(57)【要約】【課題】  大規模生産能力および高い生産効率を有し、さらに安全性の高いタンパク質の生産系、およびタンパク質の生産方法、並びに該タンパク質の生産方法を行うためのキットを提供することにある。【解決手段】  ウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有するトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）の外被タンパク質遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換した組み換えＴｏＭＶのｃＤＮＡを、ステロイドホルモンで転写誘導をすることができるプロモーターの下流に導入して構築した発現ベクターを構築する。該発現ベクターをタバコＢＹ−２細胞に導入した形質転換タバコＢＹ−２細胞に対して、ステロイドホルモンによる転写誘導を行うことにより、ＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの増幅、およびＧＦＰの誘導発現が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、
ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結してなる発現ベクターとが、
生物由来細胞に導入されていることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項２】
前記植物ウイルスが、トバモウイルス属に属するウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項３】
前記トバモウイルス属に属するウイルスが、タバコモザイクウイルスまたはトマトモザイクウイルスであることを特徴とする請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
前記ホルモンが、ステロイドホルモンであることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
前記生物由来細胞が植物由来細胞であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の植物由来細胞が、タバコ由来細胞であることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項７】
請求項６に記載のタバコ由来細胞が、タバコＢＹ−２細胞であることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項８】
上記タンパク質発現用ベクターがアグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
前記タンパク質の生産方法であって、形質転換細胞の培養工程を含むことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
前記のタンパク質の生産方法であって、さらにホルモンによる転写誘導工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１２】
前記ホルモンによる転写誘導工程が、ステロイドホルモンによる転写誘導工程であることを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１３】
請求項９ないし１２のいずれか１項に記載のタンパク質の生産方法を行うためのタンパク質生産キット。
【請求項１４】
前記タンパク質の生産キットであって、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１３に記載のタンパク質生産キット。
【請求項１５】
前記タンパク質の生産キットであって、さらにホルモンを含むことを特徴とする請求項１３または１４に記載のタンパク質生産キット。
【請求項１６】
前記ホルモンがステロイドホルモンであることを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質生産キット。
【請求項１７】
前記タンパク質の生産キットであって、さらに宿主となる生物由来細胞が含まれていること特徴とする請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載のタンパク質生産キット。
【請求項１８】
前記生物由来細胞が、植物由来細胞であることを特徴とする請求項１７に記載のタンパク質生産キット。
【請求項１９】
前記植物由来細胞が、タバコ由来細胞であることを特徴とする請求項１８に記載のタンパク質生産キット。
【請求項２０】
前記タバコ由来細胞が、タバコＢＹ−２細胞であることを特徴とする請求項１９に記載のタンパク質生産キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結してなる発現ベクターが導入されていることを特徴とする形質転換細胞、および該形質転換細胞を用いたタンパク質の生産方法、並びに該タンパク質の生産方法を行うためのキットに関するものである。
【０００２】
より具体的には、発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）に対するサプレッサーを有するトマトモザイクウイルス（以下適宜ＴｏＭＶと略す）の遺伝子と、ステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結してなる発現ベクターを、アグロバクテリウム法により導入されてなる形質転換タバコＢＹ−２細胞、および該形質転換タバコＢＹ−２細胞を用いたタンパク質の生産方法、並びに該タンパク質の生産方法を行うためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
近年、医薬品をはじめとする有用タンパク質の効率的生産方法の開発が注目されている。特に植物を食糧のみならず、医薬品をはじめとする有用タンパク質の生産工場として利用することを目指し、開発が進められている。このような試みは、「分子農業」と呼ばれ次世代農業として期待されている。
【０００４】
現在植物における有用タンパク質の生産は、形質転換植物を用いる方法（例えば非特許文献５参照）と、ウイルスベクターを植物に感染させる方法のいずれかで行われている（例えば、非特許文献１および２参照）。
【０００５】
本発明者は、これまでに植物ウイルス（ブロムモザイクウイルス）の複製酵素遺伝子と、これにより増幅される有用タンパク質遺伝子をともに植物の染色体内に組み込むことができ、複製酵素遺伝子の発現を制御することにより、有用タンパク質を合成することができる遺伝子発現系（以下高効率ｍＲＮＡ誘導増幅系と称する）を構築した。当該高効率ｍＲＮＡ誘導増幅系を、ニコチニアベンサミアーナ植物に適用し、複製酵素のサブユニットの一つである１ａタンパク質をステロイドホルモン制御系で誘導発現することによって、ガンマインターフェロン遺伝子をＲＮＡレベルで増幅することが可能となった（非特許文献１および２参照）。
【０００６】
さらに本発明者は、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）に対するサプレッサーを持ち、かつ複製能力の高い一本鎖ＲＮＡウイルスであるトバモモザイクウイルス属であるトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）をベクターとし、ステロイドホルモンによる誘導によって、高効率に外来タンパク質のｍＲＮＡを増幅する系の構築を行った。当該系をニコチニアベンサミアーナ植物に適用し、Green Fluorescent Protein 遺伝子（以下ＧＦＰ遺伝子と称す）をレポーター遺伝子として、ステロイドホルモン制御系で誘導発現を試みた結果、該遺伝子のＲＮＡレベルでの増幅、およびＧＦＰの発現が確認できた（非特許文献２参照）。
【０００７】
一方、植物由来培養細胞を用いた有用タンパク質生産も試みられている。例えば、非特許文献３においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いたタバコＢＹ−２細胞における組み換えタンパク質の生産が報告されている。また、非特許文献４においては、タバコモザイクウイルス（以下ＴＭＶと称す）の外被タンパク質遺伝子の３’末端に目的とするペプチド遺伝子を連結した変異型ウイルスＲＮＡベクターを用いて、プロトプラスト化したタバコＢＹ−２細胞に接種させ、外被タンパク質との融合タンパク質を発現させている。
【非特許文献１】石川県農業短期大学付属農業資源研究所平成１２年度年報、Ｎｏ．９，２０００，ｐ．１６−１８（発行日：平成1３年１０月２５日）
【非特許文献２】石川県農業短期大学付属農業資源研究所平成１３年度年報、Ｎｏ．１０，２００１，ｐ．１３−１６（発行日：平成1４年９月２５日）
【非特許文献３】Matsumoto S, Ikura K, Ueda M, Sasaki R. “Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells.” Plant Mol boil. 1995 Mar; 27(6): 1163-72.
