(57)【要約】【課題】  本発明は、高血圧性腎障害の検査方法の提供を課題とする。【解決手段】  高血圧性腎障害の危険因子として有用な遺伝子多型が明らかにされた。これらの多型のジェノタイプを同定し、被検者が特定のジェノタイプである場合に、被検者が高血圧性腎障害の危険因子を有すると予測される。危険因子を有すると判定された被検者の、高血圧性腎障害を防止することにより、腎障害をより効果的に予防、あるいは進展を遅らせることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、高血圧性腎障害素因の検査方法であって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である方法。
(a)  被検者が有する、指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)  (a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の高血圧性腎障害素因を予測する工程
【請求項２】
多型が１塩基多型である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
指標遺伝子がエンドセリン変換酵素１遺伝子であり、その多型が、エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の塩基および／または６５４５１位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の塩基の多型が、CとAであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
腎障害が高血圧性早期腎障害である請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプにＴアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される請求項３に記載の検査方法。
【請求項７】
指標遺伝子がミネラルコルチコイド受容体遺伝子であり、その多型が、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項８】
ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基の多型が、CとGであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項８に記載の検査方法。
【請求項１０】
指標遺伝子がウロテンシンII遺伝子であり、その多型が、ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１１】
ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の塩基の多型が、GとAであり、そのジェノタイプがＧＧの場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１０に記載の検査方法。
【請求項１２】
指標遺伝子がスーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子であり、その多型が、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の塩基および／または−６７９７位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１３】
スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の塩基の多型が、AとCであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１２に記載の検査方法。
【請求項１４】
スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１２に記載の検査方法。
【請求項１５】
指標遺伝子がサイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子であり、その多型が、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１６】
サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１５に記載の検査方法。
【請求項１７】
指標遺伝子がグアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子であり、その多型が、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項１８】
グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基の多型が、GとCであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１７に記載の検査方法。
【請求項１９】
指標遺伝子が肝細胞成長因子遺伝子であり、その多型が、肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項２０】
肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の塩基の多型が、AとTであり、そのジェノタイプがＡＡである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項１９に記載の検査方法。
【請求項２１】
指標遺伝子がβ３アドレナリン受容体遺伝子であり、その多型が、β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項２２】
β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプがＴＴである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項２１に記載の検査方法。
【請求項２３】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項２２に記載の検査方法。
【請求項２４】
指標遺伝子がアルドステロン合成酵素遺伝子であり、その多型が、アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項２５】
アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項２４に記載の検査方法。
【請求項２６】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項２５に記載の検査方法。
【請求項２７】
指標遺伝子が内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子であり、その多型が、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項２８】
内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプがＴＴである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項２７に記載の検査方法。
【請求項２９】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項２８に記載の検査方法。
【請求項３０】
指標遺伝子がKlotho遺伝子であり、その多型が、Klotho遺伝子の４４６０５位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項３１】
Klotho遺伝子の４４６０５位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される請求項３０に記載の検査方法。
【請求項３２】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項３１に記載の検査方法。
【請求項３３】
指標遺伝子がNa-Ca交換体遺伝子であり、その多型が、Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項３４】
Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の塩基の多型が、CとAであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される請求項３３に記載の検査方法。
【請求項３５】
腎障害が高血圧性腎血流障害である請求項３４に記載の検査方法。
【請求項３６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）  被検者の生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）  以下に記載の指標遺伝子における各多型部位の少なくとも１つのジェノタイプを決定する工程
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の多型C/A
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の多型T/C
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の多型C/G
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の多型G/A
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の多型A/C
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の多型C/T
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の多型C/T
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の多型G/C
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の多型A/T
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の多型T/C
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の多型C/T
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の多型T/C
13)Klotho遺伝子の４４６０５位の多型C/T、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の多型C/A
（ｃ）  各指標遺伝子のジェノタイプが以下に記載のいずれかの場合に高血圧性腎障害素因を有すると予測する工程
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位のジェノタイプにＴアレルを有する場合
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位のジェノタイプがＧＧの場合
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位のジェノタイプがＣＣである場合
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位のジェノタイプがＣＣである場合
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位のジェノタイプがＣＣである場合
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基のジェノタイプにＣアレルを有する場合
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位のジェノタイプがＡＡである場合
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位のジェノタイプがＴＴである場合
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位のジェノタイプがＣＣである場合
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位のジェノタイプがＴＴである場合
13)Klotho遺伝子の４４６０５位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位のジェノタイプがＣＣである場合
【請求項３７】
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位のジェノタイプにＣアレルを有する場合に高血圧性早期腎障害素因が予測される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
各指標遺伝子のジェノタイプが以下に記載のいずれかの場合に高血圧性腎血流障害素因を有すると予測される請求項３６に記載の方法。
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位のジェノタイプがＴＴである場合
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位のジェノタイプがＣＣである場合
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位のジェノタイプがＴＴである場合
13)Klotho遺伝子の４４６０５位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位のジェノタイプがＣＣである場合
【請求項３９】
指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、高血圧性腎障害素因検査用のプライマーであって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子であるプライマー。
【請求項４０】
多型部位が、以下の1)-14)のいずれかに記載の部位である請求項３９に記載のプライマー。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位
13)Klotho遺伝子の４４６０５位、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位
【請求項４１】
指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、高血圧性腎障害素因検査用のプローブであって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子であるプローブ。
【請求項４２】
多型部位が、以下の1)-14)のいずれかに記載の部位である請求項４１に記載のプローブ。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位
13)Klotho遺伝子の４４６０５位、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧性腎障害の検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、継続的に血管にダメージを与え、その結果としてさまざまな合併症の危険因子となる。高血圧症の代表的な合併症は、脳血管障害、心臓血管障害、そして腎障害である。脳や心臓における合併症には、高血圧症によって進行する動脈硬化が密接に関連している。一方高血圧による腎障害は、腎糸球体の障害や、メサンギウム細胞の増殖によって進行する。高血圧性腎障害は、最も重要で頻度の高い高血圧合併症の一つである。
【０００３】
腎機能と高血圧とは密接に関連している。一般に、なんらかの原因によって腎機能が低下すると、腎による血液のろ過機能を維持するために血圧が上昇する。他方、高血圧の持続は腎機能障害の原因となる。したがって、腎機能と高血圧とは、互いに悪化を促進する関係にあると言うことができる。
【０００４】
高血圧による腎の障害機構は、たとえば次のように考えられている。腎が血液ろ過機能を維持するためには、腎糸球体におけるろ過のための圧力が必要である。腎は、全身血圧の変動に対して糸球体内部の血圧（糸球体内圧）を一定に保つための血圧調節機構を有している。すなわち、糸球体に血液を運び込む血管（輸入細動脈）と運び出す血管（輸出細動脈）の収縮と弛緩によって、糸球体内部の血圧を調節している。輸入細動脈の弛緩と輸出細動脈の収縮は、糸球体内部の圧力を上昇させる。逆に、輸入細動脈の収縮と輸出細動脈の弛緩は、糸球体内部の圧力を低下させる。
【０００５】
輸入細動脈の収縮は、筋原性の収縮反応と尿細管糸球体フィードバックによって調節されている。すなわち輸入細動脈は全身血圧の上昇に反応して収縮し、糸球体内部の血圧の上昇を防ぐ。また尿細管糸球体は、糸球体内部の圧力の上昇に対して、輸入細動脈の収縮刺激を発し、糸球体内の血圧を一定に保とうとする。
一方輸出細動脈は、いろいろな血管作動性物質によって収縮が調節されている。血管作動性物質の刺激に応答して輸入細動脈が収縮すれば、糸球体内圧は上昇する。血管作動性物質としては、アンジオテンシンIIが知られている。
【０００６】
高血圧によって全身血圧の高い状態が持続すると、糸球体内部の血圧調節機構の反応性が低下する。その結果、輸入細動脈における血管抵抗が小さくなって、糸球体内圧が上昇する。糸球体内圧が上昇した状態を糸球体高血圧と言う。糸球体高血圧は、糸球体組織を障害する。また糸球体高血圧そのものが、腎組織のレニン・アンジオテンシン系を刺激するため、アンジオテンシンIIのような血管作動性物質の産生を誘導する。アンジオテンシンIIは上記のように輸入細動脈を収縮させるため、更に糸球体内圧が上昇することになる。こうして糸球体に対する障害が継続し、やがて高血圧性腎症にいたる。高血圧性腎症が進行するとやがて腎不全となる。
【０００７】
したがって、高血圧による腎障害の危険をできるだけ早く検知し、血圧のコントロールなどによって腎障害の進行を遅らせる必要がある。アンジオテンシン変換酵素阻害剤、あるいはアンジオテンシンII受容体拮抗剤などの降圧剤は、その降圧作用のみならず、腎組織に対する保護作用をも有することが知られている。したがって、高血圧による腎障害の可能性を早期に診断し、これらの薬剤を投与すれば、腎機能障害の進行を遅らせられる可能性がある。
【０００８】
腎障害は、尿中アルブミン排泄を指標として検出することができる。しかし尿中へのアルブミンの漏出は、腎機能の障害の結果である。つまり尿中にアルブミンが検出されたときには、既に腎機能は障害されている。またアルブミンの漏出は、尿細管の障害の原因でもある。したがって、より早期に腎機能障害のリスクを知ることができれば有用である。
【０００９】
