(57)【要約】【課題】  複数の実験区の設定や反復的な実験が可能な体性幹細胞移植の評価方法であって、移植の有効性や安全性を的確に評価できる方法を提供する。【解決手段】  体性幹細胞をドナー細胞としてクローン動物を作製し、このクローン動物に前記体性幹細胞を移植し、移植後の体性幹細胞又はクローン動物を調べることを特徴とする体性幹細胞移植の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体性幹細胞をドナー細胞としてクローン動物を作製し、このクローン動物に前記体性幹細胞を移植し、移植後の体性幹細胞又はクローン動物を調べることを特徴とする体性幹細胞移植の評価方法。
【請求項２】
体性幹細胞が、唾液腺幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝臓前駆細胞、膵島前駆細胞、皮膚組織幹細胞、又は脂肪細胞前駆細胞であることを特徴とする請求項１記載の体性幹細胞移植の評価方法。
【請求項３】
体性幹細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の体性幹細胞移植の評価方法。
【請求項４】
クローン動物が、疾患モデル動物であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項記載の体性幹細胞移植の評価方法。
【請求項５】
移植に用いる細胞が、遺伝子が改変されている細胞であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項記載の体性幹細胞移植の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体性幹細胞移植の評価方法に関し、より詳しくは、移植された体性幹細胞の定着性、増殖性、機能といった移植の有効性や移植した幹細胞が癌化しないかどうかといった移植の安全性などを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己の体性幹細胞を用いた細胞移植治療は、従来の臓器移植や異種移植、さらに胚性幹細胞による再生医療に内包される様々の問題、すなわちドナー不足、拒絶反応、人畜共通感染症さらに倫理的問題等に束縛されないという優れた特徴を持つ。この移植治療技術を臨床応用するためには、移植された細胞の定着性、増殖性、機能といった移植の有効性や移植した幹細胞が癌化しないかどうかといった移植の安全性を評価するための動物モデル系が必要である。
【０００３】
このような動物モデル系としては、まず単純な自家移植モデル系が考えられる。即ち、動物から体性幹細胞を採取し、その採取した動物に体性幹細胞を移植し、移植後の細胞の状態を観察し、移植の有効性及び安全性を評価するモデル系である。
【０００４】
しかし、このモデル系には幾つか欠点がある。まず、移植対象とする動物は１個体だけなので、複数の実験区を設定するのが困難である。また、実験対象とする動物には寿命があるので移植実験を行う期間が限られ、反復的な移植実験を行うことができない。
【特許文献１】特表2003-509028号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、体性幹細胞移植の有効性や安全性を的確に評価するための動物モデル系は未だ開発されていないのが現状である。
【０００６】
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、複数の実験区の設定や反復的な実験が可能な動物モデル系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、体性幹細胞をドナー細胞としてクローン動物を作製し、そのクローン動物に体性幹細胞を移植することにより、複数区での移植実験の評価や反復的な移植実験の評価が可能になることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕  体性幹細胞をドナー細胞としてクローン動物を作製し、このクローン動物に前記体性幹細胞を移植し、移植後の体性幹細胞又はクローン動物を調べることを特徴とする体性幹細胞移植の評価方法。
〔２〕  体性幹細胞が、唾液腺幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝臓前駆細胞、膵島前駆細胞、皮膚組織幹細胞、又は脂肪細胞前駆細胞であることを特徴とする〔１〕記載の体性幹細胞移植の評価方法。
〔３〕  体性幹細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕記載の体性幹細胞移植の評価方法。
〔４〕  クローン動物が、疾患モデル動物であることを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれか記載の体性幹細胞移植の評価方法。
〔５〕  移植に用いる細胞が、遺伝子が改変されている細胞であることを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれか記載の体性幹細胞移植の評価方法。
