(57)【要約】【課題】本発明は、新規の蛍光物質を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、次式（I）：【化１】2005232104.tif 000008で表される新規イソクマリン系化合物およびその製造方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（I）：
【化１】
2005232104.tif 000006
で表される化合物。
【請求項２】
レジオネラ属に属し、且つ、次式（I）：
【化２】
2005232104.tif 000007
で表される化合物を生産する能力を有する細菌を培養し、培養物から上記式（I）で表される化合物を採取することを特徴とする上記式（I）で表される化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規蛍光物質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光物質は、蛍光増白剤、蛍光プローブなどに利用することができる。
レジオネラ属に属する細菌のうちの幾つかは青白色の蛍光を発することから、レジオネラ属細菌から新規蛍光物質を単離できる可能性がある。本発明者らはこれまでに、レジオネラ属に属する細菌から新規蛍光物質を単離する試みを行ってきたが、未だ蛍光物質の特定に至っていない。
【０００３】
【非特許文献１】前川純子、倉文明、渡辺治雄：Legionella dumoffiiの青白色蛍光についての解析。第75回日本細菌学会総会抄録集、2002年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規の蛍光物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１）次式（I）：
【化１】
2005232104.tif 000002
で表される化合物。
【０００６】
（２）レジオネラ属に属し、且つ、次式（I）：
【化２】
2005232104.tif 000003
で表される化合物を生産する能力を有する細菌を培養し、培養物から上記式（I）で表される化合物を採取することを特徴とする上記式（I）で表される化合物の製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、波長340nmの長波紫外線で励起され450nmの青色蛍光を発する新規蛍光物質およびその製造方法が提供される。この新規蛍光物質は、蛍光増白剤、蛍光プローブなどに利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、次式（I）：
【化３】
2005232104.tif 000004
で表される新規イソクマリン系化合物およびその製造方法に関する。
【０００９】
上記化合物は、波長340nmの長波紫外線で励起され450nmの青色蛍光を発する。
なお、イソクマリン骨格を有し蛍光を有する天然由来の化合物としてはレプロシビン (Leprocybin)（Liebigs Ann. Chem. 1982, 1280-1296）が知られているが、本発明の化合物とは異なる化合物である。
【００１０】
式（I）で表される化合物は、レジオネラ属に属し且つ式（I）で表される化合物を生産する能力を有する細菌を培養し、培養物から式（I）で表される化合物を採取することにより製造することができる。
【００１１】
レジオネラ属に属し且つ式（I）で表される化合物を生産する能力を有する細菌としては、例えばレジオネラ・デュモフイ (Legionella dumoffii)、レジオネラ・ボゼマニイ (Legionella bozemanii)、レジオネラ・ゴルマニイ (Legionella gormanii)、レジオネラ・アニサ (Legionella anisa)、レジオネラ・タクソネンシス (Legionella tucsonensis)、レジオネラ・チェリイ (Legionella cherrii)、レジオネラ・パリシエンシス (Legionella parisiensis)、レジオネラ・リチカ (Legionella lytica)、レジオネラ・スタイガーワルチイ (Legionella steigerwaltii)、レジオネラ・ロウボサミ (Legionella rowbothamii)であって式（I）で表される化合物を生産する能力を有するものが挙げられ、なかでもレジオネラ・デュモフイが特に好ましい。これらの細菌は、目的に応じて適宜改変されていてもよい。改変方法としては、例えば、式（I）で表される化合物の過剰生産を促進する転写因子（例えばレジオネラ・デュモフイのgacA 遺伝子）をクローニングしたプラスミドベクターをレジオネラ属に属する細菌に導入する方法が挙げられる。
【００１２】
レジオネラ属に属し且つ式（I）で表される化合物を生産する能力を有する細菌としては、更に具体的には、レジオネラ属菌内で増殖可能なプラスミドベクターpMMB207cに、PCRで増幅したgacA遺伝子をクローニングして作製されたプラスミド：pMMB207c-gacAをレジオネラ・デュモフイNY23株（ATCC 33279）に導入したもの（以下、「蛍光物質大量生産株」と称する）が挙げられる。この蛍光物質大量生産株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにより受託が拒否された（受託拒否証明書通知番号：１５産生寄第１９２２）が、本蛍光物質大量生産株の分譲は出願人が保証する。ここで、gacA遺伝子とは、種々のオペロンの転写を調節する因子をコードする遺伝子である。gacA遺伝子を含むDNA配列を配列番号１に示す。このDNA配列のうちタンパク質のコード領域（終始コドンを含む）は第395番〜第1054番である。gacA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。gacA遺伝子の過剰発現により、本発明の新規蛍光物質の生産量が数倍上昇する。これは本発明の新規蛍光物質の生合成系酵素（群）が大量に作られる結果と考えられる。この蛍光物質大量生産株は、10％スキムミルクに濃厚に懸濁して-80℃で保存することができる。
