(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の同定及びその定量情報を簡単な処理で得ることのできる分析方法を提供する。【解決手段】質量分析計を用いて２種のタンパク質含有試料を対比し、それぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を解析する方法において、試料をそれぞれペプチド鎖含有試料とする工程と、ペプチド鎖含有試料に含まれる同種のペプチド鎖に質量差を与える工程と、同試料を混合し該混合試料を各ペプチド鎖毎に分別定量してＭＳスペクトルを測定し、含有量比を求める工程と、各ペプチド鎖からアミノ酸配列を特定すべきペプチド鎖を選択し、該ペプチド鎖のアミノ酸配列を定性する工程と、既知ＤＮＡ配列より対応するタンパク質を特定する工程と、前記同位体修飾したペプチド鎖の質量差による分別定量値に基づいて、前記特定したタンパク質の前記各タンパク質含有試料に含まれる含有量の比を求める工程と、を含タンパク質解析方法。【選択図】図１
2005181011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計を用い、２種のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれるタンパク質の同定及びそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を解析するタンパク質解析方法において、
前記２種のタンパク質含有試料をそれぞれ制限酵素により特定アミノ酸部位で切断し、ペプチド鎖含有試料とする工程と、
同位体により異なる質量差を有する標識化合物を前記それぞれのペプチド鎖含有試料に含まれるペプチド鎖に修飾し、それぞれのペプチド鎖含有試料に含まれる同種のペプチド鎖に質量差を与える工程と、
各同位体標識したペプチド鎖含有試料を混合し、該混合試料を各ペプチド鎖毎に分別定量してＭＳスペクトルを測定し、同位体標識によって質量差を与えられた同種のペプチド鎖について含有量比を求める工程と、
前記ＭＳスペクトルを参照して、各ペプチド鎖からアミノ酸配列を特定すべきペプチド鎖を選択し、該ペプチド鎖から生成されるプロダクトイオンの質量スペクトルによって、該ペプチド鎖のアミノ酸配列を定性する工程と、
前記ペプチド鎖のアミノ酸配列に基づき、既知ＤＮＡ配列より対応するタンパク質を特定する工程と、
前記同位体修飾したペプチド鎖の質量差による分別定量値に基づいて、前記特定したタンパク質の前記各タンパク質含有試料に含まれる含有量の比を求める工程と、
を含むことを特徴とするタンパク質解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質解析方法において、
前記標識化合物としてＯ−メチル−イソウレアとその安定同位体を用いたことを特徴とするタンパク質解析方法。
【請求項３】
請求項２に記載のタンパク質解析方法において、
前記同種のペプチド鎖の含有量比を求める工程で、前記修飾化合物によって質量差を与えられた同種のペプチド鎖の２つのＭＳスペクトルのピークを比較する際に、天然に存在する同位体元素によるペプチド鎖の同位体ピークとの重なりを除去して定量比の補正をすることを特徴とするタンパク質解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の解析方法、特にタンデム型の質量分析計を用いた解析方法の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノムプロジェクトのような遺伝子情報の解析プロジェクトの進展に伴い明らかにされた膨大な遺伝子情報と、細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関連を明らかにすることにより、遺伝子の機能解析を進めていくことが求められている。プロテオーム解析は、細胞の機能を支える多様なタンパク質の関係を総合的にとらえようとする試みである。しかし現在の分析技術では、タンパク質の解析には多大な時間と労力が必要とされており、このように多様性に富むタンパク質の集合であるプロテオームの変化を、総合的に、しかも迅速に把握することが求められている。
従来タンパク質の分離分析として一般的に行われている電気泳動法では、高い分離能で分離できる一方で、自動化が困難で再現性や定量性の確保が難しいという問題があった。
そのため、近年、液体クロマトグラフと質量分析計、データ解析システムを結合し、試料の分離からタンパク質の同定に至る過程を一貫して自動的に行う大規模なタンパク質同定システムが開発されている。
【特許文献１】特開２００３−１０７０６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
