(57)【要約】【課題】  高脂血症病の発症のリスクを予測する方法の提供。【解決手段】  被検者に由来する核酸試料において、アポリポプロテインＡ５遺伝子のハプロタイプを同定することにより、前記被検者の高脂血症の発症のリスクを予測する方法であって、（ａ）前記遺伝子の翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基、（ｂ）前記遺伝子の第３エクソンの第１１８５番目に位置するヌクレオチド残基、および（ｃ）前記遺伝子の第３エクソンの第１８９１番目に位置するヌクレオチド残基を同定する工程を含んでなる、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者に由来する核酸試料において、アポリポプロテインＡ５遺伝子のハプロタイプを同定することにより、前記被検者の高脂血症の発症のリスクを予測する方法であって、
（ａ）前記遺伝子の翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基、
（ｂ）前記遺伝子の第３エクソンの第１１８５番目に位置するヌクレオチド残基、および
（ｃ）前記遺伝子の第３エクソンの第１８９１番目に位置するヌクレオチド残基
を同定する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記（ａ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第６４２残基に対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第２９５７残基に対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｃ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第３６６３残基に対応するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＴ、ＧおよびＴであり、かつ、他方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＧおよびＣである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＴ、ＧおよびＴであり、かつ、他方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＴおよびＴである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
両方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれれＣ、ＧおよびＣである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
一方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＧおよびＣであり、かつ、他方のアレルにおける前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＴおよびＴである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ハプロタイプの同定が、前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハプロタイプの同定が、前記（ａ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子、前記（ｂ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子、および前記（ｃ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を用いて行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
高脂血症の発症のリスクを予測するためのキットであって、
アポリポプロテインＡ５遺伝子における、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を含んでなる、キット：
（ａ）翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基、
（ｂ）第３エクソンの第１１８５番目に位置するヌクレオチド残基、および
（ｃ）第３エクソンの第１８９１番目に位置するヌクレオチド残基。
【請求項１２】
前記（ａ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第６４２残基に対応するものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記（ｂ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第２９５７残基に対応するものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記（ｃ）のヌクレオチド残基が、配列番号１で表わされるヌクレオチド配列における第３６６３残基に対応するものである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
前記（ａ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子、前記（ｂ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子、および前記（ｃ）のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を含んでなるものである、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アポリポプロテインＡ５遺伝子のハプロタイプを同定することによる高脂血症等の発症リスクの予測法に関する。
【０００２】
背景技術
