(57)【要約】【課題】              タンパク質合成活性を高く維持しながら、且つタンパク質を構成するすべてのアミノ酸を同位体標識できるような合成反応系を開発する。【解決手段】          Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩と、同位体標識されたＬ−アミノ酸とを含有する反応混合物を用いて無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を合成する。好ましい実施形態において、前記Ｄ−アミノ酸の塩がＤ−アスパラギン酸、及び／又はＤ−グルタミン酸のカリウム塩であり、前記ポリアミノ酸の塩がポリグルタミン酸のカリウム塩である。また、前記同位体標識アミノ酸は、１３Ｃ、１５Ｎ、及び／又は２Ｈで標識されたアミノ酸であることが好ましい。【選択図】            図１
2005102513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩と、同位体標識されたＬ−アミノ酸とを含有する反応液混合物を用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記Ｄ−アミノ酸の塩がＤ−アスパラギン酸、及び／又はＤ−グルタミン酸のカリウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリアミノ酸の塩がポリグルタミン酸のカリウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法により製造された同位体標識化タンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載の同位体標識化タンパク質を用いてＮＭＲ測定により当該タンパク質の立体構造解析を行う方法。
【請求項６】
大腸菌のＳ３０抽出液と、同位体標識されたＬ−アミノ酸と、緩衝液と、塩と、ヌクレオチド三リン酸と、エネルギー物質とを含む無細胞タンパク質合成用反応液混合物において、前記塩として１００〜３００ｍＭのＤ−アミノ酸のカリウム塩を含むことを特徴とする反応液混合物。
【請求項７】
前記Ｄ−アミノ酸がＤ−アスパラギン酸又はＤ−グルタミン酸であることを特徴とする請求項６に記載の反応液混合物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の反応液混合物を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成用キット。
【請求項９】
Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩を含有する反応液混合物を用いることを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成方法に関するものであり、特に、ＮＭＲによる立体構造解析の試料として用いるのに好適な同位体標識タンパク質の合成方法、及びかかる方法により合成されたタンパク質を用いてＮＭＲ測定を行うことを特徴とするタンパク質の立体構造の解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞抽出液を用いる無細胞系タンパク質合成システムは、主に遺伝子産物の同定や、その働きを調べるために用いられている。例えば、合成されたタンパク質の酵素活性やＤＮＡ結合能等の機能を調べたり、放射性同位元素で標識して翻訳産物の分子量を決定することができる。また、近年その合成量が飛躍的に増大する技術（例えば、特許文献１及び２参照。）が開発されたことから、Ｘ線結晶構造解析やＮＭＲ等によるタンパク質の構造解析等へも利用されるようになってきた。
【０００３】
翻訳反応を行わせる抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のものが市販されている。大腸菌の抽出液では、転写、翻訳の共役反応によりＤＮＡからタンパク質を合成できることが知られ、例えば、ズベイらによって大腸菌のＳ３０抽出液を用いる方法が系統的に開発されている（例えば、非特許文献１参照）。Ｓ３０抽出液には、ｍＲＮＡの翻訳に必要なリボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子が含まれている。合成タンパク質の鋳型としてＤＮＡを用いる場合は、強力なプロモーター（一般的にはＴ７プロモーター）の下流に目的タンパク質遺伝子を配置したＤＮＡが用いられ、転写と翻訳の両反応を共役させるために、系内にＴ７ＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドを添加する。アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰ及びＧＴＰが必要であることから、これらを再生系（クレアチンキナーゼ−クレアチンリン酸系等）とともにエネルギー源として無細胞系に加える。このような構成成分により、細胞内で起こるタンパク質合成反応を試験管内で再構成している。
