(57)【要約】【課題】 本発明は、小児及び牛、馬、豚、猿などの幼い動物で急性下痢及び腸炎を起こす主な原因体として知られているロタウイルスを抑制する新菌株及び該菌が生成する抗ロタウイルス活性蛋白質を提供する。【解決手段】 本発明の新菌株は、ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)と名付けた。本発明の新菌株及びこれから分離された活性蛋白質は整腸製品として活用することができ、特に幼児用製品として活用度が高いと思われる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロタウイルスの抑制活性を有する新菌株ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)。
【請求項２】
序列番号1に開示された塩基序列で表示される請求項１に記載のビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)由来のロタウイルスの抑制活性を有する蛋白質を暗号化する遺伝子。
【請求項３】
序列番号2に開示されたアミノ酸序列で表示される請求項１のビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)由来のロタウイルスの抑制活性を有する蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載の新菌株及び請求項３に記載の蛋白質を単独または混合したものを有効成分とする整腸製品。
【請求項５】
前記整腸製品は、液状型または粉末型であることを特徴とする請求項４に記載の整腸製品。
【請求項６】
前記整腸製品は、幼児用であることを特徴とする請求項４または請求項５に記載の整腸製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロタウイルスを抑制する新菌株及び該菌が生成する抗ロタウイルス活性を有する蛋白質に関し、さらに詳細には、新菌株ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)及び該菌が生成する抗ロタウイルス活性を有する蛋白質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスは、オーストラリアの司教などによって、１９７３年、急性下痢症の治療の為に入院した子供からの十二指腸の生検標本で発見された。
ロタウイルスは、レオウイルス科(Reoviridae)に属するウイルスであって、ウイルス粒子の二重カプシド(double capsid)が、まるで牛車と馬車の車輪のようだといってrota（車輪)ウイルスと名付けられた。以後、ロタウイルスが幼児の急性下痢症の最も重要な病因であるということが世界各地の研究によって明らかになった。
１９４３年、ライト（Light）とホデス（Hodes）が胃腸管炎を病む幼児の糞便から分離し、１９７７年、電子顕微鏡によって形態学的特性が明らかになった。一方、レオウイルスの類似ウイルスが哺乳動物と鳥類から分離されて、該ウイルスはロタウイルスであることが証明され、１９７８年にFamily ReoviridaeのGenus Rotavirusとして分類された。
ロタウイルスは抗原的にお互いに異なる６群(A-F)で構成されている。A、B、C群のロタウイルスは人と動物の両方で発見され、D、E、F群は動物のみで発見される。血清別に区分される群はお互いに共通の抗原または交差する抗原を持っているが、この中でA群は、ロタウイルスの存在が初めて報告された以後最も多くの研究が行われてその性格がよく解明されており、人からの分離株の大部分を占めている。主な内部カプシド蛋白質であるVP６は下位グループを決めて、外部カプシド蛋白質中のVP７とVP４は血清型を決める。今まで少なくとも2つの下位グループと4つの血清型が知られている。
ロタウイルスは、外皮はなく、外部カプシドとコアを有している。二重螺旋型RNAの１１個の分離されたセグメント(segment)によりウイルスゲノムが構成されている。２つのウイルス蛋白質(VP4とVP7)が外部カプシドを成しているが、この中でウイルス赤血球凝集素であって細胞付着蛋白質であるVP4は、ウイルスの表面からスパイクのように出ていてウイルスの重量の２.５％に達する。VＰ４はトリプシンによりVＰ５*(Mr６０、０００)とVP８*(Mr２８、０００)に分かれてウイルスの細胞内に浸透する。VＰ７は３７ｋDaの糖蛋白質であり、スムース(smooth)外部カプシド細胞シェル(shell)を構成しウイルスの重量の３０％を占める。
下記の表１はロタウイルスの一般的な特徴である。
【０００３】
