(57)【要約】  【課題】  ヒト遺伝子治療に有用なＡＡＶベクターを十分な量で産生することが望まれている。  【解決手段】  送達システムとして使用可能である高力価のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組換えベクターを生成するための方法であって、ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程を含み、該細胞は以下：（ａ）該細胞中に安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーであって、該ＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてｒｅｐ遺伝子の発現が該細胞において制限的である、ベクター；および（ｂ）該ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドであって、該プラスミドにおいて、該ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結している、プラスミド、を含み、これによって組換えＡＡＶベクターが生成される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
送達システムとして使用可能である高力価のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）組換えベクターを生成するためのプロセスであって、該プロセスは、ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にする条件下で細胞をインキュベートする工程を包含し、該細胞は以下：
（ａ）該細胞中に安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーであって、該ＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてｒｅｐ遺伝子の発現が該細胞において制限的である、ベクター；および
（ｂ）該ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドであって、該プラスミドにおいて、該ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結している、プラスミド、
を含み、これによって組換えＡＡＶベクターが生成される、プロセス。
【請求項２】
（ｂ）の前記パッケージングプラスミドが、前記細胞の（ａ）のベクター中のＡＡＶ配列との重複する相同性を欠く、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
（ｂ）の前記異種プロモーターがＨＩＶ−ＬＴＲである、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記パッケージングプラスミドがｐＲＳ５（ＡＴＣＣ  ６９４８３）である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）ポリペプチドをコードする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
以下を包含する送達システムとして使用可能である高力価のＡＡＶ組換えベクターを生成するためのパッケージングシステム：
（ａ）該細胞中に安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞であって、該ＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてｒｅｐ遺伝子の発現が該細胞において制限的である、細胞；および
（ｂ）該細胞中に導入された場合に該ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドであって、該プラスミドにおいて、該ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結している、プラスミド。
【請求項７】
（ｂ）の前記パッケージングプラスミドが、（ａ）で提供される前記細胞中のベクターのＡＡＶ配列との重複する相同性を欠く、請求項６に記載のパッケージングシステム。
【請求項８】
（ｂ）の前記異種プロモーターがＨＩＶ−ＬＴＲである、請求項６または請求項７に記載のパッケージングシステム。
【請求項９】
前記パッケージングプラスミドがｐＲＳ５（ＡＴＣＣ  ６９４８３）である、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１０】
前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）ポリペプチドをコードする、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載のパッケージングシステム。
【請求項１１】
ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするパッケージングプラスミドであって、該プラスミドが異種プロモーターに作動可能に連結したｒｅｐ遺伝子を含み、該パッケージングプラスミドが細胞中に安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターのＡＡＶ配列との重複する相同性を欠き、該細胞が該ＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含み、ここで、該ＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含む、パッケージングプラスミド。
【請求項１２】
ｒｅｐが作動可能に連結される前記パッケージングプラスミドの前記プロモーターがＨＩＶ−ＬＴＲである、請求項１１に記載のパッケージングプラスミド。
【請求項１３】
前記プラスミドがｐＲＳ５（ＡＴＣＣ  ６９４８３）である、請求項１１または請求項１２に記載のパッケージングプラスミド。
【請求項１４】
以下を包含する送達システムとして使用可能である高力価のＡＡＶ組換えベクターの生成のための細胞：
（ａ）該細胞中に安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくもと１つの完全なコピーであって、ここで、該ＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域、および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、ｒｅｐ遺伝子の発現が該細胞において制限的である、ベクター；および
（ｂ）該ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドであって、ここで、該プラスミドにおいて該ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結される、プラスミド。
【請求項１５】
（ｂ）の前記パッケージングプラスミドが、前記細胞の（ａ）のベクター中のＡＡＶ配列との重複する相同性を欠く、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
（ｂ）の前記異種プロモーターがＨＩＶ−ＬＴＲである、請求項１４または請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記パッケージングプラスミドがｐＲＳ５（ＡＴＣＣ  ６９４８３）である、請求項１４〜請求項１６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記標的ポリヌクレオチドが、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）ポリペプチドをコードする、請求項１４〜請求項１７のいずれか１項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、遺伝子治療、およびさらに詳細には遺伝子治療手順に使用するための高力価組換えＡＡＶベクターの生成に使用される物質および方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療に有用性を有し得るが、これ以前にはヒトヘの遺伝子治療の適用のための臨床的に有用な量で、このような組換えベクターの十分量を生成する能力がないという重大な障害かある。これは、肺に直接送達するようなインビボでの適用に特に問題である。
【０００３】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、インビボの遺伝子転移剤として有用性を有することが示された数少ない組換えウイルスベクターシステムの中のものであり（Carter、1992、Current Opinion in Biotechnology、3:533-539;Muzcyzka、1992、Curr. Top. Microbiol. Immunol.158:97-129に総説されている）、従って潜在的にヒトの遺伝子治療に大変重要である。  ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症（ＣＦ）気管支および鼻上皮細胞（Flotteら、1992a、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356;Eganら1992、Nature、358:581-584;Flotteら、1993a、J. Biol. Chem. 268:378卜3790 ;F-lotteら、1993b、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、  印刷中）、ヒト骨髄由来赤白血病細胞−（Walshら、1992、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:7257-7261）、およびいくつかの別のものを包含する種々の細胞で、高頻度の安定なＤＮＡ組込みおよび発現をし得る。ＡＡＶは、安定な発現のために活発な細胞分裂を必要とし得ず、これはレトロウイルスに対して、特に大部分の細胞が最終的に分化を終えており、そして非分裂であるヒトの気道上皮のような組織では明らかに有利である。
【０００４】
ＡＡＶは、特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞においてのみ増殖する欠陥パルボウイルスである（図１参照）。一般的なＡＡＶの総説は、Carter、1989 Handbook of Parvoviruses、第1巻、169-228ページ、 Berns、1990、Virology、1743で64ページ、Raven Press、(New York)に見出され得る。  ＡＡＶの増一殖および複製に対するヘルパー機能を提供する同時感染ウイルスの例は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびある場合にはワクシニアのような天然痘ウイルスである。ヘルパー機能の性質は知られていないが、細胞でＡＡＶ複製を可能にするヘルパーウイルスの間接的な効果であるようである。この概念は、細胞を遺伝子毒性のある（ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ）薬剤または細胞周期を中断させる薬剤のいずれかで処理すると、特定の場合に、ヘルパーウイルスの同時感染なしでＡＡＶ複製が低レベルの効率で生じ得る観察により支持される。
【０００５】
ＡＡＶは、特定の異常な状態でヘルパーウイルス非存在下で限られた程度複製され得るにもかかわらず、上記のように、より一般的な結果は、ヘルパー機能非存在下での細胞のＡＡＶウイルスでの感染が、ＡＡＶの宿主細胞ゲノムヘの組込みをもたらすことである。組込まれたＡＡＶゲノムは、組込まれたＡＡＶプロウイルスを含有する細胞をアデノウイルスのようなヘルパーウイルスで追いうち感染した場合、感染性の子孫ＡＡＶ粒子のバーストを与えるために回収および複製され得る。なぜなら、ＡＡＶの組込みは効果的な反応と思われることから、このことはＡＡＶがヒトの遺伝子治療のような用途のために細胞に遺伝子を導入し、安定に発現させる有用なベクターであることを示唆する。さらに最近の結果（KotinおよびBerns1989、Virology 170:460-467;Kotinら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2211-2215; Samulskiら、 1991、 EMBO J. 10:3941-3950）では、ＡＡＶは、ヒト第１９染色体上の部位での組込みがいくらか好ましいことが示唆されているが、しかしこの現象の一般性および機構は完全には解明されていない。
