(57)【要約】  【課題】CD34陽性細胞等の未分化な前駆細胞の増殖を阻害せずに、未分化細胞の増殖集団として維持すること。  【解決手段】デルタ1を細胞表面に発現した細胞又はデルタ1を固相化した不溶性材料を含み、トロンボポエチンを含む1種類以上のサイトカイン（FLを除く）を含有することを特徴とする細胞培養器具および該細胞培養器具を用いた細胞製剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルタ1を細胞表面に発現した細胞又はデルタ1を固相化した不溶性材料を含み、トロンボポエチンを含む1種類以上のサイトカイン（FLを除く）を含有することを特徴とする細胞培養器具。
【請求項２】
さらにIL6を含有することを特徴とする請求項1に記載の細胞培養器具。
【請求項３】
前記サイトカインが、トロンボポエチン、IL6の2種類のみからなることを特徴とする請求項1に記載の細胞培養器具。
【請求項４】
培養される細胞がCD34陽性細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養器具。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養器具を用いて細胞を培養するステップを有することを特徴とする細胞製剤の製造方法。
【請求項６】
セルソーティングを行うステップを有することを特徴とする請求項５に記載の細胞製剤の製造方法。
【請求項７】
セルソーティングを行うステップと、細胞を培養するステップを有し、前記セルソーティングを行うステップを前記細胞を培養するステップの後に行うことを特徴とする請求項６に記載の細胞製剤の製造方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の方法により製造された細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CD34陽性細胞を含む細胞製剤を製造するための培養媒体、これらの細胞製剤の安全で簡便な製造方法、得られた細胞製剤及びこれら細胞製剤を用いた細胞治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD34陽性細胞は、多分化能を維持しながら自己複製することが可能な幹細胞を含んでいると想定されている。CD34陽性細胞を増殖させる因子としては、ステムセルファクター（SCF）や、インターロイキン、コロニー刺激因子などが知られている。これらのサイトカイン等を用いてCD34陽性細胞を培養すると、多分化能を失い、幹細胞としての性質が消失する。分化を抑制することで前駆細胞を未分化な状態に保ち、前駆細胞を増殖あるいは維持することが可能なのではないかと考えられる。
【０００３】
ノッチ経路を利用して、幹細胞の分化を制御できると考えられた。「新規細胞製剤製造用培養媒体」（特許文献1）では、細胞外マトリクスと可溶性ヒトノッチリガンドの組み合わせ、又は固相化ヒトノッチリガンドを有効成分として含有する、細胞を培養して細胞製剤を製造するための培養媒体に関する技術である。つまり、ノッチリガンド蛋白質を細胞培養用の培地中に溶けた状態で用いる方法と固体表面に静電的な吸着や蛋白質の官能基や架橋剤を用いた共有結合で固定化する方法を用いてヘルパーT細胞の免疫寛容を誘導するDC（樹状細胞）及び調節性T細胞を効果的に増幅させる。また、固相化デルタ1と5種類（SCF、FL、TPO、IL6、IL3）のサイトカインを組み合わせてCD34陽性細胞のエクスビボ増幅を促進する技術が検討されている（非特許文献1）。
【０００４】
しかしこれら上記の方法では、総細胞数は増幅させるが分化を抑制することは不十分であり、造血幹細胞の未分化を実質的に維持することは困難であった。すなわち、「新規細胞製剤製造用培養媒体」（特許文献1）では、細胞の選択的な分化誘導を示すだけで分化の抑制は示されておらず、CD34陽性細胞のみを選択的に増殖させ、分離することは困難である。また、非特許文献1のCD34陽性細胞のエクスビボ増幅方法では、FLが含まれているため、CD34陽性細胞を増幅させるが分化を抑制することは困難である。
【特許文献１】公開特許公報2003-93048
