(57)【要約】【課題】  大豆オリゴ糖を消費しにくくした納豆菌を開発し、該納豆菌を用いて発酵することにより、健康機能に優れた大豆オリゴ糖高含有納豆を提供すること。【解決手段】  納豆菌のレバンシュクラーゼ遺伝子を、遺伝子操作によりまた突然変異処理によって、  欠損させたレバンシュクラーゼ欠損性納豆菌を開発し、該納豆菌を用いて納豆を発酵生産することにより、大豆中に本来含有する大豆オリゴ糖が発酵中に減少しにくくし、その結果、健康機能に優れた大豆オリゴ糖を高濃度に含有する納豆を製造する。さらに、該納豆菌を用いて発酵する際に、大豆オリゴ糖含有物を必要に応じて添加し、任意の濃度で大豆オリゴ糖を含有する大豆オリゴ糖高含有納豆を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバンシュクラーゼ活性を欠損させたことを特徴とする納豆菌。
【請求項２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ２２（バシラス  サチリス  ｓａｃＢ２２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３８）。
【請求項３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｂ−１（バシラス  サチリス  Ｂ−１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５８４）。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の納豆菌を使用すること、を特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項５】
請求項１、２又は３に記載の納豆菌を用い、大豆オリゴ糖又は大豆オリゴ糖含有物を添加して製造すること、を特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
【請求項６】
大豆オリゴ糖含有物が大豆煮汁又はその処理物であること、を特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該処理物が大豆煮汁の濃縮物、ペースト化物、乾燥物、希釈物の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法で製造してなる大豆オリゴ糖高含有納豆。
【請求項９】
大豆オリゴ糖が納豆菌によって消費されるタイプの大豆オリゴ糖であること、を特徴とする請求項８に記載の大豆オリゴ糖高含有納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、レバンシュクラーゼ欠損性納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された大豆オリゴ糖高含有納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース）は、腸内のビフィズス菌を増殖させ、腸内菌そうの改善、腸内腐敗産物の抑制、便性改善などの優れた健康機能を有することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
大豆オリゴ糖は大豆中に含まれ、大豆を食することによって上記の健康機能が発揮されることが期待されるが、一方、納豆は大豆から生産される健康食品でありながら、発酵過程において煮豆中に含まれる大豆オリゴ糖が納豆菌により消費されるため、ほとんど大豆オリゴ糖を含まないことが知られていた（例えば、非特許文献２参照）。
【０００４】
このような背景の中で、納豆の原料となる煮豆中に、納豆菌によって消費されないオリゴ糖類を添加して発酵させ、オリゴ糖含有量を高めた納豆を製造する方法も開発されていた（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、この方法では、本来大豆中に含有されている大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース）そのものの含量を高めることはできず、大豆オリゴ糖の有する上記の健康機能を高めるという点では充分に満足できるものではなかった。このように、本来大豆中に存在してはいるものの納豆菌によって消費される大豆オリゴ糖を高含有する納豆を、製品納豆に大豆オリゴ糖を強化する方法ではなく、発酵法によって直接製造するのに成功した例は未だ報告されていない。
【非特許文献１】「健康・栄養食品研究、３巻、ｐ．８９〜９１、２０００年」
【非特許文献２】「日本食品工業学会誌、２９巻、ｐ．１０５〜１１０ぺージ、１９８２年」
【特許文献１】特開２００３−２３５４９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、大豆中に本来含有されている大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース）の含量を高めた納豆を製造する方法を提供し、大豆本来の健康機能を発揮させることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑み、本発明者らは、各方面から検討を行い、納豆菌由来の各種酵素の研究の課程において、レバンシュクラーゼ（レバンシュークラーゼあるいはレバンスクラーゼともいわれるが、本明細書ではレバンシュクラーゼという）に着目した。
