(57)【要約】【課題】  方法条件および方法段階を改変することによって従来技術の欠点を回避することである。【解決手段】  この課題は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を酵素で還元する方法において、ａ）ＮＡＤまたはＮＡＤＰを蟻酸塩脱水素酵素および水ｂ）および少なくとも１種類のアルカリ金属蟻酸塩と一緒にインキュベーションし、ｃ）生じたアルカリ金属炭酸塩を０．５〜５重量％の量まで溶液から除去しそしてｄ）生じる還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）またはニ    コチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を単離することを特徴とする、上記方法によって解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を酵素で還元する方法において、
ａ）ＮＡＤまたはＮＡＤＰを蟻酸塩脱水素酵素および水
ｂ）および少なくとも１種類のアルカリ金属蟻酸塩と一緒にインキュベーションし、
ｃ）生じたアルカリ金属炭酸塩を０．５〜５重量％の量まで溶液から除去しそして
ｄ）生じる還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）またはニ    コチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を単離する
ことを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
ａ）ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、蟻酸塩脱水素酵素および水を
ｂ）少なくとも１種類のアルカリ金属蟻酸塩および少なくとも1種類のアルカリ土類金属蟻酸塩よりなる混合物と一緒にインキュベーションしそして
ｃ）生じるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルカリ金属蟻酸塩として蟻酸リチウム、−ナトリウム、−カリウム、−ルビジウムまたは−セシウムあるいは蟻酸アンモニウムを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アルカリ土類金属蟻酸塩として蟻酸ベリリウム、−マグネシウム、−カルシウム、−ストロンチウムまたは−バリウムを使用する請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、蟻酸塩脱水素酵素および水を蟻酸ナトリウムおよび蟻酸カルシウムよりなる混合物と一緒にインキュベーションしそして生じる還元されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離する請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＤまたはＮＡＤＰを反応終了後にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの最終濃度を基準として１％〜３０％、好ましくは１０％〜２５％の濃度で使用する、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
アルカリ金属蟻酸塩を使用されるＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して少なくとも等モル量であるが好ましくは過剰に使用する、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
アルカリ金属蟻酸塩を使用されるＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して１２倍モル過剰まで、好ましくは使用されるＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して２〜１０倍モル過剰に使用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生じるアルカリ金属炭酸塩の除去を、有機性または無機性のアルカリ土類金属塩、例えば塩化カルシウム、蓚酸カルシウム、酢酸カルシウム、マレイン酸カルシウム、蓚酸マグネシウム、酢酸マグネシウムまたはマレイン酸マグネシウムを用いて沈殿させることによってまたはｐＨ値を下げそして不活性ガスでの排気および／または減圧下で二酸化炭素を排除することによって実施する、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
アルカル土類金属蟻酸塩とＮＡＤまたはＮＡＤＰとの比が、１モルのＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して０．４モル〜０．９モル（アルカリ土類金属蟻酸塩）、好ましくは０．５５〜０．７５モルである請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