【表１】
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ロタウイルスは小児及び牛、馬、豚、猿などの幼い動物で急性下痢及び腸炎を起こす主な原因体であると知られている。ウイルスは糞便から経口への経路を通して感染し、満２歳以下の幼い幼児で伝染性急性下痢症の原因になるが、このような感染状態はよく幼児性胃腸管炎、または急性胃腸管炎と呼ばれる。
下痢が現れることは、ロタウイルスの感染により腸管の粘膜細胞の吸収機能に障害が発生するからであると知られている。ウイルスが小腸の絨毛細胞に感染してこの細胞の細胞質で増殖して、輸送メカニズムに障害を起こす。損傷された細胞は腸管から落ちて多量のウイルスを放出し、糞便でウイルスが発見される。ロタウイルスによる下痢は、絨毛の損傷された細胞が吸収能がない未熟な腺窩細胞(crypt cell)に代替されることによって発生する、ナトリウム、葡萄糖の吸収機能損傷から起因することである。
一方、前記ロタウイルスによる幼児の下痢疾患は、主に離乳直後に短く現れ、このような下痢疾患を「Weanling diarrhea」または「Colibacillosis」とする。このような現象は、好機性腐敗菌株において主に非溶血性E.coliとEnterococciの溶血性E.coliへの劇的な転移を伴う。これらの溶血性E.coli菌株は、普通、毒素(enterotoxin)を生産すると共にpiliを持っていて、このpiliはE.coliが上皮細胞(enterocyte)に特異的に付着することができるようにする。このような菌株を病原血清型または脹内毒性生成E.coliと呼んで、多様な血清型が存在する。
１９７３年には、初乳を飲ませずに人工飼育した子豚から発生した激しい下痢疾患の病因について研究し、このような疾患をcolibacillosisと診断した。また、細菌はなく、上皮細胞(enterocyte)に感染して結局細胞を破壊するロタウイルスを含有した下痢性のものを初乳を飲ませなかった子豚に感染させることによってこのような現象を誘発させることができた。後に、生後３-４週の離乳したばかりの子豚の下痢の糞便の中で、多量のロタウイルスを発見し、幼いものの下痢においてロタウイルスの病因学的な重要性がさらに確認された。また、下痢の期間中に非溶血性E.coliが溶血性E.coliに転移されることが確認されたが、ロタウイルスを一緒に投与せずに溶血性、病原血清型E.coliのみを子豚に経口投与した時は子豚の下痢が起きなかった。結論的に、ロタウイルスは、腸管に損傷を引き起こして病原血清型E.coliが小腸に移住して集落を形成するのに適当な環境を提供する役割りも遂行することである。
臨床症状は腸管係の症状が主であり、嘔吐、下痢に腹痛を伴い、多少の発熱現象も現れる。幼児では脱水現象と電解質不均衡の状態が急速に発展する。
世界保健機構の統計資料によると、地球上の５歳以下の子供たちの中で下痢症により死亡する数字が毎年５００万人に達して、これらの中で２０％に該当する１００万余名がロタウイルスによる下痢症で死亡していると言う。韓国のソウル地域の小児下痢群を対象として12ヵ月間12種類以上の下痢誘発原因体を調査した研究報告によると、ロタウイルスが下痢群の47％から検出されて最も高い出現頻度を示し、これは、世界保健機構の統計値である20％の２倍を上回る数値である。冬季にはやって開発途上国では幼児死亡原因の中でも最も大きな部分を占めている。これに対する予防法としては母乳を飲ませることが推薦されている。母乳の中にはロタウイルスに対する高い力価のIgAが含まれていてロタウイルスの感染により引き起される幼児の下痢症を予防することができるからである。
下記の表2は下痢症状を見せる群及び下痢症状を見せない韓国の子供たちに現れる病原血清型に関する統計である。
【０００４】
【表２】
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a   : 同一患者から分離された多数の病原体が各々記録されている。
b  : n = 231   
c  : n = 104
【０００５】
下痢の症状を見せる患者中56(24.2％)は病原体が検出されず、対照群は52(52.9％)で病原体が検出されなかった。
大部分の患者は水分供給等の適切な治療を受ければ回復するが、開発途上国ではこのような治療さえ普遍化されていない状況で、きれいな飲み水の供給と衛生処理などによって細菌性下痢患者の発生頻度は減少しているが、ロタウイルスによる感染はこの方法では大きな効果を得ることができない。
ロタウイルス感染は場内で分泌されるIgAの合成を誘導する。また、羊、子牛、そして豚を対象とする実験結果によると腸(lumen)で分泌される抗体が血清やリンパ内に存在する抗体よりロタウイルス感染の予防にさらに重要な要因であることが分かる。
