(57)【要約】【課題】固形有機物を低コストで効率よく可溶化できる可溶化微生物、及び、固形有機物を低コストで効率よく可溶化できる固形有機物の可溶化方法を提供する。【手段】ペトロトーガ（Petrotoga）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。この微生物の存在下、固形有機物を分解処理する固形有機物の可溶化方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペトロトーガ（Petrotoga）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項２】
ペトロトーガ属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである請求項１に記載の可溶化微生物。
【請求項３】
クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項４】
クロストリジウム属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである請求項３に記載の可溶化微生物。
【請求項５】
ペトロトーガ属微生物とクロストリジウム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項６】
サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項７】
サーモアナエロバクター属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである請求項６に記載の可溶化微生物。
【請求項８】
ペトロトーガ属微生物とサーモアナエロバクター属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項９】
アナエロバキュラム（Anaerobaculum）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項１０】
アナエロバキュラム属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである請求項９に記載の可溶化微生物。
【請求項１１】
ペトロトーガ属微生物とアナエロバキュラム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項１２】
ペトロトーガ属に属する微生物、クロストリジウム属に属する微生物、サーモアナエロバクター属に属する微生物及びアナエロバキュラム属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の可溶化微生物の存在下で、固形有機物を分解処理する固形有機物の可溶化方法。
【請求項１４】
可溶化微生物として、請求項１又は２に記載の可溶化微生物を使用する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
可溶化微生物として、請求項１２に記載の可溶化微生物を使用する請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
66〜100℃の温度下で分解処理を行う請求項１３〜１５のいずれかに記載の可溶化方法。
【請求項１７】
５〜10のｐＨの下で分解処理を行う請求項１３〜１６のいずれかに記載の可溶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生ゴミのような固形有機物を可溶化する微生物及びそれを用いた固形有機物の可溶化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球環境保全の重要性や省エネルギーの観点から、食品工場などから排出される有機廃棄物、ホテル、飲食店、一般家庭などから排出される有機廃棄物（生ゴミ）畜産廃棄物、下水汚泥などの有機廃棄物を、メタン発酵によりメタンガスとして回収する技術開発が進められている。有機物からできるだけ多くのメタンを回収し、最終廃棄物の量を削減するために、有機物分解率を向上させる方法が開発されつつある（例えば、特許文献１）。
【０００３】
しかし、固形有機廃棄物のメタン発酵処理では、発酵槽に存在する可溶化微生物により可溶化された固形物がメタン細菌によりメタン化される。従来のメタン発酵技術では、この可溶化率が70％程度と低く、残り30％は残渣となり有効利用されない。
【０００４】
有機廃棄物中の固形物の可溶化率を向上させることを目的として開発された方法として、例えば特許文献２には、余剰汚泥をオゾン吹き込みにより可溶化し、可溶化により得られた液体をメタン発酵槽に返送して再度メタン発酵に供する方法を開示している。この方法は、オゾン発生装置が必要であるために装置が大型化して、コスト高になる。
