(57)【要約】      （修正有）【課題】主要物質として分子種を含有する試料のＮＭＲスペクトルから、該分子種内の予め選択された同位元素の原子核の数を推定するための方法を提供する。【解決手段】該ＮＭＲスペクトルは該原子核に一致する複数のシグナルピークを含有している。含有および順序付けの基準を適用することにより、順序付けられたシグナルピークのセットが得られ、その積分から順序付けられた積分値のセットが導き出される。ネスト化した外部および内部反復サイクルが実行されるが、ここで各サイクルに対して、該順序付けされた積分値のひとつには原子核の試験番号が付与され、同時に他の順序付けられた積分値は適宜再設計され、隣接する整数値へと四捨五入され、これにより原子核の候補総数が得られる。複数の原子核の候補総数で発生回数が最も多いものから、最低値のものを取り出すことにより原子核の推定総数が得られる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要物質として分子種を含有する試料のＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルから、該分子種内の予め選択された(preselected)同位元素の原子核の数を推定するための方法であって、該ＮＭＲスペクトルは該原子核に一致する複数のシグナルピークを含有し、以下の工程からなる方法：
ａ）  該複数のシグナルピークから、含有の基準を満たす含有されたシグナルピークのセットを選択すること、
ｂ）  予め選択されたシグナルの順序付けの基準に従い、該含有されたシグナルピークのセットを順序付け、これに一致する順序付けられたシグナルピークのセットを得ること、
ｃ）  該順序付けられたシグナルピークそれぞれの積分値(integral)を決定し、これに一致する順序付けられた積分値のセットを得ること、
ｄ）  予め選択された最大整数を超えない、互いに同一ではない正の整数のセットを特定し、予め選択された数の順序付けの基準に従って該セットを順序付け、順序付けられた整数のセットを得ること、
ｅ）  該順序付けられた積分値の第一番目を選択することによって外部反復サイクル(outer iteration cycle)を開始し、選択された整数を得ること、
ｆ）  該順序付けられた整数の第一番目の値に通し番号を付与することによって内部反復サイクル(inner iteration cycle)を開始すること、
ｇ）  該現在選択された積分値に対する該通し番号の比率によって与えられる低減係数(common scaling factor)を計算すること、
ｈ）  該低減係数を、該順序付けられた積分値それぞれに乗じ、低減(scaled)積分値のセットを作製すること、
ｉ）  該低減積分値をそれぞれ、最も近い整数の値に四捨五入して、整数化した(integerized)低減積分値のセットを作製すること、
ｊ）  該整数化した低減積分値のセットの総数を計算して、原子核の候補総数を作成すること、
ｋ）  即時(instant)内部反復サイクルに一致する結果セットを検索可能に保存することであって、該保存した結果セットは少なくとも該原子核の候補総数を含むこと、
ｌ）  該順序付けられた整数中の次のものと同等の通し番号を設定することにより、さらなる内部反復サイクルを開始すること、続いて、該通し番号を、該選択された積分値に付与し、該順序付けられた整数のすべての処理が完了するまで工程ｇ）乃至ｌ）を繰り返すこと、
ｍ）  該順序付けられた積分値から次のものを選択することにより、さらなる外部反復サイクルを開始し、順序付けられた積分値がすべて処理されるまで工程ｆ）乃至ｍ）を繰り返すこと、
ｎ）  複数の該保存された結果セットから、各個の該原子核の候補総数の発生回数を決定すること、
ｏ）  最高発生回数を特定すること。
ｐ）  該発生最高数と等しい発生回数を示した、すべての原子核の候補総数で構成されるセットを形成すること、および；
ｑ）  該原子核の候補総数のセットから最低値を選択することにより、原子核の推定総数を得ること。
【請求項２】
さらに以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
ａ）  該原子核の推定総数、またはその倍数であるいずれかの整数であって、予め選択された倍化された最大整数(largest integer multiplicator)以下のものが、該分子種の原子核の仮総数と同一であるか否かを確認すること；および
ｂ）  該同一性の確認がすべて陰性であった場合、警告通知を発行すること。
【請求項３】
複数の整数化した低減積分値と、即時内部反復サイクル内で得られた複数の低減積分値間の偏差のグローバル測定が、該保存された各結果セットにさらに含有され、以下の工程をさらに含む請求項1または２に記載の方法：
ａ）  該原子核の推定総数に一致するすべての結果セットを取り出すこと；
ｂ）  偏差のグローバル測定の最小値を有する結果セットを選択すること；および
ｃ）  該選択した結果セットから、該順序付けたシグナルピークに一致する整数化した低減積分値を取り出すことにより得られる、一致する原子核の部分数(partial number)を該順序付けられたシグナルピークそれぞれに対して付与すること。
【請求項４】
以下の工程をさらに含む請求項３に記載の方法：
ａ）  該含有の基準を満たさないが、較正種(calibration species)の特定の原子核数に一致する較正シグナル(calibration signal)ピークを提供すること；
ｂ）  該較正シグナルピークを積分し、その結果を該特定の原子核数で割って較正積分値を得ること；
ｃ）  少なくとも一種の該順序付けられたシグナルピークを含む定量セットを選択すること；
ｄ）  該定量セットの順序付けられたシグナルピークに一致する順序付けられた積分値の合計を取り出すこと；
ｅ）  該定量セットの順序付けられたシグナルピークの原子核の推定部分数(estimated partial numbers)の合計を取り出すこと；
ｆ）  該順序付けられた積分値の合計と該原子核の推定部分数の合計との比率で定義された、正規化された試料積分値(normalized sample integral)を得ること；および
