(57)【要約】【課題】  多様なイチゴ品種を正確に識別することが可能であり、しかも、柔軟に対応できるとともに、イチゴ品種を正確に識別することができる方法イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが可能な方法を提供すること。【解決手段】  １９種類のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＰＸＦｗ２（配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）とＡＰＸＲｖ２（配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）、ＣＨＩＦｗ（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）とＣＨＩＲｖ２（配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）、Ｆ３Ｈ２Ｆｗ（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）とＦ３ＨＲｖ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）、ＤＦＲＦｗ（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）とＤＦＲＲｖ（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）、ＣＴＩ１Ｆｗ（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）とＣＴＩ１Ｒｖ（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）、ＭＳＲＦｗ（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）とＭＳＲＲｖ（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）、ＰＧＰＦｗ（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）とＰＧＰＲｖ（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）、ＰＧＰ２Ｆｗ（配列表の配列番号１５記載の塩基配列参照）とＰＧＰ２Ｒｖ（配列表の配列番号１６記載の塩基配列参照）、ＡＰＸ２Ｆｗ（配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ（配列表の配列番号１８記載の塩基配列参照）、ＡＰＸ３Ｆｗ（配列表の配列番号１９記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ、ＡＰＸ４Ｆｗ（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ、ＡＵＢＦｗ（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）とＡＵＢＲｖ（配列表の配列番号２２記載の塩基配列参照）、ＯＬＰＦｗ（配列表の配列番号２３記載の塩基配列参照）とＯＬＰＲｖ（配列表の配列番号２４記載の塩基配列参照）、ＣＴＩ２Ｆｗ（配列表の配列番号２５記載の塩基配列参照）とＣＴＩ２Ｒｖ（配列表の配列番号２６記載の塩基配列参照）、ＣＹＴＦｗ（配列表の配列番号２７記載の塩基配列参照）とＣＹＴＲｖ（配列表の配列番号２８記載の塩基配列参照）、ｔＲＮＡＦｗ（配列表の配列番号２９記載の塩基配列参照）とｔＲＮＡＲｖ（配列表の配列番号３０記載の塩基配列参照）、ＰＹＤＦｗ（配列表の配列番号３１記載の塩基配列参照）とＰＹＤＲｖ（配列表の配列番号３２記載の塩基配列参照）、ＰＹＤ２Ｆｗ（配列表の配列番号３３記載の塩基配列参照）とＰＹＤ２Ｒｖ（配列表の配列番号３４記載の塩基配列参照）、および、ＰＹＤ３Ｆｗ（配列表の配列番号３５記載の塩基配列参照）とＰＹＤ３Ｒｖ（配列表の配列番号３６記載の塩基配列参照）のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【請求項２】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ（配列表の配列番号３７および３８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ中のＭｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号３９参照）を認識する制限酵素Ｍｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項３】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＨＩ（配列表の配列番号４０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＨＩ中のＰｖｕ  ＩＩ認識配列（配列表の配列番号４１参照）を認識する制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項４】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、Ｆ３Ｈ２（配列表の配列番号４２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＦ３Ｈ２中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項５】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＤＦＲ（配列表の配列番号４４記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＤＦＲ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項６】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ１（配列表の配列番号４６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ１中のＨｉｎｆ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４７参照）を認識する制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項７】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＭＳＲ（配列表の配列番号４８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＭＳＲ中のＡｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４９参照）を認識する制限酵素Ａｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項８】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ（配列表の配列番号５０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項９】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ２（配列表の配列番号５２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ２中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１０】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ２（配列表の配列番号５３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ２中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１１】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ３（配列表の配列番号５５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ３中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１２】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ４（配列表の配列番号５６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ４中のＴａｑ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５７参照）を認識する制限酵素Ｔａｑ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１３】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＵＢ（配列表の配列番号５８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＵＢ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１４】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＯＬＰ（配列表の配列番号５９記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＯＬＰ中のＤｄｅ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６０参照）を認識する制限酵素Ｄｄｅ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１５】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ２（配列表の配列番号６１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ２中のＭｂｏ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６２参照）を認識する制限酵素Ｍｂｏ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１６】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＹＴ（配列表の配列番号６３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＹＴ中のＢｓａＢ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６４参照）を認識する制限酵素ＢｓａＢ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１７】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ｔＲＮＡ（配列表の配列番号６５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したｔＲＮＡ中のＦｏｋ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６６参照）を認識する制限酵素Ｆｏｋ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１８】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ（配列表の配列番号６７記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＣｆｒ１３  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６９参照）を認識する制限酵素Ｃｆｒ１３  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項１９】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ２（配列表の配列番号７０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ２中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項２０】
イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ３（配列表の配列番号７１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ３中のＨｇａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７２参照）を認識する制限酵素Ｈｇａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法。
【請求項２１】