【０００５】
また特許文献３には、有機廃棄物を好気性細菌及びミネラル液を用いて可溶化する方法が記載されているが、この方法もミネラル液を使用するためにコスト高になる。
【０００６】
この他、超音波処理により固形有機廃棄物を可溶化する方法（非特許文献１）、無機酸化剤処理により固形有機廃棄物を可溶化する方法（非特許文献２）も提案されているが、いずれもコストが高く実用的でない。
【特許文献１】特許第3064272号公報
【特許文献２】特開平14-86196号公報（請求項１、段落0010、0023など）
【特許文献３】特開2002-52374号公報（請求項１、３など）
【非特許文献１】第40回下水道研究会予稿集（第1072頁）
【非特許文献２】第40回下水道研究会予稿集（第1060頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、固形有機物を低コストで効率よく可溶化できる可溶化微生物、及び、固形有機物を低コストで効率よく可溶化できる固形有機物の可溶化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、90℃以上の温泉源に堆積している土壌及び温泉水から、66℃以上の温度で生育可能であり、このような高温下で効率良く固形有機物を可溶化できる微生物を単離した。また、この微生物がペトロトーガ属に属する嫌気性微生物であることを確認した。
【０００９】
この他、同様にして、クロストリジウム属微生物、サーモアナエロバクター属微生物及びアナエロバキュラム属微生物を単離し、これらは単独で使用する場合、及び、その１種又は２種以上を上記のペトロトーガ属微生物に併用する場合に、固形有機物を効率良く可溶化することができることを見出した。
【００１０】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の可溶化微生物及び固形有機物の可溶化方法を提供することを課題とする。
【００１１】
項１．  ペトロトーガ（Petrotoga）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００１２】
項２．  ペトロトーガ属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである項１に記載の可溶化微生物。
【００１３】
項３．  クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００１４】
項４．  クロストリジウム属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである項３に記載の可溶化微生物。
【００１５】
項５．  ペトロトーガ属微生物とクロストリジウム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００１６】
項６．  サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００１７】
項７．  サーモアナエロバクター属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである項６に記載の可溶化微生物。
【００１８】
項８．  ペトロトーガ属微生物とサーモアナエロバクター属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００１９】
項９．  アナエロバキュラム（Anaerobaculum）属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００２０】
項１０．  アナエロバキュラム属微生物が66℃以上の温度下で生育できるものである項９に記載の可溶化微生物。
【００２１】
項１１．  ペトロトーガ属微生物とアナエロバキュラム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００２２】
項１２．  ペトロトーガ属に属する微生物、クロストリジウム属に属する微生物、サーモアナエロバクター属に属する微生物及びアナエロバキュラム属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる可溶化微生物。
【００２３】
項１３．  項１〜１２のいずれかに記載の可溶化微生物の存在下で、固形有機物を分解処理する固形有機物の可溶化方法。
【００２４】
項１４．  可溶化微生物として、項１又は２に記載の可溶化微生物を使用する項１３に記載の方法。
【００２５】
項１５．  可溶化微生物として、項１２に記載の可溶化微生物を使用する項１３に記載の方法。
【００２６】
項１６．  66〜100℃の温度下で分解処理を行う項１３〜１５のいずれかに記載の可溶化方法。
