(57)【要約】【課題】  光増感一電子酸化反応による生体分子損傷（切断）の効率を高めた生体分子損傷方法、および当該方法を実施するための装置を提供することにより、患者の負担および医師の労力を軽減可能な、短時間で高効率の治療効果を達成することができるＰＤＴの方法を実現する。【解決手段】  光増感物質に対して光ビームを照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、上記光増感物質に対して異なる波長の光ビームを少なくとも一回ずつ照射して、上記光増感物質を複数回励起させる生体分子損傷方法によれば、効率的に生体分子を損傷させることができる。【選択図】  図１
2005102831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感物質に対して光ビームを照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、
上記光増感物質に対して異なる波長の光ビームを少なくとも一回ずつ照射して、上記光増感物質を複数回励起させることを特徴とする生体分子損傷方法。
【請求項２】
光ビームを照射することにより光増感物質を励起させる第１光励起工程と、
上記第１光励起工程によって励起した光増感物質と生体分子とが反応し発生する光増感物質のラジカルアニオンに対して光ビームを照射することにより、当該光増感物質ラジカルアニオンをさらに励起させ電子を放出させる第２光励起工程とを含むことを特徴とする請求項１に記載の生体分子損傷方法。
【請求項３】
上記第２光励起工程において、放出された電子が酸素分子と反応し、活性酸素種を発生させることを特徴とする請求項１または２に記載の生体分子損傷方法。
【請求項４】
上記第２光励起工程で用いられる光ビームは、上記第１光励起工程で用いられる光ビームに比べて長波長の光ビームであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体分子損傷方法。
【請求項５】
上記第２光励起工程で照射される光ビームの入射角は、上記第１光励起工程で照射される光ビームの入射角と異なることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体分子損傷方法。
【請求項６】
上記第２光励起工程での光ビームの照射は、第１光励起工程での光ビームの照射に対してナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーの遅延時間で行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体分子損傷方法。
【請求項７】
光増感物質に対して同一波長の光ビームを複数回照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、
上記光増感物質として２光子励起が可能な光増感物質を用いており、
上記光増感物質の吸収波長の略２倍の波長の光ビームを光増感物質に対して照射し、光増感物質を励起させる第１光励起工程と、
上記第１光励起工程によって励起した光増感物質と生体分子とが反応し発生する光増感物質のラジカルアニオンに対して光ビームを照射することにより、当該光増感物質ラジカルアニオンをさらに励起させ電子を放出させる第２光励起工程とを含むことを特徴とする生体分子損傷方法。
【請求項８】
上記生体分子とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の生体分子損傷方法。
【請求項９】
少なくとも波長の異なる２種の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えていることを特徴とする生体分子損傷装置。
【請求項１０】
上記光ビーム照射手段は、少なくとも波長の異なる２種の光ビームの照射の遅延時間をナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段を備えていることを特徴とする請求項９に記載の生体分子損傷装置。
【請求項１１】
単一波長の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えており、
上記光ビーム照射手段は、単一波長の光ビームの照射を遅延時間ナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段をさらに備えていることを特徴とする生体分子損傷装置。
【請求項１２】
上記光ビーム照射手段は、上記少なくとも２種の光ビームの入射角を変更させることができるように形成されていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の生体分子損傷装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感剤を光励起させることにより直接または間接的に生体分子を損傷（切断など）させる方法および装置に関し、より詳細には、多段階光励起法により生体分子を損傷させる方法、および当該方法を実施するための装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ガン治療の一つとして、光線力学療法（Photo Dynamic Therapy、レーザー光学治療とも称される。以下、ＰＤＴと称する）が注目されている。このＰＤＴの原理について、簡単に説明する。まず、例えば、ガン患者に光化学反応（光増感反応）を起こしやすい腫瘍親和性化学物質（光増感剤など）を静脈内注射により摂取させる。この場合、当該化学物質は正常細胞には取り込まれにくく排泄も早いが、ガン細胞には取り込まれやすく長時間残留することになる。このため、ガン組織にレーザー光線を照射することにより、光化学反応により局所的かつ選択的にガン細胞が破壊される。このとき、高出力のレーザー光線で直接細胞を焼く場合と異なり、正常細胞にレーザー光線が照射されても影響が無い。したがって、ＰＤＴによれば、重篤な副作用もなく、また外科的療法にように患者に過大な負担を負わせることなく、ガンを治療することができる（例えば、非特許文献１参照）。また、このＰＤＴを効率的に行うための方法や装置も開示されている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
