(57)【要約】【課題】LXR転写共役因子の作用を制御することで、TG合成亢進といった副作用のない、及び／又は既存の合成LXRアゴニストとは異なる効果を有する脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】酵母ツーハイブリッドシステムによりLXR転写共役因子clone6、LXRM、及びEAR-2を同定し、これらの因子が脂質代謝、糖代謝において重要な役割を担っているABCA1及び／又はSREBP1cの転写を制御することを見出した。clone6、LXRM、若しくはEAR-2の活性、発現、又はLXRとの相互作用を制御することで、TG合成亢進といった副作用のない、及び／又は既存の合成LXRアゴニストとは異なる効果を有する脂質代謝及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、並びに、（２）試験物質依存的なLXRの転写活性の変化を分析する工程を含む脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項２】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに、（２）配列番号７で表される塩基配列、若しくは配列番号７で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するSREBP1cのプロモーター領域を含むポリヌクレオチド、又は配列番号８で表される塩基配列、若しくは配列番号８で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するABCA1のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドと融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞。
【請求項３】
LXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はRXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項２又は請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
（１）請求項２乃至請求項４に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、（２）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的なABCA1、又はSREBP1cの転写活性の変化を分析する工程、並びに（３）ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する試験物質を選択する工程を含む、ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項６】
ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する物質が脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬である請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドが発現している細胞、或いはLXRのアゴニスト活性を有する化合物と接触させることにより配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドを発現するようになる細胞に試験物質を接触させる工程、並びに（２）前記細胞内における前記ポリペプチドの試験物質依存的な発現量の変化を分析する工程を含む、配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドの細胞内における発現を抑制する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドの細胞内における発現を促進する物質からなる脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項８】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、並びに（２）LXRとLXRに結合する物質の試験物質依存的な相互作用の変化を分析する工程を含む、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項９】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、（２）前記ポリペプチドとLXRとの結合を測定する工程、並びに、（３）前記ポリペプチドとLXRとの結合を変化させる物質を選択する工程を含む、配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を阻害する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を阻害する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を促進する物質が、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬である請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項５乃至請求項１０に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び、前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含む、脂質代謝改善、及び／又はインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過剰発現によりABCA1の発現を制御するLXR転写共役因子を用いてLXR標的遺伝子の発現量を変動させる物質をスクリーニングする方法、前記LXR転写共役因子の発現量を変動させる物質をスクリーニングする方法、前記LXR転写共役因子とLXRとの結合を制御する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核内受容体である肝臓X 受容体(liver X receptor：LXR)α及びLXRβ（以下LXRと記載）は生体内のコレステロール、及び脂肪酸のホメオスタシスを制御していると報告されている（非特許文献１参照）。生体内の過剰なコレステロールからオキシステロールが産生され、それがリガンドとしてLXRを活性化し、LXRはコレステロールの代謝や輸送を担っている分子の遺伝子上流にある応答配列に結合し、それらの転写を制御することで、生体内のコレステロールバランスを負の方向(排出方向)に制御する。例えば、肝臓ではコレステロールを小腸へ排出する律速酵素である胆汁酸合成酵素CYP7Aの発現を促進する（非特許文献２、３参照）。小腸ではLXRはATP結合カセット輸送担体(ATP-binding cassette transporter :ABC) A1、ABCG5、ABCG8の発現を誘導しコレステロールの排出や吸収抑制を行う（非特許文献４参照）。動脈硬化巣ではLXRはABCA1やアポ蛋白質の発現を誘導し、コレステロール逆転送系を促進し、抗動脈硬化作用を持つと報告されている（非特許文献５−８参照）。さらに、LXRは肝臓で糖新生を促進する酵素の発現を抑制し、脂肪では糖代謝を促進する糖輸送担体GLUT4の発現を誘導し、インスリン抵抗性をも改善する可能性が報告されている（非特許文献９参照）。
これらの知見より、LXRが脂質代謝や糖代謝の改善に有用であることから、LXRを活性化する合成LXRアゴニストの探索が盛んに行われているが、これまでのLXRとの結合を指標にしたスクリーニングにより得られた合成LXRアゴニストは、マウスへの投与により血中、及び肝臓中のトリグリセリド（triglyceride:TG）含量を増加させるという望ましくない作用を惹起する（非特許文献１０参照）。これはLXRが脂肪酸のホメオスタシスの制御も担っており、合成LXRアゴニストによりステロール制御因子結合蛋白(sterol regulatory element-binding protein : SREBP) 1cの発現が誘導され、TG合成を亢進したためと考えられる。また、ヒト肝癌由来HepG2細胞においても合成LXRアゴニストはSREBP1cの発現を増加させ、マウスのみならず、ヒトでもTG合成が亢進すると考えられた。
【０００３】
LXRの転写誘導活性には他の核内受容体と同様に転写共役因子群との相互作用が必要である。ABCA1とSREBP1c遺伝子のLXRによる転写活性制御には異なる転写共役因子が関与することが報告されている（非特許文献１１参照）。また、核内受容体に結合する転写共役因子の種類はその核内受容体に結合しているアゴニストにより変化し、どの転写共役因子が結合したかでその核内受容体が認識する応答配列(応答遺伝子)も変化することがペルオキシソーム増殖剤応答性核内受容体(peroxisome proliferator-activated receptor : PPAR)αやPPARγで報告されている（非特許文献１２、１３参照）。
【０００４】
clone6は、その塩基配列が特許文献１、非特許文献１４に記載されているが、その機能については不明である。LXRMは、その塩基配列が特許文献２、非特許文献１５に記載されているが、その機能については不明である。EAR-2は、その塩基配列及びアミノ酸配列がデータベースに登録されており（GenBankアクセッション番号BC002669）、甲状腺ホルモン核内受容体（Thyroid hormone nuclear receptor : TR）の転写共役因子として機能するという報告がある（非特許文献１６参照）。しかし、LXRとの結合やその転写活性への関与については知られていない。
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／６４８３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／７０５３９号パンフレット
【非特許文献１】「ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）」、（英国）、２００２年、第８巻、ｐ．１２４３−１２４８
【非特許文献２】「ネイチャー（Nature）」、（英国）、１９９６年、第３８３巻、ｐ．７２８−７３１
【非特許文献３】「セル（Cell）」、（米国）、１９９８年、第９３巻、ｐ．６９３−７０４
【非特許文献４】「サイエンス（Science）」、（米国）、２０００年、第２８９巻、ｐ．１５２４−１５２９
【非特許文献５】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Scineces of the United States of America）」、（米国）、２００３年、第９７巻、ｐ．１２０９７−１２１０２
【非特許文献６】「モレキュラー・セル（Molecular Cell）」、（米国）、２００１年、第７巻、ｐ．１６１−１７１
【非特許文献７】「フェブス・レターズ（FEBS Letters）」、（米国）、２００３年、第５３６巻、ｐ．６−１１
【非特許文献８】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Scineces of the United States of America）」、（米国）、２００２年、第９９巻、ｐ．７６０４−７６０９
