(57)【要約】【課題】  全反射照明と極斜光照明とを同時に標本に照明できる顕微鏡を提供すること。【解決手段】  対物レンズ１１と、前記対物レンズ１１を介して照明を行う照明光学系とを有し、前記照明光学系は、前記対物レンズ１１の瞳１２の全反射照明領域と極斜光照明領域の両方の領域にわたり照明光束を照射する顕微鏡。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、
前記対物レンズを介して照明を行う照明光学系とを有し、
前記照明光学系は、前記対物レンズの瞳の全反射照明領域と極斜光照明領域の両方の領域にわたり照明光束を照射することを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記照明光束は、前記対物レンズの瞳の開口数が１．００から１．７０の範囲に照射されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記照明光学系は、前記照明光束の照射領域が可変可能であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記照明光束は、光軸に略垂直な面内で移動可能であることを特徴とする請求項１または２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記照明光束は、前記照明光学系の対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置された開口絞りで制限されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記開口絞りは、円弧状開口絞り又は円形開口絞り又はリング状開口絞りであることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物顕微鏡に関し、特に全反射照明状態と極斜光照明状態とを同時に実現可能な生物顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生物顕微鏡において、カバーガラスの極近傍の細胞の蛍光観察を行うために、対物レンズを介して全反射照明状態を実現し、このとき生じるエバネッセント波により標本が発生する蛍光を観察することが行われている。この際、落射照明状態から全反射照明状態へ照明光束を切替えている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００３−９８４３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
対物レンズを介した全反射照明の特徴は、カバーガラスが接している細胞の０．１ミクロン以下の深さにエバネッセント波を発生し、このエバネッセント波によって励起された蛍光をコントラスト良く観察できることにある。しかし、エバネッセント波は０．１ミクロン以上の深さでは急激に減衰してしまうため、エバネッセント波が到達する深さより深い部分の蛍光を観察することは困難である。
【０００４】
近年、細胞などにおける各種の現象を解析するために、カバーガラスが接している近傍の細胞膜から細胞内部への状態変化等を観察することが望まれている。
【０００５】
本発明は、上記課題に鑑みて行われたものであり、標本に対して全反射照明状態と極斜光照明状態とを同時に実現可能な顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、対物レンズと、前記対物レンズを介して照明を行う照明光学系とを有し、前記照明光学系は、前記対物レンズの瞳の全反射照明領域と極斜光照明領域の両方の領域にわたり照明光束を照射することを特徴とする顕微鏡を提供する。
【０００７】
また、本発明の顕微鏡では、前記照明光束は、前記対物レンズの瞳の開口数が１．００から１．７０の範囲に照射されることが好ましい。
【０００８】
