(57)【要約】      （修正有）【課題】測定の再現性と安定性を有し、微量糖脂質の高感度測定に適した担体の作製法とそれを用いた測定法を提供すること。【解決手段】長鎖炭化水素鎖を含む化合物が共有結合により固層化されたマイクロプレートを用いて糖脂質を測定すること。【効果】本発明のマイクロプレートは糖脂質の微量測定に適しており、医学や生化学の研究分野、または診断分野等において有用である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖炭化水素鎖を含む化合物が共有結合により固層化されたマイクロプレート。
【請求項２】
前記長鎖炭化水素鎖の炭素数が８〜１８である、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記共有結合がアミド結合である、請求項１又は２に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
糖脂質測定用である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
請求項４に記載のマイクロプレートを含む、糖脂質測定用キット。
【請求項６】
糖脂質を含む試料を請求項４に記載のマイクロプレートに添加し、該マイクロプレートに結合した糖脂質の量を測定することを特徴とする、糖脂質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖脂質の微量測定に適したマイクロプレートに関する。本発明はまた、該マイクロプレートを用いた糖脂質の微量測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質とは分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基を含む物質であり、スフィンゴ糖脂質及びグリセロ糖脂質等が含まれる。近年の研究により、これらの糖脂質がシグナル伝達や抗原反応など生体内で重要な役割を果たしていることが明らかにされつつあり、糖脂質を正確に測定する方法の確立が求められている。
【０００３】
糖脂質など分子内に疎水基を持つ分子の測定にはまず固層に結合させることが必須であり、従来のマイクロプレートなどを用いたELISA法による糖脂質抗原の測定では、ポリスチレン製マイクロプレートなどが汎用され、ポリスチレンとの疎水結合を介して糖脂質を結合させる方法が使用されている。ポリスチレン担体自身は疎水基であるベンゼン環を露出しているものの、疎水基との疎水結合を介する脂質などとの結合には、ベンゼン環が持つ立体化学的な制約から疎水基を持つ物質との結合は不十分であり、それが測定値の再現性や信憑性に疑念をもたらす結果となっている。また、ベンゼン環はその立体化学的なサイズの小ささから、疎水基としての性質は弱い。従って、固定化した脂質類は、ELISA法などに必須な操作である緩衝液による洗浄やタンパク質によるブロッキングの段階でかなりの量が固層から逸脱する。このように、従来のマイクロプレートは糖脂質抗原の担体への固定化量が不安定であり、また、糖脂質糖鎖の違いによって固定化量が異なることから糖脂質量の測定には限界があった。
【０００４】
疎水基を分子内に持つ糖脂質やリン脂質は炭素数８個（オクチル）のアガロースゲルや炭素数１８個（ステアリル基）のシリカゲル担体によく結合することが報告されており、これらの担体は、主にこれら脂質の脂肪酸鎖の違いによる分子種の分離や脂質溶液からの脱塩に用いられている（例えば、島津製作所製のODSカラム）。しかしながらこれらのアガロースゲルやシリカゲル担体は、マイクロプレートなどのような多数の脂質類を高速に測定するために成形することは不可能であり、また、長鎖炭化水素を有する担体が脂質類の定量測定に使用された例はなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、測定の再現性と安定性を有し、微量糖脂質の高感度測定に適した担体の作製法とそれを用いた測定法を提供することを課題とする。
【０００６】
具体的には以下を課題とする。
（１）脂質類の測定技術を完全なものとするため、強い疎水結合能を持つ担体を提供する。
（２）糖脂質を含む脂質類の固定化量を増大させ、さらに固定化された脂質類の洗浄などによる逸脱を防止する方法を提供する。
