(57)【要約】【課題】  関心ある反応を行い、該関心ある反応に関する増幅された熱を獲得し、該増幅された熱を測定し、該測定段階において獲得された信号を用いて、関心ある反応の特性を求める段階を含む、関心ある反応の特性を検知する方法を提供する。【解決手段】  ナノ熱量計１０は、測定領域１４及び基準領域１６を備える熱隔離層１２を含む。領域１４及び１６は、別箇の隔離領域内に収めることができる。熱隔離領域１２は、周囲の熱的環境からの隔離を与え、したがって、測定時間を増やし、熱雑音を減らすものである。この例示的なの実施形態において、層１２は、ナノ熱量計１０の反応及び温度感知構成部品を熱的に隔離するように用いられるが、これらの構成部品を熱的に隔離するためのいずれの手段も、本発明の代替的な実施形態において用いることができる。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心ある反応の特性を検知する方法であって、
約３０マイクロリットル又はそれより少ない体積を有する材料において関心ある反応を開始し、
前記関心ある反応に関連する増幅された熱を獲得し、
前記増幅された熱を測定し、
前記測定段階において獲得された前記測定された増幅熱を用いて、前記関心ある反応の前記特性を間接的に求める、
段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素反応を監視する方法であって、
対象酵素及び１つ又はそれ以上の対象化合物が３０マイクロリットルより少ない組合わせ体積を有する場合において、前記対象酵素を前記１つ又はそれ以上の対象化合物と反応させて１つ又はそれ以上の酵素特有生成物を生成し、第１の熱量を生成する一次反応を行い、
前記一次反応から二次反応を生成し、増幅された熱量を生成する、
段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
酵素反応を監視する方法であって、
対象酵素及び１つ又はそれ以上の対象化合物が３０マイクロリットルより少ない組合わせ体積を有する場合において、前記対象酵素及び前記１つ又はそれ以上の対象化合物の反応を行わせて、１つ又はそれ以上の酵素特有生成物を生成し、第１の熱量を発生する一次反応を行い、
第２の熱量を発生する二次反応カスケードを開始することによって、前記一次反応から発生した前記第１の熱量を増幅し、
前記一次反応からの前記第１の熱量及び前記二次反応カスケードからの前記第２の熱量を検知する、
段階を含み、
前記二次反応カスケードからの前記熱量が、前記一次反応の前記熱量に加わり、検知器によって検知することができる熱量が生成されることを特徴とする方法。
【請求項４】
酵素反応を監視する方法であって、前記方法が、
対象酵素及び１つ又はそれ以上の対象化合物が３０マイクロリットルより少ない組合わせ体積を有する場合において、前記１つ又はそれ以上の対象化合物との前記対象酵素の反応を行わせて、前記対象酵素に特有の１つ又はそれ以上の生成物を生成し、第１の熱量を発生する一次反応を行い、
増幅酵素によって触媒作用が及ぼされ、第２の熱量を発生する増幅反応を含む二次反応カスケードを開始し、
前記一次反応から発生した前記第１の熱量及び前記増幅反応から生じた前記第２の熱量を検知する、
段階を含み、
前記一次反応は、前記増幅反応がない状態で、前記対象酵素及び対象化合物が低濃度で存在する場合に検知可能な熱量が生成されないことを特徴とする方法。
【請求項５】
関心ある反応の特性を検知する方法であって、
関心ある反応を開始し、
前記関心ある反応に関連した増幅された熱を獲得し、
前記増幅された熱を測定し、
前記測定段階において獲得された前記測定された増幅熱を用いて、前記関心ある反応の前記特性を間接的に求める、
段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
酵素反応を監視する方法であって、
対象酵素を１つ又はそれ以上の対象化合物と反応させて１つ又はそれ以上の酵素特有生成物を生成し、第１の熱量を生成する一次反応を行い、
前記一次反応から二次反応を生成し、増幅された熱量を生成する、
段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
酵素反応を監視する方法であって、
対象酵素及び１つ又はそれ以上の対象化合物の反応を行わせて、１つ又はそれ以上の酵素特有生成物を生成し、第１の熱量を発生する一次反応を行い、
第２の熱量を発生する二次反応カスケードを開始することによって、前記一次反応から発生した前記第１の熱量を増幅し、
前記一次反応から発生した前記第１の熱量及び前記二次反応カスケードからの前記第２の熱量を検知する、
段階を含み、
前記二次反応カスケードからの前記熱量が前記一次反応の前記熱量に加わり、検知器によって検知することができる熱量が生成されるようになったことを特徴とする方法。
【請求項８】
酵素反応を監視する方法であって、
１つ又はそれ以上の対象化合物との対象酵素の反応を行わせて、前記対象酵素に特有の１つ又はそれ以上の生成物を生成し、第１の熱量を発生する一次反応を行い、
増幅酵素によって触媒作用が及ぼされ、第２の熱量を発生する増幅反応を含む二次反応カスケードを開始し、
前記一次反応から発生した前記第１の熱量及び前記増幅反応から生じた前記第２の熱量を検知する、
段階を含み、
前記一次反応は、前記増幅反応がない状態では、前記対象酵素及び対象化合物が低濃度で存在する場合に検知可能な熱量が生成されないことを特徴とする方法。
【請求項９】
酵素反応を監視するためのエンタルピー・アレイ装置であって、
対象酵素を１つ又はそれ以上の対象化合物と反応させて１つ又はそれ以上の酵素特有生成物を生成し、第１の熱量を発生する一次反応を行うための手段と、
前記一次反応から生成された前記第１の熱量を増幅し、検知可能な増幅された熱量を生成するための手段と、
を備えることを特徴とするエンタルピー・アレイ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱量測定及びエンタルピー・アレイを用いる化学反応を監視するためのシステム及び方法に関し、より具体的には、該反応を増幅させるために酵素を用いるシステム及び方法に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
関心ある反応を行い、該関心ある反応に関する増幅された熱を獲得し、該増幅された熱を測定し、該測定段階において獲得された信号を用いて、関心ある反応の特性を求める段階を含む、関心ある反応の特性を検知する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００３】
ここで用いられる「増幅」、「増幅する」、「増幅された熱」という用語及びその派生語は、「一次反応」とも呼ばれる関心ある特有の反応がサンプル内で起こる時に、サンプル内に発生する熱量の増加を指す。増加した熱量は、関心ある特有の反応のエンタルピーによって直接発生する熱に加えて生じるものである。一次反応は、発熱性、吸熱性、又はゼロの反応エンタルピーを有するものであって、依然としてここに定められるような増幅を受けることができるものである。増幅の目的が熱イベントの大きさを増大させることである限り、「増幅」という用語は、増幅が発熱性ではなく吸熱性である場合に、吸収された熱量すなわち冷却量の増加を説明するために用いることになる。