また、本発明の顕微鏡では、前記照明光学系は、前記照明光束の照射領域が可変可能であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明の顕微鏡では、前記照明光束は、光軸に略垂直な面内で移動可能であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の顕微鏡では、前記照明光束は、前記照明光学系の対物レンズの瞳位置と共役な位置に配置された開口絞りで制限されることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の顕微鏡では、前記開口絞りは、円弧状開口絞り又は円形開口絞り又はリング状開口絞りであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、全反射照明光束と極斜光照明光束とを同時に標本に照射できる顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態にかかる顕微鏡に関し図面を参照しつつ説明する。
【００１４】
図１は、本発明の第１実施形態にかかる顕微鏡の概略構成図を示す。図２は、標本に対する、全反射照明状態の照明光束（実線）と極斜光照明状態の照明光束（破線）とを模式的に示している。図３は、第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円弧状開口絞りの照明状態を示す。図４は、第１実施形態において、（ａ）はランプ光源のアーク部を示し、（ｂ）はアーク部を円弧状開口部に位置調整した状態をそれぞれ示している。図５は、第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円形開口絞りの照明状態を示す。図６は、第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳におけるリング状開口絞りの照明状態を示す。図７は、第１実施形態に用いられる開口絞りを配置したスライダーを示す図であり、（ａ）は円弧状開口絞りを、（ｂ）は円形開口絞りを、（ｃ）はリング状開口絞りをそれぞれ示している。図８は、第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円弧状開口絞りを面内で移動し、全反射照明領域のみを照明している状態を示す。図９は、本発明の第２実施形態にかかる顕微鏡の概略構成図を示している。
【００１５】
（第１実施形態）
以下、本発明にかかる顕微鏡の第１実施形態について図１から図８を用いて説明する。
【００１６】
図１から図８において、ランプ光源１の光束は、コレクタレンズ２により集められ、第１集光レンズ３により対物レンズ１１の瞳１２と共役な位置に配置された開口絞り４の開口部に集光される。集光された光束は、コリメートレンズ５に入射し平行光になり、視野絞り６で視野が制限され、折り曲げミラー７により進行方向を変えられて、第２集光レンズ８を通過し、励起フィルタ９を通過し、ダイクロイックミラー１０で反射され、対物レンズ１１の瞳１２の全反射照明領域と極斜光照明領域の両領域に第２集光レンズ８により集光され、対物レンズ１１から照明光として標本１４に向け照射される。こうのようにして、照明光学系が構成されている。
【００１７】
不図示のステージ上にシャーレ１３が置かれ、その中に観察対象となる標本１４と標本１４の乾燥を防ぐための培養液１５が入っている。標本１４は、例えば、培養細胞や細胞組織の切片を蛍光色素で染色したものである。また、シャーレ１３の対物レンズ１１側にはカバーグラス１６が貼り付けられ、その上に標本１４が付着している。対物レンズ１１は、高解像、高倍の対物レンズを使用し、対物レンズ１１の先端とカバーガラス１６との間には、専用の油１７が満たされている。
【００１８】
図２に示すように、全反射照明光束（実線）によりカバーガラス１６の標本１４側の表面にエバネッセント波が発生し、標本１４のカバーガラス１６の近傍の細胞に照射される。カバーガラス１６から離れエバネッセント波が到達しない位置にある標本１４は、極斜光照明光束（破線）により照明される。
【００１９】
図１において、両照明光で標本１４から発生した蛍光１８は、対物レンズ１１で集光され、ダイクロイックミラー１０を通過して、必要な波長を選択するエミッションフィルタ１９を通過し、結像レンズ２０で結像面２１に結像され、結像面２１に配置された不図示のＣＣＤ等の撮像素子で撮像され不図示のモニター等で観察される。このようにして顕微鏡が構成されている。
【００２０】
なお、照明光学系の光路には不図示のＮＤフィルタを適宜挿入して、照明光の強度を調整しても良い。ＮＤフィルタを挿入する位置は、例えば、視野絞り６と第２集光レンズ８の間が望ましい。
【００２１】
図１では、対物レンズ１１の光軸とランプ光源１から折り曲げミラー７までの光軸は略平行であるが、実際の配置は対物レンズ１１の光軸が鉛直に対して、ランプ光源１から折り曲げミラー７までの光軸は略水平となっている。
