(57)【要約】【課題】鶏のヘモフィルス・パラガリナラムＡ型感染症に対するワクチンを注射した後、注射局所が腫脹するなどの副作用が生じる場合があり、副作用の少ないワクチンの開発が望まれている。【解決手段】ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物に赤血球凝集抑制抗体産生を誘導する組み換え蛋白であって、配列番号１で示された塩基配列を含む塩基配列から作製される組み換え蛋白である。また、本発明の組み換え蛋白を筋肉内投与して鶏を免疫化する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物に赤血球凝集抑制（以下、「ＨＩ」という。）抗体産生を誘導することを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項２】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においてヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質をもつことを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項３】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においてヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質が、熱処理によって消失することを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項４】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質が、ＳＤＳ処理によって消失することを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項５】
前記動物がほ乳類または鳥類であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組み換え蛋白。
【請求項６】
配列番号１で示された塩基配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のある塩基配列を含む塩基配列から作製されることを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項７】
配列番号２で示されたアミノ酸配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のあるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項８】
配列番号３で示された塩基配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のある塩基配列から作製されることを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項９】
配列番号４で示されたアミノ酸配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のあるアミノ酸配列を有することを特徴とする組み換え蛋白。
【請求項１０】
請求項１乃至９に記載した組み換え蛋白を筋肉内投与して鶏を免疫化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の感染防御抗原である赤血球凝集素（以下、「ＨＡ」という。）を組み換え蛋白として得ることであり、この蛋白を用いて鶏等の動物を免疫化する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘモフィルス・パラガリナラムは、伝染性コリーザと呼ばれる家禽の呼吸器伝染病の原因菌である。症状は鼻汁の漏出、顔面の腫脹、流涙などであり、致死率は低いが、しばしば他の感染症を併発して重症となる。養鶏産業においては育成率、産卵率の低下による経済的な損失が大きな伝染病である。血清型はＰａｇｅが凝集反応によって３つの型が存在することを報告し、Ａ，Ｂ，Ｃ型と呼ばれる（例えば、非特許文献１を参照。）。また、交差免疫は成立しないことがＫｕｍｅらの報告によって明らかにされた（例えば、非特許文献２、３、４、５を参照。）。
【０００３】
伝染性コリーザの予防にはワクチンが有効であり、強毒株を鶏血清加鶏肉汁培地で培養し、ホルマリンもしくはチメロサールで不活化した菌体を抗原に用いた不活化ワクチンが広く使用されている。このワクチンを注射することにより菌体表面に存在する赤血球凝集素（以下、「ＨＡ」という。）に対する赤血球凝集抑制（ＨＩ）抗体の産生が誘導され、ＯｔｕｋｉらやＫｕｍｅらがすでに報告しているとおり、ＨＩ抗体価が高いほど感染防御率が高いことが知られている（例えば、非特許文献６、７を参照。）。
【０００４】
また、Ｍａｔｕｍｏｔｏらはヘモフィルス・パラガリナラム不活化菌体を用いたワクチンを注射することによって、注射局所が腫脹したり、限局的に壊死巣を形成したりすることがあると報告している（例えば、非特許文献８を参照。）。本局所反応の原因となる物質は特定されておらず、より安全性の高いワクチン抗原の開発が望まれている。
【０００５】
上述のＯｔｕｋｉらの報告にあるようにヘモフィルス・パラガリナラムの感染防御抗原としては、ＨＡが以前から注目されている。Ｋｕｍｅ、Ｓａｗａｔａらの報告では、Ａ型菌のＨＡは、易熱性でトリプシン感受性であるＨＡ−Ｌ、易熱性でトリプシン耐性であるＨＡ−ＨＬ及び耐熱性でトリプシン耐性であるＨＡ−ＨＳの少なくとも３種類のＨＡが存在するとしている（例えば、非特許文献９、１０を参照。）。また、Ｉｒｉｔａｎｉらは、易熱性で蛋白分解酵素感受性の３９キロダルトンの蛋白を精製し、この蛋白がＨＡ性を示したことからＨＡの分子量は３９キロダルトンであると報告している（例えば、非特許文献１１を参照。）。
