(57)【要約】【課題】  正常な動物を用いて肥満から糖尿病を発症せしめる肥満糖尿病モデル動物の製造方法、及び該方法によって製造された肥満糖尿病モデル動物を用いた肥満治療薬、糖尿病予防薬、及び糖尿病治療薬の試験方法、肥満治療物質、糖尿病予防物質、及び糖尿病治療物質、糖代謝異常改善物質、及び脂質代謝改善物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得されて物質等を提供すること。【解決手段】  C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育するか、過食にして肥満にする方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、肥満したマウスを選択する工程。
【請求項２】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、通常食で飼育したマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程。
【請求項３】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの血糖値及び／又は尿糖値を調べ、通常食で飼育したマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程。
【請求項４】
以下の工程１）乃至３）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、通常食で飼育したマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程；
３）通常食で飼育したマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程。
【請求項５】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース（goldthioglucose）を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、肥満したマウスを選択する工程。
【請求項６】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程。
【請求項７】
以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの血糖値及び／又は尿糖値を調べ、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程。
【請求項８】
以下の工程１）乃至３）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程；
３）ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程。
【請求項９】
雑種のマウスがC57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]であることを特徴とする、請求項１乃至８から選択されるいずれか１項に記載の肥満糖尿病モデルマウスの製造方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９から選択されるいずれか１項に記載の製造方法によって製造された肥満糖尿病モデルマウス。
【請求項１１】
以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【請求項１２】
以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量、インスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【請求項１３】
以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスより摘出した組織における、トリグリセリド含量、グルコース取り込み能及びグルコース合成能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【請求項１４】
以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスより摘出した組織における、トリグリセリド含量、グルコース取り込み能及びグルコース合成能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）トリグリセリド含量の低下、インスリン含量の増加、インスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項１５】
以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）被験物質を投与したマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項１６】
以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）請求項１０に記載の肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量、インスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）トリグリセリド含量の低下、インスリン含量の増加、インスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項１７】
以下の工程１）乃至２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【請求項１８】
以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項１９】
以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項２０】
以下の工程１）乃至２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース及び被験物質を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【請求項２１】
以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース及び被験物質を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【請求項２２】
雑種のマウスがC57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]であることを特徴とする、請求項１７乃至２１から選択されるいずれか１項に記載の糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法。
【請求項２３】
請求項１１乃至２２の方法によって取得された糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質
【請求項２４】
請求項２３に記載の物質を有効成分として含有する、糖尿病、肥満、高脂血症から選択される少なくともいずれか一つの疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満から糖尿病を発症する肥満糖尿病モデル動物の製造方法、及び該方法によって製造された肥満糖尿病モデル動物を用いた肥満治療薬、糖尿病予防薬、糖尿病治療薬、高脂血症治療薬の試験方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、その増加が大きな社会問題となりつつある肥満と2型糖尿病は、密接に関連している。例えば、肥満は2型糖尿病の主要なリスクファクターの一つであり、肥満から2型糖尿病に進行することが知られている。
【０００３】
ヒトにおける肥満の大部分は、運動不足と脂肪含有率の高い食事（以下、「高脂肪食」と略す。）の摂取が主な原因となって引き起こされ、単一の遺伝子疾患ではない。一方、大部分のヒトの2型糖尿病も単一の遺伝子疾患ではなく、インスリンの作用低下（インスリン抵抗性）と膵臓からのインスリン分泌の低下により発症するが、その原因としては筋組織やβ細胞への脂肪蓄積（脂肪毒性仮説）などが提唱されているものの、実際の機構については不明な点が多い（例えば、非特許文献１参照。）。そして特に、両疾患の関連の原因、つまり肥満が2型糖尿病のリスクとなる原因や肥満から2型糖尿病へ進行する原因はまだ解明されていない。
【０００４】
前述のヒトにおける肥満から2型糖尿病へ至る原因を解明し、またその治療薬を開発するためには適切な動物モデルが必要である。そしてそのモデルは、ヒトにおける肥満から2型糖尿病への進行に類似した病態を示し、かつ遺伝子異常を伴わないことが重要である。しかしながら、従来用いられていた糖尿病モデル動物は、食餌による肥満を主な原因として肥満・糖尿病を発症するものではなく、遺伝子の異常が原因で糖尿病を発症するものであり、ヒトにおける肥満と糖尿病発症との関係を解明するには適当なモデル動物ではなかった。
【０００５】
例えば、db/dbマウスはレプチン受容体遺伝子が変異しており、異常な過食と重篤な糖・脂質代謝障害によって著しい肥満と糖尿病をほぼ同時に発症する(例えば、非特許文献２参照。)。また、KKマウスでは、複数の特定の遺伝子の異常による肥満に伴って糖尿病の症状を呈する(例えば、非特許文献３参照。)。
【０００６】
一方、正常マウスにはさまざまな遺伝的背景を持つ近交系が古くから存在し、糖尿病に関連する特定の遺伝子の異常により実際に糖尿病を発症するストレインが知られている。例えば、上述のレプチン受容体遺伝子変異や、レプチン遺伝子欠損などの遺伝子異常をもつ場合、DBA/2マウスやC57BL/KsJマウスは重篤な糖尿病を発症することが知られている（例えば、非特許文献４参照。）。しかしながら、これまでのところ、近交系のマウスについて、高脂肪食によって肥満を形成させることで明確な糖尿病を発症するとの報告はない。
【０００７】
糖尿病に近い病態を示すものとして、高脂肪食で飼育したC57BL/6マウスが報告されているが、C57BL/6マウスは肥満によるインスリン抵抗性を発症するものの血糖値上昇は軽度であり、糖尿も呈さないことから、糖尿病への進展は明確ではない(例えば、非特許文献５参照。)。
【０００８】
また、高脂肪食を与えることで肥満となりやすいマウスのストレインも存在し、例えば、高脂肪食飼育によりAKR/JマウスのほうがSWR/Jマウスより重い肥満を形成することが報告されている（例えば、非特許文献６乃至８参照。）。しかしながら、これらのストレインでも高脂肪食により糖尿病を発症することは知られていない。以上の例以外を含めても、ヒトの肥満の主原因である高脂肪食により、肥満を発症し、さらに進行して糖尿病に発展するモデルマウスは知られていなかった。また、肥満しやすいストレインと糖尿病を発症しやすいストレインの形質を併せ持たせたマウスを高脂肪食飼育することにより肥満・糖尿病を発症させることに成功した報告はない。
【０００９】
従って現在まで、高脂肪食による肥満を原因として糖尿病を発症するマウスモデルは存在せず、ヒトの糖尿病に類似した動物モデルを用いて、糖尿病の発症メカニズムの解析や、糖尿病治療薬の探索やその評価を行うことは困難であった。
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー＆メタボリズム（The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism）」、２００１年、第８６巻、ｐ．４０４７−４０５８
【非特許文献２】「ダイアベトロジア（Diabetologia）」、１９７０年、第６巻、ｐ．２６８−２７３
【非特許文献３】「ダイアビーティーズ＆メタボリズム（Diabetes & metabolism）」、１９９７年、第２３巻 Ｓｕｐｐｌ ２、ｐ．３８−４６
【非特許文献４】「ダイアビーティーズ（Diabetes）」、１９８１年、第３０巻、ｐ．１０２９−１０３４
【非特許文献５】「メタボリズム（Metabolism）」、１９９９年、第４２巻、ｐ．１４０５−１４０９
【非特許文献６】「ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Journal of Clinical Investigation）」、１９９４年、第９４巻、ｐ．１４１０−１４１６
【非特許文献７】「ネイチャー（Nature）」、２０００年、第４０４巻、ｐ．６４４−６５１
【非特許文献８】「オビーシティー・リサーチ（Obesity Research）」、２０００年、第８巻、ｐ．８９−１１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、正常な動物を用いて肥満から糖尿病を発症せしめる肥満糖尿病モデル動物の製造方法、及び該方法によって製造された肥満糖尿病モデル動物を用いた肥満治療薬、糖尿病予防薬、及び糖尿病治療薬の試験方法、肥満治療物質、糖尿病予防物質、及び糖尿病治療物質、糖代謝異常改善物質、及び脂質代謝改善物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得されて物質等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、肥満したマウスを選択する工程、
（２）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、通常食で飼育したマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程、
