(57)【要約】【課題】  食品または食品素材中に含まれるタンパク質またはペプチドのアミノ酸組成の分析に応用可能な、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンまたはアスパラギンを正確に且つ簡便に分析できる方法を提供すること。【解決手段】  タンパク質またはペプチドを、該タンパク質またはペプチド中のペプチド態のグルタミンおよび／またはアスパラギンのアミド基と反応しうる保護剤、好ましくはビス（１，１−トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンまたはヨードベンゼンジアセテートと、アセトニトリルの存在下および塩基の存在下もしくは不存在下で反応させてアミノ酸誘導体を形成させた後、加水分解し、生成するグルタミン誘導体および／またはアスパラギン誘導体を検出または定量する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドを、該タンパク質またはペプチド中のペプチド態のグルタミンおよび／またはアスパラギンのアミド基と反応しうる保護剤と反応させてアミノ酸誘導体を形成させた後、加水分解し、生成するグルタミン誘導体および／またはアスパラギン誘導体を検出または定量することを特徴とするタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法。
【請求項２】
保護剤がビス（１，１−トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンであり、且つタンパク質またはペプチドと保護剤との反応を、溶媒としてアセトニトリルを用い塩基の存在下で行う請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
塩基がピリジン類、アンモニア、水溶性アミン、アルカリ金属アルコラート、アルカリ土類金属アルコラート、アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選択される請求項２記載の分析方法。
【請求項４】
保護剤がヨードベンゼンジアセテートであり、且つタンパク質またはペプチドと保護剤との反応を、溶媒を用い塩基の存在下または不存在下で行う請求項１記載の分析方法。
【請求項５】
溶媒がアセトニトリルである請求項４記載の分析方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の分析方法を用いることを特徴とする食品または食品素材中のアミノ酸組成の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質またはペプチド中のグルタミンおよび／またはアスパラギンを定量・分析する方法に関する。本発明の分析方法は、例えば、食品または食品素材中に含まれるタンパク質またはペプチドのアミノ酸組成の分析に好適に利用しうるものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタミンやアルギニンは、非必須アミノ酸に分類されているため、必須アミノ酸と比較すると栄養素として重要視されていなかった。しかし、最近、グルタミンやアルギニンなどの非必須アミノ酸も生体内では重要な機能を担っており、特にグルタミンは、小腸粘膜細胞、免疫細胞といった増殖の速い細胞ではエネルギー源としても使用され、消化管、腎臓、免疫系などの機能維持に必須であることが明らかになり、その重要性が改めて注目されている。このため、必要な量のグルタミンを摂取するために、食品および食品素材中に含まれるグルタミン量やアルギニン量を正確に分析することが求められている。
【０００３】
一方、日本で公定法として一般的に実施されている食品および食品素材中のアミノ酸組成の分析法は、ＡＯＡＣで定められた方法に準じたものであり、これは食品または食品素材中のタンパク質またはペプチドを塩酸で加水分解後、遊離したアミノ酸組成を測定する方法である。
しかし、この方法では、側鎖にアミド基を有するグルタミンおよびアスパラギンはそれぞれ、グルタミン酸およびアスパラギン酸に変換されてしまう。また、ピログルタミン酸もグルタミン酸に変換されてしまう。そのため、食品または食品素材中のグルタミン、グルタミン酸およびピログルタミン酸はそれらの総量がグルタミン酸として測定され、アスパラギンおよびアスパラギン酸はそれらの総量がアスパラギン酸として測定されるのみであって、それぞれの含量を把握することはできない。
【０００４】
これらのアミノ酸量を個別に定量する方法として、ピログルタミン酸については、ピログルタミン酸アミノペプチターゼを用いて個別に定量する方法が提案されている（特許文献１参照）。
