(57)【要約】【課題】  運搬性或いは保存性に優れた培養骨膜パッケージ、及びその調製方法を提供する。【解決手段】  a)カップ状部を有する第１容器を用意し、採取した骨膜片を前記カップ状部の内底面上に載置するステップ；b)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ前記骨膜片が剥離しないように連続的又は定期的に培地交換をしつつ培養するステップ；c)培養後、前記カップ状部に保存液を満たした状態で前記第１容器を密封するステップによって、培養骨膜パッケージを調製する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カップ状部を有する容器と、
前記カップ状部の内底面に接着した状態で前記容器内に収納されている培養骨膜と、を備え、
前記カップ状部内に保存液を満たした状態で前記容器が密封されている、培養骨膜パッケージ。
【請求項２】
前記容器が、前記カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有する、請求項１に記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項３】
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている、請求項１又は２に記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項４】
前記二本の溝が、前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、請求項３に記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項５】
前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、請求項１〜４のいずれかに記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項６】
前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、請求項５に記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項７】
カップ状部を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されており、
前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域を包囲して連続的又は断続的に連なる溝が形成されている容器と、
前記カップ状部の内底面に接着した状態で前記容器内に収納されている培養骨膜と、を備え、
前記カップ状部内に保存液を満たした状態で前記容器が密封されている、培養骨膜パッケージ。
【請求項８】
前記容器が、複数の前記カップ状部を備える、請求項１〜７のいずれかに記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項９】
前記容器において各カップ状部間には、隣接するカップ状部同士を切り離すための連続的又は断続的に連なる溝が形成されている、請求項８に記載の培養骨膜パッケージ。
【請求項１０】
培養骨膜の調製及び運搬に使用される容器であって、
カップ状部を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている容器。
【請求項１１】
培養骨膜の調製及び運搬に使用される容器であって、
カップ状部と、及び該カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている容器。
【請求項１２】
前記二本の溝が、前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、請求項１０又は１１に記載の容器。
【請求項１３】
前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、請求項１０〜１２のいずれかに記載の容器。
【請求項１４】
前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、請求項１３に記載の容器。
【請求項１５】
複数の前記カップ状部を備える、請求項１０〜１４のいずれかに記載の容器。
【請求項１６】
前記容器において各カップ状部間には、隣接するカップ状部同士を切り離すための連続的又は断続的に連なる溝が形成されている、請求項１５に記載の容器。
【請求項１７】
以下のステップを含む、培養骨膜パッケージの調製方法：
a)カップ状部を有する第１容器を用意し、採取した骨膜片を前記カップ状部の内底面上に載置するステップ；
b)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ前記骨膜片が剥離しないように連続的又は定期的に培地交換をしつつ培養するステップ；
c)培養後、前記カップ状部に保存液を満たした状態で前記第１容器を密封するステップ。
【請求項１８】
前記ステップb)が以下のステップを含む、請求項１７に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-1)前記第１容器の前記カップ状部を収容可能な形状及び大きさの凹部を備える箱状の第２容器を用意するステップ；
b-2)前記第２容器の前記凹部内に、前記第１容器の前記カップ状部をセットするステップ；
b-3)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ定期的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記凹部以外の領域から前記第２容器内の培地を除去した後、前記凹部以外の領域から前記第２容器内へと新しい培地を注入することによって前記培地交換が行われるステップ。
【請求項１９】
前記ステップb)が、以下のステップを含む、請求項１７に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-1)前記第１容器の前記カップ状部を収容可能な形状及び大きさの凹部を備える箱状の第２容器を用意するステップ；
b-2)前記第２容器の前記凹部内に、前記第１容器の前記カップ状部をセットするステップ；
b-4)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ連続的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記第２容器の一領域から前記第２容器内の培地を連続的に排出するとともに、前記一領域と異なる領域から前記第２容器内へと新しい培地を連続的に導入することによって前記培地交換が行われるステップ。
【請求項２０】
前記第１容器が、前記カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有し、前記ステップb)が以下のステップを含む、請求項１７に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-5)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ定期的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記第１容器において前記部分に保持された培地を除去した後、前記部分に新しい培地を注入することによって前記培地交換が行われるステップ。
【請求項２１】
前記第２容器が複数の前記凹部を備える、請求項１７〜請求項２０のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２２】
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、及び
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている、請求項１７〜２１のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２３】
