(57)【要約】【課題】  その体内で発現される生体内蛋白質複合体を分離精製することができるトランスジェニック動物および生体内蛋白質複合体を分離精製する方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、アフィニティ精製用のタグであって特定の生体成分と結合しないタグを２種類以上含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物に関する。本発明のトランスジェニック動物から生体内蛋白質複合体を精度よく精製分離することができる。  また、前記のトランスジェニック動物から得られた生体材料抽出液に前記タグを結合可能な物質を相互作用させて前記タグが連結された生体内蛋白質複合体を分離する方法に関する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフィニティ精製用のタグであって特定の生体成分と結合しないタグを２種類以上含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記タグが複数個の連続したヒスチジンおよびフラッグペプチドを含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
請求項１に記載のトランスジェニック動物から得られた生体材料抽出液に前記タグと結合可能な物質を相互作用させて前記タグが連結された生体内蛋白質複合体を分離する生体内蛋白質複合体の分離方法。
【請求項４】
前記タグが複数個の連続したヒスチジンおよびフラッグペプチドからなるタグであって、前記タグと結合可能な物質がニッケル及び抗フラッグペプチド抗体である請求項３に記載の生体内蛋白質複合体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスジェニック動物およびそれを利用した生体内蛋白質複合体の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の蛋白質が混在する試料から所望の蛋白質を分離精製するためにタグと呼ばれるオリゴペプチドが使用されている。ヒスチジンとフラッグペプチドからなる複合タグが特許文献１に開示されている。
【０００３】
また、ＴＡＰ（ｔａｎｄｅｍ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）タグを用いる汎用的な複合体取得技術を利用した酵母におけるプロテオーム解析が非特許文献１に報告されている。
【０００４】
また、ヒスチジンタグとフラッグペプチドとを付加した組み換え蛋白質ＯｖＰＸＮ−２をｐＡＰ−ｌａｃＩＱ細胞に発現させ、ヒスチジンタグを利用して精製し、抗フラッグペプチド抗体を利用して検出することが、非特許文献２に示されている。
【特許文献１】特開２００２−６５２６５号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，４１５巻，１４１−１４７ページ，２００２年
【非特許文献２】Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  Ｒｅｓ．，８４巻，６２３−６３１ページ、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体内で形成された蛋白質複合体（以下、生体内蛋白質複合体という）の解析には試料となる生体内蛋白質複合体を生体から分離精製しなければならない。目的とする蛋白質の組み換え体を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで複合体を形成するのは困難であり、また、複合体が形成されたとしてもそれは生体内で形成される複合体とは異なることがあるからである。
しかし、生体内蛋白質複合体を生体から分離精製することは、前記複合体が分解し易いため、非常に困難なことであった。
ＴＡＰタグを利用して蛋白質複合体を精製するには、二段階精製のうち第一段階で抗ＩｇＧ抗体結合ビーズにＴＡＰタグ付蛋白質複合体を結合させる。このときに検体中に含まれるＩｇＧも前記抗ＩｇＧ抗体結合ビーズに、ＴＡＰタグ付蛋白質複合体と競合的に結合する。したがって、精製後の蛋白質にＩｇＧが混入し、その分ＴＡＰタグ付蛋白質複合体の分離が不十分という問題がある。
【０００６】
