(57)【要約】【課題】  卵母細胞の膜電位を利用した細胞アッセイ系の高スループット化を達成する。【解決手段】  微細加工技術により高精度電極アレーを作製し、細胞自動装填装置により測定領域に装填された細胞に電極アレーを同時に挿入し、低分子化合物を添加した際に発生する膜電位を同時に測定する。【選択図】  図９
2005204624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶シリコン材料からなり、内部に中空チャネルを有する細胞アッセイ用針状体。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞アッセイ用針状体において、前記中空チャネルに金属電極を有することを特徴とする細胞アッセイ用針状体。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞アッセイ用針状体において、長さ方向に沿って外壁部に低電気抵抗領域を有する細胞アッセイ用針状体。
【請求項４】
結晶シリコン材料からなり、前記結晶シリコン材料中に金属電極が隙間なく配置されていることを特徴とする細胞アッセイ用針状体。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞アッセイ用針状体において、前記結晶シリコン材料の外壁部に長さ方向に沿って低電気抵抗領域を有することを特徴とする細胞アッセイ用針状体。
【請求項６】
任意の受容体を表面に発現させた細胞に化合物を投与し、電極により計測される膜電位の値により化合物と受容体の結合をアッセイする系において、複数細胞を計測領域に自動的に搬送し、向きが最適化された細胞に、微細加工技術により高精度で作製された電極を自動的に挿入し、細胞表面の特定領域に任意量の化合物を自動的に注入することにより、細胞に対するアッセイを同時、高精度、迅速に行うアッセイ系。
【請求項７】
請求項６に記載のアッセイ系において、複数の細胞を保管する保管領域が計測する計測手段から分離されており、保管領域から計測手段に細胞を搬送するにあたって、吸引構造を有するキャリアプレートに複数細胞を吸引効果により一時的に固定化し、保管領域から計測手段にキャリアプレートを移動させた後、細胞を計測領域内の分注プレートに自動的に装填することを特徴とするアッセイ系。
【請求項８】
請求項５に記載のアッセイ系において、計測領域に搬送された細胞の向きを振動、液体の流れ、機械的な力のいずれかにより配向させた後、細胞の特性領域に微細加工技術により高精度で作製された電極を自動的に挿入し、信号の最適化および再現性の向上を図ることを特徴とするアッセイ系。
【請求項９】
請求項８に記載のアッセイ系において、電解液で充填されたシリコン製の中空電極を振動させながら細胞に挿入し、細胞内における電極先端の位置を高精度で制御することにより、細胞損傷の低減および信号の再現性を向上させることを特徴とするアッセイ系。
【請求項１０】
請求項９に記載のアッセイ系において、ひとつの細胞に複数本の独立した電極、もしくは複数電極の機能を一体化した一本の電極を挿入し信号を測定することを特徴とするアッセイ系。
【請求項１１】
請求項６に記載のアッセイ系において、細胞表面の受容体発現領域、計測用電極の挿入位置、化合物の添加領域の位置関係を制御することにより、信号の最適化および再現性の向上を図ることを特徴とするアッセイ系。
【請求項１２】
請求項１１に記載のアッセイ系において、複数細胞に同じ化合物を同時に添加し、これら複数細胞からの結果を平均化することにより、計測結果の精度向上を図ることを特徴とするアッセイ系。
【請求項１３】
請求項６に記載のアッセイ系において、一台のアンプで一つの細胞を測定することを特徴とするアッセイ系。
【請求項１４】
請求項１３に記載のアッセイ系において、アンプと電極の接続を電気的もしくは機械的に切り替えることにより、一台のアンプで複数個の細胞を測定することを特徴とするアッセイ系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化合物と受容体の結合を細胞の膜電位により測定するアッセイ系の自動化に関するものであり、特に、細胞アッセイ用針状体及び高精度細胞アッセイシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の電気生理学的方法にはガラス電極を用いた膜電位固定法があり、図３に示す。中空のガラスチューブ３１を加熱電極３２で局所的に加熱し、両端から引き伸ばすことにより形成されたガラス針３３中に、塩化銀処理された銀線３４を導入することによりガラス電極３５を作製する（図３（ａ）〜（ｃ））。
