(57)【要約】【課題】スポット形状、スポット内濃度が均一なマイクロアレイを作製する。【解決手段】予めサンプルを結合させたマイクロビーズ１２を平板基板１１の表面に埋め込んでマイクロアレイ１０を作製する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板状の基板と、
前記基板の表面に一部露出するようにして埋め込まれ固定された複数のマイクロビーズとを備え、
前記マイクロビーズは表面に生体分子が結合されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロアレイにおいて、前記基板はシリコーン製であり、前記マイクロビーズはガラスもしくはアクリル製であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のマイクロアレイにおいて、前記マイクロビーズは直径が５０μｍから１００μｍの球体であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４】
生体分子を粒径が揃った複数のマイクロビーズの表面全体に均一に結合させる工程と、
前記マイクロビーズを基板の表面に一部が露出するようにして１箇所に１個づつ埋め込み固定する工程と
を含むことを特徴とするマイクロアレイ作製方法。
【請求項５】
生体分子を粒径が揃った複数のマイクロビーズの表面全体に均一に結合させる工程と、
表面に差し渡しが前記マイクロビーズの直径とほぼ等しく深さが前記マイクロビーズの半径とほぼ等しい複数のくぼみが整列して設けられた基板を用意する工程と、
前記マイクロビーズを前記基板の前記くぼみに押し付け、前記基板の表面に一部が露出するようにして埋め込み固定する工程と
を含むことを特徴とするマイクロアレイ作製方法。
【請求項６】
請求項５記載のマイクロアレイ作製方法において、前記マイクロビーズを内径が前記マイクロビーズの直径より小さなキャピラリの先端に吸引して前記基板の前記くぼみに搬送し、押し付けることを特徴とするマイクロアレイ作製方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載のマイクロアレイ作製方法において、前記マイクロビーズはガラスあるいはアクリル製であり、前記基板はシリコーン製であることを特徴とするマイクロアレイ作製方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項記載のマイクロアレイ作製方法において、前記生体分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリアミノ酸又は合成高分子であることを特徴とするマイクロアレイ作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基板上に複数種類の生体分子を配置したマイクロアレイ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生化学における遺伝子などの研究では、複数種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、たんぱく質等の生体分子からなるサンプル（プローブともいう）をガラスプレートやナイロン又はニトロセルロースメンブレン等の基板にスポットしたマイクロアレイを用いて、ハイブリダイズなどの実験が行われている。マイクロアレイの作成方法には、ピンを使って基板表面に生体分子からなるサンプルを付着させてスポットを形成する方式（例えば、特許文献１）や、細いノズルの先から一定量のサンプルを担体表面に吹きつけるインクジェット方式（例えば、特許文献２）などがある。ピン方式では、溶媒に溶かしたＤＮＡやタンパク質などの高分子サンプルをピン先に付着させ、サンプルの付着したピンを平板基板上に接触させることで、平板基板上に円形のスポットを作成している。
【０００３】
ピンには中実の棒状形状をした通常のピンや、中空の形状を有し、そこにサンプルを染み込ませて、先端を平板基板上に接触させる時間と圧力を加減することによってほぼ同量のサンプルを平板基板上に付着させる方式のピンなどがある。ピン方式ではどのような形状のピンを用いるとしても、ピンの先端を平板基板上に接触させることによって、平板基板上に円形のスポットを形成する。このとき作成されるマイクロアレイは、ハイブリダイゼーション結果を画像として読み取る際にサンプル間の誤差を少なくするため、各スポットが完全に円形であって形の歪みや中抜けがないことが望ましい。また、同じ理由により、円形スポット内部でサンプルの濃度むらがないことが望ましい。