【０００４】
以下の方法の説明は、これに限定されるべきではないが、この用途を適用できる特定の熱量計としては、米国特許出願第１０／１１４，６１１号に記載され、図１の１つの実施形態において本明細書に示されるナノ熱量計がある。ナノ熱量計１０は、測定領域１４及び基準領域１６を備える熱隔離層１２を含む。以下に説明されるように、領域１４及び１６は、別箇の隔離領域内に収めることができる。熱隔離領域１２は、周囲の熱的環境からの隔離を与え、したがって、測定時間を増やし、熱雑音を減らすものである。この例示的なの実施形態において、層１２は、ナノ熱量計１０の反応及び温度感知構成部品を熱的に隔離するように用いられるが、これらの構成部品を熱的に隔離するためのいずれの手段も、本発明の代替的な実施形態において用いることができる。
【０００５】
この例示的な実施形態において、熱隔離層１２は、薄いホイル形状（典型的には、本実施形態については、１２．５ミクロン未満から約２５ミクロンまでの範囲の厚さであり、他の適用例については、２ミクロンの薄さ及び５００ミクロンの厚さとすることができる）の樹脂材料から構成することができる。候補となる樹脂材料は、ポリイミド（例えば、Ｄｕｐｏｎｔ  Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）その他）、ポリエステル（例えば、Ｄｕｐｏｎｔ  Ｍｙｌａｒ（登録商標））、ポリエーテル・エーテル・ケトン（ＰＥＥＫ）、又はポリフェニレン・サルファイド（ＰＰＳ）を含む。或いは、実施形態において、熱隔離領域は、ＳｉＮ及び同等の材料のような十分に低い熱伝導性をもつ他の薄い膜から構成される。
【０００６】
測定領域１４及び基準領域１６は、それぞれ熱平衡領域１８及び２０を含み、これらの領域は、検知器の機械的支持部から熱的に隔離されている。この例示的な実施形態において、熱平衡領域１８は、反応温度を測定する２つの抵抗温度計２２を含み、熱平衡領域２０は、背景温度の変化を測定する、第２の組の２つの温度計２４を含む。抵抗温度計は、これらに限られるものではないが、薄いフィルムの石版パターン加工、超小型電子製造技術（例えば、スパッタ、化学的エッチング、蒸着を含む）、及び印刷回路板製造技術を実施形態として含む標準的な製造技術を用いて、熱平衡領域１８及び２０内に置かれる。両方の熱平衡領域１８及び２０は、直接印刷によって配置された蛋白質及び配位子の別々の液滴を受け、かつ支持するのに十分大きく、さらに、例示的な液滴合体装置２６によってトリガされた合体の後、これら２つの液滴の組み合わせを支持するのに十分大きい。液滴合体システムの例は、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  ｔｏ  Ｃａｕｓｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｍｏｖｍｅｎｔ」という名称の、２００２年４月１日に出願された米国特許出願第１０／１１５，３３６号に示されており、この特許の全体を引用によりここに組み入れる。例えば、４００ｎＬの最終液滴のサイズについて、測定領域及び基準領域を含む検知器は、縦３．７ｍｍ、横４．６ｍｍとすることができる。各々の熱平衡領域１８及び２０は、該領域について、熱放散に対比して迅速に平衡を達成するのに十分な熱伝導性を有する。これらの領域は、反応熱が支持体にほとんど吸収されないように、十分に低い熱容量を有する。
【０００７】
上に示唆したように、熱平衡領域は、反応によって生じた温度差が放散するのに比較的長い時間がかかるように、それらの環境から熱的に隔離されていなければならない。この放散時間が長いほど、信号を測定中に組み込むことができ、信号雑音比が改善される。
【０００８】
各々の熱平衡領域１８及び２０は、温度計２２、２４及び液滴合体電極２６を含む。ここでの目的のために、温度計２２、２４は、各々の熱平衡領域１８及び２０において中央に寄せて位置させられた液滴合体電極２６から間隔を置いて示されるが、この構成は例示的な手段に過ぎない。液滴合体装置２６及び温度計２２、２４が高電導性フィルムと良好な接触状態にあるならば、該温度計２２、２４及び該液滴合体電極２６の正確な位置決めは、熱的な考慮事項のためには重要ではない。
【０００９】
作動において、熱平衡領域１８に位置している２つの抵抗温度計２２が、該熱平衡領域１８内に置かれた液滴内の反応熱を検知する。液滴は、基質、及び混合時に溶液がエンタルピー変化を受けるのに必要と考えられる何らかの必要な補因子、蛋白質、配位子、又は他の化合物と共に、酵素を含むことができる。本例において、反応熱は、ブリッジ回路として構成された温度計の抵抗変化による、該ブリッジ回路における電圧変化の測定を通して検知される。熱平衡領域１８における抵抗温度計２２は、サンプル配位子と蛋白質（又は酵素基質）との間の反応を検知し、熱平衡領域２２における他の抵抗温度計２４は、基準として働く。反応による温度上昇が小さいため、抵抗温度計２２及び２４は、小さな温度変化のもとで大きな抵抗変化をもたらす材料から製造される。
【００１０】
抵抗温度計２２、２４は、ＡＣ発電機２８及び接地３０によって駆動されるＡＣブリッジとして構成され、以下により詳細に説明される。液滴が熱平衡に到達した後、それらは互いの方向に移動させられて反応を開始する。運動を生じさせる操作が、２つの液滴の十分な混合を、測定時間に比べて少ない時間で達成する。検査混合の蛋白質と配位子（又は酵素と基質）の反応によって放出された熱は、基準温度計と対比して、影響された温度計の抵抗変化の原因となる。この抵抗変化は、検知点での電圧を変化させる原因となる。次に、この出力反応は、検知用電子機器３２によって検知される。次に、この変化は、感度の良い、ロックイン増幅器を含む回路又はシステムのような雑音を拒否する回路によって検知される。
【００１１】
上述のナノ熱量計を含む、ナノ熱量計及びナノ熱量計のアレイを用いる利点は、サンプル体積を保持し、よってサンプルの消費を少なくすることができる点である。特に、上述のナノ熱量計を用いる両方の結合反応及び酵素反応が、約２００ｎＬから２５０ｎＬまでのサンプル体積を使用することが実証された。研究されるべき材料を得ることが困難であり、化合物の大きなライブラリに対するスクリーニングのように多数の研究を行わなければならない場合には、このことは非常に重要である。多数の測定を可能にすることは、高処理量戦略を用いて研究に取り組む能力を提供し、これにより他の方法では可能でない広範な検査が可能になる。ナノ熱量計の少量の測定によって、他の方法ではわずかな熱しか発生しない検知のための反応熱を増幅することによって、本発明は、少量でナノ熱量計を用いて実行することができる測定範囲を拡張する。具体的には、本発明は、５０μＬから６００μＬ及びそれより少ないサンプル体積、特に約３０μＬより少ないサンプル体積の範囲において特に有用であり、これらのサンプル体積は、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａ  Ｎａｎｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」という名称の、２００２年４月１日に出願された米国特許出願第１０／１１４６１１号、米国特許第６，３８０，６０５  Ｂ１号、米国特許第６，５４５，３３４  Ｂ２号、及びＶｅｒｈａｅｇｅｎ他による論文（Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  ８２（２０００年）、１８６−１９０）を含む、ナノ熱量計についての文献に引用されているサンプル体積の上端には一般的なものである。
