(57)【要約】    【解決手段】  本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、超臨界二酸化炭素と脂質膜構成物質の存在下に、封入物質を含有する水溶液を混合し、次いで超臨界二酸化炭素を排出することにより調製されたリポソームの懸濁液を、１１５〜１３５℃、０．１７〜０．３１ＭＰａの条件下で加熱加圧処理することを特徴とする。    【効果】    本発明のリポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液を所定の条件で加熱加圧処理することにより、リポソームの封入物質の内包率が向上したリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、保存安定性に優れる。したがって、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界二酸化炭素と脂質膜構成物質との混合溶液に、封入物質を含有する水溶液を添加混合し、次いで超臨界二酸化炭素を排出することにより調製されたリポソームの懸濁液を、１１５〜１３５℃、０．１７〜０．３１ＭＰａの条件下で加熱加圧処理することを特徴とするリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項２】
加熱加圧処理を３〜４５分間行うことを特徴とする請求項１に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項３】
前記脂質膜構成物質には、転移温度を有するリン脂質が少なくとも含まれることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項４】
リポソームの懸濁液を加熱加圧処理する前に、０．１〜０．４μｍの孔径を有する濾過膜を通過させることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項５】
濾過膜を通過させる際の濾過容器の温度が、転移温度を有するリン脂質の転移温度以上であることを特徴とする請求項４に記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項６】
封入物質が造影化合物、または抗がん性物質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリポソーム含有製剤の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって製造されたことを特徴とするリポソーム含有製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入物質の内包率が高いリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、主にリン脂質によって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有するため、従来から様々な研究材料として用いられてきている。リポソームは、内部に有する水相には水溶性の封入物質を、二分子膜の内部には油溶性の封入物質を保持するという、いわゆるカプセル構造を構築できることから、診断、治療、化粧などの様々な分野で用いられてきている。さらに、近年では、薬物送達システム（ＤＤＳ）への応用が盛んに研究されている。
【０００３】
このような封入物質が内包されたリポソームを調製するには、従来からBangham法や逆
相蒸発法（REV法）などが用いられている。これらの方法では、素材としての安全性が高
く、生体内で適度な分解性を有するリポソームの中に封入物質を内包させているにもかかわらず、製造過程においてリポソーム膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒を使用する必要がある。そのため、上記方法で得られるリポソーム含有製剤においては、有機溶媒の残留が避けられず、有機溶媒によりリポソーム膜が柔らかくなってしまうため、フィルターを通したり、熱をかけたりすると、膜の一部が壊れて中に封入した物質が漏れ出してしまう問題があった。
【０００４】
さらに、従来の方法では、封入物質の保持効率（リポソームの脂質膜構成物質に対する封入物質の内包率）が高いリポソームを得ることは容易ではなかった。したがって、封入物質による所望の効果を得るためには、リポソームが高濃度に分散されたリポソーム含有製剤を用いるか、または多量のリポソーム含有製剤を用いる必要があった。リポソーム含有製剤が高濃度であると製剤粘度が高くなるため、該製剤を生体内に投与する際には、患者に与える負担が大きく、また、リポソーム含有製剤を多量に投与する場合にも同様の問題があった。特に、リポソームが有する薬物内包機能を用いた造影剤は、血管などを介して生体内に投与（注射）するものであるため、投与するリポソーム含有製剤が高濃度であったり、または多量に投与する必要があると、患者に負担を与えるのみならず副作用の懸念があった。このように、どうしても治療用薬剤に比べて投与量が多くなる診断用造影剤への応用を考えた場合、造影物質の保持効率（内包率）が高いリポソーム含有製剤が求められていた。
【０００５】
