(57)【要約】【解決課題】微量サンプルを用いハイスループットな解析が可能で分解能の高い蛋白質同定装置、及び蛋白質同定法を提供する。【解決手段】多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定を行うための測定方法であって、試料蛋白質をペプチドに断片化して得た試料をフリーフロー電気泳動法により分離する工程と、液体クロマトグラフ法により分離分画された各々の分画試料を分離する工程と、各分画分離試料を質量分析ユニットにかけて試料蛋白質の質量分析データを得る工程とを含む測定方法であって、該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することが可能となることを特徴とする、蛋白質同定のための測定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定を行うための測定方法であって、試料蛋白質をペプチドに断片化して得た試料をフリーフロー電気泳動法により分離する工程と、液体クロマトグラフ法により分離分画された各々の分画試料を分離する工程と、各分画分離試料を質量分析ユニットにかけて試料蛋白質の質量分析データを得る工程とを含む測定方法であって、該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することが可能となることを特徴とする、蛋白質同定のための測定方法。
【請求項２】
請求項１記載の測定方法において、該方法は質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定する工程を含むことを特徴とする、測定方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の蛋白質同定のための測定方法において、前記フリーフロー電気泳動法を１５０μm以下の厚みの電気泳動槽にて行うことを特徴とする、蛋白質同定のための測定方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の蛋白質同定のための測定方法において、液体クロマトグラフ法をカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフィユニットを用いて行い、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用い、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結したことを特徴とする、蛋白質同定のための測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の蛋白質同定のための測定方法において、ナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系を用いて液体クロマトグラフユニットに送液し、液体クロマトグラフユニットが微小内径のカラムに逆相系の微小充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットであり、質量分析ユニットがＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計であることを特徴とする、蛋白質同定のための測定方法。
【請求項６】
多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定装置を提供するもので、該蛋白質同定装置は、試料蛋白質をペプチドに断片化して得た試料を分離するフリーフロー電気泳動ユニットと、フリーフロー電気泳動ユニットで分離分画された各々の分画試料を分離する液体クロマトグラフユニットと、液体クロマトグラフユニットで分離された各試料を質量分析する質量分析ユニットとを含む測定装置であって、質量分析ユニットによって得られた試料蛋白質の該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することを可能とする、蛋白質同定のための測定装置。
【請求項７】
請求項６に記載した蛋白質同定のための測定装置であって、該測定装置が、質量分析ユニットによって得られた試料蛋白質の該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定する演算処理装置を含むことを特徴とする、蛋白質同定のための測定装置。
【請求項８】
請求項６または７記載の蛋白質同定のための測定装置において、前記フリーフロー電気泳動ユニットの電気泳動槽の厚みが１５０μm以下であることを特徴とする、蛋白質同定のための測定装置。
【請求項９】