前記二本の溝が、前記第１容器の前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、請求項２２に記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２４】
前記カップ状部の底壁表面に、前記骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、請求項１７〜２３のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２５】
前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、請求項２４に記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２６】
前記第１容器が、複数の前記カップ状部を備える請求項１７〜２５のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
【請求項２７】
ステップb)の後に以下のステップが行われる、請求項１７〜２６のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-6)ステップb)によって得られる膜状の構造体から、前記骨膜片を取り除くステップ。
【請求項２８】
以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
請求項１〜請求項９のいずれかに記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記培養骨膜パッケージを開封し、収納されている前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
【請求項２９】
以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
請求項３又は４に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記側壁表面及び前記底壁表面に形成された前記各溝に沿って前記容器を開裂させ、前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
【請求項３０】
以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
請求項５に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に付された前記印をたよりに前記骨膜片を除去するステップ；
前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
【請求項３１】
以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
請求項６に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に形成された前記溝を利用して該溝に囲まれた領域を打ち抜き、前記骨膜片を除去するステップ；
前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
【請求項３２】
以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
請求項７に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に形成された前記溝を利用して該溝に囲まれた領域を打ち抜き、前記骨膜片を除去するステップ；
前記ステップによって前記容器に形成された孔に歯冠を通し、歯牙上に前記容器を設置するステップ；
前記容器の前記側壁表面及び前記底壁表面に形成された前記各溝に沿って前記容器を開裂させ、患部である歯周組織上に被さるように前記培養骨膜を取り出すステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養骨膜を収納した培養骨膜パッケージ、並びに培養骨膜パッケージの調製方法及び使用方法に関する。本発明の培養骨膜パッケージは例えば、歯周組織の治療用の移植片を提供することに利用される。
【背景技術】
【０００２】
近年、病気や怪我による生体組織の欠損、創傷を、細胞や組織を用いて治療する再生医療の研究が進み、産業化にむけて大きく動き出している。特に産業化が急速に進んでいる組織としては皮膚、骨、歯周組織があげられる。骨組織又は歯周組織の再生（再建）を目的としては様々な技術の開発が進められているが、その一つとして骨膜を利用しようとする試みがある。骨膜は皮質骨の外周を覆う結合組織であって、その中には骨細胞、軟骨細胞などへの分化能を備える幹細胞が存在することが確認されている（非特許文献１、２）。
【０００３】
【非特許文献１】In Vivo Differentiation of Bone and Hypertropic Cartilage from Periosteal-Derived Cells, Experimental Cell Research, 195, 492-503 (1991)
【非特許文献２】In Vivo Osteochondrogenic Potential of Cultured Cells Derived From the Periosteum, Clinical Orthopaedics and Related Research, 259, 223-232 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らはこれまでに骨組織及び歯周組織の再生を目的として研究を行い、その成果として、骨膜を適切な条件下で培養することにより膜状の構造体（培養骨膜）を得ることに成功した。また、得られた培養骨膜を歯槽骨欠損部に移植した結果、良好な再生効果が認められ、歯槽骨の再生に培養骨膜を適用することが有効であることを確認した（特許出願中、特願2002-64235）。
現在のところ培養骨膜は、採取した骨膜を培養皿上において所定の条件下で培養することによって得られている。動物実験などの研究段階では、移植術を施す現場の近隣において培養骨膜の調製を行うことが可能であり、また一般的でもあるが、臨床応用の場面では培養骨膜の調製が治療現場から離れた場所において行われることがむしろ多いと予想される。したがって培養骨膜の実用化にあたっては、培養骨膜を運搬（或いは保存）に耐え得る形態で提供することが要請される。現在の培養方法に使用される培養皿は運搬に適したものではないことから、以上の要請に応えるためには培養骨膜を培養皿から剥離し、そして運搬に適した容器へと移す必要がある。ところが培養骨膜はその厚みが一般に約50〜100μmと極めて薄く、一旦培養皿より剥離された培養骨膜は運搬中にその形状が変形したり、或いは折れ重なったりする傾向にあることから、治療現場での扱い難さが指摘されている。つまり、治療現場において培養骨膜をひろげるという煩雑な操作が必要となり、これが移植術を複雑化して医師及び患者の負担を増加させてしまうということが問題となる。また、当該操作によって培養骨膜が損傷し、十分な治療効果を得られない可能性をも生じさせてしまう。一方、上記のような運搬形態を採用した場合には、運搬中の振動・衝撃などによって培養骨膜が損傷し、移植後にその機能を十分に発揮できないおそれもある。また、治療対象によっては培養骨膜の表裏いずれの面を患部への接触面として移植するかが治療効果に重大な影響を及ぼすが、上記のようにして医療現場へと提供された培養骨膜では移植時（使用時）にその表裏を判別して移植することは事実上不可能であることから十分な治療効果が望めない場合がある。
一方、培養直後の膜状組成物には培養骨膜の基となる骨膜片が含まれているが、この培養後の骨膜片には移植後の治療効果に貢献する細胞、即ち活性の高い細胞はもはや存在していないと考えられ、これを培養骨膜とともに移植することは治療効果を下げることはあっても治療効果を高めることはないと予想される。このことを考慮すれば移植術前に当該骨膜片を除去することが好ましいが、上記のように運搬中に複雑に折り重なったりした薄い移植材料から骨膜片を除去する作業には困難が伴う。