使用される酵素の量が反応混合物中の使用されたＮＡＤまたはＮＡＤＰ１ｋｇ当たり約１０００単位〜１，０００，０００単位、好ましくは約１０，０００〜１００，０００単位である、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
反応溶液のｐＨ値を７〜９の値、好ましくは７．５〜８．５の値に一定に維持する、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
温度が１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜３５℃である、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
反応時間が１０分〜１０時間、好ましくは１００分〜２００分、特に好ましくは１２０分〜１５０分である、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
ａ）調製物の非揮発性成分を基準として８０〜９５重量％の量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよび
ｂ）調製物の非揮発性成分を基準として０．５〜５重量％の量のアルカリ金属炭酸塩
を含有する調製物。
【請求項１６】
追加的に水を調製物の非揮発性成分を基準として３〜７重量％の量で含有する請求項１５に記載の調製物。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の方法で得られる、請求項１５または１６に記載の調製物。
【請求項１８】
疲労、“時差ぼけ” の治療の際のおよびアルツハイマー、パーキンソン氏病および鬱病の様な病気の治療を補佐する際の栄養補給剤として請求項１５または１６に記載の調製物を用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を蟻酸塩脱水素酵素で接触還元することによって還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと言う）または還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（以下、ＮＡＤＰＨと言う）を酵素で製造する方法および安定なＮＡＤＨなＮＡＤＰＨ−調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの用途は従来から実質的に酵素分析においておよび種々の酸化還元酵素での酵素アッセイにおいて使用される医学的診断にある。それ以来、本発明者はＮＡＤＨが疲労、“時差ぼけ”の治療の際におよびアルツハイマー、パーキンソン氏病および鬱病の様な病気の治療を補佐する場合に治療上有効な効果を示すことを発見し、栄養補給剤として広範な用途でＮＡＤＨを用いることを見出した（米国特許第５，４４４，０５３号明細書）。このことがＮＡＤＨの需要を絶えず増大させる結果をもたらした。
【０００３】
ＮＡＤＨの製造は従来には、ビール酵母またはパン焼き用イーストから抽出してＮＡＤを用意しそして次にＮＡＤＨに還元して行なわれている。ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する一連の酵素法が公知である（H.Chenault等、Applied Biochemistry and Biotechnology, 第14巻、1987、第147-197頁）。この場合、アルコール脱水素酵素、蟻酸塩脱水素酵素、グルコース−６−ホスファート−脱水素酵素を使用するのが有利である。ＮＡＤＨの製造は大規模では実質的にアルコール−脱水素酵素およびエタノールを用いて実施される。この目的のためにはエタノールが大過剰に使用されそして生じる揮発性アセトアルデヒドは連続的に排除される。この方法の長所は価格的に有利なエタノール、およびサッカロミセス(Sacchromyces) cervisiaeから多量に入手できるアルコール脱水素酵素にある。この方法の欠点はＮＡＤがＮＡＤＨに完全に転化しないことおよび合成の際に毒性のあるアセトアルデヒドが生じることである。
【０００４】
ＮＡＤＰＨの製造は例えばＮＡＤＨからＮＡＤＨ−キナーゼ(Kinase)により酵素的に行なわれる(ドイツ特許出願公開（Ａ１）第４２０１９３０号明細書)。
【０００５】
蟻酸塩脱水素酵素を用いてＮＡＤＨを酵素で製造することも公知である。この場合、一般に蟻酸ナトリウムまたは蟻酸アンモニウムが使用される。蟻酸塩脱水素酵素を用いてのＮＡＤの還元反応の際に、酸性〜中性のｐＨ値のもとで反応混合物から漏れ出す二酸化炭素が生じる。しかしながら生じるＮＡＤＨおよび使用された蟻酸塩脱水素酵素を安定化するために７．５〜８．５のｐＨ値が非常に有利である。この場合のｐＨ値はアンモニア、ＮａＯＨまたはＫＯＨの様な適当の塩基で滴定することによって一定に維持する。使用された蟻酸ナトリウムまたは蟻酸アンモニウムからその時に相応する炭酸ナトリウムまたは−アンモニウムが生じる。これらの炭酸塩は、ＮＡＤＨを安定化させるという大きな長所を有するが、ＮＡＤＨから分離し難くそして大量ではＮＡＤＨを乾燥する際に水およびエタノールの付加によって問題をもたらすという欠点も有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、方法条件および方法段階を改変することによって上記の欠点を回避することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は，蟻酸塩脱水素酵素および少なくとも１種類のアルカリ金属蟻酸塩を用いてＮＡＤおよびＮＡＤＰを水性酵素還元することによって解決される。その際にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離する前に、生じたアルカリ金属炭酸塩は０．５〜５重量％の量にまで溶液から除かれる。
