(57)【要約】【課題】  受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）のキナーゼドメインを活性化する新規なアゴニスト抗体を含む医薬組成物、および受容体チロシンプロテンキナーゼ（ｐＴＫ）の細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む新規なキメラタンパク質を提供する。【解決手段】  受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）のキナーゼドメインを活性化するのに有効な量の、ａ）ＳＡＬ−Ｓ１；ｂ）ＨｐＴＫ５；およびｃ）ｂｐＴＫ７よりなる群から選択した受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）のキナーゼドメインを活性化するアゴニスト抗体、および製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物；およびａ）ＳＡＬ−Ｓ１；ｂ）ＨｐＴＫ５；およびｃ）ｂｐＴＫ７よりなる群から選択した受容体チロシンプロテンキナーゼ（ｐＴＫ）の細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含むキメラタンパク質；および該キメラタンパク質をコードする核酸。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）のキナーゼドメインを活性化するのに有効な量のアゴニスト抗体であって、
ａ）ＳＡＬ−Ｓ１；
ｂ）ＨｐＴＫ５；および
ｃ）ｂｐＴＫ７
よりなる群から選択した受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）のキナーゼドメインを活性化するアゴニスト抗体、および製薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項２】
ａ）ＳＡＬ−Ｓ１；
ｂ）ＨｐＴＫ５；および
ｃ）ｂｐＴＫ７
よりなる群から選択した受容体チロシンプロテンキナーゼ（ｐＴＫ）の細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含むキメラタンパク質。
【請求項３】
ｐＴＫがＨｐＴＫ５である請求項２のキメラタンパク質。
【請求項４】
ｐＴＫがＳａｌ−Ｓ１である請求項２のキメラタンパク質。
【請求項５】
免疫グロブリン定常ドメイン配列がＩｇＧ免疫グロブリンの配列である請求項２のキメラタンパク質。
【請求項６】
請求項２のキメラタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６の核酸を含む複製可能なベクター。
【請求項８】
請求項６の核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項９】
ａ）ＳＡＬ−Ｓ１；
ｂ）ＨｐＴＫ５；および
ｃ）ｂｐＴＫ７
よりなる群から選択した受容体プロテインキナーゼ（ｐＴＫ）の細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含むキメラタンパク質を産生させるための該キメラタンパク質をコードする核酸分子の使用方法であって、請求項８の宿主細胞を培養することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規プロテインチロシンキナーゼ（ｐＴＫ）遺伝子、これらの遺伝子によってコードされたタンパク質、該遺伝子にハイブリダイズするＲＮＡ核酸配列、該コードされたタンパク質に特異的な抗体、該タンパク質のキメラおよびその使用法に関する。
【０００２】
とりわけ、本願は本明細書に開示する受容体ｐＴＫｓのチロシンキナーゼドメインを活性化することができるアゴニスト抗体およびｐＴＫ−免疫グロブリンキメラに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の増殖および分化を調節するシグナルの変換は、様々な細胞のタンパク質のリン酸化によって一部は調節されている。プロテインチロシンキナーゼはこのプロセスを触媒する酵素である。さらに、多くのものは成長因子受容体として機能する。受容体チロシンキナーゼのｃ−ｋｉｔサブグループは外在的基質ならびにそれ自身のポリペプチド鎖内のチロシン残基のリン酸化を触媒する（非特許文献１）。該ｃ−ｋｉｔサブグループの成員にはＦＬＴ／ＦＬＫ（胎児肝臓キナーゼ（Fetal Liver Kinase））、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子受容体（Fibroblast Growth Factor Receptor））およびＮＧＦ（神経成長因子受容体（Nerve Growth Factor Receptor））を含む。
【０００４】
ＥＰＨチロシンキナーゼサブファミリー、Ｅｐｈ、Ｅｌｋ、Ｅｃｋ、Ｅｅｋ、Ｈｅｋ、Ｈｅｋ２、Ｓｅｋ、Ｅｈｋ−１、Ｅｈｋ−２、Ｃｅｋ−４〜Ｃｅｋ−１０、Ｔｙｒｏ１、４、５、６は膜貫通型チロシンキナーゼの最大のサブファミリーであるようである（非特許文献２〜１４）。
【非特許文献１】ウルリッヒ（Ullrich）ら、Cell 1990, 61: p.203
【非特許文献２】ヒライ（Hirai）ら、Science 1987, 238: p.1717-1720
【非特許文献３】レトウィン（Letwin）ら、Oncogene 1988, 3: p.621-678
【非特許文献４】ロータック（Lhotak）ら、Mol. Cell. Biol. 1993, 13: p.7071-7079
【非特許文献５】リンドバーグ（Lindberg）ら、Mol. Cell. Biol. 1990, 10: p.6316-6324
【非特許文献６】ボーム（Bohme）ら、Oncogene 1993, 8: p.2857-2862
【非特許文献７】ウィックス（Wicks）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89: p.1611-1615
【非特許文献８】パスカル（Pasquale）ら、Cell Regulation 1991, 2: p.523-534
【非特許文献９】サッジャーディ（Sajjadi）ら、New Biol. 1991, 3: p.769-778
【非特許文献１０】ロータックら、Mol. Cell. Biol. 1991, 11: p.2496-2502
【非特許文献１１】ギラルディ−ヘベンストライト（Gilardi−Hebenstreit）ら、Oncogene 1992, 7: p.2499-2506
【非特許文献１２】ライ（Lai）ら、Neuron 1991, 6: p.691-704
【非特許文献１３】サッジャーディら、Oncogene 1993, 8: p.1807-1813
【非特許文献１４】メゾンピエール（Maisonpierre）ら、Oncogene 1993, 8: p.3277-3288
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さらなるｐＴＫｓおよびアゴニスト抗体が、治療薬剤としての使用および診断目的に関しての細胞の増殖および分化のさらなる研究のために必要である。従って、本発明の目的は新規のｐＴＫ遺伝子、それによってコードされるタンパク質、コードされたタンパク質に特異的な抗体、該タンパク質のキメラおよびそれらの使用法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に記載の単離された遺伝子とは、集合的に「プロテインチロシンキナーゼ遺伝子」または「ｐＴＫ遺伝子」である。これらの遺伝子の幾つかの核酸配列は、本明細書に記載されたようにして単離したが、成長因子受容体として機能する（例えば、ｃ−ｋｉｔサブグループのｐＴＫｓ）、細胞外ドメインを有する以前に同定されたプロテインチロシンキナーゼと有意にホモロジーを示す。ｐＴＫ遺伝子の幾つかは、巨核球細胞およびリンパ球細胞の両方に存在していることが示された。
【０００７】
とりわけ、１４のｐＴＫ遺伝子が同定された。ＳＡＬ−Ｓ１およびＳＡＬ−Ｄ４の２つのｐＴＫ遺伝子は、巨核球細胞において同定された。ＳＡＬ−Ｄ４は細胞内ｐＴＫｓのＣＳＫファミリーに関連を有し、ＳＡＬ−Ｓ１はｐＴＫｓのＦＧＦ受容体ファミリーに関連を有する。ＬｐＴＫｓと称する５つのｐＴＫ遺伝子は、リンパ球細胞において同定され、巨核球細胞においても同様に存在していることが示された。ＨｐＴＫ５という１つのｐＴＫ遺伝子は、ヒト肝ガン細胞において同定された。ｂｐＴＫ遺伝子と称する６つのｐＴＫ遺伝子は、ヒトの脳組織において認められた。
【０００８】
本発明の主題であるｐＴＫ遺伝子は、一般的に変性オリゴヌクレオチドプライマーの２つのセットを使用して同定された：すべてのｐＴＫ ＤＮＡセグメントを増幅する第１のセット（配列番号：１〜２）、およびｐＴＫｓのｃ−ｋｉｔサブグループの触媒ドメインに存在する非常に良く保存された配列を増幅する第２のセット（配列番号：３〜４）。この方法で同定されたｐＴＫ遺伝子は下記に示す。
【０００９】
ＳＡＬ−Ｓ１は幾つかの巨核球細胞株において発現されるが、赤血球系細胞株には発現されない。ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列が得られ、１６０塩基対を含む配列が明らかにされた（配列番号：５）。この単離したＤＮＡ断片はＦＬＴ／ＦＬＫファミリーの既知のプロテインチロシンキナーゼと有意な配列ホモロジーを示すアミノ酸配列（配列番号：６）をコードした。ＳＡＬ−Ｓ１（配列番号：３３）の推定アミノ酸配列は１２９８残基を含む。
【００１０】
ＳＡＬ−Ｄ４もまた巨核球細胞に発現し、１４７塩基対のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片である（配列番号：７）。この単離されたＤＮＡ断片は、ＣＳＫ細胞内ｐＴＫファミリーの既知のプロテインチロシンキナーゼと有意な配列ホモロジーを示すアミノ酸配列（配列番号：８）をコードした。
【００１１】
ＬｐＴＫ ２、ＬｐＴＫ ３、ＬｐＴＫ ４、ＬｐＴＫ １３およびＬｐＴＫ２５を含むＬｐＴＫｓはリンパ球細胞並びに巨核球細胞において発現する。ＬｐＴＫ３遺伝子のヌクレオチド配列（１５１塩基対）を得た（配列番号：１１）。ＬｐＴＫ ２、ＬｐＴＫ ４、およびＬｐＴＫ １３遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ１４９塩基対（配列番号：９）、１３７塩基対（配列番号：１３）、および２１１塩基対（配列番号：１５）を有した。ＬｐＴＫ ２５は、３１２０塩基対のヌクレオチド配列を有する（配列番号：２２）。完全長遺伝子配列を７６０７塩基対を有するＬｐＴＫ ２に関して得た（配列番号：１９）。さらに、ＬｐＴＫ ４のシークエンシングは４０４塩基対の配列を明らかにした（配列番号：２１）。
【００１２】
ＨｐＴＫ５遺伝子はヒト肝ガン細胞に発現するが、３９６９塩基対のヌクレオチド配列を有する（配列番号：２３）。
【００１３】
ｂｐＴＫ １、ｂｐＴＫ ２、ｂｐＴＫ ３、ｂｐＴＫ ４、ｂｐＴＫ ５およびｂｐＴＫ７を含むｂｐＴＫｓのヌクレオチド配列は、ヒト脳組織に発現し、それぞれ配列番号：２５〜３０および３６のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００１４】
従って、本発明はヒト巨核球細胞株から単離された、ｃ−ｋｉｔサブグループのプロテインチロシンキナーゼの触媒ドメインにおいて非常に良く保存されているアミノ酸配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを含む。
【００１５】
本発明はまた、本明細書で記載されたように同定されたｐＴＫ遺伝子によってコードされたタンパク質を含み、該タンパク質はｐＴＫｓのｃ−ｋｉｔサブグループの成員ならびにＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫｓによってコードされたタンパク質と有意な配列ホモロジーを示す。本発明はまた、ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫのホモログまたは均等物（すなわち、チロシンキナーゼ活性を示す、ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫｓ、ＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫｓの配列と実質的に類似しているが同一ではないアミノ酸配列を有するタンパク質）を含む。本発明はさらに、チロシンキナーゼ活性を保有するがＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫ配列の全長より短いペプチド（ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫ断片）；およびＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫ核酸配列、およびＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫ均等物の使用を含む。
【００１６】
本発明はさらに、ｃ−ｋｉｔサブグループ内に含まれるプロテインチロシンキナーゼのＦＬＴ／ＦＬＫ、ＦＧＦ受容体またはＮＧＦ受容体ファミリーと有意な配列ホモロジーを示す、本明細書に記載のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする核酸配列を含む。このような核酸配列は他の脊椎動物、特に哺乳動物、および他の細胞タイプにおけるｐＴＫ遺伝子を同定するためのプローブとして有用である。それらはまた、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方においてプロテインチロシンキナーゼ活性を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
【００１７】
