(57)【要約】【課題】  土壌中で難溶性のフィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として生育することが可能な微生物を提供するとともに、この微生物の様々な利用方法を提供する。【解決手段】  本願発明者等は、不良環境条件下において植物と微生物との間の相互作用を植物栄養学的見地から解析するために、高い低リン耐性を示す白花ルーピンを栄養制限を施した土壌中で栽培した。そして、その土壌中からフィチンを唯一の炭素源およびリン源として微生物をスクリーニングした結果、土壌中の難溶性リン化合物せあるフィチン酸アルミニウム塩を唯一の炭素源およびリン源として生育することが可能な微生物の存在を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の微生物は、土壌を肥沃化する土壌添加剤、植物の成長を促進させる植物成長促進剤、土壌汚染防止剤などに利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌中の難溶性フィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として利用して生育することを特徴とする微生物。
【請求項２】
上記微生物は、植物の根の周辺に生息し、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離して植物に供給することを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２４のバークホーデリア・ｓｐｐ．ＦＬＡＰ１であることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れか１項に記載の微生物を含んでなる土壌添加剤であって、土壌を肥沃化することを特徴とする土壌添加剤。
【請求項５】
上記土壌添加剤には、さらに、炭素栄養源が含まれていることを特徴とする請求項４に記載の土壌添加剤。
【請求項６】
上記土壌添加剤は、マメ科植物が生育している土壌中に添加されることを特徴とする請求項４または５に記載の土壌添加剤。
【請求項７】
請求項４または５に記載の土壌添加剤を含み、植物が生育する土壌中に添加することによって、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離して植物の栄養源として植物に供給し、植物の成長を促進させる植物の成長促進剤。
【請求項８】
マメ科植物に対して用いられることを特徴とする請求項７に記載の植物の成長促進剤。
【請求項９】
請求項４ないし６の何れか１項に記載の土壌添加剤を土壌中に添加し、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離させて植物に吸収させることによって、難溶性フィチン酸塩が土壌中に残留することを防止する方法。
【請求項１０】
請求項４ないし６の何れか１項に記載の土壌添加剤を含んでなる土壌汚染防止剤。
【請求項１１】
請求項１ないし３の何れか１項に記載の微生物によって生産されるフィターゼタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１に記載のフィターゼタンパク質を含んでなる土壌添加剤であって、土壌を肥沃化することを特徴とする土壌添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌中でフィチン酸とアルミニウムや鉄などの金属とが結合して形成された難溶性のフィチン酸塩を唯一の栄養源（炭素源、リン源）として生育することが可能な微生物と、その微生物の種々の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近代農業においては、窒素、リンなどの化学肥料を大量に投入する多収型農法が主流である。しかし、この多収型農法を長期的に行う場合、化学肥料の原料となる資源の枯渇、化学肥料の製造段階での環境汚染、化学肥料の土壌中への残留による環境汚染などといった様々な問題が発生する。そこで、将来的にはより少ないエネルギー・資源投入量で安定した収量が得られる低投入持続型農法への転換が求められることが予測される。
【０００３】
この低投入持続型農法の開発において注目されているのが、土壌中に生息し、植物と相互に影響を及ぼし合って共生している土壌微生物である。このような土壌微生物を単離し、その機能解析を通して有効な利用法を見つけ出すことで、新しい農法の開発に貢献できることが期待されている。これまでのところ、この土壌微生物を植物栽培に利用しようとする研究は、根粒菌および土壌病害拮抗菌に集中しており、他の微生物に関する研究は極めて限られた種に対してのみでしか行われてこなかった。しかし、１９９０年代に入ると根圏微生物中に植物生育促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）として植物の生育促進効果を持つ細菌の存在が認知されてきた（非特許文献１参照）。
【０００４】
さらに近年、植物の不良環境土壌への適応に関する研究から、根と土との境界である根面（Rhizoplane）に生息する根面微生物の働きが注目され始めている。
【非特許文献１】Gieseke A., Appl. Environ. Microbiol. 67 1351-1362 (2001)
【非特許文献２】Richardson A. E., Hadobas P.A., Hayes J.E., Plant J., 25 641-649 (2001)