Ｆ３ＨＦｗ（配列表の配列番号７３記載の塩基配列参照）とＦ３ＨＲｖ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）をプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列Ｆ３Ｈ（配列表の配列番号７４記載の塩基配列参照）を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＦ３Ｈ中のＥａｒ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７５参照）を認識する制限酵素Ｅａｒ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイチゴの品種識別方法に関し、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で相違性のある塩基配列を標的にしたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、得られた増幅産物を制限酵素処理して得られるＤＮＡの多型を検出し、これを識別することによってイチゴの品種を識別する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、イチゴの品種識別は、果実の形や大きさ、葉の形や大きさ、草型等の形質の比較により行われてきたが、この方法では正確な判断が極めて困難である上に、苗の大きさや生育状態等を揃えて同一の条件下で栽培した場合には有効であるが、果実のない苗では品種を識別することは事実上できないという問題があった。また、市場に流通しているイチゴは、多様な条件の下で栽培されているため、上記の従来方法では品種を識別することは困難であった。
【０００３】
このような問題点を解決すべく、本発明者らは、イチゴのガクを含む果実及び／又は葉より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型（ＤＮＡ断片の長さの差異）を識別することを特徴とするイチゴの品種識別方法を開発した（特許文献１）。
特許文献１記載の識別方法では、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ−ＭｌｕＩ、ＣＨＩ−ＰｖｕＩＩ、Ｆ３Ｈ−ＮｃｏＩ、Ｆ３Ｈ−ＨｐａＩＩ、Ｆ３Ｈ２−ＡｃｃＩ、Ｆ３Ｈ−ＤｄｅＩ及びＦ３Ｈ−ＲｓａＩの７つのうち少なくとも１種を識別用ＤＮＡマーカーとして用い、ＤＮＡ多型部分を検出することにより品種の識別を行う。しかし、７種のマーカーの全てを用いたとしても、識別可能な品種に限界があった。例えば、「女峰」と「アスカルビー」、「レッドパール」と「さつまおとめ」、および、「とよのか」と「はるのか」は、識別することができない。
昨今は、新品種の育種が活発であり、市場に流通する品種も多様化しているが、このように既存の品種の識別に限界がある特許文献１記載の方法は、このような状況に柔軟に対応することが困難である。
【０００４】
また、イチゴが遺伝的に８倍体であることに起因して、特許文献１で挙げられている７つの識別用ＤＮＡマーカーにより検出されるＤＮＡ多型断片は、視覚的に薄く、非常に見えにくい。そのため、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が不十分であると、多型の判断に間違いが生ずる可能性があり、品種識別の正確性に問題があった。
このような状況下、識別可能な品種が限定されず、しかも多様化する市場において次々と生み出される新品種に柔軟に対応できる、イチゴの品種識別方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特願２００２−１５５５４７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多様なイチゴ品種を正確に識別することが可能であり、しかも、柔軟に対応できるとともに、イチゴの種苗、果実等を試料として、栽培条件や保存条件などに左右されずに、イチゴ品種を正確に識別することが可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＰＣＲ法に用いるプライマーの塩基配列に改変を加えることにより、多型検出マーカーのより明瞭な検出を可能とするとともに、新たな多型検出マーカーを加え従来法では不明確であったイチゴ品種を明瞭に識別可能な多型検出マーカーを新たに見出した。本発明は係る知見に基づくものである。
【０００８】
すなわち従来のマーカーは、イチゴの保有する対立遺伝子全てをＰＣＲ法で増幅していたため、目的の多型マーカーが不要な対立遺伝子に妨害され不明瞭となったが、イチゴ遺伝子の塩基配列情報を元にプライマー配列を改変することで、多型マーカーを含む必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅し、明確なマーカーに改良できることを見出した。
【０００９】
また、プライマーを構成する塩基配列に改変を施すことにより、多型検出に必要な対立遺伝子のみを選択的に増幅させることで、副次的効果として、従来法と同様の操作手順で、従来法よりも多くの多型を得られることを見出した。
【００１０】
また本発明者らは、イチゴ品種間で塩基配列が異なり、かつその差が制限酵素で処理することにより検出可能となる遺伝子を、従来のＡＰＸ、ＣＨＩ、Ｆ３Ｈの他に複数探索した。これらを利用すると、従来法では識別不可能であった品種が識別できるようになることを確認し、本発明に至った。
【００１１】
即ち、請求項１記載の本発明は、ＡＰＸＦｗ２（配列表の配列番号１記載の塩基配列参照）とＡＰＸＲｖ２（配列表の配列番号２記載の塩基配列参照）、ＣＨＩＦｗ（配列表の配列番号３記載の塩基配列参照）とＣＨＩＲｖ２（配列表の配列番号４記載の塩基配列参照）、Ｆ３Ｈ２Ｆｗ（配列表の配列番号５記載の塩基配列参照）とＦ３ＨＲｖ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）、ＤＦＲＦｗ（配列表の配列番号７記載の塩基配列参照）とＤＦＲＲｖ（配列表の配列番号８記載の塩基配列参照）、ＣＴＩ１Ｆｗ（配列表の配列番号９記載の塩基配列参照）とＣＴＩ１Ｒｖ（配列表の配列番号１０記載の塩基配列参照）、ＭＳＲＦｗ（配列表の配列番号１１記載の塩基配列参照）とＭＳＲＲｖ（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）、ＰＧＰＦｗ（配列表の配列番号１３記載の塩基配列参照）とＰＧＰＲｖ（配列表の配列番号１４記載の塩基配列参照）、ＰＧＰ２Ｆｗ（配列表の配列番号１５記載の塩基配列参照）とＰＧＰ２Ｒｖ（配列表の配列番号１６記載の塩基配列参照）、ＡＰＸ２Ｆｗ（配列表の配列番号１７記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ（配列表の配列番号１８記載の塩基配列参照）、ＡＰＸ３Ｆｗ（配列表の配列番号１９記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ、ＡＰＸ４Ｆｗ（配列表の配列番号２０記載の塩基配列参照）とＡＰＸ２Ｒｖ、ＡＵＢＦｗ（配列表の配列番号２１記載の塩基配列参照）とＡＵＢＲｖ（配列表の配列番号２２記載の塩基配列参照）、ＯＬＰＦｗ（配列表の配列番号２３記載の塩基配列参照）とＯＬＰＲｖ（配列表の配列番号２４記載の塩基配列参照）、ＣＴＩ２Ｆｗ（配列表の配列番号２５記載の塩基配列参照）とＣＴＩ２Ｒｖ（配列表の配列番号２６記載の塩基配列参照）、ＣＹＴＦｗ（配列表の配列番号２７記載の塩基配列参照）とＣＹＴＲｖ（配列表の配列番号２８記載の塩基配列参照）、ｔＲＮＡＦｗ（配列表の配列番号２９記載の塩基配列参照）とｔＲＮＡＲｖ（配列表の配列番号３０記載の塩基配列参照）、ＰＹＤＦｗ（配列表の配列番号３１記載の塩基配列参照）とＰＹＤＲｖ（配列表の配列番号３２記載の塩基配列参照）、ＰＹＤ２Ｆｗ（配列表の配列番号３３記載の塩基配列参照）とＰＹＤ２Ｒｖ（配列表の配列番号３４記載の塩基配列参照）、および、ＰＹＤ３Ｆｗ（配列表の配列番号３５記載の塩基配列参照）とＰＹＤ３Ｒｖ（配列表の配列番号３６記載の塩基配列参照）のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法である。
【００１２】
請求項２記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ（配列表の配列番号３７および３８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ中のＭｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号３９参照）を認識する制限酵素Ｍｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項３記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＨＩ（配列表の配列番号４０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＨＩ中のＰｖｕ  ＩＩ認識配列（配列表の配列番号４１参照）を認識する制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項４記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、Ｆ３Ｈ２（配列表の配列番号４２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＦ３Ｈ２中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１３】
請求項５記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＤＦＲ（配列表の配列番号４４記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＤＦＲ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項６記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ１（配列表の配列番号４６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ１中のＨｉｎｆ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４７参照）を認識する制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項７記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＭＳＲ（配列表の配列番号４８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＭＳＲ中のＡｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４９参照）を認識する制限酵素Ａｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１４】
請求項８記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ（配列表の配列番号５０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項９記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ２（配列表の配列番号５２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ２中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１０記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ２（配列表の配列番号５３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ２中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１５】
請求項１１記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ３（配列表の配列番号５５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ３中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１２記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ４（配列表の配列番号５６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ４中のＴａｑ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５７参照）を認識する制限酵素Ｔａｑ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１３記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＵＢ（配列表の配列番号５８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＵＢ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１６】
請求項１４記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＯＬＰ（配列表の配列番号５９記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＯＬＰ中のＤｄｅ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６０参照）を認識する制限酵素Ｄｄｅ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１５記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ２（配列表の配列番号６１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ２中のＭｂｏ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６２参照）を認識する制限酵素Ｍｂｏ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１６記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＹＴ（配列表の配列番号６３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＹＴ中のＢｓａＢ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６４参照）を認識する制限酵素ＢｓａＢ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１７】
