(57)【要約】  【課題】  表面プラズモン測定装置において、測定チップ毎の感度の個体差に起因する測定誤差を低減して測定精度を向上させる。  【解決手段】  誘電体ブロック１０と、光ビーム１３を発生させるレーザ光源１４と、光ビーム１３を誘電体ブロック１０と金属膜１２との界面１０ｂに対して種々の入射角が得られるように入射させる光学系１５と、上記界面１０ｂで全反射し平行光化された光ビーム１３を検出する光検出手段１７とを備えた測定装置において、測定チップの金属膜１２上に分析対象分子３３と略同一サイズかつ略同一の屈折率の参照分子３０’を付着させた状態で測定を行い、参照分子３０’を金属膜１２上から除去し、測定チップ１０に試料１１を保持させた状態で暗線位置の測定を行い、参照分子３０’を付着させた状態での暗線位置検出の結果に基づいて感度補正された、分析対象分子３３についての暗線位置検出の結果を得る。【選択図】          図５
2005221274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層の表面上に分析対象分子を含む試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定チップと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる光ビーム入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用した測定装置により前記分析対象分子の分析を行う測定方法において、
前記測定チップの前記薄膜層上に前記分析対象分子と略同一サイズかつ略同一の屈折率の参照分子を付着させた状態で前記暗線位置の測定を行い、
前記参照分子を前記薄膜層上から除去し、
前記測定チップに前記試料を保持させた状態で前記暗線位置の測定を行うと共に、
前記参照分子を付着させた状態での暗線位置の測定の結果に基づいて前記測定チップ毎に前記測定手段の感度を補正することを特徴とする測定方法。
【請求項２】
前記感度の補正を、前記測定チップに前記試料を保持させた状態で前記暗線位置の測定を行う前に行うことを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に分析対象分子を含む試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定チップと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる光ビーム入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用した測定装置において、
前記測定チップの前記薄膜層上に該薄膜層に対して脱着可能な、前記分析対象分子と略同一サイズかつ略同一の屈折率の参照分子を付着させた状態で測定された暗線位置の測定の結果に基づいて、前記測定チップ毎に前記測定手段の感度を補正する感度補正手段を備えたことを特徴とする測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に接した薄膜層と誘電体ブロックとの界面で光ビームを全反射させてエバネッセント波を発生させ、それにより全反射した光ビームの強度に表れる変化を測定して試料の分析を行う全反射減衰を利用した測定方法および測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
金属中においては、自由電子が集団的に振動して、プラズマ波と呼ばれる粗密波が生じる。そして、金属表面に生じるこの粗密波を量子化したものは、表面プラズモンと呼ばれている。
【０００３】
従来より、この表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置が種々提案されている。そして、それらの中で特に良く知られているものとして、 Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特許文献１）。
【０００４】
上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０００５】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０００６】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０００７】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角θSPより表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。すなわち表面プラズモンの波数をＫSP、表面プラズモンの角周波数をω、真空中の光速をｃ、金属、被測定物質の誘電率をそれぞれεm、εsとすると、以下の関係がある。
【数１】
2005221274.tif 000003
【０００８】
