(57)【要約】  【課題】  骨粗鬆症の予防及び／又は治療効果を安定して発揮できる骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤を提供する。  【解決手段】  有効成分としてエクオールを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤において、前記エクオールの含有量が０．１〜１００重量％であり、且つ、前記エクオールの投与量が一日あたり０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤により解決する。本発明の骨粗鬆症予防剤または治療剤は、骨密度および骨強度の低下を防止又は向上させることができるのみならず、子宮重量を増大させないものである。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてエクオールを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤において、前記エクオールの含有量が０．１〜１００重量％であり、且つ、前記エクオールの投与量が一日あたり０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
前記骨粗鬆症が、原発性骨粗鬆症又は続発性骨粗鬆症である請求項１記載の骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤。
【請求項３】
有効成分としてエクオールを投与する骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法において、
前記エクオールの投与量が一日当り０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨粗鬆症や骨折などの予防及び／又は治療に用いることのできる骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤、詳しくは、主成分としてエクオールを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨粗鬆症の予防又は治療剤の有効成分として、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン等のイソフラボン類が注目されている。骨粗鬆症とは、骨量（骨密度）が減少し、骨折し易くなり、高齢者では寝たきりの原因となる疾患である。骨粗鬆症は大きく原発性骨粗鬆症と続発性骨粗鬆症とに分類することができる。
【０００３】
原発性骨粗鬆症には、加齢によって腸の働きが衰え、カルシウムの吸収率が落ちたり、腎臓の働きが弱まって、カルシウム吸収に必要な活性型ビタミンＤの合成量が低下することが原因とされる老人性骨粗鬆症と、骨からのカルシウム吸収（破骨）を抑える女性ホルモン（エストロゲン）の欠乏が原因とされる閉経後骨粗鬆症、更に、原因は不明とされているが思春期や青年期に発生して骨折を生じ易くなる若年性骨粗鬆症がある。続発性骨粗鬆症は、ステロイド剤の投与や、糖尿病、卵巣摘出といった病気や疾患などが原因となる骨粗鬆症である。
【０００４】
高齢化社会に移行しつつある我が国では、寝たきりの原因の第１位が脳卒中、第２位が老衰、第３位が骨粗鬆症による骨折であることから、高齢社会が抱える問題の一つとなっている。
【０００５】
イソフラボン類を骨粗鬆症の治療又は予防を目的として使用した例としては、例えば、特表２００１−５２３２５８号公報に、更年期症状または骨粗鬆症の治療または予防を目的として、ホルモノネチンやダイゼイン等のイソフラボンを任意に薬学的に許容される１以上のアジュバント、キャリヤおよび/または賦形剤とともに投与する更年期症状または骨粗鬆症の治療剤または予防剤が開示されている。また、上記ダイゼインが、ダイゼインの代謝物であるエクオール、Ｏ−デスメチルアンゴレンシン（ＯＤＭＡ）、デヒドロエクオール、２−デヒドロ−ＯＤＭＡ、６−ヒドロキシ−ＯＤＭＡ、ジヒドロダイゼイン及びテトラ−ヒドロダイゼインと置き換えることができる旨も開示されている（特許文献１）。
【０００６】
別の例としては、特開平１０−１１４６５３号公報に、主たる有効成分としてイソフラボン、特にイソフラボンに含まれるゲニスチン又はゲニスティンを有効成分とする骨形成促進および骨塩量減少防止用組成物が開示されている（特許文献２）。
【特許文献１】特表２００１−５２３２５８号公報
【特許文献２】特開平１０−１１４６５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ダイゼインやゲニステイン等のイソフラボン類の代謝は、主として腸内細菌により行われるため、個人の腸内細菌叢に大きく影響されるほか、雌雄の相違や人種の相違によってもイソフラボン類の摂取効果に差異が生じする可能性があることが報告されている。そのため、同量のイソフラボン類を投与した場合でも、個人差によりその効果が発揮されない場合がある。
【０００８】
