(57)【要約】【課題】  神経変性疾患の緊急処置に有用な医学的手法の提供。【解決手段】  レピノタンまたは生理学的に許容されるレピノタンの塩を含有する医薬組成物と体液内のレピノタンまたはその代謝産物の濃度を測定する手段とを包含するキットおよびレピノタンまたは生理学的に許容されるレピノタンの塩を含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩、および生理学的に許容される酸を含有する、固形状医薬組成物。
【請求項２】
活性化合物の重量比が０．０１〜１５重量％であり、酸の重量比が０．５〜１５重量％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
活性化合物としてレピノタン塩酸塩を、および酸としてクエン酸または酒石酸を含有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
活性化合物、酸、およびさらに医薬用添加剤を水および／またはその他の適当な溶媒に溶解し、要すればその溶液を滅菌し、次にその溶液を凍結乾燥する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって得られる組成物。
【請求項６】
レピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩、およびリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸および酒石酸から構成される群から選択される酸の１種またはそれ以上を含有する注入用液剤。
【請求項７】
酸がクエン酸または酒石酸である、請求項６に記載の注入用液剤。
【請求項８】
レピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩、およびリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸および酒石酸から構成される群から選択される酸の１種またはそれ以上を含有する注入用液剤の製造方法であって、水または等張電解質溶液を請求項５に記載の組成物に添加することからなる方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって得られる注入用液剤。
【請求項１０】
注入用液剤を調製するための、請求項５に記載の組成物の使用。
【請求項１１】
式：
【化１】
2005232189.tif 000004
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レピノタンまたは生理学的に許容されるレピノタンの塩を含む医薬組成物を含有するキット、および体液中のレピノタンまたはその代謝産物の濃度を測定する方法、およびレピノタンまたは生理学的に許容されるレピノタンの塩を含有する新規医薬組成物、およびその製造方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者が神経的および機能的な長期欠陥に到ることの多い脳卒中および頭蓋脳損傷のような神経変性疾患の緊急処置には、有効であると世界的に認められた処置の原則は今までのところ存在しない。虚血性発作後３時間以内に血栓溶解剤（例えばt−ＰＡ）を使用すること、または外傷性クモ膜下出血の患者にニモジピンを使用すること、を除いて病理生理学的カスケードを適切に配慮した医学的手法は依然存在しない。
【０００３】
欧州特許公開第０３５２６１３号は、中枢神経系疾患、特に脳卒中を処置するための２−［４-（｛[（２Ｒ）−クロマン−２−イル]メチル｝アミノ）ブチル］−１，２−ベンズイソチアゾール−３（２Ｈ）−オン １，１−ジオキシド（一般名：レピノタン）およびレピノタンの塩を開示している（特許文献１）。
【０００４】
ドイツ特許公開第１９５４３４７６号は、レピノタンとその塩が頭蓋脳損傷の処置に対して適切であることを記載している（特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】欧州特許公開第０３５２６１３号