【０００６】
ＡＡＶは、明らかな種特異性も組織特異性も伴わない非常に広い宿主域を有し、そして事実上、適切なヘルパーの存在が提供されるヒト、サル、齧歯類起源の任意の細胞株で複製される。ＡＡＶは遍在し、そして大部分の哺乳動物およびいくつかのトリ種を包含する広範囲の動物種から単離されている。
【０００７】
ＡＡＶは、任意の疾患の原因とは関係しない。ＡＡＶは、形質転換ウイルスまたは腫瘍ウイルスではない。ヒト細胞株の染色体へのＡＡＶの組込みによって、細胞の増殖特性または形態的特徴におけるいずれの顕著な変化も生じない。また、これらのＡＡＶの特性から、潜在的に有用なヒト遺伝子治療ベクターとしてＡＡＶが勧められる。なぜなら、この適用に提案されるレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはボックスウイルスのような他の大部分のウイルス系は、疾患を引き起こすウイルスであるからである。
【０００８】
ＡＡＶ粒子は、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を有するタンパク質キャプシドからなっており、そしてＤＮＡゲノムを囲んでいる。ＡＡＶのＤＮＡゲノムは、約１．５×１０６ダルトンの分子量またはおよそ４６８０ヌクレオチドの長さを有する直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。相補的センスの「プラス」または「マイナス」鎖のいずれかの鎖が個々の粒子にパッケージされるが、それぞれの粒子は１つのＤＮＡ分子しか有しない。同数のＡＡＶ粒子は、プラス組またはマイナス鎖のいずれかを含有する。どちらの鎖も同等に感染性であり、複製は親の感染一本鎖を二本鎖の形態に変換し、次に二本鎖分子の大きなプールの増幅が起き、その二本鎖から子孫の一本鎖がはずされ、そしてキャプシドにパッケージされる。細菌プラスミドまたはファージミドに挿入された二本鎖または一本鎖コピーのＡＡＶゲノムは、アデノウイルス感染細胞にトランスフェクトされた場合に感染性であり、そしてこれはＡＡＶ遺伝学の研究およびＡＡＶベクターの開発を可能にしている。  ＡＡＶの複製周期を、図１に示す。
【０００９】
ＡＡＶ２ゲノムは、１コピーの１４５ヌクレオチド長のＩＴＲ（逆方向末端反復）を各末端に有し、そしてｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子（Hermonatら、J. Virol. 51:329-339; Tratschinら、1984a、 J. Virol,、51:611-619）の２つの主要なオープンリーディングフレームを含有する４４７０ヌクレオチド長（Srivastavaら、1983、 J. Virol.、45:555-564）の非反復配列部分を有する。非反復部分は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現させるために使用される３つの転写プロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０（Laughlinら、 1979、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 76:5587-5571）を含有する。  ＩＴＲ配列は、シスで必要とされ、そして機能的な複製開始点（ｏｒｉ）を提供するのに十分であり、そしてまた細胞ゲノムヘの組込みおよび宿主細胞染色体または組換えプラスミドからの効率的な切り出しおよび回収に必要とされるシグナルを供給するのに十分である。さらに、ＩＴＲは、ＡＡＶベクターの転写プロモーターとして直接機能し得ることが示されている（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３、上記参照）。
【００１０】
ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、それぞれウイルスゲノムの複製およびキャプシド化機能を提供するためにトランスで必要とされる。ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーターＰ５およびＰ１９から発現される。Ｐ５からの転写は、タンパク質Ｒｅｐ７８をコードするスプライシングされない４．２ｋｂのｍＲＮＡ、およびタンパク質Ｒｅｐ６８をコードするスプライシングされた３．９ｋｂのｍＲＮＡを生成する。Ｐ１９からの転写は、Ｒｅｐ５２をコードするスプライシングされないｍＲＮＡ、およびＲｅｐ４０をコードするスプライシングされない３．３ｋｂのｍＲＮＡを生成する。従って、４つのＲｅｐタンパク質全てが、共通する内部領域配列を含むが、それらのアミノ末端およびカルボキシル末端領域については異なる。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８のみが、ＡＡＶ二本鎖ＤＮＡの複製に必要とされるが、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、子孫の一本鎖ＤＮＡの蓄積に必要とされるようである。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の変異は、表現型がＲｅｐ−であり、一方Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のみに影響する変異はＲｅｐ＋であるがＳｓｄ−である。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、ＡＡＶのＩＴＲのヘアピン立体構造に特異的に結合し、そしてＡＡＶ末端で複製を決定するのに必要ないくつかの酵素活性を有する。  Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、これらの特性を有さない。
【００１１】
Ｒｅｐタンパク質、主としてＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ＡＡＶ遺伝子の正の調節または負の調節、ならびにいくつかの異種プロモーターからの発現を包含するいくつかの多面的調節活性、および細胞増殖に対する阻害効果を示す（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８８４−２８９４；Ｌａｂｏｗら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１３２０−１３２５；Ｋｈｌｅｉｆら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８１：７３８−７４１）。ＡＡＶのｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８によって負に自己調節される（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ６：２８８４−２８９４）。細胞増殖に対するｒｅｐの発現阻害効果ゆえに、細胞株でのｒｅｐの構成的発現は、容易に達成されていない。例えば、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら（１９８８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６６：１５４−１６５）は、ＡＡＶゲノムの安定な組込み後の特定の細胞株でのいくつかのＲｅｐタンパク質の非常に低レベルな発現を報告した。
【００１２】
タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は全て共通の重復配列を共有するが、ＶＰ１およびＶＰ２が付加的なアミノ末端配列を含むという点で異なっている。全て３つのタンパク質とも、Ｐ４０プロモーターから転写された２．３ｋｂのスプライシングされたｍＲＮＡから発現される同じｃａｐ遺伝子のリーディングフレームからコードされる。ＶＰ２およびＶＰ３は、別の開始コドンを使用して同じｍＲＮＡから生成される。ＶＰ１は、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする主なｍＲＮＡに使用される３’ドナーから３０ヌクレオチド上流の３’ドナー部位を使用する微量のｍＲＮＡからコードされる。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は、全てキャプシド産生に必要とされる。３つ全てのタンパク質を除去する変異（Ｃａｐ−）は、一本鎖子孫ＡＡＶのＤＮＡの蓄積を妨げる一方、ＶＰ１アミノ末端内の変異（Ｌｉｐ−へIｎf−は、一本鎖の産生を可能にするが、安定な感染性粒子の会合を妨げる。
【００１３】
上記のＡＡＶの遺伝解析は、細菌のプラスミドに分子的にクローン化されたＡＡＶゲノムの変異解析に基づいていた。初期の研究では、ＡＡＶの感染性ゲノムの分子クローンは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２、Ｐｒｎｃ．ＮａｔＬＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：２０７７−２０８１、制限エンドヌクレアーゼを含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３、Ｇｅｎｅ、２３：６５−７３）または直接平滑末端連結（ＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：４６６１−４６６６）のような手順でプラスミドにＡＡＶの二本鎖分子を挿入することにより構築した。次に、アデノウイルスのような適当なヘルパーウイルスでもまた感染させた哺乳動物細胞にこのようなＡＡＶ組換えプラスミドをトランスフェクトすると、任意のプラスミド配列を含まないＡＡＶゲノムの回収および切り出し、および回収されたゲノムの複製ならびに一定量の子孫の感染性ＡＡＶ粒子の産生をもたらした（図１参照）。これは、上記で概賂したようにＡＡＶの遺伝解析を行うための基礎を提供し、そしてＡＡＶ形質原人ベクターの構築を可能にした。
【００１４】
遺伝解析に基づくＡＡＶベクター構築の一般原理は、最近考察されたように定義された（Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５８：９７−１２９）。ＡＡＶベクターは、ベクタープラスミドを生成するためにＡＡＶをコードする配列部分を外米ＤＮＡに置換することによりＡＡＶ組換えプラスミド内に構築される。ベクタープラスミドでは、ＡＡＶ配列の末端（ＩＴＲ）部分は完全に保持されていなければならない。なぜなら、これらの領域はトランスフェクション後のプラスミドからの切り出し、ベクターゲノムの複製、ならびに宿主細胞ゲノムから組込みおよび回収を含むいくらかの機能がシスで要求されるからである。次に、ＡＡＶ形質導入ウイルスの生成のために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような適切なヘルパーウイルスで感染した細胞にベクタープラスミドをトランスフェクトすることにより、ベクターはＡＡＶ粒子にパッケージされ得る。複製およびベクターゲノムのＡＡＶ粒子へのキャプシド化を達成するために、ベクタープラスミドは、ベクタープラスミドの構築物に欠失しているトランスで必要な任意のＡＡＶ機能、すなわちｒｅｐおよびｃａｐを相補しなければならない。
【００１５】
ヒトの遺伝子治療に使用するために設計した任意のＡＡＶベクターの所望の特徴は少なくとも２つある。第１に、形質導入ベクターは、送達システムとして実用的な十分に高い力価で生成されねばならない。これは、インビボでのベクター送達を目的とした遺伝子治療ストラテジーでは特に重要である。気道へのインビボでの直接送達による嚢胞性線維症の処置のようなＡＡＶベクターの多くの所望される適用については、１０10を越える形質転換ベクターの量を必要とするようである。第２に、ベクター調製物には、野生型のＡＡＶウイルスが存在してはならない。高力価ＡＡＶベクターの達成は、野生型ＡＡＶゲノムが存在するまたは組換えにより生成される場合、野生型ＡＡＶゲノムを優先的にキャプシド化すること、およびｒｅｐまたはｃａｐのような十分に相補的な機能を生成することが不可能であることを包含するいくつかの理由から困難である。このような相補的機能を発現する有用な細胞株は、部分的にはｒｅｐ遺伝子のいくつかの阻害機能のため、生成されていない。
【００１６】
