(57)【要約】  【課題】  蛍光物質等の標識をすることなく、特定のＤＮＡを迅速、簡便に検出することが可能で、かつ、小型化された高感度のバイオセンサーを提供する。  【解決手段】  微細加工技術によって１または複数の微小ウェルを電極表面上に配列させ、これら１または複数の微小ウェルの各々にプローブＤＮＡを固定化したバイオ分子アレイチップを作製し、このプローブＤＮＡにターゲットＤＮＡが相互作用したときの酸化還元電流値の変化を高感度で測定することによって、ターゲットＤＮＡ中の単一塩基の変異を検出する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されている該バイオチップ。
【請求項２】
該プローブ一本鎖ＤＮＡの１の端部に第１の分子が結合され、該第１の分子と特異的結合する第２の分子が該ウェルの底部に固定化され、該第１の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されている請求項１記載のバイオチップ。
【請求項３】
該第１の分子がビオチンであって、該第２の分子がストレプトアビジンである請求項２記載のバイオチップ。
【請求項４】
該一本鎖ＤＮＡがレプチンをコードするＤＮＡの断片である請求項１記載のバイオチップ。
【請求項５】
少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、該作用電極は、１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されているバイオチップであり、
処理前に、該バイオチップの第１の電気的信号を測定し；
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズする非標識ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項６】
該電気的信号が、酸化還元電流値である請求項５記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非標識のターゲットＤＮＡを検出するためのバイオチップおよびそれを用いたバイオセンサーに関する。より詳しくは、電気的信号検出によって非標識一塩基多型ＤＮＡを認識することができる高感度のバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の研究及び新薬開発プロセス、医療診断等などの分野において、バイオチップが注目され、研究開発が盛んに進められている。
バイオチップとは、固体表面上（固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など）にＤＮＡ等の核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子等のプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである。特に、微量のサンプルを用いて大量にハイスループットな検出および解析ができるところから、大量かつ同時並行的な処理を要求されるポストゲノム時代のバイオ分子の機能解析技術にはバイオチップ関連技術が必須となっている。
【０００３】
バイオチップの代表例として、基板上にＤＮＡを高密度に固定化し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）や、タンパク質を固定化し相互作用するタンパク質を検出するタンパク質チップ（プロテインチップ）などがある。
また、微細加工技術を利用してシリコン、ガラス等の基板表面上に流路、回路を成形し、微小空間上で反応、分離、検出等を行う装置、器具（ラボ・オン・チップ、μＴＡＳ(micro-total analysis system)、バイオＭＥＭＳ(micro-electro-mechanical systems)等）が実用化され、それらをバイオチップと称することもある。
【０００４】
ゲノムプロジェクトによって、ヒトをはじめとする様々な生物の遺伝子配列情報が蓄積されてきた。今日のポストゲノム時代において、これらの遺伝子配列情報を有効に利用するための最も有効でこれから普及する技術として、バイオチップのなかでもＤＮＡチップが研究されている。ＤＮＡチップは、多種類の遺伝子をハイスループットで検査する手法として注目されており、広い分野での基盤技術となると考えられる（非特許文献１）。
【０００５】
ＤＮＡチップを用いれば、ある条件下と対象条件下での遺伝子発現量の違いを解析することができるため、遺伝子機能解析分野で広く利用されるようになり、遺伝子診断、新薬開発、臨床診断の分野におけるバイオチップの応用が検討されている。特に、疾患に関与する遺伝子の解析は、病気の早期発見、早期治療を行っていく上で非常に重要であり、今後遺伝子診断への期待はますます高まって行くであろう。
【０００６】
従来、微小なチップ上にＤＮＡを配列させ、固定化するマイクロアレイ技術では、まず、ピン（特許文献１）、インクジェット（特許文献２および３）、フォトリソグラフィー法で多種類のプローブ一本鎖ＤＮＡをガラス基板上に高密度で固定化し（ＤＮＡアレイの作製）；蛍光標識化ターゲット一本鎖ＤＮＡをＤＮＡアレイ上でハイブリダイゼーションさせ；次いで、ＤＮＡアレイを洗浄・乾燥させている。その後、基板上に結合した蛍光標識化ターゲットＤＮＡを蛍光顕微鏡や蛍光スキャナーで画像化し解析することによってプローブとターゲットとの相互作用を確認する。
【０００７】
また、ＤＮＡが負電荷を帯びていることに着目し、プローブＤＮＡの特定位置に正電位をかけることでＤＮＡの固定化を達成するエレクトロニクスアドレッシング技術が開発され、プロープＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション時間の短縮化に成功している。しかしながら、この技術も、ハイブリダイゼーションの検出のために蛍光物質を使う。
