(57)【要約】【課題】  合成効率の高い無細胞蛋白質合成方法を提供する。【解決手段】  少なくとも胚芽抽出物および翻訳鋳型を含む無細胞反応系中で蛋白質合成を行う無細胞蛋白質合成方法であって、該反応液には胚芽細胞抽出物による蛋白質合成反応が活性化し得る濃度のサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩が添加されていることを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも胚芽抽出物および翻訳鋳型を含む無細胞反応系中で蛋白質合成を行う無細胞蛋白合成方法であって、該反応液には胚芽細胞抽出物による蛋白質合成反応が活性化し得る濃度のサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩が添加されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩が、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、並びに、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩よりなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩の添加濃度が、０．１ミリモル／リットル以上である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
胚芽抽出物が、胚芽細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程および細胞抽出物含有液を分離・精製する工程を含む方法で製造されたものである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
胚芽抽出物が、さらに細胞の細分化物を活性化剤で処理する工程を含む方法で製造されたものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
活性化剤が、酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、ベントナイトおよび各種リガンドが結合したカラム担体よりなる群から選ばれる少なくとも一種の活性化剤である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
胚芽抽出物が、さらに細胞抽出物含有液から蛋白質合成阻害物質を排除する工程を含む方法で製造されたものである請求項４に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質合成阻害物質の排除が、透析により行われる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも胚芽抽出物およびサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体を含有することを特徴とする無細胞蛋白質合成用溶液。
【請求項１０】
さらにＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有する請求項９に記載の蛋白質合成用溶液。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の蛋白質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞蛋白質合成用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞蛋白質合成方法に関し、更に詳しくは、少なくともコムギ胚芽抽出物および翻訳鋳型を含む反応液に、蛋白質合成活性の増強物質を添加して無細胞反応系で効率よく蛋白質を合成する方法、それに用いる蛋白質合成用溶液および無細胞蛋白質合成用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内でおこなわれている蛋白質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、蛋白質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内における蛋白質合成を試験管等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームを生物体から抽出し、これらを用いて試験管内で無細胞蛋白質合成を行う方法の研究が盛んに行われている（例えば特許文献１〜５参照）。これらの方法には、リボソームの原料として、大腸菌、植物胚芽、ウサギ網状赤血球等が用いられてきた。特に植物胚芽、例えばコムギ胚芽の抽出物を用いる方法は、安定的に長時間にわたり効率よく蛋白質合成が可能な方法として、近年注目を集めている。
【０００３】
植物胚芽からリボソームを含有する無細胞蛋白質合成用胚芽抽出物を得る方法としては、通常、植物種子を粉砕した後、種皮や胚乳画分を取り除いて粗胚芽画分を取得し、更に洗浄により胚乳成分を除去した後、粉砕、抽出、精製する方法が行われている。
一方、大腸菌やウサギ網状赤血球より調製された無細胞翻訳系（無細胞蛋白質合成系）では、反応液にアデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸（ｃＡＭＰ）の添加が行われていた（例えば特許文献６参照）。しかしながら、M. E. John and W. Knoechelによると、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸（ｃＡＭＰ）は、コムギ胚芽抽出物無細胞翻訳系では効果のないことが報告されている（非特許文献１参照）。この様な報告もあり、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸（ｃＡＭＰ）は、コムギ胚芽抽出物無細胞翻訳系では効果が無いと考えられ、本発明者らの知る限り、反応液への該化合物の添加は行われていなかった。
【特許文献１】特開平６−９８７９０号公報
【特許文献２】特開平６−２２５７８３号公報
【特許文献３】特開平７−１９４号公報
【特許文献４】特開平９−２９１号公報
【特許文献５】特開平７−１４７９９２号公報
【特許文献６】特開２０００−１７５６９５号公報
【非特許文献１】M. E. John and W. Knoechel, Enhancement of in-vitro Translation of Eukaryoic RNAs by Cyclic AMP, Z. Naturforsh. 38c, 227-281 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
無細胞蛋白質合成系は、ペプチド合成反応速度と翻訳反応の正確性において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ目的とする蛋白質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため、該合成系をより有用に産業上に適用するため、合成効率の向上に関するいくつかの発明が開示されてきたが、必ずしも満足できる結果が得られているわけではない。産業上の有用性向上のためには、さらに合成効率が改良され、目的とする蛋白質を大量に効率よく合成可能な方法の提供が求められている。