請求項１７記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ｔＲＮＡ（配列表の配列番号６５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したｔＲＮＡ中のＦｏｋ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６６参照）を認識する制限酵素Ｆｏｋ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１８記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ（配列表の配列番号６７記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＣｆｒ１３  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６９参照）を認識する制限酵素Ｃｆｒ１３  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項１９記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ２（配列表の配列番号７０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ２中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
【００１８】
請求項２０記載の本発明は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ３（配列表の配列番号７１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ３中のＨｇａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７２参照）を認識する制限酵素Ｈｇａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする請求項１記載のイチゴの品種識別方法である。
請求項２１記載の本発明は、Ｆ３ＨＦｗ（配列表の配列番号７３記載の塩基配列参照）とＦ３ＨＲｖ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）をプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列Ｆ３Ｈ（配列表の配列番号７４記載の塩基配列参照）を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＦ３Ｈ中のＥａｒ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７５参照）を認識する制限酵素Ｅａｒ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とするイチゴの品種識別方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明におけるプライマー改良により、従来法では明確には検出できなかったイチゴ品種識別用マーカーの多型ＤＮＡ断片を明確に検出することが可能となることに加え、１つのマーカーで得られる多型パターンが増加する。
また、本発明における新たなマーカーを従来法のものと併用することにより、市場流通しているほぼ全ての品種を識別することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
請求項１に係る本発明のイチゴの品種識別方法は、１９組のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
即ち、請求項１に係る本発明のイチゴの識別方法は、１９組のプライマー対のいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を行うと、増幅した配列中に、イチゴ品種間で異なる塩基配列が存在すること、および制限酵素によりその配列を認識できることを組み合わせることによってイチゴの品種識別を行う方法に基づいている。
１９組のプライマー対とは、以下に示すようなものである。
【００２１】
（１）ＡＰＸＦｗ２とＡＰＸＲｖ２
ＡＰＸＦｗ２とＡＰＸＲｖ２は、それぞれ配列表の配列番号１および２に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＤＮＡデータベースからアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＥＣ．１．１１．１．１１）をコードする遺伝子（ＡＰＸ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２２】
（２）ＣＨＩＦｗとＣＨＩＲｖ２
ＣＨＩＦｗとＣＨＩＲｖ２は、それぞれ配列表の配列番号３および４に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＤＮＡデータベースからカルコン酸シンターゼによって合成されたカルコンを異性化する酵素をコードする遺伝子（ＣＨＩ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２３】
（３）Ｆ３Ｈ２ＦｗとＦ３ＨＲｖ
Ｆ３Ｈ２ＦｗとＦ３ＨＲｖは、それぞれ配列表の配列番号５および６に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＤＮＡデータベースから植物に含まれる天然色素であるアントシアニンの生合成経路を触媒する酵素をコードする遺伝子（Ｆ３Ｈ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２４】
（４）ＤＦＲＦｗとＤＦＲＲｖ
ＤＦＲＦｗとＤＦＲＲｖは、それぞれ配列表の配列番号７および８に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ジヒドロフラボノール４−レダクターゼ（ＥＣ．１．１．１．２１９）をコードする遺伝子（ＤＦＲ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２５】
（５）ＣＴＩ１ＦｗとＣＴＩ１Ｒｖ
ＣＴＩ１ＦｗとＣＴＩ１Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号９および１０に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、キチナーゼ２−１（ＥＣ．３．２．１．１４）をコードする遺伝子（ＣＴＩ１）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２６】
（６）ＭＳＲＦｗとＭＳＲＲｖ
ＭＳＲＦｗとＭＳＲＲｖは、それぞれ配列表の配列番号１１および１２に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、メチオニンスルホキシドレダクターゼ（ＥＣ．１．８．４．５）をコードする遺伝子（ＭＳＲ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２７】
（７）ＰＧＰＦｗとＰＧＰＲｖ
ＰＧＰＦｗとＰＧＰＲｖは、それぞれ配列表の配列番号１３および１４に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ポリガラクツロナーゼインヒビター蛋白質（ＰＧＰ）をコードする遺伝子（ＰＧＰ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２８】
（８）ＰＧＰ２ＦｗとＰＧＰ２Ｒｖ
ＰＧＰ２ＦｗとＰＧＰ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号１５および１６に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＰＧＰの別の対立遺伝子（ＰＧＰ２）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００２９】
（９）ＡＰＸ２ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖ
ＡＰＸ２ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号１７および１８に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＡＰＸの別の対立遺伝子（ＡＰＸ２）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３０】
（１０）ＡＰＸ３ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖ
ＡＰＸ３ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号１９および１８に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＡＰＸおよびＡＰＸ２の別の対立遺伝子（ＡＰＸ３）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものであり、リバースプライマーは、先のプライマー対（９）で用いるリバースプライマーと同じものである。
【００３１】
（１１）ＡＰＸ４ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖ
ＡＰＸ４ＦｗとＡＰＸ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号２０および１８に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＡＰＸ、ＡＰＸ２およびＡＰＸ３の別の対立遺伝子（ＡＰＸ４）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものであり、リバースプライマーは、先のプライマー対（９）および（１０）で用いるリバースプライマーと同じものである。
【００３２】
（１２）ＡＵＢＦｗとＡＵＢＲｖ
ＡＵＢＦｗとＡＵＢＲｖは、それぞれ配列表の配列番号２１および２２に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、オーキシン結合蛋白質をコードする遺伝子（ＡＵＢ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３３】
（１３）ＯＬＰＦｗとＯＬＰＲｖ
ＯＬＰＦｗとＯＬＰＲｖは、それぞれ配列表の配列番号２３および２４に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、オスモチン様蛋白質をコードする遺伝子（ＯＬＰ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３４】
（１４）ＣＴＩ２ＦｗとＣＴＩ２Ｒｖ
ＣＴＩ２ＦｗとＣＴＩ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号２５および２６に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、キチナーゼ２−２（ＥＣ．３．２．１．１４）をコードする遺伝子（ＣＴＩ２）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３５】
（１５）ＣＹＴＦｗとＣＹＴＲｖ
ＣＹＴＦｗとＣＹＴＲｖは、それぞれ配列表の配列番号２７および２８に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、シスタチオニンガンマシンターゼ（ＥＣ．２．５．１．４８）をコードする遺伝子（ＣＹＴ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３６】
（１６）ｔＲＮＡＦｗとｔＲＮＡＲｖ
ｔＲＮＡＦｗとｔＲＮＡＲｖは、それぞれ配列表の配列番号２９および３０に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ｔＲＮＡ−ＬｅｕおよびｔＲＮＡ−Ｐｈｅをコードする遺伝子（ｔＲＮＡ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３７】
（１７）ＰＹＤＦｗとＰＹＤＲｖ
ＰＹＤＦｗとＰＹＤＲｖは、それぞれ配列表の配列番号３１および３２に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ．４．１．１．１）をコードする遺伝子（ＰＹＤ）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３８】
（１８）ＰＹＤ２ＦｗとＰＹＤ２Ｒｖ
ＰＹＤ２ＦｗとＰＹＤ２Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号３３および３４に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＰＹＤの別の対立遺伝子（ＰＹＤ２）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００３９】
（１９）ＰＹＤ３ＦｗとＰＹＤ３Ｒｖ  ＰＹＤ３ＦｗとＰＹＤ３Ｒｖは、それぞれ配列表の配列番号３５および３６に記載の塩基配列からなるプライマーである。
本プライマー対は、ＰＹＤおよびＰＹＤ２の別の対立遺伝子（ＰＹＤ２）のＤＮＡ配列を選択し、このＤＮＡ配列情報を参考にして設計されたものである。
【００４０】
請求項１に係る本発明のイチゴの品種識別方法は、まず、上記１９組のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅する。