ｇ）  該正規化された試料積分値を該較正積分値で割って、試料中の分子種の相対濃度を得ること。
【請求項５】
該定量セットが、選択された結果セットに関連する選択された積分値と一致する順序付けられたシグナルピークから構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該較正シグナルピークがＥＲＥＴＩＣ法を用いて生成されるものである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
順序付けられたシグナルピークのセットおよび一致する原子核の推定部分数から、該分子種に関連する物質セットおよび該サンプルに含まれる不純物質種に関連する不純物質のセットを得る工程をさらに含むものである請求項３乃至６のいずれかに記載の方法であって、物質セットは順序付けられたシグナルピークを含有し、その原子核の推定部分数はゼロより大きく、不純物質セットは順序付けられたシグナルピークを含有し、その原子核の推定部分数はゼロに等しいものである方法。
【請求項８】
以下の工程をさらに含む、請求項７に記載の方法：
ａ）  該物質のセットのシグナルピークに一致する、一種の積分値または複数の積分値の合計を取り込むことにより、物質関連積分値を得ること；
ｂ）  該不純物質のセットのシグナルピークに一致する、一種の積分値または複数の積分値の合計を取り込むことにより、不純物質関連積分値を得ること；および
ｃ）  不純物質関連積分値と物質関連積分値を比較し、試料中に含まれる不純種の原子核の相対数に対する尺度(measure)を得ること。
【請求項９】
請求項４乃至６のいずれかに記載の方法の、該試料中の該分子種の定量的な決定への使用。
【請求項１０】
コンピュータプログラム製品のコンピュータシステムを起動した際、請求項１乃至８のいずれかに記載された方法を実行するための、コンピュータで解読可能な媒体に保存されたプログラムの暗号化手段を含むコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルから、分子種内の予め選択された同位元素の原子核数を推定する方法、該方法の使用および該方法を実行するコンピュータプログラム製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴分光法は多岐に渡る試料の定性分析および定量分析に広く適用される、既知の技術である。一般的に本技術には、スピン角運動量を有する１Ｈ、１３Ｃあるいはその他多数の、予め選択された核同位元素に対して選択的な条件の下で、核磁気共鳴スペクトル、以下ＮＭＲスペクトルと称する、を記録することが含まれる。一般的に、分子種を含む試料から得られたＮＭＲスペクトルは、予め選択された同位元素の原子核に起因する複数のシグナルピークを含有している。各シグナルピークは、ある特定の分子環境の結果として特定の局所磁場を生じるひとつまたは複数の原子核に起因する特定の共振周波数に一致している。すなわち、ＮＭＲシグナルピークが検出される共振周波数は、標準シグナルについて、１００万分の１（ｐｐｍ）を単位とする、いわゆる化学シフトにより表現されており、これはシグナルピークを生じさせる単数または複数の原子核の分子配置を示すものである。
【０００３】
その他の分析技術と比較した場合、ＮＭＲ分光法の重要な利点は、ある種の既知の状況下におけるシグナルピークの積分値が共鳴原子核の数に正比例しているということにある（例えば、Ｒ.Ｒ.エルンスト(R.R.Ernst)、Ｇ.ボーデンハウゼン(G.Bodenhausen)およびＡ.ウォーカン(A.Wokaun)、Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimensions、Oxford Science Publication社、１９８８年、第９１-１５７頁参照）。従って、ＮＭＲスペクトルにおける種々のシグナルピークの積分値は、各シグナルピークに寄与する原子核の数を反映している。この事実は、例えば、定性分析等を目的とする、非特定分子種のＮＭＲスペクトルの非自動化翻訳等のマニュアルの手引きとして日常的に使用されている。
【０００４】
さらに、ＮＭＲ分光法は、定量分析に使用することも可能である。先述したシグナルピークの積分値と共鳴原子核間に比例関係があることから、ＮＭＲシグナルピークの絶対積分値は、ＮＭＲ分光計の検出容積中に存在する、共鳴原子核を含有する分子数に直接関連する。しかしながら、ＮＭＲシグナルピークの絶対積分値は、概して多くの実験条件に依存している。従って、ＮＭＲ分光法による定量分析は、測定したシグナルの積分値と較正シグナルに基づく積分値との比較が必要である。
【０００５】
好適な較正シグナルを生み出すために、例えばフランス特許出願ＦＲ  ２７３５８６５  Ａ１号に記載されているような、様々な手法が当業界で知られている。とりわけ、ＦＲ  ２７３５８６５  Ａ１号には、電子機器により作製された合成ＮＭＲ較正シグナルを含む、ＮＭＲ分光法による定量分析のための装置および方法が開示されている。この技術は、Ｌ.バランティン(L.Barantin)、Ａ.ル パプ(A.Le Pape)およびＳ.アコカ(S.Akoka)、A new method for absolute quantitation of MRS metabolites. Magn. Res. Methods  第３８巻（１９９７年）第１７９-１８２頁に記載されているように、「ＥＲＥＴＩＣ」（Electronic REference To access In vivo Concentrationsの略称）という頭字語として知られるようになってきている。
【０００６】
ＮＭＲ分光法の定性的・定量的双方の適用における根本的な問題は、実際に得られたＮＭＲスペクトルのいずれであっても、理論上の期待値からは幾らか外れるということにある。この誤差は、主に不可避のノイズに起因するものであるが、しかしながら、領域（磁場）における不均一性、ドリフトおよびさらなる影響等の、その他の実験上の影響にも起因するものである。さらに、１Ｈ−ＮＭＲ分光法を行った際に起こる水素イオンの交換などの溶媒効果および溶媒交換反応は、積分値決定時の誤差を招く可能性がある。その結果、一つのシグナルピークの積分値と、同一分子種における他のものとを比較すると、通常、理論上の推定値とは幾らか差が出る。さらなる問題は、いわゆる化学シフトの縮退を原因とするものであり、これは同一分子種内の異なる位置にある原子核が実質的に同一の化学シフトを有している状況を示すものであり、それゆえ、重複したＮＭＲシグナルピークを生じる。これらの事実により、ＮＭＲ分光法による定性および定量分析において、下記の問題が生じている。
