(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病に対する治療剤又は予防剤の探索方法を提供する。【解決手段】被検物質の存在下、ＲＯＲ核内受容体、その応答性エレメント、及びＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の動態を測定又は検出する、糖尿病治療剤又は予防剤の探索法及びそのキット；該方法により得られる化合物又はその塩を有効成分として含有した医薬組成物；被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲＯＲ核内受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、糖尿病の診断方法及びその診断用キット；並びに被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲＯＲ核内受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含む、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法及びそのキットを使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の存在下、下記（１）〜（３）：
（１）ＲＯＲ核内受容体、
（２）ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメント、及び
（３）ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の発現又は機能を調節する物質を探索することを特徴とする、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
（Ｉ）請求項１記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも1つの因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（Ｉ）（４）ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、及び
（５）ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物
を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の変動をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（Ｉ）ＲＯＲ核内受容体を内在的に発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における該ＲＯＲ核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、該核内受容体の発現量の変化をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（Ｉ）ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子を内在的に発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における該ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子の発現の変動を測定し、それにより、該補助因子の発現量の変化をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
請求項１記載の（１）又は（３）の因子の発現を亢進する化合物又はその塩を探索するものである請求項１記載の方法。
【請求項７】
請求項１記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を促進する、化合物又はその塩を探索するものである請求項１記載の方法。
【請求項８】
該ＲＯＲ核内受容体が、ＲＯＲα又はＲＯＲγである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該ＲＯＲ核内受容体が、ヒトＲＯＲα又はヒトＲＯＲγである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
請求項２記載の方法に用いるためのキットであり、かつ請求項１記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット。
【請求項１１】
請求項３記載の方法に用いるためのキットであり、かつ請求項３記載の（４）及び（５）の核酸構築物を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
請求項４又は５記載の方法に用いるためのキットであり、かつ請求項１記載の（１）又は（３）の因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
請求項４又は５記載の方法に用いるためのキットであり、かつ内在的に請求項１記載の（１）又は（３）の因子を発現している細胞を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療又は予防のための薬剤の探索手段に関する。より詳しくは、本発明は、糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に用いるキット、該スクリーニング方法により得られる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、多飲、多尿、体重減少等の症状、慢性の高血糖を主徴とし、インスリンを合成・分泌する膵ランゲルハウス島β細胞の破壊消失がインスリン作用不足の主要な原因となるI型糖尿病と、インスリン分泌低下をきたす素因を含む複数の遺伝的素因に、過食、肥満、運動不足、ストレスなどの環境因子および加齢が加わり発症するII型糖尿病（インスリン抵抗性糖尿病）に分類されている。慢性的に続く高血糖や代謝異常は、網膜、腎の最小血管症および全身の動脈硬化を起こし進展させ、さらに神経障害などの合併症を起こし、日常生活に著しく障害をきたすことが知られている。
【０００３】
従来、糖尿病の治療として、食事療法、運動療法等による生活改善をはじめ、膵β細胞のインスリン分泌、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲ）γアゴニスト、消化管からの二糖類分解酵素を標的とする治療薬やインスリンそのもの等が用いられている。しかしながら、上述の糖尿病の治療方法を適用しても、所望の効果が得られない症例もある。
【０００４】
一方、ＲＯＲ核内受容体は、オーファン核内受容体の１つであり、ＲＯＲα、ＲＯＲβ、ＲＯＲγが知られている（非特許文献１〜２参照）。
【０００５】
近年、コレステロールを添加するとＲＯＲαの転写活性が向上することが見出されており、コレステロールがＲＯＲαのリガンドであること、ＲＯＲαがコレステロールに関連する病気の診断に使用され得ることが示唆されている（非特許文献３参照）。
【０００６】
また、ＰＰＡＲγ強制発現ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞において、糖尿病薬として用いられる化合物であるピオグリタゾンを添加すると、脂肪細胞に分化し、ＲＯＲγｍＲＮＡの発現量が上昇したことから、分化の過程においてＰＰＡＲγより後の段階でＲＯＲγが分化に必要な遺伝子の制御をしていると考えられている（非特許文献４参照）。チアゾリジン誘導体はＲＯＲαのリガンドであるという知見（非特許文献５参照）もあるが、このデータは議論されており（非特許文献３参照）、否定的な見方が強い。
【０００７】
なお、ＲＯＲ核内受容体はリガンドが結合すると、標的遺伝子の制御領域に存在するＲＯＲ核内受容体の応答性エレメント（ＤＮＡ応答配列）に結合する。応答性エレメントに結合したＲＯＲ核内受容体は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体に対して直接的に、あるいは補助転写活性化因子を介して機能的に共役し、転写前開始複合体を形成し、下流にある標的遺伝子の転写を活性化させる働きを持つ。
【０００８】
その他、ＲＯＲ核内受容体のリガンド結合領域を用いた、アゴニストやアンタゴニストをスクリーニングする方法が報告されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】国際公開第０３／０００７３２号パンフレット
【非特許文献１】ベッカー−アンドレ(Becker-Andre, M.)ら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、 第１９４巻、１３７１−１３７９頁（１９９３）
【非特許文献２】ヒロセ(Hirose, T.) ら、バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)、 第２０５巻、１９７６―１９８３頁（１９９４）
【非特許文献３】カレン(Kallen, J. A.) ら、ストラクチャー(Structure)、 第１０巻、１６９７−１７０７頁（２００２）
【非特許文献４】ジェッテン（Jetten, A. M.）ら、セル  グロース  アンド  ディフェレンティエイション(Cell Growth & Differentiation)、 第９巻、２６７−２７６頁（１９９８）
【非特許文献５】ワイゼンバーグ(Wiesenberg, I.)ら、モレキュラー  ファーマコロジー  (Mol. Pharmacol.)、第５３巻、１１３１−１１３８頁（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、糖尿病に対する治療剤又は予防剤のスクリーニング方法に関する。具体的には、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子の発現又は機能を調節する物質を探索することを特徴とする、糖尿病に対する治療剤又は予防剤のスクリーニング方法に関する。本発明は、かかるスクリーニング方法により、簡便、かつ迅速に、糖尿病治療剤又は予防剤をスクリーニングすることも１つの目的とする。さらに、本発明は、前記スクリーニング方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうこと、高い信頼性で行なうことの少なくとも１つを解決しうる、スクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予防作用を発揮する医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、糖尿病、特に、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子（例えば、ＲＯＲα又はＲＯＲγ）の機能に関連して発症する糖尿病を、簡便に診断すること、迅速に診断することの少なくとも１つを解決しうる、糖尿病の診断方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記診断方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうことの少なくとも１つを解決しうる診断用キットを提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、糖尿病、特に、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子（例えば、ＲＯＲα又はＲＯＲγ）の機能に関連して発症する糖尿病に罹患している個体由来の試料を、簡便に検出すること、迅速に検出することの少なくとも１つを解決しうる、糖尿病に罹患している個体由来の試料の検出方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記検出方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうことの少なくとも１つを解決しうる検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
即ち、本発明は、
〔１〕  被検物質の存在下、下記（１）〜（３）：
（１）ＲＯＲ核内受容体、
（２）ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメント、及び
（３）ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の発現又は機能を調節する物質を探索することを特徴とする、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、
〔２〕  （Ｉ）〔１〕記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも1つの因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、〔１〕記載の方法、
〔３〕  （Ｉ）（４）ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、及び
（５）ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物
を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の変動をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、〔１〕記載の方法、
〔４〕  （Ｉ）ＲＯＲ核内受容体を内在的に発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における該ＲＯＲ核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、該核内受容体の発現量の変化をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、〔１〕記載の方法、