記載された最初のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ転写プロモーターまたはＳＶ４０プロモーターから発現されるｎｅｏまたはｃａｔまたはｄｈｆｒのような外米レポーター遺伝子を含有していた（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４ｂ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０；Ｍｃｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６２：１９８３−１９７３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：３４９−３５６）。これらのベクターは、アデノウイルス感染細胞に、天然の野生型ＡＡＶ転写プロモーターから発現されるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する第２のパッケージングプラスミドとともに同時トランスフェクションすることにより、ＡＡＶ形質導大粒子中にパッケージされた。パッケージングプラスミドのパッケージを妨げる試みにおいては、プラスミドは天然の野生型ＡＡＶ転写プロモーターから発現されるＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有していた。パッケージングプラスミドのＡＡＶ粒子へのパッケージを妨げる試みでは、いくつかのアプローチが行われた。いくつかの場合（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら１９８８）、パッケージングプラスミドは、ＡＡＶ配列内のバクテリオファージラムダＤＮＡの大きな領域を挿入し、パッケージされ得ない過剰サイズのゲノムを生成した。他の場合において（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４ｂ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８）、パッケージングプラスミドは、切り出しおよび複製ができず、そのためパッケージできないように、ＡＡＶのＩＴＲ領域を欠失した。これらの全てのアプローチは、野生型ＡＡＶのＤＮＡを含有する粒子の生成を妨げず、そしてまた効果的な高力価のＡＡＶ形質導入粒子を生成しなかった。実際、１０４ｍｌを越えない力価は、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４により引用されなかった。これらの研究での野生型ＡＡＶ粒子の生産は、おそらくベクターおよびパッケージングプラスミドに存在するＡＡＶ配列聞の重複する相同性の存在によるものであった。ＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒ（１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｉ．、２５９：４６６１−４６６６）により、このようなシステムの組換えの程度が、配列の重復の程度とほぼ同等であることが示された。初期の研究の総説（Ｃａｒｔｅｒ  １９８９、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、２４７−２８４ページ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）で、１ｍｌあたり１０６の力価が得られたことが示唆されたが、これはベクター調製物に大量の野生型ＡＡＶが混入している上記の研究に基づいていた。野生型ＡＡＶを含有するこれらのベクター調製物は、ヒトの遺伝子治療には有用でない。さらに、これらの初期のベクターは、低い形質導入効率を表し、そして細胞あたり５０，０００粒子までの多重度でベクターを供給し��としても、様々なヒトの細胞株培養物中で１％より多いまたは２％の細胞を形質導入しなかった。これは、部分的には野生型ＡＡＶ粒子の混入およびベクター中のＡＡＶのｒｅｐ遺伝子の存在を反映し得た。さらに、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２８）は、野生型ＡＡＶの存在は、パッケ一ジされたベクターの収量を著しく高めることを示した。従って、野生型ＡＡＶの生産が除去されるパッケージングシステムでは、パッケージされたベクターの収量は実際に減少し得る。それにもかかわらず、任意のヒトの臨床適用で使用するためには、野生型ＡＡＶの生産を除去することが必須である。
【００１７】
ＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子を含有しないＡＡＶベクターを生成するための別の研究（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８）では、未だに野生型ＡＡＶの生成をうけ、そして未だにヒト細胞株での非常に低い形質導入頻度を生産していた。従って、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）は、ｎｅｏ遺伝子を含有するＡＡＶのｒｅｐ−ｃａｐ−ベクターが、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）により初期に使用された、未だに野生型ＡＡＶを含有する、同じパッケージングプラスミドと共にパッケージしたことを報告した。結果として、ベクターおよび野生型粒子の二重ヒットを避けるために、このウイルスを細胞あたり０．０３粒子の多重度（すなわち、１０，０００細胞あたり３００感染単位）でしか使用し得なかった。１０００感染単位で３２，０００細胞を感染させることによる方法で実験を行った場合、平均８００個のゲネチシン耐性コロニーが得られた。これは、ウイルスが８０％の形質導入頻度を得ることができることを示すと解釈されるが、実際は細胞の２．５％のみが形質導入された。従って、このベクターの効果的な有用な力価は制限されていた。さらに、この研究は、このベクター調製物の実際の力価が、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）により以前に得られた力価より少しでも高いことを示していなかった。同様に、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８は、ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子のどちらも含有しないＡＡＶベクターをパッケージし、そしてＴｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４ｂ、１９８５）によって初期に使用されたものと同一のｏｒｉ−パッケージングプラスミドｐＢａ１Ａを使用し、そして同様に低い形質導入頻度（最も濃縮したベクターストックでも、数種のヒト細胞株では１％より多い細胞がゲネチシン耐性に形質導入され得ない）を報告した。Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８）は、意味のある方法で実際のベクター力価を報告しなかった。しかし、３ｍ１のベクター調製物に５×１０６細胞を曝した場合、１％より高くない形質導入頻度を示す生物学的アッセイは、力価が２×１０４以下であることを示した。ｐＢａ１パッケージングプラスミドはまた、ベクター中にＩＴＲ配列との重復する相同性を含有し、そして、野生型ＡＡＶの組換えによる生成をもたらす。
【００１８】
Ｌａｆａｃｅら、（１９８８）は、ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）で使用されたのと同じベクターを使用して同じ方法で調製し、そしてまた非常に低い力価を示すネズミ骨髄細胞培養物中で１．５％の形質導入頻度を得た。
【００１９】
Ｓａｎｍｌｓｋｉら（１９８７、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１は、ｐＳｕｂ２０１と呼ばれるプラスミドを構築した。これは、細菌プラスミド中の完全なＡＡＶゲノムであるが、各ＩＴＲの末端で１３ヌクレオチドの欠失を有し、従ってＡＡＶゲノム全体を含有する他のＡＡＶプラスミドよりも低い効率で回収および複製された。Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８）は、ｐＳｕｂ２０ｌに基づくが、ｒｅｐおよびｃａｐを欠失していて、そしてＳＶ４０初期遺伝子プロモーターから発現するｈｙｇまたはｎｅｏ遺伝子のいずれかを含有するＡＡＶベクターを構築した。彼らは、アデノウイルスＩＴＲの１コピーとともにいずれかの各末端を囲むヌクレオチド１９０−４４９０のＡＡＶヌクレオチド配列全体からなるｐＡＡＶ／Ａｄと呼ばれるパッケージングプラスミドでの同時トランスフェクションにより、これらのベクターをパッケージした。このパッケージングプラスミドでは、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、天然のＡＡＶプロモーターｐ５、ｐ１９、およびｐ４０から発現された。ｐＡＡＶ／ＡｄでのアデノウイルスＩＴＲの機能は、ＡＡＶキャブシドタンパク質の発現レベルを高めることであると考えられた。しかし、ｒｅｐは、その相同なプロモーターから発現され、そして負に調節されており、従ってその発現は制限されている。これらのキャプシド化システムを使用して、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９は、ＡＡＶベクターストックを生成した。これは、実質的に野生型ＡＡＶを含まないが、上清１ｍｌあたりのハイグロマイシン耐性単位が３×１０４のみの形質導入力価を有する。野生型ＡＡＶゲノムをパッケージングプラスミドに使用した場合、ＡＡＶベクター調製物の力価は、５×１０４に増加した。従ってこのシステムで生産される低力価は、そして部分的にはベクター構築に使用された基本的なｐＳｕｂ２０１プラスミドのＩＴＲ配列の欠損により、そして部分的にはｐＡＡＶ／ＡｄからのＡＡＶ遺伝子の制限された発現によるようである。ＡＡＶｎｅｏベクター調製物の力価を増加させる試みでは、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９は、２９３細胞の３０枚の１０ｃｍ皿に大量ににトランスフェクトし、そしてＣｓＣｌでのバンド形成によりベクターストックを濃縮させることにより、ベクターストックを生成した。これは、ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで測定したところ、合計１０８粒子を含有するＡＡＶｎｅｏベクターストックを生産した。このベクターストックを細胞あたり１，０００までの多重度で使用した場合、７０％の形質導入頻度が得られた。これは、細胞あたり１形質導入単位の比では、形質導入されるべき細胞の予想された比率が、ポアソン分布によれば６３％であることから、粒子対形質導入の比が、約５００〜１，０００粒子であることを示唆している。
【００２０】
ベクタープラスミドｐＳｕｂ２０１およびパッケージングプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄを用いるＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）のシステムは、２つのプラスミドの間に重複するＡＡＶ配列の相同性を有さなかったが、ＸｂａＩ部位で重複する相同性があり、そしてこれらの部位の組換えにより完全な野生型ＡＡＶを生成する。すなわち、ＡＡＶ配列の重複する相同性は存在しないが、完全なＡＡＶ配列は２つのプラスミド内に含有され、そしてこのように組換えにより野生型ＡＡＶを生成し得るが、これは望ましくない。このクラスの組換えがＡＡＶブラスミド中で起こることはＳｅｎａｐａｔｈｙおよびＣａｒｔｅｒにより示された（１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：４６６１−４６６６）。それゆえ、低力価および野生型組換え体を生成する能力の問題のためＳａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）により説明されたシステムはヒト遺伝子治療において有用性を有さない。
【００２１】