【０００７】
定性分析において、ある分子種の特定のＮＭＲスペクトルにおけるすべてのシグナルピークの相対積分値は、再設計(rescale)される必要がある。すなわち、各シグナルピークの積分値は、再設計された積分値がそれぞれ整数であるように通常の低減係数(common scaling factor)を乗じる必要がある。通常の低減係数は機器の検出感度および試料中の該分子種濃度の要因となる。こうして得られたセットの整数は、種々のシグナルピークを生み出す分子種における原子核の数に一致する。ノイズが小さく、スペクトルが単純で非密集であるといった好ましいケースでは、この手法を容易に問題なく実施することができる。しかしながら、好ましくない状況下において、強度を再設計されたセットの整数を計算することにより、非現実的な原子核数の溶液を生じることが可能である。例えば、一つの分子内の特定の原子核からそれぞれ得られた二種類のシグナルピークは、同一のシグナル積分値を有しているはずであるが、０．９７／１．０３という実験上の積分値比が見られたことから、この分子種は第一分類(the first sort)として９７の原子核、および第二分類(the second sort)として１０３の原子核を有していることを示唆すると考えられ、また、許容できないＮＭＲスペクトルの解釈を導くと考えられる。
【０００８】
定量分析において、決定されるべき分子種の特定のＮＭＲシグナルピークの積分値は、例えば、ＥＲＥＴＩＣ法による合成ＮＭＲシグナルであり得る、あるいは試料に添加される既知の濃度の較正物質(calibration substance)に由来する、適正な較正ピーク(calibration peak)の積分値と比較される。明らかに、この比較では、特定のシグナルピークの一因である、同一の化学シフトを有する原子核の数が十分に考慮されなければならない。定性分析の場合は、実験的に引き起こした、理想的なシグナルの積分値からの偏差はいかなるものであっても、定量的推定値と一致する誤算を生じる。先述の単純な例では、第一または第二積分値が較正積分値に比較されるか否かによって、結果は真正結果の０．９７または１．０３倍となる。
【０００９】
要するに、定性および定量分析におけるＮＭＲ分光法の有用性は、回避することができない実験の不正確性および化学シフトの縮退により、一つの分子種中の、予め選択された同位元素の原子核数を、該分子種を含む試料のＮＭＲスペクトルから直接得ることは概して不可能であるという事実に限定される。また、試料の濃度および純度の自動化測定法が当該技術分野において確立されていないということは、上述の技術分野におけるＮＭＲ分光法を適用する際の障壁となっている。ＮＭＲを基盤とする定量および定性分析に対して高い処理能力が求められる場合、原子核の数に関する試料の自動化分析は必須条件である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の主な目的は、上述の問題および定性および定量分析に対するＮＭＲ分光法の制限事項を克服することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、分子種を含有する試料のＮＭＲスペクトルから、該分子種内の予め選択された同位元素の原子核数を推定する方法およびその使用を提供することである。
【００１２】
本発明のさらにもう一つの目的は、分子種を含有する試料のＮＭＲスペクトルから、該分子種内の予め選択された同位元素の原子核数を推定するコンピュータプログラム製品を提供することである。
【００１３】
先述の目的、およびさらなる目的は、請求項１において定義される方法、請求項９において定義される使用、および請求項１０において定義されるコンピュータプログラム製品により達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
請求項１によれば、主要物質として分子種を含有する試料のＮＭＲスペクトルから、該分子種内の予め選択された同位元素の原子核数を推定する方法が提供される。予め選択された同位元素とは、ＮＭＲ分光法に適する核同位元素であればいずれのものでもよく、１Ｈ、１３Ｃおよび３１Ｐを含むが、これらに限定されるものではない。この方法は、様々なタイプの試料に含まれる広範な分子種に適用することが可能である。この方法では、多数のシグナルピークを保持し、ノイズ比に対する適切なシグナルを保持し、および不可抗力的な溶媒のシグナルを保持しないＮＭＲスペクトルを、対象となる分子種が生み出す必要がある。この方法は、以下に概略が記載され、説明のための注釈を付した一連の工程から成る。
【００１５】
ａ）  多数の該シグナルピークから、含有の基準を満たすセットが含有されたシグナルピークを選択すること：通常、含有の基準はシグナルピークが選択されるスペクトル域、例えば化学シフト域を特定する。該域はひとつまたはそれ以上の除外域、例えば溶媒または既知の不純物質から生じた、分析の対象ではない（単数または複数の）シグナルピークを含むスペクトル域を含む場合がある。
【００１６】
ｂ）  １セットの順序付けられたシグナルピークを得るために、予め選択されたシグナルの順序付けの基準に従い、該１セットの含有されたシグナルピークを順序付ける(ordering)こと：一般的にシグナルピークは、そのピークの位置に従って（例えば、共鳴における化学シフト）昇順または降順のいずれかで順序付けがなされるであろうが、その他の任意の順序付けもまた適用することができるであろう。
【００１７】
ｃ）  対応する１セットの順序付けられた積分値を得るために、該順序付けられたシグナルピークの各積分値を決定すること：ＮＭＲシグナルピークの積分値は当該技術分野では既知のものであり、様々な手段を用いて実施することが可能である。また、注目すべきは一連のプロセス工程ｂ）およびｃ）は入れ替えることができることである。
【００１８】
