(57)【要約】【課題】  有胞子好気性細菌を迅速かつ網羅的に検出することができる判定方法および判定キットと、それに好適に用いることができるオリゴヌクレオチドとを提供する。【解決手段】  本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでおり、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかとなっている。このオリゴヌクレオチドは、判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うときのプライマーとして用いる。これによって、特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、被判定菌が有胞子好気性細菌か否かを判定することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでおり、
上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかであることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも１種に属する細菌であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことで得られる特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定する有胞子好気性細菌の判定方法であって、
ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとしては、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが少なくとも１種用いられるとともに、
上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかであることを特徴とする有胞子好気性細菌の判定方法。
【請求項４】
上記プライマーのうち、配列番号１または２に示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがセンスプライマーとして用いられるとともに、
配列番号３ないし６の何れかに示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがアンチセンスプライマーとして用いられることを特徴とする請求項３に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【請求項５】
上記センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、上記特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが２種類以上用いられることを特徴とする請求項３または４に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【請求項６】
増幅される上記特定のＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動による分離により０．１ｋｂ近傍で検出される大きさを有することを特徴とする請求項３ないし５の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【請求項７】
上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも１種に属する細菌であることを特徴とする請求項３ないし６の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【請求項８】
請求項３ないし７の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法を行うための判定キット。
【請求項９】
判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことで得られる特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定するために用いられる判定キットであって、
ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含み、当該特異的な塩基配列が配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかであるオリゴヌクレオチドを少なくとも１種含むことを特徴とする有胞子好気性細菌の判定キット。
【請求項１０】
さらに、ゲル電気泳動用マーカーとして用いられ、長さの異なる指標用ＤＮＡ断片を複数種含むＤＮＡ断片混合物を含んでおり、
当該ＤＮＡ断片混合物には、０．１ｋｂの大きさを有する指標用ＤＮＡ断片が含まれていることを特徴とする請求項９に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【請求項１１】
さらに、被判定菌から核酸を調製する試薬群を含むことを特徴とする請求項９または１０に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【請求項１２】
さらに、ＰＣＲ反応に用いられる試薬群を含むことを特徴とする請求項９ないし１１の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、判定の対象となる被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定するためのＰＣＲに用いることができるオリゴヌクレオチドと、その利用に関するものであり、具体的には、上記オリゴヌクレオチドと、このオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、有胞子好気性細菌に特異的なＤＮＡ断片を検出することによって、被判定菌が有胞子好気性細菌か否かを判定する方法、並びに当該判定方法を行うための判定キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌を分類同定する方法としては、生理生化学的性状に基づく方法、キノン組成、菌体脂肪酸組成、細胞壁成分等に基づく方法、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量に基づく方法、ＤＮＡ相同性に基づく方法、ＤＮＡプローブを用いる方法、および１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析を行う方法等が知られている。
