(57)【要約】【課題】  一般的な宿主細胞において、異種Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを機能的に発現させるのに用いられうる核酸；工業的用途のための特定の性質を有するリパーゼ；ならびに該リパーゼを生産しうる微生物を提供すること。【解決手段】  Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８０％同一であり、かつ野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧに対応する少なくとも１２コドンを含み、該１２コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣである変異型ＤＮＡであり、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡを含有した単離核酸；第１のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの基質相互作用ドメインと第２のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの基質相互作用ドメインとを含有したキメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ；該核酸にコードされたＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ；並びに該核酸を含有した微生物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有したカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードしてなる単離核酸。
【請求項２】
配列番号：１の配列を含有してなる、請求項１記載の単離核酸。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列を含有してなるカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ。
【請求項４】
請求項２記載の単離ポリヌクレオチドを含有し、かつ細菌または酵母である微生物。
【請求項５】
細菌が、大腸菌である、請求項４記載の微生物。
【請求項６】
酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項４記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的な宿主細胞において異種C. rugosa （カンジダ・ルゴサ）リパーゼを機能的に発現させるために使用されうる核酸、工業的用途のための特定の性質を有するリパーゼ、および前記リパーゼを産生しうる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リパーゼ（EC 3.1.1.3）は、非特異的および立体特異的な加水分解、エステル化、エステル転移反応およびエステル交換反応を含む広範囲にわたる化学反応を触媒することができる。また、前記リパーゼは、水−脂質界面でのエステル結合の加水分解を触媒する。例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５を参照のこと。
【０００３】
市販のリパーゼの中でもCandida rugosa（カンジダ・ルゴサ）リパーゼは、その触媒能ゆえに、バイオ産業で広く使用されている。一般的には、ほとんど全ての生体触媒用途に粗製Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼが利用されるが、種々の供給者から入手した酵素は、それらの触媒効率および立体特異性にばらつきを示すと報告されている。非特許文献６を参照のこと。粗製Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼからはいくつかの異性体（すなわちアイソザイム）が単離されており、それらリパーゼアイソザイムは、触媒効率および特異性が異なることが明らかになった。非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９を参照のこと。
【０００４】
現在までに、Ｃ．ｒｕｇｏｓａ由来の５つのリパーゼ−コードゲノム配列が特徴づけられている。例えば、非特許文献１０および非特許文献１１を参照のこと。これら５つのリパーゼ−コード遺伝子（LIP1、２、３、４、および５）は、酵母Ｃ．ｒｕｇｏｓａのSacIゲノムライブラリーからコロニーハイブリダイゼーションによって単離されている。これら５つの遺伝子は、それぞれ（LIP1、３、４、および５において）１５アミノ酸長および（LIP2において）１４アミノ酸長の推定シグナルペプチドを有する５３４残基の成熟タンパク質をコードしている。５つの推定アミノ酸配列は６６％の全体的同一性および８４％の類似性を有する。前記推定アミノ酸配列中における高い配列相同性およびこれら５つのリパーゼ遺伝子における発現レベルの差異のための（非特許文献１２）、Ｃ．ｒｕｇｏｓａの培養物から工業的用途のための製造スケールで各アイソザイムを精製することは困難である。
【０００５】
さらに、これらのアイソザイムは、触媒三つ組残基（アミノ酸S209、H449およびE341を含む）ならびにジスルフィド結合形成に関与する部位（アミノ酸C60 、C97 およびC268、C277を含む）が保存されているが、Ｎ−グリコシル化部位、等電点および疎水性プロファイルの他のいくつかの特徴が異なっている。また、各アイソザイムは、触媒効率および特異性などの特定の性質を説明されるであろう。非特許文献１３を参照のこと。したがって、工業的用途のための特定の性質を有する単一のアイソザイムを製造するには、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼアイソザイムのクローニングおよび機能的発現が望ましい。
【０００６】
しかしながら、Ｃ．ｒｕｇｏｓａは、ロイシンのユニバーサルコドンであるトリプレットＣＴＧがセリンとして解読される二形性酵母である。このため、（ＣＴＧがロイシンとして解読される）一般的な宿主細胞ではＣ．ｒｕｇｏｓａアイソザイムの機能的発現は不可能になる。非特許文献１４を参照のこと。
【非特許文献１】Aderら（1997）Methods Enzymol. 286:351-385
【非特許文献２】Gandhi（1997）J. Am. Oil Chem. Soc. 74:621-634
【非特許文献３】Klibanov（1990）Acc. Chem. Res. 23:114-120
【非特許文献４】Shawら（1990）Biotechnol. Bioeng. 35:132-137
【非特許文献５】Wangら（1988）Biotechnol. Bioeng. 31:628-633
【非特許文献６】Bartonら（1990）Enzyme Microb. Technol. 12:577-583
【非特許文献７】Shawら（1989）Biotechnol. Lett. 11:779-784
【非特許文献８】Rua ら（1993）Biochem. Biophys. Acta 1156:181-189
【非特許文献９】Diczfalusyら（1997）Arch. Biochem. Biophys. 343:1-8
【非特許文献１０】Longhiら（1992）Biochim. Biophys. Acta 1131:227-232
【非特許文献１１】Lotti ら（1993）Gene 124:45-55
【非特許文献１２】Lee ら（1999）Appl. Environ. Microbiol. 65:3888-3895
【非特許文献１３】Chang ら（1994）Biotechnol. Appl. Biochem. 19:93-97
【非特許文献１４】Kawaguchi ら（1989）Nature 341:164-166
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、一般的な宿主細胞において、異種Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを機能的に発現させ得る手段、および工業的用途に適した特定の性質を有する実質的に単一であり、かつ単離されたＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼアイソザイムまたはその誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般的な宿主細胞において異種Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを機能的に発現させるために使用できる核酸に関する。
【０００９】
一つの側面として、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有するCandida rugosaリパーゼをコードする単離された核酸、およびコードされるアミノ酸配列を提供する。
【００１０】
