(57)【要約】【課題】比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、試料に含まれる光学異性体の分析方法及び液体クロマトグラフ装置を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフ装置は、移動相としての第一の液体を貯蔵する第一の移動供給部、前記第一の移動相供給部から供給される前記第一の液体に光学異性体を有する成分を含む試料を注入する試料注入部、前記第一の液体に注入された前記試料の前記成分を分離する分離カラム、前記分離カラムを通じて分離された前記試料の前記成分の各々を個別に保持する成分保持部、移動相としての第二の液体を前記成分保持部へ供給する第二の移動相供給部、前記成分保持部から前記第二の液体と共に供給される前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割する光学分割カラム、及び前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出する検出器を含む。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相としての第一の液体を貯蔵する第一の移動供給部、
前記第一の移動相供給部から供給される前記第一の液体に光学異性体を有する成分を含む試料を注入する試料注入部、
前記第一の液体に注入された前記試料の前記成分を分離する分離カラム、
前記分離カラムを通じて分離された前記試料の前記成分の各々を個別に保持する成分保持部、
移動相としての第二の液体を前記成分保持部へ供給する第二の移動相供給部、
前記成分保持部から前記第二の液体と共に供給される前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割する光学分割カラム、及び
前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出する検出器
を含むことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
前記成分保持部は、
前記試料の前記成分の各々を個別に保持する複数の保持部分、並びに
前記試料の前記成分の各々を個別に、前記保持部分に供給する及び前記保持部分から前記光学分割カラムへ供給する供給部分を有することを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、
前記試料の前記成分の各々を個別に保持するステップ、
前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に通じて、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び
前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップ
を含むことを特徴とする試料に含まれる光学異性体の分析方法。
【請求項４】
前記試料の成分は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であることを特徴とする請求項３記載の試料に含まれる光学異性体の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフ装置、及び試料に含まれる光学異性体の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸の多くは、α位に不斉炭素原子を有しており、Ｄ体とＬ体が存在するが、タンパク質の構成単位をはじめとして自然界に存在するアミノ酸のほとんどが、Ｌ−アミノ酸である（例えば、非特許文献１参照）。しかし近年、かつて非天然型アミノ酸と呼ばれていたＤ−アミノ酸が、細菌だけではなく環形動物、昆虫、植物、及び脊椎動物に至るまで幅広く存在し、種々の重要な役割を有していることが報告されてきた（例えば、非特許文献２参照）。哺乳類においても、ヒトを含め、ラット又はマウスなどで遊離型又はペプチド中に取り込まれた形で様々なＤ−アミノ酸の存在が報告されている（例えば、非特許文献３及び４参照）。
【０００３】
中でも遊離型のＤ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｓｐについては、他のアミノ酸と比較して内在性含量が高く、その由来や生理機能について多数の報告が存在する（例えば、非特許文献５、６、７及び８参照）。Ｄ−Ｓｅｒについては、大脳や海馬等の前脳部に局在し、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体の神経伝達を調節することが明らかになっており（例えば、非特許文献９参照）、Ｄ−Ａｓｐは、松果体及び精巣に存在し（例えば、非特許文献７、８、及び１０参照）、メラトニン及びテストステロン等の分泌を制御することが報告されている（例えば、非特許文献１１及び１２参照）。また、Ｄ−Ｓｅｒの投与により精神分裂病の症状が改善されたという報告もあり（例えば、非特許文献１３参照）、Ｄ−アミノ酸は、医薬品への応用も期待されている。
しかし、他のＤ−アミノ酸は、生体内の含量が極めて微量であり、分析法の選択性及び感度不足のためにほとんど研究が進展していない。
【０００４】
最近、発明者等は、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｒｏについて高感度かつ選択的なカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法を開発し、これらのＤ−アミノ酸が、ラット又はマウスにおいてそれぞれ異なった組織分布を示すことを明らかにした（非特許文献１４、１５、及び１６参照）。この事実は、これまで報告されていなかった様々なアミノ酸についても哺乳類中に存在し、生理機能を有する可能性を示しており、これらの存在確認と、生体内分布の解明が望まれている。このような、新たなＤ−アミノ酸の生理機能の解明が、Ｄ−アミノ酸をリード化合物とする新規薬効分子の探索を可能とし、新たな医薬品創製の基盤になることが期待される。
【０００５】
従来のＤ−アミノ酸の分析法としては、酵素を用いる方法（例えば、非特許文献１７、１８、及び１９参照）、キラルな試薬を用いるジアステレオマー法（例えば、非特許文献１７、１９、及び２０参照）、キラル移動相法（例えば、非特許文献２１及び２２参照）、キラル固定相法（例えば、非特許文献７及び２３参照）等を利用する様々な方法が開発されている。
しかし、生体内のＤ−アミノ酸は、極めて微量である場合が多く、従来法では感度や選択性の不足、前処理の煩雑さ、１種類のアミノ酸分析に時間を要する等の理由により、機能解明などを目的とする多数のＤ−アミノ酸のスクリーニングは現実的には不可能であった。
【０００６】
一方、上述のカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法は、これまで報告されている生体内微量Ｄ−アミノ酸分析法の中で最も優れた分析法の一つである（例えば、非特許文献１４、１５、及び１６参照）。
【０００７】
