(57)【要約】【課題】  ＴＩＲドメインを含みＴＲＩＦ関連アダプタータンパク質（TRIF-related adaptor molecule；ＴＲＡＭ）の機能解明に有用な、特にグラム陰性菌の細胞壁画分であるエンドトキシンに不応答性のモデル非ヒト動物や、かかるエンドトキシンに不応答性のモデル非ヒト動物を用いたＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供すること。【解決手段】  染色体上のＴＲＡＭ遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＲＡＭを発現する機能が失われており、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答性が特異的に傷害されているエンドトキシン不応答性マウスを、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニングに用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体上のＴＲＩＦ関連アダプター分子（TRIF-related adaptor molecule；ＴＲＡＭ）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＲＡＭを発現する機能が失われており、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答性が特異的に障害されていることを特徴とするエンドトキシン不応答性の非ヒト動物。
【請求項２】
ＰＧＮ、Ｒ−８４８、ＣｐＧ ＯＤＮに応答性で、ＬＰＳに不応答性であることを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１又は２記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンドとを用いて、前記免疫細胞におけるＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンドを用いて、前記非ヒト動物におけるＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体（Toll Like Receptor：ＴＬＲ）のシグナル伝達を仲介するＴＲＩＦ関連アダプター分子（TRIF-related adaptor molecule；ＴＲＡＭ）遺伝子の機能が欠損した非ヒト動物、特にエンドトキシン等のＴＬＲ４が認識するリガンドに対して不応答性のＴＲＡＭノックアウトマウスや、これらを用いたＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（例えば、非特許文献１、２参照）、また成体における侵入病原体を検出する自然免疫に関与しており（例えば、非特許文献３〜５参照）、かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体である。また、免疫反応や感染時の応答、造血、ウイルス感染や腫瘍細胞の障害に重要な役割を果たしている細胞間シグナル伝達物質であるサイトカインの中でも、リンパ球間でシグナルを伝え合うサイトカインはインターロイキン（以下「ＩＬ」という）と呼ばれているが、前記Ｉ型膜貫通受容体の細胞質内領域は、哺乳類ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（例えば、非特許文献６〜８参照）。
【０００３】
近年、Ｔｏｌｌ遺伝子の哺乳類のホモログが同定され（例えば、非特許文献９〜１２参照）、ヒトＴＬＲファミリーについては、これまでに１０種のＴＬＲ（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）が報告されている。ＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptor）として、別々の病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰｓ：pathogen-associated molecular patterns）を識別し、転写因子であるＮＦ−κＢの核内への移行を導く同様の細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。かかるシグナル伝達経路は、最終的には炎症性サイトカインを産生させ、宿主防衛反応を誘起し、さらに獲得免疫に対しても宿主防衛反応を誘起させる。また、近年多くのＴＬＲリガンドが報告されている。
【０００４】
ＴＬＲ１は、トリアシル化リポタンパク質を認識する（例えば、非特許文献１３参照）。ＴＬＲ２は、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）、細菌由来トリアシル化リポタンパク質、マイコプラズマ由来ジアシル化リポタンパク質、及びクルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）のＧＰＩアンカーなどのさまざまな細菌成分を認識する（例えば、非特許文献１４〜２１参照）。ＴＬＲ３は、ＲＮＡウイルスのライフサイクルにおいて発生する二重鎖ＲＮＡの認識に関与している（例えば、非特許文献２２参照）。ＴＬＲ４は、グラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるリポポリサッカライド（以下ＬＰＳ）の受容体である（例えば、非特許文献２３、２４参照）。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛のタンパク質成分であるフラジェリンを認識する（例えば、非特許文献２５参照）。ＴＬＲ６は、ジアシル化したリポタンパク質を認識する際に必要とされており（例えば、非特許文献２６参照）、ＴＬＲ７は、抗ウイルス性の合成化合物であるイミダゾキノリン及びその誘導体Ｒ−８４８を認識する際に極めて重要である（例えば、非特許文献２７参照）。ＴＬＲ９は、細菌由来の非メチル化ＣｐＧモチーフ（5'-Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr-3'）を有するＤＮＡの受容体である（例えば、非特許文献２８参照）。
【０００５】
ＴＬＲの細胞内シグナル伝達経路は、ＴＬＲの細胞質領域の中に保存されているＴＩＲドメインにより誘導される。細胞質分子であるＭｙＤ８８には、ＴＩＲドメイン及びデスドメインがある。ＭｙＤ８８のデスドメインは、ＩＲＡＫ−１やＩＲＡＫ−４等、その他のデスドメインを含む分子と相互作用する際に必要とされている（例えば、非特許文献２９〜３１参照）。ＴＩＲドメインは、その他のＴＩＲドメインを含む受容体又はアダプターと二量体を形成する際に必要であると報告されている。実際に、ＭｙＤ８８欠損マウスは、全てのＴＬＲリガンドとＩＬ−１に応答した炎症誘発性サイトカインの産生や脾細胞の増殖を示さず、ＭｙＤ８８が全てのＴＬＲとＩＬ−１受容体の免疫反応に必須であることを示唆した（例えば、非特許文献３２参照）。しかしながら、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいて、ＴＬＲ３リガンドであるポリ（Ｉ：Ｃ）やＴＬＲ４が認識するリガンドであるＬＰＳは、ＩＦＮ−β等の特定の遺伝子の発現を未だ刺激する。ＩＦＮ−βの誘発は、樹状細胞の成熟や、それに続くＩＦＮ誘発遺伝子の発現を引き起こす（例えば、非特許文献３３、３４参照）。これらの観察は、ＴＬＲシグナル伝達が、少なくとも２つの経路、すなわち、炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こすＭｙＤ８８依存的経路、並びにＩＦＮ誘発遺伝子の誘発及び樹状細胞の成熟と会合したＭｙＤ８８非依存的経路により構成されることを示唆した。また、全てのＴＬＲを仲介するＭｙＤ８８依存的シグナル伝達経路の特異性は、２番目に見い出された、ＴＩＲドメインを含むアダプターであるＴＩＲＡＰにより提供される（例えば、非特許文献３５、３６参照）。ＴＩＲＡＰ欠損マウスは、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４を介するＭｙＤ８８依存的シグナル伝達経路の活性の激減を示したが、その他のＴＬＲに対しては示さなかった（例えば、非特許文献３７、３８参照）。