本発明のＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫチロシンキナーゼは細胞の増殖、分化および他の代謝機能を調節する薬剤および治療剤の開発に関連し標的タンパク質として使用することができる。ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫまたはｂｐＴＫタンパク質は他のチロシンキナーゼのアゴニストまたはアンタゴニストとして使用することができる。これらｐＴＫｓはまた巨核球細胞および／または血小板接着相互作用の調節手段にできる。
【００１８】
加えて、ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫ、ＨｐＴＫおよびｂｐＴＫチロシンキナーゼは細胞の増殖および／または分化の因子を検出するスクリーニングアッセイにて使用することができる。標準的な実験技術を使用して本発明のｐＴＫｓのリガンドを同定できる。とりわけ、本発明は、本明細書に開示されているｐＴＫｓのリガンドを単離するのに有用であるキメラｐＴＫ−免疫グロブリン融合タンパク質を提供する。該キメラタンパク質はまた、細胞内に内在的にならびに細胞外液に外在的に存在するこれらのリガンドを検出するために設計された診断アッセイにも有用である。該キメラタンパク質を使用するアッセイはまた、血液および尿などの体液におけるこれらのリガンドを検出するための診断手段として設計することができる。
【００１９】
他の態様において、本発明は個々のｐＴＫ（ｐＴＫが受容体である場合）の任意のアゴsニストである、ＳＡＬ−Ｓ１、ＳＡＬ−Ｄ４、ＬｐＴＫｓ、ＨｐＴＫ５およびｂｐＴＫｓに特異的な抗体を提供する。本発明はまた、ハイブリドーマ細胞株および本明細書で定義したモノクローナル抗体をコードする単離された核酸にも関する。
【００２０】
また、本発明は本明細書に開示するｐＴＫをそれに対するアゴニスト抗体と反応させることからなる、該ｐＴＫを活性化する方法にも関する。異なる態様において、本発明は、本明細書に開示するｐＴＫを活性化するアゴニスト抗体の生理学的に有効な量をこのような処置が必要なヒト患者に投与することからなる、細胞の増殖および／または分化を増強する方法に関する。
【００２１】
またさらに別の態様においては、本発明は、ｐＴＫを含有すると考えられる源を該ｐＴＫと免疫学的に反応する検出可能に標識したモノクローナル抗体と接触させ、ついで該抗体が該源に結合するかどうかを決定することによってｐＴＫを検出する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
新規のプロテインチロシンキナーゼ遺伝子を同定し、その核酸配列を決定し、ついでコードされるタンパク質のアミノ酸配列を推定した。本明細書に記載の単離した遺伝子は、集合的に、「プロテインチロシンキナーゼ遺伝子」または「ｐＴＫ遺伝子」という。
【００２３】
これらの新規のｐＴＫｓの単離および同定を容易にするため、実施例１に記載するように２セットのＤＮＡプローブを使用した。第１のセットは一般に２つの変性オリゴヌクレオチド配列、ｐＴＫ １（配列番号：１）およびｐＴＫ ２（配列番号：２）よりなる（マシューズ（Matthews）、Cell ６５：１１４３［１９９１］；およびウィルクス（Wilks）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８６：１６０３［１９８９］）。これらの配列は、チロシンキナーゼＤＮＡセグメントを増幅するためのポリメラーゼチェーンリアクションにおいてプライマーとして使用した（ミュリス（Mullis）ら、Cold Spring Harbor Symp．Advan．Biol. ５１：２６３［１９８６］）。
【００２４】
第２のセットは一般に２つのオリゴヌクレオチド配列、ｐＴＫ ３（配列番号：３）およびｐＴＫＫＷ（配列番号：４）よりなり、これらはプロテインチロシンキナーゼのｃ−ｋｉｔファミリーの触媒ドメインの非常に良く保存された領域をコードする核酸配列を増幅するよう設計されているものである。これらの配列は、ＤＮＡ増幅の第２ラウンドにおいてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）においてプライマーとして使用した。この２段階増幅手法を使用して、これらのｐＴＫプライマーにハイブリダイズするＤＮＡ断片を同定し、単離し、ついでシークエンシングした。
【００２５】
特に、１４のｐＴＫ遺伝子を同定した。２つのｐＴＫ遺伝子、ＳＡＬ−Ｓ１およびＳＡＬ−Ｄ４は幾つかの巨核球細胞株であるＣＭＫ １１−５、ＤＡＭＩ、ＵＴ−７およびエリスロポエチン内で増殖したＵＴ−７において同定されたが、赤血球系細胞株ＨＥＬ、ＰＭＡで刺激したＨＥＬ細胞、またはＫ５６２においては同定されなかった。５つのｐＴＫ遺伝子（ＬｐＴＫｓという）はリンパ球細胞ならびに巨核球細胞にて同定された。ＨｐＴＫ ５というｐＴＫ遺伝子は、ヒト肝ガン細胞において同定され、ｂｐＴＫｓという６つの遺伝子はヒト脳細胞において同定された。
【００２６】
配列番号：５、１７および３１の核酸配列によってコードされるＳＡＬ−Ｓ１（配列番号：６、１８および３３）はｐＴＫｓのＦＬＴ／ＦＬＫファミリーと有意なホモロジーを示す。ＳＡＬ−Ｓ１はシグナルペプチド（すなわち、図１５のアミノ酸残基１〜２４）；細胞外ドメイン（すなわち、図１５のアミノ酸残基２５〜７７５）；膜貫通ドメイン（すなわち、図１５のアミノ酸残基７７６〜８００）および細胞質チロシンキナーゼドメイン（すなわち、図１５のアミノ酸残基８０１〜１２９８）を有する。配列番号：７によりコードされるＳＡＬ−Ｄ４（配列番号：８）は細胞内ｐＴＫｓのＣＳＫファミリーに関係する。配列番号：９および１９によってコードされるＬｐＴＫ ２（配列番号：１０および２０）；配列番号：１１によってコードされるＬｐＴＫ ３（配列番号：１２）；配列番号１３および２１によってコードされるＬｐＴＫ ４（配列番号：１４）；配列番号：１５によってコードされるＬｐＴＫ １３（配列番号：１６）；および配列番号：２２によってコードされるＬｐＴＫ ２５のＬｐＴＫｓもまた、既知のプロテインチロシンキナーゼと配列ホモロジーを示す。
【００２７】
配列番号：２３によりコードされるＨｐＴＫ ５（配列番号：２４）およびｂｐＴＫｓ１、２、３、４、５および７（それぞれ配列番号：２５〜２９および３４）も同様に既知のプロテインチロシンキナーゼと配列ホモロジーを示す。ＢｐＴＫ ７はシグナルペプチド（すなわち、図１６のアミノ酸残基１〜１９）；細胞外ドメイン（すなわち、図１６のアミノ酸残基２０〜５４７）；膜貫通部位（すなわち、図１６のアミノ酸残基５４８〜５７０）を有する受容体型ｐＴＫをコードする。残りの配列には、細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。
【００２８】
従って、上記のようにプロテインチロシンキナーゼのｃ−ｋｉｔサブグループの触媒ドメインに存在するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ分子を単離し、シークエンシングした。集合的に「ｐＴＫ遺伝子」という、これらの単離したＤＮＡ配列（およびその推定アミノ酸配列）は、ｐＴＫファミリーの既知成員と有意な配列ホモロジーを示した。
【００２９】
一旦単離すると、これらのＤＮＡ断片をＰＣＲなどの既知の標準的な技術を用いて増幅することができる。これらの増幅された断片を、ついで適切なクローニングベクターにクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定した。
【００３０】
これらのＤＮＡ配列は、クローニングベクターから切り出すことができ、３２Ｐなどの放射性標識したヌクレオチドで標識し、全長のｃＤＮＡクローンを得るため適当なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。
【００３１】
上記のｐＴＫ遺伝子は、例えば、巨核球細胞およびリンパ球細胞のような天然に存在する源から単離された。本発明は組換え技術などの遺伝子工学技術によって産生したｐＴＫ遺伝子ならびに化学的に合成したｐＴＫ遺伝子を包含するものである。
【００３２】
これらｐＴＫ遺伝子の推定アミノ酸配列はチロシンキナーゼのｃ−ｋｉｔサブグループのプロテインチロシンキナーゼの触媒ドメインと有意なホモロジーを示すペプチドをコードするアミノ酸配列を含む。該ｐＴＫ遺伝子によりコードされるこれらのタンパク質には、該配列内の残基が機能的に同等なアミノ酸残基で置換され、その結果、表現型において変化が認められないサイレント変化（silent change）となる配列を含むことができる。例えば、該配列内の１つまたは２以上のアミノ酸残基がサイレント置換となる機能的に同等の同様な極性の他のアミノ酸によって置換されていることができる。
【００３３】
加えて、該タンパク質構造は、該ペプチドの所望の機能的なプロテインチロシンキナーゼ特性を実質的に損なうことのない、配列においての１つまたは２位上のアミノ酸残基の欠失、付加、逆位、挿入または置換によって修飾されることができる。
【００３４】
本発明のチロシンキナーゼ活性を有する修飾したｐＴＫｓは、そのようなタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むベクターから切り出すような組換えＤＮＡ技術を使用するかまたは既知の技術を用いて機械的および／または化学的に所望のタンパク質をコードするＤＮＡを合成することによって作成することができる。
【００３５】
本発明のｐＴＫｓを生成する別のアプローチは、所望のｐＴＫの長さに依存してこのようなタンパク質のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを作るためのペプチド合成を使用することである。該ペプチドまたはその修飾した同等物はペプチド合成の標準的な固相または液相化学によって直接合成することができる。
【００３６】
本発明のｐＴＫｓは、発現するであろう適切なベクター／宿主系に該タンパク質をコードするＤＮＡを挿入することにより生成するのが好ましい。該ＤＮＡ配列は、天然に存在する源から得ることができ、化学的に合成することができ、または標準的な組換え技術を使用することで生成することができる。
【００３７】
本発明はまた、本発明のｐＴＫ遺伝子（受容体型チロシンキナーゼ活性を示すタンパク質をコードする）を含む発現ベクターにも関する。
【００３８】
本発明のｐＴＫ遺伝子は多数の診断および治療の目的のために使用することができる。例えば、該ｐＴＫ遺伝子の核酸配列は真核および原核細胞タイプを含む他の細胞タイプにおいて存在する他のプロテインチロシンキナーゼを同定するプローブとして使用することができる。
【００３９】
該核酸配列はまた、プロテインチロシンキナーゼのキナーゼ活性を直接抑制する薬剤を設計し、またはチロシンキナーゼの触媒ドメインに結合し、よってその活性を抑制するペプチドを設計するのに使用することができる。これらの配列はまた、チロシンキナーゼ活性を抑制または破壊することができるアンチセンスヌクレオチドを設計するのに使用することができる。チロシンキナーゼ活性のこのような抑制は、白血病または他の悪性腫瘍などの細胞増殖の減少が有益であるような病理学的な状態において望ましい。
【００４０】
該核酸配列はまた、上記の薬剤、ペプチドまたはアンチセンスヌクレオチドを設計するのに使用することができるが、抑制効果をチロシンキナーゼに与えるよりは増強する。このように増強したチロシンキナーゼ活性は、基質（外在性ならびに内在性のチロシン残基）のリン酸化を増加させる結果となる。増強された効果は、貧血、出血性疾患および外科手順の間のような細胞増殖の増加が有益であるような状態において望ましい。
【００４１】
本発明のｐＴＫ遺伝子はまた、それぞれのリガンドに結合することができる受容体型チロシンキナーゼの可溶性断片を得るのに使用することができる。可溶性チロシンキナーゼ断片をコードするｐＴＫ遺伝子は、組換えＤＮＡ技術または合成技術を使用して生成することができる。いずれの場合においても、得られたＤＮＡは、該断片の可溶化を可能にする疎水性膜貫通領域の実質的な部位を欠如している可溶性ｐＴＫ断片をコードする。
【００４２】
これらの可溶性ｐＴＫタンパク質断片は、それぞれのリガンドに対する内在性の膜結合ｐＴＫとの競合体として外在的に導入し、それによりチロシンキナーゼ活性を抑制することができる。別法として、リガンドには結合するがキナーゼ活性を活性化しない修飾した可溶性ｐＴＫタンパク質断片を導入することができる。
【００４３】
これらの可溶性ｐＴＫタンパク質はまた、成長および分化因子などのリガンドを検出する結合アッセイにおいて使用することができる。一度これらのリガンドが同定されると、それらはキナーゼ活性を抑制または増強するために改変または修飾されてよい。例えば、該リガンドは修飾されるかまたはリシンなどの細胞に対して毒性で、その結果標的細胞を破壊する物質に接着させられてよい。該物質は、ｐＴＫに結合した後、キナーゼ活性を実質的に増加するかまたは他の成長因子を活性化する超活性化物質（super-activating substance）であってよい。
【００４４】
本発明のｐＴＫ遺伝子はまた、キナーゼ活性を抑制または増強させる成長因子または分化因子などのリガンドのイン・ビトロスクリーニングアッセイの診断手段を開発するのに有用である。該ｐＴＫ遺伝子によってコードされるタンパク質はまた、このようなアッセイにおいて使用することができ、またはこのようなアッセイにおいて使用するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するための免疫原として使用することができる。
【００４５】
本発明の態様の１つにおいて、ｐＴＫの細胞外ドメイン（ｐＴＫが受容体である場合）と免疫グロブリン定常ドメインの融合を含むキメラが構築できるが、これは、該受容体のリガンドのアッセイに使用することができ、および該受容体の細胞外ドメインに対する抗体の産生に使用することができる。
【００４６】
