(57)【要約】【課題】  数多く見出されているトランスポーターの細胞膜輸送活性を網羅的に測定するシステム、具体的には新薬候補化合物等の被験物質がトランスポーターのいずれによって認識され、基質として輸送されるかを、ハイスループットで効率的にスクリーニングするためのトランスポーター活性プロテインアレイの開発や、かかるトランスポーター活性プロテインアレイを用いた被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】  薬物の生体膜輸送に関与することが明らかなトランスポーターや、現在のところ機能は不明であるものの薬物の生体膜輸送に関与する可能性のあるトランスポーターの遺伝子を、アデノウイルス発現ベクターに組み込み、アレイ上に配列した同一宿主細胞にそれぞれ導入して、各種トランスポーターを発現する細胞群からなるトランスポーター活性プロテインアレイを作製し、被験物質が各トランスポーターに対してどの程度の認識を受け、且つ基質として取り込み又は排出されるかといった定量的なデータを得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるトランスポーターを発現する細胞が基体上に複数配列されていることを特徴とするトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項２】
被験物質を輸送するトランスポーターを同定するために用いられることを特徴とする請求項１記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項３】
異なるトランスポーターを発現する細胞が、トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを感染させることによりトランスポーターを発現する細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項４】
トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを感染させることによりトランスポーターを発現する細胞が、同一の宿主細胞に由来する細胞であることを特徴とする請求項３記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項５】
異なるトランスポーターを発現する細胞が、７０種類以上の異なるトランスポーターを発現する細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項６】
異なるトランスポーターを発現する細胞が、トランスポーターに加えて被験物質を発現する細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項７】
発現ベクターが、さらにマーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項８】
マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項７記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項９】
発現ベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項３〜８のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項１０】
トランスポーターが、薬物動態に関連するトランスポーターであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項１１】
薬物動態に関連するトランスポーターとして、少なくとも有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、及びペプチドトランスポーターを含むことを特徴とする請求項１０記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項１２】
基体が、培養容器であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイを用いることを特徴とする被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法。
【請求項１４】
各細胞への被験物質の取込みの程度を検出又は取込み量を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定することを特徴とする請求項１３記載の被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法。
【請求項１５】
各細胞からの被験物質の排出の程度を検出又は排出量を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定することを特徴とする請求項１３記載の被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験化合物を認識するトランスポーターの同定用に有利に用いることができるトランスポーター活性プロテインアレイや、かかるトランスポーター活性プロテインアレイを用いて被験物質を認識するトランスポーターをスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内外の物質輸送を行う膜タンパク質等はトランスポーターと呼ばれ、脂質二重膜中に埋め込まれているトランスポーターに特定の分子が結合すると、コンフォメーションが変化して物質が取込みあるいは排出輸送されることが知られている。近年、かかるトランスポーター、例えば有機アニオン性物質を輸送するＯＡＴ１等の有機アニオントランスポーター、有機カチオン性物質を輸送するＯＣＴ１等の有機カチオントランスポーター、ペプチド性物質を輸送するＰＥＰＴ１等のペプチドトランスポーターなどの遺伝子が相次いで単離・同定されている。これらトランスポーター遺伝子は、全身の正常組織・臓器に偏在しているものもあるが、腎臓、肝臓、脳などといった特定の組織・臓器に局在するものも知られている。例えば、生体異物や薬物の代謝および体外排出に関して重要な役割を果たしている肝臓や腎臓の肝細胞や尿細管細胞に局在するトランスポーターにより、有機アニオン性物質が側底膜を介して肝臓や腎臓中に取り込まれたり、また細胞内代謝により産生された有機アニオン性物質が排出される。表１〜３に、従来報告されているトランスポーターの種類、名称、遺伝子バンクにおけるアクセッションナンバー、報告文献名、組織分布、輸送する基質の一覧表を示す。
【０００３】
【表１】
2005102627.tif 000002
【０００４】
【表２】
2005102627.tif 000003
【０００５】
【表３】
2005102627.tif 000004
【０００６】
新薬開発において、薬物の体内動態を規定する因子となるトランスポーターの内いずれの基質となり輸送されるかという情報は、薬物の選択的な組織移行及び副作用軽減を達成するために極めて重要である。また、腎疾患や肝疾患を持つ患者に投与されることの多い薬物も存在するが、そのような薬物の場合、その排泄経路を肝臓あるいは腎臓のいずれに設計するかは、新薬開発の戦略上非常に重要な意味を持つ。これまでに特異的な組織に発現し、薬物の消化管吸収、臓器分布や肝／腎排泄に関わるトランスポーターが同定・単離され、それぞれのトランスポーターの発現系を用いた輸送活性の測定系が個々に確立されてきている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【０００７】
その他、ＤＮＡの配列情報等を効率的に解析する技術として、遺伝子の一次配列情報を基にしたＤＮＡチップやＤＮＡアレイが、生理条件の変動や病態時、あるいは特定の薬物服用時に変化する遺伝子発現のマスプロファイルを得る強力なツールとして利用され始めている（例えば、特許文献３参照。）。また、タンパク質レベルでの機能評価をチップあるいはアレイを用いたハイスループットで行うマススクリーニング系としては、一部の特定のタンパク質に対して、同時多検体の化合物の反応性をスクリーニングするシステムが、ベンチャー企業を中心に開発されている（例えば、特許文献４参照。）。また、複数の異なるタンパク質（例えば、単一のタンパク質ファミリーの異なるメンバー）が、基板表面上の１つ以上の有機薄膜上に固定されたプロテインアレイ（例えば、特許文献５参照。）や、９６ウェルのマイクロプレートを使用し、１つのウェルの中で最大１００種類のタンパク質、ペプチド等の同時定量ができる多項目同時タンパク質定量システム（例えば、非特許文献１参照。）も開発されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１１２７６９号公報
【特許文献２】特開平９−２３４０８０号公報
【特許文献３】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献４】特表２００２−５３２４８７号公報
【特許文献５】特表２００２−５２０６１８号公報
【非特許文献１】バイオラッド（BIO-RAD）パンフレット“Bio-Plex Array System”