【０００６】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体を作製したという報告は数例あるが、作製した単クローン抗体を用いてＨＡ蛋白の遺伝子解析を行っているのは以下の２例である。すなわち、Ｔａｋａｇｉらは、ＨＩ活性を有する単クローン抗体を用いたウェスタン・ブロット法で３９キロダルトンの蛋白を同定したと報告し（例えば、非特許文献１２を参照。）、ＨｏｂｂらはＴａｋａｇｉらが作製した単クローン抗体を用いてヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の３９キロダルトンの蛋白をコードする遺伝子を同定し、塩基配列を報告している。しかし、この遺伝子断片がコードする組み換え蛋白の免疫原性については報告がない（例えば、非特許文献１３を参照。）。
【０００７】
徳永らは、ＨＩ活性を有する単クローン抗体をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによって分子量約１３０キロダルトンの蛋白（以下、本蛋白を「HPGp１３０」という。）を培養液上清から分離精製した。このHPGp１３０を用いて鶏を免疫したところＨＩ抗体の誘導が認められ、その後に強毒株を用いて攻撃試験を実施した結果、高い感染防御能を示したと報告した。次に、ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株のゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、HPGp１３０をモルモットに免役して得られた血清を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし、１．２キロベースペア（ｋｂｐ）の遺伝子断片が得られ、さらにこの遺伝子断片をプローブに用いてスクリーニングし、３．５ｋｂｐ、４．５ｋｂｐ、６．７ｋｂｐ、２．７ｋｂｐの遺伝子断片を得た。これらの遺伝子断片を解析して８，９３０ベースペア（ｂｐ）の塩基配列が得られ、この配列中に２，０４２個のアミノ酸をコードする６，１２６ｂｐの塩基配列からなるオープンリーディングフレームが認められたことを報告した。また、８，９３０ｂｐの塩基配列に含まれるＮｏ．１〜３，４５０の３，４５０ｂｐと、Ｎｏ．２，２１２〜６，２７５の４，０６４ｂｐによってコードされるポリペプチドが感染防御抗原として有効であることを報告しているが、本ポリペプチドとＨＩ活性を有する単クローン抗体との反応性、本ポリペプチドのＨＩ抗体誘導能については報告されていない（例えば、特許文献１、２を参照。）。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−８４９６９号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第2003/0027987 A1号明細書
【非特許文献１】American Journal of Veterinary Research,1962,23, p85-95
【非特許文献２】Japanese Journal of Veterinary Science,1978,40,p65-73
【非特許文献３】American Journal of Veterinary Research,1980,41,p97-100
【非特許文献４】American Journal of Veterinary Research,1980,41,p757-760
【非特許文献５】Japanese Journal of Veterinary Science,1980,42,p673-680
【非特許文献６】Avian Diseases,1974,18,p297-304
【非特許文献７】Japanese Journal of Veterinary Science,1984,46,p843-850
【非特許文献８】Avian Diseases,1971,15,p109-117
【非特許文献９】Japanese Journal of Veterinary Science,1983,45,p783-792
【非特許文献１０】Japanese Journal of Veterinary Science,1984,46,p21-29
【非特許文献１１】American Journal of Veterinary Research,1980,41,p2114-2118
【非特許文献１２】Veterinary Microbiology,1991,27,p327-338
【非特許文献１３】Microbiology,2002,148,p2171-2179
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
鶏のヘモフィルス・パラガリナラムＡ型感染症に対するワクチンを注射した後、注射局所が腫脹するなどの副作用が生じる場合があり、副作用の少ないワクチンの開発が望まれている。そのためには、ワクチン抗原として使われているヘモフィルス・パラガリナラムの不活化全菌体を、組み換え蛋白として作製した感染防御抗原に置換することが一つの解決策として考えられる。つまり、感染防御に必要とされるＨＩ抗体を誘導する感染防御抗原をコードする遺伝子を同定して、組み換え蛋白を作製することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、種々検討を行った結果、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の感染防御抗原と考えられているＨＡ蛋白の一部をコードする遺伝子断片を発見し、組み換え大腸菌を作製して組み換え蛋白として得るにいたった。すなわち、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物に赤血球凝集抑制（以下、「ＨＩ」という。）抗体産生を誘導することを特徴とする組み換え蛋白であって、動物がほ乳類または鳥類であることが好ましい。