【非特許文献３】藤原伸介、早野恒一、原田靖生、福士定雄（１９９１年）、「研究成果  ２５９」、７１−８３頁、農林水産技術会議事務局
【特許文献１】特開２０００−５０８６３公報（２０００年２月２２日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の近代農法における問題点の一つとして、リン肥料の原料であるリン鉱石の枯渇が挙げられる。耕地土壌中には、植物残さあるいは施用した肥料が難溶性のフィチン酸アルミニウム塩として固着し、大量に存在している場合が多い。そこで、土壌中に大量に含まれる難溶性フィチン酸アルミニウム塩を有効に利用することができれば、リン肥料の施肥量を減らすことができ、リン鉱石の枯渇に対して歯止めをかけることができると考えられる。しかしながら、フィチン酸アルミニウム塩は土壌中で安定な化合物であり、不溶性であるため、植物はこれをリン栄養源として利用することができない。
【０００６】
上述のような問題を解決するためには、土壌中の難溶性フィチン酸塩を可溶化する、つまり、フィチン酸塩からリン酸を遊離させることが有効である。土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離させれば、土壌中に生育する植物がリン栄養源としてリン酸を利用することが可能となるため、リン肥料の土壌への施肥量を大幅に減らすことができる。
【０００７】
これまでに報告されている、土壌中のフィチン酸塩からリン酸を遊離させる方法としては、形質転換によって可溶性のフィチン酸のリンを利用することが可能なフィターゼを獲得し、これを用いて水溶性のフィチン酸ナトリウムからリン酸を遊離させるという方法がある（非特許文献２参照）。このフィターゼは、従来公知の微生物由来のフィターゼ遺伝子を植物に形質転換し、この遺伝子を組み込んだ植物を栽培し、この植物からフィターゼを放出することによって得られる。しかしながら、この方法は難溶性のフィチン酸塩に対しては有効ではない。また、他の方法としては、キレート剤の添加によって難溶性フィチン酸塩を可溶化させ、フィターゼによってリン酸を遊離させる方法や、難溶性フィチン酸塩に対して資化性を持つ糸状菌の施与による方法がある（非特許文献３参照）。
【０００８】
そこで本発明では、土壌中で難溶性のフィチン酸塩を唯一の栄養源（炭素源、リン源）として生育することが可能な微生物を提供するとともに、この微生物を利用して土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離させて植物に利用可能にさせることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記の問題点に鑑みて鋭意検討した結果、土壌中の難溶性フィチン酸塩を分解し、栄養源として利用することができる新規な微生物を見出すとともに、当該微生物を植物の成長促進剤や土壌汚染防止剤などに利用することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明にかかる微生物は、土壌中の難溶性フィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として利用して生育することを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明の微生物は、植物の根の周辺に生息し、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離して植物に供給するものであることが好ましい。さらに、本発明の微生物は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２４のバークホーデリア・ｓｐｐ．ＦＬＡＰ１（Burkholderia spp. FLAP1）であってもよい。
【００１２】
本発明の土壌添加剤は、上述の本発明の微生物のうちの何れかを含んでなる土壌添加剤であって、土壌を肥沃化することを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明の土壌添加剤には、さらに、例えば多糖や糖、クエン酸などの有機酸といった炭素栄養源が含まれていることが好ましい。また、本発明の土壌添加剤は、マメ科植物が生育している土壌中に添加されることが好ましい。
【００１４】
本発明の植物の成長促進剤は、上述の本発明の土壌添加剤のうちの何れかを含んでおり、植物が生育する土壌中に添加することによって、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離して植物の栄養源として植物に供給し、植物の成長を促進させるものである。上記の本発明の植物の成長促進剤は、マメ科植物に対して用いられることが好ましい。
【００１５】
また、本発明には、上述の本発明の土壌添加剤のうちの何れかを土壌中に添加し、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離させて植物に吸収させることによって、難溶性フィチン酸塩が土壌中に残留することを防止する方法も含まれる。
【００１６】
また、本発明の土壌汚染防止剤は、上述の本発明の土壌添加剤のうちの何れかを含んでなるものである。
【００１７】
