(57)【要約】      （修正有）【課題】神経幹細胞増殖速度を増大させることができ、抗血液凝固活性が低く、患者体内に投与された場合、体内に蓄積された場合であっても安全な増殖助剤を提供する。【解決手段】ヘパリンを構成するＤ−グルコサミンの６位を実質的に脱硫酸したグリコサミノグリカンであり、標準血漿に最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加して測定した際のＡＰＴＴ時間が５０秒以下、好ましくは、最終濃度１００μｇ／ｍｌで添加して測定した際のＡＰＴＴ時間が１００秒以下であり、更に好ましくは８０秒以下である。この増殖助剤は、生体への移植用の神経幹細胞をインビトロで培養するのに好適に用いられる。【選択図】  図１
2005218308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞の増殖助剤であって、硫酸化グリコサミノグリカンを構成する硫酸基を有するＤ−グルコサミン残基の６位硫酸基が実質的に脱硫酸された脱硫酸化グリコサミノグリカンを有効成分とする神経幹細胞増殖助剤。
【請求項２】
前記脱硫酸化グリコサミノグリカンは、下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特徴を有する請求項１に記載の神経幹細胞増殖助剤。
（ａ）グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖体組成において２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースの合計が１０モル％以下であり、
且つ２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが１．５モル％以下であり、さらに有効二糖収率が６０％以上である、
（ｂ）重量平均分子量が３０００〜３００００ダルトンであること、
（ｃ）標準血漿に最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が５０秒以下であること。
【請求項３】
前記脱硫酸化グリコサミノグリカンは、下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特徴を有する請求項１に記載の神経幹細胞増殖助剤。
（ａ）グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖体組成において２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースの合計が１０モル％以下であり、
且つ２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが１．５モル％以下であり、さらに有効二糖収率が６０％以上である、
（ｂ）重量平均分子量が３０００〜３００００ダルトンであること、
（ｃ）標準血漿に最終濃度１００μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が１００秒以下であること。
【請求項４】
前記神経幹細胞は、ヒト由来である請求項１〜３のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤。
【請求項５】
インビトロでの培養に用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤。
【請求項６】
前記神経幹細胞は、生体への移植用である請求項１〜５のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤。
【請求項７】
塩基性繊維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子又は白血球遊走阻止因子存在下で、神経幹細胞をインビトロで培養するときに用いられる請求項１〜６のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤を含む神経幹細胞用培地。
【請求項９】
基本増殖培地に、塩基性繊維芽細胞増殖因子が添加され、且つ請求項１〜７のいずれかに記載の神経幹細胞増殖助剤が終濃度で０．０１〜１００μｇ／ｍｌで添加されている神経幹細胞用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経疾患の治療に用いることができる神経幹細胞、特に移植用神経幹細胞の増殖能力を高めることができ且つ移植患者に安全な増殖助剤、及び安全な神経幹細胞を効率よく提供できる増殖培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病等の神経組織障害；脳卒中、外傷、低酸素症等の急性脳損傷による中枢神経系疾患の治療方法として、近年、患者に神経幹細胞を移植することが提案されている。
【０００３】
神経幹細胞は、患者等の生体へ移植後、患者に生着し、そこで分化して、例えば、パーキンソン病であれば消失しているドーパミン作動性ニューロンを供給するなど、損傷、消失した神経組織を患者体内で新生することが可能となる。そこで、このような神経幹細胞移植による治療方法が、神経疾患治療方法として、期待されている。