本明細書において「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」という表現は、ここに開示する天然に存在する受容体型ｐＴＫｓの細胞外ドメインのリガンド結合機能を共有するあらゆるポリペプチド配列をいう。細胞外ドメインのリガンド結合機能とは、少なくとも１つのｐＴＫリガンドを結合することができるポリペプチドの能力をいう。従って、より小さなセグメントは通常リガンド結合に充分であると認められるので、細胞外ドメイン全部を含む必要はない。切断された細胞外ドメインは一般に可溶性である。ＥＣＤという語には、成熟ｐＴＫの疎水性膜貫通配列（および、任意に膜貫通ドメインのＣ末端および／またはＮ末端の１〜２０アミノ酸）が欠失しているポリペプチド配列を含む。従って、該可溶性細胞外ドメイン含有ポリペプチドはｐＴＫの細胞外ドメインおよび細胞質ドメインを含むことができる。好ましい態様の別法として、該ポリペプチドはｐＴＫの細胞外ドメインのみを含む。該ｐＴＫの細胞外および膜貫通ドメインは、これらのドメインが記述された既知のｐＴＫアミノ酸配列と該対象ｐＴＫをアラインメントすることによって当業者により容易に決定されることができる。別に、疎水性膜貫通ドメインは該配列の疎水性プロットに基づき容易に記述できる。該細胞外ドメインは膜貫通ドメインのＮ末端側にある。
【００４７】
「免疫グロブリン」という語は一般には本来の「Ｙ」型における通常両者がジスルフィド結合された軽鎖または重鎖を含むポリペプチドをいうが、テトラマーまたはその集合体をも含むそれらの間の他の結合は、本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
免疫グロブリン（Ｉｇ）およびその変異体は既知であり、多くが組換え細胞培養において調製されている。例えば、米国特許第４,７４５,０５５号；ＥＰ第２５６,６５４号；フォルクナー（Faulkner）ら、Nature ２９８：２８６［１９８２］；ＥＰ第１２０,６９４号；ＥＰ第１２５,０２３号；モリソン（Morrison）、J．Immun. １２３：７９３［１９７９］；ケーラー（Kohler）ら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA ７７：２１９７［１９８０］；ラソ（Raso）ら、Cancer Res. ４１：２０７３［１９８１］；モリソンら、Ann．Rev．Immunol.２：２３９［１９８４］；モリソン、Science ２２９：１２０２［１９８５］；モリソンら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA ８１：６８５１［１９８４］；ＥＰ第２５５,６９４号；ＥＰ第２６６,６６３号；およびＷＯ８８／０３５５９号を参照。再度連結した免疫グロブリン鎖もまた知られている。例えば、米国特許第４,４４４,８７８号；ＷＯ８８／０３５６５号；およびＥＰ第６８,７６３号およびこれらに引用されている参考文献を参照。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られてよいが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３から得るのが好ましい。最も好ましくは、免疫グロブリン部分はＩｇＧ−γのＦｃ部位である。
【００４９】
「ｐＴＫの細胞外ドメインと免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合からなるキメラ」または「ｐＴＫ−免疫グロブリンキメラ」とは、免疫グロブリン定常ドメイン配列にコンジュゲートしたｐＴＫの細胞外ドメインをコードするアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。この定義には、モノマー、ホモ−またはヘテロマルチマーおよび特にホモ−またはヘテロダイマー、または−テトラマー形態におけるキメラを含む。
【００５０】
好ましい態様は、ｐＴＫの細胞外ドメインのＣ末端の、抗体のＣ末端部分（特に、Ｆｃドメイン）（免疫グロブリンＧ１のエフェクター機能を含む）のＮ末端への融合である。好ましい態様において、該重鎖定常領域の全体が細胞外ドメインに融合される。他の好ましい態様においては、パパイン開裂部位（ＩgＧ Ｆcを化学的に定める；重鎖定常領域の最初の残基を１１４として（カバット（Kabat）ら、Sequences of Immunological Interest、国立衛生研究所（National Institute of Health）、ベセスダ（Bethesda）、メリーランド、［１９８７］）残基２１６、または他の免疫グロブリンの類似部位）のすぐ上流のヒンジ領域において開始している配列を、ｐＴＫのＥＣＤに融合する。
【００５１】
特に好ましい態様においては、ｐＴＫ細胞外ドメインを、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に融合する。融合がなされる正確な部位は、重要ではなく、最適な部位は日常の実験によって決定することができる。キメラの主要な利点は、組換え宿主の培地に分泌されることであるが、分泌の程度は様々な発現系によって異なる。
【００５２】
一般に、本発明のキメラは、ある種の抗体からの可変ドメインが他の種の可変ドメインで置換されたキメラ抗体と同様に構築される。例えば、ＥＰ第０ １２５ ０２３号；ＥＰ第１７３,４９４号；ムンロ（Munro）、Nature ３１２；［１９８４年１２月１３日］；ノイベルガー（Neuberger）ら、Nature ３１２：［１９８４年１２月１３日］；シャロンら、Nature ３０９；［１９８４年５月２４日］；モリソンら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA ８１：６８５１−６８５５［１９８４］；モリソンら、Science ２２９；１２０２−１２０７［１９８５］；ブリアンヌ（Boulianne）ら、Nature ３１２；６４３−６４６［１９８４年１２月１３日］；カポン（Capon）ら、Nature ３３７、５２５−５３１［１９８９］；トラウネッカー（Traunecker）ら、Nature ３３９、６８−７０［１９８９］参照。
【００５３】
ｐＴＫ−Ｉｇキメラポリペプチドを調製するために、所望のｐＴＫ配列をコードする領域を含む該ＤＮＡを、免疫グロブリン様ドメインをコードするＤＮＡの３'末端でまたはその近辺にておよび該成熟ｐＴＫのＮ末端をコードするＤＮＡまたはその付近にて（異なるリーダーの使用を考える場合）またはｐＴＫのＮ末端コーディング領域またはその付近において（本来のシグナルを使用する場合）制限酵素で開裂する。このＤＮＡ断片は、免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡ付近に隣接して容易に挿入され、もし必要であるならば、得られた構築物を欠失突然変異誘発によって調整できる（tailored）。該Ｉｇは、変異体がヒトのイン・ビボ治療を意図されている場合はヒト免疫グロブリンであるのが好ましい。免疫グロブリン軽鎖または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは既知でありまたはｃＤＮＡライブラリーから容易に利用でき、または合成される。例えば、アダムス（Adams）ら、Biochemistry １９：２７１１−２７１９［１９８０］；ゴ−（Gough）ら、Biochemistry １９：２７０２−２７１０［１９８０］；ドルビー（Dolby）ら、P．N．A．S．USA、７７：６０２７−６０３１［１９８０］；ライス（Rice）ら、P．N．A．S．USA、７９：７８６２−７８６５［１９８２］；フォルクナーら、Nature ２９８：２８６−２８８［１９８２］；およびモリソンら、Ann．Rev．Immunol. ２：２３９−２５６［１９８４］参照。
【００５４】
本明細書に開示されているキメラタンパク質は、例えば、ライマン（Lyman）ら、Cell ７５：１１５７−１１６７［１９９３］の技術を使用して当該ｐＴＫのリガンドを単離またはスクリーニングするための診断法として有用である。また、キメラタンパク質は、様々なｐＴＫｓの細胞外ドメインと様々なリガンドの相互作用を研究するための診断学的な目的のために有用である（例えば、ベネット（Bennett）ら、J．Biol．Chem. ２６６（３４）：２３０６０−２３０６７［１９９１］参照）。該キメラタンパク質はさらに、該ｐＴＫの細胞外ドメインに対する抗体の産生に有用である（本明細書の実施例３および５参照）。該キメラタンパク質はまた、増強された血漿半減期を一般に有する（細胞外ドメインのみの場合と比較して）該ｐＴＫの細胞外ドメインの可溶性形態を提供し、それゆえ製薬学的に許容し得る担体に調合でき、患者に投与することができる限り、付加的な治療上の有用性をも有する。該キメラタンパク質は、患者に投与された全身的または組織局在的な過剰なｐＴＫリガンドを除去する治療剤として使用できると思われる。過剰なリガンドの除去は、該リガンドが患者にとって毒性がある場合には特に望ましい。該キメラタンパク質は該患者において内在性のｐＴＫと競合してリガンドを結合するよう機能する。同様に、該キメラタンパク質は、患者に持続性放出組成物の形態でリガンドを投与するのと同時にまたは続いて投与することができる。該キメラタンパク質は該リガンドの可溶性結合タンパク質として機能し、それによって該リガンドの半減期を延ばすのである。
【００５５】
「抗体」という語は本明細書において最も広い意味で使用し、特に、ｐＴＫと免疫学的応答するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、免疫グロブリン鎖またはその断片を包含する。
【００５６】
本発明の好ましい態様において、該抗体は当該技術分野においてよく知られた技術を用いて産生されたモノクローナル抗体である。例えば、ケーラー（Kohler）およびミルステイン（Milstein）により最初に記載されたハイブリドーマ技術（Eur．J．Immunol.、６：５１１［１９７６］、またハンマーリング（Hammerling）ら、：Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas、エルセビエ、ニューヨーク、５６３−６８１頁［１９８１］にも記載）を使用することができる。コート（Cote）らおよびボーナー（Boerner）らの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用できる［コートら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R．Liss、７７頁［１９８５］およびボーナーら、J．Immunol.、１４７（１）：８６−９５［１９９１］］。
【００５７】
「モノクローナル抗体」という語は本明細書において、実質的に一様な抗体の集団から得た抗体（本明細書にて定義したように）をいう、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は少量に存在するかもしれない天然に起こり得るであろう突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一の抗原部位に向けられる。さらにそのうえ、異なる抗原決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、該モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンが混入することなくハイブリドーマ培養によって合成することができるという点が有利である。
【００５８】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最少アミノ酸残基を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。大部分に関しては、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容体抗体）であり、その受容体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（供与体抗体）のＣＤＲからの残基で置換されている。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、受容体抗体にもインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても認められない残基を含む。これらの修飾はさらに抗体の性能を洗練し最適化するのに使用される。
【００５９】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、対象のｐＴＫに結合することができる限り、由来の種または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラス指定とは関係なく、定常ドメインとともに抗ｐＴＫ抗体の可変（超可変部位を含む）ドメインを（例えば、「ヒト化」抗体）（一方のみがｐＴＫに向けられる）、または重鎖とともに軽鎖を、または他の種からの鎖とともに１つの種からの鎖を、または異種タンパク質との融合を、スプライシングすることにより産生されたハイブリッド（キメラ）および組換え抗体を含む［カビリー（Cabilly）ら、米国特許第４,８１６,５６７号；およびメイジ（Mage）およびラモイ（Lamoyi）、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、７９−９７頁（マーセルデッカー（Marcel Dekker, Inc.）、ニューヨーク［１９８７］参照］。
【００６０】
「キメラ」および「ヒト化」抗体に関しては、例えば、米国特許第４,８１６,５６７号；ＷＯ９１／０９９６８号；ＥＰ第４５２,５０８号；およびＷＯ９１／１６９２７号参照。
【００６１】
従って、該修飾語句「モノクローナル」は抗体の実質的に一様な集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれかの特別な方法によって抗体が産生される必要があるように解釈すべきではない。
【００６２】