【非特許文献９】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Scineces of the United States of America）」、（米国）、２００３年、第１００巻、ｐ．５４１９−５４２４
【非特許文献１０】「ジーンズ・アンド・ディベロプメント（Genes and Development）」、（米国）、２０００年、第１４巻、ｐ．２８３１−２８３８
【非特許文献１１】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）」、（米国）、２００３年、第２３巻、ｐ．５７８０−５７８９
【非特許文献１２】「プログレス・イン・メディシン（Progress in Medicine）」、１９９９年、第１９巻、ｐ．２５０７−２５１３
【非特許文献１３】「モレキュラー・アンド・セルラー・エンドクリノロジー（Molecular and Cellular Endocrinology）」、（米国）２００１年、第１７６巻、ｐ．４９−５６
【非特許文献１４】「ディエヌエィ・リサーチ（DNA Resarch）」、１９９８年、第５巻、ｐ．３１−３９
【非特許文献１５】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Scineces of the United States of America）」、（米国）、２００２年、第９９巻、ｐ．１６８９９−１６９０３
【非特許文献１６】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biology）」、（米国）、２０００年、第２０巻、ｐ．２６０４−２６１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、LXRの転写共役因子を同定し、それらの作用を制御する物質をスクリーニングすることで、TG合成亢進といった副作用のない、及び／又は既存の合成LXRアゴニストとは異なる効果を有する脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述の知見から、LXRに結合する転写共役因子が変わればLXRが転写誘導する遺伝子群が変わることから、転写共役因子の活性又は発現を制御すれば、TG合成亢進といった副作用のない、及び／又は多様な症状に対応した脂質代謝改善ができると考えた。そしてこの目的はLXRに結合する転写共役因子を同定し、それらのLXRの転写誘導活性への影響を明らかにし、その転写共役因子の活性を脂質代謝を改善する方向へ調節することで達成できると考えた。そこでLXRに結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッド(Yeast Two Hybrid:Y2H)法により同定した。その結果、LXRM、及びEAR-2がLXRに結合することを見出し、加えて、LXRMと相同性の高いclone6もLXRと結合することを見出した。従来の合成LXRアゴニストはSREBP1c及びABCA1の発現をともに亢進方向に制御するが、脂質代謝を改善するためには、TG合成を促進するSREBP1cは発現抑制方向に、コレステロール排出作用や抗動脈硬化症作用を有するABCA1は発現亢進方向に制御するのが好ましい。clone6の過剰発現により、SREBP1cの転写活性が亢進し、ABCA1の転写活性が抑制されたことから、clone6の作用を抑えることにより、ABCA1の転写活性化を介してコレステロールの排出、代謝が亢進し、SREBP1cの転写抑制を介してTGの産生が抑制され、TG合成亢進という副作用を伴わずに脂質代謝が改善されることが明らかになった。また、LXRMの過剰発現によりABCA1の転写活性が亢進し、EAR-2の過剰発現によりABCA1の転写活性が抑制したことから、LXRMの作用を増強し、又はEAR-2の作用を抑制することにより、ABCA1の転写活性化を介して、脂質代謝が改善されることが明らかになった。そこで、clone6、LXRM、若しくはEAR-2存在下で、ABCA1の発現が亢進、及び／又はSREBP1cの発現が抑制するように、LXRの転写活性を制御する物質、clone6、若しくはEAR-2の発現を抑制し、及び／又はclone6、若しくはEAR-2のLXRへの結合を抑制する物質、或いはLXRMの発現を促進し、及び／又はLXRMのLXRへの結合を亢進する物質、すなわち、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬のスクリーニング系を構築し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、
[１] （１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、並びに、（２）試験物質依存的なLXRの転写活性の変化を分析する工程を含む脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
[２] （１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに、（２）配列番号７で表される塩基配列、若しくは配列番号７で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するSREBP1cのプロモーター領域を含むポリヌクレオチド、又は配列番号８で表される塩基配列、若しくは配列番号８で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するABCA1のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドと融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞、
[３] LXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はRXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された[２]に記載の細胞、
[４] レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である[２]又は[３]に記載の細胞、
[５] （１）[２]乃至[４]に記載の細胞に試験物質を接触させる工程、（２）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的なABCA1、又はSREBP1cの転写活性の変化を分析する工程、並びに（３）ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する試験物質を選択する工程を含む、ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する物質をスクリーニングする方法、
[６] ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する物質が脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬である[５]記載のスクリーニング方法、
[７] （１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドが発現している細胞、或いはLXRのアゴニスト活性を有する化合物と接触させることにより配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドを発現するようになる細胞に試験物質を接触させる工程、並びに（２）前記細胞内における前記ポリペプチドの試験物質依存的な発現量の変化を分析する工程を含む、配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドの細胞内における発現を抑制する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドの細胞内における発現を促進する物質からなる脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
[８] （１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、並びに（２）LXRとLXRに結合する物質の試験物質依存的な相互作用の変化を分析する工程を含む、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法、
[９] （１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、（２）前記ポリペプチドとLXRとの結合を測定する工程、並びに、（３）前記ポリペプチドとLXRとの結合を変化させる物質を選択する工程を含む、配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を阻害する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を促進する物質をスクリーニングする方法、
[１０] 配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を阻害する物質、或いは配列番号４で表されるアミノ酸配列、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御するポリペプチドとLXRとの結合を促進する物質が、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬である[９]記載のスクリーニング方法、
[１１]  [５]乃至[１０]に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び、前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含む、脂質代謝改善、及び／又はインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法により、TG合成亢進といった副作用のない、及び／又は既存の合成LXRアゴニストとは異なる効果を有する脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をLXRの転写共役因子の制御に基づいて同定及びスクリーニングすることができる。また、本発明の細胞は脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬の同定及びスクリーニングに用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
[１]  本発明の細胞
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは１〜7個、更に好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド（以下、機能的等価clone6と称する）;、並びに、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性が75％以上、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド（以下、相同clone6と称する）;