上記のような精緻なメカニズムによって、糸球体内圧が維持されていることからも明らかなように、腎臓の血液の流れ（腎血流）は腎機能の重要な診断指標である。腎血流ドプラー検査を利用すれば、腎血流障害を検知することができる。しかし尿中アルブミンと同様に、このような検査は、障害が起きたことを知るための検査である。そのため、血流障害を早期に検知することはできない。
【００１０】
腎障害は、すべてのコントロール不良な高血圧患者に合併するわけではない。そのため、腎障害の進展が遺伝的素因に規定されている可能性が考えられる。実際に次のような遺伝子多型と高血圧性腎障害との関連性についての報告がある。
アンジオテンシン変換酵素(ACE) のI/D多型
Kidney Int.,58/2:513-519, 2000
Pediatr Nephrol, Apr;16/4, 356-361, 2001
5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T多型
Nephron Sep.;92/1, 235-239, 2002
Nephrol Dial Transplant, Aug.;18/8, 1535-1540, 2003
このような高血圧性腎障害の遺伝的素因の指標に関する情報が蓄積されれば、高血圧性腎障害のリスクを遺伝子多型に基づいて高い確率で予測することができる。遺伝子多型はその検出が容易であり、しかも症状が現れる前に診断することができる。したがって、高血圧性腎障害のように、早期の診断が必要な疾患の検査方法としては理想的である。
【非特許文献１】Kidney Int.,58/2:513-519, 2000
【非特許文献２】Pediatr Nephrol, Apr;16/4, 356-361, 2001
【非特許文献３】Nephron Sep.;92/1, 235-239, 2002
【非特許文献４】Nephrol Dial Transplant, Aug.;18/8, 1535-1540, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、高血圧性腎障害の検査方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
高血圧性腎障害と関連する遺伝的素因を明らかにするために、本発明者らは、４７遺伝子、１３０多型と高血圧性腎障害の関連を解析した。更に、血清クレアチニン値が正常な群においては尿中アルブミン排泄に関与する遺伝子多型の同定を試みた。尿中アルブミンは、最も早期の腎障害を反映するとされる診断指標である。遺伝子としては次のような群に属する４７遺伝子を解析の対象とした。
レニン・アンジオテンシン系
カリクレイン・キニン系
交感神経系
水・電解質調節系
血管作動物質・成長因子
老化・酸化ストレス関連遺伝子
細胞内情報伝達系
糖代謝関連
その結果、高血圧性腎障害、血清クレアチニン値が正常な群における尿中アルブミン排泄、あるいは腎血流障害と関連する遺伝子多型が見出された。こうして見出されたこれらの多型を指標として、高血圧性腎障害の遺伝的素因の検査が可能であることを明らかにし本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の検査方法、ならびにそのための試薬に関する。
【００１３】
〔１〕次の工程を含む、高血圧性腎障害素因の検査方法であって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子である方法。
(a)  被検者が有する、指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)  (a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の高血圧性腎障害素因を予測する工程
〔２〕多型が１塩基多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕指標遺伝子がエンドセリン変換酵素１遺伝子であり、その多型が、エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の塩基および／または６５４５１位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔４〕エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の塩基の多型が、CとAであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕腎障害が高血圧性早期腎障害である〔４〕に記載の検査方法。
〔６〕エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプにＴアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される〔３〕に記載の検査方法。
〔７〕指標遺伝子がミネラルコルチコイド受容体遺伝子であり、その多型が、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔８〕ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基の多型が、CとGであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される〔７〕に記載の検査方法。
〔９〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔８〕に記載の検査方法。
〔１０〕指標遺伝子がウロテンシンII遺伝子であり、その多型が、ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔１１〕ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の塩基の多型が、GとAであり、そのジェノタイプがＧＧの場合に腎障害素因を有すると予測される〔１０〕に記載の検査方法。
〔１２〕指標遺伝子がスーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子であり、その多型が、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の塩基および／または−６７９７位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔１３〕スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の塩基の多型が、AとCであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される〔１２〕に記載の検査方法。
〔１４〕スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される〔１２〕に記載の検査方法。
〔１５〕指標遺伝子がサイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子であり、その多型が、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔１６〕サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される〔１５〕に記載の検査方法。
〔１７〕指標遺伝子がグアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子であり、その多型が、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔１８〕グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基の多型が、GとCであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される〔１７〕に記載の検査方法。
〔１９〕指標遺伝子が肝細胞成長因子遺伝子であり、その多型が、肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔２０〕肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の塩基の多型が、AとTであり、そのジェノタイプがＡＡである場合に腎障害素因を有すると予測される〔１９〕に記載の検査方法。
〔２１〕指標遺伝子がβ３アドレナリン受容体遺伝子であり、その多型が、β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔２２〕β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプがＴＴである場合に腎障害素因を有すると予測される〔２１〕に記載の検査方法。
〔２３〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔２２〕に記載の検査方法。
〔２４〕指標遺伝子がアルドステロン合成酵素遺伝子であり、その多型が、アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔２５〕アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される〔２４〕に記載の検査方法。
〔２６〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔２５〕に記載の検査方法。
〔２７〕指標遺伝子が内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子であり、その多型が、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔２８〕内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の塩基の多型が、TとCであり、そのジェノタイプがＴＴである場合に腎障害素因を有すると予測される〔２７〕に記載の検査方法。
〔２９〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔２８〕に記載の検査方法。
〔３０〕指標遺伝子がKlotho遺伝子であり、その多型が、Klotho遺伝子の４４６０５位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔３１〕Klotho遺伝子の４４６０５位の塩基の多型が、CとTであり、そのジェノタイプにＣアレルを有する場合に腎障害素因を有すると予測される〔３０〕に記載の検査方法。
〔３２〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔３１〕に記載の検査方法。
〔３３〕指標遺伝子がNa-Ca交換体遺伝子であり、その多型が、Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔３４〕Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の塩基の多型が、CとAであり、そのジェノタイプがＣＣである場合に腎障害素因を有すると予測される〔３３〕に記載の検査方法。
〔３５〕腎障害が高血圧性腎血流障害である〔３４〕に記載の検査方法。
〔３６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの工程を含む、〔１〕に記載の検査方法。
（ａ）  被検者の生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）  以下に記載の指標遺伝子における各多型部位の少なくとも１つのジェノタイプを決定する工程
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位の多型C/A
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の多型T/C
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の多型C/G
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の多型G/A
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の多型A/C
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の多型C/T
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の多型C/T
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の多型G/C
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の多型A/T
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の多型T/C
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の多型C/T
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の多型T/C
13)Klotho遺伝子の４４６０５位の多型C/T、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の多型C/A
（ｃ）  各指標遺伝子のジェノタイプが以下に記載のいずれかの場合に高血圧性腎障害素因を有すると予測する工程
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位のジェノタイプにＴアレルを有する場合
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位のジェノタイプがＧＧの場合
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位のジェノタイプがＣＣである場合
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位のジェノタイプがＣＣである場合
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位のジェノタイプがＣＣである場合
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の塩基のジェノタイプにＣアレルを有する場合
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位のジェノタイプがＡＡである場合
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位のジェノタイプがＴＴである場合
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位のジェノタイプがＣＣである場合
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位のジェノタイプがＴＴである場合
13)Klotho遺伝子の４４６０５位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位のジェノタイプがＣＣである場合
〔３７〕1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位のジェノタイプにＣアレルを有する場合に高血圧性早期腎障害素因が予測される〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕各指標遺伝子のジェノタイプが以下に記載のいずれかの場合に高血圧性腎血流障害素因を有すると予測される〔３６〕に記載の方法。
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の塩基
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位のジェノタイプがＴＴである場合
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位のジェノタイプがＣＣである場合
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位のジェノタイプがＴＴである場合
13)Klotho遺伝子の４４６０５位のジェノタイプにＣアレルを有する場合
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位のジェノタイプがＣＣである場合
〔３９〕指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、高血圧性腎障害素因検査用のプライマーであって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子であるプライマー。
〔４０〕多型部位が、以下の1)-14)のいずれかに記載の部位である〔３９〕に記載のプライマー。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位
13)Klotho遺伝子の４４６０５位、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位
〔４１〕指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、高血圧性腎障害素因検査用のプローブであって、指標遺伝子が、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子であるプローブ。
〔４２〕  多型部位が、以下の1)-14)のいずれかに記載の部位である〔４１〕に記載のプローブ。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子のプロモーター領域の−３３８位
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位
13)Klotho遺伝子の４４６０５位、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位
【００１４】
解析の対象とした遺伝子のうち、β３アドレナリン受容体の多型Trp64Arg(T727C;本明細書におけるT190Cに相当)は、以下のような疾患との関連が報告されている。
肥満(Clement K et al. N Engl J Med 1995:333:352-354)
インスリン抵抗性(Urhammer SA et al. J Clin Endocrinol Metab 2000:85:3151-3154)
2型糖尿病(Walston J et al. N Engl J Med 1995:333:382-383)
高中性脂肪血症(Kim-Motoyama H et al. Diabetologia 1997:40:469-472.)
