(57)【要約】  【課題】    人手を介すること無く正確且つ迅速なHLAの型決定を行うことができる、HLAタイピング法を提供する。  【解決手段】    既知のHLAの塩基配列データを基に、予測される全対立遺伝子の組み合わせを記載したデータベースを作成し、シーケンスによって決定した検体の塩基配列と、上記のデータベース上の配列の一致する領域を一塩基ずつ比較して、不一致の数が最も少ない組み合わせ配列をその遺伝子座のHLA型として決定する。上記データベース作成の際には、塩基未決定の領域があっても削除することなく配列データの掛け合わせを行う。また、シーケンスにより確定された各塩基に、シーケンス確度を示す値を付与しておくことで、タイピング結果の信頼度を客観的に評価することができる。更にタイピングの結果複数の候補があった場合、コンピュータプログラムにより、自動的にアリル頻度に基づく絞り込みを行う。  【選択図】  図５
2005102599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLAクラスI及びクラスIIに属する各遺伝子座の少なくとも一つの遺伝子座について、その塩基配列情報に基づいてHLA型を判定する方法において、
a)既知のHLAの塩基配列データを基に予め予測される全対立遺伝子の組み合わせを記載したデータベースを作成するデータベース作成ステップと、
b)検体の該当遺伝子座の少なくとも一部の塩基配列をシーケンスによって決定する塩基配列決定ステップと、
c)その塩基配列をデータベース中の個々の配列に一致する部分について１塩基ずつ比較を行い、不一致の数が少ない対立遺伝子の組み合わせを検体の遺伝子型の候補として抽出する配列検索ステップと、
d)不一致の数が最も少ない対立遺伝子の組み合わせをその遺伝子座のHLA型として決定する型判定ステップと、
を有することを特徴とするHLAタイピング法。
【請求項２】
上記データベース作成ステップにおいて、既知のHLAの塩基配列データから目的の遺伝子座に相当する遺伝子の配列を並べ、塩基が未決定の領域があっても削除することなく塩基配列データの掛け合わせを行うことを特徴とする請求項１に記載のHLAタイピング法。
【請求項３】
更に、上記塩基配列決定ステップにより決定された塩基配列の個々の塩基について、シーケンス確度を表す指標値を付与する指標値付与ステップと、不一致部分の指標値や、配列全体の指標値の平均からタイピング結果の信頼度を客観的に評価する精度評価ステップを有することを特徴とする請求項１又は２に記載のHLAタイピング法。
【請求項４】
上記配列検索ステップにおいて、既存のホモロジー検索プログラム、これらの改良プログラム、又はこれらアルゴリズムに相当するプログラムのいずれかを使用し、上記精度評価ステップにおいて、最も有意なアライメント部分における不一致の数とそれぞれの位置を測定してタイピングの結果を評価することを特徴とする請求項３に記載のHLAタイピング法。
【請求項５】
更に、複数の候補があった場合にその検体の情報をコメントとして入力し、事前にデータベース化された人種や地域等によって偏るアリル頻度に基づく意味づけや、アミノ酸配列に翻訳した場合の情報などを基に型の絞り込みを行う絞り込みステップを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のHLAタイピング法。
【請求項６】
DNAシーケンサからアウトプットされた塩基配列情報を基にコンピュータシステムによって自動的にHLAタイピングを達成することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のHLAタイピング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLAの型を塩基配列情報に基づいて判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのMHC（主要組織適合性複合体）分子であるHLA（ヒト白血球膜抗原）分子は細胞表面に発現し、免疫系において重要な役割を果たす細胞膜抗原である。HLA分子はその機能や構造によってHLAクラスIとクラスIIに分けられており、クラスI分子は、ほぼ全ての細胞で発現し、クラスII分子はB細胞など限られた細胞のみで発現している。HLA遺伝子は第６染色体上に存在しており、主な遺伝子座としてクラスI分子をコードするHLA-A座、HLA-B座、HLA-C座と、クラスII分子をコードするHLA-DP座、HLA-DQ座、HLA-DR座がある。上記の遺伝子座にはそれぞれ多くの型が存在しており、このHLAの型を判定することは臓器（組織）移植時の適合性を判断する上で非常に重要である。そのため、従来より血清学的方法や細胞学的方法によるHLAの型判定（タイピング）が行われてきた。しかし、上記のような方法は時間や手間が掛かる上に、判定の精度も必ずしも十分とは言えなかった。