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
クローン動物の作製に用いるドナー細胞は体性幹細胞であれば特に限定されず、例えば、唾液腺幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝臓前駆細胞、膵島前駆細胞、皮膚組織幹細胞、脂肪細胞前駆細胞などを使用することができ、これらの中でも、唾液腺幹細胞を使用するのが好ましい。
【００１１】
唾液腺幹細胞の採取及び初代培養は、例えば、特開平2003-144140号公報記載の方法に従って行うことができる。即ち、顎下腺、耳下腺、舌下腺などの主唾液腺を結紮した後、これを摘出する。摘出した唾液腺は細切し、緩衝液への懸濁と遠心処理を数度繰り返すことにより、唾液腺幹細胞を含む懸濁液を得ることができる。この細胞懸濁液をコラーゲンを被覆した培養用ディッシュ内で培養することにより、プレートに付着した細胞からコロニーが形成される。このコロニーを構成する細胞を唾液腺幹細胞として使用することができる。このとき使用する培地としては、上皮成長因子、ウシ胎児血清、インスリン、デキサメタゾン、ペニシリンG、ストレプトマイシンなどを含むウィリアムのE培地などを使用することができる。
【００１２】
造血幹細胞は、骨髄、抹消血、あるいは臍帯血から採取し、純化することが可能であり、細胞表面に存在する様々な表面抗原を用いる方法がよく知られている。代表的な方法としてosawa らの方法（Osawa M, Nakamura K, Nishi N, Takahasi N, Tokuomoto Y, Inoue H, Nakauchi H. In vivo self-renewal of c-Kit+ Sca-1+ Lin(low/-) hemopoietic stem cells. J Immunol. 156:3207-3214, 1996）が知られている。この方法では骨髄、末梢血、あるいは臍帯血から有核細胞を分離し、これに表面抗原に対する抗体を作用させ、細胞分離器で分離する。ここで得られた細胞はそのまま培養可能である。
【００１３】
神経幹細胞は、ニュールスフェア法という選択的培養方法によって培養と純化が可能である。この方法は神経幹細胞を含む細胞集団をいくつかの増殖因子を含む無血清培地下で培養すると、幹細胞以外は死滅し、幹細胞は細胞塊をつくって増殖する原理を利用したもので、Weiss の開発によるものである（Weiss S, Dunne C, Hewson J, Wohl C, Wheatley M, Peterson AC, Reynolds BA. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16:7599-7609, 1996）。この培養によって得られた神経幹細胞は未分化のまま培養を継続することが可能である。
【００１４】
間葉系幹細胞は、骨髄から採取される。骨髄細胞を培養して得る方法が一般的である。基本的には長期間の培養（４〜６週以上）行って、コロニーを作って増殖してくる細胞の中に幹細胞が含まれているのでコロニーを選択して純化する。代表的な方法としてはSutherlandらの方法（Sutherland HJ, Lansdorp PM, Henkelman DH, Eaves AC, Eaves CJ. Functional characterization of individual human hematopoietic stem cells cultured at limiting dilution on supportive marrow stromal layers. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 :3584-3588, 1990）がある。これとは別に最近、骨髄細胞の中から細胞表面抗原を利用して採取する方法も確立されている。これはDeschaseauxらが報告した方法（Deschaseaux F, Gindraux F, Saadi R, Obert L, Chalmers D, Herve P. Direct selection of human bone marrow mesenchymal stem cells using an anti-CD49a antibody reveals their CD45med,low phenotype. Br J Haematol. 122:506-517, 2003）で、骨髄細胞中から直接的に間葉系幹細胞を分離することが可能になっている。
【００１５】
肝臓前駆細胞はいくつかの方法で分離されているが、代表的な方法として胎子マウス肝臓から細胞表面抗原を利用して採取する方法がSuzukiらによって記載されている（Suzuki A, Zheng Y, Kondo R, Kusakabe M, Takada Y, Fukao K, Nakauchi H, Taniguchi H.Flow-cytometric separation and enrichment of hepatic progenitor cells in the developing mouse liver. Hepatology. 32:1230-1239, 2000）。その方法では胎児肝臓をコラゲナーゼなどで処理し、分散した細胞をそのまま表面抗原に対する抗体と反応し、細胞分離器にかけるものである。ここで分離された前駆細胞は培養皿上で培養することが可能である。
