(57)【要約】【課題】  培養条件下においてその細胞系が通常分泌する生物学的物質をヒトの臓器に移植されても分泌可能な新規のインシュリン分泌β細胞系を提供する。【解決手段】  グルキナーゼおよびグルコースキャリアを正常のβ細胞のそれに匹敵するレベルに分泌するが、更に遺伝子操作によってＩＧＦ−II分泌依存増殖性をもたない細胞系を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースに対する感受性のあるインシュリン分泌を行い、インシュリン様成長因子II(ＩＧＦ−II)遺伝子の発現が該遺伝子の完全な阻止によって持続的に抑制されている、高度に差別化されたインシュリン分泌β細胞系であって、
以下のステップ：
（ｉ）ＩＧＦ−II遺伝子を有し、高度に差別化されたことでグルコースの生理的濃度に対応してインシュリンを分泌するインシュリン分泌ベータ細胞系のβ細胞に対して、ネオマイシン耐性遺伝子をコード化したカセットと、該ネオマイシン遺伝子の下部にウィルスチミジンキナーゼがコード化されたカセットと、がエキソン４に挿入されているＩＧＦ−II遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクトし、
（ｉｉ）該トランスフェクトされたβ細胞をネオマイシン、ガンサイクロビア及びＩＧＦ−IIの存在下で培養し、さらに
（ｉｉｉ）ネオマイシン及びガンサイクロビアに対して耐性のある形質転換されたβ細胞を単離すること
により得られ、
該単離された形質転換β細胞には前記２つのカセットを有するＩＧＦ−II遺伝子が同類体組み換えによって取り込まれており、かつ該形質転換β細胞の増殖はＩＧＦ−IIの外生導入に依存している
ことを特徴とするインシュリン分泌β細胞系。
【請求項２】
前記高度に差別化されたインシュリン分泌β細胞系がＩＮＳ−I細胞系である、請求項１記載のβ細胞系。
【請求項３】
前記β細胞系が、擬アイレット集合体の形である、請求項１または２記載のβ細胞系。
【請求項４】
請求項１または２に記載のインシュリン分泌β細胞系の製造方法であって、
以下に示すステップ：
（ｉ）ＩＧＦ−II遺伝子を有し、高度に差別化されたことでグルコースの生理的濃度に対応してインシュリンを分泌するインシュリン分泌ベータ細胞系のβ細胞に対して、ネオマイシン耐性遺伝子をコード化したカセットと、該ネオマイシン遺伝子の下部にウィルスチミジンキナーゼがコード化されたカセットと、がエキソン４に挿入されているＩＧＦ−II遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクトするステップ、
（ｉｉ）該トランスフェクトされたβ細胞をネオマイシン、ガンサイクロビア及びＩＧＦ−IIの存在下で培養するステップ、さらに
（ｉｉｉ）ネオマイシン及びガンサイクロビアに対して耐性のある形質転換されたβ細胞を単離するステップ
を有し、
該単離された形質転換β細胞には前記２つのカセットを有するＩＧＦ−II遺伝子が同類体組み換えによって取り込まれており、かつ該形質転換β細胞の増殖はＩＧＦ−IIの外生導入に依存している
ことを特徴とするインシュリン分泌β細胞系の製造方法。
【請求項５】
前記高度に差別化されたインシュリン分泌β細胞系がＩＮＳ−I細胞系である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プラスミドがｐUC119由来のものである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記方法により製造されたβ細胞系は、さらに非粘着性の培養皿で該細胞を培養することにより、擬アイレットの型体で細胞の集合体を作る、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記擬アイレットを膠化剤中で懸濁液として集合させ、固定剤の添加により生体適合性のあるハイドロゲル中で固定する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記固定剤がアルギン酸ソーダである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記固定剤がカルシウム塩の水溶液である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記集合され、固定された擬アイレットが成長したラットの５００〜１０００個のアイレットに含まれるのと同量のインシュリンを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記擬アイレットがカルシウム塩の水溶液の添加により膠化された生体適合性ハイドロゲル中でカプセル封入され、そして、分子量50,000から80,000の分子を透過する管状アクリル膜に配置する、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
