(57)【要約】【課題】  トランスフェクション効率が高く、細胞毒性が低くて生体に安全な、二本鎖ＤＮＡの細胞への新規な導入方法を提供する。【解決手段】  プラスミドを制限酵素で切断して得られるような、二本鎖ＤＮＡの両末端の、少なくとも一箇所に、ポリ(dA)テールのような一本鎖のオリゴＤＮＡを結合し、得られたテール結合ＤＮＡをβ−１，３−グルカン系多糖（例えば、シゾフィラン）と複合体化し核酸−多糖複合体として標的細胞に投与する。【選択図】  図１
2005204612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の遺伝情報を有する遺伝子を標的細胞に導入する方法であって、前記遺伝情報をコードする二本鎖ＤＮＡの、四つの末端のうちの少なくとも一つの末端に、一本鎖のオリゴヌクレオチドテールを結合して得られる核酸に、β−1,3−グルカン系多糖を作用させて生成した核酸−多糖複合体を前記標的細胞に導入することを特徴とする方法。
【請求項２】
オリゴヌクレオチドがポリデオキシアデニンであることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
所定の遺伝情報が、タンパク質をコードしていることを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項４】
所定の遺伝情報が、低分子干渉ＲＮＡをコードしていることを特徴とする請求項１または２の方法。
【請求項５】
β-1,3-グルカン系多糖が、シゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナン、もしくはラミナランから選択されたもの、またはその誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの方法。
【請求項６】
β-1,3-グルカン系多糖が、β-1,3-グルカンの側鎖にカチオン性または細胞親和性官能基を導入したものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のタンパク質や低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNAs）などをコードした遺伝子（核酸）を、標的細胞へ効率良く導入するための新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の進歩に対応して、遺伝子治療が盛んに研究されており、目的に応じて所定の遺伝情報をコードする遺伝子を標的細胞に効率的に導入するための研究が精力的になされている。遺伝子治療としては、従来、アンチセンスやデコイでタンパク質の発現を制御したり、ゲノムの修復を行ったり、欠損もしくは損傷している遺伝情報を外来遺伝子の形で入れて、タンパク質の発現を誘発することが行われてきた。また、最近では、遺伝情報の発現をコントロールするＲＮＡ、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用した遺伝子治療も注目を集めている。
【０００３】
細胞内への遺伝子導入効率を上げるために、通常、遺伝子キャリアーが併用される。当初、レトロウイルスまたはアデノウイルスが、遺伝子キャリアーとしてin vitroでは極めて見込みのある結果を与えたが、これら天然由来のウイルスの炎症性、免疫原的性質、ならびに突然変異誘発および細胞ゲノム中への組み込みの危険性に因り、これらのin
vivoにおける使用は制限されている。
【非特許文献１】Mulligan, Science, 260, 926-932（1993）
【非特許文献２】Miller, Nature, 357, 455-460（1992）
【非特許文献３】Crystal, Science, 270, 404-410（1995）
【０００４】
近年、非ウイルス性の人工キャリアーとしてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、さらには、ＰＥＩと同様に窒素の置換基で修飾された、種々のカチオン性ポリマーやカチオン性脂質などが研究されている。
【０００５】
しかしながら、ＰＥＩのようにアミノ基を多数有する物質は生理活性が高く、体内毒性等の危険性も考えられる。事実、今まで検討されたカチオン性ポリマーは未だ実用に供されておらず、医薬品添加物辞典等に記載されていない。
【非特許文献４】医薬品添加物辞典
【非特許文献５】日本医薬品添加剤協会縄集、薬事日報社
【０００６】
他方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖類に、β−1,3−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている。
