(57)【要約】【課題】  、血管内皮増殖因子受容体２型（ＫＤＲ）に対する特異的結合性を有し、一方、血管内皮増殖因子受容体１型（Ｆｌｔ−１）に対する結合性は示さない、血圧降下活性に優れた、新規に単離された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質の提供。【解決手段】  ＫＤＲに対する特異的結合性を有し、Ｆｌｔ−１対する結合性は示さない、血圧降下活性に優れたＶＥＧＦ様タンパク質として、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ならびに、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１が新規に精製・単離され、そのアミノ酸配列も解明された。【選択図】    図２
2005110508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎであり、
該ｖａｍｍｉｎタンパク質は、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さず、
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体である
ことを特徴とするｖａｍｍｉｎタンパク質。
【請求項２】
ｖａｍｍｉｎタンパク質の変異体タンパク質であって、
該変異体タンパク質は、
配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸への置換により変異されている、ペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体であり、
前記変異アミノ酸配列は、配列番号１に対して、Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基は、Ｓｅｒであり、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、Ａｒｇであり、７４番目、７７番目、７９番目のアミノ酸残基は、それぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓのいずれかである変異を有し（但し、配列番号３のアミノ酸配列と一致する選択を除く）、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質変異体。
【請求項３】
Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１であり、
該ＶＲ−１タンパク質は、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さず、
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体である
ことを特徴とするＶＲ−１タンパク質。
【請求項４】
ＶＲ−１タンパク質の変異体タンパク質であって、
該変異体タンパク質は、
配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸への置換により変異されている、ペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体であり、
前記変異アミノ酸配列は、配列番号２に対して、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、Ａｒｇであり、７４番目、７７番目、７９番目のアミノ酸残基は、それぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓのいずれかである変異を有し、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質変異体。
【請求項５】
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質を精製、単離する方法であって、
前記ヘビから採取されるヘビ毒中に含まれるｖａｍｍｉｎタンパク質を、多段のクロマトグラフィーを用いて、精製する工程を有し、
単離される該ｖａｍｍｉｎタンパク質は、非還元下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、２５．８ｋＤａのバンドを示す
ことを特徴とするｖａｍｍｉｎタンパク質の精製、単離方法。
【請求項６】
Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質を精製、単離する方法であって、
前記ヘビから採取されるヘビ毒中に含まれるＶＲ−１タンパク質を、多段のクロマトグラフィーを用いて、精製する工程を有し、
単離される該ＶＲ−１タンパク質は、非還元下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、２５．２ｋＤａのバンドを示す
ことを特徴とするＶＲ−１タンパク質の精製、単離方法。
【請求項７】
血圧降下剤を含んでなる医薬組成物の調製における、該医薬組成物中の血圧降下活性を有する活性成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、血圧降下活性を有する活性成分として、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項３に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用。
【請求項８】
肝炎症の治療用途に使用可能な、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、細胞増殖作用を利用して、ＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を惹起する作用を示す活性成分を含んでなる医薬組成物の調製における、該ＶＥＧＦ様タンパク質成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、ＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を惹起する作用を示す活性成分として、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項３に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用。
【請求項９】
動脈硬化に対する外科的治療の経皮的環動脈介入術（ＰＣＩ）に付随する血管内皮損傷の治療ないしは、虚血性疾患に対する治療用途の、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、ＫＤＲを介したＮＯ合成酵素の活性化が誘起する血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用を利用している、医薬組成物の調製における、該ＶＥＧＦ様タンパク質成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質成分として、
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項３に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用。
【請求項１０】
ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子より、宿主細胞中において、該ＶＥＧＦ様タンパク質を組換え発現するため、組換え導入可能なベクター中に挿入されてなる遺伝子組換え用ベクターの形態で含まれてなる、該ＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の使用であって、
前記ＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子として、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項３に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子を、宿主細胞中において、該ＶＥＧＦ様タンパク質を組換え発現するため、組換え導入可能なベクター中に挿入されてなる遺伝子組換え用ベクターの形態で含む
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の使用。
【請求項１１】
ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質に関して、該ＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合の阻害活性を有する化合物をスクリーニングする、イン  ビトロのＫＤＲに対する結合の阻害活性アッセイ系の構成における、該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
該イン  ビトロのＫＤＲに対する結合の阻害活性アッセイ系は、系内に存在させる被験化合物の結合阻害活性を、該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬のＫＤＲに対する結合量の変化によって評価するアッセイ系であり、
該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬として、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２または３に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項５に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を用いる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用。
【請求項１２】
血管新生病に対する治療用途の、ＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合性に対する、阻害活性を有する化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物の調製における、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、請求項１１に記載される結合阻害活性アッセイ系を利用して選択される、前記ＫＤＲに対する結合性に対する阻害機構として、ＫＤＲ中のリガンドとの結合部位に結合して、リガンドとの結合阻害するもの、あるいは、ＫＤＲ中の結合部位以外の部位に結合して、結合部位のコンフォメーションを変化させて、リガンドとの結合を阻害するものを含む、ＫＤＲに対する結合性に対する阻害活性を有する化合物を有効成分として含み、
該結合阻害活性アッセイ系を利用する選択において、
該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬として、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、請求項１に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質、請求項２に記載のｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、請求項３に記載のＶＲ−１タンパク質、請求項４に記載のＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を用いる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用。
【請求項１３】
前記血管新生病は、固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬のいずれかの疾患である
ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する特異的結合性を有し、一方、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）に対する結合性は示さない、新規に単離されたヘビ毒由来の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質と、その医学分野における用途に関する。より具体的には、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ならびに、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１と、これら新規なヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質（ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１）の有する、ＫＤＲを介した血圧降下作用を利用する、虚血性疾患に対する治療用途への応用などの医学分野における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ）は、血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）において、中心的な役割を担っている。血管新生は、創傷治癒、女性の性周期における子宮内膜や黄体形成などといった生理的現象において重要な役割を果たす一方、固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬などの種々の疾患に対しても、関与していることが知られている。ＶＥＧＦ−Ａは、分子量２３  ｋＤａのサブユニットがジスルフィド結合によりホモダイマーを形成した糖タンパク質である。ＶＥＧＦ−Ａと類似する増殖因子として、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＩＧＦ）がある（非特許文献１−３を参照）。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ−１（ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−１：Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦＲ−２（ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）に高親和性に結合する。ＶＥＧＦ−Ａの内皮細胞の増殖シグナルおよび血圧降下作用には、主にＫＤＲを介していることが示唆されている（非特許文献４参照）。また、ＫＤＲを介したシグナル伝達により産生されるＮＯは、血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用などさまざまな生理活性を有し、抗動脈硬化的に働いていると考えられている（非特許文献１参照）。ごく最近、Ｆｌｔ−１は、肝細胞の増殖を刺激することが報告された（非特許文献５参照）。そのため、ＫＤＲを介した血圧降下作用を誘起する、ＶＥＧＦを、虚血性疾患に対する治療に用いるにあたり、Ｆｌｔ−１との結合に起因する肝臓肥大などの副作用が問題になる。ＫＤＲのみに結合するタンパク質として、Ｐａｒａｐｏｘウィルスに由来するＶＥＧＦ−Ｅや、ＶＥＧＦを改変することにより、レセプター分子に対する選択性を付与した変異体タンパク質が報告されている。しかし、ＫＤＲに特異的なＶＥＧＦの変異体タンパク質は、天然のＶＥＧＦ−Ａより血圧降下活性が小さく、また、ＶＥＧＦ−Ｅは、血管内皮細胞の増殖活性と血管透過性がＶＥＧＦ−Ａと同程度か、むしろ弱いことが報告されている（非特許文献６−１４参照）。
【０００３】
一方、ヘビ毒中には、有用な生物活性を持つ分子が含まれている。血圧降下因子（ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＦ）が、Ｖｅｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素から単離されている。ＨＦの一次構造（アミノ酸配列）は、ＶＥＧＦと相同性を有するタンパク質であった（非特許文献１５，１６参照）。更には、つい最近、ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ＶＥＧＦとｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＣＰＰ）の２種のＶＥＧＦ様分子が、それぞれ、他のヘビ毒から単離されており、この二種のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様蛋白質は、血管透過性と血管新生の活性を有することが示されている（非特許文献１７−１９参照）。
【非特許文献１】渋谷正史、倉林正彦編、  実験医学、２０（増刊）、  １０７０−１２６９  （２００２）
【非特許文献２】小野真弓、桑野信彦著、  血管新生とがんの生物学、  共立出版、  １−９７  （２０００）
【非特許文献３】佐藤靖史編、  血管新生の最前線、  羊土社、  １０−１７１  （１９９９）
【非特許文献４】Ｌｉ，  Ｂ．等，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ３９，  １０９５−１１００  （２００２）
【非特許文献５】Ｌｅ，  Ｊ．等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９９，  ８９０−８９３  （２００３）
【非特許文献６】Ｇｉｌｌｅ，  Ｈ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ３２２２−３２３０  （２００１）
【非特許文献７】米国特許第６０５７４２８号明細書
【非特許文献８】米国特許第６０２０４７３号明細書
【非特許文献９】米国特許第６５４１００８号明細書
【非特許文献１０】国際公開  第００／  ６３３８０号パンフレット
【非特許文献１１】国際公開  第０９／７０８３１３パンフレット
【非特許文献１２】Ｏｇａｗａ，  Ｓ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３，  ３１２７３−３１２８２  （１９９８）
【非特許文献１３】Ｍｅｙｅｒ，  Ｍ．等，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １８，  ３６３−３７４  （１９９９）
【非特許文献１４】Ｗｉｓｅ，  Ｌ．  Ｍ．等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９６，  ３０７１−３０７６  （１９９９）
【非特許文献１５】Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．等，  Ｔｏｘｉｃｏｎ，  ２８，  ３５９−３６９  （１９９０）
【非特許文献１６】Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３８，  １１７９６−１１８０３  （１９９０）
【非特許文献１７】Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ  ｄｅ  Ａｚｅｖｅｄｏ，  Ｉ．  Ｌ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ３９８３６−３９８４２  （２００１）
【非特許文献１８】Ｇａｓｍｉ，  Ａ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２６８，  ６９−７２  （２０００）
【非特許文献１９】Ｇａｓｍｉ，  Ａ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ２９９９２−２９９９８  （２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述するように、ＫＤＲを介した血圧降下作用を誘起する、ＶＥＧＦ様タンパク質は、虚血性疾患に関連する血圧上昇の治療に適用する際、Ｆｌｔ−１に対する結合能を有すると、肝細胞の増殖を刺激するため、肝臓肥大などの副作用が引き起こすことが懸念されている。そのため、Ｆｌｔ−１に対する結合能は示さず、ＫＤＲに対して特異的な結合性を有し、かかるＫＤＲとの結合を介して、ＮＯ合成酵素の活性化機序に拠る、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性を示す、新規なＶＥＧＦ様タンパク質の更なる探索が、当該分野における課題となっている。
【０００５】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する特異的結合性を有し、一方、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）に対する結合性は示さない、血圧降下活性に優れた、新規に単離された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質を提供すること、ならびに、その医薬用途を提供することにある。加えて、本発明の目的には、これら新規に単離された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質について、そのアミノ酸配列を解明し、ＫＤＲに対する強固な結合性を維持しつつ、一方、Ｆｌｔ−１に対する結合を有効に抑制する上で主要な寄与を有する部分アミノ酸配列（部位）の特定を図り、該天然のＶＥＧＦ様タンパク質のアミノ酸配列に改変を加えて、天然のＶＥＧＦ様タンパク質と遜色のないＫＤＲに対する特異的で、強固な結合性と、強力な血圧降下活性とを保持するＶＥＧＦ様タンパク質変異体の提供も含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、新規な血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）様タンパク質として、多段階のクロマトグラフィー法を利用して、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ならびに、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から単離されたＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１を新たに単離し、その全一次構造（アミノ酸配列）を解明した。加えて、これら新規なヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１について、更にその立体構造を研究した結果、ｖａｍｍｉｎは、１１０アミノ酸長のペプチド鎖が鎖間のジスルフィド結合により二量体化したホモ２量体として、また、ＶＲ−１も、１０９アミノ酸長のペプチド鎖が鎖間のジスルフィド結合により二量体化したホモ２量体として存在することが判明した。このホモ２量体型のＶＥＧＦ様タンパク質、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、ともに、高い親和性でＫＤＲ（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に結合するが、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）には全く結合しないこと、また、ＫＤＲとの結合を介して、ＮＯ合成酵素の活性化機序に拠る、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性を示すことも確認した。本発明者らは、以上の一連の知見に基づき、更なるなる検討をも加えて、本発明を完成するに到った。
【０００７】
すなわち、本発明にかかる新規なＶＥＧＦ様タンパク質の第一の形態は、
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎであり、
該ｖａｍｍｉｎタンパク質は、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さず、
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体である
ことを特徴とするｖａｍｍｉｎタンパク質である。
【０００８】
加えて、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質変異体の一つは、
ｖａｍｍｉｎタンパク質の変異体タンパク質であって、
該変異体タンパク質は、
配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸への置換により変異されている、ペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体であり、
前記変異アミノ酸配列は、配列番号１に対して、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、Ａｒｇである変異を有し、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質変異体である。
【０００９】
本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質変異体の他の一つは、
ｖａｍｍｉｎタンパク質の変異体タンパク質であって、
該変異体タンパク質は、
配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸への置換により変異されている、ペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体であり、
前記変異アミノ酸配列は、配列番号１に対して、Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基は、Ｓｅｒであり、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、Ａｒｇであり、７４番目、７７番目、７９番目のアミノ酸残基は、それぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓのいずれかである変異を有し（但し、配列番号３のアミノ酸配列と一致する選択を除く）、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質変異体である。