【０００３】
特に、近年では、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統分類により得られるグループ（クラスター）を指標として、細菌の分類・識別を行うことが一般的になっている。
【０００４】
ところで、バチルス（Bacillus）属をはじめとする有胞子好気性細菌は、土壌や水、空気中など広く自然界に分布している。バチルス属の中で、ヒトに病原性を示すものとしては、炭疽病菌（Bacillus anthracis）や、食中毒の起因菌となるセレウス菌（Bacillus cereus）などが知られている。また、バチルス属を含む有胞子好気性細菌の系統分類および分類体系については、例えば、非特許文献１に記載されており、バチルス属以外にも様々な属が知られている。これら有胞子好気性細菌は芽胞を形成するという特徴を有しているが、この芽胞は、耐熱性や薬剤耐性が高いため殺菌することが難しく、食品工場の製造工程から完全に取り除くことは困難である。それゆえ、有胞子好気性細菌は食品工場の工程検査などで分離されることが多い。
【０００５】
したがって、例えば、食品の製造工場において、製品や製造工程から細菌が分離された場合には、汚染原因究明のために、分離された細菌が芽胞を形成するか否かの判定が重要となる。それゆえ、特に食品産業界においては、製品あるいは製造工程から分離された細菌が芽胞を形成するかどうかを迅速に判定することが望まれている。
【０００６】
一般に、分離された細菌が有胞子好気性細菌であるか否かは、芽胞形成培地上で判定対象となる被判定菌（供試菌）を培養し、同菌体が芽胞を形成するかどうかを顕微鏡で確認して判定する方法がとられている。この方法では、芽胞形成培地上で被判定菌を培養しなければならないため、判定までには数日から１週間という非常に長い時間を要する。この一般的な判定方法では、検出判定時間（培養時間）を短縮することによって、ある程度期間を短縮することも可能ではあるが、この場合は増殖速度の遅い菌株を検出できない可能性がありリスクが高い。
【０００７】
このように、上記一般的な判定方法では、確実に有胞子好気性細菌を判定するためには、長期間培養する必要がある。それゆえ、上記判定方法は、特に迅速性を要する食品産業の出荷前の検査には不向きであるといえる。
【０００８】
上記一般的な判定方法以外に有胞子好気性細菌に属する細菌を同定する技術としては、例えば、特許文献１および非特許文献２に開示されている方法が知られている。この技術では、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属等の有胞子好気性細菌に属する細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に存在する特異的な塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとし、被同定細菌から得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を適用し、特定のＤＮＡの増幅を指標として被同定細菌の属レベルでの同定を行う。
【０００９】
また、１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子を利用したバチルス属細菌の分類技術としては、非特許文献３に開示されている方法が知られている。１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のhypervariant region（HV region）と呼ばれる５'側の約２７５ｂｐは種特異的な領域であるため、この技術では、この領域の塩基配列解析を行うことによりバチルス属細菌の分類が可能であるとしている。
【００１０】
その他、特許文献２においては、セレウス菌由来β−ラクタマーゼ遺伝子検出用プライマーを用いて該遺伝子を検出することによって、セレウス菌を検出する方法が開示されている。
【特許文献１】特開平９−９４１００号公報（公開日:平成９（１９９７）年４月８日）
【特許文献２】特公平７−８９９５６号公報（公告日：平成７（１９９５）年１０月４日、対応公開公報：特開平３−４９６９６号公報（公開日:平成３（１９９１）年３月４日））
【非特許文献１】信太治，「好気性有胞子細菌の分類と同定」，ソフトドリンク技術資料2001年３号，221-227
【非特許文献２】Shida, O et al., Proposal for Two New Genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov., International Journal of Systematic Bacteriology, 939-946 (1996)
【非特許文献３】Goto, K et al., Application of the partial 16S rDNA sequence as an index for rapid identification of species in the genus Bacillus, The Journal of General and Applied Microbiology, 46, 1-8 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、現在のところ、芽胞を形成する有胞子好気性細菌であるかどうかを迅速かつ網羅的に判定する有効な方法はないため、特に迅速性を要する食品産業の出荷前の検査等に用いることが可能な技術の開発が望まれている。
【００１２】
具体的には、まず、上記特許文献１および非特許文献１に開示されている方法は、そもそも食品産業の出荷前の検査等に用いるための技術ではなく、細菌の同定に重点がおかれた技術である。そのため、この方法では、ＰＣＲ法によって検出するために迅速性は担保できるものの、属特異的な方法であるため、プライマーをそれぞれの属に応じて採用する必要があり操作が煩雑となる上、検出できない属の細菌に対しては適用ができないという問題点が生じる。
【００１３】
また、非特許文献２に記載の方法はバチルス属の種を同定するためには有効であるが、他属の細菌については適用できず、特許文献２に記載の方法では、セレウス菌の検出にのみ有効である。
【００１４】
このように、これまで、ある特定の属の有胞子好気性細菌を比較的迅速に検出（または判定）する技術は知られているが、有胞子好気性細菌を迅速かつ網羅的に判定する技術は知られていなかった。
