(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質のチオール基と特異的に結合する性質を有し、標識試薬自体が有する抗体との反応性及び蛍光性により被標識タンパク質の抽出が可能な標識試薬の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるダンシル基を含有するチオール基標識用試薬。2005232132.tif 000014（Ｘはハロゲンを、ｍは１〜３の整数を、ｎは２〜８の整数を意味する）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2005232132.tif 000008
（式中、Ｘはハロゲンを、ｍは１〜３の整数を、ｎは２〜８の整数を意味する）で表される化合物を含有するチオール基標識用試薬。
【請求項２】
ｍが１であり、ｎが５である請求項１のチオール基標識用試薬。
【請求項３】
一般式（II）
【化２】
2005232132.tif 000009
（式中、ｎは２〜８の整数を意味する）で表される化合物に、式（III）
【化３】
2005232132.tif 000010
（式中、Ｘはハロゲンを、ｍは１〜３の整数を意味する）で表される化合物と、式（IV）
Ｒ1−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ2      （IV）
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基であり、さらにＲ2は、
【化４】
2005232132.tif 000011
または
【化５】
2005232132.tif 000012
であり、ここで、ｐは１〜４の整数であり、Ｒ3 およびＲ4 はそれぞれ独立してメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基を意味する）で表される化合物とを反応させることからなる、請求項１に記載のチオール基標識用試薬の製造方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）
【化７】
2005232132.tif 000013
（式中、Ｘはハロゲンを、ｍは１〜３の整数を、ｎは２〜８の整数を意味する）で表される化合物を、タンパク質中のチオール基と反応させることを特徴とするタンパク質の標識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダンシル基を有するハロゲン化酢酸誘導体を利用するチオール基特異的標識試薬、その製造方法、および該標識試薬を用いた標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質やペプチド（以下、これらを併せて「タンパク質」という）等の生体分子の標識は、医学や農芸化学、生化学、分子生物学等の分野で多用される手法であり、目的とする生体分子の性質の同定や機能の付加等に有用である。
【０００３】
システインが有するチオール基、およびシステインにより形成されるジスルフィドは、タンパク質の立体構造の保持やその酵素活性を発揮するために重要である。例えば、リボヌクレアーゼ等の多くのタンパク質は分子内あるいは分子間のジスルフィド結合を切断すると、正しい立体構造が形成できなくなり、その結果として酵素活性を失うことが知られている。またグルコースオキシダーゼやパパイン等の酵素はその活性部位にチオール基を含み、プロテインジスルフィドイソメラーゼ等の酵素はその活性部位のシステイン残基がチオールとジスルフィドとを交換することで活性を発揮する。すなわち、これらの酵素ではその活性を発揮する際にチオールやジスルフィドが関与することが知られている。以上のことから、タンパク質中のチオール基およびジスルフィドの位置を同定することは、そのタンパク質の構造や活性を検討する上で非常に重要な要素となる。
【０００４】
タンパク質のチオール基やジスルフィドの位置は、被験タンパク質を（１）プロテアーゼで切断し、（２）プロテアーゼにより分解された種々のペプチド断片の中からチオール基を有するペプチド断片のみを抽出し、（３）アミノ酸シーケンス等の手段により該抽出ペプチド断片の一次構造を決定することで同定される。この「チオール基を有するペプチド断片の精製」には、チオール基の特異的標識試薬を利用する方法が考えられる。
【０００５】