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
創薬の初期の段階では薬理活性の強弱に重点がおかれている傾向がある。このため、薬理活性が強いだけで体内動態の不適切な化合物が開発候補にあげられ、前臨床や臨床試験で多くの化合物がドロップアウトしてしまう。薬物が真に効くためには、薬理活性が強いだけでは不十分で、標的部位に必要な時間、必要な量が存在しなければならない。このため薬効評価と並行して体内動態の評価を行い、これらを統合して候補化合物を選定していく必要がある。
【００１０】
薬物の体内動態の評価には、吸収・分布・排泄などの移行特性と薬物代謝特性の評価が不可欠である。薬物の吸収・分布・排泄などの移行過程には各組織での細胞膜透過機構が含まれており、近年この機構に様々なトランスポーターが関与する事が明らかになってきた。一般に、薬物は１９５０年に提唱されたｐＨ分配仮説に従い、単純拡散により細胞膜を透過すると考えられて来た。しかし、１９９０年代前半の生体膜輸送に関する研究技術の進歩によって、小腸、腎臓、肝臓、脳、胎盤における薬物の細胞内取込みや細胞外排出に本来生体物質の膜輸送に働くトランスポーターが関与する事が分子レベルで実証され、薬物の細胞膜輸送におけるトランスポーターの重要性が強く意識されるようになってきた。それにもかかわらず、トランスポーターを介した細胞膜輸送を効率的に評価するシステムが未開発であり、基礎研究で実証されたトランスポーターの重要性が創薬の現場で十分に活かしきれていない。これに対して、もう一つの薬物の体内動態を制御する因子である薬物代謝特性を評価する方法としてヒト肝ミクロソームやヒト肝細胞、酵素発現系を用いた代謝安定性試験、相互作用試験はほぼ確立してきている。このため、トランスポーターを介した細胞膜輸送を効率的に評価するシステムの開発が急務である。
【００１１】
体循環系を介してネットワークを構築する各臓器に発現するトランスポーター群は、薬物動態制御因子の一つと考えられており、その分子認識・輸送の多様性によって生体に「必要なもの」と「不必要なもの」を選別輸送する機能を有している。この生体機構の詳細を明らかにし制御することが出来れば、本来生体異物である薬物の薬効を最大限に発揮させ、毒性を最小限にする道が拓かれる。これまで本発明者らは、薬物動態に関わる多様なトランスポーター群の分子同定を行い、特に有機アニオン系薬物、有機カチオン系薬物、ペプチド系薬物あるいはリン酸系薬物に対して、生体に備わった多様な物質輸送、蓄積、排出機構について小腸、腎臓、肝臓、脳などの特定臓器に焦点を当て、臓器レベル、細胞レベル、オルガネラレベル、分子レベル、遺伝子レベルで解明してきた。
【００１２】
その成果として、オリゴペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１や、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ１や、有機アニオントランスポーターＮＰＴ１、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＡＥ２、ＯＡＴ１や、有機カチオントランスポーターＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等のトランスポーターのｃＤＮＡをクローニングするとともに、これらトランスポーターのインビトロ発現系を作製して詳細な分子構造認識や輸送特性の解析を行い、また一方で、各トランスポーターに対する特異抗体を作製して組織分布および細胞内局在性を明らかにし、更に遺伝子欠損動物（遺伝的にカルニチントランスポーターＯＣＴＮ２を欠損するＪＶＳマウス、ＭＤＲ１を欠損するノックアウトマウス、ＭＲＰ２を欠損するＥＨＢＲ等）を用いた薬物体内動態の生理学的薬物速度論解析を駆使して、インビボにおける各トランスポーターの寄与評価を行ってきた。
【００１３】
ヒトやマウスのゲノム情報が利用可能となった現在、これらの情報を利用した創薬研究の革命的な進展が期待されている。しかしながら、ゲノム情報から新薬の分子ターゲットを絞り込むことができるようになった一方で、従来から指摘されているように特異性が高く低濃度で有効な薬剤が開発されるほど、脂溶性が高く溶解性や吸収性が悪い場合がある。或いはまた、食物や他の薬物との相互作用、血液中や組織中濃度、薬効の個人間変動等の動態特性上の問題のために、薬理活性で優れた有効性が示されていているにも関わらず、実際に薬としての開発を断念せざるを得ないという現実がある。そこで、本発明者らは、ポストゲノムの新しい創薬の技術基盤として、薬物の体内動態に関わる生体の多様なトランスポーター群の分子構造認識性の定量的な情報を体系的にまとめ、さらに各トランスポーターの発現の組織分布と関連させて理解し創薬に生かすための解析システムを構築することとした。このシステムを新薬のドラックデザインやスクリーニングの現場に導入することによって、優れた体内動態特性を持ち、かつ特異的な組織移行性を兼ね備えた理想的な新薬を開発することが可能になる。参考までに、図１に、種々の組織における薬物のトランスポーターを示す。
【００１４】
また、新規候補化合物がどのようなトランスポーターによって認識され、基質として輸送されるかを、ハイスループットで効率的にスクリーニングするためのツールが必要とされており、現在いくつかのトランスポーターに関しては薬物の細胞膜輸送活性を評価するための発現系が個々に作製されてきている。しかしながら、これまでに３９ファミリー、約２３０種類という膨大な数のトランスポーターの存在が確認されていることから、新薬候補化合物の輸送に関わるトランスポーターを順次スクリーニングするといった既存の手法では多大な労力が必要となり、薬物の体内動態制御に基づく新薬開発の妨げとなっていた。また、薬物輸送にかかわるトランスポーターは今後次々と発見されると予想されることから、新薬候補化合物を認識するトランスポーターのスクリーニングは、今後ますます困難になると考えられる。本発明の課題は、数多く見出されているトランスポーターの細胞膜輸送活性を網羅的に測定するシステム、具体的には新薬候補化合物等の被験物質がトランスポーターのいずれによって認識され、基質として輸送されるかを、ハイスループットで効率的にスクリーニングするためのトランスポーター活性プロテインアレイの開発や、かかるトランスポーター活性プロテインアレイを用いた被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、トランスポーターが生体膜を介した内外の物質移動という多相系の移動を触媒するため、例えば液相で反応が進行する薬物代謝酵素群等に比べて活性測定のハイスループット系の構築が極めて困難であることに着目した。検討の結果、マルチウェルプレート上に細胞を培養し、個々のウェルに異なるトランスポーターを一つずつ発現させ、化合物の取込みを測定することで、この化合物の細胞膜輸送に寄与するトランスポーターの同定と寄与の度合いを効率的に評価するという全く新しいスクリーニング方法に着目した。そして、薬物の生体膜輸送に関与することが明らかなトランスポーターや、現在のところ機能は不明であるものの薬物の生体膜輸送に関与する可能性のあるトランスポーターを、アレイ上に配列した細胞群に発現させることにより、被験物質が各トランスポーターに対してどの程度の認識を受け、且つ基質として取込み又は排出されるかといった定量的なデータが得られ、薬物輸送に関わるトランスポーターのハイスループットなスクリーニングや、新規化合物のインビボ組織分布の予測や、現在化学療法の臨床現場で問題となっている薬物間相互作用を事前に検出し、予測するシステムを提供できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち本発明は、異なるトランスポーターを発現する細胞が基体上に複数配列されていることを特徴とするトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項１）や、被験物質を輸送するトランスポーターを同定するために用いられることを特徴とする請求項１記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項２）や、異なるトランスポーターを発現する細胞が、トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを感染させることによりトランスポーターを発現する細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項３）や、トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを感染させることによりトランスポーターを発現する細胞が、同一の宿主細胞に由来する細胞であることを特徴とする請求項３記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項４）や、異なるトランスポーターを発現する細胞が、７０種類以上の異なるトランスポーターを発現する細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項５）に関する。
【００１７】