【０００８】
このように、レバンシュクラーゼは納豆菌がつくる酵素であり、大豆中の主要な炭素源であるショ糖の資化作用に必要な酵素の一つであることと言われており、該酵素を欠損させると納豆菌の生育が悪くなることが予測される。
さらに、レバンシュクラーゼは、納豆の糸引き成分の一つであるレバンの生合成にかかわっているので、該酵素活性を欠損させると納豆の品質、特に糸引きの悪化を引き起こす可能性があることも予想された。
【０００９】
したがって、納豆菌の生育において、レバンシュクラーゼは必須の酵素であって、理論上当然のことながら、これを欠損した納豆菌は生育が困難であるため、納豆の製造には使用することができない。しかしながら、本発明者らは、発想を転換して、このような技術常識に敢えて挑戦し、レバンシュクラーゼについて更に検討した。そして、煮豆に含まれる大豆オリゴ糖（ラフィノース、スタキオース等）は納豆菌のレバンシュクラーゼによって分解されている可能性に着目し、レバンシュクラーゼ活性を欠損させた納豆菌を開発し、該納豆菌を用いて納豆を製造すれば、大豆オリゴ糖が分解されず大豆オリゴ糖を高含有した新規納豆が製造できるのではないかという新規着想を得た。
【００１０】
そこでこの新規着想に基づき、鋭意研究努力の結果、レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌の創製、取得に成功し、それを用いて納豆を製造することにより、納豆中の大豆オリゴ糖含有量、納豆菌の生育、納豆品質などに及ぼす影響を確認した結果、悪影響は殆どないことが確認でき、上記技術常識とは全く逆に、大豆オリゴ糖含有納豆の創製にはじめて成功し、本発明を完成させることが出来たのである。
【００１１】
すなわち本発明は、大豆に本来含まれているオリゴ糖であって、発酵の課程において納豆菌によって消費されるオリゴ糖を高含有する新規納豆の製造に関するものであって、その実施態様としては、例えば次のものが包含される。
【００１２】
（１）レバンシュクラーゼ活性を欠損ないし低下せしめたことを特徴とする納豆菌。
（２）ｓａｃＢ遺伝子を破壊した納豆菌、ないしは、破壊したｓａｃＢ遺伝子を導入したプラスミド（例えば、ｐＳＣＥＮ１）で形質転換した納豆菌。
（３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ２２（バシラス  サチリス  ｓａｃＢ２２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３８）。
（４）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｂ−１（バシラス  サチリス  Ｂ−１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５８４）。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）の少なくとも１項に記載の納豆菌を使用すること、を特徴とする大豆オリゴ糖高含有納豆の製造方法。
（６）大豆オリゴ糖及び／又は大豆オリゴ糖含有物の存在下で行うこと、を特徴とする上記（５）に記載の方法。
（７）大豆オリゴ糖含有物が大豆煮汁及び／又はその処理物（濃縮物、ペースト化物、乾燥物、希釈物の少なくともひとつ）であること、を特徴とする上記（６）に記載の方法。
【００１４】
（８）上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の方法で製造してなる大豆オリゴ糖高含有納豆。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、大豆中に本来含有されている大豆オリゴ糖を高濃度で含有する納豆を提供できる。また、必要に応じて大豆オリゴ糖を添加した場合にも、ほとんど大豆オリゴ糖が消費されず、より高濃度に大豆オリゴ糖を含有した健康機能により優れた大豆オリゴ糖高含有納豆を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、およびさらに改良を重ねて得られた優れた納豆菌などを用いるのが望ましい。
【００１７】
納豆菌は、枯草菌バシルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシルス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと枯草菌と区別して分類する場合もある。納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ  ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがあるほか、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００１８】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１９】
本発明では、まず、これら納豆菌のレバンシュクラーゼ遺伝子を欠損させ、該酵素活性を失活させた納豆菌を育種することにより、大豆オリゴ糖の消費能力を抑えた納豆菌を取得するのである。
【００２０】