すなわち、上記反射光強度が低下する入射角である全反射減衰角θSPを知ることにより、被測定物質の誘電率εs、つまりは屈折率に関連する特性を求めることができる。
【０００９】
なおこの種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角θSPを精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特許文献２に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００１０】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００１１】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば非特許文献１の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００１２】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００１３】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００１４】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角θSPの角度を測定している。
【００１５】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角θSPを測定し、該全反射減衰角θSPの角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩｇＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００１６】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角θSPの角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角θSPの角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角θSPの角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる。
【００１７】
このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め形成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角θSPの角度変化量の測定を行っている。
【００１８】
上記測定チップに試料液を供給し、センシング物質と被検体とが結合すると、センシング物質の屈折率が変化し、全反射減衰角θSPの角度が変化する。従って測定開始から所定時間経過した時点での、測定開始からの全反射減衰角θSPの角度変化量を求めることにより、被検体がセンシング物質と結合するか否かを判定し、また結合する場合には、被検体とセンシング物質との結合状態などを分析することができる。しかし、測定装置により検出された全反射減衰角θSPの角度変化量は、厳密にはセンシング物質と被検体の結合による屈折率の変化を正確に反映したものではなく、測定チップの金属膜の厚みや表面形状（面粗さ）等によって測定感度にばらつきが生じることが知られている。
【００１９】
そこで、この測定チップ毎の感度ばらつきを補正するために測定チップ交換毎に、試料液についての測定前に、溶媒（バッファ）のみを供給しこれについての測定を行い、その信号による感度検出を行っておくことにより、感度補正を行う方法が提案されている。
【００２０】
また、特許文献３には、屈折率が既知の複数種類の参照試料に対する測定を行い、その測定結果から校正曲線を求め、この校正曲線を基に現実の測定値を校正する方法が提案されており、屈折率が既知の液体を参照試料として用いること、および測定チップの薄膜層上に既知の屈折率（誘電率）の固体材料を固着（蒸着）した測定チップ（校正用治具）を用いることが記載されている。
【特許文献１】特開平６−１６７４４３号公報
【特許文献２】特開平１１−３２６１９４号公報
【特許文献３】特開２００３−２７９４７８号公報
【非特許文献１】「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、測定対象となる生体分子とバッファとでは信号変化の振る舞いが異なり、たとえバッファによる感度補正を行っても、現実の生体分子の測定の際には信号のばらつきが生じることを本発明者は見出した。
【００２２】
図７は、金属の伝導度σに比例する物性値ｋ（屈折率の虚数／吸収項）に対する全反射減衰の信号値（ここではＳＰＲ信号としてその移動角）の変化を示すグラフである。図中、丸（○）はバッファについての信号値、ばつ（×）は生体分子であるタンパクについての信号値を示す。なお、信号値はそれぞれ基準物性値における信号値を１として規格化している。図７に示すように、金属の物性値ｋが±１０％変化しても、バッファの信号値にはほとんどばらつきは生じない。一方、生体分子であるタンパクの信号値は±２０％程度のバラツキが生じている。従って、生体分子の検出に対しては、従来のバッファによる感度補正では十分とはいえないことが明らかである。