について、（１）、（２）、及び（３）を総称して、以下では「機能的clone6」と称する。
【００１１】
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは促進する、更に好ましくは2倍以上に促進するポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは１〜7個、更に好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは促進する、更に好ましくは2倍以上に促進するポリペプチド（以下、機能的等価LXRMと称する）;、並びに、
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が75％以上、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは促進する、更に好ましくは2倍以上に促進するポリペプチド（以下、相同LXRMと称する）;
について、（１）、（２）、及び（３）を総称して、以下では「機能的LXRM」と称する。
【００１２】
（１）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド；
（２）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは１〜7個、更に好ましくは1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド（以下、機能的等価EAR-2と称する）;、並びに、
（３）配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が75％以上、好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも過剰発現によりABCA1の発現を制御する、好ましくは抑制する、更に好ましくは1/2倍以下に抑制するポリペプチド（以下、相同EAR-2と称する）;
について、（１）、（２）、及び（３）を総称して、以下では「機能的EAR-2」と称する。
【００１３】
なお、本明細書における前記「相同性」とは、Clustal V program (HigginsとSharp、Gene、第73巻、第237-244頁、1998年；Thompsonら、Nucleic Acid Res.、第22巻、第4673-7680頁、1994年)検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identitiesを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Pairwise Alignment Parametersとして
K tuple  1
Gap Penalty  3
Window  5
Diagonals Saved 5
また、本明細書における前記「過剰発現によりABCA1の発現を制御する」とは、あるポリペプチドを細胞に過剰発現させることによって、過剰発現させない場合と比較して、細胞内のABCA1の発現量が増加、又は減少することをいう。増加する場合は、該ポリペプチドがABCA1の発現を促進すると、また、減少する場合は、該ポリペプチドがABCA1の発現を抑制するということができる。促進、又は抑制の倍率は、該ポリペプチドを過剰発現させなかった細胞に対する、過剰発現させた細胞の細胞内におけるABCA1の発現量の比によって求めることができる。細胞に検討対象のポリペプチドを過剰発現させるには、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。また、比較に用いる過剰発現させない細胞は、形質転換させなくてもよいし、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含まない発現ベクターで形質転換させてもよい。形質転換により細胞に検討対象のポリペプチドが過剰発現したか否かを調べるには、また、細胞内のABCA1の発現量を調べるには、細胞抽出液を用い、検討対象のポリペプチド又はABCA1を検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、或いは、検討対象のポリペプチド又はABCA1をコードするポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムPCRなどにより確認することができる。過剰発現させなかった細胞と比較して、過剰発現させた細胞で検討対象のポリペプチドの発現量が多いこと、好ましくは2倍以上になっていることを確認することにより、検討対象のポリペプチドが過剰発現されたと判断することができる。
さらに、本明細書における前記「プロモーター活性」とは、RNA重合酵素(RNA polymerase)が結合しRNA分子の合成を開始させる特定のDNA塩基配列であるプロモーターが、下流遺伝子のmRNAの転写量を制御する活性のことをいう。
【００１４】
本発明の細胞は、i）機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びii）配列番号７で表される塩基配列、若しくは配列番号７で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するSREBP1cのプロモーター領域を含むポリヌクレオチド、又は配列番号８で表される塩基配列、若しくは配列番号８で表される塩基配列との相同性が90%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するABCA1のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドと融合されたレポーター遺伝子で形質転換することにより作製する。必要に応じて、さらに、LXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はRXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換して作製することができる。
【００１５】
機能的clone6をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、機能的等価clone6、及び相同clone6をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるもので、過剰発現によりABCA1の発現を制御するものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（WO2001/64834号）やマウスなどの哺乳動物由来のものを用いることもできる。好ましくは、配列番号２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
機能的LXRMをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号４記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、機能的等価LXRM、及び相同LXRMをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるもので、過剰発現によりABCA1の発現を制御するものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト由来のもの（GenBankアクセッション番号NM_032752）、及び配列番号３記載の塩基配列との相同性が76.8%であるマウス由来のもの（GenBankアクセッション番号NM_172941）などの哺乳動物由来のものを用いることもできる。好ましくは、配列番号４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号３記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
機能的EAR-2をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号６記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、機能的等価EAR-2、及び相同EAR-2をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるもので、過剰発現によりABCA1の発現を制御するものであればいずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（GenBankアクセッション番号NM_005234）由来のもの、配列番号５記載の塩基配列との相同性が83.5%であるマウス由来のもの（GenBankアクセッション番号NM_010150）、及び配列番号５記載の塩基配列との相同性が84.5%であるラット由来のもの（GenBankアクセッション番号NM_139113）などの哺乳動物由来のものを用いることもできる。好ましくは、配列番号６記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号５記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００１６】
LXRは、LXRαとLXRβのいずれのサブタイプでもよく、また同じ分子種として同定されるもので、核内受容体としての生体内での機能を果たすものであればいずれの種由来のものであってもよい。LXRをコードするポリヌクレオチドとしては、例えばヒト（GenBankアクセッション番号U22662、NM_007121）、マウス（GenBankアクセッション番号AF085745、U09419）、ラット（GenBankアクセッション番号U11685、U14533）など哺乳動物由来のものを用いることができる。好ましくは、配列番号９、又は配列番号１１で表されるヒトLXRの塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いることができる。
RXRは、RXRα、RXRβ、RXRγなどいずれのサブタイプであってもよく、また同じ分子種として同定されるもので、核内受容体としての生体内での機能を果すものであればいずれの種由来のものであってもよい。RXRをコードするポリヌクレオチドとしては、例えばヒト（GenBankアクセッション番号X52773、NM_021976、NM_006917）、マウス（GenBankアクセッション番号M84817、NM_011306、NM_009107）など哺乳動物由来のものを用いることができる。好ましくは、配列番号１３で表されるヒトRXRαの塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いることができる。
【００１７】
機能的clone6、機能的LXRM、機能的EAR-2、LXR、RXRをコードするポリヌクレオチドは、既知のアミノ酸配列や塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、PCR (Polymerase Chain reaction)法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、cDNAライブラリーから単離できる。具体的には実施例１乃至実施例３、及び実施例５に記載の方法により実施できる。
【００１８】