【非特許文献１】コウシ・オオイシ(Kohshi Ohishi)、デルタ１  エンハンシス  マロウ  アンド  サイマス  リポプレイティング  アビリティ  オブ  ヒューマン  シーディー34プラスシーディー38マイナス  コード  ブラッド  セルズ(Delta-1 enhances marrow and thymus repopulating ability of human CD34+CD38- cord blood cells)、“ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲイション（The Journal of Clinical Investigation）”、（米国）、アメリカン  ソサイティ  フォ  クリニカル  インベスティゲイション（American Society for Clinical Investigation ）、2002年、第110巻、p.1165−1174
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記従来技術の問題を解消するために、本発明ではCD34陽性細胞の増殖を阻害せずに前駆細胞を未分化細胞の増殖集団として維持することを目的とし、CD34陽性細胞内の2種以上の異なったシグナル伝達経路を同時に又は個別に活性化して、CD34陽性細胞の分化を実質的に抑制し、さらに増殖を促進する。また、これらの課題を解決することにより、幹細胞を提供することが可能である。
【０００６】
また、骨髄移植や臍帯血移植、遺伝子治療や抗癌剤の副作用における問題も克服することが出来る。すなわち、(1)自己幹細胞培養による前駆細胞数が分化し、減少するという問題(2)臍帯血中の幹細胞の総細胞数が分化し、減少するという問題(3)形質転換前後の培養における幹細胞の消失などの問題を解決することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するものであり主として下記構成を有する。
【０００８】
（１）デルタ１を細胞表面に発現した細胞又はデルタ１を固相化した不溶性材料を含み、トロンボポエチンを含む1種類以上のサイトカイン（FLを除く）を含有することを特徴とする細胞培養器具。
【０００９】
（２）さらにIL6を含有することを特徴とする（１）に記載の細胞培養器具。
【００１０】
（３）前記サイトカインが、トロンボポエチン、IL6の2種類のみからなることを特徴とする（１）に記載の細胞培養器具。
【００１１】
（４）培養される細胞がCD34陽性細胞であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養器具。
【００１２】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養器具を用いて細胞を培養するステップを有することを特徴とする細胞製剤の製造方法。
【００１３】
（６）セルソーティングを行うステップを有することを特徴とする（５）に記載の細胞製剤の製造方法。
【００１４】
（７）セルソーティングを行うステップと、細胞を培養するステップを有し、前記セルソーティングを行うステップを前記細胞を培養するステップの後に行うことを特徴とする（６）に記載の細胞製剤の製造方法。
【００１５】
（８）（５）〜（７）のいずれかに記載の方法により製造された細胞製剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明における以上の手法によって、特にCD34陽性細胞等の未分化な前駆細胞の増殖を阻害せずに未分化細胞の増殖集団として維持できる。
【００１７】
本発明においてトロンボポエチンを含む1種類以上のサイトカイン（FLを除く）に、デルタ１を細胞表面に発現した細胞又はデルタ１を固相化した不溶性材料を使用することで、デルタ１を細胞表面に発現した細胞又はデルタ１を固相化した不溶性材料の繰り返し利用が可能になり、低価格な培養システムを実現することができる。
【００１８】
本発明において培養される細胞にトロンボポエチンとIL6を作用させることで、未分化細胞と既に分化した細胞への影響が異なることを利用し、細胞表面マーカーを用いて容易に未分化細胞を分離することができる。
【００１９】
本発明において、サイトカインを特にトロンボポエチンとIL6の２種類のみを使用する態様においては、分化の進んだ細胞の出現頻度を低く抑えたまま、目的の細胞を得ることができる。
【００２０】
本発明においてトロンボポエチンとIL6を含む2種類以上のサイトカイン（FLを除く）に、デルタ１を細胞表面に発現した細胞又はデルタ１を固相化した不溶性材料がCD34陽性細胞に接触することで、CD34陽性細胞の分化が抑制し、CD34陽性細胞をその分化段階で維持し、さらに増殖させることを可能にできる。
