(57)【要約】【課題】光の照射によりリガンドを簡便に固定化することができ、標的物質を高い選択率で吸着し得るアフィニティー吸着体を与えるフォトアフィニティービーズ、及びこのフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体であって、従来のアフィニティー吸着体よりも、標的物質を迅速かつ簡便に、選択性よく分離・精製し得ると共に、物理的強度の高いアフィニティー吸着体を提供する。【解決手段】固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂からなる支持体に、トリフルオロメチルアリールジアジリン、ベンゾフェノン又はアジド化合物からなる光標識化合物を直接又はスペーサを介して結合してなるフォトアフィニティービーズ、及びこのフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂からなる支持体に、トリフルオロメチルアリールジアジリン、ベンゾフェノン又はアジド化合物からなる光標識化合物を直接又はスペーサーを介して結合してなるアフィニティービーズ。
【請求項２】
樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂が、樹脂表面をポリエチレングリコール又はメタクリル化ホスファチジルコリンポリマーからなる非特異的吸着挙動を抑制する化合物でコーティングしてなる、スチレン系樹脂、ヒドロキシメチルフェニル系樹脂又はアクリルアミド系樹脂を母体樹脂とするものである請求項１に記載のフォトアフィニティービーズ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体。
【請求項４】
リガンドと特異的に相互作用する物質がタンパク質である請求項３に記載のアフィニティー吸着体。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記アフィニティー吸着体に固定化されてなるリガンドと特異的に相互作用する物質（標的物質）を、該アフィニティー吸着体に吸着させることを特徴とする標的物質の分離・精製方法。
【請求項６】
アフィニティー吸着体に固定化されてなるリガンドがリトコール酸、エポラクタエン又はＣ18−β−ＳＱＤＧであり、標的物質がＤＮＡポリメラーゼβである請求項５に記載の標的物質の分離・精製方法。
【請求項７】
作用機構が未知のリガンドが固定化されてなる請求項３又は４に記載のアフィニティー吸着体に、被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記リガンドと特異的に相互作用する物質を、該アフィニティー吸着体に吸着させたのち、吸着された物質の解析を行うことを特徴とする特定物質の単離・同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォトアフィニティービーズ、アフィニティー吸着体及び標的物質の分離・精製方法と特定物質の単離・同定方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、光の照射によりリガンドを簡便に固定化し得るフォトアフィニティービーズ、このフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体、及びこのアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記リガンドと特異的に相互作用する標的物質を、迅速かつ簡便に分離・精製する方法と特定物質を簡便に単離・同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物起源の物質には、酵素と基質、酵素と特異的インヒビター、抗原と抗体、レクチンと糖又は糖タンパク質、ホルモンとホルモン受容体のように、相互に特異的な親和性を示す相補的な物質の対が存在することが知られている。アフィニティー精製法は、前記の相補的な物質の対の一方の物質を用い、「対」の内の他方の物質（標的物質）を捕捉し、分離・精製する方法である。
このようなアフィニティー精製方法は、リガンド(標的物質に対して親和性のある物質）の支持体の違いにより、（１）クロマトグラフィー法、（２）抽出法、（３）膜法に大別することができる。前記のクロマトグラフィー法は、例えば多孔性アガロースゲルなどの支持体表面にリガンドを固定化させてなるアフィニティー吸着体をカラムに充填し、これに試料液、洗浄液及び溶離液を順次通液し、溶離液に精製された標的物質を回収する方法である。また、抽出法は、微小支持体やポリマーにリガンドを固定化させてなるアフィニティー吸着体を試料液に添加し、標的物質を結合させたのち、分離回収する方法である。一方、膜法は、例えば中空糸型多孔膜を支持体とし、これにリガンドを固定化させてなるアフィニティー吸着膜に、試料液を通過させ、孔表面のリガンドにより、標的物質を捕捉する方法である。
これらのアフィニティー精製方法の中で、クロマトグラフィー法が最も広く利用されている。しかしながら、このクロマトグラフィー法では、従来支持体として、アガロース、セルロース、親水性ポリビニールアルコール、アクリレート系ポリマー、ポリアクリルアミドなどが用いられているが、支持体の物理的強度が低かったり、リガンドの結合方法がやっかいであったり、分離・精製に時間を要したりするなどの問題があった。