請求項６乃至８のいずれかに記載の蛋白質同定装置において、液体クロマトグラフィユニットがカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフィユニットであり、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用い、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結したことを特徴とする、蛋白質同定のための測定装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の蛋白質同定のための測定装置において、さらに液体クロマトグラフユニットに送液するためのナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系を含み、前記カラムが微小内径を有するカラムであって、前記充填剤が逆相系の微小充填剤であることを特徴とする、蛋白質同定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行い蛋白質同定をするための測定方法方法とそれに用いる蛋白質同定のための測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質の同定には、従来、ペプチドマスフィンガープリンティング法（ＰＭＦ法）が用いられてきた。ＰＭＦ法とは、二次元電気泳動法(２−ＤＥ法)で分離した蛋白質をゲル中でプロテアーゼにより分解し、分解物を質量分析ユニットで分析し、その結果得られた質量スペクトル(ペプチドマスフィンガープリント)をDNAの塩基配列に対応するアミノ酸配列から計算される質量スペクトルと比較することにより、蛋白質やそれをコードする遺伝子を同定する方法である。2-DE法は蛋白質の分離精製を行う手法であり、第一の分離手段（一次元目の電気泳動）として等電点ゲル電気泳動で蛋白質を各等電点のグループ毎に分離し、各グループに対して第二の分離手段（二次元目の電気泳動）としてSDSポリアクリルアミド電気泳動法（SDS-PAGE法）を行い分子量分離する方法である。2-DE法は非常に分離能が高いものの、一次元目の電気泳動に約１７時間、二次元目の電気泳動に数時間、合計約２０時間もの時間を要する問題がある。
【０００３】
上記問題の解決法としては、例えば、非特許文献１に、一次元目の電気泳動としてフリーフロー電気泳動法を用いた報告がなされている。フリーフロー電気泳動法を用いることで、一次元目の電気泳動に要する時間を１．５時間に短縮した。フリ−フロー電気泳法とは、２枚の板に挟まれて構成された液体流路に一定流速で支持液を流して流出口への液の流れを作り、該流路への液体注入口近傍に設けた試料注入口から試料を注入し、流路の両端にも受けた電極に電圧を印加することによって試料に含まれる物質が電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動分離しながら流出口に流出する原理を利用した電気泳動法である。支持液として両性電解質のキャリアアンフォライトを用いれば等電点電気泳動も可能である。ゲル電気泳動とは異なり、ゲルを用いない無担体電気泳動であるため、高速で分離と分取が実現できる。
【０００４】
【非特許文献１】Proteomics 2001, 1, 807-818
【０００５】
また、非特許文献２「“プロテオミクス”鈴木紘一 監修，東京化学同人，５３〜５６（２００２）」には、液体クロマトグラフと質量分析ユニット（質量分析ユニット）を組み合わせて蛋白質の同定を効率的に行う２種の装置が報告されている。その１つは、微小内径のフューズドシリカ管を加工した死容積ゼロのフリットレスカラムに逆相系の微小充填剤を充填したナノＥＳＩカラムと、スプリッターなしでナノリットルレベルの濃度勾配を作成できる送液系と、ＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析ユニットとを連結したオンラインの蛋白質同定システムである。この構成により、液体クロマトグラフで分離した試料を拡散させることなく超低流速で直接質量分析ユニットに導入できるため、極微量のサンプルにて１００種類以上の蛋白質を１度の分析で自動的に同定することが可能である。なお、上述した「スプリッターなしでナノリットルレベルの濃度勾配を作成できる送液系」に関しては、特許文献１に公開されている。
【０００６】
【非特許文献２】“プロテオミクス”鈴木紘一 監修，東京化学同人，５３〜５６（２００２）
【特許文献１】特開2002-365272
【０００７】
もう１つは、二次元化した液体クロマトグラフと複合型質量分析ユニットとを連結したシステムである。この構成により、複雑な組成を持つ混合物を１段目のカラムで分離し、その溶離液を分離モードの異なる２段目のカラムで分離するため分離能が向上し、１回の分析で８００〜１０００の蛋白質の同定が可能である。
【０００８】
しかしながら、上記非特許文献１はフリーフロー電気泳動の次の工程にSDS-PAGE法を行っており、ゲル電気泳動法を用いないシステムではない。一連の工程の中にゲル電気泳動法を用いると、自動化が困難であるばかりでなく、次の工程に進む際にゲルからのスポットの切り出しが必要となり、工程も複雑となって、ハイスループットな分析システムを構築できないという問題点がある。また、ゲル電気泳動を用いるとゲル電気泳動の際にまとまったサンプル量が必要となるため、微量サンプルにて分析ができないという問題点がある。
【０００９】
また、上記非特許文献２における２つめの方法は、１段目のカラムと２段目のカラムをステップワイズでカラムスイッチングして解析をするものである。混合物をまず1段目のカラムで分離し、その溶離液を分離モードの異なる２段目のカラムに直接注入して連続分析をする。１ステップには約１時間を要するため、１サンプルで１０ステップの分析を行うと１０時間を要するため、その分解能は優れているもののハイスループットな分析システムとしては適していない。
