(57)【要約】    【課題】  少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を微生物を用いて生産する際に、炭素源である糖を高濃度にすることで発生する培養阻害要因に対して極めて影響が少ない菌種を提供すること、及び、同菌種を用いて多糖類を製造する方法を提供する。    【解決手段】  少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を産生するスフィンゴモナス・トゥルーペリ（Sphingomonas trueperi）を培地で培養し、前記多糖類を培地中に蓄積させ、同培地から前記多糖類を採取することにより、前記多糖類を製造する。    【選択図】  図２
2005185246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を産生するスフィンゴモナス・トゥルーペリ（Sphingomonas trueperi）を培地で培養し、前記多糖類を培地中に蓄積させ、同培地から前記多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造法。
【請求項２】
前記培地が、炭素源として糖類を２重量％より多く含むことを特徴とする請求項１記載の多糖類の製造法。
【請求項３】
前記糖類が、糖蜜、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン糖からなる群から選択される糖質を一種又はそれ以上含む請求項１または２に記載の多糖類の製造法。
【請求項４】
スフィンゴモナス・トゥルーペリをｐＨ  ６．０〜７．５で培養する請求項１〜３のいずれか一項に記載の多糖類の製造法。
【請求項５】
スフィンゴモナス・トゥルーペリが、スフィンゴモナス・トゥルーペリSPH-011（FERM BP-08582)又はSPH-012（FERM BP-08579）株である請求項１〜４のいずれか一項に記載の多糖類の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴモナス・トゥルーペリを培養して、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を製造する方法に関する。フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類は、衛生用品、化粧品、乾燥地農業などにおける吸水、保湿もしくは保水剤又はコンクリートに保形性、流動性または硬化性を付与する添加剤などに利用されている。
【背景技術】
【０００２】
フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の製造法としては、アルカリゲネス属細菌を用いた発酵法が知られている（例えば、特許文献１）。
【０００３】
フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の発酵生産においては、培養液中に多糖類が蓄積するに伴い、培養液の粘性が著しく増大し、培養液の通気、攪拌等の混合に支障をきたすことが多い。そのため、槽内の攪拌が不十分になると、溶存酸素が低下し、菌体は酸素不足より不完全呼吸となり発酵に異常を起こし生産が低下する。また、発酵に伴う発熱の拡散もできずに槽内が部分的に高温になってしまい、高温部においてはやはり発酵に異常を起こし多糖類生産が低下する。従って、大型の発酵槽で工業レベルで培養しようとすると、培地濃度を下げ、低濃度で培養を行い、培地の粘度を下げることで対応するしかなかった。しかし、低濃度の培養は、多糖類収率が悪く、とても工業的に採算があうものではない。
【０００４】
高粘性培養が可能な発酵槽（例えば、非特許文献１参照）や、タービン付き門型羽根とマックスブレンド等を備えた発酵槽（例えば、非特許文献２参照）が報告されているが、この種の発酵槽を大型化した実績はない。さらに、キサンタンガムとして知られる多糖類では、培養液中に種々の油脂を添加して、培養液の粘性を下げる方法（例えば、特許文献２，３，４参照）あるいは培養液中に溶媒を添加することで生産物を粒子化して培地の粘性を低下させる方法（例えば、特許文献５参照）が知られている。しかしながら、これらの方法は、特殊な発酵槽を必要としたり、培養物の生産、回収、精製に必ずしも好ましくない添加物を加えるなど、満足すべきものではない。
【０００５】
また、アルカリゲネス属に属する菌株で、液体培地中で多糖類を塊状に生成するような菌株を使用し、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を菌体とともに培養物中に生成蓄積させ、該培養物より多糖類を採取することを特徴とする方法（例えば、特許文献６参照）も知られている。しかし、培養初期には蓄積した多糖類はおもに球状またはフィルム状を有するが、長期間培養を続けると、培地中の水分を吸収して崩壊して粥状へと変化してしまい、最終的には、半分程度にしか粘度が下がらないこと、さらに、塊状となった多糖類に加熱処理等を行い、ほぐす必要性があり、実用上到底満足しうる方法ではなかった。
【０００６】
更にアルカリゲネス属に属する菌株を、完全合成培地を用いて、糖濃度２％にて培養することによって、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を製造する方法（例えば、特許文献７参照）も知られているが、この報告は５Ｌレベルの培養槽での結果であり、工業化において、かならずしも満足すべきものではない。
【非特許文献１】アプライド・ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）,35,330,(1991)〕
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・ファーメンテション・バイオエンジニアリング （J. Fermentation. Bioengnerrinng.）,83,1997
【特許文献１】特開平０２−２９１２９２号公報
【特許文献２】特開昭５８−６０９９７号公報、
【特許文献３】特開昭６０−６６９７５号公報
【特許文献４】特開昭６１−１６７４０１号公報
【特許文献５】特開昭６１−１７３７９５号公報
【特許文献６】特開平７−１８４６７６号公報
【特許文献７】特開平４−２００３８９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を微生物を用いて生産する際に、炭素源である糖を高濃度にすることで発生する培養阻害要因に対して極めて影響が少ない菌種を提供すること、及び、同菌種を用いて多糖類を培地中に高濃度に蓄積させる、生産性のすぐれた多糖類の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を高効率で生産するために、その培養法について鋭意、検討を行った結果、特定の菌種スフィンゴモナス・トゥルーペリ（Sphingomonas trueperi）を用いることで、異常培養において低酸素時に発生する有機酸および、異常培養時に生じる培養温度の上昇の影響が小さい培養方法を見出した。
【０００９】