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、無細胞蛋白質合成系の蛋白合成効率を上げる方法について検討した。その結果、コムギ胚芽抽出物含有液においても、従来は全く効果が無いと考えられていたアデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸（ｃＡＭＰ）の添加が、予測に反し充分な合成活性の向上に寄与することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明により、（１）少なくとも胚芽抽出物および翻訳鋳型を含む無細胞反応系中で蛋白質合成を行う無細胞蛋白質合成方法であって、該反応液には胚芽細胞抽出物による蛋白質合成反応が活性化し得る濃度のサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩が添加されていることを特徴とする方法が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、
（２）サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩が、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、並びに、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩よりなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物である上記（１）に記載の方法；
（３）サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩の添加濃度が、０．１ミリモル／リットル以上である上記（１）または（２）に記載の方法；
（４）胚芽抽出物が、胚芽細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程および細胞抽出物含有液を分離・精製する工程を含む方法で製造されたものである上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）胚芽抽出物が、さらに細胞の細分化物を活性化剤で処理する工程を含む方法で製造されたものである上記（４）に記載の方法；
（６）活性化剤が、酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、ベントナイトおよび各種リガンドが結合したカラム担体よりなる群から選ばれる少なくとも一種の活性化剤である上記（５）に記載の方法；
（７）胚芽抽出物が、さらに細胞抽出物含有液から蛋白質合成阻害物質を排除する工程を含む方法で製造されたものである上記（４）に記載の方法；
（８）蛋白質合成阻害物質の排除が、透析により行われる上記（７）に記載の方法
が提供される。
【０００７】
また、本発明の別の態様により、（９）少なくとも胚芽抽出物およびサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体を含有することを特徴とする無細胞蛋白質合成用溶液が提供される。
この発明の好ましい態様によれば、（１０）さらにＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含有する上記（９）に記載の蛋白質合成用溶液が提供される。
【０００８】
さらに、本発明の別の態様により、（１１）上記（９）または（１０）に記載の蛋白質合成用溶液を含むことを特徴とする無細胞蛋白質合成用試薬キットが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、蛋白質合成に必要な因子を効率的に細胞質から抽出し、さらに活性増強物質（サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体）を添加することにより、無細胞蛋白質合成をより効率よく行うことができる。本発明の無細胞蛋白質合成方法は、蛋白質合成活性が極めて増強されているものであり、高純度な蛋白質の無細胞系での大量調製、例えば進化分子工学の分野での新しい酵素や抗体等の大量調製に特に有用である。蛋白質合成能力が活性増強物質（サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体）の添加により上昇する理由は必ずしも明確ではないが、活性増強物質の添加により、細胞中の蛋白質合成関連物質が活性化されることによる可能性が考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施態様の代表例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
１．胚芽抽出物の調製法
１−１）原料胚芽の調製方法
原料として用いられる胚芽は、コムギ、オオムギ、イネ等のイネ科植物種子から得られる。これらの中で、特に好適なものとしてコムギ胚芽が挙げられる。
【００１１】
植物種子に含まれる胚芽の量は少ないため、胚芽を効率的に取得するためには胚芽以外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず、植物種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。
【００１２】
植物種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの乾式粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すればよいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。
【００１３】
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
【００１４】
胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。また胚芽と種皮、胚乳の転がり摩擦係数の違いを利用する方法、例えば振動分別機を用いることにより、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
【００１５】
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常、胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。
洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性物質を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄するのがより好ましい。界面活性物質としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性物質であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性物質は、例えば０．５％程度の濃度で使用することができる。
【００１６】
水又は水溶液による洗浄処理および界面活性物質による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
【００１７】
１−２）胚芽細胞を細分化する行程
