(57)【要約】【課題】  医療用材料の適正評価法において、医療用材料の狭小化、生体内成分の使用量の少量化、および簡易で簡便な操作性を同時に満たす評価法の提供を目的とする。【解決手段】  生体内成分と接触する部分に用いられる材料を塗布した平板を用いて、前記材料の生体適正を評価する方法であって、前記材料を塗布後の平板の平面度と平行度が、いずれも０．１ｍｍ以下になるように前記材料を平板に塗布し、この平板に細胞浮遊液を接触させた後、細胞浮遊液を除去し、これを光学的手段により分析して、前記材料への細胞の付着性または細胞種選択性からなる相互作用を評価することを特徴とする材料の生体適正評価方法。【選択図】  図１。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内成分と接触する部分に用いられる材料を塗布した平板を用いて、前記材料の生体適正を評価する方法であって、前記材料を塗布後の平板の平面度と平行度が、いずれも０．１ｍｍ以下になるように前記材料を平板に塗布し、この平板に細胞浮遊液を接触させた後、細胞浮遊液を除去し、これを光学的手段により分析して、前記材料への細胞の付着性または細胞種選択性からなる相互作用を評価することを特徴とする材料の生体適正評価方法。
【請求項２】
細胞浮遊液を除去後、細胞を染色することによって材料と細胞との相互作用を評価することを特徴とする請求項１記載の材料の生体適正評価方法。
【請求項３】
細胞を染色する方法が、ヘマトキシリン染色、メイ・グリュンワルド染色法、ペルオキシダーゼ染色法、エステラーゼ染色法、ＰＡＳ染色法、アルカリホスファターゼ染色法、鉄染色法および蛍光免疫染色法から選ばれた染色方法であることを特徴とする請求項２記載の材料の生体適正評価方法。
【請求項４】
平板が、顕微鏡用スライドガラスであることを特徴とする請求項１記載の材料の生体適正評価方法。
【請求項５】
平板上に、少なくとも生体内成分と接触する部分に用いられる材料が枠内に含まれるように枠を配置し、枠内に細胞浮遊液を導入して前記材料と接触させた後、細胞浮遊液を除いた後に枠を取り除く工程を含むことを特徴とする請求項１記載の生体適正評価方法。
【請求項６】
細胞浮遊液が白血球濃縮液であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体適正評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマテリアルあるいは生体適合性材料などで言うところの医療用材料の適正を、細胞との相互作用により評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液透析器、輸血用白血球吸着除去フィルター、人工血管などの医療用具は、いわゆる医療用材料から構成されている。これらの医療用材料は、生体内の様々な成分との相互作用が重要で、生体適合機能、血液適合機能、抗血栓機能、免疫機能、薬理・生理活性機能など、使用する医療用具に応じてより適切な機能が要求される。医療用材料に求められる性質は益々高度になり、研究開発自体の高度化のみならず迅速化も要求されるところである。
医療用材料の適正は、医療材料自身の機械的特性の他、医療用材料表面が様々な生体内の成分とその表面で接触する実施態様から、医療用材料表面が生体内成分に対して有する機能によって判断される。
【０００３】
したがって、医療用材料の開発プロセスでは、上記の機能を賦与するための表面加工処理が実施される場合が多い。例えば、化学的な酸化、スルホン化などによる官能基付加、電子線照射、コロナ放電処理、プラズマ処理、グラフト重合法によって表面改質される場合もある。また機能を賦与する手段の一つに、ポリマーを被覆する手法もある。
医療用材料の適正を評価するために用いられる生体内成分には細胞が含まれている場合が多く、特に血液細胞は、血液適合機能や抗血栓機能などを支配するため、適正評価には欠かせない生体内成分である。
上記のように、医療用材料の適正評価は、医療用材料と生体内成分に含まれる細胞を接触させることにより生じる相互作用の結果をもって評価するものであり、この“相互作用”には、材料と細胞の粘着、凝集、変性、活性化など、さまざまな原因が複雑に関係するため、他のモデル評価法で代用することができず、適正評価に生体内成分を用いることは不可欠の手段である。