【０００４】
移植に用いる神経幹細胞は、副作用、拒絶反応が少ないという観点から、ヒト由来の幹細胞であることが望まれる。ヒト由来の神経幹細胞は、患者自身の神経組織、例えば末梢神経組織から採取可能な場合もあるが、増殖能力が優れているという点に鑑み、流産胎児の発生中の脳から採取されたものを利用する場合も少なくない。
【０００５】
胎児由来の神経幹細胞は、ドナー不足から、要求に見合った十分な量の神経幹細胞を得ることはできないのが現状である。また、患者自身から採取できた場合であっても、その量は極めて僅かである。
【０００６】
このため、治療に際しては、インビトロで神経幹細胞を十分量増殖させ、その一部を移植するしかない。
【０００７】
神経幹細胞の培養には、通常、血清あるいは細胞増殖に必要な糖、アミノ酸、ビタミン類、塩類を含んだ基本培地成分に、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等の増殖因子を添加した培地で、培養される。
【０００８】
さらに、近年では、増殖速度を上げるための成分として、その他の増殖因子やグリコサミノグリカンを添加した培地で培養することが提案されている。例えば、特許文献１に、インビトロにおける神経幹細胞の増殖調節方法として、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパラン硫酸を添加することを開示している。また、特許文献２には、ＥＧＦ、ｂＦＧＦに加えて、さらに白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）を添加することが提案されている。さらに、特許文献２には、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦに加えて、ヘパリンを添加することが提案されている。
【０００９】
このような種々の増殖因子やグリコサミノグリカンの添加により、神経幹細胞の増殖速度を上げることは可能であるが、グリコサミノグリカンの種類によって、その増殖速度増大率は異なり、また併用する増殖因子の種類によっても増殖速度の増大の程度が異なっている。
【００１０】
一方、培養中には細胞増殖を促進する成分として好ましく添加される成分であっても、移植に際しては、除去されることが好ましい場合がある。例えば、ヘパリンのように抗血液凝固性が高いグリコサミノグリカンが神経幹細胞に付着されたまま患者体内に投与されると、脳内出血が起こった場合などに大変危険だからである。
【００１１】
このため、培養細胞を移植に用いる場合、培地からの細胞分離後、洗浄は必須となるが、細胞表面には増殖因子レセプターが存在し、レセプターに結合した増殖因子は洗浄程度では完全に除去することができず、細胞表面に吸着されたままとなっていることが多い。さらに、グリコサミノグリカンの多くは増殖因子との親和性が高いため、やはり、生理食塩水程度の洗浄では除去できない。洗浄回数の増大、洗浄液の工夫も考えられるが、神経幹細胞の損傷、洗浄による収率の低下といった新たな問題を招来することになる。
【００１２】
【特許文献１】特表平１０−５０９５９２
【特許文献２】特表２００２−５１８９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、神経幹細胞増殖速度を増大させることができ、しかも患者体内に投与された場合であっても、あるいは体内に蓄積された場合であっても安全な増殖助剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、種々のグリコサミノグリカンについて、硫酸基の含有率、硫酸基の位置、神経幹細胞の増殖促進能、抗血液凝固活性等について鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明の神経幹細胞増殖助剤は、硫酸化グリコサミノグリカンを構成するＤ−グルコサミン残基の６位硫酸基が実質的に脱硫酸された脱硫酸化グリコサミノグリカンを有効成分とする。
【００１６】
具体的には、前記脱硫酸化グリコサミノグリカンは、下記（ａ）（ｂ）（ｃ）の特徴を有することが好ましい。
（ａ）グリコサミノグリカン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組合わせた二糖分析により得られる不飽和二糖体組成において２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースの合計が１０モル％以下であり、且つ２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが１．５モル％以下であり、さらに有効二糖収率が６０％以上である
（ｂ）重量平均分子量が３０００〜３００００ダルトンであること。
【００１７】
（ｃ）標準血漿に最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が５０秒以下であること
あるいは、標準血漿に最終濃度１００μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が１００秒以下、さらに好ましくは８０秒以下である。