また、正常状態と疾病状態の間における、細胞タンパク質の量の変化や、発生中の組織、病気になった組織、または遺伝的に変異した組織で発現するタンパク質の量を観察するための需要が高まっている。つまり、細胞内のタンパク質の同定だけでなく、タンパク質の量といった定量情報も同時に求められている。
そのため、ＩＣＡＴ(登録商標)試薬を用いた試料間の定量比較が広く行われている（例えば、特許文献１参照）。しかし、このＩＣＡＴ(登録商標)法では、前処理操作が煩雑であるという問題があった。
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、その目的はタンパク質の同定及びその定量情報をより簡単な処理で得ることのできるタンパク質分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するために、本発明のタンパク質解析方法は、質量分析計を用い、２種のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれるタンパク質の同定及びそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を解析するタンパク質解析方法において、前記２種のタンパク質含有試料をそれぞれ制限酵素により特定アミノ酸部位で切断し、ペプチド鎖含有試料とする工程と、同位体により異なる質量差を有する標識化合物を前記それぞれのペプチド鎖含有試料に含まれるペプチド鎖に修飾し、それぞれのペプチド鎖含有試料に含まれる同種のペプチド鎖に質量差を与える工程と、各同位体標識したペプチド鎖含有試料を混合し、該混合試料を各ペプチド鎖毎に分別定量してＭＳスペクトルを測定し、同位体標識によって質量差を与えられた同種のペプチド鎖について含有量比を求める工程と、前記ＭＳスペクトルを参照して、各ペプチド鎖からアミノ酸配列を特定すべきペプチド鎖を選択し、該ペプチド鎖から生成されるプロダクトイオンの質量スペクトルによって、該ペプチド鎖のアミノ酸配列を定性する工程と、前記ペプチド鎖のアミノ酸配列に基づき、既知ＤＮＡ配列より対応するタンパク質を特定する工程と、前記同位体修飾したペプチド鎖の質量差による分別定量値に基づいて、前記特定したタンパク質の前記各タンパク質含有試料に含まれる含有量の比を求める工程と、を含むことを特徴とする。
【０００５】
上記のタンパク質解析方法において、前記標識化合物としてＯ−メチル−イソウレアとその安定同位体を用いることが好適である。
上記のタンパク質解析方法において、前記同種のペプチド鎖の含有量比を求める工程で、前記修飾化合物によって質量差を与えられた同種のペプチド鎖の２つのＭＳスペクトルのピークを比較する際に、天然に存在する同位体元素によるペプチド鎖の同位体ピークとの重なりを除去して定量比の補正をすることが好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の請求項１に係るタンパク質分析方法によれば、簡単な処理でタンパク質の定量情報を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に図面を参照して本発明の好適な実施形態を説明する。図１は、本実施形態のタンパク質解析方法の流れを示す説明図である。本実施形態のタンパク質解析方法は、タンデム型の質量分析計を用い、２種のタンパク質含有試料を対比して、それぞれの試料に含まれるタンパク質の同定及びそれぞれの試料に含まれる同種のタンパク質の量比を解析するというものである。
２種のタンパク質試料としては、例えば、同種の生体組織について、一つは健常状態のサンプルから採取したもの、もう一方は、疾病状態のサンプルから採取したもの等が想定される。そして、それらのタンパク質含有試料に含まれるタンパク質成分の発現量を定量比較する。
本実施形態のタンパク質解析方法の工程は、試料の前処理の工程(図１での混合試料を作成する段階まで)と、タンデム型質量分析計によって得たデータの解析の工程(図１でＭＳスペクトルによる含有量比の決定、ＭＳ／ＭＳスペクトル及びデータベースによるタンパク質の同定の部分)とに大きく分けられる。
【０００８】
試料の前処理の工程では、比較する２種のタンパク質含有試料の処理を行う。ここでの主な目的は、それぞれの試料に対し、同位体によって異なる質量数を持った標識化合物を標識し、質量差によってどちらの試料に由来するタンパク質であるか標識付けることにある。また、質量分析計によってタンパク質の１次構造を決定するためには、タンパク質成分をより短いペプチド鎖に切断する必要がある。
そこでまず初めに、２種のタンパク質含有試料(図１ではそれぞれ試料Ａ、試料Ｂとした)について、試料中のタンパク質成分を制限酵素によって特定のアミノ酸部位で切断し、ペプチド鎖とし、元の試料からペプチド鎖含有試料を得る。ここで、ペプチド鎖とはアミノ酸の個数が数個から十数個のものを指す事とする。つまり、質量分析計によって分析可能な長さのものを指す。
【０００９】