【０００４】
しかし、その一方で、例えば、生体内成分であるヒトの細胞の入手や取り扱いには様々な困難がある。例えば、血液細胞の場合、医療に不可欠な血液製剤を研究目的で多量に入手することは極めて困難であり、仮に入手できたとしても、血液製剤は、含有成分量や保存日数などが必ずしも同じではないため個体差が大きく、この個体差が材料評価結果を変動させる可能性がある。さらにヒトの細胞を取扱う際には、必ず感染の危険性が伴う。たとえ梅毒、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）、ＡＩＤＳなどの病原体の検査がなされ、陰性の血液製剤の場合にも、未知の病原体や、いわゆるウインドウピリオドの観点から感染の危険性は、依然、存在する。
【０００５】
従来技術には、ビーズ状の医療用材料を詰めたカラム中に血液細胞を流し、カラムに流す前後で血液剤細胞中の血小板数を計測し、その数の差から粘着した血小板数を求めて適正を評価する方法、平行板フローチャンバー内に血液細胞を流し、洗浄、固定、染色など、血球の固定染色の操作を行うことにより血小板や白血球などの粘着を測定して適正を評価する平行板フローチャンバー法などが知られている（例えば、特許文献１参照）。
しかしながら、これらの従来技術は、いずれも臨床検体の血液細胞機能検査など、血液細胞を評価するための技術であり、医療用材料の適正を評価するものとしては、医療用材料の部分が大きく、血液細胞の使用量も多いという問題がある。
【０００６】
Ｔａｋｅｍｏｔｏらは、セルロースフィルム上に各種の蛋白質を表面コートし、血小板と白血球の懸濁液と反応させ、それらの付着性をｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＳＥＭ）で観察し、血球計数装置にて細胞数を計数している（例えば、非特許文献１参照）。
この方法によれば、医療用材料の部分が狭小化され、血液細胞の使用量も少量で済むが、ＳＥＭによる測定は非常に煩雑で高度な技術が必要な上、高額な費用がかかるため、簡易で簡便な適正評価法とは言えない。
すなわち、医療用材料の適正評価法において、医療用材料の狭小化、生体内成分の使用量の少量化、および簡易で簡便な操作性を同時に満たす評価法は実現されていないのである。  
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−２２１３３７号公報
【非特許文献１】ＡＳＡＩＯ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、３５巻、ｐ３５４―３５６、１９８９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、医療用材料の適正評価法において、医療用材料の狭小化、生体内成分の使用量の少量化、および簡易で簡便な操作性を同時に満たす評価法の提供を目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、生体と接触する部分に用いられる材料の生体適正を評価する方法として、表面が評価に供する材料で被覆され、平面度と平行度が、いずれも０．０５ｍｍ以下である前記材料からなる平板に細胞浮遊液を接触させ、次いで、細胞浮遊液を除去し、接触前後の該材料と細胞との相互作用を評価することからなる材料の生体適正評価方法を発明するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）  生体内成分と接触する部分に用いられる材料を塗布した平板を用いて、前記材料の生体適正を評価する方法であって、前記材料を塗布後の平板の平面度と平行度が、いずれも０．１ｍｍ以下になるように前記材料を平板に塗布し、この平板に細胞浮遊液を接触させた後、細胞浮遊液を除去し、これを光学的手段により分析して、前記材料への細胞の付着性または細胞種選択性からなる相互作用を評価することを特徴とする材料の生体適正評価方法。