【０００３】
生きている細胞の内外部間には数10mVの電位が存在し、細胞膜中に存在するチャンネルおよびトランスポーターを介してイオンが移動すると、膜電流が発生する。チャンネルの開閉は度々同じ細胞膜中の受容体と外部から加えられた化合物との結合により誘導されることから、膜電流もしくは膜電圧を測定することにより、受容体と化合物の結合をモニターすることができる。測定対象の細胞としては、ＲＢＬ−１細胞、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）、ニューロブラストーマ細胞アッセイ系あり、またアフリカツメガエルの卵母細胞の系が良く知られている。後者はリボゾームやｔＲＮＡを豊富に含んでいるため、ｍＲＮＡをマイクロインジェクトすることにより任意の受容体を細胞表面に比較的容易に発現することができる。卵母細胞はＧＴＰ結合タンパク質を有するため、添加された化合物が受容体に結合すると、クロライドチャネルが開き、膜電流が流れる。内因性の受容体がほとんどないことから、選択性に優れた化合物・受容体結合のアッセイ系として用いることができる。そこで、卵母細胞３６にガラス電極３５を挿入し、化合物３７を添加する際発生する膜電流３８をアンプ３９で測定することにより、卵母細胞表面に発現された受容体に化合物３７が結合するかを判定できる。（図３（ｄ））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的な動物細胞、卵母細胞を用いた化合物・受容体の結合スクリーニング系は選択性に優れ、データの精度が高いため期待されている。しかし、ガラス電極の高精度大量生産は困難であり、細胞の自動搬送および電極の自動挿入が困難であるため、高スループット化されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記問題を解決するための方法を図１、２に示す。複数の細胞を測定領域に装填するにあたって、まず細胞１１を細胞保管庫１２に準備する。吸引ポンプ１３を有する搬送プレート１４により複数細胞を吸引する（図１（ａ）、（ｂ））。搬送プレート１４を測定プレート１５上に移動後吸引作用を停止し、複数細胞を解放することにより細胞を測定プレート１５上の測定スポット１６に短時間で装填することができる（図２（ａ））。
【０００６】
測定スポット１６の底面１７は複数個の細孔もしくはメッシュから形成されており、細胞１１は吸引作用１８により保持される（図２（ｂ））。細胞１１のサイズがばらついたにせよ電極１９は再現性よく挿入され、インジェクタ２０で化合物２１が添加された際発生する電流を高精度で測定することが可能となる（図２（ｃ）、（ｄ））。
【０００７】
多数の細胞を電気生理学的に測定するにあたって、大量生産が可能な電極の作製方法と電極挿入を容易にする細胞の位置決め技術が必要となる。本発明においては、微細加工技術で作製した微小電極アレーでガラス電極を置き換えることを提案する。図４（ａ）は、本発明の針状体の一例を示す正面図であり、図４（ｂ）は、平面図である。シリコンウエハー５１の面方向に片もち型カンチレーバ針５２を作製する。針の内部にはチャンネル５３が形成されており、内部壁面は塩化銀処理された銀電極にて覆われており、測定時にはＫＣｌ液で満たされる。電極の真横に細胞を配置し、シリコン基板全体を細胞方向にスライドさせることにより、電極を細胞に挿入する。一枚のシリコンウエハーに複数の電極針５４を作り込むことにより、複数の細胞に電極を同時に挿入し電流を測定することができる。
【０００８】
図５に、卵母細胞表面における受容体の発現領域、測定電極の位置、及びリガンド添加領域の位置関係を示す。細胞６１に受容体を発現させるため、受容体をコードするｍＲＮＡを予め針６２により注入する必要がある。受容体は注入領域６３近傍において集中的に発現されるため、ｍＲＮＡの注入領域６３とリガンド６４の添加領域の位置関係により信号強度は変化する。したがって、再現性の向上のためには、細胞の向き制御は重要である。
【０００９】
図６に、卵母細胞の配向方法を示す。測定スポットに装填された細胞を、ノズル６６からの液体の流れ６７により回転させ、配向させる（図６（ａ））。また、細胞が卵母細胞の場合、重心は球状細胞の幾何学的中心より動物胚側にずれているため、振動６８を加えることにより向きを揃えることが可能である（図６（ｂ））。液体の流れ、もしくは振動により配向された卵母細胞の所定位置に電極を挿入することにより、再現性よく測定することが可能となる。
【００１０】