また本発明は、異なるトランスポーターを発現する細胞が、トランスポーターに加えて被験物質を発現する細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項６）や、発現ベクターが、さらにマーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項７）や、マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項７記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項８）や、発現ベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項３〜８のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項９）や、トランスポーターが、薬物動態に関連するトランスポーターであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項１０）や、薬物動態に関連するトランスポーターとして、少なくとも有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、及びペプチドトランスポーターを含むことを特徴とする請求項１０記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項１１）や、基体が、培養容器であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイ（請求項１２）に関する。
【００１８】
さらに本発明は、請求項１〜１２のいずれか記載のトランスポーター活性プロテインアレイを用いることを特徴とする被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法（請求項１３）や、各細胞への被験物質の取込みの程度を検出又は取込み量を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定することを特徴とする請求項１３記載の被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法（請求項１４）や、各細胞からの被験物質の排出の程度を検出又は排出量を測定することにより、被験物質を輸送するトランスポーターを同定することを特徴とする請求項１３記載の被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法（請求項１５）に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のトランスポーター活性プロテインアレイは、一度の測定で被験物質がどのトランスポーターに輸送されるかをハイスループットで解析できることから、新薬のドラックデザインやスクリーニングの現場に導入することによって、優れた体内動態特性を持ち、かつ特異的な組織移行性を兼ね備えた理想的な新薬を開発することが可能になる。また、本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを用いると、被験化合物が生体に発現する全トランスポーターの一つひとつに対して、どの程度の効率で輸送されるかといった網羅的かつ定量的なデータを得ることができるばかりでなく、得られるトランスポーター分子当たりの輸送量と、通常のＤＮＡチップあるいは定量的ＰＣＲ等によって得られる正常あるいは病態時の各組織における各トランスポーター発現量との積を求めることにより、全身に発現する各トランスポーターの輸送の寄与率をも求めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のトランスポーター活性プロテインアレイとしては、異なるトランスポーターを発現する細胞が基体上に複数配列されており、被験物質を輸送するトランスポーターを同定するために好適に用いられるものであれば特に限定されるものではなく、上記被験物質としては、例えばペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物発酵物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞紬出物、真核単細胞抽出物又は動物細胞抽出物を挙げることができ、これらの中でも薬剤や、新薬候補化合物等を好適に例示することができる。また、ここで被験物質を輸送するとは、トランスポーターが被験物質を細胞内に取り込むこと、トランスポーターが被験物質を細胞外へ排出することのいずれをも含む。
【００２１】
上記トランスポーターとしては、物質輸送能を担うトランスポーターであれば特に制限されるものではないが、薬物動態に関連するトランスポーターであることが好ましく、薬物動態に関連するトランスポーターとしては、有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、ペプチドトランスポーター、アミノ酸トランスポーター、ヌクレオシドトランスポーター、小腸上皮細胞刷子縁膜トランスポーター、その他のＳＬＣ（Solute Carrier）ファミリートランスポーター、ＡＢＣトランスポーター等を挙げることができるが、少なくとも有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター、及びペプチドトランスポーターを含むことが好ましい。
【００２２】
上記有機アニオントランスポーターとしては、例えばＯＡＴ１、ＯＡＴ２、ＯＡＴ３、ＯＡＴ４、ＯＡＴＰ−Ａ、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＰＧＴ、ＯＡＴ−Ｋ１、ＮＰＴ１、ＭＣＴ１、ＡＥ２等を挙げることができ、有機カチオントランスポーターとしては、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２、ＯＣＴＮ３等を挙げることができ、ペプチドトランスポーターとしては、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２等を挙げることができ、アミノ酸トランスポーターとしては、ＬＡＴ、ＣＡＴ、ＥＡＡＴ等を挙げることができ、神経伝達物質トランスポーターとしては、ＧＡＴ１、ＧＡＴ２，ＮＥＴ１、ＳＥＲＴ等を挙げることができ、胆汁酸トランスポーターとしては、ＮＴＣＰ、ＡＳＢＴ等を挙げることができ、ＡＢＣトランスポーターとしては、ＭＤＲ１、ＭＲＰ２等を挙げることができ、ヌクレオシドトランスポーターとしては、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２等を挙げることができる。これらの中でも少なくとも、薬物輸送に関して特に重要なトランスポーターとしては、オリゴペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ１、有機アニオントランスポーターＮＰＴ１、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｃ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＡＴＰ−８、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３及びＡＥ２、並びに有機カチオントランスポーターＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２及びＯＣＴＮ３を具体的に挙げることができる。
【００２３】
また、薬物の生体膜輸送に関与することが明らかにされているか、あるいはその可能性が高い約４０分子種のトランスポーターと、薬物の生体膜輸送に関与する可能性が考えられるその他の全てのＳＬＣファミリーを代表する約３０分子種の、合計約７０分子種のトランスポーター遺伝子を各細胞に発現させることが特に好ましい。
【００２４】
これらトランスポーターをコードする遺伝子の由来としては特に制限されるものではなく、例えばヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等を挙げることができる。上記のようなトランスポーターをコードする遺伝子やｃＤＮＡを細胞に発現させる方法としては特に限定されないが、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等の遺伝子導入法により、トランスポーター遺伝子を宿主細胞へ導入することにより発現させることができるが、トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを上記宿主細胞に導入することが好ましく、中でもトランスポーター遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に感染させることにより、トランスポーターを細胞に発現させることがより好ましい。
【００２５】