【非特許文献４】Takamatsu N, Watanabe Y, Yanagi H, Meshi T, Shiba T, Okada Y. “Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector.” FEBS Lett. 1990 Aug 20; 269(1): 73-6.
【非特許文献５】Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals Glynis Giddings, Gordon Allison, Douglas Brooks & Adrian Carter Nature Biotechnology (2000) 18: 1151 - 1155.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記植物におけるタンパク質の生産方法のうち、形質転換植物を用いる方法では、植物を栽培するのみでタンパク質の生産が可能であるが、１細胞あたりの生産効率は著しく低いという問題点がある。一方ウイルスベクターを植物に感染させる方法は、高い生産効率を有するが、接種作業が必要なため作業効率が悪いこと、およびウイルスの外界への飛散等の安全性の問題により大規模生産化が困難となっている。
【０００９】
また前述の本発明者が構築したブロムモザイクウイルスを用いた高効率ｍＲＮＡ誘導増幅系の場合は、ブロムモザイクウイルスにウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）に対するサプレッサーが存在しないため、粒子化できない組み換えウイルスを用いた場合は、サイレンシング反応（ウイルス抵抗性反応）によりウイルスＲＮＡが分解されてしまう。つまり、ブロムモザイクウイルスを用いた高効率ｍＲＮＡ誘導増幅系には、当該目的タンパク質をコードする遺伝子はＲＮＡレベルで増幅するものの、時間の経過とともに該ＲＮＡがウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）によって分解されてしまい、継続的なタンパク質の高生産が行えないという欠点がある。さらに当該系においては、ステロイドホルモンで活性化された転写因子が、植物の黄化等を引き起こし植物の生長に悪影響を及ぼすという欠点も有している。
【００１０】
一方、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）に対するサプレッサーを有するＴｏＭＶを用いた系によって、植物個体内でタンパク質を生産する場合は、サイレンシングによるＲＮＡの分解は回避でき高効率にタンパク質を生産することが可能であったが、植物の栽培設備等が必要でありスケールアップが困難であること、植物の生産には比較的長期間を要すること、形質転換植物個体の種子や花粉等の飛散による安全性に対する問題、操作が煩雑であること等、様々な欠点を有している。
【００１１】
その他、非特許文献３および４に挙げたタバコＢＹ−２細胞を用いたタンパク質生産系は、培地における細胞培養によってタンパク質を生産することができ、スケールアップは容易であり、また増殖速度が高いために時間的メリットが大きい。さらに培養細胞であるため、例え外界に漏洩した場合であってもすぐに死滅してしまうために安全性の面においても優れている。しかしながら、これらの方法においても、生産効率が低い、操作が煩雑である(プロトプラスト化、接種操作)等の問題点を有している。
【００１２】
以上説示したごとく、従来の植物および植物由来細胞を用いたタンパク質の生産方法、およびタンパク質の生産系は、種々の欠点を有し、決して満足のいくものとはなっていなかった。
【００１３】
本発明は、上記従来の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、形質転換植物によるタンパク質生産の利点と、ウイルスベクターを用いたタンパク質生産の利点を併せ持つタンパク質の生産系、つまり大規模生産能力、高い生産効率、および安全性の高いタンパク質の生産系、および生産方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、ステロイドホルモンで転写誘導をすることができるプロモーターの下流に、外被タンパク質遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換した組み換えＴｏＭＶのｃＤＮＡを導入して構築した発現ベクターを、タバコＢＹ−２細胞に導入した形質転換タバコＢＹ−２細胞について、ステロイドホルモンによる転写誘導を行った結果、確かなウイルスＲＮＡの増幅、ＧＦＰの誘導発現ができることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
【００１６】
（１）発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結してなる発現ベクターが、生物由来細胞に導入されていることを特徴とする形質転換細胞。
【００１７】
（２）前記植物ウイルスが、トバモウイルス属に属するウイルスであることを特徴とする（１）に記載の形質転換細胞。
【００１８】
（３）前記トバモウイルス属に属するウイルスが、タバコモザイクウイルスまたはトマトモザイクウイルスであることを特徴とする（２）に記載の形質転換細胞。
【００１９】
（４）前記ホルモンが、ステロイドホルモンであることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれかに記載の形質転換細胞。
【００２０】
（５）前記生物由来細胞が植物由来細胞であることを特徴とする、（１）ないし（４）のいずれかに記載の形質転換細胞。
【００２１】
（６）上記（５）の植物由来細胞が、タバコ由来細胞であることを特徴とする形質転換細胞。
【００２２】
（７）上記（６）のタバコ由来細胞が、タバコＢＹ−２細胞であることを特徴とする形質転換細胞。
【００２３】
（８）上記タンパク質発現用ベクターがアグロバクテリウム法により導入されていることを特徴とする（１）ないし（７）のいずれかに記載の形質転換細胞。
【００２４】
（９）上記（１）ないし（８）のいずれかの形質転換細胞を用いることを特徴とするタンパク質の生産方法。
【００２５】
（１０）前記タンパク質の生産方法であって、形質転換細胞の培養工程を含むことを特徴とする（９）に記載のタンパク質の生産方法。
【００２６】
（１１）前記のタンパク質の生産方法であって、さらにホルモンによる転写誘導工程を含むことを特徴とする（１０）に記載のタンパク質の生産方法。
【００２７】
（１２）前記ホルモンによる転写誘導工程が、ステロイドホルモンによる転写誘導工程であることを特徴とする（１１）に記載のタンパク質の生産方法。
【００２８】
（１３）上記（９）ないし（１２）のいずれかのタンパク質の生産方法を行うためのタンパク質生産キット。