育種法の一つとして相同組換えを利用した遺伝子改良法が採用可能であるが、本方法の利点は狙いを定めた遺伝子だけを特異的に欠損させることが可能であり、そのため納豆菌などの工業的に利用される微生物においては、他の優れた特性は壊さずに、欠点となっている性質に関与する遺伝子だけに変異を起こさせて改良することができることである。
【００２１】
さらに、スタールらが枯草菌バシルス・サチリス（Ｂａｃｉ１ｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において開発した相同組換え能を利用した遺伝子失活法（例えば、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１５８巻、ｐ．４１１〜４１８、１９８４年」参照）を納豆菌用に改変した方法も利用可能である。この方法は、最終的には、育種のための遺伝子破壊などの目的で納豆菌に導入した異種遺伝子を完全に除去することができる方法であるため、育種された菌は遺伝子組換え菌とはならないなどの長所を有している。
【００２２】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、納豆菌を遺伝子導入活性が高くなる状態にするいわゆるコンピテンス法（例えば、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ１  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９〜２２１、１９７１年」参照）が利用可能である。
【００２３】
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法が既に開発されており（例えば、「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、６３巻、ｐ．４０８３−４０８９、１９９７年」参照）、本発明ではこの方法も利用可能である。
【００２４】
本発明においては、上記の育種方法を用いて、納豆菌のレバンシュクラーゼの生合成に関与する遺伝子を欠損させることによって目的のレバンシシュクラーゼ活性欠損性納豆菌を作製するのであるが、納豆菌のレバンシュクラーゼ生合成に関与する遺伝子の詳細な情報は知られていない。
【００２５】
そこで本発明者らは、各方面から鋭意検討した結果、可能性のある遺伝子としては、近年完成した枯草菌バシルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の総ゲノム情報（例えば、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９０巻、ｐ．２４９〜２５６、１９９７年」参照）から推定したｓａｃＢ遺伝子が有力なものの一つとして選択した。
【００２６】
なお、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、すなわち、既に目的遺伝子が欠損している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤変異法などによってこれらの遺伝子を変異欠損させるなどの突然変異法など、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
【００２７】
突然変異処理としては、上記した薬剤処理による変異法のほか、物理的処理による変異法等の常法が適宜使用される。薬剤処理としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトログアニジン、エチジウムブロマイド、ナイトロジェンマスタード、ジエポキシブタン、コルヒチン、パーオキサイド、、プリン誘導体、亜硝酸、アクリジン系色素等による処理が挙げられ、物理的処理としては、γ線、紫外線、温度差処理等が例示される。
【００２８】
レバンシュクラーゼ欠損性納豆菌の分離方法としては、枯草菌バシルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンシュクラーゼ欠損株はショ糖を炭素源に含むプレート上で生育させたときのコロニー形態が親株と異なるため（例えば、特表昭６０−５５０５９８号公報参照）、該コロニー形態を指標として蛮異株を選抜する方法などによっても分離可能である。
【００２９】
このようにして開発されたレバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００３０】
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２Ｋｇ／ｃｍ2、１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００３１】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したレバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００３２】
このようにしてレバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌を用いて生産した納豆と、従来から利用されている通常の納豆菌を用いた納豆とを比較すると、レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌で製造した納豆は、大豆オリゴ糖を高濃度で含有しており、大豆本来の健康機能が発揮される優れた納豆であることが確認できる。
【００３３】
