(57)【要約】【課題】従来のドッキングシミュレーションよりも高精度なスクリーニングを実現し、創薬プロセスにおける擬陽性を抑え、ＮＭＲ計測と親和性の高い高速スクリーニング方法の提供。【解決手段】標的蛋白質の立体構造を取得し、同時に該立体構造とリガンドライブラリーのリガンドの分子構造を用いて該蛋白質−リガンド複合体構造を取得する。その後に結合サイトとして注目する残基の決定を行い、注目した残基を含むモデル分子を構築、該モデル分子での電子状態の計算を行った後に、化学シフト値の解析を行う。さらに該化学シフト値を評価する原子を設定し、設定された該原子での化学シフト値から結合残基の決定および結合強さの比較を行い、結合残基位置情報および結合の強さ傾向の表示を行う。【選択図】図１
2005181104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的蛋白質に結合するリガンドをスクリーニングする方法であって、
前記標的蛋白質の立体構造を取得する工程、
前記標的蛋白質とリガンド複合体構造を取得する工程、
前記標的蛋白質とリガンド複合体構造の結合サイトとして注目する残基の決定を行う工程、
前記注目した残基を含むモデル分子を構築する工程、
前記モデル分子での電子状態の計算を行う工程、
前記モデル分子での化学シフト値の解析を行う工程、
前記化学シフト値を評価する原子を設定する工程、
前記設定された原子での化学シフト値から結合残基の決定および結合強さの比較を行う工程、
結合残基位置情報および結合の強さ傾向の表示を行う工程、
前記表示された情報を基にリガンドライブラリーの中から結合の強いリガンドを選び出す工程、および
該選び出されたリガンドに対してＮＭＲ計測を用いてスクリーニングを行う工程、
を含むことを特徴とするドッキングスコアリング方法。
【請求項２】
前記結合サイトとして注目する残基を決定する工程が、酸・塩基性側鎖の残基あるいは非荷電性側鎖の残基を注目する残基として選択する工程からなる請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項３】
前記酸・塩基性側鎖の残基がアスパラギン酸またはグルタミン酸、もしくはリシン、アルギニンやヒスチジンであり、前記非荷電性側鎖の残基がアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンである請求項２記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項４】
前記評価する原子を設定する工程が、注目する残基の側鎖を構成する炭素原子のうち主鎖を構成するＣα炭素原子に近い炭素原子を結合残基特定のための評価原子として設定し、Ｃα炭素原子から遠い炭素原子を注目している残基での結合の強さを測るための評価原子として設定する請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項５】
前記モデル分子を構築する工程が、注目する残基を中心として使用者が必要とする範囲の周辺残基を含めた分子構造を標的蛋白質から切り出す工程からなる請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項６】
前記電子状態を計算する工程が、量子化学計算を用いて該モデル分子の電子状態を求める請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項７】
前記化学シフトを求める工程が、前記電子状態を計算する工程で求めたモデル分子の電子状態から注目残基での化学シフト値を求める請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項８】
前記結合残基の決定および結合の強さの比較を行う工程が、標的蛋白質単体での各注目残基上の評価原子での化学シフトの値を基準とし、各複合体上で対応する注目残基上の評価原子での化学シフト値と基準化学シフト値との差の絶対値を用いて、決定もしくは比較する請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項９】
前記標的蛋白質の立体構造を取得する工程が、蛋白質結晶のＸ線回折やＮＭＲ計測、ホモロジーモデリングで得る請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項１０】
前記標的蛋白質とリガンドの複合体構造を取得する工程が、
該蛋白質の立体構造の取得工程、
リガンドの立体構造をライブラリから取得する工程、
これらの得られた蛋白質の立体構造とリガンドの立体構造を出発点としてドッキングシミュレーションを用いて複合体構造を取得する工程、
からなる請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項１１】
前記標的蛋白質とリガンドの複合体構造を取得する工程が、該蛋白質とリガンドの複合体の結晶に対するＸ線回折あるいは該複合体に対するＮＭＲ計測の実験的手法から取得するものである請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項１２】
前記表示する工程が結合残基の位置を特定できる化学シフトの変動値と結合の強さ傾向を示す化学シフトの変動値をそれぞれ単独に、或いは、並べて使用者に提示する請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項１３】
前記リガンドを選び出す工程が、表示された結合の強さ傾向を基にリガンド若しくは複合体に順位付けを行い、該リガンド順位付けを用いて、使用者が定める切捨て方法を用いて選び出すことを特徴とする請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【請求項１４】
前記ＮＭＲ計測を行う工程が、選び出されたリガンド若しくは複合体に対して行われる請求項１記載のドッキングスコアリング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に分子の機能および結合の位置、強さの判定に関し、特にＮＭＲ計測、Ｘ線回折、ホモロジーモデリングで立体構造が既知若しくは予測可能な蛋白質での結合を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの応用において、試料中の標的蛋白質に結合する分子の検出、および、結合の強さを高精度に判定することが望まれている。たとえば、プロテオノーム研究や医薬品の開発において極めて有用である。
【０００３】
分子の検出および結合の強さの判定や分子構造の解析に関して、多くの手法が開発されてきた。蛋白質に対する結合の実験的手法としては表面プラズモン共鳴や蛋白質結晶のＸ線回折、溶液蛋白質に対するＮＭＲ計測が一般的に用いられている。表面プラズモン共鳴は金属表面に試料との結合性を調べる物質を配置し、試料との結合により変化する金属表面でのプラズモン共鳴を観測することで結合の検出を行う。
【０００４】
蛋白質での相互作用計測を目的とする表面プラズモン共鳴の測定では結合の強さは測定できるが蛋白質上での結合に関する構造情報は分からない。このため、蛋白質に結合させる低分子を最適化するための分子構造的な情報を得るためには他の方法に頼る必要がある。
