(57)【要約】      （修正有）【課題】酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、且つ細胞内での安定性に優れるプラスミドベクターの開発を目的とする。【解決手段】特定の塩基配列、又は前記配列において１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ、酢酸菌で自律複製可能なプラスミドｐＧＩ１；前記プラスミドの少なくとも一部と選択マーカー遺伝子を含有し、酢酸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする酢酸菌用ベクター。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すプラスミドｐＧＩ１。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるプラスミド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ、酢酸菌で自律複製可能なプラスミド。
【請求項２】
請求項１記載のプラスミドの少なくとも一部と選択マーカー遺伝子を含有し、酢酸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする酢酸菌用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作技術に関し、より詳細には、酢酸菌、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）の遺伝子操作に有用なプラスミド及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は、食酢製造に広く利用されているアルコール酸化能を有する微生物である。特に、アルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌は、工業的な酢酸発酵に利用されている。
このうち、グルコンアセトバクター属の酢酸菌であるグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、特にアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）は、２０％以上の酢酸を培地中に蓄積することが可能な、最も酢酸耐性が高く有用な酢酸菌である。
【０００３】
一方、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度においても増殖能力や発酵能力が低下しない、すなわち酢酸耐性の高い酢酸菌を開発することなどが求められている。その一手段として、酢酸耐性に関与する遺伝子（酢酸耐性遺伝子）をクローニングし、その酢酸耐性遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することなどが試みられている。
ここで、酢酸菌における遺伝子操作を実施する上では、酢酸菌で自律複製可能なベクターなどが必要である。一般の遺伝子操作で用いられる公知のマルチコピープラスミドベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献１参照）、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献２参照）やｐＴＡ５００１（Ａ）及びｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献１参照）などが挙げられる。
【０００４】
しかしながら、これらのマルチコピーベクターは、上述したアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株を初めとするグルコンアセトバクター・エンタニイ等の実用酢酸菌とは異なる酢酸菌に由来するプラスミドを用いて作製されているため、前記実用酢酸菌への遺伝子導入効率が低い。また、形質転換できたとしても、細胞内においてプラスミドベクターを安定的に保持することが難しい等の問題点があったため、酢酸菌での遺伝子操作に関し、より実用性の高いベクターの開発が望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】「セルロース（Cellulose）、ｐ．１５３−１５８、１９８９年」
【非特許文献２】「アプライド・アンド・エンバイロメタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology）５５巻、ｐ．１７１−１７６、１９８９年」
【特許文献１】特開昭６０−９４８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような状況下において、酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、かつ、細胞内での安定性に優れるプラスミドベクターの開発を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題に基づき、本発明者は鋭意検討した結果、有用酢酸菌の１つであるグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、特にアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株の細胞内でも複製しうる環状二本鎖ＤＮＡプラスミド（以下、プラスミドｐＧＩ１という。）を見出した。
さらに、このプラスミドｐＧＩ１に、選択マーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子を持つ大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８を連結してキメラプラスミドを作製し、酢酸菌に形質転換を試みたところ、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株以外にも、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）やアセトバクター・アセチ  ＩＦＯ３２８３株（Acetobacter aceti IFO3283）、及びグルコンアセトバクター・ザイリナス  ＩＦＯ３２８８株（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）など、多くの酢酸菌において前記選択マーカー遺伝子が発現し、形質転換株を得ることに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち請求項１記載の本発明は、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すプラスミドｐＧＩ１である。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるプラスミド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ、酢酸菌で自律複製可能なプラスミド。
請求項２記載の本発明は、請求項１記載のプラスミドの少なくとも一部と選択マーカー遺伝子を含有し、酢酸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする酢酸菌用ベクターである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、かつ、細胞内での安定性に優れるプラスミド、及び酢酸菌用ベクターが提供されるので、酢酸菌における遺伝子操作の実施に好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１は、下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すものである。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるプラスミド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ、酢酸菌で自律複製可能なプラスミド。
