(57)【要約】【課題】  リポソームの構造安定化および水性媒中での分散安定化とヨウド化合物の保持安定性を図るとともに造影化合物の血中滞留性を高め、造影剤の効率的送達および良好なターゲティングを達成する、安全性が高いＸ線造影剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明のＸ線検査用造影剤は、非イオン性ヨウド系化合物および製剤助剤を含有する水溶液と溶媒、好ましくは超臨界二酸化炭素に溶解したリポソーム膜構成物質とを混合することにより、該ヨウド化合物を内包して形成されたリポソームの懸濁液をさらに濾過膜に透過させて得られる製剤の粘度が、37℃で15  ｍＰa・ｓ以下であることを特徴とする。本製剤は注射・注入剤として好適に使用でき、リポソームの分散安定性とヨウド化合物の保持安定性も良好である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有する水溶液を、溶媒中に存在するリポソーム膜構成物質と混合することにより得られる、ヨウ素濃度が0.1ｇ/ｍｌ以上のＸ線造影剤であって、37℃における粘度が15ｍＰa・ｓ以下であることを特徴とするＸ線造影剤。
【請求項２】
前記溶媒が、少なくとも超臨界状態の二酸化炭素であることを特徴とする請求項１に記載のＸ線造影剤。
【請求項３】
前記非イオン性ヨウド化合物の5〜35質量％が、リポソーム内に内包されていることを
特徴とする請求項１に記載のＸ線造影剤。
【請求項４】
前記製剤助剤が、緩衝剤、キレート化剤、粘度調整剤および安定化剤から選ばれる少なくとも１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のＸ線造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ線造影剤に関し、詳しくは内部に造影物質を内包したリポソームを含むＸ線造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線を用いる単純撮影やＣＴ撮影法（コンピュータ断層撮影法）は、今日の画像診断の中核を占めている。臓器、管腔などの軟組織間ではＸ線吸収の差が小さいため高いコントラスト像を得ることは困難である。したがって、コントラストの高い画像を得るために、一般的には造影剤が使用される。現在実用化されているＸ線造影剤の大部分は、トリヨードフェニル基を含有し水溶性化した化合物を造影物質とするものである。これらの造影剤は、血管、尿管、輸卵管などの管腔部位に投与され、管腔の形状、狭窄などの診断に使用されている。しかしながら、これらの化合物は組織や疾患部位と相互作用をすることなく管腔部位から速やかに排出されるために、組織や疾患部位、特に癌組織をより詳細に診断する目的には役立たない。このため目標とする組織もしくは疾患部位に選択的に集積し、その周囲またはその他の部位と明瞭なコントラストで区別できる画像を提供するＸ線造影剤もまた望まれている。そのようなＸ線検査用造影剤であれば、微細な癌組織であっても精度良く検出することも可能となるからである。
【０００３】
薬物投与の最適化を実現する基本的概念として薬物送達システムが導入されている。実用薬物の副作用、毒性を減らす努力も引き続き求められている。これらはＸ線造影剤についても例外ではない。国際公開ＷＯ98/46275、同ＷＯ95/31181、同ＷＯ94/19025、同ＷＯ96/28414、同ＷＯ96/00089、米国特許4873075号、同4567034号などには、疎水性ヨウド化合物を界面活性剤や油脂の存在下で水中に分散させたものを投与して、肝臓、脾像、副腎皮質、腫瘍、動脈硬化巣、血液プール、リンパ系などを造影する方法が開示されている。これらの方法は、造影剤を微粒子化することにより体内での滞留時間を長くして疾患部位を選択的に造影しようとするものである。その目的のために提案された製剤方法は、造影の効率および選択性とも充分でない。さらに使用するヨウド化合物が疎水性であるために、造影後、体外へ排出する速度が遅く、患者への負担が大きいという問題点もあった。
【０００４】
一方、造影剤を微粒子状にする別の方法として、生体膜類似の脂質から構成され、低い抗原性ゆえに安全性が高いとされているリポソームに造影化合物を内包させる手法も検討されてきた。たとえば国際公開ＷＯ88/09165、同ＷＯ89/00988、同ＷＯ90/07491、特開平07-316079、特開2003-5596では、イオン性または非イオン性の造影剤を含有するリポソームが提案されている。これらの方法では、素材としての安全性が高く、生体内で適度な分解性を有するリポソームを使用するにもかかわらず、実用化に至っていない（たとえば、特許文献１参照）。製造過程においてリポソーム膜を構成するリン脂質の溶剤として、有機溶媒、特にクロロホルム、ジクロロメタンといったクロル系溶剤を使用することから、どうしても残存する溶剤の毒性が懸念されるためである。
【０００５】
他方、脂質可溶性の薬剤は容易にリポソーム中に封入されるが、その封入量は他の要因にも左右されることから必ずしもそれほど多くはない。また水溶性電解質である薬剤は、その薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷との相互作用を通じてリポソーム内部の水相に封入できるが、薬剤が水溶性の非電解質である場合には、そうした手段を採ることはできない。Ｘ線造影剤についても、一般にイオン性造影化合物よりも実質的に毒性の低い非イオン性ヨウド化合物をリポソーム内に封入することが望まれるが、上記の理由から容易ではない。さらに形成されたリポソームは多重層になりやすく、ヨウド化合物の内包率も低いために効率が悪くなる。このような水溶性の非電解質を効率的にリポソーム中に封入する手
段として、逆相蒸発法、エーテル注入法が挙げられるが、有機溶剤を使用するためにやはり安全性の問題が残る。
【０００６】
特開2003-119120（特許文献２）では、リポソームを含有する化粧料、皮膚外用剤を、
超臨界二酸化炭素を用いて製造する方法が開示されており、親水性薬効成分や親油性薬効成分をリポソームに内包する皮膚外用剤の製造例が示されている。しかし、親水性薬効成分として、水溶性電解質の例は示されているが、同法により水溶性非電解質をリポソームに効率よく内包できるか不明であった。
【０００７】