【０００４】
タンパク質の合成活性を増強するために、無細胞タンパク質合成系に種々の添加物を加えたり、あるいは抽出液中の特定の成分を除去した抽出液混合物が報告されている。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液を用いるタンパク質合成反応系ではＬ−グルタミン酸のカリウム塩が通常８０〜３２０ｍＭ、好ましくは１２０〜２８０ｍＭ含まれる。特に、透析系による無細胞タンパク質合成反応において、Ｌ−グルタミン酸カリウム塩を透析内液及び外液の両方に添加することでタンパク質合成反応が約８時間持続し、極めて高い合成量が得られる（特許文献２参照）。しかしながら、この方法では、反応系の中に高濃度のＬ−グルタミン酸が存在するため合成されるタンパク質のグルタミン酸残基を同位体標識することが困難である。なぜなら、タンパク質を同位体標識する場合には、反応系における天然のＬ−アミノ酸濃度をできるだけ低くすることにより、通常数ｍＭ程度の濃度で用いられる同位体標識アミノ酸のタンパク質への取込み効率を上げる必要があるからである。一般的に同位体標識されたアミノ酸の価格が非常に高いため、できるだけ少量の同位体標識アミノ酸を用いてそのタンパク質への取込み効率を上げることは経済的に極めて重要である。従って、無細胞タンパク質合成系に、同位体標識されたＬ−グルタミン酸カリウムを上記のような高濃度添加してタンパク質を合成することは、著しくコストが上昇し現実的には不可能である。
【０００５】
一方、無細胞系に同位体標識されたアミノ酸を添加してタンパク質を合成し、得られた同位体標識タンパク質が種々の用途に利用されている。例えば、微量のタンパク質を検出するために放射性同位元素で標識したり、あるいは、ＮＭＲを用いてタンパク質の立体構造を解析する場合には、特定のアミノ酸、又は２０種類のすべてのアミノ酸をＮＭＲスペクトルの検出に適した安定同位体標識アミノ酸に置換することが必要となる。
【０００６】
従って、合成されるタンパク質中のすべてのアミノ酸残基を同位体標識するためには、合成反応系にＬ−グルタミン酸カリウム塩を添加することができず、添加した場合と比べてタンパク質合成活性が著しく低下するという問題点があった。これを回避するために、Ｌ−グルタミン酸カリウム塩の代わりに酢酸カリウムを添加してカリウム濃度を保つ方法があるが、この場合でもＬ−グルタミン酸カリウム塩の効果に比べて約半分程度の合成量しか得ることができない。
【０００７】
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【特許文献２】特開平４−２００３９０号公報
【非特許文献１】ジェフリー・ズベイ(Geoffrey Zubay)、「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Annual Review of Genetics）」１９７３年、第７巻、ｐ．２６７−２８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質合成活性を高く維持しながら、且つタンパク質を構成するすべてのアミノ酸を同位体標識できるような合成反応系を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑みて本発明者らはＬ−グルタミン酸カリウムと化学的性質が類似する種々の物質について、無細胞タンパク質合成系での合成活性に与える影響と、合成されるタンパク質への同位体アミノ酸の標識効率について調べた結果、これら両方の活性について良好な効果を示す特定の物質を見出した。つまり、無細胞タンパク質合成系に添加した場合に、Ｌ−グルタミン酸カリウムと同様にタンパク質合成活性を高く維持することができると共に、同位体標識アミノ酸の取り込みを全く阻害しない物質を見出すことによって本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、改善された組成の反応液混合物を用いる無細胞タンパク質合成方法を提供するものであって、その第１の視点において、Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩と、同位体標識されたＬ−アミノ酸とを含有する反応混合物を用いることを特徴とする。上記Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩とは、Ｄ−アミノ酸塩及び／又はポリアミノ酸塩を指すとともに、上記Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸とカリウムやナトリウム等のイオンとが必要に応じて中和された状態の水溶液も含まれる。すなわち、上記Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸の塩とは、Ｄ−アミノ酸及び／又はポリアミノ酸と、当該アミノ酸を中和する塩基とが上記反応液混合物中でイオン化した状態となるものを指す。なお、該ポリアミノ酸としては、Ｄ体、Ｌ体を問わない。