さらに、培養骨膜を移植する際には通常、ピンセット等を用いて培養骨膜を培養皿から剥離しているが、上記のように培養骨膜は極めて薄いことからこの剥離操作によって組織が破損を受けやすい。また、剥離する際に培養骨膜が折れ重なり易く、移植部で培養骨膜をひろげる操作が必要となる。このように、培養骨膜の移植時（使用時）においても、治療効果及び操作性の両面において課題が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以上の課題の少なくとも一つを解決することを目的として、以下の各構成からなる、培養骨膜パッケージ、培養骨膜パッケージの調製方法、及び培養骨膜パッケージの使用方法を提供する。
[１]  カップ状部を有する容器と、
前記カップ状部の内底面に接着した状態で前記容器内に収納されている培養骨膜と、を備え、
前記カップ状部内に保存液を満たした状態で前記容器が密封されている、培養骨膜パッケージ。
[２]  前記容器が、前記カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有する、[１]に記載の培養骨膜パッケージ。
[３]  前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている、[１]又は[２]に記載の培養骨膜パッケージ。
[４]  前記二本の溝が、前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、[３]に記載の培養骨膜パッケージ。
[５]  前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、[１]〜[４]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージ。
[６]  前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、[５]に記載の培養骨膜パッケージ。
[７]  カップ状部を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されており、
前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域を包囲して連続的又は断続的に連なる溝が形成されている容器と、
前記カップ状部の内底面に接着した状態で前記容器内に収納されている培養骨膜と、を備え、
前記カップ状部内に保存液を満たした状態で前記容器が密封されている、培養骨膜パッケージ。
[８]  前記容器が、複数の前記カップ状部を備える、[１]〜[７]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージ。
[９]  前記容器において各カップ状部間には、隣接するカップ状部同士を切り離すための連続的又は断続的に連なる溝が形成されている、[８]に記載の培養骨膜パッケージ。
[１０]  培養骨膜の調製及び運搬に使用される容器であって、
カップ状部を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている容器。
[１１]  培養骨膜の調製及び運搬に使用される容器であって、
カップ状部と、及び該カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有し、
前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている容器。
[１２]  前記二本の溝が、前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、[１０]又は[１１]に記載の容器。
[１３]  前記カップ状部の底壁表面に、前記培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、[１０]〜[１２]のいずれかに記載の容器。
[１４]  前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、[１３]に記載の容器。
[１５]  複数の前記カップ状部を備える、[１０]〜[１４]のいずれかに記載の容器。
[１６]  前記容器において各カップ状部間には、隣接するカップ状部同士を切り離すための連続的又は断続的に連なる溝が形成されている、[１５]に記載の容器。
[１７]  以下のステップを含む、培養骨膜パッケージの調製方法：
a)カップ状部を有する第１容器を用意し、採取した骨膜片を前記カップ状部の内底面上に載置するステップ；
b)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ前記骨膜片が剥離しないように連続的又は定期的に培地交換をしつつ培養するステップ；
c)培養後、前記カップ状部に保存液を満たした状態で前記第１容器を密封するステップ。
[１８]  前記ステップb)が以下のステップを含む、[１７]に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-1)前記第１容器の前記カップ状部を収容可能な形状及び大きさの凹部を備える箱状の第２容器を用意するステップ；
b-2)前記第２容器の前記凹部内に、前記第１容器の前記カップ状部をセットするステップ；
b-3)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ定期的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記凹部以外の領域から前記第２容器内の培地を除去した後、前記凹部以外の領域から前記第２容器内へと新しい培地を注入することによって前記培地交換が行われるステップ。
[１９]  前記ステップb)が、以下のステップを含む、[１７]に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-1)前記第１容器の前記カップ状部を収容可能な形状及び大きさの凹部を備える箱状の第２容器を用意するステップ；
b-2)前記第２容器の前記凹部内に、前記第１容器の前記カップ状部をセットするステップ；
b-4)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ連続的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記第２容器の一領域から前記第２容器内の培地を連続的に排出するとともに、前記一領域と異なる領域から前記第２容器内へと新しい培地を連続的に導入することによって前記培地交換が行われるステップ。
[２０]  前記第１容器が、前記カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分を有し、前記ステップb)が以下のステップを含む、[１７]に記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-5)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ定期的に培地交換をしつつ培養するステップであって、前記第１容器において前記部分に保持された培地を除去した後、前記部分に新しい培地を注入することによって前記培地交換が行われるステップ。
[２１]  前記第２容器が複数の前記凹部を備える、[１７]〜[２０]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２２]  前記カップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝が形成されており、及び