さらに首尾良く造影物質をリポソーム内部に内包させても、時間経過とともに外部へ漏出する問題、あるいはリポソームそのものが、加工処理時または保存中に不安定になる事態も考慮されねばならない。さらにリポソームを生体内へ投与しても、その多くが肝臓、脾臓などの網内系組織で捕捉されるため、所期の効果が得られないことも指摘されている（Cancer Res., 43, 5328(1983)）。
【０００８】
造影剤の粘度は、特に小児科Ｘ線撮影法、および迅速なボーラス投与が要求されるX線
撮影技術、たとえば血管造影などにおいては際だった問題であった。X線造影剤の粘度の
抑制は、従来、特にヨウ素造影物質の高濃度送達を狙った二量体造影化合物では、検討課題となっていた（ＷＯ96/09282、ＷＯ96/09285）。同様に、脂質を使用するリポソーム含有Ｘ線造影剤では、造影剤の粘度の調整は、造影化合物の内包率とともに検討されるべき問題である。
【特許文献１】特開平7-316079号公報
【特許文献２】特開2003-119120号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、造影物質をリポソーム内にできるだけ多量に内包させ、さらに良好に保持させるとともに、安全性の高いＸ線検査用造影剤を提供することを目的とする。すなわち水溶性ヨウド系化合物の送達効率が向上し、造影力にも優れたＸ線造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する本発明は、以下の構成を有する。
【００１１】
本発明のＸ線造影剤は、非イオン性ヨウド化合物および製剤助剤を含有する水溶液を、溶媒中に存在するリポソーム膜構成物質と混合することにより得られる、ヨウ素濃度が0.1ｇ/ｍｌ以上のＸ線造影剤であって、37℃における粘度が15ｍＰa・ｓ以下であること
を特徴としている。
【００１２】
前記溶媒が、少なくとも超臨界状態の二酸化炭素であることが望ましい。
前記非イオン性ヨウド化合物の5〜35質量％が、リポソーム内に内包されていることが好
ましい。
【００１３】
前記製剤助剤が、緩衝剤、キレート化剤、粘度調整剤および安定化剤から選ばれる少なくとも１つ以上であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＸ線造影剤では、造影物質をリポソーム内にできるだけ多量に内包させ、さらに良好に保持させることができるように、リポソームの粒径分布および構造安定性が改善されている。そのリポソームに安定的に内包される造影物質は血中滞留性が良好であり、
ＥＰＲ効果が発揮されて目的とする疾患部位または組織、とりわけ癌組織に選択的に集中し蓄積する。造影後は、該ヨウド化合物が水溶性であるため、体外へ速やかに排泄される。本発明のＸ線造影剤は、有毒な溶媒、特に毒性の高いクロル系溶媒を使用せず、また製剤の粘度が37℃で15  ｍＰa・ｓ以下と、注射・注入剤として好適に使用でき、リポソー
ムの分散安定性も良好である。
【００１５】
〔発明の具体的説明〕
リポソームに内包されたヨウド系造影物質を含むＸ線造影剤は、リポソームに全く内包させない場合よりもその粘度が上昇する。たとえばヨウ素300ｇ/Ｌのイオパミドール水溶液の粘度は、37℃で、4.7 ｍPa・ｓの粘度を有するが、リポソームに内包させた場合、その造影剤組成物の粘度が、37℃で、20〜30 ｍPa・ｓであったと報告されている（特許第2619037号公報）。リポソームの形態、その分散状態によっては、さらに粘度が増大することも予想される。
【００１６】
本発明のＸ線検査用造影剤は、その粘度が37℃で15  ｍＰa・ｓ以下であることを特徴
とする造影剤である。これはリポソームの形態のみならず、ヨウド化合物の内包率、その保持安定性についても改良を重ねたことに基づく。
【００１７】
造影化合物
本発明のＸ線造影剤の造影化合物として水溶性の非イオン性ヨウド系化合物が好ましく用いられる。これにはヨウ化フェニル基、たとえば2,4,6−トリヨードフェニル基を少な
くとも1個有する非イオン性ヨウド化合物が好適である。
【００１８】
好ましい非イオン性ヨウド化合物として、具体的にはイオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、N,N′−ビス〔２
−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−2,4,6−トリヨード−1,3−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミドなどが挙げられる。
【００１９】
造影化合物はこれらの例示に限定されるものではない。また、造影化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物なども含めて言及することがある。
【００２０】
本発明造影剤に特に好適なヨウド系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノールなどが挙げられる。イオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨウド化合物では、ヨウ素担持効率が高く、同一ヨウド濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧を低下させる利点があるが、製剤の粘度が高くなることが指摘されていた（ＷＯ96/09282、ＷＯ96/09285）。
【００２１】
本発明の造影剤における水溶性ヨウド系化合物の濃度は、該造影化合物の性質、意図する製剤の投与経路および臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入されたヨウド系化合物の量は、典型的にはＸ線造影剤における全ヨウド化合物の5〜40質量％、好ましくは5〜35質量％、より好ましくは10〜25質量％である。この内包率はリポソーム粒子の細密充填の限界を下回るために、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。
【００２２】
リポソーム
本発明のＸ線検査用造影剤は、上記造影化合物を標的部位へ効率よく送達するために、マイクロキャリヤーであるリポソーム内部に封入した形態で使用される。優れた腫瘍描出
性へ導くＥＰＲ（Enhanced permeability and retention、透過性の亢進および滞留）効
果を生じさせるために、リポソーム構造の安定性、封入物質の内包化の割合および保持性を改善させるとともに、血中安定性、血中滞留性といった特性を有することが造影剤には求められる。そこで本発明の造影剤は、経時安定性ならびに血中安定性が改善されたリポソームを用いることにより血中滞留性を向上させて、効率的な薬物送達ならびにターゲティングの実現を図っている。