また、上記特許文献においては、ダイゼインの代謝物であるエクオール等の投与量については何ら検討されていない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、骨粗鬆症の予防及び／又は治療効果を安定して発揮できる骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、有効成分としてエクオールを含有する骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤において、前記エクオールの含有量が０．１〜１００重量％であり、且つ、前記エクオールの投与量が一日あたり０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤を提供するものである。即ち、本発明に係る骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤は、エクオールのみで構成することも、薬学的に許容される添加物を含む混合物として構成することもでき、上記投与量の範囲で投与されることにより、骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤としての作用効果を発揮するものである。
【００１１】
前記骨粗鬆症は、原発性骨粗鬆症又は続発性骨粗鬆症を含む。即ち、本発明の骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤並び予防及び／又は治療方法には、老人性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症及び若年性骨粗鬆症等の原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症のいずれの骨粗鬆症に対しても有効である。
【００１２】
また、本発明は、主成分としてエクオールを投与する骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法において、前記エクオールの投与量が一日当り０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤は、前記エクオールの含有量が０．１〜１００重量％であり、且つ、前記エクオールの投与量が一日あたり０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重とすることにより、骨粗鬆症の予防及び／又は治療効果を安定して発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明で用いられるエクオールは、既述のように、大豆イソフラボン類の一種であるダイゼインの代謝産物である。例えば、大豆中のダイゼイン（Ｉ）が生体内に摂取されると、小腸の腸内細菌により代謝されてエクオール（II）となり、小腸から吸収される。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
エクオールはダイゼインを酵素処理することにより製造することができる。また、エクオールは市販の(±)−Ｅｑｕｏｌ（4'7-Isoflavandiol; Extrasynthese 社製）を使用することもできる。
【００１７】
エクオールの含有量は、骨粗鬆症の予防または治療に有効な量であり、かつ、患者の年齢、体重、併用療法の種類、治療の頻度、望まれる効果の種類、あるいは投与法等により適宜決定されるべきであるため一概には決められないが、０．１〜１００重量％の濃度である。即ち、本発明に係る骨粗鬆症の予防及び／又は治療剤は、エクオールのみで構成することも、後述する薬学的に許容される添加物を含む混合物として構成することもできる。
【００１８】
一日当たりの投与回数は、１回または２〜３回に分けて行うことができるが、いずれの場合もエクオールの投与量が一日当り０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲となるように投与される。
【００１９】
エクオールの投与量が０．３ｍｇ／ｋｇ未満では骨粗鬆症の予防及び／又は治療効果を得ることができない。一方、エクオールは大豆イソフラボンの一種であるダイゼイン由来の化合物であるため過剰投与の影響はないと考えられるが、必要以上投与しても効果は向上しないため、製造コストを考慮すれば投与量の上限は１．０ｍｇ／ｋｇである。骨粗鬆症の予防及び／又は治療の観点からは、好ましくは０．３〜０．８ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは、０．４〜０．７ｍｇ／ｋｇである。なお、本発明の剤を予防剤として用いる場合には、骨密度等が大きく減少する前に投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の骨粗鬆症予防剤または治療剤は、骨密度および骨強度の低下を防止又は向上させることができるのみならず、子宮重量を増大させないものである。従来公知のエストロゲンを有効成分として用いた場合には、骨密度および骨強度を向上させることができる点で効果を有しているものの、子宮重量が増大するという副作用を有していることが知られている。しなしながら、本発明の骨粗鬆症予防剤または治療剤は、従来公知の骨粗鬆症治療剤と同等あるいはそれ以上の骨密度および骨強度の低下防止又は向上効果を、副作用を伴うことなく達成することができる。