従って、口腔により服用できる生ウイルスワクチンの開発が望ましく、マイクロカプセル化(microencapsulation)された死んだワクチンやサブユニットワクチン(subunit vaccine)の開発が試みられている。
過去20余年間、ワクチンの開発の為の多くの努力があって、現在、伝統的な開発方法と分子生物学的方法が両方試みられている。それにも関わらず、副作用のないワクチンの開発は成功することができなかった。また、開発されたワクチンも副作用がひどくて使用することができない状態である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前述した問題点を解決する為に発明されたものであって、ロタウイルス感染疾患が離乳期に集中的に現われると共に、この時期に脹内に常駐するビフィドバクテリウム菌数が急激に減少してE.coliが増加することに着眼し、ロタウイルス感染の抑制効果を有する新規なビフィドバクテリウム菌株であるビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)を提供しようとする。
本発明のほかの目的は、上記菌が生成する抗ロタウイルス活性蛋白質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ロタウイルスの抑制活性を有するビフィズス新菌株であるBifidobacterium longumAR８１(KCCM-１０４９２)及び該新菌株由来のロタウイルスの抑制活性を有する蛋白質を提供する。
本発明のロタウイルスの抑制活性を有するビフィズス新菌株は、ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)と名付けて、韓国微生物保存センターに2003年5月6日付けで寄託した。寄託番号はKCCM-１０４９２号である。
本発明から分離されたビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)の菌学的な特性は下記の表3のようである。
【０００８】
【表３】
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【０００９】
この菌株から抗ロタウイルス活性を示す蛋白質を分離し、これをコーディングする遺伝子の塩基序列は序列目録1、アミノ酸序列は序列目録2のようである。
このような蛋白質は、実験結果、抗ロタウイルス活性を持っていることが確認されて、これを含む薬学的な組成物は薬剤学的に許容される賦形劑、担体、希釈剤などを含むことができると共に、錠剤、丸剤、分散剤、顆粒、elixir、懸濁剤、油化剤、溶液、シロップなどの形態も可能である。また、経口もしくは非経口的に投与されることができ、1日投与量は体重1Kg当たり1ないし20mgの範囲である。
前記の蛋白質の分離錠剤は、本発明の新菌株ビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)を0.1％アスコルビン酸及び0.01％チオグリコル酸ナトリウムを含むTSB(trypic soy broth)pH7.2で培養した後、遠心分離、沈殿化、透析などの工程を経て分離及び精製する。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００１０】
対象になる細胞及び細胞の培養
本発明で使用した細胞はMacaccus'Rhesus monkey kidney cell(MA-104)であって、日本富山衛生試験研究所から分譲してもらて、MA-104細胞に10％のFBSを添加して抗生物質-抗真菌剤1％と中炭酸ナトリウム3.5g/Lを補強したDMEMを使用してCO2培養基で37℃、5％CO2ガスに飽和された条件で培養した。
【実施例２】
【００１１】
ロタウイルスの分譲及びウイルス液の製造
SA11 rotavirusは国立保健院から、wa rotavirusはATCCから分譲してもらた。
これらのウイルスを各々組織培養(T.C.)フラスコ(25ｃｍ２基準)に細胞の個数が1-2x106細胞/フラスコになるように分注した後に37℃、5％CO2条件で1時間程度細胞を付着させた。
上登液をすくい取ってFBSが含まれていない洗浄(washing)培地であるDMEM培地で洗浄した後に、Wa virusまたはSA11virus液400μlにトリプシン5μｇ/mlを含んだDMEM培地(感染培地)20μlを加えて、３７℃で30分間処理して既に活性化させたWa virus液400μlを加えて細胞表面に均一に伸ばした後、37℃で1時間感染させた。