しかし、カラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法では、単一のシステムで一度に一種類のアミノ酸しか分析できないことに加えて、一回の分析に長時間を要する。これは主にこのＨＰＬＣ装置の光学分割能の不足に起因している。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｊ．Ｊ．Ｃｏｒｒｉｇａｎ：Ｄ−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６４，１４２−１４９（１９６９）
【０００９】
【非特許文献２】
左右田健次：Ｄ−アミノ酸の生化学（Ｉ），化学３２，５１７−５２６（１９７７）
【００１０】
【非特許文献３】
長田洋子：生体に存在するＤ−アミノ酸  −哺乳類を中心として−，札幌医誌，５８，２７１−２７８（１９８９）
【００１１】
【非特許文献４】
本間  浩，今井一洋：生体におけるＤ−アミノ酸，ぶんせき，１９９８，２６６−２７３（１９９８）
【００１２】
【非特許文献５】
Ａ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．Ｆｕｊｉｉ，Ｋ．Ｈａｒａｄａ，Ｔ．Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ：  Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  Ｄ−Ｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２９６，３３−３６（１９９２）
【００１３】
【非特許文献６】
Ａ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ｏｋａ：Ｆｒｅｅ  Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，５２，３２５−３５３（ｌ９９７）
【００１４】
【非特許文献７】
Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｙ．Ｔａｋｉｇａｗａ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｍａｉ：Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｎａｔａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３３４，２１４−２２２（ｌ９９７）
【００１５】
【非特許文献８】
８．  Ａ．Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ，Ｍ．Ｍ．Ｄ．Ｆｉｏｒｅ，Ｇ．Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ，Ｆ．Ｅ．Ｃｏｌｉｎ，Ｇ．Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｂ．Ｐ．Ｓｅｔｃｈｅｌｌ：Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４３６，２３−２７（１９９８）
【００１６】
【非特許文献９】
Ａ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ：  Ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｄ−Ｓｅｒｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ：  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６０，７８３−７８６（ｌ９９３）
【００１７】
【非特許文献１０】
Ｋ．Ｓａｋａｉ，Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｊ．−Ａ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ，Ｋ．Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｔ．Ｉｗａｔｓｕｂｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｍａｉ：Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄｉｎ  ｅｌｏｎｇａｔｅ  ｓｐｅｒｍａｔｉｄｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｉｓ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，３５１，９６−１０５（１９９８）
【００１８】
【非特許文献１１】
Ｙ．Ｔａｋｉｇａｗａ，Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｊ．−Ａ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ，Ｔ．Ｉｗａｔｓｕｂｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｍａｉ：Ｄ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎｔｏ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｐｉｎｅａｌｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４８，６４ｌ−６４７（１９９８）
【００１９】
【非特許文献１２】
Ａ．Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ，Ａ．Ｄ．Ｃｏｓｍｏ，Ｃ．Ｄ．Ｃｒｉｓｔｏ，  Ｌ．Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ，Ｌ．Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｇ．Ｆｉｓｈｅｒ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｔｅｓｔｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５９，９７−１０４（１９９６）
【００２０】
【非特許文献１３】
Ｇ．Ｔｓａｉ，Ｐ．Ｙａｎｇ，Ｌ．−Ｃ．Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｌａｎｇｅ  ａｎｄＪ．Ｔ．Ｃｏｙｌｅ：Ｄ−Ｓｅｒｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  ａｎｔｉｐｓｙｃｈｏｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ，Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔ．，４４，１０８１−１０８９（１９９８）
【００２１】
【非特許文献１４】