上記発現ベクターとしては、例えば、非分裂細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）、ＳＶ４０のようなパポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等のウイルスベクターの他、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、高い効率で細胞における遺伝子発現が可能なアデノウイルスベクターが特に好ましい。また、これらの発現ベクターへのトランスポーター遺伝子の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流にトランスポーター遺伝子等を挿入することにより発現ベクターを構築することができる。
【００２６】
上記トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターには、トランスポーター遺伝子に加えてマーカー遺伝子を含ませることができ、トランスポーター遺伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いることにより、アレイ上の各細胞に各トランスポーターが感染したことを簡便に確かめることができる。かかるマーカー遺伝子としては、アレイ上の各細胞に各トランスポーターが感染したことを簡便に確かめることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素をコードするＤＮＡや、抗体のＦｃ領域をコードするＤＮＡや、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質をコードするＤＮＡや、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、β−ｇａｌとｎｅｏＲの融合遺伝子（β−ｇｅｏ）等の選択マーカー遺伝子等を具体的に挙げることができるが、これらの中でもＧＦＰ遺伝子等の蛍光性タンパク質をコードするＤＮＡが感染確認及び各トランスポーター間の発現量のモニターの容易さからして好ましい。かかるＧＦＰには、ＥＧＦＰ（Enhanced GFP）、ＥＹＦＰ（Enhanced Yellow Fluorescent Protein）、ＥＣＦＰ(enhanced CYAN fluorescent protein）（青色）、ＤｓＲｅｄ（赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラベルを行うこともできる。
【００２７】
また、発現ベクターは、トランスポーター遺伝子及びマーカー遺伝子に加えて、トランスポーターの細胞当たりの発現量を規格化するためのＩＲＥＳ（ｍＲＮＡ内部のリボソーム結合サイト）の他、エンハンサー、ターミネーター等発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。さらに、発現ベクターとして、ペプチド系被験物質をコードするＤＮＡを含んでいてもよい。この場合、トランスポーターを発現する宿主細胞は、併せてペプチド系被験物質をも発現することになる。また、異なるトランスポーターと同一のペプチド系被験物質を発現する細胞は、トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターと、ペプチド系被験物質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとを宿主細胞にコトランスフェクションすることにより調製することもできる。いずれにしても、異なるＡＢＣトランスポーターなどのトランスポーターと同一のペプチド系被験物質を発現する複数の細胞を用いることにより、ペプチド系被験物質の排出に関与するトランスポーターを同定することが可能となる。
【００２８】
トランスポーターを発現する宿主細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ−３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨＴ２９細胞、ヒトリンパ芽球細胞や、これらのｄｈｆｒ欠損株、ＨＧＰＲＴ欠損株、ウアバイン耐性株等を挙げることができる。具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＢＨＫ（ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１ Ｏｒｉｇｉｎ，ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ヒトリンパ芽球細胞（ＩＭ−９，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５９）を例示することができる。
【００２９】
本発明のトランスポーター活性プロテインアレイは、アレイという性質上、非常に多くの種類のトランスポーター発現細胞、例えば７０種類以上の異なるトランスポーター発現細胞を保持することが好ましく、しかも輸送活性を正当に評価するためには、各トランスポーターの発現量や細胞の増殖の程度を同調させることが好ましいことから、各トランスポーターの安定発現細胞を用いるよりも、宿主細胞として全て同一の細胞を用いることが好ましい。同一の宿主細胞に由来する各種トランスポーター発現細胞を、溶液状態で安定に保存することができ、ウイルス溶液の希釈で発現量を容易に調整できるアデノウイルス等をベクターとして用いた一過性発現細胞、例えばＣＨＯ細胞を用いることがより好ましい。また、多数のウイルスのクロスコンタミネーションを予防するためには、マルチウェル対応のオートディスペンサーを導入することで対応が可能である。
【００３０】
本発明のトランスポーター活性プロテインアレイは、異なるトランスポーターを発現する細胞を基体上に複数配列して構成することができ、複数のトランスポーター発現細胞をグループ化して基体上に配列することにより、スクリーニング効率の向上を図ることができる。かかる基体としては、複数の異なるトランスポーター発現細胞を配列することができれば特に限定されるものではないが、例えば細胞を接着した状態で単層培養することができる複数配列可能な基体や、細胞を浮遊した状態で培養することができる複数配列可能な基体、具体的にはフィルター、膜、基板、穴又は孔が形成された基板、培養容器等を挙げられ、特に、液体シンチレーションカウンターやフルオロメーター、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等のハイスループット検出系に移行可能な培養容器であることが好ましい。具体的な培養容器としては、９６ウェル培養プレート、多孔性保持担体トランスウェル等のマルチウェルフォーマットの培養容器が挙げられ、中でも９６ウェル培養プレートであることが好ましい。また、培養液の分離が容易にできるフィルターメンブレンを介して底部に吸引機構を備えた培養容器がより好ましい。例えば、底がフィルターでできたマルチウェルフィルタープレートを用いることで、プレート上での細胞培養が可能であり、バキュームマニホールド等の簡易的な装置で反応停止を同時に行え、かつプレートのまま測定ができる。この迅速濾過法と呼ばれる方法の概要を図２に示す。また、基体に用いられる材料は特に限定されるものではないが、例えばガラス、シリコン、プラスチック等を用いることができる。さらに、これら基体には表面処理が施されていてもよい。
【００３１】
本発明の被験物質を認識するトランスポーターのスクリーニング方法としては、上記の本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを用いるスクリーニング方法であれば特に制限されるものではないが、異なるトランスポーターを発現する各細胞への被験物質の取込みの程度を検出又は取込み量を測定することにより、被験物質を輸送（細胞内へ導入）するトランスポーターを同定するスクリーニング方法や、異なるトランスポーターを発現する各細胞からの被験物質の排出の程度を検出又は排出量を測定することにより、被験物質を輸送（細胞外へ排出）するトランスポーターを同定するスクリーニング方法を好適に例示することができる。トランスポーター活性プロテインアレイを用いて、各細胞への被験物質の取込み量や各細胞からの被験物質の排出量を測定することにより、トランスポーター活性を定量的に把握することが可能となる。
【００３２】
以下、図３を参照しながら、本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを用いるスクリーニング方法のうち、異なるトランスポーターを発現する各細胞への被験物質の取込みの程度を検出又は取込み量を測定することにより、被験物質を輸送（細胞内へ導入）するトランスポーターを同定するスクリーニング方法について説明する。本発明のトランスポーター活性プロテインアレイは、図３（１）に示すように、先ず、例えば９６穴マルチウェルプレートの各ウェルに同一の細胞を撒いて培養し、図３（２）に示すように、各ウェル中の細胞に異なるトランスポーターを発現するウイルスを感染させ、図３（３）に示すように、各ウェル中にそれぞれ異なるトランスポーター発現細胞を調製することにより作製することができる。次に、図３（４）に示すように、トランスポーター活性プロテインアレイの各ウェルの細胞への被験物質の取込み量を検知・測定するために、各ウェルに例えば１種類の被験薬物を添加し、所定時間後に細胞を洗浄する。細胞の洗浄は、細胞が付着細胞の場合、培養液を吸引等により除去した後に培養液で洗浄し、該洗浄培養液を除去することにより行うことができる。また、細胞が浮遊細胞の場合、各ウェルの底部に設けられたフィルターを通して培養液を吸引濾過して細胞をフィルター上に固定した後に培養液で洗浄し、該洗浄培養液を吸引濾過することにより細胞を洗浄することができる。次いで、洗浄後の細胞に取り込まれた被験薬物を定量することで、図３（５）に示すように、被験薬物がどのトランスポーターによって、どの程度の効率で認識・取り込まれたかのプロファイルを得ることができる。被験薬物の取込み量を測定する方法としては、例えば液体シンチレーションカウンター、フルオロメーター、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
