(57)【要約】 【課題】  ｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を特定の位置で切断する。【解決手段】  本発明のヌクレオチド鎖（ターゲット）の切断方法は、ターゲットに対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、プライマが結合されたターゲットを所定の制限酵素を用いて切断する。例えば、プローブとハイブリダイゼーションさせた後のｃＤＮＡに、制限酵素認識配列を有するプライマをさらにハイブリダイゼーションする。その後、制限酵素を添加して二重鎖となった部分を切断し、ｃＤＮＡの余剰部分を除去する。【選択図】  図４
2005110567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）に対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、
上記プライマが結合された上記ターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断すること
を特徴とするヌクレオチド鎖の切断方法。
【請求項２】
上記ターゲットの塩基配列のうち必要な領域を特定し、当該必要な領域以外の領域から所定の制限酵素の認識配列を検出し、
検出した制限酵素の認識配列のうち少なくとも１つを選択し、
上記制限酵素の認識配列を少なくとも含むとともに当該認識配列と連続している３´側及び５´側の塩基配列を含めることによって、上記必要な領域の塩基配列に対して特異な配列を形成し、
上記特異な配列に対して相補的な塩基配列であるプライマを生成し、
上記ターゲットと上記プライマとをハイブリダイゼーションすることによって、上記ターゲットにプライマを結合し、
プライマが結合されたターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断すること
を特徴とする請求項１記載のヌクレオチド鎖の切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、ｓｓＤＮＡやｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を切断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列されたいわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
ＤＮＡチップは、ガラスやシリコン等の基板上にＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（Complementary DNA）等の検出用のＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）が配置されており、そのＤＮＡプローブに対して検体等から抽出された一本鎖のターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより、ＤＮＡ解析を行うことができる。
【０００４】
ＤＮＡチップによるＤＮＡの解析は、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブ及びターゲットＤＮＡに対してインターカレータ等を挿入し、所定の検出器で蛍光測定を行うことによってターゲットＤＮＡの塩基配列を判断する。
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０３８４５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、ターゲットＤＮＡは、自然な状態では数キロベースにも及ぶ長さとなってしまう。
【０００７】
そのため、ターゲットＤＮＡがランダムコイル状になり、立体障害によりハイブリダイゼーションを阻害してしまう。また、図１３に示すように、ＤＮＡプローブ（Ｐ）とターゲットＤＮＡ（Ｔ）とをハイブリダイゼーションを行ったとしても、ターゲットＤＮＡ（Ｔ）ハイブリダイゼーションが行われていない余剰部分が多い。そのため、その余剰部分が自身でハイブリダイゼーションを起してしまい、この部分が蛍光検出を行った時のノイズとなってしまう。
【０００８】
このような問題を解決するために、ＤＮＡプローブの塩基配列とは関係しない部位（解析対象となっていない部位）に関しては、ハイブリダイゼーションの後に、又は、ハイブリダイゼーションの前から、ターゲットＤＮＡから除去することが望ましい（特許文献１参照。）。
【０００９】
一般に、ｃＤＮＡ等を切断する手法として、超音波により切断する手法が知られている。しかしながら、超音波を用いる手法の場合、切断位置を特定することができずｃＤＮＡの長さがまちまちとなり、例えば蛍光測定等を行った時に蛍光の検出強度が安定しない。
【００１０】
そこで、以上のような問題を解決するため、ｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を特定の位置で切断することができるヌクレオチド鎖の切断方法を提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法は、切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）に対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、上記プライマが結合された上記ターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断する。
【００１２】
例えば、本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法は、上記ターゲットの塩基配列のうち必要な領域を特定し、当該必要な領域以外の領域から所定の制限酵素の認識配列を検出し、検出した制限酵素の認識配列のうち少なくとも１つを選択し、上記制限酵素の認識配列を少なくとも含むとともに当該認識配列と連続している３´側及び５´側の塩基配列を含めることによって、上記必要な領域の塩基配列に対して特異な配列を形成し、上記特異な配列に対して相補的な塩基配列であるプライマを生成し、上記ターゲットと上記プライマとをハイブリダイゼーションすることによって、上記ターゲットにプライマを結合し、プライマが結合されたターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法では、切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）に対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、プライマ所定の制限酵素を用いて切断するので、特定の位置でｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を切断することが、また、切断後に残存するヌクレオチド鎖の長さを特定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態として、ハイブリダイゼーションを行う際におけるターゲットＤＮＡの切断の方法について説明をする。