（３）疎水性担体の合成法に新たな方法を導入する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、長鎖炭化水素鎖を固層化したプレートを用いることにより、糖脂質を正確に再現性良く測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）長鎖炭化水素鎖を含む化合物が共有結合により固層化されたマイクロプレート。
（２）前記長鎖炭化水素鎖の炭素数が８〜１８である、（１）のマイクロプレート。
（３）前記共有結合がアミド結合である、（１）又は（２）のマイクロプレート。
（４）糖脂質測定用である、（１）〜（３）のいずれかのマイクロプレート。
（５）（４）のマイクロプレートを含む、糖脂質測定用キット。
（６）糖脂質を含む試料を（４）のマイクロプレートに添加し、該マイクロプレートに結合した糖脂質の量を測定することを特徴とする、糖脂質の測定方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプレートは糖脂質に対して強い疎水結合能を有しており、洗浄などによる糖脂質の逸脱が起こりにくい。したがって、本発明のプレートを用いることにより、糖脂質を正確に再現性良く測定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のマイクロプレートは、長鎖炭化水素鎖を含む化合物が共有結合により固層化されたマイクロプレートである。
【００１１】
マイクロプレートとは、微量の液体試料を添加することのできる容器をいうが、多種類の試料を添加できるように複数のウェル（穴）を有するものであってもよい。例えば、６、１２、２４、４８、９６穴のマルチウェルのプレートを挙げることができる。
【００１２】
本発明のマイクロプレート上には、長鎖炭化水素鎖を含む化合物が共有結合により固層化されている。固層化された化合物に含まれる長鎖炭化水素鎖の長さは糖脂質を十分に疎水的に結合させることができる限り制限されないが、炭素数８〜２４であることが好ましく、８〜１８であることがより好ましい。なお、化合物中の長鎖炭化水素鎖は枝分かれしていてもよい。この場合、上記炭素数は最も長い鎖の炭素数を指す。さらに、長鎖炭化水素鎖には不飽和炭素が含まれていてもよい。
【００１３】
共有結合の種類は特に制限されないが、例えば、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、イミノ結合などが挙げられ、その中では特にアミド結合が好ましい。長鎖炭化水素鎖を含む化合物がアミド結合により固層化されたプレートとしては、オクチル基がアミド結合を介して結合したプレート、オクタデシル基がアミド結合を介して結合したプレートなどが例示できる。
【００１４】
本発明のマイクロプレートは、長鎖炭化水素鎖を含む化合物を、該化合物が共有結合可能な官能基を有するマイクロプレート上に、共有結合を介して固層化することにより製造することができる。製造に用いる長鎖炭化水素鎖を含む化合物としては、長鎖炭化水素鎖にカルボキシル基やアミノ基などの反応基が結合したものを挙げることができる。これらの反応基は長鎖炭化水素鎖又は疎水性官能基の末端に結合していることが好ましい。このような化合物としては、長鎖脂肪酸や長鎖アルキルアミンなどを例示することができる。
【００１５】
一方、化合物の反応基と共有結合可能な官能基を有するマイクロプレートとしては、例えば、化合物がカルボキシル基を含む化合物である場合には、アミノ基などを有するプレートを用い、化合物がアミノ基を含む化合物である場合はカルボキシル基やN-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（NHSエステル）、マレイミド基などを有するプレートを用いることができる。このようなプレートは、通常のプラスチックプレートなどに官能基を導入することによって得ることができる。アミノ基を有するプレートとしては、住友ベークライト社のAプレート、カルボキシル基を有するプレートとしては、同社のCプレート
などを例示することができる。
【００１６】
具体的には、例えば、長鎖カルボン酸を、アミノ基を有するプレート上にカルボジイミドなどの縮合剤を用いて共有結合させることにより、長鎖アルキル化合物がアミド結合により固層化されたプレートを作製することができる。このようなプレートは長鎖アルキルアミンを、カルボキシル基を有するプレート上に共有結合させることによっても得ることができる。なお、プレート上に固層化された官能基と、化合物に含まれる官能基の組合せは共有結合により固層化される限り、特に制限されない。