【０００８】
このように、従来のマイクロアレイ技術は、例えば、ターゲットを蛍光標識し、蛍光発光の有無を光学的に検出することによって、プローブとターゲットとの相互作用を検出してきた。しかしながら、（１）ターゲットＤＮＡを蛍光標識化するための前処理工程および、（２）蛍光標識を励起するためのレーザー装置や発光した蛍光を画像化し解析する装置が必要なため、従来の技術では、作業性および経済性の面から実用化が困難であった。
【０００９】
また、従来の蛍光検出型ＤＮＡチップを用いて対象遺伝子の発現を解析するには、数万もの遺伝子断片を用意して基板上に高密度に配置させる必要があるが、製造装置や解析装置にコストがかかるという理由から、一部の研究機関や病院でしか使用されていない。
【００１０】
現在、遺伝子ＤＮＡ中の一塩基レベルの変異が特定の疾患に関与することから、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)の解析が急速に進んでいるとともに、個人のＳＮＰ情報をもとにした新薬開発や、個人差に合わせた医療を行うオーダーメード医療が最も重要な応用分野となっている。
ＳＮＰの解析には、安定性の微妙に異なった多種類のＤＮＡ二重らせんを同時に測定することが必要であり、所定の温度条件下、特定の溶液中で測定することが必要であるが、乾燥下で測定する従来のＤＮＡマイクロアレイ技術ではこの測定は不可能であった。
【００１１】
特許文献４には、蛍光色素を核酸プローブに標識し、当該プローブに標的核酸がハイブリダイズしたときの蛍光強度の変化量から、標的核酸の多型および／または変異を解析する方法が記載されている。
【００１２】
近年、電気化学的にＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出する研究が行われている（非特許文献２および３）。
電気化学的な手法は、蛍光標識等を標識せずに非標識でＤＮＡのハイブリダイゼーションを検出できることから、遺伝子解析の迅速化、解析装置の簡略化および低コスト化が図れるという利点を有している。
【００１３】
そのため、電気化学的ＤＮＡチップの研究は近年急激に増加しており（特許文献５,６および７）、単なるＤＮＡセンシングのみでなく、ガンの発生メカニズムを分子生物学的に解析する手段としても研究されている（非特許文献４,５および６）。また、ミケルセン(Mikkelsen)らは、近年報告された電気化学的ＤＮＡチップの特性を他の遺伝子検出法と比較して示した（非特許文献７）。
【００１４】
例えば、特許文献５には、インターカレーターが結合されているＤＮＡプローブが固定された電極を有するＤＮＡチップが開示され、このＤＮＡチップを核酸またはタンパク質である標的物質に接触させた後、サイクリックボルタモグラフィー等を用いて、ＤＮＡ塩基対とインターカレーターとの間の電子移動により生じる電気的信号の入出力を検出している。
【００１５】
これらの研究は、主に、プローブＤＮＡまたはターゲットＤＮＡに酸化還元物質を修飾するか、ＤＮＡに特異的に結合するインターカレーターを導入するか（特許文献４,５および６）、または、インジケータフリー(indicator-free)な方法でハイブリダイゼーションを検出している。
したがって、これらの方法には、それぞれ、酸化還元物質を修飾するのでコストが上昇したり、ＤＮＡに特異的に結合するインターカレーターを選ばなければならないことや塩基対にインターカレーターが挿入して二重らせん構造に影響を与えるため、ＳＮＰの検出には適当ではないという問題がある。また、インジケータフリーな方法では塩基配列中にグアニン（Ｇ）の存在が必須であるので、測定可能範囲が限定されるといった問題がある。
【００１６】
さらに近年、医療現場での臨床検査としてポイント・オブ・ケア検査(Point-Of-Care Testing; POCT)の重要性が高まっており、ＰＯＣＴ装置の１つとして、携帯型バイオセンサーのような小型化された自動分析システムが有力になると考えられる。
また電気化学的に遺伝子の発現解析を行うことを目的とする場合、数千ないし数万もの微小電極アレイを同時に測定する手法や装置が必要であるが、ケイ・カマン(K. Cammann)らによって報告された手法を応用することにより（非特許文献８および１０）、高度に集積化された微小電極アレイ型ＤＮＡチップを開発することも可能であると考えられる。
【００１７】
その他、表面プラズモン共鳴センサー、微小水晶振動子上で相互作用を振動周波数の変化として検出する水晶振動子マイクロバランス（特許文献７）等を用いてハイブリダイゼーションによる重量変化を測定する手法、表面の偏光反射光の解析から相互作用を薄膜の厚みの増加として測定する偏光解析、相互作用を認識する抗体を用いた免疫化学的手法などさまざまな原理に基づく手法があるが、携帯型バイオセンサー用に小型化された装置はまだ実用化されていない。
【００１８】
【特許文献１】特開２００３−２７９５７６号公報
【特許文献２】特開２００１−１８６８８０号公報
【特許文献３】特開２００１−３４３３８６号公報
【特許文献４】特開２００２−１９１３７２号公報
【特許文献５】特開２００３−８３９６８号公報
【特許文献６】特開２００３−１６１７３０号公報
【特許文献７】特開２００３−２８７５３８号公報
【非特許文献１】Nature Genetics, Vol.21, No. 1 supplement January 1999
【非特許文献２】S. Takenaka, K. Yamashita, M. Takagi, Y Uto, and H. Kondo, "DNA Sensing on a DNA Probe-Modified Electrode Using Ferrocenylnaphthalene Diimide as the Electrochemically Active Ligand", Anal. Chem, 72, 1334-1341 (2000)
