(57)【要約】  【課題】クラミジア・ニューモニエ感染による動脈硬化症の進展を抑制し得る新規動脈硬化症治療薬のスクリーニング手段の提供。  【解決手段】単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを用いることを特徴とする、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを用いることを特徴とする、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩で刺激し、両条件下におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を比較することを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジア・ニューモニエに感染させ、両条件下におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を比較することを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生し得る単球系株化細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を、試験化合物の存在下および非存在下で比較することを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
１００ｎＭのクラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩で４８時間刺激したときのマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現が、非刺激時の５倍以上である単球系株化細胞を用いることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
単球系株化細胞が、非刺激時にマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子を実質的に発現しないことを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
単球系株化細胞が、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ、ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１からなる群より選択される株化細胞である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
単球系株化細胞がＴＨＰ−１株化細胞である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを含んでなる、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング用キット。
【請求項１０】
クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る細胞がクラミジア・ニューモニエまたは単球系株化細胞である、請求項９記載のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
単球系株化細胞が、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ、ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１からなる群より選択される株化細胞である、請求項９記載のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
単球系株化細胞がＴＨＰ−１株化細胞である、請求項９記載のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質を含有してなる、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療剤。
【請求項１４】
クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防または治療方法。
【請求項１５】
動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防または治療剤の製造のための、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化症の治療薬およびその合併症の予防・治療薬をスクリーニングするための方法およびキットに関する。より詳細には、本発明は、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae；以下、「Ｃｐ」と略記する場合がある）由来の６０ｋＤａ熱ショック蛋白質（以下、「HSP60」と略記する場合がある）および哺乳動物の単球系株化細胞を用いた、動脈硬化症の治療薬およびその合併症の予防・治療薬のスクリーニング法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
偏性細胞内寄生性グラム陰性菌であるクラミジア・ニューモニエは市中肺炎の主要な原因菌の一種であるとともに、動脈硬化症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、多発性硬化症などの慢性疾患との関連性が示唆されている。
動脈硬化症（特に粥状硬化症）は、日米欧で死因の上位を占める急性冠症候群（ＡＣＳ；急性心筋梗塞、不安定狭心症を含む）や脳血管疾患（特に虚血性脳血管障害；脳梗塞、脳塞栓、脳血栓などを含む）等の合併症を発症させる。Ｃｐの動脈硬化症との関連性は、交通事故死者での調査により動脈硬化病変と血清中抗Ｃｐ抗体の保有率とが相関するとの報告がなされて以来注目され始めた（非特許文献１）。その後、血清疫学的知見に基づいた動脈硬化症におけるＣｐの原因微生物としての証拠が数多く報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。さらに、実験動物モデルにおいて、Ｃｐ感染は動脈硬化病変の形成を促進することが報告され、抗菌薬の投与によりその病変形成が抑制されることも示されている（例えば、非特許文献３を参照）。
これらの知見に基づいて、心筋梗塞患者約２００人を対象にしてマクロライド系抗菌薬を用いた臨床試験が実施され、発作の再発率が３分の１以下に減少したと報告された。しかしながら、この成果を受けて米国で約７０００人を対象にして実施された同薬剤での大規模長期試験では無効との判定が示されており、抗菌薬の有効性についての議論は未だ決着していない。さらに、抗菌薬の乱用による耐性菌の出現といった問題点も指摘されており、仮に有効性が確認されたとしても、抗菌薬は動脈硬化症治療の主流とはならないと予測される。
【０００３】
Ｃｐ感染による動脈硬化病変の形成・進展の分子機構についてはこれまでよく理解されていなかった。最近、Ｃｐ由来のHSP60（以下、「chsp60」と略記する場合がある）がヒトの動脈硬化病変から検出され（非特許文献４）、さらに、ヒト単球から分化させた初代マクロファージをchsp60で刺激するとコラーゲン分解酵素の１つであるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（以下、「MMP-9」と略記する場合がある）の産生量が増加することが報告された（非特許文献５）。MMP-9は進展したヒト動脈硬化病変で過剰産生され、特に破綻した病変で強発現し、活性化されている（非特許文献６）。また、血漿中のMMP-9濃度の高さが心血管疾患死の危険因子であり得ることや、MMP-9遺伝子の多型が安定狭心症患者における将来の心血管イベントの発症率と有意に相関すること（非特許文献７）、さらに、MMP-9ノックアウトマウスでは、粥状動脈硬化症における病変の進展が抑制されること等も示されている（非特許文献８）。
粥状動脈硬化症は、コラーゲン線維に覆われた粥腫（プラーク）によって血管内腔が狭窄される病態を指すが、臨床上の知見から、心筋梗塞や狭心症などのＡＣＳの発症に至る血栓形成を伴った冠動脈のイベントには、狭窄度よりむしろプラークの性状が重要であると考えられている。即ち、脂質コアが大きくそれを被覆する線維性被膜の薄い病変はプラーク破綻を来しやすく、合併症を発症するリスクが高いとの仮説が支持されている（非特許文献９）。
プラーク表面を覆う線維性被膜の主成分はコラーゲンであり、コラーゲン分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ群（MMPs）は被膜を直接的に脆弱化させ得る（非特許文献１０、１１）。プラーク破綻は、Ｔ細胞により活性化されたマクロファージや血管平滑筋細胞が酸化ＬＤＬを取り込んで泡沫化し、生じた泡沫細胞から分泌されるMMPsにより線維性被膜が脆弱化されることにより起こると考えられている。中でも、MMP-9は破綻プラークにおいて有意な産生増強が確認されていることから、プラークの不安定化に主要な役割を果たしていると考えられる。 
以上のことから、Ｃｐ感染による動脈硬化症進展のメカニズムとして、chsp60刺激によってマクロファージ等からのMMP-9分泌が促進され、そのMMP-9が線維性被膜を脆弱化させ、プラーク破綻を引き起こすことが強く示唆される。
【０００４】
実際に、MMP-9分泌産生抑制作用を示す薬物が動脈硬化症の進展抑制効果を有するとの報告が多くなされている。例えば、高血圧症治療薬であるラシジピンは、ホルボールエステルや腫瘍壊死因子（TNF-α）により刺激されたマウスマクロファージにおけるMMP-9分泌産生を抑制したが（非特許文献１２）、臨床試験の結果、ラシジピンは動脈硬化の進展抑制効果があることが実証された（非特許文献１３）。また、コレステロール低下薬として知られるフルバスタチンとシンバスタチンは、ホルボールエステル(TPA)により刺激されたマウス及びヒトマクロファージにおけるMMP-9分泌産生を阻害したが（非特許文献１４）、これらを含む多くのスタチン系薬物が複数の臨床試験において動脈硬化の進展抑制効果を有することが示された（非特許文献１５）。
【非特許文献１】サイック（Saikku, P.）ら、「ランシット（Lancet）」、（英国）、第２巻、ｐｐ．９８３−９８６（１９８８年）
【非特許文献２】トーマス（Thomas, M.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第９９巻、ｐｐ．２７３３−２７３６（１９９９年）