【非特許文献６】Theresa M. McIntire and DavidA. Brant, J. Am. Chem. Soc., 120,6909（1998）
【０００７】
さらに、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約20年の使用実績がある。
【非特許文献７】清水、陳、荷見、増淵、Biotherapy, 4, 1390（1990)
【非特許文献８】長谷川、Oncology and Chemotherapy,8, 225（1992）
【０００８】
このようなβ−1,3−グルカンを化学修飾して、ＤＮＡ等の生体材料とのコンジュゲイトを作成し、これを遺伝子キャリアーに使用できることが知られている。この先行技術には、天然のβ−1,3−グルカン、すなわち、３重螺旋構造を有するβ−1,3−グルカンをそのまま使用し、これと生化学活性のある材料を、共有結合を介して、β−1,3−グルカン／生体材料のコンジュゲイトを製造する方法が述ベられている。
【特許文献１】PCT/US95/14800
【０００９】
また、最近、本発明者らにより、β−1,3−グルカンまたはβ−1,3−キシラン系の多糖類が、人工的に処理されることで、各種の核酸と新しいタイブの複合体を形成することが見出された。
【特許文献２】再表01-034207
【非特許文献９】櫻井、新海、J. Am. Chem. Soc., 122, 4520（2000）
【非特許文献１０】木村、甲元、櫻井、新海、Chem. Lett., 1242（2000）
【００１０】
もともと、天然もしくは水中で３重螺旋として存在するこの多糖を、極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる、３重螺旋型の複合体が形成されるのである。このような多糖と遺伝子の複合体は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
【非特許文献１１】櫻井和朗、井口律子、木村太郎、甲元一也、水雅美、新海征治、Polym.Preprints Jpn.,49, 4054（2000)
【００１１】
天然の多糖類を使用した場合の核酸との複合体における結合エネルギーは、場合によってはさほど強くなく、比較的容易に複合体が解離する。また、予め多糖類にアミノ基のようなカチオン性官能基を導入して核酸との複合体の安定性をより強くする方法も研究されている。そして、これらの多糖類と核酸の３重螺旋型複合体は、細胞膜の透過性およびヌクレアーゼ耐性があり、遺伝子キャリアーとして使える可能性が高いことが本発明者らによって明らかにされている。
【特許文献３】PCT/ JP02/02228
【００１２】
さらに、細胞内へのトランスフェクション効率を高める手段として、最近は、標的細胞への特異的な親和性を活用する方法の研究が盛んである。例えば、細胞の表面に存在する接着蛋白であるインテグリンとの結合に有効なＲＧＤ配列を含むペプチドを、既知のキャリアーに導入することによって、遺伝子のトランスフェクション効果を上げる試みが、特許に例示されている。
【特許文献４】特表2002-502243
【特許文献５】特願2003-52508
【００１３】
同様に、標的化の対象として細胞の表面に存在する糖レセプターを活用するトランスフェクションの方法も研究されている。例えば、肝細胞に代表されるガラクトース受容体をもつ細胞に対して、特異的に親和性を有するガラクトースまたはガラクトースを構成成分として含むラクトースで修飾された脂質、ペプチド、ポリエチレングリコール等の高分子物質が、肝臓癌のアンチセンスＤＮＡ治療薬のキャリアーとして特許出願されている。
【特許文献６】特開平9-235292
【特許文献７】特開平11-290073
【特許文献８】特表2002-515418
【特許文献９】特表2002-538174
【００１４】
上記のように、β−1,3−グルカン系のような多糖は核酸１本＋多糖２本からなる安定な三重螺旋状の複合体を形成するので、これを利用してアンチセンスＤＮＡ（通常は一本鎖である）などとして所定の遺伝情報を有する遺伝子を標的細胞に導入することができる。しかしながら、一般のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡは二本鎖ＤＮＡである例が多く、そのままでは、上記のようなβ−1,3−グルカンとの三重螺旋状の複合化技術を細胞への遺伝子導入に適用することはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、プラスミドＤＮＡのような二本鎖で存在する核酸を、トランスフェクション能が高く、かつ細胞毒性が低くて生体に安全に細胞に導入し得る新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、二本鎖ＤＮＡの末端に、β−1,3−グルカン系多糖と相互作用が可能なオリゴヌクレオチドのテールを付加（結合）することにより、安定な二本鎖ＤＮＡ−多糖複合体が形成することに着意して本発明を導き出した。