次にそれぞれのペプチド鎖含有試料に、質量差を有する標識化合物を修飾する。この標識化合物として、それを構成する元素の一部を同位体元素に変えることで質量数の異なる2つのものを用意する。図１では、ペプチド鎖含有試料Ａに対し、軽い標識化合物、同じく試料Ｂに対し、重い標識化合物を修飾した場合を示している。
このようにして同位体標識したそれぞれのペプチド鎖含有試料を混合する。
【００１０】
次にこうして得た混合試料を、液体クロマトグラフ及びタンデム型質量分析計によって分析を行う。本実施形態では、まず液体クロマトグラフによって、各ペプチド鎖毎に分離する。
そして、各ペプチド鎖は、タンデム型質量分析計へと送られ、第１の質量分析計でＭＳスペクトル、第２の質量分析計でＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。こうして得られたデータの解析は以下のようにして行う。
各ペプチド鎖は、試料Ａ由来のものと、試料Ｂ由来のものとがあり、それぞれは、同位体標識によって一定の質量差が与えられている。そのため、上記のＭＳスペクトルデータでは、試料Ａ由来のペプチド鎖のピークと、試料Ｂ由来のペプチド鎖のピークが分離して示される。これらの各ピーク高さ(または、ピーク面積等)を比較することで、このペプチド鎖の試料Ａでの含有量と試料Ｂでの含有量との比を求めることができる。
【００１１】
次に上記のペプチド鎖が何のタンパク質の一部であったかを特定するため、上記各ペプチド鎖のＭＳ／ＭＳスペクトルデータを解析する。このとき、上記ＭＳスペクトルを参照して、測定した各ペプチド鎖の内、どのペプチド鎖についてタンパク質の特定を行うかを選択することができる。
選択されたペプチド鎖に対して、周知の解析技術によって、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータから各ペプチド鎖のアミノ酸配列を決定することができる。つまり、ペプチド鎖のアミノ酸配列に基づき、既知ＤＮＡ配列を記憶した公知のデータデースによって、そのペプチド鎖に対応する遺伝子及びタンパク質を特定することができる。
上記でペプチド鎖の試料Ａでの含有量と試料Ｂでの含有量との比は求められていたので、そのペプチド鎖に対応したタンパク質について、試料Ａでの含有量と試料Ｂでの含有量との比が求められることとなる。
【００１２】
以上が本実施形態の概略説明である。以下に、各工程について詳細に説明する。
まず、最初の工程では、２種類のタンパク質含有試料Ａ、Ｂに対し、それぞれの試料を制限酵素によって特定のアミノ酸の部位で切断し、ペプチド鎖に断片化する。この制限酵素としては、Ｌｙｓ−Ｃ／Ｐを用い、リジンのＣ末端側で切断する。
次の工程では、上記のようにペプチドに断片化した試料に対し、質量差を有する標識化合物を修飾することで、試料Ａ、試料Ｂにそれぞれ含まれるペプチド鎖に質量差を持たせる。
標識化合物として下記の化学式(１)、(２)で表されるＯ−メチル−イソウレア(Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｅ−ｉｓｏｕｒｅａ)を用いる。
【００１３】
化学式(１)
【化１】
2005181011.tif 000003
化学式(２)
【化２】
2005181011.tif 000004
ここで、上記の化学式でＣ及びＮの左肩の数字は、質量数を表している。つまり、重い標識化合物(化学式(２))は、軽い標識化合物(化学式(１))の質量数１４の窒素原子Ｎ及びメチル基以外の質量数１２の炭素原子Ｃを、それぞれ、質量数１５の窒素原子Ｎ、質量数１４の炭素原子Ｃという安定同位体に置き換えている。そのため、重い標識化合物(質量数４５)と軽い標識化合物(質量数４２)とでは３Ｄａの質量差を持つことになる。
上記のＯ−メチル−イソウレアは下記の反応でリジン残基の部分と結合する。
【００１４】
【化３】
2005181011.tif 000005
そこで、軽い試薬で試料Ａに含まれるペプチド鎖を、重い試薬で試料Ｂに含まれるペプチド鎖を、それぞれ同位体修飾する。その後、これらの同位体標識をした試料Ａ、試料Ｂを混合する。
次に上記の混合試料を液体クロマトグラフ(ＬＣ)によって分離する。重い標識化合物と軽い標識化合物とには化学的性質には相違はない、つまり同種のペプチド鎖であれば試料Ａ由来のものと試料Ｂ由来のものとでは質量数以外に差がないため、ＬＣによる分離では、同種の試料Ａ由来のペプチド鎖と試料Ｂ由来のペプチド鎖とは同一のピークとして現れる。混合試料は、ＬＣによる分離の後、質量分析計によって分析が行われる。
【００１５】
本実施形態においては質量分析計として、四重極飛行時間型のタンデム型質量分析計(ＭＳ／ＭＳ)を用い、ＭＳスペクトル及びＭＳ／ＭＳスペクトルを測定する。この装置構成としては、従来と同様なものを用いることができる。また、この他にもフーリエ変換質量分析計（ＦＴ−ＭＳ）も用いることが可能である。ＬＣによって分離された混合試料は、ＥＳＩ(エレクトロスプレーイオン化法)等で、ペプチド鎖がイオン化され、第１の質量分析計に送られる。第１の質量分析計で上記のイオンから特定の前駆イオンが選択され、第２の質量分析計へと送られる。この前駆イオンは、アルゴンガス等を照射されることでさらに小さいプロダクトイオンに断片化され、第２の質量分析計で検出される。このように、選択されたペプチドイオンに対して、それを断片化したプロダクトイオンの質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）が得られる。また、同時に、プロダクトイオンに断片化される前のペプチド鎖に対するＭＳスペクトルデータも得られる。