【特許文献２】ドイツ特許公開第１９５４３４７６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多数の臨床研究では、レピノタンは健康人と脳卒中または頭蓋脳損傷後の患者において、良好な許容性を示している。さらに、現存する臨床試験結果は、神経学的および機能的欠陥（適用に依存して３ヶ月および６ヶ月後に）を改善することができる事実を証明している。特に血中濃度が約５−２０μg／Lの範囲内である患者の症例では、処置の結果はプラセボ処置を受けた患者の症例よりも著しい改善を示した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のキットを使用すれば特に良好な処置結果が得られる。このキットには、レピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩を含む医薬組成物および体液中のレピノタンまたはその代謝産物の濃度を測定する手段が含まれている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のキットを使用すれば、遊離塩基または酸付加塩の形態にてレピノタンを活性化合物として含む薬剤を投与でき、また処置された患者の体液中のレピノタンまたはその代謝産物の実際の濃度を短時間に測定することができる。従って、本発明は、最適治療に必要なこともある用量調節を遅滞なく、かつ人材および装置を小規模として行うことができる。それ故、本発明のキットは神経変性疾患、特に脳卒中および頭蓋脳損傷の緊急な治療に顕著な進歩を与える。
【０００９】
本発明のキットに含まれる医薬組成物は、例えば錠剤、コーティングした錠剤、丸剤、顆粒剤、エアロゾル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液剤，液剤または再構成で液剤にできる凍結乾燥剤として存在できる。活性化合物として、この医薬組成物はレピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩を含有する。ここでは、この活性化合物は混合物全体の約０．０５から９５重量％、好ましくは約０．５から９０重量％の濃度、すなわち処方された用量範囲を達成するために充分な重量で存在すべきである。活性化合物に加えて、本医薬組成物はさらに不活性で非毒性の医薬的に適切な添加剤を含有する。
【００１０】
「レピノタン」は次式の構造式で示される：
【化１】
2005232189.tif 000002
【００１１】
レピノタンの「生理学的に許容される塩」は、レピノタンと鉱酸、カルボン酸またはスルホン酸との塩でありうる。レピノタンの好適な塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、プロピオン酸，乳酸、酒石酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸または安息香酸との塩である。レピノタン塩酸塩は殊に好適である。
【００１２】
「添加剤」の選択は製剤の様式に依存する。指摘しうる添加剤は例えば、水、非毒性有機溶媒、例えばパラフィン（石油画分など）、植物油（南京豆油、ゴマ油など）、アルコール（エチルアルコール、グリセリンなど）、担体、例えば粉砕した天然鉱物（カオリン、粘土、タルク、白亜など）、粉砕した合成鉱物（高度に分散した珪酸、珪酸塩など）、糖類（ショ糖、乳糖、デキストロースなど）、乳化剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテルなど）、分散剤（リグニン亜硫酸廃液、メチルセルロース、澱粉、ポリビニルピロリドンなど)、および滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸，硫酸ナトリウムなど）であることができる。
【００１３】
本発明のキットには好ましくは、活性化合物を含有する注入用溶液（液剤）、または水か等張電解質溶液かを添加すれば注入用液剤を調製できる固形状医薬組成物が医薬組成物として包含される。
【００１４】
好適な固形状医薬製剤は凍結乾燥剤であり、これは水か等張電解質溶液かを添加して、例えば注入用液剤に再構成できる。本凍結乾燥剤では、活性化合物の貯蔵安定性が増大しており、また凍結乾燥剤からは、患者に直接使用するのに適した粒子不含溶液、例えば注入液剤を無菌条件下に容易かつ迅速に製造することができる。活性化合物に加え、本凍結乾燥剤はさらに医薬的に適切な添加剤，特にマトリックス形成剤を含有させるのが有益である。
【００１５】