感染が終った後には上登液をすくい取って細胞変性効果(cpe)を観察、確認して冷凍させた。
冷凍後に速く溶かす過程を3回繰り返して細胞の細胞膜を完全に破って、4℃、500rpmで20分間遠心分離し、ウイルス液である上登液のみを各々取って冷凍保管した。
【実施例３】
【００１２】
使用する乳酸菌及びビフィドバクテリウム
本実験で使用したLactobacillus acidophilus KCTC3150、Bifidobacterium longum KCTC3215、Bifidobacterium infantis KCTC3226は、韓国の遺伝工学研究所で分譲してもらて、他の菌株は人の脹内細菌叢から分離して使用した。
【実施例４】
【００１３】
ロタウイルス液の力価の決定(End-point dilution method)
実施例1で培養されたMA-104細胞を0.25％トリプシン-EDTAに処理して取り出した後新しい培地を加えて、これを1200rpmで5分間遠心分離した後、上登液を捨てて、望む濃度である5x105細胞数/mlになるように感染培地でml数を合わせた。
ロタウイルスの貯蔵液(stock solution)から10-1から10-8まで希釈系を作って１つの濃度当たり８個のウエルに100μlずつ分注した。
ここに培養されたMA-104細胞を同量分注してCO2培養基で37℃、5％CO2ガスに飽和された条件で7日間培養した。
培養後、 各々のウエルに現われたcpeを顕微鏡で観察してTCID50(50％ Tissu-culture infectious dose)/mlを求め、ここに係数0.69を掛けてpfu(plaque forming unit)/mlを求めた。
【実施例５】
【００１４】
ロタウイルス感染に対する乳酸菌細胞質成分の影響
実験に使用された菌株を各々GAM broth  5mlで18時間培養して、3000rpmで20分間遠心分離して菌沈殿物を得た。この沈殿物をPBS1mlで懸濁して超音波処理した後12000rpmで60分間遠心分離して得た上登液を乳酸菌細胞質液にした。
収得した細胞質液を穴の大きさ0.45μmのシリンジフィルター(syringe filter)を使用して瀘過滅菌した。
MA-104細胞とSA11virusまたはWa virus希釈液を加えたウエルに最終濃度が0.01、0.02、0.04mg蛋白質/mlになるように各菌株の細胞質液を希釈した後50μlずつ加えて培養した後cpeを観察し、その結果は各々表4及び表5のようである。
【００１５】
【表４】
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B-81 : Bifidobacterium longum AR８１(KCCM-１０４９２)
a    : KCTC
【００１６】
【表５】
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B-81 : Bifidobacterium longum AR８１(KCCM-１０４９２)
a    : KCTC
【００１７】
乳酸菌の中では、Bifidobacterium animalis  KCTC  3126とBifidobacterium infantis  KCTC  3226の細胞質成分が感染抑制効果が良く、分離菌の中では47、81(Bifidobacterium  longum  AR８１(KCCM-１０４９２))、179菌株が優秀だったが、その中で本発明の新菌株である81番が最も優秀だった。
分離菌株である47番、81番、179番のグラム染色の結果、全部グラム陽性を示して形態的には棍棒型、Y型などのビフィズスの特徴的な姿を現わした。また、ビフィズスの特異的な酵素であるF6PPK(fructose6phosphate phosphoketolase)の活性検査を通じて分析した結果、全部陽性を示して、ビフィズスであることを確認した。
分離菌の中で活性が比較的優秀な４7番、81番菌株を16SrRNA塩基序列分析を通じて同定した。16srDNA序列を利用して菌株を同定する為にPCRプライマーを製作する。Bifidobacteriumに関する一般的な16srDNA序列はGene Bankから得て、大略的な大きさは約1.5kbであり内側に保存序列が存在することが分る。従って、これを基礎として4種の始発体を製作した。
先ず、PCRの為の鋳型はGenereleaser kitを利用して得る。そして、序列分析鋳  型(sequencing  template)を得る為にPrimer616Vと610Rを使用して約0.5kbDNA短  片を得て、そして612Fと630RIIIを利用して0.5KbDNAを得た。