〔５〕  （Ｉ）ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子を内在的に発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における該ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子の発現の変動を測定し、それにより、該補助因子の発現量の変化をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、〔１〕記載の方法、
〔６〕  〔１〕記載の（１）又は（３）の因子の発現を亢進する化合物又はその塩を探索するものである〔１〕記載の方法、
〔７〕  〔１〕記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を促進する化合物又はその塩を探索するものである〔１〕記載の方法、
〔８〕  該ＲＯＲ核内受容体が、ＲＯＲα又はＲＯＲγである、〔１〕記載の方法、
〔９〕  該ＲＯＲ核内受容体が、ヒトＲＯＲα又はヒトＲＯＲγである、〔１〕記載の方法、
〔１０〕  〔２〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ〔１〕記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット、
〔１１〕  〔３〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ〔３〕記載の（４）及び（５）の核酸構築物を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット、
〔１２〕  〔４〕又は〔５〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ〔１〕記載の（１）又は（３）の因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット、
〔１３〕  〔４〕又は〔５〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ内在的に〔１〕記載の（１）又は（３）の因子を発現している細胞を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット、
〔１４〕  前記〔１〕〜〔９〕いずれか１項に記載の方法により得られる化合物又はその塩を有効成分として含有してなる、医薬組成物、
〔１５〕  糖尿病の治療又は予防に用いる、前記〔１４〕記載の医薬組成物、
〔１６〕  被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲＯＲ核内受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルと比べて変動している場合、該被検対象の個体が、糖尿病に罹患している疑いがあることの指標となる、糖尿病の診断方法、
〔１７〕  発現レベルが、ＲＯＲ核内受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を指標として測定される、前記〔１６〕記載の方法、
〔１８〕  発現レベルが、ＲＯＲ核内受容体遺伝子産物の量を指標として測定される、前記〔１６〕記載の方法、
〔１９〕  配列番号：１又は３記載の配列を検出しうる核酸を含有してなる、前記〔１６〕又は〔１７〕記載の方法を行なうための診断用キット、
〔２０〕  ＲＯＲ核内受容体に対する抗体又はその断片を含有してなる、前記〔１６〕又は〔１８〕記載の方法を行なうための診断用キット、
〔２１〕  被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲＯＲ核内受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルと比べて変動している場合、該被検試料が、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
〔２２〕  発現レベルが、ＲＯＲ核内受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を指標として測定される、前記〔２１〕記載の方法、
〔２３〕  発現レベルが、ＲＯＲ核内受容体遺伝子産物の量を指標として測定される、前記〔２１〕記載の方法、
〔２４〕  配列番号：１又は３記載の配列を検出しうる核酸を含有してなる、前記〔２１〕又は〔２２〕記載の方法を行なうための検出用キット、
〔２５〕  ＲＯＲ核内受容体に対する抗体又はその断片を含有してなる、前記〔２１〕又は〔２３〕記載の方法を行なうための検出用キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法によれば、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子の機能に対する作用機序に基づく、糖尿病に対する治療剤又は予防剤を、簡便、かつ迅速に、スクリーニングすることができ、前記治療剤又は予防剤の候補化合物の薬理評価を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができる。さらに、本発明の医薬組成物によれば、糖尿病に対する治療又は予防を可能にするという優れた効果を奏する。また、本発明の糖尿病の診断方法によれば、糖尿病を、簡便、迅速に、高い信頼性で診断することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の診断用キットによれば、前記診断方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができる。さらに、本発明の糖尿病に罹患している個体由来の試料の検出方法によれば、糖尿病に罹患している個体由来の試料を、簡便、迅速に、高い信頼性で検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の検出用キットによれば、前記検出方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、インスリン抵抗性モデルラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ）に対して、食餌制限を適用するか、あるいは食餌制限と運動負荷との組み合わせを適用することにより、該ラットにおけるインスリン抵抗性を改善させた場合、改善前よりも脂肪組織におけるＲＯＲα又はＲＯＲγの発現が上昇する、という本発明者らの驚くべき知見に基づく。この知見から、ＲＯＲα及びＲＯＲγが糖尿病の病態に深く関わっていると考えられ、ＲＯＲの機能の調節が糖尿病治療又は予防に有効であることが示唆された。また、ＰＰＡＲγアゴニストとして知られ、既に抗糖尿病治療薬として用いられているピオグリタゾン存在下では、糖尿病モデル動物の病態改善に関わらず、ＲＯＲα及びＲＯＲγの発現変動は見られなかった。このことから、ＲＯＲは脂肪組織においてＰＰＡＲγが関与しないメカニズムで発現変動していることが示唆された。
【００１６】
また、本発明者らは、インスリンの生理作用である脂肪組織及び筋におけるグルコース取り込み促進について研究した。
【００１７】
脂肪細胞前駆細胞である３Ｔ３−Ｌ１細胞において該ＲＯＲα又は該ＲＯＲγを強制発現させることにより、インスリンの感受性に必要な遺伝子（アジポネクチン）及び脂肪細胞分化に必須の転写因子（Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγ）の発現量が減少すること、グルコース取り込み能が低下すること、及び、脂肪細胞の分化が抑制されることを明らかにした。３Ｔ３−Ｌ１細胞は分化しなければ、グルコースの取りこみが起こらないことが知られている。上記結果から、３Ｔ３−Ｌ１細胞において過剰発現されたＲＯＲは脂肪細胞の分化を抑制し、グルコースの取りこみ及び脂肪細胞が分泌するアジポネクチンの発現量を評価することが出来なかったと考えられる。つまり、分化の過程においてＣ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγより前の段階でＲＯＲが分化に必要な遺伝子の制御をし、脂肪細胞の分化を抑制させる機能を持つことが示唆された。
【００１８】
さらに、骨格筋様細胞において該ＲＯＲαを強制発現させることにより、グルコース取り込み能が上昇することを明らかにした。つまり、ＲＯＲは骨格筋様細胞においてグルコースの取りこみを上昇させる機能を持っていることが示唆された。
【００１９】
脂肪細胞は生体内のエネルギーの貯蔵組織を構成するだけでなく、種々のアディポサイトカインを分泌しており、各種生活習慣病（糖尿病、高脂血症、高血圧等）を引き起こす大きな原因ともなっていることが明らかにされており、特に、肥大した脂肪細胞からはＴＮＦα、レジスチン等が多量に産生・分泌され、骨格筋でインスリンの情報伝達を傷害し、インスリン抵抗性を惹起することが知られている。そのため、脂肪細胞の分化を適正に調節することがグルコース・脂質代謝を改善し、糖尿病予防につながる。例えば、脂肪細胞分化に関与していることが知られているＰＰＡＲγのアゴニスト（例えば、ピオグリタゾン等）は、分化促進と肥大脂肪細胞のアポトーシス促進による脂肪細胞の小型化を介してインスリン抵抗性を改善するため、抗糖尿病作用を有し、逆に、ＰＰＡＲγの活性を中程度に低下させる薬剤（アンタゴニスト）は、脂肪細胞肥大やインスリン抵抗性を抑制するため、抗糖尿病作用を有する可能性が示唆されている（細胞工学、Vol.23 No.2 2004、150-155頁；Molecular Medicine Vol.39 No.4 2002, 438-446頁）。以上のことから、正常個体においてＲＯＲは、ＰＰＡＲγの上流においてＰＰＡＲγを調節し、脂肪細胞の分化を適正に調節していると考えられる。
【００２０】
これらのことから、ＲＯＲα及びＲＯＲγの発現又は機能を調節（特に発現の亢進又は機能の促進）することが糖尿病治療又は予防に有効であることが示唆された。
【００２１】
上記の結果から、ＲＯＲα及びＲＯＲγは脂肪細胞への分化を調節し、グルコースの取り込み能やインスリン抵抗性の調節に関わっていることが考えられる。よって、ＲＯＲの機能調節剤や発現調節剤が糖尿病に有効であると考えられる。
【００２２】
以下にＲＯＲ核内受容体ポリヌクレオチドの調製、ＲＯＲ核内受容体ポリペプチドの調製、組換えベクター、形質転換体、該組換えベクター又は形質転換体の製造方法、抗体、該ポリペプチドの定量方法又は免疫学的検出方法、ｍＲＮＡの定量方法、ｍＲＮＡの翻訳抑制方法、結合物質、結合物質スクリーニング方法、転写制御活性調節物質、転写制御活性調節物質スクリーニング方法、発現調節物質、発現調節物質スクリーニング方法、スクリーニング用キット、糖尿病の検出方法、遺伝子検出用キット、医薬組成物について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法及び免疫学的手法が採用される。
【００２３】
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法は、かかる本発明者らの知見に基づくものであり、具体的には、被検物質の存在下、下記（１）〜（３）：
（１）ＲＯＲ核内受容体、
（２）ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメント、及び
（３）ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の発現又は機能を調節する物質を探索することを１つの特徴とする。
【００２４】
なお、ＲＯＲ核内受容体は、ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメントに結合し、ＲＮＡポリメラーゼ複合体と補助因子を介して機能的に共役し、下流にある配列の転写を活性化させる働きを持つため、上記の（１）〜（３）の因子の発現又は機能を調節する物質を探索する方法には、様々な方法が含まれる。
【００２５】
前記（１）〜（３）の少なくとも１つの因子の発現を調節する物質としては、前記（１）の発現を調節する物質等が挙げられ、例えば、前記（１）のプロモーターの働きを調節する物質等が考えられる。このような物質は、例えば、前記〔４〕記載の方法によって探索することができる。
【００２６】
前記（１）及び（３）の少なくとも１つの因子の機能を調節する物質としては、前記（１）〜（３）のいずれかに結合する物質等が挙げられる。例えば、そのような物質は、前記（１）と（２）の結合、前記（１）と（３）の結合又は前記（３）とＲＮＡポリメラーゼ複合体の結合を促進又は阻害し、前記（１）〜（３）のいずれかの因子の機能を調節することができる。このような物質は、例えば、〔２〕又は〔３〕記載の方法によって探索することができる。
【００２７】
したがって、本発明のスクリニーング方法によれば、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子の機能に関連して発症する糖尿病に有効な糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によれば、ＰＰＡＲを活性化させることによりインスリン抵抗性改善を図るチアゾリジンジオン化合物とは異なる作用機序の糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングできる。
【００２８】
また、本発明のスクリーニング方法によれば、前記機能に対する作用機序に基づく治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【００２９】
さらに、本発明のかかるスクリーニング方法によれば、前記作用機序に基づく糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物を、簡便、かつ迅速にスクリーニングすることができる。
【００３０】
なお、本発明のスクリーニング方法は、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療剤又は予防剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。
【００３１】
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。核酸としては、ＲＯＲ核内受容体遺伝子に対するＲＮＡｉを誘発しうるｓｉＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡ、リボザイム等も含まれる。