他のいくつかの報告がＡＡＶベクターについて記載している。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８０７８−８０８２）は、Ｓａｒａｕｌｓｋｉら（１９８７）はｐＳｕｂ２０１プラスミドに基づくＡＡＶベクターについて記載した。そこではＡＡＶのコーディング配列は他のパルボウイルスＢ１９のコーディング配列に置き換えられた。このベクターはｐＡＡＶ／Ａｄパッケージングプラスミドを用いてＡＡＶ粒子にパッケージされ、機能的ベクターを生成したが、力価は報告されなかった。このシステムはｐＳｕｂ２０１に基づいていたので、このプラスミドの上記の欠陥をこうむる。第２に、ベクターおよびパッケージングプラスミドは両方とも重複するＡＡＶ配列（ＩＴＲ領域）を含有していたので、野生型ウイルスの混入をもたらす組換えが非常によく起こる。
【００２２】
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら（１９９１，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，８５−８９ページ）、Ｗｏｎｇら（１９９１  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９１，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １８３−１８９ページ）、およびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅら（１９９２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１４８５−１４８８）は、ＨＩＶあるいは単純ヘルペスウイルスのような感染性ウイルスに対するアンチセンスＲＮＡを発現するよう設計されたＡＡＶベクターについて記載している。しかし、これらの著者はそのＡＡＶベクターストックの力価についてなにも報告しなかった。さらに、彼らは、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４ｂ，  １９８５）により使用された、ＡＡＶゲノムのＢａｌＡフラグメントを含有するプラスミドに類似のＯｒｉ−パッケージングプラスミドを用いてベクターをパッケージし、それ故彼らのパッケージングプラスミドは、ベクター構築物中に存在するＡＡＶ配列に相同性を有するＡＡＶベクター配列を含有した。これはまた、野生型ＡＡＶの生成を生じる。このように、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、およびＷｏｎｇらは低力価しか示さないことが公知のパッケージングシステムを使用した。そして、それはベクターおよびパッケージング配列の重複する相同性のため、野生型ＡＡＶゲノムの生成を生じ得る。
【００２３】
他の報告は、ヒトリンパ球（Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏら，１９９２，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１１：２３１−２３７）
あるいはヒト赤白血病細胞株（Ｗａｌｓｈら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７２５７−７２６１）中で遺伝子を発現するＡＡＶベクターの、ｐＳｕｂ２０１ベクタープラスミドおよびＰＡＡＶ／Ａｄパッケージングプラスミドに基づいたベクターとの使用を記載している。また、ベクターストックの力価は報告されず、そして明らかに低い。なぜなら、選択マーカー遺伝子がベクターで首尾よく形質導入された細胞を同定するために使用されたからである。
【００２４】
嚢胞性線維症患者由米のインビトロで増殖したヒト気道上皮細胞の、ＡＡＶｐ５プロモーターから選択マーカー遺伝子ｎｅｏを発現するＡＡＶベクターでの形質導入が報告された（Ｆｌｏｔｔｅら，１９９２，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６）。この研究では、ＡＡＶｎｅｏベクターはｐＡＡＶ／Ａｄパッケージングプラスミドを用いてＡＡＶ粒子にパッケージされた。培養物中の細胞の７０％までがゲネチシン耐性に形貧導入され得、そして粒子対形質導入の割合は、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）により報告されたものと同等であった。このように細胞の７０％の形質導入を得るためには、細胞当たり数百までのベクター粒子の多重度が必要であった。ＡＡＶ  ＩＴＲプロモーターからＣＦＴＲ遺伝子を発現するＡＡＶ形質導入ベクターを用いるインビトロ培養でのヒト気道上皮細胞の形質導入は、この細胞が嚢胞性線維症患者由来の細胞に存在する塩素チャンネル機能の電気生理学的欠陥を機能的に修正し得ることを示した（Ｅｇａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５８：５８１−５８４；Ｆｌｏｔｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：３７８１−３７９０）。
【００２５】
上記の研究は、ＡＡＶベクターが遺伝子治療によるヒト疾病の治療のためのベクターとしての潜在的な有用性を有し得ることを示唆する。しかし、十分な量のＡＡＶベクターを生成する能力は、ＡＡＶベクターを使用するヒト遺伝子治療の発展における厳しい制限であった。また、この制限の１つの局面は、インビボ動物モデルでＡＡＶベクターを使用する前研究がない結果になった。これは一般的に、インビボでの送達および遺伝子発現に有用な高い力価を有するＡＡＶベクターストックを十分量生成することに関する困難の反映である。ＡＡＶ遺伝子治療の制限要素の１つは、使用されるベクターパッケージングシステムが比較的効率的でないことである。  ｒｅｐおよびｃａｐのようなＡＡＶトランス補足機能を発現する細胞株の欠如のため、ＡＡＶベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドおよびベクタープラスミドの同時トランスフェクションによってアデノウイルス感染細胞中で達成されている。このプロセスの効率は、それぞれのプラスミド構築物のトランスフェクションの効率により、および今まで記載されたパッケージングプラスミド由来のＲｅｐタンパク質の発現レベルにより制限され得る。これらの問題はそれぞれ、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の生物学的活性に関連しているようである。さらに、上記のように、上述の全てのパッケージングシステムは組換えによる野生型ＡＡＶを生成する能力を有する。
機能的Ｒｅｐを安定して発現する細胞株の欠如は、明らかにＲｅｐによるｎｅｏ−耐性コ口ニー形成の阻害（Ｌａｂｏｗら，  １９８７；Ｔｒｅｍｐｅら，１９９１）により示されるように、Ｒｅｐの細胞傷害性あるいは細胞増殖抑制性の機能を反映する。また、これは培養細胞中の不死化表現型を逆転させるＲｅｐの傾向に関連するようであり、それが安定して機能的Ｒｅｐを発現する細胞株の生成を極めて困難にしている。Ｒｅｐを発現する細胞株を生成する試みはいくつか行われている。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら（１９８８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６６：１５４−１６５）は、１つの細胞株で、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子を含有するプラスミドでのＨｅＬａあるいは２９３細胞の安定なトランスフェクション後、ＡＡＶＲｅｐ５２タンパク質のいくつかの低レベルの発現を得たが、Ｒｅｐ７８あるいはＲｅｐ６８タンパク質の発現を得なかったことを報告した。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質が存在しないため、細胞株でベクターは生成され得なかった。別の細胞株はかろうじて検出できる量の非機能性Ｒｅｐ７８を生成した。Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３５３−３５９ページ）は正常ＡＡＶプロモーターから発現するＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有する細胞株の生成を試みた。しかし、これらの試みはベクターが１００倍の過剰の野生型ＡＡＶ粒子が混入したからか、あるいはベクターが４×１０３より小さい非常に低い力価でしか生成されなかったからかのいずれかのために成功しなかった。
【００２６】
他のアプローチでは、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（米国特許第５，１７３，４１４号，１９９２年１２月２２日発行）がエピソーマルプラスミドでＡＡＶベクターを含有する細胞株を構築した。次いで、これらの細胞株はアデノウイルスで感染され、トランス補足ＡＡＶ機能性ｒｅｐおよびｃａｐでトランスフェクションされＡＡＶベクターの調製物を生じ得た。このことから高力価のＡＡＶストックの生成を可能にしたことが主張される。しかし、示された例において、示された力価に関する唯一の情報は、１つのヒト細胞株Ｋ５６２がわずか１％あるいはそれより低い効率で形質導入され得たということであり、それはいかなる高力価のＡＡＶベクターの生成をも示してない。このシステムにおいて、ベクターはエピソーマル（非組込み構築物）として運ばれ、そしてベクターの組込まれたコピーが好ましくないと述べられる。
【００２７】
Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９９２）により記載されたＡＡＶベクターのパッケージングのアプローチはいくつかの望ましくない局面を有する。第１に、細胞株中の組込まれていない多くのコピー数のエピソーマルプラスミドとしてベクターを維持することは望ましくない。なぜなら、細胞当たりのコピー数は厳密に制御され得ず、そしてエピソーマルＤＮＡはおそらく欠陥ベクターの生成を導く再配列を受けるからである。第２に、このシステムにおいては、まだ、ベクターはアデノウイルスによって細胞を感染させ、そしてＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドを導入することによりパッケージされなければならない。  Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９９２）により再び使用されたプラスミドはｐＢａｌであり、これは、上記のように、ベクターＩＴＲ配列と重複する相同性を有し、そして結果として野生型ＡＡＶを生成する。第３に、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８，  １９９２）により使用されたｐＢａｌパッケージングプラスミド中で、ｒｅｐ遺伝子はその相同なｐ５プロモーターから離れて発現し、このように負に自己調節され、それ故にｒｅｐの発現は制限されるようである。
【００２８】
プラスミドのトランスフェクション後のｒｅｐ発現のやや最適のレベルの問題は、これらのタンパク質の別の生物学的活性に関連し得る。  ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質は、ｐＡＡＶ／Ａｄ（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，  １９８９）あるいはｐＢａｌ（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，  １９８８，１９９２）のような前述の全てのパッケージング構築物に使用されたＡＡＶ−ｐ５プロモーターからのそれ自体の発現を下方調節するという証拠がある（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，  １９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ６：２８８４−２８９４）。
【００２９】
（発明の開示）
遺伝子治療の基本的挑戦の１つは，エクスビボで容易に操作し得ず，活発に分裂しない細胞および組織の形質導入の方策の発展であった。例えば、ＡＡＶベクターは気道でのインビボ遺伝子移転を達成し得るが、可能な限り少量の十分に高い多重度のベクターの送達を可能にするように、高力価が重要である。これは、ＡＡＶに基づく遺伝子治療の可能性を決定するにおいて、中心的に重要な最適のパッケージングの方法論を作り出す。安定でヘルパーを含まないＡＡＶパッケージング細胞株は、主にＲｅｐタンパク質の活性のためにわかりにくかったが、Ｒｅｐタンパク質はそれ自体の発現を下方調節し、そして細胞の不死化を完全に変える。本発明において記載されるアプローチは効果的にこれらの問題を回避し、そしてパッケ−ジング効率を実質的に改良している。