一方、特許文献１には、超臨界二酸化炭素を用いて、封入物質が内包されたリポソームを製造する方法が開示されている。この方法は、製造条件を種々設定することが可能であることから、従来のリポソームの懸濁液の製造方法に比べ、比較的容易に封入物質の保持効率（内包率）を向上させることができる。したがって、超臨界二酸化炭素を用いたリポソームの調製法は、診断、治療、化粧などの様々な分野での応用が期待されている。特に、ＤＤＳ製剤においては、リポソームの封入物質の保持効率（内包率）が高いと、体内の目標とする部位に取り込まれたリポソームが少量であったとしても所望の効果を得ることができるため期待されている。しかしながら、超臨界二酸化炭素を用いた方法は、従来の方法に比べ封入物質の保持効率が向上したリポソームを調製することができるものの、溶解助剤である水溶性有機溶媒により膜の強度が低下し、リポソーム含有製剤の保存安定性に改良の余地があった。
【特許文献１】特開２００３−１１９１２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、封入物質の内包率が高いリポソームを含有するリポソーム含有製剤の製造方法、および該方法により得られたリポソーム含有製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るリポソーム含有製剤の製造方法は、超臨界二酸化炭素と脂質膜構成物質との混合溶液に、封入物質を含有する水溶液を添加混合し、次いで超臨界二酸化炭素を排出することにより調製されたリポソームの懸濁液を、１１５〜１３５℃、０．１７〜０．３１ＭＰａの条件下で加熱加圧処理することを特徴とする。
【０００８】
加熱加圧処理を３〜４５分間行うことが好ましい。
【０００９】
前記脂質膜構成物質には、転移温度を有するリン脂質が少なくとも含まれることが好ましい。
【００１０】
リポソームの懸濁液を加熱加圧処理する前に、０．１〜０．４μｍの孔径を有する濾過膜を通過させることが好ましい。
【００１１】
濾過膜を通過させる際の濾過容器の温度が、転移温度を有するリン脂質の転移温度以上であることが好ましい。
【００１２】
封入物質が造影化合物、または抗がん性物質であることが好ましい。
【００１３】
本発明に係るリポソーム含有製剤は、前記の方法によって製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液を所定の条件で加熱加圧処理することにより、リポソームの封入物質の内包率が向上したリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、保存安定性に優れる。したがって、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明のリポソーム含有製剤の製造方法について詳細に説明する。
【００１６】
本発明によるリポソーム含有製剤の製造方法は、超臨界二酸化炭素とリン脂質などの脂質膜構成物質との混合溶液に、封入物質を含有する水溶液を添加混合し、次いで超臨界二酸化炭素を排出することにより調製されたリポソームの懸濁液を、所定条件で加熱加圧処理する方法である。
【００１７】
まず、リポソームの懸濁液について以下に説明する。
【００１８】
リポソームの懸濁液
リポソームの懸濁液は、水溶性封入物質が内包されたリポソームが水性溶媒中に分散している懸濁液である。本発明に用いられるリポソームの懸濁液は、リポソーム量の水性溶媒量に対する量比は特に限定されない。
【００１９】
リポソームの形態としては、多重層膜からなるリポソーム（Multilamellar vesicles; 
ＭＬＶ）、粒径が大きい一枚膜のＬＵＶからなるリポソーム（Large unilamellar veislcles）、粒径が50nm未満の小さい一枚膜のＳＵＶからなるリポソーム（Small unilamellar
vesicles）が挙げられ、これらはリポソームの懸濁液中に混在していてもよい。
【００２０】
リポソームは、二分子膜小胞体であり、一般には脂質二重膜で構成される。本発明の製造方法に用いられるリポソームの脂質膜構成物質は、膜構成成分として一般に使用されるものであれば特に限定されない。通常は、リポソーム用脂質であるリポソーム形成能を有するリン脂質および／または糖脂質を必須の主要成分とし、それ以外に任意成分として共存させる物質がある。任意成分には、脂質膜安定化物質としてのステロール類、グリコール類などのほか、荷電物質としての脂肪酸またはその塩、脂質混合乳化物など、従来から小胞体の形成成分として用いられているものも含まれる。
【００２１】
このようなリポソームの懸濁液の調製は、Langmuir.17,3898(2001)等に記載されている超臨界二酸化炭素を混和媒体としたリポソームの調製方法（以下、超臨界二酸化炭素法）において、実質的に溶解助剤を用いない方法により調製される。この超臨界二酸化炭素法は、Bangham法や逆相蒸発法（REV法）などの従来の方法に比べ、混合条件を適宜設定することにより比較的容易にリポソームの封入物質の保持効率（内包率）を向上させることができるため好適に用いられる。
【００２２】
以下に、リポソームの懸濁液の調製する際に用いられる各成分について説明する。
【００２３】
（封入物質）
本発明で用いられる水溶性の封入物質としては、造影化合物、抗がん化合物、抗酸化化合物、抗菌化合物、抗炎症化合物、血行促進化合物、美白化合物、肌荒れ防止化合物、老化防止化合物、発毛促進化合物、保湿化合物、ホルモン剤、ビタミン類、色素、およびタンパク質類などが挙げられる。
【００２４】