【００３２】
ＲＯＲ核内受容体は、高密度リポタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、ＰＰＡＲα、Ｎ−ｍｙｃ、α―Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ及びＢｃｌ−ｘＬのそれぞれの遺伝子の転写活性化等に関係しており、それぞれのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量をＰＣＲ、ノーザンブロティング、ドットブロティング、ウエスタンブロティング、イムノアッセイ等の測定法により測定することによっても、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニングを行うことができる。
【００３３】
本明細書において、「ＲＯＲ核内受容体」とは、ＲＯＲに属する核内受容体を意味する。かかる「ＲＯＲ核内受容体」としては、高密度リポタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、ＰＰＡＲα、Ｎ−ｍｙｃ、α―Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ及びＢｃｌ−ｘＬのそれぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質の発現制御の機能を有するものであればよく、例えば、ＲＯＲα、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ等が挙げられる。特にＲＯＲα又はＲＯＲγが好ましい。なお、前記「ＲＯＲ核内受容体」は、天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、前記機能を有するバリアントであってもよい。
【００３４】
前記ＲＯＲαは、末梢血白血球から多量に検出され、心臓、脳、肺、肝臓、筋肉等、様々な器官において広く発現が見られるという特徴を有する。
【００３５】
前記ＲＯＲγは、骨格筋、胸腺、すい臓、前立腺、睾丸、心臓、肝臓において発現が見られ、骨格筋＞胸腺＞すい臓、前立腺、睾丸、心臓、肝臓の発現パターンを示すという特徴を有する。
【００３６】
前記ＲＯＲα又はＲＯＲγは、例えば、ヒト由来のＲＯＲα又はヒト由来のＲＯＲγの場合、トランスアクチベーションに関与するドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、二量体形成に関与するドメイン、転写抑制に関与するドメイン、ホルモン（リガンド）結合ドメイン等を有する核内受容体の構造的特徴がある。
【００３７】
前記「ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメント」としては、ＲＯＲ核内受容体の結合する核酸配列を有するエレメントであればよく、例えば、ＲＯＲ応答性エレメント〔ＡＧＧＴＣＡ、配列番号：５、６、７〕等が挙げられる。
【００３８】
前記「ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子」とは、ＲＯＲ核内受容体のパートナーであり、ＲＯＲ核内受容体とヘテロ多量体を構成しうる補助因子をいう。前記「ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子」は、ＲＯＲ核内受容体と協調して、高密度リポタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、ＰＰＡＲα、Ｎ−ｍｙｃ、α―Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ及びＢｃｌ−ｘＬのそれぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質の発現制御の機能を有するものであればよい。ここで、前記「ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子」は、天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、前記機能を有するバリアントであってもよい。
【００３９】
本発明においては、ＲＯＲ核内受容体の機能を阻害若しくは発現を抑制する観点から、前記因子の中では、ＲＯＲ核内受容体又はＲＯＲ核内受容体の応答性エレメントが好ましい。具体的には、ヒトの糖尿病に対してより有効な治療剤又は予防剤の候補化合物を得る観点及びインスリン抵抗性を改善する観点から、前記ＲＯＲ核内受容体の中では、ヒトＲＯＲα及びヒトＲＯＲγが好ましく、前記ＲＯＲ核内受容体の応答性エレメントの中では、ヒトＲＯＲα応答性エレメント及びヒトＲＯＲγ応答性エレメントが好ましい。前記ヒトＲＯＲαは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号：NM-134261に、その塩基配列（配列番号：１）及びアミノ酸配列（配列番号：２）が開示されている。前記ヒトＲＯＲγは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号：NM-005060に、その塩基配列（配列番号：３）及びアミノ酸配列（配列番号：４）が開示されている。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法において、測定又は検出の対象は、前記（１）〜（３）の因子全てによる協調的な動態であってもよく、前記（１）〜（３）の因子から任意に選ばれた２種の因子の組み合わせによる協調的な動態であってもよく、前記（１）〜（３）の因子それぞれ単独による動態であってもよい。
【００４１】
本発明のスクリーニング方法は、以下のものを測定又は検出の対象として行うことができる。例えば、ＲＯＲ核内受容体の発現、具体的には、該発現レベルの変動；該ＲＯＲ核内受容体とそのリガンドとの結合の有無；該ＲＯＲ核内受容体と該核内受容体が特異的に結合するＲＯＲ核内受容体の応答性エレメントとの結合の有無、ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子とＲＯＲ核内受容体又はＲＮＡポリメラーゼ複合体との結合の有無等が挙げられる。
【００４２】
また、ＲＯＲ核内受容体のプロモーター領域及びＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子のプロモーター領域もまた、本発明のスクリーニング方法に使用することのできる因子となり得る。プロモーター領域に転写複合体が結合することによってＲＯＲ核内受容体又は補助因子の発現が起ることから、前記ＲＯＲ核内受容体のプロモーター領域又は補助因子のプロモーター領域の下流及び支配下に、レポーター遺伝子を連結し、細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無及び増減が測定又は検出対象となり、該プロモーターの機能を調節（特に促進）する被験物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補物質となり得る。
【００４３】
具体的には、例えば、（Ｉ）ＲＯＲ核内受容体プロモーター又はＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた核酸構築物と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で得られた核酸構築物における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の変動をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法には、限定するわけではないが、以下の３つの実施態様が含まれる。
【００４５】
本発明のスクリーニング方法の第１の実施態様としては、
（Ｉ）〔１〕記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも1つの因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップを含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記因子への結合を介して当該因子の機能を調節する物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、直接的に前記因子に結合してその機能を調節するという特徴的な性質を有する。したがって、選択された候補化合物は、前記因子に直接的かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４６】
前記ステップ（Ｉ）において、前記因子と被検物質との接触は、該因子の本来の機能を妨げない溶液中において、前記因子と被検物質とを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。
【００４７】
前記「因子の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。
【００４８】
また、ステップ（Ｉ）における反応条件としては、特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜９．０、より好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．０で、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは、２５℃〜３７℃、さらに好ましくは、２５℃、１分〜１時間、好ましくは、３分〜３０分、より好ましくは５分〜２０分、さらに好ましくは、１０分維持すること、又は０℃〜２０℃、好ましくは、２℃〜１０℃、より好ましくは、３℃〜８℃、さらに好ましくは、４℃で、２０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜１２時間、より好ましくは、４０分〜２時間、さらに好ましくは、１時間維持すること等が挙げられる。より具体的には、１０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｄＩｄＣ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０％  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ中、前記条件下に維持することが挙げられる。
【００４９】
ついで、ステップ（ＩＩ）において、前記ステップ（Ｉ）で得られた産物について、前記因子と被検物質との結合の有無を調べる。
【００５０】
前記因子と被検物質との結合の検出は、例えば、表面プラズモン解析、被検物質を保持した担体へのバインディングアッセイ等により行なわれうる。
【００５１】
表面プラズモン解析により、前記因子と、被検物質との間の結合を測定する場合、例えば、下記ステップ：
−  前記因子を固定化したセンサーチップと、被検物質を含有した溶液を一定の流速で送液するステップ、及び
−  適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）〕により、光学的変動又は質量の変動として、前記因子と、被検物質との相互作用を検出するステップ；
を含む方法を行なうことにより、該結合を測定することができる。なお、表面プラズモン解析を用いた測定方法においては、前記因子と、被検物質との間の結合は、例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液による被検物質の導入により変動した場合、当該被検物質が、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択されうる。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法の第２の実施態様としては、
（Ｉ）（４）ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
（５）核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と
を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の変動をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ、
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、核内受容体と該核内受容体に対する応答性エレメントとの相互作用による該応答性エレメントの下流のレポーター遺伝子の発現の有無を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、前記核内受容体に対する阻害能、特に、前記核内受容体の転写抑制能に対する阻害能を有するという特徴的な性質を有し、前記核内受容体の転写制御能、あるいはＤＮＡ結合活性に対する阻害能が細胞レベルで機能するという優れた効果を発揮する。
【００５３】
前記ステップ（Ｉ）に用いられる（４）の核酸構築物は、ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントと、プロモーターと、レポーター遺伝子とを含む構築物である。
【００５４】
ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントとは、ＲＯＲ核内受容体が結合することにより応答する塩基配列からなる核酸をいい、例えば、アポタンパクＣ−III遺伝子のプロモ
ーター領域に局在するＲＯＲ核内受容体による標的配列からなる核酸、前記標的配列からなる核酸のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつＲＯＲ核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる核酸の塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつＲＯＲ核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる核酸の塩基配列と少なくとも６０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＯＲ核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子等も含まれる。
