(57)【要約】  【課題】粘膜ワクチンの送達を効率化する物質のスクリーニング法、そのような物質を利用した粘膜ワクチン等を提供すること  【解決手段】  絨毛上皮細胞層のＭ細胞（絨毛Ｍ細胞）を用いて、このＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法、例えば、上記絨毛Ｍ細胞に抗原及び／又は試験化合物を接触させる工程を含むＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法、このスクリーニング方法によって同定されるワクチン標的物質、それを標的とするワクチンなどによって達成される。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞を用いて、このＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
上記Ｍ細胞に試験化合物を接触させる工程を含む前記請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記試験化合物として標識された試験化合物を用い、その試験化合物を接触させた後のＭ細胞を電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムで観察する工程を含む前記請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
上記Ｍ細胞に、抗原と試験化合物を接触させる工程を含む前記請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記抗原として標識された抗原を用い、その抗原と上記試験化合物を接触させた後のＭ細胞を電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムで観察する工程を含む前記請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムによる観察が免疫組織学的手法に基づく前記請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞を用いることにより、これらのＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞のそれぞれに、抗原及び／または試験化合物を接触させる工程を含む前記請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記請求項１〜８のいずれかの方法によって同定される、Ｍ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質。
【請求項１０】
前記請求項９に記載の物質を含んでなるアジュバント。
【請求項１１】
前記請求項１０に記載のアジュバントを含んでなる粘膜ワクチン。
【請求項１２】
前記請求項９記載の物質を標的とする粘膜ワクチン。
【請求項１３】
絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞を用いることにより、粘膜ワクチンの送達効果を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞（以下、「絨毛Ｍ細胞」ともいう）への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法、そのスクリーニングによって同定されるワクチン標的物質、その物質を用いる粘膜ワクチンなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
外界からの異物の侵入に対する防御システムとして免疫システムが存在している。免疫システムには、（１）胸腺、骨髄を中心とした全身系、末梢系免疫システムと（２）粘膜免疫システムとに大別できる。
【０００３】
粘膜は、口腔、鼻腔、呼吸器、消化器、生殖器を被う、外部環境との界面である。粘膜は、食物摂取、呼吸などを通して種々の異物と接しており、例えば病原微生物にとっては宿主体内へ侵入する主要な経路となっている。そのために、粘膜における免疫防御機構は生命バリアとして重要である。
【０００４】
粘膜免疫において抗原特異的な免疫を誘導するためには、各器官の粘膜面に存在する、例えば腸管関連リンパ組織（gut associated lymphoreticular tissue；以下、ＧＡＬＴと略す）のような粘膜免疫誘導組織に抗原が取り込まれる必要がある。粘膜免疫誘導組織の上皮細胞層には、抗原の取り込み機能に特化されたＭ細胞が存在している。このＭ細胞により取り込まれた抗原が、Ｍ細胞の下層に存在するマクロファージや樹状細胞のような抗原提示細胞へ送達されて初めて抗原特異的な免疫誘導が開始される（例えば、Yuki Y, Kiyono H: New generation of mucosal adjuvants for the induction of protective immunity. Rev Med Virol 13. 293-310. 2003参照：非特許文献１）。
【０００５】