このような問題に対処するために、例えば物理的強度の高い支持体として、スチレンとグリシジルメタクリレートと架橋剤であるジビニルベンゼンとの架橋共重合体からなり、かつ表面をグリシジルメタクリレートでコーティングしてなるビーズを用い、これにリガンドを固定化し、抗炎症剤Ｅ３３３０（医薬品の開発コード番号）［例えば、非特許文献１参照］や、ＦＫ５０６（医薬品の開発コード番号）［例えば、非特許文献２参照］の標的タンパク質を分離・精製する技術が報告されている。
しかしながら、前記ビーズは、技術的にリガンドの固定化が困難である、一部の有機溶媒に不安定である、リガンドの固定化において遠心分離などの後処理に手間がかかる、などの問題があった。
ところで、従来、合成ペプチドをリガンドとするアフィニティー吸着体を作製する場合には、合成ペプチドを単離・精製しなければならず、煩雑な作業が必要とされていた。また、特に合成ペプチドの量が少ない小スケールの合成時には、該合成ペプチドを単離・精製してアガロースなどの支持体に固定化させるには、ロスなどによって効率が著しく低下するのを免れないという問題があった。
一方、近年、コンビナトリアル・ケミストリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の急速の発展に伴い、反応操作が簡便で自動化が容易である固相での有機反応が注目されている。この固相反応は、ペプチド固相合成において最初に適用された反応であり［例えば、非特許文献３参照］、ジビニルベンゼンなどで架橋されたポリスチレン等の高分子重合体を修飾して官能基を導入し、それを足がかりにして主要な合成を高分子重合体上で行い、最後に高分子重合体から合成物質を適当な方法で切り離して目的物を得る方法である。前記高分子重合体は、溶媒に不溶であるため、個々の反応の後処理は、基本的にはろ過で不要なものを全て洗い流すのみでよく、固相反応の操作は極めて簡略化されている。したがって、機器を用いた自動化が容易で、多種類の化合物群（ライブラリー）を合成するのに適している。
本発明者らは、このような固相有機合成用樹脂に着目し、このものを支持体としてリガンドを簡便に固定化し、有機溶媒に対する安定性の向上や後処理の簡便さを図ってきた。その一環として、ポリヒドロキシメチルフェノキシ樹脂にＤＮＡポリメラーゼβの阻害剤であるリトコール酸を結合させたカラムを作製し、Ｈｉｓ−β（ＤＮＡポリメラーゼβ＋ポリヒスチジン）を分離・精製できるかを確認した。しかしながら、その際、Ｈｉｓ−β以外にもリトコール酸と相互作用するはずのないリゾザイムも吸着してしまい、樹脂自体に非特異的な吸着があるということが判明した。
一方、リガンドの固定化方法として、フォトアフィニティーラベルを利用する方法が知られている。このフォトアフィニティーラベルを利用する方法は、光を用いて薬剤、タンパク質などを固定化する簡便な方法であり、生物分野で広く利用されている方法である。該フォトアフィニティーラベルに適用される活性中間体としては、例えばカルベンやニトレン、ケチルラジカルなどが知られており、カルベンの前駆体としてジアゾ基やその環状異性体であるジアジリニル基が、ニトレンの前駆体としてアジド基が、ケチルラジカルの前駆体としてベンゾフェノンのような芳香族ケトンがよく用いられている。
前記活性中間体の中で、カルベンは反応性が高く、その前駆体はラベル化材として有用である。このカルベン前駆体の中で、ジアジリン型の光標識化合物であるトリフルオロメチルアリールジアジリンは、比較的長波長側（３５０ｎｍ）でカルベンを発生し、ラベル化を行える化合物として、近年注目されている。しかしながら、このトリフルオロメチルアリールジアジリンは、従来のジアジリン型の光標識化合物に比べて転移反応を抑え、かつ化学的安定性を増すことによって安定したラベル化を行える有用なラベル化材であるが、その化学合成の困難さから、これまであまり用いられることがなかった。また、固相有機合成用樹脂に、光標識化合物として前記トリフルオロメチルアリールジアジリンを結合してなるフォトアフィニティービーズは、これまで知られていない。
一方、最近、ジアジリン化合物の効率的な合成法の確立が報告され、その汎用性が高まっている［例えば、非特許文献４参照］。
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，７８４（１９９８）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３４１，７５８（１９８９）
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９６３）
【非特許文献４】Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，４６，１１９（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような事情のもとで、光の照射によりリガンドを簡便に固定化することができ、標的物質を高い選択率で吸着し得るアフィニティー吸着体を与えるフォトアフィニティービーズ、このフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体であって、従来のアフィニティー吸着体よりも、標的物質を迅速かつ簡便に、選択性よく分離・精製し得ると共に、物理的強度の高いアフィニティー吸着体、及びこのアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、その中に存在する標的物質を迅速かつ簡便に分離・精製する方法と特定物質を簡便に単離・同定する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、フォトアフィニティービーズにおける支持体として、固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂を用い、これに光標識化合物として特定の構造を有する化合物を固定化することにより、その目的を達成し得ることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂からなる支持体に、トリフルオロメチルアリールジアジリン、ベンゾフェノン又はアジド化合物からなる光標識化合物を直接又はスペーサーを介して結合してなるアフィニティービーズ、
