(57)【要約】【課題】特定の細胞または生体組織を個別に回収できる新たな方法を提供すること。【解決手段】感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法。感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法であって、
感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取する前記方法。
【請求項２】
採取すべき細胞数または生体組織数が１である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体の供給量が0.5〜5マイクロリットルである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
感熱応答性ポリマーが基板上に層として設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
感熱応答性ポリマーがウェルを有する基板上の少なくともウェル中に設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
各ウェル中の感熱応答性ポリマーに１つの細胞または１つの生体組織が包埋している請求項５に記載の方法。
【請求項７】
液体の供給及び細胞または生体組織の採取を同一のマイクロピペットで行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
感熱応答性ポリマーがN-イソプロピルアクリルアミドであり、下限臨界溶解温度３２℃である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感熱応答性ポリマーを用いた細胞の固定化および採取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーをコーティングして生体材料を固定化する方法については報告があり、ポリマーとして感熱応答性ポリマーを用いることも知られている(特開2003-102466号公報(特許文献1)、特開平9-23876号公報(特許文献2))。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一方、細胞を1つ1つのレベルで特定し、選別し、選別された細胞を用いる試みがなされている。例えば、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された1つの抗原特異的リンパ球を回収し、回収された1つの抗原特異的リンパ球を用いて、例えば、抗体を製造することが検討されている（民谷ら、BIO INDUSTRY, p60-67, Vol.20, No.7, 2003 (非特許文献1)。
【特許文献１】特開2003-102466号公報
【特許文献２】特開平9-23876号公報
【非特許文献１】民谷ら、BIO INDUSTRY, p60-67, Vol.20, No.7, 2003
【０００４】
しかし、従来は、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異的リンパ球を回収することは容易でなかった。非特許文献1では、細胞単位で細胞を特定することが確認されたと記載され、かつ特定された細胞を回収することも可能であると記載されている。しかし、実際に1つの細胞を回収するとなると、熟練者が相当の注意を図って初めて可能なことであり、この方法を汎用するには、さらなる改良が求められていた。特に、集積度を挙げたチップでは、細胞を格納するウェル間の距離が非常に短くなり、狙った細胞のみを他の細胞の混入なしに確実に回収することは、容易ではなかった。
【０００５】
また、細胞以外にも、生体組織（組織断片を含む）から、特定の生体組織のみを選択し、回収したいという要望があった。例えば、ある特定の機能を有するタンパク質や酵素を含む(ある活性を示す)組織(または組織断片)のみを回収したい場合があり、その場合、活性染色などを行い、目的物質を含む組織(または組織断片)を回収することがある。
【０００６】
そこで本発明は、特定の細胞または生体組織を個別に、必要により1つずつでも、回収できる新たな方法を提供することを目的とする。
特に、隣り合う細胞間の距離または生体組織間の距離が短い、高い集積度の場合にも、狙った細胞または生体組織のみを他の細胞または生体組織の混入なしに確実に回収することができる方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
[請求項１]感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法であって、
感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取する前記方法。
[請求項２]採取すべき細胞数または生体組織数が１である請求項１に記載の方法。
[請求項３]液体の供給量が0.5〜5マイクロリットルである請求項２に記載の方法。
[請求項４]感熱応答性ポリマーが基板上に層として設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項５]感熱応答性ポリマーがウェルを有する基板上の少なくともウェル中に設けられている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[請求項６]各ウェル中の感熱応答性ポリマーに１つの細胞または１つの生体組織が包埋している請求項５に記載の方法。