別の側面として、本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡを含む単離された核酸を特徴とする。前記変異型ＤＮＡは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％）同一であり、野生型ＤＮＡ中のＣＴＧコドンに対応する少なくとも１２（例えば、１３、１５、１７、または全て）のユニバーサルセリンコドンを含む。各ＣＴＧコドンは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａにおいてセリンとして解読される。前記ユニバーサルセリンコドンのそれぞれは、独立してTCT
、TCC 、TCA 、TCG 、AGT またはAGC である。本明細書で使用する用語「Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ」は、単一のアイソザイムをいい、天然のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２、３、５および８ならびにそれらのバリアントおよびリパーゼ４バリアントを含む。前記単離された核酸の例としては、限定されないが、配列番号：３、５、９および１１が挙げられ、対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：４、６、１０および１２である。
【００１１】
変異型ＤＮＡは、配列番号：３、５、９および１１のＤＮＡまたはその縮重バリアントもしくは配列番号：７バリアントであることができる。縮重バリアントとは、ユニバーサルコドンに基づき、配列番号：３、５、７、９および１１によってコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをコードするいかなる他のＤＮＡ配列をもいう。また、変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０および１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、９５％、９８％または１００％）同一であるポリペプチド配列をコードするＤＮＡでもありうる。実際には、ポリペプチド配列は、そのポリペプチド中の目的とする触媒能が完全には消失しているものであれば、前記アミノ酸配列の全長である必要はない。例えば、変異型ＤＮＡは、配列番号：３、５、９および１１のヌクレオチド配列の少なくとも１０７０ヌクレオチド（例えば、１２００または１５００ヌクレオチド）を含む機能的断片、または配列番号：４、６、１０および１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的断片であって少なくとも３５０アミノ酸（例えば、４００または５００アミノ酸）を含むものである断片をコードする配列である。 
【００１２】
「単離された核酸」という用語は、天然に存在する核酸の構造と、または独立した３個を超える遺伝子にまたがる天然に存在するゲノム核酸の断片の構造とは同一でない構造である核酸をいう。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、それが天然に存在している生物のゲノム内で分子の部分に隣接するコード配列の両方が隣接していないＤＮＡ、（ｂ）得られた分子が天然に存在する任意のベクターまたはゲノムＤＮＡとは同一でないような形式でベクターに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている核酸、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）によって生成された断片、または制限断片などの独立した分子、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子（すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である組換ヌクレオチド配列などを含む。本発明の前記単離された核酸は、微生物に導入してその中で発現させることができ、これも本発明の範囲である。微生物の例は、細菌（例えば、大腸菌）または酵母（例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris ）である。
【００１３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「同一率」（または「相同率」）は、Thompsonらのアルゴリズム（CLUSTAL W 、1994 Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）を用いて決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列を「クエリー配列」として使用して、例えば、関連配列を同定するために目的で公開データベースに対する検索を行なうこともできる。かかる検索は、KarlinおよびAltschul（1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）に記載されているように改変されたKarlinおよびAltschulのアルゴリズム（1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268）を用いて行なわれうる。そのようなアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTおよびXBLASTプログラム（1990 J. Mol. Biol. 215:403-410）に組み込まれている。BLAST ヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア（score ）＝100 、語長（wordlength）＝12で行なわれる。BLAST タンパク質検索はXBLASTプログラム、スコア＝50、語長＝３で行なわれる。２つの配列間にギャップが存在する場合は、Altschulら（1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）に記載されているように、Gapped BLASTを使用する。BLAST プログラムおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合は、各プログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用する。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。
【００１４】
別の側面として、本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡの作製方法を特徴とする。本方法は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡを提供し、該野生型ＤＮＡと、ＤＮＡポリメラーゼと、野生型ＤＮＡ全体を網羅する一対の外部プライマーと野生型ＤＮＡの断片を網羅する多数の内部プライマー対とを混合し、PCR 増幅を行なうことを含む。「外部プライマー」は、変異型ＤＮＡ全体を増幅するように設計されたPCR プライマーであり、「内部プライマー」は、変異型ＤＮＡの断片を増幅するように設計されたPCR プライマーである；プライマーは、外部プライマーとしても内部プライマーとしても機能できる。内部プライマーのそれぞれは、TCT 、TCC 、TCA 、TCG 、AGT 、AGC 、AGA 、GGA 、TGA 、CGA 、ACT およびGCT から選択された１またはそれ以上のセリンのユニバーサルコドンおよびアンチコドンを含み、ユニバーサルコドンおよびアンチコドンは、野生型ＤＮＡ中の少なくとも１２個のCTG コドンに対応する。さらに、各内部プライマーは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする変異型ＤＮＡが得られるような形式で別の内部プライマーまたは外部プライマーと部分的に重なり合っている。
【００１５】
さらなる一側面として、本発明は、第１のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの基質相互作用ドメインと第２のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの非基質相互作用ドメイン（例えば、カルボキシルエステラーゼドメイン）とを含むキメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを特徴とする。例えば、第２のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、配列番号：８のポリペプチドであり、第１のＣ．ｒｕｇｏｓａは、配列番号：４、６、１０または１２のポリペプチドである。
【００１６】
生体触媒用途のためのＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの製造のための前記核酸の使用も本発明の範囲に包含される。
【００１７】