【００２３】
また、特許文献３に記載されている屈折率が既知の液体を参照試料として用いた場合にも、バッファによる感度補正の場合と同様に、現実の生体分子の測定の際には信号のばらつきが生じると考えられ、校正用治具を用いる場合、各測定チップ毎の感度補正を行うことができないという問題がある。
【００２４】
本発明は上記の事情に鑑みて、測定チップ毎の測定感度の個体差に起因する測定誤差を低減して測定精度を十分に向上させることのできる測定方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記のようにバッファや参照試料を用いた感度補正では十分な補正ができないという問題は、測定に用いられているエバネッセント波およびそれによって生じる表面プラズモン共鳴が、金膜近傍の生体分子のようにサイズの小さい物質に対してのみ選択的に敏感であり、バッファのようにサイズの大きい物質には鈍感であるという特性からくるものであると本発明者は想到し、以下の発明に至った。
【００２６】
本発明の測定方法は、光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、および該薄膜層の表面上に分析対象分子を含む試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定チップと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる光ビーム入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用した測定装置により前記分析対象分子の分析を行う測定方法において、
前記測定チップの前記薄膜層上に前記分析対象分子と略同一サイズかつ略同一の屈折率の参照分子を付着させた状態で前記暗線位置の測定を行い、
前記参照分子を前記薄膜層上から除去し、
前記測定チップに前記試料を保持させた状態で前記暗線位置の測定を行うと共に、
前記参照分子を付着させた状態での暗線位置の測定の結果に基づいて前記測定チップ毎に前記測定手段の感度を補正することを特徴とするものである。
【００２７】
なお、前記感度の補正は、結果として感度補正された測定値を得ることができれば、前記測定チップに試料を保持させた状態で暗線位置の測定を行う前後のいずれに行ってもよいが、前記測定チップに前記試料を保持させた状態で前記暗線位置の測定を行う前に行うことが望ましい。
【００２８】
本発明の測定装置は、光ビームを発生させる光源と、
前記光ビームに対して透明な誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に分析対象分子を含む試料を保持する試料保持機構を備えてなる測定チップと、
前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記薄膜層との界面で全反射条件が得られる入射角で入射させる光ビーム入射光学系と、
前記界面で全反射した光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段とを備えてなる全反射減衰を利用した測定装置において、
前記測定チップの前記薄膜層上に該薄膜層に対して脱着可能な、前記分析対象分子と略同一サイズかつ略同一の屈折率の参照分子を付着させた状態で測定された暗線位置の測定の結果に基づいて、前記測定チップ毎に前記測定手段の感度を補正する感度補正手段を備えたことを特徴とするものである。
【００２９】
ここで、暗線位置を測定するとは、光ビーム中の暗線となった成分の入射角（全反射角）を測定することと同義である。なお、暗線位置の測定は、暗線位置そのものの測定であってもよいし、暗線位置の所定位置からの変化量の測定であってもよい。
【００３０】
上記のような測定装置としては、金属膜を上記薄膜層として用いる前述の表面プラズモン測定装置や、誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成された光導波層とからなる層を上記薄膜層として用いる前述の漏洩モード測定装置等がある。
【００３１】
なお、薄膜層上にはセンシング媒体を備えてもよく、その場合、センシング媒体を介して薄膜層上に分析対象分子および参照対象分子を付着させるようにしてもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の測定方法および測定装置においては、屈折率が既知である複数種類の参照試料液を用いて測定された全反射減衰の状態の測定結果を参照測定結果とし、参照測定結果に基づいて試料に対する測定の測定結果を校正することにより、測定装置の測定感度の個体差に起因する測定誤差を低減することができるため、測定精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。本発明の一実施の形態の測定装置は、複数の誘電体ブロックに光ビームを並列的に入射させることにより複数の試料の分析を同時に行うことが可能な表面プラズモン測定装置であり、図１は本実施の形態の表面プラズモン測定装置の概略構成を示す平面図であり、図２はこの表面プラズモン測定装置の側面形状を示すものである。