【００３０】
高レベルのＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質を発現するＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターの使用は、他で報告されている（Ａｎｔｏｎｉら，１９９１）が、この発現システムの組換えＡＡＶベクターのパッケージングヘの適用は新たな発展である。実際、Ｒｅｐの発現レベルが同時トランスフェクションにおいてＡＡＶベクターのパッケージングプロセスを制限することは以前に示されていない。パッケージング力価の１０倍の上昇が、Ｒｅｐ発言の増加により達成されたという事実は、Ｒｅｐのレベルがこの環境において制限して鋳ることの直接的な証拠を提供する。ｐＡＲｔａｔ同時トランスフェクションがパッケージング効率をさらに上昇させなかったという事実は、以下のいずれかを示し得る：（１）２９３細胞におけるＨＩＶプロモーターからの発現レベルは、ｔａｔの非存在下において最大に引き上げられた、あるいは（２）ｐＲＳ５のみによって達成されたＲｅｐのレベルは、Ｒｅｐ発現がパッケージング効率をもはや制限していなかったことを確実にするに十分であった。現在、ｐＲＳ５に類似のパッケージングプラスミド中でＲｅｐを生成するために他の非ＡＡＶプロモーターが使用され得ることは明らかである。
【００３１】
同様に、組込まれた組換えＡＡＶゲノムの回収の現象は公知である（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，１９８５；Ｆｌｏｔｔｅら，１９９３ａ）が、本明細書で記載されているようなベクター産生細胞株の生産に適用されたことは未だかつてない。
【００３２】
ｐＲＳ５−ベクター細胞株システムの全体的なパッケージング効率は、パッケージング細胞当たり少なくとも１０４粒子であった。これは臨床用グレードのＡＡＶ組換えベクター試薬を生産させるに十分以上である。野生型ＡＡＶの生成はこの方法においては観察されておらず、これはほとんどの同時トランスフェクションよりもさらに有利な点である。これらの改良は遺伝子治療で使用される臨床用グレードのＡＡＶ組換えベクター生成を可能にする。
【００３３】
野生型ＡＡＶの非存在下での高力価のＡＡＶベクターを産生させる手順および構築物が本明細書中で記載されている。
【００３４】
従って、本発明の１つの実施態様は、高力価のＡＡＶ組換えベクター生成のプａセスであり、以下の工程を包含する：
（ａ）安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞を提供する工程であって、このＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そして細胞においてｒｅｐ遺伝子の発現が制限されている、工程；
（ｂ）このｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドを提供する工程であって、このプラスミドにおいて、ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そしてこのパッケージングプラスミドが工程（ａ）で提供される細胞中のベクターのＡＡＶ配列との重複する相同性を欠く、工程；
（ｃ）ＡＡＶパッケージングプラスミドを細胞に挿入する工程およびＡＡＶの複製を可能にする条年下で細胞をインキュベートする工程；および
（ｄ）工程（ｃ）で生産された組換えＡＡＶベクターを単離する工程。
【００３５】
この実施態様に含有されるプロセスでは、Ｒｅｐが作動可能に連結されているパッケージングプラスミドのプロモーターはＨＩＶ−ＬＴＲであり、そしてこのプロセスにおいてパッケージングプラスミドはＰＲＳ５である。
【００３６】
また、この実施態様に含有されるプロセスでは、標的ポリヌクレオチドは嚢胞性線維症トランスメンブランココンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）として機能し得るポリペプチドをコードする。
【００３７】
本発明の他の実施態様は高力価のＡＡＶ組換えベクターを生成するためのパッケージングシステムであり、以下を包含する：
（ａ）安定に組込まれた組換えＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを含有する細胞であって、このＡＡＶベクターがＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結した転写プロモーターを含み、そしてｒｅｐ遺伝子の発現が細胞において制限されている、細胞；および
（ｂ）ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にするＡＡＶパッケージングプラスミドであって、このプラスミドにおいて、ｒｅｐ遺伝子が異種プロモーターに作動可能に連結し、そしてパッケージングプラスミドが（ａ）で提供される細胞中のベクターのＡＡＶ配列と重複する相同性を欠く、プラスミド。
【００３８】
本発明のさらに他の実施態様は、ｒｅｐ遺伝子の産物の発現を可能にする高力価のＡＡＶ組換えベクターの生成の生産で使用するためパッケージングプラスミドであり、このプラスミドは異種プロモーターに作動可能に連結されるｒｅｐ遺伝子を含む。
【００３９】
発明の詳細な説明
ＡＡＶベクターは、ヒトの遺伝子治療、特に嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血症のような疾患に関係がある。本明細書で記載される発明は、遺伝子治療で使用するための高力価の組換えＡＡＶベクターの産生に使用する方法および物質を提供する。
【００４０】
本発明の実施には、性に示されていなければ、分子生物学、微生物学、腺換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術が使用されており、それらは当業者の技術範囲内である。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４），Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｉｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編，１９８７），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，およびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編，１９８７），およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ，Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編，１９９１）を参照のこと。本明細書中の前記および後記の全ての特許、特許出願、および出版物は本明細書中で参照として援用されている。
【００４１】
転写を必要とする異種ポリヌクレオチドを含有する高力価の組換えＡＡＶベクターの生成は以下の方法によって達成される。
【００４２】
この方法において、適切なＡＡＶベクタープラスミドを含有するクローン細胞が提供される。  ＡＡＶベクタープラスミドはＡＡＶ  ＩＴＲ領域および標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結される転写プロモーターを含有する。標的プロモーターに連結される転写プロモーターは転写物の形成を可能にし、そして例えば、非ＡＡＶプロモーターならびにｐ５、ｐ１９、ｐ４０のようなＡＡＶプロモーターおよびＡＡＶ  ＩＴＲプロモーターを含む。標的ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳産物は、好ましくは遺伝子治療に使用される。従って、標的ボリヌクレオチドは遺伝子治療のために送達される遺伝子を含み、例えば、ヘモグロビンのサブユニット鎖、酵素、嚢胞性腺維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（ＣＦＴＲ）のようなタンパク質などをコードする遺伝子である。標的ポリヌクレオチドはまた、転写されたときにアンチセンス分子として、転写あるいは翻訳因子に結合するデコイとして、リボザイムとしてなどの活性を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００４３】
この方法で提供されるクローン細胞の不可欠な特徴は、この細胞が安定に細胞に組込まれ、そしてまた相補的ＡＡＶｒｅｐまたはｒｅｐおよびｃａｐ機能がまた提供される時にアデノウイルスのようなヘルパーウイルスでトランスフェクトされた細胞の感染により回収され得る、ＡＡＶベクタープラスミドの少なくとも１つの完全なコピーを含有していることである。
【００４４】
以下の実施例において、発明者らはＡＡＶｎｅｏベクターを使用し、そこではベクター含有細胞株の初期選択をゲネチシン選択により行った。しかし、全く選択マー
カーを含有しないＣＦＴＲ遺伝子含有ＡＡＶベクターのようなベクターを含有する細胞株を生成するために、所望のベクタープラスミドおよび選択マーカーを含有する第２のプラスミドで共に細胞をトランスフェクトすることが簡単であることは当業者には明らかである。選択マーカーに基づく細胞クローンの選択後、高力価でベクターが回収され得るクローン細胞が直接スクリーニングを用いて容易に同定されることは明らかである。この１つの例がＦｌｏｔｔｅら（１９９３ａ）により報告されているが、その例では、ＡＡＶウイルスおよびアデノウイルスでの感染により細胞が回収された。Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３ａ）の記録によれば、選択マーカーを含有しない回収可能なＡＡＶベクターを含有する産生細胞株がまた得られ得た。その例では、ＡＡＶベクタープラスミドは、ＩＴＲを含有するＡＡＶプロモターに作動可能に連結されたヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含有する構築物を含有していた。これらのベクターの安定に組込まれたコピーを含有する細胞株は、ＡＡＶ−ＣＦＴＲベクタープラスミドおよび選択マーカ−ｎｅｏを含有する第２のプラスミドでのヒト上皮細胞株ＩＢ−３の同時トランスフェクションにより得られた。ゲネチシンでのコロニーの選択後、個々のクローンは、安定に組込まれたベクターを含有するものを得た。そのベクターは、ヘルパーアデノウイルスおよび野生型ＡＡＶ粒子による併発感染により回収され得る。これは、それ自体には選択マーカーを有さないベクターの安定に組込まれたコピーを有するクローンの生成を明らかに可能にする。
【００４５】
この方法はまた、補足パッケージングプラスミドを提供することを包含する。このプラスミドによりＲｅｐまたはＲｅｐおよびＣａｐタンパク質がｒｅｐまたはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子から発現され得る。パッケージングプラスミドは、ベクター間の配列の重複する相同性が欠けており、そしてＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む。さらに、パッケージングプラスミドとベクターとの組み合わせは、完全なＡＡＶゲノムを生じ得ない。下記の実施例では、ＡＡＶ  Ｐ５プロモーターの周囲の１２０ヌクレオチド長の配列が、パッケージングプラスミドとベクターの両方で欠けている。さらに、パッケージングプラスミドでは、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ  Ｐ５プロモーターから転写されないが、むしろ異種の転写プロモーターに作動可能に連結されており、ｒｅｐからの発現による負の様式で強く自己調節されない。
【００４６】
パッケージングプラスミドの好ましい例（例えば、ｐＲＳ５によって示される）に
