(57)【要約】【課題】  ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡが相補対を作ることができる十分な空間をもったバイオチップの提供及びこれを用いる核酸との相補性を試験する方法の提供。【解決手段】  構造式（１）又は（２）で表される化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングによりＤＮＡ鎖が固定されていることを特徴とするＤＮＡ鎖が固定化されている基板。（１）Ｒ1―Ａ―Ｒ―Ｓ―Ｈ、（２）［Ｒ1―Ａ―Ｒ―Ｓ］2（式中、Ａは、パラカルボラン化合物、カルボラン化合物の１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基。Ｒは、ポリエチレングリコキシベンゼンなどを表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸とターゲット核酸をハイブリダイゼーションして、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法において、基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸が、構造式（１）で表されるスルフイド及び構造式（２）で表されるジスルフイドから選ばれる化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングにより核酸が固定されていることを特徴とする基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法。
【化１】
2005274525.tif 000009
【化２】
2005274525.tif 000010
（式中、Ａは、パラカルボラン化合物である。カルボラン化合物の１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基であり、水素原子、アルキル基、又はカルボン酸基、アルデヒド基、アミノ基、水酸基、フエニル基、エーテル基から選ばれる原子又は基を表す。カルボランの３〜１１位は、水素原子又はアルキル基、トルフロロメチル基で選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
Ｒは、アルキル基、アルキルベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はポリエチレングリコキシベンゼンを表す。アルキル基は炭素数が１〜２０のアルキル基、ポリエチレングリコール基をあらわす。）
【請求項２】
固定されている自己組織化膜にアミドカップリングにより固定されている核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸とターゲット核酸のハイブリダイゼーションの有無を表面プラズモン共鳴法により検出する請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出するための請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
核酸を固定化した基板表面へのターゲットＤＮＡの吸着を、１価又は２価の金属イオンの存在下で行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
２価金属イオンがマグネシウムイオン又はナトリウムイオンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ鎖が固定化されている基板において、構造式（１）で表されるスルフイド及び構造式（２）で表されるジスルフイドから選ばれる化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングによりＤＮＡ鎖が固定されており、ＤＮＡ鎖は二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であることを特徴とするＤＮＡ鎖が固定化されている基板。
【化３】
2005274525.tif 000011
【化４】
2005274525.tif 000012
（式中、Ａは、パラカルボラン化合物である。カルボラン化合物の１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基であり、水素原子、アルキル基、又はカルボン酸基、アルデヒド基、アミノ基、水酸基、フエニル基、エーテル基から選ばれる原子又は基を表す。カルボランの３〜１１位は、水素原子又はアルキル基、トルフロロメチル基で選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
Ｒは、アルキル基、アルキルベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はポリエチレングリコキシベンゼンを表す。アルキル基は炭素数が１〜２０のアルキル基、ポリエチレングリコール基をあらわす。）
【請求項８】
基板が、ガラス基板に金を蒸着したものであることを特徴とする請求項７に記載のＤＮＡ鎖が固定化されている基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボラン誘導体化合物を用いる自己組織化膜を用いるバイオチップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸（標的核酸）を検出する目的で核酸ブロープが用いられる。核酸ブロープとしては、ＤＮＡ合成機により容易に合成できるという理由から、ＤＮＡブロープが主に使用されている．そして、近年、多数の核酸ブローブを基材に国定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレ−が実用化されるようになり、ターゲット核酸の検出に使用されている。
