(57)【要約】【課題】煩雑な前処理操作を不要としたアトロピン及びスコポラミンの同時定量方法を提供し、もってロートエキスの定量分析方法を簡易化し、胃腸薬製剤の品質評価試験の省力化を図ることを目的とする。【解決手段】アトロピンと機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、アトロピンを除去することによって得られるアトロピンの鋳型を有する球形の高分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アトロピンと機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、アトロピンを除去することによって得られるアトロピンの鋳型を有する球形の高分子。
【請求項２】
請求項１記載のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてアトロピンを選択的に捕捉し、アトロピンを定量する方法。
【請求項３】
請求項１記載のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子をカラムに充填し、アトロピンを含有する溶液を通過させて、アトロピンを選択的に定量する方法。
【請求項４】
請求項１記載のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてスコポラミンを選択的に捕捉し、スコポラミンを定量する方法。
【請求項５】
請求項１記載のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子をカラムに充填し、スコポラミンを含有する溶液を通過させて、スコポラミンを選択的に定量する方法。
【請求項６】
請求項１記載のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてアトロピン及びスコポラミンを選択的に捕捉し、ロートエキスを定量する方法。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロートエキスの定量法に関し、さらに詳しくはアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてアトロピン及びスコポラミンを選択的に捕捉し、製剤中のロートエキスを定量分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本薬局方収載の医薬品製造原料であるロートエキスは、胃腸薬等に頻繁に配合される重要な生薬である。ロートエキスの主成分はアトロピン（アトロピンはヒヨスチアミンのラセミ体を意味する。）及びスコポラミンなどのトロパンアルカロイドであり、消化液分泌抑制、鎮痛、鎮痙薬として内服されてきた（非特許文献１参照）。
【０００３】
アトロピン及びスコポラミンの分析法としては、これまでに滴定法、蛍光法（非特許文献２参照）、薄層クロマトグラフィー・デンシトメトリー法（非特許文献３参照）、ガスクロマトグラフ法（非特許文献４参照）、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法（非特許文献５〜７参照）、キャピラリー電気泳動法（非特許文献８参照）など種々の方法が知られている。
【０００４】
しかしながらロートエキスは薬効が強いため他の成分と比較して処方量が極めて微量であり、製剤中の定量分析を行うには、夾雑成分を除去するための煩雑な前処理操作が必要であった。
【０００５】
また、アトロピン、スコポラミンは、ともに紫外部吸収が弱く、検出感度を向上させるための濃縮操作も必要であることが多く、分析のための試料溶液調製に多くの時間を要していた。更にこれらの操作の過程で、加水分解等により成分のロスを生じる可能性も高く、迅速かつ正確な操作を行うには熟練が必要であり、より簡便に製剤中のロートエキスを定量できる試験法が望まれていた。
【０００６】
さらに、製剤中の有効成分の含量規格は、定量試験誤差を含めてその許容範囲を定めるため、ロートエキスのように薬効及び劇性の強い成分を製剤に配合する場合には、適切な製剤の含量規格を設定するため、高精度な定量法の確立が望まれている。
【０００７】
ところで、固相抽出法は、多種多量の共存成分を含む試料中から低濃度の分析目的成分を分離濃縮するための前処理法として優れた方法である。中でも固相抽出カラムをＨＰＬＣ装置に組み込んだオンライン固相抽出法は、試料分析の自動化が容易で再現性も良好であり、一連の分析を短時間で完了させることができる有効な方法であり、環境分析や生体試料分析等で使用されている（非特許文献９参照）。
【０００８】