【非特許文献３】ムーレシュタイン（Muhlestein, J.B.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第９７巻、ｐｐ．６３３−６３６（１９９８年）
【非特許文献４】コール（Kol, A.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第９８巻、ｐｐ．３００−３０７（１９９８年）
【非特許文献５】ヴェーマン−クルーラ（Vehmaan-Kreula, P.）ら、「アーテリオスクレローシス・スロンボーシス・アンド・ヴァスキュラー・バイオロジー（Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.）」、（米国）、第２１巻、ｐｐ．ｅ１−ｅ８（２００１年）
【非特許文献６】ロフタス（Loftus, A.）ら、「ストローク（Stroke）」、（米国）、第３１巻、ｐｐ．４０−４７（２０００年）
【非特許文献７】ブランケンベルグ（Blankenberg, S.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第１０７巻、ｐｐ．１５７９−１５８５（２００３年）
【非特許文献８】ルトゥン（Luttun, A.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第１０９巻、ｐｐ．１４０８−１４１４（２００４年）
【非特許文献９】リビー（Libby, P.）、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第９１巻、ｐｐ．２８４４−２８５０（１９９５年）
【非特許文献１０】ヤング（Young, J.L.）ら、「スロンボーシス・アンド・ヒーモスタシス（Thrombosis and Haemostasis）」、（独国）、第８８巻、ｐｐ．５５４−５６７（２００２年）
【非特許文献１１】ジョーンズ（Jones, C.B.）ら、「カーディオバスキュラー・リサーチ（Cardiovascular Research）」、（オランダ）、第５９巻、ｐｐ．８１２−８２３（２００３年）
【非特許文献１２】ベロスタ（Bellosta, S.）ら、「ザ・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピュティクス（The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics）」、（米国）、第２９６巻３号、ｐｐ．７３６−７４３（２００１年）
【非特許文献１３】ザンチェッティー（Zanchetti, A.）ら、「サーキュレーション（Circulation）」、（米国）、第１０６巻、ｐｐ．２４２２−２４２７（２００２年）
【非特許文献１４】ベロスタ（Bellosta, S.）ら、「アーテリオスクレローシス・スロンボーシス・アンド・ヴァスキュラー・バイオロジー（Asteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology）」、（米国）、第１８巻、ｐｐ．１６７１−１６７８（１９９８年）
【非特許文献１５】グローベー（Grobbee, D.E.）ら、「ドラッグズ（Drugs）」、（ニュージーランド国）第６３巻、ｐｐ．８９３−９１１（２００３年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の知見から、Ｃｐ感染またはchsp60刺激によるマクロファージ等からのMMP-9の過剰産生を抑制し得る物質は、動脈硬化症の治療、進展抑制（特にＡＣＳ、虚血性脳血管障害等の重篤な合併症の予防）またはそれら合併症の治療に有効な新規薬剤として期待される。しかしながら、そのような薬物の探索および評価系として使用し得るのに十分な感度を有し、且つ再現性に優れた化合物スクリーニング系はこれまでに知られていない。上記スタチン系薬物やラシジピンの薬効評価系のように、ホルボールエステルやTNF-αで刺激することにより高レベルのMMP-9産生を誘導することは可能であるが、これら薬剤もしくはサイトカインによるMMP-9産生誘導は実際のＣｐ感染イベントを反映しておらず、また、従来使用されている単球やマクロファージでは構成的なMMP-9発現のために非刺激時のバックグラウンドが高いなどといった問題点があった。
したがって、本発明の目的は、Ｃｐ感染またはchsp60刺激によるマクロファージ等からのMMP-9の過剰産生を抑制し得る物質を、高感度で且つ再現性および効率よく選抜し得るスクリーニング系を提供し、以って、新規な動脈硬化症治療薬およびその合併症の予防・治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、MMP-9産生細胞として単球系の株化細胞（例：THP-1細胞株）を用いてこれをＣｐに感染もしくはchsp60で刺激すると、意外にも、血液から単離した単球やそれを分化させた初代マクロファージに比べて著しく高いMMP-9発現が誘導されることを初めて見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］  単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを用いることを特徴とする、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［２］  試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩で刺激し、両条件下におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を比較することを特徴とする、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［３］  試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジア・ニューモニエに感染させ、両条件下におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を比較することを特徴とする、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［４］  クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生し得る単球系株化細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現を、試験化合物の存在下および非存在下で比較することを特徴とする、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［５］  １００ｎＭのクラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩で４８時間刺激したときのマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現が、非刺激時の５倍以上である単球系株化細胞を用いることを特徴とする、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［６］  単球系株化細胞が、非刺激時にマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子を実質的に発現しないことを特徴とする、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［７］  単球系株化細胞が、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ、ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１からなる群より選択される株化細胞である、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［８］  単球系株化細胞がＴＨＰ−１株化細胞である、上記［１］記載のスクリーニング方法、
［９］  単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを含んでなる、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング用キット、
［１０］  クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る細胞がクラミジア・ニューモニエまたは単球系株化細胞である、上記［９］記載のスクリーニング用キット、
［１１］  単球系株化細胞が、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ、ＲＡＷ２６４．７およびＪ７７４Ａ．１からなる群より選択される株化細胞である、上記［９］記載のスクリーニング用キット、
［１２］  単球系株化細胞がＴＨＰ−１株化細胞である、上記［９］記載のスクリーニング用キット、
［１３］  クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質を含有してなる、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療剤、
［１４］  クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防または治療方法、及び
［１５］  動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防または治療剤の製造のための、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ−９遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の使用などに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法は、単球系株化細胞を使用することにより、血液から単離した単球や初代マクロファージに比べて高いMMP-9発現が誘導されるという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法は、単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞とを用いることを特徴とする。ここで「動脈硬化症の治療」とは、例えば、動脈硬化病変の進展抑制やプラークの安定化などを意味し、また「動脈硬化症の合併症」としては、例えば、急性心筋梗塞、不安定狭心症等の急性冠症候群（ＡＣＳ）、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症等の虚血性脳血管障害などの心血管および脳血管イベントが挙げられる。