Ａ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｈａｍａｓｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｚａｉｔｓｕ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１２，６６−７２（２００３）
【００２２】
【非特許文献１５】
Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ａ．Ｍｏｒｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｚａｉｔｓｕ：  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｎｕｔｅ  ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｄ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｂｒａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，７４４，２１３−２１９（２０００）
【００２３】
【非特許文献１６】
Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ａ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｒ．Ｋｏｒｍｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｚａｉｔｓｕ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  Ｄ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９８，２５３−２５８（２００１）
【００２４】
【非特許文献１７】
Ｋ．Ｉｍａｉ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ，Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ｋ．Ｓａｋａｉ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋａｔｏ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１０，３０３−３１２（１９９６）
【００２５】
【非特許文献１８】
Ｇ．Ｈ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ａ．Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏ，Ａ．Ｖｅｔｅｒｅ，Ｌ．Ｐａｄｕｌａ，Ｇ．Ｐ．Ｃｕｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｍａｎ：ＦｒｅｅＤ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｂｒａｉｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．，２６，９８３−９８５（１９９１）
【００２６】
【非特許文献１９】
Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ａ．Ｍｏｒｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｚａｉｔｓｕ：Ｄ−Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，７８１，７３−９１（２００２）
【００２７】
【非特許文献２０】
Ａ．Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｋ．Ｈａｍａｓｅ，Ｔ．Ｉｎｏｕｅ，Ｒ．Ｋｏｎｎｏ，Ａ．Ｎｉｗａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｚａｉｔｓｕ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆｆｒｅｅ  Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，  Ｄ−Ｓｅｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｄ−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，７５７，１１９−１２５（２００１）
【００２８】
【非特許文献２１】
Ａ．Ｍ．Ｒｉｚｚｉ，Ｐ．Ｂｒｉｚａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ：Ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ−ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｕｓｉｎｇ  β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ａｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５８２，３５−４０，（ｌ９９２）
【００２９】
【非特許文献２２】
秋山知子，笹川  立：Ｄ，Ｌアミノ酸の一斉分析法とその応用，蛋白質  核酸  酵素，４０，７６−８３（１９９５）
【００３０】
【非特許文献２３】
Ｋ．Ｉｍａｉ，Ｍ．Ｋａｔｏ，Ｙ．Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｔ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．Ｓａｎｔａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈｏｍｍａ，Ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ，１１７，６３７−６４６（１９９７）
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、液体クロマトグラフ装置を提供することを目的とする。
【００３２】
また、本発明は、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、試料に含まれる光学異性体の分析方法を提供することを目的とする。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、液体クロマトグラフ装置において、移動相としての第一の液体を貯蔵する第一の移動供給部、前記第一の移動相供給部から供給される前記第一の液体に光学異性体を有する成分を含む試料を注入する試料注入部、前記第一の液体に注入された前記試料の前記成分を分離する分離カラム、前記分離カラムを通じて分離された前記試料の前記成分の各々を個別に保持する成分保持部、移動相としての第二の液体を前記成分保持部へ供給する第二の移動相供給部、前記成分保持部から前記第二の液体と共に供給される前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割する光学分割カラム、及び前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出する検出器を含むことを特徴とする。
