(57)【要約】【課題】  水中に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を、正確、迅速かつ簡便に検出することができると共に、長時間にわたって安定した連続的なモニタリングが可能な有害物質検出方法を提供する。【解決手段】  遺伝子損傷性物質検出用微生物と生育阻害物質検出用微生物とを用いて試料水中の有害物質を検出する際に、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させて、前記各固定化微生物膜の発光状態を光検出器で連続的に測定し、前記試料水中の有害物質を連続的にモニタリングする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子損傷性物質によりＤＮＡが損傷を受けたときに発現されるＳＯＳ遺伝子と、その下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子と、そのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された遺伝子損傷性物質検出用微生物と、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された生育阻害物質検出用微生物とを用いて試料水中の有害物質を検出する方法において、
前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させて、前記各固定化微生物膜の発光状態を光検出器で連続的に測定し、前記試料水中の有害物質を連続的にモニタリングすることを特徴とする有害物質検出方法。
【請求項２】
前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜及び前記試料水を１６〜２４℃に保持する、請求項１に記載の有害物質検出方法。
【請求項３】
前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる、請求項１又は２に記載の有害物質検出方法。
【請求項４】
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いる、請求項３に記載の有害物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中の有害物質の検出方法に関し、例えば、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、工業排水等に含まれる有害物質を連続的にモニタリングするのに好適な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中には６〜１０万種もの人為的に合成された化学物質や、トリハロメタン等の消毒副生成物、ダイオキシン等の燃焼副生成物といった非意図的生成物質、更には環境中での変化体等の数多くの化学物質が存在しており、これらの化学物質の中には、急性毒性、発ガン性、変異原性等を有する有害物質が数多くある。
【０００３】
通常、環境水中における上記のような化学物質の濃度は、ごく微量であると考えられるが、このような環境水を水道原水とする浄水場においては、人体への影響の観点からより高度な水質の連続監視が求められている。
【０００４】
また、下水処理場、廃棄物最終処分場、化学薬品を使用する工場等から排出される廃水には様々な化学物質が含まれているが、最終的には河川等の環境中に排出されるため、通常、オゾン処理や生物処理、活性炭処理等により、安全基準値以下にまで化学物質を分解あるいは除去してから放流されている。そのため、廃水処理プロセスが適切に稼動し、水中の有害物質が除去されているかどうかを監視する必要がある。
【０００５】
従来より、水中の有害物質を監視する手段として、魚類の活動電位又は異常行動を監視する方法や、硝化細菌を利用した急性毒物モニタ等の有害物質検出方法が知られているが、これらの方法では、発ガン性、変異原性等を有する有害物質（本発明では、このような有害物質を遺伝子損傷性物質という。）の蓄積による発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性までは評価することができなかった。
【０００６】
また、発ガン性物質の一次選別法として、例えば、ｕｍｕテストやＳＯＳクロモテスト等の微生物を用いた遺伝子損傷性試験法が知られているが、操作が煩雑である、検出感度が低い、高価な発色試薬が必要である等の問題があり、環境水等に含まれる有害物質を検出する方法としてはあまり実用的であるとは言えなかった。
【０００７】
そのため、下記特許文献１には、ＤＮＡの損傷に対して感受性のＳＯＳ遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換された微生物を利用して、遺伝子損傷性物質を検出する方法が開示されている。
【０００８】
また、下記特許文献２には、その一面に鉄バクテリアを保持した微生物膜が設けられるとともに内部液を有するケースと、ケース内に配置された一対の電極とを有する検出電極部と、ケースに隣接して設けられるとともに微生物膜に接する検出流路と、この検出流路内に被測定液を供給する被測定液供給装置と、検出流路内に第１鉄含有液を供給する第１鉄含有液供給装置と、検出流路内にＰＨ調整用緩衝液を供給して、検出電極部における被測定液と第１鉄含有液とＰＨ調整用緩衝液との混合液のＰＨを一定の値に定めるＰＨ調整用緩衝液供給装置と、検出電極部の一対の電極間を流れる電流値を測定して被測定液の異常水質を検出する演算部と、を備えたことを特徴とする異常水質検出装置が開示されている。
【０００９】
また、下記特許文献３には、導入口を有する測定槽と、導入口に接続され、導入口に被測定液を導入する導入管と、導入管に接続され、導入管内に第１鉄含有溶液を導入する試薬配管と、測定槽内に、導入管から導入口を経て測定槽内に導入される被測定液の流れ方向に沿って設けられた、鉄バクテリアを保持する微生物膜と、微生物膜に接続された電極装置と、を備えたことを特徴とする異常水質検出装置が開示されている。