【００１０】
本発明において使用されるchsp60は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質であれば、その由来に特に制限はなく、例えば、天然より分離されたクラミジア・ニューモニエに属する各種菌株（例えば、肺炎患者からの臨床分離株など）から単離することができる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列に基づいて化学的に合成されたものであってもよく、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。あるいは、該核酸を鋳型として無細胞（転写）翻訳系を用いて生化学的に合成された蛋白質であってもよい。
【００１１】
「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。
アミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
より好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００１２】
「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」とは、前記の「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」を含有し、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をいう。
ここで「活性」とは、哺乳動物（例：ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等）細胞（例えば、単球・マクロファージなどの単球系細胞を含む白血球細胞や血管平滑筋細胞等の血液もしくは血管壁に存在する細胞など）におけるMMP-9発現増強活性、プラーク不安定化（線維性被膜脆弱化）活性をいい、「実質的に同質」とは、それらの活性が性質的に（例：生理学的に、または薬理学的に）同質であることをいう。したがって、MMP-9発現増強活性等が同等（例：０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
MMP-9発現増強活性の測定は、例えば、上記非特許文献５等に記載される方法（抗MMP-9抗体を用いたELISA、ゼラチン・ザイモグラフィー、定量的RT-PCR）またはそれに準じる方法に従って行うことができる。
【００１３】
また、本発明で使用されるchsp60としては、例えば、1)配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、2)配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、3)配列番号２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、4)配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は特に限定されない。
本発明におけるchsp60は、好ましくは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する、クラミジア・ニューモニエ KKpn-1株［Kishimoto T. and Soejima R., Intern. Med., 32： 934-937 (1993)］由来の蛋白質［該KKpn-1株由来のchsp60遺伝子を導入された組換え大腸菌Escherichia coli BL21(DE3)/pHSP21-1株は、FERM BP-8430の受託番号を付され、平成１５（２００３）年７月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている］、あるいは他のＣｐ菌株由来のそのバリアントである。
【００１４】
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載されている。配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとするchsp60は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
chsp60がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものもchsp60に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、chsp60には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００１５】
chsp60の部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したchsp60の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つchsp60と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はchsp60の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち、哺乳動物細胞におけるMMP-9発現増強作用に関わる領域を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドとしては、少なくとも５０個以上、好ましくは１００個以上、より好ましくは２００個以上のアミノ酸を有するペプチドなどが好ましい。
【００１６】
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、chsp60について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したchsp60と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００１７】
chsp60またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１８】
chsp60またはその塩は、前述の通り、各種Ｃｐ菌株の菌体から自体公知の蛋白質分離・精製技術によって調製することができる。具体的には、例えば、ヒト肺由来培養細胞（例：HL細胞等）などの適当な宿主細胞をＣｐに感染させ、クラミジア増殖に適した培地（例：シクロヘキシミド添加イーグル培地等）中で適当な期間培養した後、超音波処理等によって細胞を破砕し、密度勾配遠心法等を用いてＣｐ菌体を大量精製する。得られたＣｐ菌体を溶解して可溶性画分を抽出した後、該可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどで分離することによって、chsp60またはその塩を精製することができる。
【００１９】
chsp60もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、「chsp60類（chsp60s）」と総称する場合がある）は、公知のペプチド合成法にしたがって製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。chsp60類を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の1)〜5)に記載された方法にしたがって行われる。
1)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
2)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
4)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学IV、 205、(1977年)
5)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られた蛋白質（ペプチド）は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質（ペプチド）が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質（ペプチド）が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２０】
chsp60類の合成には、通常、市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。このような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質（ペプチド）の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（ペプチド）またはそのアミド体を取得する。
【００２１】
上記した保護アミノ酸の縮合においては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が好ましい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。
保護アミノ酸の縮合は、例えば活性化試薬およびラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、あらかじめ保護アミノ酸を対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとして活性化した後に樹脂に添加することによって行われる。
【００２２】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択される。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；トリフルオロエタノールなどのアルコール類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；ピリジンなどのアミン類；ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類；あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。
反応温度は、蛋白質縮合反応に使用されることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。縮合反応を繰り返しても縮合が不十分な場合には、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、十分な縮合を行なうことができる。