免疫システムを作用させるためにワクチンが利用されている。現行の多くのワクチンで採用されている注射による投与形態では、全身系免疫システムを介した免疫応答を誘導するのに有効ではあるが、粘膜免疫システムを介した免疫応答はほとんど誘導されない。この粘膜免疫システムに免疫応答を誘導するためには経口あるいは経鼻による投与形態をとることが必要となる。さらにワクチンを経口あるいは経鼻投与することにより、全身系免疫システムにも同時に免疫応答が誘導されることが知られるようになった。
【０００６】
現在の、例えば経口ワクチンのような粘膜ワクチンの開発は、ＧＡＬＴの代表格であるパイエル板等の粘膜免疫誘導組織に存在する抗原取り込みの専門の細胞であるＭ細胞へ効率良くワクチン抗原を運搬・送達する事を考慮して行われている。
【非特許文献１】Yuki Y, Kiyono H: New generation of mucosal adjuvants for the induction of protective immunity. Rev Med Virol 13. 293-310. 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、抗原の取り込み口であるＭ細胞は、上皮細胞層に散在している上に、全上皮細胞の０．１％未満と少なく、検出するために使用できる特異的マーカーも知られていない。このような状況下、Ｍ細胞の機能を利用することによる、ワクチン抗原の運搬・送達を可能にする分子のスクリーニング、あるいは得られた分子を標的とした新規粘膜ワクチンの開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、粘膜免疫に関与するＭ細胞について研究を重ねた結果、今回初めて、パイエル板などの粘膜免疫誘導組織にだけ存在すると考えられていたＭ細胞が、驚くべきことに、腸管吸収上皮細胞からなる絨毛上皮細胞層にも存在することを発見し、本発明を完成したものである。具体的には、本発明は、下記に示すようなワクチン標的物質のスクリーニング方法、そのスクリーニングによって同定されるワクチン標的物質、その物質を用いる粘膜ワクチンなどを提供する。
【０００９】
（１）絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞を用いて、このＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法。
（２）上記Ｍ細胞に試験化合物を接触させる工程を含む前記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）上記試験化合物として標識された試験化合物を用い、その試験化合物を接触させた後のＭ細胞を電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムで観察する工程を含む前記（２）に記載のスクリーニング方法。
【００１０】
（４）上記Ｍ細胞に、抗原と試験化合物を接触させる工程を含む（１）に記載のスクリーニング方法。
（５）上記抗原として標識された抗原を用い、その抗原と上記試験化合物を接触させた後のＭ細胞を電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムで観察する工程を含む前記（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）上記電子顕微鏡及び／又は共焦点イメージ解析システムによる観察が免疫組織学的手法に基づく前記（５）に記載のスクリーニング方法。
【００１１】
（７）絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞を用いることにより、これらのＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法。
（８）絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞のそれぞれに、抗原及び／または試験化合物を接触させる工程を含む前記（７）に記載のスクリーニング方法。
【００１２】
（９）前記請求項１〜８のいずれかの方法によって同定される、Ｍ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質。
（１０）前記（９）に記載の物質を含んでなるアジュバント。
（１１）前記（１０）に記載のアジュバントを含んでなる粘膜ワクチン。
（１２）前記（９）に記載の物質を標的とする粘膜ワクチン。
（１３）絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞を用いることにより、粘膜ワクチンの送達効果を評価する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は従来から言われているパイエル板等の粘膜免疫誘導組織上皮細胞層Ｍ細胞（以下、「パイエル板Ｍ細胞」ともいう）のみならず、吸収上皮細胞から構成されている絨毛上皮細胞層に存在するＭ細胞（絨毛Ｍ細胞）同定することにより、後者特異的または両Ｍ細胞特異的にワクチン抗原を運搬・送達させる事を可能にする分子の発見やそれを標的とした新規粘膜ワクチン開発への手段を提供する。さらに既存の経粘膜抗原投与方法が後者または前者並びに両者に運搬・送達されているかを観察する手段を提供する。さらに、絨毛Ｍ細胞を介した新しい感染経路の解明は、新規予防法開発への手段を提供する。
【００１４】
