(57)【要約】【課題】本発明は、１個の混合器での流量の対応範囲が広い、とりわけ、微小流量から大流量にも対応できる混合器を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、モノリス型カラムと、該カラムに接続される配管とからなる混合器である。Ａ液としてメタノール、Ｂ液としてアセトンとして、次のグラジエントを行ったときのベースラインの変動（検出：UV254nm）を図２（ａ）〜（ｆ）に示す。  グラジエント：Ａ１００％→Ａ７０％（10分）→Ａ４０％（10分）→Ａ０％（10分）→Ａ１００％  図２（ａ）は、流速0.25ｍｌ、（ｂ）は流速0.5ｍｌ、（ｃ）は流速1.0ｍｌ、（ｄ）は流速2.0ｍｌ、（ｅ）は流速3.0ｍｌ、（ｆ）は流速5.0ｍｌで使用した図である。  流速が変わってもタイムラグがなく混合効率が変わらないことを示している。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作成したモノリス型カラムと、該カラムに接続された配管とからなる混合器。
【請求項２】
モノリス型カラムのマクロ孔が直径100nm〜10000nmである請求項１記載の混合器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上の液を混合する混合器、例えば、液体クロマトグラフ用グラジェントミキサー、反応器として利用できる。
【背景技術】
【０００２】
２種以上の液を混合するため混合器が使用されている。例えば、液体クロマトグラフによるグラジエント分析は、一般に異種の溶媒を混合器へ送液し、その溶媒組成を順次変えながらカラムへ送るようにしている。混合器としては、コイル、混合室内にビーズを詰めたもの、混合室内にデッドボリュームを設け、複数の溶媒を反強制的に攪拌するスタティックミキサーと、複数の溶媒を強制的に攪拌するダイナミックミキサーとがある（特許文献１）。
また、液体クロマトグラフカラムで分離した後試薬を反応させ誘導体化するポストカラム法が知られており、反応部として混合器が使用されている。かかる混合器としては、例えば、Ｔ型コネクターや反応試薬を流すチューブの中に液体クロマトグラフカラムからのチューブを挿入した構成がある（特許文献２）。
【０００３】
【特許文献１】実開平７−６７５９号公報
【特許文献２】特開平８−３０４３７３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の混合器のうちスタティックミキサーは、十分な混合成果を得るために一定の長さを要し、その設置スペースや設置等の外部条件の影響を受けやすく、またダイナミックミキサーは、溶媒の流れ方向の濃度勾配がなくなり、グラジエントの精度や再現性が悪くなるなどの問題があった。
また、ポストカラム法の混合器では、内部容量が限られ、一つの混合器で対応できる流量範囲は狭いという問題もあった。
そこで、本発明は、１個の混合器での流量の対応範囲が広い、とりわけ、微小流量から大流量にも対応できる混合器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本件発明者は、モノリス型カラムを混合器として使用すれば、流量の対応範囲の広い混合器を提供できることを見出して、本発明をなすに至ったのである。
すなわち、本発明は、モノリス型カラムと、該カラムに接続される配管とからなる混合器を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、混合によるタイムラグがなく、流量の対応範囲の広い混合器を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
モノリス型カラムは、相分離を利用したゾル―ゲル法によって調製することが好ましく、  本発明におけるモノリス型カラムは、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜50nmのメソ孔が存在することが好ましいが、メソ孔は必ずしも必要ではない。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【０００８】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【０００９】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１０】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１１】
相分離・ゲル化にあたっては、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１２】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１３】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溝内において、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００１４】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００１５】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００１６】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００１７】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって、溝内において、管壁に密着した乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【００１８】
なお、モノリス型カラムのサイズは、内径２mm〜５mm、長さ２cm〜１５cmが好ましいが、これに限定されず、キャピラリーカラムでももちろんよい。
また、カラムのマクロ孔のサイズは、反応系の組成及び温度、ｐH、水溶性高分子の分子量等の各種条件によって変わり、これら条件を調節することによって、所望のマクロ孔を得ることができる。またカラム体積を調節することにより混合流量を大容量から微小流量に変更することができる。例えば、カラム体積が10nL〜200μLのときは、流量は10nL/min〜1000μL/min、200μL〜1mLのときは、流量は100μL/min〜10mL/minである。
【００１９】
さらに、モノリス型カラムの作成にハイブリッドのゲルを使うことによって、アルカリ性の試薬にも対応できる。