【０００５】
蛋白質とリガンドの結合に関する分子構造的な情報を得るためには大別して２つの実験的な方法がある。１つは蛋白質結晶のＸ線回折であり、もう１つは溶液・固体蛋白質試料に対するＮＭＲ計測による立体構造解析である。
【０００６】
蛋白質結晶のＸ線回折では、大量の蛋白質を用意しそれを結晶化させる必要がある。この大量の蛋白質を取得するために、大腸菌に目的蛋白質を発現するＤＮＡを導入して生成させる大量発現系が多く用いられている。しかし、創薬標的として注目されるヒト関連蛋白質や膜蛋白質のように遺伝情報的・構造的にも複雑になると、蛋白質の発現量は少なくなり、結晶化条件も複雑になる為、良質な蛋白質結晶を得るのは難しくなる傾向がある。
【０００７】
一方、ＮＭＲ計測は一般的には溶液試料に対して行われる。そのため、蛋白質の高精度なＮＭＲ計測を行う為には、蛋白質の溶解度が高い条件を見付ける必要がある。蛋白質は酸性、塩基性といった水溶性アミノ酸残基や、脂溶性を示すアミノ酸残基など２０種類から構成されている。ゆえに、それぞれの蛋白質ごとに、媒質、水素イオン濃度、温度といった溶解条件や溶解度が異なる。
【０００８】
また、ＮＭＲ計測は試料分子中に存在する水素原子、１３Ｃ原子、１５Ｎ原子の核スピンの共鳴信号を検出して、核原子核の周囲の電子状態や分子構造を観測する方法である。このため、出来るだけ良好な共鳴信号を検出するためには、より高濃度の蛋白質溶液が必要となる。ＮＭＲ検出に必要な蛋白質濃度を下げるためには、検出器（プローブ）の感度を向上させる必要がある。これに対してはＮＭＲ装置メーカが液体ヘリウムを利用した極低温プローブを開発して高感度化を実現させている。さらに、解析可能な蛋白質の分子量の上限を向上させる方法としてＮＭＲスペクトルの高分解能化技術が挙げられる。現在のＮＭＲで用いられている磁場強度の最大がおおよそ２１テスラ程度であり、これはプロトンの共鳴周波数に換算して約９００ＭＨｚに対応する。この場合の分解能から計測可能な蛋白質分子量の上限は４０ＫＤａであると考えられており、４０ＫＤａ程度までの蛋白質であるならば、ＮＭＲ計測による立体構造解析が可能である。
【０００９】
これらに対して、コンピュータの高い計算能力を利用した、蛋白質の立体構造の構築やリガンドとの複合体構造予測を行うＩｎＳｉｌｉｃｏと呼ばれる分野がある。この分野では、既に知られている蛋白質に関する網羅的なデータを利用してアミノ酸１次配列データを用いた蛋白質の相同性検索や立体構造予測を行うバイオインフォマティクス技術、蛋白質を構成する原子に働く力をパラメータ化して計算する分子動力学シミュレーション、複合体構造を計算し、結合エネルギの評価を行うドッキングシミュレーションがある。特にドッキングシミュレーションでは標的となる蛋白質の立体構造情報が既知であれば、立体構造を元にリガンドとの相互作用する部位の予測を行い、この予測部位に対する結合の強さを経験的スコアリング関数に基づいて計算することができる（例えば、特許文献１：特表２００２−５２３０５７号公報）。
【００１０】
但し、このドッキングシミュレーションを使用する為には、出発点となる標的蛋白質の立体構造を得る必要がある。このためＸ線回折実験やＮＭＲ計測あるいはホモロジー検索等のバイオインフォマティクス技術に基づいた分子モデリングが不可欠である。
【００１１】
しかし、ドッキングシミュレーションによるリガンドの高精度なスクリーニングは困難である。非特許文献１（S. Rudisser and W. Jahnke, Combinational Chemistry ＆ High Throughput Screening, 5 (2002) 591.）によると、この方法は分子の自由エネルギを計算し、結合状態と結合していない状態での自由エネルギの差から結合エネルギを算出する方法である。自由エネルギの差はエネルギの加算性の原理（additivity principle）に従って導出された式を用いて表される。
【００１２】
【数１】
2005181104.tif 000003
ここで、ΔGinternal energyは複合体の変形によるエネルギ、ΔGVdWはファンデルワールス力からの寄与、ΔGsolvationは複合体に対する溶媒からの寄与、ΔGCoulは複合体へのクーロン相互作用からの寄与、TΔSflexible bondsは分子の柔軟性由来のエントロピーへの寄与を表す。計算の定量性を向上させるために様々な項が考案されているが、各項の間での独立性があいまいな為、加算性の原理が保障されていない。またエントロピーなどの計算方法が明確でないため、定量的な結合エネルギの議論が困難である。
【００１３】
このようにさまざまな手法が開発されている中で、創薬研究で重要となる蛋白質とリガンドの相互作用計測は主に前述した表面プラズモン共鳴計測によって行われている。しかし、蛋白質と分子の結合を表面プラズモン共鳴で調べる為には、結合するリガンドの分子量がある程度大きくないと結合の強さを定量的に比較することが難しくなり、擬陽性を示してしまう恐れがある。そこで、近年ＮＭＲによる相互作用計測に注目が集まっている。ＮＭＲを用いた標的蛋白質−リガンド複合体の測定では、特定の各スピンの共鳴信号を利用するので、リガンドの分子量の大小が結合強さの評価に与える影響は小さく、低分子リガンドに対する擬陽性を抑えることができる。この低分子量の分子に対する有効なＮＭＲスクリーニング方法は大別して２つある。１つは標的蛋白質に対して同位体標識を導入し、蛋白質のＮＭＲ信号を観測して分子との結合を検出する方法であり、もうひとつは低分子のＮＭＲ信号のみを観測して蛋白質との結合を検出する方法である。それぞれの代表的な検出方法としてＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲ（特許文献２：特表２００２−５１０３８４号公報）とＡｆｆｉｎｉｔｙ−ＮＭＲが挙げられる。
【００１４】
どちらの方法にしてもＮＭＲ計測で標的蛋白質と分子の結合をスクリーニングする場合、ＮＭＲ計測は時間の掛かる方法であるため、数百万個オーダのリガンド候補分子のなかから探すためにはコンピュータを利用したスクリーニングを併用する必要がある。しかし、ドッキングシミュレーションでは結合エネルギの評価によりスクリーニングを実施する為、スクリーニング精度が不十分な場合には擬陽性が発生する恐れがある。また、擬陽性を抑える為にＮＭＲスクリーニングの適用範囲、すなわち候補リガンド数を多く設定する必要があり、高速なスクリーニングを妨げる大きな要因となる（例えば、非特許文献２：山口芳樹、嶋田一夫、“核磁気共鳴を用いた創薬研究の新しいアプローチ”, 蛋白質  核酸  酵素, 45 (2000) 895.）。
【００１５】
したがって、低分子であっても擬陽性を抑えかつ膨大な候補化合物を高速でスクリーニングできる、安全で、精度の高い、スクリーニング方法が業界で必要とされている。
【００１６】
【特許文献１】特表２００２−５２３０５７号公報
【００１７】
【特許文献２】特表２００２−５１０３８４号公報
【非特許文献１】S. Rudisser and W. Jahnke,“NMR and In silico Screening”, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 5 (2002) 591.