【００２３】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法ならびに保護基、およびその保護基の脱離方法、反応に関与する官能基の活性化方法などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料アミノ酸のカルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。エステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などが挙げられる。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２４】
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元；無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理；ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理；液体アンモニア中ナトリウムによる還元などが挙げられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれる。酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノール処理により除去される。トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は、１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２５】
原料アミノ酸のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料アミノ酸のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
【００２６】
蛋白質（ペプチド）のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質（ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（ペプチド）とを製造し、この両蛋白質（ペプチド）を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（ペプチド）のアミド体を得ることができる。
蛋白質（ペプチド）のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記蛋白質（ペプチド）のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
【００２７】
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、chsp60またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
【００２８】
さらに、chsp60類は、chsp60またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養し、得られる培養物からchsp60類を分離精製することによって製造することもできる。
chsp60またはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、Ｃｐ菌体から常法により抽出したゲノムＤＮＡ、Ｃｐ菌体から常法により抽出したＲＮＡから逆転写反応により調製した（あるいはRT-PCRにより増幅した）ｃＤＮＡ、化学合成したＤＮＡなどが挙げられる。
【００２９】
chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとして、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例：MMP-9発現増強活性など）を有する蛋白質（ペプチド）をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と、オーバーラップする領域において、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、配列番号１で表される塩基配列と、オーバーラップする領域において、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡとがハイブリダズし得る条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃、特に好ましくは、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００３１】
chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１で表される塩基配列またはコドンの読み枠の一致した（即ち、インフレームの）該塩基配列の一部を含有するＤＮＡなどである。
【００３２】
chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用い、chsp60を産生する細胞（例：Ｃｐ菌体）由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって増幅するか、または該ゲノムＤＮＡ断片もしくはｃＤＮＡを適当なクローニングベクター（例：バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど）に組み込んで作製したライブラリーを、chsp60の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものをプローブとしたコロニーもしくはプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ライブラリー用のベクターとして発現ベクターを使用した場合、抗chsp60抗体を用いた抗体スクリーニング法によってもchsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡをクローニングすることができる。また、迅速かつ簡便に完全長ｃＤＮＡクローンを得る方法として、ＲＡＣＥ法を用いることができる。即ち、chsp60のｃＤＮＡの一部に相当する二本鎖ＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の部分塩基配列に相同なオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成して、各オリゴヌクレオチドと適当なアダプタープライマーとを一対のＰＣＲプライマーとして５’及び３’ＲＡＣＥ反応を行い、各増幅断片を制限酵素とリガーゼを用いる等の方法で連結することにより、完全長のｃＤＮＡクローンを得ることができる。
あるいは、chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号１で表される塩基配列に基づいて、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて化学的に合成することができる。センス鎖及びアンチセンス鎖のフラグメントを互いにオーバーラップするような長さで合成し、これらのフラグメントをハイブリダイズさせ、ＰＣＲ法等を組み合わせて完全長のＤＮＡを作製することもできる。
【００３３】
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化された蛋白質をコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００３４】
chsp60またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターは、例えば、chsp60をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
【００３５】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕等が挙げられる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、chsp60のＮ端末側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
【００３６】
chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体は、公知の方法にしたがい、該ＤＮＡを含有する発現ベクターで、宿主を形質転換することによって製造することができる。
ここで、発現ベクターとしては、前記したものが挙げられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ-、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３７】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３８】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法にしたがって実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７５巻，１９２９(１９７８)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００３９】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法にしたがって実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜約８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜約４３℃で、約３〜約２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜約４０℃で、約６〜約２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜約８である。培養は、通常約２０℃〜約３５℃で、約２４〜約７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）, 195, 788 (1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜約６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜約５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。培養は、通常約３０℃〜約４０℃で、約１５〜約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外にchsp60もしくはその部分ペプチドまたはその塩を製造することができる。