本発明の最も好ましい態様においては、該抗体はアゴニスト抗体である。「アゴニスト抗体」によって、特定のｐＴＫに結合でき、活性化することができる抗体が意味される。例えば、該アゴニストは該ｐＴＫの細胞外ドメインに結合し、それによってｐＴＫのダイマー化を引き起こし、細胞内の触媒キナーゼドメインのリン酸基転移および活性化となってよい。従って、これはイン・ビトロおよび／またはイン・ビボでの該受容体を発現する細胞の増殖および／または分化の刺激という結果となってよい。本明細書におけるアゴニスト抗体は、好ましくは該ｐＴＫの細胞外ドメイン内のエピトープに対するものであり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１,５８３として寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体と同じ生物学的な特徴を好ましくは有する。「生物学的な特徴」はモノクローナル抗体のイン・ビトロおよび／またはイン・ビボ活性を意味し、例えば、特定のｐＴＫのキナーゼドメインを活性化させる能力、該ｐＴＫを発現する細胞の細胞増殖および／または分化を刺激する能力、および該抗体の結合特徴などを意味する。従って、該抗体は、好ましくは本明細書に特に開示されている抗ＨｐＴＫ５モノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合する。最も好ましくは、該抗体はまた、本明細書に開示されている抗ＨｐＴＫ５モノクローナル抗体と実質的に同じかまたはそれ以上の抗原結合アフィニティーを有するであろう。モノクローナル抗体が特に開示されている抗ＨｐＴＫ５抗体（すなわち、ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ１１,５８３号を有する抗体）と同じ特異性を有するかどうかを決定するため、例えば、競合的なＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用することが可能である。
【００６３】
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは従来技術の使用により容易に単離し、シークエンシングすることができる（例えば、マウスの抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。本発明のハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい源として機能する。一度単離されると、該ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、該発現ベクターはついで、大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または、さもなくば免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞にトランスフェクションされ、該組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成する。
【００６４】
本明細書に開示されているアゴニスト抗体は対象ｐＴＫ受容体を活性化するためのイン・ビトロ診断アッセイに有用である。これは、細胞の増殖および／または分化における該受容体の役割を研究するために有用である。
【００６５】
該ｐＴＫアゴニスト抗体はさらに、外在性ｐＴＫアゴニスト抗体の生理学的に有効な量をこのような処置が必要なヒト患者に投与することからなる、細胞の増殖および／または分化を増強するための方法において治療的な有用性を有する。該ＳＡＬ−Ｓ１ ｐＴＫに対するアゴニスト抗体は出血性疾患および貧血において有用性が見いだされる。というのは、このｐＴＫは巨核球細胞において発現すると認められたからである。該ｂｐＴＫアゴニスト抗体は同様に脳組織におけるこれらの受容体の発現に基づき神経変性疾患（アルツハイマー病など）において脳細胞の分化および／または増殖を増強するために使用されてもよい。最後に、ＨｐＴＫ５アゴニスト抗体は、化学−または放射線療法または骨髄移植を受けている患者の原造血細胞の増殖を増強するために使用されてよい。
【００６６】
本明細書において定義する「外在性」の治療化合物とは、哺乳動物患者にとって外来性であるかまたは哺乳動物患者において認められる化合物に類似の物であるが、哺乳動物患者外で生成される治療化合物を意味する。
【００６７】
本発明の抗体はまた、検出可能に標識したモノクローナル抗体とｐＴＫを含むと考えられる源を接触させ、ついで該源に抗体が結合するかどうかを決定することによってｐＴＫを検出するのに適している。当該技術分野において、多くの異なる標識および標識の方法が知られている。例えば、適切な標識には酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学−および生物発光化合物、常磁性同位体が含まれる。該ｐＴＫは生物学的液体または組織などの生物学的サンプルに存在していてよい。分析的または診断的目的のために、本発明の抗体は、該モノクローナル抗体が特異的であるｐＴＫの部位の検出を可能にするのに十分な量にて投与される。検出可能に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ｐＴＫエピトープに結合したとき、バックグランドより高い検出可能なシグナルを与えるのに十分であるべきである。
【００６８】
本明細書に開示されているｐＴＫアゴニスト抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、巨丸剤として静脈内でまたは一定期間にわたる連続注入により、または筋肉内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下、経口、局所的または吸入経路によって投与されていてよいものを含む製薬学的に許容し得る剤型にて投与される。
【００６９】
このような剤型は、本質的に無毒性で非治療的である製薬学的に許容し得る担体を含む。このような担体の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝液物質、例えばリン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセライド混合物、水、塩、または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、およびポリエチレングリコールなどが挙げられる。抗体の局所的なまたはゲルベースの形態の担体は、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはメチルセルロースなどのポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびヒトツバエニシダ（wood wax）アルコールを含む。すべての投与において、通常のデポ剤型が適切に使用される。このような剤型には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入剤型、鼻腔スプレーおよび舌下錠が含まれる。該抗体は典型的に、約０.１ｍｇ/ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度でこのようなビヒクルにて調合されるであろう。
【００７０】
医薬組成物は当該分野において既知の方法によって、調製され剤型に調合されてよい；例えば、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）、マック（Mack）出版社、イーストン（Easton）、ペンシルバニア、１５版、１９７５参照。
【００７１】
治療上使用される該ｐＴＫアゴニスト抗体の有効量は、例えば、治療対象、投与経路および患者の状態に依存するであろう。従って、療法士は、投薬の力価をはかり、最適の治療効果を得るために、必要に応じて投与経路を修飾する必要がある。典型的な１日当たりの投与量は、上記の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇまでかそれ以上の範囲であってよい。典型的に、臨床医は所望の効果に達する投薬量まで該分子を投与するであろう。この療法の進行は、通常のアッセイにより容易にモニターできる。
【００７２】
疾患のタイプと重篤度によって、約０.００１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０.０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１０〜２０ｍｇ／ｋｇのアゴニスト抗体が、例えば、１度またはそれより多くの分割投与によるかまたは連続的な注入によるかによって、患者に投与する最初の候補投与量とされてよい。数日またはそれより長い期間の反復投与では、状況により、該治療は、疾患の兆候の所望の抑制が起こるまで、または該患者の状態が改善されるまで繰り返される。しかしながら、他の投与計画もまた有用である。
【００７３】
本発明を以下の実施例によって説明するが、これらはいかなる意味においても制限することを意図しているのではない。明細書に引用されている全ての参照文献の開示は、参照のため本明細書に包含される。
【００７４】
実施例１
ｐＴＫ遺伝子の同定および単離
これらの新規のｐＴＫ遺伝子の単離および同定を容易にするために、２セットのＤＮＡプローブを一般に使用した（表１を参照）。
【００７５】
第１のセットは２つの変性オリゴヌクレオチド配列、ｐＴＫ１（配列番号：１）およびｐＴＫ２（配列番号：２）からなっていた。これらの配列はポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして、標準的なＰＣＲ技術を使用してチロシンキナーゼＤＮＡセグメントを増幅するために使用した。
【００７６】
第２のセットは、プロテインチロシンキナーゼのｃ−ｋｉｔサブグループの触媒ドメインの非常に良く保存された領域から選択された２つのオリゴヌクレオチド配列、ｐＴＫ３（配列番号：３）およびｐＴＫＫＷ（配列番号：４）からなっていた。これらの配列はまた、ＤＮＡ増幅の第２ラウンドにおけるポリメラーゼチェーンリアクションプライマーとして使用した。この２段階増幅手法を使用することにより、これらのｐＴＫプライマーにハイブリダイズするＤＮＡ断片を同定し、単離し、ついで既知の実験技術を使用してシークエンシングした。
【００７７】
表１
増幅の第１ラウンド
プローブ名 配列
pTK1                           5'-CGGATCCACAGNGACCT-3'（配列番号：１）
pTK2                           5'-GGAATTCCAAAGGACCAGACGTC-3'（配列番号：２）
増幅の第２ラウンド
pTK3（kitファミリー特異的）    5'-CGGATCCATCCACAGAGATGT-3'（配列番号：３）
pTKKW（kitファミリー特異的）   5'-GGAATTCCTTCAGGAGCCATCCACTT-3'（配列番号：４）
【００７８】
実施例２
ＨｐＴＫ５の単離および特徴付け
Ａ．ＨｐＴＫ５のＤＮＡ増幅およびクローニング
低密度ヒト骨髄単核細胞（ディアコネス・ホスピタル・インスティチューショナル・リビュー・ボード（Deaconess Hospital Institutional Review Board）に認可されているプロトコールを使用し、自発的な書面のインフォームド・コンセントにて健常な有志から得た）を抗ＣＤ−３４抗体（ＡＭＡＣ、ウエストブルック（Westbrook）、メイン）および免疫磁気ビーズ（ダイナル（Dynal）、オスロ（Oslo）、ノルウェー）により分離した。ＦＩＴＣ−コンジュゲートした抗ＣＤ３４抗体（ＡＭＡＣ）を使用したフローサイトメトリー分析は単離した細胞の９５％までＣＤ３４陽性を確認した。肝ガン細胞株であるＨｅｐ３Ｂをアルファ培地（ギブコ（Gibco）、グランドアイランド（Grand Island）、ニューヨーク）に、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および１０％ウシ胎仔血清（ギブコ）を添加したものにて、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で培養した。ＣＤ３４＋骨髄単核細胞またはＨｅｐ３Ｂ細胞から抽出した総ＲＮＡをランダムプライマーおよびモロニー・マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）を用いて２０μlの反応液にて製造業者（ギブコ−ＢＲＬ）の条件に従って逆転写した。ＰＣＲは、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、１.５ｍＭのＭｇＣｌ、２０μｇ／ｍｌのゼラチン、０.２ｍＭのｄＮＴＰｓ、２.５ユニットのTaqポリメラーゼ（パーキン−エルマー／シータス（Perkin−Elmer／Cetus）およびｐＴＫ特異的変性プライマー各５０ｐｍｏｌ
［pTK1  5'TCGGATCCACA/CGNGAC/TC/TTGGC3'（配列番号：３７）
pTK1B  5'TCGGATCCAC/TC/AGNGAC/TC/TTNGCNGC3'（配列番号：３８）
pTK2  5'CTCGAATTCCA/GA/TAA/GC/GT/ACCAG/CACA/GTC3'（配列番号：３９）
pTK2B  5'CTCGAATTCCA/GA/TAT/CC/GT/ACCAT/AACA/GTC3'（配列番号：４０）］
［これらは、他者により以前に報告されて既知であるｐＴＫｓの中の一致領域由来のものである（ハンクス（Hanks）ら、Science、２４１：４２−５２［１９８８］；ウィルクス、Proc．Nat．Acad．Sci.、USA ８６：１６０３−１６０７［１９８９］；およびマシューズら、Celｌ ６５：１１４３−１１５２［１９９１］）］を含む１００μl反応液中にてＲＴ反応生成物に対して行った。該ＰＣＲサイクルは、９５℃で１.５分、３７℃で２分および６３℃で３分を３５回繰り返すものであった。該反応生成物を２％低溶アガロースゲル上で電気泳動的に分離し、Elutip−Ｄカラム（シュライヒャー（Schleicher）およびシュエル（Schuell））上で精製し、ＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【００７９】