（３）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの血糖値及び／又は尿糖値を調べ、通常食で飼育したマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程、
（４）  以下の工程１）乃至３）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスを高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、通常食で飼育したマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程；
３）通常食で飼育したマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程、
（５）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース（goldthioglucose）を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、肥満したマウスを選択する工程、
（６）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程、
（７）  以下の工程１）及び２）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの血糖値及び／又は尿糖値を調べ、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程、
（８）  以下の工程１）乃至３）を含む、肥満糖尿病モデルマウスの製造方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコースを投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重を測定し、ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ体重が２０％以上増加したマウスを選択する工程；
３）ゴールドチオグルコースを投与しなかったマウスに比べ血糖値の上昇及び／又は糖尿が確認されたマウスを選択する工程、
（９）  雑種のマウスがC57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]であることを特徴とする、（１）乃至（８）から選択されるいずれか１項に記載の肥満糖尿病モデルマウスの製造方法、
（１０）  （１）乃至（９）から選択されるいずれか１項に記載の製造方法によって製造された肥満糖尿病モデルマウス、
（１１）  以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程、
（１２）  以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量、インスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程、
（１３）  以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスより摘出した組織における、トリグリセリド含量、グルコース取り込み能及びグルコース合成能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程、
（１４）  以下の工程１）及び２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスより摘出した組織における、トリグリセリド含量、グルコース取り込み能及びグルコース合成能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）トリグリセリド含量の低下、インスリン含量の増加、インスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（１５）  以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）被験物質を投与したマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（１６）  以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）（１０）に記載の肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量、インスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）トリグリセリド含量の低下、インスリン含量の増加、インスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（１７）  以下の工程１）乃至２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程、
（１８）  以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1）マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（１９）  以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]のマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（２０）  以下の工程１）乃至２）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース及び被験物質を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程、
（２１）  以下の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスとの雑種のマウスにゴールドチオグルコース及び被験物質を投与して飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、尿糖値、血中インスリン値、糖負荷試験での血糖値及びインスリン値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、ランゲルハンス島のインスリン分泌能及びインスリン反応性から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、尿糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、糖負荷試験での血糖値の低下もしくはインスリン値の上昇、血中中性脂肪濃度の低下、ランゲルハンス島のインスリン含量の増加、ランゲルハンス島のインスリン分泌能の上昇及びインスリン反応性の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程、
（２２）  雑種のマウスがC57BL/6マウスとDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]であることを特徴とする、（１７）乃至（２１）から選択されるいずれか１項に記載の糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質の試験方法：
（２３）  （１１）乃至（２２）の方法によって取得された糖代謝異常、肥満及び脂質代謝異常から選択される少なくともいずれか一つの疾患の予防物質及び／又は改善物質
（２４）  （２３）に記載の物質を有効成分として含有する、糖尿病、肥満、高脂血症から選択される少なくともいずれか一つの疾患の治療剤、
からなる。
【００１２】
本発明者らは、C57BL/6マウスでは高脂肪食を与えたときの肥満の形成が、DBA/2マウスやC57BL/KsJマウスより顕著であることを見出した。また本発明者らは肥満を形成しやすい形質を持つストレインであるC57BL/6と、糖尿病を発症しやすいが肥満しにくい形質をもつストレインであるDBA/2の両ストレインとのF1交配雑種であるBDF1マウスを用いることにより、正常なマウスを高脂肪食で肥満させたのちに重篤な糖尿病を発症せしめることに成功した。
【００１３】
本発明者らは、正常マウスとして汎用されるBDF1マウスを高脂肪食条件下で飼育することにより、該マウスが、（1）高脂肪食摂餌後８週間でインスリン抵抗性とインスリン分泌亢進を伴うが糖尿病を伴わない単純性肥満を発症すること、（2）摂餌後12週以降では、肥満に加えて、耐糖能異常、著しい血糖値上昇、尿糖出現を引き起こすこと、（3）ランゲルハンス島インスリン含量は低下し、単離ランゲルハンス島でのグルコース刺激によるインスリン分泌能は低下すること、さらに（4）ランゲルハンス島でのインスリン染色とグルカゴン染色の異常を伴うことを発見し、肥満期と肥満・2型糖尿病期を区別して発症させることに成功し、これらの病態がヒトでの肥満から2型糖尿病への進行と類似していること、さらには、ヒトの2型糖尿病患者で示唆されているランゲルハンス島の疲弊を再現させることに成功した。
【００１４】
本発明者らはさらに、汎用される他のストレインのマウス（C57BL/6）では、同様な高脂肪食飼育でインスリン抵抗性の肥満は発症するが、糖尿病は発症しないことを明らかにし、高脂肪食により誘発される肥満から糖尿病を発症するために必要な遺伝的要因が、DBA/2マウスに存在することを見出した。
【００１５】
本発明者らは更に、上記製造方法によって製造された肥満糖尿病モデルマウスを利用した、肥満治療薬、糖尿病予防薬、及び糖尿病治療薬の試験方法、並びに、肥満治療物質、糖尿病予防物質、及び糖尿病治療物質、糖代謝異常改善物質、及び脂質代謝改善物質のスクリーニング方法を提供することに成功し、該方法によって肥満治療薬、糖尿病予防薬、及び糖尿病治療薬、肥満治療物質、糖尿病予防物質、及び糖尿病治療物質、糖代謝異常改善物質、及び脂質代謝改善物質が提供できることを示し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、正常な動物を用いて肥満から糖尿病を発症する肥満糖尿病モデル動物の製造方法が提供された。また、該方法によって製造された肥満糖尿病モデル動物を用いた肥満治療薬、糖尿病予防薬、及び糖尿病治療薬の試験方法が提供された。さらに、該方法によって製造された肥満糖尿病モデル動物を用いた肥満治療効果を有する物質、糖尿病予防効果を有する物質、及び／又は、糖尿病治療効果を有する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって得られる物質が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書中における、「肥満になりやすい形質」とは、高脂肪食を摂取したときに肥満を形成する形質をいい、肥満になりやすい形質を有するマウスとしては、具体的にはC57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス及びAKR/Jマウスを挙げることができる。また、本明細書中における、「肥満した場合に糖尿病を発症しやすい形質」とは、肥満と糖尿病に相関が見られる形質をいい、肥満した場合に糖尿病を発症しやすい形質を有するマウスとしては、レプチン受容体変異（db/db）を有する場合、あるいはgold thioglucos処置を行った場合に糖尿病を発症するマウス（例えばDBA/2、C57BL/KsJ、SWR/J、CBA/LT、C3HeB/FeJ、ICR(CD1)及びFVB/NJマウスなど）を挙げることができる。
【００１８】
本明細書中における、「肥満糖尿病モデルマウス」とは、本発明の方法によって肥満状態を経て糖尿病を発症したマウスのことをいう。
【００１９】
１．動物
本発明において糖尿病を発症している動物を製造するために用いる動物は、肥満になりやすい形質と、肥満した場合に糖尿病を発症しやすい形質を併せ持つマウスであれば、特に制限はなく、例えば、C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスの雑種を挙げることができ、好適には、C57BL/6マウスとDBA/2マウスとのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1]であるマウスを挙げることができ、特に好適には、メスC57BL/6マウスとオスDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1] である雄性BDF1マウス（日本チャールズリバー）を挙げることができる。ここで、129/Jマウス及びAKR/Jマウスは高脂肪食で肥満を形成するストレインである。またC57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス及びFVB/NJマウスは、レプチン受容体変異（db/db)を有したり、gold thioglucos処置を行うことで糖尿病を発症するストレインである。また、これらのマウスの組合せによる組換え近交系マウス（例えばC57BL/6とのDBA/2組換え近交系であるBXDマウスなど）も、用いることができる。
【００２０】
糖尿病を発症しない対照群のマウスとしては、例えばC57BL/6マウス（日本チャールズリバー）を用いることが出来る。高脂肪食によって肥満しにくい動物としては、DBA/2マウス(日本チャールズリバー）やC57BL/KsJマウス（日本クレア）を用いることができる。上記のマウスは例えば日本チャールズリバー及び日本クレアから購入できるが、その他の飼育施設より入手することも出来、さらに、購入したマウスを用いての自家繁殖や自家繁殖して確立したマウスも用いることが出来る。
【００２１】
２．飼料