【００１２】
図２Ａに注意を向けると、例示的な本実施形態の概念が、化学反応及び／又は生化学反応、特に熱量計又はエンタルピー・アレイを用いる、検査酵素すなわち対象酵素及び検査化合物の反応を監視する方法に向けられる。検査化合物は、一般に、何らかの検査活性剤、抑制剤、補因子などと協働する基質及び酵素である。検査化合物は、成分から調合された混合物の状態で提供することができ、或いは細胞全体、細胞抽出物、又は他の何らかの非精製混合物の調合から提供することもできる。検査酵素すなわち対象酵素の例は、キナーゼ、プロテアーゼ、イオン・チャネル、ホスファターゼ、代謝酵素、核酸結合及び修飾酵素、転写／翻訳因子、シグナル伝達酵素、蛋白質修飾酵素、輸送／追跡酵素、ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ、及びＧ蛋白質、並びにオーファン酵素を含む。このリストは、網羅的なものであることを意図するものではないが、寧ろ、関心ある情報を提供する何らかの酵素を、本概念に適した検査酵素すなわち対象酵素とし得ることを理解すべきである。反応生成物は、一般に、１つ又はそれ以上の酵素特有生成物、及び／又は１つ又はそれ以上の他の生成物（すなわち、非酵素特有生成物）を含む。例えば、ＡＴＰキナーゼ反応は、キナーゼ特有リン酸化生成物（ＡＴＰキナーゼに特有の基質によって）及びＡＤＰを生成する。低濃度で検知可能な熱量を生成することができない化学反応を監視するために、この方法を用い得ることが理解される。さらに、反応熱は検知可能であるが、例えば、低い信号対雑音比がある場合に、有用な情報／データを与えるのに測定の感度が十分なものではない場合にも、増幅が有用である。増幅は、信号を増大させ、信号対雑音比を改善し、よりすぐれた検知精度を可能にする。
【００１３】
この監視方法は、対象酵素反応によって発生した熱を増幅する段階を含む。続けて図２Ａを参照すると、対象酵素反応から発生した熱を増幅する一般的な方法が示される。最初に、適切な基質４０が、一次酵素、及び関心ある特定の反応に必要とされるか、又は関心ある反応の影響に関して検査される、何らかの活性剤、抑制剤、他のシグナル伝達分子、又は補因子４２と組み合わされる。この活動は、一次反応４４を引き起こす。この一次反応は、研究される対象（又は一次）酵素及び／又は対象化合物すなわち検査化合物を含む１つ又はそれ以上の酵素反応からなり、１つ又はそれ以上の反応生成物４６を生み出す。一次反応は、熱（ΔＨ1）４８を発生する。
【００１４】
一次反応に続いて、該一次反応からの熱が増幅される。一次反応は、二次反応カスケードを始めることによって、増幅酵素５０及び該増幅酵素のための基質５２を組み合わせるプロセスによって、増幅される。二次反応カスケードは、これらの実施形態のために適切に設計された自然発生イベント又は一連のイベントとすることができ、或いは自然に発生するのではない設計されたイベント又は一連のイベントとすることもできる。二次反応カスケードは、同じく増幅された熱（ΔＨ2）５４を発生する付加的な下流反応を含む。下流反応からの熱５４は、一次反応から発生した熱４８に加えられる。熱量計及び／又はエンタルピー・アレイのような検知器が提供され、一次熱４８及び増幅された熱５４を検知する。一次反応からの熱を増幅することにより、一次反応だけから得られるものより多くの熱量が与えられる。したがって、熱量計又は他の適切な装置によって測定された時に、増幅された熱５４及び一次熱４８は、一時酵素反応だけから得られるものより、大きな信号を生成する。
【００１５】
二次反応カスケードは、所望の増幅の熱信号を生成するために、十分な熱量が生成されるように、十分に高濃度の状態で、増幅材料すなわち酵素５０及び基質５２を含む。一般に、二次反応カスケードにおいて、増幅酵素５０は、酵素反応すなわち増幅反応が起こり、一次反応の増幅である増幅熱５４を生成するように、基質５２と組み合わせられる。１つの実施形態においては、一次反応の生成物４６の１つ又はそれ以上の生成の結果として、増幅酵素が直接的又は間接的に活性化又は行動化される際に、二次反応カスケードの増幅反応が起こる。ここで用いられる酵素の活性化は、行動化又は酵素の行動化を含む。別の実施形態においては、一次反応の生成物によって、増幅酵素が直接的又は間接的に抑制された場合、増幅反応が減少する。
【００１６】
増幅反応に加えて、二次反応カスケードは、一連の付加的な反応を含むことができる。前述のように、一次反応の生成物４６は、二次反応カスケードを開始する。例えば、１つ又はそれ以上の生成物をさらに線形に処理して、付加的な熱を放出することができる。具体的には、図２Ａの１つ又はそれ以上の生成物４６は、１つ又はそれ以上の増幅酵素５０のための基質５２として働くことができる。他の実施形態において、１つ又はそれ以上の生成物は、異なる基質の大きなリザーバに作用できる増幅酵素に結合し、該増幅酵素を活性化し、又は抑制する。この結合は、アロステリック活性化、アロステリック又は拮抗的阻害とすることができ、或いは例のように活性のために必要とされる触媒補因子を提供することができる。さらに他の実施形態において、１つ又はそれ以上の生成物は、非活性酵素を活性形態に改変するための基質として働くことができ、一例は、一次反応からのヌクレオチドを用いて、キナーゼをリン酸化することによって、キナーゼが別のキナーゼを活性化させるカスケードである。さらに別の実施形態においては、２つ又はそれ以上の段階における増幅に引き続いて酵素カスケードを用いる実施形態を含めて、上記の方法の組み合わせが共に用いられる。
【００１７】
増幅酵素５０の活性化又は行動化によって増幅反応が推進される際に、該増幅酵素は、一次反応の生成物によって、直接的又は間接的に活性化又は行動化される。直接的な活性化又は行動化において、生成物は、増幅酵素を直接的に活性化又は行動化する。間接的な活性化においては、一次反応の生成物は、増幅酵素を活性化又は行動化する種に変換される。このように、間接的な活性化又は行動化の下では、二次反応カスケードは、一次反応の生成物を、増幅酵素を活性化又は行動化する種に変換する１つ又はそれ以上の反応を含む。
【００１８】
