(57)【要約】      （修正有）【課題】メチル化特異的プライマー伸長反応（ＭＳＰＥ）を用いることにより、核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルを検出する方法を提供する。【解決手段】ＭＳＰＥは、ＣｐＧ部位で非メチル化シトシンをウラシルに修飾し、その後、化学処理した核酸を増幅させる薬剤を用いる。ＭＳＰＥを行うために非メチル化ＣｐＧ部位とメチル化ＣｐＧ部位とを識別するＭＳＰＥプライマーが提供される。１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルは、ＭＳＰＥ反応産物中に組み込まれた標識のシグナル強度を検出することにより行われる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項２】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位の該シトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項３】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、ｄＮＴＰ、標識ｄｄＣＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項４】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項５】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることてあって、ここで該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせると、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項６】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項７】
核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法であって、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長反応を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定すること、
を含む、核酸配列中のＣｐＧ部位のシトシン残基でのＤＮＡ５’−メチル化の検出法。
【請求項８】
被検体における疾患または障害の検出法であって、
（ａ）被検体から生体試料を得ること、
（ｂ）該被検体における１つまたは複数のＤＮＡ配列の１つまたは複数の選択されたＣｐＧ部位でのＤＮＡ５’−メチル化状況を判定すること、および
（ｃ）（ｂ）からの該メチル化状況を、疾患または障害の無い正常な被検体からの対照メチル化状況と比較することであって、有意差は該被検体における疾患または障害を示す、比較すること、
を含む、被検体における疾患または障害の検出法。
【請求項９】
（１）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する薬剤、（２）核酸分子の増幅用プライマー、（３）メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー（primersmethylated）、（４）非メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー、（５）標識ｄＮＴＰおよび未標識ｄＮＴＰ、（６）標識ｄｄＮＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ、ならびに（７）標識または未標識逆プライマーを含む、試料からメチル化ＣｐＧ含有核酸を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、包括的に、遺伝子中のＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化状況を検出する方法に関する。さらに、本発明は、被検体の核酸のＤＮＡメチル化状況を判定することにより障害または疾患を診断する方法に関する。
【０００２】
［優先権の主張］
本出願は、２００３年１２月１６日に出願した米国仮出願６０／５３０，０１０号の利益を主張する。上記出願の全教示は、本明細書中参照として援用される。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
哺乳類において、ＤＮＡメチル化は通常ＣｐＧジヌクレオチドとして知られるグアニンの５’側に位置するシトシンで起こる。ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ−Ｍｔａｓｅ）は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからシトシンの５番目の位置の炭素にメチル基を付加することにより、この反応を触媒する。Chiang, PK, et al.,「Ｓ−アデノシルメチオニンおよびメチル化（S-adenosylmethionine and methylation）」, FASEB J, 10: 471-480 (1996)。ヒトゲノムにおいて、ＣｐＧジヌクレオチド内の大部分のシトシンはメチル化されているが、特定のＧＣに富む領域ではメチル化されていないものもある。これらの領域は、ＣｐＧ島と呼ばれる。Antequera, F. et al.,「細胞株のＣｐＧ島における高レベルのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化および改変クロマチン構造（High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell Iines）」, Cell, 62: 503-514 (1990)。ＣｐＧ島は、一般的に、長さが０．２Ｋｂ〜約１Ｋｂの間であり、そして多くのハウスキーピング遺伝子および組織特異的遺伝子の上流に位置するが、ただし遺伝子翻訳領域内まで伸長することもある。Antequera, F. et al.,「細胞株のＣｐＧ島における高レベルのｄｅ  ｎｏｖｏメチル化および改変クロマチン構造」, Cell, 62: 503-514 (1990)。
【０００４】
ＤＮＡメチル化は、遺伝的、可逆的、かつ後成的な変化であり、これは、発生および遺伝に深刻な結果を有する、遺伝子発現を変更させる可能性を有する。ＤＮＡメチル化は、細胞発達の過程で遺伝子発現の調節に役割を果たしていることが知られている。この後成的な事象は、しばしば、刷込み遺伝子、いくつかの反復エレメント、および不活性Ｘ染色体上の遺伝子の転写的サイレンシングに伴う。Li, E. et al,「遺伝子刷込みにおけるＤＮＡメチル化の役割（Role for DNA methylation in genomic imprinting）」 Nature, 366: 362-365 (1993)、 Singer-Sam, J. and Riggs, AD, 「Ｘ染色体不活性化およびＤＮＡメチル化（X chromosome inactivation and DNA methylation）」、Jost, J. P. and Saluz, H. P. (編),「ＤＮＡメチル化：分子生物学および生物学的意義（DNA Metlylation: molecular Biology and Biological Significance）」, Birkhaeuser Verlag, Basel, Switzerland, pp. 358-384 (1993)。新生物細胞においては、正常な非メチル化ＣｐＧ島が異常メチル化、または過剰メチル化され得ることが観測されている。Jones, PA,「ＤＮＡメチル化エラーと癌（DNA methylation errors and cancer）」, Cancer Res., 56:2463-2467 (1996)。
【０００５】
ＣｐＧジヌクレオチドでの異常メチル化シトシンは、癌では広く見られる現象である。 Jones, PA and Laird, PW,「年齢からくる癌の後成的遺伝学（Cancer epigenetics comes of age）」, Nat. Genet. 21: 163-167 (1999)。ＣｐＧ島の過剰メチル化の結果として、プロモーター中のクロマチン構造が改変され得、転写機構との正常な相互作用を阻害する。Baylin, SB, et al.「ＤＮＡメチル化における改変：異常増殖の基本的様相（Alterations in DNA methylation: A fundamental aspect of neoplasia）」, in Advances in cancer research (編集、 G.F. Vande Woude and G. Klein), 第72巻: 141-196 (1998), Academic Press, San Diego, CA。増殖阻害に決定的な遺伝子でこれが生じた場合、もたらされる転写の沈黙化は腫瘍の進行を促進する可能性がある。また、プロモーターＣｐＧ島の過剰メチル化は、古典的腫瘍抑制因子遺伝子および細胞周期調節に重要な遺伝子の転写不活性化、ならびにＤＮＡ不適正修復の一般的な機構であることが示されている。
【０００６】