【００２９】
（１４）前記タンパク質の生産キットであって、（１）ないし（８）のいずれかに記載の発現ベクターを含むことを特徴とする（１３）に記載のタンパク質生産キット。
【００３０】
（１５）前記タンパク質の生産キットであって、さらにホルモンを含むことを特徴とする（１３）または（１４）に記載のタンパク質生産キット。
【００３１】
（１６）前記ホルモンがステロイドホルモンであることを特徴とする（１５）に記載のタンパク質生産キット。
【００３２】
（１７）前記タンパク質の生産キットであって、さらに宿主となる生物由来細胞が含まれていること特徴とする（１３）ないし（１６）のいずれかに記載のタンパク質生産キット。
【００３３】
（１８）前記生物由来細胞が、植物由来細胞であることを特徴とする（１７）に記載のタンパク質生産キット。
【００３４】
（１９）前記植物由来細胞が、タバコ由来細胞であることを特徴とする（１８）に記載のタンパク質生産キット。
【００３５】
（２０）前記タバコ由来細胞が、タバコＢＹ−２細胞であることを特徴とする（１９）に記載のタンパク質生産キット。
【発明の効果】
【００３６】
上記のように本発明にかかる形質転換体は、発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結してなる発現ベクターが、生物由来細胞に導入されていることを特徴とする形質転換細胞という構成である。
【００３７】
また同じく本発明にかかるタンパク質の生産方法は、上記本発明にかかる形質転換細胞を用いてなり、好ましくは該細胞の培養工程、およびホルモンによる転写誘導工程により構成されている。
【００３８】
また本発明にかかるタンパク質生産キットは、上記本発明にかかるタンパク質生産方法を行うためにキットであり、好ましくは上記発現ベクター、転写誘導を行うためのホルモン、および発現ベクターが導入される宿主となる細胞により構成されている。
【００３９】
上記構成によれば、発現タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡをウイルスの高い複製能力によって高度に増幅することができる。また該ｍＲＮＡは、ウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有するウイルスに起因して増幅されているため、宿主細胞のウイルス抵抗性反応によって分解が抑制される。そのため継続的に目的タンパク質を高生産することができる。さらに発現ベクターが導入された宿主が生物個体でなく生物由来細胞であるため、培養は液体培養で行うことが可能であり、また培養スケールの増大が安価かつ容易である。また、形質転換細胞は、自生することができず、万一該形質転換細胞が外界に漏洩した場合であっても死滅するため安全であるといえる。
【００４０】
よって、本発明にかかる形質転換細胞、本発明にかかるタンパク質生産方法、および本発明にかかるタンパク質生産キットは、大規模生産能力および高い生産効率を有し、さらに安全性の高いタンパク質の生産が可能となるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
本発明は、（Ａ）発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結して構築した発現ベクターが生物由来細胞に導入されてなる形質転換細胞（以下本発明にかかる形質転換細胞と称する）、（Ｂ）該形質転換細胞を用いたタンパク質の生産方法（以下本発明にかかるタンパク質生産方法と称する）、および（Ｃ）該タンパク質の生産方法を行うためのキット（以下本発明にかかるタンパク質生産キットと称する）に関するものである。
【００４３】
以下各発明についてそれぞれ説明する。
【００４４】
（Ａ）本発明にかかる形質転換細胞
本発明にかかる形質転換細胞は、発現させるタンパク質をコードする遺伝子を含むウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子と、ホルモンで転写誘導されるプロモーターとを連結して構築した発現ベクターが生物由来細胞に導入されてなるものである。
【００４５】
＜ウイルス抵抗性反応のサプレッサーを有する植物ウイルス＞
ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）とは、線虫、ショウジョウバエ、マウス、ヒト、および植物等の種々の生物が備えている、その生命活動に不適切なＲＮＡを効率的に排除する機能の一つであり、特に生物におけるウイルス感染に対する防御機構のことをいう。
【００４６】
より具体的には、生物にウイルスが感染すると、生物細胞にとって好ましくないウイルス由来のＲＮＡ（ｍＲＮＡやウイルスゲノムＲＮＡ）が多量に生産される。このためウイルスに感染した生物細胞は、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）を機能させ、かかるウイルス由来ＲＮＡを駆逐し、ウイルス感染の拡大を防いでいる。
【００４７】
これに対して、多くのウイルスは、生物細胞におけるウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）を抑制する能力を備えている。すなわちウイルスは、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）による増殖抑制に対抗すべく、それに対するサプレッサー（抑制因子）を発現させる。
【００４８】
本発明にかかる形質転換細胞は、植物ウイルスの遺伝子を含む発現ベクターを導入することによりなり、最終的には該ベクターに含まれる目的タンパク質の発現に用いるため、上述のウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）に対するサプレッサー（以下単にサプレッサーと称する）を有する必要がある。
【００４９】
本発明に用いる植物ウイルスが、かかるサプレッサーを有しなければ、前述の従来技術に掲げたごとく、目的タンパク質の遺伝子がｍＲＮＡレベルで増幅したにも関わらず、時間の経過とともに該ＲＮＡがウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）によって分解されてしまい、継続的なタンパク質生産が行えないということとなる。
【００５０】
よって、本発明において用いる植物ウイルスは、サプレッサーを有することが好ましい。
【００５１】