上記により得られた蛋白質合成能を有する胚芽細胞を細分化する。細分化方法は特に限定されず、従来から用いられている、乳鉢、スタンプミル、ボールミル等で摩砕又は圧砕することにより微粉砕する方法により行えばよい。植物胚芽は小さく強度も高いため容易に粉砕することができないため、洗浄後の胚芽を予め液体窒素等で凍結した後に微粉砕することが好ましい。
【００１８】
本発明においては、胚芽細胞を細分化する際に、摩砕又は圧砕によるのではなく、衝撃または切断により細分化することが好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕又は圧砕と比べて最小限に止めうる条件で細胞を破壊することを意味する。
【００１９】
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いるのが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、胚芽の蛋白質合成能力が失われない温度であれば特に限定されないが、好ましくは１０℃以下で細分化の操作が可能な温度範囲、特に好ましくは４℃程度が適当である。
【００２０】
胚芽細胞を衝撃または切断により細分化することにより、細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が全て破壊されてしまうのではなく、少なくともその一部は破壊されることなく残ると考えられる。即ち、特にこの細分化方法を胚芽に適用した場合、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在する蛋白質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
【００２１】
１−３）細分化された胚芽細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程
次いで、細分化された胚芽細胞に抽出溶媒を加えて攪拌した後、細胞抽出物含有液を遠心分離等により回収し、ゲルろ過等により精製することにより胚芽抽出物を得ることができる。
また、衝撃または切断により胚芽細胞を細分化する際に、抽出溶媒を存在させることにより、胚芽を細分化する工程と細分化された胚芽と抽出溶媒とを混合して胚芽抽出物を得る工程を同時に行うことができる。この場合、胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのが好ましい。
【００２２】
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止物質を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Pattersonらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞蛋白質合成用の胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
【００２３】
１−４）胚芽細胞の抽出物含有液を分離・精製する工程
上記で得られた胚芽細胞の抽出物（胚芽抽出物）をゲルろ過等により分離・精製する。
ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度もそれ自体既知であり、無細胞蛋白質合成用の細胞抽出物、例えば胚芽抽出物の製造法に通常用いられるものを採用すればよい。
【００２４】
ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞蛋白質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が排除可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子サイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばSartorius製のMinisartTM等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、先ずポアサイズが大きめのフィルターを用い、次に混入する可能性のある微生物が排除可能なポアサイズのフィルターを用いて、ろ過するのが好ましい。
【００２５】
かくして得られる胚芽抽出物含有液は、原料細胞自身が含有する又は保持する蛋白質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳蛋白質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
【００２６】
この様に、上記で得られる胚芽抽出物含有液（以下これを単に「細胞抽出液」と称することがある）は、優れた蛋白質合成能を保持しているが、さらに５）細胞の細分化物を活性化剤で処理する工程や、６）蛋白質合成阻害物質を排除する工程を組み合わせることにより、さらに蛋白質の合成効率が優れる細胞抽出液とすることができる。次に、これらの工程をさらに詳細に説明する。
【００２７】
１−５）胚芽細胞の細分化物を活性化剤で処理する工程
活性化剤で処理する工程は、細胞を細分化する工程、細分化された細胞と抽出溶媒とを混合して細胞抽出物を得る工程、細胞抽出物含有液を分離・精製する工程のいずれかの製造工程中または工程後に行うことができる。この様に、活性化剤による処理時期は、これらの工程の中であれば特に限定されないが、細胞抽出物含有液を分離・精製した後に行うのが特に好ましい。
【００２８】
活性化剤としては、固体担体であって、該固体担体と細分化した胚芽細胞とを接触させることにより蛋白質合成能が向上し得るものであれば特に限定されない。具体的には、例えば酸化アルミニウム、活性酸化アルミニウム、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゲルクロマトグラフィー用担体、ベントナイト、各種リガンドが結合したカラム担体等が挙げられる。酸化チタンとしては２酸化チタンが好ましく、酸化ジルコニウムとしては２酸化ジルコニウムが好ましい。ゲルクロマトグラフィー用担体としては、例えば酸化アルミニウム系担体、ポリビニルアルコール系担体、アガロース系担体、セルロース系担体、デキストラン系担体等が挙げられ、これらの中で酸化アルミニウム系担体が好ましい。
【００２９】
また、各種リガンドが結合したカラム担体としては、例えば強陰イオン交換体の結合した担体であるＱｕａｎｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ結合担体、Ｑｕａｎｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ結合担体、弱陰イオン交換体の結合した担体であるｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ結合担体、強陽イオン交換体の結合した担体であるｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ結合担体、ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ結合担体、弱陽イオン交換体の結合した担体であるｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ結合担体、表面が酸性、塩基性、中性である活性アルミナ等がが挙げらる。これらの中で、ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ結合担体、ｓｕｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ結合担体、ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ結合担体、塩基性である活性酸化アルミニウムが好ましい。
