(57)【要約】【課題】  医薬候補化合物のスクリーニング、臨床検査、又は環境因子変動の検出に利用でき、さらに機能性物質のバイオリアクターとして利用ができ、製造が簡単で値段が安く、利用できる生理活性物質が多様で、かつ高機能の機能性物質固定化素子を提供する。【解決手段】  ナノメートル単位の網状構造内に機能性物質を包含した薄膜に被覆された固定化素子、ナノメートル単位の孔を有する多孔質固定化素子、及び該薄膜を固定化素子上に形成する方法である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子。
【請求項２】
固定化素子が、多孔質固定化素子である請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項３】
該固定化素子が、溶媒を透過する０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径１〜１００ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子である、請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項４】
該機能性物質が、タンパク質、核酸、脂質、糖、金属触媒、特異的な形状の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項５】
該機能性物質が、Ｐ４５０、グルクロニルトランスフェラーゼ、トリプシン、ペプシン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、脂質、糖、金属触媒、フラーレン、カーボンナノチューブ、ポリロタキサン、カテナンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項６】
網目状構造の薄膜が、有機金属化合物を主成分とするものである、請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項７】
機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子。
【請求項８】
固定化素子が、多孔質固定化素子である請求項７記載の該被覆された固定化素子。
【請求項９】
該固定化素子が、溶媒を透過する０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径１〜１００ｎｍの細孔を有する、多孔質固定化素子である、請求項７記載の被覆された固定化素子。
【請求項１０】
該機能性物質が代謝酵素である、請求項７記載の被覆された固定化素子。
【請求項１１】
該機能性物質が、Ｐ４５０、又はグルクロニルトランスフェラーゼである、請求項１記載の被覆された固定化素子。
【請求項１２】
網目状構造の薄膜が、有機金属化合物を主成分とするものである、請求項７記載の被覆された固定化素子。
【請求項１３】
機能性物質を包含した網目状構造の薄膜、又は機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された多孔質固定化素子が内部に形成されているキャピラリー、カラム管、又はマイクロチップ。
【請求項１４】
固定化素子上に機能性物質を含む網目状構造の薄膜を被覆する方法であって：
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること；該加水分解溶液と、機能性物質を含有する溶液とを混合してゾル溶液を得ること；及び該ゾル溶液に、固定化素子を浸漬し、乾燥させることにより、該固定化素子の表面上に薄膜を形成することを含む、前記薄膜の被覆方法。
【請求項１５】
乾燥温度が０℃〜１２０℃である、請求項１４記載の薄膜の被覆方法。
【請求項１６】
溶媒を透過する０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径１〜１００ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子。
【請求項１７】
請求項１６記載の多孔質固定化素子の製造方法であって：
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること；該加水分解溶液にゲル化の過程で相分離を引き起こす溶媒を混合すること；及び該混合液を熱重合、又は光重合により重合させることを含む、前記製造方法。
【請求項１８】
前記加水分解の反応温度が０〜８０℃であり、かつ反応時間が１０分間〜２４時間である、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