（２）樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂が、樹脂表面をポリエチレングリコール又はメタクリル化ホスファチジルコリンポリマーからなる非特異的吸着挙動を抑制する化合物でコーティングしてなる、スチレン系樹脂、ヒドロキシメチルフェニル系樹脂又はアクリルアミド系樹脂を母体樹脂とするものである上記(１)項に記載のフォトアフィニティービーズ、
（３）上記(１)又は(２)項に記載のフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体、
（４）リガンドと特異的に相互作用する物質がタンパク質である上記(３)項に記載のアフィニティー吸着体、
（５）上記(３)又は(４)項に記載のアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記アフィニティー吸着体に固定化されてなるリガンドと特異的に相互作用する物質（標的物質）を、該アフィニティー吸着体に吸着させることを特徴とする標的物質の分離・精製方法、
（６）アフィニティー吸着体に固定化されてなるリガンドがリトコール酸、エポラクタエン又はＣ18−β−ＳＱＤＧであり、標的物質がＤＮＡポリメラーゼβである上記(５)項に記載の標的物質の分離・精製方法、及び
（７）作用機構が未知のリガンドが固定化されてなる上記(３)又は(４)項に記載のアフィニティー吸着体に、被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記リガンドと特異的に相互作用する物質を、該アフィニティー吸着体に吸着させたのち、吸着された物質の解析を行うことを特徴とする特定物質の単離・同定方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、支持体として固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂を用い、これに特定の光標識化合物を結合させることにより、光の照射によってリガンドを簡便に固定化することができ、標的物質を高い選択率で吸着し得るアフィニティー吸着体を与えるフォトアフィニティービーズを提供することができる。
また、前記フォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されてなるアフィニティー吸着体であって、従来のアフィニティー吸着体よりも、標的物質を迅速かつ簡便に、選択性よく分離・精製し得ると共に、物理的強度の高いアフィニティー吸着体、及びこのアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、その中に存在する標的物質を迅速かつ簡便に分離・精製する方法と特定物質を簡便に単離・同定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明のフォトアフィニティービーズは、固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂からなる支持体に、光標識化合物としてトリフルオロメチルアリールジアジリン、ベンゾフェノン又はアジド化合物からなる光標識化合物を直接又はスペーサを介して結合していることを特徴とし、光の照射により、リガンドを固定化し得る機能を有している。
当該フォトアフィニティービーズにおいて、支持体として用いられる固相有機合成用樹脂は、樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制されたものを好ましく用いることができる。この固相有機合成用樹脂が、非特異的吸着挙動を示す場合には、前記樹脂を支持体とするフォトアフィニティービーズを用いて得られたアフィニティー吸着体は、それに固定されたリガンドと特異的に相互作用する物質、すなわち標的物質以外の物質を吸着し、吸着選択率が低下するおそれがある。
一般に、固相有機合成用樹脂は、水や有機溶媒などの媒体に実質上不溶性の母体樹脂に、直接又はスペーサを介して官能基を導入し、この官能基を足がかりにして、該樹脂上でペプチド合成を始め、その他有機合成を行うのに用いられる樹脂である。母体樹脂としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂などのスチレン系樹脂、ヒドロキシメチルフェニル系樹脂、アクリルアミド系樹脂などが用いられる。
【０００７】
本発明においては、前記の固相有機合成用樹脂を用いてもよいが、この固相有機合成樹脂に、母体樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された性質を付与するために、母体樹脂として、スチレン系樹脂、ヒドロキシメチルフェニル系樹脂又はアクリルアミド系樹脂の表面をポリエチレングリコール又はメタクリル化ホスファチジルコリンポリマーでコーティングしたものを使用することが好ましい。
