(57)【要約】【課題】  環境水等に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を正確かつ迅速に検出することが可能であり、測定操作やメンテナンスが簡単な有害物質検出装置を提供する。【解決手段】  微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出装置において、通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜が同時に同一の試料水に接触できるように一つのサンプル容器内に収納されてなるセンサユニットと、前記微生物膜の発光量を測定する光検出器とを具備させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出装置であって、
通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜が同時に同一の試料水に接触できるように一つのサンプル容器内に収納されてなるセンサユニットと、前記微生物膜の発光量を測定する光検出器とを備えていることを特徴とする有害物質検出装置。
【請求項２】
前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、遺伝子損傷性物質によりDNAが損傷を受けたときに発現されるSOS遺伝子とその下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された微生物を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物を用いる、請求項１に記載の有害物質検出装置。
【請求項３】
前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる、請求項２に記載の有害物質検出装置。
【請求項４】
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる、請求項３に記載の有害物質検出装置。
【請求項５】
前記微生物膜の活性を維持するための恒温槽と、試料水と培養液の撹拌と前記微生物膜への酸素供給を行う手段とを更に備えている、請求項１〜４のいずれか一つに記載の有害物質検出装置。
【請求項６】
前記サンプル容器は、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び前記生育阻害物質検出用微生物膜をそれぞれ個別に又は両者一緒に保持する微生物膜セルと、試料水及び培養液を保持するサンプルセルとを有し、前記微生物膜セルは、前記サンプルセルに脱着可能に取り付けられている、請求項１〜５のいずれか一つに記載の有害物質検出装置。
【請求項７】
前記光検出器は、その受光面が上向きになるように配置され、該受光面の上方に前記サンプル容器内の前記各微生物膜が配置されている、請求項１〜６のいずれか一つに記載の有害物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等を対象として、水中の有害物質のモニタリングに好適なバイオセンサ応用水質計測器に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には６〜１０万種もの人為的に合成された化学物質や、トリハロメタン等の消毒副生成物、ダイオキシン等の燃焼副生成物といった非意図的生成物質、更には環境中での変化体等の数多くの化学物質が存在しており、これらの化学物質の中には、急性毒性、発ガン性、変異原性等を有する有害物質が数多くある。
【０００３】
通常、環境水中における上記のような化学物質の濃度は、ごく微量であると考えられるが、このような環境水を水道原水とする浄水場においては、人体への影響の観点からより高度な水質の連続監視が求められている。
【０００４】
また、下水処理場、廃棄物最終処分場、化学薬品を使用する工場等から排出される廃水には様々な化学物質が含まれているが、最終的には河川等の環境中に排出されるため、通常、オゾン処理や生物処理、活性炭処理等により、安全基準値以下にまで化学物質を分解あるいは除去してから放流されている。そのため、廃水処理プロセスが適切に稼動し、水中の有害物質が除去されているかどうかを監視して、各処理プロセスの評価結果を処理プロセスにフィードバック、更には処理施設の改善等の措置を講じる必要がある。
【０００５】
従来より、水中の有害物質を監視する手段として、魚類の活動電位又は異常行動を監視する方法や、硝化細菌を利用した急性毒物モニタ等の有害物質検出方法が知られているが、これらの方法では、発ガン性、変異原性等を有する有害物質（本発明では、このような有害物質を遺伝子損傷性物質という。）の蓄積による発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性までは評価することができなかった。
【０００６】
また、発ガン性物質の一次選別法として、例えば、umuテストやSOSクロモテスト等の微生物を用いた遺伝子損傷性試験法が知られているが、操作が煩雑、検出感度が低い、高価な発色試薬が必要である等の問題があり、環境水等に含まれる有害物質を検出する方法としてはあまり実用的であるとは言えなかった。
【０００７】
そのため、下記特許文献１には、DNAの損傷に対して感受性のSOS遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換された微生物を利用して、遺伝子損傷性物質を検出する方法が開示されている。
【０００８】
また、水に含まれる有害物質を検出する装置として、下記特許文献２には、その一面に鉄バクテリアを保持した微生物膜が設けられるとともに内部液を有するケースと、ケース内に配置された一対の電極とを有する検出電極部と、ケースに隣接して設けられるとともに微生物膜に接する検出流路と、この検出流路内に被測定液を供給する被測定液供給装置と、検出流路内に第１鉄含有液を供給する第１鉄含有液供給装置と、検出流路内にPH調整用緩衝液を供給して、検出電極部における被測定液と第１鉄含有液とPH調整用緩衝液との混合液のPHを一定の値に定めるPH調整用緩衝液供給装置と、検出電極部の一対の電極間を流れる電流値を測定して被測定液の異常水質を検出する演算部と、を備えたことを特徴とする異常水質検出装置が開示されている。
【０００９】
また、下記特許文献３には、試料と供試菌体とを混合してから一定時間反応させた後、これにATP抽出試薬を注入してから、さらに、これに発光試薬を注入することで生じた光の発光量を計測する工程と、ブランクと供試菌体とを混合してから一定時間反応させた後、これにATP抽出試薬を注入してから、さらに、これに発光試薬を注入することで生じた光の発光量を計測する工程と、前記二つの工程で得られた計測値を比較することで、試料における有害物質の有無を確認する工程とを有する有害物質監視装置であって、被発光量測定試料から発した光を検出するセンサーを備え該試料が供給されるフローセルの一次側経路に、試料とブランクのいずれかを供給するバルブ手段を備え、さらに、このバルブ手段の二次側に、供試菌体供給路と、ATP抽出試薬供給路と、発光試薬供給路と、を備えたことを特徴とする有害物質監視装置が開示されている。