【０００３】
基材に国定された核酸ブロープはターゲット核酸と接触条件下に置かれ、核酸プロープとターゲット核酸とのハイブリダイズの有無を検出する。ハイブリタイズの有無の検出には、例えば、核酸ブローブが有する、蛍光標識等の標識を用いて検知する。蛍光標識以外に、Ｒlなどが用いられる場合もある。
【０００４】
これまでターゲット核酸とハイブリダイズした核酸ブローブを検知しやすいという観点から、蛍光標識が用いられることが多かった。しかし、蛍光標識を用いる場合、ターゲット核酸を蛍光ブロープ等で修飾する必要があるが、この操作は、煩雑である。今後、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーが、より広汎に実用されるためには、より簡便に上記ハイブリダイゼーションを検出できる手段が必要である。それに加えて、より微量のターゲット核酸を対象にした場合にも、上記ハイブリダイゼーションの検出が容易にできる、より高感度な検出を可能にする手段が必要である。このような検出装置として以下のものが知られている。
ヌクレオチド検出装置には、基板上に配置されたナノメータサイズの金粒子、金粒子に結合された一本鎖チオールＤＮＡが設けられているヌクレオチド検出装置が知られている（特許文献1）。同様に、一本鎖の核酸プローブを支持体の表面に固定化することも知られている（特許文献２）
しかしながら、これらの一本鎖チオールＤＮＡや一本鎖の核酸プローブを用いると、自己組織化したプローブＤＮＡは密に凝集してしまうため十分な自由空間がないことからターゲットＤＮＡが近づくことができず、相補対を作らないことが知られている。このような場合に、プローブＤＮＡの分子間距離を作るために、メルカプトヘキサノールなどとチオール修飾したＤＮＡとの共吸着により間引きする方法が一般的に用いられるが、混合比の検討課題が残されている。このようなことから、プローブとターゲットＤＮＡが相補対を作る頃ができるバイオイップの実現が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ０１／０６８８３４号公報
【特許文献２】特開０００３−１０２４９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＤＮＡプローブとターゲットＤＮＡが相補対を作ることができる十分な空間をもったバイオチップを提供することである。又、このチップを用いた高感度な核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を検討し、アルキル基、アルキルアゾベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はエチレングリコキシベンゼンを主鎖にもつスルフィド又はジスルフイドにおいて、スルフィド又はジスルフイド基からもっとも離れた末端部位に、反応性の機能性分子を有するカルボラン又はその誘導体を前記主鎖の部分に取り込んだ自己組織化膜は、カルボランの作用により、自己組織化膜を構成する分子相互では、凝集する状態を離れて、自由に機能性分子が近づくことができるようになるために、自己組織化膜と反応しようとする機能性分子との反応を阻害することなく、反応を進行させることができることを見出した。すなわち、３次元的に広がりを持つホウ素クラスターであるカルボランとＤＮＡを結合させた分子をプローブＤＮＡに接近するための十分な自由空間を作ることが可能となった。
機能性置換基を有するカルボラン化合物誘導体を有する生成物を基板に固定した自己組織化膜に、アミノ化ＤＮＡと縮合剤を用いて反応させることにより、ＤＮＡを導入することができる。
このようにして得られた基板上にＤＮＡが固定された状態で水溶液に溶解させた状態とし、ターゲットＤＮＡをハイブリダーゼーションさせると、自己組織化膜にカルボラン化合物誘導体が存在することにより、ハイブリダーゼーションを阻害せず、十分にこの反応を進行させることができる。このことを見出して，本発明を完成したものである。
【０００８】
本発明によると、以下の発明が提供される。
（１）基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸とターゲット核酸をハイブリダイゼーションして、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法において、基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸が、構造式（１）で表されるスルフイド及び構造式（２）で表されるジスルフイドから選ばれる化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングにより核酸が固定されていることを特徴とする基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法。
【化１】
2005274525.tif 000002
【化２】
2005274525.tif 000003
（式中、Ａは、パラカルボラン化合物である。カルボラン化合物の１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基であり、水素原子、アルキル基、又はカルボン酸基、アルデヒド基、アミノ基、水酸基、フエニル基、エーテル基から選ばれる原子又は基を表す。カルボランの３〜１１位は、水素原子又はアルキル基、トルフロロメチル基で選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