電気泳動を遂行してDNAバンドをゲル抽出キット(gel extraction kit)(Qiagen、U.S.A)を使用して回収した後、pGEM Teasy vector(Promega、USA)にTAクローニングを実施して序列確認に使用した。
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【００１８】
GeneBankで序列検索をした結果、47番菌株と81番菌株の場合、Bifidobacterium longumと99％以上の高い序列相同性を現し、B.longumに同定して、この中で81番菌株はビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)と名付けて、韓国微生物保存センターに2003年5月6日付けで寄託した。
下記は47番及び本発明の新菌株である81番菌株についてのプライマーに関する資料である。
47番菌株(forward primer):
1. Bifidobacterium longum NCC2705 section 172 of 202 of the complete  genome  
Length = 10301 Score = 1061 bits (535), Expect = 0.0  Identities = 553/559 (98％), Gaps = 1/559 (0％)  Strand = Plus / Plus
47番菌株(reverse primer):
1. Bifidobacterium longum NCC2705 section 172 of 202 of the complete genome Length = 10301  Score =  940 bits (474), Expect = 0.0  Identities = 477/478 (99％)  Strand = Plus / Plus 
81番菌株(forward primer):
1. Bifidobacterium longum NCC2705 section 172 of 202 of the complete genome Length = 10301 Score = 1061 bits (487), Expect = 0.0  Identities = 486/487 (99％), Gaps = 1/487 (0％)  Strand = Plus / Plus
81番菌株(reverse primer):
1. Bifidobacterium longum NCC2705 section 172 of 202 of the complete genome Length = 10301 Score = 1061 bits (521), Expect = 0.0  Identities = 520/521 (99％), Gaps = 1/521(0％)  Strand = Plus / Plus
【実施例６】
【００１９】
ロタウイルス感染に対する乳酸菌細胞壁成分の影響
実験に使用した菌株は各々GAMブロス(broth)5mlで18時間培養して、3000rpmで20分間遠心分離して菌沈殿物を得た。この沈殿物をPBS1mlで懸濁して超音波処理した後12000rpmで60分間遠心分離して得た沈殿物を乳酸菌細胞質膜、細胞壁物質とした。このようにして得た沈殿物をPBS1mlに懸濁した後同量のエーテルを混ぜて24時間放置して滅菌した。
MA-104細胞とSA11virusまたはWa virus希釈液を加えたウエルに最終濃度が0.02、0.04、0.08mg蛋白質/mlになるように各々の菌株の細胞質液を希釈した後50μlずつ加えて培養した後cpeを観察した。その結果は、各々表6及び表7のようである。
【００２０】
【表６】
2005102696.tif 000009
B-81 : Bifidobacterium longum AR８１(KCCM-１０４９２)
a    : KCTC
【００２１】
【表７】
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B-81 : Bifidobacterium longum AR８１(KCCM-１０４９２)
a    : KCTC
【００２２】
前記の表のように、乳酸菌細胞壁成分より細胞質成分がウイルス感染抑制効果が優秀であることが分かる。
【実施例７】
【００２３】
乳酸菌のWa virus感染抑制物質の特性及び決定
乳酸菌をGAMブロス(broth)に培養して遠心分離により集菌して生理食塩水に懸濁して超音波処理した後、遠心分離して得た上登液を高圧蒸気滅菌、瀘過滅菌、熱処理(100、15分)、灰化、またはアセトン沈殿をさせた。