特許文献１には蛍光性を有するチオール基標識試薬（アクリジン誘導体）、該標識試薬を用いたタンパク質の標識方法、および該標識試薬により標識されたタンパク質（被標識タンパク質）をポストカラム高速液体クロマトグラフィーで抽出する方法が開示されている。また、特許文献２および非特許文献１〜５には蛍光性を有するチオール基標識試薬（マレイミド誘導体、Ｎ−(２−ブロモアセチルアミノ)エチル−２−(メチルアミノ)ベンズアミド、ジフルオレセインジスルフィド、モノブロモビマン、Ｎ−(ヨードアセチルアミノエチル)−ナフチルアミン硫酸、Ｎ−(ｐ−(２−ベンゾキサゾイル)フェニル)マレイミド）および該標識試薬を用いたタンパク質の標識方法が、特許文献３ならびに非特許文献６および７には、放射性核種を有するチオール基標識試薬（マレイミドベース化合物、デアミノリシン(Ｎ6−Ｎ−マレオイル−β−アラニン)−８−アルギニンバソプレシン、３−(２−ピリジルジチオ)プロピオニルアルギニル−[125Ｉ]−モノヨードチロシン）および該標識試薬を用いたタンパク質の標識方法が、非特許文献８には紫外線吸収作用を有するチオール基標識試薬（Ｎ−(４−アジドフェニルチオ)フタルイミド）および該標識試薬を用いたタンパク質の標識方法が開示されている。
【０００６】
したがって、これらの標識試薬であらかじめ被験タンパク質を標識し、該タンパク質をプロテアーゼにより切断し、プロテアーゼにより分解された複数のペプチド断片を各ペプチド断片が有する物理的または化学的性質の差異を利用して前記液体クロマトグラフィー等の手段により分離して、チオール基を有するペプチド断片を抽出することも考えられる。
【０００７】
しかしながら、試料中に数種から数十種以上のタンパク質が含まれる場合、前記液体クロマトグラフィー等による分離は、（１）試料中に含まれる各タンパク質の性質によっては、複数のタンパク質が同一分画に抽出される可能性があり、被標識タンパク質だけを確実に抽出することができない点、（２）試料中に目的とするタンパク質が極微量しか存在しない場合は十分な収量が得られない点等の問題があることから、実際には液体クロマトグラフィー等の抽出分画をアミノ酸シーケンスの試料に用いることは不可能であった。このことは、特にタンパク質をプロテアーゼにより複数のペプチド断片に切断する操作を含むチオール基の位置の同定において最も問題となる。
【０００８】
他方、非特許文献９には、トランスグルタミナーゼの存在下で、被験タンパク質と、トランスグルタミナーゼ反応性のグルタミン残基に対する特異的標識試薬（モノダンシルカダベリン）とを結合させ、該標識試薬が有する抗ダンシル基抗体との反応性を利用し、抗体アフィニティークロマトグラフィーにより被標識タンパク質を特異的に抽出する方法が開示されている。さらに、同文献には、該方法により抽出された被標識タンパク質をアミノ酸シーケンス用の試料として利用できること、およびアミノ酸シーケンスにより該被標識タンパク質の一次構造を決定できることが記載されている。
【０００９】
このように、標識試薬自体に抗体との反応性等の性質が存在すれば、その性質を利用して被標識タンパク質を特異的かつ大量に抽出することも可能となる。しかしながら、このような性質を有するチオール基の標識試薬は知られていない。
【特許文献１】特開平９−２４９６６３号公報
【特許文献２】特開平６−１２２６７９号公報
【特許文献３】特開平５−１９４３８４号公報
【非特許文献１】Pouchnik, D.J.ら、Anal. Biochem. 235: 26-35 (1996)
【非特許文献２】Wingender, E.ら、Anal. Biochem. 127: 351-360 (1982)
【非特許文献３】Kosower, N.S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3382-3386 (1979)
【非特許文献４】Hudson, E.N.ら、Biochemistry 12: 4154-4161 (1973)
【非特許文献５】金岡ら、Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 15: 1738-1743 (1967)
【非特許文献６】Pavo, I.ら、FEBS Lett. 316: 59-62 (1993)
【非特許文献７】Krueger, R.J.ら、Anal. Biochem. 198: 165-173 (1991)
【非特許文献８】Moreland, R.B.ら、Anal. Biochem. 121: 321-326 (1982)
【非特許文献９】Takagi, J.ら、Eur. J. Biochem. 232: 773-777（1995）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、タンパク質のチオール基と特異的に結合するとともに、標識試薬自体が有する性質により被標識タンパク質を抽出することが可能な標識試薬の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題の解決のために、チオール基およびアミノ基との反応性を有するモノハロゲン化カルボン酸と、市販の抗ダンシル基抗体との反応性と蛍光性とを有するダンシル基とを利用することとし、これらの性質を兼ね備えるチオール基標識用試薬を開発した。
すなわち本発明の目的は、一般式（Ｉ）
【化１】
2005232132.tif 000002
（式中、Ｘはハロゲンを、ｍは１〜３の整数を、ｎは２〜８の整数を意味する）
で表される化合物を含有するチオール基標識用試薬を提供することである。