【００１０】
また、本発明にかかる新規なＶＥＧＦ様タンパク質の第二の形態は、
Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ由来の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１であり、
該ＶＲ−１タンパク質は、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さず、
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体である
ことを特徴とするＶＲ−１タンパク質である。
【００１１】
また、本発明にかかるＶＲ−１タンパク質変異体の一つは、
ＶＲ−１タンパク質の変異体タンパク質であって、
該変異体タンパク質は、
配列番号２のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸への置換により変異されている、ペプチド鎖ユニット二本が鎖間ジスルフィド結合で連結されたホモ二量体であり、
前記変異アミノ酸配列は、配列番号２に対して、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、Ａｒｇであり、７４番目、７７番目、７９番目のアミノ酸残基は、それぞれ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓのいずれかである変異を有し、
血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する結合性を有し、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、血管内皮増殖因子受容体３型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３；Ｆｌｔ−４）、およびニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）に対する結合性は示さない
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質変異体である。
【００１２】
さらには、本発明は、前記ｖａｍｍｉｎタンパク質ならびにＶＲ−１タンパク質を調製する方法の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質の調製方法は、
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から、ｖａｍｍｉｎタンパク質を精製、単離する方法であって、
前記ヘビから採取されるヘビ毒中に含まれるｖａｍｍｉｎタンパク質を、多段のクロマトグラフィーを用いて、精製する工程を有し、
単離される該ｖａｍｍｉｎタンパク質は、非還元下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、２５．８ｋＤａのバンドを示す
ことを特徴とするｖａｍｍｉｎタンパク質の精製、単離方法である。
【００１３】
また、本発明にかかるＶＲ−１タンパク質の調製方法は、
Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から、ＶＲ−１タンパク質を精製、単離する方法であって、
前記ヘビから採取されるヘビ毒中に含まれるＶＲ−１タンパク質を、多段のクロマトグラフィーを用いて、精製する工程を有し、
単離される該ＶＲ−１タンパク質は、非還元下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析において、２５．２ｋＤａのバンドを示す
ことを特徴とするＶＲ−１タンパク質の精製、単離方法である。
【００１４】
加えて、本発明は、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の医薬分野における用途の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の用途発明の一つは、
血圧降下剤を含んでなる医薬組成物の調製における、該医薬組成物中の血圧降下活性を有する活性成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、血圧降下活性を有する活性成分として、前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用である。
【００１５】
また、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の用途発明の一つは、
肝炎症の治療用途に使用可能な、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、細胞増殖作用を利用して、ＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を惹起する作用を示す活性成分を含んでなる医薬組成物の調製における、該ＶＥＧＦ様タンパク質成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、ＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を惹起する作用を示す活性成分として、前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用である。
【００１６】
また、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の用途発明の一つは、
動脈硬化に対する外科的治療の経皮的環動脈介入術（ＰＣＩ）に付随する血管内皮損傷の治療ないしは、虚血性疾患に対する治療用途の、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、ＫＤＲを介したＮＯ合成酵素の活性化が誘起する血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用を利用している、医薬組成物の調製における、該ＶＥＧＦ様タンパク質成分としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質成分として、前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を、そのキャリアとともに含んでなる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用である。
【００１７】
あるいは、本発明は、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の医薬分野における用途の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の用途発明の一つは、
ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子より、宿主細胞中において、該ＶＥＧＦ様タンパク質を組換え発現するため、組換え導入可能なベクター中に挿入されてなる遺伝子組換え用ベクターの形態で含まれてなる、該ＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の使用であって、
前記医薬組成物は、ＶＥＧＦ様タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子として、
前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子を、宿主細胞中において、該ＶＥＧＦ様タンパク質を組換え発現するため、組換え導入可能なベクター中に挿入されてなる遺伝子組換え用ベクターの形態で含む
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子核酸分子の使用である。
【００１８】
一方、本発明は、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の生化学分野における用途の発明をも提供しており、
すなわち、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質の用途発明の他の一つは、
ＫＤＲに対して結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質に関して、該ＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合の阻害活性を有する化合物をスクリーニングする、イン  ビトロのＫＤＲに対する結合の阻害活性アッセイ系の構成における、該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬としての、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
該イン  ビトロのＫＤＲに対する結合の阻害活性アッセイ系は、系内に存在させる被験化合物の結合阻害活性を、該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬のＫＤＲに対する結合量の変化によって評価するアッセイ系であり、
該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬として、前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を用いる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用である。
【００１９】
さらに、本発明は、前記の結合阻害活性アッセイ系の構成における、上記ＨＦタンパク質、あるいは、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用に加えて、かかる結合阻害活性アッセイ系を利用して選択される、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合性に対する、阻害活性を有する化合物を用いた医薬組成物を調製するため、上記ＨＦタンパク質、あるいは、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質を使用する発明をも提供し、
すなわち、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質を使用する方法の一つは、
血管新生病に対する治療用途の、ＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合性に対する、阻害活性を有する化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物の調製における、ＫＤＲに特異的な結合性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド鎖二本からなるホモ二量体であるＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用であって、
前記医薬組成物は、上記の本発明にかかる結合阻害活性アッセイ系を利用して選択される、前記ＫＤＲに対する結合性に対する阻害機構として、ＫＤＲ中のリガンドとの結合部位に結合して、リガンドとの結合阻害するもの、あるいは、ＫＤＲ中の結合部位以外の部位に結合して、結合部位のコンフォメーションを変化させて、リガンドとの結合を阻害するものを含む、ＫＤＲに対する結合性に対する阻害活性を有する化合物を有効成分として含み、
該結合阻害活性アッセイ系を利用する選択において、
該ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質試薬として、前記ＨＦタンパク質、上記のｖａｍｍｉｎタンパク質、ｖａｍｍｉｎタンパク質変異体、ＶＲ−１タンパク質、ＶＲ−１タンパク質変異体からなる群より選択される、ＶＥＧＦ様タンパク質の少なくも一種を用いる
ことを特徴とするＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用である。
【００２０】