また、インフルエンザ、ＳＡＲＳ，エイズ、赤痢、コレラをはじめ重篤な感染症の多くが鼻腔、口腔、上気管支、腸管、泌尿生殖器等の粘膜で覆われた組織を介して引き起こされるという事実から粘膜面での侵入メカニズムとその防御メカニズムの解明が、それ応用した感染予防法確立に最も効果的であることは明白である。従来の注射型ワクチン投与法は全身免疫を効果的に誘導し、パイエル板Ｍ細胞標的型経口ワクチンは粘膜免疫応答を効果的に誘導する。本発明は、新たに発見された絨毛Ｍ細胞を標的とした粘膜ワクチン開発の鍵となる腸管絨毛吸収上皮細胞層に存在するＭ細胞の同定・分離、そして抗原取り込み・病原微生物侵入解析に関するものであり、新規ワクチンデリバリー分子の同定や既存粘膜ワクチンの評価に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の第一の態様によれば、絨毛Ｍ細胞を用いて、このＭ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質をスクリーニングする方法が提供される。具体的には、上記絨毛Ｍ細胞に抗原及び／又は試験化合物を接触させて、その試験化合物がＭ細胞に取り込まれるか否か、さらにはどの程度の量取り込まれるか否かを試験する。
【００１６】
ここで用いられるＭ細胞は、新規に見出された絨毛Ｍ細胞であり、特にこれらに限定されないが、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳動物の小腸、大腸、回腸などから採取する。上記スクリーニング実験においては、小腸、大腸、回腸等の組織片中に存在するＭ細胞として用いてもよいし、場合によっては、培養したものを用いることもできる。Ｍ細胞の培養は公知の手法に基づいて行うことができる（文献：Kerneis, S. et al.: Science 277, 949-52 (1997)。
【００１７】
上記スクリーニング実験を効率良く行う場合は、例えば、Ｍ細胞を有する組織片あるいは、培養液を９６ウエル等のプレートに分取し、これに抗原及び／又は試験化合物を添加し、一定時間、例えば５〜１２０分、好ましくは１０〜３０分、一定温度、例えば３０〜４０℃、好ましくは３５〜３７℃でインキュベーションを行う。この反応は、細胞、組織などに適切な培地、例えば、ＲＰＭＩ、ＭＥＭなど、あるいはＰＢＳなどの中性付近の等張緩衝液中で行われることが望ましい。
【００１８】
ワクチン抗原としては、微生物に由来する抗原あるいは弱毒化微生物、また精製抗原を用いることができるが、次の顕微鏡観察の工程が容易になるように、抗原に標識することが望ましい。標識のために用いられる標識剤としては、例えば、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン、ＧＦＰ（green fluorescent protein）などが用いられる。
【００１９】
ここで試験化合物とは、Ｍ細胞へのワクチン抗原の運搬・送達を促進させる物質の候補物質を指し、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などから選択される。これらはまた、新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。必要に応じて試験化合物に標識する。抗原と試験化合物の両者を標識する時は、両者を区別できるように別の標識物質を用いるとよい。
【００２０】
上記のようにして、Ｍ細胞と抗原及び／又は試験化合物を接触させた後は、適当な手法を用いて抗原及び／又は試験化合物がＭ細胞にどの程度取り込まれたかを確認する。例えば、インキュベーション後に、標識された試料を走査型あるいは透過型電子顕微鏡、共焦点イメージ解析システム等を用いて、その画像を解析し、Ｍ細胞にワクチン抗原を運搬・送達させることを可能にする分子の候補を選択する。通常、このような解析は、当業者に公知である免疫組織学的手法に基づいて行なわれる。
【００２１】
このようにして、絨毛Ｍ細胞に対して抗原を送達する能力の高い分子をスクリーニングすることができる。上記例では、絨毛Ｍ細胞のみを用いる例を示したが、絨毛Ｍ細胞に加えて、粘膜免疫誘導組織由来のＭ細胞を用いることにより、いずれかのＭ細胞に特異的あるいは両者特異的にワクチン抗原送達能力の高い分子をスクリーニングすることができる。
【００２２】
本発明の別の態様では、上記スクリーニング方法によって同定される、Ｍ細胞への抗原の運搬又は送達を促進する物質を提供することができる。そのような物質は、粘膜ワクチンのアジュバントとして用いることができる。
【００２３】
また、本発明の別の態様によれば、そのようなアジュバントを含んでなる粘膜ワクチンを提供することができる。
