(57)【要約】【課題】  ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を、簡便かつ安価に短時間で精製し得る分離法を提供する。【解決手段】  疎水性クロマトグラフィーによってＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を分離する方法であって、前記疎水性クロマトグラフィーに用いる充填剤が、下記一般式（１）又は下記一般式（２）で表されるリガンドを有する蛋白質の分離方法。【化１】2005110591.tif 000009一般式（１）中、ｍは２〜２０の整数を表す。【化２】2005110591.tif 000010一般式（２）中、ｍは０〜２０の整数を表す。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性クロマトグラフィーによってＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質
を分離する方法であって、
前記疎水性クロマトグラフィーに用いる充填剤が、下記一般式（１）又は下記一般式（２
）で表されるリガンドを有する
ことを特徴とする蛋白質の分離方法。
【化１】
2005110591.tif 000007
一般式（１）中、ｍは２〜２０の整数を表す。
【化２】
2005110591.tif 000008
一般式（２）中、ｍは０〜２０の整数を表す。
【請求項２】
イオン強度を０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌに調整した緩衝液Ａにより充填剤を平衡化
する工程、
平衡化された前記充填剤にＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を吸着さ
せる工程、及び
イオン強度を下げた前記緩衝液Ａにより、まず、前記ＰＰＩａｓｅ又は前記ＰＰＩａｓｅ
を含有する融合蛋白質が吸着した前記充填剤を洗浄し、次いで、前記ＰＰＩａｓｅ又は前
記ＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を前記充填剤から溶出させる工程
を含有することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の分離方法。
【請求項３】
イオン強度を０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌに調整した緩衝液Ａにより充填剤を平衡化
する工程、
平衡化された前記充填剤にＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を吸着さ
せる工程、
イオン強度を下げた前記緩衝液Ａにより、前記ＰＰＩａｓｅ又は前記ＰＰＩａｓｅを含有
する融合蛋白質が吸着した前記充填剤を洗浄する工程、及び、
炭素数１〜６のアルコール又は疎水性アミノ酸を含有する緩衝液Ｂにより、前記ＰＰＩａ
ｓｅ又は前記ＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を前記充填剤から溶出させる工程
を含有することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の分離方法。
【請求項４】
ＰＰＩａｓｅは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求
項１、２又は３記載の蛋白質の分離方法。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴
とする請求項４記載の蛋白質の分離方法。
【請求項６】
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする
請求項５記載の蛋白質の分離方法。
【請求項７】
古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであるこ
とを特徴とする請求項６記載の蛋白質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え蛋白質の機能解析や蛋白質の生産に使用されＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩ
ａｓｅとの融合蛋白質を、液体クロマトグラフィーを利用して特異的に分離、精製する方
法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質を単一に精製する手段の１つとしてクロマト分離技術が利用されているが、クロマ
ト分離技術に用いられる担体としては、架橋アガロースゲルやビニルポリマー系ビーズ等
の親水性担体をベースとした、イオン交換、疎水性相互作用、ゲル濾過等のさまざまな分
離モードの異なる担体が市販されている。これらは、蛋白質の各種担体に対する親和性の
違いを利用したものであり、通常いくつかの異なる分離モードを有する担体を組み合わせ
て目的蛋白質を精製している（非特許文献１）。
【０００３】
グルタチオンをカップリング法により固定化した担体は、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）と特異的な親和性を有するため、ＧＳＴとの融合蛋白質として発現さ
せた目的蛋白質の精製に利用される（特許文献１）。ＧＳＴとグルタチオンとの親和性は
特異性が高いため、この精製ステップによって高純度に目的蛋白質を精製することができ
る。また、イミノジ酢酸を担持させた担体には、ニッケル等の金属イオンをキレートさせ
ることができるので、ニッケルとヒスチジンとの親和性を利用して、ヒスチジンに富む蛋
白質を特異的に高純度に精製することが可能である（特許文献２）。
【０００４】
一方、異種生物由来の蛋白質を、大腸菌をはじめとするバクテリアの宿主発現系を用いた
蛋白質発現法により発現させる場合、目的蛋白質のフォールディング異常により、立体構
造が天然型と異なった異常型蛋白質しか得られない場合がある。このような異常型蛋白質