【００４１】
鋳型として用いるＤＮＡは、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より以下の方法により抽出して得ることができる。
ＤＮＡの抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のDNeasy Plant Mini kit等のＤＮＡ抽出キットを用いそのプロトコルに従う方法で行うことができる。
また、Laurence Marechal-Drourard et.al．（Plant Molecular Biology Reporter，1995，vol．13(1)，p．26-30）の方法を改変して行うこともできる。具体的には、すりつぶした試料にＤＮＡ抽出溶液を加えて保温・冷却処理したのち、遠心して得た上清にイソプロパノールなどの溶媒を加えてＤＮＡを沈殿させ、必要に応じて遠心してＤＮＡを分離する。次いで、ＴＥとリボヌクレアーゼ溶液を加えてＲＮＡを分解する。このＲＮａｓｅ処理後の溶液にＤＥＡＥセファデックス混液を添加し、再度遠心して得た固形物に溶出バッファーを加えてＤＮＡを溶出させ、これを常法により精製して行うことができる。
【００４２】
ＰＣＲ法は、上記１９組のプライマー対のうちのいずれかをプライマーとして用い、上述のようにしてイチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型とするのであれば、常法に従って行うことができる。
即ち、抽出ＤＮＡに、上記１９組のプライマー対のうちの一組、Ｔａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、反応用緩衝液およびｄＮＴＰｓを加えた状態で、常法に従い約９０〜１００℃の高温処理過程（変性）、約３０〜７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０〜７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を１サイクルとする反応を３０〜４０サイクル行ってＤＮＡを増幅する。
【００４３】
次に、請求項１に係る本発明のイチゴの品種識別方法においては、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡの制限酵素による消化で生じる多型を検出する。
ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡの制限酵素による消化は、増幅したＤＮＡに適切な制限酵素４〜５ユニットを常法に従って、作用させることにより行う。制限酵素としては、例えば、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ａｃｃ  Ｉ、Ｈｈａ  Ｉ、Ｈｉｎｆ  Ｉ、Ｒｓａ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、Ｔａｑ  Ｉ、Ｄｄｅ  Ｉ、Ｍｂｏ  Ｉ、ＢｓａＢ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｈａｅ  ＩＩＩ、Ｃｆｒ１３  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｅａｒ  Ｉ等を挙げることができる。
【００４４】
多型の検出は、アガロースゲル電気泳動による分離等ＤＮＡ断片長（分子量の差）によりＤＮＡを分離する方法を利用して行うことができる。
例えば、アガロースゲルを用いる場合、アガロースゲル中のＰＣＲにより増幅したＤＮＡの制限酵素による消化産物は、その断片長により直流電荷に引かれて移動する距離が相違するので、これを臭化エチジウムブロマイド等により染色して得られるバンドは、ＤＮＡ断片長によりバンドを検出することができるので、バンドの有無により多型を識別することができる。
【００４５】
請求項１に係る本発明の識別方法において、イチゴ品種間で異なる塩基配列とは、複数のイチゴの品種間で１塩基以上の特異的な変異が１箇所以上存在する塩基配列のことを意味し、例えば以下のような手順で解明することができる。
イチゴ各品種から得られたＤＮＡ断片をアガロースゲルごと切り出してＤＮＡを回収し、これをEasy T Vectorシステム（プロメガ社）等を用いてクローニングを行う。まず、ＤＮＡをプラスミドに組み込み、大腸菌に導入する。次いで、大腸菌を増殖させた後、プラスミドを取り出して精製し、ＤＮＡシーケンサーを用いてクローンの塩基配列を決定する。イチゴ各品種からのプラスミドの解析結果や公開されている配列情報を比較することによって、標的とした塩基配列中に品種間で特異的に変異しており、かつその差を制限酵素処理と電気泳動により検出できる部位が存在するかを調べ、品種識別用マーカーとする。
【００４６】
このような請求項１に係る本発明は、例えば以下に説明するような請求項２〜２０に係る本発明の識別方法により、実施することが可能である。
【００４７】
〔１〕ＡＰＸ−ＭｌｕＩ（請求項２に係る本発明）
請求項２に係る本発明の識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ（配列表の配列番号３７および３８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ中のＭｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号３９参照）を認識する制限酵素Ｍｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＡＰＸは、前述のＡＰＸＦｗ２およびＡＰＸＲｖ２をプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００４８】
このＡＰＸは、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載されているように、プライマーとしてのＡＰＸＦＰおよびＡＰＸＲＶ、並びに制限酵素Ｍｌｕ  Ｉを用いても、多型を生じる識別用マーカーである。しかしながら、後述の実施例１に示すように４種類にしか分類できず、更に、多型マーカー以外のバンドが多数検出され不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難である（図１（ａ）参照）。
【００４９】
一方、ＡＰＸＦｗ２およびＡＰＸＲｖ２をプライマーとして用いることにより、後述の実施例１（図１参照）に示すように６種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１（ｂ）参照）。
このように、請求項１に係る本発明のように、ＡＰＸＦｗ２およびＡＰＸＲｖ２をプライマーとして用いることにより、従来法では識別できなかった「女峰」（レーン２）と「とちおとめ」（レーン３）の識別をも行うことが可能である。
【００５０】
〔２〕ＣＨＩ−ＰｖｕＩＩ（請求項３に係る本発明）
請求項３に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＨＩ（配列表の配列番号４０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＨＩ中のＰｖｕ  ＩＩ認識配列（配列表の配列番号４１参照）を認識する制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＣＨＩは、前述のＣＨＩＦｗおよびＣＨＩＲｖ２をプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００５１】
このＣＨＩは、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載されているように、プライマーとしてのＣＨＩＦＰおよびＣＨＩＲＶ、並びに制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩを用いても、多型を生じる識別用マーカーである。しかしながら、後述の実施例２に示すように２種類にしか分類できず、更に、多型マーカー以外のバンドが多数検出され不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難である（図２（ａ）参照）。
【００５２】
一方、ＣＨＩＦｗおよびＣＨＩＲｖ２をプライマーとして用いることにより、後述の実施例１に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図２（ｂ）参照）。
このように、請求項１に係る本発明のように、ＣＨＩＦｗおよびＣＨＩＲｖ２をプライマーとして用いることにより、従来法では識別できなかった「紅ほっぺ」の識別をも行うことが可能である。
【００５３】
〔３〕Ｆ３Ｈ２−ＡｃｃＩ（請求項４に係る本発明）
請求項４に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、Ｆ３Ｈ２（配列表の配列番号４２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＦ３Ｈ２中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、Ｆ３Ｈ２は、前述のＦ３Ｈ２ＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００５４】
このＦ３Ｈ２は、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載されているように、プライマーとしてのＦ３ＨＦＰ、Ｆ３ＨＦＰ２、およびＦ３ＨＲＶ、並びに制限酵素ＡｃｃＩを用いても、多型を生じる識別用マーカーである。しかしながら、後述の実施例３に示すように２種類にしか分類できず、更に、多型マーカー以外のバンドが多数検出され不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難である（図３（ａ）参照）。
【００５５】
一方、Ｆ３Ｈ２ＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いることにより、後述の実施例３に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図３（ｂ）参照）。
このように、請求項１に係る本発明のように、Ｆ３Ｈ２ＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いることにより、従来法では識別できなかったイチゴ品種の識別をも行うことが可能である。
【００５６】
〔４〕ＤＦＲ−ＨｈａＩ（請求項５に係る本発明）
請求項５に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＤＦＲ（配列表の配列番号４４記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＤＦＲ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＤＦＲは、前述のＤＦＲＦｗおよびＤＦＲＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００５７】
請求項５に係る本発明の方法によれば、後述の実施例４に示すように２種類に分類することが可能であり、正確な識別が可能である（図４参照）。
【００５８】
〔５〕ＣＴＩ１−ＨｉｎｆＩ（請求項６に係る本発明）
請求項６に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ１（配列表の配列番号４６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ１中のＨｉｎｆ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４７参照）を認識する制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＣＴＩ１は、前述のＣＴＩ１ＦｗおよびＣＴＩ１Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００５９】
請求項６に係る本発明の方法によれば、後述の実施例５に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図５参照）。
【００６０】
〔６〕ＭＳＲ−ＡｌｕＩ（請求項７に係る本発明）
請求項７に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＭＳＲ（配列表の配列番号４８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＭＳＲ中のＡｌｕ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４９参照）を認識する制限酵素Ａｌｕ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＭＳＲは、前述のＭＳＲＦｗおよびＭＳＲＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００６１】
請求項７に係る本発明により、後述の実施例６に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図６参照）。
【００６２】
〔７〕ＰＧＰ−ＡｃｃＩおよびＰＧＰ−ＲｓａＩ（請求項８に係る本発明）
請求項８に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ（配列表の配列番号５０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＡｃｃ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４３参照）を認識する制限酵素Ａｃｃ  Ｉによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＧＰ中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＰＧＰは、前述のＰＧＰＦｗおよびＰＧＰＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００６３】