【非特許文献３】M.I. Pividori, A. Merkoci, S. Alegret, "Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection methods", Biosensors & Bioelectronics, 15, 291-303 (2000)
【非特許文献４】E. Palecek, M. Fojta, M. Tomschik, J. Wang, "Electrochemical biosensors for DNA hybridization and DNA damage", Biosensors & Bioelectronics, 13, 621-628 (1998)
【非特許文献５】D. H. Johnson, K. C. Glasgow, and H. H. Thorp, "Electrochemical Measurement of the Solvent Accessibility of Nucleobases Using Electron Transfer between DNA and Metal Complexes", J. Am. Chem. Soc., 117, 8933-8938 (1995)
【非特許文献６】P. A Ropp and H. H. Thorp, "Site-selective electron transfer from purines to electrocatalysts: voltammetric detection of a biologically relevant deletion in hybridized DNA duplexes", Chem Biol., 6, 599-605 (1999)
【非特許文献７】S. R. Mikkelsen, "Electrochemical Biosensors for DNA Sequence Detection", Electroanalysis, 8, 15-19 (1996)
【非特許文献８】B. Ross, K. Cammann, W. Mokwa, and M. Rospert, "Ultramicroelectrode arrays as transducers for new amperometric oxygen sensors", Sensors and Actuators B, 7, 758-762 (1992)
【非特許文献９】H. Meyer, H. Drewer, J. Krause, K. Cammann, R. Kakerow, Y. Manoli, W. Mokwa, and M. Rospert, "Chemical and biochemical sensor array for two-dimensional imaging of analyte distributions", Sensors and Actuators B, 18-19, 229-234 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、従来の蛍光検出型ＤＮＡチップの有する問題を解決し、簡便性、携帯性、開発コストの面で優れている微小電極アレイ型ＤＮＡチップを開発することにある。
今までに報告された集積型電極チップによる遺伝子検出の例では、微小電極アレイ上へのプローブＤＮＡの固定化法として電気化学的手法を用いているが、最終的には蛍光測定によって遺伝子の検出を行っている。
【００２０】
本発明者らは、ＤＮＡのハイブリダイゼーション後の二本鎖ＤＮＡを検出するために、ＤＮＡが電気活性を持ち、相補的な一本鎖ＤＮＡ同士が特異的に結合することを利用して非標識ＤＮＡを用いたＤＮＡハイブリッド検出法の確立が重要だと考えた。
そこで、本発明者らは、プローブＤＮＡを電極上に固定化する方法を検討し、微小電極アレイ型ＤＮＡチップを作製し、一切の標識分子修飾を行うことなく同時に複数のターゲットＤＮＡを電気化学的に検出する新しい「次世代ＤＮＡチップ電極アレイシステム」の構築を行った。
そして、本発明の最終的な目的は、本発明によるＤＮＡチップを、迅速かつ簡便な臨床遺伝子検査に応用することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明において、微細加工技術によって１または複数の微小ウェルを電極表面上に配列させ、これら１または複数の微小ウェルの各々にプローブバイオ分子を固定化したバイオ分子アレイチップを作製し、このプローブ分子にターゲット分子が相互作用したときの酸化還元電流値の変化を高感度で検出する。
【００２２】
より詳しくは、本発明は、１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されている該バイオチップを提供する。
【００２３】
本発明において、「ＤＮＡ」とは、生体由来の核酸のみならず、それらの誘導体、模倣体も含むことを意図している。
【００２４】
本発明によるバイオチップにおいて、該プローブ一本鎖ＤＮＡの１の端部に第１の分子が結合され、該第１の分子と特異的結合する第２の分子が該ウェルの底部に固定化され、該第１の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されている。
【００２５】
特に、本発明によるバイオチップにおいて、該第１の分子がビオチンであって、該第２の分子がストレプトアビジンである。
また、該一本鎖ＤＮＡがレプチンをコードするＤＮＡの断片である。
【００２６】