図７に、振動する電極を卵母細胞に挿入する方法を示す。電極を挿入する際、電極を超音波の周波数で振動させることにより、細胞への損傷を抑えることができる。圧電素子８１を備えたアクチュエータ８２を用いることにより、電極８３を挿入方向もしくは垂直方向に振動させながら細胞８４に挿入することが可能である。また、電極先端の位置８５を制御することにより、信号の再現性を向上できる。
【００１１】
複数の電極を有する電極アレーを挿入する方法として、次の方法を用いることができる。図８に、電極アレーを複数細胞に挿入する方法を示す。細胞に横方向から電極を挿入する場合には、横向きの電極８６を備えた電極アレー８７を用いる。電極アレー８７を横にスライドさせ、細胞８８を細胞保持バリア８９に押し付けることにより、電極８６を細胞に挿入する（図８（ａ））。また、下向きの電極９０を複数個有する下向き電極アレー９１を下にスライドさせ、電極９０に挿入できる（図８（ｂ））。また、上向きの電極９２を有する上向き電極アレー９３を上にスライドさせ、穴を通して細胞を蓋９４に押し付けることにより、上向きの電極を細胞に挿入できる（図８（ｃ））。また、上向きの電極９５を基板９６上に予め形成しておき、蓋９７で細胞を下に押し付けることにより、電極を細胞に挿入する（図８（ｄ））。
【００１２】
電気容量が大きな細胞を電気生理的に測定する際には、一つの細胞に電流注入と電圧測定用の複数の電極を挿入する必要が生じる。その際には、下向き電極を有する電極アレー１０１と上向き電極を有する電極アレー１０２で細胞を挟むことにより、一つの細胞に二本の電極を挿入できる（図８（ｅ））。または、上部横向き電極アレー１０３と下部横向き電極アレー１０４を相対的に横にスライドさせることにより、一つの細胞に二本の電極を挿入できる（図８（ｆ））。
【００１３】
図９に、複数卵母細胞からの信号を処理することによる、信号の高精度化方法を示す。複数の細胞を用いて測定を行うことにより、測定精度をさらに向上することができる。ｍＲＮＡを同時期に注入した複数の細胞１１１を測定プレート１１２に装填し、細胞に対して一組の電極アレー１１３と１１４を挿入する。それぞれの細胞に同一のリガンドを添加し、発生する電流をアンプ１１５により測定する。それぞれのアンプからの測定結果１１６は計算機１１７により平均化され、高精度な最終結果１１８として出力される。
【００１４】
複数細胞からの電流を測定するにあたって次の方法がある。図１０に、複数卵母細胞からの信号を複数個のプリアンプおよびアンプの組み合わせで測定する方法を示す。一つには細胞数に対応する数のプリアンプ１２１が測定プレート１２２上に配置され、それぞれのプリアンプ１２１は独立したアンプ１２３と接続されている（図１０（ａ））。また、細胞数に対応する数のプリアンプ１２１が測定プレート上に配置され、プリアンプ１２１は機械的もしくは電気的スイッチ１２４を介してアンプ１２３に接続されている。細胞への薬物投与は、若干時間をずらしながら逐次的に行われ、薬物を投与された細胞からの信号は、プリアンプ１２１とスイッチ１２４を介して、アンプ１２３に送られる（図１０（ｂ））。また、一つにはプリアンプ１２１はスイッチ１２４を介して複数個のアンプ１２３に接続され、スイッチ１２４で切り替えることにより２個以上の細胞からの信号を同時に測定する（図１０（ｃ））。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の構成により、細胞膜電位の測定を高精度で行うことができる。特に、複数個の細胞で同時に測定することにより、高信頼度のデータを短時間で得ることができる。
【実施例１】
【００１６】
図１１に、卵母細胞の装填方法示す。テフロン（商標名）で作製された細胞保管庫１３１と測定領域１３２はともに生理食塩水１３３で満たされている。細胞１３４を細胞保管庫１３１から測定領域１３２に搬送するには、搬送装置１３５を用いる。搬送装置１３５の上部に形成された穴１３６に負圧をかけることにより、搬送装置１３２の下部に形成された逆漏斗型吸引口１３７に細胞１３４が吸引される。搬送装置１３５は測定領域１３２へ搬送され、穴１３６に圧１３８を加えると同時に、測定領域１３２の下部に形成されている穴１３９から吸引することにより、細胞を測定プレート１４０に装填できる。細胞保管庫１３１と測定領域１３２の間にはバリア１４１が形成されているが、液面１４２を十分高く維持することにより細胞１３４を液中に保持したまま細胞保管庫１３１から測定領域１３２まで搬送することができる。
【００１７】
