(57)【要約】【課題】  白血球であるかゴミであるかの判別を正確に行えるようにする。【解決手段】  蛍光染色した白血球Ａに励起光を照射すると、蛍光が発生して、図３(a) に示す強度分布信号ｆ（ｘ）が得られる。この信号ｆ（ｘ）を微分し（同図(b) 参照）、強度分布信号ｆ（ｘ）とその微分信号ｆ’（ｘ）とを合成すると同図(c) に示すような形状の合成信号ｇ（ｘ）が得られる。この信号について、第１閾値Ｃ１を超える部分（符号Ｄ１参照）と第２閾値Ｃ２を超える部分（Ｄ２或いはＤ２−Ｄ１）と求める。このとき、谷部Ｇ１よりも外側の部分（符号Ｄ３に示す部分）は検出しないようにしておく。その結果、Ｄ２或いはＤ２−Ｄ１の領域を正確に知ることができ、測定している蛍光粒子が白血球であることを正確に判別することができる。【選択図】  図３
2005274268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
収容されている蛍光粒子に励起光を照射するための励起光光源と、前記励起光の照射により発生した蛍光を捕捉してその強度分布を測定する蛍光測定手段と、を設けて構成した蛍光粒子判別装置において、
前記蛍光測定手段からの強度分布信号を微分した微分信号を出力する微分手段と、
前記強度分布信号に前記微分信号を加算することに基づき、ピーク部と該ピーク部に連なる立ち上がり部とからなる略山型であって該立ち上がり部の外側には谷部を有する合成信号を出力する加算手段と、
該合成信号の値が第１閾値を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値を超えている前記ピーク部を検出するピーク部検出手段と、
該ピーク部検出手段により検出した前記ピーク部に近接する側から前記谷部に近接する側まで、前記合成信号の値が第２閾値を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する立ち上がり部検出手段と、
特定の蛍光粒子であるかを判別する際に基準となる基準値を発生させる基準値発生手段と、
前記立ち上がり部検出手段の検出結果と前記基準値発生手段からの基準値に基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する蛍光粒子判別手段と、
を設けて構成した蛍光粒子判別装置。
【請求項２】
前記ピーク部検出手段は、前記ピーク部の分布領域の大きさを検出し、
前記蛍光粒子判別手段は、前記立ち上がり部検出手段が検出した前記立ち上がり部の分布領域の大きさ、前記ピーク部検出手段が検出した前記ピーク部の分布領域の大きさ及び前記基準値発生手段からの基準値に基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判断する、
ことを特徴とする請求項１に記載の蛍光粒子判別装置。
【請求項３】
前記第２閾値は、前記第１閾値より小さく、かつ、前記谷部の外側部分における前記合成信号の値にほぼ等しい、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光粒子判別装置。
【請求項４】
前記ピーク部検出手段は、第１閾値を出力する第１閾値発生手段と、前記合成信号の値が前記第１閾値を超えているかどうかを判断する第１閾値比較手段と、により構成され、
前記第１閾値発生手段は、前記蛍光粒子に対する前記励起光の照明状態に応じた前記第１閾値を演算出力する、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛍光粒子判別装置。
【請求項５】
前記ピーク部を含む所定の領域について前記合成信号の値を記憶するメモリ手段、を少なくとも１つ備え、
前記立ち上がり部検出手段は、前記メモリ手段に記憶されている合成信号の値が第２閾値を超えているかどうかを前記ピーク部に近接する側から微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の蛍光粒子判別装置。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の蛍光粒子判別装置と、
該蛍光粒子判別装置による判別結果に基づき、特定の蛍光粒子の数をカウントする蛍光粒子カウント手段と、
を設けて構成した蛍光粒子計数装置。
【請求項７】
蛍光粒子に励起光を照射する工程と、
該励起光の照射に基づき発生した蛍光を捕捉してその強度分布を測定する工程と、
該測定により求めた強度分布信号を微分して微分信号を出力させる工程と、
前記強度分布信号に前記微分信号を加算することに基づき、ピーク部と該ピーク部に連なる立ち上がり部とからなる略山型であって該立ち上がり部の外側には谷部を有する合成信号を出力させる工程と、
該合成信号の値が第１閾値を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値を超えている前記ピーク部を検出する工程と、
該ピーク部に近接する側から前記谷部に近接する側まで、前記合成信号の値が第２閾値を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する工程と、
該立ち上がり部の分布領域の大きさについての検出結果と基準値に基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する工程と、
からなる蛍光粒子の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象の蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する蛍光粒子判別装置、該蛍光粒子判別装置を備えた蛍光粒子計数装置、及び蛍光粒子の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光染色した粒子に励起光を照射して粒子の種類を判別したり、粒子の個数を計測したりすることが行われている。