【０００６】
ＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達経路の詳細な分子機構については明らかになっていないが、別のＴＩＲドメインを含む分子、ＴＲＩＦの新たな同定（例えば、非特許文献３９、４０参照）や、この遺伝子が変異したマウスによる遺伝学的証拠により、ＴＲＩＦは、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４が共有するＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達経路における重要な役割を果たしていることが明らかになった（例えば、非特許文献４１、４２参照）。さらに、近年の研究により、２種の非典型的ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）、すなわち、ＩＫＫ−ι／ＩＫＫε及びＴＢＫ１／Ｔ２Ｋが、ＴＲＩＦと相互作用し、ＩＲＦ−３を活性化し、最終的にＩＦＮ−βの誘発を引き起こすことが明らかになった（例えば、非特許文献４３、４４参照）。
【０００７】
現在まで、ヒトゲノムにおいて、さらに２種のＴＩＲドメインを含むアダプターが同定されている。１種はＳＡＲＭ（ＳＡＭドメイン及びＡＲＭドメインを含むタンパク質（SAM and ARM domain-containing protein）の略語）と呼ばれており、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達におけるその生理学的機能は、未だ明らかではない（例えば、非特許文献４５、４６参照）。もう１種は、ＴＲＡＭ（ＴＲＩＦ関連アダプター分子（TRIF-Related Adaptor Molecule）の略語、別名ＴＩＲＰ）である（例えば、非特許文献４７参照）。これまでのインビトロ分析は、ＴＲＡＭの異所的発現が、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ及びＴＲＩＦのようなＮＦ−κＢを活性化することを示唆した。しかしながら、ＴＲＩＦとは異なり、ＩＦＮ−βプロモーターを活性化しなかった。このタンパク質のドミナントネガティブ変異体は、ＩＬ−１Ｒを介してＮＦ−κＢの活性化を阻害したが、ＴＬＲを介しては阻害しなかった。これは、ＴＲＡＭが、ＩＬ−１Ｒを介したＭｙＤ８８依存的シグナル伝達経路において、特異的なアダプタータンパク質であることを示唆した。しかしながら、インビボにおけるＴＲＡＭの役割は、未だ明らかではない。
【０００８】
【非特許文献１】Cell 52, 269-279, 1988
【非特許文献２】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献３】Nature 406, 782, 2000
【非特許文献４】Nat. Immunol. 2, 675, 2001
【非特許文献５】Annu. Rev. Immunol. 20, 197, 2002
【非特許文献６】Nature 351, 355-356, 1991
【非特許文献７】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献８】J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998
【非特許文献９】Nature 388, 394-397, 1997
【非特許文献１０】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998
【非特許文献１１】Blood 91, 4020-4027, 1998
【非特許文献１２】Gene 231, 59-65, 1999
【非特許文献１３】J. Immunol. 169, 10-14, 2002
【非特許文献１４】Science 285, 732, 1999
【非特許文献１５】Science 285, 736, 1999
【非特許文献１６】J.Biol. Chem. 274, 33419, 1999
【非特許文献１７】Immunity 11, 443, 1999
【非特許文献１８】J. Immunol. 164, 554, 2000
【非特許文献１９】Nature 401, 811, 1999
【非特許文献２０】J. Immunol. 167, 416, 2001
【非特許文献２１】Nat. Med. 8, 878-884, 2002
【非特許文献２２】Immunity 11, 443-451, 1999
【非特許文献２３】Nature 413, 732-738, 2001
【非特許文献２４】J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999
【非特許文献２５】Science 282, 2085-2088, 1998
【非特許文献２６】Nature 410, 1099-1103, 2001
【非特許文献２７】Int. Immunol. 13, 933-940, 2001
【非特許文献２８】Nat. Immunol. 3, 196-200, 2002
【非特許文献２９】Nature 408, 740-745, 2000
【非特許文献３０】Immunity 7, 837-847, 1997
【非特許文献３１】Moll. Cell. 11, 293-302, 2003
【非特許文献３２】Immunity 9, 1, 143-150, 1998
【非特許文献３３】J. Immunol. 167, 5887-5894, 2001
【非特許文献３４】J. Immunol. 166, 5688-5694, 2001
【非特許文献３５】Nat. Immunol. 2, 835-841, 2001
【非特許文献３６】Nature 413, 78-83, 2001
【非特許文献３７】Nature 420, 324-329, 2002
【非特許文献３８】Nature 420, 329-333, 2002
【非特許文献３９】J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002
【非特許文献４０】Nat. Immunol. 4, 161-167, 2003
【非特許文献４１】Science 301, 640-643, 2003
【非特許文献４２】Nature, 424, 743- 748, 2003
【非特許文献４３】Science 300, 1148-1151, 2003
【非特許文献４４】Nat. Immunol. 4, 491-496, 2003
【非特許文献４５】Genomics 74, 234-244, 2001
【非特許文献４６】Trends Immunol. 24, 286-290, 2003
【非特許文献４７】J. Biol. Chem. 278, 24526-24532, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ＴＩＲドメインを含みＴＲＩＦ関連アダプタータンパク質であるＴＲＡＭの機能解明に有用な、特にグラム陰性菌の細胞壁画分であるエンドトキシンに不応答性のモデル非ヒト動物や、かかるエンドトキシンに不応答性のモデル非ヒト動物を用いたＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＴＲＡＭ欠損マウスを作製し、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路におけるＴＲＡＭのインビボでの役割について分析し、以下の知見を得た。
【００１１】
ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＴＬＲ４が認識するリガンドに応答して、サイトカインの産生、脾細胞の増殖及び表面分子のアップレギュレーションに対して著しい欠損を示したが、その他のＴＬＲリガンドに対しては欠損を示さなかった。さらに、ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＩＦＮ−β誘発遺伝子及びＩＦＮ誘発遺伝子のＴＬＲ４を介した発現は阻害されたが、ＴＬＲ３を介した発現は阻害されなかった。細胞内シグナル伝達に関しては、ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＩＲＡＫ−１のＬＰＳを誘導した自己リン酸化やＮＦ−κＢ活性化の初期相はインタクト（intact）であった。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損細胞において、ＩＲＦ−３の活性化は認められず、また、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答は認められなかったが、ＬＰＳに応答して、ＮＦ−κＢ活性化の遅延相の欠損が認められた。後者の現象がＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達経路の特徴であることを考えると、ＴＲＡＭがＴＬＲ４シグナル伝達のＭｙＤ８８非依存的経路を特異的に介することが示唆された。
【００１２】
ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＩＲＡＫ−１の自己リン酸化及びＮＦ−κＢ活性化の初期相により特徴づけられる、ＭｙＤ８８依存的経路のＴＬＲ４を介した活性化は、野生型細胞と比較することができた。しかしながら、炎症誘発性サイトカインのＴＬＲ４を介した産生は減少した。同様に、ＴＬＲ４及びＴＬＲ３を介したＭｙＤ８８非依存的経路に必須のＴＲＩＦを欠損したマウスにおいて、炎症誘発性サイトカインのＴＬＲ４を介した産生が著しく低下した。ＭｙＤ８８欠損マウスが同様の表現型を示したため、炎症誘発性サイトカインを誘発するには、ＭｙＤ８８非依存的経路の活性化が明らかに必要とされている（Science 301, 640-643, 2003、Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling.  Nature, 424, 743- 748, 2003）。したがって、ＴＬＲ４のシグナル伝達の場合、炎症誘発性サイトカインを産生するためには、ＭｙＤ８８依存的経路及びＭｙＤ８８非依存的（ＴＲＡＭ／ＴＲＩＦ依存的）経路の両方を活性化する必要がある。しかしながら、ＭｙＤ８８非依存的経路を活性化しない、ＴＬＲ２、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９のシグナル伝達経路では、炎症誘発性サイトカインを誘発するためにはＭｙＤ８８依存的経路を活性化するだけで十分である（Science 282, 2085-2088, 1998、Nat. Immunol. 3, 392-398, 2002、J. Exp. Med. 192, 595-600, 2000、Curr. Biol. 10, 1139-1142, 2000）。ＴＬＲ４シグナル伝達が炎症誘発性サイトカインを誘発するために、ＭｙＤ８８依存的経路及びＴＲＩＦ依存的経路の両方を活性化させる必要がある理由については未だ明らかではないが、ＴＬＲ４だけが、現在特徴づけられているＴＩＲドメインを含むアダプター、すなわち、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ、ＴＲＩＦ及びＴＲＡＭの全てを利用することがわかった。
【００１３】
以上のとおり、ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９及びＩＬ−１βのリガンドに対しては正常な応答を示したが、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対してはＭｙＤ８８依存的応答の激減を示した。さらに、ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達カスケードの活性を示さなくなったが、ＭｙＤ８８依存的シグナル伝達カスケードの活性は示した。この表現型は、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４の両方のシグナル伝達においてＭｙＤ８８非依存的経路の活性化が欠如したＴＲＩＦ欠損マウスを暗示したが、ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＴＬＲ３リガンドに対して正常な応答を示した。これらの結果は、ＴＲＡＭが、ＴＬＲ４シグナル伝達のＭｙＤ８８非依存的経路に特異性を与えるアダプター分子であることを示した。
【００１４】
本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１５】
すなわち本発明は、染色体上のＴＲＩＦ関連アダプター分子（TRIF-related adaptor molecule；ＴＲＡＭ）遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＲＡＭを発現する機能が失われており、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答性が特異的に障害されていることを特徴とするエンドトキシン不応答性の非ヒト動物（請求項１）や、ＰＧＮ、Ｒ−８４８、ＣｐＧ ＯＤＮに応答性で、ＬＰＳに不応答性であることを特徴とする請求項１記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物（請求項２）や、非ヒト動物が、マウスであることを特徴とする請求項１又は２記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物（請求項３）に関する。
【００１６】
また本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンドとを用いて、前記免疫細胞におけるＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項４）や、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒト動物と、被検物質と、ＴＬＲ４が認識するリガンドを用いて、前記非ヒト動物におけるＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答を測定・評価することを特徴とするＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法（請求項５）に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＴＲＡＭノックアウトマウス等のエンドトキシン不応答性モデル非ヒト動物は、エンドトキシン等のＴＬＲ４が認識するリガンドに対して不応答性であるため、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニングが可能となり、ひいては、エンドトキシン又はそのレセプターの過剰な産生等に起因するエンドトキシンショック等の疾病に対する薬剤の開発に有用な情報を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のエンドトキシン不応答性の非ヒト動物としては、ＴＲＡＭ遺伝子の一部もしくは全部が欠損し、野生型において発現されるＴＲＡＭを発現する機能が失われており、ＴＬＲ４が認識するリガンドに対する応答性が特異的に傷害されているモデル非ヒト動物であれば特に制限されるものではなく、ＴＬＲ４が認識するリガンドとしては、主としてグラム陰性菌の外膜成分として存在するエンドトキシンとも呼ばれるリポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陽性細菌の細胞壁成分であるリポテイコ酸（ＬＴＡ）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）溶解物、グラム陽性菌細胞壁画分等を例示することができ、また本発明においては、便宜上、ＴＬＲ４が認識するリガンドの他、これらリガンドを担持するキャリアや、これらリガンドが細胞表層に存する細菌菌体自体も本発明におけるＴＬＲ４が認識するリガンドに包含される（以下、「本件リガンド類」という）。