【００１５】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、有胞子好気性細菌を迅速かつ網羅的に判定することができる方法に好適に用いることができるオリゴヌクレオチドと、当該オリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅反応を行い、有胞子好気性細菌に特異的なＤＮＡ断片を検出することによって、被判定菌が有胞子好気性細菌か否かを判定する方法、並びに当該判定方法を行うためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、バチルス属およびその近縁の有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子上で比較的共通している塩基配列領域に着目し、鋭意検討を行った。その結果、本発明にかかるオリゴヌクレオチドをプライマーにもちいてＰＣＲ増幅を行うことによって、バチルス属をはじめとする有胞子好気性細菌に特異的な約１００ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されてくることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００１７】
（１）有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでおり、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかであるオリゴヌクレオチド。
【００１８】
（２）上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも１種に属する細菌である（１）に記載のオリゴヌクレオチド。
【００１９】
（３）判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことで得られる特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定する有胞子好気性細菌の判定方法であって、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとしては、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが少なくとも１種用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかである有胞子好気性細菌の判定方法。
【００２０】
（４）上記プライマーのうち、配列番号１または２に示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがセンスプライマーとして用いられるとともに、配列番号３ないし６の何れかに示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがアンチセンスプライマーとして用いられる（３）に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【００２１】
（５）上記センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの少なくとも一方として、上記特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドが２種類以上用いられる（３）または（４）に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【００２２】
（６）増幅される上記特定のＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動による分離により０．１ｋｂ近傍で検出される大きさを有する（３）〜（５）の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【００２３】
（７）上記有胞子好気性細菌が、バチルス属、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、アンピバチルス属、ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチリス属、サリバチルス属、マリニバチルス属、およびスポロラクトバチルス属細菌の中から選択される少なくとも１種に属する細菌である（３）〜（６）の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法。
【００２４】
（８）上記（３）〜（７）の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定方法を行うための判定キット。
【００２５】
（９）判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことで得られる特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、上記被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定するために用いられる判定キットであって、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含み、当該特異的な塩基配列が配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかであるオリゴヌクレオチドを少なくとも１種含む有胞子好気性細菌の判定キット。
【００２６】
（１０）さらに、ゲル電気泳動用マーカーとして用いられ、長さの異なる指標用ＤＮＡ断片を複数種含むＤＮＡ断片混合物を含んでおり、当該ＤＮＡ断片混合物には、０．１ｋｂの大きさを有する指標用ＤＮＡ断片が含まれている（９）に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【００２７】
（１１）さらに、被判定菌から核酸を調製する試薬群を含む（９）または（１０）に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【００２８】
（１２）さらに、ＰＣＲ反応に用いられる試薬群を含む（９）〜（１１）の何れか１項に記載の有胞子好気性細菌の判定キット。
【発明の効果】
