(57)【要約】【課題】ヒトの腸内で安定的に定着することができ、優れた生理的活性を有する新規な乳酸菌及びこの用途を提供する。【解決手段】本発明は、新規なペディオコッカス属微生物に関するもので、より詳しくはヒトの腸内から由来した、免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有するペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１（ＫＣＣＭ−１０５１７）及びこの用途に関するものである。本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１は大食細胞/脾臟細胞活性化及び腸管免疫活性誘導を通じて優れた免疫増強活性を表し、また抗癌及び抗菌活性を表すため、免疫増強剤、抗癌剤及び抗菌剤をはじめとして食品添加剤、整腸剤、生菌剤、飼料添加剤及びその他の発酵製品の製造に多様に利用することができる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５１７）、または前記菌株と同等な免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有する前記菌株のミュータントまたはバリアント。
【請求項２】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する免疫増強用組成物。
【請求項３】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する抗癌用組成物。
【請求項４】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する抗菌用組成物。
【請求項５】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する整腸用組成物。
【請求項６】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する生菌剤組成物。
【請求項７】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する飼料用組成物。
【請求項８】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する食品添加用組成物。
【請求項９】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する発酵製品。
【請求項１０】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地で30-45℃、10-40時間培養することを特徴とするペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントの培養方法。
【請求項１１】
請求項1のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを微生物と接触させることを含む微生物生長（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ）をコントロールする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なペディオコッカス属微生物に関するものとして、より詳しくはヒトの腸内から由来した、免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有するペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１（ＫＣＣＭ−１０５１７）及びこの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）は炭水和物を分解し、これを用いて乳酸を作る細菌であって、酸素が少ない所でうまく増殖する通性嫌気性菌または偏性嫌気性菌である。乳酸菌は5属に区分できるが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、そして、ペデイオコツカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に分けられる。連鎖状球菌であるストレプトコッカス属微生物は同型発酵菌として、牛乳を発酵させて乳酸を生成することにより腐敗菌や病原菌を抑制することと知られている。ラクトバチルス属微生物は同型または異型発酵をする乳酸桿菌として、乳製品や野菜の発酵過程でよく見られる菌であり、双球菌であるロイコノストック属微生物は異型発酵をして野菜類の発酵に主に関与する。また、ビフィドバクテリア属微生物は酸素がある所では生育できない偏性嫌気性菌として、糖を発酵して幼児に有用に代謝できるL(+)型の乳酸を生成する。最後に、ペディオコッカス属微生物は糸連菌の形態を有する同型発酵菌として、キムチや塩漬け食品に存在し、ソーセージなどの肉類発酵に関与する。これらの中、ヒトの腸内に最多の乳酸菌は偏性嫌気性乳酸菌であるビフィドバクテリアであって、ラクトバチルス、ストレプトコッカスなどのような通性嫌気性乳酸菌より約1百〜1千倍以上多く存在すると知られている。
【０００３】
乳酸菌は、腸内のpHを酸性に維持させて大腸菌やクロストリジュウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＳＰ．）のような有害菌の繁殖を抑制し、下痢と便泌を改善するのみならず、ビタミン合成、抗癌作用、血清コレステロール低下などの役割を果たす。特に、乳酸菌は腸の粘膜と上皮細胞に強く結合できる特定蛋白質を有していて有害細菌の成長を防止する整腸作用に大いに役立つ。また、乳酸菌は大食細胞の増殖を促進して大食細胞の腸内有害細菌に対する認知能力、殺菌能力などを強化させ、免疫関連物質の分泌を促進して免疫増強効果を奏すると知られている（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照。）その中でもラクトバチルス属微生物はアシドフィリン（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｎ）を生産して異質菌、サルモネラ菌、葡萄状球菌などの有害菌の成長を阻害し、下痢原因菌の増殖を抑制して腸内菌叢を正常化することにより、下痢を止める作用を果たすと知られている。また、ペディオコッカス ペントサセウスは菌株特異的な抗菌ペプチドを分泌してヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ＳＰ．）など体内の有害細菌の生長を抑制する能力が卓越したものと明らかになった。
【０００４】