二次反応カスケードを開始する反応生成物は、酵素特有生成物又は一次反応の別の生成物のいずれかとすることができる。二次反応カスケードは、一次反応の１つ又はそれ以上の酵素特有生成物の少なくとも１つによって開始することができる。二次反応カスケードが、酵素特有生成物によって開始された場合、該酵素特有生成物は、増幅酵素５０を直接的に活性化することができ、或いは該酵素特有生成物を、該増幅酵素を活性化できる種に変換することができる。酵素特有生成物を、増幅酵素を活性化又は行動化できる種に変換するために、こうした変換を完了するのに必要な試薬が与えられる。活性種への酵素特有生成物の変換は、一連の酵素反応を含むことができる。
【００１９】
代替的に、酵素特有生成物以外の一次反応の生成物によって、増幅酵素５０を直接的又は間接的に活性化することができる。例えば、一次反応の別の生成物は、増幅酵素を直接的に活性化する。さらに、一次反応の別の生成物は、１つ又はそれ以上の酵素反応を介して、増幅酵素を活性化する種に変換することができる。
【００２０】
増幅酵素５０が活性化又は行動化されると、該増幅酵素５０と熱を生成する該増幅酵素のための基質５２との間に、別の酵素反応、すなわち増幅反応が起こる。増幅酵素５０のための基質５２は、このプロセスに十分な濃度で与えられることが好ましい。増幅反応からの熱は、一次反応から生じた熱４８を増幅する。増幅された熱５４は、熱量計又はエンタルピー・アレイによって検知できる十分な熱量を提供する。
【００２１】
適切な状況において、すなわち適切な材料及び検査パラメータを用いて、材料（例えば、適切な条件の下で一次酵素の活性を増大させる蛋白質を含む、分子のような）５８を一次酵素４４に結合することによって、増幅された熱（ΔＨ3）５６を獲得できることを、図２Ｂから理解すべきである。この実施形態において、「増幅された熱」という用語は、この技術を用いる前に他の方法で対象酵素から得ることができたものより大きい熱を意味するように意図される。したがって、図２Ａ及び図２Ｂに用いられるような増幅された熱という用語の共通性は、前に獲得可能であったものと比べて、関連した酵素からより大きい熱量を得るという概念である。次に、増幅された熱５６は、活性剤、抑制剤、シグナル伝達分子、及び補因子のような、一次酵素に結合する材料に起因する一次酵素反応の変化を検知するために用いられる。したがって、材料を一次酵素に結合する研究に用いることができる、熱を増幅する別の方法が示される。この方法は、例えば、それ自体が、作用薬又は抑制剤として作用するために配位子を必要とする蛋白質種を含む、作用薬又は抑制剤のためのライブラリをスクリーニングするために用いることができる。一次反応からの熱を増幅する方法は、基質の転換又は潜在的な基質の研究に用いることもできる。例えば、異なる濃度の基質における実験を用いて、運動パラメータを求めることができ、異なる候補基質を用いるスクリーニング実験を用いて、酵素のための代理基質を見つけることができる。一次酵素がオーファン酵素、すなわち知られていないが、予測される機能をもつ酵素である場合、代理基質を見つけることは、特に有用である。オーファン・キナーゼ又はゲノムから求められたホスファターゼは、こうした酵素の例である。
【００２２】
一次反応によって生成される熱４８を増幅するのに十分な熱量を生成することができる酵素は、ここに述べられる方法と共に用いるのに適している。同様に、所定の増幅酵素は、２つを結合する能力だけが制限された、多くの異なる一次反応のための増幅された熱を提供するように働くこともできる。増幅酵素が、２つの状態、すなわち１）厳密に調整された非活性状態、及び２）高度に活性化された状態の２つの状態を採り得ることが好ましい。増幅酵素として用いるのに適した酵素の限定されない例には、ホスホリラーゼｂ、ホスホフルクトキナーゼ、イソクエン酸脱水素酵素、及びピルビン酸キナーゼが含まれる。ホスホリラーゼｂは、増幅酵素として特に適している。ホスホリラーゼｂは、ウサギの筋肉のような筋肉内に極めて豊富にあり、市販されている。ＡＭＰホスホリラーゼｂがない場合には、非活性となる。ＡＭＰがある状態で、ＡＭＰは、ホスホリラーゼｂに結合し、酵素をアロステリックに活性化するので、加リン酸分解によってグリコーゲン分解に効果的に触媒作用を及ぼし、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）を生成する。真核生物からのホスホフルクトキナーゼは、ＡＭＰ、ＡＤＰ、及び３’，５’−サイクリックＡＭＰによって活性化され、原核生物の大腸菌及び好熱性細菌からのホスホフルクトキナーゼは、ＡＤＰ及びＧＤＰによって活性化され、イソクエン酸脱水素酵素は、ＡＭＰによってアロステリックに活性化され、ピルビン酸キナーゼは、フルクトース１，６−２リン酸によってアロステリックに活性化される（Ａ．Ｆｅｒｓｈｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【００２３】
特に図２Ａに注目すると、一次反応の生成物が増幅酵素５０を抑制する場合、一次酵素反応が起こらなかった場合に、増幅された熱５４が発生する。このように、抑制の場合には、一次酵素５０が非活性である場合に増幅された信号が生じる。したがって、例えば、同相分除去を行う際に、増幅酵素を基準面にも測定面にも置くことができ、これにより、一次酵素が活性であり、増幅酵素を非活性化する際に、異なる信号がもたらされる。
【００２４】
ここで図３を参照すると、ホスホリラーゼｂ６０を含む、図２Ａの前述の酵素反応の増幅部分の概略が示される。ＡＭＰ６２は、ホスホリラーゼｂ６０と結合して、活性ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４を形成する。この活性ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４は、グリコーゲン６６からの最終的なグルコース残留物の除去に触媒作用を及ぼす。具体的には、活性ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４は、ｎ個のグルコース単位を有するグリコーゲン６６及び無機リン酸（Ｐi）６８の反応に触媒作用を及ぼし、グルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）７０及びｎ−１個のグルコース単位を有するグリコーゲン７２を生成する。活性化された錯体６４は、多くの基質分子６６及び６８を代謝回転できるので、この反応は、与えられたＡＭＰ６２ごとに多くの熱当量を放出することができる。したがって、Ｇ１Ｐを生成するための活性ホスホリラーゼｂとグリコーゲンの酵素反応は、一次反応から生成された熱を増幅するのに十分な熱を生成する。
【００２５】