おいて、本発明者らは、異種のプロモーターとしてＨＩＶ−ＬＴＲを用いたが、いずれの異種のプロモーターも用い得、そして好ましくは、構成性または誘導性のプロモーターが用いられ得る。ＨＩＶ−ＬＴＲは、両タイプのプロモーターの一例である。一般に、このプロモーターは、ｔａｔタンパク質の作用により非常に高レベルの発現を誘導し得る。しかし、本明細書で示される好ましい例では、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターは、２９３細胞において用いられる場合、ｒｅｐの高レベルの構成性発現を示す。これは、２９３細胞が、ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターをトランス作用活性化することが知られているアデノウイルスＥＩＡ遺伝子産物を発現するためである。従って、２９３細胞（ベクターを含む細胞を樹立するのに好ましい細胞株である）においては、ｐＲＳ５中のＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターをさらにトランス作用活性化することは、最大レベルの機能的ｒｅｐ発現を得るために必ずしも必要ではあり得ない。ベクター産生細胞株が別の細胞で作製される場合には、ｐＡＲｔａｔ（Ａｎｔｏｎｉら、１９９１）のようなｔａｔ発現プラスミドの追加によるｐＲＳ５のトランス作用活性化を所望し得る。このような細胞株は、任意のヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＫＢ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＷＩ３８）または適切なヘルパー機能が発現され得る任意の細胞株を含み得る。ヒトアデノウイルスをヘルパーとして用いる場合、これはサルの所望の細胞株ＶＥＲＯも含み得る。あるいは、ヘルペスウイルスあるいはワクシニアまたは鳥類のポックスのようなポックスウイルスを用いてヘルパー機能を提供する場合、任意の遺切なヒト、鰯歯類、またはサル細胞株はベクター変生細胞として十分であり得る。
【００４７】
ｐＲＳ５パッケージングプラスミドは誘導性または構成性プロモーターのいずれかのモデルとして役立つ。他の多くの誘導性または構成性プロモーターがパッケージングプラスミド構築物において用いられ得ることは当業者には明らかである。このパッケージングプラスミドの主な特徴は、それが野生型ＡＡＶ  ｐ５プロモーターを含まず、それ故ｒｅｐにより強く負に自己調節されないということである。そのようなプロモーターの他の例は、野生型ｐ５プロモーターの変異である。この変異により親の野生型プロモーターとの相同性が除かれるか、またはこのプロモーターの負の調節エレメント（例えば、ｐ５プロモーターのＹＹＩ領域）が不活化される。誘導性プロモーターの例には以下のものが挙げられる：金属イオン誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）；ステロイドホルモン誘導性
プロモーター（例えば、ＭＭＴＶプロモーター）；あるいは、成長ホルモンプロモーター；ヘルパーウイルスによって誘導され得るプロモーター（例えば、アデノウイルスＥＩＡタンパク質によって誘導され得るアデノウイルス初期遺伝子プロモーター）、またはアデノウイルス主要後期プロモータ−  ；  ＶＰ１６または１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質によって誘導され得るヘルペスウイルスプロモーター、あるいはワクシニアまたはポックスウイルス誘導性プロモーター、あるいはポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼによって誘導され得るプロモーター、あるいはポックスウイルスＲＮＡポリメラーゼによって誘導され得るＴ７ファージ由来のプロモーターのような細菌プロモーター、あるいはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ由来のプロモーターのような細菌プロモーター。
【００４８】
パッケージングプラスミドにおけるｒｅｐ発現のための異種プロモーターとしての使用に適切な多くの強力な構成性プロモーターがあり、それらには、アデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、βアクチン（ａｃｔｉｏｎ）プロモーター、またはβグロビンプロモーターを含む。  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって活性化されるプロモーターもまた用いられ得る。
【００４９】
ＡＡＶベクタープラスミドをパッケージングするためのＲｅｐおよびＣａｐ機能の補足に関するパッケージングプラスミドの効率は、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ機能を欠き、さらにマーカーを含むＡＡＶ発現ベクターを用いてテストされ得る。このような発現ベクターは当該分野で公知であり、例えば、ｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ構築物を含む（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２）。実施例では、記載されたパッケージング技術のそれぞれをテストするためにｐＡＡＶｐ５ｎｅｏをベクター構築物として用いた。なぜなら、ｐＡＡＶｐ５ｎｅｏはＤＮＡドットブロットによる粒子数（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）およびｎｅｏ一形質導入力価による粒子数についての両方の力価を測定し得るからである。
【００５０】
パッケージングプラスミドを、当該分野で公知の任意の適切な技術（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどを含む）によって、組み込まれたＡＡＶベクタープラスミドを含む細胞に導入する。パッケージングプラスミドの導入後、この細胞をＡＡＶの複製を可能にする条件下で３〜５日間増殖させ、細胞溶解物を調製し、そして組換えＡＡＶベクター粒子を当該分野で公知の技術により精製する。
【００５１】
以下の実施例は、当該分野に従事する当業者に対するさらなる指針として提供され、どのような方法によっても本発明を限定するものとして解釈されない。
【００５２】
Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞株中のプラスミドｐＲＳ５（Ｅ．ｃｏｌｉ：：ｐＲＳ５株）は、１９９３年１１月９日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌ１ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ２０８５２）に寄託され、受託番号６９４８３を付与された。寄託はブダペスト条約に基づいて行われた。本出願が米国特許として査定され、発行されるに際し、この寄託に関する全ての入手可能性の制限は変更不能に除かれる；そして指定された寄託物へのアクセスは、米国特許法施行規則§１．１４および米国特許法§１．２２に基づき特許商標庁長官によって権利が付与されることが決められた者に上記名称の出願が係属している間は利用可能である。さらに、指定された寄託物は、寄託の日から３０年間、または寄託の最終申請後５年間；あるいは米国特許を実施し得る期間、のいずれかより長い期間、維持される。本明細書で言及する寄託された物質は、簡便さのみを目的としており、本明細書の記載を考慮して本発明を実施するためには必要とされない。さらに、これらの物質は本明細書中で参考として援用される。
【００５３】
実施例
【実施例１】
【００５４】
パッケージングプラスミドｐＲＳ５
パッケージングプラスミドｐＲＳ５において、ＡＡＶ  ｐ５プロモーターは、ｒｅｐ遺伝子ポリペプチドの発現がそれ自身の合成を負に自己調節しないように異種のプロモーターで置換される。
【００５５】
プラスミドｐＲＳ５を、以前に記載されたｐＨＩＶｒｅｐ（Ａｎｔｏｎｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，６５：３９６−４０４）プラスミドの大きな（５ｋｂ）ＨｉｎｄＩＩＩからＳ油Ｉまでのフラグメント（ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターおよびｐＢＲ３２２プラスミド配列に隣接したＡＡＶヌクレオチドの２６３〜１８８６を合むｒｅｐ遺伝子配列を合む）をｐｃａｐｌと呼ばれるプラスミド由来のＨｉｎｄＩＩＩからＳｐｈＩまでのフラグメント（ｐＢＲ３２２プラスミド配列に隣接し、ＡＡＶ−ＩＴＲを有さないヌクレオチド１８８６〜４４９１に由来するＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む）に連結することにより構築した（図２参照）。これらの２つのフラグメントの連結後、パッケージングプラスミドｐＲＳ５を産生した。このプラスミドでは、ＡＡＶ−ｒｅｐ遺伝子（Ｒｅｐ６８および７８夕ンパク質）がＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターから転写され、より小さなＲｅｐ産物（４０ｋＤおよび５２ｋＤ  Ｒｅｐタンパク質）およびキャプシドタンパク質をそれぞれ内在的なＡＡＶ  ｐ１９プロモーターおよびｐ４０プロモーターが転写する。従って、ｐＲＳ５は、全ＡＡＶコーディング配列をヌクレオチド２６３〜４４９１のＡＡＶヌクレオチド配列内に含む。それは、異種ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターに作動可能に連結したＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８のｒｅｐコーディング配列を含み、ＡＡＶ  ｐ１９プロモーターからＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０を、そしてｐ４０プロモーターからＡＡＶキャプシドタンパク質を発現する。この構築物のマップを図１に示す。
【００５６】
記載されたパッケージング技術のそれぞれをテストするためにｐＡＡＶｐ５）ｎｅｏ構築物（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２）をベクター構築物として用いた。なぜなら、ｐＡＡＶｐ５ｎｅｏは、ＤＮＡドットブロットによる粒子数（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）およびｎｅｏ一形質導人力価による粒子数についての両方の力価を測定し得るからである。
【実施例２】
【００５７】
細胞株
ヒト２９３−３１細胞（Ｇｒａｈａｍら、１９６７，      Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ３６：５９−７２）を、１０％ウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅ改変必須培地で３７℃にて５％Ｃ０２下で増殖した。この２９３細胞株を、ベクター調製物のパッケージングおよびｎｅｏ形質導入力価の評価のためのｎｅｏ一形質券大実験の両方に用いた。
【実施例３】
【００５８】
ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーター−ｒｅｐ遺伝子プラスミドを用いる
ＡＡＶビリオンのパッケージング
ｐＲＳ５構築物を用いて、アデノウイルス５型（Ａｄ５）感染２９３細胞に同時トランスフェクションすることによりｐＡＡＶｐ５ｎｅｏベクタープラスミドをパッケージした（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２）。全部で１０枚の１０ｃｍ皿（それぞれ２×１０６個の２９３細胞を含む（準集密的））を、それぞれ１２．５μｇのｐＲＳ５およびｐＡＡＶｐ５ｎｅｏでトランスフェクションする前に、２×１０６ｐ．ｕ．のＡｄ５（ｍ．ｏ．ｉ．＝１）で１時間感染させた。次いで、採取の前に細胞を３日問３７℃でインキュベートした。次いで、細胞を掻き採って低速遠心分離（４０００ｒｐｍｘ１０分）によりプールした。
次いで、細胞ペレットを４ｍ１の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に再懸濁し、３回の凍結−融解により溶解し、２５ゲージ針で数回押出して粘性を減少させ、そしてミクロコッカスヌクレアーゼで処理した（４０μ１の３００μ／μｌストック、３７℃で２０分間、次いで４℃で１０分間インキュベートした）。次いで、最終密度が１．４１ｇ／ｃｃとなるようにＣｓＣｌを添加した。各試験管に０．５〜１．０ｍｌの鉱油を重層し、スウィングバケットローター（ＳＷ５０）で３５，ＯＯＯｒｐｍで４でにて１２時間遠心分離した。