【００４０】
前記形質転換体を培養して得られる培養物からchsp60類を自体公知の方法にしたがって分離精製することができる。
例えば、chsp60類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。培養液中に蛋白質（ペプチド）が分泌される場合には、培養物から、公知の方法で培養上清を集める方法が用いられる。
このようにして得られた培養上清あるいは抽出液中に含まれる蛋白質（ペプチド）の精製は、自体公知の方法にしたがって分離精製することができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は適宜組み合わせることもできる。
より迅速かつ簡便に組換えchsp60類を精製するには、アフィニティークロマトグラフィーを利用することが好ましい。アフィニティーカラムとしては、抗chsp60抗体カラムを用いることができ、また、chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに適当なタグ配列（例：Hisタグ、GSTタグ、MBPタグなど）を付加した場合は、金属イオンキレート、グルタチオン、マルトース固定化カラムなどを適宜用いることができる。chsp60に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体はいずれも市販されており（例：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製など）、あるいは、chsp60類を抗原として用いて自体公知の抗体または抗血清の製造法（例えば、後記参照）に従って製造することができる。
【００４１】
かくして得られる蛋白質（ペプチド）が遊離体として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質（ペプチド）が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生する蛋白質（ペプチド）を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるchsp60類の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
【００４２】
あるいはまた、chsp60類は、上記のchsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.et al., Transcription and Tranlation, 179-209, Hames B.D.&Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system(Promega社製)やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM(TOYOBO社製)等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B.et al., Nature, 179, 160-161 (1957)あるいはErickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt,J.M.et al. (1984) 前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Spirin A.S. et al., Science, 242, 1162-1164 (1988)）、透析法（木川等、第21回日本分子生物学会、WID6）、あるいは重層法（PROTEIOSTMWheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書：TOYOBO社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開2000-333673）等を用いることができる。
かくして得られる蛋白質（ペプチド）の塩（遊離体）への変換、精製前後の修飾および存在の確認（検出）は、上記と同様にして行うことができる。
【００４３】
本発明のスクリーニング法において、chsp60類は、単離された蛋白質（ペプチド）としてだけではなく、それを産生し得る細胞の形態で提供することもできる。chsp60類を産生し得る細胞としては、天然にchsp60を産生するクラミジア・ニューモニエに属する各種菌株の他、人為的にchsp60類を産生するように操作された細胞、例えば、前記したchsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体が挙げられる。後者の場合、該形質転換体は、単球系株化細胞の培養に適した条件下で該株化細胞におけるMMP-9発現を増強するのに十分な量のchsp60を産生し得るものである。
好ましくは、chsp60類を産生し得る細胞は、クラミジア・ニューモニエに属する各種菌株、特に好ましくは前記KKpn-1株が挙げられる。
【００４４】
本発明で使用される単球系株化細胞は、哺乳動物由来の単球もしくはマクロファージから樹立される細胞株の細胞であれば特に制限はなく、公知の単球系細胞株（例えば、ヒト単球由来のＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ、マウス単球由来のＲＡＷ２６４．７、Ｊ７７４Ａ．１等）の他、哺乳動物から単離した単球もしくはマクロファージを公知の培養技術を用いて株化することによって新たに樹立される細胞株の細胞も包含される。
単球系株化細胞は、ヒトなどの哺乳動物から単離した単球やマクロファージ、あるいは単球からGM-CSFなどの分化誘導因子により分化させた初代マクロファージ等の単球系の初代培養細胞に比べて、chsp60刺激によるMMP-9発現増強の度合が顕著に高い。従って、より高感度のスクリーニング系を提供し得るという利点を有する。望ましくは、１００ｎＭのchsp60類で４８時間刺激したときのMMP-9遺伝子の発現が、chsp60類で刺激しない場合のそれの５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上である単球系株化細胞が用いられる。chsp60非刺激時のMMP-9遺伝子の発現量については特に制限はないが、実質的にMMP-9遺伝子を発現しない（即ち、検出限界以下である）ことがより好ましい。
好ましくは、単球系株化細胞は、ヒト単球由来のTHP-1、Ｕ−９３７、Ｐ３１／ＦＵＪ等の細胞株の細胞であり、特に好ましくはTHP-1細胞株の細胞である。
単球系株化細胞は、各細胞に適した培養液［例えば、所望によりウシ胎仔血清や抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）を添加した最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地等］中で継代培養し、維持することができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング法は、試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をchsp60類で刺激した場合の、両条件下におけるMMP-9遺伝子の発現を測定・比較することを特徴とする。
chsp60類による刺激は、提供されるchsp60類の形態に応じて適宜選択することができる。即ち、chsp60類が単離された蛋白質（ペプチド）である場合は、chsp60類を所定の濃度となるように溶解した単球系株化細胞用培養液（例えば、上記参照）を用いて単球系株化細胞をインキュベーションすることにより行うことができる。chsp60類濃度としては、約１００〜約１０００ｎＭ（chsp60を用いた場合、約５〜約８０μg/ml）、好ましくは約２００〜約４００ｎＭが挙げられる。インキュベーションは動物細胞の培養に用いられる培養容器を用いて行うことができ、例えば、９６穴ウェルプレート等が好ましく用いられる。細胞密度としては約５×１０5〜約１×１０6cells/mlが例示される。インキュベーションは、例えば、ＣＯ2インキュベーター（例：５％ＣＯ2、９５％大気）中、約３０〜約４０℃で約４０〜約７２時間、好ましくは約４４〜約５０時間行うことができる。
一方、chsp60類がそれを産生し得る細胞の形態で提供される場合、該細胞の共存下に単球系株化細胞をインキュベーションすることにより、株化細胞をchsp60類で刺激することができる。chsp60類を産生し得る細胞の添加量としては、上記濃度のchsp60類で刺激するのと同等の刺激を与え得る量であればよく、例えば、天然のＣｐ菌体を使用する場合、約５×１０5〜約１×１０7IFU (Inclusion-Forming Units)/ml、好ましくは約１×１０6〜約１×１０7IFU (Inclusion-Forming Units)/mlが挙げられる。インキュベーションは上記と同様の条件下で行うことができる。
【００４６】
本発明の別の実施態様においては、chsp60類産生細胞は単球系株化細胞自体であってもよい。即ち、単球系株化細胞を宿主細胞とし、これを上記の方法に従ってchsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換することにより得られる形質転換体を、上記と同様の条件下でインキュベーションすることにより、本発明のスクリーニングを実施することができる。
この場合、該形質転換体は、chsp60類を所定の条件下でのみ産生し得るように操作されていることがより好ましい。そのような形質転換体の作製方法としては、例えば、chsp60またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを誘導性プロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター等）の制御下に配置した発現ベクターを用いる方法、CRE-loxP系を用いる方法などが挙げられる。このような形質転換体を使用する場合、chsp60類で刺激した時とは誘導物質（または誘導ストレス）を負荷した時をいい、非刺激時とはchsp60類発現非誘導時をいう。
【００４７】