【００１０】
また、上記非特許文献２における１つ目の方法は、LCで分離した試料を拡散させることなく超低流速で直接質量分析ユニットに導入できることで、極微量サンプルをハイスループットで解析できる特徴があるものの、一つの液体クロマトグラムの分解能に依存にした解析能となるため、２つ目の方法ほど分解能が高くないという問題点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって本発明は、上記問題点を解決すべくなされたもので、微量サンプルを用いハイスループットな解析が可能で分解能の高い蛋白質同定装置、及び蛋白質同定法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る蛋白質同定方法は、多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定を行うための測定方法であって、試料蛋白質をペプチドに断片化して得た試料をフリーフロー電気泳動法により分離する工程と、液体クロマトグラフ法により分離分画された各々の分画試料を分離する工程と、各分画分離試料を質量分析ユニットにかけて試料蛋白質の質量分析データを得る工程とを含む測定方法であって、該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することが可能となることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る蛋白質同定方法は、以下の作用効果を有する。
（１）フリーフロー電気泳動ユニット（フリーフロー電気泳動素子）はマイクロファブリケーション技術によって作成される分離素子であり、泳動槽の間隔が狭いために、微量のサンプルを用いて蛋白質の同定ができ、また、高電圧の印加下に連続的に流下分離が可能であるため高速な分離ができる。
（２）フリーフロー電気泳動は無担体電気泳動であり、流出液をそのまま液体クロマトグラフィユニットによる二次分離に持っていけるためサンプルロスが非常に少ない。
（３）したがって、本発明により、微量サンプルを用いハイスループットな解析が可能で高分離能の蛋白質同定方法を提供することができる。
【００１４】
本発明は、さらに、該蛋白質同定方法に用いることのできる、多種類の蛋白質を分離精製しアミノ酸配列分析を行う蛋白質同定装置を提供するもので、該蛋白質同定装置は、試料蛋白質をペプチドに断片化して得た試料を分離するフリーフロー電気泳動ユニットと、フリーフロー電気泳動ユニットで分離分画された各々の分画試料を分離する液体クロマトグラフユニットと、液体クロマトグラフユニットで分離された各試料を質量分析する質量分析ユニットとを含む測定装置であって、質量分析ユニットによって得られた試料蛋白質の該質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することを可能とすることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に、本発明について詳細に説明する。
（１）ペプチド断片化、ペプチド断片化ユニット
試料蛋白質をペプチドに断片化するには、試料蛋白質をサンプルカップに入れ、サンプルカップを温度調整機構によって一定温度に保ち、該サンプルカップ中に所定量のプロテアーゼを分注して試料蛋白質を分解する。プロテアーゼとしてはトリプシン等が用いられる。ペプチド断片化およびペプチド断片化ユニットは周知であり、詳細な説明は省略する。
【００１６】
（２）フリーフロー電気泳動法、フリーフロー電気泳動ユニット
前述の通り、フリーフロー電気泳動ユニットはマイクロファブリケーション技術によって作成される分離素子であり、２枚の板に挟まれて構成された液体流路に一定流速で支持液を流して流出口への液の流れを作り、該流路への液体注入口近傍に設けた試料注入口から試料を注入し、流路の両端にも受けた電極に電圧を印加することによって試料に含まれる物質が電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動分離しながら流出口に流出する原理を利用した電気泳動法である。支持液として両性電解質のキャリアアンフォライトを用いれば等電点電気泳動も可能である。ゲル電気泳動とは異なり、ゲルを用いない無担体電気泳動であるため、高速で分離と分取が実現できる。本発明では、フリーフロー電気泳動ユニットとしては従来のマイクロファブリケーション技術で作成したものを用いることができる。
【００１７】
（３）液体クロマトグラフ法、液体クロマトグラフユニット
液体クロマトグラフ法としては、液体クロマトグラムユニットに吸着された溶質を異なる溶離液を用いてそれらの溶出強度に基づいてグラジエント溶離する構成の液体クロマトグラフユニットを用いることが好ましい。このような液体クロマトグラフユニットに対して、所定容量の溶離液分岐流路を有し該分枝流路に組成の異なった溶離液を一時格納する溶離液格納手段と、該一時格納された溶離液を順次選択し、液体カラムクロマトグラムユニットに流す溶離液選択手段からなる送液手段を用いることが好ましい。このような液体カラムクロマトグラムユニットとして、本発明では、特許文献１に開示されている液体クロマトグラムを用いることができる。