組換え体をサンガーのジデオキシ法によりシークエンシングし、ＦＡＳＴＡ核酸配列分析プログラムによって評価した。ＨｐＴＫ５（２１４ｂｐ）と命名された１つのクローンをランダムプライミングにより放射性標識し、オリゴｄＴ−プライム・ラムダ ｇｔ１０ Ｈｅｐ３Ｂ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。ＤＮＡを１７の陽性ファージプラークから単離し、挿入物をpBluescriptのEcoＲＩサイトにサブクローニングした（ストラタジ−ン（Stratagene）、ラ・ジョラ（La Jolla）、カリフォルニア）。３９６９ｂｐのｃＤＮＡである最大の挿入物を８００〜２０００ｂｐの平均的なサイズに超音波で処理し、Ｍ１３のＳmaＩサイトにクローニングした。重複したクローンをカタリスト（Catalyst)８００モレキュラー・バイオロジー・ラブ・ステーション（Molecular Biology Lab Station）（ＡＢＩ）上でTaq ダイプライマーサイクル法（Dye Primer Cycle Method）（ＣＡＢＩ）を使用してシークエンシングした。シークエンシング反応物をついでＡＢＩ ３７３Ａ自動ＤＮＡシークエネーター上で分析した。
【００８０】
単一の全長３９６９ｂｐ ｃＤＮＡを単離し、シークエンシングした（図８Ａ−８Ｆ）。肝ガン膜貫通キナーゼ（hepatoma transmembrane kinase）（ＨＴＫ）またはＨｐＴＫ５と命名された全長のクローンは、１０８,２７０ダルトンの９８７アミノ酸タンパク質をコードすると推定されるヌクレオチド９０〜３０５０にわたるオープンリーディングフレームを含んだ。該推定開始コドンは７８塩基で開始するインフレームの停止コドンにより先行される。オープンリーディングフレームに先行して、多くの成長因子または成長因子受容体に特徴的であるようなＧＣの豊富な５'の非翻訳領域である（コザック（Kozak）、J．Cell．Biol.１１５：８８７−９０３［１９９１］）。
【００８１】
該推定されたタンパク質配列はＨｐＴＫ５を細胞外（ＥＣＤ）ドメインと細胞内（ＩＣＤ）ドメインに分割する膜貫通領域（アミノ酸５３８〜５６３）を含む。５３８アミノ酸のＥＣＤは、１５アミノ酸のシグナルペプチドおよび２０システイン残基を含むシステインに富むボックスを含む。さらに、アミノ酸３２１〜４２５および４３５〜５２６にわたる２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ繰り返しが存在する。２０８、３４０および４３１位置のアスパラギンはＮ−グリコシル化の可能性のあるサイトである。
【００８２】
推定細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、６１３〜８８１までのキナーゼコンセンサス領域を含む。このキナーゼ領域は６２２〜６２７の位置でサブドメインＩにおいて推定ＡＴＰ−結合コンセンサス（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ）を含む。６４７位置のＬys（サブドメインII）はリン酸基転移反応に重要であると考えられるチロシンキナーゼの中で不変のＬyｓに対応している。基質特異性を示すサイン領域（signature regions）は、ＨｐＴＫ５がセリン／トレオニンキナーゼよりはむしろチロシンキナーゼであることを示唆する。これらはサブドメインＶＩにおける７４０〜７４５位置での配列およびサブドメインＶＩＩＩにおける７８３〜７９０位置での配列を含む。６０１、６１９および７４１の位置のチロシン残基はチロシンキナーゼ活性の基質である可能性がある。
【００８３】
ＨｐＴＫ５の推定アミノ酸配列はＥＰＨによって元々定義されたサブファミリーの配列と極めてよく類似している。ＥＰＨサブファミリーの発現パターンは分化と発達における役割を示唆するものである。特に、神経要素の出現はあるＥＰＨ関連遺伝子の発現と一致する。ＥＰＨファミリー受容体であるＨｅｋ２およびＥｌｋは、ＨｐＴＫ５への最も密接に関係したｐＴＫｓである。それらはそれぞれＩＣＤ内で７９.３％および７６.５％の同一性を、それぞれＥＣＤ内で４５％および４２％の同一性を有している。
【００８４】
Ｂ．ＨｐＴＫ５の染色体マッピング
２５のヒト−ハムスター細胞株のパネルからの体細胞ハイブリッドＤＮＡ（ビオス（Bios）、ニューヘブン、コネチカット）をＰＣＲによる染色体局在に使用した。２セットのプライマーをＨｐＴＫ５の３'非翻訳領域から選択した。ＰＣＲは、２５０ｎｇのＤＮＡと各５０ｐｍｏｌの５'および３'プライマー、５０ｍＭのＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌのゼラチン、０.２ｍＭのｄＮＴＰｓおよび２.５ユニットのＴaq ポリメラーゼを最終容量１００μlにて行った。９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返した。各サンプルの一部（１５μl）を１.５％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブレーンにトランスファーし、オートラジオグラフィーの５時間前に３２Ｐで標識した全長のＨｐＴＫ５のｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした。陽性のものを記録し、各体細胞のハイブリッドＤＮＡに存在するヒト染色体物質のマトリックス概要と比較した。
【００８５】
３'−非翻訳領域は特徴的に、介在配列は殆ど含まず（含むとしても）、遺伝子ファミリーの成員の間で高い程度の多様性を有し、このタイプの分析において好ましいものとなっていた。プライマーの両方のセットは、ヒト第７染色体にだけ一致する結果を与えた。ヒト第７染色体はまた、ＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）受容体、ＨＧＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびインターロイキン−６の遺伝子をも含む。この染色体に関連する核型異常は、ヒト白血病、特に、放射線、アルキル化剤化学療法または前もって存在した脊髄形成異常条件の後に起こる攻撃性（aggressive)骨髄性白血病において一般的である（バエル（Baer）ら、Curr．Opin．Oncol. ４：２４−３２［１９９２］）。
【００８６】
Ｃ．ＨｐＴＫ５のノザンブロッティング
ポリＡ選択したＲＮＡを１.２％アガロース、２.２Ｍホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ナイロンフィルターにトランスファーした。調製したまたは市販のフィルターを４２℃で５０％のホルムアミドで３２−Ｐで標識したＨｐＴＫ５、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＡＰＤＨ）またはアクチンｃＤＮＡ挿入物にハイブリダイズさせ、ストリンジェント条件下で洗浄した（最終洗浄：６５℃にて０.１×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ）。ＳＳＣは０.１５ＭのＮａＣｌ／０.０１５Ｍのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７.６である。ヒト胎児または成人組織ＲＮＡのノザンブロットはクローンテク（Clontech）（パロ・アルト（Palo Alto）、カリフォルニア）から得られ、ポリＡ選択ＲＮＡを２μｇ／各レーンで含んでいた。
【００８７】
ヒト胎児組織のノザンブロット分析は、４ｋｂまでの単一の転写産物が心臓、肺、肝臓および腎臓に存在し、脳には若干弱いシグナルが検出されることを明らかにした。ヒト成人組織においては、脳では検出できるシグナルは全くなかった一方で、胎盤は特に強いシグナルを有し、腎臓、肝臓、肺および膵臓がそれに続いて強いシグナルを有した。骨格筋および心臓は弱いシグナル強度であった。
【００８８】
ヒト腫瘍細胞株におけるＨｐＴＫ５の発現もまた、上記と同様に行ったノザンブロット分析により分析した。肝臓、乳房（ＭＣＦ ７）、結腸（Colo ２０５）、肺（ＮＣＩ ６９）、メラニン細胞（ＨＭ−１）または頸（cervix）（ＨeＬa）由来の細胞株は適切なサイズの検出可能なシグナルを有した。メッセージは造血細胞が源である選択した細胞株において存在した。Ｋ５６２（多能の原始骨髄細胞）、ＴＨＰ−１（単球様細胞）、Ｕ９３７（脊髄単球性細胞株）、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝ガン細胞株）およびＣＭＫ（巨核球細胞由来）はすべてＨｐＴＫ５のメッセージに陽性であったが、リンパ球（Ｈ９、ジュルカット（Jurkat）、ＪＨ−１、ラジ（Raji）、ラモス（Ramos））または選択した他の骨髄細胞（ＫＧ−１またはＫＭＴ２）には、ノザン分析では全く転写産物を検出できなかった。
【００８９】
胎児と成人のＨｐＴＫ５転写産物の異なる発現は、ＨｐＴＫ５は、他のＥＰＨサブファミリー成員と、神経の発達において関連する事象においての役割を共有していることを示唆している。しかしながら、もっぱらニューロンにおいて発現しているＥＰＨサブファミリーのいくつかの成員（メゾンピエールら、上記）とは異なり、ＨｐＴＫ５は他の組織にも広範に発現している。特に、ＨｐＴＫ５はＣＤ３４＋造血原始細胞を含む造血性細胞に発現する。初期の造血細胞および骨髄細胞系の細胞株においてＨｐＴＫ５メッセージが存在し、リンパ球由来細胞株には存在しないことは、ＨｐＴＫ５は細胞株に限定した発現をするかもしれないことを示唆する。
【００９０】
実施例３
ＨｐＴＫ５に対するポリクローナル抗体の産生
ＨｐＴＫ５細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合遺伝子を構築し、以前に記載されたようにして融合タンパク質を生成した（ベネットら、J．Biol．Chem. ２６６：２３０６０−２３０６７［１９９１］）。ポリクローナル抗体はニュージーランド白ウサギにて該融合タンパク質に対して製造された；１００μｌのＰＢＳ中の４μｇをフロイントアジュバント（第１次注射には完全アジュバントであり、全ブーストには不完全アジュバントである）と共に懸濁した。第１次免疫および第１次ブーストでは、該タンパク質を直接膝窩リンパ節に注射した（シゲル（Sigel）ら、Methods Enzymol. ９３：３−１２［１９８３］）。続くブーストでは該タンパク質を皮下および筋肉内部位で注射した。１.３μｇタンパク質／ｋｇ体重を３週間ごとに注射し、各ブーストの後１および２週間で採血した。免疫されたウサギ血清のＨｐＴＫ５特異性を、免疫前血清または抗ＨｐＴＫ５−ＩｇＧ Ｆｃ血清の１：２００希釈を使用した、ＨｐＴＫ５全長またはベクター単独でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のフローサイトメトリー分析によって評価した。有意なピークのシフトが、免疫前血清またはベクター単独でトランスフェクションしたコントロールに比較していくつかのＨｐＴＫ５発現クローンにおいて観察された。
【００９１】
実施例４
ＨｐＴＫ５に対するポリクローナル抗体の有用性およびアゴニスト活性
Ａ．ＦＬＡＧ−ＨｐＴＫ５融合構築物
４アミノ酸抗体認識部位「ＦＬＡＧ」（ＩＢＩ、ニューヘブン、コネチカット）、５'−ＥcoＲＶ制限部位および３'−ＮcoＩ制限部位を含む配列ＭＤＹＫＤＤＤＤＫＫＬＡＭ（配列番号：４１）を有する１２アミノ酸ペプチドをコードする重複オリゴヌクレオチド：5'-CCGGATATCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGCTTGCCATGGAGCTC（配列番号：４２）をEcoＲＶで消化したBluescript（ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）ベクター中のＨｐＴＫ５のNcoＩサイト（塩基８８）にライゲーションした。
【００９２】
Ｂ．イン・ビトロ転写および翻訳
転写は、線形化したＨｐＴＫ５またはＦＬＡＧ−ＨｐＴＫ５を含んだプラスミドの２ｐｍｏｌを３７℃で１時間、１０ｍＭのジチオスレイトール、２.５μｇウシ血清アルブミン、各０.２５ｍＭのｄＮＴＰ、０.５Ｍのｍ７ＧＲＮＡ cap（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）、ビバリー（Beverly）、マサチューセッツ）、２.５ユニットのＲＮアーゼインヒビター（ＲＮasin）（プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン）、３ユニットのＴ３ＲＮＡポリメラーゼ（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー）を含む５０μlの容量中で行った。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行う前に、３７℃で１５分間、１μgのＤＮＡアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ、ビバリー、マサチューセッツ）を添加した。翻訳は、メーカーの仕様書に従い、３５Ｓ−メチオニン（３５０μＣｉ）標識を使用するかまたは使用しないで、プロメガ・ウサギ網状赤血球溶解産物キットを使用して行った。沸騰および１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う前に、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含むサンプルバッファーを加えた。
【００９３】
Ｃ．ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＨｐＴＫ５発現