マウスの飼育に用いる飼料としては、マウスの飼育に通常用いることができる飼料であれば特に制限はない。本明細書中において「通常食」とは、マウスの飼料として通常用いることができる飼料であれば特に制限はないが、例えば、市販されているげっ歯類飼育用の餌（FR-2ペレット、船橋農場：水分、粗タンパク質、粗脂肪、灰分、可溶無窒素物の各組成は、8.0、20.8、4.8、3.2、5.0、58.2％）を用いることが出来るし、また、類似の餌も使用できる。
【００２２】
本明細書中において、「高脂肪食」とは、通常食に比べて脂肪の含有割合が高い食餌をいい、例えば、通常食に脂肪を添加することによって調製することができる。通常食に添加する脂肪の量は、糖尿病を発症させることができる限りにおいて特に制限はないが、好ましくは、脂肪を含む飼料全体の重量に対して、脂肪の割合が重量比で10％乃至70％、より好ましくは20％乃至50％、更に好ましくは、25％となる量である。
【００２３】
添加する脂肪の種類は特に制限はないが、例えば、ラード、ラード以外の動物油（例えば牛脂、マグロ油、イワシ油等の魚類油）、及び植物油（例えばココナッツ油、菜種油、パーム油、ダイズ油、ごま油、紅花油や綿実油など）等を挙げることができる。また、脂肪を含んでいる限りにおいて、脂肪を含んでいる食品をそのまま用いることもできるし、未精製の粗油、一部精製油、完全に精製した油を適宜用いることもできる。また、これらの脂肪は単一種類のものでも良いし、複数の脂肪の混合物でも良い。また、高脂肪食は通常の餌に脂肪を混ぜたものに限らず通常食と脂肪を別々に用意し、マウスが両方の餌を摂取することによって結果として脂肪摂取量が高くなっているものでもよい。高脂肪食の一例として、FR-2粉末（船橋農場）の最終重量の25％の量のラードを添加して作成したペースト状飼料を挙げることができる。
【００２４】
なお、高脂肪食としては上記のように、餌中の脂肪の含有割合に基づいて、脂肪の量を計算して調製する方法の他に、摂取カロリー全体で脂肪の占める割合を高くすることによっても調製することもできる。摂取カロリーに基づく高脂肪食の例としては、餌中の45カロリー％の濃度でラードを添加したげっ歯類飼育用の餌を挙げることができるが、脂肪の種類や濃度はこれに限定されるものではない。
【００２５】
また、肥満を形成させる飼料の成分としては、肥満とインスリン抵抗性を誘発させる他の食餌（例えばスクロース含量の高い食餌。Surwit RS et al., Metabolism, 44:645-651, 1995）も用いることができる。
【００２６】
３．飼育方法
（１）高脂肪食による肥満の形成
マウスの飼育は当業者に周知の方法で行うことができる。
【００２７】
高脂肪食を与える前には通常食で一定期間の飼育（「前飼育」という。）を行うことが望ましい。前飼育の期間は特に制限がないが、通常１週間程度である。ただし、前飼育は行わなくても良い。
【００２８】
実験に用いるマウスの年齢は高脂肪食を与えることによって糖尿病を発病する限りにおいて特に制限はなく、用いるマウスの種類によって、適当に選択することができるが、メスC57BL/6マウスとオスDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6 x DBA/2): F1] である雄性BDF1マウス（日本チャールズリバー）を用いた場合は、例えば、3週齡乃至12週齡、好ましくは5週齡乃至10週齡、より好ましくは7週齡のマウスを用いることができる。
【００２９】
前飼育が終わったマウスに対して、高脂肪食で飼育することによって糖尿病の発症を確認することができる。高脂肪食は一定量を摂取するようにすることもできるし、自由に摂取するようにすることもできる。また、水についても一定量を摂取するようにすることもできるし、自由に摂取することもできる。マウスの摂餌量及び／又は摂水量は必要に応じて記録しておくこともできる。
【００３０】
また、全ての食餌を高脂肪食にせずに、通常食と高脂肪食を一定の割合で与えるという方法によっても飼育できる。そのような方法としては、例えば、６日間高脂肪食で飼育した後、１日間通常食で飼育し、再び６日間高脂肪食で飼育し、また、１日間通常食で飼育するということを繰り返すような場合を挙げることができるが、肥満、血糖値異常、及び／又は糖尿病の発症が確認できる限りにおいて、特にこの方法に限定されない。
【００３１】
また、通常食で飼育するマウスをコントロールとして用意することが好ましい。
【００３２】
飼育期間は肥満、血糖値異常、及び／又は糖尿病の発症が確認できる限りにおいて特に制限はないが、例えば、雄性BDF1マウスを用いる場合は5週間乃至20週間、好ましくは7週間乃至15週間、より好ましくは12週間とすることができる。
【００３３】
なお、マウスの飼育期間については、飼育日数ではなく、体重が一定の重さに達した段階で飼育を終了する等の別の基準で飼育期間を定めても良い。
【００３４】
（２）goldthioglucoseによる肥満の形成
マウスを肥満させる方法としては上記の（１）に記載の方法に加えて、ゴールドチオグルコース（goldthiogluceose）を投与する方法を用いることもできる。ゴールドチオグルコースを投与したマウスでは、過食になり（Debons AF et al., Fed Proc, 36:143-147, 1977）肥満となる。
【００３５】
goldthioglucoseはマウスの体重に対して、0.4乃至1.5 g/kgの用量で腹腔内に投与する。
【００３６】
マウスに与える飼料は、通常食でも高脂肪食でもよく、その他の飼育条件は（１）に準じる。
【００３７】
４．肥満と糖尿病の検定法
（１）マウス肥満形成の確認
マウスの肥満の形成は、体重測定や脂肪組織重量（例えば精巣上体脂肪、腸間膜脂肪、鼠径部脂肪及び／又は褐色脂肪）の測定により行うことが出来る。
【００３８】
例えば、高脂肪食で飼育したマウスについて、通常食で飼育したコントロールのマウスと比較して、（ａ）体重が20％以上増加している場合、（ｂ）体重が5 g以上増加している場合、（ｃ）腸間膜脂肪及び／又は鼠径部皮下脂肪が30%以上増加している場合、（ｄ）腸間膜脂肪及び／又は鼠径部皮下脂肪が300 mg以上増加している場合、の（ａ）乃至（ｄ）の少なくともいずれか一つに該当する場合には、マウスが肥満になったと確認できる。
【００３９】
（２）病態解析
高脂肪食で飼育したマウスの病態は以下に示す各種測定の結果によって調べることができる。高脂肪食で飼育したマウスが糖代謝異常を有するか否かはこれらの測定結果から総合的に判断することが好ましい。
【００４０】
（ａ）インスリン抵抗性
インスリン抵抗性を発症した肥満の病態解析は、血中のホルモン類（例えばインスリン、レプチンなど肥満との関連が指摘されているもの）の測定により行うことが出来る。これらの測定用サンプルは当業者が通常行っている方法によって取得することができる。血中インスリン及び血中レプチンがコントロール動物と比較して、統計学的に有意に上昇している場合に、インスリン抵抗性を発症した肥満の病態があると判断することができる。
【００４１】
（ｂ）糖尿病
糖尿病の検定には、血中や尿中のグルコース濃度及びヘモグロビンの糖化率 (HbA1c)の定量により行うことが出来きる。血漿中及び尿中のグルコース濃度の単位は一般的にmg/dl（ただしdlは100ml）が用いられる為、それに従った。測定の結果、血漿中グルコース濃度がコントロール動物の値を統計学的に有意に上回る場合には糖代謝に異常があると判断でき、血漿中グルコース濃度が250mg/dlを超え、尿中グルコース濃度が50mg/dlを上回る場合には、糖尿病を発病していると判断できる。また、HbA1cがコントロール動物に比べて有意に高い場合は、糖尿病状態が恒常的に続いていることが判断できる。
【００４２】
本発明の方法によって、糖尿病を発症しているマウスを肥満糖尿病モデルマウスという。
【００４３】
（ｃ）血中脂質
血中脂質の変化は、血漿中総コレステロール濃度、血漿中遊離脂肪酸濃度、及び血漿中中性脂肪濃度の測定により行うことが出来る。これらの濃度は当業者が通常行う方法によって測定することができるが、例えば、以下の方法によっても測定することができる。血漿中総コレステロール濃度はコレステロールCII-テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定することができる。血漿中遊離脂肪酸濃度は、NEFA C-テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定することができる。血漿中中性脂肪濃度はGPO-TRINDER (SIGMA社)を用いて測定することができる。
【００４４】
（ｄ）耐糖能
耐糖能の検討は、経口糖負荷試験（Perley MJ and Kipnis DM, J Clin Invest, 46:1954-1962, 1967）によって行うことが出来る。高脂肪食で飼育したマウスでは、経口糖負荷後に、例えば500mg/dlを超えるような急激な血糖値上昇と、その後の高血糖状態の持続が観察される。
【００４５】
（ｅ）ランゲルハンス島内のインスリン含量
ランゲルハンス島内のインスリン含量は、既存の方法（Walters GH et al., Horm Metab Res Suppl, 25:20-26, 1991）などを用いてランゲルハンス島を単離して、例えば超高感度ラットインスリン測定キット（生化学工業）を用いてインスリンを測定することが出来る。ランゲルハンス島の大きさの違いは、用いたランゲルハンス島のDNA含量を測定することにより行うことが出来る（例えばPicoGreen DNA quantitation kit、Molecular Probe）。
【００４６】
高脂肪食で飼育し、糖代謝に異常を来たしたマウスのランゲルハンス島内のインスリン濃度はコントロール動物に比べて20%以上低下する。
【００４７】
（ｆ）インスリン分泌試験
単離ランゲルハンス島におけるインスリン分泌試験は、前述の方法などで単離した単離ランゲルハンス島を、生理的塩濃度の緩衝液（例えばKrebs-Ringer bicarbonate緩衝液）中に懸濁して、異なるグルコース濃度により刺激されて上清中に遊離されるインスリンを前述の方法などにより測定することにより求めることが出来る。高脂肪食で飼育し、糖代謝異常が認められるマウスでは、グルコースに反応するインスリン分泌が著しく低下する。また、高濃度塩化カリウム刺激によって誘導される、最大インスリン分泌能力の低下が認められる場合もある。
【００４８】
（ｇ）ランゲルハンス島の免疫組織化学的分析
ランゲルハンス島の免疫組織化学的分析は、摘出した膵臓を、例えばブアン溶液（飽和ピクリン酸：ホルマリン：酢酸 = 15:5:1）を用いて固定した後、常法に従ってパラフィン包埋し、薄切切片を脱パラフィン処置を行い、常法に従い、免疫染色を行うことによって出来る。抗インスリン抗体（例えばH-86、Santa Cruz）、抗グルカゴン抗体（Zymed）を用いる事ができるが、その他ランゲルハンス島に存在するペプチド類に対する抗体（例えばソマトスタチンなど）を用いて行うことも出来る。高脂肪食で飼育し、糖代謝異常が認められたマウスでは、インスリン染色性が低下することに加え、本来はランゲルハンス島の外周部に局在するグルカゴン陽性細胞がランゲルハンス島内部に現れるなどの、構造的変化が観察される。
【００４９】
（３）糖尿病の発症予測
上記（１）におけるマウスの肥満形成の確認と（２）における病態の測定結果から、糖尿病を発症するか否かは、肥満の程度、例えば体重もしくは脂肪組織重量を測定して予測することができることが明らかになった。例えば、雄性BDF1マウスを用いた場合には、体重が、通常食に比べて２０％以上増加している場合や、体重が48gを超えた場合には、糖尿病を発症していると予測できる。このようにして、肥満糖尿病モデルマウスが取得できる。
【００５０】
５．糖尿病発症マウスにおけるポリヌクレオチドの発現量の解析
上記「４．」の項目に記載したように、肥満になりやすい形質と、肥満した場合に糖尿病を発症しやすい形質を併せ持つマウスに高脂肪食を摂取させるかあるいはゴールドチオグルコースを投与して過食にすると肥満糖尿病モデルマウスを製造できる。ヒトの糖尿病を始めとした糖代謝異常についても高脂肪食の摂取及び／又は過食が原因となる場合が多く、本発明によって製造されたマウスはヒトの糖代謝異常に類似した発症機構によって糖代謝異常が引き起こされている。したがって、本発明で示したマウスは糖尿病の発症原因及び肥満から糖尿病へ進行する原因の解明に利用できる。
【００５１】
なお、糖尿病に代表される、糖代謝異常を有する動物では脂質代謝異常も有することが多い。したがって、本発明によって得られるマウスはヒトの糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常の機構を解明するための有効なモデル動物となる。糖尿病に代表される糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常の発症機構の解明のための実験は当業者が通常行っている実験手法を組み合わせることによって行うことができるが、例えば、以下の方法によっても行うことができる。
【００５２】
（１）発現が変動しているポリヌクレオチドを解析する方法
正常なマウスと糖尿病発症マウスの間で、発現量に差があるポリヌクレオチドは糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に関連している遺伝子をコードしていると判断することができる。そのような遺伝子は具体的には以下の方法によって特定することができる。
【００５３】
（ｉ）マウスの飼育及び選別
上記「３．飼育方法」の項に記載した方法に準じて高脂肪食で飼育したマウス及び通常食で飼育するマウスから、一定期間経過毎あるいは、一定期間経過後、あるいは体重等が一定の基準に達した後でサンプルを採取する。
【００５４】
すなわち、本発明においては、高脂肪食摂取によって既に糖尿病を発症しているマウスについての解析のみならず、高脂肪食を摂取し、体重が増加していき、将来的に糖尿病を発症すると予想されるマウスを用いることもできる。