なお、この血管新生病に対する治療用途の、ＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合性に対する、阻害活性を有する化合物を有効成分として含んでなる医薬組成物の調製における、前記ＨＦタンパク質、あるいは、上述する本発明にかかるヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質またはその変異体タンパク質の使用に付随して、調製される医薬組成物は、例えば、固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬など、種々の病状の血管新生病に対する薬物治療の用途に適用できるものとなる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明にかかる新規なＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）には全く結合せず、一方、高い親和性でＫＤＲ（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）に結合するので、天然のＶＥＧＦ−Ａタンパク質に代えて、該ＶＥＧＦ様タンパク質とＫＤＲとの結合により誘起される、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性や血管新生促進作用を利用して、血圧降下剤、血小板凝集阻害、抗血栓作用を利用した虚血性疾患の治療薬、動脈硬化の外科的治療法である経皮的冠動脈介入術（ＰＣＩ）によって傷ついた血管内壁の治療等に利用可能な、血管内皮細胞損傷の治療薬、あるいは、抗炎症作用を利用した、肝細胞の保護を図る肝炎の治療薬に利用でき、これらの適用において、長期投与する際に懸念される、Ｆｌｔ−１との結合に起因する肝細胞の過度な増殖、肝臓肥大という副作用は大幅に少なくできる可能性がある。同じく、Ｆｌｔ−１との結合性は無く、ＫＤＲと特異的に結合するＶＥＧＦ−ＥとＶＥＧＦ―Ａに変異を与えたタンパク質と比較した際、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、血圧降下能がより優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明をより詳細に説明する。
【００２３】
本発明が提供する、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎおよびＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ＶＲ−１は、それぞれ、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体、ならびに、１０９アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体であることは、下記の実施例に記載する解析結果より検証されている。具体的には、ｖａｍｍｉｎを構成する、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造（アミノ酸配列）は、下記の配列１：
配列1：ｖａｍｍｉｎの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＥＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶＰＩＬＱＥＹＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＶＤＬＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ
また、ＶＲ−１を構成する、１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造（アミノ酸配列）は、下記の配列２：
配列２：ＶＲ−１の１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＤＶＹＱ  ＲＳＡＣＱＴＲＥＴＬ  ＶＳＩＬＱＥＨＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＭＫＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＡＤＩＱＩＭＲ  ＭＮＰＲＴＨＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＭＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＷＫＱＧ  ＥＰＥＧＰＫＥＰＲ
である。
【００２４】
なお、前記Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から精製・単離されたＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎ１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造は、同様に、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体である、Ｖｅｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素から単離されているＨＦの一次構造、下記配列３：
配列３：HFの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＥＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶSＩＬＱＥＹＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＶＤＬＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ
あるいは、Ｖｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎａのヘビ毒から単離されているＩＣＰＰの一次構造、下記配列４：
配列４：ＩＣＰＰの１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＰＤＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶSＩＬＱＥＹＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＫＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＶＤＭＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ
と対比すると、極めて高い相同性を示すことを、下記実施例に記載するように、本発明者らのアミノ酸配列の解析によって、解明された。
【００２５】
加えて、これら一連のヘビ毒由来ＶＥＧＦ様タンパク質の生理活性と、そのアミノ酸配列との相関を十分に検討した結果、アミノ酸配列の一致部分のなかでも、ＫＤＲとの高い親和性を維持しつつ、Ｆｌｔ−１との結合性を持たないという特性に、顕著に貢献するアミノ酸配列上の特徴の一つは、配列１中のＡｌａ１３、Ｌｙｓ５５、Ａｒｇ７４、Ｓｅｒ７７、Ｌｙｓ７９の５つのアミノ酸を有していることであることが判明した。
【００２６】
さらには、天然のｖａｍｍｉｎと実質的に等価な生理活性を保持する、ｖａｍｍｉｎタンパク質の人為的な変異体として、ペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体を構成するペプチド鎖の一次構造が、下記する配列５：
配列５：Ｌｙｓ５５→Ａｒｇの変異を有するｖａｍｍｉｎ変異体の１１０アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＥＶＨＥ  ＲＳＡＣＱＡＲＥＴＬ  ＶＰＩＬＱＥＹＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＬＲＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＶＤＬＱＩＭＲ  ＶＮＰＲＴＱＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＴＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＲＫＱＧ  ＥＰＤＧＰＫＥＫＰＲ
など、
また、天然のＶＲ−１と実質的に等価な生理活性を保持する、ＶＲ−１タンパク質の人為的な変異体として、ペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体を構成するペプチド鎖の一次構造が、下記する配列６：
配列６：Ｌｙｓ５５→Ａｒｇの変異を有するＶＲ−１変異体の１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＤＶＹＱ  ＲＳＡＣＱＴＲＥＴＬ  ＶＳＩＬＱＥＨＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＭＲＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＡＤＩＱＩＭＲ  ＭＮＰＲＴＨＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＭＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＷＫＱＧ  ＥＰＥＧＰＫＥＰＲ
下記する配列７：
配列７：Ｓｅｒ２２→Ｐｒｏの変異を有するＶＲ−１変異体の１０９アミノ酸からなるペプチド鎖の一次構造
ＥＶＲＰＦＬＤＶＹＱ  ＲＳＡＣＱＴＲＥＴＬ  ＶＰＩＬＱＥＨＰＤＥ
ＩＳＤＩＦＲＰＳＣＶ  ＡＶＬＲＣＳＧＣＣＴ  ＤＥＳＭＫＣＴＰＶＧ
ＫＨＴＡＤＩＱＩＭＲ  ＭＮＰＲＴＨＳＳＫＭ  ＥＶＭＫＦＭＥＨＴＡ
ＣＥＣＲＰＲＷＫＱＧ  ＥＰＥＧＰＫＥＰＲ
など、ならびに、これらの一アミノ酸置換を組み合わせたものとすると、好ましいと判断される。
【００２７】
本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質は、天然の起源であるヘビ毒から、そのペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体を保持する形態で精製、単離する手段としては、還元剤が存在しない状況下で、多段のカラム・クロマトグラフィーを用いて、精製する工程を利用することが好ましい。例えば、この多段のカラム・クロマトグラフィー精製工程は、下記実施例１に記載する、
（工程１）  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ゲル濾過クロマトグラフィー
（工程２）  ＨｉＴｒａｐ  ｈｅｐａｒｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
（工程３）  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
（工程４）  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
（工程５）  Ｍｏｎｏ  Ｓ  カラム・クロマトグラフィー
の形態とすると、効率的で、高い精製純度が容易に達成でき、好ましいものである。なお、各段における、夾雑物の除去・分離の原理が、実質的に同じとなるように、具体的な工程順序、利用されるカラムの種類、各カラム精製における緩衝液、溶出条件などは、適宜変更することが可能である。
【００２８】
一方、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質は、遺伝子組換え生産する。具体的には、下記実施例において、利用されている組換え型ヒトＶＥＧＦ１６５などの遺伝子組換え生産に利用される発現系を利用し、かかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質のペプチド鎖をコードする核酸分子を該発現系に組換えすることで、天然のＶＥＧＦタンパク質と同様に、ペプチド鎖の鎖内に、保存されるシステインナット・モチーフによるループ構造を形成し、ペプチド鎖二本が、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体の構造を完成した組換え型タンパク質が得られる。なお、その精製・単離は、利用される発現系、宿主に応じて、適宜選択される。また、組換え生産において、これらのＶＥＧＦ様タンパク質においては、例えば、対応するペプチド鎖に翻訳後、適正な鎖内、鎖間のジスルフィド結合で連結されたホモ２量体へとフォールディング過程等の観点から、発現系に利用する宿主としては、複数のペプチド・ユニットからなる成熟タンパク質のフォールディング・アセンプリー機構、あるいは、分泌機構中に、前記する対応するペプチド鎖に翻訳後、適正な鎖内、ならびに鎖間のジスルフィド結合による連結等の機構を具える、酵母、真菌、植物細胞、植物、動物細胞、昆虫細胞などの真核生物を用いること望ましい。
【００２９】
また、遺伝子組換え生産された、ｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質に関して、そのアミノ酸配列が所望のものであることを検証するためには、下記する実施例に記載するアミノ酸配列の解析手順が利用可能である。その際、例えば、ホモ２量体を解離して、各ペプチド鎖を分離し、含有されるシステインの−ＳＨのアルキル化、断片化等の手順は、下記の実施例の手法を利用した後、各断片のアミノ酸配列の解析手段は、他の手法を利用するなどの、変更を加えることもできる。
【００３０】