は宿主内で封入体と呼ばれる凝集体として発現したり、宿主細胞のプロテアーゼにより、
分解されたりすることが知られている。このような問題を解決するためには、目的蛋白質
の宿主細胞内での折り畳み反応が正確に行われるよう制御することが極めて重要であると
考えられる。上記ＧＳＴとの融合蛋白質や、ヒスチジンヘキサペプチドとの融合蛋白質は
、グルタチオン固定化担体やニッケルキレート担体を用いることにより宿主由来蛋白質か
ら高純度に精製することが可能であるが、上記のフォールディング異常に関する問題を解
決するものではなく、利用できる蛋白質には制限があった。この問題を解決するために、
本発明者らはすでに分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒ
ｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）との融合発現系を提案しており、
この発現系により、従来法では封入体として発現した蛋白質を、活性を有する可溶性蛋白
質として宿主内に発現させることに成功している。これらの融合蛋白質を特異的に精製す
るための担体として、これまでにＰＰＩａｓｅの阻害剤として知られる免疫抑制剤である
ＦＫ５０６（タクロリムス）やシクロスポリンＡ等をリガンドとして固定化した担体を用
いる方法が考えられている。しかしながら、これらのＰＰＩａｓｅの阻害剤は非常に高価
であるため、より安価なリガンドを用いる方法が望まれていた。また、これらのＰＰＩａ
ｓｅの阻害剤は、担体に固定化するためにアミノ基やカルボキシル基等の適当な官能基を
導入しないといけないといった制約があり、操作性に問題があった。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５６５４１７６号明細書
【特許文献２】特許第２６８６０９０号公報
【非特許文献１】新生化学実験講座  日本生化学会編  第１巻  「蛋白質Ｉ  分離・精製・性質」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を、簡
便かつ安価に短時間で精製し得る分離法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、疎水性クロマトグラフィーによってＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する
融合蛋白質を分離する方法であって、上記疎水性クロマトグラフィーに用いる充填剤が、
下記一般式（１）又は下記一般式（２）で表されるリガンドを有する蛋白質の分離方法で
ある。
【０００８】
【化３】
2005110591.tif 000002
【０００９】
一般式（１）中、ｍは２〜２０の整数を表す。
【００１０】
【化４】
2005110591.tif 000003
【００１１】
一般式（２）中、ｍは０〜２０の整数を表す。
以下に本発明を詳述する。
【００１２】
本発明の分離方法は、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を分離対象と
するものである。
上記ＰＰＩａｓｅは、蛋白質のフォールディングに関与する蛋白質折り畳み因子の１つで
あり、細胞内でフォールディング途上のターゲット蛋白質中のアミノ酸のうち、プロリン
残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活
性）を有する酵素である。
【００１３】
上記ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型及びパーブリン型の３種類に分類される
。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害される
ＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、別の免疫阻害
剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。一
方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュ
グロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるものである。この３種類のＰＰＩ
ａｓｅの間には、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどない。
【００１４】
本発明の分離方法は、なかでも分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを精製するため
に好適に利用される。分子シャペロン活性とは、変性した蛋白質を元の天然型にリフォー
ルディングさせる活性、又は、変性した蛋白質の不可逆的な凝集を抑制する活性を意味し
、ＰＰＩａｓｅ活性とは独立した活性である。例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、
リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田、バ
イオサイエンスとインダストリー  ５６，  ５９３−、１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸
グアニジン等の蛋白質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈し
た際に開始する変性蛋白質の再生率や、変性蛋白質の凝集の抑制率でその検定対象物質の
分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性蛋白質の再生率を評価する方法
としては、例えば、ロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０、３６１−、１９９５年）が挙げられ、変性蛋白質の
凝集抑制を評価する方法としては、田口らの方法（Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９、８５２９−、１９９４年）等が挙げられる。