【００３４】
請求項１記載の発明によれば、移動相としての第一の液体を貯蔵する第一の移動供給部、前記第一の移動相供給部から供給される前記第一の液体に光学異性体を有する成分を含む試料を注入する試料注入部、前記第一の液体に注入された前記試料の前記成分を分離する分離カラム、前記分離カラムを通じて分離された前記試料の前記成分の各々を個別に保持する成分保持部、移動相としての第二の液体を前記成分保持部へ供給する第二の移動相供給部、前記成分保持部から前記第二の液体と共に供給される前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割する光学分割カラム、及び前記試料の前記成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出する検出器を含むので、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、液体クロマトグラフ装置を提供することができる。
【００３５】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、前記成分保持部は、前記試料の前記成分の各々を個別に保持する複数の保持部分、並びに前記試料の前記成分の各々を個別に、前記保持部分に供給する及び前記保持部分から前記光学分割カラムへ供給する供給部分を有することを特徴とする。
【００３６】
請求項２記載の発明によれば、前記成分保持部は、前記試料の前記成分の各々を個別に保持する複数の保持部分、並びに前記試料の前記成分の各々を個別に、前記保持部分に供給する及び前記保持部分から前記光学分割カラムへ供給する供給部分を有するので、分離カラムを通じて分離された試料の成分の各々を、容易且つ確実に、個別に保持することができる。
【００３７】
請求項３記載の発明は、試料に含まれる光学異性体の分析方法において、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々を個別に保持するステップ、前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に通じて、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする。
【００３８】
請求項３記載の発明によれば、試料に含まれる光学異性体の分析方法において、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々を個別に保持するステップ、前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に通じて、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むので、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、試料に含まれる光学異性体の分析方法を提供することができる。
【００３９】
請求項４記載の発明は、請求項３記載の試料に含まれる光学異性体の分析方法において、前記試料の成分は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であることを特徴とする。
【００４０】
請求項４記載の発明によれば、前記試料の成分は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体であるので、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、試料に含まれるアミノ酸又はアミノ酸誘導体の光学異性体の分析方法を提供することができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態について図面と共に説明する。
【００４２】
まず、本発明による液体クロマトグラフ装置の典型的な実施の形態について図１を用いて説明する。図１に示す本発明による典型的な液体クロマトグラフ装置は、第一の移動相供給部１１、脱気装置８０、第一のポンプ２１、試料注入部３０、逆相ミクロカラム４１、逆相ミクロカラム恒温装置４５、第一の検出器５１、第一の記録計９１、カラム選択ユニット６０、マルチループユニット１００、第二の移動相供給部１２、第二のポンプ２２、キラルカラム４２、キラルカラム用恒温装置４６、第二の検出器５２、及び第二の記録計９２を含む。
【００４３】
第一の移動相供給部１１には、移動相としての第一の液体が貯蔵されており、第一のポンプ２１によって第一の液体がくみ上げられる。第一のポンプ２１によってくみ上げられた第一の液体に含まれる空気は、第一のポンプ２１に対するノイズの原因となるため、脱気装置８０によって除去される。脱気装置８０によって空気が除去された第一の液体は、試料注入部３０へ送られる。試料注入部３０において、複数種のアミノ酸又はアミノ酸の誘導体などのような光学異性体を有する成分を含む試料が注入される。試料は、第一の液体と共に、逆相ミクロカラム用恒温装置４５で一定の温度に維持された逆相ミクロカラム４１に送られる。アミノ酸又はアミノ酸の誘導体のような試料に含まれる複数の成分は、逆相ミクロカラム４１に充填された第一の充填剤によって互いに分離され、互いに異なる保持時間で第一の検出器５１によって検出される。第一の検出器５１で検出された試料の成分の信号は、第一の記録計９１に送られて記録され、保持時間に対する検出された試料の成分の量に関するグラフを得ることができる。
【００４４】
一方、第二の移動相供給部１２に貯蔵された移動相としての第二の液体は、第二のポンプ２２によってくみ上げられる。また、カラム選択ユニット６０は、図１に示すように、（実線で示す）Ａ１、Ａ２及びＡ３の組み合わせ並びに（点線で示す）Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の組み合わせの間で、第一の液体及び第二の液体の流路を切替える。カラム選択ユニット６０における第一の液体及び第二の液体の流路がＡ１、Ａ２、及びＡ３の組み合わせである場合には、逆相ミクロカラム４１で分離されたアミノ酸は、流路Ａ１を通じて廃棄される。また、第二の液体は、流路Ａ２を通じてマルチループユニット１００に送られ、マルチループユニット１００から流路Ａ３を通じてキラルカラム４２へ送られ、第二の検出器５２を通じて廃棄される。
【００４５】
ここで、第一の検出器５１でアミノ酸又はアミノ酸誘導体などの試料の成分が検出されたとき、カラム選択ユニット６０における流路をＡ１、Ａ２、及びＡ３の組み合わせからＢ１、Ｂ２及びＢ３の組み合わせに切替えると、第一の液体と共に第一の検出器５１で検出されたアミノ酸又はアミノ酸誘導体などの試料の成分を、マルチループユニット１００に送ることができる。第一の検出器５１で試料の成分が検出されなくなるまで、マルチループユニット１００に第一の液体を流してやると、全ての試料の成分が、第一の検出器５１で検出された順序で、マルチループユニット１００へ送られることになる。
