(57)【要約】【課題】  安全な臨床グレードの試薬を用いて、造血系の幹細胞や炎症性白血球を含まずに間葉系細胞を骨髄液から分離する。【解決手段】  骨髄液と赤血球沈降剤を混合することにより、間葉系細胞含有赤血球画分を分離する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄液と赤血球沈降剤を混合することによる分離操作において得られる間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項２】
間葉系細胞以外の有核細胞濃度が分離前の骨髄液中の１／２〜１／１００に減少した請求項１記載の間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項３】
赤血球沈降剤を用いた分離操作が自然沈降によるものである請求項１又は２記載の間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項４】
赤血球沈降剤を用いた分離操作が遠心沈降によるものである請求項１又は２記載の間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項５】
赤血球画分において濃度勾配を形成する請求項１〜４のいずれか1項に記載の間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項６】
赤血球沈降剤がヒドロキシエチル澱粉である請求項１〜５のいずれか1項に記載の間葉系細胞含有赤血球画分。
【請求項７】
骨髄液と赤血球沈降剤を混合することによる間葉系細胞の分離方法。
【請求項８】
骨髄液と赤血球沈降剤を混合することにより得られた間葉系細胞含有赤血球画分は、間葉系細胞以外の有核細胞濃度が分離前の骨髄液中の１／２〜１／１００に減少したものである請求項７記載の間葉系細胞の分離方法。
【請求項９】
骨髄液と赤血球沈降剤を混合した後、間葉系細胞含有赤血球画分を自然沈降させる請求項７又は８記載の間葉系細胞の分離方法。
【請求項１０】
骨髄液と赤血球沈降剤を混合した後、間葉系細胞含有赤血球画分を遠心沈降させる請求項７又は８記載の間葉系細胞の分離方法。
【請求項１１】
赤血球沈降剤がヒドロキシエチル澱粉である請求項７〜１０のいずれか１項に記載の間葉系細胞の分離方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の間葉系細胞含有赤血球画分又は該間葉系細胞を増幅させた細胞を３次元環境下におくことによる、移植用組織の製造方法。
【請求項１３】
移植用組織が組織損傷患者に移植するためのものである請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
組織が軟骨及び／又は骨である請求項１２又は１３記載の製造方法。
【請求項１５】
組織が心筋及び／又は血管である請求項１２又は１３記載の製造方法。
【請求項１６】
組織が神経組織である請求項１２又は１３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞（ＭＳＣ）含有赤血球画分、間葉系細胞の分離方法及び移植用組織の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄液中には近年になって骨、軟骨、筋肉、脂肪など多様な細胞に分化しうる性質を持った間葉系細胞（略称：ＭＳＣ）が存在することが明らかになってきている（例えば特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
ＭＳＣはこのように多種多様な細胞、臓器に分化しうる能力（これをｐｌｕｒｉｏｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓと呼ぶ）を有しているので、この細胞を効率良く増幅させる方法は再生医療発展の見地から極めて重要である。
ＭＳＣは骨髄液中に成人で１０４から１０６個に１つ程度の数という非常に存在頻度が少ないことが報告されており（非特許文献４）、ＭＳＣ画分を濃縮回収する方法が各種検討されている。例えばＰｉｔｔｅｎｇｅｒらは、密度勾配分離方法であるフィコールパック分画法を用いて１．０７３ｇ／ｍｌの比重の分画に脂肪、軟骨、骨細胞への分化前駆細胞が存在することを見出している（非特許文献４）。また関谷らもフィコールパック分画法で比重分画した細胞を用いて軟骨への分化を試みている（非特許文献５）。
