(57)【要約】【課題】  不純物有機酸として従来より微生物によりＤ−乳酸を生成蓄積させた培地中からの除去が容易ではなかったピルビン酸の蓄積量を低減化させたＤ-乳酸生産法を提供すること、更には、光学純度の高いＤ−乳酸を効率的に生産するＤ−乳酸の生産方法を提供すること。【解決手段】  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は除く）を導入した大腸菌であって、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産する大腸菌を培養して乳酸を製造する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は除く）を導入した大腸菌であって、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産することを特徴とする大腸菌。
【請求項２】
ピルビン酸を培地中に蓄積する性質を有する大腸菌にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のものは除く）を導入して得られることを特徴とする請求項１に記載の大腸菌。
【請求項３】
リポ酸要求性を有することを特徴とした請求項１又は請求項２に記載の大腸菌。
【請求項４】
ピルベートホルメートリアーゼの機能を欠失したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌。
【請求項５】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸菌。
【請求項６】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が乳酸菌由来であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌。
【請求項７】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および／またはペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、由来であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の大腸菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の大腸菌を、培地を用いて通気条件下で培養し、該培地中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめることを特徴とするＤ−乳酸製造法。
【請求項９】
培養の際の培地のｐＨを４〜８とすることを特徴とする請求項８に記載のＤ−乳酸製造法。
【請求項１０】
培養の際の培地のｐＨを６〜７とすることを特徴とする請求項９に記載のＤ−乳酸製造法。
【請求項１１】
培養を培養槽を用いて行い、その際の通気条件が酸素移動容量係数ｋLａが１ｈ-1以上４００ｈ-1以下となるような運転条件で温度３０℃の水に空気を常圧下の培養槽に供給したときに達成し得る酸素供給量と同等の条件であることを特徴とする請求項８〜１０の何れか一項に記載の乳酸製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸菌を培養して、培地にＤ−乳酸を生成蓄積させることを特徴とするＤ−乳酸の製造法に関し、詳しくは純度が高い、特にピルビン酸の生成蓄積量が少ないＤ−乳酸の効率的な製造法に関わる。更に詳しくは本発明はＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ｌｄｈと略することがある）をコードする遺伝子（但し、大腸菌由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、ｌｄｈＡと略することがある）をコードする遺伝子は除く。）を挿入した大腸菌であって、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産することを特徴とする大腸菌、及び該大腸菌を培養することによりＤ−乳酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性ポリマーであるポリ乳酸は、ＣＯ2問題・エネルギー問題の顕在化とともにサスティナビリティー（持続可能性）、ＬＣＡ（ライフサイクルアセスメント）対応型製品として強い注目を浴びており、その原料である乳酸には効率的で安価な製造法が求められている。
【０００３】
ちなみに現在生産されているポリ乳酸はＬ−乳酸ポリマーであるが、乳酸にはＬ−乳酸（以下、Ｌ体と略することがある）とＤ−乳酸（以下、Ｄ体と略することがある）の２種類の光学異性体があり、Ｄ体についてもポリマー原料や農薬、医薬の中間体として近年注目が集まりつつある。但しいずれの用途においても、原料たるＬ体、Ｄ体には高い純度要求されるのが事実である。
【０００４】
自然界には乳酸菌などの乳酸を効率良く生産する細菌が存在し、それらを用いた乳酸製造法の中には既に実用化されているものもある。例えば、Ｌ体を効率良く生産させる細菌としてＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなどがあり、Ｄ体を効率良く生産させる細菌としてＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物などが知られている。いずれの場合も嫌気培養で乳酸の蓄積量は高いレベルに達しているが、培養液中に含まれる乳酸以外の副生物、例えば酢酸、エタノール、アセトイン、ピルビン酸といった化合物が精製過程で除けずに、最終産物である乳酸の品質低下につながることがある。