ホスホリラーゼｂを増幅酵素として用いるために、１つの方法は、一次反応からの酵素特有生成物の生成を、ＡＭＰの生成に結合させることである。すなわち、酵素特有生成物を用いて下流反応を開始し、増幅酵素を活性化する場合、該酵素特有生成物をＡＭＰに変換するか、又は１つ又はそれ以上の付加的な反応によって引き続きＡＭＰに変換できる種に変換することが必要である。代替的に、酵素特有生成物以外の生成物をＡＭＰに変換し、ホスホリラーゼｂを活性化することができる。ホスホリラーゼｂの代謝役割は、ＡＴＰレベルが低下し、ＡＭＰレベルが上昇した時に、グリコーゲンを分解し、解糖作用のために細胞にグルコースを供給することである。グリコーゲンは、短期のエネルギー必要性のための炭水化物の貯蔵庫として用いられるグルコースの重合体である。グルコースを分解する機能を実行するために、ホスホリラーゼｂを厳重に調整しなければならず、細胞のエネルギーが不足しない限り、すなわちＡＭＰレベルが高い場合、グリコーゲンは低下されない。次に、ＡＭＰは、ホスホリラーゼｂを「作動させる」、又は活性化する、或いは行動化するためのスイッチとして働く。活性化されたホスホリラーゼｂ６４の酵素反応から増幅された熱を生成するために、無機リン酸（Ｐi）６８と反応するように十分な量のグリコーゲン６６が与えられ、Ｇ１Ｐ（７０）を形成し、増幅された熱を生成する。ホスホリラーゼｂの活性化において、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素が省略されることが好ましい。こうした酵素を省略することは、ＡＭＰが最終的にＡＴＰに再充電されることを防止し、よってＡＭＰは、ホスホリラーゼｂを活性化するために利用可能となる。
【００２６】
第１の反応の生成物が増幅酵素を抑制する場合、一次反応が起こらない時に増幅された熱が発生する。したがって、この場合は、一次酵素反応がない状態に対して、該一次酵素反応がある状態の信号が、他の場合よりも大きいという意味で、一次酵素反応が一次酵素が非活性である時に、依然として有用な「増幅」である増幅された信号を与える。
【００２７】
当該技術分野において周知のような反応のエンタルピーによって、化学反応を監視するのに適した如何なる方法、手段、及び／又は装置も、ここに述べられる増幅方法と共に用いることができる。化学反応によって生成された熱を検知するのに適した熱量計又はエンタルピー・アレイを用いて、増幅された熱を検知することが好ましい。これにより各々の測定に必要とされるサンプル体積が減少されるので、約３０マイクロリットルより少ない量のような、３０マイクロリットルから５０ナノリットルまで、１マイクロリットルから５０ナノリットルまで、並びに１マイクロリットル又はそれ未満、或いは３マイクロリットル又はそれ未満の範囲といった、少量での測定を可能にする熱量計又はエンタルピー・アレイが特に有用である。一次反応及び二次反応カスケードは、反応熱を検知するために用いられる装置内で結合される。一般的に、検査材料について試験を行う前に、すなわち増幅反応と結合された一次反応を実行する前に、増幅反応を装置内で較正し、増幅反応によって生成された熱を求める。
【実施例１】
【００２８】
この実施例において、ヘキソキナーゼ触媒反応は、増幅酵素としてホスホリラーゼｂを用いて増幅される。対象酵素としてのヘキソキナーゼの使用は、増幅方法を示すために用いられる例示的な参照としてのみ理解すべきであり、如何なる方法によっても説明の限定要因として見られることを意図していない。したがって、ここで説明されるような増幅方法は、他の基質及び薬剤候補の組み合わせ技術などを用いる研究に適用可能である。ヘキソキナーゼ触媒反応の増幅は、図４の反応系に示されている。ヘキソキナーゼは、グルコース及び他の糖のリン酸化に触媒作用を及ぼす。リン酸化は熱を生成するが、低濃度の酵素及び／又は基質においては、生成された熱が低すぎるため、所望の熱量測定法を用いて十分な信号対雑音比で検知することができない。すなわち、熱は、適切なレベルの（検知）精度を与えるのに十分なものではない。例えば、幾つかの用途において、発生した熱量は、エンタルピー・アレイによる検知のためには低すぎるものであり、さらに、こうしたアレイの使用により、薬剤開発活動における作用薬又は抑制剤のための組み合わせスクリーニングが可能になる。図４のヘキソキナーゼ触媒反応は、グルコースのリン酸化のためのものである。ヘキソキナーゼ（ｈｘｋ）８０は、グルコースのリン酸化に触媒作用を及ぼし、ヘキソキナーゼ特有生成物、すなわちグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）８２を生成する。具体的には、ヘキソキナーゼ８０は、グルコース８４及びＡＴＰ８６の反応に触媒作用を及ぼし、Ｇ６Ｏ８２及びＡＤＰ８８を生成する。増幅酵素、すなわちホスホリラーゼｂを活性化させる、ヘキソキナーゼ反応の酵素特有生成物の場合には、Ｇ６Ｐ酵素特有生成物を用いて、ＡＭＰを生成する。ヌクレオチド代謝からの酵素を用いて、ＡＭＰを生成するためにＧ６Ｐ８２を用いることができる。一般に、Ｇ６Ｐ８２は、一連の反応において、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）９４に変換される。具体的には、Ｇ６Ｐ８２は、Ｇ６Ｐヒドロゲナーゼによって、６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）９０に変換される。次に、６ＰＧ９０は、ホスホリボイソメラーゼによって、リブロース−５−リン酸（Ｒｕ５Ｐ）９２に変換され、Ｒｕ５Ｐ９２は、ホスホリボイソメラーゼによって、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）９４に変換される。ホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）シンターゼによるリボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）の活性化は、１分子のＡＴＰ９６を消費し、１分子のＡＭＰ９８及びＰＲＰＰ１００を生成する。次に、アデニン・リボシル・トランスフェラーゼを用いて、ＰＲＰＰ１００をＡＭＰ１０２に変換し、第２分子のＡＭＰ１０２を生成することができる。このように、正味反応は、１分子のＧ６Ｐ８２、ＡＴＰ８６、ＡＴＰ９６、及びアデニン１０４が、２分子のＡＭＰ９８及び１０２、並びにピロリン酸塩（ＰＰi）１０６に変換されるというものである。この反応は、ＡＴＰが消費されるとすぐに、減損する。ピルビン酸キナーゼを用いて、ヘキソキナーゼによって生成された循環ＡＤＰ８８によって、反応を完了させることが可能である。ピルビン酸キナーゼは、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）１０８及びＡＤＰ８８の反応に触媒作用を及ぼし、ピルビン酸��１１０及び再生ＡＴＰ８６を生み出す。過剰のホスホエノールピルビン酸塩を用いて、全体のプロセスをＡＭＰ生成に向けさせることができる。幾つかの実施形態において、ＡＭＰをＡＤＰに変換する酵素を省くことは有利である。この酵素を省くことで、ＡＭＰが最終的にＡＴＰに再生されることが防止され、ホスホリラーゼｂを活性化させるためにＡＭＰが利用可能であることを保証する。ＡＭＰ１０２及び９８へのＧ６Ｐ８２の変換に用いられる全ての酵素を購入することができ、或いは該全ての酵素は、大腸菌内に過剰に発現される。酵素は、何日間も溶液内で安定している。さらにＡＭＰ生成モジュールは、ヘキソキナーゼ分析法に容易に移植され、ＡＭＰ生成をグルコースのリン酸化に直接結合させる。
【００２９】