【００１６】
膵島前駆細胞の分離の方法は基本的には培養してコロニーを選択する方法である。このなかで代表的な方法としては膵臓内の膵島に存在するネスチン陽性細胞を培養して分離するものがある。これはこの細胞はZulewskiらが報告したものであるが（Zulewski H, Abraham EJ, Gerlach MJ, Daniel PB, Moritz W, Muller B, Vallejo M, Thomas MK, Habener JF.  Multipotential nestin-positive stem cells isolated from adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic phenotypes. Diabetes. 50:521-533, 2001）、この方法では膵島を構成するインスリン分泌細胞やグルカゴン分泌細胞などの様々な細胞への分化能を有する細胞が得られる。
【００１７】
皮膚組織に存在する幹細胞も様々な方法で分離可能であるが、代表的な方法としてはTomaらの方法（Toma JG. Akhavan M. Fernandes KJ. Barnabe-Heider F. Sadikot A. Kaplan DR. Miller FD. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nature Cell Biology. 3:778-784, 2001 ）がある。この方法では細胞培養によって細胞にニューロスフェアを作製させるもので、長期間の培養によって皮膚由来幹細胞を得ることができる。
【００１８】
脂肪細胞前駆細胞は培養骨髄間葉系細胞、培養脂肪組織血管細胞、培養皮膚繊維芽細胞などをもとに、これらの細胞に脂肪細胞へ分化誘導刺激を加えることで比較的容易に作製することができる。代表的な方法はRosenmらによって記載されている（Rosenm RD, Spiegelman BM. Molecular regulation of adipogenesis Annual Review of Cell & Developmental Biology. 16:145-171, 2001.）。
【００１９】
クローン動物の作製は、ドナー細胞として体性幹細胞を用いること以外、通常のクローン動物の作製方法と同様に行うことができる。この体性幹細胞を用いたクローン動物の作製方法の一例として、以下の（１）〜（５）の工程を含む方法を挙げることができる。
【００２０】
工程（１）：この工程では、除核した卵を調製する。卵の除核は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）に記載されている方法などを挙げることができる。使用する卵は、ヒト以外の動物の卵であればどのようなものでもよいが、工程（２）で使用する体性幹細胞と同じ種類の動物の卵を用いるのが好ましい。また、除核は未受精卵に対して行うことが好ましく、特に第一極体の放出後の成熟卵に対して行うのが好ましい。
【００２１】
工程（２）：この工程では、体性幹細胞を調製する。体性幹細胞は、上述したものを使用することができ、それぞれ上述した方法によって調製することができる。体性幹細胞は、ヒト以外の動物由来のものであればどのような動物のものでもよいが、哺乳動物、例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ由来の体性幹細胞を使用するのが好ましく、特にブタ由来の体性幹細胞を使用するのが好ましい。
【００２２】
調製した体性幹細胞は、血清飢餓培養法（Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.）、接触阻止法（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）などにより、細胞周期を休止期に誘導する。
【００２３】
工程（３）：この工程では、除核した卵と体性幹細胞を融合させる。卵と体性幹細胞の融合は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気融合法、注入法などによって行うことができる。電気融合法は、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）の記載に従って行うことができ、注入法はOnishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）の記載に従って行うことができる。電気融合法による電気刺激は、体性幹細胞の核が卵に移植され、正常な胚が形成され得る範囲内であれば特に限定されないが、例えば、直流パルスであれば電圧は100〜300V/mm、時間は10〜30 μsec、回数は1〜3回とするのが好ましく、交流であれば周波数は1〜5MHz、電圧は1〜10V、時間は1〜30secとするのが好ましい。