【０００８】
本発明の方法において、生じる二酸化炭素の大部分は例えばカルシウムイオンによって沈殿されそして二酸化炭素の約０．５％〜５％の部分は、使用されたアルカリ金属によって例えば炭酸ナトリウムの状態で反応溶液中に保持される。炭酸ナトリウムによって、生じたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは製法全体にわたり最適に安定化されておりそして同時に良好に乾燥できる。この場合、食品補給剤として使用する際に炭酸ナトリウムが安定剤としても添加されるので、炭酸ナトリウムは妨害しない。
【０００９】
それ故に本発明は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰ）を酵素で還元する方法において、
ａ）ＮＡＤまたはＮＡＤＰを蟻酸塩脱水素酵素および水
ｂ）および少なくとも１種類の蟻酸アルカリ金属塩と一緒にインキュベーションし、
ｃ）生じた炭酸アルカリ金属塩を０．５〜５重量％の量まで溶液から除去しそして
ｄ）生じる還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）またはニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファート（ＮＡＤＰＨ）を単離する
ことを特徴とする、上記方法に関する。
【００１０】
本発明の別の対象は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、蟻酸塩脱水素酵素および水を少なくとも１種類のアルカリ金属蟻酸塩および少なくとも1種類のアルカリ土類蟻酸塩よりなる混合物と一緒にインキュベーションしそして生じるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離することを特徴とする、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの酵素還元法に関する。
【００１１】
別の本発明の対象は、
ａ）ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、蟻酸塩脱水素酵素および水を
ｂ）少なくとも１種類の蟻酸ナトリウムおよび蟻酸カルシウムよりなる混合物と一緒にインキュベーションしそして
ｃ）生じるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離する、
ＮＡＤまたはＮＡＤＰの酵素還元法に関する。
【００１２】
“アルカリ金属蟻酸塩”とは、蟻酸リチウム、−ナトリウム、−カリウム、−ルビジウムまたは−セシウムの様な蟻酸の水溶性塩を意味する。アルカリ金属蟻酸塩としては蟻酸アンモニウムも使用できる。アルカリ土類金属蟻酸塩とは蟻酸ベリリウム、−マグネシウム、−カルシウム、−ストロンチウムまたは−バリウムの様な蟻酸の塩を意味する。
【００１３】
本発明の方法は例えばガラス製または金属製の閉じられた反応容器において実施される。この目的のためには、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、アルカリ金属蟻酸塩、アルカリ土類金属蟻酸塩、蟻酸塩脱水素酵素および水の各成分を個々に反応容器に供給しそして例えば窒素ガスまたは空気の雰囲気で攪拌する。
【００１４】
ＮＡＤは固体の状態でまたは好ましくは水に溶解して使用する。ＮＡＤはビール酵母またはまたはパン焼き用イーストから抽出して得られる。合成混合物中のＮＡＤまたはＮＡＤＰの濃度は１〜３０％、好ましくは１０〜２５％である。この百分率値はＮＡＤまたはＮＡＤＰの完全添加後の合成の終わりにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの最終濃度を基準とする。
【００１５】
ＮＡＤからＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへの完全転化を保証するために、アルカリ金属蟻酸塩の様な蟻酸塩を使用されるＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して少なくとも等モル量で、好ましくは過剰に存在させるべきである。この場合、蟻酸塩は１２倍の過剰モル量まで、特に２〜１０倍の過剰モル量で使用してもよい。
【００１６】
０．５〜５重量％までの生じたアルカリ金属炭酸塩を溶液から除くことは、例えば有機性または無機性アルカリ土類金属、例えば塩化カルシウム、蓚酸カルシウム、酢酸カルシウム、マレイン酸カルシウム、蓚酸マグネシウム、酢酸マグネシウムまたはマレイン酸マグネシウムを用いて沈殿させることによって行う。