該加水分解溶液に加える相分離を引き起こす溶媒が、トルエン、クロロホルム、又はポリエチレングリコール溶液からなる群から選ばれた少なくとも一種の溶媒である、請求項１７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性物質含有薄膜で被覆された固定化素子、及びその製造方法に関する。詳細に述べると、本発明は、ナノメートル単位の網状構造内に機能性物質を包含した薄膜に被覆された固定化素子、ナノメートル単位の細孔を有する多孔質固定化素子、及び該薄膜を固定化素子上に形成する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、酵素、抗体、又は生理活性物質などの機能性物質を利用して、医薬候補化合物のスクリーニング、診断用データを得るための臨床検査、及び環境因子変動の検出などが行われ、またこれら機能性物質をバイオリアクターとして用い、有用化合物が製造されている。
【０００３】
これらの機能性物質は、効率的、かつ経済的に繰り返し使用するため、又は反応効率及び検出感度・効率を向上させるため、様々な担体に固定して利用されてきた。例えば、機能性物質として幅広く利用されているタンパク質の固定化法を挙げると、不溶性の担体にタンパク質を結合させる担体結合法、酵素を２個以上の官能基を有する試薬と反応させる架橋法、ゲルの微細な格子の中に包み込むか、半透膜性のポリマーの皮膜により被覆する包括法などがある。
【０００４】
該担体結合法には、Glassmeyer, C. K.らのアミノエチルセルロースを担体として、グルタルアルデヒドを用いてトリプシンを固定化する方法があり（非特許文献１）、例えば、生理活性物質を担体上に固定した固定化酵素製剤（特許文献１）や不溶性マトリックス上に固定化されたリパーゼ複合体（特許文献２）などが開発されている。該担体結合法は、共有結合による固定化法なので、酵素が簡単に脱離することは無いが、反応操作が複雑で、比較的激しい処理をするため生物活性作用物質であるタンパク質の高次構造の変化、活性の低下などが起こりやすいという欠点がある。
【０００５】
該架橋法には、Quiocho, F.A.らのグルタルアルデヒドを用いて酵素間にシッフ塩基を形成させて架橋し、カルボキシペプチダーゼＡを固定化する方法があり（非特許文献２）、例えば、カルボン酸エステル結合を有するカップリング剤を無機担体に結合させることにより製造した固定化リパーゼ（特許文献３）、及び生物活性作用物質を有機膜上に固定した基板からなる生体分子スクリーニング用デバイス（特許文献４）などが開発されている。しかし、該架橋法も担体結合法と比較すると簡便ではあるものの、生物活性物質を共有結合を介して行うため、活性の低下が起こりやすいという欠点がある。
【０００６】
さらに、該包括法には、Bernfeld, P.らの、目的の酵素液に、アクリルアミドモノマー、架橋剤、重合促進剤、重合開始剤などを加えて重合させ、トリプシン、アミラーゼなどをゲル内に取り込む方法がある（非特許文献３）。この方法は、担体結合法や架橋法と異なり、生理活性物質と担体とを化学結合させる必要はないので、活性低下が起こり難いという利点があるが、一方、個々の生理活性物質が担体と結合反応していないので強度が低くなりやすいという欠点があった。
【０００７】
また、Ellerbyらにより開発された、アルコキシシランを用いたゾル−ゲル法により、緩衝液に溶解したタンパク質をシリカマトリックス内に包含する方法がある(非特許文献４)。この方法により高次構造と生理活性を保持したまま、生理活性物質を固定してバイオリアクターとして応用することができるが、ゾル−ゲル化反応後、各種用途に応じてゲルの乾燥、粉砕などの処理を行うと、固定化タンパク質などの活性が低下し、また、処理プロセスが煩雑であるといった欠点があった。
【０００８】
これらの固定化法は、これまで記載したように生理活性物質が固定化に適した官能基を有することが必要なため限られたものしか固定できない、固定化操作に多くの反応、精製操作が必要なため、煩雑でコストが高い、又は安定した生理活性物質しか固定できないなどの欠点があった。
【０００９】
このような状況にあって、近年、技術の進歩に伴い、医薬候補化合物のスクリーニング、臨床検査、環境因子変動の検出、及び機能性物質のバイオリアクターとして機能性物質が盛んに利用されるようになっている。また、コンビナトリアルケミストリーなどの進歩に伴い、伝統的な手法によって調製される化合物、及び天然の産物の抽出物などと比べ、医薬候補となり得る化合物の数は著しく増加しており、有用な医薬となる化合物を発見するためにより高効率のスクリーニングが必要となっている。
【００１０】
これらの要望に応えるため、製造が簡単で値段が安く、利用できる生理活性物質が多様で、かつ高機能の機能性物質固定化素子が必要とされている。
【特許文献１】特開平２０００−８３６６３号公報
【特許文献２】特表２００２−５３９７８２号公報
【特許文献３】特開平９−３１３１７９号公報
【特許文献４】特表２００２−５２０６２１号公報
【非特許文献１】Glassmeyer, C. K.et. al, Biochemistry, 1971, 10, 786.