本発明によるバイオチップは、基板上に１または複数の電極配線を形成し、該１または複数の電極配線を絶縁膜で被覆し、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルを形成し、次いで、該１または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖ＤＮＡを固定化することによって作製する。
【００２７】
さらに、本発明は、少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、該作用電極は、１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡが配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブ一本鎖ＤＮＡが固定化されているバイオチップであり、
処理前に、該バイオチップの第１の電気的信号を測定し；
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズする非標識ターゲットＤＮＡを検出することを特徴とするバイオセンサーを提供する。
【００２８】
ここで、「処理」とは、プローブ一本鎖ＤＮＡと非標識ターゲットＤＮＡとをハイブリダイズさせるために必要なプロセスをいう。したがって、処理前、バイオチップにおいては、該１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡには非標識ターゲットＤＮＡがハイブリダイズしていない。また、試験溶液中に該非標識ターゲットＤＮＡが存在していれば、この処理によって、該１または複数のプローブ一本鎖ＤＮＡに非標識ターゲットＤＮＡがハイブリダイズする。本発明のバイオチップに上記の処理を行う前後で電気的信号を測定し、電気的信号に変化があれば、該試験溶液中に、非標識ターゲットＤＮＡが存在していたことを確認することができる。
すなわち、プローブＤＮＡにターゲットＤＮＡがハイブリダイズしていない系で測定した電気的信号とプローブＤＮＡにターゲットＤＮＡがハイブリダイズした系で測定した電気的信号との間に統計学的に有意な変化があった場合、当該有意な変化をターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションに関連付けることができる。
【００２９】
本発明において、特に、電気的信号として酸化還元電流値を用いる。
すなわち、本発明によれば、非標識ターゲットＤＮＡのプローブＤＮＡへのハイブリダイゼーションの有無をバイオチップのバイオ分子アレイ上の酸化還元状態の変化から検出する。したがって、ターゲットＤＮＡに蛍光物質等を標識することなく、酸化還元電流値を測定するだけでハイブリダイゼーションを検出できるので、迅速かつ簡便な測定が可能となる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によるバイオチップを用いれば、蛍光物質等の標識分子を用いることなくターゲットバイオ分子を検出することができるので、迅速、簡便に測定が可能で、かつ、小型化されたバイオセンサーを構築することができる。
また、本発明によるバイオチップには、複数の電極上に各自異なるプローブＤＮＡを固定化することができるので、複数の遺伝子を同時に検出することができる。
さらに、本発明によるバイオセンサーは非常に高感度であり、ＳＮＰを検出することができるので、種々の疾患に関連するＳＮＰ遺伝変異の検出から、従来、長時間をかけて培養しなければならなかった病原菌の検出等、さまざまな可能性を秘めている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
実施例１：ＤＮＡチップの作製
本発明によるＤＮＡチップの上面図を図１に示す。この実施例では、ガラス基板１０上に８本の電極配線１３を形成し、一度に８点測定が可能なＤＮＡチップ１を形成した。
電極配線１３の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド１３２が形成されている。
図２にバイオ分子アレイ領域１３１の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域１３１上には絶縁性レジスト膜１４が形成され、この絶縁膜に１または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための１または複数のウェル１３１ａが形成されている。
バイオ分子アレイ領域１３１には、ウェル１３１ａの直径が５μｍ以上の場合、図２ａに示すように単一のウェルを形成することができ、ウェル１３１ａの直径がサブミクロン以下２０ｎｍ程度までの場合、図２ｂに示すように複数のウェルを配列させることができる。
【００３２】
バイオ分子アレイ領域１３１の断面図を図３ａに示す。この実施例では、ガラス基板１０上に、まず、Ｔｉ薄膜１３ａを形成し、その上にＡｕ薄膜１３ｂを形成することによって、Ａｕ／Ｔｉ積層薄膜からなる電極配線１３を形成した。Ａｕ薄膜を直接ガラス基板に形成することもできるが、Ａｕ薄膜の接着強度が弱いので、Ａｕ薄膜の剥離を防止し、バイオチップの信頼性を向上させるためにＴｉ薄膜を用いた。Ｔｉ以外にＣｒを用いることもできる。
【００３３】
この図が示すように、絶縁性レジスト膜に形成された孔は、下部層の電極配線の表面にまで達している。すなわち、バイオ分子アレイ領域に形成されたウェルの側面は絶縁性レジスト膜１４により定められ、ウェルの底部は電極配線の表面により定められている。
この構成を用いて、図３ｂに示すように、ウェル１３１ａの底部の露出した電極表面上にのみプローブ２となるバイオ分子を固定化する。
【００３４】
本発明のＤＮＡチップを作製するために、半導体製造技術の１つであるフォトファブリケーション技術を用いた。ここでは、「フォトファブリケーション技術」なる用語は、フォトリソグラフィー技術、蒸着技術、エッチング技術などを組み合わせた技術を意味する。