またアルドステロン合成酵素の多型(C-344T)については、以下の疾患との関連性が報告されている。
低レニン高アルドステロン血症を示す高血圧(Lim PO et al. J Clin Endocrinol Metab 2002:87:4398-4402)
Corticosterone methyl oxidase type I ならびにtype IIの不活性化(Mitsuuchi Y et al. Biochem Biophys Res Commun 1993:190:864-869, Biochem Biophys Res Commun 1992:182:972-979)
あるいは内皮性一酸化窒素合成酵素の多型(T-786C;本明細書のT-813Cに相当)と異型狭心症の関連性も明らかにされている(Nakayama M et al. Circulation 1999:99:2855-2857)。しかし腎障害との関連についての報告は無い。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明者らは、本態性高血圧患者において、腎機能障害と関連性がある多型が存在することを明らかにした。そして、これらの多型に基づいて、本態性高血圧患者が腎機能障害素因を有することを判定することができる。
【００１６】
従来、腎機能障害素因を予測する手法は知られていなかった。そのため、実際に腎機能の異常が見られるまで、機能障害を検査することはできなかった。本発明によれば、遺伝子の多型に基づいて、腎機能障害素因を予測することが可能となった。高血圧患者の腎機能障害の合併は、更なる血圧の上昇要因となる。そして血圧の上昇が腎機能を障害する。つまり互いに症状を悪化させる関係にある。したがって、腎機能障害素因を早期に知り、腎機能障害を予防できることの意義は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、高血圧性腎障害素因の検査方法を提供する。本発明の検査方法には、少なくとも、次の(a)、および(b)の工程が含まれる。すなわち、
(a)被検者が有する、指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)(a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の高血圧性腎障害素因を予測する工程である。
本発明における指標遺伝子は、エンドセリン変換酵素１遺伝子、ミネラルコルチコイド受容体遺伝子、ウロテンシンII遺伝子、スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子、サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子、グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子、肝細胞成長因子、β３アドレナリン受容体遺伝子、アルドステロン合成酵素遺伝子、内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子、Klotho遺伝子、およびNa-Ca交換体遺伝子からなる群から選択される。指標遺伝子は、単独であっても良いし、複数の指標遺伝子を組み合わせて利用することもできる。複数の指標遺伝子を組み合わせることによって、高血圧性腎障害素因の予測精度を高めることができる。たとえば、高血圧性腎障害素因と関連するジェノタイプをより多く有している被検者は、少ない場合と比較して高血圧性腎障害素因を有する確率が高いと考えることができる。
【００１８】
特に表現型との関連性が統計学的に強い多型は、本発明の検査方法において重要性が高い。このような多型が、高血圧性腎障害素因と関連するジェノタイプである場合には、よりリスクが高いと判断することができる。統計学的な関連性の強さは、P値によって評価される。すなわち、実施例に示したP値が小さいものは、高血圧性腎障害との関連性がより強いと言うことができる。
【００１９】
本発明において、「高血圧性腎障害素因」とは、高血圧性腎障害が進展する可能性のある素因を意味する。本発明における高血圧性腎障害は、腎の血液濾過機能が障害されている状態を言う。腎機能を診断するためのさまざまな指標が公知である。たとえば、尿や血液中の、腎機能を反映するマーカーを測定して腎機能を診断することができる。あるいは、腎血流量も腎機能のマーカーとして有用である。本発明においては、これらの腎機能マーカーのいずれかの異常を伴う状態を、腎機能障害を有すると言う。たとえば、血中のクレアチニン値、尿中のアルブミン、あるいは超音波ドプラーによって測定した腎血流量のいずれかの指標が異常である状態は、腎機能が障害された状態に含まれる。
【００２０】
腎の血液濾過機能は、複雑なメカニズムによって維持されている。腎機能障害は、そのメカニズムのどこかが障害された状態と考えることができる。障害されたメカニズムによって、異常を示す診断指標は異なる。しかし、一般に腎機能を維持するメカニズムは、部分的な障害が他の機能障害の原因にもなる。たとえば糸球体高血圧と腎機能障害の間には、互いに一方が他方の増悪因子という関係にある。つまり、あるメカニズムの機能低下は、他のメカニズムの障害の原因となりうる。したがって、なんらかの腎機能マーカーの異常を予測することは、けっきょく腎機能障害傾向を有している群（ハイリスク群）に属していることを明らかにすることに他ならない。
【００２１】
本発明における指標遺伝子は、本願発明者らによってその遺伝子上に高血圧性腎障害との関連性のある多型が見出された。本発明において、「遺伝子」とはアミノ酸配列をコードする構造遺伝子に加え、構造遺伝子の転写に必要な発現制御領域を含む。したがって、「遺伝子」は、構造遺伝子に限定されずプロモータやオペレータなどの制御機能をもつ領域を含む。更に構造遺伝子とは、エキソンとイントロンによって構成される。実際に、本願発明者らが腎障害との関連性を見出した多型は、プロモーター、イントロン、あるいはエキソンにおける多型である。
【００２２】
多型とは、遺伝学的には、人口中1％以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、1％未満の塩基の変化であっても本発明の「多型」に含まれる。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型(SNPs)から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２３】
上述の通り、本願発明者らにより、指標遺伝子上に高血圧性腎障害と関連性を有する多型の存在が見出された。当業者は、本願発明の知見に基づいて、各指標遺伝子上の高血圧性腎障害の素因と関連する多型を明らかにすることができる。たとえば、本態性高血圧患者において、腎機能マーカーの異常を有する患者における多型の頻度を解析し、有意性を有する多型を、高血圧性腎障害素因の指標として選択することができる。
【００２４】
本発明において高血圧性腎障害素因と関連する指標遺伝子上の多型は望ましくは１塩基多型(SNPs)である。SNPsは、ヒトゲノム上に、１０００塩基に１つの割合で存在すると考えられている。したがって、たとえば２０kbからなる指標遺伝子座には、理論的には約２０のSNPsが存在していると考えられる。これらのSNPsから、連鎖解析によって高血圧性腎障害素因との関連性を有するSNPsを見出すことができる。
【００２５】
本発明における各指標遺伝子の好ましい多型を以下に示す。本発明者らの解析によれば、これらの指標遺伝子の多型において、それぞれ以下のようなジェノタイプを有する高血圧患者は、腎機能マーカーの異常を有する割合が有意に高かった。したがって、以下のようなジェノタイプを有する患者は、高血圧性腎障害素因を有する。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子の−３３８位の多型C/A
［Cアレルを有する患者]
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の多型T/C
［Tアレルを有する患者］
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の多型C/G
［Cアレルを有する患者］
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の多型G/A
［Gアレルをホモで有する患者］
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の多型A/C
［Cアレルをホモで有する患者］
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の多型C/T
［Cアレルをホモで有する患者］
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の多型C/T
［Cアレルをホモで有する患者］
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の多型G/C
［Cアレルを有する患者］
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の多型A/T
［Aアレルをホモで有する患者］
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の多型T/C
［Tアレルをホモで有する患者］
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の多型C/T
［Cアレルをホモで有する患者］
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の多型T/C
［Tアレルをホモで有する患者］
13)Klotho遺伝子の４４６０５位の多型C/T
［Cアレルを有する患者］、および
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の多型C/A
［Cアレルをホモで有する患者］
【００２６】
上記の多型のうち、以下の多型は血中クレアチニン値の異常を伴う高血圧性腎障害のリスク予測に有用である。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子の−３３８位の多型C/A
2)エンドセリン変換酵素１遺伝子の６５４５１位の多型T/C
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の多型C/G
4)ウロテンシンII遺伝子の３７５５位の多型G/A
5)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−７５３９位の多型A/C
6)スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子の−６７９７位の多型C/T
7)サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子の１７８４位の多型C/T
8)グアノシンサイクラーゼ−Ａ遺伝子の２１７３位の多型G/C
9)肝細胞成長因子遺伝子の４３８３９位の多型A/T
【００２７】
またこれらの多型の中で、特に以下の多型は、尿中アルブミン排泄の異常を伴う高血圧性腎障害のリスク予測に有用である。
1)エンドセリン変換酵素１遺伝子の−３３８位の多型C/A
【００２８】
更に上記多型の中で、特に以下の多型は、腎血流量の異常を伴う高血圧性腎障害のリスク予測に有用である。
3)ミネラルコルチコイド受容体遺伝子の−２位の多型C/G
10)β３アドレナリン受容体遺伝子の１９０位の多型T/C
11)アルドステロン合成酵素遺伝子の−３４４位の多型C/T
12)内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子の−８１３位位の多型T/C
13)Klotho遺伝子の４４６０５位の多型C/T
14)Na-Ca交換体遺伝子の−２３４４９位の多型C/A
【００２９】
以下に既知のゲノム塩基配列と、各遺伝子、遺伝子を構成するエキソンとイントロン、並びに本発明に関する多型部位の関係をまとめた。添付の配列表中には、既知のエキソンの位置情報を記載した。これらの遺伝子の中は、複数のスプライシングバリアントが同定されているものもある。異なるスプライシングバリアントは、異なるエキソンで構成されていたり、あるいは特定のエキソンがスキップされる場合がある。
【００３０】
ミネラルコルチコイド受容体遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：１に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_016606)ている。配列番号：１に示した塩基配列は、NT_016606の塩基配列上の塩基番号10517478から10886478に位置している。配列番号：１において翻訳開始点は８８０２に相当する。したがって、多型部位として示した−２は、配列番号：１の塩基配列においては８８００位に位置する。
【００３１】
サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：２に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_010463)ている。配列番号：２に示した塩基配列は、NT_010463の塩基配列上の塩基番号146057から195368に位置している。配列番号：２において翻訳開始点は３００１に相当する。したがって、多型部位として示した１７８４は、配列番号：２の塩基配列においては４７８４位に位置する。
【００３２】
スーパーオキサイドディスムターゼ３遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：３に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_006316)ている。配列番号：３に示した塩基配列は、NT_006316の塩基配列上の塩基番号15467010から15479010に位置している。配列番号：３において翻訳開始点は９４９３に相当する。したがって、多型部位として示した−７５３９および−６７９７はそれぞれ、配列番号：３の塩基配列においては１９５４位および２６９６位に位置する。
【００３３】
肝細胞成長因子遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：４に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_007933)ている。配列番号：４に示した塩基配列は、NT_007933の塩基配列上の塩基番号6560989から6637989に位置している。配列番号：４において翻訳開始点は４４６５に相当する。したがって、多型部位として示した４３８３９は、配列番号：４の塩基配列においては４８３０３位に位置する。