【００１５】
上記分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅのうち、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては
、例えば、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、バクテリア由来トリガーファクタータイ
プＰＰＩａｓｅ（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９、１２５４−、２０００年）
、ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ａｒｉｅ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９、１９９
−、２００１年）、真核生物由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓｅ、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ２７４、１７１５−、１９９６年）等が挙げられる。また、シクロフィリン型Ｐ
ＰＩａｓｅとしては、例えば、真核生物由来ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ等が挙げられ
る（Ｐｉｒｋｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８、７９５−、２００１年）。また、パー
ブリン型ＰＰＩａｓｅとしては、ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｅｈｒｅｎｓ、ＥＭＢ
Ｏ  Ｊ．  ２０、２８５−、２００１年）が挙げられる。
【００１６】
なお、本発明により分離可能なＰＰＩａｓｅには、これらのＰＰＩａｓｅと実質的に同等
なポリペプチド、少なくともこれらの一部分を含むポリペプチド、及び、一部のアミノ酸
を他のアミノ酸に改変したもの等も含まれる。上記ＰＰＩａｓｅと３０％以上の相同性を
有する蛋白質であれば本発明の分離方法により精製することができる。好ましい相同性は
５０％以上であり、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上である。なお
、蛋白質の相同性はＣｕｌｕｓｔａｌＷ等の多重整列ソフトを用いて判断することができ
る。また、これらの相同性を示すポリペプチドであれば生物種が限定されるものではない
。
【００１７】
本発明の分離方法により精製されるＰＰＩａｓｅとしては、なかでもＦＫＢＰ型ＰＰＩａ
ｓｅが好ましく、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅがより好ましい。
上記古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより、２種類に大別でき
る。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は分子量が２６
〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の分離方法により精製される古細菌由来
ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとしては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれであってもよ
いが、ショートタイプの方が好ましい。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされ
ているＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明の分離方法により精製される古細菌由来Ｆ
ＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するも
のであればいずれであってもよい。
【００１８】
本発明の分離方法は、疎水性クロマトグラフィーによって、上記ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩ
ａｓｅを含有する融合蛋白質を分離するものである。
疎水性クロマトグラフィーは、蛋白質と基材（ゲル）に結合したリガンドとの間の疎水性
相互作用に基づく分離方法であり、蛋白質の疎水性表面とリガンドとの結合を利用した吸
着クロマトグラフィーの一つである。リガンドとして疎水性基を持つゲル基材（固定相）
に蛋白質を吸着させて、親水性移動相（溶出液）で溶出すると蛋白質表面の疎水性部分と
基材上の疎水性基との間の結合力が弱い蛋白質から順に溶出される。
本発明者は、ＰＰＩａｓｅが疎水性クロマトグラフィー用充填剤に対し、他の蛋白質と比
較して強い相互作用を示すことを見いだし、本発明を完成させた。
【００１９】
本発明の分離方法では、下記一般式（１）又は下記一般式（２）で表されるリガンドを有
する充填剤を用いて疎水性クロマトグラフィーを行う。
【００２０】
【化５】
2005110591.tif 000004
【００２１】
一般式（１）中、ｍは２〜２０の整数を表す。
【００２２】
【化６】
2005110591.tif 000005
【００２３】
一般式（２）中、ｍは０〜２０の整数を表す。
【００２４】
上記一般式（１）中、ｍは２〜２０の整数である。ｍが２未満であると、リガンドが短す
ぎ、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質が立体的に吸着しにくくなるが
、ｍが２０を超えても吸着性能は変わらない。好ましくは下限が３、上限が８である。上
記一般式（１）で表されるリガンドとしては直鎖状であっても分岐を有していても良く、
具体的には、ブチル基、イソブチル基、ヘキシル基、オクチル基等が好ましく例示される
。