最近にはヒトの腸内に少数存在する乳酸菌を腸内に定着させるために、乳酸菌を分離し、前記乳酸菌を生菌剤、食品添加剤、整腸剤などに開発しようとする研究が活発に進行されている。大韓民国特許第264295号には「韓国人に適合した生理活性を保有した新規なビフィドバクテリウムロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＭＫ−Ｇ７ビフィダス菌株及びこの用途」について開示されており、大韓民国特許第１５８０４９号には「保湿性に優れた多量の粘質多糖類を生産するビフィドバクテリウムロンガムＨＳ９０」について開示されている。また、大韓民国特許第２０００−３１６５１７号には「酸生成能力及び耐酸性に優れた新規なラクトバチルス アシドフィルスＹＤ９９０４菌株及びこれを含有する製品」について開示されており、大韓民国特許第２００１−７０６８９号には「耐酸性及び耐胆汁性に優れて、病原性微生物と腐敗性微生物の生育を抑制させる抗菌能力があるラクトバチルス アシドフィルス３０ＳＣ」について開示されており、大韓民国特許出願第２００１−１１７９７号には「ロタウイルス及び有害微生物抑制活性を有する新規な耐酸性ラクトバチルスロイテリプロバイオ-16及びこれを含有する生菌活性剤」について開示されている。このように、乳酸菌に対する大部分の研究は耐酸性及び/または有害微生物抑制活性を有するラクトバチルス属微生物とビフィドバクテリウム属微生物についてのみ主に行われてきた。
【０００５】
これに、本発明者らは免疫増強活性に優れた新規な乳酸菌を開発すべく研究を重ねた中、人糞から新規なペディオコッカス属微生物を分離し、前記微生物が免疫増強活性のみならず、抗癌及び抗菌活性を有していることを確認することにより本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｇａｂｒｉｅｌａ ｐｅｒｄｉｇｏｎ ｅｔ ａｌ．、 ｊ． ｏｆ ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ５３：４０４−４１０、 １９９０
【非特許文献２】Ｋａｔｓｕｍａｓａ ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ３２（７）：６８９−６９８、 １９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする技術的課題は、ヒトの腸内で安定的に定着することができ、優れた生理的活性を有する新規な乳酸菌及びこの用途を提供することである。
したがって、本発明はヒトの腸内から由来した、免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有するペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１およびその変異体としてのミュータントまたは変異体としてのバリアントを提供する。
【０００７】
微生物の特性を変化させないながら、そのミュータントを得る方法は当業界に公知されている。例えば、ミュータントは紫外線、Ｘ線、ガンマー線のような物理的または化学的突然変異原及びｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅのような化学物質を処理して得られる。また、ナチュラル バリアントを得る方法、例えば親菌株（ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）の培養菌（ｃｕｌｔｕｒｅｓ）のスクリーニングも当業界に公知されている。したがって、本発明はペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１の特性、例えば免疫増強、抗癌及び抗菌活性を保有する前記菌株のミュータントまたはバリアントを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する免疫増強用、抗癌用、抗菌用、整腸用、生菌剤、飼料用及び食品添加用組成物を提供する。
また、本発明は前記ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを含有する発酵製品を提供する。
【０００９】
本発明は、前記ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを培養する方法を提供する。
更に、本発明は前記ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを微生物と接触させることを含む微生物生長をコントロールする方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有する新規なペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を分離・同定した。本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントは大食細胞/脾臟細胞活性化及び腸管免疫活性誘導を通じて優れた免疫増強活性を表し、また抗癌及び抗菌活性を表すために、免疫増強剤、抗癌剤及び抗菌剤をはじめとして食品添加剤、整腸剤、生菌剤、飼料添加剤及びその他の発酵製品の製造に多様に利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は優れた免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有する新規なペディオコッカス属微生物を提供する。乳酸菌がヒトに使用され得るためには、腸内に安定的に定着しなければならず、耐胆汁性及び耐酸性がなければならない。したがって、ヒトを対象とした乳酸菌製品を作るためには、ヒトから由来した乳酸菌を利用しなければならない。これに、本発明者らは人糞からヒトの腸内から由来した、優れた免疫増強活性を有するペディオコッカス属微生物を分離した。まず、人糞から乳酸菌選択培地であるLBSアガール培地を用いて多数の乳酸菌を選択的に分離した後、各菌株を培養して得た菌体を大食細胞と共に培養した。以後、最も高い大食細胞増殖率を表す微生物を選別した後、同定した。この時、前記大食細胞には、哺乳動物の腹腔から分離した大食細胞を使用することが望ましく、具体的に本発明ではマウスの腹腔から分離した大食細胞を使用した。また、分離された微生物の同定は形態学的、培養学的及び生理学的特性を基礎にしてバージースマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  ｍａｎｕａｌ）の分類基準及び微生物同定用キットを用いた分析プログラムを利用して実施することができる。また、グラム染色、酸素要求性、栄養要求性、資化性、代謝による生成物、酵素反応、抗生物質抵抗性などのような生理的特性などを調査して同定することができ、ＤＮＡ塩基組成、１６Ｓ ＲＮＡ構造分析を利用する分子遺伝学的方法、細胞壁構成成分、電子伝達系のキノン型、菌体脂肪酸組成（ＭＩＤＩ）化学分類法及び免疫学的方法を利用することができる。具体的に、本発明では微生物同定用キットであるＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ Ｃｏ．、 Ｆｒａｎｃｅ）を用いて得られた結果をＡＰＩ ＬＡＢプラスデータベースＶ５．０で分析して本発明の微生物を同定した。その結果、本発明で分離された微生物がペデイオコツカスペントサセウスと９９．９％の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示すことを確認した。したがって、本発明者らは前記微生物を「ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１」と命名し、韓国微生物保存センターに２００３年１０月１０日付で寄託した(寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５１７)。