また、前記固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂の母体樹脂に導入される官能基又は官能基を有するスペーサとしては、例えばアミノメチル基、ヒドロキシメチル基、メルカプトメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ホルミル基、ジメチルシリル基、アリルジメチルシリル基、ブロモアシル基、Ｎ−メチルアミノメチル基、４−(ブロモメチル)フェニルアセトアミドメチル基、４−(ブロモメチル)フェノキシメチル基、４−ヒドラジノベンゾイルアミノメチル基、ヒドロキシエチルスルファニルメチル基、(３−ホルミルインドリル)アセトアミドメチル基、(４−メトキシフェニル)ジメチルシリルプロピル基、３−[４−(トリチルチオール−４−イル)フェニル]プロピオニルアミノメチル基、(トリチルヒドロキシド−４−イル)カルボニルアミノメチル基、(トリチルクロリド−４−イル)カルボニルアミノメチル基、(トリチルアミン−４−イル)カルボニルアミノメチル基、３−(４−ヒドロキシメチルフェノキシ)プロピオニルアミノメチル基、３−(３,５−ジメトキシ−４−ホルミルフェノキシ)プロピオニルアミノメチル基、４−(４−アミノメチル−３,５−ジメトキシフェノキシ)ブタンカルボニルアミノ基、４−(４−ホルミル−３,５−ジメトキシフェノキシ)ブタンカルボニルアミノ基、スクシンイミドキシカルボニルエチルカルボニル基などが挙げられる。
当該アフィニティービーズにおいては、前記の官能基を利用して、トリフルオロメチルアリールジアジリン、ベンゾフェノン又はアジド化合物からなる光標識化合物が、直接又はスペーサを介して固相有機合成用樹脂又は樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂の母体樹脂に結合される。
例えば、樹脂自体の非特異的吸着挙動が抑制された固相有機合成用樹脂として、式（１）
【化１】
2005221394.tif 000002
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコールを示す。）
で表されるものを用い、トリフルオロメチルアリールジアジリンとして、式（２）
【化２】
2005221394.tif 000003
（式中、Ｒは光の照射に対して不活性な置換基、ｎは０〜４の整数、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を示す。）
で表される化合物を反応させることにより、式（３）
【化３】
2005221394.tif 000004
（式中、ＰＥＧ、Ｒ、ｎ及びＴＦＡは、前記と同じである。）
で表されるフォトアフィニティービーズを得ることができる。
前記式（１）で表される固相有機合成用樹脂は、母体樹脂にコーティングされたポリエチレングリコールにおける水酸基の酸素原子に、スクシンイミドキシカルボニルエチルカルボニル基が結合した構造を有する。また、式（２）で表されるトリフルオロメチルアリールジアジリンにおいて、Ｒで表される光の照射に対して不活性な官能基としては特に制限はないが、例えば低級アルキル基や低級アルコキシル基などを挙げることができる。
【０００８】
前記反応は、トリエチルアミンやジイソプロピルエチルアミンなどのアミン類の存在下、ジメチルホルムアミドなどの溶媒中において実施することができる。フォトアフィニティービーズ中のトリフルオロメチルアリールジアジリンの結合量については特に制限はないが、通常１×１０-6〜０.５ｍｍｏｌ／ｇ程度、好ましくは０.１〜０.５ｍｍｏｌ／ｇの範囲である。なお、本発明のフォトアフィニティービーズは、前記の製造方法や例示物質に限定されるものではない。
前記式（２）において、ｎが０であるトリフルオロメチルアリールジアジリンは、例えば以下に示すスキーム（Ｉ）に従って製造することができる。
【化４】
2005221394.tif 000005
まず、３−ブロモアニソール（４）と１−トリフルオロアセチルピペリジン（５）をグリニヤール反応させて、３−トリフルオロアセチルアニソール（６）に導く。次いで、これにヒドロキシルアミン塩酸塩を反応させてオキシム体（７）を得たのち、トシル化後、アンモニアを作用させてジアジリジン体（８）を得る。次に、このジアジリジン体（８）を酸化して３−(３−メトキシフェニル)−３−(トリフルオロメチル)−３Ｈ−ジアジリン（９）に導いたのち、三臭化ホウ素を作用させて、メトキシ基をヒドロキシル基に変換してフェノール体（１０）を得る。このフェノール体（１０）に、Ｂｏｃ化エタノールアミン（１１）を反応させて（１２）を得たのち、トリフルオロ酢酸を作用させて、脱Ｂｏｃ化を行うことにより、目的の２−[３−(３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル)−フェノキシ]−エチルアミン トリフルオロアセテート（２−ａ）を得ることができる。
【０００９】
本発明のアフィニティー吸着体は、前記のようにして得られたフォトアフィニティービーズに、光の照射によりリガンドが固定化されたものである。照射する光の波長としては、通常２００〜６００ｎｍ程度、好ましくは３００〜４００ｎｍの範囲である。
当該アフィニティー吸着体は、これに被処理液を接触させることにより、該被処理液中に存在する前記リガンドと特異的に相互作用する物質を吸着分離する機能を有している。