【００１９】
本発明において不応答性とは、本件リガンド類による刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われていることを意味する。したがって、本発明においてエンドトキシン不応答性モデル非ヒト動物とは、本件リガンド類による刺激に対して、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいはほぼ失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいう。また、本件リガンド類による刺激としては、エンドトキシンを生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞にエンドトキシンを接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。
【００２０】
そして、本発明におけるエンドトキシン不応答性モデル非ヒト動物としては、エンドトキシン、リポテイコ酸、結核菌溶解物等の細菌菌体成分などの本件リガンド類に対して不応答性であり、ＴＬＲ２のリガンドであるＰＧＮ、ＴＬＲ９のリガンドであるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、ＩＬ−１、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ＴＬＲ３のリガンドであるポリＩ：Ｃ、ＴＬＲ７リガンドである合成化合物Ｒ−８４８に対しては応答性である非ヒト動物を挙げることができ、具体的には、ＴＲＡＭ遺伝子の機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を挙げることができる。
【００２１】
本発明において、ＴＲＡＭ遺伝子の機能が欠損した動物としては、ＴＲＡＭ-/-マウスの他、例えばＴＲＡＭ遺伝子の発現機能が欠損したラット等の齧歯目動物を例示することができる。これらＴＲＡＭ遺伝子の発現機能が欠損した非ヒト動物としては、メンデルの法則に従い出生してくるＴＲＡＭ-/-非ヒト動物が、正確な比較実験をすることができる同腹の野生型と共に得ることができる点で好ましい。かかるＴＲＡＭ遺伝子の発現機能が欠損した動物の作製方法を、ＴＲＡＭ-/-マウスを例にとって以下説明する。
【００２２】
ＴＲＡＭ遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＴＲＡＭ遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＴＲＡＭ遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＴＲＡＭをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３’末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００２３】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明のＴＲＡＭ-/-マウスを作製することができる。また、ＴＲＡＭ-/-マウスにおいて、ＴＲＡＭが生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＲＡＭの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２４】
また、作出されたＴＲＡＭ-/-マウスが本件リガンド類に対して不応答性であることは、例えば、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分であるＬＰＳをＴＲＡＭ-/-マウスの腹腔マクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２等の産生量や、脾細胞の増殖応答や、骨髄由来樹状細胞におけるＩＦＮ−β誘発遺伝子及びＩＦＮ誘発遺伝子の発現量や、転写因子ＩＲＦ−３の活性化を測定することや、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分であるＬＰＳをＴＲＡＭノックアウトマウスに静脈注射等により投与し、発熱、ショック、白血球や血小板の減少、骨髄出血壊死、血糖低下、ＩＦＮ誘発、Ｂリンパ球（骨髄由来免疫応答細胞）の活性化等のエンドトキシンの生物活性を測定することにより確認することができる。
【００２５】
本発明のエンドトキシン不応答性モデル非ヒト動物や該モデル動物由来のマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞は、ＴＬＲ４リガンドの作用機序の解明の他、ＴＬＲ４リガンドに対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング等に用いることができる。本発明の本件リガンド類に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法としては、本発明のモデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、本件リガンド類とを用いて、前記免疫細胞における本件リガンド類に対する応答を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物と、被検物質と、本件リガンド類とを用いて、前記モデル非ヒト動物における本件リガンド類に対する応答を測定・評価するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明のスクリーニング方法の実施の形態を以下に例を挙げて説明する。
【００２６】
本発明のモデル非ヒト動物から得られるマクロファージ、脾臓細胞又は樹状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、本件リガンド類とを共に培養し、該免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物に被検物質をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を本件リガンド類の存在下で培養し、該免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物に本件リガンド類をあらかじめ投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリーニング方法や、本発明のモデル非ヒト動物に本件リガンド類と被検物質とを同時又はどちらか一方を先に投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するスクリーニング方法を挙げることができる。
【００２７】
上記マクロファージ、脾臓細胞等の免疫細胞における細胞活性の程度の測定・評価方法としては、免疫細胞がマクロファージの場合、マクロファージにおけるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２等のサイトカインの産生量や、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合作用の程度を測定・評価する方法を、免疫細胞が脾臓細胞の場合、脾臓細胞の増殖の程度や、脾臓細胞におけるＭＨＣクラスIIの発現量を測定・評価する方法を、それぞれ例示することができる。また、免疫細胞における細胞活性の程度を測定・評価するに際し、対照として本発明のモデル非ヒト動物の野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
【００２８】