また、最近では、モレキュラーインプリントポリマー（Molecularly Imprinted Polymer；ＭＩＰ）をＨＰＬＣ用オンライン固相抽出カラム充填剤として利用し、特定の分析目的成分を他成分中から簡便かつ高選択的に分離する方法が報告されている（非特許文献１０及び１１参照）。
【０００９】
ＭＩＰとは、認識対象とする分子（鋳型分子）と、その分子と相互作用をもつモノマー（機能性モノマー）の複合体を形成させ、その周囲を架橋剤で重合することによって得られる人工高分子である。重合後、鋳型分子を洗い流すことによって高分子構造内に空孔が形成され、この空孔が鋳型分子の大きさや形を認識する相補的な結合部位として働くことにより、認識対象分子に対する特異的な保持性能を示すことが知られている（非特許文献１２参照）。
【００１０】
なお、アトロピンを鋳型とするＭＩＰとしては非特許文献１８に記載のものが公表されている。しかし、その調製には塊状重合法を用いているため、充填剤として利用するには破砕、分級といった煩雑な操作が必要であり、また得られるＭＩＰは、破砕により結合部位が一部破壊され、粒子の形状及び大きさが不均一となり、このことは、ＨＰＬＣ用充填剤として利用する場合、目的とするアトロピンやスコポラミンの選択保持性能に影響するものと考えられる。
【００１１】
【非特許文献１】日本薬局方解説書編集委員会編，第14改正日本薬局方解説書， 廣川書店，東京，D-1246
【非特許文献２】佐藤和男ら，昭和48年度 厚生科学研究報告，大阪生薬協会，p.191
【非特許文献３】布浦由樹，岩上正臓，昭和49年度 厚生科学研究報告，大阪生薬協会，p.116
【非特許文献４】西本喜重ら，薬誌，100, 396-401(1980)
【非特許文献５】真弓忠範，「一般用医薬品の試験法 下巻」薬事時報社，東京，1997, p.196-200
【非特許文献６】T. Oshima et. al., Chem. Pharm. Bull., 37, 2456(1989)
【非特許文献７】中西裕幸ら，薬誌，112, 944-949( 1992 )
【非特許文献８】小里一友ら，薬誌，119, 868-879( 1999 )
【非特許文献９】Yi Fan et. al., Analytica Chimica Acta, 484, 145-153( 2003 )
【非特許文献１０】N.Masque et. al., Anal. Chem., 72, 4122-4126 ( 2000 )
【非特許文献１１】J. Haginaka and H. Sanbe, Anal. Chem., 72, 5206-5210 ( 2000 )
【非特許文献１２】T. Takeuchi and J. Haginaka, J. Chromatogr. B, 728, 1-20 ( 1999 )
【非特許文献１３】K. Hosoya and J.M.J Frechet, J. Polym. Sci., Part A, Polym. Chem., 31, 2129-2141( 1993 )
【非特許文献１４】K. Hosoya et. al., Chem. Lett., 1437-1438 ( 1994 )
【非特許文献１５】K. Hosoya et. al., J. Chromatogr. A, 728, 139-147 ( 1996 )
【非特許文献１６】J. Haginaka and C. Kagawa, J. Chromatogr. A, 948, 77-84 ( 2002 )
【非特許文献１７】V. Smigol, F. Svec, K. Hosoya, Q. Wang, J.M.J. Frechet, Angew. Makromol. Chem., 195, 151-164 (1992)
【非特許文献１８】G. Theodoridis et. al., J. Chromatogr. A, 987, 103-109 ( 2003 )
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、煩雑な前処理操作を不要としたアトロピン及びスコポラミンの精度の高い同時定量方法を提供し、もってロートエキスの定量分析方法を簡易化し、胃腸薬製剤の品質評価試験の省力化を図ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、アトロピンを対象としたＭＩＰを調製し、ＨＰＬＣ用オンライン固相抽出カラム充填剤として応用することで、製剤中に配合されるロートエキスの定量法を簡便化する検討を行った。
【００１４】
ＭＩＰは、多段階膨潤重合法（非特許文献１３〜１６参照）により粒子径の揃った球形の高分子として調製した。
【００１５】
得られたＭＩＰのアトロピン及びスコポラミンに対する保持性能を検討し、さらにＭＩＰを前処理カラム充填剤として用いるカラムスイッチングＨＰＬＣ法により、水系の移動相を用いてモデル胃腸薬中のアトロピン及びスコポラミンの定量を試みた。
【００１６】