次に、本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを用いるスクリーニング方法のうち、異なるトランスポーターを発現する各細胞からの被験物質の排出の程度を検出又は排出量を測定することにより、被験物質を輸送（細胞外へ排出）するトランスポーターを同定するスクリーニング方法について、被験薬物が脂溶性低分子化合物等の場合とペプチドの場合について説明する。先ず、被験薬物が脂溶性低分子化合物のような細胞に取り込まれやすい物質の場合、例えば９６穴マルチウェルプレートの各ウェルに同一の細胞を撒いて培養し、各ウェル中の細胞に異なるトランスポーターを発現するウイルスを感染させ、各ウェル中にそれぞれ異なるトランスポーター発現細胞を調製することによりトランスポーター活性プロテインアレイを作製する。次に、トランスポーター活性プロテインアレイの各ウェルの細胞への被験物質の取込み量を検知・測定するために、各ウェルに例えば１種類の水溶性低分子化合物等の被験薬物を添加し、所定時間の後に細胞を洗浄する。細胞を洗浄した後、各ウェルに培養液を再補充し、所定時間後に培養液を回収する。培養液の回収については、細胞が付着細胞の場合、培養液を吸引等により回収することができる。また、細胞が浮遊細胞の場合、各ウェルの底部に設けられたフィルターを通して培養液を吸引濾過して回収することができる。次いで、培養液中の被験薬物を定量することで、被験薬物がどのトランスポーターによって、どの程度の効率で認識・取込み後排出されたかのプロファイルを得ることができる。
【００３４】
他方、被験薬物がペプチド系被験薬物の場合は、例えば９６穴マルチウェルプレートの各ウェルに同一の細胞を撒いて培養し、各ウェル中の細胞に異なるトランスポーターを発現するウイルス及び同一のペプチド系被験薬物を発現するウイルスを共感染させ、各ウェル中にそれぞれ異なるトランスポーターと同一のペプチド系被験薬物とを発現する細胞を調製することによりトランスポーター活性プロテインアレイを作製する。次に、トランスポーター活性プロテインアレイの各ウェルの細胞からの被験物質の排出を検出するために、所定時間後に培養液を回収する。培養液の回収については、細胞が付着細胞の場合、培養液を吸引することにより行うことができる。また、細胞が浮遊細胞の場合、各ウェルの底部に設けられたフィルターを通して培養液を吸引濾過して回収することができる。次いで、培養液中のペプチド系被験薬物を定量することで、ペプチド系験薬物がどのトランスポーターによって、どの程度の効率で排出されたかのプロファイルを得ることができる。
【００３５】
また、本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを用いて定量されたトランスポーター分子当たりの輸送量と、各組織における各トランスポーター発現量とから、全身に発現するトランスポーターの輸送の寄与率を求めることもできる。各組織における各トランスポーター発現量は、正常又は病態時の各組織について、通常のＤＮＡチップ、ＤＮＡアレイ、定量的ＰＣＲ等により測定することができる。さらに、新規化合物のイン ビボ組織分布の予測や、現在化学療法の臨床現場で問題となっている薬物間相互作用を事前に検出し、予測可能なシステムを構築することができる。具体的にはマウスを用いて有機アニオントランスポーター、有機カチオントランスポーター等幾つかのトランスポーターファミリーについてプロトタイプ化合物の組織分布（組織中対血漿中薬物濃度比）のデータを集め、アレイデータから得られるトランスポーター活性プロファイルとの対応付けを、ニューラルコンピュータアルゴリズムにより解析し、アレイデータからイン ビボ薬物組織分布及び排泄経路の予測を行う。なお、体内動態規定因子として薬物代謝酵素の関与が大きい化合物も存在する。そこで、肝ミクロソームやＳ９画分を用いて代謝による安定性も測定し、並列ニューロンの一つとして計算に組み込んで解析を行うことで、薬物組織分布及び排泄経路の予測精度をさらに高めることができる。
【００３６】
さらに、実際に臨床で用いられている薬物について、前臨床試験（動物実験）での組織分布プロファイルと、トランスポーター活性プロテインアレイによって得られたトランスポーター活性プロファイルとを比較することにより、アレイ情報からイン ビボ組織分布への予測精度を検討することができる。ヒトの臨床データでは、組織分布が示されていることは稀であるため、尿中および胆汁中（糞中）回収率のデータとの対応付けをエンドポイントとする。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
実施例１−１［迅速濾過法における使用フィルタープレートの検討］
９６穴フィルタープレートとして、数日間の細胞培養に耐える液保持性を持つ、マルチスクリーンプレート（MultiScreen Plate；MILLIPORE社製）、およびサイレントスクリーンプレート（Silent Screen Plate；Nalge Nunc社製）を購入し、比較検討した。まずマルチスクリーンプレート、サイレントスクリーンプレートに培地（ＤＭＥＭ）を２００μＬ／ウェルで加え、２日間培地が漏れないか観察した。次にマルチスクリーンプレートとサイレントスクリーンプレートとそれぞれのマニホールドを用い水３００μＬ／ウェルの吸引を２回行い、吸引後のフィルターの様子を観察した。また、吸引後乾燥させ、バックシールを張り、マイクロシンチ２０を３０μＬ／ウェルで加え、液漏れがないか観察した。培養液保持性に関しては共に申し分なかったが、吸引によるフィルターの剥離、吸引後乾燥させたプレートにおける液体シンチレーションカクテルの保持性に優れたマルチスクリーンプレートを選択した。このうち蛋白低吸着メンブレンでできたポアサイズ０．６５μｍのフィルター上に目詰まり防止用のグラスフィルターのついたＭＡＦＣ Ｎ０Ｂを選択した。
【００３９】
実施例１−２［使用細胞および培養方法］
フィルタープレート上で細胞培養し、そのまま迅速濾過法で被検物質を取込むため、接着脂肪では培養の段階から目詰まりを起こしてしまい吸引ができなくなるおそれがある。そのため浮遊細胞であるＣＨＯ−Ｓ細胞（Chinese Hamster Ovary Suspension Adapted Cells（Cat NO.11619-012）：インビトロジェン社製）を使用した。なお、細胞の継代方法は次のとおりとした。
１．２×１０6生細胞/ｍＬ以上になったら、ピペッティングで細胞を剥離した。
２．浮遊液を遠沈管に移し、３０秒間ボルテックスした。
３．トリパンブルーで生細胞数を、コールターカウンター（COULTER社製）で全細胞数をそれぞれ測定した。
４．３７℃に暖めておいたＣＤ−ＣＨＯ培地２０ｍＬの入ったＴ−フラスコに１〜３×１０6生細胞/ｍＬで播種した。
５．キャップをゆるく閉め、３７℃、８％ＣＯ2インキュベーターで培養した。
【００４０】
また、この操作で使用した培地ＣＤ−ＣＨＯ培地は、ＣＤ−ＣＨＯ ＡＧＴ（ＧＩＢＣＯ社製 １２４９０−０１７）をミリＱ水１Ｌに溶かし濾過滅菌し、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン４０ｍＬ、ＨＴサプリメント １０ｍＬを加えることにより調製した。このＣＤ−ＣＨＯ培地は４℃で保存した。なお、上記２００ｍＭ Ｌ−グルタミン液は、Ｌ−グルタミン５．８４０ｇに塩化ナトリウム１．７ｇを加え、蒸留水で計２００ｍＬとすることにより、また、ＨＴサプリメント（×１００）液は、ヒポキサンチン６８．０５ｍｇにチミジン１９．３７６ｍｇを加え、蒸留水で計５０ｍＬとすることにより、それぞれ調製した。
【００４１】
実施例１−３［アデノウイルス感染及び感染効率の検討］
ウイルス液は次の手順で調製した。
１．１サンプルにつき６０本のＴ１５０フラスコ底面にＨＥＫ２９３細胞が９０％コンフルエント(約１×１０7)に増殖した際にＭＯＩ(multiplicity of Infection)５〜１０で感染させた。
２．すべての細胞が丸くなり、細胞の半分が剥がれた時（通常感染後３〜４日後）に細胞をラバーポリスマンで剥がして、すべてのフラスコの中身を２２５ｍＬ遠沈管数本に回収した。
３．ベンチトップ遠心機を使用して５分間、５００ｇ（２０００ｒｐｍ）で遠心し、上清を除去した。
４．ペレットを合計４８ｍＬの滅菌済みのＰＢＳで再懸濁させた。
５．液体窒素による凍結操作、３７℃での融解、ボルテックス操作を４サイクル行い、続いて日立社製遠心機で、７８３０ｒｐｍ（７０００ｇ）４℃、５分間遠心した。
６．１２５ｍＬ遠心管に塩化セシウムを２６．４ｇ秤量し、５の上清４８ｍＬ添加し、混合後、ボルテックスした。
