(57)【要約】【課題】本発明の目的は、軟骨分化促進作用を有し、変形性関節症などの骨・関節疾患に関与する遺伝子を同定することである。さらに、該遺伝子の機能を抑制する物質のスクリーニング法及びスクリーニングにより選別される物質を提供し、これらを利用した疾病の診断手段、治療薬を提供する。【解決手段】Ｒｕｎｘ３遺伝子が軟骨分化促進作用を有し、変形性関節症などの骨・関節疾患に関連した遺伝子であることが明らかとなった。したがって、Ｒｕｎｘ３の機能を制御する物質は、変形性関節症などの骨・関節疾患に対する医薬品になりうる。また、本発明により、Ｒｕｎｘ３の機能を制御する物質のスクリーニング方法を提供し、さらに、Ｒｕｎｘ３遺伝子及びタンパク質の発現を解析することにより、変形性関節症などの骨・関節関連疾患の診断法又は診断薬が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制し、骨・関節疾患の治療及び／又は予防効果を有する物質。
【請求項２】
配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患の一因となる蛋白質をコードするＤＮＡの発現又は機能を抑制し、骨・関節疾患の治療及び／又は予防効果を有する物質。  
【請求項３】
該物質がデコイ分子である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項４】
該物質がアンチセンス核酸分子である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項５】
該物質がＲＮＡｉ核酸分子である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項６】
該物質が抗体又は抗体断片である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項７】
該物質がドミナントネガティブ蛋白質である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項８】
該物質が、ドミナンドネガティブ蛋白質をコードする核酸分子である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項９】
請求項８に記載のドミナントネガティブ蛋白質をコードする核酸分子を含む、発現用ベクター。
【請求項１０】
該物質が、ｓｃＦｖ蛋白質である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項１１】
該物質が、ｓｃＦｖ蛋白質をコードする核酸分子である請求項１又は２に記載の抑制物質。
【請求項１２】
請求項１１に記載のｓｃＦｖ蛋白質をコードする核酸分子を含む、発現用ベクター。
【請求項１３】
請求項９又は１２に記載のベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項１４】
Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制する骨・関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制する骨・関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程。
（２）該Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを測定する工程。
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、該Ｒｕｎｘ遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
【請求項１７】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程。
（２）該レポーター遺伝子の活性を測定する工程。
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させる化合物を選択する工程。
【請求項１８】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程。
（２）該被験動物の生体試料における、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を測定する工程。
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、該遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
【請求項１９】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子によってコードされるタンパク質と候補化合物を接触させる工程。
（２）該タンパク質の活性を測定する工程。
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記タンパク質の活性を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
【請求項２０】
Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子である請求項１４〜１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項１４から請求項１９いずれかに記載のスクリーニング方法によって選択される化合物。
【請求項２２】
請求項１〜１１及び請求項２１のいずれかに記載の物質を少なくとも１つ含有する医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１１及び請求項２１のいずれかに記載の物質を少なくとも１つを含有する骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項２４】
請求項１〜１１及び請求項２１のいずれかに記載の物質を少なくとも１つを含有する変形性関節症の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項２５】
Ｒｕｎｘ３蛋白質と結合する抗体、Ｒｕｎｘ３核酸分子を認識するプローブ、及びＲｕｎｘ３核酸分子を認識するプライマーのうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする骨・関節疾患の診断薬組成物。
【請求項２６】
Ｒｕｎｘ３蛋白質と結合する抗体、Ｒｕｎｘ３核酸分子を認識するプローブ、及びＲｕｎｘ３核酸分子を認識するプライマーのうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする変形性関節炎の診断薬組成物。
【請求項２７】
Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む請求項２５又は２６に記載の診断薬組成物。
【請求項２８】
Ｒｕｎｘ３蛋白質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列あるいはＲｕｎＸ３遺伝子のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質であって、かつ骨・関連疾患に関連する活性を有する蛋白質を含む請求項２５又は２６に記載の診断薬組成物。
【請求項２９】
Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を増強もしくは低下させた、骨・関節疾患の病態を解析するのに利用されるトランスジェニック動物。
【請求項３０】
Ｒｕｎｘ３遺伝子を、ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いて発現させたトランスジェニック動物。
【請求項３１】
トランスジェニック動物がトランスジェニックマウスである請求項２９又３０に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む請求項２９〜３１のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）請求項２９〜３２のいずれかに記載の動物に治療剤及び／又は予防剤の候補化合物を投与する工程。
（２）該動物の生体試料における、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を測定する工程。
（３）候補化合物を接触させない対照動物と比較して、該Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
【請求項３４】
（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法。
（１）請求項２９〜３２のいずれかに記載の動物に候補化合物を投与する工程。
（２）該動物の生体試料における、軟骨分化を解析する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照動物と比較して、軟骨分化の抑制もしくは亢進させる化合物を選択する工程。
【請求項３５】
Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む請求項３３又は３４に記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
請求項３３又は３４のスクリーニング方法によって選択される化合物。
【請求項３７】
請求項３６に記載の化合物を含有する医薬組成物。
【請求項３８】
請求項３６に記載の化合物を含有する骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項３９】
請求項３６に記載の化合物を含有することを特徴とする変形性関節症の治療剤及び／又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規機能として軟骨分化制御作用をもつタンパク質、そのタンパク質をコードする遺伝子及びこれらの遺伝子の取得方法に関する。さらに、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬のスクリーニング方法、及び治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨・関節疾患の１つである変形性関節症（ＯＡ）は、加齢または力学的ストレスに伴い、軟骨変性及び骨棘形成を生じ、２次性の滑膜炎を伴う疾患である。リスクファクターとしては、加齢以外に、性別（女性）、肥満、外傷（靭帯や半月板損傷など）が挙げられているが、病因については、不明な点が多い。変形性関節症は、日本国内で年間約９０万人もの新たな発症者がいるとの報告もあり（非特許文献１）、今後高齢化が進むに従い、より患者数が増加するものと考えられる。
【０００３】
変形性関節症の保存的治療としては、内服薬としては非ステロイド性抗炎症剤が一般的に用いられる。また、関節内注入療法としては、高分子のヒアルロン酸が使用されている。しかしながら、作用機序として、軟骨変性を明確に抑制し、軟骨再生を促進するような薬剤はいまだにない。変形性関節症の病因はいまだ解明されていない部分が多いので、そのような薬剤の開発には、まず、変形性関節症の病態進行に深く関与する遺伝子の同定が必要である。
【０００４】
変形性関節症患者の軟骨においては、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチン、コラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）のような成長軟骨で見られるような軟骨分化マーカーの発現が亢進することが示されており（非特許文献２〜非特許文献５）、実際に変形性関節症の軟骨において石灰化も観察されている（非特許文献６）。Ａ．Ｒｏｂｉｎ  Ｐｏｏｌｅは、Ａｒｔｈｉｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍの論説の中で、変形性関節症の軟骨破壊に伴い、軟骨分化が進み、肥大軟骨細胞がみられ、その過程は成長板でみられる内軟骨性骨化と似たプロセスであると述べている（非特許文献７）。このような変形性関節症で見られる永久軟骨の成長軟骨化が、変形性関節症の病態進行と深い関りがあることが示唆されている（非特許文献８）。
【０００５】
Ｒｕｎｘファミリーに属する転写因子であるＲｕｎｘ２（Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２）は、骨芽細胞の分化に必須であり、軟骨細胞の成熟にも関与することが報告されている（非特許文献９〜非特許文献１６）。Ｒｕｎｘ２を、ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いて軟骨特異的に発現させると、変形性関節症でみられるような永久軟骨の成長軟骨化が見られる（非特許文献１７）。また、Ｒｕｎｘ２により制御される遺伝子の１つであるコラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）は（非特許文献１８）、知られている３つのコラゲナーゼの中で最も変形性関節症の軟骨破壊に重要な役割を果たすことが判明している（非特許文献１９）。また、コラゲナーゼ−３の軟骨特異的発現トランスジェニックマウスは変形関節症様の病態を示し、肥大軟骨分化マーカーであるＸ型コラーゲンの発現も観察されることがわかっている（非特許文献２０）。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２が変形性関節症の病態進行に重要な役割を果たしており、Ｒｕｎｘ２の機能を阻害して軟骨分化を抑制することにより変形性関節症の治療が可能になることを示唆している。また、Ｒｕｎｘ２以外にも変形性関節症の治療のターゲットとなる分子が存在する可能性もある。
【０００６】
一方、Ｒｕｎｘ２ノックアウトマウスの軟骨細胞は成熟が著しく遅れるが、一部の軟骨細胞では最終分化が起こる（非特許文献２１〜非特許文献２４）。このことは、Ｒｕｎｘ２以外に軟骨の成熟に関与する遺伝子が存在することを示唆している。このような軟骨分化促進作用を有するＲｕｎｘ２以外の遺伝子を同定し、その変形性関節症との関与を解析することができれば、新たな変形性関節症の治療薬が開発できると考えられる。