【非特許文献２】山口芳樹、嶋田一夫、“核磁気共鳴を用いた創薬研究の新しいアプローチ”, 蛋白質  核酸  酵素, 45 (2000) 895.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来のドッキングシミュレーションよりも高精度なスクリーニングを実現し、創薬プロセスにおける擬陽性を抑え、ＮＭＲ計測と親和性の高い高速スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
標的蛋白質の立体構造を取得し、同時に該立体構造とリガンドライブラリーのリガンドの分子構造を用いて該蛋白質−リガンド複合体構造を取得する。その後に結合サイトとして注目する残基の決定を行い、注目した残基を含むモデル分子を構築、該モデル分子での電子状態の計算を行った後に、化学シフト値の解析を行う。さらに該化学シフト値を評価する原子を設定し、設定された該原子での化学シフト値から結合残基の決定および結合強さの比較を行い、結合残基位置情報および結合の強さ傾向の表示を行う。表示された情報を基にリガンドライブラリーの中から結合の強いリガンドを選び出すことで、ＮＭＲ計測と親和性が高く、かつ、従来よりも高速なスクリーニングが可能なＮＭＲ計測を用いたスクリーニング方法を実現する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、実際の標的蛋白質や該蛋白質の複合体試料を作成する前に、標的蛋白質とリガンドとの結合の傾向を評価する方法であり、該蛋白質の立体構造を基に結合部分の電子状態の計算を行うことで化学シフト値の解析を行い、該化学シフト値の変動値から結合残基の決定および結合強さの傾向を決定し、効率的なＮＭＲ計測を行うスクリーニング指針を与える。
【００２１】
本発明は従来技術と比べて著しい利点を提供する。本発明は従来ドッキングシミュレーションとの併用が容易であり、本発明と従来ドッキングシミュレーションとの併用によりさらなるリガンドの絞込みが可能である。またＮＭＲ計測との併用により従来法よりも擬陽性の少ない複合スクリーニングを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
図１にコンピュータシミュレーションを用いた化学シフトに基づくスクリーニングの好ましいフローを示す。図２Ａ−図２Ｄには本発明の実施のための各アミノ酸残基における評価原子の好ましい指定方法を示す。創薬開発におけるリガンド探索に有効な本発明と従来ドッキングシミュレーションおよびＮＭＲスクリーニングとの組み合わせの一例を図３に示す。
【００２３】
（実施例１）
図１にコンピュータを利用した化学シフトに基づくスクリーニングの好ましいフローを示す。図中の破線で囲われた部分は本発明の新規な部分であり、従来技術と本発明の新規技術との組み合わせの様子を明示する。
【００２４】
標的蛋白質の立体構造取得工程１は、標的蛋白質結晶のＸ線回折、ＮＭＲ計測そして蛋白質のアミノ酸１次元配列情報等を用いたバイオインフォマティクス技術を活用したホモロジーモデリングによって行われ、場合によっては溶液中の分子動力学シミュレーションを用いて実施される。蛋白質結晶に対するＸ線回折測定による蛋白質立体構造の同定や蛋白質試料のＮＭＲ計測による蛋白質立体構造の同定に関してはその具体的な方法が多くの文献に記されている。
【００２５】
分子―標的蛋白質の複合体立体構造取得工程は、３つの工程からなる場合と、１つの工程からなる場合がある。図１には３つの工程からなる場合の工程の流れを示した。この３つの工程は標的蛋白質の立体構造情報を取得する工程１、化合物（リガンド）ライブラリからリガンドの立体構造情報を取得する工程２、これらを出発点としてドッキングシミュレーション等による複合体構造を取得する工程３からなる。また、１つの工程からなる場合の工程は標的蛋白質とリガンドからなる複合体の立体構造を試料結晶のＸ線回折やＮＭＲ計測から直接得る工程である。
【００２６】
図１の工程３では、蛋白質のアミノ酸１次元配列情報等を用いたホモロジー検索、構造認識などのバイオインフォマティクス技術を利用した分子モデリングとドッキングシミュレーション、場合によっては溶液中の分子動力学シミュレーションを用いて実施される。特に、ドッキングシミュレーションで分子―標的蛋白質の複合体を求める際に、分子と結合したことによる標的蛋白質の構造変化（緩和）を評価していない場合には複合体全体を溶液中に入れたモデルでの分子動力学シミュレーションを実施し、標的蛋白質複合体の緩和構造を求めておく。ホモロジー検索ではAlrschulらによって開発されたBLAST法（S. F. Altschul, W. Miller, E. W. Myers, D. J. Lipman, J. Mol. Biol., 215 (1990) 403.参照。）などが代表的である。これは入力したアミノ酸１次元配列情報を過去に決定された蛋白質の配列と比較してその相同性を検査するアルゴリズムである。相同性が高い蛋白質同士は構造・機能においても近い性質を持つことが多いので、この相同性は蛋白質構造を予測する上で１つの重要な情報となる。また蛋白質の構造を部分に分割して分類・比較して似た構造を検索することを構造認識という。この構造認識では３Ｄ−ＰＳＳＭ（L. A. Kelley, R. M. MacCallum, M. J. Sternberg, J. Mol. Biol., 299 (2000) 499.参照。）が代表的である。３Ｄ−ＰＳＳＭは蛋白質のアミノ酸１次元配列を入力として、予測立体構造を出力する。
【００２７】
注目残基の決定工程４は、標的蛋白質の立体構造取得工程１によって得られた標的蛋白質が含む残基の中から使用者が選択する工程からなり、酸・塩基性側鎖の残基あるいは非荷電性側鎖の残基を注目する残基として選択する。更に、化学シフト評価の為に使用する評価原子は注目する残基の側鎖を構成する炭素原子のうち主鎖を構成するＣα炭素原子に近い炭素原子を結合残基特定のための評価原子として設定し、Ｃα炭素原子から遠い炭素原子を注目している残基での結合の強さを測るための評価原子として設定する。各アミノ酸残基に対する具体的な評価原子の指定方法を図２Ａ−図２Ｄに示す。
【００２８】
図２Ａ−図２Ｄにおいて３文字のアルファベットは各アミノ酸の名前を示しており、その下にアミノ酸の分子構造式を示す。各元素記号の右上の肩にあるギリシャ文字と数字の組み合わせはＮＭＲ計測で用いられている標準的な原子の指定名を表す。各アミノ酸残基の原子の中に□で囲った原子が存在する。この原子は上述したように評価原子として設定され、Ｃα炭素原子（プロリンの場合は主鎖上のＮ原子も対象とする）に近い炭素原子である。○で囲った原子は上述したＣα炭素原子から遠い炭素原子を表す。また、グリシン（Ｇｌｙ）には本発明における指定すべき原子に該当する炭素原子が存在しない。
【００２９】
以下、図２Ａ−図２Ｄに示した各アミノ残基での評価原子を示す。
【００３０】
図２Ａに酸性側鎖の性質を示すアミノ酸残基の例を示す。
（１）アスパラギン酸（ＡＳＰ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃγ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（２）グルタミン酸（ＧＬＵ）を注目残基として指定した場合では、ＣβまたはＣγ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃδ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
【００３１】
図２Ｂに塩基性側鎖を示すアミノ酸残基の例を示す。
（３）ヒスチジン（ＨＩＳ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃε１炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（４）リシン（ＬＹＳ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃε炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（５）アルギニン（ＡＲＧ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃζ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