本発明の他の特徴、目的および利点は特許請求の範囲と以下の説明から明らかであろう。
【００１８】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８０％同一であり、かつ野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧに対応する少なくとも１２コドンを含み、該１２コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである変異型ＤＮＡであって、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡを含有してなる単離核酸、
（２）  少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１）記載の核酸、
（３）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（２）記載の核酸、
（４）  全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（２）記載の核酸、
（５）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（４）記載の核酸、
（６）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（５）記載の核酸、
（７）  変異型ＤＮＡが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８５％同一である、前記（１）記載の核酸、
（８）  少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（７）記載の核酸、
（９）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（８）記載の核酸、
（１０）  全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（８）記載の核酸、
（１１）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１０）記載の核酸、
（１２）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（１１）記載の核酸、
（１３）  変異型ＤＮＡが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも９０％同一である、前記（１）記載の核酸、
（１４）  少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１３）記載の核酸、
（１５）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１４）記載の核酸、
（１６）  全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（１４）記載の核酸、
（１７）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（１６）記載の核酸、
（１８）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（１７）記載の核酸、
（１９）  前記（１）記載の核酸を含有し、かつ細菌または酵母である微生物、
（２０）  細菌が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、前記（１９）記載の微生物、
（２１）  酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（１９）記載の微生物、
（２２）  変異型ＤＮＡが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも８５％同一である、前記（１９）記載の微生物、
（２３）  細菌が、大腸菌である、前記（２２）記載の微生物、
（２４）  酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（２２）記載の微生物、
（２５）  変異型ＤＮＡが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡに対して少なくとも９０％同一である、前記（１９）記載の微生物、
（２６）  細菌が、大腸菌である、前記（２５）記載の微生物、
（２７）  酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（２５）記載の微生物、
（２８）  配列番号：３、５、９、もしくは１１のＤＮＡまたはその縮重バリアントまたは配列番号：７バリアントのＤＮＡを含有してなる単離核酸、
（２９）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする野生型ＤＮＡを提供する工程；および
野生型ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼと該野生型ＤＮＡの全体を網羅する外部プライマー対と野生型ＤＮＡの断片をそれぞれ網羅する内部プライマー対とを混合して、ＰＣＲ増幅を行なう工程
を含み、ここで、内部プライマーのそれぞれが、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴおよびＧＣＴからなる群より選ばれたセリンに対する１以上のユニバーサルコドンおよびアンチコドンであって、野生型ＤＮＡにおける少なくとも１２個のＣＴＧコドンに対応するユニバーサルコドンおよびアンチコドンを含み、各内部プライマーが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡが得られる様式で別の内部プライマーまたは外部プライマーとオーバーラップするものであり、ただし、該カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ４ではないものである、
カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードする変異型ＤＮＡの製造方法、
（３０）  少なくとも１５コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該１５コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（２９）記載の方法、
（３１）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（３０）記載の方法、
（３２）  全コドンが、野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応し、かつ該コドンのそれぞれが、独立して、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣである、前記（３０）記載の方法、
（３３）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２に対して少なくとも９０％同一である、前記（３２）記載の方法、
（３４）  カンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼのアミノ酸配列が、配列番号：４、６、１０または１２である、前記（３３）記載の方法、
（３５）  変異型ＤＮＡが、配列番号：３、５、９もしくは１１のＤＮＡ、またはその縮重バリアント、または配列番号：７バリアントのＤＮＡである、前記（２９）記載の方法、
（３６）  第１のカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼの基質相互作用ドメインと、第２のカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼの非基質相互作用ドメインとを含有してなるキメラカンジダ
ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、
（３７）  第２のカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、配列番号：８である、前記（３６）記載のリパーゼ、
（３８）  第１のカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼが、配列番号：４、６、１０、または１２である、前記（３７）記載のリパーゼ、
（３９）  配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有したカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼをコードしてなる単離核酸、
（４０）  配列番号：１の配列を含有してなる、前記（３６）記載の単離核酸、
（４１）  配列番号：２のアミノ酸配列を含有してなるカンジダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ、
