(57)【要約】【課題】本発明は、有用な特定物質を高含有量で生産できるような特異的な変異株効率的に生産する方法を提供することにある。【解決手段】  本発明の突然変異体の生産方法は、化学的突然変異原を微生物へ適用し、前記微生物の突然変異体を得て、得られた前記突然変異体を薬剤存在下で培養することにより得ることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学的突然変異原を微生物へ適用し、前記微生物の突然変異体を得て、得られた前記突然変異体を薬剤存在下で培養することにより得ることを特徴とする突然変異体の生産方法。
【請求項２】
化学的突然変異原が、エチルメタンスルホン酸（EMS）、N―メチルーN−ニトロソ尿素(MNU)、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシアミン、N-mechiru−N’-ニトロソグアニジン（MNNG）からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記化学的突然変異原を、前記微生物に対して６０〜１２０分間処理する請求項１又は2項に記載の方法。
【請求項４】
前記化学的突然変異原を、微生物の生残率が２０〜４０％になるまで処理する請求項１又は2項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、脂肪酸合成関連酵素の阻害剤である請求項1〜４項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、セルレニン、キザロフォフ、クロロスルフロンからなる群から選択される少なくとも1種である請求項５項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤の存在下、さらに微生物の生残率が０．１〜１．０％となるまで培養する請求項１〜６項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤の濃度が、５０〜１５０μMである請求項１〜７項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、ナンノクロロプシスである請求項１〜８項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９項のいずれか1項に記載の方法によって得られる突然変異体。
【請求項１１】
以下の(ａ)、又は(ｂ)からなる核酸。
(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１―10で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−10の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項１２】
以下の(ａ)、又は(ｂ)からなる核酸。
(ａ)配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−16で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−16の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【請求項１３】
請求項１１又は１２項に記載の核酸からなるプローブ。
【請求項１４】
請求項１３記載のプローブを用いて、RAPD分析することによって突然変異株を検出する突然変異株の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異株、突然変異株の生産方法、核酸、当該核酸からなるプローブ、及び突然変異体の検出方法に関し、特に、微生物に関する突然変異体、突然変異体の生産方法、核酸、当該核酸からなるプローブ、及び突然変異体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚介類の種苗生産において用いられる微細藻類のうち、珪藻の一種（Phaeodactylum tricornutum）において変異原で処理することによって、EPA含有量の多い変異株が誘導されることが知られている(Lopez Alonso D, Segura del Castillo C I., Grima E M, CohenZ(1996) First insight into improvement of eicosapentaenoic acid content in phoeodactylium tricornutum(Bacillariophyceae) by induced mutagenesis, Journal of Phycology 32:339-345.)。
【０００３】
【非特許文献１】(Lopez Alonso D, Segura del Castillo C I., Grima E M, CohenZ(1996) First insight into improvement of eicosapentaenoic acid content in phoeodactylium tricornutum(Bacillariophyceae) by induced mutagenesis, Journal of Phycology 32:339-345.)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の処理方法によれば、親株を変異原処理した後、生残した細胞から生じたコロニーの選別に特定の処理を行なわず無作為に行なっていたので、EPAなどの目的とする物質の含有量が極めて低いという問題を生じていた。
