(57)【要約】【課題】  組換えhGH の凍結乾燥物を安定化するための手段の提供。【解決手段】  サッカロースの手段により安定化されたhGH を含む医薬組成物を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン(hGH）及び安定化する量のサッカロースの固体の完全な混合物を単独又は他の賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記固体の完全な混合物が凍結乾燥物であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記hGH が組換え体であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記安定化剤がサッカロースのみであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記安定化剤がマンニトールと組み合わせたサッカロースであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
５又は10mg／バイアルのhGH を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びリン酸緩衝液から選択される緩衝液を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記緩衝液がリン酸緩衝液であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記溶液のpHが 6.0〜8.0 の範囲内であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記溶液のpHが7.5 であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
５もしくは10mg／バイアルのhGH ，68.4mg／バイアルのサッカロース並びにpH7.5 におけるリン酸緩衝液を含むことを特徴とする請求項１〜10のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記構成物の水溶液の調製、容器内の分散及び該容器内の凍結乾燥を含むことを特徴とする請求項１〜11のいずれかに記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項１３】
使用前の保存並びに注入可能物のための溶媒もしくは溶液内への前記混合物の再構成のために適した容器内に滅菌条件において密閉された請求項１〜11のいずれかに記載の固体混合物を含む前記医薬組成物の提供形態。
【請求項１４】
注入可能物のための溶媒又は溶液において再構成されることを特徴とする請求項13に記載の固体混合物を含む溶液。
【請求項１５】
前記溶媒が静菌溶媒であることを特徴とする請求項14に記載の溶液。
【請求項１６】
前記静菌溶媒がｍ−クレゾール 0.3％であることを特徴とする請求項15に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト成長ホルモン(hGH）含有医薬組成物に関する。更に詳しくは、それはサッカロース安定化ヒト成長ホルモンの組成物に関する。高度に精製された蛋白質は時間不安定性であり、例えばラクトース及びマンニトールのようなサッカリドと、又は他にアルブミン及びグリシンのような蛋白質及びアミノ酸との混合において安定化されることが知られている。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモンは、ヒト下垂体において分泌される。その成熟形態において、それは191 アミノ酸からなり、22,000の分子量を有し、これによりインシュリンより３倍超大きい。このホルモンは、２つの鎖内ジスルフィド架橋を含む線状ポリペプチドである。組換えDNA 技術の出現まで、hGH は限られたソース：ヒトの死体の下垂体腺からの困難な抽出によってのみ得ることができた。結果の物質の不足は、それが火傷、創傷治癒、ジストロフィー、骨癒合、散在性胃出血及び偽関節の治療に有効であると提唱されていてでさえ、その適用が下垂体機能低下小人症の治療に限定されていた。HGH は、それが下垂体機能低下小人症及びそれが有効である他の症状を治療するのに適切であろう量において、組換え宿主細胞において産生され得る。
【０００３】
hGH の主な生物学的効果は成長を促進することである。影響を受ける器官系は、骨格、結合組織、筋肉、並びに肝臓、腸及び腎臓のような内臓を含む。成長ホルモンは細胞膜上の特定のレセプターとの相互作用を通してその作用を示す。
【０００４】