固定化され、膠化された擬アイレットが、移植用繊維に取り入れられる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
生体適合性の移植用としての、分子量50,000から80,000の分子を透過する管状アクリル膜に入れられ、繊維に取り入れられる、請求項１記載の形質転換されたインシュリン分泌β細胞系の擬アイレット。
【請求項１５】
効果的なインシュリン濃度を得るために50,000から200,000個の擬アイレットをインシュリン依存型糖尿病患者に投与するための請求項１４記載の擬アイレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インシュリン分泌細胞系、その製造方法と使用
ここに発表された発明は生物学、特に細胞化学の分野に関するものである。
【０００２】
その主題は特に培養条件下においてその細胞系が通常分泌する生物学的物質をヒトの臓器に移植されても分泌可能な新規の細胞系である。
【０００３】
この発明の主題は特に主要な特性がグルコース(ブドウ糖)に対する感受性のあるベータ細胞系(ＩＮＳ−I)と命名する新規のグルコース感受性の細胞系である。従ってこれらの細胞はインシュリンの高含量とグルコキナーゼ(ブドウ糖酵素)とブドウ糖キヤリヤーのグルート２(Glute２)を通常のベータ細胞が分泌するのに匹敵するレベルに分泌する能力によって特徴づけられており、さらに細胞は遺伝子工学により非増殖の細胞としてつくられる。
【０００４】
従って、この細胞はインシュリン依存性の臓器に移植されインシュリン依存型糖尿病の場合に糖血症の"生理学的"統制を行うことを可能にする。
【背景技術】
【０００５】
臓器移植又は組織移植は多くの疾病に使用される治療手段の一部をなす。さらに最近では、現在まで不治の病とされている疾病の治療法として遺伝子工学技術がもたらす他種の可能性も予見されるようになった。
【０００６】
そこで真性糖尿病の治療に対する移植と遺伝子治療を組み合わせた研究プロジェクトが提案された。実際に、申請者は、ＩＮＳ−I系であるベータ細胞系を作りだした。この細胞系はグルコースの生理的濃度に対応してインシュリンを分泌し、遺伝子工学の応用により、移植とインシュリン依存型糖尿病の糖血病の"生理学的"制御に使用できる。
【０００７】
過去１０年間におこなわれた治療努力にも拘わらず、糖尿病の治療は相変わらずきわめて不満足である。これが新規の治療法が探求される理由であり膵臓またはランゲルハンス島細胞の一部の移植はその一部である（例えば非特許文献１および２参照。）。世界的に1000件以上の全膵臓の移植と数１０回のランゲルハンス島細胞の移植がおこなわれた。これらは有望であつたが、その困難な技法は大別して２つの問題を提起した。一つは免疫学的なもの、他は臓器の供給面である。
【非特許文献１】Hellerstrom C, Andersson A, Groth C-G, Sandler S, Jansson L, Korsgren O, Swenne I, Petersson B, Tollemar J, Tyden G - Diabetes Care 11(Suppl.1) 45-53 1988
【非特許文献２】Pipelleers DG, Pipelleers-Marichal M, Hannaert J-C, Berghmans M, In't Veld PA, Rozin J, Van de Winkel M, Gepts W - Diabetes 40:908-919 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
