(57)【要約】【課題】  タンパク質超分子複合体の各サブユニットタンパク質の化学量論比を測定する方法を提供する。【解決手段】上記課題は、（１）タンパク質超分子複合体を水溶性トリアルキルホスフィンまたはその塩を含むｐＨ6.5-7.5の溶液に対して透析し（２）透析後の水溶液にＳＤＳを加えてタンパク質を変性させ、（３）過剰の蛍光マレイミド試薬を加えて各タンパク質サブユニット中のシステイン残基と反応させ、（４）水溶性チオールを加えて反応を停止させ、（５）過剰の蛍光マレイミド試薬を除去し、（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各サブユニットタンパク質へ分離し、（７）２次元蛍光アナライザーを用いて蛍光強度測定する、ことを含む方法によって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質超分子複合体の各サブユニットタンパク質の化学量論比を測定する方法であって、
（１）タンパク質超分子複合体をトリアルキルホスフィンまたはその塩を含むｐＨ６．５−７．５の溶液に対して透析し
（２）透析後の水溶液にＳＤＳを加えてタンパク質を変性させ、
（３）過剰の蛍光マレイミド試薬を加えて各タンパク質サブユニット中のシステイン残基と反応させ、
（４）水溶性チオールを加えて反応を停止させ、
（５）過剰の蛍光マレイミド試薬を除去し、
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各サブユニットタンパク質へ分離し、
（７）２次元蛍光アナライザーを用いて蛍光強度測定する、
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質超分子複合体の化学量論比測定方法に関し、詳しくは蛍光マレイミド試薬を用いた、タンパク質超分子複合体を形成する各サブユニットタンパク質の化学量論比の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンルギー代謝、高分子物質性合成、細胞分裂、シグナル伝達など生体内における種々の重要な現象の多くが、多数のサブユニットから構成されるタンパク質超分子複合体によって行われている。そのようなタンパク質超分子複合体の機能を真に理解するためには、超分子複合体全体の構造情報が極めて重要になる。
立体構造を始めとする物理的解析では多量の試料を必要とするが、生体内から得られる「生きた」超分子複合体の量は一般に微量である。従って目的超分子複合体の立体構造解析を行うためには、生体外で超分子複合体を再構成する必要があり、そのためには超分子複合体構成成分の全てを同定し、さらにはそれらの化学量論比を決定することが必須である。
【０００３】
タンパク質超分子複合体の化学量論比の決定は従来つぎのようにして行われている
タンパク質超分子複合体中のサブユニット、あるいはタンパク質混合溶液をＳＤＳ変性条件下、電気泳動法によって分離し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、分離したタンパク質分子の定量法として、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いたバンド染色像よりデンシトメーター等を用いた強度測定法が一般的に用いられている（nature,227,680-695; EMBO J., 21, 2923-2935, 2002）。ＣＢＢによる単位タンパク質あたりの発色度はおおよそタンパク質の分子量に比例するとされている。しかし、実際には個々のタンパク質によって発色効率は大きく異なり、泳動ゲルのバンド定量結果から直接タンパク質超分子複合体の化学量論比を決められるケースは極めて少ない。したがって、ＣＢＢ染色されたバンドから定量を行うためには、それぞれのタンパク質サブユニットを、紫外部吸収スペクトルなどを用いて濃度決定可能なほどに高度に精製した試料を調製し、そのそれぞれについて検量線を作成する必要がある。しかし、目的とする超分子複合体を構成するサブユニット数が多くなると、検量線作成には多大な労力を要する。また、複合体から単離することで不安定になるサブユニットの精製は極めて困難である。
【０００４】
タンパク質超分子複合体の分離方法としては、逆相クロマトグラフィーや変性条件下でのゲルろ過クロマトグラフィーなどがある（Nucleic acids Res., 30, 4329-4338,2002）。スペクトルの定量解析の点では上の方法より有利であるが、各サブユニットの分離能はＳＤＳ−ＰＡＧＥに大きく劣り、個々のサブユニットのピークが重なると正確な化学量論比測定は出来ない。また、一度に一条件の試料しか分析出来ないので、検量線を作成するためには必要とする測定点の回数だけ繰り返し分析を行わなければならず、簡便性に欠ける。