ＡＭＰ１０２及び９８の生成は、ホスホリラーゼｂ６０を活性化し、グリコーゲンの存在下で、図３に示される増幅反応が起こる。グリコーゲン６６が、活性化されたＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４のための基質として与えられる。活性ホスホリラーゼｂ６４及びグリコーゲン６６の酵素反応は、グリコーゲン（ｎ）６６をグリコーゲン（ｎ−１）７２及びグルコース−１−リン酸（Ｇ１Ｐ）７０に変換し（図３及び図４に示されるように）、これにより熱が生成される。すなわち、ホスホリラーゼｂの活性化が、Ｇ１Ｐへのグリコーゲンの分解を開始する。ホスホリラーゼｂ及びグリコーゲンの酵素反応から生成された熱は、一次反応から、すなわちヘキソキナーゼによって触媒作用が及ぼされたリン酸化から発生した熱を増幅させる。ヘキソキナーゼすなわち対象酵素が要する時間内に、増幅酵素、すなわち活性化されたＡＭＰ・ホスホリラーゼｂが、多くの反応イベントに触媒作用を及ぼすために、熱信号が増幅される。
【００３０】
ヘキソキナーゼ触媒反応（図５）からの熱を増幅するためにホスホリラーゼｂを用いる増幅スキームの別の実施形態においては、ＡＭＰの生成をさらに刺激し、ホスホリラーゼｂをさらに活性化させるために、正のフィードバック・ループが与えられる。図５の実施形態において、正のフィードバック・ループは、ホスホグルコムターゼ１１２によって、増幅反応の生成物すなわちＧ１Ｐ７０をＧ６Ｐ８２に変換することを含む。図４に示されるように、Ｇ６Ｐ８２は、ＡＭＰ１０２及び９８の生成を刺激し、ＡＭＰ１０２及び９８は、ホスホリラーゼｂを活性化する。反応を推進するために、酵素、基質、及び他の化合物の十分なプールが与えられる。例えば、ＡＭＰへのＧ６Ｐの変換のために、十分な量の酵素が与えられる。さらに、増幅反応をさらに推進するために、グリコーゲンのプール、又はホスホリラーゼｂのための他の基質が、多量のまま保持される。
【００３１】
ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ活性化錯体６４による増幅の大きさは、ホスホリラーゼｂの活性に基づいて推定される。ホスホリラーゼｂの活性は、１ｍｇの蛋白質につき（１単位＝１マイクロモル／分）３０単位となるように報告される。蛋白質の分子量は、１００ｋＤであるので、蛋白質の活性は、マイクロモルにつき事実上およそ３０００単位である。グルコースごとに２つのＡＭＰが生成されるので、あらゆる単位のヘキソキナーゼ活性を、６０００単位のホスホリラーゼｂ活性に変更することができる。ヘキソキナーゼの反応熱の実際の増幅は、グリコーゲン加リン酸分解のエンタルピーによって決まる。グリコーゲン加リン酸分解のエンタルピーが小さい場合は、感度の増加が減少される。さらに、ＡＴＰ、Ｇ１Ｐ、及びＧ６Ｐなどの反応生成物によるホスホリラーゼｂのフィードバック抑制が、増幅を減少させることがある。このシステムは、限定試薬の消費又は生成物の抑制によって自己制御式になる。
【実施例２】
【００３２】
図６に示される増幅スキームは、増幅を開始するために、一次反応の酵素特有反応生成物以外の生成物を用いることによって、信号を増幅する方法を示す。具体的には、この増幅スキームは、広いクラスの酵素に適用可能な増幅を示し、この場合、このクラスは、ＡＴＰキナーゼである。対照的に、実施例１における増幅は、Ｇ６Ｐ８４を生成する反応に特有のものであった。一次反応の酵素特有反応生成物、又は別の生成物を用いるかどうかの選択は、用途によって決まる。酵素特有生成物（図４のＧ６Ｐ８２のような）を用いる増幅は、例えば、幾つかの反応が同時に起こり、特定の反応が増幅されたことだけを確かめたい場合に有用である。他方、非酵素特有生成物（ＡＴＰキナーゼのためのＡＤＰのような）は、例えば、オーファン酵素と共に用いることができる方法を提供する。
【００３３】
図６の増幅は、増幅酵素としてホスホリラーゼｂを用いる。一次反応において、ＡＴＰキナーゼは、基質１２２とのＡＴＰの反応に触媒作用を及ぼし、リン酸化生成物、すなわち生成物１２４を形成する。ＡＴＰキナーゼ１２６は、リン酸塩をＡＴＰ１２０から切断し、基質１２２がリン酸化されることを可能にする。ＡＴＰキナーゼ１２６を含む酵素反応は、キナーゼ特有リン酸化生成物１２４及びＡＤＰ１２８を生成する。ＡＴＰキナーゼ１２６によって生成される各々のリン酸化イベントは、特定の熱量１２７を生成する。特定の場合においては、反応速度が遅すぎ、該反応によって生成された熱は、検知のためには低すぎる。反応速度が検知のために遅すぎる場合には、キナーゼ特有リン酸化生成物１２４ではなく、ＡＤＰ１２８を用いることによって、発熱を増幅することが可能である。
【００３４】
下流反応すなわち二次反応カスケードを開始するために、ＡＤＰ１２８が用いられる。ホスホリラーゼｂ６０を活性化するために、ＡＤＰ１２８がＡＭＰ１３０に変換される。次に、図３に関連して前述したように、ＡＭＰ１３０は、ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４を形成することによって、ホスホリラーゼをアロステリックに活性化し、引き続きグリコーゲン６６の減少に触媒作用を及ぼす。ホスホリラーゼｂのための基質として働くように、適量のグリコーゲン６６が与えられる。活性化されたＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４は、グリコーゲン６６の分解に触媒作用を及ぼし、触媒作用が及ぼされた各反応イベントについて熱を生成する。ＡＭＰ−ホスホリラーゼｂ錯体６４によるグリコーゲン６６の触媒分解から生成された熱は、キナーゼ触媒反応から生成された熱を増幅し、エンタルピー・アレイによる検知のために十分な熱量をもたらす。
【００３５】
何らかの適切な方法を用いて、ＡＤＰをＡＭＰに変換することができる。図６に示される実施形態において、増幅方法は、ＡＤＰ特有酵素としてＡＤＰ依存グルコキナーゼを用い、ＡＤＰがＡＭＰに変換される。ＡＴＰキナーゼを検査するための分析において、Ｄ−グルコース１３４が、ＡＤＰ特有グルコキナーゼ１３２のための基質として与えられ、ＡＤＰ１２８をＡＭＰ１３０に変換する。具体的には、ＡＤＰ特有グルコキナーゼは、ＡＤＰ１２８及びＤ−グルコース１３４に触媒作用を及ぼし、ＡＭＰ１３０及びＧ６Ｐ１３６を生み出す。ＡＤＰ依存グルコキナーゼは、標準的な検査条件に対して高い最適温度を有するが、ＡＤＰ依存グルコキナーゼは、多くの実験室の研究に一般的な温度である、２５℃−３７℃で、依然として幾らかの活性を保持する。ＡＤＰ依存グルコキナーゼは、これらの温度において、ＡＭＰを生成するための満足のいく活性を示し、増幅酵素ホスホリラーゼｂを活性化する。ＡＤＰ依存グルコキナーゼを多量に提供することは困難であるが、ホスホリラーゼｂを活性化するために、十分な量のＡＭＰを提供するのに十分な量だけが必要とされる。ＡＤＰをＡＭＰに変換するために、他の酵素を用いることもできる。ＡＤＰをＡＭＰに変換するための他の適切な酵素は、これらに限られるものではないが、ＡＤＰ特有ホスホフルクトキナーゼ及びヌクレオシドニリン酸を含む。ヌクレオシドニリン酸が用いられる場合には、該ヌクレオシドニリン酸を（ＡＴＰではなく）ＡＤＰに特有のものにしなければならない。ヌクレオシドニリン酸は、ＡＤＰ及び水（Ｈ2Ｏ）をＡＭＰ及びリン酸塩に変換する。次に、ＡＭＰを用いて、ホスホリラーゼｂのような増幅酵素を活性化し、グリコーゲンと反応させ、増幅熱１３８を生成する。適切なヌクレオシドニリン酸は、寄生原生動物の赤痢アメーバからのヌクレオシド二リン酸である（Ｊ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ｄ．Ｇ．Ｌｉｎｄｍａｒｋ及びＭ．Ｍｕｅｌｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７８年、８２：９１３−９２０）。