【０００３】
例えば、医療の分野では、血液から血小板及び赤血球を抽出した血小板製剤および赤血球製剤が使用されているが、これらの血小板製剤や赤血球製剤には白血球が残存していない方が好ましいため、製造過程において白血球の除去が行われる。そして、血小板製剤や赤血球製剤から白血球が除去されたかどうかの確認のための白血球の計数方法が種々提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
ここで、図１２は、白血球を計数する従来装置の構造の一例を示すブロック図であり、図１３は、白血球の計数方法の一例を示すフローチャート図である。図１２中の符号１００は、血小板製剤等を入れるための撮像用容器を示し、符号１０１は、該撮像用容器１００にレーザビームを照射するレーザ光源を示し、符号１０２はミラーを示し、符号１０３はＣＣＤカメラを示す。
【０００５】
このような装置を用いて、血液中や血小板製剤中や赤血球製剤中における白血球の数を計数するには、まず、血液や血小板製剤等に薬液（トライトンＸなどの界面活性剤）を入れて白血球以外のもの（血小板や赤血球など）を除去し（図１３のＳ２１参照）、次に、プロピディウム・イオダイド等の蛍光色素により白血球の蛍光染色を行う（Ｓ２２参照）。このように前処理した血小板製剤等を上述の撮像用容器１００に入れ、レーザ光源１０１にてレーザビーム（励起光）を照射すると（Ｓ２３参照）、白血球の像がＣＣＤカメラ１０３にて撮影される（Ｓ２４参照）。その画像は、コンピュータに取り込まれ、画像処理が施されて白血球の数が計数される（Ｓ２５参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−１８３３８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、ちりやほこり等の夾雑物が血液等に混入されている場合には、それらは界面活性剤によっても溶解されること無く残ってしまうため、白血球と夾雑物との判別が難しくなったり、白血球の計数精度が悪くなったりするという問題があった。
【０００８】
また、白血球の蛍光画像信号は、概ね図１４のｆ１（ｘ）で示す分布形状をしていて、夾雑物の蛍光画像信号は、例えば同図のｆ２（ｘ）で示す分布形状をしているが、符号Ｃ１で示す閾値と比較して両者を区別しようとしても区別が困難であり、また、符号Ｃ２で示す閾値と比較して両者を区別しようとした場合、閾値が低すぎてノイズの影響を受け易いという問題があった。
【０００９】
本発明は、蛍光粒子を精度良く判別できる蛍光粒子判別装置、該蛍光粒子判別装置を備えた蛍光粒子計数装置、及び蛍光粒子の判別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に係る発明は、図１に例示するものであって、収容されている蛍光粒子に励起光を照射するための励起光光源（３）と、前記励起光の照射により発生した蛍光を捕捉してその強度分布を測定する蛍光測定手段（４）と、を設けて構成した蛍光粒子判別装置（１）において、
前記蛍光測定手段（４）からの強度分布信号（ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ））を微分した微分信号（ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ））を出力する微分手段（５）と、
前記強度分布信号（ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ））に前記微分信号（ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ））を加算することに基づき、ピーク部と該ピーク部に連なる立ち上がり部とからなる略山型であって該立ち上がり部の外側には谷部（図３(c) の符号Ｇ１参照）を有する合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））を出力する加算手段（６）と、
該合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が第１閾値（図３(c) の符号Ｃ１参照）を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値（Ｃ１）を超えている前記ピーク部を検出するピーク部検出手段（７）と、
該ピーク部検出手段（７）により検出した前記ピーク部に近接する側から前記谷部（Ｇ１）に近接する側まで、前記合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が第２閾値（図３(c) の符号Ｃ２参照）を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値（Ｃ２）を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する立ち上がり部検出手段（８）と、
特定の蛍光粒子であるかを判別する際に基準となる基準値を発生させる基準値発生手段（１５）と、
前記立ち上がり部検出手段（８）の検出結果と前記基準値発生手段（１５）からの基準値とに基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する蛍光粒子判別手段（９）と、を設けて構成したことを特徴とする。
【００１１】
請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明において、前記ピーク部検出手段（７）は、前記ピーク部の分布領域の大きさを検出し、
前記蛍光粒子判別手段（９）は、前記立ち上がり部検出手段（８）が検出した前記立ち上がり部の分布領域の大きさ、前記ピーク部検出手段（７）が検出した前記ピーク部の分布領域の大きさ及び前記基準値発生手段（１５）からの基準値に基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判断する、ことを特徴とする。