移植手術のそれぞれの種類に固有の生体許容の問題があるのに加えて、糖尿病は自己免疫の病気であり、糖尿病患者である膵臓受領者は移植されたベータ細胞を破壊する可能性があることを知らなければならない。したがって、絶体的に必要であるのは移植手術と免疫抑制療法とを組み合わせることである。この免疫抑制療法を行わないですむために、ある研究者はカプセル封入のランゲルハンス島細胞の移植を提唱している(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254: 1782-1784 1991) (Chicheportich D, Reach G - Diabetolgia 31: 54-57 1988)。この予防法、特にカプセル封入法の主要な利点は移植された組織を免疫システムの攻撃から守ることにある。しかしながら、ランゲルハンス島細胞の供給が十分でないので、治療用の材料を準備する事を困難にしている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、過去１０年間において、糖尿病とインシュリン分泌の研究のための雛形としてベータ細胞を作成するために可成りの努力が向けられた。これらの大部分の細胞系は、その主要なベータ細胞の機能、例えばグルコースに対応してインシュリンを分泌する機能を失った。この機能の損失は２次培養と継続的な継代培養の間におこる。従って、本発見申請者は正常のベータ細胞系に非常に類似した性質を持つ高度に差別化されたベータ細胞系(ＩＮＳ−Ｉ)を作成することができ(Asfari M, Janjic D, Meda P, Li G, Halban PA, Wollheim CB - Endocrinology 130: 167-178 1992)そしてこれが本発明の本質を構成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この細胞系の注目すべき特性のなかで特に言及されるべき事は、正常なベータ細胞のそれに同等にインシュリンの含有量が高くそれに匹敵するレベルにグルコキナーゼとブドウ糖キヤリヤーのグルート２を分泌することである。さらに、器官分化時または生理的な濃度の発育ホルモンであるプロラクチンのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−IIに対する反応である。出願人等はグルコースの濃度を３から２０ｍＭに増加する事により、細胞間のｃＡＭＰの濃度を増加する物質の存在下で、ＩＮＳ−Ｉ細胞のインシュリン分泌を４倍に増加できる事を証明した。
【００１１】
更に、近年になって、これらの細胞をグルコースの生理学的濃度(５ｍＭで４８時間)中での培養でグルコース濃度の変動に対してより敏感に反応する事がしられた。これらの分化する性質によって、この細胞が糖尿病患者における生体適合カプセルの異物移植手術に使用する最も適切な候補といえる。
【００１２】
しかしながら、移植する前に、これらの細胞を非増殖性にしなくてはならない。実際に、もし制御できない発育と、保護的なカプセルの破壊の可能性を防止する必要がある場合には、増殖の阻止が不可欠である。このことは直接又は間接に細胞増殖に関与している遺伝子を破壊することにより達成できる。最近になってこれらの細胞中ＩＧＦ−IIが豊富に分泌されることが知られた。ＩＧＦ−IIはオートクライン(autocrine)の方法で、本質的に細胞の発育を調節する発育因子である。従って、次に記述する最近の試験結果に基づいて、ＩＧＦ−IIが制御されない細胞発育に関与し、ＩＧＦ−II遺伝子の分泌の制御(遺伝子を破壊すること)によって、細胞の増殖を阻止ないし増殖を減少できると考えられる。この遺伝子工学によって、ＩＮＳ−Ｉ細胞系はカプセル封入と移植に適合できるようになり、このことによって膵臓のランゲルハンス島の移植手術とその準備に至るまでのやっかいで困難な問題を避けることができる。
【００１３】
最終的に、遺伝子工学的に改変されており通常は血清の存在しない条件下で培養されるベータ細胞の増殖は、結合蛋白ＩＧＦＢＰ−３の存在下では相当減少する(Gopinath R, Walton PE, Etherton ED- Endocrinol 120:231-236 1989)。申請者が開発したＩＧＦＢＰ−３モデルにおいては、分離したＩＧＦ−IIの生物学的活性は減少する。ＩＧＦＢＰの添加はＩＮＳ−Ｉ細胞の増殖を阻止する。結合蛋白、特にＢＰ−３の知られている唯一の機能はＩＧＦ群と結合することであるので、ＩＧＦ−IIがＩＮＳ−Ｉ細胞の増殖に主要な役割を演じることをこの現象は示唆する。ＩＧＦ−IIはオートクリンまたはパラクリンの様式で、腫瘍細胞の増殖を刺激するという実験結果を支持する間接的な証拠が多くある(El-Bardy OH, Romanus JAI, Helman LH, Coper MH, Rrchler MM, Israel MA-J.Clin, Invest. 