【００２７】
項１７．  ５〜10のｐＨの下で分解処理を行う項１３〜１６のいずれかに記載の可溶化方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の可溶化微生物を用いることにより、高価な設備や材料を用いることなく簡単に、かつ効率良く、固形有機物を可溶化することができる。メタン発酵では可溶化された有機物がメタンに変換されることから、メタン発酵に供する固形有機物を本発明の可溶化微生物を用いて予め可溶化しておくことにより、有機物から高回収率でメタンを回収できる。
装置の滞留時間を30〜100日間程度とする場合は可溶化微生物Aを用いればよく、装置の滞留時間を2〜30日間程度とする場合は可溶化微生物Bを用いればよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
(I)可溶化微生物
第１の可溶化微生物
本発明の第１の可溶化微生物は、ペトロトーガ属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。本発明の第１の可溶化微生物は、固形有機物を70％以上可溶化できる微生物であることがより好ましい。
【００３０】
第１の可溶化微生物には、当該ペトロトーガ属微生物の他に、固形有機物の可溶化に寄与する他の微生物が含まれていてもよい。
【００３１】
本発明における「固形有機物の可溶化率」は、有機物の可溶化により固形画分中のCODが液体画分中にどれだけ移動したかを示す値であり、以下の方法で測定された値である。
【００３２】
200ml容の血清瓶に、被験微生物を1010個/ml程度含む微生物液を80mlと、モデル固形有機物として以下のようにして作製した人工生ゴミ10gとを入れ、さらに水を加えて全量を100mlとしてモデル有機物を作製する。上部気体を窒素で置換した後に、ブチルゴム栓で密閉し、80℃で保温する。5〜40時間後に、注射器を用いて内容物を0.1ml抜き取り、液体画分のCOD量（I）を測定する。液体画分は、抜き取った内容物を直ちに室温下で10,000gで10分間で遠心分離し、上澄みを0.45μm孔のフィルターで濾過した濾液を使用する。
＜人工生ゴミの作製＞
以下に示す食品材料をそれぞれ５mm角に切り、以下に示す比率で各材料を混合し、よく攪拌した。この混合物をフードカッターを用いて、10,000rpmで５分間砕き混ぜる。
【００３３】
・果実類（20%） リンゴ              2.5%
オレンジ（皮）      7.5%
バナナ（皮）         10%
・野菜類（50%） キャベツ             10%
ジャガイモ           10%
ニンジン             10%
大根                 10%
白菜                 10%
・肉（2.5%）    挽肉                2.5%
・魚介類         魚                 3.5%
骨                 1.5%
・卵類           卵                 2.5%
・残飯類（20%）  米飯                10%
パン                2.5%
麺類                7.5%
上記COD量(I)の測定方法において可溶化微生物に代えて水を加えた他は同様の可溶化処理を別途行い、液体画分のCOD量(II)を測定する。このCOD量(II)は、固形有機物が80℃加温の効果だけで可溶化した結果得られる液体画分のCOD量である。
【００３４】
上記COD量(I)の測定方法において使用する、被験微生物を添加する前のモデル有機物の固形画分のCOD量(III)を別途測定しておく。この固形画分のCOD量(III)は、モデル有機物をミキサーですりつぶした後に総COD量（液体画分のCOD量と固体画分のCOD量との合計）を測定し、この値から液体画分のCOD量を減ずることにより算出する。
【００３５】
被験微生物による固形有機物の可溶化率は、以下の式で表される。
【００３６】
可溶化率＝（I−II）／III
本発明の第１の可溶化微生物中のペトロトーガ属微生物は、66℃以上の温度下で生育できる微生物であることが好ましく、70℃の温度下で生育できる微生物であることであることがより好ましく、75℃以上の温度下で生育できる微生物であることがさらにより好ましい。
【００３７】
本発明において「生育できる」とは、菌数が１オーダー以上減少しないことを指す。
第２〜第７の可溶化微生物