本発明における「マトリックス形成剤」には、グリシン、アラニンまたはアスパラギン酸のようなアミノ酸；ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンのようなペプチド：グルコースまたは乳糖のような単糖類；麦芽糖、蔗糖またはトレハロースのような二糖類；サイクロデキストリンまたはマルトデキストリンのような寡糖類；澱粉および澱粉誘導体または繊維素および繊維素誘導体のような多糖類；ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコールのような高分子マトリックス形成剤；塩化ナトリウムまたは炭酸カルシウムのような塩；マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールのような糖アルコール；も包含する。マンニトール、塩化ナトリウム、グリシン、蔗糖、麦芽糖および乳糖は好適である。マンニトールは非常に好適である。
【００１６】
この凍結乾燥剤を注入用液剤作製のために再構成するなら、等張性であるのが有利である。これは、例えば塩化ナトリウムのような電解質、マンニトールまたはグルコースを予め適量含む凍結乾燥剤によって、あるいは再構成および溶液の希釈に使用する等張性電解質溶液によって、達成できる。
【００１７】
「等張性電解質溶液」は例えば、０．９重量％塩化ナトリウム水溶液または５重量％ グルコース溶液である。
【００１８】
注入液剤内の活性化合物の量は、約０．１μｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５から５μｇ／ｍＬとなろう。
【００１９】
レピノタンおよびレピノタン塩の製造は欧州特許公開第０３５２６１３号に記載されている。レピノタン塩酸塩はこの文献の実施例９２Ｈに対応する。
【００２０】
本発明の塩は、レピノタン遊離塩基を適当な溶媒中で化学量論的または超化学量論的な量の目的とする塩に対応する酸と０℃から溶媒の沸点までの範囲内の温度で反応させれば得られる。適当な溶媒は例えば、水；メタノール、エタノール、２−プロパノールのような脂肪族アルコール；ジエチルエーテル、tert−ブチルメチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランのような脂肪族の開環または環状エーテル；または２−プロパノン、２−ブタノンのような脂肪族ケトン、およびこれらの混合物である。この塩は、この混合物から直接に固体として得られるが、要すれば溶媒を部分的または完全に留去した後に得られる；塩は、例えば前記溶媒または溶媒混合物中での再結晶または再沈殿によって精製できる。
【００２１】
本発明キットの医薬組成物は、レピノタンとその塩との混合物またはレピノタンの様々な塩の混合物を含有できる。
【００２２】
レピノタンまたはその生理学的に許容される塩は、不活性で非毒性の医薬的に適当な賦形剤または溶媒を使用して例えば錠剤、コーティング錠剤、丸剤、顆粒剤、エアロゾル剤、シロップ剤、乳液剤、懸濁液剤および液剤のような通常の製剤に公知の様式で変換できる。好適な活性化合物溶液または固形状医薬組成物は、例えば凍結乾燥物のように液剤に変換できるものである。ここに治療的に活性な化合物は、いずれの場合も混合物全体の約０．０５から９５重量％の濃度、好ましくは約０．５から９０重量％、すなわち指示された用量範囲を達成するために充分な量、で存在することになろう。
【００２３】
この製剤は、例えば活性化合物を溶媒および／または添加剤で増量することによって製造するが、もしも適当であるならば乳化剤および／または分散剤を使用し、また、ここに、例えば水を希釈剤として使用する場合には、要すれば補助溶剤として有機溶媒を使用することも可能である。
【００２４】
本発明のキットはさらに、体液中のレピノタンまたはその代謝産物の濃度を測定する手段を包含する。
【００２５】
使用した活性化合物ではなく、レピノタンの代謝産物を被分析物として測定することが有利なこともある。レピノタンの代謝産物は記載されている。
【００２６】
本発明における「体液」は例えば、尿、血液、および血清または血漿のような血液から得られる画分である。血液および血液から得られる画分は好適であり、殊に血漿が好ましい。
【００２７】
レピノタンの濃度は血液または血液から得られる画分において測定するが、血漿が好ましい。
【００２８】
