(57)【要約】【課題】  ウイルス感染、特に、フィロウイルスに代表されるムチン型糖タンパク質を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性診断のための方法およびキットを提供することを目的とする。【解決手段】  ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性を診断する方法であって、ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）の３５番アミノ酸の多型、典型的には当該アミノ酸のＡｒｇ/Ｃｙｓ多型を検出する方法。【選択図】図１
2005185235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）遺伝子のエクソン３においてｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＣＧＣ（Ａｒｇ）とＴＧＣ（Ｃｙｓ）との間の一塩基多型を検出するための、
１）少なくとも一種のプライマーおよび／またはプローブ；または
２）少なくとも一種の制限酵素
を含むことを特徴とする、前記一塩基多形検出用キット。
【請求項２】
前記キットが、ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性を診断するために用いられる、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記プライマーまたはプローブが、ｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドンを含むｈＭＧＬ遺伝子エクソン３内の少なくとも２０以上の連続した塩基配列またはそれに相補的な配列からなる請求項１または２に記載のキット。
【請求項４】
前記制限酵素が、ＢｓｒＢ１である請求項１または２に記載のキット。
【請求項５】
前記ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスがエボラウイルスである、請求項２乃至４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトを含む哺乳動物個体のウイルス感染に対する感受性診断のための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
フィロウイルス
霊長類に対するフィロウイルス感染症は、他の出血熱ウイルスによるものと比べても、極めて重篤な出血兆候と高い死亡率を示す。該感染症を引き起こすフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスにおいては、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）とエボラ（Ｅｂｏｌａ）の２つの属が知られており、更に後者は４つの種、すなわち、ザイール（Ｚａｉｒｅ）、スーダン（Ｓｕｄａｎ）、アイボリー・コースト（Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ）およびレストン（Ｒｅｓｔｏｎ）を含む。４種のうちでは、ザイール種が最も強毒性と考えられており、感染者の約９０％が死亡したことも報告されている（１９７６年のザイール（現コンゴ）とスーダンの流行では、発病した５００名中４３０名が死亡）。該ウイルスによる感染症の経過について、感染後の潜伏期は４〜１６日であり、発病後直ちに、頭痛や背腰痛が始まる。発病後２日目前後には高熱、眼球結膜炎、咽頭炎、咳を伴う胸痛などが生じ、ついで、嘔吐や下痢の症状にたり、時に血便〜タール便となることもある。患者は急速に脱水状態に陥り、５乃至７日目から歯肉、鼻、膣、皮下等からの出血、吐血、下血等の出血傾向がみられるほか、かゆみのない斑丘疹性の発疹が全身性に現れる。患者の約半数は発病後４乃至１０日目に強い中毒症状と播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を呈して死亡するが、もちこたえれば３週目以後、回復する。
【０００３】
このような背景から、エボラウイルス感染症、すなわち、エボラ出血熱は、厳重な隔離治療を要する国際伝染病とされている。なお、レストン種は、非ヒト霊長類の実験において、エボラのほかの種に比べて病原性が弱いことが報告されており、実際に、ヒトにおける症候性の感染は確認されていない。
【０００４】
分子生物学的に、フィロウイルスは、エンベロープを有する非分節性１本鎖（−）極性のＲＮＡウイルスであり、少なくとも７種の構造タンパク質を含む。それら全てのタンパク質は、モノシストロン性ポリアデニル化ｍＲＮＡ転写体から翻訳される。フィロウイルスゲノムの３’末端から４番目の遺伝子は、エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）をコードしており、ウイルスの宿主細胞膜に対する受容体結合および融合に関与していると考えられている（非特許文献１および２）。当該遺伝子からは、エンベロープＧＰと非構造性の分泌型糖タンパク質が発現される（非特許文献３および４）。これらの糖タンパク質は、高度にグリコシル化されており、Ｎ−結合型糖鎖およびＯ結合型糖鎖（ムチン型糖鎖）を有するが、該糖鎖においては、ウイルス種および該ウイルスの増殖に用いた細胞株の相違に依存して、末端シリル化のパターンが異なる（非特許文献５）。