一方、グルタミンについては、酵素分解して定量する方法（酵素分解法；非特許文献１および２参照）、塩酸により末端アミド部分のみを加水分解して定量する方法（末端アミド分解法；特許文献２参照）、ジメチルホルムアミドおよびピリジンの存在下にビス（１，１−トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンを用いてホフマン転位させた後、加水分解してジアミノ酪酸として定量する方法（ホフマン転位法；非特許文献３参照）が報告されている。
【０００５】
しかし、上記酵素分解法には、難消化性部位を分解できないために定量的な回収率が得られないという問題があり、また上記末端アミド分解法には、どちらも末端アミド基を持つアミノ酸であるグルタミンとアルギニンとを区別できないという問題があり、何れの方法も、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンの定量法としては使用し難いものである。また、上記ホフマン転位法には、このような問題がなく有用な方法ではあるものの、使用する試薬が不安定で安定した結果が得られないことや、非特許文献３に記載された条件ではマイクロウェーブ発生装置などの特殊な機器を要すること、それらの機器を使用しない場合には良好な回収率が得られないという問題がある。
【０００６】
また、ヨードベンゼンジアセテートを用いてアミド基を保護したアスパラギンのホフマン転位が報告されている（非特許文献４参照）。しかし、この方法で保護されるアスパラギンは、遊離アスパラギンであり、タンパク質およびペプチド中のペプチド態ではない。また、ヨードベンゼンジアセテートによるグルタミンのアミド基の保護については何らの報告もない。
【特許文献１】特開２０００−１５７２９６号公報
【特許文献２】特開平１０−２８２９０９号公報
【非特許文献１】Sato et. al., J. Agric. Food Chem., Vol. 40, No. 5, 1992, p.806-810
【非特許文献２】Sato et. al., J. Agric. Food Chem., Vol. 46, No. 9, 1998, p.3403-3405
【非特許文献３】Kuhn et. al., J. Agric. Food Chem., Vol. 44, No. 7, 1996, p.1808-1811
【非特許文献４】Zhang et. al., J. Org. Chem., Vol. 62, No. 20, 1997, p.6918-6920
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、食品または食品素材中に含まれるタンパク質またはペプチドのアミノ酸組成の分析に応用可能な、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンまたはアスパラギンを正確に且つ簡便に分析できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ホフマン転位法の実用化を検討する中で、特定の保護剤と溶媒とを併用することにより、特殊な機器を用いることなく加熱するだけで、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンまたはアスパラギンを定量的にホフマン転位を起こせることを知見した。
本発明は、斯かる知見に基づいてなされたものであって、タンパク質またはペプチドを、該タンパク質またはペプチド中のペプチド態のグルタミンおよび／またはアスパラギンのアミド基と反応しうる保護剤と反応させてアミノ酸誘導体を形成させた後、加水分解し、生成するグルタミン誘導体および／またはアスパラギン誘導体を検出または定量することを特徴とするタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【０００９】
特に、本発明のタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法は、「上記保護剤がビス（１，１−トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼンであり、且つ上記のタンパク質またはペプチドと保護剤との反応を、溶媒としてアセトニトリルを用い塩基の存在下で行う方法」および「上記保護剤がヨードベンゼンジアセテートであり、且つ上記のタンパク質またはペプチドと保護剤との反応を、溶媒を用い塩基の存在下または不存在下で行う方法」が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法は、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンまたはアスパラギンを正確に且つ簡便に分析することができ、またグルタミン誘導体およびアスパラギン誘導体の検出または定量を食品分析で通常用いられているアミノ酸分析計により行うことができるため、食品または食品素材中に含まれるタンパク質またはペプチドのアミノ酸組成の分析に好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法について詳細に説明する。