【００２１】
また、本発明の骨粗鬆症予防剤または治療剤は、製剤化する場合に格別の制限はなく、経口、直腸内、眼内、口内（例えば舌下）、又は非経口（例えば皮下、筋肉内、皮内、静脈内）等、種々の投与形態に応じて製剤化することができる。
【００２２】
製剤化は、エクオールのみあるいは適当な賦形剤とともに公知の方法で行うことができる。剤型の具体例としては、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口剤、注射剤、あるいは外用剤を挙げることができる。
【００２３】
錠剤の場合に用いられる賦形剤としては、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ココナッツ油、アーモンド油、落花生油が挙げられる）、中鎖脂肪酸グリセリド等の油状エステル、鉱物油、ワセリン、動物油脂、セルロース誘導体（例えば結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロースが挙げられる）、ポリビニルピロリドン、デキストリン、乳糖、マンニトール、ソルビトール、デンプン等が挙げられる。また、必要に応じて、酸化防止剤、湿潤剤、粘度安定剤、着色剤等の添加剤を加えることもできる。
【００２４】
注射剤とする場合は、注射用水、電解質液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの電解質が含まれるもの）；糖液（例えば、ブドウ糖、果塘、マンニトール、デキストリン糖の糖類を１乃至複数成分含むもの）；リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等の緩衝剤；塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤等を添加することもできる。
【００２５】
外用剤とする場合は、ワセリン、グリセリン、サイクロデキストリン等の慣用の製剤用担体やトリエタノールアミン、ツゥイーン（標章）等のような慣用の吸収助剤を配合することができる。
【実施例１】
【００２６】
以下の要領で、エクオールを有効成分とする皮下投与剤を調整した。即ち、エクオール１０ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）５０μＬで溶解し、更にポリエチレングリコール２００μＬを添加し、撹拌することにより所望の皮下投与剤を得た。
【実施例２】
【００２７】
８週齢の雌性ｄｄＹマウスに卵巣摘出術（ＯＶＸ）を実施し、人為的に骨粗鬆症を発症させたＯＶＸマウスを得た。このＯＶＸマウスに、実施例１で調整した皮下投与剤２５０μＬを、１日当たりの投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重となるように浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ社製、製品番号２００２）を用いて頚部付近から皮下投与した。その後４週間、ＡＩＮ−９３Ｇ（日本クレア社製）に含まれる大豆油をコーン油で代替した飼料を自由摂取させて飼育した（図中、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑと表記する）。  
【００２８】
［比較例１］
８週齢の雌性ｄｄＹマウスに偽手術（ｓｈａｍ）を実施し、その後４週間、ＡＩＮ−９３Ｇ（日本クレア社製）に含まれる大豆油をコーン油で代替した飼料を自由摂取させて飼育した（図中、ｓｈａｍと表記する）。  
【００２９】
［比較例２］
８週齢の雌性ｄｄＹマウスに卵巣摘出術（ＯＶＸ）を実施し、人為的に骨粗鬆症を発症させたＯＶＸマウスを得た。その後４週間、ＡＩＮ−９３Ｇ（日本クレア社製）に含まれる大豆油をコーン油で代替した飼料を自由摂取させて飼育した（図中、ＯＶＸと表記する）。  
【００３０】
［比較例３］
エクオール２ｍｇをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）５０μＬで溶解し、更にポリエチレングリコール２００μＬを添加し、撹拌することにより所望の皮下投与剤を調製し、エクオールの１日当たりの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重となるように投与した以外は、実施例２と同様に飼育した（図中、ＯＶＸ＋０．１Ｅｑと表記する）。
［比較例４］
８週齢の雌性ｄｄＹマウスに卵巣摘出術（ＯＶＸ）を実施し、人為的に骨粗鬆症を発症させたＯＶＸマウスを得た。このＯＶＸマウスに、公知の骨粗鬆症治療剤としての１７β−エストラジオール（シグマ社製）を１日当たりの投与量が１ｍｇ／ｋｇ体重となるように浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ社製）を用いて頸部付近から皮下投与した。その後４週間、ＡＩＮ−９３Ｇ（日本クレア社製）に含まれる大豆油をコーン油で代替した飼料を自由摂取させて飼育した（図中、ＯＶＸ＋Ｅ2と表記する）。  