（４２）  前記（４０）記載の単離ポリヌクレオチドを含有し、かつ細菌または酵母である微生物、
（４３）  細菌が、大腸菌である、前記（４２）記載の微生物、ならびに
（４４）  酵母が、ピー．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、前記（４２）記載の微生物、
である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、一般的な宿主細胞における工業的用途のための特定の性質を有するカンジダ  ルゴサリパーゼの単一のアイソザイムの製造及び工業的用途に有用である。本発明は、カンジダ  ルゴサリパーゼをコードする、カンジダ  ルゴサリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと８０％同一であり、かつ野生型ＤＮＡにおけるＣＴＧコドンに対応する少なくとも１２個（例えば、１３個、１５個、１７個または全部）のユニバーサルセリンコドンを含む変異型ＤＮＡを含む単離核酸を特徴とする。ユニバーサルコドンのそれぞれは、独立して、TCT 、TCC 、TCA 、TCG、AGT またはAGC である。カンジダ  ルゴサリパーゼは、カンジダ  ルゴサリパーゼ２、３、５または８でありうる。また、本発明は、新規リパーゼ８と命名された新規カンジダ  ルゴサリパーゼ８をコードする単離核酸およびコードされたリパーゼを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有したCandida rugosaリパーゼに関する。本発明の発明者らは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８と命名された、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含有した新規Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを見出した。本発明の新規リパーゼ８遺伝子は、リパーゼ生産能を有する微生物Candida rugosaから得られる。好ましくは、前記リパーゼ８遺伝子は、配列番号：１の核酸配列を有する。
【００２１】
以下にＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８の核酸配列とコードされたアミノ酸配列とを示す。
【００２２】
【化１】
2005185290.tif 000002
【００２３】
【化２】
2005185290.tif 000003
【００２４】
【化３】
2005185290.tif 000004
【００２５】
本発明は、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする野生型ＤＮＡと少なくとも８０％同一である変異型ＤＮＡを含む単離核酸に関する。
【００２６】
以下に、野生型ＤＮＡにおけるセリンに対応する全てのＣＴＧコドンが、ユニバーサルセリンコドンにより置換されている、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ３、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ４、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ５、およびＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８の変異型核酸配列を示す。変異ヌクレオチドを黒色バックグラウンドで示す。また、コードされたアミノ酸配列を示す。
【００２７】
【化４】
2005185290.tif 000005
【００２８】
【化５】
2005185290.tif 000006
【００２９】
【化６】
2005185290.tif 000007
【００３０】
以下に、Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol.387, March 1, pp93-98, 2001に発表された、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ４の変異型核酸配列およびコードされたアミノ酸配列を示す。
【００３１】
【化７】
2005185290.tif 000008
【００３２】
【化８】
2005185290.tif 000009
【００３３】
【化９】
2005185290.tif 000010
【００３４】
【化１０】
2005185290.tif 000011
【００３５】
各変異型ＤＮＡと、対応する野生型ＤＮＡとの間の差異は、ユニバーサルセリンコドンによるＣＴＧコドンの置換によるものであり、それに加えて、ユニバーサルコドンに基づき野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼまたはその機能的に同等なアミノ酸配列をコードするＤＮＡバリアントをもたらす遺伝子コドンの縮重によるものである。このような変異型ＤＮＡを含む単離された核酸は、一般的な宿主細胞においてＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをクローン化し、発現させるために使用されうる。ＤＮＡバリアントは、特定の原核宿主または真核宿主により優先されるコドンを保持することができる。宿主によりコドンが使用される頻度に従って、原核宿主または真核宿主において、ポリペプチドの発現が生じる速度が増加するように、コドンを選択してもよい。変異型ＤＮＡは、野生型ＤＮＡ上のヌクレオチドの置換、欠失、逆位または挿入などのバリエーションをさらに含むことができる。前記バリエーションは、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼのクローニング、プロセシングおよび発現を改変しうる。
【００３６】
前記変異型ＤＮＡは、核酸配列中における所定の位置に極めて特異的なヌクレオチド置換（すなわち変異）を導入する部位特異的変異導入法に基づいて作製されうる。例えば、ZollerおよびSmith （1983）Meth. Enzymol. 100:468ならびにMolecular Cloning, A Laboratory Manual、（1989）、Sambrook、Fritsch およびManiatis、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、第１５章などを参照のこと。他方、当該技術分野で周知の化学的方法を用いて変異型ＤＮＡを、全部または部分的に合成してもよい。Caruthers ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223 およびHornら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232 を参照のこと。特に、多重変異の導入は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)、リガーゼ連鎖反応（LCR ）またはオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応などに基づく種々の方法によって達成できる。GeおよびRudolph （1997）BioTechniques 22:28-30を参照のこと。
【００３７】
変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０または１２のポリペプチドをコードすることができる。他方、変異型ＤＮＡは、配列番号：４、６、１０または１２と９０％同一であるか、１、５、１０、５０またはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド変異体をコードすることができる。この比較に整列が必要な場合は、最大相同性になるように配列を整列させるべきである。ポリペプチドバリアントは、配列番号：４、６、１０または１２によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つの触媒活性（例えば、エステル結合加水分解またはエステル化など）と関連づけられる。ポリペプチドバリアントは、置換アミノ酸が類似した構造的または化学的性質を有する「保存的」変化を有しうる。当該技術分野では類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義づけられている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。ある態様では、ポリペプチドバリアントは、「非保存的」変化、例えば、メチオニンによるロイシンの置換を有してもよい。さらに、ポリペプチドバリアントは、アミノ酸の欠失または挿入もしくはその両方を含んでもよい。どのアミノ酸残基が、触媒活性の消失なしに置換、挿入または削除できるかを決定する際の指針は、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム（例えば、DNASTAR ソフトウェアなど）を用いて見出されるであろう。