本発明の第２の可溶化微生物は、クロストリジウム属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。また、本発明の第３の可溶化微生物は、ペトロトーガ属微生物とクロストリジウム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。第２の可溶化微生物には、当該クロストリジウム属微生物以外の、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよく、第３の可溶化微生物も、当該ペトロトーガ属微生物及び当該クロストリジウム属微生物の他に、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよい。
【００３８】
本発明の第６の可溶化微生物は、サーモアナエロバクター属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。また本発明の第７の可溶化微生物は、ペトロトーガ属微生物とサーモアナエロバクター属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。第５の可溶化微生物には、当該サーモアナエロバクター属微生物以外の、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよく、第６の可溶化微生物も、当該ペトロトーガ属微生物及び当該サーモアナエロバクター属微生物の他に、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよい。
【００３９】
本発明の第７の可溶化微生物は、アナエロバキュラム属に属する微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。また本発明の第８の可溶化微生物は、ペトロトーガ属微生物とアナエロバキュラム属微生物とを含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できる微生物である。第７の可溶化微生物には、当該アナエロバキュラム属微生物以外の、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよく、第８の可溶化微生物も、当該ペトロトーガ属微生物及び当該アナエロバキュラム属微生物の他に、固形有機物の可溶化に寄与する微生物が含まれていてもよい。
【００４０】
第２〜第７の各可溶化微生物は、いずれも、固形有機物を70％以上可溶化できる微生物であることが好ましい。
【００４１】
上記のクロストリジウム属微生物、サーモアナエロバクター属微生物及びアナエロバキュラム属微生物は、いずれも66℃以上の温度下で生育できる微生物であることが好ましく、70℃の温度下で生育できる微生物であることであることである好ましく、75℃以上の温度下で生育できる微生物であることがさらにより好ましい。
第８の可溶化微生物
本発明の第８の可溶化微生物は、ペトロトーガ属微生物、クロストリジウム属微生物、サーモアナエロバクター属微生物及びアナエロバキュラム属微生物を含み、嫌気性条件下で、固形有機物を60％以上可溶化できるものである。これらは、おそらく共生的混合微生物となっていると考えられる。
【００４２】
第８の各可溶化微生物は、固形有機物を80％以上可溶化できる微生物であることが好ましい。
【００４３】
上記のクロストリジウム属微生物、サーモアナエロバクター属微生物及びアナエロバキュラム属微生物は、いずれも66℃以上の温度下で生育できる微生物であることが好ましく、70℃の温度下で生育できる微生物であることであることである好ましく、75℃以上の温度下で生育できる微生物であることがさらにより好ましい。
【００４４】
本発明の第１〜第８の可溶化微生物は、例えば６６℃以上の温度の温泉源泉、海底熱水鉱床又は火山などに堆積している土壌又は温泉水などを採取し、有機物を添加して、ｐＨを５〜10程度に調整し、65〜100℃程度の温度で、嫌気性雰囲気中で培養することにより、得ることができる。
固形有機物の可溶化方法
本発明の固形有機物の可溶化方法は、本発明の第１〜第８の可溶化微生物のいずれか存在下で、固形有機物を分解処理する方法である。
【００４５】
対象となる固形有機物は特に限定されず、例えば、家庭、飲食店、ホテル、学校などから廃棄される生ゴミ；下水汚泥；畜産廃棄物などが挙げられる。また固形有機物は、固形物以外の液体成分や気体成分とともに分解処理に供されることができる。
【００４６】
本発明方法では上記の嫌気性微生物により、炭水化物、脂質又はタンパク質等が糖、アミノ酸、ペプチド等まで低分子化され、さらにその一部又は大部分は酸分解を受けてプロピオン酸、酪酸等の有機酸にまで分解されていると考えられるが、詳細は完全には明らかではない。
【００４７】
使用する微生物は、特に、ペトロトーガ属微生物を含む第１の可溶化微生物；又はペトロトーガ属微生物、クロストリジウム属微生物、サーモアナエロバクター属微生物及びサーモバキュラム属微生物を含む第８の可溶化微生物を用いることが、可溶化率が高い点で好ましい。