また脇谷らはデキストランを用いて赤血球以外の画分の細胞を取得し、この細胞での軟骨への分化を試みている（非特許文献６）。
【０００３】
しかしながら上記フィコールは医薬品ＧＭＰに準拠して製造されておらず、実際の治療を目的として用いることはできない。またデキストランを用いた自然沈降方法は医薬品準拠したデキストランを用いることができるが、赤血球層以外の画分にＭＳＣが他の有核細胞（造血幹細胞、炎症性の白血球、巨核細胞など）と共存して分離され、必ずしも分離という観点からは最善の方法ではない。このような理由から実際にＭＳＣを培養する場合には骨髄液をそのまま培養している例が多数報告されている（例えば非特許文献７）。
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ０１／８３７０９号公報
【非特許文献１】Ｐｌｉａｒｄ，Ａら、Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｍｍｏｒｔｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ、Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ、ｏｒ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙｓ、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３０（６）：１４６１−７２（１９９５）
【非特許文献２】Ｍａｃｋａｙら，Ａ．Ｍら、Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｍａｒｒｏｗ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４（４）：４１５−４２８（１９９８）
【非特許文献３】Ａｎｇｅｌｅ，Ｐら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｏｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｗｉｔｈ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−Ｇｅｒａｔｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｓｐｏｎｇｅ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５（６）：５４５−５５３（１９９９）
【非特許文献４】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８４：１４３−１４７、（１９９９）
【非特許文献５】Ｓｅｋｉｙａら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｒｏｍａ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｅｎｔｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ７（９９）：４３９７−４４０２（２００２）
【非特許文献６】Ｗａｋｉｔａｎｉら、Ｈｕｍａｎ  Ａｕｔｏｌｏｇｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  Ｋｎｅｅｓ、ＯｓｔｅｏＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００２）１０、１９９−２０６
【非特許文献７】Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＦＧＦ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２８８，４１３−４１９（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように骨髄液からＧＭＰ準拠した方法で製造された試薬を用いて効率良く間葉系細胞を他の有核細胞（例えば炎症性の白血球や巨核細胞など）から分離する方法は報告されていない。実際、非特許文献６に示すデキストランを用いた方法でも有核細胞を赤血球画分と分離しているだけの方法であり、有核細胞は全て含んでいる。