【００１３】
本発明には、以上で説明した細菌の菌株（蛍光物質大量生産株のように改変されたものも含む）を変異誘発処理して得られる変異株を用いてもよい。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことができる。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原を用いてもよい。
【００１４】
本発明で使用する細菌の培養方法としては、液体培地または固体培地による培養を行うことができ、用いられる菌の生育に適し、かつ本発明の化合物の生産に適した培養条件が選ばれる。培養は好気的条件下で行うのが一般的に有利であり、培養温度は３０℃〜３７℃、好ましくは３５℃〜３６℃であり、培養時間は使用する培地や培養条件によって異なるが、通常２日〜７日程度である。
【００１５】
本発明で使用する細菌の培養に用いられる培地は、当該細菌が利用し得る栄養物を含有する培地であればよい。例えば、炭素および窒素源としてアミノ酸を使用することができ、アミノ酸の供給源として例えば酵母エキスを使用することができる。アミノ酸の中でも特にＬ−システインの要求性が高いため、Ｌ−システインを培地に添加することがより好ましい。このほか必要に応じて無機塩類を培地に添加することができる。無機物としては特に鉄の要求性が高いため、鉄を含む無機塩類を培地に添加することが好ましい。さらにまた、菌の発育または本発明化合物の生産を促進する有機化合物または無機化合物を適当に添加することができる。また、寒天を用いた固体培地で培養する場合、寒天に含まれる不純物（脂肪酸等）が生育を抑制することがあるので、不純物を吸着させるために、デンプンまたは活性炭を添加することが好ましい。本発明に使用するレジオネラ属細菌の培養ｐＨは６．５〜７．５好ましくは、６．８５〜６．９５である。このように培養ｐＨの範囲が非常に狭いので、緩衝剤を培地に添加してｐＨの調整を行なうのが好ましい。緩衝剤としてはＡＣＥＳ（N-(2-アセタミド)-2-アミノエタンスルホン酸）が好適に使用される。本発明の細菌の培養には、固体培地としてはＢＣＹＥα培地（Buffered Charcoal-Yeast Extract 0.1％α-ketogulutalate）が、液体培地としてはＢＹＥ培地（Buffered Yeast Extract）が、それぞれ好適に使用できる。
【００１６】
本発明の化合物を培養物から採取するにあたっては、通常の精製採取手段、例えば溶媒抽出、イオン交換樹脂等を用いる吸着カラムクロマトグラフィーまたは分配カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、透析、遠心分離等を、単独であるいは適宜組み合わせて使用することができる。特に好ましい方法は以下ようなものである。
【００１７】
レジオネラ属に属する細菌の培養菌体を遠心分離により集菌し、菌体から有機溶剤を用いて脂質を抽出し、抽出された脂質をシリカゲルカラムで分画し、蛍光物質を含む画分を更に分取用HPLCに供して340nmの励起波長による450nmの蛍光を発する画分を分取することにより、本発明の化合物を採取するのである。
【００１８】
上記式（Ｉ）で表される化合物はまた通常の化学的合成法により合成することもできる。
次に、本発明を実施例により更に詳しく説明する。
【実施例】
【００１９】
菌株の調製
プラスミドベクターpMMB207c（Hales, L. M., および H. A. Shuman. 1999. Infect. Immun. 67:3662-3666を参照されたい）に、PCRで増幅したgacA遺伝子をクローニングし、プラスミド、pMMB207c-gacAを作製した。PCRに使用するプライマーはgacA遺伝子全体を増幅できるよう外側に設定した。プライマーの配列は5’-TGCTGCAACCGGTTTATTTCG-3’（配列番号３）、5’-GGAACGATAGCTTTCTATGCG-3’（配列番号４）である。TaqポリメラーゼとしてAmpli Taq（Applied Biosystems）を用い、製造業者が推奨する通常の方法でPCRを行なった。PCR産物を精製後、平滑末端化し、pMMB207cのSmaI部位に挿入した。
【００２０】
こうして得られたpMMB207c-gacAをレジオネラ・デュモフイNY23株 (ATCC 33279)に、Gene Pulser II（Bio-Rad）を用いて電気穿孔法により導入した。0.1cmのキュベットを使用し、2.0 kV、100Ω、2.5μFの条件で行なった。
【００２１】
得られた蛍光物質大量生産株は、以下の実験に使用するまで、10％スキムミルクに菌体を濃厚に懸濁して、-80℃で保存した。
【００２２】
培養および集菌
保存された上記蛍光物質大量生産株１白金耳分を、9cmシャーレ中のBCYEα寒天培地（Buffered Charcoal-Yeast Extract 0.1％α-ketogulutalate、Difco）に塗り広げ、35℃で3日間生育させた。密に生育してきたコロニーをすべて、1.8 L のBYE培地（Buffered Yeast Extract）(Ristroph, J. D., K. W. Hedlund, および R. G. Allen. J Clin Microbiol. 11:19-21を参照されたい)に接種し、37℃で一晩振盪培養した。培養後、高速遠心器により集菌し、湿重量6gの菌体を得た。それを蒸留水で２回洗浄した。