【０００５】
そのような乳酸の純度低下を回避するには、細菌によって生産される副生物の量を低減化させることが最も効果的である。近年発展してきた遺伝子組換え技術を利用して微生物の特定遺伝子を破壊すれば、狙った副生物の生産を特異的に阻害することが可能となってきた。ただ現状的には、遺伝子破壊法がどのような細菌にでも容易に適応できる訳ではなく、乳酸菌など元来乳酸を高生産できる細菌での適応は困難である。なぜなら乳酸菌はゲノム情報が必ずしも十分とは言えず、遺伝子組換えの宿主としても汎用されていないからである。
【０００６】
それに対しゲノム情報が豊富で、遺伝子組換え宿主としての実績が十分にある細菌として大腸菌が挙げられる。
【０００７】
ゾウら〔Zhou,S., Appl Environ Microbiol (2003)  69 399-407〕の報告によれば、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）、フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄＡＢＣＤ）（以下ｆｒｄと略すことがある）、アルコール／アルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下ａｄｈＥと略すことがある）、およびアセテートキナーゼ（以下ａｃｋＡと略すことがある）の４重破壊大腸菌を５％のグルコースを含む無機塩培地で嫌気条件下にて１６８時間培養することによって、４８．５ｇ／ＬのＤ体が生産され、培地中のコハク酸、蟻酸、酢酸、エタノールといった副生物量が顕著に低減化されている。しかしながら、ピルビン酸については言及がなく、ピルビン酸生産能の低減化効果については不明である。ピルビン酸はＤ体の代謝反応前駆体であるため、例えばホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への反応を触媒する酵素を破壊すると、ピルビン酸蓄積量は低下するであろうが同時にＤ体蓄積量も低下するといった好ましからざる結果を招くことが予想される。一般にピルビン酸が乳酸モノマー原料に不純物として含まれた場合には、ポリマー重合率が低下する等の好ましからざる問題が生じることは当業者には良く知られた事実であり、その意味からもピルビン酸はぜひとも低減化すべき副生物の一つである。にも拘わらずＤ体蓄積量を低下させることなく、ピルビン酸蓄積量を低下させることに成功したという報告は過去になされていない。
【０００８】
コンタグら〔Contag, PR., Appl Environ Microbiol  (1990) 56 3760-3765〕はクロストリジウム・アセトブチリカム由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子をクローニングするため、嫌気条件下では増殖できないＦＭＪ３９という大腸菌株を宿主とした発現実験を行っている。ＦＭＪ３９にクロストリジウム・アセトブチリカム由来ｌｄｈ遺伝子を導入して発現させた株は、嫌気条件下でも増殖できるようになるため、この性質を利用してｌｄｈ遺伝子をクローニングしている訳である。彼らはこの実験で、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のｌｄｈ遺伝子断片が組み込まれた２種類の発現プラスミドｐＰＣ３７とｐＰＣ５８を、それぞれＦＭＪ３９に導入した株の乳酸生産濃度とｌｄｈ活性を開示している。その結果はｌｄｈ活性はＦＭＪ３９（ｐＰＣ３７）がＦＭＪ３９（ｐＰＣ５８）よりも高いにもかかわらず、乳酸生産量はＦＭＪ３９（ｐＰＣ３７）の方が低くなっていた。すなわち 、コンタグらはクロストリジウム・アセトブチリカム由来のｌｄｈ遺伝子を大腸菌で発現させてはいるものの、そのことにより乳酸の生産性が向上したことを示してはおらず、またそのことには全く言及もしていない。また、副生物であるピルビン酸についても全く言及していない。
【０００９】
またコンタグらとは別の細菌由来ｌｄｈを大腸菌に過剰発現させた例としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ｌｄｈの発現例としてはコッカーら〔Kochhar,S., Eur. J. Biochem., (1992) 208, 799-805〕やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ由来ｌｄｈの発現例としてコッカーら〔Kochhar,S., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1992)  185, 705-712〕が挙げられるが、いずれの例も発現させた酵素の物理化学的性質を調べたものであって、Ｄ体やピルビン酸の蓄積量についての言及は皆無である。
【００１０】
つまるところ、過去において大腸菌以外の乳酸デヒドロゲナーゼを大腸菌に過剰発現させた例はあるものの、乳酸の生産時に通気条件下で発現させ、乳酸の高生産と同時にピルビン酸蓄積量を有意に低下させることに成功したものは無かった。