【００１８】
前記神経幹細胞はヒト由来であることが好ましく、生体移植用の神経幹細胞をインビトロで培養するのに用いられることが好ましい。
【００１９】
また、本発明の神経幹細胞増殖助剤は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又はＬＩＦ存在下で、神経幹細胞をインビトロで培養するときに用いられることが好ましい。
【００２０】
本発明の神経幹細胞用培地は、上記いずれかの発明の神経幹細胞増殖助剤を含むもので、好ましくは、神経幹細胞の増殖に必要な無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミンを含む公知の基本増殖培地に、ｂＦＧＦが添加され、且つ上記本発明の神経幹細胞増殖助剤が終濃度で０．０１〜１００μｇ／ｍｌで添加されている。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の神経幹細胞増殖助剤は、従来より神経幹細胞の増殖助剤として知られているヘパリンと同等以上に増殖速度を高めるとともに、抗血液凝固活性が低いので、体内に神経幹細胞とともに投与されても、あるいは神経幹細胞に付着したまま生体内に移植され、その後体内で代謝されずに残存したとしても、血液凝固が起らず、出血傾向を示すといったような弊害をもたらさずに済む。従って、本発明の神経増殖助剤を用いて培養した神経幹細胞を、細胞損傷や収率の低下を招来しない程度の洗浄で、ヒトの神経性疾患の治療のための移植に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の神経幹細胞増殖助剤は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、硫酸化ヒアルロン酸等の硫酸化グリコサミノグリカンを構成する硫酸基を有するＤ−グルコサミン残基のＯ−６位硫酸基が脱硫酸された脱硫酸化グリコサミノグリカンを有効成分とする。上記Ｄ−グルコサミン残基のＯ−６位硫酸基が脱硫酸された脱硫酸化グリコサミノグリカンは、抗血液凝固活性が低く、脳内出血等に対する影響が少なくて済むからである。
【００２３】
ここで、硫酸化グリコサミノグリカンとは、グリコサミノグリカンのうち、アミノ糖残基が、Ｄ−グルコサミンのＮ−アセチル、Ｎ−硫酸及び／又はＯ−硫酸置換体で、硫酸基を有するものであり、ヘキスロン酸残基はＤ−グルクロン酸若しくはＬ−イズロン酸、又はこれらのヒドロキシル基が硫酸化されたものを意味し、具体的にはヘパリン、ヘパラン硫酸、硫酸化ヒアルロン酸が包含される。特に、ヘパリンとは、主としてほ乳動物の肥満細胞に存在するグリコサミノグリカンで、ヘキスロン酸（Ｄ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸）とグルコサミンの二糖の繰り返し単位からなり、グルコサミンのＮ−２位の他、グルコサミンのＯ−６位及びヘキスロン酸のＯ−２位の大部分が硫酸化されており、カルボキシル基１に対して２．５〜３個の硫酸基を有している。
【００２４】
本発明において、「脱硫酸化された」とは、人工的に硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸基を除去することのみを意味しておらず、通常は硫酸化されていることが多い特定位置の硫酸基が存在しないことを意味する。従って、硫酸化グリコサミノグリカンを構成する硫酸基を有するＤ−グルコサミン残基の６位硫酸基が脱硫酸された化合物としては、天然に存在するヘパラン硫酸；人工的に硫酸基を脱硫酸したヘパリン；人工的にＤ−グルコサミン残基のＯ−６位硫酸基だけを脱硫酸した脱硫酸化グリコサミノグリカン（以下「６ＤＳＨ」という）などが挙げられるが、後述するように、安全性の面、増殖速度の増大寄与の点から、６ＤＳＨが好ましく用いられる。
【００２５】
６ＤＳＨは、WO００／０６６０８号に開示されている方法により製造できる。例えば、ヘパリンのピリジン可溶性塩をＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）存在下においてピリジン中１００℃以上で、化学的二糖分析法において、グルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間加熱し（１００〜１１５℃程度で９０〜１５０分）、得られた反応混液からピリジンを留去した後、水を添加してその後常温で減圧する（通常１０−２〜１０−４Ｔｏｒｒ）。
【００２６】
尚、本明細書にいう化学的二糖分析法は、ＷＯ９６／０１２７８号、WO００／０６６０８号及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）１２３，２４０−２４６に記載されている。
【００２７】