本発明の分析対象であるグルタミンおよびアスパラギンは、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンおよびアスパラギンである。
該ペプチド態のグルタミンおよびアスパラギンを含有するタンパク質およびペプチドとしては、特に制限されるものではなく、例えば、アラニルグルタミン、グリシルグルタミンなどの合成グルタミン誘導体や、食品または食品素材中に含まれるタンパク質またはペプチドでもよい。
【００１２】
また、上記ペプチド態のグルタミンおよびアスパラギンのアミド基と反応しうる保護剤としては、ビス（１，１−トリフルオロアセトキシ）ヨードベンゼン（以下、ＢＴＩと略称する）およびヨードベンゼンジアセテート（以下、ＰＩＤＡと略称する）が好ましい。
【００１３】
上記タンパク質またはペプチドと上記保護剤との反応は、溶媒を用い塩基の存在下または不存在下で行われる。
上記溶媒としては、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、テトラハイドロフランなどが挙げられ、特に上記保護剤としてＢＴＩを用いる場合は、溶媒としてアセトニトリルを用いることが好ましい。
また、上記塩基としては、ピリジン類、アンモニア、トリエチルアミン等の水溶性アミン、アルカリ金属アルコラート、アルカリ土類金属アルコラート、アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物などが挙げられる。また、ピリジン類としては、ピリジン、メチルピリジン、ジメチルピリジン、エチルピリジン、トリメチルピリジン、エチルメチルピリジン、プロピルピリジン、テトラメチルピリジンなどが挙げられる。
アルカリ金属アルコラートとしては、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート、カリウムメチラート、カリウムエチラートなどが挙げられ、アルカリ土類金属アルコラートとしては、カルシウムメチラート、カルシウムエチラート、マグネシウムメチラート、マグネシウムエチラートなどが挙げられる。アルカリ金属水酸化物としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属水酸化物としては、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどが挙げられる。
上記保護剤としてＢＴＩを用いる場合は、これら塩基を用いる必要がある。上記保護剤としてＰＩＤＡを用いる場合は、塩基は用いても用いなくてもよいが、塩基を用いない方が好ましい。
【００１４】
上記保護剤の使用量は、被検物質であるタンパク質またはペプチドのグルタミンまたはアスパラギン含量に基づき、例えばグルタミンまたはアスパラギンに対して、モル比で１〜２０倍量、好ましくは２〜８倍量の範囲である。しかし、分析対象のタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギン含量が不明であるため、天然のタンパク質中のこれらアミノ酸の含量が５〜１０％程度であることを考慮すると、保護剤の使用量は通常はタンパク質またはペプチド１ｍｇに対して、０. ０５〜２００ｍｇ、好ましくは０. ４〜４０ｍｇの範囲である。
同様に、上記溶媒の使用量は、通常はタンパク質またはペプチド１ｍｇに対して、１０μｌ〜１０ｍｌ、好ましくは２００μｌ〜４ｍｌの範囲である。
上記塩基の使用量は、通常はタンパク質またはペプチド１ｍｇに対して、０. ００１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０. ０４ｍｇ〜４ｍｇの範囲である。
反応温度は、通常は室温〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは４５〜５５℃である。反応時間は、反応温度により変化しうるが、通常は１〜２０時間、好ましくは２〜６時間、より好ましくは４〜５時間の範囲である。
【００１５】
上記反応により形成されたアミノ酸誘導体の加水分解は、触媒として塩酸などの酸または水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて、好ましくは８０〜２００℃、より好ましくは１００〜１３０℃の温度下で、好ましくは２〜４０時間、より好ましくは５〜２０時間行うとよい。
【００１６】
上記加水分解により、グルタミン誘導体としてジアミノ酪酸（以下、ＤＡＢＡと略称する）が生成し、アスパラギン誘導体としてジアミノプロピオン酸（以下、ＤＡＰＡと略称する）が生成する。
このようにして、本発明は、タンパク質およびペプチド中のペプチド態のグルタミンおよびアスパラギンをそれぞれ安定な誘導体であるＤＡＢＡおよびＤＡＰＡに変換して、タンパク質およびペプチドのアミノ酸組成の分析を行うものである。