ワクチンに使用する抗原のうち、例えば微生物の抗原もしくは弱毒化微生物として、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型・２型、ＡＴＬ（成人型Ｔ細胞白血病）ウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、突発性発疹ウイルス（ＨＨＶ−６）、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプス（おたふくかぜ）ウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、ノーウオークウイルス、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、天然痘ウイルス、テング熱ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、ＳＡＲＳ（コロナウイルス）、エボラ出血熱ウイルス（フィロウイルス）、マールブルグウイルス（フィロウイルス）、ラッサ熱ウイルス、ハンタウイルス、ニパウイルス等の病原性ウイルス、虫歯連鎖球菌、歯周病原性菌、コレラ菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭ソ菌、病原性大腸菌、ペスト菌、野兎病菌、大腸菌Ｏ１５７、ライム病ボレリア、サルモネラ菌、ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌）、ＶＲＥ（腸球菌）、結核菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、レジオネラ菌、ブルセラ病（波状熱）菌等の病原性細菌を含む細菌類、クラミジア、Ｑ熱リケッチャなどのリケッチア類、アメーバ赤痢、マラリア病原虫などの原虫類等のタンパク質抗原、もしくはこれら微生物そのものの病原性を弱めた弱毒化微生物等を挙げることができる。なお、微生物のタンパク質抗原としては、インフルエンザウイルスの場合には、ヘマグルチニン（ＨＡ）やノイラミニダーゼ（ＮＡ）の単品もしくは混合物を、本発明の経口ワクチンに保持させるものとして例示することができる。これらの抗原は、微生物から加工、精製する等の方法で得ることができるが、合成によって得ることもでき、さらに遺伝子工学的に製造することもできる。
【００２４】
また、本発明に示される経口ワクチンが保持しうる抗原は、脂質膜構造体の種類によっても異なる。例えば、リポソームが保持しうるものとしては特に制限がなく、水溶性あるいは脂溶性の微生物抗原もしくは弱毒化微生物等を挙げることができる。またエマルジョンの場合には脂溶性の抗原を、ミセルの場合には水難溶性の抗原を保持可能なものとして挙げることができる。
【００２５】
本発明に示されるワクチンは、経口投与によって抗体価をあげることを特徴とするが、用量としては成人一人１回当り、例えば１０〜１０００μｇである。これを１回投与するか、または１週間間隔で２回投与するか、２週間間隔で２回投与するか、３週間間隔で２回投与するか、もしくは１か月間隔で２回投与するように応用することもできる。さらに、同様な間隔で３回投与、４回投与、５回投与、６回投与することもできる。通常は単回投与または１か月間隔での２から４回投与である。用法としては注射用ワクチンと同様に考えることができる。これ以外の抗原に対するワクチンに関しても、注射用のワクチンの同量から２０倍量で、用法もこれらに準じて適宜投与すれば良い。また、投与される個人の免疫応答性や年令等に応じて適宜増減する場合があってもよい。
【００２６】
本発明に示されるワクチンは、例えば以下のように製造できる。
ａ）リポソーム型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ホスファチジルセリン類（レシチン）、スフィンゴミエリン等の膜成分物質と、ホスファチジルセリン及び／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用いて、公知の方法（例えば、Annual Review of Biophysics and Bioengeneering, 9, 467 (1980)）に従いリポソームの水分散液を調製する。かかるリポソームには安定化剤としてコレステロール等のステロール類、ジアルキルホスフェート、ジアシルホスファチジン酸、ステアリルアミン等の荷電脂質及びα−トコフェロール等の酸化防止剤を含ませても良い。
【００２７】
ｂ）エマルジョン型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、レシチン、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween) 等の両親媒性物質と、大豆油等の油脂と、ホスファチジルセリンおよび／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用い、公知のエマルジョン調製方法に従ってエマルジョンを調製する。
【００２８】
ｃ）ミセル型ワクチンの製造法
微生物の抗原もしくは弱毒化微生物そのものと、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、脂肪酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等のミセル形成界面活性物質（ミセル形成臨界濃度以上の濃度で水性溶媒に加える）と、ホスファチジルセリンおよび／またはマンノースを結合している糖脂質と、場合によっては更にアジュバント物質とを用い、公知のミセル調製方法に従ってミセルの水分散液を調製する。
【００２９】
