(57)【要約】【課題】  細胞膜透過性を有しているペプチドオリゴマーによる前駆体の構成、及びＰＮＡオリゴマーの構成を提供すること。【解決手段】  下記の一般式によって表されるＰＮＡオリゴマーによる化合物。                                記【化２０】2005185271.tif 000021（式中、Ｂは、互いに独立し、同一又は異なった関係であるアデニン、グアニン、シトシン又はチミンの何れかであり、Ｒは、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）が除外されたことによるアルギニン残基であり、Ｒ１、Ｒ２は、水素原子又はアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、ｘ１〜ｘ３、ｙ１、ｙ２およびｚ１〜ｚ５はいずれも０以上の整数であり、ｘ１＋ｘ２＋ｘ３≧１であり、ｙ１＋ｙ２≧１であり、ｚ１＋ｚ２＋ｚ３＋ｚ４＋ｚ５≧０であり、ｍは１以上の整数であり、０ではないｘ１、ｘ２、ｘ３においては、ｍ×ｘ１≧５、ｍ×ｘ２≧５、ｍ×ｘ３≧５である。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）によって表されるペプチドオリゴマーによる前駆体。
記
【化１】
2005185271.tif 000018
（Ｒは、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）が除外されたアルギニン残基であり、Ｒ１は、水素原子、又はアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体であり、ｍ、ｘは、１以上の整数であり、かつｍ×ｘ≧５である。）
【請求項２】
下記一般式（２）によって表されるＰＮＡオリゴマーによる化合物。
【化２】
2005185271.tif 000019
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一又は異なった関係であるアデニン、グアニン、シトシン又はチミンの何れかであり、Ｒは、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）が除外されたことによるアルギニン残基であり、Ｒ１、Ｒ２は、水素原子又はアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、ｘ１〜ｘ３、ｙ１、ｙ２およびｚ１〜ｚ５はいずれも０以上の整数であり、ｘ１＋ｘ２＋ｘ３≧１であり、ｙ１＋ｙ２≧１であり、ｚ１＋ｚ２＋ｚ３＋ｚ４＋ｚ５≧０であり、ｍは１以上の整数であり、０ではないｘ１、ｘ２、ｘ３においては、ｍ×ｘ１≧５、ｍ×ｘ２≧５、ｍ×ｘ３≧５である。）
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方として、下記の結合基を選択したことを特徴とする請求項２記載の化合物。
記
【化３】
2005185271.tif 000020
（尚、ｎは２以上の整数を示す。）
【請求項４】
ランタノイド金属と、請求項３の結合基とによって形成された錯体による化合物。
【請求項５】
ランタノイド金属として、ツリウム（Ｔｍ）を選択したことを特徴とする請求項４記載の錯体による化合物。
【請求項６】
請求項１の前駆体、同２、同３、同４、および同５の化合物の製造工程において、下記の結合基において、アルギニン残基Ｒ’とＦｍｏｃとを加水分解することによって、アルギニン残基の多重結合体（Ｒ）ｍを順次形成する方法。
記
−(Ｒ)ｍ−１Ｒ’Ｆｍｏｃ
（但し、ｍは、１以上の整数であり、Ｒ’は、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）、及び水素原子（Ｈ）をそれぞれ除外したアルギニン残基である。）
【請求項７】
請求項２、同３、同４、および同５記載の化合物の水溶液に、蛍光標識化合物を配合したことによる細胞透過性プローブ液。
【請求項８】
蛍光標識化合物として、ＦＩＴＣを選択したことを特徴とする請求項７記載の細胞透過性プローブ液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性を有する化合物、及び当該化合物によるペプチド核酸（Peptide Nucleic Acid：以下「ＰＮＡ」と略称する。）、および当該ＰＮＡの使用方法、およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来遺伝子工学や分子生物学の分野においてＤＮＡに対する切断機能を有している制限酵素は、一般に４〜６塩基対の特異的な配列を認識して切断することを基本原理しているが、ＤＮＡ中の特定遺伝子について解析するためには、少なくとも１３塩基対を認識することを不可欠としている。