【００３４】
上記表面プラズモン測定装置１０１は、同様の構成の複数の表面プラズモン測定ユニット１０１Ａ、１０１Ｂ、１０１Ｃ…により構成されている。
【００３５】
各測定ユニットの構成について、個別の要素を表す符号であるＡ、Ｂ、Ｃ…の符号は省略して説明する。各測定ユニットは、測定チップ９と、光ビーム１３を発生する光源であるレーザ光源１４と、上記光ビーム１３を測定チップ９に対して入射させる入射光学系１５と、測定チップ９で反射された光ビーム１３を平行光化して光検出器１７に向けて射出するコリメータレンズ１６と、コリメータレンズ１６より出射された光ビーム１３を受光して光強度を検出する光検出器１７と、光検出器１７に接続された差動アンプアレイ１８と、差動アンプアレイ１８に接続されたドライバ１９と、ドライバ１９に接続されたコンピュータシステム等からなる信号処理部２０とからなる。なお、信号処理部２０は、後述する、測定チップ９毎になされる感度補正を行う感度補正手段としても機能するものである。なお、光検出器１７、差動アンプアレイ１８、ドライバ１９および信号処理部２０により光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段が構成されている。
【００３６】
測定チップ９は、四角錐の４つの稜線が集まる頂角を含む一部分が切り取られ、かつこの四角錐の底面に試料液１１を貯える試料保持機構として機能する凹部１０ｃが形成された形状の誘電体ブロック１０と、この誘電体ブロック１０の凹部１０ｃの底面に形成された、例えば金、銀、銅、アルミニウム等からなる薄膜層である金属膜１２とからなる。この誘電体ブロック１０は、例えば透明樹脂等により形成することができる。なお、金属膜１２の上に後述するセンシング媒体３０を設けてもよい。なお、ここでは隣接する複数の測定チップ９が連結され一体的に取り扱うことができる構成とされている。
【００３７】
入射光学系１５は、レーザ光源１４から射出された光ビーム１３を平行光化するコリメータレンズ１５ａと、この平行光化された光ビーム１３を上記界面１０ｂに向けて収束させる集光レンズ１５ｂとから構成されている。
【００３８】
光ビーム１３は、集光レンズ１５ｂにより上述のように集光されるので、界面１０ｂに対して種々の入射角θで入射する成分を含むことになる。なお、この入射角θは、全反射角以上の角度とされる。そのため、界面１０ｂで全反射した光ビーム１３には、種々の反射角で全反射された成分が含まれることになる。なお、上記入射光学系１５は、光ビーム１３を界面１０ｂ上に点状に集光させずにデフォーカス状態で入射させるように構成してもよい。そのようにすれば、界面１０ｂ上のより広い領域において光ビーム１３が全反射されるので、全反射減衰の状態の検出誤差が平均化されて全反射解消角の測定精度を高めることができる。
【００３９】
なお光ビーム１３は、界面１０ｂに対してｐ偏光で入射させる。そのようにするためには、予めレーザ光源１４をその偏光方向が上記所定の方向となるように配設すればよい。その他、光ビーム１３を界面１０ｂに対してｐ偏光で入射させるには波長板で光ビーム１３の偏光の向きを制御するようにしてもよい。
【００４０】
また、表面プラズモン測定装置１０１は、各測定ユニットの信号処理部２０Ａ、２０Ｂ、２０Ｃ…に接続された１つの表示手段２１を備えている。
【００４１】
以下、上記構成の表面プラズモン測定装置による試料分析について説明する。
【００４２】
図２に示す通り、レーザ光源１４から射出された光ビーム１３は、入射光学系１５を通して、誘電体ブロック１０と金属膜１２との界面１０ｂ上に収束される。
【００４３】
界面１０ｂ上に収束され、この界面１０ｂで全反射された光ビーム１３は、コリメータレンズ１６を通して光検出器１７によって検出される。光検出器１７は、複数の受光素子であるフォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…が１列に並設されてなるフォトダイオードアレイであり、フォトダイオードの並設方向が図２の紙面に略平行となるように、かつコリメータレンズ１６を通して平行光化されて入射される光ビーム１３の伝播方向に対して略直交するように配設されている。したがって、上記界面１０ｂにおいて種々の反射角で全反射された光ビーム１３の各成分を、それぞれ異なるフォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…が受光することになる。そして、光検出器１７は、各フォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…によって検出された上記光ビーム１３の強度分布を示す信号を出力する。
【００４４】