【非特許文献２】Quiocho, F.A. et. al, Proc. Nat. Acad. Sci. 1964, 52,  833
【非特許文献３】Bernfeld, P.et. al, Science,142, 678,1963
【非特許文献４】Ellerby et.al, Science, 1992, 255, 1113-1115
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、医薬候補化合物のスクリーニング、臨床検査、又は環境因子変動の検出に利用でき、さらに機能性物質のバイオリアクターとして利用ができ、製造が簡単で値段が安く、利用できる生理活性物質が多様で、かつ高機能の機能性物質固定化素子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するため研究を行った結果、本発明者らは、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物と機能活性物質とを含むゾル反応溶液を、固定化素子上でゲル化することにより、固定化素子上に、生理活性物質を保持した数ナノメートル(以下、ｎｍと略す。）の空隙を有する網状構造を持つ薄膜を形成できるという知見を得た。
【００１３】
さらに、不安定で細胞外では容易に活性を失う代謝酵素などの生理活性物質をミクロソームに包含させ、該ミクロソームと加水分解性の官能基を有する有機金属化合物とを含むゾル反応溶液を、固定化素子上でゲル化することにより、固定化素子上に、安定的な形態で生理活性物質を含有したミクロソームを保持した数ｎｍの空隙を有する網状構造を持つ薄膜を形成できるという知見を得た。
【００１４】
さらに、本発明者らは、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物を特定の条件下で処理することにより、溶媒を透過する数μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径数ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子を製造できるという知見を得た。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
【００１５】
したがって、本発明は、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子、特に多孔質固定化素子を提供する。
また、本発明は、該固定化素子が、溶媒を透過する０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径１〜１００ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子であることを特徴とする、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子を提供する。
【００１６】
また、本発明は、該機能性物質が、タンパク質、核酸、脂質、糖、薬物等の生理活性物質、金属触媒、特異的な形状の化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、前記被覆された固定化素子を提供する。
また、本発明は、機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子、特に多孔質固定化素子を提供する。
また、本発明は、該固定化素子が、溶媒を透過する数μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径数ｎｍの細孔を有する、多孔質固定化素子であることを特徴とする、機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子を提供する。
【００１７】
また、本発明は、該機能性物質が、Ｐ４５０、又はグルクロニルトランスフェラーゼなどの代謝酵素である、機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された固定化素子を提供する。
また、本発明は、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜、又が機能性物質を含むミクロソームを包含した網目状構造の薄膜で被覆された多孔質固定化素子が内部に形成されているカラム、又はマイクロチップを提供する。
また、本発明は、固定化素子上に機能性物質を含む網目状構造の薄膜を被覆する方法であって：
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること；該加水分解溶液と、機能性物質を含有する溶液とを混合してゾル溶液を得ること；及び該ゾル溶液に、固定化素子を浸漬し、乾燥させることにより、該固定化素子の表面上に薄膜を形成することを含む、前記薄膜の被覆方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、溶媒を透過する０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径１〜１００ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子を提供する。