このＰＤＴによる細胞死のメカニズムの詳細は未だ明らかになっていないが、図２に示す２つのメカニズムが提案されている。図２（ａ）には、励起状態の光増感剤と酸素分子との反応により生じる活性酸素種によるＤＮＡ損傷のメカニズムＩを示す。同図に示すように、まず、患部に集積した光増感剤（Ｓ）にレーザー光（ｈν）が照射されることにより、光増感剤が励起状態となる（Ｓ*）。その後、励起状態の光増感剤（Ｓ*）と酸素分子（Ｏ2）とが反応し、光増感剤が再生されるとともに一重項酸素が発生する（1Ｏ2）。そして、この一重項酸素がＤＮＡに対して損傷を与える。
【０００４】
また、図２（ｂ）には、光増感一電子酸化反応によるＤＮＡ損傷のメカニズムＩＩを示す。同図に示すように、まず、まず、患部に集積した光増感剤（Ｓ）にレーザー光（ｈν）が照射されることにより、光増感剤が励起状態となる（Ｓ*）。ここまではメカニズムＩと同様である。その後、励起状態の光増感剤（Ｓ*）とＤＮＡとが直接一電子酸化反応を起こし、ＤＮＡ中にラジカルカチオン（ＤＮＡ●＋）と、光増感剤ラジカルアニオン（Ｓ●−）とが生じる。その結果、ＤＮＡ中に生じたラジカルカチオンがＤＮＡに対して損傷を与える。
【特許文献１】米国特許第５，８５１，２２５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０３０，４１１号明細書
【非特許文献１】Dolmans, D. E. J. G. J., Fukumura, D. & Jain, R. K. TIMELINE: Photodynamic therapy for cancer. Nat. Rev. Cancer 3, 380-387 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＤＴによる治療には、高強度パルスレーザーを必要とする。このため、２つ以上の活性種による複合反応、あるいは生じた活性中間体の光反応がＤＮＡ損傷に重要であると考えられる。さらに、光増感反応のターゲットがＤＮＡである場合、上記メカニズムＩＩがより重要になると考えられる。
【０００６】
しかしながら、上記従来のメカニズムＩＩにおけるＤＮＡ光増感一電子酸化反応では、電子移動反応によりＤＮＡ中に生じたラジカルカチオンと光増感剤ラジカルアニオンとの間で電荷再結合が起こってしまい、ＤＮＡ光増感一電子酸化反応の量子収率は、きわめて低くなる。このため、光反応による効率的なＤＮＡの酸化切断が生じないという問題点がある。
【０００７】
また、ＰＤＴによる治療では、合併症等の報告例はほとんどないが、唯一日光過敏症が問題となっている。すなわち、使用した光増感剤が代謝されるまでの数週間にわたり遮光が必要となる。そのため、出来る限り外用する光増感剤の量を減らすことが望まれる。また、光源としては比較的高強度のパルスレーザーを必要とし、治療時間も長時間必要とするため照射面積に制約をうけ、一定期間に治療しうる患者数も制限される。さらに、ＰＤＴによる治療を実施する医師および医療機関の労力、負担も大きい。
【０００８】
このため、ＰＤＴによる治療の普及のためにも、少量の光増感剤を用いた高効率の生体分子損傷（切断、破壊など）法の開発が強く望まれていた。
【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、光増感一電子酸化反応による生体分子損傷（切断、破壊など）の効率を高めた生体分子損傷方法、および当該方法を実施するための装置を提供することにより、患者の負担および医師の労力を軽減可能な、短時間で高効率の治療効果を達成することができるＰＤＴの方法を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、光増感剤に対してレーザーを照射して光増感剤を励起させた後（第１段階光励起）、励起された光増感剤とＤＮＡとの一電子酸化反応により生じた光増感剤ラジカルアニオンに対してレーザーを照射することによって当該光増感剤ラジカルアニオンを励起させ（第２段階光励起）、電子を溶媒中に放出させて増感剤を再生させることにより、ＤＮＡ中に生じたラジカルカチオンと光増感剤ラジカルアニオンとの電荷再結合を妨げることができることを見出し、光増感一電子酸化反応によるＤＮＡ損傷を高効率で発生させることができるという本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記課題を解決するために、光増感物質に対して光ビームを照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、上記光増感物質に対して異なる波長の光ビームを少なくとも一回ずつ照射して、上記光増感物質を複数回励起させることを特徴としている。
【００１２】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、光ビームを照射することにより光増感物質を励起させる第１光励起工程と、上記第１光励起工程によって励起した光増感物質と生体分子とが反応し発生する光増感物質のラジカルアニオンに対して光ビームを照射することにより、当該光増感物質ラジカルアニオンをさらに励起させ電子を放出させる第２光励起工程とを含むことが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記第２光励起工程において、放出された電子が酸素分子と反応し、活性酸素種を発生させることが好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記第２光励起工程で用いられる光ビームは、上記第１光励起工程で用いられる光ビームに比べて長波長の光ビームであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記第２光励起工程で照射される光ビームの入射角は、上記第１光励起工程で照射される光ビームの入射角と異なることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記第２光励起工程での光ビームの照射は、第１光励起工程での光ビームの照射に対してナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーの遅延時間で行われることが好ましい。