血中の中性脂肪やコレステロールの増加は、高脂血症、動脈硬化の原因となり、さらには心筋梗塞を初めとする種々の循環器疾患を引き起こすことが知られている（Hodis HN, Mack WJ. Triglyceride-rich lipoproteins and the progression of coronary artery disease. Curr Opin Lipidol. 1995;6:209-214.，Malloy MJ, Kane JP. A risk factor for atherosclerosis: triglyceride-rich lipoproteins. Adv Intern Med. 2001;47:111-136.）。循環器疾患の危険因子である高脂血症は、遺伝子多型と関連することが報告されており、アポリポプロテインＡ遺伝子も高脂血症との関連が注目されている遺伝子の一つである。アポリポプロテインＡについては、いままでに４種類（Ａ１, Ａ２, Ａ３, Ａ４）が知られていたが、最近新たにＡ５が発見され、その遺伝子多型が血漿中の中性脂肪やコレステロール値と強く相関することが報告されている（Pennacchio LA, Olivier M, Hubacek JA, Cohen JC, Cox DR, Fruchart JC, Krauss RM, Rubin EM. An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing. Science. 2001; 294: 169-173. ，Pennacchio LA, Rubin EM. Apolipoprotein A5, a newly identified gene that affects plasma triglyceride levels in humans and mice. Arterioscle Thromb Vasc Biol. 2003;23: 529-534.）。
【０００３】
例えば、アポリポプロテインＡ５遺伝子における遺伝子変異、ｃ．５５３Ｇ＞Ｔは、中国人における高トリグリセリド血症のリスクファクターとして有用であることが報告されている（非特許文献１：Kao JT, Wen HC, Chien KL, Hsu HC, Lin SW. A novel genetic variant in the apolipoprotein A5 gene is associated with hypertriglyceridemia. Hum Mol Genet. 2003;12(19):2533-9.）。
【０００４】
また、アポリポプロテインＡ１／Ｃ３／Ａ４／Ａ５遺伝子複合体（gene  cluster）における遺伝子変異は、家族型高脂血症の発症と関連することが報告されている（非特許文献２：Eichenbaum-Voline S, Olivier M, Jones EL, Naoumova RP, Jones B, Gau B, Patel HN, Seed M, Betteridge DJ, Galton DJ, Rubin EM, Scott J, Shoulders CC, Pennacchio LA. Linkage and Association Between Distinct Variants of the APOA1/C3/A4/A5 Gene Cluster and Familial Combined Hyperlipidemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 ）。
【０００５】
また、アポリポプロテインＡ５遺伝子における遺伝子変異は、シンガポール人の血中トリグリセリドレベルに関連していることが報告されている（非特許文献３：Lai CQ, Tai ES, Tan CE, Cutter J, Chew SK, Zhu YP, Adiconis X, Ordovas JM. The apolipoprotein A5 locus is a strong determinant of plasma triglyceride concentrations across ethnic groups in Singapore. J Lipid Res. Papers In Press. Published on September 1,2003 as manuscript M300251-JLR200）。
【０００６】
また、近年、循環器疾患に関連する様々な危険因子は、個々の因子が循環器疾患の発症と進展に寄与するばかりでなく、相互に関連し、集積することで循環器疾患のリスクをさらに上昇させることが指摘されている。２００１年には、米国のNational Choresterol Education Program(NCEP)のAdult Treatment Part III(ATP-III)において、心血管系疾患の危険因子（インスリン抵抗性、肥満、トリグリセリド高値、ＨＤＬコレステロール低値、高血圧）の重要性を勧告し、これらの危険因子が３項目以上集積した状態はメタボリックシンドロームと定義された(非特許文献４：JAMA. 2001 May 16;285(19):2486-97)。メタボリックシンドロームになると、脳卒中や虚血性心疾患等の循環器疾患の罹患が高くなるので、健診での生活習慣改善指導が必要である。
【非特許文献１】Kao JT, Wen HC, Chien KL, Hsu HC, Lin SW. A novel genetic variant in the apolipoprotein A5 gene is associated with hypertriglyceridemia. Hum Mol Genet. 2003;12(19):2533-2539
【非特許文献２】Eichenbaum-Voline S, Olivier M, Jones EL, Naoumova RP, Jones B, Gau B, Patel HN, Seed M, Betteridge DJ, Galton DJ, Rubin EM, Scott J, Shoulders CC, Pennacchio LA. Linkage and Association Between Distinct Variants of the APOA1/C3/A4/A5 Gene Cluster and Familial Combined Hyperlipidemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003