Ｒは、アルキル基、アルキルベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はポリエチレングリコキシベンゼンを表す。アルキル基は炭素数が１〜２０のアルキル基、ポリエチレングリコール基をあらわす。）
（２）固定されている自己組織化膜にアミドカップリングにより固定されている核酸がＤＮＡである（１）に記載の方法。
（３）前記基板表面に固定化された自己組織化膜に固定された核酸とターゲット核酸のハイブリダイゼーションの有無を表面プラズモン共鳴法により検出する（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出するための（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）核酸を固定化した基板表面へのターゲットＤＮＡの吸着を、１価又は２価の金属イオンの存在下で行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
（６）２価金属イオンがマグネシウムイオン又はナトリウムイオンである（５）に記載の方法。
（７）ＤＮＡ鎖が固定化されている基板において、構造式（１）で表されるスルフイド及び構造式（２）で表されるジスルフイドから選ばれる化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングによりＤＮＡ鎖が固定されており、ＤＮＡ鎖は二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であることを特徴とするＤＮＡ鎖が固定化されている基板。
【化３】
2005274525.tif 000004
【化４】
2005274525.tif 000005
（式中、Ａは、パラカルボラン化合物である。カルボラン化合物の１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基であり、水素原子、アルキル基、又はカルボン酸基、アルデヒド基、アミノ基、水酸基、フエニル基、エーテル基から選ばれる原子又は基を表す。カルボランの３〜１１位は、水素原子又はアルキル基、トルフロロメチル基で選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
Ｒは、アルキル基、アルキルベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はポリエチレングリコキシベンゼンを表す。アルキル基は炭素数が１〜２０のアルキル基、ポリエチレングリコール基をあらわす。）
（８）基板が、ガラス基板に金を蒸着したものであることを特徴とする（７）に記載のＤＮＡ鎖が固定化されている基板。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、自己組織化膜に３次元的に広がりをもつホウ素クラスターであるカルボラン化合物とＤＮＡを結合させた分子をプローブＤＮＡとした。このカルボラン化合物を用いることにより、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡに接近するための、十分な自由空間を作ることができたことにより、簡便かつ好感度なバイオチップが得られる。また、これを用いて、高感度な核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のカルボラン誘導体化合物は、以下の構造式（１）で表されるスルフイド、構造式（２）で表されるジスルフイドである。
【化５】
2005274525.tif 000006
【化６】
2005274525.tif 000007
上記式中、Ａは、パラカルボラン化合物である。カルボラン化合物の置換基以下の通りである。
カルボランの１２位にある置換基Ｒ1は、機能性置換基であり、水素原子、アルキル基、又はカルボン酸基、アルデヒド基、アミノ基、水酸基、フエニル基、エーテル基から選ばれる原子又は基を表す。
カルボランの３〜１１位は、水素原子又はアルキル基、トルフロロメチル基で選ばれる原子又は基で置換されていてもよい。
前記アルキル基は、メチル基、エチル基、ｎプロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基を表す。
Ｒは、アルキル基、アルキルベンゼン基、フエノキシエチレングリコキシベンゼン、又はポリエチレングリコキシベンゼンを主鎖にもつスルフィド又はジスルフイドである。ここで、アルキル基は炭素数が１〜２０のアルキル基、ポリエチレングリコール基をあらわす。
【００１１】
前記カルボラン化合物誘導体の製造方法は、Ｒを構成している基によって相違する。
（１）Ｒが、アルキルスルフィドの場合
カルボランを、ｎ-ブチルリチウムの存在下にクロロギ酸メチルと反応させてカルボランの１位にメチルエステル基を導入する。炭酸カリウムの存在下にジブロモアルカンと反応させてブロモアルキルカルボランを合成し、水酸化カリウムにより１位のメチルエステルを加水分解して、ギ酸に変え、次にチオ尿素と反応させて、メルカプトアルキルカルボランを製造する。
（２）Ｒが、ベンジルアルキルスルフィドの場合
カルボランを、ｎ-ブチルリチウムの存在下にクロロギ酸メチルと反応させてカルボランの１位にメチルエステル基を導入する。４−ヨードアルキルベンゼンと反応させて１２位に臭化アルキルベンゼン基を導入し、水酸化カリウムにより１位のメチルエステルを加水分解して、ギ酸に変え、次にチオ尿素と反応させて、メルカプトアルキルベンゼンカルボランを製造する。
（３）Ｒが、ｎエチレングリコール−ジスルフイドの場合
カルボランを、ｎ-ブチルリチウムの存在下にクロロギ酸メチルと反応させてカルボランの１位にメチルエステル基を導入する。炭酸カリウムの存在下にジブロモアルカンと反応させてブロモアルキルカルボランを合成し、水酸化カリウムにより１位のメチルエステルを加水分解して、ギ酸に変え、次にチオ尿素と反応させて、メルカプトエチレングリコールカルボランを製造する。