【０００３】
近年、遺伝子解析技術の進歩に伴い、塩基配列情報に基づいたHLAのタイピングが行われるようになった。これは検体のHLA遺伝子の塩基配列をダイレクトシーケンスによって決定し、その塩基配列をEMBLやGenbank等のデータベースに登録されている塩基配列情報と比較するものであり、最も相同性の高かったものをその検体のHLA型として判定する。しかし、ヒトは各遺伝子について父親由来と母親由来の２種類を有するが、上記のような既存のデータベースに登録されているHLAの塩基配列の大部分は単一遺伝子のデータであり、２種類の型を組み合わせたデータは、僅かしか登録されていないという問題があった。
【０００４】
このような問題を解決するものとして、特許文献１には既存のデータベースに登録されている単一遺伝子のデータを組み合わせることによって、予想される全ての組み合わせ配列のデータベースを作成し、これをHLAタイピングに用いることが記載されている。
【０００５】
しかし、特許文献１に記載のデータベース作成法においては、既存のデータベースに登録されている単一遺伝子のデータから組み合わせデータを作成する際に、図１(a)に示すように、目的の遺伝子座に相当する遺伝子の配列を全て並べ、塩基配列が未決定な領域（＊印で表した部分）を含むデータがあれば、それに合わせてアミノ酸単位で図１(b)に示すように全ての配列データを端部から削除してから、各データを２つずつ掛け合わせ、図１(c)のように、塩基の異なる部分（枠で囲んだ部分）をNC-IUBの定義（図３）にしたがって１文字のコードに置き換えることで、組み合わせデータを作成していた。しかし、削除されるデータの中にはHLAの型を特徴づける重要な配列（反転で示した部分）が含まれていることがあり、これが失われることにより判定が正確に行われない場合があった。
【０００６】
また、従来のHLAタイピングでは、上記のように作成した組み合わせ配列のデータベースを用いて検体のHLA塩基配列の配列検索を行う際に、FASTA等の既存のホモロジー検索プログラムを用いていた。しかし、このようなホモロジー検索プログラムは登録されている多様な配列データから相同性の高いものを検出するためのものであり、データベース中に相同性の高いデータが膨大に存在すると、必ずしも検索対象の配列に最も近いものが抽出されないという問題がある。
【０００７】
また通常、自動シーケンサによる解析結果は、波形データに基づいてベースコールが行われるが、このとき波形のピークが不明瞭な部分や複数のピークが重なるところで誤りが生じることがある。このような場合、従来のHLAタイピングでは人手によって修正を施していたが、手間が掛かる上に人手を加えることによって逆に修正ミスなどの人為的エラーが発生する可能性があった。
【０００８】
更に、HLAタイピングの結果、候補となるHLAの遺伝子型が複数出る場合があり、このような場合は、従来、人種や地域などのデータを基に、HLAのアリル頻度などで型の絞り込みを行っていた。しかし、このような絞り込みには専門知識が必要であり、専門知識を持たない人は絞り込みが行うことができなかった。
【特許文献１】特開平10-179188号公報（[0017]、図１、図２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は係る問題を解決するために成されたものであり、その課題とするところは、人手を介すること無く正確且つ迅速なHLAの型決定を行うことができる、HLAタイピング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明に係るHLAタイピング法は、HLAクラスI及びクラスIIに属する各遺伝子座の少なくとも一つの遺伝子座について、その塩基配列情報に基づいてHLA型を判定する方法において、既知のHLAの塩基配列データを基に予め予測される全対立遺伝子の組み合わせを記載したデータベースを作成するデータベース作成ステップと、検体の該当遺伝子座の少なくとも一部の塩基配列をシーケンスによって決定する塩基配列決定ステップと、その塩基配列をデータベース中の個々の配列に一致する部分について一塩基ずつ比較を行い、不一致の数が少ない対立遺伝子の組み合わせを検体の遺伝子型の候補として抽出する配列検索ステップと、不一致の数が最も少ない対立遺伝子の組み合わせをその遺伝子座のHLA型として決定する型判定ステップと、を有することを特徴とする。
【発明の実施の形態及び効果】
【００１１】