さらに、本発明においては、より高濃度で大豆オリゴ糖を含有する納豆を製造する方法として、大豆に対して、大豆オリゴ糖及び／又は大豆オリゴ糖含有物を添加含有させた後、上記レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌を用いて発酵することができる。
【００３４】
添加する大豆オリゴ糖としては、ラフィノースやスタキオースなどの大豆中に含有される大豆オリゴ糖がよく、また、大豆から抽出精製した大豆オリゴ糖製品、例えばＳＯＹＡ  ＯＬＩＧＯ（カルピス社製）などが例示される。
【００３５】
大豆オリゴ糖の添加時期は納豆菌で発酵させる工程以前が望ましく、さらに大豆を水に浸漬する工程や、引き続いて大豆を蒸煮する工程、あるいは大豆蒸煮後の工程などがより望ましい。
【００３６】
更に、大豆オリゴ糖含有物としては、大豆オリゴ糖を含有する物であれば全ての物が含まれ、例えば精製度の高くないオリゴ糖を含有する大豆抽出物も利用できる。このような精製度の低いものとしては、例えば大豆蒸煮工程で得られる大豆煮汁及び／又はその処理物（濃縮物、ペースト化物、乾燥物、乾燥粉末、希釈物から選ばれる少なくともひとつ）が挙げられる。納豆は、常に大豆の蒸煮工程を経て製造されることになるが、蒸煮工程においては大豆煮汁が発生するのが一般的であり、大豆煮汁は最終的には蒸煮釜の外部に流出させ、廃棄されるのが常である。
【００３７】
しかし、この大豆煮汁中には大豆中の水溶性の糖類、特に大豆オリゴ糖を初めとする各種の有効成分が溶出含有されている。本発明においては、このような大豆煮汁を有効利用する方法として、蒸煮大豆に添加して利用することが可能である。
【００３８】
大豆煮汁を大豆に添加する方法としては、例えば特開平１１−２２５７００号公報に開示の方法や、特開昭５７−１０２１５５号公報、特開昭５２−１０５２４５号公報開示の方法などが採用可能であるが、特に限定されるものではない。大豆煮汁の添加量についても格別の限定はないが、例えば、大豆煮汁としてその２倍濃縮汁を使用する場合、蒸煮大豆４０ｇに対して、１〜２０ｇ、好ましくは５〜１５ｇ添加することができる。他の処理物の場合はもとより、大豆オリゴ糖自体を添加使用する場合は、上記に準じてその量を定めればよい。
【００３９】
以上の方法によって、大豆オリゴ糖を高濃度で含有する納豆を製造することが可能になる。このようにして本発明によれば、納豆５０ｇ当り、大豆オリゴ糖４００〜５００ｍｇ以上の納豆を得ることができ、例えば大豆煮汁その他大豆オリゴ糖を添加した場合には、更に濃度を高めることができ、８００ｍｇ以上、場合によっては煮豆と同等レベルの高濃度オリゴ糖含有納豆を得ることも可能である。
【００４０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００４１】
（レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌の作製）
（１）基本条件
レバンシュクラーゼ活性を欠損させる親株としては、納豆菌バシルス・サチリスｒ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｒ２２）株（以下、ｒ２２株と称する場合もある）（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）を用いた。ｒ２２株は、市販納豆から常法により分離した納豆菌であるＯ−２株を、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得した形質転換能を高めた変異株である。また、他には大腸菌ＤＨ５α（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α）株（タカラバイオ社製）、及び大腸菌ＩＮＶ１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＮＶ１１０）株を用いた。
【００４２】
プラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）及びｐＥ１９４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。
なお、特に記載しない限り、培養条件、培地及びその他の遺伝子組換え技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ１）、２版（１９９２）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ」の記載に従った。
【００４３】
また、基本的な培養は、以下の表１に示すＮＢ培地を用いて行った。
【００４４】
【表１】
2005185270.tif 000002
【００４５】
ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅には、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は、Ｔａｑポリメラーゼに添付のマニュアルに従った。
【００４６】
納豆菌の形質転換等は、以下の方法によった。
すなわち、納豆菌の染色体ＤＮＡは、市販のキットを使用して調製し、形質転換は「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５６巻、ｐ．２０９〜２２１、１９７１年」の方法に従った。
【００４７】