また炎症性の白血球などを分離することができれば患部に間葉系細胞だけを注入することも可能となり、液量を減らす濃縮効果も十分期待できる。
従って、造血系幹細胞と間葉系細胞を簡単な分離試薬や簡単な方法で分離できれば実用化、例えば直接細胞を患部に注入する場合にも極めて有効であり、副作用を生じさせにくいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の問題解決を目的として我々は鋭意検討を進め、赤血球沈降剤を用いて簡便な操作で骨髄液由来の間葉系細胞（ＭＳＣ）を赤血球画分に分離する方法を見出した。
【０００７】
すなわち第１の本発明は、骨髄液と赤血球沈降剤を混合することによる分離操作において得られる間葉系細胞含有赤血球画分に関する。第一の本発明の間葉系細胞含有赤血球画分は、間葉系細胞以外の有核細胞濃度が分離前の骨髄液中の１／２〜１／１００に減少したものであることが好ましい。第一の本発明において、赤血球沈降剤を用いた分離操作が自然沈降によるものであることが好ましい。第一の本発明において、赤血球沈降剤を用いた分離操作が遠心沈降によるものであることが好ましい。第一の本発明の赤血球画分において濃度勾配を形成することが好ましい。第一の本発明において、赤血球沈降剤がヒドロキシエチル澱粉であることが好ましい。
第二の本発明は、骨髄液と赤血球沈降剤を混合することによる間葉系細胞の分離方法に関する。第二の本発明において、骨髄液と赤血球沈降剤を混合することにより得られた間葉系細胞含有赤血球画分は、間葉系細胞以外の有核細胞濃度が分離前の骨髄液中の１／２〜１／１００に減少したものであることが好ましい。第二の本発明において、骨髄液と赤血球沈降剤を混合した後、間葉系細胞含有赤血球画分を自然沈降させることが好ましい。第二の本発明において、骨髄液と赤血球沈降剤を混合した後、間葉系細胞含有赤血球画分を遠心沈降させることが好ましい。第二の本発明において、赤血球沈降剤がヒドロキシエチル澱粉であることが好ましい。
第三の本発明は、第一の本発明の間葉系細胞含有赤血球画分又は該間葉系細胞を増幅させた細胞を３次元環境下におくことによる、移植用組織の製造方法に関する。第三の本発明において、移植用組織が組織損傷患者に移植するためのものであることが好ましい。第三の本発明において、組織が軟骨及び／又は骨であることが好ましい。第三の本発明において、組織が心筋及び／又は血管であることが好ましい。第三の本発明において、組織が神経組織であることが好ましい。
【０００８】
本発明で用いられる赤血球沈降剤とは、赤血球の表面に変化を与え、軽度の遠心分離操作もしくは自然沈降（静置）操作により有核細胞を上清に残したままで優先的に赤血球を下層に沈降させるものである。赤血球沈降剤としては特に限定されないが、例えば、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、フィブリノーゲン、α−グロブリン等を挙げることができる。好ましくはヒドロキシエチル澱粉である。ヒドロキシエチル澱粉は、赤血球の表面の電荷に影響を与え、連線形成を促し、静置もしくは遠心操作を行った場合に有核細胞との沈降速度の差を生じさせることによって、赤血球を優先的に沈降させることができる。
【０００９】
本発明においては、赤血球沈降剤の添加量は特に限定されないが、骨髄液１ｍＬに対して１〜３００ｍｇ添加することが好ましい。より好ましい下限は５ｍｇであり、より好ましい上限は１００ｍｇである。赤血球沈降剤は直接添加してもよいし、水溶液の状態で添加してもよい。また、骨髄液に赤血球沈降剤を添加する前に、ヘパリン等の抗血液凝固剤を添加しておくことが好ましい。
【００１０】
本発明における間葉系細胞（ＭＳＣ）は自己増殖を繰り返す能力を有し、下流の細胞系譜への分化が可能な細胞を指す。このＭＳＣは分化誘導因子により骨芽細胞や軟骨細胞、更には神経細胞、肝細胞にも分化する可能性のある細胞である。
【００１１】
本発明においては、骨髄液と赤血球沈降剤を十分に混合した後、遠心沈降又は自然沈降（静置）等を行うことにより間葉系細胞含有赤血球層を沈降させる。遠心操作は、例えば、１００ｒｐｍ（１０ｇ）〜２０００ｒｐｍ（７２ｇ）で１〜２０ｍｉｎ行えばよい。好ましくは４００ｒｐｍ（３０ｇ）〜７００ｒｐｍ（９０ｇ）で５〜１０ｍｉｎ遠心操作を行う。更に好ましくは５３０ｒｐｍ（５０ｇ）で５ｍｉｎ遠心操作を行う。
【００１２】