これらの発見に基づき、シトシンのメチル化は遺伝子発現の制御に重大な役割を果たしており、そしてメチル化パターンまたはメチル化状況の変更は疾患を引き起こすということが言える。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。本方法は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得ること、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させること、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させること、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行うことであって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長を行うこと、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることであって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせること、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定することを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、ｄＮＴＰ、標識ｄｄＣＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００１０】
代替的に、別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程を含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００１２】
代替的に、別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上のＣｐＧ部位の該シトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００１４】
本発明によれば、工程（ａ）のＤＮＡはゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００１５】
本発明によれば、非メチル化シトシンをウラシルに変換するために使用される薬剤は重亜硫酸化合物であることが好ましい。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために使用される薬剤は重亜硫酸ナトリウムである。
【００１６】
本発明によれば、化学処理した核酸を増幅するのにＰＣＲを使用することが好ましい。１つの好適な実施形態において、ＰＣＲ増幅は、少なくとも１対のＰＣＲプライマーで行われ、かつＰＣＲプライマーは、メチル化および非メチル化ＤＮＡテンプレートの両方を認識するものとする。ＰＣＲプライマーは、厳密な条件下、少なくとも約７、好ましくは約１２、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、またはそれより多くのヌクレオチドと、理想的には約１７〜４０ヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいてもよい。別の好適な実施形態において、複数のＣｐＧ部位を認識する複数対のＰＣＲプライマーが用いられ、そしてＤＮＡテンプレートを同時に増幅するために多重ＰＣＲが行われる。
【００１７】
本発明によれば、１つまたは複数の核酸分子における１つまたは複数のＣｐＧ部位のメチル化レベルの分析のためにＭＳＰＥ反応が行われる。１つの好適な実施形態において、ＭＳＰＥ反応を行っている間、複数の単独または多発ＰＣＲ反応がプールされ得る。１つの実施形態において、プライマー伸長反応に用いられるＭＳＰＥプライマーは、最初からＣｐＧジヌクレオチドを含む配列とハイブリダイズするように設計される。
【００１８】
１か所の定義されたＣｐＧ部位の分析のため、好ましくは少なくとも２つのクラスのＭＳＰＥプライマーが伸長反応に関与する。一方のクラスのＭＳＰＥプライマーは、メチル化に特異的でかつメチル化ＣｐＧ部位とアニーリングし、そして他方のクラスのＭＳＰＥプライマーは、非メチル化ＣｐＧ部位に特異的でかつ増幅された核酸の非メチル化ＣｐＧ部位とアニーリングする。各クラスのＭＳＰＥプライマーは２つの部分からなる。３’末端部分は増幅された核酸の定義されたＣｐＧ部位（単数または複数）とアニーリングし、そして５’末端部分は増幅された核酸のいずれによってもアニーリングされないユニーク／アダプター配列とアニーリングする。
【００１９】
１つの実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用い、そして標識ｄＮＴＰを用いることにより行われ、ここでｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰは標識されていてもよい。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用い、そして標識ｄｄＣＴＰを用いることにより行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用い、そして標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物および未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物を用いることにより行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、テンプレートＤＮＡの下の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用い、そして標識ｄＮＴＰを用いることにより行われ、ここでｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰは標識されていてもよい。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの下の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用い、そして標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物および未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物を用いることにより行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの上の鎖を、未標識ｄＮＴＰを用いてアニーリングする標識逆プライマーを用いて行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅されたＤＮＡの下の鎖を、未標識ｄＮＴＰを用いてアニーリングする標識逆プライマーを用いて行われる。
【００２０】
伸長産物中に組み込まれるｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、検出可能な標識で標識されてもよい。検出可能な標識は当該分野で既知である。任意の型の検出可能な標識が用いられ得る。１つの好適な実施形態において、標識は放射性同位体である。別の好適な実施形態において、標識は蛍光剤である。別の好適な実施形態において、標識はビオチンのような結合部分である。
【００２１】
検出可能な標識は、直接検出され得る一次標識、または間接的に検出され得る二次標識のいずれでもあってもよい。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、１つまたは複数のＣｐＧ部位を含むＭＳＰＥ反応産物のシグナル強度を分析することにより、１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルを判定および定量する方法を提供する。１つの好適な実施形態において、多数のＣｐＧ部位が、それらの相対的メチル化レベルを同時に判定され得、例えば、１つまたは複数のＣｐＧ部位における相対的メチル化レベルの判定および定量が、高処理様式で、またはマイクロアレイで行われ得る。
【００２３】
本発明の別の態様はまた、１つまたは複数のＣｐＧ部位における相対的メチル化レベルの検出用キットを提供する。キットは、（１）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する薬剤、（２）核酸分子の増幅用プライマー、（３）メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー（標識または未標識のいずれか）、（４）非メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー（標識または未標識のいずれか）、（５）標識ｄＮＴＰおよび未標識ｄＮＴＰ、（６）標識ｄｄＮＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ、ならびに（７）標識または未標識逆プライマーを含み得る。キットはさらに、核酸増幅緩衝液およびＭＳＰＥ反応用試薬を含み得る。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する薬剤は重亜硫酸化合物である。
【００２４】
本発明の別の態様はまた、被検体において、疾患または障害の素因を判定するための、あるいは疾患または障害を診断および／または予知（prognose）するための、あるいは薬物または化合物の治療的応答をモニタリングするための、本方法および／またはキットの使用法を提供し、この方法は、核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルを判定すること、および被検体の相対的メチル化レベルを、疾患または障害の素因を有さない対照被検体（または標準）からの言及の核酸分子の相対的メチル化レベルと比較することを含み、相対的メチル化レベルにおける有意差は被検体において、疾患または障害の素因を示す。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、試料中のＤＮＡメチル化状態または状況を判定することにより、疾患の診断、予知、または治療道具を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
［発明の詳細な説明］
概要