界面１０ｂに特定入射角θSPで入射した上記光ビーム１３の成分は、金属膜１２とこの金属膜１２に接している物質との界面に表面プラズモンを励起させるので、この光については反射光強度が鋭く低下する。つまり上記特定入射角θSPが全反射解消角であり、この角度θSPにおいて反射光強度は極小値を示す。この反射光強度が低下する領域は、図２にＤで示すように、界面１０ｂで全反射された光ビーム１３中の暗線として観察される。
【００４５】
次に、光検出器１７から出力された光ビーム１３の強度分布を示す信号の処理について詳細に説明する。
【００４６】
図３は、この表面プラズモン測定装置の電気的構成を示すブロック図である。図示の通り上記ドライバ１９は、差動アンプアレイ１８の各差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力をサンプルホールドするサンプルホールド回路２２ａ、２２ｂ、２２ｃ…、これらのサンプルホールド回路２２ａ、２２ｂ、２２ｃ…の各出力が入力されるマルチプレクサ２３、このマルチプレクサ２３の出力をデジタル化して信号処理部２０に入力するＡ／Ｄ変換器２４、マルチプレクサ２３とサンプルホールド回路２２ａ、２２ｂ、２２ｃ…とを駆動する駆動回路２５、および信号処理部２０からの指示に基づいて駆動回路２５の動作を制御するコントローラ２６から構成されている。
【００４７】
上記フォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…の各出力は、差動アンプアレイ１８の各差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…に入力される。この際、互いに隣接する２つのフォトダイオードの出力が、共通の差動アンプに入力される。したがって各差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力は、複数のフォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…が出力する光検出信号を、それらの並設方向に関して微分したものと考えることができる。
【００４８】
各差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力は、それぞれサンプルホールド回路２２ａ、２２ｂ、２２ｃ…により所定のタイミングでサンプルホールドされ、マルチプレクサ２３に入力される。マルチプレクサ２３は、サンプルホールドされた各差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力を、所定の順序に従ってＡ／Ｄ変換器２４に入力する。Ａ／Ｄ変換器２４はこれらの出力をデジタル化して信号処理部２０に入力する。
【００４９】
図４は、界面１０ｂで全反射された光ビーム１３の界面１０ｂへの入射角θ毎の光強度と、差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力との関係を説明するものである。ここで、光ビーム１３の界面１０ｂへの入射角θと上記反射された光ビーム１３の光強度Ｉとの関係は、同図（１）のグラフに示すようなものであるとする。
【００５０】
また図４の（２）は、フォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…の並設方向を示しており、先に説明した通り、これらのフォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…の並設方向位置は上記入射角θと一義的に対応している。
【００５１】
そしてフォトダイオード１７ａ、１７ｂ、１７ｃ…の並設方向位置、つまりは入射角θと、差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の出力Ｉ’（反射光強度Ｉの微分値）との関係は、同図（３）に示すようなものとなる。すなわち、ここで暗線位置を測定するとは、ファとダイオードアレイ上の暗線位置を検出することであるが、それは、対応する入射角θを検出するものとみなすことができる。
【００５２】
信号処理部２０は、Ａ／Ｄ変換器２４から入力された微分値Ｉ’の値に基づいて、差動アンプ１８ａ、１８ｂ、１８ｃ…の中から、微分値として正の値を有し、かつ全反射解消角θSPに対応する微分値Ｉ’＝０に最も近い出力が得られているもの（図４（３）の例では差動アンプ１８ｅとなる）と、微分値として負の値を有し、かつ全反射解消角θSPに対応する微分値Ｉ’＝０に最も近い出力が得られているもの（図４（３）の例では差動アンプ１８ｄとなる）を選択し、それらの差動アンプが出力する微分値に基づいて、全反射解消角θSPを算出する。なお、場合によっては微分値Ｉ’＝０を出力している差動アンプが存在することもあり、そのときはその差動アンプに基づいて全反射解消角θSPを算出する。以後、所定時間が経過する毎に上記と同様な動作を繰り返し、全反射解消角θSPを算出し、測定開始時からの角度変化量を求め表示手段２１に表示する。
【００５３】