本発明は、その体内で発現される生体内蛋白質複合体を分離精製することができるトランスジェニック動物および生体内蛋白質複合体を分離精製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アフィニティ精製用のタグであって特定の生体成分と結合しないタグを２種類以上含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが連結された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物に関する。特に、複数個の連続したヒスチジンとフラッグペプチドとからなる複合タグをコードするポリヌクレオチドが連結された遺伝子が導入されたトランスジェニック動物に関する。本発明でいうトランスジェニック動物は、導入される遺伝子を問わず、遺伝子が導入される部位も問わない。したがって、ゲノムの特定の部位に遺伝子が導入されたノックイン動物も含む。
【０００８】
また、前記のトランスジェニック動物から得られた生体材料抽出液に前記タグを結合可能な物質を相互作用させて前記タグが連結された生体内蛋白質複合体を分離する生体内蛋白質複合体の分離方法に関する。特に、前記タグが複数個の連続したヒスチジンとフラッグペプチドとからなる複合タグであって、前記タグを結合可能な物質がニッケル及び抗フラッグ抗体である生体内蛋白質複合体の分離方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のトランスジェニック動物から生体内蛋白質複合体を精度よく精製分離することができる。例えば、トランスジェニック動物から抽出された生体内蛋白質複合体を含む抽出液から前記生体蛋白質複合体を精度よく精製分離することができる。
また、本発明のトランスジェニック動物により目的とする生体内蛋白質複合体の発現の様子をｉｎ  ｓｉｔｕで追跡可能である。
本発明の生体内蛋白質の分離方法により、動物を試料とした場合であっても夾雑物を除去して生体内蛋白質複合体を分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のトランスジェニック動物は、Ｎ末端側にアフィニティ精製用のタグが２種以上連結された目的とする蛋白質を生体内で発現する。そして、前記トランスジェニック動物の生体内で前記蛋白質の複合体が形成される。この動物の組織抽出液等から前記タグを利用して前記蛋白質複合体を精製することができる。２種以上のタグの間およびタグと目的とする蛋白質との間にはスペーサペプチドが挿入されてもよい。
本発明のアフィニティ精製用タグは、特定の生体成分と結合しないものである。特定の生体成分には、ＩｇＧ抗体を挙げることができる。本発明で好適に使用可能なアフィニティ精製用タグには、複数個の連続したヒスチジンからなるヒスチジンタグやフラッグペプチドがある。ＴＡＰタグは、特定の生体成分であるＩｇＧ抗体に結合するので本発明には適さない。
【００１１】
転写因子等の既知の蛋白質Ｘに生体内での相互作用により別の蛋白質Ｙが会合して形成された生体内蛋白質複合体Ｚを生体内から分離精製する場合を例として本発明を以下に説明する。
蛋白質Ｘの遺伝子ｘをＰＣＲ等の手法により得る。このとき５’末端側のプライマーにフラッグペプチドをコードするポリヌクレオチドｆと複数個のヒスチジンをコードするポリヌクレオチドｈとを連結したポリヌクレオチドを使用する。ポリヌクレオチドｆをポリヌクレオチドｈの５’末端側に連結することが好ましい。これにより、フラッグペプチドとヒスチジンとからなる複合タグ（以降、複合タグＦＨという）をコードするポリヌクレオチドｆｈが連結された遺伝子ｘをＰＣＲ産物として得る。
【００１２】
フラッグペプチドは例えば配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるものがある。そして、６ないし１０個の連続したヒスチジンを使用すると、ヒスチジンを結合可能な担体と前記ヒスチジンがとの結合力が強まり、ヒスチジンのタグとして作用が強まるので好ましい。
フラッグペプチドとヒスチジンタグとの間またはヒスチジンタグと蛋白質Ｘとの間には、それぞれスペーサペプチドが入るように、前記スペーサペプチドをコードするポリヌクレオチドをポリヌクレオチドｆとポリヌクレオチドｈとの間またはポリヌクレオチドｈと遺伝子ｘとの間にいれてもよい。こうして得られた複合タグ付き蛋白質ＦＨ−Ｘをコードするポリヌクレオチドを以下では複合タグ付き遺伝子ｆｈ−ｘと呼ぶ。
【００１３】
複合タグ付き遺伝子ｆｈ−ｘを動物に導入してトランスジェニック動物を得る。
例えば、図１に示すように、遺伝子ｘ（１）に複合タグＦＨをコードするポリヌクレオチドｆｈ（２）を付加した遺伝子ｆｈ−ｘ（３）をＰＣＲ等で作製する。