【０００７】
Ｒｕｎｘファミリーに属するＲｕｎｘ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ００４３５０）は、胃粘膜上皮細胞の成長調節及び後根神経節ニューロンの成長に重要であることが報告されている（非特許文献２５〜非特許文献２７）。また、Ｒｕｎｘ３の疾患への関与としては、胃がん及び肺がんにおいてＲｕｎｘ３が癌抑制遺伝子として機能していることが見出されている（特許文献１）。Ｒｕｎｘ３が軟骨に発現しているという報告はあるが（非特許文献２８）、軟骨における機能は不明であり、変形性関節症などの骨・関節疾患との関連は全く解析されていない。
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０２／０６１０６９号パンフレット
【非特許文献１】別冊整形外科、南江堂、２００２年、４２巻、ｐ２〜６
【非特許文献２】アースリティス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、（ＵＳＡ）、１９９２年、３５巻、ｐ８０６−８１１
【非特許文献３】マトリックス  バイオロジー（Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、（Ｇｅｒｍａｎｙ）、２０００年、１９巻、ｐ２４５−２５５
【非特許文献４】ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、（ＵＳＡ）、１９９６年２月、９７巻、３号、ｐ７６１−８
【非特許文献５】アースリティス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、（ＵＳＡ）、１９９７年１１月、４０巻、１１号、ｐ２０６５−７４
【非特許文献６】骨と軟骨のバイオロジー、金原出版株式会社、２００２年
【非特許文献７】アースリティス  アンド  リウマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、（ＵＳＡ）、２００２年、４６号、ｐ２５４９−２５５２
【非特許文献８】岩本容泰、「軟骨組織形成の制御機構」、第１７回日本骨代謝学会学術賞受賞論文
【非特許文献９】ジャーナル  オブ  セルラー  バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（ＵＳＡ）、２００２年、８７巻、ｐ１−８
【非特許文献１０】セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、１９９７年、８９巻、ｐ７５５−７６４
【非特許文献１１】セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、１９９７年、８９巻、ｐ７６５−７７１
【非特許文献１２】セル（Ｃｅｌｌ）、１９９７年、８９巻、ｐ７４７−７５４
【非特許文献１３】ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（ＵＳＡ）、２０００年、２７５巻、ｐ８６９５−８７０２
【非特許文献１４】ジーンス  アンド  デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、（ＵＳＡ）、２００１年、１５巻、ｐ４６７−４８１
【非特許文献１５】ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、（ＵＳＡ）、２００１年、１５３巻、ｐ８７−９９
【非特許文献１６】デベロップメンタル  バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、（ＵＳＡ）、２００２年５月１日、２４５巻、１号、ｐ９５−１０８
【非特許文献１７】ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．）、（ＵＳＡ）、２００１年、１５３巻、ｐ８７−９９
【非特許文献１８】モレキュラー  アンド  セル  バイオロジー  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、（ＵＳＡ）、１９９９年、１９巻、ｐ４４３１−４４４２）
【非特許文献１９】ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、（ＵＳＡ）、１９９６年、９７巻、ｐ７６１−７６８
【非特許文献２０】ザ  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、（ＵＳＡ）、２００１年  、１０７巻、ｐ３５−４４
【非特許文献２１】セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、１９９７年、８９巻、ｐ７５５−７６４
【非特許文献２２】セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、８９巻、ｐ７６５−７７１
【非特許文献２３】メカニズム  オブ  デベロップメント（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、（Ｉｒｅｌａｎｄ）、１９９９年、８０巻、ｐ１５９−１７０
【非特許文献２４】デヴェロップメンタル  ダイナミックス（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ）、（ＵＳＡ）、１９９９年、２１４巻、ｐ２７９−２９０
【非特許文献２５】セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、２００２年４月５日、１０９巻、１号、ｐ１１３−２４
【非特許文献２６】ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ）、（Ｅｎｇｌａｎｄ）、２００２年７月１日、２１巻、１３号、ｐ．３４５４−６３
【非特許文献２７】ネイチャー  ニューロサイエンス（Ｎａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、（ＵＳＡ）、２００２年１０月、５巻、１０号、ｐ９４６−５４
【非特許文献２８】デベロップメンタル  バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、（ＵＳＡ）、２００２年５月１日、２４５巻、１号、ｐ９５−１０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、新規機能として軟骨分化促進作用を有し、変形性関節症などの骨・関節疾患に関与する遺伝子を同定することである。さらに本発明の目的は、該遺伝子の機能を抑制する物質、例えば、デコイ、アンチセンス、ＲＮＡｉ、ドミナントネガティブなどのスクリーニング法及びスクリーニングにより選別される物質を提供することであり、これらを利用した疾病の診断手段、治療薬などを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
Ｒｕｎｘ２ノックアウトマウスの軟骨細胞は成熟が著しく遅れるが、一部の軟骨細胞では最終分化が起こることから（非特許文献１０、１１、２３、及び２４）、Ｒｕｎｘ２以外に軟骨の成熟に関与する遺伝子が存在すると考えられる。我々が想定したＲｕｎｘ２以外の軟骨分化促進遺伝子は、該遺伝子のノックアウトマウスとＲｕｎｘ２ノックアウトマウス（Ｒｕｎｘ２−／−）を交配して、ダブルノックアウトマウスを作製し、Ｒｕｎｘ２−／−の軟骨と比較することにより同定することができる。すなわち、ダブルノックアウトマウスにおいて、Ｒｕｎｘ２−／−で認められる最終分化した軟骨が消失すれば、ノックアウトされた遺伝子が我々の想定している軟骨分化促進遺伝子であることを示すことができる。さらに、該遺伝子が変形性関節症に関与しているか否かは、該遺伝子を細胞に発現させた場合に、ＭＭＰ−１３などの変形性関節症で発現が亢進しているマーカー遺伝子の発現が誘導されるかどうかを検討することにより確認することができる。
【００１１】
我々は、Ｒｕｎｘファミリーに属するＲｕｎｘ３が軟骨で発現していることから（非特許文献１６）、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３ダブルノックアウトマウス（Ｒｕｎｘ２−／−３−／−）を作製し、軟骨分化に対するＲｕｎｘ３の関与を検討した。その結果、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウスでは、Ｒｕｎｘ２−／−で認められた最終分化した軟骨が完全に消失しており、Ｒｕｎｘ３が軟骨の分化に重要であることが明らかになった。また、軟骨細胞にＲｕｎｘ３遺伝子を発現させると、変形性関節症と非常に深い関連性のあるＭＭＰ−１３の発現が誘導された。このことはＲｕｎｘ３が軟骨分化促進作用を有しており、変形性関節症に関連した遺伝子であることを示している。従って、Ｒｕｎｘ３の機能を抑制することにより変形性関節症の治療が可能になると考えられる。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制し、骨・関節疾患の治療及び／又は予防効果を有する物質、
（２）配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患の一因となる蛋白質をコードするＤＮＡの発現又は機能を抑制し、骨・関節疾患の治療及び／又は予防効果を有する物質、  
（３）該物質がデコイ分子である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（４）該物質がアンチセンス核酸分子である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（５）該物質がＲＮＡｉ核酸分子である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（６）該物質が抗体又は抗体断片である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（７）該物質がドミナントネガティブ蛋白質である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（８）該物質が、ドミナンドネガティブ蛋白質をコードする核酸分子である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（９）（８）に記載のドミナントネガティブ蛋白質をコードする核酸分子を含む、発現用ベクター、
（１０）該物質が、ｓｃＦｖ蛋白質である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（１１）該物質が、ｓｃＦｖ蛋白質をコードする核酸分子である（１）又は（２）に記載の抑制物質、
（１２）（１１）に記載のｓｃＦｖ蛋白質をコードする核酸分子を含む、発現用ベクター、
（１３）（９）又は（１２）に記載のベクターで形質転換させた形質転換体、
（１４）Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制する骨・関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、
（１５）Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現又は機能を抑制する骨・関節疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング用キット、
（１６）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程。
（イ）該Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを測定する工程。
（ウ）候補化合物を接触させない対照と比較して、該Ｒｕｎｘ遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
（１７）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程。
（イ）該レポーター遺伝子の活性を測定する工程。
（ウ）候補化合物を接触させない対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させる化合物を選択する工程。
（１８）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）被験動物に候補化合物を投与する工程。
（イ）該被験動物の生体試料における、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を測定する工程。
（ウ）候補化合物を接触させない対照と比較して、該遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
（１９）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）Ｒｕｎｘ３遺伝子によってコードされるタンパク質と候補化合物を接触させる工程。
（イ）該タンパク質の活性を測定する工程。
（ウ）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記タンパク質の活性を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
（２０）Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む遺伝子である（１４）〜（１９）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（２１）（１４）から（１９）のいずれかに記載のスクリーニング方法によって選択される化合物。
（２２）（１）〜（１１）及び（２１）のいずれかに記載の物質を少なくとも１つ含有する医薬組成物、
（２３）（１）〜（１１）及び（２１）のいずれかに記載の物質を少なくとも１つを含有する骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤、
（２４）（１）〜（１１）及び（２１）のいずれかに記載の物質を少なくとも１つを含有する変形性関節症の治療剤及び／又は予防剤、