【０００３】
このような制限酵素としては、主に遷移金属と錯体を形成し、そこから発生する活性酸素種によるデオキシリボースから水素の引き抜きによる破壊的切断を行うブレオマイシンやビラジカルを形成してデオキシリボースから水素を引き抜いて破壊的切断を行うエンジイン系抗生物質、或いはプリン塩基のアルキル化後の熱処理や化学的処理によってデオキシリボースを破壊的切断するデュオカルマイシンなどが存在する。
【０００４】
しかしながら、これらの制限酵素による切断の基本原理は、デオキシリボースの酸化的破壊による切断であり、天然の制限酵素がリン酸ジエステル結合を加水分解の態様によって切断することによる反応方式とは相違しており、また、リガーゼによる再結合が不可能であった。そのため、人工制限酵素の開発要件として、天然の制限酵素と同様にリン酸ジエステル結合に対する加水分解を行う方式が要請されていた。
【０００５】
ＰＮＡは、図１に示すように、核酸の構成要素として塩基配列を基礎付けるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）を有した各構成単位の結合によって分子を形成しており、特に図２に示すように、前記塩基配列における相補性に基づき、特定の塩基配列を有しているＤＮＡを構成している一部の配列部分と結合することによって、該当するＤＮＡを認識する機能を有している。
【０００６】
前記認識機能に基づき、ＰＮＡは、ＤＮＡの一重鎖と高い親和性・特異性を伴って二重鎖を形成したり、ＤＮＡ二重鎖との結合によってＤＮＡの化学上の性格を変化させるなど、特色のある機能を持つため、遺伝子工学用の機能性素材として注目を集めている。
【０００７】
出願人は、前記ＰＮＡオリゴマーとして、多種多様な機能性分子を容易に導入できるようなＰＮＡオリゴマーの製造方法およびその構成に関する出願を行った（特願２００２−１２１６６７号、以下「先願発明」と略称する。）。
【０００８】
先願発明においては、機能性分子として、細胞膜透過性を有している機能分子誘導体をも含むことを提唱しており、そのために、前記機能分子誘導体における機能性分子として、アルギニン、リジン、およびセリンなどの水溶性アミノ酸が適切である旨の例示を行っている（先願発明における特許明細書［００６４］）。
【０００９】
しかしながら、前記細胞膜透過性を有している機能性分子誘導体による前駆体、および当該前駆体を含むＰＮＡオリゴマーに関する具体的な構成については、先願発明において必ずしも明らかにしている訳ではない。
【特許文献１】特開２００３−１７１３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞膜透過性を有しているアミノ酸誘導体に基づく前駆体の構成、更には当該前駆体を構成要素とすることによって、細胞膜透過性を有しているＰＮＡオリゴマーによる化合物の構成を具体的に提唱することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するため、本発明の構成は、
（１）．下記の一般式（１）によって表されるペプチドオリゴマーによる前駆体、
記
【化４】
2005185271.tif 000002
（Ｒは、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）が除外されたアルギニン残基であり、ｍ、ｘは、１以上の整数であり、かつｍ×ｘ≧５である。）
（２）．下記一般式（２）によって表されるＰＮＡオリゴマーによる化合物、
【化５】
2005185271.tif 000003
（式中、Ｂは、互いに独立し、同一又は異なった関係であるアデニン、グアニン、シトシン又はチミンの何れかであり、Ｒは、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）が除外されたことによるアルギニン残基であり、Ｒ１、Ｒ２は、水素原子又はアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体であり、ａ〜ｈは０〜１０の整数であり、ｘ１〜ｘ３、ｙ１、ｙ２およびｚ１〜ｚ５はいずれも０以上の整数であり、ｘ１＋ｘ２＋ｘ３≧１であり、ｙ１＋ｙ２≧１であり、ｚ１＋ｚ２＋ｚ３＋ｚ４＋ｚ５≧０であり、ｍは１以上の整数であり、０ではないｘ１、ｘ２、ｘ３においては、ｍ×ｘ１≧５、ｍ×ｘ２≧５、ｍ×ｘ３≧５である。）
からなる。
【発明の効果】
【００１２】