【００１１】
本発明の第二は、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においてヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質をもつことを特徴とする組み換え蛋白であって、動物がほ乳類または鳥類であることが好ましい。
【００１２】
本発明の第三は、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においてヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質が、熱処理によって消失することを特徴とする組み換え蛋白あって、動物がほ乳類または鳥類であることが好ましい。
【００１３】
本発明の第四は、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌の外膜蛋白遺伝子由来の蛋白であり、投与した動物にＨＩ抗体産生を誘導し、ＥＬＩＳＡ法またはイムノドットブロット法においヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来のＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する性質が、ＳＤＳ処理によって消失することを特徴とする組み換え蛋白あって、動物がほ乳類または鳥類であることが好ましい。
【００１４】
本発明の第五は、配列番号１で示された塩基配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のある塩基配列を含む塩基配列から作製されることを特徴とする組み換え蛋白であって、配列番号３で示された塩基配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のある塩基配列から作製されることが好ましい。
【００１５】
本発明の第六は、配列番号２で示されたアミノ酸配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のあるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする組み換え蛋白であって、配列番号４で示されたアミノ酸配列を基本にした一部変異配列、一部挿入配列、または一部欠損配列のあるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００１６】
本発明の第七は、本発明の第一乃至第六で得られた組み換え蛋白を筋肉内投与して鶏を免疫化する方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって提供されるヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌由来の組み換え蛋白は、１００℃５分程度の熱感作や０．１％程度のSodium Dodecyl Sulfate（以下、「ＳＤＳ」という。）による可溶化によってその抗原性が失われるという特徴を有し、これらの処理を必要とするウェスタン・ブロット法による解析は不可能である。しかし、ＥＬＩＳＡ法とイムノドットブロット法によってＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応することと、ＨＩ活性を有する単クローン抗体のＨＩ活性を阻害する性質をもつことから、ＨＡ蛋白の一部であることが確認され、これらの特徴をもつ蛋白はこれまでに報告がなく、新規の蛋白である。さらに、本発明の組み換え蛋白は、既存のポリペプチドなどとは異なり、１回の注射による投与によって、その効果を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌のＨＡをコードする遺伝子を同定して組み換え蛋白を作製し、その免疫原性を確認するために以下の試験を実施した。すなわち、ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体をマウスに免役し、ＨＩ活性を有する単クローン抗体を作製した。一般的には単クローン抗体が得られれば、ウェスタン・ブロット法によってその単クローン抗体が認識する蛋白が同定できるが、ウェスタン・ブロット法では反応するバンドが認められなかった。そこでこのＨＩ活性を有する単クローン抗体が認識する蛋白をコードする遺伝子を同定することとした。ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株の染色体遺伝子を制限酵素SauIIIAIで部分消化し、ファージベクターZap Express Vector(Stratagene社製) に連結して組み換えファージライブラリーを作製した。ＨＩ活性を有する単クローン抗体を用いた酵素抗体法によって、ファージライブラリーのスクリーニングを実施し、陽性クローンが一つ得られた。ExAssist helper phage システム(Stratagene社製) によってファージミドとし、遺伝子解析を実施した結果、得られた遺伝子断片は配列番号３に示す５，１５７ベースペア（ｂｐ）であった（以下、このファージミドを「pHL17」という。）。
【００１９】