【００５５】
なお、マウスを飼育する際には、マウスを通常食で飼育して標準体重であるマウス、通常食で飼育して肥満となったマウス、高脂肪食で飼育して肥満となったマウス、高脂肪食で飼育したが標準体重のままで肥満とならなかったマウスの各群に分けて、サンプルの分析をすることもできる。また、同時に、必要に応じてそれぞれのマウスについて上記「４．肥満と糖尿病の検定法」の項に記載の方法に従って、体重脂肪組織重量、血中や尿中のグルコース濃度、ヘモグロビンの糖化率、血漿中総コレステロール濃度、血漿中遊離脂肪酸濃度、及び血漿中中性脂肪濃度の測定から選択される少なくとも１つ以上の項目について測定し、それぞれのマウス個体の糖代謝等の状態を調べる。
【００５６】
（ｉｉ）全ＲＮＡの調製
マウスにおける、ポリヌクレオチドの発現量を解析するには一般に特定の組織由来のＲＮＡにおけるポリヌクレオチドの発現量の差を解析するのが望ましいが、遺伝子の発現量の差を解析できる限りにおいて、全組織由来のＲＮＡを用いることもできる。
【００５７】
ＲＮＡを取得する組織としては特に制限はないが、例えば、血液、膵臓、小腸、肝臓、筋肉、及び、白色脂肪細胞を含む脂肪組織を挙げることができ、このうち、マウス白色脂肪組織を用いる場合を以下に示す。マウスの白色脂肪組織から全ＲＮＡを抽出するに際しては、屠殺、採血後に他の組織が混入しないように注意しながら白色脂肪組織を切り出し、該組織をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。又は、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等のタンパク質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００５８】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．、（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００５９】
得られた全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、上記１）に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に用いることもできる。
【００６０】
（ｉｉｉ）  各マウス間で発現量に差があるポリヌクレオチドを特定する工程
ポリヌクレオチドの発現量は、上記（ｉｉ）で得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００６１】
以下に、ポリヌクレオチド発現量の解析方法として、固相化試料を用いた解析方法と、その他のいくつかの解析方法について説明する。
【００６２】
（ａ）  固相化試料を用いた解析方法
ａ−１）固相化試料
前記固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
【００６３】
ａ−１−１）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）配列又はｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の遺伝子チップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ、Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔ．２１、ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき製造してもよい。遺伝子チップ上に固相化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの基となるＥＳＴ配列又はｍＲＮＡ配列は、解析対象の動物あるいは動物細胞と、同種の動物由来のものであることが最も好ましい。マウス由来のｍＲＮＡを解析する場合はマウス由来のものが最も好ましく、例えば、アフィメトリックス社製マウス１９Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ  １９Ｋ  ＳＥＴ：１９ＫＡ、１９ＫＢ、１９ＫＣ）やマウス１１Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ  １１Ｋ  ＳＥＴ：１１ＫＡ、１１ＫＢ）を用いることができる。
【００６４】
ｂ）マウス全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイ又はメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡ又はＲＴ−ＰＣＲ産物は、マウスのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：タカラバイオ社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：タカラバイオ社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００６５】
ａ−１−２）プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００６６】
ａ−２）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００）を用いてハイブリダイゼーション及び解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００６７】
ａ−３）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被験物質添加細胞由来のポリ（Ａ）+ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）+ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーション及び洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（タカラバイオ（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したのもでもよい。
【００６８】
ａ−４）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）+ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クロンテック社製）を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クロンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００６９】
前記ａ）乃至ｃ）のいずれに記載の方法も、各マウス白色脂肪細胞由来のプローブと正常なマウス白色脂肪細胞由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ、Ｐ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔ、２１、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、３３−３７）。
【００７０】
（ｂ）その他の解析方法
上記以外の解析方法として、サブトラクションクローニング法（実験医学別冊  新  遺伝子工学ハンドブック、羊土社（１９９６）Ｐ３２−３５参照）、ディファレンシャルディスプレー法（基礎生化学実験法４  核酸・遺伝子実験  II.応用編、東京化学同人（２００１）、ｐ１２５−１２８）等を挙げることができるが、遺伝子の発現量の差を解析できる限りにおいて他の方法でも良い。
【００７１】
（ｉｖ）評価・判定
上記解析の結果、正常なマウスと糖代謝異常を有するマウス由来白色脂肪細胞で、発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを、糖代謝異常に関連する遺伝子として特定することができる。ここで、発現量が「著しく異なる」とは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒ．３．０を用いて解析した場合、Ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値が２倍増加又は減少している場合をいう。
【００７２】
（２）相同性ポリヌクレオチドの検索
（１）の方法によって見出されたポリヌクレオチドについては、公知のデータベースとの間で相同性検索を行うことにより、同様の機能を有すると推定できるポリヌクレオチドを同定することができる。相同性検索によって同定されたポリヌクレオチドについても上記方法により、特異的発現を調べることでポリヌクレオチドの機能を解明することができる。相同性ポリヌクレオチドは同種生物間に限らず、他種生物間でも検索することができる。相同性ポリヌクレオチドの検索はGenBank等のデータベースに登録されているデータに対してBLAST等の検索プログラムを用いて行なうことができるが、その他、市販の検索ソフトを用いても検索することができる。なお、このようにして検索された配列を有するポリヌクレオチドはそれぞれの生物由来のｃＤＮＡライブラリーを用いて適当なＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ反応を行なうことにより取得することができる。
【００７３】
（３）糖代謝関連ポリヌクレオチド
上記（１）及び上記（２）において特定されたポリヌクレオチドの他に、それぞれのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、正常マウスと糖代謝異常を有するマウスとの間で発現量に差があるポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含めることができる。
【００７４】
（４）インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの検定
上記のようにして得られたポリヌクレオチドは、マウス由来白色脂肪細胞において正常なマウスと糖代謝異常を有するマウスの間で発現量が著しく変化しており、糖代謝及び／又は脂質代謝の変化に影響を与えるポリヌクレオチドであり、インスリン抵抗性改善剤を始めとした糖代謝及び／又は脂質代謝に影響を及ぼす物質のスクリーニングに有効である。
【００７５】
まず、特定されたポリヌクレオチド断片をプローブとして、マウス又はヒトｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡをマウス又はヒト細胞に導入して高発現させ、糖代謝及び／又は脂質代謝に影響が生じるか否かを検討する。
【００７６】
ｃＤＮＡを動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、又はＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００７７】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００７８】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞に分化する細胞等のインスリン感受性を有する細胞へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、糖や脂質の産生や取り込み、あるいはグリコーゲンの蓄積等の糖脂質代謝を調節する機能にどの様な影響が現れるかを検討することができる。逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能にどの様な影響が出るかを調べることもできる。また、遺伝子の発現を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖ＲＮＡ（siRNA）を用いる方法を挙げることもできる（「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（Genes and Developments）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００）。例えば、siRNAを文献記載の方法に従って導入し、siRNAの対象となる遺伝子の発現量及びグルコース濃度を調べることができる。
【００７９】
完全長ｃＤＮＡを動物又は細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーター及び形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｓ.  ｅｔ  ａｌ.（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１、８５４−８６４）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、コスミドベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製）等が挙げられるが、これに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２、４５６−４５７）、及び電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、 Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１、８４１−８４５）などによりサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３、１７５−１８２、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、４１２６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５７３）等に取り込ませることができるが、これらに限定されない。かくして所望の形質転換体を得ることができる．