【０００４】
一方で、近年になってマイクロビーズと呼ばれる微小球体の作成方法（例えば、特許文献３）や、球体表面の生化学的修飾法が開発されており（例えば、特許文献４）、医薬品開発や学術研究で盛んに利用されている。マイクロビーズは、球体であることからサンプルを全面に均一に固定できる点、微粒子であるために溶媒に溶かして研究用チューブ内で扱うことができ、操作が簡便な点などを特徴として持っている。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−１８１８３７号公報
【特許文献２】
特開２００２−１１６２０５号公報
【特許文献３】
特開平８−１５５４２０号公報
【特許文献４】
特開２００３−０４７４８５号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
マイクロアレイの作製を行う場合、例えば、ピンを用いてＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又はペプチド等のサンプルを、ガラス製の平板基板のような担体に、円形スポットとして高密度に付着させていく方式では、ピン先を平板基板上に接触させる時の圧力、ピンの形状、サンプル粘度、周囲雰囲気の温度、湿度、その他様々な要因により、完全に円形で、円内が均一なサンプル濃度となったスポットを形成することは困難である。ピン方式では、特にピン自体の形状によって、平板基板上に形成されるスポットの形状が大きく左右されるという問題もある。また、平板基板上に形成したスポット内のサンプル濃度は、ピンを接触させる時の状態、溶媒の粘度、溶媒の乾燥過程で大きく変化し、スポット状に形成されたサンプルを例えば蛍光法で検出した際には蛍光の輝度値がスポット内で大きく変化するなどの問題があった。一方、インクジェット方式には、試料を吹き付けた後のノズルのメンテナンス、特に多種類の試料を扱う際のコンタミネーションに気を払わねばならない。また、ピン方式と同じく周囲雰囲気の温・湿度などにも影響を受けるなど問題があった。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、基板上に同一形状のスポットが多数形成され、各スポット内のサンプル濃度が均一なマイクロアレイ、及びその作成方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明者らは、マイクロビーズ技術を利用することにより、従来完全な円形のスポットとすることが困難であったマイクロアレイ作製方式を、より簡便に真円形に近づける技術を開発した。
【０００９】
すなわち、本発明によるマイクロアレイは、平板状の基板と、基板の表面に一部露出するようにして埋め込まれ固定された複数のマイクロビーズとを備え、マイクロビーズは表面に生体分子が結合されていることを特徴とする。基板は埋め込みに適するだけの柔らかさを持っているのが好ましい。ビーズは埋め込む際に破壊されない程度の硬さを持っているのが好ましい。このような観点から、基板は例えばシリコーン製とすることができ、マイクロビーズはガラスもしくはアクリル製とすることができる。また、ガラスあるいはアクリル製のビーズは、表面修飾技術が進んでいることからも好ましい。
【００１０】
マイクロビーズは直径が５０μｍから１００μｍの球体とすることができる。後述するキャピラリを用いた配列法でマイクロアレイを作製するには、あまり小さなマイクロビーズ（０．５〜１０μｍクラス）は好ましくない。また大きすぎるビーズ（２００μｍ以上のクラス）もマイクロアレイの意味がなくなるため、好ましくない。
【００１１】
本発明によるマイクロアレイ作製方法は、生体分子を粒径が揃った複数のマイクロビーズの表面全体に均一に結合させる工程と、そのマイクロビーズを基板の表面に一部が露出するようにして１箇所に１個づつ埋め込み固定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明によるマイクロアレイ作製方法は、また、生体分子を粒径が揃った複数のマイクロビーズの表面全体に均一に結合させる工程と、表面に差し渡しがマイクロビーズの直径とほぼ等しく深さがマイクロビーズの半径とほぼ等しい複数のくぼみが整列して設けられた基板を用意する工程と、マイクロビーズを基板のくぼみに押し付け、基板の表面に一部が露出するようにして埋め込み固定する工程とを含むことを特徴とする。マイクロビーズは、内径がマイクロビーズの直径より小さなキャピラリの先端に吸引して基板のくぼみに搬送し、押し付けることで、基板の表面に一部が露出するようにして埋め込み固定することができる。マイクロビーズはガラスあるいはアクリル製とし、基板はシリコーン製とすることができる。生体分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリアミノ酸又は合成高分子を用いることができる。