【００１２】
請求項３に係る発明は、図３(c) に例示するように、請求項１又は２に記載の発明において、前記第２閾値（Ｃ２）は、前記第１閾値（Ｃ１）より小さく、かつ、前記谷部（Ｇ１）の外側部分における前記合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値にほぼ等しい、ことを特徴とする。
【００１３】
請求項４に係る発明は、図１に例示するように、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の発明において、前記ピーク部検出手段（７）は、第１閾値（Ｃ１）を出力する第１閾値発生手段（７０）と、前記合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が前記第１閾値（Ｃ１）を超えているかどうかを判断する第１閾値比較手段（７１）と、により構成され、
前記第１閾値発生手段（７０）は、前記蛍光粒子に対する前記励起光の照明状態に応じた前記第１閾値（Ｃ１）を演算出力する、ことを特徴とする。
【００１４】
請求項５に係る発明は、図５に例示するように、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の発明において、前記ピーク部を含む所定の領域について前記合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値を記憶するメモリ手段（１３）、を少なくとも１つ備え、
前記立ち上がり部検出手段（８）は、前記メモリ手段（１３）に記憶されている合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が第２閾値（Ｃ２）を超えているかどうかを前記ピーク部に近接する側から微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値（Ｃ２）を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する、ことを特徴とする。
【００１５】
請求項６に係る発明は、図１に例示するように、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の蛍光粒子判別装置（１）と、
該蛍光粒子判別装置（１）による判別結果に基づき、特定の蛍光粒子の数をカウントする蛍光粒子カウント手段（１０）と、を設けて構成したことを特徴とする蛍光粒子計数装置に関する。
【００１６】
請求項７に係る発明は、蛍光粒子に励起光を照射する工程と、
該励起光の照射に基づき発生した蛍光を捕捉してその強度分布を測定する工程と、
該測定により求めた強度分布信号（ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ））を微分して微分信号（ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ））を出力させる工程と、
前記強度分布信号（ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ））に前記微分信号（ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ））を加算することに基づき、ピーク部と該ピーク部に連なる立ち上がり部とからなる略山型であって該立ち上がり部の外側には谷部（Ｇ１）を有する合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））を出力させる工程と、
該合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が第１閾値（Ｃ１）を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値（Ｃ１）を超えている前記ピーク部を検出する工程と、
該ピーク部に近接する側から前記谷部（Ｇ１）に近接する側まで、前記合成信号（ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ））の値が第２閾値（Ｃ２）を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値（Ｃ２）を超えている前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出する工程と、
該立ち上がり部の分布領域の大きさについての検出結果と基準値とに基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する工程と、からなる蛍光粒子の判別方法に関する。
【００１７】
なお、括弧内の番号などは、図面における対応する要素を示す便宜的なものであり、従って、本記述は図面上の記載に限定拘束されるものではない。
【発明の効果】
【００１８】
請求項１及び７に係る発明によれば、第２閾値を超えているかどうかの判別は、前記ピーク部に近接する側から前記谷部に近接する側までの部分について行われるだけで、該谷部の外側の部分については行われないため、該谷部の外側のノイズの影響を回避でき、蛍光粒子の判別を正確に行うことができる。
【００１９】
請求項２に係る発明によれば、前記蛍光粒子判別手段による判別を、前記立ち上がり部の分布領域の大きさだけでなく、前記ピーク部の分布領域の大きさに基づいても行うようになっているため、その判別精度を高めることができる。
【００２０】
請求項３に係る発明によれば、前記第２閾値は、前記第１閾値より小さく、かつ、前記谷部の外側部分における前記合成信号の値にほぼ等しい値であるため、立ち上がり部の分布領域の大きさを正確に検出することができ、それに伴い、白血球と共雑物とを明確に識別することができる。