（２５）Ｒｕｎｘ３蛋白質と結合する抗体、Ｒｕｎｘ３核酸分子を認識するプローブ、及びＲｕｎｘ３核酸分子を認識するプライマーのうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする骨・関節疾患の診断薬組成物、
（２６）Ｒｕｎｘ３蛋白質と結合する抗体、Ｒｕｎｘ３核酸分子を認識するプローブ、及びＲｕｎｘ３核酸分子を認識するプライマーのうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする変形性関節炎の診断薬組成物、
（２７）Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む（２５）又は（２６）に記載の診断薬組成物、
（２８）Ｒｕｎｘ３蛋白質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列あるいはＲｕｎＸ３遺伝子のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡでコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質であって、かつ骨・関連疾患に関連する活性を有する蛋白質を含む（２５）又は（２６）に記載の診断薬組成物、
（２９）Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を増強もしくは低下させた、骨・関節疾患の病態を解析するのに利用されるトランスジェニック動物、
（３０）Ｒｕｎｘ３遺伝子を、ＩＩ型コラーゲンプロモーターを用いて発現させたトランスジェニック動物、
（３１）トランスジェニック動物がトランスジェニックマウスである（２９）又は（３０）に記載のトランスジェニック動物、
（３２）Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む（２９）〜（３１）のいずれかに記載のトランスジェニック動物、
（３３）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）（２９）〜（３２）のいずれかに記載の動物に治療剤及び／又は予防剤の候補化合物を投与する工程。
（イ）該動物の生体試料における、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現強度を測定する工程。
（ウ）候補化合物を接触させない対照動物と比較して、該Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程。
（３４）（ア）〜（ウ）の工程を含む、骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤のスクリーニング方法、
（ア）（２９）〜（３２）のいずれかに記載の動物に候補化合物を投与する工程。
（イ）該動物の生体試料における、軟骨分化を解析する工程、
（ウ）候補化合物を接触させない対照動物と比較して、軟骨分化の抑制もしくは亢進させる化合物を選択する工程。
（３５）Ｒｕｎｘ３遺伝子が、配列番号１に記載のＤＮＡ分子あるいは配列番号１記載のＤＮＡ分子又はその相補配列に、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ骨・関節疾患に関連する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を含む（３３）又は（３４）に記載のスクリーニング方法、
（３６）（３３）又は（３４）のスクリーニング方法によって選択される化合物、
（３７）（３６）に記載の化合物を含有する医薬組成物、
（３８）（３６）に記載の化合物を含有する骨・関節疾患の治療剤及び／又は予防剤、
（３９）（３６）に記載の化合物を含有することを特徴とする変形性関節症の治療剤及び／又は予防剤、である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者は、Ｒｕｎｘ３遺伝子が軟骨分化促進作用を有することを見出し、変形性関節症などの骨・関節疾患に関連した遺伝子であることを明らかにした。従って、本発明のＲｕｎｘ３の機能を制御する物質は、変形性関節症などの骨・関節疾患に対する治療剤又は予防剤などの医薬品になりうる。また、本発明は、Ｒｕｎｘ３の機能を制御する物質のスクリーニング方法である。さらに、本発明により、Ｒｕｎｘ３遺伝子及びタンパク質の発現を解析することによる、変形性関節症などの骨・関節関連疾患の診断法又は診断薬を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［骨・関節疾患の定義］
本発明において、骨・関節疾患とは、骨格を形成する骨及び軟骨の異常を症状の一つとする、全身性もしくは関節に主病変を生じる疾患の総称である。より具体的には、骨分化及び軟骨分化と病変の発症に結びつきが示されている疾患と定義することもできる。代表的な骨・関節疾患には、変形性関節症、慢性関節リウマチなどを示すことができる。また、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、Ｒｅｉｔｅｒ症候群、全身性エリテマトーデズ（ＳＬＥ）、進行性全身性硬化症、Ｃｈａｒｃｏｔ関節（神経障害性関節症）、ＣＰＰＤ結晶沈着症、ＢＣＰ結晶沈着症、又は痛風も、関節炎を病変の一つとして伴う場合があり、本発明における骨・関節疾患に含まれる。また、骨分化と病変との関連という点から、骨粗鬆症も本発明における骨・関節疾患に含まれる。
【００１５】
変形性関節症は、関節軟骨の変性、磨耗及び軟骨下骨の硬化、増殖性変化を特徴とする疾患であり、２次的な滑膜炎も観察される。変形性関節症は、加齢を基盤とした多因子性疾患と考えられており、リスクファクターとしては、加齢以外に性別（女性）、肥満、外傷（靭帯・半月板損傷など）が考えられているが、その病因には不明な点が多い。変形性関節症の関節軟骨においては、正常永久軟骨では見られない肥大軟骨マーカーの発現亢進、石灰化が見られることが知られており、軟骨の肥大化（分化亢進）は変形性関節症の発症に関与していることが示唆されている。したがって、軟骨分化を制御することにより、変形性関節症の症状の改善が可能である。
【００１６】
［骨・関節疾患関連遺伝子］
本発明は、骨・関節疾患関連遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましくは、軟骨分化に対して、促進または抑制作用を示す遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。特に好ましくは、前記のことに加え、変形性関節症に関連する遺伝子をコードするポリヌクレオチドに関する。すなわち、前記の遺伝子は、該遺伝子のノックアウトマウスとＲｕｎｘ２−／−を交配して、ダブルノックアウトマウスを作製し、Ｒｕｎｘ２−／−の軟骨と比較することにより同定することができる。すなわち、ダブルノックアウトマウスにおいて、Ｒｕｎｘ２−／−で認められる最終分化した軟骨が消失すれば、ノックアウトされた遺伝子が軟骨分化促進遺伝子であることを示すことができる。さらに、該遺伝子が変形性関節症に関与しているか否かは、該遺伝子を細胞に発現させた場合に、ＭＭＰ−１３などの変形性関節症で発現が亢進しているマーカー遺伝子の発現が誘導されるかどうかを検討することにより確認することができる。本発明は、前記の手法によりＲｕｎｘ３が軟骨分化促進因子であることを明らかにした。
【００１７】
［プライマー・プローブ］
プライマーあるいはプローブには、Ｒｕｎｘ３遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより、決定することができる。
【００１８】
このようなポリヌクレオチドは、Ｒｕｎｘ３遺伝子を検出するためのプローブとして、またはＲｕｎｘ３を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、Ｒｕｎｘ３遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００１９】
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。
１）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
２）ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
３）クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（バーガー、キンメル著（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ．）ガイド  トゥ  モレキュラー  クローニング  テクニック、メソッド  イン  エンザイムオロジー（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，）（ＵＳＡ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年；ヘイムズ、ヒギンス著（Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＳＪ）ジーンス  プローブス：ア  プラクティカル  アプローチ（Ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５年；  サンブロック、フリッチ、マニアティス著（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｎ．）（ＵＳＡ）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）
４）ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（メルトン、クリーグ、レバクキアティ、マニアティス、ツィン、グリーン著（Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ  ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ  ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｚｉｎｎ  Ｋ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ．）ヌクレイック  アシッド  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、（Ｅｎｇｌａｎｄ）、１９８４年、１２巻、ｐ７０３５−７０５６）
５）放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（クリッカ著（Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ．）、ノンアイソトピック  ディーエヌエー  プロービング  テクニック（Ｎｏｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９２年）
【００２０】
なお、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち重合度が比較的低いものを意味し、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
【００２１】
［ポリペプチド］
本発明のＲｕｎｘ３遺伝子のポリペプチドは、配列番号１に記載のものを含む。また、公共のデータベースで調べることにより、ポリペプチドの配列を調べることができる。さらに、新たにＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅが見つかった場合には、そのポリペプチドであってもよい。また、これらのポリペプチドは、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、そのアミノ基もしくはカルボキシル基などの修飾など、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、それ自体で、それら自体の生体内での機能を調節するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、それらの機能を調節し得る化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤などを得るためのスクリーニングや、それらに対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドは、試薬としても使用可能である。
【００２３】
［抗体］
Ｒｕｎｘ３タンパク質に対する抗体は、骨・関節疾患の診断・治療に用いることができる。例えば、診断においては、各Ｒｕｎｘ３遺伝子に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。また治療においては、Ｒｕｎｘ３タンパク質の活性を制御する抗体により行うことができる。
【００２４】
上記で用いる抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（ミルシュテイン等（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，ｅｔ．ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８３年、３０５巻、５９３４号、ｐ５３７−４０）であることができる。例えば、Ｒｕｎｘ３タンパク質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血清等から回収することができる。Ｒｕｎｘ３タンパク質に対するモノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することができる。
【００２５】
Ｒｕｎｘ３タンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識してやればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
【００２６】