【００２１】
本発明においてCD34陽性細胞由来の増殖した細胞群からセルソーティングすることにより、前駆細胞を分離し、細胞製剤を製造することも可能である。この方法により目的とする有用な前駆細胞群を高純度で大量に得ることができる。
【００２２】
本発明における、細胞を培養するステップの後にセルソーティングを行うステップを有する細胞製剤の製造方法は、より高純度に前駆細胞群を得ることができる優れた細胞製剤の製造方法である。
【００２３】
本発明に係る製造方法により、前駆細胞を未分化維持しつつ増殖させることによって製造された細胞製剤は、造血幹細胞移植への適応や生着不全の回避、造血回復の促進、輸血量の軽減、複数の患者への移植、患者の入院期間の短縮やより安全な移植を実現することができるという著明な効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、デルタ1を細胞表面に発現した細胞又はデルタ1を固相化した不溶性材料と1種類以上のサイトカイン（FLを除く）を主成分とし、それらを用いてCD34陽性細胞等の未分化な前駆細胞の増殖を阻害せずに未分化細胞の増殖集団として得られるように、前駆細胞を維持した細胞製剤の製造方法及びその製造方法により製造された細胞製剤に関する。
【００２５】
以下詳細に説明する。
【００２６】
本発明における細胞培養器具とは、細胞培養で直接細胞と接触する全ての器具を意味し、具体的には培養培地、培養容器が含まれる。さらには、細胞培養時に添加するセルロースやアガロースで構成される培養媒体が含まれる。
【００２７】
本発明におけるデルタ1は、ノッチへの結合を媒介するデルタ1タンパク質及び誘導体、ならびに上記をコードする核酸（コードする産物をインビボで発現させるために投与することができる）を含むが、それらだけに限定されない。好ましい実施態様においては、デルタ1は機能的に活性な断片を含むタンパク質又はその誘導体又は断片である。別な好ましい実施態様においては、デルタ1はヒト・タンパク質又はその一部である。また、デルタ1からアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加したものやデルタ1のcDNAにハイブリダイズする塩基配列をコードする蛋白であってノッチ活性化能を有するものまでも含むが、それらだけに限定されない。また、デルタ1は、タンパク質-タンパク質相互作用でノッチ経路を活性化することができる。
【００２８】
本発明におけるトロンボポエチンは、トロンボポエチンレセプターへの結合を媒介するトロンボポエチンタンパク質及び誘導体、ならびに上記をコードする核酸（コードする産物をインビボで発現させるために投与することができる）を含むが、それらだけに限定されない。好ましい実施態様においては、トロンボポエチンは機能的に活性な断片を含むタンパク質又はその誘導体又は断片である。別な好ましい実施態様においては、トロンボポエチンはヒト・タンパク質又はその一部である。また、トロンボポエチンからアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加したものやトロンボポエチンのcDNAにハイブリダイズする塩基配列をコードする蛋白であってc-mpl活性化能を有するものまでも含むが、それらだけに限定されない。
【００２９】
本発明におけるIL6は、IL6レセプターへの結合を媒介するIL6タンパク質及び誘導体、ならびに上記をコードする核酸（コードする産物をインビボで発現させるために投与することができる）を含むが、それらだけに限定されない。好ましい実施態様においては、IL6は機能的に活性な断片を含むタンパク質又はその誘導体又は断片である。別な好ましい実施態様においては、IL6はヒト・タンパク質又はその一部である。また、IL6からアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加したものやIL6のcDNAにハイブリダイズする塩基配列をコードする蛋白であってGP130蛋白の活性化能を有するものまでも含むが、それらだけに限定されない。
【００３０】