納豆菌の胞子は、以下の表２に示すＳｔｅｒｌｉｎｉ−Ｍａｄｅｌｓｔａｍ置換培地を用いて調製した。
【００４８】
【表２】
2005185270.tif 000003
【００４９】
（２）ベクター構築
ベクター構築に用いた各ＤＮＡ断片の作製概略を図１に示した。
【００５０】
すなわち、ｒ２２株のｓａｃＢ遺伝子の５’フランキング領域の増幅にはプライマー１（配列表の配列番号１（図４）に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２（図５）に記載）を、３’フランキング領域の増幅にはプライマー３（配列表の配列番号３（図６）に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４（図７）に記載）を使用した。
【００５１】
ｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性遺伝子の増幅には、プライマー５（配列表の配列番号５（図８）に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６（図９）に記載）を用いた。
【００５２】
それぞれのプライマーは、枯草菌バシルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓａｃＢ遺伝子の塩基配列（例えば、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３９０巻、ｐ．２４９〜２５６、１９９７年」参照）を、またｐＥ１９４のエリスロマイシン耐性遺伝子の塩基配列（例えば、「プロシージングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７７巻、１２号、ｐ．７０７９〜７０８３、１９８０年」参照）をもとにして設計し合成した。
【００５３】
すなわち、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にし、プライマー１（配列表の配列番号１に記載）及びプライマー２（配列表の配列番号２に記載）を用いｓａｃＢ遺伝子の５’フランキング領域を増幅するとともに制限酵素サイトＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片１）（図１）。また、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型にしプライマー３（配列表の配列番号３に記載）及びプライマー４（配列表の配列番号４に記載）を用いｓａｃＢ遺伝子の３’フランキング領域を増幅するとともに制限酵素サイトＸｂａＩおよびＰｓｔＩを両端に導入した（ＤＮＡ断片２）（図１）。
【００５４】
さらに、ｐＥ１９４を鋳型にしプライマー５（配列表の配列番号５に記載）及びプライマー６（配列表の配列番号６に記載）を用いエリスロマイシン耐性遺伝子を増幅するとともに制限酵素サイトＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを遺伝子両端に導入した（ＤＮＡ断片３）（図１）。
【００５５】
続いて、上記ＤＮＡ断片を用いてベクターを構築したが、その概略は図２に示した。すなわち、ＤＮＡ断片１を制限酵素Ｓａｃ１およびＢａｍＨＩで、ＤＮＡ断片２をＸｂａＩおよびＰｓｔＩで、ＤＮＡ断片３をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで処理した。得られた断片をｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト上のＳａｃＩ−ＰｓｔＩ間にＤＮＡ断片１、ＤＮＡ断片３、ＤＮＡ断片２の順に順次導入し、プラスミドｐＳＣＥＮ１を得た（図２）。
【００５６】
（３）形質転換
ＰｓｔＩ処理し直鎖化したｐＳＣＥＮ１を用いてｒ２２株を形質転換した。形質転換株の選択はエリスロマイシン２μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で３７℃、１８時間培養することによって行った。このようにして得られた形質転換株は、これをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ２２（バシラス  サチリス  ｓａｃＢ２２）と命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３８として国際寄託した。
【００５７】
得られた形質転換株バシラス・サチリスｓａｃＢ２２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓａｃＢ２２）株（以下、ｓａｃＢ２２株と称する場合もある）のｓａｃＢ遺伝子は、塩基番号９９１〜９９２の２塩基がエリスロマイシン耐性遺伝子に置換していることが、ＰＣＲ法による解析などによって確認された。（図３）
【００５８】
また、以下の方法によって、ｓａｃＢ２２株のレバンシュクラーゼ活性も、親株ｒ２２株に比べて、失活していることを確認した。
【００５９】
すなわち、ｓａｃＢ２２株ならびにｒ２２株をＬ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ  ショ糖）により培養し、ＯＤ660で調べた濁度が１．４になるまで培養し、遠心して菌体を除き、培養上清を採取した。培養時間はｓａｃＢ２２株において３．７５時間、ｒ２２株において３．２５時間要した