【００５５】
前記ＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントとしては、具体的には、配列番号：５、６、７等が挙げられる。
【００５６】
前記プロモーターとしては、核酸構築物を導入するために用いられる細胞により適宜選択されうるが、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等が挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたＰｔｒｐｘ２プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター、等が挙げられる。前記プロモーターは、前記応答性エレメントの下流及び支配下に動作可能に連結される。
【００５７】
前記レポーター遺伝子としては、その産物の発現が検出可能である遺伝子であればよく、核酸構築物を導入するために用いられる細胞により適宜選択されうるが、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、Ｂｉｏｔｉｎ遺伝子、蛍光タンパク質等が挙げられる。前記レポーター遺伝子は、前記プロモーターの下流及び支配下に動作可能に連結される。なお、前記プロモーターは、前記レポーター遺伝子本来のプロモーターであってもよい。
【００５８】
前記（４）の核酸構築物は、慣用の細胞導入用担体、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、金属微粒子等に担持させてもよい。前記ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）；特開平３−２２９７９号公報〕、ｐＡＧＥ１０３〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）〕、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）等が挙げられる。
【００５９】
前記（５）の発現用核酸構築物は、ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸を含有する。
【００６０】
前記ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸としては、具体的には、例えば、
ｉ）配列番号：２及び４のアミノ酸配列をコードする核酸、
ii）前記ｉ）の核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
iii)配列番号：２及び４のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
iv）配列番号：２及び４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列同一性を有し、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節するの機能を発揮するものである核酸、
等が挙げられる。ここで、前記機能は、前述の機能の評価方法により評価されうる。
【００６１】
前記（４）の核酸構築物と、前記（５）の発現用核酸構築物とは、好ましくは、細胞内で互いに共存できるもの（和合性を有するもの）であることが望ましい。
【００６２】
前記（４）の核酸構築物はＲＯＲ核内受容体の応答性エレメントを慣用のレポータープラスミドのクローニング部位に挿入することにより構築されうる。レポータープラスミドとしては前記レポーター遺伝子の発現、及び検出ができるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとして、ｐＧＬ３、ｐＲＬ、ｐＣＡＴ３（プロメガ社製）、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＣＦＰ、ｐＥＹＦＰ、ｐＤｓＲｅｄ、ｐＳＥＡＰ、ｐβｇａｌ（クロンテック社製）、ＰＧＶ−ＣＳ，ＰＧＶ−Ｂ、ＰＧＶ−Ｐ、ＰＧＶ−Ｃ２、ＰＧＶ−Ｐ２、ＰＧＶ−Ｂ２（東洋インキ社製）等が挙げられる。
【００６３】
前記（５）の発現核酸構築物は、ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸を発現可能な慣用の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等におけるクローニング部位に挿入することにより構築されうる。該ＲＯＲ核内受容体をコードする核酸の発現に適した発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとしては、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）；特開平３−２２９７９号公報〕、ｐＡＧＥ１０３〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）〕、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）等が挙げられる。発現ベクターは、構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーター、ポリＡ付加シグナル、複製開始起点、抗生物質耐性遺伝子等が含まれていることが望ましい。
【００６４】
前記プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればよく、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００６５】
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９号公報）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０〕及びＣＯＳ−７〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１〕、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。
【００６６】
本明細書に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、高ストリンジェンシーな条件、例えば、１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳの条件等をいう。ここで、ストリンジェンシーを向上させるため、より低イオン強度、例えば、０．５×ＳＳＣ、好ましくは、０．２×ＳＳＣ、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、５０℃以上、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下で洗浄等を行なってもよい。
【００６７】
本明細書に用いられる「変異」とは、塩基の置換、欠失、付加及び挿入をいう。かかる変異は、天然に存在するバリエーションであってもよく、慣用の部位特異的変異方法等により人為的に導入された変異であってもよい。
【００６８】
本明細書に用いられる「配列同一性」とは、比較対象の少なくとも２つの配列について、適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより算出されうる値をいう。かかる配列同一性は、具体的には、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、一般に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズム等により算出されうる。
【００６９】
ステップ（Ｉ）においては、前記（４）の核酸構築物と、前記（５）の発現用核酸構築物とを適切な細胞に導入する。
【００７０】
使用する細胞としては、発現ベクターに対応する適当な細胞又は組織を用いることが可能であればよく、動物細胞等が挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、例えば、マウス由来株細胞の３Ｔ３−Ｌ１（繊維芽細胞、ＡＴＣＣ：ＣＬ−１７３）、ラット由来株細胞のＬ６〔骨格筋由来筋芽細胞〕、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、サル由来株細胞のＣＯＳ−１〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０〕及びＣＯＳ−７〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１〕、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等が挙げられる。
【００７１】
細胞への核酸構築物及び発現核酸構築物の導入は、慣用の遺伝子導入法により行なわれうる。例えば、宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）；Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）〕、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等により行なわれうる。
【００７２】
本発明の形質転換体は、当該分野において周知慣用の常法により培養する。形質転換した宿主に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、ＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＹＴ培地、ＢＥＭ培地等が用いられる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＩＭ培地等にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したもの等が用いられる。培地には、必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよい。転写活性を促進する物質としては、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等が挙げられる。
【００７３】
培地には、形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、ＦＣＳ、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。
【００７４】
培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件で行なうことができる。培養温度、培養時間及び培養液のｐＨは、各種宿主に適した範囲に設定される。例えば、培養は、通常１５〜４０℃、５時間〜７日間、ｐＨ３．０〜９．０、５％  ＣＯ２存在下等の条件で行なわれうる。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行なれうる。また、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして、誘導性のプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７５】
なお、第２の実施態様のスクリーニング方法においては、前記核酸構築物と発現核酸構築物とが導入された安定な細胞系を用いる場合、ステップ（Ｉ）は、省略してもよい。
【００７６】
ついで、ステップ（ＩＩ）において、前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞と、被検物質とを接触させる。
【００７７】
ステップ（ＩＩ）は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞を培養すること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に細胞をさらすこと、細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。
【００７８】
その後、ステップ（ＩＩ）で得られた細胞における前記レポーター遺伝子の発現の有無又は発現の変動を測定する。なお、対照として、前記（４）の核酸構築物と前記（５）の発現用核酸構築物とを保持した細胞であり、かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、被検物質にさらされていない細胞、あるいは細胞抽出液等が用いられうる。
【００７９】
レポーター遺伝子の発現は、用いられたレポーター遺伝子に応じて、その産物の発現を調べることにより測定される。例えば、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等の酵素遺伝子である場合、酵素活性を調べればよい。また、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、１２５Ｉ等の放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法、ウェスタンブロット法及び免疫組織染色等も例示される。
【００８０】
被検物質と接触させた細胞において、レポーター遺伝子の発現が完全に抑えられる場合、該物質はＲＯＲ核内受容体又はＲＯＲ核内受容体に対する応答性エレメントの機能を阻害する物質であり、当該物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であると言える。レポーター遺伝子の発現が見られる場合は、対照の細胞に比べて、被検物質と接触させた細胞において、レポーター遺伝子の発現レベルが変動（特に増加）した場合、当該物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であると言える。
【００８１】