【００３２】
図２Ｃに非荷電極性側鎖の性質を持つアミノ酸残基の例を示す。
（６）セリン（ＳＥＲ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃβ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（７）アスパラギン（ＡＳＮ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃγ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（８）グルタミン（ＧＬＮ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃδ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（９）トレオニン（ＴＨＲ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃβ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１０）チロシン（ＴＹＲ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃζ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
【００３３】
図２Ｄは非極性荷電を示すアミノ酸残基の例を示す。
（１１）アラニン（ＡＬＡ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃβ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１２）システイン（ＣＹＳ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃβ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１３）イソロイシン（ＩＬＥ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃγ１もしくはＣδ１炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１４）ロイシン（ＬＥＵ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、ＣγもしくはＣδ１，Ｃδ２炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１５）メチレオニン（ＭＥＴ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃε炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１６）フェニルアラニン（ＰＨＥ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、ＣγもしくはＣδ１，Ｃδ２，Ｃε１，Ｃε２，Ｃζ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１７）プロリン（ＰＲＯ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ，Ｃδ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃγ炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１８）トリプトファン（ＴＲＰ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃδ１，Ｃδ１，Ｃε２，Ｃε３，Ｃζ２，Ｃζ３，Ｃη２炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
（１９）バリン（ＶＡＬ）を注目残基として指定した場合では、Ｃβ炭素原子を結合残基位置特定用に、Ｃγ１もしくはＣγ２炭素原子を結合の強さ比較用に用いる。
【００３４】
図２Ｅはアミノ酸残基としてのグリシン（ＧＬＹ）を示す。しかし、グリシンは結合残基位置を特定するＣβ炭素原子を持たないので、本発明の対象残基に該当しない。  図１の工程４でスクリーニングに用いる残基を決定する際には標的蛋白質の生化学的な性質等を考慮して決定する。スクリーニングされるリガンドは蛋白質の酵素反応等の性質を阻害、促進させるのが目的であり、注目残基は標的蛋白質の活性部位に存在する残基に設定するのが望ましい。
【００３５】
たとえば、ＨＩＶ−１プロテアーゼは２量体として対構造を形成することで、そのプロテアーゼとしての活性を示す。木曽良明、蛋白質核酸酵素，４３（１９９８）７２５に示されているように中心部分に存在するポケット部で酵素反応が生じる。その活性中心は２５番目のアスパラギン酸であることが知られているが、ポケット部には２５番目以外に２９番目、３０番目にもアスパラギン酸が位置しこれらはリガンドとの結合に深く関与している。このような場合には、リガンドとの結合を２５番目のアスパラギン酸のみで調べるのではなく、２９番目、３０番目のアスパラギン酸もスクリーニングの為の注目残基として用いる。
【００３６】
また、もうひとつの例としてセリンプロテアーゼとして知られているトリプシンを挙げる。トリプシンでは２つのβシートの間に形成された溝の部分で酵素反応が生じる。活性部位は５１番目のヒスチジン、１０２番目のアスパラギン酸、１９５番目のセリンである。この場合にはこれら３つの残基をスクリーニング用の注目残基として指定してスクリーニングを実施する。
【００３７】
工程４で決定された注目残基を含む複数残基の切り出し工程５、９は標的蛋白質あるいは標的蛋白質−リガンド複合体から該注目残基を含む小さな分子を切り出す工程である。この切り出しは、コンピュータ上で蛋白質、複合体の立体構造の電子データから該当部分を抽出することで実施する。
【００３８】
一般的に蛋白質の立体構造は電子データとしてファイルに記述されており、蛋白質立体構造情報を記述する標準的なフォーマットが広く用いられている。立体構造記述フォーマットとしてはPDB、mmCIFが有名であり、業界一般で用いられている（J. Westbrook, P. M., “Structural Bioinformatics”, ed. Bourne ＆ Weissig，(2003, John Wiley ＆ Sons, Inc.) pp.161.参照）。蛋白質の立体構造を記述する場合、原子の名前、元素、構成している原子の座標情報、原子同士の繋がりの情報、原子が属する残基の情報、残基１次元配列情報が含まれている。これらの情報のうち、原子が属する残基、原子同士の繋がり、残基の繋がりの情報を用いてモデル分子の抽出・切り出しを実施する。
【００３９】
例えば、ＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼでは２５番目にアスパラギン酸が存在する。このアスパラギン酸を中心に前後１残基ずつ含む３残基を切り出すとする。このプロテアーゼの残基１次元配列情報から３残基はＬｅｕ（２４）−Ａｓｐ（２５）−Ｔｈｒ（２６）となるので、蛋白質全体の原子座標データからこの３つの残基に属する原子のデータをすべて抽出する。
【００４０】
以下、工程５−８および工程９−１２は、工程１で取得された標的蛋白質の立体構造に着目した一連の工程、および、工程３で予測された複合構造体に着目した一連の工程に対応するものである。ここで工程５−８は基準化学シフト値を決定するステップであり、複合構造体の化学シフト値を決定するステップである。
【００４１】
工程５、９で切り出された蛋白質の部分構造は両端部の結合手が未結合のままである。また、蛋白質の立体情報がＸ線回折等実験的に得られている場合の多くは水素原子の情報は記載されていない。この場合未結合手がなくなるように水素原子を適当に付加し、工程６，１０を実施する。このとき３残基の端部に位置するペプチド結合の炭素原子と酸素原子（ＣＯ）が正しく２重結合を形成させるように注意する必要がある。
【００４２】