フォトファブリケーション技術はすでにＩＣやＬＳＩ製造技術の１つとして確立されているため、従来のＤＮＡチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。
【００３５】
図４ないし図９は、本発明のＤＮＡチップを作製する工程を示す概略図である
まず、直径５μｍ以上の単一ウェル（第１の具体例）を作製する工程について説明する。基板１０上にスピンコーターを用いて感光性材料であるフォトレジスト１１を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図４ａ,４ｂ）。この実施例ではガラス基板を用いたが、アルミナ基板、シリコン基板、または、シリコーン樹脂のごとき樹脂製基板等のいずれの材質の基板も用いることができる。
次いで、フォトマスクを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図４ｃ）、フォトレジスト１１を現像して電極配線１３用の配線パターンを形成する（図４ｄ）。フォトレジストには、露光によって結合が分解して現像液に溶解するもの（ポジ型）と、逆に重合して溶解しないもの（ネガ型）があるが、ここではフォトレジスト１１としてポジ型レジスト（ＡＺ１５００：クラリアントジャパン株式会社）を用いた。
【００３６】
その後、真空蒸着やＲＦスパッタリングなどの蒸着技術によって基板上に電極材料となる金属薄膜を形成する（図４ｅ）。
さらに、これをアセトンのごとき有機溶媒中に浸漬して、レジスト１１を剥離することによって、ガラス基板１０上に電極配線１３を形成した（図４ｆ）。電極配線１３が形成されたチップの概略上面図を図６ａに示す。図６において、一方の端部に円形のバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部には電気的信号を取り出すための角型パッド１３２が形成された電極配線が示されているが、これは電極配線の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。
また、電極配線の本数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。
【００３７】
次に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＡＺ１５００）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図５ａ）。次いで、フォトマスクを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図５ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上にウェル１３１ａを形成した（図５ｃ）。これを１５０℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させた（図５ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図６ｂに示す。
【００３８】
次に、直径がサブミクロン以下のウェルのアレイ（第２の具体例）を作製する工程を説明する。直径５μｍ以上の単一ウェルを作製したときと同様にして電極配線を形成し（図４）、その後、図５ａに示す工程と同様に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＺＥＰ５２０：日本ゼオン株式会社）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図７ａ）。次いで、７５ｋＶにて電子ビーム１５を照射し（図７ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上に複数のウェル１３１ａの配列を形成した（図７ｃ）。これを２００℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させた（図７ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図８に示す。
【００３９】
従来の半導体製造技術を用いれば、基板上にウェルを形成することができるので、上記の条件に限定されることなく、適宜、当業者によく知られた他の条件でウェルを形成することができる。
【００４０】
次に、生物化学の分野でよく知られている方法を用いて、ウェル底部の電極表面上にストレプトアビジンを固定化した。具体的には、まず、チップをピランハ溶液（Ｈ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４＝１：３［ｖ／ｖ］に１０分間浸漬してウェル底部の電極表面上の有機不純物質を除去し、純粋で十分に洗浄し、エタノールで洗浄した後（図９ａ）、３,３’−ジチオジプロピオン酸（ＤＴＤＰ）のエタノール溶液に浸漬してＤＴＤＰをその−Ｓ−Ｓ−基を介して電極表面に結合させた。次いで、ジオキサンおよび水（９：１［ｖ／ｖ］）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）の混合溶液にチップを浸漬して、ＤＴＤＰのカルボキシル基を活性化した。ここに、ストレプトアビジン溶液を添加することによって、そのＮＨ２基を介して活性化ＤＴＤＰにストレプトアビジンを連結させた（図９ｂ）。リン酸バッファ溶液（ＰＢＳ）で洗浄することによって、ウェル底部に固定化されていない未結合のストレプトアビジンを除去した。
したがって、ウェル底部の電極表面にのみストレプトアビジンが固定化されるように、前記のレジスト１４はＤＴＤＰの−Ｓ−Ｓ−基が結合しない材料であることが必要である。
最後に、予めビオチン化したプローブＤＮＡ２２のＰＢＳ溶液にストレプトアビジン固定化チップを浸漬することによって、ストレプトアビジン−ビオチンの特異的結合を介してプローブＤＮＡをウェル底部に固定化した（図９ｃ）。