【０００５】
ヨウ化ナトリウムＮａＩの放射性同位体によってチロシン残基特異的ラベル化したタンパク質超分子複合体の化学量論比を測定する方法がある（非特許文献１参照）。チロシン残基特異的に結合するＮａＩ放射性同位体（［１２５Ｉ］ＮａＩ）を用いた化学量論比測定法では、［１２５Ｉ］ＮａＩは結合反応条件によってはヒスチジン残基にも結合する可能性があり、特異性に欠ける場合がある。また放射性同位体試薬を用いるため、安全性・簡便性に欠ける。
【０００６】
立体構造情報の解析を目的とし、酸化・非変性条件下でタンパク質分子の溶媒側に露出した遊離システイン残基を定量するため、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸（ＰＣＭＢ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）などを用いてシステイン残基を化学修飾し、それらを分光光度法によって検出する方法がある（Anal. Biochem., 48, 557-568,1972;氏家郁三等編集「生物化学実験法１０」”ＳＨ基の定量法”、学会出版センター）。これらの方法では、全てのシステイン残基への修飾ではなく、ある条件を満たすシステイン残基のみを修飾する手法であり。以下に説明する本発明の目的とは本質的に異なる。
【０００７】
蛍光試薬あるいはＧＦＰ等の蛍光タンパク質を用いてラベル化したタンパク質の物理化学的および機能的特性を蛍光光度計などによって計測する方法がある（FRET: Fluorescence Resonance Energy Transferなど）。（Biochemistry, 40,6921-6928,2001）これらの方法は目的タンパク質の生体内局在解析、あるいは動的構造解析などを蛍光ラベルを導入することによって高感度で行うことを目的としており、以下に説明する本発明とは本質的に目的が異なる。
【非特許文献１】Nat. Struct. Biol. 10, 141-145, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
多種類のサブユニットより構成される複雑なタンパク質超分子複合体の化学量論比を、簡便で定量性が高く、さらに高感度で測定する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、タンパク質超分子複合体の各サブユニットタンパク質の化学量論比を測定する方法であって、
（１）タンパク質超分子複合体をトリアルキルホスフィンまたはその塩を含むｐＨ６．５−７．５の溶液に対して透析し
（２）透析後の水溶液にＳＤＳを加えてタンパク質を変性させ、
（３）過剰の蛍光マレイミド試薬を加えて各タンパク質サブユニット中のシステイン残基と反応させ、
（４）水溶性チオールを加えて反応を停止させ、
（５）過剰の蛍光マレイミド試薬を除去し、
（６）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各サブユニットタンパク質へ分離し、
（７）２次元蛍光アナライザーを用いて蛍光強度測定する、
ことを含む方法に関する。
【００１０】
以下、本発明でのタンパク質複合体化学量論比の測定方法をさらに詳しく説明する。
（１）タンパク質複合体試料の前処理
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて個々のサブユニットの同定が可能なまでに精製したタンパク質複合体を、ｐＨ  ６．５〜７．５、１ｍＭのトリアルキルホスフィンまたはその塩を含む溶液に対して透析する。本明細書において「トリアルキルホスフィン」とはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはトリス（３−カルボキシプロピル）ホスフィン（ＴＣＰＰ）を言い、「その塩」はそれらの塩酸、硫酸、硝酸、スルホン酸などの強酸との塩が好ましい。溶液のｐＨはマレイミド基とシステイン残基の側鎖スルフヒドリル（ＳＨ）基との間の反応特異性を維持するために重要である。また、ＴＣＥＰ等の水溶性トリアルキルホスフィンはマレイミド試薬との反応前に遊離システイン残基を保護し、かつマレイミド試薬と交換可能な還元剤である。必要であれば透析中にタンパク質複合体を安定に保ちうる試薬（ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ等）を添加しても良い。
【００１１】
（２）蛍光マレイミド試薬のシステイン残基への結合反応