次に、pHL17の欠失変異体を作製し、５，１５７ｂｐより短い挿入遺伝子断片をもつ４つのクローンが得られた（以下、これらのファージミドを「ｐＨＬ17Ｅ5」、「ｐＨＬ17Ｅ8」、「ｐＨＬ17Ｅ9」及び「ｐＨＬ17Ｆ1」という。）。これらのクローンの遺伝子断片の塩基配列を解析し、図１に示した。また、組み換え蛋白の発現を誘導してその菌体を破砕し、未破砕菌体を除いた粗精製組み換え蛋白を作製してＨＩ活性を有する単クローン抗体との反応性をイムノドットブロット法によって解析した結果を表１に示した。さらに、徳永らが報告した組み換え蛋白、粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチドと粗ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチドを作製して供試した。これらの結果からＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応するエピトープを発現させる最短の遺伝子断片は配列番号１に示したｐＨＬ17Ｅ5の４，８０１ｂｐであることが明らかとなった。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
ＨＩ活性を有する単クローン抗体とｐＨＬ17Ｅ5粗精製組み換え蛋白との反応の特異性を確認するために、ＨＩ抑制試験を実施した。ｐＨＬ17Ｅ5粗精製組み換え蛋白、徳永らが報告している粗ＨＰＧ３．５ｋ−ＨＩＳポリペプチドと粗ＨＰＧ４．１ｋ−ＨＩＳポリペプチド、ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体、対照としてリン酸緩衝食塩液（以下、「ＰＢＳ」という。）、大腸菌XLOLR株の菌体破砕液、を供試した。これらの抗原とＨＩ活性を有する単クローン抗体を混合して感作し、遠心分離の後に上清を用いてＨＩ抗体価の測定を行った結果を表２に示した。ｐＨＬ17Ｅ5粗精製組み換え蛋白を感作させた単クローンのＨＩ抗体価は明らかに低くなり、この反応が特異的であることが確認された。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
さらに組み換え蛋白の発現を誘導した菌体破砕液をオイルアジュバントと混合乳化して鶏の脚部筋肉内へ注射し、注射後４週目及び５週目にＨＩ抗体価を測定し、５週目の採血の後にヘモフィルス・パラガリナラム２２１株で攻撃し、その結果を表３に示した。ｐＨＬ17Ｅ5及びｐＨＬ17Ｅ8の粗精製組み換え蛋白を免役した群はＨＩ抗体価の上昇が認められ、１００％の発症防御率であった。以下の実施例において、詳細を説明する。
【００２４】
【表３】
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【実施例１】
【００２５】
まず、ＨＩ活性を有する単クローン抗体の作製を実施した。ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体とFreund incomplete adjuvant（DIFCO社製）を混合、乳化したものでマウスを３週間隔で３回免役し、最後に全菌体のみを静脈内に注射して最終免疫した。骨髄腫細胞sp2/0 を用い、常法に従ってポリエチレングリコールを用いた細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製した。ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体を抗原としたELISA法と、ＨＩ抗体の産生性によってスクリーニングを行い、限界希釈法によりクローニングし、得られた抗体産生ハイブリドーマをマウスの腹腔内に接種し、腹水を採取、精製した。その結果、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌に特異的で高いＨＩ活性を有する単クローン抗体S24-951が得られた。この単クローン抗体が認識するＨＡ蛋白の同定を試み、ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体を抗原としたウェスタン・ブロット法を行ったが、反応するバンドは認められなかった。ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体を抗原としたELISA法とイムノドットブロット法では本単クローン抗体の反応が確認できることから、ウェスタン・ブロット法で反応しない原因について検討したところ、抗原を熱処理、またはSDS感作することによって単クローン抗体との反応が失われることが明らかとなった。すなわち、単クローン抗体S24-951は、ヘモフィルス・パラガリナラムＡ型菌体に存在する熱感受性且つSDS感受性のＨＡを認識することを確認した。
【００２６】
ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株のゲノムDNAをEasy DNA kit（Invitrogen社製）を用いて抽出精製し、制限酵素Sau IIIAI（TAKARA BIO社製）にて部分消化し、遺伝子断片をZap Express Vector（Stratagene社製：La Jolla, Calf.）のBamHIサイトに連結し、Gigapack III Gold packaging extract（Stratagene社製）を用いてパッケージングを行った。この組み換えファージライブラリーを単クローン抗体S24-951を用いた酵素抗体法によってスクリーニングし、陽性が確認されたプラークをクローニングしてExAssist helper phage（Stratagene社製）を用いてファージミドとし、大腸菌ホストセルXLOLR株（Stratagene社製）へトランスフォーメーションしてpHL17クローンを得た。
【００２７】