請求項８に係る本発明の識別方法により、後述の実施例７および８に示すように３種類および２種類ずつに分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図７および８参照）。
【００６４】
〔８〕ＰＧＰ２−ＲｓａＩ（請求項９に係る本発明）
請求項９に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＧＰ２（配列表の配列番号５２記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＧＰ２中のＲｓａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５１参照）を認識する制限酵素Ｒｓａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＰＧＰ２は、前述のＰＧＰ２ＦｗおよびＰＧＰ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００６５】
請求項９に係る本発明の識別方法により、後述の実施例９に示すように２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図９参照）。
【００６６】
〔９〕ＡＰＸ２−ＤｒａＩ（請求項１０に係る本発明）
請求項１０に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ２（配列表の配列番号５３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ２中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＡＰＸ２は、前記のＡＰＸ２ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００６７】
請求項１０に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１０に示すように２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１０参照）。
【００６８】
〔１０〕ＡＰＸ３−ＤｒａＩ（請求項１１に係る本発明）
請求項１１に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ３（配列表の配列番号５５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ３中のＤｒａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５４参照）を認識する制限酵素Ｄｒａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＡＰＸ３は、前記のＡＰＸ３ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００６９】
請求項１１に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１１に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１１参照）。
【００７０】
〔１１〕ＡＰＸ４−ＴａｑＩ（請求項１２に係る本発明）
請求項１２に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＰＸ４（配列表の配列番号５６記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＰＸ４中のＴａｑ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号５７参照）を認識する制限酵素Ｔａｑ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＡＰＸ４は、前記のＡＰＸ４ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００７１】
請求項１２に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１２に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１２参照）。
【００７２】
〔１２〕ＡＵＢ−ＨｈａＩ（請求項１３に係る本発明）
請求項１３に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＡＵＢ（配列表の配列番号５８記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＡＵＢ中のＨｈａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号４５参照）を認識する制限酵素Ｈｈａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＡＵＢは、前記のＡＵＢＦｗおよびＡＵＢＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００７３】
請求項１３に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１３に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１３参照）。
【００７４】
〔１３〕ＯＬＰ−ＤｄｅＩ（請求項１４に係る本発明）
請求項１３に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＯＬＰ（配列表の配列番号５９記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＯＬＰ中のＤｄｅ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６０参照）を認識する制限酵素Ｄｄｅ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＯＬＰは、前記のＯＬＰＦｗおよびＯＬＰＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００７５】
請求項１４に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１４に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１４参照）。
【００７６】
〔１４〕ＣＴＩ２−ＭｂｏＩ（請求項１５に係る本発明）
請求項１５に係る本発明のイチゴの品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＴＩ２（配列表の配列番号６１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＴＩ２中のＭｂｏ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６２参照）を認識する制限酵素Ｍｂｏ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＣＴＩ２は、前記のＣＴＩ２ＦｗおよびＣＴＩ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００７７】
請求項１５に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１５に示すように３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１５参照）。
【００７８】
〔１５〕ＣＹＴ−ＢｓａＢＩ（請求項１６に係る本発明）
請求項１６に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＣＹＴ（配列表の配列番号６３記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＣＹＴ中のＢｓａＢ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６４参照）を認識する制限酵素ＢｓａＢ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＣＹＴは、前記のＣＹＴＦｗおよびＣＹＴＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００７９】
請求項１６に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１６に示すように２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１６参照）。
【００８０】
〔１６〕ｔＲＮＡ−ＦｏｋＩ（請求項１７に係る本発明）
請求項１７に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ｔＲＮＡ（配列表の配列番号６５記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したｔＲＮＡ中のＦｏｋ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６６参照）を認識する制限酵素Ｆｏｋ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ｔＲＮＡは、前記のｔＲＮＡＦｗおよびｔＲＮＡＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００８１】
請求項１７に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１７に示すように２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１７参照）。
【００８２】
〔１７〕ＰＹＤ−ＨａｅＩＩＩおよびＰＹＤ−Ｃｆｒ１３Ｉ（請求項１８に係る本発明）
請求項１８に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ（配列表の配列番号６７記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型、および／またはＰＣＲにより増幅したＰＹＤ中のＣｆｒ１３  Ｉ認識配列（配列表の配列番号６９参照）を認識する制限酵素Ｃｆｒ１３  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＰＹＤは、前記のＰＹＤＦｗおよびＰＹＤＲｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００８３】
請求項１８に係る本発明の識別方法により、後述の実施例１８および１９に示すように、それぞれ３種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図１８および１９参照）。
【００８４】
〔１８〕ＰＹＤ２−ＨａｅＩＩＩ（請求項１９に係る本発明）
請求項１９に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ２（配列表の配列番号７０記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ２中のＨａｅ  ＩＩＩ認識配列（配列表の配列番号６８参照）を認識する制限酵素Ｈａｅ  ＩＩＩによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＰＹＤ２は、前記のＰＹＤ２ＦｗおよびＰＹＤ２Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００８５】
請求項１９に係る本発明の識別方法により、後述の実施例２０に示すように、２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図２０参照）。
【００８６】
〔１９〕ＰＹＤ３−ＨｇａＩ（請求項２０に係る本発明）
請求項２０に係る本発明の品種識別方法は、イチゴ品種間で異なる塩基配列として、ＰＹＤ３（配列表の配列番号７１記載の塩基配列参照）を利用し、ＰＣＲにより増幅したＰＹＤ３中のＨｇａ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７２参照）を認識する制限酵素Ｈｇａ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
尚、ＰＹＤ３は、前記のＰＹＤ３ＦｗおよびＰＹＤ３Ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅される。
【００８７】
請求項２０に係る本発明の識別方法により、後述の実施例２１に示すように、２種類に分類することが可能であり、更に、多型マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能である（図２１参照）。
【００８８】
〔２２〕Ｆ３Ｈ−ＥａｒＩ（請求項２１に係る本発明）
請求項２１に係る本発明の品種識別方法は、Ｆ３ＨＦｗ（配列表の配列番号７３記載の塩基配列参照）とＦ３ＨＲｖ（配列表の配列番号６記載の塩基配列参照）をプライマーとして用い、イチゴの果実、ガク、葉および茎の中から選ばれた少なくとも１種類より抽出したＤＮＡを鋳型として、イチゴ品種間で異なる塩基配列Ｆ３Ｈ（配列表の配列番号７４記載の塩基配列参照）を標的としたＰＣＲ法によってＤＮＡを増幅し、増幅したＦ３Ｈ中のＥａｒ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７５参照）を認識する制限酵素Ｅａｒ  Ｉによる消化で生じる多型を検出することを特徴とする。
即ち、請求項２１に係る本発明の品種識別方法は、プライマー対として、Ｆ３ＨＦｗおよびＦ３ＨＲｖを用いる他は、請求項１に係る本発明と同様にして行うものである。