また、遺伝子操作により、ノックアウト動物を製造し、糖代謝及び／又は脂質代謝を調節する機能にどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、肥満や糖尿病といった症状を呈する動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を製造し、その病態が改善・治療されるか否かを検討することも可能である。前記トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得ることができ、その手順は公知の方法（発生工学実験マニュアル(野村達次  監修、勝木元也  編、１９８７年刊)、特開平５−４８０９３号等参照）に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるためのプロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩又は帝王切開により出生させる。
【００８０】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば、前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンス及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部又は一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【００８１】
６．肥満糖尿病モデルマウスにおけるポリペプチドの発現量の解析
正常なマウスと肥満糖尿病モデルマウスの間で、発現量に差があるポリペプチドは糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に関連していると判断することができる。そのようなポリペプチドは具体的には以下の方法によって特定することができる。
【００８２】
（１）試料の調製
試料としては、上記、「５.糖尿病発症マウスにおけるポリヌクレオチドの発現量の解析」の項に記載したのと同様のマウス由来の血液、膵臓、小腸、肝臓、筋肉、及び、白色脂肪細胞を含む脂肪組織が好ましい。試料は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去したものを用いる。例えば、正常なマウス及び糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常が認められるマウス由来のポリペプチドをポリアクリルアミド電気泳動し、両者で発現量に差があるポリペプチドを同定し、アミノ酸シークエンサー等を用いてアミノ酸配列を決定し、アミノ酸配列情報に基づいてポリペプチドを同定する。一方、既に糖代謝及び／又は脂質代謝に関連があることが知られていたり、予想されるポリペプチドの発現量についてはＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ等を用いて発現量を調べることができる。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えばマウス由来の試料をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば血清や、膵臓、小腸、肝臓、筋肉、及び、白色脂肪細胞を含む脂肪組織の抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した血清や、膵臓、小腸、肝臓、筋肉、及び、白色脂肪細胞を含む脂肪組織そのもの、又は緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【００８４】
（２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガントの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。ポリペプチドを固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法又はスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）又はポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【００８５】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober）、セミドライ式ブロッティング法（上記CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）。
【００８６】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料又はその希釈液（例えば０．０５％  アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃乃至室温で一晩、又は３７℃で１乃至３時間静置することにより、ウエル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【００８７】
（３）抗体
用いられる抗体は、検出及び／又は定量しようとするポリペプチド又はその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、特定のポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウス又はヒト由来のタンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【００８８】
前記抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、p.389-397、1992）、抗原となるタンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）に従って、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【００８９】
（４）測定及び判定
上記の方法で、肥満糖尿病モデルマウスから採取した検体と、正常なマウスから採取した検体との間で検出結果を比較し、正常個体に比べ発現量に変化が認められるポリペプチドは糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に関連すると判定することができる。
【００９０】
７．糖代謝異常改善物質の評価
本発明によって得られる肥満糖尿病モデルマウスは糖尿病治療薬、糖尿病予防薬、高脂血症治療薬、高脂血症予防薬、肥満治療薬、肥満予防薬、糖代謝異常改善物質及び／又は脂質代謝改善物質の作用の解明や評価、並びに、糖代謝異常改善物質及び／又は脂質代謝改善物質の試験や、評価及び／又はスクリーニングに有効である。以下、本マウスを用いた糖尿病治療薬、糖尿病予防薬、高脂血症治療薬、高脂血症予防薬、肥満治療薬、肥満予防薬、糖代謝異常改善物質及び／又は脂質代謝改善物質の試験方法、評価方法及び／又はスクリーニング方法について説明する。
【００９１】
（１）被験物質
本発明で用いる「被験物質」としては、既に、糖尿病治療薬、糖尿病予防薬、高脂血症治療薬、高脂血症予防薬、肥満治療薬、肥満予防薬として知られているものや糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常の改善効果が知られている物質、並びに、該効果が知られていない物質のいずれも用いることができる。以下、糖代謝異常改善効果が既に知られている物質（糖代謝異常改善物質）と該効果が未だ知られていない物質に分けて説明する。
【００９２】
（１−１）糖代謝異常改善物質
本発明で用いる糖代謝異常改善物質とは、糖代謝異常を改善する機能を有する物質であれば良いが、例えば、インスリン抵抗性改善剤を挙げることができる。インスリン抵抗性改善剤とは、糖尿病の治療に使用される薬剤をいい、インスリン抵抗性改善剤としては有効成分としてインスリン抵抗性改善剤を有する医薬組成物を挙げることができる。「インスリン抵抗性改善剤」は、インスリン受容体のシグナル伝達を増強することにより、インスリン作用の感受性を上げ、不足を補う作用メカニズムによりインスリン抵抗性を改善する薬剤であり、糖尿病用剤として使用される。そのようなインスリン抵抗性改善剤としては、例えば、
特開昭６０−０５１１８９公報に記載されたトログリタゾン（５−［４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イルメトキシ）ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特開昭６１−２６７５８０号公報（ＥＰ特許第１９３，２５６号公報又は米国特許第４，６８７，７７７号公報）に記載されたピオグリタゾン（５−[４−[２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）エトキシ]ベンジル]−２,４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特表平９−５１２２４９号公報（ＷＯ９５／２１６０８号公報又は米国特許第５，００２，９５３号公報）に記載されたロシグリタゾン（５−[４−[２−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ピリジルアミノ）エトキシ]ベンジル]−２,４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（マレイン酸塩等）、
ＷＯ００／８００２号公報に記載されたＧＩ−２６２５７０（化学名は、２（Ｓ）−（２−ベンゾイルフェニルアミノ）−３−[４−[２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ]フェニル]プロピオン酸）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＷＯ９５／１８１２５号公報（ＥＰ公開第６８４，２４２号公報又は米国特許第５，７２８，７２０号公報）に記載されたＪＴＴ−５０１（４−[４−[２−（５−メチル−２−フェニル−オキサゾール−４−イル）エトキシ]ベンジル−３,５−イソオキサゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＷＯ９９／６２８７２号公報（ＥＰ公開第１，０８４，１０３号公報又は米国特許第６，２５８，８５０号公報）に記載されたＡＺ−２４２（２−エトキシ−３−[４−[２−（４−メチルスルホニルオキシフェニル）エトキシ]フェニル]プロパン酸）及び、その薬理上許容される塩（ナトリウム塩等）、
特開平６−２４７９４５号公報（ＥＰ公開第６０４，９８３号公報又は米国特許第５，５９４，０１６号公報）に記載されたＭＣＣ−５５５（５−[６−（２−フルオロベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル]チアソリジン−２,４−ジオン）及び、その薬理上許容される塩、
ＷＯ９４／２５４４８号公報（ＥＰ特許第６９６，５８５号公報又は米国特許第５，６４３，９３１号公報）に記載されたＹＭ−４４０（（Ｚ）−１,４−ビス[４−（３,５−ジオキソ−１,２,４−オキサジアゾリジン−２−イルメチル]フェノキシ]−２−ブテンで）及び、その薬理上許容される塩、
特開平１０−８７６４１号公報（米国特許５，９４８，８０３号公報）に記載されたＫＲＰ−２９７（５−（２,４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−（４−トリフルオロメチルベンジル）ベンズアミド）及び及びその薬理上許容される塩、
特開昭６４−５６６７５号公報（ＥＰ特許第２８３０３５号公報又は米国特許第４，８９７，３９３号公報）に記載されたＴ−１７４（５−[２−（２−ナフチルメチル）−５−ベンズオキサゾリルメチル]−２,４−チアゾリジンジオン）及び薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特開平９−１００２８０号公報（ＥＰ公開第７８７７２５号公報又は米国特許第５，６９３，６５１号公報）に記載されたＮＣ−２１００（５−（７−ベンジルオキシ−３−キノイルメチル）−２,４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＷＯ９９／１９３１３号公報（米国特許６，０５４，４５３号公報）に記載されたＮＮ−６２２（（Ｓ）−３−[４−[２−（フェノキサジン−１０−イル）エトキシ]フェニル]−２−エトキシプロパン酸）及び、その薬理上許容される塩（ナトリウム塩等）、
ＷＯ０１／２１６０２号公報に記載されたＢＭＳ−２９８５８５（Ｎ−（４−メトキシフェノキシカルボニル）−Ｎ−[４−[２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）エトキシ]ベンジル]グリシン）であり、及びその薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＥＰ公開第７４５６００号公報に記載された５−[４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル]チアゾリジン−２,４−ジオン及びその薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