前記二本の溝を繋げるように前記カップ状部の底壁表面に溝が形成されている、[１７]〜[２１]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２３]  前記二本の溝が、前記第１容器の前記カップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されている、[２２]に記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２４]  前記カップ状部の底壁表面に、前記骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されている、[１７]〜[２３]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２５]  前記印が、連続的又は断続的に連なる溝からなる、[２４]に記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２６]  前記第１容器が、複数の前記カップ状部を備える、[１７]〜[２５]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法。
[２７]  ステップb)の後に以下のステップが行われる、[１７]〜[２６]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージの調製方法：
b-6)ステップb)によって得られる膜状の構造体から、前記骨膜片を取り除くステップ。
[２８]  以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
[１]〜[９]のいずれかに記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記培養骨膜パッケージを開封し、収納されている前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
[２９]  以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
[３]又は[４]に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記側壁表面及び前記底壁表面に形成された前記各溝に沿って前記容器を開裂させ、前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
[３０]  以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
[５]に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に付された前記印をたよりに前記骨膜片を除去するステップ；
前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
[３１]  以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
[６]に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に形成された前記溝を利用して該溝に囲まれた領域を打ち抜き、前記骨膜片を除去するステップ；
前記培養骨膜を取り出すステップ；
取り出した前記培養骨膜を患部に移植するステップ。
[３２]  以下のステップを含む、培養骨膜の移植方法：
[７]に記載の培養骨膜パッケージを用意するステップ；
前記容器の前記底壁表面に形成された前記溝を利用して該溝に囲まれた領域を打ち抜き、前記骨膜片を除去するステップ；
前記ステップによって前記容器に形成された孔に歯冠を通し、歯牙上に前記容器を設置するステップ；
前記容器の前記側壁表面及び前記底壁表面に形成された前記各溝に沿って前記容器を開裂させ、患部である歯周組織上に被さるように前記培養骨膜を取り出すステップ。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の培養骨膜パッケージでは、容器の一部に接着した状態で培養骨膜が収納され、しかも容器内が保存液を満たした状態で密封されていることから、運搬時に培養骨膜が変形したり、折り重なったりすることが効果的に防止される。したがって、本発明の培養骨膜パッケージを用いることにより、治療現場において取扱いが容易な培養骨膜が得られる。また、運搬中における組織の損傷も防止されることから、その本来の機能を発揮することが可能な、治療効果に優れた培養骨膜が提供される。さらに、本発明の培養骨膜パッケージでは運搬中（或いは保存中）に培養骨膜の表裏が不明になることがないことから、移植時において培養骨膜の表裏を容易に判別できる。これによって、良好な治療効果を期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の第１の局面は培養骨膜パッケージに関し、以下の構成からなる。
カップ状部を有する容器と、前記カップ状部の内底面に接着した状態で前記容器内に収納されている培養骨膜と、を備え、前記カップ状部内に保存液を満たした状態で前記容器が密封されている、培養骨膜パッケージである。
以上の構成では培養骨膜が容器の一部に接着した状態にあることから、原則として、保存中（又は運搬中）に培養骨膜が変形したり折り重なったりすることはない。一方、保存液を充填していることによって、運搬中に外部から振動、衝撃が加わった場合の水流の発生が最小限に抑えられる。これによって、運搬中に培養骨膜が容器から剥離することを防止でき、同時に組織の損傷も抑えられる。このように、以上の構成の培養骨膜パッケージを利用することによって、その膜状組織を保持した状態で培養骨膜を治療現場へと提供することが可能となる。したがって、当該培養骨膜を用いた移植術では高い治療効果が望める。また、移植時における培養骨膜の取り扱いが容易となり、移植術が簡易化される。これによって一層の治療効果の向上が望めることとなる。
【０００８】
本発明の培養骨膜パッケージに使用される容器はカップ状部を備える。ここでのカップ状部とは、底壁と側壁とによって囲まれ且つ上方が開放された（上方の一部のみが開放されたものであってもよい）部分をいう。かかる条件を満たす限りにおいて底壁及び側壁の形状や大きさ等は特に限定されるものではない。カップ状部の具体的形状としては、培養皿の形状として一般に採用されている形状、即ち底壁の平面視形状が円形であり、略円柱状の内空間を有する形状を例示することができる。その他の具体例として、底壁の平面視形状が同じく円形であり、底壁から遠ざかるにつれて内空間の横断面積が漸増する形状（この場合には側壁が上方に向かって外側へとテーパーする）を挙げることができる。尚、底壁の平面視形状は円形に限られず、例えば楕円形、三角形、矩形などであってもよい。
【０００９】
本発明の一態様では、カップ状部の外縁部（上端部）に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分（以下、「液体保持部分」ともいう）を有する容器が使用される。このような容器を使用した場合には、後述するように、培養骨膜パッケージの調製段階において、他の容器（第２容器）を使用することなく培地交換を行うことが可能となる。
【００１０】
また、本発明の他の一態様では、カップ状部の外縁部に連続するフランジ部を備える容器が使用される。上記のように液体保持部分を有する容器が使用される場合においては、液体保持部分を介してカップ状部に連続するように当該フランジ部が形成される。即ち、カップ上部とフランジ部との間に液体保持部が位置することとなる。
フランジ部はカップ状部の外縁部（上端部）に連続して形成される。フランジ部は主として後述のシーリング（密封）を容易にすることを目的として備えられる。即ち、フランジ部を接着面として利用すれば容易にシーリングすることが可能となる。
【００１１】
容器の材質は特に限定されず、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーンなどをその例として挙げることができる。容器の表面にコーティングを施してもよい。このようなコーティングによって骨膜（骨膜細胞）の接着性及び／又は増殖性を向上させることができる。コーティング材料としてはコラーゲン（Ｉ型など）、ポリリジンを具体例として挙げることができる。
【００１２】