以上によって沈降した赤血球層中に間葉系細胞（ＭＳＣ）が多く含まれる。当該赤血球層を分離することにより、間葉系細胞含有赤血球画分を得ることができる。当該間葉系細胞含有赤血球画分においては、一般に、間葉系細胞／赤血球の比率が１．５〜２．５ｘ１０６であり、間葉系細胞／炎症性細胞の比率が０．７５〜１．２５ｘ１０５である。また、この間葉系細胞含有赤血球画分は、間葉系細胞以外の有核細胞（白血球細胞や造血幹細胞等）を、分離前の骨髄液中の１／２〜１／１００しか含まないので、炎症性の白血球、好中球などが減少しており、間葉系細胞を患部に移植するのに適した画分である。
得られた赤血球画分において、好ましくは濃度勾配が形成される。濃度勾配とは、赤血球画分の単位体積当たりに存在する間葉系細胞の個数の勾配を示す。
【００１３】
本発明における３次元環境下とは細胞のみを凝集させた状態あるいは３次元の支持体に細胞を保持させた状態である。またこの３次元の支持体は多孔性の支持体であることが望ましい。この多孔性支持体の材質は特に限定されないが、生理学的条件で体内に吸収される物質、つまり生体適合性材料が好ましく、これは天然のものでも合成物質でも良い。多孔性支持体を構成する生体適合材料としては、天然から得られるものと合成により得られるものが挙げられるが、加工性、滅菌性、感染性の点から、加水分解により分解し得る合成ポリマーが好ましく、特にα−及びβ−ヒドロキシカルボン酸の加水分解性ポリマーが好ましい。このような生体適合性材料の例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸／グリコール酸共重合体、ポリε−カプロラクトン、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体等が挙げられる。
【００１４】
本発明で用いる赤血球沈降剤を用いて分画された間葉系細胞含有赤血球画分は、体外、好ましくはフラスコで培養した場合、２又は３回培地交換を行うと、赤血球が培地交換の都度、除去され、約１週間程度で目的とするＭＳＣのみが接着性細胞として得られる。培養する際の条件としては特に限定されないが、例えば、培地としてＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製のαＭＥＭ培地に１５〜２０％の牛胎児血清を添加したものを用い、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで７〜１４日間培養することが望ましい。
【００１５】
得られたＭＳＣは約４８時間で約２倍に増殖する性質を持つ細胞である。この細胞は細胞剥離剤、好ましくはトリプシンを用いてフラスコから回収することができる。上記培養にあたっては、分化誘導剤を添加し、各種細胞に分化させることができる。分化誘導剤としては特に限定されないが、軟骨への分化誘導剤としてはデキサメサゾン、ＴＧＦβ、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、プロリン、アスコルビン酸等が挙げられ、骨への分化誘導剤としてはデキサメサゾン、βグリセロリン酸、ビタミンＣ等が挙げられ、心筋への分化誘導剤としてはＥＧＦ、ＰＤＧＦ、５−アザシチジン等が挙げられ、神経への分化誘導剤としてはｂＨＬＨ、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２等が挙げられ、血管への分化誘導剤としてはｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ等が挙げられる。
【００１６】
本発明の赤血球沈降剤を用いて分離したＭＳＣは培養することによって軟骨損傷患者に移植する細胞を提供することができる。
この細胞は直接損傷患部に投与しても良いし、形態保持のためにある種の３次元支持体に播種し、この混合物を患部に埋め込み治療することもできる。
【００１７】
また本発明の赤血球沈降剤を用いて分離したＭＳＣは培養することによって骨疾患患者に移植する細胞を提供することができる。
この細胞は直接損傷患部に投与しても良いし、形態保持のためにある種の３次元支持体に播種し、この混合物を患部に埋め込み治療することもできる。
【００１８】
また本発明の赤血球沈降剤を用いて分離したＭＳＣは培養することによって心筋疾患患者または血管疾患患者に移植する細胞を提供することができる。
この細胞は直接損傷患部に投与しても良いし、形態保持のためにある種の３次元支持体に播種し、この混合物を患部に埋め込み治療することもできる。
【００１９】
また本発明の赤血球沈降剤を用いて分離したＭＳＣは培養することによって神経組織を損傷した患者に移植する細胞を提供することができる。