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えばＲｕｎｘ３遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作製し、該形質転換体を培養して組換え蛋白質を発現させ、発現させた組換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ハムスターなどが用いられる。
【００２７】
また、上述の抗体は抗原への結合性を失わずに、断片化することも可能である。代表的な例としてはＦａｂ化や（Ｆａｂ）’２化した抗体が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
さらに別の形態としては、上述の抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列やそれをコードする核酸分子及び立体構造の情報を用いて、組換え型の抗体分子を作製することも可能である。その代表的な例としては抗体の抗原結合部位のアミノ酸配列をコードする核酸の配列情報を用いて作成されるｓｃＦｖ（単鎖型抗体分子）が挙げられる。また別の形態としては、ヒト以外の動物で作成した抗体をヒトの免疫グロブリン定常領域を持つ、キメラ抗体やヒト型化抗体なども作成することが可能である。
【００２９】
上記の抗体のうち、Ｒｕｎｘ３に結合してその活性を抑制するものは、治療用抗体として用いることが出来る。Ｒｕｎｘ３は細胞内で機能する分子であるが、抗体をリポソーム等を用いて疾患部位の細胞に導入することによって、Ｒｕｎｘ３の機能を抑制することが出来る。また、このＲｕｎｘ３の活性を抑制する抗体分子をコードする核酸分子やそれを含む発現ベクターの形で、疾患部位の細胞に導入し、細胞内で発現機能させることによって、Ｒｕｎｘ３の機能を抑制することが出来る。この場合の代表的な例としては、ｓｃＦｖ型の抗体分子をコードする核酸分子もしくはそれを含む発現ベクターを疾患部位の細胞に導入し、細胞内で発現機能させることによる方法が挙げられる（レガステロス等（Ｌａｇａｓｔｅｌｏｉｓ  Ｉ．，ｅｔ．ａｌ）、ジャーナル  オブ  バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、（ＵＳＡ）、２０００年６月、７４巻、１２号、ｐ５７１２−５７１５、スタインベルガー等（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇａｅｒ  Ｐ．，  ｅｔ．  ａｌ．）、プロシーディング  オブ  ナショナル  アカデミー  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテット  ステイト（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、（ＵＳＡ）、２０００年１月１８日、９７巻、２号、ｐ８０５−８１０）。
【００３０】
［アンチセンス］
遺伝子の全長配列情報が明らかであれば、当業者は遺伝子の機能を阻害するアンチセンスオリゴの設計が可能である。また、遺伝子の部分配列のみの情報であっても、アンチセンスオリゴの設計は可能である。本発明で、軟骨分化に対して促進的に作用することが明らかになったＲｕｎｘ３においては、その開始コドン付近の配列５’−ｇｃｔ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ｃｇｔ  ａｔｔ  ｃｃｃ  ｇｔａ  ｇａｃ  ｃｃａ  ａｇｃ−３’（配列番号３）より、アンチセンスオリゴの候補配列である５’−ｇｃｔ  ｔｇｇ  ｇｔｃ  ｔａｃ  ｇｇｇ  ａａｔ  ａｃｇ  ｃａｔ  ａａｃ  ａｇｃ-３’（配列番号４）などのアンチセンスオリゴを設計することができる。アンチセンスオリゴは、細胞内での分解を避けるために様々な修飾や結合様式が知られており、当業者であれば、適切なアンチセンスオリゴの構造を選択することができる。その構造としては、天然型（Ｄ−オリゴ）、ホスホロチオエート型（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート型（Ｍ−オリゴ）、ホスホロアミデート型（Ａ−オリゴ）、２’−Ｏ−メチル型Ｄ−オリゴ、モルフォリデート型（Ｍｏ−オリゴ）、ポリアミド核酸、などが例示できる。また、長さは１０塩基から７０塩基、好ましくは１５塩基から３０塩基のものを用いる。このようにして作製されたアンチセンスオリゴは、Ｒｕｎｘ３の機能を抑制することが期待でき、さらに骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬として利用可能である。
【００３１】
［ＲＮＡｉ］
ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ、ＲＮＡ干渉）は、２１〜２３残基の二重鎖ＲＮＡが同じ配列を含むターゲットのＲＮＡを分解することにより、その発現を強力に抑制する現象をいう。したがって、Ｒｕｎｘ３遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡは、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るためには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。Ｒｕｎｘ３においては、開始コドン付近の配列から５’−  ａｕｇ  ｃｇｕ  ａｕｕ  ｃｃｃ  ｇｕａ  ｇａｃ  ｃｃａ−３’（配列番号５）及びその相補鎖である５’−ｕｇｇ  ｇｕｃ  ｕａｃ  ｇｇｇ  ａａｕ  ａｃｇ  ｃａｕ  −３’（配列番号６）の２つのＲＮＡ鎖を合成し、それぞれをアニーリングすることにより、二重鎖ＲＮＡを作成することができ、これらはＲＮＡｉとして利用可能である。またそれぞれの鎖の３’側に２塩基のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。ＲＮＡｉの設計に用いる配列及び長さや構造については、当業者であれば、様々な改変を試みて、最も遺伝子発現抑制作用の強いＲＮＡｉを至適化することが可能である。またこのようにして得られたＲＮＡｉは、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現を抑制することにより、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬として利用可能である。
【００３２】
［デコイ］
デコイとは、転写因子が結合する染色体上のＤＮＡ配列を含む化合物であり、転写因子が染色体上のＤＮＡに結合することを阻害する化合物をいう。代表的には、デコイに用いられる化合物とは、核酸及びその類縁体である。Ｒｕｎｘ３に対するデコイの好ましい例として、ゲノム上のＲｕｎｘ３遺伝子のエクソン１（特許文献１）もしくはその上流領域において、Ｒｕｎｘ３もしくはＲｕｎｘ３を含む転写ユニットが結合する部位を含む核酸分子及びその変異体が挙げられる。さらに好ましい例として、Ｒｕｎｘ３が結合するＤＮＡ配列である５’−ＡＡＣＣＡＣＡ−３’、またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、これらの変異体が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡでもＲＮＡでも良く、またはそのオリゴヌクレオチド内に核酸修飾体及び／または擬核酸を含むものであっても良い。また、これらのオリゴヌクレオチド、その変異体、またはこれらを分子内に含む化合物は、１本鎖でも２本鎖であっても良く、線状であっても環状であっても良い。変異体とは上記配列の一部が、変異、置換、挿入、欠失しているもので、Ｒｕｎｘ３が結合する核酸と拮抗する能力を有する核酸を意味する。デコイに含まれるオリゴヌクレオチドは、細胞内での分解を避けるために様々な修飾や結合様式が知られており、当業者であれば、適切なデコイに含まれるオリゴヌクレオチドの構造を選択することができる。その構造としては、天然型（Ｄ−オリゴ）、ホスホロチオエート型（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート型（Ｍ−オリゴ）、ホスホロアミデート型（Ａ−オリゴ）、２’−Ｏ−メチル型Ｄ−オリゴ、モルフォリデート型（Ｍｏ−オリゴ）、ポリアミド核酸、などが例示できる。さらに、当業者であれば、様々な改変を試みて、Ｒｕｎｘ３の機能抑制作用の強いデコイを至適化することが可能である。
【００３３】
［ドミナントネガティブ］
ドミナントネガティブとは、野生型に対して量的及び質的に優位に働いて、野生型の機能を阻害する変異体である。ドミナントネガティブは、野生型のアミノ酸の一部を欠失、あるいは変換することによりを作製することが可能である。Ｒｕｎｘ３のドミナントネガティブは、１２２番目のアミノ酸であるＡｒｇをＣｙｓに変換することで作製することができる（非特許文献２５）。また、Ｃ末端に存在する転写活性化ドメインを欠失させる、あるいはＣ末端の転写活性化ドメインとＮ末端を欠失させ、Ｒｕｎｔドメインのみにすることによって、Ｒｕｎｘ３のドミナントネガティブを作製することもできる。さらに、当業者であれば、様々な改変を試みて、Ｒｕｎｘ３の機能抑制作用の強いドミナントネガティブを至適化することが可能である。
【００３４】
［活性の測定方法］
さらに本発明においては、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料におけるＲｕｎｘ３タンパク質の生物学的な活性を指標にして、診断などを行うことができる。また、生物学的な活性を阻害または活性化をする低分子化合物もしくは抗体をスクリーニングすることにより、Ｒｕｎｘ３タンパク質の活性制御化合物もしくは抗体を取得することができ、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節炎の治療に用いることができる。
【００３５】
活性の測定方法としては、例えば、まず、Ｒｕｎｘ３を３２Ｐなどで標識した転写因子の標的配列を含む２本鎖オリゴＤＮＡと共に室温でインキュベートして結合させる。インキュベート後のサンプルはＳＤＳを含まない未変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、標識したオリゴＤＮＡの移動度を３２Ｐの放射活性などを指標にして評価する。転写因子にオリゴＤＮＡに対する結合活性があれば、標識したオリゴＤＮＡの移動度が遅くなり、高分子量側にシフトする。また、標的配列の下流にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのレポーター遺伝子を連結した発現ベクターと転写因子遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の応答遺伝子プロモーターなどの下流に連結した発現ベクターを、ＨｅｌａやＨＥＫ２９３などの細胞株に共遺伝子導入し、４８時間後に細胞破砕液を調製してＣＡＴの発現量を調べることにより評価できる（ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（ＵＳＡ）、２００１年、２７６巻、ｐ４０７５５−４０７６０）。
【００３６】
［診断方法］
本発明の診断方法については、通常、被験者から採取された生体試料を試料とする。本発明における生体試料としては、血液、関節液、バイオプシーにより採取された関節軟骨片、滑膜組織などを用いることができる。これらの生体試料の採取方法は公知である。
【００３７】
生体試料が関節軟骨片や滑膜組織などの細胞である場合には、ライセートを調製すれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、関節液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈して蛋白質や遺伝子の測定のための試料とすることができる。
【００３８】
上記の生体試料からライセートを調製すれば、Ｒｕｎｘ３タンパク質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいは、このライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、Ｒｕｎｘ３遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートまたはｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。またＲｕｎｘ３タンパク質が血中や関節液に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の方法に使用することができる。
【００３９】
ｍＲＮＡを測定する場合には、本発明におけるＲｕｎｘ３遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明においてＲｕｎｘ３遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨなどを挙げることができる。
【００４０】
さらに本発明は、診断方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、Ｒｕｎｘ３遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、骨・関節疾患の診断用試薬に関する。あるいは、本発明は、Ｒｕｎｘ３タンパク質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、骨・関節疾患の診断用試薬に関する。
【００４１】
本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合わせて診断用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素（１）〜（６）を以下に示す。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
（１）試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
（２）陽性対照
（３）陰性対照
（４）標識を測定するための基質
（５）反応容器
（６）アッセイプロトコルを記載した指示書
【００４２】