遺伝子ｆｈ−ｘ（３）を受精卵（４）にインジェクションする。
得られた遺伝子導入受精卵をマウス（５）に導入する。動物個体の生涯で時期特異的に発現する蛋白質複合体を調べるには、目的にかなうように遺伝子導入受精卵を導入するマウスの時期を選択する。例えば、老化に特有な蛋白質複合体を調べるのであれば老化したマウスに遺伝子導入受精卵を導入する。疾患特異的に発現する蛋白質複合体を調べるには、目的とする疾患に罹患したマウスを選択して、そのマウスに遺伝子導入受精卵を導入する。例えば、癌に特有な蛋白質複合体を調べるのであれば癌に罹患したマウスに遺伝子導入受精卵を導入する。時期と疾患の両方を特定のものに選択したマウスに遺伝子導入受精卵を導入することもできる。
【００１４】
遺伝子ｆｈ−ｘが導入されたトランスジェニックマウスが樹立されれば、そのマウスから各臓器（脳、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚等の組織）抽出液を得る。複合タグＦＨ付き生体内蛋白質複合体ＦＨ−Ｚ（６）を前記臓器抽出液から複合タグＦＨ（９）により精製する。こうして、各臓器ごとに蛋白質Ｘ（７）と複合体を形成する蛋白質Ｙ（複数の蛋白質Ｙ１、Ｙ２、・・・の場合もある）（８）の種類や発現量を知ることができる。
今度は、蛋白質Ｙと複合体を形成する別の蛋白質Ｗ（複数の蛋白質Ｗ１、Ｗ２、・・・の場合もある）を同様に調べる。このサイクルで次々と蛋白質複合体を同定することで動物の生体内蛋白質に関する情報が網羅的に得られる。トランスジェニックマウスは一旦樹立されると後は交配により容易に増殖することができるので、前記サイクルを回すための多数の検体をまかなうことができる。
動物はヒト以外の動物であり、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の動物を挙げることができる。
【００１５】
前記トランスジェニック動物の細胞内では、複合タグ付き蛋白質ＦＨ−Ｘが発現され、生体内の反応により他の蛋白質Ｙと会合して複合タグ付き蛋白質複合体ＦＨ−Ｚが形成される。ここで、Ｙはただ一つの蛋白質とは限らず、複数の蛋白質Ｙ１、Ｙ２、・・・であってもよい。蛋白質複合体もＺ１，Ｚ２、・・・と複合体であってもよい。一つの生体内蛋白質複合体Ｚ１が蛋白質Ｘに複数の蛋白質Ｙ１、Ｙ２、・・・が会合した複合体であってもよい。
このトランスジェニック動物の生体材料抽出液を得る。目的とする蛋白質の存在が予想される部位の器官、組織または細胞等の生体材料から抽出液を得る。例えば、肝臓内の蛋白質複合体を得る場合は、トランスジェニック動物から肝臓を取り出し、溶解液を加えて溶解してホモジナイズする。得られた組織溶解液を超遠心分離して細胞膜破砕片等の夾雑物を除去して組織抽出液を得る。
核内に存在が予想される蛋白質複合体を取得する場合、器官や組織から核を取り出し、核を溶解して核溶解液を得、その核溶解液を超遠心分離して核膜破砕片等の夾雑物を除去して核抽出液を得る。
【００１６】
前記組織抽出液等をニッケルおよび抗フラッグペプチド抗体に作用させる。例えば、ニッケル結合担体および抗フラッグペプチド抗体結合担体にかけて、前記組織抽出液から複合タグ付き蛋白質複合体ＦＨ−Ｚを分離精製する。
【００１７】
図２に示すように、既知の生体内蛋白質Ｘ（７）にはヒスチジン（１０）およびフラッグペプチド（１１）が付加されている。生体内蛋白質Ｘ（７）は他の蛋白質Ｙ（８）、Ｙ２（８ｂ）と生体内蛋白質複合体Ｚ（６）を形成している。ヒスチジンとフラッグペプチドは生体内蛋白質複合体Ｚ（６）に付加されていることになり、複合タグＦＨ付き生体内蛋白質複合体ＦＨ−Ｚ（１２）が生体材料抽出液（１３）中に存在する。生体材料抽出液（１３）中には、図２では黒く塗りつぶして示した夾雑蛋白質（１４）が同時に存在する。
この生体材料抽出液をニッケル結合担体（１５）を固定したカラムにかけて、ニッケル（１６）とヒスチジン（１０）とを結合させる。ニッケル（１６）に結合しなかった夾雑蛋白質（１４）を洗い流す。その後、溶出液をカラムにかけてニッケル（１６）とヒスチジン（１０）の結合を切り、ＦＨ−Ｚ（１２）を溶出する。
得られた溶出液を抗フラッグペプチド抗体結合担体（１７）を固定したカラムにかけて抗フラッグペプチド抗体（１８）とフラッグペプチド（１１）とを結合させる。抗フラッグペプチド抗体（１８）に結合しなかった夾雑蛋白質（１４）を洗い流す。その後、別のフラッグペプチドを含む溶出液をカラムにかけ、フラッグペプチド（１１）を抗フラッグペプチド抗体（１８）から解離させ、溶出する。