【００２３】
本発明のＸ線造影剤では、造影化合物を内包するリポソームの粒子径およびその二分子膜を適切に設計することによりターゲティング機能を実現することができる。受動的ターゲティングおよび能動的ターゲティングいずれも考慮される。受動的ターゲティングでは、リポソームの粒子径、脂質組成、荷電などの調整を通じてその生体内挙動を制御することができる。リポソーム粒子径を狭い範囲に揃える調整は、後述する方法に基づき容易に行われる。さらにリポソーム膜表面の設計において、リン脂質の種類と組成、共存物質を変えることにより、内包物質の保持効率の向上、リポソームの安定化という要求をも満たすことができる。
【００２４】
造影剤のより高度な選択性と集積性を可能とする能動的ターゲティングの採用ならびに造影剤の安全性もまた検討されるべきである。たとえばリポソーム表面にポリアルキレンオキシド高分子鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入することは、標的部位までの誘導過程を制御し得るため、極めて有益な手法である。癌組織、疾患部位などに到達しなかったＸ線造影剤は、正常部位に集積することなく、リポソームが分解されて体外に排泄される。このことはリポソームを設計する際にその安定性を体外排出時間との関係で適切にコントロールすることにより可能となる。造影物質として水溶性ヨウド系化合物を使用するため、腎臓を経由して速やかに尿中に排泄される。したがって徒に体内に留まることによる弊害、遅発性の副作用などを防止できる。
【００２５】
リポソームは、通常、脂質二重膜から形成されている。その脂質膜の成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。
【００２６】
本発明において使用するリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリンなどで代表されるリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品など、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００２７】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられる。
【００２８】
上記中性リン脂質のほかに、アニオン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、さらには重合性リン脂質、ならびにカチオン性（正荷電）脂質を含んでもよい。負に荷電したリン脂質には、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（DPPS）、ジステアロイルホス
ファチジルセリン（DSPS）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジステアロイルホスファチジン酸（DS
PA）、ジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）、ジミリストイルホスファチジン酸(DMPA)などが挙げられる。
【００２９】
本発明の造影剤におけるリポソーム用脂質は、転移温度を有するリン脂質を少なくとも含むことが望ましい。相転移点を有するリン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン（転移温度、以下同じ、23〜24℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（41.0〜41.5℃）、水素添加大豆レシチン（53℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（54℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（54.1〜58.0℃）などが例示される。リン脂質の「（相）転移温度」とは、リン脂質がとり得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度で、示差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定できる。
【００３０】
カチオン性リン脂質として、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、たとえばジパルミトイルホスファチジン酸（DPPA）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなどが挙げられる。
【００３１】
これらのリン脂質は単独で使用してもよく、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。
【００３２】
さらに、カチオン性物質、たとえばステアリルアミンといった脂肪族アミン、カチオン性脂質などがリポソームの膜構成成分として存在すると、水溶性ヨウド化合物のリポソーム内での保持効率もまた向上する。おそらくリン脂質分子の再配置を脂質膜内において促がし、膜構造が強化され、リポソーム構造全体も安定化されるためであろう。これにより造影物質の取り込みの効率が上昇するとともに、逆にリポソームからのその逸失も減少することとなる。カチオン性物質は、リン脂質量に対し0.1〜5質量％、好ましくは0.3〜3質量％、より好ましくは0.5〜2質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００３３】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００３４】
上記脂質の他にリポソームの膜構成物質として、必要に応じ他の物質を加えることもできる。たとえば、膜安定化剤として作用するコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、ラノステロールまたは２，４−ジヒドロラノステロールなどのステロール類などが挙げられる。また１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体にもリポソームの安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）これらのうち、コレステロールが特に好ましい。さらに、ステロール類がリポソームの膜構成成分として存在すると、水溶性ヨウド化合物のリポソーム内での保持効率もまた向上する。リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。リポソーム膜構成成分として膜中に含めるコレステロールには、必要に応じリンカーを介してその先にポリアルキレンオキシド基を結合させてもよい。特開平9−3093号