また、本発明は、前記多孔質固定化素子の製造方法であって：
加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解すること；該加水分解溶液にゲル化の過程で相分離を引き起こす溶媒を混合すること；及び該混合液を熱重合、又は光重合により重合させることを含む、前記製造方法を提供する。
【００１９】
本明細書で用いる用語「固定化素子」とは、機能性物質を含む網目状構造の薄膜を被覆する構造体（支持体）を意味する。特に断らない限り、該用語「固定化素子」を単独で用いる場合、被覆されていない構造体を意味し、機能性物質を含む網目状構造の薄膜で被覆されている場合、「被覆された固定化素子」と記載する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、医薬候補化合物のスクリーニング、臨床検査、又は環境因子変動の検出に利用でき、さらに機能性物質のバイオリアクターとして利用ができ、製造が簡単で値段が安く、利用できる生理活性物質が多様で、かつ高機能の機能性物質固定化素子が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（固定化素子）
本発明で用いる機能性物質の固定化素子は、機能性物質を包含した網目状構造の薄膜で被覆できるものであれば、特に限定されない。また、その形状は、使用目的に合わせ特に制限なく選択することができる。例えば、使用目的に応じた大きさを有するタブレット状粒子、又はビーズ状粒子などの定型又は非定型粒子、平坦な又は多孔質部を設けた基板上の規定領域、基板に形成された円筒形などの凹部の、平坦な又は多孔質部を設けた内壁面などを、該薄膜を被覆する固定化素子として用いることができる。また微細加工技術を利用して作製される微小空間内での利用も可能である。
【００２２】
また、固定化素子の材質は、表面に前記網目状構造の薄膜を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、該固定化素子が定型又は非定型粒子である場合、シリコン、シリカ、石英、ガラス、多孔質ガラス、炭素、活性炭、アルミナ、チタニア、酸化タンタル、ゲルマニウム、窒化シリコン、ゼオライト、及び有機ポリマー化合物などを使用することができる。
【００２３】
また、固定化素子が基板の規定領域、又は基板に形成された凹部の内壁である場合、ガラス、セラミックス、ポリマー、又は各種多孔質材料と組み合わせて用いることができる。該ポリマーの例を挙げると、ポリスチレン、ポリ（テトラ）フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルエチレン、ポリエチレンイミン、ポリビニルフェノール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリイミド、及びこれらのブロックコポリマーがある。本発明の固定化素子は、その使用目的に応じて、前記材料から常法で製造することができる。
【００２４】
本発明の多孔質固定化素子は、溶媒が容易に通過する空隙、及び該空隙を構成する粒子、又は壁に表面積を広げる微細な凹凸を有することが好ましい。特に好ましいのは、溶媒を透過する数μｍ、例えば０．１〜１０μｍ、好ましくは０．３〜６μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径数ｎｍ、例えば直径１〜１５０ｎｍ、好ましくは直径１〜１００ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子である。また、使用する機能性物質と被覆する薄膜の性質により異なってくるが、該多孔質固定化素子の空隙率は４０〜９５％、特に５０〜９０％であるのが好ましく、該多孔質構造による表面積は１ｇ当たり５０〜１，０００ｍ２、特に１００〜８００ｍ２であるのが好ましい。
【００２５】
該多孔質固定化素子は、図１の写真に示すように溶媒を透過する数μｍの空隙を有する多孔性構造を有し、さらに拡大すると図２に示すように、多孔性構造の表面に極めて多くの直径数ｎｍの窪み(ｎｍ細孔）を有する。したがって、該多孔質固定化素子の表面積は極めて大きく、該表面上を機能性物質を含む薄膜で被覆することにより、機能性物質による反応を効率的に行うことができる。
【００２６】
該多孔質固定化素子は、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、及び／又は、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解し、かつ重合して得られた重合体を含むものである。
【００２７】
該有機金属化合物には、ケイ素、チタン、ジルコニウム、及びアルミニウムからなる群から選ばれる金属を含む有機金属化合物があり、特にケイ素を含む有機金属化合物が好ましい。本発明では、これらを単独で、又は組み合わせて用いることができる。
該加水分解性の官能基を有する有機金属化合物の例を挙げると、下記一般式（１）で表される金属アルコキシドがある。また、少なくとも１個の金属−炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物の例を挙げると、一般式（２）〜（４）で表される金属アルコキシドがある。これらの金属アルコキシドを単独で、又は組み合わせて使用することができる。