さらに本発明の他の目的は、上記式（Ｉ）で表される化合物の製造方法を提供することである。
さらにまた、本発明の他の目的は上記式（Ｉ）で表される化合物を用いるタンパク質の標識方法を提供することである。
【００１２】
［本発明の式（Ｉ）で表される化合物の製造方法］
本発明の式（Ｉ）で表される化合物は、以下のスキームに示すように一般式（II）で表される化合物をカルボジイミド（IV）の存在下で、ハロゲン化カルボン酸（III）と反応させることにより一段階の反応で簡便に製造することができる。製造した化合物（Ｉ）は、生成物と出発物質との物理的および化学的性質の相違に基づく公知の分離方法によって精製することができる。かかる精製方法として、クロマトグラフィー、分別抽出、分別結晶または分別蒸留等が挙げられる。
【化２】
2005232132.tif 000003
式中、Ｘ、ｍ、ｎは上述したとおりであり、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基であり、さらにＲ2は、
【化３】
2005232132.tif 000004
または
【化４】
2005232132.tif 000005
であり、ここで、ｐは１〜４の整数であり、Ｒ3 およびＲ4 はそれぞれ独立してメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基を意味する。
【００１３】
一般式（II）の具体例としては、
１−（アミノエチルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
１−（アミノプロピルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
１−（アミノブチルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
１−（アミノペンチルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
１−（アミノヘプチルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
１−（アミノオクチルスルファミル）−５−（ジメチルアミノ）ナフタレン、
等が挙げられる。
【００１４】
ハロゲン化カルボン酸（III）の例としては、ヨード酢酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロ酢酸等のハロ酢酸、３−ブロモプロパン酸、４−ブロモブタン酸、３−クロロプロパン酸等の水溶性のハロゲン化カルボン酸が挙げられる。ハロゲン化カルボン酸（III）は式（II）の化合物１当量に対し１〜３当量の割合で用いられる。
【００１５】
本発明において使用されるカルボジイミドとしては、例えば、一般式（IV）
Ｒ1−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ2                （IV）
（式中、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立して、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基であり、さらにＲ2は、
【化５】
2005232132.tif 000006
または
【化６】
2005232132.tif 000007
であり、ここで、ｐは１〜４の整数であり、Ｒ3 およびＲ4 はそれぞれ独立してメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基またはシクロヘキシル基を意味する）が挙げられる。カルボジイミド（IV）は式（II）の化合物１当量に対し１〜３等量の割合で用いられる。
【００１６】
反応に使用される溶媒は、反応に影響を与えない限り特に限定されないが、ハロゲン化炭化水素（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等）、ケトン類（例えば、アセトン、メチルエチルケトン等）もしくはアセトニトリル等の有機溶媒を単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【００１７】
反応時間は使用する出発物質の種類および量に依存するが、反応の終了は最終的には薄相クロマトグラフィーにより確認することができる。また、反応温度はおおよそ室温程度で実施することが望ましい。
上記のアミド化工程に引き続く分離操作はクロマトグラフィー、分別抽出、分別結晶、分別蒸留またはこれらの組合せにより行うことができる。
【００１８】