【００１１】
好ましい実施形態において、前記Ｄ−アミノ酸の塩がＤ−アスパラギン酸、及び／又はＤ−グルタミン酸のカリウム塩であり、前記ポリアミノ酸の塩がポリグルタミン酸のカリウム塩であることを特徴とする。前記同位体標識アミノ酸は、１３Ｃ、１５Ｎ、及び／又は２Ｈで標識されたアミノ酸であることが好ましい。
【００１２】
本発明の他の視点において、上記何れかの方法により製造された同位体標識化タンパク質を提供することを特徴とする。
【００１３】
本発明のさらに異なる視点において、上記同位体標識化タンパク質を用いてＮＭＲ測定することにより当該タンパク質の立体構造を解析する方法を提供することを特徴とする。
【００１４】
他の視点において、本発明は、大腸菌のＳ３０抽出液と、同位体標識されたＬ−アミノ酸と、緩衝液と、塩と、ヌクレオチド三リン酸と、エネルギー物質とを含む無細胞タンパク質合成用反応液混合物を提供するものであって、前記塩として５０〜３２０ｍＭのＤ−アミノ酸のカリウム塩を含むことを特徴とする。前記Ｄ−アミノ酸のカリウム塩の濃度は好ましくは１００〜３００ｍＭの濃度範囲であり、より好ましくは１５０〜２５０ｍＭである。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明の反応液混合物に含まれる前記Ｄ−アミノ酸の塩がＤ−アスパラギン酸、及び／又はＤ−グルタミン酸のカリウム塩であり、前記ポリアミノ酸の塩がポリグルタミン酸のカリウム塩であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法により、すべてのアミノ酸について同位体標識が可能な条件下において、無細胞系での高いタンパク質合成活性を得ることができ、立体構造の解析、特にＮＭＲ解析に適したタンパク質を効率よく合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の方法において、無細胞タンパク質合成系とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。
【００１８】
大腸菌の抽出液としては、ズベイら(前掲)又はプラットら(Pratt, J.M. et al., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 179-209, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)に記載された方法により調製されたＳ３０抽出液を用いることができる。大腸菌Ｓ３０抽出液は、転写及び翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいる。更に補充的な混合液を添加することができる。具体的な調製方法としては、まず最初に大腸菌を培養し、菌体を遠心分離等により回収する。回収された菌体は、洗浄後、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。破砕された大腸菌の不溶物質を遠心分離で除去し、プレインキュベーション混合液と混合してインキュベーションする。この操作によって内在性のＤＮＡ、ＲＮＡが分解されるが、更に、カルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加して内在性の核酸を分解させてもよい。続いて、透析により内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除き、適量ずつ分注して液体窒素又は−８０℃にて保存する。
【００１９】
真核細胞抽出物としては、ウサギ網状赤血球溶解物及び小麦胚芽抽出物が好ましい。ウサギ網状赤血球溶解物は、ペルハム及びジャクソン(Pelham, H.R.B. and Jachson, R.J. Eur. J. Biochem., 67, 247-256, 1976)によって記載された方法を用いることができる。小麦胚芽抽出液の作製方法としては、例えばロバーツ及びパターソン(Roberts, B.E. and Paterson, B.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2330-2334, 1973)によって記載された方法を用いることができる。