【００２１】
請求項４に係る発明によれば、前記第１閾値発生手段は、前記蛍光粒子に対する前記励起光の照明状態に応じた第１閾値を演算出力するため、該照明状態が一定でなくても蛍光粒子を正確に判別することができる。
【００２２】
請求項５に係る発明によれば、前記立ち上がり部検出手段は、前記メモリ手段に記憶されている合成信号の値に基づき前記立ち上がり部の分布領域の大きさを検出するように構成されているため、メモリ手段に記憶されている合成信号を保存した形で第２閾値による立ち上がり部分の検出処理を行うことが出来、第２閾値を変更した形の立ち上がり部分の検出処理を繰り返し行うことが出来る。これにより、最初に設定した第２閾値が適正でない場合でも、合成信号の演算を再度行うことなく、処理を継続することが出来る。
【００２３】
請求項６に係る発明によれば、蛍光粒子カウント手段により、蛍光粒子の計数を正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、図１乃至図１１に沿って、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００２５】
図１は、本発明に係る蛍光粒子判別装置及び蛍光粒子計数装置の構造の一例を示すブロック図であり、図２(a) は、白血球の蛍光強度分布（二次元分布）の一例を示す図であり、図２(b) は、夾雑物の蛍光強度分布（二次元分布）の一例を示す図である。また、図３(a) は、蛍光粒子の蛍光強度一次元分布（強度分布信号）の一例を示す図であり、図３(b) は、同図(a) の強度分布信号を微分した微分信号を示す図であり、図３(c) は、同図(a) に示す強度分布信号に同図(b) に示す微分信号を加算した合成信号を示す図である。さらに、図４は、白血球の合成信号と夾雑物の合成信号との違い等を説明するための波形図であり、図５は、本発明に係る蛍光粒子判別装置及び蛍光粒子計数装置の構造の他の例を示すブロック図であり、図６は、蛍光粒子の判別方法を説明するためのフローチャート図であり、図７は、蛍光粒子の判別方法を説明するための模式図である。また、図８は、蛍光粒子の計数方法の一例を説明するためのフローチャート図であり、図９は、本発明に係る蛍光粒子判別装置の構造の一例を示すブロック図であり、図１０は、その詳細構造を説明するためのブロック図である。さらに、図１１は、本発明の効果を説明するための図である。
【００２６】
本発明に係る蛍光粒子判別装置は、図１に符号１で示すように、収容されている蛍光粒子に励起光を照射するための励起光光源３と、を備えている。このような励起光の照射により蛍光が発生するが、蛍光測定手段４によって、該蛍光を捕捉してその強度分布、つまり、
・  図２(a) 及び(b) のｆ１（ｘ，ｙ）、ｆ２（ｘ，ｙ）に示すような二次元分布
或いは、
・  図３(a) のｆ（ｘ）に示すような一次元分布
を測定するように構成されている。なお、図１の符号２は、蛍光粒子（例えば、白血球）を収容するための蛍光粒子収容手段を示す。
【００２７】
また、本発明に係る蛍光粒子判別装置１は、図１に示すように、
・  前記蛍光測定手段４からの強度分布信号ｆ（ｘ，ｙ）或いはｆ（ｘ）を微分した微分信号ｆ’（ｘ，ｙ）或いはｆ’（ｘ）を出力する微分手段５と、
・  前記強度分布信号ｆ（ｘ，ｙ）或いはｆ（ｘ）に前記微分信号ｆ’（ｘ，ｙ）或いはｆ’（ｘ）を加算することに基づき合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）を出力する加算手段６と、
を備えている。ここで、合成信号ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ）は、図３(c) に例示するような信号であって、ピーク部と該ピーク部に連なる裾部（立ち上がり部）とからなる略山型をしており、該裾部の外側（つまり、合成信号の外側）には谷部Ｇ１を有している。
【００２８】
さらに、本発明に係る蛍光粒子判別装置１は、図１に示すように、
・  該合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値が第１閾値（図３(c) の符号Ｃ１参照）を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値Ｃ１を超えている前記ピーク部（図３(c) の符号Ｄ１参照）を検出するピーク部検出手段７と、
・  該ピーク部検出手段７により検出した前記ピーク部に近接する側から前記谷部Ｇ１に近接する側まで、前記合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値が第２閾値（図３(c) の符号Ｃ２参照）を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値Ｃ２を超えている前記裾部の分布領域の大きさを検出する裾部検出手段（立ち上がり部検出手段）８と、
・  特定の蛍光粒子（例えば、白血球）であるかを判別する際に基準となる基準値を発生させる基準値発生手段１５と、
・  前記裾部検出手段８の検出結果を前記基準値発生手段１５からの基準値と比較することに基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する蛍光粒子判別手段９と、
を備えている。
【００２９】
なお、本明細書において“微小部分”とは、図２のような二次元分布の場合には微小面積を持つ領域（同図においては１つ１つの長方形部分）を意味し、図４のような一次元分布の場合には微小長さを持つ区画（ｘ軸上の目盛りで区切られる区画）を意味するものとする。また、前記ピーク部検出手段７は、少なくともピーク部の位置（分布している位置）を検出するように構成されている。
【００３０】
ここで、前記蛍光粒子判別装置１の作用について図３を参照して説明する。
【００３１】