本発明における骨・関節疾患の診断とは、例えば以下のような診断が含まれる。骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症が疑われる症状を示しながら、一般的な検査では、変形性関節症と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えば変形性関節症疾患の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、変形性関節症疾患が疑われる症状を示す患者において、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現の上昇もしくは低下は、その症状の原因が変形性関節症である可能性が高いことを示している。
【００４３】
あるいは、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、変形性関節症疾患に対する治療効果の判定に有用である。より具体的には、変形性関節症疾患が疑われる症状を示す患者において、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現の上昇もしくは低下は、変形性関節症疾患がさらに進行もしくは改善している可能性が高いことを示している。
【００４４】
さらに、発現レベルの違いに基づいて、変形性関節症の重症度を判定することもできる。すなわち、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現の上昇の程度は、変形性関節症の重症度もしくは軽症度に相関する可能性がある。
【００４５】
［トランスジェニック動物、骨・関節疾患モデル動物］
本発明は、Ｒｕｎｘ３遺伝子もしくはＲｕｎｘ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、全身性、好ましくは軟骨特異的に発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト動物からなる骨・関節疾患モデル動物、好ましくは変形性関節症モデル動物に関する。本発明により、Ｒｕｎｘ３遺伝子は軟骨分化に対して促進作用を示すことが明らかになった。したがって、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、変形性関節症の関節軟骨で見られる軟骨分化促進が観察され、変形性関節症のモデル動物として利用できる可能性がある。
【００４６】
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、Ｒｕｎｘ３遺伝子によってコードされるタンパク質において明らかにされている活性と同様の活性を備えたタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種におけるＲｕｎｘ３遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
【００４７】
本発明による変形性関節症モデル動物は、変形性関節症のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の薬効評価及び安全性の試験に有用である。例えば本発明による変形性関節症モデル動物が軟骨変性作用を示し、何らかの変形性関節症関連マーカーや軟骨分化マーカーの測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物をスクリーニングするシステムが構築できる。
【００４８】
本発明において、発現レベルの上昇とは、Ｒｕｎｘ３遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは被験動物が本来備えているＲｕｎｘ３遺伝子の転写とタンパク質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物であるタンパク質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。
【００４９】
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性間細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（セル（Ｃｅｌｌ）、（ＵＳＡ）、１９８９年、５７巻、ｐ７１７）。
【００５０】
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性のＲｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを調整することができる。
【００５１】
本発明の変形性関節炎のモデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作製することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、あるいはウシ等の脊椎動物において、様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
【００５２】
［骨／関節疾患治療候補化合物のスクリーニング方法（ｉｎ  ｖｉｖｏ）］
本発明は、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症治療候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、Ｒｕｎｘ３遺伝子は、軟骨分化促進作用を有することが明らかになった。変形性関節症においては、その病態において永久関節軟骨の軟骨分化亢進が示されている。したがって、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物をスクリーニングすることにより、変形性関節症の治療薬を得ることができる。
【００５３】
本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、及び蛋白質の活性発現のいずれかのステップに対し、抑制的に作用する化合物である。
【００５４】
本発明の骨・関節疾患好ましくは変形性関節症治療候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程
（２）前記被験動物の生体試料におけるＲｕｎｘ３遺伝子の発現強度を測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００５５】
本発明のスクリーニング方法において、Ｒｕｎｘ３遺伝子もしくはＲｕｎｘ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用することができる。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、Ｒｕｎｘ３遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験物質が本来備えている、その動物種におけるＲｕｎｘ３遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
【００５６】
本発明のスクリーニングにおける被験動物としては、本発明のトランスジェニック動物による骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症のモデル動物を利用することができる。それ以外にも公知の変形性関節症モデルを利用することが可能である。公知の変形性関節症モデルとしては、自然発症変形性関節症発症モデル（ＳＴＲ／ＯＲＴマウスなど）や、前十字靭帯切除モデル（マウス、ラット、ウサギ、イヌなど）などを例示することができる。
【００５７】
当業者は、本発明の開示に基づいて、マウス以外の種におけるホモログを特定することができる。例えば、ホモロジーサーチによって、ヒトホモログの塩基配列、あるいはアミノ酸配列と相同性の高い他種の遺伝子（あるいは蛋白質）を見出すことができる。あるいは、Ｒｕｎｘ３遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、他種におけるホモログを単離することもできる。なお、ヒト遺伝子を導入されたモデル動物を用いるスクリーニング方法では、当該動物のホモログのみならずヒト遺伝子がＲｕｎｘ３遺伝子として測定される場合もある。
【００５８】
このようにして、被験動物に薬剤候補化合物を接触させ、被験動物由来の生体試料におけるＲｕｎｘ３遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験物質の由来の生体試料におけるＲｕｎｘ３遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の診断方法と同様の手法によってモニターすることができる。さらにこの評価の結果に基づいて、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
【００５９】
このようなスクリーニングにより、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
（２）Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写活性の抑制
（３）Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進など
【００６０】
［骨・関節疾患治療候補化合物のスクリーニング法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）］
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニングにおいては、例えば、Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルの低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００６１】
本発明において、Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞は、Ｒｕｎｘ３遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、及び宿主細胞は、本発明のＲｕｎｘ３遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
【００６２】
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微小核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理学的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【００６３】
本発明のスクリーニング方法においては、Ｒｕｎｘ３遺伝子を発現する細胞として、Ｒｕｎｘ３欠損軟骨細胞、マウス軟骨細胞株（ＡＴＤＣ５）、ラット、ウサギ、ニワトリ及びマウスの初代軟骨培養細胞などを用いることも可能である。なお、関節軟骨及び成長板軟骨からの軟骨初代培養細胞は、公知の方法により採取することができる。
【００６４】
なお、本発明のスクリーニング方法において、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するためには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
【００６５】
さらに、本発明の開示に基づいて本発明のＲｕｎｘ３遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
【００６６】
すなわち本発明は、次の（１）〜（３）の工程を含む、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬のスクリーニング方法であって、Ｒｕｎｘ３遺伝子、もしくはＲｕｎｘ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００６７】
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックスなどを例示することができる。
【００６８】
またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができる。
【００６９】
あるいは本発明における各Ｒｕｎｘ３遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させない対照と比較して、候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ３のレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択することにより、本発明のスクリーニングを行うことができる。
【００７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、Ｒｕｎｘ３遺伝子の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬のスクリーニング方法であって、Ｒｕｎｘ３遺伝子もしくはＲｕｎｘ３遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）Ｒｕｎｘ３遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、Ｒｕｎｘ３の活性を低下させる化合物を選択する工程
【００７１】
本発明におけるＲｕｎｘ３遺伝子がコードする蛋白質が有する活性を指標として、Ｒｕｎｘ３の活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、該遺伝子の働きを抑制する。その結果、変形性関節症で見られる軟骨分化促進を阻害することにより、変形性関節症の病態を制御することができる。Ｒｕｎｘ３遺伝子がコードするタンパクの活性の測定は、前記の一般的な方法を用いて、測定することができる。また、当業者であれば、用いる試薬の組成や緩衝液の組成、基質などに変更を加えることにより、測定方法を最適化することができる。
【００７２】
これらのスクリーニングに用いる被験候補物質としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