SREBP1cのプロモーター領域を含むポリヌクレオチドは、下流の遺伝子のmRNAの転写量を制御する活性であるプロモーター活性を有するものであれば、いずれの種由来のものであってもよく、例えばマウス(GenBankアクセッション番号AB046200)、ラット、ヒトなどの哺乳動物由来のプロモーターの一部、若しくは全部を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドと90%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを用いることができる(Amemiya-Kudoら、J. Biol. Chem.、第275巻、第31078-31085頁、2000年)。好ましくは配列番号７で表される塩基配列との相同性が90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを、また、更により好ましくは、配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをSREBP1cのプロモーター領域として用いることができる。
【００１９】
ABCA1のプロモーター領域は、下流の遺伝子のmRNAの転写量を制御する活性であるプロモーター活性を有するものであれば、いずれの種由来のものであってもよく、例えばヒト（GenBankアクセッション番号AF287262）、マウス(GenBankアクセッション番号AF287263)、ラットなどの哺乳動物由来のプロモーターの一部、若しくは全部を含むポリヌクレオチド、又は、該ポリヌクレオチドと90%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを用いることができる（Langmannら、J. Biol. Chem.、第277巻、第14443-14450頁、2002年； Yangら、Journal of Lipid Research、第43巻、第297-306頁、2002年）。好ましくは配列番号８で表される塩基配列との相同性が90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上である塩基配列からなり、しかもプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを、また、更により好ましくは、配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをABCA1のプロモーター領域として用いることができる。
SREBP1cのプロモーター領域、及びABCA1のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドは、既知の塩基配列の情報などをもとに設計し合成したプライマーやプローブを用いて、PCR法やハイブリダイゼーションによるスクリーニングにより、染色体DNAから単離できる。具体的には実施例５に記載の方法により実施できる。
【００２０】
前記のように単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当な発現ベクターに組み込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞に形質移入することができるようになり、宿主細胞において、形質移入したポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させることが可能である。発現ベクターには、宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターを用いることができる他、宿主細胞に応じて適宜選択したベクタープラスミドに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入したものを用いることができる。数種類のポリヌクレオチドで同時に一つの細胞を形質転換する場合は、数種類のポリヌクレオチドが一つの発現ベクターに含まれるように構成してもよく、または各々別々の発現ベクターに含まれるように構成してもよい。あるいは、このような構成が染色体DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。所望のポリヌクレオチドを導入した発現ベクターは、DEAE-デキストラン法（Luthmanら、Nucleic Acids Res.、第11巻、第1295-1308頁、1983年）、リン酸カルシウム-DNA共沈殿法（Grahamら、Virology、第52巻、第456-457頁、1973年）、市販のトランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000 (インビトロジェン社)やFuGENE 6（Roche Molecular Biochemicals社）を用いた方法、及び電気パルス穿孔法（Neumannら、EMBO J.、第1巻、第841-845頁、1982年）等により宿主細胞に取り込ませ、形質転換させることができる。
【００２１】
プロモーター領域の下流に配置される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(CAT)、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子(Luc)、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（GFP）等が挙げられる。レポーター遺伝子は、プロモーター領域に機能的に連結されているものが用いられる。プロモーター領域に連結されたレポーター遺伝子も、一般的な遺伝子組み換え技術を用いて構築し、この構成をベクタープラスミド中に組み込んだ上、得られた組み換えプラスミドを前記の方法で宿主細胞中に形質移入することができる。
具体的には、「Molecular Cloning」「Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年」に記載の方法により、LXR、RXR、機能的clone6、機能的LXRM、及び機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを単独、あるいは連結し、哺乳動物細胞用の発現ベクターpcDNA3.1に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができる。また、SREBP1c及びABCA1のプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを単独でピッカジーンベーシックベクター2(東洋インキ株式会社)に組み込むことでプロモーター領域にレポーター遺伝子が融合した発現ベクターを得ることができる。
【００２２】
前記のように作製した発現ベクターを用いて、具体的には、i) 機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びii) SREBP1c、又はABCA1のプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子で、NIH-3T3細胞をLipofectamine 2000を用いて形質転換させることができる。さらにiii) LXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はiv) RXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターも同時に、該NIN-3T3細胞に、形質移入させることができる。内在性のLXR及びRXRが豊富に存在する細胞、例えば肝臓由来細胞などを宿主細胞として用いる場合は、i) 機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び ii) SREBP1c、又はABCA1のプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子を形質移入してもよい。また、内在性のRXRが豊富に存在する細胞、例えば脂肪由来細胞などを宿主細胞として用いる場合には、i) 機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ii) SREBP1c、又はABCA1のプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子、及び iii) LXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを形質移入してもよい。より具体的には、実施例５に記載の方法により実施することができる。
【００２３】
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できるが、核内受容体に作用することが報告されているフェノールレッドを含まない培地を使用するほうが好ましい。培地に添加する血清は活性炭、及びデキストラン処理活性炭で血清中に含まれる微量成分を吸着除去したものを使用するほうが好ましい。例えば上記NIH-3T3細胞であれば、活性炭、及びデキストラン処理活性炭で処理した牛胎児血清等の血清成分を添加したフェノールレッド不含ダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（DMEM）等の培地を使用できる。
【００２４】
[２]  本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法には、LXR転写共役因子(機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2)の作用及び／又は発現量を制御する試験物質を、以下に挙げる活性や発現量を指標にスクリーニングする方法が含まれる。
１．LXR転写共役因子存在下で、LXRの転写活性として、
A) ABCA1、及び／又はSREBP1cの転写活性
B) LXR応答配列に融合されたレポーター遺伝子の発現量
C)LXR標的遺伝子の発現量
を指標にスクリーニングする方法
２．LXR転写共役因子の発現量を指標にスクリーニングする方法
３．LXRとLXRに結合する物質の相互作用の変化を指標にスクリーニングする方法
以下にこれらのスクリーニング方法について説明する。
【００２５】
１．LXR転写共役因子存在下で、LXRの転写活性を指標にスクリーニングする方法
本発明の実施態様としては、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された細胞に試験物質を接触させ、試験物質依存的なLXRの転写活性の変化を分析する工程を含む、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法が挙げられる。LXRの転写活性の変化を分析するには、具体的には、A)ABCA1、若しくはSREBP1cの転写活性の変化を分析してもよく、B) LXR応答配列に融合されたレポーター遺伝子の発現量の変化を分析してもよく、又はC)プロモーター領域にLXR応答配列を有するLXR標的遺伝子の発現量の変化を分析してもよい。以下にA)、B)及びC)の分析方法を用いたスクリーニング方法について説明する。
【００２６】
A)LXR転写共役因子存在下で、ABCA1、又はSREBP1cの転写活性を指標にスクリーニングする方法