【００１７】
また、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記課題を解決するために、光増感物質に対して同一波長の光ビームを複数回照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、上記光増感物質として２光子励起が可能な光増感物質を用いており、上記光増感物質の吸収波長の略２倍の波長の光ビームを光増感物質に対して照射し、光増感物質を励起させる第１光励起工程と、上記第１光励起工程によって励起した光増感物質と生体分子とが反応し発生する光増感物質のラジカルアニオンに対して光ビームを照射することにより、当該光増感物質ラジカルアニオンをさらに励起させ電子を放出させる第２光励起工程とを含むことを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係る生体分子損傷方法では、上記生体分子とは、ＤＮＡ、またはＲＮＡあることが好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る生体分子損傷装置は、少なくとも波長の異なる２種の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えていることを特徴としている。
【００２０】
また、上記光ビーム照射手段は、少なくとも波長の異なる２種の光ビームの照射の遅延時間をナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段を備えていることが好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る生体分子損傷装置は、単一波長の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えており、上記光ビーム照射手段は、単一波長の光ビームの照射を遅延時間ナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段をさらに備えていることを特徴としている。
【００２２】
また、上記光ビーム照射手段は、上記少なくとも２種の光ビームの入射角を変更させることができるように形成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る生体分子損傷方法または生体分子損傷装置によれば、光増感一電子酸化反応による生体分子損傷の効率を高めることができるという効果を奏する。このため、より効率よく生体分子損傷を引き起こすことによる新しいＰＤＴによるガン等の腫瘍の治療に利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の一実施形態について図１〜図１０に基づいて説明すると以下の通りである。なお、本発明はこれに限られるものではないことはいうまでもない。
【００２５】
（Ａ）生体分子損傷方法について
本発明に係る生体分子損傷方法は、光増感物質に対して光ビームを照射して生体分子を損傷させる生体分子損傷方法であって、上記光増感物質に対して異なる波長の光ビームを少なくとも一回ずつ照射して、上記光増感物質を複数回励起させる方法であればよく、その他の具体的な条件、工程などは特に限定されるものではない。すなわち、本発明は、多段階光励起による生体分子損傷方法と称することができる。
【００２６】
ここで、「光増感物質を用いて生体分子を損傷させる方法」とは、光増感物質に対して光ビーム（例えば、パルスレーザーなど）を照射して励起させ、この励起した光増感物質が生体分子を直接または間接的に損傷させる方法をいう。より具体的には図１（ａ）に示すように、励起した光増感物質が活性酸素種を発生させ、この活性酸素種が生体分子を損傷させる場合、および図１（ｂ）に示すように、励起した光増感物質が生体分子から電子を引き抜き、生体分子を直接的に損傷させる場合を含む。なお、特に後者の励起した光増感物質がＤＮＡを構成する塩基（特にグアニン）から一電子引き抜き、ＤＮＡラジカルカチオンを生じさせる反応（光増感一電子酸化反応）によってＤＮＡを損傷させる方法が好ましい。なお、ここでいう「生体分子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質など様々な細胞内分子をいうが、特にＤＮＡ、ＲＮＡが好ましい。
【００２７】
また、ここでいう「光増感物質」とは、光子を吸収して電子的励起状態を生じる光化学反応を起こしやすい物質をいい、光反応物質と称されることもある。なお、本発明にはＰＤＴなどに使用される従来公知の光増感剤を利用することができる。具体的には、例えば、hematoporphyrin、HpD、porphyrin、chlorin、purpurin、ALAの他、後述する実施例で用いたナフタルジイミド（ＮＤＩ）などを挙げることができる。
【００２８】
また、「生体分子を損傷させる」とは、細胞内の生体分子を損傷させ、細胞を死滅させる程度に損傷させることをいい、特に生体分子がＤＮＡあるいはＲＮＡである場合、遺伝情報が正確に複製あるいは転写されなくなる程度にＤＮＡまたはＲＮＡが損傷を受けることをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡを切断する場合を含む。なお、本発明でいう「ＤＮＡ」とは、基本的には２本鎖ＤＮＡをいうが、１本鎖ＤＮＡをも含む。また、生体内に存在するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成技術により作成されたＤＮＡをも含む。このＤＮＡの鎖長は特に限定されるものではなく、光増感物質が相互作用できる程度の鎖長を有するＤＮＡであればよい。
