(57)【要約】【課題】            癌細胞から抗癌剤を排出する排出ポンプを同定し、かかる排出ポンプを阻害する物質を検索することにより、新たな抗癌剤、または抗癌活性増強剤をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】        癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を用いる、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング方法であり、具体的には、癌細胞に抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を形質導入し、当該形質導入した癌細胞を抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤とともに培養し、その細胞の生存率を検出することにより抗癌剤の排出阻害を評価することを特徴とするスクリーニング方法である。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を用いる、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
癌細胞から抗癌剤の排出阻害を指標とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
癌細胞に抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を形質導入し、当該形質導入した癌細胞を抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤とともに培養し、その細胞の生存率を検出することにより抗癌剤の排出阻害を評価することを特徴とする請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子。
【請求項５】
TETRAN遺伝子の薬物排出機能を阻害する活性を有する化合物からなる抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤。
【請求項６】
TETRAN遺伝子を使用する、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤のスクリーニング方法に関し、詳細には、癌細胞が抗癌剤の排出を促進させる薬剤排出ポンプ機能を有する遺伝子を用いる抗癌剤のスクリーニング方法に関する。また本発明は、当該遺伝子の薬剤排出機能を阻害する活性を有する抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）は、抗炎症薬として以外にも、種々の作用を有しており、例えば、NSAIDSのなかでも代表的なアスピリンは、少量投与で「抗血小板薬」としての作用を有しており、狭心症や心筋梗塞、脳卒中（脳梗塞）などの治療に用いられている。また最近では、NSAIDS自体が癌細胞にアポトーシスを誘導させることから、抗癌剤としての作用が期待され、例えばインドメタシンは、抗癌剤として使用されているが、その詳細なメカニズムはいまだ不明な部分が多い。
【０００３】
本発明者は、従来から、これらの非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）の種々の作用機序に着目し、これまで癌細胞に対する非ステロイド系抗炎症薬の作用メカニズムを積極的に検討してきている。そのなかで、本発明者は、癌細胞には自己の細胞中から抗癌剤を排出するタンパク質、すなわち、薬剤の排出ポンプを司る遺伝子が存在し、細胞内の抗癌剤を細胞外へ排出し、細胞を抗癌剤に対し耐性化することを見出した。
【０００４】
事実、抗癌剤を細胞外へ排出する排出ポンプを阻害する物質は、癌細胞を抗癌剤に感受性化、すなわち抗癌治療効果を増大させることとなる。そこで、抗癌作用を有する非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）の排出ポンプの同定を行なったところ、癌細胞に新たな薬剤排出ポンプが存在することを見出した。
【特許文献１】なし
【非特許文献１】なし
【０００５】
すなわち、本発明者が新たに見出した癌細胞におけるNSAIDSまたは抗癌剤を排出するポンプは、癌細胞の細胞膜上に存在する遺伝子産物であるタンパク質であり、かかるタンパク質が、癌細胞からNSAIDS、および他の抗癌剤を細胞外へ排出し、癌細胞を抗癌剤に対して耐性化させる役割を担っているものであることが判明した。
したがって、かかる排出ポンプ作用を阻害する作用物質は、逆に、抗癌剤を癌細胞内に高濃度で滞留せしめ、抗癌剤の癌細胞に対する感受性を高めるものであり、より有効な抗癌活性を発揮し得ることとなる。すなわち、かかる薬剤排出ポンプを阻害する物質を検索（スクリーニング）すれば、その物質は有効な抗癌剤となり得る。
【０００６】
ところで、従来から抗癌剤のスクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系における適当な標準癌細胞の増殖抑制、あるいは、癌細胞を移植した動物に対し抗癌剤を投与し、その延命効果によりスクリーニングが行なわれていた。しかしながら、本発明が提供する薬剤排出ポンプを阻害する物質を検索することにより、より現実的は抗癌活性化合物、あるいは抗癌活性増強剤のスクリーニングを行なうことができることとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明は、これまで全く知られていなかった癌細胞から抗癌剤を排出する排出ポンプを同定し、かかる排出ポンプを阻害する物質を検索することにより、新たな抗癌剤、または抗癌活性増強剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するための本発明の基本的態様は、癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を用いる、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング方法であり、具体的には、癌細胞から抗癌剤の排出阻害を指標とする前記のスクリーニング方法である。