溶離液の組成は、段階的に変えていく段階的溶離法又は連続的に変えていく勾配溶離法のいずれも選択可能である。
【００１８】
（４）質量分析法、質量分析ユニット（質量分析ユニット）
液体クロマトグラフ法により分離分画された各々の分画試料を質量分析するのに用いる質量分析ユニットは、特限定されない。例えば、単収束質量分析ユニット、四重極質量分析ユニット、飛行時間差型質量分析ユニット、四重極飛行時間型質量分析ユニット等を用いることができる。四重極飛行時間型質量分析ユニットは、上流側の四重極質量分析ユニットと下流側の飛行時間型質量分析ユニットとを組み合わせた複合型質量分析ユニットであり、本発明では、四重極飛行時間型質量分析ユニットを用いることが好ましい。液体クロマトグラフと質量分析ユニットとのインターフェースは、ＥＳＩ（エレクトロスプレー）法、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化法）のいずれも採用することが可能である（特開２００２−３６５２７２の００４２から取りました）。
【００１９】
以下に、本発明の好ましい実施態様を挙げる。特に矛盾が無ければ、それらの任意の組み合わせも本発明の好ましい実施態様である。
（１）該測定方法は、質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定する工程を含む。これによって、収集した質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することができる。
【００２０】
上記目的のため、演算処理装置が質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定する。
具体的な実施態様に基づいてより詳しく述べると、大量の質量分析ユニットからの質量分析データは自動的に第1のPCに自動的に保存され、データ処理用のプログラム（例えば、ProteinLynx,Micromass）によってテキストファイルに変換されてからデータベース検索エンジン（例えば、Mascot,Matrix  Science）搭載の第2のPCに転送される。検索エンジンは利用可能な全てのゲノム・遺伝子・蛋白質データベースを配列タグ法によって検索し、該当するペプチドから特定の蛋白質を同定する。本演算処理装置は、大量の質量分析ユニットからの質量分析データは自動的に保存する第1のPCと、データ処理用のプログラム及びデータベース検索エンジン搭載の第2のPCとすることができ、第2のPCにおいて検索エンジンが利用可能な全てのゲノム・遺伝子・蛋白質データベースを配列タグ法によって検索し、該当するペプチドから特定の蛋白質を同定する。但、本演算処理装置は上記具体例のみに限定されるものではない。
【００２１】
（２）蛋白質同定ための測定方法及び測定装置において、フリーフロー電気泳動ユニットの電気泳動槽の厚みが１５０μm以下である。このようにすることによって、微量サンプルを用いて蛋白質の同定が可能となる。
【００２２】
安定層流が実現できる間隔であれば任意の間隔とすることができるが、１５０μm以下であれば、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。なお、泳動槽の間隔を狭くすることによってその効果は大きくなり、泳動槽の容積も小さくなるために緩衝液や試料の微量化ができる。例えば、泳動槽の間隔を10μm〜50μmの範囲とすることによって、泳動槽の抵抗を充分に低減し、泳動槽への水圧の負荷も小さくなる等の利点が生じる。また、この範囲であれば、高電圧印加時に流れる電流が必要最小限となり気泡発生や熱の発生等の問題が生ずる可能性も無くなる。
【００２３】
（３）蛋白質同定のための測定方法及び測定装置において、液体クロマトグラフユニットとしてカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットを用い、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用い、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結する。液体クロマトグラフユニットとしてカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットを用いることによって、ペプチド分解した試料蛋白質を高精度にグラジエント溶離することが可能となる。また、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用いることによって、液体クロマトグラフユニットからの流出液を直接質量分析装置に導入することができる。従って、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結することによって、ペプチド分解した試料蛋白質を高精度にグラジエント溶離でき、更に質量分析装置に導入することで複雑な作業をすることなく連続して迅速に蛋白質の同定が可能となる。
【００２４】
（４）蛋白質同定のための測定方法及び測定装置において、ナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系を用いて液体クロマトグラフユニットに送液し、液体クロマトグラフユニットが微小内径のカラムに逆相系の微小充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットであり、質量分析ユニットがＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計である。