このプライマー対Ｆ３ＨＦｗおよびＦ３ＨＲｖは、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載されたプライマー対（Ｆ３ＨＦＰおよびＦ３ＨＲＶ）であるが、これらのプライマーを用いて増幅したＦ３Ｈ中のＥａｒ  Ｉ認識配列（配列表の配列番号７５参照）を認識する制限酵素Ｅａｒ  Ｉによる消化で生じる多型を検出すること、については、上記先願明細書には全く記載されていない。
【００８９】
請求項２１に係る本発明の識別方法により、後述の実施例２２に示すように、２種類に分類することが可能であり、正確な識別が可能である（図２２参照）。
【００９０】
請求項１に係る本発明の識別方法によれば、種々のプライマー対を組み合わせることにより、多種多様なイチゴ品種を正確に識別することができる。
特に、請求項２に係る本発明のイチゴ品種間で異なる各塩基配列、即ち多型識別マーカーを、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別用マーカー（改良したものを含む）と併用することにより、アイストロ、アイベリー、あかしゃのみつこ、あかねっ娘、章姫、アスカウェイブ、アスカルビー、越後姫、エバーベリー、大石四季成２号、きたえくぼ、北の輝、久能早生、けいきわせ、紅寿、さがほのか、さちのか、さつまおとめ、サマーベリー、沢ベリー、サンチーゴ、しずたから、しずちから、しずのか、しゅうこう、スルガエース、セレナータ、ダナー、とちおとめ、栃の峰、とちひめ、とねほっぺ、とよのか、女峰、濃姫、はつくに、はるのか、はるよい、ピーストロ、ひのみね、ひみこ、媛育、福岡Ｓ６号、福羽、ペチカ、紅ほっぺ、ベリースター、ベルルージュ、芳玉、宝交早生、堀田ワンダー、マラー、みよし、明宝、八雲、リンダモール、麗紅、レッドパール、苺香、および早紅の６０品種全てを識別することができる。
【実施例】
【００９１】
以下に、本発明の実施例を詳しく説明するが、本発明はこれによって制限されるものではない。
以下の実施例においては、サンプルとしてとよのか、女峰、とちおとめ、章姫、さちのか、アイベリー、レッドパール、濃姫、サンチーゴ、ピーストロ、アイストロ、紅ほっぺ、けいきわせ、久留米ＩＨ−１号、久留米ＩＨ−２号、久留米９３２３号、セセナ、栃の峰、とちひめ、さがほのか、系統Ａ−１７、福岡Ｓ６号および宝交早生の各イチゴ品種を用いて、各プライマー対を用いた品種識別を行った。
【００９２】
実施例１（ＡＰＸ−ＭｌｕＩによる品種識別）
サンプルからのＤＮＡの抽出には、QIAGEN社のDNeasy Plant Mini kitを利用し、その操作はプロトコルに従った。各品種のイチゴ果実のガク部位または葉を１／２〜１／３程度（５０ｍｇ以下）エッペンドルフチューブに入れ、消泡剤一滴と４００μＬのキット付属AP1 bufferおよび４μｌのＲＮａｓｅを加えQIAGEN社のＭＭ−３００細胞破砕機で破砕した。
これを６５℃で１０分間保温した後、１３０μｌのAP2 bufferを加え氷上で５分間置いて、遠心し（１５０００ｒｐｍ、５分間）、その上清をQIA shredderに移した。これを更に遠心し（１５０００ｒｐｍ、２分間）、下層を新しいエッペンドルフチューブに移してその１．５倍量のＡＰ３／Ethanol bufferを加えて混合した。これをspin columnに移して遠心し（１５０００ｒｐｍ、１分間）、更にカラムに５００μｌのAW bufferを２度通すことでＤＮＡ以外の吸着物を洗浄した。
最後に１００μｌのAE bufferでカラムからＤＮＡを溶出させ、これを２度繰り返すことで計２００μｌとなった抽出液をＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【００９３】
こうして得られたＤＮＡ抽出液を１０倍に希釈して、５μｌ（ＤＮＡ約１〜１０ｎｇ）を反応に用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ溶液５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造、５units／μｌ）０．５μｌ、反応用緩衝液（１００ｍＭトリス酢酸、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．３）５μｌ、ｄＮＴＰｓ（１００μM）４μｌおよびＡＰＸＦｗ２プライマーとＡＰＸＲｖ２プライマーそれぞれ５０ｐｍｏｌに、滅菌水を加えて反応量５０μｌとした。
反応液にミネラルオイルを重ね、ＡＢＩ（Applied Biosystems Instrument）社製のGene Amp ＰＣＲ System 9700を使用して９４℃５分後、９４℃３０秒−５５℃３０秒−７２℃30秒の反応を３５サイクル繰り返し、７２℃５分間の伸長反応を補足してＰＣＲ反応によるＡＰＸの増幅を行った。
【００９４】
増幅したＡＰＸのＤＮＡ溶液５０μｌ中、５μｌを制限酵素処理に用いた。反応溶液の組成は、５μｌのＤＮＡ増幅液、制限酵素Ｍｌｕ  Ｉ  ０．４μｌ（ＮＥＢ社製・１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、酵素添付の反応緩衝液１μｌに滅菌水を加えて１０μｌとした。これを３７℃で１時間処理した後、反応液全量を用いてエチジウムブロマイドを含有する１．５％のアガロースゲルで電気泳動分離を行い、紫外線照射によりＤＮＡを検出した。
結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）中Ａの矢印はマーカーＡを示し、Ｂの矢印はマーカーＢを示し、Ｘの矢印は共通バンドＸを示す。また、レーン１〜２４は、１：とよのか、２：女峰、３：とちおとめ、４：章姫、５：さちのか、６：アイベリー、７：レッドパール、８：濃姫、９：サンチーゴ、１０：ピーストロ、１１：アイストロ、１２：紅ほっぺ、１３：けいきわせ、１４：久留米ＩＨ−１号、１５：久留米ＩＨ−２号、１６：久留米９３２３号、１７：同１６、１８：セセナ、１９：栃の峰、２０：とちひめ、２１：さがほのか、２２：系統Ａ−１７、２３：福岡Ｓ６号、２４：宝交早生を示す。
尚、レーン１〜２４の各イチゴ品種については、以下の図においても同様である。
また、多型の出現パターンを表１（改良法）に示す。
【００９５】
一方、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法により、プライマーとしてＡＰＸＦＰ（配列表の配列番号７６参照）およびＡＰＸＲＶ（配列表の配列番号７７参照）を用いた他は上記と同様の手順で多型を検出した。
結果を図１（ａ）に示す。図１（ａ）中、Ａの矢印はマーカーＡを示し、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、多型の出現パターンを表１（従来法）に示す。
【００９６】
【表１】
2005102535.tif 000002
【００９７】
図１（ａ）から、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、マーカーＡ保有グループ（表１（従来法）のＡ）、マーカーＢ保有ブループ（表１（従来法）のＢ）、マーカーＡおよびＢ保有グループ（表１（従来法）のＣ）およびマーカーのないグループ（表１（従来法）のＸ）の４種類しか分類できないことが明らかである。この点については、表１（従来法）にも示すとおりである。
更に、図１（ａ）から、多型マーカー以外のバンドが多数検出され、一方多型検出マーカーは不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難であることが分かる。
【００９８】
図１（ｂ）から明らかなように、本発明の識別方法におけるＡＰＸ−ＭｌｕＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡ、マーカーＢおよび共通バンドＸの出現の有無により、６種類に分類される。即ち、表１（改良法）に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１（改良法）のＢ）、マーカーＡおよびＢ保有グループ（表１（改良法）のＣ）、マーカーＡをホモで保有するグループ（表１（改良法）のａ）、マーカーＢをホモで保有するグループ（表１（改良法）のｂ）、およびマーカーを保有しないグループ（表１（改良法）のＸ）に分類できる。特に、従来法ではイチゴ品種「女峰」と「とちおとめ」を識別できなかったが、「女峰」（図１（ｂ）のレーン２）はＡタイプ、「とちおとめ」（図１（ｂ）のレーン３）はａタイプ、「とよのか」（図１（ｂ）のレーン１）はＢタイプ、「章姫」（図１（ｂ）のレーン４）はＸタイプを示すため、それぞれを識別することが可能である。
また、図１（ｂ）と（ａ）とを比較しても明らかなように、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
このように、ＡＰＸＦＰおよびＡＰＸＲＶをプライマーとして用いる特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、識別できる品種に制限があると共に、正確な検出が困難なものであったが、請求項１に係る本発明の識別方法によれば、ＡＰＸＦｗ２およびＡＰＸＲｖ２をプライマーとして用いることにより、従来法よりも多くのイチゴの品種の識別が可能であるとともに、マーカーの明瞭性の改善が見られ、イチゴの品種識別が正確に行えることが分かる。例えば、従来法では識別できなかった「女峰」（レーン２）と「とちおとめ」（レーン３）の識別を行うことが可能である。
【００９９】
実施例２（ＣＨＩ−ＰｖｕＩＩによる品種識別）
実施例１において、ＣＨＩＦｗおよびＣＨＩＲｖ２をプライマーとして用いて、ＰｖｕＩＩを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）中、Ａの矢印はマーカーＡを示し、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、多型の出現パターンを表２（改良法）に示す。
【０１００】
一方、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法により、プライマーとしてＣＨＩＦＰ（配列表の配列番号３参照）およびＣＨＩＲＶ（配列表の配列番号７８参照）を用いた他は上記と同様の手順で多型を検出した。
結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、多型の出現パターンを表２（従来法）に示す。
【０１０１】
【表２】
2005102535.tif 000003
【０１０２】
図２（ａ）から、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、マーカーＡ保有グループ（表２（従来法）のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表２（従来法）のＸ）の２種類しか分類できないことが明らかである。この点については、表２（従来法）にも示すとおりである。
更に、図２（ａ）から、多型マーカー以外のバンドが多数検出され、一方多型検出マーカーは不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難であることが分かる。
【０１０３】
図２（ｂ）から明らかなように、本発明の識別方法におけるＣＨＩ−ＰｖｕＩＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１（改良法）に示すように、マーカーＡ保有グループ（表２（改良法）のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表２（改良法）のＢ）およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表２（改良法）のＣ）に分類できる。特に、イチゴ品種「紅ほっぺ」（図２（ｂ）のレーン１２）はＢタイプを示すことから、これらの品種を他の品種から識別することが可能である。
また、図２（ｂ）と（ａ）とを比較しても明らかなように、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
このように、ＣＨＩＦＰおよびＣＨＩＲＶをプライマーとして用いる特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、識別できる品種に制限があると共に、正確な検出が困難なものであったが、請求項１に係る本発明の識別方法によれば、ＣＨＩＦｗおよびＣＨＩＲｖ２をプライマーとして用いることにより、従来法よりも多くのイチゴの品種の識別が可能であるとともに、マーカーの明瞭性の改善が見られ、イチゴの品種識別が正確に行えることが分かる。
【０１０４】
実施例３（Ｆ３Ｈ２−ＡｃｃＩによる品種識別）
実施例１において、Ｆ３Ｈ２ＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いて、Ａｃｃ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）中、Ａの矢印はマーカーＡを示し、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、多型の出現パターンを表３（改良法）に示す。
【０１０５】
一方、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法により、プライマーとしてＦ３ＨＦＰ（配列表の配列番号７３参照）、Ｆ３ＨＦＰ２（配列表の配列番号７９参照）、およびＦ３ＨＲＶ（配列表の配列番号６参照）を用いた他は上記と同様の手順で多型を検出した。
結果を図３（ａ）に示す。図３（ａ）中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、多型の出現パターンを表３（従来法）に示す。
【０１０６】
【表３】
2005102535.tif 000004
【０１０７】
図３（ａ）から、特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、マーカーＡ保有グループ（表３（従来法）のＡ）およびマーカーのないグループ（表３（従来法）のＸ）の２種類しか分類できないことが明らかである。この点については、表３（従来法）にも示すとおりである。