本発明に用いるサイトカインとは、細胞増殖、分化の調節作用をはじめとする細胞間相互作用を媒介するたんぱく質性因子の総称をいう。造血因子は、サイトカインの一つであり、本発明において、具体的にはインターロイキン1（IL1）、インターロイキン2（IL2）、インターロイキン3（IL3）、インターロイキン4（IL4）、インターロイキン5（IL5）、インターロイキン6（IL6）、インターロイキン7（IL7）、インターロイキン8（IL8）、インターロイキン9（IL9）、インターロイキン10（IL10）、インターロイキン11（IL11）、インターロイキン12（IL12）、インターロイキン13（IL13）、インターロイキン14（IL14）、インターロイキン15（IL15）、インターロイキン16（IL16）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、単球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（SCF）、幹細胞増殖因子、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（MIP-1α）などを用いることができる。特には、SCF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、G-CSF、IL3、IL6、EPO、TPOのうちから1種類あるいは2種類以上を組み合わせて使用することが好ましくそのうちの1種類はTPOであり、さらにIL6を含むとなお好ましい。更には造血幹細胞の培養においては、SCF、TPO、IL6を使用することが好ましい。また、サイトカインとしてTPOとIL6のみを用い、他のサイトカインを含まない態様は非常に好ましく使用されうる。これらのサイトカインは精製法、あるいは遺伝子組み換え法のいずれかで調整されたものであってもよい。本発明に係る細胞培養器具は、以上に挙げた1種類以上のサイトカインを含むことが重要であり、サイトカインを含まない場合は、CD34陽性細胞を選択的に増殖・分化させる活性が、本発明に含まれる態様と比較して低い。また、本発明に係る細胞培養器具にはFLを含有しないことが必要である。
【００３１】
本発明における「培養される細胞」とは、本発明に係る細胞培養器具に投入する細胞群を意味し、CD34陽性細胞が含まれていることが好ましい。本発明における「培養される細胞がCD34陽性細胞である」とは、細胞培養器具に投入される細胞群の中にCD34陽性細胞が含まれていることを意味する。投入される細胞群の中に占めるCD34陽性細胞の含有率については、特に指定しないが、CD34陽性細胞の含有率が高いものを用いることが好ましく、各種のソーティング方法によりCD34陽性細胞の含有率を高めたものも好ましく用いられうる。
【００３２】
本発明におけるCD34陽性細胞とは、骨髄、臍帯血、末梢血などから得られる細胞であって、あらゆる系列の血球に分化する能力を有するとともに、造血再構築能を有する細胞である。また、分化抗原表現形の1種であるCD34を発現していることから下記方法に従って検証する事が出来る。フローサイトメトリー法を用いた方法により調製した、未分化細胞における表面抗原マーカーであるCD34陽性細胞あるいはCD38陰性細胞を指標とした細胞の分画にはより未分化な細胞が存在している。
【００３３】
本発明においてデルタ1を細胞表面に発現している細胞とは、ヒトストローマ細胞やデルタ１遺伝子組み替え細胞を含み、CD34陽性細胞と接触することにより、CD34陽性細胞のノッチへ結合する細胞である。
【００３４】
本発明においてデルタ1を固相化した不溶性材料は、大量の細胞群を一度に培養できるように培養液の循環が可能な水不溶性担体が好ましく、担体の形状としては平膜状、中空糸膜状、繊維状、粒子状、ゲル状など何でもよいが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけずに循環できる利点から平膜状、中空糸膜状、繊維状が望ましく、また、表面積を確保し、細胞とデルタ1との相互作用を大きくする点からこれらは多孔質であることがのぞましい。多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の制御も可能である。
【００３５】
担体に使用される素材は、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ナイロンなどの合成高分子材料、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサンなどの天然材料、ハイドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、炭酸カルシウムなどの無機材料及びこれら材料の誘導体が挙げられる。 この中でも特にポリスルホン、ポリメチルメタクリレート、ナイロン、ポリプロピレン、ポリスチレンは膜状や繊維状への成形が容易で、成形したときの膜性能に優れているため、好適に用いられる。