いま、図３に符号Ａで示す蛍光粒子に励起光が照射されて、前記蛍光測定手段４が一次元強度分布信号ｆ（ｘ）で示される蛍光強度分布を測定したとする（同図(a) 参照）。前記微分手段５は、その強度分布信号ｆ（ｘ）を微分して微分信号ｆ’（ｘ）を算出し（同図(b) 参照）、前記加算手段６は、一次元強度分布信号ｆ（ｘ）と微分信号ｆ’（ｘ）とを合成した合成信号ｇ（ｘ）を算出する（同図(c) 参照）。そして、前記ピーク部検出手段７は、該合成信号ｇ（ｘ）の値が第１閾値Ｃ１を超えているかどうかを判別することに基づき、第１閾値Ｃ１を超えている前記ピーク部Ｄ１を検出し、前記裾部検出手段８は、該ピーク部Ｄ１に近接する側から前記谷部Ｇ１に近接する側まで、前記合成信号ｇ（ｘ）の値が第２閾値Ｃ２を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値Ｃ２を超えている前記裾部の分布領域の大きさ（Ｄ２−Ｄ１の大きさ）を検出する。その後、前記蛍光粒子判別手段９は、前記裾部検出手段８の検出結果を前記基準値発生手段１５からの基準値と比較することに基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する。
【００３２】
例えば、白血球と夾雑物とが混在している状態のものに励起光を照射すると、白血球の蛍光強度分布は例えば図３(a) に示すような形状になるのに対し、夾雑物の蛍光強度分布は例えば裾の部分が広がった形状を示し、その場合の白血球の合成信号は、図４のｚ＝ｇ１（ｘ）に示す形状になるのに対し、夾雑物の合成信号は、同図のｚ＝ｇ２（ｘ）に示す形状を取る。したがって、第１閾値Ｃ１については両者の差は小さくても、第２閾値Ｃ２については両者の差は大きく、両者を正確に判別できることとなる。
【００３３】
ところで、前記蛍光粒子判別手段９は、前記裾部検出手段８の検出結果（つまり、前記裾部の分布領域の大きさ）に基づき判別を行うものであるが、該裾部検出手段８の検出結果以外の数値も加味して判別を行うようにしても良い。例えば、前記ピーク検出手段７によって（ピーク部の位置だけでなく）ピーク部の分布領域の大きさも検出するようにしておいて、前記裾部検出手段８が検出した前記裾部の分布領域の大きさ、前記ピーク部検出手段７が検出した前記ピーク部の分布領域の大きさ、及び前記基準値発生手段１５からの基準値に基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを前記蛍光粒子判別手段９が判別するようにしても良い。そのようにした場合には、（裾部の分布領域の大きさだけに基づき判別する場合よりも）判別精度を高めることができる。具体的には、裾部の分布領域の大きさをＳＬとし、ピーク部の分布領域の大きさをＳＨとした場合、前記蛍光粒子判別手段９は、
・  ＳＬ／ＳＨの比
・  （ＳＬ−ＳＨ）／ＳＨの比
・  （ＳＬ−ＳＨ）の値
等に基づき判別すると良い。この場合は、第１閾値及び第２閾値の２つの閾値を用いて判別を行っているが、もちろんこれに限られるものではなく、３つ以上の閾値を用いて判別を行うようにしても良い。
【００３４】
なお、図３(c) に例示するように、前記第２閾値Ｃ２は、前記第１閾値Ｃ１より小さく、かつ、前記谷部Ｇ１の外側部分（符号Ｄ３で示す部分であって、光励起による光放出が無い非蛍光部分）における前記合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値にほぼ等しい値にしておく（符号Ｅ参照）。一般に、白血球の合成信号及び共雑物の合成信号は、そのような第２閾値Ｃ２（つまり、前記谷部Ｇ１の外側部分における前記合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値にほぼ等しい閾値）のレベルで大きく異なるので（図４のｚ＝ｇ１（ｘ）及びｚ＝ｇ２（ｘ）参照）、白血球と共雑物とを明確に識別することができる。
【００３５】
ところで、上述したピーク部検出手段７は、図１に示すように、第１閾値Ｃ１を出力する第１閾値発生手段７０と、前記合成信号ｇ（ｘ）、ｇ（ｘ，ｙ）の値が前記第１閾値Ｃ１を超えているかどうかを判断する第１閾値比較手段７１と、により構成すると良い。また、前記第１閾値Ｃ１を超えている微小部分の数をカウントする第１カウント手段７２を設けても良い。上述した裾部検出手段８も同様であって、第２閾値Ｃ２を出力する第２閾値発生手段８０と、各微小部分について前記合成信号ｇ（ｘ）、ｇ（ｘ，ｙ）の値が前記第２閾値Ｃ２を超えているかどうかを判断する第２閾値比較手段８１と、により構成すると良い。また、前記第２閾値Ｃ２を超えている微小部分の数をカウントする第２カウント手段８２を設けても良い。
【００３６】
なお、第１閾値Ｃ１の最適値は、
・  前記蛍光粒子に対する前記励起光の照明状態、
・  被検体の種類、
・  界面活性剤と蛍光色素の作用の強さ（主に濃度で決まる）、
等によって異なる。例えば、蛍光色素の濃度が低いと合成信号の値が全体的に低くなるので、第１閾値Ｃ１もそれに応じて低くすべきである。なお、前記励起光の照明状態に応じて第１閾値Ｃ１の最適値が異なる場合とは、
・  該励起光の照射にムラがあり、ある部分と他の部分とで照明状態が異なる場合、
・  該励起光の照射強度が時間的に変化してしまい、ある照射タイミングと他の照射タイミングとで照明状態が異なる場合、
等を意味する。したがって、前記第１閾値発生手段７０は、前記照明状態等に応じた適正な第１閾値Ｃ１を演算出力するようにしておくと良い。例えば、上述のような励起光の照射ムラ（場所的なムラ）をセンサにより検知できるようにしておいて、該照射ムラに応じて第１閾値Ｃ１を場所的に変更したり、照射強度の時間的変化を検知できるようにしておいて、その強度変化に応じて第１閾値Ｃ１を変更できるようにしておくと良い。これにより、該照明状態等が一定でなくても蛍光粒子を正確に判別することができる。なお、かかる最適値を計算により求めるのは困難であるため、実験により求めておくと良い。例えば、幾つかの種類の界面活性剤や蛍光色素、幾つかの種類の被検体等に関して最適な第１閾値Ｃ１を実験的に求めておいて、その値をテーブルデータとして保存しておき、前記第１閾値発生手段７０は該テーブルデータから適宜第１閾値Ｃ１を読み出すようにしておくと良い。第２閾値Ｃ２の最適値も同様にしておくと良い。