【００３０】
上記した活性化剤の中で、酸化アルミニウムが特に好ましい。これら活性化剤は、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。また、これらの活性化剤はそれ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手することができる。
活性化による処理方法も特に限定されず、各工程の特徴に応じて適当な処理方法、例えば活性化剤と細胞抽出物含有液とを混合して接触させた後に、活性化剤を分離する方法等を採用すれば良い。また活性化剤を充填したカラムに細胞抽出液を通液して処理することもできる。
【００３１】
活性化剤の使用量は特に制限させず、得られた細胞抽出物の蛋白質合成活性を指標として、適宜使用量を決めれば良い。具体的には、酸化アルミニウムの場合、細胞（胚芽）１ｇ当たり３〜１０００ｍｇ、好ましくは１５〜６４０ｍｇ程度が適当である。また細胞抽出物を得る工程およびそれ以降の工程においては、細胞抽出物１ｍｌ当たり、通常１０〜１０００ｍｇ、好ましくは５０〜６４０ｍｇ程度が適当である。
【００３２】
細胞の細分化物と活性化剤との処理時間（細分化物と活性化剤との接触時間）に特に制限が無く、通常５〜６０分、好ましくは１０〜２０分程度が適当である。
細胞の細分化物と活性化剤との処理温度（細分化物と活性化剤との接触時間）に特に制限はなく通常４〜５０℃、好ましくは１０〜２５℃程度が適当である。
上記活性化剤による処理を行うことにより、さらに活性が優れた無細胞蛋白質合成用細胞抽出物を得ることができる。
【００３３】
１−６）蛋白質合成阻害物質を排除する工程
上記１−４）で得られた細胞抽出液は、低分子の蛋白質合成阻害物質（以下これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含有していると考えられるため、細胞抽出液の構成成分から、これら低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画排除することが好ましい。排除されるべき物質（低分子阻害物質）の分子量は、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成に必要な因子よりも小さいものであればよい。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものが挙げられる。
【００３４】
低分子合成阻害物質の細胞抽出液からの排除方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法（透析法）が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。以下、透析法を用いる場合を例に詳細に説明する。
【００３５】
透析に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の排除分子量を有するものが挙げられる、具体的には排除分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｓａｌｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ製）や、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＴＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の上記細胞抽出液を入れ常法により透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
【００３６】
低分子合成阻害物質の排除を行う際、細胞抽出液に不溶性成分が生成される場合には、これを阻害する（以下これを「細胞抽出液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出液（以下これを「処理後細胞抽出液」と称することがある）の蛋白質合成活性が高まる。細胞抽出液の安定化の具体的な方法としては、低分子阻害物質の排除を行う際に、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等を含む溶液中で行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
【００３７】
これらの成分（以下これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液中で低分子阻害物質の排除を行う場合は、細胞抽出液に予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の排除工程に供してもよい。低分子合成阻害物質の排除に透析法を用いる場合は、細胞抽出液だけでなく透析外液にも安定化成分を添加して透析を行い低分子阻害物質の排除を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
【００３８】
安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、細胞抽出液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出液に添加し、適当な時間の後に低分子阻害物質の排除工程を行い、取得された処理後細胞抽出液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出液を用いて無細胞蛋白質合成を行い、蛋白質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上記の選択方法において、細胞抽出液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出液中の不溶性成分量や、得られた細胞抽出液の蛋白質合成活性等により選択する方法も挙げられる。
【００３９】
このようにして選択された細胞抽出液の安定化条件として、例えばコムギ胚芽抽出物含有液（以下これを「コムギ胚芽抽出液」と称することがある）で、透析法により低分子阻害物質の排除工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、蛋白質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
【００４０】
細胞抽出液への安定化成分の添加方法は、特に制限はなく、低分子阻害物質の排除工程の前に添加しこれを適当時間インキュベートして安定化を行った後、低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよいし、安定化成分を添加した細胞抽出液、及び／または安定化成分を添加した該排除工程に用いるための緩衝液を用いて低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよい。
【００４１】
２．細胞抽出液への活性増強物質の添加