本発明は、試料中のＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法に関する。一般に、方法の第一段階は、ＣｐＧ部位を化学的に修飾すること、非メチル化シトシンをウラシルに変換すること、５’−メチル化シトシンを未修飾のままにすることを含む。次いで、化学処理されたＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を含む従来の分子生物学的技法により増幅され得る。次いで、増幅ＤＮＡ産物におけるメチル化状態または状況は、タグ付き（tagged）プライマーまたはｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰを用いて、プライマー伸長反応で分析され得る。本発明の別の態様は、メチル化状態または状況の、疾患マーカーとしての、または治療の基礎としての、臨床的応用に関する。詳細には、ＣｐＧ部位での異常メチル化は、遺伝子発現を不活性化させる。したがって、同部位での非メチル化レベルと比較しての１つまたは複数の特定ＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルは、診断、予知、または治療道具として機能する。
【００２７】
定義
本明細書中使用される場合、「メチル化」という用語は、遺伝子調節領域のＣｐＧジヌクレオチド内のヌクレオチド塩基のシトシンのＣ５位でのメチル基の共有結合を示す。「メチル化状態」または「メチル化状況」という用語はＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の有無を示す。本明細書中使用される場合、「メチル化状況」および「メチル化状態」という用語は互換的に使用される。メチル化部位は、配列特異的メチラーゼにより認識されてメチル化される近接して結合したヌクレオチドの配列である。メチラーゼは、メチル化部位で１つまたは複数のヌクレオチドをメチル化する（すなわち、メチル基を共有結合させる）酵素である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧ島」という用語は、ＣｐＧジヌクレオチドに富んだ短いＤＮＡ配列であり、そしてヒト遺伝子の全体の約１／２の５’領域で見いだされ得る。「ＣｐＧ部位」という用語は、ＣｐＧ島内のＣｐＧジヌクレオチドを示す。ＣｐＧ島は、一般的に、約０．２ｋｂ〜約１ｋｂの長さであるが、常にそうあるわけではない。
【００２９】
本明細書中使用される場合、「試料」という用語は、その最広義において使用されるとおり、例えば、個体から単離された組織または液体（血漿、血清、脳脊髄液、リンパ、涙、だ液、および組織切片が挙げられるがそれらには限定されない）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物から単離された組織または液体などの、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含む任意の植物、動物、またはウイルス性材料、ならびに環境からの試料を示す。「試料」という用語はまた、「生体試料」を示す。本明細書中使用される場合、「生体試料」という用語は、生物体全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、体液として、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、だ液、羊膜液、羊膜帯血、尿、膣液、および精液が挙げられるがこれらに限定されない）のサブセットを示す。「生体試料」はさらに、生物体全体、あるいはその組織、細胞、または構成部分、またはそのフラクションもしくは一部分から調製されるホモジネート、ライセート、または抽出物を示し、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖器管の外部切片、涙、だ液、母乳、血球、腫瘍、器官が挙げられるが、これらに限定されない。最も頻繁には、試料は動物から採取されてきたが、しかし「生体試料」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち動物から採取されずに分析される、細胞または組織も示し得る。代表的には、「生体試料」は、動物からの細胞を含むだろうが、この用語は、癌関連ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルを測定するために使用され得る、血液、だ液、または尿の非細胞性フラクションなどの、非細胞性生体材料も示し得る。「生体試料」はさらに、生物体が繁殖しており、タンパク質または核酸分子などの細胞性構成分を含む、栄養ブロスまたはゲルなどの培地を示す。
【００３０】
本明細書中使用される場合、「薬剤」という用語は、どの５’−メチル化シトシンも未変化で残しながら非メチル化シトシンを別のヌクレオチドに修飾する特性を有する任意の化合物を示す。修飾は、非メチル化シトシンをメチル化シトシンと識別するだろう。好ましくは、薬剤は、非メチル化シトシンをウラシルに修飾する。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するために使用される薬剤は重亜硫酸ナトリウムである。しかしながら、非メチル化シトシンを同様に修飾するがメチル化シトシンは修飾しない他の薬剤もまた、本発明で使用され得る。
【００３１】
本明細書中使用される場合、「プライマー」という用語は、核酸制限消化から精製されたのであろうと合成で産生されたのであろうと、核酸鎖と相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、すなわちヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの重合化剤の存在下、かつ適した温度およびｐＨに置かれたときに、核酸合成の開始点として作用し得るポリヌクレオチドを示す。プライマーは、効率を最大限にするために好ましくは一本鎖であるが、代替的に二本鎖でもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するのに使用される前に、最初に処理されてその鎖が分けられる。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合化剤の存在下、伸長産物の合成をプライムするのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度およびプライマー源を含む多くの要因に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、ポリヌクレオチドプライマーは代表的には１５〜２５またはそれより多くのヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドも含み得る。短いプライマー分子は一般に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。
【００３２】
本明細書中使用される場合、「ＭＳＰＥプライマー」という用語は、アッセイされるべきＣｐＧ部位とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを示す。「ＭＳＰＥプライマー」は２つの部分を含む。ＭＳＰＥプライマーの５’末端は、アッセイされるべき試料中のどのＤＮＡともハイブリダイズしないユニーク配列を含み、そしてＭＳＰＥプライマーの３’末端は、アッセイされるべきＣｐＧ部位を含む領域と相補的な配列を含む。
【００３３】
本明細書中使用される場合、「ジップコード（zip code）」または「アダプター配列」とも呼ばれる「ユニーク配列」という用語は、一般に標的配列に対して外来性、例えば人工の配列である。１つの好適な実施形態において、アダプター配列は、検出マイクロビーズまたはマイクロアレイの捕獲プローブに対して実質的に相補的（そして好ましくは完全に相補的）であるように設計される。好ましくは、捕獲プローブは、アレイ支持体について本明細書中記載されるようなマイクロスフェア、あるいはプラスチックスライドまたはスライドガラスなどの平面基材を含み得る固体支持体に固定される。非制限的な一例は、３’アミン修飾オリゴである：ＣＰ３２：５’
ＣＧＡＡＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＧＣＧＴＣ３’（配列番号１）、ＣＰ３３：５’
ＧＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣ３’（配列番号２）、ＣＥ３２：５’
ＧＡＣＧＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＧＣＧＴＴＣＧ３’（配列番号１３）、およびＣＥ３３：５’
ＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＣＡＣ３’（配列番号１４）。
【００３４】
本明細書中使用される場合、「増幅する」という用語は、テンプレート核酸の鎖のうち１本または両方と相補的である核酸分子を合成するプロセスを示す。核酸分子の増幅は、一般的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの溶融温度より低い温度でプライマーをテンプレート核酸にアニーリングすること、およびプライマーから酵素で延長して増幅産物を生成することを含む。変性工程、アニーリング工程、および伸長工程はそれぞれ、１回行われ得る。しかしながら、一般に、変性工程、アニーリング工程、および延長工程は、増幅産物の量が増加するように複数回行われ、その回数はしばしば指数関数的であるが、指数関数的増幅は本方法では必要ではない。増幅は、一般的にはデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、および適切な緩衝液および／またはポリメラーゼ酵素の最適活性のための補因子の存在を必要とする。「増幅産物」という用語は、本明細書中定義されるとおりの増幅プロセスから産生される核酸配列を示す。
【００３５】
