を各温度で３０分間インキュベーションした後、ｐＨ８．０で測定した。
【０１８３】
【図６】図６は、組換えＳＳＡＰによるＬ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの加水分解の温度依存性を調べた結果を示す図である。比較対照として、ＳＧＡＰを用いた。パネルＡは、ｋｃａｔ（ｓ-1）における温度の影響、パネルＢは、Ａｒｒｈｅｎｉｕｓプロット、パネルＣは、Ｋm（ｍＭ）のｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロット、パネルＤは、ＳＳＡＰによるＬ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ加水分解のエネルギーダイアグラムを示す。図中、白丸は、ＳＳＡＰ、白四角は、ＣａＣｌ2非存在下でのＳＧＡＰ、黒四角は、１ｍＭ  ＣａＣｌ2存在下でのＳＧＡＰを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１８４】
配列番号：５は、プライマーの配列である。
【０１８５】
配列番号：６は、プライマーの配列である。
【０１８６】
配列番号：７は、プライマーの配列である。
【０１８７】
配列番号：８は、プライマーの配列である。
【図１】
2005218319.tif 000006
【図２】
2005218319.tif 000007
【図３】
2005218319.tif 000008
【図４】
2005218319.tif 000009
【図５】
2005218319.tif 000010
【図６】
2005218319.tif 000011
【配列表】
2005218319000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月4日(2004.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）により産生されるものである、請求項１記載のアミノペプチダーゼ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
すなわち、本発明は、
〔１〕  下記性質：
（１）至適反応ｐＨ：
ｐＨ７．５〜１０．５
（２）基質特異性：
Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−メチオニン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−リジン−ｐ−ニトロアニリド、Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド及びＬ−プロリン−ｐ−ニトロアニリドに対して加水分解活性を示す、
（３）至適反応温度：
約７５℃、
（４）熱安定性：
５０％熱不活性化温度として、約７８℃
（５）カルシウムイオンによる触媒活性の影響が実質的にない、
を有するアミノペプチダーゼ、
〔２〕  ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９）により産生されるものである、前記〔１〕記載のアミノペプチダーゼ、
〔３〕  （Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列を含有してなり、コードされるポリペプチドが、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すものである、アミノペプチダーゼをコードする核酸、
〔４〕  前記〔３〕記載の核酸を含有してなる、アミノペプチダーゼの発現用担体、
〔５〕  前記〔３〕記載の核酸を保持してなる形質転換細胞、
〔６〕  １）前記〔５〕記載の形質転換細胞を培養して、培養物を得る工程、及び
２）前記工程１）で得られた培養物からアミノペプチダーゼを回収する工程、
を含む、組換えアミノペプチダーゼの製造方法、
〔７〕  前記〔３〕記載の核酸によりコードされる組換えアミノペプチダーゼ、
〔８〕  （ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも１００ヌクレオチド残基からなる塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、又は
（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列若しくは該塩基配列に対する実質的に相補的な塩基配列、
を含有してなる、前記〔３〕記載の核酸を検出するためのプローブ、
〔９〕  Ａ．  （Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中の塩基番号：２６８〜２７４、３２５〜３３４、５３４〜５５８からなる群より選ばれたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列、又は（ＩＩ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸に対して、前記（Ｉ）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同等の相補性を示すオリゴヌクレオチドの塩基配列、
を含有したオリゴヌクレオチドと、
Ｂ．  配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸の配列中、前記Aのオリゴ
ヌクレオチドに対応する塩基配列の３’末端のヌクレオチド残基から少なくとも１００ヌクレオチド残基離れたヌクレオチド残基を含む連続した少なくとも２０ヌクレオチド残基からなる塩基配列に対する実質的に相補的な配列を含有したオリゴヌクレオチドと
からなる、前記〔３〕記載の核酸若しくはその一部を増幅するためのプライマー対、
〔１０〕  前記〔８〕記載のプローブを用いたハイブリダイゼーション及び／又は前記〔９記載のプライマー対を用いたＰＣＲにより、（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列、
（Ｃ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列において、少なくとも１つのヌクレオチド残基の置換、欠失、付加又は挿入を有する塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
（Ｄ）前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸の塩基配列であり、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、及び
（Ｅ）前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列をコードし、かつコードされるポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を示すものである塩基配列、
からなる群より選ばれた塩基配列中の該プローブに対応する領域及び／又は該プライマー対を用いて得られたＰＣＲ増幅産物に対応する領域を検出し、カルシウムイオンの非存在下で、アミノアシル−ｐ−ニトロアニリドに対して、加水分解活性を示すアミノペプチダーゼをスクリーニングすることを特徴とする、アミノペプチダーゼの検索方法、並びに
〔１１〕  前記〔１〕若しくは〔２〕記載のアミノペプチダーゼ又は前記〔４〕若しくは〔５〕記載の組換えアミノペプチダーゼに対する抗体又はその断片、
に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
なお、前記ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
ストレプトマイセス  セプタタス  ＴＨ−２〔Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＴＨ−２と命名・表示され、寄託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７３２９（寄託日：１９９９年３月２４日）として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されている〕〔ハギシタ（Ｈａｇｉｓｈｉｔａ，Ｔ．）ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２，１５８７−１５９０（２０００）；畑中（Ｈａｔａｎａｋａ，Ｔ．）ら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，３１，２３３−２４１，（２００２）〕を、培地〔組成：０．５重量％  グルコース、０．５重量％  クエン酸、０．２重量％  Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５重量％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５重量％  ポリペプトン及び０．５重量％  酵母エキス〕中３４℃で２６時間好気的に培養した。培養中、経時的に培養物  １ｍｌを採取し、得られた培養物を遠心分離して、培地上清を得た。得られた培地上清を、ホスファチジル−パラ−ニトロフェノールの加水分解反応に供し、培地上清中における細胞外ホスホリパーゼＤを検出した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＰＬＤ抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションにより、培地上清中における細胞外ホスホリパーゼＤを解析した。