前記（１）の前駆体は、それ自体、細胞膜透過性を有していることから、両末端において、試薬としての機能を有している他の誘導体と化学結合を行うことによって、細胞膜内において、当該試薬に基づき様々な試験を行うことを可能とすると共に、前記（２）のＰＮＡオリゴマーによる化合物の構成要素とすることができる。
【００１３】
前記（２）の化合物は、細胞膜透過性を有するＰＮＡオリゴマーであることから、細胞内において、ＤＮＡとの相互作用、就中、ＤＮＡに対する切断を行うことによって、細胞内におけるＤＮＡ分析に多大な寄与を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
前記（１）の前駆体は、細胞膜透過性を有する単一の構成単位であるのに対し、前記（２）の化合物は、前記（１）の前駆体による構成単位を化合物を形成する要素としているＰＮＡオリゴマーを構成単位としている。
【００１５】
前記（１）の前駆体による構成単位が細胞膜透過性を有していることは、前記（２）のＰＮＡオリゴマーの結合構成から、前記（１）の化合物の結合を除外したことによる化合物（前記（２）において、ｘ１、ｘ２、ｘ３の全てが０である場合の化合物、但しこのような化合物は、前記（２）の構成には含まれていない。）においては、何ら細胞膜透過性を有していないことによって判明する。
【００１６】
前記（１）の前駆体、（２）の各化合物の製造法は、先願発明の明細書に記載されている機能性ＰＮＡオリゴマーの製造工程と基本原理は同一である。
【００１７】
即ち、当初Ｆｍｏｃ−ωーアミノ酸−ＢｏｃＰＮＡ−ＯＨ（以下「アミノ酸−ＰＮＡ基本単位」と略称する。）を形成したうえで、当該アミノ酸ＰＮＡ構成単位の相互の結合によるオリゴマーを形成し、かつ末端において、安定剤としての機能を有している化合物（ＭＢＨＡ：４−Methylbenzhydrylamineによる樹脂）を結合させたうえで、機能性分子との結合予定部分において、当初第２級アミノ基によるＭＨＦｍｏｃから第１級アミノ基である−ＮＨ２に変化させ、更には当該第１級アミノ基と機能分子との結合によって、第２級アミノ基を介した機能分子との結合基（−ＮＨＲ）を実現したうえで、アルギニン残基（Ｒ）の多重結合（−ＮＨＲｍ）を順次形成している。
【００１８】
前記（１）の前駆体を構成要素としている化合物の具体的な製造工程は、以下の通りである。
【化６】
2005185271.tif 000004
【化７】
2005185271.tif 000005
【化８】
2005185271.tif 000006
【化９】
2005185271.tif 000007
【化１０】
2005185271.tif 000008
【００１９】
前記工程によって得られた化合物は、末端において第１アミノ基（−ＮＨ）及び安定剤による化合物（ＭＢＨＡ）と結合した状態として存在しているが、前記末端の第１級アミノ基（−ＮＨ２）は、必要に応じて水素原子をアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体（前記（２）の化合物を構成しているＲ１）と置換し、前記末端の安定剤としての機能を有している化合物（ＭＢＨＡ）については、当該安定剤中の第１級アミノ基（−ＮＨ２）を摘出したうえで、必要に応じて、当該アミノ基の内の水素原子を上記の場合と同じようにアミノ酸誘導体、又は機能性カルボン酸誘導体（前記（２）の化合物を構成しているＲ２）と置換することによって、前記（１）の前駆体は、以下のような一般式として、独立した化合物として存在させることが可能である。
【化１１】
2005185271.tif 000009
【００２０】
上記化合物自体は、既に細胞透過性を有しているが、両末端の結合基−Ｒ１、及び−ＮＨＲ２が除去されている前記（１）の前駆体は、試薬としての機能を有している他の化合物と結合することによって、細胞膜内に透過し、細胞内において、当該試薬としての機能を発揮させることが可能となる。
【００２１】
前記（１Ａ）から（１Ｂ）へのＦｍｏｃ基の脱保護とする際には、２０分〜４０分程度のピペリジン処理を行っており、前記（１Ｂ）から（１Ｃ）へのアルギニン残基との置換においては、アルギニンが有しているカルボン酸とアミノ基が有している水素原子との加水分解反応によって実現されている。
【００２２】
前記加水分解反応の触媒としては、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵおよびＢＯＰなどの縮合剤が採用されることが多い。
【００２３】