凍結乾燥された蛋白質の組成物は M.J. Pikal, Biopharm, October 1990, 25 〜30に記載される。マンニトールグリシン、アルギニン及びラクトースのような安定化賦形剤を含む成長ホルモン製剤の例が報告されている。
【０００５】
特に、崩壊温度を増加させ、より短い凍結乾燥時間を得るのを許容する糖のようなそれらのアモルファス状態における種々の物質の存在における凍結乾燥が記載されている。しかしながら、著者によれば、全ての蛋白質のために標準的な製剤を予測することが可能でなく、最良の製剤の選択には著しい選択の労力を必要とする。
【０００６】
ドイツ特許DE3520228 号は、反復性マルトトリオース単位を含むポリザカリドの手段により安定化される製剤において、成長ホルモンを含む生物活性蛋白質を記載する。
【０００７】
WO89／09614 は、ヒト成長ホルモン：グリシンのモル比が：１：50〜200 であるグリシン、マンニトール及び緩衝液で安定化されたヒト成長ホルモンの製剤を記載する。
【０００８】
US5122367 特許は、ポリマーマトリックス内に組み込まれた蛋白質及びポリサッカリドを含む成長ホルモンの投与のための制御された放出システムを記載する。
【０００９】
EP210039特許出願は40％サッカロースを含むマトリックスの形態において、ウシ又はブタ成長ホルモンの動物への皮下投与のための制御された放出性移植物を記載する。
【００１０】
本発明に従うと、hGH は天然又は合成のいずれかであり得、即ち組換えDNA 技術を基にして製造され得、後者が好ましい。
【００１１】
ヒト成長ホルモンの注入可能な製剤は、乾燥粉体を得るためにそれらの凍結乾燥を含む処理により得られる。ヒト成長ホルモンは、凍結乾燥過程の間、非常に変性しやすく、それらを室温に保存する場合より長いサイクルの生治を維持することが安定した製剤を得るのに必要とされる。
【００１２】
hGH 様の材料は健康に注意する人及び患者に供されるべきであるため、これらの材料は医薬組成物として調製されなければならない。このような組成物は適切な期間、活性を維持しなければならず、容易かつ迅速なヒトへの投与をそれ自体で受け入れなければならず、そして直ちに製造できなければならない。多くの場合、医薬製剤は凍結又は凍結乾燥された形態において提供される。この場合、組成物は使用前に解凍又は再構成されなければならない。凍結乾燥された標品はそれらの液体物より優れた活性をしばしば維持することが当業者に認められているので、凍結又は凍結乾燥された形態は広範囲の種々の保存条件下での組成物内に含まれる医療剤の生化学的一体性及び生物活性を維持するのにしばしば用いられる。これらの凍結乾燥された標品は、注入のための滅菌水又は滅菌生理塩類溶液等のような適切な医薬として許容される希釈剤の添加により使用前に再構成される。
【００１３】
あるいは、組成物は即時の使用のために適した液体形態において供され得る。必要とされるのは、長期の保存においてその活性を維持する液体製剤である。
【００１４】
現在のhGH の製剤は、製剤過程の間並びに保存及び再構成の間、二量体及びより高次の凝集（マクロレンジ）の製剤のため活性を失う。脱アミド化及び酸化のような他の化学的変化も保存によりおこり得る。
【００１５】
ヒト成長ホルモンは、例えばマンニトールSaizenＲ及び GrormＲ, Seronoで安定化された製剤において市場で見つけられる。
【００１６】
我々は、サッカロースがhGH の製剤に対して、特に組換えDNA 技術で調製されたこの糖蛋白質の形態に対してより優れた安定性を与えることを現在、発見している。サッカロースが、再構成された溶液が振とうされた時に沈殿の形成を防ぐことも発見されている。
【００１７】
本発明の主な目的は、単独又は他の安定化剤との組合せにおけるヒト成長ホルモン及び安定化する量のサッカロースの固体の完全な混合物を含む医薬組成物を提供することである。
【００１８】
更なる目的は、容器内の構成物の水溶液を凍結乾燥させるステップを含む前記医薬組成物の調製のための方法を提供することである。他の目的は、使用前の保存に適し、注入可能物質のための混合物の再構成に適した容器内に滅菌条件において密閉された前記固体混合物を含む前記医薬組成物の提供形態を提供することである。
【００１９】
他の目的は、注入可能溶液内に再構成された前記固体混合物のための溶液を提供することである。活性成分の安定性に対する賦形剤の効果を見積もるために、５又は10mgのプロ・バイアルを含む組換えhGH の種々の製剤は、種々の賦形剤：サッカロース、グリシン、マンニトール、サッカロース＋マンニトール及びマンニトール＋グリシンと共に調製されている。
【００２０】
調製された種々の製剤の組成を表１及び４に報告する。全てがpH7.5 で緩衝されている安定化剤を含む溶液でhGH のバルクを希釈することにより凍結乾燥物の調製を行った。得られた溶液をろ過して最終容量とし、種々のガラス瓶に充填し、凍結乾燥した。