【０００５】
前記フィロウイルスの感染に関する近年の研究は、樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３接着性ノンイテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）または肝臓／リンパ節特異的ＩＣＡＭ−３接着性ノンイテグリン（Ｌ−ＳＩＧＮ）が、該ウイルスの感染において重要な役割を担っていることを明らかにした。すなわち、非特許文献６乃至９は、ＤＣ−或いはＬ−ＳＩＧＮが細胞表面に過剰発現された場合に、それらの分子が、高度にグリコシル化されたエボラＧＰを認識し、更に該ウイルスの偽タイプおよび真性ウイルスによる感染を促進することを示した。とりわけ、ウイルスのＧＰに結合した高マンノース型Ｎ−グルカンが、ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮのようなレクチンとの相互作用において重要であると考えられている（非特許文献１０）。
【０００６】
ＭＧＬ
マクロファージおよびミエロイド由来の関連細胞群は、ガレクチン−３（ｇａｌｅｃｔｉｎ−３）、シアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）、マンノース受容体等の細胞表面または可溶性糖タンパク質を認識する多様なレクチン類を発現していることが知られている。マクロファージ上のこれらのレクチンは、細胞間接着、造血新生、エンドサイトーシス、および壊死した細胞や分子の清掃に関与している。マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ＭＧＬ）は（非特許文献１１）、上記のレクチンの１種であり、マクロファージおよび未成熟樹状細胞上に発現する２型膜貫通型タンパク質である。本発明者等は、先に、マウスにおいて該レクチンをクローニングしており（非特許文献１２および１３)、更にその遺伝子産物（スプライシングバリアントを含む）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ガラクトース末端性糖タンパク質のエンドサイトーシスに関与していることを報告している（非特許文献１４および１５）。
【０００７】
また、ヒトＭＧＬ（ｈＭＧＬ）も同定されており、やはりこのレクチンも、Ｏ結合型のガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミンを有する糖鎖（すなわち、ムチン型糖鎖）を特に強く認識する。ヒトにおいて、このタンパク質は、単球由来の未成熟樹状細胞およびマクロファージ上で発現し、ガラクトシル化された糖タンパク質抗原のエンドサイトーシス受容体として機能することが報告されている（非特許文献１２および１６）。
【０００８】
加えて、非特許文献１６は、ｈＭＧＬの細胞内領域に位置し膜貫通ドメインに隣接する３５番目のアミノ酸がアルギニン（Ａｒｇ）からシステイン（Ｃｙｓ）となるようなＳＮＰの存在を明らかにしている。すなわち、当該タンパク質をコードするｈＭＧＬ遺伝子内のエクソン３において、前記アミノ酸に対応するコドンが、ＣＧＣ（Ａｒｇ）からＴＧＣ（Ｃｙｓ）となるようなＳＮＰの存在が確認されている。
【０００９】
上記ｈＭＧＬは、これまでのところ、マクロファージ上でのガラクトース／Ｎ−アセチルガラクトサミンに特異的な唯一のＣ型レクチンであり、前記ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＬ−ＳＩＧＮとは異なるリガンド特異性を示すことが確認されている（非特許文献１２）。
【００１０】
しかしながら、ＭＧＬとウイルス糖タンパク質との相互作用に関する直接的な知見は存在しなかった。特に、上記ＤＣ−ＳＩＧＮやＬ−ＳＩＧＮのフィロウイルス感染過程における関与、およびそれらの間での異なるリガンド特異性についての報告を考慮すれば、その他のレクチン分子、とりわけ、ＭＧＬ分子がウイルスの感染過程に関与するとの示唆は存在しなかった。
【非特許文献１】Takada, A., C. Robison, H. Goto, A. Sanchez, K. G. Murti, M. A. Whitt, and Y. Kawaoka, "A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 94, pp. 14764-14769 (1997)
【非特許文献２】Wool-Lewis, R. J. and P. Bates, "Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.", J. Virol., vol. 72, pp. 3155-3160 (1998)
【非特許文献３】Sanchez, A., S. G. Trappier, B. W. Mahy, C. J. Peters, and S. T. Nichol, "The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two reading frames and are expressed through transcriptional editing.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 93, pp. 3602-3607 (1996)