ここで、本発明で用いるサプレッサーを有する植物ウイルスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ポティ属（Potyvirus属）ウイルス、ククモウイルス属（Cucumovirus属）ウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶと略す）)、ポテックスウイルス属（Potexvirus属）ウイルス（例えばジャガイモＸウイルス(ＰＶＸと略す)）、トンブスウイルス属（Tombusvirus属）ウイルス(例えばトマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶと略す）、Cymbidiumu ringspot virus （ＣｙｍＲＳＶと略す）)、カルモウイルス属（Carmovirus属）ウイルス(例えば、Turnip rinkle virus （ＴＣＶと略す）)、トバモウイルス属（Tobamovirus属）ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶと略す）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶと略す））が挙げられる。
【００５２】
後述する実施例において、ＴｏＭＶを用いて発現ベクターを構築しているが、当該ウイルスは、(ア)他のウイルスと比較して増殖能が高く、タンパク質の大量生産が期待できること、(イ)該実施例において宿主として用いたタバコＢＹ−２細胞での増殖能が高いこと、および(ウ)従来から広く使用されており、取り扱い性、汎用性、応用性に富むという理由から採用した。
【００５３】
上記サプレッサーを有する植物ウイルスを用いることによって、増幅した目的タンパク質のｍＲＮＡは、ウイルス抵抗性反応（サイレンシング反応）によって分解されることなく、継続的なタンパク質の高生産が行うことが可能である。
【００５４】
なお、ここで植物ウイルスとは、植物を宿主とするウイルスの総称であり、狭義には、高等植物のウイルスを指す。ウイルスに感染した植物は、モザイク、退緑、黄化、奇形、巻葉、矮化、壊死などのウイルスの種類と寄生植物の組み合わせによって、種々の異なる病徴を示し、栽培作物の品質や、収穫に甚大な被害を与える。ウイルスの伝播様式には、汁液伝播、虫媒伝播、土壌伝播、接木伝播、種子伝播などがある。ある種のウイルスは、媒介昆虫体内でも増殖し、経卵伝染するものもある。
【００５５】
＜発現ベクターの構築＞
発現させる目的タンパク質は、生物由来細胞中で発現可能であるタンパク質であれば、特に限定されるものではない。例えば、医薬品に利用可能な有用酵素、インターフェロン、アレルゲンタンパク質、病原体の抗原、エリスロポエチン、エンケファリン、細胞増殖因子、抗体（免疫グロブリン）、アルブミン等が挙げられる。上記タンパク質が発現した生物由来細胞を適量摂取することにより、該タンパク質を摂取するのと同様の効果が得られるといった医薬品としての利用が可能となる。
【００５６】
発現させる目的タンパク質をコードする遺伝子は、前述のサプレッサーを有する植物ウイルスの遺伝子の一部との置換、または該ウイルスの遺伝子に連結するなど通常の遺伝子組み換え技術を用いて導入すればよい。
【００５７】
本発明にかかる形質転換細胞に導入する発現ベクターは、上記目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された組み換え植物ウイルスの遺伝子を、ホルモンで転写誘導されるプロモーターの下流に連結して構築すればよい。かかるホルモンで誘導されるプロモーターを用いることによって、その下流に連結した植物ウイルス由来のタンパク質が高効率に誘導発現される。
【００５８】
かかるプロモーターおよびベースとなるベクターは特に限定されるものではなく、従来公知のプロモーターおよびベクターを用いればよい。例えば、ステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＴＡ７００１（McNellis TW, Mudgett MB, Li K, Aoyama T, Horvath D, Chua NH, Staskawicz BJ. Glucocorticoid-inducible expression of a bacterial avirulence gene in transgenic Arabidopsis induces hypersensitive cell death. Plant J. 1998 Apr;14(2):247-57.参照）から本発明者等が構築したｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）、およびエストロジェンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＥＲ８（Zuo, J., Niu, Q.W., and Chua, N.H. (2000).An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants.Plant J. 24, 265-273.参照）等を好適に用いることができる。また、その他形質転換用のベクターの例としては、他の形質転換用ベクターとしては、エクジソンで転写誘導されるプロモーターを持つプラスミド、ｐＥＳ６０およびｐＥＳ４６（The Plant Journal (1999) 19: 97-106. Ecdysone agonist inducible transcription in transgenic tobacco plants Alberto Martinez, Caroline Sparks, Cliff A. Hart, John Thompson and Ian Jepson）がある。
【００５９】
また該発現ベクターには、プロモーターの転写因子を含んでいることが好ましい。転写因子によって、プロモーターの下流に連結した植物ウイルスの遺伝子の転写調節が行われ、さらに高効率に転写を誘導することが可能となるからである。該転写因子は、使用するプロモーターに対応して選択すればよい。例えば、前述のステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）を用いた場合の転写因子はＧＶＧであり、エストロジェンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＥＲ８を用いた場合は、ＸＶＥである。
【００６０】
また該発現ベクターには、その他種々のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。ＤＮＡセグメントとしては、例えば、ターミネーターを挙げることができる。また、必要に応じて、キメラタンパク質を発現させるために、他のタンパク質をコードする遺伝子や、このような遺伝子を導入するための制限酵素認識部位（マルチクローニングサイト等）を含んでいてもよい。
【００６１】
上記発現ベクターを構築する方法（作製方法）は具体的には特に限定されるものではなく、組み換えウイルス遺伝子およびプロモーター等のＤＮＡセグメントと、上述したベースとなるベクターとを、公知の組換えＤＮＡ技術を用いてつなげればよい。また、構築された発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌細胞内で増殖させればよい。このときベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００６２】