このようにして製造される６ＤＳＨは、ヘパリン消化酵素（ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ、ＩＩ）で消化し、生成した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析すると、下記一般式及び表１に示す不飽和二糖の総量〔２−アセトアミドー２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−０Ｓ」という）、２−アセトアミドー２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−６Ｓ」という）、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ＮＳ」という）、２−アセトアミドー２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ＵＳ」という）、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ」と記載する）、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ」と記載する）、２−アセトアミドー２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ」という）、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース（以下「△ＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ」という）のモル％合計〕を１００％として、６位に硫酸基を有するグルコサミン残基を含む不飽和二糖（△ＤｉＨＳ−６Ｓ、△ＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ、△ＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ及び△ＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓの合計）が１０モル％以下、好ましくは５モル％以下であり、△ＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓが１．５モル％以下、好ましくは１モル％以下、最も好ましくは検出不可能である。通常、酵素的二糖分析法によって分析した標準ヘパリンを基準として算出すると、６位脱硫酸率は９０％以上である。
【００２８】
【化１】
2005218308.tif 000003
【００２９】
【表１】
2005218308.tif 000004
【００３０】
ゲル濾過を用いて測定した平均分子量は、３０００〜３００００ダルトン（Ｄａ）であることが好ましく、５０００〜２００００Ｄａであることがさらに好ましく、７０００〜１６０００Ｄａであることが最も好ましい。
【００３１】
また、標準血漿に最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が５０秒以下である。正常検体のＡＰＴＴ時間は２５〜４０秒程度であることから、大量に体内に蓄積される場合であっても、１００秒を超えないようにする必要がある。従って、標準血漿に最終濃度１００μｇ／ｍｌで添加して測定した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）が１００秒以下であることがより好ましく、更に好ましくは８０秒以下である。このような安全性の条件を満足するのは、強制的にＤ−グルコサミンのＯ−６位を１００％近く脱硫酸した６ＤＳＨである。
【００３２】
以上のような構成を有する神経幹細胞増殖助剤は、インビトロでの神経幹細胞の増殖助剤として好適に用いられる。なお、神経細胞増殖助剤は、脱硫酸化グリコサミノグリカン以外に、水、緩衝液等を含んでいてもよい。
【００３３】
適用される神経幹細胞培養培地は、基本増殖培地に、神経幹細胞増殖因子としてｂＦＧＦを含むものである。具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ−１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）に、ｂＦＧＦを終濃度で、０．００１〜０．１μｇ／ｍｌ添加した培地である。増殖因子として、さらにＥＧＦ、ＬＩＦを添加してもよい。
【００３４】
本発明の神経幹細胞増殖助剤は、上記培地に、終濃度で、０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２０μｇ／ｍｌで添加される。本発明の神経幹細胞増殖助剤、特に６ＤＳＨは、ｂＦＧＦとの共存により、増殖速度の倍加に寄与することができるが、０．０１μｇ／ｍｌ未満では増殖速度の増大にほとんど寄与できず、１００μｇ／ｍｌを超えても、増殖速度増大の程度が低減する傾向にあり、残存の弊害の方が大きくなるからである。
【００３５】
培養は、１０日以上行うことが好ましい。理由は明らかではないが、１０日未満では、本発明の神経幹細胞増殖助剤の添加による増殖速度増大効果がわずかにしか認められないからである。
【００３６】
本発明の神経幹細胞増殖助剤を含む培地で２週間培養すると、本発明の神経幹細胞増殖助剤を含まない場合と比べて、増殖率は１．５倍程度となり、その結果、３ヶ月培養すれば、１０倍以上の細胞を得ることができる。
【００３７】