【００１０】
また、下記特許文献４には、発光細菌を高分子ゲル化剤で固定した発光細菌固定手段と、この発光細菌固定手段に試料液を連続的に導入する試料液導入手段と、発光細菌の発光量を測定する光検出手段と、この測定データを処理し発光量に応じた出力を行なうデータ処理手段とを備えることを特徴とする毒性物質検知装置が開示されている。
【特許文献１】特許第３２７７４２６号公報
【特許文献２】特開平１１−３７９６９号公報
【特許文献３】特開２００２−３６５２２０号公報
【特許文献４】特開２００３−４７２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記特許文献１に開示された方法では、試験操作において微生物の培養や分注、希釈等を行う必要があるため、測定操作が煩雑であるだけでなく、前記形質転換された微生物は遺伝子損傷性物質が存在する場合に発光するが、微生物に対して生育阻害作用を示し、発光反応を阻害するような有害物質（本発明では、このような有害物質を生育阻害物質という。）、例えば、呼吸阻害物質等が共存すると該微生物の代謝が低下して発光しない場合もあるため、試料水の異常を見逃してしまう恐れもあった。
【００１２】
一方、上記特許文献２〜４に開示された装置においては、生育阻害物質の検出は可能であるが、発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性と関連のある遺伝子損傷性物質を検出することはできなかった。更に、上記特許文献３に開示された装置においては、測定毎に新たに供試菌体及びATP抽出試薬を補充しなければならず、コストが高くなってしまうという問題もあった。
【００１３】
このように、これまでの有害物質検出装置においては、遺伝子損傷性物質及び生育阻害物質の両方を正確に検出できるものはなかった。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、環境水等に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を正確かつ迅速に検出することが可能であり、測定操作やメンテナンスが簡単な有害物質検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の有害物質検出装置は、微生物に発光遺伝子を導入した組換え微生物を固定化した微生物膜を用い、前記微生物の発光反応による発光量から試料水中の有害物質を検出する有害物質検出装置であって、通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜が同時に同一の試料水に接触できるように一つのサンプル容器内に収納されてなるセンサユニットと、前記微生物膜の発光量を測定する光検出器とを備えていることを特徴とする。
【００１６】
本発明の有害物質検出装置によれば、通常は消光しており、遺伝子損傷性物質が存在すると発光する遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と、通常は発光しており、生育阻害物質が存在すると消光する生育阻害物質検出用微生物を固定化した生育阻害物質検出用微生物膜の少なくとも２種類の微生物膜が同時に同一の試料水に接触できるように一つのサンプル容器内に収納されてなるセンサユニットを有しているので、各微生物膜における測定条件を同一にすることができる。すなわち、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物膜は、試料水中に遺伝子損傷性物質が存在すると発光し、前記生育阻害物質検出用微生物は、試料水中に生育阻害物質が存在すると、その代謝活性が低下して発光が弱くなる（あるいは消光する）ので、試料水中に有害物質が含まれず正常な場合は、生育阻害物質検出用微生物膜のみが発光する。また、遺伝子損傷性物質が混入したときは、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜の両方が発光し、生育阻害物質が混入したときは、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜の両方が消光する。したがって、これらの微生物膜の発光量を光検出器により測定することにより、正確かつ迅速に試料水中の有害物質を検出することができる。
【００１７】
本発明においては、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、遺伝子損傷性物質によりDNAが損傷を受けたときに発現されるSOS遺伝子とその下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された微生物を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物を用いることが好ましい。
【００１８】
この態様によれば、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物は、該微生物のDNAが損傷を受けると、SOS応答と共にルシフェラーゼ及びその基質が合成されて発光するので、その発光量を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質を容易に検出することができる。一方、前記生育阻害物質検出用微生物は、試料水中の生育阻害物質によって、その代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼ活性が低下して発光が弱くなる（あるいは消光する）ので、その発光量を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質を容易に検出することができる。
【００１９】
また、本発明においては、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibriofischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることが好ましい。
【００２０】
更に、本発明においては、前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることが好ましい。
【００２１】
これらの態様によれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物を簡単に作成することができる。
【００２２】
更にまた、前記微生物膜の活性を維持するための恒温槽と、試料水と培養液の撹拌と前記微生物膜への酸素供給を行う手段とを更に備えていることが好ましい。
【００２３】
この態様によれば、微生物膜の活性を好適な状態に維持することができるので、より正確な測定が可能となる。
【００２４】