かくして調製された細胞抽出液は、優れた蛋白質合成能を有しており、これをそれぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入し、蛋白質合成を行うことができるが、その際、反応系中に、サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩（以下これを単に「活性増強物質」と称することがある）を添加することにより、さらに蛋白質合成活性を増強させることができる。本発明の無細胞蛋白質合成方法は、上記した点に一つの特徴を有する方法である。
【００４２】
活性増強物質として用い得るサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体またはその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、いずれの誘導体またはその塩であっても良い。具体的には、例えばアデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−３’，５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−３’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、８−ブロモアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸（ブロモｃＡＭＰ）およびその塩、８−（４−クロロフェニルチオ）アデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸）（クロロフェニルチオｃＡＭＰ）およびその塩、５，６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン−３’，５’−サイクリック一リン酸）（ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルｃＡＭＰ）およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、アデノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリック一リン酸およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｓｐアイソマー）およびその塩、グアノシン−２’,５’サイクリックチオ一リン酸（Ｒｐアイソマー）およびその塩等が挙げられる。
【００４３】
サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば如何なる塩基でも良いが、それらの中で好ましいものとして、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。
上記活性増強物質の中で、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸、アデノシン−３’，５’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４４】
活性増強物質は、予め細胞抽出液へ添加をしておいても良いが、これら物質が水溶液中で不安定である場合は、蛋白質合成反応への使用時に添加することが好ましい。
活性化増強物質の添加量は、胚芽抽出物による蛋白質合成反応が活性化（増加）し得る濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常０．１ミリモル／リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは０．２ミリモル／リットル、より好ましくは０．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８ミリモル／リットルであり、また濃度の上限は、好ましくは２４ミリモル／リットル、より好ましくは６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは３．２ミリモル／リットルである。濃度範囲は、これら下限と上限の組み合わせの範囲であればよいが、好ましくは０．２〜２４ミリモル／リットル、より好ましくは０．４〜６．４ミリモル／リットル、特に好ましくは０．８〜３．２ミリモル／リットル程度が適当である。
【００４５】
活性増強物質添加時の細胞抽出液の温度に特に制限はなく、通常０〜３０℃、好ましくは１０〜２６℃程度が適当である。
上記活性増強物質の添加を行うことにより、さらに活性が優れた無細胞蛋白質合成用細胞抽出液とすることができる。
【００４６】
３．無細胞蛋白質合成方法
上記細胞抽出液は、活性増強物質とともに蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有させ、さらに翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）を存在させることにより、無細胞蛋白合成反応系とすることができる。上記方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のｔＲＮＡが含まれているため、従来のように、別途調製したｔＲＮＡを追加することは必須要件ではない。
【００４７】
無細胞蛋白質合成反応系による蛋白質の合成は、上記細胞抽出液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。
蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ（回分）法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、該細胞抽出液に無細胞蛋白質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳTM  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３号公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）等を用いることができる。
【００４８】
このうち、バッチ法では蛋白質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸やエネルギー源の連続、または不連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。ここで、エネルギー源としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸等が挙げられ、アミノ酸としては２０種類のＬ型アミノ酸が挙げられる。
【００４９】
バッチ法により蛋白質合成を行う場合には、例えば翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後に翻訳鋳型を添加してインキュベートすること等により行うことができる。コムギ胚芽抽出液を用いる場合、上記プレインキュベートは１０〜４０℃で５〜１０分間、インキュベートは同じく１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で行う。反応時間は、反応が停止するまでの時間であるが、バッチ法では通常１０分〜７時間程度である。
【００５０】
透析法により蛋白質合成を行う場合には、合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製：透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製：１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、１０，０００ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