【００３７】
また、上述のように、ピーク部の分布領域の面積ＳＨと、裾部の分布領域の面積ＳＬとの比ＳＨ／ＳＬを用いて蛍光粒子の判別を行う場合には、図１に示す基準値発生手段１５にてＳＨ／ＳＬの基準値を発生させ、前記蛍光粒子判別手段９のＳＨ／ＳＬ演算手段９０にてＳＨ／ＳＬの値（演算値）を演算し、ＳＨ／ＳＬ比較手段９１にて該適正値と該演算値とを比較するようにすると良い。
【００３８】
ところで、前記裾部検出手段８は、第２閾値Ｃ２を超えているかで裾部の分布領域の大きさを検出するようになっているが、裾部以外の部分が第２閾値Ｃ２を超えている場合もあり（例えば、図４にｚ＝ｇ１（ｘ）で示す実線曲線について符号Ｅで示す部分参照）、かかる部分までも検出してしまうと判別結果が間違ったものとなってしまうおそれがある。また、前記裾部の分布領域の大きさだけでなく、前記ピーク部の分布領域の大きさを加味して前記蛍光粒子判別手段９による蛍光粒子の判別が行われる場合、該判別に用いられる裾部の分布領域の大きさと、ピーク部の分布領域の大きさとは同じ蛍光粒子についてのものでなければならず、ある蛍光粒子についての裾部の分布領域の大きさと、別の蛍光粒子についてのピーク部の分布領域の大きさとに基づき判別を行った場合には、その判別結果は間違ったものとなってしまうおそれがある。これに対し、本発明においては、第２閾値を超えているかどうかの判別は、前記ピーク部に近接する側から前記谷部Ｇ１に近接する側までの部分について行われるだけで、該谷部の外側の部分Ｄ３については行われないため、該谷部の外側のノイズの影響を回避でき（或いは、別の蛍光粒子についての裾部の分布領域の大きさを検出してしまうことを回避でき）、蛍光粒子の判別を正確に行うことができる。例えば、蛍光粒子収容手段２に白血球（蛍光粒子）や夾雑物（白血球以外の細胞成分やちりやほこり）が収容されている場合、白血球と夾雑物とを正確に判別することができる。
【００３９】
なお、前記ピーク部を含む所定の領域についての前記合成信号の値を記憶するメモリ手段（図５の符号１３参照）を少なくとも１つ設けておいて、前記裾部検出手段８は、前記メモリ手段１３に記憶されている合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値が第２閾値Ｃ２を超えているかどうかを前記ピーク部に近接する側から微小部分毎に順次判別することに基づき、第２閾値Ｃ２を超えている前記裾部の分布領域の大きさを検出する、ようにすると良い。それにより、蛍光粒子の判別時間の短縮及び判別精度の向上を図ることができる。以下、具体的に説明する。
【００４０】
すなわち、まず、第１閾値Ｃ１を超えている微小部分の抽出を上述のようにピーク部検出手段７により行う（図６のＳ１参照）。そして、図７に“(1) ”で示す７個の微小部分が抽出されたとすると、各微小部分の上下左右に隣接する微小部分（未だ抽出されていない部分）のラベリング情報（アドレス情報）と合成信号値（各微小部分における合成信号の値）とがメモリ手段１３に格納され（図６のＳ２参照）、該格納された合成信号値に基づき第２閾値Ｃ２を超えている微小部分の抽出を裾部検出手段８により行う（図６のＳ３参照）。いま、図７に“(2) ”で示す微小部分が第２閾値Ｃ２を超えているとする。すると、それらの微小部分の上下左右に隣接する微小部分（未だ抽出されていない部分。以下、同じ。）につき、ラベリング情報及び合成信号値がメモリ手段１３に格納され（図６のＳ４、Ｓ２参照）、該格納された合成信号値に基づき第２閾値Ｃ２を超えている微小部分の抽出を裾部検出手段８により行う（図６のＳ３参照）。いま、図７に“(3) ”で示す微小部分が第２閾値Ｃ２を超えていて、“×３”で示す微小部分が第２閾値Ｃ２を超えていないとする。すると、“(3) ”で示す微小部分の上下左右に隣接する微小部分につき、ラベリング情報及び合成信号値がメモリ手段１３に格納され（図６のＳ４、Ｓ２参照）、該格納された合成信号値に基づき第２閾値Ｃ２を超えている微小部分の抽出を裾部検出手段８により行う（図６のＳ３参照）。なお、“−”で示す微小部分（つまり、“×３”で示す微小部分に隣接する微小部分）についての判断は行われない。以下、同様に判断が行われる。そして、第２閾値Ｃ２を超えている微小部分が、“(4) ”“(5) ”“(6) ”“(7) ”“(8) ”“(9) ”に示すように順に抽出されて行き、第２閾値Ｃ２を超えない微小部分が“×４” “×５” “×６” “×７” “×８” “×９” “×１０”で示すように順に判明していく。この“×３”〜“×１０”で示す部分が“谷部”に相当する部分となる。そして、所定エリア（図７では、１１行×１１列の１２１個の微小部分により構成されるエリア）を超えるときには、その判断を中止する（図６のＳ４，Ｓ５参照）。該エリア内の比較だけで蛍光粒子の判別が可能なので、エリアを広げる必要は無い。
【００４１】
ここで、図５に示す装置ではメモリ手段１３は１つ設けられているだけであるが、複数設けておいて、
・  加算手段６から出力される各微小部分の合成信号値及びラベリング情報を第１メモリ手段に格納し、
・  図７の符号“(2) ”で示す微小部分の合成信号値及びラベリング情報を第２メモリ手段に格納し、
・  図７の符号“(3) ”で示す微小部分の合成信号値及びラベリング情報を第３メモリ手段に格納し、
・  図７の符号“(4) ”で示す微小部分の合成信号値及びラベリング情報を第４メモリ手段に格納し、
というようにしても良い。
【００４２】
なお、図８に示す方法で蛍光粒子を計測しても良い。
【００４３】