【００６０】
採取した培養上清をＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−３（ミリポア社製）で限外濾過することにより、培養液中に含まれるタンパクを５倍程度に濃縮し、これを粗酵素液とした。
【００６１】
この粗酵素液１００μｌを８％ショ糖含有５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５００μｌに添加して３７℃で４０分間反応、反応中に遊離するグルコース量をグルコースＣII−テストワコー（和光純薬社製）で測定した。１分間に１μｍｏｌグルコースを遊離させるレバンシュクラーゼ活性を１Ｕ（酵素単位）として、レバンシュクラーゼ活性を測定した。また、粗酵素液のタンパク量については、ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ社製）で測定し、タンパク質１ｍｇ当りの活性（比活性）で表わした結果を表３に示した。
【００６２】
【表３】
2005185270.tif 000004
【００６３】
その結果、ｓａｃＢ２２株においては、レバンシュクラーゼ活性がまったく検出されず、レバンシュクラーゼ活性欠損性が確認された。
【実施例２】
【００６４】
（納豆試作と品質評価）
常法に従い、ｒ２２株、およびｓａｃＢ２２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３８）の胞子液を調整した。すなわち、ｒ２２株またはｓａｃＢ２２株を表１に示したＮＢ培地に１白金耳植菌し、３７℃、１晩培養後、その培養液を表２に示した胞子形成培地に１％植菌し、３７℃、２４時間培養して胞子液を調製した。
【００６５】
以下、それぞれの胞子液を種菌として使用し、常法に従い納豆を試作した。すなわち、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧２ｋｐａで８分間蒸煮した。このようにして調製した蒸煮大豆に対して、上記のｒ２２株またはｓａｃＢ２２株の胞子液を滅菌水で１００倍に希釈し、蒸煮大豆１００ｇあたり０．８ｍｌ種菌し、３９℃で１８時間発酵した。発酵後、４℃で２４時間保存して、納豆を調製した。
【００６６】
ｓａｃＢ２２株を用いて発酵を行った場合、ｒ２２株を用いて発酵した場合と比べて、発酵時間の遅延、発酵中の納豆品温の低下等は見られず、レバンシュクラーゼ欠損変異が納豆菌の生育に影響を及ぼさないことが分かった。
【００６７】
続いて試作により得られた納豆を官能検査に供した。
その結果、親株（ｒ２２株）と変異株（ｓａｃＢ２２株）とで品質上に違いが見られず、ｓａｃＢ２２株を種菌に用いて作製した納豆が、納豆として必要な品質を具備していることが確認できた。
【００６８】
なお、納豆中のレバンの分析は以下の方法によった。すなわち、１０ｇの納豆に２０ｍｌの２．５％トリクロロ酢酸を加え５０℃、１０分保温する。上清を５０ｍｌのメスフラスコに移す。残った納豆に更に２０ｍｌの２．５％トリクロロ酢酸を加え５０℃、１０分保温する。ナイロンメッシュでろ過し納豆を除く。
【００６９】
ろ液を１回目の抽出時の上清とあわせた後５０ｍｌまでメスアップする。メスアップした抽出液を１２，０００ｒｐｍ、２０分、３０℃で遠心する。上清を２０ｍｌ採取し、ＮａＯＨでｐＨ７．０〜７．２に調節する。ｐＨ調節後、２５ｍｌまでメスアップする。その内５ｍｌを採取し、２０ｍｌのエタノールを加え氷上に１０分間置く。１２，０００ｒｐｍ、１０分遠心し、沈殿を回収し自然乾燥させる。沈殿を２０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、粗抽出液とした。
【００７０】
粗抽出液０．６ｍｌに、レゾルシン−チオ尿素試薬（レゾルシン０．１ｇ、チオ尿素０．２５ｇ、酢酸１００ｍｌ）０．３ｍｌ、３０％塩酸０．２１ｍｌを加え、８０℃、１０分加熱した。急冷した後、Ａ500を測定した。フラクトース溶液を用いて作成した検量線に、レバンの加水分解による増加分を考慮し０．９を乗じてレバン濃度を計算した。
【００７１】
以上の方法により、納豆中のレバンを分析した結果を表４に示したが、ｓａｃＢ２２株ではｒ２２株に比べレバンの生成が減少しており、レバンシュクラーゼ遺伝子欠損の効果が見られた。かつ、レバンの減少は、納豆の糸引きに影響を与えないことがわかった。
【００７２】
さらに、納豆中の大豆オリゴ糖を下記の方法に従って分析した。すなわち、納豆または煮豆１ｇを乳鉢ですりつぶし、５ｍｌの脱イオン水に懸濁した。懸濁液に２０ｍｌのエタノールを加え攪拌後、超音波処理（１５分間）し、さらに３，０００ｒｐｍ、１０分遠心した。遠心後の上清を濾過（ポワーサイズ０．４５μｍ）し、粗抽出液を得た。
【００７３】
粗抽出液中の糖（ショ糖、ぶどう糖、果糖）および大豆オリゴ糖（スタキオース、ラフィノース）濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣは、以下の条件で実施した。
【００７４】
（ＨＰＬＣ条件）
溶出液：７８％アセトニトリル
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ
カラム温度：３０℃
流速：１ｍｌ／分
検出器：示差屈折計
【００７５】
以上の方法によって分析した納豆中の糖およびオリゴ糖の濃度を表４に示した。
【００７６】
【表４】
2005185270.tif 000005