【００４６】
マルチループユニット１００は、複数のループ７０、並びに複数のループ７０のうち選択されたループ７０を流路Ｂ１及びＢ３と接続する切り替え手段１１０を有する。このようなマルチループユニット１００を用いることで、逆相ミクロカラム４１で分離された試料の成分の各々を、それぞれ、個別にループ７０に保持することができる。すなわち、第一の検出器５１における試料の成分の検出に合わせて、流路Ｂ１及びＢ３と接続するループ７０を切替えれば、各々のループ７０ごとに、試料の成分の各々を保持することができる。全ての試料の成分を個別に複数のループ７０に保持した後、カラム選択ユニット６０における流路を再度Ａ１、Ａ２、及びＡ３に切替えると同時に、光学分割を望む試料の成分を保持したループ７０を流路Ａ２及びＡ３と接続させる。
【００４７】
複数のループ７０の一つに保持された所望の試料の成分は、第二の液体と共にキラルカラム用恒温装置４６によって一定の温度の維持されたキラルカラム４２に送られ、その試料の光学異性体（アミノ酸又はアミノ酸誘導体のエナンチオマー（Ｄ体及びＬ体）など）が互いに分離される。分離された試料の成分の光学異性体は、互いに異なる保持時間で第二の検出器５２によって検出される。次に、流路Ａ２及びＡ３と接続するループを切り替え手段によって切替えて、別の試料の成分についてキラルカラム４２を通じた光学異性体の分割及び第二の検出器９２による検出を行う。このようにして、流路Ａ２及びＡ３と接続するループ７０を順次切替えることによって、マルチループユニット１００に保持された全ての試料の成分について光学異性体の分割及び検出を行うことができる。試料の成分がアミノ酸である場合には、多種類のアミノ酸を、４１逆相ミクロカラムでＤ−体及びＬ−体のラセミ混合物として粗分離した後、複数のループ７０を使用して、キラルカラム４２に順次導入し、迅速な光学分割を行うことができる。
【００４８】
すなわち、この本発明による液体クロマトグラフ装置では、第一の液体に対する一回の試料の注入で、一次元目で試料の成分であるアミノ酸又はアミノ酸誘導体と夾雑成分を分離し、全てのアミノ酸又はアミノ酸誘導体について二次元目で光学分割してＤ体及びＬ体を定量することができる。よって、本発明による液体クロマトグラフ装置を使用すれば、一回の試料の注入で全ての試料の成分について光学分割及び検出を行うことができるので、従来のカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法と比較して、廃棄する試料の量が少なく、試料の量は少量でよく、また、試料の成分における光学異性体に関する分析を迅速に行うことができる。また、試料の成分の各々を逆相ミクロカラムで分離した後に、光学分割しているので、試料の成分に関する分離能も高い。
【００４９】
なお、本発明による液体クロマトグラフ装置を、以下の機器を使用して構成することができる。第一のポンプ２１及び第二のポンプ２２には、日本分光株式会社のＰＵ−２０８０  Ｐｌｕｓを、逆相ミクロカラム恒温装置４５及びキラルカラム用恒温装置４６には、島津製作所のＣＴＯ−６Ａを、試料注入部３０には、ＲＨＥＯＤＹＮＥの７１２５を、グラジエントユニット（図示せず）には、日本分光株式会社のＧＰ−Ａ４０を、脱気装置８０には、日本分光株式会社のＤＧ−９８０−５０を、カラム選択ユニット６０には、日本分光株式会社のＨＶ−９９２−０１を使用することができる。また、マルチループユニット１００は、例えば、日本分光株式会社の６ベッセルチェンジャー１１０、ＳＣＦ−Ｅｖｃ−Ｓｒに、内径０．８ｍｍ×長さ８０ｃｍ（容積４００μＬ）のループ７０を６本接続して作製することができる。その他、第一の検出器５１及び第二の検出器５２としての蛍光検出器には、日本分光株式会社のＦＰ−１５２０を、第一の記録計９１及び第二の記録計９２には、日本分光株式会社の８０７−ＩＴを使用することができる。
【００５０】
本発明による液体クロマトグラフ装置を使用し、移動相としての第一の液体及び第二の液体、並びに固定相としての逆相ミクロカラム充填剤及びキラルカラム充填剤、両カラムの温度、移動相の流速などのパラメータを適切に選択すれば、様々なアミノ酸又はアミノ酸誘導体の光学分割が可能である。ここでは、分析対象のアミノ酸として、Ｈ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｃｈｉｅｂｅｒ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｔｍ  ｂｙ  ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１５，１６６−１７２（２００１）において哺乳類の尿中及び脳内においてその存在が報告されており、詳細な組織分布の解明が求められている疎水性アミノ酸であるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＰｈｅを選択した場合における光学分割の好適な条件について検討した。
【００５１】
まず、標品アミノ酸を用いたキラルカラムにおける迅速な光学分割のための条件について説明する。本発明による液体クロマトグラフィ装置を使用するＤ−アミノ酸の迅速な二次元分析システムでは、逆相ミクロカラムで粗分離したアミノ酸をキラルカラムに順次導入してＤ体及びＬ体の定量を行う。本発明の液体クロマトグラフ装置によれば、キラルカラムにおいて高分離能での迅速な光学分割を行うことができる。
【００５２】
使用したキラルカラム充填剤であるｔ−ＢｕＣＱＮは、キニーネが光学活性中心であり、この光学活性中心は、スペーサーを介してシリカゲルの表面に化学結合している。このキラル固定相におけるＮＢＤ−アミノ酸の光学分割について、ＨＰＬＣにより検討した。
【００５３】
なお、上記標品アミノ酸としては、核酸合成用アミノ酸標品は、関東化学株式会社、ナカライテスク株式会社、和光純薬工業株式会社、及び石津製薬株式会社から入手したものを使用した。また、ＨＰＬＣ用乾燥アセトニトリルは、和光純薬工業株式会社から、特級ＮＢＤ−Ｆは、東京化成工業株式会社から入手した。加えて、アミノ酸自動分析用水酸化ナトリウムは、和光純薬工業株式会社から、特級ホウ酸は、和光純薬工業株式会社から、特級トリフルオロ酢酸は、和光純薬工業株式会社からそれぞれ入手したものを使用した。さらに、ＨＰＬＣ標識用クエン酸一水和物は、和光純薬工業株式会社から、ＨＰＬＣ用メタノールは、和光純薬工業株式会社から入手したものを使用した。また、アミノ酸自動分析用水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｅｌｉｘ  ３及びＧｒａｄｉｅｎｔ  Ａ１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて精製したものを使用した。その他の試薬は、特記しない限り市販の特級品、１級品、ＨＰＬＣ用等を必要に応じて使用した。
【００５４】