【００２２】
本第１実施形態では、図３に示すように全反射照明領域３１と極斜光照明領域３３の両方の照明を達成するために、開口絞り４に円弧状開口絞り４ａを配置している。円弧状開口絞り４ａの開口の位置は照明光束の光軸に垂直な平面内において、対物レンズ１１の瞳１２の全反射照明領域３１と極斜光照明領域３３に照明光束を照射する位置に光軸中心Ｏからずらして配置している。符号３５は、全反射照明領域と極斜光照明領域との境界となるＮＡ＝１．３８（標本１４が細胞の場合）を、符号３７は、ここで使用する対物レンズ１１の最大のＮＡであるＮＡ＝１．４５を、符号３９は、極斜光照明の限界のＮＡであるＮＡ＝１．００をそれぞれ示している。
【００２３】
また、一般的に入手可能な高屈折率ガラスとオイルで実現できる最大の開口数は、１．７０である。但し、そのガラスとオイルの特性は通常使用するものと特性は異なるものである。例えば、ガラスはその成分から培養する細胞に対して悪影響を与えることがある。好ましくは、通常使用するガラスやオイル用の対物レンズを利用する条件がよい。そのときの最大の開口数が１．５０となる。なお、現時点で量産されているこの種の対物レンズの最大の開口数は１．４５である。
【００２４】
本第１実施形態では、円弧状開口絞り４ａの開口部は、ＮＡ＝１．００からＮＡ＝１．４５の領域を円弧状（約１２０度）に開口し、対物レンズ１１の瞳１２において全反射照明領域３１と極斜光照明領域３３とに照明光束を同時に照射している。なお、ＮＡ＝１．００を１．３０とすることにより極斜光照明領域３３を制限し、全反射照明状態と極斜光照明状態とのバランスをとり、両方の照明によるの蛍光がより観察し易くなる。
【００２５】
また、本第１実施形態では、図４（ａ）、（ｂ）に示すようにランプ光源１のアーク部１ａが円弧状開口絞り４ａの開口部に位置するように、図１においてランプ光源１の位置が光軸に垂直な平面内においてずらして配置され、円弧状開口絞り４ａの開口部にランプ光源１のアーク部１ａが焦点を結ぶように光軸方向に焦点位置が調整されている。このように、アーク部１ａを配置することによって、ランプ光源１を使用した際に於いても効率よく照明を行うことが可能となる。
【００２６】
なお、アーク部１ａを円弧状開口絞り４ａの開口部に位置合わせする方法として、ランプ光源１を光軸に対して移動する方法、照明光学系のレンズを移動する方法、光学系のミラーを移動する方法など種々の方法を用いることができる。
【００２７】
また、瞳１２と共役な位置にある開口絞り４には、図３に示す円弧状開口絞り４ａ以外にも、図５に示す円形開口絞り４ｂや、図６に示すリング状開口絞り４ｃ等を使用することができる。円形開口絞り４ｂやリング状開口絞り４ｃの作用、効果は円弧状開口絞り４ａと同様であり説明を省略する。
【００２８】
図７（ａ）〜（ｃ）は、本第１実施形態に用いられる円弧状開口絞り４ａ（図７（ａ））、円形開口絞り４ｂ（図７（ｂ））、リング状開口絞り４ｃ（図７（ｃ））を搭載したスライダー４１ａ、４１ｂ、４１ｃをそれぞれ示している。これらのスライダー４１ａから４１ｃを図１の開口絞り４として挿入することによって、全反射照明状態と極斜光照明状態の両方の状態が実現できる。
【００２９】
図７（ａ）において、スライダー４１ａには、円弧状開口絞り４ａが位置調整可能に設けられている。スライダー４１ａの外周部の一部にクリック溝４３が設けられており、図１に示す顕微鏡の開口絞り４に挿入した際、顕微鏡に設けられた不図示のばねによって、光路中に固定、保持される。またスライダー４１ａに形成された窪み部４３、４３は、スライダー４１ａを顕微鏡の光路に挿脱する際に指で摘みやすくするために設けられている。
【００３０】
円弧状開口絞り４ａは、絞り支持部４７に配置され、絞り支持部４７の一端部に設けられているばね４９と他端部に設けられているネジ５１、５３とによって支持されている。ネジ５１、５３を不図示の工具あるいはヘクスキー等で回転することによって、円弧状開口絞り４ａを紙面平面内で移動可能であり、円弧状開口絞り４ａの位置調整を行うことができる。
【００３１】