【００１８】
分離精製は、ニッケル結合担体（例えば、Ｎｉアガロースビーズ）にかけ、その後抗フラッグペプチド抗体結合担体（例えば、Ｍ２アガロース）にかける順で行うことが好ましい。先にヒスチジンタグを利用してニッケル結合担体にヒスチジンを結合させＦＨ−Ｚをニッケル結合担体に結合させる。ＦＨ−Ｚ以外にもニッケルに非特異的に結合する蛋白質があるのでこの時点での精製は不十分であることが多い。特に、動物の組織抽出液等は非常に夾雑蛋白質が多く、ニッケルによる精製では不十分である。したがって、ヒスチジンタグを利用して精製した後にフラッグペプチドタグを利用して抗フラッグペプチド抗体にフラッグペプチドを結合させて蛋白質複合体ＦＨ−Ｚを分離することが好ましい。
【００１９】
本発明のトランスジェニック動物の組織切片を抗フラッグペプチド抗体を利用して染色することで、導入した蛋白質を特異的に染色することができ、前記蛋白質の生体内での発現をｉｎ  ｓｉｔｕで観察することができる。トランスジェニック動物の時期（年齢）や疾患の進み具合と関連させることで、前記生体内蛋白質またはその複合体の生体内での発現の様子をｉｎ  ｓｉｔｕで追跡することができる。
【実施例】
【００２０】
（１）トランスジェニックマウスの作製
複合タグＦＨ付きのメディエータ転写制御因子ＳＢ１（以降、ＦＨ−ＳＢ１という）をコードする遺伝子（以降、ｆｈ−ｓｂ１という）を、特開２００２−６５２６５号公報に開示された方法に従い、ただし鋳型にはマウスｃＤＮＡライブラリーを使用してＰＣＲにて作製した。この遺伝子をＱｉａｇｅｎ（登録商標）で精製して導入用遺伝子とした。ここで、フラッグペプチドをコードするポリヌクレオチドｆが６個の連続するヒスチジンをコードするポリヌクレオチドｈよりも５’末端側となるようにした。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、常法により前核期卵を得た。この卵の前核に前記導入用遺伝子をマイクロインジェクターを使用して導入した。得られた遺伝子導入卵を１ないし２時間培養後、プラグのついたＩＣＲマウスに導入した。このＩＣＲマウスをＳＰＦで飼育し、出産させた。生まれた前記遺伝子導入卵からの新生仔を離乳まで飼育し、離乳後、尻尾からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２１】
Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを使用して  ９４℃に１分おき、続いて５５℃に２分おき、続いて７２℃に２分おくことを１サイクルとして３０サイクル繰り返して、前記ゲノムＤＮＡ１μｌをＰＣＲした。ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動して、増幅された遺伝子が観察されることを確認した。
【００２２】
（２）組織抽出液の調製
マウスより摘出した各臓器（肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、精巣）２ｇに氷冷した３倍溶解液（０．４５Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート（ｐＨ７．８）、０．１５Ｍ  酢酸カリウム（ｐＨ７．８）、６０％グリセロール、１５ｍＭ  ２−ＭＥ、１．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、６ｍＭベンズアミジン、３μＭロイペチン、６μＭペプスタチン）２ｍｌを加えた後、氷中においてルースガラスホモジェナイザーで２０回、タイトガラスホモジェナイザーで２０回ホモジェナイズした。
これをコーニングチューブに移し、さらに氷冷した１倍溶解液２ｍｌを加えて洗い込み、１００ｍＭ酢酸カリウムを加えて４℃で１５分間攪拌した。その後、７５００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清を組織抽出液とした。  
１０ｍｌの抽出液を調製する場合は、上記の方法をスケールアップするとともに遠心分離を３５０００ｒｐｍで行って得られた上清を組織抽出液とした。
【００２３】
（３）複合タグ付き蛋白質発現マウスの確認
前記（２）で調製した組織抽出液に含まれるはずの複合タグ付き蛋白質（ＦＨ−ＳＢ１）をウェスタンブロットにより検出することを試みた。