また、アルミブロックヒーターは、ＫＯＩＫＥ  ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳのＭＢ−１Ｈ−Ｕを、微量天秤は、ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＢＰ２１１Ｄを用いた。さらに、ｐＨ測定には、堀場製作所のＦ−１２型ｐＨメーターを、ボルテックスミキサーには、ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳのＴＭ−１５０を使用した。
【００５５】
以上の結果よりキラルカラムとしてｔＢｕＣＱＮを用い、４種類の疎水性アミノ酸について迅速な光学分割が可能である。そこで次に、これらの光学分割の条件に加えて、疎水性Ｄ−アミノ酸の迅速な二次元分析に好適な逆相ミクロＨＰＬＣによるアミノ酸の分離条件について説明する。
【００５６】
ｔ−ＢｕＣＱＮをキラル固定相とし、４種類の疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ）について迅速光学分割を達成したが、これらの光学分割は、同一の固定相と同一の移動相を用いており、一次元目の逆相ミクロＨＰＬＣにおける分離条件を検討することもまた疎水性Ｄ−アミノ酸の迅速二次元分析に有効である。そこで、各アミノ酸の連続的な二次元分析を可能とするマルチループユニットを使用する本発明による液体クロマトグラフ装置において、標品を用いた逆相ミクロＨＰＬＣの分離条件を検討した。
逆相ミクロカラムにおけるＮＢＤ−Ｖａｌ、−Ｉｌｅ、−Ｌｅｕ、−Ｐｈｅの迅速な分離について、アセトニトリルを含むＴＦＡ水溶液を移動相として用いた。各アミノ酸に対しては、ＮＢＤ蛍光誘導体化反応を行い、この反応液を逆相ミクロＨＰＬＣに注入した。移動相中のアセトニトリル濃度が、２２．５％であるときに得られるクロマトグラムを図２に示す。本条件において４種類のＮＢＤ−アミノ酸は、ほぼ４０分で良好にベースライン分離された。
逆相ミクロＨＰＬＣを用いてＤＬ混合物として分離される各アミノ酸の分画を、連続的にキラルカラムへ導入して光学分割を行うため、本発明では、上述のマルチループシステムを有する液体クロマトグラフ装置を使用する。ここでは、本発明による液体クロマトグラフ装置において、逆相ミクロＨＰＬＣとキラルＨＰＬＣをカラムスイッチングユニットで接続し、従来の液体クロマトグラフ装置に使用される分取用ループの代わりに、マルチループユニットとして４００μＬのループを６本並列に接続した６ベッセルチェンジャーを使用する。分取用ループの切り替えは、６ベッセルチェンジャーにより行い、６本の任意のループに目的とするアミノ酸分画が導入可能である。逆相ミクロＨＰＬＣと上述のキラルＨＰＬＣを接続した本発明による液体クロマトグラフ装置を用いて、ＤＬ−Ｖａｌ、−Ｉｌｅ、−Ｌｅｕ、−Ｐｈｅ混合標品のＮＢＤ蛍光誘導体化反応液を分析する。
【００５７】
図３及び図４は、本発明による液体クロマトグラフ装置を用いて４種類の疎水性アミノ酸を連続で分析して得られたクロマトグラムである。各アミノ酸は、ＮＢＤ蛍光誘導体化反応を行い、この反応液５μＬをＨＰＬＣに注入した。
ここで、一次元目のミクロＯＤＳカラムについては、カラム充填剤としてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰを使用し、カラムは、４０℃に維持された内径１．０ｍｍ×長さ１０ｃｍのものを用いた。また、ミクロＯＤＳカラムに対する移動相は、ＣＨ３ＣＮ／ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ＝２２．５／０．０２／７７．５（ｖ／ｖ）であり、その流速は、７５μＬ／分であった。検出は、蛍光分析法（励起波長：４７０ｎｍ，発光波長：５３０ｎｍ）で行った。
【００５８】
一方、二次元目のキラルカラムに対しては、カラム充填剤としてｔ−ＢｕＣＱＮを用い、カラムは、２５℃に維持された内径４．０ｍｍ×長さ１５ｃｍのものを用いた。プレカラム充填剤には、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−１２０Ｔを用い、カラムは、２５℃に維持された内径３．２ｍｍ×長さ１．５ｃｍのものを使用した。また、移動相は、１０ｍＭのクエン酸を含むＣＨ３ＣＮ／ＣＨ３ＯＨ＝４０／６０（ｖ／ｖ）の溶液を使用し、その流速は、Ｖａｌ、Ｉｌｅに対しては１．５ｍＬ／分であり、Ｌｅｕ、Ｐｈｅに対しては、２．０ｍＬ／分とした。検出は、蛍光分析法（励起波長：４７０ｎｍ、発光波長：５３０ｎｍ）で行った。
【００５９】
４種のＮＢＤ−アミノ酸のループへの導入は、ミクロＯＤＳカラム側の蛍光検出器をモニターしながら行った。Ｖａｌは、ピーク立ち上がりから１０秒後に流路を切替えて、３分間（２２５μＬ）ループ１に導入し、これを分取後直ちにｔ−ＢｕＣＱＮにインジェクトした。Ｉｌｅは、ピーク立ち上がり１０秒後からＬｅｕ立ち上がり１０秒後までループ１に導入し、続いてＬｅｕをＰｈｅ立ち上がり１０秒後までループ２に導入した。更にＰｈｅを３分間（２２５μＬ）ループ３に導入した。これらのアミノ酸は、順次ｔ−ＢｕＣＱＮにインジェクトし、光学分割を行った。
いずれのアミノ酸もキラルカラムのみでの分析と同様に、良好に迅速な光学分割がなされ、ミクロＯＤＳカラムの移動相やループの切り替え等の影響は受けないことがわかる。また、４種類の疎水性アミノ酸の全てに対する定量に要する分析時間は、６０分以内であり、迅速な二次元分析が可能である。
【００６０】
次に、生体試料への適用性を検討するためｄｄＹ／ＤＡＯ＋、ｄｄＹ／ＤＡＯ  −マウスの大脳中のＤ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅについて定量を試みた結果について説明する。
【００６１】
本発明によるマルチループを利用する液体クロマトグラフ装置について生体試料への適用性を検討するため、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋及びｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス大脳中のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＰｈｅのエナンチオマーについて定量を試みた。Ｒ．Ｋｏｒｍｏ  ａｎｄ  Ｙ．Ｙａｓｕｍｕｒａ：Ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０３，２７７−２８５（１９８３）に記載されるように、ｄｄＹ／ＤＡＯ−マウスは金野等によって樹立された系統であり、Ｄ−アミノ酸を分解するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ）活性を持たないためＤ−アミノ酸研究に有用である。ここでは、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋  及びｄｄＹ／ＤＡＯ−系統マウス（ＳＰＦ）は、獨協医科大学の金野柳一博士によって樹立されたものを譲り受け、各動物は、使用まで九州大学大学院薬学研究院内の動物舎において飼育した。飼育条件は、Ｌｉｇｈｔ  ７：００−１９：００、Ｄａｒｋ  １９：００−７：００であり、水及び飼料は自由に摂取させた。飼料は、オリエンタル酵母のｏｒｉｅｎｔａｌ  ＮＭＦ  ｄｉｅｔを使用した。