【００３４】
グアノシンサイクラーゼＡ遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：５に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_004668)ている。配列番号：５に示した塩基配列は、NT_004668の塩基配列上の塩基番号98527から117527に位置している。配列番号：５において翻訳開始点は２８９１に相当する。したがって、多型部位として示した２１７３は、配列番号：５の塩基配列においては５０６３位に位置する。
【００３５】
ウロテンシンII遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：６に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_028054)ている。配列番号：６に示した塩基配列は、NT_028054の塩基配列上の塩基番号2029327から2043827に位置している。配列番号：６において翻訳開始点は３２７８に相当する。したがって、多型部位として示した３７５５は、配列番号：６の塩基配列においては７０３２位に位置する。
【００３６】
エンドセリン変換酵素１遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：７に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_004610)ている。配列番号：７に示した塩基配列は、NT_004610の塩基配列上の塩基番号2347270から2421270に位置している。配列番号：７において翻訳開始点は１１１４に相当する。したがって、多型部位として示した‐３８８および６５４５１はそれぞれ、配列番号：７の塩基配列においては７７６位および６６５６４位に位置する。
【００３７】
β３アドレナリン受容体遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：８に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_030059)ている。配列番号：８に示した塩基配列は、NT_030059の塩基配列上の塩基番号34240332から34244332に位置している。配列番号：８において翻訳開始点は１１９８に相当する。したがって、多型部位として示した１９０は、配列番号：８の塩基配列においては１３８７位に位置する。
【００３８】
アルドステロン合成酵素遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：９に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_008127)ている。配列番号：９に示した塩基配列は、NT_008127の塩基配列上の塩基番号278077から287077に位置している。配列番号：９において翻訳開始点は１２７９に相当する。したがって、多型部位として示した‐３４４は、配列番号：９の塩基配列においては９３５位に位置する。
【００３９】
内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：１０に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_007914)ている。配列番号：１０に示した塩基配列は、NT_007914の塩基配列上の塩基番号11230886から11255886に位置している。配列番号：１０において翻訳開始点は２７７８に相当する。したがって、多型部位として示した‐８１３および５２１９はそれぞれ、配列番号：１０の塩基配列においては１９６５位および７９９７位に位置する。
【００４０】
Klotho遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：１１に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_024524)ている。配列番号：１１に示した塩基配列は、NT_024524の塩基配列上の塩基番号2159855から2217855に位置している。配列番号：１１において翻訳開始点は５２１６に相当する。したがって、多型部位として示した４４４０５は、配列番号：１１の塩基配列においては４９６２０位に位置する。
【００４１】
Na-Ca交換体遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：１２に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_022184)ている。配列番号：１２に示した塩基配列は、NT_022184の塩基配列上の塩基番号19157223から19558223に位置している。配列番号：１２において翻訳開始点は８４８７１に相当する。したがって、多型部位として示した‐２３４４９は、配列番号：１２の塩基配列においては６１４２２位に位置する。
【００４２】
被検者によっては、各配列番号に記載した塩基配列における多型の位置が他の部位における塩基の欠損や挿入によってずれる可能性がある。転写開始点からの塩基数がずれていても、当業者は各配列番号に示した多型の前後の塩基配列との整列によって、タイピングすべき塩基の位置を特定することができる。このようにして照合することができる塩基の位置を、相同な位置と言う。各多型に相同な位置の塩基のジェノタイピングによって、本発明の方法を実施することもできる。
【００４３】
被検者の「ジェノタイプの決定」は、まず一例を挙げれば、被検者の指標遺伝子座の塩基配列を明らかにすることにより実施することができる。ジェノタイピングを行うためには、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の生体試料から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。生体試料としては、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便、および毛髪等を利用することができる。ここで調製されたDNA試料を用いて指標遺伝子における高血圧性腎障害素因と関連する多型を有する部位の塩基配列を決定する。
【００４４】
より具体的には、本発明者らが見出した高血圧性腎障害素因と関連する多型のジェノタイピングは、当該領域の塩基配列を決定し、いずれの塩基であるかを確認する。各多型において上記のようなアレルを有するとき、被検者は高血圧性腎障害素因を有すると判定される。
【００４５】
更に、ハプロタイプブロックのようにこれら多型と連鎖不平衡の関係を有するタグとなる多型に基づいて、間接的にこれらジェノタイプを決定することができる。ハプロタイプブロックは、連鎖不平衡の関係にある一群の多型を示す用語である。ハプロタイプを構成する多型は、高い確率で連鎖して遺伝する。したがって、本発明者らが見出した高血圧性腎障害素因と関連している多型とともにハプロタイプブロックを構成する他の多型を指標として、各多型のジェノタイプを決定することもできる。ゲノム解析の結果に基づいて、ハプロタイプ地図の整備が進んでいる。この解析の成果に基づいて、本発明者らが示した多型を含むハプロタイプブロックを同定し、当該ブロック内の他の多型に基づいて、本発明におけるジェノタイピングを実施することもできる。
【００４６】
このように指標遺伝子における高血圧性腎障害と関連する多型のジェノタイプが決定されると、次に、高血圧性腎障害素因に関連する多型として同定されたジェノタイプと比較され、これらの素因が予測される。ここで、高血圧性腎障害素因を有すると予測された被検者は、高血圧性腎障害のハイリスク群として管理することにより、腎障害の進行を防止または遅延させることが可能となる。
【００４７】
上記ジェノタイプを決定する手法として、直接、高血圧性腎障害素因に関連する多型部位の塩基配列を決定する方法を例示した。塩基配列を決定する以外にも、より迅速にジェノタイプを決定することができるさまざまな方法が公知である。PCR法を応用した解析方法としては、TaqMan PCR法、AcycroPrimer法、蛍光磁気ビーズ法、１分子蛍光分析システムの利用、およびMALDI-TOF/MS法等を利用することができる。またPCRに依存しないジェノタイピングのための方法としては、Invader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明におけるジェノタイピングに応用できる。
【００４８】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００４９】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
【００５０】
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時にジェノタイプを判定することもできる。たとえば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アレルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡまたはアレルＢのホモであることが明らかになる。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRとジェノタイピングを同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、大量の被検者のジェノタイピング方法として有用である。
【００５１】
［Acyclo Prime法］
PCR法を利用したジェノタイピング方法として、Acyclo Prime法も実用化されている。Acyclo Prime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、SNPs検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムのSNPsを含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっているSNPsに隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
【００５２】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、SNPsに相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。
【００５３】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによってジェノタイプを解析することもできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、蛋白質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによるジェノタイピングのためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
【００５４】
MALDI-TOF/MSを利用したジェノタイピングには、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確なジェノタイピングが期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
【００５５】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速でジェノタイピングが可能な方法も報告されている。たとえば、IIs型制限酵素を利用してSNPsのジェノタイピングが行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。したがって、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうどSNPsの部位で増幅産物を切断することができる。
【００５６】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、SNPsに対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物はSNPs部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
【００５７】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。たとえばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、ジェノタイプを決定することができる。
【００５８】
［磁気蛍光ビーズを使った多重化SNPsタイピング］
複数のアレルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアレルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化SNPsタイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
【００５９】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化SNPsタイピングにおいては、各アレルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アレルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アレル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。
【００６０】
アレルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、SNPsに相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的なジェノタイプであった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。
【００６１】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、ジェノタイプが決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類のSNPsを単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