上記のＤＡＢＡおよびＤＡＰＡの検出または定量は、食品分析で通常用いられているアミノ酸分析計（ニンヒドリン反応による発色）により行うことができる。
【００１７】
本発明のタンパク質またはペプチド中のグルタミンまたはアスパラギンの分析方法の好ましい実施形態としては、下記（１）および（２）の方法が挙げられる。
（１）タンパク質またはペプチドと、保護剤のＢＴＩとを、溶媒としてアセトニトリルを用い塩基の存在下で反応させてアミノ酸誘導体を形成させた後、加水分解し、生成するＤＡＢＡおよび／またはＤＡＰＡを、食品分析で通常用いられているアミノ酸分析計により検出または定量する方法。
（２）タンパク質またはペプチドと、保護剤のＰＩＤＡとを、溶媒を用い塩基の存在下または不存在下で反応させてアミノ酸誘導体を形成させた後、加水分解し、生成するＤＡＢＡおよび／またはＤＡＰＡを、食品分析で通常用いられているアミノ酸分析計により検出または定量する方法。
【００１８】
上記（１）の「保護剤としてＢＴＩを用いる方法」について更に説明する。この方法では、溶媒としてアセトニトリルを用いる必要がある。溶媒として例えばジメチルホルムアミドを用いた場合には、グルタミンのアミド基を十分に保護することができない。また、上記塩基としてはピリジンが好ましい。
上記ＢＴＩの使用量は、被検物質のタンパク質またはペプチド１ｍｇに対して、０. ０５〜２００ｍｇ、好ましくは０. ４〜４０ｍｇであり、上記アセトニトリルの使用量は、１０μｌ〜１０ｍｌ、好ましくは２００μｌ〜４ｍｌであり、上記塩基の使用量は、０. ００１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０. ０４ｍｇ〜４ｍｇである。また、タンパク質またはペプチドとＢＴＩとの反応温度は、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは４５〜６０℃であり、反応時間は、好ましくは２〜６時間、より好ましくは４〜５時間である。
上記アミノ酸誘導体の加水分解は、触媒として塩酸を用いて、好ましくは８０〜２００℃、より好ましくは１０５〜１１０℃の温度下で、好ましくは２〜４０時間、より好ましくは１２〜２４時間行うとよい。
【００１９】
上記（２）の「保護剤としてＰＩＤＡを用いる方法」について更に説明する。この方法では、溶媒は特に制限されないが、アセトニトリルが好ましい。また、塩基は用いる必要がないが、塩基を用いてもよい。
上記ＰＩＤＡの使用量は、好ましくは被検物質のタンパク質またはペプチド１ｍｇに対して、０. ０５〜２００ｍｇ、好ましくは０. ４〜４０ｍｇであり、上記溶媒の使用量は、好ましくは１０μｌ〜１０ｍｌ、好ましくは２００μｌ〜４ｍｌである。また、タンパク質またはペプチドとＰＩＤＡとの反応温度は、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは４５〜６０℃であり、反応時間は、好ましくは２〜６時間、より好ましくは４〜５時間である。
上記アミノ酸誘導体の加水分解は、触媒として塩酸を用いて、好ましくは８０〜２００℃、より好ましくは１０５〜１１０℃の温度下で、好ましくは２〜４０時間、より好ましくは１２〜２４時間行うとよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例および比較例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例および比較例に何ら制限されるものではない。
【００２１】
実施例１
下記表１に示す濃度のアラニルグルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）２００μｌ、アラニルグルタミンの４倍量のモル比になるように調製したＢＴＩ溶液（溶媒：アセトニトリル）２００μｌおよび５０μｍｏｌ／ｍｌのピリジン水溶液５０μｌを混合し、５０℃で４時間反応させた。反応後、真空乾燥して溶媒および水を除去し、乾燥物を６Ｎ−塩酸に溶解し、１１０℃で２４時間加水分解処理を行った。次いで、加水分解溶液を真空乾燥し、アラニルグルタミンの濃度が１０〜１００μｍｏｌ／ｍｌの場合（実施例１−２〜１−５）については、最初の真空乾燥時にＢＴＩと思われる沈殿が目視で確認されたので、クロロホルム４００μｌで２回抽出操作を行った後、アラニルグルタミンの濃度が５μｍｏｌ／ｍｌの場合（実施例１−１）については、該クロロホルム抽出を行わずに、高速アミノ酸分析計（日立（株）製、Ｌ−８５００Ａ）により定量を行った。その結果を下記表１に示した。
また、対照として、ＢＴＩ未処理の５μｍｏｌ／ｍｌ濃度のアラニルグルタミンの場合の結果も併せて下記表１に示した。
尚、下記表１に示した収率は、アラニルグルタミンの各濃度でのアラニン（Ａｌａ）量（ｎｍｏｌ）を１００％の値として用いて算出した（後記の表２および表３においても同じ）。但し、ＢＴＩ処理した５μｍｏｌ／ｍｌ濃度のアラニルグルタミンの場合（実施例１−１）では、アラニンが完全に測定されていないものと考え、対照のグルタミン酸（Ｇｌｕ）量（ｎｍｏｌ）を１００％の値として用いて算出した。