本発明のスクリーニング方法の第３の実施態様としては、〔１〕記載の（１）又は（３）の因子が内在的に発現している細胞と被検物質とを接触させ、前記（１）又は（３）の因子の発現の変動をタンパク質レベル又は核酸レベルで検出し、それにより、前記（１）又は（３）の因子の発現の変動（特に増加）をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択する方法が挙げられる。
【００８２】
前記（１）のＲＯＲ核内受容体の発現変動を指標とする場合のスクリーニング方法としては、
（Ｉ）内在的にＲＯＲ核内受容体を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における該ＲＯＲ核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、該核内受容体の発現の変動（特に増加）をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ、
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、ＲＯＲ核内受容体の発現の変動を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、細胞レベルにおいてＲＯＲ核内受容体の発現を転写レベルで調節（特に促進）するという特徴的な性質を有し、ＲＯＲ核内受容体の機能を阻害することなくＲＯＲ核内受容体の発現を特異的に調節（特に促進）することができるという優れた効果を発揮する。
【００８３】
前記（３）の補助因子の発現の変動を指標とする場合のスクリーニング方法としては、
（Ｉ）内在的にＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞におけるＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる補助因子の発現の変動を測定し、それにより、該補助因子の発現の変動（特に増加）をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ、
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記補助因子の発現の変動を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、ＲＯＲの転写複合体を構成するいずれかの因子に作用するという優れた効果を発揮する。
【００８４】
内在的に〔１〕記載の（１）又は（３）の因子を発現している細胞としては、マウス由来株細胞の３Ｔ３−Ｌ１（繊維芽細胞、ＡＴＣＣ：ＣＬ−１７３）、ラット由来株細胞のＬ６〔骨格筋由来筋芽細胞〕が挙げられる。
【００８５】
〔４〕及び〔５〕記載のステップ（Ｉ）において、細胞と被検物質の接触は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、内在的に〔１〕記載の（１）又は（３）の因子を発現している細胞を培養すること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に内在的に前記（１）又は（３）の因子を発現している細胞をさらすこと、内在的に前記（１）又は（３）の因子を発現している細胞の細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。
【００８６】
なお、対照として、内在的に〔１〕記載の（１）又は（３）の因子を発現している細胞であり、かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、被検物質を含まないＰＢＳ等の緩衝液にさらされた内在的に前記（１）又は（３）の因子を発現している細胞、被検物質を含まない、内在的に前記（１）又は（３）の因子を発現している細胞の細胞抽出液等を用いうる。
【００８７】
〔４〕及び〔５〕記載のステップ（ＩＩ）において、ステップ（Ｉ）で使用された細胞における前記（１）及び（３）の因子の発現の変動は、タンパク質レベルでは、例えば、前記ステップ（Ｉ）で得られた細胞における前記（１）及び（３）の因子の発現レベルと、対照の細胞における前記（１）及び（３）の因子の発現レベルとを、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；前記（１）及び（３）の因子に対する抗体又はその断片のそれぞれを用いたウエスタンブロット解析；前記抗体又はその断片を用いたイムノアッセイ等により測定し、比較することにより評価されうる。また、前記（１）及び（３）の因子の発現の変動は、核酸レベルでは、例えば、被検物質との接触後の細胞から、核酸を抽出し、得られた核酸を、例えば、前記（１）及び（３）の因子をコードした各核酸を検出しうる核酸、すなわち、前記（１）及び（３）の因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸を用いたハイブリダイゼーション；前記（１）及び（３）の因子の因子をコードした各核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、比較することにより評価されうる。
【００８８】
ここで、対照の細胞に比べて、被検物質と接触させた細胞において、前記（１）及び（３）の因子の発現レベルが変動（特に増加）した場合、当該被検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。
【００８９】
その他のスクリーニング方法としては、ＲＯＲ核内受容体とLXXLL（Leu-X-X-Leu-Leu）配列を含むタンパク質又はペプチドとの結合の有無を検出する方法も挙げられる（Xは任意のアミノ酸）。前記「ＲＯＲ核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させ得る補助因子」の中の補助転写活性化因子の多くはLXXLL配列を共通して持つこと、この配列部分と核内受容体とが結合することが知られている。
【００９０】
ＲＯＲ核内受容体が、アゴニストと結合する場合、LXXLL配列を含む前記補助因子と結合する。例えば、ＲＯＲ核内受容体と、LXXLL配列を含むタンパク質又はペプチドと、非検物質とを接触させる実験において、ＲＯＲ核内受容体とLXXLL配列を含むタンパク質又はペプチドとの結合が検出された場合、非検物質はＲＯＲ核内受容体のアゴニストとして働く物質となり得る。
【００９１】
また、ＲＯＲ核内受容体が、アンタゴニストと結合する場合、LXXLL配列を含む前記補助因子と結合することができない。例えば、ＲＯＲ核内受容体とそのアゴニストと、LXXLL配列を含むタンパク質又はペプチドとを結合させた状態で非検物質を加える実験において、ＲＯＲ核内受容体とLXXLL配列を含むタンパク質又はペプチドの結合の解離が検出された場合、非検物質はＲＯＲ核内受容体のアンタゴニストとして働く物質となり得る。
【００９２】
このように、結合の有無を調べることで、ＲＯＲ核内受容体のアゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングができ、これらのＲＯＲ核内受容体の機能を調節する非検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補物質となり得る。
【００９３】
なお、本発明のスクリーニング方法において、因子の動態を測定又は検出するための抗体としては、前記（１）又は（３）の因子それぞれに対する抗体、その断片等が挙げられる。前記抗体の作製方法は、例えば、1992年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（John Weily & Sons, Inc）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（John E. Coligan ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Current Protocols in Immunology ）に記載の方法により、前記（１）又は（３）の因子の全部又は一部を用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。前記抗体は、前記（１）又は（３）の因子に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、前記（１）又は（３）の因子中における特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。
【００９４】
ＲＯＲα又はＲＯＲγを認識するポリクローナル抗体の作製は、ＲＯＲα又はＲＯＲγのポリペプチドの全長、その部分ペプチド若しくは該部分ペプチドを含むポリペプチドを抗原として哺乳動物に投与することにより抗体を作製することができる。抗原とは、前記ポリペプチド又は部分ペプチドをそのまま用いてもよく、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）やウシチログロブリン（ＢＴＧ）等に結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）及び不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター等を用いることができる。
【００９５】
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）(Cold Spring Harber Laboratory Press)〕等に従って作製することができる。
【００９６】
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
【００９７】
前記抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔「酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）」  医学書院刊（１９７６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）(Cold Spring Harber Laboratory Press)〕等に記載の方法で確認することができる。
【００９８】
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）(Cold Spring Harber Laboratory Press)〕又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラム等の各種クロマトグラフィーを単独又は組み合わせることで行うことができる。
【００９９】
ＲＯＲ核内受容体を認識するモノクローナル抗体は、例えば、十分な抗体価が得られた免疫哺乳動物から、脾臓又はリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得、得られたハイブリドーマを用いて慣用の方法により目的の抗体を生産させることにより得られうる。
【０１００】
具体的には、ＲＯＲ核内受容体、その部分ペプチド若しくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを抗原として投与して、十分な抗体価を示したラットに、前記抗原を最終投与する。その後、３〜７日目に、ラットから、脾臓を摘出する。得られた脾臓を、ＭＥＭ培地（例えば、日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。得られた沈殿分画中の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して、赤血球を除去する。その後、得られた脾細胞を、ＭＥＭ培地で３回洗浄する。得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【０１０１】
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから由来の株化細胞が挙げられる。かかる骨髄腫細胞としては、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す)〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等が挙げられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ  ８−アザグアニンを含む正常培地〔１．５ｍＭ  グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ジェンタマイシン及び１０％  ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）〕で継代し、細胞融合を行なう３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０７個以上用いる。
【０１０２】
細胞融合は、既知の方法で行なわれ得、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）〕に従って行なわれうる。具体的には、前記抗体産生細胞と前記骨髄腫細胞とを、ＭＥＭ培地又はＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３ｇ  リン酸二ナトリウム、０．２１ｇ  リン酸一カリウム、７．６５ｇ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０８個当たり、ポリエチレングリコール溶液〔２ｇ  ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ  ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）〕０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０−４Ｍ  ヒポキサンチン、１．５×１０−５Ｍ  チミジン及び４×１０−７Ｍ  アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし、懸濁する。
【０１０３】
得られた懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）(Cold Spring Harber Laboratory Press)〕等に記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、ＲＯＲ核内受容体に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