【００１１】
トランスポゾンを用いたピルベートデヒドロゲナーゼ（以下ｐｄｈと略することがある）の変異及び／または変異剤を用いたピルベートホルメートリアーゼに関する変異を有する変異株については１９８３年にチャンら〔Chang,YY., J. Bacteriol., (1983) 154,756-762〕により取得されており、公知である。またこれらの株を利用したＤ体の生産例は報告されていない。
【００１２】
大腸菌を用いて乳酸発酵させる場合、一般には酸素の存在は好ましくないと考えられている。なぜなら酸素のような電子受容体が存在すると、大腸菌は発酵ではなく呼吸を行うからである。酸素のような電子受容体が無い場合に限り、大腸菌は基質レベルのリン酸化のみによりエネルギー（ＡＴＰ）を得、解糖系で得られた還元力（ＮＡＤＨ）を用いて乳酸などの還元性有機酸を生産する。そのような理由から、従来の大腸菌によるＤ体発酵は殆ど嫌気培養で行われている。まれに培養の前半を通気し、後半を嫌気培養するという二相培養が行われる場合もあるが、これは前半の通気培養によって十分な菌体量を確保するのが目的であり、最終的な乳酸発酵はやはり嫌気で行っている訳である。しかし実際の工業生産を想定した場合、培地に添加する安価なアミノ酸源であるコーンスティープリカー（以下ＣＳＬと略すことがある）等の中には不純物となる有機酸だけでなく、Ｄ体、Ｌ体両方の乳酸が含まれるが、嫌気培養だとＬ体が資化されず、培地中に残存したままとなる。Ｌ体からピルビン酸を生成する反応の触媒酵素であるＬ-乳酸デヒドロゲナーゼは通気条件下で発現することが知られているので、もし通気条件下でも効率良くＤ−乳酸発酵させる方法があれば、その方法を用いることで培地中に含まれるＬ体を菌体に資化させ、光学的にも高い純度のＤ体を生産させることが可能となるものと期待されるが、これまでそれを実現する技術は存在しなかった。
【非特許文献１】ゾウら、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー、アメリカ合衆国、（２００３）  ６９  ３９９−４０７〔Zhou,S., Appl Environ Microbiol, United States (2003)  69 399-407〕
【非特許文献２】コンタグら、アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー、アメリカ合衆国、（１９９０）  ５６  ３７６０−３７６５〔Contag, PR., Appl Environ Microbiol, United States  (1990) 56 3760-3765〕
【非特許文献３】コッカーら、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、ドイツ  （１９９２）  ２０８，  ７９９−８０５〔Kochhar,S., Eur. J. Biochem., Germany (1992) 208, 799-805〕
【非特許文献４】コッカーら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ、アメリカ合衆国  （１９９２）  １８５，  ７０５−７１２〔Kochhar,S., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1992)  185, 705-712〕
【非特許文献５】チャンら、ジャーナル  オブ  バイオテクノロジー、アメリカ合衆国、（１９８３）  １５４    ７５６−７６２〔Chang,YY., J. Bacteriol. (1983) 154   756-762〕
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の第１の目的は、不純物有機酸として従来より微生物によりＤ−乳酸を生成蓄積させた培地中からの除去が容易ではなかったピルビン酸の蓄積量を低減化させたＤ-乳酸生産法を提供することにある。そして本発明の第２の目的は光学純度の高いＤ−乳酸を効率的に生産するＤ−乳酸の生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、これら上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（但し、大腸菌由来のものは除く）を導入した大腸菌であって、グルコースが存在する培地で通気培養下でも野生型よりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が有意に多く発現する様に工夫された大腸菌、さらに好ましくは上記に加えてピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌ）、または／及びピルベートデヒドロゲナーゼ（ｐｄｈ）の活性が低下若しくは消失した大腸菌を培地で培養してＤ−乳酸を生成蓄積すると、Ｄ−乳酸の生成に同伴して培地中に生成蓄積する不純物であるピルビン酸の濃度が顕著に低下し、従来より短時間に高濃度にＤ−乳酸を生産し、培地中に光学異性体のＬ−乳酸が含まれていても光学純度９９．９％ｅｅ以上のＤ−乳酸を生産することを見出だし本発明に到達した。
【００１５】
すなわち本発明は以下のとおりである。
［１］  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は除く）を導入した大腸菌であって、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産することを特徴とする大腸菌。