従来知られているフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の生産菌、例えばアルカリゲネス・レータス Ｂ−１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０１５）株では、大型の発酵槽を用いて通気培養する場合の多糖類の生産量は、８ｇ/リットル程度であり、一般的に行われている微生物による物質生産の生産効率と比較すると必ずしも満足できる値とはいえない。例えば、工業的に最も成功している、キサントモナス属の菌株で発酵生産法により、キサンタンガムを生産する場合は、50g/リットルのグルコースを炭素源とすることで、30ｇ/リットルの多糖類を得ることができる（例えば、フードケミカル、１０、63-71、１９８７年 参照）。培養後の多糖類は、アルコールで沈澱させて回収されるが、培養液中の多糖類の濃度により、使用するアルコールの量も大きく変化することから、多糖類の収率はコスト的に大きく影響する。
【００１０】
本発明者らは、コストダウンを目的として、培養後の培地における、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の濃度を上げることを目的として、栄養源である培地成分の濃度を上げた、しかし、アルカリゲネス・レータス
Ｂ−１６株を使用した場合は、培地の初発炭素源の濃度を２％より多くしても、目的とする多糖類の収率が上がらないことを見出すに至った。そして、更にその原因について追求したところ、多糖類の発酵生産においては、培養液中に多糖類が蓄積するに伴い、培養液の粘性が著しく増大し、培養液の通気、攪拌等の混合に支障をきたすことが多く、そのため、槽内の攪拌が不十分になると、溶存酸素が低下し、菌体は炭素源を二酸化炭素まで酸化させることが出来ず、有機酸を発生することとなり、それが培養液中に蓄積することにより、アルカリゲネス・レータス Ｂ−１６菌体はその影響をうけ活性が低下してしまうことが判明した。また、アルカリゲネス・レータス Ｂ−１６菌体は、培養温度が３２℃になると、その活性が著しく低下するため、発酵に伴う発熱の拡散もできずに部分的に高温になると、その影響を強く受けることが判明した。
【００１１】
発酵時の冷却は、コストが大きく増えることと、培養日数が延びることから、あらかじめ培養温度を低めに設定することは望ましい方法ではない。
【００１２】
本発明者らは、上述の問題点に鑑み、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を大量に生産させる方法について鋭意研究を行ったところ、スフィンゴモナス・トゥルーペリが、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の効率的な製造に好適であること、及び、特定の成分を培地に添加することで、生産する多糖類の生産量を一層高めることができることを見出した。そして、分離源が異なる、２種類のスフィンゴモナス・トゥルーペリの菌株が、共にフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を大量に生産させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を産生するスフィンゴモナス・トゥルーペリを培地で培養し、前記多糖類を培地中に蓄積させ、同培地から前記多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造法。（２）前記培地が、炭素源として糖類を２重量％より多く含むことを特徴とする前記の多糖類の製造法。
（３）前記糖類が、糖蜜、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン糖からなる群から選択される糖質を一種又はそれ以上含む請求項１または２に記載の多糖類の製造法。
（４）スフィンゴモナス・トゥルーペリをｐＨ  ６．０〜７．５で培養する前記の多糖類の製造法。
（５）スフィンゴモナス・トゥルーペリが、スフィンゴモナス・トゥルーペリFERM BP-08582株又はFERM BP-08579株である前記の多糖類の製造法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、スフィンゴモナス・トゥルーペリを用いた発酵法を用いることで、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の生産性を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を詳細に説明する。
本願発明の多糖類の製造方法は、多糖類を生産する微生物として、スフィンゴモナス・トゥルーペリを用いる。同菌種を用いることにより、培地中に少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を高濃度で蓄積させることができる。
【００１６】
スフィンゴモナス属は、菌体外多糖類を産生することは良く知られており、その種類は約１０種類あり、スフィンガンと呼ばれている。しかし、従来知られているスフィンゴモナス属が産生する多糖類の構成単糖は、全てグルコース、ラムノース、マンノース、グルクロン酸から構成されており（（A. Steinbuchel et al., Biopolymers, Vol.5, 239-258, 2002 参照）、本発明のフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類とは異なる。
【００１７】
従来知られているスフィンガンは、ADP-D-グルコース、TDP-L-ラムノース 、UDP-D-グルクロン酸、及びGDP−D-マンノースの各糖ヌクレオチドの糖部分が、グルコシルトランフェラーゼにより連結されることによって生成すると考えられる（図１参照）。
【００１８】
しかし、本発明の多糖類が産生されるには、GDP−D-マンノースが還元異性化され、GDP-L−フコースが生成する必要がある。しかしながら、スフィンゴモナス属ではGDP−D-マンノースを還元異性化する酵素の存在については知られておらず、スフィンゴモナス・トゥルーペリ種はスフィングモナス属の中でも、他の種と異なり特異的である。
【００１９】
尚、本発明の「少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類」とは、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースのみを構成単糖とする多糖類であってもよく、さらに他の単糖を構成単糖として含んでいてもよい。多糖類を占めるフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースの割合は、モル比で１〜２：１〜４：１〜２：１〜２である。
【００２０】
また、本発明の方法により製造される多糖類は、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類のみであってもよく、同多糖類と、それとは異なる他の多糖類との混合物であってもよい。他の多糖類としては、フコース及びマンノースを構成単糖とする多糖類、又はラムノース及びマンノースを構成単糖とする多糖類が挙げられる。
【００２１】
本発明に用いるスフィンゴモナス・トゥルーペリは、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類を産生する限り、特に制限されないが、具体的には例えば、本発明者らにより単離されたＳＰＨ−０１１及びＳＰＨ−０１２が挙げられる。これらの菌株は、２００３年１２月８日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国際寄託されており、それぞれ受託番号FERM BP-08582、FERM BP-08579が付与されている。