のようなオキサゾール化合物、オキサジアゾリジン化合物、チアゾリジン化合物又はフェノキサジン化合物を挙げることができる。
【００９３】
（１−２）糖代謝異常改善効果が知られていない物質
糖代謝異常改善効果が知られていない物質については、以下の方法によって糖代謝異常の改善効果を調べることができる。該効果を調べる対象となる物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体又はそれらの混合物等が挙げられる。また、特定の遺伝子の発現量を増加するように設計された核酸又はその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ等を含む）を、使用することも可能である。
【００９４】
（２）マウス、該マウス由来の組織又は細胞
本実験に用いるマウスは上記「３．飼育方法」の項に記載の方法によって、糖尿病を既に発症している肥満糖尿病モデルマウスの他に、未だ糖尿病を発症していないマウスも用いることができる。
【００９５】
糖尿病を既に発症しているマウスを用いて、被験物質を投与した場合と投与しなかった場合で、糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常が改善されていれば、被験物質は糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常の改善効果を有すると判断することができる。
【００９６】
また、糖尿病を発症していないマウスを高脂肪食で飼育する又はゴールドチオグルコースを投与して飼育する際に被験物質を同時に投与する場合と投与しない場合で比較して、被験物質を投与した場合に肥満、糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常が観察されない場合は、被験物質は肥満、糖代謝異常及び／又脂質代謝異常の予防物質となり得る。
【００９７】
これらは、マウス個体に被験物質を投与して、その後該動物個体の体重を測定する方法、該動物個体から摘出されたその臓器又は組織細胞におけるポリヌクレオチドの発現量及び／又はポリペプチドの発現量を調べる方法、血中や尿中のグルコース濃度、ヘモグロビンの糖化率、血漿中総コレステロール濃度、血漿中遊離脂肪酸濃度、血漿中中性脂肪濃度、血中インスリン濃度、血中レプチン濃度、及び血中アディポネクチン濃度から選択される少なくともいずれか一つを調べる方法のいずれかの方法又はこれらの方法の組み合わせによって調べることができる。なお、ここで被験物質とは上記、（１−１）又は（１−２）に記載した物質をいう。検体としては、血液や分析対象とする臓器又は組織であれば、特に制限はないが、好ましくは血液、膵臓、小腸、肝臓、筋肉、及び、白色脂肪細胞を含む脂肪組織、から選択される少なくともいずれか一つを含むものである。
【００９８】
マウス、マウス組織又はマウス由来細胞由来の全ＲＮＡの抽出、ポリヌクレオチドの発現量の測定、ポリペプチドの発現量の測定については、上記した方法に従って行うことができる。
【００９９】
（３）  被験物質の糖代謝及び／又は脂質代謝に対する影響
以下、マウス個体を用いる場合及びマウス由来組織を用いる場合についてそれぞれ説明するが、本発明は被験物質の糖代謝／及び又は脂質代謝に対する影響を調べることができる限りにおいてこれらの方法に制限されない。
【０１００】
本方法におけるポリヌクレオチドの検出、ポリヌクレオチドの発現量の測定、ポリペプチドの検出、ポリペプチドの発現量の測定、インスリン濃度、グルコース濃度、総コレステロール濃度、遊離脂肪酸濃度、及び中性脂肪濃度の測定は上述の方法によって行うことができる。
【０１０１】
なお、以下の方法において発現量の測定の対象になるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドとしては、糖代謝及び／又は脂質代謝に関連することが分かっており、発現量の変化と糖代謝及び／又は脂質代謝の改善効果に関連があることが明らかになっているものを用いることが好ましい。このようなものとしては例えば、糖新生の律速酵素であるグルコース6-ホスファターゼ、フルクトース-1,6-ビスフォスファターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼあるいはホスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼや、糖取り込みにかかわるグルコーストランスポーターや、中性脂肪合成にかかわるグリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼあるいはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼや、脂肪酸合成にかかわるアシルCo-Aシンターゼ、アシルCo-Aカルボキシラーゼあるいは脂肪酸シンターゼや、脂肪分解にかかわるリポプロテインリパーゼ、ホルモン感受性リパーゼや、脂肪酸酸化にかかわるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼあるいはアシルCo-Aオキシダーゼや、脂肪組織から放出されるホルモンである、TNF-αあるいはアディポネクチンや、インスリン情報伝達にかかわるインスリン受容体あるいはインスリン受容体基質などの蛋白質及び又はその遺伝子を挙げることができるが、これらに制限されない。
【０１０２】
以下、糖尿病治療薬、糖尿病予防薬、高脂血症治療薬、高脂血症予防薬、肥満治療薬、肥満予防薬、糖代謝異常改善物質及び／又は脂質代謝改善物質の試験方法、評価方法及び／又はスクリーニング方法を具体的に説明する。
【０１０３】
Ａ）マウス個体を用いる場合
Ａ−１）以下の工程、１）及び２）を含む：
１）肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、血中インスリン値、経口糖負荷試験での血糖値、血中中性脂肪濃度、及びランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【０１０４】
Ａ−２）以下の工程１）乃至２）を含む：
１）肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量及びインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【０１０５】
Ａ−３）以下の工程１）及び２）を含む：
１）肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）被験物質を投与されたマウスの体重、血糖値、血中インスリン値、経口糖負荷試験での血糖値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、及びランゲルハンス島のインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【０１０６】
Ａ−４）以下の工程１）及び２）を含む：
１）肥満糖尿病モデルマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織におけるトリグリセリド含量、インスリン含量及びインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【０１０７】
Ａ−５）  以下の工程１）及び３）を含む：
１）肥満糖尿病モデルマウスに被験物質を投与する工程；
２）被験物質を投与したマウスの体重、血糖値、血中インスリン値、血中中性脂肪濃度、、ランゲルハンス島のインスリン含量、及びランゲルハンス島のインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）体重の低下、血糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、及び血中中性脂肪濃度の低下から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【０１０８】
Ａ−６）  以下の工程１）乃至２）を含む：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、血中インスリン値、経口糖負荷試験での血糖値、血中中性脂肪濃度、及びランゲルハンス島のインスリン含量もしくはインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
【０１０９】
Ａ−７）  以下の工程１）乃至３）を含む：
１）C57BL/6マウス、129/Jマウス、MA/Jマウス、BALB/cマウス及びAKR/Jマウスから選択されるマウスと、DBA/2マウス、C57BL/KsJマウス、SWR/Jマウス、CBA/LTマウス、C3HeB/FeJマウス、ICR (CD1)マウス及びFVB/NJマウスから選択されるマウスに被験物質を投与して、高脂肪食で飼育する工程；
２）１）のマウスの体重、血糖値、血中インスリン値、経口糖負荷試験での血糖値、血中中性脂肪濃度、ランゲルハンス島のインスリン含量、及びランゲルハンス島のインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程。
３）体重の低下、血糖値の低下、血中インスリン濃度の上昇、及び血中中性脂肪濃度の低下から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【０１１０】
Ａ−８）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質を投与したマウスより採取した検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）１）由来の全ＲＮＡと被験物質を投与しなかった動物より採取した検体より得た全ＲＮＡの間における、ポリヌクレオチドの発現量の差を検出する工程；
３）２）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常改善効果を判定する工程。
【０１１１】
Ａ−９）以下の工程１）及び２）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体における、ポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する工程；
２）１）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体から採取した検体における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進又は抑制効果を判定する工程。
【０１１２】
Ａ−１０）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した検体中の全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記固相化ポリペプチドにおける、ポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する工程；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した検体中における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進又は抑制効果を判定する工程。
【０１１３】
Ｂ）マウス組織を用いる場合
Ｂ−１）  以下の工程１）乃至４）を含む：
１）糖尿病を発症しているマウス由来の組織と被験物質を接触させる工程；
２）１）の組織における、トリグリセリド含量、インスリン含量及びインスリン分泌能から選択される少なくともいずれか一つを測定する工程；
３）トリグリセリド含量の低下、インスリン含量の低下、及びインスリン分泌能の上昇から選択される少なくともいずれか一つが観察された被験物質を選択する工程。
【０１１４】
Ｂ−２）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質とマウス由来組織を接触させる工程；
２）１）の組織より全ＲＮＡを抽出する工程；
３）２）由来の全ＲＮＡと被験物質と接触させなかったマウス組織より得た全ＲＮＡの間における、ポリヌクレオチドの発現量の差を検出する工程；
３）２）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常改善効果を判定する工程。
【０１１５】
Ｂ−３）以下の工程１）及び２）を含む：
１）被験物質とマウス由来組織を接触させる工程；
２）被験物質と接触させた組織における、ポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する工程；
３）２）で測定されたポリペプチドの発現量と、被験物質と接触させなかったマウス由来組織における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常改善効果をを判定する工程。
【０１１６】
Ｂ−４）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質とマウス由来組織を接触させる工程；
２）１）の組織由来の全ポリペプチドを固相化する工程；
３）上記固相化ポリペプチドにおける、ポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて検出する工程；
４）３）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質と接触させなかったマウス由来組織における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常改善効果をを判定する工程。