【００６２】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。たとえばInvader法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、ジェノタイピングを実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。   アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
【００６３】
一方、インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
【００６４】
多型部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。
【００６５】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
【００６６】
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
【００６７】
Invader法に基づいてジェノタイプを決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考えかたによって、ジェノタイプを解析することができる。
【００６８】
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。したがって、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、けっきょくジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
【００６９】
［RCA法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
【００７０】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。たとえば環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。したがって、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。
【００７１】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAがSNPsの塩基に応じて生成されれば、RCA法を利用してSNPsをタイピングすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべきSNPsの両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。SNPs部分がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。したがって、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、SNPsのジェノタイピングが可能である。
【００７２】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければジェノタイプを決定することができない。これらの点をジェノタイピング用に改良した方法が公知である。たとえばモレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブでジェノタイピングを行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
【００７３】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブでジェノタイピングが可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
【００７４】
［１分子蛍光分析システム(Single molecule fluorescence spectroscopy)］
1fL(femtoliter)という微小領域の蛍光分析を可能とするシステムが実用化されている。このシステムを用いれば、蛍光標識プライマーの伸長を、並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出することができる。タイピングの対象となるアレルに対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを用意する。各プライマーには、それぞれ識別可能な蛍光標識を結合しておく。このプライマーを使ってPCRを行い、増幅産物を蛍光相関分析法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)によって蛍光測定する。サンプルがプライマーに相補的な塩基配列を有していれば、PCRによってプライマーは伸長する。伸長したプライマーは分子が大きくなるために、蛍光の揺らぎを生じる。この蛍光の揺らぎが並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出される。プライマーに相補的な塩基配列がサンプル中に含まれなければ、PCRの増幅産物が生成しないので、蛍光変化は起きない。
【００７５】
具体的には、２つのアレルＡとＢに対して、それぞれ異なる蛍光標識を有するプライマーを用いて、同じ反応液中でＰＣＲを行う。増幅産物の蛍光測定において、ＡまたはＢのいずれか一方の蛍光シグナルの変化が観察されれば、いずれかのホモ、両方の蛍光シグナルが変化すればヘテロであることが確認できる(PharmaGenomics, July/August 46-48, 2003)。正確で迅速な解析方法として評価されている。
【００７６】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らないジェノタイピングも古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。
【００７７】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
【００７８】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
【００７９】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【００８０】
具体的には、まずPCR法等によってSNPs部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
【００８１】
更にDNAアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一 ）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、たとえば、多数のSNPsを同時に解析するには、DNAアレイは有用である。
【００８２】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
【００８３】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００８４】
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
【００８５】
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべきSNPsを含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数のSNPsを解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
【００８６】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。たとえば、まずSNPsを含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
【００８７】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべきSNPsが存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によってSNPs部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
【００８８】
本発明はまた、上記検査方法のためのプローブまたはプライマーを提供する。上述したジェノタイプの解析方法では、上記多型配列に又はその近傍の配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドをプライマーやプローブとして用いることが多い。したがって、当該多型部位の塩基を明らかにするためのプローブあるいはプライマーは、本発明の検査方法に重要な要素であり、有用である。
【００８９】
プライマーは、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位を含むように相補鎖合成を開始し得るように設計される。プライマーの長さは１５〜１００範囲であり、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は、任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。また、多型部位上にプライマーがハイブリダイズするようにプライマーを設計してもよい。この場合、高血圧性腎障害素因を有すると判定される多型の配列のみハイブリダイズし、他の多型上にはハイブリダイズしない（あるいは、ハイブリダイズし難い）配列に設計してもよい。また、プライマーを構成する塩基配列は、配列番号：１〜配列番号：１２に示した指標遺伝子の配列に基づいて選択することができる。ただし、本発明のプライマーは、鋳型と完全に相補する配列に限定されず、また、相補的な配列に適宜変更を加えてもよい。例えば、配列を変更する場合を例示すれば、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に、任意の塩基配列を付加することである。ここで付加する配列としては、IIs型制限酵素の認識配列などが挙げられる。IIs型制限酵素の認識配列を付加することにより、IIs型制限酵素を利用した多型解析のプライマーとして使用し得る。
【００９０】
また、本発明のプライマーは物理的に修飾したものも含まれる。物理的な修飾の例としては、同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンまたはジゴキシンなどの結合親和性物質による標識などが挙げられる。こうした標識プライマーは各種のジェノタイピング方法において有用となる。
【００９１】
また、本発明のプローブは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るように設計される。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。したがって、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
【００９２】
また、ハプロタイプブロック解析によりジェノタイプを決定するためのプローブは、高血圧性腎障害素因に関連を有する多型配列あるはそれと隣接する配列にはハイブリダイズしなくとも、タグ多型を検出し得るように、タグ多型配列あるいはタグ多型に隣接する配列にハイブリダイズし得るようなプローブも本発明に含まれる。本発明のプローブには、プライマーと同様に、鋳型と完全に相補する配列に限定されず、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。たとえばInvader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、配列番号：１〜配列番号：１２に記載の指標遺伝子座の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。なお、プローブの長さは、上記DNAアレイ法の説明で記載した長さとほぼ同様であり、１５〜１００の範囲内であり、一般には１５〜５０、通常は１５〜３０である。
【００９３】
上記プライマーおよびプローブの合成は、当業者において用いられている任意の方法によって合成することができる。修飾プライマー、修飾プローブの合成においては、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用してオリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することは公知である。また、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。これらオリゴヌクレオチドの修飾は市販のキットなどを用いて行うこともできる。
【実施例】
【００９４】
本態性高血圧患者における遺伝子解析による高血圧性腎障害素因の同定
遺伝子解析に対するインフォームドコンセントの得られた本態性高血圧患者920例（男性509例、女性411例、平均年齢65±10歳）を対象とした。血液検査で血清クレアチニン値(s-Crn)が1.4mg/dl以上を腎障害群(n=99)と定義した。また血清クレアチニン値正常群(s-Crn＜1.4mg/dl)のうちクレアチニン補正した尿中アルブミン排泄(UAE)が30mg/g・Crn以上認められる患者を早期腎障害群とした。更に、超音波ドプラーで腎血流量を測定しRIが０．７以上の患者を腎血流量障害群とした。遺伝子多型は、アレル頻度5%以上を示す一塩基多型(SNPs)に対してTaqMan PCR法にてタイピングを施行した。
【００９５】
まず一部のサンプルで以下の遺伝子の全配列を解析し、同定された一塩基多型（SNP）および挿入／欠失（I/D）多型のうち主要なものを全症例でタイピングした。
ミネラルコルチコイド受容体遺伝子(MLR)
サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子(TSC)
スーパーオキサイドディスムターゼ遺伝子(SOD3)
肝細胞成長因子(HGF)
グアノシンサイクラーゼ遺伝子(NPR1)
ウロテンシンII遺伝子(UTS2)
Klotho遺伝子
Na-Ca交換体遺伝子
【００９６】
更に以下の遺伝子については、既に同定されている一塩基多型（SNP）および挿入／欠失（I/D）多型のうち主要なものを全症例でタイピングした。
エンドセリン変換酵素１(ECE1)