本明細書中使用される場合、「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）効果を提供するために使用され得り、かつ核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子を示す。標識として、色素および32Ｐなどの放射標識、ビオチンなどの結合部分、ジゴキシゲニン（digoxgenin）などのハプテン、発光性（luminogenic）、燐光、または蛍光発光性部分、および単独の、または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により発光スペクトルを抑制またはシフトさせ得る部分と組み合わせた蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。標識は、蛍光、放射能、比色、重力測定、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性などにより検出可能なシグナルを提供し得る。標識は、電荷を帯びた部分（正電荷または負電荷）であってもよく、あるいは中性の電荷であってもよい。標識は、その標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質配列を含み得り、または構成し得る。「標識ｄＮＴＰ」という用語は、結合した標識により修飾されているｄＮＴＰを示す。「標識ｄｄＮＴＰ」という用語は、結合した標識により修飾されているｄｄＮＴＰを示す。
【００３６】
本明細書中使用される場合、「ハイブリダイズする」という用語は、通常のハイブリダイゼーション条件下、核酸鎖が第二の相補的核酸鎖とアニーリングして、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれかの安定な二本鎖を形成し、そして同じ通常のハイブリダイゼーション条件下で関連しない核酸分子と安定な二本鎖を形成しないプロセスを示す。二本鎖の形成は、２本の相補的核酸鎖をハイブリダイゼーション反応でアニーリングすることにより達成される。ハイブリダイゼーション反応は、２本の核酸鎖が実質的にまたは完全に相補的である特定の配列中に一定数のヌクレオチドを含有しない限り、２本の核酸鎖間のハイブリダイゼーションが安定な二本鎖を形成しない、例えば、通常の厳密条件下で二本鎖を形成された（double-strandedness）領域を保持する二本鎖を形成しない、ように、ハイブリダイゼーション反応が行われるハイブリダイゼーション条件（しばしば、ハイブリダイゼーション厳密度（stringency:ストリンジェンシー）として示される）を調整することにより高度に特異的にされ得る。「通常のハイブリダイゼーション条件または通常の厳密条件」は、任意の所定のハイブリダイゼーション反応について容易に判定される。例えば、Ausubel et al.,「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, Inc., New York, またはSambrook et al.,「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照。本明細書中使用される場合、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸鎖が塩基対形成を通して相補的鎖と結合する任意のプロセスを示す。
【００３７】
本明細書中使用される場合、「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合化を触媒する酵素を示す。一般に、酵素はＤＮＡテンプレート配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始し、そしてテンプレートに沿って５’方向に進行する。既知のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼとも示される）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（ＵｌＴｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびピロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。上記の酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当該分野で既知の手段により定義され得る。ＤＮＡポリメラーゼ活性の一単位は、本発明によれば、１０ｎｍｏｌｅの全ｄＮＴＰを重合型に組み合わせるのを７２℃で３０分で終わらせるように触媒する酵素の量として定義される。本発明で使用され得る好適な熱安定ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、ストッフェル断片（Stoffel fragment）、ＶＥＮＴ（登録商標）、およびＤＥＥＰＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの突然変異、変異体、および誘導体が挙げられる。米国特許出願第５，４３６，１４９号、米国特許出願第４，８８９，８１８号、米国特許出願第４，９６５，１８８号、米国特許出願第５，０７９，３５２号、米国特許出願第５，６１４，３６５号、米国特許出願第５，３７４，５５３号、米国特許出願第５，２７０，１７９号、米国特許出願第５，０４７，３４２号、米国特許出願第５，５１２，４６２号、米国特許出願第６，０１５，６６８号、米国特許出願第５，９３９，３０１号、米国特許出願第５，９４８，６１４号、米国特許出願第５，９１２，１５５号、ＷＯ９７/０９４５１、ＷＯ９８/３５０６０、ＷＯ９２/０６１８８、ＷＯ９２/０６２００、ＷＯ９６/１０６４０、Barnes, W.M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F.C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M, et al., Nucl. Acids Res. 22 (15): 3259-3260 (1994)を参照。
【００３８】
本明細書中使用される場合、「検出する」とは、試料中の分子の有無の同定を意味する。検出されるべき分子がリガンドの場合、検出工程は、リガンドを検出可能に標識された抗体と結合させることにより行われ得る。検出可能な標識は、独立して、または刺激に応答してのいずれかで、観察可能なシグナルを発生することができる分子である。検出可能な標識は、蛍光標識、色素標識、発光標識、または放射性標識であり得るが、これらに限定されない。標識を「検出する」方法として、標準または共焦点顕微鏡観察、ＦＡＣＳ分析に適応した定量的および定性的方法、およびマルチウェルプレート、アレイ、またはマイクロアレイを含む高処理法に適合したものが挙げられる。当業者は、所定の蛍光リガンドまたは色素からの蛍光発光を検出するのに適したフィルターセットおよび励起エネルギー源を選択し得る。本明細書中使用される場合、「検出する」とはまた、検出されるべきリガンドに対して複数の抗体を使用することも含み得、ここで複数の抗体は検出されるべきリガンド上の異なるエピトープに結合する。このように使用される抗体は、２種またはそれより多くの検出可能な標識を用い得り、そして、例えば、ＦＲＥＴ対を含み得る。本発明によれば、ポリペプチド分子は、検出可能なシグナルのレベルが、検出可能な標識のバックグラウンドレベルよりもとにかく大きい場合に、または、測定された核酸のレベルが対照試料で測定されたレベルよりもとにかく大きい場合に、「検出」される。
【００３９】
本明細書中使用される場合、「検出する」とはまた、標的核酸分子（例えば、対象の核酸分子）の存在を検出することを示し、直接または間接的に標識されたプローブ核酸分子（試料中の標的とハイブリダイズし得る）により生じたシグナルが測定または観測されるプロセスを示す。したがって、プローブ核酸の検出は、マーカー遺伝子をコードする配列などの標的核酸の存在、したがってその検出を直接示すものである。例えば、検出可能な標識が蛍光標識の場合、標的核酸は、プローブ核酸上の蛍光標識が適切な波長で励起された時に、それにより発せられる光を観測または測定するこにより「検出され」、または検出可能な標識が蛍光／消光剤対の場合、標的核酸は、プローブ核酸上に存在する蛍光／消光剤対の会合または乖離時に発せられる光を観測または測定するこにより「検出され」、ここでプローブ核酸の検出が標的核酸の検出を示す。検出可能な標識が放射性標識の場合、標的核酸は、放射性標識プローブとのハイブリダイゼーションに続いて、例えば、オートラジオグラフィーにより「検出され」る。蛍光標識、放射性標識、および他の化学標識を「検出する」方法および技法は、Ausubcl et al. (1995, 「分子生物学の短いプロトコル（Short Protocols in Moleculor Biology）、第３版、John Wiley and Sons, Inc.)に見いだされ得る。あるいは、核酸は「間接的に検出され」てもよく、ここで酵素活性などの部分が標的とハイブリダイズするプローブ核酸に結合されて、適切な基質の存在を検出可能にするか、または特異的抗原もしくは他のマーカーが抗体もしくは他の特異的指標の添加により検出可能にする。あるいは、標的核酸分子は、標的核酸配列の一部とハイブリダイズするように特別に設計されているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、患者の臨床試料から調製された核酸試料を増幅することにより検出され得る。ＴａｑＭａｎなどの定量的増幅法（これらに限定されない）もまた、本発明による、標的核酸を「検出する」のに用いられ得る。本明細書中で使用される場合、核酸分子は、測定された核酸のレベル（定量的ＰＣＲによるなど）、または検出可能な標識により提供される検出可能なシグナルのレベルがバックグラウンドレベルをとにかく超える場合に、「検出」される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、 「検出する」はさらに、細胞または組織の疾患状態を表す、標的核酸分子の特定の ＣｐＧ部位上でのメチル化状態または状況を検出することを示す。標的核酸分子の特定の ＣｐＧ部位上でのメチル化状態または状況は、診断、疾患のモニタリング、および治療的アプローチに有用な情報を提供し得る。当該分野で既知の様々な方法が特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況を判定するのに使用され得る。