【００１２】
本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１は次のような生理的特性を有する。
第一に、細胞濃度に依存して大食細胞の増殖を促進させ、大食細胞による細胞性免疫活性、脾臟細胞による体液性免疫活性及び腸管免疫活性を増進させる(図3〜図5及び図7〜図9を参照)。
【００１３】
第二に、癌細胞の増殖を有意的に抑制する(図10〜図11を参照)。
第三に、多様な有害微生物に対して抗菌活性を表す(表3〜表5を参照)。
したがって、本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントはヒト及び動物の健康増進のための用途、すなわち免疫増強用、抗癌用、抗菌用、整腸用、生菌剤または飼料用組成物として使用され得る。前記組成物は、本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントの破砕された細胞壁分画、生菌、死菌、乾燥菌または培養物を有効成分として含むことができ、賦形剤または担体を更に含むことができる。前記培養物は液体培地で培養した培養液自体、前記培養液を濾過または遠心分離して菌株を除去した濾液(遠心分離した上澄液)、前記培養液を超音波処理または溶解酵素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）処理して得た細胞破砕液などを含む。組成物内のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントの含量は組成物の用途及び剤形に応じて変わり得る。
【００１４】
本発明に係る免疫増強用、抗癌用、抗菌用、整腸用または生菌剤組成物は多様な剤形と方法で製造及び投与することができる。例えば、ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを薬剤学的分野において通常的に使用する担体及び香料と混合して錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）または顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅ）などの形態で製造及び投与することができる。前記担体には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤などを使用することができる。投与方式は経口、非経口または塗布法を使用することができるが、望ましくは経口投与することが望ましい。また、投与容量は体内で活性成分の吸収度、不活性率及び排せつ速度、被投与字の年齢、性別、状態などに応じて適切に選択することができる。また、本発明に係る飼料用組成物は発酵飼料、配合飼料、ペレット形態及びサイレッジ（ｓｉｌａｇｅ）などの形態で製造することができる。前記発酵飼料は、本発明の乳酸菌と種々の微生物菌または酵素を添加することにより有機物を発酵させて製造することができ、前記配合飼料は種々の一般飼料と本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを混合して製造することができる。ペレット形態の飼料は前記発酵飼料または配合飼料をペレット機で剤形化して製造することができ、サイレッジは青刈飼料を本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントで発酵させることにより製造することができる。
【００１５】
本発明に係る抗癌用組成物として治療または予防できる癌は、これに限定されないが、乳房癌、大腸癌、肺癌、小細胞肺癌、胃癌、肝癌、血液癌、骨癌、膵贓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、皮膚または眼球内黒色種、子宮癌、卵巣癌、直膓癌、肛門癌、結腸癌、喇叭管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎臓細胞癌腫、腎臓骨盤癌腫、ＣＮＳ腫瘍、１次ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、脳下垂体腺腫またはこれらの組合であり得る。望ましくは腹水癌、肺癌、胃癌または血液癌であり得る。
【００１６】
また、本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントは離乳食、キムチ、飲料などの食品に対する食品添加剤として使用することができる。併せて、本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントは発酵製品製造のための種菌として使用することができる。前記発酵製品はハム及びソーセージのような発酵肉製品、発酵生食製品、キムチなどを含む。本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを用いた発酵製品は当業界に公知された通常の方法により製造することができる。例えば、前記発酵生食製品は、玄米と鳩麦などの穀類粉末に本発明に係る乳酸菌またはこれを含む2-3種の混合乳酸菌を処理して適正温度で発酵させた後、白豆、もち米、黍などの多様な農産物を栄養的な均衡と嗜好性に優れたように適切に配合して製造することができる。
【００１７】
本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントは通常的なペディオコッカス属微生物の培養方法により大量で培養することができる。培養培地には、炭素源、窒素源、ビタミン及びミネラルで構成された培地を使用することができ、例えば、ＭＲＳ（Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐ）培地または牛乳が添加された培地を使用することができる。微生物の培養は通常の乳酸菌培養条件下で可能であり、例えば、30℃〜45℃で10時間〜40時間程度培養することができる。より望ましくは37℃で18時間程度培養することが望ましい。培養液中の培養培地を除去し、濃縮された菌体のみを回収するために遠心分離または濾過過程を経ることができ、このような段階は当業者が必要に応じて行うことができる。濃縮された菌体は通常的な方法により冷凍（ｆｒｏｚｅｎ）したり、または冷凍乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）してその活性が失わないように保存することができる。
【００１８】
本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１は、グラム-陽性及びグラム-陰性微生物に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で広範囲な抗菌活性スペクトルを表す。したがって、本発明はペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントを微生物と接触させることを含む微生物生長をコントロールする方法を提供する。前記微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、 Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのようなグラム陽性細菌及びＥ． ｃｏｌｉ、 Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、 Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、 Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ のようなグラム陰性細菌を含む。