【００２４】
融合処理後の卵には、活性化処理を行うのが好ましい。活性化処理は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気刺激や塩化ストロンチウム処理などにより行うことができる。電気刺激による活性化処理としては、電圧30〜200 V/mm、時間10〜200 μsec、1〜5 回の直流パルスを印加する方法などを例示できる。また、活性化処理は、融合処理から0〜6時間後に行うのが好ましい。
【００２５】
また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。
【００２６】
工程（４）：この工程では、融合卵を培養し、クローン胚を得る。融合卵の培養は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Betthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。培地としては、NCNU23培地、TCM199、BECM、PZM培地などを使用することができる。
【００２７】
工程（５）：この工程では、クローン胚を仮親動物の卵管あるいは子宮に移植し、クローン動物を得る。クローン胚の卵管あるいは子宮への移植は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Onishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190）やBetthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。仮親動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、体性幹細胞を採取した動物と同じ種類の動物を用いることが好ましい。クローン胚は、正常なクローン動物に生育できるものであれば特に限定されないが、１細胞期から胚盤胞期の胚を使用するのが好ましい。
【００２８】
上記のように作製されるクローン動物は、特定の疾患を示す疾患モデル動物であってもよい。この疾患モデル動物に体性幹細胞を移植し、移植後の疾患モデル動物を調べることにより、疾患に対する体性幹細胞移植の治療効果を評価することができる。ここでいう疾患としては、例えば、肝疾患、糖尿病、先天性免疫不全症、再生不良性貧血、骨形成不全症、筋ジストロフィー症、遺伝性皮膚構成蛋白異常症、ハンチントン舞踏病、神経変性疾患などを挙げることができる。
【００２９】
このような疾患は、ドナーとして用いる体性幹細胞の遺伝子改変、クローン動物への薬物投与や外科的処置などにより発症させることができる。遺伝子改変により疾患を発症させる方法は、よく知られており、当業者は公知の文献に従って適切に行うことができる。
【００３０】
具体的には、肝臓におけるフマリルアセト酢酸分解酵素遺伝子の破壊によって進行性で重傷の肝疾患モデルを作製できる（Grompe M, Lindstedt S, al-Dhalimy M, Kennaway NG, Papaconstantinou J, Torres-Ramos CA, Ou CN, Finegold M. Pharmacological correction of neonatal lethal hepatic dysfunction in a murine model of hereditary tyrosinaemia type I. Nat Genet. 10:453-460.1955）。また、糖尿病モデルとしては多くの方法があるが、例えば、PDX1遺伝子の標的破壊（Sussel L. Kalamaras J. Hartigan-O'Connor DJ. Meneses JJ. Pedersen RA. Rubenstein JL. German MS. Mice lacking the homeodomain transcription factor Nkx2.2 have diabetes due to arrested differentiation of pancreatic beta cells. [Journal Article] Development. 125(12):2213-21, 1998 ）、あるいは変異hepatocyte nuclear factor-1 alpha遺伝子の導入（Hagenfeldt-Johansson KA. Herrera PL. Wang H. Gjinovci A. Ishihara H. Wollheim CB. Beta-cell-targeted expression of a dominant-negative hepatocyte nuclear factor-1 alpha induces a maturity-onset diabetes of the young (MODY)3-like phenotype in transgenic mice. Endocrinology. 142(12):5311-5320, 2001 ）によってモデルの作製は可能である。