「濃度測定に適する手段」は、例えば液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーのようなクロマトグラフ装置であるが、要すれば、質量分析スペクトロメータと組合せてもよい（ＬＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ）。同様にして例えばＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）のような免疫学的方法に従って操作する方法も適当である。この型の手段は公知である。
【００２９】
特に好適な手段は、処置の場所で採用できるものである（ベッドサイド試験または医療現場試験）。何故ならこれによって最適治療のために必要な用量調製を時間的遅滞なく、随意に達成できるからである。
【００３０】
本発明のキットにおいて、好適な方法は、ＷＯ−Ａ−９９／４６５９１号に記載されている被分析物濃度測定装置である。この装置はここに記載の方法で生産し、使用できる。それによって遅滞なしに小規模な人員および装置で最適治療を行うために必要となりうる用量調製が可能になる。
【００３１】
本発明のキットは、殊に神経変性疾患、特に脳卒中または頭蓋脳損傷の緊急処置に適している。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、好ましくは経口的にまたは非経口的、殊に舌下的または脈管内的に、通常の様式で投与される。経口投与の場合には、前記の添加剤とは別に、勿論、錠剤はクエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよび燐酸二カルシウムのような賦形剤も、たとえば澱粉、好ましくはバレイショ澱粉、ゼラチンなどのような様々な追加的物質とともに含有することができる。ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクのような滑沢剤も打錠のためにさらに添加できる。水性懸濁液剤の場合には、前記添加剤とは別に、本活性化合物を様々な嬌味増強剤または着色剤で処理できる。非経口投与の場合には、適当な液体担体物質を使用する活性化合物の液剤を採用できる。
【００３３】
一般に、脈管内投与の場合、有効な結果を得るためには、用量約０．０１μｇ／ｋｇ／時から１０μｇ／ｋｇ／時（毎時体重ｋｇ当りμｇまたはｍｇ）まで、好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ／時から２μｇ／ｋｇ／時までの量の活性化合物を投与することが有利であることが証明されている。いずれの場合も投与は個々の用量剤として行うことができる。
【００３４】
経口投与の場合には、活性化合物の日用量は０．００１から０．２ｍｇ／体重kg、好ましくは１０から１００μｇ／体重ｋｇである。
【００３５】
前記に拘らず適当であれば、すなわち、体重、投与経路の型、薬剤に対する個体の反応、製剤の様式、投薬の時間または間隔、などに依存して、前記用量範囲から外れることが必要な場合もある。そこで、症例によっては前記最低量以下で処置するのが適当であり、一方、他の症例では、前記最大限度を超えて処置しなければならない。比較的多量を投与する症例では、１日の間に多回の投薬に分けて分服させるのが得策である。
【００３６】
治療的に最も良好なレピノタン濃度に対して患者を安定化させるためには、患者に所定の初期用量でレピノタンを投与し、本発明の手段を使用して、所定の予め決定しておいた回数レピノタン濃度を検査して、必要ならば、以後の用量を調整する。
【００３７】
例えば、患者にレピノタンとして日用量１．２５ｍｇの速度でレピノタン塩酸塩溶液を注入する。６時間後、本発明の手段を用いてレピノタンの血中濃度が約１７μｇ／Ｌよりも高いか低いかを測定する。レピノタンの血中濃度が前記閾値濃度以下であれば、前記速度で注入を続行する。しかし、レピノタンの血中濃度が前記閾値を超えていれば、注入速度をレピノタンとして日用量０．５ｍｇに減速する。注入開始から１２時間後に、レピノタン血中濃度をもう一度検査する。今回も、レピノタン血中濃度が約１７μｇ／Ｌ以下であれば注入速度を維持し、レピノタン血中濃度が約１７μｇ／Ｌを超えていればレピノタン日用量を０．６２５ｍｇまたは０．２５ｍｇに注入速度を低下させる。こうして、最大数の患者をレピノタン血漿中濃度の好ましい治療用の用量範囲、約５から２０μｇ／Ｌに維持することができる。
【００３８】
さらに、別の側面では、本発明はレピノタンまたはその生理学的に許容できる塩と、生理学的に許容される酸と、を含有する固形状医薬組成物に関する。