【００２１】
４℃，25℃，37℃及び50℃で24週間保存されたこのような製剤の安定性の研究を次により行った：R.M. Riggin et al., Anal. Biochem., 167 : 199 〜209, 1987 により記載される方法に従う逆相HPLC(RP-HPLC）、及びUS Pharmacopeia Preview Nov-Dec 1990 pag. 1253〜1261に従うサイズ排除HPLC(HPSEC）。この結果を表２〜３及び５〜６に報告する。ここで、この測定は種々の製剤においてhGHの回収率の百分率として表される。
【００２２】
hGH の回収百分率を測定するためのクロマトグラフィーアッセイ方法をPikal in Pharmaceutical Research 8, pag. 428“Assays”により記載されるように行った。
【００２３】
調剤前の段階において、凍結乾燥形態におけるrhGHの安定性に対するpH及び緩衝液の効果を、50℃における安定性を測定することによりテストした。NaOHでpH6.00，7.00及び8.00にされた酢酸、リン酸、コハク酸で調製された異なる緩衝システムにおいてテストを行った。
【００２４】
この結果は、rhGH安定性が緩衝液により影響を受けず、製剤が約pH8.00においていずれにおいてもより安定であることを示した。
【００２５】
組成物のために選択されたpHは7.5 であった。
【００２６】
その後、５mg／バイアルのrhGH濃度における７の乾燥された製剤を、異なる賦形剤（サッカロース68.4mg／バイアル、マンニトール36.4mg／バイアル、マンニトール／グリシン25＋４mg／バイアル、マンニトール／サッカロース32＋ 7.5mg／バイアル）との活性薬剤の適合性をテストするために、pH7.5 におけるリン酸及びコハク酸緩衝液の両方を用いて調製した。賦形剤の量を静菌溶液での再構成の後に等張液を有するよう選択した。充填量は１mlであった。
【００２７】
滅菌条件下で調製されたサンプルを24週間、50℃，37℃，25℃及び４℃で保存し、HPSEC 、逆相HPLCによりテストした。pH及び水分含量を測定した。
【００２８】
４℃及び25℃における 0.3％ｍ−クレゾール及び 0.9％ベンジルアルコールで再構成された溶液の安定性も研究した。
【００２９】
HPSEC 及びRP-HPLC を先に記載のように行った。
【００３０】
注入のために１mlの水で再構成された１のバイアルで、pHメーターによりpHを測定した。凍結乾燥されたバイアルの水分量を測定するために、１つバイアルの組成物を２−イソプロパノール１mlで懸濁し、Anotop 10, 0.22um Disposable filter (Merck）を通してろ過して、Metrohm Coulometerにおいて注入した。
【００３１】
RP-HPLC によりテストされた安定性の結果(Riggin's method）を表２に報告する。50℃で24週間後のサッカロースを含む製剤（表１の HGH／３及び HGH／７）のクロマトグラフィープロファイルは時間０において得られたものと異ならない。
【００３２】
同温度において、13〜22％の純度の減少が、マンニトール及びマンニトール＋グリシンを含む製剤において見つけられた。
【００３３】
表３に報告されるデータは、HPSEC 分析により得られた結果を示すrHGH純度百分率の減少は全てのテストされた製剤において見い出されなかった。水分量の大きな変化は全ての凍結乾燥されたテストされた製剤における研究の間、観察されなかった。
【００３４】
pHの減少が、表１のロット HGH／５及び HGH／７について37℃及び50℃において観察された。
【００３５】
再構成された溶液の安定性もRP-HPLC (Riggin's method）及びHPSEC 分析を通して研究された。
【００３６】
RP-HPLC 法において、25℃において５週間後に、ベンジルアルコールで、及びｍ−クレゾールでの両方で再構成されたサンプルにおいて30％〜50％の範囲において、純度の減少が見られた。４℃で７週間後において、その変異はベンジルアルコールの存在下で約14％、ｍ−クレゾールで４％〜８％であった。
【００３７】
HPSEC 法で４℃においては変異は観察されなかった；これに反して、ベンジルアルコール及びｍ−クレゾールの両方の存在下における全ての製剤について25℃において、約５％のrHGH純度の減少が見い出された。
【００３８】
結果は、サッカロース及びサッカロース＋マンニトールを含む製剤が他の製剤と比較してより優れた安定性プロファイルを示すことを示した。
【００３９】