さらに、本発明のフィターゼタンパク質は、上述の本発明の微生物のうちの何れかによって生産されるものである。また、本発明の土壌添加剤は、本発明のフィターゼタンパク質を含んでなる土壌添加剤であって、土壌を肥沃化することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の微生物によれば、土壌中の多量に残留している難溶性のフィチン酸塩を分解することができる。そして、この難溶性フィチン酸塩から遊離したリン酸を植物が栄養源として吸収することが可能となる。それゆえ、この微生物を植物が生育する土壌中に添加すれば、植物に対して施肥するリン肥料の量を大幅に減少させることができる。なお、上記微生物は、特にマメ科植物が生育する土壌において活性化されるため、マメ科植物が生育している土壌中に添加されると、フィチン酸塩の分解をより効果的に行うことができる。
【００１９】
以上のように、本発明にかかる微生物が単離されたことで、植物を生育させる場合に土壌中の大量に蓄積されている難溶性フィチン酸塩を有効に利用することが可能となる。それに加え、難溶性のフィチン酸塩が土壌中に残留していると、雨水や地下水などとともに河川や海洋に流れ出て汚染源となるという問題が発生するが、本発明の微生物は、汚染源となるフィチン酸塩を分解することができるため、この問題についても解決することができる。
【００２０】
すなわち、本発明の微生物は、土壌を肥沃化させる土壌添加剤に利用することができ、さらに、上記土壌添加剤は、土壌汚染防止剤としても利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２２】
近年、植物が生育する土壌環境である根圏に生息する根圏細菌中に植物生育促進根圏細菌（ＰＧＰＲ）として植物に対して生育促進効果を持つ細菌の存在が認知されてきた。また、植物の不良環境条件への適応に関する研究から、根と土との境界である根面に生息する根面微生物の働きが注目されてきている。
【００２３】
本願発明者等は、不良環境条件下において植物と微生物との間の相互作用を植物栄養学的見地から解析するために、高い低リン耐性を示す白花ルーピン（Lupinus albus L. cv. kievskij mutant）を栄養制限を施した北海道大学の長期連用試験区（１９０４年設立）で栽培した。そして、土壌中から水溶性フィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として微生物をスクリーニングした結果、土壌中の難溶性リン化合物せあるフィチン酸アルミニウム塩を唯一の炭素源およびリン源として生育することが可能な微生物の存在を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２４】
（１）本発明の微生物について
本発明にかかる微生物は、土壌中の難溶性フィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として利用して生育することを特徴とするものである。
【００２５】
ここで、「難溶性フィチン酸塩」とは、フィチン酸とアルミニウム、鉄、カルシウム、銅、亜鉛などのカチオン（金属イオン）とによって形成される難溶性の塩のことである。フィチン酸は、イノシトール６リン酸からなる土壌中リンの２０〜８０％を占める有機態リンの主要成分であり、Ａｌイオン、Ｆｅイオン、Ｃａイオンなどの各種カチオンと難溶性の塩を形成する。この難溶性の塩は、一般的なフォスファターゼでは分解できず、フィターゼによって特異的に分解される。そのため、土壌中では、分解されずに安定した状態を保っている。
【００２６】
本発明にかかる微生物は、この難溶性フィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として利用して生育することができる。つまり、本発明の微生物は、難溶性フィチン酸塩を分解し、リン酸を遊離させるという機能を有するものである。
【００２７】
本発明にかかる微生物によれば、土壌中の多量に残留している難溶性のフィチン酸塩を分解することができる。そして、この難溶性フィチン酸塩から遊離したリン酸を植物が栄養源として吸収することが可能となる。それゆえ、この微生物を植物が生育する土壌中に添加すれば、植物に対して施肥するリン肥料の量を大幅に減少させることができる。
【００２８】
図１には、本発明にかかる微生物の作用によって、土壌中のフィチン酸アルミニウム塩からリン酸を遊離して、植物に供給する様子を模式的に示す。図１に示すように、本発明の微生物１の作用（矢印Ａ）によって、土壌中に大量に蓄積している難溶性のフィチン酸アルミニウム塩（Ａｌ−ＩＨＰ）からリン酸（Ｈ３ＰＯ４）が遊離する（矢印Ｂ）。遊離したリン酸（Ｈ３ＰＯ４）は可溶性であるため、植物の根２へ吸収され（矢印Ｃ）、さらに、植物の各器官へと供給される（矢印Ｄ）。
【００２９】
ここで、本発明の微生物を単離する方法（スクリーニング方法）について説明する。本発明の微生物は、土壌中からフィチン酸塩を唯一の炭素原およびリン源として生育する微生物を選抜するというスクリーニングによって単離することができる。
【００３０】
より詳しくは、先ず、無機リン酸が欠乏し、有機態リンが蓄積した土壌を準備し、そこに植物を生育させる。次に、植物の生育後に当該植物の根圏および根面からサンプルを採取する。そして、このサンプルから従来公知の方法に基づいて微生物懸濁液を調製する。
【００３１】
続いて、この微生物懸濁液を、炭素およびリンの唯一の供給源として水溶性フィチン酸ナトリウム塩（Ｎａ−ＩＨＰ）を含むフィチン酸特異的培地で培養することによって、フィチン酸を栄養源として利用可能な微生物を選抜することができる。なお、このスクリーニング方法については、例えば、上記特許文献１に記載の方法に基づいて実施することができる。