（４）Ｒが、フェノキシ−ｎエチレングリコール−ジスルフィドの場合
ｎがテトラの場合について説明する。
パラカルボランと４−ヨードアニソールとを反応させて、１−（４−メトキシフェニル）−１，１２−カルボランを得る工程（２を製造する工程）、１−（４−メトキシフェニル）−１，１２−カルボランの１２位にメチルエステルを導入して、１−（４−メトキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランを得る工程（３を製造する工程）、１−（４−メトキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランと三臭化ホウ素とを反応させて、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランを得る工程（４を製造する工程）、１−（４−ヒドロキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランと１、１１−ジブロモテトラエチレングリコールを反応させて１−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンを得る工程（５を製造する工程）、１−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンを加水分解して、１−（１２−ギ酸−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンを得る工程（６を製造する工程）、１−（１２−ギ酸−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンとチオ尿素を反応させて、１２−（４−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−フェノキシ）−テトラエチレングリコール−ジスルフィドを得る工程（７を製造する工程）
【化７】
2005274525.tif 000008
【００１２】
本発明の自己組織化膜は、前記構造式（１）で表されるスルフイド、又は構造式（２）で表されるジスルフイドを基板上に固定されているものである。
基板には、ガラスなどの板に金属を蒸着して得られるものが用いられる。
金属には、金、銀、ニッケル、パラジウム、白金、鉄、コバルト、インジウムなどの金属を挙げることができる。
構造式（１）で表されるスルフイド、又は構造式（２）で表されるジスルフイドを溶剤に溶解させて、希薄溶液を作り、前記基板と接触させて、室温下に数時間に渡り放置する。その後、基板に過剰に付着した前記化合物を除去する。
このようにして金属基板の表面に吸着させた自己組織化膜を得ることができる。
具体的には、前記の工程により得られる１２−（４−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２―カルボラン）フエノキシ）−テトラエチレングリコール−ジスルフイドを、金属と共存させた状態に保つことによって、金属基板の表面に吸着させて自己組織化膜を形成する。
前記工程で得られた１２−（４−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２―カルボラン）フエノキシ）−テトラエチレングリコール−ジスルフイドを、溶剤に溶解させて、希薄溶液を作り、前記基板と接触させて、室温下に数時間に渡り放置する。その後、基板に過剰に付着した前記化合物を除去する。
このようにして自己組織化膜が得られる。
溶媒は、適宜選択して使用することができる。具体的には、ジクロロメタンなどに溶解させて１ｍＭの溶液とし、室温で、２から１２時間程度放置する。
【００１３】
前記工程で得られた機能性置換基を有するカルボラン化合物誘導体を有する生成物を基板に固定した自己組織化膜を、機能性分子と反応させる際にカルボラン化合物誘導体の作用により実際に反応を阻害されることがないかを確認する。
本発明では機能性分子に核酸、特にＤＮＡを用いて確認を行なう。本発明では、機能性置換基を有するカルボラン化合物誘導体を有する生成物を基板に固定した自己組織化膜を、アミノ化ＤＮＡと縮合剤を用いて反応させることにより、ＤＮＡを導入することができる。この縮合剤には４−（４，６−ジメトキシー１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などが用いられる。
このようにして得られた基板上にＤＮＡが固定された状態で水溶液に溶解させた状態で、ターゲットＤＮＡをハイブリダーゼーションさせて、自由に反応させることができるかどうかを確認する。具体的には、ハイブリダイゼーションが生起していれば反応を阻害していないというとことがわかる。これには、ハイブリダイゼーションの確認には、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法などが適宜採用される。本発明では、表面プラズモン法によりハイブリダイゼーションが生起していることを確認している。
具体的には、特開2002−22653に記載されているような表面プラズモン共鳴分光法により、自己組織化膜の反射率の変化をモニターすることによって観察することができる。
本発明では、後で述べるように比較例としては、同じく末端に機能性置換基を有するものの、カルボラン化合物誘導体を有していない、従来から用いられてきた自己組織化膜を用いて同じく基板上にＤＮＡが固定された状態で水溶液に溶解させた状態で、ターゲットＤＮＡをハイブリダーゼーションさせて得られた結果を調べたものである。
【００１４】
前記工程で得られた機能性置換基を有するカルボラン化合物誘導体を有する生成物を基板に固定した自己組織化膜を、機能性分子と反応させる際にカルボラン化合物誘導体の作用により実際に反応を阻害されることがないかを確認する。