かくして、本発明は、所定の遺伝情報を有する遺伝子を標的細胞に導入する方法であって、前記遺伝情報をコードする二本鎖ＤＮＡの、四つの末端のうちの少なくとも一つの末端に、一本鎖のオリゴヌクレオチドテールを結合して得られる核酸に、β−1,3−グルカン系多糖を作用させて生成した核酸−多糖複合体を前記標的細胞に導入することを特徴とする方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体に安全な多糖をキャリアーとして、所定の遺伝情報をコードする二本鎖のＤＮＡを標的細胞に効率よく、且つ安全に導入できる。また、本発明に従えば、プラスミドなどから目的遺伝子の発現に不要な領域（抗生物質耐性遺伝子など）を除去し、目的の遺伝子領域のみを直鎖状の二本鎖ＤＮＡとして細胞に導入することで発現効率が向上する。このようにＤＮＡを直鎖とする場合、一般に、その酵素（ヌクレアーゼ）耐性が問題となるが、本発明においては多糖と複合化していることで末端からのＤＮＡの分解を抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、多糖から成る遺伝子キャリアーとの複合化部分として一本鎖のオリゴヌクレオチドから成るテールを二本鎖ＤＮＡの末端に付与し、多糖キャリアーと複合化させることで核酸−多糖複合体として遺伝子を細胞に導入するものである。オリゴヌクレオチドテールとしては、ポリデオキシアデニンから成るテール〔本明細書および図面中、ポリ（dA）テール、またはpoly(dA)tailと記すことがある〕の他、ポリデオキシグアニン、ポリデオキシシトシンまたはポリデオキシチミンから成るテールも適用可能であるが、実用的にはポリデオキシアデニンから成るテールが好ましい。ポリ(dA)テールに代表されるオリゴヌクレオチドのテールの長さは、特に限定されるものではないが、一般的には、50〜100個程度のヌクレオチド分子から成るものが好ましい。
【００１９】
所定の遺伝情報をコードする二本鎖ＤＮＡは、一般に、プラスミドに組み込まれたプラスミドＤＮＡとして入手できるものを利用するが、これに限られるわけではない。二本鎖ＤＮＡの末端に一本鎖オリゴヌクレオチドテールを付加する（結合する）方法としてはいくつかの方法が考えられるが、最も効率よく導入する方法としてＤＮＡリガーゼ（ligase）による合成一本鎖ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の付加が挙げられる。ただ、そのままでは、ＤＮＡリガーゼは一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに結合することができないため、付加するＤＮＡの末端も二本鎖としておく必要がある。例えば、まず、プラスミドなどの二本鎖ＤＮＡを特定の制限酵素（図１に示す例ではSph I）で切断する。それによって生成する粘着末端と相補的な配列を持つ15mer程度の一本鎖ＤＮＡ（アダプター：adaptor）及びそれと相補的な配列を有し多糖との複合化部分となるポリ(dA)などの繰り返し塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡを設計する（実施例１、図１参照）。
【００２０】
それら2本の一本鎖ＤＮＡをアニーリングした後、制限酵素処理した二本鎖ＤＮＡと混合し、ＤＮＡリガーゼを添加することで末端に一本鎖ＤＮＡを持つ二本鎖ＤＮＡの調製を行うことができる（実施例１、図１）。また、二本鎖ＤＮＡの末端に一本鎖オリゴヌクレオチドを結合する方法としては、以上の方法の他に、例えばターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡの末端に一本鎖ホモポリマーを付加することも可能である。
【００２１】
なお、付加するオリゴヌクレオチドテールは図１に示す両末端に一本ずつ〔図２（a）及び（b）〕以外に、片末端に一本〔図２（c）及び（d）〕、あるいは両末端に2本ずつ〔図2（e）〕付加することも可能である。また、ポリ(dA)のようなオリゴヌクレオチドテール配列をループ状にし、末端を閉じることもできる〔図２（f）〕。
【００２２】
本発明に従えば、上記の如くして得られる、オリゴヌクレオチドテール結合ＤＮＡと複合体を形成させるために遺伝子キャリアーとして、β−1,3−グルカン系多糖が使用される。核酸のテール部分とβ−1,3−グルカン系多糖とは、主に水素結合と疎水性相互作用により核酸1：多糖2の化学量論比から成る３重螺旋状の安定な複合体を形成し、標的細胞に導入可能となる。