pHL17の挿入遺伝子断片の塩基配列を解析したところ配列番号３に示したように、１，７１９個のアミノ酸をコードする５，１５７ｂｐであり、オープンリーディングフレーム（以下、「ORF」という。）を検索したが有意な長さのORFが認められなかった。ジーンバンクに登録されている塩基配列との相同性検索を行った結果、Tokunagaらが報告したヘモフィルス・パラガリナラム由来の８，９３０ｂｐの塩基配列と１００％の相同性を示した。しかし、Tokunagaらが感染防御抗原として報告したのは上述したように、約３．５ｋｂｐと約４．１ｋｂｐの遺伝子断片がコードするポリペプチドであり、図２に示したようにpHL17の挿入遺伝子断片５，１５７ｂｐとは遺伝子領域が異なる（例えば、特許文献１および２を参照。）。
【００２８】
単クローン抗体S24-951と反応するエピトープをコードする遺伝子領域を確認するために欠失変異体pHL17E5、pHL17E8、pHL17E9、pHL17F1を作製し、これらのクローンの組み換え蛋白を含む菌体破砕液を作製し、単クローン抗体S24-951との反応についてイムノドットブロット法を用いて検討した。各ファージミドの挿入遺伝子領域を図１に、イムノドットブロット法の結果を表１に示した。後方から３５６ｂｐ削ったpHL17E5は単クローン抗体S24-951と反応するが、後方から１，０８３ｂｐ削ったpHL17E9、前方から１７７ｂｐ削ったpHL17F1は反応しなくなることが確認された。この結果から、ＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応する組み換え蛋白を作るには一連の長さの遺伝子が必要であり、配列番号１に示したpHL17E5の４，８０１ｂｐがほぼ最短の長さであった。また、図１に示したようにpHL17E8の挿入遺伝子断片は５，１５７ｂｐでpHL17と同一であるが、pHL17E8は挿入遺伝子断片のＣ末端近くのベクター側の６つの塩基が欠失したファージミドであった。
【００２９】
次に、組み換え蛋白の発現がイソプロピル・ベータ・ディー・チオガラクトピラノシド（Isopropyl-β-D-thiogalactpyranoside,以下「IPTG」という。）添加の有無によって安定してコントロールされるpHL17E8を用いて、５，１５７ｂｐの遺伝子断片から発現する組み換え蛋白の分子量を解析した。前述したように単クローン抗体S24-951が認識するヘモフィルス・パラガリナラムのエピトープは熱感受性、SDS感受性であるためウェスタン・ブロット法の解析に使用できないので、pHL17E8クローンの組み換え蛋白発現誘導前後のSDS-PAGEプロフィールを比較して、発現した蛋白の分子量を解析した。結果は、図３のレーン３に示したようにIPTG添加によって発現が誘導されると考えられるバンドが４本認められ、それぞれ約１４１、１４６、１５６、１７５キロダルトンであった。pHL17E8の挿入遺伝子断片はpHL17とまったく同一の５，１５７ｂｐで、アミノ酸配列から計算した分子量は１７９キロダルトンであり、ウェスタン・ブロット法で認められた１７５キロダルトンのバンドとほぼ一致する。以上の結果からpHL17E8組み換え蛋白は熱感受性、SDS感受性であり、ＨＩ活性を有する単クローン抗体と反応し、分子量は約１７５キロダルトンの蛋白であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００３０】
pHL17E5粗精製組み換え蛋白とpHL17E8粗精製組み換え蛋白の免疫原性について以下のように検討した。まず、免疫原については、徳永らが報告した組み換え蛋白、粗HPG3.5k-HISポリペプチドと粗ＨＰＧ4.1k-HISポリペプチドを作製し、pHL17E5、pHL17E8も同様に菌体破砕液を作製して原液とした。対照に非接種群とヘモフィルス・パラガリナラム221株全菌体免疫群を設けた。ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体を抗原とした免疫原の抗原濃度はワクチン中に不活化前生菌数が１×１０7/ml含まれるように原液を調整した。免疫原はADJUVANT INCOMPLETE FREUND（DIFCO社製）と各原液を等量混合してW/O乳剤とした。３５日齢のSPF鶏を各群１０羽、合計６０羽供試し、免疫原を脚部筋肉内へ０．５ml注射し、注射前と注射後４、５週目に採血してＨＩ抗体価を測定した。また、５週目に採血した後にヘモフィルス・パラガリナラム221株によって攻撃し、発症の有無を観察した。結果は表３に示したように、pHL17E5とpHL17E8粗精製組み換え蛋白にて免疫した群は１００％（１０羽中１０羽）が発症防御し、粗HPG3.5k-HISポリペプチドは０％、粗HPG4.1k-HISポリペプチドは３０％の発症防御率であった。また、ヘモフィルス・パラガリナラム２２１株全菌体で免役した群は１００％発症防御し、非免疫群は全羽発症した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
pHL17E5またはpHL17E8クローンから得られる組み換え蛋白を大量に製造し、精製する方法を開発すれば、伝染性コリーザの感染防御に有効で且つ副反応の少ないワクチン抗原を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｐＨＬ17とその欠失変異体の遺伝子断片領域の図
【図２】既報の遺伝子断片領域とｐＨＬ17とｐＨＬ17Ｅ8、pHL17E5の遺伝子断片領域の比較
【図３】ｐＨＬ17Ｅ8クローンが誘導した組み換え蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像
【図１】
2005218414.tif 000005
【図２】
2005218414.tif 000006
【図３】
2005218414.tif 000007
【配列表】
2005218414000001.app