肝臓抽出液８０μｌに５倍サンプルバッファー４０μｌを加えて３分間煮沸し、これを電気泳動用サンプルとした。このうち５μｌを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２５ｍＡの定電流で１時間電気泳動した。電気泳動後のゲルをトランスファーバッファーで処理した。
セミドライ転写装置にトランスファーバッファーを浸透させた３ＭＭとＰＶＤＦメンブラン、前記処理したゲル、さらに３ＭＭをセットし７０ｍＡ以下の定電流で１時間転写させた。
【００２４】
転写後のメンブランをＴＢＳで洗浄後、３％スキムミルクで室温で１時間ブロッキングし、一次抗体（ラビット抗ラットＳＢ１抗体を３％スキムミルクで３０００倍に希釈したもの）を室温で１時間反応させた。その後、３％スキムミルクで３回洗浄し、二次抗体（抗ラビットＩｇＧ  ＡＰコンジュゲイテッドを３％スキムミルクで５０００倍に希釈したもの）を室温で１時間反応させた。反応後、ＴＢＳＴで２回洗浄し、さらにＴＢＳで１回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ（バイオラッド社製）の発色を指標に検出した。
また、一次抗体として抗フラッグペプチド抗体を使用し、他は前記と同様にしてウェスタンブロッティングを行った。
結果を図３に示す。２系統のトランスジェニックマウス（＃６および＃３５）が樹立されたが、＃３５では複合タグ付きＳＢ１（ＦＨ−ＳＢ１、図３ではダブルタグＳＢ１と記載）と内在性ＳＢ１（ｅ−ＳＢ１）がほぼ等量発現していることが確認された。
【００２５】
＃３５のトランスジェニックマウスの各組織抽出液ごとのＦＨ−ＳＢ１および内在性ＳＢ１の発現の様子を図４に示す。検討した全ての組織、すなわち肝臓、胸腺、脾臓、腎臓および精巣でＦＨ−ＳＢ１と内在性ＳＢ１の発現が確認された。
なお、今回サンプルとした５つの組織は生体からの分離が容易かつ抽出液の調製が可能であることを考慮して決定した。生体からの分離が容易であることは組織の活性を落とさないための重要な要因である。筋肉組織系は破砕が困難であるので抽出液を得ること困難である。したがって、今回のサンプルには含めなかった。
【００２６】
（４）生体内蛋白質複合体の分離
＃３５のトランスジェニックマウスの精巣抽出液を以下の手順で精製した。
１．ヒスチジンタグによる精製
精巣抽出液１０ｍｌを氷冷した２５０ｍｌチューブに移し、５０体積％のＮｉアガローズビーズ（キアゲン社製）を２．５ｍｌ（ベッドボリュームは１．２５ｍｌ）加えた。このチューブを冷所で２時間１０ｒｐｍで回転させた。
この液をカラムに載せた。このカラムにＮｉ洗浄液１（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、２５０ｍＭ塩化カリウム）を６．２５ｍｌ（５ベッドボリューム）流してカラムを洗浄した。その後、Ｎｉ洗浄液２（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、２５０ｍＭ塩化カリウム）２．５ｍｌ（２ベッドボリューム）をカラムに流して洗浄した。その後、Ｎｉ洗浄液３（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、２５０ｍＭ塩化カリウム溶液）２．５ｍｌ（２ベッドボリューム）をカラムに流して洗浄した。
【００２７】
その後、３．７５ｍｌ（３ベッドボリューム）のＮｉ溶出液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、２００ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、２５０ｍＭ塩化カリウム溶液）をカラムに流し、カラムを通過した液を回収した。
【００２８】
２．フラッグタグによる精製
この液を１５ｍｌチューブに移し、５０体積％のＭ２アガロース（シグマ社製）を０．３５ｍｌ（ベッドボリュームは０．１７５ｍｌ）加えた。このチューブを冷所で２時間１０ｒｐｍで回転させた。
この液をカラムに載せた。このカラムにＭ２洗浄液１（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グルセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、３００ｍＭ塩化カリウム溶液）を４．０２５ｍｌ（２３ベッドボリューム）流してカラムを洗浄した。その後、Ｍ２洗浄液２（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グリセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、１００ｍＭ塩化カリウム）１．０５０ｍｌ（６ベッドボリューム）をカラムに流して洗浄した。
