(57)【要約】【課題】  効率のよい無細胞タンパク質合成系を用いた非天然アミノ酸導入タンパク質の合成方法を提供する。【解決手段】  植物種子由来の抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の一ヵ所ないしは複数ヶ所に、非天然アミノ酸を導入する方法。好ましくは、植物種子由来の抽出液が、コムギ胚芽由来の抽出液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物種子由来の抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の一ヵ所ないしは複数ヶ所に、非天然アミノ酸を導入する方法。
【請求項２】
植物種子由来の抽出液が、コムギ胚芽由来の抽出液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非天然アミノ酸が、自然界に存在するタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のいずれでもないことを特徴とする請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
非天然アミノ酸が、電子供与性、電子受容性、光分解性、光異性化等の光・電子機能性、または蛍光性などの機能性を持つアミノ酸であることを特徴とする請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
非天然アミノ酸が、蛍光性アミノ酸であることを特徴とする請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡが、該非天然アミノ酸が該ｔＲＮＡの３’末端に有機化学的に担持されていることを特徴とする請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載の方法により、タンパク質に人工機能を付与する方法。
【請求項８】
人工機能が蛍光性であることを特徴とする請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法により合成された、非天然アミノ酸が導入されたタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜８に記載の方法により合成された、人工機能が付与されたタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜８に記載の方法により合成された、蛍光性が付与されたタンパク質。
【請求項１２】
蛍光性が付与されたタンパク質が、相互作用物質の結合により、該タンパク質の蛍光波長ないしは蛍光強度が変化することを特徴とする請求項９〜１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項９〜１３に記載のタンパク質を用いて、蛍光性が付与されたタンパク質の相互作用物質との結合を蛍光波長ないしは蛍光強度が変化することを用いて検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成法を用いて人工的に構造を改変したタンパク質を合成する方法に関し、より詳細には、無細胞タンパク質合成法により任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質を合成する方法に関する。また、無細胞タンパク質合成法により任意のアミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質、および該タンパク質の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質は、２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列はＤＮＡの塩基配列によって規定されている。そのタンパク質をＤＮＡの塩基配列を改変することで、遺伝子工学的手法により目的のタンパク質のアミノ酸配列を任意に組換えて構造を改変するという方法は比較的古くから用いられてきた。しかしながらこの方法では、可能なのはあくまで２０種類のアミノ酸からなる配列の組換えであり、２０種類のアミノ酸のいずれの構造中にも含まれない任意の機能基をタンパク質分子に導入することは事実上不可能であるため、タンパク質に人工機能を導入する手法としては限界があった。また一方で、タンパク質に任意の機能基を導入する手法としては、タンパク質分子の化学修飾という方法が用いられてきた。しかしこの方法では、タンパク質の特定の位置だけに機能基を導入することは非常に困難であり、そのため予測できない位置への化学修飾によってタンパク質本来の機能が著しく減じてしまう場合があるという問題があった。それに加え、化学修飾による方法ではタンパク質分子内部への機能基の導入を行うことができないといった欠点もあった。
【０００３】