この細胞は直接損傷患部に投与しても良いし、形態保持のためにある種の３次元支持体に播種し、この混合物を患部に埋め込み治療することもできる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、骨髄液より赤血球沈降剤を用いて効率的に非接着性細胞（造血系幹細胞や炎症性白血球細胞）と接着性細胞（間葉系幹細胞）を分離することが可能となり、骨髄液から少なくとも２〜３倍の濃縮が可能となった。
この方法を用いて分離した間葉系細胞含有成分は炎症性白血球を含まないため、直接患部に注入した場合、従来より副作用の少ない治療方法となりうる。
またこの方法で分離された間葉系細胞は極めて良好な増殖性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
（実施例１）赤血球沈降剤を用いた間葉系幹細胞の分離
ヒト骨髄液の原液３ｍＬに対して１０Ｕ／ｍＬのヘパリンＰＢＳ溶液等量を良く混合したものを分離用原液として用いる。この赤血球沈降用骨髄原液（６ｍｌ）に対して１／５量のＨＥＳ（Ｎｉｐｒｏ製６％ヒドロキシエチルデンプン水溶液  分子量４０万  商品コード：８９−１２０）を添加し終濃度を１％にする。５３０ｒｐｍ（５０ｇ）にて５ｍｉｎ遠心分離し、２層（上層の比較的透明な層と下層の赤血球層）に分かれることを確認する。
この分離層の最上層（透明な層のみ）と中間層（透明な層と赤血球層の上層部分を含むいわゆる境界付近の層）及び最下層（完全な赤血球層）を回収する。
その後Ｔ７  ５フラスコに各層の細胞を播種する。播種は直接Ｔ７５フラスコに注入後、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製ＭＥＭα＋１５％ウシ胎児血清培地１３ｍｌで均一にする。このフラスコは５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中で１１日間培養する。尚この間に培地は週２回（火曜、金曜）全量（１３ｍＬ）交換した。１１日間培養した細胞はトリプシン処理で回収し、間葉系細胞数を計測した。その結果、間葉系細胞数は、骨髄液を分離しないで３．６ｍｌ直接フラスコに播種した場合は平均２．７５×１０６個であった。最上層（２．３ｍｌ）からは平均０．８５×１０６個、中間層（０．６５ｍｌ）からは平均１．５×１０６個、最下層（０．６５ｍｌ）からは平均１．４５×１０６個の間葉系細胞が取得された。以上の結果を図1のグラフに示した。従って約８０％の間葉系細胞が骨髄液からこの方法で赤血球画分に取得できることが明らかとなった。
実施例１に記述した方法にて取得されたＨＥＳを用いた分離画分の最上層を除く層（中間層と下層）の中に得られた間葉系細胞は全体の７８％に相当し、骨髄液量は１．３ｍｌ（中間層０．６５ｍｌ、最下層０．６５ｍｌ）であった。骨髄液１ｍｌ当たりの間葉系細胞量は最上層が３．７×１０５個／ｍｌであるのに対して赤血球層（中間層＋最下層）では中間層は２．３×１０６／ｍｌ、最下層は２．２×１０６／ｍｌであり、ＨＥＳ未処理に対して赤血球層への濃縮効果は２．９倍であった。この関係を図２のグラフに示した。従って直接体内に投与する場合にはより濃度の高い少量の骨髄液で行うことができる。
【００２３】
（実施例２）赤血球沈降剤を用いて得られた間葉系細胞を用いた軟骨組織形成
実施例１の方法により得られた赤血球画分から培養によって得られた間葉系細胞をＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地２０ｍＬで１回洗浄し、遠心分離操作（１０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ  ４℃）で細胞を集め再度ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地に軟骨分化誘導を促す下記の添加物を加えた培地で間葉系細胞濃度が４Ｘ１０５個／ｍｌになるように懸濁する。また非誘導のものは下記の添加剤は加えないものとする。この細胞懸濁液を０．５ｍＬ取り、１５ｍＬファルコンチューブに入れる。その後遠心分離操作（１０００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ  ４℃）を行うと細胞がペレット状になるが、そのままチューブの蓋を緩めて、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中で３週間培養する。尚この間に培地は週２回（火曜、金曜）全量（０．５ｍＬ）交換した。培養終了後は球形となった細胞塊を回収し、組織固定用ホルマリンで固定し、軟骨基質染色剤であるトルイジンブルー染色を行った。この結果を図３に示した。組織切片を顕微鏡観察した結果、軟骨基質が紫色に染まる異染色性（メタクロマジー）が矢印部分に観察された。