84:829 1989)。このことは移植された細胞においても実証された(Park JHY, McCusker RH, Vanderhoof JA, Mohammadpour H, Harty RF, MacDonald RG- Endocrinology 131: 1359-1368 1992)。又原始ベータアイレット培養でも確認された(Rabinovith A, Quigley C, Russel T, Patel Y, Mintz DH - Diabetes 31: 160-164 1982)(Hill DJ, Hogg J- E. M. Spencer (ed), Elsvier Science Publishing CO, INC 1991 235-240)。
【００１４】
本発見の主題は又移植手術の目的で遺伝工学的に修正されカプセルに封入されたＩＮＳ−Ｉの細胞系の確立である。
【実施例】
【００１５】
予備実験の結果
これらの結果は主にＩＧＦ−II、培養媒体中のグルコースの濃度及び細胞増殖間の関連性に関することである。グルコースの５ｍＭの濃度では、細胞の増殖性は変化しないようであった。５ｍＭから２０ｍＭの間では、増殖性の増加が培養７２時間観察された。平行して、１０から２０ｍＭにわたるグルコース濃度に対するＩＧＦ−II伝令ＲＮＡの増加が観察された。ラジオイムノアッセイ法によって、ＩＧＦ−Ｉ蛋白は検出されず(Binoux M, Seurin D, Lassarre C, Gourmelen M- J.Clin.Endocrinol. Metab. 59:453-462 1984)又成長ホルモンに対する長時間にわたる暴露後でもこれらの細胞中に伝令ＲＮＡの増加は見られなかった。
【００１６】
実験方法の原理
実験は２段階で実施される。
【００１７】
グルコースに対する感受性を保持する一方、その細胞を非増殖性にする不活性のＩＧＦ−II遺伝子を持つＩＮＳ−Ｉの細胞系を作成する。
【００１８】
引き続いてヒトに同様な方法で移植する目的で、上記の細胞系をカプセル封入し、糖尿病動物に移植する。
【００１９】
実験方法
第１部：同類体遺伝子組み換え手法によってＩＧＦ−II遺伝子の永久的な不活化を行う(Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990)(Pennington S, Wilson JH - Proc. Natl. Acad. Sci.88:9498-9502 1991)。出願人はプラスミッドｐＵＣ１１９のクローンＩＧＦ−II遺伝子を使用した(Dr. HOLTHUIZEN)(Holthuizen P, Van der Lee FM, Ikejiri K, Yamamoto M, Sussenbach JS - Biochem Biophys, Acta 1087:341-343 1990)。ＩＧＦ−IIをコード化した伝令ＲＮＡの４つの違った種類の内、３．６ｋｂ伝令ＲＮＡがＩＮＳ−Ｉ細胞系で主に分泌される。この伝令はＰ３促進物質の利用により転写される(Matsuguchi T, Takahashi K, Ikejiri K, Ueno T, Endo H, Yamamoto M - Biochem Biophys Acta 1048:165-170 1990)。ＣＭＶ幼若遺伝子の促進剤の調節の下でネオマイシン(ｎｅｏ)耐性遺伝子をコード化したカセットをＩＧＦ−II遺伝子のエキソン４に挿入することを提案する。その構成の下部にヘルペス単独ウィルスチミジンキナーゼがコード化されたカセットを挿入する。これは無差別な挿入によるのではなく、同類体遺伝子組み換えによるＩＧＦ−II−ｎｅｏを持つ珍しいクローンを選択できる構成である。実際にこの同類体遺伝子組織に由来するクローンはネオマイシンとガンサイクロビアに抵抗性を持つが、任意の遺伝子組み換えに由来するクローンはネオマイシン耐性であるが、ガンサイクロビール(gancyclovir)には感受性を有する。
【００２０】