【００２９】
以下に、本発明に係る生体分子損傷方法の基本的な部分について図１を用いて説明する。本発明は、生体分子の損傷を引き起こしたい部位、例えば、疾患部位（ガンの発生部位など）に光増感物質を取り込ませ、その後選択的な光照射を行うことによって、疾患部位のみ選択的に生体分子損傷を引き起こし、疾患部位の周りの正常部位には何らのダメージも与えないで疾患の治療を行うことができるＰＤＴに利用可能である。以下では、生体分子として主にＤＮＡを挙げて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。光増感物質Ｓは光を吸収した後、1Ｓ*に励起され、その後3Ｓ*へと変換される場合もある。上述したように、ガン細胞を死滅させるメカニズムとして、この3Ｓ*が酸素分子に電子を供与して発生する一重項酸素が細胞の構成要素を酸化させて細胞死を誘導する場合（メカニズムＩ）と、1Ｓ*または3Ｓ*が細胞の構成要素から電子を引き抜き酸化させて細胞死を誘導する場合（メカニズムＩＩ）との２通りある。ＤＮＡを標的とする場合、光増感物質ＳとＤＮＡとの結合がメカニズムＩＩに必要である。すなわち、光増感物質ＳとＤＮＡとの近接相互作用が光増感一電子酸化反応には重要である。ＤＮＡと結合し、光照射により励起された光増感物質Ｓ*は、光ＤＮＡを構成する塩基であるグアニンから電子を引き抜き、光増感物質ラジカルアニオン（Ｓ●−）とグアニンラジカルカチオン（Ｇ●＋）とを発生させて電荷分離状態を生じさせる。しかし、ＤＮＡ鎖の切断反応よりも電荷再結合反応の方がより速く起こる。このため、グアニンラジカルカチオンによるＤＮＡ鎖の切断反応の効率は低下してしまう。
【００３０】
そこで、本発明では図１に示すように、２段階で光増感物質Ｓを励起させることにした。すなわち、まず、第１段階目の光照射によって、光増感物質Ｓを励起させ、ＤＮＡ中のグアニンから電子を引き抜かせ、光増感物質ラジカルアニオン（Ｓ●−）とグアニンラジカルカチオン（Ｇ●＋）とを発生させる。そして、生じた光増感物質ラジカルアニオンに対して第２段階目の光照射を行う。この第２段階目の光照射によって、光増感物質ラジカルアニオンを励起させ、電子を放出させる。これにより、光増感物質ラジカルアニオンを消滅させることができるため、ＤＮＡ中のラジカルカチオンとの電荷再結合を妨げることができ、効率的なＤＮＡ損傷を引き起こすことができる。
【００３１】
すなわち、本発明に係る生体分子損傷方法は、上記第１段階目の光励起を行う第１光励起工程と、第２段階目の光励起を行う第２光励起工程とを有することが好ましい。なお、第１光励起工程と第２光励起工程とを繰り返し実施してもよい。以下、第１光励起工程と第２光励起工程とに分けて詳細に説明する。
【００３２】
（Ａ−１）第１光励起工程
本発明に係る第１光励起工程は、光ビームを照射することにより光増感物質を励起させる工程であればよく、その他の具体的な条件、材料などは特に限定されるものではない。すなわち、本第１光励起工程とは、光増感物質を光ビームの照射により励起させ、励起状態の光増感物質を発生させる工程であるともいえる。この工程により発生した励起状態の光増感物質が、例えば、直接ＤＮＡを構成する塩基分子（特にグアニン）から電子を引き抜いてＤＮＡラジカルカチオンを発生させたり、または酸素分子と反応して活性酸素種を生じさせたりして、ＤＮＡなどの生体分子を損傷させることになる。
【００３３】
ここで、「光ビーム」として、パルスレーザーなどの従来公知の光ビーム照射装置を用いることができる。これにより簡便かつ効率的に光増感物質を励起することができる。また、「光増感物質を励起させる」とは、光増感物質を光ビームの照射によって選択的に励起させることが好ましいが、これに限られない。
【００３４】
なお、この第１光励起工程にて照射する光ビームの波長は、使用する光増感物質を励起することができる波長であり、光増感物質の種類、性質などに応じて適宜設定可能であることはいうまでもない。
【００３５】
また、第１光励起工程にて照射する光ビームの照射時間、照射強度などは、使用する光増感剤やその他の条件に応じて適宜設定可能である。
【００３６】
（Ａ−２）第２光励起工程
本発明に係る第２光励起工程は、上記第１光励起工程によって励起した光増感物質と生体分子とが反応し発生する光増感物質のラジカルアニオンに対して光ビームを照射することにより、当該光増感物質ラジカルアニオンをさらに励起させ、当該光増感物質ラジカルアニオンから電子を放出させる工程であればよく、その他の具体的な条件、材料等は特に限定されるものではない。
【００３７】
例えば、上記第１光励起工程によって発生した励起状態の光増感物質がＤＮＡを構成する塩基分子（特にグアニン）から一電子を引き抜いた場合、光増感物質ラジカルアニオンとＤＮＡラジカルカチオンが発生するが、通常これらは電子移動反応により、電荷再結合してしまう。その結果、ＤＮＡラジカルカチオンによるＤＮＡ損傷の効率が低下する。しかし、上記第２光励起工程を行うことにより、生じた光増感物質ラジカルアニオンを再度励起させ一電子を放出させることによって、光増感物質ラジカルアニオンを消滅させて光増感物質を再生することができる。このため、光増感物質ラジカルアニオンとＤＮＡラジカルカチオンとが電荷再結合することによるＤＮＡ損傷の効率低下を防ぐことができる。このようにして、本発明では生体分子を効率的に損傷させることができる。
【００３８】