カップ状部の大きさは、その中に収納する培養骨膜の大きさや培養骨膜パッケージの使用目的などを考慮して定めることができる。例えば、歯周組織の再建に利用するための培養骨膜パッケージを構成する場合には、カップ状部の内底面の面積を約0.7cm2〜約100cm2程度、好ましくは約3.0cm2〜約40cm2程度、更に好ましくは約12cm2〜約20cm2程度に設定することができる。
【００１３】
容器内に収納される培養骨膜は、骨膜片をその中に含まれる細胞が増殖可能な条件で培養することによって得られる膜状の構造体である。本発明においてはかかる培養骨膜が、容器のカップ状部の内底面（底壁の表面）に接着した状態で容器内に収納されている。このような状態の培養骨膜は、採取した骨膜片を、本発明の培養骨膜パッケージに使用される容器のカップ状部内で培養することによって得ることができる。このようにして得られる培養骨膜はカップ状部の内底面に良好に接着したものとなる。
【００１４】
本発明の一態様では、容器のカップ状部の側壁表面に、縦方向に連なる二本の溝（以下「第１の溝及び第２の溝」という）が形成されるとともに、カップ状部の底壁表面にも当該二本の溝を繋げるようにして同様に溝（以下、「第３の溝」という）が形成される。このような態様の培養骨膜パッケージでは、使用時（移植時）にこれらの溝に沿って容器を開裂させることによって培養骨膜を容易に取り出すことができる。したがって、ピンセット等によって培養骨膜を剥離する操作が必要なくなることから、培養骨膜へのダメージを極力抑えることができる。また、移植部の直上において培養骨膜を取り出すこととすれば、膜状形態を保持した状態の培養骨膜で患部を直接被覆することが可能であるから、容器からの脱離後に改めて患部上にて培養骨膜を設置する作業が不要となる。
【００１５】
カップ状部の外側面側に第１の溝及び第２の溝を形成することが好ましい。同様に、カップ状部の外底面（裏面）側に第３の溝を形成することが好ましい。このようにカップ状部の外面側に各溝を形成すればカップ状部の内面を平坦な面とすることができることから、カップ状部壁面に対する培養骨膜の良好な接着を確保できる。
第１ないし第３の溝は、特別の道具ないし器具を使用することなく当該溝に沿って容器を開裂することができる態様（深さ、幅など）で形成されることが好ましい。具体的には例えば、単位長が約1mm〜約3mm、幅0.5mm〜約1mm、インターバル約0.5mm〜約2mmで、点線上に連なる溝とすることができる。或いは、幅約0.5mm〜約1mmで連続的に連なる溝とすることができる。尚、各溝の態様の選定においては容器の材質を考慮することが好ましい。
第１の溝と第２の溝が、容器のカップ状部の中心軸を基準として略対称となる位置に形成されていることが好ましい。このように両溝を形成すれば、カップ状部の中央で容器を開裂することができることから作業性が向上することは勿論のこと、開裂時に培養骨膜に加わる外力が左右にバランスがとれたものとなって培養骨膜を確実に取り出すことができ、同時に培養骨膜の変形や損傷を極力抑えることができる。
【００１６】
容器のカップ状部の底壁表面に、培養骨膜の基となる骨膜片が載置される領域であることを示す印が付されていることが好ましい。このような印を付すことによって、当該印をたよりに骨膜片の位置を把握することが可能となる。ここで、培養骨膜が形成された後の骨膜片には再生効果に寄与する活性の高い細胞はもはや存在していないと考えられ、このような骨膜変を培養骨膜とともに移植することは治療効果を下げることはあっても治療効果を高めることはないと予想される。したがって、培養骨膜を使用する前に骨膜片を除去することが好ましいところ、上記のような印を用いればこれをたよりに骨膜片を簡単に除去することができることから、使い勝手に優れた培養骨膜パッケージが構成されることとなる。尚、使用時における骨膜片の除去作業を省略するために、予め骨膜片が除去された状態として本発明の培養骨膜パッケージが構成されていてもよい。
【００１７】
上記の印は例えば、所望の色のインク、塗料、テープなどによって形成することができる。あるいは、一定領域を包囲するようにカップ状部の底壁表面に連続的又は断続的に連なる溝を形成し、この溝をここでの印として用いることもできる。このような溝からなる印を採用すれば、穿孔（パンチング）装置（器具）を用いて、当該溝に囲まれた領域のカップ状部底壁と骨膜片とを容易に除去することができる。
上記の印はカップ状部の中央領域に付されていることが好ましいが、その位置は特に限定されるものではない。
【００１８】
容器内に充填される保存液としては、本発明の培養骨膜パッケージを使用する時点まで培養骨膜の性状を保持することができるものが採用される。典型的には、培養骨膜の調製（培養）に使用される培地を保存液として使用することができる。
尚、例えば使用までの時間が比較的短いと予想される場合（即ち、保存液に積極的な生育ないし増殖作用が必要ないと考えられる場合）には、リン酸系緩衝液などや生理食塩水などを保存液として使用することもできる。
凍害防止剤（例えばグリセロールやDMSO）や保存剤（例えばアジ化ナトリウム（NaN3）や抗生物質）が添加された保存液を用いてもよい。このような保存液を使用すれば冷凍環境において保存或いは運搬可能な培養骨膜パッケージが構成される。
本発明ではカップ状部内に保存液を満たした状態で容器が密封されているが、密封操作上不可避的な気体のカップ状部内への混入があってもよい。
【００１９】
本発明の培養骨膜パッケージでは容器が密封されている。例えば、容器の開口部をシーリングすることで容器が密封されている。この場合には、少なくともカップ状部が密封されるようにシーリングされておればよく、したがってシーリングがカップ状部の開口部に行われていてもよい。尚、シーリングには樹脂製シート（フィルム）や、樹脂製シートの表面を金属コーティングしたシート（フィルム）など、医療分野又は食品分野などでシーリングに使用されている材料を用いることができる。
蓋（蓋体）によって容器の密封が行われていてもよい。例えばネジ式、ねじ込み式、押し込み式など、様々な機構の蓋を用いることができる。蓋は容器の一部として構成されていても、或いは容器とは別体として構成されていてもよい。
【００２０】
本発明の一態様では容器が複数のカップ状部を備え、各カップ状部にそれぞれ培養骨膜が収納される。このような態様においては、各カップ状部間に、隣接するカップ状部同士を切り離すための連続的又は断続的に連なる溝が形成されていることが好ましい。このような溝を形成することによって、使用時に各カップ状部を切り離すことが可能となり、使い勝手に優れたものとなるからである。このような態様の容器の例を図７に示す。図示した容器８０では、カップ状部８１が合計６箇所設けられ、各カップ状部８１の間には点線上の溝（切れ込み）８２が形成されている。
【００２１】
次に、本発明の第２の局面である、培養骨膜パッケージの調製方法を説明する。ここで開示する調製方法は、上述の培養骨膜パッケージを調製することに好適に利用できる。但し、上述の培養骨膜パッケージが、以下に説明する調製方法によって得られるものに限定されることを意図するものではない。
本発明の第２の局面は培養骨膜パッケージの調製方法に関し、その一態様は以下のステップを含むことを特徴とする。即ち、
a) カップ状部を有する第１容器を用意し、採取した骨膜片を前記カップ状部の内底面上に載置するステップ；
b)前記骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ前記骨膜片が剥離しないように連続的又は定期的に培地交換をしつつ培養するステップ；
c)培養後、前記カップ状部に保存液を満たした状態で前記第１容器を密封するステッププである。
ステップa)では採取した骨膜片が第１容器内の所定の位置、即ちカップ状部の内底面上に載置される。骨膜は適当なドナーから採取されるが、免疫拒絶の問題を考慮すれば培養骨膜パッケージを使用する対象（患者）自身から骨膜を採取することが好ましい。ここで、「骨膜」とは皮質骨の外周を覆う結合組織であって、その構成は大きく内層と外層とに分かれる。内層は多分化能を有する細胞からなる細胞層が存在し、外層はコラーゲン繊維と線維芽細胞からなる。