種々の機能側鎖を持つ非天然アミノ酸を合成し、それらを天然のアミノ酸と同様に位置特異的に導入する非天然アミノ酸導入法は、これらの点を改善し、さらにタンパク質の機能をほとんど損なわずにさまざまな機能基を導入できるという点で優れている。天然のアミノ酸のみを用いた組換えタンパク質と比較して、導入した非天然アミノ酸に応じた種々の人工機能を発現することが期待でき、タンパク質の広範囲な機能拡張が可能となる。またさらに化学修飾法と比較しても、機能基を導入する位置を任意に決定することが可能であるため、タンパク質の本来の機能を損なう危険性を大幅に減じることができる。
【０００４】
天然のタンパク質は、前述のように２０種類のアミノ酸から構成されており、そのアミノ酸配列は、そのタンパク質をコードしている遺伝子によって規定されている。遺伝子はＤＮＡ上の連続した３つの塩基の組み合わせからなる遺伝暗号（コドン）によりアミノ酸を指定している。塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の４種類があり、それらの組み合わせからなる３塩基コドンの総数は４ｘ４ｘ４＝６４種類であるが、その大半である６１種類のコドンは天然の２０種類のアミノ酸に割り当てられている。残りの３種類、ＴＡＧ、ＴＡＡ、ＴＧＡの３種のコドンは終止コドンとよばれ、２０種類のどのアミノ酸にも対応せず、タンパク質のアミノ酸配列の終止を規定している。
【０００５】
非天然アミノ酸をタンパク質へ位置特異的に導入するには、それらを指定する専用のコドンが必要となる。しかしながら前述の様に３つの塩基で構成可能な６４種類のコドンは、すべて指定する情報が規定されている。
【０００６】
Schultzら（Noren, C. J. et al. (1989) Science, 244, 182-188） やChambarlinら(Bain, J. D. et al. (1989) J. Am. Chem, Soc., 111, 8013-8014)は、終止コドンの一つであるＴＡＧを非天然アミノ酸に割り当てた。タンパク質上の任意の位置のコドンをＴＡＧに置き換え、天然には存在しない、終止コドンＴＡＧに対応するアンチコドンＣＵＡを持つｔＲＮＡを合成し、非天然アミノ酸を担持させて非天然アミノ酸を位置特異的に導入するという手法であった。しかしながらこの方法では、非天然アミノ酸の取り込みはタンパク質合成の終了と競合することになり、収率が低下してしまうという欠点があった。さらに、同一のタンパク質の複数箇所に別々の非天然アミノ酸を導入することも、非天然アミノ酸の指定に転用可能な終止コドンの種類数から考えて事実上不可能であった。
【０００７】
非天然アミノ酸の位置を決めるもう一つの手法として、通常の３塩基コドンを拡張した４塩基コドンを用いるという方法がある（非特許文献１）。この方法では、たとえばＣＧＧＧからなる４塩基コドンが、４塩基のアンチコドンをもつ人工的に合成したｔＲＮＡによって翻訳されると、非天然アミノ酸が導入された完全長のタンパクが合成される。一方、ＣＧＧの３塩基のみに対する３塩基アンチコドンをもつ天然のｔＲＮＡによって翻訳されると、その後のコドンの読み枠がシフトし、終止コドンに出会うことによってタンパク質の合成は途中で終止してしまうことになる。このように、４塩基コドンを用いる方法は、６４種類存在する通常の３塩基コドンとは事実上独立に非天然アミノ酸を規定できる点が特徴であり、前述の終止コドンを用いる方法とくらべて多種類の非天然アミノ酸を同一のタンパク質分子にそれぞれ位置特異的に導入し、機能発現させることも可能である。実際に、一例としてストレプトアビジンの５４位に電子受容基を持つ非天然アミノ酸ニトロフェニルアラニンを、８４位に蛍光基を持つ非天然アミノ酸アンスラニルアミドアラニンを導入した変異タンパク質を合成した報告がある（非特許文献２）。その合成された非天然二重変異タンパク質は予測通り蛍光消光を示した。また更に最近、５塩基コドンも非天然アミノ酸を指定できることが明らかになっている。
【０００８】
非天然アミノ酸導入法は、任意の非天然アミノ酸を担持させたｔＲＮＡを細胞内で発現させることが困難なことから、通常は無細胞タンパク質合成系を用いて行われている。無細胞タンパク質合成系は、様々な利点を持つタンパク質合成法として近年注目を浴びるようになってきた技術である。この無細胞タンパク質合成法の利点は、これまで用いられてきたタンパク質合成の手段として組換え微生物や培養細胞などを用いる方法と比べ、１）生体に負に作用するようなタンパク質（翻訳系に影響を及ぼすものは除く）の合成が比較的容易である、２）簡便に条件を決定することができる（微生物などを用いる場合、最低一ヶ月程度を要するのが普通である）、３）非天然型アミノ酸を用いることができる、ことなどを挙げることができる。このようなことから今後、無細胞タンパク質合成は多種類のタンパク質を短時間で合成する必要がある場合や、組み換え生物による生産の困難なタンパク質の合成などの幅広い用途に使用されることが期待されている。現在、無細胞タンパク質合成系は、生体細胞からの抽出液を用いたものが主流であり、その中でも、大腸菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球に由来するものが特に広く用いられている。特に大腸菌に由来する系は、原料の供給が比較的容易であることもあり、他の二つの系と比較してもより一般的に用いられている。