(57)【要約】      （修正有）【課題】  CYP2C9遺伝子のcDNAの1075位の変異（A1075C変異）を検出する方法を提供する。【解決手段】  A1075C変異を含む領域をPCRで増幅し、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)特定な塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)特定な塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)特定な塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【請求項２】
核酸プローブが、配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列を有する請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、CYP2C9遺伝子のcDNAにおける1075位の変異であり、核酸プローブは、請求項１または２に記載の核酸プローブである前記方法。
【請求項４】
試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅をDNAポリメラーゼを用いる方法により行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅を核酸プローブの存在下で行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、請求項３記載の方法のためのキット。
【請求項８】
核酸プローブが、配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列を有する請求項７記載のキット。
【請求項９】
CYP2C9遺伝子のcDNAにおける1075位の変異を含む領域を、DNAポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む請求項７または８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムP450の分子種CYP2C9の遺伝子の変異の検出法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
CYP2C9は、さまざまな薬剤を代謝する酵素であり、たとえば、トルブタミド、フェニトイン、S-ワルファリン、ロサルタンなどを代謝する。
【０００３】
CYP2C9の遺伝子のcDNAの1075位のAがCに置換する変異（A1075C変異）が存在すると、359位のイソロイシンがロイシンに変異し、タンパク質の構造が異常になり、したがって、A1075C変異がホモで存在すると、様々な薬剤の代謝効率が減少し副作用等のリスクが上昇する。A1075C変異を有する遺伝子はCYP2C9*3アレルと呼ばれている。
【０００４】
A1075C変異が存在するとその部分の制限酵素の認識部位が消失するため、PCRで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（PCR-RFLP）で検出を行うことが出来る。
【０００５】
PCRは数分子の鋳型から数10億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。PCR-RFLPはPCR反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことがある。さらに、PCR終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
【０００６】
一方、一般に、変異を含む領域をPCRで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（非特許文献１、特許文献１）。
【非特許文献１】クリニカルケミストリー(Clinical Chemistry)、2000年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、A1075C変異を検出するのに有効な消光プローブを特定し、A1075C変異を検出する方法およびそのためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のプローブを用いる方法に関する文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのGとCのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。本発明者らは、A1075C変異に関し、上記条件を満たす消光プローブを設計し、検出を試みたが、容易に検出を可能とする消光プローブは得られなかった。
【０００９】
本発明者は、A1075C変異を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりA1075C変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１０】
（１）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【００１１】
（２）核酸プローブが、配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列を有する（１）の核酸プローブ。
【００１２】
（３）一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、CYP2C9遺伝子のcDNAにおける1075位の変異であり、核酸プローブは、（１）または（２）の核酸プローブである前記方法。
【００１３】
（４）試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む（３）の方法。
【００１４】
（５）増幅をDNAポリメラーゼを用いる方法により行う（４）の方法。
【００１５】
（６）増幅を核酸プローブの存在下で行う（５）の方法。
【００１６】
（７）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、（３）の方法のためのキット。
【００１７】
（８）核酸プローブが、配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列を有する（７）のキット。
【００１８】
（９）CYP2C9遺伝子のcDNAにおける1075位の変異を含む領域を、DNAポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む（７）または（８）のキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、A1075C変異を検出するのに有効な消光プローブが提供され、さらに、それを用いるA1075C変異を検出する方法およびそのためのキットが提供される。CYP2C9*3アレルはA1075C変異を含むので、本発明の消光プローブならびに方法およびキットは、CYP2C9*3アレルの検出に使用できる。
【００２０】
Tm解析は数十秒で完了するため、検出に必要な時間が大幅に短縮出来る。プローブの存在下での核酸の増幅とTm解析を組み合わせる本発明の好ましい態様によれば、核酸の増幅後にプローブのTmを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、さらに、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜１＞本発明プローブおよび本発明検出方法
本発明プローブは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
【００２２】
本発明プローブは、配列番号２に示す塩基配列（A1075C変異における変異型の塩基を有する配列）において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列、または、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有する他は、特許文献１に記載された消光プローブと同様でよい。本発明に使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号５〜８のいずれかに示すものが挙げられる。蛍光色素としては、特許文献１に記載されたものが使用できるが、具体例としては、FAM(商標)、TAMRA(商標)、BODIPY(商標) FL等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１に記載の方法に従って行うことができる。
【００２３】
本発明検出方法は、一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、A1075C変異であり、核酸プローブは本発明プローブであることを特徴とする。
【００２４】
本発明検出方法は、A1075C変異を含む領域を増幅すること、および、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Tm解析）の方法に従って行うことができる。