【００６２】
ｄｄＹ／ＤＡＯ−及びｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウス（ＳＰＦ、雄性、１０週齢）をエーテル麻酔下で断頭し、摘出した大脳を２０倍量のメタノールで氷冷下ホモジナイズした。これを４５００ｇで５分間遠心分離し、上清１０μＬを４０°Ｃで減圧乾固した。この残渣に２００ｍＭのホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬ、２０ｍＭのＮＢＤ−Ｆ／ＣＨ３ＣＮの１０μＬを加えて６０°Ｃで２分間反応させた。この溶液に５％ＴＦＡ水溶液２０μＬを加え、５μＬを本発明による液体クロマトグラフ装置を用いて分析した。また、大脳試料への標品添加はｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウスを用いて行い、上記メタノールホモジネートの上清１０μＬを、減圧乾固した残渣を０．５μＭのＤＬ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅを含む２００ｍＭのホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）の２０μＬに溶解して同様に試料調製を行った。ｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウス大脳試料に４種類の疎水性アミノ酸標品をインジェクト量当たりＤＬ体として１ｐｍｏｌ添加し、本発明による液体クロマトグラフ装置を用いて分析した。なお、遠心分離機は、ＩＷＡＫＩ  ＧＬＡＳＳのＣＦＭ−１００を使用した。
本発明による液体クロマトグラフ装置を用い、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋及びｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス大脳中のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅの定量を試みた。
【００６３】
図５は、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋及びｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス大脳を分析して得られたＬｅｕの分画のクロマトグラムである。ここで、キラルカラム充填剤には、ｔ−ＢｕＣＱＮを使用し、カラムには内径４ｍｍ×長さ１５０ｍｍのものを２５℃の温度条件で使用した。また、移動相としての液体（流速２．０ｍＬ／分）には、１０ｍＭのクエン酸を含むアセトニトリル：メタノール＝４０体積％：６０体積％の溶液を用いた。ｄｄＹ／ＤＡＯ＋及びｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス共にＤ−Ｌｅｕが良好に分離されており、本システムが高感度な迅速二次元分析法として生体試料への適応が可能であることを示す。
従来のカラムスイッチングキラルＨＰＬＣ法では、二次元目の光学分割に長時間を要していた。本発明の液体クロマトグラフ装置では、４種の疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ）の連続光学分割が短時間で完了し、迅速な分析が可能である。また従来の微量Ｄ−アミノ酸二次元分析法が単一のＤ−アミノ酸のみを分析対象としたことと比較し、本発明の液体クロマトグラフ装置は、多数のＤ−アミノ酸の連続分析が可能である。現在、多数のＤ−アミノ酸を対象とする一斉分析法としては、Ａ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．Ｏｋａ，Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５８２，４１−４８（１９９２）に報告されたＨＰＬＣジアステレオマー法としてＯＰＡ試薬とＢｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈ．Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｓ．Ｈａａｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｔ．  Ｗｅｓｔｈａｕｓｅｒ，Ｒ．Ｗｉｔｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇｏｄｅｌ：Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−  ａｎｄ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ｃｈｉｒａｌ  ｔｈｉｏｌｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，６６６，  ２５９−２７３（１９９４）等に報告されたキラルチオールを用いる方法、Ｓ．Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ，Ｂ．Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ｐ．Ｍｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｓａｎｃｈｅｚ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｒａｌ  ａｍｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  （＋）−１−（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５９，１１９１−１１９５（１９８７）に報告されたＦＬＥＣ、及びＹ．Ｎａｇａｔａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ：Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−  ａｎｄ  Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，５７５，１４７−１５２（ｌ９９２）に報告されたＦＤＡＡなどを利用する方法がある。またＧＣにおいてもＣｈｉｒａｓｉｌ−Ｌ−ＶａｌなどのキラルカラムとＭＳを組み合わせて定量する方法などが用いられている。これらの方法では標品ＤＬ−アミノ酸においては、長時間をかければ、良好な分離、定量が可能である。しかし、実試料では生体由来の様々な夾雑成分の妨害を受け、多量のＤ−アミノ酸を含む試料にしか適用されていないのが現状である。一方、本発明の液体クロマトグラフ装置は、二次元法であり、一次元目で目的アミノ酸と夾雑成分を粗分離するため極めて選択性が高く、微量のＤ体も分析可能である。またその感度も標品における検出限界が高く、極めて高感度かつ選択的な分析法である。
【００６４】
