(57)【要約】      （修正有）【課題】エンテロウィルスの検出に有用であるプローブおよびプライマー、およびそれらを用いるエンテロウィルス検出方法の提供。【解決手段】（ａ）特定の配列からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列と、任意選択的に（ｂ）選択される増幅反応または検出反応に必要とされる配列とから本質的に構成されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列と、任意選択的に（ｂ）選択される増幅反応または検出反応に必要とされる配列とから本質的に構成されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記選択される増幅反応または検出反応に必要とされる配列が、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、BsoB1、BsrI、BstNI、BsmAI、BstOI、BslIまたはHincIIエンドヌクレアーゼにより認識される部位からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、BsoB1エンドヌクレアーゼにより認識されることを特徴とする請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記選択される増幅反応または検出反応に必要とされる配列が、ヘアピン、Ｇ−カルテット、制限部位、およびレポータープローブとハイブリダイズする配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識で標識化されていることを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記検出可能な標識は蛍光性標識であることを特徴とする請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが１０〜７０塩基の長さであることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドを収容する少なくとも１つの容器とを含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
（ａ）配列番号３から配列番号１０までの任意のものの標的結合配列と、任意選択的に選択される増幅反応に必要とされる配列とから本質的に構成される配列を有する第１の増幅プライマーを用いて、標的配列を増幅する工程と、（ｂ）増幅された標的配列を検出する工程とを含むことを特徴とするエンテロウィルス標的配列を検出するための方法。
【請求項１１】
配列番号３から配列番号１０までの任意のものの標的結合配列と、任意選択的に選択される増幅反応に必要とされる配列とから本質的に構成される配列を有する第２の増幅プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の増幅プライマーは、配列番号５から配列番号８までからなる群から選択されることを特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記第２の増幅プライマーの標的結合配列は、配列番号５から配列番号８までの任意のものの標的結合配列であることを特徴とする請求項１１の方法。
【請求項１４】
増幅された標的配列は、配列番号９または配列番号１０の標的結合配列と、任意選択的に選択される検出反応に必要とされる配列とから構成される配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて検出されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択される検出反応に必要とされる配列が、ヘアピン、Ｇ−カルテット、制限部位、およびレポータープローブとハイブリダイズする配列からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識が蛍光性標識であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の増幅プライマーは標識化されておらず、および標的配列は標識化されたレポータープローブのオリゴヌクレオチドの相補体のハイブリダイゼーションによって検出されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロウィルス属の検出に有用であるプローブおよびプライマー、およびエンテロウィルス属を検出するために該プローブおよびプライマーを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロウィルス属は、ヒトにおける最も一般的なウィルス感染として、ライノウィルス属に次いで第２位である。エンテロウィルス属は、米国において年間に推定１０〜１５百万の症候性感染を起こす。特に、免疫無防備状態の患者に加えて、子供が、感染の危険にさらされる。
【０００３】
エンテロウィルス属は、ピコルナウィルス科の１つの属である。現在、６４の血清型が人に感染することが知られており、該血清型は、３種のポリオウィルス、２３種のコクサッキーＡウィルス、６種のコクサッキーＢウィルス、２８種のエコーウィルス、および４種の他のエンテロウィルスを含む。エンテロウィルスのゲノムは、１つの大きなタンパク質をコードする単一鎖ＲＮＡであり、該タンパク質は、より小さい構造タンパク質および非構造タンパク質の組への自触反応による蛋白分解を受ける。現在認識されているエンテロウィルス全てのゲノムは、配列を決定されている。
【０００４】
エンテロウィルスは、消化管およびことによると呼吸経路を通して身体に侵入する。それらの複製の通常部位は胃腸管であり、胃腸管において、エンテロウィルスは、典型的には非特異的発熱疾患が付随する緩和なＧＩ疾患を引き起こす。しかしながら、血液を通した他の器官へのウィルスの広がりは、種々の深刻な疾病を引き起こす恐れがある。発熱疾患に加えて、主要な疾病関連は、麻痺性灰白随炎、無菌性髄膜炎、ヘルパンギーナ（喉の炎症）、結膜炎、深刻な新生児疾患、心筋心膜炎（心臓組織の炎症）、ボーンホールム病（流行性胸膜痛）、脳炎、発疹、若年発症ＩＤＤＭ、呼吸器感染、ポリオ様疾患、ならびに手、足および口の疾病を含む。エンテロウィルス属およびそれが引き起こす疾病の概要に関しては、www.cdc.gov/ncidod/dvrd/entrirs.htmから利用可能な非特許文献１、およびvirology-online.com/viruses/enteroviruses.htmから利用可能な非特許文献２を参照されたい（非特許文献１および２参照）。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，２７０，１８４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４５５，１６６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４８，２１１号明細書
【特許文献４】米国特許第５，１６９，７６６号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献６】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献８】米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【特許文献９】欧州特許第０６８４３１５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，１３０，２３８号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，４２７，９３０号明細書
【特許文献１２】欧州特許第０６２４６４３号明細書
【特許文献１３】米国特許第６，３１６，２００号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，９２８，８６９号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，９５８，７００号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，６９１，１４５号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，４７０，７２３号明細書
【特許文献１８】欧州特許第０６７８５８２号明細書