【００２５】
ここに、「前記送液系と、微小内径のカラムに逆相系の微小充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットと、ＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計との組合わせ」をナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムと呼ぶ。本実施態様では、ナノLC-MS/MSシステムでの分析の前にマイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットを用いてペプチド断片試料を１次分離する。
ナノLC-MS/MSシステムは、極微量のサンプルにて１００種類以上の蛋白質を１度の分析で自動的に同定することが可能である。このため、マイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットとナノLC-MS/MSシステムを組み合わせることによって、微量サンプルを用いて、フリーフロー電気泳動によって１次分離を行った後、ナノLC-MS/MSシステムにて解析することが可能となる。ナノLC-MS/MSシステム単独ではでは１度で１５０個以上の蛋白同定は困難であるが、フリーフロー電気泳動を組み合わせることによって、例えば約２倍の蛋白の同定が可能となる。
【００２６】
以下に、本発明を具体的実施の態様に基づいて詳細に説明する。
図1は、本発明に係る蛋白質同定のための測定方法および測定装置を模式的に説明するフローチャートである。本装置は、第１工程として試料蛋白質をペプチドに断片化するユニット１と、第２工程としてフリーフロー電気泳動法により試料を分離するフリーフロー電気泳動ユニット２と、第３工程として液体クロマトグラフ法により試料を分離する液体クロマトグラフユニット３と、第４工程として質量分析装計により蛋白質を同定する質量分析ユニット４とを具備する。本蛋白質同定用測定装置は、質量分析ユニットからの測定データを保存するＰＣ５と、データ検索エンジン搭載のＰＣ６と、さらにペプチド断片化ユニット１、フリーフロー電気泳動ユニット２、液体クロマトグラムユニット３、質量分析ユニット４と、第1のＰＣ５と第２のＰＣ６とを制御するＣＰＵ７を含む。
【００２７】
第１工程の試料蛋白質をペプチドに断片化する工程は、試料蛋白質を保持したサンプルカップを一定温度に保つ温度調節機構と、サンプルカップに所定量のプロテアーゼを分注して加える機構とから成るが、その詳細は第１工程は図示していない。
【００２８】
第２の工程において、図２に示すフリーフロー電気泳動ユニット１を用いてフリーフロー電気泳動法により試料を分離・分取する。図２はフリーフロー電気泳動ユニット１１の上面図である。フリーフロー電気泳動ユニット１１は、マイクロファブリケーション技術によって作成する。フリーフロー電気泳動ユニット１１は、泳動槽構成基板１２と注入口構成基板１３との組み合わせで構成される。図２の線III-III部分の断面図を図３に示す。泳動槽構成基板１２には、幅広の溝からなる泳動槽１８と細長い溝からなる２つの電極室１９ａ，１９ｂとが形成されている。電極室１９は泳動槽１８よりも深い溝で構成されている。注入口構成基板１３には、複数の緩衝液注入口１４ａ〜１４ｇと複数の試料注入口１５ａ〜１５ｃと複数の流出口１６ａ〜１６ｕとが形成されている。電極室１９ａ、１９ｂには電極１７ａ，１７ｂがそれぞれ設置されている。泳動槽１８は、泳動槽構成基板１２と注入口構成基板１３とを組み合わせた際の間隔が３０μmとなるように構成されている。
【００２９】
第３工程である液体クロマトグラフ法により試料を分離する工程と、第４工程である質量分析ユニットにより蛋白質を同定する工程は、微小内径のカラムに逆相系の微小充填剤を充填したカラムと、ＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計とを連結したシステムにて構成される。
【００３０】
図４にナノLC-MS/MSシステム２０を示す。ナノLC-MS/MSシステム２０はナノリットルレベルで濃度勾配を形成する送液系２１と逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフィユニット（イオン源カラム）２２と四重極飛行時間型質量分析ユニット２３とからなる。四重極飛行時間型質量分析ユニット２３は四重極質量分析ユニット２４と飛行時間型質量分析ユニット２５を組み合わせた複合型質量分析ユニットである。図４（ｂ）に液体クロマトグラフィユニット２２の先端の模式図を示す。イオン源カラム２２は微小内径のフューズドシリカ管を加工し、その内部に逆相系の充填剤２６を充填して死容積がゼロとなるように構成されている。
【００３１】