公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、効率よく種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、かつ、リポソームの形成成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。
【００３５】
本発明の造影剤におけるステロール類の使用量として、リン脂質１重量部に対して0.05〜1.5重量部、好ましくは0.2〜1重量部、より好ましくは0.3〜0.8重量部の割合が望まし
い。0.05重量部より少ないと混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化作用が発揮されず、2重量部より多すぎるとリポソームの形成が阻害されるか、形成されて
も不安定となる。
【００３６】
上記のカチオン性物質、ステロール類などの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの物質の使用により、超臨界二酸化炭素中へのリン脂質類の溶解・分散も促進されることから、リポソーム膜構造が効率的に形成され、水溶性ヨウド化合物のリポソーム内への内包化も良好となる。さらにリポソーム膜構造が安定的なものであれば、その保持効率も向上する。
【００３７】
他に添加できる化合物として、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルなども例示される。
【００３８】
本発明のＸ線造影剤において、リポソーム内における造影化合物の保持効率を向上させるために、高分子鎖であるポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）基またはまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を有するリン脂質または化合物をリポソーム膜の一成分として使用してもよい。またこれにより新たな機能をリポソームに付与することができる。たとえば、ＰＥＧ化リポソームには免疫系から認識されにくくなる（いわゆる「ステルス化」された状態である）効果が期待できる。あるいはＰＥＧの導入により水和層が形成され、リポソームが親水的傾向を持つことで血中安定性を増し、血中滞留性も向上する、すなわち長時間にわたり血液中の濃度を維持できることが明らかになっている（Biochim. Biophys. Acta., 1066, 29-36(1991)）。また、リポソームの血中滞留性を向上させるために、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質をリポソーム脂質膜に含有させる手法が開示された（特開2002−37833号公報）。そのようなリポソームでは経時安定性も改善されているこ
とが示されている。
【００３９】
これらの性質を利用してＸ線造影剤に特定臓器への指向性を与えることもできる。具体的には脂質成分は肝臓に貯まりやすいことから肝臓の選択的な造影を目的とする場合には、ＰＥＧ、すなわち−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈを使用しないか、あるいはＰＥＧ含有量の
少ないリポソームを用いるのが望ましい。また粒径を200nm以上に大きくすると、肝臓Kupffer細胞の食作用により速やかに取り込まれる可能性が高くなり、肝臓の該部位に集積する。肝臓癌の撮像においては、その癌組織には正常組織に比べてKupffer細胞が少ないた
めに、造影剤リポソームの取込み量は、相対的に少なくなりコントラストが鮮明となる。脾臓においても同様である。反対に他臓器の造影の場合、ＰＥＧを導入すればリポソームをステルス化して肝臓などに集まりにくくすることができるため、ＰＥＧ化リポソームの使用が推奨される。リポソームのＰＥＧ化は、公知の技術を利用することができる。
【００４０】
ＰＥＧのオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧとして、オキシエチレン単位が10〜3500のポリエチレングリコールが好適である。またＰＥＧを使用する場合の使用量は、該リポソームを構成する脂質に対して0.1〜30質量％、好ましくは1〜15質量％程度含むのがよい。
【００４１】
上記ＰＥＧに代わり公知の各種ポリアルキレンオキシド基、−（ＡＯ）n−Ｙ（ＡＯは
炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数、Ｙは水素原子、アルキル基または機能性官能基を表す。）をリポソーム表面に導入してもよい。
【００４２】
炭素数２〜４のオキシアルキレン基として、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシテトラメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基などが挙げられる。これらのオキシアルキレン基は、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、１−ブテンオキシド、２−ブテンオ
キシド、テトラヒドロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基である。
【００４３】
ｎは１〜２０００、好ましくは１０〜５００、さらに好ましくは２０〜２００の正数である。
【００４４】
ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は、同一のものでも異なるものでもよい。後者の場合、ランダム状に付加していても、ブロック状に付加していてもよい。ポリアルキレンオキシド鎖に親水性を付与する場合、ＡＯとしてはエチレンオキシドが単独で付加したものが好ましく、この場合、ｎが１０以上のものが好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドを付加する場合、エチレンオキシドが２０モル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ましい。ポリアルキレンオキシド鎖に親油性を付与する場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。たとえばポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合物を含有するリポソームが好ましい。