分別抽出する場合、有機層に使用する溶媒としては、水層に使用する水系溶媒と均一に混合しなければ特に限定はなく、炭化水素類（例えばベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン等）、ハロゲン化炭素類（クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素等）を単独でまたは組みあわせて使用することができる。また、水層に使用する溶媒としては、ｐＨ２〜３に調整した酸性水系溶媒（例えば、塩酸水溶液、酢酸水溶液、クエン酸水溶液等）およびｐＨ１０〜１１に調整した塩基性水系溶媒（例えば、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液等）を使用することができる。さらに、ｐＨをそれぞれ２〜３または１０〜１１に調整したグリシン緩衝液等も使用することができる。
【００１９】
クロマトグラフィーを行う場合、使用するカラム担体としては例えばシリカゲルが挙げられ、使用する移動相としては分離に影響を与えなければ特に限定はなく、炭化水素類（例えばベンゼン、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン等）、ハロゲン化炭素類（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素等）、エーテル類（例えば、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等）または酢酸エチル等が単独あるいは組み合わせて用いることができる。
【００２０】
このように分離、精製した化合物（Ｉ）は、エバボレーター等を用いて２０℃〜１００℃（ただし８０℃が望ましい）で乾固し、粉末の状態で、−２０℃で遮光保存しておくのが望ましい。
【００２１】
次に、本発明の化合物（Ｉ）をタンパク質中のチオール基に反応させ、これらを標識する方法について説明する。
【００２２】
［本発明の化合物（Ｉ）によるタンパク質の標識方法］
本発明の化合物（Ｉ）を用いたタンパク質の標識は、緩和な条件で実施することができ、例えばチオールを有するタンパク質と、該タンパク質のチオール基１当量に対して、必要に応じ、ＳＤＳ、トライトンＸ、チャプス、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤で可溶化した２〜４当量の化合物（Ｉ）とを室温、ｐＨ６〜８の緩衝溶液中で、遮光下で反応させればよい。反応時間は３０分以上であればよく、一晩以上反応させてもタンパク質中のチオール基以外の基（例えばアミノ基等）と反応することはないが、標準的な反応時間は４５分〜２時間である。なお、反応溶液中には化合物（Ｉ）とタンパク質との反応を阻害しな
いものであれば、防腐剤、界面活性剤、安定化剤が共存していてもよい。
【００２３】
化合物（Ｉ）により標識されるタンパク質は、該タンパク質がチオール基を有していれば特に限定されず、不溶性のタンパク質である場合には、ＳＤＳ、トライトンＸ、チャプス、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤により可溶化して標識することができる。
【００２４】
化合物（Ｉ）は、タンパク質におけるチオール基との特異的反応性を有し、ジスルフィドとは反応しないが、ジスルフィド結合を形成しているシステイン残基を標識したい場合には、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤であらかじめ該ジスルフィド結合をチオール基に還元すればこのようなシステイン残基も標識可能である。
【００２５】
［本発明の化合物（Ｉ）により標識されたタンパク質（被標識タンパク質）の検出および抽出方法］
このようにして得られた被標識タンパク質は、化合物（Ｉ）中に含まれるダンシル基の抗ダンシル基抗体との反応性を利用して抗体アフィニティークロマトグラフィー等の手段により、被標識タンパク質を特異的に抽出することができる。さらに、ウエスタンブロッティングや免疫測定法等といった高感度の免疫学的手法による検出が可能となる。また、ダンシル基が有する蛍光性を利用して、公知のダンシル基の蛍光測定条件の下、例えば紫外線照射の下蛍光を測定することにより、被標識タンパク質を検出することもできる。
【００２６】
本発明の応用としては、例えば、化合物（Ｉ）が有するチオール特異的反応性を利用して被験タンパク質中に存在するチオール基が酸化型と還元型のいずれで存在するか確認することができる。例えば、グルタチオン等の酸化型と還元型を有するタンパク質を特定の条件で化合物（Ｉ）と反応させた後、質量分析器等により分子量を測定することで、該条件でこのようなタンパク質がいずれの状態で存在するか確認することができる。
【００２７】
別の本発明の応用としては、例えば、抗体アフィニティークロマトグラフィーによる被標識タンパク質の抽出が挙げられる。すなわち、前記のように標識された被標識タンパク質を抗ダンシル抗体を付加したアフィニティーカラムに通すことにより、化合物（Ｉ）で標識された被標識タンパク質だけを抽出することができる。
【００２８】