本発明では機能性分子にＤＮＡを用いて確認を行なう。本発明では、機能性置換基を有するカルボラン化合物誘導体を有する生成物を基板に固定した自己組織化膜を、アミノ化ＤＮＡと縮合剤を用いて反応させることにより、ＤＮＡを導入することができる。この縮合剤には４−（４，６−ジメトキシー１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロライド（ＤＭＴ−ＭＭ）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などが用いられる。
このようにして得られた基板上にＤＮＡが固定された状態で水溶液に溶解させた状態で、ターゲットＤＮＡをハイブリダーゼーションさせて、自由に反応させることができるかどうかを確認する。具体的には、ハイブリダイゼーションが生起していれば反応を阻害していないというとことがわかる。これには、ハイブリダイゼーションを、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子法などが適宜採用される。
本発明では、後で述べるように表面プラズモン法によりハイブリダイゼーションが生起していることを確認している。比較例としては、同じく末端に機能性置換基を有するものの、カルボラン化合物誘導体を有していない、従来から用いられてきた自己組織化膜を用いて同じく基板上にＤＮＡが固定された状態で水溶液に溶解させた状態で、ターゲットＤＮＡをハイブリダーゼーションさせて得られた結果を調べたものである。
【００１５】
相補性試験方法については、以下の通りである。
本発明の相補試験方法では、前記スルフイド又はジスルフイドから選ばれる化合物が基板上に固定されている自己組織化膜にアミドカップリングにより核酸が固定されている基板表面に固定化された核酸と、ターゲット核酸とをハイブリダイゼ−ション可能な状態に保持し、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する。
この方法に用いる、表面に核酸を固定化した基板、基板に固定化される核酸、ターゲット核酸、並びにハイブリダイゼーションの一般的方法及び条件は、公知の物、方法及び条件をそのまま利用できる。
【００１６】
ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板が金属基板又は金属被覆を有する基板である場合、基板の金属表面にＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。金属基板としては、例えば、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属製の基板を挙げることができる。また、金属被覆を有する基板としては、ガラス、マイカ（雲母）等の基板の表面に、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属被覆を設けた基板を挙げることができる。
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１７】
また、ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板がガラス基板又はシリコン基板である場合、基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。ガラス基板としては、一般的なスライドガラス等のガラス基板を挙げることができる。また、シリコン基枝は、シリコンウェハ等であることができる。
基板の表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１８】
本発明の相補性試験方法は、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリタイゼーション可能な状態に置く。上記粒子に固定化された核酸とターゲット核酸とはハイブリタイズする。ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とが相補的配列である場合、ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とがハイブリダイズする。このようにして、相補性を試験する。
【００１９】
表面プラズモン共鳴法は、基板表面にレーザ光を照射し、基板表面で生じる表面プラズモン共鳴を剖定することで基板表面に存在する膜等の厚みを測定する方法であり、ターゲットＤＮＡとハイブリタイゼーションしたＤＮＡ鎖の存在の有無を膜厚の違いとして認識し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。
本発明では、表面に核酸を固定化した粒子を併用することで、表面プラズモン共鳴法を用いて、より高感度にハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００２０】
水晶振動子法は、水晶振動子の電極への物質の付着による振動数の減少から付着物の質量を求める方法である（例えば、Chem.Rev.,1992，92．1355−1379参照）。水晶撮勤子法を用いる場合も、表面に核酸を固定化した粒子を併用する。
【００２１】
本発明の相補性試験方法では、塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。即ち、本発明の相補性試験方法では、完全相補的なターゲットＤＮＡは、ハイブリタイゼーションをするが、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをせず、その結果、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡを放出することもできる。