【００２０】
タンパク質合成反応を行う際には、上記細胞抽出液に転写／翻訳鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡ、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類、抗菌剤、また鋳型としてＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的タンパク質や、用いるタンパク質合成系の種類によって適宜選択して調製される。例えば、大腸菌のＳ３０抽出液の場合は、Ｔｒｉｓ−酢酸、ＤＴＴ、ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，及びＵＴＰ）、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸、又はそれらの誘導体）を含む。放射性同位元素でタンパク質を標識する場合には標識アミノ酸を除いた残りを添加する。また、すべてのアミノ酸を同位体標識する場合にはすべての天然アミノ酸を除く。また、鋳型ＤＮＡとしては組換えＤＮＡ技術により作成されたプラスミドＤＮＡ等の環状二本鎖ＤＮＡ、あるいはＰＣＲにより試験管内で簡易に調製することのできる直鎖状（線状）ＤＮＡのいずれも使用可能であるが、無細胞タンパク質合成系の混合物組成を改善することにより直鎖状鋳型ＤＮＡを用いても安定且つ高効率にタンパク質を合成することができる。
【００２１】
本発明の方法において、エネルギー再生系としては好ましくは０．０２〜５μg/μｌのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と１０〜１００ｍＭのクレアチンホスフェート（ＣＰ）の組合せや、１〜２０ｍＭのホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）と０．０１〜１μg/μｌのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の組合せ等によるＡＴＰ再生系が使用可能であるが、これらに限定されない。上記ＰＫ及びＣＫは何れもＡＤＰをＡＴＰに再生する酵素であり、それぞれＰＥＰおよびＣＰを基質として必要とする。
【００２２】
タンパク質合成活性を増強させる目的で種々の添加物を加えることができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、葉酸、ｃＡＭＰ、ｔＲＮＡ、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、及び至適濃度の酢酸マグネシウム等の一部あるいは全部を添加する。これらの補充的な混合液は、通常Ｓ３０抽出液とは別に保存しておき、使用直前に混合するが、これらをＳ３０抽出液とあらかじめ混合して凍結融解を行い、ＲＮＡ分解酵素複合体を除去することもできる（国際公開ＷＯ０１８３８０５号パンフレット参照）。
【００２３】
本発明においては、上記グルタミン酸カリウムとして一般的に用いられているＬ−グルタミン酸カリウムに代えて、Ｄ−グルタミン酸カリウム、あるいはＤ−アスパラギン酸カリウム、及び／又はポリグルタミン酸カリウムを添加する。ポリグルタミン酸はＬ−体及びＤ−体のいずれであっても良い。ここで、Ｄ−グルタミン酸カリウム、あるいはＤ−アスパラギン酸カリウム、及び／又はポリグルタミン酸カリウムとしては、入手可能な場合には市販品を用いてもよく、又はＤ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、ポリグルタミン酸をカリウムやナトリウム等の水酸化物（より好ましくは、水酸化カリウム）で中和した水溶液として添加しても良い。添加量は、タンパク質合成活性が最も高くなるように適宜設定することができるが、通常は、Ｄ−グルタミン酸カリウムの場合、１００〜３００ｍＭ、好ましくは、１５０〜２５０ｍＭである。
【００２４】
さらに本発明においては、無細胞タンパク質合成系で合成されるタンパク質を同位体標識するために同位体アミノ酸を添加する。これらの同位体は３Ｈや１４Ｃなどの放射性同位元素、１３Ｃや１５Ｎのような安定同位体元素のいずれであっても良い。好ましくは、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いたタンパク質の立体構造の解析を行うために用いる安定同位体元素で置換されたアミノ酸を用いる。ＮＭＲは、溶液中におけるタンパク質の原子レベルにおける静的・動的立体構造を決定できる唯一の分光法であり、ＮＭＲによって決定されたタンパク質の立体構造をもとに、さまざまな生命現象が研究されている。