更にまた、前記サンプル容器は、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び前記生育阻害物質検出用微生物膜をそれぞれ個別に又は両者一緒に保持する微生物膜セルと、試料水及び培養液を保持するサンプルセルとを有し、前記微生物膜セルは、前記サンプルセルに脱着可能に取り付けられていることが好ましい。
【００２５】
この態様によれば、微生物膜セルをサンプル容器に容易に脱着できるので、人為的ミスによる微生物膜の破れや水漏れを防ぐことができ、装置の維持が簡単になる。また、微生物膜セル構成にしたことで、微生物の拡散を防止でき、バイオハザードＰ２レベルのクリーンルーム等の設備がない場所や現地での評価が可能となる。
【００２６】
更にまた、前記光検出器は、その受光面が上向きになるように配置され、該受光面の上方に前記サンプル容器内の前記各微生物膜が配置されていることが好ましい。
【００２７】
この態様によれば、サンプル容器を容易に取り出すことができる等、メンテナンス性をよくすることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の有害物質検出装置によれば、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等に含まれる有害物質の検出を、簡単な操作で正確かつ迅速に行うことができる。したがって、各処理プロセスの評価結果を処理プロセスにフィードバック、更には処理施設の改善等の措置を講じることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明で用いられる遺伝子損傷性物質検出用微生物は、遺伝子損傷性物質に依存して発光する組換え遺伝子により形質転換された微生物であり、通常は消光しているが、遺伝子損傷性物質により微生物のDNAが損傷を受けると発光する。
【００３０】
具体的には、DNAの損傷に対して感受性のSOS遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換された微生物が例示できる。この遺伝子損傷性物質検出用微生物は、遺伝子損傷性物質により該微生物のDNAが損傷を受けると、SOS遺伝子の発現と同時にルシフェラーゼ活性を有する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子も発現される。その結果、ルシフェラーゼ活性の基質が菌体内で連続的に供給される条件が達成され、ルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こるので、この発光を測定することにより、例えば、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２−アミノアントラセン、ベンゾ（ａ）ピレン、１−ニトロピレン、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド等の遺伝子損傷性物質を検出、測定することができる。
【００３１】
すなわち、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子をDNAの損傷に依存して発現させるための発現制御手段としてSOS遺伝子を利用するものである。したがって、SOS遺伝子はDNA損傷時に発現されるものであればよく、SOSボックスと称する制御部分を含有するものであればよい。なお、本発明においてDNA損傷時に発現されるSOS遺伝子とは、前記SOSボックスと称される制御部分を含有するものを意味し、SOSボックス自体でもよく、またこれを含有する任意のDNA断片であってもよい。
【００３２】
SOS遺伝子としては、umu遺伝子、例えばumuD遺伝子及びumuC遺伝子、並びにsfiA遺伝子等が例示できるがこれらに限定されない。例えば、umuD，umuC遺伝子は、Pro. Natl. Acad. Sci. USA Vol.82, 4336-4340 (1985)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。本発明においては、umuD遺伝子並びにumuC遺伝子の一部とlacZ遺伝子との融合遺伝子を、プラスミドベクターpBR322に導入したプラスミドpSK1002由来のSOS遺伝子が好ましく用いられる。プラスミドpSK1002は、H. Shinagawaら、Gene, 23, 167 (1983)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。
【００３３】
一方、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、SOS遺伝子の制御下でその両遺伝子群が発現されるものであればよく、特に限定されないが、例えば、海洋細菌の生物発光遺伝子群を用いることができる。上記性質を有する生物発光遺伝子群を持つ海洋細菌としては、ビブリオ（Vibrio）群のビブリオ（Vibrio）属では、ビブリオ・ハーベイ（V.harveyi）、ビブリオ・フィシェリ（V. fischeri）、ビブリオ・スプレンディドゥス（V. splendidus）、ビブリオ・コレラ（V.cholerae）等が挙げられる。また、フォトバクテリウム（Photobacterium）属では、フォトバクテリウム・ホスホリウム（P.phosphoreum）、フォトバクテリウム・レイノクナシ（P. leiognathi）等が挙げられる。本発明においては、ビブリオ・フィシェリ（V.ficsheri）由来の生物発光遺伝子群（luxA,B,C,D,E）が好ましく用いられる。このビブリオ・フィシェリ（V. ficsheri）由来の生物発光遺伝子群は、リポーター遺伝子として使い易くするために、生物発光遺伝子群のオペレーター領域を取り除き、構造遺伝子部分（ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子群及びその基質であるアルデヒドの生産を触媒する酵素である脂肪酸リダクターゼ活性を発現する遺伝子群）だけを含む種々のカセットベクター、例えば、pUCD320, pUCD613, pUCD614, pUCD618, pUCD620, pUCD623, pUCD1111等が報告されている。これらのカセットベクターについては、Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)に記載されており、これらのベクターから生物発光遺伝子群の構造遺伝子部分を容易に入手することができる。
【００３４】
なお、本発明において、ルシフェラーゼ活性の基質とは長鎖アルデヒド等を意味し、これらの生産を触媒する酵素とは、NAD(P)H−FMN還元酵素、脂肪酸リダクターゼ等を意味する。また、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素の遺伝子は同一の起源のものを用いてもよく、異なる起源のこれらの遺伝子を連結して用いてもよい。
【００３５】