【００３９】
驚くべきことに、生理学的に許容される酸の添加によって、レピノタンまたはその生理学的に許容できる塩を含有する固体医薬組成物の貯蔵安定性が向上することが明らかである。
【００４０】
本発明の生理学的に許容される酸は、例えばリンゴ酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、安息香酸、コハク酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、グルタミン酸、グリコール酸、馬尿酸、マレイン酸、乳酸、硫酸、ソルビン酸、酒石酸または桂皮酸である。リンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸および酒石酸は好適である。クエン酸および酒石酸は、殊に好適である。
【００４１】
本発明の作用は、殊に本活性化合物、すなわちレピノタンまたはその生理学的に許容される塩が組成物全重量の０．０１−１５重量％を占め、かつ、生理学的に許容される酸が組成物全重量の０．５−１５重量％を占める、固形状医薬組成物で達成される。
【００４２】
レピノタン塩酸塩およびクエン酸または酒石酸を含有する固形状医薬組成物は、本発明のために特別に好適である。
【００４３】
本発明による固形状医薬組成物は、常法に従って製造できる。
【００４４】
本発明の別な側面は、レピノタンまたはその生理学的に許容できる塩と生理学的に許容される酸とを含む、凍結乾燥剤に関するが、ここに好適な活性化合物はレピノタン塩酸塩であり、好適な酸はリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸および酒石酸であるが、クエン酸および酒石酸は殊に好適である。これに加えて、本凍結乾燥剤は、例えば前記マトリックス形成剤などの、医薬的添加剤を有利に含有することができる。
【００４５】
例えば、本凍結乾燥剤を製造するには、前記量のレピノタンまたはレピノタン塩、生理学的に許容される酸、および要すれば別の医薬用添加剤を、水および／または他の適当な溶媒に溶解し、滅菌し、適当な容器に充填し、凍結乾燥する。
【００４６】
本発明の意味における適当な溶媒は、例えば氷酢酸またはｔｅｒｔ−ブタノールである。
【００４７】
この溶液は、常法によって５℃から３５℃、好ましくは２０℃から２５℃の温度で製造できる。本発明の溶液を滅菌とは、例えば、ポリエーテルスルホンまたはナイロン６.６などの適当なフィルター素材製の最大ポア０．２μmのフィルターを通過させる無菌濾過などによってこの溶液を無菌の状態に変換することを意味する。
【００４８】
この凍結乾燥のために適当な容器は、例えば、吹き込み成形したガラスビンまたは管状のガラスビンである。分注する溶液の容量は０．２ｍＬと２０ｍＬとの間、好ましくは０．５ｍＬと５ｍＬとの間であり、殊に好ましくは０．７ｍＬと３．０ｍＬとの間である。
【００４９】
この溶液は容器内で凍結乾燥する。これには、溶液を入れた容器を予め冷却してあるか、冷却していない棚板（shelf plate）の上に置き、凍結する。続けて行う主乾燥は、室圧０．０５ミリバールから１．８ミリバールの真空下に、棚板温度−４０℃ から＋６０℃で行う。事後乾燥を、室圧１マイクロバールから１．８ミリバール、棚板温度−２０℃ から＋７０℃で行う。
【００５０】
あるいは、この凍結乾燥工程を国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０７０３４号に記載の方法によって行うこともできる。この凍結乾燥によって、前記組成物の貯蔵に安定な凍結乾燥剤が形成される。
【００５１】
本発明はさらに、レピノタンまたはレピノタンの生理学的に許容される塩、およびリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸および酒石酸から構成される群から選択された酸、好ましくは、クエン酸または酒石酸から構成される群から選択された酸の１種またはそれ以上を含有する注入用溶液に関する。
【００５２】
本発明の注入用液剤は予期以上の高度な貯蔵安定性を示す。
【００５３】