＜形質転換方法＞
構築された発現ベクターを宿主（ホスト）となる植物由来細胞へ導入する具体的な手法は特に限定されるものではなく、宿主となる植物由来細胞の種類に応じた適切な形質転換方法を用いればよい。植物由来細胞への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができ、後述する実施例に示すように、本発明でもアグロバクテリウム法を好適に用いることができる。またその他パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００６３】
組み換え植物ウイルス遺伝子（発現ベクター）が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、各種マーカーを用いればよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと組み換え植物ウイルス遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。
【００６４】
例えば後述する実施例においては、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｈｙｇr）を用いており、ハイグロマイシンを含有する培地中で、形質転換候補株を培養することにより、生育してきた細胞株を形質転換体として選抜することが可能となる。その他のマーカーとしては、ビアラホス耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー等が植物細胞の選抜に有効であり、ピューロマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、ＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等が動物細胞の選抜には有効である。さらに酵母などでは、ウラシル要求性マーカーをはじめとする栄養要求性マーカーを選抜に用いることができる。但しこれら形質転換体の選抜方法は、限定されるものではなく、発現ベクターを導入する宿主等に応じて適宜選択して用いればよい。
【００６５】
その他、宿主細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入したタンパク質の遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、目的タンパク質をコードする遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、該遺伝子の導入を確認することができる。
【００６６】
また、その他の方法としては、あるいは、目的タンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)をマーカーとして用い、目的タンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、発現ベクターには、形質転換植物細胞における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。
【００６７】
＜宿主細胞＞
また、発現ベクターが導入される宿主細胞としては、生物由来細胞であれば特に限定されるものではなく、動物由来細胞であっても植物由来細胞であってもよい。ただし、植物物由来細胞は、動物由来細胞に比して、増殖速度が速くコンタミネーションのリスクが少ない点、培地作成費用が非常に安価であるという点において、植物由来細胞がより好ましい。ここで、動物由来細胞、および植物由来細胞とは、それぞれ動物個体、および植物個体を除く細胞、組織、並びに器官も含む意味である。特に液体培地等で培養可能な細胞が好ましい。
【００６８】
また由来となる動物としては、特に限定されるものでないが、ヒト、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、チャイニーズハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、メダカやゼブラフィッシュ等の魚類、カイコ、夜蛾（Spodoptera frugiperda）等が挙げられる。また由来となる植物としては、特に限定されるものではないが、イネ、シロイナズナ、オオムギ、コムギ、タバコ、トマト、キュウリ、ダイズ、ジャガイモ、トウモロコシ、ニチニチソウ、シロイヌナズナ、アルファルファが挙げられる。
【００６９】
その他、枯草菌や乳酸菌などの菌類、酵母など単細胞生物が宿主細胞として利用できる。
【００７０】
また動物由来細胞の例としては特に限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、メラノーマ細胞、マウス３Ｔ３細胞が挙げられる。また植物由来細胞の例としては、タバコＢＹ−２細胞、ジャガイモ由来、イネ由来、サツマイモ由来、ダイズ由来、パセリ由来、シロイヌナズナ由来、コムギ由来、トウモロコシ由来細胞、ニチニチソウ由来細胞が挙げられる。
【００７１】
後述する実施例において、タバコＢＹ−２細胞を宿主として用いている。タバコＢＹ−２細胞(Toshiyuki nagata, Yasuyuki Nemoto, and Seiichiro Hasezawa “Tobacco BY-2 Cell Line as the “Hela” Cell in the Cell Biology of Higher Plants” International Review of cytology, vol.132, p.p. 1-30 (1992) 、および http://wwwriken.go.jp/r-wprld/info/release/press/2003/030620/ 参照)は、植物培養細胞株としては、世界中で最も広く用いられているものであり、最も増殖速度が速いこと、遺伝子操作が容易なこと、大量培養を容易に行うことができるという理由から採用した。
【００７２】
また本発明において植物個体ではなく、植物由来細胞を宿主としているが、それは以下に示す利点を有するからである。
【００７３】
(a)植物個体を宿主とする場合と比較して、増殖速度が速く、形質転換細胞を短期間で増殖することができる。また大規模化、大量生産も容易である。
【００７４】
(b)植物個体を宿主とする場合と比較して、生育させるための広大なスペース、施設(畑、温室)等を必要としない。また培養装置を容易に大型化することが可能である。
【００７５】
(c)植物個体を宿主とする場合と比較して、カルスから植物個体を分化させる工程、花を咲かせて種子をとる工程、該種子を蒔いて増殖させるという工程が無いため、形質転換体の作成、スクリーニング、タンパク質生産の期間を著しく短縮することができる。