【００２２】
ＳＰＨ−０１１を適切な培地、例えば標準液体培地で培養を行うと、２種類の多糖類を産生する。ひとつはフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類であり、他は、フコース、及びマンノースを構成単糖とする多糖類である。またＳＰＨ−０１２を適切な培地、例えば標準液体培地で培養を行うと、２種類の多糖類を産生する。ひとつはフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類であり、他は、ラムノース、及びマンノースを構成単糖とする多糖類である。いずれの菌株も、フコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類を産生する。
【００２３】
ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２について、16S rDNA-Full塩基解析を行ない、BLAST Result DNA塩基配列データベースにて、相同性検索を行った結果、ＳＰＨ−０１１は、９９．９％、ＳＰＨ−０１２は９９．７％の同一性で、スフィンゴモナス・トゥルーペリの基準菌株であるLMG 2142T株と一致した。また、DNA-DNAハイブリダイゼーションを行ったところ、ＳＰＨ−０１１およびＳＰＨ−０１２共に、基準菌株であるスフィンゴモナス・トゥルーペリLMG ２１４２T株と７０％以上の相同性を示したことから、ＳＰＨ−０１１およびＳＰＨ−０１２は基準菌株と同種であると同定された。
【００２４】
少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類を産生するさせるためにスフィンゴモナス・トゥルーペリを培養する培地としては、スフィンゴモナス・トゥルーペリが生育し、かつ、前記多糖類を産生する培地であれば特に制限無く使用することができるが、例えば、糖類、リン酸塩、有機窒素源、無機窒素源、塩類で構成される培地が挙げられる。糖類は、通常の単糖類、二糖類が使用され、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ラムノース、セロビオース、ガラクトース、キシロース、ラクトース、アラビノース、マルトース等、またそれらの混合物である、糖蜜、でんぷん糖等から選ばれる一種又はそれ以上であるが
、これらの中ではグルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、でんぷん糖が望ましく、その配合濃度としては、通常０．１〜重量１０％、好ましくは１〜７重量％、更に好ましくは、２〜５重量％である。０．１重量％より少ないと、多糖類の生産性が低く、本発明の特徴を生かすことができない場合があり、又１５重量％より多いと、基質の添加量に見合うだけの生産量を得ることが出来ず、非効率的である場合がある。
【００２５】
リン酸塩は、通常のリン酸塩化合物を使用することができ、例えばリン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩から選ばれる一種又はそれ以上が挙げられ、具体的にはリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）が挙げられる。その配合濃度としては、通常０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜２重量％、更に好ましくは、０．１〜１重量％である。０．０１重量％より少ないと、多糖類の生産性低く、本発明の特徴を生かすことができない場合があり、又５重量％より多いと、基質の添加量に見合うだけの生産量を得ることが出来ず、非効率的である場合がある。
【００２６】
無機窒素源は、通常の窒素化合物を使用することができ、例えば尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等から選ばれる一種又はそれ以上が挙げられ、好ましくは尿素、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムである。その配合濃度としては、通常０．０１〜２重量％、好ましくは０．０２〜１重量％、更に好ましくは、０．０５〜０．５重量％である。０．０１重量％より少ないと、多糖類の生産性低く、本発明の特徴を生かすことができない場合があり、又２重量％より多いと、基質の添加量に見合うだけの生産量を得ることが出来ず、非効率的である場合がある。
【００２７】
有機窒素源としては、細菌を培養する際の通常の成分を使用することができる。例えば、イーストエキストラクト、ペプトン、（魚）肉エキス、麦芽エキス、コーンスープリカー等から選ばれる一種又はそれ以上が挙げられ、好ましくはエーストエキストラクトを使用する。その配合濃度としては、通常０．０１〜５重量％、好ましくは０．０５〜２重量％、更に好ましくは、０．１〜１重量％である。０．０１重量％より少ないと、多糖類の生産性低く、本発明の特徴を生かすことができない場合があり、また５重量％より多いと、基質の添加量に見合うだけの生産量を得ることが出来ず、非効率的である場合がある。
【００２８】
無機塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられ、必要に応じて適量を配合する。
培養温度は、好ましくは２５℃〜３５℃の範囲であり、培養日数は、通常４〜８日間である。
【００２９】
培養方法は特に限定されることはなく、培養開始時に培地に配合成分を全量投入しても良いし、炭素源と有機窒素源を培養開始に一部投入し、その後２〜４日後に、残りを投入しても良い。発酵槽の攪拌羽は、通常のタービン羽根、マックスブラン羽根、フルゾン羽根等が使用できる。
【００３０】
通気量は、発酵槽の容量の１〜３倍量/分程度、槽内圧力は、大気圧の１〜２倍程度が好ましい。
前培養は、生産培地と同様の培地にて、２〜６日間培養した後、生産培地の１/１００から１/３００量を本培養培地（生産培地）に接種することが好ましい。
【００３１】
本発明の方法を用いて、スフィンゴモナス・トゥルーペリを培養し、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類を製造する場合、炭素源である糖類を、培地に２％以上、１０重量％まで添加することが出来、好適な条件で培養した場合の多糖類の生産量は、乾燥固形分換算にて、通常１重量％〜５重量
％である。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
〔実施例１〕
ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２の培養菌体から、一般的に使用されるグラム陰性細菌DNA抽出法（鈴木健一朗、DNAの調製；鈴木健一朗ら編、微生物の分類・同定実験法 分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に、15-33.シュプリンガー・フェアラーク東京、2001年
参照）によりDNAを抽出、精製し、GC含量測定のためのDNAを取得した。測定の主な手法は、前記鈴木らに記載の方法によった。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた測定法は、Katayamaら（Katayama-Fujimura(Y.) etc, Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 3169-3172 参照）に記載の方法によった。