【００１７】
本発明のマイクロプレートに固層化された長鎖炭化水素鎖は糖脂質に含まれる疎水鎖と相互作用するため、本発明のマイクロプレートは糖脂質の測定に好適に使用することができる。
【００１８】
本発明において、糖脂質とは、分子内に水溶性糖鎖と脂溶性基を含む物質を言うが、本発明における糖脂質には、スフィンゴ糖脂質、及びグリセロ糖脂質等が含まれる。また、本発明における糖脂質には、シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシド、硫酸を含む糖脂質であるスルファチド（スルホリピド）、ウロン酸を含む糖脂質、又はリン酸を含む糖脂質などの酸性糖脂質、及び中性糖脂質等が含まれる。なお、ガングリオシド（シアロ糖脂質 ）は、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質の総称である。このガングリオシドとしては、例えば、ＧＭ１ａ、ＧＭ１ｂ、ＧＭ１−Ｆｕｃ、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＭ３（ＮｅｕＧｃ）、ＧＭ４、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３（ＮｅｕＡｃ／ＮｅｕＧｃ）、ＧＤ３（ＮｅｕＧｃ）２、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ａ、ＧＱ１ｂ、ＧＱ１ｃ、ＧＰ１ａ、ＧＰ１ｂ、ＧＰ１ｃ、又はＬＭ１等を挙げることができる。
【００１９】
本発明のマイクロプレートを用いて上記のような糖脂質を測定する方法としては、例えば、動物や植物などの生体由来の組織や細胞などから常法により抽出された糖脂質含有試料を本発明のマイクロプレートに添加し、洗浄などを行った後、マイクロプレートに長鎖炭化水素鎖を介して結合した糖脂質を検出する方法が挙げられる。糖脂質は、直接測定してもよいが、抗体などを用いて測定することが好ましい。マイクロプレートリーダーを用いて同時に多検体を測定することも可能である。
【００２０】
抗体を用いた検出法としては、ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法が挙げられる。具体的には、例えば、糖脂質含有試料を本発明のマイクロプレートに添加し、洗浄などを行った後、マイクロプレート上に長鎖炭化水素鎖を介して結合した糖脂質に、糖脂質を特異的に認識する抗体を反応させ、その後、該抗体のFc部位などを認識する２次抗体を用いて検出することができる。２次抗体は、検出のため、蛍光物質や酵素などで標識されていることが好ましい。また、２次抗体にビオチンが結合したものを用い、検出にアビジンが結合した酵素を用いることもできる。酵素としてはペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどを例示することができる。なお、糖脂質に対する抗体は市販されているものを用いることができる。
【００２１】
本発明はまた、本発明のマイクロプレートを含む糖脂質の測定用キットを提供する。このようなキットは、さらに、検出用抗体などを含むものであってもよい。例えば、ELISA用キットの場合、抗糖脂質抗体、標識２次抗体、検出基質などを含むキットを挙げることができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２３】
（１）試薬の調製
糖脂質のプレートへのブロッキング用タンパク質としては、1%牛血清アルブミン(BSA)、1%ヒト血清アルブミン(HSA)、1%ニワトリアルブミン(OVA)、0.3％ゼラチン、5％スキムミルク（S.M）、Block Ace (B.A；雪印社)、又はSuper Block (S.B;  Pearce社）を含むリン酸緩衝液(PBS)（pH 7.4）を使用した。これらのタンパク質は従来、糖脂質固定化後のブロッキングに用いられているものである。洗浄液としては、ツィーン(Tw20；Poly（Oxyethylene）sorbitan monolaulate)0.02%を含むPBS（pH 7.4）緩衝液を用いた。
【００２４】
（２）プレートの作製
住友ベークライト製のアミノ基が露出するA-プレート(0.17nmol 露出)、カルボキシル基が露出するC-プレート（0.30nmol露出）を長鎖炭化水素鎖導入プレートに用いた。
【００２５】