【００１９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するもので、本発明の内容がこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
本発明に係るペディオコッカス属微生物の分離及び同定
人糞1gを生理食塩水１００ｍｌに懸濁した後、適当量を取ってＬＢＳアガール培地(酢酸ナトリウム２５ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、パンクレアチックダイジェストカゼイン１０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４６．０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、クエン酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、ポリソルビン酸８０１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５７５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４０．０３４ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４ ０．１２ｇ／Ｌ、酢酸１．３２ｍＬ／Ｌ、アガール１５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．５)に塗抹して単一コロニーを分離した。以後、各コロニーをＭＲＳ培地(１Ｌ当りペプトン10ｇ、酵母抽出物5ｇ、ビーフ抽出物10ｇ、葡萄糖20ｇ、ポリソルビン酸1ｇ、クエン酸アンモニウム2ｇ、酢酸ナトリウム5ｇ、ＭｇＳＯ４0.1ｇ、ＭｎＳＯ４ 0.05ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ 2ｇ)に接種し、37℃で24時間培養した。以後、遠心分離し、培養液から菌体を回収した後、超音波破砕機で菌体を破砕して試料を製造した。それから、Ｂａｌｂ／Ｃマウス(大韓実験動物センター)の腹腔から分離した大食細胞と前記試料を12時間培養して大食細胞の増殖率が最も高い菌株を選抜した。この時、大食細胞の増殖率はニュートラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ）アッセイを通じて生存細胞内に蓄積される染料の量を測定して調査した。以後、選抜された菌株をＡＰＩ ５０ ＣＨＬキット（ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ Ｃｏ．、 Ｆｒａｎｃｅ）を用いて同定した。前記菌株をＡＰＩ ＣＨＬ培地に懸濁した後、ストリップに分注し、培養して発酵された炭水和物の酸生成有無によるpHによる色の変化に基づいて結果を判読した。各結果を微生物同定プログラムであるＡＰＩ ＬＡＢプラスデータベースＶ5.0を用いて分析した。その結果、前記選抜された菌株はペデイオコツカスペントサセウスと９９．９％の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示した。したがって、本発明者らは前記菌株を「ペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１」と命名し、２００３年１０月１０日付で韓国微生物保存センターに寄託した(寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５１７)。図1は、本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１(以下、ＥＲＯＭ１０１という)を顕微鏡により観察した結果を示したものである。前記菌株の生化学的な特性は次の通りであり、糖利用性は下記表1に記載されている通りである。
<菌株特性>
1．生育温度:30-45℃で生育が良好であるが、15℃では生育不可能(最適温度:37℃)
2．生育ｐＨ：６−７（最適ｐＨ：６．５）
3．運動性:なし
4．グラム染色:陽性
5．α-グルコシダーゼ活性:陽性、β-ガラクシトダーゼ活性:陰性
6．酸素影響:通性嫌気性
【００２１】
【表１】
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【実施例２】
【００２２】
ＥＲＯＭ１０１の免疫増強活性調査:試験管内テスト
<2-1>大食細胞増殖率及び活性調査
a)大食細胞増殖率測定
前記実施例1で分離したＥＲＯＭ１０１の免疫増強活性を調査するために、培養時間による生菌数を測定した。前培養された菌株をＭＲＳ培地に最終濃度2％になるように接種して37℃で培養し、培養時間による生菌数を測定した。その結果、図2に示されているように、18時間培養した時最も高い生菌数を示すことが確認できた。
【００２３】
以後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の免疫増強活性を確認するために、18時間培養したＥＲＯＭ１０１を前記実施例1の記載と同様にマウス腹腔由来大食細胞と共に24時間培養した。この時、対照群には公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３１２１）を使用した。以後、前記実施例1と同様な方法により大食細胞の増殖率を調査し、大食細胞の増殖率は対照群に対する％で表した。その結果、図3のAに示されているように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１による大食細胞増殖率がラクトバチルス アシドフィルスよる増殖率より顕著に高いことが確認できた。また、生菌数による大食細胞の増殖率を調査するために、18時間培養したＥＲＯＭ１０１を各濃度に希釈してマウス由来大食細胞と共同培養した。その結果、図3のBに示されているように、細胞濃度により大食細胞の増殖率が増加することが確認できた。前記結果から本発明のＥＲＯＭ１０１が大食細胞の増殖を高い水準で促進することが確認できた。
b)大食細胞活性調査