【００２９】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、被判定菌から得られた染色体ＤＮＡ等を鋳型としてＰＣＲ増幅等の増幅反応を行うことによって、バチルス属およびその近縁の有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に存在する特異的なＤＮＡ断片を増幅することができる。これにより、上述の増幅反応によって当該特異的なＤＮＡ断片（約０．１ｋｂ）が増幅されてくるか否かで、被判定菌がバチルス属及びその近縁の有胞子好気性細菌であるか否かを迅速に判定することが可能とる。また上記オリゴヌクレオチドを含めてキット化することにより、有胞子好気性細菌の判定キットを提供することができる。
【００３０】
それゆえ、本発明によれば、これまで困難とされていた有胞子好気性細菌の検出を、迅速かつ網羅的に行うことができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の実施の一形態について図１に基づいて以下に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３２】
本実施の形態では、本発明にかかるオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドを用いた本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定方法（以下、単に判定方法と略す場合がある）、並びに、本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定キット（以下、単に判定キット略す場合がある）の順に、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
（１）本発明にかかるオリゴヌクレオチド
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでいるものであり、具体的には、上記特異的な塩基配列が、配列番号１ないし６に示される塩基配列の何れかを上記特異的な塩基配列として含むオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
上記オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１ないし６の何れかに示される塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含んでいるものであれば特に限定されるものではない。より具体的には、例えば、次の６種類のオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）を挙げることができる。
（ａ）次に示す塩基配列（配列番号１）を有し、２４塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ａ）：(5')  d−ACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGG  (3')
（ｂ）次に示す塩基配列（配列番号２）を有し、２４塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ｂ）：(5')  d−ACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGG  (3')
（ｃ）次に示す塩基配列（配列番号３）を有し、２２塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ｃ）：(5')  d−TTGAGTTTCAGTCTTGCGAGCG  (3')
（ｄ）次に示す塩基配列（配列番号４）を有し、２２塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ｄ）：(5')  d−TTGAGTTTCAGTCTTGCGACCG  (3')
（ｅ）次に示す塩基配列（配列番号５）を有し、２２塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ｅ）：(5')  d−TTGAGTTTCACTCTTGCGAGCG  (3')
（ｆ）次に示す塩基配列（配列番号６）を有し、２２塩基からなる。
オリゴヌクレオチド（ｆ）：(5')  d−TTGAGTTTCACTCTTGCGACCG  (3')
本発明にかかるオリゴヌクレオチドとしては、上記（ａ）〜（ｆ）に限定されるものではなく、配列番号１〜６の何れかに示される塩基配列を有するもの以外に、これら塩基配列の相補的配列を有するものであってもよい。また、本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、配列番号１〜６の何れかに示される塩基配列やこれらの相補的配列以外に付加的な塩基配列を含んでいてもよい。さらには、本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、配列番号１〜６の何れかに示される塩基配列やこれらの相補的配列中に、１〜３程度の範囲内の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変されたものであってもよい。
【００３５】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドの取得方法は特に限定されるものではない。具体的には、公知の方法で配列番号１〜６の何れかの塩基配列またはその相補的配列を化学合成すればよい。
【００３６】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲのプライマーとして好適に用いられるものであるが、その塩基配列および長さ（サイズ）は、後述する実施例に示すように、ＢＬＡＳＴデータベースを用いて決定した。具体的には、まず、データベース（ＢＬＡＳＴ）からBacillus属とその近縁の芽胞形成細菌および芽胞非形成細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子配列を抽出した。次に、VectorNTIのAlignXという遺伝子解析ソフトを用いてアライメントを行い、有胞子好気性細菌に比較的共通している領域を選び出した。
【００３７】
これら複数種の領域の中で、次に示すプライマーとして好適な各条件をできるだけ満たすようにして、その塩基配列と長さを確定した。
１．長さ（サイズ）は２０〜２５塩基が適当である。
２．Ｇ＋Ｃ（グアニン＋シトシン）含量は５０％前後が好ましい。
３．プライマー間の相補性については、ダイマー形成を防ぐために、３’末端が相補的なプライマーを避ける。
４．プライマー内には、二次構造を形成することを避けるため、自己相補配列を含まないようにする。
５．２種のプライマーはなるべくＴｍ値の近いものを選択する。
【００３８】