β３アドレナリン受容体遺伝子
アルドステロン合成酵素遺伝子
内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子
【００９７】
これらの遺伝子多型のうち各アレル頻度が20%以上の3つのcommon variantについて血清クレアチニン値レベル、尿中アルブミン排泄(UAE)、および腎血流量との関連を調べた。その結果、表１に示したように、これまでに高血圧性腎障害との関連の報告のない9SNPsがアレル間での比較、ならびにrecessive modelのアレル頻度で高血圧性腎障害と有意な関連性を示した。このうちエンドセリン変換酵素１(ECE1)のPromoter領域のC/A多型(C-338A)が血清クレアチニン値正常群で唯一UAEと有意な関連を示した（表２）。また表３で示した６つの多型が腎血流量障害と有意な関連を示した。
今回同定された高血圧性腎障害と関連性を示す計９遺伝子多型を、高血圧患者に対する遺伝子診断として応用することにより、高血圧性臓器障害の進展を予知または予防できる可能性があると期待される。
【００９８】
上記の腎障害との関連性を有していた多型を解析するためのPCR条件およびシークエンス条件は次のとおりである。
解析のためのPCRおよびシークエンシング：PCRには各対象者から採取したゲノムDNA（２０ng）を試料とし、全量２０μlの反応系で実施した。PCR用プライマーを反応系に最終濃度として各250nM添加した。また、酵素はFastStart Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)、またはHotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN, Hilden, Germany、NPR1、KL、およびNCX1用)を用いた。増幅産物は、DyeEX 96 Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)で精製して、シークエンス反応に用いた。
【００９９】
シークエンス反応はBigDye Terminator Cycle Seqencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて実施した。反応後の配列決定にはシークエンサーABI PRISM 3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を使用した。
シークエンシングに用いたプライマーとPCRの条件を以下に示す。いずれの遺伝子についても、forwardプライマーをシークエンシング用プライマーとして用いた。
【０１００】
ミネラルコルチコイド受容体遺伝子(MLR)
forwardプライマー：tctcgacaagctgtagtcaatactc（配列番号：１３）
reverseプライマー：gagcctcgattttcagcattag（配列番号：１４）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  60℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０１】
サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子(TSC)
forwardプライマー：tgaactcctaagctcaagcaatc（配列番号：１５）
reverseプライマー：acggatttgtgtgtttagtgcag（配列番号：１６）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  59℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０２】
スーパーオキサイドディスムターゼ遺伝子(SOD3)C-7539A
forwardプライマー：ctcttcactgaggaacagcact（配列番号：１７）
reverseプライマー：tttcgtacaggaatgccagttgt（配列番号：１８）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  60℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０３】
スーパーオキサイドディスムターゼ遺伝子(SOD3)C-6797T
forwardプライマー：gtttgaagtaatctggttgggta（配列番号：１９）
reverseプライマー：ggtagagtgaaatctgaaccca（配列番号：２０）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  60℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０４】
肝細胞成長因子(HGF)
forwardプライマー：cagtaatttgggcagagtcag（配列番号：２１）
reverseプライマー：cttagaactgtggctgtcagt（配列番号：２２）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  64℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０５】
グアノシンサイクラーゼ遺伝子(NPR1)
forwardプライマー：atcacttcatgcagggcatagg（配列番号：２３）
reverseプライマー：agaaacatggaacaatgggaagg（配列番号：２４）
PCRの条件  反応前    95℃/15分
変性      95℃/30秒
アニール  59℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０６】
ウロテンシンII遺伝子(UTS2)
forwardプライマー：tctttgacgagctactggactg（配列番号：２５）
reverseプライマー：tcgaacttctgacctcaggtg（配列番号：２６）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  64℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０７】
Klotho遺伝子(KL)
forwardプライマー：caggagctgacaatttatgaa（配列番号：２７）
reverseプライマー：aaagggcaggcaggttctatc（配列番号：２８）
PCRの条件  反応前    95℃/4分
変性      95℃/30秒
アニール  56℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０８】
Na-Ca交換体遺伝子(NCX1)
forwardプライマー：gtctctccccacaggtcattctg（配列番号：２９）
reverseプライマー：ccacacccccaaactgattaac（配列番号：３０）
変性      95℃/30秒
アニール  61℃/30秒
伸長      72℃/60秒
【０１０９】
上記全症例のジェノタイプは、TaqMan反応試薬（TaqMan Universal PCR Master Mix, No UNG (Applied Biosystems)を用い、TaqManPCR法により決定した。TaqManPCR法は、後述する、いずれかのプローブおよびプライマーの存在下で行った。反応条件は、反応酵素の活性化と鋳型DNAの変性ステップ（95℃/10 分）後、DNA変性ステップ（92℃/15秒）→アニーリングおよび伸長反応ステップのサイクルを40サイクル行った。
【０１１０】
TaqMan用PCRプライマーの塩基配列、および添加濃度は次の通りである。また各アレルを同定するためのプローブの塩基配列、使用濃度、およびアニーリング温度を以下に示す。一方の各アレルについてレポーター色素としてFamまたはVicを用い、クエンチャーにはMGBを用いた。各アレルを同時に解析し、ホモ、へテロのいずれであるかを同定した。
【０１１１】
ミネラルコルチコイド受容体遺伝子(MLR)
forwardプライマー：TTGTGGCTTAGCAAATGCAATT（配列番号：３１、800nM）
reverseプライマー：CAGGGAGACTGTGGTAGCCTTT（配列番号：３２、800nM）
Cアレル用プローブ：Fam-TTTGTTAGCGATGGAGAC-MGB（配列番号：３３、602nM、62℃）
Gアレル用プローブ：Vic-ATTTGTTAGGGATGGAGAC-MGB（配列番号：３４、224nM、40℃）
【０１１２】
サイアザイド感受性NaCl共輸送体遺伝子(TSC)
forwardプライマー：CGCAGTGGTGCAGGTCAGT（配列番号：３５、800nM）
reverseプライマー：AGGTGTCTGCCTTCCTGCTG（配列番号：３６、800nM）
Cアレル用プローブ：Fam-CAGAGACGCCGTCC-MGB（配列番号：３７、200NM、58℃）
Tアレル用プローブ：Vic-TGCAGAGATGCCGTC-MGB（配列番号：３８、200NM、40℃）
【０１１３】
スーパーオキサイドディスムターゼ遺伝子(SOD3)C-7539A
forwardプライマー：GAAAGCAAACGTGCCAGAATG（配列番号：３９、800nM）
reverseプライマー：CTAAGAGCCTCTGCTGTACCAGG（配列番号：４０、800nM）
Cアレル用プローブ：Fam-TGAAGGGTGCCCATT-MGB（配列番号：４１、294nM、58℃）
Aアレル用プローブ：Vic-ATGAAGGGTGACCATT-MGB（配列番号：４２、299nM、40℃）
【０１１４】
スーパーオキサイドディスムターゼ遺伝子(SOD3)C-6797T
forwardプライマー：CAGGGTAACCACTCTATTTCCTGG（配列番号：４３、800nM）
reverseプライマー：TTAGGAAGTGCGTTGAAAAGCA（配列番号：４４、800nM）
Cアレル用プローブ：Fam-TTCCTGTACGAAATGTA-MGB（配列番号：４５、277nM、58℃）
Tアレル用プローブ：Vic-TCCTGTATGAAATGTAC-MGB（配列番号：４６、262nM、40℃）
【０１１５】
肝細胞成長因子(HGF)
forwardプライマー：TTCAGTAATTTGGGCAGAGTCAGT（配列番号：４７、800nM）
reverseプライマー：ACGTTGGTGAAGTCAGCGCTAT（配列番号：４８、800nM）
Aアレル用プローブ：Fam-AGTCCAAAAAGTTAGAACT-MGB（配列番号：４９、314nM、62℃）
Tアレル用プローブ：Vic-AGTCCAAAATGTTAGAAC-MGB（配列番号：５０、194nM、40℃）
【０１１６】
グアノシンサイクラーゼ遺伝子(NPR1)
forwardプライマー：CCTGGCCTATGAGCAGTTCAA（配列番号：５１、480nM）
reverseプライマー：TCCCGGGACCCCTTCTTAC（配列番号：５２、480nM）
Cアレル用プローブ：Fam-CTTCACCATCGAGGAT-MGB（配列番号：５３、107nM、58℃）
Gアレル用プローブ：Vic-TCACCATGGAGGATG-MGB（配列番号：５４、107nM、40℃）
【０１１７】
ウロテンシンII遺伝子(UTS2)
forwardプライマー：TGATGAACTGGCTTCAAAACTGTT（配列番号：５５、800nM）
reverseプライマー：TGGCCAATTATTTTAAGGTGTGG（配列番号：５６、800nM）
Gアレル用プローブ：Fam-CAGACTCAAGTACCAACA-MGB（配列番号：５７、200nM、58℃）
Aアレル用プローブ：Vic-TCAGACTCAAATACCAACAT-MGB（配列番号：５８、200nM、40℃）
【０１１８】
エンドセリン変換酵素(ECE1)C-338A
forwardプライマー：CCCCAGTGGCAGATAACAAAAG（配列番号：５９、480nM）
reverseプライマー：CCTAGACACACCTAAGGGCTGATG（配列番号：６０、480nM）
Aアレル用プローブ：Fam-CCTCGATTTGGCC-MGB（配列番号：６１、107nM、58℃）
Cアレル用プローブ：Vic-CTCGATGTGGCCCAG-MGB（配列番号：６２、107nM、40℃）
【０１１９】
エンドセリン変換酵素(ECE1)T65451C
forwardプライマー：CTGGCTGACTTGGTGGTAGCTT（配列番号：６３、480nM）
reverseプライマー：GGCCTGACAAAGACACAGGAA（配列番号：６４、480nM）
Cアレル用プローブ：Fam-CAGAGGTGAGAACAG-MGB（配列番号：６５、107nM、58℃）
Tアレル用プローブ：Vic-CTGCAGAGATGAGAAC-MGB（配列番号：６６、107nM、40℃）
【０１２０】
β３アドレナリン受容体遺伝子
forwardプライマー：CACGTTGGTCATGGTCTGGA（配列番号：６７、800nM）
reverseプライマー：GAGGCAACCTGCTGGTCATC（配列番号：６８、800nM）
Tアレル用プローブ(*)：Fam-CGGAGTCCAGGCGA-MGB（配列番号：６９、200nM、58℃）
Cアレル用プローブ：Vic-TCGGAGTCCGGGCG-MGB（配列番号：７０、200nM、40℃）
【０１２１】
アルドステロン合成酵素遺伝子
forwardプライマー：TGGACATTTTCTGCAGTTTTTGA（配列番号：７１、800nM）
reverseプライマー：TCCTTTCTCCAGGGCTGAGA（配列番号：７２、800nM）
Tアレル用プローブ：Fam-ATCCAAGGCTCCCTCT-MGB（配列番号：７３、100nM、56℃）
Cアレル用プローブ：Vic-CAAGGCCCCCTCT-MGB（配列番号：７４、100nM、40℃）
【０１２２】
内皮性一酸化窒素合成酵素遺伝子
forwardプライマー：CACCTGCATTCTGGGAACTGTA（配列番号：７５、800nM）
reverseプライマー：GTCATTCAGTGACGCACGCTT（配列番号：７６、800nM）
Tアレル用プローブ：Fam-TTCCCTGGCTGGCT-MGB（配列番号：７７、100nM、58℃）
Cアレル用プローブ：Vic-TTCCCTGGCCGGCT-MGB（配列番号：７８、100nM、40℃）
【０１２３】
Klotho遺伝子
forwardプライマー：CAGCCCCAGATCGCTTTACTC（配列番号：７９、480nM）
reverseプライマー：CAGTCCAGGGAGAAGCGAAA（配列番号：８０、480nM）