一方、上記一般式（２）中、ｍは０〜２０の整数である。ｍが２０を超えてもＰＰＩａｓ
ｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質に対する吸着性能は変わらない。好ましくは下
限が０、上限が２である。上記一般式（２）中、−ＣｍＨ２ｍ＋１で表されるアルキル基
は直鎖状であっても分岐を有していても良い。上記一般式（２）で表されるリガンドとし
ては、具体的には、フェニル基等が好ましく例示される。
【００２５】
上記充填剤の基材としては、水、生理食塩水、緩衝液等の溶液に不溶性であれば特に限定
されないが、多孔性であるものが好ましい。なかでも有効表面積が広い多孔性ものが好ま
しく、排除限界蛋白質分子量が約１０６〜１０９であるか、又は、平均細孔径が約５０〜
１０００ｎｍであるものを使用するのが好ましい。
このよう基材としては、例えば、ＣＭ−セルロファイン（生化学工業社製）等のセルロー
ス系、ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）等のポリビニルアルコール系、ＣＭ−ト
リスアクリルＭ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のポリアクリルアミド系、セファ
ロースＣＬ−４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のアガロース系等の有機質系担
体、及び、ＣＰＧ−１０−１０００（米国エレクトロ−ニュークレオニクス社製）等の多
孔性ガラス等の無機質系担体等が挙げられる。
上記基材の粒径は、下限が０．０５μｍ、上限が１０００μｍであることが好ましく、よ
り好ましくは、下限が１μｍであり、上限が１００μｍである。
【００２６】
上記一般式（１）又は上記一般式（２）で表されるリガンドを基材に固定化する場合、カ
ルボニル基又はエーテル結合を介し、炭素数０〜２０の−（ＣＨ２）ｎ−からなるアルキ
レン基をリンカーとして導入することが好ましい。このようなリンカーを設けることによ
り、リガンドと目的蛋白質とが相互作用しやすくなり、良好な分離が可能となる。上記ア
ルキレン基の炭素数は５〜１５であることがより好ましい。
【００２７】
上記リガンドの固定化量は、水不溶性の基材１ｍＬあたり下限は０．１μｍｏｌ、上限は
２００μｍｏｌであることが好ましい。０．１μｍｏｌ未満であると、ＰＰＩａｓｅ又は
ＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質が充填剤に充分に吸着できない場合があるが、２００
μｍｏｌを超えても吸着性能は変わらない。より好ましい固定化量は下限が１μｍｏｌ、
上限が１００μｍｏｌである。
【００２８】
本発明の分離方法においては、まず、イオン強度を下限が０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、上限が
２０００ｍｍｏｌ／Ｌに調整した緩衝液Ａにより充填剤を平衡化する。
通常の疎水性クロマト分離技術では蛋白質の疎水性表面とリガンドとの結合を強めるため
に、例えば１．８〜１．５Ｍ（イオン強度として５４００〜４５００ｍｍｏｌ／Ｌ）程度
の硫酸アンモニウム等を含む高塩濃度の緩衝液で、あらかじめ充填剤を平衡化しておくこ
とが必要である。通常この程度のイオン強度でないと目的の蛋白質が充分に充填剤に吸着
しない。
【００２９】
本発明者らがＰＰＩａｓｅについて検討を行ったところ、０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／
Ｌのイオン強度の緩衝液で平衡化した充填剤を用いた場合に、夾雑蛋白質の分離が良好で
簡便にＰＰＩａｓｅを分離精製できることを見い出した。また、ＰＰＩａｓｅを含有する
融合蛋白質についても同様の条件にて良好な分離精製を実現できることが判明した。なお
、上記イオン強度は（１／２）ΣｍＺ２で計算され（ｍは重量モル濃度、Ｚはイオン価）
、硫酸アンモニウム塩の場合、０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度は約３．３
μｍｏｌ／Ｌ〜６６６ｍｍｏｌ／Ｌのモル濃度に相当する。
上記緩衝液Ａのより好ましいイオン強度は、下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、上限は９００ｍ
ｍｏｌ／Ｌである。
【００３０】
上記緩衝液Ａのイオン強度を調整するための塩としては、一般の緩衝液の調製に使用され
る塩類であれば特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等の水に解けやすい塩類が挙げられるが、なかでも、硫酸アンモ
ニウムが好適に利用できる。
上記緩衝液Ａとしては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液等が挙げられる。
【００３１】
本発明の分離方法においては、あらかじめ０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌのイオン強度
を示す緩衝液Ａで充填剤を平衡化しておき、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融
合蛋白質を含む溶液を同イオン強度とし、平衡化しておいた充填剤に添加する。この際、
このような低イオン強度条件下では、ＰＰＩａｓｅ及びＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白
質は充填剤に吸着されるが、それ以外の蛋白質はほとんど充填剤に吸着せず、充填剤を素
通りすることになる。
本発明の分離方法においては、充填剤はカラム管に充填しておいても良いが、カラムに充
填せずとも試験管等に懸濁させた充填剤に蛋白質を吸着させてもよい。また、上記緩衝液
Ａは、ＥＤＴＡやＤＴＴ、各種界面活性剤等の、蛋白質の研究で一般的に用いられる添加
剤を含有してもよい。
【００３２】
上記ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を充填剤に吸着させた後、イオ