その結果、図１に示すようなアライメントにより、上記ポリヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）を設計した。同図中「ＤＮＡ増幅領域」として示される領域は、判定の対象となる被判定菌が有胞子好気性細菌か否かを判定するための指標となる「特定のＤＮＡ断片」に相当する。なお、同図中左は、Paenib validus以上（図中線より上側）がBacillus属とその近縁の芽胞形成細菌の学名を示し、Staphy aureus以下（図中線より下側）が芽胞非形成細菌の学名を示し、網掛けの部分は相同性を有する塩基を示す。また、同図中下の矢印のうち、Ｆで示される矢印はオリゴヌクレオチド（ａ）・（ｂ）に対応する領域であり、Ｒで示される矢印はオリゴヌクレオチド（ｃ）〜（ｆ）に対応する領域である。
【００３９】
（２）本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定方法
本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定方法は、（１）で説明した上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことにより、特定のＤＮＡ断片を増幅させ、それを指標として判定する方法である。
【００４０】
具体的には、本発明にかかる判定方法においては、少なくとも上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う「ＰＣＲ工程」と、ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物中に増幅された特定のＤＮＡ断片が含まれているか否かを判定する「ＤＮＡ断片増幅確認工程」を含んでいればよく、さらには、「検体調製工程」等の他の工程を含んでいてもよい。
【００４１】
＜有胞子好気性細菌＞
本発明で判定対象となる有胞子好気性細菌とは、具体的には、バチルス（Bacillus）属とそのその近縁の細菌であれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、バチルス属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、アンピバチルス（Amphibacillus）属、ビルジバチルス（Virgibacillus）属、ハロバチルス（Halobacillus）属、グラチリバチリス（Gracillibacillus）属、サリバチルス（Salibacillus）属、マリニバチルス（Marinibacillus）属、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属等の細菌を挙げることができる。上記有胞子好気性細菌は、これら有胞子好気性細菌は芽胞を形成するという特徴を有している。
【００４２】
上記各有胞子好気性細菌は、その分子系統等により複数のサブグループに分類することができる。具体的には、例えば、バチルス属の各種のサブグループ；アリシクロバチルス属のサブグループ；パエニバチルス属のサブグループ；ブレビバチルス属のサブグループ；アネウリニバチルス属のサブグループ；ゲオバチルス属のサブグループ；ビルジバチルス属、ハロバチルス属、グラチリバチルス属、およびサリバチルス属のサブグループ；アンピバチルス属、およびスポロラクトバチルス属のサブグループ；等を挙げることができる。本発明はこれら何れのサブグループの有胞子好気性細菌を判定する用途に対しても適用することができる。
【００４３】
上記各有胞子好気性細菌の中でも、バチルス属の各種、パエニバチルス属、アネウリニバチルス属、ゲオバチルス属、アリシクロバチルス属、およびブレビバチルス属の各サブグループは、特に食品関係でよく分離される細菌であり、本発明はこれら有胞子好気性細菌の判定に対して、特に好適に適用することができる。
【００４４】
本発明にかかる判定方法では、上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）等のように、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる。それゆえ、被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを網羅的に判定することが可能となる。
【００４５】
したがって、本発明にかかる判定方法は、個別の属を特定するような従来の技術とは異なり、被判定菌が芽胞を形成する菌か否かを迅速に判定できるので、特に食品産業界においては、製品あるいは製造工程から検出された細菌が芽胞を形成するかどうかを迅速に判定する検査方法として好適に用いることができる。
【００４６】
＜ＰＣＲ工程＞
ＰＣＲ工程は、判定の対象となる被判定菌から調製した核酸を検体として用い、当該検体を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程であって、このとき、プライマーとして本発明にかかるオリゴヌクレオチド、例えば上記オリゴヌクレオチドを用いる。
【００４７】
ここで、上記プライマーのうち、配列番号１または２に示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドはセンスプライマーとして用いられる。具体的には、上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）のうち、オリゴヌクレオチド（ａ）および／または（ｂ）がセンスプライマーとして用いられる。一方、配列番号３ないし６の何れかに示される塩基配列、あるいはこれら塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドがアンチセンスプライマーとして用いられる。具体的には、上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）のうち、オリゴヌクレオチド（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のうちの少なくとも何れかがアンチセンスプライマーとして用いられる。
【００４８】
なお、上記センスプライマーまたはアンチセンスプライマー、あるいはこれら何れのプライマーにおいても、１種類のみのオリゴヌクレオチドが用いられてもよいし、２種類以上のオリゴヌクレオチドが用いられてもよい。具体的には、センスプライマーとしては、オリゴヌクレオチド（ａ）または（ｂ）のみが用いられてもよいし、双方とも用いられてもよい。同様に、アンチセンスプライマーとしては、オリゴヌクレオチド（ｃ）〜（ｆ）の何れかが用いられてもよいし、これら４種類のうち２種類以上が用いられてもよい。