【００７３】
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、さらにはキットの使用方法を記載した指示書などをパッケージしておくこともできる。
【００７４】
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症に治療薬として有用である。あるいは、Ｒｕｎｘ３遺伝子のうち軟骨分化促進を示す遺伝子の発現を抑制することができるデコイ、ドミナントネガティブ、アンチセンス、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制することによって、変形性関節症治療薬として有用である。さらに、Ｒｕｎｘ３蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体も、変形性関節症の治療薬として有用である。  
【００７５】
［医薬品］
本発明の骨・関節疾患、好ましくは変形性関節症の治療薬は、スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦活剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明の変形性関節症の治療薬は、変形性関節症の症状の改善を目的として、経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００７６】
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、関節腔注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
【００７７】
また、投与すべき治療薬の有効成分が蛋白質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらす蛋白質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
【００７８】
あるいは、デコイ、ドミナントナガティブ、アンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、適当なプロモーター配列の下流に組込み、デコイ、ドミナントナガティブ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、あるいはＲＮＡｉ効果をもたらすＲＮＡの発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターを変形性関節症患者の関節軟骨もしくは滑膜細胞などに導入すれば、これらの遺伝子のデコイ、ドミナントナガティブ、アンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によって変形性関節症に対し、治療効果を達成することができる。
【００７９】
デコイとは、転写因子が結合する染色体上のＤＮＡ配列を含む化合物であり、転写因子が染色体上のＤＮＡに結合することを阻害する化合物をいう。代表的には、デコイに用いられる化合物とは、核酸及びその類縁体である。デコイは転写因子が結合するＤＮＡ配列、またはこれらの相補体を含むオリゴヌクレオチド、あるいはこれらの変異体により作製することが可能である。
【００８０】
ドミナントネガティブとは、野生型に対して量的及び質的に優位に働いて、野生型の機能を阻害する変異体である。ドミナントネガティブは、野生型のアミノ酸の一部を欠損、あるいは変換することによりを作製することが可能である。
【００８１】
アンチセンスＲＮＡとは、遺伝子のセンス配列に相補的な塩基配列を有するＲＮＡである。アンチセンスＲＮＡによって遺伝子発現を抑制するには、通常１５塩基以上たとえば２０塩基以上、あるいは３０塩基以上の連続した塩基配列を有するＲＮＡが用いられる。たとえば開始コドンを含む領域にハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸は、当該遺伝子の発現抑制効果が大きいとされている。
【００８２】
リボザイムは、塩基配列特異的にＲＮＡを切断する触媒作用を備えたＲＮＡである。ハンマーヘッド型やヘアピン型のリボザイムが知られている。いずれのリボザイムも，切断すべき領域に相補的な塩基配列部分と触媒活性の発現に必要な構造を保持するための塩基配列部分とで構成されている。切断すべき領域に相補的な塩基配列は任意とすることができる。したがって、この領域の塩基配列を標的遺伝子に相補的な塩基配列とすることによって、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現を制御するためのリボザイムをデザインすることができる。
【００８３】
次にＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果は、ｍＲＮＡと同じ塩基配列を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ＲＮＡの発現を強力に抑制する現象を言う。したがって、Ｒｕｎｘ３遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡは、Ｒｕｎｘ３遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るためには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。
【００８４】
アンチセンス核酸、リボザイム、並びにＲＮＡｉ効果を得るためのポリヌクレオチドにおいて、相補的、あるいは同一の塩基配列とは、完全に相補的、あるいは同一の塩基配列に限定されない。これらのＲＮＡの発現抑制作用は、高度に相補性あるいは同一性を維持して入れば、維持される。ある塩基配列または、ある塩基配列と相補的な塩基配列に対して、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、たとえば９８％以上の同一性を有する場合、高度な同一性あるいは相補性を有すると言うことができる。
【００８５】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、１回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００８７】
［Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウスの作製］
Ｒｕｎｘ２＋／−マウス及びＲｕｎｘ３＋／−マウスは、既知の方法により作製した（Ｃｅｌｌ  ８９，７５５７６４（１９９７）、Ｃｅｌｌ  ８９，７６５７７１（１９９７）、Ｃｅｌｌ．２００２、Ａｐｒ．５；１０９（１）：１１３−２４．）。Ｒｕｎｘ２＋／−マウス及びＲｕｎｘ３＋／−マウスを交配し、Ｒｕｎｘ２＋／−３＋／−マウスを作製した。さらにＲｕｎｘ２＋／−３＋／−雄性マウス及びＲｕｎｘ２＋／−３＋／−マウス雌性マウスを交配し、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウスを作製した。遺伝子型は尾部のＤＮＡを用いてＰＣＲ法により決定した。
【００８８】
［βガラクトシダーゼ活性の測定、骨格標本の作製、組織学的解析、ＢｒｄＵの組込み］
Ｒｕｎｘ３＋／−マウスにおけるＲｕｎｘ３遺伝子のエクソン３中に組み込まれたβガラクトシダーゼの活性を、既知の方法で測定した（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５３，８７−９９（２００１））。染色した胚はパラフィンに包埋し、７μｍの切片の標本を作製した。新生児骨格標本はアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ）及びアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）で染色して作製した（Ｃｅｌｌ  ８９，７５５７６４（１９９７））。組織学的解析のために、胚を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した後、７μｍ切片を作成し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）染色、Ｈ−Ｅ及びｖａｎ  Ｋｏｓｓａによる２重染色、アルシアンブルー染色を既知の方法で行った（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５３，８７−９９（２００１））。ＢｒｄＵの取り込みの解析は、ＢｒｄＵを妊娠中のマウスに対し、屠殺１時間前に５０μｇ／ｇ体重を腹腔内投与し、抗ＢｒｄＵ抗体（Ｄａｋｏ社製）を使った免疫組織化学的方法により、胚の組織学的解析及びＢｒｄＵの取り込み量の検出を行った。各切片はトルイジンブルーでカウンター染色した。
【００８９】
［Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ］
ジゴキシゲニン１１ＵＴＰ標識一本鎖ＲＮＡプローブ（ロッシュ  バイオケミカ社製  ＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ）は、同キットの使用方法にしたがって作製した。Ｃｏｌ２ａ１  ｃＤＮＡの０．４−ｋｂフラグメント（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９））、マウスＣｏｌ１０ａ１  ｃＤＮＡの０．６５−ｋｂフラグメント（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９））、オステオポンチンｃＤＮＡの１．２−ｋｂフラグメント（Ｃｅｌｌ、８９，７５５−７６４（１９９７））、マウスＳｏｘ９  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド７２３−１２６３、ａｃｃｅｓｓｕｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ−０１１４４８）の０．４−ｋｂフラグメント、マウスＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ  ｃＤＮＡの０．８−ｋｂフラグメント（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９））、マウスＩｈｈ  ｃＤＮＡの０．６−ｋｂフラグメント（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９））を、アンチセンス及びセンスプローブとして使用した（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９）、Ｃｅｌｌ  ８９，７５５−７６４（１９９７））。Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎは既知の方法で実施し、切片をメチルグリーンでカウンター染色した（Ｃｅｌｌ、８９，７５５−７６４（１９９７））。
【００９０】
［細胞培養及びアデノウイルスによる遺伝子導入］
Ｅ１８．５  Ｒｕｎｘ２−／−胚から軟骨細胞を単離し、２４穴プレート（コーニング社製）に１×１１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で加え、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）を添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）ハイブリッド培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ製）で培養した（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７（１９７５））。細胞がコンフルエントになった時、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現ウイルス、Ｒｕｎｘ２−ＥＧＦＰ発現ウイルス、またはＲｕｎｘ３−ＥＧＦＰ発現ウイルスで細胞を２時間感染させ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析用にウイルス感染開始後の各時間における感染細胞を採取した。Ｒｕｎｘ２−ＥＧＦＰあるいはＥＧＦＰ発現アデノウイルスベクターは、既知の方法で作製した（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３２，６３３−６３８（２００２））。Ｒｕｎｘ３−ＥＧＦＰ発現アデノウイルスベクターはヒトＲｕｎｘ３  ｃＤＮＡを使用して作製した（Ｇｅｎｅ  １５９，２４５−２４８（１９９５））。
【００９１】
［リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ］
Ｒｕｎｘ２−／−軟骨細胞から抽出した全ＲＮＡは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を使って逆転写した。ｃＤＮＡとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を混合し、ＡＢＩ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、各遺伝子の発現量を解析した。Ｒｕｎｘ２、Ｒｕｎｘ３、Ｉｈｈ、Ｘ型コラーゲン、ＭＭＰ１３のＣＴ値（検出の増幅閾値に達した時のサイクル番号）はΔΔＣＴ法により、げっ歯類のＧＡＤＰＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）発現量に対して標準化した。ΔΔＣＴの平均値は、式：２−ΔΔＣＴにより相対発現量に変換し、その範囲は式：２−（ΔΔＣＴ＋ＳｔｄｅｖΔΔＣＴにより計算した。
【００９２】
［結果］
Ｒｕｎｘ３＋／−マウスにおけるＲｕｎｘ３遺伝子のエクソン３の中に組み込まれているβガラクトシダーゼ遺伝子を用いて、胚形成期の骨格におけるＲｕｎｘ３発現を調べた結果、βガラクトシダーゼ活性は、Ｅ１２．５の肩甲骨、肋骨、及び四肢の骨格部分において最初に検出され、Ｅ１３．５においては、活性は骨盤及び椎骨に広がり、Ｅ１５．５においては殆どの軟骨骨格に広がっており（図１のａ〜ｆ）、前肥大軟骨細胞で増加し、肥大軟骨細胞で維持され、最終分化した軟骨細胞では減少していた（図１のｇ，ｈ）。