【０１０４】
前記ハイブリドーマによる抗体の生産は、慣用の方法により行なわれうる。
【０１０５】
なお、本発明のスクリーニング方法において、因子の動態を測定又は検出するための核酸としては、前記（１）又は（３）の各因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸等が挙げられる。前記（１）又は（３）の各因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸としては、例えば、前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（３）の補助因子をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（３）の補助因子をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１及び３からなる群より選ばれた核酸、配列番号：８〜１１からなる群より選ばれた核酸、それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。
【０１０６】
前記（１）又は（３）の各因子をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸及び前記（３）の補助因子をコードした核酸それぞれの５'末端に対応するプライマーと３'末端に対応するプライマーとからなるプライマー対；前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列及び前記（３）の補助因子をコードした核酸に特徴的な部分配列それぞれの５'末端に対応するプライマーと３'末端に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１及び３からなる群より選ばれた配列を、核酸増幅を介して検出できるプライマー対等が挙げられる。なお、かかるプライマー対は、前記配列番号：１及び３の配列の全部又はその特徴的な部分配列を増幅可能なものであればよい。より具体的には、例えば、配列番号：１２、１４、１６及び１８からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１３、１５、１７及び１９からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。プライマー対の具体例としては、特に限定されないが、配列番号：１２と１３とのプライマー対、配列番号：１４と１５とのプライマー対、配列番号：１６と１７とのプライマー対、配列番号：１８と１９とのプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光色素による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。
【０１０７】
本明細書において、「（核酸に）特徴的な部分配列」とは、例えば、データベースに登録された配列のうち、前記（１）又は（３）の因子を除くものの塩基配列には、見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、２０％以下、好ましくは、１０％以下、より好ましくは、５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。
【０１０８】
本発明のスクリーニング方法により得られる化合物又はその塩としては、例えば、前記（１）〜（３）の因子の少なくとも１つに結合することにより、該因子の少なくとも１つの機能を阻害する化合物、例えば、低分子化合物、高分子化合物、該（１）又は（３）の各因子に対する各抗体、該（１）又は（３）の各因子をコードする各核酸及び該（２）のアンチセンス鎖等の核酸、ペプチド等が挙げられる。
【０１０９】
本発明のスクリーニング方法に用いられる前記（１）〜（３）の各因子、該（１）又は（３）の各因子をコードする各核酸、該核酸を保持した細胞等は、本発明のスクリーニング方法を行なうためのキットとしても提供される。したがって、このようなスクリーニング用キットも本発明に含まれる。
【０１１０】
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
前記〔２〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ〔１〕記載の（１）〜（３）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット；
〔３〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ〔３〕記載の（４）及び（５）の核酸構築物を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット；
〔４〕又は〔５〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ前記（１）又は（３）の因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット；
〔４〕又は〔５〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ前記（１）又は（３）の因子が内在的に発現している細胞を含有してなる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット
等が挙げられる。
【０１１１】
本発明のスクリーニング用キットは、検出用試薬、緩衝液、標準物質、標準曲線等をさらに含有してもよい。
【０１１２】
本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法を、簡便に、かつ迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができるという優れた効果を発揮する。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、前記（１）〜（３）の各因子の機能に対する作用機序に基づく作用、前記（１）〜（３）の各因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予防作用を発揮しうる。したがって、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、前記（１）〜（３）の各因子の機能に関連する疾患、特に糖尿病の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、本発明の医薬組成物は、前記（１）〜（３）の各因子の機能に関連する疾患、該機能に関連して発症する疾患に対して、該因子の機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。また、本発明の医薬組成物によれば、糖尿病、特に、前記（１）〜（３）の各因子、例えば、ＲＯＲαの機能に関連して発症する糖尿病に対して、該機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の医薬組成物によれば、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲγ）を活性化させることに基づくチアゾリジンジオン化合物とは異なる作用機序によりインスリン抵抗性を改善することができるという優れた効果を発揮する。
【０１１５】
本発明の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。
【０１１６】
本発明の医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。
【０１１８】
また、本発明の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
【０１１９】
本発明の医薬組成物の薬理評価は、例えば、インスリン抵抗性モデル動物、例えば、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔに、本発明の医薬組成物を投与し、非投与動物に比べ、投与動物において、インスリン抵抗性の改善が見られた場合を指標として評価する方法；グルコースクランプ試験法等により行なわれうる。
【０１２０】
本発明によれば、インスリン抵抗性モデルラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ）において、インスリン抵抗性を改善させた場合、改善前よりも、ＲＯＲα又はＲＯＲγの発現が、増加し、さらに、培養細胞において該ＲＯＲα又はＲＯＲγを強制発現させることにより、グルコース取り込み能が低下するという知見に基づき、糖尿病の診断方法が提供される。
【０１２１】
本発明の糖尿病の診断方法は、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲＯＲ核内受容体遺伝子、すなわち、前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルを測定することを１つの特徴とする。したがって、本発明の診断方法によれば、糖尿病、具体的には、糖尿病、特に、ＲＯＲ核内受容体、例えば、ＲＯＲαの機能に関連して発症する糖尿病を、簡便に、迅速に、診断することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の診断方法によれば、高い信頼性で診断することを可能にする。
【０１２２】
本発明の診断方法においては、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検対象の個体が、糖尿病に罹患している疑いがあることの指標となる。
【０１２３】
前記個体としては、ヒト、マウス、ラット、サル等が挙げられる。
【０１２４】
核酸含有被検試料は、例えば、個体の組織、細胞、血液等から慣用の手法により調製されうる。
【０１２５】
前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルは、前記（１）の核内受容体の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量又は前記（１）の核内受容体の遺伝子産物の量を指標として測定されうる。
【０１２６】
ｍＲＮＡ転写物の量を指標とする場合、被検対象の個体由来の核酸含有被検試料及び正常個体由来の核酸含有対照試料のそれぞれを、例えば、前記（１）の核内受容体をコードした核酸を検出しうる核酸、すなわち、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特異的に結合する核酸を用いたハイブリダイゼーション、あるいは前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、比較することにより評価されうる。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションに用いられる核酸としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１及び３からなる群より選ばれた核酸、配列番号：８〜１１からなる群より選ばれた核酸、それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。
【０１２８】
ＰＣＲに用いられるプライマー対としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸の５'末端に対応するプライマーと３'末端に対応するプライマーとからなるプライマー対、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の５'末端に対応するプライマーと３'末端に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１及び３からなる群より選ばれた配列を、核酸増幅を介して検出できるプライマー対等が挙げられる。より具体的には、例えば、配列番号：１２、１４、１６及び１８からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１３、１５、１７及び１９からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。
【０１２９】
遺伝子産物の量を指標とする場合、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料のそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、前記（１）の核内受容体に対する抗体又はその断片を用いたウエスタンブロット解析；前記抗体又はその断片を用いたイムノアッセイ等に供し、遺伝子産物量を測定し、比較することにより評価されうる。
【０１３０】
また、本発明によれば、本発明の診断方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうために、前記プローブ及び／又はプライマー対を含有した診断用キット、又は前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を含有した診断用キットが提供される。
【０１３１】
本発明の診断用キットには、検出用試薬、緩衝液、対照試料等をさらに含有してもよい。
【０１３２】
さらに、本発明によれば、糖尿病、特に、ＲＯＲ核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、ＲＯＲαの機能に関連して発症する糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法も提供される。
【０１３３】
本発明の検出又は選別方法によれば、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料を、簡便、迅速に、高い信頼性で検出することができる。
【０１３４】
