(57)【要約】【課題】高感度かつ広い測定範囲を有する免疫測定試薬および免疫測定方法を提供すること。【解決手段】抗原に対する親和力が５×１０9〜１×１０11  Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第１標識モノクローナル抗体および該抗原に対する親和力が１×１０8〜５×１０9未満Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第２標識モノクローナル抗体の組み合わせからなる免疫測定試薬およびこの免疫測定試薬を用いた免疫測定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する親和力が５×１０9〜１×１０11  Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第1標識モノクローナル抗体および該抗原に対する親和力が１×１０8〜５×１０9未満Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第２標識モノクローナル抗体の組み合わせからなることを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項２】
固相に対して直接固定されたまたは固定剤を介して固定された抗原の存在する試料に、該抗原に対する第１標識モノクローナル抗体および第２標識モノクローナル抗体を添加し、得られた免疫反応物を該標識について測定することを特徴とする免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる２種類の標識モノクローナル抗体を使用する免疫測定法および異なる２種類の標識モノクローナル抗体を含有する免疫測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、臨床検査や免疫学、生化学、分子生物学などの研究分野で、操作が簡便なことから免疫反応を利用した測定法が多用されている。その内、特に酵素免疫測定法や化学発光免疫測定法等が高感度化の観点から多用されている。
【０００３】
これらの測定法は、通常、同一抗原上の異なったエピトープを認識する２種の抗体を、それぞれ、粒子や試験管壁に固定する抗体または標識抗体として用いるサンドイッチ法にて被検体中の抗原量を測定する。この測定法によって検量線を作成すると、ある抗原濃度以下では、抗原濃度が低下するに従って傾きが小さくなり、かつ、ある濃度以上でも抗原濃度が上昇するに従って傾きが小さくなる、といったシグモイド曲線を描く。傾きが小さい領域では抗原濃度変化の幅に対する出力変化の幅が小さく、正確な測定が困難となる。
【０００４】
抗原濃度が高い被検体中の抗原濃度を正確に測定する手段としては、被検体量を減らしたり、抗原に対する親和力が低い抗体を使用する方法が用いられてきた。しかしながら、この方法では低濃度域の感度が得られず、高感度化が困難であった。一方、抗原濃度が低い被検体中の抗原濃度を正確に測定する手段として、被検体量を増やしたり、抗原に対する親和力が強い抗体を用いて高感度化する方法が用いられてきた。しかし、この方法では高濃度域において反応が飽和し、測定が困難であった。被検体を希釈すれば高濃度まで測定することはできるが、操作が煩雑になることによって誤差が生じたり、検体のマトリックス効果などで反応性が変化し、正確な測定値が得られなかったり、また、測定結果が得られるまでの時間が増加したりする、といった欠点がある。このように、これまで、低濃度域から高濃度域まで広い測定範囲を得ることはできなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、希釈すること無しに広い濃度範囲を高感度で測定することのできる免疫測定試薬および免疫測定方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、抗原に対する親和力が異なる２種類以上の抗体を標識抗体に用いて、抗原が低濃度でも感度を維持しつつ、反応性を損なわずに高濃度まで測定できる免疫測定試薬及び免疫測定方法を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、抗原に対する親和力が５×１０9〜１×１０11  Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第１標識モノクローナル抗体および該抗原に対する親和力が１×１０8〜５×１０9未満Ｌ／ｍｏｌの範囲にある第２標識モノクローナル抗体の組み合わせからなることを特徴とする免疫測定試薬および該免疫測定試薬を用いた免疫測定方法によって達成される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の免疫測定試薬および免疫測定方法を用いることにより、被検体を希釈することなく高感度かつ広い範囲にわたって測定が可能となる。疾患の発見や再検率の減少などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いられる標識モノクローナル抗体とは、標識物を化学的または物理的に結合したモノクローナル抗体を言う。標識方法は標識物に適した方法が用いられる。該モノクローナル抗体は一般的な方法で取得可能なものであり、市販品として購入できるものもある。該モノクローナル抗体のサブタイプは特に限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＭが好ましい。また、抗体は、それが認識する抗原の種類によって限定されることもない。抗体を取得する場合に用いられる動物種も特に限定されるものではない。とりわけ、マウス、ラットなど免疫学的測定において通常用いられる動物が好ましい。
【００１１】