まず、上述した第１カウント手段７２により、各蛍光粒子について、第１閾値Ｃ１を超えている部分の面積ＳＨの算出及び保存を行う（Ｓ１１参照）。次に、各蛍光粒子について、その周辺の微小部分についての情報（合成信号値及びラベリング情報）をメモリ手段に保存する（Ｓ１２参照）。該保存された情報に基づき、上述した第２カウント手段８２により、各蛍光粒子について、第２閾値Ｃ２を超える部分の面積ＳＬの算出及び保存を行う（Ｓ１３参照）。その後、前記ＳＨ／ＳＬ演算手段９０が、各蛍光粒子について、ＳＨ／ＳＬの値を演算する（Ｓ１４参照）。前記ＳＨ／ＳＬ比較手段９１が、ＳＨ／ＳＬの基準値ＲとＳＨ／ＳＬの演算値とを比較し（Ｓ１５参照）、演算値の方が小さい場合には所定の蛍光粒子であるとしてカウントに入れ（Ｓ１６参照）、基準値の方が小さい場合には所定の蛍光粒子ではないとしてカウントに入れない（Ｓ１７参照）。この演算及び比較を各蛍光粒子について順次行う（Ｓ１８，Ｓ１５，Ｓ１６，Ｓ１７参照）。そして、全ての蛍光粒子について判別を終えて、計数を中止する（図８のＳ１８，Ｓ１９参照）。
【００４４】
ところで、上述した励起光光源３は、蛍光色素（白血球等を蛍光染色するための色素）の吸光特性に対応させて選択する必要がある。例えば蛍光色素としてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いる場合は、５００〜５５０ｎｍぐらいの波長域の励起光（緑色光）を発生させる光源がよい。さらに、検出するのに十分な蛍光強度を得るために、励起光光源も十分な出力を持つ必要がある。具体的には緑色レーザー、半導体レーザー誘起の固体レーザー、緑色ＬＥＤアレイ、高輝度ＬＥＤなどを用いることができる。なお、励起光光源３と蛍光粒子収容手段２との間には、励起光の集光度等を調整するための投光系１１を配置しておくと良い。
【００４５】
蛍光測定手段４としては、ＣＣＤカメラが構成上最も簡便であるが、ＣＭＯＳカメラ等の二次元光検出器や、ラインセンサ、光検出器、光検出器アレイと観測点を移動するための機構と組み合わせて実現することもできる。
【００４６】
また、前記蛍光粒子収容手段２と蛍光測定手段４との間には、蛍光により生じた光のみを通過させる（他の波長域の光は通過させない）ためのフィルタ手段１２を配置しておくと良い。例えば蛍光色素としてPIを用いる場合、使用した励起光（例えば550nm以下の光）をカットし、600nm前後の光を透過するようなフィルタを用いる。フィルタの種類は、色ガラスフィルタ、誘電体多相膜フィルタなど分光特性を制御できるフィルタを用いることができる。
【００４７】
上述した蛍光粒子判別手段９の判別結果に基づき、特定の蛍光粒子の数をカウントする蛍光粒子カウント手段（図１の符号１０参照）を前記蛍光粒子判別装置１に接続して、蛍光粒子計数装置を構成しても良い。この蛍光粒子計数装置によれば、第２閾値を超えているかどうかの判別は、前記ピーク部に近接する側から前記谷部Ｇ１に近接する側までの部分について行われるだけで、該谷部の外側の部分Ｄ３については行われないため、該谷部の外側のノイズの影響を回避でき、蛍光粒子の計数を正確に行うことができる。例えば、蛍光粒子収容手段２に白血球（蛍光粒子）や夾雑物（白血球以外の細胞成分やちりやほこり）が収容されている場合、白血球のみを正確に計数することができる。
【００４８】
また、本発明に係る蛍光粒子判別装置を図９及び図１０に示す構成としても良い。
【００４９】
すなわち、上述した蛍光測定手段４には信号変換器１４を接続して、蛍光測定手段４からのアナログ信号をデジタル信号に変換するようにすると良い。なお、蛍光測定手段４としてＣＣＤカメラを用いた場合は、信号変換器１４としてはＡ／Ｄ変換回路を内蔵したビデオキャプチャボードを用いると良い。また、蛍光測定手段４としてラインセンサや光検出器と観測点を移動するための機構部の組み合わせを用いた場合は、信号変換器１４で得られた信号を画像として再構築するための回路を設けておく必要がある。
【００５０】
また、この信号変換器１４にはパソコン２０を接続して、パソコン内に所定のソフトウェアに基づく、上述した微分手段５や加算手段６やピーク部検出手段７や裾部検出手段８や蛍光粒子判別手段９等を設けておくと良い。
【００５１】
そして、このパソコン２０のモニター２１には種々の情報を表示できるようにすると良い。
【００５２】
さらに、このパソコン内には、図１０に示すように演算処理部２００を設けておいて、取り込んだ画像データの平滑化処理やラプラシアン・フィルタ処理を行ってノイズ除去を行うようにすると良い。また、このパソコン内には複数の画像メモリＭ１，Ｍ２，…や画像データ転送制御部２０１を設けておいて、適宜、画像データを転送するようにすると良い。
【００５３】
例えば、取り込まれた画像データを、画像データ転送制御部２０１により画像メモリＭ１に転送する。転送された画像データに対しては、演算処理部２００によって画像処理を施し、その後の画像解析の妨げとなるノイズを除去する。まず、画像メモリＭ１に保存された画像データに平滑化処理を加え、元の画像データは画像メモリＭ１に保存したまま、平滑処理後の画像を画像メモリＭ２に構築し保存する。その後、画像メモリＭ２に保存された平滑処理後の画像データにラプラシアン・フィルタ処理を行い、処理後の画像を画像メモリＭ３に保存する。
【００５４】
次に、本発明に係る蛍光粒子の判別方法について説明する。
【００５５】
本発明に係る蛍光粒子の判別方法は、次の各工程により構成される。すなわち、
・  蛍光粒子に励起光を照射する工程
・  該励起光の照射に基づき発生した蛍光を捕捉してその強度分布を測定する工程
・  該測定により求めた強度分布信号ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ）を微分して微分信号ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ）を出力させる工程