上述のように、測定チップの金属膜１２に接している物質の誘電率つまりは屈折率が変化すると、それに応じて全反射解消角θSPも変化するため、この全反射解消角θSPの角度変化量を時間の経過とともに測定し続けることにより、金属膜１２に接している物質の屈折率変化を調べることができる。
【００５４】
なお、一般に、金属膜１２に分析対象分子を効果的に吸着させるために金属膜１２上には、自己組織化膜（ＳＡＭ膜）やデキストリン等を設ける。
【００５５】
またさらに、金属膜１２の上に、試料液１１の中の特定物質と結合するセンシング媒体３０を固定した場合、試料液１１とセンシング媒体３０との結合状態に応じて金属膜１２上の物質の屈折率が変化するので、上記微分値Ｉ’を測定し続けることにより、この結合状態の変化の様子を調べることができる。そのような特定物質とセンシング媒体３０との組合せとしては、例えば抗原と抗体等が挙げられる。
【００５６】
ところで、上記の測定装置において測定された全反射解消角θSPの角度変化は、厳密には測定チップの金属膜１２に接するおよび／または近接する物質の屈折率の変化を正確に反映したものではなく、測定チップの測定感度の個体差により多少の誤差を生じる場合がある。
【００５７】
そのため、本発明の測定装置においては、感度補正のために以下のような手順で測定を行う。
【００５８】
ここでは、塩基配列および分子量が既知のオリゴ・ヌクレオチド（13-mer）をセンシング媒体３０として用い、塩基配列等が特定されていないオリゴ・ヌクレオチドを含む試料液を測定チップに分注してミスマッチ検出をする場合について図５を参照して説明する。図５は、測定チップ１０の凹部１０Ｃの金属膜１２上の様子を測定手順に沿って記載した模式図である。
【００５９】
まず、金属膜１２としての金膜を用い、この金膜上に塩基配列および分子量が既知のオリゴ・ヌクレオチド（13−mer）を固定化する（図５（ａ））。
【００６０】
この金膜１２上のオリゴ・ヌクレオチド３０に対して、図５（ｂ）に示すように、塩基配列および分子量、すなわち屈折率（ＳＰＲ信号値）が既知である参照分子としての相補鎖（13-mer）３０’を結合させてＳＰＲ信号を検出する。実際には、相補鎖３０’を含む参照液１１’を測定チップに分注し、所定時間経過後にＳＰＲ信号を検出する。これにより、この相補鎖によるＳＰＲ信号値の本来のＳＰＲ信号値（既知の値）からのずれ量Δθを得ることができる。このずれ量Δθを感度補正量として、感度補正手段による感度補正がなされる。
【００６１】
その後、金膜上のオリゴ・ヌクレオチドから相補鎖を解離させる（図５（ｃ））。測定チップの温度を９０℃まで上昇させることにより、相補鎖をオリゴ・ヌクレオチドから解離させることができる。
【００６２】
バッファ等で測定チップ内を洗浄後、塩基配列等が特定されていないオリゴ・ヌクレオチド３３を分析対象分子として含む試料液１１を分注し（図５（ｄ））、分注時から連続的に、もしくは所定時間経過後にＳＰＲ信号の検出を行う。
【００６３】
信号処理部20からは、測定チップ９に依存する感度バラツキを補正した感度補正済みの信号値が出力される。これにより、分析対象たるオリゴ・ヌクレオチドの塩基配列がセンシング媒体としてのオリゴ・ヌクレオチドの塩基配列に対して一致するものであるか否か、また一致の程度等を分析することができる。
【００６４】
なお、センシング媒体３０としてのオリゴ・ヌクレオチドに対して分析対象たるオリゴ・ヌクレオチドの塩基配列の一致度によって、ＳＰＲ信号値が変化し、例えば、１０個の塩基が一致する場合と１３個の塩基全てが一致する場合とでは微妙に信号量（信号変化量）が異なる。このとき、先に求めたずれ量Δθによる感度補正を行わない場合、両者の信号変化量の差異が不明確となる虞があるが、上述のような感度補正を施すことにより、高い精度で信号変化量を検出することができるため、より詳細な情報を正確に取得することができる。
【００６５】
なお、同一のオリゴ・ヌクレオチドを用いたミスマッチ検出において、上述の相補鎖による感度補正を行わなかった場合と、感度補正を行った場合について各２０個の測定チップについて測定を行った結果、感度補正を行わなかった測定チップ２０個についての信号のバラツキ（ＣＶ値）が９％であったのに対し、感度補正を行った測定チップ２０個についての信号のバラツキは３％であった。
【００６６】
次に、試料液内に所定のタンパク質が含まれているか否かを測定する際の測定方法を説明する。
【００６７】
まず、金属膜として金膜を用い、該金膜上にカルボキシル基が表面に豊富にある固定化膜（カルボキシメチルデキストラン）を固定する。このカルボキシメチルデキストランは、金膜上にタンパク質を吸着される媒介として作用するものである。
【００６８】
このカルボキシメチルデキストラン上に分子サイズおよび屈折率が既知であるＮ−アビジン（等電点〜ｐＨ７）をｐＨ〜６の酢酸緩衝溶液を用いて固定化する。カルボキシメチルデキストラン表面はマイナス、Ｎ−アビジンはプラスに帯電しているので、静電作用により効果的に固定化することができる。なお、Ｎ−アビジンは分析対象たるタンパク質と略同一サイズおよび略同一の屈折率を有するものである。
【００６９】