【００１１】
まず、（Ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるプラスミドは、約３．１ｋｂｐの長さを持ち、図１の制限酵素地図を有する環状二本鎖プラスミドである。図１中、「Ｓｆｉ  Ｉ」及び「Ｈｉｎｃ  ＩＩ」は、制限酵素認識部位を示す。また、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＧＩ１」は、プラスミド名を、「３０８０ｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
即ち、図１に示すように（Ａ）プラスミドは、配列表の配列番号１に記載の約３１００塩基対（ｂｐ）からなり、Ｈｉｎｃ  ＩＩで３カ所、また、Ｓｆｉ  Ｉで１カ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドとして得ることができる。また、プラスミド（Ａ）は、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの認識部位を有していない。
【００１２】
このような（Ａ）プラスミドは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）から一般的な遺伝子工学的手法により調製することができる。
例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株を適当な培地（例えば、ＹＰＧ培地）で培養し、次いで、これを集菌し、溶菌する。溶菌には、大腸菌等の細菌を溶菌させる公知の方法を適用することができ、例えば水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて行うことができる。得られる溶菌物から、例えばフェノール抽出およびエチジウムブロミド存在下の塩化セシウム密度勾配遠心法の如き通常用いられる方法により、目的のプラスミドを分離、精製することができる。
【００１３】
（Ａ）プラスミドの自律複製機能や宿主細胞内での安定維持に関与する遺伝子など、プラスミドとして宿主細胞内で複製したり、或いは存在するために必須の遺伝子は、一般的なプラスミドと同様に、（Ａ）プラスミドを構成する配列表の配列番号１に記載の塩基配列の一部に担われていると考えられ、この領域の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位が起こると、プラスミドとして機能しなくなる場合がある。しかし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の中で、プラスミドの自律複製機能や宿主細胞内での保持に関与しない領域については、欠失していたり、別の領域が挿入又は付加されていたり、或いは位置が逆になっていたりするような誘導体も同様にプラスミドとしての機能を有すると考えられる。それ故、請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１は、（Ａ）プラスミドのみに限定されるのではなく、（Ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、かつ、酢酸菌で自律複製可能なプラスミドであっても良い。
【００１４】
したがって、（Ｂ）プラスミドにおける配列表の配列番号１に記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列とは、上述したように、配列表の配列番号１に記載の塩基配列中、プラスミドの自律複製機能や宿主細胞内での保持に関与しない領域において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列を意味する。
【００１５】
また、（Ｂ）プラスミドにおいて、酢酸菌で自律複製可能とは、酢酸菌細胞内で自律的に複製でき、細胞内に安定して存在することができることを意味する。
酢酸菌としては、アルコール酸化能を有するものであれば良く、中でも、アセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌が好ましい。
アセトバクター属の酢酸菌として、例えばアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、具体的には、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）やアセトバクター・アセチ  ＩＦＯ３２８３株（Acetobacter aceti IFO3283）が挙げられる。
また、グルコンアセトバクター属の酢酸菌としては、グルコンアセトバクター・ユウロパエウス  ＤＳＭ６１６０株（Gluconacetobacter europaeus DSM6160）やグルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）や、グルコンアセトバクター・ザイリナス  ＩＦＯ３２８８株（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）が挙げられる。
【００１６】
このようなプラスミド（Ｂ）は、プラスミド（Ａ）と同様に、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）から一般的な遺伝子工学的手法により、具体的には、実施例１に示すような手順及び条件により、調製することができる。
【００１７】
このような請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１は、選択マーカー遺伝子を連結することにより、宿主としての酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌を形質転換するためのベクターとして用いることができる。このような酢酸菌用ベクターを提供するのが、請求項２に係る本発明である。
即ち、請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、請求項１記載のプラスミドの少なくとも一部と選択マーカー遺伝子を含有し、酢酸菌の細胞内で複製可能であることを特徴とする。
【００１８】
選択マーカー遺伝子とは、導入すべき形質を担う遺伝子が酢酸菌に導入されたか否かを知るためのマーカーとなり得る遺伝子を意味し、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子などを挙げることができる。具体的には例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００１９】
請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、請求項１記載のプラスミドの少なくとも一部と選択マーカー遺伝子を含有するが、その他に、導入すべき形質を担う遺伝子や発現調節に関与するＤＮＡ配列を含有するものであっても良い。
導入すべき形質を担う遺伝子としては、特に限定はなく、プロテアーゼ、リパーゼ、ＤＮＡ合成酵素、ＲＮＡ合成酵素、アミノ酸や有機酸合成系に関与する酵素代謝合成酵素などの酵素の遺伝子などを挙げることができ、具体的には例えば、酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、１７５巻、ｐ．６８５７−６８６６、１９９３年」参照）を挙げることができる。