【００４５】
Ｙは、水素原子、アルキル基または機能性官能基である。アルキル基として、炭素数１〜５の、分岐していてもよい脂肪族炭化水素基が挙げられる。機能性官能基は、ポリアルキレンオキシド鎖の先端に糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付するためのもので、たとえばアミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む官能基が挙げられる。「機能
性物質」の機能は、「認識素子」として特定臓器指向性、癌組織指向性などを発揮する作用が例示される。
【００４６】
ポリアルキレンオキシド基を有するリン脂質または化合物は、一種類を単独で使用することができ、あるいは二種以上のものを組み合わせて使用することもできる。その含有量は、リポソーム膜形成成分の合計量に対し、0.001〜50モル％、好ましくは0.01〜25モル
％、より好ましくは0.1〜10モル％である。
【００４７】
リポソームへのポリアルキレンオキシド鎖の導入は、公知の技術を利用することができる。たとえば、特開2002−37883号公報には、血中滞留性を高めた水溶性高分子修飾リポ
ソームを作製するための高純度ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質が開示されている。そうしたリポソームを作製する際にモノアシル体含量が低いポリアルキレンオキシド修飾リン脂質を使用すると、リポソーム分散液の経時安定性が良好であったことが記載されている。
【００４８】
リポソーム分散液の経日安定性は、リポソームの分散状態および造影剤懸濁液の粘度にも関係する。リポソームの分散状態は、リポソーム粒子の水性分散媒中での懸濁状態であり、リポソーム粒子が比較的密集していても、上記のようにリポソーム表面がポリアルキレンオキシド鎖などで修飾されておれば、これらの親水性鎖と分散媒との親和性が良好であり、粒子同士の相互作用は少なくなる。したがってリポソーム粒子同士の合一、凝集などは起こりにくく、長期の保存でもほとんど沈殿が生ぜず、注射剤として実質的に即使用状態にある。
【００４９】
・リポソームの作製
リポソームを作製する方法として、これまでに様々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的に出来上がったリポソームの形態および特性もまた著しく異なることが多い（特開平6-80560号公報）。そのため所望するリポソームの形態、特性に応じてそ
の製造方法を適宜選択することが一般に行なわれている。従来リポソームは、リン脂質、ステロール、レシチンといった脂質成分を、ほとんど例外なくまず有機溶媒、たとえばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなどとともに容器中で混合、溶解することにより調製されている。そうしたリポソー
ムの調製品は、必ず有機溶媒を含んでいる。有機溶媒を完全に除去することは困難であり、残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒の生体に及ぼす悪影響が懸念される。
【００５０】
本発明に使用するリポソームを調製するには、上記の問題点を回避できる方法として、超臨界もしくは亜臨界の二酸化炭素を使用するリポソーム調製法を利用する。二酸化炭素の臨界温度が31.1℃、臨界圧力が75.3 kg/cm2と比較的扱いやすく、大気圧下では不活性
なガスゆえ残存しても人体に無害であり、また高純度流体が安価で容易に入手できるなどといった理由により好適である。本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の好適な圧力は、50〜500kg/cm2、好ましくは100〜400 kg/cm2、より好ましくは90〜200 kg/cm2である。また好適な臨界状態の二酸化炭素ガスの温度としては、32〜200℃、好ましくは35〜100℃である。これらの範囲内で、温度および圧力を適宜選択して組み合わせることにより、超臨界状態（亜臨界状態を含む）とするのがよい。
【００５１】
本発明のＸ線造影剤に使用するリポソームの調製方法は、具体的に以下のようにして行なわれる。圧力容器に液体二酸化炭素を加え、膜脂質成分として上記リン脂質とともに、カチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド修飾リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有する化合物、ポリエチレングリコール基を有する化合物、ステロール類から少なくとも1種選ばれた化合物を混合して入れる。あるいは予めこれらの化合物を加えた圧力容器
に液体二酸化炭素を加え、次いで温度、圧力を調整して超臨界状態にする。
【００５２】
その際、溶解助剤を添加することもできる。溶解助剤として、低級アルコール、グリコール、グリコールエーテルなどを1種または2種以上併用することが望ましい。たとえばアルコール類を超臨界二酸化炭素の0.1〜10質量％、好ましくは、1〜8質量％の割合で助溶
媒として使用するのがよい。より好ましい溶解助剤としては、安全性の観点からエタノールである。
【００５３】
引き続き生成した脂質混合物に、ヨウド系化合物、必要に応じて後述の製剤助剤を含む水溶液を連続的に添加して、水相／二酸化炭素エマルジョンを形成する。このエマルジョン系において脂質成分はミセル状となり離合集散をしていると推定される。さらに二酸化炭素相と水相とが分離するまで水溶液を連続的に添加する。水相容積の増大とともに、水/炭酸ガスエマルジョン＋炭酸ガス/水エマルジョンの２相系となる。系内を減圧して二酸化炭素を排出すると、ヨウド系化合物を内包するリポソームが分散している水性分散液が生成する。
【００５４】