図１２と図１３に、卵母細胞の電極挿入方法を示す。測定プレート１４０は３層の（１００）面シリコン基板と、１層のガラス基板から構成されている。最下部シリコン基板１４３には細胞を保持するためのくぼみ１４４が形成されており、細胞は底面のスリット１４５を通して吸引される。上二枚のシリコン基板１４６と１４７を接合することにより、シリコン電極１４８を作製する。ガラス基板１４９は、複数個の細胞を隔離するバリアとして機能する（図１２）。
【００１８】
ひし形断面を有するシリコン電極はシリコン基板１４７から構成される上部シリコン基板１５１とシリコン基板１４６から構成される下部シリコン基板１５２から構成される。上部シリコン基板１５１には断面が台形の溝がエッチングにより形成されており、上部１５１と下部１５２を直接接合することにより、（１１１）壁面を有する中空のチャンネル１５３が形成される。注入口１５４にＫＣｌ液を加えることにより、接続している中空チャンネル１５３をＫＣｌ液で充填することができる。中空チャンネル１５３の壁面は塩化銀１５５で被覆されており、外部から電極パッド１５６に電気的に接続することができる。最下部シリコン基板１４３表面にスパッタリングによりパイレックスの膜を形成し、シリコン基板１４６とシリコン基板１４３を陽極接合する。ガラス基板１４９とシリコン基板１４７も同様に陽極接合によりボンディングする。（図１３）
図１４に、電極挿入のメカニズムを示す。シリコン電極を細胞に挿入するには、てこの原理を用いる。圧電素子１６１に電位をかけることにより、てこ１６２を押す。支点１６３の反対側においては、てこがシリコン電極１６４を押す効果が発生し、電極先端が細胞１６５内に挿入される。圧電素子１６１に印加する電位にＡＣ成分を持たせると、電極先端が振動し細胞への挿入が容易になる。
【実施例２】
【００１９】
図１５に、電極挿入のメカニズムを示す。また、図１６に、二次元電極アレーの構造を示す。上向きの電極を底面に備えた測定プレートを用いて測定を行う。電極の作製方法は実施例１の場合と類似する。二枚の（１００）面シリコン基板１７１を用意し、片方の表面にエッチングで溝を形成してから二枚を直接結合することにより、中空チャンネル１７３を有する電極１７４を作製する。複数の１次元電極アレー１７５をガラス製梁１７６により結合することにより２次元電極アレー１７７が得られる。メッシュ１７８をかぶせられた二次元電極アレー１７７をバリア１７９で分割する。
【００２０】
図１７に、卵母細胞の装填方法を示す。卵母細胞１８０を測定プレートに装填するにあたって、卵母細胞１８０を予め卵母細胞保管庫１８１に入れておき、測定プレートの各区画１８２に移す。
図１８に、アレー電極を卵母細胞に挿入する方法を示す。
【実施例３】
【００２１】
図１９に、アレー電極を動物細胞にランダムに挿入して測定する方法を示す。多数の針電極１９０が形成された基板１９１の上に神経細胞等の付着細胞１９２を培養する（図１９（ａ））。膜電位測定の際には神経細胞を繊維等の多孔質材料１９３にて電極に押し付けることにより、電極を細胞内に挿入する（図１９（ｂ））。電極はランダムに細胞に挿入されるが、少なくとも一本は挿入されるよう、十分の数の電極を予め作製しておく。電極の挿入が成功したか否やかを配線１９４からの電気信号で判断し、挿入された電極のみを用いて測定を行う（図１９（ｃ））。
【実施例４】
【００２２】
図２０に、細胞の自動搬送方法を示す。細胞２０１を細胞保管庫２０２から測定プレート２０３へ搬送するメカニズムを示す。細胞保管庫２０２の底に配置されている搬送プレート２０４には、穴２０５が形成されてあり、流れにより細胞２０１が落とし込まれるようになっている。穴２０５のサイズは細胞２０１の大きさに合わせてあり、穴２０５の底はシャッタープレート２０６で塞がれているため、一個の穴に細胞２０１が入るようになる（図２０（ａ））。搬送プレート２０４をシャッタープレート２０６と共に移動し、測定プレート２０３領域まで細胞２０１を搬送する（図２０（ｂ））。次に搬送プレート２０４とシャッタープレート２０６の相対位置をずらすことにより、シャッタープレート２０６に形成された穴より、細胞２０１を測定プレート２０３に形成された穴に導入する（図２０（ｃ）、（ｄ））。測定後の細胞２０１は、測定プレート２０３の下部もしくは上部から廃棄される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の基本概念を示す図。
【図２】本発明の基本概念を示す図。
【図３】従来技術における電極作製方法および測定方法を示す図。
【図４】シリコン製電極針の構造を示す図。
【図５】卵母細胞表面における受容体の発現領域、測定電極の位置、リガンド添加領域の位置関係を示す図。
【図６】卵母細胞の配向方法を示す図。
【図７】振動する電極を卵母細胞に挿入する方法を示す図。