【０１１７】
（４）評価
上記の方法によって被験物質の肥満、糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に対する改善効果及び／又は予防効果を調べることができる。本方法によって肥満、糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に対する改善効果及び／又は予防効果が見出された物質は糖尿病治療薬、糖尿病予防薬、高脂血症治療薬、高脂血症予防薬、肥満治療薬、肥満予防薬、糖代謝異常改善物質及び／又は脂質代謝改善物質となり得る。
【０１１８】
８．糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常改善剤及び予防剤
上記、「７．糖代謝異常改善物質の評価」の項目に記載の方法で本発明の方法によって取得された、肥満、糖代謝異常及び／又は脂質代謝異常に対する改善効果及び／又は予防効果を有する物質を糖代謝と関連する疾患、例えば、糖尿病、及び／又は高脂血症もしくは肥満症等の脂質代謝異常の治療剤及び／又は予防剤として用いる場合には、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【０１１９】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０１２０】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Mannino et al.,Biotechniques,1988,6,682;Blume and Cevc,Biochem.et Biophys.Acta,1990,1029,91;Lappalainen et al.,Antiviral Res.,1994,23,119;Chonn and Cullis,Current Op.Biotech.,1995,6,698 ）。
0 .2-0 .4 μｍ のサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Fraley et al.,Trends Biochem.Sci.,1981,6,77 ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８ の炭素原子、特に１６ −１８ の炭素原子を含有し、飽和している（１４ −１８ の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０１２１】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Morishita et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.),1993,90,8474 ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ ；Ｆ （ａｂ'）2 ）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤（例えば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドとその他の薬剤）は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０１２２】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、注射の場合には、１回当り下限０．１mg（好適には、５mg）、上限１０００mg（好適には、５００mg）を皮下注射、筋肉注射又は静脈注射によって投与することができる。
【実施例】
【０１２３】
以下に実施例を記載し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明をこれらの実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、糖、インスリン、レプチン、DNAの定量に関しては、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。なお、糖、総コレステロール及び中性脂肪の濃度は、慣例に従い、デシリットルあたりで表記した。
【０１２４】
（実施例１）  マウスのストレインによる高脂肪食飼育での肥満形成程度の違い
7週齡の雄性C57BL/6NマウスとDBA/2Nマウス（日本チャールズリバーより購入）、及びC57BL/KsJ（+m/+m）マウス（日本クレアより購入）に高脂肪食（船橋農場製FR-2粉末飼料75 gに対してラード（ROTTERDAMSCHE MARGARINE INDUSTRIE社製）を25 gの割合で加えたもの）を与えて飼育し、その後の肥満の形成を12週間にわたって検討した（各群ともに16匹）。高脂肪食開始時点での平均体重が異なるため（C57BL/6N: 19.0 g、DBA/2N:22.8 g、C57BL/KsJ: 21.6 g）、開始後の体重増加分をもって比較を行った。結果を図1に示す。C57BL/6Nマウスは最も体重増加が著しく、12週間にわたって体重が増加し、12週目で平均23.4gの体重増加を示した。一方、DBA/2Nマウスの体重増加は、8摂餌週で15.1gに達したが、その後の体重増加は少なく、12週目でも15.9gであり、12摂餌週ではC57BL/6マウスに対して7.5 gの体重差が形成された。C57BL/KsJマウスは、体重の増加が最も鈍く、12週間で9.6 gしか増加しなかった。以上の結果より、C57BL/6Nマウスは、高脂肪食飼育によって肥満しやすいが、DBA/2NマウスとC57BL/KsJマウスは肥満しにくいことが明らかとなった。
【０１２５】
なお、DBA/2Nマウスについては、21摂餌週（体重41.7 g）まで高脂肪食飼育を行ったが、糖尿病は発症しなかった。
【０１２６】
（実施例2）  BDF1マウスにおける高脂肪食飼育による肥満の発症
高脂肪食飼育により肥満を形成しやすいC57BL/6マウスと、糖尿病になりやすいDBA/2マウスの両方の形質を持つと予想されるBDF1マウスに高脂肪食を与え、肥満による糖尿病の発症を検討した。
【０１２７】
メスC57BL/6マウスとオスDBA/2マウスのF1雑種[(C57BL/6N x DBA/2N): F1] である7週齡の雄性BDF1マウス（日本チャールズリバーより購入）に通常食（FR-2ペレット、船橋農場製）を与えた群（16匹）及び高脂肪食を与えた群（16匹）について、肥満の形成及び糖尿病の発症を14週間にわたって検討した。
【０１２８】
両群の平均体重の変化を図2Aに示す。高脂肪食群の体重は実験を開始してから8摂餌週まで著明に増加し、通常食群に比べて約10 ｇ多かった。その後は両群ともにほぼ同じ速度で体重が増加し、実験を開始してから14週間目（14摂餌週）でも両群の体重差は約10 gのままであった。肥満による体脂肪の増加を確認するため、14摂餌週において各種組織重量を測定した（図2B）。高脂肪食群において腸間膜脂肪（内臓脂肪）及び鼠径部皮下脂肪（皮下脂肪）が著しく増加した。また、肝重量も著しく増大し、通常食飼育での肝臓と比較して外観は白色を呈しており、脂肪肝の存在が強く示唆された。
【０１２９】
（実施例3）  BDF1マウスとにおける高脂肪食飼育による糖尿病の発症
（1）マウスの飼育及び血漿、尿及び組織の取得
7週齡の雄性BDF1マウスに実施例1と同じように通常食を与えた群及び高脂肪食を与えた群について、糖尿病の発症を14週間にわたって検討した。採尿、及び採血は自由摂食下で朝9時から10時30分の間に実施した。
【０１３０】
ヘパリン処理ヘマトクリット管（HIRSCHMANN LABORGERATE社製）を用いてマウスの尾静脈から血液を採取し、血液を10000 rpmにて5分間の遠心分離をして血漿を調製し、凍結保存した。尿は排尿直後の自発尿を採取し凍結保存した。組織重量測定には、動物をエーテル麻酔下にて断頭し、各種脂肪組織と肝臓を摘出し、それらの湿重量を測定した。
【０１３１】
（2）血糖値及び尿糖値の測定
マウス血漿中の血糖値及び尿糖値をグルコースCII-テストワコー（和光純薬社製）を用いてムロターゼ・GOD法によって測定した。実験開始後の個体別及び、平均血糖値の変化を図3Aに示す。
【０１３２】
高脂肪食群において、8摂餌週から301 mg/dlという高血糖を呈する個体が出現し、8摂餌週以降14摂餌週まで血糖値は通常食群に比べ統計学的に有意に上昇した。14摂餌週における通常食群の血糖値は179±19mg/dl（mean ± SD）であったが、高脂肪食群では16例中13匹（81%）が250 mg/dl以上の血糖値を示し、500 mg/dl前後の著しい高血糖を示す個体も現れた。14摂餌週における個体別の尿糖値と血糖値の関係を図3Bに示す。14摂餌週における通常食群での尿糖値は13.2±5.0 mg/dl (mean±SEM)であり、30 mg/dlを上回る個体はいなかった。高脂肪食群の尿糖値は血糖値と正の相関を示し、最大で約10000 mg/dl前後の著しい高値を示した。測定を行った動物の73％（例数11/15）が30 mg/dl以上の尿糖値を示した。また、持続的な高血糖状態を反映すると考えられている赤血球糖化ヘモグロビン（HbA1c）率は、高脂肪食群では14摂餌週において統計学的に有意な上昇が認められた（図3C）。
【０１３３】
高脂肪食群の体重と血糖値の関係を図3Dに示す。体重が20 gから約47 gの間の個体では血糖値に大きな変化はなかったが、体重が約48-50 gを超えた個体では血糖値の急激な上昇を示し、高血糖の発症には体重が関係していた。このことは、体重が47 g以下での糖尿病を伴わない単純性肥満期が存在し、さらに体重が約48-50 gでは、肥満依存的糖尿病期が存在し、両方の期間が明確に分離されて存在することを示している。ヒトの肥満症でも、耐糖能正常の肥満から耐糖能異常へ、さらには糖尿病へ移行していくことが知られており、高脂肪食飼育のBDF1マウスにおける肥満・糖尿病の表現形は、ヒトでの表現形に類似した肥満から2型糖尿病へ進展するモデルであると考えられる。
【０１３４】
（3）血漿中のインスリン濃度
血漿中のインスリン濃度をマウスインスリンを標準品に用いて超高感度ラットインスリン測定キット（生化学工業）にて測定した。血漿中レプチン濃度はマウスレプチン測定キット（生化学工業）にて測定した。
【０１３５】
血漿中のインスリン濃度は高脂肪食群及び通常食群ともに経時的に上昇していたが、高脂肪食群でより顕著に上昇していた。血漿中レプチン濃度は両群ともに体重に応じて増加していた(表１)。
【０１３６】
【表１】
2005110632.tif 000002
（4）血漿中の脂質濃度
血漿中の総コレステロール濃度をコレステロールCII-テストワコー（和光純薬社製）で測定した。また、血漿中遊離脂肪酸濃度をNEFA C-テストワコー（和光純薬社製）で測定した。また、血漿中中性脂肪濃度はGPO-TRINDER (SIGMA社)を用いて測定した。
【０１３７】
8摂餌週以降では、高脂肪食群においては、通常食群に比べ、血漿中総コレステロール濃度は上昇していたが、血漿中中性脂肪濃度は減少していた（表2）。なお、血漿中総コレステロール濃度の上昇と血漿中中性脂肪濃度の減少は血糖値の上昇が観察される前に観察された。一方、血漿中遊離脂肪酸濃度は、餌の種類にかかわらず変化していなかった。
【０１３８】
【表２】
2005110632.tif 000003
（実施例4）  高脂肪食で飼育したBDF1マウスにおける糖尿病での糖負荷試験時の耐糖能とインスリン分泌の解析
（1）糖尿病発症マウスと非糖尿病マウスの選択
高脂肪食で14−18週間飼育したマウスのうち、給餌条件下で血糖値が300 mg/dl以上の値を示すマウスを糖尿病を発症したマウス（糖尿病マウス）とし、それ以下のマウスを非糖尿病マウスとした。
【０１３９】
（2）耐糖能の測定
14-18摂餌週のBDF1マウスを用いて耐糖能を測定した。通常食飼育BDF1マウス（通常食群、7匹）と高脂肪食飼育で糖尿病を発症したBDF1マウス（高脂肪食・糖尿病群：  給餌条件下平均血糖値は440 mg/dl、7匹）と高脂肪食飼育で糖尿病症状の認められなかったBDF1マウス（高脂肪食・非糖尿病群：  給餌条件下平均血糖値は225 mg/dl、6匹）の３群に分けて実験を行った。マウスを1晩絶食したのち，グルコース溶液（500 mg/ml）を2.0 g/kgの用量で経口投与（4.0 ml/kg）し，投与後0、10、15、30、45、60分経過後に尾静脈より採血を行った。血液を10000 rpmにて5分間遠心分離して血漿を分離した。
【０１４０】
血漿中グルコース濃度はグルコースCII-テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。血漿中インスリン濃度は超高感度ラットインスリン測定キット（生化学工業社）を用いて測定した。
【０１４１】
高脂肪食・非糖尿病群と通常群の糖負荷30分後及び60分後の血糖値は、それぞれ、373±40及び408±53 mg/dl (mean±SEM)と378±33及び360±42 mg/dl (mean±SEM)で有意差は認められず、高脂肪食・非糖尿病群では、通常食群とほぼ同等の耐糖能が維持されていた。一方、高脂肪食・糖尿病群においては、通常食群に比べて経口糖負荷後の血糖値が著明に上昇し（糖負荷30分後及び60分後の血糖値は、610±37及び678±37 mg/dl(mean±SEM)でP値は0.0012及び0.0013）、耐糖能の異常が明確に表れた（図4A）。血漿中インスリン濃度は、BDF1の全食餌群において糖負荷後に増加した（図4B）。しかし、高脂肪食・非糖尿病群では著明なインスリン分泌の亢進が認められたが、高脂肪食・糖尿病群では高脂肪食・非糖尿病群に比べ、インスリン分泌は明らかに低下していた。経口糖負荷後の60分間における、血糖値のAUC（Area Under the Curve：濃度変化曲線における曲線下面積）と血漿中インスリン濃度のAUCの関係は負の相関を示し、耐糖能が悪い個体ほどインスリン分泌能が低いことが明らかとなった（図4C）。