【非特許文献４】Volchkov, V. E., S. Becker, V. A. Volchkova, V. A. Ternovoj, A. N. Kotov, S. V. Netesov, and H.-D. Klenk, "GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and vaccinia virus polymerases.", Virology, vol. 214, pp. 421-430 (1995)
【非特許文献５】Feldmann, H. and M. P. Kiley, "Classification, structure, and replication of filoviruses.", Curr. Top. Microbiol. Immunol., vol. 235, pp. 1-22 (1999)
【非特許文献６】Alvarez, C.P., F. Lasala, J. Carrillo, O. Muniz, A. L. Corbi, and R. Delgado, "C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans.", J. Virol., vol. 76, pp. 6841-6844 (2002)
【非特許文献７】Baribaud, F., S. Pohlmann, and R. W. Doms, "The role of DC-SIGN and DC-SIGNR in HIV and SIV attachment, infection, and transmission.", Virology, vol. 286, pp. 1-6 (2001)
【非特許文献８】Baribaud, F., S. Pohlmann, G. Leslie, F. Mortari, and R. W. Doms, "Quantitative expression and virus transmission analysis of DC-SIGN on monocyte-derived dendritic cells.", J. Virol., vol. 76, pp. 9135-9142 (2002)
【非特許文献９】Simmons, G., J. D. Reeves, C. C. Grogan, L. H. Vandenberghe, F. Baribaud, J. C. Whitbeck, E. Burke, M. J. Buchmeier, E. J. Soilleux, L. J. Riley, R. W. Doms, P. Bates, and S. Pohlmann, "DC-SIGN and DC-SIGNR bind ebola gycoproteins and enhance infection of macrophages and endothelial Cells.", Virology, vol. 305, pp. 115-123 (2003)
【非特許文献１０】Lin, G., G. Simmons, S. Pohlmann, F. Baribaud, H. Ni, G. J. Leslie, B. S. Haggarty, P. Bates, D. Weissman, J. A. Hoxie, and R. W. Doms, "Differential N-linked glycosylation of Human Immunodeficiency Virus and Ebola Virus envelope glycoproteins modulates interactions with DC-SIGN and DC-SIGNR.", J. Virol., vol. 77, pp. 1337-1346 (2003)
【非特許文献１１】Oda S., Sato M., Toyoshima S. and Osawa T., "Purification and characterization of a lectin-like molecule specific for galactose/N-acetylgalactosamine from tumoricidal macrophages.", J. Biochem. (Tokyo), vol. 104, pp. 600-605 (1988)
【非特許文献１２】Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)
【非特許文献１３】Tsuiji M., Fujimori M., Ohashi Y., Higashi N., Onami T.M., Hedrick, S.M., Irimura T., "Molecular cloning and characterization of a novel mouse macrophage C-type lectin, mMGL2, which has a distinct carbohydrate specificity from mMGL1.", J. Biol. Chem., vol. 277, pp. 28892-28901 (2002)
【非特許文献１４】Denda-Nagai, K., Kubota N., Tsuiji M., Kamata M. and Irimura T., "Macrophage C-type lectin on bone marrow-derived immature dendritic cells is involved in the initialization of glycosilated antigens.", Glycobiology, vol. 12, pp. 443-450 (2002)