工程６、１０では付加した水素原子を分子として適した位置に配置させるために分子力場を利用した計算を実施し、水素原子位置を最適化する。このとき、水素以外の原子はすべて固定させて実施する。
【００４３】
工程７、１１では、工程５、９で水素原子終端処理を行った分子構造に対する電子状態の計算を量子力学計算による電子状態の計算を行う。アスパラギン酸などの不対電子を持ちやすい部分を有する場合には、分子に合わせて荷電状態、スピン状態の選択を行い、電子相関のレベルを決定する。この荷電状態、スピン状態、電子相関レベルは比較するすべての複合体において統一する。分子軌道法を用いて計算する場合には基底関数を原子ごとに設定し、注目している残基は十分に大きな基底を用い、周辺の残基部分は小さめの基底を用いる。こうすることで、スクリーニングに必要な情報を持つ注目残基での計算精度を劣化させずに、計算処理時間を短縮することができる。例として、先のアスパラギン酸の３残基Ｌｅｕ（２４）−Ａｓｐ（２５）−Ｔｈｒ（２６）へＧａｕｓｓｉａｎ社製分子軌道計算プログラムＧａｕｓｓｉａｎ９８を用いて計算する場合には、Ａｓｐ（２５）に属する原子に対して６−３１１＋Ｇ（２ｄ，ｐ）基底を用い、Ｌｅｕ（２４）およびＴｈｒ（２６）に属する原子に対して６−３１＋Ｇ（２ｄ，ｐ）基底を用いる。基底の指定はＧｅｎキーワードを用いて原子ごとに基底関数を指定する。
【００４４】
工程８，１２では、工程７，１１で得られた電子状態を元にＮＭＲ化学シフトを計算する。例としてＧａｕｓｓｉａｎ社製分子軌道計算プログラムＧａｕｓｓｉａｎ９８を用いて計算する場合には、ＮＭＲ化学シフトの計算を指定するキーワードを指定する。ＣＳＧＴ法を用いて計算する場合にはＮＭＲ＝ＣＳＧＴと指定し、ＧＩＡＯ法を用いる場合にはＮＭＲ＝ＧＩＡＯと指定する。
【００４５】
ＮＭＲ化学シフトの分子軌道法による計算方法を説明する。原子核は試料にかかる磁場をそのまま受けるのではなく、核をとりまく電子の遮蔽によって変化した磁場を受ける。電子は磁気粒子であるからその運動は外部磁場の影響を受ける。核に働く磁場をＨ、外部磁場をＨ０とすると、
【００４６】
【数２】
2005181104.tif 000004
で表される。ここでσは２階のテンソルであり、遮蔽テンソル（shielding tensor）と呼ばれる。理論的には、この遮蔽テンソルは試料分子の電子状態から直接計算することが可能である。
【００４７】
分子軌道法によって求めた電子状態からNMR遮蔽テンソルを計算する方法は幾つか開発されているが、Continuous set of gauge transformations （CSGT)法と呼ばれている方法の概略を説明する。この解析方法の詳細はJ. R. Cheeseman, G. W. Trucks, T. A. Keith, and M. J. Frisch, J. Chem. Phys. 104 (1996) 5497に記載されている。核磁気遮蔽テンソルは核の磁気モーメントｍと外部磁場Ｂによるエネルギεの２階微分によって表される。
【００４８】
【数３】
2005181104.tif 000005
この式は１次の誘導電子流密度Ｊ（１）（ｒ）でも表すことができる。
【００４９】
【数４】
2005181104.tif 000006
ｘ軸に沿った磁場を印加した場合の１次の誘導電子流密度は次式で表される。
【００５０】
【数５】
2005181104.tif 000007
ここで、ρは電子密度であり、軌道
【００５１】
【数６】
2005181104.tif 000008
においてｃμｉは分子軌道の展開係数、添字Ｌ，ｐはそれぞれ角運動量と運動量に関する１次摂動から導出された状態を表す。また、ＣＳＧＴで用いるｄ関数はＢｅｃｋｅの定義に従う（A. D. Becke, J. Chem. Phys. 88 (1988) 2547.参照）。
【００５２】
工程１３では、工程５、６、７、８を経て得られた基準化学シフト値と工程９、１０，１１、１２を経て得られた複合体の化学シフト値の差の絶対値を求める。各注目残基内部での評価に用いる原子は図２Ａ−図２Ｄに示した通りである。
【００５３】
例としてＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼにおけるリガンドの結合部位の決定および結合強さの比較を示す。図４にはＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼとリガンド（薬）が結合した複合体の立体構造（1pro: Sham, H. L., Zhao, C., Stewart, K. D., Betebenner, D. A., Lin, S., Park, C. H., Kong, X. P., Rosenbrook Jr., W., Herrin, T., Madigan, D., Vasavanonda, S., Lyons, N., Molla, A., Saldivar, A., Marsh, K. C., McDonald, E., Wideburg, N. E., Denissen, J. F., Robins, T., Kempf, D. J., Plattner, J. J., Norbeck, D. W.: A novel, picomolar inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 protease. J. Med. Chem. 39 pp. 392 (1996).参照。）を示す。ここで、図中のリボン状の矢印はβシート構造部分を表し、円筒はαヘリックス構造を、ひも状の部分はループを表す。蛋白質の中心部分にポケットと呼ばれる深い溝が存在し、その中に結合したリガンドをボール＆スティックで表示する。
【００５４】
図４に示す様に、この蛋白質は２つの蛋白質が２量体を形成することで、プロテアーゼ活性を示すことが知られている。このプロテアーゼ活性部位はそれぞれの蛋白質の２５番目のアスパラギン酸を中心として形成されており、２９番目、３０番目にもアスパラギン酸が存在する。この３つのアスパラギン酸をそれぞれ注目残基として、結合分子の違いから来る化学シフトの変動値を求める。
【００５５】
HIV-1ウイルスのプロテアーゼへの結合の強さの検討のために１５種類のリガンドを用いた。それぞれのプロテアーゼとリガンドの複合体のＰＤＢファイルは以下の通りである。
1pro：(前述した図４に示す複合体構造。)
5hvp：(Fitzgerald, P. M. D., Mckeever, B. M., Vanmiddlesworth, J. F., Springer, J. P., Heimbach, J. C., Leu, C.-T., Herber, W. K., Dixon, R. A. F., Darke, P. L.: Crystallographic Analysis of a Complex between Human Immunodeficiency Virus Type 1 Protease and Acetyl-Pepstatin at 2.0 Angstroms Resolution J.Biol.Chem. 265 pp. 14209 (1990)参照。), 
1hte：(Jhoti, H., Singh, O. M., Weir, M. P., Cooke, R., Murray-Rust, P., Wonacott, A.: X-ray crystallographic studies of a series of penicillin-derived asymmetric inhibitors of HIV-1 protease. Biochemistry 33 pp. 8417 (1994)参照。), 
4hvp：(Miller, M., Schneider, J., Sathyanarayana, B. K., Toth, M. V., Marshall, G. R., Clawson, L., Selk, L., Kent, S. B., Wlodawer, A.: Structure of complex of synthetic HIV-1 protease with a substrate-based inhibitor at 2.3 A resolution. Science 246 pp. 1149 (1989)参照。), 