ン強度を低下させた上記緩衝液Ａを充填剤に流すことにより、不純物が充填剤から順次溶
出され、充填剤が洗浄される。更に引き続き緩衝液Ａのイオン強度を低下させることによ
りＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質が充填剤から溶出され、高純度の
ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を得ることができる。
【００３３】
上記緩衝液Ａのイオン強度を順次低下させることにより充填剤から不純物を完全に除去し
て、高純度のＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を溶出させることが可
能であるが、炭素数１〜６のアルコール又は疎水性アミノ酸を含有する緩衝液Ｂを用いる
ことにより、ＰＰＩａｓｅ及びＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を更に迅速に溶出する
ことができる。上記緩衝液Ｂは融合蛋白質を溶出する際に特に好適に用いられる。
上記アルコールとしては特に限定されず、１価であっても多価であってもよいが、例えば
、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、ブチ
レングリコール、グリセロール等が好適に用いられる。なかでも、グリセロール、エチレ
ングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコールは蛋白質の安定性を向上させる効
果が期待できるので好ましい。
上記緩衝液Ｂのアルコール濃度は、下限が約０．１％、上限が６０％であることが好まし
い。０．１％未満であると、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質が充填
剤から溶出しにくく、６０％を超えても溶出効果は変わらない。より好ましくは下限が１
０％、上限が４０％である。
【００３４】
上記疎水性アミノ酸としては、例えば、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、イソロ
イシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、トリプトファン等が挙げられるが、
これらアミノ酸の誘導体を使用しても良い。
上記緩衝液Ｂの疎水性アミノ酸の濃度は、下限が１０ｍＭ、上限が１０００ｍＭであるこ
とが好ましい。１０ｍＭ未満であると、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋
白質が充填剤から溶出しにくく、１０００ｍＭを超えても溶出効果は変わらない。
上記アルコール及び疎水性アミノ酸は、それぞれ単独で用いられてもよく、併用されても
よい。
また、上記緩衝液Ｂは、ＥＤＴＡやＤＴＴ、各種界面活性剤等の、蛋白質の研究で一般的
に用いられる添加剤を含有してもよい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の分離方法によれば、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白質を、疎
水性クロマトグラフィーの原理を用いて特異的に分離することができる。このため、本発
明の分離方法を用いることにより、高い純度に精製されたＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅ
を含有する融合蛋白質を、簡便に得ることができる。従って、本発明によれば、これまで
バクテリア、酵母、昆虫細胞等を用いた蛋白質発現系において問題となっていた封入体の
形成を防ぎ、且つ、得られた蛋白質をワンステップの精製法により、高純度で精製するこ
とが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
【００３７】
（実施例１）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタ
イプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＴｃＦＫＢＰ１８（Ｉｄｅｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５
７、４６５−、２００１年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ  ２
２２、２４９−、１９９８年）を鋳型とし、そのＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子断片をＰＣＲ法
により増幅した。ＰＣＲ用のプライマーとして、表１に示したＴｃＦｕ―Ｆ１及びＴｃＦ
ｕ―Ｒ２を用いることにより増幅産物の両端に制限酵素サイトを設けた。ＴｃＦＫＢＰ１
８遺伝子の配列を配列番号１に示す。
【００３８】
【表１】
2005110591.tif 000006
【００３９】
一方、ＴｃＦＫＢＰ１８融合蛋白質をプロテアーゼによりＴｃＦＫＢＰ１８と目的蛋白質
とに切断するためのリンカーをコードする塩基配列として、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相
補鎖を設計した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２は、その５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏ
ＲＩサイトをそれぞれ有している（図１）。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２のトロンビン切断部分のＤ
ＮＡ配列の下流には、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイトを有しているため、目的蛋白質