本発明の幹細胞増殖助剤を含む培地で培養した神経幹細胞を生体への移植に使用する場合、培地から細胞を分離し、生理食塩水などで１〜３回程度洗浄したものを使用する。この程度の洗浄では、膜表面に結合したｂＦＧＦの大部分が付着したまま残存し、さらに、ｂＦＧＦに結合した増殖助剤も付着したままである。しかしながら、洗浄回数の増大に対する増殖助剤の遊離量の増加割合が小さく、洗浄回数の増大による神経幹細胞の損傷及び収率の低下の弊害の方が大きくなるので、この程度の洗浄にとどめておくことが好ましい。一方、本発明の神経幹細胞増殖助剤は、抗血液凝固活性が低く、５０μｇ／ｍｌ程度では血液凝固時間に与える影響はほとんどなく、６ＤＳＨでは、正常検体と比べて血液凝固時間が２倍に延長されるのに１００μｇ／ｍｌ以上が必要となる。従って、本発明の増殖助剤を神経幹細胞とともに移植する場合はもちろん、本発明の増殖助剤を含む培地で培養された神経幹細胞を長期間にわたって投与し続けた結果、脳内に蓄積される場合であっても、正常検体の場合と比べて、脳内出血などに対する危険性が過度に高まるといった弊害を回避することができる。
【実施例】
【００３８】
〔測定方法〕
はじめに、本発明実施例で用いた測定方法について説明する。
（Ａ）酵素消化による二糖分析
試料１．０ｍｇを２ｍＭ酢酸カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２２０μｌに溶解して、２０ｍＵのヘパリナーゼ、２０ｍＵのヘパリチナーゼＩ及びＩＩを加えて、３７℃で２時間反応させた。得られた酵素消化液、すなわち生成した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィーで分析した。各不飽和二糖のピーク面積を計算して、全面積に対するピーク面積を％としてあらわした。
【００３９】
ＨＰＬＣによる分析は、酵素消化液１５μｌを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル８５２型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム４．０ｍｍ×２５０ｍｍ）を使用し、２３２ｎｍでの吸光度を測定した。不飽和二糖スタンダード（生化学工業（株）製）を基準とし（Ｙａｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０,８６９６−８７０６,（１９９５））、流速１ｍｌ／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０ｍＭ→２．５Ｍ）を用いる方法に準拠した（Ｋａｒｉｙａら，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０３Ｂ，４７３，（１９９２））。
【００４０】
（Ｂ）重量平均分子量
１％溶液５μｌをＨＰＬＣによるゲル濾過で分析した。カラムは、ＴＳＫｇｅｌ−（Ｇ４０００＋Ｇ３０００＋Ｇ２５００）ＰＷＸ（東ソー、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、０．２Ｍ塩化ナトリウムで、４０℃、０．６ｍｌ／分の流速で溶出した。検出には、示差屈折計（島津製作所、ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。
【００４１】
（Ｃ）ＡＰＴＴ時間
ラットの下大動脈より３．２％クエン酸１／１０容量で採取した血液を１０００×ｇ、１０分間遠心分離して得た血漿１００μｌと様々な濃度の各サンプル１００μｌとを測定用カップにいれ、３７℃で１分間保温した。その後、予め３７℃に保温しておいたアクチン（商品名：三菱ウェルファーマ（株））１００μｌを添加し、さらに２分間保温した。次いで、３７℃に保温しておいた０．０２Ｍ塩化カルシウム溶液１００μｌを添加し、このときより凝固が起るまでの時間を血液凝固自動測定装置（ＫＣ−１０Ａ：アメルング社製）で測定した。
【００４２】
（Ｄ）エンドトキシン
ＬＡＬカイネティック法により測定した。すなわち、生化学工業社製ＬＳ−５０Ｍセットを用いた。検体、標準液（希釈系列）及びブランクのそれぞれ５０μｌをマイクロプレート（エンドトキシン、β−グルカンフリー）のウェルにチップ（エンドトキシン、β−グルカンフリー）等で分注した。調製したＬＡＬ試薬をシリンジ（エンドトキシン、β−グルカンフリー）等で検体、標準液、ブランクが分注されたウェルにそれぞれ５０μｌ添加した。マイクロプレートに蓋を被せ、ウェルリーダーＳＫ６０１にセットした。１分間の攪拌の後、加温及び測定が開始された。すなわち、測定波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍにおいて３７℃、３０分間での吸光度の経時変化〔ｍＡｂｓ／ｍｉｎ〕を測定した。
【００４３】
（Ｅ）増殖測定
ＡＴＰ法により測定した。すなわち、神経幹細胞が１×１０５個／ｍｌの細胞密度で１００μｌ／ウェル入った神経幹細胞が播種された９６ウェルプレートに、ＡＴＰ量による細胞増殖測定キット（Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を７５μｌ／ウェルもしくは１００μｌ／ウェルを添加し、３０分後に発光測定プレートリーダー（１４２０  ＡＲＶＯ−Ｄ：パーキンエルマー社製）で測定した。