７．混合液（約１０ｍＬ、密度１．３５ｇ／ｍＬ）をスイング式超遠心用１２ｍＬポリアロマーチューブに分注し、その上にミネラルオイルを注射筒を使用して添加し、バランスを取り、３２０００ｒｐｍ、１０℃、２４時間超遠心した（加速度９、減速度７）。
８．ウイルスフラクション（約０．５〜１．０ｍＬ）を１８Ｇニードルがついた３ｃｃシリンジで回収し１５ｍＬファルコンチューブに添加し、２×保存用緩衝液で等量希釈した。
９．２×保存用緩衝液で等量希釈し、ウイルスストックとしてを約１ｍＬずつ分注し、−８０℃で保存した。
【００４２】
次に、以下の操作手順により、ＧＦＰ法でウイルス力価をチェックした。
１．ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルのディッシュ２枚にまいた。
２．細胞がコンフルエントになったら３次ウイルス液を段階希釈（１μＬ／ウェル→１００ｎＬ／ウェル→１０ｎＬ／ウェル→１ｎＬ／ウェル→１０ｐＬ／ウェル→ウイルスなし）して細胞にかけた。
３．２日後、メディウムを交換し、ウイルス液を取り除いた。
４．２日後に蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を見て、写真に撮った。
５．単位面積当たり蛍光を発している細胞の数の割合を求めた。
６．３次ウイルス液の力価を計算により求めた。
【００４３】
以下にヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞の培養方法を示す。
１．シャーレ上の培地をアスピレーターにより取り除いた。
２．ＰＢＳ（−）を１０ｍＬシャーレに加え、細胞表面を洗いアスピレーターにて除去した。
３．トリプシン・ＥＤＴＡを５ｍＬ加え、５〜１０分間細胞がシャーレから剥がれるまで放置した。
４．細胞が完全に剥がれたら、培地５ｍＬを加え、よく懸濁した。
５．１５ｍＬ遠沈管に細胞懸濁液をいれ、１０００ｒｐｍ、５分遠心した。
６．遠心後、上清をアスピレーターにより除去した。
７．培地１０ｍＬを加え懸濁した。
８．細胞懸濁液を２００μＬ取り、コールターカウンターにて細胞数を計測した。
９．１０ｃｍシャーレの場合は１〜２×１０6個の割合で、O１５ｃｍシャーレやＴ１５０ｃｍ2フラスコの場合は３〜４×１０6個の割合で細胞を播いた。
１０．シャーレを縦横に揺さぶり、細胞がシャーレ上に均一になるようにした。
【００４４】
ＣＨＯ−Ｓ細胞にＧＦＰ遺伝子を有する発現アデノウイルスベクターＡｄＧＦＰをＭＯＩ＝０、１０、３０、５０、１００、３００、５００、１０００で感染させ、２４時間後のＧＦＰの発現具合を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。ＭＯＩ＝５００、１０００ではＧＦＰ発現もほとんどなく、細胞が死んでいた。ＭＯＩ＝１００、３００では発現はよいが、細胞の形が崩れていた。一方、ＭＯＩ＝１０、３０では発現効率が３０％以下と低かった。このため発現効率がほぼ１００％で細胞の形も保っているＭＯＩ＝５０で感染取込み実験を行った。
【００４５】
なお、ＣＨＯ−Ｓ細胞へアデノウイルスベクターを感染させる手順は次の通りで行った。
１．Ｔ−フラスコに５×１０5生細胞／ｍＬで播種した。
２．１日後、コールターカウンターで全細胞数を確認し、それぞれのＭＯＩに必要なウイルス液の量を計算した。
３．ウイルス液の入ったバイアルから必要量取出し、細胞の入ったＴ−フラスコに添加した。
４．Ｔ−フラスコを縦横に揺さぶり、ウイルスが均一になるようにし、ウイルス用のＣＯ2インキュベーターに入れた
５．２０〜２４時間後、蛍光顕微鏡で感染状況を確認し、写真をとり、細胞を回収した。
【００４６】
実施例１−４［ＣＨＯ−Ｓ細胞に導入したｈＰＥＰＴ１の機能の確認］
ペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１（Liang R ei al. J Biol Chem. 1995 Mar 24;270(12):6456-63）は蛍光性タンパク質をコードするＥＹＦＰとのキメラ蛋白として発現させてもその機能が変化しないこと（Sun D et al.:AAPS PharmSci. 2001;3(1):E2）から、ＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染によりＣＨＯ−Ｓ細胞に導入されたＰＥＰＴ１の機能を、シリコンレイヤー法によって確認した。細胞数はＨＥＫ２９３細胞で実施したと同様に１×１０6細胞／測定点とし、ＭＯＩ＝５０で１日間培養することにより感染させた。また、ＰＥＰＴ１はプロトン共輸送（Mackenzie B et al.:1996 Mar 8;271(10):5430-7）のため、反応はｐＨ６．０で行った。ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、対照としてのＧＦＰ遺伝子を有するＰＥＰＴ１遺伝子欠失発現アデノウイルスベクターＡｄＧＦＰを感染させ、３７℃で［3Ｈ］グリシルサルコシン（１μＭ）取込みの時間的推移を調べた。結果を図５に示す。その結果、非感染細胞（△）、ＡｄＧＦＰ感染細胞（○）に比べＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞（●）で取込みの増加が確認できた。これによりＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染でＣＨＯ−Ｓ細胞に発現させたＰＥＰＴ１は機能していることが確認できた。
【００４７】
実施例１−５［ＣＨＯ−Ｓ細胞に導入したＯＡＴ１の機能の確認］
ＯＡＴ１（Sweet DH et al.:J Biol Chem. 1997 Nov 28;272(48):30088-95、Sekine T et al.:J Biol Chem. 1997 Jul 25;272(30):18526-9）を発現するアデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１感染によりＣＨＯ−Ｓ細胞に導入したＯＡＴ１の機能を、シリコンレイヤー法によって確認した。ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０で１日間培養することにより、ＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１と、対照としてのＧＦＰ遺伝子を有するＯＡＴ１遺伝子欠失発現アデノウイルスベクターＡｄＧＦＰを感染させ、３７℃、ｐＨ７．４で［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸（０．８８μＭ）取込みの時間的推移を調べた。結果を図６に示す。その結果、非感染細胞（△）、ＡｄＧＦＰ感染細胞（○）に比べＡｄｒＯＡＴ１感染細胞（●）で取込みの増加が確認できた。これによりＡｄｒＯＡＴ１感染でＣＨＯ−Ｓ細胞に発現させたｒＯＡＴ１が機能していることが確認できた。
【００４８】
実施例１−６［ウェル当たりの細胞数の検討］
ウェル当たりの細胞数は液体シンチレーションカウンターで取り込み量の検出が可能な細胞数以上で、かつ取り込みの実験操作での洗浄で迅速に濾過できる細胞数である必要がある。まず、実施例１−４に準じて、細胞数１×１０6、３．３×１０6、１×１０5、３．３×１０4 細胞／測定点でシリコンレイヤー法により１０分間の［3Ｈ］グリシルサルコシンの取込み実験を行い、液体シンチレーションカウンターでのカウント（dpm）により検出限界を調べた。結果を表４に示す（表中のＳ．Ｅ．Ｍ．は標準誤差を示す）。その結果、どの細胞数でもＰＥＰＴ１発現による［3Ｈ］グリシルサルコシンの取込み量の増加は検出できた。しかし、細胞数３．３×１０4細胞／測定点では非感染細胞、ＡｄＧＦＰ感染細胞の５分のカウントがそれぞれ４０．５７、３３．８３とバイアルブランクの１５とあまり差がないので検出感度は充分とはいえず、よって、検出には非感染細胞、ＡｄＧＦＰ感染細胞の５分のカウントがバイアルブランクの約１０倍ある１×１０6細胞／測定点以上の細胞数が好ましいことがわかった。
【００４９】
【表４】
2005102627.tif 000005
【００５０】
続いてマルチスクリーンプレートに１×１０6、２×１０6、３×１０6、４×１０6、５×１０6、６×１０6、７×１０6細胞／ウェルで細胞を加え、３００μＬ／ウェルの緩衝液を吸引するのに要する時間を測定し、迅速に濾過可能な細胞数を調べた。吸引圧力は細胞の吸引に推奨されている２．４ inch Hgで行った。結果を表５に示す。その結果、細胞数６×１０6 細胞／ウェルで吸引時間が急に延び、７×１０6細胞／ウェルで目詰まりを起こし吸引が不能になった。よって、迅速濾過には５×１０6細胞／ウェル以下の細胞数が好ましいことがわかった。以上のことから細胞数１〜５×１０6細胞／ウェルの範囲で選択可能であるが、上記検出感度の結果から、より細胞数の多い方が容易に検出できるため、以後の実験は５×１０6細胞／ウェルの細胞数で行った。
【００５１】
【表５】
2005102627.tif 000006
【００５２】
実施例１−７［洗浄回数の検討］