前記（１Ｃ）から（１Ｄ）によるアミノ酸残基（Ｒ）の多重構造である（Ｒ）ｍを得るためには、下記の結合基の内のアルギニン残基Ｒ’とＦｍｏｃとの結合部に対する加水分解を行い、アルギニン残基Ｒ’をアルギニン残基Ｒに変化させ、順次多重結合構造とすれば良い。
記
−(Ｒ)ｍ−１Ｒ’Ｆｍｏｃ
（但し、ｍは、１以上の整数であり、Ｒ’は、アルギニンから水酸基（−ＯＨ）、及び水素原子（Ｈ）をそれぞれ除外したアルギニン残基である。）
【００２４】
前記（２）の化合物の具体的な製造工程は、以下の通りであり、前記（１）の前駆体の製造工程と基本的原理は同一である。
【化１２】
2005185271.tif 000010
【００２５】
ｚ基（Ｎ−ベンジルオキシカルボン酸）などで保護されているアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）を有する既存のＰＮＡオリゴマーとの結合によって、下記のようなオリゴマーを得る（下記の化合物において、ｃｂｚは、前記ｚ基を表わす。）。
記
【化１３】
2005185271.tif 000011
【化１４】
2005185271.tif 000012
【化１５】
2005185271.tif 000013
Ｂｏｃの除去に伴い、末端ＢｏｃをＲ１に置換する（但し、Ｒ１は、アミノ酸誘導体又は機能性カルボン酸誘導体を表す。）。
【化１６】
2005185271.tif 000014
【００２６】
前記（１ｄ）式において、末端のＭＢＨＡの内から第１級アミノ基（−ＮＨ２）を摘出し、必要に応じて１個の水素原子をＲ２に置換することによって（但し、Ｒ２は、アミノ酸誘導体又は機能性カルボン酸誘導体を表す。）、前記（２）式の化合物を製造することができる。
【００２７】
前記（１ａ）から（１ｂ）への反応は、前記（１Ａ）から（１Ｂ）への反応と同様であり、（１ｂ）から（１ｃ）への反応は、前記（１Ｂ）から（１Ｃ）への反応と同様であり、前記（１ｃ）から（１ｄ）への反応は、前記（１Ｃ）から（１Ｄ）への反応と同様である。
【００２８】
尚、前記（１ｃ）から（１ｄ）への反応においては、アルギニン残基（Ｒ）の多重結合（Ｒ）ｍを形成する工程とＺ基の脱保護を行う工程とを同時に表現しているが、実際には双方の反応工程は、それぞれ独立して行われている。
【００２９】
そして、前記Ｚ基の脱保護を行う場合には、例えば、ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ＝６０／２５／１０／１０のような一般的な条件において好適に行われる。
【００３０】
以下、前記（２）の化合物について、細胞膜透過性に関する具体的な実験に即して説明する。
【００３１】
サルから摘出した細胞として、ｍ−ＲＮＡの内、特に
ＧＧＡＵＧＡＧＵＧＧＧＡＵＧＣ
の配列を有しているｍＲＮＡをターゲットとして、前記（２）の化合物の内、ｚ１＝ｚ２＝１とし、ｚ３＝ｚ４＝ｚ５＝０とし、ｙ１＝１５とし、ｙ２＝０とし、ｚ２＝ｚ３＝０としたうえで、ｙ１＝１５とした場合の前記Ｂの組み合わせとして、前記ｍ  ＲＮＡの核酸配列と相補性の関係にある
ＧＣＡＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴＣＣ
の配列を選択し、ｍ、ｘ１の数値として、以下の組み合わせを選択したうえで、前記（２）のＰＮＡオリゴマーをそれぞれ製造した。
ｍ＝１、ｘ１＝５、７、９
ｍ＝２、ｘ２＝３、５、７
ｍ＝３、ｘ１＝３，５
ｍ＝４、ｘ１＝３
【００３２】
前記ｍおよびｘ１の組み合わせによる前記（２）の化合物であるＰＮＡオリゴマーについて、１、３、１０Ｍによる各濃度としたうえで、蛍光標識化合物として、ＦＩＴＣを混入することによって、プローブ液を作成したうえで、８ウェル型チェンバーに各ウェル毎に１．０×１０４（セルス）となるように４００μｌ細胞懸濁液に対し、１５０ｍｌのプローブ液をそれぞれ添加し、３７℃の保温状態にて静置した。
【００３３】
各細胞に対しては、細胞核に対し、Ｈｏｅｃｈｓｔによって、青色の核染色を施したところ、何れの場合においてもプローブ液を添加してから１時間後に、細胞核の位置（予めヘキスト《Ｈｏｅｃｈｓｔ》試薬によって青色に着色されている。）に概略相当する位置、又はその周囲にＦＩＴＣによる黄緑の着色状態を検出することができた。
【００３４】
細胞核の位置に略相当する位置における着色は、前記（２）の化合物によるプローブ液が、細胞核の内側に侵入したことを意味しており、細胞核による着色の位置の周囲における着色は、細胞膜内に透過するも、細胞核の内側に侵入していないことを意味しているが、前記各プローブ液のサンプルの内、
ｍ＝１、ｘ１＝７
ｍ＝２、ｘ１＝３、５
ｍ＝３、ｘ１＝３
の場合は、図４（ａ）に示すように、細胞核による着色状態と概略同一位置にまで侵入したことを意味しており、