また、本第１実施形態では、図８に示すように、円弧状開口絞り４ａを、例えばＸ軸に沿って移動することにより、全反射照明状態と極斜光照明状態の両方の照明状態（図３参照）から、全反射照明状態のみに照明状態を可変可能である。これにより図３に示す全反射照明状態と極斜光照明状態の両照明状態から図８に示す全反射照明状態のみの状態に円弧状開口絞り４ａの位置を調整できる。また、全反射照明状態を維持しながら極斜光照明状態の照明光束を標本１４へ照射することができ、標本１４に対する極斜光照明光束の入射位置（カバーガラス１６から極斜光照明光束までの距離）を変えることが可能となる。
【００３２】
なお、円弧状開口絞り４ａの位置調整は、図７（ａ）に示す機構以外に、ネジ５１，５３の代わりにマイクロメータヘッドを用いることによって微細な移動調整が可能となる。また、電動マイクロメータヘッドを利用すれば、移動位置を記憶し所定の位置にボタン一つの操作で円弧状開口絞り４ａを移動させることが可能となる。
【００３３】
図７（ｂ）に示す円形開口絞り４ｂを搭載したスライダー４１ｂおよび図７（ｃ）に示すリング状開口絞り４ｃを搭載したスライダー４１ｃは、図７（ａ）に示す円弧状開口絞り４ａを搭載したスライダー４１ａと同様の構成であり、円弧状開口絞り４ａと同様の作用、効果を奏することができるので、図７（ａ）と同様の部材には同じ符号を付し説明を省略する。
【００３４】
以下、簡単に本第１実施形態の顕微鏡の照明光学系の調整方法について述べる。
【００３５】
図１において、開口絞り４に対するランプ光源１の位置は、光軸に略垂直な方向では、ランプ光源１自体をコレクタレンズ２に対して移動し、焦点方向はコレクタレンズ２を光軸方向に移動して調整する。調整の確認は、対物レンズ１１を標本１４のカバーガラス１６に対して密着している部分にピントを合わせた後、対物レンズ１１の瞳１２の位置を不図示のベルトランレンズや、視度望遠鏡により観察しながら行う。あるいは、対物レンズ１１の瞳１２の位置にマット面を持つ不図示の芯だし調整治具を対物レンズ１１の代わりに光路に入れ、ランプ光源１のアーク部のピント状態を観察しながら行っても良い。
【００３６】
開口絞り４の開口部を対物レンズ１１の瞳１２に位置合わせするには、光軸に略垂直な方向についてはスライダー４１ａの位置調整機構を用いて行う。光軸方向の調整は、まずコリメートレンズ５と開口絞り４の間隔を所定の精度でどちらかに移動して調整しておき、使用時に第２集光レンズ８を光軸方向に移動して調整する。
【００３７】
開口絞り４は、挿脱可能に設けられており、色々な形状の開口絞り４（例えば、図７（ａ）〜（ｃ））を光路中に挿入することができる。
【００３８】
なお、開口絞り４は、光軸に対して垂直な方向に移動できるだけでなく、回転も可能とすることによって、開口部を対物レンズ１１の瞳１２にさらに良く位置合わせすることが可能となる。
【００３９】
また、励起フィルタ９、ダイクロイックミラー１０、およびエミッションフィルタ１９をセットとした蛍光用フィルターカセット２２を切替えて照明光束の波長を変える場合、各レンズに色収差があると瞳１２に対する集光位置がずれてしまう。これを防ぐために、各レンズの色収差を補正しておく必要がある。特にコレクタレンズ２、コリメートレンズ５、第２集光レンズ８は色収差の影響が大きいので、各レンズの色収差を補正することによって、波長による瞳１２に対する集光位置の変化を許容値以内に抑えることが可能となる。
【００４０】
（第２実施形態）
図９は、本発明の第２実施形態にかかる顕微鏡の概略構成図を示している。本第２実施形態では、光源をファイバーの端面とした場合を示し、第１実施形態のランプ光源１からコリメートレンズ５までの部材が異なっており、その他の構成は第１実施形態と同様である。第１実施形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００４１】
図９において、ファイバー６１の出射端面６１ａからの光束は、コレクタレンズ６２で略平行な光束にされ、励起フィルタ９を含むフィルタ系ＦＬを通過し、視野絞り６、折り曲げミラー７、集光レンズ８、ダイクロイックミラー１０を介して、対物レンズ１１の瞳１２に集光される。コレクタレンズ６２と集光レンズ８の焦点距離によってファイバー６１の出射端面６１ａの射出径が拡大される。この拡大率を所望の値にすることによって、図５に示す円形開口絞り４ｂに相当する照明光束を対物レンズ１１の瞳１２に形成することができる。
【００４２】