骨膜は、例えば局所麻酔下において観血的に、長幹骨、顎骨、頭蓋骨などから採取することができる。採取した骨膜は、必要に応じて適当な大きさに裁断された後、第１容器内の所定位置に載置される。骨側であった面が下になるように（即ち接着面となるように）骨膜を載置することが好ましい。即ち、骨膜の内層側がカップ状部の内底面に接着するように載置し、培養に供することが好ましい。骨膜細胞のより良好な増殖が期待できるからである。尚、採取した骨膜を培養前に抗生剤で処理してもよい。
【００２２】
ステップa)の後、第１容器内に培地が添加され、骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で、且つ前記骨膜片が剥離しないように連続的又は定期的に培地交換をしつつ培養が行われる（ステップb））。最初に培地を添加する前に、カップ状部の内底面に骨膜片が接着している状態を確認することが好ましい。培養条件は骨膜片に含まれる細胞（骨膜細胞）が増殖できる限り特に限定されない。このような条件で培養することにより、骨膜細胞が増殖し、それに伴い細胞外基質（細胞外マトリックス）が産生される。その結果、移植する際に必要とされる強度、特に縫合に耐え得る強度を有した膜状の構造体（培養骨膜）が形成される。尚、使用できる培地としては、市販のMedium 199（Gibco社製）に血清を添加したものを例示できる。血清としてはウシ胎児血清(FBS)やヒト血清などを用いることができる。前者は多くのメーカーによって市販されており、容易に入手することが可能である。他方、ヒト血清の場合には、本発明の培養骨膜パッケージを使用する対象（即ち培養骨膜のレシピエント）自身から採取したものを好適に使用することができる。
骨膜細胞の一つである多分化能を有する細胞が増殖でき、かつ骨系細胞への分化が促される培養条件を採用することもできる。このような培養条件を培養期間の一部（例えば培養後期）において採用してもよい。このような培養条件としては例えば、血清、L−アスコルビン酸を含む培地を用いる条件を挙げることができる。
【００２３】
培養時間は使用する骨膜片の状態などによって異なるが、例えば約１週間〜約２ヶ月間培養することにより細胞外基質が層状を呈した構造体（培養骨膜）が得られる。得られる膜状の構造体が薄すぎる場合には十分な強度が得られないことから、好ましくは0.3mm以上の厚み（例えば0.3mm〜1mm）が得られるように所定時間培養を継続することが好ましい。
【００２４】
培養中は連続的又は定期的に培地交換が実施される。この培地交換は骨膜片（培養骨膜形成後には、骨膜片及び培養骨膜）が剥離しないように穏やかな条件で行われる。仮に骨膜片が収納されるカップ状部から直接培地を除去し、そして新しい培地を同様にカップ状部に直接注入すれば、培地交換に伴う水流によって骨膜片が剥離するおそれがある。そこで本発明では例えば以下の手順で培地交換が実施される。まず、第１容器のカップ状部を収容可能な形状及び大きさの凹部を備える箱状の第２容器（典型的には上方が開放されている）を用意し（ステップb-1））、この第２容器の凹部内に第１容器のカップ状部をセットする（ステップb-2)。第１容器のカップ状部をセットしたときに当該カップ状部が第２容器の凹部内に完全に収容されるように、第１容器のカップ状部と第２容器の凹部の形状、大きさ等を設計することが好ましい。また、第１容器のカップ状部をセットしたときに当該カップ状部と第２容器の凹部との間に実質的な間隙が存在しないように、第１容器のカップ状部と第２容器の凹部の形状、大きさ等を設計することが好ましい。以上の条件を満たすことによって後述の培地交換を一層効率的に行うことができ、また培地交換の際に第１容器が振動したり或いは第２容器の凹部から脱落したりすることを防止できる。
第２容器として複数の凹部を備えるものを用意し、各凹部内にそれぞれ第１容器をセットすることが好ましい（この場合には第２容器の凹部の数と同数の第１容器が用意される）。このようにすれば同時に多数の骨膜片を培養することができる。即ち、培養効率が向上する。
【００２５】
以上のようにして第２容器の凹部に第１容器をセットした後、骨膜片に含有される細胞が増殖する条件下で定期的に又は連続的に培地交換をしつつ培養が行われる。定期的な培地交換の場合にはまず、第２容器において凹部以外（即ち、第１容器が設置される領域以外）の領域から第２容器内の培地を除去する。この操作によって原則的には、第１容器内を除く第２容器内の領域に存在していた培地が全て取り除かれる。もちろん、第１容器内のみならず、他の領域に存在していた培地の一部が残存するような条件とすることもできるが、培地交換の効果を高めるためにはできるだけ多くの培地が入れ替わるように残存する培地量は極力少ないことが好ましい。
培地の除去操作に続いて、第２容器内に新しい培地が注入される。尚、第２容器内の培地を完全に除去する前に、新しい培地の注入を開始することもできる。上記除去操作の場合と同様に、培地の注入操作も第２容器の凹部以外の領域で行われる。以上のように第２容器の凹部以外の領域で培地の除去及び注入の操作を行うことによって、第１容器内に大きな水流を生じさせることなく培地交換を実施することが可能となる。したがって、第１容器内の培養骨膜（及び骨膜片）に対する培地交換による影響は極めて小さく、培地交換によって培養骨膜が剥離したり、損傷したりすることが効果的に防止される。
培地交換の頻度としては1日1回、2日に1回、又は3日に1回を例示できるが、これらに限定されるものではない。
尚、培地の除去及び注入は例えば、ピペットやチューブを利用して行われる。
【００２６】
培地交換を連続的に行う場合には、第２容器の一領域から培地を連続的に排出するとともに、当該領域と異なる領域から第２容器内へと新しい培地を連続的に導入する。典型的には、第２容器の一端側から容器内の培地を排出し、第２容器の他端側から容器内へと培地を導入する。第２容器内に仕切りを設けることによって、所定のルートに沿った水流が培地交換に伴い生ずるようにすることもできる。
連続的な培地交換を行う場合の培地交換速度（頻度）としては、1分あたり第２容器の容積の1/1〜1/600、1/5〜1/300、又は1/10〜1/120に相当する培地が導入及び排出される速度を例示できるが、これらに限定されるものではない。
典型的には培養ステップの全体を通して培地交換が継続して実施されるが、培養ステップ中に培地交換が実施されていない期間があってもよい。このような場合とは例えば、連続的な培地交換をした後、所定時間の休止を挟んで再び連続的な培地交換を行うような場合である。
【００２７】
第１容器として、カップ状部の外縁部に連続し且つ上方に液体を保持可能な部分（液体保持部分）を有するものを採用することにより、第２容器を使用することなく培地交換を実施することもできる。このような容器を使用する場合の培地交換は、第１容器の液体保持部分に保持された培地を除去した後、液体保持部分に新しい培地を注入すること（ステップb-5)）によって行われる。このような培地交換は定期的に実施される。培地交換の頻度としては1日1回、2日に1回、又は3日に1回を例示できるが、これらに限定されるものではない。例えば図８に示す形態の容器をここでの第１容器として使用することができる。図示した容器９０では、カップ状部９１とフランジ部９２との間に、液体保持部分に相当する段差９３が設けられ、この段差９３部分を利用して培地交換が行われる。これによって、カップ状部９１内へ培地が直接流入（及び流出）することがなく、カップ状部９１内で培養される培養骨膜が剥離したり、ダメージを受けたりすることを効果的に防止できる。
【００２８】
培養ステップ（定期的な培地交換による場合、及び連続的な培地交換による場合の両者を含む）の全体を通して同一組成の培地が使用される必要はない。例えば培養ステップの初期と後期とで異なる組成の培地を使用してもよい。
【００２９】
培養ステップを、連続的、断続的、定期的、或いは間欠的な振動を加えながら実施してもよい。
【００３０】
培養ステップの後に、カップ状部に保存液を満たした状態で第１容器を密封するステップ（ステップc））が実施される。具体的には例えば、培養後の第１容器を第２容器から取り出し、次に第１容器内に保存液を満たし、その後に密封する。保存液としては培養ステップにおいて使用した培地や、リン酸系緩衝液、生理食塩水などを使用することができる。保存液として凍害防止剤（例えばグリセロールやDMSO）や保存剤（例えばアジ化ナトリウム（NaN3）や抗生物質）が添加されたものを用いてもよい。このような保存液を使用すれば冷凍環境において保存或いは運搬可能な培養骨膜パッケージが調製される。保存液として培地を使用する場合、典型的には、培養後の第１容器へ培地（保存液）を補充するようにして第１容器内を培地（保存液）で満たし、その後に密封する。