したがって、目的とする物質をより高く生産し得るコロニーのみを選別し得る方法が望まれていた。しかしこのような方法はこれまで存在しない。
【０００５】
そこで、本発明は、有用な特定物質を高含有量で生産できるような特異的な変異株効率的に生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、発明者らは、特定の阻害剤に着目し、適当な変異原との組み合わせ等について鋭意研究を重ねた結果、本発明の突然変異株の生産方法を見出すに至った。
【０００７】
すなわち、本発明の突然変異株の生産方法は、化学的突然変異原を微生物へ適用し、前記微生物の突然変異体を得て、得られた前記突然変異体を薬剤存在下で培養することにより得ることを特徴とする。
【０００８】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、化学的突然変異原が、エチルメタンスルホン酸（EMS）、N―メチルーN−ニトロソ尿素(MNU)、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシアミン、N-mechiru−N’-ニトロソグアニジン（MNNG）からなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記化学的突然変異原を、前記微生物に対して60〜120分間処理することを特徴とする。
【００１０】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記化学的突然変異原を、微生物の生残率が20〜40％になるまで処理することを特徴とする。
【００１１】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記薬剤が、脂肪酸合成関連酵素の阻害剤であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記阻害剤が、セルレニン、キザロフォフ、クロロスルフロンからなる群から選択される少なくとも1種であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記薬剤の存在下、さらに微生物の生残率が０．１〜１．０％となるまで培養することを特徴とする。
【００１４】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記薬剤の濃度が、５０〜１５０μMであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の突然変異株の生産方法の好ましい実施態様において、前記微生物が、ナンノクロロプシスであることを特徴とする。
【００１６】
本発明の突然変異株は、請求項１〜９項のいずれか1項に記載の方法によって得られることを特徴とする。
【００１７】
本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなることを特徴とする。
(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１―10で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−10の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【００１８】
本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなることを特徴とする。
(ａ)配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−16で示される塩基配列からなる核酸。
(ｂ)前記塩基配列番号１−16の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸。
【００１９】
本発明のプローブは、請求項１１又は１２項に記載の核酸からなることを特徴とする。
【００２０】
本発明の突然変異体の検出方法は、請求項１３記載のプローブを用いて、RAPD分析することによって突然変異株を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、例えば、脂肪酸生合成の代謝経路、及び突然変異体選別法を含む微生物の突然変異の迅速なスクリーニングを可能とし、核、細胞質、葉緑体器官の生化学的突然変異体の異なるタイプの単離を可能とするという有利な効果を奏する。このような突然変異体は、遺伝子の研究において使用するためのマーカー源として、藻類代謝、特に、脂肪酸代謝における調査を助けるための試験的プローブとして、より重要なものとして、株を改善するための新しい株の源としてかなり貢献するという有利な効果を奏する。
【００２２】