先天性免疫不全症モデルの作製では、例えば、CD40リガンド遺伝子の改変でX連鎖性免疫不全症のモデルが作製できる（Xu J. Foy TM. Laman JD. Elliott EA. Dunn JJ. Waldschmidt TJ. Elsemore J. Noelle RJ. Flavell RA. Mice deficient for the CD40 ligand. Immunity. 1:423-431, 1994 ）。また、再生不良性貧血の一つであるファンコニ貧血のモデルは、例えば、FANCD遺伝子の標的破壊によって作製することが可能である（Chen M. Tomkins DJ. Auerbach W. McKerlie C. Youssoufian H. Liu L. Gan O. Carreau M. Auerbach A. Groves T. Guidos CJ. Freedman MH. Cross J. Percy DH. Dick JE. Joyner AL. Buchwald M. Inactivation of Fac in mice produces inducible chromosomal instability and reduced fertility reminiscent of Fanconi anaemia. Nature Genetics. 12:448-451, 1996）。筋ジストロフィー症では、ジストロフィン遺伝子の標的破壊によってモデルの作製が可能である（Araki E. Nakamura K. Nakao K. Kameya S. Kobayashi O. Nonaka I. Kobayashi T. Katsuki M. Targeted disruption of exon 52 in the mouse dystrophin gene induced muscle degeneration similar to that observed in Duchenne muscular dystrophy. Biochemical & Biophysical Research Communications. 238:492-497, 1997 ）。遺伝性皮膚構成蛋白異常症では、先天性表皮水疱症のモデルがGRIP1遺伝子の標的破壊で作製できる（Bladt F. Tafuri A. Gelkop S. Langille L. Pawson T. Epidermolysis bullosa and embryonic lethality in mice lacking the multi-PDZ domain protein GRIP1. Proc Natl Acad Sci USA. 99: 6816-6821, 2002 ）。また、同様に変異ケラチン10遺伝子の導入によって水泡性先天性魚鱗癬様紅皮症モデルの作製が可能である（Fuchs E, Esteves RA, Coulombe PA. Transgenic mice expressing a mutant keratin 10 gene reveal the likely genetic basis for epidermolytic hyperkeratosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 89:6906-6910. 1992）。また、神経疾患では、ハンチンチン遺伝子の標的破壊によってハンチントン舞踏病（ Dragatsis I. Levine MS. Zeitlin S. Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice. Nature Genetics. 26:300-306, 2000）が作製できるなど、遺伝子改変によって多種多様な疾患モデルの作製が可能である。
【００３１】
また、薬物投与により疾患を発症させる方法も、よく知られており、当業者は公知の文献に従って適切に行うことができる。例えば、４塩化炭素あるいは２−アセトアミドフルオレン（2-acetamidofluorene）の投与で肝障害モデルを作製することができる。この方法で作製した肝障害は肝臓幹細胞の増殖を観察するのに適していると考えられている。また糖尿病はストレプトゾトシン（streptozotocin）の投与で作製できる。この方法はマウス、ラットで広く利用されている方法であり、膵島の破壊を伴うモデルが作製できる。神経疾患のモデルの代表としては1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridineの投与によるパーキンソン病のモデルの作製がよく知られている。骨髄細胞の抑制による貧血などもモデルはさまざまな抗ガン剤などの投与で作製が可能である。さらに紫外線照射による皮膚への傷害モデルや様々な薬剤による皮膚傷害は皮膚疾患モデルとなりうる。
【００３２】