５mg組成物で得られた結果を基にして、サッカロース及びマンニトールはNaOH 2.5Ｍで調整されたpH7.5 のリン酸及びコハク酸緩衝液を用いて10mg hGH／vialを含む５の凍結乾燥製剤（表４）の標品について選択した。１つの製剤はリン酸緩衝液のみの中にサッカロースの68.4mg／バイアル（充填容量１ml）を含み、他方は、リン酸及びコハク酸緩衝液の両方の中にサッカロースの 102.6mg／バイアル（充填容量1.5ml)及びマンニトール＋サッカロース 130＋40mg／バイアル（充填量1.5ml)を含む。サッカロースとマンニトールとの間の最適比率及び良好な物理特性で産物を得るための充填量を予備的凍結乾燥試験を基にして調整した。高い温度に対する凍結乾燥−ケーク耐性の点における最適比マンニトール／サッカロースは３：１であり、凍結乾燥されるべき最大容量は1.5ml であった。
【００４０】
この製剤を24週間、50℃，37℃，25℃及び４℃においてサンプルを保存することにより安定性テストを行った。サンプルを次の分析制御：HPSEC ，RP-HPLC (Riggin's method），pH及び水分量にかけた。
【００４１】
４℃における 0.3％ｍ−クレゾール及び 0.9％ベンジルアルコールでの再構成された溶液の安定性を４週間監視した。サンプルを、先に記載されるように５mg投与において行われた同じ制御にかけた。この分析は次の結果を示した：RP-HPLC 分析によりテストされたコハク酸緩衝液中のサッカロースの68.4mg／バイアル及び 102.6mg／バイアルを含む製剤は、全てのテストされた温度における24週間の保存の後に純度の減少を示さなかった。結果を表５に報告する。50℃における４／６週間の保存後でさえ、他の製剤においては、デグラデーション産物の形成が観察された。
【００４２】
rHGH純度百分率の減少は、HPSEC 分析による全てのテストされた製剤において見い出されなかった。表６参照のこと。研究の間、全てのテストされた製剤においてpH及び水分量の変化は観察されなかった。
【００４３】
サッカロースのみを含む再構成された溶液に基づく研究もRP-HPLC (Riggin's method）及びHPSEC 分析により行った。
【００４４】
４℃で４週間後に、RP-HPLC 法において、ベンジルアルコールの存在下で約12％、及びｍ−クレゾールで４％の純度の減少が見い出された。HPSEC 法において、ベンジルアルコール及びｍ−クレゾールの両方の存在下において、４℃でrHGH純度の減少は観察されなかった。
【００４５】
抗菌保存の効能を評価するために、表１の HGH／３製剤のバイアルを静菌溶媒（ｍ−クレゾール 0.3％又はベンジルアルコール 0.9％）で再構成した。それらを、接種から21日目までEuropean Pharmacopeia に従ってテストした。結果を表７及び８に報告する。
【００４６】
両方の保存溶液において最小許容効能（Minimum criteria）に達した。塩類溶液（NaCl 0.9％）及び静菌溶液の両方におけるスパイキングの後に微生物が計数される０時間において得られた結果は各々90,000〜25,000及び78,000〜8,000UFC／mlのスパイキングの後すぐに削減される主にスタフィロコッカス及びシュードモナスについてのｍ−クレゾール対ベンジルアルコールのより高い効能を示すようである（表７）。
【００４７】
更に、アスペルギルスは接種から14日後にｍ−クレゾールにおいて消滅し（表８）、シュードモナスは６時間後に消失した。
【００４８】
先の結果は68.4mgのサッカロース、pH7.5 におけるリン酸緩衝液、メタ−クレゾール 0.3％で再構成された充填容量１mlを含む製剤が５及び10mg濃度の両方のr-HGH の最も優れた安定性を保証するものであることを示す。
【００４９】
医薬の製造の例
材料：純粋なサッカロースPh Eur, BP, Nord, NF (Merck)；H３PO４  Suprapur (Merck)；分析使用のためのNaOH (Merck)；注入のための水。
【００５０】
容器としては、バイアルDIN 2R（ボロシリケートガラスタイプＩ）、ゴム栓（Pharmagummi Ｗ1816Ｖ50）並びにアルミニウムリング及びフリップ−オフキャップ（Pharma-Metal GmbH)。
【００５１】
（各々10mg hGHを含む1000のバイアルのための）サッカロースを含むrHGHの調製。
開始サッカロース溶液を得るために、サッカロース（68.4ｇ），H３PO４(1.96ｇ）を注入可能物(800ml）のために水に溶解する。hGH(10ｇ）のバルクをこのサッカロース溶液に加え、 2.5Ｍ NaOH によりpHを7.5 に調整した後、最終容量1000mlにする。この溶液を0.22μｍ Durapore 滅菌フィルター(Millipore）を通してろ過する。この過程の間、溶液温度を４℃〜８℃に保持する。異なる賦形剤又は異なる活性薬剤投与量を含む溶液を同様に調製する。