該モノクローナル抗体の抗原に対する親和力は、一方の抗体は５×１０9〜１×１０11  Ｌ／ｍｏｌの範囲にあり、もう一方の抗体は１×１０8〜５×１０9未満Ｌ／ｍｏｌの範囲にある。これら２種類の抗体は、親和力の差が１０倍以上の組み合わせが好ましい。親和力の差が小さいと期待される効果は少ない。また、親和力が強い抗体と親和力が弱い抗体のモル比は前者対後者の比で、１：４〜１：５０の範囲が好ましい。これより比が小さいと低濃度での感度は高いが高濃度での反応性が低下し、比が大きいと高濃度での反応性は十分であるが、低濃度での感度が十分ではない。
【００１２】
前記標識物としては、免疫測定法で一般的に使用されるものが用いられる。例えば放射性同位体、酵素、発光物質、蛍光物質などが挙げられる。特に限定されるものではないが、これらのうち酵素が好ましい。より好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと表す）、アルカリフォスファターゼである。
【００１３】
本発明の標識モノクローナル抗体を含有する試薬を使用して抗原の存在を測定する測定法において、固相としては、例えばポリスチレンビーズ、磁性粒子、ガラスフィルター、メンブレンなどの免疫測定法でそれ自体公知の物が使用できる。また、抗原を固相に固定する方法としては、例えば、固相表面への吸着といった物理的方法、固定剤を介して固定する化学的方法を挙げることができる。さらに、該固定剤としては、例えばビオチン−ストレプトアビジン、抗体、種々の２価性試薬を利用したものなどが挙げられる。
【００１４】
本発明の試薬には、好ましくは緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、バルビタール緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッド緩衝液などのそれ自体公知の緩衝液が制限なく使用できる。緩衝液の緩衝剤の濃度やｐＨは特に限定されないが、濃度が高すぎると反応系に影響を及ぼす可能性があり、低すぎると反応が不安定になりやすい。反応系には生体由来のタンパク質が存在するため、中性から弱アルカリ性が良く、例えばｐＨ７．０〜８．５の範囲とするのがもっとも良好である。本発明の試薬には、その他添加剤が存在してもよく、例えば、牛血清アルブミンやカゼインなどのタンパク質、塩化ナトリウムや塩化カリウム等の無機塩、アジ化ナトリウムやマイクロサイド等の防腐剤等が含まれていてもよい。
【００１５】
標識の測定には、標識物に適した測定方法が用いられ、特に限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
本発明を更に詳細に説明するために、以下実施例および比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるのものではない。
【００１７】
本発明で用いられるモノクローナル抗体例えば抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体と該抗体が認識する抗原例えばヒトアルブミンとの親和力は、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて測定した。
【００１８】
即ち、センサーチップＣＭ５を活性化した後、アミンカップリング試薬（ビアコア社製）にて該抗体に対する抗体（以下、抗体Ｓと略す）例えば抗マウスＩｇＧ抗体をセンサーチップ上に固定した。続いて、ブロッキングバッファー（ビアコア社製）でセンサーチップをブロッキングした後、レスポンスが約１２００ＲＵとなるように、該抗体例えば抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体をインジェクションし、抗体Ｓ例えば抗マウスＩｇＧ抗体に結合させた。さらに、至適濃度の抗原溶液例えば５０μｇ／ｍｌになるように調製したヒトアルブミンを、１０μＬインジェクションし、該抗体例えば抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体と抗原例えばヒトアルブミンの結合と解離のセンサーグラムを得た。この結果から、該抗体の抗原との親和力を求めた。
【００１９】
なお、センサーチップＣＭ５の再生は次のようにして行った。すなわち、抗体Ｓ例えば抗マウスＩｇＧ抗体からモノクローナル抗体例えば抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体をはずすために、２００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む２００ｍｍｏｌ／ｌグリシン塩酸溶液（ｐＨ２．７）を流した。その後、ランニングバッファーを流しセンサーチップの再生を完了した。
【００２０】
実施例１
１．ＨＲＰ標識抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体の調製
第１標識モノクローナル抗体として、親和力が５×１０10  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体（エイアンドティー社製）を用いた。該抗体１ｍｇと西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）を用い、ナカネ法（Ｎａｋａｎｅ  ＰＫ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ２２（１２）１０８４−１０９１，１９７４）によりＨＲＰ標識抗体Ａを調製した。
【００２１】
第２標識モノクローナル抗体として、親和力が３×１０9  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用い、上記方法と同様に行ない、ＨＲＰ標識抗体Ｂを調製した。
【００２２】
２．ビオチン標識抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体溶液の調製
ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ナカライテスク社製）１０ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解した（以下、ビオチン溶液と表す）。抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製）を１ｍｇ／ｍＬになるように１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。これに上記調製したビオチン溶液１０μＬを加え、さらによく混和し、２５℃で４時間反応した。未反応のビオチンラベル化剤を除去するため、ＮＡＰ−５（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、取扱説明書に従ってＰＢＳでゲルろ過を行なった。ゲルろ過で回収したビオチン標識抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体溶液を１ｗ／ｖ％ＢＳＡおよび０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ２００（シグマアルドリッチ社製）を含むＰＢＳ（以下、標識抗体希釈液と表す）で５μｇ／ｍＬになるように希釈した。これをビオチン標識抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体溶液（以下第１試薬と表す）とした。
【００２３】
３．ＨＲＰ標識抗体溶液の調製
標識抗体希釈液を用い、上記ＨＲＰ標識抗体Ａが０．０２５μｇ／ｍＬ、ＨＲＰ標識抗体Ｂが０．５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、混合した。これをＨＲＰ標識抗体溶液（以下第２試薬と表す）とした。
【００２４】
４．測定
測定には全自動酵素免疫測定装置ＭＩ０１（エイアンドティー社製）を使用し、アルブミン標準液（エイアンドティー社製）を測定し、検量線を作成した。実際の測定の流れは次の通りである。検体２０μＬと第１試薬４０μＬを混合して免疫複合体溶液を調製し、４５℃で５分間インキュベーションした。一方で、抗ビオチン抗体担持反応剤（エイアンドティー社製）を４５℃でインキュベーションした。なお、このインキュベーションは測光終了まで継続した。該反応剤へＭＩ０１用ブロック液（エイアンドティー社製）を５０μＬ滴下した。ついで、インキュベーションが終了した免疫複合体溶液を３５μＬ滴下し、さらに第２試薬を２０μＬ滴下した。２分後、ＭＩ０１用洗浄液（エイアンドティー社製）１６０μＬを８０μＬずつ滴下し、さらに１分後、ＭＩ０１用発色液（エイアンドティー社製）を３０μＬ滴下した。発色液滴下から７〜８秒後の１秒間に、反応剤の固相表面へ６７０ｎｍのレーザー光を照射したときの反射強度（Ｋ／Ｓ）を測定した。
【００２５】
比較例１
第２試薬中のＨＲＰ標識抗体の濃度を、ＨＲＰ標識抗体Ａ：０．５２５μｇ／ｍＬ、ＨＲＰ標識抗体Ｂ：０．０μｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様の操作を行なった。
【００２６】
比較例２
第２試薬中のＨＲＰ標識抗体の濃度を、ＨＲＰ標識抗体Ａ：０．０μｇ／ｍＬ、ＨＲＰ標識抗体Ｂ：０．５２５μｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様の操作を行なった。
【００２７】
比較例３
実施例１と同様に、第２標識モノクローナル抗体として、親和力が５×１０9  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いてＨＲＰ標識抗体Ｃを調製した。第２試薬中のＨＲＰ標識抗体の濃度を、ＨＲＰ標識抗体Ａ：０．０２５μｇ／ｍＬ、ＨＲＰ標識抗体Ｃ：０．５μｇ／ｍＬとした以外は実施例１と同様の操作を行なった。
【００２８】
実施例１および比較例１、２、３で測定したＫ／Ｓ変化量を表１に示した。
【００２９】
【表１】
2005195434.tif 000002
【００３０】
また、表１のデータを図示した検量線を、図１（実施例１）、図２（比較例１）、図３（比較例２）および図４（比較例３）に示した。
【００３１】
図１から明らかなように、実施例１の測定値から作成された検量線は、アルブミン低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示した。これに対し、親和力が５×１０10  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体のみを第２試薬に用いた試薬による比較例１の検量線はヒトアルブミン低濃度では強いシグナルを示すが、高濃度域においては反応性が低下し、直線性を示さなかった。また、親和力が３×１０9  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体のみをＨＲＰ標識抗体溶液に用いた試薬による比較例２の検量線はヒトアルブミン低濃度域において、本発明による方法よりも感度が低いため、良好な直線性を示さなかった。さらに、親和力が５×１０10  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体と親和力が５×１０9  Ｌ／ｍｏｌである抗ヒトアルブミンマウスモノクローナル抗体を用いた試薬による比較例３の検量線は比較例１と同様に、ヒトアルブミン高濃度における反応性が低下し、本発明による方法のような直線性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１により得られた検量線。
【図２】比較例１により得られた検量線。
【図３】比較例２により得られた検量線。
【図４】比較例３により得られた検量線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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