【００９３】
初期骨格形成において、間葉系細胞は凝集し軟骨細胞の表現型を取得する。この未成熟軟骨細胞は増殖し、成熟を開始し、軟骨骨格の中央で、副甲状腺ホルモン／副甲状腺ホルモン様ペプチド受容体（ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ）及びＩｈｈを発現する前大軟骨細胞になる。この軟骨細胞はさらに肥大軟骨細胞に成熟し、タイプＸコラーゲンを発現する。軟骨細胞が最終分化したとき、成熟肥大軟骨細胞はオステオポンチンを発現し、組織は石灰化し、血管は石灰化軟骨に侵入して、最終的に軟骨は骨に置換される。軟骨頭蓋、脊椎骨、肋骨、及び四肢を含む大抵の骨格は、内軟骨性骨化と一般に呼ばれるこのような連続した過程を経て形成される（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，ｐ３５１−３５７（１９９７）、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９））。
【００９４】
Ｒｕｎｘ３＋／−マウスは正常に成育したが、Ｒｕｎｘ３−／−マウスは生後すぐに死亡した（Ｃｅｌｌ、１０９，１１３−１２４（２００２）．）。Ｒｕｎｘ３−／−マウスでは、軟骨細胞の成熟、軟骨への血管の浸潤の過程は、Ｅ１５．５ではやや遅延した（図１のｉ〜ｌ）。しかし新生児段階では全体として正常な骨格形成が認められた（図２のｂ，ｃ）。さらに骨格形成におけるＲｕｎｘ３の関与を明らかにするため、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスとＲｕｎｘ３＋／−マウスを交配し、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウス作製した。Ｒｕｎｘ２＋／−マウスでは新生児段階で外観上は正常な内軟骨性骨化が起こったが（Ｃｅｌｌ、８９，７５５−７６４（１９９７）、Ｃｅｌｌ、８９，７６５−７７１（１９９７）．）、Ｒｕｎｘ２＋／−３−／−マウスでは、軟骨頭蓋、椎骨、肋骨、及び四肢の石灰化部位が少なく、内軟骨性骨化が明らかに遅延していた（図２ｃ，ｆ）。Ｅ１８．５における野生型及びＲｕｎｘ３−／−マウスの脛骨は、広範囲に骨に置換されていたが、Ｒｕｎｘ２＋／−３−／−の脛骨の骨幹は、骨梁で覆われた石灰化軟骨で構成され、血管は石灰化軟骨に浸潤をしはじめていたが、海綿骨は観察されなかった（図２ｇ〜ｉ）。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈ、Ｘ型コラーゲン及びオステオポンチンの発現が、骨幹に制限されていたことから、これは明らかに軟骨細胞成熟の遅延により生じたと考えられた（図２ｊ−ｒ）。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２遺伝子量が半分の場合には、Ｒｕｎｘ３は内軟骨性骨化に必要であることを示している。
【００９５】
Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の胚の初期骨格形成において、間葉系細胞の凝集及びプロテオグリカン合成はやや遅延していた（図３ａ〜ｆ）。間葉系細胞の凝集に必須のＳｏｘ９の発現は、未成熟軟骨を含む骨格部分に強く検出されるが（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，８５−８９（１９９９）．）、Ｅ１３．５における野生型及びＲｕｎｘ２−／−の四肢骨格の分化した軟骨では弱く検出された（図３ｇ，ｈ，ｊ，ｋ）。しかしながら、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の四肢骨格においては、四肢の全ての軟骨においてＳｏｘ９が強く発現しており（図３ｉ，ｌ）、全ての軟骨細胞が未成熟であることを示していた。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は間葉系細胞凝集に必須ではないが、部分的に関与し、間葉系細胞が凝集すると直ぐに軟骨への分化を誘導することを示している。
【００９６】
Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−マウスの新生児において、Ｒｕｎｘ２−／−の新生児の四肢、椎骨、肋骨の限定された領域で観察される石灰化は（Ｃｅｌｌ、８９，７５５−７６４（１９９７））、全身の骨格において完全に欠損していた（図４）。興味深いことに、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の新生児は恥骨構造を完全に欠損していたことから、間葉系細胞の凝集は骨格形成の初期段階に影響することを示唆している（図４ｌ）。Ｅ１８．５における組織学的解析の結果では、Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨の骨幹は石灰化されていたが、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨は石灰化されていない軟骨であった（図５ｂ−ｄ）。Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の胚の全脛骨の軟骨細胞はＩＩ型コラーゲンを発現していたが、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈ、Ｘ型コラーゲンは発現していなかった（図５ｅ−ｔ）。Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−脛骨の骨幹における軟骨細胞はやや増大していたが、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨全体は、小さい均質な軟骨細胞で占められていた（図６ｃ，ｄ）。Ｒｕｎｘ２−／−３−／−  のＥ１８．５の全骨格において軟骨細胞の成熟は完全に抑制されていた。これらの知見は軟骨細胞の成熟阻害はＲｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３の量に依存し、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は軟骨細胞の成熟に必須であることを示している。
【００９７】
野生型、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウスは、Ｅ１３．５においては四肢の長さは同様であるが（図３ｄ，ｆ）、新生児期においてはＲｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３の用量依存的に減少していた（図４ｉ−ｌ）。このことは、四肢の縮小は軟骨細胞の成熟阻害と関連していると考えられる。増殖中の軟骨細胞をＢｒｄＵでラベルし、四肢骨格における軟骨細胞の増殖と成熟との関係を解析した（図６ａ−ｄ、図７、図８）。Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨の軟骨細胞は最終分化しており、軟骨細胞の成熟のすべてのステージが観察された（Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０，１５９−１７０（１９９９）、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１４，２７９−２９０（１９９９）、図６ｂ）。Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨では、野生型の脛骨と同様に、ＢｒｄＵ−陽性細胞は休止期及び増殖期の軟骨細胞層に限定され（図６ａ，ｂ）、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３＋／−では、脛骨の全ての領域で検出された（図６ｃ，ｄ）。さらに、ＢｒｄＵ陽性細胞は均一に分布し、近位遠位軸に沿った増殖により形成される軟骨細胞の円柱状配列は、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨においては完全に欠損しており（図６ｄ）、このような成熟阻害は、非組織的軟骨の増殖を招くことを示している。さらに、Ｒｕｎｘ２欠損はＲｕｎｘ３欠損とは異なり、顕著に軟骨細胞の増殖を減少させた（図７）。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２は軟骨細胞の増殖を誘導し、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は縦方向への組織化された軟骨細胞の増殖に重要な役割を果たすことを示している。
【００９８】
Ｉｈｈはおそらく間接的に骨端表面にＰＴＨｒＰを誘導する。骨端表面におけるＰＴＨｒＰの発現により、骨幹との間にＰＴＨｒＰの濃度勾配が生じ、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒを介して軟骨細胞の成熟が阻害される（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３，６１３−６２２（１９９６））。Ｉｈｈ−／−マウスの四肢は、軟骨細胞の増殖抑制により著しく小さくなることから、Ｉｈｈは、軟骨細胞成熟の負の調節因子であるのと同様に（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３，２０７２−２０８６（１９９９））、軟骨細胞増殖の正の調節因子であることを示している。Ｉｈｈの発現は、軟骨細胞の成熟阻害に依存して減少し、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の骨格では完全に欠失していた（図５ｍ−ｐ）。
【００９９】
次に、Ｒｕｎｘ２とＲｕｎｘ３のどちらが直接Ｉｈｈの発現に関与するか解析した（図９）。Ｒｕｎｘ２−／−の軟骨細胞にアデノウイルスを用いてＲｕｎｘ２を導入すると、感作後６時間でＩｈｈの発現が強力に誘導されたが、Ｒｕｎｘ３を導入してもＩｈｈの発現は誘導されなかった。Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は共に、Ｒｕｎｘ２の下流遺伝子（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９，４４３１−４４４２（１９９９）．）であるＭＭＰ１３の発現を誘導した。しかしながら、Ｒｕｎｘ２，Ｒｕｎｘ３はいずれもＸ型コラーゲンの発現は誘導しなかった。Ｒｕｎｘ２及びＩｈｈは共に、前肥大軟骨細胞で発現が上昇していることから（Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１０９，４１３−４１７（２００１））、これらの知見は、Ｒｕｎｘ２はＩｈｈの発現に直接関与しており、Ｒｕｎｘ３はＩｈｈ発現に間接的に関与しているか、Ｒｕｎｘ３によるＩｈｈの発現誘導には追加の因子が必要であることを示している。これらの知見は、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は、少なくとも部分的にＩｈｈの発現誘導を介して、軟骨細胞の増殖を促進及び組織化することを示している。
【０１００】
以上の結果から、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は軟骨細胞の成熟に必須であり、少なくとも部分的にはＩｈｈの発現誘導を介して軟骨細胞増殖を調節することが明らかになった。ＰＴＨｒＰの添加により、Ｒｕｎｘ２により誘導される軟骨細胞の成熟が阻害されることと同様に（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １１，６−１５（２００３））、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３によるＩｈｈの発現上昇は、軟骨細胞の成熟を適当な速度で行うための負フィードバック経路としても重要である。このように、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３は、軟骨細胞の成熟に必須であることに加えて、骨格が適切な大きさ及び形で形成されるために必要な軟骨細胞の成熟と増殖の両方を組織化することに関与することが明らかになった。
【０１０１】
［その他］
各図面の詳細試験条件を以下に示す。
図１は、Ｒｕｎｘ３の発現部位及びＲｕｎｘ３−／−マウスの胎生期における骨格形成を解析した結果を示す。ａ〜ｈは、Ｅ１２．５（ａ，ｄ，ｇ）、Ｅ１３．５（ｂ，ｅ）、Ｅ１５．５（ｃ，ｆ）、Ｅ１６．５（ｈ）におけるＲｕｎｘ３の発現部位を示す。Ｒｕｎｘ３の発現をＲｕｎｘ３＋／−マウスにおけるＲｕｎｘ３遺伝子のエクソン３中に組み込まれたβガラクトシダーゼの活性により調べた。Ｒｕｎｘ３は軟骨を含む骨格に発現した（ａ〜ｆ）。またＲｕｎｘ３は軟骨細胞で発現していたが、骨芽細胞では発現していなかった。前肥大軟骨細胞で発現が高く、成熟肥大軟骨細胞では発現が低かった（ｇ，ｈ）。ｉ〜ｌは、Ｒｕｎｘ３−／−マウスのＥ１５．５における骨格形成を示す。野生型（ｉ，ｋ）及びＲｕｎｘ３−／−（ｊ，ｌ）の脛骨の、Ｈ−Ｅ及びＫｏｓｓａ染色（ｉ，ｊ）及びＸ型コラーゲンアンチセンスプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｋ，ｌ）の結果を示す。石灰化はｉ及びｊでは、黒く染色された。データは示さないが、Ｘ型コラーゲンのセンスプローブを使用した結果では、シグナルは検出されなかった。野生型の脛骨の骨幹部は石灰化軟骨であり、Ｘ型コラーゲンの発現が陰性で（ｋ）、骨幹部に血管の進入が認められた（ｉ）。一方、Ｒｕｎｘ３−／−脛骨の骨幹部は、Ｘ型コラーゲン陽性であり、血管の侵入が認められない肥大軟骨細胞から構成されていた（ｊ，ｌ）。尚、ｉからｌのスケールバーは５００μｍを示す。
【０１０２】