【実施例３】
【００３６】
上記に示される増幅方法は、ホスホフルクトキナーゼを用いて、一次酵素反応の熱信号を増幅することもできる。一次反応において、対象酵素は、Ｒａｓ又はＧ蛋白質のようなＧＴＰアーゼである。ＧＴＰアーゼは、水を用いて、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解する。次に、ＧＤＰは、原核動物の大腸菌及び好熱性細菌からのホスホフルクトキナーゼをアロステリックに活性化させる。（Ａ．Ｆｅｈｒｓｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６０ページ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．１９９９年））。ホスホフルクトキナーゼのための基質、すなわちＡＴＰ及びフルクトース−６−リン酸が与えられる。ＡＴＰとのホスホフルクトキナーゼの反応から生成された熱及びフルクトース−６−リン酸が、増幅された熱を生成する。ＡＤＰは、ＡＴＰ及びフルクトース−６−リン酸との、ホスホフルクトキナーゼの反応から生成される。ＡＤＰはまた、ホスホフルクトキナーゼを活性化又は行動化する。ホスホフルクトキナーゼのＡＤＰ活性化／行動化は、ＧＤＰ活性化へのスワンピング効果を有する。したがって、ホスホフルクトキナーゼを用いる増幅スキームにおいて、このスワンピング効果を防止するように、このＡＤＰを消費しなければならない。消費ＡＤＰのための手段として、ＡＤＰアーゼ又はＡＤＰ依存キナーゼを提供することができる。
【実施例４】
【００３７】
この実施例において、本実施形態を用いて、ＧＰＣＲへの、この場合は作用薬である配位子の結合を研究する。この方法は、逆作用薬、拮抗薬、又は他の何らかのアロステリック又は競合的変調器にも容易に適用することができる。ＧＰＣＲは、製薬産業にとって、最も重要なクラスの蛋白質ターゲットの１つである。ＧＰＣＲは、細胞外のシグナル伝達分子に基づいたシグナル伝達細胞に含まれる膜蛋白質であり、現在のところマーケット対象ＧＰＣＲの上位２００の薬剤のうちの約５０％である。さらに、ヒトゲノムの完了の結果として、細胞経路における役割についての従来の知識なしに、ゲノムから多くのＧＰＣＲが識別され、そのことが、これらの「オーファン」ＧＰＣＲの薬剤スクリーニングを困難にしている。現在、オーファンＧＰＣＲの配位子のためのスクリーニング方法は、蛍光タグ付け、ＧＰＣＲの細胞行動についての仮説を含む細胞分析を用い、例えば、構成的に活性にするために、ＧＰＣＲ自体を潜在的に修飾する。これらの方法は、ＧＰＣＲに結合する配位子又は関連したＧ蛋白質の活性を直接検知するものではなく、寧ろ、ＧＰＣＲが信号を送った経路の細胞応答を調べるものである。この実施例は、上述の配位子結合を直接的に検知するための、本発明の使用を示す。
【００３８】
原則的に、ナノ熱量計アレイを用いて、ＧＰＣＲに結合する配位子を一般的にスクリーニングし、ＧＰＣＲへの配位子の結合熱を測定することができるが、配位子の結合からの熱を検知するのに十分に高い濃度でＧＰＣＲを準備することは、非常に困難である。例えば、過剰に発現されたＧＰＣＲを有する膜断片の懸濁液は、図１に示されるようなナノ熱量計アレイと共に用いるのに適した十分に低い粘度で、約１ｍｇ又はそれより少ない膜蛋白質／ｍｌとすることができる。過剰に発現されたＧＰＣＲは、一般に、膜全体の約１％から２％までとすることができる。このように、ＧＰＣＲ濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから０．０２ｍｇ／ｍｌ又はそれより少ない。３０Ｋダルトンの公称ＧＰＣＲ分子量（その数は、ＧＰＣＲごとに変わる）について、モル濃度は、０．２μＭから０．４μＭまで又はそれより少なく、これは、図１のナノ熱量計が容易に測定できるものより少ない。より高い濃度のＧＰＣＲにおいて測定が実行可能であったとしても、過剰に発現されたＧＰＣＲサンプルは、費用と時間がかかり、一連の測定に利用可能な材料の量を制限するので、濃度及びＧＰＣＲサンプルの体積を減少させることも重要である。したがって、少ない体積及び低濃度（約０．０１ｍｇ／ｍｌから０．１０ｍｇ／ｍｌまで、又はそれより少ない）のＧＰＣＲを用いる方法には、多くの利点がある。
【００３９】
本発明者らは、増幅された反応熱源として、関連したＧＴＰのＧ蛋白質加水分解を用いることによって、低いＧＰＣＲ濃度で、ＧＰＣＲに結合する作用薬（Ｇ蛋白質結合受容体）を含む反応を測定した。この実施例における熱の大部分は、結合された作用薬を用いてＧＰＣＲで活性化されたＧ蛋白質によるＧＴＰ加水分解からのものである。ＧＰＣＲは、細胞外側の受容体（例えば、作用薬又は抑制剤）を結合させる膜貫通蛋白質であり、受容体の結合時に、細胞内側の蛋白質（同じく膜蛋白質）により、ＧＴＰのためのＧＤＰが交換される。ＧＴＰの結合後、Ｇ蛋白質は、ＧＰＣＲから分離し、αサブユニットがβ−γ錯体から分離する。次に、αサブユニット及びβ−γ錯体が、膜に沿って別箇に移動し、対象物と相互に作用する。αサブユニットは、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、熱を発生することもでき、発熱時に、該αサブユニットは、β−γ錯体と再結合し、再び活性化する。
【００４０】
図２Ａについてこの測定を説明すると、ＧＰＣＲは、一次酵素４４である。ＧＰＣＲは、Ｇ蛋白質上のＧＴＰのためのＧＤＰの交換、続いてβ−γ錯体からのＧ蛋白質のαサブユニットの分離に触媒作用を及ぼすので、本発明者らは、ＧＰＣＲを酵素と呼ぶ。ＧＤＰ−ＧＴＰ交換及び分離の前のＧ蛋白質は、基質４０を考慮することができる。ＧＰＣＲは受容体でもあり、したがって、この実施例において、作用薬の結合によって活性化され、よって、ＧＰＣＲは活性剤４２である。一次酵素反応の生成物４６は、分離されたＧ蛋白質のαサブユニット及びβ−γ錯体である。この実施例において、生成物４６、Ｇ蛋白質のαサブユニットのうちの１つは、増幅酵素５０でもある。これは、基質５２であるＧＴＰを加水分解し、増幅された熱５４を生成する。次に、Ｇ蛋白質のαサブユニットは、β−γ錯体（図２Ａに図示されていない）と再結合し、該β−γ錯体をＧＰＣＲ４４のための基質４０として再び利用できるようにする。
【００４１】