【非特許文献１５】Higashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol. 14, pp. 545-554 (2002)
【非特許文献１６】Higashi, N., K. Fujioka, K. Denda-Nagai, S. Hashimoto, S. Nagai, T. Sato, Y. Fujita, A. Morikawa, M. Tsuiji, M. Miyata-Takeuchi, Y. Sano, N. Suzuki, K. Yamamoto, K. Matsushima, and T. Irimura, "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.", J. Boil. Chem., vol. 277, pp. 20686-20693. (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ウイルス感染、特に、フィロウイルスに代表されるムチン型糖タンパク質を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性診断のための方法およびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＤＣ−ＳＩＧＮおよび／またはＬ−ＳＩＧＮに加えて、ＭＧＬのウイルス感染過程への関与が明らかとなった。更には、当該感染効率が、ＭＧＬにおける一塩基多型（ＳＮＰ）により影響を受けることが見出された。
【００１３】
従って、本発明は、ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）の３５番アミノ酸に関する多型、典型的には当該アミノ酸のＣＧＣ／ＴＧＣ（Ａｒｇ／Ｃｙｓ）多型を検出することを特徴とする方法／キットを提供する。上記のとおり、当該多型の検出は、ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性を診断する際に、極めて有用である。
【００１４】
例えば、該キットは、ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）遺伝子のエクソン３において、ｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＳＮＰ、即ちＣＧＣ（Ａｒｇ）／ＴＧＣ（Ｃｙｓ）多型を検出するための、少なくとも一種のプライマーおよび／またはプローブを含むことができる。
【００１５】
好ましくは、前記プライマーまたはプローブが、ｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドンを含むｈＭＧＬ遺伝子エクソン３内の少なくとも２０以上の連続した塩基配列またはそれに相補的な配列からなる。
【００１６】
或いは、該キットは、当該ＳＮＰに基づくＲＦＬＰを検出するための制限酵素を含んでよい。
【００１７】
好ましくは、前記制限酵素として、ＢｓｒＢ１を用いる。
【００１８】
特に、前記ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスがエボラウイルスである場合において、本発明のキットは好適に使用し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、ＭＧＬのＳＮＰを検出することで、ある種のウイルス、典型的には、そのエンベロープＧＰ上にムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスの感染に対する、個体の感受性を診断することを特徴とする。
【００２０】
つまり、本発明は、ムチン型糖鎖を有するウイルスの感染成立過程におけるＭＧＬの重大な関与を実証し、更に当該ウイルス感染に対するＭＧＬのＳＮＰが、該ウイルスの感染効率に顕著な影響を与え得ることを明らかにしたことを基礎にする。
【００２１】
より詳細に、本願発明では、ｈＭＧＬの３５番アミノ酸をコードする、ｈＭＧＬ遺伝子のエクソン３内の特定のコドンにおいて、Ａｒｇ（ＣＧＣ）からＣｙｓ（ＴＧＣ）への置換をもたらすＳＮＰにより、当該多型を有する遺伝子を発現する細胞のウイルスに対する感受性が増加するという知見に基づいて、当該アミノ酸の置換或いは当該遺伝子におけるＳＮＰを検出する。
【００２２】
ここで、ムチン型糖鎖（或いはＯ結合型糖鎖とも称される）とは、一般的に、そのＮ−アセチルガラクトサミンがセリンやトレオニンのヒドロキシル基にＯ−グリコシド結合している糖鎖を指す。ウイルス粒子に存在するタンパク質は、そのような糖鎖により修飾され得ることが広く知られており、従って、本発明で用いる「ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルス」の用語には、エンベロープＧＰに代表されるウイルス粒子の糖タンパク質が、前記ムチン型の糖鎖により修飾されているウイルスを包含し得る。当該ウイルスとしては、フィロウイルス科のウイルス、すなわちエボラウイルスおよびマールブルグウイルスが例示できるが、これに限定されない。
【００２３】