更に、図３（ａ）から、多型マーカー以外のバンドが多数検出され、一方多型検出マーカーは不明瞭であることから、多型の正確な検出が困難であることが分かる。
【０１０８】
図３（ｂ）から明らかなように、本発明の識別方法におけるＦ３Ｈ２−ＡｃｃＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表３（改良法）に示すように、マーカーＡ保有グループ（表３（改良法）のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表３（改良法）のＢ）およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表３（改良法）のＣ）に分類できる。
また、図３（ｂ）と（ａ）とを比較しても明らかなように、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
このように、Ｆ３ＨＦＰ、Ｆ３ＨＦＰ２、およびＦ３ＨＲＶをプライマーとして用いる特願２００２−１５５５４７号明細書に記載の識別方法によれば、識別できる品種に制限があると共に、正確な検出が困難なものであったが、請求項１に係る本発明の識別方法によれば、Ｆ３Ｈ２ＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いることにより、従来法よりも多くのイチゴの品種の識別が可能であるとともに、マーカーの明瞭性の改善が見られ、イチゴの品種識別が正確に行えることが分かる。
【０１０９】
実施例４（ＤＦＲＦｗおよびＤＦＲＲｖを用いたＤＦＲ−ＨｈａＩによる品種識別）
実施例１において、ＤＦＲＦｗおよびＤＦＲＲｖをプライマーとして用いて、Ｈｈａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図４に示す。図４中Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＤＦＲ−ＨｈａＩによる多型の出現パターンを表４に示す。
【０１１０】
【表４】
2005102535.tif 000005
【０１１１】
図４から明らかなように、ＤＦＲ−ＨｈａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表４に示すように、マーカーＡ保有グループ（表４のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表４のＸ）に分類できることが分かる。
【０１１２】
実施例５（ＣＴＩ１ＦｗおよびＣＴＩ１Ｒｖを用いたＣＴＩ１−ＨｉｎｆＩによる品種識別）
実施例１において、ＣＴＩ１ＦｗおよびＣＴＩ１Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｈｉｎｆ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図５に示す。図５中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＣＴＩ１−ＨｉｎｆＩによる多型の出現パターンを表５に示す。
【０１１３】
【表５】
2005102535.tif 000006
【０１１４】
図５から明らかなように、ＣＴＩ１−ＨｉｎｆＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよび共通バンドＸ（図５中、マーカーＡの上部に観察されるバンド）の出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表５に示すように、マーカーＡ保有グループ（表５のＡ）、マーカーＡをホモで保有するグループ（表５のａ）、マーカーＡを保有しないグループ（表５のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１１５】
実施例６（ＭＳＲＦｗおよびＭＳＲＲｖを用いたＭＳＲ−ＡｌｕＩによる品種識別）
実施例１において、ＭＳＲＦｗおよびＭＳＲＲｖをプライマーとして用いて、Ａｌｕ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図６に示す。図６中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＭＳＲ−ＡｌｕＩによる多型の出現パターンを表６に示す。
【０１１６】
【表６】
2005102535.tif 000007
【０１１７】
図６から明らかなように、ＭＳＲ−ＡｌｕＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表６に示すように、マーカーＡ保有グループ（表６のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表６のＢ）、マーカーＡおよびＢ保有グループ（表６のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１１８】
実施例７（ＰＧＰＦｗおよびＰＧＰＲｖを用いたＰＧＰ−ＡｃｃＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＧＰＦｗおよびＰＧＰＲｖをプライマーとして用いて、Ａｃｃ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図７に示す。図７中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＰＧＰ−ＡｃｃＩによる多型の出現パターンを表７に示す。
【０１１９】
【表７】
2005102535.tif 000008
【０１２０】
図７から明らかなように、ＰＧＰ−ＡｃｃＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表７に示すように、マーカーＡ保有グループ（表７のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表７のＢ）、マーカーＡおよびＢ保有グループ（表７のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１２１】
実施例８（ＰＧＰＦｗおよびＰＧＰＲｖを用いたＰＧＰ‐ＲｓａＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＧＰＦｗおよびＰＧＰＲｖをプライマーとして用いて、Ｒｓａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図８に示す。図８中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＰＧＰ−ＲｓａＩによる多型の出現パターンを表８に示す。
【０１２２】
【表８】
2005102535.tif 000009
【０１２３】
図８から明らかなように、ＰＧＰ−ＲｓａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表８に示すように、マーカーＡ保有グループ（表８のＡ）およびマーカーＡを保有しないグループ（表８のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１２４】
実施例９（ＰＧＰ２ＦｗおよびＰＧＰ２Ｒｖを用いたＰＧＰ２−ＲｓａＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＧＰ２ＦｗおよびＰＧＰ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｒｓａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図９に示す。図９中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＰＧＰ２−ＲｓａＩによる多型の出現パターンを表９に示す。
【０１２５】
【表９】
2005102535.tif 000010
【０１２６】
図９から明らかなように、本発明の識別方法によるＰＧＰ２‐ＲｓａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表９に示すように、マーカーＡ保有グループ（表９のＡ）およびマーカーＡおよびＢを保有するグループ（表９のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１２７】
実施例１０（ＡＰＸ２ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖを用いたＡＰＸ２−ＤｒａＩによる品種識別）
実施例１において、ＡＰＸ２ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｄｒａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１０に示す。図１０中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＡＰＸ２−ＤｒａＩによる多型の出現パターンを表１０に示す。
【０１２８】
【表１０】
2005102535.tif 000011
【０１２９】
図１０から明らかなように、ＡＰＸ２−ＤｒａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表１０に示すように、マーカーＡを保有するグループ（表１０のＡ）およびマーカーＡを保有しないグループ（表１０のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１３０】
実施例１１（ＡＰＸ３ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖを用いたＡＰＸ３−ＤｒａＩによる品種識別）
実施例１において、ＡＰＸ３ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｄｒａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１１に示す。図１１中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＡＰＸ３−ＤｒａＩによる多型の出現パターンを表１１に示す。
【０１３１】
【表１１】
2005102535.tif 000012
【０１３２】
図１１から明らかなように、ＡＰＸ３−ＤｒａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよび共通バンドＸ（図１１においてマーカーＡの上部に観察されるバンド）の出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１１に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１１のＡ）、マーカーＡをホモで保有するグループ（表１１のａ）、およびマーカーＡを保有しないグループ（表１１のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１３３】
実施例１２（ＡＰＸ４ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖを用いたＡＰＸ４−ＴａｑＩによる品種識別）
実施例１において、ＡＰＸ４ＦｗおよびＡＰＸ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｔａｑ  Ｉを制限酵素として用いたこと、ならびに、制限酵素処理を６５℃で行ったことの他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１２に示す。図１２中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＡＰＸ４−ＴａｑＩによる多型の出現パターンを表１２に示す。
【０１３４】
【表１２】
2005102535.tif 000013
【０１３５】
図１２から明らかなように、ＡＰＸ４−ＴａｑＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１２に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１２のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１２のＢ）、およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表１２のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１３６】
実施例１３（ＡＵＢＦｗおよびＡＵＢＲｖを用いたＡＵＢ−ＨｈａＩによる品種識別）
実施例１において、ＡＵＢＦｗおよびＡＵＢＲｖをプライマーとして用いて、Ｈｈａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１３に示す。図１３中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＡＵＢ−ＨｈａＩによる多型の出現パターンを表１３に示す。
【０１３７】
【表１３】
2005102535.tif 000014
【０１３８】
図１３から明らかなように、ＡＵＢ−ＨｈａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよび共通バンドＸ（図１３中、マーカーＡの下部に観察されるバンド）の出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１３に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１３のＡ）、マーカーＡをホモで保有するグループ（表１３のａ）、およびマーカーを保有しないグループ（表１３のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１３９】
実施例１４（ＯＬＰＦｗおよびＯＬＰＲｖを用いたＯＬＰ−ＤｄｅＩによる品種識別）
実施例１において、ＯＬＰＦｗおよびＯＬＰＲｖをプライマーとして用いて、Ｄｄｅ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１４に示す。図１４中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＯＬＰ−ＤｄｅＩによる多型の出現パターンを表１４に示す。