本発明のリポソーム含有製剤は、造影剤、または抗がん剤として用いることが望ましい。
【００２５】
造影剤として用いる場合、封入物質としては、造影化合物である水溶性ヨウド系化合物を用いることができる。水溶性ヨウド系化合物は、造影性があればイオン性、非イオン性を問わず、特に規定されない。一般的には非イオン性ヨウド化合物の方が、イオン性ヨウド化合物よりも浸透圧が低く、投与された人体に対する負荷が小さいためにより望ましい。水溶性の非イオン性ヨウド系化合物としてヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6−トリ
ヨードフェニル基を少なくとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。
【００２６】
そのような非イオン性ヨウド化合物として、具体的には、イオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、N,N′−ビス
〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−2,4,6−トリヨード−1,3−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。
【００２７】
これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。なお本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００２８】
本発明のリポソーム含有製剤に好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールなどが挙げられる。特にイオトラン、イオジキサノールといった二量体非
イオン性ヨウド化合物では、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧をさらに低下させる利点がある。
【００２９】
本発明のリポソーム含有製剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の５〜４０質量％、好ましくは５〜３５質量％、より好ましくは１０〜２５質量％であることが望ましい。この内包率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るため、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。
【００３０】
一方、本発明のリポソーム含有製剤を抗がん剤として用いる場合、封入物質としては、メトトレキサート、ドキソルビシン、エビルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトボシド、エリブシチン、カプトデシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスブラチン、ブレドニゾン、これらの塩などが挙げられる。これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
（脂質膜構成物質）
また、リポソームの脂質膜構成物質は、リン脂質を主成分として含むものである。このリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどで代表されるリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００３２】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
【００３３】
上記中性リン脂質のほかに、アニオン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、さらには重合性リン脂質、ならびにカチオン性（正荷電）脂質を含んでもよい。
【００３４】
負に荷電したリン脂質として、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホスファ
チジルセリン（DSPS）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジミリストイルホスファチジン酸などを挙げることができる。
【００３５】
カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。
【００３６】
本発明において用いられる脂質膜構成物質には、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含むことが望ましい。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度である。その測定は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）
を使用する示差熱分析による。
【００３７】
相転移点を有するリン脂質としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度（以下同じ）：23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。なお、カチオン性リン脂質、カチオン性脂質、脂肪族アミンなど正電荷を与える化合物を併用することは内包率が向上するため望ましい。