本発明の実施態様としては、前記の本発明の細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現を指標として、ABCA1の転写を活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を抑制する物質、すなわち脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法が挙げられる。
レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、1993年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその5'上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用、又はプロモーター抑制作用すなわち発現抑制作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、SREBP1cのプロモーター領域又はABCA1のプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、SREBP1c又はABCA1の発現調節に対する試験物質の作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。SREBP1cのプロモーター領域又はABCA1のプロモーター領域と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験物質依存的な転写活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、ABCA1の転写を好ましくは2倍以上に活性化し、及び／又はSREBP1cの転写を好ましくは1/2倍以下に抑制する物質、すなわち脂質代謝及び／又はインスリン抵抗性を改善する物質のスクリーニングを実施できる。具体的には、例えば、実施例５に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。
【００２７】
B）LXR転写共役因子存在下で、LXR応答配列に融合されたレポーター遺伝子の発現量を指標にスクリーニングする方法
本発明の実施態様としては、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞に、LXR応答配列を含むポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子を同時に形質移入し、そのレポーター遺伝子の発現量の変化を分析する工程を含む脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法が挙げられる。
「LXR応答配列」とは、LXRのDNA結合領域が結合し得る応答配列を含むポリヌクレオチドのことで、LXRはRXRとヘテロダイマーを形成し、5'AG(G/T)TCA 3'のモチーフが間に4塩基はさんで2回繰り返す配列に結合することが知られている。例えば、マウスSREBP1c遺伝子のプロモーターでは、-282〜-297の部位にLXR応答配列があることが知られている（Repaら、Genes ;Dev.、第14巻、第2819-2830頁、2000年）。また、ヒト、マウス、及びラットのABCA1遺伝子のプロモーターでは、エクソン1の上流約50bpの部位にLXR応答配列があることが知られている（Yangら、Genomics、第73巻、第66-76頁、2001年）。LXR応答配列は、遺伝子のプロモーターからその領域を切り出して用いてもよいし、あるいはその配列を化学的に合成してもよい。「応答配列」のより詳しい定義と実例については、「分子細胞生物学第４版」（丸山ら訳、東京化学同人社、2001年）に記載されている。
【００２８】
本発明の一つの実施態様として、具体的には、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを形質移入した細胞に、更に、i) LXR応答配列を含むポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子、並びに／又はii)LXR及びRXRをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを形質移入し作製した細胞に試験物質を接触させ、試験物質によるレポーター遺伝子の発現量の変化を分析することにより実施できる。i)のLXR応答配列を含むポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子に、例えば、ABCA1遺伝子プロモーターのLXR応答配列を含むポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子を用いた場合、レポーター遺伝子の発現量を好ましくは2倍以上に増加させる試験物質を選択することで、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。また、例えば、SREBP1c遺伝子プロモーターのLXR応答配列を含むポリヌクレオチドに融合されたレポーター遺伝子を用いた場合、レポーター遺伝子の発現量を好ましくは1/2倍以下に減少させる試験物質を選択することで、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
【００２９】
C）LXR転写共役因子存在下で、LXR標的遺伝子の発現量を指標にスクリーニングする方法
本発明の実施態様としては、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された細胞に試験物質を接触させ、プロモーター領域にLXR応答配列を有する遺伝子の試験物質依存的な発現量の変化を分析する工程を含む脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法が挙げられる。プロモーター領域にLXR応答配列を有する遺伝子としては、具体的にはSREBP1c遺伝子やABCA1遺伝子が挙げられる。機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された細胞に試験物質を接触させるには、細胞に試験物質を添加又は非添加して一定時間培養する方法がある。試験物質依存的なSREBP1c、又はABCA1の発現量の変化は、試験物質非添加の細胞と試験物質添加の細胞で、SREBP1c若しくはABCA1遺伝子の転写産物であるmRNA、または、該mRNAにより翻訳される蛋白質の量を測定し、比較することにより、分析することができる。細胞から回収したRNA中のSREBP1cやABCA1のmRNA量を、例えば、リアルタイムPCR法などにより検出することができる。また、SREBP1c又はABCA1のmRNAと特異的にハイブリダイゼーションするプローブをあらかじめ固定したプレートを用いたアッセイシステム（HPSATM；クロマジェン社）により、多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。更に、回収した細胞抽出液中のSREBP1cやABCA1の蛋白量を、例えば、免疫化学的な方法（ウエスタンブロッティング法など）により検出することができる。このようにして、試験物質依存的なSREBP1cやABCA1の発現量の変化を分析し、ABCA1の発現量を好ましくは2倍以上に増加させ、及び／又はSREBP1cの発現量を好ましくは1/2倍以下に低下させる試験物質、すなわち、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
【００３０】
２．LXR転写共役因子の発現量を指標にスクリーニングする方法
本発明の一つの実施態様としては、i) 細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ii) 試験物質依存的な機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2発現量の変化を分析する工程を含む方法で、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
本方法で使用する「細胞」としては、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2を発現している細胞ならば何れでも良い。具体的には、肝細胞、脂肪細胞、腎臓由来細胞が好ましく、より具体的にはヒト肝癌由来細胞HepG2細胞やヒト胎児腎臓由来細胞HEK-293細胞、マウス由来胚繊維芽細胞NIH-3T3細胞が好ましい。LXRのアゴニスト活性を有する化合物と接触させることにより機能的LXRMを発現するようになる細胞を用いることもできる。細胞に接触させるLXRのアゴニスト活性を有する化合物としては、具体的にはT-0901317 (N-(2,2,2-trifluoroethyl)-N-[4-(2,2,2-trifluoro-1-hydroxy-1-trifluoromethylethyl)phenyl]benzenesulfonamide)（Joshuaら、Gene Dev.、第14巻、第2831-2838頁、2000年；WO2000/54759号）やGW3965 (3-{3-[N-(2-chloro-3-trifluoromethylbenzyl)-N-(2,2-diphenylethyl)amino]propoxy}phenyl)acetic acid)（Collinsら、J. Med. Chem.、第45巻、第1963-1966頁、2002年）を用いることができ、より具体的には、例えば、T-0901317を10nMの濃度以上で12時間以上接触させることにより、機能的LXRMを発現するようになる細胞を用いることができる。
【００３１】
細胞が機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2を発現しているか否かは、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2をコードするポリヌクレオチドの一部、又は全部の塩基配列を利用したRT-PCR、ノーザンブロッティング解析、in situ ハイブリダイゼーションなどや、機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング解析などにより特定することができる。
上記１．C)で記載の方法と同様の方法で、細胞に試験物質を接触させ、試験物質非添加の細胞と試験物質添加の細胞で機能的clone6、機能的LXRM、若しくは機能的EAR-2の発現量の変化を分析し、機能的clone6、若しくは機能的EAR-2の発現を好ましくは1/2倍以下に抑制する物質、又は機能的LXRMの発現を好ましくは2倍以上に促進する物質、すなわち、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
【００３２】
３．LXRとLXRに結合する物質の相互作用の変化を指標にスクリーニングする方法
本発明の実施態様として、具体的には、LXRに結合する物質が、1) LXR転写共役因子（機能的clone6、機能的LXRM、又は機能的EAR-2）である場合、及び2) LXR応答配列を含むポリヌクレオチドである場合が挙げられる。以下に1)及び2)のスクリーニング方法について説明する。
【００３３】
１）LXR転写共役因子とLXRとの結合を指標に脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法