【００２８】
【化１】
2005102574.tif 000002
【００２９】
【化２】
2005102574.tif 000003
【００３０】
【化３】
2005102574.tif 000004
【００３１】
【化４】
2005102574.tif 000005
【００３２】
これらの式中、Ｒ１〜Ｒ４は、メチル基、エチル基、プロピル基、アリル基、アルキルメタクリル基、アリルメタクリル基、アルキルスルホニル基、アリルスルホニル基、アリルアミノ基、又はアルキルアミノ基などを表す。
本発明の多孔質固定化素子は、特にテトラメトキシシランの重合体、テトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランとの共重合体、又はテトラエトキシシラン、メタクリル酸３−トリメキシシリルプロピルの重合体で構成するのが好ましい。前記多孔質固定化素子は、次のように作製することができる。
【００３３】
先に記載した、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物（以下、有機金属化合物という。）を加水分解する。
該加水分解には、塩酸、硫酸、トシル酸、陽イオン交換樹脂等の酸触媒、アンモニア、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、陰イオン交換樹脂等の塩基性触媒等を用いて、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等の有機溶媒；又はこれらの混合溶媒中で重合を行う。反応温度は０〜１２０℃、好ましくは０〜８０℃とし、反応時間は１分〜２００時間、好ましくは１０分間〜２４時間とする。
【００３４】
次に、該加水分解溶液の一部にゲル化の過程で相分離を引き起こす溶媒を混合する。相分離を起こす溶媒であれば特に制限なく使用できるが、例を挙げると、トルエン、クロロホルム、ポリエチレングリコール溶液などがある。該混合液を熱重合、光重合により重合させる。光重合の際には、ラジカル発生剤、例えばイルガキュア1800（Irgacure1800（日本チバ・ガイギー社））などを共存させる。
【００３５】
該重合の後、得られた反応物を水もしくはメタノールなどの有機溶媒で洗浄し、乾燥させて多孔質固定化素子を得る。キャピラリー、又はカラム管内に該固定化素子を形成する場合は、キャピラリー又はカラム管内で重合反応をおこなう。また、この場合の重合度は、多孔質固定化素子の大きさにより適宜変化させることが出来る。
【００３６】
最後に、溶媒を気化させることにより乾燥ゲルの多孔質固定化素子とする。該乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、その後、２００〜８００℃程度で加熱し、共存有機物を取り除くのが好ましい。
【００３７】
なお、本発明の多孔質固定化素子を、キャピラリー、又はカラム菅の全体、又は一部に、或いはマイクロチップのアレイに形成して、機能性物質を被覆して使用することができる。すなわち、前記キャピラリー等の内部で、前記加水分解性の官能基を有する有機金属化合物等を適当な条件で重合させ、溶媒を透過する数μｍの貫通孔を有する多孔質構造を有し、かつ該構造表面に直径数ｎｍの細孔を有する多孔質固定化素子を形成し、続いて、該固定化素子に機能性物質を被覆するのである。これにより、該機能性物質に基づく生化学、又は化学反応を行い、かつ生成物の分離を容易に行うことができ、続く分析、又は回収行程を連続的に行うことができる。
【００３８】
本発明では、市販されている電気泳動用、又はガスクロマトグラフィー用のキャピラリーを特に制限なく使用できる。該キャピラリーの寸法は、内径が１〜２００μｍ、特に５０〜１００μｍとするのが好ましく、長さは、１ｃｍ〜１０ｍ、特に１０ｃｍ〜１ｍとするのが好ましい。長さが、１ｃｍ未満の場合、十分な分離が行われず、また１０ｍを超える場合、分離に長時間が必要となるため好ましくない。また、カラム菅は、ガラス、ステンレス、プラスチック、又はフッ素樹脂（例えば、テフロン（登録商標））のものを特に制限なく使用できる。
【００３９】
また、基板に形成された円筒形などの凹部の、平坦な又は多孔質部を設けた内壁面、すなわちアッセイプレートのウェル内壁を前記薄膜の固定化素子として使用することができる。該アッセイプレートには、１枚のプレートに各６、１２、２４，４８、９６、３８６、又は１５３６個等のウェル形成したものが存在し、これらのウェルの内壁を固定化素子として利用することができる。なお、必要に応じこれらの内壁表面上で、前記加水分解性の官能基を有する有機金属化合物等を適当な条件で重合させ、又は別に作成した多孔質固定化素子の粒子を固定して多孔質固定化素子として用いることもできる。
【００４０】
（機能性物質）
本明細書における用語「機能性物質」とは、化学的、生物化学的、又は生物学的な反応を起こす、又は触媒する物質をいい、酵素、ホルモン、抗体などの生理活性物質のみならず、広範囲の活性物質を含む。本発明の網状構造の薄膜に固定して利用できるものであれば、特に制限なく該機能性物質として用いることができる。
【００４１】