【００５２】
充填及び凍結乾燥
バイアルにHGH 滅菌溶液１mlを充填し、凍結乾燥機に移して少くとも６時間、−45℃に冷却する。凍結乾燥を0.07mBarの真空で−45℃の温度で開始する。次のスキームに従って、加熱を行う：12時間、＋10℃；次にサイクルの終りまで＋35℃。
【００５３】
【表１】
2005232177.tif 000002
【００５４】
【表２】
2005232177.tif 000003
【００５５】
【表３】
2005232177.tif 000004
【００５６】
【表４】
2005232177.tif 000005
【００５７】
【表５】
2005232177.tif 000006
【００５８】
【表６】
2005232177.tif 000007
【００５９】
【表７】
2005232177.tif 000008
【００６０】
【表８】
2005232177.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月31日(2005.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモン(hGH）並びに安定化量のサッカロース及びマンニトールの固体の完全な混合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記固体の完全な混合物が凍結乾燥物であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記hGHが組換え体であることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
５又は10mg／バイアルのhGHを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記構成物の水溶液の調製と、容器内の分散と、該容器内の凍結乾燥と、を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項６】
前記水溶液が酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液及びリン酸緩衝液から選択される緩衝溶液であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝溶液がリン酸緩衝液であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液のpHが6.0〜8.0の範囲内であることを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液のpHが7.5であることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
使用前の保存並びに注入可能物のための溶媒もしくは溶液内への前記混合物の再構成に適した容器内において滅菌条件下に密閉された請求項１〜４のいずれかに記載の固体混合物を含む前記医薬組成物の提供形態。
【請求項１１】
注入可能物のための溶媒又は溶液において再構成された請求項10に記載の前記固体混合物を含む溶液。
【請求項１２】
５又は10mg／バイアルのhGHと、7.5mg／バイアルのサッカロース及び32mg／バイアルのマンニトールと、pH7.5におけるリン酸緩衝液と、を含むことを特徴とする請求項11に記載の再構成された溶液。
【請求項１３】
前記溶媒が静菌溶媒であることを特徴とする請求項12に記載の溶液。
【請求項１４】
前記静菌溶媒がｍ−クレゾール 0.3％であることを特徴とする請求項13に記載の溶液。
【請求項１５】
火傷の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
創傷治癒の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ジストロフィーの処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
骨癒合の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
散在性胃出血の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
偽関節の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
下垂体機能低下小人症の処置のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。