本発明の具体的な実施態様として、i) LXR転写共役因子と試験物質を接触させる工程、ii) LXR転写共役因子とLXRとの結合を測定する工程、及びiii) 機能的clone6、若しくは機能的EAR-2とLXRとの結合を阻害する物質、又は機能的LXRMとLXRとの結合を促進する物質を選択する工程を含む方法で、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
LXR転写共役因子と試験物質を接触させるには、LXR転写共役因子の一部、若しくは全領域、又はLXR転写共役因子の一部、若しくは全領域にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）やFlag、Hisなどのタグを融合させたポリペプチドを発現させた細胞に試験物質を添加又は非添加して一定時間培養する方法がある。あるいは、上述のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加又は非添加して一定時間インキュベートしてもよい。ポリペプチドを発現させる細胞には、LXRを発現している細胞、又はLXRを上記のように形質移入して得られた細胞を用いることができる。具体的には、LXRを発現している細胞としては肝細胞、脂肪細胞、腎臓由来細胞が好ましく、より具体的にはヒト肝癌由来細胞HepG2細胞やヒト胎児腎臓由来細胞HEK-293細胞が好ましい。LXRを形質移入する細胞としては、COS細胞、CHO細胞、NIH-3T3細胞が好ましい。
【００３４】
前記細胞から抗LXR抗体を用いた免疫沈降によりLXR蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞の処理に用いた試験物質と同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたLXR、及びその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロッティングによりLXR転写共役因子の蛋白量を測定することにより、LXR転写共役因子とLXRの結合を阻害、又は促進する試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、LXR転写共役因子の一部若しくは全領域に対する抗体（例えば抗clone6、LXRM若しくはEAR-2抗体）、あるいは上記のタグを認識する抗体を利用することができる。
またLXR転写共役因子の一部、若しくは全領域、又はLXR転写共役因子一部若しくは全領域にGSTやFlag、Hisなどのタグを融合させたポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加又は非添加したものから、LXR転写共役因子とは異なるタグをつけて精製したLXRを用いたin vitroのプルダウン法（松七五三ら、実験工学、第l13巻、第528頁、1994年）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせることによってもLXR転写共役因子とLXRの結合を阻害、又は促進する試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させたLXR転写共役因子の一部、若しくは全領域、及びLXRを同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のELISA法に従ってもLXR転写共役因子とLXRの結合を阻害、又は促進する試験物質を選択するスクリーニングが可能である。
【００３５】
また、別の実施態様としては酵母ツーハイブリッド（Y2H）法を用いた方法がある。Y2H法は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして蛋白質−蛋白質相互作用を検出する方法である。一般に転写因子はDNA結合領域と転写活性化領域という機能の異なる2つの領域を有するが、Y2H法では、2種類の蛋白質XとYの相互作用を調べるために、転写因子のDNA結合領域とXからなる融合蛋白質、及び、転写因子の転写活性化領域とYからなる融合蛋白質の2種類を同時に酵母細胞内で発現させる。DNA結合領域に結合させた蛋白質Xをバイト（bait）、転写活性化領域に結合させた蛋白質Yをプレイ（prey）という。蛋白質XとYが相互作用すると2種類の融合蛋白質が1つの転写複合体を形成し、これが細胞の核内において該転写因子の応答配列と結合してその下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このように２つの蛋白質の相互作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。具体的には、GAL4のDNA結合領域と融合させたLXRとGAL4の転写活性化領域と融合させたLXR転写共役因子を酵母に導入し、培地中に試験物質を添加し、LXRとLXR転写共役因子の相互作用の強度を測定することができる。より具体的には実施例４若しくは実施例１に記載の手法により実施できる。また公知の哺乳動物細胞におけるツーハイブリッドシステム（クロンテック社）を利用して、GAL4のDNA結合領域と融合させたLXRと、VP16の転写促進領域を融合させたLXR転写共役因子を用いて、既存のCAT若しくはルシフェラーゼ活性の検出によりLXR転写共役因子とLXRの結合を阻害、又は促進する試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
このようにして、機能的clone6、若しくは機能的EAR-2とLXRとの結合を好ましくは1/2倍以下に阻害する物質、又は機能的LXRMとLXRとの結合を好ましくは2倍以上に促進する物質、すなわち、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
【００３６】
２）LXR転写共役因子存在下で、LXR応答配列を含むポリヌクレオチドへのLXRの結合を指標に脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングする方法
LXR転写共役因子存在下で、試験物質添加による、LXR応答配列へのLXRの結合量の変化を分析することにより、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。具体的には、試験物質、LXR、RXR、LXR応答配列、及び機能的clone6、機能的LXRM、若しくは機能的EAR-2を混合し、一定時間放置した後、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う公知のゲルシフトアッセイ（Electrophoretic Mobility Shift Assay）により実施することができる。機能的clone6、又は機能的EAR-2存在下ではLXR応答配列へのLXR結合量を好ましくは1/2倍以下に減少させる試験物質を選択し、機能的LXRM存在下ではLXR応答配列へのLXR結合量を好ましくは2倍以上に増加させる試験物質を選択する。このようにして、脂質代謝改善薬、及び／又はインスリン抵抗性改善薬をスクリーニングすることができる。
【００３７】
[３]  試験物質
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrettら、J. Steele. Tetrahedron、第51巻、第8135-8173頁、1995年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的、又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
【００３８】
[４]  脂質代謝改善、及び／又はインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び、前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含む、脂質代謝改善、及び／又はインスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法の発明が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が望ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口投与のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
【００３９】
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重60kgとして）において、1日につき約0.1〜100mg、好ましくは0.1〜50mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50mg、好ましくは0.01〜10mgである。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法(「Molecular Cloning」 Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、等)に従って実施可能である。酵母を用いた実験操作はYeast Protocols Handbook（クロンテック社）等公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従っても実施可能である。
【００４１】
実施例１ 
Y2H法による、LXRとリガンド依存的に相互作用する蛋白質の同定
LXRにリガンド依存的に結合する転写共役因子を探索する目的で、Y2H法による候補遺伝子クローニングを実施した。LXRのDNA結合領域、及びリガンド結合領域をバイトにし、ヒト肝臓cDNAライブラリーからのスクリーニングを実施した。
（１）Y2H用バイトの作製
配列番号１５及び配列番号１６に示したプライマーを用いてPCR法（DNAポリメラーゼ（Taq DNA polymerase；シグマ社）を用い、94℃（5分）の後、94℃（30秒）、55℃（30秒）、72℃（40秒）のサイクルを30回繰り返した）により、LXRを含むcDNAを取得した。Y2H用発現ベクターpDBtrp(インビトロジェン社)に挿入するため、配列番号１７及び１８に示したプライマーを用いて、前述のPCR産物をテンプレートとして再度PCR（DNAポリメラーゼ（Taq DNA polymerase ； シグマ社）を用い、94℃（5分）の後、94℃（30秒）、55℃（30秒）、72℃（30秒）のサイクルを25回繰り返した）を行い、配列番号１０に示すLXRの第93番目のアミノ酸から終止コドン直前までの355アミノ酸でDNA結合領域およびリガンド結合領域（Ligand Binding Domain；LBD）を含む領域をコードするcDNAを取得した。このLXRを含むDNA断片をpDBtrpにYeast Protocols Handbook（クロンテック社）の方法に従って挿入し、pDB-LXRを構築した。pDBtrpのGAL4のDNA結合領域のコード領域とLXR遺伝子の翻訳フレームが一致して挿入されたプラスミド（以下pDB-LXRと略称する）を含む酵母をバイトとして選択した。
【００４２】
（２）Y2Hスクリーニング