透析終了後の（１）試料溶液に終濃度約１％（ｗ／ｖ）となるように１０％ＳＤＳ水溶液を加えてタンパク質を変性させる。存在しうるシステイン残基の約５０倍量の蛍光マレイミド試薬（水溶液あるいは蛍光マレイミドの溶解を高める有機溶媒溶液）を加えて結合反応を開始する。遮光条件下、室温で２時間静置後、蛍光マレイミド試薬に対して大過剰量の水溶性チオール、例えばβ−メルカプトエタノールを加えて反応を停止させる。蛍光マレイミド試薬としてはフルオレセイン−５−マレイミド、アレキサフラワ５３２（Alexa Flour 532、Molecular Probe社）、アレキサフラワ５４６（Alexa Flour 546,Molecular Probe社）、テトラメチルローダミン（Molecular Probe社）を含む。
【００１２】
（３）余剰の蛍光マレイミド試薬の除去
操作（５）での蛍光イメージアナライザによる蛍光強度測定の際、ラベル化タンパク質のバンド強度測定の妨げとならぬように、ゲルろ過スピンカラムにてｂｕｆｆｅｒ交換を行い、試料溶液中の余剰の蛍光マレイミド試薬を除去する。スピンカラムは１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを添加した（１）で用いた透析ｂｕｆｆｅｒで平衡化しておく。
【００１３】
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各タンパク質サブユニットの分離
グリセロールなど、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルへのローディングに必要な試薬を適当量加え、電気泳動用試料に調製する。あらかじめ予備測定にて蛍光イメージアナライザでの蛍光強度の検出・定量可能な試料添加量を求めておき、その範囲内で約１０段階ほど添加量を変えてアプライし、遮光条件下で通常通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。
【００１４】
（５）２次元蛍光イメージアナライザによる蛍光強度測定
ゲルに残存する電気泳動バッファーは蛍光イメージのバックグラウンドを大幅に上昇させてしまうので、電気泳動終了後、ゲルを蒸留脱イオン水に浸して遮光条件下、数分間浸透して、ゲル中泳動バッファーを水に置換する。蛍光イメージアナライザのプロトコールに従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからそれぞれのタンパク質サブユニットから発せられる蛍光強度を読みとり、蛍光強度定量を行う。強度読み取り時間内のわずかな時間差による強度測定誤差を極力抑えるため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける試料泳動方向とイメージアナライザの主走査方向を一致させることが望ましい。アナライザ付属の解析ソフト或いは市販の２次元イメージ解析ソフトにより、個々のタンパク質バンドの蛍光強度を読みとる。システイン残基数をもとに各タンパク質サブユニットの相対強度比を計算する。
【実施例１】
【００１５】
以下に本発明を、タンパク質超分子複合体としてPyrococcus furiosus由来クランプローダー複合体（ＲＦＣ）、蛍光マレイミド試薬としてフルオレセイン−５−マレイミド（Fluorescein-5-maleimide； PEIRCE社）（図１）用いた実施例においてさらに詳細に説明する。ＲＦＣは分子量約５５ＫのＲＦＣＬサブユニット（配列番号１）と分子量３７ＫのＲＦＣＳサブユニット（配列番号２）が化学量論比１：４で機能的複合体を形成していると考えられている。野生型ＲＦＣＬはシステイン残基を有していないため、部位特異的変異法によって１６８番目のイソロイシンをシステインに置換しポリペプチド鎖中に１個のシステイン残基を導入した変異体（ＲＦＣＬ−Ｉ１６８Ｃ）を定量測定に用いた。また、野生型の配列中２個のシステイン残基（１４７番目、１６１番目）を有するＲＦＣＳは１６１番目のシステインをＡｌａに置換し、ポリペプチド鎖中に１個のシステイン残基を有する変異体（ＲＦＣＳ−Ｃ１６８Ｓ）を定量測定に用いた。同時に、本発明法における蛍光マレイミド基とシステイン残基の反応特異性を確認するため、ＲＦＣＬとＲＦＣＳが有するシステイン残基数がそれぞれ０：１、１：２、１：１、１：０となるように４種類のＲＦＣＬ／ＲＦＣＳ複合体を作成し、定性的に蛍光強度を比較した。
【００１６】
（１）高度に精製した２μＭ ＲＦＣ複合体溶液を透析バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＴＣＥＰ・ＨＣｌ）に対して４℃にて一晩透析した。