SOS遺伝子と、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子は、SOS遺伝子のSOSボックスを少なくとも含有するDNA断片の該SOSボックスより下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を連結することにより作製することができる。この連結は、DNAリガーゼを用いて常法にしたがって行うことができる。また、この組換え遺伝子を宿主微生物に導入するためには、上記組換え遺伝子はベクター中に存在する必要があり、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。
【００３６】
宿主微生物としては、該微生物のDNAが遺伝子損傷性物質により損傷された際にSOS遺伝子を発現させることができる微生物、すなわちSOS機能を有する微生物であれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichiacoli）、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）、酵母（Saccharomycescerevisiae）等が挙げられる。本発明においては、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００３７】
発現ベクターにより宿主微生物を形質転換する方法は、例えば細菌の形質転換に用いられる常法にしたがって該組換え遺伝子を含有する発現ベクターを宿主微生物に導入すればよい。
【００３８】
一方、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物は、常時発光する組換え遺伝子により形質転換された微生物であり、通常は発光しているが、生育阻害物質により微生物の活性が低下すると発光が弱くなるあるいは消光する。
【００３９】
具体的には、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された微生物が例示できる。この生育阻害物質検出用微生物は、通常の状態ではルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こっている。したがって、生育阻害物質によって、該微生物の代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼによる発光反応が低下するので、この発光状態を測定することにより、例えば、シアン化カリウム、フェノール、塩化水銀等の生育阻害物質を検出、測定することができる。
【００４０】
すなわち、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、これらの遺伝子が常時発現するような発現制御手段の下に配置されている。このような発現制御手段としては、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonellatyphimurium）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）等の微生物内でタンパク質を発現させるために用いられる種々の発現ベクターを用いることができ、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。本発明においては、プラスミドベクターpBR322が好ましく用いられる。プラスミドベクターpBR322は、例えばタカラバイオ株式会社、東洋紡株式会社等から入手することができる。
【００４１】
また、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられる。
【００４２】
ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子は、常法にしたがって上記のような発現ベクターのクローニングサイトに、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を組込むことにより作製することができる。本発明においては、pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内に組込むことが好ましい。
【００４３】
このようにして作製された組換え発現ベクターは、常法にしたがって、宿主微生物に導入すればよい。なお、宿主微生物としては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられ、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００４４】
本発明においては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物は、これらの微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料水中の溶解化学物質、栄養成分及び酸素が透過できるポアサイズと親水性を有する微孔性膜と、該微生物からの発光を透過できる光透過性膜との間に薄膜状に固定化した微生物膜として用いられる。
【００４５】
図１には、微生物膜の一例が示されている。この微生物膜５は、微孔性膜２と光透過性膜３がドーナツ状の両面テープ４によって張り合わされたものであり、その中心部には、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物１が薄膜状に固定化されている。
【００４６】
上記微孔性膜としては、ポアサイズ0.2〜0.4μmのセルロース、ニトロセルロース、ポリカーボネート等の材質からなる膜を用いることができ、その厚さは、通常、厚さ10μm程度のものが用いられる。
【００４７】
また、上記光透過性膜としては、ポリエチレン、塩化ビニル等の材質からなり、厚さが30〜100μmである透明又はそれに近い膜が用いられる。
【００４８】
このような微生物膜は、例えば以下のようにして作製することができる。すなわち、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物を常法にしたがって培養し、得られた培養液を遠心して上澄み液を除去した後、1%アルギン酸ナトリウム水溶液を適量加えて懸濁し、菌体懸濁液を得る。
【００４９】
次いで、微孔性膜２の中心部に、上記菌体懸濁液を滴下して、余剰のアルギン酸ナトリウム水溶液を吸引除去した後、更に塩化カルシウム水溶液（30g/L）を適量滴下して、余剰の塩化カルシウム水溶液を吸引除去し、菌体を固定化した面を内側にして、ドーナツ状の両面テープ４を介して光透過性膜３と張り合わせる。
【００５０】
そして、最後に塩化カルシウム水溶液（30g/L）に浸漬し、アルギン酸ナトリウムを完全にゲル化させて菌体を固定化すればよい。
【００５１】
このようにして作製した遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜は、使用するときまで、保存液（TGA培地85%、グリセロール15%）に浸漬し、−20℃以下で凍結保存することができる。
【００５２】