本発明の検出又は選別方法は、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおける前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも低くなる場合、該被検試料が、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる。
【０１３５】
本発明の検出又は選別方法においては、発現レベルは、前記（１）の核内受容体の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量、又は前記（１）の核内受容体の遺伝子産物の量を指標として測定されうる。
【０１３６】
ｍＲＮＡ転写物の量又は遺伝子産物の量の測定は、前記プローブ及び／又はプライマー対、あるいは前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を用いることにより実施されうる。
【０１３７】
また、本発明によれば、本発明の検出又は選別方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうために前記プローブ及び／又はプライマー対を含有した診断用キット、又は前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を含有した検出用キットが提供される。
【０１３８】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。
【実施例１】
【０１３９】
病態改善をおこなった糖尿病モデルラットの作成
インスリン抵抗性モデル動物について、（ａ）インスリン抵抗性改善剤であるピオグリタゾンの投与〔ピオグリタゾン投与群〕（2匹）、（ｂ）非投与〔コントロール群〕（2匹）、（ｃ）食餌制限〔食餌制限群〕（2匹）、（ｄ）食餌制限と運動負荷との組み合わせ〔食餌制限＋運動負荷群〕（2匹）、（ｅ）通常飼育〔コントロール群〕（2匹）による処理を行なった。
【０１４０】
インスリン抵抗性モデル動物として、Zucker Fattyラット（J.Hered, 52，275-278（1961））（塩野義製薬株式会社油日ラボラトリーズAC部門育成供給、10齢）を用いた。飼育温度24±１℃湿度55±5％ 照明期間12時間（8時から20時）の飼育条件の下、自由に摂餌飼育した。
【０１４１】
前記（ａ）のピオグリタゾン投与群については、ピオグリタゾン（武田薬品社製、商品名：アクトス）20 mg/kgラット体重を、１日あたり、１回投与した。上記と同じの飼育条件の下、3週間、飼育した。
【０１４２】
前記（ｃ）の食餌制限群については、Zucker Fattyラットに、一日摂餌量の70％相当量のみを摂餌させた。期間は5週間とした。上記と同じ条件の下、飼育した。
前記（ｄ）の食餌制限＋運動負荷群については、食事制限に加えトレッドミルを用いて運動負荷を行った。運動負荷条件は15 ml/min×15min のwarming-up、20 ml/min×60min、15 ml/min×15min cool-downとした。期間は５週間とした。
【０１４３】
インスリン抵抗性の改善は、グルコースクランプ試験を行ない、グルコース注入量の増加をインスリン抵抗性が改善したことの指標とした。
【実施例２】
【０１４４】
インスリン抵抗性モデルラットにおけるRORγ ｍＲＮＡの発現
RORγは、脂肪細胞で発現していることが知られている。したがって、前記（ａ）〜（ｅ）の各処理群及びコントロール群について、RT-PCRによりZucker Fattyラットの脂肪組織におけるRORγ遺伝子の発現量比較をおこなった（図１）。
【０１４５】
また、8週齢（各２匹）、10週齢（各２匹）、12週齢（各２匹）、13週齢（各1匹）、14週齢（各２匹）、17週齢（各1匹）のZucker leanラットとZucker Fattyラットの脂肪組織におけるRORγの発現量比較をおこなった（図２）。
【０１４６】
ラットの脂肪組織より、TRIzol試薬（インビトロジェン社）を用いて、添付マニュアルに従いTotal RNAを抽出し、50 μｇのTotal RNAを得た。このRNAをRNeasy mini kit  （キアゲン社）にて添付マニュアルに従いDNase Ｉ（キアゲン社）処理した後、回収した。得られたTotal RNA 2 μgよりSuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCR（インビトロジェン社）を用いて添付マニュアルに従い、cDNAを合成した。次に、ラットRORγ（Genebank accession No.H33887） とラットβ-actin（Genebank accession No.NM-031144）の配列をもとにプローブ検索ソフトPrimer Express（アプライドバイオシステムズ社）によりリアルタイム定量PCR用プライマーを選択した。ラットRORγのPCR用プライマーとして配列番号：14と15とのプライマー対を、ラットβ-actinのPCR用プライマーとして配列番号：20と21とのプライマー対を選択した。プライマーはキアゲン社に合成を依頼した。このプライマーを用いて、合成したcDNAを鋳型としてSYBR Green Iによるリアルタイム定量PCRを行いmRNA量を定量した。
【０１４７】
反応試薬としてはQuantiTect SYBR Green PCR kit （キアゲン社）を使用し、95℃で15分間反応した後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の反応を40サイクル行って定量した。PCR反応、及び蛍光測定はABI PRISM 7000 Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ社）にて行った。図1、図2のグラフはβ-actinで補正したRORγの発現量を相対値で示した。リアルタイム定量PCRでは、増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一種類のみ増幅されていることを確認した。
【０１４８】
実験の結果、インスリン抵抗性モデルラット脂肪組織において、食餌制限と運動負荷によりインスリン抵抗性が改善されるとRORγの発現が増大することが確認された（図1）。また、正常ラットの方がインスリン抵抗性モデルラットより発現量が多いことか確認された（図2）。以上から、インスリン抵抗性になるにしたがって、RORγの発現量が減少することから、RORγがインスリン抵抗性に関わる可能性を示唆した。
【実施例３】
【０１４９】
ヒトRORα及びRORγを用いたレポーターアッセイ
ヒトRORの機能解析を行うために、遺伝子クローニングと発現ベクターの構築をおこなった。ヒトRORα遺伝子を含むESTクローン（IMAGE:4110795）（インビトロジェン社）を鋳型にORF領域をPCRにより増幅し、pENTER/D-TOPOベクター（インビトロジェン社）にクローニングした。また、ヒト骨格筋 Human Marathon -Ready cDNA（クロンテック社）よりヒトRORγ遺伝子をPCRにより増幅し、pENTER/D-TOPOベクターにクローニングした。ヒトRORα遺伝子とヒトRORγ遺伝子をレトロウィルスベクターpCLX（IMGENEX社）に組み込み、pCLX-hRORαとpCLX-hRORγを構築した。
【０１５０】
RORの機能を確認するためのレポーターベクターの構築をおこなった。RORレスポンスエレメントとして、Rev-DR2（Mol Cell Biol. 15（9）:4791-802）を用い、オリゴDNA（配列番号：22及び23）の合成をおこなった。その後、オリゴDNAをアニーリングし、pGL3（プロメガ社）のBgl II部位に挿入した。以後、このレポーターベクターをpGL3-Rev
-DR2と呼ぶ。
【０１５１】
L6-GLUT4myc細胞（トロントのThe Hospital for Sick Children 所属 Philip Bilan博士より入手）はα-MEM（インビトロジェン社）/10% FBS（Hyclone  Laboratories社）/1X Antibiotic-Antimycotic（インビトロジェン社）を培地として、37℃、5% CO2で培養した。L6-GLUT4myc細胞を24wellプレートに3×104個/wellで撒き込み、一晩培養後、FuGENETM6 トランスフェクション試薬（ロッシュ社）を用いてトランスフェクションした。（ａ）pCLX（200ng）/pGL3-DR2（150 ng）/pRL-TK（プロメガ社）（2 ng）、（ｂ）pCLX（100 ng）/pCLX-hRORα（100 ng）/pGL3-DR2（150 ng）/pRL-TK（2 ng）、（ｃ）pCLX（100 ng）/pCLX-hRORγ/pGL3-DR2（150 ng）/pRL-TK（2 ng）の（ａ）〜（ｃ）のプラスミド混合液にそれぞれFuGENETM6試薬を1.2 μl、OPTI-MEM Ｉ Reduced-Serum Medium （インビトロジェン社）20μlを加えてFuGENETM6の添付プロトコールに従い、トランスフェクションした。２晩培養後、細胞をピッカジーンデュアル・シーパンジー（東洋インキ製造社）の細胞溶解液で溶解し、ピッカジーンデュアル・シーパンジーの添付プロトコールに従い、ルーマットLB9501（ベルトールド社）を用いて、ホタルルシフェラーゼの発光を10秒間測定し、続けて、シーパンジールシフェラーゼの発光を10秒間測定した。サンプル間の補正はシーパンジールシフェラーゼの測定値でおこなった。
【０１５２】
RORによる転写活性化能を図3に示す。RORα又はRORγを発現させることによりRORによる転写活性可能を確認できた。
【実施例４】
【０１５３】
コレステロールによるRORαとRORγの活性化能の検討
L6-GLUT4myc細胞を24wellプレートに3×104個/wellで撒き込み、一晩培養後、FuGENETM6を用いてトランスフェクションした。（ａ）pCLX（300 ng） /pGL3-DR2（50 ng）/pRL-TK（2 ng）、（ｂ）pCLX-hRORα（300 ng）/pGL3-DR2（50 ng）/pRL-TK（2 ng）、（ｃ）pCLX-hRORγ（300 ng）/pGL3-DR2（50 ng）/pRL-TK（2 ng）の（ａ）〜（ｃ）のプラスミド混合液にそれぞれFuGENETM6試薬を1.2 μl、OPTI-MEM  Ｉ Reduced-Serum Medium （インビトロジェン社）20μlを加えてFuGENETM6の添付プロトコールに従い、トランスフェクションした。トランスフェクション後、α-MEM/10% FBSで４時間培養し、さらにα-MEM、10% Lipoprotein-deficient Fetal Calf Serum（シグマ社）/10mM HPCD（シグマ社）/5 μM Lovastatine（シグマ社）で４時間培養後、α-MEM/10% Lipoprotein-deficient Fetal Calf Serum/5 μM Lovastatineに終濃度10 μM コレステロール（シグマ社）になるように添加したものと未添加のもので、２日間、培養した。細胞をピッカジーンデュアル・シーパンジーの添付プロトコールに従い、ルーマットLB9501でホタルルシフェラーゼ及びシーパンジールシフェラーゼの発光を10秒間測定した。サンプル間の補正はシーパンジー・ルシフェラーゼの測定値でおこなった。
【０１５４】
実験の結果、RORαとRORγはコレステロールにより活性化され、転写活性化能が増大することが明らかになった（図4）。
【実施例５】
【０１５５】
ROR過剰発現3T3-L1細胞における脂肪細胞関連遺伝子の発現変動
293EBNA細胞（インビトロジェン社）はD-MEM（シグマ社）/10% FBS/1X Antibiotic-Antimycoticを培地として、37℃、5% CO2で培養した。10 cmシャーレに4× 106個の細胞を撒き、一晩培養後、リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションした。（ａ）pCLX（5μg）/pCL-Ampho（IMGENEX社）（1μg）、（ｂ）pCLX-hRORα（5μg）/pCL-Ampho（1μg）、（ｃ）pCLX-hRORγ（5μg）/pCL-Ampho（1μg）のプラスミド溶液と30μlのリポフェクトアミン2000試薬をそれぞれ混和し、リポフェクトアミン2000試薬の添付プロトコールに従い、トランスフェクションした。2日後の培養上清を0.45μm フィルター Millex-HA（ミリポア社）でろ過し、その濾液をレトロウィルス液として用いた。
【０１５６】
3T3-L1細胞はD-MEM（High Glucose）（インビトロジェン社）/10% FBS（Hyclone  Laboratories社）の培地で37℃、5％CO2で培養した。感染当日に50％コンフルエントになるように6wellプレートに3T3-L1細胞（ATCC  No.CL-173）を前日まき込み、各レトロウィルス液（コントロール用、RORα発現用、RORγ発現用）と終濃度10 μg/mlになるようにポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）（シグマ社）を添加し、6 時間感染させた。培地を交換後、コンフルエント寸前で、6 wellプレートに5×104個/ウェルで捲き込んだ。コンフルエント後、さらに2日間培養し、培地に終濃度 4μg/ml Insuline （シグマ社）、500μM IBMX（3-Isobutyl-1-methylxanthine）（シグマ社）、25μM Dexamethasone（ナカライテスク社）になるように薬剤を添加したものに交換し、3日間培養した。さらに、培地に終濃度4μg/ml Insulineを添加したものに交換して6日間培養した。
【０１５７】