その後MA-104細胞とロタウイルス希釈液を加えたウエルに最終濃度(V/V％)が5、10、20％になるように希釈した後50μlずつ加えて培養した後cpeを観察した。
その結果は、表8のようである。
【００２４】
【表８】
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a : 最終濃度(％)
b : 検出されない
実験結果、乳酸菌のウイルス感染抑制効果は高圧蒸気滅菌、熱処理、灰化効果などによって減少または消滅される一方、アセトン沈殿によっては若干の減少だけを現し、瀘過滅菌によって阻害活性が維持されることを見ると、乳酸菌中Wa virusの感染を抑制することができる物質は蛋白質であることに判断された。
【実施例８】
【００２５】
抗ロタウイルス活性を示す蛋白質遺伝子のクローニング
抗ロタウイルス活性を有する蛋白質遺伝子をクローニングする為に図1の段階によって先発菌株から蛋白質を分離及び精製した。
【実施例９】
【００２６】
抗ロタウイルス活性蛋白質のアミノ酸序列の決定
実施例8で分離精製された抗ロタウイルス蛋白質のアミノ酸序列を決める為に内部序列(internal sequence)を分析した。
アミノ酸序列の決定は韓国基礎科学支援研究院に依頼して決めた。その結果次のような10個のアミノ酸序列を決めることができた。
N'-HLDLAVENT-C'
上記の結果を利用してDATA  BASE(GenBank)の検索をした結果、ビフィズス  由来の遺伝子中でdipeptidaseD(GenBank Accession numberNC_004307)で上記のアミノ酸序列と一致する序列を発見した。
この情報を利用して下記のプライマーを利用し、上記アミノ酸序列をコーディングする全体遺伝子を含む領域をPCRを通じて増幅した。
pepD-F: 5'-AAAACCGATTGGCAACTCGGG-3'
pepD-R: 5'-GCCACTTCTGGGCGCCGGC-3'
その後、これをpGEM-Teasyベクターにクローニングして塩基序列を決めた。
塩基序列は序列目録1のようであり、その中で蛋白質は序列目録2のようである。
【実施例１０】
【００２７】
抗ロタウイルス活性蛋白質の発現及び力価確認
上記実施例7の抗ロタウイルス蛋白質の活性を確認する為に大腸菌発現ベクターを利用して発現して確認した。
この為に下記のプライマーを利用してPCRした後、これをpBAD-TOPOに接合した。
pepTOPO-F: 5'-ATGGCCTGCACCACGATTCTGGTAGG-3'
pepTOPO-R: 5'-AAAGTCGGACATGTGGAAGCCGTTC-3'
これを大腸菌に形質転換して、アラビノース（arabinose）を利用して導入された遺伝子の発現を誘導した。その後、菌体を回収及び超音波破砕を通じて助酵素を製造した後抗ロタウイルス活性を検定した。
その結果、表9で示しているように、対照群に比べて高い阻害活性を示すことが分かった。
【００２８】
【表９】
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【実施例１１】
【００２９】
粉末型整腸製品の開発
ロタウイルスを抑制する本発明の新菌株を利用して幼児用整腸製品を開発した。
先ず、ビフィズス生産用培地に接種して10ml-->500ml-->5L-->50L-->  500L-->5KLに培養して遠心分離により菌体を回収し、これを凍結保護剤と混合して急速凍結させて、凍結乾燥機を利用して完全に乾燥した。また、整腸用乳酸桿菌も同様な過程を経て菌体を確保して整腸製品の製造に利用した。この以外にも整腸効果と他の機能性を付与する為にガラクトオリゴ糖とその他の機能性成分を下記の表のような組成で製造した。
【００３０】
【表１０】
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【００３１】
以上説明したように、新規なビフィドバクテリウム菌株であるビフィドバクテリウムロンガム(Bifidobacterium longum)AR８１(KCCM-１０４９２)は、小児及び幼い動物で下痢を起こすものと知られたロタウイルスの抑制効果を有する。
特に、前述した菌株及び該菌株から分離された抗ロタウイルス活性を有する蛋白質は、食品等に添加する時、整腸製品として活用することができる。
特に、幼児用機能性醗酵乳としての活用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の活性蛋白質の分離及び錠剤過程を示している。
【図１】
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