ｈＭＧＬ遺伝子は、１７番染色体上に位置し、９個のエキソンから構成される遺伝子であるが、これまでに、選択的スプライシング（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の結果として、7つの異なるサブタイプの発現が知られている。これらの選択的スプライシングは、エクソン６および／またはエクソン８について知られており、該スプライシング・バリアントは、夫々、ｈＭＧＬ（６Ａ）、ｈＭＧＬ（６Ｂ）、ｈＭＧＬ（６Ｃ）、ｈＭＧＬ（６Ａ／８Ａ）、ｈＭＧＬ（６Ｃ／８Ａ）およびｈＭＧＬ（８Ａ）と記述される。
【００２４】
エクソン３では、ｈＭＧＬタンパク質の３５番アミノ酸（本明細書においては、Ｎ末端のメチオニンを１番と数える。）をコードするコドン内にＳＮＰが存在する（Higashi, N., K. Fujioka, K. Denda-Nagai, S. Hashimoto, S. Nagai, T. Sato, Y. Fujita, A. Morikawa, M. Tsuiji, M. Miyata-Takeuchi, Y. Sano, N. Suzuki, K. Yamamoto, K. Matsushima, and T. Irimura, "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.", J. Boil. Chem., vol. 277, pp. 20686-20693. (2002)参照）。すなわち、ｈＭＧＬ遺伝子の２１０８番塩基において、Ｃ／ＴのＳＮＰが知られ、該多型により３５番目のアミノ酸がＡｒｇ／Ｃｙｓ置換する。以下の実施例で示されるように、Ｃｙｓ多型は、Ａｒｇ多型に比べて著しく増加したエボラウイルス感染性を示す。なお、エクソン３についての選択的スプライシングは知られていない。
【００２５】
上記ＳＮＰの検出においては、当該方法として当業者に知られるいかなる方法も適用でき、その非限定的例として、ＰＣＲ法およびＮＡＳＢＡ（商標）法或いはＲＦＬＰ法をあげることができる。
【００２６】
例えば、感受性を診断する個体から得た細胞、血液等の体液、或いは組織をサンプルとし、該サンプルから抽出したｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡやｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡからのｍＲＮＡを鋳型として、適切なプロトコールによりＰＣＲ或いはＲＴ−ＰＣＲを実施して、いずれか一方の多型の存在を検出する。
【００２７】
サンプルからのｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲの例では、まず逆転写酵素により対応するｃＤＮＡを作製し、当該ｃＤＮＡについてＰＣＲを実施する。例えば、サンプルからの全ｍＲＮＡを調製し、ｄＮＴＰ、ランダム・ヘキサマー等の存在下、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素等によりｃＤＮＡを作製する。当該ｃＤＮＡからのＰＣＲでは、ｈＭＧＬのエクソン３を含む増幅産物を与えるように、適切な一対のプライマーにより、ｈＭＧＬのｃＤＮＡを増幅する。例えば；
センス：5'-aatcacaccctccagacctccc-3'（配列番号：１）
アンチセンス：5'-tcccaccaaaggcagctcagtg-3'（配列番号：２）
の一組のプライマーでｈＭＧＬ遺伝子をＰＣＲ増幅する。
【００２８】
ついで、ＰＣＲ増幅物について、アガロースゲル電気泳動などの後、増幅産物についての塩基配列を決定してもよいが、好適には、そして通常は、ｈＭＧＬ遺伝子のエクソン３においてｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＣＧＣ（Ａｒｇ）とＴＧＣ（Ｃｙｓ）との間の一塩基多型を検出するためのプローブにより、該多型について決定する。プローブは、標識等されていてよく、そのような標識も当業者に周知である。
【００２９】
或いは、前記ｃＤＮＡについて、直接、一方の多型のみを増幅するようなＰＣＲを行ってもよく、その場合、ＰＣＲプライマーは、ｈＭＧＬ遺伝子のエクソン３においてｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＣＧＣ（Ａｒｇ）とＴＧＣ（Ｃｙｓ）との間の一塩基多型について、そのいずれか一方のみを選択的に増幅するように設計する。更には、サンプルからのｍＲＮＡに対して直接ＮＡＳＢＡ（商標）法を適用してもよい。ＮＡＳＢＡおよびその改変の詳細は、例えば、特開平０５−２１９９９９号公報を参照されたい。ＮＡＳＢＡプライマーもまた、ｈＭＧＬ遺伝子のエクソン３においてｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＣＧＣ（Ａｒｇ）とＴＧＣ（Ｃｙｓ）との間の一塩基多型について、そのいずれか一方のみを選択的に増幅するように設計する。３’末端が多形塩基に対応するプライマー／プローブは好ましい態様である。
【００３０】
また、そのプライマー／プローブ配列は、上記ＳＮＰの特異的な検出を担保するために充分な長さを有していなければならない。通常、該プローブおよびプライマーの長さは、少なくとも１０塩基長を超えるべきであり、好ましくは２０塩基長、より好ましくは３０塩基長以上であるべきであるが、例えば数百にも及ぶような塩基長は、通常、必要とされないであろう。
【００３１】