[請求項７]液体の供給及び細胞または生体組織の採取を同一のマイクロピペットで行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]感熱応答性ポリマーがN-イソプロピルアクリルアミドであり、下限臨界溶解温度３２℃である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、特定の細胞または生体組織を個別に、必要により1つずつでも、回収できる新たな方法を提供することができる。
特に、本発明によれば、隣り合う細胞間の距離または生体組織間の距離が短い、高い集積度の場合にも、狙った細胞または生体組織のみを他の細胞または生体組織の混入なしに確実に回収することができる。
【０００９】
本発明の方法では、例えば、ガラス上などでは吸着が強くなり過ぎて採取困難な細胞または生体組織でも、細胞または生体組織にダメージを与えることなく、目的とする細胞または生体組織のみを迅速にかつ簡単に採取できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、感熱応答性ポリマーを用いて固定化した細胞または生体組織を感熱応答性ポリマーから採取する方法である。そして、本発明は、感熱応答性ポリマーの採取すべき細胞または生体組織を包埋する部分に、感熱応答性ポリマーの下限臨界溶解温度未満の温度の液体を、採取すべき細胞数または生体組織数に応じた量で供給し、次いで、前記液体を供給した感熱応答性ポリマーの部分から細胞または生体組織を採取することを特徴とする。
【００１１】
本発明の方法で用いる感熱応答性ポリマーは、感熱応答性を有するポリマー、即ち、温度に応答性を有するポリマーであれば制限はない。感熱応答性ポリマーは、例えば、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）であることができる。N-イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）は３２℃である。N-イソプロピルアクリルアミド以外に感熱応答性ポリマーとして利用できるポリマーとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
本発明においては、使用用途に応じて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）の異なる感熱応答性ポリマーを選択し、細胞の固定化及び回収をすることができる。また、ＬＣＳＴの異なる感熱応答性ポリマーを複数組み合わせて、ＬＣＳＴを調整することもできる。
【００１４】
感熱応答性ポリマーとしてN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）を用いる細胞の固定化及び採取方法について説明する。
【００１５】
32℃前後で膨潤収縮する感熱応答性N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーを、基板、例えば、スライドグラスにコーティングする。ポリマーのコーティング量は、例えば、5〜10mg/m2の範囲とすることができる。あるいは、コーティング層の厚みは、例えば、20〜100nmの範囲であることができる。本発明においては、感熱応答性ポリマーが基板上に層として設けられている態様以外に、感熱応答性ポリマーがウェルを有する基板上の少なくともウェル中に設けられている態様も含まれる。
【００１６】
ウェルを有する基板は、例えば、複数個のマイクロウェルを有し、各マイクロウェルに１個の細胞または生体組織を格納して用いられるマイクロウェルアレイチップであって、前記マイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つの細胞または生体組織のみが格納される形状及び寸法を有するマイクロウェルアレイチップであることができる。上記マイクロウェルは、円筒形、直方体、逆円錐形、若しくは逆角錐形またはこれらの2つ以上を組合せた形状であることができる。また、マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、マイクロウェルに格納しようとする細胞または生体組織の直径の1〜5倍の範囲であり、かつマイクロウェルの深さは、マイクロウェルに格納しようとする細胞または生体組織の高さの1〜5倍の範囲であることができる。
【００１７】
ポリマーがコーティングされた基板は、ヒーターなどを用いて温度をN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーが収縮する温度である32℃以上に保ちながら、細胞あるいは生体組織を固定化する。(図1(A)) 
【００１８】
基板がマイクロウェルを有する基板である場合、予め各ウェルに細胞あるいは生体組織を格納し、その後に、32℃以上に保持した基板にN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーをコーティングすることもできる。あるいは、マイクロウェル内及び基板表面にN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーを予めコーティングしておき、NIPAAmが膨潤する温度である32℃以上に保ちながら、マイクロウェル内に細胞あるいは生体組織を固定化することもできる。
【００１９】