さらに、別の本発明の応用としては、例えば、抗ダンシル基抗体との反応性を利用したウエスタンブロッティング法や免疫測定法による被標識タンパク質の検出が挙げられる。これらの方法は、前記クロマトグラフ法と比べて高い検出感度を有することから、少ない試料で被標識タンパク質を検出することが可能となる。
【００２９】
また、本発明の別の応用例としては、例えば、前記のように標識した被標識タンパク質を薄層クロマトグラフィーで分離し、ダンシル基が有する蛍光を検出することにより、被験タンパク質中におけるチオール基の存在を確認することができる。
【００３０】
また、別の本発明の応用としては、例えば、いわゆるポストカラム高速液体クロマトグラフィーの利用が考えられる。すなわち、被験タンパク質を本発明の化合物（Ｉ）で標識し、前記クロマトグラフ等の分離手法により分離し、蛍光検出器による蛍光測定により、被標識タンパク質を抽出することができる。
【００３１】
さらにまた、別の本発明の応用としては、例えば、抗ダンシル抗体アフィニティークロマトグラフィーと、高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた被標識タンパク質の抽出が挙げられる。すなわち、抗体アフィニティークロマトグラフィーの抽出物中に複数種類の被標識タンパク質が含まれる場合、これをさらに高速液体クロマトグラフィーで分離し、被標識タンパク質を単離することが可能となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の化合物（Ｉ）は、ハロゲン化カルボン酸とは異なり、タンパク質中に含まれるチオール基を特異的に認識し、アミノ基やジスルフィド基とは結合しないことから、チオール基を有するタンパク質のみを特異的に標識することができる。すなわち、このような化合物（Ｉ）の性質を利用して、チオール基を有するタンパク質を特異的に検出することができ、さらにはタンパク質中のシステイン残基が酸化型で存在するか還元型で存在するかを確認しうる。
【００３３】
また、化合物（Ｉ）に含まれるダンシル抗体は、抗ダンシル基抗体との反応性を有することから、従来行い得なかった抗体アフィニティークロマトグラフィー等の手段により被標識タンパク質を抽出することができる。すなわち、被標識タンパク質のみを特異的にかつ大量に調製することが可能となり、アミノ酸シーケンス用の試料の調製が容易となることから、タンパク質中のシステイン残基の位置の同定に資する。さらに、抗体アフィニティークロマトグラフィーと高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせることで、被標識タンパク質が複数種類存在する場合であっても、被標識タンパク質の種類ごとに単離することが可能となる。
【００３４】
また、ダンシル基が有する蛍光性を利用した検出手段に加えて、抗ダンシル基抗体との反応性を有することから、これを利用して高感度の免疫学的検出手段であるウエスタンブロッティングまたは免疫測定等の手段を利用することが可能となる。すなわち、被標識タンパク質が極微量しか存在しない場合でも、本法を用いることにより簡便に検出することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。
【００３６】
〔実施例１〕  ヨードアセチルダンシルカダベリンの合成
ヨードアセタミド（１１.１mg、終濃度２０mM）とモノダンシルカダベリン（１０.１mg、終濃度１０mM）とＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジアミド（６.２mg、終濃度１０mM）をジクロロメタン（３mL）中で、室温で１５分撹拌した。
ヘキサン／酢酸エチル（１：１）を用いて薄層クロマトグラフィーを行なうことにより反応が終了したことを確認した後、反応溶液をｐＨ３.０とｐＨ１０.０のグリシン緩衝液（３mL）で交互に２回二層分配した。洗浄後、ヨードアセチルダンシルカダベリンを含む有機層を回収し、ロータリーエバポレーターにより乾固し、クロロホルム（３mL）に再溶解した。この溶液をクロロホルム／メタノール／グリシン緩衝液（３mL、ｐＨ３.０）（４０：２０：７）の溶液で２回洗浄し、再びヨードアセチルダンシルカダベリンを含む有機層を回収し、ロータリーエバポレーターにより乾固した。それをヘキサン／酢酸エチル（１：１）の溶液で溶解し、シリカゲルカラム（直径１２mm、長さ２５０mm）によって精製することにより、ヨードアセチルダンシルカダベリンを７.２mｇ得た（収量４８％）。この物質の分析値は、以下のとおりであった。
1H-NMR（CDCl3）ppm：δ1.07-1.42（6H, m）, 2.88（2H, dt, J=5.6 Hz）, 2.89（6H, s）, 3.10（2H, dt, J=6.3 Hz）, 3.66（2H, s）, 4.6（1H, s）, 6.74（1H, s）, 7.19（1H, d, J=7.6 Hz）, 7.50-7.59（2H, m）, 8.22（1H, d, J=8.6 Hz）, 8.31（1H, d, J=8.6 Hz）, 8.54（1H, d, J=8.6 Hz）