このようにして得られたＭＳスペクトルデータ及びＭＳ／ＭＳスペクトルデータは、コンピュータに保存され、以下のようなデータ処理によって試料に含まれているタンパク質の同定、２つの試料に含まれているタンパク質の相対比、が求められる。
【００１６】
まず、ＭＳスペクトルデータから、各ペプチド鎖について、試料Ａ由来のものと、試料Ｂ由来のものとの量比を求めることができる。つまり、ＭＳスペクトルの一つのペプチド鎖のピーク(試料Ａ由来のもの)と、そのピークと３質量差離れた場所に現れるピーク(試料Ｂ由来のもの)と、を比較することによって、試料Ａに含まれていたあるペプチド鎖の量と、試料Ｂに含まれていたそのペプチド鎖の量との相対比が求まることになる。
ただし、天然の元素の多くは、各元素に固有の安定同位体が存在する。このため、ある化合物の分子量も、その化合物を構成する各元素が、どの質量数の同位体をどのくらい含んでいるかによって、幾つかのピークが存在することになる。それぞれのピークの比は、化合物を構成する元素の同位体の天然の存在比から求めることが可能である。そこで、上記のようにして同定したタンパク質の試料Ａと、試料Ｂとの定量比を比較するときには、この天然に存在する同位体ピークの分を考慮に入れ、天然の安定同位体によるピークの部分を引いておく必要がある。
【００１７】
図２がその説明図である。図２(ａ)に示すように、ＭＳスペクトルにおいて一つのペプチドのピークに(符号２１０ａ)は、それぞれ天然に存在する同位体のピーク(符号２１０ｂ、２１０ｃ、２１０ｄ、２１０ｅ、・・・)が付随する。図２(ａ)では、それらのピークの内、最も質量数が低いものを実線で、他のものを点線で示した。
【００１８】
一方、２種類のタンパク質試料Ａ、Ｂをそれぞれ異なる質量数を持つ標識化合物Ｏ−メチルイソウレアで修飾したため、混合試料のＭＳスペクトルにおいて、軽い標識化合物で同位体標識したペプチドのピーク(符号２１０ａ)に対応して、質量数３だけ離れた位置に、重い標識化合物で同位体標識したペプチドのピーク(符号２２０)が現れることになる。そのため、軽い標識化合物でラベル化したペプチド鎖に付随する天然に存在する同位体のピークの一つ(図２(ｂ)の符号２１０ｄ)と、重い標識化合物でラベル化したペプチドのピーク(符号２２０)とが重なってしまう。そこで、符号２２０のピークから、符号２１０ｄのピークを差し引いて得たピーク高さ(符号２４０)と、符号２１０ａのピーク高さ(符号２３０)とを比較することで、それぞれのピークで表されたペプチド鎖の量比が決定される。
ここでは、ピークの内最も質量数の小さいピークを基準として用いた場合を示したが、他の部分、例えば、ピーク高さが最も高いピークを基準として用いてもよい。
【００１９】
次に、ＭＳ／ＭＳスペクトルからは、各ペプチド鎖のアミノ酸配列が決定される。ここで、どのペプチド鎖に対してアミノ酸配列の特定を行うかは、上記のＭＳスペクトルによる情報をもとにして選択することができる。この選択は、解析の目的に応じて行えばよい。例えば、試料Ａと試料Ｂとの間で異なる部分のみを解析したい場合、試料Ａと試料Ｂとで含有量が異なるペプチド鎖に対してのみ解析を行えばよい。もちろん、同量のものについて解析を行っても、また、すべてのペプチド鎖に対して解析を行ってもよい。このように、どのペプチドを解析するかを選択できるため、効率よく試料の解析を行うことができる。
以上のようにしてペプチド鎖のアミノ酸配列が決定されれば、既知のＤＮＡ配列を記録した公知のデータベース検索ソフト(例えば、Ｍａｓｃｏｔ等)によって、そのアミノ酸配列と、既知タンパク質の遺伝子情報とが比較され、目的とするペプチド鎖に対応するタンパク質が同定できる。
【００２０】
各ペプチド鎖に対する試料Ａ、試料Ｂにおける含有量の比は、上記のようにＭＳスペクトルから求められているため、タンパク質自身の含有量の比もそのタンパク質に対応するペプチド鎖の含有量の比として求まることとなる。
このように、ＭＳ／ＭＳスペクトルから両方の試料Ａ、Ｂ中に含まれていたタンパク質を同定すると同時に、ＭＳスペクトルからその相対量を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のタンパク質分析方法の説明図
【図２】データ処理の説明図
【図１】
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【図２】
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