本発明者らの実験において、過剰に発現されたＧＰＣＲ  Ｐ２Ｙ６受容体錯体と、バキュロウイルス接種昆虫細胞からの関連したＧ蛋白質とを含む断片膜を使用した。ＧＰＣＲの過剰発現は、本発明者らが観察する信号が、他のＧＰＣＲ及び同じく細胞膜内に存在するＧＴＰアーゼではなく、主としてこのＧＰＣＲに起因するものであることを保証する。膜断片を準備するために、膜が溶解され、緩衝液内で２度すすがれ、２６標準規格注射針を２回通過することによって均質化される。バイオ・ラッド蛋白質分析法により、そのうちの１−２％が関心あるＰ２Ｙ６  ＧＰＣＲ錯体であると考えられる１００ｍｇ／ｍｌの蛋白質が判明した。この実施例におけるＧ蛋白質増幅方法を用いるナノ熱量測定に適した濃度である１ｍｇ／ｍｌの全蛋白質濃度まで、溶液が１００倍に薄められた。
【００４２】
本発明者らは、作用薬としてＵＤＰを用いて熱量測定を行った。具体的には、ナノ熱量計セル（図１を参照されたい）の測定側において、上述の膜断片の希釈溶液の２５０ｎＬ液滴を、２５０ｎＬ液滴の緩衝液にＵＤＰ及びＧＴＰ溶液を加えたものと結合し、測定側において、２つの２５０ｎＬ液滴の緩衝液を結合した。ＵＤＰ濃度は０．８ｍＭであり、ＧＴＰ濃度は２．３ｍＬであった。上述のように、ＧＴＰは、作用薬がＧＰＣＲに結合する時に、Ｇ蛋白質のための基質として働く。液滴の結合後、濃度はこれに応じて低下し、合体時の結合された液滴について、濃度［ＵＤＰ］＝０．４ｍＭ及び［ＧＴＰ］＝１．１５ｍＭがもたらされた。この測定に用いられたＰ２Ｙ６  ＧＰＣＲ受容体の量は、前の段落で引用された１−２％の推定に対応する、２．５ｎｇから５ｎｇまでであった。
【００４３】
図７は、これらの膜蛋白質を用いるナノ熱量測定の結果を示す。本発明者らは、液滴が合体された後、約１−２秒間における１．２ｍ℃の信号の大きさを参照する。図７は、ナノ熱量計測定が、これらのＧＰＣＲ結合及びＧ蛋白質活性化カスケードを検知できることを示す。低濃度のＧＰＣＲの場合には、図７の熱の大部分が、増幅段階におけるＧＴＰ加水分解から来たということである。１．１５ｍＭＧＴＰの全てが瞬間的に加水分解されるべき場合には、次に、信号が、約６ｍ℃の大きさとなるので、観察された信号は、極めて適当で、ＧＴＰ加水分解の有限速度を考慮したものであり、Ｇ蛋白質に結合するＧＴＰ対ＧＤＰが、ＧＤＰ濃度として減少されるという事実により、最終的に加水分解速度が減衰される。この反応に用いられる受容体錯体の総推定量は、高処理量のスクリーニング操作のために許容可能な量である８５フェムトモルであった。
【００４４】
別の実施形態において、非加水分解性ＧＴＰアナログが、ナノ熱量計の基準面上に用いられ、非加水分解性ＧＴＰアナログの例は、Ｇｐｐ（ＮＨ）−ｐ（５’−グアニリルイミドリン酸塩）、ＧＴＰ−γ−Ｓ（グアノシン５’−Ｏ−（３−チオトリリン酸塩））、及びＡｌＦ４（Ｇα−ＧＤＰにおいてＧＤＰ上に第３の「偽」リン酸塩を形成する）である。具体的には、基準面上の１つの液滴は、Ｇ蛋白質の活性化−非活性化サイクルを阻止するのに十分な非加水分解性ＧＴＰアナログと共に、測定面上と同じかほぼ同じ濃度で関心あるＧＰＣＲを含む膜断片を備え、これによりＧＴＰの加水分解が防止される。基準面上の第２の液滴は、測定面上の対応する液滴と同じかほぼ同じ濃度で作用薬及びＧＴＰを含み、これにより液滴が合体された時に、基準面と測定面との間の希釈熱が良好に合致される。図示するため、この実施例の作用薬はＵＤＰであり、ＧＰＣＲはＰ２Ｙ６受容体錯体であるが、この実施形例に示される方法を、他のＧＰＣＲ及びそれらの配位子調整剤に容易に適用できることを理解することができる。測定時に、測定面上の２つの液滴が合体され（一方は関心あるＧＰＣＲを含み、他方は作用薬及びＧＴＰを含む）、同時に、基準面上の２つの液滴が合体される。測定面と基準面との間の示差温度が測定され、温度上昇は、測定面上のＧＰＣＲの活性化及び関連したＧ蛋白質によるＧＴＰ加水分解を示す。
【００４５】
さらに別の実施形態において、膜断片の非行動化懸濁液が、ナノ熱量計の基準面上に用いられる。具体的には、基準面上の１つの液滴が、測定面上と同じか又はほぼ同じ濃度で、関心あるＧＰＣＲを含む膜断片を備える。基準面上の第２の液滴は、測定面上の対応する液滴と同じか又はほぼ同じ濃度で、ＧＴＰを含むが、作用薬又は検査作用薬を含んでいず、これにより、作用薬又は検査作用薬がある状態に対する該作用薬又は検査作用薬がない状態のＧＴＰ加水分解の示差測定値が与えられる。図示するため、この実施例の作用薬はＵＤＰであり、ＧＰＣＲはＰ２６Ｙ受容体錯体であるが、この実施例に示された方法を、他のＧＰＣＲ及びそれらの配位子調整剤に容易に適用できることを理解することができる。測定時に、測定面上の２つの液滴が合体され（一方は関心あるＧＰＣＲを含み、他方は作用薬及びＧＴＰを含む）、同時に、基準面上の２つの液滴が合体される。測定面と基準面との間の示差温度が測定され、温度上昇は、測定面上のＧＰＣＲの活性化及び関連したＧ蛋白質によるＧＴＰ加水分解を示す。
【００４６】
上述の実施形態において、ＧＰＣＲのための配位子を見つけるために、ここに開示された方法を、ＧＰＣＲの構造的研究と共に用いることができる。ＧＰＣＲの構造的研究に取り組んでいる会社の例としては、Ｓａｒｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社が、ＧＰＣＲの結晶化に取り組んでおり、構造についてもっと知るために結晶を用いている。この目的は、候補となる配位子を特定するために、構造的情報を用いることである。説明された実施形態は、これらの努力を補完し、ＧＰＣＲのための配位子及びリードを見つけるための経路をスピードアップするものである。例えば、構造的研究により、可能な配位子のファミリーが提案され、次に、ナノ熱量計アレイを用いて、配位子のファミリーをスクリーンし、本発明によって説明された増幅を用いて、配位子の特定例を見つけることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明を実施することができるナノ熱量計デバイス／装置の構成部品を示すブロック図である。
【図２Ａ】酵素反応から発生した熱を増幅する方法の一般的なスキームの概略である。
【図２Ｂ】熱を増幅する別の方法の一般的なスキームの概略である。
【図３】酵素ホスホリラーゼｂを増幅するための増幅反応の概略である。
【図４】増幅酵素としてホスホリラーゼｂを用いる、ヘキソキナーゼ触媒反応の増幅についての概略である。
【図５】反応を増幅するためにホスホリラーゼｂ及び正のフィードバック・ループを用いる、ＡＴＰキナーゼ触媒反応の増幅についての概略である。
【図６】増幅酵素としてＡＤＰ依存グルコキナーゼを用いる、ＡＴＰキナーゼ触媒反応の増幅についての概略である。
【図７】配位子をＧＰＣＲに結合することによって得られるナノ熱量計測定を示す。
【符号の説明】
【００４８】
１０：ナノ熱量計
１２：熱隔離層
１４：測定領域
１６：基準領域
１８、２０：熱平衡領域
２２、２４：温度計
４０、５２、１２２：基質
４２：補因子
４４：一次反応
４６、１２４：反応生成物
４８、５６、１２７：熱
５０：増幅酵素
５４、１３８：増幅された熱
６０：ホスホリラーゼｂ
６２、９８、１０２、１３０：ＡＭＰ
８６、９６、１２０：ＡＴＰ
８８、１２８：ＡＤＰ
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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