一方、上記の組換え生産に利用される、ＨＦタンパク質、ならびに、ｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質のペプチド鎖をコードする核酸分子は、目的とするアミノ酸配列に従い、また、組み換え発現を行う宿主におけるコドン利用等をも考慮して、全塩基配列を化学合成することで作製することができる。また、その起源であるヘビから、採取されるｍＲＮＡからｃＤＮＡとして、採取することもでき、あるいは、ゲノム遺伝子中から、対応するプローブ、ＰＣＲプライマーを利用して、目的とするＤＮＡを採取することも可能である。なお、その起源であるヘビから採取される、コードする核酸分子は、そのコドン利用は、組み換え発現を行う宿主におけるコドン利用と相違することもあるが、その場合、常法に従って、コドンの適正化、置換を行うことが望ましい。一方、人為的変異体タンパク質のペプチド鎖をコードする核酸分子は、部位特異的変異導入を行うことで、適宜作製することができる。
【００３１】
また、ＨＦタンパク質、ならびに、ｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質のペプチド鎖をコードする核酸分子は、ヒトの体内に導入して、これらＶＥＧＦ様タンパク質をヒト細胞に分泌生産させる、所謂、遺伝子治療の用途にも利用可能である。その際、ヒト細胞中に遺伝子導入し、分泌生産を行わせるために利用される遺伝子組換えベクターとしては、種々な遺伝子治療の用途に開発されているベクター系を用いる方法が可能である。例えば、種々な遺伝子欠陥の由来する疾患の遺伝子治療の用途に開発されている、レトロ・ウイルス型のベクター系の利用も可能である。
【００３２】
一方、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質は、その優れた血圧降下作用を利用して、これらＶＥＧＦ様タンパク質を含む液を直接、静脈内注射など体内に導入することにより、血圧降下剤としての応用が考えられる。また、ＫＤＲに特異的なヒトＶＥＧＦ変異体は、ＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を惹起する（ＬｅＣｏｕｔｅｒ，  Ｊ．等，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９９，  ８９０−８９３  （２００３）を参照）ことが報告されており、ｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質に関しても、同様のＫＤＲを介した肝細胞の保護作用を利用して、肝炎の治療への適用が考えられる。
【００３３】
加えて、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質は、血管内皮細胞の増殖因子としての機能を利用することで、静脈内注射など体内に導入することにより、動脈硬化の治療法である経皮的冠動脈介入術（ＰＣＩ）によって傷ついた血管の治療への適用が考えられる。また、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、ＫＤＲを介したＮＯ合成酵素の活性化が誘起する血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用を利用して、虚血性疾患の治療への適用が考えられる。
【００３４】
これらの用途では、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質は、血流中に直接投与し、作用部位へ供給する形態での投与が適しており、通常、静脈内投与に適する剤形の医薬組成物に調製することが好ましい。具体的には、種々の生理活性を有するタンパク質の静脈内投与に利用されている剤形、例えば、静脈注射剤、点滴剤などの剤形とされ、各単位投与用量は、その治療用途に応じて、適宜決定される。また、投与対象（患者）の状況、症状の重篤さ、性別、年齢、体重、その他の健康状態などを考慮して、その推定される総血液量において、所望の生理活性が発揮される血中濃度となるように、投与用量を設定することが好ましい。なお、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質を静脈注射剤の剤形で利用する際には、通常、用量は、０・０３〜０．３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは、０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲に設定することが望ましい。
【００３５】
また、ＨＦタンパク質、ならびに、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質について、組換え生産した際、その生理活性の定量的な評価が必要となるが、その評価は、下記実施例に記載される評価手法、血圧降下能の測定方法、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１への結合特性の分析方法、ＮＯ合成酵素の活性化に関するイムノ・アッセイ分析方法を利用することができる。なお、具体的な評価手順、条件などは、同様の定量的な評価が可能な範囲で、適宜変更することもできる。また、これらの評価法と等価な生理活性の定量的な評価が可能な、別のアッセイ系、評価手法を利用しても構わない。
【００３６】
本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質、あるいは、ＨＦタンパク質を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合に起因する、ＫＤＲを介したＮＯ合成酵素の活性化が誘起する血管弛緩作用、血小板凝集阻害、抗血栓作用、抗炎症作用を利用して、虚血性疾患の治療へ適用する際には、継続的な投与が必要となる症例も想定でき、その際には、これらＶＥＧＦ様タンパク質をコードする遺伝子を人工的に合成し、治療対象（患者）の体内細胞内にこの遺伝子をベクターなどで導入し、該細胞によって、体内生産を行わせる遺伝子治療の形態によっても、虚血性疾患の治療に応用できる。
【００３７】
その他、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質、あるいは、ＨＦタンパク質は、特異的なＫＤＲ、Ｆｌｔ−１への結合特性を有するので、下記する実施例１に記載する、表面プラズモン共鳴によるレセプター結合性評価方法、システムにおいて、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１への結合特性の分析を行う際、標準試薬として利用できる。逆には、かかる表面プラズモン共鳴によるレセプター結合性評価方法、システムを利用して、ＨＦタンパク質、あるいは、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質のＫＤＲに対する結合を阻害する作用を示す、結合阻害剤をスクリーニングすることも可能である。特に、かかる結合阻害剤の阻害機構に関しても、例えば、予め判明している、本発明にかかるｖａｍｍｉｎタンパク質、ＶＲ−１タンパク質ならびにそれらの人為的変異体タンパク質、ならびにＨＦタンパク質の結合特性パラメータを利用して、解析を行うことにより、これらＶＥＧＦ様タンパク質に作用して、その結合特性に影響を及ぼすものか、あるいは、ＫＤＲに作用することで、これらＶＥＧＦ様タンパク質に対する結合に影響を及ぼすものであるかなど、その検討も可能である。さらには、スクリーニングされた結合阻害剤の阻害特性パラメータを、種々の条件で測定された結果に基づき、算定することも可能である。
【００３８】
加えて、ＨＦタンパク質、あるいは、本発明にかかるＶＥＧＦ様タンパク質のＫＤＲに対する結合を阻害する作用を示す、結合阻害剤は、同じ阻害機構に基づき、内因性のＶＥＧＦタンパク質、例えば、ヒトＶＥＧＦのＫＤＲに対する結合をも阻害する作用を有することを確認した上で、例えば、ヒト体内における、内因性ＶＥＧＦのＫＤＲへの結合に起因する、血管新生病（固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬など）の治療に適用可能な、血管新生阻害剤として利用可能である。例えば、この種の血管新生阻害剤は、前記のスクリーニング手法を適用して、公知の化合物ライブラリーより、ランダム・スクリーニングによって、所望の阻害能の有無を確認する実験を繰り返すことにより、探索することもできる。なお、スクリーニングの対象とされる、化合物ライブラリーは、合成化合物、天然物化合物でもよく、低分子化合物、高分子化合物でもよい。上記結合阻害剤における阻害機構としては、ＫＤＲ中のリガンドとの結合部位に結合して、リガンドとの結合阻害するもの、あるいは、結合部位以外の部位に結合して、結合部位のコンフォメーションを変化させ、リガンドとの結合を阻害するものなどが考えられ、いずれの阻害機構に因るものも利用可能である。
【００３９】
探索された血管新生阻害剤は、治療対象（患者）に投与した際、不要な副作用を引き起こさないことを検証した上で、対象の血管新生病（固形腫瘍の増殖、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬など）の部位、症状に応じて、適宜選択される投与経路、投与形態で利用することが好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。
【００４１】
下記する実施例では、
各ヘビ毒からＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１を精製・単離する手順、
該ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、ペプチド鎖二本がジスルフィド結合したホモ２量体であることの確認、そのペプチド鎖のアミノ酸配列の決定、
ＶＥＧＦ受容体との結合特性とその結合特性に関与するアミノ酸配列上の特徴、
ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦの血圧降下能と、その作用機序の解明、
の各項目に関して、より具体的に説明を行う。
【００４２】
１．  抗ＨＦ抗体の作製方法
下記する、各ヘビ毒からＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１を、それぞれ精製、単離する工程では、精製の段階における精製純度の評価手段である、これらヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質のＥＬＩＳＡ法分析、ウエスタン・ブロット分析には、交差反応性を有する、抗ＨＦ抗体を利用している。
【００４３】
この抗ＨＦ抗体は、Ｖｅｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素から単離されているＨＦを免疫注射したウサギから調製した。まず、オスのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｒａｂｂｉｔに、完全アジュバントと精製したＨＦ  １８０  μｇを免疫注射した。１４日間隔で、２回の追加免疫後、全血を採取した。遠心分離により、血清を分離後、ＥＬＩＳＡで、含有される抗ＨＦＩｇＧ抗体の抗体価を測定した。最終的に、１万倍希釈で、抗原ＨＦに反応する抗血清を得た。
２．  各ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質の精製方法
各ヘビ毒中に含まれる、ＶＥＧＦ様タンパク質の精製は、クロマトグラフィー装置：ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍと、評価装置：ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを使用して、４℃で行った。各クロマトグラフィー・カラムの溶出画分に含まれる、蛋白質濃度の測定は、２８０  ｎｍの吸光度測定によって行った。
【００４４】
Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から、ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎの精製は、以下の５段階のクロマトグラフィー工程によって実施した。
【００４５】
先ず、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓの粗ヘビ毒２００  ｍｇを、２  ｍＬの５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０中に溶解した。
【００４６】
（工程１）  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ゲル濾過クロマトグラフィー