【００２２】
【表１】
2005195549.tif 000002
【００２３】
上記表１に示す結果から明らかなように、溶媒としてアセトニトリルを用い塩基の存在下でＢＴＩ処理した場合は、高い収率でグルタミン（Ｇｌｎ）がＤＡＢＡに変換していることがわかる。ＢＴＩ処理した５μｍｏｌ／ｍｌ濃度のアラニルグルタミンの場合（実施例１−１）に、アラニン（Ａｌａ）量が低いが、これはクロロホルム抽出を行っていないため、アラニンは析出したＢＴＩにトラップされて溶けなかったか、若干水溶液に溶けたＢＴＩが検出の際に影響したためであると思われる。
【００２４】
比較例１
下記表２に示す濃度のアラニルグルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）について、溶媒としてアセトニトリルの代わりにジメチルホルムアミドを用いたＢＴＩ溶液を用いた以外は、実施例１−２と同様にして定量を行った。その結果を下記表２に示した。
【００２５】
【表２】
2005195549.tif 000003
【００２６】
上記表２に示す結果から明らかなように、溶媒としてジメチルホルムアミドを用い塩基の存在下でＢＴＩ処理した場合は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびバリン（Ｖａｌ）が検出された。これはグルタミン（Ｇｌｎ）がＢＴＩ保護されず、ＤＡＢＡに完全に変換していないことを意味する。
【００２７】
比較例２
下記表３に示す濃度のアラニルグルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）について、ＢＴＩの使用量を４倍量から５倍量に増やした以外は、比較例１と同様にして定量を行った。その結果を下記表３に示した。
【００２８】
【表３】
2005195549.tif 000004
【００２９】
上記表２に示す結果と上記表３に示す結果との対比から明らかなように、ＢＴＩの使用量が４倍量のとき（比較例１）よりもさらに反応（ＤＡＢＡへの転位）が進んでいないことがわかる。
【００３０】
実施例２
２. ５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液２００μｌ、３. ０ｍｇ／ｍｌのＢＴＩ溶液（溶媒：アセトニトリル）２００μｌおよび５０μｍｏｌ／ｍｌのピリジン水溶液５０μｌを混合し、５０℃で４時間反応させた。反応後、真空乾燥して溶媒および水を除去し、乾燥物を６Ｎ−塩酸に溶解し、１１０℃で２４時間加水分解処理を行った。次いで、加水分解溶液を真空乾燥し、ジエチルエーテル４００μｌで２回抽出操作を行った後、高速アミノ酸分析計（日立（株）製、Ｌ−８５００Ａ）により定量を行った。その結果を下記表４に示した。
また、対照としてＢＴＩ未処理の牛血清アルブミンの酸加水分解物の場合の結果、および牛血清アルブミンのアミノ酸シークエンスのデータも併せて下記表４に示した。
尚、下記表４に示したアミノ酸数は、酸加水分解物１ｍｏｌ当たりのアミノ酸数である。但し、グルタミン（Ｇｌｎ）およびアスパラギン（Ａｓｎ）については、ＤＡＢＡ（グルタミン保護体）とＤＡＰＡ（アスパラギン保護体）とが近い保持時間で検出され、ピークが一部重なり合い、直接測定するのが困難であったため、ＧｌｘおよびＡｓｘが減少した量が保護された量と考え、アミノ酸数を算出した。（後記の表５においても同じである。）
【００３１】
【表４】
2005195549.tif 000005
【００３２】
上記表４に示す結果から明らかなように、ＢＴＩ処理した場合、シスチン（Ｃｙｓ）およびチロシン（Ｔｙｒ）を除くアミノ酸のほとんどがシークエンスデータとほぼ同じ値となった。シスチン（Ｃｙｓ）およびチロシン（Ｔｙｒ）は分解しやすいので、シークエンスデータより低い値となった。尚、グルタミン（Ｇｌｎ）の収率は９５. ７％、アスパラギン（Ａｓｎ）の収率は７６. ４％であった。また、ジエチルエーテル抽出を行わなかった以外は上記と同様のＢＴＩ処理した場合も、上記と同様の結果が得られた。
【００３３】
実施例３
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）について、ＢＴＩの代わりにＰＩＤＡを用い且つピリジン水溶液を未添加とした以外は、実施例２と同様にして定量を行った。その結果を下記表５に示した。
【００３４】
【表５】
2005195549.tif 000006
【００３５】
上記表５に示す結果から明らかなように、ＰＩＤＡ処理した場合も、シスチン（Ｃｙｓ）およびチロシン（Ｔｙｒ）を除くアミノ酸のほとんどがシークエンスデータとほぼ同じ値となった。尚、グルタミン（Ｇｌｎ）の収率は１０８. ５％、アスパラギン（Ａｓｎ）の収率は８８. ６％であった。