【非特許文献３】Lai CQ, Tai ES, Tan CE, Cutter J, Chew SK, Zhu YP, Adiconis X, Ordovas JM. The apolipoprotein A5 locus is a strong determinant of plasma triglyceride concentrations across ethnic groups in Singapore. J Lipid Res. Papers In Press. Published on September 1,2003 as manuscript M300251-JLR200
【非特許文献４】JAMA. 2001 May 16;285(19):2486-2497
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、今般、ヒトアポリポプロテインＡ５遺伝子における、３種の特定の一塩基多型からなるハプロタイプが高脂血症の発症のリスクに関連することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、高脂血症の発症のリスクを予測する方法およびその診断用キットの提供を目的とする。
【０００９】
そして、本発明による方法は、被検者に由来する核酸試料において、アポリポプロテインＡ５遺伝子のハプロタイプを同定することにより、前記被検者の高脂血症の発症のリスクを予測する方法であって、
（ａ）前記遺伝子の翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基、
（ｂ）前記遺伝子の第３エクソンの第１１８５番目に位置するヌクレオチド残基、および
（ｃ）前記遺伝子の第３エクソンの第１８９１番目に位置するヌクレオチド残基
を同定する工程を含んでなるものである。
【００１０】
さらに、本発明によるキットは、高脂血症の発症のリスクを予測するためのキットであって、
アポリポプロテインＡ５遺伝子における、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載のヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を含んでなるものである：
（ａ）翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基、
（ｂ）第３エクソンの第１１８５番目に位置するヌクレオチド残基、
（ｃ）第３エクソンの第１８９１番目に位置するヌクレオチド残基。
【００１１】
本発明によれば、ヒトアポリポプロテインＡ５遺伝子におけるハプロタイプを同定することにより、高脂血症（好ましくは、高トリグリセリド血症）の発症のリスクを予測することが可能となる。また、本発明によれば、低ＨＤＬ血症および動脈硬化の発症、メタボリックシンドロームのリスクを予測することが可能となり、これらの情報は、心筋梗塞等を含む種々の循環器疾患の予防に利用することができる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明による方法において、アポリポプロテインＡ５遺伝子中の３カ所のヌクレオチド残基が同定される。その第一のヌクレオチド残基は、前記遺伝子の翻訳開始点に対して１１３１ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基であり、該遺伝子は、この位置においてチミン残基（Ｔ）とシトシン残基（Ｃ）との多型を有する（以下「−１１３１Ｔ＞Ｃ」という）。また、第二のヌクレオチド残基は、前記遺伝子の第３エクソンの第１１８５残基に位置するヌクレオチド残基であり、該遺伝子は、この位置においてグアニン残基（Ｇ）とチミン残基（Ｔ）との多型を有する（以下「１１８５Ｇ＞Ｔ」という）。さらに、第三のヌクレオチド残基は、前記遺伝子の第３エクソン第１８９１残基に位置するヌクレオチド残基であり、該遺伝子は、この位置においてチミン残基（Ｔ）とシトシン残基（Ｃ）との多型を有する（以下「１８９１Ｔ＞Ｃ」という）。  
アポリポプロテインＡ５遺伝子のヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、ヒトアポリポプロテインＡ５遺伝子の配列としては、配列番号１で表されるゲノム上のヌクレオチド配列、配列番号２で表されるｃＤＮＡ配列、および配列番号３で表されるアミノ酸配列が挙げられる。−１１３１Ｔ＞Ｃの位置は、配列番号１中の第６４２残基に相当する。１１８５Ｇ＞Ｔの位置は、配列番号１中の第２９５７残基および配列番号２中の第５６１残基に相当する。１８９１Ｔ＞Ｃの位置は、配列番号１中の第３６６３残基および配列番号２中の第１２６７残基に相当する。
【００１３】
アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、および１８９１Ｔ＞Ｃの組み合わせからなるハプロタイプは、高脂血症（好ましくは、高トリグリセリド血症）、さらにはメタボリックシンドロームのリスクファクターとして使用できる。従って、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基を同定することにより、高脂血症（好ましくは、高トリグリセリド血症）さらにはメタボリックシンドロームのリスクを予測することが可能となる。本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００１４】
本発明の一つの実施態様によれば、一方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＴ、ＧおよびＴであり、かつ、他方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＧおよびＣである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される。
【００１５】
また、本発明の他の実施態様によれば、一方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＴ、ＧおよびＴであり、かつ、他方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＴおよびＴである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される。
【００１６】
また、本発明の他の実施態様によれば、両方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＧおよびＣである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される。