【００３３】
滅菌水に溶解し、熱変性したDNA（350μg/mL）20μLに等量のヌクレアーゼP1溶液（O.lmg/mLヌクレアーゼP1（DNA.GCKit、ヤマサ醤油製、生化学工業販売）−40mM酢酸ナトリウム−2mM硫酸亜鉛[pH5.3]）を加え、50℃で1時間処理しヌクレオチドに分解後、HPLC測定の試料とした。測定は、HPLC（LC-lO、島津製作所、京都）を用い、移動相：10mMリン酸バッファー（10mMリン酸水素ニカリウム、10mMリン酸二水素一カリウム[pH7.O]）、カラム：DevelosilODS-HG-5φ4.6mm×250mm（野村化学、愛知）、流速：1.Oml/分、
検出波長：270nmの条件で行なった。
【００３４】
DNA-GCKit(ヤマサ醤油製、生化学工業販売)に含まれる標準ヌクレオチド混合物（dCMP,dAMP,dGMP,dTMPを等モル含有）および検体のリテンションタイムにより、各ヌクレオチドの同定を行うとともに、標準ヌクレオチド混合物と検体の各ピーク面積比から検体のDNA塩基組成をGC含量として次式により算出した。
【００３５】
（数１）
G＋C（mol%）=((Cx/Cs+Gx/Gs)/(Cx/Cs+Ax/As+Gx/Gs+Tx/Ts))×lOO
Nxは検体のdCMP、dAMP、dGMP、又はdTMPのピーク面積の値、Nsは標準ヌクレオチド混合物に含まれているdCMP、dAMP、dGMP、dTMPのピーク面積の値を表す。
【００３６】
その結果、ＳＰＨ−０１１、およびＳＰＨ−０１２に由来するDNA試料と、標準ヌクレオチド混合物のクロマトグラムを示した。３回の計測による検体と標準ヌクレオチド混合物の各ピーク面積および、その比率から算出した検体のGC含量を表１に、その結果に基づく平均値を表２に示した。ＳＰＨ−０１１のGC含量は、６５．５％であり、ＳＰＨ−０１２のGC含量は、６５．３％であった。
【００３７】
【表１】
2005185246.tif 000003
【００３８】
【表２】
2005185246.tif 000004
【００３９】
〔実施例２〕
ＳＰＨ−０１１及びＳＰＨ−０１２を、Nutrient Agar（Oxoid, England, UK）に植菌し、30℃で２日間培養した。その後、この菌体をDNA抽出の供試菌体とした。
ゲノムDNAの抽出には、PrepMan Method（Applied Biosystems,CA,USA. http://www.appliedbiosystems.cojp/website/jp/home/index_g.jsp）を使用した。抽出したゲノムDNAを鋳型として、PCRにより16SリボゾームRNA遺伝子（16SrDNA）の全塩基配列約1500〜1600bp
の領域を増幅した。その後、増幅された16SrDNAをシーケンシングし、検体の16S rDNA 塩基配列を得た。PCR反応及びPCR産物の精製には、MicroSeqFull l6S rDNA Bacterial Sequencing Kit（AppliedBiosystems,CA,USA.）を使用した。サーマルサイクラーには、GeneAmpPCRSystem9600（Applied Biosystems,CA,USA.）、塩基配列決定に用いたDNAシーケンサーにはABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems, CA, USA.）を使用し、得られた塩基配列断片の結合にはAuto Assembler2.1（Applied Biosystems,CA,USA）を使用した。なお、ゲノムDNA抽出からサイクルシークエンスまでの基本的操作は、Applied Biosystems社のプロトコール（P/N4308132Rev:A）に従った。
【００４０】
解析では、得られた16S rDNAの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率が最も高い10株を決定した。更に、検索された上位10株と検体の16SrDNAを用いて近隣結合法（Saitou, N.ら、Molecular Biology and Evolution 4, 406-425, l987 参照）により分子系統樹を作成し、検体の近縁種および帰属分類群の検討を行った。相同性検索は、BLAST（Altschul, S.F.ら、Nucleic Acids Res. 25,  3389-3402, 1997参照）を用いてDNA塩基配列データベース（GenBank）に対して相同性検索を行った。
【００４１】
その結果、BLASTを用いたGenBankに対する相同性検索の結果、ＳＰＨ−０１１の16SrDNAは、スフィンゴモナス・トゥルーペリLMG2142T株（KAMPFER, P.ら、Int. J. Syat. Bacteriol, 1997, 47, 577-583）の16SrDNAに対し、最も高い相同性（99.9%）を示した。
【００４２】
ＳＰＨ−０１２の16SrDNAはスフィンゴモナス・トゥルーペリLMG2142T株（同種の基準株）の16SrDNAに対し、最も高い相同性（99.7%）を示した。
【００４３】
〔実施例３〕
＜１＞マイクロプレート法によるDNA−DNAハイブリッド形成試験
ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２、スフィンゴモナス・トゥルーペリLMG2142T株 （同種の基準株）の培養菌体から、一般的に使用されるグラム陰性細菌DNA抽出法（前記鈴木ら、p.15-21参照）によりDNAを抽出した。抽出されたDNAは多糖類による粘性を生じていたため、田村らの方法（田村朋彦、中川恭好、川崎浩子、遺伝子解析法、日本放線菌学会編放線菌の分類と同定 p.83-85 (財)口本学会事務センター.2001 参照）によりヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Hexadecyltrimethyl ammoniumbromide：CTAB)を用いて精製し、DNA-DNAハイブリッド形成試験に用いた。
【００４４】
マイクロプレート法を用いたDNA-DNAハイブリッド形成試験の主な手法は、河村の方法（河村好章、細菌の系統分類と同定方法  第18回日本細菌学会技術講習会テキスト 日本細菌学雑誌55(3):545-584, 2000 参照）および成書（前記鈴木ら）によった。熱変性したDNAを10μg/mLの濃度になるよう0.1M塩化マグネシウム−リン酸バッファー（8g塩化ナトリウム, 0.2g塩化カリウム、1.15gリン酸一水素ニナトリウム、0.2gリン酸二水素一カリウム（以下のリン酸バッファーも同一組成)）で溶解し、これを96穴マイクロプレートに1ウェルあたり100μLずつ分注し、30℃で一夜置床し、DNAをウェルに固定した。固定後、液を捨て45℃で乾燥させ、使用するまでデシケーターに入れて保管した。標識DNAは、10μgのDNAに10μLのlmg/mLフォトビオチン水溶液(Ｐhotoprobe biotin, Vector Laboratories SP-1000,フナコシ）を加え30分間光照射して作製した。
【００４５】