しかしながら、大腸菌は原核細胞であり、真核細胞由来のタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を合成しようとした場合、合成システムがうまく適合せずに合成に失敗する例が数多く見られる。中でも、受容体、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、転写因子など、癌などの原因因子としても特に研究が盛んであるシグナル伝達系のタンパク質は、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系が最も不得手とするタンパク質であるが、逆にその機能解析に応用するため最も非天然アミノ酸を導入する需要が高いタンパク質でもある。このようなことから、非天然アミノ酸を導入する技術が確立できても、大腸菌由来の合成系では、性能不足によりタンパク質自体が合成できず、結果として非天然アミノ酸導入タンパク質が合成できない可能性があるという問題点があった。
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ，  Ｓｏｃ．、  第１１８巻  第９７７８−９７７９頁、１９９６年。
【非特許文献２】Ｈｏｈｓａｋａ，  Ｔら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ，  Ｓｏｃ．、  第１２１巻、  第１２１９４−１２１９５頁、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上に述べたような理由から、効率のよい無細胞タンパク質合成系を用いた非天然アミノ酸導入タンパク質の合成方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は、効率のよい無細胞タンパク質合成系を用いた非天然アミノ酸導入タンパク質の合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目標を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、植物種子由来の抽出液を用いる無細胞タンパク質合成法により、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つないしは４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の位置に非天然アミノ酸を導入できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の項目より成る。
（１）植物種子由来の抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の位置に、非天然アミノ酸を導入する方法。
【００１３】
（２）植物種子由来の抽出液が、コムギ胚芽由来の抽出液であることを特徴とする（１）に記載の方法。
【００１４】
（３）非天然アミノ酸が、自然界に存在するタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のいずれでもないことを特徴とする（１）または（２）に記載の方法。
【００１５】
（４）非天然アミノ酸が、電子供与性、電子受容性、光分解性、光異性化等の光・電子機能性、または蛍光性などの機能性を持つアミノ酸であることを特徴とする（１）から（３）に記載の方法。
【００１６】
（５）非天然アミノ酸が、蛍光性アミノ酸であることを特徴とする（１）から（４）に記載の方法。
【００１７】
（６）４つないしは４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡが、該非天然アミノ酸が該ｔＲＮＡの３’末端に有機化学的に担持されていることを特徴とする（１）から（５）に記載の方法。
【００１８】
（７）（１）から（６）に記載の方法により、タンパク質に人工機能を付与する方法。
【００１９】
（８）人工機能が蛍光性であることを特徴とする（１）から（７）に記載の方法。
【００２０】
（９）（１）から（８）に記載の方法により合成された、該非天然アミノ酸が導入されたタンパク質。
【００２１】
（１０）（１）から（８）に記載の方法により合成された、人工機能が付与されたタンパク質。
【００２２】
（１１）（１）から（８）に記載の方法により合成された、蛍光性が付与されたタンパク質。
【００２３】
（１２）蛍光性が付与されたタンパク質が、相互作用物質の結合により、該タンパク質の蛍光波長ないしは蛍光強度が変化することを特徴とする（９）〜（１１）に記載のタンパク質。
【００２４】
（１３）（９）〜（１２）に記載のタンパク質を用いて、蛍光性が付与されたタンパク質の相互作用物質との結合を蛍光波長ないしは蛍光強度が変化することを用いて検出する方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、無細胞タンパク質合成系を用いて、従来の方法と比較して効率良く非天然アミノ酸導入タンパク質を合成方法することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