また、本発明によれば、化学的突然変異原(EMS及びMNU)の使用によって微小藻類において生ずるか発生することができる突然変異体の異なるタイプを選別するための方法を提供することができる。この開発された新しい方法は、親微生物と比較してより広い温度範囲で、養殖においてプランクトンの餌、及び多くの重要な薬剤用途を有するEPAの単離用に好ましい起源として熱帯から温帯な地域において利用可能であることを示し、よりよく成長する高い除草剤耐性を有する向上したEPA生産株の選択の機会を提供するという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の突然変異株の生産方法では、化学的突然変異原を用いる。ここで、化学的突然変異原について、特に限定されるものではないが、好ましくは、エチルメタンスルホン酸（EMS）、N―メチルーN−ニトロソ尿素(MNU)、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシアミン、N-mechiru−N’-ニトロソグアニジン（MNNG）からなる群から選択される少なくとも1種である。当該化学突然変異原を微生物へ適用する。これは、所望の特性を有する突然変異体を得るための前提として、微生物をまず、突然変異させる必要があるからである。
【００２４】
化学的突然変異原の処理は、前記微生物に対して６０〜１２０分間行なうことが、変異株を効率的に作出するという観点から好ましい。
【００２５】
また、別に側面において、前記化学的突然変異原を、微生物の生残率が２０〜４０％になるまで処理することが、多様な変異株を作出するという観点から、好ましい。このようにして化学的突然変異原を微生物へ適用し、前記微生物の突然変異体を得ることができる。
【００２６】
その後、得られた前記突然変異体を薬剤存在下で培養する。薬剤存在下において培養するのは、前記突然変異体の中で、所望の特性を有するコロニーのみを選択するためである。例えば、薬剤として、脂肪酸合成関連酵素の阻害剤を用いた場合に、全ての変異株に対して脂肪酸合成関連酵素の作用機能が阻害されるが、このような阻害環境中においても生残するコロニーがあれば、脂肪酸合成の優勢な株のみを作出することができる。
【００２７】
このような阻害剤としては、セルレニン、キザロフォフ、クロロスルホンからなる群から選択される少なくとも1種を挙げることができる。高度不飽和脂肪酸を多量に生成する変異株を効率的に得るという観点から、好ましくは、セルレニンである。
【００２８】
また、前記薬剤の存在下、さらに微生物の生残率が０．１〜１．０％となるまで培養する。このように微生物の生残率を規定したのは、高度不飽和脂肪酸を多量に生成する変異株を効率的に得るという理由からである。また、前記薬剤の濃度についても、特に限定されることはないが, 高度不飽和脂肪酸を多量に生成する変異株を効率的に得るという観点から、２５〜７５μMである。
【００２９】
好ましい実施態様において、本発明に適用する微生物は、クラミドモナス、ナンノクロロプシスなどを挙げることができる。
【００３０】
本発明の突然変異株は、上述のような本発明の突然変異体の生産方法によって得ることができる。したがって、上述の本発明の突然変異体の生産方法についての説明をそのまま適用することができる。
【００３１】
次に、本発明の核酸について説明する。本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなることを特徴とする。すなわち、
(ａ)配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１―10で示される塩基配列からなる核酸、
(ｂ)前記塩基配列番号１−10の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸である。好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するものをも包含する。
【００３２】
また、本発明の核酸は、以下の(ａ)、又は(ｂ)からなることを特徴とする。すなわち、(ａ)配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−16で示される塩基配列からなる核酸、
(ｂ)前記塩基配列番号１−16の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％の相同性を有する核酸である。好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するものをも包含する。このような核酸配列について、後述するように目的とする突然変異体を検出するプローブとして用いることができる。
【００３３】
すなわち、本発明のプローブは、上記本発明の核酸からなる。当該核酸を用いて、突然変異体の検出をすることができる。すなわち、本発明の突然変異体の検出方法は、上記本発明のプローブを用いて、RAPD分析することによって突然変異株を検出する。
【００３４】
RAPD分析とは、任意の短い塩基配列からなるプライマーを用いてPCR反応を行い、PCR産物をマーカーとして多型を分析する方法である。この方法では、プライマーを選択することで、ゲノム中の任意の配列を増幅させることができ、多くの領域の多型を検出することが可能で、RFLP法よりも多型の検出の効率がよいという利点を有する。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００３６】
実施例１
ナンノクロロプシス(Nannochloropsis oculate ST-6株)の対数増殖期の細胞（７×１０６個/ml）を変異原エチルメタンスルホン酸(100mM)、或いはN-メチル-N−ニトロソ尿素(10mM)で６０分間処理(細胞の生残率約２０％)した。生残した細胞を７日間培養(20℃、5000lｘ、12:12時間明暗周期)した後、脂肪酸合成関連酵素の阻害剤であるセルレニン或いはキザロフォフを含む培地で培養し、これら阻害剤に抵抗性を示し、コロニーを形成した株を選別した。