本発明における注入用液剤は、主に溶媒としての水を含む溶液であって、通常は２５０から５００ミリオスモル／ｋｇ、好ましくは、２８０から３５０ミリオスモル／ｋｇの浸透圧重量モル濃度を有する。この注入用液剤の前記浸透圧重量モル濃度は、例えば塩化ナトリウム、マンニトールまたはグルコースの必要量が既に固体医薬組成物に入れてあれば、これを水で再構築および／または希釈するか、あるいは必要量のこれらの物質を再構築媒体／希釈媒体に添加すれば、達成できる。注入用液剤のレピノタン濃度は、通常レピノタン０．１から５００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５から５μｇ／ｍＬの溶液である。この注入用液剤は、２０℃でｐＨが３．５から５、好ましくは約４になるのに充分な酸を含有する。
【００５４】
通常、この溶液は室温で添加する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
実施例１：レピノタン塩酸塩含有組成物の凍結乾燥剤
レピノタン塩酸塩５５ｍｇ（レピノタン５０ｍｇ相当）、マンニトール２０ｇおよびクエン酸３．７ｇの混合物を、水で１０００ｍＬとした。この水溶液を最大ポア径０．２μｍのポリエーテルスルホン製フィルターで滅菌濾過し、筒状ガラスビンに分注した。この溶液の注入量は１ｍＬであった。
【００５６】
この溶液を筒状ガラスビン中で凍結乾燥した。そのために、室温で溶液を注入した筒状ガラスビンを凍結乾燥機の棚板上に置いて、−４０℃で凍結した。続いて室圧０．２ｍｂａｒの真空下に、棚板温度０℃で主乾燥を行った。事後乾燥は室圧１０μｂａｒ、棚板温度４０℃で行った。この凍結乾燥によって貯蔵安定性の高い最終産物が形成された。
【００５７】
これとは別に、この凍結乾燥は、国際特許出願ＰＣＴ/ＥＰ００/０７０３４号に記載の方法に従って行うこともできる。
【００５８】
実施例1に記載の方法に準じて、レピノタン０．２５ｇ、０．６２５ｇ、１．２５ｇおよび２．５ｇに対応するレピノタン塩酸塩各々０．２７ｇ、０．６８１ｇ、１．３６ｇおよび２．７３ｇを含有する凍結乾燥剤を、実施例１に使用した所定量のマンニトール、クエン酸および水を使用して、製造した。
【００５９】
実施例２：レピノタン塩酸塩含有注入用液剤
実施例１に記載の凍結乾燥産物から、０．９重量％ＮａＣｌ溶液を用いて凍結乾燥産物を再構成し、次にこの溶液で全容積５００mlに希釈することによって、使用準備完了注入用液剤を製造する。この使用準備完了液剤は、室温では少なくとも３０時間の貯蔵に当って化学的に安定であって、すなわち、この溶液はその時点で未だに少なくとも９０％の不変化レピノタンを含有する。
【００６０】
実施例３：マイクロタイタープレート上、ＥＬＩＳＡによるレピノタンの測定
この試験は、競合ＥＬＩＳＡに基づいて行う。レピノタンに類似するハプテンのプロテイン複合体と、レピノタンの化学構造に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体ＦａｂまたはＦａｂ２断片の定常量と、レピノタン含有標品の定常容とを反応させる。結合したプロテイン複合体と、遊離のプロテイン複合体との比率から、既知濃度のレピノタンで並行してプロットした検量曲線を用いて被検標品内レピノタン濃度を測定できる。
【００６１】
ヤギＩｇＧをモル比１：７．５で後記のレピノタン類似体に化学的に結合した。この複合体をｐＨ＝９．６の０．１Ｍ−炭酸ナトリウム緩衝液中３７℃で１時間、マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢなど）中でインキュベーションした。次に、これを燐酸緩衝カゼイン(１％)含有食塩水溶液を用いて室温で３０分間ブロックした。続いて、トゥイーン(０．０５％)含有燐酸緩衝食塩水溶液で３回洗浄した。
【００６２】
この方法で製造したプレート上で、競合試験を行うことができる。そのため、標品１００μＬをマイクロタイターウェルに注入し、抗体溶液（マウス抗レピノタン抗体１０ｎｇ／ｍＬ燐酸緩衝食塩水溶液）１００μＬで処理する。この混合物を室温で１時間インキュベーションする。洗浄緩衝液（前記参照）で３回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１：１、Ｚｙｍｅｄヤギ抗マウスＩｇＧ、１：１０００希釈）に結合した次段反応用二次抗体をマイクロタイターウェルにピペットで入れる。これは、レピノタン類似体ハプテン複合体と結合したレピノタン特異的マウス抗体に結合する。このようして生成したレピノタン特異的マウス抗体結合物の量と、間接的に標品内遊離レピノタンの量とが比例する。３回洗浄して、過剰な抗体−酵素複合体を洗い去り、酵素の基質（ＴＭＢ）を添加後、残留する結合量を光学的に反応速度論的な測定を行う。ここに示すプロトコルを用いて、１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬまでのレピノタン濃度を適当なカリブレータを用いて測定できる。