【００２３】
蛍光物質の抽出および精製
Bligh-Dyerの変法(脂質の化学、生化学実験講座、東京化学同人、1974を参照されたい)により、菌体から脂質を抽出した。120mLのメタノール:クロロホルム(1:1)に上記菌体 6ｇを懸濁し、１時間撹拌後、遠心分離（5500g, 10分間）を行った。得られた上清を減圧下で乾固し、200mgの抽出物を得た。この抽出物に蒸留水30mL、メタノール75mL、クロロホルム37.5mLを順次加え、3分間撹拌した後、15分放置した。さらに、クロロホルム37.5mLを加え、1分間撹拌後、蒸留水37.5mLを加え、30分間撹拌した。有機溶媒層と水層が完全に分離するまで遠心分離（6000g、30分間）を行った。得られた有機溶媒層（下層）を減圧下で乾固した。こうして、6ｇの菌体から100mgの脂質が得られた。
以上の操作を２回行い、得られた脂質をプールした。
【００２４】
次に、シリカゲルカラムを用いて、脂質を分画した(脂質研究法、生化学実験法、東京化学同人、1975を参照されたい)。上記で得られた脂質 200mgをヘキサン5mLに溶解させた。この溶解液を、ヘキサンで膨潤させたシリカゲル 12ｇを充填したカラム（内径2cm）に装填し、ヘキサン45mL、ヘキサン：ジエチルエーテル(99:1) 95mL、ヘキサン：ジエチルエーテル(95:5) 60mL、ヘキサン：ジエチルエーテル(92:8) 75mL、ヘキサン：ジエチルエーテル(85:15) 115mLを順次溶出溶媒として溶出した。溶出液に長波紫外線を照射し、蛍光の発光をモニターした。溶出溶媒がヘキサン：ジエチルエーテル(99:1)またはヘキサン：ジエチルエーテル(95:5)であるときに溶出された画分に蛍光発光が認められ、それ以外の画分では蛍光発光はほとんど認められなかった。そこで、ヘキサン：ジエチルエーテル(99:1)またはヘキサン：ジエチルエーテル(95:5)であるときに溶出された画分を集め、溶媒を減圧留去した。
【００２５】
こうして得られた蛍光物質を含む溶出物をヘキサンに溶解し、HPLCによって精製した。シリカゲルカラム（Inertsil 5μm、内径4.6mm×25cm、ジーエルサイエンス株式会社）を用いて、溶媒は10%エーテル／ヘキサン、流速は1ml/分で、340nmの光による450nmの蛍光をモニターして分取を行い、単一の蛍光物質（約100μg）を得た。
【００２６】
得られた単一物質の物理化学的性状は以下の通りであった。
（１）形状：黄色粉末
（２）溶解性：クロロホルム、ヘキサン、メタノール、ＤＭＳＯ、ジメチルエーテル、アセトンに可溶、水に難溶
（３）分子式：C19H14O3
（４）質量スペクトル（EI, m/z, 相対強度）：290(M+,100),215(14),149(32),145(13),138(17),115(25),105(13),57(13)
（５）高分解能マススペクトルの結果、分子量は290.0942である
（６）1H-NMR (500MHz, CDCl3): δ 10.97 (s, 1H), 7.54 (t, 1H, J=7.5Hz), 7.44 (d, 2H, J=7.5Hz), 7.33 (t, 2H, J=7.5Hz), 7.26 (t, 1H, J=7.5Hz), 7.22 (dd, 1H, J=11.0, 15.0Hz), 6.91 (d, 1H, J=7.5Hz), 6.89 (dd, 1H, J=11.0, 15.5Hz), 6.85 (d, 1H, J=7.5Hz), 6.80 (d, 1H, J=15.5Hz), 6.37 (s, 1H), 6.23 (d, 1H, J=15.0Hz)
（７）13C-NMR (125MHz, CDCl3): δ166.0, 161.8, 152.1, 138.0, 137.3, 137.0, 136.6, 133.8, 128.8, 128.4, 127.5, 126.8, 122.4, 116.3, 115.3, 106.4, 106.1
（８）この物質は更に、図１に示す1H-1H-COSYスペクトル、図２に示すHMQCスペクトル、図３に示すHMBCスペクトルを示した。
【００２７】
以上の物理化学的性状から、この蛍光物質は、次式（I）：
【化４】
2005232104.tif 000005
で表される、イソクマリン骨格を持つ化合物であると特定された。この化合物は新規な化合物である。
【００２８】
この化合物の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定したところ、最大励起波長は340nm、最大蛍光波長は450nmであった（図４）。図４において、横軸は波長、縦軸は相対的な強度を示し、Ｅｘは励起(excitation)スペクトルを示し、Ｅｍは蛍光(emission)スペクトルを示す。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】式（I）で表される化合物の1H-1H-COSYスペクトルである。
【図２】式（I）で表される化合物のHMQCスペクトルである。
【図３】式（I）で表される化合物のHMBCスペクトルである。
【図４】式（I）で表される化合物のスペクトル特性を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３０】
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
【図１】
2005232104.tif 000009
【図２】
2005232104.tif 000010
【図３】
2005232104.tif 000011
【図４】
2005232104.tif 000012
【配列表】
2005232104000001.app