その結果、煩雑な前処理操作なしにロートエキス配合製剤中のアトロピン及びスコポラミンを精度良く同時定量できる簡便な分析法を確立した。
【００１７】
本発明の態様の一つは、アトロピンと機能性モノマーとの複合体を形成し、その周囲を架橋剤で重合し、アトロピンを除去することによって得られるアトロピンの鋳型を有する球形の高分子である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明にかかるアトロピンの鋳型を有する球形の高分子は、球形で粒子径にばらつきがなく、目的とするアトロピン及びスコポラミンの選択保持性能に優れる。これにより、煩雑な前処理を要せず、アトロピン及びスコポラミンの定量分析が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の他の態様は、前記のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてアトロピンを選択的に捕捉し、アトロピンを定量する方法である。
【００２０】
本発明の他の態様は、前記のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子をカラムに充填し、アトロピンを含有する溶液を通過させて、アトロピンを選択的に定量する方法である。
【００２１】
本発明の他の態様は、前記のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてスコポラミンを選択的に捕捉し、スコポラミンを定量する方法である。
【００２２】
本発明の他の態様は、前記のアトロピンの鋳型を有する球形の高分子を用いてアトロピン及びスコポラミンを選択的に捕捉し、ロートエキスを定量する方法である。
【００２３】
「アトロピンの鋳型を有する球形の高分子」（以下、適宜「アトロピンＭＩＰ」と略記する。）とは、アトロピンと機能性モノマーとの複合体を形成させ、その周囲を架橋剤で重合し、アトロピンを除去することによって得られる、アトロピンの鋳型を有する球形の高分子である。
【００２４】
アトロピンＭＩＰは、多段階膨潤重合法により調製され（非特許文献１１参照）、その形状はＨＰＬＣ用カラム充填剤に適するように球形で、平均粒子径は約７μｍである（図１参照）。
【００２５】
アトロピンＭＩＰは主にカラム充填剤として用いられ、アトロピン及びスコポラミンの選択的な分離検出のためのカラム充填剤として機能する。
【００２６】
「機能性モノマー」とは、鋳型分子と相互作用を有する重合可能な有機分子であって、例えば、２−（トリフルオロメチル）アクリル酸、メタクリル酸が挙げられる。また、「複合体」とは鋳型分子と前記機能性モノマーが相互作用により結合したものであり、「架橋剤」とは、２つ以上のビニル基等の重合性基を有する、前記複合体を架橋反応により重合させることができる有機分子であって、例えば、エチレングリコールジメチルアクリレート、ジビニルベンゼンが挙げられる。そして、「アトロピンを除去する」には、アトロピンを溶解する性質を有する溶媒、例えば、メタノールによって重合体を洗浄すればよい。
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２８】
［試薬］
実験に使用した２−（トリフルオロメチル）アクリル酸（ＴＦＭＡＡ）及びエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）は市販品で、使用する前に蒸留により安定剤を除去した。ポリビニルアルコール（重合度約５００，けん化度８６．５−８９ｍｏｌ％）及び２，２'−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）も市販品を用いた。アセトニトリル及びメタノールは液体クロマトグラフ用の市販品を使用した。水は純水製造装置によって精製したものを用いた。ＭＩＰ調製における鋳型分子として用いたアトロピン市販品で。その構造式を化１に示す。今回分析対象としたスコポラミンの構造式も 同様に化１に示す。
【００２９】
【化１】
2005201739.tif 000002
【００３０】
標準品は、日本公定書協会の硫酸アトロピン標準品、臭化水素酸スコポラミン標準品を使用した。ロートエキス３倍散はアルプス薬品から購入し、添加回収試験に用いた。またロートエキス配合製剤としてモデル胃腸薬Ａを用いた。モデル胃腸薬Ａの処方を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2005201739.tif 000003
【００３２】
また、モデル胃腸薬Ａからロートエキス３倍散を抜いた処方の試料を調製し、特異性及び添加回収試験に用いた。その他の試薬は、全て試薬特級のものをそのまま用いた。
【００３３】
［ＭＩＰの調製］