本発明のＴＬＲ４が認識するリガンド又はこの含有物に対する応答の促進物質又は抑制物質のスクリーニング方法により得られる促進物質又は抑制物質は、インビボにおける細菌菌体成分刺激によるシグナル伝達におけるメカニズムの解明に有用であり、特に促進物質は細菌感染症の予防・治療剤として使用しうる可能性がある。細菌感染症の予防・治療効果が期待できる上記促進物質を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品を用いる予防若しくは治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２９】
以下、結果及び方法の順に示された実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（４番目のＴＩＲドメインを含むアダプターＴＲＡＭの同定）
本発明者らは、既に、データベース検索分析を用いることにより、３番目のＴＩＲドメインを含むアダプターである、ＴＲＩＦを同定している（J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002）（図１ａ）。この分析の際に、本発明者らは、別のＴＩＲドメインを含む分子を同定した。この分子のＴＩＲドメインは、ＭｙＤ８８又はＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインと比較して、ＴＲＩＦのＴＩＲドメインに対してより高い相同性を示した。この分子の遺伝子は、２３５ａａをコードする７０８ｂｐの翻訳領域を有しており、ＴＲＩＦ関連アダプター分子（TRIF-related adaptor molecule）を意味するＴＲＡＭとして、登録及び命名された（アクセッションナンバーＡＹ２３２６５３、別名ＴＩＲＰ（J. Biol. Chem. 278, 24526-24532, 2003））。２９３細胞におけるＴＲＡＭの異所的発現は、ＭｙＤ８８及びＴＲＩＦを介したそれぞれの活性化と比較すると低水準ではあったが、ＮＦ−κＢ依存的プロモーター及びＩＦＮ−βプロモーターを活性化した（図１ｂ、図１ｃ）。
【実施例２】
【００３１】
（ＴＲＡＭ欠損マウスの作製）
本発明者らは、ＴＲＡＭの生理学的役割を解明するために、ジーンターゲティングによりＴＲＡＭ欠損マウスを作製した。マウスのＴｒａｍ遺伝子は、１つのエキソンからなる。本発明者らは、ターゲティングベクターを構築し、エキソン全体をネオマイシン耐性遺伝子カセットに置換した（図１ｄ）。正確なターゲティングを行なった２つのＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６の胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製した。キメラマウスの仔とＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交雑させ、サザンブロット分析により変異対立遺伝子の伝達をモニターした（図１ｅ）。次に、ヘテロ接合体マウスを交配させて、Ｔｒａｍ遺伝子の無発現変異を保有する子孫を作製した。ＴＲＡＭ欠損マウスは、予想されたメンデル比で生まれ、発達上の異常は認められなかった。Ｔｒａｍ遺伝子の欠損を確認するために、野生型肺繊維芽細胞及びＴＲＡＭ欠損肺繊維芽細胞から得た全ＲＮＡに対し、ノーザンブロット分析を行なった。ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＴＲＡＭの転写物は認められなかった。さらに、脾細胞について免疫沈降分析を行なった結果、Ｔｒａｍ遺伝子の欠損により、ＴＲＡＭタンパク質が発現しないことが確認された（図１ｆ）。
【実施例３】
【００３２】
（ＴＲＡＭは、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達に関与していない）
これまでのインビトロ研究により、ＴＲＡＭがＩＬ−１Ｒを介するＭｙＤ８８依存的経路に関与していることが明らかになったため（J. Biol. Chem. 278, 24526-24532, 2003）、まず、ＴＲＡＭ欠損細胞においてＩＬ−１Ｒシグナル伝達に障害があるかどうかについて調べた。ＩＬ−１βに応答した、野生型マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスから得たマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）によるＩＬ−６の産生について、ＥＬＩＳＡで測定した（図２ａ）。ＴＲＡＭ欠損ＭＥＦにおいて、ＩＬ−１βを誘発したＩＬ−６の産生は正常であった。次に、本発明者らは、ＩＬ−１βに応答した、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫ１の活性化について分析した（図２ｂ、図２ｃ）。ＩＬ−１βで刺激したところ、野生型ＭＥＦ及びＴＲＡＭ欠損ＭＥＦの両方において、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫ１の活性は同程度を示し、ＴＲＡＭがＩＬ−１Ｒを介したシグナル伝達経路には関与しないことが証明された。
【実施例４】
【００３３】
（ＴＲＡＭ欠損マウスにおける、著しく障害されたＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８依存的応答）
次に、ＰＧＮ、ＬＰＳ、Ｒ−８４８、ＣｐＧ ＤＮＡ等の様々なＴＬＲリガンドに応答した、腹腔マクロファージによるＴＮＦ−α又はＩＬ−６等の炎症誘発性サイトカインの産生について分析した。ＰＧＮ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡで刺激したところ、野生型マクロファージ及びＴＲＡＭ欠損マクロファージの両方で、同量のＩＬ−６又はＴＮＦ−αを産生した。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損細胞においては、ＬＰＳ刺激に応答して、炎症性サイトカインの産生は著しく減少した（図３ａ）。野生型細胞は、ＬＰＳ刺激に応答して、投与依存的にＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０を産生した（図３ｂ）。これに対して、ＴＲＡＭ欠損細胞におけるＬＰＳ誘発によるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の産生は、著しく損なわれていた。したがって、ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＬＰＳ誘発によるサイトカイン産生は、不完全な応答を示すことがわかった。
【００３４】
次に、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡの刺激に応答した、脾細胞の増殖について分析した。Ｒ−８４８及びＣｐＧ ＤＮＡに応答して、野生型マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスの脾細胞の増殖では、同じ割合が認められた。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損脾細胞は、ＬＰＳ刺激に対して不完全な増殖を示した（図３ｃ）。次に、ＬＰＳ又は抗ＩｇＭ抗体で刺激した後、ＦＡＣＳにより、Ｂ２２０陽性脾細胞のＣＤ６９及びＣＤ８６の表面発現について分析した。抗ＩｇＭ抗体に応答して、野生型Ｂ２２０陽性細胞及びＴＲＡＭ欠損Ｂ２２０陽性細胞の両方が、ＣＤ６９及びＣＤ８６のアップレギュレーションについて比較できる水準を示した（図３ｄ）。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損細胞において、これらの分子のＬＰＳが誘発した増大は、激しく障害されていた。これらのことから、TRAM欠損マウスにおいてTLR4を介した応答のみが欠失していることが明らかになった。
【実施例５】
【００３５】
（ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的遺伝子発現を著しく損なうが、ＴＬＲ３を介したＭｙＤ８８非依存的遺伝子発現は損なわない）
ＴＬＲ３リガンド及びＴＬＲ４が認識するリガンドは、ＭｙＤ８８非依存的形式において、ＩＦＮ−βの産生を誘発し、その後ＩＦＮ誘発遺伝子を発現することが明らかになっている（Immunity 11, 443-451, 1999、J. Immunol. 167, 5887-5894, 2001、J. Immunol. 166, 5688-5694, 2001）。ＴＲＡＭ欠損マウスは、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８依存的な生物応答を障害することから、次にＭｙＤ８８非依存的応答も障害するかどうかについて調べた。ノーザンブロット分析により、野生型マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスの両方におけるＩＦＮ−β誘発遺伝子及びＩＦＮ誘発遺伝子の発現について分析した。野生型骨髄由来ＤＣにおいて、ＬＰＳは、ＩＳＧ５４、ＩＰ−１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１等のＩＦＮ−β誘発遺伝子及びＩＦＮ誘発遺伝子の発現を刺激した。しかしながら、ＬＰＳ誘導によるこれら遺伝子の発現は、ＴＲＡＭ欠損細胞においては著しく障害されていた（図４ａ）。ＴＬＲ３の応答の場合は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の刺激に続いて、野生型腹腔マクロファージ及びＴＲＡＭ欠損腹腔マクロファージの両方で、これら遺伝子の比較できる程度の誘発が認められた（図４ｂ）。これらのデータは、ＴＲＡＭの欠損が、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８依存的応答だけではなく、ＭｙＤ８８非依存的応答に対しても影響を及ぼすことを示した。
【実施例６】
【００３６】
（ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達は認められなかった）
ＩＰ−１０ ｍＲＮＡのＬＰＳ誘発は、Ｓｔａｔ１のシグナル伝達に依存している。このことは、Ｓｔａｔ１欠損マウスにおいて、野生型細胞と比較した場合に、ＬＰＳで刺激したマクロファージではＩＰ−１０ ｍＲＮＡの発現が著しく低下したことにより証明された（J. Immunol. 163, 1537-1544, 1999、J. Leukoc. Biol. 69, 598-604, 2001、Nat. Immunol. 3, 392-398, 2002）。野生型マクロファージでは、Ｓｔａｔ１の７０１Ｙは、ＬＰＳを２時間刺激した後でリン酸化した。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損マクロファージにおいては、Stat1のチロシンリン酸化が検出されなかった（図５ａ）。対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）を刺激したところ、野生型細胞及びＴＲＡＭ欠損細胞の両方において、同程度のＳｔａｔ１リン酸化を示した（図５ｂ）。
【００３７】
次に、Ｓｔａｔ１のリン酸化がＩＦＮ−βに依存している（Nat. Immunol. 3, 392-398, 2002）ことから、ＩＦＮ−β産生の際に必要とされるシグナル伝達分子の活性化について調べた。転写因子であるＩＲＦ−３は、ＬＰＳ及びポリ（Ｉ：Ｃ）を介したＩＦＮ−β産生に必須であると報告されている。実際に、未変性ＰＡＧＥ分析を行なったところ、野生型細胞において、ＬＰＳが誘導したＩＲＦ−３ホモ二量体の形成が認められた。しかしながら、ＴＲＡＭ欠損マウスの細胞においては、ＬＰＳ誘導によるＩＲＦ−３の活性化は生じなかった（図５ｃ）。それに対して、ＴＲＡＭ欠損細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激すると、野生型細胞と比較して、同程度のＩＲＦ３二量体形成を示した（図５ｄ）。ＬＰＳ誘導によるＳｔａｔ１のリン酸化及びＩＲＦ−３の活性化はＭｙＤ８８に非依存的であることから、これらのデータは、ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達経路のＴＬＲ４を介した活性化は損なわれるが、ＴＬＲ３を介した活性化は損なわれないことを示している。ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達は、ＩＲＦ−３の活性化に加えて、ＮＦ−κＢ活性化の遅延相を引き起こす。ＬＰＳを１時間及び２時間刺激した後も、野生型細胞のＮＦ−κＢ活性化は安定していた。ＴＲＡＭ欠損細胞において、ＬＰＳを誘導したＮＦ−κＢの活性化は、早期の時点（early time point）（１０分、２０分）では正常であったが、後期の時点（later time point）（６０分、１２０分）では次第に消え、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達の特徴であるＮＦ−κＢ活性化の遅延相が、ＴＲＡＭ欠損マウスにおいては著しく損なわれていることを示した（図５ｅ）。それに対して、ＴＲＡＭ欠損細胞では、ポリ（Ｉ：Ｃ）を誘導したＮＦ−κＢ活性化が正常であることが認められた（図５ｆ）。自己リン酸化及び分解により検知されたように、ＭｙＤ８８依存的シグナル伝達経路を活性化すると、ＩＲＡＫ−１の活性化が生じる（図５ｇ）。ＴＲＡＭ欠損マクロファージは、野生型細胞に対して、同程度のＬＰＳを誘導したＩＲＡＫ−１の活性化を示し、ＴＲＡＭ欠損マウスにおいて、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の活性化が損なわれていないことを示した。総合すると、これらの観察は、ＴＲＡＭがＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的シグナル伝達経路に特異的に必須であることを示した。
【実施例７】
【００３８】
（プラスミド）
ＥＬＡＭ−１プロモーター由来のルシフェラーゼレポータープラスミド（ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター）は、Dr. D. T. Golenbockより提供された。マウスＩＦＮ−βプロモータールシフェラーゼレポーターは、ＰＣＲにより、以前の報告（Immunity 7, 837-847, 1997）の通りに作製した。ＦｌａｇがタグされたヒトＴＲＡＭ（Flag-tagged human TRAM）をｐＥＦ−ＢＯＳベクターにクローニングした。ＴＲＩＦ及びＭｙＤ８８の発現ベクターは、文献（J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002）記載のものを用いた。
【実施例８】
【００３９】
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
２９３細胞に、レポータープラスミド及び示された発現ベクターを一時的にコ・トランスフェクションした。全細胞溶解液のルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Dual-luciferase reporter assay system）（Promega社製）を用いて、文献（J. Immunol. 169, 6668-6672, 2002）記載の通り測定した。内部標準として、レニラルシフェラーゼ（Rennilla-luciferase）レポーター遺伝子（５０ｎｇ）を使用した。
【実施例９】
【００４０】
（ＴＲＡＭ欠損マウスの作製）