上記のようなワクチンは、場合によってはさらに公知のアジュバントを添加して用いてもよい。本発明で用いられる粘膜免疫ワクチン用のアジュバントは、粘膜免疫ワクチンとして用いられるタンパク質抗原であれば、いずれのタンパク質抗原とも一緒に粘膜アジュバントとして用いることができる。タンパク質抗原としては、例えばHaemophilus influenzaeの細胞膜タンパク質、Streptococcus mutansの外膜タンパク質などが挙げられる。また、百日せきワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、マイコプラズマワクチンなどに通常使用されるタンパク抗原などと一緒にアジュバントを用いることもできる。さらに、アジュバントは糖質、脂質、ウイルス、細菌自体などであってもよい。
【００３０】
本発明で用いられるアジュバントは、通常、経粘膜投与用ワクチンとして用いられるタンパク抗原と一緒に、経鼻投与あるいは経口投与により投与される。特に経口投与により投与するのが好ましい。本発明で用いられるアジュバントはタンパク質抗原と共に、通常、液状あるいは粉末状の形態で、鼻腔内あるいは口腔内に滴下、噴霧あるいはスプレーすることにより投与される。このようにして投与されるアジュバントの剤型としては、例えば、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。液剤としては、タンパク質抗原と一緒に精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともによく混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。
【００３１】
本発明で用いられるアジュバントは、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、タンパク質抗原と同時に、通常成人１人当たり１回につき１００μｇから１０００μｇの範囲、好ましくは１００μｇから５００μｇの範囲で投与する。アジュバントを粘膜免疫ワクチンと共に、経口投与などの経粘膜投与することにより、唾液、鼻腔、消化管、呼吸器、生殖器分泌液等および血清の双方にワクチンとして用いたタンパク質抗原に特異的な抗体の産生が著しく増強される。従って、本発明で用いられるアジュバントは、各種の粘膜免疫ワクチン 用のアジュバントとして有効である。
【００３２】
本発明のさらに別の態様によれば、絨毛Ｍ細胞と粘膜免疫誘導組織上皮細胞層のＭ細胞を用いることにより、粘膜ワクチンの送達効果を評価する方法をも提供することができる。この方法によれば、既存の粘膜ワクチンを評価することができる。
【００３３】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。まず、本発明で使用する材料および一般的な方法について記述する。
【００３４】
［使用するマウス］
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスは日本クレア株式会社（東京）より購入する。ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質で処理したマウスおよび、ＴＮＦとＬＴ−αの両者をノックアウトしたマウス（ＴＮＦ／ＬＴ−α-/-；１２９×Ｃ５７ＢＬ／６）を、Eugsterら、Int. Immunol. 8、23-36 (1996)およびRennertら、J. Exp. Med. 184、1999-2006 (1996)に記載の方法により作出する。ＬＴ−α-/-（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスはジャクソンラボラトリー（メイン州バーハーバー）から入手する。Ｉｄ２-/-（１２９／Ｓｖ）マウスをYokotaら、Nature 397、702-706 (1999)に記載の方法により作出する。
【００３５】
［Ｍ細胞の染色方法］
ネズミのＭ細胞の検出に、Gebertら、Am. J. Pathol. 154、1573-1582 (1999)に記載の標準的なレクチン染色法を用いる。パイエル板（ＰＰ）を有する、あるいはパイエル板を有していない、未だ実験に供していないＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの粘液を除去した小腸を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、洗浄した後、０．１％グリシンを含有するＰＢＳに溶解した１０％ ＦＢＳでブロックする。レクチン標識実験は、ＴＲＩＴＣを結合したハリエニシダのアグルチニン（ＵＥＡ−１−ＴＲＩＴＣ、ベクター社、カリフォルニア州バーリンゲーム）およびＦＩＴＣを結合したコムギ胚のアグルチニン（ＷＧＡ−ＦＩＴＣ）を用いて、２０μｇ／ｍｌ濃度で２時間行う。ＰＢＳで洗浄後、試料は３０％グリセロールと０．１％窒化ナトリウムを含有するＴｒｉｓ緩衝液中で保存する。試料をバイオラッドＭＲＣ−６００共焦点イメージングシステム（バイオラッド社、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で観察する。アルカリホスファターゼ活性およびアルシアンブルー染色は、Debardら、Gastenterology 120、1173-1182 (2001)に記載の方法により、固定した小腸全体について行われる。
【００３６】
［電子顕微鏡による観察］