【特許文献１】特許第３２７７４２６号公報
【特許文献２】特開平１１−３７９６９号公報
【特許文献３】特開２０００−３２１２３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記特許文献１に開示された方法では、試験操作において微生物の培養や分注、希釈等を行う必要があるため、連続的なモニタリングに適していないだけでなく、前記形質転換された微生物は遺伝子損傷性物質が存在する場合に発光するが、微生物に対して生育阻害作用を示し、発光反応を阻害するような有害物質（本発明では、このような有害物質を生育阻害物質という。）、例えば、呼吸阻害物質等が共存すると該微生物の代謝が低下して発光しない場合もあるため、試料水の異常を見逃してしまう恐れもあった。
【００１１】
また、上記特許文献２、３に開示された方法においては、発ガン性、遺伝毒性、慢性毒性と関連のある遺伝子損傷性物質までは評価することができなかった。
【００１２】
上記のような問題点を鑑み、本発明者らは、ＳＯＳ遺伝子と発光遺伝子からなる組換え遺伝子により形質転換した遺伝子損傷性物質検出用微生物と、常時ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子により形質転換された生育阻害物質検知用微生物をそれぞれ微孔性膜上に固定化した２種類の固定化微生物膜を用い、各微生物の発光の有無を測定することにより、試料水中の遺伝子損傷性物質及び生育阻害物質を検出する方法を提案している（特願２００２−３４１７６４号）。
【００１３】
しかしながら、上記の遺伝子損傷性物質検出用微生物と生育阻害物質検知用微生物を用いた方法においても、より長時間にわたって安定した連続的なモニタリングを可能とすることが求められていた。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、水中に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を、正確、迅速かつ簡便に検出することができると共に、長時間にわたって安定した連続的なモニタリングが可能な有害物質検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の有害物質検出方法は、遺伝子損傷性物質によりＤＮＡが損傷を受けたときに発現されるＳＯＳ遺伝子と、その下流に配置されたルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子と、そのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子により形質転換された遺伝子損傷性物質検出用微生物と、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換された生育阻害物質検出用微生物とを用いて試料水中の有害物質を検出する方法において、
前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させて、前記各固定化微生物膜の発光状態を光検出器で連続的に測定し、前記試料水中の有害物質を連続的にモニタリングすることを特徴とする。
【００１６】
本発明の有害物質検出方法によれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物と、生育阻害物質検出用微生物とを用いて試料水中の有害物質を検出する際に、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させることにより、前記生育阻害物質検知用微生物の増殖速度を低下させることができるので、前記固定化微生物膜の透過性を長時間にわたって良好に維持することができ、発光反応に必要な酸素及び補酵素等や微生物の生育に必要な栄養分等の不足による発光量の低下を防ぐことができる。その結果、試料水中の遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を、正確、迅速かつ簡便に検出することができると共に、長時間にわたって安定した連続的なモニタリングが可能となる。
【００１７】
本発明においては、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜及び前記試料を１６〜２４℃に保持することが好ましい。これによれば、前記生育阻害物質検出用微生物の代謝活性を損なうことなく、増殖速度を抑制できるので、長時間にわたってより安定した連続的なモニタリングが可能となる。
【００１８】
また、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物として、プラスミドpSK1002由来のumuD,C遺伝子の下流に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用い、
前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターに、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることが好ましい。
【００１９】
また、前記生育阻害物質検出用微生物として、プラスミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ内に、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）由来の発光遺伝子群を連結したプラスミドを導入して形質転換したサルモネラ菌を用いることがより好ましい。
【００２０】
これらによれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物を簡単に作成することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、遺伝子損傷性物質検出用微生物と、生育阻害物質検出用微生物とを用いて試料水中の有害物質を検出する際に、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させることにより、前記生育阻害物質検知用微生物の増殖速度を低下させることができるので、前記固定化微生物膜の透過性を長時間にわたって良好に維持することができ、発光反応に必要な酸素及び補酵素等や微生物の生育に必要な栄養分等の不足による発光量の低下を防ぐことができる。その結果、試料水中の遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を、正確、迅速かつ簡便に検出することができると共に、長時間にわたって安定した連続的なモニタリングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明で用いられる遺伝子損傷性物質検出用微生物は、ＤＮＡの損傷に対して感受性のＳＯＳ遺伝子の下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子を配置した組換え遺伝子により形質転換されているので、遺伝子損傷性物質により該微生物のＤＮＡが損傷を受けると、ＳＯＳ遺伝子の発現と同時にルシフェラーゼ活性を有する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子も発現される。その結果、ルシフェラーゼ活性の基質が菌体内で連続的に供給される条件が達成され、ルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こるので、この発光を測定することにより、遺伝子損傷性物質、例えば、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキサイド、２−アミノアントラセン、ベンゾ（ａ）ピレン、１−ニトロピレン、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド等を検出、測定することができる。
【００２３】
すなわち、本発明で用いられる遺伝子損傷性物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子をＤＮＡの損傷に依存して発現させるための発現制御手段としてＳＯＳ遺伝子を利用するものである。したがって、ＳＯＳ遺伝子はＤＮＡ損傷時に発現されるものであればよく、ＳＯＳボックスと称する制御部分を含有するものであればよい。なお、本発明においてＤＮＡ損傷時に発現されるＳＯＳ遺伝子とは、前記ＳＯＳボックスと称される制御部分を含有するものを意味し、ＳＯＳボックス自体でもよく、またこれを含有する任意のＤＮＡ断片であってもよい。
【００２４】
ＳＯＳ遺伝子としては、umu遺伝子、例えばumuD遺伝子及びumuC遺伝子、並びにsfiA遺伝子等が例示できるがこれらに限定されない。例えば、umuD，umuC遺伝子は、Pro. Natl. Acad. Sci. USA Vol.82, 4336-4340 (1985)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。本発明においては、umuD遺伝子並びにumuC遺伝子の一部とlacZ遺伝子との融合遺伝子を、プラスミドベクターpBR322に導入したプラスミドpSK1002由来のＳＯＳ遺伝子が好ましく用いられる。プラスミドpSK1002は、H. Shinagawaら、Gene, 23, 167 (1983)に記載されており、その記載に基いて容易に入手することができる。
【００２５】
一方、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、ＳＯＳ遺伝子の制御下でその両遺伝子群が発現されるものであればよく、特に限定されないが、例えば、海洋細菌の生物発光遺伝子群を用いることができる。上記性質を有する生物発光遺伝子群を持つ海洋細菌としては、ビブリオ（Vibrio）群のビブリオ（Vibrio）属では、ビブリオ・ハーベイ（V. harveyi）、ビブリオ・フィシェリ（V. fischeri）、ビブリオ・スプレンディドゥス（V.splendidus）、ビブリオ・コレラ（V. cholerae）等が挙げられる。また、フォトバクテリウム（Photobacterium）属では、フォトバクテリウム・ホスホリウム（P.phosphoreum）、フォトバクテリウム・レイノクナシ（P. leiognathi）等が挙げられる。本発明においては、ビブリオ・フィシェリ（V.ficsheri）由来の生物発光遺伝子群（luxA,B,C,D,E）が好ましく用いられる。このビブリオ・フィシェリ（V. ficsheri）由来の生物発光遺伝子群は、リポーター遺伝子として使い易くするために、生物発光遺伝子群のオペレーター領域を取り除き、構造遺伝子部分（ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子群及びその基質であるアルデヒドの生産を触媒する酵素である脂肪酸リダクターゼ活性を発現する遺伝子群）だけを含む種々のカセットベクター、例えば、pUCD320, pUCD613, pUCD614, pUCD618, pUCD620, pUCD623, pUCD1111等が報告されている。これらのカセットベクターについては、Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)に記載されており、これらのベクターから生物発光遺伝子群の構造遺伝子部分を容易に入手することができる。
【００２６】
なお、本発明において、ルシフェラーゼ活性の基質とは長鎖アルデヒド等を意味し、これらの生産を触媒する酵素とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮ還元酵素、脂肪酸リダクターゼ等を意味する。なお、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素の遺伝子は同一の起源のものを用いてもよく、異なる起源のこれらの遺伝子を連結して用いてもよい。