【００１７】
しかしながら、生じるアルカリ金属炭酸塩の除去は、ｐＨ値を下げそして不活性ガスで排気することによっておよび／または減圧下に二酸化炭素を排除することによって行う。
【００１８】
生じるアルカル金属炭酸塩の除去はアルカリ金属蟻酸塩と同時にまたはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの単離前にアルカリ土類金属蟻酸塩を添加することによって行ってもよい。
【００１９】
アルカリ土類金属蟻酸塩とＮＡＤまたはＮＡＤＰとの比は、１モルのＮＡＤまたはＮＡＤＰに対して０．４モル〜０．９モル（アルカリ土類金属蟻酸塩）、好ましくは０．５５〜０．７５モルである。
【００２０】
適するＮＡＤ−依存の蟻酸塩脱水素酵素はPseudomonas sp. 101, Candida biodinii または Candida methylica (Gene, 第162巻、1995、第99-104頁)を出所とする。適するＮＡＤＰ−依存の蟻酸塩脱水素酵素も同様に公知である（K. Seelbach等、A novel efficient regenerating method of NADPH using a new formate dehydrogenase, Tetrahedron letters [ 1996] 第37巻、第1377-1380頁; またはTishkov等、Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase, J Biotechnol. Bioeng. [1999] 第64巻、第187-193頁）。
【００２１】
使用すべき酵素量は反応混合物中の使用されたＮＡＤまたはＮＡＤＰ１ｋｇ当たり約１０００単位〜１,０００,０００単位、好ましくは約１０,０００〜１００,０００単位／ｋｇである。
【００２２】
この場合、酵素１単位（Ｕ）は１分あたりに１μｍｏｌのＮＡＤまたはＮＡＤＰを転化するのに必要とされる酵素量に相当する。
【００２３】
反応の間に反応溶液のｐＨ値を７〜９の値、好ましくは７．５〜８．５の値に一定に維持する。これは適当なアルカリ溶液または酸の添加によって、特に好ましくはアンモニウム−イオンの添加によって行う。
【００２４】
温度は例えば約１０℃〜７０℃、好ましくは２０℃〜３５℃である。
【００２５】
反応時間は１０分〜１０時間、好ましくは１００分〜２００分、特に好ましくは１２０分〜１５０分である。
【００２６】
次いで反応混合物を後処理する。不溶性成分、例えば炭酸カルシウムを遠心分離または濾過によって分離した後に、使用された蟻酸塩脱水素酵素を限外濾過によって分離する。限外濾過はアルカリ金属炭酸塩を沈殿させる前に行うことができる。次に限外濾過液を例えばエタノールを用いて沈殿処理する。炭酸ナトリウムの様な炭酸塩の溶解性成分をその際に、得られたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと一緒に固体として沈殿させる。反応混合物中のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度が高いので、生成物を沈殿させる前に更に濃縮する段階がもはや必要ない。
【００２７】
分離された蟻酸塩脱水素酵素は再び使用することができる。
【００２８】
エタノールの沈殿後に、得られた生成物を洗浄しそして減圧下に乾燥する。
【００２９】
本発明は更に、
ａ）調製物の非揮発性成分を基準として８０〜９５重量％の量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよび
ｂ）調製物の非揮発性成分を基準として０．５〜５重量％の量のアルカリ金属炭酸塩
を含有する調製物にも関する。
【００３０】
本発明は、また
ａ）調製物の非揮発性成分を基準として８０〜９５重量％の量のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、
ｂ）調製物の非揮発性成分を基準として０．５〜５重量％の量のアルカリ金属炭酸塩およ
び
ｃ）調製物の非揮発性成分を基準として３〜７重量％の量の水
を含有する調製物にも関する。
【００３１】
“アルカリ金属炭酸塩”とは炭酸塩、例えば炭酸リチウム、−ナトリウム、−カリウム、−ルビジウムまたは−セシウムまたは炭酸水素リチウム、−ナトリウム、−カリウム、−ルビジウムまたは−セシウムの様な炭酸の塩を意味する。
【００３２】
調製物は、ＮＡＤＨおよびアルカリ金属炭酸塩の量が調製物の非揮発性成分を基準として過剰または不足しない限り、更に別の揮発性成分および非揮発性成分を含有していてもよい。
【００３３】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量はそれぞれ本発明の調製物の非揮発性成分を基準としており、８５重量％〜９５重量％、特に８９重量％〜９１重量％である。
【００３４】
アルカリ金属炭酸塩の量は、本発明の調製物の非揮発性成分を基準としており、好ましくは１〜３重量％、特に好ましくは１．５重量％〜２．５重量％である。
【００３５】
水の量は本発明の調製物の非揮発性成分を基準としており、好ましくは３〜８重量％、好ましくは５〜６重量％である。