［２］   （嫌気性条件下で培養した場合に）ピルビン酸を（培地中に）蓄積する性質を有する大腸菌にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のものは除く）を導入して得られることを特徴とする［１］に記載の大腸菌。
［３］  リポ酸要求性を有することを特徴とした［１］又は［２］に記載の大腸菌。
［４］  ピルベートホルメートリアーゼの機能を欠失したことを特徴とする［１］〜［３］のいずれか一項に記載の大腸菌。
［５］  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結されていることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか一項に記載の大腸菌。
［６］  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が乳酸菌由来であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか一項に記載の大腸菌。
［７］  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および／またはペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、由来であることを特徴とする請求項［１］〜［５］のいずれかに記載の大腸菌。
［８］   ［１］〜［７］のいずれか一項に記載の大腸菌を、培地を用いて通気条件下で培養し、該培地中にＤ−乳酸を生成蓄積せしめることを特徴とするＤ−乳酸製造法。
［９］  培養の際の培地のｐＨを４〜８とすることを特徴とする［８］に記載のＤ−乳酸製造法。
［１０］  培養の際の培地のｐＨを６〜７とすることを特徴とする［９］に記載のＤ−乳酸製造法。
［１１］  培養を培養槽を用いて行い、その際の通気条件が酸素移動容量係数ｋLａが１ｈ-1以上４００ｈ-1以下となるような運転条件で温度３０℃の水に空気を常圧下の培養槽に供給したときに達成し得る酸素供給量と同等の条件であることを特徴とする［８］〜［１０］の何れか一項に記載のＤ−乳酸製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ピルビン酸の生成量が少ないＤ−乳酸を生成する大腸菌が提供される。そして、本発明により作成された菌体を培養し、Ｄ−乳酸を生産することにより既存の方法に比較してより経済的に化学的純度及び光学純度の高いＤ−乳酸を生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。まずはじめに本発明の大腸菌に関して以下に説明する。
【００１８】
本発明におけるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈ）とは、ピルビン酸およびＮＡＤＨより乳酸およびＮＡＤを生成する酵素をコードする大腸菌由来以外の遺伝子であり、大腸菌に由来するもの以外の遺伝子であればその由来に特に制限はない。そのようなものとして具体的にはタグチ  ら〔Taguchi, H.,J Biol Chem 5;266(19):12588-94(1991)〕が取得したラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、および／またはジャミンら〔Garmyn D., J Bacteriol 177(12):3427-37(1995)〕が取得したペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、その他乳酸菌由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を例示することができる。
【００１９】
また、また、このような遺伝子組み換えに用いるＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子には、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を大腸菌以外の菌株から単離した後に変異を施し、変異前の遺伝子がコードするＤ−乳酸デヒドロゲナーゼに対して１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入された変異体で、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するものをコードする遺伝子のようなものも含む。該変異体は、たとえば、１個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を行うことにより作ることができる。１個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換の手段は自体は公知であり、例えば、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でＰＣＲを行い、ＤＮＡ合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばサムブルック等編［モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル 第２版］コールドスプリングハーバーラボラトリー、１９８９、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。