【００１７】
また、本発明の他の実施態様によれば、一方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＧおよびＣであり、かつ、他方のアレルにおける−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基が、それぞれＣ、ＴおよびＴである場合に，高脂血症のリスクがあるものと予測される。
【００１８】
アポリポプロテインＡ５遺伝子における前記ハプロタイプの同定は、当該技術分野において公知の方法によって行うことができ、その具体的方法は特に制限されないが、例えば、−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基を同定しうる１種以上の核酸分子を用いて行うことができる。これらの核酸分子は、前記アポリポプロテインＡ５遺伝子の−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび／または１８９１Ｔ＞Ｃにおけるいずれか一方のヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１９】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。
【００２０】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００２１】
本発明に用いる核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、イントロンにハイブリダイズする部分だけでなく、エクソンにハイブリダイズする部分をも含むことができ、あるいは、これらのどちらか一方のみにより構成されていてもよい。
【００２２】
本発明に用いる核酸分子は、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、および１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基の同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、前記核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、または１８９１Ｔ＞Ｃに位置するヌクレオチド残基を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００２３】
本発明において核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００２４】
また、本発明に用いる核酸分子は、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基の同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、前記核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の−１１３１Ｔ＞Ｃに位置するヌクレオチド残基を含む領域、１１８５Ｇ＞Ｔに位置するヌクレオチド残基を含む領域、または１８９１Ｔ＞Ｃに位置するヌクレオチド残基を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００２５】
本発明において核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００２６】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明に用いる核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃにおけるヌクレオチド残基を同定する上で好ましいものである。
【００２７】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。これらのプライマーペアは、上記ポリヌクレオチドの、−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔまたは１８９１Ｔ＞Ｃにおけるヌクレオチド残基を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、上述の核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００２８】
上記の核酸分子またはプライマーペアを用いることにより、−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃにおけるヌクレオチド残基を同定することができ、これにより、高脂血症の発症のリスクを予測することができる。
【００２９】
本発明の方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、上記の核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃにおけるヌクレオチド残基を同定することができる。核酸増幅法およびこれによるヌクレオチド残基の同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００３０】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００３１】
また、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、または１８９１Ｔ＞Ｃにおいて、いずれか一方のヌクレオチド残基の存在により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて上記の多型をにおけるヌクレオチド残基を同定することができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において前記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【００３２】