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による解析を行うために、まず小腸の切片から粘液を除去し、これを１００ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有するＰＢＳに溶解した２％グルタールアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒド中で室温、１時間固定化する。ＰＢＳで洗浄後、試料を１％四酸化オスミウムで、室温、１時間処理し、段階的なアルコール溶液を用いて脱水する。脱水試料をＣＯ2で臨界点乾燥し、スパッタコーティングした後、日立Ｓ−７００走査型電子顕微鏡（日立）を用いて観察する。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による解析のために、組織試料をカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解した２％ホルムアルデヒドおよび０．０５％グルタールアルデヒド中で４時間固定する。１％Ｌ−リジンを含有するＰＢＳで４時間ブロックした後、試料をＵＥＡ−１−ビオチン（２５μｇ／ｍｌ）、ＵＥＡ−１−ＴＲＩＴＣ（１２．５μｇ／ｍｌ）およびＷＧＡ−ＦＩＴＣ（２０μｇ／ｍｌ）で染色する。染色後、絨毛Ｍ細胞を含む試料を共焦点顕微鏡からなる共焦点イメージ解析システムで観察しながら単離する。次いで、得られた組織を２０ｎｍの金コロイドを結合したヤギ抗ビオチン抗体を含有するＰＢＳで標識し、日立Ｈ−７１００透過型電子顕微鏡を用いて観察する。
【００３７】
［in situでの抗原の取り込み］
プラスミドｐＫＫＧＦＰで形質転換したサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）ＰｈｏＰｃ株は、F. Niedergang博士より供与されたものを使用する。さらに、ＧＦＰを発現するエルシニア菌（Yersinia pseudotuberculosis）、大腸菌のインベイシンおよび大腸菌を公知の方法により調製する。マウスを１匹あたり２ｍｇのケタミン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を腹腔内注射して麻酔する。ＴＮＦ／ＬＴ−α-/-マウスおよび野生型マウスの小腸の約１０ｃｍの長さの断片をその両端で外科用縫合糸を用いて連結する。５×１０8のＧＦＰを発現する細菌を１．０ｍｌに懸濁し、ループに接種し、ｉｎ ｓｉｔｕでインキュベートする。１０分後、パイエル板およびパイエル板を含まない腸管の断片を取り出し、冷却したＰＢＳおよび１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ培地で十分洗浄する。腸管上皮細胞をパイエル板および腸管の断片から、Yamamotoら、J. Immunol. 160、2188-2196 (1998)に記載の方法により単離する。単離した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳ中１０％ＦＢＳで洗浄し、ＵＥＡ−１−ＴＲＩＴＣで標識する。二重陽性の腸管上皮細胞の割合をＦＡＣＳカリバー・フローサイトメーター（ベクトン・ディキンソン社、カリフォルニア州サンノゼ）で解析する。選択したマウスを用いて、小腸断片全体を共焦点顕微鏡で上述のように処理する。弱く接着している、および／または細胞外の細菌を除去するために、冷却したＰＢＳおよびゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地での激しい洗浄を、細菌感染後のＭ細胞を含む絨毛上皮組織および上皮細胞の分離過程で行う。サルモネラ菌に致死効果を有するので、ゲンタマイシンを抗生物質として選択する。
【００３８】
［免疫］
免疫実験に用いる組換え型のサルモネラ菌（S. typhimurium）ＢＲＤ ８４７株は、嫌気的条件で誘導されるｎｉｒＢプロモーターの支配下でプラスミドｐＴＥＴｎｉｒ１５から、非毒性の免疫原性を有する破傷風トキソイドの５０−ｋＤａ  ＴｏｘＣ断片を発現する、ａｒｏＡ ａｒｏＣの二重突然変異体（ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＴｏｘＣ）である。コントロールとして、ＴｏｘＣを発現しないｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａを使用する。組換え型サルモネラ菌を１ｍｌあたり２．５×１０10濃度となるようにＰＢＳに懸濁する。このサルモネラ菌の懸濁液をチューブからマウス１頭あたり０．２ｍｌずつ経口投与する。血清中の抗体価を、Yamamotoら、J. Immunol. 164、5184-5191 (2000)に記載の酵素免疫測定法により測定する。
【００３９】
［データの解析］
データを平均値±標準偏差で表し、マンホイットニーＵ検定により評価する。０．０５未満のＰ値を実質的に有意であると仮定する。
【実施例１】
【００４０】
腸管絨毛上皮組織におけるＵＥＡ−１細胞群の同定