【００４９】
ＰＣＲ工程におけるＰＣＲ用の試薬群や装置、ＰＣＲ反応の条件は特に限定されるものではなく、試薬群は市販のＰＣＲキットや装置を好適に用いることができ、反応温度、反応時間、サイクル回数等の条件はＰＣＲキットや装置の種類に応じて適宜設定することができる。
【００５０】
＜ＤＮＡ断片増幅確認工程＞
ＤＮＡ断片増幅確認工程は、上記ＰＣＲ工程で得られたＰＣＲ産物中に、増幅された特定のＤＮＡ断片があるか否かを判定する工程であれば特に限定されるものではない。本発明にかかる判定方法では、上記特定のＤＮＡ断片の増幅を指標として、判定の対象となる被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定することができる。
【００５１】
上記特定のＤＮＡ断片の増幅を確認する方法は特に限定されるものではないが、一般的には、ゲル電気泳動法による方法が好ましく用いられる。ゲル電気泳動による方法は、核酸を取り扱う実験には広く一般的に用いられている技術であり、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を確実かつ効率的に分離できるとともに、ゲルの染色によってそのサイズ（長さ）を確認することができる。ゲル電気泳動法を行う装置や電気泳動条件については特に限定されるものではなく、市販の電気泳動装置等を好適に用いることができ、当該装置に応じた条件で電気泳動すればよい。
【００５２】
ＤＮＡ断片増幅確認工程にて確認される上記特定のＤＮＡ断片の長さは、図１に示す「ＤＮＡ増幅領域」からも明らかなように、約１００ｂｐである。換言すれば、増幅される上記特定のＤＮＡ断片は、ゲル電気泳動による分離により０．１ｋｂ近傍で検出される大きさを有する。例えば、図１示す例では、１０１塩基の領域が増幅されることになる。有胞子好気性細菌の種類によっては、当該領域に塩基の欠損や付加が生じていることも考えられるので、少なくとも９０〜１１０ｂｐの範囲内、好ましくは１００ｂｐ〜１１０ｂｐの範囲内のサイズを有するＤＮＡ断片が増幅され得る。換言すれば、上記範囲内であれば０．１ｋｂのサイズを有すると見なすことができる。したがって、ＤＮＡ断片増幅確認工程では、ゲル電気泳動による分離により０．１ｋｂ近傍で検出される大きさを有するＤＮＡ断片が検出されているか否かを確認すればよい。
【００５３】
＜その他の工程＞
本発明にかかる判定方法においては、上記ＰＣＲ工程およびＤＮＡ断片増幅確認工程が含まれていればよいが、さらに他の工程、例えば検体調製工程が含まれていてもよい。
【００５４】
検体調製工程は、上記ＰＣＲ工程の前段になされるものであって、一定量の被判定菌から公知の方法で染色体ＤＮＡ等の核酸を調製するようになっていればよい。菌体からの核酸の調製方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を好適に用いることができるため、市販のＤＮＡ調製キット等を利用して行えばよい。
【００５５】
他に、検査対象となる製品や製造工程の機械・装置等から分離された被判定菌を一定量培養するための被判定菌培養工程等を含んでいてもよい。このときの培地や培養条件も特に限定されるものではないが、公知の培地や培養条件を適宜選択することができる。
【００５６】
（３）本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定キット
本発明にかかる有胞子好気性細菌の判定キットは、（２）で説明した上記有胞子好気性細菌の判定方法を行うための判定キットであればよい。具体的には、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーとして、有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な、配列番号１〜６の何れかの塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを、少なくとも含んでいる構成であればよく、好ましくは、上述した各工程を実施するための試薬類等を含んでいる構成を挙げることができる。
【００５７】
例えば、本発明にかかる判定キットにおいては、上記配列番号１〜６の何れかの塩基配列または当該塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドとして、センスプライマーとして上記オリゴヌクレオチド（ａ）・（ｂ）の少なくとも一方を含み、アンチセンスプライマーとしてオリゴヌクレオチド（ｃ）〜（ｆ）の少なくとも何れかを含んでいればよい。これらオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応のプライマーとして用いることができるようになっていればどのような状態であってもよく、例えば、バッファーに溶解した溶液状態であってもよい。
【００５８】
本発明にかかる判定キットには、上述した各工程を実施するための試薬類等が含まれていてもよいが、このような試薬類としては、ＰＣＲ反応用の試薬群、ＤＮＡ断片増幅を確認するための試薬群、被判定菌から核酸を調製する試薬群、被判定菌を培養するための試薬群等を挙げることができる。これら試薬群は少なくとも１種類が含まれていればよい。なお、ここでいう試薬群とは、上記工程の実施に用いられる試薬、実験用素材、または使い捨ての実験器具等を２種類以上含んでいるものを指す。
【００５９】
ＰＣＲ用試薬群としては、具体的には、例えば、ｄＮＴＰ、Taq polymerase、およびTaq polymerase用バッファー（Taq Buffer）等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【００６０】
ＤＮＡ断片増幅を確認するための試薬群としては、ゲル電気泳動により増幅を確認する場合には、電気泳動用ゲルを作成するためのアガロース、バッファー、ゲル電気泳動用マーカー等を挙げることができる。このうち、ゲル電気泳動用マーカーとしては、長さの異なる指標用ＤＮＡ断片を複数種含むＤＮＡ断片混合物であればよいが、当該ＤＮＡ断片混合物には、０．１ｋｂの大きさを有する指標用ＤＮＡ断片が含まれている必要がある。上述したように、判定の指標である特定のＤＮＡ断片は、約１００ｂｐのサイズを有しているため、ゲル電気泳動用マーカーには、このサイズのバンドが電気泳動上明確に分かるような指標用ＤＮＡ断片が含まれていることが非常に好ましいためである。なお、このゲル電気泳動用マーカーに用いられるＤＮＡ断片の由来は特に限定されるものではない。
【００６１】
その他、被判定菌から核酸を調製する試薬群としては、公知のＤＮＡ調製キットを挙げることができ、被判定菌を培養するための試薬群としては、培地またはその原料を挙げることができる。