【００３２】
そして、選抜されたフィチン酸を栄養源として利用可能な微生物について、今度は難溶性フィチン酸塩（例えば、Ａｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰ、Ｃａ−ＩＨＰなど）を唯一の炭素源およびリン源として含む培地で培養を行うことによって、本発明にかかる微生物を取得することができる。
【００３３】
また、上記のフィチン酸特異的培地として、難溶性フィチン酸塩（例えば、Ａｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰ、Ｃａ−ＩＨＰなど）を唯一の炭素源およびリン源として含む培地を用いれば、本発明にかかる微生物を上記の微生物懸濁液から直接単離することができる。ただし、異なる微生物間の相互作用に基づく効果を除くためには、単離後に再度その生理的な特性を解析する必要がある。
【００３４】
なお、本発明にかかる微生物を取得するためには、当該微生物が生息している可能性のある植物の根圏土壌および植物の根面土壌から土壌試料を採取し、スクリーニングすることが好ましい。そして、有機態リン利用能の高い植物根圏から試料を取得したり、マメ科植物（白花ルーピン、ダイズ、エンドウ、アズキ、ミヤコグサなど）の生育している土壌中から試料を取得したりして、スクリーニングを行うことが好ましい。これによれば、難溶性フィチン酸塩分解能を有する本発明の微生物を効率良く取得することができる。
【００３５】
なお、本願発明者らが上述の方法で本発明にかかる微生物をスクリーニングして、当該微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列から当該微生物の同定を行った結果、本発明にかかる微生物の多くは、バークホーデリア属に属するものであった。
【００３６】
続いて、本発明の微生物の培養方法について以下に説明する。
【００３７】
本発明にかかる微生物は、難溶性のフィチン酸塩を炭素源およびリン源として利用することが可能であるため、その培養に使用する培地としては、炭素源およびリン源として上記フィチン酸塩を含むものを挙げることができる。しかしながら、本発明の微生物の培養に使用する培地は、適当な炭素源、リン源、窒素源、無機塩類などを含む培地であれば特に限定されない。好ましい炭素源としては、イノシトール、グルコースなどが、好ましいリン源としては、無機リン酸などが、好ましい窒素源としては、アンモニウム無機塩、硝酸無機塩などが挙げられる。
【００３８】
培養に際しては、温度を２５〜３０℃、ｐＨを４〜７に維持することが好ましい。さらに、ＮａＣｌなどの従来公知の塩を適宜添加することにより、好適な塩濃度で培養することが好ましい。
【００３９】
本発明にかかる微生物の具体例としては、バークホーデリア属の一種であるバークホーデリア（Burkholderia）・ｓｐｐ．ＦＬＡＰ１を挙げることができる。この微生物株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。寄託日は、平成１５年９月１８日であり、受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２４である。
【００４０】
以下に、本発明にかかる微生物株バークホーデリア・ｓｐｐ．ＦＬＡＰ１の特徴について説明する。
【００４１】
微生物株バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１は、マメ科植物の白花ルーピン（Lupinus albus L. cv. kievskij mutant）を、炭素源とリン源が厳しく制限された環境下で生育させ、土壌、水中分画にて分画した白花ルーピンの根圏および根面に生息する微生物としてスクリーニングされたものである。このスクリーニングの詳細な方法については、後述の実施例に記載する。
【００４２】
この微生物株の菌学的性状について以下の通りである。
細胞の形：桿菌、運動性：（＋）、グラム染色性：陰性、酸素要求性：好気性、コロニーの色：乳白色、コロニーの形状：円形
また、この微生物株の培養条件は、次の通りである。
１．培地
ＳＯＹＢＥＡＮ−ＣＡＳＥＩＮ  ＤＩＧＥＳＴ  ５００ｇ（日本製薬株式会社（３９３−００１８５）を用いることが好ましい。また、第１３改正日本薬局方一般試験法、及び、薬発第２９７号「内用液剤およびＸ線造影剤の菌数の限度及び試験法について」などに記載されているソイビーン・カゼイン・ダイジェスト・ブロス培地（ＳＣＤ液状培地）に該当する培地を使用してもよい。
２．培地の組成
精製水１Ｌ当たり、カゼイン製ペプトン１７ｇ、大豆製ペプトン３ｇ、リン酸一水素カリウム２．５ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを含むものを用いることが好ましい。
３．培地のｐＨ
培地を滅菌した後のｐＨで、ｐＨ７．１〜７．５とすることが好ましい。
４．培地の殺菌条件
培地調製後、１２１℃、２０分でオートクレーブすることが好ましい。
５．培養温度：２５〜３０℃とすることが好ましい。
６．培養期間：３日間の培養で約２ｍｍのコロニーを形成する。
７．酸素要求性：通性好気性条件下での培養が好ましい。
【００４３】