（２）  細胞浮遊液を除去後、細胞を染色することによって材料と細胞との相互作用を評価することを特徴とする（１）に記載の材料の生体適正評価方法。
（３）  細胞を染色する方法が、ヘマトキシリン染色、メイ・グリュンワルド染色法、ペルオキシダーゼ染色法、エステラーゼ染色法、ＰＡＳ染色法、アルカリホスファターゼ染色法、鉄染色法および蛍光免疫染色法から選ばれた染色方法であることを特徴とする（２）に記載の材料の生体適正評価方法。
【００１１】
（４）  平板が、顕微鏡用スライドガラスであることを特徴とする（１）に記載の材料の生体適正評価方法。
（５）  平板上に、少なくとも生体内成分と接触する部分に用いられる材料が枠内に含まれるように枠を配置し、枠内に細胞浮遊液を導入して前記材料と接触させた後、細胞浮遊液を除いた後に枠を取り除く工程を含むことを特徴とする（１）に記載の生体適正評価方法。
（６）  細胞浮遊液が白血球濃縮液であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれか１つに記載の生体適正評価方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、医療用材料の適正評価法において、医療用材料の狭小化、生体内成分の使用量の少量化、および簡易で簡便な操作性が同時に満たされる。その結果、医療用材料を用いた医療器具などの設計開発において、時間およびコストの節約に効果をもたらすと共に、同時に多数の材料を評価する、いわゆるコンビナトリアル・ケミストリーのような技術分野で活用することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明について、以下、詳細に説明する。
本発明の、生体と接触する部分に用いられる材料（以下、評価に供する材料、という）で表面が被覆された平板（以下、被覆平板、という）の平面度と平行度は、いずれも０．１ｍｍ以下であり、好ましくは、いずれも０．０５ｍｍ以下である。平行度と平面度が０．１ｍｍよりも大きくなると、被覆平板と細胞の相互作用を光学的手段によって分析する際に焦点が定まりにくく困難になる。
本発明において、評価に供する材料を被覆するのに用いる平板は、具体的には、顕微鏡用スライドガラス、顕微鏡用カバーガラス、板ガラス、プラスチック板などが挙げられる。
【００１４】
評価に供する材料は、医用・医療機器に用いられるもので、医用・医療用機器に成形加工可能なものであり、例えば、合成高分子化合物、天然高分子化合物、無機化合物などをあげることができる。
合成高分子化合物としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスルホン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメトキシエチルアクリレート、メタクリロイルホスフォリルコリンを含む共重合ポリマー、ポリウレタンなどがあげられ、天然高分子化合物には、セルロース（その誘導体を含む）、キチン、キトサン、アルギン酸塩などがあげられる。
【００１５】
評価に供する材料が成型加工可能な医用・医療用機器は、診断や治療といった臨床医学のみならず、分子生物学、細胞生物学、免疫学、生化学等の基礎医科学の研究に用いられる機器や器具も含む。例えば、透析用医療器具および医療機器、輸血用白血球除去フィルター、血漿分離膜、人工血管、人工骨、人工皮膚、あるいは各種細胞の培養・分離・保存などを用途とする容器等の器具である。該材料は、成型加工可能な医用・医療用機器において、必ずしも主成分である必要はなく、混合物や添加物であってもよい。
被覆平板の製造法の一例を説明する。
被覆平板の製造に際して、平板をあらかじめ化学的な酸化、スルホン化などによる官能基付加、電子線照射、コロナ放電処理、プラズマ処理、グラフト重合法などによって表面改質することが好ましい。簡便に材料を被覆する方法として、評価に供する材料の溶液に平板を浸漬する方法およびスピンコーターを用いる方法をあげることができる。これらの方法を用いる場合、真空乾燥などによって、評価に供する材料の溶媒を完全に除去する必要がある。いずれにしろ、被覆平板の平面度と平行度は、いずれも０．１ｍｍ以下を充足できる組み合わせを選定する必要がある。