（１）膨潤及び重合
ポリスチレン種粒子は乳化剤フリー懸濁重合法（emulsifier-free emulsion polymerization）を用いて調製した（非特許文献１７参照）。得られたポリスチレン種粒子の粒子径は約１μｍであった。ＭＩＰの調製には多段階膨潤重合法（multi-step swelling and   polymerization method）を用いた。多段階膨潤重合法によるＭＩＰの調製における各膨潤過程での粒子の様子を図１に示す。
【００３４】
まず、膨潤助剤（activating solvent）であるフタル酸ジブチル０．４８ｍＬを、超音波発生装置（トミー精工製，ＵＤ−２０１）を用いてドデシル硫酸ナトリウム溶液（２ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬ中に微分散させ、これをポリスチレン種粒子懸濁液（０．３０５ｇ／ｍＬ）０．２８ｍＬに加えた。一次膨潤は室温でスターラーを用いて回転数約１２５ｒｐｍで攪拌しながら、フタル酸ジブチルの微分散液滴が消失するまで行った（約１５時間）。尚、微分散液滴の消失は光学顕微鏡にて確認した。
【００３５】
次に、重合開始剤（initiator）である２，２'−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）０．３７５ｇを希釈剤（porogen）であるトルエン５ｍＬに溶かし、超音波発生装置を用いて水１２．５ｍＬと４．８％ポリビニルアルコール溶液（懸濁安定剤）１０ｍＬの混液中に微分散させ、これを一段階目の膨潤が終了した液に加えた。二次膨潤は、室温でスターラーを用いて回転数約１２５ｒｐｍで攪拌しながら、重合開始剤の溶解したトルエンの微分散液滴がなくなるまで行った（約２時間）。
【００３６】
続いて、アトロピン（鋳型分子）及びＴＦＭＡＡ（機能性モノマー）をＥＤＭＡ（架橋剤）５ｍＬに溶かし、これを超音波発生装置を用いて水１２．５ｍＬと４．８％ポリビニルアルコール溶液１０ｍＬの混液中に微分散させ、これを二段階目の膨潤の終了した液滴に加え、微分散液滴がなくなるまで三段階目の膨潤操作を行った（約２時間）。 鋳型分子、機能性モノマー及び架橋剤のモル量を表２に示す。このモル量比は、非特許文献１６に記載の条件を参考にした。
【００３７】
【表２】
2005201739.tif 000004
【００３８】
三次膨潤終了後、三次膨潤液滴を含む溶液を重合用のリアクターに移し、１６０ｒｐｍで攪拌しながらアルゴンで２０分間バブリングを行った。その後、攪拌を続けながら５０℃の油浴上で加熱し重合反応を行った（２４時間）。
【００３９】
比較のために、テンプレート分子を用いずに同一条件下で膨潤及び重合反応を行ったノンインプリントポリマー（ベースポリマー：ＢＰ）も調製した。 
【００４０】
（２）洗浄
反応終了後、粒子をメタノール２５０ｍＬ中に分散させた。粒子が沈降したら上澄みを捨て、引き続きこの操作をメタノール、水、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いて各２回ずつ行いポリマー粒子を洗浄した。得られたポリマー粒子をガラスフィルター上に回収し、ＴＨＦ及びアセトンで洗浄し、室温で風乾させた。
【００４１】
（３）充填
得られたポリマーを、スラリー溶媒としてメタノール／２−プロパノール混液（２：１）を用いて超音波により分散させた後、充填溶媒としてメタノールを用い、９.８１×１０6Ｐａの定圧でステンレス製カラム（５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．及び１０ｍｍ×４．０ｍｍ ｉ．ｄ．）に充填した。
【００４２】
（４）ＭＩＰの評価
［ＨＰＬＣ装置及び分析条件］
ＨＰＬＣ装置は、紫外可視吸光光度計（ＳＰＤ−１０ＡＶ，島津製作所製）、送液ポンプ（ＬＣ−１０ＡＤ，島津製作所製）、カラムオーブン（ＣＴＯ−１０ＡＣ，島津製作所製）、データ処理装置（Ｃ−Ｒ７Ａ，島津製作所製）で構成される装置を使用した。流量は、０．５ｍＬ／ｍｉｎで一定とした。検出は２１０ｎｍで行った。カラム温度は３０℃ とした。移動相は、リン酸、リン酸水素二カリウム、リン酸ニ水素カリウム及びアセトニトリルを用いて調製した。
【００４３】
アトロピンＭＩＰを充填したカラム（５０ｍｍ×４．０ｍｍ ｉ．ｄ．）を用いて，アトロピン及びスコポラミンの標準溶液を注入してクロマトグラムをとり，ＭＩＰ及びＢＰへのアトロピン及びスコポラミンの保持性能を評価した。
【００４４】
［パラメータの算出］
保持係数ｋは、ｋ＝（ｔR−ｔ0）／ｔ0より算出した。ｔR及びｔ0はそれぞれアトロピン及びアセトンのピークの保持時間を示す。選択係数は、ｋMIP／ｋBPより算出した。ここで、ｋMIP及びｋBPは、それぞれアトロピンのＭＩＰ及びＢＰへの保持係数を示す。