上記の微生物株バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１は、フィチン酸アルミニウム塩などの難溶性のフィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として生育することが可能である。そのため、難溶性であるため植物の栄養源としては利用できなかったフィチン酸アルミニウム塩を、本発明にかかる微生物の作用によって、植物の栄養源として使用することが可能となる。
【００４４】
従来、難溶性のフィチン酸アルミニウム塩は、土壌の肥沃度として評価されなかったが、本発明の微生物を生息させた土壌中においては、肥沃度として評価することができるため、土壌への肥料（特に、リン酸肥料）の施肥量を大幅に減量させることが可能となる。したがって、本発明の微生物は、少ないエネルギー・資源投入量で安定した収量が得られる低投入持続型農法の実現に大きく貢献できると考えられる。
【００４５】
（２）微生物の利用方法
続いて、本発明の微生物の利用方法について説明する。
【００４６】
上述したように、本発明にかかる微生物は、難溶性のフィチン酸塩を唯一の炭素源およびリン源として生育することが可能である。そのため、土壌中で生息させることによって、土壌中に大量に含まれる難溶性フィチン酸塩を可溶化し、それに由来する炭素およびリンを、当該土壌中に生育している植物へ養分として供給すれば、植物の栄養を促進することができる。
【００４７】
そこで、本発明にかかる微生物は、土壌を肥沃化するための土壌添加剤として利用することができる。つまり、本発明の土壌添加剤は、本発明の微生物を含んでなる土壌添加剤であって、土壌を肥沃化することを特徴とするものである。
【００４８】
本発明の土壌添加剤を土壌に添加すれば、当該添加剤に含まれる微生物の作用によって植物が利用不可能な難溶性のフィチン酸塩を可溶化することができ、植物の炭素源およびリン源という栄養源とすることができるため、結果的に土壌を肥沃化させることができる。
【００４９】
本発明の土壌添加剤は、本発明の微生物が生存可能な状態で含まれているものであればよく、それ以外の含有物は特に限定されない。この土壌添加剤には、土壌を肥沃化するために用いられる従来公知の土壌添加剤に含まれる成分を含有させることができる。
【００５０】
また、本発明の土壌添加剤の効果を向上させるためには、当該添加剤に含まれる微生物の活性を向上させればよい。本発明の土壌添加剤の肥沃化効果を向上させるための方法としては、当該土壌添加剤に、さらに、多糖や糖、クエン酸などの有機酸を含む炭素栄養源などを含ませるという方法、あるいは、当該土壌添加剤を、クエン酸などのキレート剤と共に施与するという条件のもとで使用するという方法などを挙げることができる。
【００５１】
また、本発明の土壌添加剤に含まれる微生物がバークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１である場合には、当該土壌添加剤にさらに多糖や糖、クエン酸などの有機酸を含む炭素栄養源などを含ませたり、当該土壌添加剤を、クエン酸などのキレート剤と共に施与するという条件のもとで使用したりすることが好ましい。これによれば、当該土壌添加剤の土壌肥沃化効果を向上させることができる。
【００５２】
さらに、微生物株バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１は、マメ科植物の白花ルーピンと共生関係にあることが確認されているため、上記土壌添加剤をマメ科植物が生育している土壌で使用すれば、土壌をより一層肥沃化することができる。その結果として、上記土壌添加剤が添加された土壌に生育するマメ科植物の成長を促進させることができる。
【００５３】
以上のように、本発明の土壌添加剤は、植物の成長を促進させる効果を発揮するため、植物の成長促進剤として利用することができる。つまり、本発明の植物の成長促進剤は、上記の土壌添加剤を含んでおり、植物が生育する土壌中に添加することによって、土壌中の難溶性フィチン酸塩からリン酸を遊離して植物の栄養源として植物に供給し、植物の成長を促進させるというものである。本発明の植物の成長促進剤によれば、化学肥料であるリン肥料の施肥量を減少させても、植物の成長を維持することができる。
【００５４】
本発明の植物の成長促進剤には、上記の土壌添加剤以外の成分として、他の植物成長促進作用を有する成分が含まれていてもよい。これによって、植物の成長を一層促進させることが可能となる。
【００５５】
また、本発明の植物の成長促進剤に微生物株バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１が含まれる場合には、特にマメ科植物に対して顕著な成長促進効果を示す。それゆえ、本発明の植物の成長促進剤は、マメ科植物に対して用いられることが好ましい。
【００５６】
また、本発明の微生物は、難溶性のフィチン酸塩を分解することができることから、このフィチン酸塩を分解できる酵素タンパク質であるフィターゼを生産することができると考えられる。このことは、後述の実施例で本発明にかかる微生物が高いフィターゼ活性を有していることからも示唆される。
【００５７】
したがって、本発明には、本発明にかかる微生物が生産するフィターゼタンパク質も含まれる。このフィターゼタンパク質は、本発明の微生物を培養（好ましくは、大量培養）した後、当該微生物から従来公知の酵素の精製方法に基づいて取得することができる。上記フィターゼタンパク質を用いれば、土壌中の難溶性のフィチン酸塩をより効率的に分解することができる。それゆえ、本発明の土壌添加剤は、上記のフィターゼタンパク質を含むものであってもよい。
【００５８】