トランスフェクションの後、この細胞は、ネオマイシン、ガンサイクロビールとＩＧＦ−IIの存在下で培養される。内生ＩＧＦ−IIの不在しかし外生ＩＧＦ−IIの存在条件下でこの耐性クローンは増殖能力をテストされ、サザンブロット手法ＰＣＲ(複性連鎖反応)によってこの融合が正しいかどうか調べるために試験される。ＩＧＦ−IIの発現は伝令ＲＮＡと蛋白質のレベルでノーザン、ウエスタンブロット法で各々試験される。ＩＧＦ−II遺伝子の父系対立遺伝子だけが活性があるように作成されており(De Chaiara TM, Robertson EJ, Efstratiadis A - Cell 64:849-859 1991)，同類体遺伝子組み替えは転写的に活性があるＤＮＡ区分のレベルでより効果的であるので(Nickoloff JC - MEB 12:5311-5318 1922)、単一のＤＮＡトランスフェクション／選択処置によってＩＧＦ−IIを発現しないＩＮＳ−Ｉ細胞系を得ることが期待できる。しかしながら、この方法が成功しなかった場合は、ＩＧＦ−II遺伝子の第２番目のコピーを破壊することが可能である(Riete H, Maandag ER, Clarke A, Hooper M, Berns A - Nature 384:649-651 1990)。この作業のそれぞれの段階で、インシュリンの分泌を促すグルコースの能力を検査しなくてはならない。
【００２１】
第２部：もしＩＧＦ−II遺伝子の破壊に成功すれば、IＮＳ−Ｉ細胞系が最終的に得られる。これは完全に又は大部分発育に必要なＩＧＦ−IIの外部からの投与に左右される。理論的に、この新規の細胞系はその親細胞系のそれと同じようにグルコースに対して感受性がある。今回は、これらの細胞はカプセル封入と移植に使用される。
【００２２】
１．ＩＮＳ−Ｉ細胞系のカプセル封入
ａ）効果的なカプセル封入には、擬アイレット型に集合しなければならない。これは非粘着性の培養皿で培養することによって実施される。集合体(＝擬アイレット)大きさは培養時の細胞の密度によって決められる。一方集合体の細胞の数は収穫した擬アイレット(ＰＩ)のトリプシン処理の後検査できる。
【００２３】
ｂ）500〜1000個の成長したラットのアイレット(２−４×１０8個の細胞)に含まれるのと同等のインシュリンの量を含む一定のＰＩをアルギン酸ソーダの溶液に懸濁する(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi - Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci.88: 11100-11104 1991)。そしてカルシウム塩の水溶液を使用して、生体適合性のあるハイドロゲル中にカプセル封入して固定する。50000〜80000以下の分子量をもつ分子を透過する管状のアクリル膜にこのカプセル封入されたＰＩを設置する(Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi - Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler DH, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc.Natl.Acad.Sci. 88:11100-11104 1991)。
【００２４】
ｃ）グルコースの種々の濃度に対応するインシュリン分泌に変化を与える強さと早さを知るために灌流によってカプセル封入されたＰＩを生体内で検査する。試験のこの部分が満足であれば、繊維素に含まれたＰＩは移植に使用される。
【００２５】
２．移植
このカプセル封入されたＰＩは皮下又は腹腔内投与で移植される。この二つの方法は、ヒトのインシュリン依存性糖尿病の動物モデルの正常な血糖値を維持するのに有効であった。バイオ繁殖ラット(ＢＢ)とノノビース糖尿病マウス(ＮＯＤ)は特殊の組織適合性のある遺伝子型と関連し、免疫の観点からは移植された糖尿病動物と同様な欠陥を持っている(細胞障害性Ｔリンパ球の存在) (Lacy P, Hegre OD, Gerasimidi - Vazeo A, Gentile FT, Dionne KE - Science 254:1782-1784 1991) (Lanza RP, Butler Dh, Borland KM, Staruk JE, Faustman DL, Solomon BA, Muller TE, Rupp RG, Maki T, Monaco AP, Chick WL - Proc. Natl. Acad. Sci. 88:11100-11104 1991)。腹腔内ルートによる移植は移植された細胞に対する良い生物学的環境を保証するのにより好ましいと思われる。この手法はインシュリン依存性糖尿病患者に同様に利用できる。有効なインシュリンの濃度に到達するのは50,000から200,000個のＰＩを移植しなくてはならない。