該機能性物質の例を挙げると、Ｐ４５０、グルクロニルトランスフェラーゼなどの代謝酵素、トリプシン、ペプシンなどのタンパク質加水分解酵素等のタンパク質、核酸、脂質、糖、薬物等の生理活性性質、金属触媒などの合成機能性物質、フラーレン、カーボンナノチューブ、ポリロタキサン、カテナンなどの特異的な形状の化合物などがある。なお、該薬物の例を挙げるとアスピリン、モルフィネ、テトロドトキシンなどがある。本発明では、特に不安定で、不活性化し易い各種代謝酵素などは、ミクロソームに包含した形態で薄膜に固定して用いることができる。
【００４２】
（網状構造を有する薄膜の形成）
まず、機能性物質を含有する有機金属化合物のゾル溶液を調製する。加水分解性の官能基を有する有機金属化合物、又は少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解する。
【００４３】
該加水分解には、塩酸、硫酸、トシル酸、陽イオン交換樹脂等の酸触媒、アンモニア、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、陰イオン交換樹脂等の塩基性触媒等を用いて、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等の有機溶媒；又はこれらの混合溶媒中で行う。前記有機金属化合物と溶媒のモル比は、使用する有機金属化合物、溶媒などで変化するが、３：１〜１：１０、特に１：１〜１：４とするのが好ましい。また反応温度は０〜１２０℃、好ましくは、０〜８０℃とし、反応時間は１分〜２００時間、好ましくは１０分間〜２４時間とする。
【００４４】
次に、該加水分解溶液と、機能性物質を含有する溶液とを混合する。該混合液をゾル溶液と称する。該機能性物質が酵素など生体物質の場合は、緩衝液に溶解することが好ましい。該機能性物質の濃度、溶液のｐＨ、緩衝液の場合は塩濃度などを適宜最適化することにより、ゲル化速度、ゲルの微細構造などを変化させることが出来る。
また、図８に示すように、ゲルはｐＨが酸性側であると空隙の大きな鎖状構造に、ｐＨが塩基性側であると分岐が多い網状構造になる。
例えば、機能性物質がタンパク質からなる生理活性物質の場合、溶液中の濃度を１０−５〜１Ｍｏｌ／ｌ（モル／リットル）、好ましくは１０−４〜１０−１Ｍｏｌ／ｌとし、該溶液のｐＨは２〜１０、特に４〜８とするのが好ましく、かつ塩濃度を０．００１〜１Ｍｏｌ／ｌ、特に０．０１〜０．２Ｍｏｌ／ｌとするのが好ましい。
【００４５】
続いて、該ゾル溶液がゲル化する前に、前記多孔質固定化素子を該ゾル溶液に浸漬し、該多孔質固定化素子から余分なゾル溶液を取り除き、乾燥させることにより、該多孔質固定化素子の表面上に機能性物質を含有する薄膜を塗布することができる。乾燥を行う際の温度は、高いほど乾燥が早く進むが、機能性物質が生理活性物質である場合、変性又は活性低下を防止するため０℃から３０℃、好ましくは０℃〜２０℃、さらに好ましくは０℃〜１０℃とする。
【００４６】
機能性物質を含む網状構造の薄膜を被覆した多孔質固定化素子は、測定ごとにアッセイプレートから取り出し再利用することも可能であるが、直接、アッセイプレートに結合させ、活性測定と再生を繰り返し行うこともできる。
なお、該薄膜作成時のゾル−ゲル反応をアルコキシシランの重合反応に基づき説明すると、図４に示すように、所定のアルコキシシランを加水分解し、生成したモノマーを重縮合することにより所望のゲルを形成するものであり、図５に示すように、該モノマーが重合し、網状構造が形成される過程で機能性物質が、薄膜の網状構造に固定される。
【００４７】
これを拡大して描くと図３に示すように、多孔質固定化素子の窪み(ｎｍ細孔)の表面を、厚さ１〜１０，０００ｎｍの薄膜が覆っており、さらに部分的に拡大すると図３のＡに示すように、該薄膜は０．１〜５０ｎｍの空隙を有する網状構造の中に機能性物質を捉えて固定している。
また、本発明で用いるミクロソームは、常法によりラット肝臓などから精製できる。また、Ｐ４５０やグルクロニルトランスフェラーゼを導入したミクロソームが市販されている（第一化学薬品）。
【００４８】
(本発明の固定化素子の使用の態様）
ウェルを有するアッセイプレートを使用する場合
アッセイプレートのウェル内に機能性物質を薄膜で被覆した多孔質固定化素子を入れ、又は固定し、該機能性物質による生化学あるいは化学反応を行う。また、該ウェルの内壁を固定化素子として、機能性物質を薄膜で被覆することもできる。
【００４９】
該アッセイプレートとしては、１枚のプレートに各６、１２、２４、４８、９６、３８６、又は１５３６個等のウェルを有するものが市販されており、作製時に多孔質固定化素子の大きさを適宜変えて、これらのウェルに適した大きさとする。所定の反応を行った後、活性測定は、プレートリーダーなどを用いて行うことができる。
【実施例１】
【００５０】
ペプシン固定化カラムの製造と性能試験
一方の端部に、長さ５cmの、ペプシン（和光純薬）を含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子を有するフューズドシリカキャピラリー（内径７５μｍ、長さ１ｍ、Polymicro Technologies INC.製）を用いた。
【００５１】