さらに、本発明にかかる微生物、および、この微生物を含んでなる土壌添加剤のもう一つの利用の仕方として、難溶性のフィチン酸塩が土壌中に残留して汚染源となることを防止するというものが挙げられる。
【００５９】
土壌中の難溶性のフィチン酸塩は、上述のように土壌中で非常に安定な化合物であるため、土壌中に残留している。そして、この残留しているフィチン酸塩は、雨水や地下水など一緒に河川に流れ出ることになり、河川や海洋の汚染源となることが問題となっている。
【００６０】
それゆえ、本発明の微生物や、それを含んでなる土壌添加剤を土壌中に添加し、難溶性のフィチン酸塩を可溶化してリン酸を遊離させ、この遊離されたリン酸を植物に吸収させることによって、フィチン酸塩が土壌中に残留することを防止することができる。これによって、汚染源となるフィチン酸塩が河川や海洋に流れ出ることを防止することができる。
【００６１】
つまり、本発明の微生物や土壌添加剤は、土壌汚染防止剤やフィチン酸塩が土壌中に残留することを防止する方法に利用することができる。
【実施例】
【００６２】
〔実施例１〕微生物の取得
（１）試験土壌の整備と土壌試料採取
白花ルーピン（Lupinus  albus  L.  cv.  Kievskij  mutant）は、窒素、リン酸、カリ、硫酸肥料を含まない北海道大学の長期連用試験区で２００２年５月から９月まで栽培された。土壌のタイプは、褐色低地土壌（ｐＨ（Ｈ２Ｏ）６．２）に分類される。土壌試料は、播種前、播種から１２、４０、５８、７８日経過後にそれぞれの敷地から採取された。植物の生育していない土壌では、播種前に上層５ｃｍのところから試料を採取した。
【００６３】
採取した土壌試料から、土壌微生物懸濁液が以下の方法で作製された。土壌１０ｇが滅菌された０．９％ＮａＣｌ溶液１００ｍｌに懸濁され、１２０ｒｐｍで２時間攪拌された。その後、懸濁液は１０分間静置され、０．９％ＮａＣｌ溶液で、１０倍希釈液が第４回目の希釈液（１０４倍希釈液）まで順次作製された。播種後には、根圏土壌および根面試料は、各試験土壌から６個体づつ無作為に採取され、微生物懸濁液は、水中分画法によって調製された。根圏土壌および根面試料から得られた微生物懸濁液の第２番目と第３番目の希釈液が、さらなる解析に使用された。微生物懸濁液の調製は、全ての工程において室温で実施された。
（２）Ｎａ−ＩＨＰを利用する土壌微生物の単離
炭素源とリン源が著しく制限された環境下で生育可能な土壌微生物を単離する目的で、Ｎａ−ＩＨＰを利用する微生物株が、培地特異的な生存活性によってスクリーニングされた。炭素およびリンの唯一の供給源としてＮａ−ＩＨＰ（水溶性フィチン酸塩：イネ由来のイノシトール−６リン酸−１２ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ製））を利用する微生物を単離して培養するために、２種類のフィチン酸特異的培地（ＰＳ培地）が使用された。
【００６４】
このＰＳ培地は、（１）培地中のｐＨの変化を観察するために０．０１ｇ／ｌのブロモクレゾールグリーン（Bromo  cresol  green）を添加する、あるいは、（２）１．５％の寒天を、異なる酸素要求性（呼吸）のタイプによって微生物の成長を分類することができる０．２％  Gelrite（和光純薬製）に代える、という２つの方法で調製された。（２）の方法で調製された培地を半固体ＰＳ培地と呼ぶ。
【００６５】
Ｎａ−ＩＨＰを利用する微生物を単離するために、異なる濃度の希釈サンプルが半固体ＰＳ培地中で培養され、個々のコロニーが得られた。これらのコロニーは半固体ＰＳ培地から採取され、固体培地上に移された。固体培地への移し換えは、純粋なコロニーを得るために複数回繰り返された。微生物の培養は、２６℃で実施された。
【００６６】
その結果、採取した土壌試料（根圏土壌、および根面試料）からＮａ−ＩＨＰを利用できる微生物株が全部で３００株以上単離された。これらの単離微生物は、フィチン酸Ｎａ（フィチン酸ナトリウム塩）を唯一の炭素源およびリン源として利用して生育することが可能であった。
【００６７】
さらに、これらの微生物に対して、呼吸のタイプ、コロニーの形態、培地のｐＨ変化が調べられた。その結果、全ての単離微生物は、半固体培地の上層にコロニーを形成したため、好気性または通性好気性と考えられた。ｐＨ変化解析では、多くの単離微生物が培養培地のｐＨを低下させる高い機能を有していた。
【００６８】
なお、単離された微生物のＮａ−ＩＨＰ利用能は、微生物の増殖速度、リン放出能、フィチン酸特異的（ＬＰＳ）培養液を制限した液体中での細胞外フィチン酸活性によって推測された。ＬＰＳ培養液は、１ｍＭＮａ−ＩＨＰを含むＰＳ培地の１０ｇのＮａ−ＩＨＰを置き換えることによって作製された。微生物の増殖速度は、１週間の水平振とう培養（２００ｒｐｍ）後にＡ６１０を測定することによって微生物の生体量の濃度として決定した。リン濃度は、モリブデートブルー法を使用して測定した。リン放出能は、培養後の培地のリン濃度によって決定された。細胞外フィチン酸活性は、RichardsonとHadobasの論文（Can. J. Microbiol. 43, 509-516（1997年））に記載の方法によって決定された。活性の１単位（Ｕ）は、１分間にＮａ−ＩＨＰから放出される１μｍｏｌのリン酸（Ｐｉ）で決定された。
（３）Ｎａ−ＩＨＰを利用する土壌微生物の同定