【００６３】
実施例４：ベッドサイドでのレピノタン検査
このレピノタン検査は集中治療室など院内での使用を意図し、全血、血清または血漿中のレピノタン濃度が所定の閾値濃度約１７ｎｇ／ｍＬ以上かまたはそれ以下かを測定するものである。これは可視的に表示されるワンス・オフ（once-off）検査である。
【００６４】
装置の概要：
この検査は、競合的免疫学的過程に基づく前記低分子の測定法である。表示機構としては、酵素的な光学スペクトル法の代わりに、コロイド金粒子の反射信号を使用する。通常の免疫学的検定法を行うために必要な、装置部品および機械的操作は全て、プラスチック製の装置に組み込んである。この装置には、血清から血球を分離する機構と、このようにして分離した血清の一定量から正確に測定するための機構とを含む。緩衝液容器には、反応に必要で、系内で毛細管運動を可能にする、液相を含有する。抗レピノタン抗体およびハプテンヤギＩｇＧ−金複合体は、このプラスチック製装置の反応槽内で凍結乾燥する。毛細管末端の混合室および免疫クロマトグラフィー試験片をもってこの系が完成する。ロバ抗マウス抗体およびウサギ抗ヤギ抗体の試験片に、静的反応ゾーンを適用する。
【００６５】
レピノタン不在時には、ロバ抗マウス抗体が金複合体の大部分を捕捉し、赤色のゾーンを形成する。試験すべき標品中のレピノタン濃度が増加すると、抗レピノタン抗体に比例して置換された金複合体は、ウサギ抗ヤギ反応に捕捉される。
【００６６】
免疫クロマトグラフィー試験片の末端には吸収ゾーンがあり、その開始点には水溶性色素を適用する。この色素は液の先端とともに前進して、吸収ゾーン末端まで移動させる。これが検査反応の終了を示す。
【００６７】
この検査の所要時間は標品の仕込みから結果の読み出しまで約１５分間である。この検査は血清約１５μＬの取得が保証される全血１００−１５０μＬで実施できる。
【００６８】
この試験装置の製造には次の反応成分が必要である：
ａ）モノクローナル抗レピノタン抗体
ｂ）金−レピノタン類似体−ヤギＩｇＧ複合体
ｃ）コロイド金、２０ｎｍ
ｄ）ニトロセルロース膜
ｅ）ヤギ抗マウス抗体
ｆ）ウサギ抗ヤギ抗体
ｇ）標準レピノタン
ｈ）燐酸緩衝食塩水検定緩衝液中、０．２％トリトンＸ３０５
ｆ）燐酸緩衝食塩水凍結乾燥緩衝液中、０．４％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、２％ ＢＳＡ、２．５％蔗糖、１．２５％トレハロース
ｇ）２．５ｃｍシンク部材
ｈ）プラスチック裏板、幅５．３ｃｍ、厚さ８ｍｉｌ
ｉ）ヒト血清
【００６９】
検査の操作法：
全血約１５０μＬ（5滴）、血清または血漿を標品プレートに載せる。
装置を約３分間水平に維持する。添加フラスコのハンドルを約９０度回転して、装置の底部に水平にする。次に装置を水平な位置に室温で１５分間貯蔵する。表示ウィンドウに青色の点が現れた時に、検査が終了し、結果を読み取ることができる。
【００７０】
標品の仕込みおよび添加フラスコの操作を除けば、全検査にわたって標品または装置の操作はこれ以上不要である。それ故、この検査は技術者でない者でも実施できる。
【００７１】
結果の解釈：
ＷＯ−Ａ−９９／４６５９１号に記載の通り、ウィンドウＡおよびウィンドウＢ内にあるバンドの濃度２種を比較すれば、レピノタン濃度の簡単で半定量的な測定が可能になる。ウィンドウＡのシグナルがウィンドウＢのシグナルよりも強ければ、レピノタン濃度は閾値よりも高く、シグナルの強さが逆の場合には閾値以下である。この閾値は凍結乾燥物内の抗レピノタン抗体濃度と金−レピノタン類似体ヤギＩｇＧの濃度との比率によって確定することができる。
【００７２】
金−レピノタン類似体ヤギＩｇＧ複合体に含まれているレピノタン類似体は、次式で示される化合物である：
【化２】
2005232189.tif 000003
【００７３】
この化合物は新規化合物であって、ＥＰ−Ａ−０３５２６１３号に記載の方法に従って、例えば、レピノタンと６−ブロモヘキサンカルボン酸３級ブチルエステルとを、塩基存在下に適当な溶媒中で反応させ、続いて酸でエステルを分解させて製造できる。