【非特許文献１】National Center of Infectious Diseases, Respiratory and Enteric Viruses Branch, Non-Polio Enterovirus Infection (November 6, 2000)
【非特許文献２】Enteroviruses (March 20, 2003)
【非特許文献３】J. Clin. Microbiol. 40:3666-70 (2002)
【非特許文献４】J. Clin. Microbiol. 35:976-77 (1997)
【非特許文献５】Science 254:1497-1500 (1991)
【非特許文献６】Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:392 (1992)
【非特許文献７】Nucl. Acids Res. 20:1691 (1992)
【非特許文献８】Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:1874-78 (1990)
【非特許文献９】BioTechnology 6:1197 (1988)
【非特許文献１０】Nat Genet 19:225-232 (1998)
【非特許文献１１】Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:1173-77 (1989)
【非特許文献１２】Anal. Biochem. 259:226-34 (1998)
【非特許文献１３】J. Clin. Microbiol. 37:518-523 (1999)
【非特許文献１４】Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed., 2001)
【非特許文献１５】BMC Informatics 3:9 (2002)
【非特許文献１６】J. Virol. 68:8232-38 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
エンテロウィルス感染の慣用の臨床診断は、たとえば、喉または便の試料、脳脊髄液、皮膚の病変または生検材料のような感染した組織からウィルス粒子を検出するための専門の研究設備を必要とする。伝統的には、ウィルスは、細胞培養物から単離される。しかしながら、この技術は約３〜７日を要し、高価であり、かつ容易に利用することができない。慣用の診断方法を用いる感染の最も良好な証拠は、進行期感染または回復期中の中和抗体滴定量の上昇である。より新規なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検出方法が、エンテロウィルス検出の速度および感度を改善した。脳脊髄液の被検体において、細胞培養に基づく診断の３５〜４０％の成功割合に比較して、エンテロウィルス性髄膜炎が確認または疑われる症例の６６〜９０％超においてエンテロウィルスを検出することができる。前述のＰＣＲ試験は、細胞培養に基づく診断より優れる利点を提供するが、ＰＣＲは、特異性の欠如という難点を有する。具体的には、ライノウィルス核酸とのＰＣＲに用いられるプライマーのクロスハイブリダイゼーションが、誤診をもたらす可能性がある（非特許文献３および４参照）。したがって、当該技術において、エンテロウィルス感染を迅速かつ正確に診断する能力を改善することに対する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
当該技術のこの要求は、エンテロウィルス核酸の検出および定量化を改善する本発明の増幅プライマー、ハイブリダイゼーションプローブおよび関連する分析方法によって達成される。広範囲のエンテロウィルスの血清型を検出することができる。本発明の増幅方法は、たとえばライノウィルス核酸に比較して、エンテロウィルスに対して高度に特異的かつ選択的である。さらに、分析の高い感度および大きな速度は、１時間ほどの短い時間に、エンテロウィルスゲノムの５００個以下のコピーの検出を可能にする。
【０００８】
１つの態様において、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列からなるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、配列番号３の塩基１−１４、配列番号４の塩基１−１３、配列番号５の塩基２５−３７、配列番号６の塩基２５−３８、配列番号７の塩基２５−３７、配列番号８の塩基２５−３９、配列番号９の塩基２１−４０、および配列番号１０の塩基２１−４０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列から構成されていてもよい。標的結合配列は、エンテロウィルス核酸配列とハイブリダイズする機能を維持しつつ、１つまたは２つの塩基によって修飾されてもよい。したがって、本発明の別の態様は、前述のオリゴヌクレオチドの変異体であって、該変異体の標的結合配列は、その配列において、配列番号３の塩基１−１４、配列番号４の塩基１−１３、配列番号５の塩基２５−３７、配列番号６の塩基２５−３８、配列番号７の塩基２５−３７、配列番号８の塩基２５−３９、配列番号９の塩基２１−４０、および配列番号１０の塩基２１−４０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列から１つまたは２つの塩基が異なる。前記配列と異なる塩基対は、オリゴヌクレオチド変異体の５’末端の近傍または該末端に位置して、ポリメラーゼ伸長反応におけるオリゴヌクレオチド変異体のプライミング効率およびエンテロウィルス核酸との二重鎖形成の特異性に対するいずれの影響をも最小限にしてもよい。
【０００９】
別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの標的結合配列と、（ｂ）標的結合配列の３’または５’末端あるいはその両方に、標的配列と二重鎖を形成しない少なくとも１つの追加の配列とを含むオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、追加の配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端に位置して、エンテロウィルス核酸との二重鎖形成の特異性およびポリマー伸長反応におけるオリゴヌクレオチドのプライミング効率に対する影響を最小限にする。
【００１０】
標的結合配列の３’または５’末端あるいはその両方に位置する追加の配列は、選択される増幅反応に必要とされる配列または選択される検出反応のための配列のいずれを含んでもよい。すなわち、増幅または検出に有用である追加の配列を、標的結合配列に添加してもよい。たとえば、選択される増幅反応がストランド置換増幅である場合、選択される増幅反応に必要とされる配列は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、BsoB1、BsrI、BstNI、BsmAI、BstOI、Bs1IまたはHincIIエンドヌクレアーゼによって認識される部位からなる群から選択されてもよいが、それらに限定されるものではない（参照により本明細書の一部をなすものとする特許文献１〜３を参照）。たとえば選択される増幅反応が転写をベースとする増幅である場合、選択される増幅要件のために必要とされる配列はＤＮＡポリメラーゼプロモーターであってもよい（特許文献４参照）。選択される検出反応に必要とされる配列は、任意の検出可能な配列であってもよく、該配列は、ヘアピン、Ｇ−カルテット(G-quartet)、制限部位またはレポータープローブとハイブリダイズする配列を含むが、それらに制限されるものではない。あるいはまた、もしくはそれに加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識で標識化されてもよい。１つの実施形態において、標識は、蛍光性標識である。
【００１１】
本発明の別の態様は、エンテロウィルス核酸を検出する方法であって、エンテロウィルス核酸とオリゴヌクレオチドとの間のハイブリッドを形成するのに適当な条件下、生物試料をオリゴヌクレオチドと接触させる工程と、エンテロウィルス核酸とオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む方法である。この方法を実施するのに用いられるオリゴヌクレオチドは、前述のオリゴヌクレオチドの任意のものから選択することができる。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは検出可能に標識化されており、およびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標識によって直接的に検出される。
【００１２】