【００３８】
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。
【００３９】
カチオン性脂質の例としては、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（DOGS
）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、
２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）およびＮ−［１
−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）などが挙げられる。
【００４０】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００４１】
必要に応じリポソームの脂質膜構成物質として、上記以外に他の成分を加えることもできる。その例として、膜安定化剤またはポリアルキレンオキシド基導入用アンカーとしてコレステロール、コレステロールエステルなどのステロール類、荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなどが挙げられる。
【００４２】
本発明における好ましいリポソームの別の態様として、脂質膜構成物質としてホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンからなる群より選ばれるリン脂質を用いることができ、両者を組み合わせてもよい。
【００４３】
（製剤助剤）
またリポソームの懸濁液には、製剤助剤が溶解または分散していてもよい。「製剤助剤」とは、製剤化に際し封入物質とともに水性溶媒中に添加されるものであり、各種の物質が適宜使用される。具体的には生理学的に許容される各種の緩衝剤、キレート化剤、さらに必要に応じて、浸透圧調節剤、安定化剤、粘度調節剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、パラオキシ安息香酸メチルといった保存剤などが挙げられる。
【００４４】
このような各成分を用いて、リポソームの懸濁液が調製される。
【００４５】
リポソームの懸濁液の調製方法
本発明におけるリポソームの懸濁液の調製方法は、超臨界二酸化炭素と脂質膜構成物質との混合溶液に、封入物質を含有する水溶液を添加混合し、次いで超臨界二酸化炭素を排出することにより調製する方法（以下、超臨界二酸化炭素法）である。このような超臨界二酸化炭素法においては、実質的に溶解助剤を使用しないで懸濁液を調製する。
【００４６】
二酸化炭素は、その臨界温度が３１．１℃、臨界圧力が７５．３ｋｇ／ｃｍ2と比較的
扱いやすく、そのガスは不活性であるため残存しても人体に無害であり、さらに高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により好適である。本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、通常３２〜１００℃、好ましくは３２〜８０℃である。かかる温度範囲の中でも特に好適な温度は、使用するリン脂質の相転移温度またはそれより上である。圧力は、通常５０〜５００ｋｇ／ｃｍ2、好ましく
は９０〜１５０ｋｇ／ｃｍ2、特に好ましくは１００〜１２０ｋｇ／ｃｍ2範囲である。また、高温下に脂質類を水中で強制的に融和させる方法でないために、高温による脂質類の変性、たとえばリン脂質が加水分解してリゾ体を生じたり、不飽和成分の過酸化が起きるといった問題もない。
【００４７】
リポソームの懸濁液の調製は、具体的には以下のように行なわれる。
【００４８】
まず、圧力容器に液体二酸化炭素を加え、上記の圧力および温度として超臨界状態もしくは亜臨界状態にする。次いで、超臨界（もしくは亜臨界）状態の二酸化炭素に、リポソームの脂質膜構成物質としてリン脂質および脂質膜安定化物質などを混合する。脂質膜構成物質として上記リン脂質を、好ましくはカチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類、グリコール類から少なくとも１種選ばれた化合物とともに混合する。あるいは予めこれらの化合物を加えた圧力容器に液体二酸化炭素を加え、温度、圧力を調整して超臨界状態にして混合してもよい。
【００４９】
次いで、この超臨界二酸化炭素を攪拌しながら、その中に、封入物質、必要に応じて前記製剤助剤を含む水溶液を２回以上に分けて添加し、あるいは少量ずつ連続的に添加して混合する。具体的には該水溶液を、１分当り該超臨界二酸化炭素容量の１／１０００〜１／５容量、好ましくは１／５００〜１／１０容量、より好ましくは１／２００〜１／２０容量の割合で添加することがよい。なお、添加する側と加えられる側の選択は重要であり、必ず膜構成成分が存在する超臨界二酸化炭素の中に、封入物質を含有する水溶液を添加する。
【００５０】
封入物質のリポソーム内への内包化の効率は、リポソーム用脂質の脂質総量と封入物質などを含む水溶液との比率によっても左右される。ここでいう脂質総量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。上記水溶液１リットル（Ｌ）に対し脂質総量が１５〜１５０ｍmoles 、好ましくは３０〜１２０ｍmolesの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍmolesの範囲の割合で混合すると、水溶性封入物質のリポソーム内への内包化が良好に進行し、結果的にその封入物質の保持効率も向上する。