次いで、０．５ｍ１の面分を連続して回収し、そして各々をＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションによって力価測定した（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）。各面分を１０倍に希釈し、ニトロセルロースフィルター上にブロットし、２．３ｋｂのｎｅｏ遺伝子フラグメントからＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍのランダムプライミングキットを用いて調製した３２Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。次いで、選択された灰分をＲｉｎｇｅｒ平衡食塩溶液、ｐＨ７．４に対して透析し、形質導入力価実験における使用のために−２０℃で保存した。
【実施例４】
【００５９】
ＡＡＶ−ｎｅｏベクターストックの形質導入力価の測定
上記で概説したようにして作製されたＡＡＶ−ｎｅｏベクターストックを、１細胞当たり１０〜１０００粒子の範囲の１０倍漸増粒子多重度で２９３−３１細胞を感染することにより、２９３−３１細胞において力価測定した。各場合、細胞を１ウェル当たり１０４細胞でマイクロタイターウェルに播種し、次いで、ベクターを直接培地に接種することにより２時間感染させた。次に、各ウェルの細胞を２４時間後にトリプシン処理し、４〜１００ｍｍ皿上にプレートした。次いで、各セットのうち３枚の皿を２００μｇ／ｍｌの用量のＧ４１８で選択した（活性、最初の感染から４８時間後に開始）。各セットの４番目の皿を平板効率についてのコントロールとしてＧ４１８なしで生育させた。細胞を１０日から１４日間選択し、サフラニンレッドで染色した。ゲネチシン耐性コロニーを計数して各セットの遺伝子コロニーの平均数を平板効率コントロールプレート内で見られるコロニー数で除すことにより形質導入頻度を決定した。次いで、このアッセイにおける形質導入単位（ｔ．ｕ．）を、６３％の細胞をゲネチシン耐性に形質導入するのに必要な１細胞当たりの接種容量として規定した。
【実施例５】
【００６０】
ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーター発現ベクターを用いることによる
同時トランスフェクションＡＡＶベクターパッケージングの改良
表１（実験１〜３）に、以前に確立されたｐＡＡＶ／Ａｄ同時トランスフェクション技術および並行したｐＲＳ５同時トランスフェクションによって変生されたＡＡＶ−ｎｅｏ粒子調製物のＤＮＡドットブロットカ価測定の結果を示す。
【表１】
2005110694.tif 000002
ａベクター調製物を以下のように得た。全てのベクター調製物は、ベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ（ｐＳＡ２０６）に由来するＡＡＶｎｅｏベクターを示す。実験１、２、および３では、ベクター調製物は、２９３細胞のヘルパーとしてのアデノウイルスでの感染、および感染細胞のベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ（ｐＳＡ２０６）およびパッケージングプラスミド（示したように、ｐＡＡＶ／Ａｄ、ｐＲＳ５、またはｐＲＳ５＋ｐＡＲｔａｔ）による同時感染により得られた。実験４では、ベクターは、細胞株ｎｅｏ４−６を、ヘルパーとしての感染するアデノウイルス５型の存在下でパッケージングプラスミドＰＲＳ５でトランスフェクトすることにより、この細胞株から組み込まれたベクターを回収することにより得られた。細胞株ｎｅｏ４−６は、２９３細胞をベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ（ｐＳＡ２０６）でトランスフェクトし、抗生物質Ｇ４１８  （ゲネチシン）でゲネチシン耐性を選択することにより得られた。全てのベクター調製物をＣｓＣｌ中でのバンド形成により精製した。
ｂ精製したベクター調製物をドットブロットアッセイによりアッセイして粒子力価を測定した。
【００６１】
表１の結果は、同時トランスフェクションによって導入されたｐＲＳ５構築物によって達成される力価（実験例４）が、ｐＡＡＶ／Ａｄパッケージングプラスミドを用いて得られる力価より約５〜１０倍高かったことを示す。プラスミドの３重トランスフェクションによるＨＩＶの転写のトランスアクチベーター（ｔａｔ）遺伝子の追加によってもパッケージング効率はほとんど増加しなかった。図３に示した実験において、ｐＲＳ５単独での３．０×１０１０からｐＲＳ５十ｐＡＲｔａｔによる４．０×１０１０まで、最大力価両分の粒子力価において３０％のみ増加していた。これらの結果に基づいて、ｒｅｐおよびｃａｐ発現レベルは、もはやこの技術において制限しないように思われた。
図３の実験は以下のように行った。
【実施例６】
【００６２】
安定な細胞株に存在する完全なＡＡＶ−ｎｅｏゲノムの回収
この実施例では、２×１０６のヒト２９３細胞の培養物を、５μｇのＡＡＶベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ（ｐＳＡ２０６）でトランスフェクトした。個々のコロニーを、培地１ｍ１当たり２００μｇの活性なＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて、トランスフェクションの４８時間目からゲネチシン耐性を選択した。個々のＧ４１８耐性コロニーを滅菌クローニングシリンダーによって単離し、安定な細胞株に拡大した。これらの細胞株のいくつかから、２×１０６細胞をアデノウイルス５型（ｍｏｉ＝２）および野生型ＡＡＶ２（ｍｏｉ＝２）の両方で感染した。  ４８時間後、低分子量ＤＮＡをＨｉｒｔ高垣界面活性剤手法を用いて選択し、そして０．７％アガロースゲル電気泳動およびランダムプライム３２Ｐ標識ｎｅｏＤＮＡプローブによるサザンブロッティングにより分析した。  Ｈｉｒｔ抽出ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図３に示す。
【００６３】
図は、７〜８個の個別の細胞株を試験し（トラックＡ〜Ｇ）、ベクター配列が回収され複製され得たことを示す。トラックＨは、１つのゲネチシン耐性細胞株の一例を示し、それからはベクターは回収され得なかった。
【００６４】
ベクターゲノムの予想された細胎内複製種（ＲＦｍはモノマー二本鎖複製型およびＲＦｄは二本鎖ダイマー複製型）およびその子孫の一本鎖ゲノム（ＳＳ）を示す。８例のうち少なくとも６例（トラックＡ〜Ｄ、ならびにトラックＦおよびＧ）において、再配列されなかったベクターのコピーを回収した。
【実施例７】
【００６５】
組込まれた回収可能なＡＡＶベクターを有する細胞株の使用は
パッケージング効率を改良する
ｐＲＳ５構築物のＡＡＶ−ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現を改良した後、本発明者らは、組込まれているが回収可能なＡＡＶ−ｎｅｏベクターゲノムのコピーを含む均一な細胞集団を産生することによりパッケージング効率をさらに改良しようとした。ｒｅｐおよびｃａｐのｐＲＳ５トランスフェクションと細胞株へのｐＡＡＶ−ｐ５ｎｅｏベクターの安定な添加との組み合せにより、パッケージング効率を顕著に改良した。
細胞株を、野生型ＡＡＶ２およびＡｄ５の両方で各ウイルスにつき５ｍ．ｏ．ｉ．で感染されたＡＡＶ−ｐｓｎｅｏをトランスフェクトすることにより産生した。Ｈｉｒｔ抽出を用いて、複製ウイルスＤＮＡを単離し、そしてこれらのＤＮＡサンプルを電気泳動および３２Ｐ標識したｎｅｏプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。図３に示すように、回収可能なＡＡＶ−ｎｅｏ組換え体は、ほぼ全てのこれらの細胞株に存在していた。予想通りのバンドのパターンは、一本鎖（ゲル底付近のぼやけたバンド）、２．７ｋｂサイズの二本鎖モノマー、５．４ｋｂのダイマー、より大きなマルチマー形態を含んでいた。
同様の様式で作製し、ｎｅｏ４−６およびｎｅｏ４−９と命名した２つの細胞株を構築し、そして続いてのパッケージング実験に用いた。直接的な比較を、２９３細胞へのｐＲＳ５およびｐＡＡＶ−ｐ５ｎｅｏの同時トランスフェクションとｎｅｏ４−６またはｎｅｏ４−９細胞株のいずれかへのｐＲＳ５の単一トランスフェクションとの間で行った。表１に示すように、ｎｅｏ４−６細胞株は、力価が２．６×１０１１であるパッケージされたＡＡＶ−ｎｅｏを産生した。この粒子力価は、２９３細胞同時トランスフェクション法の数倍の改良を示し、そして任意の方法または用いた方法の組み合せの最も高い力価を生じた。ほぼ２，６×１０１１粒子の全粒子力価は、２×１０７細胞から始まって達成され、そして１細胞につき１０４粒子を生じることを示す。
上記のアッセイは、ＡＡＶ粒子中にパッケージされていないＡＡＶ−ｎｅｏゲノムのコピーも理論的には検出し得るＤＮＡ／ドットブロット法に全て基づいている。２つの型のコンントロール実験の結果は、この可能性を排除した。まず、ＡＡＶｐ５ｎｅｏおよびＰＲＳ５プラスミドを、上記のとおりではあるが、Ａｄ５感染の非存在下で２９３細胞に同時トランスフェクトした。これらの細胞の溶解物を、上記の任意の他の調製物とともに処理した。図４に示すように、コントロールのドットブロットハイブリダイゼーションは、ｎｅｏシグナルがパッケージしたＡＡＶ−ｎｅｏゲノムを反映していることを示した。
【００６６】
ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションを、以下のように行った：最初に５０マイクロリットルの各画分を用いて、５回の１０倍の連続希釈をＰＢＳで行った。ビリオンを溶解するために、１／１０容量（５μｌ）の３Ｎ  ＮａＯＨを添加し、そして混合物を６５°Ｃで１時間インキュベートした。等量（５０μｌ）の２Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、ｐＨ７．０を添加して、合計１００μｌ容量を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉマイクロサンプル濾過マニホルドを用いて０．４５μｍナイロンフィルター上に移した。次いで、これらのフィルターを標準条件下でランダムプライム３２Ｐ標識ｎｅｏＤＮＡプローブでハイブリダイズした。
【００６７】
上記のように調製したコントロールストックの１０倍連続希釈物を、アデノウイルス感染後、ｎｅｏ４−９細胞株のｐＲＳ５トランスフェクションにより調製されたＡＡＶ−ｎｅｏストックの希釈物と比較した（カラムＡに示す）。カラムＢは、アデノウイルス感染のないｎｅｏ４−９細胞株のｐＲＳ５トランスフェクションを示す。カラムＣは、ｐＲＳ５トランスフェクションをしていないｎｅｏ４−６細胞株のアデノウイルス感染を示す。カラムＤは、ｐＲＳ５同時トランスフェクションをしていないＰＳＡ２０６トランスフェクト２９３細胞のアデノウイルス感染を示す。存続した細胞またはプラスミドＤＮＡが顕著なｎｅｏシグナルを提供する場合はなかった。図４の結果は、検出可能なＡＡＶ−ｎｅｏシグナルが、この実験のＤＮＡ／ドットブロットハイブリダイゼーションに存在しないことを示し、これはプラスミドＤＮＡがこれらの精製調製物中に存在しないこと
を明確に示す。
【００６８】
次いで、直接的な比較を、２つのプラスミドトランスフェクション系で、または安定な株からのベクターの回収により産生されるＡＡＶ−ｎｅｏベクターストックの形質導人力価について行った。表２に示すとおり、いずれかの系で産生された等数のベクター粒子を用いて得た形質導入の頻度は同様であった。これは、安定な細胞株からベクターを回収することにより生じたベクター粒子が、２つのトランスフェクションで生じた粒子と等しい生物学的効率および形質導入能力であったことを示す。従って、細胞株から回収したベクターは、顕著な生物学的改変を有さなかった。
【表１】
2005110694.tif 000003
ａ  いくつかのＡＡＶ−ｎｅｏベクター調製物の形質導入効率を２９３細胞株で比較した。
ｂ  ベクター調製物を、以下のように得た：全てのベクター調製物は、ベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ由来のＡＡＶｐ５ｎｅｏベクターを示す。ｎｅｏ４−６およびｎｅｏ４−９と命名した調製物を、ヘルパーとして感染アデノウイルス５の存在下で、パッケージングプラスミドｐＲＳ５で細胞株をトランスフェクションすることによる細胞株４−６または４−９由来の組込まれたベクターを回収することにより得た。細胞株４−６および４−９を、ベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏでの２９３細胞のトランスフェクションおよびゲネチシン耐性について抗生物質Ｇ４１８（ゲネチシン）での選択により得た。