３２ｂｐのリンカー配列、pBluescript（ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）ポリリンカーの３７ｂｐおよび全３９６９ｂｐのＨｐＴＫ５ ｃＤＮＡを含む４０３８ｂｐのＣｌａＩ−ＸｂａＩ ｃＤＮＡ断片をラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモータの制御下にて発現ベクターｐＲＩＳ（ジェネンテク（Genentech）社）にサブクローニングした。１０％ＦＣＳを補った高濃度グルコースダルベッコ（Dulbecco's）改変イーグル（Ｅagle's）培地（ＤＭＥＭ）にて維持したＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＲＩＳ−ＨｐＴＫ５およびｐＮｅｏ（ＳＶ４０に基づいたネオマイシン耐性マーカー含有ベクター）に、リン酸カルシウム法によってトランスフェクションした（ゴーマン（Gorman）ら、DNA Prot．Engineer．Tech. ２：３−１０［１９９０］に記載）。ネオマイシン耐性コロニーをジェネティシン（Geneticin）（ギブコ／ＢＲＬ）４００μg／ｍｌにてトランスフェクションした４８時間後に選択した。１４日後、個々の耐性コロニーを単離し、拡張させ、ウサギポリクローナル抗血清を使用してＨｐＴＫ５の発現をフローサイトメトリーにより分析した。
【００９４】
Ｄ．免疫沈降
細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、コントロールＮＩＨ３Ｔ３またはＨｐＴＫ５をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３）またはイン・ビトロ翻訳タンパク質（ＨｐＴＫ５またはＦＬＡＧ−ＨｐＴＫ５）を血清（免疫前または抗ＨｐＴＫ５−ＩｇＧ Ｆｃ）かまたはモノクローナル抗体（ＦＬＡＧ特異的、Ｍ２またはアイソタイプコントロール）（ＩＢＩ、ロチェスター（Rochester）、ニューヨーク）のいずれかで免疫沈降に使用した。サブコンフルエント細胞を２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで１８時間標識し、３０分間氷上で溶菌バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０.０２５アジ化ナトリウム、１％のＮＰ−４０、０.１％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、０.５％のデオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１０μg／ｍｌのアプロチニン（aprotinin）、１０μg／ｍｌのロイペプチンおよび５０μＭバナジン酸ナトリウム）内で溶菌した。該細胞溶解産物を４℃で１０分間遠心した（１２,０００×ｇ）。細胞溶解産物の上清またはイン・ビトロ翻訳混合物を０.０５容量の正常ウサギ血清で前もって清澄化し、ついで０.０５容量のスタフィロコッカス・アウレウスのプロテイン−ＡセファロースＣＬ４Ｂに吸着させた。遠心後、免疫前または免疫血清（１：１００希釈）、またはモノクローナル抗体を添加し、４℃で一晩中振盪し、ついで１００μlのプロテイン−ＡセファロースＣＬ４Ｂを添加し、該溶液をさらに２時間４℃にて振盪した。免疫沈澱物を洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディングバッファー（１０％のグリセロール、５％の２−ＭＥ、２.３％のＳＤＳおよび６２.５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６.８）に懸濁し、９５℃で５分間加熱し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００９５】
Ｅ．細胞分画
Ｈｅｐ３Ｂ細胞細胞分画を、ＨｐＴＫ５のアミノ酸配列によって予測される膜局在を確認するために行った。Ｈｅｐ３Ｂ細胞（１×１０７）を１０％の透析されたＦＣＳを含むαＭＥＭ培地中、２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで一晩標識した。該細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの冷バッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、０.２５Ｍのショ糖、０.０１％のロイペプチン、４ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの２−ＭＥ）にこすり入れ、４０秒間の超音波処理によって破壊した。全ホモジネートを１２,０００×ｇで１５分間遠心し、核ペレットを単離し、デカントした上清を４℃で４０分間１４０,０００×ｇで遠心し、膜をペレット化した。得られた上清は細胞質ゾル（Ｃ）分画として機能した。核（Ｎ）および膜（Ｍ）分画を洗浄し、０.５％のＮＰ−４０を含むバッファーに溶かし、ついで免疫沈降を行った。該Ｃ、ＮまたはＭ分画を抗ＨｐＴＫ５または免疫前（コントロール）血清で免疫沈降し、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、オートラジオグラフィーにかけた。免疫沈降物質は細胞質ゾルにおいてわずかな程度に明らかであったが、ＨｐＴＫ５は、膜分画で優先的に分離した。
【００９６】
Ｆ．プロテインキナーゼアッセイ
免疫沈澱物をキナーゼバッファー（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｎＣｌ２）で１回洗浄し、標識していないＡＴＰかまたは１０μＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ）のいずれかを含む４０μlのキナーゼバッファーに再懸濁した。３０℃で１０分間インキュベートした後、４０μlの２×サンプルバッファーを加えてサンプルを３分間沸騰させることにより反応を停止し、８.０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動した。乾燥したゲルを３５Ｓ標識したタンパク質オートラジオグラフィーを遮るために４枚のアルミニウムホイルで覆い、該ゲルを５時間〜一晩フィルムの下に置いた。
【００９７】
Ｇ．ウエスタンブロッティングおよびホスホチロシンアッセイ
タンパク質を、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％のメタノールを含むバッファーにて１００ｍＡで２時間かけて、０．２μｍのニトロセルロース（バイオラド（Bio−Rad））または０.４５μｍのポリビニリデンジフルオライド（ミリポア（Millipore））に電気泳動的にトランスファーした。フィルターをＴＢＳ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、ＴＢＳＴ（ＴＢＳと０.０５％のTween−２０）と５％のＢＳＡにて一晩インキュベートすることによって遮断した。フィルターをＴＢＳＴで５分間ずつ４回洗浄し、ＵＢＩからの４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体（ＴＢＳＴにて１：１０００希釈）で２時間インキュベートした。フィルターをＴＢＳＴにて各５分間４回洗浄し、ＴＢＳＴにて１：７５００希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウス第２抗体（プロメガ）で１時間インキュベートした。４回洗浄した後、該ブロットをＡＰバッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）とＢＣＩＰ、ＮＢＴ基質内で３０〜６０分間発色した。
【００９８】
Ｈ．抗体誘導リン酸化アッセイ
ＨｐＴＫ５−ＩｇＧ Ｆｃに対するウサギ抗血清の、ＨｐＴＫ５をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＨｐＴＫ５のリン酸化を誘導する能力を試験した。細胞を６−ウエルプレートに５×１０５細胞／ウエルの密度でプレーティングし、２４時間後に、１時間血清を与えない状態にし（serum starved）、ついで、免疫前または免疫血清を３０分間１：５０希釈して添加した。ついで細胞をＰＢＳにて洗浄し、２×サンプルバッファーかまたは上記のＮＰ−４０溶菌バッファーのいずれかで溶菌した。ついで、粗製溶解産物または免疫沈降した細胞の溶解産物を４〜１２％の濃度勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離し、上記の抗ホスホチロシン免疫ブロットによって分析した。ＨｐＴＫ５発現細胞を抗血清にさらし、免疫沈降を伴うまたは伴わないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。該電気泳動ゲルを抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロットした。ＨｐＴＫ５のチロシンリン酸化の増強が観察されたのは、抗体結合のアゴニスト様効果を示すポリクローナル抗血清にさらした後であった。ＨｐＴＫ５とそのＥＣＤに直接向けられた抗体との相互作用はリン酸化を誘導する。これは、ＨｐＴＫ５がキナーゼ活性を誘発するリガンドの受容体として機能するかもしれないということをさらに支持する。ＨｐＴＫ５のシグナル伝達経路の詳細は、代理リガンドとして抗血清を使用することにより、さらに研究されるかもしれない。
【００９９】
Ｉ．結論
ＨｐＴＫ５ ＥＣＤ−ＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を発現させ、精製し、Ｈｅｐ３Ｂ細胞から１２０ｋＤのタンパク質を免疫沈降したウサギ抗血清を生成するために使用した。該抗血清の特異性は、イン・ビトロ翻訳したＨｐＴＫ５ ＲＮＡおよびＨｐＴＫ５をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の免疫沈降により確認した。ＨｐＴＫ５の機能的な能力を決定するため、イン・ビトロ翻訳したＨｐＴＫ５を免疫沈降し、キナーゼ状態にさらし、ホスホチロシン特異的モノクローナル抗体を使用して免疫ブロットした。得られたデータはＨｐＴＫ５がチロシン上でリン酸化されるということを示した。しかしながら、３２Ｐ標識した免疫沈降で首尾一貫して現れる他のバンドの存在はＨｐＴＫ５タンパク質が部分的にしか精製されておらず、ゆえにＨｐＴＫ５が酵素的に活性であると結論付けることができないことを示唆した。この問題を解決するため、８アミノ酸エピトープ（ＦＬＡＧ）をＨｐＴＫ５のＮ−末端に付加した融合構築物を製造した。該ＦＬＡＧ−ＨｐＴＫ５融合をイン・ビトロ翻訳し、ＦＬＡＧ特異的モノクローナル抗体で免疫沈降し、その結果、適当なサイズの単一タンパク質（〜１２０ｋＤ）となった。３２Ｐ−ＡＴＰの存在条件下においてキナーゼ条件を課したところ、該ＨｐＴＫ５−ＦＬＡＧ融合タンパク質はチロシンで標識され、チロシン自己リン酸化、およびそれによりＨｐＴＫ５のキナーゼ機能が確認された。
【０１００】
実施例５
ＨｐＴＫ５に対するモノクローナル抗体の産生
抗ＨｐＴＫ５モノクローナル抗体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩイムノケムリサーチ（ImmunoChem Research）、ハミルトン（Hamilton）、モンタナ）中でＨｐＴＫ５細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質（上記に開示した技術を使用して産生）を腹腔内注射により高度免疫し、マウスミエローマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８.６５３と脾臓細胞を融合することにより産生した（カーニー（Kearney）ら、J．Immunol. １２３：１５４８−１５５０［１９７９］）。該抗体をプロテインＡ−セファロ−ス（レプリゲン（Repligen）社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）および確立されたアフィニティークロマトグラフィー法（ゴディング（Goding，J．W.）、J．Immunol．Methods ２０：２４１−２５３［１９７８］）を使用して腹水液体から精製した。
【０１０１】
モノクローナル抗体を、ＨｐＴＫ５抗原に結合する能力に関してスクリーニングした。融合から１５日後に開始し、融合プレートから培養上清を回収し、ＨｐＴＫ５−ＩｇＧを特異的に「捕捉する」能力をアッセイした。このＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヤギ抗マウスＩｇＧを９６ウエルマイクロタイタープレート上にコーティングした。該培養上清（１００μl）をウエルに添加し、存在するマウスＩｇＧには該ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が結合した。プレートを洗浄し、ＨｐＴＫ５−ＩｇＧかまたはＣＤ４−ＩｇＧ（６ｎＭで１００μl）のいずれかを添加した。該「捕捉した」イムノアドヒーシン（immunoadhesin）を、ヤギ抗−ｈｕ（Ｆｃ特異的）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートおよびオルトフェニレンジアミン基質を使用して検出した。基質触媒作用の定量化は４９０ｎｍの光学密度で決定した。
【０１０２】
アゴニスト抗体をついで以下の実施例６に開示した技術を使用してスクリーニングした。２つのアゴニストモノクローナル抗体を同定し、そのうちの１つはＡＴＣＣに寄託した。
【０１０３】
実施例６
ＨｐＴＫ５に対するモノクローナル抗体のアゴニスト活性