予め、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０  緩衝液で平衡した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ゲル濾過クロマトグラフィー・カラム（２．６  ｃｍφ×６０  ｃｍ  Ｌ）に、流速：２  ｍＬ／ｍｉｎで、前記粗ヘビ毒溶液をアプライした。各溶出画分に含まれる、ｖａｍｍｉｎの検出、濃度測定は、抗ＨＦ抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ法によって行った。ｖａｍｍｉｎを含む画分をプールし、次段の精製に用いた。
【００４７】
（工程２）  ＨｉＴｒａｐ  ｈｅｐａｒｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡した、ＨｉＴｒａｐ  ｈｅｐａｒｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムに、プールした前段のｖａｍｍｉｎ画分をアプライした。該カラムからの溶出は、流速：１  ｍＬ／ｍｉｎで、２０カラム容量を、０．６  Ｍ  ＮａＣｌまでの線形勾配の条件で行った。同じく、各溶出画分をＥＬＩＳＡ法で分析した結果、ｖａｍｍｉｎは、０．３  Ｍ  ＮａＣｌ付近に溶出されていた。プールされた、ｖａｍｍｉｎを含む画分は、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０に透析して、脱塩を行った。この透析処理液を、次段の精製に用いた。
【００４８】
（工程３）  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
前段の透析処理液を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ（１．６  ｃｍφ×１０  ｃｍ  Ｌ）にアプライした。ＥＬＩＳＡ法で分析した結果、ｖａｍｍｉｎは、素通り分画に含まれていた。プールされた、素通り分画は、２０  ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．０に透析した。透析により、緩衝液を交換した、ｖａｍｍｉｎを含む透析処理液を、次段の精製に用いた。
【００４９】
（工程４）  ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
前記ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ緩衝液で平衡した、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ（１．６  ｃｍφ×１１  ｃｍ  Ｌ）に、前段のｖａｍｍｉｎを含む透析処理液をアプライした。該カラムからの溶出は、流速：１  ｍＬ／ｍｉｎで、４カラム容量を、０．３  Ｍ  ＮａＣｌまでの線形勾配の条件で行った。
【００５０】
同じく、各溶出画分をＥＬＩＳＡ法で分析した結果、ｖａｍｍｉｎは、０．１  Ｍ  ＮａＣｌ付近に溶出されていた。ｖａｍｍｉｎを含む画分を、プールした。
【００５１】
（工程５）  Ｍｏｎｏ  Ｓ  カラム・クロマトグラフィー
最後に、前段のｖａｍｍｉｎを含む画分に、Ｍｏｎｏ  Ｓ  ｃｏｌｕｍｎ精製を施し、精製評品とした。
【００５２】
粗ヘビ毒２００  ｍｇから、精製済みｖａｍｍｉｎタンパク質１．３  ｍｇを得ることができた。
【００５３】
また、Ｄａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒から、ＶＥＧＦ様タンパク質；ＶＲ−１の精製も、上述するｖａｍｍｉｎの精製工程と、同じ手順、同様の条件で行い、粗ヘビ毒１９００  ｍｇから、精製済みＶＲ−１タンパク質８．２  ｍｇを得ることができた。
【００５４】
なお、精製評品タンパク質溶液を用いて、アミノ酸分析と、ならびにｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を行い、タンパク質濃度を測定した。
【００５５】
図１（Ａ）に、上記ｖａｍｍｉｎの精製工程中、工程５のＭｏｎｏ  Ｓ  カラム・クロマトグラフィーにおける、ｖａｍｍｉｎを含む溶出画分（図中、棒線で示す画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ｖａｍｍｉｎは、還元剤を添加した還元条件下（Ｒ）では、１４．６−ｋＤａに、非還元条件下（ＮＲ）では、２５．８−ｋＤａにバンドを示し、ペプチド鎖二本がジスルフィド結合した２量体であると考えられた。図１（Ｂ）に、ＶＲ−１の精製工程中、工程４のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィーにおける、ＶＲ−１を含む溶出画分（図中、棒線で示す画分）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＶＲ−１は、還元条件下（Ｒ）では、１４．７−ｋＤａに、非還元条件下（ＮＲ）では、２５．２−ｋＤａにバンドを示し、同じく、ペプチド鎖二本がジスルフィド結合した２量体であると考えられた。
【００５６】
還元した後、Ｓ−ピリジルエチル化したｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、いずれも、逆相ＨＰＬＣにおいて、一本のピークで溶出されたことから、これらのタンパク質は、ペプチド鎖二本が鎖間のジスルフィド結合したホモ２量体タンパク質であると結論した。
３．  アミノ酸配列分析
常法に従い、ＶＲ−１とｖａｍｍｉｎ、それぞれ５  ｎｍｏｌを、還元アルキル化した（Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｙ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４１，  １１３３１−１１３３７  （２００２）参照）。凍結乾燥した該ホモ２量体タンパク質を構成する、Ｓ−アルキル化ペプチド鎖を、エンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｒｇ−Ｃで、２４時間３７℃で消化し、断片化した。前記エンドプロテアーゼ酵素消化で得られる、各ペプチド断片を、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７３Ａ，  ４７７，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＰＰＳＱ−２１Ａ）によって分析した。Ｎ末端のピロリドン環の開環は、メタノール・塩酸で行った（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｉ．等，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４８，  ５４６−５５６  （１９７２）参照）。また、別途、凍結乾燥したＳ−アルキル化ペプチド鎖（２５０  ｐｍｏｌ）を、４０℃で２時間、３Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨで処理し、そのＮ末アミノ酸配列を、プロテインシークエンサーで分析した。これらエンドプロテアーゼ酵素消化で得られる、各ペプチド断片のアミノ酸配列、Ｎ末アミノ酸配列に基づき、各ホモ２量体タンパク質を構成するペプチド鎖の全アミノ酸配列を決定した。
【００５７】
決定されたｖａｍｍｉｎのペプチド鎖の全アミノ酸配列を、配列番号１に、ＶＲ−１のペプチド鎖の全アミノ酸配列を配列番号２に示す。ｖａｍｍｉｎは、１１０アミノ酸からなるペプチド鎖二本で構成されるホモ２量体タンパク質であり、ＶＲ−１は、１０９アミノ酸からなるペプチド鎖二本で構成されるホモ２量体タンパク質である。図２に、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１を構成するペプチド鎖の一次構造とは、既に報告されている、ＶＥＧＦファミリーのメンバー（ヒトＶＥＧＦ  １６５、ＨＦ、ＩＣＰＰ）のホモ２量体タンパク質を構成するペプチド鎖の一次構造の対比結果を示す。ホモ２量体タンパク質を構成するペプチド鎖の一次構造において、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、既知のＶＥＧＦファミリーのメンバーと相同性を示し、これらＶＥＧＦファミリータンパク質の特性である、システインナット・モチーフが完全に保存されていた。ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、ヒトＶＥＧＦ１６５との相同性は、それぞれ４７．６％と４８．１％であり、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質（ＨＦ、ＩＣＰＰ）に対しては、さらに高い相同性を示した。
【００５８】
ヒトＶＥＧＦ  １６５のＮ結合型糖鎖の結合部位（Ａｓｎ７５）は、他のヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質（ＨＦ、ＩＣＰＰ）と同じように、ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１でも、他のアミノ酸残基（Ｔｈｒ）に置換されている（図２）。全てのアミノ酸残基は、ペプチドシークエンスによって同定できたことから、糖鎖結合やリン酸化のようなアミノ酸残基の修飾は受けていないと結論した。
【００５９】
変異体解析と結晶構造解析によって、ヒトＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ受容体に対する結合に重要な残基が見出されている（Ｋｅｙｔ，  Ｂ．  Ａ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１，  ５６３８−５６４６  （１９９６）；  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｙ．  Ａ．等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７１９２−７１９７（１９９７）；  Ｗｉｅｓｍａｎｎ，  Ｃ．等，  Ｃｅｌｌ，  ９１，  ６９５−７０４  （１９９７）；  Ｆｕｈ，  Ｇ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３，  １１１９７−１１２０４  （１９９８）；  Ｌｉ，  Ｂ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ２９８２３−２９８２８  （２０００）；  Ｐａｎ，  Ｂ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１６，  ７６９−７８７  （２００２）を参照）。ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１でも、このヒトＶＥＧＦ１６５中において、ＫＧＲ受容体結合のための重要な残基（●印で示す）のほとんどは、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１でも高く保存されていたが、Ｆｌｔ−１結合のために重要な残基（□印で示す）のいくつかのは、他のアミノ酸残基に変化していた（図２）。まず、ヒトＶＥＧＦ１６５のＴｙｒ２５（ｖａｍｍｉｎの１３番目のアミノ酸残基が相当）は、Ａｌａに置換されていた。ヒトＶＥＧＦの、この位置のアラニン変異体（ヒトＶＥＧＦ  Ｔｙｒ２５→Ａｌａ）は、ＫＤＲへの結合に影響することなく、Ｆｌｔ−１への結合が約１００倍減少することが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｙ．  Ａ．等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７１９２−７１９７（１９９７）；  Ｐａｎ，  Ｂ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１６，  ７６９−７８７  （２００２）を参照）。次に、立体構造解析の結果から、Ｆｌｔ−１と相互作用することが示唆されている、ヒトＶＥＧＦ１６５の第三ループの３つのアミノ酸（Ｈｉｓ８６，  Ｇｌｎ８９，  Ｉｌｅ９１）は、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１ででは、Ａｒｇ７４，  Ｓｅｒ７７，  Ｌｙｓ７９に置換されている（Ｗｉｅｓｍａｎｎ，  Ｃ．等，  Ｃｅｌｌ，  ９１，  ６９５−７０４  （１９９７）を参照）。これら三箇所の残基のいずれか一つのアラニン変異は、Ｆｌｔ−１への結合に影響を与えないことが報告されている（Ｋｅｙｔ，  Ｂ．  Ａ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１，  ５６３８−５６４６  （１９９６）；  Ｌｉ，  Ｂ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ２９８２３−２９８２８  （２０００）；  Ｐａｎ，  Ｂ．等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３１６，  ７６９−７８７  （２００２）を参照）。第三に、Ｆｌｔ−１への結合のために重要であることが示唆されている、ＶＥＧＦ１６５の中における、２番目のループの３種の負電荷のアミノ酸残基（Ａｓｐ６３，  Ｇｌｕ６４，  Ｇｌｕ６７：図２中に下線を付す）のうちの一つ（Ｇｌｕ６７）は、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質では、正電荷の残基（Ｌｙｓ５５）に置き換わっている（Ｋｅｙｔ，  Ｂ．  Ａ．等，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１，  ５６３８−５６４６  （１９９６）を参照）。ＶＥＧＦ１６５中の、これら５残基（Ｔｙｒ２５；Ｇｌｕ６７；Ｈｉｓ８６，Ｇｌｎ８９，Ｉｌｅ９１）が、他のアミノ酸に置換する（図２中��▼印で示す）ことで、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質は、ＫＤＲ選択的なアゴニストになっていると考えた。