【００３１】
［試験例１］
実施例２及び比較例１〜３で得られたマウスを用い、以下の要領で全身骨密度の測定を行った。マウスに全身麻酔を施し、麻酔下のまま、ＰＩＸＩｍｕｓ骨密度測定装置（Ｌｕｎａｒ社製）を用い、二重Ｘ線エネルギー法（ＤＸＡ法）にて全身骨密度（ＢＭＤ、ｍｇ／ｃｍ2）を測定した。
【００３２】
結果を図１に示す。なお、図面左から、ｓｈａｍ（比較例１）、ＯＶＸ（比較例２）、ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ（実施例２）、ＯＶＸ＋Ｅ2（比較例４）をそれぞれ示す。また、図中、「ａ」はｓｈａｍ（比較例１）に対して有意差が認められたことを意味し、「ｂ」はＯＶＸ（比較例２）に対して有意差が認められたことを意味する。
【００３３】
図１に示すように、卵巣摘出術を実施したマウス（ＯＶＸ；比較例２）ではｓｈａｍ（比較例１）に比べて全身骨密度が減少していた。これは、骨からのカルシウム吸収（破骨）を抑えるエストロゲンの欠乏が原因と考えられた。また、エクオールの１日当たりの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重のマウス（ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ；比較例３）では、比較例２と同様、全身骨密度がｓｈａｍ（比較例１）と比較して減少しており、１日当たりのエクオールの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重では骨粗鬆症の予防・治療効果が得られないことが判明した。
【００３４】
これに対し、エクオールの１日当たりの投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重のマウス（ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ；実施例２）は、公知の骨粗鬆症治療剤である１７β−エストラジオールを投与したマウス（ＯＶＸ＋Ｅ2；比較例４）と同様に、ＯＶＸ（比較例２）と比較して全身骨密度の改善が認められた。  
【００３５】
［試験例２］
実施例２及び比較例１〜３で得られたマウスを用い、以下の要領で大腿骨骨密度の測定を行った。マウスの大腿骨を採取し、摘出骨をＤＣＳ６００−ＥＲ−Ｘ（アロカ社製）を用い、ＤＸＡ法にて大腿骨骨密度（ＢＭＤ、ｍｇ／ｃｍ2）を測定した。
【００３６】
結果を図２に示す。なお、図面左から、ｓｈａｍ（比較例１）、ＯＶＸ（比較例２）、ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ（実施例２）、ＯＶＸ＋Ｅ2（比較例４）をそれぞれ示す。また、図中、「ａ」はｓｈａｍ（比較例１）に対して有意差が認められたことを意味し、「ｂ」はＯＶＸ（比較例２）に対して有意差が認められたことを意味する。
【００３７】
図２に示すように、エクオールの１日当たりの投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重のマウス（ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ；実施例２）は、公知の骨粗鬆症治療剤である１７β−エストラジオールを投与したマウス（ＯＶＸ＋Ｅ2；比較例４）ほどではないが、ＯＶＸ（比較例２）と比較して大腿骨骨密度の改善が認められ、エクオール投与の効果が認められた。
【００３８】
なお、エクオールの１日当たりの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重のマウス（ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ；比較例３）では、ＯＶＸ（比較例２）と同様、大腿骨骨密度がｓｈａｍ（比較例１）と比較して減少しており、１日当たりのエクオールの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重では骨粗鬆症の予防・治療効果が得られないことが判明した。  
【００３９】
［試験例３］
実施例２及び比較例１〜３で得られたマウスを用い、以下の要領で子宮重量の測定を行った。マウスを解剖後、子宮を摘出し、子宮の周囲に存在する脂肪を除去した後、子宮の湿重量（UTERINE WEIGHT、ｍｇ）を電子計り（島津製作所社製）を用いて測定した。
【００４０】
結果を図３に示す。なお、図面左から、ｓｈａｍ（比較例１）、ＯＶＸ（比較例２）、ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ（実施例２）、ＯＶＸ＋Ｅ2（比較例４）をそれぞれ示す。また、図中、＊印はシャムに対して有意差が認められたことを意味する。
【００４１】