【００４５】
（５）製剤中のロートエキス定量への応用
［分析条件］
カラムスイッチングＨＰＬＣ装置は、紫外可視吸光光度計（ＳＰＤ−１０ＡＶ，島津製作所製）、送液ポンプ２台（ＬＣ−１０ＡＤ，島津製作所製）、６ポートスイッチングバルブ（ＦＣＶ−１２ＡＨ，島津製作所製）、カラムオーブン（ＣＴＯ−１０ＡＣ，島津製作所製）、データ処理装置（Ｃ−Ｒ７Ａ，島津製作所製）で構成される装置を使用した。装置の構成を図２に示す。
【００４６】
アトロピンＭＩＰを充填したカラム（１０ｍｍ×４．０ｍｍ ｉ．ｄ．）を前処理カラムとして用いた。分析カラムには、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ−８０（資生堂製，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を用いた。前処理用移動相は、２５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）−アセトニトリル（４：１）（移動相Ａ）とし、流量は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃  で行った。分析用移動相は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸塩緩衝液（ｐＨ３．０）−アセトニトリル（４：１）（移動相Ｂ）とし、流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、検出は２１０ｎｍで行った。サンプル注入量は４００μＬ（アトロピン０．２μｇ相当量）とし、前処理用カラムに負荷してから１０分後に流路を切り替えて分析を行った。
【００４７】
［モデル胃腸薬Ａの定量 −試料溶液及び標準溶液の調製−］
本品２０錠以上をとり、その質量を精密に量り、メノウ乳鉢を用いて均質な粉末とし、試料とした。
試料０．２３ｇ（ロートエキス３倍散約７ｍｇ対応量）を精密に量り、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液２０ｍＬを正確に加え、１５分間超音波処理を行い、無機制酸剤の中和により発生するガスを十分に発泡させた。毎分３５００回転で１０分間遠心分離を行い、上澄液５ｍＬを正確に量り、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を中和量（別途滴定法により求めておく）を正確に加え、さらにｐＨ６．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を加えて正確に１０ｍＬとし、試料溶液とした。
【００４８】
別に硫酸アトロピン標準品（別途乾燥減量を測定しておく）約０．０２５ｇを精密に量り、水に溶かし、正確に５０ｍＬとし、標準原液Ａとした。また、臭化水素酸スコポラミン標準品（別途乾燥減量を測定しておく）約０．０２３ｇを精密に量り、水に溶かし、正確に１００ｍＬとし、標準原液Ｂとした。標準原液Ａ ６ｍＬ及び標準原液Ｂ １．５ｍＬを正確に量り、水を加えて正確に１００ｍＬとし、この液２ｍＬを正確に量り、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加えて正確に５０ｍＬとした。この液５ｍＬを正確に量り、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液の中和量を正確に加え、さらにｐＨ６．０の０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を加えて正確に１０ｍＬとし、標準溶液とした。
【００４９】
試料溶液及び標準溶液４００μＬにつき、次の試験条件で液体クロマトグラフ法により試験を行った。それぞれの液のアトロピンのピーク面積ＡTa及びＡSa並びにスコポラミンのピーク面積ＡTb及びＡSbを求め、アトロピン及びスコポラミン量を計算し、それらの合計を総アルカロイドの量とした。
【００５０】
［操作条件］
トラップカラム：ＭＩＰカラム（１０ｍｍ×４．０ｍｍ ｉ．ｄ．）
バルブ切り替え時間：試料注入後１０分
分析カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ−８０（資生堂製，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）
カラム温度：４０℃  
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１０ｎｍ）
流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（トラップ条件）及び１．０ｍＬ／ｍｉｎ（分析条件）