さらに、実験動物として広く用いられているマウスのうち、ｄｄＹ系統のものを使用した。この系統は金野等によってＤＡＯ活性を有するｄｄＹ／ＤＡＯ＋系統と活性を持たないｄｄＹ／ＤＡＯ−系統が樹立されている。ｄｄＹ／ＤＡＯ−マウスはＤ−アミノ酸を分解することができないため、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウスに比べて組織中のＤ−アミノ酸含量が高い。そのためこのｄｄＹ／ＤＡＯ−系統は生体内におけるＤ−アミノ酸スクリーニングの初期検討及び動態解析などの検討に適している。これまでに、Ｙ．Ｎａｇａｔａ，Ｒ．Ｋｏｎｎｏ，Ｙ．Ｙａｓｔｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ａｋｉｎｏ：Ｉｎｖｏｌｖｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５７，２９１−２９２（１９８９）に報告されるように、ｄｄＹ／ＤＡＯ−マウスには、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウスと比較して２−１０倍量の総Ｄ−アミノ酸が含まれている。また、Ｙ．Ｎａｇａｔａ，Ｒ．Ｋｏｎｎｏ  ａｎｄ  Ａ．Ｎｉｗａ：Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４３，１１５３−１１５７（１９９４）及びＡ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒ．Ｋｏｎｎｏ，Ａ．Ｎｉｗａ，Ｙ．Ｙａｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｏｋａ  ａｎｄ  Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ：Ｆｒｅｅ  Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ，Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅａｎｄ  Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１５２，３３−３６（１９９３）などに報告されているように、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｒｏの脳内や血中、尿中濃度が定量されており、ほとんどの組織でｄｄＹ／ＤＡＯ−マウスにおいてｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウスよりも多量のＤ−アミノ酸が存在することが示されている。本発明による液体クロマトグラフ装置を使用して、ｄｄＹ／ＤＡＯ＋マウス大脳と比較してｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス大脳中に多量のＤ−Ｌｅｕが認められた。発明者等は、既にｄｄＹ／ＤＡＯ−マウス大脳中においてｄｄＹ／ＤＡＯ＋  マウス大脳中と比較して約１０倍高濃度のＤ−Ｌｅｕが存在することを明らかにしているが、本発明による液体クロマトグラフ装置を使用して得られた結果と良く一致する。
ここで分析対象としたＤ−アミノ酸について、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｐｈｅは、生体内における存在が報告されている。中でもＤ−Ｌｅｕは研究が進んでおり、マウス脳内において松果体や下垂体に局在することや、その血中及び尿中濃度が明らかにされている。また、Ｄ−Ｖａｌ、及びＤ−Ｐｈｅについては哺乳類の血液や尿などでその存在が確認されており、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ等によってその定量値はヒト血中でＤ−Ｐｈｅが０−０．３  ｎｍｏｌ／ｍＬ、Ｄ−Ｖａｌが０．３−０．４  ｎｍｏｌ／ｍＬ、ヒト尿中でＤ−Ｐｈｅが０．４−２．８  ｎｍｏｌ／ｍＬ、Ｄ−Ｖａｌが０−１．６  ｎｍｏｌ／ｍＬであると報告されている。一方、これらの体内での詳細な分布については明らかになっていない。Ｄ−Ｉｌｅはこれまでに哺乳類体内における存在の報告はないが、本発明による液体クロマトグラフ装置を使用した分析結果によってマウス大脳中での存在が示唆される。
【００６５】
本発明は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＰｈｅを連続分析できる液体クロマトグラフ装置を提供し、生体内における微量なＤ体の分析を可能とした。これにより、これらのＤ−アミノ酸の体内分布や生理機能の解明が容易になると考えられる。ここで、本発明による液体クロマトグラフ装置による分析対象は、４種類の疎水性アミノ酸であったが、本発明による液体クロマトグラフ装置は、更に多数の微量Ｄ−アミノ酸連続定量に適用可能であり、二次元目のキラル固定相の種類や移動相の検討による適用アミノ酸の拡大が期待できる。
【００６６】
哺乳類における微量Ｄ−アミノ酸については未だ解明されていない点が多く、その解明のため迅速かつ高選択的な高感度分析法が求められている。本発明による液体クロマトグラフ装置は、マルチループユニットを使用することで、従来では不可能であったアミノ酸の迅速な二次元連続分析を達成しており、今後のＤ−アミノ酸研究の発展に役立つと期待される。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、液体クロマトグラフ装置を提供することができる。
【００６８】
また、本発明によれば、比較的少量の試料で迅速な分析を行うことが可能な、試料に含まれる光学異性体の分析方法を提供することができる。
【００６９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による液体クロマトグラフ装置の典型的な実施の形態を説明する図である。
【図２】逆相ミクロカラムにおけるアミノ酸の分離の結果を示す図である。
【図３】本発明による液体クロマトグラフ装置を使用して得られたＶａｌ及びＩｌｅの光学分割の結果を示す図である。
【図４】本発明による液体クロマトグラフ装置を使用して得られたＬｅｕ及びＰｈｅの光学分割の結果を示す図である。
【図５】ｄｄＹ／ＤＡＯ＋又はｄｄＹ／ＤＡＯ−マウスの大脳におけるＮＢＤ−Ｌｅｕのクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
１１    第一の移動相供給部
１２    第二の移動相供給部
２１    第一のポンプ
２２    第二のポンプ
３０    試料注入部
４１    逆相ミクロカラム
４２    キラルカラム
４５    逆相ミクロカラム恒温装置
４６    キラルカラム用恒温装置
５１    第一の検出器
５２    第二の検出器
６０    カラム選択ユニット
７０    ループ
８０    脱気装置
９１    第一の記録計
９２    第二の記録計
１００    マルチループユニット
１１０    切り替え手段
【図１】
2005003558.tif 000003
【図２】
2005003558.tif 000004
【図３】
2005003558.tif 000005
【図４】
2005003558.tif 000006
【図５】
2005003558.tif 000007