例えば、シングルモードファイバーを用いる場合、ファイバーのコア径は約０．００４ｍｍである。一方、対物レンズ１１の瞳１２における、照明光束の径は、対物レンズ１１の焦点距離（例えば、ｆ＝３．３３とする）と対物レンズ１１の瞳１２におけるＮＡによって決められる。全反射照明状態を実現するためには、ＮＡ＝１．４５からＮＡ＝１．３８（細胞の場合）の間に照明光束を集光する必要があり、照明光束の径は、３．３３×（１．４５−１．３８）＝０．２３ｍｍ以内に集光する必要がある。よって、０．００４ｍｍのコア径を０．２３ｍｍまで拡大すれば全反射照明領域のほぼ全域に照明光束を照射でき効率的に全反射照明を行うことが可能となる。そこで、コレクタレンズ６２と集光レンズ８との倍率を約６０倍に設定することで、０．００４ｍｍのコア径からの光束を、対物レンズ１１の瞳１２で約０．２３ｍｍに拡大でき、効率的な全反射照明が可能となる。
【００４３】
本第２実施形態では、対物レンズ１１の瞳１２で全反射照明状態と極斜光照明状態の両方の状態を可能とするため、０．２３ｍｍの照明光束の中心を図４に示す全反射照明領域３１と極斜光照明領域３３との境界位置３５に合わせるように移動可能としている。
【００４４】
また、本第２実施形態では、全反射照明状態のみの場合は、光源にレーザ光を用い照明光束の輝度が充分あるため、全反射照明領域全体にわたる光束を入射する必要はなく、０．００４ｍｍのコア径からの照明光束を１０倍した０．０４ｍｍ程度の光束で照明するように構成している。このため全反射照明可能領域の０．２３ｍｍの幅に対して余裕を持って照明光束の位置調整ができる。
【００４５】
なお、照明光束のサイズは、観察条件等により適宜変更が可能である。
【００４６】
照明光束の移動は、ファイバー６２の移動、光学系のレンズの移動、あるいはミラーの移動等で行うことができる。
【００４７】
なお、ファイバー６２に導入する照明光束の光源として、レーザや水銀ランプ光源等を用いることができる。
【００４８】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の第１実施形態にかかる顕微鏡の概略構成図を示す。
【図２】標本に対する、全反射照明状態の照明光束（実線）と極斜光照明状態の照明光束（破線）とを模式的に示している。
【図３】第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円弧状開口絞りの照明状態を示す。
【図４】第１実施形態において、（ａ）はランプ光源のアーク部を示し、（ｂ）はアーク部を円弧開口部に位置調整した状態をそれぞれ示している。
【図５】第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円形開口絞りの照明状態を示す。
【図６】第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における輪帯状開口絞りの照明状態を示す。
【図７】第１実施形態に用いられる開口絞り配置したスライダーを示す図であり、（ａ）は円弧状開口絞りを、（ｂ）は円形開口絞りを、（ｃ）は輪帯状開口絞りをそれぞれ示している。
【図８】第１実施形態の顕微鏡の対物レンズの瞳における円弧状開口絞りでの照明状態を面内で移動し、全反射照明領域のみを照明している状態を示す。
【図９】本発明の第２実施形態にかかる顕微鏡の概略構成図を示している。
【符号の説明】
【００５０】
１    光源
２    コレクタレンズ
３    第１集光レンズ
４    開口絞り
４ａ  円弧状開口絞り
４ｂ  円形開口絞り
４ｃ  リング状開口絞り
５    コリメートレンズ
６    視野絞り
７    ミラー
８    第２集光レンズ（集光レンズ）
９    励起フィルタ
１０  ダイクロイックミラー
１１  対物レンズ
１２  瞳
１３  シャーレ
１４  標本
１５  培養液
１６  カバーガラス
１７  油
１８  蛍光
１９  エミッションフィルタ
２０  結像レンズ
２１  結像面
２２  フィルタボックス
３１  全反射照明領域
３３  極斜光照明領域
３５  境界
４１ａ、４１ｂ、４１ｃ  スライダー
４３  クリック溝
４５  窪み部
４７  フィルタ保持部
４９  ばね
５１、５３  ねじ
６１  ファイバー
６２  コレクタレンズ
Ｏ    光軸
ＦＬ  フィルタ群
【図１】
2005140925.tif 000003
【図２】
2005140925.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005140925.tif 000009
【図８】
2005140925.tif 000010
【図９】
2005140925.tif 000011