(57)【要約】【課題】  フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を精度良く検出する方法、並びにその検出用プローブ、検出用キットを提供すること。【解決手段】  スフィンゴシン・キナーゼ１（SPHK1）結合タンパク質ＲＰＫ１１８由来のＰＸドメインをプローブに用いて、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を検出する方法。実際に、同ＰＸドメインを用いたプローブは、種々の細胞に於いて特異的にPI3Pを認識し、細胞内でのPI3Pの局在を調べるのに優れたプローブであった。本発明は各種研究解析などに利用できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴシン・キナーゼ１結合タンパク質ＲＰＫ１１８由来のＰＸドメインをプローブに用いて、フォスファチジルイノシトール３リン酸を検出する方法。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰＸドメインをプローブに使用することを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
フォスファチジルイノシトール３リン酸検出用プローブであって、スフィンゴシン・キナーゼ１結合タンパク質ＲＰＫ１１８由来のＰＸドメインを有することを特徴とするプローブ。
【請求項４】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰＸドメインを有することを特徴とする請求項３記載のプローブ。
【請求項５】
請求項３又は４記載のプローブを備えたことを特徴とする、フォスファチジルイノシトール３リン酸検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＸプローブを用いたフォスファチジルイノシトール３リン酸（以下、「PI3P」と略す場合がある。）の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フォスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸を介する細胞内情報伝達は、細胞増殖・癌化や抗アポトーシス作用の分子メカニズムを解明する中で、その下流に位置するAktと併せて急速に研究が進んできた。
【０００３】
一方、フォスファチジルイノシトール3-リン酸（PI3P）は、酵母に於ける小胞輸送を調節する因子として研究されてきた。PI3Pを産生する酵素Vps34は、一般的に良く知られるPI3キナーゼとは異なり、フォスファチジルイノシトールのみを基質とし、フォスファチジルイノシトール4,5-二リン酸を基質としない。最近、ヒトからもVps34のホモログh Vps34が同定され、ほ乳類に於けるPI3Pの生理作用に関する関心が俄に高まりつつある。
【０００４】
ほ乳類の培養細胞に於いては、PI3Pは初期エンドソーム（early endosome）、ファゴソーム（phagosome）、オートファゴソーム（autophagosome）等の膜に集積することが知られ、PI3Pによるこれらの過程の調節が推測されている（下記の非特許文献１参照）。しかしながら、PI3Pに対する特異的な抗体やプローブが利用できなかったため、この分野の研究が遅れていた。
【０００５】
PI3Pに結合する蛋白質は現在までに多く報告されているが、そのほとんどが分子内にFYVEドメイン或いはPXドメインを有することが知られている（下記の非特許文献２参照）。これらの機能ドメインは、蛋白質によってその構造に差が見られ、あるものは比較的PI3Pに特異性が高かったり、またあるものは他の脂質にも結合能が認められる。このことはFYVE或いはPXドメインを有する蛋白質の機能の多様性を示すものと理解されている。以上の経緯から、PI3Pに特異性が高く他の脂質と結合しない蛋白質のFYVEドメイン或いはPXドメインの、PI3Pを同定・検出するための結合プローブとしての幅広い応用に期待がかかり、その一部は商品化されてきたが、PI3Pに対する特異性に関しては以前から改善の余地が指摘されてきた。
【０００６】
【非特許文献１】Birkeland, H. C., Stenmark, H., Protein targeting to endosomes and phagosomes via FYVE and PX domains. Curr. Top. Microbiol. Immunol. （2004）282: 89-115.
【非特許文献２】Misra, S., Miller, G. J., Hurley, J. H., Recognizing phosphatidylinositol 3-phosphate. Cell （2001）107: 559-562.