なお、上記電子分離状態において発生する光増感物質ラジカルアニオンはその寿命が非常に短いため、第２光励起工程における光ビーム照射は、第１光励起工程における光ビーム照射に対してナノ秒オーダー（１０-9秒）〜マイクロ秒オーダー（１０-6秒）の遅延時間で行われることが好ましい。なお、第１光励起工程における光ビーム照射に対する第２光励起工程における光ビーム照射の遅延時間は、使用する光増感物質の種類や性質、また光増感物質と生体分子との結合状態や結合位置などに応じて適宜設定可能である。より具体的には、図５に示すように、第１光励起工程における光ビームを照射し光増感物質とＤＮＡとにおいて電荷分離を生じさせた後、ＤＮＡ中のグアニンに生じたラジカルカチオンの電荷が再結合する前に、第２光励起工程における光ビームの照射を行うことが好ましい。このようなタイミングで、第２光励起工程における光ビームの照射を行う場合、最もＤＮＡの切断効率が高まるためである。
【００３９】
ここで、光増感物質の分子が還元されラジカルアニオンになることにより、その吸収波長はしばしば長波長側にシフトする。このため、第２光励起工程において使用される光ビームは、第１光励起工程で使用される光ビームよりも長波長であることが好ましい。これにより、効率的に光増感物質ラジカルアニオンを励起させ電子を放出させることができる。
【００４０】
また、本発明では第１光励起工程によって生じた励起状態の光増感物質が生体分子（例えば、ＤＮＡ）から一電子還元されることにより生じる過渡種（光増感物質ラジカルアニオン）を、第２光励起工程によりさらに励起するため、通常、第２光励起工程で使用する光ビームは、第１光励起工程で使用する光ビームより高出力を要することになるが、長波長の光ビームは、高出力が得やすいため、この点でも優れている。さらに、長波長の光ビームは細胞透過性が高いため、本発明をＰＤＴに利用した場合、深部ガンの治療に用いることができる。また、長波長の光ビームは、正常細胞へのダメージが少ないといった利点を有し、第１光励起工程で使用する短波長の光ビームを高強度で照射するよりも優れている。
【００４１】
なお、この第２光励起工程にて使用する光ビームの波長は、上記第１光励起工程にて励起状態となった光増感物質を再度励起することができる波長であり、光増感物質の種類、性質などに応じて適宜設定可能であることはいうまでもない。
【００４２】
また、光増感物質ラジカルアニオンから放出された電子は、溶媒（例えば、水など）に放出されることが好ましい。このとき、放出された電子と溶媒中の酸素分子とが反応し、活性酸素種を発生させることがより好ましい。この場合、発生した活性酸素種が生体分子に対して損傷を与えるため、生体分子の損傷効率がより一層高まる。なお、ここでいう「活性酸素種」とは、医学・生物学的に用いられるものであって、いわゆる、生体内で通常の酸素分子よりも高い反応性を示す酸素化合物（一重項酸素、スーパーオキサイドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシラジカルなど）をいう。
【００４３】
また、上記第２光励起工程で照射される光ビームの入射角は、上記第１光励起工程で照射される光ビームの入射角と異なることが好ましい。２以上の異なる波長の光ビームを、入射角度を変えて照射することにより、反応点の区間的な制御が可能となる。このため、本発明をＰＤＴに応用した場合、空間を制御したガン治療が可能となる。
【００４４】
また、上記第２光励起工程における光ビームの照射時間、強度などは適宜設定可能であり、特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、光ビームの照射時間および強度に比例して、生体分子の損傷の効率は高まるが（図９、１０参照）、ＰＤＴなどに利用した場合、患部の状態、治療時間、患者の様態などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００４５】
さらに、ここまで説明してきた２波長２レーザーを利用した生体分子損傷方法だけでなく、単一波長の光ビーム（レーザー）のみを使用して生体分子を損傷させることも可能である。１つのレーザーのみでＤＮＡなどの細胞内分子を効率的に損傷させる方法は、実用を考えたときに非常に有効である。
【００４６】
すなわち、適当な光増感剤の選択により、単一波長を利用してラジカルアニオンの２光子励起による生成、そして３光子目の励起によるラジカルアニオンの光励起を経る電子放出も可能である。増感剤の吸収波長の２倍の波長の高強度レーザー光を照射すると増感剤の光励起が起こって、増感剤の励起状態が生成する場合がある。このようにして、増感剤の励起状態と生体分子（例えば、ＤＮＡなど）の間で電子移動が起こり、増感剤のラジカルアニオンとDNAラジカルカチオンを生成することができる。そこで、増感剤のラジカルアニオンの吸収がレーザー光の波長と一致する場合は、増感剤のラジカルアニオンが同じレーザー光を吸収して電子放出が起こる。この場合、増感剤のラジカルアニオンとＤＮＡラジカルカチオンとの電荷再結合が抑制されるため、ＤＮＡ損傷の効率が飛躍的に向上するのは、２波長２レーザー照射方法と同様である。
【００４７】
この単一のレーザーによる３光子励起過程を含む方法は、１レーザーパルス内に起こすことも可能である。すなわち、光増感剤の２光子励起によって電子移動が起こり、増感剤のラジカルアニオンとＤＮＡラジカルカチオンが生成し、連続的にレーザーパルス内で増感剤のラジカルアニオンが励起されれば増感剤のラジカルアニオンからの電子放出が起こり、効率的にＤＮＡ損傷を起こすことができる。この単一波長、１レーザーによる方法は、実用性を考慮した場合、特に重要な方法である。
【００４８】
このように、上記光増感物質として２光子励起が可能な光増感物質を用いた場合、光増感物質に対して光ビームを複数回（少なくとも２回）照射して、光増感物質を複数回（少なくとも２回）励起させる方法も本発明に含まれる。この場合、まず、所定の光ビームを照射し、光増感物質を第１励起状態とする。この励起状態の光増感物質が生体分子から一電子引き抜き、光増感ラジカルアニオンと生体分子中のラジカルカチオンが発生する。その後、この電荷分離状態に対して同じ波長の光ビームを照射することにより、上記と同様のメカニズムにより電荷再結合を妨げることができる。このため、生体分子の一電子酸化の効率が高くなり、生体分子の損傷（酸化損傷）の効率を高めることができる。すなわち、２光子光励起が可能な光増感物質を用いることにより、１つ波長の光ビームでも多段階光励起による効率的なＤＮＡ損傷方法を実施することができる。なお、この「２光子光励起が可能な光増感物質」とは、同一の波長の光を吸収して、２回励起する光増感物質のことをいう。