【００３７】
＜変異株の特徴＞
セルレニン或いはキザロフォフに抵抗性の変異株であるNE-1、NE−2株は、いずれの株も親株ST-６と比較して魚介類稚子魚の必須脂肪酸である不飽和脂肪酸(リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸)の含量が多く、特にエイコサペンタエン酸（EPA）を多く含む。また、NE−１及びNE-2株は、親株ST-6と比較して、15〜31℃における増殖率が高いという特徴を備えている。
【００３８】
魚介類の種苗生産において用いられる微藻類の親株を変異原処理した後、生残した細胞から生じたコロニーの選抜に脂肪酸合成関連酵素の阻害剤に対する抵抗性を指標に変異株を選抜する方法の導入によって、魚介類の稚子魚に必須であるEPAのような不飽和脂肪酸含量の高い変異株の分離が効果的に実施できるようになることが判明した。
【００３９】
親株ST-6に比べて変異株NE-1及びNE-2の優れた点としては、魚介類の稚子魚に必須である高度不飽和脂肪酸のうち最も重要とされているEPAの含量は乾燥１ｇの細胞試料中に、親株ST-6では22.8mgであるが、変異NE-1株では、30.8mg、NE−２株では28.3mgであり、変異株における含量がかなり多いことである。ナンオクロロプシスを餌として大量培養したワムシが用いられることが多い。ナンノクロロプシスを餌として培養したワムシでも、ナンノクロロプシスの供給量が不十分であるとEPA含量が低くなるので、給餌に先立ち、ワムシの栄養価の高い微細藻類を充分に給餌して栄養価を高めた後、稚子魚に与える方法がとられている。変異株NE-1及びNE-2はEPAの含量が多く、また増殖率が高いことから、現在、広く利用されている親株のST−6株よりもワムシの餌として優れているなどの利点を有する。
【００４０】
実施例２
次に、NE1は、18個の炭素より少ない脂肪酸の鎖の長さを制御する際に含まれる既知の濃縮酵素、特にβ-ケトアセチルACPシンターゼを阻害する脂肪酸シンターゼ（FAS）生合成阻害剤、例えば,セルレニンに突然変異した微生物をさらして試験を行なった。
【００４１】
また、NE2は脂肪酸代謝の制御に伴うかぎとなる酵素であるアセチルCoAカルボキシラーゼ（ACCアーゼ）の阻害剤、例えば,quizalofop-P-エチルなどにさらして試験を行なった。
【００４２】
その結果、本発明の最も好ましい藻類の微生物は、NE１及びNE２株である。それらは、乾燥重量グラム当たり約75,55及び76.24mgの全脂肪酸を生産することが可能であるという特性を有し、非常に長い不飽和脂肪酸（VLC-PUFAｓ）の含有量は、全脂肪酸のグラム乾燥重量当たりそれぞれ36.5及び33.63であった。また、親株(グラム乾燥重量当たり28.2mg)に比較して、EPA含有量は、乾燥重量を基礎として突然変異体NE１、NE２株において、それぞれ、29％と18％増加していることが判明した(表１)。
【００４３】
【表１】
2005218402.tif 000002
【００４４】
表１は、N.oculataの親株に存在する脂肪酸含有量(乾燥１g当たりのmg)と比較した突然変異株NE1及びNE2の脂肪酸組成の変化のガスクロマトグラフィー分析を示す。
【００４５】
藻類微生物NE1及びNE2株は、乾燥重量ベースで野生型に存在する全脂肪酸の割合として発現させたとき、野生型の全脂肪酸の含有量のEPAを最大49％と45％生産し、野生型におけるEPAの含有量は、それ自体で、その全脂肪酸のもの(37.7％)であった。新しく開発された突然変異株NE1及びNE2は、また、親株（WT）と比較して葉緑体リピッドプール、特にトリアシルグリセロール(C14:0、C16:0、C16:1,C18:0及びC18:1)を23％及び25％増加を示し、新しく開発された株NE1及びNE2における向上したEPA合成の可能性を示唆した。
【００４６】
新しく開発された微生物NE１及びNE2の最も重要な同定特性は、32度のアニ-リング温度でプライマーP３（５‘-GTAGACCCGT-３’）を使用して、RAPD分析を行なったとき得られるDNAパターンであった。しかしながら、突然変異体微生物NE2の追加の同定特性は、RAPD分析をプライマー（GATA）4をアニ-リング温度38℃で使用して行なったとき、1.252kb追加DNAバンドの損失であった。
【００４７】
実施例３
高められたEPA生産株の単離方法と突然変態体の同定用分子マーカーの開発
最も早く成長する突然変異体コロニーの選別を含み、最大のそれぞれの除草剤耐性能力を有し、より広い温度耐性を示す。これらのコロニーを更に大量生産用に選別する試験を行なった。
【００４８】
乾燥細胞重量１ｇ当たり少なくとも約30.8及び28.3mgEPAを生産する能力を有する突然変異株を選別する方法であり、それぞれNE1及びNE２株と呼ばれる変異株とナンノクロロプシスOxulata同定特性のすべてを有する一方、親株(野生型)におけるEPA生産のレベルは１gm乾燥細胞重量当たり23.9mgであった。
【００４９】
高められたEPA生産藻類微生物、及びNE1とNE２と呼ばれるそれらの突然変異体は、32℃の特異的アニ-ル温度でプライマー（５‘-GTAGACCCGT-３’）、及び38℃の特異的アニ-ル温度で別の16プライマー(5‘-GATAGATAGATAGATA-3’)を使用してRAPD分析を行なったとき、DNA多形の基礎に基づき遺伝的にその野生型株から区別することができ、これら２つの突然変異株の大量培養の増殖をチェックするための遺伝子型特異的マーカーとして使用することができた。