本実施例で用いたペプシン固定化カラムを次の手順で製造した。メタクリル酸３−トリメトキシシリルプロピル（MTMSP）（東京化成）７５０μlに、水２２５μl及び１ＭのＨＣｌを２２．５μl加え、室温で３０分間撹拌を行った。該溶液３０μlにトルエン１７０μlを加え再び３０分間撹拌した後、イルガキュア１８００（Irgacure1800（日本チバ・ガイギー社））８．９ｍｇを加え、更に２．５時間以上撹拌した。固定化素子を作製する部位（キャピラリーの一端約５ｃｍ）以外をポリイミドコーティングで遮光した内径７５μｍ、長さ４０ｃｍのキャピラリー内に該溶液を充填し、約２０分間ＵＶ照射を行い、光重合反応により固定化素子をキャピラリー内に作製した。該ＵＶ照射には、ＲＰＲ−１００光化学反応器（photochemical reactor, Ultraviolet Company, Branford, CT, USA）を用いた。メタノールで未反応溶液を除去後、１１０℃のオーブン中に一晩静置し、乾燥させた。
テトラメトキシシラン（TMOS）（東京化成）７６１μlに水１６９μl、０．０４ＭのＨＣｌを１１μl加え、室温で２０分間攪拌を行った。該溶液２０μlに２５％(w/v)ペプシンを含む１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）６０μlを加え混合した後、該ゾル溶液を固定化素子のみが浸漬するようにシリンジでキャピラリー内に導入した。４℃で５分間放置後、キャピラリーから該混合液を追い出し、４℃で２日以上静置することにより、固定化素子上にペプシンを包含した薄膜を作製した。
【００５２】
電気泳動装置にはAgilent社製の3DCE systemを、質量分析装置にはMSD mass spectrometerを用いた。また泳動液には、５００ｍＭのギ酸溶液（和光純薬）を用い、分析時には１５kVの電位差をキャピラリーの両端に与え、さらに多孔質固定化素子のある端部から５０mbarの圧力で送液を行った。試料には、インシュリンβ鎖（Sigma-Aldrich）やリゾチーム（Sigma-Aldrich）を用い、キャピラリーの両端に２０秒間２０kVの電位差を生じさせることで注入した。
【００５３】
ペプシンを含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子により、注入された試料は消化され、生成したペプチドフラグメントを電気泳動により分離し、直接質量分析装置に導入して、検出した。検出されたペプチドフラグメントは、試料をペプシンで酵素消化した時に生じると考えられる酵素特異的な切断が行われていた。また生成したペプチド断片を用いタンパク質の同定ソフトであるProtein Prospector 4.0.5 (the University of California San Francisco, http://prospector.ucsf.edu)を用いることで、試料のタンパク質を同定した。該検出工程を３０回連続して行い分析しても、ペプシンの活性は保持されていた。
【実施例２】
【００５４】
トリプシンを含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子の製造と使用
９６穴アッセイプレート（Millipore製）のウェルの大きさに合うトリプシン（Sigma-Aldrich社）固定化素子を調製し、実験に用いた。
本実施例で用いたトリプシン薄膜固定化素子を次の手順で製造した。テトラメトキシシラン（TMOS）（東京化成）１ｍｌにポリエチレングリコール０．２７ｇを溶解した０．０１Ｍ酢酸２．５ｍｌを加え、０℃で４５分間撹拌した。該溶液を４０℃で１晩放置し重合反応させ、水で洗浄後、目的の形状に成型し、０．０１Ｍアンモニア水で１２０℃、３時間処理後、再び水で洗浄し、４０℃で３日間乾燥させた。該重合体を６００℃で２．５時間加熱し、多孔質固定化素子を作製した。
テトラメトキシシラン（TMOS）（東京化成）７６１μｌに水１６９μｌ、０．０４ＭのＨＣｌを１１μｌ加え、室温で２０分間攪拌を行った。該溶液２０μｌに５％(w/v)トリプシンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１２０μｌを加え混合した後、該ゾル溶液に多孔質固定化素子を５分間浸漬し、多孔質固定化素子を取り出し、４℃で２〜３日間静置することにより、多孔質固定化素子表面にトリプシン包含薄膜を形成した。
【００５５】
固定化素子に固定されたトリプシンの活性測定には、マルチラベルカウンタ１４２０ARVOsx (Wallac製)を用い、試料にはＮα-ベンゾイルアルギニンｐ-ニトロアニリド（Nα-benzoyl-arginine p-nitroanilide (BAPNA) (Sigma社)）とアゾカゼイン(azocasein, Sigma社)とを用いた。１ｍｇ/μｌのＢＡＰＮＡ３０μｌと６２．５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１２０μｌとの混合溶液の入ったウェルにトリプシンを固定化した多孔質固定化素子を加え、３７℃で１５分間攪拌することで酵素反応を行った。該多孔質固定化素子を取り除いた後、吸収強度（４０５ｎｍ）の変化を測定することで、酵素活性を測定した。アゾカゼインを用いた実験についても同様な手法を用い、３５５ｎｍの吸収強度の変化により活性を測定した。
【００５６】
図６に示すように、該活性を２０回以上測定しても、トリプシンの活性は低下せず、５０回連続して分析を行っても必要な活性を維持していた。また、４℃で保存すると３ヶ月以上、トリプシンの活性は変化しなかった。