別の実施形態において、エンテロウィルス核酸を検出する方法は、エンテロウィルス核酸の一部をコピーする工程を含む。コピー工程は、逆転写を含んでもよく、あるいはエンテロウィルス核酸の一部を増幅する工程を含んでもよい。増幅は、中温性ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、好熱性ストランド置換増幅（ｔＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応、自動継続する配列複写、核酸をベースとする増幅、Ｑβレプリカーゼをベースとする増幅、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル増幅または転写をベースとする増幅を含むが、それらに限定されるものではない方法によって実施することができる。増幅は、エンテロウィルス核酸を逆転写酵素と接触させる工程と、逆転写酵素を用いるｃＤＮＡの重合を触媒する工程を含んでもよい。１つの実施形態において、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが標識化されており、および検出工程は標識化されたオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む。別の実施形態において、試料中の対照標準配列（エンテロウィルス核酸の実時間での定量化のためのもの）の存在下、単一の密封された反応容器中において逆転写増幅および検出が実施される。増幅プライマーとして使用することができるオリゴヌクレオチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５の塩基２５−３７、配列番号６の塩基２５−３８、配列番号７の塩基２５−３７、および配列番号８の２５−３９からなる群から選択される標的結合配列を含む。１つの実施形態において、配列番号５または配列番号６のオリゴヌクレオチドを順方向プライマーとして用い、および配列番号７または配列番号８のオリゴヌクレオチドを逆方向プライマーとして用いる。本発明の別の態様は、前述のオリゴヌクレオチドの任意のものにしたがうオリゴヌクレオチドを含むキットである。それらオリゴヌクレオチドは別個にまたは一緒に包装されてもよく、および該キットは、標識または酵素のような種々の他の成分に加えて、オリゴヌクレオチドの使用の指示を包含してもよい。１つの実施形態において、キットは、髄膜炎または脳炎を引き起こす他の病原体の核酸を検出するのに有用な試薬をさらに含んでもよい。特に、キットは、単純性疱疹ウィルス１または単純性疱疹ウィルス２を検出するのに有用な試薬を含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
エンテロウィルスゲノムの領域に相補的であるオリゴヌクレオチドを提供して、エンテロウィルス感染の診断を改善する。本発明の核酸を、プライマーをベースとする増幅分析のような核酸をベースとする検出方法を用いるエンテロウィルスゲノムの検出のためのプローブまたはプライマーとして使用してもよい。あるいはまた、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション反応における標識化されたプローブとして用いる際には、該オリゴヌクレオチドを用いてエンテロウィルス核酸を直接的に検出することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、他のウィルス種、バクテリア、菌類および他の潜在的病原体のオリゴヌクレオチドとは対照的に、エンテロウィルスゲノムを特異的に認識する。この高い識別は、以下に示すように、１２の血清型のエンテロウィルスの検出によって例示される。さらに、オリゴヌクレオチドがエンテロウィルスを識別する能力は、同様に以下に示すように、エンテロウィルスの近接した系統発生的な同族であることが知られている種々の株のライノウィルスが、増幅のためのターゲットとして機能しないことによって実証される。
【００１４】
標的核酸の増幅は、本発明の最も感度が高い実施形態の方法を提供する。標的の増幅を用いて、エンテロウィルスゲノムの５００個以下のコピーを生物試料中で検出することができる。１つの実施形態において、プライマーをベースとする増幅は、プライマーと標的配列との間の二重鎖部位を重合の開始部位として用いる、ＲＮＡをベースとするウィルスのテンプレートのｃＤＮＡへの変換のための逆転写酵素工程を含む。次に、ｃＤＮＡストランドを、種々の核酸をベースとする検出方法（ストランド置換増幅または標識化されたプローブとのハイブリダイゼーションを含む）のためのテンプレートとして用いることができる。
【００１５】
「標的配列」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが特異的に結合するエンテロウィルスの核酸配列を意味する。これらは、増幅される本来の核酸配列およびそれに相補的な２次ストランド（エンテロウィルスゲノムおよびエンテロウィルス遺伝子のｍＲＮＡ転写物のようなもの）も、増幅反応中に発生する本来の標的配列のコピーのいずれのストランドも含む。増幅反応中に発生する標的配列のコピーは、「増幅生成物」または「アンプリコン」と呼ばれる。「伸長生成物」は、標的配列をテンプレートとして用いる、プライマーのハイブリダイゼーションおよびヌクレオチド重合酵素によるプライマーの伸長によって生成される標的配列のコピーを意味する。
【００１６】
術語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドの機能を意味する。オリゴヌクレオチドがテンプレート上で伸長される際に、オリゴヌクレオチドはプライマーとして機能する。オリゴヌクレオチドが標的配列とハイブリダイズして、標的配列を捕捉ないし検出する場合に、オリゴヌクレオチドはプローブとして機能する。標的核酸を捕捉ないし検出することが可能である場合に、増幅に用いられるオリゴヌクレオチドは同様にプローブとして機能してもよい。本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、一般的に、１０、１５、２０または２５ヌクレオチドから、４０、５０または７５ヌクレオチドまでの長さである。典型的には、好熱性ストランド置換増幅に有用な増幅プライマーの全長は、３０〜４５ヌクレオチドである。しかしながら、それは１０〜７０ヌクレオチドであってもよい。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたは増幅プライマーを調製するのに適当な塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルおよびチミンのような天然に存在するヌクレオチド塩基、およびイノシンを含むがそれに限定されるのものではない天然に存在しないヌクレオチド塩基（すなわち「合成」ヌクレオチド塩基）から選択することができる。合成塩基は、検出または捕捉を容易にする種々の付加物を含んでもよく、それらは当該技術においてよく知られている。そのような付加物は、蛍光体、放射性同位体またはビオチンを含むが、それらに限定されるものではない。
【００１８】
オリゴヌクレオチドの主鎖は、全体的または部分的に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、カルボサイクル(carbocycles)のような修飾された糖、およびフルオロ置換およびメトキシ置換のような２’置換を含む糖を包含してもよい。主鎖のホスホジエステル結合は、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデートおよびホスホロアミデートのような修飾されたホスフェートであってもよい。オリゴヌクレオチドはペプチド核酸であってもよい（非特許文献５参照）。唯一の要件は、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくともその一部が標的ＤＮＡ分子の配列の一部と結合することができる配列を有するべきであるということである。
【００１９】
増幅方法およびプライマー設計
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドを、当該技術において知られている核酸増幅の任意の方法において用いることができる。「増幅プライマー」は、プライマー伸長による標的配列の増幅のためのプライマーである。伸長生成物は、プライマー、プライマーの一部、およびプライマーの結合部位の下流の標的配列の相補体(complement)である新規に合成されたストランドを含む。２種の増幅プライマーの組を用いて、エンテロウィルス標的配列を増幅してもよい。あるいはまた、単一の増幅プライマーまたは３種以上の増幅プライマーを用いて本発明の方法を実施することができる。
【００２０】