【００２０】
本発明の大腸菌は、ヘテロ乳酸醗酵により乳酸を生産し得る大腸菌に、上記のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入して得ることができる大腸菌であり、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産することを特徴とする。ここにおいて、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（但し、大腸菌（Escherichia coli）由来のものは除く）を導入したとは、大腸菌の染色体上および／または自己複製するベクター上にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挿入され、大腸菌内に大腸菌由来以外のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が発現可能に存在することを示す。
【００２１】
また、通気条件下で培養するとＤ−乳酸を生産するとは、導入したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が通気培養条件下で発現し、該遺伝子を導入する前と比較して大腸菌のＤ−乳酸生産時のＤ−乳酸の蓄積量が向上する能力を有することを示す。
【００２２】
本発明の大腸菌は、Ｄ−乳酸の生産に伴って培地にピルビン酸を蓄積することがあるが、その場合には従来知られているような微生物を用いた乳酸生産において培地中に生成するピルビン酸の量に比べて遥かに少ない。
【００２３】
本発明におけるピルビン酸を蓄積することを特徴とするとは、通気条件でグルコースを含む培地で培養を行った際、大腸菌野生株ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６）もしくはＷ３１１０株（ＡＴＣＣ３９９３６）と比較し有意に多くピルビン酸を蓄積する大腸菌を意味し、具体的には例えば大腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）株、大腸菌ＭＴ−１０９３４株、任意の大腸菌野生株のピルベートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を破壊した菌株が例示できる。
【００２４】
ピルベートデヒドロゲナーゼ（ｐｄｈ）とはピルビン酸からアセチルＣｏＡを生成する酵素を指す。ピルベートデヒドロゲナーゼは、その活性を発現するためにリポ酸を要求する。したがってリポ酸の生合成能力を失ったリポ酸要求性株は培地より供給されるリポ酸により、その活性をコントロールすることが可能である。本発明におけるリポ酸要求性とは、リポ酸を含まない培地では生育できないが、リポ酸を培地に加えることで生育が可能となることで、そのような大腸菌は、具体的にはＷ１４８５ｌｉｐ２株（ＡＴＣＣ２５６４５）が例示できる。以上のような理由から、本発明の大腸菌は、リポ酸要求性を有することがある。
【００２５】
本発明の大腸菌は、更にピルベートホルメートリアーゼの機能を欠失したものであってもよい。ピルベートホルメートリアーゼはピルビン酸からギ酸を生成する酵素を指す。なお、ピルベートホルメートリアーゼは、ｐｆｌＡ遺伝子とｐｆｌＢ遺伝子の２つの遺伝子の産物により構成されている。両者を区別する必要がない場合は単にｐｆｌと記載し、ｐｆｌＢ遺伝子のみを指す場合はｐｆｌＢと記載する。
【００２６】
本発明においてピルベートホルメートリアーゼの機能を欠失したとは、大腸菌野生株ＭＧ１６５５株もしくはＷ３１１０株と比較し有意にピルベートホルメートリアーゼ活性が低下した菌株であり、活性がまったく消失したものも含む。具体的には大腸菌ＭＴ−１０９３４株および任意の大腸菌野生株のピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）をコードする遺伝子を破壊した菌株が例示できる。
【００２７】
ＭＴ−１０９３４はすでにピルベートデヒドロゲナーゼがトランスポゾンを用いた変異で完全破壊され、ピルベートホルメートリアーゼは変異剤によりその活性が低下しているため、これを用いて容易に本発明を実施することが可能である。本菌株は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９２の寄託番号で、茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに平成１４年１１月８日より寄託されている。
【００２８】
本発明の大腸菌は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターと連結されていることもできる。
【００２９】
本発明における解糖系、核酸生合成系又はアミノ酸生合成系に関わる蛋白質の発現を司る遺伝子のプロモーターとは、恒常的に大腸菌内で機能する強力なプロモーターで且つグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター（ＧＰＡ）やセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）プロモーターが例示できる。