【図８】電極アレーを複数細胞に挿入する方法を示す図。
【図９】複数卵母細胞からの信号を処理することによる、信号の高精度化方法を示す図。
【図１０】複数卵母細胞からの信号を複数個のプリアンプおよびアンプの組み合わせで測定する方法を示す図。
【図１１】卵母細胞の装填方法を示す図。
【図１２】卵母細胞の電極挿入方法を示す拡大図。
【図１３】卵母細胞の電極挿入方法を示す図。
【図１４】電極挿入のメカニズムを示す図。
【図１５】二次元電極アレーの構造を示す図。
【図１６】二次元電極アレーの構造を示す図。
【図１７】卵母細胞の装填方法を示す図。
【図１８】アレー電極を卵母細胞に挿入する方法を示す図。
【図１９】アレー電極を動物細胞にランダムに挿入して測定する方法を示す図。
【図２０】細胞の搬送方法を示す図。
【符号の説明】
【００２４】
１１：細胞、１２：細胞保管庫、１３：吸引ポンプ、１４：搬送プレート、１５：測定プレート、１６：測定スポット、１７：底面、１８：吸引作用、１９：電極、２０：インジェクタ、２１：化合物、３１：ガラスチューブ、３２：加熱電極、３３：ガラス針、３４：塩化銀処理された銀線、３５：ガラス電極、３６：卵母細胞、３７：化合物、３８：膜電流、３９：アンプ、５１：シリコンウエハー、５２：片もち型カンチレーバ針、５３：チャンネル、５４：複数の電極針、６１：細胞、６２：針、６３：注入領域、６４：リガンド、６５：電流測定用電極、６６：ノズル、６７：液体の流れ、６８：振動、８１：圧電素子、８２：アクチュエータ、８３：電極、８４：細胞、８５：電極先端の位置、８６：横向き電極、８７：電極アレー、８８：細胞、８９：細胞保持バリア、９０：下向き電極、９１：下向き電極アレー、９２：上向き電極、９３：上向き電極アレー、９４：蓋、９５：上向き電極、９６：基板、９７：蓋、１０１：下向き電極アレー、１０２：上向き電極アレー、１０３：上部横向き電極アレー、１０４：下部横向き電極アレー、１１１：細胞、１１２：測定プレート、１１３：電極アレー、１１４：電極アレー、１１５：アンプ、１１６：測定結果、１１７：計算機、１１８：高精度最終結果、１２１：プリアンプ、１２２：測定プレート、１２３：アンプ、１２４：スイッチ、１３１：細胞保管庫、１３２：測定領域、１３３：生理食塩水、１３４：細胞、１３５：搬送装置、１３６：穴、１３７、逆漏斗型吸引口、１３８：圧、１３９：穴、１４０：測定プレート、１４１：バリア、１４２：液面、１４３：最下部シリコン基板、１４４：くぼみ、１４５：スリット、１４６：中間シリコン基板、１４７：最上部シリコン基板、１４８：シリコン電極、１４９：ガラス基板、１５１：シリコン電極上部、１５２：シリコン電極下部、１５３：中空チャンネル、１５４：注入口、１５５：塩化銀、１５６：電極パッド、１６１：圧電素子、１６２：てこ、１６３：てこ支点、１６４：シリコン電極、１６５：細胞、１７１：（１００）面シリコン基板、１７２：接合面、１７３：中空チャンネル、１７４：電極、１７５：１次元アレー、１７６：ガラス製梁、１７７：２次元アレー、１７８：メッシュ、１７９：バリア、１８０：卵母細胞、１８１：卵母細胞保管庫、１８２：区画、１９０：電極、１９１：基板、１９２：付着細胞、１９３：多孔質材料、１９４：配線、２０１：細胞、２０２：細胞保管庫、２０３：測定プレート、２０４：搬送プレート、２０５：穴、２０６：シャッタープレート。
【図１】
2005204624.tif 000003
【図２】
2005204624.tif 000004
【図３】
2005204624.tif 000005
【図４】
2005204624.tif 000006
【図５】
2005204624.tif 000007
【図６】
2005204624.tif 000008
【図７】
2005204624.tif 000009
【図８】
2005204624.tif 000010
【図９】
2005204624.tif 000011
【図１０】
2005204624.tif 000012
【図１１】
2005204624.tif 000013
【図１２】
2005204624.tif 000014
【図１３】
2005204624.tif 000015
【図１４】
2005204624.tif 000016
【図１５】
2005204624.tif 000017
【図１６】
2005204624.tif 000018
【図１７】
2005204624.tif 000019
【図１８】
2005204624.tif 000020
【図１９】
2005204624.tif 000021
【図２０】
2005204624.tif 000022