実施例５に開示した技術を使用して産生したモノクローナル抗体を、ＨｐＴＫ５をトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＨｐＴＫ５のリン酸化を誘導する能力を試験した。細胞を６ウエルのプレートにて５×１０５細胞／ウエルの密度でプレーティングし、２４時間後、血清を与えない状態にし、ついで１時間後に免疫前血清または抗ＨｐＴＫ５モノクローナル抗体（非希釈のならしハイブリドーマ培地を使用）を３０分間添加した。ついで細胞をＰＢＳにて洗浄し、上記の２×サンプルバッファーかまたはＮＰ−４０溶菌バッファーのいずれかにて溶菌した。ついで粗製の溶解産物かまたは免疫沈降した細胞溶解産物のいずれかを上記の４〜１２％の濃度勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離し、抗ホスホチロシン免疫ブロットにより分析した。ＨｐＴＫ５発現細胞をモノクローナル抗体にさらし、免疫沈降を伴うまたは伴わないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動的にトランスファーしたゲルを抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロットした。増強したＨｐＴＫ５のチロシンリン酸化が抗体結合のアゴニスト様効果を示すモノクローナル抗体にさらした後に観察された。従って、ＨｐＴＫ５とそのＥＣＤに直接向けられたモノクローナル抗体との相互作用はそのキナーゼドメインのリン酸化を誘導することができる。
【０１０４】
実施例７
ＳＡＬ−Ｓ１に対するポリクローナル抗体の産生
ＳＡＬ−Ｓ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合遺伝子を構築し、融合タンパク質を以前に記載されたように産生した（ベネットら、J．Biol．Chem. ２６６：２３０６０−２３０６７［１９９１］）。端的には、ＰＣＲプライマーｏｔｋ １.４１.１（配列番号：４３）およびｏｔｋ １.４１.２（配列番号：４４）を、ＳａｌＩ／ＢｓｔＥII で消化すると１５５ｂｐのＳａｌＩ／ＢｓｔＥII 断片を生成するＤＮＡ断片を作り出すための鋳型としてＳＡＬ−Ｓ１核酸を含むプラスミドｐＲＫ５.ｔｋ１−１.１（配列番号：４５）を使用するＰＣＲ技術において使用した。この１５５ｂｐの断片をｐＲＫ５.ｔｋ−１.１から単離した６８３９ｂｐのＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片およびｐＢＳＳＫ−ＣＨ２−ＣＨ３から単離した７１９ｂｐのＢｓｔＥII／ＨｉｎｄIII 断片と混合した（ベネットら、上記）。これらの断片を一緒にライゲーションしてｐＲＫ５.ｔｋ１.ｉｇ１.１（大きさは７７１３ｂｐ）プラスミドを生成し、このものは２９３細胞にトランスフェクションした場合にＳＡＬ−Ｓ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−ヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質を産生するのに使用した。上記ベネットらに記載されたようにして融合タンパク質を調製し、精製した。該融合タンパク質に対するポリクローナル抗体を雌ニュージーランド白ウサギにおいて製造した。端的には、０.６２５ｍｌのＰＢＳ中の１２.５μgの該融合タンパク質を０.６２５ｍｌのフロイントアジュバント（１次注射に関しては完全アジュバントであり、すべてのブーストにおいては不完全アジュバントである）で懸濁した。該１次注射および全てのブーストは、２カ所で筋肉内注射し、複数の場所で皮下注射であった。ブーストは３週間の間隔で行い、各ブーストの１および２週間後に採血した。免疫されたウサギ血清のＳＡＬ−Ｓ１特異性を、１：２００に希釈した免疫前血清または抗ＳＡＬ−Ｓ１−ＩｇＧ Ｆｃ血清を使用した全長ＳＡＬ−Ｓ１またはベクターのみ（下記参照）でトランスフェクションした２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５９３）およびＣＯＳ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）細胞のフローサイトメトリーによる分析で評価した。有意なピークのシフトが、免疫前血清またはベクターのみでトランスフェクションしたコントロールに比較して、いくつかのＳＡＬ−Ｓ１発現クローンにおいて観察された。
【０１０５】
実施例８
ＳＡＬ−Ｓ１ポリクローナル抗体の有用性およびアゴニスト活性
Ａ．免疫沈降
コントロール２９３およびＣＯＳ７細胞ならびにＳＡＬ−Ｓ１トランスフェクションした２９３およびＣＯＳ７細胞を免疫前血清かまたは抗−ＳＡＬ−Ｓ１−ＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体のいずれかとの免疫沈降に使用した。ＣＯＳ７および２９３細胞をゴーマン（Gorman，C.）により、以前に記載されたリン酸カルシウム法を使用してトランスフェクションした（DNA Cloning、グローバー（Glover）編、ＩＲＬプレス、オックスフォード、２巻：１４３−１９０（１９８５））。一過性の発現に関しては、２９３細胞をギアリング（Gearing）らにより記載されたようにして、トランスフェクションした（ＥＭＢＯ ８：３６６７−３６７６（１９８９））。サブコンフルエント細胞を２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンで１８時間標識し、氷上で１０分間、溶菌バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１ｍＭのＥＧＴＡ、０.０２５のアジ化ナトリウム、１％のTriton−X １００、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル［ＰＭＳＦ］、１０μg／ｍｌのアプロチニン、１０μg／ｍｌのロイペプチンおよび５０μＭのバナジン酸ナトリウム）において溶菌した。細胞溶解産物を４℃で１０分間遠心した（１２,０００×ｇ）。遠心後、免疫前またはポリクローナル抗体を該上清に添加し、４℃で４時間振盪し、ついで１００μlのプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂを添加し、該溶液をさらに２時間４℃にて振盪した。免疫沈降物を洗浄し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディングバッファー（１０％のグリセロール、５％の２−ＭＥ、２.３％のＳＤＳおよび６２.５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６.８）に懸濁し、９５℃に５分間加熱し、７.５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１０６】
Ｂ．ウエスタンブロットおよびホスホチロシンアッセイ
タンパク質を０.２μｍニトロセルロース（バイオラド）または０.４５μｍポリビニリデンジフルオライド（ミリポア）膜に、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１９２ｍＭのグリシンおよび２０％のメタノールにて１００ｍＡで２時間電気泳動的にトランスファーした。フィルターをＴＢＳ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）にて洗浄し、ＴＢＳＴ（ＴＢＳに０.０５％のTween−２０を加えたもの）に５％のＢＳＡを加えたもので一晩インキュベートすることにより遮断した。フィルターをＴＢＳＴにて各５分間４回洗浄し、ついでＵＢＩからの４Ｇ１０抗ホスホチロシン抗体（ＴＢＳＴにて１：１０００に希釈したもの）で２時間インキュベートした。フィルターをＴＢＳＴにおいて各５分間４回洗浄し、ついでＴＢＳＴで１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼ標識した抗マウス第２抗体（プロメガ）とともに１時間インキュベートした。４回の洗浄後、ブロットをＡＰバッファー（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）にＢＣＩＰ、ＮＢＴ基質を加えたもので３０〜６０分間発色した。
【０１０７】
Ｃ．抗体誘導リン酸化アッセイ
ＳＡＬ−Ｓ１−ＩｇＧ  Ｆｃに対するウサギ抗血清の、ＳＡＬ−Ｓ１トランスフェクションした２９３細胞においてＳＡＬ−Ｓ１リン酸化を誘導する能力を試験した。細胞を６ウエルプレートに５×１０５細胞／ウエルの密度でプレーティングし、２４時間後、血清を与えない状態にし、ついで１２時間後に免疫前または免疫血清を１：５希釈で３０分間添加した。ついで細胞をＰＢＳにて洗浄し、上記のようにサンプルバッファーまたはTriton−X溶菌バッファーで溶菌した。粗製溶解産物かまたは免疫沈降した細胞溶解産物のいずれかをついで８％または４〜１２％濃度勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分離し、上記のように抗ホスホチロシン免疫ブロットによって分析した。ＳＡＬ−Ｓ１発現細胞を抗血清にさらし、免疫沈降を伴うまたは伴わないＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動的にトランスファーしたゲルを抗ホスホチロシン抗体で免疫ブロットした。ＳＡＬ−Ｓ１の増強されたチロシンリン酸化がポリクローナル抗血清にさらした後に観察され、抗体結合のアゴニスト様効果を示した。ＳＡＬ−Ｓ１とそのＥＣＤに直接向けられた抗体との相互作用はリン酸化を誘導する。
【０１０８】
実施例９
ＳＡＬ−Ｓ１に対するモノクローナル抗体の産生
抗ＳＡＬ−Ｓ１モノクローナル抗体を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを足趾でＲＩＢＩアジュバント（ＲＩＢＩイムノケムリサーチ、ハミルトン、モンタナ）中のＳＡＬ−Ｓ１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質で高度免疫し、リンパ節からのリンパ球とマウスミエローマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ１とを融合することにより産生した。
【０１０９】
融合して１０日後に開始し、培養した上清を融合プレートから回収し、ＳＡＬ−Ｓ１に結合する能力をアッセイした。このＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＳＡＬ−Ｓ１ ＩｇＧ１を９６マイクロタイタープレートにコーティングした。該培養上清（１００μl）をウエルに添加し、存在する該マウス抗体はＳＡＬ−Ｓ１ ＩｇＧ１に結合した。該プレートを洗浄し、マウスＩｇＧをヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的で、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対して交差応答はない）西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートおよびオルトフェニレンジアミン基質を使用して検出した。基質触媒作用の定量化は４９０ｎｍの光学密度により決定した。
【０１１０】
ＥＬＩＳＡから陽性である培養上清をついで、ＳＡＬ−Ｓ１受容体でトランスフェクションした２９３に特異的に結合する能力を試験し、フローサイトメトリーで分析した。ついで、アゴニスト抗体を以下の実施例１０に開示する技術を使用してスクリーニングした。６つのアゴニストモノクローナル抗体を同定した。
【０１１１】
実施例１０
ＳＡＬ−Ｓ１に対するモノクローナル抗体のアゴニスト活性
該モノクローナル抗体のＳＡＬ−Ｓ１トランスフェクションした２９３細胞におけるＳＡＬ−Ｓ１リン酸化を誘導する能力を試験した。細胞をアッセイバッファーによって組織培養皿から回収し、同バッファーで２回洗浄した。１×１０５細胞を９６Ｕ底プレートに添加し、これを遠心し、アッセイバッファーを除去した。培養上清１５０μlを各ウエルに添加し、ついで３７℃で３０分間インキュベートし、該プレートを遠心し、培養上清を除去した。固定液１００μlを添加し、細胞を−２０℃にて３０分間固定し、細胞を２回バッファーで洗浄し、ＦＩＴＣを有する抗ホスホチロシンコンジュゲートで４℃で６０分間染色した。細胞をフローサイトメトリーで分析した（ファクスキャン・ベクトン・ディッキンソン（FACScan Becton Dickinson）、ミルプリタス（milplitas)、カリフォルニア）。該６つの抗−ＳＡＬ−Ｓ１モノクローナル抗体はＳＡＬ−Ｓ１トランスフェクションした２９３細胞においてＳＡＬ−Ｓ１リン酸化を誘導することができた。
【０１１２】
材料の寄託
以下の培養物はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン（Parklawn）ドライブ、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託された：
ハイブリドーマ              ＡＴＣＣ番号                寄託日
抗ＨｐＴＫ５              ＨＢ １１,５８３       １９９４年３月１５日
【０１１３】
この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の条項およびその規則下になされた。このことは、寄託の日から３０年間生存能力のある培養物の維持を保証する。該生物は、ブダペスト条約の約定下に、ならびにジェネンテクとＡＴＣＣとの間の契約（当該米国特許の発行または米国または外国特許出願の公開のいずれか早いときから該培養の継代物の永久的かつ非制限的な入手可能性を保証し、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに従う特許商標長官規約（８８６ ＯＧ ６３８を特に参照し、３７ ＣＦＲ§１.１４を含む）に従って特許商標庁長官によって決定された権利を有する者に該継代物の入手可能性を保証する）に基づいてＡＴＣＣより入手可能である。
【０１１４】
本願の譲り受け人は、寄託されている培養物が適当な条件下で培養されている際に死亡または紛失または破壊した場合には、通知によって同じ培養の生存標本で速やかに取り替えることに同意した。寄託した株の入手可能性は、その特許法に従って政府の権限下に付与された権利を侵害するような該特許の実施を許諾するものとして解釈されるべきではない。
【０１１５】