【００１６】
平面度は、ＪＩＳ  Ｂ０６１０のろ波最大うねり（ＷＣＭ）の方法によって、ＪＩＳ  Ｂ０６５１に規定する表面粗さ測定器を用いて測定する。平行度は、最小読取値が０．００１ｍｍの測厚器を用いて厚さの最大値と最小値の差で測定する。
次に、本発明に用いられる生体内成分としての細胞浮遊液について説明する。
本発明において、細胞とは、ヒトから採取した細胞のことである。代表的なものとして血液細胞が挙げられる。その他、各種臓器由来の組織細胞、各種臓器由来の組織培養細胞、癌細胞などが挙げられる。細胞浮遊液とは、浸透圧および緩衝作用を使用する細胞にとって適切な条件で調製した溶液中に、医療用材料の使用目的に応じた存在頻度で細胞を浮遊させた液のことである。
【００１７】
赤血球、白血球および血小板を含む血液細胞の場合、採血によって血液、すなわち、細胞浮遊液が得られる。該材料と細胞との相互作用をできる限り小規模で効率良く行うために、細胞浮遊液は遠心分離などによって、異なる細胞種の比率をあまり差の無いようにしておくことが好ましい。
血液の場合、血中の他の血球と比べて存在比の小さい白血球を濃縮し、存在比の大きい赤血球を減少させ、調整することが好ましい。例えば、健康な男性の末梢血の場合、赤血球は４４０〜５４０万個／ｍｍ３、白血球は４千〜５千個／ｍｍ３、血小板は１２万〜３８万個／ｍｍ３存在する。すなわち、白血球は、赤血球の約１０００分の１の存在比である。したがって、健常人末梢血を用いる場合、好ましくは白血球数に対し赤血球数を１０分の１〜１０００分の１、より好ましくは１００分の１〜１０００分の１に調整して用いられる。このような細胞の調整には、細胞の比重の違いを利用した遠心分離法により容易に作製することができる。
【００１８】
本発明の医療用材料の適正評価方法は以下のとおりである。
本発明によると、先ず、被覆平板と細胞浮遊液を接触させることが必要である。接触させるために、平板上に、一時的に、評価に供する材料と細胞浮遊液を接触させるための枠を設けることが好ましい。枠として、例えば、内径６ｍｍφ、外径８ｍｍφの金属管などを用いることができる。評価に供する材料を少なくとも枠内に存在するよう、平板上に上記の金属管を金属管の管方向が平板表面に垂直になるように設置する。このような方法によれば、金属管を複数個、設置することにより、複数の細胞浮遊液について、適正評価を一度に行うことが可能となる。
【００１９】
平板と細胞浮遊液との接触条件は、医療材料の仕様範囲内で温度、時間などを任意に決定する。
被覆平板と細胞浮遊液を接触させた後、未付着の細胞を含む細胞浮遊液と枠を取り除き、引き続き、光学的手段を用いた分析を行うための工程を実施する。
光学的手段としては、通常の光学顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光顕微鏡などによる鏡検、ＣＣＤカメラを付属させた画像解析システムを利用する。
光学的手段を用いた分析に際して、前以て、被覆平板上に残存している細胞を染色することが好ましい。染色法としては、ヘマトキシリン染色、メイ・グリュンワルド染色法、ペルオキシダーゼ染色、エステラーゼ染色、ＰＡＳ染色、アルカリホスファターゼ染色、鉄染色、蛍光免疫染色法などが採用される。
【００２０】
評価の対象となる材料と細胞との相互作用の評価は、被覆平板上に残存する細胞の付着形態または細胞選択性によりおこなう。もちろん、両者を併用しておこなってもよい。
細胞の付着形態は、細胞の個数、凝集、活性化状態などによって現れる。活性化状態とは、例えば、血小板の場合、通常の細胞の円形の形ではなく、突起を持った輪郭を形成することである。このような材料と細胞の相互作用の結果は、光学的手段により、材料の仕様目的に応じて、生体適性評価される。
細胞選択性とは、例えば、赤血球、白血球、血小板からなる細胞浮遊液を該被覆平板と接触させた結果、白血球のみが選択的に付着されるという現象であり、このような特性は、特定の細胞を分離するための材料などに有用な評価項目となる。
【００２１】