【００３０】
本発明における乳酸菌とは糖を発酵的に分解して生産される有機酸の５０％以上が乳酸に変換される微生物で具体的にはラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）が例示できる。
【００３１】
本発明の大腸菌は、５０ｇ／Ｌ以上のグルコース存在下で発現するように設計されており、５０ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生産するときに導入する前と比較して１０％以上Ｄ−乳酸の蓄積量が向上し、同時に生産されるピルビン酸が有意に減少する能力を持つように設計され導入されていることが好ましい。具体的にはラクトバチルス・プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼを導入したＭＴ−１０９３４／ｐＧＬＰｌｄｈ株、ペディオコッカス・アシディラクティシの乳酸デヒドロゲナーゼを導入したＭＴ−１０９３４／ｐＧＰＡｌｄｈ株が例示できる。
【００３２】
次に、本発明に係る大腸菌の培養方法並びにＤ−乳酸の製造法に関して説明する。
【００３３】
本発明における乳酸生産のための培養とは、培地を用いて本発明に係る大腸菌を培養することである。その際、使用される培地としては作成された菌体がＤ−乳酸を生産するために必要な栄養源を含むものであれば特に制限されない。このような栄養源としては、炭素源、窒素源、無機イオン、菌体が要求する有機微量元素、核酸及びビタミン類等が挙げられ、これらから適宜選択したものを利用して培地を調製することができる。
【００３４】
より好ましい結果を得るためには、２種以上のアミノ酸を含む培地が好ましい。このようなアミノ酸の添加の形態としては、天然のアミノ酸の２種以上の組合わせや、酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカー等の複数のアミノ酸を混合物として含有する天然物や天然物抽出物の加水分解物を挙げることができる。酵母エキス、ペプトン、ホエー、廃糖蜜、コーンスティープリカー等より選ばれる少なくとも１種類、もしくはそれらの混合物の総量が０．５質量％から２０質量％含む培地がより好ましく、1質量％から１0質量％ではさらに好ましい。特にコーンスティープリカーや酵母エキス添加はペプトン、カザミノ酸添加よりもさらに大きな効果が得られ、このとき硫酸アンモニウムなどの塩は添加しないほうがむしろよい結果となる。培地は通常液体培地である。
【００３５】
培養はフラスコ等を用いて、その中に液体培地を入れてしんとう培養してもよいが、通常は液体培地を培養槽に入れて、温度調節及び攪拌しながら行う。
【００３６】
培養条件としては作成された大腸菌菌体の種類や、培養装置により適宜変更可能であるが、大腸菌の培養に適した条件であり、１０〜４０℃、好ましくは２０〜４０℃で、ｐＨ４〜８、好ましくは６〜７である。
【００３７】
例えばピルベートホルメートリアーゼ活性が低下しているＭＴ−１０９３４を使用する場合は培養温度は２０℃から４０℃、より好ましくは２５℃から３５℃で培養することが好ましく、ｐＨはＮａＯＨ、ＮＨ3等で４．０から８．０、より好ましくは６から７で調整し、培養することが好ましい。
【００３８】
本発明の通気条件下とは必ずしも培養液中を空気が通過する必要はなく、培養槽の形状によっては適度に培養液を撹拌しながら培養液上の空気層が換気されるような上面通気も含み、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させた状態を意味する。
【００３９】
本発明の培養時の通気条件は、通気を全く行わなくともＤ−乳酸を生産することは可能であるが、不純物の低減、光学純度の向上などより好ましい結果を得るために通気を行った方がよい。
【００４０】
培養槽内の培養液中に通気する場合は培養槽の内圧、撹拌羽根位置、撹拌羽根形状、撹拌速度の組み合わせにより溶存酸素濃度が変化するためにＤ−乳酸の生産性およびＤ−乳酸以外の有機酸量を指標に次のように最適条件を求めることができる。  例えば上記大腸菌をＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１等の比較的小型の培養槽で培養する場合は、５００ｇの培養液を使用した際、空気を常圧で０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、撹拌速度５０ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、より好ましくは、常圧で０．１ｖｖｍ〜０．５ｖｖｍ、撹拌速度１００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍで達成し得る通気条件で好ましい結果を得ることができる。
【００４１】
以上のような通気条件は通気撹拌条件が温度３０℃の水を対象とした場合常圧で酸素移動速度係数ｋLａが１ｈ-1以上４００  ｈ-1以下より好ましくは１ｈ-1以上２００  ｈ-1以下となる条件で達成し得る酸素供給を可能とする条件である。また、最適な通気条件の別の指標としてはＭＴ−１０９３４が嫌気培養で通常生産するギ酸、酢酸、コハク酸、グリセロール、エタノール等が５．０ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以下になり且つ、Ｄ−乳酸が生産されるような通気量、撹拌速度により達成される通気条件である。また、最適な通気条件の別の指標としてはＭＴ−１０９３４によるＤ−乳酸の生産時に０．３％の光学異性体であるＬ−乳酸を含む培養液で培養した際に１０〜１００時間以内にＬ−乳酸の濃度が０．０２質量％以下に低下するような通気量、攪拌速度である。