【００３６】
水不溶性担体へデルタ1が安定的に固定される方法を用いる。例えば、デルタ1と担体の相互作用による固定化方法やデルタ1上の官能基と担体上の官能基を縮合剤や二官能性の反応剤あるいはリンカーなどを利用して共有結合により固定化する方法、担体上にデルタ1と特異的に相互作用する物質を固定化した後、デルタ1を作用させて固定化する方法等があげられるがこれらに限定されない。デルタ1を固定化した担体上で細胞を培養することにより、細胞に安定的にノッチ経路を活性化させながら培養することができる。また、デルタ1が担体に固定化されているため、一度培養に使用した担体を繰り返して使用することができる。
【００３７】
本発明においてCD34陽性細胞を含む細胞群を培養することにより、CD34陽性細胞をその分化段階で維持し、さらに増殖させることができる。
【００３８】
本発明にかかる細胞製剤の製造方法にはセルソーティングを行うステップが含まれることが好ましい。特に細胞を培養するステップの後にソーティングのステップを行う態様は好ましく用いられうる。そのようなプロセスを採用することにより、CD34陽性細胞由来の増殖した細胞群からセルソーティングすることができるため、細胞製剤の製造方法として好ましい態様である。この製造方法により目的とする有用な前駆細胞群を高純度で大量に得ることができ、効果の優れた細胞製剤を製造することができる。さらに、セルソーティングのステップの後に本発明に係る細胞培養器具で培養するステップを行い、再びセルソーティングのステップを行うという態様もまた本発明に係る細胞製剤の製造方法として好ましいものである。ここで用いられるセルソーティングとしてはフローサイトメトリー、磁気ビーズ法、アフィニティーカラム法など様々な方法を用いることができるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明における培養器具で製造された細胞製剤を構成する細胞は、CD34分子が発現している前駆細胞が主であり、この細胞はあらゆる系列の血球に分化する能力を有するとともに、造血再構築能を有する細胞を含んでいる。
【００４０】
本発明における培養器具で製造された細胞製剤は、直接体内に投与することができ、成人への幹細胞移植などの適応や生着不全の回避、造血回復の促進、輸血量の軽減、複数の患者への移植、患者の入院期間の短縮やより安全な移植が実現できる。
【００４１】
本発明に係る細胞製剤を以下に説明するような造血疾患モデル動物に対して投与する実験を行うことにより、該細胞製剤が造血疾患に有効であることを確認することができる。用いる動物は、特に限定しないが、マウスを用いることが好ましく、特に、BALB/c nu/nu、SCID、NOD-SCIDなどの先天異常マウスが好ましく用いられうる。これらの動物を用いて造血疾患モデルを作製するには、動物に致死量もしくは準致死量の放射線を照射する方法や５ＦＵ（５−フロオロウラシル）、ＣＰＭ（サイクロフォスファミド）、ＭＭＣ（マイトマイシンＣ）などの抗腫瘍剤を投与する方法が好ましく用いられうる。以上のような方法で作製した造血疾患モデル動物に投与される細胞製剤は、ヒト由来のものでも、他の動物由来のものでも用いられうる。該細胞製剤を投与された造血疾患モデルにおける造血能の回復は、投与後の末梢血球数の回復、ＣＦＵ−Ｓ（脾臓コロニー数）やコロニーアッセイによって測定されたＣＦＵ数などによって確認されうる。投与した細胞製剤が、モデル動物と異種である場合や異系統である場合には、フローサイトメトリを用いて表面マーカーを調べることにより、本発明に係る細胞製剤由来の末梢血球の含まれる割合を確認できる。
【００４２】
本発明に係る細胞製剤は、以上に説明した造血疾患モデル動物を用いた実験で、優れた効果を示した。
【００４３】
以下詳細に本発明による細胞培養器具及び細胞製剤を用いた疾患の治療方法について言及する。
（幹細胞移植）