【００４８】
分解処理を行う可溶化槽内は嫌気性とする。槽内の上部空気をN2ガス又はCO2ガスなどで置換することにより嫌気性雰囲気とすることもできるが、槽を密閉又は略密閉するだけでもよい。
【００４９】
本発明方法では、可溶化槽内に固形有機物及び可溶化微生物を投入して分解処理を開始した後、連続的又は間欠的に新たな固形有機物を追加投入し、投入量と同量の槽内容物を引き抜く。新たな固形有機物の追加投入速度は、固形有機物及びそれが分解されたものからなる槽内容物中の可溶化微生物の密度が108〜1012個程度に維持されるようにして定める。従って、新たな固形有機物の投入速度は、微生物の種類、槽内容物のpH、温度等により定まる微生物の増殖速度によって異なってくる。
槽内への新たな固形有機物の投入量は、例えば、上記４種類の微生物を含む第８の可溶化微生物を使用する場合は、通常、１日当たり、可溶化槽の容量の1/30〜1/100程度のとすることが好ましく、1/40〜1/80程度とすることがより好ましく、1/50〜1/70程度とすることがさらにより好ましい。
また、例えばペトロトーガ属微生物を含む第１の可溶化微生物を使用する場合は、通常、１日当たり、可溶化槽の容量の1/２〜1/30程度とすることが好ましく、1/4〜1/20程度とすることがより好ましく、1/6〜1/15程度とすることがさらにより好ましい。
上記の固形有機物の追加投入速度の範囲であれば、酸分解の進行に伴い槽内容物のpHが低下し過ぎることがないとともに、十分に可溶化を行える。
なお、新たな固形有機物を、1日当たり槽容量の１/x量投入する場合は、固形有機物の槽内での滞留時間（１日の固形有機物の投入量／可溶化槽容量）はｘ日間である。
また分解処理中の槽内容物のpHは特に限定されないが、通常５〜10程度が好ましく、６〜9程度がより好ましく、７〜８程度がさらにより好ましい。上記pH範囲であれば、可溶化菌より酸分解菌の方が優先種になることがなく、かつpHが高すぎて菌の生育が阻害されるということがない。
また分解処理中の層内容物の温度は、可溶化微生物が生育する限り特に限定されず、また可溶化微生物の種類によって異なるが、概ね、66〜100℃程度とすることが好ましく、70〜90℃程度とすることがより好ましく、75〜85℃程度とすることがさらにより好ましい。上記温度範囲であれば、加温によるコストが高くなりすぎるとがなく、かつ環境中の他の微生物のコンタミネーションが回避される。
本発明方法は、このような高温で分解処理を行えるため、有機物の水等の液体画分への溶解度が向上し、低温下では分解できない物質も低分子化できる。また、分解の対象となる有機物は、細胞膜や細胞壁内に含まれている場合があるが高温下ではこれらの組織が緩み、有機物が細胞外に放出されて可溶化酵素による分解を受け易くなる。
分解処理中は、槽内容物を攪拌してもよく又はしなくてもよいが、内容物の成分に偏りが生じない程度に攪拌することが好ましい。
実施例
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
＜可溶化微生物の作製＞
泉温が９０℃以上の兵庫県下の温泉において、源泉に堆積している土壌または温泉水を採取し、ガラス製瓶（容積１L）に入れ、このガラス瓶をブチルゴム栓により密閉することにより嫌気条件とし、８０℃程度の温度、ｐＨ６．５〜８に維持しながら、10ml/日間程度の供給量でモデル生ゴミ（セルロース０．３％、でんぷん２％）を供給しつつ７日間程度維持した。
ガラス製瓶底部付近の内容物(汚泥）を採取した。前掲の人工生ゴミからなる固形有機物を添加して、嫌気性条件下で、pH7.5程度、温度80℃程度に維持しつつ、10日間程度維持したところ、固形有機物の一部が液化した。このことから、採取した土壌中には、固形有機物の可溶化微生物が含まれることが分かる。
＜可溶化微生物の作製＞
上記の可溶化微生物を含む汚泥１５０ｍｌに上記の人工生ゴミ３ｇ及び水１５０ｍｌを加え、実効容積１Ｌの密閉容器で８０℃に保温したものを分解槽（可溶化槽）とした。培養初期は、人工生ゴミの分解量及びｐＨをモニターしつつ、１日あたり５ｇの内容物を引き抜くとともに５ｇの人工生ゴミを２カ月に渡り継続的に添加した。
次に実効容積１Ｌの密閉容器に300mlの５５℃メタン発酵汚泥を入れたメタン発酵槽を準備した。このメタン発酵槽を５５℃に保温した。
上記の可溶化槽及びメタン発酵槽からそれぞれ８０mlの内容物を取り出した後、可溶化槽には、メタン発酵槽から取り出したもののうち７５ｍｌと人工生ゴミ５ｇを加え（メタン発酵槽から取り出した残り５mlは廃棄）、メタン発酵槽には可溶化槽から取り出した８０ｍｌを加えるという操作を２カ月に渡り継続した。本操作により可溶化槽内に蓄積した可溶化微生物を可溶化微生物Ａと呼ぶ。