【非特許文献３】Hayashi, S., Okada, T., Igarashi, N., Fujita, T., Jahangeer, S., Nakamura, S., Identification and characterization of RPK118, a novel sphingosine kinase-1-binding protein. J. Biol. Chem. （2002）277: 33319-33324.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、脂質代謝を介する細胞内情報伝達機構を解析してきた。最近、スフィンゴシン・キナーゼ１（SPHK1）に対する結合タンパク質を酵母two-hybrid法を用いてスクリーニングしたところ、新規蛋白質RPK118を同定した（上記の非特許文献３参照）。RPK118は、分子内にPXドメインを有し、SPHK1を初期エンドソームにリクルートする機能を有することについても明らかにした。さらにRPK118を精製し、その脂質結合能を調べたところ、PI3Pに特異的に結合し、他の脂質には結合が認められなかった。そこで、RPK118由来のPXドメインをPI3P 結合プローブとして利用することによって、従来よりも精度良くPI3Pを検出することができるのではないかと考えた。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に着目してなされたものであり、その目的は、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を精度良く検出する方法、並びにその検出用プローブ、検出用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題に鑑み、RPK118由来のPXドメインの、PI3P 結合プローブとしての利用可能性を鋭意検討した結果、同PXドメインを用いたプローブは、種々の細胞に於いて特異的にPI3Pを認識し、細胞内でのPI3Pの局在を調べるのに優れたプローブであること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、産業上および医療・医学研究上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｅ）の発明を包含するものである。
Ａ）  スフィンゴシン・キナーゼ１（SPHK1）結合タンパク質ＲＰＫ１１８由来のＰＸドメインをプローブに用いて、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を検出する方法。例えば、細胞内でのPI3Pの局在を検討する実験や、PI3Pの発現変化を調べる各種研究解析などに有用である。細胞実験系での利用に限らず、無細胞実験系（cell free system）において本発明を利用してもよい。
Ｂ）  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰＸドメインをプローブに使用することを特徴とする上記Ａ）記載の検出方法。後述の実施例に示すように、実際にこのプローブを使用することによって、PI3Pを精度良く検出することができた。
Ｃ）  フォスファチジルイノシトール３リン酸検出用プローブであって、スフィンゴシン・キナーゼ１結合タンパク質ＲＰＫ１１８由来のＰＸドメインを有することを特徴とするプローブ。プローブは、同ＰＸドメインのほかに、検出用の付加配列などを有していても勿論よい。
Ｄ）  配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰＸドメインを有することを特徴とする上記Ｃ）記載のプローブ。
Ｅ）  上記Ｃ）又はＤ）記載のプローブを備えたことを特徴とする、フォスファチジルイノシトール３リン酸検出用キット。例えば、プローブのほかに、各種反応用試薬或いは検出用試薬と組合せた構成が挙げられる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を特異的に検出することができるので、PI3Pの機能解析における利用は勿論のこと、小胞輸送・小胞形成の研究、脂質代謝を介する細胞内情報伝達機構の研究、PI3Pと疾患との関連性についての研究など、各種研究解析に本発明を利用できる。さらに、疾患の診断法や治療法の開発、治療薬のスクリーニングなどにも利用できる可能性がある。例えば、PI3Pの局在や発現に異常を示す疾患においては、本発明のプローブを当該疾患の診断用プローブに利用することができる。
【００１２】
本発明のプローブに使用されるＰＸドメインは、比較的短い配列によって構成されるので、生産容易であり、その取扱いも比較的容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の具体的態様等について更に詳しく説明する。
本発明は前述のように、ＲＰＫ１１８由来ＰＸドメイン（ＰＸ領域）をプローブに使用して、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を検出する方法である。配列表の配列番号１には、後述の実施例において実際にプローブに使用したヒトＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインのアミノ酸配列が示される。このＰＸドメインは、配列番号２に示す塩基配列（即ち、ヒトＲＰＫ１１８のＰＸドメインをコードする領域の塩基配列）を発現ベクターに挿入し、発現させることによって作製可能である。このとき、後工程での検出のため、当該ＰＸドメインを他のポリペプチド（又はタンパク質）と融合させて発現させ、得られた融合タンパク質をプローブに使用してもよい。後述の実施例においては、ＰＸドメインとＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合タンパク質をプローブに使用し、蛍光物質と結合した抗ＧＳＴ抗体によってPI3Pを同定・検出した。