【００７６】
(d)化学物質等の誘導物質によるタンパク質誘導発現が簡便に行うことができる。植物個体を宿主とする場合は、植物個体に化学物質等を直接塗布、散布等の方法によって、該植物個体全体に均一に投与する必要があり、非常に手間と時間がかかる。一方、植物由来細胞を宿主とした場合は、細胞培養の際に、該誘導物質等を培地中に添加するだけで足り、前細胞に対して、同時かつ均一に誘導をかけることが可能となる。
【００７７】
(e)植物個体は、蒸散作用等によって厳密な表面温度の管理が困難であるが、液体培地中で生育する培養細胞の場合は、温度管理等が容易である。環境条件の変化等による種々のストレスに感受性の高いプロモーターを用いた際に、安定的にタンパク質の生産が行うことが可能である。
【００７８】
(f)種々の組織からなる植物個体とは異なり、培養細胞は均質であるため、組織特異的な影響が無く、タンパク質の発現コントロールが容易である。
【００７９】
(g)細胞周期を高度に同調化できるため、厳密なタンパク質発現をコントロールすることが可能となる。
【００８０】
(h)液体培養であるため、分泌型タンパク質を培地中に分泌させることによって、タンパク質の回収、精製が容易である。また、目的タンパク質が、分泌型タンパク質でない場合であっても、分泌型のタグを目的タンパク質に付加することによって、同様の効果が得られる。
【００８１】
(i)植物個体と異なり、培養細胞は生育に光を必要としないため、照明設備、および照明にかかるコストを削減することが可能である。また、光に感受性なタンパク質を発現させる場合にも有利である。
【００８２】
(j)培地中に種々の化学物質等を添加することによって、生産するタンパク質を化学修飾することが可能である。例えば、放射性同位元素を添加することによって、放射性標識がされたタンパク質を容易に作成することが可能となる。
【００８３】
(k)形質転換体が外界に漏出した場合であっても、植物個体とは異なり自生することができず、死滅するために安全である。このことにより、植物個体、種子、花粉等の飛散防止、安全性試験、遺伝子組み換え生物に対するリスク管理に要する設備、費用、時間が軽減できる。
【００８４】
（Ｂ）本発明にかかるタンパク質生産方法
本発明にかかるタンパク質生産方法は、前述の本発明にかかる形質転換細胞を用いて行われる。本発明にかかるタンパク質の生産工程においては、形質転換の際に取得した形質転換細胞を培養せずに細胞中のタンパク質を取得してもよい。しかし、本発明にかかるタンパク質生産方法には、本発明にかかる形質転換細胞を培養する工程（以下細胞培養工程と称する）が含まれていることが好ましい。かかる培養工程によって、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞数を増加させることができ、該タンパク質の生産量を増加させることが可能となるからである。
【００８５】
かかる細胞培養工程における細胞培養の方法は特に限定されるものではなく、培養する細胞に好適な培地、培養条件を適用して行えばよい。植物細胞を培養する際の培地としては、限定されるものではないが、無機塩類、炭素源、ビタミン類、アミノ酸が加えられている場合がある。さらに、ココナツミルクや酵母エキスを加えて成長を促進させる場合がある。その他、オーキシンとサイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン等の植物ホルモンを添加する場合がある。また培養条件であるが、光、温度、通気の有無等を培養する細胞に応じて最適なものを採用すればよい。例えば、後述する実施例において、タバコＢＹ−２細胞を培養する際には、３７０ｍｇ／ｌリン酸二水素カリウム、１ｍｇ／ｌチアミン塩酸、３％スクロース、０．２ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含むＭＳ培地を用い、暗所、２６℃、１３５回転/分で旋回振盪培養後、１／１００量を一週間ごとに継代している。
【００８６】
一方、動物細胞を培養する際の培地としては、限定されるわけではないが、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類に、血清が加えられている場合がある。その他、緩衝液として重炭酸／炭酸ガス系緩衝液が用いられており、培養器として、ＣＯ2インキュベーターが用いられている。またｐＨのモニター用にフェノールレッドを添加する場合がある。培養条件は、一般的には３７℃で培養するが、細胞株によっては、２８℃、４０℃の場合がある。
【００８７】
本発明にかかるタンパク質生産方法においては、上記細胞培養工程に加えさらに、培養された細胞に対して、ホルモンによる転写誘導を行う工程（以下転写誘導工程）が含まれることが好ましい。前述の本発明にかかる形質転換細胞に導入された発現ベクターには、ホルモンで転写誘導されるプロモーターが含まれているため、該転写誘導工程によって、目的タンパク質をコードする遺伝子の転写の開始、転写量の増加およびコントロール等が可能となり、タンパク質の生産量の増加、タンパク質の生産量のコントロールができる。
【００８８】
本転写誘導工程に用いるホルモンは特に限定されるものではなく、本発明にかかる形質転換細胞に導入された発現ベクターに含まれるプロモーターに応じて、適宜選択すればよい。例えば、ステロイドホルモン、エストロジェン、エクジソン等があるこの他、エタノールなどが転写誘導に利用できる。
【００８９】
後述の実施例においては、ステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）をベースとしてタンパク発現ベクターを構築していることから、ステロイドホルモンによって誘導を行っている。
【００９０】
また本転写誘導工程に用いるホルモンの量については、プロモーターの種類、細胞株の種類、細胞株の培養フェーズ、細胞の培養条件等に応じて適宜選択すればよい。例えば、後述する実施例においては、３０μＭの濃度のステロイドホルモン（デキサメタゾン）を用いて本転写誘導工程を行っている。
【００９１】
さらに本転写誘導工程を行う時期についても、特に限定されるものではなく、細胞株の種類、細胞株の培養フェーズ、細胞の培養条件等に応じて適宜選択すればよい。例えば後述する実施例においては、継代培養後５日目において転写誘導を行った場合が最もレポータータンパク質であるＧＦＰを発現した細胞の割合が高いという結果であった。このことより、本実施例の条件においては、前培養５日目における培養細胞の生理的条件が、転写誘導とタンパク質の発現に適していたことがいえる。
【００９２】
（Ｃ）本発明にかかるタンパク質生産キット