【００３８】
クチナーゼは、三次元構造が決定された最も小さい脂肪分解酵素であり、脂質をも含む、より広い活性を有するエステラーゼであると考えられうることが周知である。二次構造（例えば、αヘリックスまたはβ鎖）の整列に基づき、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼポリペプチド鎖のトポロジーは、クチナーゼのトポロジーと似ている（LIP1およびLIP3の三次元構造は決定されている。例えば、Grochulskiら（1993）J. Biol. Chem. 268:12843-12847；およびGhosh ら（1995）Structure 3:279-288 を参照のこと）。したがって、リパーゼに共通する折り畳みパターン（Cyglerら（1997）Methods in Enzymol 284:3-37 ）に従って、残基１００〜４５６の範囲内のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの最小機能断片を決定することができる（例えば、β２鎖〜α８，９ヘリックス、全体として約350 アミノ酸および1070ヌクレオチド）。
【００３９】
配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２とはＮ末端ペプチド（すなわち、SMNSRGPAGRLGS ）および４アミノ酸（すなわち、 A1V；T35S；R78L；H79D）が異なる。配列番号：６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ３とはＮ末端ペプチドおよび５アミノ酸（すなわち、 A1V；P148H ；I395V ；F396L ；I399L ）が異なる。配列番号：１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ５とはＮ末端ペプチドおよび５アミノ酸（すなわち、A1V 、K147E 、T256A 、G346D 、S492Y ）が異なる。配列番号：１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ１とはＮ末端ペプチドおよび１７アミノ酸（すなわち、A1V ；L184M ；I253V ；N265D ；Y320F ；N330S ；I331V ；Q357E ；E360Q ；K363T ；I374L ；G383Q ；I395V ；G414A ；T416I ；L417H ；F517S ）（全アミノ酸の約３％）が異なり、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、野生型Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ１およびＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ８とは全アミノ酸の３．４％が異なる。
【００４０】
前記ポリペプチドは、本発明の単離された核酸を含む発現ベクターを用いて製造されうる。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、そのベクターと連結された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子をいい、プラスミド、コスミドまたはウイルスベクターなどが挙げられうる。ベクターは、自己複製し得、本発明の核酸を宿主細胞における当該核酸の発現に適した形で含む。ベクターは、発現対象の核酸配列に作動可能に連結された１またはそれ以上の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）などを含む。調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的発現を支配するものおよび組織特異的調節配列または誘導性配列が挙げられる。ベクターは、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞（例えば、P. pastoris （ピキア・パストリス））または哺乳類細胞などの原核もしくは真核細胞におけるＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの発現のために設計されうる。Goeddel （1990）Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 （Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ）には適切な宿主細胞がさらに記載されている。Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの発現は、融合リパーゼまたは非融合リパーゼの発現を支配する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行なわれうる。融合リパーゼは、可溶性ポリペプチドの精製を容易にするであろう。融合ベクターはそこにコードされているポリペプチド（通常はそのポリペプチドのアミノ末端）にいくつかのアミノ酸を付加する。典型的な融合発現ベクターにはpGEX（Pharmacia Biotech Inc.；Smith およびJohnson （1988）Gene 67:31-40 ）、pMAL（New England Biolabs 、マサチューセッツ州ビバリー）およびpRIT5 （Pharmacia 、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が挙げられ、これらのベクターはそれぞれグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST ）、マルトースE 結合タンパク質またはプロテインA を標的ポリペプチドに融合させる。
【００４１】
ベクターは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法を介して宿主細胞に導入されうる。本明細書で使用する用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションなどを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための技術として当該技術分野で認識されている種々の技術をいう。本発明の宿主細胞はＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼを発現させるために用いられ得る。発現されたＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、宿主細胞または培養培地から単離することができる。
【００４２】
本発明は、アイソザイムの基質相互作用ドメインと、別のアイソザイムの非基質相互作用ドメインとを含むキメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼも提供する。「基質相互作用ドメイン」とは、およそ３２アミノ酸の配列（例えば、配列番号：４、６、８、１０または１２のアミノ酸６３〜９４など）を特徴とし基質相互作用に参加する断片をいう。「非基質相互作用ドメイン」は、カルボキシルエステラーゼドメインなどの少なくとも１つの触媒ドメインを含む。基質相互作用ドメインは、全長のアミノ酸配列に沿って広く分散していて脂肪族アシル鎖などと相互作用するトンネルを形成する基質結合領域の一部でありうる。Cyglerら（1999）Biochim. Biophys. Acta 1441:205-214 を参照のこと。
【００４３】
カルボキシルエステラーゼドメインはカルボン酸エステルの加水分解を触媒し、触媒三つ組残基、すなわちセリン、グルタミン酸（またはアスパラギン酸）およびヒスチジンを含む。活性部位セリン付近の配列はよく保存されており、シグネチャーパターンとして利用できる。例えば、Krejciら（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6647-6651 （1991）またはCyglerら（1993）Protein Sci. 2:366-382を参照のこと。本発明のキメラポリペプチドは、ドメインシャフリング法によって作製できる。例えば、前記方法には、SphI(184)-BstXI(304)制限酵素ＤＮＡ断片を交換して、成熟キメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードする組換核酸を得ることが含まれる。この成熟リパーゼは、あるアイソザイムの基質相互作用ドメインと、別のアイソザイム（例えば、LIP4）の非基質相互作用配列とを含む。次に、前記の組換核酸を、ベクター（例えば、pET-23a(+)大腸菌T7発現ベクター（Novagen ）のNdeI部位とEcoRI 部位の間）に連結する。
【００４４】
前記ドメインのそれぞれは、キメラポリペプチドにおいて目的とする機能が保たれているものであれば、対応する野生型配列と少なくとも７０％（例えば、８０％、９０％、９５％または１００％）の相同性を有する。キメラポリペプチドは、融合キメラポリペプチド、例えば、キメラポリペプチドのＮ末端に融合したチオレドキシンなどとして製造されうる。