本発明において、リガンド、及び該リガンドと特異的に相互作用する物質とは、例えば酵素と基質、酵素と特異的インヒビター、抗原と抗体、レクチンと糖又は糖タンパク質、ホルモンとホルモン受容体、ＤＮＡと発がん性又は変異原生物質、プロテインＡと免疫グロブリンＧなどのように相互に特異的な親和性を示す相補的な物質の対を指し、これらの「対」のいずれかをリガンドとして支持体に固定化させるかは、「対」の種類やその他の状況に応じて適宜選択される。リガンドが固定化されたアフィニティー吸着体に、標的物質を含む被処理液を接触させると、リガンドに親和性のない物質は吸着されずに、相補的な物質（標的物質）のみが吸着される。
このように、固相有機合成用樹脂からなる支持体に、光の照射によりリガンドを固定化させて得られた本発明のアフィニティー吸着体は、従来のアガロースなどの支持体にリガンドを固定化させてなるアフィニティー吸着体に比べて、物理的強度が高く、また、標的物質の分離・精製を迅速かつ簡便に効率よく行うことができる。
本発明のアフィニティー吸着体においては、リガンド及び該リガンドと特異的に相互作用する物質（標的物質）については特に制限はなく、前述で例示した「対」などの中から適宜選択することができるが、特にタンパク質を標的物質とするリガンドを固定化させたものが好ましい。またその使用形態についても特に制限はなく、例えば粒状吸着体の形でカラムに充填し、アフィニティー・クロマトグラフィー用として用いてもよく、あるいは中空糸型の多孔膜の形でアフィニティー膜として用いてもよい。
【００１０】
本発明の標的物質の分離・精製方法においては、前記のようにして得られたアフィニティー吸着体に被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記アフィニティー吸着体に固定化されてなるリガンドと特異的に相互作用する物質（標的物質）を、該アフィニティー吸着体に吸着させたのち、適当な溶離液で脱着させることにより、該標的物質の分離・精製を行う。
この方法においては、標的物質の種類に応じて、アフィニティー吸着体に固定化させるリガンドが選択される。例えばリガンドとして、標的物質が酵素である場合には該酵素のインヒビターを、抗体である場合には抗原を、糖又は糖タンパク質である場合にはレクチンを、ホルモンである場合にはホルモン受容体を用いることができる。
本発明の標的物質の分離・精製方法は、酵素などのタンパク質の分離・精製に好ましく適用することができる。
次に、酵素の分離・精製方法について、具体的に説明する。
ＤＮＡポリメラーゼα，βは真核細胞の核に存在し、それぞれＤＮＡを複製及び修復する酵素である。これらの酵素の中で、特にＤＮＡポリメラーゼβの阻害剤として、リトコール酸（Ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、エポラクタエン（Ｅｐｏｌａｃｔａｅｎｅ）及びＣ18−β−ＳＱＤＧ(Ｒ＝１８：０)が有効であることが知られており、そのＩＣ50は、それぞれ１１μｍｏｌ／Ｌ、９４μｍｏｌ／Ｌ及び４３μｍｏｌ／Ｌである。それぞれの構造式を以下に示す。なお、Ｃ18−β−ＳＱＤＧ（Ｒ＝１８：０）は、３−Ｏ−(６−デオキシ−６−スルフォノ−β−Ｄ−グルコピラノシル)−ビス−１,２−Ｏ−オクタデカノイルグリセロールの略称である。
【化５】
2005221394.tif 000006
固相有機合成用樹脂からなる支持体に前記リコール酸、エポラクタエン又はＣ18−β−ＳＱＤＧをリガンドとして固定化させてなるアフィニティー吸着体に、ＤＮＡポリメラーゼβを含む被処理液を接触させると、該被処理液中のＤＮＡポリメラーゼβは選択的に吸着される。
【００１１】
本発明の特定物資の単離・同定方法においては、固相有機合成用樹脂からなる支持体に、作用機構が未知のリガンドが、本発明に係る方法で固定化されてなるアフィニティー吸着体に対し、被処理液を接触させ、該被処理液中に存在する前記リガンドと特異的に相互作用する物質を、該アフィニティー吸着体に吸着（リガンドに結合）させたのち、吸着された物質を解析することにより、特定物質の単離・同定を行う。
リガンドに結合した物質の解析は、例えばファージディスプレイ法などを適用することができる。
本発明のフォトアフィニティービーズは、以下に示す利用が考えられる。
（１）生物活性物質を固定化し、その標的タンパク質を探索、分離精製することができる。
（２）標的タンパク質を濃縮できるので、微量タンパク質を高感度で検出、定量できる。
（３）タンパク質やＤＮＡを容易に樹脂に固定化し得るので、ＤＮＡチップやプロテインチップのような、これらの機能を利用した検出法にも適用できる。
また、具体的な用途としては、例えば医薬品の作用機構の解明、疾患の原因タンパク質を分解するタンパク質の探索、劇症肝炎の診断、肝機能や糖尿病の診断、膵疾患の検査、内分泌撹乱物質の検出、ＤＮＡチップやプロテインチップとしての利用、固定化酵素の作製などが考えられる。
【実施例】
【００１２】
次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
製造例１  式（２−ａ）化合物の合成
（１）３−(３−メトキシフェニル)−３−(トリフルオロメチル)−３Ｈ−ジアジリン（９）
標題化合物は、文献（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，３８３−３８７）記載の方法に従って合成した。
【化６】
2005221394.tif 000007