【００５１】
透析外液としては、上記合成反応液から翻訳鋳型を除いたものが用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度および時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては、通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で１０分〜１２日間行うことができる。
【００５２】
重層法を用いて蛋白質合成を行う場合には、合成反応液を適当な容器に入れ、該溶液上に、上記透析法に記載した透析外液を、界面を乱さないように重層することにより蛋白質合成を行う。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応相とする。容器としては、例えばマイクロタイタープレート等が挙げられる。この反応相の上層に上記透析法に記載した透析外液（供給相）を界面を乱さないように重層して反応を行う。
【００５３】
両相の界面は必ずしも重層によって水平面状に形成させる必要はなく、両相を含む混合液を遠心分離することによって、水平面を形成することも可能である。両相の円形界面の直径が７ｍｍの場合、反応相と供給相の容量比は１：４〜１：８が適当であるが、１：５が好適である。両相からなる界面面積は大きいほど拡散による物質交換率が高く、蛋白質合成効率が上昇する。従って、両相の容量比は、両相の界面面積によって変化する。合成反応は静置条件下で、反応温度および時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては、通常１０〜４０℃で、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で、通常１０〜１７時間行うことができる。
【００５４】
不連続ゲルろ過法を用いて蛋白質合成を行う場合には、合成反応液により合成反応を行い、合成反応が停止した時点で、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を供給し、合成物や分解物を排出することにより蛋白質合成を行う。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応を行う。容器としては、例えばマイクロプレート等が挙げられる。
【００５５】
合成反応の停止した上記反応溶液を、予め上記透析法に記載の透析外液と同様の組成の供給液により平衡化したゲルろ過カラムを通す。このろ過溶液を再度適当な反応温度に保温することにより、合成反応が再開し、蛋白質合成は数時間に渡って進行する。以下、この反応とゲルろ過操作を繰り返す。反応温度、及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては２６℃で約１時間ごとにゲルろ過を繰り返すのが好ましい。
【００５６】
かくして得られた蛋白質は、それ自体既知の方法により確認することができる。具体的には例えば、アミノ酸の蛋白質への取りこみ測定や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分離とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色、オートラジオグラフィー法（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００））等を用いることができる。
【００５７】
また、かくして得られる反応液には、目的蛋白質が高濃度に含まれているので、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過等のそれ自体既知の分離、精製法により、該反応液から目的蛋白質を容易に取得することができる。
【００５８】
４．蛋白質合成用溶液および蛋白質合成用試薬キット
本発明の蛋白質合成用溶液は、少なくとも胚芽抽出物と活性増強物質（サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体）とを含有するものである。これに、蛋白質合成に必須の成分であるＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、Ｌ型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオンととを含有させることにより、簡便に使用することができるレディーメイド型の無細胞蛋白質合成用溶液とすることができる。上記各成分の含有量は特に限定されず、無細胞蛋白合成反応を行いうる濃度であればよい。活性増強物質も、上記の通り使用すれば良い。
【００５９】
具体的には、反応系中の胚芽抽出物の最終濃度として、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ260）が通常１０Ａｂｓ以上、好ましくは２０〜１００Ａｂｓ、より好ましくは３０〜７０Ａｂｓ程度が適当である。
特にレディーメイド型の無細胞蛋白質合成用溶液は、蛋白質合成に際して従来のように反応溶液の調製を必要とせず、目的とする翻訳鋳型（ｍＲＮＡ）を添加するだけで、簡便に、効率的に、大量に蛋白質を合成することができる。該蛋白質合成用溶液は、溶媒として上記抽出溶媒を用い、それに必要に応じて上記成分を添加することにより調製することができる。
【００６０】
本発明の試薬キットは、少なくとも上記蛋白質合成用溶液を含み、任意の要素として、希釈液（緩衝液）、透析液、エネルギー供給液、発現ベクター、コントロール用発現ベクター、制限酵素等を含んでいてもよい。また、該試薬キットにはＲＮＡポリメラーゼ等の転写系に用いる試薬が含まれていてもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【００６１】
なお、以下の実施例において、ｌはリットル、ｍｌはミリリットル、Ｍはモル／リットル、ｍＭはミリモル／リットル、μｇはマイクログラムをそれぞれ表す。
【実施例１】
【００６２】
コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産のチホクコムギ（未消毒）を用い、ＷＯ０２／２９５３７７号公報の実施例に記載の方法に準じて、胚芽を分離し、胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで選別した。得られたコムギ胚芽５０ｇを、４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去したコムギ胚芽を得た。
【００６３】
次いで、以下の操作を４℃で行い、コムギ胚芽抽出物含有液を得た。まず洗浄したコムギ胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００〜２００００rpmで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後再び５０００乃至２００００rpmで３０秒粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布をレーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。
【００６４】