殺菌されたチオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）1ｍｌを5週齢のＢａｌｂ／Ｃマウス(大韓実験動物センター)の腹腔に投与して72時間活性化させた。以後、マウスの頚椎を脱骨させた。ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、 ＮＥＷ ＹＯＲＫ、 ＵＳＡ）5ｍｌを前記マウスの腹腔に注入して洗滌した後、培地を再回収した。この過程を2-3回反復遂行した。回収液を4℃、1,500ｒｐｍで10分間遠心分離し、細胞数が1×106ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地に懸濁した。以後、前記細胞液を最終濃度が1×105ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように96-ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）にウェル当り100μｌづつ分注した。37℃で2時間５％ ＣＯ２培養器で培養した。大食細胞がプレートに付着されて単一層が形成されているか否かを確認した。プレートの培養液を除去した後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１生菌及びその細胞破砕液（ｌｙｓａｔｅ）を濃度別(1μｇ、10μｇ、100μｇ及び１ｍｇ)にＲＰＭＩ １６４０培地（＋１０％ＦＢＳ）に添加し、前記培地を各ウェルに200μｌづつ分注した。前記生菌は1×109の個数で培養した細胞培養液を0.2μｍフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）で濾過して使用した。前記細胞破砕液は、次のような方法で製造して使用した;細胞培養液を6,000rpmで15分間遠心分離して上層液を除去し、ＰＢＳで2回洗浄した。以後、溶解酵素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ｈｅｎ ｅｇｇ ｗｈｉｔｅ、 Ｆｌｕｋａ Ｃｏ． Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を0.1ｇ／10ｍｌの濃度で処理し、37℃振盪培養器で1時間放置した後、0.2μｍフィルタ（ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した。この時、陽性対照群にはＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ;大腸菌から抽出されたB-細胞誘導物質）20μｇが添加されたＲＰＭＩ １６４０培地（＋１０％ＦＢＳ）を分注した。また、陰性対照群には培地のみを分注した。以後、５％ ＣＯ２培養器で24時間培養して大食細胞を活性化させた。大食細胞の活性調査は、大食細胞活性時に分泌される酵素（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｎｚｙｍｅ）活性を測定して行った。培養が完了した後、上層液を除去した。0.1％トリトン-Ｘ-100を25μｇ添加して約20秒間培養器で反応させた。以後、100ｍＭ ρ-ニトロフェニルホスフェート(ρ-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ)150μｇ及び0.1Ｍクエン酸緩衝溶液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ６．０）50μｇを添加した後、37℃、５％ ＣＯ２培養器で45分間反応させた。0.2Ｍほう酸塩緩衝溶液（ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９．６）50μｇを添加して反応を停止させた。以後、ＥＬＩＳＡリーダ（ｒｅａｄｅｒ）（ＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）により405ｎｍで吸光度を測定した。
【００２４】
その結果、図4のAから見られるように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液がＥＲＯＭ１０１生菌より高い大食細胞活性を示した。ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液の最大活性は陽性対照群(ＬＰＳ処理群)(100％)に比較した時、93.84％の高い活性を示した。
c)公示菌株との大食細胞活性比較調査
本発明に係るＥＲＯＭ１０１の大食細胞活性を公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３１２１）と比較して調査した。活性調査は、前記b)と同様な方法で行った。その結果、図4のBから見られるように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１がラクトバチルス アシドフィルスより高い大食細胞活性を示した。
<2-2>脾臟細胞活性調査
5週齢のＢａｌｂ／Ｃマウス(大韓実験動物センター)から脾臟を除去した後、メッシュ（ｍｅｓｈ）を用いて脾臟細胞を分離した。4℃、1,700ｒｐｍで5分間遠心分離した後、上層液を除去した。ＲＰＭＩ １６４０培地で2回洗滌した後、脾臟細胞液に含有されている赤血球を除去するために溶解緩衝溶液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（155ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、 10ｍＭ ＫＨＣＯ３、 ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）３ｍｌを添加し、37℃の恒温水槽で5分間放置した後、4℃、1,700ｒｐｍで5分間遠心分離した。上層液を除去した後、ＲＰＭＩ １６４０培地で2回洗浄した。細胞液を最終濃度5×106ｃｅｌｌｓ／ｍｌで96-ウェルプレートにウェル当り200μｌづつ分注した。以後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液とラクトバチルス アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３１２１）の細胞破砕液を濃度別にそれぞれ処理した。前記細胞破砕液は前記<2-1>のb)と同様な方法により製造して使用した。陽性対照群にはＬＰＳ 10μｇ／μｇを処理し、陰性対照群には滅菌水を処理した。以後、MTS測定法により脾臟細胞の増殖率を測定して脾臟細胞活性を調査した。72時間37℃、５％ ＣＯ２培養器で培養した後、ＭＴＳ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ．Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ Ｎｏ：Ｇ３５８０）20μｇ／ｍｌを処理して1-3時間反応させた。ＥＬＩＳＡリーダ（ＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ、 Ａｕｓｔｒｉａ）により492ｎｍで吸光度を測定した。
【００２５】
その結果、図5から見られるように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の場合、公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルスより高い脾臟細胞活性を示し、陽性対照群（100％）と比較時、最大123.13％の高い活性を示した。
【実施例３】
【００２６】
ＥＲＯＭ１０１の免疫増強活性調査:生体内テスト
<3-1>試料摂取