【００６２】
（４）本発明の用途
本発明にかかるオリゴヌクレオチド並びにこれを用いた判定方法、および判定キットの用途は特に限定されるものではなく、有胞子好気性細菌の判定が必要な用途全てに用いることができる。具体的には、例えば、微生物による汚染が品質に大きな影響を及ぼす各種工業製品の製造工程で、同工業製品やその製造環境等から分離された菌が有胞子好気性細菌であるか否かを判定する場合に好適に用いられる。
【００６３】
判定の対象となる被判定菌の由来となる上記工業製品としては、代表的なものとして、食品、飲料、医薬品・試薬・医薬部外品、使い捨ての医療用器具等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記食品としては、より具体的には、パン、和洋菓子（冷菓等も含む）、惣菜食品、乳製品、シリアル食品、豆腐・油揚げ類、麺類、弁当類、調味料、小麦粉や食肉等の農産加工品、栄養補助食品（サプリメント等）、長期保存食品（缶詰、冷凍食品、レトルト食品等）等を挙げることができるが特に限定されるものではない。飲料としては、より具体的には、各種清涼飲料水、ミネラルウォーター、牛乳・乳飲料、清酒、ビール、発泡酒等を挙げることができるが特に限定されるものではない。医薬品・試薬・医薬部外品としては、より具体的には、例えば、各種医家向け医薬品、各種大衆薬、臨床検査薬、実験用試薬類、その他検査薬全般等を挙げることができるが特に限定されるものではない。使い捨ての医療用器具としては、より具体的には、例えば、注射針等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００６４】
工業製品の製造設備においては、空中浮遊菌であっても表面付着菌であってもその他の菌であっても、被判定菌となり得る。空中浮遊菌の分離には、落下細菌試験法、エアーサンプラー法等の方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。表面付着菌の分離には、ふき取り試験法、スタンプアガー法等の方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００６５】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６６】
以下本発明を実施例および図２および図３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６７】
〔実施例１：プライマーの有胞子好気性細菌検出力の検定〕
バチルス属（Bacillus属）およびその近縁の有胞子好気性細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子に特異的な遺伝子配列を検索し設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、有胞子好気性細菌とそれ以外の細菌を検出できるか否かを評価した。
【００６８】
＜検体調製工程＞
バチルス属（Bacillus属）、パネニバチルス属（Paenibacillus属）、アネウリニバチルス属（Aneurinibacillus属）、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus属）、およびバチルス属（Bacillus属）細菌と比較的遺伝子配列の類似している芽胞非形成の細菌を用いた。検体として用いた細菌については、表１に示した。これら各菌株に最適な培養条件で培養した菌株から、ゲノムＤＮＡをGenomic DNA Purification Kit（Edge Biosystems社製）を用い、添付のプロトコールに従って調製した。
【００６９】
【表１】
2005110530.tif 000002
【００７０】
＜プライマーの設計及び合成＞
データベース（ＢＬＡＳＴ）からバチルス属（Bacillus属）とその近縁の有胞子好気性細菌（例えば、パネニバチルス属（Paenibacillus属）、アネウリニバチルス属（Aneurinibacillus属）、ゲオバチルス属（Geobacillus属）、アリシクロバチルス属（Alicyclobacillus属）、ブレビバチルス属（Brevibacillus属）等）、および芽胞非形成の細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子配列を抽出して、VectorNTIのAlignXという遺伝子解析ソフトを用いてアライメントを行い、有胞子好気性細菌に比較的共通している領域を選び出した。その中で、配列番号１〜６の配列を選び、それらと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、プライマーとして用いた。以下、各プライマーをそれぞれオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）と称する。
【００７１】
＜ＰＣＲ工程・ＤＮＡ断片増幅確認工程＞
前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、上記オリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）を用いて、表２に示したサンプルを調製してＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲ反応は、Biometra社製T GRAGIENTを用いて行い、ＰＣＲ条件は表３に示すとおりにした。ＰＣＲ反応終了後、Agilent2100バイオアナライザ（Agilent Technologies社製）に添付のプロトコールに従って分析を行い、ＤＮＡの増幅バンド、およびそのバンドのサイズを確認した。
【００７２】
＜結果＞
バイオアナライザによる電気泳動の結果を図２に示した。図２中レーン１は分子量マーカー、レーン２はBacillus subtilis (IFO13719)の結果、レーン３はB. sphaericus (NBRC15095)の結果、レーン４はB. cereus (IAM12605)の結果、レーン５はB. coagulans (IAM12463)の結果、レーン６はB. megaterium (JCM2506)の結果、レーン７は、Paenibacillus validus (BUB75)の結果、レーン８はP. illinoisensis (IFO15379)の結果、レーン９はAneurinibacillus aneurinolyticus (IAM1077)の結果、レーン１０は、Alicyclobacillus acidoterrestris (ATCC49025)の結果、レーン１１はA.acidocaldarius (JCM5260)の結果、レーン１２はStaphylococcus aureus (ATCC9144)の結果、レーン１３はStaphylococcus capitis (ATCC27840)の結果、レーン１４はStreptococcus salivarius (SAM0180)の結果、およびレーン１５はLactobacillus delbrueckii (IAM1928)の結果をそれぞれ示した。