例えば、該プローブは、ｈＭＧＬのｃＤＮＡ（配列番号：３として示した）の３００〜３２０番塩基をもとに、或いはそれと相補的な配列をもとに作製してよい。なお、該ｃＤＮＡの３１０番塩基が検出すべきＳＮＰ（コドンとして３１０〜３１２番目塩基）である。
【００３２】
また、特に好ましいプライマーは、その３’末端が前記ｃＤＮＡ内の３１０番塩基であり得る。その場合、該３’末端が単に鋳型と相補しないというだけで、選択的な増幅が可能となる。例えば、配列番号：３において、２９０〜３１０番目塩基が、好適なプライマーとなし得る。あわせて、ＬＣＲ法についての特開平０８−５０１２１２号公報の記載も参照されたい。
【００３３】
加えて、いっそう好ましい本発明のＳＮＰ検出として、制限酵素ＢｓｒＢ１を使用するＲＦＬＰ法を例示できる。すなわち、ＢｓｒＢ１は、配列ＣＣＧＣＴＣを認識し、該配列を中央で制限するものであり、一方、３５番アミノ酸がＡｒｇであるｈＭＧＬのｃＤＮＡ（配列番号：３）において、その３０９〜３１４番目の塩基の配列も当該ＣＣＧＣＴＣであるから、この遺伝子では、当該箇所でのＢｓｒＢ１制限断片を生じる。他方、３５番目アミノ酸がＣｙｓのｈＭＧＬは、前記３０９〜３１４番目の塩基配列が、ＣＴＧＣＴＣであるから、ＢｓｒＢ１は当該配列を制限せず、従って、Ａｒｇ型のｈＭＧＬゲノムとは異なる制限断片を与えるのである。
【００３４】
より詳細には、例えば、ｈＭＧＬのゲノムを任意の特異的増幅用プライマー対でＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ増幅物を上記ＢｓｒＢ１で制限し、当該制限断片をアガロースゲル電気泳動してそのパターンを比較することで、前記ＳＮＰを検出することができる。
【００３５】
なお、上記において、ゲル電気泳動、ブロッティング、ハイブリダイゼーション、オートラジオグラフィー、スキャニングなど、前記の増幅・検出プロトコールにおいて必要な手法は、全て、当業者に周知である。従って、そのような各種のプロトコールに応じた試薬を含めて、本発明のプローブまたはプライマーの少なくとも一種を含むキットを構成することもまた、当業者にとって容易であろう。例えば、ＰＣＲ増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼなどがキットに含まれ得る。
【００３６】
更に説明せずとも、これまでの説明を与えられた当業者は、本発明を充分に活用し得る。以下、説明のみの目的で実施例を与える。
【実施例１】
【００３７】
I．方法
（１）ウイルス
偽フィロウイルス：水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を欠き、更にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するように改変したウイルス株（ＶＳＶΔＧ＊）に対し、エボラウイルス（Ｚａｉｒｅ、Ｓｕｄａｎ、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ、Ｒｅｓｔｏｎ株およびＭａｒｂｕｒｇウイルス）のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）を導入した（Takada, A., C. Robison, H. Goto, A. Sanchez, K. G. Murti, M. A. Whitt, and Y. Kawaoka, "A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 94, pp. 14764-14769 (1997)参照）。
【００３８】
各ウイルスは、各々、ベロ（Ｖｅｒｏ）Ｅ６細胞内で増殖させ、使用時まで−８０℃で保存した。
【００３９】
（２）細胞
サル腎臓ベロＥ６細胞およびヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）は、１０％子牛胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地内で、夫々、培養した。
【００４０】
エボラウイルスを含む全ての被感染物質は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈにおいて、バイオセイフティーレベル４の施設内で取り扱った。
【００４１】
（３）ヒトＭＧＬの発現
ヒトＭＧＬ遺伝子として、ｈＭＧＬ６Ａのコード配列（Suzuki N, Yamamoto K, Osawa T, Irimura T., "Molecular cloning and expression of cDNA encoding human macrophage C-type lectin : its unique carbohydrate specificity for Tn antigen.", J. of Immunology, vol. 156: pp. 128-135 (1996)およびHigashi, N., K. Fujioka, K. Denda-Nagai, S. Hashimoto, S. Nagai, T. Sato, Y. Fujita, A. Morikawa, M. Tsuiji, M. Miyata-Takeuchi, Y. Sano, N. Suzuki, K. Yamamoto, K. Matsushima, and T. Irimura, "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.", J. Boil. Chem., vol. 277, pp. 20686-20693. (2002)）を、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン製）に、センス方向（ＣＲ４またはＣＲ４Ｔ）およびアンチセンス方向（ＣＲ７：コントロール）で挿入した。ＣＲ４は、３５番アミノ酸がＡｒｇであり、ＣＲ４Ｔは、３５番アミノ酸がＣｙｓを与える。