（ＥＳ）細胞（Ｅ１４．１）からTaKaRa LA TaqTM（TaKaRa社製）を用いてＰＣＲにより抽出したゲノムＤＮＡから、Ｔｒａｍ遺伝子を単離した。ターゲティングベクターは、ＴＲＡＭ ＯＲＦ全体をコードする１．０ｋｂ断片をネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏ）で置換し、負の選択のためにＰＧＫプロモーターにより作動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼをゲノム断片に挿入することにより構築した（図１ｄ）。かかるターゲティングベクターをＥＳ細胞中にトランスフェクションした後、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す二重耐性コロニーを選択し、ＰＣＲとサザンブロットでスクリーニングを行なった。相同的組換え体をＣ５７ＢＬ／６雌マウスにマイクロインジェクションし、ヘテロ接合体のＦ１子孫をインタークロスして、ＴＲＡＭ欠損マウスを得た。こうしたインタークロスにより生まれたＴＲＡＭ欠損マウス及びその野生型の同腹子を実験に使用した。
【実施例１０】
【００４１】
（試薬）
Ｒ−８４８は、株式会社ジャパンエナジー、医薬バイオ研究所（Pharmaceuticals and Biotechnology Laboratory, Japan Energy Corporation）より提供された。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを文献（Nat. Immunol. 3, 196-200, 2002）記載の通りに調製した。フェノール−クロロホルム−石油エーテル抽出手順により調製したサルモネラ・ミネソタ（Salmonella minnesota）Ｒｅ−５９５のＬＰＳ、S. aureus由来のPGN、ならびにポリ（Ｉ：Ｃ）を、Sigma社、Fluka社及びAmersham社よりそれぞれ購入した。抗ホスホＪＮＫ抗体及び抗ホスホＳｔａｔ１抗体は、Cell Signaling Technology社より購入した。抗ＪＮＫ１抗体、抗Ｓｔａｔ１抗体及び抗アクチン抗体は、Santa Cruz社製である。マウスＴＲＡＭのアミノ酸２１９〜２３２に対して、ポリクローナル抗ＴＲＡＭ抗体を作製した。ポリクローナル抗ＩＲＦ−３抗体及び抗ＩＲＡＫ−１抗体は、文献（Science 301, 640-643, 2003）記載の通りであった。抗ＩｇＭ抗体分析（Anti-IgM antibody analysis）は、Jackson ImmunoResearch Laboratoryより購入した。ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン、ＰＥ共役抗Ｂ２２０抗体、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ８６抗体及び抗Ｉ−Ａb抗体は、Pharmingen社製である。
【実施例１１】
【００４２】
（炎症誘発性サイトカイン濃度の測定）
チオグリコール酸を誘発させた腹腔マクロファージを、９６ウエルプレートで、記載の濃度のＰＧＮ、ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡで培養した（ウエル毎に５×１０4細胞）。培養上澄液中のＴＮＡ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０の濃度を、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡで測定した（ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２ｐ４０はGenzyme社製、ＩＬ−６はR&D社製）。
【実施例１２】
【００４３】
（樹状細胞の調製及び分析）
１０ｎｇ ｍｌ-1のＧＭ−ＣＳＦを用いて、野生型マウス又はＴＲＡＭ欠損マウスの骨髄細胞を６日間培養した。未成熟のＤＣを回収し、分析した。
【実施例１３】
【００４４】
（肺繊維芽細胞の調製）
マウスの肺を切除し、ＰＢＳ内で洗浄し、小さく切断し、撹拌し、３７℃で３０分間酵素消化した。消化用緩衝液（１０ｍｌ／肺）は、４００ｎＭのＥＤＴＡを含む０．２５％のトリプシン溶液からなる。得られた細胞懸濁液に、氷温の完全ＤＭＥＭ培地を添加した。遠心分離（１１００ｒｐｍ、５分間）した後、ペレットを完全培地で再び懸濁し、その後皿で培養した。肺繊維芽細胞は、切除から１０日後、各実験に使用した。
【実施例１４】
【００４５】
（電気泳動移動度分析）
腹腔マクロファージ及び肺繊維芽細胞（１×１０6）を、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ及び５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で、それぞれ記載の時間刺激した。細胞から核抽出物を精製し、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合部位に特異的なプローブを用いてインキュベーションを行ない、電気泳動にかけ、文献（Immunity 9, 1, 143-150, 1998）記載の通りにオートラジオグラフィーで視覚化した。
【実施例１５】
【００４６】
（脾細胞の増殖アッセイ）
脾細胞（１×１０5）を、９６ウエルプレートで、記載の濃度のＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡを用いて、２４時間培養した。最後の１２時間は、１マイクロキュリーの［3Ｈ］チミジンのパルス標識を行ない、その後、［3Ｈ］の摂取量をβシンチレーションカウンター（Packard社製）で測定した。
【実施例１６】
【００４７】
（ウエスタンブロット分析及びインビトロキナーゼアッセイ）
腹腔マクロファージ（２×１０6）、胚繊維芽細胞（１×１０6）及び肺繊維芽細胞（１×１０6）を、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β及び５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で、記載の時間刺激した。その後、１．０％のNonidet-P40、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics社製）を含む溶解緩衝液中に、かかる細胞を溶解した。細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解し、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）に移した。かかる膜を特定の抗体でブロットし、強化した化学発光システム（enhanced chemiluminescence system）（Perkin Elmer Life Sciences社製）で視覚化した。細胞溶解液のＩＲＡＫ−１活性を、文献（Immunity 13, 539, 2000）記載の通りにインビトロキナーゼアッセイにより測定した。
【実施例１７】
【００４８】
（フローサイトメトリー分析）
５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体を用いて、２００万個の脾細胞を培養した。培養から３６時間後、細胞を収集し、ＰＥ共役抗Ｂ２２０抗体及びビオチン共役抗ＣＤ６９、ＣＤ８６又はＩ−Ａb抗体で染色し、その後、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。染色した細胞を、セルクエストのソフトウェア（Cell Quest software）（Beckton Dickinson社製）により、ＦＡＣＳ Caliburで分析した。
【実施例１８】
【００４９】
（未変性ＰＡＧＥアッセイ）