ｄ）  １セットの順序付けられた整数を得るために、予め選択された最も大きな整数を超えない、互いに同一ではない１セットの正の整数を特定し、予め選択された数の順序付けの基準に従って該セットを順序付けること：この操作より、１と、予め選択された最も大きな整数Ｋｍａｘとの間にある、順序付けられた１セットの整数を生み出す。これは、例えば、順序付けられた１セット｛１、２、３、４、５、・・・、Ｋｍａｘ｝であるかもしれない。しかしながら、この１セットにおける要素は、他のいかなる並びであっても採用され得るものであり、さらに、順序付けられた１セットは、１とＫｍａｘ間の全整数を含む必要はなく、Ｋｍａｘ＝８９であれば、順序付けられた１セット｛３、２７、４、・・・、６、８９、２｝のようなものが一例として挙げられる。
【００１９】
ｅ）  選択した積分値を得るために、該順序付けられた積分値の第一番目を選択することによって外部反復サイクルを開始すること：該順序付けられた積分値それぞれに対して外部反復サイクルを実施し、該順序付けられた整数すべてが処理されるまでは、第一番目から開始する（下記の工程ｍ）を参照のこと）。所定の外部反復サイクルに対し、現在選択されている整数（一個）が存在する。
【００２０】
ｆ）  該順序付けられた整数の第一番目の値に通し番号を付与することによって内部反復サイクルを開始すること：該順序付けられた整数それぞれに対して内部反復サイクルを実施する（下記の工程ｌ）を参照のこと）。所定の内部反復サイクルにおいて、通し番号は該順序付けられた整数中の現在のもの（一個）に等しく設定される。この通し番号は、現在選択された積分値に対して一時的に付与された原子核の推定数という意味合いを持っている。
【００２１】
ｇ）  該現在選択された積分値に対する該通し番号の割合によって与えられた低減係数を計算すること：低減係数は、現在選択された積分値に対して一時的に付与された原子核の推定数に基づく。
【００２２】
ｈ）  該低減係数を、該順序付けられた整数それぞれに乗じ、１セットの低減積分値を作製すること：この作業とともに、現在選択された積分値に対して一時的に付与された原子核の推定数に従って、全積分値が再設計(rescale)される。
【００２３】
ｉ）  該低減積分値をそれぞれ、これに最も近い整数の値に四捨五入して、１セットの整数化した低減積分値を作製すること：測定の不正確さが不可避であること、また現在選択された積分値に対して一時的に付与された原子核の推定数は、多くの場合間違っていることから、低減された積分値は概して、非整数の値をとるものと思われる。四捨五入を行うことにより、１セットの整数値である積分値が作製される。
【００２４】
ｊ）  該１セットの整数化した低減積分値の総数を計算して、原子核の総数の候補を作成すること：現在選択された積分値に対して一時的に付与された原子核の推定数に対し、整数化した低減積分値すべての合計は、分子種内の原子核の候補総数を生み出す。本処理におけるこの段階では、該候補総数が、原子核の真正な総数として許容できる推測値である。
【００２５】
ｋ）  即時内部反復サイクルに対応する１セットの結果を検索可能に保存すること。該保存した１セットの結果は少なくとも該原子核の候補総数を含む：この保存した１セットの結果は、一時的または永久的に保存することが可能であり、好ましくはカーネルメモリーのような、何らかの適切なコンピュータ格納媒体に保存することが可能である。特定の内部反復サイクルに対応する１セットの結果の検索は、保存したデータを、例えば関連データベースのフレームワーク内で適切に暗号化することにより確実なものなる。
【００２６】
ｌ）  該順序付けられた整数中の次のひとつに等しい通し番号を設定することにより、さらなる内部反復サイクルを開始すること、続いて、該通し番号を、該選択した積分値に付与し、該順序付けられた整数がすべて処理されるまで工程ｇ）乃至ｌ）を繰り返すこと：上記の工程ｆ）を参照のこと。
【００２７】
ｍ）  該順序付けられた積分値中の次のひとつを選択することにより、さらなる外部反復サイクルを開始すること、および順序付けられた積分値がすべて処理されるまで工程ｆ）乃至ｍ）を繰り返すこと：上記の工程ｅ）を参照のこと。
【００２８】
ｎ）  該保存した複数の結果セットから、各該原子核の候補総数の発生回数を決定すること：この処理では、総数の分布が得られるが、この総数の分布は、内部および外部反復サイクル完了後に、各原子核の候補総数がいかなる頻度で発現しているかを示すヒストグラムとして座標上に示されることが可能である。
【００２９】
ｏ）  該総数の分布における発生回数の最大値を決定すること。
【００３０】
ｐ）  該発生回数の最高数と等しい発生回数を示した、すべての原子核の候補総数によって構成される１セットを形成すること：この１セットは常に少なくとも一個の原子核の総数候補を含有している。
【００３１】
ｑ）  該原子核の候補総数による１セットから最低値を一つ選択することにより、原子核の推定総数を得ること：この工程は、本法が唯一のソリューション(unique solution)であることを証明するものである。特に、最も容易なソリューションの３倍に対応するソリューションはこうして省略される。
【００３２】
上記にて定義した方法は、主要物質として目的の分子種を含む試料の、本来任意のＮＭＲスペクトルから、原子核の推定総数を得る方法として、容易かつ信頼性のある、処理面において優れた定義がなされた方法を提供するものである。
【００３３】
請求項９によれば、該試料中の該分子種の定量的決定を目的とする本発明方法の使用が提供される。
【００３４】
請求項１０によれば、コンピュータプログラム製品がコンピュータシステムを起動させた際、上記により定義された方法を実行するための、コンピュータによる解読が可能な媒体に保存されたプログラムの暗号化手段を含むコンピュータプログラム製品が提供される。例えば、コンピュータプログラム製品には、パソコン内に読み込まれるために、コンパクトディスクまたはその他の適した媒体に保存された実行可能なプログラムが含まれてもよい。
【００３５】
本発明による有益な実施形態は、従属クレームに開示されている。
【００３６】