DNAを固定したマイクロプレートにプレハイブリダイゼーション溶液1.OmL 20xSSC（3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム)、1.OmL 50×Denhardt's溶液（(株)ニッポンジーン、東京)、0.lmL 10mg/mLサケ由来DNA（Sigma, MO, USA）, 5.OmLホルムアミド、蒸留水)を200μLずつ分注し、37℃で30分保持した。フォトビオチンで標識したDNAは超音波処理によって断片化し、熱変性後急冷しハイブリダイゼーション液(プレハイブリダイゼーション溶液に5%量の硫酸デキストランを添加）に加えた。プレート中のプレハイブリダ
イゼーション液を捨て、標識DNAを加えたハイブリダイゼーション液をウェルあたり100μLずつ分注し、プレートシールをした後、51.1℃（(Tm-45)℃=24.3+[G+C(mol%)1×0.41]にて3時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後、ハイブリダイゼーション液を捨て、1×SSCで洗浄し、ウェルあたり100μLのストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ溶液（10μLのl unit/mLストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ（Sigma, MO, USA）を10mL O.5%仔ウシ血清アルブミン（FractionV）（(Sigma, NO, USA)リン酸バッファーに溶解）を加え、37℃で30分間保持した。
【００４６】
反応終了後、1×SSCで洗浄し、4MUF溶液（100μL 4MUF(4メチルウンベリフェリルガラクトピラノシド(Sigma, MO, USA)を10mg/mL の濃度でジメチルホルムアミドに溶解）、10mL O.1M塩化マグネシウム−リン酸バッファー）をウェルあたり100μLずつ分注し、37℃に加温した蛍光プレートリーダー(ジェニオス、TECAN(和光純薬))で0分から15分ごとに60分後までの蛍光強度を測定した。測定用フィルターは励起波長360nm、蛍光波長465nmを用いた。
【００４７】
蛍光強度は、測定時間に対して直線性を示し。反応開始45分後の数値を測定値とした。自己再会合（ポジティブコントロール）の蛍光強度を相同値100%、ネガティブコントロール（仔ウシ胸腺由来DNA）の蛍光強度を相同値0%として、各検体の組み合わせの相同値を次式により算出した。
【００４８】
（数２）
DNA相同値(%)=100×(A-N)/(P-N)
A：測定対象のDNAの蛍光強度、P：ポジティブコントロールの蛍光強度、N:ネガティブコントロールの蛍光強度
【００４９】
＜２＞メンブランフィルター法によるDNA-DNAハイブリッド形成試験
次に、メンブレンフィルター法でDNA-DNAハイブリッド形成試験を行った。主な手法は、成書（前記鈴木ら、p.4-47参照）に基づいた。ただしプローブの標識・検出はRIの代わり化学発光を用いた。熱変性した100μg/mLの濃度のDNAに1/2量の20×SSC（3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム）を加えた。これをナイロンメンブレン（Hybcmd+、
Amersham Biosciences、NJ、USA）に1スポットあたり2μLずつスポットし、80℃で10分間置床後、Hybridizer and HybriLinker Hybridization Ovens（UVP、CA、USA）により2分間UV照射し、DNAをメンブレンに固定した。メンブレンは、固定後、使用するまでデシケーターに入れて保管した。DNAの標識は、AlkPhos Direct Labeling and Detection System with CDP-Star（Amersham Biosciences、NJ、USA）を用いアルカリフォスファターゼを直接標識した。具体的には、熱変性した1μgのDNAに10μLのReaction buffer、2μLのlabeling reagent、滅菌水で5倍希釈した10μLのCross linker solutionを氷上で順次加えた後、37℃、30分間置床した。
【００５０】
Hybridisation buffer（Amersham Biosciences、NJ、USA）を15mLずつ分注したシャーレにDNAを固定したメンブレンを入れ、51.1℃（(Tm-45)℃=24.3+[G+C(mol%)1×0.41]で1時間プレハイブリダイゼーションした。その後、Hybridisation bufferに標識DNAを加え
℃（(Tm-45)℃=24.3+[G+C(mol%)1×0.41]）で一晩ハイブリダイゼーション反応を行なった。反応後、ハイブリダイゼーション液を捨て、1次洗浄バッファー（2M Urea、0.1% SDS、50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、150mM塩化ナトリウム、lmM塩化マグネシウム、0.2% Blocking reagent）を用いて45℃で2回、2次洗浄バッファー(50mM Tris base、100mM塩化ナトリウム、2mM 塩化マグネシウム)を用いて室温で2回洗浄し、余分な洗浄バッファーをろ紙で吸い取り、メンブレンに対し40μL/cm２のCDP-Star chemiluminescent detection reagent（Amersham Biosciences、NJ、USA）を加え5分間保持した。
【００５１】
反応終了後、余分なdetectionreagentをろ紙で吸い取り、メンブレンを気泡がないようにラップでくるみ、ブロット面が上になるように化学発光検出用ミニカメラ（ECLMini-Camera、Amersham Biosciences、NJ、USA）にセットし2時間露光した。露光後、カメラからインスタントフィルム(FP-3000B、FUJIFILM、京都)を抜き取りスキャナー（GTL7600UF、EPSON、長野）でフィルム画像を取り込み、画像解析ソフトImage Jで発光強度を測定した。  自己再会合（ポジティブコントロール）の発光強度を相同値100%、ネガティブコントロール（スポットをしていないメンブレン部分）の発光強度を相同値0%として、各検体の組み合わせの相同値を次式により算出した。
【００５２】
（数３）
DNA相同値(%)=100×(A-N)/(P-N)
A:測定対象のDNAの発光強度、P:ポジティブコントロールの発光強度、N:ネガティブコントロールの発光強度
【００５３】
＜３＞結果
マイクロプレート法とメンブランフィルター法の２種の手法により、合計３回のハイブリダイゼーション試験を行った。それぞれの試験の結果およびその平均値を表３に示した。
【００５４】
【表３】
2005185246.tif 000005
【００５５】
３回の試験結果の平均から、ＳＰＨ−０１１をプローブとして用いたときは、他の２検体に対しての相同値は70%以上の高い値を示した。一方、ＳＰＨ−０１２およびスフィンゴモナス・トゥルーペリLMG2142T株 をプローブとして用いたときは、ＳＰＨ−０１１に
対しての相同値はそれぞれ67%及び69%という値であったが、それ以外は70%以上の値を示した。現
在、細菌の種は、DNA-DNA相同値の比較の結果、70%以上の相同値を示す菌株同士を同種、また60%以上の相同値を示す菌株同士を別亜種も含めた同種とすると定義されている（Wayne, L.G.ら、Int, J. Syst. Bacteriol., 1987, 37, 463-464）。また、16SrDNA塩基配列解析の結果と総合的に解析すると、ＳＰＨ−０１１およびＳＰＨ−０１２は、スフィンゴモナス・トゥルーペリLMG2142T株と同種であると同定される。