【００４４】
〔グリコサミノグリカン〕
下記（１）〜（６）の硫酸化グリコサミノグリカン又はその脱硫酸化物（２ＤＳＨ，６ＤＳＨ）を使用した。ヘパリン系グリコサミノグリカン（ヘパリン、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ、へパラン硫酸）の組成については表２に示す通りであり、各グリコサミノグリカンの重量平均分子量、エンドトキシンは、表３に示す通りである。
【００４５】
（１）ヘパリン
米国ＳＰＬ社製のブタ小腸由来の注射グレード品を用いた。
【００４６】
（２）２−Ｏ−ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ−ヘパリン（２ＤＳＨ）
上記ヘパリンを原料に、ヘキスロン酸のＯ−２位の硫酸基を選択的に脱硫酸することにより調製した。選択的脱硫酸は、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物水溶液やアルカリ土類金属水酸化物水溶液に、ヘパリンナトリウム塩等を溶解した後、２０〜３０分放置した溶液を凍結して凍結乾燥を行う方法により調製した。試料は、活性炭処理に付して、エンドトキシンを除去した。
【００４７】
（３）６−Ｏ−ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ−ヘパリン（６ＤＳＨ）
上記ヘパリンを原料に、グルコサミンのＯ−６位の硫酸基を、ＷＯ００／０６６０８号記載の方法に従い、選択的に脱硫酸することにより調製した。選択的脱硫酸は、ヘパリンのピリジン可溶性塩をＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）存在下においてピリジン中１００℃以上で、化学的二糖分析法において、グルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間加熱し（１００〜１１５℃程度で９０〜１５０分）、得られた反応混液からピリジンを留去した後、水を添加してその後常温で減圧する（通常１０−２〜１０−４Ｔｏｒｒ）という方法によって調製した。試料は、活性炭処理に付して、エンドトキシンを除去した。
【００４８】
（４）コンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ）
生化学工業株式会社久里浜工場で製造したサメ軟骨由来の注射グレード品を用いた。
【００４９】
（５）デルマタン硫酸（ＤＳ）
生化学工業株式会社中央研究所で調製した鶏冠由来物である。
試料は、活性炭処理に付してエンドトキシンを除去した。
【００５０】
（６）ヘパラン硫酸（ＨＳ）
生化学工業製のアセトン脱脂ウシ腎臓からアルカリ抽出後、、プロテアーゼ消化して分散された細胞を得、核酸を除去した後、アルコール分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理し、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６，９８３，（１９６１）のクロマトグラフィーで精製したものを用いた。
【００５１】
【表２】
2005218308.tif 000005
【００５２】
【表３】
2005218308.tif 000006
【００５３】
〔神経幹細胞〕
神経幹細胞は、国立病院大阪医療センター倫理委員会及びティッシュエンジニアリング研究センター医の倫理委員会承認の下、妊娠９週齢及び１０週齢のヒト胎児由来のもので、初代培養日数１００〜２００日のニューロスフェアを、トリプシン処理によりシングルセルにしたものを測定に用いた。
【００５４】
〔グリコサミノグリカンの種類と神経幹細胞の増殖率の関係〕
１×１０５個／ｍｌの神経幹細胞を９６ウェルプレートに播種し培養した。
培養培地としては、ＤＥＭＥＭ／Ｆ１２を基本培地として、ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｍｉｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の抗生物質で、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを含有）、ｐｌａｓｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社の抗マイコプラズマ剤）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の血清代替物の商品名）、ＦＧＦ−２（終濃度０．０２μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（終濃度０．０２μｇ／ｍｌ）、ＬＩＦ（終濃度０．０１μｇ／ｍｌ）及び上記表３に示すグリコサミノグリカンのいずれか１種（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加した培地、並びにコントロール培地として、グリコサミノグリカンを含まない培地を用いた。
【００５５】