適当な増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、特許文献５〜８参照）、ストランド置換増幅（「ＳＤＡ」、非特許文献６および７、ならびに特許文献１参照、それら文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする）、好熱性ストランド置換増幅（「ｔＳＤＡ」、特許文献９参照）、自動継続する配列複写（「３ＳＲ」、非特許文献８参照）、核酸配列をベースとする増幅（「ＮＡＳＢＡ」、特許文献１０参照）、Ｑβレプリカーゼ系（非特許文献９参照）、リガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」、特許文献１１参照）、ローリングサークル増幅（非特許文献１０参照）、および転写をベースとする増幅（非特許文献１１参照）を含むが、それらに限定されるものではない。本発明の増幅プライマーを用いて、ＰＣＲ、ＳＤＡまたはｔＳＤＡを実施することができ、ここでｔＳＤＡが好ましい。
【００２１】
増幅プライマーの設計は、それぞれの増幅の方法に最適化してもよい。たとえば、ＳＤＡに有用な増幅プライマーは、標的配列とハイブリダイズすることができる３’末端を含む。増幅プライマーは、特許文献１、２および９に記載されるように、その５’末端近傍に、認識部位が半修飾(hemimodified)される際にＤＮＡ二重鎖をニックすることを可能にする制限エンドヌクレアーゼのための制限部位をさらに含む。また、増幅プライマーは、増幅プライマーの標的結合配列が標的配列とハイブリダイズする際にポリメラーゼによって伸長可能な３’−ＯＨ基を含む。
【００２２】
（ＰＣＲ）に有用である増幅プライマーは、標的結合配列のみから構成されてもよい。なぜなら、増幅反応を行うために特別な配列も構造も必要としないからである。対照的に、３ＳＲおよび核酸配列をベースとする増幅（ＮＡＳＢＡ）のような他の増幅方法に有用である増幅プライマーは、当該プライマーの５’末端近傍にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。プロモーターは、標的配列に付加され、そして標的のＲＮＡの多数のコピーの転写を誘導することによって増幅反応を行う。ＲＮＡポリメラーゼにより触媒される重合のテンプレートとして機能するプライマーにおいて、プロモーター配列を含む安定なＤＮＡ二重鎖が、増幅される標的配列の上流側に形成されなければならない。そのようなポリメラーゼプロモーター配列は標的配列との二重鎖を直接的には形成しないので、それらプロモーターは、プライマーの標的結合配列とのハイブリダイゼーション特異性を変化させない。
【００２３】
ｔＳＤＡの場合、プライマーおよびそれらの標的配列を、それらのＧＣ含有率が全ヌクレオチド組成の７０％未満であるように選択して、標的増幅の効率を制限する恐れがある二次構造およびプライマー−プライマー相互作用を最小限にする。ｔＳＤＡに適当な増幅プライマーは、プローブの３’末端から５’末端ヘ向かう順序で、標的結合配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および「テール」を含む。標的結合配列は、標的核酸の相補的配列に対して特異的にハイブリダイズする。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、非特許文献６および７に記載されるように、認識部位が半修飾(hemimodified)される際に、ＤＮＡ二重鎖の一方のストランドをニックする制限エンドヌクレアーゼによって認識される。５’テールは、ｔＳＤＡ中に増幅プライマーの残部がニックおよび置換される際に、ポリメラーゼのリプライミング部位として機能する。テールのリプライミング機能は、ｔＳＤＡ反応を継続させ、および単一の標的分子からの多数のアンプリコンの合成を可能にする。テール領域の長さおよび配列は、テールがニックの後に標的に対してハイブリダイズしたままであること、およびテールが標的結合配列または他のプライマーのいずれもに対してハイブリダイズする配列を含有しないことを条件として、変化してもよい。
【００２４】
ｔＳＤＡのようないくつかの増幅方法は、好ましくは、「バンパープライマー」または「外部プライマー」を用いて、プライマー伸長生成物を置換する。あるいはまた、プライマー伸長生成物は、加熱することによって置換されてもよい。バンパープライマーは、増幅プライマーの標的結合配列の上流の標的配列にハイブリダイズして、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物を置換するようにされる。ＳＤＡおよびｔＳＤＡにおいて用いられるバンパープライマーはエンテロウィルス核酸に対して特異的にハイブリダイズする必要はない。むしろバンパープライマーは、増幅プライマーの上流であり、かつ増幅プライマーの結合部位に充分に近接する任意の標的配列とハイブリダイズし、バンパープライマーの伸長時に増幅プライマー伸長生成物を置換してもよい。一般的に、バンパープライマー配列とその標的配列との間のミスマッチは、バンパープライマーが依然としてその標的配列にハイブリダイズすることを条件として、増幅効率に影響しない。さらに、他の核酸に優先する標的配列の増幅に関するＳＤＡ系の特異性は、標的核酸に対するハイブリダイゼーションに関するバンパープライマーの特異性に依存しない。標的配列に関するＳＤＡ系の特異性は、ＳＤＡプライマーと、増幅生成物の検出に用いられるプローブまたはオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの忠実度(fidelity)に由来する。
【００２５】
エンテロウィルス核酸を検出する１つの方法は、逆転写酵素ＳＤＡ（「ＲＴ−ＳＤＡ」）である。定量的ＲＴ−ＳＤＡを実施する方法は、たとえば非特許文献１２に教示される（非特許文献１２参照、該文献は参照により本明細書の一部をなすものとする）。この方法においては、最初に逆転写酵素（「ＲＴ」）がＲＮＡをｃＤＮＡへと変換し、次にそれを、等温ＳＤＡを用いて増幅する。逆転写酵素は、プライマーとエンテロウィルス標的核酸との間の二重鎖においてＤＮＡの重合を触媒することを開始する。ＲＴに触媒される重合を開始するのに有用なプライマーは、コピーされるエンテロウィルスＲＮＡ配列の３’末端において、または３’末端を越えて特異的にハイブリダイズする任意のプライマーを含む。本発明の方法によれば、プライマーは、配列番号７および配列番号８にて前述したプライマーを含む。たとえば、コクサッキーウィルスＢ５のテンプレートを用い、Ent5rp1.0（配列番号７）を用いてＲＴ活性をプライミングしてもよい（以下の実施例参照）。逆転写をプライミングするためのプライマーは、配列番号４の塩基１−１３、配列番号７の塩基２５−３７、および配列番号８の塩基２５−３９からなる群から選択される塩基からなる標的結合配列を含んでもよい。これらのプライマーの標的結合配列は、過酷なハイブリダイゼーション条件下で安定な二重鎖を形成することができる。１つの実施形態において、標的結合配列は、標的結合配列である配列番号４、配列番号７または配列番号８と１つの塩基が異なっており、およびさらに別の実施形態においては２つの塩基が異なっている。本発明のさらなる実施形態において、非特許文献１３（参照により本明細書の一部をなすものとする）に記載されるように、多数のオリゴヌクレオチドを用いて逆転写をプライミングしてもよい。この実施形態は、単一のＲＮＡ種からの引き続いて起こる増幅のために、ｃＤＮＡテンプレートの多数のコピーを発生させる逆転写酵素の固有のストランド置換活性を利用する。たとえば、本発明の方法によれば、プライマーEntreb1.0（配列番号４）およびEnt5rp1.0（配列番号７）のそれぞれを用いて、ＳＤＡに先だって、エンテロウィルスＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡコピーを発生させてもよい。さらなる実施形態において、逆転写に３種以上のプライマー配列を用いて、エンテロウィルスＲＮＡの検出の効率を向上させてもよい。
【００２６】
１つの実施形態において、逆転写、増幅および検出を、サンプル中のエンテロウィルス核酸の実時間における定量化のための対照標準配列の存在下、単一の密閉された反応容器中で行ってもよい。対照標準配列は、好ましくは、ウィルスの標的核酸と同じプライマーを用いて逆転写および共増幅されるＲＮＡ分子またはその部分である。増幅された対照標準配列およびウィルスの標的核酸は、特異的信号プライマーおよび／または標識化されたプローブを用いて、区別して検出される。ウィルスの量(load)の定量化を必要としない定性的用途においては、内部対照標準の成功した増幅を用いて、たとえば、阻害性化合物の存在に関して、反応を監視する。