ｍ＝１、ｘ１＝９
ｍ＝２、ｘ１＝７
ｍ＝３、ｘ１＝５
ｍ＝４、ｘ１＝３
の場合は、図４（ｂ）に示すように、細胞核内に侵入せずに、その周囲に留まっていることを示していた（尚、図４（ａ）、（ｂ）において、点線によって示す領域部分は、細胞膜内におけるＦＩＴＣによる着色状態を示しており、白丸によって示す領域は、細胞核の位置におけるＨｏｅｃｈｓｔによる着色状態を示している。）。
【００３５】
前記の検出結果から、アルギニン残基を有しているＰＮＡの結合の数が多いほど（前記（２）の構成において、ｘ１、ｘ２、ｘ３の数が大きいほど）、更には、アルギニン残基による重畳結合の数が大きいほど（前記（２）の化合物においてｍが大きいほど）、細胞膜内に浸透し易く、更には細胞核内に浸透し易いことが判明した。
【００３６】
尚、前記（２）の化合物においては、０ではないｘ１、ｘ２、ｘ３においては、ｍ×ｘ１≧５、ｍ×ｘ２≧５、ｍ×ｘ３≧５であることを要件としているが、当該要件は、前記試験と同時にｍ×ｘ≧５が成立しない場合、即ち、４以下である場合について行われた試験において、前記の場合と同一条件のプローブ液の濃度、蛍光標識化合物の添加量、細胞懸濁液の量を設定したことによる着色試験を行っても、プローブ液が細胞膜内に透過する機能が極めて弱いという試験結果が得られていることに由来している。
【００３７】
以下、実施例に従って説明する。
【実施例１】
【００３８】
実施例１は、（２）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方として、下記の結合基を選択したことを特徴としている。
記
【化１７】
2005185271.tif 000015
【００３９】
出願人は、下記の化合物の構成を提唱し、かつ特許出願を既に行っている（特願２００３−３２４３８０）。
記
【化１８】
2005185271.tif 000016
（式中Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンの何れかを表し、ｎは、２以上の整数を示し、ｍは、１以上の整数を示す。）。
【００４０】
前記（３）の化合物は、前記（２）において、Ｒ１として、前記（４）の結合基を選択し、かつＲ２として、水素原子を選択したうえで、ｘ１＝ｘ２＝ｘ３＝０、ｚ１＝ｚ２＝ｚ３＝０とした場合に該当しているが、当該化合物は、ＤＮＡと反応溶液内に共存させた場合には、前記（３）の化合物が有している塩基性配列と相補関係にあるＤＮＡの配列部分に対し、デオキシリボースの酸化的破壊を伴わずに、所望の配列単位によるＤＮＡをリン酸ジエステル結合に対する加水分解を伴って切断することが可能となる。
【００４１】
このようなＤＮＡの結合部分を切断し得ることは、切断部位において、リン酸ジエステル結合に対する加水分解が行われ、しかも前記各化合物が当該加水分解に対する触媒機能を発揮していることを意味している。
【００４２】
このような切断機能は、前記（２）の化合物において、Ｒ１として水素原子を選択し、Ｒ２として前記（４）の結合基を選択したうえで、ｘ１＝ｘ２＝ｘ３＝０、ｚ１＝ｚ２＝ｚ３＝ｘ４＝ｚ５＝０としたことによる化合物、即ち、
【化１９】
2005185271.tif 000017
によっても実現可能である。
【００４３】
前記（３）、（３）’のようなデオキシリボースの酸化的破壊を伴わずに、切断機能を有しているＰＮＡオリゴマーの構成に着目し、前記（２）の化合物において特にＲ１、Ｒ２の一方又は双方として、前記（４）の結合基を選択している。
【００４４】
このような切断機能を有している前記（２）の化合物の場合には、細胞膜内に透過した後に、細胞内のＤＮＡに対し、デオキシリボースの酸化的破壊を伴わずに、相補関係にあるＤＮＡを切断したので、個別のＤＮＡの組み合わせなどに基づいて、ＤＮＡが有している個別の遺伝子機能の解明などに十分資することができる。
【実施例２】
【００４５】
実施例２は、ランタノイド金属と、実施例１による化合物とによって錯体を形成していることを特徴としている。
【００４６】
前記特願２００３−３２４３８０号明細書に記載したように、一般にランタノイド金属がＤＮＡのリン酸ジエステル結合に対し、加水分解機能を有していることが既に判明しており、特にセリウム（Ｃｅ）の場合に、そのような作用が顕著であることが判明している。
【００４７】
実施例２においては、実施例１の構成を前提としたうえで、実施例１を構成しているアミノ酸誘導体の末端において、図３に示すように、ランタノイド金属との間にて錯体による化合物を得ることによって、実施例１の化合物が有しているデオキシリボースの破壊を伴わない切断機能を更に一層増長させている。