上記ヨウド化合物のリポソーム内への内包化の割合は、リポソーム用脂質の総量とヨウド化合物（必要に応じてさらに製剤助剤）を含む水溶液との比率によっても左右される。リポソームの円滑な形成、ならびにその脂質膜内へのヨウド化合物の効率的な内包化には、使用する脂質総量と内包物質を含有する水溶液との比率もまた調整する必要がある。この脂質総量とは、リポソーム膜を構成するリン脂質類、ステロール類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。上記水溶液１リットル（Ｌ）に対して、脂質総量が5〜150ｍmolesの範囲、好ましくは8〜120ｍmolesの範囲でリポソーム膜構成物質を含む溶媒を混合する。そうした場合、水溶性ヨウド化合物のリポソーム内への内包化は良好に進行し、結果的にそのヨウド化合物の保持効率も向上する。脂質の量が150ｍmolesを超えると、水溶液との混和が不充分でリポソーム化しない脂質となり、夾雑物として、これは出来上がったリポソームの凝集を促進する。
【００５５】
超臨界もしくは亜臨界二酸化炭素を使用するリポソーム調製法は、従来法に比べてリポソームの生成率、封入する物質の内包率、リポソーム内の封入物質保持率が高いことが示されている（上記特許文献２参照）。さらに工業的スケールでの応用も可能であり、有機溶剤を使用せずに非イオン性かつ水溶性の物質を効率よくリポソームに封入することがで
きる本法は、本発明のＸ線造影剤の製造には有用な方法である。
【００５６】
本発明の造影剤におけるリポソームは、通常、多重層膜リポソームと一枚膜リポソームが混在していてもよい。ここにいう一枚膜リポソームとは、リン脂質二重層が実質的に1
つの層としてなる膜（unilamellar vesicle）で構成されるリポソームである。ここで「
実質的に」とは、以下の凍結かつ断（Freeze fracture ）レプリカ法による透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察において、レプリカが概ね1つの層として認められるリン脂質二重層
によりリポソームが構成されていることをいう。多重層膜（multilamellar vesicles; ＭＬＶ）からなる大きいリポソームは、リポソーム膜の二分子膜を剥がしてその多重層をなるべく薄くすることが望ましい。多重層膜リポソームでは、ヨウド化合物の脂質重量当りの内包率は低く、反面、脂質の占める割合が相対的に大きいため、粘度上昇の原因にもなる。リポソーム懸濁液の粘度が高いと、一定孔サイズのフィルターに通す、後続エクストルーダー操作の際、かける圧力を一層高めなくてはならない。さらにＸ線造影剤の粘度が高いと、投与の際にも不都合が多い。これを回避するためには、たとえば作製後に引き続き超音波照射を行って、多重層膜の脂質膜枚数を減らし、サイズの比較的小さい粒子にえる。
【００５７】
これに代わって超臨界二酸化炭素にリポソーム膜構成物質を溶解する際、エタノールを溶解助剤として適宜添加することにより、超臨界二酸化炭素にリポソーム膜構成物質を充分に溶解させて、一枚膜リポソームの比率を高めることも好ましい。一枚膜リポソーム、特に大きい一枚膜リポソームであるＬＵＶ（Large unilamellar veislcles）は、多重層
膜リポソームに比べて大きい封入容量を提供し、リポソームの投与量、換言すると投与脂質量が大きくならないという利点もあるためである。
【００５８】
内包するヨウド化合物の重量が相対的に多過ぎるとリポソームの安定性は低下する。特にイオン強度の急激な変化には弱い傾向が観察されていた。そこで比較的小さい粒径に調整し、リポソーム膜にステロール類を含有させ、あるいはカチオン性リン脂質、ポリアルキレンオキシド基を有するリン脂質またはカチオン性物質を含有させて、脂質膜の安定化を図ることもできる。実際、そうしたリポソームは、たとえば塩ショックに対しても安定的であることが判明した。
【００５９】
リポソーム粒子のサイズおよびその分布は、本発明のＸ線造影剤が目指す、高い血中滞留性、ターゲティング性、送達効率と密接に関わっている。ここで「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径を指している。なお、粒子径または粒径は、粒子の直径を意味する。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行なうことができる。たとえば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。
【００６０】
リポソームの粒子径の分布をより狭い範囲に揃えるには、作製されるリポソームの懸濁液を一定サイズの孔径を有する濾過膜、好ましくは混合セルロース膜などに強制的に透過させてもよい。この場合、濾過膜として0.05〜0.4μ、好ましくは0.1〜0.4μ、さらに好
ましくは0.15〜0.2μの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより
、リポソーム多重層膜の脂質膜枚数を減らすとともに、中心粒径として100〜300nmの最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。具体的には、各種の静圧式押出し装置、たとえば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）、「リポナイザー」（商品名、野村マイクロサイエンス製）などを使用して、フィルターを強制的に透過させる。フィルターは、ポリカーボネート系、セルロース系などのタイプを適宜使用することができる。押出し濾過法については、たとえばBiochim. Biophys.Acta 557巻,9ページ(1979)に記載されている。
【００６１】
前記押出し濾過の好ましい態様は、水性懸濁液を、相転移温度を有するリン脂質の転移
温度以上で細孔のある膜を通すことである。この“転移温度以上”とは、用いるリン脂質の種類と組成にもよるが、大体20℃〜90℃である。このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。引き続きリポソーム分散液を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法により未保持の薬剤を除去して精製したり、濃縮、希釈、凍結乾燥などの操作を任意に行ってもよい。滅菌処理、パッケージングなどの製剤過程を経て、本発明のＸ線検査用造影剤が調製される。
【００６２】
上記のように受動的ターゲティング能力をリポソームに持たせるには、その粒径のサイジングも考慮する必要がある。Ｘ線撮像の目的に応じて、粒径が適切に設定される。本発明の造影剤リポソームの中心粒径は、通常50〜300nm、好ましくは50〜200nm、より好ましくは50〜130nmである。たとえば腫瘍部分の選択的撮像目的の場合には、特に110〜130nm