【００２７】
ＳＯＳ遺伝子と、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含んでなる組換え遺伝子は、ＳＯＳ遺伝子のＳＯＳボックスを少なくとも含有するＤＮＡ断片の該ＳＯＳボックスより下流に、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を連結することにより作製することができる。この連結は、ＤＮＡリガーゼを用いて常法にしたがって行うことができる。また、この組換え遺伝子を宿主微生物に導入するためには、上記組換え遺伝子はベクター中に存在する必要があり、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。
【００２８】
宿主微生物としては、該微生物のＤＮＡが遺伝子損傷性物質により損傷された際にＳＯＳ遺伝子を発現させることができる微生物、すなわちＳＯＳ機能を有する微生物であれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonellatyphimurium）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。本発明においては、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００２９】
発現ベクターにより宿主微生物を形質転換する方法は、例えば細菌の形質転換に用いられる常法にしたがって該組換え遺伝子を含有する発現ベクターを宿主微生物に導入すればよい。
【００３０】
次に、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物について説明する。本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物は、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子により形質転換されているので、通常の状態ではルシフェラーゼによる連続的な発光反応が起こっている。したがって、生育阻害物質によって、該微生物の代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼによる発光反応が低下するので、この発光状態を測定することにより、生育阻害物質、例えば、シアン化カリウム、フェノール、２，４−ジクロロフェノール、塩化水銀等を検出、測定することができる。
【００３１】
すなわち、本発明で用いられる生育阻害物質検出用微生物においては、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、これらの遺伝子が常時発現するような発現制御手段の下に配置されている。このような発現制御手段としては、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonellatyphimurium）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）等の微生物内でタンパク質を発現させるために用いられる種々の発現ベクターを用いることができ、例えば、プラスミドベクターとしては、pBR系プラスミド、pUC系プラスミド等を利用することができる。本発明においては、プラスミドベクターpBR322が好ましく用いられる。プラスミドベクターpBR322は、例えばタカラバイオ株式会社、東洋紡株式会社等から入手することができる。
【００３２】
また、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子は、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられる。
【００３３】
ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子とを含み、常時ルシフェラーゼ活性を発現する組換え遺伝子は、常法にしたがって上記のような発現ベクターのクローニングサイトに、上記ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子とそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子群を組込むことにより作製することができる。本発明においては、pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ内に組込むことが好ましい。
【００３４】
このようにして作製された組換え発現ベクターは、常法にしたがって、宿主微生物に導入すればよい。なお、宿主微生物としては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物で説明したものと同様のものが用いられ、TA1535株、TA1538株等のサルモネラ菌が好ましく用いられる。
【００３５】
本発明の有害物質検出方法においては、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物は、これらの微生物が漏出せず、かつ少なくとも試料水中の溶解化学物質、栄養成分及び酸素が透過できるポアサイズと親水性を有する微孔性膜と、該微生物からの発光を透過できる光透過性膜との間に薄膜状に固定化して、固定化微生物膜として用いられる。
【００３６】
図１には、固定化微生物膜の一例が示されている。この固定化微生物膜５は、微孔性膜２と光透過性膜３がドーナツ状の両面テープ４によって張り合わされたものであり、その中心部には、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物１が薄膜状に固定化されている。
【００３７】
上記微孔性膜としては、ポアサイズ０．２〜０．４μｍのセルロース、ニトロセルロース、ポリカーボネート等の材質からなる膜を用いることができ、その厚さは、通常、厚さ１０μｍ程度のものが用いられる。