アルゴン気流下、オキザリルクロライド０.２４ｍＬ（２.８ｍｍｏｌ）を溶かしたジクロロメタン溶液４ｍＬに−７８℃でジメチルスルホキシド０.２３ｍＬ（３.０ｍｍｏｌ）を加え、そのままの温度で１０分間撹拌した。続いて、ジアジリジン体（８）５４６.８ｍｇ（２.５ｍｍｏｌ）の溶解したジクロロメタン溶液３ｍＬを−７８℃で加え、３０分間そのままの温度で撹拌した。撹拌終了後、トリエチルアミン１.７５ｍＬ（１２.５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１.５時間撹拌した。反応溶液を水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：Ｅｔ2Ｏ＝８：１）にて精製して生成物（９）３５１.０ｍｇ（６５％）を得た。
Ｒｆ値：（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝３：１）０.６６
1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：
δ  ３.８１（３Ｈ，ｓ，ＯＭｅ）
６.６９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２）
６.７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８.１Ｈｚ，Ｈ−６）
６.９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.４，８.１Ｈｚ，Ｈ−４）
７.３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.１，８.１Ｈｚ，Ｈ−５）
（２）{２−[３−(３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル)−フェノキシ]−エチル}カルバミン酸  ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２）
【化７】
2005221394.tif 000008
フェノール体（１０）２３０.４ｍｇ（１.１ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃエタノールアミン５５１.２ｍｇ（３.４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１２ｍＬに溶かし、トリフェニルホスフィン２６２.９ｍｇ（２.９ｍｍｏｌ）を加えた。さらに５０℃でジエチルジアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）（４０％濃度のトルエン溶液）１.６ｍＬ（３.４ｍｍｏｌ）を加え、そのままの温度で２時間撹拌した。反応溶液の溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６：１）にて精製して生成物（１２）３０２.７ｍｇ（７７％）を得た。
Ｒｆ値：（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝３：１）０.５５
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３２１，３０３５，３００４，２９８７，２９７８，２９５０，２９２５，２８７１，１７０４，１６８７，１６５５，１６０９，１５８２，１５３１，１３６６，１３０３，１２５２，１２１２，１１７３，１１５１，１９７３，７８３
1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：
δ  １.４５（９Ｈ，ｓ，−Ｏｔ−Ｂｕ）
３.６８（２Ｈ，ｂｒ，ｄｔ，−ＣＨ2ＮＨ−）
４.０１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４.８Ｈｚ，−ＯＣＨ2−）
４.９８（１Ｈ，ｂｒ，ＮＨ）
６.６７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２）
６.７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７.９Ｈｚ，Ｈ−６）
６.９３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４）
７.３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７.９，７.９Ｈｚ，Ｈ−５）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ  ２８.４，４０.０，６７.４，７７.２，７９.７，１１３.０，１１５.４，１１９.１，１２２.０（ｑ），１３０.１，１３０.６，１５５.８，１５８.８
ＨＲＭＳ：ＨＲＭＳ：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ15Ｈ18Ｏ3Ｆ3Ｎａ(Ｍ＋Ｎａ+)３６８．１１９２，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ３５８．１２０８
ｍ．ｐ．：３５−３７℃
（３）２−[３−(３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−３−イル)−フェノキシ]−エチルアミン トリフルオロアセテート（２−ａ）
【化８】
2005221394.tif 000009
Ｎ−Ｂｏｃ体（１２）３０２.７ｍｇ（０.８８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液８.８ｍＬに０℃でトリフルオロ酢酸４.４ｍＬを加えて、そのままの温度で１時間撹拌した。反応溶媒を留去し、得られた粗生成物をクロロホルム／ヘキサンで結晶化を行い、生成物（２−ａ）２２９.８ｍｇ（７３％）を得た。