8hvp：(Jaskolski, M., Tomasselli, A. G., Sawyer, T. K., Staples, D. G., Heinrikson, R. L., Schneider, J., Kent, S. B., Wlodawer, A.: Structure at 2.5-A resolution of chemically synthesized human immunodeficiency virus type 1 protease complexed with a hydroxyethylene-based inhibitor. Biochemistry 30 pp. 1600 (1991)参照。), 
2upj：(Thaisrivongs, S., Watenpaugh, K. D., Howe, W. J., Tomich, P. K., Dolak, L. A., Chong, K. T., Tomich, C. C., Tomasselli, A. G., Turner, S. R., Strohbach, J. W., et al.: Structure-based design of novel HIV protease inhibitors: carboxamide-containing 4-hydroxycoumarins and 4-hydroxy-2-pyrones as potent nonpeptidic inhibitors. J Med Chem 38 pp. 3624 (1995)参照。), 
4phv：(Bone, R., Vacca, J. P., Anderson, P. S., Holloway, M. K.: X-Ray Crystal Structure of the HIV Protease Complex with L-700,417, an Inhibitor with Pseudo C=2= Symmetry J.Am.Chem.Soc. 113 pp. 9382 (1991)参照。), 
1gno：(Hong, L., Treharne, A., Hartsuck, J. A., Foundling, S., Tang, J.: Crystal structures of complexes of a peptidic inhibitor with wild-type and two mutant HIV-1 proteases. Biochemistry 35 pp. 10627 (1996)参照。), 
1hpv：(Kim, E. E., Baker, C. T., Dwyer, M. D., Murcko, M. A., Rao, B. G., Tung, R. D., Navia, M. A.: CRYSTAL-STRUCTURE OF HIV-1 PROTEASE IN COMPLEX WITH VX-478, A POTENT AND ORALLY BIOAVAILABLE INHIBITOR OF THE ENZYME. J Am Chem Soc 117 pp. 1181 (1995)参照。), 
1hbv：(Hoog, S. S., Zhao, B., Winborne, E., Fisher, S., Green, D. W., DesJarlais, R. L., Newlander, K. A., Callahan, J. F., Moore, M. L., Huffman, W. F., et al.: A check on rational drug design: crystal structure of a complex of human immunodeficiency virus type 1 protease with a novel gamma-turn mimetic inhibitor. J Med Chem 38 pp. 3246 (1995)参照。), 
1hvi：(Hosur, M. V., Bhat, T. N., Kempf, D. J., Baldwin, E. T., Liu, B. S., Gulnik, S., Wideburg, N. E., Norbeck, D. W., Appelt, K., Erickson, J. W.: INFLUENCE OF STEREOCHEMISTRY ON ACTIVITY AND BINDING MODES FOR C(2) SYMMETRY-BASED DIOL INHIBITORS OF HIV-1 PROTEASE. J Am Chem Soc 116 pp. 847 (1994)参照。), 
1hvj：(Hosur, M. V., Bhat, T. N., Kempf, D. J., Baldwin, E. T., Liu, B. S., Gulnik, S., Wideburg, N. E., Norbeck, D. W., Appelt, K., Erickson, J. W.: INFLUENCE OF STEREOCHEMISTRY ON ACTIVITY AND BINDING MODES FOR C(2) SYMMETRY-BASED DIOL INHIBITORS OF HIV-1 PROTEASE. J Am Chem Soc 116 pp. 847 (1994)参照。), 
1hvk：(Hosur, M. V., Bhat, T. N., Kempf, D. J., Baldwin, E. T., Liu, B. S., Gulnik, S., Wideburg, N. E., Norbeck, D. W., Appelt, K., Erickson, J. W.: INFLUENCE OF STEREOCHEMISTRY ON ACTIVITY AND BINDING MODES FOR C(2) SYMMETRY-BASED DIOL INHIBITORS OF HIV-1 PROTEASE. J Am Chem Soc 116 pp. 847 (1994).参照。), 
1hvl：(Hosur, M. V., Bhat, T. N., Kempf, D. J., Baldwin, E. T., Liu, B. S., Gulnik, S., Wideburg, N. E., Norbeck, D. W., Appelt, K., Erickson, J. W.: INFLUENCE OF STEREOCHEMISTRY ON ACTIVITY AND BINDING MODES FOR C(2) SYMMETRY-BASED DIOL INHIBITORS OF HIV-1 PROTEASE. J Am Chem Soc 116 pp. 847 (1994).参照。), 
1hvr：(Lam, P. Y., Jadhav, P. K., Eyermann, C. J., Hodge, C. N., Ru, Y., Bacheler, L. T., Meek, J. L., Otto, M. J., Rayner, M. M., Wong, Y. N., et al.: Rational design of potent, bioavailable, nonpeptide cyclic ureas as HIV protease inhibitors. Science 263 pp. 380 (1994).参照。)
基準化学シフト値を求める為の標的蛋白質構造として1g6l(Pillai, B., Kannan, K. K., Hosur, M. V.: 1.9A X-Ray Study Shows Closed-Flap Conformation in Crystals of Tethered HIV1-Pr. Proteins: Struct., Funct., Genet. 43 pp. 57- (2001).参照。)を用いた。
【００５６】
基準となる標的蛋白質に対しては工程５，６、７、８を実施し、また、上記複合体構造に対しては工程９，１０，１１，１２を実施することで、標的蛋白質および各複合体での注目残基での化学シフトを得る。更に工程１３を実施し各複合体での化学シフト変動値を得る。
【００５７】
結合残基位置を決定する為の化学シフト変動値を表示する好ましい例を図５に示す。
【００５８】
図５の横軸は各複合体の名前あるいはＰＤＢ登録番号などの複合体を一意に指定できる記号を示す。ここで、横軸をリガンドの名称あるいは番号などのリガンドを一意に指定する記号を用いても構わない。縦軸には結合残基位置を決定する為の化学シフト変動値をとる。具体的には指定したＣα原子に近い炭素原子、すなわち図２Ａ−図２Ｄ中で「四角」で囲われた原子における化学シフト変動値をプロットする。