作製されたクローン動物には、ドナー細胞として用いた体性幹細胞と同一の体性幹細胞を移植する。この際、移植する体性幹細胞には、GFP遺伝子などのマーカー遺伝子を導入してもよい。また、移植する体性幹細胞には、疾患に対して治療効果を持つように遺伝子を改変してもよい。例えば、肝臓病、糖尿病の遺伝子改変モデルに対する幹細胞を用いた治療実験ではあらかじめ異常を生じている遺伝子異常を補正した細胞を利用する、あるいは遺伝子の機能を高めることで可能である。これは個々モデル毎に数多くの遺伝子の改変で治療が可能になる可能性があり、これらを検討することがこのモデル系を用いた研究の成果でもある。
【００３３】
動物に体性幹細胞を移植する方法はよく知られており、当業者は公知の文献に従って適切に行うことができる。例えば、Okumuraらは、唾液腺から得た肝臓の幹細胞をラットの脾臓に投与した例を報告している（Okumura K, Nakamura K, Hisatomi Y, Nagano K, Tanaka Y, Terada K, Sugiyama T, Umeyama K, Matsumoto K, Yamamoto T, Endo F Salivary gland progenitor cells induced by duct ligation differentiate into hepatic and pancreatic lineages. Hepatology. 38:104-113. 2003）。また、骨髄細胞（造血幹細胞と間葉系幹細胞を含む）を様々な方法で培養して様々な細胞を作製して静脈内へ投与した例、皮膚由来幹細胞を皮膚へ移植した例、膵臓の幹細胞から膵島を作製して、腎臓皮膜下及び皮膚へ移植した例、骨髄の造血幹細胞から神経を作製して脳へ移植した例、骨髄の幹細胞から筋肉を作製して筋へ移植した例、神経幹細胞から様々な神経細胞を作製して、脳あるいは脊髄の様々な部位に移植した例、神経幹細胞から筋を作製して筋へ移植した例、神経幹細胞から造血細胞を作製して血管へ移植した例、間葉系幹細胞から様々な細胞を作製して様々な部位へ移植した例についての報告もある。
【００３４】
移植後、体性幹細胞又はクローン動物を調べ、体性幹細胞移植の評価を行う。ここで、「体性幹細胞移植の評価」とは、主として体性幹細胞移植の有効性や安全性の評価をいい、例えば、移植した幹細胞が目的の細胞へ分化したかどうか、幹細胞が移植した組織等へ定着したどうか、幹細胞が癌化していないかどうか、移植によりクローン動物の健康状態が損なわれていないかどうか、発症させた疾患に対し体性幹細胞移植が治療効果を発揮したかどうか、幹細胞が体内のどの部分へ移動したか、といったようなことを評価することである。また、「体性幹細胞又はクローン動物を調べる」とは、前記の体性幹細胞移植の評価を行うための操作をいい、例えば、クローン動物の肉眼による観察、移植した体性幹細胞やその周辺組織の顕微鏡による観察、マーカーとなる遺伝子（例えば、癌マーカー遺伝子、特定細胞への分化の指標となる遺伝子）の発現の検出などをいう。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の体性幹細胞移植の評価方法により、従来の移植評価方法では困難であった複数実験区の設定や反復的な実験が可能になり、より的確な移植の評価が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
〔実施例１〕  ドナー細胞の調製
核移植のドナー細胞としては、唾液腺幹細胞、胎児繊維芽細胞、卵管由来繊維芽細胞の３種類の細胞を用いた。採取した細胞は、継代培養した後、凍結保存し、核移植操作前に解凍した。解凍した細胞は、血清飢餓培養法及び接触阻止法により、細胞周期を休止期に誘導した。細胞の採取、継代培養、凍結保存、血清飢餓培養、接触阻止は、以下の通り行った。
【００３８】
唾液腺幹細胞の採取
離乳後約２週間目のブタ（LWD《ランドレス・デュロック》種、生後4〜5週、雄、7-10 kg）を、硫酸アトロピン、ストレスニル、ケタラール麻酔下に大腿動脈を切断して脱血し、仰臥位に固定した。下顎から頚部を正中切開し顎下腺を摘出した。採取した顎下腺は氷冷したウイリアムズE培地（FBS無添加）へ保存し、直径約1.5 cm、約2-4gの大きさに細切した。
滅菌はさみで唾液腺を1-2 mm大に細切した。50 ml遠心管に入れたEGTAバッファー20mlに懸濁して、37℃で20分間、10回／分の速度で回転震盪した。組織細片液は遠心 (100 xg、５分、室温)し、上清は捨てた。ペレットをコラゲナーゼ(collagenase)/ヒアルロニダーゼ(hyaluronidase)バッファーに懸濁し、37℃で40分間、回転震盪した。100 xg、５分、室温にて遠心分離し、ペレットをディスパーゼ液に懸濁し、37℃、60分間、回転震盪した。懸濁液を細胞濾過器にかけ、遠心(100 xg、５分、室温)した。細胞ペレットをウイリアムズE培地に懸濁し、同培養液で３回洗浄した。
上記の細胞ペレットを維持培養液に懸濁し細胞数を計測した。細胞浮遊液をＩ型コラーゲンコート培養皿(IWAKI)に5x105 〜1x106cells/ 100mm dish の細胞密度で播種し、初代培養を開始した。培養液交換は初回を36時間目に行い、以降は5日毎に行った。
この培養によって増殖してくる紡錘型細胞が唾液腺幹細胞である。
【００３９】
胎児繊維芽細胞の採取