マルチスクリーンプレート、ＭＯＩ＝５０、５×１０6細胞／ウェルで［3Ｈ］グリシルサルコシンの取り込みを行い、洗浄の回数を１〜７回と変化させ、最適な洗浄回数を検討した。１２チャンネルピペッターで分注を行ったため、９６ウェルすべてに薬液を加えるのに約３０秒を要し、この３０秒間における変化の大きい取込み初期ではなく、変化の小さい１０分で取込みを行った。結果を表６に示す（表中のＳ．Ｅ．Ｍ．は標準誤差を示す）。その結果、洗浄回数が少ないとバラツキは大きく、洗浄回数が増すにつれてバラツキは小さくなった。ＭＯＣＫに対するＡｄｈＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞の取込み量の割合は洗浄回数の増加とともに増加し、５回洗浄を境に減少した。よって、ＭＯＣＫに対するＡｄｈＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞の取込み量の割合が一番大きく、バラツキが落ち着いた５回の洗浄にした。続いて、洗浄回数５回における３７℃で１０分間の［14Ｃ］マンニトール（４５μＭ）の取込み実験を迅速濾過法により行い、付着水の影響を調べた。結果を図７に示す。この結果、付着水は１〜２μＬ／ｍｇタンパク質と小さく、５回の洗浄でよく洗浄できていることが確認できた。
【００５３】
【表６】
2005102627.tif 000007
【００５４】
実施例１−８［迅速濾過法とシリコンレイヤー法の比較］
上記実施例で選択した実験条件で、［3Ｈ］グリシルサルコシンと［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸との取り込み実験を行い、同細胞数で行ったシリコンレイヤー法の結果と比較した。シリコンレイヤー法と迅速濾過法のそれぞれの操作は以下のとおりである。
（シリコンレイヤー法）
１．アデノウイルス感染後、約２０〜２４時間に細胞をフラスコからピペットで遠沈管に回収した。
２．回収した細胞を７００ｒｐｍ、４℃、５分遠心し、上清を捨て、氷冷したトランスポートバッファー２ｍＬ／Ｔ１５０ｃｍ2フラスコで洗浄し、７００ｒｐｍ、４℃、５分遠心した。
３．上清を捨て、氷冷したトランスポートバッファーを６．６×１０6細胞／ｍＬになるように加えて細胞を懸濁し、実験使用時まで氷冷下で保存した。
４．トランスポートバッファーの細胞懸濁液の１００μＬを採取し、３７℃で１０分間プレインキュベーション（蛋白定量用に１測定点分をサンプリングし、卓上遠心機で分離）した。
５．プレインキュベーション後、細胞懸濁液の１００μＬの入ったエッペンに薬液１００μＬ加え反応を開始した。
６．所定時間経過後、反応液の１５０μＬを採取し、ポリスピッツに添加して、直ちに卓上遠心機を用いて遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分）することにより反応を停止した。
７．反応停止後３時間以上放置し細胞を可溶化した。
８．ポリスピッツの３Ｍ ＫＯＨの部分をカッターナイフで切り取り、液体シンチレーションカウンター用ディスポーザブルバイアルの中に入れた。
９．バイアルの中に、５Ｎ ＨＣｌを３０μＬ入れ、中和した。
１０．バイアルの中に４ｍＬのクリアゾルを入れ、良く振騰、混和した。
１１．液体シンチレーションカウンターにより、放射活性を測定した。
なお、この操作で使用した溶液等を次の表７及び８に示す。
【００５５】
【表７】
2005102627.tif 000008
【００５６】
【表８】
2005102627.tif 000009
【００５７】
（迅速濾過法）
１．アデノウイルス感染後、約２０〜２４時間に細胞をフラスコからピペットで遠沈管に回収
２．回収した細胞を７００ｒｐｍ、４℃、５分遠心し、上清を捨て、氷冷したトランスポートバッファー２ｍＬ／Ｔ１５０flaskで洗浄し、７００ｒｐｍ、４℃、５分遠心
３．上清を捨て、氷冷したトランスポートバッファーを６．６×１０6細胞／ｍＬになるように加えて細胞を懸濁し、実験使用時まで氷冷下で保存した。
４．細胞懸濁液を必要量エッペンに取り、３７℃で１０分間プレインキュベーション
５．３７℃に暖めておいたマルチスクリーンプレートに細胞懸濁液を７５μＬ／ウェルで加えた。
６．３７℃に暖めておいた薬液を７５μＬ／ウェルで加え反応を開始（反応は５５℃に暖めたホットプレート上で行った）
７．所定時間経過後、氷冷してあったトランスポートバッファーを１５０μＬ／ウェルで加え、直ちにバキュームマニホールドで吸引濾過する事で反応を停止
８．１５０μＬ／ウェルずつ所定回数洗浄
９．乾燥後、マイクロシンチ２０を３０μＬ／ウェルで加え、プレート用液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定
なお、トランスポートバッファーはシリコンレイヤー法と同様のものを使用した。
【００５８】
［3Ｈ］グリシルサルコシンについてはｐＨ６．０、［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸についてはｐＨ７．４で行った結果をそれぞれ図８及び図９に示す（図中、オープンカラムは反応開始０分後を、クローズドカラムは反応開始１０分後の測定値）。［3Ｈ］グリシルサルコシンでは迅速濾過法、シリコンレイヤー法共にＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞で取込みの増加が顕著に観察された（図８）。しかし、迅速濾過法とシリコンレイヤー法とで取り込み量の絶対値に大きな差が出た。これは、迅速濾過法では洗浄中に取込んでいる化合物の排出が起きてしまっているため、シリコンレイヤー法よりは小さい値になると考えられた。ＡｄＧＦＰ感染あるいは非感染細胞に関しても同様に小さい値になったのでＡｄＧＦＰ感染細胞に対するＡｄｈＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞の取込み量の割合でみると迅速濾過法で１４．６、シリコンレイヤー法で１７．０となり絶対値程大きな差はなく、［3Ｈ］グリシルサルコシンの取込みに関しては十分評価できることがわかった。［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸ではシリコンレイヤー法に比べ迅速濾過法でＡｄＯＡＴ１発現細胞での顕著な取込み増加が見られなかった（図９）。ＡｄＧＦＰ感染細胞に対するＡｄＯＡＴ１感染細胞の取込み量の割合でみてもシリコンレイヤー法と迅速濾過法で大きな差が出てしまった。［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸の場合、洗浄中での排出が大きいのかも知れないが確かではない。しかし、わずかではあるがＡｄＯＡＴ１感染細胞での取込み増加が見えたので他の基質(ＰＥＰＴ１の基質、ＯＡＴ１の基質、ＰＥＰＴ１とＯＡＴ１の共通の基質)でこの取込み実験系を評価することにした。
【００５９】
実施例１−９［取込み実験系の評価］
すべての化合物の取込みはｐＨ７．０で行った。
（ＰＥＰＴ１の基質での取込みでアレイを評価）
ＰＥＰＴ１の基質として好適な基質である［3Ｈ］グリシルサルコシンと［3Ｈ］カルノシン（Carnosin）、好適な基質ではない［14Ｃ］テモカプリル（Temocapril；Tsuji A.:Yakugaku Zasshi. 2002 Dec;122(12):1037-58）を使用した。結果を図１０に示す。好適な基質である［3Ｈ］グリシルサルコシンと［3Ｈ］カルノシンでは、ＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞で顕著な増加が見られた。また、ｐＨ７．０における［3Ｈ］カルノシンの取り込みは［3Ｈ］グリシルサルコシンより大きいという報告を反映した結果が得られた。［14Ｃ］テモカプリルについても他の二つの基質程顕著ではないがＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞による取込みの増加が十分に確認できた。
【００６０】
［ＯＡＴ１の基質での取込みをアレイで評価］
ＯＡＴ１の基質として［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸、［14Ｃ］ｐ−アミノ馬尿酸、［14Ｃ］サルチル酸（Salicylic acid；Apiwattanakul N et al.:Mol Pharmacol. 1999 May;55(5):847-54.）、［14Ｃ］尿酸（Uric acid；Sekine T et al.: J Biol Chem. 1997 Jul 25;272(30):18526-9）、［14Ｃ］インドメタシン（Indometacin；Apiwattanakul N et al.:Mol Pharmacol. 1999 May ; 55 (5) :847-54.）の取込みを行った。結果を図１１に示す。［14Ｃ］ｐ−アミノ馬尿酸でのみＡｄＯＡＴ１感染細胞による取込みの増加が見えた。他の基質に関してはＡｄＧＦＰ感染細胞とＡｄＯＡＴ１感染細胞で差がなかった。
【００６１】
［ＰＥＰＴ１、ＯＡＴ１の共通の基質での取り込みをアレイで評価］
ＰＥＰＴ１、ＯＡＴ１の共通の基質として［14Ｃ］ベンジルペニシリン（Benzyl penicilin；Tsuji A.:Yakugaku Zasshi. 2002 Dec;122(12):1037-58、Jariyawat S et al. : J Pharmacol Exp Ther. 1999 Aug;290(2):672-7）を選んだ。結果を図１２に示す。ＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞による取込みの増加は多少ではあるが観察されたが、ＡｄＯＡＴ１感染細胞ではＡｄＧＦＰ感染細胞に比べ逆に取込みが減少する結果となった。