【００５９】
図５中のデータはＨＩＶ−１プロテアーゼでの注目残基（ＡＳＰ２５，ＡＳＰ２９，ＡＳＰ３０）でのＣβ原子での化学シフト変動値である。全体的に見てＣβ原子での化学シフトの変動は２５番目のアスパラギン酸が一番大きく、次に３０番目、２９番目と続く。このように多くの複合体でＣβの変動値が大きい残基はリガンドとの結合による構造的な変化が大きい残基であると解釈する。
【００６０】
このように変動が大きい残基は結合中心である可能性が高い。これは図５中の「平均」と記した、各注目残基の複合体にわたって取った平均値からも分かる。結合中心が２５番目のアスパラギン酸であるという本発明で判定した結果は前述した実験によって決定された事実と一致する。
【００６１】
結合の強さの傾向を示す化学シフト変動値を表示する好ましい例を図６に示す。図６の横軸は図５と同様に各複合体の名前あるいはＰＤＢ登録番号などの複合体を一意に指定できる記号を示す。ここで、横軸をリガンドの名称あるいは番号などのリガンドを一意に指定する記号を用いても構わない。縦軸には結合の強さを示す化学シフト変動値をとる。具体的には指定したＣα原子に遠い炭素原子、すなわち図２Ａ−図２Ｄ中で「丸」で囲われた原子における化学シフト変動値をプロットする。
【００６２】
図６においては本発明の有効性を示すために、本発明で得られた化学シフト変動値の平均値（実線）と、実測で得られた結合エネルギに−１を乗じた値［−ｋｃａｌ／ｍｏｌ］（太い破線）、従来ドッキングシミュレーションによる予測された結合エネルギに−１を乗じた値［−ｋｃａｌ／ｍｏｌ］（細かい破線）を同一のグラフ内に示す。
【００６３】
一般には本発明による解析結果（実線）のみの表示となる。本発明の変動値は、従来ドッキング方法による予測よりも実験値をより忠実に再現していることが分かる。本発明での結果によると１ｐｒｏと記した複合体での変動が著しく、実験によって得られた結果と対応している。これに対して従来方法では他の複合体（１ｈｖｒ）が最も結合が強いことを示している。この結果は従来方法で出現している擬陽性の傾向を本発明で抑制できていることを表している。以上より本発明の化学シフト比較はドッキングシミュレーションでの予測値よりも実測値に近い傾向を示していることが分かる。
【００６４】
工程１４で作成した複合体あるいはリガンドに対する結合の強さの順位を他の方法で求めた順位を比較する為に、実測値、ドッキングシミュレーション、本発明の化学シフト比較での各順位を図７に示す。順位が低いほど結合が強いことを表している。「実測値」は測定値による評価を表し、「ドッキング」はドッキングシミュレーションによる結合エネルギによる評価、「本発明」は本方式による化学シフト変動値解析による評価を表す。本発明による結果は実測値からのばらつきが従来の方法よりも小さく、本発明の比較方法は従来の方法に比べ、擬陽性が少ないことが分かる。
【００６５】
工程１５では注目残基上の指定した原子での各化学シフトの変動値をグラフ化して表示を行い、場合によってはファイル出力を行い、リガンドの結合の強さに関する順位のリストを作成する。
図８Ａ，図８Ｂに本発明で求めた結合情報の表示例を示す。図８Ａでは結合位置判定用化学シフトの変動と、結合の強さ判定用化学シフトの変動を上下２段に並べて表示した形態を表している。このように２つのグラフの横軸を統一させてリガンドもしくは複合体でプロットすると、それぞれのリガンドでの結合の強さとそれに対応した各注目残基での変化を同時に比較できるので、リガンドの結合ポケット部での空間的な広がりと結合の強さの関係を使用者は簡単に視覚的に把握できる。また、このように把握した情報は使用者が次のリガンドを作成する上での重要な情報、すなわちドラッグデザインに不可欠な分子の機能と構造の相関を示すものである。この点からも本発明は薬開発において重要な情報を使用者に提供することが分かる。
【００６６】
図８Ｂは、図８Ａの形態に加えて標的蛋白質のアミノ酸残基１次元配列データを表示している。このアミノ酸残基配列データ上に注目残基の印も合わせて表示する。このような情報を付加させることで、注目残基の周辺残基情報を使用者に提供し、使用者に標的蛋白質の特定部分の化学的な性質を参照させやすくする利便性を与え、リガンドと結合する部分のより詳しい残基情報を使用者に提供することが出来る。使用者はこの情報を用いて、選択した注目残基の検討を行い、本発明のスクリーニング条件（注目残基の指定など）を変更できる。
【００６７】
さらに本発明はコンピュータシミュレーション技術を利用するものである。工程１６に示すように本発明の結果を利用してＮＭＲ計測によるスクリーニングを行うことで、ＮＭＲ計測で検討・作成すべき試料数を減らすことができる。これはスクリーニング全体の費用を安くし、スクリーニング時間の短縮を可能にする。また、扱う分子の種類を減らすことは安全性の向上にも繋がる。
【００６８】
（実施例２）
本発明と従来ドッキングシミュレーションおよびＮＭＲスクリーニングを組み合わせる方法の他の実施例を図３に示す。図中の破線で囲まれた二つの工程２６，２７は、それぞれ、図１の破線で囲まれた本発明の実施例の４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の各工程から成る一連の工程に対応している。
【００６９】
まずは、標的蛋白質の立体構造取得工程２１と化合物ライブラリからリガンド構造取得工程２２を出発点として従来のドッキングシミュレーションによるスコアリング工程２３を実施する。ドッキングシミュレーションが標的蛋白質の複合体としての安定構造を出力しない場合には、スコアリングを求めた後に溶液中での各複合体構造の最適化を分子動力学シミュレーションで行う。
【００７０】
工程２４はシミュレーションの対象とするリガンドをリガンドグループに分割するための各グループに属すべきリガンドの数を決める。
【００７１】
工程２５では、工程２３で得られたスコアリングされたリガンドを、工程２４で決めたリガンドの数に応じて、スコア順にリガンドグループに分割する。たとえばグループ当り１０種のリガンドが入り、１万のリガンドを千のグループに分割する。このとき１番目のグループには結合が強い上位１０個のリガンドが属している。
【００７２】
工程２６では１番目のグループに対して、本発明の化学シフト比較によるスクリーニングを実施する。この工程は図１での破線で囲まれた一連の工程に対応している。
【００７３】
工程２７では２番目のグループに対して、本発明の化学シフト比較によるスクリーニングを実施する。この工程は図１での破線で囲まれた一連の工程に対応している。
【００７４】
工程２８では上記の２つのグループのリガンドを本発明の化学シフト比較によるスクリーニングで得られたスコアに基づいて並び替え、下位のグループに属するリガンドを捨てる。
【００７５】
工程２９ではトップグループの入れ替えが生じなくなるまで、下位のグループとの比較を繰り返す。あるいは使用者があらかじめ設定した閾値回数まで実施する。この繰り返しを行うことで、ドッキングスクリーニングで得られたリガンド候補化合物をさらに絞りこむことが出来る。また、本発明を用いると化学シフトの変動が大きい残基あるいは原子の種類、位置が分かるので、ＮＭＲ計測をする際の試料調整や計測スペクトルの選択等の実験戦略を立てることが可能となり、ＮＭＲ計測を効率的に進めることが出来る。
【００７６】
工程３０ではトップグループのメンバーのリガンドに対して、ＮＭＲ計測に基づくスクリーニングを実施する。得られたスペクトルデータから、最終的な候補化合物を選択する。
【００７７】
工程３１で、ＮＭＲ計測で実際に結合が確認できたリガンドを得る。
【００７８】
（実施例３）
本発明をＧＰＣＲに代表される膜蛋白質に適用する実施例を以下に示す。
【００７９】
生体膜の基本構造は脂質２重層で構成されており、膜機能の多くはその脂質２重層を貫通している膜蛋白質が担っている。この膜貫通型蛋白質は脂質と同じく両親媒性を有し、膜内にあって脂質２重層の疎水性の尾部と相互作用する疎水性領域と、膜の両側に突出していて水と接している親水性領域がある。
【００８０】
また、細胞外の水溶性シグナル分子（神経伝達分子、ペプチドホルモン、成長因子など）や一部の脂溶性シグナル分子と特異的に結合する膜蛋白質（細胞表面受容体蛋白質）が存在する。シグナル分子とこれらの膜蛋白質が結合して、細胞外のシグナルを細胞内のシグナルに変換して細胞の応答を引き出す。