まず本発明は、植物種子由来の抽出液を用いて無細胞タンパク質合成を行う方法であって、タンパク質をコードするＤＮＡ塩基配列上の４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡを介して該タンパク質の任意の位置に、非天然アミノ酸を導入する方法である。
【００２７】
本発明における植物種子由来の抽出液は、どのようなものであってもよいが、コムギ、ライムギ、オオムギ、コメ等の穀類胚芽、特にコムギ胚芽が好適に使用される。最近、コムギ胚芽抽出液において、タンパク質合成阻害物質を除去することによりタンパク質合成効率を飛躍的に向上させることができるようになることが報告されており（Madin K et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564）、その原理を用いた製品が販売されていることから（PROTEIOS cell-free protein synthesis kit:東洋紡績製）、それを用いることが好ましいと言える。
【００２８】
本発明における無細胞タンパク質合成とは、細胞を用いずに核酸類内に含まれる情報を元にタンパク質やポリペプチドを合成する技術を言い、具体的にはｍＲＮＡを添加してタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞翻訳系、あるいはＤＮＡからの情報を元にしてｍＲＮＡを合成し、さらにタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞転写翻訳系のいずれでもよい。
【００２９】
無細胞タンパク質合成方法を用いてタンパク質を合成する方法としては公知の方法をそのまま用いることができ、市販のキットを用いる場合にはその説明書に従って合成することができる。
【００３０】
本発明における４以上の連続した塩基は、いかなる配列のものを用いてもよいが、CGGG、AGGT、GGGT、CTCT、CGGTなどの配列が好適に用いられる。
【００３１】
本発明における４つ以上の連続した塩基を認識するｔＲＮＡは、通常、３塩基を認識する天然のｔＲＮＡまたはそれに準じた構造を持つ人工のｔＲＮＡと異なり、３塩基のみのコドンは認識しないものを用いる。その具体的な構造については、大腸菌や酵母などの自然界に存在する種々の生物に由来するｔＲＮＡの構造を改変したもの、特に酵母由来のものが好適に用いられるが、構造についてはとくに限定されない。
【００３２】
本発明における非天然アミノ酸とは、天然に存在するタンパク質に含有される２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を指し、自然界に存在しない人工アミノ酸に加え、天然には存在するが通常タンパク質の構造中には含まれないアミノ酸も含まれる。非天然アミノ酸の構造は特に限定されないが、タンパク質に有用な機能を付加するという点で、なんらかの機能性を持つアミノ酸が好ましい。具体的には、電子供与性、電子受容性、光分解性、光異性化等の光・電子機能性、または蛍光性などの機能性を持つアミノ酸であることが好ましい。
【００３３】
ここでいう蛍光性をもつアミノ酸とは、側鎖に蛍光色素が結合したものをいい、蛍光色素としては、Alexa Fluor、BODIPY FL、Cascade Blue、FITC、Oregon Green、RITC、Texas Red、TRITC、Coumarin Maleimide、Cy Dye、Dansyl Chloraide、Dansyl Hydrazineなどを用いることができる。
【００３４】
本発明における非天然アミノ酸が３’末端に有機化学的に担持されたｔＲＮＡにおいては、そのｔＲＮＡへの非天然アミノ酸の担持方法については特に限定されないが、Hechtらによって開発された化学的アミノアシル化法(Hechler, T., et al. (1983) J. Biol. Chem., 258, 4492-4495) が好適に用いられる。
【００３５】
また本発明は、上記方法に従って合成された非天然アミノ酸が位置特異的に導入されたタンパク質である。非天然アミノ酸は、なんらかの機能性を持つアミノ酸であることが好ましい。具体的には、電子供与性、電子受容性、光分解性、光異性化等の光・電子機能性、または蛍光性などの機能性を持つアミノ酸であることが好ましい。
【００３６】
また本発明は、上記方法に従って合成された人工機能が付与されたタンパク質である。具体的には、蛍光や光電子移動などの人工機能を付与することができる。
【００３７】
さらに本発明は、人工機能を付与したタンパク質の利用法である。具体的には、抗体、酵素、レセプタ等のタンパク質の特定の位置に蛍光性アミノ酸を導入したものを用い、抗原、基質、リガンド、あるいはインヒビターの結合によって蛍光波長や強度の変化を測定することで、それら抗原、基質、リガンド、あるいはインヒビターを高感度で検出することができる。
【００３８】
以下、本発明における植物種子由来抽出液を用いた無細胞タンパク質合成法による人工タンパク質の合成方法について詳細に説明する。