【００１４】
勿論、ＧＳＴ以外のタンパク質、例えば、蛍光関連タンパク質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）又は各種エピトープ（ＨＡ・ＦＬＡＧ等）と、ＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインとの融合タンパク質をプローブに使用してもよい。あるいは、このような検出用のアミノ酸配列を付加する方法以外に、ＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインを各種蛍光物質や放射性元素等によって標識し、このように標識されたＰＸドメインをプローブに使用してもよい。
【００１５】
プローブの作製とも関連するが、具体的なPI3Pの検出方法（PI3Pの局在を可視化する方法等）については特に限定されるものではなく、後述の免疫染色法のほかに、従来公知の種々の検出方法を適用してPI3Pを同定・検出することができる。また、本発明以降に新たに開発された検出方法を使用するものであってもよい。
【００１６】
プローブに使用するＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインの配列についても、配列番号１に示す配列に限定されるものではなく、PI3Pとの特異的結合能が維持される限りにおいて、これより短い配列であってもよいし、長い配列であってもよい。また、PI3Pとの結合能を高めること等を目的として、ＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインのアミノ酸配列を人為的に一部改変してもよく、このように同ＰＸドメインを人為的に改変したものをPI3P検出プローブに使用する場合も本発明に含まれる。なお、同ＰＸドメインの人為的改変は、当該ドメインをコードする塩基配列に点変異を導入する方法等によって容易に行うことができる。
【００１７】
プローブに使用するＰＸドメインの生物起源は、検出対象のPI3Pの生物起源と同じであることが好ましいが、異なる生物起源のものを使用してもよい。例えば、配列番号１に示すヒトＲＰＫ１１８由来ＰＸドメインをプローブに使用した場合、同プローブは、ヒト由来のHeLa細胞のみならず、サル由来のCOS7細胞に対しても、細胞内のPI3Pを特異的に認識、検出することができた。
【００１８】
本発明のPI3P検出方法、検出用プローブおよび検出用キットは、例えば、細胞内でのPI3Pの局在を検討する実験や、PI3Pの発現変化を調べる各種研究解析などに有用である。また、細胞実験系での利用に限らず、無細胞実験系（cell free system）において本発明を利用してもよい。
【実施例】
【００１９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２０】
［方法］
＜GST-PXプローブ作製法＞
全長hRPK118のcDNA（DDBJ/EMBL/GenBankTM accession no. AB070706）を鋳型として、以下のプライマー対でPCR反応を行った。
センスプライマー：5'-CGGAATTCA ATG ACC TCT TAC CGG GAG-3'(配列番号３）
アンチセンスプライマー：5'-CGGAATTC AGA ACT ATC ATT AAT TAT TCC-3'(配列番号４）
【００２１】
得られたフラグメントをEcoRIで処理した後、同じくEcoRIで切断してアルカリホスファターゼ処理したpGEX-3Xベクター(アマシャムファルマシア社製。GSTコード配列を有する)にサブクローニングし、大腸菌DH5αにトランスフォームした。
【００２２】
上記ベクターに挿入された配列の全長シーケンス解析の結果、得られたPX領域の配列が正しいことを確認した（下記配列参照）。発現したGST-PX蛋白質をグルタチオンセファロース・カラムを用いて精製し、本発明のプローブとして以下の実験に使用した。
【００２３】
ヒトRPK118のPX領域のアミノ酸配列：
MTSYRERSADLARFYTVTEPQRHPRGYTVYKVTAGVVSRRNPEDVQEIIVWKRYSDFKKLHKELWQIHKNLFRHSELFPPFAKGIVFGRFDETVIEERRQCAEDLLQFSANIPALYNSKQLEDFFKGGIINDSS（配列番号１）
【００２４】
ヒトRPK118のPX領域のDNA配列：
atgacctcttaccgggagcggagtgccgacctggcccgtttctacactgtcaccgagccccagcgacacccgaggggctacacagtatataaggtcaccgccggggttgtttcacgaagaaatccagaggatgtccaggagataattgtatggaagagatacagtgattttaagaaactacacaaagaactatggcaaattcacaaaaacttattccgacattcagagttgtttcctccatttgctaaaggaatagtgtttgggcgatttgatgaaactgttatcgaagagagaagacaatgtgctgaagacctgctacagttctctgccaatattcctgctctttacaatagtaaacagcttgaagactttttcaagggtggaataattaatgatagttct（配列番号２）