本発明にかかるタンパク質生産キットは、前記本発明にかかるタンパク質生産方法を行うことができる試薬、器具、装置等が含まれていればよく、特に限定されるものではないが、本発明にかかる形質転換細胞に導入されている発現ベクターを含んでいることが好ましい。この場合は、該発現ベクターに発現しようとする目的タンパク質をコードする遺伝子を、連結または置換等の通常の遺伝子組み換え技術を用いて導入することで、目的タンパク質の生産を行うことが可能となる。
【００９３】
例えば、ステロイドホルモンで転写誘導をすることができるプロモーターの下流に、外被タンパク質遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換した組み換えＴｏＭＶのｃＤＮＡを導入して構築した発現ベクターが含まれていてもよい。かかる場合は、ＧＦＰ遺伝子と発現しようとする目的タンパク質遺伝子とを置換してもよいし、ＧＦＰ遺伝子に連結してもよい。ＧＦＰ遺伝子に連結した場合は、目的タンパク質がＧＦＰとの融合タンパク質として取得され、ＧＦＰの蛍光を指標として、発現をモニターしながらタンパク質生産が可能となる。
【００９４】
また本発明にかかるタンパク質生産キットには、さらに、前述の転写誘導工程を行うためのホルモンが含まれていることも好ましい。該キットに含まれているホルモンについては、前述と同様、本発明にかかる形質転換細胞に導入された発現ベクターに含まれるプロモーターに応じて、適宜選択すればよい。例えば、ステロイドホルモン、エストロジェン、エクジソン等がある。この他、エタノールなどが転写誘導に利用できるため、該キットに含まれていてもよい。
【００９５】
例えば後述の実施例において示すごとく、ステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターを持つＴｉプラスミドｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）をベースとしてタンパク発現ベクターを構築している場合は、ステロイドホルモンが含まれていることが好ましいといえる。
【００９６】
また本発明にかかるタンパク質生産キットには、さらに、宿主となる生物由来細胞が含まれていてもよい。該キットに含まれる宿主細胞としては、生物由来細胞であれば特に限定されるものではなく、動物由来細胞であっても植物由来細胞であってもよい。また由来となる動物としては、特に限定されるものでないが、ヒト、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、チャイニーズハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、メダカやゼブラフィッシュ等の魚類、カイコ、夜蛾（Spodoptera frugiperda）等が挙げられる。また由来となる植物としては、特に限定されるものではないが、イネ、シロイナズナ、オオムギ、コムギ、タバコ、トマト、キュウリ、ダイズ、ジャガイモ、トウモロコシ、ニチニチソウ、シロイヌナズナ、アルファルファが挙げられる。
【００９７】
その他、枯草菌や乳酸菌などの菌類、酵母など単細胞生物が宿主細胞の例として挙げられる。
【００９８】
また動物由来細胞の例としては特に限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、メラノーマ細胞、マウス３Ｔ３細胞が挙げられる。また植物由来細胞の例としては、タバコＢＹ−２細胞、ジャガイモ由来、イネ由来、サツマイモ由来、ダイズ由来、パセリ由来、シロイヌナズナ由来、コムギ由来、トウモロコシ由来細胞、ニチニチソウ由来細胞が挙げられる。
【００９９】
そのほか本発明にかかるタンパク質生産キットには、また生物由来細胞を培養するための培地、および培養器等が含まれていてもよい。
【０１００】
以上説示した発明によれば、大規模生産能力、高い生産効率、および安全性の高いタンパク質の生産系、および生産方法等を提供することが可能であることは明白である。
【０１０１】
なお本発明は、以上説示した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１０２】
以下本発明を実施例および図１〜４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１０３】
〔実施例１：タバコＢＹ−２細胞におけるステロイドホルモンによるタンパク質の誘導発現〕
＜発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)の構築＞
ウイルウスベクターとして、外被タンパク質遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換したＴｏＭＶ変異体(ToMV-erG3(SF3))を用いた。なお、該ToMV-erG3(SF3)は、飯  哲夫博士(京都大学大学院)より分譲された。
【０１０４】
一方形質転換用ベクターとして、ステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターと転写因子（ＧＶＧ）を持つＴｉプラスミドｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）を用いた。該ベクターは、ｐＴＡ７００１の転写開始点に、ＰＣＲ法を用いてＳｔｕＩサイトを導入して作成した。なお該ｐＴＡ７００１は、Chua博士(Laboratory of Plant Molecular Biology, The Rockefeller University)より分譲された。
【０１０５】
次に、ToMV-erG3(SF3)のｃＤＮＡをｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）のステロイドホルモンで転写誘導されるプロモーターの下流に導入し、発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)を構築した。該ベクターの構築を、さらに詳しく説示すれば、以下のとおりとなる。ＴｏＭＶ変異体のｃＤＮＡを含むpiL.erG3(SF3)（Atsushi Tamai and Tetsuo Meshi,”Tobamoviral movement protein transiently expressed in a single epidermal cell nctions beyond multiple plasmodesmata and spreads multicellularly in an infection-coupled manner” Molecular Plant-Microbe interaction (2001) 14: 6-134参照）からリンカーを用いてＭｌｕＩサイトをＡｖｒＩＩサイトに置換したプラスミドpiL.erG3(SF3)(Avr)を作成した。さらに、piL.erG3(SF3)を鋳型とし、ＰＣＲ法を用いて5’末端にＳｎａＢＩサイトを導入したＴｏＭＶ ｃＤＮＡ５’末端約１６００塩基対のＤＮＡ断片を、ＳｎａＢＩおよびＳｐｅＩで切断した。この操作により得られた約１２２０塩基対のＤＮＡ断片を、ｐＴＡ７００１（Ｓｔｕ）のＳｔｕＩサイトとＳｐｅＩサイトの間に挿入し、プラスミドpTA7001-ToMV5’-Speを作成した。pTA7001-ToMV5’-SpeをＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩで切断した後、ＴｏＭＶ変異体ｃＤＮＡの３’末端部分を含む約５２００塩基対の断片を、pTA7001-ToMV5’-SpeのＳｐｅＩサイトに挿入し、発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)を作成した。