４．  ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦの血圧降下能の評価
ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質が示す血圧降下能の測定は、オスのＷｉｓｔａｒ  ｒａｔ（各群個体数  ｎ＝３または５，  １５０〜２２０  ｇ）を使用して行った。各個体について、カルバミン酸エチルエステル（１  ｇ／ｋｇ）の腹膜注射による麻酔後、２５％  ＭｇＳＯ4で満たしたポリエチレンチューブを頸動脈に挿入し、圧力トランスデューサー（モデルＰ１０ＥＺ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に接続して、動脈圧をモニターした。圧力トランスデューサーで測定される収縮期、拡張期、平均動脈圧は、アンプ（ｍｏｄｅｌ  ＡＰ−６２１日本光電）につながれたレコーダーで記録した。
【００６０】
各被験個体に対して、生理食塩水（６００  μＬ）注射により血圧が安定していることを確認後、ＶＥＧＦ様タンパク質（６００  μＬ）を左大腿静脈から投与した。ＶＥＧＦ様タンパク質静脈内投与後、収縮期、拡張期血圧に対する影響は、投与前の血圧を基準として、最大血圧降下時における降下率で算出した。ＶＥＧＦ様タンパク質誘導血圧降下における、ＮＯ合成酵素阻害剤Ｎω−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（Ｌ−ＮＮＡ）の効果を測定するため、ＶＥＧＦ様タンパク質の静注の前後に、用量２．５  μｇ／ｇのＬ−ＮＮＡ（６００  μＬ）を右大腿静脈から投与した。
【００６１】
各データは、各群の個体数ｎを、少なくとも３とする実験から得られる結果を、平均値±標準誤差で示した。有意性の評価はｔ検定で行い、Ｐ値が０．０５より小さい場合、有意差があると判断した。
【００６２】
図３のＡには、ｖａｍｍｉｎ（用量０．３  μｇ／ｇ）静脈内投与の前後における、動脈圧の変化を経時間的に観測した結果を示す。ｖａｍｍｉｎ静脈内投与の直後から、急速な血圧降下を示し、投与後３〜５分で、最大の降下効果に達した。図３のＢには、ｖａｍｍｉｎの静脈内投与により引き起こされる、収縮期、拡張期動脈圧の降下率に対する用量依存性を示す。用量３０  ｎｇ／ｇのｖａｍｍｉｎの静注によっても、有意な血圧降下が惹起されており、用量０．１  μｇ／ｇ以上では、飽和傾向が見られるが、用量依存的に効果が増し、用量０．３  μｇ／ｇの投与において、最大の血圧降下効果が観察された。なお、図３のＢに示す、用量応答曲線は、収縮期血圧より拡張期血圧に対して、強く血圧降下作用を示した。用量０．３  μｇ／ｇ投与時における血圧降下効果を１００％と仮定して、ｖａｍｍｉｎの静脈内投与における、拡張期血圧、収縮期血圧に対する血圧降下作用のＥＣ50値は、それぞれ２４  ｎｇ／ｇ、２９  ｎｇ／ｇと推定された。同様に、ＶＲ−１、ＨＦも、静脈内投与において、劇的な血圧降下を示した。用量応答曲線に基づき、静脈内投与における血圧降下作用に関して、ＶＲ−１、ＨＦのＥＣ50値を推定したところ、それぞれ、拡張期血圧に対して、１０  ｎｇ／ｇ、１５  ｎｇ／ｇであり、収縮期血圧に対して、１５  ｎｇ／ｇ、１８  ｎｇ／ｇであった。
【００６３】
血圧の最大降下は、ｖａｍｍｉｎ（ｎ＝３）では、拡張期血圧で５６．０±６．８％、収縮期血圧で２４．７±５．２％であり、ＶＲ−１（ｎ＝３）では、拡張期血圧で４８．４±１．７％、収縮期血圧で１６．７±１．１％であり、ＨＦ（ｎ＝３）では、拡張期血圧で５２．０±１．９％、収縮期血圧で２４±５．９％であった。このヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質三種の中では、ＶＲ−１は、他の二種のＶＥＧＦ様タンパク質よりやや弱い効果を持つが、これらヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質三種は、血圧降下作用に関して、本質的には等しい効果を有することを示している。報告値では、ヒトＶＥＧＦは、２０〜２５％程度の平均動脈圧降下作用を示すのに対し、平均動脈圧に対して、ｖａｍｍｉｎは、４１％、ＶＲ−１は、４０％の降下作用を示した。加えて、拡張期血圧に対する急速な降下作用を示すことから、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１ならびにＨＦは、末梢血管に影響を与えていると考えた。
【００６４】
次に、これらヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質で誘起される血圧降下の機序に関して、ＮＯの関与の有無を検証する目的で、ＮＯ合成酵素阻害剤  Ｎω−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（Ｌ−ＮＮＡ）を使用して、血圧降下作用抑制の有無を検討した。ヘビ毒由来ＶＥＧＦ様タンパク質の静注で血圧降下を誘導後、上述する用量のＬ−ＮＮＡの事後投与は、正常レベルまで血圧を回復した。さらに、上述する用量のＬ−ＮＮＡを事前に投与すると、ヘビ毒由来ＶＥＧＦ様タンパク質の静注による血圧降下の惹起を完全に抑制した。しかし、αアドレナリン受容体のアゴニストであるフェニレフリンの投与では、血圧降下を抑制する効果は観察されなかった。これらの結果は、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質によって惹起される血圧降下作用には、ＮＯが関与していること、また、その機序は、ＮＯ合成酵素の活性化を介していることを強く示している。
５．  ＮＯ合成酵素の活性化に関するイムノ・アッセイ分析
ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦは、ＫＤＲとの結合を介して、ＮＯ合成酵素の活性化を誘起することを、下記のイムノ・アッセイ法により検証した。
【００６５】
ウシ冠状動脈内皮細胞（ＣＡＥＣｓ）を、φ１０  ｃｍ培養用ディッシュで１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中で培養した。サブコンフルエントの状態（７０〜８０％）に達した培養細胞を、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で２度リンスし、血清無しＤＭＥＭで１５〜１８時間培養した。
【００６６】
血清無添加のＤＭＥＭ中で培養されているＣＡＥＣを、ヘビ毒由来ＶＥＧＦ様タンパク質（１  ｎＭ）を含む液で処理した後、細胞は氷冷したＰＢＳで２回素早く洗い、セル・スクレイパーを使用して、４００  μｌのＴｒｉｔｏｎ／ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．５％  ＮＰ−４０，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５，  ２．５  ｍＭ  ＫＣｌ，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３０  ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ５０  ｍＭ  ＮａＦ，  １  ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4，  ０．１％  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ））で回収した。
【００６７】
前記溶解バッファー中に回収した細胞を、ローテーターで４℃、１時間撹拌後、細胞破砕物を、４℃で１５分間、１５，０００×ｇで遠心分離し、沈澱物（不溶性画分）を取り除いた。回収された上清中のタンパク質濃度は、ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ，  ＰＯ，  ＵＳＡ）で決定した。同量の上清サンプルを用いて、含まれるタンパク質を６．５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。泳動分離された、総ｅＮＯＳ量、リン酸化ｅＮＯＳ（セリン１１７７）量は、それぞれ、抗ｅＮＯＳ抗体と抗リン酸化ｅＮＯＳ抗体を用いて、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で検出し、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ）  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で可視化した。
【００６８】
図４に、ｖａｍｍｉｎ（１  ｎＭ）処理後、ＣＡＥＣの細胞内における、総ｅＮＯＳタンパク質量（下図）とリン酸化ｅＮＯＳタンパク質量（上図）の経時的な変化を、イムノ・ブロット法により評価した結果を示す。Ｖａｍｍｉｎ（１  ｎＭ）処理は、経時的に、ｅＮＯＳタンパク質中のセリン１１７７のリン酸化を惹起し、５分間経過時に、最大の効果を示し、６０分間経過後、未刺激時と同レベルまで戻った。ＶＲ−１（１  ｎＭ）処理とＨＦ（１  ｎＭ）処理によっても、ｖａｍｍｉｎと同じレベルで、ｅＮＯＳタンパク質のリン酸化が誘起された。これらの結果は、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦは、セリン１１７７のリン酸化によるｅＮＯＳの活性化を通して、該活性化されたＮＯ合成酵素が産生するＮＯを介して、その血圧降下作用が発揮されていることを示唆している。
６．  表面プラズモン共鳴によるレセプター結合性解析
ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦのレセプター結合解析を、表面プラズモン共鳴法を利用して行った。
【００６９】
表面プラズモン共鳴法による測定装置：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００  （Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して、ＶＥＧＦレセプターに対するＶＥＧＦ様タンパク質の結合・解離特性を評価した。レセプター結合解析の実験は、ＨＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０）を使用して、２５℃で行った。Ｆｌｔ−１−ＩｇＧとＫＤＲ−ＩｇＧは、それぞれ、アミンカップリング・キット（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で、ＣＭ５センサー・チップ上に固定した。
【００７０】
ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦ、ならびに、組換え生産ヒトＶＥＧＦ１６５は、ＨＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、タンパク質濃度  ３，  １０，  ３０  ｎＭに調製し、２０  μＬ／ｍｉｎの流速でフロー・セルに注入した。ネガティブ・コントロールとして、ブランク・フローチャネルのシグナルを、バックグラウンド・シグナルとして、サンプル・フローチャネルのシグナルから差し引き、バックグラウンド補正を行った。結合過程では、前記タンパク質濃度の液をセンサー・チップ上に前記流速で流入させつつ、共鳴シグナルの上昇を測定し、解離過程では、前記緩衝液をセンサー・チップ上に前記流速で流入させつつ、共鳴シグナルの減少を測定する。
【００７１】
各ＶＥＧＦ様タンパク質のＶＥＧＦレセプター上への結合における、結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）、最大結合量（Ｒmax）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１カーブフィッティングソフトフェア（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して、算出した。みかけの解離定数（Ｋd）は、速度論定数の比（ｋdiss／ｋass）として、前記算出値から計算した。
【００７２】