が好ましい。リポソームの粒径を100〜200nm、より好ましくは110〜130nmの範囲に揃えることにより癌組織へ選択的にＸ線造影剤を集中させることが可能となる（「ＥＰＲ効果」）。固形癌組織にある新生血管壁の孔は、正常組織の毛細血管壁窓（fenestra）の孔サイズ、30〜80nm未満に比べて異常に大きく、約100nm〜約200nmの大きさの物質でも血管壁から漏れ出る。ＥＰＲ効果は、癌組織にある新生血管壁では、正常組織の微小血管壁より透過性が高いことによるものであるため、血中滞留性の向上が図られねばならない。本発明のＸ線造影剤は、特に大きい粒子を含まないため、細網系内皮細胞による捕獲の対象になりにくい。またリポソームがいわば赤血球類似の姿と挙動をしていて腎臓を経由して速やかに排出されることはなく、さらにステルス（隠蔽）化されている場合には細網系内皮細胞に貪食されることもなく、血流中に比較的長くとどまる。
【００６３】
Ｘ線検査用造影剤
本発明のＸ線検査用造影剤は、上述のようにリポソーム自体の安定性が改善されているために、製剤工程における処理時、貯蔵・保管期間にもリポソーム内に造影物質が安定的に保持される。さらに造影剤の血中安定性も上記リポソーム内への内包により図られている。Ｘ線造影のコントラスト性能を規定する、標的臓器への必要ヨウ素送達量は、明らかにされている（たとえば特許2619037号公報）。本発明のＸ線造影剤は製剤化に際し、必
要に応じてさらに製剤助剤として薬理学的に許容される緩衝剤、安定化剤、α‐トコフェロールなどの抗酸化剤、粘度調整剤なども含めてもよい。
【００６４】
本発明造影剤のようにヨウド系化合物をリポソームというマイクロキャリヤーに封入する場合には、造影物質の保持安定性および送達効率に加えて脂質の用量も考慮されねばならない。ヨウド系造影化合物がカプセル化されていないヨウドＸ線造影剤に対して、リポソームに内包させたヨウドＸ線造影剤では、リポソーム脂質が製剤の粘度上昇に寄与することは疑いない。このような粘度上昇を抑えるには、脂質１ｇ当りのヨウド化合物の内包率を上げるとともに、ヨウド担持効率の高いヨウド化合物をリポソームに内包させることが好ましい。この観点からは、たとえば二量体非イオン性ヨウド化合物、好ましくはＷＯ96/09282、ＷＯ96/09285に提案された二量体ヨウド化合物を、脂質膜層の薄いリポソーム、好ましくは一枚膜リポソームに内包させた造影剤が望ましい。
【００６５】
本発明製剤の粘度（オスワルド法で測定した場合）は、３７℃で、20  mPa・ｓ以下、
好ましくは18  ｍＰa・ｓ以下、より好ましくは15 mPa・ｓ以下である。
【００６６】
造影剤懸濁液の粘度が、３７℃において20 mPa・ｓよりも高いと、上述した製剤の品質管理上の問題が生起するのみならず、生体に造影剤を注射、注入する際に、高い注射圧をかける必要があって、被験者に苦痛を与える。目詰まり等のトラブルも起きるため、比較的大きい内径の注射針も必要となる。本発明の造影剤の粘度を低くするために、分散媒、緩衝液などで希釈して希薄分散液とすると、造影剤液の投与容量の増大、リポソーム粒子
の不安定化を招く。
【００６７】
本発明の方法により製造されるＸ線検査用造影剤は、含有するリポソームの脂質膜にもその内部水相にも有機溶媒が含まれていないことを特徴としている。さらにヨウド含有量として通常、想定される10〜300mlの製剤懸濁液の投与量では、100〜500mgI／mlであり、好ましくは、150〜300mgI／mlである。またＸ線検査用造影剤に残存する遊離ヨウ素イオ
ン量は、0.001mole／Ｌ造影剤 以下、好ましくは0.0001mole／Ｌ造影剤 以下にすべきで
ある。遊離ヨウ素イオンのトラップ剤として機能するキレート化剤を加えることが好ましい。そのようなキレート剤としてＥＤＴＡNa2−Ca、ＥＤＴＡNa2などが挙げられる。
【００６８】
本発明のＸ線検査用造影剤は、投与後にリポソームが体内に安定に維持されるように、体内の浸透圧に対し、等張の溶液または懸濁液の形でリポソーム中に封入される。そうした溶液もしくは懸濁液の媒質として、水、緩衝液、たとえばトリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを使用することができる。
【００６９】
上記溶液もしくは懸濁液の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。Ｘ線造影剤が多ヒドロキシル基を有する水溶性ヨウド系化合物である場合、好ましい緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数を有す
る緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、特に好ましくはトリス（TRIS）である。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のＸ線造影剤の安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。したがって、注射用無菌造影剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。オートクレーブ滅菌を適用できないリポソームには、ろ過滅菌を行なうのがよい。
【００７０】
等張の溶液または懸濁液を得るには、等張液を提供する濃度で造影剤を媒質中に溶解もしくは懸濁させる。たとえば造影剤化合物の溶解性が低いために造影剤が単独では等張液を提供できない場合、等張の溶液もしくは懸濁液が形成されるように他の非毒性の水溶性物質、たとえば塩化ナトリウムのごとき塩類、マンニトール、グルコース、ショ糖、ソルビトールなどの糖類を媒質中に添加してもよい。
【００７１】
本発明のＸ線検査用造影剤は、注射剤または点滴注入剤として、非経口的に、具体的には血管内投与、好ましくは静脈内投与により被験者に投与されＸ線照射により撮像される。その用量は、従来のヨウド系造影剤に準じる。リポソーム内のヨウド総量、またはそれとリポソーム外のヨウド総量の和が、従来の投与量と同程度になるようにしてもよい。実際の診断的検査においては、本発明のＸ線検査用造影剤を、コンピュータ断層撮影装置（CT）と組み合わせたＸ線撮影装置に使用することにより、その造影剤性能をさらに有効に発揮することも期待される。
【００７２】
〔実施例〕