各微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列の確認が実施された。まず、全量ＤＮＡが単離された。そして、部分的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ断片が以下のプライマーを用いて増幅された。
（使用されたプライマー）
２７ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１：E.coliの１６Ｓ  ｒＤＮＡの８〜２７番目の部分）
１４９２ｒ：５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’ （配列番号２：E.coliの１６Ｓ  ｒＤＮＡの１５１０〜１４９２番目の部分）
ｒＤＮＡ断片は、Ｔ−ＧＲＡＤＩＥＮＴ（Biometra製）、ＫＯＤ  ＤＡＳＨ（東洋紡製）を使用することによって、ＤＮＡテンプレート１μｌを含む２０μｌの反応溶液中で増幅された。増幅反応は、次に示すようなサイクル：９８℃２分間のプレ変性、その後、９８℃１５秒間、６４℃２秒間、７２℃４５秒間のＰＣＲ反応を３３サイクル実施、続いて、７２℃２分間の処理：で行われた。これらのＰＣＲ産物は、８０μｌのＴＥに添加され、６０μｌの２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌと混合された。その後、この混合物は、氷中に１時間静置され、１８，０００ｇで２０分間遠心分離された。ＤＮＡの濃度は、ＵＶ分光光度計（ＵＶ−１６００、島津製作所製）で２６０ｎｍの吸光度を測定することで決定された。配列決定に使用されたプライマーは、
ｒ２Ｌ’：５’−ＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣ−３’ （配列番号３：E.coliの１６Ｓ  ｒＤＮＡの８０５〜７８６番目の部分）
ｒ３Ｌ’：５’−ＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧＣＧＧＧＡＣＴ−３’ （配列番号４：E.coliの１６Ｓ  ｒＤＮＡの１１１１〜１０９３番目の部分）
であった。
【００６９】
配列決定における反応は、ＤＴＣＳ  クイックスタートキット（Beckman  Coulter製）を使用して実施された。２０μｌの反応溶液には、１００ｆｍｏｌのＤＮＡテンプレートおよび２μｍｏｌのプライマーが含まれていた。９６℃２０秒間、５０℃２０秒間、６０℃４分間の配列決定反応が３０サイクル実施された。これらの反応産物は、エタノール沈殿で精製された後、ＣＥＱ８０００（Beckman  Coulter製）にかけられた。決定された塩基配列は、ＤＤＢＪからＢＬＡＳＴｎプログラムによる相同性解析に使用された。
【００７０】
この１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列解析は、根圏効果が最も明らかに観察される播種から５８日経過後の開花段階で獲得した７３株のＮａ−ＩＨＰ利用微生物（根圏土壌から３６株、根面から３７株）について実施された。その結果、全ての単離微生物がプロテオバクテリアのベータプロテオバクテリアに属するとされ、そのうち７０株の微生物がバークホーデリア属と高い相同性を有することが確認された。
【００７１】
〔実施例２〕単離された微生物におけるＡｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰの利用能、および、植物の成長促進機能の確認
（１）Ｎａ−ＩＨＰを利用可能な微生物のＡｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰの利用能の確認
播種から５８日経過後の開花段階で獲得した上述の７３株のＮａ−ＩＨＰ利用微生物について、Ａｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰの利用能を有しているかの確認が以下のような方法で実施された。
【００７２】
フィチン酸カルシウム（和光純薬製）から得られたＡｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰは、JackmanとBlackの論文（Soil. Sci. 72, 179-186（１９５１年））に記載の方法によって調製された。この解析のために、調製ＰＳ半固体培地中のＮａ−ＩＨＰは、０．１％Ａｌ−ＩＨＰ、あるいは、Ｆｅ−ＩＨＰと置き換えられた。Ａｌ−ＩＨＰ培地とＦｅ−ＩＨＰ培地は、０．２％  Ｃａ−ＩＨＰと０．６％遊離リン酸（Ｐｉ）、あるいは、１．７％Ｃａ−ＩＨＰと５．５％遊離リン酸（Ｐｉ）をそれぞれ含んでいる。微生物の増殖速度とリン放出能は、上述のＮａ−ＩＨＰの利用の解析における方法と同様にして実施された。
【００７３】
その結果、７３株すべての単離微生物おいてＡｌ−ＩＨＰを含む培地のｐＨを低下させた。これは、これらの単離微生物がＡｌ−ＩＨＰを分解しながら生育することによって、培地が酸性化したことを示している。この結果から、単離された７３株の微生物はすべてＡｌ−ＩＨＰを唯一の炭素源およびリン源とした環境下で生育可能であることが示される。
【００７４】
そして、上記７３株の微生物のうち４６株の微生物が、Ｆｅ−ＩＨＰを含む培地のｐＨを低下させることが確認された。この結果から、上記４６株の微生物は、Ｆｅ−ＩＨＰを唯一の炭素源およびリン源とした環境下で生育可能であることが確認された。
【００７５】