【００４５】
以下の具体的な実施例は、単なる例示に過ぎず、決して本明細書の他の部分を制限するものではないと解釈すべきである。さらに詳述することなく、本明細書の説明に基づいて、当業者は、本発明を最大限に利用できると考えられる。本明細書で引用する全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【実施例１】
【００４６】
Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ２（LIP2）の発現
材料および方法
菌株およびプラスミド  プラスミド含有形質変換体は、主にアンピシリン（100 μg/mL）を追加したルリア- ベルターニ（LB）ブロスで生育させた。P. pastoris 発現ベクターpGAPZ αC （Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）は、ゼオシン（25μg/mL）を追加した低塩ルリア- ベルターニ（LB）ブロス（１％トリプトン、0.5 ％酵母エキスおよび0.5 ％NaCl、pH7.5 ）で生育した大腸菌TOP10'株中で操作した。LIP2の発現にはP. pastoris X-33（野生型）を使用し、その形質転換体は、100 μg/mLのゼオシンを含むYPD （0.1 ％酵母エキス、0.2
％ペプトンおよび0.2 ％ブドウ糖、pH7.2 ）中、26℃で培養した。
【００４７】
発現ベクターの構築  LIP2は、以前、配列決定されている（EMBLデータバンクアクセッション番号X64704）。5'末端にKpnI制限部位および3'末端にNotI部位を有する、全LIP2コード領域を含むPCR 産物を調製し、P. pastoris 発現ベクターｐGAPZαC のKpnI-NotI 部位にクローン化して、pGAPZ α-LIP2 を得た。
【００４８】
プラスミドＤＮＡのP. pastoris への形質転換  遺伝子工学的に作製されたリパーゼ遺伝子を保持するプラスミドＤＮＡ（10μg ）を、EcoRV により、総液量20μL にて２時間消化した。エレクトロポレーション法によって直鎖状プラスミドをP. pastoris に形質転換した。パルスコントローラー（Pulse Controller；Bio-Rad Laboratories）を装備したGene Pulser （登録商標）を用いて、0.2cm
電極間隙キュベット（Bio-Rad Laboratories）中の試料100 μL に高電圧パルス（1.5kV ）を印加した。形質転換体の個々のコロニーを選び、トリブチリンエマルションYPD 平板にパッチした。リパーゼ分泌形質転換体を、不透明なトリブチリンエマルション上の透明な領域によって同定した。PGAPZ αC により形質転換されたP. pastoris を陰性対照として使用した。
【００４９】
組換LIP2の精製  P. pastoris の培養培地を分子量30,000カットオフの膜における限外ろ過により濃縮した。次にこれらの試料をHiPrepＴＭ 16/10オクチルFFカラム（Pharmacia Biotech ）に供した。前記カラムを５カラム体積のTE緩衝液＋1mM CHAPS 、次いでTE緩衝液＋4mM CHAPS で洗浄した。次に、30mM CHAPSを含む５カラム体積のTE緩衝液により、結合しているタンパク質を溶出した。溶出した物質をTE緩衝液に対して透析した。
【００５０】
次に、溶出したタンパク質を、TE緩衝液で平衡化したHiPrepＴＭ  16/10 Q XLカラム（Pharmacia Biotech ）に供し、0mM 〜300mM の５カラム体積の(NH４)２SO４  の直線勾配を用いてタンパク質を溶出させた。Bio-Rad アッセイキットを用いて、各画分のタンパク質濃度を測定し、p-ニトロフェニルブチレートを基質として、エステラーゼ活性を測定した。精製タンパク質を、貯蔵緩衝液（60mM KCl、10mM Tris-HCl 、1.25mM EDTA 、１％トリトンX-100 および17％グリセロール、pH7.5 ）中、−20℃で保存した。
【００５１】
酵素の特徴づけ  精製組換LIP2と市販リパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma ）の分子量を、SDS-PAGE解析により決定した。リパーゼの熱安定性を解析するために、37℃〜100 ℃の種々の温度で試料を10分間インキュベートし、残存活性を分光測光法（Redondo ら（1995）Biochim. Biophys. Acta 1243:15-24 ）により、p-ニトロフェニルカプリルレート(caprylrate)を基質として37℃で決定した。リパーゼに関する至適反応温度を10℃から60℃までの種々の温度で調べ、分光測光法によりp-ニトロフェニルブチレートを基質として用い、pH7.0 で活性を測定した。リパーゼの至適反応pHを3.0 から9.0 までのpHで調べ、分光測光法によりp-ニトロフェニルブチレートを基質として用い、37℃で活性を測定した。
【００５２】
種々の鎖長の脂肪酸を有するトリグリセリドを基質として用い滴定測定によりリパーゼ活性を測定した。Wangら（1988）Biotechnol. Bioeng. 31:628-633を参照のこと。pHスタット(pH-Stat) における1mM NaOHによる滴定により、遊離脂肪酸の放出を連続的にモニターした。37℃におけるエステラーゼ活性は、p-ニトロフェニルエステルを基質として用い、分光光学的に決定した。活性の１単位は、１分あたり１μmol のp-ニトロフェノールを放出できる酵素の最小量として定義された。
【００５３】
結果
組換LIP2の発現プラスミドの構築および過剰発現  LIP2遺伝子の全17個のCTG
コドンを、同時多重部位特異的変異導入法によってユニバーサルSer コドン（TCT ）と置換した。GeおよびRudolph （1997）BioTechniques 22:28-30を参照のこと。エレクトロポレーションにより、遺伝子工学的に作製されたLIP2を保持するプラスミドをP. pastoris に形質転換した。形質転換体細胞を、200mL のYPD 培地が入っている500mL フラスコで３日間生育させた。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAP ）の強力な構成的プロモーターは、LIP2の高レベルでの発現を可能にする。発現したLIP2の多くは、培養培地中に分泌され、LIP2の推定量は、2.3mg/L であった。形質転換体は、高く安定であり、高細胞密度発酵では生産されたLIP2が著しく増加するだろう。Cereghino およびCregg （2000）FEMS Microbiol. Rev. 24:45-66 を参照のこと。
【００５４】
組換LIP2の生化学的特徴づけ  LIP2の至適pHは７であり、本酵素は、pH6 で90％の活性を示した。これに対して、LIP4および市販Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ（CRL ）の至適pHは、それぞれpH７〜８およびpH８であった。LIP2は、p-ニトロフェニルブチレートに対して、試験した全てのpHで（また特にpH6 で）LIP4およびCRL よりも、より高い比活性を示した。LIP2、LIP4およびCRL の比活性の比は、pH6 では100 ：４：３であったが、pH８では100 ：80：25であった。したがって、LIP2は、弱酸性〜中性のpHで工業的用途にとりわけ有用である。
【００５５】
さらに、LIP2、LIP4およびCRL の至適温度は、それぞれ40〜50、40および37℃であった。LIP2は30〜50℃の広い至適温度範囲を示し、試験された全ての温度（10〜60℃）でLIP4およびCRL よりはるかに高い比活性を示した。予想外なことにLIP2は低温で極めて高い活性を示し、例えば、10℃における比活性は1000U/mgで、これは至適温度における比活性の50％であった。これは、本酵素が不安定な化合物および低沸点化合物の低温での合成に応用できることを示唆した。
【００５６】
また、種々の温度で10分間加熱した後の酵素活性を比較した。LIP2は、50〜70℃におけるLIP4またはCRL よりも安定であった。70℃で10分間の加熱後に、LIP2、LIP4およびCRL の残存活性は、それぞれ80％、50％および35％であった。
【００５７】
種々の鎖長の脂肪酸のp-ニトロフェニルエステルの加水分解（表１）に関して、LIP2、LIP4およびCRL はエステル基質に対して異なる選択性を示した。LIP2、LIP4およびCRL の最もよい基質は、それぞれ、p-ニトロフェニルパルミテート、p-ニトロフェニルパルミテート、およびp-ニトロフェニルカプリレートであった。LIP2およびLIP4の両方が、中〜長鎖脂肪酸エステル (C１２  〜C１８)に、より高い活性を示したが、LIP2は、LIP4より２〜３倍高い活性を有した。p-ニトロフェニルブチレート、p-ニトロフェニルカプリレート、p-ニトロフェニルカプレート、p-ニトロフェニルラウレート、p-ニトロフェニルミリステート、p-ニトロフェニルパルミテートおよびp-ニトロフェニルステアレートを含む多くのp-ニトロフェニルエステルに関して、比活性は、LIP2＞LIP4＞CRL の順序であった。