Ｎ−アビジンを固定化した状態でＳＰＲ信号の検出を行う。Ｎ−アビジンの屈折率から求められる本来の信号値からのずれ量Δθを感度補正量として、感度補正手段による感度補正がなされる。
【００７０】
その後、バッファのｐＨを〜９にすることによって、Ｎ−アビジンをカルボキシメチルデキストランから解離させる。ｐＨを９程度にすることによって、カルボキシメチルデキストラン表面およびＮ−アビジンは、共にマイナスに帯電するために、静電的な反発によりＮ−アビジンを解離させることができる。ただし経験的に、一旦固定化されたＮ−アビジンは、バッファのｐＨを変えただけでは完全には脱離することができないため、ｐＨ〜９のバッファにより脱離を行った後、２Ｍ（モル濃度）のNaOH溶液にて洗浄を行う。これにより、固定化したＮ−アビジンを完全に除去することができる。
【００７１】
その後、分析対象分子としてタンパク質を含む試料液を分注し、継続的にもしくは所定時間経過後にＳＰＲ信号の測定を行うことにより、該タンパク質が所定のものであるか否かを検出することができる。
【００７２】
上述の表面プラズモン測定装置は、一部の構成を変更することにより漏洩モード測定装置とすることができる。図８は、上述の表面プラズモン測定装置１０１の一部を変更して構成した漏洩モード測定装置の測定ユニットの側面図である。なおこの図８において、図２中の要素と同等の要素には同番号を付してあり、それらについての説明は特に必要の無い限り省略する。
【００７３】
この漏洩モード測定装置も、上述の表面プラズモン測定装置と同様に測定チップ９を用いるように構成されている。この測定チップ９の上面に形成された凹部１０ｃの底面にはクラッド層４０が形成され、さらにその上には光導波層４１が形成されている。これらクラッド層４０と光導波層４１とによって薄膜層が形成されている。
【００７４】
誘電体ブロック１０は、例えば合成樹脂やＢＫ７等の光学ガラスを用いて形成されている。一方クラッド層４０は、誘電体ブロック１０よりも低屈折率の誘電体や、金等の金属を用いて薄膜状に形成されている。また光導波層４１は、クラッド層４０よりも高屈折率の誘電体、例えばＰＭＭＡを用いてこれも薄膜状に形成されている。クラッド層４０の膜厚は、例えば金薄膜から形成する場合で３６．５ｎｍ、光導波層４１の膜厚は、例えばＰＭＭＡから形成する場合で７００ｎｍ程度とされる。
【００７５】
上記構成の漏洩モード測定装置において、レーザ光源１４から射出された光ビーム１３を誘電体ブロック１０を通してクラッド層４０に対して全反射角以上の入射角で入射させると、該光ビーム１３の多くの成分が誘電体ブロック１０とクラッド層４０との界面１０ｂで全反射するが、クラッド層４０を透過して光導波層４１に特定入射角で入射した特定波数の光は、該光導波層４１を導波モードで伝搬されるようになる。こうして導波モードが励起されると、特定入射角で入射した入射光のほとんどが光導波層４１に取り込まれるので、上記界面１０ｂに特定入射角で入射し、全反射された光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。
【００７６】
光導波層４１における導波光の波数は、該光導波層４１上の試料液１１の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角である全反射解消角を知ることによって、試料液１１の屈折率や、それに関連する試料液１１の特性を分析することができる。
【００７７】
このような漏洩モード測定装置においても、上記表面プラズモン測定装置の場合と同様に感度補正手段を備えることにより、同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施の形態による表面プラズモン測定装置の概略構成を示す平面図
【図２】表面プラズモン測定装置の側面形状を示す図
【図３】表面プラズモン測定装置の電気的構成を示すブロック図
【図４】光ビームの界面への入射角と差動アンプの出力との関係を示す図
【図５】本発明の測定方法を説明するための模式図
【図６】漏洩モード測定装置の一例を示す図
【図７】金属物性値の変動に伴うＳＰＲ信号の変動を示すグラフ
【符号の説明】
【００７９】
９    測定チップ
１０    誘電体ブロック
１３    光ビーム
１４    レーザ光源
１５    入射光学系
１６    コリメータレンズ
１７    光検出器
１８    差動アンプアレイ
１９    ドライバ
２０    信号処理部
２１    表示手段
３０    センシング媒体
３０’    参照分子
３３    分析対象分子
１０１    表面プラズモン測定装置
１０１Ａ、１０１Ｂ、１０１Ｃ…    表面プラズモン測定ユニット
【図１】
2005221274.tif 000004
【図２】
2005221274.tif 000005
【図３】
2005221274.tif 000006
【図４】
2005221274.tif 000007
【図５】
2005221274.tif 000008
【図６】
2005221274.tif 000009
【図７】
2005221274.tif 000010