【００３８】
また、上記光透過性膜としては、ポリエチレン、塩化ビニル等の材質からなり、厚さが３０〜１００μｍである透明又はそれに近い膜が用いられる。
【００３９】
このような固定化微生物膜は、例えば以下のようにして作製することができる。すなわち、上記遺伝子損傷性物質検出用微生物又は生育阻害物質検出用微生物を常法にしたがって培養し、得られた培養液を遠心して上澄み液を除去した後、１％アルギン酸ナトリウム水溶液を適量加えて懸濁し、菌体懸濁液を得る。
【００４０】
次いで、微孔性膜２の中心部に、上記菌体懸濁液を滴下して、余剰のアルギン酸ナトリウム水溶液を吸引除去した後、更に塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）を適量滴下して、余剰の塩化カルシウム水溶液を吸引除去し、菌体を固定化した面を内側にして、ドーナツ状の両面テープ４を介して光透過性膜３と張り合わせる。
【００４１】
そして、最後に塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）に浸漬し、アルギン酸ナトリウムを完全にゲル化させて菌体を固定化することにより、固定化微生物膜を作製することができる。
【００４２】
このようにして作製した遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜、及び生育阻害物質検出用固定化微生物膜は、使用するときまで、保存液（ＴＧＡ培地８５％、グリセロール１５％）に浸漬し、−２０℃以下で凍結保存すればよい。
【００４３】
本発明の有害物質検出方法は、上記遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜及び生育阻害物質検出用固定化微生物膜を、試料水に接触させる際に、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させ、前記各固定化微生物膜の発光状態を測定することにより、試料水中の有害物質を連続的にモニタリングするものである。
【００４４】
本発明において、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度とは、該生育阻害物質検出用微生物の代謝活性を維持しつつ、その増殖速度を抑制できる温度を意味する。例えばサルモネラ菌、大腸菌、酵母の至適生育温度は３７℃付近にあるため、これらの微生物を用いる場合、固定化微生物膜及び試料水を１６〜２４℃に保持することが好ましく、１９〜２１℃に保持することがより好ましい。
【００４５】
上記のような温度範囲に保持することにより、生育阻害物質検出用微生物の代謝活性を損なうことなく、増殖速度を低下させることができ、生育阻害物質検出用の固定化微生物膜の寿命を延ばすことができる。更に、前記生育阻害物質検出用微生物に導入する発光遺伝子として、上記の海洋細菌由来の生物発光遺伝子群を用いた場合、これらの海洋細菌の生育温度が２０〜２６℃であるとことから、発光酵素（ルシフェラーゼ）の活性を最も高い状態に維持することができ、より正確に試料水中の生育阻害物質を検出することができる。
【００４６】
以下、図２、３に基づいて本発明の有害物質検出方法を具体的に説明する。      
図２には、本発明の有害物質検出方法を行う際に用いられる、遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜と生育阻害物質検出用固定化微生物膜を利用した発光検出型バイオセンサを備えた有害物質モニタリング装置の概略構成図が示されている。
【００４７】
この有害物質モニタリング装置１０は、遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜と該固定化微生物膜の発光状態を測定するための光検出器とからなる遺伝子損傷性物質検出用発光検出型バイオセンサ１１と、生育阻害物質検出用固定化微生物膜と該固定化微生物膜の発光状態を測定するための光検出器とからなる生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ１２と、これらのバイオセンサに試料水を供給するための手段（送液ポンプ１５）と、前記固定化微生物膜に酸素を供給するための手段（エアポンプ１６）と、前記発光検出型バイオセンサからの出力を増幅する手段（アンプ１７）と、その出力データを表示する手段（コンピュータ１８）とから構成されている。なお、アンプ１７は、後述する光検出器３０の電源も兼ねている。
【００４８】
前記遺伝子損傷性物質検出用発光検出型バイオセンサ１１と前記生育阻害物質検出用発光検出型１２は、外界からの光を遮断すると共に固定化微生物膜の微生物の代謝活性を維持するために、それぞれ所定の温度に保持された恒温器１３、１４の中に設置されており、前記生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ１２が設置された前記恒温器１４は、上記のように生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度より低い温度に保持されている。
【００４９】
また、図示しない手段により、試料水中に固定化微生物膜の微生物の活性を維持するための栄養成分を連続的に添加できるようになっている。上記栄養成分としては、例えば、ＴＧＡ培地（バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、グルコース０．２％、アンピシリンナトリウム２０μｇ／ｍＬ）等を用いることができる。栄養成分の添加量は、通常、試料水中に、上記培地が１０（ｖ／ｖ）％以上となるように添加すればよい。
【００５０】
一方、図３には、前記生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ１２の断面の模式図が示されている。なお、生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンンサ１２と遺伝子損傷性物質検出用発光検出型バイオセンサ１１は、固定化微生物膜の種類が異なるだけで基本的な構造は同じであるので、以下の説明においては、生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ１２について説明する。