A-プレート１ウェル当たり5 nmolのオクタン酸（炭素数８）、又はC-プレート１ウェル当たり5 nmolのオクチルアミンを加え、以下は共通に5μlのDMSO溶液、1 mgの水溶性カルボジイミド(WSC)、95 μlのPBS（pH5.8）を加え、37℃、1〜5時間反応させた。反応後、反応液を除去して、エタノール0.3mlで５回洗浄後、PBS（pH7.4）0.3mlで３回洗浄し、同様の緩衝液を入れて使用時まで冷所にて保存した。Aプレートにオクタン酸を結合させたものをOct-Aプレート、Cプレートにオクチルアミンを結合させたものをOct-Cプレートとした（図１参照）。また、これらの反応において、オクタン酸のかわりに同濃度のオクタデカン酸（炭素数18）を、オクチルアミンのかわりにオクタデシルアミン（炭素数18）を用いて、それぞれに対応する疎水性プレートを作製した（OD-Aプレート、OD-Cプレート）。
【００２６】
上記プレートへの長鎖炭化水素の結合量を調べるため、A-プレートのアミノ基へ、カルボン酸の結合反応液として、[14C]標識オクタン酸あるいは [14C]標識オクタデカン酸を加え、反応後、反応上清の一部を分取して未反応のカルボン酸の放射活性を測定し、ウェルへのカルボン酸の結合量を決定した（図３）。コントロールとして、WSCを加えない反応系を用いた。一方、C-プレートへの脂肪族アミンの結合量の決定には、標識脂肪族アミンを加え、反応上清の未反応脂肪族アミンを蛍光分析法（フロレスカミン法）により分析した。
【００２７】
（３）糖脂質抗原
中性糖脂質としてウマ腎臓から精製したLactosylCeramide(LC)を、酸性糖脂質として牛脳から精製したGM1あるいはGD1aを用いた。これらの糖脂質の分子像は、LCは糖鎖が短いため比較的疎水性であり、GM1,GD1aは糖鎖が長いため比較的親水性である（図２参照）。糖脂質のプレートへの結合量および洗浄による逸脱量を測定するため、それぞれの糖脂質の一部を既知の方法によりトリチウム標識した。
【００２８】
（４）糖脂質の結合
プレートに対する糖脂質の結合量および洗浄による逸脱量の測定では、１ウェル当たり放射標識糖脂質（GM1又はLC）0.1μgを含む５μｌアルコール溶液を加えて、洗浄後、乾燥させて糖脂質を結合させた。洗浄液における標識糖脂質の回収率から結合量を測定した（図４，５）。なお、比較対象のためのプレートとして、Immulon1B (Dynatech社、ポリスチレン製)、MaxiSorpプレート(Nunc社、ポリプロピレン製)を用いた。
【００２９】
（５）プレートの結合力とブロッキング剤の検討
各プレートに糖脂質を結合させた後、0〜0.06％の濃度の界面活性剤Twを含むPBS＋0.3%gelatinで洗浄し、その後、ELISA法（後述）を行い、各プレートに結合した糖脂質の遊離度（遊離しやすさ）測定した（図６）。
【００３０】
次に、各プレートを用いてELISA法を行う際のバックグランドを低減するブロッキング剤として、PBS中0.3%gelatin, 1%HSA, 1%BSA, 4倍希釈ブロックエース、Super Block, 1%OVA, 1%スキムミルクを用い、それらの効果を調べた（図７）。洗浄液には各タンパク質とTween0.02%を含むPBS緩衝液を用いた。
【００３１】
（６）ELISA法による測定
ELISA法による糖脂質の測定では、１ウェル当たり非標識糖脂質0〜100ngを含む５μｌアルコール溶液を加えた。比較対照のため、糖脂質を含まない等量のアルコールを別のウェルに加えた。
【００３２】
ELISA法は既知の方法によった。糖脂質に対する抗体のうち、GM1(IgG)とGD1a(IgM)に対するモノクローナル抗体が市販されているため、それらを一次抗体に、二次抗体に前者にはペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG ヒツジ抗体（Jackson ImmunoResearch社）を、後者にはペルオキシダーゼ標識抗マウスI gM抗体（Jackson ImmunoResearch社）を用いた。
【００３３】