まず、本発明のHLAタイピング法におけるデータベース作成ステップについて説明する。既存のデータベースに登録されている遺伝子配列情報の中から目的の遺伝子座に相当する配列を全て並べる。このとき、塩基配列が決定されていない部分があっても塩基配列の削除は行わない。両親由来の２種類の遺伝子の全組み合わせをカバーするため、整列された各データを２つずつ掛け合わせて予想される全ての組み合わせデータを作成する。塩基の異なる部分は図３に示すNC-IUBの定義に従い１文字のコードで表現する。例えば、図２のように塩基がAとGであった場合にはRと置き換える。以上のように、塩基未決定領域があっても塩基配列の削除を行わないことにより、データ量を減少させることなく組み合わせ配列データが作成されるため、従来の方法に比べて正確なタイピングを行うことができる。
【００１２】
次に、本発明のHLAタイピング法における塩基配列決定ステップについて説明する。まず、自動シーケンサによって検体の目的遺伝子座の少なくとも一部の塩基配列を決定し、自動シーケンサに付属のプログラム等を用いてベースコールを行う。このとき、波形データのピークが複数重なっているところでは、上記のNC-IUBコードに従って塩基を表現する。シーケンサから出力されたデータは、人手による修正を施すことなくタイピングに使用する。これにより修正ミスなどによる人為的エラーの発生を防ぐことができる。また、Phred（Phil Green、University of Washington）等のプログラムによって、ベースコールされた各塩基毎にベースコールの精度を示す指標値（例えばクオリティバリュー値）を付与する指標値付与ステップを設けることが望ましい。なお、指標値の付与に使用するプログラムはPhredに限らず、シーケンスの精度を客観的に表現できるものであればいずれのプログラムを用いても良い。
型決定したい領域が長く、一度のシーケンスでは該領域全体の配列を決定できない場合は、必要な回数だけシーケンスを行い、Phrap（Phil Green、University of Washington）等のプログラムを用いてアセンブルし、指標値付きのコンセンサス配列を求めておく。アセンブルに使用するソフトはPhrapに限らず、アセンブルによって得られたコンセンサス配列の精度を客観的に表現できるものであればいずれのプログラムを用いても良い。
以上のように指標値によってシーケンス結果の信頼性を示すことにより、タイピングの際の不一致箇所の信頼性や、タイピング結果の信頼性を客観的に評価することができる。
【００１３】
本発明のHLAタイピング法における配列検索ステップは以下の方法によって行う。まず、型決定したい配列が、上記のように作成したHLA遺伝子型のデータベースに含まれる配列のどの領域に該当するのかを検索する。次に上記の領域において、目的配列とデータベースの配列を一塩基ずつ比較して行き、ミスマッチ箇所があれば、その位置と全体のミスマッチ数を記憶しておく。データベースの全組み合わせ配列について上記のような一塩基ずつの比較を実行し、ミスマッチの少なかった組み合わせ配列をデータベースから抽出する。このような一塩基ずつの比較を行うことによりミスマッチの数を明確にすることができ、結果の解釈が容易になる。また、データベース中の全ての組み合わせ配列について１つずつ比較を行うため、対立遺伝子の組み合わせが膨大になっても、その中から最も近いものを抽出することができる。上記の配列検索ステップの後、型判定ステップにおいて、最もミスマッチの少なかった組み合わせ配列を検体のHLA型として決定する。
【００１４】
また、上記のHLAタイピングの結果を評価する精度評価ステップを備えることが望ましい。精度評価ステップでは、上記一塩基ずつの比較において、不一致だった塩基に関しては指標値を調べ、ベースコール精度の低かったものについてはシーケンス不良であると判断し、ベースコール精度の高かったものに関しては新規の型である可能性があると判断する。また、配列全体の指標値の平均などからシーケンスの精度を調べ、それを基にタイピング結果の信頼性を評価する。このようにシーケンスの精度からタイピング結果の信頼性を評価できることは、特に多数のタイピングを行う場合等に非常に有効である。指標値を用いたタイピング結果の評価は、上記の一塩基ずつの比較による配列検索を行った場合に限らず、既存のホモロジー検索プログラム(BLAST,FASTA等)や、これらのプログラムの改良プログラム、あるいはこれらのアルゴリズムに相当するプログラムを用いて配列検索を行った場合にも適用することができる。
【００１５】
更に、絞り込みステップを設け、予めHLA型の候補として複数の組み合わせデータが検出された場合には、人種や地域等、検体の由来に関する情報を入力し、予めデータベース化された人種や地域等によって偏るアリル頻度に基づく意味づけや、アミノ酸配列に翻訳した場合の情報を基に結果の絞り込みを行うようにしても良い。これにより、従来は専門知識を基に人が行っていた型の絞り込みを、コンピュータプログラムによって自動的に行うことができ、専門知識を持たない人でもHLAタイピングが行えるようになる。  