【００５１】
生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ１２は、フローセル上部１２ａとフローセル下部１２ｂとからなるフローセル内に、生育阻害物質検出用固定化微生物膜５ａと光検出器３０とを有している。
【００５２】
前記光検出器としては、例えば、光電子倍増管、高感度ＣＣＤカメラ等を用いることができる。
【００５３】
前記固定化微生物膜５ａは、微孔性膜側を上にして固定化微生物膜支持用ガラス板２２上に載置され、これらは２個のＯリング２３によって挟み込まれた状態で、該固定化微生物膜５ａの微孔性膜が試料水の流路に面するように、フローセル下部１２ｂ内に収納されている。そして、前記フローセル上部１２ａを前記フローセル下部１２ｂに装着することにより、２個のＯリング２３によって前記固定化微生物膜５ａ及び固定化微生物膜支持用ガラス板２２がフローセル内に固定されるようになっている。
【００５４】
また、前記フローセル上部１２ａの前記フローセル下部１２ｂと接する側の面には、底面に貫通孔２１ａ、２１ｂを有する凹部２１ｃが形成されており、前記フローセル上部１２ａを前記フローセル下部１２ｂに装着した際に、前記凹部２１ｃの開口部が前記固定化微生物膜５ａによって塞がれてシールされ、試料水の流路（２１ａ、２１ｃ、２１ｂ）が形成されるようになっている。
【００５５】
一方、フローセル内の固定化微生物膜支持用ガラス板２２側には光検出器３０が設置されており、前記固定化微生物膜５ａの光透過性膜及び前記固定化微生物膜支持用ガラス板２２越しに前記固定化微生物膜５ａの発光量を検出し、電圧値等として出力できるようになっている。
【００５６】
この有害物質モニタリング装置１０によれば、図示しない手段により固定化微生物膜の微生物の活性を維持するための栄養成分が添加された試料水は、エアポンプ１６により空気を送り込まれながら、送液ポンプ１５によって、所定の温度（通常２５〜３０℃）に保持された恒温室１３内に設置された遺伝子損傷性物質検出用発光検出型バイオセンサ１１、及び生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度より低い温度に保持された恒温室１４内に設置された生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンンサ１２に送液され、各バイオセンサ内の固定化微生物膜と接触した後、排出される。そして、各固定化微生物膜の発光状態は光検出器３０によって電圧値等として出力され、コンピュータ１８に表示される。
【００５７】
なお、前記恒温室１４は、上記のように生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度より低い温度に保持されているので、恒温室内で適当な長さの流路を確保してやることにより、試料水を生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度より低い温度に保持することもできるが、流路の途中に冷却器等を設置して試料水の温度を調整することもできる。また、培地タンクを恒温槽内に入れて温度を保持することもできる。
【００５８】
本発明の有害物質検出方法によれば、前記遺伝子損傷性物質検出用微生物は、試料水中の遺伝子損傷性物質によって微生物のＤＮＡが損傷を受けると、ＳＯＳ応答と共にルシフェラーゼ及びその基質が合成されて発光し、前記生育阻害物質検出用微生物は、試料水中の生育阻害物質によって、その代謝活性が低下すると、ルシフェラーゼ活性が低下して発光が弱くなる（あるいは消光する）。すなわち、試料水中に有害物質が含まれず正常な場合は、生育阻害物質検出用微生物のみが発光し、遺伝子損傷性物質が混入したときは、遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物の両方が発光し、生育阻害物質が混入したときは、遺伝子損傷性物質検出用微生物及び生育阻害物質検出用微生物の両方が消光するため、試料水中に含まれる遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を正確、迅速かつ簡便に検出することができる。
【００５９】
また、前記生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させているので、前記生育阻害物質検知用微生物の増殖速度を低下させて、前記固定化微生物膜の透過性を長時間にわたって良好に維持することができ、発光反応に必要な酸素及び補酵素等や微生物の生育に必要な栄養分等の不足による発光量の低下を防ぐことができる。その結果、試料水中の遺伝子損傷性物質や生育阻害物質等の有害物質を、長時間にわたって安定して連続的にモニタリングすることができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００６１】
実施例
（１）遺伝子損傷性物質検出用微生物
上記特許文献１（特許第３２７７４２６号）に記載された方法により、遺伝子損傷性物質検出用微生物を作製した。
【００６２】
すなわち、ＳＯＳ遺伝子として、大腸菌（CSH26「Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972」：F- ara del(lac-pro)thi）に導入されたプラスミドpSK1002のumuD,C遺伝子を利用した。
【００６３】
また、ルシフェラーゼ活性を発現する遺伝子及びそのルシフェラーゼ活性の基質の生産を触媒する酵素を発現する遺伝子としては、大腸菌（HB101：hsd20 (rB -, mB -）, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, supE44）に導入されたプラスミドpUCD620（Clarence I. Kadoら、Plant Molecular Biology Reporter, 5, 225 (1987)）の発光遺伝子群を利用した。