次に、本発明の有害物質検出装置について説明する。      
図２には本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の一実施形態が示されており、（ａ）は断面の模式図、（ｂ）はサンプル容器内部を上から見た模式図である。
【００５３】
図２（ａ）に示すように、サンプル容器２０は、底面に微生物膜を収納すると共に培養液や試料水と接触させるための所定の大きさの穴（微生物膜収納部）が２つ設けられたサンプルセル６と、サンプルセル蓋１０とから構成されている。そして、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａと生育阻害物質検出用微生物膜５ｂは、前記サンプルセル６の底面の各微生物膜収納部に、その微孔性膜側が試料水に接触し、光透過性膜側が光検出器側（図中下方向）にあるように配置されており、それぞれＯリング８とワッシャ９を介して円筒状の微生物膜固定ネジ７をサンプルセル６にねじ込むことによりサンプルセル６の底面に押圧されて固定されている。前記Ｏリング８及びワッシャ９は、微生物膜（５ａ、５ｂ）とサンプルセル６との密着性を高め、かつ取り付け時に微生物膜の損傷を防ぐために挿入されているが、各微生物膜（５ａ、５ｂ）とＯリング８との間に、前記微生物膜の発光波長を透過する透明なガラス板又は樹脂板を挿入することにより、更に微生物膜の損傷を防ぐことができる。
【００５４】
また、サンプルセル６の上面にはサンプルセル蓋１０が取り付けられており、該サンプルセル蓋１０には、試料水及び培養液を注入するための試料注入口１１と、培養液と試料水の撹拌及び微生物膜内の微生物へ酸素供給を行うためのエア注入口１２及びエア排出口１３が設けられており、エア排出経路には0.22μmのフィルターが設けられている。なお、培養液と試料水の撹拌及び微生物膜内の微生物への酸素供給は、撹拌翼やマグネティックスターラーによる撹拌によって行うこともできる。
【００５５】
この態様によれば、微生物膜の光透過性膜は水を通さないため、微生物膜固定ネジ７により固定化された遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａ及び生育阻害物質検出用微生物膜５ｂと、サンプルセル６とでサンプル容器の底面が形成される（図２（ｂ）参照）。したがって、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａ及び生育阻害物質検出用微生物膜５ｂに同時に同一の試料水を接触させることが可能となると共に微生物膜固定ネジ７をはずすだけで容易に各微生物膜の交換ができる。また、前記微生物膜固定ネジ７が円筒状であるので、前記サンプル容器２０の下側に光検出器を配置することにより、各微生物膜の発光状態を測定することができる。
【００５６】
図３には、本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の別の実施形態を示す断面模式図が示されている。
【００５７】
このサンプル容器３０は、底面に微生物膜セルを取り付けるための所定の大きさの２つの穴（微生物膜セル取り付け部）が設けられたサンプルセル２１と、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａを有する微生物膜セル２６ａと、生育阻害物質検出用微生物膜５ｂを有する微生物膜セル２６ｂと、サンプルセル蓋１０とから構成されている。そして、前記微生物膜セル（２６ａ、２６ｂ）は、Ｏリング２７を介して前記サンプルセル２１の底面の各微生物膜セル取り付け部にねじ込むことにより装着されている。
【００５８】
前記微生物膜セル（２６ａ、２６ｂ）は、微生物膜ホルダー２２、微生物膜（５ａ又は５ｂ）、Ｏリング２５、微生物膜押さえ２３及び微生物膜固定蓋２４とから構成されている。なお、前記微生物膜ホルダー２２は、微生物膜を保持すると共に、微生物膜が培養液及び試料水に接触し、かつ微生物膜の発光状態を測定できるように中空構造となっている。また、前記微生物膜押さえ２３及び前記微生物膜固定蓋２４も同様に微生物膜の発光状態を測定できるように中心部に所定の大きさの穴が設けられている。
【００５９】
そして、前記微生物膜（５ａ又は５ｂ）は、その微孔性膜側が試料水に接触し、光透過性膜側が光検出器側（図中下方向）にあるように前記微生物膜ホルダー２２内に配置され、前記Ｏリング２５及び前記微生物膜押さえ２３を介して前記微生物膜固定蓋２４を前記微生物膜ホルダー２２にねじ込むことにより、微生物ホルダー２２内に固定されている。
【００６０】
この態様によれば、各微生物膜セル（２６ａ、２６ｂ）をそれぞれ容易に脱着できるので、各微生物膜を取り替える際に、微生物膜セルごと取り替えることができる。その結果、微生物膜のよじれや破損を防ぐことができ、メンテナンス性が向上する。なお、図２の場合と同様に微生物膜の損傷等による試料水の漏れを防ぐために、各微生物膜（５ａ、５ｂ）と微生物膜押さえ２３との間に、前記微生物膜の発光波長を透過する透明なガラス板又は樹脂板を挿入してもよい。
【００６１】
図４には、本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器のさらに別の実施形態を示す断面図が示されている。なお、以下の説明においては、上記図３と基本的に同一の部分には同じ番号を付し、その説明を省略する。
【００６２】
このサンプル容器４０は、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａを有する微生物膜セル３４ａと生育阻害物質検出用微生物膜５ｂを有する微生物膜セル３４ｂがＯリング２７を介してそれぞれサンプルセル２１の底面に設けられた微生物膜セル保持部にねじ込まれ、容易に脱着できるようになっている点で図３に示す例と同じであるが、微生物膜セル内における微生物膜の固定方法が異なっている。
【００６３】
すなわち、この例においては、前記各微生物膜セル（３４ａ、３４ｂ）は、微生物膜ホルダー３１、微生物膜（５ａ又は５ｂ）、Ｏリング２５、微生物膜押さえ３２及びネジ３３とから構成されている。そして、前記微生物膜（５ａ又は５ｂ）は、その微孔性膜側が試料水に接触し、光透過性膜側が光検出器側（図中下方向）にあるように前記微生物膜ホルダー３１内に配置され、前記Ｏリング２５を介して前記微生物膜押さえ３２を前記ネジ３３で前記微生物膜ホルダー３１に固定することにより、微生物ホルダー３１内に固定されている。なお、前記と同様に前記微生物膜ホルダー３１は、微生物膜を保持すると共に、微生物膜が培養液及び試料水に接触し、かつ微生物膜の発光状態を測定できるように中空構造となっており、前記微生物膜押さえ３２も同様に微生物膜の発光状態を測定できるように中心部に所定の大きさの穴が設けられている。
【００６４】
図５には、本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器のさらに別の実施形態を示す断面図が示されている。
【００６５】