【０１４０】
【表１４】
2005102535.tif 000015
【０１４１】
図１４から明らかなように、ＯＬＰ−ＤｄｅＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１４に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１４のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１４のＢ）、およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表１４のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１４２】
実施例１５（ＣＴＩ２ＦｗおよびＣＴＩ２Ｒｖを用いたＣＴＩ２−ＭｂｏＩによる品種識別）
実施例１において、ＣＴＩ２ＦｗおよびＣＴＩ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｍｂｏ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１５に示す。図１５中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＣＴＩ２−ＭｂｏＩによる多型の出現パターンを表１５に示す。
【０１４３】
【表１５】
2005102535.tif 000016
【０１４４】
図１５から明らかなように、ＣＴＩ２−ＭｂｏＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１５に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１５のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１５のＢ）、およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表１５のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１４５】
実施例１６（ＣＹＴＦｗおよびＣＹＴＲｖを用いたＣＹＴ−ＢｓａＢＩによる品種識別）
実施例１において、ＣＹＴＦｗおよびＣＹＴＲｖをプライマーとして用いて、ＢｓａＢ  Ｉを制限酵素として用いたこと、ならびに、制限酵素処理を６０℃で行ったことの他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１６に示す。図１６中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＣＹＴ−ＢｓａＢＩによる多型の出現パターンを表１６に示す。
【０１４６】
【表１６】
2005102535.tif 000017
【０１４７】
図１６から明らかなように、ＣＹＴ−ＢｓａＢＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表１６に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１６のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表１６のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１４８】
実施例１７（ｔＲＮＡＦｗおよびｔＲＮＡＲｖを用いたｔＲＮＡ−ＦｏｋＩによる品種識別）
実施例１において、ｔＲＮＡＦｗおよびｔＲＮＡＲｖをプライマーとして用いて、Ｆｏｋ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１７に示す。図１７中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ｔＲＮＡ−ＦｏｋＩによる多型の出現パターンを表１７に示す。
【０１４９】
【表１７】
2005102535.tif 000018
【０１５０】
図１７から明らかなように、ｔＲＮＡ−ＦｏｋＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表１７に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１７のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表１７のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１５１】
実施例１８（ＰＹＤＦｗおよびＰＹＤＲｖを用いたＰＹＤ−ＨａｅＩＩＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＹＤＦｗおよびＰＹＤＲｖをプライマーとして用いて、Ｈａｅ  ＩＩＩを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１８に示す。図１８中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＰＹＤ−ＨａｅＩＩＩによる多型の出現パターンを表１８に示す。
【０１５２】
【表１８】
2005102535.tif 000019
【０１５３】
図１８から明らかなように、ＰＹＤ−ＨａｅＩＩＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１８に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１８のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１８のＢ）、およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表１８のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１５４】
実施例１９（ＰＹＤＦｗおよびＰＹＤＲｖを用いたＰＹＤ−Ｃｆｒ１３Ｉによる品種識別）
実施例１において、ＰＹＤＦｗおよびＰＹＤＲｖをプライマーとして用いて、Ｃｆｒ１３  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図１９に示す。図１９中、Ａの矢印はマーカーＡを、Ｂの矢印はマーカーＢを示す。
また、ＰＹＤ−Ｃｆｒ１３Ｉによる多型の出現パターンを表１９に示す。
【０１５５】
【表１９】
2005102535.tif 000020
【０１５６】
図１９から明らかなように、ＰＹＤ−Ｃｆｒ１３Ｉによる多型の出現パターンは、マーカーＡおよびマーカーＢの出現の有無により、３種類に分類される。即ち、表１９に示すように、マーカーＡ保有グループ（表１９のＡ）、マーカーＢ保有グループ（表１９のＢ）、およびマーカーＡおよびＢ保有グループ（表１９のＣ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１５７】
実施例２０（ＰＹＤ２ＦｗおよびＰＹＤ２Ｒｖを用いたＰＹＤ２−ＨａｅＩＩＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＹＤ２ＦｗおよびＰＹＤ２Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｈａｅ  ＩＩＩを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図２０に示す。図２０中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＰＹＤ２−ＨａｅＩＩＩによる多型の出現パターンを表２０に示す。
【０１５８】
【表２０】
2005102535.tif 000021
【０１５９】
図２０から明らかなように、ＰＹＤ２−ＨａｅＩＩＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表２０に示すように、マーカーＡ保有グループ（表２０のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表２０のＸ）に分類できる。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１６０】
実施例２１（ＰＹＤ３ＦｗおよびＰＹＤ３Ｒｖを用いたＰＹＤ３−ＨｇａＩによる品種識別）
実施例１において、ＰＹＤ３ＦｗおよびＰＹＤ３Ｒｖをプライマーとして用いて、Ｈｇａ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図２１に示す。図２１中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、ＰＹＤ３−ＨｇａＩによる多型の出現パターンを表２１に示す。
【０１６１】
【表２１】
2005102535.tif 000022
【０１６２】
図２１から明らかなように、ＰＹＤ３−ＨｇａＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表２１に示すように、マーカーＡ保有グループ（表２１のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表２１のＸ）に分類できる（２２、２３はデータなし）。
また、本マーカー以外のＤＮＡがほとんど検出されていないことから、マーカーが顕著に明瞭化され、多型検出が妨害されずに済み、正確な識別が可能となることが分かる。
【０１６３】
実施例２２（Ｆ３ＨＦｗおよびＦ３ＨＲｖを用いたＦ３Ｈ−ＥａｒＩによる品種識別）
実施例１において、Ｆ３ＨＦｗおよびＦ３ＨＲｖをプライマーとして用いて、Ｅａｒ  Ｉを制限酵素として用いた他は、実施例１と同様にして行った。
結果を図２２に示す。図２２中、Ａの矢印はマーカーＡを示す。
また、Ｆ３Ｈ−ＥａｒＩによる多型の出現パターンを表２２に示す。
【０１６４】
【表２２】
2005102535.tif 000023
【０１６５】
図２２から明らかなように、Ｆ３Ｈ−ＥａｒＩによる多型の出現パターンは、マーカーＡの出現の有無により、２種類に分類される。即ち、表２２に示すように、マーカーＡ保有グループ（表２２のＡ）およびマーカーを保有しないグループ（表２２のＸ）に分類できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明におけるプライマー改良により、従来法では明確には検出できなかったイチゴ品種識別用マーカーの多型ＤＮＡ断片を明確に検出することが可能となることに加え、１つのマーカーで得られる多型パターンが増加する。
また、本発明における新たなマーカーを従来法のものと併用することにより、市場流通しているほぼ全ての品種を識別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】実施例１の結果を示す写真図である。
【図２】実施例２の結果を示す写真図である。
【図３】実施例３の結果を示す写真図である。
【図４】実施例４の結果を示す写真図である。
【図５】実施例５の結果を示す写真図である。
【図６】実施例６の結果を示す写真図である。
【図７】実施例７の結果を示す写真図である。
【図８】実施例８の結果を示す写真図である。
【図９】実施例９の結果を示す写真図である。
【図１０】実施例１０の結果を示す写真図である。
【図１１】実施例１１の結果を示す写真図である。
【図１２】実施例１２の結果を示す写真図である。
【図１３】実施例１３の結果を示す写真図である。
【図１４】実施例１４の結果を示す写真図である。
【図１５】実施例１５の結果を示す写真図である。
【図１６】実施例１６の結果を示す写真図である。
【図１７】実施例１７の結果を示す写真図である。
【図１８】実施例１８の結果を示す写真図である。
【図１９】実施例１９の結果を示す写真図である。
【図２０】実施例２０の結果を示す写真図である。
【図２１】実施例２１の結果を示す写真図である。
【図２２】実施例２２の結果を示す写真図である。
【符号の説明】
【０１６８】
図１〜２４中、レーン１〜２４は、それぞれ、とよのか、女峰、とちおとめ、章姫、さちのか、アイベリー、レッドパール、濃姫、サンチーゴ、ピーストロ、アイストロ、紅ほっぺ、けいきわせ、久留米ＩＨ−１号、久留米ＩＨ−２号、久留米９３２３号、久留米９３２３号、Cesena、栃の峰、とちひめ、さがほのか、系統Ａ−１７、福岡Ｓ６号、宝交早生の各品種の結果をそれぞれ示す。
また、図１〜２４中、右側のＡ、ＢおよびＸは、それぞれマーカーＡ、マーカーＢおよび共通バンドＸの位置を示す。
更に、図１〜３中、（ａ）は従来法による結果を、（ｂ）は本発明の識別方法による結果を示す。
【図１】
2005102535.tif 000024
【図２】
2005102535.tif 000025
【図３】
2005102535.tif 000026
【図４】
2005102535.tif 000027
【図５】
2005102535.tif 000028
【図６】
2005102535.tif 000029
【図７】
2005102535.tif 000030
【図８】
2005102535.tif 000031
【図９】
2005102535.tif 000032
【図１０】
2005102535.tif 000033
【図１１】
2005102535.tif 000034
【図１２】
2005102535.tif 000035
【図１３】
2005102535.tif 000036
【図１４】
2005102535.tif 000037
【図１５】
2005102535.tif 000038
【図１６】
2005102535.tif 000039
【図１７】
2005102535.tif 000040
【図１８】
2005102535.tif 000041
【図１９】
2005102535.tif 000042
【図２０】
2005102535.tif 000043
【図２１】
2005102535.tif 000044
【図２２】
2005102535.tif 000045
【配列表】
2005102535000001.app