(57)【要約】【課題】  生体分子の非特異的吸着を抑制するペプチドチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、未反応の官能基をブロッキングすることで、信頼性の高いデータを得ることのできるペプチドチップを得る。【解決手段】  チップ上の官能基（Ａ）とペプチドに存在しているかあるいは付加されている官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上にペプチドを固定化した後に、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするペプチドチップの作製方法。【選択図】なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップ上の官能基（Ａ）とペプチドに存在しているかあるいは付加されている官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上にペプチドを固定化した後に、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするペプチドチップの作製方法。
【請求項２】
末端のみに官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を用いる請求項１記載の方法。
【請求項３】
親水性高分子の分子量が４００以上である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
親水性高分子がポリエチレングリコールである請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８の作成方法により作成されたことを特徴とするバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドチップを用いた物質相互作用の解析系において、親水性高分子をブロッキングすることで生体分子の非特異的吸着を抑制することのできるバイオチップの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
しかしながら、相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性高分子が表面に固定化されたバイオチップが開発されている。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。
【０００４】
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。ただし、形成したスクシンイミド基は１００％反応しないため、残存したスクシンイミドをブロッキングする必要がある。ここではエタノールアミンを用いて、スクシンイミド基のブロッキングを行っており、ブロッキング材料に親水性高分子を用いる手法は示されていない。
【０００５】
生体分子を固定化した後に、基板上に親水性高分子を反応させる手段は公知である（特許文献１）。しかし、ここではチップ上のマレイミド基と対象分子が有するチオール基を反応させて、チップ上に対象分子を固定化しているが、その後、マレイミド基をブロッキングする工程は全く含んでいない。そのため、マレイミド基が残存したまま残っており、非特異的吸着の問題を引き起こす心配がある。また、固定化した生体分子と反応しうる親水性高分子を用いるため、生体分子が改質し変性する恐れがある。
【０００６】
本発明は、対象分子としてペプチドの固定化に使用した官能基を、ペプチドを変性させることなく、効率よくブロッキングし、非特異的吸着を効果的に抑制する手段を提供するものである。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【特許文献１】米国特許第６１２７１２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを提供することにある。特にペプチドとの相互作用解析に用いた際に、正確に相互作用を評価できるチップを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
１．チップ上の官能基（Ａ）とペプチドに存在しているかあるいは付加されている官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上にペプチドを固定化した後に、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするペプチドチップの作製方法。
２．末端のみに官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を用いる１記載の方法。
３．親水性高分子の分子量が４００以上である１または２に記載の方法。
４．親水性高分子がポリエチレングリコールである１〜３のいずれか記載の方法。
５．チップ表面が金であることを特徴とする１〜４のいずれか記載の方法。
６．チップの基板が透明基板であることを特徴とする１〜５のいずれか記載の方法。
７．２種類以上のペプチドが同一チップ上に固定化されることを特徴とする１〜６のいずれか記載の方法。
８．チップが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする１〜７のいずれか記載の方法。
９．１〜８の作成方法により作成されたことを特徴とするバイオチップ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチドチップの作製方法を採用することにより、非特異的吸着が抑制されたペプチドチップを簡便に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のバイオチップ作製方法は、チップ上の官能基（Ａ）とペプチドに存在しているか、あるいは付加されている官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上にペプチドを固定化する手法に関して、固定化反応に使われずにチップ上に残存している官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて共有結合的にブロッキングするペプチドチップの作製方法である。従って、物理吸着やイオン吸着によるブロッキング方法は本発明には含まれない。また、固定化されるペプチドに関しては、１種類のみであってもよいし、２種類以上であってもよい。ここで、ペプチドとは一般的に用いられる意味のものを指し、アミノ酸が２個以上ペプチド結合により連結されたものである。そのアミノ酸残基の数は特に限定されないが、通常は５〜６０残基程度であり、１０〜２５残基程度がより好ましい。分析する目的に応じて、アミノ酸残基のうち１乃至数残基において化学的な修飾を加えられたアミノ酸が含まれていてもよい。また特に限定されるものではないが、特定の酵素に対して基質としての機能を有しているペプチドを少なくとも１種は含むことが好ましい。
【００１２】
ここで、官能基がペプチドに存在している場合とは、具体的には例えば固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在する状態のものをいう。この場合、該システイン残基が有するチオール基が官能基（Ｂ）に相当する。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。
【００１３】
また、官能基がペプチドに付加されている場合とは、固定化されるペプチドに対して、アミノ酸以外の化合物で例えばチオール基のような官能基（Ｂ）に該当するものを有する化合物が１箇所以上のいずれかのアミノ酸残基において化学結合されている状態のものをいう。該化合物の結合箇所も特に限定はされないが、いずれかの末端のアミノ酸残基に結合されていることが好ましい。
【００１４】
官能基（Ａ）は、固定化するペプチドに存在しているか、あるいは付加されている官能基（Ｂ）と反応することができ、親水性高分子が有する官能基（Ｃ）とも反応することができる。
官能基（Ａ）、官能基（Ｂ）、官能基（Ｃ）は特に限定されるものではないが、カルボキシル基、アミノ基、スクシンイミド基、硫酸化スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシ基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、トシル基、トレシル基、無水酢酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アシルアジド基、塩化硫酸基、イミドエステル基などが挙げられる。ここで官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）、官能基（Ａ）と官能基（Ｃ）は反応しうるペアである。官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）、官能基（Ａ）と官能基（Ｃ）は基本的に異なる官能基であるが、官能基（Ｂ）と官能基（Ｃ）は同一であっても異なる官能基であってもよい。
【００１５】
チップ上に官能基（Ａ）を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いて官能基（Ａ）を導入する手段なども含まれる。
【００１６】