【００６４】
導入する微生物として、サルモネラ菌（TA1535「Ames, B. N., J. McCann, E. Yamasaki, Mutation Res., 31, 347, 1975」：hisG46, Δgal, Δchl, Δbio, ΔuvrB, rfa-, SJ10002：r-, m+）を利用した。
【００６５】
（ｉ）ＳＯＳ遺伝子の調製
プラスミドpSK1002を含む大腸菌（CSH26）を、アンピシリンを含むＬＢ培地（Bactoトリプトン１％、Bacto酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ １％）で培養し、アルカリ抽出法「Birnboim, H. C., Doly, J., Nucl. Acids Res., 11, 1513, 1979」によって、pSK1002を大量に調製した。このプラスミドpSK1002をSalI及びSmaIで切断し、umuD,C遺伝子を含む約７．５ｋｂのSalI−SmaＩＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。
【００６６】
得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを単離し、このプラスミドをMluIで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化した。
【００６７】
一方、umuCに対して終止コドンとして働き、かつBamHIサイトを持つ配列番号１に示すＤＮＡリンカーを化学合成した。
【００６８】
そして、上記ＤＮＡリンカーと、前記MluIＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、常法に従い大腸菌（DH5）を形質転換した。得られた形質転換体からアルカリ抽出法によりプラスミドを抽出し、このプラスミドをBamHI及びSalIで切断して、umuD,C遺伝子を含む約７．４ｋｂのBamHI−SalIＤＮＡ断片を得た。
【００６９】
（ｉｉ）発光遺伝子群の調製
プラスミドpUCD620を含む大腸菌（HB101）を、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養後、アルカリ抽出法によってpUCD620を大量に調製した。プラスミドpUCD620をBamHI及びSalIで切断し、発光遺伝子群を含む約７．５ｋｂのBamHI−SalIＤＮＡ断片を得た。
【００７０】
（ｉｉｉ）ＳＯＳ遺伝子と発光遺伝子群との連結及び発光ベクターのクローニング
上記発光遺伝子群を含むBamHI−SalIＤＮＡ断片（約７．５ｋｂ）と、前記umuD,C遺伝子を含むBamHI−SalIＤＮＡ断片（約７．４ｋｂ）をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210）を構築した。
【００７１】
大腸菌（SJ10002）をＬＢ培地で一夜培養し、ＬＢ培地に、１／１００容量の前記培養液を加え、６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００）が約０．４になるまで培養した。
【００７２】
この培養液５ｍｌを遠心分離し、沈澱画分を５ｍｌの３０ｍＭＣａＣｌ２水溶液に懸濁し、４５分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を０．４ｍｌの３０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液に懸濁し、大腸菌（SJ10002）のコンピテントセルを調製した。
【００７３】
大腸菌（SJ10002）のコンピテントセル１００μｌに、前記発光ベクター（pTL210）約２００ｎｇを加え、３０分間氷中に放置した。４２℃で２分間処理した後、室温にて５分間放置した。ＬＢ培地１ｍｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。この液を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに播種して得られたSJ10002の形質転換体から、前記発光ベクター（pTL210）をアルカリ抽出法で調製した。
【００７４】
（ｉｖ）形質転換体の調製
サルモネラ菌（TA1535）をＬＢ培地で一夜培養し、ＬＢ培地に、１／１００容量の前記培養液を加え、ＯＤ６００が約０．４になるまで培養した。この培養液５ｍｌを遠心分離し、沈澱画分を５ｍｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２水溶液に懸濁し、４５分間氷中に放置した後、再度遠心分離を行い、菌体を０．４ｍｌの１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２水溶液に懸濁し、サルモネラ菌（TA1535）のコンピテントセルを調製した。
【００７５】
そして、前記と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に前記発光ベクター（pTL210）を導入し、形質転換体（遺伝子損傷性物質検出用微生物）を得た。
【００７６】
（２）生育阻害物質検出用微生物
プラスミドpBR322（株式会社ニッポンジーン製）を、BamHI及びSalI（いずれの切断部位もテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ内にある）で切断し、アンピシリン耐性遺伝子を含む約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
【００７７】