【００２２】
本発明の相補性試験方法では、ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲットＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行うことがハイブリダイゼーション後の鎖部分の安定性という観点から好ましい。２価金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲とすることが適当である。
【００２３】
尚、本発明では基板にＤＮＡ鎖を固定化する態様について説明した。しかし、例えば、基板に固定化きれる核酸は、一部又は全部がＲＮＡであってもよい。
以下、実施例により本発明の内容を更に詳細に説明する。本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
１−（４−メトキシフェニル）−１，１２−カルボラン（化合物２）の合成方法
窒素雰囲気下、パラカルボラン(1.44 g, 10 mmol)に100 mlの無水１，２−ジメトキシエタンを加えた後、0℃で1.57 mM、n-ブチルリチウム(7.0 ml, 11 mmol)をゆっくり滴下し、室温で１時間撹拌した。その後、ヨウ化銅（Ｉ）(1.1 g, 11 mmol)を加えて２時間
、さらにピリジン(6 ml)を加えて３０分間室温で撹拌することで、銅（Ｉ）−パラカルボ
ラン溶液を調整した。この溶液に４−ヨードアニソール(2.34 g, 10 mmol)を加えて110℃で４日間加熱還流させた。その後溶媒を減圧留去し、粗生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、ヘキサンとジエチルエーテル(15 : 1)を展開溶媒にしてシリカゲルカラムクロマト分離により単離精製し、化合物２番を４０％の収率で得た。以下の分析結果から、表記の化合物１−（４−メトキシフェニル）−１，１２−カルボランであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.09 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.66 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.72 (s, 1H) ; ; IR (KBr) 2837, 2613, 1614, 1515, 1302, 1263, 1184, 1140, 1086, 1040, 1024, 843, 808, 737 cm-1; HRMS (EI) Calcd for C9H18B10O: 250.2362. Found: 250.2449.
【実施例２】
【００２５】
１−（４−メトキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン（化合物３）の合成方法
続いて窒素雰囲気下、化合物２番(0.75 g, 3.0 mmol)に50 mlの無水テトラヒドロフランを加えた後、0℃で1.57 mM、n-ブチルリチウム(2.3 ml, 3.6 mmol)をゆっくり滴下し、室温で１時間撹拌した。その後、クロロギ酸メチル(0.28 ml, 3.6 mmol)を加え、室温で５時間撹拌させた。その後溶媒を減圧留去し、粗生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、ヘキサンと酢酸エチル(10 : 1) を展開溶媒にしてフラッシュシリカゲルカラムクロマト分離により単離精製し、化合物３番を８９％の収率で得た。以下の分析結果から、表記の化合物１−（４−メトキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.06 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6..66 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.63 (s, 3H); HRMS (EI) Calcd for C11H20B10O3: 308.3880. Found: 308.3821.
【実施例３】
【００２６】
１−（４−ヒドロキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン（化合物４）の合成方法
続いて窒素雰囲気下、化合物３番(0.62 g, 2.0 mmol)に40 mlの無水ジクロロメタンを加えた後、0℃で三臭化ホウ素(0.38 ml, 4.0 mmol)をゆっくり滴下し、0℃で５時間撹拌した。その後溶媒を減圧留去し、粗生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、ヘキサンと酢酸エチル(10 : 1) を展開溶媒にしてフラッシュシリカゲルカラムクロマト分離により単離精製し、化合物４番を１００％の収率で得た。以下の分析結果から、表記の化合物１−（４−ヒドロキシフェニル）−１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボランであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.06 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6..66 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.63 (s, 3H); HRMS (EI) Calcd for C10H18B10O3: 294.3611. Found: 294.3610.