親水性高分子における官能基（Ｃ）は高分子末端に存在していることが好ましく、片末端であるとさらに好ましい。高分子の主鎖もしくは主鎖から多数分岐した側鎖に官能基（Ｃ）が存在していると、固定化した対象分子に対して立体障害を与える恐れがあるため、好ましくない。また、主鎖もしくは側鎖に多数の官能基（Ｃ）が存在すると、官能基（Ａ）と反応しブロッキングされてもなお、官能基（Ｃ）が残存する。官能基（Ｃ）も非特異的吸着を引き起こす可能性は否定できない。従って、末端にのみ官能基（Ｃ）が存在していることが好ましい。さらに好ましくは片末端のみに官能基（Ｃ）があり、もう一つの末端には活性の低いメトキシ基やヒドロキシル基を有する親水性高分子が好ましい。
【００１７】
親水性高分子の分子量は４００以上が好ましく、１，０００以上であるとさらに好ましい。分子量／繰り返し単位が多い方が、非特異的吸着を抑制する効果が強いためである。ただし、分子量が５０，０００以上であると固定化した対象分子に対して立体障害を与え、悪影響を及ぼす場合もあるためあまり好ましくない。
【００１８】
親水性高分子とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。
具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。
【００１９】
しかしながら、本発明における親水性高分子は非特異的吸着を抑制するのが目的であるため、どちらかといえばイオン性の官能基を有する化合物は好ましくないことがある。これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール（ポリオキシエチレンと呼ぶこともある）は親水性が高く、反応性の有する官能基がないため非特異的な吸着を抑制する効果が高い。
【００２０】
本発明におけるペプチドチップはさまざまな用途に応用可能であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着しなければ、正確に測定できていると判断することができる。
【００２１】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の共有結合によるブロッキング方法は非常に効果的である。
【００２２】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどによる物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する場合がある。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングが必要である。
【００２３】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。金程度に好ましくはないが、銀、白金、銅、アルミニウムなどの金属を使用することも可能である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。ガラス程度に好ましくはないが、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートのようなポリエステル、メチルメタクリレートのようなアクリル樹脂というような比較的透明性の高いプラスチック材料も使用できる。
【００２４】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１］
（ペプチド固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１０，０００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が４つ存在する分子であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
【００２７】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００２８】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が１６個有し（４個×４個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されパターン化される。照射されなかった部分は、４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００２９】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００３０】
上記のようにして得られた表面に、チロシンキナーゼの一つであるｃＳｒｃキナーゼの基質ペプチドを固定化させた。基質ペプチドのアミノ酸配列を表１に示した。基質１がｃＳｒｃキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列を有している。基質ペプチド２は、基質ペプチド１におけるチロシン残基が予めリン酸化されている。それぞれの基質ペプチドをリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、図１に示したような配置で各基質ペプチド溶液をマニュアル操作により０．１μｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、１６時間静置させて固定化反応を行った。チップの表面に形成させたマレイミド基と基質ペプチド末端のシステイン残基が有するチオール基とが反応し、基質ペプチドを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００３１】
【表１】
2005201689.tif 000002
【００３２】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、一時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００であり、親水性が非常に高く、非特異吸着を抑制する効果が期待できる。
【００３３】
（ＳＰＲイメージング法による測定）
こうして得られたペプチド固定化チップを、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、リン酸化チロシン抗体ＰＴ６６（シグマ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで２０００倍希釈した溶液を用いた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
また、ＳＰＲイメージングによる解析も検討した。上記ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによりアレイ表面を撮像した画像の取り込みを２秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行うことにより、アレイ全体においての抗体が結合している様子を示すことができる。
【００３４】
（観察の結果と考察）
シグナル変化のグラフを図１上段に示す。センサグラムは８箇所におけるシグナルの平均値をプロットしている。Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄについては、基質ペプチドのスポット部分以外の任意に選択した８箇所を測定ポイントとして得たシグナルの平均値をプロットしている。リン酸化基質ペプチド２には抗体が結合し、非リン酸化基質ペプチド１にはほとんど結合しない様子を観察することができた。このグラフにおけるＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分はシグナル変化がみられておらず、抗体がほとんど結合しなかったことを示している。ＳＰＲイメージングによる結果も基質ペプチド２のスポット部位のみ抗体が結合し、その他の部分にはほとんど結合されていないことが観察されている。このように表面の官能基を共有結合的に親水性高分子でブロッキングすることによって、非特異的吸着が抑制されたペプチドチップを容易に得ることができた。
【００３５】
［比較例１］
（ペプチド固定化）
実施例１と同様に行った。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
ここではブロッキング操作は行わず、そのまま次のステップに進んだ
（ＳＰＲイメージング法による測定）
実施例１と同様に行った。
【００３６】
（観察の結果と考察）
シグナル変化のグラフを図１下段に示す。ここで、リン酸化基質ペプチド２には抗体が結合し、非リン酸化基質ペプチド１に抗体が結合されていない傾向は実施例１と同様であるが、このグラフにおけるＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分においてシグナル増加がみられている。また、ＳＰＲイメージングによる結果からも、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分において非特異的吸着による影響が示唆される箇所が一部認められている。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の方法により作製されたペプチドチップは、非特異的吸着が抑制され、正確な測定が可能となる。また作製方法も容易であり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１及び比較例１におけるＳＰＲ解析結果
【符号の説明】
【００３９】
１        ｃＳｒｃ
２        ｐ−ｃＳｒｃ
ｂｇ      ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
【図１】
2005201689.tif 000003