本発明のスクリーニングに供される試験化合物は特に制限はなく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００４８】
単球系株化細胞におけるMMP-9遺伝子の発現を測定する方法も特に制限されない。例えば、MMP-9をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸をプローブとして用い、該株化細胞から抽出したＲＮＡを鋳型としてノーザンハイブリダイゼーションを行うか、MMP-9をコードする塩基配列の一部を含有する合成オリゴＤＮＡをプライマーとして用い、該株化細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として定量的RT-PCRを行うことにより、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現量を測定することができる。
MMP-9をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸としては、例えば、配列番号３で表される塩基配列または該塩基配列とハイストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る塩基配列を含有する核酸が挙げられる。該核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラでもよい。また、該核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。二本鎖の場合はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
【００４９】
あるいは、MMP-9遺伝子の発現は、抗MMP-9抗体を用いて慣用のイムノアッセイ系により蛋白質レベルで行うこともできる。ここで使用される抗MMP-9抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、また、完全な抗体分子の他、Ｆ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、Ｆａｂ画分なども用いることができる。
MMP-9に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体はいずれも市販されており（例：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製など）、あるいは、MMP-9もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、「MMP-9類（MMP-9s）」という場合もある）を抗原として用いて自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗原として用いられるMMP-9蛋白質としては、スクリーニングに使用する単球系株化細胞と同一起源の蛋白質が好ましいがこれに限定されない。例えば、ヒト由来の単球系株化細胞を使用する場合には、配列番号４で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号−８７〜６０１で示されるアミノ酸配列を含有する９２ｋＤａプロ蛋白質またはアミノ酸番号１〜６０１で示されるアミノ酸配列を含有する８８ｋＤａ活性型蛋白質が挙げられる。MMP-9類は、上記chsp60類と同様に、MMP-9産生細胞（例：哺乳動物由来の単球、マクロファージ等）から公知の蛋白質分離技術を用いて精製するか、配列番号４で表されるアミノ酸配列情報に基づいて固相合成法により化学的に合成するか、配列番号３で表される塩基配列情報に基づいてクローニングしたMMP-9をコードするＤＮＡを用いて組換え生産するか、あるいはMMP-9をコードする核酸を鋳型として無細胞合成することにより得ることができる。
MMP-9に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、例えば、以下のようにして作製することができる。
【００５０】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
MMP-9類を、温血動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物（また、哺乳動物以外でニワトリ等）が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化蛋白質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００５１】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、蛋白質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。このような培地としては、例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分離精製することができる。
【００５２】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
MMP-9に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物からMMP-9に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、０．１〜２０、好ましくは１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００５３】
抗MMP-9抗体を用いるMMP-9またはその塩の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
具体的には、抗MMP-9抗体を用いたイムノアッセイ法としては、
（ｉ）抗MMP-9抗体と、被検液（インキュベーション後の培養上清）および標識化されたMMP-9類とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたMMP-9類の割合を測定することにより被検液中のMMP-9またはその塩を定量する方法（競合法）、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した抗MMP-9抗体および標識化された別の抗MMP-9抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のMMP-9またはその塩を定量する方法（サンドイッチ法）等が挙げられる。
上記（ii）の定量においては、一方の抗体がMMP-9のＮ端部を認識する抗体である場合、他方の抗体がMMP-9の他の部分、例えばＣ端部を認識する抗体であることが望ましい。
【００５４】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
【００５５】
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
【００５６】
サンドイッチ法においては不溶化した抗MMP-9抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の抗MMP-9抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のMMP-9またはその塩の量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行ってもよいし、また、同時に行っても、時間をずらして行ってもよい。標識剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体および標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５７】
上記サンドイッチ法によるMMP-9またはその塩の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる抗MMP-9抗体は、MMP-9の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体がMMP-9のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５８】
抗MMP-9抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体（一次抗体）に対する二次抗体などを用いる液相法、および、一次抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、一次抗体は可溶性のものを用い二次抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。液相法では、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光イムノアッセイ、蛍光消光イムノアッセイ、蛍光エネルギー転移イムノアッセイ等の均一系イムノアッセイを用いることができる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてMMP-9の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【００５９】
あるいはまた、MMP-9遺伝子の発現は、生成したMMP-9またはその塩の酵素活性を指標として測定することもできる。酵素活性の測定法は特に制限されないが、例えば、被検液（インキュベーション終了後の培養上清）をMMP-9の基質（例：ゼラチン、タイプＩＶコラーゲン等）を含有するゲル（例：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル等）上の電気泳動に付し、ＳＤＳを除去してMMP−9をリフォールディングさせた後、適当なバッファー中で該ゲルをインキュベーションし、溶解バンドの濃さを画像解析により定量する方法等が挙げられる。
【００６０】
特に好ましくは、本発明のスクリーニング法におけるMMP-9遺伝子発現の測定法は、抗MMP-9抗体に被検液と酵素標識したMMP-9類とを競合的に反応させる競合ELISA法である。
【００６１】
上記のMMP-9遺伝子発現の測定の結果、例えば、chsp60刺激時のMMP-9遺伝子の発現量を約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上減少させる試験化合物を、chsp60によるMMP-9の発現誘導を阻害する化合物として選択することができる。
【００６２】