本発明の方法の主たる適用のひとつは、未知の原子核総数を有する分子を対象とするものであるが、本方法を、既知の原子核総数（以下、「原子核の仮（名目上の）総数（nominal total number of nuclei）」と称する）を有する分子に適用することも可能である。理想的な状況下では、原子核の推定総数は原子核の仮総数と同一となる。しかしながら、ある特定の状況下では、原子核の仮総数は、原子核の推定総数の整数倍、例えば２倍大となる。原子核の推定総数あるいはその整数倍と、原子核の仮総数間の矛盾（後者が利用可能である場合）は、ＮＭＲシグナルに実質的に影響を与える不純物質の存在、あるいはＮＭＲシグナルピークの見かけ上の積分値に対する交換反応(exchange reaction)の影響のような、非理想的な影響を示すものである。概して、このような非理想的な影響が存在する場合、オペレーター担当者による介入が必要となる。従って、請求項２による好ましい実施形態において、本方法はさらに以下の工程を含む：
【００３７】
ａ）  該原子核の推定総数、またはその倍数であるいずれかの整数であって、予め選択された倍化された最大整数以下のものが、該分子種の原子核の仮総数と同一であるか否かを確認すること；および
ｂ）  該同一性の確認がすべて陰性であった場合、警告通知を発行すること。
【００３８】
請求項３による好ましい実施形態において、該保存した結果セットはそれぞれ、さらに複数の整数化した低減積分値と、即時内部反復サイクル内に得られた複数の低減積分値間の偏差のグローバル測定を含有し、本方法はさらに次の工程を含む：
【００３９】
ａ）  該原子核の推定総数に一致する結果セットをすべて取り出すこと、
ｂ）  偏差のグローバル測定の最小値を有する結果セットを選択すること、および
ｃ）  該選択した結果セットから、該順序付けたシグナルピークに一致する整数化した低減積分値を取り出すことにより得られる、一致する原子核の部分数を該順序付けられたシグナルピークそれぞれに付与すること。
【００４０】
このようにして、目的の分子種の原子核の推定総数に加えて、ＮＭＲスペクトルの各シグナルピークに対応する原子核の部分数の推定値が得られる。このような情報は、目的の分子種の構造式の解明に対して特に有用である。原子核の推定総数に対応する結果セットが２組以上の場合、原子核の部分数に対する唯一のソリューションは、偏差のグローバル測定の最小値を有する結果セットを選択することにより選ばれるが、後者は整数化した低減積分値と低減積分値間の絶対偏差の合計であるか、あるいは二乗平均平方根偏差またはその他の適切な統計的測定であり得る。
【００４１】
請求項４による好ましい実施形態において、本方法はさらに以下の工程を含む：
ａ）  該含有の基準を満たさないが、較正種の特定の原子核数に一致する較正シグナルピークを提供すること、
ｂ）  該較正シグナルピークを積分し、その結果を該特定の原子核数で割って較正積分値を得ること、
ｃ）  少なくとも一種の該順序付けられたシグナルピークを含む定量セットを選択すること、
ｄ）  該定量セットの順序付けられたシグナルピークに一致する順序付けられた積分値の合計を取り出すこと、
ｅ）  該定量セットの順序付けられたシグナルピークの原子核の推定部分数の合計を取り出すこと、
ｆ）  該順序付けられた積分値の合計と該原子核の推定部分数の合計との比率で定義された、正規化された試料積分値（normalized sample interal）を得ること、および
ｇ）  該正規化された試料積分値を該較正積分値で割って、試料中の分子種の相対濃度を得ること。
【００４２】
試料のＮＭＲスペクトルと共に較正シグナルピークを得る必要はないということを強調するべきである。換言すれば、較正シグナルは、十分に特性が知られた参考試料から採取した、別のＮＭＲスペクトルから抽出することが可能である。いずれの場合にも、外部および内部反復サイクルを実行する際に必ずそれが考慮されないように、較正シグナルピークは該含有の基準を満たすものではない。
【００４３】
上記で定義された実施形態は、ある既知の状況下（例えば、上記引用文中のＲ.Ｒ.エルンスト(R.R.Ernst)、Ｇ.ボーデンハウゼン(G.Bodenhausen)およびＡ.ウォーカン(A.Wokaun)を参照）では、ＮＭＲシグナルピークの積分値は、共鳴する原子核の数に正比例するという事実に依存している。目的の分子種のシグナルピークとオーバーラップしない較正シグナルピークを提供することが必須となる。較正シグナルピークは較正種の特定の原子核数に一致することが既知であるということも理解される。該特定の原子核による較正ピークの積分値を割ることにより、該分子種の定量的決定のための参照として役立つ較正積分値を得られる。
【００４４】
この定量セットは、該順序付けされた積分値のいずれかを含有していてもよい。特に、順序付けた積分値すべてを含有することも有り得るが、その場合、合計を求める工程ｅ）の結果は、該分子種内にある該予め選択された同位元素の原子核の推定総数に一致する。工程ｇ）の結果としては、較正シグナルピークに対応するものと比較して表される試料中の分子種の濃度がもたらされる。
【００４５】
正規化された試料シグナルを獲得する有利な方法は、請求項５において定義されており、これによれば、該定量セットは、選択された結果セット関連の選択された積分値に対応する、順序付けたシグナルピークから構成される。換言すれば、偏差のグローバル測定の最小値に関連するシグナルピークを用いて、定量的決定が行われる。
【００４６】
請求項６による特に好ましい実施形態において、該較正シグナルピークはＥＥＲＴＩＣ法を用いて生成され、従って合成ＮＭＲ較正ピークの既知の利点を有効活用することができる。
【００４７】
請求項７による方法は、順序付けたシグナルピークおよび対応する原子核の推定部分数のセットから、該分子種に関連する物質のセットおよび該試料に含まれる不純種に関連する不純物質のセットを得る工程を含む。ここで、物質のセットは、原子核の推定部分数がゼロより大きい、順序付けたシグナルピークを含有し、不純物質のセットは、原子核の推定部分数がゼロに等しい、順序付けたシグナルピークを含有する。従って、不純物質のセットは目的の分子種より生じたものではないシグナルピークを含有している。この情報は、含有の基準を精緻化するために利用してもよい。すなわち精緻化された結果を得るために、含有されたシグナルピークの精緻化セットを用いて、原子核数を推定するために上述の手順を繰り返すことが可能である。
【００４８】