【００４９】
なお、２光子励起には連続的２光子励起と段階的２光子励起がある。前者は増感剤が全く吸収のない波長(λ)の１／２波長（λ／２）に吸収を持つ場合、波長λの高強度短パルスレーザー光照射によって起こる非線形光学現象である。後者は増感剤が波長λに非常に弱い吸収を持ち、1光子励起で生成する励起状態が波長λに比較的強い吸収を持つ場合に中間の励起状態の励起（２光子目の励起）が起こる現象である。増感剤となりえる多くの有機化合物は、多かれ少なかれこのような２光子励起を起こすことが可能であり、1波長を使用する照射方法において、様々な分子を増感剤として使用することが可能である。
【００５０】
（Ｂ）生体分子損傷装置について
本発明に係る生体分子損傷装置は、少なくとも波長の異なる２種の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えているものであればよい。すなわち、本発明に係る生体分子損傷装置は、上述の（Ａ）欄で説明した本発明に係る生体分子損傷方法を実施するための装置といえる。
【００５１】
上記光ビーム照射手段は、例えば、波長の異なる光源を２以上有するレーザー照射装置などを挙げることができる。具体的な構成は、従来公知のレーザー照射装置の構成を利用可能である。
【００５２】
さらに、本発明に係る生体分子損傷装置において、上記光ビーム照射手段は、上記少なくとも２種の光ビームの入射角を変更させることができるように形成されていることが好ましい。上記の構成によれば、例えば、２以上の光ビームの入射角を変えて照射することができ、これにより反応点の空間的な制御が可能であり、空間を制御した腫瘍の治療が可能となる。
【００５３】
具体的には、例えば、上記少なくとも２種の光ビームの入射角を変更させることができる入射角変更手段を備えている生体分子損傷装置を挙げることができる。この入射角変更手段は、ユーザーの手動により、または自動的に、患部に併せて光ビーム照射の入射角を制御・変更することができる。
【００５４】
また、上記光ビーム照射手段は、少なくとも波長の異なる２種の光ビームの照射の遅延時間をナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段を備えていることが好ましい。これは、上述したように、第２光励起工程にて光ビームを照射させる対象である光増感物質ラジカルアニオンは非常に寿命が短いため、波長の異なる２種の光ビームを非常に短い遅延時間で（実質的には略同時に）照射する場合もあり得えるためである。なお、光増感物質とＤＮＡとの結合位置や結合状態により光照射の遅延時間は適宜変更可能である。
【００５５】
さらに、本発明に係る生体分子損傷装置には、単一波長の光ビームを照射することができる光ビーム照射手段を備えており、上記光ビーム照射手段は、単一波長の光ビームの照射を遅延時間ナノ秒オーダー〜マイクロ秒オーダーで制御することができる制御手段をさらに備えているものも含まれる。この装置を用いることにより、上記（Ａ）欄で説明した単一波長の光ビーム（レーザー）のみを用いてＤＮＡなどの生体分子を効率的に損傷させることができる。
【００５６】
（Ｃ）生体分子損傷方法および生体分子損傷装置の利用法について
以上のように、本発明に係る生体分子損傷方法および生体分子損傷装置によれば、発生した光増感物質ラジカルアニオンとＤＮＡ中のラジカルカチオンとの電荷再結合を妨げることができ、一電子酸化反応によるＤＮＡ損傷の効率を高めることができる。このため、より少量の光増感物質の使用で、効率よくＤＮＡ損傷を引き起こすことが可能となる。
【００５７】
したがって、光増感一電子酸化反応によりＤＮＡを損傷させる方法および装置は、新しいＰＤＴによるガン等の腫瘍の治療または治療装置などに利用可能である。すなわち、本発明は、医療への利用・応用が可能である。上述したように、ＰＤＴは高齢や心不全、他の疾患の治療等の直後で外科的療法の適用が困難な患者に対して有効な治療法である。特に、本発明に係る生体分子損傷方法および生体分子損傷装置を利用することにより、より少量の光増感物質の使用で足り、また治療時間も少なくて済む。このため、一定時間に治療できる患者数も制限されることなく、患者の負担と医師の労力の低減を同時に図ることができる画期的な発明であるといえる。この点で本発明は社会的インパクトが非常に高い発明であるといえる。
【００５８】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００５９】
〔１〕ＤＮＡに結合した光増感物質からの電子放出の確認
まず、ＤＮＡに結合した光増感物質ＳのラジカルアニオンＳ●−を光励起することにより、Ｓ●−から電子を放出させることができるか否かを検討した。具体的には以下のように行った。
【００６０】
まず、ＤＮＡの光増感一電子酸化により生じたラジカルイオンの寿命は非常に短いと予想され、その光反応を分光学的手法で捕らえることは困難を伴うと考えられた。そこで、まずモデル系の光増感物質としてナフタルジイミド（ＮＤＩ）を選択した。なお、本実施例ではより用いやすい水溶性ＮＤＩを使用した。ここで、この水溶性ＮＤＩを用いてパルスラジオリシス法によりＮＤＩラジカルアニオン（ＮＤＩ●−）を発生させた場合、水溶液中において水溶性ＮＤＩ●−が４９５ｎｍに極大を有するブロードな吸収を示すこと、およびマイクロ秒オーダーでは安定に存在することを予備実験により見出している（Kawai, K., Takada, T., Tojo, S. & Majima, T. Kinetics of Weak Distance-Dependent Hole Transfer in DNA by Adenine-Hopping Mechanism. J. Am. Chem. Soc. 125, 6842-6843 (2003)、Ishida, A. et al. Lifetimes and Transient Phenomena of Stilbene Radical Cations in the 2nd Excited Doublet State. J. Phys. Chem. 99, 10808-10814 (1995).）。