【００２７】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的結合配列の３’末端に追加の配列を含まない。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、標的結合配列の５’末端において追加の配列を含有し、該追加の配列は制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
【００２８】
プライマーがエンテロウィルス核酸に結合することを条件として、ＲＴプライマーの標的結合配列に対して修正を施すことができることを、当業者は容易に理解するであろう。以下に関連するように、「ハイブリダイゼーションプローブ」の下では、二重鎖の安定性と、温度、ミスマッチの塩基の程度および溶液の条件のようなパラメータとの間の関係が与えられれば、プライマーの標的結合配列に対する修正の、プライマー−標的二重鎖の安定性に対する効果を予測することができる。この場合においては、適切な溶液条件は、ＲＴ活性を容認するようなものである。本発明において有用である他の有用なＲＴをベースとする増幅方法は、ＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡを含む。
【００２９】
内部対照標準配列および対応するプライマーまたは信号プライマー／プローブを提供して、エンテロウィルスＲＮＡの正確な定量化を可能にしてもよく、またはエンテロウィルス核酸の定量的分析における成功した増幅の対照標準として機能させてもよい。バンパープライマーは、増幅反応において、テンプレートストランドから単一鎖ＤＮＡの増幅生成物を解離させるのに有効である。しかしながら、固有のＲＮアーゼＨ活性を有する逆転写酵素を用い、および該酵素がＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中間体のＲＮＡストランドの分解を触媒する場合、ＲＴ−ＳＤＡにおいては、そのようなバンパープライマーを必要としない。あるいはまた、反応に対して外因性ＲＮアーゼＨを添加して、ｃＤＮＡ合成の後にＲＮＡテンプレートを分解してもよい。
【００３０】
一般的に、ＳＤＡは、以下の経路に沿って進行する。第１に、増幅プライマーが、標的配列または以前に重合され置換された単一鎖の伸長生成物に結合する。第２に、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが、伸長生成物中にα−チオデオキシヌクレオシドトリホスフェート（「α−チオ−ｄＮＴＰ」）を組み込む。たとえば、α−チオ−ｄＮＴＰがα−チオ−ｄＣＴＰである場合、テンプレート中に相補的なＧ残基が存在する場合には必ず、それ（α−チオ−ｄＣＴＰ）が伸長生成物中に組み込まれる。制限エンドヌクレアーゼ認識部位における伸長生成物中へのα−チオ−ｄＮＴＰの組み込みは、半修飾部位、すなわち伸長生成物ストランド上のみにおいて修飾された部位をもたらす。次に、制限エンドヌクレアーゼが半修飾された二重鎖の制限部位をニックする。次に、制限エンドヌクレアーゼがニック部位から解離する。最後に、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が欠損しているポリメラーゼが、ニックの３’末端から伸長し、そしてＤＮＡの下流のストランドを置換する。ニック(nicking)、ストランド伸長およびストランド置換は同時かつ連続的に発生する。なぜなら、ニックからの伸長が、別のニック可能な制限部位を再生するからである。それぞれが標的配列を含む二重鎖の二重鎖の２つのストランドの一方とハイブリダイズする一対の増幅プライマーを用いる場合、増幅は指数的である。なぜなら、増幅のそれぞれの回においてセンスストランドおよびアンチセンスストランドがテンプレートとして機能するからである。単一の増幅プライマーを用いる場合、増幅は一次である。なぜなら、一方のストランドのみがプライマー伸長のためのテンプレートとして役に立つからである。α−チオ−ｄＮＴＰが組み込まれる際にそれらの二重鎖の認識部をニックし、かつＳＤＡに適当である制限エンドヌクレアーゼの例は、BsoB1、BsrI、BstNI、BsmAI、BstOI、BslI、AvaI、HincIIおよびNciIを含む。ＳＤＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする特許文献１〜３にさらに記載されている。
【００３１】
試薬、ピペット計量装置、および実験表面における、以前の増幅反応から持ち込まれる増幅生成物による相互汚染を、伸長生成物中に種々の残基を組み込むことによって減少させてもよい。たとえば、チミンを２’−デオキシウリジン−５−トリホスフェート（「ｄＵ」）で置換してもよい（特許文献１２参照）。増幅生成物中に組み込まれるｄＵの除去は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（「ＵＤＧ」）によって触媒することができ、それはｄＵを含有する増幅生成物のさらなる増幅を不可能にする。引き続く増幅に対して適切である場合には、ＵＤＧ自身を不活性化してもよい。
【００３２】
本明細書に開示される増幅プライマーを、エンテロウィルス核酸の一部をコードする核酸とハイブリダイズし、そして該核酸を増幅する。特に、本明細書に開示される増幅プライマーは、ヒトに対して感染性であると認識されているエンテロウィルス血清型をコードする核酸を増幅する。該血清型は、２３種のコクサッキーＡウィルス、６種のコクサッキーＢウィルス、２８種のエコーウィルス、および４種の他のエンテロウィルスを含むが、それらに限定されるものではない。１つの実施形態において、増幅プライマーを用いて、コクサッキーウィルスＡ９、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５；エコーウィルスＥ６、Ｅ７、Ｅ９、Ｅ１１、Ｅ２５およびＥ３０；およびエンテロウィルスＥ７１の核酸を増幅してもよい。１つの実施形態において、増幅プライマーは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８で与えられる配列を有する。増幅プライマーは、（ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５の塩基２５−３７、配列番号６の塩基２５−３８、配列番号７の塩基２５−３７、および配列番号８の塩基２５−３９からなる群から選択される標的結合配列と；（ｂ）該標的結合配列の５’末端における、標的配列と二重鎖を形成することが不可能である少なくとも１つの追加の配列とを含んでもよい。バンパープライマーは、配列番号３および配列番号４にて記載した配列から構成されてもよい。他の有用なバンパープローブは、（ａ）配列番号３の塩基１−１４および配列番号４の塩基１−１３からなる群から選択される標的結合配列と、（ｂ）該標的結合配列の５’末端における、標的配列と二重鎖を形成することが不可能である少なくとも１つの追加の配列とを含む。
【００３３】
増幅された核酸の検出
エンテロウィルス核酸の存在は、増幅されたエンテロウィルス核酸の存在を測定することによって検出してもよい。増幅生成物は、慣用の技術を用いる標識化されたプローブとのハイブリダイゼーションによって検出することができ、好ましくは内部プローブ（すなわち、増幅プライマーの間に存在する配列において増幅された核酸とハイブリダイズするもの）を用いる。あるいはまた、増幅生成物は、それらの特徴的サイズによって、たとえば、電気泳動と、それに引き続いて行われる核酸を可視化するための臭化エチジウム染色によって検出してもよい。さらなる代替手段においては、標識化された増幅プライマーを用いる。さらに別の代替手段においては、非特許文献６および７に記載されるように、標識化された増幅プライマー／内部プローブ（「検出プライマー」）を標的配列上で伸長させる。
【００３４】