【００７３】
図２中レーン２〜１１に示す有胞子好気性細菌のみで１００ｂｐ付近にバンドが検出され、有胞子好気性細菌以外の細菌の結果を示すレーン１２〜１５では、１００ｂｐ付近にバンドは検出されなかった。よって、かかる約１００ｂｐの大きさを持つＤＮＡ断片は、有胞子好気性細菌に特異的なものであり、このＤＮＡ断片の有無を指標として有胞子好気性細菌であるか否かを容易に判断できるものであるといえる。
【００７４】
〔実施例２：食品の製造環境から分離された未同定細菌株の検定〕
未同定細菌株に対して１００ｂｐのＤＮＡ断片の有無を指標にして有胞子好気性細菌か否かを判断した結果と、当該細菌の同定結果とを比較することによって、本発明にかかる有胞子好気性細菌の検出判定方法の妥当性を検討することにした。
【００７５】
＜検体調製工程＞
食品の製造環境から分離された未同定細菌２株（Ｎｏ．１およびＮｏ．２とする）をトリプチケースソイ寒天培地（ＢＢＬ社製）にて、３５℃，好気条件下で培養した。培地上の菌体を１コロニー採取し、Genomic DNA Purification Kit（Edge Biosystems社製）を用いて添付のプロトコールに従ってＤＮＡを抽出し、これを検体とした（検体調製工程）。
【００７６】
＜ＰＣＲ工程・ＤＮＡ断片増幅確認工程＞
前記検体液を鋳型として、前述したオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）を用いて、表２に示したサンプルを調製してＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、Biometra社製T GRAGIENTを用いて行い、ＰＣＲ条件は表３に示すとおりにした。ＰＣＲ終了後、Agilent2100バイオアナライザ（Agilent Technologies社製）に添付のプロトコールに従って分析を行い、ＤＮＡの増幅バンド、およびそのバンドのサイズを確認した。
【００７７】
【表２】
2005110530.tif 000003
【００７８】
【表３】
2005110530.tif 000004
【００７９】
＜結果＞
電気泳動の結果を図３に示した。図３中レーン１は分子量マーカー、レーン２はＮｏ．１の未同定細菌株の結果、およびレーン３はＮｏ．２の未同定細菌株の結果をそれぞれ示した。
【００８０】
Ｎｏ．１では１００ｂｐ付近にバンドが検出され、該細菌が有胞子好気性細菌であると判定された。さらに、顕微鏡での観察を行ったところ、芽胞形成が確認された。また、Api50CHB（日本ビオメリュー社製）を用い添付のプロトコールに従って該細菌の同定を行ったところ、有胞子好気性細菌であるBacillus licheniformisと同定された。よって、１００ｂｐのバンドを指標に判断を行った結果と一致した。
【００８１】
一方Ｎｏ．２では、１００ｂｐ付近にバンドは検出されず、有胞子好気性細菌ではないと判定された。該細菌について１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列シークエンスを行って同定したところ、有胞子好気性細菌ではないMethylobacterium属細菌であるということが判明した。よって、Ｎｏ．２についても１００ｂｐのバンドを指標に判断を行った結果と一致し、１００ｂｐ付近のバンドの有無を指標にして有胞子好気性細菌であるか否かを検出判定する方法は妥当であるということがわかった。
【００８２】
以上の結果より、本発明にかかるオリゴヌクレオチド（ａ）〜（ｆ）をプライマーとしてＰＣＲ増幅等の増幅反応を行い、特異的なＤＮＡ断片（約１００ｂｐ）が増幅されてくるか否かで、被判定菌が有胞子好気性細菌であるか否かを簡便に判定することが可能となる。つまり本発明にかかる判定方法は、有胞子好気細菌の有効な検出および判定手段であるといえる。また前記オリゴヌクレオチドを含めてキット化すれば、有胞子好気細菌の判定キットを提供することが可能となるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
これまで、芽胞を形成する細菌（有胞子好気性細菌）であるかどうかを判定するには、芽胞形成培地上で被判定菌を培養し、当該菌が芽胞を形成するかどうかを検鏡で確認しなければならなかった。そのため、判定までには数日〜1週間という非常に長い時間を要していた。本発明によれば、半日程度で有胞子好気性細菌であるか否かを判定することができ、有胞子好気性細菌であるか否かを簡便かつ迅速に判定することが可能となった。
【００８４】
それゆえ、本発明は、食品製造業、飲食産業、薬品産業等における衛生管理、工程管理、品質管理に利用することが可能である。また、万一微生物汚染が検出された際にも、該細菌が有胞子好気性細菌であるかどうかを迅速に判定することにより、トラブルに対する迅速な対応ができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明にかかるオリゴヌクレオチドを得るために、各種細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を比較した結果と、指標となる特定のＤＮＡ断片となる領域とを示す図である。
【図２】実施例１において、本発明にかかるオリゴネクレオチドをプライマーとして用い、有胞子好気性細菌およびそれ以外の細菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際の増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図３】実施例２において、本発明にかかるオリゴネクレオチドをプライマーとして用い、食品の製造環境から分離された未同定細菌２株Ｎｏ．１およびＮｏ．２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際の増幅産物の電気泳動結果を示す図である。
【図１】
2005110530.tif 000005
【図２】
2005110530.tif 000006
【図３】
2005110530.tif 000007
【配列表】
2005110530000001.app