（２）透析後、６５μｌの試料溶液に１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液９μｌ（終濃度約１％（ｗ／ｖ））、２０ｍＭ フルオレセイン−５−マレイミドのＤＭＦ溶液を３μｌ（終濃度約６５０ｎＭ）、ＤＭＦを１５μｌ（終濃度約２０％（ｖ／ｖ））加え、遮光条件下、室温で２時間静置した。ＤＭＦはフルオレセイン−５−マレイミドの溶解度を保持するために必要とされる。
（３）１００ｍＭ β−メルカプトエタノールを１０μｌ加え、反応を停止させた。１％ＳＤＳを含む透析バッファーで平衡化しておいた簡易型ゲルろ過スピンカラム（AmershamBioscience社 G-50spin column）に３）の試料をアプライし、余剰のフルオレセイン−５−マレイミドを除去した。
（４）５ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇバッファー（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５％（ｖ／ｖ） β−メルカプトエタノール、３５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５％（ｗ／ｖ） ブロモフェノールブルー）を１５μｌ加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料とした。試料は必要に応じて、１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇバッファーを用いて希釈した。
（５）４−２０％グラジエントゲル（第一化学薬品）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。検量線作成のために同種類の試料を、添加量を変えて泳動を行うときは、ハンド定量時に隣接レーンとのバンドの重なりを極力避けるために、隣接レーンとは時間差を与えてゲルにアプライした。遮光条件下、室温にて４０ｋＶ、１００ｍＡで約６０分間泳動を行った。
（６）電気泳動終了後、ゲルを蒸留脱イオン水に浸し、数分間穏やかに振とうした。
（７）蛍光イメージアナライザ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製ＦＭＢＩＯＩＩ、蛍光励起波長＝５３２ｎｍ、検出波長＝５０５ｎｍ）の読み取り部ガラス板をイソプロパノールで丁寧に磨き、少量の水を乗せ、空気が入らないように丁寧にゲルを乗せた。繰り返し回数５１２回（読み取り時間約１０分）でバンドイメージを読みとった。
（８）イメージアナライザ付属の解析ソフトウェアにてバンド定量を行った。解析は「１Ｄゲル解析モード」、すなわち各レーンごとにバックグランドを見積り、バンド強度の積算を行った。
（９）結果１：蛍光マレイミド試薬とシステイン残基の反応特異性について。図３に示す通り、ＣＢＢ染色では可視化されるシステイン残基を持たないタンパク質は、蛍光強度測定ではバンドは全く検出されなかった。これは、反応が極めて特異的であることを示している（図３ａ）。
（１０）結果２：各ポリペプチド鎖当たり１個のシステイン残基を有する変異ＲＦＣ複合体（ＲＦＣＬ−Ｉ１６８Ｃ／ＲＦＣＳ−Ｃ１６１Ｓ）を約１．０〜１０．０ｐｍｏｌ（０．２〜２．０μｇ）の範囲で１４段階の希釈系列でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、バンド強度測定ならびに化学量論比の測定を行った（図４）。測定結果を表１に示す。横軸に試料アプライ量、縦軸にバンド強度をプロットしたグラフから、蛍光強度は試料量と高い直線性を示すことがわかった（図４ｂ）。それぞれの検量線の傾きの比から得られたＲＦＣＬとＲＦＣＬの化学量論比は１：４であり、予想と一致した結果である。また、各レーンごとに求めたＲＦＣＬとＲＦＣＳのバンド強度比（表１）をプロットしたグラフからも、ＲＦＣＬとＲＦＣＬの化学量論比は１：４であること示された（図４ｃ）。
［表１］
注入（μｌ）      ＲＦＣＬ      ＲＦＣＳ          Ｓ/Ｌ比
12             2935          11443               3.90
10             2096           8976               4.28
9             1947           7134               3.66
8             1531           6584               4.30
7             1441           5487               3.81
6             1276           5112               4.01
5              953           3919               4.11