請求項８による方法は、さらに以下の工程を含む：
ａ）  該物質のセットのシグナルピークに一致する、一種の積分値または複数の積分値の合計を取り込むことにより、物質関連積分値を得ること、
ｂ）  該不純物質のセットのシグナルピークに一致する、一種の積分値または複数の積分値の合計を取り込むことにより、不純物質関連積分値を得ること、および
ｃ）  不純物質関連積分値と物質関連積分値を比較し、試料中に含まれる不純種の原子核の相対数に対する尺度を得ること。
【００４９】
上述の実施形態はすべて、同一の分子種を含むと共に様々な量の特定の型の不純種を含む、一連の試料中の不純物質の含有量に対する相対尺度を得るために容易に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
本明細書中に提示する具体例は、本明細書の開示の範囲、あるいは本発明の権利範囲を何ら限定するものとして解釈されるものではない。
【００５１】
図示するスペクトルはＡＣＤ／ＨＮＭＲソフトウェアパッケージを使用してシミュレートされた。シミュレーションはすべて、仮（名目上）の磁場強度を１４．１テスラとして、非交換プロトン(non-exchanging protons)に対して１Ｈｚ、交換プロトンに対して５Ｈｚの初期線幅(default line-width)を用いて行われた。１６０００の算出スペクトルデータポイントから、化学シフトの幅が１２．３ｐｐｍである、各スペクトルが得られた。
【実施例１】
【００５２】
この実施例では、原子核数が不明な種の本質的に純粋な試料に適用したものを記載している。図１は、Ｃ２１Ｈ２２ＦＮ３Ｏ３Ｓ（図２を参照のこと）（以下、「分子種Ａ」と称す）およびＮＭＲ分光法に対する既知の較正化合物であるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）の混和物を含む試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示している。分子種Ａは２２のプロトンを含むことが知られているが、この情報はこれから行う手順では使用しないものとする。このスペクトルは約０乃至１１ｐｐｍの範囲にある化学シフト? を持つ複数のシグナルピークを含有している。これらのピークはすべて、いくつかの多重線の構造を有しているが、全般的なスペクトルは１０種類の異なるシグナルピークから構成されていることが容易にわかる。今回の場合、１から１１ｐｐｍの間にあるシグナルピークのみがさらなる分析に含められ、｛Ｐ１、Ｐ２、…、Ｐ９｝を構成要素とする、含有されたシグナルピークＰのセットを規定する。０ｐｐｍにおけるシグナルはＴＭＳから発生していることが判っており、これは較正を目的とする実施例３でのさらなる分析に用いられるが、本実施例における含有されたシグナルピークのセットの一部ではない。セットＰは、各含有されたシグナルピークにピーク番号を付与することにより、ピークの位置に従って順序付けられ、このようにして｛П１、П２、…П９｝を構成要素とする、順序付けられたシグナルピークПのセットが形成される。各順序付けられたシグナルピークの積分値は、標準数値積分法により求められ、結果として｛Ｓ１、Ｓ２，…Ｓ９｝を構成要素とする、順序付けられた積分値Ｓのセットが得られる。これにより、表１に示す生データのセットを調製するための初期段階の手順が完了する。
【００５３】
【表１】
2005140788.tif 000003
【００５４】
分子種Ａ内の１Ｈ原子核数（以下、「プロトン」と称する）を推定する手順をここで説明する。プロトンの数に関する情報（今回の場合は２２であると判っている）について、本手順を行うために使用することはなかったことを強調しておきたい。
【００５５】
まず、未知のプロトン数に対する上限として選択される、予め選択された最大整数Ｋｍａｘが特定される。適切なＫｍａｘ値は、通常、目的の分子種に関する追加の化学的情報、例えば既知の反応物質からどのように分子種が合成されるのか、に関する知見から獲得することができる。代替方法として、燃焼分析またはその他のルーチン分析法からＫｍａｘを抽出してもよい。簡単にするために、ここではＫｍａｘ＝５０と推定するが、実際にはより大きな値を選択することもできる。続いて、互いに同一ではない正の整数であってＫｍａｘを超えないＫの順序付けられたセット、例えば、｛Ｋ１，Ｋ２，…Ｋ５０｝を構成要素とする、順序付けられたセットＫ＝｛１，２，３，４，５，…，５０｝を決定する。
【００５６】
ピークП１に関連する、第一の順序付けられた積分値Ｓ１を選択することにより、外部反復サイクルがここで開始される。さらに、先述した正の整数Ｋのセットの第一要素Ｋ１の値に通し番号を付与することによって、内部反復サイクルが開始される。次に、該選択された正の整数Ｋ１と選択された即時積分値Ｓ１との比率として、即時外部および内部反復サイクルの倍率ｓ（Ｓ１，Ｋ１）が計算される。すなわち、ｓ（Ｓ１，Ｋ１）＝１／４．３３５＝約０．２３が得られる。Ｓ中の各々順序付けられた積分値Ｓｊに、この即時倍率を乗じて、｛Ｃ１，Ｃ２，…Ｃ９｝を構成要素とする、低減積分値Ｃのセットを導き出す。この処理により、順序付けられた積分値Ｓ１がＫ１プロトンと関連しているという即時の推定に従って、順序付けられた積分値のセットが再設計される。その後、各々の該低減積分値Ｃｊを、最も近い整数値に四捨五入し、｛Ｉ１，Ｉ２，…Ｉ９｝を構成要素とする、整数化された低減積分値Ｉのセットを作製する。次に、整数化された低減積分値すべての合計から、即時外部および内部反復サイクルに対するプロトンＭの総計の候補が得られる。少なくとも該プロトンの総数候補を含有する結果セットＲ（Ｓ１，Ｋ１）はさらなる処理のために保存される。先述の工程の結果を表２に記す。
【００５７】
【表２】
2005140788.tif 000004
【００５８】
偶然にも、整数化された低減積分値Ｉｊを合計することにより、プロトンＭの総数候補２２が得られるが、これは種Ａのプロトンの正しい数と一致する。しかしながら、プロトンの数が未知であると仮定する本実施例においては何の関連性もない。
【００５９】