【００５８】
トリグリセリドの加水分解活性  リパーゼの重要な工業的用途の一つは、トリグリセリドとして自然界に存在する脂肪および植物油の加水分解による脂肪酸の製造である。例えば、Shawら（1990）Biotechnol. Bioeng. 35:132-137を参照のこと。表２は、LIP2、LIP4およびCRL がトリグリセリド基質に対して異なる選択性を有することを示した。LIP2、LIP4およびCRL の最もよいトリグリセリド基質は、それぞれ、トリブチリン、トリカプリリンおよびトリカプリリンであった。
【００５９】
トリブチリン、トリラウリン、トリパルミチン、トリステアリンおよびトリオレインに関して、加水分解の比活性はLIP2＞LIP4＞CRL の順序であった。トリアセチンおよびトリカプロインに関して、順序は、LIP2＞CRL ＞LIP4であった。トリカプリリンに関して、順序は、LIP4＞CRL ＞LIP2であった。トリカプリンとトリミリスチンに関して、順序は、CRL ＞LIP2＞LIP4であった。したがって、トリグリセリド加水分解において、異なる工業的用途には、異なるLIP アイソフォームを使用すべきである。
【００６０】
コレステロールエステラーゼ活性  表３に示すように、試験した３つのコレステリルエステルでは、LIP2はLIP4およびCRL よりも、より高いコレステロールエステラーゼ比活性を示した。種々のコレステリルエステルのなかで、コレステリルラウリレートは、LIP2によって加水分解される最もよい基質であった。したがって、LIP2は、臨床化学、生化学および食品分析における用途に有用なコレステロールエステラーゼとして用いられ得る。血清コレステロールの約70〜80％は種々の鎖長の飽和脂肪酸でエステル化されているので（Roeschlau ら（1974）12:403-407）、コレステロールエステラーゼ活性を有するLIP2は、コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼとカップリングして、血清コレステロールを酵素的に測定するために用いられ得る。種々のコレステリルエステルに対するLIP2の高い比活性は、血清および食品中のコレステロールエステルの高効率かつ正確な測定を可能にする。
【００６１】
エステルの合成  リパーゼは、果物風味の製品（例えば、飲料、キャンディー、ゼリーおよびジャム）、焼き菓子、ワイン、乳製品（例えば、発酵バター、サワークリーム、ヨーグルト、およびチーズなど）、乳化剤、滑沢剤および化粧品などの工業用途のための種々のエステルの合成を効率よく触媒することができる。例えば、Kim ら（1998）J. Am. Oil Chem. Soc. 75:1109-1113；ShawおよびLo（1994）J. Am. Oil Chem. Soc. 71:715-719；またはShawら（1991）Enzyme Microb. Technol. 3:544-546 を参照のこと。表４は、LIP2がオクタデシルミリステートのヘキサデシルミリステート(hexadecyl of octadecyl myristae) の合成においてLIP4またはCRL よりも、より優れていることを示し、異なるアルコールの等モル混合物によるミリスチン酸のエステル化において、LIP2が長鎖アルコールに有利に働くことを示唆する。これに対して、ヘキシルミリステート、オクチルミリステートおよびドデシルミリステートの合成にはCRL が最もよく、ミリスチン酸エステル合成に関してCRL は中〜短鎖アルコールに有利に働くことが示唆された。
【００６２】
表５は、LIP2が、プロリルブチレートの合成に関して、LIP4またはCRL よりも、より高い活性を有することを示し、鎖長の異なる脂肪酸の等モル混合物によるn-プロパノールのエステル化において、LIP2が短鎖の酸に有利に働くことが示唆された。これに対して、プロピルドデカノエート、プロピルヘキサデカノエートおよびプロピルオクタデカノエートの合成にはLIP4が最もよく、プロピルエステル合成に関してLIP4は中〜長鎖脂肪酸に有利に働くことを示唆した。
【００６３】
【表１】
2005185290.tif 000012
【００６４】
【表２】
2005185290.tif 000013
【００６５】
【表３】
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【００６６】
【表４】
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【００６７】
【表５】
2005185290.tif 000016
【実施例２】
【００６８】
キメラタンパク質の発現
材料および方法
発現ベクターの構築  大腸菌発現ベクターpET23a-LIP4-S19 およびpET23a-trx-LIP4-S19 を、Tangら（2000）Protein Exp. Purif. 20:308-313に記載のように構築した。リーダー配列をもたないLIP1、LIP2、LIP3、およびLIP5のオープンリーディングフレームを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって得た。Longhiら（1992）Biochim. Biophy. Acta 1131:227-232およびLotti ら（1993）Gene 124:44-55を参照のこと。キメラＤＮＡ配列を、LIP4のSphI(184)-BstXI(304)制限ＤＮＡ断片とLIP1、LIP2、LIP3またはLIP5の対応する断片とをそれぞれ置換することによって構築した。得られた配列は、それぞれTrX-LIP4/lid1 、TrX-LIP4/lid2 、TrX-LIP4/lid3 、およびTrX-LIP4/lid5 と呼ばれる成熟キメラＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼをコードし、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【００６９】
大腸菌からの組換LIP4の製造  組換プラスミドを保持する大腸菌AD494(DE3)株（Novagen 、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を、50μg/mLアンピシリンと15μg/mLカナマイシンとを追加したルリア−ベルターニ（LB）ブロス中、37℃で終夜生育させた。次に、細胞を新しい培地に20倍希釈し、25℃で振盪培養した。最終濃度0.05mMになるようにIPTGを添加した後、OD600 が1.0 に達するまで細胞を10℃でインキュベートした。
【００７０】
組換LIP4の精製  誘導後に、AD494(DE3)形質転換体を4000g 、４℃、10分間での遠心分離によって回収した。細胞ペレットをTE緩衝液（20mM Tris-HCl および2.5mM EDTA、pH8.0 ）に再懸濁した。細胞を超音波処理装置で破砕し、ついで、細胞溶解物の可溶性画分を15,000g 、４℃、30分間の遠心分離によって回収した。可溶性画分を分子量10,000カットオフの膜での限外ろ過によって濃縮した。ついで、これらの試料を、TE緩衝液で平衡化したDEAE- セファロースCL-6B （Pharmacia Biotech ）カラムに供した。0mM 〜100mM の５カラム体積の(NH４)２SO４  の直線勾配を用いて組換リパーゼを溶出した。
【００７１】
ついで、溶出されたタンパク質をButyl-Sepharose 4 Fast Flow （Pharmacia
Biotech ）疎水相互作用カラムに供した。前記カラムを、５ベッド体積のTE緩衝液＋1mM CHAPS 、ついでTE緩衝液＋4mM CHAPS で洗浄した。次に、結合したタンパク質を30mM CHAPSを含有する５ベッド体積のTE緩衝液で溶出させた。溶出した試料をTE緩衝液に対して透析し、貯蔵緩衝液（60mM KCl、10mM Tris-HCl 、1.25mM EDTA 、１％トリトンX-100 および17％グリセロール、pH7.5 ）中、−20℃で保存した。画分におけるタンパク質濃度を、Bio-Rad アッセイキットを用いて測定し、エステラーゼ活性をp-ニトロフェニルブチレートを基質として用いて測定した。精製組換リパーゼと市販リパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma L1754）との分子量を、SDS-PAGE解析によって決定した。
【００７２】
キメラタンパク質の発現  基質相互作用ドメインが別の異性体のものと交換されたキメラタンパク質を前記のように調製した。
【００７３】
酵素アッセイ  トリブチリンを基質として用いて滴定測定によってリパーゼ活性を測定した。pH−スタットでの10mM NaOH を使った滴定によって遊離脂肪酸の放出を連続的にモニターした。37℃におけるエステラーゼ活性は、p-ニトロフェニルエステルを基質として用いる分光光学的に決定した。活性の１単位は、１分あたり１μmol のp-ニトロフェノールを放出できる酵素の量として定義された。