【００２３】
本発明において用いられるβ−1,3−グルカン系多糖とは、β−1,3−結合で結合されたグルコース構造を含む多糖である。本発明において用いられるのに好適なβ−1,3−グルカン系多糖の例は、従来より知られた各種の天然多糖類であり、シゾフィラン、カードラン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン、レンチナン、またはラミナランなどが挙げられ、それらの誘導体を使用することもできる。
【００２４】
また、トランスフェクション効率を上げるために、それらのβ−1,3−グルカンの側鎖を適当な官能基で修飾したものも本発明で使用されるのに好適なβ−1,3−グルカン系多糖として含まれる。そのような修飾基としては、アミノ基やイミノ基で代表されるカチオン性官能基や、特定のアミノ酸残基、ペプチド残基、コレステロール基、単糖およびオリゴ糖の残基、ポリエチレングリコール残基などの細胞親和性官能基が好適に使用される。
【００２５】
オリゴヌクレオチドテール結合された核酸（ＤＮＡ）とβ−1,3−グルカン系多糖との複合体形成の処理条件は、既述の先行特許文献３などに記載されているものと基本的に変わりはなく、多糖の極性溶媒溶液とＤＮＡの水溶液とを適当な緩衝液を用いて水中で混合すればよい（実施例４参照）。
本発明の方法は、所定の遺伝情報として、タンパク質をコードしている二本鎖ＤＮＡ、または、低分子干渉ＲＮＡをコードしている二本鎖ＤＮＡなどを標的細胞に導入するのに利用することができ、用いられる二本鎖ＤＮＡの由来、塩基配列、長さなどに特に制限はない。以下、本発明をさらに具体的に明らかにするため、変異型緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子の末端にポリ(dA)テール（Ａ80:80個のデオキシアデニン分子から成るテール）を結合する場合に沿って実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAの調製
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAを図1のスキームに従って調製した。EGFPをコードする遺伝子を含むプラスミドpEGFP-C1（BD
Biosciences Clontech社、配列番号１）水溶液（10ng）を大腸菌XL-1懸濁液に加え、キュベットに移し、所定量の滅菌水を加えて体積を調整した。このキュベットに1.25kVの電圧を印可してプラスミドDNAを大腸菌に導入し、LB培地1mlを入れたマイクロチューブにこの溶液を加え、37℃で1時間振とう培養した（エレクトロポレーション法）。この溶液を遠心分離した後、菌液を200μg/mlのアンピシリンを含むLB-Agarプレートに播種し、37℃で一晩培養した。培養後、コロニーを5個拾ってミニプレップ（アルカリ法）によりプラスミドDNAの回収を行った。これを制限酵素処理することで確認を行い、プラスミドDNAの導入を確認した。
【００２７】
図３に示すプライマー（primer）を設計し、PCRを行った。FwおよびRvプライマーはいずれもともに制限酵素Sph I認識部位を付加するように設計した（配列番号２および配列番号３）。PCR反応溶液としてKOD-Plus
polymerase（TOYOBO社）1μl、2mM（each）dNTP 5μl、10×KOD buffer 5μl、鋳型DNA（pEGFP-C1）0.2μl（50
ng）、10μMプライマー1.5μl、25mM MgSO42μl、滅菌水で全量を50μlとした。図４に示す温度プログラムでPCRを行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。ここで確認された目的バンド（2039bp）を含む部分をカッターで切り出し、DNA回収キット（GENEPURE,
NIPPON GENE社）を用いて目的のDNAのみを回収して43μlの滅菌水に溶解した。KOD-polymeraseによって増幅されたDNA断片には末端にアデニンが付加されておらず、TAクローニングには向かない。そこで、続けてTaq
polymeraseによってPCR産物の3’末端にポリ（dA）を付加した。回収したPCR産物43μlに50mMMgCl21.5μl、10mM
dNTP1μl、10×buffer 5μl、Platinum Taq polymerase（invitrogene社）0.5μlを加え全量を50μlとして72℃で2時間反応を行った。2時間後、Microcon-PCR（millipore社）を使って精製を行った。
【００２８】