次に、第一の外部反復サイクルの第二の内部反復サイクルを実行することにより本手順が続行される。Ｋ２に相当する通し番号のセットを用いて、先に概説した全工程が繰り返される。基本的に、これは順序付けられた積分値Ｓ１に対して２種のプロトンを付与することを意味する。最終的には、Ｒ（Ｓ１，Ｋ２）に保存された４５のプロトンＭの総数候補が導き出される。さらに、Ｋ５０に到達するまで内部反復サイクルが完全に実施され、従来より多くのプロトンの総数候補が得られる。
【００６０】
続いて、Ｋ１より始まる、順序付けられた積分値ＳのセットからＳ２を選択することにより、すなわち、積分値Ｓ２に一つのプロトンを付与し、これをＫ５０まで続けることにより、次の外部反復サイクルが開始される。セットＳのすべての積分値が処理されるまで、さらに外部および内部反復サイクルが行われる。積分値が９であり、Ｋの構成要素が５０である場合、全部で４，５００回の反復が必要となる。
【００６１】
複数の保存された結果Ｒから、プロトンＭ（これは、所定の内部反復サイクル中の整数化した低減積分値Ｉｊの全合計から得られる。上記を参照のこと）の該候補総数それぞれの発生回数ｆ（Ｍ）を決定する。この目的のためには、２３までの値に関して表３に示すように、プロトンＭの候補総数の値の増加により結果セットを分類するとともに、これらを順序付けることが適当である。
【００６２】
表３より、例えば１に相当するプロトンの候補総数を得るためのソリューションはたったひとつであるが、１０個のプロトンに対しては４種類のソリューションがあることが判る。最大発生回数が２２のときのプロトンの候補総数（表３において太字で示している）は、ｆ（２２）＝９である。９つの順序付けられた積分値を分析に使用したため、この場合は９が最大発生可能数であることに留意されたい。これは、セットＳ中の各積分値に対するプロトンの数が、種Ａ中に合計で２２のプロトンに帰着することでわかることを意味している。
【００６３】
【表３】
2005140788.tif 000005
【００６４】
１乃至５０の範囲のプロトンＭの候補総数に対してプロットした、発生数ｆ（Ｍ）の図表的な表示を図３に示す。結果の全セットの調査により、Ｍが２２と同等であることが実際に最高発生数のソリューションであることが示された。従って、本実施例におけるプロトンの推定総数がＭｅｓｔ＝２２に等しいということは、分子種Ａのプロトンの仮総数と完全に一致する。
【００６５】
表３に戻るが、最右列には、各結果セットに一致する偏差のグローバル測定ΔＭ（ПＫ）を示しており、本明細書においては、プロトンＭの所定の候補総数および所定の選択されたピークПＫに対する整数値由来の絶対偏差の合計として定義される。換言すれば、特定の結果セットに対し、セットＳ中の各順序付けられた積分値に対する低減積分値および整数化された低減積分値間の絶対偏差が計算され、続いて、特定の結果セットのためにこれらの絶対偏差の合計が取り出される。ＣｊおよびＩｊ間の二乗平均平方根偏差の合計など、その他の統計的測定法を代わりに用いることも可能である。該原子核の推定総数に一致する結果セット中、すなわちＭ＝２２である結果セット中、選択されたピークｊ＝２に関連する結果セットが偏差のグローバル測定の最小値を有しており、Δ２２（П２）＝０．４０７である。この結果セットは、ピーク番号２に対して２種類のプロトンの数を付与することに一致し、その結果は表４に示す。表４において太字で示した列は、ピーク番号２が２種類のプロトンと関連するとした即時推定を示しており、表４の最右列に示される整数化した低減積分値は、各ピークに起因する原子核の部分数を表している。原子核の部分数の合計は明らかに２２であり、従って原子核の推定総数と一致する。
【００６６】
【表４】
2005140788.tif 000006
【実施例２】
【００６７】
主要分子種Ａを含む一方、不純物質の実質的な寄与も受ける、純粋ではない試料への適用を表している。図４は、分子種Ａ、較正化合物ＴＭＳ、および１０％のＣ１３Ｈ１４ＣＩＮ３Ｏ３の混合物（以下、「分子種Ｂ」と称する）を含む第二試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示している。本実施例の目的のために、分子種Ｂを試料中の未知の不純物質とみなす。
【００６８】
再び、１-１１ｐｐｍの範囲にある化学シフトのシグナルピークのみを取り出し、含有されたシグナルピークのセットを構築し、これをピーク位置に従って順序付けることにより、順序付けられたシグナルピークのセットПを形成する。各順序付けられたシグナルピークを積分した後、表５に列挙されている順序付けられた積分値のセットＳ＝｛Ｓ１，Ｓ２，…Ｓ１３｝が得られる。実施例１とは対照的に、今回は９ではなく、１３の順序付けられた積分値が存在している。ピーク番号１４はＴＭＳから発生しており、含有されたシグナルピークのセットには含まれない。一見して、ピーク番号２、４、６および９は他のピークに比べて非常に弱く、これは不純物によるものかもしれないが、この事実は今回の手順に利用しない。
【００６９】
【表５】
2005140788.tif 000007
【００７０】
上記実施例１で概略を述べた工程を行い、Ｋｍａｘ＝５０を用い、プロトンの候補総数の値の増加により結果を分類した後、Ｍ＝５０以下の結果セットに対するヒストグラムとして図６に示されるデータが得られる。本実施例では、プロトンの候補総数Ｍ＝２２はたった３回発生するだけであり、最大発生回数はＭ＝４８、ｆ（４８）＝７である。換言すれば、プロトンの推定総数Ｍｅｓｔ＝４８はプロトンの仮（総）数であるＭｎｏｍ＝２２と一致しない。さらに、単一化合物を用いた全積分値に対する一貫性を保った解析(consistent interpretation)が可能であった場合に推定される数である１３とｆ（４８）の値は一致しない。明らかに、これらの矛盾は不純物質種Ｂに由来する無視することができないシグナルによって発生する。
【００７１】
好都合なことに、プロトンの推定総数と仮総数間の矛盾がいずれの時点で見つかっても、警告通知が発行される。例えば、警告通知は試料に不純物質が混入しているようであること、そうでなければ、腐敗している可能性があることをオペレーターに警告するエラーメッセージで構成され得る。好ましい場合、特定数のシグナルピーク、とりわけ最小数のものをオペレーターが廃棄し、同一のものに限定される含有基準(correspondingly restricted inclusion criterion)を使用して原子核数を推定するための手順を繰り返すことも可能であり得る。