【００５６】
〔実施例４〕
＜１＞ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２の培養
下記組成の培地５０Ｌを、マルビシエンジニアリング社製の９０Ｌの発酵槽に入れ、滅菌後、ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２をそれぞれ摂取し、培養を行った。
【００５７】
発酵槽の攪拌羽にはタービン攪拌羽根を用いて、700rpm〜800rpmの範囲で撹拌し、通気量 は１ｖｖｍ〜２ ｖｖｍの範囲とした。ｐHは、６．５±０．４の範囲となるようにNaOH 1N水溶液を使用してコントロールした。また、培養温度は、３０℃±０．２でコントロールを行った。培養は６日間行った。
【００５８】
＜培地の組成＞
グルコース          〔和光純薬工業(株)製〕４．００ｇ
リン酸水素二カリウム〔和光純薬工業(株)製〕０．４０ｇ
リン酸二水素カリウム〔和光純薬工業(株)製〕０．２０ｇ
塩化ナトリウム      〔和光純薬工業(株)製〕０．０１ｇ
硫酸マグネシウム    〔和光純薬工業(株)製〕０．０２ｇ
硝酸カリウム        〔和光純薬工業(株)製〕０．１０ｇ
イーストエキストラクト Hy-Yeast ４１２ 〔シグマ社製〕０．１５ｇ
【００５９】
＜２＞高分子成分と低分子成分の分析
上記培養方法にて培養を行ったＳＰＨ−０１１、Bそれぞれの培養液の一部を、イオン交換水で100倍に希釈し、その希釈液をメンブレンフィルターシステム（Minitan ミリポア製、ポアーサイズ0.22μm 、膜面積90cm２）にて濾過を行い、水溶解成分と不溶成分の分離を行った。そして水溶解成分より低分子成分を精製し、それぞれ低分子多糖A、低分子多糖Bとした、不溶成分より高分子成分を精製し、それぞれ高分子多糖A、高分子多糖Bとした。
【００６０】
（１）高分子成分の精製
水不溶成分である濾過残渣に、その約２倍量のエタノールを加え、多糖類を沈澱させた後、上澄み液を除いた。多糖類の塊に少量の水を加えた後、60℃程度に加熱して多糖類を溶解させ、そして再度エタノールで沈澱させた。この洗浄作業を５回繰り返し粗精製サンプルを得た。粗精製サンプルを、0.02％の水酸化ナトリウム溶液に移し、一晩撹拌を行い多糖類を分散させた（多糖類濃度は約 200ppm）。更に、121℃、10分間の条件で加熱して溶解させた。次に、遠心分離（40,000G, 40分）にて除菌を行った。菌体除去の確認は、上清の透明度で判断した。次に、前記メンブレンフィルターシステムにて濾過を行い濾過残渣を得た。この濾過残さに再度、体積として約100倍量純水を足し撹拌した後、再濾過をおこなう。この操作を５回繰り返し水不溶成分の脱塩を行い精製を得た。メンブレンフィルターシステムによりある程度脱水したゲル状の水不溶成分をそのまま常温減圧乾燥し、高分子成分とした。
【００６１】
（２）低分子成分の精製
培養液の濾液をロータリーエバポレーターにて（約60℃）50倍に濃縮し、エタノールを
用いて塩析を行った。そして、0.2μmのメンブレンフィルターによる濾過、もしくは遠心分離より固形物を除去した。次に得られた上清を希釈し、イオン交換樹脂 AG50W-X8（H型）と AG1-X4（Ac-OH型）（バイオラッド社製）にて極性物質を除き、脱塩を行った。これをロータリエバポレーターにより濃縮した後、エタノール沈澱を行い多糖類を沈澱回収した。含水している多糖類を常温減圧乾燥し、低分子成分とした。
【００６２】
（３）構成単糖の分析
高分子多糖A、Bと低分子多糖A、Bそれぞれ２０．０mgを4.5mlの水に溶かし、0.5mlの硫酸（4N）を加えた後、アンプルに入れ、-80℃で凍結、減圧し、封かんした。100℃で２時間加熱後冷却し、炭酸バリウムにて中和した。沈澱物を除去した後、60℃のエバポレーターにて約0.5mlに濃縮した。加水分解サンプルをＨＰＬＣにて分析を行った。ＨＰＬＣ装置は「ヒューレッドパッカード社製、HPLC-1090M」社製を使用した。カラムは、SH-1011（昭和電工(株)製）２本を直列に接続して使用した。カラム温度は50℃、移動相はH２SO４（0.01N）、流速は0.75 ml/分で行った。
【００６３】
ＨＰＬＣ分離のチャートは図２〜５に示した。リテンションタイムは、グルクロン酸17.0分、グルコース18.9分、マンノース19.8分、ラムノース20.7分、フコース22.3分であることから、各多糖類の構成単糖は以下のとおりである（カッコ内は、モル比を表す）。
【００６４】
高分子多糖Aの構成単糖：グルクロン酸、グルコース、ラムノース、フコース（１：２：１：１）
高分子多糖Bの構成単糖：グルクロン酸、グルコース、ラムノース、フコース（１：２：１：１）
低分子多糖Aの構成単糖：マンノース、フコース（１：１）
低分子多糖Bの構成単糖：マンノース、ラムノース（２：１）
【００６５】
＜２＞メチル化分析
高分子多糖A、Bにおける構成単糖の結合部位を決定するためにメチル化分析を行った（C.J.Lawsonら、Biochem. J., 115, 947-958(1969)）。高分子多糖A、Bは酸性糖（グルクロン酸）を含むため、メチル化分析を行う前にサンプルを二つに分け、一方はそのままメチル化し、他方はカルボキシル基をLiAlH4で還元後メチル化した〔I.Uiya、「糖タンパク質糖鎖研究法（７）」（学会出版センター）ｐ８３−８９（１９８９）〕。
【００６６】
メチル化後 90％ギ酸で105℃、1.5時間、続いて0.3N硫酸で105℃、12〜18hr、加水分解した。得られた部分メチル化糖を NaBH４で還元後アセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテートとして、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析及びガスクロマトグラフィー・マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）分析した。ＧＣ分析は、島津製作所製ＧＣ−９Ａを用い、カラムは OV-101D (0.25mmφ×50m)を用い、カラム温度は140℃で２分間保持した後、５℃/分で230℃まで昇温させ、検出は水素炎検出器を用いて行った。一方 GC-MS分析は、QP-1000装置（島津製作所製）を用いて、カラムはHRー101-50M-025 (0.25mmφ×25m)を用い、カラム温度は140℃(2分) →230℃(8℃/分)とし、EI法でイオン化し、加速電圧は70eVで行った。結果を表４及び図６〜９に示す。その結果、高分子多糖A、B共に同じ結合部位をもつ単糖で構成されていることが判明した。
【００６７】
グルクロン酸を還元しないでそのままメチル化分析を行うと、2,3-ジメチルグルコースのピークが現れないことから、グルクロン酸は４位で結合しており、分岐は無いことが明らかになった。
【００６８】
【表４】
2005185246.tif 000006
【００６９】
〔実施例５〕ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２の培養液の組成の検討
ＳＰＨ−０１１及びＳＰＨ−０１２の培養液に含まれる成分について検討を行った。
【００７０】
（１）培養
ＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２を、グルコース０．５％、リン酸水素二カリウム０．０４％、 リン酸二水素カリウム０．０８％、 イーストエキストラクト０．０５％、食塩０．０１％、硫酸マグネシウム０．０２％、硝酸カリウム０．１％ からなる培地１Ｌに接種し、３０℃、３６時間、振盪培養した。これを種として、下記組成の培養培地１乃至３について、培養培地２００Ｌを入れた３００Ｌ容量のジャーファーメンターで、３０℃、１４４時間通気撹拌（通気量：２００Ｌ／分、撹拌数：２５０ｒｐｍ）培養した。
【００７１】
比較例として、アルカリゲネス・レータス Ｂ−１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０１５）株を同様にして培養した。
【００７２】
＜培地の組成（２００Ｌ中）＞
（培地１）（培地２）（培地３）
グルコース          〔和光純薬工業(株)製〕      5.00kg    9.00kg    14.00kg
リン酸水素二カリウム〔和光純薬工業(株)製〕      0.40kg    0.40kg    0.40kg
リン酸二水素カリウム〔和光純薬工業(株)製〕      0.20kg    0.20kg    0.20kg
塩化ナトリウム      〔和光純薬工業(株)製〕      0.01kg    0.01kg    0.01kg
硫酸マグネシウム    〔和光純薬工業(株)製〕      0.02kg    0.02kg    0.02kg
硝酸カリウム        〔和光純薬工業(株)製〕      0.10kg    0.10kg    0.10kg
イーストエキストラクト         〔シグマ社製 Hy-Yeast 412〕 0.20kg    0.36kg    0.50kg
ｐＨ６．５
【００７３】
（２）培養液中の多糖類濃度の測定
上記（１）で培養した培養液中の多糖類の濃度を、以下の条件で高速液体クロマトグラフィーにて測定した。
【００７４】
装置  ：ヒューレッドパッカード社製   ＨＰＬＣ １０９０Ｍ
カラム：昭和電工（株）製  ＳＨ−１０１１ × ２
ＥＣＤ：（パルス電圧  Ｐ＝０．１５Ｖ）
移動相：０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４
温度  ：５０℃
注入量：２０μｌ
【００７５】
（３）培養液中の有機酸の測定
前記培養液中の多糖類の濃度を、以下の条件でイオンクロマトグラフィーにて測定した。
装置  ：ヒューレッドパッカード社製   ＩＣ ７０００Ｓ
カラム：ヒューレッドパッカード社製   ＣＨＡ−Ｅ１１
検出器：ＵＶ（検出波長 ＝ ２１０ｎｍ ）
溶離液：０．００２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４
除去液：２５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４
温度  ： ４０℃
【００７６】
（４）培養液中のアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の定量
前記培養液中のアンモニウムイオン（ＮＨ４＋）の濃度を、インドフェノール法準拠の（株）共立理化学研究所の水質検査用試薬セット（製品名ＷＡＫ−ＮＨ4）を用いた。スタンダードとして硫酸アンモニウムを用いた。
【００７７】
（５）多糖類の収量
高速遠心分離により菌体を除いた前記培養液１００ｇに、３００ｍｌのエタノールを加え、多糖類を沈澱させた後、２００メッシュのナイロンで絞り、溶媒を除去させた。次に、１０５℃、１時間乾燥させた後、室温にて乾燥固形物の重量を測定した。
【００７８】
（６）培養液粘度
前記培養液の粘度を、Ｂ型粘度計（トキメック社製）にて、３０ｒｐm、Ｎｏ．３ロータにて測定した。
【００７９】
（７）基質転換率
前記培養によって得られた多糖類の、培地に加えたグルコースからの転換率を、下記式により算出した。
【００８０】
（数４）
基質転換率（％）＝ 多糖類収量／グルコース添加量×１００
【００８１】
（８）結果
上記の測定の結果は、表５〜７に示した。
【００８２】
【表５】
2005185246.tif 000007
【００８３】
【表６】
2005185246.tif 000008
【００８４】
【表７】
2005185246.tif 000009
【００８５】
比較例の菌株（アルカリゲネス・レータス Ｂ−１６）の場合は、糖濃度２．５重量％の場合は、基質転換率３２％、糖濃度４．５重量％の場合は、３１％、７の場合は、糖濃
度２３重量％と、基質を添加しても、生産量は上がらなかった。また、培地中の残糖も多く、培養が不完全であった。
【００８６】
それに対し、実施例の菌株（ＳＰＨ−０１１及びＳＰＨ−０１２）の場合は、全ての場合において、基質添加率５０％以上を維持し、残糖も殆どなく、良好に培養が行われた。また、実施例の場合と、比較例の場合において、生育阻害物質である、培地中の酢酸、乳酸、アンモニアの含有量が殆ど変わらないことから、実施例の菌株は、これらの生育阻害物質の影響と考えられる。
【００８７】
本発明の菌種を使用すると、糖濃度が２％以上の高濃度培養において、良好な培養を維持でき、少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖として含む多糖類の生産に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】スフィンガンの合成経路を示す図。
【図２】高分子多糖AのＨＰＬＣのチャート。
【図３】低分子多糖AのＨＰＬＣのチャート。
【図４】高分子多糖BのＨＰＬＣのチャート。
【図５】低分子多糖BのＨＰＬＣのチャート。
【図６】高分子多糖Aの還元前のＣＧ−ＭＳのチャート。
【図７】高分子多糖Aの還元後のＣＧ−ＭＳのチャート。
【図８】高分子多糖Bの還元前のＣＧ−ＭＳのチャート。
【図９】高分子多糖Bの還元後のＣＧ−ＭＳのチャート。
【図１】
2005185246.tif 000010
【図２】
2005185246.tif 000011
【図３】
2005185246.tif 000012
【図４】
2005185246.tif 000013
【図５】
2005185246.tif 000014
【図６】
2005185246.tif 000015
【図７】
2005185246.tif 000016
【図８】
2005185246.tif 000017
【図９】
2005185246.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月12日(2004.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
少なくともフコース、グルコース、グルクロン酸、及びラムノースを構成単糖とする多糖類を産生するスフィンゴモナス・トゥルーペリを培養する培地としては、スフィンゴモナス・トゥルーペリが生育し、かつ、前記多糖類を産生する培地であれば特に制限無く使用することができるが、例えば、糖類、リン酸塩、有機窒素源、無機窒素源、塩類で構成される培地が挙げられる。糖類は、通常の単糖類、二糖類が使用され、例えばグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ラムノース、セロビオース、ガラクトース、キシロース、ラクトース、アラビノース、マルトース等、またそれらの混合物である、糖蜜、でんぷん糖等から選ばれる一種又はそれ以上であるが、これらの中ではグルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、でんぷん糖が望ましく、その配合濃度としては、通常０．１〜重量１０％、好ましくは１〜７重量％、更に好ましくは、２〜５重量％である。０．１重量％より少ないと、多糖類の生産性が低く、本発明の特徴を生かすことができない場合があり、又１５重量％より多いと、基質の添加量に見合うだけの生産量を得ることが出来ず、非効率的である場合がある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