の遺伝子断片はこれらの制限酵素サイトを利用して導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１
８との融合蛋白質を得ることができる（図１）。
【００４０】
上記ＴｃＦＫＢＰ１８の遺伝子断片と、トロンビン切断部分をコードするＤＮＡ断片を、
各々の制限酵素で処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプ
ラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２の
順でライゲーションした。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合蛋白質発現用プラスミドをＴｃ
ＦＫｆｕｓｉｏｎ２とした。
【００４１】
（実施例２）ＰＰＩａｓｅと融合蛋白質の発現ベクターの調製
ＰＰＩａｓｅと融合させる蛋白質として、難発現性蛋白質である超好熱性古細菌Ａｅｒｏ
ｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼを使用し、実施例１記載のＴｃＦＫＢＰ１８と
の融合蛋白質を発現させるためのベクターを以下の通り調製した。すなわち、Ａｅｒｏｐ
ｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  
ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子を増幅した。上記ロダネーゼの塩基配列を配列番号２
に、ＰＣＲで用いたプライマーＡｐＴＳ−Ｆ１及びＡｐＴＳ−Ｒ１をそれぞれ表１に示す
。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルにて精製後、ｐＴ７−ｂｌｕｅＴベクターにライ
ゲーションし、増幅したロダネーゼ遺伝子がＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘのゲノム
情報と相違ないことを確認した。得られたロダネーゼ遺伝子を含むｐＴ７  ｂｌｕｅＴベ
クターをＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理し、アガローズゲルを用いた電気泳動法により、ロダネ
ーゼ遺伝子断片を精製した。あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理しておいたＴｃＦＫｆｕ
ｓｉｏｎ２に、このＤＮＡ断片をライゲーションした。得られたプラスミドをｐＴｃＦＫ
−ＴＳとした。
【００４２】
（実施例３）ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の発現
実施例１で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２によりＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株
をトランスフォーメーションした。２Ｌの三角フラスコに２×ＹＴ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅ
ｘｔｒｕｃｔ  １６ｇ／Ｌ、ＢＡＣＴＯ  ＴＲＹＰＴＯＮ  ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ
／Ｌ、アンピシリン  １００μｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを入れ、組み換え大腸
菌２〜３白金耳を接種した。３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、遠心分
離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭ  ＥＤ
ＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて
凍結保存した。
【００４３】
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分
）に分離した。沈殿画分は、更に封入体画分を精製するため、４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−
１００を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁後、
３０分間反応させることで膜成分を可溶化し、遠心分離にて沈殿する封入体成分を回収し
た。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿部を封入体画分とした。可溶性画分１０μｇ
と、それに相当する封入体画分の容量をそれぞれ１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その
結果、ＴｃＦＫＢＰ１８に相当するバンドは、可溶性画分のみに見られた。
【００４４】
（実施例４）ＰＰＩａｓｅ及びロダネーゼの融合蛋白質の発現
実施例２で調製したＰＰＩａｓｅ及びロダネーゼの融合蛋白質の発現用プラスミドｐＴｃ
ＦＫ−ＴＳを実施例３と同様の方法で大腸菌に組み込み、そのトランスフォーマントを取
得した。本菌を実施例３と同様の方法で培養・回収し、−２０℃にて凍結保存した。
【００４５】
得られた菌液を超音波破砕後、遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分
）に分離し、実施例３と同様の方法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルは、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色し、ロダネーゼは融合蛋白
質として可溶性画分に発現していることを確認した。
【００４６】
（実施例５）フェニル基をリガンドとする疎水性クロマト用担体を用いたＴｃＦＫＢＰ１
８の精製
実施例３で調製したＴｃＦＫＢＰ１８を含む大腸菌破砕液上清４ｍＬに硫酸アンモニウム