【００３７】
〔実施例２〕  還元型グルタチオンの標識
チオール基を有するトリペプチドである還元型グルタチオン（３０μg、終濃度１０μM）を５０mMトリスバッファー（ｐＨ７.５、１mL）に溶解した後、ヨードアセチルダンシルカダベリン（５μg、終濃度１０μM）を溶解し、室温で４５分間、遮光して反応させた
。反応終了後、溶液を１％酢酸を含むメタノール／水（１：１）溶液で希釈し、エレクトロスプレーイオン化質量分析器を用いて反応物の分子量を測定した。
その結果、還元型グルタチオンとヨードアセチルダンシルカダベリンとの反応生成物に水素イオンが付加した分子量６８３.３の化合物と、水素イオンが付加した未反応の還元型グルタチオン（分子量３０８.２）が少量検出された（図１のＡ）。これに対し、チオール基を有さない酸化型グルタチオンを用いて同様の実験を行なった結果、ヨードアセチルダンシルカダベリンと酸化型グルタチオンは反応せず、質量分析の結果、本化合物に水素イオンが付加した化合物（分子量５０４.２）と酸化型グルタチオンに水素イオン（分子量６１３.３）およびナトリウムイオン（分子量６３４.９）が付加した化合物がそれぞれ検出された（図１のＢ）。
この結果から、ヨードアセチルダンシルカダベリンはジスルフィドとは反応せず、チオール基とのみ特異的に反応することが明らかになり、さらにタンパク質中のチオール基が酸化型、還元型のいずれで存在するか確認しうると考えられた。
【００３８】
〔実施例３〕  薄層クロマトグラフィーによる被標識還元リボヌクレアーゼの検出
ジチオスレイトールにより分子内のシステイン残基をすべてチオール基としたリボヌクレアーゼを２０μg調製し、５０mMトリスバッファー（１mL、ｐＨ７.５）中でヨードアセチルダンシルカダベリン（５０.３μg、０.１mM）と室温で４５分間、遮光して反応させた。その後、メタノール／酢酸（１９：１）を展開溶媒として用いた薄層クロマトグラフィーにより、レーン２にはヨードアセチルダンシルカダベリンのみを、レーン１にはヨードアセチルダンシルカダベリンとリボヌクレアーゼとの反応混合物を展開し、紫外光ランプにより分析した。その結果、レーン２ではヨードアセチルダンシルカダベリンを示すスポットのみが観察されたのに対し、レーン１では未反応のヨードアセチルダンシルカダベリンを示すスポットと展開溶媒によって移動しないリボヌクレアーゼとの反応生成物を示すスポットが観察された（図２）。
この結果から、ヨードアセチルダンシルカダベリンにより結合したタンパク質は蛍光標識され、蛍光を測定することで被標識タンパク質を検出しうることが明らかになった。
【００３９】
〔実施例４〕  ウエスタンブロッティングによる被標識タンパク質の検出
ジチオスレイトールにより分子内のシステイン残基をすべてチオール基としたリボヌクレアーゼ、リゾチーム、ウシ血清アルブミンを各２０μg調製し、１％ トライトンＸ−１００を含む５０mMトリスバッファー（１mL、ｐＨ７.５）中でヨードアセチルダンシルカダベリン（０.５mg、終濃度１mM）、ヨードアセチルダンシルカダベリン（０.５mg、終濃度１mM）と５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)（０.４mg、終濃度１０mM）、ヨードアセチルダンシルカダベリン（０.５mg、終濃度１mM）とヨードアセトアミド（０.２mg、終濃度１０mM）と室温で４５分間、遮光して反応させた。その後に、各反応溶液を抗ダンシル抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。その結果、分子内のシステイン残基をすべてチオール基としたリボヌクレアーゼ、リゾチーム、ウシ血清アルブミンとヨードアセチルダンシルカダベリンとは反応し、抗ダンシル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより各タンパク質のバンドが検出された（図３、レーン２）。これに対し、ヨードアセチルダンシルカダベリン（０.５mg、終濃度１mM）と５,５’−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)またはヨードアセトアミドを同時に加えた場合には、還元した各タンパク質とヨードアセチルダンシルカダベリンとの反応が阻害された（図３、レーン３、４）。加えて、ジチオスレイトール処理していないリボヌクレアーゼ、リゾチーム、ウシ血清アルブミンをヨードアセチルダンシルカダベリンと反応させても、ウエスタンブロッティングにより各タンパク質のバンドがほとんど検出されなかった（図３、レーン１）。
この結果から、ヨードアセチルダンシルカダベリンはタンパク質中のアミノ基には結合せず、チオール基とのみ特異的に反応すること、被標識タンパク質は抗ダンシル基抗体との反応性を有すること、およびこの性質を利用して免疫学的手法により被標識タンパク質を検出できることが明らかになった。
【００４０】