移動相：２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／アセトニトリル混液（４：１）（トラップ条件）及び５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセトニトリル混液（４：１）（分析条件）
試料注入量：４００μＬ
【００５１】
［従来試験法による製剤中のロートエキスの定量（非特許文献５の改良法）］
試料約０．２３ｇ（成分のロートエキス３倍散７ｍｇ対応量）を精密に量り、希塩酸２ｍＬ及び０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液５ｍＬを加え、１５分間かき混ぜた後、毎分３５００回転で５分間遠心分離し、上澄液を分取した。残留物は０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液５ｍＬを用い、更にこの操作を２回行った。上澄液を合わせ、ジエチルエーテル７．５ｍＬを加え、５分間かき混ぜた後、毎分３５００回転で５分間遠心分離し、水層を分取した。ジエチルエーテル層は０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液１．５ｍＬを加え、５分間かき混ぜた後、毎分３５００回転で５分間遠心分離し、水層を分取した。全水層を合わせ、塩化ナトリウム０．７ｇ及びアンモニア水（２８）６ｍＬを加え、更にジエチルエーテル１２ｍＬを加え、５分間かき混ぜた後、毎分３５００回転で５分間遠心分離し、ジエチルエーテル層を分取した。水層はジエチルエーテル１２ｍＬを用い、更にこの操作を３回行った。全ジエチルエーテル層を合わせ、内標準溶液２ｍＬを正確に加え、水浴上でジエチルエーテルを減圧留去した。残留物を移動相２ｍＬに溶かし、試料溶液とした。
【００５２】
別に硫酸アトロピン標準品（別途乾燥減量を測定しておく）約０．０２５ｇを精密に量り、水に溶かし、正確に５０ｍＬとした。この液５ｍＬを正確に量り、水を加えて正確に２０ｍＬとし、標準原液Ａとした。また、臭化水素酸スコポラミン標準品（別途乾燥減量を測定しておく）約０．０２０ｇを精密に量り、水に溶かし、正確に１００ｍＬとした。この液９ｍＬを正確に量り、水を加えて正確に５０ｍＬとし、標準原液Ｂとした。標準原液Ａ ５ｍＬ及び標準原液Ｂ ２ｍＬを正確に量り、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液を加えて正確に１００ｍＬとした。この液４ｍＬを正確に量り、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸試液１ｍＬを加えた後、希塩酸２ｍＬを加え、１５分間かき混ぜた後、試料溶液と同様に操作し、標準溶液とした。
【００５３】
試料溶液及び標準溶液２０μＬにつき、次の条件で液体クロマトグラフ法により試験を行った。それぞれの液の内標準物質のピーク面積に対するアトロピンのピーク面積の比ＱTa及びＱSa並びにスコポラミンのピーク面積の比ＱTb及びＱSbを求め、アトロピン及びスコポラミンの量を計算し、それらの合計を総アルカロイドの量とした。
【００５４】
内標準溶液  ブルシン二水和物のメタノール溶液（１ｍｇ／２５０ｍＬ）
［操作条件］
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１０ｍｎ）
カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）
カラム温度：３０℃付近の一定温度
移動相：リン酸二水素カリウム６．８ｇを水９００ｍＬに溶かし、トリエチルアミン１０ｍＬを加え、リン酸でｐＨ３．５に調整した後、水を加えて１０００ｍＬとした液／液体クロマトグラフ用アセトニトリル混液（９：１）
流量：スコポラミンの保持時間が約８分になるように調整する（通例毎分１ｍＬ）
【００５５】
結果と考察
（１）ＭＩＰの形状
表２に記載の条件で、約５ｇのＭＩＰ及びＢＰが得られた。ＭＩＰ及びＢＰの形状を光学顕微鏡で観察したところ、ＭＩＰとＢＰとで形状の差はなく、粒子径の均一性は良好であり、ＨＰＬＣ用充填剤として適した球形ポリマー（粒子径約７μｍ）であることを確認した（図３及び４参照）。
【００５６】
（２）アトロピンＭＩＰの性能評価
ＭＩＰ及びＢＰを充填したカラム（５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）を  ＨＰＬＣ装置に組み込み、移動相として１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセトニトリル（５０：５０）混液を用いてアトロピン溶液を注入しクロマトグラムをとり、ＭＩＰ及びＢＰカラムのそれぞれのアトロピンに対する保持係数を求めた。
【００５７】