そのような方法として、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法（restriction landmark genomic scanning）（ Kawai et al., 「制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法によるマウス細胞株間でのＤＮＡメチル化パターンの比較（Comparison of DNA methylation patterns among mouse cell lines by restriction landmark genomic scanning）」, Mol. Cell Biol. 14 (11): 7421-7427 (1994)を参照）、 メチル化ＣｐＧ島増幅法（Toyota et al.,「メチル化ＣｐＧ島増幅法による結腸直腸癌中のメチル化状態が異なった配列の同定（Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification）」, Cancer Res., 59: 2307-2312 (1999)を参照、同じくＷＯ  ００／２６４０１Ａ１も参照、メチル化状態が異なったハイブリダイゼーション法（Huang et al.,「ヒト乳癌細胞におけるＣｐＧ島のメチル化プロファイリング（Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells）」, Hum. Mol Genet., 8: 459-470 (1999)を参照）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Herman et al.,「メチル化特異的ＰＣＲ：ＣｐＧ島のメチル化状況についての新規ＰＣＲアッセイ（Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands）」, PNAS USA 93: 9821-9826 (1992)を参照、同じく米国特許第５，７８６，１４６号も参照）、メチル化感受性単独ヌクレオチドプライマー伸長法（methylation-sensitive single nucleotide primer extension）（Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ）（米国特許第６，２５１，５９４号を参照）、総合重亜硫酸塩制限分析（combined bisulfite restriction analysis）（ＣＯＢＲＡ）（Xiong and Laird,「ＣＯＢＲＡ：高感度かつ定量的なＤＮＡメチル化アッセイ（COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay）」, Nucleic Acids Research, 25(12): 2532-2534 (1997)を参照）、重亜硫酸塩ゲノム配列決定（Frommer et al.,「個々のＤＮＡ鎖における５−メチルシトシン残基の陽性表示をもたらすゲノム配列決定プロトコル（A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methycytosine residues in individual DNA strands）」, PNAS USA, 89: 1827-1831 (1992)を参照）、およびメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書中使用される場合、「検出する」とはさらに、患者における疾患または障害の、早期発見、または予知、または治療反応を示す。本明細書中使用される場合、「検出する」とはさらに、上記に記載されるのと同じ検出判定基準を用いた、個体における疾患再発の検出を示す。本明細書中使用される場合、「検出する」とはさらになお、治療化合物での治療前および／または治療後の疾患または障害の程度の変化を測定することを示す。この場合、治療化合物に応じた結腸直腸癌の程度の変化は、治療化合物の不在下での発現レベルと比較して治療化合物の存在に応じて、ＣｐＧ部位のメチル化レベルが少なくとも１０％増加または減少することを示す。
【００４２】
本明細書中使用される場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを示す。この用語はまた、等価体として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡいずれかの類似体、および記載される実施形態に応用可能であるとして、一本鎖（センス鎖またはアンチセンス鎖）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、核酸として示されてもよい分子の代表例である。
【００４３】
本明細書中使用される場合、単数形または複数形のいずれかで用いられる「癌性細胞」または「癌細胞」という用語は、その細胞を宿主生物に対して病理的にする悪性形質転換を起こしてしまった細胞を示す。悪性形質転換は、単独または複数工程のプロセスであり、細胞の遺伝的構成および／または遺伝子発現プロフィアルにおける変更に一部関与する。悪性形質転換は、自発的に、あるいは薬物もしくは化学処理、照射、他の細胞との融合、ウイルス感染、または特定遺伝子の活性化もしくは不活性化などの、１つの事象または事象の組み合わせを介してのいずれかで、生じ得る。悪性形質転換はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ得り、そして必要であれば実験的に誘導され得る。悪性細胞は、明確な腫瘍塊内で見いだされ得るか、他の身体部位に転移し得る。癌細胞の特徴は、宿主による制御不可能な様式で増殖する傾向であるが、特定の癌細胞に伴う病状は、任意の形態を取り得る。一次癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位付近から得られる細胞）は、十分に確立された病理学的技法、特に組織学的検査により、非癌性細胞と容易に識別され得る。癌細胞の定義は、本明細書中使用される場合、一次癌細胞だけでなく、癌細胞祖先から由来する任意の細胞も含む。これは、転移した癌細胞、ならびに癌細胞由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物および細胞株を含む。
【００４４】
本明細書中使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも５つのヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１５ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約１５〜３０またはそれより多くのヌクレオチドを含む分子を示す。正確な大きさは多くの要因によって決まるが、その要因はオリゴヌクレオチドの最終的な機能または利用によって決まる。オリゴヌクレオチドは、どのような様式で産生されてもよく、化学的合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４５】
本明細書中使用される場合、「単離する」という用語は、材料がその本来の環境（例えば、それが天然に生じる場合は自然環境）から取り出されるプロセスを示す。例えば、生きている動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系に共存する材料の一部またはすべてから分離される、同じポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドが単離される。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部となる可能性があり、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部となる可能性があり、そしてさらにそのベクターまたは組成物が自然環境の一部ではないという点で単離される。例えば、生きている動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドは単離されないが、自然系に共存する材料の一部またはすべてから分離される、同じポリヌクレオチドが単離される。「単離される」の定義から具体的に除外されるのは、天然に生じる染色体（染色体伝播など）、人工染色体ライブラリ、ゲノムライブラリ、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸調製物として、または形質移入／形質転換した宿主細胞調製物としてのいずれかで存在するｃＤＮＡライブラリ（ここで宿主細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ異種調製物であるか、または単独コロニーの異種集団として平板培養するかのいずれかである）である。同じく具体的に除外されるのは、特定のポリヌクレオチドがベクター分子中の核酸挿入物数のうち５％未満を占める、上記のライブラリである。さらに具体的に除外されるのは、全細胞ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ調製物である（機械的に剪断された、または酵素で消化された言及の全細胞調製物を含む）。さらに具体的に除外されるのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製物としての、または電気泳動（そのブロット移動物を含む）により分離された不均一混合物としてのいずれかの上記の全細胞調製物であり、ここで本発明のポリヌクレオチドは、電気泳動媒体中の異種ポリヌクレオチドからさらに分離されてはいない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットの不均一バンド集合から単独のバンドを切除することによりさらに分離する）。
【００４６】