PCRによって増幅したEGFP
DNA 1μl（10ng）とpGEM-T vector（promega社、配列番号４）1μl（50ng）、T4 DNA ligase（promega社）1μl、2×buffer
5μl、滅菌水2μlを混合し、全量を10μlとしてライゲーション反応を行った。これを4℃で一晩インキュベートしてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によって塩を除去し、減圧乾燥後、滅菌水10μlに溶解した。この溶液の5μlを大腸菌XL-1にエレクトロポレーション法により形質転換した。菌液を4%
X-Gal、0.1M IPTGを塗布した200μg/mlアンピシリンを含むLB-Agarプレートに播種し、37℃で一晩培養し、コロニーの青白選択を行った。白コロニーを4つ拾い、試験管培養してミニプレップ（アルカリ法）を行い、プラスミドDNAの精製を行った。得られたプラスミドDNA溶液1μlと10×H
buffer 1μl、制限酵素Sph I 1μl、滅菌水で全量を10μlとして37℃で1時間、制限酵素処理を行った。反応後、切断を確認するためにアガロースゲル電気泳動を行い、インサートを確認した（pGEM-T-EGFP）。
【００２９】
得られたコロニーの培養液4mlをLB培地400ml（100μg/mlアンピシリンを含む）の入ったフラスコに入れ、37℃にて一晩振とう培養した。4℃、8000rpmにて20分間遠心し、上澄みを除去した。その後、Maxi
prepキット（キアゲン社）を用いてプラスミドの精製を行った。得られた溶液をエタノール沈殿し、減圧乾燥により得られたDNAペレットを600μlの滅菌水に溶かした。
【００３０】
精製したプラスミド溶液175μlにTAKARA H buffer 20μl、制限酵素Sph
I（タカラバイオ社）を5μlを混合し、全量を200μl（同様のものを3本調製）として37℃で一晩制限酵素処理を行った。反応後、切断を確認するためにアガロースゲル電気泳動（1wt%アガロースゲル、1×TAE
buffer、100V、30分）を行った。目的のバンドが確認されたので2039bpのバンドを含む部分をカッターで切り出し、DNA回収キット（GENE PURE社製品）を用いて目的のDNAのみを回収した。これをエタノール沈殿後、減圧乾燥し、60μlの滅菌水に溶解した。
【００３１】
図５に上記で調製した遺伝子DNAの末端に結合させるアダプターオリゴヌクレオチド（adaptor ODN）およびポリ(dA)テールオリゴヌクレオチド（poly(dA)tail
ODN）の配列（配列番号５および配列番号６）を示した。adaptor ODNのリン酸化反応は、まず、adaptor ODNを200μMとなるように滅菌水に溶解し、それを2μl（400
pmol）と10×kinase buffer 16μl、10mM ATP 16μl、10U/μl T4 polynucleotide kinase（promega社）4μl、滅菌水120μlを混合し、37℃で1時間インキュベートした。1時間後、0.5M
EDTAを8μl添加して反応を止め、マイクロスピンG-25カラム（amasham社）で精製を行った。
【００３２】
次にリン酸化したadaptor
ODNとpoly(dA)tail ODNのアニーリングを行った。リン酸化したadaptor ODN 5μlと200μM tail ODN 1.7μl、2×ligation
buffer 6.7μlを混合した。混合溶液をサーマルサイクラーを用いて70℃で10分加熱した後、1時間かけて4℃にした。アニーリングしたODNを制限酵素処理して回収したEGFP遺伝子にDNAリガーゼによって結合させた。2×ligation
buffer 17μl とEGFP遺伝子溶液17μl（6.4pmol）及びアニーリングしたODN溶液17μl（640pmol）を混合した。ここにT4
ligase（promega社）4μlを添加し、4℃で24時間インキュベートした。ゲル電気泳動を行って、目的バンドを切り出し、DNA回収キット（GENE PURE社）を用いて回収した後、エタノール沈殿を行った。これを60μlの滅菌水に溶解し、目的のポリ（dA）テール付加遺伝子DNAを得た。
なお、本実施例1の実験操作全般にわたり参考にした文献の一例を以下に記載する。
【非特許文献１２】ラボマニュアル遺伝子工学第三版、村松正實 編、丸善株式会社
【実施例２】
【００３３】
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAのキャラクタリゼーション
1.  ゲル電気泳動による確認