【００５１】
上記のようにして超臨界二酸化炭素と水溶液とが混合された混合溶液を調製した後に、圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出すると、封入物質を内包するリポソームが分散しているリポソームの懸濁液が生成する。
【００５２】
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包率、封入物質のリポソーム内の保持率が高い。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、有機溶剤を使用せずに水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することができる本法は、本発明のリポソーム含有製剤の製造には有用な方法である。
【００５３】
本発明におけるリポソームの多くは、通常、多重層膜リポソームとして存在するが、一
枚膜リポソームもまた混在していてもよい。ここにいう一枚膜リポソームとは、リン脂質二重層が実質的に1つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察において、レプリカが概ね1つの層として認められ
るリン脂質二重層によりリポソームが構成されていることをいう。すなわち、観察したカーボン膜に残された粒子の跡について段差がないものを一枚膜と判定し、２つ以上の段差が認められるものを「多重層膜」と判定している。多重層膜からなるリポソーム（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）は、リポソーム膜の二分子膜を剥がしてその多重層をなるべく薄くすることが望ましい。一枚膜リポソームは、多重層膜リポソームに比べ、封入容量が大きく、さらに封入効率が高い。したがって、投与する脂質量も大きくならないため、一枚膜リポソームの割合が多い方が望ましい。
【００５４】
本発明においては、このようなリポソームの懸濁を、さらに所定の孔径を有する濾過膜を通過させて濾過することが好ましく、エクストルーダーを使用して濾過することがより好ましい。この濾過膜としては、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができ、孔径は大きいものから小さいものへと順次小さくしていくことが好ましく、最終的には０．０５〜０.４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ま
しくは０．１５〜０．２μｍの範囲まで孔径を小さくしていくことが望ましい。
【００５５】
具体的には、上記孔径を有するフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、所望の寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。この静圧式押出し装置としては、各種の静圧式押出し装置、たとえば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製）などを挙げることができる。これにより脂質分子の配向が均一であり、水分散性が良好なリポソーム用脂質が得られる。押出し濾過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557
巻,9ページ(1979)に記載されている。
【００５６】
本発明の望ましい態様として、前記押出し濾過は、リポソームの懸濁液を転移温度を有するリン脂質の転移温度以上、好ましくは“転移温度＋１０℃”以上に加温し、その後、細孔のある膜を通すことが好ましい。この「転移温度＋１０℃以上」とは、用いるリン脂質の種類と組成にもよるが、３５℃から６５℃程度である。このようにリポソームの懸濁液を加温するには、濾過容器を上記温度範囲に加熱することにより行われる。
【００５７】
加圧押出し濾過の操作では、このようにリン脂質の転移温度以上に加温すると、転移温度を有するリン脂質は液晶状態となり、流動性が高まる。本発明の製造方法によるリポソーム用脂質は、規則正しい配向を有する均一な脂質膜を構成しているため、水溶性封入物質を封入した、比較的粘度の高いリポソーム懸濁液であっても、フィルターの目詰まりを起こすことなく粒径の揃ったリポソームを作製することができる。
【００５８】
このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、望ましくない物質の除去、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。
【００５９】
このようにして得られるリポソーム懸濁液を用いて、本発明のリポソーム含有製剤を製造する。
【００６０】
リポソーム懸濁液の加熱加圧処理
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法においては、前記リポソームの懸濁液を、所定の条件で加熱加圧処理する。この処理は、製剤の最終工程で行うことが好ましい。
【００６１】
処理条件は、リポソームの懸濁液に含有されるリポソームの形態、粒子径分布、内包率等により適宜選択されるが、