【００７４】
結果
タンパク質の溶解性を向上させ、精製を容易にするために、大腸菌チオレドキシン（Trx ）をLIP4のN 末端に融合して、融合タンパク質Trx-LIP4を作製した。Trx-LIP4は、より良好な溶解性を有し、天然LIP4と同様の活性を保っていた。LIP4と比較したLIP1、LIP2、LIP3およびLIP5の全アミノ酸配列の各ペアの同一性は、それぞれ81、83、84および78％であったが、基質相互作用ドメイン（すなわち、lid 領域）のアミノ酸同一性は、それぞれ50、53、50および56％であった（表６）。
【００７５】
リパーゼ活性におけるlid 領域の影響を調べるために、他の４つのＣ．ｒｕｇｏｓａアイソフォーム（LIP1、２、３、および５；それぞれlid1、2 、3 および5 ）由来のlid 領域をLIP4のlid 領域と交換し、それぞれキメラタンパク質Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid2 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 として発現させた。表７に示すように、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid3 のリパーゼ加水分解活性は、トリブチリンを基質とした天然LIP4と比較してそれぞれ14％および32％増加したが、Trx-LIP4/lid1 とTrx-LIP4/lid5 は、それぞれ85％および20％減少した。
【００７６】
リパーゼ特異性におけるlid の影響は使用される基質に著しく依存した。表８に示すように、lid が変化しているキメラタンパク質は全て未改変のTrx-LIP4と比較して種々の程度に活性の低下を示したが、鎖長が異なる脂肪酸の種々のコレステロールエステルに関する相対活性は本質的な変化を示した。例えば、Trx-LIP4、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid3 の最もよい基質は、コレステロールカプレートであるが、Trx-LIP4/lid1 とTrx-LIP4/lid5 にとって最もよい基質はコレステロールステアレートであった。これに対して、p-ニトロフェニルエステルを基質として使用した場合は、p-ニトロフェニルカプレートとp-ニトロフェニルステアレートとの両方がTrx-LIP4およびTrx-LIP2の最もよい基質であったが、Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 の最もよい基質は、p-ニトロフェニルカプレートのみであった。またlid の変化は、種々の不飽和脂肪酸のコレステロールエステルの選択性における酵素の基質特異性にも影響を及ぼした。表９に示すように、Trx-LIP4の最もよい基質は、コレステリルオレエート（18：１）であり、それに続いてコレステリルリノレエート（18：２、相対活性68％）であるが、コレステリルステアレート（18：０）は悪い基質であった（相対活性７％）。Trx-LIP4/lip2 およびTrx-LIP4/lid3 は、よく似た基質選択性パターンを有していた。
【００７７】
さらに、Trx-LIP4/lid1 の最もよい基質は、コレステリルステアレートであり、それに続いてコレステリルリノレエート、次がコレステリルオレエートであった。Trx-LIP4/lid5 については、基質選択性の順序が、コレステリルオレエート、コレステリルステアレート、およびコレステリルリノレエートであった。コレステリルリノレエートとの種々の組換LIP4キメラタンパク質の反応速度パラメーターを解析した。表10に示すように、融合タンパク質Trx-LIP4は、VmaxおよびKmの両方が増加したが、天然LIP4と同様のKcat/Km を示した。Trx-LIP4/lid2 がTrx-LIP4と同様の触媒効率を保っていたのに対し、Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid3 およびTrx-LIP4/lid5 は、著しく低下したKcat/Km を示した。触媒効率の低下はKcatの著しい減少によるものと思われた。
【００７８】
また、lid ドメインは、リパーゼのエナンチオ選択性に影響を及ぼした。表11に示すように、Ｃ．ｒｕｇｏｓａリパーゼは、d-メンチルアセテートよりもl-メンチルアセテートの加水分解に有利であった。組換Trx-LIP4および全キメラLIP4は、市販のＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼ（リパーゼ、タイプVII 、Sigma ）よりも、よりよいエナンチオ選択性を示した。Trx-LIP4/lid3 のエナンチオ選択性だけがTrx-LIP4と同様であった。他のキメラタンパク質（Trx-LIP4/lid1 、Trx-LIP4/lid2 およびTrx-LIP4/lid5 ）は、酢酸メチルを基質とするエナンチオ選択性における本質的な低下を示した。他のキラル基質を使用した場合、エナンチオ選択性の順序が変化した可能性はかなり高い。
【００７９】
リパーゼの触媒作用にlid ドメインが及ぼす影響の構造上の根拠は何か  コンピューター解析によれば、天然LIP4のlid ドメイン（lid4）中の正に荷電したLys75 は、タンパク質表面に存在する負に荷電したAsp292と水素結合および静電相互作用を形成して、開口型コンフォメーション（疎水性基質に対するリパーゼの活性状態）にあるlid4を安定化する。したがって、これが中および長鎖脂肪酸エステルなどの疎水性基質に対するLIP4の高い活性の一因になった（表8-10）。lid2ドメインは、開口型コンフォメーションの安定化においてlid4に類似したlid コンフォメーションおよびアミノ酸残基を有するので（表６）、Trx-LIP4/lid2 キメラタンパク質はTrx-LIP4に近い触媒効率を示した。これに対し、Lys75-Asp292相互作用はlid1、3 および5 におけるGlu71 によって中断されるので、これらのキメラタンパク質は、疎水性基質に関して触媒効率の著しい低下を示した。
【００８０】
短鎖親水性基質の場合、この開口型安定化の効果はそれほど重要でない。したがって、Trx-LIP4よりも、トリブチリン加水分解において、さらによいTrx-LIP4/lid3 のリパーゼ活性（表７）は、活性部位または基質結合部位のコンフォメーションが異なるためであろう。また、Trx-LIP4/lid3 は、Trx-LIP4と同様のエナンチオ選択性を示し（表11）、同様の触媒機構が第２アルコールに対するキラルなエナンチオ選択性を呈したのかもしれない。Cyglerら（1994）J. Am. Chem. Soc. 116:3180-3186 を参照のこと。これらのケースにおいて、lid ドメイン交換の影響はコンフォメーション変化によるものであり、そのコンフォメーション変化が活性部位領域に対して微妙な影響を持ち、基質特異性および触媒効率の変化をもたらしたのだろう。
【００８１】
結論として、lid ドメインは、組換LIP 酵素の触媒効率、エステル基質の脂肪酸鎖長および不飽和度選択性、ならびにエナンチオ選択性に対して有意な影響を有する。したがって、lid ドメインは、所望の工業的用途のためにＣ．ｒｕｇｏｓａリパーゼの生体触媒特性を合理的に設計する上で、タンパク質工学にとってよい選択肢である。基質特異性、触媒効率、エナンチオ選択性、さらには酵素安定性を担うアミノ酸残基を特定するために、LIP4のlid 領域での部位特異的変異導入を現在行なっているところである。
【００８２】
【表６】
2005185290.tif 000017
【００８３】
【表７】
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【００８４】
【表８】
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【００８５】
【表９】
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【００８６】
【表１０】
2005185290.tif 000021
【００８７】
【表１１】
2005185290.tif 000022
【００８８】
他の態様
本明細書において開示された特徴の全てを、いかなる組合せで組み合わせてもよい。本明細書において開示された各特徴は、同じ目的、均等な目的または類似の目的を行なう他方の特徴により置き換えられてもよい。したがって、開示された各特徴は、他に特別に述べることなく、均等な特徴または類似の特徴の一般的な系列の一例にすぎない。
【００８９】
上記記載から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合するように種々の変更及び改変をなしうる。したがって、他の態様も請求の範囲の範囲内である。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、一般的な宿主細胞における工業的用途のための特定の性質を有するカンジダ  ルゴサリパーゼの単一のアイソザイムの製造及び工業的用途に有用である。
【配列表】
2005185290000001.app