Tアレル用プローブ(*)：Fam-TGTGTAACATGCATTTC-MGB（配列番号：８１、107nM、58℃）
Cアレル用プローブ：Vic-TGTAACGTGCATTTC-MGB（配列番号：８２、107nM、40℃）
【０１２４】
Na-Ca交換体遺伝子
forwardプライマー：GAATCTGCAATCCCCATGTGAT（配列番号：８３、800nM）
reverseプライマー：AGAACCACTGCTCTAGGCCAAT（配列番号：８４、800nM）
Aアレル用プローブ：Fam-CTCACATTCATGTTTGAG-MGB（配列番号：８５、200nM、56℃）
Cアレル用プローブ：Vic-ACTCACATTAATGTTTGAGG-MGB（配列番号：８６、200nM、40℃）
(*)をつけたプローブは逆鎖(antisense strand)用にデザインした
【０１２５】
表１−１：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Endothelin converting enzyme 1 (ECE1 C-338A)
Promoter-C/A多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
AA         CA           CC      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  253 (32%)   400 (50%)    146 (18%)   799
腎障害あり   22 (22%)    50 (51%)     26 (27%)    98
合計      275 (31%)   450 (51%)    172 (18%)   897
----------------------------------------------------
カイ2乗値 5.539、P値 0.063                          
====================================================
AA        CA+CC    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  253 (32%)   546 (68%)   799
腎障害あり   22 (22%)    76 (78%)    98
合計      275 (31%)   622 (69%)   897
----------------------------------------------------
オッズ比 0.624、95%信頼限界 0.380-1.027
カイ2乗値 3.487、P値 0.062
====================================================
Aアレル      Cアレル   合計
腎障害なし  906 (57%)   692 (43%)   1598
腎障害あり   94 (48%)   102 (52%)    196
合計     1000 (56%)   794 (44%)   1794
----------------------------------------------------
オッズ比 0.704、95%信頼限界 0.523-0.947
カイ2乗値 5.402、P値 0.020
====================================================
【０１２６】
表１−２：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Endothelin converting enzyme 1 (ECE1 T65451C)
Intron17-T/C多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
CC          CT         TT      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  348 (44%)   358 (45%)   90 (11%)   796
腎障害あり   56 (57%)    37 (38%)    5  (5%)    98
合計      404 (45%)   395 (44%)   95 (11%)   894
----------------------------------------------------
カイ2乗値 7.670、P値 0.022
====================================================
CC         CT+TT    合計
腎障害なし  348 (44%)   448 (56%)   799
腎障害あり   56 (57%)    42 (43%)    98
合計      404 (45%)   490 (55%)   897
----------------------------------------------------
オッズ比 1.716、95%信頼限界 1.123-2.623
カイ2乗値 6.349、P値 0.012
====================================================
Cアレル      Tアレル    合計
腎障害なし  1054 (66%)   538 (34%)   1592
腎障害あり   149 (76%)    47 (24%)    196
合計      1203 (67%)   585 (33%)   1788
----------------------------------------------------
オッズ比 1.618、95%信頼限界 1.147-2.282
カイ2乗値 7.636、P値 0.006
====================================================
【０１２７】
表１−３：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Mineral corticoid receptor (MLR C-2G)
Exon 2-C/G多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
GG          GC          CC      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  431 (53%)   324 (40%)   54  (7%)   809
腎障害あり   42 (43%)    52 (53%)    5  (4%)    99
合計      473 (52%)   376 (41%)   59 (60%)   908
----------------------------------------------------
カイ2乗値 5.667、P値 0.059
====================================================
GG        GC+CC   合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  431 (53%)  378 (47%)  809
腎障害あり   42 (42%)   57 (58%)   99
合計      473 (45%)  435 (55%)  908
----------------------------------------------------
オッズ比 0.646、95%信頼限界 0.424-0.985
カイ2乗値 4.162、P値 0.041
====================================================
Gアレル      Cアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  1186 (73%)   432 (27%)   1618
腎障害あり   136 (69%)    62 (31%)    198
合計      1322 (73%)   494 (27%)   1816
----------------------------------------------------
オッズ比 0.799、95%信頼限界 0.588-1.100
カイ2乗値 1.896、P値 0.169
====================================================
【０１２８】
表１−４：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Urotensin II (UTS2 G3755A)
Exon 4-G/A多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
AA        GA          GG        合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  35 (4%)   288 (36%)   483 (60%)   806
腎障害あり   1 (1%)    27 (27%)    71 (72%)    99
合計      36 (4%)   315 (35%)   554 (61%)   905
----------------------------------------------------
カイ2乗値 6.277、P値 0.043
====================================================
GA+AA        GG        合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  323 (40%)   483 (60%)   806
腎障害あり   28 (28%)    71 (72%)    99
合計      351 (39%)   554 (61%)   905
----------------------------------------------------
オッズ比 0.590、95%信頼限界 0.372-0.934
カイ2乗値 5.164、P値 0.023
====================================================
Aアレル     Gアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  358 (22%)  1254 (78%)   1612
腎障害あり   29 (15%)   169 (85%)    198
合計      387 (22%)  1423 (78%)   1810
オッズ比 0.601、95%信頼限界 0.398-0.907
カイ2乗値 5.999、P値 0.014                              
====================================================
【０１２９】
表１−５：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Superoxide dismutase 3 (SOD3 C-7539A)
Promoter-C/A多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
AA          CA         CC     合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  79 (10%)   344 (42%)  388 (48%)  811
腎障害あり  11 (11%)    30 (30%)   58 (59%)   99
合計      90 (10%)   374 (41%)  446 (49%)  910
----------------------------------------------------
カイ2乗値 5.396、P値 0.067
====================================================
CA+AA        CC      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  423 (52%)   388 (48%)   811
腎障害あり   41 (41%)    58 (59%)    99
合計      464 (51%)   446 (49%)   910
----------------------------------------------------
オッズ比 0.648、95%信頼限界 0.425-0.990
カイ2乗値 4.075、P値 0.044
====================================================
Aアレル     Cアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  502 (31%)  1120 (69%)   1622
腎障害あり   52 (26%)   146 (74%)    198
合計      554 (30%)  1266 (70%)   1820
----------------------------------------------------
オッズ比 0.795、95%信頼限界 0.569-1.109
カイ2乗値 1.831、P値 0.176
====================================================
【０１３０】
表１−６：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Superoxide dismutase 3 (SOD3 C-6797T)
Promoter-C/A多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
TT        CT         CC        合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  2 (0%)   92 (11%)   719 (89%)   813
腎障害あり  1 (1%)   20 (20%)    78 (79%)    99
合計      3 (0%)  112 (12%)   797 (88%)   912
----------------------------------------------------