温度115〜118℃、圧力0.17〜0.19MPaの場合は、30〜45分間、
温度121〜124℃、圧力0.21〜0.23MPaの場合は、15〜30分間、
温度126〜129℃、圧力0.24〜0.26MPaの場合は、10〜15分間、
温度132〜135℃、圧力0.29〜0.31MPaの場合は、3〜10分間、
の条件で行うことが望ましい。
【００６２】
このような効果が得られる理由は明らかではないが、上記条件で加熱加圧処理することにより、例えば、凝集して塊状になったリポソームの離反、分散が促される、あるいは、多重層膜からなるリポソーム（ＭＬＶ）においてリン脂質膜が再構築され、ＬＵＶからなるリポソームやＳＵＶからなるリポソームが生成しているためと推測される。さらに、脂質膜内で構成分子の再配置も起こり、安定な膜構造が形成される。これらが、封入物質の内包率向上につながると考えられる。さらに、このような条件下で加熱加圧処理を行うことにより、実質的に有機溶媒などの溶解助剤を用いなくても、効率的にリポソームの封入物質の内包化率が向上するとともに、リポソームを微細化することができる。さらに、溶解助剤により膜強度が低下することがないため、リポソームの保存安定性に優れる。
【００６３】
リポソームの懸濁液の加熱加圧処理は、具体的には、上述のように調製されたリポソーム懸濁液を有する耐圧容器内に、必要に応じて、大気、二酸化炭素、窒素、ヘリウム、アルゴン等を所定の圧力になるまで供給する。このような気体は、菌やウイルス等が混入するのを防止する観点から、滅菌フィルターを通過させて供給することが好ましい。滅菌フィルターは、孔径０．４５μｍ以下であるのが好ましく、例えば、孔径０．２μｍの滅菌フィルターを用いる。
【００６４】
このようにリポソーム懸濁液が満たされた耐圧容器内に、必要に応じて、所定の圧力になるまで気体を供給するとともに、耐圧容器に備えられた加熱装置によって所定の温度まで加熱し、さらにその状態を所定の時間維持することによりリポソームの懸濁液の加熱加圧処理を行う。また、リポソームの懸濁液を別容器に移した後に、上記条件で加熱加圧処理を行ってもよい。
【００６５】
この加熱加圧処理は、連続的であってもよく、間欠的であってもよい。間欠的に処理する場合には、累積時間が上記処理時間となるように行うことが好ましい。
【００６６】
引き続きリポソームを、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により未保持の封入物質を除去して精製してもよい。濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。次いで、滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のリポソーム含有製剤が調製される。
【００６７】
リポソーム含有製剤
本発明のリポソーム含有製剤は、封入物質がリポソーム膜構成成分に対して、１〜１０、好ましくは２〜８、より好ましくは３〜６の重量比となる量で内包されているリポソームを含有することが望ましい。
【００６８】
このように、製造方法によるリポソーム含有製剤は、リポソームの封入物質の内包率が向上しているため、生体内に投与するリポソーム含有製剤は少量で済み、患者に与える負担が小さい。特に、リポソームの目標部位への薬物送達機能を利用して造影剤に適用される場合においては、患者に与える負担がさらに軽減される。
【００６９】
本発明のリポソーム含有製剤は、リポソームの中心粒径は、１００〜３００ｎｍの範囲
内であることが望ましい。このように、本発明のリポソーム含有製剤に含まれるリポソームは、その粒子径が小さいため、リポソームが所定の目的とする部位に到達しやすく、封入物質（薬効成分）により目的とする薬効を得ることができる。リポソーム含有製剤が、たとえば腫瘍部分の選択的撮像を目的として用いられる場合には、特に１１０〜１３０ｎｍがより好ましい。リポソームの粒径が上記範囲であることにより、癌組織へ選択的にリポソームを集中させることが可能となる。これは「ＥＰＲ効果」として知られている。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、３０〜８０ｎｍ未満に比べて異常に大きく、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの大きさの分子でも新生血管壁から漏れ出る。すなわちＥＰＲ効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものである。
【００７０】
またさらに、本発明のリポソーム含有製剤は、適用する用途によって好ましい粘度範囲が異なるが、例えば造影剤に用いる場合、３７℃で、６ｃＰａ以下、好ましくは０．９〜３ｃＰａであることが望ましい。
【００７１】
このような本発明のリポソーム含有製剤は、特に限定されず、化粧料、皮膚外用剤、内服薬、造影剤などに適用することができる。本発明においては、上記効果が得られることから造影剤に好適に用いることができる。
【００７２】
本発明においては、リポソーム含有製剤が、加熱加圧処理されたリポソームの水性分散液として得られる態様によって説明したが、さらにこの水性分散液を、凍結乾燥などにより乾燥して、リポソーム粉体としてもよい。
【００７３】
［実施例］
以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。