このサンプル容器５０は、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａ及び生育阻害物質検出用微生物膜５ｂの２種類の微生物膜を有する微生物膜セル４５が、サンプルセル４１の底面にＯリング４７を介してネジ４６により固定されている点で、上記図３〜４に示す例と異なっている。
【００６６】
この例においては、前記微生物膜セル４５は、２つの微生物膜（５ａ及び５ｂ）を保持すると共に、各微生物膜が培養液及び試料水に接触し、かつ微生物膜の発光状態を測定できるように所定の大きさの穴（微生物膜保持部）が２つ設けられた微生物膜ホルダー４２と、微生物膜（５ａ及び５ｂ）と、微生物膜押さえ４３及びネジ４４とから構成されている。そして、２種類の前記微生物膜（５ａ及び５ｂ）は、その微孔性膜側が試料水に接触し、光透過性膜側が光検出器側（図中下方向）にあるように前記微生物膜ホルダー４２の微生物膜保持部にＯリング４７ａを介して配置され、その上から微生物膜押さえ４３をネジ４４で微生物膜ホルダー４２に固定することにより、固定されている。なお、前記微生物膜押さえ４３には、前記微生物膜ホルダー４２の微生物膜保持部に対応するように所定の大きさの穴が２つ設けられている。
【００６７】
この態様によれば、微生物膜セルを容易に脱着できるだけでなく、２種類の微生物膜を一度に取り替えることができるので、よりメンテナンス性が向上する。なお、微生物膜の損傷等による試料水の漏れを防ぐために、各微生物膜と微生物膜ホルダー４２との間に、前記微生物膜の発光波長を透過する透明なガラス板又は樹脂板を挿入してもよい。
【００６８】
図６には、本発明の有害物質検出方装置本体の模式図が示されており、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【００６９】
この有害物質検出装置７０は、操作手順や測定結果を表示する表示部６４を有し、外光の侵入がない遮光可能な恒温槽６１内に複数個のサンプル容器４０が設置されており、各サンプル容器の下側には微生物膜の発光を検出するための光検出器６２がそれぞれ設置されている。また、サンプル容器４０にエアを送り、エアレーションによる培養液及び試料水の撹拌と微生物への酸素供給を行うことができるようにエアポンプ６３が設置されている。なお、前記光検出器６２は、各サンプル容器４０の底面に取り付けられた微生物膜の光透過性膜と光検出器の受光面とが向き合うように、その受光面を上向きにして設置されている。
【００７０】
更に、この例においては、図７に示すように、前記サンプル容器４０と前記光検出器６２との間に、サンプル容器４０の位置決めをすると共にサンプル容器４０と光検出器６２との相対距離を一定にするためのサンプル容器−光検出器固定台５１が設けられており、サンプル容器４０内の微生物膜と光検出器６２の受光面との位置合わせが容易にできるようになっている。前記サンプル容器−光検出器固定台５１には、サンプル容器を設置した際に、微生物膜の発光状態を光検出器で測定できるように、各微生物膜の位置に対応する部分に所定の大きさの穴が設けられており、該穴には微生物膜の発光する波長を透過できる透明な材質（ガラス又は樹脂）からなる板７１がシリコンゴム等で接着されている。
【００７１】
本発明においては、光検出器としては、光電子増倍管、フォトダイオード、ＣＣＤ、冷却型ＣＣＤ、光導電素子、光起電力素子等の通常知られている検出手段を用いることができる。
【００７２】
次に、本装置を用いた有害物質の測定方法を、図８のフローチャートに基づいて説明する。
【００７３】
先ず、有害物質装置７０の電源を入れ、ウォーミングアップし、恒温槽６１を37℃に加温する。恒温槽６１が37℃に到達するとスタンバイ状態となるので、OKキーを押し、測定準備ができたら再度OKキーを押す（ステップＳ１）。
【００７４】
次に、測定準備段階として、冷凍保存された、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜５ａを取り付けた微生物膜ホルダー３５ａと生育阻害物質検出用微生物膜５ｂを取り付けた微生物膜ホルダー３５ｂをそれぞれサンプルセル２１に取り付けると共に、サンプルセル蓋１０も取り付けてサンプル容器４０を構築した後、サンプルセル蓋１０の試料注入口１１から培養液（例えば、TGA培地等）をシリンジ等で注入する。そして、サンプル容器４０を有害物質検出装置７０の恒温槽６１内に設置し、サンプルセル蓋１０のエア注入口１２及びエア排出口１３にそれぞれエアポンプ６３の配管とエア排出管を接続した後、恒温槽６１の蓋を閉めて、活性化キーを押すと、エアポンプ６３が作動し37℃に温められたエアがサンプル容器４０内に送られ、培養液を撹拌すると共に微生物膜内の微生物に酸素を供給する。このステップは、微生物膜を37℃で所定時間保温して、冷凍保存により活性が低下した微生物を活性化させるために行う（ステップＳ２）。
【００７５】
次に、設定時間経過後、逆流を防ぐためにエアポンプ６３が停止する。この状態で、試料注入口１１から試料水をシリンジ等で注入し、OKキーを押す（ステップＳ３）。
【００７６】
そして、再び恒温槽６１の蓋を閉めて測定キーを押すと、恒温槽６１の設定温度が３７℃から測定に適した温度である３０℃に切り替わると同時に、エアポンプ６３が作動し37℃に温められたエアがサンプル容器４０内に送られ、培養液を撹拌すると共に微生物膜内の微生物に酸素を供給する。また、前記微生物膜の発光を測定するため光検出器６２がオンとなり、各微生物膜の発光量をセンサ出力として経時的に収集しはじめる（ステップＳ４）。
【００７７】
設定時間経過後、光検出器６２とエアポンプ６３がオフとなり、測定が終了すると共に、収集したセンサ出力の結果から試料水が正常であるか、又は試料水中に遺伝子損傷性物質が存在するか、生育阻害物質が存在するかが判定され、表示部６４に表示される。こうして測定が終了した後、本体電源をＯＦＦにする（ステップＳ５）。
【００７８】
上記判定は以下のようにして行われる。すなわち、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設置値よりも小さく、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも大きい場合は試料水が正常であると判定される。一方、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設定値を超え、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも大きい場合は試料水中に遺伝子損傷性物質が混入していると判定される。また、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量が設置値よりも小さく、生育阻害物質検出用微生物膜の発光量が設定値よりも下回った場合は試料水中に生育阻害物質が混入していると判定される。
【実施例１】
【００７９】
（１）遺伝子損傷性物質検出用微生物
特許第３２７７４２６号公報に記載された方法にしたがって、遺伝子損傷性物質検出用微生物を作製した。
【００８０】