ＩＲ（ＫＢｒ）：３４１２，３０５０，２９５２，２８５６，１６８５，１６１４，１５８３，１５３０，１４９５，１４５１，１４３２，１２９７，１２７１，１２０７，１１８６，１１５１
1Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：
δ  ３.２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５.０Ｈｚ，−ＣＨ2ＮＨ−）
４.１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５.０Ｈｚ，−ＯＣＨ2−）
６.７６（１Ｈ，ｂｒ，Ｈ−２）
６.８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.１，０.７Ｈｚ，Ｈ−６）
６.９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２.４，８.１Ｈｚ，Ｈ−４）
７.３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８.１，８.１Ｈｚ，Ｈ−５）
13Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：δ  ２９.４（ｑ），４０.２，６５.６，１１４.４，１１７.０，１１８.２（ｑ），１２０.７，１２３.５，１３１.６，１３１.８，１５９.９，１６３.１（ｑ）
ＨＲＭＳ：ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ10Ｈ11Ｎ3ＯＦ3(Ｍ−ＣＦ3ＣＯ2)２４６．０８４８，ｆｏｕｎｄ ｆｏｒ ２４６．０８４８
ｍ．ｐ．：１０８−１０９℃
【００１３】
実施例１  フォトアフィニティービーズの製造
式（１）で表される固相有機合成用樹脂ビーズ「Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＣＯＯＳｕ」５６.０ｍｇ（コハクイミドの含有量：０.５ｍｍｏｌ／ｇ）と、製造例１で得られた式（２−ａ）で表されるアリーロキシエチルアミン・トリフルオロ酢酸塩体２０ｍｇ（０.０５６ｍｍｏｌ）を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）液中に、ジイソプロピルエチルアミン０.０２ｍＬ（０.１１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３４時間撹拌した。なお、撹拌は［東京理化器械(株)製「ＥＹＥＬＡ  ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００」］を用いて、１５×１００ｒｐｍの撹拌速度で行った。
次いで、ろ過によりビーズを回収し、メタノールで洗浄を３回繰り返した。ろ液の溶媒を留去し、残渣の1Ｈ−ＮＭＲから、式（３）（ただし、ｎ＝０）で表されるビーズが６１％の収率（アリーロキシエチルアミン・トリフルオロ酢酸塩体の収率）で得られたことが分かった。回収したビーズは真空乾燥処理することにより、フォトアフィニティービーズを得た。
このフォトアフィニティービーズは、０.１６５ｍｍｏｌ／ｇのジアジリニル基を有するものである。
実施例２  アフィニティー吸着体の製造
実施例１で得られたフォトアフィニティービーズ３０ｍｇと、基質５.０μｍｏｌを含む各溶液［エポラクタエン；リトコール酸を含むメタノール溶液；Ｃ18−β−ＳＱＤＧ(Ｒ＝１８：０)を含むクロロホルム／メタノール／水の混合溶剤溶液］を耐熱ガラス容器中で３０分間撹拌した。撹拌条件は、実施例１と同様である。次いで、窒素ガスを吹きかけ溶媒を除去し、残渣を３時間真空乾燥した。その後、残渣を光反応装置に入れ、高圧水銀灯にて波長２００〜６００ｎｍの光を１時間照射した。なお、高圧水銀灯は、ウシオ電機社製「ＵＭ−４５２」を、安定器にウシオ電機社製「ＵＭ−４５３−Ａ」を使用した。また、冷却管には東京理化器械(株)製「ＥＹＥＬＡ  ＣＯＯＬ  ＡＣＥ  ＣＡ−II II」を接続して０℃に設定した。
その後、ろ過によりビーズを回収し、エポラクタエン、リトコール酸はメタノール、Ｃ18−β−ＳＱＤＧはクロロホルム／メタノール／水の混合溶媒にて洗浄を３回繰り返した。回収したビーズを真空乾燥処理して、アフィニティー吸着体を得た。
実施例３  ＤＮＡポリメラーゼβの吸着実験
実施例２で得られた各アフィニティー吸着体（リトコール酸固定吸着体をＬＣＡビーズ、エポラクトエン固定吸着体をｅｐｏビーズ、Ｃ18−β−ＳＱＤＧ(Ｒ＝１８：０)固定ビーズをＳＱＡＧビーズと称す。）と、コントロール用のビーズを用いて、ＤＮＡポリメラーゼβ（以下、Ｈｉｓ−βと略記する。）の吸着実験を、以下のようにして実施した。
なお、コントロール用のビーズとして、「Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＣＯＯＳｕ」を加メタノール分解処理してなるコントロール樹脂ビーズを作製した。
（イ）透析用の緩衝液として、下記の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の３種のＮａＣｌ濃度の異なる緩衝液を、それぞれ２Ｌずつ調製した。
（Ａ）緩衝液
ＮａＣｌ：１００ミリモル／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）：５０ミリモル／Ｌ
ＥＤＴＡ：１ミリモル／Ｌ
（Ｂ）緩衝液
ＮａＣｌ：２００ミリモル／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）：５０ミリモル／Ｌ