【００７４】
なお、非イオン性ヨウド化合物としては以下のものを用いた。
【００７５】
非イオン性ヨウド化合物
商品名：オイバロミン150（コニカミノルタエムジー（株）製Ｘ線造影剤：イオパミド
ールを306.2mg/ml含有（ヨード含有量150mg/ml））
［実施例１］
水素添加大豆リン脂質（COATSOME NC-21：日本油脂（株）製）を95.8mg、PEG化リン脂
質（SUNBRIGHT DSPE 20H：日本油脂（株）製）を31.9mg、コレステロールを31.9mgを、エタノール1mlに溶解後、70℃に過熱したステンレス製の特製圧力容器に仕込み、約30分間
窒素ガスを吹き込んで、エタノールを除去した。その後、圧力容器の蓋をした。この中に、圧力50kg/cm2の液化二酸化炭素を圧力容器内に加えた後、圧力容器の体積を減少させることにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに容器内の内圧を120kg/cm2まで加圧し
た。圧力容器内をマグネティックスターラーにて攪拌しながら、10ｍｌのオイバロミン150をHPLCの送液ポンプを利用し、1ml/minの流速で圧力容器内に注入した。
注入終了後、圧力容器内の二酸化炭素を約20分かけて徐々に抜き、常圧に戻した後、中の溶液を取り出した。得られた溶液の一部を生理食塩水１Ｌにて３回透析を行い、少量のエタノールを加えてリポソームを壊し、遠心分離後、分光光度計で242nmのイオパミドール
の吸収を測定することにより、リポソーム中に内包されていたイオパミドールの定量を行った。その結果、内包率が15％であることが分かった。この懸濁溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.3μmの混合セルロースメンブ
ランフィルターで６回濾過した。得られたリポソーム含有製剤の粒径を、光散乱粒径測定装置（マルバーン社製、ゼータサイザー1000）にて測定したところ、平均粒径が212nmで
あった。
【００７６】
このようにして得られたリポソーム含有製剤を、圧力センサーと温度センサーとを入れたバイアル瓶４本に分けて中に入れ、封をした後、オートクレーブ（KN3330004、テック
ジャム社製）に入れ、130℃に加熱した。温度センサーをトレースし、内温が129℃となった時点から10分間加熱を続けた。この間の内圧は0.26MPaであった。
【００７７】
その後、室温まで冷却し、一本のバイアル瓶を開封し、リポソームに内包されているイオパミドールの定量を行ったところ、内包率16％、平均粒径212nmであった。これを、37
℃の条件で保存し、1週間後、1カ月後、3カ月後に残りのバイアル瓶を開封し、それぞれ
内包率と平均粒径を測定した。
【００７８】
結果を、表１に示す。
【００７９】
［実施例２〜４、比較例１〜２］
オートクレーブ加熱加圧処理の条件を、表１のように変更した以外は、実施例１と同様にしてリポソーム含有製剤を調製した。さらに同様にして、内包率と平均粒径を測定した。
【００８０】
結果を、表１に示す。
【００８１】
［比較例３］
クロロホルム42mlに、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）86mgと、コレステロール38.4mgとを溶解した。この溶液に、ジイソプロピルエーテルを42ml加え、さらに、オイバロミン150を1.5ｍｌ加え、60℃に加熱した後、超音波を5分間かけエマルションを
作成した。得られたエマルションをロータリーエバポレーターにかけ、45℃にて約5mlに
なるまで濃縮した。この中に、オイバロミン150を3ｍｌ、純水を2ml加え、再度4mlになるまで濃縮し、さらにオイバロミン150を5.5ｍｌ、純水を2.5ml加え、再度8mlになるまで濃縮した。この後、純水にて10mlとした。このときのリポソームの内包率は、15％であった。
【００８２】
この溶液を、80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.45μmの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.3μmの混合セルロースメンブランフィルターで６回濾過して、リポソーム含有製剤（造
影剤）を調製した。この造影剤のリポソームの平均粒径は220nmであった。
【００８３】
このようにして得られたリポソーム含有製剤を、圧力センサーと温度センサーとを入れたバイアル瓶４本に分けて中に入れ、封をした後、オートクレーブ（KN3330004、テック
ジャム社製）に入れ、130℃に加熱した。温度センサーをトレースし、内温が129℃となった時点から10分間加熱を続けた。この間の内圧は0.26MPaであった。
【００８４】
その後、室温まで冷却したところ、脂質と造影剤溶液とが分離した状態になった。
【００８５】
【表１】
2005232053.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のリポソーム含有製剤の製造方法によれば、リポソームの懸濁液を所定の条件で加熱加圧処理することにより、リポソームの封入物質の内包率が向上したリポソーム含有製剤を製造することができる。さらに、このような製造方法により得られるリポソーム含有製剤は、保存安定性に優れる。したがって、薬物の担体や人工酸素運搬体として好適
に使用することができる。