〔実施例５〕  グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素由来のシステイン残基を含むペ
プチド断片の同定
以下の方法によりグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素由来のシステイン残基を含むペプチド断片の同定を行なった。
１mMジチオスレイトールと１％トライトンＸ−１００、４Ｍ尿素を含む５０mMトリスバッファー（１mL、ｐＨ７.５）に、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（１mg、終濃度３０μM）を溶解し、室温で２時間、遮光して反応させた。その後に、ヨードアセチルダンシルカダベリン（２.５mg、終濃度５mM）を添加し、さらに１時間反応させた。反応溶液を５０mMトリスバッファー（ｐＨ７.５）、５０mMトリスバッファー（ｐＨ８.８）で順次透析した後、リジルエンドペプチダーゼ（１６.５μg、終濃度０.６μM）と尿素（０.２４mg、終濃度４Ｍ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１mg、終濃度０.１％）を加え、３７℃で２０時間、遮光して反応させ、ヨードアセチルダンシルカダベリンで標識されたグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素をプロテアーゼ消化した。この溶液中のペプチド断片をＣ−１８疎水性カラムを装填した高速液体クロマトグラフィーにより分離し、２０５nmの吸光（図４のＡ）および蛍光（励起波長３６０nm、蛍光波長５１０nm）（図４のＢ）により検出した。その結果、吸光のクロマトグラフでは、多数のピークが検出されたのに対し、蛍光のクロマトグラフでは互いに近接したいくつかのピークが検出された。
【００４１】
さらに、この反応溶液を抗ダンシル抗体を付加した抗体アフィニティーカラムに通し、ヨードアセチルダンシルカダベリンによって標識されたペプチド断片のみを吸着、溶出させた。溶出物を同様にＣ−１８疎水性カラムを装填した高速液体クロマトグラフィーにより分離し、２０５nmの吸光（図５のＡ）および蛍光（励起波長３６０nm、蛍光波長５１０nm）（図５のＢ）により検出した。その結果、吸光と蛍光のクロマトグラフがほぼ一致し、４つのピークが得られた。図５のＡおよびＢ中の１〜４のピークを分取し、プロテインシーケンサによりペプチドのアミノ酸配列を分析した結果、それぞれ図６の１〜４で示す下線部の配列と一致した。
この結果から、本法により、被標識ペプチドを特異的に抽出できること、また該ペプチド抽出物を用いてタンパク質分子内におけるシステイン残基の位置の同定を行えることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ヨードアセチルダンシルカダベリンとグルタチオンとの反応溶液をエレクトロスプレーイオン化質量分析器で測定した質量スペクトルの結果を示す。図中Ａは還元型グルタチオンを、図中Ｂは酸化型グルタチオンを被験ペプチドとした場合の結果を示す。
【図２】被標識リボヌクレアーゼを薄層クロマトグラフィーで分離し、紫外光ランプで検出した結果を示す。
【図３】各種被標識タンパク質（リボヌクレアーゼ（上段）、リゾチーム（中段）、ウシ血清アルブミン（下段））をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す。
【図４】リジルエンドペプチダーゼで断片化した被標識グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素のペプチド断片の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示す。図中Ａは２０５nmの吸光を測定した場合、図中Ｂは蛍光を測定した場合の溶出曲線である。
【図５】リジルエンドペプチダーゼで断片化した被標識グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素のペプチド断片を抗ダンシル抗体カラムに通し、該抗ダンシル抗体カラムから受け取った溶出液を高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を示す。図中Ａは２０５nmの吸光を測定した場合、図中Ｂは蛍光を測定した場合の溶出曲線である。
【図６】チキンの筋由来グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の一次構造を示す。
【図１】
2005232132.tif 000015
【図２】
2005232132.tif 000016
【図３】
2005232132.tif 000017
【図４】
2005232132.tif 000018
【図５】
2005232132.tif 000019
【図６】
2005232132.tif 000020
【配列表】
2005232132000001.app