妊娠２５日齢のデュロック種の胎児をハサミにより細断し、PBS(-)で洗浄した。これを1200rpmで５分間遠心処理し、沈殿を採取した。この沈殿に0.25%トリプシン（0.01% EDTA添加）を加え５分間静置した。続いて400rpmで５分間の遠心処理し、上清側に集まった細胞を採取した後に15%ウシ胎児血清（FCS）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）に懸濁した。上記のトリプシン処理からの過程をもう一度繰り返し、最後に1200rpmで５分間遠心処理して得られた沈殿を5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより培養した。
【００４０】
卵管由来繊維芽細胞の採取
雌ブタ（LW種、６ヶ月令）の採卵時に得られる卵管灌流液から卵管由来組織を採取した。卵管灌流液を1200rpmで５分間遠心処理し、沈殿を採取した。この沈殿に0.05%トリプシン（0.01% EDTA添加）を加え５分間静置した。その後沈殿を10%ウシ胎児血清（FCS）を添加したDMEMに懸濁し、1000rpmで５分間遠心処理して得られた沈殿を5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより培養した。
【００４１】
胎児繊維芽細胞及び卵管由来繊維芽細胞の継代培養
培養液は、胎児繊維芽細胞については15%ウシ胎児血清、卵管由来繊維芽細胞については10%ウシ胎児血清を添加したDMEMを用いた。また、細胞培養は5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより行った。細胞が培養ディッシュの７〜９割に達した時点で0.1%トリプシン（0.01% EDTA添加）により処理し、剥離した細胞を1000rpmで５分間の遠心処理により回収、得られた細胞を新しい培地に移し、再び培養した。
【００４２】
細胞の凍結保存及び解凍
凍結液は10%ジメチルスルフォキシド（DMSO）を添加した培養液を用いた。培養ディッシュの７〜９割に達した時点で0.1%トリプシン（0.01% EDTA添加）により処理し、剥離した細胞を1000rpmで５分間の遠心処理により回収した。細胞濃度を1×106/mlになるように調整し、氷中で冷やした凍結液に懸濁した。これを凍結用チューブに分注し、緩慢凍結法（−20℃で30分、−80℃で一晩）を行った後、液体窒素中に保存した。
解凍は38℃の恒温槽で行い、解凍した細胞を培養液で10倍希釈した。これを1000rpmで５分間遠心処理し、得られた沈殿を5%CO2、37.5℃でインキュベーターにより培養した。
【００４３】
血清飢餓培養
細胞が培養ディッシュの８割程度に達した時点で培養液を0.5% FCSを添加したDMEMに置き換えて２〜５日培養した。
【００４４】
接触阻止法
細胞が培養ディッシュの底面を埋め尽くした時点から、１〜１０日間培養を継続した。またこの期間、３日おきに新鮮なDMEMと交換した。
【００４５】
〔実施例２〕  レシピエント卵の調製
レシピエント卵は、ブタ（LW種、ＬＷＤ種、６ヶ月令）の卵巣から採取した卵を体外で培養して成熟させ、その後、核を取り除くことにより調製した。体外培養、除核は以下の通り行った。
【００４６】
体外培養
食肉工場から得た卵巣を0.2% 臭化セチルトリメチル  アンモニウム（CETAB）、続いてPBS(-)-PVAで３回洗った後、38.5℃の恒温槽で待機させた。卵巣は、75μg/mlペニシリンG、50μg/ml硫酸ストレプトマイシン、0.1%ポリビニールアルコールを添加したダルベッコPBS（PBS(-)-PVA）内に入れ、24〜30℃に加温した状態で食肉工場から輸送してきた。
ホットプレートにより38.5℃に加温した状態で、20ゲージの注射針と５mlシリンジを使い、直径３〜６mmの卵胞から卵胞液ごと卵を吸引した。得られた卵胞液を800rpmで２分間遠心処理することにより、卵を沈殿させた。この沈殿をTL-Hepes-PVPに懸濁させ、顕微鏡下で卵丘細胞が多量付着しており、かつ卵の細胞質が正常な卵丘卵子複合体を選別した。選別した卵丘卵子複合体を、NCSU23に0.6mMシステイン、10μg/ml上皮増殖因子（EGF）、10%ブタ卵胞液、75μg/mlペニシリンG、50μg/ml硫酸ストレプトマイシン、10IU/mlウマ絨毛性ゴナドトロピン（eCG）、10IU/mlヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を添加したNCSU23培養液で5%CO2、38.5℃でインキュベーターにより培養した。培養開始から22時間後にホルモンを除いたNCSU23に移し変え、さらに22時間培養した。
培養を終了した卵を0.01%ヒアルロニダーゼで処理した後、TL-Hepes-PVPのドロップ内においてピペッティングにより卵丘細胞、顆粒層細胞を除去した。これにより卵の透明帯が露出し、顕微鏡下での観察や操作が容易となる。次に、成熟卵の特徴である第一極体の放出を起こした卵のみを選別した。また、この際に死んだ卵および細胞質の形状がいびつな卵などは排除した。
【００４７】
除核