【００１５】
なお、ここで、ターゲットＤＮＡとは、解析対象となる一本鎖のヌクレオチド鎖であり、例えばｃＤＮＡやｓｓＤＮＡ、一本鎖のＲＮＡ等である。また、プローブとは、ターゲットＤＮＡの解析対象となる部位の塩基配列に対して相補的な塩基配列とされているヌクレオチド鎖である。通常、プローブは、ＤＮＡチップ上のウェル内に固定化されている。
【００１６】
まず、ターゲットＤＮＡの塩基配列に基づき切断用プライマを作成する。
【００１７】
図１（Ａ）に示すように、ハイブリダイゼーションの対象となるターゲットＤＮＡの塩基配列中で、プローブがハイブリダイゼーションする塩基配列の領域（プローブ設計領域[Ｐ]）を特定する。
【００１８】
続いて、図１（Ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡのプローブ設計領域[Ｐ]を除く領域で、任意の制限酵素認識配列と同一の配列の領域（制限酵素認識領域：[Ｘ１]，[Ｘ２]，[Ｘ３]…）を見つけ出す。なお、制限酵素とは、特定の塩基配列のパターンを検出して、そこで二本鎖のＤＮＡを切断する酵素のことである。制限酵素は、その種類毎にそれぞれ特異的な切断パターンを持っており、そこでしか二本鎖のＤＮＡは切断されないものである。また、見つけ出す制限酵素認識領域は、複数の制限酵素の認識配列を含んでいてもよい。
【００１９】
続いて、図１（Ｃ）に示すように、見つけ出した複数の制限酵素認識領域（[Ｘ１]，[Ｘ２]，[Ｘ３]…）のなかから、プローブ設計領域[Ｐ]を挟んで２つの制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]を選択する。選択した２つの制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]の間に挟まれた領域のことを領域のことを、ここでは選択領域[Ｚ]という。
【００２０】
なお、図１（Ｄ）に示すように、１つの制限酵素認識領域[Ｙ１]のみを選択して、一方をターゲットＤＮＡの末端としてもよい。この場合、選択領域[Ｚ]は、選択した制限酵素認識領域[Ｙ１]から、プローブ設計領域[Ｐ]を挟んで反対側にある末端までの領域となる。
【００２１】
続いて、図１（Ｅ）に示すように、制限酵素認識領域[Ｙ１]及び制限酵素認識領域[Ｙ２]のそれぞれに対して、制限酵素認識領域[Ｙ１]（又は制限酵素認識領域[Ｙ２]）を少なくとも含み、さらに、制限酵素認識領域[Ｙ１]の３´側及び５´側の塩基配列を含んだ領域（プライマ特定領域[Ｒ]）を特定する。
【００２２】
ここで、プライマ特定領域[Ｒ]は、選択領域[Ｚ]内で特異な配列でなければならない。つまり、プライマ特定領域[Ｒ]と同一の塩基配列が、選択領域[Ｚ]内に存在してはならない。従って、選択領域[Ｚ]内で特異な配列となるように、３´側及び５´側の塩基の数を増減しながら、プライマ特定領域[Ｒ]を決定する。なお、プライマ特定領域[Ｒ]は、選択領域[Ｚ]内で特異な配列にさえなっていれば、制限酵素認識領域[Ｙ１]の３´側及び５´側のいずれか一方の塩基配列又は両者の塩基配列を、含んでいなくてもよい。
【００２３】
続いて、図１（Ｆ）に示すように、プライマ特定領域[Ｒ]の塩基配列と相補的な塩基配列のプライマ（切断用プライマ１０）を生成する。
【００２４】
この切断用プライマ１０がターゲットＤＮＡの切断に用いられる。
【００２５】
つぎに、ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析を行う際における、ハイブリダイゼーション後のターゲットＤＮＡの余剰部分の切断手順を説明する。
【００２６】
図２は、溶液中で、一方の末端がウェルの側壁等に固定化されたプローブ１１と切断対象となるターゲットＤＮＡ１２とがハイブリダイゼーションした後の状態の図を示す。ターゲットＤＮＡ１２は、プローブ設計領域[Ｐ]に対応する部位がプローブ１１と結合して二本鎖を形成し、その他の部位は一本鎖の状態のままとなっている。
【００２７】
この状態から、図３に示すように上述の切断用プライマ１０を溶液に添加し、溶液温度を上昇させてターゲットＤＮＡ１２とプライマ１０とをハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションさせると、図３に示すように、切断用プライマ１０がプライマ特定領域[Ｒ]に対応する部位に結合し、この部位が二重鎖となる。
【００２８】
続いて、溶液中に、プライマ特定領域[Ｒ]を切断する制限酵素を添加する。このように制限酵素を添加すると、図４に示すように、ターゲットＤＮＡの余剰部分を切断することができる。
【００２９】
なお、ここではプローブ設計領域[Ｐ]の片側のみしか切断していないが、プローブ設計領域[Ｐ]の両側を切断してもよい。このようにプローブ設計領域[Ｐ]の両側を切断する場合であり、且つ、両者の制限酵素が異なる場合には、対応する２種類の制限酵素を添加すればよい。
【００３０】
以上のように本発明が適用されたターゲットＤＮＡの切断の方法では、ターゲットＤＮＡを目的の位置で切断することができ、そのためターゲットＤＮＡの長さを特定することができる。
【００３１】
具体的には、制限酵素認識領域[Ｙ１]の切断位置から[Ｙ２]の切断位置までの間が、切断後のターゲットＤＮＡとなる。従って、制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]を最適に選択すれば、ターゲットＤＮＡを目的の長さに切断することができる。
【００３２】
このことにより、例えば、ＤＮＡチップ上でターゲットＤＮＡをプローブとハイブリダイゼーションさせ、二重鎖となった部分にインターカレータを挿入し、その蛍光を検出することによって当該ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ解析に上述した切断方法を適用すれば、蛍光の発光強度を均一にすることができ、ノイズのない正確な測定をすることができる。
【００３３】
なお、本実施の形態の説明では、ハイブリダイゼーション後の余剰の一本鎖部分の切断に本発明を適用した場合について説明をしたが、本発明は一本鎖のヌクレオチド鎖を切断する場合であれば、特にハイブリダイゼーションの後に行う切断以外の場面での切断に適用してもよい。
【００３４】
つぎに、具体例について説明をする。
【００３５】
図５に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ２ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列が存在する。この“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列は、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列である。この“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図５中では特異な配列となる。なお、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”は、図６に示すような二本鎖配列を切断する制限酵素である。