【００４８】
前記ランタノイド金属とによる錯体は、実施例１による化合物溶液に対し、ランタノイド金属を添加することによって容易に精製することができる。
【実施例３】
【００４９】
膜透過性の評価
本発明のＰＮＡプローブの膜透過性を評価するために、下記の実験を行った。
１．細胞の播種
１．０×１０４個のＣＯＳ−７細胞（培養液：ＤＭＥＭ）を培養容器（８穴チャンバー）に播種し、３７℃で２４時間インキュベーションした。
２．プローブ液処理
培養液を除去し、細胞培養液用いて濃度を１、３及び１０μＭに調整したプローブ液１５０μＬを加え、ＣＯＳ−７細胞をさらに２４時間インキュベーションした。
３．余剰プローブの洗浄
プローブ液を除去し、細胞表面をＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２回）した。
４．細胞の固定
常法により（４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（−））細胞を固定した。
５．観察
固定液を除去し、ＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２回）したのち、封入液で細胞を封入し、共焦点蛍光顕微鏡を用いてシグナル分子（蛍光分子）の局在を観察した。
【００５０】
場合により、上記工程３および４の間に、細胞の位置を明瞭にする核染色工程や免疫染色工程を加えた。
核染色工程は、ＰＢＳ（−）を除去し、Ｈｏｅｃｈｓｔ液（ＰＢＳ（−）で１０００倍に希釈した１ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２液）１００μＬを加えて室温で５分間、静置した。Ｈｏｅｃｈｓｔ液を除去して、再び細胞表面をＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２回）した。
【００５１】
核および免疫染色工程は、細胞表面をＰＢＳ（−）で洗浄（２分×２回）し、３％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）４００μＬで１５分間ブロッキングし、次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で１／２００に希釈した一次抗体  ２００μＬで、３７℃、２時間インキュベーションした。
細胞表面をＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２回）した。
ＰＢＳ（−）を除去し、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で１／５００に希釈した二次抗体  ２００μＬを加え、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、ＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２回）した。
続いて、ＰＢＳ（−）を除去し、Ｈｏｅｃｈｓｔ液（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８液（１ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ（−）で１０００倍希釈したもの）１００μＬを加えて室温で５分間、放置した。Ｈｏｅｃｈｓｔ液を除去して、再び細胞表面をＰＢＳ（−）２００μＬで洗浄（２分×２）した。
【００５２】
その結果、ブラシ型（ｍ＝１の場合、図５のＲ１×ｎ）では、図５のＮｏ１：Ｒ１×５に比べて図５のＮｏ．３：Ｒ１×９の方が細胞膜を透過したプローブ数が多く、アルギニン数の増加に伴い、プローブの細胞膜透過性が向上した。また、樹木型（ｍ≧２の場合、図５のＲ２×ｎ、Ｒ３×ｎ、Ｒ４×ｎ）でも、Ｎｏ．４：Ｒ２×３に比べてＮｏ．６：Ｒ２×７やＮｏ．８：Ｒ３×５そしてＮｏ．９：Ｒ４×３とアルギニン結合数が増加するに伴い、プローブの細胞内蓄積量が増加した。
プローブの細胞膜透過性については、ブラシ型と樹木型との間に有意な差は認められなかった。
上記の結果より、プローブの細胞膜透過性は、ブラシ型と樹木型のいずれの場合においても、アルギニン数の増加に依存することが明らかとなった。
【実施例４】
【００５３】
細胞内局在に関する最適化実験
プローブ液１０μＭで２４時間処理により、効果的に細胞内へ導入することが確認できた新規プローブの局在変化を観察するために、濃度およびプローブ処理時間を変化させて実験を行った。プローブには、ブラシ型結合プローブ（図５のＮｏ．３：Ｒ１×９）と樹木型結合プローブ（図５のＮｏ．６：Ｒ２×７）そしてコントロールとして膜透過性促進分子を結合してない従来型プローブを用いた。