・  該強度分布信号ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ）に前記微分信号ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ）を加算して前記合成信号ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ）を出力させる工程
・  該合成信号ｇ（ｘ，ｙ）ｇ（ｘ）の値が第１閾値（図３(c) の符号Ｃ１参照）を超えているかどうかを判別することに基づき第１閾値Ｃ１を超えている前記ピーク部を検出する工程
・  該ピーク部に近接する側から前記谷部Ｇ１に近接する側まで、前記合成信号ｇ（ｘ，ｙ）或いはｇ（ｘ）の値が第２閾値（図３(c) の符号Ｃ２参照）を超えているかどうかを微小部分毎に順次判別することに基づき該第２閾値Ｃ２を超えている前記裾部の分布領域の大きさを検出する工程
・  該裾部の分布領域の大きさについての検出結果を基準値と比較することに基づき、測定している蛍光粒子が特定の蛍光粒子であるか否かを判別する工程
【００５６】
なお、蛍光粒子について上述のような判別をした後は、蛍光粒子の数をカウントするようにしても良い。
【００５７】
ところで、本発明に係る蛍光粒子の判別方法により、血液中や血小板製剤中や赤血球製剤中における白血球を判別したり、白血球の計数を行うことができるが、その場合には、赤血球や血小板を除去すると共に（図１３のＳ２１）、白血球の細胞膜を溶解し、白血球の細胞核を蛍光染色（同図のＳ２２）する必要がある。
【００５８】
なお、本発明者は本発明の効果を以下の方法により確認している。
【００５９】
まず、既知の数の白血球が混入されている血小板製剤類似溶液を希釈し、白血球濃度の異なる被検体を複数種作成した。そして、各被検体における白血球の個数を、従来装置と本発明に係る装置とで計測したところ、従来装置の計測結果は図１１(a) の“□”に示す通りとなり、本発明に係る装置の計測結果は同図の“●”に示す通りとなった。同様に、既知の数の白血球が混入されている赤血球製剤類似溶液を希釈し、白血球濃度の異なる被検体を複数種作成した。そして、各被検体における白血球の個数を、従来装置と本発明に係る装置とで計測したところ、従来装置の計測結果は図１１(b) の“□”に示す通りとなり、本発明に係る装置の計測結果は同図の“●”に示す通りとなった。なお、各種溶液を希釈すれば、白血球の濃度は各図の１点鎖線のように変化するはずであるが、従来装置の計測結果より本発明に係る装置の計測結果の方がその１点鎖線に沿っていることが分かる。両データの回帰直線を計算によって求め、まとめたものが図１１(c) の表である。この表より、本発明の計測結果の方が、回帰直線の傾き（理想的には１に近づく）、ｙ切片（理想的には０に近づく）ともに、従来方法に比べ改善されており、より精度の高い測定が行われたことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明に係る蛍光粒子判別装置及び蛍光粒子計数装置の構造の一例を示すブロック図である。
【図２】図２(a) は、白血球の蛍光強度分布（二次元分布）の一例を示す図であり、図２(b) は、夾雑物の蛍光強度分布（二次元分布）の一例を示す図である。
【図３】図３(a) は、蛍光粒子の蛍光強度一次元分布（強度分布信号）の一例を示す図であり、図３(b) は、同図(a) の強度分布信号を微分した微分信号を示す図であり、図３(c) は、同図(a) に示す強度分布信号に同図(b) に示す微分信号を加算した合成信号を示す図である。
【図４】図４は、白血球の合成信号と夾雑物の合成信号との違い等を説明するための波形図である。
【図５】図５は、本発明に係る蛍光粒子判別装置及び蛍光粒子計数装置の構造の他の例を示すブロック図である。
【図６】図６は、蛍光粒子の判別方法を説明するためのフローチャート図である。
【図７】図７は、蛍光粒子の判別方法を説明するための模式図である。
【図８】図８は、蛍光粒子の計数方法の一例を説明するためのフローチャート図である。
【図９】図９は、本発明に係る蛍光粒子判別装置の構造の一例を示すブロック図である。
【図１０】図１０は、その詳細構造を説明するためのブロック図である。
【図１１】図１１は、本発明の効果を説明するための図である。
【図１２】図１２は、白血球を計数する従来装置の構造の一例を示すブロック図である。
【図１３】図１３は、白血球の計数方法の一例を示すフローチャート図である。
【図１４】図１４は、白血球の蛍光画像信号、夾雑物の蛍光画像信号、及び従来の問題点を説明するための図である。
【符号の説明】
【００６１】
１              蛍光粒子判別装置
２              蛍光粒子収容手段
３              励起光光源
４              蛍光測定手段
５              微分手段
６              加算手段
７              ピーク部検出手段
８              裾部検出手段（立ち上がり部検出手段）
９              蛍光粒子判別手段
１０            蛍光粒子カウント手段
１３            メモリ手段
７０            第１閾値発生手段
７１            第１閾値比較手段
Ｃ１              第１閾値
Ｃ２              第２閾値
ｆ（ｘ，ｙ），ｆ（ｘ）      蛍光強度分布を示す強度分布信号
ｆ’（ｘ，ｙ），ｆ’（ｘ）      微分信号
ｇ（ｘ，ｙ），ｇ（ｘ）          合成信号
【図１】
2005274268.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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