図５にナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系および液体クロマトグラフィユニットからなるシステムを示す。図中、３１は送液ポンプ、３２は圧力計、３３，３３’は溶離液搬送流路、３４は溶離液充填用回転バルブ、３５は溶離液充填シリンジ、３６１０ポートの多岐管（マニホールド）、３７は分岐流路、３８は溶離液選択用回転バルブ、３９は試料注入部、４０はインジェクタ、４１はトップカラム、４２は試料残液槽、４３は液体クロマトグラフィユニットカラム、４４はポート、Ｅは溶離液の流れ、Ｓｍは試料の流れ、Ｓｏは溶質溶離液の流れを示す。機能については、特許文献１参照。
【実施例】
【００３２】
次に本発明の蛋白質同定装置を用いた蛋白質同定法の実施例を示す。
試料蛋白質として大腸菌を用い、第１工程としてトリプシンにて試料蛋白質をペプチドに断片化した。ペプチドに断片化した試料を６０マイクロリットルサンプリングし、第２工程のフリーフロー電気泳動ユニットにより試料を分離する工程に用いた。
【００３３】
フリーフロー電気泳動ユニットとして、図２に示すフリーフロー電気泳動ユニット１１を使用した。電気泳動槽１８に流す緩衝液として10v/v%のエチルアルコールを含んだ２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン−９ｍＭホウ酸緩衝液を、試料としてペプチド断片化した蛋白質を用い、フリーフロー電気泳動ユニット１１にてフリーフロー電気泳動を行った。緩衝液は、緩衝液注入口１４ａ〜１４gからポンプで注入した。緩衝液の流速は各緩衝液注入口１４ａ〜１４gに注入する流速をそれぞれ３０マイクロリットル／ｍｉｎとした。試料は試料注入口１５aからポンプで注入した。試料注入流速は５マイクロリットル／ｍｉｎとした。電極１７は電極１７ａを電源の陰極に電極１７ｂを電源の陽極に接続した。フリーフロー電気泳動は、緩衝液と試料溶液を注入しながら電極１７間に１ｍＡの定電流を流して行った。電流印加中に流出口１６から流出する液を回収した。吸収光度計による分析により、ペプチド断片は流出口１６ｃ〜１６ｊに流出していることを確認した。このため、第３及び４の工程であるナノLC-MS/MS２０（図４）には、流出口１６ｃ〜１６ｊからの回収液を用いた。
【００３４】
流出口１６ｃ〜１６ｊをそれぞれナノLC-MS/MS２０を用いシークエンスタグ法にて蛋白質の同定を行った。同定結果を図６に示す。本実施例により３４２個の蛋白質の同定ができた。
【００３５】
次に、実施例の作用及び効果を説明する。
本実施例では、ナノLC-MS/MSシステムでの分析の前にマイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットを用いてペプチド断片試料を１次分離している。マイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットは、泳動槽の間隔が狭いために微量のサンプルを用いることができ、また、高電圧の印加が可能であるため高速な分離ができる。また、無担体電気泳動であり流出液をそのまま二次分析に持っていけるためサンプルロスが非常に少ない。ナノLC-MS/MSシステム、極微量のサンプルにて１００種類以上の蛋白質を１度の分析で自動的に同定することが可能である。このため、マイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットとナノLC-MS/MSシステムを組み合わせることによって、微量サンプルを用いて、フリーフロー電気泳動によって１次分離を行った後、ナノLC-MS/MSシステムにて解析することが可能となる。ナノLC-MS/MSシステム単独ではでは１度で１５０個以上の蛋白同定は困難であるが、実施例の結果にあるように、フリーフロー電気泳動を組み合わせることによって約２倍の蛋白の同定が可能となった。
【００３６】
したがって、本実施形態により、微量サンプルを用いハイスループットな解析が可能な蛋白質同定装置、及び蛋白質同定法を提供することができる。
なお、本実施例では、第１の工程にペプチド断片化する工程を具備しているが、予めペプチドに断片化した試料を用いればこの工程は削除することができる。フリーフロー電気泳動法には単一の緩衝液を用いたゾーン電気泳動法を用いているが、その泳動モードは特に限定されない。両性担体を用いた等電点電気泳動や、２種以上の緩衝液を用いた等速電気泳動とすることもできる。しかしながら、両性担体を用いた等電点電気泳動の場合、その両性担体がペプチドに似た組成であるため、正確な蛋白同定が困難となる。本発明で最適な分離モードは本実施形態の実施例に用いたゾーン電気泳動である。
【００３７】
請求項に掲げる発明は、以下の効果を奏する。
（１）請求項１及び請求項６に係る蛋白質同定のための測定方法及び測定装置によれば、フリーフロー電気泳動ユニット（フリーフロー電気泳動素子）はマイクロファブリケーション技術によって作成される分離素子であり、泳動槽の間隔が狭いために、微量のサンプルを用いて蛋白質の同定ができ、また、高電圧の印加下に連続的に流下分離が可能であるため高速な分離ができる。
フリーフロー電気泳動は無担体電気泳動であり、流出液をそのまま液体クロマトグラフィユニットによる二次分離に持っていけるためサンプルロスが非常に少ない。したがって、本発明により、微量サンプルを用いハイスループットな解析が可能で高分離能の蛋白質同定方法を提供することができる。
【００３８】