3週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌性マウス(大韓実験動物センター)を各6匹づつ1)対照群(滅菌水投与群)、2)ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群(ER)、3)ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群(EL)、4)ラクトバチルスの生菌経口投与群(LR)、5)ラクトバチルスの細胞破砕液経口投与群(LL)に分類し、各試料を200μｇづつ1日1回4週間経口投与させた。前記生菌及び細胞破砕液はフィルタで濾過したことを除いては前記実施例<2-1>のb)と同様な方法で製造して使用した。大食細胞、脾臟細胞及び腸管免疫活性実験では陽性対照群としてB細胞誘導物質であるLPS及び/または糖蛋白質の一種としてT細胞を誘導する物質であるＣｏｎＡ（ｃｏｎｃａｎｖａｌｉｎＡ）をそれぞれ10μｇ／ｍｌの濃度で処理した。各群のマウスは温度32±2℃、湿度±20％、12時間照明(AM07:00〜PM07:00)の条件下で飼育した。飼料にはマウス用固形飼料を、飲水には上水道水を制限なく摂取させた。
<3-2>体重変化及び臓器重さの測定
各群のマウスの成長有無を調査するために体重変化を調査した。その結果、図6のAから見られるように、実験群と対照群の両方共有意な差は認められなかった。また、各群のマウスの臓器異常有無を確認するために、経口投与4週後マウスの腹部を切開し、臓器(肝及び脾臟)を分離してこれらの重さを測定した。その結果、図6のBから見られるように、全ての群が類似した様相を示した。
<3-3>血液内生化学的指標及び血液学的指標の測定
経口投与4週後に眼窩採血し、それぞれの血清を分離した。生化学分析機（Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａ ｐｌｕｓ）を用いて血液の生化学的指標-肝機能指標(ＧＯＴ及びＧＰＴ)、腎臓機能指標(ＢＵＮ及びクレアチン)-を測定し、血球分析機（Ｍｅｄｏｎｉｃ Ｃａ ６２０, Ｂｏｕｌｅ、 Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて血液学的指標(赤血球、血小板及び血色素)を測定した。その結果、下記表２から見られるように、全ての群のマウスの血液の生化学的指標と血液学的指標は正常範囲に属した。
【００２７】
【表２】
2005218324.tif 000004
ａER:本発明のＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群
ｂEL:本発明のＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群
ｃLR:ラクトバチルス アシドフィルスの生菌経口投与群
ｄLL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液経口投与群
<3-4>大食細胞活性の調査
各群のマウスから大食細胞を分離した後、前記実施例<2-1>のb)と同様に大食細胞活性時分泌される酵素活性を測定して大食細胞活性を調査した。その結果、図7から見られるように、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群(EL)>ラクトバチルスの細胞破砕液経口投与群(LL)>ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群(ER)>ラクトバチルスの生菌経口投与群(LR)の順に高い活性を示した。また、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群の場合、陽性対照群に比べてより高い活性を示した。
<3-5>脾臟細胞活性の調査
前記実施例<2-2>と同様に各群のマウスから脾臟細胞を分離してＭＴＳ測定法により脾臟細胞活性を調査した。その結果、図8から見られるように、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群(EL)>ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群(ER)>ラクトバチルスの細胞破砕液経口投与群(LL)>ラクトバチルスの生菌経口投与群(LR)の順に活性を示した。特に、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群の場合には陽性対照群であるLPS処理群とＣｏｎＡ処理群に比べてより高い活性を示した。
<3-6>腸管免疫活性の調査
腸管免疫活性は、消化管粘膜上皮細胞（ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ）から分泌されるＩｇＡの量を測定して調査した。まず、各群のマウスを頚椎脱骨で犠牲させた後、マウスの腹部を切開して小腸を摘出した。以後、小腸上に存在する消化管粘膜上皮細胞を剥がし、メッシュ（ｍｅｓｈ）を用いて細胞を抽出した。抽出された細胞を1×106ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０（＋１０％ＦＢＳ）培地に懸濁した。以後、懸濁液を24-ウェルプレートにウェル当り1ｍｌづつ分注した。対照群の細胞懸濁液が分注された一部のウェルにはＬＰＳ 10μｇ／ｍｌを追加処理した(陽性対照群)。以後、37℃、５％ ＣＯ２培養器で5日間培養して消化管粘膜上皮細胞を活性化させた。培養が完了した後、培養上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を採取して生成された総ＩｇＡの抗体量を測定した。このために、抗-マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、 ＵＳＡ）を96-ウェルプレートに固定させ、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ ａｃｅ）（10％ ＦＢＳを含有するＰＢＳ）を処理して抗体の非特異的結合を阻害した後、ＩｇＡを含有する試料を結合させた。以後、パーオキシダーゼ-結合抗-マウスＩｇＡ抗体（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、 ＵＳＡ）と反応させた。ＥＬＩＳＡリーダ（ＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ、 Ａｕｓｔｒｉａ）により450ｎｍで吸光度を測定した。
【００２８】
その結果、図9から見られるように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液を処理した群のＩｇＡ生成量が最も高いことと表され、陽性対照群に比べて約2.8倍高いことと表された。
前記結果らから本発明に係るＥＲＯＭ１０１が免疫増強活性を保有しており、公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルスより優れた免疫増強活性を保有していることが確認できた。
【実施例４】
【００２９】
ＥＲＯＭ１０１の抗癌活性調査
<4-1>試験管内テスト