【０１０６】
図１に構築した発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)を示した。
【０１０７】
＜タバコＢＹ−２細胞の形質転換＞
前記発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)を、タバコＢＹ−２細胞にアグロバクテリウム法によって導入した。具体的には、以下に示すとおりにした。
【０１０８】
発現ベクターを、エレクトロポレーション法によってAgrobacterium Tumefacience EHA105系統に導入した。これをカナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）を含むＡＢ sucrose培地で前培養を行った。次にタバコＢＹ-２細胞と混合してシャーレに移し、２６℃、暗所で４２〜４８時間静置してタバコＢＹ-２細胞を形質転換した。タバコＢＹ-２細胞用培地にて洗浄した後、カルベニシリン（１００ｍｇ／ｌ）およびハイグロマイシン(２０ｍｇ／ｌ)を含むタバコＢＹ−２細胞用固形培地に広げ、形質転換タバコＢＹ−２細胞を増殖させた。
【０１０９】
＜ステロイドホルモンによる転写誘導＞
取得した形質転換タバコＢＹ−２細胞に対してステロイドホルモン処理(以下適宜ＤＥＸ処理と称する)による転写誘導を行った。具体的には、形質転換タバコＢＹ−２細胞の培養液に、ステロイドホルモン（デキサメタゾン）を３０μＭになるように加えて行った。
【０１１０】
転写誘導の結果は、実体型蛍光顕微鏡装置（オリンパス社製）を用いて４８時間後にＧＦＰ蛍光を観察した。また、転写誘導の４８時間後のトータルＲＮＡを、トライゾル法にて抽出し、ノーザン解析に用いた。ノーザン解析には、ＴｏＭＶの３’非翻訳領域約２００塩基に相補的なＲＮＡプローブを用いた。プローブのラベリングには、ロシュ・ディアグノスティック社のDIG RNA Labelling Kitを用いて行った。検出には、同社のDIG Luminescent Ditection Kit、およびCDP−Starを用い、それぞれキットのマニュアルにしたがって行った。
【０１１１】
図２に、ＤＥＸ処理の有無におけるＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの転写を、ノーザン解析により調べた結果を示す。図２より明らかなように、ＤＥＸ処理によるＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの転写誘導が確認できた。
【０１１２】
図３に、ＤＥＸ処理後の形質転換タバコＢＹ−２細胞の蛍光顕微鏡観察結果を示した。ＧＦＰによる蛍光を検出した結果、図３に示すごとく、ＤＥＸ処理によるＧＦＰの誘導発現が確認できた。
【０１１３】
＜タバコＢＹ−２細胞の前培養条件の検討＞
継代培養後ＤＥＸ処理までの前培養日数とＧＦＰの発現率を調べた。方法は以下のようにして行った。
【０１１４】
形質転換細胞を１／１００量継代し、３日、５日および７日間前培養をした。そこにステロイドホルモン（デキサメタゾン）を３０μＭになるように加え、さらに４８時間培養した後、ニコン社の正立型蛍光顕微鏡装置で細胞を観察した。ＧＦＰ蛍光が認められる細胞と認められない細胞をそれぞれ計数し、発現率を算出した。
【０１１５】
図４に前培養日数と、ＧＦＰの発現率との関係を調べた結果を示した。その結果、５日間前培養した場合のＧＦＰの発現率が、約４％と最も高い値を示した。このことは、増殖にともなう細胞の生理状態の変化が、ウイルス配列の複製およびＧＦＰの発現に影響しているためと考えられる
以上説示したごとく、ステロイドホルモンで転写誘導をすることができるプロモーターの下流に、外被タンパク質遺伝子をＧＦＰ遺伝子に置換した組み換えＴｏＭＶのｃＤＮＡを導入して構築した発現ベクターを、タバコＢＹ−２細胞に導入した形質転換タバコＢＹ−２細胞について、ステロイドホルモンによる転写誘導を行った結果、確かなウイルスＲＮＡの増幅、ＧＦＰの誘導発現ができた。よって、本発明にかかる形質転換細胞、本発明にかかるタンパク質生産方法、および本発明にかかるタンパク質の生産キットを用いることによって、大規模生産能力および高い生産効率を有し、さらに安全性の高いタンパク質の生産が行えるということがいえる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
以上のように、本発明によれば、本発明は安価で大量にタンパク質を生産することが可能であり、得られたタンパク質は、医薬、化学工業、食品工業をはじめとする広範な分野に有効に利用できる。さらには、本発明にかかる形質転換細胞に導入された発現ベクター、宿主細胞等をタンパク質発現キットとして市販したりすることができるので、実験・研究用の試薬産業等にも応用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明にかかる形質転換細胞に導入される発現ベクターの一例であるpTA7001-ToMV-erG3(SF3)の構造を示す模式図である。
【図２】実施例において、発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)が導入された形質転換タバコＢＹ−２細胞に対して、ステロイドホルモン処理（ＤＥＸ処理）の有無におけるＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの転写を、ノーザン解析により調べた結果を示す図である。
【図３】実施例において、発現ベクターpTA7001-ToMV-erG3(SF3)が導入された形質転換タバコＢＹ−２細胞に対してステロイドホルモン処理（ＤＥＸ処理）を行った際に、該細胞のＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す図である。
【図４】実施例において、継代培養後ＤＥＸ処理までの前培養日数（前培養３日目、５日目、７日目）とＧＦＰの発現率の関係を調べた結果を示す折れ線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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