ＮＭＲでタンパク質の立体構造を解析するためには種々の方法があるが、例えば、種々の安定同位体元素標識されたタンパク質を用いて測定したＮＭＲシグナルがタンパク質中のどの原子由来であるかを明らかにする、いわゆるＮＭＲシグナルの帰属を行う。シグナル帰属法ついては、いくつかの２次元ＮＭＲをはじめとして３次元、４次元ＮＭＲスペクトルを使用する系統的な戦略が確立されている。これらの情報の中には核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）、スピン結合などタンパク質の構造決定に有用な情報が多数含まれている。シグナル帰属に基づき溶液中のタンパク質の原子間距離を見積もることができる。原子間の距離からそれぞれの原子の座標を求める計算をディスタンス・ジオメトリー計算とよび、ＮＭＲによるタンパク質の立体構造計算はＮＯＥから得られた距離情報などをもとにディスタンス・ジオメトリー法により立体構造を計算することである。シグナルの帰属を正確に行うために、例えば、１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣ、ＨＮＣＯ、及びＨＮＣＡなどの種々のスペクトルが測定される。安定同位体原子による置換方法にも種々の方法があり、タンパク質中の特定のアミノ酸のみを標識する場合もあるが、すべてのアミノ酸を標識することも可能である。
【００２５】
このような同位体標識タンパク質を合成する方法としては、組換えＤＮＡ技術により作製された形質転換細胞を用いるよりも無細胞タンパク質合成系の方が好ましい。細菌や酵母、動物細胞内で発現させる方法に比べて同位体標識アミノ酸の使用量が少なくコスト的に有利であるばかりでなく、細菌や酵母の場合には培養中に同位体アミノ酸が代謝され同位体元素の希釈化が起こるからである。また、ＮＭＲスペクトルで検出可能な所望の部位のみが標識されたアミノ酸、例えば、α‐アミノ基を１５Ｎで、カルボニル炭素及びα炭素を１３Ｃで標識し、側鎖は非標識のままのアミノ酸を用いることもできる。
【００２６】
これらの無細胞タンパク質合成用反応混合物又は同位体アミノ酸混合物は、それぞれ別に、若しくはあらかじめ混合した状態で、使用しやすいように一定量ごと分注して製品として配送することができる。これらの製品は凍結又は乾燥状態で保存することができ、保存及び輸送に適した容器に収容してキットとして販売される。キットには取扱説明書や陽性コントロールＤＮＡ、ベクターＤＮＡ等を添付することができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例として、ＣＡＴ及びＧＦＰタンパク質を用いて本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［実施例１］ＣＡＴタンパク質合成のグルタミン酸カリウム濃度依存性
大腸菌Ｓ３０抽出液はズベイ(Zubay)ら（Annu.Rev.Geneti.,7,267-287,1973）の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１codon plus株から調製した。タンパク質合成反応は下記の表１に示した組成の溶液を、表２に示した組成の透析外液に対して透析し、３０℃で８時間行った。なお、ＣＡＴ発現ベクターとしてはｐＫ７−ＣＡＴ(Kim et al.,Eur. J. Biochem. 239, 881-886, 1996参照)を用いた。反応スケールは反応液３０μｌ、透析外液３００μｌとした。合成されたＣＡＴタンパク質の定量はＳｈａｗらの方法(Methods Enzymol. 735-755, 1975参照)に従った。すなわち、アセチルコエンザイムＡとクロラムフェニコールを基質としてＣＡＴによるクロラムフェニコールのアセチル化反応を行い、その結果生じた還元型コエンザイムＡを５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＮＴＢ）を用いて発色定量した。３７℃、４１２ｎｍにおける吸光度の単位時間当たりの増加量よりＣＡＴの活性を定量し、これを指標としてＣＡＴタンパク質量を決定した。
【００２９】
グルタミン酸カリウムとしては、Ｌ−グルタミン酸カリウム又はＤ−グルタミン酸カリウムを０〜３２５ｍＭの種々の濃度となるように添加して合成反応を行った。また、Ｄ−グルタミン酸カリウムを添加した実験において、酢酸アンモニウムの濃度は０ｍＭ、２７ｍＭ、又は５４ｍＭとした。なお、添加したＬ−及びＤ−グルタミン酸カリウムは、Ｌ−グルタミン酸及びＤ−グルタミン酸を水酸化カリウム溶液に溶解させてｐＨ７．０となるように調節した水溶液を添加したものと、和光純薬社より購入したＬ−グルタミン酸カリウム２００ｍＭ（酢酸アンモニウムの濃度は２７ｍＭとした。図１中、×印で表す。）を添加したものをそれぞれ使用した。その結果を図１に示した。図１中には、比較としてグルタミン酸カリウムの代わりに酢酸カリウム１００ｍＭを添加した従来例も併せて示す（酢酸アンモニウムの濃度は７４ｍＭとした。図１中、米印）。