【００６１】
また、ＤＮＡへのＮＤＩの結合過程の複雑な議論を省くため、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）にＮＤＩを共有結合で導入したＮＤＩ−ＯＤＮをＤＮＡ合成機より合成した（図４参照）。なお、ＮＤＩ−ＯＤＮとして、ＮＤＩを５’末端のアデニンに結合させた（ＮＤＩ−ＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＣ／ＴＴＴＴＴＴＣＡＣＧＣＧ）を用いた。
【００６２】
そして、このＮＤＩ−ＯＤＮを用いて、パルスラジオリシス法により、ＮＤＩ−ＯＤＮ中にＮＤＩラジカルアニオン（ＮＤＩ●−）を発生させた。光増感物質ラジカルアニオンＳ●−は、しばしば非還元型の光増感物質に比べて長波長の光を吸収することが知られている。そこで、ＮＤＩ●−を、ＹＡＧレーザーの第二高調波５３２ｎｍを照射することにより励起し、溶媒への電子放出を調べた。その結果を図７に示す。なお、図中、グレーで示す線は、ＮＤＩ−ＯＤＮをパルスラジオリシスすることにより発生させたＮＤＩ●−のΔＯＤ495を示し、黒線は電子パルス２μ秒後に５３２ｎｍの光を照射しＮＤＩ●−を励起した場合のΔＯＤ495を示す。
【００６３】
同図に示すように、５３２ｎｍのパルスレーザーをＮＤＩ●−に対して照射したところ、ΔＯＤ495が減少した。そして、図７中の挿入図（inset）に示すように、ΔＯＤ630を調べることにより、光照射によりＮＤＩ●−を励起させることにより、ＮＤＩ●−から溶媒へ電子が放出されることを確認できた。
【００６４】
〔２〕２波長２レーザー励起を用いた高効率ＤＮＡ切断の検討
次に、２種類の波長を有する２つのレーザーを照射することにより、高効率にＤＮＡを切断することができるか否かの検討を行った。本実施例では、増感剤ラジカルアニオン励起による、溶媒への電子放出を電子線パルス・レーザー複合照射により検討した。その際、詳細な速度論算出のため、モノクロメーターを用いた。そして、２波長２レーザー励起によるＤＮＡ酸化損傷効率を、ヌクレオシドレベルまで酵素分解した後、ＨＰＬＣを用いて定量した。具体的には、以下のように行った。
【００６５】
２波長２レーザー励起法により、ＮＤＩ−ＯＤＮ中のグアニンの破壊と、ＮＤＩ−ＨＣｌ（N,N’-bis-[3-(N-dimethyl)propyl]-1,4,5,8-naphthaldiimide dichloridite）存在下でのＯＤＮ−ＧおよびＯＤＮ−ＧＧにおけるグアニンの破壊の程度を調べた。ＮＤＩ−ＯＤＮは、ｐＨ７．０の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中、４０μＭの鎖濃度で用いた。また、ＯＤＮ−Ｇ溶液およびＯＤＮ−ＧＧ溶液（鎖濃度４０μＭ）には、４０μＭのＮＤＩ−ＨＣｌを加えた。２波長２レーザー励起法のために、５３２ｎｍパルスレーザー（２０mＪ/pulse）を３５５ｎｍパルスレーザー（１．６mＪ/pulse）に同期させ、遅延時間１０ナノ秒で照射した。光増感されたＯＤＮｓは、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ／ヌクレアーゼＰ１／アルカリフォスファターゼにより２’−デオキシモノヌクレオチドへと酵素分解し、グアニンの破壊量についてＨＰＬＣを用いたプロダクトアナリシスにより定量した。なお、ＮＤＩ−ＯＤＮへの光照射時間は５分間、ＯＤＮ−ＧおよびＯＤＮ−ＧＧへの光照射時間は１０分間行った。
【００６６】
その結果を図６に示す。なお、ＮＤＩ−ＯＤＮ、ＯＤＮ−Ｇ、ＯＤＮ−ＧＧの塩基配列は、それぞれ表中に示したものを用いた。
【００６７】
同図に示すように、グアニンの破壊は、３５５ｎｍのみを照射した場合に比べて、第１段階目に３５５ｎｍレーザーを、第２段階目に５３２ｎｍレーザーを照射した場合、増加した。また、５３２ｎｍレーザーのみを照射した場合は、ＤＮＡへの損傷はなかった。また、ＯＤＮ−Ｇと比較した場合、ＯＤＮ−ＧＧにおけるグアニンの破壊量はより高かった。このことから、グアニンの破壊は、第１段階の光照射による光増感一電子酸化反応に基づくものであると考えられる。また、ＮＤＩを共有結合させたＯＤＮが、第２レーザーの照射によって、最もグアニンの破壊が促進された。
【００６８】
以上のことから、２波長２レーザー励起を用いて高効率でＤＮＡを切断することができることがわかった。
【００６９】
〔３〕ＮＤＩ−ＯＤＮの１波長レーザー光分解におけるＮＤＩ●−の時間座標の検討
次に、ＮＤＩ−ＯＤＮの１波長レーザー光分解におけるＮＤＩ●−の時間座標について検討し、その結果を図８に示す。図中の左軸には、ＮＤＩ●−の一時的な吸収を３５５ｎｍの励起の後、４９５ｎｍにて観察した結果を示す。また、図中の右軸には、グアニン破壊量を３５５ｎｍパルスレーザーに関して５３２ｎｍパルスレーザーの遅延時間の影響を表すものとして示した。図中点線は、５３２ｎｍパルスレーザー照射を行わない場合のグアニン破壊量を示す。なお、ＮＤＩ−ＯＤＮとして、５’末端のチミンにＮＤＩを共有結合させた（ＮＤＩ−ＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴ／ＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡ）を用いた。
【００７０】