4              832           3449               4.15
3.5            853           3084               3.62
3              545           2669               4.90
2.5            534           2215               4.15
2              367           1664               4.53
1.5            386           1407               3.65
1              195            745               3.82
【００１７】
本発明は以下のような従来の方法では得られない優れた効果を有する。
１）ＳＤＳなど界面活性剤を用いた還元変性条件下、蛍光発色団とマレイミド基を併せ持つ蛍光マレイミド試薬をシステイン残基に特異的に結合させることで、立体構造に依存せずに１００％の効率でシステイン残基をラベル化することができ、蛍光強度から非常に正確な化学量論比の決定を可能とする。
２）あらかじめ蛍光マレイミド試薬によってラベル化した超分子複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離、ごく短時間の前処理操作後、迅速かつ低いノイズレベルで２次元蛍光イメージアナライザによって個々のサブユニットの可視化および蛍光強度測定を可能とする。
３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって超分子複合体を分離するので、一度に多数の条件の解析が可能であり、個々のサブユニットの検量線の作成と、化学量論比の決定を一回の分析で同時に行うことを可能とする。
４）蛍光ラベルを利用することで、ＣＢＢ染色では検出困難な０．１μｇ程度の試料でも定量測定することを可能とする。
５）本発明法により機能的なタンパク質超分子複合体中のサブユニットの正確な化学量論比をすることによって、試料調製（ロット）ごとのばらつきを高精度で評価する事ができ、目的複合体の機能解析および構造解析に対して高い再現性を与える。
６）試験管内で再構成によって調製したタンパク質超分子複合体と、生体内より抽出した複合体との成分比較を正確に行うことができ、再構成複合体の機能解析および構造解析における実験結果の信頼性・再現性を評価することができる。
７）タンパク質複合体を構成する各サブユニットの分離をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行うので、各サブユニットの検出・定量の妨げにさえならなければ、粗精製試料複合体を用いても、高度に精製した試料を用いた場合と同様の正確な化学量論比測定が可能である。
８）定量用プローブとして蛍光発色団を用いるので、微量の試料で定量測定を行うことができる。また、放射性同位体を用いる方法に比べて特別な実験設備等を必要とせず、実験の安全性・簡便性の点で極めて有利である。したがって、蛍光マレイミド試薬の安定性、測定の定量性・感度、操作プロトコールを改善すれば、より簡便かつ信頼性の高いタンパク質超分子複合体化学量論比測定法としてキット化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】フルオレセイン−５−マレイミドの構造式（ａ）およびシステイン残基のＳＨ基との反応機構（ｂ）を示す。
【図２】ＲＦＣＬおよびＲＦＣＳサブユニットのアミノ酸配列と、部位特異的変異を導入したアミノ酸位置。
【図３】定性的解析から、蛍光マレイミド試薬とシステイン残基の反応は極めて特異性が高いことが示された。
【図４】定量解析結果を示す。（ａ）イメージアナライザによって読みとった蛍光マレイミドラベル化ＲＦＣ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンである。（ｂ）添加量に対してバンド強度を測定し、ＲＦＣＬ、ＲＦＣＳのぞれぞれについて検量線を作成し、それら検量線の傾きから化学量論比を求めた。（ｃ）各レーンごとにＲＦＣＬとＲＦＣＳのバンド強度比を求め、それをアプライ量に対してプロットした。いずれのプロットもＲＦＣＬ：ＲＦＣＳの比が１：４であることを明瞭に示した。
【図１】
2005164433.tif 000002
【図２】
2005164433.tif 000003
【図３】
2005164433.tif 000004
【図４】
2005164433.tif 000005
【配列表】
2005164433000001.app