M細胞は粘膜免疫誘導組織の一つである腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、例えばパイエル板のドーム上皮細胞層（またはＦＡＥ）に存在し、そこでのみ成育すると考えられてきた。しかし、ＴＲＩＴＣを結合したハリエニシダのアグルチニン（ＵＥＡ−１）とＦＩＴＣ標識したコムギ胚アグルチニン（ＷＧＡ）で染色したネズミの腸全体の共焦点イメージ解析を用いて、図１に示したように、パイエル板のＦＡＥ領域（ｊ−ｍ）だけでなく、絨毛上皮組織にＵＥＡ−１+ ＷＧＡ-細胞（絨毛Ｍ細胞）を見出した（ａ−ｉ）。図１において、ａ−ｆ、ｊ及びｋで白色又は灰色として観察される（実際には緑色）部分はＷＧＡにより染色された部分であり、矢印が示す個所（実際には赤色）がＵＥＡ−１で染色された個所である。ＵＥＡ−１はαー（１−２）−フコースを含む炭水化物構造に特異性を有するが、選択的にパイエル板のM細胞の原形質膜全体に結合し、ＷＧＡ+円柱上皮細胞には結合しない。ＵＥＡ−１染色の特異性をさらに確認するために、５０ｍＭ 可溶性フコースを用いたブロッキング実験を行った。ＵＥＡ−１を可溶性フコースと予め１時間インキュベーションすると明らかにＦＡＣＳでのＵＥＡ−１染色をブロックし、データは示さないが、免疫組織学的解析によりさらにＵＥＡ−１染色法の特異性が示された。また、図１に示したように、絨毛ＵＥＡ−１+ ＷＧＡ-細胞（絨毛Ｍ細胞）の２種類の形態、すなわち密集型（ａとｂ）と拡散型（ｄとｅ）は、同細胞集団の密度に基づいて区別される。
【実施例２】
【００４１】
パイエル板のない各種マウスにおけるＵＥＡ−１+の絨毛Ｍ細胞群の成育
絨毛Ｍ細胞がパイエル板（またはＧＡＬＴ）欠損マウスで成育できるかを試験した。マウスとしては、子宮内でＬＴβＲ−Ｉｇ処理されたマウス、ＬＴα-/-マウス、ＴＮＦ／ＬＴα-/-マウス、Ｉｄ２-/-マウスが使用された。図２においても、白色部分（実際には緑色）がＷＧＡにより染色された部分であり、それよりも濃い色で観察される部分（実際には赤色）はＵＥＡ−１で染色された部分である。この濃い部分がＭ細胞の所在を示す。図２に示すように、全てのパイエル板欠損マウスの腸管絨毛の先端領域で、特徴的なＵＥＡ−１+ ＷＧＡ-染色を示すＭ細胞を見出した。これはＦＡＥ非依存性のＭ細胞の成育経路が存在することを示すものである。さらに、データは示さないが、パイエル板に加え、新規に記述された単離リンパ小節（ＩＬＦ）を欠損したＴＮＦ／ＬＴα-/-マウスにおいても、Ｍ細胞が存在することが示されたことにより、さらにデータは支持されるものである。野生型マウスとＧＡＬＴがないマウスにおいて、絨毛Ｍ細胞の分布と数を決定するために、共焦点イメージ解析システムを用いて、全小腸における絨毛Ｍ細胞の密度を調べた。野生型マウスでは、全小腸あたり約４０から５０密度の絨毛Ｍ細胞群が、同様にＴＮＦ／ＬＴα-/-マウスでは、約５０から６０密度の絨毛Ｍ細胞群が見出された。両者の数値が類似していることは、絨毛Ｍ細胞の成育がＧＡＬＴおよびＦＡＥに完全に依存しないことを示唆するものである。
【実施例３】
【００４２】
絨毛Ｍ細胞による細菌の接着と内在化
絨毛Ｍ細胞の病原性微生物に対する取り込み能を評価する実験を行った。連結した野生型マウスの小腸ループに、ＧＦＰを発現するrSalmonella typhimurium（ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰ）、Yersinia pseudotuberculosis（エルシニア−ＧＦＰ）、エルシニアのインベイシンを発現する大腸菌（大腸菌−インベイシン−ＧＦＰ）および野生型大腸菌−ＧＦＰを接種した。それぞれの細菌についてｉｎ ｓｉｔｕのインキュベーションを１０分間行った後、免疫組織学的解析を行い、図３Ａのａおよびｂ（野生型マウス）、ならびにｅおよびｆ（ＴＮＦ／ＬＴα-/-マウス）に示したように、絨毛上皮組織のＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）にｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰが存在することが明らかとなった。さらに、図３Ａのｃおよびｄ（野生型マウス）ならびにｇおよびｈ（ＴＮＦ／ＬＴα-/-マウス）に示したように、エルシニア−ＧＦＰもまた特異的に絨毛ＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）に接着した。図３Ａのｉおよびｊに示すように、凍結切片を用いた免疫組織学的解析から、ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰが絨毛ＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）の先端膜領域に局在することがわかった。絨毛ＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）の細菌取り込み能を示すために、ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰを用いた回腸ループ感染実験を行い、共焦点顕微鏡を用いて細菌の局在を解析した。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂのａ、ｂおよびｃに示すように、ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰは細胞内領域に局在していることが明らかとなった。さらに図３Ｂのｄに示すように、サイトスピンで調製された絨毛ＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）の細胞内領域にｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰが見出された。