【０００９】
具体的には、癌細胞に抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を形質導入し、当該形質導入した癌細胞を抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤とともに培養し、その細胞の生存率を検出することにより抗癌剤の排出阻害を評価することを特徴とするスクリーニング方法である。
【００１０】
さらに本発明は、また別の観点からみれば、上記したスクリーニング方法に使用する癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を提供するものでもあり、また、かかるTETRAN遺伝子を使用する、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤スクリーニング用のキットを提供する。さらに本発明は、かかるスクリーニング方法により選定された、TETRAN遺伝子を阻害する活性を有する化合物からなる抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤を提供するものでもある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明が提供するスクリーニング方法で検索される化合物は、癌細胞が抗癌剤を細胞外へ排出するポンプを阻害させることとなり、より現実的な抗癌活性化合物、あるいは抗癌活性増強剤となり得るのである。従来から抗癌剤のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系における適当な標準癌細胞の増殖抑制、あるいは、癌細胞を移植した実験動物に対し抗癌剤を投与し、その延命効果によりスクリーニングが行なわれており、有効な抗癌活性化合物の検索手段がなかったが、本発明方法により、臨床的に極めて有効な抗癌活性化合物、あるいは抗癌活性増強剤をスクリーニングすることができるのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者は、抗癌剤としても使用されている非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）を用いて、抗癌剤の排出ポンプ（細胞内の抗癌剤を細胞外に排出し、細胞を抗癌剤に耐性化させる）を司る物質、すなわち、癌細胞における非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）排出ポンプの同定を検討した。
【００１３】
そのために、先ず、酵母の全ての遺伝子をスクリーニングし、非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）のなかでも代表的なインドメタシンを用い、インドメタシンを排出し、細胞をインドメタシンに対し耐性化する遺伝子として、TPO1を同定した。
TPO1は、ポリアミンの排出ポンプに関与することが報告されていたが、NSAIDSの排出を行なうことは報告されていなかった。
【００１４】
次いで、得られたTPO1のヒトホモログの同定を試みたが、TPO1とホモロジーの高い遺伝子をデータベースから発見できなかった。そこで、ショウジョウバエでTPO1のホモログ（D. melanogaster tetracycline resistance protein (Drtet) (AE003733 [GenBank])を発見した。次にその遺伝子に対するヒトホモログとして、TETRAN遺伝子（The tetracycline transporter-like protein (L11669 [GenBank])）を見出した。
【００１５】
このTETRAN遺伝子は、すでにDuyo M. P.らにより、そのアミノ酸配列が、大腸菌のテトラサイクリン排出ポンプに類似するものであるとして、その一次構造式のみが報告されていた（Duyo M. P.ら：Hum. Mol. Genet: 1993, 2, 673-676）が、その生化学的活性は全く判明していないものであった。しかしながら、大腸菌におけるテトラサイクリン排出ポンプに似ているものであることから、大腸菌をテトラサイクリン耐性にする作用を発揮するものであった。
【００１６】
したがって、ある癌細胞にそのTETRAN遺伝子を導入すれば、その癌細胞は、すくなくともテトラサイクリンを排出し、テトラサイクリンに耐性化することとなることより、導入した遺伝子が、同様に、インドメタシンを排出するかどうかを検討した。
【００１７】
そこで、ヒト胃粘膜由来癌細胞（ＭＫＨ４５細胞）にTETRAN遺伝子を形質導入し、過剰発現させて、癌細胞がインドメタシンを排出するか否か、すなわち、ヒト胃粘膜由来癌細胞が、NSAIDSであるインドメタシンに耐性を示すか否かを検討した。
その結果、TETRAN遺伝子の形質導入により、ヒト胃粘膜由来癌細胞は、有意にインドメタシンを排出し、インドメタシンに対し耐性化することを確認した。また、代表的な抗癌剤として臨床的に使用されているエトポシドを用いて、エトポシドに対して耐性化するかどうかを検討したところ、同様の耐性化がみられた。
【００１８】
したがって、このTETRAN遺伝子は、癌細胞からの抗癌剤であるインドメタシンならびに抗癌剤であるエトポシドの排出を促進していることより、インドメタシンならびに抗癌剤の排出ポンプとして作用していることが判明した。
かかるTETRAN遺伝子が示す薬剤排出ポンプとしての働きは、本発明者により新規に見出した事実であり、したがって、かかるTETRAN遺伝子の排出ポンプの作用を阻害させる物質、すなわちTETRAN遺伝子を阻害する物質は、抗癌活性化合物、あるいは癌細胞を抗癌剤に感受性化（すなわち、治療効果を増大）させるものとなる。