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、限外ろ過膜を使用して濃縮を行った。これをコムギ胚芽抽出物含有液（コムギ胚芽抽出液）とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ260）が１８０〜２５０（Ａ260／Ａ280＝１．５程度）になるように調製した。
【実施例２】
【００６５】
酸化アルミニウム処理を行ったコムギ胚芽抽出物の作製
１）酸化アルミニウム懸濁液の調製
酸化アルミニウム（細胞破砕用、純度９５％以上、粒径１２μｍ、ナカライテスク社製）１０ｇをＢｕｆｆｅｒ−１ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））またはＢｕｆｆｅｒ−２（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、４ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））１０ｍｌにて縣濁した。次に１５０００ｒｐｍ、５分、摂氏4度の条件で遠心分離を行い、上清を取り除いた。同操作を２度繰り返し、酸化アルミニウムの洗浄を行った。洗浄後の酸化アルミニウムをＢｕｆｆｅｒ−１ １０ｍｌにて縣濁し、１ｇ 酸化アルミニウム／１ｍｌ Ｂｕｆｆｅｒ−１またはＢｕｆｆｅｒ−２の条件の縣濁液を調製した。
２）酸化アルミニウム縣濁液を用いたコムギ胚芽抽出液の処理
上記１）で作製した酸化アルミニウム縣濁液に対し、実施例１で調製したコムギ胚芽抽出液を１６：１００または３２：１００の条件で加え縣濁し、酸化アルミニウムが沈殿しないように室温で１５分間ゆっくり攪拌した。攪拌後の縣濁液を１５０００ｒｐｍ、５分間、摂氏４度の条件で遠心分離を行い、上清を回収した。この上清を再度１５０００ｒｐｍ、５分間、摂氏４度の条件で遠心分離を行い、上清を回収し、完全に酸化アルミニウムを除去した。
３）酸化アルミニウム処理後のコムギ胚芽抽出物の液組成調整
上記の条件で処理を行ったコムギ胚芽抽出液の組成を最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後、液組成を調整したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５ＡｂｓになるようにＢｕｆｆｅｒ−３ （３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ））を用いて調整した。
【実施例３】
【００６６】
透析法により蛋白質合成阻害物質を排除したコムギ胚芽抽出液の作製
実施例１で調製したコムギ胚芽抽出液の組成を最終濃度３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後、調整したコムギ胚芽抽出液を透析内液とし、Ｂｕｆｆｅｒ−１を用いて１７時間透析を行い、蛋白質合成阻害物質の排除を行ったコムギ胚芽抽出液を作製した。
【実施例４】
【００６７】
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出物の作製
１）Ｂｕｆｆｅｒ組成の調整
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成に用いるためのＢｕｆｆｅｒ組成をｃＡＭＰ最終濃度が０、０．４、０．８、１．６、３．２、６．４ｍＭの６条件で、他の液組成が最終濃度３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。
２）ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の調整
実施例２で作製した酸化アルミニウム処理コムギ胚芽抽出液をｃＡＭＰ最終濃度が０、０．４、０．８、１．６、３．２、６．４ｍＭの６条件で、他の液組成が最終濃度３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。その後、液組成を調整したコムギ胚芽抽出液を２６０ｎｍでの吸光度が７５Ａｂｓになるように、上記の方法で作製した６つのＢｕｆｆｅｒを用いて調整した。
【実施例５】
【００６８】
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の評価（回分法）
実施例４で作製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）１６μｌに対して、ＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、それぞれ６条件のｃＡＭＰ濃度（０、０．４、０．８、１．６、３．２、６．４ｍＭ））８μｌを混合し、蛋白質合成溶液を作製し、摂氏２６度で３時間蛋白質合成反応を行った。
【００６９】
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００７０】
反応後の蛋白質合成溶液を５倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図１（蛍光強度は測定値を５倍し原液の値を表示）に示す。 図１に示すように、最適なｃＡＭＰ濃度により、コムギ胚芽抽出液の蛋白質合成能が上記回分法にて上昇することが確認された。
【実施例６】
【００７１】
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の評価（重層法）
実施例４で作製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）１６．６μｌに対してＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、それぞれ６条件のｃＡＭＰ濃度（０、０．４、０．８、１．６、３．２、６．４ｍＭ）８．４μｌを混合し、蛋白質合成溶液を作製した。
【００７２】
この蛋白質合成溶液を１２５μｌの実施例４の１）で作製した６条件のＢｕｆｆｅｒに対して重層を行い、摂氏２６度で１８時間蛋白質合成反応を行った。
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００７３】
反応後の蛋白質合成溶液を５倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図２（蛍光強度は測定値を５倍し原液の値を表示）に示す。図２に示すように、最適なｃＡＭＰ濃度により、コムギ胚芽抽出液の蛋白質合成能が上記重層法にて上昇することが確認された。
【実施例７】
【００７４】
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の評価（透析法）
実施例４で作製したコムギ胚芽抽出液（各種サンプル）４０μｌに対してＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、それぞれ６条件のｃＡＭＰ濃度（０、０．４、０．８、１．６、３．２、６．４ｍＭ）２０μｌを混合し、蛋白質合成溶液を作製した。
【００７５】
この蛋白質合成溶液を透析膜に入れ、実施例４の１）で作製した６条件のＢｕｆｆｅｒ２．５ｍｌを透析外液として用い、摂氏２６度で蛋白質合成反応を行った。
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミド、ＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００７６】