【００４３】
腸管上皮細胞をさらに絨毛上皮組織およびパイエル板から分離し、ＧＦＰを発現する微生物の回腸ループ感染実験とフローサイトメトリー分析のためのＴＲＩＴＣ−ＵＥＡ１の逆染色を行った。図３Ｃに示すように、絨毛上皮組織から単離したＵＥＡ−１-細胞よりもＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）の分画に、高頻度でｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰ、エルシニア−ＧＦＰ、あるいは大腸菌−インベイシン−ＧＦＰを含有する細胞が現れた。さらにこれと類似したパターンがパイエル板のドーム領域から単離されたＵＥＡ−１+細胞（ＦＡＥ−Ｍ細胞）とＵＥＡ−１-細胞で得られた。また、図３Ｃに示すように、ｒＳａｌｍｏｎｅｌｌａ−ＧＦＰ、エルシニア−ＧＦＰ、あるいは大腸菌−インベイシン−ＧＦＰを含有する多くの細胞が、ＧＡＬＴを欠損するＴＮＦ／ＬＴα-/-マウスの絨毛上皮組織から単離されたＵＥＡ−１-細胞ではなく、ＵＥＡ−１+細胞から回収された。これらの結果は、絨毛ＵＥＡ−１+細胞（絨毛Ｍ細胞）はＦＡＥ−Ｍ細胞により取り込みが起きることが知られている管腔側から数種の異なる細菌を取り込む能力を有することを示している。さらに上記方法を用いることにより抗原あるいはワクチンの送達効果を容易に評価することができる。
【実施例４】
【００４４】
絨毛Ｍ細胞の走査型および透過型電子顕微鏡による解析
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）解析から、絨毛Ｍ細胞はパイエル板のＭ細胞で観察される顕著な特徴、すなわち図４ａからｃに示すような、短い不規則な微絨毛をもつ，落ち込んだ表面を有することが明らかとなった。図４ｆとｇに示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析からも、金粒子を結合したＵＥＡ−１細胞が絨毛Ｍ細胞に結合することが示された。さらに図４ｈに示すように、浸潤単核細胞が絨毛Ｍ細胞のポケットに観察された。ＳＥＭでもまた、図４ｉからｌに示すように、腸管へサルモネラ菌を曝した後のＦＡＥがないＴＮＦ／ＬＴα-/-マウスの小腸において、絨毛Ｍ細胞の細胞膜へ細菌が結合することが示された。これらの結果は、新規に同定された絨毛Ｍ細胞が抗原取り込みの別のゲートウェイおよび／または腸管絨毛上皮組織の管腔側からの入り口を形成することを示唆するものである。これらの結果は、Ｍ細胞がパイエル板のＦＡＥだけでなく、絨毛上皮組織でも成育し、局在することを示す初めての証拠である。
【実施例５】
【００４５】
ＰＰ欠損マウスにおける抗原特異的免疫応答の誘導
図３に示したように、絨毛Ｍ細胞は細菌抗原に対する有効な抗原取り込み口であるので、ＧＡＬＴ欠損マウスにおいて、抗原特異的抗体応答が絨毛Ｍ細胞を介して誘導されるかを調べた。ＴＮＦ／ＬＴ−α遺伝子を欠くＧＡＬＴ欠損マウスを破傷風トキソイドワクチン抗原の５０−ｋＤａのＴｏｘＣ断片を発現する組換え体サルモネラ菌ＢＲＤ ８４７株で経口免疫した場合、破傷風トキソイド（ＴＴ）特異的血清ＩｇＧの抗体価は、図５に示したように、ＴＮＦ／ＬＴαマウスの血清中と経口免疫した野生型マウスとで同程度であった。予想したとおり、ＴＴ特異的血清ＩｇＧの抗体価は、Ｔｏｘ−Ｃを発現しない組換え体サルモネラ菌で野生型マウスおよびＴＮＦ／ＬＴαマウスを経口免疫した場合、検出できなかった。これらの結果から、絨毛Ｍ細胞は胃腸環境にある抗原に対する抗原特異的な免疫応答を誘導するための重要な抗原取り込み口であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本特許は、新たに発見された絨毛Ｍ細胞を標的とした粘膜ワクチン開発の鍵となる腸管絨毛吸収上皮細胞層に存在するＭ細胞の同定・分離、そして抗原取り込み・病原微生物侵入解析に関するものであり、新規ワクチンデリバリー分子の同定や既存粘膜ワクチンの評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】正常ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるパイエル板ドームのＦＡＥ上皮組織とそこに存在するＵＥＡ−１+のＭ細胞（パイエル板Ｍ細胞）および絨毛上皮組織におけるＵＥＡ−１+Ｍ細胞（絨毛Ｍ細胞）の共焦点顕微鏡による観察図である。
【図２】パイエル板のない各種マウスにおける絨毛Ｍ細胞の存在を示す図である。
【図３】（Ａ）ＵＥＡ−１+絨毛Ｍ細胞による抗原取り込みの免疫組織学的解析の結果を示す図である。（Ｂ）ＵＥＡ−１+絨毛Ｍ細胞の細胞内領域におけるＧＦＰを発現するサルモネラ菌の局在を示す図である。（Ｃ）ＵＥＡ−１+絨毛Ｍ細胞による抗原取り込みを示す図である。
【図４】絨毛Ｍ細胞およびパイエル板Ｍ細胞の走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。
【図５】パイエル板欠損マウスにおける抗原特異的免疫応答の誘導を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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