【００３０】
図１の結果より、Ｌ−体及びＤ−体のいずれのグルタミン酸カリウムを添加した場合においても、無添加の場合に比べて濃度依存的にＣＡＴ合成量が増加し、約２００〜２５０ｍＭの濃度範囲においては極めて高い合成量が得られることがわかった。また、この濃度範囲に調製した場合では、従来より反応液組成中の塩として添加されている酢酸カリウムの系よりも非常に良好な結果が得られることがわかった。
【００３１】
［表１］タンパク質合成反応液組成
2005102513.tif 000003
【００３２】
［表２］透析外液組成
2005102513.tif 000004
【００３３】
［実施例２］Ｄ−グルタミン酸カリウム系での直鎖状鋳型ＤＮＡの発現
次に、タンパク質合成反応液組成中にグルタミン酸カリウムとして２５０ｍＭのＤ-グルタミン酸カリウムを添加した系でＣＡＴタンパク質をコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の方法によりＣＡＴタンパク質の合成を行った。
【００３４】
ここで使用した大腸菌Ｓ３０抽出液は、大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ株から調製したものに代えた。また、上記直鎖状二本鎖ＤＮＡは、実施例１で使用したＣＡＴ発現ベクターｐＫ７-ＣＡＴを鋳型とし、５’プライマーM13-45 Fw：5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号１）及び３’プライマーM13 Rev：5'-AATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'（配列番号２）を用い、通常のＰＣＲにより得た。ＰＣＲの反応液組成は以下の表３に示したとおりである。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、初期変性を９４℃で２分間行ったあと、９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で２分間のサイクルを１０回、続いて９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で（２分＋５秒／サイクル）間のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で５分間の伸長反応を１回行った。
【００３５】
［表３］
2005102513.tif 000005
【００３６】
このようにして調製した直鎖状鋳型ＤＮＡ及び環状プラスミドｐＫ７−ＣＡＴを用い、Ｄ−グルタミン酸カリウム系（２５０ｍＭ  Ｄ−グルタミン酸カリウム、２７ｍＭ酢酸アンモニウム）、Ｌ−グルタミン酸カリウム系（２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸カリウム、２７ｍＭ酢酸アンモニウム）、及び酢酸カリウム系（１００ｍＭ酢酸カリウム、７２ｍＭ酢酸アンモニウム）の３種類の条件で実施例１と同様の方法で合成したＣＡＴタンパク質量を図２に示した。
【００３７】
図２より、鋳型ＤＮＡとして、直鎖状のものを用いた場合でも、環状プラスミドを用いた場合とほぼ同程度の高い合成量が確保できることが明らかとなった。従って、本発明を適用したＤ-グルタミン酸カリウムの合成系では、直鎖状鋳型ＤＮＡを用いた効率良いタンパク質合成が可能であることがわかった。
【００３８】
［実施例３］安定同位体標識Ｒａｓタンパク質の合成
（１）Ｒａｓタンパク質合成
実施例１において、表１に示すタンパク質合成反応液組成中、鋳型ＤＮＡをＲａｓタンパク質をコードする配列番号３に示した塩基配列の環状二本鎖ＤＮＡ（発現ベクターpK7-Nhis-Ras）２μｇ/ｍｌに代えるとともに、アミノ酸を１５Ｎ標識アミノ酸に代え、その他は実施例１と同様にして、グルタミン酸カリウムとしてＤ-グルタミン酸カリウム又はＬ-グルタミン酸カリウムを２５０ｍＭ添加したそれぞれの合成系により標識Ｒａｓタンパク質を合成した。
【００３９】
（２）１５Ｎ標識Ｒａｓタンパク質の精製
上述のように合成したＲａｓタンパク質の精製を行った。１５Ｎ標識タンパク質の精製には、ヒスチジンタグとコバルトの親和性を利用した。操作は４℃で行った。まず合成反応終了後、３ｍｌの反応液を２．６ｍｌの洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／７５０ｍＭ塩化ナトリウム）で希釈、回収し、１９６０×ｇ、５分間遠心して沈殿を取り除いた。次に、得た上清を３．２ｍｌのＴＡＬＯＮ樹脂(BD Biosciences clontech社)に通して吸着させ、９．６ｍｌの洗浄緩衝液を通すことで夾雑物を除去した。最後に４ｍｌの溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／３００ｍＭ塩化ナトリウム／５００ｍＭイミダゾール）を通すことでサンプルを樹脂から遊離させた。