【００１３】
このように、サンプル生体分子を結合させたマイクロビーズを平板基板上に規則的に配置することで、従来のマイクロアレイよりも高精度な形状で、濃度が均一なサンプルが配置されたマイクロアレイを作製することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施する場合の一形態を図面により具体的に説明する。
図１は本発明によるビーズ埋め込み式マイクロアレイの一例を示す模式図であり、図１（ａ）は平面図、図１（ｂ）はそのＡＡ断面図である。このマイクロアレイ１０は、平板状の基板１１上に多数のマイクロビーズ１２が規則的に配置された構造を有する。基板１１は、ガラス、プラスチック、シリコーンゴム（ＰＤＭＳ）、金属などからなる。マイクロビーズ１２は、例えば直径が５０μｍ〜１００μｍ程度のガラス製あるいはポリスチレン製の球体であり、図１（ｂ）に示すように基板１１の表面に一部分が埋め込まれた状態で固定されている。マイクロビーズ１２の表面にはサンプルとして核酸、タンパク質等の生体分子が均一にコーティングされている。イオン性生体分子のマイクロビーズ１２への結合は公知の方法、例えばカップリング反応（アミノ基−カルボキシル基）、ビオチン−アビジン結合、アミノ基−スクシニル基結合などによって行われる。
【００１５】
次に、本発明によるビーズ埋め込み式マイクロアレイの製造方法について説明する。図２は基板上にマイクロビーズを配置、固定する方法の一例を説明する模式図であり、図は１個のマイクロビーズに着目して、それを基板表面に固定する工程を示している。
【００１６】
マイクロアレイ用の基板として、マイクロビーズの直径と同じか、又は僅かに小さい直径で、マイクロビーズの半径と同じ深さの小さなくぼみ２２が形成された基板２１を用意する。この基板２１の作製は、金属やシリコーンなどによって型をつくり、そこにプラスチックやシリコーンゴムなどの原材料を流し込むなどの方法によって行うことができる。ここでは、アルミ素材の簡易金型によって、表面に直径９０μｍ、深さ４５μｍの半球状のくぼみ２２を相互の間隔２００μｍとして格子状に多数形成したシリコーン（ＰＤＭＳ）製の基板を用意した。シリコーン（ＰＤＭＳ）は、加工が容易でやわらかい材質のため、本発明によるビーズ埋め込み式マイクロアレイ用の基板材料に適している。
【００１７】
また、マイクロビーズとして、球体表面をストレプトアビジン修飾された直径１００μｍのガラス製の球形ビーズを用意した。用意したマイクロビーズは複数の組みに分け、各組のマイクロビーズの表面にそれぞれ異なるサンプルを結合させた。今回は例として、ビオチン標識したオリゴヌクレオチドを各種用意した。各種ビオチン標識オリゴヌクレオチドと、ストレプトアビジン表面修飾マイクロビーズとを互いに混ぜてよく攪拌した後、室温（２０〜２５℃）で１時間反応させ、ビーズ表面上に均一にオリゴヌクレオチドを配列した。表面にサンプルを均一にコーティングした各種オリゴヌクレオチド結合マイクロビーズ２４は、それぞれ別々の容器２３に分けて入れておく。
【００１８】
マイクロビーズを搬送するための手段としてビーズの直径よりも小さい内径を持つキャピラリ管を用いる。ここでは、内径８０μｍ、外径１００μｍのガラス製のキャピラリ管２５を用いた。キャピラリ管２５は、先端から空気を吐き出したり、吸引したりできるようになっている。図２において、キャピラリ管２５内に図示した矢印はキャピラリ管内を流れる空気の動きを示したものである。
【００１９】
最初に、図２（ａ）に示すように、サンプルを均一にコーティングしたマイクロビーズ２４の入った容器２３にキャピラリ管２５の先端を近づけ、キャピラリ管２５の先端から空気を吸引することによって、キャピラリ管先端に１個のマイクロビーズ２４を保持する。先端に１個のマイクロビーズを保持したら、そのまま吸引状態を保って、図２（ｂ）に示すように、キャピラリ管２５を基板２１に設けられたくぼみ２２の上方に移動する。その後、図２（ｃ）に示すように、キャピラリ管２５を基板２１に向けて下降し、先端に保持しているマイクロビーズ２４をくぼみ２２上に押し付け、固定する。基板材料として用いたシリコーン（ＰＤＭＳ）はやわらかい材質であるため、その表面に形成されたくぼみにマイクロビーズを押し付けると、マイクロビーズはくぼみに挟まれ、固定される。次に、キャピラリ管２５による空気の吸引を停止し、又は僅かに吐き出すことで、キャピラリ先端に保持していたマイクロビーズを解放し、くぼみに固定する。最後に、図２（ｄ）に示すように、基板２１の表面からキャピラリ管２５を上昇させる。このとき、キャピラリ管２５から空気を吐き出しながら上昇させるようにしてもよい。