カイ2乗値 8.181、P値 0.017
====================================================
CT+TT       CC       合計
----------------------------------------------------
腎障害なし   94 (12%)   719 (88%)   813
腎障害あり   21 (21%)    78 (79%)    99
合計      115 (13%)   797 (87%)   912
----------------------------------------------------
オッズ比 2.059、95%信頼限界 1.215-3.490
カイ2乗値 7.458、P値 0.006
====================================================
Tアレル    Cアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし   96  (6%)  1530 (94%)  1626
腎障害あり   22 (11%)   176 (89%)   198
合計      118  (6%)  1706 (94%)  1824
----------------------------------------------------
オッズ比 1.992、95%信頼限界 1.222-3.248
カイ2乗値 7.909、P値 0.005
====================================================
【０１３１】
表１−７：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
====================================================
Thiazide sensitive Na-Cl cotransporter (TSC C1784T)
Intron1-C/T多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
TT       CT         CC        合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  16 (2%)  180 (22%)   608 (76%)   804
腎障害あり   3 (3%)   30 (30%)    64 (67%)    97
合計      19 (2%)  210 (23%)   672 (75%)   901
----------------------------------------------------
カイ2乗値 4.287、P値 0.117
====================================================
CT+TT       CC       合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  196 (24%)  608 (76%)   804
腎障害あり   33 (34%)   64 (66%)    97
合計      229 (25%)  672 (75%)   901
----------------------------------------------------
オッズ比 1.599、95%信頼限界 1.020-2.508
カイ2乗値 4.245、P値 0.039
====================================================
Tアレル    Cアレル     合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  212 (13%)  1396 (87%)   1608
腎障害あり   36 (19%)   158 (81%)    194
合計      248 (14%)  1554 (86%)   1802
----------------------------------------------------
オッズ比 1.500、95%信頼限界 1.016-2.215
カイ2乗値 4.210、P値 0.040
====================================================
【０１３２】
表１−８：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Guanylate cyclase-A (GC-A G2173C (Met341Ile))
Exon3-G/C多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
GG          GC         CC    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  712 (89%)   86 (11%)   3 (0%)   801
腎障害あり   78 (80%)   20 (20%)   0 (0%)    98
合計      790 (88%)  106 (12%)   3 (0%)   899
----------------------------------------------------
カイ2乗値 8.153、P値 0.017
====================================================
GG         GC+CC    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  712 (89%)    89 (11%)   801
腎障害あり   78 (80%)    20 (20%)    98
合計      790 (88%)   109 (12%)   899
----------------------------------------------------
オッズ比 0.488、95%信頼限界 0.285-0.835
カイ2乗値 7.084、P値 0.008
====================================================
Gアレル     Cアレル   合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  1510 (94%)   92  (6%)   1602
腎障害あり   176 (90%)   20 (10%)    196
合計      1686 (94%)  112  (6%)   1798
オッズ比 0.536、95%信頼限界 0.323-0.891
カイ2乗値 5.950、P値 0.015
====================================================
【０１３３】
表１−９：遺伝子多型と高血圧性腎障害(血清クレアチニン1.4mg/dl以上)との関連
Hepatocyte growth factor (HGF A43839T)
Intron8-A/T多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
TT         AT          AA      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  29 (4%)   235 (29%)   546 (67%)   810
腎障害あり   0 (0%)    24 (24%)    74 (76%)    98
合計      29 (3%)   259 (29%)   620 (68%)   908
----------------------------------------------------
カイ2乗値 4.976、P値 0.083
====================================================
AT+TT        AA      合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  264 (33%)   546 (67%)   810
腎障害あり   24 (24%)    74 (76%)    98
合計      288 (32%)   620 (68%)   908
----------------------------------------------------
オッズ比 0.671、95%信頼限界 0.414-1.088
カイ2乗値 2.650、P値 0.104
====================================================
Tアレル     Aアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  293 (18%)  1327 (82%)   1620
腎障害あり   24 (12%)   172 (88%)    196
合計      317 (17%)  1499 (83%)   1816
----------------------------------------------------
オッズ比 0.632、95%信頼限界 0.405-0.987
カイ2乗値 4.141、P値 0.042
====================================================
【０１３４】
表２：クレアチニン値正常高血圧患者における遺伝子多型と高血圧性早期腎障害
(尿中アルブミン排泄:UAE 30mg/g Crn以上)との関連
Endothelin converting enzyme 1 (ECE1 C-338A)
Promoter-C/A多型頻度と腎障害との関連（カイ2乗検定）
====================================================
AA        CA           CC    合計
----------------------------------------------------
UAE 30未満  137 (33%)  195 (48%)   78 (19%)  410
UAE 30以上   65 (24%)  126 (49%)   78 (27%)  269
合計     202 (30%)  321 (47%)  156 (23%)  679
----------------------------------------------------
カイ2乗値 11.721、P値 0.003                              
====================================================
AA        CA+CC    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  137 (33%)  273 (67%)   410
腎障害あり   65 (24%)  204 (76%)   269
合計      202 (30%)  477 (70%)   679
----------------------------------------------------
オッズ比 0.635、95%信頼限界 0.449-0.898
カイ2乗値 6.652、P値 0.010
====================================================
Aアレル     Cアレル    合計
----------------------------------------------------
腎障害なし  469 (57%)   351 (43%)    820
腎障害あり  256 (48%)   282 (52%)    538
合計      725 (53%)   633 (47%)   1358
----------------------------------------------------
オッズ比 0.679、95%信頼限界 0.546-0.845
カイ2乗値 12.060、P値 0.001
====================================================
【０１３５】
表３−１：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
β３アドレナリン受容体 (NDRB3 T190C)
2005110606.tif 000002
【０１３６】
表３−２：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
アルドステロン合成酵素 (CYP11B2 C-344T)
2005110606.tif 000003
【０１３７】
表３−３：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
内皮性一酸化窒素合成酵素 (eNOS T-813C)
2005110606.tif 000004
【０１３８】
表３−４：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
Klotho遺伝子 (KL C44605T)
2005110606.tif 000005
【０１３９】
表３−５：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
ミネラルコルチコイド受容体 (MLR C-2G)
2005110606.tif 000006
【０１４０】
表３−６：遺伝子多型と高血圧性腎血流障害（RI０．７以上）との関連
Na-Ca 交換体 (Na-Ca交換体 C-23449A)
2005110606.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
上述の通り、本発明により本態性高血圧症患者における高血圧性腎障害と関連するいくつかの遺伝子多型が明らかにされた。これらの関連遺伝子多型を高血圧患者に対する遺伝子診断として応用することにより、高血圧性腎障害のリスクを予測することができる。これまで高血圧性腎障害の発症を予測することは、困難とされていた。したがって、その遺伝的な素因を予測できることの意義は大きい。
降圧剤の中には、血圧のコントロールのみならず、腎機能の保護作用を有すると考えられている薬剤が実用化されている。本発明に基づいて、腎機能障害のハイリスク群に属することが予測された高血圧症患者に対して、このような薬剤を投与することによって、腎機能障害の発症を予防、あるいは遅らせることができる。
【配列表】
2005110606000001.app