近年、白血病などの重い血液疾患に対して骨髄移植の代わりに特に臍帯血を供給源として用いた造血幹細胞移植が行われている。臍帯血を用いた移植は、主に急性リンパ性白血病（ALL）や急性骨髄性白血病（AML）、再生不良性貧血、先天性免疫不全症、先天性代謝異常疾患などの治療に用いられており、骨髄移植や末梢血幹細胞移植に比べて移植後の移植片対宿主病（GVHD）が軽くまた、増殖能力が旺盛であるため骨髄移植時に使用される細胞数の10分の1程度の細胞数でも移植が可能となる。臍帯血に含まれる幹細胞の総細胞絶対数は少なく成人における造血幹細胞の生着に必要な細胞数が確保されず、これまで移植は主に小児に対して行われていた。本発明の方法により、臍帯血中の造血幹細胞及び前駆細胞を未分化維持しつつ増殖させることにより成人への幹細胞移植などの適応拡大や生着不全の回避、造血回復の促進、輸血量の軽減、複数の患者への移植、患者の入院期間の短縮やより安全な移植を実現することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４５】
１.  デルタ1の作製方法
本発明に用いたデルタ1もしくはその一部を有するタンパク質をコードする遺伝子は胎盤由来のmRNAから既報のアミノ酸配列（ジェンバンク登録番号：AF003522）をもとに設計したプライマーを用い、RT-PCR法によりcDNAを得た。得られたcDNAよりPCR法を用いて増幅し、得られたDNA断片をpBADベクター（発現ベクター；INVITROGEN社）に組み込み大腸菌TOP10株に導入した。得られた宿主大腸菌は培養した後37℃4時間アラビノースを用いて誘導を行い、ニッケルキレート担体を用いて精製を行い透析後、10mg/mlのデルタ１を含有する標品を得た。
【００４６】
２.  デルタ1固相化材料の作製方法
担体としてポリメチルメタクリレート（PMMA）膜を使用し、この膜を4N NaOH水溶液に50℃で２時間浸漬して表面加水分解した後、中和、洗浄した膜を1mg/ml の1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimideを含むMES緩衝液（pH 4.5）中に室温で2時間浸漬し、膜表面のカルボキシル基を活性化した。活性化後の膜をPBSで洗浄した後、１．で得られたデルタ１を10μg/mlとなるようにPBS溶液に溶解した溶液に浸漬し、4℃で24時間反応させることにより、デルタ1を固定したPMMA膜を作製した。
【００４７】
３.  ヒト臍帯血からのCD34陽性細胞の採取及び調整
比重遠心法により臍帯血から単核球を分離した。臍帯血をリン酸緩衝液により2倍に希釈し、比重液15ｍｌの上に希釈された臍帯血を重層後、1600rpm、30分間、20℃にて遠心した。遠心後、中間層を採取し、単核球細胞を得た。得られた単核球細胞を３回リン酸緩衝液により洗浄して血小板を取りのぞいた。得られた単核球細胞と磁気ビーズ標識抗ヒトCD34抗体（Mirteny社）と反応させたのち、磁気カラムに通すことで、85％から95％程度の純度でCD34陽性細胞を得た。さらに純度を上げるため、FITC標識抗CD34抗体とPE標識抗CD38抗体と反応させた上記CD34陽性細胞を、セルソーター（FACS vantage SE）を用いてCD34陽性細胞を分離した。
【００４８】
４.  デルタ1固相化材料とIL6とTPOにおける臍帯血由来CD34陽性細胞の培養
培養器として12ウェルマルチウェルプレートを使用し、well底面に２．より得られたノッチリガンド固相化PMMA膜を貼り付けエタノール滅菌したものを用いた。培地としてはStemPro34（インビトロジェン社製）を基本培地として用い、培地中に加えたサイトカインはパープロテック社製のTPO(50ng/ml)とIL6（10ng/ml）を添加し、３．により得たCD34陽性細胞を3〜10×104cells/mlの密度で２ml/wellで播種し、37℃, 5%CO2インキュベーター内で20日間培養した。培養期間中、培養細胞群に存在するCD34陽性細胞の割合を、FITC標識抗ヒトCD34抗体を用いてフローサイトメトリー法を用いて検出した。デルタ１を接触させない条件で培養した培養10日目の結果を比較例１，２とし、デルタ１の接触させた条件で培養した培養10日目の結果を実施例１，２とした。比較例を図1に示し、実施例を図2に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】比較例１（TPO）、比較例２（TPOとIL6）における培養10日目の細胞群中のCD34陽性細胞の割合を示す図面である。
【図２】実施例１（デルタ1固相化材料とTPO）、実施例２（デルタ1固相化材料とTPOとIL6）における培養10日目の細胞群中のCD34陽性細胞の割合を示す図面である。
【図１】
2005102656.tif 000002
【図２】
2005102656.tif 000003