ここで固定化する細胞は、特に制限されないが、例えば、リンパ球、赤血球だけではなく、接着性を有する細胞(例えば、癌細胞、神経細胞など)にも有効である。また、本発明の方法は、細胞以外にも、生体組織に適用することもできる。生体組織としては、例えば、生体膜（またはその断片）、細胞小器官（オルガネラ）等を挙げることができる。また、生体組織には、生体組織断片を含み、生体組織及び生体組織断片ともに、大きさが、例えば、１〜１００μｍの範囲のものが、本発明の方法の対象とするのに適している。
【００２０】
固定化された細胞を採取するために、例えば、マイクロマニュピレーターを用いて目的の細胞付近に、温度が32℃未満の冷水を加える（図1(B)）。これによって、冷水を加えた部分付近のみのNIPAAmを膨潤化（柔らかく）して、冷水を加えたマイクロマニュピレーターを吸引あるいは冷水の供給を停止することで毛細管現象により、目的の細胞のみをそのままマイクロマニュピレーターによって採取することができる（図1(C)）。この方法では、ポリマーコーティング中に細胞が適当な距離を置いて分散していれば、冷水の添加量をコントロールすることで採取すべき細胞数を１とすることができる。ポリマーコーティング中に分散される細胞間の適当な距離は、例えば、15μm以上であり、液体(冷水)の供給量は、例えば、0.5〜5マイクロリットルであることができる。
【００２１】
本発明の方法では、コーティングされたNIPAAm等の感熱応答性ポリマーの温度を液体の添加で局所的に制御することにより、その膨潤収縮性（疎水親水性）をコントロールし、ターゲット（細胞または生体組織）を簡単に採取できる。特に、本発明では上述のように、液体の供給及びターゲット（細胞または生体組織）の採取を同一のマイクロピペットで行うことが好ましい。
【００２２】
尚、本発明の方法においては、採取するターゲット（細胞または生体組織）の特定方法には特に制限はない。例えば、細胞を蛍光標識し、刺激を加えることによって蛍光が変化することで、特定の細胞を検知し、採取することができる。但し、蛍光に限らず、例えば、吸光度（通常の発色反応）を追うこともできる。本発明の方法では、ターゲットの検出方法にどのような方法を採用しても、顕微鏡を使って検出できうる系であれば実施は可能である。また、蛍光標識を使用する場合には、蛍光スキャナー等を使用することもできる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
スライドガラス程度の厚み（約1mm）のガラス上に、スティック型のヒーターを2本設置し、その間に感熱応答性N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）ポリマーをコーティングしたカバーガラスを置き、2本のヒーターを55℃に設定することによって、ヒーター間の温度を32℃以上（実際には34-37℃）になるように設定し、NIPAAmの環境を疎水環境にする。なお、載せているカバーガラスは、34-35℃になるように制御できていた。
【００２４】
次に、NIPAAmのカバーガラスへの固定化方法は、スピンコーターを用いて、3000rpm、20秒の条件で、0.05-0.1mg/μlのNIPAAmポリマー溶液100μlをカバーガラスへ滴下して、均一にガラス上にコーティングし、恒温槽にて40℃で乾燥させた。出来上がった薄膜は、膜厚が約50nm程度であった。
【００２５】
上記のような環境を顕微鏡のステージ上に設定した後、細胞溶液をNIPAAmポリマーでコーティングしたカバーガラス上に展開し、細胞が沈殿するのを待った（約10分間）。細胞間の距離は20-30μmであった。冷水（氷水、約0-4℃）を吸わせたマイクロマニュピレーター（口径20μm程度のガラス製のマニュピレーター）を用いて、顕微鏡を覗きながら目的の細胞付近までマニュピレーターの先端を近づけて、含まれていた冷水を一滴（1μl以下）出して、目的の細胞付近の温度を低下させた。マイクロマニュピレーターから一滴冷水を落とすと目的部分周辺の温度が29℃まで低下することも確認できた。［これによって、目的細胞周辺のNIPAAmポリマーが32℃以下になって膨潤していると考えられる。］その後、すぐにそのマイクロマニュピレーターによって目的の細胞のみを回収した。この際、近くに存在していた（細胞間距離20-30μm）細胞を取ることなく、目的の一細胞を回収できたことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の方法によれば、例えば、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異的リンパ球を回収することができる。この場合、感染症に対しては、病原体特異的リンパ球を検出し、病原体特異的抗体遺伝子をクローニングすることにより、がんに対しては腫瘍特異的リンパ球を検出し、腫瘍特異的抗体遺伝子、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングすることにより、抗体を用いた抗体療法、また、Ｔ細胞受容体遺伝子を用いた遺伝子治療が可能になると期待される。
【００２７】
また、本発明の方法は、細胞のみならずタンパク質などの生体組織を固定した後、再び回収さらには解析するためには、非常に有効な技術である。また、吸着力の制御によっては、チップをアレー化せずともそのまま細胞チップとしても利用できる可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】感熱応答性ポリマーコーティングへの細胞の固定化及びマイクロマニュピレーターによる採取方法の説明図。
【図１】
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