【００４１】
この実施例において、プローブＤＮＡとしては、配列番号：１：
【００４２】
5'-gag gag ttg ggg gag cac att-3'
【００４３】
で示される２１塩基の人工核酸を用いた。生物化学の分野において、１８ないし２２塩基程度の一本鎖ＤＮＡ同士であれば、ハイブリダイゼーションを確実に起こすことが知られている。
この人工核酸の５’末端に、よく知られている方法によってビオチンを結合させて、ビオチン化プローブＤＮＡ２２を作製した。
【００４４】
ストレプトアビジンは、ビオチンと生物学的に最も強固で安定に結合（Ｋｄ＝１０−１５Ｍ）するタンパク質であり、４分子のビオチンと結合する。
ストレプトアビジン−ビオチン間の特異的結合を利用して、ストレプトアビジンを修飾した分子と、ビオチンを修飾したもう一つの分子とを結合させる手法が一般的に用いられている。したがって、様々なタンパク質にビオチンを修飾する技術がすでに確立され、そのためのキットも市販されている。また、ビオチン修飾したＤＮＡも商業的に入手可能である。
【００４５】
ストレプトアビジンが基板上に固定化されている場合、ビオチン化ＤＮＡの有効結合数は１であることがすでに知られている。固定化によりビオチンが接近可能なストレプトアビジンの結合部位が限定され、さらに、１本のビオチン化ＤＮＡがストレプトアビジンに結合した後、ＤＮＡ同士の静電反発によりさらなるビオチン化ＤＮＡがストレプトアビジンに接近できないためと考えられる。特に、本発明の場合、ストレプトアビジンは周囲が壁に囲まれたウェル底部に固定化されているので、１つの固定化ストレプトアビジン２１には１本のビオチン化プローブＤＮＡ２２が結合していると十分に考えられる。
【００４６】
図１０は、蛍光を用いた走査型近接場光顕微鏡(Scanning Near-Field Optical Microscopy; SNOM)像を示す。
図１０ａは、実施例１に記載された方法によりＳＮＯＭ観察用のマイカ基板上にストレプトアビジンを固定化し、このストレプトアビジンにビオチン化プローブＤＮＡを結合したときのＳＮＯＭ像である。このプローブＤＮＡには、イソチオシアン酸フロオレセイン（ＦＩＴＣ）が標識してある。この図から分かるように、５×５μｍ角の観察視野全体から蛍光発光が観察された。すなわち、均一にストレプトアビジンが配列されたことが確認された。
図１０ｂは、ＦＩＴＣを標識していないプローブＤＮＡをストレプトアビジンに結合させ、ＦＩＴＣ標識ターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせたときのＳＮＯＭ像である。この図から分かるように、観察視野全体から蛍光発光が観察され、ほぼ均一にハイブリダイゼーションが発生したことが確認された。
また、図１０ｃは、ＦＩＴＣを標識していないプローブＤＮＡをストレプトアビジンに結合させ、ターゲットとしてプローブＤＮＡと同一の配列を有するＤＮＡにＦＩＴＣを標識したものを用いたときのＳＮＯＭ像である。この図から分かるように、観察視野全体から蛍光発光は全く観察されなかった。これは、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡと同一の配列を有するので、静電反発によってハイブリダイゼーションが全く発生しないからであるが、さらに、ターゲットＤＮＡがウェル以外のレジスト膜に非特異的に結合しないことを示している。
かくして、本発明の方法によれば、電極表面に均一にプローブを固定化できることが確認された。
【００４７】
実施例２：ＤＮＡチップの検出性能評価
実施例１に記載された方法により作製された第１の具体例のＤＮＡチップ１（バイオ分子アレイ領域上、直径２００μｍの単一ウェル）を用いてバイオセンサーを構築し、ターゲットＤＮＡ３の検出実験を行った。
具体的には、５ｍＭのＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］および１００ｍＭ ＫＣｌの混合水溶液中、ＤＮＡチップ１を作用電極とし、白金を対極とし、銀／塩化銀を参照電極として電気化学セルを構成して、サイクリックボルタンメトリーによって、ＤＮＡチップ１の酸化還元電位を測定した。また、測定は２５℃にて行い、電位の掃引速度は５０Ｖ／秒とした。
【００４８】
まず、対照として、プローブＤＮＡ２２にターゲットＤＮＡ３がハイブリダイズしていないＤＮＡチップを用いて電流電位曲線Ａを得た（図１１）。
次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のターゲットＤＮＡ３溶液（ＤＮＡ濃度：１μＭ）に、前記のハイブリダイズしていないＤＮＡチップを３０℃にて２４時間浸漬し、その後、ＰＢＳで数回洗浄して未結合のターゲットＤＮＡ３を十分に除去して、プローブＤＮＡ２２にターゲットＤＮＡ３がハイブリダイズしたＤＮＡチップを作製した。このＤＮＡチップを用いて電流電位曲線Ｂを得た（図１１）。
図１１に示す電流電位曲線において、ピーク電流値が酸化還元電流値を示している。
【００４９】
この実施例において、ターゲットＤＮＡ３としては、配列番号：２：
【００５０】
3'-ctc ctc aac ccc ctc gtg taa-5'
【００５１】
で示される２１塩基の人工核酸を用いた。この人工核酸はプローブＤＮＡ（配列番号:１）に対して完全に相補的である。
【００５２】
ターゲットＤＮＡ３がハイブリダイズしたＤＮＡチップを用いて測定した酸化還元電流値は、平均して、対照ＤＮＡチップでの値から４０％減少した。すなわち、ターゲットＤＮＡ３がプローブＤＮＡにハイブリダイズしたことによる酸化還元電流の平均変化率は−４０％である。ここで、酸化還元電流の変化率（ΔＩ）は、次式：
【００５３】
ΔＩ＝（ＩＴ−ＩＰ）／ＩＰ
【００５４】