【実施例３】
【００５７】
Ｐ４５０を含有するミクロソームを包含した薄膜を被覆した多孔質固定化素子の製造とその使用例
まず、実施例２と同じ手順で固定化素子を製造した。次いで、テトラメトキシシラン（TMOS）（東京化成）７６１μｌに水１６９μｌ、及び０．０４ＭのＨＣｌを１１μｌ加え、室温で２０分間攪拌を行った。該溶液２０μｌにＰ４５０を含むミクロソーム（第一化学薬品）溶液（タンパク質濃度２．７５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え攪拌した混合液に、多孔質固定化素子を浸し、直ちに取り出し、４℃で２日以上乾燥させることで多孔質固定化素子表面にＰ４５０含有薄膜を作製した。
【００５８】
多孔質固定化素子は、溶媒が透過できる０．３〜６μｍの貫通孔を有し、さらに表面積を大きくする１〜１００ｎｍの細孔を有することから、Ｐ４５０の反応効率を高めることが期待された。
一方、ミクロソームのコーティングには、アルコキシシランの加水分解及び重合に伴い、その架橋構造内に緩和な条件でミクロソームを包含し、固定化する手段を用いた。
ハイスループットスクリーニングシステムに適応させるため、反応は９６穴マイクロプレートを用い、ウェルに入る大きさになるよう多孔質固定化素子を作製した。９６穴マイクロプレートのウェルにＰ４５０を含む薄膜を被覆した多孔質固定化素子と蛍光性基質エトキシレゾルフィン溶液を入れ、３７℃で反応させた。該反応は下記化学式（５）に示すように起きる。
【００５９】
【化５】
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【００６０】
Ｐ４５０の代謝活性は、多孔質固定化素子を取り除き、プレートリーダーを用いて生成したレゾルフィンの生成量を蛍光測定することにより測定した(Ex.550ｎｍ, Em.590ｎｍ)。測定後、該多孔質固定化素子を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、乾燥することで、繰り返し４回、４日間測定することが可能であった。
これまでＰ４５０は容易に不活性化するので固定化して利用できず、また、Ｐ４５０が代謝活性の測定を妨げるため、代謝物をＰ４５０から分離しなければならなかった。これに対し、本発明でＰ４５０を含む薄膜で被覆した多孔質固定化素子を作成、使用することにより、Ｐ４５０を繰り返し利用できるようになり、測定すべき代謝物をＰ４５０から分離する必要がなくなり、少量の試料、及び試薬で解析が可能になった。すなわち、本発明によりＰ４５０を用いた解析が経済的かつ短時間で行えるようになった。
【実施例４】
【００６１】
Ｐ４５０を含有するミクロソームを包含した薄膜を、直接９６穴マイクロプレートのウェル底部上に形成し、酸化反応を行った使用例
まずテトラメトキシシラン（TMOS）（東京化成）７６１μｌに０．０４ＭのＨＣｌを１１μｌと水１６９μｌを加え、室温で２０分間攪拌した。該溶液２０μｌにＰ４５０を含むミクロソーム溶液（タンパク質濃度２．７５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加えて混合した後、予めポリ酢酸ビニルで表面を親水性処理した９６穴マイクロプレートの各ウェルに１０μｌずつ分注し、４℃で２日間以上放置することでゲル化を進行させ、Ｐ４５０を含む薄膜をウェル内壁に固定した。
【００６２】
当該固定化Ｐ４５０を用いて、実施例３と同様な方法で薬物の代謝反応を測定した。図７に経過時間とレゾルフィンの生成量との関係を表すグラフを示す。本方法で作製したＰ４５０固定化素子においても、繰り返し１３回、６日間測定が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明の多孔質固定化素子の構造を示す電子顕微鏡写真である。該写真に示されている空間は、溶媒を透過する数μｍの空隙を有する多孔性構造を示す。
【図２】図２はさらに、前記多孔性構造の表面にある極めて多くの直径数ｎｍの窪み(ｎｍ細孔)を示す拡大図である。
【図３】図３は、本発明の多孔質固定化素子上に形成された薄膜の網状構造を示す拡大図であり、多孔質固定化素子の窪み(ｎｍ細孔)の表面を、厚さ数ｎｍの薄膜が覆っている状態を示す。右上拡大部分Ａは、該薄膜がその数ｎｍの空隙を有する網状構造の中に機能性物質を捉えて固定している状態を示す。
【図４】図４は、本発明の薄膜作成時のゾル−ゲル反応をアルコキシシランの重合反応に基づき説明した図である。
【図５】図５は、本発明の薄膜作成時のゾル−ゲル反応において、アルコキシシランの加水分解により生成したモノマーが、重合する過程で、機能性物質を、薄膜の網状構造に固定する状況を示す図である。
【図６】図６は、実施例２における、固定されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例４において、Ｐ４５０の作用による代謝生成物の産生量を示すグラフである。
【図８】図８は、ｐＨの条件とゲルの網状構造との関係を示す概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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