細胞をPBS（−）（シグマ社）で洗浄後、1 ml のTRIzol試薬（インビトロジェン社）で溶解し、プロトコールにしたがってtotal RNAを精製した。RT反応 はSuperScript FirstStrand System（インビトロジェン社）の方法に従い行なった。Total RNA 5μgを材料に、SuperScript First-strand Synthesis System for RT-PCRを用いて添付マニュアルに従い、cDNAを合成した。次に、マウスC/EBPα（Genebank accession No. XM-133376）、マウスPPARγ（Genebank accession No.U09138)、マウスAdiponectin（Genebank accession No. NM-009605）、マウスGAPDH（Genebank accession No.M32599）の配列をもとにプローブ検索ソフトPrimer Expressによりリアルタイム定量PCR用プライマーを選択した。マウスC/EBPαのPCR用プライマーとして配列番号：24と25とのプライマー対、マウスPPARγのPCR用プライマーとして配列番号：26と27とのプライマー対、マウスAdiponectinののPCR用プライマーとして配列番号：28と29とのプライマー対、マウスGAPDHののPCR用プライマーとして配列番号：30と31とのプライマー対を選択した。プライマーはキアゲン社に合成を依頼した。このプライマーを用いて、合成したcDNAを鋳型としてSYBR Green Iによるリアルタイム定量PCRを行いｍRNA量を定量した。
【０１５８】
反応試薬としてはQuantiTect SYBR Green PCR kit を使用し、95℃で15分間反応した後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で1分の反応を40サイクル行って定量した。PCR反応、及び蛍光測定はABI PRISM 7000 Sequence Detection Systemにて行った。サンプル間の補正はGAPDHの発現量で補正し、各遺伝子の発現量を相対値で表した。
【０１５９】
実験の結果、ROR過剰発現により、脂肪細胞の分化及び機能に関わる遺伝子であるC/EBPα及びPPARγとインスリン抵抗性を改善するadiponectinの発現量が減少することが明らかになった（図5）。これは、RORにより、脂肪細胞分化に必要な遺伝子の発現量が減少したために、分化が抑制され、その結果、脂肪細胞で発現するadiponectinの発現量が減少したと考えられる。よって、RORは脂肪細胞の分化調節に関与していることが考えられる。
【実施例６】
【０１６０】
ROR過剰発現3T3-L1細胞におけるグルコース取り込み能の検討
3T3-L1細胞はD-MEM（High Glucose）、10% FBSの培地で37℃、5％CO2で培養した。感染当日に50％コンフルエントになるように6 wellプレートに3T3-L1細胞（ATCC  No.CL-173）を前日まき込み、各レトロウィルス液（コントロール用、RORα発現用、RORγ発現用）と終濃度10 μg/mlになるようにポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）（シグマ社)を添加し、6時間感染させた。培地を交換後、コンフルエント寸前で、Cytostar-T プレート（アマシャムバイオサイエンス社）に4 ×103個/wellで捲き込んだ。コンフルエント後、さらに2日間培養し、培地に終濃度 4μg/ml Insuline（シグマ社）、500μM IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)（シグマ社）、25μM Dexamethasone（ナカライテスク社）になるように薬剤を添加したものに交換し、3日間培養した。さらに、培地に終濃度4μg/ml Insulineを添加したものに交換して6日間培養した。
【０１６１】
培地をD-MEM（High Glucose）、0.5% BSA（シグマ社）に置換し、一晩、培養した。培地を200μlのHEPES-Krebs buffer ( 119 mM NaCl、4.75 mM KCl、5 mM NaHCO3、2.54 mM CaCl2・2H2O、1.2 mM MgSO4、20 mM HEPES・7H2O（pH 7.4））に置換し、4時間培養後、終濃度0 nM、3 nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nMになるようにInsuline（インビトロジェン社）を添加した。37℃で15分間、インキュベーションし、その後、2-Deoxy-D-[U-14C]glucose（アマシャムバイオサイエンス社）を10μl（0.1 μCi）添加した。37℃で１時間、インキュベーションし、その後、100μMのCytochalasin Bを10μl添加し、放射活性をTopCount（パッカード社製）で測定した。
【０１６２】
実験の結果、ROR過剰発現により、脂肪細胞への分化が抑制され、グルコースの取り込み能を示さないことがわかった（図６）。
【実施例７】
【０１６３】
RORによる3T3-L1細胞の脂肪細胞分化に対する影響
RORによる脂肪細胞分化に対する影響を調べるために、細胞内トリグリセライド量を測定した。細胞内トリグリセライド量はトリグリセライド E-テスト ワコー（和光純薬工業社）で測定した。実施例５で用いた方法と同様に6wellプレートで分化誘導したROR過剰発現3T3-L1細胞を1ml の0.1% SDSで37 ℃、10分間、溶解した。サンプル20 μlに発色試薬 100μlを添加し、37℃、30分間、インキュベーションした。吸光度の測定はマルチスキャンアセント（サーモバイオアナリシス社）を用いて、620 nmの波長でおこなった。
【０１６４】
その結果、ROR過剰発現により細胞内トリグリセライド量が減少した（図7）。以上の結果から、RORは脂肪細胞の分化に抑制的に働いていることが明らかになった。
【実施例８】
【０１６５】
ROR過剰発現骨格筋様細胞L6-GLUT4myc細胞におけるグルコース取り込み能の検討
L6-GLUT4myc細胞（トロントのThe Hospital for Sick Children 所属 Philip Bilan博士より入手）はα-MEM、10% FBSの培地で37℃、5％CO2で培養した。感染当日に２0％コンフルエントになるように6 wellプレートにL6-GLUT4myc細胞を前日まき込み、各レトロウィルス液（コントロール用とRORα発現用）と終濃度10 μg/mlになるようにポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）（シグマ社)を添加し、6時間感染させた。培地を交換後、コンフルエント寸前で、Cytostar-T プレート（アマシャムバイオサイエンス社）に1 ×104個/wellで捲き込んだ。一晩、培養後、培地を100μlのHEPES-Krebs buffer ( 119 mM NaCl、4.75 mM KCl、5 mM NaHCO3、2.54 mM CaCl2・2H2O、1.2 mM MgSO4、20 mM HEPES・7H2O（pH 7.4））に置換し、30分間培養した。バッファーを取り除き、0 nM、6 nM、20 nM、60 nM、200 nM、600 nMのInsuline（シグマ社）を含むHEPES-Krebs bufferを50μl添加した。10分後、0.2 μCi の2-Deoxy-D-[U-14C]glucose（アマシャムバイオサイエンス社）を含むHEPES-Krebs bufferを50 μl添加した。37℃で2時間、インキュベーションし、その後、100μMのCytochalasin Bを含むHEPES-Krebs buffer を10μl添加し、放射活性をTopCount（パッカード社製）で測定した。細胞数補正をするために、細胞をRIPA液（10 mM Tris-HCl,pH7.4/1% NP40/0.1% sodium deoxycholate/0.1% SDS/0.15 M NaCl/1 mM EDTA）で溶解し、BCA Protein Assay Kit （PIERCE社）を用いて、タンパク定量をおこなった。補正値は各ウェルの放射活性値をタンパク量で割り算した。
【０１６６】
実験の結果、RORα過剰発現によりグルコースの取り込み能が増加することがわかった（図８）。
【０１６７】
以上の実施例から、RORは脂肪細胞に対して分化を抑制することから、脂肪細胞分化に関与していることが考えられる。糖尿病では終末分化した脂肪細胞が多く、TNFαなどのインスリン抵抗性分子を産生していることが知られており、RORの機能を調節することで脂肪細胞分化を適正にすることが期待できる。一方、RORαは骨格筋様細胞において、グルコースの取り込み能を増加させることから、血中グルコースの取り込み臓器と知られている骨格筋において、RORの活性化剤がグルコース取り込み能を上昇させることにより血糖値を低下させ、糖尿病治療薬としての可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明により、被験物質存在下におけるＲＯＲ核内受容体の機能調節を測定又は検出する、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング法及びそのキット、該方法により得られる化合物又はその塩を有効成分として含有した医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】図１は、ピオグリタゾン投与群、食餌制限群及び食餌制限＋運動負荷群それぞれのＺｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ脂肪組織におけるＲＯＲγ遺伝子の発現変動結果を示す図である。
【図２】図２は、正常及びインスリン抵抗性ラットの脂肪組織におけるＲＯＲγ発現量の比較を示す図である。
【図３】図３は、ラットＬ６細胞におけるＲＯＲα及びＲＯＲγ遺伝子の転写活性化能の解析結果を示す図である。
【図４】図４は、コレステロールによって活性化されるＲＯＲα及びＲＯＲγ遺伝子の転写活性能の解析結果を示す図である。
【図５】図５は、ヒトＲＯＲα及びＲＯＲγ強制発現細胞での脂肪細胞関連遺伝子の発現量の変動を示す図である。
【図６】図６はヒトＲＯＲα及びＲＯＲγ強制発現細胞（脂肪細胞前駆細胞）でのグルコース取り込み能の解析結果を示す図である。
【図７】図７はヒトＲＯＲα及びＲＯＲγ強制発現細胞での脂肪細胞分化能の解析結果を示す図である。
【図８】図８はヒトＲＯＲα強制発現細胞（骨格筋様細胞）でのグルコース取り込み能の解析結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７０】
配列番号：５は、ＲＯＲ応答性エレメントの配列を示す。（J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):27120-9.参照)
【０１７１】
配列番号：６は、ＲＯＲ応答性エレメントの配列を示す。（J Biol Chem. 2002 Dec 20;277(51):49275-81参照)
【０１７２】
配列番号：７は、ＲＯＲ応答性エレメントの配列を示す。（Genes Dev. 1994 Mar 1;8(5):538-53参照)
【０１７３】
配列番号：８は、ＲＯＲαの検出用プローブ（ヒトＲＯＲα  全長ＯＲＦ）の配列を示す。
【０１７４】
配列番号：９は、ＲＯＲγの検出用プローブ（ヒトＲＯＲγ  全長ＯＲＦ）の配列を示す。
【０１７５】
配列番号：１０は、ＲＯＲαの検出用プローブ（ヒトＲＯＲα 3'領域1401-1700）の配列を示す。
【０１７６】
配列番号：１１は、ＲＯＲγの検出用プローブ（ヒトＲＯＲγ 3'領域1401-1700）の配列を示す。
【０１７７】
配列番号：１２は、ラットＲＯＲα増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１７８】
配列番号：１３は、ラットＲＯＲα増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１７９】
配列番号：１４は、ラットＲＯＲγ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１８０】
配列番号：１５は、ラットＲＯＲγ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１８１】
配列番号：１６は、ヒトＲＯＲα増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１８２】
配列番号：１７は、ヒトＲＯＲα増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１８３】
配列番号：１８は、ヒトＲＯＲγ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１８４】
配列番号：１９は、ヒトＲＯＲγ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１８５】
配列番号：２０は、ラットβ-actin増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１８６】
配列番号：２１は、ラットβ-actin増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１８７】
配列番号：２２は、ＲＯＲ応答性エレメントの配列を示す。
【０１８８】
配列番号：２３は、ＲＯＲ応答性エレメントの配列を示す。
【０１８９】
配列番号：２４は、マウスＣ/ＥＢＰα増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１９０】
配列番号：２５は、マウスＣ/ＥＢＰα増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１９１】
配列番号：２６は、マウスＰＰＡＲγ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１９２】
配列番号：２７は、マウスＰＰＡＲγ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１９３】
配列番号：２８は、マウスＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１９４】
配列番号：２９は、マウスＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１９５】
配列番号：３０は、マウスＧＡＰＤＨ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１９６】
配列番号：３１は、マウスＧＡＰＤＨ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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