５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）及び１μｇ／ｍｌのＬＰＳを用いて、肺繊維芽細胞（１×１０6）及び腹腔マクロファージ（５×１０6）をそれぞれ記載の時間刺激した後、溶解した。未変性ＰＡＧＥサンプル緩衝液（６２．５ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８、１５％のグリセロール及び１％のデオキシコール酸）中の細胞溶解液を、未変性ＰＡＧＥ上で分離させ、その後、文献（Immunity 13, 539, 2000）記載の通りに抗ＩＲＦ−３抗体で免疫ブロットを行なった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒトＴＲＡＭのクローニング及び特徴づけ、並びに標的とするマウスＴｒａｍ遺伝子の欠損についての図である。（ａ）ヒトＴＲＡＭ、ＴＲＩＦ、ＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰの構造の比較。ドメインは、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定した。アミノ酸の長さを記載した。ＤＤ、デスドメイン；ＴＩＲ、ＴＩＲドメイン。（ｂ、ｃ）２９３細胞に、１μｇのＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦ又はエンプティーベクター、及び０．１μｇのＮＦ−κＢレポーター（ｂ）又はＩＦＮ−βプロモータールシフェラーゼレポーター（ｃ）を一時的にコ・トランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。（ｄ）Ｔｒａｍ遺伝子、ターゲティングベクター及び予測された破壊遺伝子の構造。黒く塗りつぶされた部分は、コードしたエキソンを示す。制限酵素：Ｂ、ＢａｍＨＩ。（ｅ）へテロ接合体のインタークロスで生じた子孫のサザンブロット分析。マウスの尾部からゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨＩで消化し、（ｄ）に示した放射能標識したプローブを用いて電気泳動にかけ、ハイブリダイゼーションを行なった。サザンブロットにより、野生型マウス（＋／＋）には単一の７．６ｋｂバンドが、ホモ接合体マウス（−／−）には２．４ｋｂバンドが、ヘテロ接合体マウス（＋／−）にはその両方のバンドが得られた。（ｆ）抗ＴＲＡＭ抗体を用いて、胚繊維芽細胞から調製した細胞溶解液を免疫沈降及び免疫ブロットした。同じ溶解液を抗アクチン抗体にブロットしてタンパク質の発現をモニターした。
【図２】ＴＲＡＭ欠損細胞において、ＩＬ−１誘発応答はインタクトであることを示す図である。（ａ）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β又は１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで、野生型マウス及びＴＲＡＭ欠損マウスの胚繊維芽細胞を刺激した。２４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６分析を行なった。記載の値は、３回の平均±ＳＤである。Ｎ．Ｄ．、検出せず。（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで、胚繊維芽細胞を記載の時間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢに特異的なプローブを用いて、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合作用をＥＭＳＡで定量した。（ｃ）抗ホスホＪＮＫ特異抗体を用いて、細胞抽出物にウエスタンブロットを行ない、ＪＮＫ活性化についても定量した。
【図３】ＴＲＡＭ欠損マウスにおける、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８依存的応答の減少を示す図である。（ａ）ＴＲＩＦ欠損マウス又は野生型マウスの腹腔マクロファージに対して、刺激を与えないか、又は、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下で、１０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００ｎＭのＲ−８４８、１μＭのＣｐＧ ＤＮＡで刺激した。２４時間後、ＴＮＦ−ａ及びＩＬ−６分析のために、ＥＬＩＳＡにより上清を回収した。記載の値は３回の平均±ＳＤである。Ｎ．Ｄ．、検出せず。（ｂ）腹腔マクロファージを、３０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下で、記載の濃度のＬＰＳで２４時間刺激した。上清を用いて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２ｐ４０をＥＬＩＳＡで測定した。記載の値は３回の平均±ＳＤである。（ｃ）ＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡで刺激した脾細胞の増殖。記載の濃度のＬＰＳ、Ｒ−８４８又はＣｐＧ ＤＮＡで、脾細胞を２４時間培養した。最後の１２時間は、［3Ｈ］チミジン（１μＣｉ）のパルス標識を行なった。［3Ｈ］チミジンの取り込みを、シンチレーションカウンターで測定した。（ｄ）１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００ｎＭのＲ−８４８又は１０μｇ／ｍｌの抗ＩｇＭ抗体を用いて、脾臓Ｂ２２０+細胞を培養した。培養から３６時間後、細胞を収集し、ビオチン共役抗ＣＤ６９抗体又は抗ＣＤ８６抗体で染色し、その後ストレプトアビジン−ＰＥで染色した。染色した細胞を、セルクエストのソフトウェア（Cell Quest software）により、FACS Caliburで分析した。
【図４】ＴＲＡＭ欠損マウスにおける、ＴＬＲ４を介したＭｙＤ８８非依存的応答の著しい欠損を示す図である。  １００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（ａ）又は５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（ｂ）で、骨髄由来樹状細胞（ａ）及び腹腔マクロファージ（ｂ）を、それぞれ記載の時間刺激した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を抽出し、ノーザンブロットで記載のプローブの発現を分析した。βアクチンプローブを用いて、同じ膜を再びハイブリダイズした。
【図５】ＴＬＲ４シグナル伝達において、ＭｙＤ８８非依存的経路は特異的に障害されたことを示す図である。（ａ、ｃ）５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）又は（ｂ、ｄ）１μｇ／ｍｌのＬＰＳで、腹腔マクロファージ（ａ、ｃ）又は肺繊維芽細胞（ｂ、ｄ）をそれぞれ記載の時間刺激した。抗ホスホＳｔａｔ１特異抗体（ａ、ｂ）を用いて、細胞抽出物のウエスタンブロットを行ない、Ｓｔａｔ１の活性化についても測定した。細胞溶解液を調製し、未変性ＰＡＧＥにかけた。ウエスタンブロットにより、ＩＲＦ−３の単量体形（矢印）及び二量体形（矢頭）を検出した（ｃ、ｄ）。１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（ｅ）又は５０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で、腹腔マクロファージ（ｅ）又は肺繊維芽細胞（ｆ）をそれぞれ記載の時間刺激した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢに特異的なプローブを用いて、ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合作用をＥＭＳＡで定量した。（ｇ）抗ＩＲＡＫ−１抗体を用いて、ＬＰＳで刺激したマクロファージから得た溶解液の免疫沈降を行なった。インビトロキナーゼアッセイで、ＩＲＡＫ−１のキナーゼ活性を測定した（上）。抗ＩＲＡＫ−１抗体で同じ溶解液をブロットした（下）。Ａｕｔｏは、自己リン酸化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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