（式中、ＩＰはターゲットＤＮＡ非ハイブリダイズＤＮＡチップで測定された酸化還元電流を意味し；ＩＴはターゲットＤＮＡハイブリダイズＤＮＡチップで測定された酸化還元電流を意味する。）を用いて算出した。
【００５５】
次に、ターゲットＤＮＡ３をプローブＤＮＡ２２にハイブリダイズさせるときに用いる溶液のＤＮＡ３濃度を変化させて、同様の測定を行なった。酸化還元電流の変化率の測定結果を表１および図１２に示す。
【００５６】
【表１】
2005164387.tif 000003
【００５７】
上記の結果から、本発明のＤＮＡチップを用いて、サブフェムトモルの感度で各ウェルにおけるプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションの有無の検出に成功したことが示された。
【００５８】
実施例３：一塩基多型ＤＮＡ（ＳＮＰ）の検出
（１）人工核酸を用いた性能評価
次に、配列番号：２で示されるターゲットＤＮＡに対して、一塩基のみ異なる人工ＳＮＰ−ＤＮＡを用いて、第１の具体例のＤＮＡチップ（バイオ分子アレイ領域上、直径２００μｍの単一ウェル）を作製し、本発明のＤＮＡチップの検出性能を評価した。
このＳＮＰ−ＤＮＡは、配列番号：３：
【００５９】
3'-ctc ctc aac cct ctc gtg taa-5'
【００６０】
で示される２１塩基の人工核酸である。プローブＤＮＡ（配列番号:１）に対して完全に相補的なターゲットＤＮＡ（配列番号:２）とＳＮＰ−ＤＮＡ（配列番号:３）とを用いて、実施例２と同様にして、酸化還元電流値を測定した。
酸化還元電流値の変化率を比較した結果の一例を図１３に示す。本発明のＤＮＡチップは、８本の電極を有しているので、一度に８点の測定を行うことができる。図１３には、１回の測定で得られた８点の測定値のうち５点を示している。
プローブＤＮＡに完全に相補的なターゲットＤＮＡでの酸化還元電流の平均変化率−４０％に対して、ＳＮＰ−ＤＮＡでは−７％であった。すなわち、本発明のバイオチップを用いれば、ＤＮＡ配列中単一の塩基が異なるだけで、酸化還元電流値に有意な差を示し、本発明のＤＮＡチップがＳＮＰ検出に非常に有用であることが示された。
【００６１】
また、この実施例においては、複数の電極上に一種類のプローブＤＮＡを固定化して測定を行ったが、図１３に示すように、複数の電極のいずれも酸化還元電流値の変化率において完全に相補的なターゲットＤＮＡとＳＮＰ−ＤＮＡとの間に有意な差が観察されることから、複数の電極の各々に異なる種類のプローブＤＮＡを固定化して複数のＳＮＰ−ＤＮＡを同時に検出する可能性が明らかとなった。
【００６２】
（２）レプチンを用いた性能評価
レプチンは、脂肪細胞で生合成、分泌され、摂食抑制とエネルギー消費高進をもたらすペプチドホルモンとして知られている。このレプチンに異常があると摂食抑制が正常に機能せず、過食と肥満を引き起こすことが知られている。したがって、レプチンをコードするＤＮＡのＳＮＰを簡便に検出できる手段が確立されれば、肥満の原因解明に役立つものと考えられる。
そこで、生体由来ＤＮＡとしてヒトレプチンＤＮＡを用いて、同様の酸化還元測定を行った。ヒトレプチンＤＮＡは、第７染色体長腕に約２０ｋｂの領域に広がる遺伝子であるが、この実験では、プローブＤＮＡとして配列番号：４：
【００６３】
5'-aga aga agt gca cga ccg gaa-3'
【００６４】
で示される２１塩基のレプチンＤＮＡ断片を用いた。このレプチンＤＮＡ断片の５’末端に、よく知られている方法によってビオチンを結合させて、ビオチン化プローブＤＮＡ２２を作製した。ターゲットＤＮＡとして、配列番号：５：
【００６５】
3'-tct tct tca cgt gct ggc ctt-5'
【００６６】
で示される２１塩基のレプチンＤＮＡ断片を用いた。このＤＮＡはプローブＤＮＡ（配列番号：４）に対して完全に相補的である。また、ＳＮＰ−ＤＮＡとして、配列番号：６：
【００６７】
3'-tct tct tca cat gct ggc ctt-5'
【００６８】
で示される２１塩基の人工核酸を用いた。
この実験において、完全に相補的なターゲットレプチンＤＮＡ（配列番号:５）に対する酸化還元電流値の平均変化率−４０％に対して、ＳＮＰ−ＤＮＡ（配列番号:６）に対する酸化還元電流値の平均変化率は−９％であった。この測定結果から、本発明のＤＮＡチップは実際の生体由来ＤＮＡにおけるＳＮＰ検出にも有効であることが示された。
【００６９】
実施例４：ウェル径と検出感度の関係
バイオ分子アレイ領域上に２００×２００個の配列で直径１００ｎｍのウェルを形成した第２の具体例のＤＮＡチップを作製し、実施例２（第１の具体例のＤＮＡチップ）と同様の測定を行って、ウェル径がＤＮＡチップの検出感度に与える影響を調べた。
【００７０】
バイオ分子アレイ領域に１００ｎｍ径ウェルのアレイを形成し、実施例１に記載された方法で複数のウェル底部の電極表面上にプローブＤＮＡ２２（配列番号:１）を固定化して（図９）、第２の具体例のＤＮＡチップを作製した。
【００７１】
原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いてタッピングモードで、第２の具体例のバイオ分子アレイ領域１１３の表面を観察した（図１４）。共振周波数１２５ｋＨｚおよびバネ定数１４Ｎ／ｍのシリコン製カンチレバー（セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＩ−ＤＦ−２０）を用いた。
このＡＦＭ像から、各ウェル（黒色円形に示される領域）にストレプトアビジン（ウェル内、白色で示される物質）が固定化されているのが確認された。また、観察視野全体にわたって、均一にウェル内にストレプトアビジンの存在が確認された。
【００７２】
かくして、プローブＤＮＡがバイオ分子アレイ領域１１３に形成された複数のウェルに均一に分散して固定化されたＤＮＡチップが得られた。