密封操作は、樹脂製シート（フィルム）や、樹脂製シートの表面を金属コーティングしたシート（フィルム）などを用いて容器の開口部（或いはカップ状部の開口部）をシーリングすることによって行うことができる。シーリングは常法で行うことができ、例えば医薬分野や食品分野などで公知の種々のシーリング方法を採用することができる。
或いは、ネジ式、ねじ込み式、押し込み式など適当な蓋を用いて容器の密封を行ってもよい。蓋は容器の一部として構成されていても、或いは容器とは別体として構成されていてもよい。
尚、以上の密封操作を無菌的に行うことが好ましい。
【００３１】
ステップc)の前に、培養ステップによって得られる膜状の構造体から、培養に使用した骨膜片を取り除くステップ（ステップb-6））を行うこともできる。このステップを実施することにより、骨膜片を含まない培養骨膜を収納した培養骨膜パッケージが調製されることとなる。かかる培養骨膜パッケージではその使用時に骨膜片を除去する操作が不要となる。このように、当該ステップを行うこととすれば、使用者の操作負担が軽減される培養骨膜パッケージを提供することができる。
【００３２】
以上の各操作（一部の操作のみ、或いは全操作であってもよい）を自動化することもできる。
【００３３】
以上、本発明の第２の局面について説明したが、特に言及しない事項については第１の局面における説明が援用される。したがって例えば、縦方向に連なる二本の溝がカップ状部の側壁表面に形成されている第１容器を使用可能なことや、骨膜片が載置される領域であることを示す印が第１容器のカップ状部の底壁表面に付されていてもよいこと等は、第２の局面においても当然に考慮される。
【００３４】
次に、歯周組織の再建を目的とした移植術の場合を例に採って、本発明の培養骨膜パッケージの使用方法を説明する。
最初に培養骨膜パッケージを開封し、保存液を除去する。全部の保存液を除去するのではなく、一部の保存液のみを除去してもよい（例えば、移植時ないし移植直後の乾燥を防止する目的で保存液の一部を残存させる）。保存液の除去後、培養骨膜の洗浄を行ってもよい。このような洗浄は、培養骨膜に損傷を与えず、また培養骨膜が容器から剥離しない条件の下で行われることが好ましい。例えば、容器内に洗浄液を穏やかに注入し、その後、注入した洗浄液を穏やかに除去する。以上のような洗浄を複数回行ってもよい。洗浄液としてはリン酸系緩衝液や生理食塩水などを使用することができる。
続いて、骨膜片を除去する。但し、培養骨膜パッケージの状態において骨膜片が除去済みの場合には当該操作は省略される。この場合に限らず、当該除去操作を省略して以下の操作を行うこともできる。骨膜片の位置を示す印が容器の底壁に付されている場合には、当該印を利用して骨膜片を除去することができる。好ましくは、骨膜片の除去と同時に容器カップ状部の底壁の一部を打ち抜く。上述のように当該印を溝によって形成しておけば、この打ち抜き操作を容易に実施することができる。尚、カップ状部の底壁を打ち抜くのに十分なせん断力の器具を利用することが可能な場合には、上記のような溝によらなくとも、骨膜片の除去及びカップ状部底壁の打ち抜きを行うこともできる。
次に、容器より培養骨膜を取り出す。容器カップ状部の側壁及び底壁に溝が形成されている場合には、当該溝に沿って容器を開裂させて取り出すことができる。このような方法によればピンセット等、他の器具を使用しなくとも培養骨膜を取り出すことができ、作業性が向上する。また、ピンセット等によって剥離して取り出す場合に問題となる、培養骨膜の損傷や変形などを効果的に防止できる。加えて、患部（移植部）の直上で培養骨膜を取り出し、膜状形態を保持した状態の培養骨膜を患部に直接移植することが可能となり、容器からの脱離後に改めて患部上にて培養骨膜を設置する作業が不要となる。
取り出した培養骨膜は、患部（歯周組織上）に被さるように載置される。骨膜片を除去することによって一部に孔を有する培養骨膜となっている場合には、当該孔に歯冠を通し（くぐらせ）、そして培養骨膜が患部（歯周組織上）に被さるように載置することが好ましい。培養骨膜を容易かつ確実に患部に移植できるからである。
骨膜片を除去する際に容器カップ状部の底壁に孔を形成した場合には、培養骨膜の取り出しと、取り出した培養骨膜の患部への移植とを同時に行うことができる。即ち、容器カップ状部の底壁に形成された孔に歯冠を通すことで歯牙上に容器を設置した状態で容器を開裂し、これによって培養骨膜を取り出せば、取り出された培養骨膜は時間的な間隔を実質的に置かずに患部（歯周組織上）へと載置される。このような移植術によれば、作業性が一段と向上し、併せてより確実な移植が可能となる。
【実施例１】
【００３５】
[培養骨膜パッケージの調製]
培養骨膜パッケージに使用される容器（以下、「第１容器」ともいう）１を図１に示す。この容器はポリスチレン製であって、その内面は一様にコラーゲンIコートされている。図示したように、容器１はカップ状部１１及びその外縁部（上端部）に連続するフランジ部１２からなる。カップ状部１１はその底壁１１ａが直径約4cmの円形であって、底壁１１ａから遠ざかるにつれて内空間の横断面積が漸増する形状を有する。カップ状部側壁１１ｂの外側表面には縦方向に連なる二本の溝（以下、「開裂用第１溝及び第２溝」という）２１、２２が形成されている。これら二つの溝２１、２２は、第１容器１のカップ状部１１の中心軸を基準として対称となる位置に形成されている。一方、カップ状部底壁１１ａの外側表面（裏面）には当該開裂用第１溝及び第２溝を繋ぐように一筋の溝（以下、「開裂用第３溝」という）２３が形成されている。カップ状部底壁１１ａの外側表面にはまた、その中央領域を円形に包囲する連続的な溝（以下、「骨膜位置表示溝」という）２４が形成されている。
【００３６】
以上の構成の第１容器１を利用して骨膜の培養を行う。まず、患者を局所麻酔した後、手術用のメスを用いて歯肉を切開し、下顎骨より約10cm2の骨膜を採取する。採取した骨膜を適当な大きさ（例えば約0.1cm2〜約1cm2）に裁断した後、第１容器１へと移す。このとき、第１容器１の底壁に形成された骨膜位置表示溝２４に包囲された領域内に骨膜が載置されるようにする。また、内層側（骨側）が下になるように骨膜を載置する。
本実施例では、以上の操作によって、同一患者より採取した骨膜片を載置した第１容器１を合計６個用意する。
【００３７】
次に、各第１容器１を第２容器２にセットする（図２を参照）。第２容器２は、ほぼ等間隔に形成された６個の凹部３０を有する。これら各凹部３０は、その中に第１容器１を実質的な隙間無く嵌め込むことができる形状及び大きさ（深さ）で形成されている。図３では、対応する各凹部３０に各第１容器１をセットした状態の断面図が示される。図中の符号５は骨膜片を示す。図３に示したように、この実施例では第１容器１のカップ状部１１は対応する凹部３０内に完全に収容され、一方で第１容器１の縁部１２は対応する凹部３０の縁に係合する。このような態様で第１容器１をセットすることによって、後述の培地交換の際、第１容器１の位置がずれたり、第１容器１が凹部３０から外れたりすることが防止される。尚、縁部１２を利用すれば第１容器１のセット及び取り出しを容易に行える。
【００３８】
第１容器１をセットした後、約37℃に保温したCO2インキュベータ内に第２容器２を移し、所定時間（例えば約15分〜45分）静置する。その後、CO2インキュベータより第２容器２を取り出し、骨膜片５が第１容器カップ状部１１の底壁表面に接着したのを確認した後、第２容器２において凹部３０が形成されていない領域（例えば図３において矢印A示す領域）より、スポイトを用いて第２容器２内に培地をゆっくりと注ぐ。尚、第２容器２の容積の例えば約70%〜約90%に相当する量の培地を使用する。但し、培地量はここに示した範囲に限定されるものではなく、少なくとも全ての第１容器１内が培地で満たされる限度において、より少量の培地量であってもよく、一方で培養操作及び培地交換操作に支障のない限度において、より多量の培地量であってもよい。