上記のようにして選択されるMMP-9の発現誘導を阻害する化合物は、Ｃｐ感染によるマクロファージや血管平滑筋細胞由来の泡沫細胞からのMMP-9の分泌増加を阻害してプラークの線維性被膜の脆弱化を抑制し、プラークの不安定化・破綻を防ぐことができるので、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療に有効である。
【００６３】
本発明はまた、上記のスクリーニング法を実施するのに好適なキットを提供する。本発明のスクリーニング用キットは、単球系株化細胞と、chsp60類あるいはそれを産生し得る細胞またはそれをコードするDNAを含む発現ベクターとを含んでなることを特徴とする。単球系株化細胞およびchsp60類あるいはそれを産生し得る細胞またはそれをコードするDNAを含む発現ベクターとしては、本発明のスクリーニング方法の説明において上記した通りのものが使用できる。
また、一実施態様においては、本発明のスクリーニング用キットは、chsp60類を産生し得るように操作された単球系株化細胞を含んでなる。そのような単球系株化細胞としては、本発明のスクリーニング方法の説明において上記した通りのものが使用できる。
【００６４】
本発明のスクリーニング用キットは、MMP-9遺伝子の発現を測定するための試薬類をさらに含んでいてもよい。例えば、MMP-9遺伝子の発現をRT-PCRを用いて測定する場合、該キットは、例えば、MMP-9 RNAの断片を増幅し得るセンス及びアンチセンスプライマーをさらに含むことができる。該プライマー対の塩基配列としては、例えば、上記非特許文献５に記載されたプライマー等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者は、MMP-9をコードする核酸の塩基配列（例えば、配列番号３で表される塩基配列）に基づいて、必要に応じて公知のプライマー設計支援ソフトウェアを用い、容易に他の好適なプライマーを構築することができる。
また、MMP-9遺伝子の発現を競合ELISA法を用いて測定する場合、該キットは、抗MMP-9抗体および酵素標識されたMMP-9もしくはその部分ペプチドまたはその塩をさらに含むことができる。ここで抗MMP-9抗体および酵素標識されたMMP-9類としては、本発明のスクリーニング方法の説明において上記した通りのものがそれぞれ使用できる。該キットは、さらに抗MMP-9抗体（一次抗体）を特異的に認識し得る二次抗体（例えば、一次抗体がウサギ由来抗MMP-9 IgG抗体の場合、ヤギ由来抗ウサギIgG抗血清など）、抗MMP-9抗体または該二次抗体を固相化するための担体（例：マイクロタイタープレート、ガラスビーズなど）を含んでいてもよい。
【００６５】
本発明はまた、chsp60による哺乳動物細胞におけるMMP-9遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質を含有してなる、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療剤を提供する。該予防・治療剤は、必要に応じて薬理学的に許容される担体を含有することができる。
ここで、「薬理学的に許容される担体」としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００６６】
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、デキストリン、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例、食用赤色２号および３号、食用黄色４号および５号、食用青色１号および２号などの食用色素）、水不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
【００６７】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙げられ、これらはそれぞれ経口的あるいは非経口的に安全に投与できる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の本発明のスクリーニング方法により得られる化合物の含量は、剤形、該化合物の投与量などにより異なるが、例えば約０．１ないし１００重量％である。
【００６８】
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプン、Ｄ−マンニトールなど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。
【００６９】
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる１種または２種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＥ〔オイドラギットＥ（商品名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーＬ〔オイドラギットＬ（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーＬＤ〔オイドラギットＬ−３０Ｄ５５（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーＳ〔オイドラギットＳ（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＲＳ〔オイドラギットＲＳ（商品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットＮＥ（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。
【００７０】
注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０など、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００７１】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該予防・治療剤の投与量は、対象疾患、重篤度、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、粥状動脈硬化症に罹患している成人患者（体重６０ｋｇ）においては、有効成分であるMMP-9発現誘導抑制物質の量として、一日あたり約０.１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、この量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００７２】
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（selenocysteine）
【００７３】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号１〕
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来のchsp60をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号２〕
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来のchsp60のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号３〕
ヒトMMP-9（プレプロ蛋白質）をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号４〕
ヒトMMP-9（プレプロ蛋白質）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号５〕
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来chsp60をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号６〕
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来chsp60をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
【００７４】
以下に参考例および実施例を示し、本願発明をさらに詳しく説明する。しかし、これらは単なる例であって、本発明を何ら限定するものではない。
尚、以下に記載の遺伝子操作法は、成書（Maniatisら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratory、1989年）に記載されている方法もしくは試薬の添付プロトコールに記載されている方法などに従った。
【実施例１】
【００７５】
参考例１  chsp60遺伝子のクローニング
chsp60遺伝子のクローニングはCp感染細胞より抽出されたDNAを鋳型とするPCR法により行った。
HEp-2細胞（約2.5×105cells/ml；入手先  大日本製薬株式会社）を接種したプレート（25cm2 flask）を炭酸ガスインキュベーター内で37℃、一晩培養した後、モノレイヤーの上清を捨て、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地（10% FBS, 100μg/mL streptomycin, 50μg/mL gentamicin, 0.5μg/mL cycloheximide添加）に調製されたクラミジア・ニューモニエ（Ｃｐ）KKpn-1株［Kishimoto T. and Soejima R., Intern. Med., 32： 934-937 (1993)］菌液を接種し、HEp-2に感染させることでCpを培養した。72時間培養後、セルスクレーパーで感染細胞を回収し、PBSで2回洗浄後、TE緩衝液4mlに再懸濁し、-80℃で凍結融解を3回繰り返すことで細胞を破砕した後にこれをフェノール処理とエタノール沈殿して得られた核酸画分をPCR用の鋳型とした。Cp AR-39株由来のchsp60 (GroEL)遺伝子の塩基配列（GenBank Accession NO. M69217）を参考に作製したプライマー［5'-ggaaggcatatggcagcgaaaaatattaaata-3'（配列番号：５）および5'-ggaaggcatatgctagtagtccattcctgcgctt-3'（配列番号：６）］を各50pmolずつPCR反応液に添加し、KOD DNA Polymerase（東洋紡）を使用して、Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems）を用いてPCRを行った（反応条件：95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を25サイクル）。