上記明細書は本発明を当業者が実施することができるのに十分であると考えられる。本発明は、寄託された培養物によってその範囲を制限されるものではない。というのは、寄託された態様は、本発明の１つの態様の１つの例として意図されているのであり、機能的に均等な培養物はいずれも本発明の範囲内であるからである。本明細書の材料の寄託は、本明細書に含まれる記載が本発明の最良の態様を含む本発明のいかなる態様の実施を可能にするのに不適切であることを承認するものでもないし、該寄託が提示する特定の例示に請求の範囲を限定するものとして解釈されるものでもない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な変更が上記記載から当業者には明らかであろうし、添付の請求項の範囲の範囲に包含されるであろう。
【０１１６】
均等物
当業者は日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載された具体的な態様に均等な多くのものを認識し、または確認することができるであろう。このような均等物も以下の請求項に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：５）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【０１１８】
【図２】ＳＡＬ−Ｄ４のヌクレオチド配列（配列番号：７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【０１１９】
【図３Ａ】ＬｐＴＫ ２のヌクレオチド配列（配列番号：９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【０１２０】
【図３Ｂ】ＬｐＴＫ ３のヌクレオチド配列（配列番号：１１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【０１２１】
【図３Ｃ】ＬｐＴＫ ４のヌクレオチド配列（配列番号：１３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【０１２２】
【図３Ｄ】ＬｐＴＫ １３のヌクレオチド配列（配列番号：１５）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【０１２３】
【図４Ａ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２４】
【図４Ｂ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２５】
【図４Ｃ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２６】
【図４Ｄ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２７】
【図４Ｅ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２８】
【図４Ｆ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１２９】
【図４Ｇ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１３０】
【図４Ｈ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１３１】
【図４Ｉ】ＳＡＬ−Ｓ１のヌクレオチド配列（配列番号：１７）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【０１３２】
【図５Ａ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３３】
【図５Ｂ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３４】
【図５Ｃ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３５】
【図５Ｄ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３６】
【図５Ｅ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３７】
【図５Ｆ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３８】
【図５Ｇ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１３９】
【図５Ｈ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１４０】
【図５Ｉ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１４１】
【図５Ｊ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１４２】
【図５Ｋ】ＬｐＴＫ ２の全長のヌクレオチド配列（配列番号：１９）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【０１４３】
【図６】ＬｐＴＫ ４の部分的ヌクレオチド配列（配列番号：２１）を示す。
【０１４４】
【図７Ａ】ＬｐＴＫ ２５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２２）を示す。
【０１４５】
【図７Ｂ】ＬｐＴＫ ２５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２２）を示す。
【０１４６】
【図７Ｃ】ＬｐＴＫ ２５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２２）を示す。
【０１４７】
【図８Ａ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１４８】
【図８Ｂ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１４９】
【図８Ｃ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５０】
【図８Ｄ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５１】
【図８Ｅ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５２】
【図８Ｆ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５３】
【図８Ｇ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５４】
【図８Ｈ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５５】
【図８Ｉ】ＨｐＴＫ ５の全長のヌクレオチド配列（配列番号：２３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【０１５６】
【図９】ｂｐＴＫ １のアミノ酸配列（配列番号：２５）を示す。
【０１５７】
【図１０】ｂｐＴＫ ２のアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【０１５８】
【図１１】ｂｐＴＫ ３のアミノ酸配列（配列番号：２７）を示す。
【０１５９】
【図１２】ｂｐＴＫ ４のアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【０１６０】
【図１３】ｂｐＴＫ ５のアミノ酸配列（配列番号：２９）を示す。
【０１６１】
【図１４】ｂｐＴＫ ７のアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【０１６２】
【図１５Ａ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６３】
【図１５Ｂ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６４】
【図１５Ｃ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６５】
【図１５Ｄ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６６】
【図１５Ｅ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６７】
【図１５Ｆ】ＳＡＬ−Ｓ１の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３１）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【０１６８】
【図１６Ａ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１６９】
【図１６Ｂ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７０】
【図１６Ｃ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７１】
【図１６Ｄ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７２】
【図１６Ｅ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７３】
【図１６Ｆ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７４】
【図１６Ｇ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【０１７５】
【図１６Ｈ】ｂｐＴＫ７の全長のヌクレオチド配列（配列番号：３３）およびその推定アミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【図１】
2005218452.tif 000002
【図２】
2005218452.tif 000003
【図３Ａ】
2005218452.tif 000004
【図３Ｂ】
2005218452.tif 000005
【図３Ｃ】
2005218452.tif 000006
【図３Ｄ】
2005218452.tif 000007
【図４Ａ】
2005218452.tif 000008
【図４Ｂ】
2005218452.tif 000009
【図４Ｃ】
2005218452.tif 000010
【図４Ｄ】
2005218452.tif 000011
【図４Ｅ】
2005218452.tif 000012
【図４Ｆ】
2005218452.tif 000013
【図４Ｇ】
2005218452.tif 000014
【図４Ｈ】
2005218452.tif 000015
【図４Ｉ】
2005218452.tif 000016
【図５Ａ】
2005218452.tif 000017
【図５Ｂ】
2005218452.tif 000018
【図５Ｃ】
2005218452.tif 000019
【図５Ｄ】
2005218452.tif 000020
【図５Ｅ】
2005218452.tif 000021
【図５Ｆ】
2005218452.tif 000022
【図５Ｇ】
2005218452.tif 000023
【図５Ｈ】
2005218452.tif 000024
【図５Ｉ】
2005218452.tif 000025
【図５Ｊ】
2005218452.tif 000026
【図５Ｋ】
2005218452.tif 000027
【図６】
2005218452.tif 000028
【図７Ａ】
2005218452.tif 000029
【図７Ｂ】
2005218452.tif 000030
【図７Ｃ】
2005218452.tif 000031
【図８Ａ】
2005218452.tif 000032
【図８Ｂ】
2005218452.tif 000033
【図８Ｃ】
2005218452.tif 000034
【図８Ｄ】
2005218452.tif 000035
【図８Ｅ】
2005218452.tif 000036
【図８Ｆ】
2005218452.tif 000037
【図８Ｇ】
2005218452.tif 000038
【図８Ｈ】
2005218452.tif 000039
【図８Ｉ】
2005218452.tif 000040
【図９】
2005218452.tif 000041
【図１０】
2005218452.tif 000042
【図１１】
2005218452.tif 000043
【図１２】
2005218452.tif 000044
【図１３】
2005218452.tif 000045
【図１４】
2005218452.tif 000046
【図１５Ａ】
2005218452.tif 000047
【図１５Ｂ】
2005218452.tif 000048
【図１５Ｃ】
2005218452.tif 000049
【図１５Ｄ】
2005218452.tif 000050
【図１５Ｅ】
2005218452.tif 000051
【図１５Ｆ】
2005218452.tif 000052
【図１６Ａ】
2005218452.tif 000053
【図１６Ｂ】
2005218452.tif 000054
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2005218452.tif 000056
【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
2005218452.tif 000058
【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
2005218452.tif 000060
【配列表】
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