第１段階のレーザー照射による励起では、ホールの移動はレーザーの照射時間（５ナノ秒）内に電荷分離状態へとつながる。電荷再結合は、ＮＤＩ●−から約１３Å離れたグアニンラジカルカチオン（Ｇ●＋）からの第１段階の超変換によって進行するため、電荷分離状態の寿命は１００ナノ秒程度である。また、図８には、時間を遅延させた２波長レーザー照射による光分解における、第２レーザー照射の遅延時間の影響を表すものとしてグアニン破壊量を示す。グアニン破壊についての遅延時間の依存性は、１波長レーザー照射による光分解において得られるＮＤＩ●−の一時的な吸収の減衰と一致する。それゆえ、第２レーザー照射によるグアニン破壊の促進効果は、明らかにＮＤＩ●−の励起に基づくものである。
【００７１】
〔４〕第２レーザーの照射時間および照射強度がＤＮＡ損傷へ与える影響の検討
続いて、第２レーザーの照射時間がＤＮＡ損傷に与える影響を検討した。具体的には、以下のように行った。ｐＨ７．０のリン酸ナトリウムバッファー中に４０μＭのＮＤＩ−ＨＣｌを加えたＯＤＮ−ＧＧ溶液（鎖濃度：４０μＭ）を用いた。２波長２レーザー照射のために、５３２ｎｍパルスレーザー（２０ｍＪ/pulse）を３５５ｎｍパルスレーザー（１．６ｍＪ/pulse）に同期させ、遅延時間１０ナノ秒で用いた。ＯＤＮ−ＧＧ溶液は、２０分間光照射を行い、その後、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ／ヌクレアーゼＰ１／アルカリフォスファターゼにより２’−デオキシモノヌクレオチドへと酵素分解し、グアニンの破壊量についてＨＰＬＣを用いたプロダクトアナリシスにより定量した。
【００７２】
その結果を図９に示す。なお、図中白丸（○）は３５５ｎｍのみを照射した場合のグアニン破壊量を示し、黒丸（●）は３５５ｎｍレーザーと５３２ｎｍレーザーとを２段階照射した場合のグアニン破壊量を示す。この結果、同図に示すように、３５５ｎｍレーザーと５３２ｎｍレーザーとを２段階照射した場合、照射時間に比例してグアニンの破壊量が増加することがわかった。
【００７３】
また、第２レーザーの照射強度がＤＮＡ損傷に与える影響を検討した。具体的な実験条件は、上記と同様に行った。
【００７４】
その結果を図１０に示す。なお、図中白丸（○）は３５５ｎｍレーザーと５３２ｎｍレーザーとを２段階照射した場合のグアニン破壊量を示す。この結果、同図に示すように、３５５ｎｍレーザーと５３２ｎｍレーザーとを２段階照射した場合、第２レーザーである５３２ｎｍレーザーの照射強度に比例してグアニンの破壊量が増加することがわかった。
【００７５】
以上の実施例の結果から、本発明を実施した場合、図３に示すような現象が起こっていると考えられる。すなわち、まず、第１段階のレーザー（1stレーザー）の照射により、光増感物質ＮＤＩが選択的に励起される。次に、励起されたＮＤＩ*が近傍の塩基（グアニン）から電子を引き抜き、ＮＤＩラジカルアニオン（ＮＤＩ●−）とグアニンラジカルカチオン（Ｇ●＋）が発生する。そして、第２段階のレーザー（2ndレーザー）の照射により、ＮＤＩラジカルアニオンが励起され、電子が放出されＮＤＩが再生される。最後に、放出された電子と酸素とが反応し、一重項酸素（Ｏ2●−）が発生し、この一重項酸素とグアニンラジカルカチオンとがＤＮＡを酸化損傷させることになる。
【００７６】
したがって、本実施例に係る生体分子損傷方法によれば、光増感物質ラジカルアニオンとグアニンラジカルカチオンとの電荷再結合を防止することができるため、効率的なＤＮＡ損傷を引き起こすことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、皮膚ガン、胃ガンなどのガン治療法の一つとして近年注目されているＰＤＴに利用することができる。このため、臨床医療および医療機器製造業などの分野に利用することができる。特に高齢、心不全、他の病気の直後で外科療法が困難な患者に対して有効なガン治療法となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明に係る生体分子損傷方法の基本的なメカニズムを模式的に示す図である。
【図２】ＰＤＴによる細胞死のメカニズムを示す図であり、（ａ）は活性酸素種によってＤＮＡが損傷を受ける場合のメカニズムを示す図であり、（ｂ）は光増感一電子酸化反応によってＤＮＡが損傷を受ける場合のメカニズムを示す図である。
【図３】本発明に係る実施例において行った実験を模式的に示す図である。
【図４】本発明に係る実施例において使用した水溶性ＮＤＩと、この水溶性ＮＤＩを結合させたＤＮＡを模式的に示す図である。
【図５】第２光励起工程において光ビームを照射するタイミングを変更することによって、ＤＮＡの切断効率が変化することを模式的に示す図である。
【図６】本発明に係る実施例にて行った実験の結果を示す図であり、より詳細には、光増感反応によって損傷を受けたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）中に含まれるグアニンの破壊について示す図である。
【図７】本発明に係る実施例にて行った実験の結果を示す図であり、より詳細には、５３２ｎｍのパルスレーザーにより励起させたＮＤＩラジカルアニオンからの電子放出を調べた図を示し、挿入図は溶媒和した電子の生成と減衰を６３０ｎｍにて観察した結果を示す図である。
【図８】本発明に係る実施例にて行った実験の結果を示す図であり、より詳細には、ＮＤＩラジカルアニオンの生成と減衰とを調べた結果と、オリゴデオキシヌクレオチドと結合したＮＤＩを用いてパルスラジオリシス法によりＮＤＩラジカルアニオンを発生させた間のグアニン破壊における２つのパルスレーザー間の遅延時間の効果を調べた結果を示す図である。
【図９】ＤＮＡの損傷に対する第２レーザーの照射時間の影響を調べた結果を示す図である。
【図１０】ＤＮＡの損傷に対する第２レーザーの照射強度の影響を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005102831.tif 000010
【図９】
2005102831.tif 000011
【図１０】
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【配列表】
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