【実施例４】
【００２７】
１−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼン（化合物５）の合成方法
続いて化合物４番(0.44 g, 1.5 mmol)と１、１１−ジブロモテトラエチレングリコール(0.72 g, 2.25 mmol)と炭酸カリウム(0.63 g, 4.5 mmol)に20 mlのアセトンを加えて１日加熱還流した。その後溶媒を減圧留去し、粗生成物をジエチルエーテルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、ヘキサンと酢酸エチル(2 : 1) を展開溶媒にしてフラッシュシリカゲルカラムクロマト分離により単離精製し、化合物５番を５５％の収率で得た。以下の分析結果から、表記の化合物１−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.06 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6..66 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.76-3.80 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.63-3.67 (m, 8H), 3.43 (t, J = 6.4 Hz, 2H); 13C NMR (500 MHz, CDCl3) d 159.0, 128.1, 114.0, 71.2, 70.8, 70.7, 70.6, 70.5, 69.6, 67.4, 54.1, 30.3;  HRMS (EI) Calcd for C18H33B10O6Br: 533.4704. Found: 533.4701.
【実施例５】
【００２８】
１−（１２−ギ酸−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼン（化合物６）の合成方法
続いて化合物５番(0.37 g, 0.7 mmol)と水酸化カリウム(0.2 g, 3.5 mmol)に 20 mlのテトラヒドロフランと水(1 : 1)を加えて１日攪拌した。その後溶媒を減圧留去し、粗生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルを展開溶媒にしてフラッシュシリカゲルカラムクロマト分離により単離精製し、化合物６番を１００％の収率で得た。以下の分析結果から、表記の化合物１−（１２−ギ酸−１，１２−カルボラン）−４−（１−ブロモ）−テトラエチレングリコキシベンゼンであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.05 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6..67 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 4.04 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.76-3.80 (m, 4H), 3.63-3.67 (m, 8H), 3.43 (t, J = 6.4 Hz, 2H); HRMS (EI) Calcd for C17H31B10O6Br: 519.4435. Found: 519.4433.
【実施例６】
【００２９】
１２−（４−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−フェノキシ）−テトラエチレングリコール−ジスルフィド（化合物７）の合成方法
続いて化合物６番(0.1 g, 0.2 mmol)とチオ尿素(0.06 g, 0.8 mmol)に20 mlのエタノールを加えて、６時間加熱還流する。その後、3 mlの１０％水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、３時間過熱還流する。その後、反応溶液を中和させ、粗生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、化合物７番を１００％の収率で得た。。以下の分析結果から、表記の化合物１２−（４−（１２−ギ酸メチルエステル−１，１２−カルボラン）−フェノキシ）−テトラエチレングリコール−ジスルフィドであることを確認した。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.05 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 6..67 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 4.04 (t, J = 4.9 Hz, 4H), 3.76-3.78 (m, 4H), 3.56-3.70 (m, 20H), 2.83 (t, J = 4.0 Hz, 4H); HRMS (EI) Calcd for C17H31B10O6Br: 943.2110. Found: 943.2104.
【実施例７】
【００３０】
金基板上に自己組織化膜を形成させた。この自己組織化膜にアミノ修飾したＤＮＡと縮合剤として4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride （ＤＭＴ−ＭＭ） を用いて金基板上でアミド反応を行った。カルボン酸と縮合剤（ＤＭＴ−ＭＭ）により形成される中間体を考慮すると、カルボランの立体効果により、ＤＮＡの一級アミン部位が中間体に近づくのに有利であると考えられる。このプローブＤＮＡに相補する塩基配列を持ったターゲットＤＮＡが20 mM MgCｌ2水溶液中で相補対を形成することを表面プラズモン共鳴法により観察した（図１）。この結果により前記化合物が金表面に固定化されたことが確認された。
なお、プローブＤＮＡの配列は、ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＧＴであった。
比較例１
【００３１】
比較例に従来から自己組織化膜として用いられていたカルボンラン化合物を有していない
ＣＯＯＨ基を置換基として有するテトラエチレングリコキシベンゼンを主鎖にもつ化合物の自己組織化膜を用いて同様の実験を行なった。その結果、前記実施例１の結果に比較して反射率が低い結果となっている（図２）。両者の結果を対比すると、本発明のカルボラン化合物を有する自己組織化膜の効果が確認できる。
プローブＤＮＡについては、実施例７の場合と同じく、ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＡＧＴＣＡＡＧＡＧＧＴであった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の自己組織化膜のプローブによるプラズモン共鳴法の結果を示す図。
【図２】本発明の自己組織化膜のプローブと比較例のプローブによるプラズモン共鳴法の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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