【００４２】
上述した通気条件は培養初期から終了まで一貫して行う必要はなく、培養工程の一部で行うことでも好ましい結果を得ることができる。
【００４３】
本発明における培養物とは、上述した方法により生産された菌体、菌体を含む培養液、菌体が除去されている培養液、及びそれらの処理物を指す。
【００４４】
以上のようにして得られた培養液等の培養物からＤ−乳酸を回収する方法は、通常知られた方法が利用でき、例えば、培養物を酸性化した後直接蒸留する方法、乳酸のラクチドを形成させて蒸留する方法、アルコールと触媒を加え乳酸をエステル化した後蒸留する方法、有機溶媒中に乳酸を抽出する方法、イオン交換カラムで乳酸を分離する方法、電気透析により乳酸を濃縮分離する方法などやそれらを組み合わせた方法が採用できる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例により本発明の一例を示すが、これらは本発明を何ら制限するものではない。なお、特に記載しない限りは「％」は質量基準である。
実施例１（Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現ベクターおよびＤ−乳酸生産菌の構築）
セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(serine hydroxymethyltransferase）（ｇｌｙＡ）プロモーターを取得するため大腸菌ゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて配列番号１、及び配列番号２によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化することで約８５０ｂｐのｇｌｙＡプロモーターをコードするフラグメントを得た。さらにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｌｄｈＡ）を取得するために大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ４７０７６株から定法により抽出して取得した）をテンプレートに用いて配列番号３、及び配列番号４によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１．０ｋｂｐのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子（ｌｄｈＡ）フラグメントを得た。
【００４６】
上記の２つのＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、大腸菌（ＤＨ５α株）に形質転換することによりプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡを得た。
【００４７】
同様にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＡＴＣＣ８０４１）より得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５および配列番号６を用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを増幅し、発現プラスミドｐＧＬＰｌｄｈを得た。さらに大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１および配列番号９を用いてＰＣＲ法により得られたＤＮＡフラグメントのＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ切断フラグメントおよびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ（ＡＴＣＣ）より得たゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号７、配列番号８を用いてＰＣＲ法により得られたＤＮＡフラグメントのＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断フラグメント及びプラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを連結し、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ由来Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現プラスミドｐＧＰＡｌｄｈを得た。
【００４８】