本発明に使用される無細胞抽出液は、植物種子由来のいかなる組成のものを用いてもよい。しかし、タンパク合成効率や、取扱の簡便さを考慮すると、コムギ胚芽由来抽出液を用いるのが望ましい。無細胞タンパク質合成反応液には、無細胞抽出液のほか、目的のタンパク質をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、緩衝液、ＡＴＰまたはＧＴＰなどのエネルギー源、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ等のＡＴＰ再生系、安定化剤、ＲＮase阻害剤等を適量加える。反応温度は、２３〜２６℃が適している。
【００３９】
タンパク質合成の鋳型となるｍＲＮＡは、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により提供される。本発明に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、通常のいかなる構造の物を用いてもよい。しかし、ｍＲＮＡ転写効率や、取扱の簡便さを考慮すると、市販のＴ７、ＳＰ６等のウィルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望ましい。
【００４０】
本発明に用いられる鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモータ配列と、その下流に目的遺伝子のオープンリーディングフレームが配置される構造を持つ。望ましくは、プロモータとオープンリーディングフレームとの間に翻訳増強配列が含まれるものが良い。また、適当なベクター上に配置されたプラスミドＤＮＡの形態であることが望ましい。
【００４１】
本発明に用いられるｔＲＮＡは、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により提供される。本発明に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、通常のいかなる構造の物を用いてもよい。しかし、ｍＲＮＡ転写効率や、取扱の簡便さを考慮すると、市販のＴ７、ＳＰ６等のウィルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望ましい。
【００４２】
本発明における非天然アミノ酸が３’末端に担持されたｔＲＮＡは、通常のいかなる構造のものを用いてもよいが、効率や技術的な成熟度を考慮すると、Hechtらによって開発された化学的アミノアシル化法が好適に使用される。具体的には、まず、混合ジヌクレオチドpdCpAを合成し、その３’末端にＮ末端保護アミノ酸を結合させる。さらに後者をＲＮＡリガーゼでｔＲＮＡに結合させる。このようにして特定のｔＲＮＡに特定の非天然アミノ酸を担持させることができる。
【実施例】
【００４３】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４４】
実施例１
４塩基コドンを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質の無細胞タンパク質合成
コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成キット「PROTEIOS(R)」(東洋紡績製)を用いて、変異ストレプトアビジンタンパク質を合成した。
具体的には、プラスミドpBluescript IIにクローニングされた、野生型ストレプトアビジン遺伝子PGSH-WT(配列番号１)および、その4塩基コドン変異遺伝子（PGSH-83-GGGT(配列番号２)、PGSH-83-CTCT（配列番号３）、PGSH-83-CGGT(配列番号４)、PGSH-83-AGGT(配列番号５)）およびアンバー変異遺伝子（PGSH-83-TAG(配列番号６)）を、制限酵素Xho IおよびNot Iを使用して切断し、その処理後の断片を、「PROTEIOS(R)」専用プラスミドベクター「pEU3-NII」のXhoV、Not  Iの位置にサブクローニングを行った。その後、大腸菌JM109を宿主としてプラスミドの調製を行った。その構築したプラスミドを鋳型として、Thermo T7 RNAポリメラーゼ(東洋紡績製)によりmRNAの合成を行った。  合成したmRNAをG-25マイクロスピンカラム(Amersham社製)を用いて精製、20mM HEPES-KOH (pH 7.6)にバッファー置換し、バッチ法による無細胞タンパク合成を行った。
バッチ法反応は、0.5mlマイクロチューブにおいて、「PROTEIOS(R)」付属のBuffer #2を3μl、Creatine Kinase (10mg/ml)を1μl、L-[U-14C]Leucine(1.85MBq、50μCi/ml、アマシャムバイオサイエンス社製)1μlを混合したRI mix液を調整し、さらに「PROTEIOS(R)」付属のBuffer #1を1.7μl、ｍＲＮＡ溶液を6μｇ、RNase Inhibitor(東洋紡績製)を0.5μl、「PROTEIOS(R)」付属のWheat Germ Extractを5μl、前記のRI mix液を5μl、滅菌水を合計液量が25μlになるように加え、混合することでおこなった。反応は、23℃で2時間おこなった。合成したタンパク質の検出は、10ulのコムギ無細胞タンパク質合成反応液のうち5ulをSDS-PAGEした後、BASシステムを用いたオートラジオグラフィーによって行った。