（２）請求項２及び請求項７に係る蛋白質同定のための測定方法及び測定装置によれば、質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定する工程を含む。これによって、収集した質量分析データに基づいて該試料蛋白質のアミノ酸配列を決定して該試料蛋白質を同定することができる。
【００３９】
（３）請求項３及び請求項８に係る蛋白質同定ための測定方法及び測定装置によれば、フリーフロー電気泳動ユニットの電気泳動槽の厚みが１５０μm以下である。このようにすることによって、微量サンプルを用いて蛋白質の同定が可能となる、またレイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。
【００４０】
（４）請求項４及び請求項９に係る蛋白質同定ための測定方法及び測定装置によれば、液体クロマトグラフユニットとしてカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットを用い、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用い、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結する。液体クロマトグラフユニットとしてカラムに逆相系の充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットを用いることによって、ペプチド分解した試料蛋白質を高精度にグラジエント溶離することが可能となる。また、質量分析ユニットとしてＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計を用いることによって、液体クロマトグラフユニットからの流出液を直接質量分析装置に導入することができる。従って、該液体クロマトグラフィユニットと複合型質量分析装計とを連結することによって、ペプチド分解した試料蛋白質を高精度にグラジエント溶離でき、更に質量分析装置に導入することで複雑な作業をすることなく連続して迅速に蛋白質の同定が可能となる。
【００４１】
（５）請求項５及び請求項１０に係る蛋白質同定ための測定方法及び測定装置によれば、蛋白質同定のための測定方法及び測定装置において、ナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系を用いて液体クロマトグラフユニットに送液し、液体クロマトグラフユニットが微小内径のカラムに逆相系の微小充填剤を充填した液体クロマトグラフユニットであり、質量分析ユニットがＥＳＩイオン源を持つ複合型質量分析装計である。
【００４２】
マイクロファブリケーション技術によって作成したフリーフロー電気泳動ユニットとナノLC-MS/MSシステムを組み合わせることによって、微量サンプルを用いて、フリーフロー電気泳動によって１次分離を行った後、ナノLC-MS/MSシステムにて解析することが可能とであり、ナノLC-MS/MSシステム単独ではでは１度で１５０個以上の蛋白同定は困難であるが、フリーフロー電気泳動を組み合わせることによって、例えば約２倍の蛋白の同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明に係る蛋白質同定のための測定方法及び測定装置を模式的に説明する。
【図２】本発明に係る蛋白質同定のための測定方法及び測定装置に使用されるフリーフロー電気泳動ユニットの平面図である。
【図３】図２に示すフリーフロー電気泳動ユニットの線III-IIIにおける断面図である。
【図４】本発明に係る蛋白質同定のための測定方法及び測定装置で用いることのできるナノLC-MS/MSシステムを模式的に示す。
【図５】ナノリットルレベルの濃度勾配を作成する送液系および液体クロマトグラフィユニットからなるシステムを示す。
【図６】実施例におけるペプチド同定及び蛋白質同定結果を示す。
【符号の説明】
【００４４】
１  ペプチド断片化ユニット
２  フリーフロー電気泳動ユニット
３  液体クロマトグラフィユニット
４  質量分析ユニット
５  質量分析データ保存用ＰＣ
６  データベース検索エンジン搭載ＰＣ
７  ＣＰＵ
１１  フリーフロー電気泳動ユニット
１２  泳動槽構成基板
１３  注入口構成基板
１４  緩衝液注入口
１５  試料注入口
１６  流出口
１７  電極
１８  泳動槽
１９  電極室
２０  ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム
２１  送液系
２２  液体クロマトグラフィユニット
２３  四重極飛行時間型質量分析ユニット
２４  四重極質量分析計
２５  飛行時間型質量分析計
２６  充填剤
３１  送液ポンプ
３２  圧力計
３３，３３’  溶離液搬送流路
３４  溶離液充填用回転バルブ
３５  溶離液充填シリンジ
３６  多岐管（マニホールド）
３７  分岐流路
３８  溶離液選択用回転バルブ
３９  試料注入部
４０  インジェクタ
４３  液体クロマトグラフィユニットカラム、
Ｅ  溶離液の流れ
Ｓｍ  試料の流れ
Ｓｏ  溶質溶離液の流れ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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