【００７３】
このＤＮＡチップを用いる以外は、実施例２と同様にして、電気化学セルを構成した。
直径２００μｍの単一ウェルが形成された第１の具体例のＤＮＡチップを用いた場合、ターゲットＤＮＡ（配列番号:２）がプローブＤＮＡ２２（配列番号:１）にハイブリダイズする前後での酸化還元電流の平均変化率が−４０％であったのに対して、直径１００ｎｍウェルアレイ（２００×２００個）が形成された第２の具体例のＤＮＡチップを用いた場合、ハイブリダイズ前後での酸化還元電流値の平均変化率が−６０％となり、検出感度が向上した。
【００７４】
ストレプトアビジンの直径は１０ｎｍ程度であり、直径１０ｎｍウェルには単一のストレプトアビジンしか固定化されず、この実施例の場合、４０,０００個のストレプトアビジンが一つのバイオ分子アレイ領域に存在すると考えられる。
一方、ウェル径が２００μｍであれば、１つのウェル内に計算上約１０１８個のストレプトアビジンが存在すると考えられる。
【００７５】
直径１０ｎｍウェルのアレイに固定化されるストレプトアビジンの個数が、計算上２００μｍ単一ウェルに固定化されるストレプトアビジンの個数の１０１４分の１程度でも検出感度が向上したのは、直径２００μmの単一ウェルの場合、ウェル内に多数のストレプトアビジンが密集して固定化されているので、ストレプトアビジン同士の会合が起きたり、その結合部位の配向が制御されていないために、ストレプトアビジンにビオチン化プローブＤＮＡが有効に結合していないか、または、プローブＤＮＡが互いに近接しあっているために、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション効率の低下が起きた一方で、１００ｎｍウェルのアレイの場合、１つのウェルに個別にストレプトアビジンが固定化され、高効率でターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーションが起きたためであると考えられる。
【００７６】
実施例１〜４は、直径２００μｍの単一ウェルが形成された第１の具体例のＤＮＡチップを用いて行われたものであり、本発明のＤＮＡチップが十分に高いＳＮＰの検出性能を有することを示したが、この実施例の結果から、ウェル径をより小さくして、ストレプトアビジンの配列を制御すればさらに検出感度を増大させることが可能となることが分った。
【００７７】
以上の結果から、本発明によれば、ターゲットＤＮＡを蛍光物質等で標識化する必要がないこと、電解質溶液中での測定が可能なこと、マイクロファブリゲーション法を利用して複数の電極を作製することができることから、迅速かつ簡単な解析を可能にし、コストパフォーマンスに優れた次世代ＤＮＡアレイシステムを提供する技術として期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明のＤＮＡチップの上面図。
【図２】本発明のＤＮＡチップのバイオ分子アレイ領域の上面図。
【図３】本発明のバイオ分子アレイ領域の断面図。
【図４】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図５】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図６】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図７】本発明の第２の具体例のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図８】本発明の第２の具体例のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図９】本発明のＤＮＡチップの製造工程を説明する概略図。
【図１０】本発明のＤＮＡチップ本発明のタンパク質チップと同様の構成でマイカ基板に作製したＤＮＡアレイのＳＮＯＭ像。
【図１１】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップを用いて測定した電流電位曲線。
【図１２】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップを用いて測定した酸化還元電流値の変化率とハイブリダイゼーションにおけるターゲットＤＮＡ濃度との関係を説明するグラフ。
【図１３】本発明の第１の具体例のＤＮＡチップを用いたＳＮＰ−ＤＮＡ検出結果。
【図１４】本発明の第２の具体例のＤＮＡチップのＡＦＭ像。
【符号の説明】
【００７９】
１・・・バイオチップ（ＤＮＡチップ）、１０・・・基板、１１・・・フォトレジスト、１２ａ・・・紫外線、１２ｂ・・・フォトマスク、１３・・・電極配線、１３１・・・バイオ分子アレイ領域、１３１ａ・・・ウェル、１３２・・・パッド、１４・・・絶縁性レジスト、１５・・・電子ビーム、２・・・プローブ、２１・・・ストレプトアビジン、２２・・・プローブＤＮＡ、３・・・ターゲットＤＮＡ。
【図１】
2005164387.tif 000004
【図２】
2005164387.tif 000005
【図３】
2005164387.tif 000006
【図４】
2005164387.tif 000007
【図５】
2005164387.tif 000008
【図６】
2005164387.tif 000009
【図７】
2005164387.tif 000010
【図８】
2005164387.tif 000011
【図９】
2005164387.tif 000012
【図１０】
2005164387.tif 000013
【図１１】
2005164387.tif 000014
【図１２】
2005164387.tif 000015
【図１３】
2005164387.tif 000016
【図１４】
2005164387.tif 000017
【配列表】
2005164387000001.app