すなわち、TETRAN遺伝子の阻害剤は、癌細胞内に抗癌剤を止まらせ、その結果、細胞内の抗癌剤の濃度を上昇させ、抗癌剤の抗癌活性を有効に発揮させることとなる。
【００１９】
以上の点からみれば、本発明が提供する、癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を用いる、抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング方法を用いることにより、臨床的により現実に即した抗癌剤または抗癌剤の感受性増強剤をスクリーニングすることができる。
【００２０】
かかるスクリーニング方法に使用するTETRAN遺伝子は、すでにその塩基配列が判明したタンパク質であり、GeneBankより容易に入手することができるほか、慣用のアミノ酸合成により合成することも可能である。したがって、本発明が提供するスクリーニング方法としては、化合物の抗癌活性の評価を行なう癌細胞にかかるTETRAN遺伝子を形質導入し、その形質導入された癌細胞が対象化合物に対し耐性化される否かを評価することにより行なうことができる。
【実施例】
【００２１】
上記したように、本発明が提供する、癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子を用いる抗癌剤、または抗癌剤の感受性増強剤のスクリーニング方法としては、例えば、ターゲットとなる癌細胞にこのTETRAN遺伝子を形質導入し、スクリーニング対象とする化合物への耐性を検討することにより行なわれる。より具体的には、例えば、ヒト胃粘膜由来の癌細胞にTETRAN遺伝子を形質導入し、対象となる化合物とともに培養を行ない、癌細胞自体の生存率を検討することで実施することができる。
【００２２】
その具体的一例を以下に記載することにより、本発明を更に詳細に説明する。
ヒトTETRAN遺伝子（IMAGE clone 4878602）のｃ−ＤＮＡを含有するプラスミドを試験管内遺伝子操作（Invitrogen）により得た。得られたプラスミドを、EcoRIおよびXhoIにより消化させ、得られたDNAフラグメントとをpcDNA3.1（＋）のEcoRI−XhoIサイトに導入し、ヒト胃粘膜由来の癌細胞（ＭＫＨ４５細胞）の形質導入に使用した。
【００２３】
形質導入は、Lipofectamine(TM2000)を使用し、一般的製造プロトコールにしたがって行なった。すなわち、G418を600μg/mL含有する選択培地に細胞を保持した。TETRAN遺伝子の安定した発現をノーザンブロッティング法により選択した。活性クローンを、G418を600μg/mLとともに保存した。
【００２４】
TETRAN遺伝子による排出ポンプの阻害は以下のようにして行なった。すなわち、上記で形質導入した細胞（各ウエル２×１０５；２４−ウエルプレート）で２４時間培養し、次いで、培地を非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDS）のなかでも代表的なインドメタシン、あるいは抗癌剤としてのエトポシドを含有する新鮮な培地に移し、細胞の生存率をＭＴＴ法により同定した。
インドメタシンについては、培地への添加濃度を０、０．２、０，４、０．６，０．８、１．０および２．０ｍＭとし、その濃度でのTETRAN遺伝子を形質導入したヒト胃粘膜由来の癌細胞、ベクターおよび非形質ヒト胃粘膜由来の癌細胞の生存率を求めた。また、エトポシドについては、培地への添加濃度を０、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０および１４０μＭとし、同様に、その濃度でのTETRAN遺伝子を形質導入したヒト胃粘膜由来の癌細胞、ベクターおよび非形質ヒト胃粘膜由来の癌細胞の生存率を求めた。
【００２５】
その結果を図１および図２に示した。図１に示したように、インドメタシンについては、TETRAN遺伝子が形質導入されたヒト胃粘膜由来の癌細胞のアポトーシスが濃度依存的に認められ、排出ポンプの阻害が生じていることが確認された。すなわち、TETRAN遺伝子の形質導入により、癌細胞は有意にインドメタシンに耐性化した。また、図２に示したように、抗癌剤であるエトポシドについても、TETRAN遺伝子が形質導入されたヒト胃粘膜由来の癌細胞のアポトーシスが濃度依存的に認められ、排出ポンプの阻害が生じていることが確認された。すなわち、エトポシドに対しても、同様の耐性化が確認された。
【００２６】
インドメタシンおよびエトポシドは、これまでの抗癌活性を有する化合物、すなわち抗癌剤として使用されていた化合物である。したがって、これらの化合物に対してとしてTETRAN遺伝子を形質導入した癌細胞が耐性化を示したことは、これら薬剤を癌細胞から排出しているものである。したがって、以上の点から判断すると、本発明が提供する癌細胞から抗癌剤を排出させるポンプ機能を有するTETRAN遺伝子の機能を阻害する物質をスクリーニングすることにより、癌細胞に抗癌剤を感受性化、すなわち、抗癌活性を増強させる化合物を見出すことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
以上説明したように、本発明が提供するスクリーニング方法により、簡便な方法で、より現実的な癌細胞にTETRAN遺伝子を形質導入し、その形質導入された癌細胞を対象に化合物の耐性化を検討することで抗癌活性をスクリーニングすることが可能となり、より有効な抗癌剤、あるいは抗癌活性増強剤を選択することが可能となり、医療上の効果は多大なものであるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のスクリーニング方法における、インドメタシン耐性の結果を示した図である。
【図２】本発明のスクリーニング方法における、エトポシド耐性の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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