【００７７】
上記結果から明らかなように、親株（ｒ２２株）を用いて作成した納豆では、オリゴ糖がすべて分解されて検出されなかった。一方、レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌（ｓａｃＢ２２株：ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３８）を用いて作成した納豆には煮豆の約７割の大豆オリゴ糖が残留しており、所期の目的どおりレバンシュクラーゼ欠損納豆菌を用いることにより大豆オリゴ糖を含んだ納豆を実現できた。
【００７８】
また、ｓａｃＢ２２株においてもショ糖の分解は起こっており、納豆菌がレバンシュクラーゼ以外にショ糖の分解資化系を有していることが分かった。この系があるため、レバンシュクラーゼの欠損が、納豆菌の生育に影響を及ぼさなかったと思われる。
【実施例３】
【００７９】
（煮汁添加方法による大豆オリゴ糖高含有納豆の製造）
以下の方法で納豆を試作した。すなわち胞子液の調製、及び納豆の発酵方法は基本的に実施例２で示した方法に準じた。
【００８０】
一方、極小大豆を水道水で４℃、１晩浸漬し、圧力蒸煮釜で蒸気圧２ｋｐａで８分間蒸煮して蒸煮大豆を調製後、圧力蒸煮釜から回収した大豆煮汁を４００ｇ採取し、約１００℃の湯浴で２００ｇまで加熱濃縮した２倍濃縮煮汁を調製した。このようにして調製した２倍濃縮煮汁中の糖類およびオリゴ糖成分は、表５に示す通りであった。
【００８１】
【表５】
2005185270.tif 000006
【００８２】
このようにして調製した蒸煮大豆及び２倍濃縮煮汁を用いて、以下納豆を調製した。
すなわち、一方は、実施例２と同様にして、２倍濃縮煮汁を添加せず、蒸煮大豆そのものにｒ２２株またはｓａｃＢ２２株を種菌し、納豆を調製した。
【００８３】
また、２倍濃縮煮汁を添加した納豆の製造は、上記２倍濃縮煮汁を蒸煮大豆４０ｇに対して１０ｇ添加した後、上記と同様にして納豆を調製した。
【００８４】
以上の方法で調製した納豆について、熟練したパネル３０名により、品質を評価し、また、糖組成を分析した。
【００８５】
なお、品質評価は糸引き：１（弱い）〜５（強い）、菌膜の厚さ：１（薄い）〜４（厚い）、豆の色：２（暗い）〜４．５（明るい）、香り：１（異臭有り）〜３（異臭無し）、熟度（発酵の進み具合）：１（未熟）〜１０（過熟）について行い、結果を表６に示した。
【００８６】
【表６】
2005185270.tif 000007
【００８７】
表６の結果から、２倍濃縮煮汁を添加することにより、菌膜が厚く、豆の色が暗くなる傾向がみられたが、納豆の品質としては、間題のないレベルであることが確認できた。
【００８８】
また、できた納豆中の糖組成を、実施例２と同様の方法で測定した。結果を表７に示した。
【００８９】
【表７】
2005185270.tif 000008
【００９０】
表７の結果から、ｒ２２株で発酵した場合は、もともと蒸煮大豆中に存在した大豆オリゴ糖は、そのほとんどが発酵中に消費され、納豆中には残存していなかったのに対して、ｓａｃＢ２２株を用いて調製した納豆では、大豆煮汁を添加しなかった場合にも、かなりの大豆オリゴ糖が残存しており、大豆オリゴ糖高含有納豆が製造可能であることが確認できた。さらに、大豆煮汁を添加した場合には、大豆煮汁中の大豆オリゴ糖が付加され、ほぼ蒸煮大豆並みの大豆オリゴ糖を含有する納豆が製造可能であることが確認できた。
【実施例４】
【００９１】
（変異株の取得と、大豆オリゴ糖高含有納豆の製造）
（１）変異株の取得
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＯＵＶ２３４８１（以下、ＯＵＶ２３４８１株又は親株ということもある：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−６６５９として国際寄託されている）を、ＮＢ培地（表１）で一晩３７℃で振とう培養した後、遠心分離して滅菌生理食塩水で洗浄した。
【００９２】
この洗浄菌体を約１０7ｃｆｕ／ｍｌの濃度で滅菌生理食塩水に懸濁した後、２０ｍｇ／リッターの濃度となるようにＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、３０分間振とうして、変異処理を行った。このときの生存率は約２％であった。
【００９３】
変異処理した菌体をＮＢ培地で培養し形質を発現させ、その後に滅菌生理食塩水で洗浄し、さらに１０％ショ糖を含むＮＢ培地プレート（寒天１．５％含有）に塗抹した。
【００９４】
そして３７℃で１日間培養した後、親株のコロニーと比較しコロニー表面にレバンを産生していない特徴を示すコロニーを取得した。
【００９５】
得られたコロニーについてレバンシュクラーゼ活性を測定し、この中から該酵素活性が完全に失活している変異株を得た。そしてこれをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｂ−１（バシラス  サチリス  Ｂ−１）と命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５８４として国際寄託した。
【００９６】