【００２０】
発現調節に関与するＤＮＡ配列としては、酢酸菌、特にアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能するものであれば特に制限はなく、プロモーター、エンハンサー、各種リプレッサー遺伝子およびそれに対応するリプレッサー結合領域などを挙げることができる。
【００２１】
請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、上記のような選択マーカー遺伝子を含有するプラスミドが、請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１の少なくとも一部に連結されたものであっても良い。
連結するプラスミドとしては、導入すべき形質を担う所望の遺伝子を導入してあらかじめ作製しておいたプラスミドの他、アンピシリン耐性遺伝子を担うｐＵＣ１８、テトラサイクリン耐性遺伝子を担うｐＢＲ３２２、カナマイシン耐性遺伝子を担うｐＨＳＧ２９８等の公知のプラスミドを挙げることができる。尚、ｐＵＣ１８プラスミドは、大腸菌で自律複製可能なため、これを連結することにより、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターを得ることができる。
【００２２】
このような請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、請求項１に係る本発明のプラスミドの少なくとも一部に、選択マーカー遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド（例えば、ｐＵＣ１８）を連結することによって作製することができる。
具体的には、例えば、請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１を、制限酵素で切断し、ＰＣＲ法によって増幅した後、更に制限酵素で切断し、一方、プラスミド（例えば、ｐＵＣ１８）を、同じ制限酵素で切断し、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結反応（ライゲーション（Ligation））させることにより、得ることができる。
制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Ｓｆｉ  Ｉの場合は、酵素濃度１ユニット／μｇ、温度５０℃で１時間、Ａａｔ  ＩＩの場合は酵素濃度１ユニット／μｇ、温度３７℃で１時間作用させる。なお、後記実施例では、Ｓｆｉ  Ｉ及びＡａｔ  ＩＩを用いた。
【００２３】
図２に、請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターの一例（ｐＵＣ１８を導入して得られる酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８）の作製手順及び制限酵素地図を示す。図２中、「Ａａｔ
ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳは、マルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」は、プラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。図２に示す酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８は、ｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有しており、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）である。
【００２４】
このような請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞内で複製可能である。言い換えれば、請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターは、酢酸菌に形質転換させて所望の遺伝子が導入されてなる組換え酢酸菌を得ることが可能である。酢酸菌の具体例については、請求項１に係る本発明の説明において示した通りである。
尚、前述したように、選択マーカー遺伝子を含むプラスミド（例えば、ｐＵＣ１８）を連結することにより、酢酸菌の細胞内のみならず、大腸菌の細胞内でも複製可能な酢酸菌−大腸菌シャトルベクターを得ることができる。
【００２５】
形質転換については、特に限定はなく、通常行われる手順・条件を適用することができる。例えば、塩化カルシウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry），４９巻，p.２０９１−２０９７，１９８５年」参照）、エレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）などを挙げることができる。
請求項２に係る本発明の酢酸菌用ベクターが導入された酢酸菌は、ベクターの選択マーカー遺伝子の担う表現形質に対応する選択培地、例えば選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子であれば、その薬剤を含む培地で培養することにより、選択することが可能である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１（プラスミドｐＧＩ１の調製）
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０時間から３３６時間振盪培養した。得られた菌体について水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
得られたプラスミドＤＮＡを、各種制限酵素（宝酒造社製）で切断し（３７℃、酵素濃度１ユニット／ｍｌ）、得られたＤＮＡ断片の塩基対長をアガロースゲル電気泳動により求めた。図１にｐＧＩ１の制限酵素地図を示す。図１中、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。
【００２７】
図１から明らかなように、得られたプラスミドＤＮＡはＨｉｎｃ  ＩＩで３カ所、また、Ｓｆｉ  Ｉで１カ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの認識部位を有していなかった。
得られたプラスミドＤＮＡをプラスミドｐＧＩ１と命名し、以下の実施例に用いた。
【００２８】
実施例２（ｐＧＩ１の全塩基配列の決定）
ｐＵＣ１８（宝酒造社製：２６８６ｂｐ）をＳｍａ  Ｉで切断し、ｐＧＩ１をＳｆｉ  Ｉで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化したものを、実施例１で得られたプラスミドｐＧＩ１に連結反応させた。ｐＧＩ１の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。尚、塩基配列の決定は、ＤＮＡ２本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号１記載の塩基配列が決定された。
【００２９】
実施例３（ｐＧＩ１へのアンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子の付与並びに酢酸菌用ベクターの作成）
図２に示す手順で酢酸菌用ベクターの作製を試みた。
上記実施例１で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、Ａａｔ  ＩＩで切断した。