本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、ＣｐＧ島内のＣｐＧ部位でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００４７】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位の該シトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００４８】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、ｄＮＴＰ、標識ｄｄＣＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上のＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程と、を含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００４９】
代替的に、別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）プライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡ配列の該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、該対の第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズし、かつ該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含む、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と相補的であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と相補的である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００５１】
代替的に、別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの上の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位の該シトシン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該上の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は分析されるべき該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するチミン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせる工程と、
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００５２】
別の態様において、本発明は、
（ａ）分析されるべき試料からＤＮＡを得る工程と、
（ｂ）該ＤＮＡを、どの５’−メチル化シトシンも未変化のまま残しながら非メチル化シトシンをウラシルに修飾する薬剤と接触させる工程と、
（ｃ）該ＤＮＡを、鎖特異的プライマーを用いて増幅させる工程と、
（ｄ）該増幅ＤＮＡの下の鎖とハイブリダイズする少なくとも１対のＭＳＰＥプライマー、少なくとも１種の標識逆プライマー、ｄＮＴＰ、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応を行う工程であって、該対の第一のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第一のユニーク配列を含み、かつ該第一のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンと相補的なグアニン残基でハイブリダイズし、該第二のＭＳＰＥプライマーの５’末端は該試料中のどのＤＮＡ配列ともハイブリダイズしない第二のユニーク配列を含み、かつ該対の該第二のＭＳＰＥプライマーの３’末端は該非メチル化ＤＮＡの該下の鎖に特異的なポリヌクレオチド配列を含み、該プライマーの３’最末端は該上の鎖上の該ＣｐＧ部位の該シトシンに由来するアデニン残基でハイブリダイズする、プライマー伸長反応を行う工程と、
（ｅ）（ｄ）からの該プライマー伸長産物を少なくとも１対のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程であって、該対の第一のオリゴヌクレオチドは該第一のユニーク配列と同一であり、かつ該対の第二のオリゴヌクレオチドは該第二のユニーク配列と同一である、ハイブリダイズさせる工程と、および
（ｆ）該ＣｐＧ部位の該シトシン残基での５’−メチル化状況を、該試料中の、該メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度と該非メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーション強度とを比較することにより判定する工程とを含む、対象の特定のＣｐＧ部位（単数または複数）でのＤＮＡメチル化状態または状況を判定する方法を提供する。
【００５３】
任意の核酸試料が、ただしそれがＣｐＧ含有核酸を含む核酸配列を含んでいる、または含んでいると思われる条件で、精製または未精製の形態で、本発明に従って利用され得る。多くの遺伝子において、ＣｐＧ島はプロモーターのちょうど上流から始まって、下流の転写領域内まで延びる。プロモーターでのＣｐＧ島のメチル化は、通常、遺伝子の発現を阻止する。この島はまた、遺伝子の翻訳領域の５'領域ならびに翻訳領域の３'領域も取り囲み得る。したがって、ＣｐＧ島は、プロモーター領域を含む調節領域中のコード配列上流、翻訳領域中（例えば、エキソン）、例えば、エンハンサー領域中およびイントロン中の翻訳領域下流を含む、核酸配列の複数領域で見いだされ得る。一般に、ＣｐＧ含有核酸は、ＤＮＡである。しかしながら、本発明の方法は、例えば、ＤＮＡ、またはＤＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを含む試料を用いてもよく、ここでＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよく、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが試料中に含まれてもよい。核酸の混合物もまた用いられてもよい。検出されるべき特定の核酸配列は、巨大分子のフラクションであってもよく、または特定配列が核酸全体を構成するように最初は別々の分子として存在し得る。研究されるべき配列が最初に純粋な形で存在している必要ない。核酸は、全ヒトＤＮＡに含まれるような、複合混合物の少量フラクションであってもよい。核酸は、天然または非天然に生じるものであってもよい。さらに、それらのメチル化状況は、ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスの、または実験操作（例えば、推定ＤＮＡ損傷剤、または推定メチル化剤への慎重な曝露）の結果であってもよい。好適な実施形態において、試料中の核酸は、ゲノムＤＮＡである。
【００５４】
核酸の単離法は、当該分野で既知であり、そして適した方法が、標準的な分子生物学の教科書に見いだされ得る。
【００５５】
メチル化ＣｐＧを検出するためのＤＮＡを含有する試料は、どのような源から得られてもよい。好ましくは、試料は、細胞株、血液、痰、便、尿、血清、脳脊髄液、パラフィンに包埋した組織、例えば、目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、または肝臓の組織、組織学的切片、およびそれらの全ての可能な組み合わせから得られてもよい。
【００５６】
本発明によれば、非メチル化シトシンをウラシルに変換するのに使用される薬剤は重亜硫酸化合物であることが好ましい。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾するのに使用される薬剤は重亜硫酸ナトリウムである。しかしながら、同様に非メチル化シトシンを修飾するがメチル化シトシンは修飾しない他の薬剤もまた、本発明の方法に使用されてもよい。重亜硫酸塩（ＮａＨＳＯ3）は、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとはあまり反応しない。シトシンは重亜硫酸イオンと反応してスルホン化シトシン反応中間体を形成し、これが脱アミノ化を受けやすくて、スルホン化ウラシルを生じる。スルホン酸基は、アルカリ条件下で除去されて、ウラシルの形成をもたらす。ウラシルは、Ｔａｑポリメラーゼによりチミンとして認識され、したがってＰＣＲにおいて、得られる増幅産物は、出発テンプレートＤＮＡ中５−メチルシトシンが生じた場所でシトシンのみを含む。
【００５７】
本発明の方法の工程（ｃ）において、核酸を増幅させるために当該分野で既知の様々な方法が用いられ得る。本発明で用いられる増幅法として、ＰＣＲおよびＬＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に従って用いられ得る他の増幅法は、等温増幅、プライマー伸長反応、ローリングサークル増幅、および当業者に既知の全ての他の増幅反応である。
【００５８】
ＰＣＲすなわちポリメラーゼ連鎖反応は、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載されるように、クローンまたは精製することなく核酸混合物中の標的核酸配列のセグメント濃度を増加させる方法である。この技術は、低濃度の標的配列という問題への１つのアプローチを提供する。ＰＣＲは、標的の濃度を容易に検出可能であるレベルに直接増加させるのに用いられ得る。この標的配列を増幅させるプロセスは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的であるモル濃度過剰の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に導入することを含む。混合物は変性され、次いでハイブリダイズさせられる。ハイブリダイゼーションに続いて、プライマーは相補鎖を形成するようにポリメラーゼで伸長される。変性、ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ伸長の工程は、相対的に高濃度の、所望の標的配列のセグメントを得るために、必要なだけ繰り返され得る。、所望の標的配列のセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対的位置により判定され、それゆえ、この長さは制御可能なパラメーターである。標的配列の所望のセグメントは混合物中（濃度の点で）優勢な配列になるため、それらは「ＰＣＲ増幅された」と称される。