を加え、蛋白質溶液中のイオン強度を約１５００ｍｍｏｌ／Ｌ（硫酸アンモニウム濃度約
５００ｍＭ）とした。一方、あらかじめ緩衝液Ａとして５００ｍＭ硫酸アンモニウムを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍＬフェニル基固定化担体（アマ
シャムバイオサイエンス社製  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ  ｈｉｇｈ  ｓｕｂタ
イプ）に、上記ＰＰＩａｓｅを含む蛋白質溶液をアプライし、同緩衝液Ａ２０ｍＬ（１０
ｍＬ×２回）で洗浄し、通過液を回収した。次に硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬ（１０ｍＬ×２回）にてカラムを洗浄後、緩衝液Ｂと
して３０％エチレングリコールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬ（１
０ｍＬ×２回）をカラムにアプライし溶出液を回収した。
【００４７】
得られた各々の溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色したところ、ＰＰＩａ
ｓｅは５００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）による溶出
画分には溶出せず、緩衝液Ｂ中にほぼ単一バンドとして高純度で溶出することが確認され
た（図２）。
【００４８】
（実施例６）ブチル基をリガンドとする疎水性クロマト用担体を用いたＴｃＦＫＢＰ１８
の精製
実施例３で調製したＴｃＦＫＢＰ１８を含む大腸菌破砕液上清４ｍＬに硫酸アンモニウム
を加え、蛋白質溶液中のイオン強度を約６００ｍｍｏｌ／Ｌ（硫酸アンモニウム濃度約２
００ｍＭ）とした。一方、あらかじめ緩衝液Ａとして２００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍＬブチル基固定化担体（東ソー社
製  Ｂｕｔｙｌ  ６５０−Ｃ）に、上記ＰＰＩａｓｅを含む蛋白質溶液をアプライし、同
緩衝液Ａ２０ｍＬ（１０ｍＬ×２回）で洗浄し、通過液を回収した。次に硫酸アンモニウ
ムを含まない５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬ（１０ｍＬ×２回）をカラム
にアプライし、溶出液を回収した。
【００４９】
得られた各々の溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色したところ、ＰＰＩａ
ｓｅは２００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）による溶出
画分に若干ＰＰＩａｓｅの溶出が見られたものの、ほとんどのＰＰＩａｓｅが硫酸アンモ
ニウムを含まない５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中にほぼ単一バンドとして高純度
で溶出することが確認された（図３）。
【００５０】
（実施例７）フェニル基をリガンドとする疎水性クロマト用担体を用いた融合蛋白質の精
製
実施例４で調製したＰＰＩａｓｅ及びロダネーゼの融合蛋白質を含む大腸菌破砕液上清４
ｍＬに硫酸アンモニウムを加え、蛋白質溶液中のイオン強度を約６００ｍｍｏｌ／Ｌ（硫
酸アンモニウム濃度約２００ｍＭ）とした。一方、あらかじめ緩衝液Ａとして２００ｍＭ
硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化した５ｍＬフェニ
ル基固定化担体（アマシャムバイオサイエンス社製  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ
ｈｉｇｈ  ｓｕｂタイプ）に、上記融合蛋白質を含む蛋白質溶液をアプライし、同緩衝
液Ａ３０ｍＬ（１０ｍＬ×３回）で洗浄し、通過液を回収した。次に硫酸アンモニウムを
含まない５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）４０ｍＬ（１０ｍＬ×４回）をカラムにア
プライし、溶出液を回収した。
【００５１】
得られた各々の溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢにより染色したところ、融合蛋白
質は２００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）による溶出画
分に若干の溶出が見られたものの、ほとんどの融合蛋白質が硫酸アンモニウムを含まない
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）中にほぼ単一バンドとして高純度で溶出することが
確認された（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、上述の構成よりなるので、ＰＰＩａｓｅ又はＰＰＩａｓｅを含有する融合蛋白
質を、疎水性クロマトグラフィーの原理を用いて特異的に分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと融合蛋白質を作成するためのベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の遺伝子配置を示す図である。
【図２】フェニル基をリガンドとする疎水性用担体を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の溶出パターンを示す図である。
【図３】ブチル基をリガンドとする疎水性用担体を用いたＴｃＦＫＢＰ１８の溶出パターンを示す図である。
【図４】フェニル基をリガンドとする疎水性用担体を用いたＴｃＦＫＢＰ１８及びロダネーゼからなる融合蛋白質の溶出パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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