ライゲーション反応によってadaptor ODN及びpoly(dA) tail ODNがEGFP遺伝子に付加した場合、その末端近くに制限酵素Sph I認識部位が復元する。そこで、tail付加したEGFP遺伝子をSph Iで処理し、tail ODNの付加をゲル電気泳動によって確認した。DNA3μl、H
buffer1μl、滅菌水5μl、Sph I1μlを混合して37℃で1時間インキュベートした。その後、2.5wt%アガロースゲル電気泳動を行った（100V、40分）。結果を図６に示す。制限酵素処理したポリ(dA)テール付加EGFP遺伝子（レーン2）と同時に切断されたテールと同じ長さとなるpoly(dA)
tail ODNとadaptor ODNをアニーリングしたものを泳動させた（レーン3）。図６より、レーン2にレーン3のODNとほぼ同じ位置にバンドがみられた。従って、EGFP遺伝子にポリ(dA)テールが付加されたことを確認することができた。
【００３４】
2.  DNAシーケンサーによる確認
poly(dA)tailのおよそ400bp上流にシーケンスプライマーを設計し、DNAシーケンスを行った（図７）。図７より、二本鎖DNAの末端に付加されたポリ(dA)の相補鎖となるポリ(dT)配列が確認できポリ（dA）テールの付加を確認した。
【実施例３】
【００３５】
β−1,3−グルカン（SPG）の調製
３重螺旋構造のシゾフィラン（SPGと記すことがある）を文献記載の定法に従って製造した。すなわち、ATCC（American
Type Culture Collection社）から入手したSchizophyllum
commune. Fries（ATCC 44200）を、最小培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量45万の３重螺旋シゾフィランを得た。
【非特許文献１３】Gregory G. Martin, Michael F. Richardson, Gordon C. Cannon and CharlesL. McCormick, Am. Chem. Soc. Polymer Prepr., 38(1), 253-254(1997)
【非特許文献１４】Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata and AkiraMisaki, Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)
【実施例４】
【００３６】
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAとシゾフィランの複合体調製
1.  ゲル電気泳動による確認のための複合体調製
実施例1で合成されたポリ（dA）テール付加遺伝子DNA水溶液（9ng）に実施例3で調製したシゾフィラン（SPG）のジメチルスルホキシド（以下DMSOと表記）溶液、100mM
Tris-HCl（pH8.0）、滅菌水を表1に従って混合した。SPGはポリ（dA）部分のモル数に対して1、5、10、50倍となるようにした。得られた溶液は全て透明で均一であった。混合溶液は4℃で3日間静置した。
【００３７】
【表１】
2005204612.tif 000003
【００３８】
2.  原子間力顕微鏡（AFM）測定のための複合体調製
実施例1で合成されたポリ（dA）テール付加遺伝子DNA水溶液（400ng）に実施例3で調製した50
mg/ml SPG DMSO溶液0.7μl、100mM Tris-HCl（pH8.0）5μlを混合した。SPGはポリ（dA）部分のモル数に対して2.5倍となるようにした。得られた溶液は全て透明で均一であった。混合溶液は4℃で3日間静置した。
【実施例５】
【００３９】
複合化の確認
1.  ゲル電気泳動による複合化の確認
1wt%アガロースゲル電気泳動（20V、2時間30分）行って複合化の確認を行った（図８、レーン1；DNAラダー、レーン2；Tail：SPG＝1：0、レーン3；Tail：SPG＝1：1、レーン4；Tail：SPG＝1：5、レーン5；Tail：SPG＝1：10、レーン6；Tail：SPG＝1：50）。図８より、SPG濃度の増加に伴ってバンドがスメアとなり、薄くなった。この結果より調製したポリ(dA)テール付加DNAはSPGと複合化することが確かめられた。
【００４０】
2.  原子間力顕微鏡（AFM）測定による複合化の確認
実施例4で調製した溶液を2mM MgCl2水溶液で希釈し、DNA濃度2ng/μlとしてマイカ基盤上にキャストし、水で洗浄後、減圧乾燥してAFM測定を行った。AFM測定にはNanoscope