【００２５】
核酸増幅の方法としては、PCRポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、PCR、ICAN、LAMP等が挙げられる。PCRポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのTmを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００２６】
以下、PCRを用いる場合を例として、さらに説明する。PCRに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のPCRにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびTmは、通常には、12mer〜40merで40〜70℃、好ましくは16mer〜30merで55〜60℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーの
Tmはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Tm値は最近接塩基対(Nearest Neighbor)法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号３および４に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００２７】
PCRは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなくTm解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのTmやPCRの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００２８】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常25〜40回繰り返す。
(1) 変性、90〜98℃、1〜60秒
(2) アニーリング、60〜70℃、10〜60秒
(3) 伸長、60〜75℃、10〜180秒
【００３１】
アニーリングおよび伸長を一ステップで行う場合には、60〜70℃、10〜180秒の条件が挙げられる。
【００３２】
Tm解析は、本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従って行うことができる。蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。Tm解析における昇温速度は、通常には、0.1〜1℃／秒である。Tm解析を行うときの反応液の組成は、プローブとその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が1.5〜5 mM、pHが７〜９である。PCR等のDNAポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままTm解析に用いることができる。
【００３３】
Tm解析の結果に基づくA1075C変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出の他、変異型DNAの定量、正常型DNAと変異型DNAの割合の測定も包含する。
【００３４】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、末端
が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、(a)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号595もしくは588で終わる８〜40塩基長の塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている、(b)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号574から始まる10〜40塩基長の塩基配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている、または、(c)配列番号２に示す塩基配列において塩基番号576から始まる８〜40塩基長の塩基配列に相補的な配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている核酸プローブを含むことを特徴とする。
【００３５】
消光プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００３６】
本発明検出キットは、消光プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にDNAポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
【００３７】
本発明検出キットにおいて消光プローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００３８】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００３９】
CYP2C9遺伝子のcDNAの1075位のＡ→Ｃ変異（A1075C変異）の部位を含む塩基配列（配列番号２（変異型）、塩基番号583がCYP2C9遺伝子のcDNAの1075位に相当）に基づき、A1075C変異を含む部分を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
次に、表３に示す、末端部にCを有するプローブを設計した。表３中、位置は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、A1075C変異の部位を示し、3'末端の(P)は、リン酸化されていることを示す。TAMRA(商標)による標識は、常法に従って行った。
【００４２】
【表３】
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【００４３】
精製ヒトゲノム（GFX Genomic Blood DNA Purification Kitダイレクト法にて全血から抽出）をサンプルとして、Smart Cycler System（Cephied)を用い、以下の条件でPCRおよびTm解析を行った。Tm解析における励起波長および検出波長は、それぞれ450〜495 nmおよび505〜537 nm（BODIPY FL）、または、それぞれ527〜555 nmおよび565〜605 nm（TAMRA）であった。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
【表５】
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【００４６】
各プローブを用いてPCRおよびTm解析を行った結果、プローブ3FL-mt-F3-20、3FL-mt-F4-19、5FL-mt-F5-21及び3T-mt-R1-19を用いたとき、Tm解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。なお、各プローブのA1075C変異を含む塩基配列に対する配置を図１に示す。図中、Wild配列およびmutant配列は、それぞれ配列番号１および２の塩基配列の塩基番号561〜600の塩基配列に相補的な配列である。また、図中、Ｆは蛍光色素を示す。図１に示す配置からみて、プローブがTm解析で使用できるかどうかは、蛍光色素を結合させたCの位置に依存すると考えられ、プローブの長さは、多型部位を含む限り、あまり重要でないと考えられる。
【００４７】
サンプルとして、0.01μlの血液から抽出したＤＮＡ（３サンプル）ならびに変異型配列および正常型配列を有するDNA（それぞれ、mt/mtおよびwt/wt）ならびに変異型配列および正常型配列の両方を有するDNA（wt/mt）を調製し、プローブ3FL-mt-F3-20を用いてタイピングを行った。結果を図２に示す。また、血液の量を変えて（0.01〜１μl）タイピングを行った結果を図３に示す。これらの結果から、この定量方法は再現性がよく、感度が高いことが分かる。プローブ3FL-mt-F4-19、5FL-mt-F5-21及び3T-mt-R1-19を用いた場合も同様の結果が得られた。
【００４８】
なお、図２及び３において縦軸は、蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（-dF/dt）、横軸は温度（℃）である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】変異の識別可能な消光プローブの位置を示す。
【図２】実施例１の方法の再現性を示す。
【図３】実施例１の方法のゲノムDNAの絶対量に関する感度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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