以下に本発明をより詳細に説明するために実施例および実施例を示すが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７３】
造影剤の調製
非イオン性ヨウド化合物として、商品名「オイパロミン150」（コニカミノルタエムジ
ー社製Ｘ線造影剤：イオパミドールを306.2mg/mL含有（ヨウド含有量150mg/mL））を準備して以下の造影剤の作製に供した。
【００７４】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）86mgとコレステロール38.4mgを、60℃に
加熱したステンレス製の特製圧力容器に仕込み、蓋をした。しばらく放置して全体が融解するのを確認した後、圧力容器内をマグネティックスターラーで撹拌しながら、圧力が50kg/cm2の液化二酸化炭素13gを圧力容器に注入した。注入後、圧力容器の体積を減じるこ
とにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに圧力を120kg/cm2まで加圧した。その後
、オイパロミン150を10ml、HPLCの送液ポンプを利用して、0.1ml/minの流速で圧力容器内に注入した。注入終了後、圧力容器内の二酸化炭素を約20分間かけて徐々に抜き、常圧に戻した後、中の溶液を取り出した。
【００７５】
得られた溶液を37℃の温度で、オスワルド粘度計により粘度を測定したところ、10.0ｍＰａ・ｓであった。この溶液を80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μｍの混合
セルロースメンブランフィルターで３回、孔径0.45μｍの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔径0.3μｍの混合セルロースメンブランフィルターで6回通して、本発明
の造影剤１を得た。
【００７６】
さらに得られた溶液の一部を透析膜に入れて、生理食塩水、1Lにて3回透析を行い、少
量のエタノールを加えてリポソームを破壊し、遠心分離後、分光光度計により242ｎｍの
イオパミドールの吸収を測定することにより、リポソームに内包されていたイオパミドールの定量を行い、内包率が、15％であることがわかった。
【００７７】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）86mgと、コレステロール38.4mg、ＰＥＧ化脂質（日本油脂社製、SUNBRIGHT DSPE-020CN）4mgを60℃に加熱したステンレス製の特
製圧力容器に仕込み、蓋をした。全体が融解するのを確認した後、圧力容器内をマグネティックスターラーで撹拌しながら、圧力が50kg/cm2の液化二酸化炭素13gを圧力容器に注
入した。注入後、圧力容器の体積を減じることにより、二酸化炭素を超臨界状態にし、さらに体積を減ずることにより120kg/cm2まで加圧した。その後、オイパロミン150を10ml、HPLCの送液ポンプを利用して、0.1ml/minの流速で圧力容器内に注入した。注入終了後、
圧力容器内の二酸化炭素を約20分間かけて徐々に抜き、大気圧にした後、中の溶液を取り出した。
【００７８】
この溶液を80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μｍの混合セルロースメンブ
ランフィルターで３回、孔径0.45μｍの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔
径0.3μｍの混合セルロースメンブランフィルターで6回通して、本発明の造影剤２を得た。
【００７９】
このものの粘度は、37℃で８ｍＰａ・ｓであった。また内包率は、19％であった。
【００８０】
[比較例]
クロロホルム42ml に、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）86mgとコレステ
ロール38.4mgを溶解した。この溶液にジイソプロピルエーテルを42ml加え、さらにオイパロミン150を1.5ml加えて、60℃に加熱した後、超音波を５分間かけてエマルジョンを作成した。得られたエマルジョンをロータリーエバポレータにかけ、45℃にて約5 mlになるまで濃縮した。この中に、オイパロミン150を3ml、純水を2ml加え、再度4 mlになるまで濃
縮し、さらにオイパロミン150を5.5ml、純水を2.5ml加えて再度8 mlになるまで濃縮した
。その後、純水にて10 mlに仕上げた。
【００８１】
この溶液を80℃に加熱したエクストルーダーにて、孔径1μｍの混合セルロースメンブ
ランフィルターで３回、孔径0.45μｍの混合セルロースメンブランフィルターで3回、孔
径0.3μｍの混合セルロースメンブランフィルターで6回通して、比較例の造影剤を得た。
【００８２】
このものの粘度は、37℃で、26.5ｍＰａ・ｓであった。また内包率は、9％であった。
【実施例２】
【００８３】
肝癌発癌ラットの作製
特開2002-95382号公報の記載に従い、肝癌発癌ラットを作製した。F344系雄ラット（5
週齢）にCDAA食にて1週間飼育後、DEN、20mg/ｋｇ体重を腹腔内に単回投与し、CDAA食に
て通算で64週間飼育し、さらに普通食（CRF−１）にて8週間以上飼育することにより、原発性肝癌モデル動物を作製した。肝癌発癌ラットを下記造影試験に供した。
【００８４】
Ｘ線造影試験および安定性試験
上記の肝癌発癌ラットに、その尾静脈から、実施例1で調製したX線造影剤溶液をそれぞれ2ｍｌ/kg用量となるように投与した。試験造影剤溶液を投与して、1分後、5分後、30分後、１時間後、６時間後、12時間後に、ラットをジエチルエーテルで麻酔し、ラット全身のX線画像を撮影した。
【００８５】
評価は、所要部分のX線写真から、腫瘍部が識別できるかどうかを、以下の基準で評価
した。
【００８６】
５．はっきりと識別できる
４．ややはっきりと識別できる
３．識別できる
２．少し識別できる
１．かろうじて識別できる（すなわち、造影剤を投与しなくとも識別できるレベル）
０．解からない
造影剤溶液の安定性試験は、試料1mlを暗所で40℃の保存温度で2週間放置し、析出、沈殿物の有無を確認した。析出または沈殿物が全くないレベルを◎、僅かにヘイズがかって見られるが、撹拌により消失してしまうレベルを○、ヘイズがかっているが、撹拌では消失しないレベルを△、分離してしまうレベルを×として評価した。
結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
2005232052.tif 000002