ＥＤＴＡ：１ミリモル／Ｌ
（Ｃ）緩衝液
ＮａＣｌ：５００ミリモル／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）：５０ミリモル／Ｌ
ＥＤＴＡ：１ミリモル／Ｌ
（ロ）大腸菌で発現させたＨｉｓ−βの溶液（約２〜４.５ｍｇ／ｍＬ）約３〜４ｍＬを、それぞれ上記の透析用緩衝液を用いて透析に付した。この際、透析用緩衝液は、１Ｌずつ２回で入れ換えを行った。
次いで、ＬＣＡビーズ、ｅｐｏビーズ、ＳＱＡＧビーズ、コントロール用のビーズを、それぞれ３本のエッペンの内の２本の中に１０ｍｇずつ入れた。続いて、前記のＮａＣｌ濃度が異なる（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の３種類の透析用の緩衝度を、ＬＣＡビーズ、ｅｐｏビーズ、ＳＱＡＧビーズ、コントロール用のビーズが入ったエッペンの中に、それぞれ１０００μＬずつ加えて膨潤させた。なお、空のエッペンの中にも、前記３種類の透析用緩衝液を同量ずつ入れておく。
（ハ）上記エッペン９本の中に、透析後のＨｉｓ−βをそれぞれ２００μＬずつ入れ、一晩４℃で反応させた。一晩反応させたＬＣＡビーズ、ｅｐｏビーズ、ＳＱＡＧビーズ、コントロール用のビーズの入ったエッペンを氷上で静置し、ビーズを沈殿させたのち、その上澄の溶液を採取した。
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）溶液（５倍希釈液）をエッペンの中に１ｍＬずつ入れ、その中に上記の採取したビーズ上澄溶液、透析用緩衝液とＨｉｓ−βのみでビーズの入っていない溶液、検量線用に各濃度のγ−グロブリン溶液（１ｍｇ／ｍＬ、０.５ｍｇ／ｍＬ、０.２５ｍｇ／ｍＬ、０.１２５ｍｇ／ｍＬ、０ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれ３０μＬずつ加え、よくまぜ合わせ、その後室温で１５分間放置してから、吸光度計で、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。
（ニ）γ−ブロブリン溶液の各濃度と吸光度との関係から検量線を作成し、その検量線を用いて、上澄溶液のタンパク質濃度と、透析用緩衝液とＨｉｓ−βのみでビーズの入っていなかった溶液のタンパク質濃度を求めた。このタンパク質濃度から、ビーズに吸着したＨｉｓ−βの量を算出した。
図１にタンパク質定量検量線を、図２に、各ビーズ１０ｍｇ当たりのＨｉｓ−β吸着量を柱状グラフで示す。
その結果、コントロール用のビーズにおいて少量の非特異的吸着が見られるが、３種類の化合物を固定化したビーズすべてにおいてＨｉｓ−βが吸着するということが分かった。また、本来３種類の化合物の中で最もＤＮＡポリメラーゼβの阻害活性が強いはずのＬＣＡビーズがＳＱＡＧビーズよりもＨｉｓ−βの吸着量が少ないという結果も得られた。このことは光反応における非特異的な反応に原因があると考えている。つまり、ＬＣＡビーズの活性部位はそのカルボン酸にあり、非特異的な光反応によって活性部位であるカルボン酸と結合したためにＨｉｓ−βの吸着量は減少したと考えられる。それに比べＳＱＡＧビーズの場合は糖の水酸基など活性に係わらない官能基が数多く存在するためにその活性が失われなかったと判断できる。
実施例４  ベンゾフェノンを樹脂に固定化したフォトアフィニティービーズの製造
【化９】
2005221394.tif 000010
式（１）で表される固相有機合成用樹脂ビーズ「Ｔｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＣＯＯＳｕ」１６１ｍｇ（コハクイミドの含有量：０.５ｍｍｏｌ／ｇ）と、文献記載（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９５年５巻３６３頁）に準じて合成した(４−ヒドロキシメチルフェニル)フェニルメタノン（式１３）３４ｍｇ（０.１６ｍｍｏｌ）を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中に、トリエチルアミン０.２５ｍＬ（１.８ｍｍｏｌ）を加え、２４℃にて５０時間撹拌した。なお撹拌は東京理化器械(株)製「ＥＹＥＬＡＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００」を用いて、１５ｘ１００ｒｐｍの撹拌速度で行った。
次いで、ろ過によりビーズを回収し、メタノールで洗浄を３回繰り返した。回収したビーズは、真空乾燥処理することにより、フォトアフィニティービーズ（式１４）を得た。ろ液の溶媒を留去した後、残留物をシリカゲルカラムにより分離し、未反応の(４−ヒドロキシメチルフェニル)フェニルメタノンが８４％回収されたことから、１６％の収率であった。
【産業上の利用可能性】
【００１４】
本発明のフォトアフィニティービーズを用いることにより、光の照射で簡便にリガンドを固定することができ、このアフィニティー吸着体を使用することによって、被処理液中の標的物質を迅速かつ簡便に分離・精製することができると共に、被処理液中の特定物質を簡便に単離・同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例３におけるタンパク質定量検量線である。
【図２】実施例３における各ビーズ１０ｍｇ当たりのＨｉｓ−β吸着量の柱状グラフである。
【図１】
2005221394.tif 000011
【図２】
2005221394.tif 000012