図５のaは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；Ｆｌｔ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（１０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（１０  ｎＭ；直線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のｂは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；ＫＤＲ−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（３０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（３０  ｎＭ；直線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のｃは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；Ｆｌｔ−４（ＶＥＧＦ受容体３型）に対する、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ変異体（５００  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（５００  ｎＭ；直線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のｄは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（３０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（３０  ｎＭ；直線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。ヒトＶＥＧＦ１６５は、Ｆｌｔ−１−ＩｇＧとＫＤＲ−ＩｇＧの両方に対して、高い親和性で結合した。一方、ｖａｍｍｉｎは、ＫＤＲには高い親和性で結合するが、Ｆｌｔ−１には、実質的に、結合性を示さなかった。また、ｖａｍｍｉｎは、Ｆｌｔ−４、ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１−ＩｇＧに対しても、実質的に、結合性を示さなかった。
表１に、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎ、ＶＲ−１、ＨＦ、ならびに、組換え生産ヒトＶＥＧＦ１６５に関して、Ｆｌｔ−１−ＩｇＧとＫＤＲ−ＩｇＧのそれぞれに対する、結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）、最大結合量（Ｒmax）を算出した値と、計算されたみかけの解離定数（Ｋd）を示す。ｖａｍｍｉｎのＫＤＲに対するｋassとｋdissは、ヒトＶＥＧＦ１６５と比較して、ともに小さかった。すなわち、ＫＤＲに対するｖａｍｍｉｎの結合は、ＶＥＧＦ１６５と比べて、遅く強固な結合であることを示している。
【００７３】
ＶＲ−１とＨＦも、ｖａｍｍｉｎと同様に、高い親和性でＫＤＲと結合したが、Ｆｌｔ−１とは結合しなかった。ＨＦのｋassとｋdissは、ｖａｍｍｉｎに似た遅い強固な結合特性を示したが、ＶＲ−１は、ＶＥＧＦ１６５と同様の結合特性を有していた。
【００７４】
【表１】
2005110508.tif 000003
【００７５】
各ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質に関して、タンパク質濃度（３−３０  ｎＭ）三水準における、結合および解離曲線の測定結果より、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１を用いて、最適なカーブ・フィットが可能な、結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）、最大結合量（Ｒmax）を算出した。なお、各４回の独立した実験を行い、同様の結果が得られることを確認している。記載される解離定数（Ｋd）は、ｋdiss／
ｋassの比として、計算した値である。
７．  細胞増殖活性の評価
細胞増殖活性は、ＷＳＴ−８法による細胞数計測により評価した。ウシ大動脈内皮細胞を、９６ウェルプレートに３，０００個／ウェルとなるよう播種した。６時間培養した後、０．１％ウシ胎児血清を含む培地に交換した。さらに、１８時間後、前記培地にｖａｍｍｉｎならびにＶＥＧＦ１６５（陽性対照）を添加し、培養を６日間継続した後、細胞数を計測した。ＷＳＴ−８法における、発色の吸収係数Ａ４９２−５４５を、細胞数の指標とした。図６のａに、ｖａｍｍｉｎ（彩色カラム）ならびにＶＥＧＦ１６５（陽性対照：白色カラム）の有する内皮細胞増殖活性における、添加濃度依存性を対比して示す。評価した添加濃度範囲、０．１〜３０ｎｍにおいて、ｖａｍｍｉｎは、ＶＥＧＦ１６５（陽性対照）よりも高い活性を示している。
【００７６】
加えて、上記の例４に記載の手法に従って、ｖａｍｍｉｎならびにＶＥＧＦ１６５（陽性対照）について、血圧降下作用の比較を行った。図６のｂに、ｖａｍｍｉｎならびにＶＥＧＦ１６５（陽性対照）について、それぞれ、用量０．１  μｇ／ｇで静脈内投与の前後における、頸動脈圧の変化を経時間的に観測した結果の対比を示す。図６のｃは、ｖａｍｍｉｎならびにＶＥＧＦ１６５（陽性対照）について、それぞれ、用量０．１  μｇ／ｇで静脈内投与後、平均動血圧（ＭＡＰ）の最大降下を対比して示す。群の個体数ｎ＝３−４における平均値を示す。ｖａｍｍｉｎは、ＶＥＧＦ１６５（陽性対照）と比較して、有意に（Ｐ＜０．０５）高い血圧降下作用を示している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
天然のＶＥＧＦ−Ａタンパク質に代えて、ｖａｍｍｉｎとＶＲ−１は、該ＶＥＧＦ様タンパク質とＫＤＲとの結合により誘起される、一酸化窒素（ＮＯ）依存性の強力な血圧降下活性や血管新生促進作用を利用して、血圧降下剤、血小板凝集阻害、抗血栓作用を利用した虚血性疾患の治療薬、動脈硬化の外科的治療法である経皮的冠動脈介入術（ＰＣＩ）によって傷ついた血管内壁の治療等に利用買可能な、血管内皮細胞損傷の治療薬、あるいは、抗炎症作用を利用した、肝細胞の保護を図る肝炎の治療薬に利用でき、これらの適用において、長期投与する際に懸念される、Ｆｌｔ−１との結合に起因する肝細胞の過度な増殖、肝臓肥大という副作用は大幅に少なくできる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１のＡは、実施例に記載するｖａｍｍｉｎの精製工程中、工程５のＭｏｎｏ  Ｓ  カラム・クロマトグラフィーにおける、ｖａｍｍｉｎを含む溶出画分（図中、棒線で示す画分）と、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示し、図１のＢは、実施例に記載するＶＲ−１の精製工程中、工程４のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィーにおける、ＶＲ−１を含む溶出画分（図中、棒線で示す画分）と、そのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示している。挿入されているＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果において、各レーンは、ＮＲ：非還元下、Ｒ：還元下の泳動結果を示す。
【図２】図２は、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質とヒトＶＥＧＦ１６５のペプチド鎖のアミノ酸配列アライン結果を示す。ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質において、一致するアミノ酸残基は網掛けで、システイン残基は、白ヌキで示し、鎖内、鎖間のジスルフィド結合を表示し、また、システインナット・モチーフを形成する、ＶＥＧＦ１６５鎖内のループ部分は横線で示されている。また、ＶＥＧＦ１６５のヘパリン結合部位は、点線で囲まれている。ヒトＶＥＧＦ１６５中の、ＫＧＲ受容体結合のための重要な残基を、●印で、Ｆｌｔ−１結合のために重要な残基を、□印で、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質における、Ｆｌｔ−１への結合性の低下に寄与する、アミノ酸置換部位を、▼印で示す。ＨＦ：Ｖｉｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒由来のｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ；  ＩＣＰＰ：Ｖｉｐｅｒａ  ｌｅｂｅｔｉｎａのヘビ毒由来のｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ；  ＶＥＧＦ１６５：  ヒト血管内皮増殖因子  １６５（ＧｅｎＢａｎｋ  登録番号，  ＡＡＭ０３１０８）
【図３】図３（Ａ）は、用量０．３  μｇ／ｇのｖａｍｍｉｎを静脈注射後、ラット動脈圧の時間推移の記録チャート、図３（Ｂ）は、ｖａｍｍｉｎの静脈内投与における、ラット動脈圧の収縮期血圧（ＳＢＰ；  白四角）と拡張期血圧（ＤＢＰ；  黒四角）の低下率に対する投与用量依存性を示すプロットである。図３（Ｂ）に示すデータは、各群３匹または５匹の個体で得られる結果から算出した、平均値±標準誤差として示している。＊：コントロール（陰性対照群）と比較した際の、有意差のｔ検定における  Ｐ＜０．０５  を示す。
【図４】血清を除いたＣＡＥＣを、ｖａｍｍｉｎ（１  ｎＭ）で処理した後、所定時間経過後、細胞を氷冷ＰＢＳですぐに２回洗浄し、溶解緩衝液中で破砕した。各細胞溶解液は、それぞれ、リン酸化ｅＮＯＳ（ｓｅｒｉｎｅ  １１７７、上図）、総ｅＮＯＳ  （下図）に対する抗体によるイムノ・ブロティッング法により、その存在を検出した。
【図５】図５のａは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；Ｆｌｔ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（１０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（１０  ｎＭ；直線）の結合、解離の各過程における共鳴信号変化を対比し、図５のｂは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；ＫＤＲ−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（３０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（３０  ｎＭ；直線）の結合、解離の各過程における共鳴信号変化を対比し、図５のｃは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；Ｆｌｔ−４（ＶＥＧＦ受容体３型）に対する、ＶＥＧＦ−Ｃ１５６Ｓ変異体（５００  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（５００  ｎＭ；直線）の結合、解離の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のｄは、ＣＭ５センサー・チップ上に固定したレセプター分子；ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ１６５（３０  ｎＭ；点線）とｖａｍｍｉｎ（３０  ｎＭ；直線）の結合、解離の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【図６】ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質ｖａｍｍｉｎと、ヒトＶＥＧＦ１６５との生理作用の比較結果を示す。図６のａ：ｖａｍｍｉｎとヒトＶＥＧＦ１６５の血管内皮細胞増殖作用の比較。０．１％ウシ胎児血清下で培養したウシ大動脈内皮細胞（３，０００個／ウェル）に各濃度のｖａｍｍｉｎまたはＶＥＧＦ１６５を加えた。６日後に、ＷＳＴ−８法で細胞数を測定した。灰色のカラム：ｖａｍｍｉｎ、白いカラム：ＶＥＧＦ１６５。図６のｂ、ｃ：ｖａｍｍｉｎとおよびＶＥＧＦ１６５のラット頸動脈圧に対する血圧降下作用の比較。ｂ：ｖａｍｍｉｎ（０．１  μｇ／ｇ）またはＶＥＧＦ１６５（０．１  μｇ／ｇ）をラット大腿静脈より投与し、血圧変化を観血的に測定した。ｃ：ｖａｍｍｉｎ（０．１  μｇ／ｇ）またはＶＥＧＦ１６５（０．１  μｇ／ｇ）を静脈投与後の平均動脈圧（ＭＡＰ）の最大降下を示す。＊＊Ｐ＜０．０５，ｎ＝３−４。
【図１】
2005110508.tif 000004
【図３】
2005110508.tif 000005
【図４】
2005110508.tif 000006
【図５】
2005110508.tif 000007
【図６】
2005110508.tif 000008
【図２】
2005110508.tif 000009
【配列表】
2005110508000001.app