【００３６】
本発明の調製物の製造は例えば、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ、蟻酸塩脱水素酵素および水を蟻酸ナトリウムと蟻酸カルシウムとの混合物と一緒にインキュベーションしそして生じる還元されたＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離することによって行う。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを単離する場合には、不溶性成分、例えば炭酸カルシウムを遠心分離または濾過によって分離し、使用した蟻酸塩脱水素酵素を限外濾過によって分離しそしてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを限外濾過液から、例えばエタノールによって沈殿させる。得られる沈殿生成物を洗浄しそして次に乾燥する。
【００３７】
本発明の調製物は良好な貯蔵安定性を有しそして分解生成物、例えばＡＤＰ−リボーゼ(Ribose)、ＤＡＰ、ＡＭＰまたはＮＡＤの発生が十分に阻止される。
【００３８】
調製物の非揮発性の成分を基準として３〜７重量％の量で水を含む本発明の調製物はタブレットの状態に圧縮するのに特に良好に適する。
【００３９】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する：
【実施例１】
【００４０】
蟻酸ナトリウムおよび蟻酸カルシウムを用いてのＮＡＤＨの合成：
反応用混合物は以下の成分を含有する：
１５０ｇのＮＡＤ（０．２２５モル）            ３００ｍＬの水に溶解されている
１７ｇの（ＨＣＯＯ）2Ｃａ（０．１３２モル） 反応容器に最初に導入する
２０ｇの（ＨＣＯＯ）Ｎａ（０．３モル）      反応容器に最初に導入する
５０００単位の蟻酸塩脱水素酵素                反応容器に最初に導入する
最終容量                                      ７５０ｍＬ
ｐＨ調整しながら室温で１５０分攪拌しそして相応してＮＨ3で滴定した後に反応溶液を後処理する。ＮＡＤＨの収量は１２０ｇの、ＮＡＤＨの二−ナトリウム塩（理論値の７０％）である。炭酸カルシウムを遠心分離によって分離しそして蟻酸塩脱水素酵素の分離を限外濾過によって行う。限外濾過の後に６００ｍＬの限外濾過濾液が得られる。これを６．９Ｌのエタノールで沈殿処理する。得られる残留物を減圧乾燥する。乾燥された生成物は以下の生成物特性を有する：
成分                            含有量
蟻酸塩／酢酸塩                  １％
エタノール                      ２．５％
水                              ５％
Ｎａ2ＣＯ3                      ２％
純度                            ９７．５％（原料からの２．５％のＡＤＰ−リボ
ーゼ）
ＮＡＤＨ含有量                  約８９〜９１％
この様にして生成されたＮＡＤＨは未だ１〜２％のＮａ2ＣＯ3を含有しており、これはプロセスの進行全体を安定化する作用をする。このことはＮＡＤＨの分解生成物を含まない生成物をもたらし、良好に乾燥することができそしてそれ故に栄養補給剤としての用途のための圧縮および賦型にとって最適な特性を有する。
【実施例２】
【００４１】
蟻酸ナトリウムおよび蟻酸カルシウムを用いてのＮＡＤＨの合成：
反応用混合物は以下の成分を含有する：
５０ｇのＮＡＤ（０．０７４モル）            １００ｍＬの水に溶解されている
７ｇの（ＨＣＯＯ）2Ｃａ（０．０５４モル）    反応容器に最初に導入する
７ｇの（ＨＣＯＯ）Ｎａ（０．１モル）          反応容器に最初に導入する
２５００単位の蟻酸塩脱水素酵素                  反応容器に最初に導入する
最終容量                                      ２５０ｍＬ
ｐＨ調整しながら室温で８０分攪拌しそして相応してＮａＯＨで滴定した後に、反応溶液を後処理する。ＮＡＤＨの収量は４０ｇの、ＮＡＤＨの二−ナトリウム塩（理論値の７０％）である。炭酸カルシウムを遠心分離によって分離しそして蟻酸塩脱水素酵素の分離を限外濾過によって行う。限外濾過の後に２００ｍＬの限外濾過濾液が得られる。これを２．３Ｌのエタノールで沈殿処理する。得られる残留物を減圧乾燥する。乾燥された生成物は以下の生成物特性を有する：
成分                            含有量
蟻酸塩／酢酸塩                  １．５％
エタノール                      ２．４％
水                              ６％
Ｎａ2ＣＯ3                      ０．１％
純度                            ９７．５％（原料からの２．５％のＡＤＰ−リボ
ーゼ）
ＮＡＤＨ含有量                  約８９〜９１％。