【００２４】
＜軟骨分化誘導の際に用いた添加物＞
ＴＧＦβ３ヒトリコンビナント：フナコシ  ＲＳ−００３２−４３
培地に最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加
デキサメサゾン：ＳＩＧＭＡ  Ｄ８８９３
培地に最終濃度１００ｎＭで添加
アスコルビン酸リン酸エステル：ＷＡＫＯ  ０１３−１２０６１
培地に最終濃度５０μｇ／ｍＬで添加
ピルビン酸ナトリウム：コスモバイオ  ２５−０００−Ｃ１
培地に最終濃度１００μｇ／ｍＬで添加
Ｌ―プロリン：コスモバイオ  ３３５８２
培地に最終濃度４０μｇ／ｍＬで添加
ＩＴＳ−プラス：コスモバイオ  ３５４３５２
培地に市販原液を１／１００量添加    
（注意）培地とは上記に示したＤＭＥＭ−ハイグルコース培地を指す。
【００２５】
（実施例３）赤血球沈降剤を用いて得られた間葉系細胞を用いた骨組織形成
実施例１の方法により得られた赤血球画分から培養によって得られた間葉系細胞を最終濃度１Ｘ１０４／ｍＬになるようにＧＩＢ  ＣＯ  ＢＲＬ社製ＭＥＭα培地＋１５％ウシ胎児血清培地に懸濁し、１２穴培養プレートに２ｘ１０４個／Ｗｅｌｌになるように細胞を播種（各Ｗｅｌｌに２ｍｌ細胞懸濁液を入れる）する。２４時間経過後に骨への分化誘導を促す３種類の添加物（β―グリセロリン酸：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ  ３５６７５、アスコルビン酸リン酸エステル：ＷＡＫＯ  ０１３−１２０６１、デキサメサゾン：ＳＩＧＭＡ  Ｄ８８９３）をそれぞれ１０ｍＭ、５０μｇ／ｍＬ、１００ｎＭになるように添加し、これを骨分化誘導群とする。非誘導群はβ―グリセロリン酸のみを添加したものとする。これらを５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中で２週間培養する。また培地交換は週に３回全量（２ｍＬ）交換するものとする。最終培地交換日（解析日の２日前）にカルセイン（Ｄｏｊｉｎ  ３４４−００４３１）を１μｇ／ｍｌになるように添加し、培養を行う。
解析日に骨化がどれだけ進行したかカルシウムの沈着量で評価する。具体的にはカルシウムと結合したカルセインの蛍光強度を測定することで骨化進行度合いが求められる。蛍光測定装置タイフーン８６００（アマシャムファルマシア社製）を用いて単位面積あたりの蛍光強度（Ｖｏｌｕｍｅ／Ａｒｅａ）測定する。結果を図４に示した。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
ＧＭＰ準拠した試薬である赤血球沈降剤を用いて、骨髄液より短時間に間葉系細胞を選択的に赤血球画分に得ることが可能となった。またこの分画細胞は炎症性白血球などを含まないため、治療面においても副作用のない極めて効果の高い方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＨＥＳを用いて骨髄液を分画した場合、赤血球画分（中間及び最下層）に約７８％の間葉系細胞（ＭＳＣ）を分離することができたことを示す図。
【図２】ＨＥＳを用いて骨髄液を分画した場合、赤血球画分（中間及び最下層）に分離しない場合の約２．９倍のＭＳＣが単位液量中に存在するほど濃縮が可能になったことを示す図。
【図３】赤血球画分に含まれる間葉系細胞（ＭＳＣ）を培養し、軟骨にインビトロで分化誘導することが可能であることを示す図（写真）。分化誘導したものが軟骨特有の基質の産生を認めた。
【図４】赤血球画分に含まれる間葉系細胞（ＭＳＣ）を培養し、骨にインビトロで分化誘導することが可能であることを示す図。カルセインを用いた蛍光強度を測定することにより骨に分化誘導した典型的指標である石灰化を確認し、顕著に骨形成が進んでいることを認めた。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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