上述のバイトを用いてヒト肝臓cDNAライブラリー（Match Maker cDNA library；クロンテック社）をYeast Protocols Handbook（クロンテック社）の方法に従ってスクリーニングした。なお、LXRアゴニストであることが報告されているT-0901317(200μＭ)（Joshuaら、Gene Dev.、第14巻、第2831-2838頁、2000年；WO2000/54759号）を特許明細書に従って合成し、培地にあらかじめ塗布しておいた。T-0901317存在下で生育してくる酵母をLXRに結合する蛋白質を発現している陽性クローンとして取得した。次に、この陽性クローンをT-0901317(2mＭ)を塗布したYPD固形培地上で30℃にて培養後、結合指示レポーターであるlacZ遺伝子の発現をβ-ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β-ガラクトシダーゼ活性はYeast Protocols Handbook（クロンテック社）の方法に従って測定した。β-ガラクトシダーゼ活性が検出された酵母を選択することにより、これをT-0901317の存在に依存してLXRに結合する蛋白質を発現している最終的な陽性クローンとして特定した。これらからライブラリー由来のプラスミドを抽出し、これに含まれる遺伝子断片の塩基配列をシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）およびシーケンサー（ABI 3700 DNA sequencer；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、配列番号４に記載のLXRMの部分配列（配列番号４の第1番目〜第661番目）、配列番号６に記載のEAR-2の部分配列（配列番号６の第34番目〜第514番目）をそれぞれコードするクローンが含まれていた。なお、LXRの相互作用因子として公知であるRXRα（Willyら、Genes & Dev.、第9巻、1033-1044頁、1995年）の部分配列をコードするクローンも陽性クローンの一つとして含まれていたため、上記スクリーニングによりLXR相互作用因子を取得できることが確認された。
上述のようにY2Hスクリーニングの結果、LXRM及びEAR-2はLXRのリガンド結合領域にLXRリガンド存在下で結合することが確認された。これによりLXRM及びEAR2がLXRに結合する因子であることが明らかとなった。
【００４３】
実施例２ 
LXRM及びEAR-2全長クローニング並びに発現ベクター構築
（１）LXRM全長クローニング
Y2H法で得られた部分塩基配列情報をもとに、ヒト膵臓mRNA(クロンテック社)より調製したcDNAライブラリーを用いてLXRM全長cDNAを取得した。cDNAライブラリーはスパースクリプトチョイスシステム（インビトロジェン社）のキットを用い、添付された説明書に従い合成した。プライマーにはキットに添付されたrandom 
hexamerを用いた。Y2H法で得られたLXRMの部分塩基配列をBLAST検索し、高い相同性の得られた配列情報（GenBankアクセッション番号NM_032752）を基に設計した配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いてPCR法（DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造株式会社）を用い、98℃（10秒）、65℃（30秒）、72℃（2分30秒）のサイクルを40回繰り返した）によりLXRM全長cDNAを取得した。得られたcDNAはpCR-Blunt2-TOPO(インビトロジェン社)にクローニング後、pcDNA3.1(+)(インビトロジェン社)のCMVプロモーター下流で発現するようにHindIII、XhoI制限酵素部位に組み込んだ。得られたクローンにより、配列番号３に記載の塩基配列によりコードされるLXRM蛋白質を発現する発現ベクターを構築することができた。
【００４４】
（２）EAR-2全長クローニング
Y2H法で得られた部分塩基配列情報をもとに、肝臓cDNAライブラリー(Human liver Marathon-ReadyTM cDNA；クロンテック社)を用いてEAR-2全長cDNAを取得した。Y2H法で得られたEAR-2の部分塩基配列をBLAST検索し、高い相同性の得られた配列情報（GenBankアクセッション番号X12794）を基に設計した配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを用いてPCR法（DNAポリメラーゼ（Advantage 2 PCR Kit；クロンテック社）を用い、96℃（30秒）の後、96℃（30秒）、68℃（2分30秒）のサイクルを35回繰り返した）によりEAR-2全長cDNAを取得した。得られたcDNAはpCR-XL-TOPO(インビトロジェン社)にクローニング後、pcDNA3.1(-)(インビトロジェン社)のCMVプロモーター下流で発現するようにXhoI、HindIII制限酵素部位に組み込んだ。得られたクローンにより、配列番号５に記載の塩基配列によりコードされるEAR-2蛋白質を発現する発現ベクターを構築することができた。
【００４５】
実施例３ 
clone6全長クローニングおよび発現ベクター構築
Y2H法で得られたLXRMの塩基配列（配列番号３）をもとに、GenBankデータベースに対してBLAST検索を実施した。その結果、KIAA0557（GenBankアクセッション番号AB011129）との相同性が確認された。KIAA0557は部分cDNA配列であったため、3'および5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 法によりclone6全長cDNA配列（配列番号１）を同定した。配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いて小腸のcDNAライブラリー(Human small intestine Marathon-ReadyTM cDNA；クロンテック社)を鋳型として、PCR法（DNAポリメラーゼ（Pfu DNA polymerase；ストラタジーン社）を用い、95℃（1分）の後、95℃（30秒）、68℃（4分）のサイクルを35回繰り返した）により、clone6の全長cDNAを取得した。得られたcDNAはpCR-Blunt2-TOPO(インビトロジェン社)にクローニング後、pcDNA3.1(＋)(インヴィトロジェン)のCMVプロモーター下流で発現するようにEcoRI制限酵素部位に組み込んだ。得られたクローンにより、配列番号１に記載の塩基配列によりコードされるclone6蛋白質を発現する発現ベクターを構築することができた。
【００４６】
実施例４ 
Y2H法によるclone6とLXRの結合確認
LXRM及びEAR-2はY2H法でリガンド依存的なLXR結合分子としてクローニングしており、LXR結合能を確認している。LXRMのホモログとして得たclone6もLXRM同様にLXR結合能を持つか確認した。
配列番号２５及び配列番号２６に示したプライマーを用いて、実施例３で得たclone6(配列番号１)をもとに、clone6をコードするDNA断片をPCR法（DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造株式会社）を用い、98℃（5分）の後、98℃（10秒）、55℃（30秒）、72℃（90秒）のサイクルを25回繰り返した）により取得した。活性化ドメインベクターpACT2(クロンテック社) はヒト肝臓cDNAライブラリー(Match Maker cDNA library；クロンテック社)から精製し、制限酵素（EcoRI及びXhoI；宝酒造株式会社）で処理してインサートを除いて直鎖状にしたものを用いた。これにclone6を含むDNA断片をYeast Protocols Handbook（クロンテック社）の方法により挿入しpACT2-clone6を構築した。pDB-LXRを含む酵母をpACT2-clone6を用いて形質転換し、同方法により酵母を選択培地上で30℃にて培養した。なお、同培地中にはあらかじめLXRアゴニストであることが知られているT-0901317(200μＭ)を添加した。上述のY2Hの結果、LXRリガンド依存的な生育が確認され、clone6がLXRに結合する因子であることが明らかとなった。
【００４７】
実施例５ 
SREBP1cレポーターアッセイ、及びABCA1レポーターアッセイ
clone6、LXRM、EAR-2によるLXRターゲット遺伝子であるSREBP1c、ABCA1の発現制御をSREBP1c、ABCA1各遺伝子の転写調節領域を含むレポーター遺伝子を用いて確認した。
（１）SREBP1c及びABCA1レポーター遺伝子の構築
配列番号２７及び２８に示したプライマーを用いて、マウス染色体DNA（クロンテック社）を鋳型にしてPCR法（DNAポリメラーゼ（Advantage 2 PCR Kit；クロンテック社）を用い、95℃（1分）の後、95℃（30秒）、68℃（3分）のサイクルを30回繰り返した）によりマウスSREBP1cの転写調節領域をコードする染色体DNAを取得した。このDNA断片を制限酵素（BglII及びHindIII；宝酒造株式会社）で切断し、BglII、HindIIIで切断したピッカジーンベーシックベクター２（pGV-B2;東洋インキ株式会社）と結合し、マウスSREBP1c-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を構築した。
配列番号２９及び３０に示したプライマーを用いて、マウス染色体DNA（クロンテック社）を鋳型にしてPCR法（DNAポリメラーゼ（Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造株式会社）を用い、98℃（10秒）、65℃（30秒）、72℃（1分）のサイクルを40回繰り返した）によりマウスABCA1の転写調節領域をコードする染色体DNAを取得した。このDNA断片を制限酵素（KpnI及びXhoI；宝酒造株式会社）で切断し、KpnI、XhoIで切断したピッカジーンベーシックベクター２（pGV-B2;東洋インキ株式会社）と結合し、マウスABCA1-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を構築した。
【００４８】
（２）LXR発現プラスミドの構築
配列番号３１及び３２に示したプライマーを用いて、ヒト肝臓cDNAライブラリー（クロンテック社）から、PCR法（DNAポリメラーゼ（Pfu DNA polymerase；ストラタジーン社）を用い、94℃（1分）の後、94℃（15秒）、60℃（30秒）、72℃（3分）のサイクルを30回繰り返した）により、ヒトLXR cDNAを取得した。得られたcDNAはpCR-Bluntにクローニング後、pcDNA3.1(インビトロジェン社)のCMVプロモーター下流で発現するようにEcoRV、BamHI制限酵素部位に組み込み、pcDNA-hLXRαを構築した。
【００４９】
（３）RXRα発現ベクターの構築
ヒトRXRα発現ベクターphRXRαはpVgRXR（インビトロジェン社）をもとに構築した。pVgRXRはRXRαおよびエクダイソン受容体を同時に発現するように構築された発現ベクターである。そこで、pVgRXRから制限酵素（KpnI；宝酒造株式会社）でエクダイソン受容体部分に相当する2096bpを除去し、RXRαのみを発現するphRXRαを構築した。
【００５０】
（４）レポーターアッセイ法