ＡＴＰ法に従って、培養１日目、６日目、１４日目の相対細胞数を測定した。結果を図１に示す。
図１からわかるように、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）やデルマタン硫酸（ＤＳ）では、コントロールよりも細胞増殖が劣る傾向にあり、１４日目では、コントロールでは細胞数の増加は６倍以上となったのに対し、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸では６倍未満であった。従って、神経幹細胞の増殖速度の増大には、ヘパリン系グリコサミノグリカンの添加が有効であることがわかる。さらに、１４日目で８倍を超えるものは、２ＤＳＨ、６ＤＳＨ、ヘパラン硫酸であり、ヘパリンと比べて硫酸含有率が低い化合物の方が増殖速度の増大に寄与できることがわかる。
【００５６】
〔ヘパリン系グリコサミノグリカンの抗血液凝固活性比較〕
表２に示すヘパリン系グリコサミノグリカンについて、添加濃度とＡＰＴＴ時間との関係を調べた。結果を表４及び図２に示す。
【００５７】
【表４】
2005218308.tif 000007
【００５８】
ヘパリンは、１μｇ／ｍｌという微量で、ＡＰＴＴ時間が正常検体の５０秒を超え、危険であることがわかる。ヘパリンを脱硫酸した脱硫酸化グリコサミノグリカンは、いずれもヘパリンよりもＡＰＴＴ時間が短くなったが、２ＤＳＨは、３μｇ／ｍｌを超えると、抗血液凝固活性を示すようになり、脱硫酸基の位置が重要であることがわかる。
【００５９】
一方、６ＤＳＨ、ヘパラン硫酸は、いずれも３０μｇ／ｍｌでＡＰＴＴ時間は５０秒以下であった。しかしながら、正常検体のＡＰＴＴ時間が２倍に延長される濃度を見ると、６ＤＳＨは１００μｇ／ｍｌでも２倍に延長されることはないが、ヘパラン硫酸では、２倍に延長される。
【００６０】
〔６ＤＳＨの濃度と増殖率の関係〕
ＤＥＭＥＭ／Ｆ１２を基本培地として、ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｍｉｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の抗生物質で、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを含有）、ｐｌａｓｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社の抗マイコプラズマ剤）、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の血清代替物の商品名）、ＬＩＦ（終濃度０．０１μｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（終濃度０．０２μｇ／ｍｌ）を添加し、さらに６ＤＳＨを終濃度が２０、２、０．２、又は０．０２μｇ／ｍｌとなるように添加した培地を調製し、各培地に、１×１０５個／ｍｌの神経幹細胞を播種し、１７日間培養した。
【００６１】
６ＤＳＨの各濃度について、培養２日目、７日目、１７日目の相対細胞数をＡＴＰ法で測定した。結果を図３に示す。
また、培地に添加する増殖因子として、ｂＦＧＦに代えて、ＥＧＦを添加した以外は上記と同様にして、６ＤＳＨの終濃度が２０，２．０，０．２，又は０．０２μｇ／ｍｌとなるように添加した各培地について、培養２日目、７日目、１７日目の相対細胞数をＡＴＰ法で測定した。結果を図４に示す。図３及び図４について、「□（白四角）」は培養２日目、「▲（黒三角）」は培養７日目、「○（白丸）」は培養１７日目を表す。
【００６２】
図３では、１７日目において、６ＤＳＨの濃度に依存して細胞数が異なっていたが、図４では６ＤＳＨの濃度の違いによる細胞数の違いはほとんど認められなかった。このことから、６ＤＳＨは、ｂＦＧＦとの共存において、増殖速度増大に寄与できることがわかる。
また、図３から、６ＤＳＨの終濃度０．１〜２０μｇ／ｍｌのときに、特に増殖率増大効果が大きいことが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の神経幹細胞増殖助剤は、インビトロでの神経幹細胞の増殖速度の倍加に役立ち、大量に投与される場合、あるいは微量であっても連続的に投与されて脳内に蓄積されるような場合であっても脳内出血等に対する危険性が低いので、神経幹細胞の増殖助剤として直接神経幹細胞とともに投与したり、あるいは神経疾患の移植治療用としてのヒトの神経幹細胞をインビトロで培養するときの増殖助剤として有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】各種グリコサミノグリカンによる細胞の増殖結果を示すグラフである。
【図２】各種グリコサミノグリカンの濃度とＡＰＴＴ時間の関係を示すグラフである。
【図３】ｂＦＧＦ存在下での６ＤＳＨの濃度と細胞増殖の関係を示すグラフである。
【図４】ＥＧＦ存在下での６ＤＳＨの濃度と細胞増殖の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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