【００１６】
また、上記のようなHLAタイピングは全てコンピュータシステムによって自動で行うことができる。すなわち、上述した各処理手段を実行するためのプログラムを汎用のコンピュータに搭載しておき、オペレータがこのプログラムの実行指示を与えることで、自動的にHLAタイピングを達成することができる。これにより、予め上記のデータベースを作成しておけば、以後は検体のシーケンス結果を基にベースコールからタイピング、タイピング結果の精度評価や、アリル頻度による型の絞り込みまでを人手を介すことなく迅速且つ正確に行うことができる。その結果、検査時間の短縮、検査数の向上が可能となり、検査費用のコストダウンを量ることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明のHLAタイピング法によってHLA-A座のエクソン２と３のDNA配列情報に基づいたタイピングを行う場合の例について説明する。図４は本実施例のHLAタイピング法の各ステップの流れを示すフローチャートである。
【００１８】
まず、European Bioinformatics Instituteのデータベースサーバや、日本組織適合性学会の公開データ等から入手したHLAの塩基配列データを基に、組み合わせ配列のデータベースを作成する（データベース作成ステップ）。同一領域に関する塩基配列データを全て並べ、予測される全対立遺伝子の組み合わせについて塩基配列の掛け合わせを行い、塩基が異なる箇所はNC-IUBに基づいて１文字のコードに置き換えて表現する。
【００１９】
次に、検体サンプルについてエクソン３の３’末端からエクソン２の５’末端までのシーケンスを行う（塩基配列決定ステップ）。シーケンス終了後、自動シーケンサに付属のプログラムによりシーケンス結果のベースコールを行い、Phredプログラムを利用してベースコールされた各塩基に指標値を付与する（指標値付与ステップ）。
【００２０】
以上により得られた配列情報を基に、上記において作成されたデータベース中の組み合わせ配列の中から候補となる配列を抽出する（配列検索ステップ）。まず、型決定したい配列がデータベースの配列のどの領域に相当するかを検索し、続いてその領域において検体の配列とデータベースの組み合わせ配列とを一塩基ずつ比較し、塩基が一致しない箇所があればその数を記憶する。データベース中の全組み合わせ配列について上記一塩基ずつの比較を行い、予め定められた相同性以上のもの、又は所定の数のデータをミスマッチの少なかったものから順に抽出する。配列検索の結果は図５に示すように、抽出された組み合わせ配列の名称１０、ミスマッチの数１１と位置１２、及びミスマッチ箇所の配列１３に加えて、該ミスマッチ箇所の指標値１４を表示する。更に、該ミスマッチ箇所の波形データも合わせて出力するようにしても良い。上記の配列検索によって抽出された組み合わせ配列のうち、最もミスマッチの少なかったものを検体のHLA型と判定する（型判定ステップ）。
【００２１】
また、ミスマッチ箇所の指標値及びシーケンス配列の平均指標値からタイピング結果の信頼度を評価する（精度評価ステップ）。更に、タイピング結果として複数の組み合わせ配列の候補があったものに関しては、日本人特有のアリル情報に基づいて絞り込みを行う（絞り込みステップ）。  
【００２２】
以上のような手順でHLAタイピングを行うことにより、検体のHLA型を高精度且つ迅速に判定することができる。なお、上記実施例は本発明を制限するものではなく、本発明は請求の範囲に記載された技術的範囲内で種々の変更が許容されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】従来のデータベース作成方法を説明する図。(a)既知のデータベースから入手した配列データを並べた状態。(b)上記配列データから塩基未決定領域を取り除いた状態。
【図２】本発明に係るデータベース作成方法を説明する図。(a)既知のデータベースから入手した配列データを並べた状態。(b)配列データを組み合わせた状態。
【図３】NC-IUBによる塩基配列のコード表現を示す図。
【図４】本実施例のHLAタイピング法の各ステップの流れを示すフローチャート。
【図５】本実施例のHLAタイピング法における配列検索の結果を示す図。
【符号の説明】
【００２４】
１０…組み合わせ配列の名称
１１…ミスマッチの数
１２…ミスマッチの位置
１３…ミスマッチ箇所の配列
１４…ミスマッチ箇所の指標値
【図１】
2005102599.tif 000003
【図２】
2005102599.tif 000004
【図３】
2005102599.tif 000005
【図４】
2005102599.tif 000006
【図５】
2005102599.tif 000007