【００３６】
従って、“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＡＴＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣ”という切断用プライマを生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を添加すると、図７に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。
【００３７】
図８に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ１ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列が２つ存在する。この“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列は、上述したように制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列である。この“ＧＧＡＴＣＣ”という配列と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図８中では特異な配列となる。
【００３８】
従って、“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＣＣ”という切断用プライマ、“ＴＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＧ”を生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を添加すると、図９に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。
【００３９】
図１０に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ２ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＡＡＧＣＴＴ”という塩基配列が存在する。この“ＡＡＧＣＴＴ”という塩基配列は、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”の認識配列である。この“ＡＡＧＣＴＴ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図１０中では特異な配列となる。なお、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”は、図１１に示すような二本鎖配列を切断する制限酵素である。
【００４０】
従って、“ＡＡＧＣＴＴ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧＣＧ”という切断用プライマを生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”を添加すると、図１２に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（Ａ）はターゲットＤＮＡのプローブ設計領域Ｐを示す図であり、（Ｂ）はターゲットＤＮＡの制限酵素認識領域Ｘを示す図であり、（Ｃ）は両端が制限酵素の場合の選択領域Ｚを示す図であり、（Ｄ）は一端が末端となっている場合の選択領域Ｚを示す図であり、（Ｅ）はプライマ特定領域Ｒを示す図であり、（Ｆ）は切断用プライマを示す図である。
【図２】ハイブリダイゼーションされたターゲットとプローブを示す図である。
【図３】ターゲットに切断用プライマをハイブリダイゼーションさせた図である。
【図４】ターゲットを切断した図である。
【図５】制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列と、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。
【図６】制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を説明するための図である。
【図７】制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”により切断された上記“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。
【図８】マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。
【図９】制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”により切断された上記“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。
【図１０】制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”の認識配列と、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。
【図１１】制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”を説明するための図である。
【図１２】制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”により切断された上記“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。
【図１３】ハイブリダイゼーションされた状態のターゲットとプローブを示す図である。
【符号の説明】
【００４２】
１０  切断用プライマ、１１  プローブＤＮＡ、１２  ターゲット
【図１】
2005110567.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005110567.tif 000009
【図８】
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【図９】
2005110567.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
2005110567.tif 000013
【図１２】
2005110567.tif 000014
【図１３】
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