培地としては、市販のMedium 199（Gibco社製）に血清、Ｌ−アスコルビン酸、及びAntibiotic-Antimycotic（Invitrogen社製）を添加したもの（例えば、順に10％、25μg/ml、及び1％(v/v)となるように添加したもの）を使用することができる。血清としては牛胎児血清(FBS)やヒト血清などを用いることができる。
【００３９】
第１容器表面への骨膜の接着を促すために接着性材料を用いることができる。接着性材料としては例えばフィブリン糊を用いることができる。接着性材料を用いる場合には、(1)第１容器において骨膜を載置する領域に予め接着性材料を滴下、塗布などしておいた後に骨膜を載置する方法や、(2)第１容器の所定の位置に骨膜を載置した後に、骨膜の上から接着性材料を滴下、塗布などすることによって骨膜表面を接着性材料によってコートする方法などによって、第１容器表面への骨膜の接着が強化される。接着性材料を用いる代わりに、或いはこれに併せて、載置した骨膜上にカバーガラスを載せることなどによって骨膜に対して第１容器方向への力を加え、これによって骨膜−第１容器間の接着力の強化を図ることもできる。カバーガラス等を使用した場合には、第１容器表面へ骨膜が良好に接着した後（培養条件によっても異なるが例えば、培養開始から約１週間〜約２週間経過した後）にカバーガラス等の回収を行うことができる。
以上のような手段によって骨膜−第１容器間の接着の強化を図る場合には、上述したような、培地注入前に所定時間静置する操作を省略してもよい。
【００４０】
続いて第２容器２を再びCO2インキュベータ内に移し、約37℃、約5％CO2の条件で培養を行う。培養中は定期的に培地交換を行う。具体的には培養初期は3日に1回培地交換を行い、細胞が増殖するのを肉眼で確認できるようになったところで培地交換の頻度を１日に１回とする。培地交換は、まず、培地を注ぐ操作と同様に、第２容器２において凹部３０が形成されていない領域より第２容器２内の培地をゆっくりと吸引し、これによって第１容器１内以外の領域に存在する培地を除去する。続いて、37℃に保温しておいた培地を、上記と同様の操作で第２容器２内にゆっくりと注ぎ足す。この一連の操作からなる培地交換を行った後、再びCO2インキュベータ内で、約37℃、約5％CO2の条件で培養を継続する。
【００４１】
以上のようにして培養することによって、骨膜片５の周囲に膜状の構造物（培養骨膜）が次第に形成されていく。尚、例えば、第１容器１の底壁表面を完全に被覆する程度の大きさの培養骨膜が形成されるまで培養を継続する。使用する骨膜片の状態や培地の組成によって当然異なるものであるが、このような大きさの培養骨膜が形成されるまでには例えば約１週間〜約２ケ月の期間を要すると予想される。
【００４２】
培養終了後、各第１容器１を第２容器２より取り出す。そして、培養に使用した培地と同一組成の培地（保存液）を第１容器１内に満たし、空気を含まないようにして第１容器１のカップ状部１１を密封包装（シーリング）する（図４を参照）。以上の操作によって、その内壁に接着した状態で培養骨膜６を内包し、かつ培地が充填された培養骨膜パッケージ６０が得られる。培養骨膜パッケージ６０は使用時（運搬時を含む）まで、所定の条件下で保存される。好ましくは遮光及び低温条件下で保存される。培地（保存液）中に凍害防止剤を添加すれば凍結保存も可能である。凍結保存によれば、品質を保持した状態でより長期に保存することが可能となる。
【実施例２】
【００４３】
[培養骨膜パッケージを使用した移植術]
実施例１で得られた培養骨膜パッケージ６０を開封し、第１容器１をゆっくりと傾けて容器内の保存液を廃棄する。次に、図５に示すように、第１容器のカップ状部底壁１１ａに形成された溝２４に沿うようにして打ち抜くことが可能な穿孔装置４０を用いて、骨膜片５部分を除去するとともに、カップ状部底壁１１ａの一部を打ち抜く。このような操作の後、図６(a)に示すように、患部（歯周組織）の直上で第１容器１を開裂する。第１容器１の開裂は、カップ状部１１の側壁及び底壁に形成された溝２１、２２、及び２３を利用して行われる。具体的には、カップ状部１１の側面に形成された二つの溝２１、２２から最も離れた２点においてそれぞれ上下から挟むように第１容器を持ち、そして、カップ状部１１の上方から下方に向かって左右に開裂するように力を加える。以上のように第１容器１を開裂することによって、第１容器１のカップ状部底壁１１ａの表面より培養骨膜６が剥離する（図６(a)）。このとき、培養骨膜６に形成された孔６ａに歯冠７１が通るように培養骨膜６の位置を調節する。このようにすることで、剥離された培養骨膜６は歯周組織を被覆すると同時にその中央領域に形成された孔６ａによって歯牙７０に保持されることとなる（図６(b)）。例えば、第１容器１を開裂するに先立って、第１容器１の底壁に形成された孔に歯冠７１を通しておき（第１容器１が歯牙７０に一時的に保持された状態になる）、この状態で上記の開裂操作を行う。このような手順によれば確実に、上記のごとく歯牙７０に保持された状態となるように培養骨膜６を移植することができる。
最後に、移植部への生着及び移植部での長期間の保持を可能とするために、設置した培養骨膜６の周縁部を欠損部周囲の組織に縫合する。尚、培養骨膜６を覆うように、従来のGTR法などで利用されているコラーゲン膜、ゴアテックス膜などを載置してもよい。このようにすれば組織欠損部への上皮組織等の侵入をより確実に防止することができ、一層高い歯周組織再生効果を期待できる。
【００４４】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明よれば、歯周組織や骨組織の再建に利用可能な培養骨膜パッケージが提供される。本発明の培養骨膜パッケージは、歯周組織、骨組織、或いは軟骨組織の修復、再生が必要とされる各種の分野に適用することができるものである。例えば、歯周病等による歯槽骨の欠損部における歯槽骨、歯周組織の再生に適用することができる。また、高度な骨吸収が認められる顎堤に人工歯根の植立を行う場合の骨増生に適用することができる。更には、外傷、各種骨疾患により生ずる骨欠損部における骨組織の再生、骨の補強又は補填に適用することができる。本発明の培養骨膜パッケージでは、その中に収納される培養骨膜がその形状及び品質を保存中或いは運搬中においても高度に維持できる状態にあり、治療現場において取扱いが容易で、かつ高い治療効果も期待できる培養骨膜を提供できるものとなる。また、本発明の一態様によれば、特に歯周組織の再建に好適な使用形態を実現できる培養骨膜パッケージが提供される。かかる培養骨膜パッケージを利用すれば、極めて作業性に優れた移植術を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、本発明の一態様において使用される容器（第１容器１）を示す斜視図である。
【図２】図２は、第１容器１を第２容器２にセットした状態を示す斜視図である。
【図３】図３は、第１容器１を第２容器２にセットした状態を示す断面図である。
【図４】図４は、本発明の一実施例である培養骨膜パッケージ６０を示す断面図である。
【図５】図５は、培養骨膜パッケージ６０を使用する際における、骨膜片５を除去する操作を示す図である。
【図６】図６は、培養骨膜６の移植操作を示す図であり、(a)では第１容器１より培養骨膜６を取り出した直後の状態、(b)では取り出した培養骨膜６を歯周組織７５上に移植した状態がそれぞれ示される。
【図７】図７は、本発明の培養骨膜パッケージに使用可能な容器の一例を示す図である。
【図８】図８は、本発明の培養骨膜パッケージに使用可能な容器の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
１：第１容器、２：第２容器、５：骨膜片、６：培養骨膜、１１：第１容器カップ状部、２１：開裂用第１溝、２２：開裂用第２溝、２３：開裂用第３溝、２４：骨膜位置表示溝、３０：第２容器凹部、６０：培養骨膜パッケージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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