【実施例３】
【００７２】
本実施例では実施例１の結果を参照し、これを用いて問題の試料の分子種Ａの定量的な決定を行った。このような決定は、較正化合物ＴＭＳは分子あたり１２プロトンを含むという事実に依存している。さらに、本法では種Ａで決定された原子核の総数または部分数、ならびにＡおよびをＴＭＳに見られるＮＭＲシグナル積分値の相対振幅(relative magnitudes)を利用している。以下に記述する積分値は任意単位で示されているが、これは特定のＮＭＲスペクトル由来の全積分値に対する同一の任意単位である。
【００７３】
較正積分値ＹＴＭＳは、ＴＭＳから発生するピーク番号１４を積分し、１２であることが判っているプロトン数で割ることにより得られる。今回の場合、較正積分値ＹＴＭＳ＝１５．２３／１２＝１．２７が導かれる。
【００７４】
さらに、少なくとも一つの順序付けられた種Ａのシグナルピークから構成される定量セットが定義される。次に、定量セットの順序付けられた積分値の合計を、それに一致する原子核の推定部分数の合計で割ったものを取り出すことにより、正規化された試料積分値が得られる。簡略化の観点から、定量セットはすべての選択されたピーク、すなわちピーク番号１乃至９から構成されるようにする。従って、表２の第３列のＳｊ値の合計を取り出し、原子核の推定部分数の合計である２２で割ることにより、正規化試料積分値が得られる。これにより正規化試料積分値である１００／２２＝４．５５が導かれる。
【００７５】
最後に、該正規化試料積分値を、該較正積分値で割ることにより、試料中の分子種の相対濃度が得られる。本実施例において、較正化合物ＴＭＳに対する種Ａの相対濃度４．５５／１．２７＝３．５８が導かれた。明らかに、これは較正化合物の絶対濃度がＣＴＭＳになるとわかる場合、種Ａの絶対濃度はＣＡ＝３．５８ＣＴＭＳとなるということを意味する。
【００７６】
試料に添加した較正化合物のシグナルを取り出す代わりに、ＥＲＥＴＩＣ法に従い、電子較正シグナル(electronic calibration signal)を利用することが可能である。そうである場合、どのプロトン濃度が特定のＥＲＥＴＩＣシグナルと同一であるかを構築するために初期較正の手順(initial calibration procedure)を実行する必要がある。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
以下に説明する添付の図面とともに、本発明の様々な実施形態に関する記述を参照し、上述およびその他の本発明の特徴ならびに対象およびこれらを達成する方法がより明確になると共に、本発明自体がより理解される。
【図１】信号強度Ｉ（任意の単位）対化学シフトδ（ｐｐｍ）でプロットした、分子種Ａ（Ｃ２１Ｈ２２ＦＮ３Ｏ３Ｓ）および較正化合物であるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）の混和物を含む第一試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】水素原子の化学シフト（ｐｐｍ）を含む分子種Ａの構造式を示す。
【図３】発生数ｆ（Ｍ）に対する原子核の総数候補Ｍでプロットした、図１のスペクトルから決定した１Ｈ原子核の総数候補のヒストグラムを示す。
【図４】信号強度Ｉ（任意単位）に対する化学シフト? （ｐｐｍ）でプロットした、分子種Ａ、較正化合物であるＴＭＳの混和物、および分子種Ｂ（Ｃ１３Ｈ１４ＣＩＮ３Ｏ３）の混和物を含む第二試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】水素原子の化学シフト（ｐｐｍ）を含む分子種Ｂの構造式を示す。
【図６】発生数ｆ（Ｍ）に対する原子核の総数候補Ｍでプロットした、図４のスペクトルから決定した１Ｈ原子核の総数候補のヒストグラムを示す。
【符号の説明】
【００７８】
ｆ（Ｍ） Ｍの発生回数
Ｋｊ  正の整数
Ｋｍａｘ  予め選択された最大整数
Ｍ  プロトンの候補総数
Ｍｅｓｔ  プロトンの総数
Ｐ  （含有ピークに対する）ピーク番号
Ｒ  結果セット
ｓ（Ｐ，ｎ） 低減係数
Ｓｊ  積分されたシグナル
δ  化学シフト
Ｉｊ  整数化した低減積分値
Пｊ  順序付けられたシグナルピーク
Ｃｊ  低減積分値
ΔＭ（Пｋ） 偏差のグローバル測定
【図１】
2005140788.tif 000008
【図２】
2005140788.tif 000009
【図３】
2005140788.tif 000010
【図４】
2005140788.tif 000011
【図５】
2005140788.tif 000012
【図６】
2005140788.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月10日(2004.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
以下に説明する添付の図面とともに、本発明の様々な実施形態に関する記述を参照し、上述およびその他の本発明の特徴ならびに対象およびこれらを達成する方法がより明確になると共に、本発明自体がより理解される。
【図１】信号強度Ｉ（任意の単位）対化学シフトδ（ｐｐｍ）でプロットした、分子種Ａ（Ｃ２１Ｈ２２ＦＮ３Ｏ３Ｓ）および較正化合物であるテトラメチルシラン（ＴＭＳ）の混和物を含む第一試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】水素原子の化学シフト（ｐｐｍ）を含む分子種Ａの構造式を示す。
【図３】発生数ｆ（Ｍ）に対する原子核の総数候補Ｍでプロットした、図１のスペクトルから決定した１Ｈ原子核の総数候補のヒストグラムを示す。
【図４】信号強度Ｉ（任意単位）に対する化学シフトδ（ｐｐｍ）でプロットした、分子種Ａ、較正化合物であるＴＭＳの混和物、および分子種Ｂ（Ｃ１３Ｈ１４ＣＩＮ３Ｏ３）の混和物を含む第二試料の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】水素原子の化学シフト（ｐｐｍ）を含む分子種Ｂの構造式を示す。
【図６】発生数ｆ（Ｍ）に対する原子核の総数候補Ｍでプロットした、図４のスペクトルから決定した１Ｈ原子核の総数候補のヒストグラムを示す。