III a（Digital Insturuments社）を用い、大気中タッピングモードでAFM観察を行った。カンチレバー（NCH-10V）は、曲率半径5〜10nm、ばね定数20〜100N/ｍ、共振周波数200〜400ｋHzとした。得られたAFM像を図９に示す。なお、図９では、ＡＦＭ像〔写真、(a)〕の理解を助けるために、写真に沿って作成した模式図(b)も併せて示している。紐状のDNAの両末端に玉状のSPGが結合している像が観測された。この結果より、実施例1で合成したポリ（dA）テール付加DNAの末端にSPGが結合することが確かめられた。
【実施例６】
【００４１】
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAとペプチド修飾多糖（SPG）キャリアーの複合体調製
先行特許記載のペプチド修飾多糖（オリゴアルギニン修飾SPG；R8-SPG、ペプチド導入率1.8mol%、分子量15万）を用いてポリ（dA）テール付加遺伝子DNAとの複合化を行った。20mg/mlR8-SPG
DMSO溶液とポリ（dA）テール付加遺伝子DNA水溶液、100mM Tris-HCl（pH8.0）を水の体積分率（Vw）が0.92となるように混合した。SPGはポリ（dA）テールのアデニンに対して2倍モルとなるように混合した。混合溶液を4℃で3日間静置して複合体形成を行った。
【特許文献１０】特願2003-052508
【実施例７】
【００４２】
ポリ（dA）テール付加遺伝子DNAとペプチド修飾多糖（SPG）キャリアーの複合体によるヒト由来肺ガン細胞A549への遺伝子導入
実施例6で調製した複合体溶液は限外ろ過（マイクロコン社YM-3、millipore）を用いてDMSOを除去し、Dullbecco’s
Modified Eagles’Medium（DMEM培地）で所定濃度に希釈して使用した。細胞はヒト肺ガン細胞A549を用いた（培養条件：DMEM,10%FBS,37℃）。細胞はヒト由来肺ガン細胞A549を用いた。細胞数を測定後、96穴プレート（Nunc）に細胞数が5×103cell/wellとなるように播種し、24時間培養した。その後、各wellをDMEMで洗浄した後、テール付加EGFP遺伝子DNA/R8-SPG複合体のDMEM溶液100μl（DNA100ng）を添加した。インキュベーターで3時間半培養後、10%FBSを含むDMEM培地100μlに培地を交換してさらに24時間培養した。その後、共焦点レーザー顕微鏡（顕微鏡；ECLIPSE
TE2000-U、Nikon社、共焦点スキャンユニット；Radiance 2100C、Bio-Rad)を用いて緑色蛍光タンパク質（EGFP）の発現を観察した。テール付加EGFP遺伝子DNA/R8-SPG複合体を添加した細胞においてEGFP由来の緑色蛍光を示す細胞がみられた（図１０（a）透過像、図１０（b）蛍光像）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の遺伝子導入法を適用することにより、所定の遺伝情報をコードする二本鎖DNAを、生体に優しい多糖系キャリアーを使って標的細胞に導入することが可能となる。また、この際、多糖がDNAに結合することによってDNAをヌクレアーゼなどの酵素から保護する。さらに遺伝子発現に不要な部分を除去した遺伝子を導入することで通常のプラスミドを導入するよりも発現効率が向上する。これらのことから、本発明は効果的且つ安全な遺伝子導入法として遺伝子治療の分野での利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ポリ(dA)テール付加遺伝子DNAの調製スキーム（実施例１）。
【図２】ポリ(dA)テール付加のバリエーション。
【図３】プライマーの設計（実施例１）。
【図４】PCRの温度プログラム（実施例１）。
【図５】遺伝子DNA末端結合用アダプター用オリゴヌクレオチドおよびポリ(dA)テールオリゴヌクレオチドの塩基配列（実施例１）。
【図６】ライゲーション反応におけるアダプターおよびポリアデニンテールのEGFP遺伝子への付加を確認するゲル電気泳動図（実施例２）。
【図７】ポリ(dA)テールの相補鎖となるポリ(dT)配列のDNAシーケンスによる確認図（実施例２）。
【図８】ポリ(dA)テール付加遺伝子DNAと多糖キャリアーの複合体の生成をゲル電気泳動で確認した図（実施例５）。
【図９】ポリ(dA)テール付加遺伝子DNAと多糖キャリアーの複合体の生成を、原子間力顕微鏡(AFM)測定によって確認した図（実施例５）。
【図１０】ポリ(dA)テール付加遺伝子DNAと多糖キャリアーの複合体によるヒト由来肺ガン細胞A549への遺伝子導入を共焦点レーザー顕微鏡の透過像による確認図(a)、および蛍光像による確認図(b)（実施例７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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