図２は、野生型、Ｒｕｎｘ３−／−、及びＲｕｎｘ２＋／−３−／−の骨格形成を解析した結果を示す。ａ〜ｆは、野生型（ａ，ｄ）、Ｒｕｎｘ３−／−（ｄ，ｆ）、及びＲｕｎｘ２＋／−３−／−（ｃ，ｆ）の新生児の骨格を示す。後肢骨格はｄ〜ｆに示した。石灰化組織は、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）で赤に染色し、軟骨はアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ）で青に染色した。野生型及びＲｕｎｘ３−／−の新生児骨格は同様に石灰化している（ａ，ｂ，ｄ，ｅ）のに対して、Ｒｕｎｘ２＋／−３−／−新生児の軟骨内の骨（ｃ，ｆ）では、石灰化部位は殆ど見られなかった。Ｒｕｎｘ２＋／−３−／−の新生児では、Ｒｕｎｘ２＋／−マウスに特徴的な、鎖骨の発育不全、泉門及び縫合の開放が認められた（ｃ）。
【０１０３】
ｇ〜ｒは、野生型（ｇ，ｊ，ｍ，ｐ）、Ｒｕｎｘ３−／−（ｈ，ｋ，ｎ，ｑ）、Ｒｕｎ２＋／−３−／−（Ｉ，ｌ，ｏ，ｒ）のＥ１８．５における脛骨の組織学的解析の結果を示す。ｇ〜ｉはＨ−Ｅ及びＫｏｓｓａ染色の結果、ｊ〜ｒはＩＩ型コラーゲン（ｊ〜ｌ）、Ｘ型コラーゲン（ｍ〜ｏ）、オステオポンチン（ｐ〜ｒ）のアンチセンスプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの結果を示す。データには示さないが、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、オステオポンチンのセンスプローブを使用した結果では、シグナルは検出されなかった。野生型及びＲｕｎｘ３−／−の新生児においては、脛骨は大きく骨に置換され（ｇ，ｈ）、オステオポンチン陽性の骨芽細胞が骨髄を占有し（ｐ，ｑ）、ＩＩ型コラーゲン陽性の軟骨細胞（ｊ，ｋ）及びＸ型コラーゲン陽性の軟骨細胞（ｍ，ｎ）は骨端部に見られた。しかし、Ｒｕｎｘ２＋／−３−／−の脛骨は軟骨のままであり（ｉ）、骨梁に接するオステオポンチン陽性の成熟肥大軟骨細胞が占有している石灰化した骨幹部（Ｉ，ｒ）以外の軟骨では、ＩＩ型コラーゲン（ｌ）またはＸ型コラーゲン（ｏ）を発現していた。ａ〜ｃのスケールバーは１ｍｍ、ｄ〜ｆは１ｍｍ、ｇ〜ｒは５００μｍを示す。
【０１０４】
図３は、野生型、Ｒｕｎ２−／−、及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の胚の初期骨格形成を解析した結果を示す。野生型（ａ，ｄ，ｇ，ｊ）、Ｒｕｎ２−／−（ｂ，ｅ，ｈ，ｋ）、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−（ｃ，ｆ，Ｉ，ｌ）の胚の後肢（ａ〜ｆ）及び前肢（ｇ〜ｌ）を解析に使用した。ａ〜ｃ：Ｅ１２．５におけるＨ−Ｅ染色の結果、ｄ〜ｆ：Ｅ１３．５における全標本アルシアンブルー染色の結果、ｇ〜ｉ：Ｅ１３．５におけるＳｏｘ９アンチセンスプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎの結果、ｊ〜ｌ：ｇ〜ｉのボックス領域の高倍率の結果を示す。データには示していないが、Ｓｏｘ９のセンスプローブを使用した結果ではシグナルは検出されていない。
【０１０５】
軟骨原基は、Ｅ１２．５における野生型（ａ）、Ｒｕｎｘ２−／−（ｂ）の胚で明確に観察され、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−胚（ｃ）では認められず、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の胚では間葉系細胞の凝集が緩やかに遅延していることを示している。Ｅ１３．５のＲｕｎｘ２−／−３−／−の後肢のアルシアンブルー染色（ｆ）は、野生型（ｄ）、Ｒｕｎｘ２−／−（ｅ）の後肢の染色よりも弱く、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の軟骨では、おそらく軟骨細胞分化が遅延したことにより、プロテオグリカン生成が少なくなったと考えられた。野生型及びＲｕｎｘ２−／−の前肢骨格において、前腕、尺骨及び橈骨の骨端部（ｇ，ｈの矢印）、手根骨、中手骨（ｇの矢印端）はＳｏｘ９の発現が強い未成熟な軟骨細胞で構成され、前腕、尺骨及び橈骨の骨幹部はＳｏｘ９の発現が弱い分化した軟骨細胞で構成されていた（ｇ，ｈ，ｊ，ｋ）。これに対してＲｕｎｘ２−／−３−／−の前肢骨格では、全ての軟骨細胞で、Ｓｏｘ９が強く発現していた（Ｉ，ｌ）。尚、スケールバーはａ〜ｃは１００μｍ、ｇ〜Ｉは５００μｍ、ｊ〜ｌは１０μｍを示す。
【０１０６】
図４は、野生型、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−マウスの新生児期における骨格の解析結果を示す。ａ〜ｄ：全身骨格、ｅ〜ｈ：胸壁部、ｉ〜ｌ：後肢、ｍ〜ｐ：骨盤を示す。石灰化は、Ｒｕｎｘ２−／−マウスの四肢、脊椎及び肋骨を含む骨格の限定された部位に見られたが（ｂ，ｆ，ｊ）、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−マウスでは完全に欠損していた（ｃ，ｄ，ｇ，ｈ，ｋ，ｌ）。骨盤は、野生型の新生児ではよく形成され（ｍの矢印）、Ｒｕｎｘ２−／−の新生児では、中間部はアルシアンブルーでは染色されなかったが、実体顕微鏡では骨盤構造が観察された（ｎの矢印）。しかし、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−（ｏの矢印）及びＲｕｎｘ２−／−３−／−（ｐの矢印）のマウスでは、完全に骨盤構造が欠損していた。特記すべきは、四肢長はＲｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３の用量に依存して減少し、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−マウスでは著しく減少し、その一方で厚い四肢が形成されていた（ｉ〜ｌ）。尚、スケールバーは１ｍｍを表す。
【０１０７】
図５は、野生型、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−のＥ１８．５における脛骨の組織学的解析の結果を示す。野生型（ａ，ｅ，Ｉ，ｍ，ｑ）、Ｒｕｎｘ２−／−（ｂ，ｆ，ｊ，ｎ，ｒ）、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−（ｃ，ｇ，ｋ，ｏ，ｓ）及びＲｕｎｘ２−／−３−／−（ｄ，ｈ，ｌ，ｐ，ｔ）胚の脛骨切片は、Ｈ−Ｅ及びＫｏｓｓａ染色（ａ〜ｄ）、ＩＩ型コラーゲン（ｅ〜ｈ）、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ（ｉ〜ｌ）、Ｉｈｈ（ｍ〜ｐ）、及びＸ型コラーゲン（ｑ〜ｔ）のアンチセンスプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎで解析した。データは示していないが、ＩＩ型コラーゲン、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈ、及びＸ型コラーゲンのセンスプローブではシグナルは検出されなかった。
【０１０８】
野生型の胚において、脛骨は広範囲に骨に置換され、一方、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨は軟骨のままであった。Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨の骨幹は石灰化軟骨で構成され、骨端部の軟骨はＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈ、またはＸ型コラーゲンが発現していたが、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈの発現は、野生型の脛骨に比較して弱かった。これに対して、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨では石灰化は認められず、脛骨全体の軟骨細胞はＩＩ型コラーゲンを発現し、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ−Ｒ、Ｉｈｈ、及びＸ型コラーゲンは発現していなかった。スケールバーは５００μｍを表す。
【０１０９】
図６は、Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３によるＩｈｈの発現制御の解析及びＢｒｄＵ標識により軟骨細胞の増殖制御を解析した結果を示す。ａ〜ｄはＢｒｄＵ標識した野生型（ａ）、Ｒｕｎｘ２−／−（ｂ）、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−（ｃ）及びＲｕｎｘ２−／−３−／−（ｄ）のＥ１８．５における脛骨を抗ＢｒｄＵ抗体を使用して免疫組織化学的に解析した結果である。各切片はトルイジンブルーでカウンター染色した。ボックス領域（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ）の拡大図は同じカラムに示した。              野生型及びＲｕｎｘ２−／−の脛骨において、ボックス領域（Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ）は、休止期、増殖期、及び肥大期の軟骨細胞を示す（ａ，  ｂ）。Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨において、Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩのボックス領域は、骨端、骨幹端、骨幹の軟骨細胞を示す（ｃ，ｄ）。休止期、増殖期、肥大期、成熟肥大期の軟骨細胞から構成される成長プレートは、Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨では野生型の脛骨と同様によく形成され、一方、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の脛骨では形成されなかった（ａ〜ｄ）。Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−脛骨の骨幹はやや肥大した軟骨細胞から構成され、一方、Ｒｕｎｘ２−／−３−／−の全ての脛骨は均一で小さな軟骨細胞で構成されていた（ｃ，ｄ）。
【０１１０】
図７は、ＢｒｄＵ陽性細胞の変動を示す。野生型の胚（ｎ＝６）、Ｒｕｎｘ２−／−の胚（ｎ＝６）、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−の胚（ｎ＝１）及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の胚（ｎ＝２）から脛骨を採取し、ＢｒｄＵ陽性細胞の数をカウントした。また、Ｒｕｎｘ２−／−の大腿骨における軟骨細胞成熟が、Ｒｕｎｘ２−／−の脛骨よりも著しく阻害されていることから、Ｒｕｎｘ２−／−の大腿骨中のＢｒｄＵ陽性細胞の数もカウントした。各骨に対して３切片をカウントし、ＢｒｄＵ陽性細胞の平均パーセント±標準偏差を示した。カウントした領域は、図６のａ〜ｄの矢印で示した。
【０１１１】
図８〜図１１は、Ｒｕｎｘ２−／−の培養軟骨細胞におけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの解析結果を示す。
【０１１２】
Ｒｕｎｘ２−／−の軟骨細胞に、ＥＧＦＰ発現、Ｒｕｎｘ２−ＥＧＦＰ発現、またはＲｕｎｘ３−ＥＧＦＰ発現アデノウイルスを感染させた。感染細胞は、ウイルス感作開始後、図に示した時間に採取し、Ｒｕｎｘ２、Ｒｕｎｘ３、Ｉｈｈ、Ｘ型コラーゲン、及びＭＭＰ１３の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３の発現量は、Ｒｕｎｘ２の４８時間後の値を１と定義し、相対量を同じグラフに示した（図８）。ＥＧＦＰ発現アデノウイルス感染によるＲｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３量はバックグラウンドレベルであり、グラフには示していない。Ｉｈｈ、Ｘ型コラーゲン、ＭＭＰ−１３の発現量は、Ｒｕｎｘ２−ＥＧＦＰ発現アデノウイルス感染の４８時間後の値を１とし、相対量を示した（図９〜図１１）。各データは３〜６穴の平均値で表し、３つの独立実験データを示した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで決定した。尚、スケールバーはａ〜ｅは１００μｍ、ａＩ〜ｃＩＩＩは１０μｍを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】Ｒｕｎｘ３の発現部位及びＲｕｎｘ３−／−マウスの胎生期における骨格形成を解析した結果の写真。
【図２】野生型、Ｒｕｎｘ３−／−、及びＲｕｎｘ２＋／−３−／−の骨格形成を解析した結果の写真。
【図３】Ｒｕｎ２−／−、及びＲｕｎｘ２−／−３−／−の胚の初期骨格形成を解析した結果の写真。
【図４】野生型、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−マウスの新生児期における骨格の解析結果の写真。
【図５】野生型、Ｒｕｎｘ２−／−、Ｒｕｎｘ２−／−３＋／−及びＲｕｎｘ２−／−３−／−のＥ１８．５における脛骨の組織学的解析の結果の写真。
【図６】Ｒｕｎｘ２及びＲｕｎｘ３によるＩｈｈの発現制御の解析及びＢｒｄＵ標識により軟骨細胞の増殖制御を解析した結果の写真。
【図７】ＢｒｄＵ陽性細胞の変動を表すグラフ。
【図８】Ｒｕｎｘ２−／−の培養軟骨細胞におけるＲｕｎｘ２、Ｒｕｎｘ３の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析結果を表すグラフ。
【図９】Ｒｕｎｘ２−／−の培養軟骨細胞におけるＩｈｈの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの解析結果を表すグラフ。
【図１０】Ｒｕｎｘ２−／−の培養軟骨細胞におけるＸ型コラーゲンの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの解析結果を表すグラフ。
【図１１】Ｒｕｎｘ２−／−の培養軟骨細胞におけるＭＭＰ１３の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの解析結果を表すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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