【００８１】
さらに、細胞表面受容体蛋白質は伝達機能によって分類される３種類のいずれかに含まれる。チャネル連結型受容体は伝達物質でイオンチャネルを開放して、細胞膜のイオン透過性すなわち電気的な興奮性が短時間変化するものである。触媒型受容体はリガンドによって活性化されると直接酵素として働く。Ｇ蛋白質連結型受容体（ＧＰＣＲ）は細胞膜に結合した酵素あるいはイオンチャンネルを間接的に活性化または不活性化する。受容体と酵素あるいはイオンチャンネルの相互作用を仲介する蛋白質はＧＴＰ結合調節蛋白質（Ｇ蛋白質）と呼ばれる。通常Ｇ蛋白質は細胞内メッセンジャーと呼ばれるシグナル分子の濃度を変え、連鎖的に細胞内シグナルを伝達させていく。
【００８２】
このためＧＰＣＲに代表される膜蛋白質に結合するリガンドを発見し最適化することは様々な疾病に対して有効な薬の製造において重要である。
【００８３】
膜蛋白質は分子量が大きく、蛋白質そのものをＮＭＲで直接計測するのは困難である。ＮＭＲで計測可能にするためには選択的に同位体標識を行い、特定残基のみを観測するか、膜蛋白質を計測可能なサイズに分割し、所望の部分のみの溶液試料を作成して観測する。このように人為的に選択する必要があるために、ＮＭＲによる計測に入る前にコンピュータシミュレーションによって受容体（レセプター）での結合中心や結合に影響する残基の特定を行うことは非常に重要である。
【００８４】
ホモロジー検索等を利用した分子モデリングや生化学的情報を元にレセプター内のターゲットとなる残基を特定する。ホモロジー検索ではBLAST（S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D. J. Lipman, J. Mol. Biol., 215, (1990) 403. 参照）、FASTA（W. R. Pearson, D. J. Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988) 2444. 参照）といった相同性検索のプログラムを用いて対象となる蛋白質の残基配列と既知蛋白質の残基配列の相同性を調べ、３D-PSSM（http://www.bmm.icnet.uk/~3dpssm/ 参照）やGenTHREADER（ http://insulin.brunel.ac.uk/psipred/ 参照 ）といった構造認識プログラムを利用して類似性の高い立体構造を選び出してレセプターの立体構造を求める。
【００８５】
得られたレセプターの立体構造に対して、注目残基および原子を特定する。
【００８６】
標的レセプターの詳細が定まったら、図１に示した実施例に従い解析を進めていく。図１の工程１において標的レセプターのみの構造を取得するために、分子動力学などの技術を用いて溶液中での構造安定化を行う。
【００８７】
図１の工程３においてリガンドとレセプターの複合体構造を作成する際にはドッキングシミュレーションを利用して、２つの分子の配置を決定する。このときには、それぞれの分子の構造変化を考慮せず、また媒質である水分子等の影響も入っていない。このとき２つの分子の予測した結合部位の原子がお互い相互作用するような形に配置しているか確認する。次にドッキングシミュレーションで得られた複合体構造に対して分子動力学などの技術を用いて溶液中での構造安定化を行う。
【００８８】
図１に示した各工程に従って解析を進めることで、レセプターと結合するリガンドの特定や、局所的な電子状態から見た場合の結合の強さ、結合の位置が明らかになるので、ＮＭＲ計測やＷｅｔ系の実験を行うための指針を与えることが出来る。
【００８９】
更にＷｅｔ系実験等で既にレセプターに結合するリガンドが既知の場合、本発明は結合部位の特定および、その部分でのＮＭＲスペクトルの変動を予測できる為、ＮＭＲ解析または複合体結晶のＸ線回折を行わずにレセプターとリガンドの結合状態を詳細に知ることが出来る。
【００９０】
（実施例４）
本発明を蛋白質同士の相互作用解析に適用する１つの実施例を以下に示す。蛋白質同士の相互作用解析において結合の強さのみならず結合中心や結合に関連する残基の特定が非常に重要である。なぜなら、溶液中の蛋白質−蛋白質複合体をそのままＮＭＲ計測することは分子量の上限という点から難しく、選択的な同位体標識などの人為的な残基選択技術を導入する必要がある。この点、あらかじめ本方式を用いて、特定残基での結合時の化学シフト変動値を予測しておくことは、同位体標識の方法やＮＭＲ計測で用いるパルスシーケンスの決定といった、計測ストラテジの確立に役立ち、煩雑な実験の繰り返しを排除できる。
【００９１】
まずは、各蛋白質のそれぞれの結合部位や結合に関連する残基を生化学的情報や蛋白質−蛋白質ドッキングシミュレーションを活用して決定する。
【００９２】
それぞれの蛋白質の単体での注目した残基での化学シフトを図１の工程５、６、７、８に従って求める。
【００９３】
蛋白質−蛋白質ドッキングシミュレーションで得られた複合体構造が溶液中の構造安定化が行われていない場合には、分子動力学を用いて溶液中で構造安定化させる。
【００９４】
蛋白質−蛋白質複合体構造からそれぞれの蛋白質の注目した残基の化学シフトを図１の工程９，１０，１１，１２に従って求める。
【００９５】
それぞれの残基に対する化学シフトの差を工程１３で求め、比較する。このとき評価原子のみで行うのではなく、ＨＮ、Ｈα、Ｈβ、といった主鎖、側鎖に属する水素原子を用いても良い。
【００９６】
前記の比較の結果、蛋白質同士の結合によって大きく変動する残基や側鎖を構成する原子や水素原子を特定することが出来る。
【００９７】
前記で特定できた残基や原子を選択的に観測する試料作成の方法やパルスシーケンスの組み合わせの実験ストラテジを構築し、実験を行う。
【００９８】
蛋白質の持つ機能に対して中心的な働きを持つ残基に注目し、その残基を含んだモデル分子を切り出し、電子状態およびＮＭＲ化学シフト値の解析を行い、該化学シフト値から結合残基の決定および結合強さの比較を行うので、擬陽性が大きく従来スクリーニングでは難しかったリガンドや標的蛋白質に対しても適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実施例１のコンピュータシミュレーションを用いた化学シフトに基づくスクリーニングの好ましいフローを示す図。
【図２Ａ】酸性側鎖の性質を示すアミノ酸残基に対する具体的な評価原子の指定方法の例を示す図。
【図２Ｂ】塩基性側鎖を示すアミノ酸残基に対する具体的な評価原子の指定方法の例を示す図。
【図２Ｃ】非荷電極性側鎖の性質を持つアミノ酸残基に対する具体的な評価原子の指定方法の例を示す図。
【図２Ｄ】非極性荷電を示すアミノ酸残基に対する具体的な評価原子の指定方法の例を示す図。
【図２Ｅ】アミノ酸残基としてのグリシン（ＧＬＹ）を示す図。
【図３】創薬開発におけるリガンド探索に有効な本発明と従来ドッキングシミュレーションおよびＮＭＲスクリーニングとの組み合わせの一例を示す図。
【図４】ＨＩＶ−１プロテアーゼと結合した分子の複合体立体構造を示す図。
【図５】結合残基位置を決定する為の化学シフト変動値を表示する好ましい例を示す図。
【図６】結合の強さの傾向を示す化学シフト変動値を表示する好ましい例を示す図。
【図７】化学シフト比較での各スコアを示す図。
【図８Ａ】結合位置判定用化学シフトの変動と、結合の強さ判定用化学シフトの変動を上下２段に並べて表示した形態の例を示す図。
【図８Ｂ】図８Ａの形態に加えて標的蛋白質のアミノ酸残基１次元配列データを表示した例を示す図。
【図１】
2005181104.tif 000009
【図２Ａ】
2005181104.tif 000010
【図２Ｂ】
2005181104.tif 000011
【図２Ｃ】
2005181104.tif 000012
【図２Ｄ】
2005181104.tif 000013
【図２Ｅ】
2005181104.tif 000014
【図３】
2005181104.tif 000015
【図４】
2005181104.tif 000016
【図５】
2005181104.tif 000017
【図６】
2005181104.tif 000018
【図７】
2005181104.tif 000019
【図８Ａ】
2005181104.tif 000020
【図８Ｂ】
2005181104.tif 000021