【００２０】
ここでは、基板として柔らかな材質を用い、そこに形成したくぼみにマイクロビーズを固定する例について説明したが、その他の固定方法としては、くぼみを形成した平板基板の材質と、マイクロビーズの材質の温度による膨張や収縮の作用により、相互の膨張、収縮の関係を利用することで、マイクロビーズをくぼみに固定する方法がある。
【００２１】
図３は、表面に異なるサンプルをコーティングした複数種類のマイクロビーズを効率よく基板上の一定の位置に配置してマイクロアレイを作製することのできる装置の一例を示す図である。
【００２２】
ビーズ埋め込み式マイクロアレイ用の複数の基板３２は支持台３１上に配置されている。支持台３１は、Ｙ方向駆動部３４によってＹ方向に移動可能になっている。支持台３１の横に配置されたマイクロタイタープレート３３の各ウェルには、各種の生体高分子を結合させたマイクロビーズが所定の規則に従って配列されている。複数のキャピラリ管３５が取り付けられた移動ヘッド３６は、Ｚ方向駆動部３７によって上下方向であるＺ方向に駆動可能であり、また、Ｘ方向駆動部３８によってＸ方向に移動可能になっている。移動ヘッド３６は吸排気制御エアポンプを有し、その下方に取り付けられた複数のキャピラリ管３５の先端からの吸気・排気を制御する。また、超音波洗浄ユニット４１及び吸引乾燥ユニット４２が設けられている。Ｘ方向駆動部３８、Ｙ方向駆動部３４、Ｚ方向駆動部３７、移動ヘッド３６内の吸排気制御エアポンプ、超音波洗浄ユニット４１及び吸引乾燥ユニット４２は、ディスプレイ４０が接続された制御ユニット３９によって制御される。
【００２３】
ビーズ埋め込み式マイクロアレイの作製に当たっては、Ｘ方向駆動部３８によって移動ヘッド３６がマイクロタイタープレート３３の上方に移動する。その後、Ｚ方向駆動部３７によって下降され、移動ヘッド３６内の吸排気制御エアポンプによって吸気・排気を制御される複数のキャピラリ管３５により、マイクロタイタープレート３３中のサンプル結合マイクロビーズは配列どおりにキャピラリ管群によりピックアップされる。
【００２４】
サンプル結合マイクロビーズをピックアップした複数のキャピラリ管３５は指定された基板３２上に移動し、図２にて説明した方法により、それぞれの先端に保持しているマイクロビーズを基板３２上に配列どおりに固定する。マイクロビーズを固定する基板３２及びその基板上での位置は、支持台３１をＹ方向に駆動し、基盤のＹ方向位置を決定するＹ方向駆動部３４、及び移動ヘッド３６をＸ方向に駆動し各キャピラリ管３５のＸ方向位置を決定するＸ方向駆動部３８によって決められる。マイクロビーズを固定後のキャピラリ管は、超音波洗浄ユニット４１により超音波洗浄と流水洗浄を受け、吸引乾燥ユニット４２により真空乾燥される。こうして清浄な状態に戻されたキャピラリ管３５は、基板３２上に指定されたとおりのマイクロビーズの配列ができるまで、前記の作業を繰り返す。以上の作業は制御ユニット３９によってプログラミングの指示どおりに制御される。
【００２５】
このようにして、表面に均一にサンプルが付着した安価なビーズと、安価な基板を組み合わせ、ピン方式を用いるよりも形状が優れた、表面サンプル濃度が均一なマイクロアレイを作製することが可能となる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、均一な形状で、濃度が均一なサンプルが配置されたマイクロアレイが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるビーズ埋め込み式マイクロアレイの一例を示す模式図。
【図２】基板上にマイクロビーズを配置、固定する方法の一例を説明する模式図。
【図３】マイクロアレイ作製装置の一例を示す図。
【符号の説明】
１０：マイクロアレイ、１１：基板、１２：マイクロビーズ、２１：基板、２２：くぼみ、２３：容器、２４：マイクロビーズ、２５：キャピラリ管、３１：支持台、３２：基板、３３：マイクロタイタープレート、３４：Ｙ方向駆動部、３５：キャピラリ管、３６：移動ヘッド、３７：Ｚ方向駆動部、３８：Ｘ方向駆動部、３９：制御ユニット、４０：ディスプレイ、４１：超音波洗浄ユニット、４２：吸引乾燥ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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