ハイブリッドカラムは、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物と、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物を加水分解・重合して反応溶液系のゲル化を行った後、ゲル中の不要物質を除去し、加熱することにより作成できる。
ここで、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物の容量が、加水分解性の官能基を有する有機金属化合物の容量の１／１０以上であることが好ましい。
また、少なくとも１個の金属・炭素結合を介して結合した非加水分解性の有機官能基と加水分解性の官能基とを含む有機金属化合物として、例えばメチルトリメトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、γーグリキシドキシプロピルトリメトキシシラン、γーグリキシドキシプロピルトリエトキシシラン、βー（３，４エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、Nーβ（アミノエチル）γーアミノプロピルトリメトキシシラン、Nーβ（アミノエチル）γーアミノプロピルトリエトキシシラン、γーメタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、γーアミノプロピルトリエトキシシラン、γーアミノプロピルトリメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランを用いることができる。
【００２０】
本発明の混合器は、例えばモノリス型カラムを液体クロマトグラフの分離カラムと移動相溜の間に配設することにより、グラジェントミキサーとして利用できる。また、ポストカラム用の反応器としても利用可能である。
【実施例】
【００２１】
実験例１（グラジエントミキサーの例）
本発明を液体クロマトグラフのグラジエントミキサーとして使用した例を図１に示す。
図１中１は、本発明の混合器で次の方法で作製したモノリス型カラムである。２は分離カラム、３は試料注入器、４は検出器、５，６は送液ポンプ、Ａ、Ｂは移動相である。
（モノリス型カラムの作成）
フォルムアミド（ＦＡ）３０．５ｇ、１Ｍ−硝酸０．７５ｇ溶液にテトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）４０ｍｌを加え、１０分間混合し加水分解する。これにメチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＳ）１０ｍｌを加え、１０分間混合し加水分解する。この溶液を４０℃で２日間保持し、分相・ゲル化させる。得られたゲルを１Ｍアンモニア溶液につけ、１２０℃３時間処理する。その後、４０℃３日間乾燥し、４００℃１０時間熱処理した。得られたゲルの細孔径を水銀圧入法、窒素吸着法で測定した結果、１．１μm、７．５ｎｍであった。ＦＡの量を３２．０ｇとしその他は同じ条件で作製すると、細孔径３．２μmのゲルが得られた。
かかるゲルを混合器（容量0.5ｍｌ）として組み立てた。
【００２２】
Ａ液としてメタノール、Ｂ液としてアセトンとして、次のグラジエントを行ったときのベースラインの変動（検出：UV254nm）を図２（ａ）〜（ｆ）に示す。
グラジエント：Ａ１００％→Ａ７０％（10分）→Ａ４０％（10分）→Ａ０％（10分）→Ａ１００％
図２（ａ）は、流速0.25ｍｌ、（ｂ）は流速0.5ｍｌ、（ｃ）は流速1.0ｍｌ、（ｄ）は流速2.0ｍｌ、（ｅ）は流速3.0ｍｌ、（ｆ）は流速5.0ｍｌで使用した図である。
流速が変わってもタイムラグがなく混合効率が変わらないことを示している。
なお、比較のため、従来の混合器（島津製ミキサSUS228-28000-91）を使用して同様に実験したものを図３に示す。図３より従来の混合器によればグラジエントカーブの段差が緩やかであり、タイムラグがあることが分かる。
【００２３】
実験例２（カラム内カップリング反応）
従来のペプチド合成法である固相法と液相法の両方の利点を有すると期待される新しい合成法「準固相法」について、モデルペプチドとしてフェニルアラニルロイシン（以下L-Phe-L-Leu）、N末端保護基としてベンジルオキシカルボニル（以下Z）基、カップリング法としてDCC法を採用してジペプチドの合成を試みた。このカラム内カップリング反応は、あらゆるアミノ酸を用いたペプチド合成に適用できる。
＜Z-L-Phe-L-Leu-O-CH2-Biphenylのカラム内生成＞
（1）高速液体クロマトグラフィー用送液ポンプを用いて、オクタデシルジメチル-N,N-ジエチルアミノシラン／トルエン（20/80, v/v）溶液を60℃3時間送液することによって得られたオクタデシルシリル化したモノリス型カラムにメタノール（以下MA）−アセトニトリル（以下AN）の移動相（体積比３：１）を流速0.4ml/minで送液し室温において平衡させた。
（2）次にAN1.0ml、基質であるL-Leu-O-CH2-BiphenylのAN溶液0.2ml（10mg/ml、6.7μmol）、次いでインジェクターの注入部の洗浄のためにAN0.2mlを2回注入し６分間送液した。
（3）12.5当量分のベンジルオキシカルボニル-フェニルアラニン（以下Z-Phe）のAN溶液（50mg/ml）0.5ml、次いでAN0.25mlを2回注入し４分間送液した。
（4）50当量分のN,N'-dicyclohexylcarbodiimide（以下DCC）のAN溶液（35mg/ml）2.0ml、AN0.25mlを2回注入、送液して、移動させながら基質やZ-Pheのバンドと重ねることによって反応した。
（5）Z-PheとDCCの溶出後、移動相を100％THFとして、生成物を溶出した。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、液体クロマトグラフ用グラジェントミキサー、反応器として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】液体クロマトグラフを示す図
【図２】本発明の混合器を用いて流速を変化させたときのグラジエントカーブを示す図
【図３】従来の混合器を使用してときのグラジエントカーブを示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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