ｐＲＳ５  ｔｒｆと命名したベクター調製物を、ヘルパーとしての感染するアデノウイルス５型の存在下で、ベクタープラスミドｐＡＡＶｐ５ｎｅｏおよびパッケージングプラスミドｐＲＳ５で２９３細胞を直接同時トランスフェクションすることにより得た。べクター調製物ｐＲＳ＋ｔａｔもまた、同時トランスフェクションがＨＩＶ  ｔａｔ転写アクチベーターを発現するプラスミドｐＡＲｔａｔも含むことを除いて、ｐＲＳ５  ｔｒｆと全く同様の直接トランスフェクションにより得た。
ｃ  １０４の２９３細胞の培養梅を、１０５粒子のＡＡＶｎｅｏベクター調製物で感染した。従って、各ベクターの調黄梅を用いて、１細胞につき１０ベクター粒子の多重度で２９３細胞を感染した。
ｄ次いで、感染した培養物を、ゲネチシン耐性コロニーを選択するための条件下で増殖した。ゲネチシン耐性に安定に形質導入した２９３細胞のパーセント（すなわち、形質導入頻度）を、ゲネチシンで処理していないコントロール培養で得たコロニーの数で除した個々の培養物由来のゲネチシン耐性コロニーの数として算出した。
【００６９】
上記の結果は、本明細書に記載の組み合わせた改変が、約５０〜１００倍のベクターカ価で増加を生じ得ることを示す。また、既に公表された報告と比較して（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）、この手順は、少なくとも２×１０１１のベクター粒子力価を与え得、これは、同数の細胞（すなわち、合計１０枚の１０ｃｍ細胞培養皿で増殖したヒト２９３細胞）から既に達成されたベクター粒子力価よりも３オーダー大きい。
【実施例８】
【００７０】
ＣＦＴＲをコードするＡＡＶベクターのパッケージング
ＡＡＶ−ＣＦＴＲベクターｐＴＲＦ４２は、選択マーカーの非存在下でプロモーターとしてＡＡＶ  ＩＴＲから発現したＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含み、ｐＳＶｎｅｏプラスミドとの同時トランスフェクションにより２９３細胞株中に安定なベクター産生株を生じるために用いた。このベクターは、安定な細胞株から回収可能であり、そして回収したベクターは完全であり、再配列されなかった。
【００７１】
ｐＴＲＦ４２の構築は記載されている（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３ａ，Ｊ、Ｂｉｏｌ．    Ｃｈｅｍ．      ２６８：３７８１−３７９０）。この構築物は、ＡＡＶ  ５’末端（ＩＴＲ）の１４５ヌクレオチド、それに続くインフレームのＡＴＧ（Ｍｅｔ）開始コドンからなるＡＡＶ−ＣＦＴＲベクターを含み、アミノ酸１Ｈ９からのＣＦＴＲコーディング配列を直接的に読み取る。ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡの残りは、天然の終結コドンより下流および元の配列のヌクレオチド４６２９までで完全である。これに、合成ポリアデニル化シグナルが続き、次いでＡＡＶヌクレオチド４４９０−４６８１（３’  ＩＴＲ）が続く。４マイクログラムのこのベクターを、２×１０６個のヒト２９３細胞に１マイクログラムのｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドで同時トランスフェクトし、次いで、これを、トランスフェクション４８時間後に初めて、２００μｇの活性なＧ−４１８で選択した。次いで、Ｇ一４１８耐性クローンをクローニングシリンダーで単離し、そして増大した。ｎｅｏベクター含有株について行ったように、クローンを、組み合わせた野生型ＡＡＶ２およびＡｄ５感染（それぞれ、ｍｏｉ＝２）で回収することにより分析した。低分子量ＤＮＡ（Ｈｉｒｔ）抽出物を、再び０．７％アガロースゲル電気泳動およびランダムプライム３２Ｐ標識ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡプローブを用いるサザンブロッティングにより分析した。再度、細胞株は、モノマーおよびダイマーの複製形態（ＲＦ）について推測されたサイズ（それぞれ約４．６および９．  ２ｋｂ）の回収可能な完全なベクター配列を有することが見出された。これは、回収可能なベクターを含む細胞株を臨床的に重要な例のΛＡＶ−ＣＦＴＲベクターとともに利用するアプローチの有用性を確認した。
上記の原理および技術は、本発明のさらなる例を作るために適応され、そのうちのいくつかを後述し、本発明の有用性をさらに示す。
【実施例９】
【００７２】
肺気道上皮へのｌａｃＺ遺伝子の組込み
前記の方法によりパッケージされたベクターのインビボ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素をコードするｌａｃＺ遺伝子を用いてテストした。ＡＡＶｐ５ｌｐ５ｌａｃＺベクター−を、ｐＡＡＶｐ５ｎｅｏ構築物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、そしてＨｉｎｄｉ  ＩＩを有する大きなフラグメント（ＡＡＶｐ５プロモーターに隣接するＡＡＶ  ＩＴＲおよび合成ポリアデニル化配列を含む）をＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子を合むｐＳＶＢｇａｌ由来のＢａｍＨＩフラグメントに連結することにより作製した。次いで、この最初の構築物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で平滑末端にし、そして大きなフラグメントを再連結することにより改変した。この最終操作により、ｌａｃＺコーディング配列とフレームが合わない４つのＡＴＧコドンを含む配列の介在セグメントの除去が可能になった。次いで、ベクターを、上記のようにｐＲＳ５ブラスミドを用いてパッケージした。
【００７３】
０．２〜０．５ｍｌ中に１０１０粒子を含むパッケージされたＡＡＶｐ５ｌａｃＺのアリコートを、３匹の離乳したＣ５７ＢＬマウスに腹腔内注射により投与した。ベクターを透析する同じ媒体溶液のアリコートを、コントロールとして用いた３匹の別のマウスに注射した。これらのマウスの体重は、それぞれ約３０ｇｍであり、１０８細胞と１０９細胞との間の推定総体細胞数を有する。従って、１細胞当たりの平均ベクター用量は、血流に依存して１細胞当たり１０粒子と１００粒子との間であった。動物をペントバルビタールの過剰用量により４日後に屠殺し、そして腹部壁、肺、肝臓、肺臓、腎臓、および膵臓のサンプルを採取し、２．５％グルタルアルデヒドで固定した。
【００７４】
インサイチュＰＣＲアッセイを、５ミクロンのパラフィン包埋組織切片で、ベクター特異的プライマーおよび非放射活性ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ、抗ジゴキシゲニン、上記のようなアルカリホスファターゼ免疫検出系（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９３）を用いて行った。プライマーをｌａｃＺ配列内から選択した（５’−プライマー：５−ＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴ一３’；３’−プライマー：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＴＣＧＣＴＡ−３’）。８２℃で高熱スタートした後、４０サイクルのＰＣＲを、反応産物中のジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の直接組込みを用いて行った。次いで、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで標識した抗ジゴキシゲニン抗体（Ｇｅｎｉｕｓ  ＩＩＩキット、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および免疫組織化学染色（ＮＢＴ、Ｘ−ｐｈｏｓ）を用いて検出した。
【００７５】
ベクター注射およびコントロール注射したマウスの種々の組織切片を光学顕微鏡により試験した。ベクターＤＮＡ含有細胞を、核を重層する暗紫色一褐色反応産物により示した。染色は、ベクター注射したマウス由来の切片で明らかに観察されるが、コントロール由来の切片では観察されなかった。ベクターＤＮＡを、肺の全ての細胞型、ならびにほとんどの肝細胞および膵臓腺房細胞で検出した。リンパ管を介した吸収後、ベクター粒子は、静脈循環に入り、そして肺循環に遭遇する。これは、肺における非常に効果的な遺伝子移動の原因のようである。肺を介して全身循環への通過後、ベクター粒子は、高血流の他の組織に最も効果的に分布したようである。
【実施例１０】
【００７６】
インビボでのｌａｃＺ遺伝子の発現
インサイチュＰＣＲ検出のために用いた同じ組織サンプルの一連の切片を、Ｘ−ｇａｌ試薬とともにβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した（０．２％、３７℃、１６時間）。ＡＡＶ５ｌａｃＺで注射したマウス由来の切片を、媒体コントロールで注射したマウス由来の切片と比較した。コントロール動物の肺、脾臓、肝臓、膵臓、腎臓、または腹膜から採取した切片では、内囚性β−ガラクトシダーゼ活性を検出し得なかった。
肺の切片は、ベクター注射動物の気道上皮のセグメント全休にｌａｃＺ発現を示したが、コントロールでは示さなかった。気道のいくつかでは、試験した２００細胞の７５％より多くが、陽性に染色した。気道の約２５％はこの程度の陽性の染色を示した（１切片につき４〜６の試験した気道、１匹の動物につき１〜２の切片）が、肺の他の領域はより低いレベルの発現であった。
膵臓切片は、ベクター注射動物の非リンパ系領域にβ−ガラクトシダーゼ活性を示したが、コントロールでは示さなかった。膵臓内のリンパ小節は本質的に陰性であった。肺内の非上皮細胞またはベクター処理した動物の肝臓、腹部壁、および腎臓の細胞で染色はまれに見られるが、膵臓では発現は検出され得なかった。
ベクターＤＮＡの分布を、インサイチュＰＣＲアッセイにより検出したように、以下のとおり、表３のβ−ガラクトシダーゼ活性の分布と比較する（ｎ＝３）：（――）非染色、（＋）Ｘ−ｇａｌ染色した細胞＜１％、（＋＋）１〜２５％の染色、（＋＋＋）＞２５％染色、（ｎｄ）行わず。
【表３】
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【００７７】
従って、β−ガラクトシダーゼ活性の発現は、ＤＮＡベクターの分布およびプロモーターの組織特異性の両方に依存する。例えば、ｐ５プロモーターは、気道上皮細胞で非常に活性であるが、テストした他の細胞、例えば、膵臓由来の細胞ではあまり活性でない。
【実施例１１】
【００７８】
肺癌腫細胞におけるＣＤ４４遺伝子の組込みおよび発現
ｐ５プロモーター由来の細胞表面マーカーＣＤ４４を発現するｐＳＡｃｄ４４ベクターを、ｐＳＡ２０６（ＡＡＶｐ５ｎｅｏ）構築物から直接的にサブクローニングした。粒子数を、ドットプロット分析により決定した。このベクターおよびｐＲＳ５パッケージングプラスミドを、肺癌腫細胞株Ｈ２０９およびＨ８２に同時トランスフェクトした。種々の用量のベクターを、アリコートにつき４×１０４細胞でテストした。トランスフェクションの４８〜７２時間後、細胞を抗ＣＤ４４抗体を用いて細胞表面遺伝子の発現を蛍光染色した。次いで、細胞を蛍光活性化細胞計測器に通し、陽性染色した割合を決定した。
【００７９】
この分析の結果を図６に示す。ウイルス力価を１０４の単位で表す；従って、横軸上の「１０００」は、１癌腫細胞につき２５０ベクター粒子を示す。高頻度のＣＤ４４発現は、１細胞につき１００粒子程度の低い用量で達成された。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＡＡＶのライフサイクルの図である。
【図２】パッケージングプラスミドｐＲＳ５の育生、ならびにＨＩＶ１−ＬＴＲプロモーターとＡＡＶ２  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のコーディング配列との関係を示すスキームである。
【図３】安定な細胞株に存在する回収可能な完全なＡＡＶ−ｎｅｏゲノムを示すＨｉｒｔ抽出ＤＮＡサンプルのササンブロットの網版複写物である。
【図４】コントロールおよびパッケージされたＡＡＶ−ｎｅｏゲノムにおけるｎｅｏの検出を比較するドットブロットハイブリダイゼーションの網版複写物である。
【図５】２９３細胞、ベクター変生クローンからのＡＡＶ  ＣＦＴＲベクター（ＴＲＦ４２）の回収を示す、Ｈｉｒｔ抽出ＤＮＡサンプルのサザンブロットの網版複写物である。
【図６】抗体染色およびＦＡＣＳ分析により決定される、ＣＤ４４マーカーで染色された肺癌種細胞の割合のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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