【００２５】
＜PXプローブを用いた細胞の免疫染色法による細胞内PI3Pの同定＞
下記手順による免疫染色法によって、細胞内PI3Pの同定・検出を行った。
(1) 対象となる細胞試料をＰＢＳで１回洗浄
(2) 同試料を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定
(3) ＰＢＳで１回洗浄
(4) 0.1 M glycine/PBSで１５分間処理
(5) ＰＢＳで１回洗浄
(6) 0.05% digitonin（界面活性剤）含有PBSで３分間透過処理
(7) ＰＢＳで３回洗浄
(8) 1% BSA含有PBSで１０分間ブロッキング
(9) 本発明のプローブを加えた溶液（2μg/ml GST-PXプローブ）中で１時間インキュベートし、結合反応を行わせる。
(10) ＰＢＳで３回洗浄
(11) 蛍光物質Alexa488が結合した抗GST抗体（Alexa488-anti-GST）を1000倍希釈した溶液中で１時間インキュベートし、二次染色を行う。
(12) ＰＢＳで３回洗浄
(13) 免疫蛍光顕微鏡による蛍光観察
【００２６】
＜2xFYVE-GSTプローブを用いた細胞の免疫染色による細胞内PI3Pの同定＞
2xFYVE-GSTプローブ（PI(3)P probeTM, F-1000, Echelon Biosciences Inc. Salt Lake, Utah)を用いて、同社の説明書に従いHeLa細胞を染色した。
【００２７】
［実施例１：COS7細胞におけるPI3Pの同定・検出］
アフリカミドリサル腎臓由来のCOS7細胞を固定し、上記GST-PXプローブで処理後、抗GST抗体を用いて染色すると、図１に示すように、細胞内に点状の染色像が得られた。この細胞を初期エンドソームのマーカーであるEEA-1の抗体を用いて同時染色すると、同じように点状の像が得られた。融合像に於いては、これらの点状像は良く一致した（融合像に於ける矢印で示した箇所に顕著に示される）。
【００２８】
このように、GST-PXプローブを用いて染色される細胞内の点状像は、初期エンドソームの位置とよく対応し、この結果は、PI3Pがほ乳類細胞内において初期エンドソーム等に分布するという従来の知見とよく符合するものであった。また、GST-PXプローブを加えずに二次染色を行うと、陽性シグナルは検出できなかった。
【００２９】
［実施例２：HeLa細胞におけるPI3Pの同定・検出］
次に、PI3P検出用のプローブとして市販されているもの（FYVEドメインを二つ結合させた配列に更にGSTを結合させた融合蛋白質）と、今回作製したRPK118由来のGST-PXプローブとのPI3P結合能の比較を行った。
【００３０】
実験には、ヒト子宮頚癌由来のHeLa細胞を使用した。同細胞を固定後、GST-PXプローブを用いて染色した。その結果、COS7細胞の場合と同じように、細胞内に点状のパターンが検出されたが、細胞を予めフォスファチジルイノシトール３キナーゼの阻害薬Wortmannin (200 nM)で３０分間処理すると、これらのパターンは完全に消失した（図２上段参照)。
【００３１】
一方、市販されている2xFYVE-GSTプローブを用いてHeLa細胞を染色すると、GST-PXプローブを用いたときと全く異なる染色パターンが得られた。即ち、細胞膜直下に点状又は網状のパターンとして染色され、このパターンはWortmannin処理を行ってもほとんど変化が認められなかった（図２下段参照）。
【００３２】
以上のように、GST-PXプローブおよび2xFYVE-GSTプローブを用いてHeLa細胞内のPI3Pの分布パターンを比較した結果、GST-PXプローブの場合には、HeLa細胞に於いてもCOS7細胞の場合と同じように点状構造が観察されたが、PI3キナーゼの阻害薬Wortmannin処理を行うと、これらの点状構造は完全に消失した。一方、2xFYVE-GSTプローブの場合には、GST-PXプローブを用いた場合とは全く異なる染色パターンが得られたが、これらの構造体はWortmanninに非感受性であった。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、フォスファチジルイノシトール３リン酸（PI3P）を特異的に検出することができるので、例えば、種々の細胞に於いてPI3Pを特異的に検出し、細胞内でのPI3Pの局在を調べることができ、前述したとおり、各種研究解析に利用できるほか、PI3Pが関係する疾患の診断法や治療法の開発、治療薬のスクリーニングなどにも利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のGST-PXプローブを用いてCOS7細胞内のPI3Pを検出した結果（図左）を示す図である。EEA-1の抗体を用いて同時染色した結果（図中央）もあわせて示される。図右は、両結果の融合像である。
【図２】本発明のGST-PXプローブを用いてHeLa細胞内のPI3Pを検出した結果(図上段)を示す図である。比較のため、2xFYVE-GSTプローブを用いた結果（図下段）もあわせて示される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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