【００４０】
ＮＭＲ測定の邪魔になるヒスチジンタグを切断するために、まず限外ろ過装置(ビバスピン２;ザルトリウス社)を用いて精製産物を５００μｌまで濃縮し、６μｇ／ｍｌのＴＥＶプロテアーゼを加えて３０℃で１４時間切断反応を行った。次に限外ろ過装置を用いて溶媒を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／７５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液に置換して５００μｌまで濃縮し、ヒスチジンタグの除去の邪魔になるイミダゾールを除去した。得られたサンプルに対して、３．５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／７５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液を加え、１．６ｍｌのＴＡＬＯＮ樹脂を通して、切断されたヒスチジンタグを樹脂に吸着させ除去した。ＴＡＬＯＮ樹脂に吸着しなかった画分を回収し、Ｒａｓタンパク質を得た。以上の手順により、３．４ｍｇの精製サンプルを得た。
【００４１】
（３）ＮＭＲ測定試料の調製
精製サンプルをＮＭＲ測定に適した溶媒にするために、限外ろ過装置を用いて、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）／１００ｍＭ塩化ナトリウム／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／５ｍＭ  ｄ−ＤＴＴ／０．０１％ＮａＮ３溶液に置換した。その後、サンプルを０．２５ｍｌ(サンプル濃度０．８５ｍＭ)まで濃縮した。最後に０．０３ｍｌの重水を添加してＮＭＲ測定用試料とした。
【００４２】
（４）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ測定用のサンプル管にはシゲミ社の対称型ミクロ試料管（５ｍｍプローブ用）を用いた。ＮＭＲ測定は、６００ＭＨｚのＮＭＲ装置（ＤＲＸ；ブルカー社)で、温度２５℃のもとで行った。判定には、１Ｈ−１５Ｎ２次元ＨＳＱＣスペクトル(以後、１５Ｎ-ＨＳＱＣスペクトルと略記)を用いた。その際の測定条件は、表３に示す通りである。
【００４３】
ＮＭＲ測定の結果を図３に示した。図３．２が示すようにＬ-グルタミン酸カリウムの系で合成したＲａｓタンパク質ではグルタミン酸のシグナルが消失していた。これは１５Ｎ標識グルタミン酸よりも遙かに濃い濃度の非標識Ｌ-グルタミン酸が反応液中に存在するため、これがタンパク質に取り込まれることが原因であると考えられる。一方、図３.１から明らかなように、本発明のＤ-グルタミン酸カリウムの系で合成したＲａｓタンパク質にははっきりとしたグルタミン酸のシグナルが見られ、高い効率でＲａｓタンパク質中のグルタミン酸の標識がされていることが確認された。この結果はＤ-グルタミン酸が基質としてタンパク質中に取り込まれていないこと、及び大腸菌抽出物中の酵素代謝により、１５Ｎ標識Ｌ-グルタミン酸の標識率が低下していないことを示す。
【００４４】
従って本発明により、タンパク質合成量の向上と、２０種類全てのアミノ酸残基が均一に標識されたタンパク質の合成が可能となり、ＮＭＲによる立体構造解析用試料として高品質の標識体を低コストで提供することが可能となる。
【００４５】
［表４］ＮＭＲ測定条件
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【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】種々の濃度のグルタミン酸カリウム（Ｌ型、又はＤ型）を添加した無細胞タンパク質合成系でＣＡＴ合成量を測定した結果である。
【図２】Ｄ−グルタミン酸カリウムの添加又は無添加の３種類の系でＣＡＴタンパク質の発現量を測定した結果である。
【図３．１】実施例４で合成したＲａｓタンパク質のＮＭＲ測定結果である。Ｄ−グルタミン酸カリウム存在下で合成したタンパク質の１５Ｎ-ＨＳＱＣスペクトルを示す。
【図３．２】実施例４で合成したＲａｓタンパク質のＮＭＲ測定結果である。Ｌ−グルタミン酸カリウム存在下で合成したタンパク質の１５Ｎ-ＨＳＱＣスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【配列表】
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