子宮重量の増大の程度は副作用の程度を示す指標となるものであり、子宮重量の増加により、子宮内膜ガンの発生率の上昇又は子宮内膜増殖症等の要因になるといわれている。図３に示すように、エクオールの１日当たりの投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重のマウス（ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ；比較例３）では、ＯＶＸ（比較例２）及びＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）と同様、子宮重量の増加は認められず、エクオール投与による副作用が生じないことが判明した。
【００４２】
一方、公知の骨粗鬆症治療剤である１７β−エストラジオールを投与したマウス（ＯＶＸ＋Ｅ2；比較例４）では、ｓｈａｍ（比較例１）と比較して子宮重量の増加が認められ、１７β−エストラジオールが子宮重量に影響を与えていることが判明した。  
【００４３】
［試験例４］
実施例２及び比較例１〜３で得られたマウスを用い、以下の要領で血清中エクオール濃度の測定を行った。エクオールの投与直後、マウスを全身麻酔下で心臓採血した。次いで、このマウスの血液を遠心分離機を用いて血清を得た。血清中において、エクオールはそのほとんどが不活性な抱合体で存在するため、ガラスチューブに血清１００μＬを採取し、そこに加水分解液（１００μＬ）を加え、恒温器（３７℃）内でオーバーナイトさせ、脱抱合化を行った。その際、回収率（加水分解・抽出効率）を計算するため、3Ｈでラベルしたエストラジオール−１７β−グルクロニド（１０μＬ）も添加した。なお、加水分解液は、β−グルクロニダーゼ（０．２Ｕ／ｍＬ）及びサルファターゼ（２Ｕ／ｍＬ）を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用いた。
【００４４】
翌日、前記加水分解液にジエチルエーテル（約１ｍＬ）を添加し、試験管立にセットしたグラスチューブをバイアルミキサーＶＩＸ−１００（タイテック社製）で１分間撹拌し、試験管立の向きを逆にし、更に１分間の撹拌を１サイクルとして抽出操作を行った。この抽出操作を２回繰り返し行った。抽出操作において、１サイクルごとに下層をアルコール・ドライアイス寒剤で凍結させ、上清を別のガラスチューブに移し、４５℃の恒温槽内で蒸発乾固後、そのガラスチューブに、分析に用いる緩衝液（１００μＬ）を加えた。緩衝液は、ＢＳＡ（０．５％重量）、ＮａＣｌ（８．７６ｇ／Ｌを０．９重量％）、ＮａＮ3（０．５ｇ／Ｌを０．０５重量％）、Ｔｗｅｅｎ４０（０．１ｇ／Ｌを０．０１重量％）をそれぞれ含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１００μＬ）を用いた。
【００４５】
緩衝液を添加・撹拌した後、その溶液から２０μＬを採取し、時間分解蛍光免疫法（ＴＲ−ＦＩＡ）にて活性型である脱抱合体のエクオールアグリコンを測定し、回収率で測定値を補正した後、エクオール濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を求めた。
【００４６】
結果を図４に示す。なお、図面左から、ｓｈａｍ （比較例１）、ＯＶＸ（比較例２）、ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ（実施例２）、ＯＶＸ＋Ｅ2（比較例４）をそれぞれ示す。また、図中、「ａ」はｓｈａｍ（比較例１）に対して有意差が認められたことを意味し、「ｂ」はＯＶＸ（比較例２）に対して有意差が認められたことを意味する。
【００４７】
図４に示すように、エクオールを投与したＯＶＸ＋０．１Ｅｑ（比較例３）、ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ（実施例２）にはエクオール濃度の上昇が認められた。試験例１及び２の結果から、エクオールの１日当たりの投与量が０．５ｍｇ／ｋｇ体重（ＯＶＸ＋０．５Ｅｑ；実施例２）では骨粗鬆症の予防・治療効果が認められ、０．１ｍｇ／ｋｇ体重（ＯＶＸ＋０．１Ｅｑ；比較例３）では骨粗鬆症の予防・治療効果が認められないことが判明している。
【００４８】
したがって、血中エクオール濃度が１５００ｎｍｏｌ／Ｌ程度となるようにエクオールを投与すれば、経口、非経口を問わず、骨粗鬆症の予防・治療効果が十分に認められることが判明した。一方、血中エクオール濃度が４００ｎｍｏｌ／Ｌ程度では、骨粗鬆症の予防・治療効果が認められないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】試験例１（全身骨密度）の測定結果を示す図である。
【図２】試験例２（大腿骨骨密度）の測定結果を示す図である。
【図３】試験例３（子宮重量）の測定結果を示す図である。
【図４】試験例４（血清中のエクオール濃度）の測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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