その結果を図１に示す。合成された各変異ストレプトアビジンタンパク質は、卓上遠心機で15,000rpm、10分間での遠心で、沈殿がほとんど認められず、合成された各変異ストレプトアビジンタンパク質がほぼ可溶化していることがわかった。
【００４５】
実施例２
非天然アミノ酸BODIPY FL-amino Pheを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質の無細胞タンパク質合成
4塩基コドン変異を導入した3種類のストレプトアビジン遺伝子（PGSH-83-GGGT、PGSH-83-CTCT、PGSH-83-CGGT）のmRNAの合成は、実施例１に記載した方法と同様の方法を用いて行った。タンパク質合成は、上記のバッチ法反応は、0.5mlマイクロチューブにおいて、「PROTEIOS(R)」付属のBuffer #2を3μl、Creatine Kinase (10mg/ml)を1μl、L-[U-14C]Leucine(1.85MBq、50μCi/ml、アマシャムバイオサイエンス社製)1μlを混合したRI mix液を調整し、さらに「PROTEIOS(R)」付属のBuffer #1を1.7μl、ｍＲＮＡ溶液を6μｇ、RNase Inhibitor(東洋紡績製)を0.5μl、「PROTEIOS(R)」付属のWheat Germ Extractを5μl、1ulのBODIPY FL-amino Phe-tRNA（0.1nmolに相当）、前記のRI mix液を5μl、滅菌水を合計液量が25μlになるように加え、混合することでおこなった。反応は26℃で1時間行った。また、tRNAのリチャージによる天然アミノ酸のタンパク質への取り込みの有無を検討するために、上記と同様の反応系に、1ulのpdCpA-tRNA（0.1nmolに相当）を添加してタンパク質の合成反応を行った。合成したタンパク質の検出は、10ulのコムギ無細胞タンパク質合成反応液のうち5ulをSDS-PAGEした後、BASシステムを用いたオートラジオグラフィーによって行った。
その結果を図２に示す。検討した3種類のストレプトアビジン遺伝子（PGSH-83-GGGT、PGSH-83-CTCT、PGSH-83-CGGT）に関して、変異コドンに相補的なアンチコドンをもつBODIPY FL-amino Phe-tRNA（ACCC, AGAG, ACCG）を添加した場合に、いずれもPGSH-WTの分子量と同じ大きさ（16kDa）の箇所にバンドが検出された。pdCpA-tRNA（ACCC, AGAG, ACCG）を添加した場合と、tRNAを添加していない場合には、その約半分の大きさ（8.3kDa）の箇所にしかバンドが検出されないことから、BODIPY FL-amino Phe-tRNA（ACCC, AGAG, ACCG）を添加した場合に16KDaの箇所に検出されたバンドは、tRNAのリチャージによる天然アミノ酸の取り込みに由来するものではなく、純粋にBODIPY FL-amino Pheがタンパク質中に取り込まれたもの由来と考えられる。
【００４６】
実施例３
非天然アミノ酸BODIPY FL-amino Pheを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質の蛍光測定
サンプル5μLとSample Buffer 5μLを混合し全量をアプライしてSDS−PAGEを行い、FluorImagerによりバンドを確認した。同じゲルを、抗His-tag抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
その結果を図３および図４に示す。CTCTでは、明確な蛍光のバンドが確認できた。また、抗HisTag抗体による検出でも、蛍光バンドと同じ位置にメインバンドが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明により、無細胞タンパク質合成系を用いて、従来の方法と比較して効率良く非天然アミノ酸導入タンパク質を合成方法することができるようになり、様々な人工の有用タンパクの合成が可能になり、産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】無細胞タンパク質合成した４塩基コドンまたはアンバーコドンを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質のSDS-PAGEによる解析結果を示す図。
【図２】無細胞タンパク質合成系により人工アミノ酸BODIPY FL-aminoPheを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質のSDS-PAGEによる解析結果を示す図。
【図３】無細胞タンパク質合成系により人工アミノ酸BODIPY FL-aminoPheを導入した変異ストレプトアビジンタンパク質の蛍光イメージャによる解析結果を示す図。蛍光イメージャによる解析画像。
【図４】図３と同じゲルをHisタグによるウェスタンブロッティングで解析した画像。
【図１】
2005110595.tif 000002
【図２】
2005110595.tif 000003
【図３】
2005110595.tif 000004
【図４】
2005110595.tif 000005
【配列表】
2005110595000001.app