次に１日あたりに添加する人工生ゴミ量と両槽の交換量を1週間に2割ずつ増加させていき、最終的に可溶化槽、メタン発酵槽ともに１５０mlの内容物を取り出した後、可溶化槽には、メタン発酵槽から取り出したもののうち１２０ｍｌと生ゴミ３０ｇを加え（メタン発酵槽から取り出した残り３０mlは廃棄）、メタン発酵槽には可溶化槽から取り出した１５０ｍｌを加えるという操作を２カ月に渡り継続した。本操作により作成した可溶化微生物を可溶化微生物Ｂと呼ぶ。
＜可溶化微生物構成の決定＞
可溶化微生物Ａ及びＢ並びに通常のメタン発酵汚泥のそれぞれ0.5gからアルカリ法でDNAを抽出し、その0.5μgを鋳型に以下の条件でPCR反応を行い、可溶化微生物Ａ及びＢのそれぞれに含まれる全微生物の１６ＳｒＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ条件
・プライマー１：5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG IGG CIG CA-3'(配列番号１）
・プライマー２：5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3'（配列番号２）
・初期変性:94℃で2分間
・変性:94℃で40秒間
・アニーリング:65℃から55℃に、１サイクル毎に0.5℃ずつ低下させる条件で90秒間
・伸張反応：72℃で90秒間
・反応数：４０サイクル
・最終伸張反応：72℃で7分間
得られた増幅産物5μLを下記条件のDGGE法(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）で分析した。
・変性剤濃度勾配：7M尿素及び40%ホルムアミドを100%として、40-70％
・ポリアクリルアミド濃度：7.5%
・電圧：70V
・泳動時間：16時間
・染色：0.01%サイバーグリーンで2時間
この結果、メタン発酵汚泥と比べて、可溶化微生物Aにのみ見られたDNA断片４つ（A1、A2,A3,A4）、および可溶化微生物Bにのみ見られたDNA断片１つ（B1）をポリアクリルアミドゲルから切り出し、下記抽出液に16時間浸してDNA抽出した。
抽出液組成
・0.5M酢酸アンモニウム
・10mM酢酸マグネシウム
・1mM  EDTA（pH8.0）
・0.1%SDS
得られたDNA各0.1μgを鋳型に再度以下の条件でPCR反応を行い、各DNA断片を増幅したのち、プライマー１を使って塩基配列の決定を行った。
ＰＣＲ条件
・プライマー配列３：5'- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3'(配列番号３）
・プライマー配列４：5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3'(配列番号４）
・初期変性:95℃で10分間
・変性:94℃で30秒間
・アニーリング/伸張反応:60℃で30秒間
・反応数：４０サイクル
・最終伸張反応：72℃で10分間
この結果得られた16SｒDNA-500の塩基配列を配列番号５〜８に示す。A1が配列番号５であり、A2が配列番号６であり、A3が配列番号７であり、A4が配列番号８であり、B1が配列番号９である。
これらの塩基配列をDDBJのデータベースと照合した結果、可溶化微生物Aは、A1:ペトロトーガ属微生物、A2:クロストリジウム属微生物、A3:サーモアナエロバクター属微生物、A4:アナエロバキュラム属微生物からなることが判明した。また可溶化微生物Bは、B1:ペトロトーガ属微生物からなることが判明した。
＜可溶化微生物による人工生ゴミの可溶化試験＞
人工生ゴミに可溶化微生物Ａ及びＢをそれぞれ添加し、容器を密閉して上部気体を窒素ガスに置換することにより嫌気性条件とし、pHを7.5程度、温度を80℃に保ち攪拌しつつ分解処理を行い、経時的にサンプリングして、可溶化率を測定した。また、人工生ゴミに通常のメタン醗酵汚泥を添加し、同様の嫌気性条件下で、pHを7.5程度、温度を55℃に保ち攪拌しつつ分解処理を行い、経時的にサンプリングして、可溶化率を測定した。可溶化率の推移を図１に示す。
【００５０】
図１から明らかなように、可溶化微生物A及びBのいずれを用いた場合も、メタン醗酵と比べて、高い可溶化率が得られた。特に、ペトロトーガ属微生物を含む可溶化微生物Bでは、40時間後に100％の可溶化率が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】可溶化微生物による人工生ゴミの可溶化率の推移を示す図である。図(A)は可溶化微生物Aの結果であり、図(B)は可溶化微生物Bの結果である。
【図１】
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【配列表】
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