その結果、ｋMIP＝３．７、ｋBP＝１．７であり、選択係数（ｋMIP／ｋBP）は２．２であり、ＭＩＰはＢＰに比べインプリントの効果により約２倍のアトロピン保持性能を有することを確認した（図５参照）。
【００５８】
また、ＭＩＰはＢＰに比べ、スコポラミンに対しても選択係数約１．５の選択的保持性能を有し、構造類似物質であるスコポラミンの構造も認識する性能をもつことを確認した。
【００５９】
次にＭＩＰへのアトロピン及びスコポラミンの保持挙動の溶離液ｐＨ依存性を調べた。図６にＭＩＰへのアトロピン及びスコポラミンの保持係数の溶離液ｐＨによる影響を示す。
【００６０】
その結果、アトロピン及びスコポラミンは中性のｐＨ領域（ｐＨ６〜７）においてＭＩＰへの保持係数が最大となり、酸性及びアルカリ性のｐＨ領域では保持が弱まる傾向が認められた。
【００６１】
以上の結果から、ＭＩＰを利用して製剤中のアトロピン及びスコポラミンの分析法を簡便化する方法としては、まず中性の溶離液を通過させ試料溶液中のアトロピン及びスコポラミンを選択的にＭＩＰに保持させ、共存成分を洗い流し、次にカラムスイッチを行い酸性の溶離液でＭＩＰからアトロピン及びスコポラミン溶出させて分析カラムに導入し、アトロピンとスコポラミンを分離検出する方法が適切である。
【００６２】
アトロピン及びスコポラミンをＭＩＰに選択的にトラップさせる条件としては、２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）／アセトニトリル混液（４：１）が適切であった。また、ＭＩＰからのアトロピン及びスコポラミンの溶出及び強陽イオン交換カラム（ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ−８０（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．））でのアトロピン、スコポラミンの分離に適した移動相条件は、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）／アセトニトリル混液（４：１）であった。
以下、この条件を用いて製剤中のアトロピン及びスコポラミンの定量を試みた。
【００６３】
尚、ＭＩＰはトラップ条件におけるアトロピン及びスコポラミンの保持係数はＢＰに比べて大きいため、トラップカラムへの充填量がＢＰよりも少量で済み、試料注入前の前処理カラムの予備的平衡化及びバルブ切り替え時のベースライン安定化に要する時間が短くなり有利であった。このため、以下の検討の前処理カラム充填剤にはＭＩＰを使用した。
【００６４】
（３）製剤中のロートエキス定量への応用−カラムスイッチング法
アトロピンＭＩＰをカラムスイッチングＨＰＬＣ装置に組み込み、製剤中のロートエキスの定量に応用した。
【００６５】
図７にＭＩＰカラム（１０ｍｍ×４．０ｍｍ ｉ．ｄ．）及び陽イオン交換カラム（ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＳＣＸ  ＵＧ−８０（資生堂製，１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．））をそれぞれプレカラム及び分析カラムとして用いたときの標準溶液及び水のクロマトグラムを示す。
【００６６】
標準溶液を注入した場合、設定した条件で、スコポラミン、アトロピンの順に溶出し、それぞれシャープなピークとして検出され、良好に分離可能であった。一方、水を注入した場合、約３０分にアトロピンの微小ピークが確認された。これは、ＭＩＰの調製時に使用したアトロピンがプレカラムから溶出したものである。一般にＭＩＰを固相抽出用充填剤として利用して微量分析を行う場合、調製時に使用した鋳型分子の妨害が問題となることが多い。
【００６７】
しかしながら本検討のケースでは、アトロピンの注入量を０．２μｇとした場合、定量の妨害にならなかった（妨害率０．５％以下）。また水を注入した場合、スコポラミンの溶出位置に妨害ピークは認められなかった。
【００６８】
（４）分析法バリデーション
［直線性］
アトロピン及びスコポラミンの各標準溶液濃度系列を調製し、設定した分析条件にて直線性を評価した。
【００６９】
その結果、アトロピンでは０．０２〜０．９μｇ／ｍＬ、スコポラミンでは０．００３〜０．０９μｇ／ｍＬの濃度範囲で両成分ともに相関係数０．９９９以上のほぼ原点を通る良好な直線性を有することを確認した（表３）。
【００７０】
また、スコポラミン及びアトロピンの検出限界は、それぞれ０．００４μｇ／ｍＬ、０．０１８μｇ／ｍＬ（いずれも注入量４００μＬ、シグナルノイズ比Ｓ／Ｎ＝３のとき）であった。
【００７１】
【表３】
2005201739.tif 000005
【００７２】
［特異性］