その後、０．３５ｍｌ（２ベッドボリューム）のＭ２溶出液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０％グルセロール、０．０１％ＮＰ４０、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ  ２−ＭＥ、１倍阻害剤混合液、１００ｍＭ塩化カリウム溶液、０．５ｍｇ／ｍｌフラッグペプチド）を載せ、カラムの上部をパラフィンでシールした。このカラムを１０ｒｐｍで３０分間回転させた。
溶出液を清潔なチューブに回収した。
【００２９】
Ｍ２アガロ−スカラムから回収した液をＴＣＡで約１５倍に濃縮した。濃縮後の液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。
比較対照として、遺伝子操作をしていないマウス（野生型、ＷＴ）の精巣抽出液を同様にＮｉアガロースとＭ２アガロースで精製した。
電気泳動の結果、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）による構造解析を行うのに十分な量があった５つのバンドについて構造解析を行った。４つは既知の蛋白質であり、１つは新規な蛋白質であった。
【００３０】
電気泳動後、ルビー染色した結果を図５に示す。図５中、Ｔｇはトランスジェニックマウスの精巣抽出液を電気泳動しレーンであり、ＷＴは野生型マウスの精巣抽出液を電気泳動したレーンである。トランスジェニックマウスの精巣からはＳＢ１を含め、いくつかの蛋白質が検出された。また、野生型のマウスからは蛋白質が検出されなかった。構造解析を行ったバンドについては、蛋白質の名称を図５に示した。哺乳類で報告されているアクチンライクの転写因子であるＢＡＦ５３がマウスのＳＢ１複合体に含まれていることを見いだした。さらに新規のアクチンライクの転写因子が発見された。これらは、ＳＢ１と複合体を形成している蛋白質であり、トランスジェニックマウスから精製した蛋白質には夾雑蛋白質がほとんど含まれないことが確認された。ＳＢ１およびＳＢ１ライクのバンドが他のバンドに比べて濃く、これらの蛋白質が量的に多く含まれていることが分かる。これよりＳＢ１とＳＢ１ライクだけからなる複合体が存在するものと考えられた。
【００３１】
トランスジェニックマウスの脾臓、腎臓または肝臓のそれぞれの抽出液についても同様に複合タグＦＨによる精製を行った。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図６および図７に示す。図６は脾臓と腎臓の結果を示し、図７は肝臓と精巣の結果を示す。ＳＢ１およびＳＢ１ライクに対応する５０ｋＤ付近の主要なバンドは共通に見られた。さらに、臓器特異的なバンドも見られた。
【００３２】
（比較例）
野生型のマウスの肝臓抽出液を前述と同様にして調製した。この肝臓抽出液に複合タグ付きＳＢ１を下記の手順でｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応させた。
この肝臓抽出液３０ｍｌに酵母にて作製した複合タグＦＨ付きマウスＳＢ１組み換え体溶液３００μｌ（蛋白量で３０μｇ）を加えて、１０ｒｐｍで振盪しながら４℃で２時間おいた。
得られたＦＨ−ＳＢ１添加肝臓抽出液をＮｉアガロースカラムでヒスチジンタグを利用して精製した。その後、Ｍ２アガロースカラムでフラッグペプチドタグを利用して精製した。精製は実施例と同様に行った。
【００３３】
その後、この液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、銀染色した。結果を図８に示す。図８中の各レーンは下記の通りである。
第１レーンは、肝臓抽出液をそのまま電気泳動したレーンである。