【００４２】
エレクトロポレーションにより、Ｋ５６２細胞を上記のプラスミドで形質転換し、形質転換体をＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８硫酸塩、ＧＩＢＣＯ製）で選択した。更に、ｈＭＧＬ６Ａ＋細胞は、Higashi, N., Morikawa A., Fujioka K., Fujita Y., Sano Y., Miyata-Takeuchi M., Suzuki N. and Irimura T., "Human macrophage lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is a marker for cells at an intermediate stage in their differentiation from monocytes into macrophages.", Int. Immunol., vol. 14, pp. 545-554 (2002)に記載の抗ヒトＭＧＬ抗体（ＭＬＤ−１）を用いて作製したイムノマグネティックビーズを利用して、富化した。形質転換体は、その後、限界希釈によりクローン化し、ＭＧＬ発現細胞クローンとしてＣＲ４Ｔ−１（３５番アミノ酸：Ｃｙｓ）およびＣＲ４−１０（３５番アミノ酸：Ａｒｇ）並びにコントロールとしてＣＲ７の各クローンを、続く感染実験に用いた。
【００４３】
（４）形質転換体に対するウイルス感染実験
Ｋ５６２形質転換体（コントロールであるＣＲ７クローンを含めて）の１０５細胞／クローンを、フィロウイルスＧＰを導入したＶＳＶ（偽タイプ・エボラウイルス：Ｚａｉｒｅ、Ｓｕｄａｎ、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ、ＲｅｓｔｏｎおよびＭａｒｂｕｒｇ）で感染した。感染率は、ＦＡＣＳによりＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞数を測定し、ＣＲ７クローンに対する結果を１００として標準化することで評価した。
【００４４】
ＩＩ．結果
偽フィロウイルス感染実験
該感染実験の結果を図１に示す。いずれの偽フィロウイルスも、コントロールのＣＲ７と比較して、ｈＭＧＬ（３５番アミノ酸：Ｃｙｓ）を発現する形質転換体であるＣＲ４Ｔ−１クローンにおいて極めて高い感染率を示すことが明らかとなった。３５番アミノ酸のＡｒｇ多型（ＣＲ４−１０）は、減少した感染率を示した。
【００４５】
上記の結果は、エボラを含むフィロウイルス感染が、ｈＭＧＬ上の３５番アミノ酸の置換を伴うＳＮＰにより著しく影響をうけることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性を診断する方法であって、ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）の３５番アミノ酸の多型、典型的には当該アミノ酸のＡｒｇ/Ｃｙｓ多型を検出することを特徴とする方法が提供される。特に、本発明の一態様として、ムチン型（Ｏ結合型）糖鎖を有するウイルスによる感染に対する個体の感受性を診断するためのキットであって、該キットは、ヒト・マクロファージガラクトース型Ｃ型レクチン（ｈＭＧＬ）遺伝子のエクソン３においてｈＭＧＬの３５番アミノ酸に対応するコドン内のＣＧＣ（Ａｒｇ）／ＴＧＣ（Ｃｙｓ）多型を検出するための、少なくとも一種のプライマーおよび／またはプローブ或いは制限酵素を含むことを特徴とする前記キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）をもとに作製したフィロウイルスの偽タイプ・ウイルスであるＺａｉｒｅ、Ｓｕｄａｎ、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ、ＲｅａｓｔｏｎおよびＭａｒｂｕｒｇ（各々、Ｚａｉｒｅ、Ｓｕｄａｎ、Ｉｖｏｒｙ  Ｃｏａｓｔ、ＲｅａｓｔｏｎおよびＭａｒｂｕｒｇのＧＰを発現）をヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）のｈＭＧＬ発現形質転換体（３５番アミノ酸がＣｙｓ：ＣＲ４Ｔ−１）、同じくｈＭＧＬ発現形質転換体（３５番アミノ酸がＡｒｇ：ＣＲ４−１０）、並びにコントロール（ＣＲ７）に感染させた場合の感染率を、ＦＡＣＳにより測定した結果を示す。図は、感染細胞をＦＡＣＳにより計測し、バックグラウンドの感染率を各データから差し引いて表現している。また、コントロールであるＣＲ７の感染細胞数を１００として基準化し、相対感染率を表している。実験は、５連で行い、標準偏差をバーで示している。
【図１】
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【配列表】
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