このＤＮＡ断片と、上記（１）（ｉｉ）で調製した発光遺伝子群を含む約７．５ｋｂのBamHI−SalIＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、発光ベクター（pTL210ctl）を構築した。
【００７８】
この発光ベクター（pTL210ctl）を上記（１）と同様の方法で大腸菌（SJ10002）に導入して形質転換体を得、この形質転換体からアルカリ抽出法によって、発光ベクター（pTL210ctl）を調製した。
【００７９】
そして、上記（１）と同様の方法で、サルモネラ菌（TA1535）に発光ベクター（pTL210ctl）を導入し、形質転換体（生育阻害物質検出用微生物）を得た。
【００８０】
（３）固定化微生物膜の作製
−８０℃で凍結保存した上記（１）で得られた遺伝子損傷性物質検出用微生物を解凍し、ＴＧＡ培地に１／１０００容量植菌し、３０℃で一晩、旋回振とう培養を行い、この培養液を新しいＴＧＡに１／５０容量植菌して、さらに３０℃で１．５時間、旋回振とう培養を行い、濁度（ＯＤ６００）を測定し、ＯＤ６００＝０．１になるようにＴＧＡ培地で希釈して、固定化微生物膜作成用培養液を調製した。
【００８１】
この固定化微生物膜作成用培養液１ｍＬ（菌体数約２．５×１０７個）を用いて常法にしたがって遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜を作製した。なお、微孔性膜として、商品名「メンブレンフィルター・セルロース混合エステル」（ミリポア社製）、光透過性膜として、商品名「ＬＤＰＥローデンポリ」（大倉工業株式会社製）を用いた。
【００８２】
また、上記（２）で得られた生育阻害物質検出用微生物を用いた以外は上記と同様にして生育阻害物質検出用固定化微生物膜を作製した。
【００８３】
なお、作製したこれらの固定化微生物膜は、使用するときまで保存液（ＴＧＡ培地８５％、グリセロール１５％）に浸漬し、−２０℃で凍結保存した。
【００８４】
（４）測定温度による生育阻害物質検出用固定化微生物膜を利用した発光検出型バイオセンサ（生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ）の出力の比較
上記（３）で作製した生育阻害物質検出用固定化微生物膜を用いて、測定温度を３０℃、２５℃、２０℃、１５℃にそれぞれ設定して、図３に示す構造を有する生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサの出力の経時的変化を測定した。なお、前記生育阻害物質検出用微生物（サルモネラ菌）の至適生育温度は３７℃付近である。図４に各測定温度におけるセンサ出力の経時変化を示す。
【００８５】
図４から、測定温度が３０℃及び２５℃の場合は、運転開始直後から、生育阻害物質検出用微生物の発光量が増加してセンサ出力が上昇しているが、３０℃では約１０時間後、２５℃では約２０時間後からセンサ出力が低下していることが分かる。センサ出力が５ｍＶ以上あるときに生育阻害物質のモニタリングに使用可能であるとすると、生育阻害物質のモニタリングに使用可能な時間は測定温度３０℃では約１０時間、測定温度が２５℃では約３０時間となる。
【００８６】
一方、測定温度が２０℃の場合、生育阻害物質のモニタリングに使用可能な時間は約１１０時間となることが分かる。また、測定温度が１５℃の場合、生育阻害物質検出用微生物の代謝活性が低下し過ぎたため、発光反応が低下して、生育阻害物質のモニタリングに必要な発光量が得られなくなっていることが分かる。
【００８７】
以上の結果から、生育阻害物質検出用微生物を固定化した固定化微生物膜を、前記生育阻害物質検出用微生物の至適生育温度よりも低い温度に保持しつつ、前記至適生育温度よりも低い温度に保持した前記試料水を接触させることにより、安定した発光を長時間持続できることが分かった。
【配列表フリーテキスト】
【００８８】
配列番号１：umu Cに対して終始コドンとして働き、かつBamHI サイトを持つＤＮＡリンカー
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によれば、例えば、上下水道の各処理プロセスの処理水、河川及び湖沼等の環境水、廃棄物埋立最終処分場の浸出水、工業排水等に含まれる有害物質を連続的にモニタリングするのに好適な方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明における固定化微生物膜の一例を示す概略構成図である。
【図２】遺伝子損傷性物質検出用固定化微生物膜と生育阻害物質検出用固定化微生物膜を利用した発光検出型バイオセンサを備えた有害物質モニタリング装置の概略構成図である。
【図３】生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサの断面模式図である。
【図４】測定温度を３０℃、２５℃、２０℃、１５℃にそれぞれ変えた場合の生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサの出力の経時変化を測定した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９１】
１．微生物
２．微孔性膜
３．光透過性膜
４．両面テープ
５．固定化微生物膜
５ａ．生育阻害物質検出用固定化微生物膜
１０．有害物質モニタリング装置
１１．遺伝子損傷性物質検出用発光検出型バイオセンサ
１２．生育阻害物質検出用発光検出型バイオセンサ
１２ａ．フローセル上部
１２ｂ．フローセル下部
１３、１４．恒温器
１５．送液ポンプ
１６．エアポンプ
１７．アンプ兼光検出器の電源
１８．コンピュータ
２２．固定化微生物膜支持用ガラス板
２３．Ｏリング
３０．光検出器
【図１】
2005102575.tif 000002
【図２】
2005102575.tif 000003
【図３】
2005102575.tif 000004
【図４】
2005102575.tif 000005
【配列表】
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