【００６２】
実施例１−１０［まとめ］
ＰＥＰＴ１の好適な基質であるグリシルサルコシンやカルノシンだけではなく、好適な基質ではないテモカプリルについても、ＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰ感染細胞による取込みの増加が確認できたことから、ＰＥＰＴ１の基質に関しては検出感度は十分あることが示された。よって、ＰＥＰＴ１に関してはハイスループットな取り込み実験系が構築できた。一方、ＯＡＴ１の基質ではｐ−アミノ馬尿酸以外の基質で取り込みの増加が確認できなかった。これはフィルターへの吸着や取込み時間の設定などに問題があるためだと考えられる。フィルターへの吸着に関してはアニオン性化合物にマイナスチャージフィルターを用いることで対応することができる。また被験化合物によりそれぞれ適した取り込み時間があるので、これに対してはまずＭＯＣＫ細胞で取り込みの時間依存性を調べ、定常状態の取り込み量が多い場合には取り込みがあまり上がっていない時期での取り込みを見る必要があることがわかった。
【実施例２】
【００６３】
実施例２−１［トランスポーター発現アデノウイルスベクターの調製］
各種有機アニオントランスポーター、各種有機カチオントランスポーター、各種ペプチドトランスポーター、各種アミノ酸トランスポーター、各種ヌクレオシドトランスポーター、各種ＳＬＣファミリートランスポーターおよび各種ＡＢＣトランスポーターなどの遺伝子を、前記表１〜３記載の先行技術文献記載の方法に準じて調製し、次いで、特開２００２−１１２７６９号公報に記載の方法に準じて、マーカー遺伝子としてＧＦＰ遺伝子をもつアデノウイルスベクターに導入し、有機アニオントランスポーターＯＡＴ１などの各種トランスポーター発現アデノウイルスベクターを作製した（図１３）。
実施例２−２［アデフォビルを基質とするトランスポーターＯＡＴ１の確認］
【００６４】
次に、被験化合物として抗ウイルス薬であるアデフォビルを基質とするトランスポーターが有機アニオントランスポーターＯＡＴ１であることを以下のように確かめた。実施例２−３記載の方法に準じて、［3Ｈ］アデフォビルをＯＡＴ１発現細胞に取り込ませた。ネガティブコントロールとして、ＧＦＰ遺伝子を有するＯＡＴ１遺伝子欠失発現アデノウイルスベクターで感染させたＧＦＰ発現細胞を用いた。また、ＯＡＴ１トランスポーターの阻害剤であるプロベネシドの存在下に［3Ｈ］アデフォビルを取り込ませてみた。さらに、ペプチドトランスポーターＰＥＰＴ１の基質である［3Ｈ］カルノシンをＯＡＴ１発現細胞に取り込ませてみた。結果を図１４に示す。図１４に示すように、アデフォビルはＯＡＴ１発現細胞に取り込まれたが、トランスポーターＯＡＴ１を発現しないＧＦＰ発現細胞によっては取込みは観察されなかった。また、ＯＡＴ１発現細胞によるアデフォビルの取込みは、ＯＡＴ１トランスポーター阻害剤プロベネシド存在下で顕著に減少した。さらに、ＯＡＴ１を発現する細胞によっては［3Ｈ］カルノシンの取込みは見られなかった。これらの結果から、アデフォビルはＯＡＴ１の基質として認識・輸送されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】小腸、腎臓、肝臓、脳などの種々の組織における薬物のトランスポーターを示す図である。
【図２】底がフィルターでできたマルチウェルフィルタープレートを用いる迅速濾過法の概要を示す説明図である。
【図３】本発明のトランスポーター活性プロテインアレイを作製する方法の一例及びかかるトランスポーター活性プロテインアレイを用いて被験物質の取込みを解析する方法の一例を説明する概念図である。（１）は９６穴プレートに細胞を培養する工程を示す図であり、（２）は各ウェルに異なるトランスポーター発現ウイルスを感染させる工程を示す図であり、（３）は各ウェルに異なるトランスポーターが発現する工程を示す図であり、（４）は各ウェルの細胞への被験物質の取込み量を測定する工程を示す図であり、（５）は（４）の工程で測定された、被験物質のトランスポーターへの取込み量を示すプロファイルである。
【図４】ＣＨＯ−Ｓ細胞へのアデノウイルスの感染結果を示す蛍光顕微鏡での感染状況の写真である。
【図５】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でｈＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄｈＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰを感染（●）、対照としてＡｄＧＦＰを感染（○）あるいは非感染の細胞（△）を用いて、［3Ｈ］グリシルサルコシン取込みの時間的推移を調べた結果を示す図である。３回の測定結果の平均と標準誤差が示されている。
【図６】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１を感染（●）と、対照としてＡｄＧＦＰを感染（○）あるいは非感染の細胞（△）を用いて、［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸取込みの時間的推移を調べた結果を示す図である。３回の測定結果の平均と標準誤差が示されている。
【図７】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でｒＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１とＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、［14Ｃ］マンニトール取込みによる付着水の影響を調べた結果を示す図である。３回の測定結果の平均と標準偏差が示されている。
【図８】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でｈＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、［3Ｈ］グリシルサルコシン取込み量を、迅速濾過法とシリコンレイヤー法により測定した比較結果を示す図である。
【図９】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、ＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１と、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸取込み量を、迅速濾過法とシリコンレイヤー法により測定した比較結果を示す図である。
【図１０】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、ＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１と、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、ＰＥＰＴ１の基質として好適な［3Ｈ］グリシルサルコシンと［3Ｈ］カルノシン、好適ではない［14Ｃ］テモカプリルの取込み量を測定した結果を示す図である。
【図１１】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、ＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１と、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、ＯＡＴ１の基質である［3Ｈ］ｐ−アミノ馬尿酸、［14Ｃ］ｐ−アミノ馬尿酸、［14Ｃ］サルチル酸、［14Ｃ］尿酸、［14Ｃ］インドメタシンの取込み量を測定した結果を示す図である。
【図１２】ＣＨＯ−Ｓ細胞にＭＯＩ＝５０でＰＥＰＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＰＥＰＴ１−ＥＹＦＰと、ＯＡＴ１発現アデノウイルスベクターＡｄＯＡＴ１と、対照としてのＡｄＧＦＰを感染させ、ＰＥＰＴ１とＯＡＴ１の共通の基質である［14Ｃ］ベンジルペニシリンの取込み量を測定した結果を示す図である。
【図１３】有機アニオントランスポーターＯＡＴ１発現組換えアデノウイルスベクターの構築を示す図である。
【図１４】蛍光性タンパク質ＧＦＰを発現する培養細胞（ＡｄＧＦＰ）、有機アニオントランスポーターＯＡＴ１を発現する培養細胞（ＡｄＯＡＴ１）及びＯＡＴ１の阻害剤であるプロベネシド存在下での有機アニオントランスポーターＯＡＴ１を発現する培養細胞（ＡｄＯＡＴ１＋１ｍＭプロベネシド）に対する抗ウイルス薬［3Ｈ］アデフォビルの取込み量を示す図、並びに蛍光性タンパク質ＧＦＰを発現する培養細胞（ＡｄＧＦＰ）及び有機アニオントランスポーターＯＡＴ１を発現する培養細胞（ＡｄＯＡＴ１）に対するジペプチド［3Ｈ］カルノシンの取込み量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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