１つの実施形態において、増幅の生成物は、参照により本明細書中に組み込まれるものとする特許文献１３に記載されるように、均一で実時間の形式にて検出される。この方式によれば、検出システムは、５’アダプター配列を含む標識化されていない信号プライマーをレボータープローブと組み合わせて用い、該レポータープローブの３’末端は該５’アダプター配列の相補体とハイブリダイズし、５’オーバーハングを生成する。ポリメラーゼを用いてオーバーハングを完成し、そしてレポータープローブの５’オーバーハングの相補体を合成し、該相補体を直接または間接的に検出してもよい。信号プライマーは、配列番号９または配列番号１０を含んでもよく、およびレポータープローブは配列番号１１または配列番号１２を含んでもよい。別の実施形態においては、エンテロウィルス特異的核酸増幅の検出は、反応進行中に増大または減少して特定の標的の存在を示してもよい蛍光を監視することによって行われる。さらに別の実施形態においては、レポータープローブは、ごく接近して保持される蛍光団(fluorophore)および消光剤部分によって標識化される。プローブは線状であってもよく、ヘパリンまたはＧ−カルテット(G-quartets)のように当該技術において知られている二次構造を有してもよい（それら全体は参照により本明細書の一部をなすものとする特許文献１４〜１６参照）。ハイブリダイズされるレポータープローブテンプレート上のアダプターテール相補体の３’末端からの伸長は、レポータープローブの立体配座を変化させ、２つの染料の空間的離隔を増大させ、そして蛍光を発生させる。第１表の配列番号１１および配列番号１２中にイタリックで示されるような発光体および消光体の間の二重鎖の制限エンドヌクレアーゼ認識部位の形成によって、さらなる蛍光を発生させてもよい。二重鎖の検出プローブが適切な制限酵素にさらされる際に、該配列は開裂され、したがって、発光体を消光剤からさらに離間し、そして蛍光を増大させる。
【００３５】
次に、増幅反応の進行中に蛍光を測定して、標的特異的なＳＤＡ生成物の蓄積を監視する。蛍光信号は、生成される特異的アンプリコンの量に比例する。エンテロウィルス標的核酸の存在下、蛍光は増大する。標的のない状態では、蛍光は反応を通して一貫して低いままである。
【００３６】
別の実施形態において、特許文献１４および１５に記載されるように、標識化されたレポータープローブのハイブリダイゼーションおよび伸長によって、検出は直接的に実施される。本方法の実施形態において、標識化されたレポータープローブの標的結合配列は、配列番号９または配列番号１０の標的結合領域を含む。
【００３７】
また、特異的検出方法は、増幅された生成物がビオチン化された捕捉プローブおよび酵素が結合された検出プローブを用いて検出される化学発光方法を含む（特許文献１７参照）。２つの増幅プライマー結合部位の間の異なる部位におけるこれら２つのプローブのハイブリダイゼーションの後に、複合体をストレプトアビジンで被覆されたマイクロタイタープレート上に捕捉し、そして、化学発光信号を発現させて光度計で読みとる。さらなる代替方法として、特許文献１８に記載されるような信号プライマーを増幅反応中に含めて、増幅生成物の検出を容易にする。この実施形態において、増幅中に標的増幅に依存する様式にて標識化された二次増幅生成物が発生し、および該二次増幅生成物を、付随する標識を用いて、標的増幅の指標として検出してもよい。
【００３８】
本発明の別の態様は、核酸プローブを用いてエンテロウィルスを検出するための属特異的(genus-specific)方法である。本発明のこの実施形態によれば、前述のように、核酸プローブは、増幅されたエンテロウィルス核酸にハイブリダイズし、そして次にプローブとエンテロウィルス核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する。ハイブリダイゼーションは、当該技術において知られている任意の適当な方法の下で実施することができる。しかしながら、高度に過酷なハイブリダイゼーション条件によって提供される高度の標的識別は必要ではない可能性がある。なぜなら、増幅された核酸は比較的高い濃度にあるからである。
【００３９】
同様に、プローブとエンテロウィルス核酸との間のハイブリダイゼーションの検出は、当該技術において知られている任意の方法によって実施することができる。プローブは、標識化されたプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを示す検出可能な標識を含有してもよい。プローブの検出可能な標識は、直接または間接的のいずれかにおいて検出することができる部分である。標識の直接検出のためには、プローブに放射性同位体を付与し、そしてオートラジオグラフィーによって検出してもよい。あるいはまた、プローブに蛍光性部分を付与し、そして当該技術において知られているように蛍光によって検出してもよい。さらなる代替として、プローブに該プローブを検出可能にするために追加の試薬を必要とする標識を付与することによって、該プローブを間接的に検出してもよい。間接的標識化の例示的方法は、化学発光剤；可視の反応生成物を生成する酵素；および、たとえばハプテン、抗体または抗原のような、標識化された特異的に結合する相手に結合すること（たとえば、ハプテンは標識化された抗体と結合する）によって検出することができるリガンドを使用する方法を含む。また、リガンド標識は、オリゴヌクレオチドプローブ、すなわち捕捉プローブの固相捕捉にも有用である。例示的標識は、ビオチン（標識化されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合することによって検出可能）、およびホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素（着色した反応生成物を生成する酵素基質の添加によって検出可能）を含む。オリゴヌクレオチドを標識する方法は、当該技術においてよく知られている。
【００４０】
ハイブリダイゼーションプローブ
また、本発明のオリゴヌクレオチドの標的結合配列は、標的エンテロウィルス核酸の直接検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。増幅による検出とは異なり、プローブハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼによる伸長を必要としない。多くの場合、プローブを検出可能な標識と連結して、標的配列にハイブリダイズする際の該プローブの検出または捕捉を容易にする。適切なハイブリダイゼーション方法は、ＤＮＡの検出のためのサザンブロットおよびＲＮＡの検出のためのノーザンブロットを含み、それらは当該技術においてよく知られており、非特許文献１４に記載されている（非特許文献１４参照）
【００４１】
依然としてエンテロウィルス核酸とハイブリダイズすることを可能にしながら、プローブおよびプライマーの両方の標的結合配列を修飾してもよい。標的結合配列とエンテロウィルス標的との間の相互作用の強度は、二重鎖の半分を解離させるのに必要とされる融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは、参照により本明細書の一部をなすものとする非特許文献１４に記載されるように、ホルムアミドのような有機共溶媒の濃度に加えて、ハイブリダイズする核酸のＧ残基およびＣ残基の％含有率、塩濃度、相補的塩基対を有する配列の長さの関数である。プローブまたはプライマーとその標的結合配列との間への塩基対ミスマッチの導入は、予測可能な方法で二重鎖形成に関連するエネルギーを減少させ、Ｔｍの低下に反映される（非特許文献１５参照）。好ましくは、プローブは、プローブの標的結合領域とミスマッチする多くの残基を含有する非エンテロウィルス配列とハイブリダイズしない。ハイブリダイゼーション反応を、高度に厳しい条件下、たとえば、６０℃におおける、または、さらには７０℃における、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄の過酷さにおいて実施してもよい。非特許文献１４を参照されたい。ＲＴ−ＳＤＡのような増幅方法において増幅プライマーが標的配列と相互作用する際に、異なるハイブリダイゼーション条件を用いてもよいことを、当業者は理解するであろう。
【００４２】
本明細書に開示されるプローブは、ヒトに対して感染性であると認識されているエンテロウィルス血清型をコードする核酸とハイブリダイズする。該血清型は、３種のポリオウィルス、２３種のコクサッキーＡウィルス、６種のコクサッキーＢウィルス、２８種のエコーウィルスおよび４種の他のエンテロウィルスを含むが、それらに限定されるものではない。１つの実施形態において、プローブは、コクサッキーウィルスＡ９、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５；エコーウィルスＥ６、Ｅ７、Ｅ９、Ｅ１１、Ｅ２５およびＥ３０；ならびにエンテロウィルスＥ７１の検出に有用である。本発明に有用なプローブは、（ａ）配列番号３の塩基１−１４、配列番号４の塩基１−１３、配列番号５の塩基２５−３７、配列番号６の塩基２５−３８、配列番号７の塩基２５−３７、配列番号８の塩基２５−３９、配列番号９の塩基２１−４０、および配列番号１０の塩基２１−４０からなる群から選択される標的結合配列と、（ｂ）標的配列の３’末端または５’末端の、標的配列と二重鎖を形成することができない少なくとも１つの追加の配列とを含むオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００４３】
キット