以上の結果をまとめたものを表１および表２に示す。なお、表１は、根圏土壌から単離された微生物株をまとめたものであり、表２は、根面試料から単離された微生物株をまとめたものである。なお、表１、２における「ｐＨ変化」の欄については、ブロモクレゾールグリーン含む培地を用いた実験において、培地を強く酸性化したもの（培地の色が黄色に変化したもの）を（＋＋）で、培地を酸性化したもの（培地の色がやや黄色に変化したもの）を（＋）で、培地のｐＨ変化が認められなかったもの（培地の色が黄色に変化しなかったもの）を（−）で示している。また表１、２における「Ａｌ−ＩＨＰ利用能」および「Ｆｅ−ＩＨＰ利用能」の欄については、上記の実施例２（１）の実験において、Ａｌ−ＩＨＰあるいはＦｅ−ＩＨＰ利用能を確認した結果、利用能を有するものを（＋）で、利用能を有していないものを（−）で示している。
【００７６】
【表１】
2005110526.tif 000002
【００７７】
【表２】
2005110526.tif 000003
【００７８】
（２）単離された微生物が植物の成長に及ぼす影響の確認
植物と単離されたＮａ−ＩＨＰ利用微生物との相互作用を調べるために、ミヤコグサ（Lotus  japonicus  B-129  “gifu”）の種を使用した接種試験が実施された。ミヤコグサの種子は、北海道の国立農業試験場のミヤコグサ種子センターから提供されたものを用いた。
【００７９】
微生物はＬＰＳ培養液中で１週間、２００ｒｐｍで培養された。その後、１分間１０,０００ｇの遠心分離で集められ、得られたペレットは、滅菌脱イオン水で２度洗浄された。その後、ＯＤ６１０の値が０．０１になるように調製しながら滅菌脱イオン水に懸濁された。
【００８０】
種子は、濃硫酸中に２０分間浸漬された後、２％Tween２０を含む５０％  次亜塩素酸ナトリウム中に浸漬されることによって滅菌され、その後、滅菌水で数回洗浄された。発芽は、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む０．６％の寒天固体培地中で行われ、１週間後に、MurashigeとSkoogの論文（Physiol. Plant. 15, 473-497 （１９６２年））に記載の調製培地５０ｍｌが入った１００ｍｌ試験管内に移された。ここで、ＫＨ２ＰＯ４が、１ｍＭ  Ｎａ−ＩＨＰによって置き換えられ、さらに、５ｍＭ  ＭＥＳおよび０．７％  Gelriteを添加し、半固体培地が作製された。微生物懸濁液が接種された生育条件は、温度２３℃で１６時間の明環境（試験管の上部において、６６μＥｍ−１ｓ−２）／８時間の暗環境であった。１１週間の培養後、植物が採取された。そして、植物の長さ、乾燥重量、リン濃度が測定された。全量リンは、分解した後に、モリブデートブルー法によって測定された。
【００８１】
その結果、ミヤコグサの成長は、芽の長さに関しては、根圏土壌からの１４菌株、および、根面からの１６菌株で促進されており、根の長さに関しては、根圏土壌からの９菌株、および、根面からの１０菌株で促進されていた。
【００８２】
また、図２には、単離された微生物が接種された場合と、接種されていない場合それぞれのミヤコグサの成長の様子を示す。図２中、（ａ）および（ｂ）は微生物が接種されていないもの、（ｃ）は表２におけるＮｏ．２３の微生物が接種されたもの、（ｄ）は表２におけるＮｏ．２４の微生物が接種されたもの、（ｅ）は表２におけるＮｏ．２５の微生物が接種されたものである。
【００８３】
この結果から、表２におけるＮｏ．２４の微生物（つまり、図２（ｄ）の植物の根圏土壌に接種された微生物）は、植物の成長を大きく促進することが確認された、表２におけるＮｏ．２３の微生物（つまり、図２（ｃ）の植物の根圏土壌に接種された微生物）も、若干の植物の成長促進効果を有することが認められた。
【００８４】
本実験で、植物の成長を大きく促進させる効果が確認された表２におけるＮｏ．２４の微生物は、バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１と命名され、上述のように特許生物寄託センターに寄託された。
【００８５】
以上の実施例の結果から、マメ科植物の一種である白花ルーピンが生育している土壌（根圏および根面）から単離された微生物は、難溶性のフィチン酸塩（Ａｌ−ＩＨＰ、Ｆｅ−ＩＨＰ）を唯一の炭素源およびリン源として利用することが可能であることが確認された。つまり、上記の単離された微生物は本発明の微生物に含まれることが確認された。また、この単離された微生物株のうち、バークホーデリア・ｓｐｐ．・ＦＬＡＰ１を含む数種については、マメ科植物の一種であるミヤコグサの成長を促進する作用があることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の微生物は、土壌中において難溶性のフィチン酸塩を植物が利用可能なように可溶化することができる。それゆえ、化学肥料に頼っている現在の多収型農法から、より少ないエネルギー・資源投入量で安定した収量が得られる低投入持続型農法への転換に大きく貢献することが期待できる。つまり、本発明は農業分野の発展に大きく寄与する可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明にかかる微生物の作用によって、土壌中のフィチン酸アルミニウム塩からリン酸を遊離して、植物に供給する様子を示す模式図である。
【図２】本発明にかかる微生物によって、植物の成長が促進される様子を示す模式図である。
【図１】
2005110526.tif 000004
【図２】
2005110526.tif 000005
【配列表】
2005110526000001.app