本発明に係るＥＲＯＭ１０１の抗癌活性を調査するために、ヒト由来癌細胞主を対象として癌細胞増殖抑制効果を試験した。胃癌細胞株ＡＧＳ（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、 ｓｔｏｍａｃｈ、 ｈｕｍａｎ、 ＫＣＬＢ Ｎｏ．２１７３９）、肺癌細胞株Ａ５４９（ｃａｒｃｉｎｏｍａ、 ｌｕｎｇ、 ｈｕｍａｎ、 ＫＣＬＢ Ｎ．１０１８５）及び血液癌細胞株ＨＬ６０（ｌｅｕｋｅｍｉａ、 ｂｌｏｏｄ、 ｈｕｍａｎ、 ＫＣＬＢ Ｎｏ．１０２４０）を96-ウェルプレートにウェル当り2.0-2.5×104ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように分注した。以後、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液（ｌｙｓａｔｅ）と公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルス(ATCC 43121)の細胞破砕液を濃度別に処理して24時間または72時間培養した。この時、熱-不活性化ＦＢＳ、100μｇ／μｇペニシリン、100μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて37℃、５％ ＣＯ２（９５％ ａｉｒ）培養器で培養した。前記細胞破砕液は前記実施例<2-1>のb)と同様な方法により製造した。陰性対照群には無血清培地を処理した。培養後、ＭＴＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｇ３５８１、 Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．、 ＵＳＡ）20μｇを処理して発色させ、1時間後にＥＬＩＳＡリーダ（ＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓ、 Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて492ｎｍで吸光度を測定した。
【００３０】
その結果、図10から見られるように、公示菌株であるアシドフィルスと比較して本発明に係るＥＲＯＭ１０１が胃癌、肺癌及び血液癌細胞株の増殖を有意的に抑制することが確認できた。特に、胃癌細胞株では最大42.5％、肺癌細胞株では最大35.5％の増殖抑制率を示し、胃癌細胞株に対しては濃度依存的抑制効果を奏することが確認できた。全ての結果は、統計的に有意であった。
<4-2>生体内テスト
8週齢のＩＣＲマウス(大韓バイオリンク)40匹を4グループに分類した後、3グループにはサルコマ（ｓａｒｃｏｍａ）180細胞株（ＫＣＬＢ ４００６６）1×106個を腹腔に注入して腹水癌を誘発した。以後、前記3グループ中2グループには本発明に係るＥＲＯＭ１０１とラクトバチルス アシドフィルス（ＡＴＣＣ ４３５６）の細胞破砕液をサルコマ180細胞株を注入した日から2日間隔で14日間2日1回それぞれ腹腔投与した。前記細胞破砕液はフィルタで濾過したことを除いては前記実施例<2-1>のb)と同様な方法で製造して使用した。前記4グループは1)腹水癌細胞を注入しないN-グループ、2)腹水癌細胞株を注入したTC-グループ、3)腹水癌細胞株注入後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液を腹腔投与したEC-グループ及び4)腹水癌細胞株注入後、ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液を腹腔投与したLC-グループである。各グループのマウスは病原菌がない条件で標準状態で飼育した。以後、2週間腹水癌細胞の増加により現れる体重の増加量を調査し、前記増加量を腹水癌細胞株を注入しないN-グループマウスの体重に対する増加比率で換算して免疫増強を通じた抗癌効果を観察した。
【００３１】
その結果、図11から見られるように、TC-グループはN-グループに比べて同一期間に体重が約44％程度増加し、これは腹水癌細胞の成長によるものと判断された。また、このTC-グループの体重増加量に対比してラクトバチルス アシドフィルスを腹腔投与したLC-グループは約15％の体重増加量を示した反面、本発明に係るＥＲＯＭ１０１を腹腔投与したEC-グループは約4％のみの体重増加量を示した。これから本発明に係るＥＲＯＭ１０１が癌抑制活性を保有していることが確認できた。
【実施例５】
【００３２】
ＥＲＯＭ１０１の抗菌活性調査
<5-1>グラム陽性及びグラム陰性細菌に対する抗菌活性測定
本発明に係るＥＲＯＭ１０１を250ｍｌ三角フラスコを用いて35℃で48時間培養した。この時、ボリュームは100ｍｌにし、培地にはＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．、 ＵＳＡ）を使用した。抗菌活性を測定するための被検菌株には下記表3に記載されている菌株を使用し、ＴＳＡ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．、 ＵＳＡ）培地を使用して培養した。本発明に係るＥＲＯＭ１０１の抗菌活性はペーパーディスク（ｐａｐｅｒ ｄｉｓｋ）方法を使用して調査した。ＴＳＡ培地上に被検菌株を接種した5.5ｍｌのソフトアガール(0.75％)を重畳して抗菌活性測定用プレートを製造した。前記プレート上に直径8ｍｍのペーパーディスク（Ａｄｖｅｎｔｅｃ Ｔｏｙｏ ＲｏｓｈｉＫａｉｓｈａ、 Ｌｔｄ．、 Ｊａｐａｎ）を載せた後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ）、上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）及び細胞破砕液を80μｇづつ分注して37℃で18時間培養した。この時、上澄液は前記培養液を4℃、8,000ｒｐｍで遠心分離して得て、細胞破砕液は前記遠心分離により得た沈殿物（ｐｅｌｌｅｔ）にＰＢＳを添加して懸濁液を製造した後、超音波発生機（ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｎｂｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ５００ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＳＡ）で処理して得た。以後、生成された生育阻止環を確認した。
【００３３】
その結果、下記表3から見られるように、本発明に係るＥＲＯＭ１０１は全ての被検菌株の生育を抑制することと確認された。細胞培養液と上澄液では抗菌活性が確認されたが、細胞破砕液では抗菌活性が現れなかった。
【００３４】
【表３】
2005218324.tif 000005
<5-2>公示菌株との抗菌活性比較
本発明に係るＥＲＯＭ１０１の抗菌活性を公示菌株であるペデイオコツカスペンコサセウスＫＣＣＭ１１９０２とラクトバチルス アシドフィルスＡＴＣＣ ４３１２１を比較して調査した。この時、指示菌にはバチルス セレウスＡＴＣＣ１４５７９とリステリア モノサイトジェニスＫＦＲＩ ７９９を使用した。抗菌活性測定は綿棒を利用して前記２つの指示菌を1×106ＣＦＵ／ｍｌの濃度でＴＳＡアガールプレートに塗抹した。以後、前記<5-1>と同様な方法により遂行して生育阻止環の生成を確認した。抗菌活性単位は生成された生育阻止環の面積からペーパーディスクの面積を除いた面積が1ｍｍ２である時を1ＡＵ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｕｎｉｔ）とした。