本発明に用いる核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等によるアポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、または１８９１Ｔ＞Ｃの遺伝子多型の同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明によれば、前記核酸分子と被検者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、高脂血症発症のリスクの予測法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１８９１Ｔ＞Ｃ、または１１８５Ｇ＞Ｔにかかるいずれかのヌクレオチド残基の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００３３】
この方法による診断に当たっては、例えば、被検者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、上記核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１８９１Ｔ＞Ｃ、または１１８５Ｇ＞Ｔにおけるヌクレオチド残基を同定することができる。核酸試料は、必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによるヌクレオチド残基の同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)を参照することができる。
【００３４】
アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、または１８９１Ｔ＞Ｃのヌクレオチド残基を同定する場合には、また、上述の核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００３５】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、多型部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記多型部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被検者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３６】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被検者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００３７】
アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔおよび１８９１Ｔ＞Ｃにおけるヌクレオチド残基を同定する場合には、さらに、上述の核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順ならびに使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００３８】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法においては、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１８９１Ｔ＞Ｃ、または１１８５Ｇ＞Ｔのヌクレオチド残基を含む領域に対して、そのメジャーアレルおよびマイナーアレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被検者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、上述の核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭとＶＩＣの組合せを用いる。このＰＣＲ反応においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被検者の遺伝子型が容易に決定される。
【００３９】
以上のような高脂血症の発症のリスクの予測のために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。本発明によるキットはさらに、アポリポプロテインＡ５遺伝子における−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、および１８９１Ｔ＞Ｃからなるハプロタイプを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００４１】
例１：日本人におけるアポリポプロテインＡ５の遺伝子多型とそのアレル頻度
アポリポプロテインＡ５遺伝子中の多型を同定するため、４８人の日本人についてアポリポプロテインＡ５遺伝子の配列決定を行なったところ、表１に示す１６個の一塩基多型が見出された。
【表１】
2005218378.tif 000002
【００４２】
これらの一塩基多型のうち、−１２７５Ｇ＞Ａ、−１０２０Ｇ＞Ａ、−９８３Ｇ＞Ａ、−８６５Ａ＞Ｃ、２７１Ｃ＞Ｔ、１１８３Ｃ＞Ｇ、１８０９Ｔ＞Ｃおよび２０２２−２０２３ｉｎｓＡは公共のデータベース（ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＩＭＳ−ＪＳＴ ＪＳＮＰ）には登録されておらず、新規な多型と考えられた。上記１６個の遺伝子多型のうち８個のマイナーアレル（アレル２）の頻度は０．０５以下であったので詳細な解析は行わなかった。マイナーアレル（アレル２）の頻度０．０５以上の８個の遺伝子多型については連鎖不平衡解析を行い、r-squareが０．５以上のグループの中から、３つの遺伝子多型（−１１３１Ｔ＞Ｃ、 １１８５Ｇ＞Ｔ、および１８９１Ｔ＞Ｃ）を選んで、以下の相関解析を行った。
【００４３】
例２：アポリポプロテインＡ５の遺伝子多型と血中コレステロール値との関連
本研究では、健康診断受診者１５５２人（年齢幅：３５〜９３歳、平均年齢：６５．８±１０．８才、日本人、性別：男性６９９人；女性８５３人）を調査の対象とした。研究に先立ち、上記の健康診断受診者の全員からインフォームドコンセントを書面で取得し、さらに、これらの健康診断受診者から得た試料を匿名化した。次に、上記多型のタイピングを行なった。ここで、タイピングは、−１１３１Ｔ＞Ｃ、 １８９１Ｔ＞Ｃについては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法を用いた。１１８５Ｇ＞Ｔについては、ダイレクトシークエンス法を用いた。