除核は、7.5μg/mlサイトカラシンB、10%ウシ胎児血清（FCS）を添加したTL-Hepes-PVP内の卵の第一極体周辺の細胞質を吸引することにより行った。細胞質の吸引には、先端が鋭角の口径30μmのピペットを用いた。
除核が正常に行われたかどうかは、ヘキスト染色により確認した。即ち、除核処理後の卵を、5μg/mlヘキスト33342を添加したTL-Hepes-PVPドロップ内に５分間入れて染色し、その後、蛍光顕微鏡で卵内を観察した。ヘキスト33342はDNAに結合する蛍光色素なので、除核されていなければ卵内に染色体が観察される。
【００４８】
〔実施例３〕  核移植
レシピエント卵の囲卵腔にドナー細胞を挿入し、卵とドナー細胞を融合させた後、活性化処理と倍数体化処理を行った。細胞融合、活性化処理は、以下のように行った。
【００４９】
細胞融合
レシピエント卵は10%ウシ胎児血清（FCS）添加のTL-Hepes-PVPのドロップ内、ドナー細胞は0.1%トリプシン（0.01% EDTA添加）により剥がした後10%ウシ胎児血清（FCS）添加のNCSU23-Hepes（NCSU23に21mM Hepesを添加）のドロップ内に入れて待機させた。先端が鋭角の口径30μmのピペットを用いて、除核の際にできた透明帯の穴からマイクロマニュピレーションによりレシピエント卵の囲卵腔にドナー細胞を挿入した。
細胞挿入された卵を細胞融合用マンニトール液（0.3Mマンニトールに50μM塩化カルシウム、100μM塩化マグネシウム、0.01%ポリビニールアルコールを添加）のドロップに入れ、卵と囲卵腔に挿入された細胞の接触面が電流に対して垂直になるように電極で挟んだ。
続いて、細胞融合装置（島津製作所製 SSH-1）により細胞融合を行った（交流1MHz、5V、5sec、直流200V/mm、10μsec、１回）。また、融合20分後に顕微鏡下で観察し、細胞融合が起きなかった卵については再度細胞挿入を行った。
【００５０】
活性化処理
細胞融合から1〜1.5時間後に、スライドグラス上に平行に置かれた電極間（幅１mm）に活性化用マンニトール液（0.3Mマンニトールに50μM塩化カルシウム、100μM塩化マグネシウム、0.01%ポリビニールアルコールを添加）のドロップを作り、このドロップ内に融合卵を顕微鏡下で一列に並べた。この際、卵が他の卵や電極に触れないように注意した。続いて、細胞融合装置（島津製作所製 SSH-1）により電気刺激を与えて融合卵の活性化を行った（直流100V/mm、100μsec、１回）。活性化された卵は第二極体の放出をするので、その前に5μg/mlサイトカラシンB、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）を添加したNCSU23に移し、３時間培養することで極体放出抑制処理を行った。
【００５１】
〔実施例４〕  胚の培養
活性化および倍数体化処理を行った融合卵は、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA）を添加したNCSU23内で5%CO2、38.5℃でインキュベーターにより体外培養し、発生能の評価を行った。なお、体外培養開始から96時間後に、卵を培養しているドロップに濃度が10%になるようにウシ胎児血清（FCS）を添加した。
【００５２】
発生能の評価は、正常分割率、胚盤胞形成率、胚盤胞の平均細胞数の３項目について行った。各項目の評価方法は、以下の通りである。
【００５３】
正常分割率
活性化処理から４８時間後の融合卵を観察し、２〜８細胞に分割している卵（正常卵）の全体に占める割合を正常分割率とした。
【００５４】
胚盤胞形成率
活性化処理から１６８時間後の融合卵を観察し、胚盤胞にまで発達している卵の全体の占める割合を胚盤胞形成率とした。
【００５５】
胚盤胞の平均細胞数
胚盤胞をスライドグラスにマウントし、カバーグラスで押さえた状態で酢酸メタノール（酢酸：メタノール＝1：3）に48時間浸して固定した。固定が終了した卵は1%アセトオルセイン溶液で20分染色し、その後観察しやすいようにアセトグリセロール（酢酸：グリセロール：滅菌水＝1：1：3）で洗った。その後、乾燥を避けるためカバーグラスの周囲をマニキュアで封入し、顕微鏡下で観察して細胞数を数えた。以上の細胞数の計測を、活性化処理から１６８時間後に確認されたすべての胚盤胞について行い、その平均値を胚盤胞の平均細胞数とした。
【００５６】
以上の結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
表１に示すように、唾液腺幹細胞をドナー細胞として用いることにより、胚盤胞の形成率（正常発生の指標）が３倍以上になった。また、胚盤胞の細胞数も著しく増加しており、これはクローン胚の質が向上したことを意味するものと考えられる。
【００５９】
以上のようにして得られたクローン胚を、公知の方法に従って仮親となるブタの卵管又は子宮に移植することにより、クローンブタを得ることができる。
【００６０】
このクローンブタに、前記の唾液腺幹細胞を移植し、移植した細胞やその周辺組織を顕微鏡で観察することなどにより、この唾液腺幹細胞移植の有効性及び安全性を評価することができる。