【００５９】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲ）と呼ばれることもある、Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189 (1991); Barany, PCR Methods and Applic., 1:5 (1991)、 および Wu and Wallace, Genomics 4:560(1989)に記載される）は、知名度の高い、核酸を増幅させる代替法に発展している。ＬＣＲにおいて、４種のオリゴヌクレオチド、標的ＤＮＡの鎖の１本と独自にハイブリダイズする２種の隣接オリゴヌクレオチド、および反対の鎖とハイブリダイズする、隣接オリゴヌクレオチドの相補的セットが混合され、そしてＤＮＡリガーゼが混合物に添加される。接合部で完全な相補性があるものとして、リガーゼはハイブリダイズした分子の各セットと共有結合する。重要なことに、ＬＣＲにおいて、２本のプローブは、それらが標的試料中の配列とギャップまたはミスマッチなしに塩基対形成する場合にのみ、一緒にライゲーションされる。変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションのサイクルの繰り返しは、ＤＮＡの短いセグメントを増幅させる。ＬＣＲはまた、一塩基変化の検出強化を達成するために、ＰＣＲと組み合わせて用いられてきた。Segev, ＰＣＴ出願番号第ＷＯ  ９００１０６９Ａ１（１９９０）。しかしながら、このアッセイで用いられる４種のオリゴヌクレオチドは対を形成して２種の短い結合可能なフラグメントを形成し得るため、標的から独立したバックグラウンドシグナルの発生の可能性がある。突然変異スクリーニングのためのＬＣＲの使用は、特定核酸位置の検査に限定される。
【００６０】
１つの好適な実施形態において、ＰＣＲは、化学処理された核酸を増幅させるのに用いられる。ＰＣＲ増幅は、標準プロトコルに従って行われ得る。例えば、約１μｌ〜２μｌの化学処理されたＤＮＡが、目的の領域での鎖特異的ＰＣＲ増幅用テンプレートとして用いられる。５’ＣｐＧ島の一部を増幅させるためのＰＣＲ反応プロファイルにおいて、例えば、９４℃〜９５℃で３〜１０分間の初期変性、続いて９４℃〜９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを合計３０〜４０サイクルという手順。ＰＣＲ反応は、１０μｌ〜５０μｌの体積で、以下の条件下で行われる：約５０ｎｇの重亜硫酸塩変換ＤＮＡ（微量解剖試料に対して少量）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、各２００μＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの最終濃度の各プライマー、および１単位のＴａｑポリメラーゼ。
【００６１】
１つの実施形態において、ＰＣＲ増幅は少なくとも１対のＰＣＲプライマーで行われる。本発明で用いられるＰＣＲプライマーは、メチル化および非メチル化ＤＮＡテンプレートの両方を認識するべきである。言い換えると、ＰＣＲプライマーは、可能ならばメチル化ＣｐＧ部位を含有しない領域とアニーリングするように設計されるべきである。しかしながら、２つのＰＣＲプライマーはＣｐＧ部位の橋渡しをするものとする。本発明によれば、増幅の効率の最大化のため、ＰＣＲプライマーは好ましくは一本鎖である。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、テンプレート核酸配列とハイブリダイズし、かつ相補的核酸鎖の酵素的合成をプライムする一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子である。さらに、ＰＣＲプライマーは、核酸分子のプールに存在する標的分子の一部と相補的である。
【００６２】
本発明のＰＣＲプライマーは十分な長さを有するものとする。１つの実施形態において、ＰＣＲプライマーは、厳密な条件下、少なくとも約７、好ましくは約１２、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、またはそれより多くのヌクレオチドと、理想的には約１７〜４０ヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいてもよい。本明細書中使用される場合、「厳密な条件下、ハイブリダイズする」という用語は、少なくとも７５％、８０％、８５％、好ましくは９０％互いに同一であるヌクレオチド配列が一般的に互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することを意図する。そのような厳密な条件は、当業者に既知であり、そして「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)の第６．３．１章〜第６．３．６章に見いだされ得る。別の実施形態において、ＰＣＲプライマーは、中度に厳密な条件下、少なくとも約７、好ましくは約１２、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、またはそれより多くのヌクレオチドとハイブリダイズする配列を含んでいてもよい。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査するための適した中度に厳密な条件として、以下が挙げられる：５×ＳＳＣ溶液、０．５％のＳＤＳ、および１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）での予備洗浄、５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションを一晩、続いて、６５℃で２０分間、それぞれ０．１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ含有０．５×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ含有０．２×ＳＳＣでの洗浄を２回。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を変更することなどによりハイブリダイゼーションの厳密性が容易に操作され得ることを理解するだろう。
【００６３】
プライマー長とプライマーが標的配列とアニーリングする効率および精度の両方との間に正相関が存在する。詳細には、より長い配列はより短いものが有するよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有し、そして所定の標的配列内でより繰り返されにくく、それにより無差別ハイブリダイゼーションを最小化する。Ｇ−Ｃ含量の高い、またはパリンドローム配列を含むプライマー配列は、それらが標的部位に行おうとするように、自己ハイブリダイズする傾向がある。なぜなら単分子ハイブリダイゼーション動力学は二分子よりも一般に溶液で好ましいからである。しかしながら、十分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対形成（parings）を含むプライマーを設計することもまた重要である。なぜなら、各Ｇ−Ｃ対は、Ａ−Ｔ塩基対で見られる２本の水素結合ではなく、３本の水素結合で結合されるからである。
【００６４】
本発明のＰＣＲプライマーはまた、融解温度の推定法により特定の融解温度（Ｔｍ）を有するように設計される。Ｏｌｉｇｏ（商標）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎを含む市販のプログラム、ならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含むインターネットで入手可能なプログラムが、プライマーのＴｍを計算するのに使用され得る。好ましくは、ＰＣＲプライマーのＴｍは好ましくは約４５℃〜７０℃の間であり、そしてより好ましくは約５５℃〜６５℃の間である。好ましくは、プライマーのＴｍは対応するＰＣＲプライマーのＴｍよりも約３℃〜５℃高い。
【００６５】
本発明のＰＣＲプライマーは、化学的または酵素的のいずれかの合成法により調製されることが考えられる。あるいは、そのような分子またはそのフラグメントは天然に生じ、そしてそれらの天然源から単離されるか、または供給業者から購入される。
【００６６】
さらに別の実施形態において、本発明は、１つの容器に、１つの核酸分子内の定義されたＣｐＧ領域をそれぞれがアニーリングする複数対のプライマーを提供する。複数対のプライマーは、１つの容器中、異なるＣｐＧ部位の同時増幅を可能にし、そして複数の増幅核酸フラグメントを産生する。次いで、複数の増幅核酸フラグメントは高度高処理様式で検出および定量され得る。
【００６７】
増幅核酸は、好ましくは、メチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）反応により、メチル化または非メチル化のいずれかとして同定される。プライマー伸長反応は、当該分野で既知の標準技法を用いて、ただしＭＳＰＥプライマーで行われる。例えば、１つの実施形態において、ＭＳＰＥ反応は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の３０〜４０サイクルで行われる。増幅核酸でＭＳＰＥ反応が行われる工程において、ＭＳＰＥプライマーのセットは、異なる容器で別々に、または１つの容器で同時にのいずれかで用いられる。一般に、プライマー伸長反応で用いられるＭＳＰＥプライマーは、分析されるべきＣｐＧジヌクレオチドを最初から含む配列とハイブリダイズするように設計される。最適な伸長反応のためのＭＳＰＥプライマーの選択および設計は、当業者に既知である。好ましくは、ＭＳＰＥプライマーは、厳密な条件下、少なくとも約７、好ましくは約１２、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、またはそれより多くの連続核酸配列とハイブリダイズする配列を含む。