プローブの処理濃度および処理時間を変更（２４時間処理を１時間処理または、１０μＭ処理を１μＭ処理へ変更）した以外は、実施例３の手順に従った。
実施例３の操作３と４の間に核を染色する特殊試薬（蛍光分子２：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）を用いた染色処理を施した。これらの性質の異なる蛍光分子１（ＦＩＴＣ）と蛍光分子２の局在を観察した。
その結果を図異なる染色方法で、プローブの位置および細胞の位置を確認した。Ａ〜Ｉは、プローブの局在を示し、また、Ａ’〜Ｉ’は、細胞の位置（特に核）を示す。
図５中の矢印は、同一の位置を示しており、したがって、矢印が指し示している位置がともに発色を示している場合は、細胞（特に核）にプローブが存在していることが確認できる。また、細胞の構造は大きく分けて細胞膜に包まれた細胞質と、その中に核からなっている。したがって、蛍光分子２で染められた核周辺は、細胞質であることが容易に推測できるので、この方法で核だけでなく細胞質に存在するプローブの確認にも用いることが可能である。
その結果、１０μＭ、２４時間の処理では、新規プローブは細胞質および核へ効果的な集積傾向があることが示唆された（パネル（Ｅ）（Ｆ））。
また、ＰＮＡプローブの濃度を１０μＭとし、処理時間を１時間に変更しても細胞質および核への集積傾向は確認された（パネル（Ｂ）（Ｃ））。
さらに、処理時間を２４時間とし、ＰＮＡプローブの濃度を１μＭへ変更をしたところ、新規プローブは核へ集積せず、細胞質に蓄積することが確認された（パネル（Ｈ）（Ｉ））。
また、実験に用いた新規プローブの中でも、図５に示すＮｏ．６（Ｒ２×７）が最も効率よく細胞質に局在化することが確認された。
上記の結果より、細胞質及び核内の局在化は、ＰＮＡプローブの濃度、アルギニンの個数及びインキュベーション時間に依存することが明らかとなった。したがって、今回設計した新規プローブは、濃度および処理時間を調整することで、核および細胞質への局在化コントロールが可能であり、分子生物学的ツールとして極めて有用な新規プローブであるといえる。
【実施例５】
【００５４】
細胞外排出能に関する評価
工程３と４の間に以下の二つの操作を加えた以外は、実施例３と同様の操作を行った。
プローブを含まない通常の培養液で、細胞を６時間（３時間を２回）培養した。核を染色する特殊試薬（蛍光分子２：Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８）を用いて染色処理を施した。
実験結果を図７に示した。
その結果、細胞内、特に核へ蓄積が確認されていたブラシ型結合プローブおよび樹木型結合プローブは、１０μＭ、１時間の処理後に、通常の培養液で培養することで、核外へ排出された。余剰の新規プローブが細胞から排出されることから、生細胞を用いた場合でも、未結合プローブを完全に除去することが可能である。
この結果から、今回設計した新規プローブは、これまで不可能であった多細胞系を用いた染色技術の開発に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、細胞膜内に試薬を透過することによって、細胞内部を探索する分子生物工学分野、医療分野、更には細胞内部のＤＮＡとの相互作用、就中切断機能などに基づく遺伝子解明などに関する遺伝子工学分野に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＰＮＡの構成単位を示す化学構造式を示す。
【図２】ＰＮＡがＤＮＡの配列を認識する状況を示す化学構造式である。
【図３】ランタノイド金属とＮ−ヒドロキサム酸部分との錯体結合状況を示す化学構造式の一部に関する模式図である。
【図４】前記（４）の化合物に基づいて作成したプローブの実施態様を使用したことに基づく細胞膜の透過によって得られた着色状態を示す平面図であり、（ａ）は、プローブ液が、細胞核による着色の内側にまで侵入したことによる着色状況を示しており、（ｂ）は、プローブ液が、細胞核内に侵入せずに、その周囲に留まっていることによる着色状況を示している。
【図５】細胞膜透過に関する実験結果を示す。
【図６】細胞内局在に関する最適化実験結果を示す。
【図７】細胞外排出能に関する評価結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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