【００４４】
タイピングに用いたプライマーおよびプローブ：
（１）−１１３１Ｔ＞Ｃ
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用： FAM-CGAAAGTAAGATTTGC-MGB（配列番号４）（１０７ｎＭ）、
Ｃアレル用： VIC-AAAGTGAGATTTGCC-MGB（配列番号５）（１０７ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：GTGGAGTTCAGCTTTTCCTCATG（配列番号６）（４８０ｎＭ）、
リバース：GACTCTGAGCCCCAGGAACTG（配列番号７）（４８０ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル、
（２）１１８５Ｇ＞Ｔ：
ApoAV-3s2：5'-AGGAGGAGTTGGAGGAGGTGAAG-3'（配列番号８）、
ApoAV-3a2：5'-TCAGTCCCAGTGCCTGCAAAG-3'（配列番号９）；
（３）１８９１Ｔ＞Ｃ
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用： FAM-CTGCACATCCAGC-MGB（配列番号１０）（１０７ｎＭ）、
Ｔアレル用： VIC-CCTGCATATCCAGC-MGB（配列番号１１）（１０７ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：GACAGGGAGGCCACCAAAG（配列番号１２）（４８０ｎＭ）、
リバース：GTGAATGTAATGCATCCAGATTGG（配列番号１３）（４８０ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【００４５】
次に、−１１３１Ｔ＞Ｃ、 １１８５Ｇ＞Ｔ、 および１８９１Ｔ＞Ｃの３つの遺伝子多型につき、上記健康診断受診者の血中トリグリセリド、コレステロール値、および動脈硬化指数（＝［（総コレステロール）−（ＨＤＬコレステロール）］／（ＨＤＬコレステロール））との相関について解析した。結果は表２に示した通りであった。
【表２】
2005218378.tif 000003
【００４６】
−１１３１Ｔ＞Ｃについては、男女ともに、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、および動脈硬化指数と強く相関することが明らかになった。１８９１Ｔ＞Ｃについては、男女ともにトリグリセリドと強く相関することが明らかになった。１１８５Ｇ＞Ｔ（Ｇｌｙ１８５Ｃｙｓ）については、男女ともに、トリグリセリド、ＨＤＬコレステロール、および動脈硬化指数と強く相関した。
【００４７】
例３：アポリポプロテインＡ５の遺伝子多型のハプロタイプ解析
例２においてトリグリセリドとの相関が明らかになった３つの遺伝子多型、−１１３１Ｔ＞Ｃ、１１８５Ｇ＞Ｔ、 および１８９１Ｔ＞Ｃ、について、予測される５つのハプロタイプとその頻度を表３に示した。
【表３】
2005218378.tif 000004
【００４８】
これらのハプロタイプの組み合わせ（ディプロタイプ）別に、トリグリセリドとＨＤＬコレステロール値との関係を分散分析した結果を表４に示した。
【表４】
2005218378.tif 000005
【００４９】
Ｊ１＊Ｊ１を基準にすると、男女ともに、Ｊ１＊Ｊ２、Ｊ１＊Ｊ３、Ｊ２＊Ｊ２、およびＪ２＊Ｊ３は、統計的に有意にトリグリセリド値と正相関した。さらに、Ｊ１＊Ｊ２、Ｊ１＊Ｊ３、およびＪ２＊Ｊ３は、ＨＤＬコレステロール値とは逆相関した。これらの結果から、Ｊ１＊Ｊ２、Ｊ１＊Ｊ３、およびＪ２＊Ｊ３のディプロタイプを持つ日本人はトリグリセリドが増加し、ＨＤＬコレステロールが低下することが示された。
【００５０】
さらに、対象者を肥満の有無（ＢＭＩ：２５ｋｇ／ｍ２以上）を基準として分けて、ディプロタイプ別にトリグリセリド値およびＨＤＬ値を比較した。その結果を図１に示した。同じディプロタイプ中では男女とも、肥満群の方が非肥満群よりもトリグリセリドが高く、ＨＤＬは低くなる傾向を示した。とりわけ、男性のトリグリセリドについては、肥満群とアポリポプロテインＡ５遺伝子のディプロタイプとの間に交互作用がみられた（Ｐ＝０．０３９）。
【００５１】
例４：アポリポ蛋白Ａ５遺伝子多型とメタボリックシンドロームとの関係
例３において示したアポリポプロテインＡ５遺伝子多型の各ディプロタイプについて、高トリグリセリドおよびメタボリックシンドロームとの関係を解析した。ここで、高トリグリセリドとは、血清トリグリセリド≧１５０ｍＬ／ｄＬまたは高トリグリセリド血症治療中であることを意味する。また、メタボリックシンドロームとは、以下の危険因子を少なくとも３つ以上を保有することを意味する：耐糖能異常（空腹時血糖＞１１０ｍｇ／ｄＬまたは糖尿病治療中）、肥満（男性でウエストヒップ比１．０以上またはウエスト８５ｃｍ以上、女性でウエストヒップ比０．９以上またはウエスト９０ｃｍ以上）、高トリグリセリド血症（空腹時トリグリセリド ＞１５０ｍｇ／ｄＬまたは高トリグリセリド血症薬服用)、高血圧（収縮期血圧＞１３０ｍｍＨｇまたは 拡張期血圧＞８５ｍｍＨｇまたは降圧剤服用)、低ＨＤＬ血症(男性４０ｍｇ／ｄＬ未満、女性５０ｍｇ／ｄＬ未満)。結果は表５の通りであった。
【表５】
2005218378.tif 000006
【００５２】
高トリグリセリドについては、Ｊ１＊Ｊ１を基準にすると、男性では、Ｊ１＊Ｊ２、Ｊ１＊Ｊ３、Ｊ２＊Ｊ２、Ｊ２＊Ｊ３において統計的に有意に危険度が高くなり、女性では、Ｊ１＊Ｊ３、Ｊ２＊Ｊ３において統計的に有意に危険度が高くなった。メタボリックシンドロームについては、Ｊ１＊Ｊ１を基準にすると、男性では、Ｊ１＊Ｊ２、Ｊ１＊Ｊ３、Ｊ２＊Ｊ２、Ｊ２＊Ｊ３において統計的に有意に危険度が高くなり、女性では、Ｊ２＊Ｊ３において統計的に有意に危険度が高くなった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、肥満群と非肥満群における、トリグリセリド値およびＨＤＬ値のディプロタイプ別の比較を示した図である。
【図１】
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【配列表】
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