＜２＞メンブレンフィルター法によるDNA-DNAハイブリッド形成試験
次に、メンブレンフィルター法でDNA-DNAハイブリッド形成試験を行った。主な手法は、成書（前記鈴木ら、p.4-47参照）に基づいた。ただしプローブの標識・検出はRIの代わり化学発光を用いた。熱変性した100μg/mLの濃度のDNAに1/2量の20×SSC（3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム）を加えた。これをナイロンメンブレン（Hybcmd+、
Amersham Biosciences、NJ、USA）に1スポットあたり2μLずつスポットし、80℃で10分間置床後、Hybridizer and HybriLinker Hybridization Ovens（UVP、CA、USA）により2分間UV照射し、DNAをメンブレンに固定した。メンブレンは、固定後、使用するまでデシケーターに入れて保管した。DNAの標識は、AlkPhos Direct Labeling and Detection System with CDP-Star（Amersham Biosciences、NJ、USA）を用いアルカリフォスファターゼを直接標識した。具体的には、熱変性した1μgのDNAに10μLのReaction buffer、2μLのlabeling reagent、滅菌水で5倍希釈した10μLのCross linker solutionを氷上で順次加えた後、37℃、30分間置床した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
Hybridisation buffer（Amersham Biosciences、NJ、USA）を15mLずつ分注したシャーレにDNAを固定したメンブレンを入れ、51.1℃（(Tm-45)℃=24.3+[G+C(mol%)1×0.41]で1時間プレハイブリダイゼーションした。その後、Hybridisation bufferに標識DNAを加え、51.1℃（(Tm-45)℃=24.3+[G+C(mol%)1×0.41]）で一晩ハイブリダイゼーション反応を行なった。反応後、ハイブリダイゼーション液を捨て、1次洗浄バッファー（2M Urea、0.1% SDS、50mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、150mM塩化ナトリウム、lmM塩化マグネシウム、0.2% Blocking reagent）を用いて45℃で2回、2次洗浄バッファー(50mM Tris base、100mM塩化ナトリウム、2mM 塩化マグネシウム)を用いて室温で2回洗浄し、余分な洗浄バッファーをろ紙で吸い取り、メンブレンに対し40μL/cm2のCDP-Star chemiluminescent detection reagent（Amersham Biosciences、NJ、USA）を加え5分間保持した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
＜３＞結果
マイクロプレート法とメンブレンフィルター法の２種の手法により、合計３回のハイブリダイゼーション試験を行った。それぞれの試験の結果およびその平均値を表３に示した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
＜２＞高分子成分と低分子成分の分析
上記培養方法にて培養を行ったＳＰＨ−０１１、ＳＰＨ−０１２それぞれの培養液の一部を、イオン交換水で100倍に希釈し、その希釈液をメンブレンフィルターシステム（Minitan ミリポア製、ポアーサイズ0.22μm 、膜面積90cm2）にて濾過を行い、水溶解成分と不溶成分の分離を行った。そして水溶解成分より低分子成分を精製し、それぞれ低分子多糖A、低分子多糖Bとした、不溶成分より高分子成分を精製し、それぞれ高分子多糖A、高分子多糖Bとした。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
（１）高分子成分の精製
水不溶成分である濾過残渣に、その約２倍量のエタノールを加え、多糖類を沈澱させた後、上澄み液を除いた。多糖類の塊に少量の水を加えた後、60℃程度に加熱して多糖類を溶解させ、そして再度エタノールで沈澱させた。この洗浄作業を５回繰り返し粗精製サンプルを得た。粗精製サンプルを、0.02％の水酸化ナトリウム溶液に移し、一晩撹拌を行い
多糖類を分散させた（多糖類濃度は約 200ppm）。更に、121℃、10分間の条件で加熱して溶解させた。次に、遠心分離（40,000G, 40分）にて除菌を行った。菌体除去の確認は、上清の透明度で判断した。次に、前記メンブレンフィルターシステムにて濾過を行い濾過残渣を得た。この濾過残渣に再度、体積として約100倍量純水を足し撹拌した後、再濾過をおこなう。この操作を５回繰り返し水不溶成分の脱塩を行い精製を得た。メンブレンフィルターシステムによりある程度脱水したゲル状の水不溶成分をそのまま常温減圧乾燥し、高分子成分とした。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（３）構成単糖の分析
高分子多糖A、Bと低分子多糖A、Bそれぞれ２０．０mgを4.5mlの水に溶かし、0.5mlの硫酸（4N）を加えた後、アンプルに入れ、-80℃で凍結、減圧し、封かんした。100℃で２時間加熱後冷却し、炭酸バリウムにて中和した。沈澱物を除去した後、60℃のエバポレーターにて約0.5mlに濃縮した。加水分解サンプルをＨＰＬＣにて分析を行った。ＨＰＬＣ装置は「ヒューレッドパッカード社製、HPLC-1090M」社製を使用した。カラムは、SH-1011（昭和電工(株)製）２本を直列に接続して使用した。カラム温度は50℃、移動相はH2SO4（0.01N）、流速は0.75 ml/分で行った。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
メチル化後 90％ギ酸で105℃、1.5時間、続いて0.3N硫酸で105℃、12〜18hr、加水分解した。得られた部分メチル化糖を NaBH4で還元後アセチル化して、部分メチル化アルジトールアセテートとして、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析及びガスクロマトグラフィー・マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）分析した。ＧＣ分析は、島津製作所製ＧＣ−９Ａを用い、カラムは OV-101D (0.25mmφ×50m)を用い、カラム温度は140℃で２分間保持した後、５℃/分で230℃まで昇温させ、検出は水素炎検出器を用いて行った。一方 GC-MS分析は、QP-1000装置（島津製作所製）を用いて、カラムはHR-101-50M-025 (0.25mmφ×25m)を用い、カラム温度は140℃(2分) →230℃(8℃/分)とし、EI法でイオン化し、加速電圧は70eVで行った。結果を表４及び図６〜９に示す。その結果、高分子多糖A、B共に同じ結合部位をもつ単糖で構成されていることが判明した。