上記で増幅されたDNA断片を制限酵素NdeI（宝酒造）で消化した後、アガロースゲル電気泳動して断片を回収した。そのDNA断片とあらかじめNdeIで切断された大腸菌発現プラスミドpET21a（入手先：NOVAGEN）とを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造）で連結してchsp60発現用プラスミドpHSP21-1を得た。このプラスミドで大腸菌BL21(DE3)のコンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、形質転換体Escherichia coli BL21(DE3)/pHSP21-1株を得た。この大腸菌株は、FERM BP-8430の受託番号を付され、平成１５（２００３）年７月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。
【実施例２】
【００７６】
参考例２  組換えchsp60の調製
参考例１で得られたEscherichia coli BL21(DE3)/pHSP21-1株1白菌耳を種培養用培地（1% Tryptone、0.5% Yeast Extract、0.5% NaClおよび50mg/L アンピシリン）1Lに接種し、30℃で一晩培養することで種培養を行った。これを全量主培養培地（1.2% Tryptone、2.4% Yeast Extract、0.2% Bactopeptone、0.05% NaCl、1.5% Glucose、50mg/L アンピシリンおよび50mg/L Vitamin-B1）18.5Lに移植し、経時的にクレットユニット値を測定しながら37℃、撹拌150rpm、通気量20NL/min、溶存酸素濃度2.0ppm、pHコントロール6.8の条件下で主培養を開始した。クレットユニット値が800に達した時点でIsopropyl β-D(-)-Thiogalactopyranoside (IPTG)を終濃度1mMとなるように添加し、さらに4時間培養を行うことでchsp60の発現を誘導し、6000rpm、20min遠心して発現菌体を回収した。
得られた菌体350gに5mM エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム及び1mM (p-アミジノフェニル)メタンスルホニルフルオリドを含む50mM トリス/HCl(pH8.0) 2.7Lを加えて菌体を懸濁した後、十分に氷冷しながら高圧破砕機（PANDA、NIRO SOAVI社）を用いて1,000〜1,100barで菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（17,700xG、120分間、ベックマン社）し、遠心上清3.15Lを得た。得られた遠心上清に25(w/v)% ストレプトマイシン溶液を300ｍL加えてよく攪拌し、4℃下に3日間静置した後、遠心分離（12,227xG、60分間、ベックマン社）を行い、遠心上清3.6Lを得た。次いで、この遠心上清に硫酸アンモニウム1,062gを加えて十分に溶解した後、4℃下に一晩静置してから遠心分離（12,227xG、60分間、ベックマン社）し、得られた沈殿物に20mM トリス/HCl(pH8.0) 1.5Lを加えて溶解した。この溶解液を10mM トリス/HCl(pH8.0) 10Lに対して透析後、透析内液を限外ろ過（PSU、10k、ザルトリウス社）を用いて更に脱塩し、脱塩液3Lを得た。得られた脱塩液を50mM トリス/HCl(pH8.0)で平衡化したトヨパールDEAE-650Mカラム（11.3cmφx23cm、東ソー社）に通液、吸着させた後、50mM トリス/HCl(pH8.0)、次いで50mM 塩化ナトリウムを含む50mM トリス/HCl(pH8.0)を通液して十分にカラムを洗浄した。洗浄後、150mM 塩化ナトリウムを含む50mM トリス/HCl(pH8.0)を通液し、chsp60を含む溶出液5Lを得た。この溶出液を限外ろ過（PSU、10k、ザルトリウス社）を用いて2M 尿素を含む50mM トリス/HCl(pH8.0)に置換すると共に濃縮し、濃縮液2Lを得た。次いで、この濃縮液を2M 尿素を含む50mM トリス/HCl(pH8.0)で平衡化したDEAE-5PWカラム（10.5cmφx20cm、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、10〜50% B（B=50mM トリス/HCl、2M 尿素、500mM 塩化ナトリウム、pH8.0）の濃度勾配で80分間、50mL/minの流速で通液し、chsp60溶出液2Lを得た。この溶出液を限外ろ過（PSU、10k、ザルトリウス社）を用いて脱塩後、脱塩液を再度2M 尿素を含む50mM トリス/HCl(pH8.0)で平衡化したDEAE-5PWカラム（10.5cmφx20cm、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、0〜40% B（B=50mM トリス/HCl、2M 尿素、500mM 塩化ナトリウム、pH8.0）の濃度勾配で80分間、50mL/minの流速で通液し、chsp60溶出液555mLを得た。この溶出液をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液で平衡化したセファデックスG-25カラム（5cmφx50cm、アマシャムバイオサイエンス社）に通液し、得られたchsp60画分650mLを更にダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液で平衡化したアクチクリーンイートックスカラム（5cmφx20cm、Sterogene社）に通液してエンドトキシンを除去した。最後にエンドトキシンを除去した通過液760mLを除菌ろ過（ステリベクスフィルター、日本ミリポア社）してchsp60溶液760mLを得た。
【実施例３】
【００７７】
参考例３  組換えchsp60の特性解析
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
参考例２で得られた精製chsp60に100mM DTTを含むサンプルバッファ［Laemmli，Nature，227巻，680頁（1979年）］を等量加えてよく攪拌し、95℃で3分間加熱後、パーフェクトNTゲル 10-20%（DRC社）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果、約60kDaに単一バンドが認められたことから、精製chsp60はほぼ単一であることが確認された。
【００７８】
（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
参考例２で得られた精製chsp60のN末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、モデル492型）を用いて決定した。その結果、得られたchsp60のN末端アミノ酸であるMetが欠失していることを除いて、cDNAの塩基配列（配列番号：１）から推定されたクラミジア・ニューモニエ KKpn-1株由来HSP60のN末端アミノ酸配列と一致した。
【実施例４】
【００７９】
試験例１  chsp60刺激による単球系株化細胞におけるTNFαおよびMMP-9産生誘導の経日変化
単球系株化細胞のTHP-1細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC)から購入した。1% ウシ胎児血清添加RPMI 1640培地（100μg/mL streptomycin、100units/mL penicillinおよび50μg/mL gentamicin含有）で調製した1×106cells/mLのTHP-1細胞懸濁液に参考例２で作製したchsp60を20μg/mL添加し、5% CO2、37℃の環境下で培養した。培養1日、2日および3日後にそれぞれ培養上清を吸引し、上清中のMMP-9量をAmersham社製のELISA kitおよびTNFα量をGenzyme社製のELISA kitで測定した。chsp60を添加せずに同様に培養したTHP-1細胞の培養上清を対照として用いた。なお、これらの実験は96-well plateを用いて、200μL/wellの液量で実施した。結果を図１に示す。TNFαの産生誘導は培養1日後に最大でその後減少したのに対し、MMP-9の産生誘導は培養期間の経過と共に増大した。
【実施例５】
【００８０】
試験例２  単球系株化細胞におけるMMP-9産生誘導のchsp60濃度依存性
実施例１と同様に調製した1×106cells/mLのTHP-1細胞懸濁液に参考例２で作製したchsp60を5、10または20μg/mL添加し、5% CO2、37℃の環境下で培養した。培養２日後に培養上清を吸引し、上清中のMMP-9量をAmersham社製のELISA kitで測定した。chsp60を添加せずに同様に培養したTHP-1細胞の培養上清を対照として用いた。結果を図２に示す。MMP-9の産生誘導はchsp60の濃度依存的に増大した。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明のスクリーニング方法は、単球系株化細胞を使用することにより、血液から単離した単球や初代マクロファージに比べて高いMMP-9発現が誘導されるので、クラミジア・ニューモニエ感染による動脈硬化症の進展を抑制し得る新規動脈硬化症治療薬の高感度なスクリーニング系として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】chsp60刺激による単球系株化細胞におけるTNFα（図１Ａ）およびMMP-9（図１Ｂ）産生誘導の経日変化を示す図である。
【図２】単球系株化細胞におけるMMP-9産生誘導のchsp60濃度依存性を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号：５
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来chsp60をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号：６
クラミジア・ニューモニエKKpn-1株由来chsp60をコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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