【００５０】
突然変異体の別の多様な型を都合よく、再生産可能に単離することができる。突然変異体選別法は、ナンノクロロプシスなどのミクロ藻類において現在利用可能ではなかったが、本発明の選別プロトコールは当該方法に対する重要な必要性を満足する。バッチ培養によって生産されたEPAの最大量による他のミクロ藻類との比較は、突然変異株P.tricornutumII242（Lopez-Alanso等1996）のみが、（乾燥重量ベースで）現在新しく開発された突然変異株ナンノクロロプシスのNE１(30.8mg EPA/g)よりよい最大値(38.6mg EPA/g)を生産することができることをこれまでのデータが示している。しかしながら、他の新しい株NE2(28.3mg  EPA/g)は、次いで高いEPA生産微生物である。なぜならN-oculata (Maruyama et al)における今日までに報告された最大収量は、22.8mg EPA/gだったからである。
【００５１】
また、新しく開発された株は、より広範な温度範囲(15〜31℃)で高い成長率を示しているので、それらは、藻類形成用の遺伝子マーカー、及び熱帯から温帯な地域における養殖産業におけるプランクトン餌料として使用することができることが判明した。
【００５２】
表２は、それぞれの選択圧力の不存在下、異なる温度での野生型（WT）及び突然変異体NE１及びNE２の除草剤に対する耐性の成長パターンを示す。
【００５３】
【表２】
2005218402.tif 000003
具体的な成長率及び日は、(μ)は、(Guillard.1973)の方法によって決定された。値は平均のSEである。
【００５４】
表２から、より広範な範囲において高い成長率を示すことが分かる。
【００５５】
また、図３は、１０mer 及び１６merプライマーで得られたRAPD分析を示す。Aは、ナンノクロロプシスoculataの親微生物と変異株NE１及びNE2との間の多形を明らかにしない１０mer プライマー（GTAGACCCGT）で得られたRAPDプロフィールである。全ての反応をアニ-リング温度４０℃で行なった。
【００５６】
Bは、１６mer(GATA)4反復が、野生型株（WT）と比較した突然変異株NE２及びNE1との違いを示す。全ての反応をアニ-リング温度３８℃で行なった。
【００５７】
Cは、３２℃のアニ-リング温度での１０merプライマー（GTAGACCCGT）で増幅した後に得られたRAPDパターンの比較である。突然変異微生物と親微生物(WT)との両方を識別する多形バンドが、白い矢印によって示される。
【００５８】
Mは、１００bpDNAラダー(Takar  Shuzo,  Japan)を、Cは、ネガティブ対照例を、WTは、ナンノクロロプシスの野生型、NE１及びNE2は、突然変異型を示す。これによって、本発明のプローブが、RAPD分析に使用できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
我が国及び諸外国における魚介類の種苗生産施設(企業などを含め)では、魚介類の稚子魚の餌料としてワムシを大量培養し、そのワムシの餌としてナンノクロロプシスの培養が行なわれているので、当該水産等の分野において利用可能である。
【００６０】
魚油のオメガ-3脂肪酸及び望ましくないテストにおける増加する医学の及びダイエットの関心は、医学及び食事療法において、オメガ-３脂肪酸に興味がもたれており、魚油由来の油は臭があることから、それらの脂肪酸の主要な起源、すなわち、藻類を人の消費に使用する可能性が増加している。世界中からの多くの健康団体によって推奨されており(FAO/WHO,1993)、PUFAは、病気を治療するための機能的食品として一般に現在受け入れられており、パン食品、バターミルク、肉製品、スナック、及び乳児用配合物などを含むPUFA補強食品(主にEPA及び/又はDHAを添加)の範囲は、現在、多くの国で広く利用可能である。
【００６１】
そこでナンノクロロプシス卵から新しく開発された株は、人の健康に対する莫大な薬剤用途に使用するためのこれらの微生物からEPAを直接的に単離することが経済的に可能である多くの海洋養殖システム用に供給されるように日本においてかなり開発された水産養殖産業における新たな補強かもしれない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、突然変異株NE1及びNE２耐性を示す。WT(白丸)、NE1（黒丸）、NE2（白四角）の細胞/mlの対数を成長の8日後に決定した。数値は、3つの独立した試験の平均を示す。
【図２】図２は、異なる温度での除草剤に対する野生型、突然変異体NE１及びNE２の成長パターンを示す。特定の成長率/日（μ）を以下のGuillard、１９７３の方法によって決定した。野生型（WT）(白丸)及び突然変異体微生物NE1(黒丸)、NE２（白四角）である、垂直の棒は、平均のSEである。
【図３】図３は、１０mer 及び１６merプライマーで得られたRAPD分析を示す。
【図１】
2005218402.tif 000004
【図２】
2005218402.tif 000005
【図３】
2005218402.tif 000006
【配列表】
2005218402000001.xml