ＰＣＲ法は図３に示すようにして実施した。すなわち、実施例１で調製したプラスミドｐＧＩ１を鋳型として、プライマーとしてＡａｔ  ＩＩ認識部位を有するプライマー１及びプライマー２を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。プライマー１及びプライマー２の塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号２及び配列番号３に示す通りである。
ＰＣＲの条件は、９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３分を１サイクルとして、３０サイクルとした。
【００３０】
一方、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子を担うｐＵＣ１８（宝酒造社製：２６８６ｂｐ）をＡａｔ  ＩＩで切断し（３７℃、酵素濃度１ユニット／ｍｌ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、実施例１で得られたプラスミドｐＧＩ１に連結反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた。連結後の反応液を、常法に従い、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（トリプトン １０ｇ、イーストエキス ５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／１リットル）プレート上で選択してＡｍｐ耐性の形質転換株を得た。
得られた形質転換株よりプラスミドを調製し、その制限酵素切断パターンを解析した。図２に、得られたプラスミドの制限酵素地図を示す。図２中、「Ａａｔ  ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳは、マルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」は、プラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
【００３１】
図２から明らかなように、得られたプラスミドはｐＵＣ１８およびｐＧＩ１のいずれも含有しており、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。このプラスミドを酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８と命名した。
【００３２】
実施例４（酢酸菌アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株への形質転換）
実施例３で調製した酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８を、アセトバクター・アセチ  Ｎｏ．１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析したところ、ベクターｐＧＩ１８を保持していることを確認した。
【００３３】
実施例５（アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３株への形質転換）
実施例３で調製した酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８を、アセトバクター・アセチ  ＩＦＯ３２８３株（Acetobacter aceti IFO3283）にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ベクターｐＧＩ１８を保持していることを確認した。
【００３４】
実施例６（グルコンアセトバクター・ザイリナスＩＦＯ３２８８株への形質転換）
実施例３で調製したｐＧＩ１８を、グルコンアセトバクター・ザイリナス  ＩＦＯ３２８８株（Gluconacetobacter xylinus IFO3288）にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ベクターｐＧＩ１８を保持していることを確認した。
【００３５】
実施例７（グルコンアセトバクター・エンタニイへの形質転換）
実施例３で調製したｐＧＩ１８を、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）、特にアセトバクター・アルトアセチゲネス  ＭＨ−２４株（Acetobacter altoacetigenes MH-24）（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）にエレクトロポレーション法（例えば、「バイオサイエンス・バイオテクノロジイー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry），５８巻，ｐ.９７４−９７５，１９９４年」参照）によって形質転換した。形質転換株は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３％の酢酸と４％のエタノールを添加したＹＰＧ寒天培地（寒天濃度０．５５％の軟寒天培地）で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ベクターｐＧＩ１８を保持していることを確認した。
以上のことから請求項１に係る本発明のプラスミドｐＧＩ１は、酢酸菌、特にアルコール酸化能を有するアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の酢酸菌において普遍的に使用可能なベクターとして有用であることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、酢酸菌への遺伝子導入効率が高く、且つ細胞内での安定性に優れるプラスミド、及び酢酸菌用ベクターが提供されるので、酢酸菌における遺伝子操作の実施に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】グルコンアセトバクター・エンタニイ（アセトバクター・アルトアセチゲネス）由来のプラスミドｐＧＩ１の制限酵素地図を示した図である。
【図２】ｐＧＩ１８の構築図及び制限酵素地図を示した図である。
【図３】実施例３におけるＰＣＲ法のプライマーの位置を示した図である。
【符号の説明】
【００３８】
図１中、「Ｓｆｉ  Ｉ」及び「Ｈｉｎｃ  ＩＩ」は、制限酵素認識部位を示す。また、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＧＩ１」は、プラスミド名を、「３０８０ｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
図２中、「Ａａｔ  ＩＩ」及び「Ｓｆｉ  Ｉ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳは、マルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号を示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」は、プラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
図３中、Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２は、それぞれプライマー１及びプライマー２を示し、「Ｓｆｉ  Ｉ」及び「Ａａｔ  ＩＩ」は、制限酵素認識部位を示す。
【図１】
2005110597.tif 000002
【図２】
2005110597.tif 000003
【図３】
2005110597.tif 000004
【配列表】
2005110597000001.app