NIH-3T3細胞を96ウェルプレート（コラーゲンタイプ１コートプレート；岩城硝子社）に2×104個／ウェルの密度で播種し、5%活性炭及びデキストランで処理したウシ胎児血清（ギブコ社）を含むフェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) （ギブコ社）を用い、5%二酸化炭素存在下、37℃で一晩培養した。この細胞にトランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000；インビトロジェン社）を用いて、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従い、以下i)、ii)、iii)、iv)、及びv)を一過性に同時に形質移入した。
i） 実施例５の（１）で作製したマウスSREBP1cレポーター遺伝子、若しくはマウスABCA1レポーター遺伝子（50 ng/ウェル）
ii）実施例３で作製したclone6発現ベクター、実施例２の（１）で作製したLXRM発現ベクター、若しくは実施例２の（２）で作製したEAR-2発現ベクター（0-56 
ng／ウェル）
iii） 実施例５の（２）で作製したLXRα発現プラスミド（pcDNA-hLXRα）（7 ng／ウェル）
iv） 実施例５の（３）で作製したRXRα発現ベクター(phRXRα) （7 ng／ウェル）
v）β-ガラクトシダーゼ発現ベクターpCH110（アマシャム社）(40 ng／ウェル)
なお、ii)でEAR-2発現ベクターを形質移入するときは、iv)のRXRα発現ベクター(phRXRα)は形質移入しなかった。24時間培養後、細胞に内在性に存在するLXRアゴニスト（生体内リガンド）であるハイドロキシコレステロールの合成を阻害するために5μM Mevastatin （シグマ社）を含む上記培地に交換し、LXRアゴニストT-0901317（0.03μM）存在下、非存在下で培養した。さらに24時間培養後、培養上清を除き、ピッカジーン培養細胞溶解剤（ピッカジーン社）を1ウェルあたり60μl添加し、細胞を溶解した。この細胞溶解液40μlに100μlのルシフェラーゼ基質溶液（和光純薬工業社）を添加し、化学発光測定装置（ML3000型；ダイナテックラボラトリーズ社）を用いて発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性を求めた。また、別途、前記細胞溶解液のβ-ガラクトシダーゼ活性を、β-ガラクトシダーゼ酵素測定システム（プロメガ社）を用いて測定し数値化した。これを導入遺伝子の形質転換効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。レポーター活性は、clone6発現ベクター、LXRM発現ベクター、及びEAR-2発現ベクターを導入しなかった細胞を含むウェルのルシフェラーゼ活性を100とした相対活性で示した。
【００５１】
実施例５の（１）で構築したSREBP1cレポーター遺伝子およびABCA1レポーター遺伝子が機能していることを確認するために、LXRの共役因子であるRXRα発現ベクター存在下でLXRアゴニストT-0901317の濃度依存的なルシフェラーゼレポーター活性化を確認した（図１. A,B）。また、ABCA1レポーター遺伝子に関してはRXRα非存在下でもLXRアゴニストT-0901317濃度依存的な活性化を示し、RXRαの発現量には依存しない転写活性であることを確認した（図１. C）。
【００５２】
clone6のSREBP1c及びABCA1遺伝子発現に対する作用を解析するために、clone6発現量依存的なSREBP1c及びABCA1レポーター活性を確認した。clone6はLXRアゴニストT-0901317（0.03μM）存在下でSREBP1cレポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を亢進し、ABCA1レポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を抑制した(図２. A, B)。また、clone6はLXRアゴニスト非存在下（T-0901317非添加かつMevastatin添加で内在アゴニスト（生体内リガンド）合成を阻害した条件下）でもSREBP1cレポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を亢進し、ABCA1レポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を抑制し、LXR非依存の転写制御活性を持つことを示した(図３. A,B)。
【００５３】
また、LXRMおよびEAR-2のABCA1遺伝子発現に対する作用を解析するために、LXRM又はEAR-2の発現量依存のABCA1レポーター活性を確認した。LXRMはT-0901317存在下、非存在下どちらでもABCA1レポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を亢進した(図４. A, B)。また、EAR-2はT-0901317存在下、非存在下どちらでもABCA1レポーター遺伝子のルシフェラーゼレポーター活性を抑制することを確認した。このとき、RXRα発現ベクターは細胞に形質移入しなかった(図５. A,B)。
【００５４】
従来の合成LXRアゴニストはSREBP1c遺伝子とABCA1遺伝子をともに亢進方向に発現制御するが、脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤としては、TG合成を促進するSREBP1cの遺伝子発現は抑制方向に制御するほうが好ましく、コレステロールの排出作用、抗動脈硬化症作用を持つABCA1の遺伝子発現は亢進方向に制御するほうが好ましい。
clone6はLXRアゴニストT-0901317存在下、及び非存在下で、SREBP1c遺伝子の発現を亢進し、ABCA1遺伝子の発現を抑制した。よって、clone6の作用を阻害するような薬剤は、SREBP1c遺伝子の発現を抑制し、ABCA1遺伝子の発現を亢進する脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤として好ましい特性を有することが明らかとなった。従って、clone6の活性、発現、及びLXRとの相互作用等を抑制する物質をスクリーニングすることにより、従来の合成LXRアゴニストが有するTG合成亢進作用を持たない脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤をスクリーニングすることができる。
【００５５】
また、LXRMはT-0901317存在下、及び非存在下でABCA1遺伝子の発現を亢進した。ABCA1はコレステロールの排出作用、抗動脈硬化症作用を有するため、LXRMの作用を亢進するような薬剤は、ABCA1遺伝子の発現を亢進する脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤として有用であることが明らかとなった。従って、LXRMの活性、発現、及びLXRとの相互作用等を促進する物質をスクリーニングすることにより、脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤をスクリーニングすることができる。
さらに、EAR-2はT-0901317存在下、及び非存在下でABCA1遺伝子の発現を抑制した。EAR-2の作用を抑制するような薬剤は、ABCA1遺伝子の発現を亢進する脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤として有用であることが明らかとなった。従って、EAR-2の活性、発現、及びLXRとの相互作用等を抑制する物質をスクリーニングすることにより、脂質代謝改善剤、及び／又はインスリン抵抗性改善剤をスクリーニングすることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号15, 16, 17, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】（Ａ）RXRα存在下でLXRアゴニストT-0901317の濃度依存的なSREBP1c遺伝子の転写活性、（Ｂ）RXRα存在下でT-0901317の濃度依存的なABCA1遺伝子の転写活性、及び（Ｃ）RXRα非存在下でT-0901317の濃度依存的なABCA1遺伝子の転写活性を示す図である。縦軸はT-0901317非添加でのSREBP1c遺伝子又はABCA1遺伝子の転写活性を100としたときの相対値を表示している。横軸はT-0901317の濃度（μM）を示す。Dunnett検定で、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
【図２】（Ａ）T-0901317存在下でclone6の発現量依存的なSREBP1c遺伝子の転写活性、及び（Ｂ）T-0901317存在下でclone6の発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性を示す図である。縦軸は細胞をclone6発現ベクターで形質転換しなかった時のSREBP1c遺伝子又はABCA1遺伝子の転写活性を100としたときの相対値を表示している。横軸は細胞に形質移入したclone6発現ベクターの量（ng／ウェル）を示す。Dunnett検定で、*はP<0.05を示す。
【図３】（Ａ）T-0901317非存在下、及びMevastatin存在下でclone6の発現量依存的なSREBP1c遺伝子の転写活性、並びに（Ｂ）T-0901317非存在下、及びMevastatin存在下でclone6の発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性を示す図である。縦軸は細胞にclone6を形質移入しなかった時のSREBP1c遺伝子又はABCA1遺伝子の転写活性を100としたときの相対値を表示している。横軸は細胞に形質移入したclone6発現ベクターの量（ng／ウェル）を示す。Dunnett検定で、*はP<0.05を示す。
【図４】（Ａ）T-0901317非存在下でLXRMの発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性、及び（Ｂ）T-0901317存在下でLXRMの発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性を示す図である。縦軸は細胞にLXRMを形質移入しなかった時のABCA1遺伝子の転写活性を100としたときの相対値を表示している。横軸は細胞に形質移入したLXRM発現ベクターの量（ng／ウェル）を示す。Dunnett検定で、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
【図５】（Ａ）T-0901317非存在下でEAR-2の発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性、及び（Ｂ）T-0901317存在下でEAR-2の発現量依存的なABCA1遺伝子の転写活性を示す図である。縦軸は細胞にEAR-2を形質移入しなかった時のABCA1遺伝子の転写活性を100としたときの相対値を表示している。横軸は細胞に形質移入したEAR-2発現ベクターの量（ng／ウェル）を示す。Dunnett検定で、*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
【図１】
2005204550.tif 000002
【図２】
2005204550.tif 000003
【図３】
2005204550.tif 000004
【図４】
2005204550.tif 000005
【図５】
2005204550.tif 000006
【配列表】
2005204550000001.app