図８は、標準溶液、モデル胃腸薬Ａの試料溶液及びモデル胃腸薬Ａのロートエキス抜き試料溶液をそれぞれ４００μＬ注入したときのクロマトグラムを示す。ロートエキス抜き試料溶液のアトロピン溶出位置に妨害ピークが認められた。これはモデル胃腸薬Ａ中の夾雑成分由来のピークではなく、図７で水を注入したときと同様にＭＩＰに由来するアトロピンのピークであった。ただし、設定した条件（アトロピンの注入量：０．２μｇ）で分析を行えば、このピークの妨害率は０．５％以下と小さく、定量には問題ないと判断した。またスコポラミンの溶出位置には妨害ピークは認められなかった。
【００７３】
［添加回収試験］
モデル胃腸薬Ａのロートエキス抜き試料に、対応量の７５％、１００％及び１２５％に相当する濃度のロートエキス３倍散を添加し、定量と同様の操作を行い、各成分の添加回収率を算出した（表４）。その結果、添加回収率はそれぞれ平均でアトロピンは９８．９％、スコポラミンは９９．９％であり、いずれの成分も添加回収率は良好であった。添加回収試験全体の相対標準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ）もアトロピンは０．５％、スコポラミンは１．５％と小さく、本法は定量値のばらつきの小さい、精度の高い試験法であることを確認した。
【００７４】
【表４】
2005201739.tif 000006
【００７５】
（５）モデル胃腸薬Ａの定量
設定した試験法によりモデル胃腸薬Ａ中のアトロピン、スコポラミンの定量を行い、総アルカロイド含量を算出した（表５）。
【００７６】
その結果、モデル胃腸薬Ａ１日量（９錠）中の総アルカロイド含量は０．２９０１ｍｇ（相対標準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ）＝１．７％，ｎ＝４）であり、製剤へのロートエキスの仕込み量から算出される理論値に対し、ほぼ１００％の定量値が得られた。定量結果のＲ．Ｓ．Ｄは１．７％と小さく、定量精度も良好であった。 
【００７７】
【表５】
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【００７８】
（６）従来法との定量結果の比較
本検討で設定した試験方法で得られた定量値の妥当性を確認するため、同一の試料について従来法（非特許文献５の改良法）でも試験を行い、定量値を比較した。
【００７９】
その結果、従来法によるモデル胃腸薬Ａの１日量（９錠）中の総アルカロイド含量は０．２９１９ｍｇ（相対標準偏差（Ｒ．Ｓ．Ｄ）＝２．１％，ｎ＝４）であり、両試験法で得られる定量値は、ほぼ同等であった。
以上の結果より、本法による製剤中のロートエキスの定量値は妥当であると判断した。
【００８０】
本法は従来試験法に比べ，試料溶液の調製に要する時間を約１／３以下に削減することができ、かつ煩雑な前処理操作なしにロートエキス配合製剤中のアトロピン及びスコポラミンを精度良く同時定量が可能な点で有利である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
アトロピンＭＩＰを前処理カラムとして利用したカラムスイッチングＨＰＬＣ法により、モデル胃腸薬に配合されるロートエキス中のアトロピン及びスコポラミンの定量を試みた。ＭＩＰ調製時に用いたアトロピンの分析時の漏出は、設定した試験条件では定量の妨害とならなかった。本発明の試験法は、ロートエキス配合製剤中のアトロピン及びスコポラミンの同時定量法として妥当な分析法であり、煩雑な前処理操作が不要であるため、胃腸薬製剤中のロートエキスの品質評価試験の省力化に貢献できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】多段膨潤重合法によるＭＩＰの調製における各膨潤過程での粒子状態の模式図である。
【図２】カラムスイッチングＨＰＬＣ装置の概略図である。ただし、図中、実線は前処理時の流路を示し、点線は分析時の流路を示す。
【図３】アトロピンをインプリントしたTFMAA-EDMA共重合体(MIP)の光学顕微鏡写真である。
【図４】アトロピンをインプリントしていないTFMAA-EDMA共重合体(BP)の光学顕微鏡写真である。
【図５】ＭＩＰカラム及びＢＰカラムによるアトロピンのクロマトグラムを示す。
【図６】ＭＩＰカラムのアトロピン及びスコポラミンに対する保持係数の移動相ｐＨ依存性を示す。
【図７】カラムスイッチングＨＰＬＣ装置による標準溶液（Ａ）と水（Ｂ）のクロマトグラムを示す。
【図８】カラムスイッチングＨＰＬＣ装置による標準溶液（Ａ）、モデル胃腸薬Ａ試料溶液（Ｂ）及びロートエキス抜き処方試料溶液（Ｃ）のクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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