また、本発明は、本明細書に記載されるようにオリゴヌクレオチド核酸プローブまたは増幅プライマー、好ましくは一対の増幅プライマーを含む、エンテロウィルス核酸を検出するためのキットを提供する。キットは、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＳＤＡまたはＲＴ−ＳＤＡのようなハイブリダイゼーション反応または増幅反応を実施するための他の成分および試薬をさらに含んでもよい。ハイブリダイゼーションによる検出のためには、ハイブリダイゼーションを実施するのに適切な溶液（たとえば、０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ）を含んでもよい。同様に、検出方法のための成分（たとえば、第２のプローブ、放射線標識、酵素基質、抗体など）を、キット中に含んでもよい。また、核酸増幅方法に用いることが適切な試薬を含んでもよい。キットの成分は、共通の容器中に一緒に包装され、典型的には、本明細書中に開示される方法の選択された具体的実施形態を実施するための指示を含む。
【００４４】
試料
本明細書に開示される方法、プローブ、増幅プライマーおよびキットを用いて、エンテロウィルスを含有することが疑われる任意の試料中のエンテロウィルスを検出することができる。たとえば、試料は、単離された核酸、単離されたウィルス、臨床標本または環境試料を含んでもよい。典型的には、臨床試料は、生物液体または組織（たとえば喉または便の試料）、脳脊髄液、皮膚の病変および生検材料である。エンテロウィルスはヒトおよび非ヒトの動物種の両方に感染する可能性があるので、本発明は、ヒト診断手順および獣医学的診断手順の両方に適用可能であり、および、生物試料はいずれの源から得られるものであってもよい。また、エンテロウィルスは下水または水の試料から発見される可能性があり、本発明の方法はこれらの標本および他の環境標本に適用可能である。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、および限定的と解釈するべきではない。ヌクレオチド配列は、左から右へと、５’から３’方向の単一鎖配列として示した。ヌクレオチド配列は、米国特許法施行規則(37 C.F.R.)のセクション1.822にしたがって、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionに推奨される方法にて同定される。
【００４６】
以下の実施例は、ＳＤＡの進行中に発生する標的特異的蛍光に基づく結果を含む。反応を通して蛍光を測定して、特定の増幅生成物の蓄積を監視し、および信号は生成される特定のアンプリコンの量に比例する。標的のない状態では、蛍光は反応を通して一貫して低いままである。蛍光の増大は標的核酸の存在を示し、一方蛍光の実質的変化のないことは標的のないことを示す。
【００４７】
典型的には、試料の蛍光を経時で測定して、試料が標的核酸を含有するかどうかを決定する。１つの実施形態においては、蛍光を１時間の過程について６０回測定してもよい。言い換えると、ほぼ毎分で、試料容器（またはマイクロウェル）中で測定される蛍光の量、補正値（必要な場合）および試料の各カラムのための標準物質に関してデータが収集される。グラフの曲線下の面積に関する「ＭＯＴＡ」（メトリック・アザー・ザン・アクセレーション(Metric Other Than Acceleration)）法を用いて、データを分析してもよい。ＭＯＴＡが大きいほど、より多くの蛍光が発生し、かつ増幅された生成物の検出がより効率的である。
【００４８】
別個の検出剤間の比較のための本発明に適当である別の方法は、BD ProbeTec（商標）ETシステムでの使用のために特に開発された新規のパス・アフター・スレショルド(Passes After Threshold)（ＰＡＴ）アルゴリズムである。ＭＯＴＡと同様に、より高いＰＡＴ評価値は、より効率的なＳＤＡ反応を示す。ＰＡＴアルゴリズムを使用する際には、バックグラウンドが補正された蛍光強度の信号が予め定められた閾値と交差する時間を、Ｔ３（「タイム・トゥ・スレショルド(Time-To-Threshold)」）と呼ぶ。同一の閾値の値を、全ての試料に用いる。ＰＡＴ評価値は、６０からＴ３値を減算したものに等しい。陰性の試料は蛍光の最小の閾値を達成せず、したがって０のＰＡＴ値を割り当てる。分析および標的のレベルに依存して、陽性の試料は１と６０との間のＰＡＴ値、より好ましくは４０〜５５のＰＡＴ値を有する。より低いＴ３評価値および対応するより高いＰＡＴ値はより効率的なＳＤＡに相関する。ＰＡＴアルゴリズムは、増幅曲線の最も再現性が高い部分のみを用いる。結果として、ＰＡＴアルゴリズムの方法は、ウェルまたは試料間の認識可能な差異を最小限にし、および反応間の比較の他の方法よりも正確である。ＰＡＴ評価値の決定は、BD ProbeTec（商標）ETシステムによって自動的に実施することができ、それによってBD ProbeTec（商標）ETシステムのプリントアウトは、ＰＡＴ評価値および報告可能な結果（すなわち、陽性または陰性のいずれか）を提供する。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）エンテロウィルス５’ＮＴＲのクローニング
以下のプライマーを用い、コクサッキーウィルスＢ５（American Type Culture Collection名称VR185）から単離されるＲＮＡに対して、逆転写酵素−ＰＣＲを実施した。
ｉ．  CoxA9L744  TTG AVA CYT GAG CTC CCA T       （配列番号１）
ii．  CoxA92U    TTA AAA CAG CCT GTG GGT TG      （配列番号２）
【００５０】
これらのプライマーは、ウィルスゲノムの５’末端の７６１塩基対のフラグメントを増幅する。増幅されたＤＮＡをpCRII-TOPOプラスミドベクター(Invitrogen)中に挿入した。組み換えクローンを、pCoxB5と称した。BamHI制限酵素を用いる消化によって、組み換えＤＮＡを精製および線状化した。ＤＮＡを、Qiagen QIAクイックスピンカラムを用いて生成し、蛍光性ピコグリーン試薬(Molecular Probes)を用いる分析によって定量化した。標的ＤＮＡの希釈物を、１０ｎｇ／μＬのヒトＤＮＡを含有する水中で調製した。
【００５１】
ＲＴ−ＳＤＡのために、MegaScript T7キット(Ambion)を用い、BamHIで消化されたpCoxB5からインビトロ転写物を発生させた。RNAは、リボグリーン(Molecular Probes)を用いる蛍光分光法によって定量化した。ＲＮＡ転写物の希釈物を、キャリアとして１０ｎｇ／μＬの酵母ＲＮＡを含有する水中で調製した。
【００５２】
（実施例２）クローニングされたエンテロウィルスＤＮＡの増幅
エンテロウィルスＲＮＡの検出のためのＲＴをベースとする分析の最適化に向けての最初の段階として、最初に、クローニングされたエンテロウィルスの増幅のためのＳＤＡシステムを、実施例１中に記載される標的核酸を用いて開発した。ＤＮＡ増幅分析の検出限界を、クローニングされたプラスミドの希釈物を用いて決定した。１６回のＳＤＡ反応を、それぞれの標的レベル（反応当たり１００、５０、２５、１０、５または０コピーの二重鎖ＤＮＡに相当する）において実施した。増幅は、５０ｎＭのEnt5forb1.0およびEnt5reb1.0、１００ｎＭのEnt5fp1.0、５００ｎＭのEnt5rp1.0、２５０ｎＭのEnt5UD1.0、および５００ｎＭのTBD10 D/Rを用いるBD ProbeTec（商標）ET装置を用いて、５２℃において実施した。これらのプライマーの配列を第１表に列挙する。最終バッファ条件は以下のようなものであった：１００ｍＭのビシン（bicine）、３５ｍＭのＫＯＨ、４５ｍＭのＫｉＰＯ４、１２％のグリセロール、８５％のＤＭＳＯ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、５００ｎＭの２’−デオキシシトシン−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート））「ｄＣｓＴＰ」）、１００ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１００ｎｇ／μＬのＢＳＡ、約８０単位のBstポリメラーゼおよび約２４０単位のBsoBI制限酵素。
【００５３】
１時間の経過にわたって６０回、蛍光を監視した。結果をＭＯＴＡ評価値（図３を参照）に換算して表現した。より大きなＭＯＴＡ評価値は、より多くの蛍光の発生、および一般的に増幅される生成物のより多くの蓄積を示す。本実験の目的においては、＞３０００のＭＯＴＡ評価値を、陽性であるとみなした。エンテロウィルスＤＮＡ増幅分析の検出限界は、反応当たり９コピーの標的ＤＮＡ（９５％信頼区間：４、１３）であると計算された。