材料の適正評価は、通常、比較サンプルとの相対比較によりおこなわれるが、これに限定されるものではない。比較サンプルとは、評価に供する材料の対象となるもののことで、本発明の評価技術の利用目的に応じて選択されるべきものである。例えば、未被覆の平板が比較サンプルとして用いられる。別の例として、ある組成の共重合ポリマーを基準の比較サンプルとし、組成比のみを様々に変化させた材料を評価に供するといった選択がなされる。
【実施例】
【００２２】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【００２３】
[実施例１、参照例１および参照例２]
材料の白血球付着性を評価する目的で、材料には３−ヒドロキシプロピルメタクリレートと２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートの種々のモル比率で重合したポリマーを用い、これらの材料を表面に有する平板に対する血液細胞の相互作用を評価した。
各ポリマーは、エタノール溶媒にて、それぞれ２重量％濃度溶液に調製し、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ  ＳＰＩＮＣＯＡＴＥＲ  １Ｈ−Ｄ７；ミカサ社製、日本国）にて顕微鏡用スライドガラスに被覆した。
【００２４】
健常人から採血を行い、直ちに抗凝固剤ヘパリン（血液１ｍｌあたり１ＩＵ）の入った試験管に移した。白血球濃縮液は、遠心（２１０ｘｇ，１０分）を行い、赤血球画分である下層部分の約７割を残し、血小板，血漿および白血球画分を含む上層部分を回収して得た。得られた白血球濃縮液は、血球測定装置（ＭＡＸＭ Ａ／Ｌ−Ｒｅｔｉｃ；ベックマンコールター社製、米国）にて白血球数を計数し、リン酸塩バッファーにて白血球数が約１００万個／ｍｌになるように調製し、白血球調製液とした。
ポリマーを被覆したスライドガラス１枚に、内径６ｍｍ、外径８ｍｍ、長さ１５ｍｍの金属管３個を置いて枠を作った。そこへ、上記の白血球調製液を金属管１個につき１００μｌずつ入れて室温にて１時間、静置して接触反応を行った。その後、未付着の細胞を含む白血球調製液を取り除き、金属管全てを除いた後、リン酸塩バッファーでスライドガラスを洗浄した。
【００２５】
風乾したスライドガラスは、メイ・グリュンワルド染色を行い、赤血球と白血球種の識別を顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０；オリンパス社製、日本国）にて行った。白血球高粘着性のポリマー種について、倍率１００倍の顕微鏡写真を図１に示す。
参照例として、ポリマー被覆をしていないスライドガラスに白血球調製液との接触反応を行い、以下、実施例１と同様の操作を行った参照例１（図２）、ポリマー被覆をしていないスライドガラスに白血球調製液をスメアし、実施例１と同様にメイ・グリュンワルド染色を行った参照例２（図３）を示す。実施例１では、白血球高粘着性であったのに対し、参照例１のポリマー被覆をしていないスライドガラスでは、血球をほとんど粘着しない。また、参照例２の図３から、血液試料に用いた白血球調製液には、赤血球が高頻度で存在したことが分かる。つまり、実施例１に示した白血球高粘着性ポリマーは、白血球選択性を有していたことが分かる。図２、図３および図４はいずれも、顕微鏡倍率１００倍の結果である。
【００２６】
[比較例１]
スライドガラスの代わりにポリプロピレン製フィルムを平板に用い、以下、実施例１と同様に接触反応を行った。結果を図４に示す。この平板は、平面度および平行度が０．1ｍｍを越えるため、実施例１のような光学的な血球の識別が不可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、医療器具など、医療材料の開発の分野おいて好適に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１の顕微鏡写真。
【図２】参照例１の顕微鏡写真。
【図３】参照例２の顕微鏡写真。
【図４】比較例１の顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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