すなわち、SOS遺伝子として、大腸菌（CSH26「Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972」：F- ara del(lac-pro)thi）に導入されたプラスミドpSK1002のumuD,C遺伝子を利用した。
【００８１】
また、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、大腸菌（HB101：hsd20 (rB -, mB -）, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, supE44）に導入されたプラスミドpUCD620（Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)）の発光遺伝子群を利用した。
【００８２】
導入する微生物として、サルモネラ菌（TA1535「Ames, B. N., J. McCann, E. Yamasaki, Mutation Res., 31, 347, 1975」：hisG46, Δgal, Δchl, Δbio, ΔuvrB, rfa-, SJ10002：r-, m+）を利用した。
【００８３】
（i）SOS遺伝子の調製
プラスミドpSK1002を含む大腸菌（CSH26）を、アンピシリンを含むLB培地（Bactoトリプトン1%、Bacto酵母エキス0.5%、NaCl 1%）で培養し、アルカリ抽出法「Birnboim, H. C., Doly, J., Nucl. Acids Res., 11, 1513, 1979」によって、pSK1002を大量に調製した。このプラスミドpSK1002をSalI及びSmaIで切断し、umuD,C遺伝子を含む約7.5kbのSalI−SmaI DNA断片を得、このDNA断片を、T4 DNAリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。
【００８４】
得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを単離し、このプラスミドをMluIで切断後、T4DNAポリメラーゼにより平滑末端化した。
【００８５】
一方、umuCに対して終止コドンとして働き、かつBamHIサイトを持つ配列番号１に示すDNAリンカーを化学合成した。
【００８６】
そして、上記DNAリンカーと、前記MluI DNA断片をT4 DNAリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを抽出し、このプラスミドをBamHI及びSalIで切断して、umuD,C遺伝子を含む約7.4kbのBamHI−SalI DNA断片を得た。
【００８７】
（ii）発光遺伝子群の調製
プラスミドpUCD620を含む大腸菌（HB101）を、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、アルカリ抽出法によってpUCD620を大量に調製した。プラスミドpUCD620をBamHI及びSalIで切断し、発光遺伝子群を含む約7.5kbのBamHI−SalI DNA断片を得た。
【００８８】
（iii）SOS遺伝子と発光遺伝子群との連結及び発光ベクターのクローニング
上記発光遺伝子群を含むBamHI−SalI DNA断片（約7.5kb）と、前記umuD,C遺伝子を含むBamHI−SalI DNA断片（約7.4kb）をT4 DNAリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210）を構築した。
【００８９】
大腸菌（SJ10002）をLB培地で一夜培養し、LB培地に、1/100容量の前記培養液を加え、600nmにおける濁度（OD６００）が約0.4になるまで培養した。
【００９０】
この培養液5mlを遠心分離し、沈澱画分を5mlの30mM CaCl２水溶液に懸濁し、45分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を0.4mlの30mM CaCl２水溶液に懸濁し、大腸菌（SJ10002）のコンピテントセルを調製した。
【００９１】
大腸菌（SJ10002）のコンピテントセル100μlに、前記発光ベクター（pTL210）約200ngを加え、30分間氷中に放置した。42℃で2分間処理した後、室温にて5分間放置した。LB培地1mlを加え、37℃で1時間インキュベートした。この液を、アンピシリン50μg/mlを含むLBプレートに播種して得られたSJ10002の形質転換体から、前記発光ベクター（pTL210）をアルカリ抽出法で調製した。
【００９２】
（iv）形質転換体の調製
サルモネラ菌（TA1535）をLB培地で一夜培養し、LB培地に、1/100容量の前記培養液を加え、OD６００が約0.4になるまで培養した。この培養液5mlを遠心分離し、沈澱画分を5mlの10mM CaCl２、10mM MnCl２、10mM MgCl２水溶液に懸濁し、45分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を0.4mlの10mM CaCl２、10mM MnCl２、10mM MgCl２水溶液に懸濁し、サルモネラ菌（TA1535）のコンピテントセルを調製した。
【００９３】
そして、前記と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に前記発光ベクター（pTL210）を導入し、形質転換体（遺伝子損傷性物質検出用微生物）を得た。
【００９４】
（２）生育阻害物質検出用微生物
プラスミドpBR322（株式会社ニッポンジーン製）を、BamHI及びSalI（いずれの切断部位もテトラサイクリン耐性遺伝子のORF内にある）で切断し、アンピシリン耐性遺伝子を含む約4.1kbのDNA断片を得た。
【００９５】
このDNA断片と、上記（１）（ii）で調製した発光遺伝子群を含む約7.5kbのBamHI−SalI DNA断片とをT4 DNAリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210ctl）を構築した。
【００９６】
この発光ベクター（pTL210ctl）を上記（１）と同様の方法で大腸菌（SJ10002）に導入して形質転換体を得、この形質転換体からアルカリ抽出法によって、発光ベクター（pTL210ctl）を調製した。
【００９７】
そして、上記（１）と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に発光ベクター（pTL210ctl）を導入し、形質転換体（生育阻害物質検出用微生物）を得た。
【００９８】
（３）微生物膜の作製
−80℃で凍結保存した上記（１）で得られた遺伝子損傷性物質検出用微生物を解凍し、TGA培地（バクトトリプトン1%、塩化ナトリウム0.5%、グルコース0.2%、アンピシリンナトリウム20μg/ml）に1/1000容量植菌し、30℃で一晩、旋回振とう培養を行い、この培養液を新しいTGAに1/50容量植菌して、さらに30℃で1.5時間、旋回振とう培養を行い、濁度（OD６００）を測定し、OD６００＝0.1になるようにTGA培地で希釈して、微生物膜作製用培養液を調製した。