以上のようにして得られた３種のプラスミドｐＧｌｙｌｄｈＡ、ｐＧＬＰｌｄｈ，ｐＧＰＡｌｄｈを大腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）および大腸菌ＭＴ−１０９３４に形質転換することによりＤ−乳酸生産菌としてＷ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧｌｙｌｄｈＡ、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＬＰｌｄｈ、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＰＡｌｄｈ、ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ，  ＭＴ−１０９３４／ｐＧＬＰｌｄｈ，  ＭＴ−１０９３４／ｐＧＰＡｌｄｈの６株の形質転換体を得た。
【００４９】
尚、Ｗ１４８５ｌｉｐ２株はアメリカンタイプカルチャーコレクションよりＡＴＣＣ２５６４５として入手できる。ベクタープラスミドｐＵＣ１８はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手できるＡＴＣＣ３７２５３から定法により抽出することにより得られる。また、ＭＴ−１０９３４株は、先に記載したとおり、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５０】
実施例２（Ｄ−乳酸生産菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＬＰｌｄｈ株、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＰＡｌｄｈ株によるＤ−乳酸生産）
【００５１】
【表１】
2005102625.tif 000002
【００５２】
ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍｌを１００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに入れたものを複数個用意し、Ｄ−乳酸生産菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２、およびＷ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧｌｙｌｄｈＡ、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＬＰｌｄｈ、Ｗ１４８５ｌｉｐ２／ｐＧＰＡｌｄｈをそれぞれ別々に植菌し、一晩１２０ｒｐｍで撹拌培養を行って前培養液を調製した。
【００５３】
ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１の培養槽に（表１）に記載の組成の培地４７５ｇを入れたもの４基に別々に前培養液全量を植菌した。培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度６００ｒｐｍ、培養温度３７℃、ｐＨ７．３（ＮａＯＨで調整）で２４時間行った。培養終了後、培養液中のＤ−乳酸の定量および光学純度の測定はＨＰＬＣで定法に従って行った。結果を表２に示す。尚、それぞれの培養液中の蟻酸、酢酸、コハク酸の濃度は何れも０．３ｇ／Ｌ以下であった。
【００５４】
【表２】
2005102625.tif 000003
【００５５】
実施例３（Ｄ−乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、ＭＴ−１０９３４／ｐＧＬＰｌｄｈ株、ＭＴ−１０９３４／ｐＧＰＡｌｄｈ株によるＤ−乳酸生産（カザミノ酸の添加効果））
前培養として三角フラスコにＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｇを入れたものを複数用意した。これにＤ−乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４株、ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ株、ＭＴ−１０９３４／ｐＧＬＰｌｄｈ株、ＭＴ−１０９３４／ｐＧＰＡｌｄｈ株の３種類の菌株を別々に植菌し、一晩、３０℃、１２０ｒｐｍで撹拌培養を行って前培養液とした。
【００５６】
１Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）４基に（表３）に示す培地４７５ｇを入れたものに先に調製した前培養液をそれぞれ全量植菌した。本培養は大気圧下、通気量０．５ｖｖｍ、撹拌速度２００ｒｐｍ、培養温度３１℃、ｐＨ６．８（ＮａＯＨで調整）で１２０時間行った。培養終了後、得られた本培養液中のＤ−乳酸の定量はＨＰＬＣで定法に従って測定した結果を表４に示す。
【００５７】
【表３】
2005102625.tif 000004
【００５８】
【表４】
2005102625.tif 000005
【００５９】
実施例４（Ｄ−乳酸生産菌ＭＴ−１０９３４／ｐＧｌｙｌｄｈＡ，  ＭＴ−１０９３４／ｐＧＬＰｌｄｈ，  ＭＴ−１０９３４／ｐＧＰＡｌｄｈによるＤ−乳酸生産（コーンスティープリカーの添加効果））
本培養の培地組成中、カザミノ酸５．０ｇ／Ｌに代えてコーンスティープリカー５０．０ｇ／Ｌを添加し、本培養の培養時間を５０時間とする以外は実施例３と同様に行った。結果を表５に示す。尚、本培養の培地にはコーンスティープリカー由来の酸加水分解後の還元糖０．３４％、Ｄ−乳酸０．３１％、Ｌ−乳酸０．３１％、遊離アミノ酸０．３３％及び微量の各種有機酸が含まれる。
【００６０】
【表５】
2005102625.tif 000006
【配列表】
2005102625000001.app