【０１４２】
これらの結果より、肥満・糖尿病BDF1マウスで認められた血糖値上昇は、肥満によるインスリン抵抗性の悪化に対処するために増加していたインスリン分泌が低下したことが原因で、代償性インスリン分泌不全の状態にあると考えられた。
【０１４３】
この高脂肪食性肥満BDF1マウスで認められた代償性インスリン分泌亢進の不全による糖尿病発症は、ヒトにおける肥満から2型糖尿病の発症機序によく類似している。すなわち、ヒトでも肥満が形成されるとインスリン抵抗性が惹起され、代償性に高インスリン血症が発症する。その後、ランゲルハンス島のインスリン分泌細胞の疲弊によりインスリン分泌が低下し、相対的なインスリン不足に陥り糖尿病が発症すると考えられている(Cavaghan MK et al., J Clin Invest, 106:329-333, 2000)。
【０１４４】
今回示された高脂肪食・肥満糖尿病BDF1マウスでの代償性インスリン分泌不全の機序としては、膵β細胞内インスリン含量の低下と糖誘発性インスリン分泌能の低下が重要と考えられた。
【０１４５】
（実施例5）  高脂肪食で飼育したBDF1マウスにおける糖尿病でのインスリン含量及びインスリン分泌能の測定
（1）ランゲルハンス島の単離
14摂餌週のBDF1マウスを屠殺後，膵臓を総胆管から2.5 mlのコラゲナーゼ液[4 mg/mlのタイプXIコラゲナーゼ (SIGMA)、及び2 mg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)を含むHBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)]にて灌流して摘出し、37℃にて3分30秒間インキュベートした。30 mlのアルブミン溶液（2 mg/mlのBSAを含むHBSS）にて組織を懸濁し、2分間氷上静置後に上清を除き、実体顕微鏡下でランゲルハンス島を単離して回収した。
【０１４６】
（２）インスリン含量の測定
14摂餌週のBDF1マウスより採取したランゲルハンス島を用いて、インスリン含量の測定を行った。
【０１４７】
高脂肪食・糖尿病群のランゲルハンス島には通常食群に比べて肥大化したランゲルハンス島が多数存在していたため（図6）、ランゲルハンス島DNA含量を測定してインスリン含量を除することで、ランゲルハンス島に含まれる細胞数の違いを補正した。高脂肪食・糖尿病群のランゲルハンス島インスリン含量の平均は2.3 ng/ng DNAであり、通常食群の平均（6.0 ng/ng DNA)に比べて有意に低値を示していた（図5）。このとき、高脂肪食条件下でも糖尿病を発症しなかった2例は通常食群と同等のインスリン含量を示した。
【０１４８】
（３）インスリン分泌量の測定
in vitroにおける単離ランゲルハンス島のインスリン分泌試験には，Krebs-Ringer bicarbonate緩衝液（KRB緩衝液： 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.2%のBSAを含む）を用いた。14摂餌週のBDF1より採取したランゲルハンス島を5.6 mMグルコース含有KRB緩衝液にて30分間37℃でプレインキュベートした後、5.6、11.1もしくは 22.2 mMグルコース含有KRB緩衝液及び5.6 mMグルコース含有・高カリウムKRB緩衝液（85 mM NaCl, 48.8 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.4, 0.2%のBSAを含む）にて60分間37℃でインキュベートし、上清を0.5% BSA溶液で希釈して、超高感度ラットインスリン測定キット（生化学工業）を用いてインスリン濃度を測定した。
【０１４９】
実験に用いたランゲルハンス島を30秒間超音波破砕し（Handy Sonic, 出力10）、PicoGreen DNA quantitation kit (Molecular Probe)を用いてDNA濃度を測定した。ランゲルハンス島の大きさの違いによる影響を除くため，インスリン分泌量をランゲルハンス島DNA含量で除すことにより細胞数の違いを補正した。
【０１５０】
in vitroのグルコース刺激実験においては、通常食群から採取したランゲルハンス島ではグルコース濃度の上昇に伴ってインスリン分泌が活性化されるのに対し、高脂肪食・糖尿病群のランゲルハンス島は異なった反応を示し（繰り返し測定分散分析 P=0.025）、11.1mMグルコース刺激までは通常食群と同等の反応を示したが、22.2 mMグルコース刺激ではインスリン分泌はむしろ低下していた（図6）。
【０１５１】
（実施例6）  ランゲルハンス島におけるインスリン陽性細胞
（1）発色反応
15摂餌週のマウスから摘出した膵臓をブアン溶液（飽和ピクリン酸：ホルマリン：酢酸 = 15 : 5 : 1）を用いて4℃で4時間固定し、エタノールで脱色したのちに常法に従ってパラフィン包埋した。3 μm厚に薄切した連続切片を100％キシレン（5分，2回）、100%エタノール（5分，2回）にて脱パラフィンを行った。乾燥後に0.3%過酸化水素水で30分間、次いで5%BSA含有リン酸緩衝生理食塩水で30分間ブロッキングを行った。
【０１５２】
一次抗体としてラビット抗インスリン（H-86）抗体（Santa Cruz, SC-9168，希釈率1/300）及びラビット抗グルカゴン抗体（Zymed, 18-0064, 希釈率1/1000）を用い、上記の連続切片を4℃で一晩インキュベートした。2次抗体としてはビオチン化抗ラビットIgG （Vector, BA-1000, 希釈率1/200）を用い、連続切片を室温で1時間反応させた。その後、horse radish peroxidase標識avidin-biotin複合体（Vector, Vectastain, PK-6100）と室温で45分間反応させ、AEC （Zymed, 00-2007）を用いて連続切片を発色させた。
【０１５３】
（2）ランゲルハンス島の免疫組織化学的分析
通常食群のマウスのランゲルハンス島に認められる通常サイズのランゲルハンス島（直径約150 μm）では、強く染色されるインスリン陽性細胞とその外周部に点在するグルカゴン陽性細胞が観察され、マウスランゲルハンス島に特有の細胞局在を示した（図7のAとB）。高脂肪食・非糖尿病群での通常サイズのランゲルハンス島の染色像は通常食群と同様であり、また肥大したランゲルハンス島が多く観察されたが、インスリン陽性細胞とグルカゴン陽性細胞の局在パターンは通常食の場合と同じであった（図7のEとF）。一方で高脂肪食・糖尿病群では、通常サイズのランゲルハンス島と多数の肥大化したランゲルハンス島においてインスリン染色性の低下したβ細胞が観察され（図7のGとI）、同時に多数のグルカゴン細胞がランゲルハンス島内部に認められ、ランゲルハンス島におけるインスリン陽性β細胞とグルカゴン陽性α細胞の局在は明らかに通常食群や高脂肪食・非糖尿病群の場合と異なっていた（図7のHとJ）。
【０１５４】
ヒトの単純性肥満など、耐糖能異常を伴わないインスリン抵抗性状態では、インスリン抵抗性はランゲルハンス島の肥大（β細胞の増殖）によって補償されていると考えられている(Kloppel G et al., Surv Synth Pathol Res, 4:110-125, 1985)。
【０１５５】
本実験では肥満BDF1マウスのランゲルハンス島は通常食飼育DBF1マウスに比べて著明に肥大化し、β細胞の増殖が観察された。しかし、糖尿病発症マウスの肥大化したランゲルハンス島ではインスリン免疫反応性の低下したβ細胞が多数認められ、インスリン合成機能が低下している可能性が示唆された。本モデルマウスのβ細胞は、ヒト2型糖尿病で想定されているβ細胞疲弊の状態に相当すると考えられた。
【０１５６】
（実施例7）  高脂肪食で飼育したC57BL/6マウスにおける肥満と糖尿病の有無
BDF1マウスで観察された高脂肪食肥満による糖尿病の発症が、C57BL/6マウスでも観察されるか否かを検討した。BDF1マウスでの糖尿病は、高脂肪食での12週間飼育と一定の体重（約48 gから50 g）を超過した肥満の場合に認められたため、両方の条件を満たす高脂肪食飼育18摂餌週にて平均体重約50 gのマウスを用いて実験した。高脂肪食群の平均体重は50.1 gに達し、通常食群に比べて約15 g重い著明な肥満を呈していた。C57BL/6マウスは、BDF1マウスに比べて体長が短く（高脂肪食14摂餌週にてC57BL/6 マウスの平均体長は102 mmであり、BDF1マウスは 107 mmであった）、同体重のBDF1マウスと比べてより高度な肥満状態にあると考えられる。
【０１５７】
高脂肪食で飼育したC57BL/6マウスの血糖値は通常食群に比べてわずかに高い程度であり、糖尿を示す個体は1例も見られなかった（表3）。血中インスリン濃度は、高脂肪食群で通常食群の約9倍と著しく上昇していた。
【０１５８】
【表３】
2005110632.tif 000004
OGTTを実施して耐糖能を測定した。１晩絶食後の血糖値は、高脂肪食群でわずかではあるが有意に高いものの、糖負荷後の血糖値は両群間で明らかな差はなく、高脂肪食肥満C57BL/6マウスは良好な耐糖能を示した(図8A)。糖負荷後のインスリン分泌は両群共に上昇したが、その変化は高脂肪食群で著しく、高いインスリン分泌能によって耐糖能が維持されていることが示された(図8B)。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】高脂肪食負荷による肥満形成のマウスストレインによる違いを示す図。白丸はC57BL/6マウス、黒四角はDBA/2マウス、灰色三角はC57BL/KsJマウスをあらわす。データは平均値±標準誤差（n=16)。*P<0.05、**P<0.001（DBA/2とC57BL/KsJそれぞれのC57BL/6に対する比較）。
【図２】BDF1マウスにおける高脂肪食により誘導される肥満を示す図。(A) 通常食（白丸）もしくは高脂肪食（黒丸）にて飼育した場合の体重変化を示す。各点は平均値±標準誤差（n=16）。 (B) 通常食（白カラム）もしくは高脂肪食（黒カラム）にて14週間飼育した場合の脂肪組織[性腺周囲脂肪(EPI), 腸間膜脂肪 (MES), 鼠径部皮下脂肪 (ING), 褐色脂肪 (BAT)]と肝臓の重量を示す。データは平均値±標準誤差（n=8）。*P<0.05, **P<0.001 （通常食に対する比較）。
【図３】BDF1マウスにおいて高脂肪食により誘導される糖尿病を示す図。 (A)個体別(通常食は白丸、高脂肪食は黒丸）及び、群別（通常食は点線、高脂肪食は実線）血糖値を示した。*P<0.05, **P<0.001 （高脂肪食飼育と通常食飼育との比較）。(B) 各マウスの血糖値と尿糖値の相関を示した（白丸は通常食飼育マウス、黒丸は高脂肪食飼育マウス）。
【０１６０】
(C) ヘモグロビン A1c （HbA1c）濃度を示した。値は平均値±標準誤差（n=16）。 (D)高脂肪食で飼育した場合のマウスの体重と血糖値の相関を示した。高脂肪食で飼育した期間は次のとおり：白丸は0週、灰色のダイアモンドは8週、黒三角は12週、アスタリスクは14週。
【図４】14摂餌週の時点でのBDF1マウスでの経口糖負荷試験を示す図。グルコース経口投与後の血糖値（A）、血中インスリン値（B）を示した。高脂肪食・糖尿病(n=7)は黒丸、高脂肪食・非糖尿病(n=6)は灰色三角、通常食(n=7）は白丸で示し、データは平均値±標準誤差を表す。 *P<0.05, **P<0.001 （高脂肪食・糖尿病 もしくは 高脂肪食・非糖尿病 と 通常食の比較）, †P<0.05 （高脂肪食・非糖尿病 と 高脂肪食・糖尿病の比較）。
【０１６１】
(C) 高脂肪食飼育マウスでの血糖値のAUCと血中インスリン値のAUCの相関を示した。
【図５】単離ランゲルハンス島内のインスリン含量を示す図。高脂肪食にて飼育した群は非糖尿病個体（灰色の丸）と糖尿病個体（黒丸）に分けて表した。各個体の値に加え、通常食群及び高脂肪食群の平均値と標準誤差も示した（例数は8）。*P<0.05 (高脂肪食 vs 通常食).
【図６】14摂餌週の時点での単離ランゲルハンス島からのインスリン分泌を示す図。通常食群は白カラム、高脂肪食群は黒カラムで表した。ランゲルハンス島をインキュベートした溶液中の糖とKClの濃度を図中に示した。値は平均値±標準誤差（6匹のマウスより得られた値）。  *P<0.05 (高脂肪食と通常食の比較).
【図７】ランゲルハンス島の免疫組織染色を示す図。抗インスリン抗体 (A, C, E, G, I) と抗グルカゴン抗体(B, D, F, H, J)を用いて膵臓組織を染色した。通常食で飼育したマウス（通常食）のランゲルハンス島（AとB）、もしくは高脂肪食で飼育し糖尿病を発症していないマウス（高脂肪食・非糖尿病）のランゲルハンス島（C, D, E, F）、そして高脂肪食で飼育し糖尿病を発症したマウス(高脂肪食・糖尿病)のランゲルハンス島 (G, H, I, J) を示した。スケールは 100 mm。
【図８】C57BL/6 マウスでの経口糖負荷試験を示す図。グルコース経口投与後の、血糖値（A）とインスリン値（B）を示した。白丸は通常食群、黒丸は高脂肪食群を表し、値は平均値±標準誤差を示す（例数は8）。  *p<0.05, **p<0.001 (通常食群と高脂肪食群の比較)。
【図１】
2005110632.tif 000005
【図２】
2005110632.tif 000006
【図３】
2005110632.tif 000007
【図４】
2005110632.tif 000008
【図５】
2005110632.tif 000009
【図６】
2005110632.tif 000010
【図７】
2005110632.tif 000011
【図８】
2005110632.tif 000012