第２レーンは、ＦＨ−ＳＢ１添加肝臓抽出液をＮｉアガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第３レーンは、肝臓抽出液をＮｉアガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第４レーンは、ＦＨ−ＳＢ１を添加した溶解液（０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓアセテート（ｐＨ７．８）、０．０５Ｍ  酢酸カリウム（ｐＨ７．８）、２０％グリセロール、５ｍＭ  ２−ＭＥ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２ｍＭベンズアミジン、１μＭロイペチン、２μＭペプスタチン）をＮｉアガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第５レーンは、溶解液をＮｉアガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第６レーンは、ＦＨ−ＳＢ１添加肝臓抽出液をＮｉアガロースカラムおよびＭ２アガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第７レーンは、肝臓抽出液をＮｉアガロースカラムおよびＭ２アガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第８レーンは、ＦＨ−ＳＢ１を添加した溶解液をＮｉアガロースカラムおよびＭ２アガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第９レーンは、溶解液をＮｉアガロースカラムおよびＭ２アガロースカラムで精製した液を電気泳動したレーンである。
第１０レーンは、ＦＨ−ＳＢ１溶液を電気泳動したレーンである。
【００３４】
第２レーンから分かるように、肝臓抽出液に複合タグＦＨ付きＳＢ１を添加した液をＮｉ−アガロースカラムで精製するだけでは、夾雑物が多数混ざってうまく精製できなかった。
第６レーンには、ＳＢ１のバンドが観察されるのみであり、肝臓抽出液に複合タグＦＨ付きＳＢ１を添加した液を精製しても、ＳＢ１と複合体を形成する蛋白質を得ることはできなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでは形成される蛋白質複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏでも形成されるわけではないことが分かる。
一方、本発明の方法では、ＳＢ１と生体内で蛋白質複合体を形成する蛋白質が精製された。つまり、本発明によれば、比較例に示した如くに従来得ることができなかった生体内蛋白質複合体を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明は、生体内蛋白質複合体の研究の分野で研究材料または研究方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明のトランスジェニック動物の作製手順と生体内蛋白質複合体の作製手順を示す概念図である。
【図２】本発明の生体内蛋白質分離方法の手順をを示す概念図である。
【図３】本発明のトランスジェニックマウスに導入した遺伝子が生体内で発現され蛋白質が合成されていることを示す電気泳動写真である。
【図４】本発明のトランスジェニックマウスの各組織抽出液ごとのＦＨ−ＳＢ１および内在性ＳＢ１の発現を示す電気泳動写真である。
【図５】本発明のトランスジェニックマウスの精巣から生体内蛋白質複合体精製分離し、前記生体内蛋白質複合体を電気泳動した電気泳動写真である。
【図６】本発明のトランスジェニックマウスの脾臓および腎臓から生体内蛋白質複合体精製分離し、前記生体内蛋白質複合体を電気泳動した電気泳動写真である。
【図７】本発明のトランスジェニックマウスの肝臓および精巣から生体内蛋白質複合体精製分離し、前記生体内蛋白質複合体を電気泳動した電気泳動写真である。
【図８】野生型マウスの肝臓抽出液に複合タグＦＨ付きＳＢ１をｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応させて電気泳動した電気泳動写真である。
【符号の説明】
【００３７】
１    遺伝子ｘ
２    ポリヌクレオチドｆｈ
３    遺伝子ｆｈ−ｘ
４    受精卵
５    マウス
６    生体内蛋白質複合体Ｚ
７    蛋白質Ｘ
８    別の蛋白質Ｙ
９    複合タグＦＨ
１０  ヒスチジン
１１  フラッグペプチド
１２  複合タグＦＨ付き生体内蛋白質Ｚ
１３  生体材料抽出液
１４  夾雑蛋白質
１５  ニッケル結合担体
１６  ニッケル
１７  抗フラッグペプチド抗体結合担体
１８  抗フラッグペプチド抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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