【００３５】
その結果、下記表4及び表5から見られるように、二つの指示菌に対して本発明に係るＥＲＯＭ１０１が公示菌株に比べてより高い抗菌活性を表すことが確認できた。
【００３６】
【表４】
2005218324.tif 000006
【００３７】
【表５】
2005218324.tif 000007
以上、詳察しているように、本発明では免疫増強、抗癌及び抗菌活性を有する新規なペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を分離・同定した。本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１、このミュータントまたはバリアントは大食細胞/脾臟細胞活性化及び腸管免疫活性誘導を通じて優れた免疫増強活性を表し、また抗癌及び抗菌活性を表すために、免疫増強剤、抗癌剤及び抗菌剤をはじめとして食品添加剤、整腸剤、生菌剤、飼料添加剤及びその他の発酵製品の製造に多様に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を顕微鏡により観察した図である。
【図２】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１の培養時間による生菌数を表すグラフである。
【図３】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１による大食細胞増殖率(％)を表すグラフとして、前記増殖率は公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルスによる大食細胞増殖率に対する％で表した。
【００３９】
A:公示菌株との比較実験結果
B:細胞濃度による増殖率測定結果
【図４】本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１による大食細胞活性(％)を表すグラフとして、前記活性は陽性対照群に対する％で表した。  A:ＥＲＯＭ１０１の生菌(ER)及び細胞破砕液(EL)の大食細胞活性比較結果  B:ＥＭＯＭ１０１の細胞破砕液(EL)と公示菌株であるラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液(LL)の大食細胞活性比較結果
【図５】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１による脾臟細胞活性を調査するために脾臟細胞増殖率(％)を測定した結果を表すグラフである。前記増殖率は陽性対照群に対する％で表した。
【００４０】
EL:本発明のＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液処理群
LL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液処理群
【図６】本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１の経口投与期間に測定したマウスの体重変化量(A)及び経口投与4週後に測定した組織の重さ(B)を表すグラフである。
【００４１】
Con:対照群
ER:ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群
EL:ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群
LR:ラクトバチルス アシドフィルスの生菌経口投与群
LL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液経口投与群
【図７】本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を経口投与したマウスの大食細胞活性(％)を表すグラフとして、前記活性は陽性対照群に対する％で表した。
【００４２】
ER:ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群
EL:ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群
LR:ラクトバチルス アシドフィルスの生菌経口投与群
LL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液経口投与群
【図８】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を経口投与したマウスの脾臟細胞活性を調査するために前記マウスの脾臟細胞増殖率(％)を測定した結果を表すグラフである。前記増殖率は陽性対照群に対する％で表した。
【００４３】
A:ＬＰＳ処理群を陽性対照群として利用した場合
B:ＣｏｎＡ処理群を陽性対照群として利用した場合
ER:ＥＲＯＭ１０１の生菌経口投与群
EL:ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群
LR:ラクトバチルス アシドフィルスの生菌経口投与群
LL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液経口投与群
【図９】本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１を経口投与したマウスの腸管免疫活性を調べるために、前記マウスの消化管粘膜上皮細胞で分泌されたＩｇＡの量を測定した結果を表すグラフである。
【００４４】
EL:ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液経口投与群
LL:ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液経口投与群
【図１０】胃癌細胞株（ＡＧＳ；A）、肺癌細胞株（Ａ５４９；B）及び血液癌細胞株（ＨＬ６０；C）に対する本発明に係るペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１の抗癌活性を調査した結果を表すグラフである。前記抗癌活性は癌細胞増殖率(％)を測定して調査し、前記増殖率は陰性対照群に対する％で表した。
【図１１】腹水癌に対する本発明のペディオコッカス ペントサセウスＥＲＯＭ１０１の抗癌活性を調査するために、ＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液投与による腹水癌誘発マウスの体重増加率(％)を表すグラフである。前記体重増加率は腹水癌細胞株を注入しない正常マウスの体重に対する増加比率で換算して表した。
【００４５】
EC-グループ:腹水癌細胞株注入後、本発明に係るＥＲＯＭ１０１の細胞破砕液を腹腔投与した群
LC-グループ:腹水癌細胞株注入後、ラクトバチルス アシドフィルスの細胞破砕液を腹腔投与した群
TC-グループ:腹水癌細胞株注入後、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した群
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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