反応後の蛋白質合成溶液を１００倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図３（蛍光強度は測定値を１００倍し原液の値を表示）に示す。また、ｃＡＭＰ濃度を０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６ｍＭに変更して、同様に実験を行った結果を図４に示す。図３および図４に示す通り、最適なｃＡＭＰ濃度により、コムギ胚芽抽出液の蛋白質合成能が上記透析法にて上昇することが確認された。
【実施例８】
【００７７】
ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の評価（透析法）
実施例５で効果のあった最終ｃＡＭＰ濃度１．６ｍＭに調整したコムギ胚芽抽出液４０μｌに対してＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１またはＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、１．６ｍＭｃＡＭＰ）２０μｌを混合し、蛋白質合成溶液を作製した。
【００７８】
この蛋白質合成溶液を透析膜に入れ、実施例４の１）で作製したｃＡＭＰ濃度１．６ｍＭのＢｕｆｆｅｒ２．５ｍｌを透析外液として用い、摂氏２６度で４８時間蛋白質合成反応を行った。
翻訳鋳型となるｍＲＮＡ（ΩＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１、ΩＧＦＰ）は、ＳＰ６プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）のオメガ（Ω）配列、さらに３’下流に連結させたＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１またはＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを含むプラスミドＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１／ｐＥＵ、ＧＦＰ／ｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをエタノール沈殿により定法に従い精製して用いた。
【００７９】
４０時間反応後の蛋白質合成溶液１ｕｌを、１０％アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
これらの結果を図５および６に示す。図５および６に示す通り、最適なｃＡＭＰ濃度により、コムギ胚芽抽出液の蛋白質合成能が上記透析法にて上昇することが確認された。
【実施例９】
【００８０】
コムギ胚芽抽出液作製法の違いによるｃＡＭＰ添加効果（透析法）
実施例１、２および３において作製したコムギ胚芽抽出液を、実施例４と同様に最終ｃＡＭＰ濃度１．６ｍＭ、最終濃度 ３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）になるように調整した。上記のように調整したコムギ胚芽抽出液４０μｌに対しＧＦＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡを２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む溶液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、０．３８０ｍＭスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、１．６ｍＭｃＡＭＰ）２０μｌを混合し、蛋白質合成溶液を作製した。
【００８１】
この蛋白質合成溶液を透析膜に入れ、実施例４の１）で作製したｃＡＭＰ濃度１．６ｍＭのＢｕｆｆｅｒ２．５ｍｌを透析外液として用い、摂氏２６度で４８時間蛋白質合成反応を行った。
反応後の蛋白質合成溶液を１００倍に希釈して、蛍光強度を測定した。これらの結果を図７（蛍光強度は測定値を１００倍し原液の値を表示）に示す。図７に示す通り、コムギ胚芽抽出液の作製方法の違いにおいてｃＡＭＰ添加効果が異なり、最も効果があったのは酸化アルミニウム処理コムギ胚芽抽出液を用いたものであった。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の回分法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（蛋白質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図２】ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の重層法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（蛋白質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図３】ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（蛋白質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図４】ｃＡＭＰを添加したコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示す図である。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度（蛋白質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図５】ｃＡＭＰの最終濃度が０、１．６ｍＭになるように添加したコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示すアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。ｌａｎｅ４，５はｃＡＭＰ濃度が０ｍＭの条件のＧＦＰの合成結果を示す。ｌａｎｅ６，７は蛋白質合成反応液中のｃＡＭＰ濃度が０ｍＭの条件のＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡ−１の合成結果を示す。ｌａｎｅ８，９はｃＡＭＰ濃度が１．６ｍＭの条件のＧＦＰの合成結果を示す。ｌａｎｅ１０，１１は蛋白質合成反応液中のｃＡＭＰ濃度が１．６ｍＭの条件のＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡ−１の合成結果を示す。
【図６】ｃＡＭＰの最終濃度が０、１．６ｍＭになるように添加したコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示す図である。図中の縦軸は蛋白質の合成量（図５の写真より蛋白相対濃度計算）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。ＧＦＰでは７倍、アポリポプロテインでは３．４倍の生産増加が観察された。
【図７】ｃＡＭＰの最終濃度が０、１．６ｍＭになるように添加したコムギ胚芽抽出液の透析法による評価結果を示す図である。図中の縦軸はＧＦＰの蛍光強度（蛋白質合成量）を示し、横軸はサンプルの種類を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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