Oct-A、OD-A、Oct-C、OD-Cの各プレート、Immulonn1B, Nunc製プレート,未処理のA-プレートならびにC-プレートに、標準GD1aを100ng, 50ng, 25ng, 10ng, 5ng, 2.5ng, 1ng, 0ngを加え、0.3% gelatin-PBS（pH 7.8）100μｌで室温２時間ブロッキングした後、gelatin溶液を捨て、500倍希釈の抗GM1 あるいはGD1aマウスモノクローナル抗体を加えて室温１時間反応した。次いで0.02%Twを含む0.3% gelatin-PBS（pH 7.8）（洗浄液）200μl で３回洗浄後、5000倍希釈のドンキー由来Peroxidase標識抗IgM抗体50μl加えて室温２時間反応させ、上記洗浄液で３回洗浄の後、基質（ABTS）50μｌ加えて室温10分反応させた。反応停止液50μｌを加えた後、405nmの吸光度を測定した。比較対照に、相当する非免疫イムノグロブリン（NonImIgM）を抗体の代わりに用いるか、あるいは糖脂質を含まない系を用いた。
【００３４】
（７）測定結果
１．プレートへの長鎖炭化水素鎖の結合
A-プレートへのオクタン酸（Oct-A）あるいはオクタデカン酸（OD-A）の結合量はそれぞれ0.23および0.21 nmol/ウェルであった。一方、C-プレートへのオクチルアミン（Oct-C）およびオクタデシルアミン（OD-C）の結合は0.13および0.11 nmol/ウェルであった。なお、図３には、Aプレートへ結合しなかったオクタン酸の量をたて軸に示した。P1及びP2は２回の実験結果のそれぞれの値である。コントロール（C）に比べてP1及びP2では回収液中の放射活性が減少しており、プレートに放射標識されたオクタン酸が結合したことがわかった。
【００３５】
２．プレートへの糖脂質の結合
上記作製した４種プレートおよびImmulonn1B, Nunc製プレート、未処理のA-プレートならびに未処理C-プレートに、放射標識されたLC, GM1あるいはGD1aを添加した後、洗浄液における標識糖脂質の回収率から結合量を測定した。その結果、GM1では、ポリスチレン製プレート（Immulonn1B, Nunc製プレート）よりも長鎖炭化水素鎖プレートに対する結合量が有意に勝っていた（図４）。しかし、疎水性の強いLCでは、Immulon製にも大量に結合しており（図５）、長鎖炭化水素鎖プレートと結合量の差は認められなかった。これはポリスチレン製プレートに露出するベンゼン環の露出量に比べ、上記で作製したOct-A-プレートやOct-C-プレートの長鎖炭化水素鎖の量が十分でなかったと考えられる。これについては、Oct-A-プレートやOct-C-プレートのアミノ基やカルボキシル基の露出量を増加させることで解決することができると考えられる。
【００３６】
３．プレートの結合力及びブロッキング剤の効果
長鎖炭化水素鎖固層化プレートではTw濃度0.02%まで糖脂質が80〜90%プレートに保持さ
れていたが、Immulon製、Nunc製プレートではTw濃度0.01％で約80%が遊離し、長鎖炭化水素鎖プレートの結合力の強さが証明された（図６）。
【００３７】
バックグランドを低減するブロッキング剤としては、長鎖炭化水素鎖プレートではgelatinとスキムミルクが優れていた（図７）。かつ、比較対照の測定値は低く抑えられた。これは洗浄液中のTｗの存在によると考えられた。
【００３８】
４．ELISA法による糖脂質抗原の測定
何れの長鎖炭化水素鎖プレートも2.5ng以上50ngまでの糖脂質が対数比例的に測定できた。一方、Immulon製およびNunc製プレートはGD1aでは洗浄液中のTwによって結合量が減少したため、低い感度となっている（図８）。このことから長鎖炭化水素鎖プレートが従来のマイクロプレートより優れていることが明らかである。なお、図８の縦軸は405nmの吸光度（OD405nm）を示している。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のマイクロプレートは糖脂質の微量測定に適しており、医学や生化学の研究分野、または診断分野等において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明のプレートの模式図。
【図２】糖脂質の構造を示す図。
【図３】プレートへの長鎖炭化水素鎖の固層化量を示すグラフ図。
【図４】各プレートへのGM1の結合量を示すグラフ図。
【図５】各プレートへのLCの結合量を示すグラフ図。
【図６】各プレートに結合した糖脂質の遊離度を示すグラフ図。
【図７】ブロッキング剤の効果を示すグラフ図。
【図８】各プレートを用いたELISA法の感度を示すグラフ図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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