【００５４】
【表１】
2005204664.tif 000002
【００５５】
エンテロウィルスＲＮＡ配列にハイブリダイズする（すなわち該配列と相補的である）ＳＤＡプライマーおよびアダプター内の標的結合配列すなわち領域を下線を付して示した。BsoBI制限部位は、イタリックである。
【００５６】
（実施例３）クローニングされたエンテロウィルスＲＮＡの増幅
実施例２に記載されるＤＮＡ増幅を、２段階のＲＴ−ＳＤＡシステムに変換した。該システムにおいては、最初に、ＲＮＡは、鳥類骨髄芽球−ＲＴ（ＡＭＶ−ＲＴ）を用いてｃＤＮＡにコピーされ、次に慣用のＳＤＡ反応において増幅された。ＡＭＶ−ＲＴ酵素の固有のＲＮアーゼ活性のために、ＲＮＡ標的の増幅にバンパープライマーは必要ではなかった。該ＲＮアーゼ活性は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡストランドを分解し、それによって遊離の単一鎖ＤＮＡを遊離させる。
【００５７】
簡単にいえば、逆転写を、６９．４ｍＭのビシン(bicine)、１２．３ｍＭのＫＯＨ、２０．８ｍＭのＫｉＰＯ４、５％のグリセロール、５％のＤＭＳＯ、１００ｎｇ／μＬのＢＳＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５００μＭのｄＣｓＴＰおよび５００ｍＭのプライマーEnt5rp1.0を含有するバッファ中に１０単位のＡＭＶ−ＲＴを有するミクロ遠心管内で実施した。次に２５μＬの体積の逆転写反応物を、ＳＤＡプライマー、バンパープライマー、アダプタープライマー、検出プローブ、ヌクレオチド類およびバッファー成分を含有するプライミングマイクロウェルに移動させた。マイクロウェルに蓋をし、７２℃の熱ブロックへ移動させる前に、２０分間にわたって周囲温度においてインキュベートした。同時に、酵素およびバッファ成分を含有する増幅ウェルを５４℃の熱ブロックへ移動させた。それぞれの温度におけるプライミングウェルおよび増幅ウェルの１０分間のインキュベーションの後に、１００μＬのプライミング反応物を、予熱された増幅ウェルに移動させた。最終増幅条件は以下のとおりであった：１００ｍＭのビシン(bicine)、３５ｍＭのＫＯＨ、４５ｍＭのＫｉＰＯ４、１２％のグリセロール、８．５％のＤＭＳＯ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、約８０単位のＢｓｔポリメラーゼ、および約２６５単位のＢｓｏＢＩ制限酵素。６０回にわたって蛍光を監視し、および結果をＭＯＴＡおよびＰＡＴに換算して示した（第２表参照）。実施例２においてと同様に、３０００以上のＭＯＴＡ評価値を陽性とみなした。０．０より大きいＰＡＴ評価値を陽性とみなした。
【００５８】
ＲＴを欠く対照標準反応を除いて、標的ＲＮＡを含有する全ての反応が陽性の結果を与えた。この対照標準を含めて実験中に発生される信号はＲＴ−依存性であることが例示された。したがって、陽性の結果は、ＲＮＡの増幅から得られ、およびプラスミドＤＮＡ（それから、インビトロ転写が誘導される）による汚染から得られたものではない。
【００５９】
【表２】
2005204664.tif 000003
【００６０】
【表３】
2005204664.tif 000004
【００６１】
（実施例４）  ＲＴ−ＳＤＡによるエンテロウィルス粒子の検出
Dr. M.  Pallansch(Centers for Desease Control and Prevention(Atlanta, GA))から得られた１３株のエンテロウィルスについて、ＲＴ−ＳＤＡを実施した。簡潔には、エンテロウィルスの貯蔵品を、ホスフェートで緩衝される食塩水／ＢＳＡ中に、約１００００ウィルス粒子／μＬまで希釈した。この計算は、ウィルス貯蔵品のＴＣＩＤ５０値、およびピコルナウィルス類のプラーク形成効率が約１％であるという仮定に基づいた。６０μＬの希釈されたウィルス貯蔵品を、８０μＬのＰＢＳ／ＢＳＡと混合し、そしてQIAamp Viral RNA Kit(Qiagen)を用いて処理した。簡潔には、バッファー中の１０単位のＡＭＶ−ＲＴとともに、１０μＬのQiagen溶出液（約１×１０５ウィルス粒子／反応に相当する）を用いて、マイクロウェル中で逆転写を実施した。該バッファーは、６９．４ｍＭのビシン(bicine)、１２．３ｍＭのＫＯＨ、２０．８ｍＭのＫｉＰＯ４、５％のグリセロール、５％のＤＭＳＯ、１００ｎｇ／μＬのＢＳＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５００μＭのｄＣｓＴＰ、および５００ｎＭのプライマーEnt5rp1.0を含有した。反応を１５分間にわたって４２℃にてインキュベートした。次に、マイクロウェルを１０分間にわたって７２℃に移動させて反応を停止させ、および存在する全てのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド標的を変性させた。次に、変性した標的を含有するウェルを、さらに１０分間にわたって５４℃において平衡化させた。同時に、増幅マイクロウェル（酵素、ＳＤＡプライマーEnt5fp1.0、アダプタープライマー、検出プローブ、マグネシウムおよびバッファー成分）を同一温度でインキュベートした。次に、５０μＬの体積の増幅混合物を、ＲＴ反応ウェルに移動させ、増幅を開始した。最終増幅条件は以下のようなものである：７５ｍＭのビシン(bicine)、５０ｍＭのＫＯＨ、３０ｍＭのＫｉＰＯ４、１２％のグリセロール、８．５％のＤＭＳＯ、１００ｎｇ／μＬのＢＳＡ、５ｍＭの酢酸マグネシウム、約４０単位のBstポリメラーゼ、および約２４０単位のBsoBI制限酵素。マイクロウェルを密封し、そして５２℃でインキュベートした。蛍光を６０分にわたって監視し、結果をＭＯＴＡに換算して表した（第３表参照）。３０００以上のＭＯＴＡ評価値を陽性とみなした。
【００６２】
株Ｅ２２を除いて、エンテロウィルスの全ての株が検出された。株Ｅ２２を検出することの失敗は予期できなかったことではなかった。なぜなら、このウィルスは、他のエンテロウィルスと遺伝的に異なることが知られているからである（非特許文献１６参照）。これらのデータは、本発明のプライマーおよびプローブを用いて、広範な種類のエンテロウィルスを検出する能力を例示する。
【００６３】
【表４】
2005204664.tif 000005
【００６４】
（実施例５）  エンテロウィルスＲＮＡに関するＲＴ−ＳＤＡの特異性
エンテロウィルス属と同様に、ライノウィルス属もピコルナウィルス科の一員であり、およびそのようなものとして、２つの群のウィルスは、遺伝子的に密接に関連する。エンテロウィルスを検出するために設計されたＰＣＲプライマーと、ライノウィルスの種々の株との交叉反応が充分に実証されている（非特許文献４参照）。エンテロウィルスの検出のためのＲＴ−ＳＤＡの特異性を評価するために、実施例４に記載されるライノウィルスの６種の株についてＲＴ−ＳＤＡを実施した。ライノウィルス株は、反応当たりおよそ１０５〜１０７ウィルス粒子において試験した。結果を第４表に示す。試験されたライノウィルス株の１つを除いて、試験された濃度におけるＲＴ−ＳＤＡによって陰性であった。株８６が反応当たり１０６粒子において弱い陽性の信号を与えた。一方、ｐＣｏｘＢ５のインビトロ転写物の１０５コピーから強い信号が得られた。このデータは、本発明のＲＴ−ＳＤＡ系がエンテロウィルスＲＮＡの特異的検出が可能であり、かつエンテロウィルスの株とライノウィルスの株とを識別することが可能であることを示す。
【００６５】
【表５】
2005204664.tif 000006
【００６６】
特定の代表的実施形態および詳細に関連して本発明を完全に説明したが、本発明の真意または範囲を離れることなしに、本発明に対して変更および修正ができることは当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】２４株のコクサッキーウィルス、１８株のエコーウィルス、１株のエンテロウィルスおよび１１株のポリオウィルス中のエンテロウィルスの５’非翻訳領域の保存領域を示す部分的配列を示す図である。
【図２】コクサッキーＢ３（GenBank Accession AF169665、配列番号１４）のヌクレオチド１−６６０、およびエンテロウィルス核酸の特異的検出のために設計されたプライマー、バンパー、およびアダプターの位置を示すマップである。
【図３】クローニングされたエンテロウィルスｃＤＮＡの検出限界研究の結果を示すグラフである。
【図１】
2005204664.tif 000007
【図２】
2005204664.tif 000008
【図３】
2005204664.tif 000009
【配列表】
2005204664000001.app
【外国語明細書】
2005204664000001.pdf