【００９９】
この微生物膜作製用培養液1ml（菌体数約2.5×10７個）を用いて常法にしたがって遺伝子損傷性物質検出用微生物膜を作製した。なお、微孔性膜として、商品名「メンブレンフィルター・セルロース混合エステル」（ミリポア社製）、光透過性膜として、商品名「LDPEローデンポリ」（大倉工業株式会社製）を用いた。
【０１００】
また、上記（２）で得られた生育阻害物質検出用微生物を用いた以外は上記と同様にして生育阻害物質検出用微生物膜を作製した。
【０１０１】
なお、作製したこれらの微生物膜は、使用するときまで保存液（TGA培地85%、グリセロール15%）に浸漬し、−20℃で凍結保存した。
【０１０２】
（４）遺伝子損傷性物質検出用微生物膜を用いた測定例
試料は遺伝子損傷性物質として４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド（4−NQO）を用いた。凍結保存していた遺伝子損傷性物質検出用微生物膜を解凍後、TGA培地の入った容器に浸漬し、約100ml/分の流量でエアレーションを行いながら37℃の恒温器内で2時間加温を行った。その後、0.3mg/Lの濃度になるように4−NQOを添加し、30℃に設定した恒温器内で穏やかに撹拌し、発光強度を測定した。発光を高感度CCDカメラ（商品名「ルミノイメージアナライザLAS−1000」、富士フィルム株式会社製）で撮影し、画像処理ソフトを用いて発光強度を数値化した。その結果を図９に示す。
【０１０３】
図９の縦軸は発光強度、横軸は4−NQOの暴露時間、すなわち30℃での振とう時間である。この結果、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜の発光量は4−NQO添加2時間後から発光量が上昇し、約3.5時間後に最大となった。これにより、遺伝子損傷性物質検出用微生物を固定化した微生物膜を用いて遺伝子損傷性物質を検出できることが分かった。
【実施例２】
【０１０４】
遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を用いた有害物質の測定結果を図１０に示す。試料は遺伝子損傷性物質として4−NQOを用い、生育阻害物質としてシアン化カリウムを用いた。4−NQOは0.3mg/Lになるように添加し、30℃で6時間暴露し、シアン化カリウムはシアン化物イオン濃度で30mg/Lになるように添加し30℃で3時間暴露し、各微生物膜の発光を高感度CCDカメラで撮影した。
【０１０５】
無暴露の場合、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜は発光せず、生育阻害物質検出用微生物膜は発光した。一方、4−NQOを添加した場合、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜は発光し、かつ生育阻害物質検出用微生物膜も発光を維持した。また、シアン化カリウムを添加した場合、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜は発光せず、生育阻害物質検出用微生物膜の発光は減少した。
【０１０６】
以上の結果から、遺伝子損傷性物質検出用微生物膜と生育阻害物質検出用微生物膜を用いることにより、各微生物膜の発光の有無により、試料水中に含まれる有害物質が遺伝子損傷性物質であるか、生育阻害物質であるかを容易に識別することができることが分かった。
【０１０７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：umuCに対して終止コドンとして働き、かつBamHIサイトを持つDNAリンカー。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、産業廃棄物の溶出水、工業排水等を対象としたバイオセンサ応用水質計測器に好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明で用いられる微生物膜の一例を示す概略構成図である。
【図２】本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の一実施形態を示す模式図であり、（ａ）は断面の模式図、（ｂ）はサンプル容器内部を上から見た模式図である。
【図３】本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器の別の実施形態を示す断面の模式図である。
【図４】本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器のさらに別の実施形態を示す断面の模式図である。
【図５】本発明の有害物質検出装置のセンサユニットを構成するサンプル容器のさらに別の実施形態を示す断面の模式図である。
【図６】本発明の有害物質検出方装置本体の模式図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は側面図である。
【図７】図４に示すサンプル容器をサンプル容器−光検出器固定台にセットした状態を示す模式図である。
【図８】本装置を用いた有害物質の測定方法のフローチャート図である。
【図９】遺伝子損傷性物質検出用微生物膜を用いて遺伝子損傷性物質（4−NQO）の検出を行なった結果を示す図である。
【図１０】遺伝子損傷性物質検出用微生物膜及び生育阻害物質検出用微生物膜を用いて有害物質（4−NQO、シアン化カリウム）の検出を行った結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１．微生物
２．微孔性膜
３．光透過性膜
４．両面テープ
５．微生物膜
５ａ．遺伝子損傷性物質検出用微生物膜
５ｂ．生育阻害物質検出用微生物膜
６、２１、４１．サンプルセル
７．微生物膜固定ネジ
８、２５、２７、４７．Ｏリング
９．ワッシャー
１０．サンプルセル蓋
１１．試料注入口
１２．エア注入口
１３．エア排出口
２０、３０、４０、５０．サンプル容器
２２、３１、４２．微生物膜ホルダー
２３、３２、４３．微生物膜押さえ
２４．微生物膜固定蓋
２６ａ、２６ｂ、３４ａ、３４ｂ、４５．微生物膜セル
３３、４４、４６．ネジ
５１．サンプル容器−光検出器固定台
６１．恒温槽
６２．光検出器
６３．エアポンプ
６４．表示部
【図１】
2005204548.tif 000002
【図２】
2005204548.tif 000003
【図３】
2005204548.tif 000004
【図４】
2005204548.tif 000005
【図５】
2005204548.tif 000006
【図６】
2005204548.tif 000007
【図７】
2005204548.tif 000008
【図８】
2005204548.tif 000009
【図９】
2005204548.tif 000010
【図１０】
2005204548.tif 000011
【配列表】
2005204548000001.app