このようにして新たに分離した変異株は、レバンシュクラーゼ活性が欠損している点を除き、他は親株と何ら相違するところは認められなかった。すなわち、本変異株は、形態、各培地における生育状態、生理学的性質のいずれにおいても親株と格別の相違は認められず、また、生育にビオチンを要求し、納豆を製造しうる点でも親株との相違は認められなかった。また、製品納豆についても、後記するように、オリゴ糖に関する点を除き、風味、食感、糸引き性等の納豆の性質には、変異株は、親株と格別に相違するところはなく、納豆菌にほかならないことが確認された。
【００９７】
なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｂ−１株（以下、Ｂ−１株と称する場合もある）のレバンシュクラーゼ活性の欠損性は、以下の試験で確認した。
【００９８】
すなわち、Ｂ−１株ならびに親株ＯＵＶ２３４８１株をＬ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ  ショ糖）を用いて、ＯＤ660で調べた濁度が１．４になるまで培養し、その後遠心して菌体を除き、培養上清を採取した。培養時間はＢ−１株において３時間、親株ＯＵＶ２３４８１株において３．１５時間であった。
【００９９】
採取した培養上清をＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−３（ミリポア社製）で限外濾過することにより、培養液中に含まれるタンパク質を５倍程度濃縮し、これを粗酵素液とした。
【０１００】
この粗酵素液０．１ｍｌを８％ショ糖含有５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍｌに添加して３７℃で４０分間反応させ、反応中に遊離するグルコース量をグルコースＣII−テストワコー（和光純薬社製）で測定した。１分間に１μｍｏｌグルコースを遊離させるレバンシュクラーゼ活性を１Ｕ（酵素単位）として、レバンシュクラーゼ活性を測定した。また、粗酵素液のタンパク質については、ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で測定し、タンパク質１ｍｇあたりの活性（比活性）で表わした結果を表８に示した。
【０１０１】
【表８】
2005185270.tif 000009
【０１０２】
その結果、Ｂ−１株においては、レバンシュクラーゼ活性がまったく検出されず、レバンシュクラーゼ活性欠損性が確認された。
【０１０３】
（２）納豆発酵試験
上記で得られたＢ−１株及び親株ＯＵＶ２３４８１株の胞子液を用いて、常法通り納豆を作製した。
すなわち、浸漬した大豆を水切りし、１．８Ｋｇｆ／ｃｍ2で１８分間蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり３，０００〜５，０００個の胞子となるように、上記胞子液を各々植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温３９℃で高湿下で発酵を行った。発酵終了後、熟成させて納豆を製造した。
【０１０４】
その後、納豆中のレバン、糖、大豆オリゴ糖（ラフィノースとスタキオース）の含量を実施例２と同様にして分析し、その結果を表９に示した。
【０１０５】
【表９】
2005185270.tif 000010
【０１０６】
上記結果から明らかなように、親株（ＯＵＶ２３４８１株）を用いて作成した納豆では、オリゴ糖がすべて分解されて検出されなかった。一方、レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌（Ｂ−１株）を用いて作成した納豆には蒸煮大豆の約７割の大豆オリゴ糖が残留しており、所期の目的どおり、レバンシュクラーゼ活性欠損性納豆菌を用いることにより大豆オリゴ糖を含んだ納豆を実現できた。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＤＮＡ断片作製の概略を示した図である。
【図２】ベクター構築の概略を示す図である。
【図３】ｓａｃＢ遺伝子欠損工程の概略を示す図である。
【図４】プライマー１を示す。
【図５】プライマー２を示す。
【図６】プライマー３を示す。
【図７】プライマー４を示す。
【図８】プライマー５を示す。
【図９】プライマー６を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
<110>    Mitsukan Group Corporation
<120>    Levansucrase Activity Lacked Bacillus subtilis and Natto Containing a Large Amount of Soybean Olygosaccharides
<130>    6768
<141>    2004-1-23
<160>    6
【図１】
2005185270.tif 000011
【図２】
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【図３】
2005185270.tif 000013
【図４】
2005185270.tif 000014
【図５】
2005185270.tif 000015
【図６】
2005185270.tif 000016
【図７】
2005185270.tif 000017
【図８】
2005185270.tif 000018
【図９】
2005185270.tif 000019
【配列表】
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