【００６８】
本発明は、１つより多いクラスのＭＳＰＥプライマーを包含するはずであると考えられる。１つの定義されたＣｐＧ部位を分析するため、好ましくは、少なくとも２つのクラスのＭＳＰＥプライマーが伸長反応に関与する。例えば、ＭＳＰＥプライマーの一方のクラスはメチル化特異的でありメチル化ＣｐＧ部位（単数または複数）とアニーリングし、そしてＭＳＰＥプライマーの他方のクラスは、非メチル化特異的であり増幅核酸の非メチル化ＣｐＧ部位（単数または複数）とアニーリングする。ＭＳＰＥプライマーの各クラスは２つの部分を含む。各クラスのＭＳＰＥプライマーは２つの部分からなる。５’末端部分は増幅された核酸のいずれもアニーリングしないユニーク／アダプター配列とアニーリングし、そして３’末端部分は増幅された核酸の分析されるべきＣｐＧ部位（単数または複数）とアニーリングする。１つの実施形態において、ＭＳＰＥプライマーの３’最末端は分析されるべきＣｐＧ部位（単数または複数）でアニーリングする。「３’最末端」という用語は、本明細書中使用される場合、ＭＳＰＥプライマーの３’末端の最後の数ヌクレオチド、好ましくは最後の４ヌクレオチド、より好ましくは最後の２ヌクレオチド、そして最も好ましくは最後のヌクレオチドを示し、ＭＳＰＥプライマーの最後のヌクレオチドは分析されるべきＣｐＧ部位（単数または複数）のシトシンの位置でアニーリングする。例えば、メチル化特異的ＭＳＰＥプライマーにおいて、最後のヌクレオチドは、上の鎖上のＣｐＧ部位のシトシンで、または下の鎖上のグアニンでアニーリングし、一方、非メチル化特異的ＭＳＰＥプライマーにおいて、最後のヌクレオチドは、上の鎖上のＴｐＧのチミンで、または下の鎖上のアデニンでアニーリングする。なぜなら、ＣｐＧ部位の非メチル化シトシンはウラシルに変換されてしまってチミンとして増幅されているからである。
【００６９】
ユニーク／アダプター（当該分野で「ジップコード」と呼ばれることもある）配列は、一般に標的配列にとって外来性の、例えば人工の、検出デバイスの捕獲プローブと実質的に相補的（そして好ましくは完全に相補的）であるように設計された配列である。詳細には、捕獲プローブは、マイクロスフェアあるいはプラスチックスライドまたはスライドガラスなどの平面基材を含み得る固体支持体に固定される。アダプター配列の長さは、結合の所望の「強度」および所望の異なるアダプター数に応じて変化するだろう。１つの好適な実施形態において、アダプター配列は、約６〜約５００ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約８〜約１００ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜約２５ヌクレオチドの長さの範囲である。一般に、各アダプター配列は増幅核酸フラグメントを独自に同定する。アダプター配列の検出は、アダプター配列に相補的である捕獲プローブでのハイブリダイゼーションに続いて達成される。
【００７０】
１つの実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用いて、および標識ｄＮＴＰ（ここで、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰが標識されている）を用いて行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの下の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用いて、および標識ｄＮＴＰ（ここで、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＧＴＰが標識されている）を用いて行われる。
【００７１】
別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用いて、および標識ｄｄＣＴＰを用いて行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用いて、ならびに標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物、および未標識ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物を用いて行われる。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの下の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマーを用いて、ならびに混合した標識および未標識のｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを用いて行われる。
【００７２】
あるいは、別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの上の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマー、標識逆プライマー、および未標識ｄＮＴＰを用いて行われる。逆プライマーは、本明細書中使用される場合、ＭＳＰＥプライマーによる伸長鎖と相補的であるプライマーを示す。標識逆プライマーは、テンプレートとしてＭＳＰＥ伸長鎖を用いてＭＳＰＥプライマーの反対方向に伸びていき、ＭＳＰＥプライマーの５’末端で止まるだろう。別の実施形態において、プライマー伸長反応は、増幅ＤＮＡの下の鎖とアニーリングするＭＳＰＥプライマー、標識逆プライマー、および未標識ｄＮＴＰを用いて行われる。
【００７３】
伸長産物に組み込まれるｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、検出可能な標識で標識され得る。検出可能な標識は、放射標識、蛍光標識、発光標識、その後検出され得るヌクレオチドに結合した抗体、その後検出され得るヌクレオチドに結合したハプテン、あるいは直接もしくは間接のいずれかで検出され得る任意のほかのヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含み得る。１つの実施形態において、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、放射性同位体で標識される。放射標識伸長産物は、放射能の存在により検出され得る。例えば、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、32Ｐで標識され得り、そしてその伸長産物は変性ポリアクリルアミドゲルおよびホスフォイメージャー（phosphorimage）分析で分析され得る。別の実施形態において、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、蛍光剤で標識される。１つの好適な実施形態において、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、シアニン３、シアニン５、フィコエリトリン、アレクサ（Alexa）５３２、フルオレセイン、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルソーダミン（thodamine）、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニンなどで標識される。１つのより好適な実施形態において、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、または逆プライマーは、ビオチンで標識される。ビオチンが標識に用いられる場合、伸長産物は、捕獲プローブの結合したマイクロスフェアにより捕獲されて蛍光法で定量され得る。
【００７４】
好適な実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォアなどの、直接検出され得る一次標識である。別の好適な実施形態において、検出可能な標識は、間接的に検出され得る二次標識である。そのような標識として、ビオチン／ストレプトアビジンなどの結合対のうちの１つ、化学修飾可能な部分、ヌクレアーゼインヒビター、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ（lucifierases）などの酵素などが挙げられるが、これらに限定されない。適した結合対として、抗原と抗体、タンパク質と小分子、酵素と基質またはインヒビター、受容体とリガンド、炭水化物とその結合相手、および核酸と核酸結合タンパク質、などが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、核酸に組み込むために、対の小さい方がＮＴＰまたはｄＮＴＰに結合される。好ましくは、結合対としてビオチン（またはイミノビオチン）とストレプトアビジン、ジゴキシゲニン（digeoxinin）と抗体、およびＰｒｏｌｉｎｘ＿試薬が挙げられる。より好ましくは、結合対は、ビオチンまたはイミノビオチンとストレプトアビジンを含む。
【００７５】
ＭＳＰＥ伸長産物は、試料中のシトシンメチル化の相対的定量のため、さらに分析される。定量は、最初に、ＭＳＰＥ伸長産物を、ＭＳＰＥ伸長産物上のアダプター配列と相補的である捕獲プローブとハイブリダイズさせることを含む。様々なハイブリダイゼーション手順が当該分野で既知であり、そして本発明はどの特定のハイブリダイゼーション手順にも限定されない。概して、ハイブリダイゼーションは通常、高イオン強度（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）の溶液中、Ｔｍより低い２０℃〜２５℃の温度で行われる。厳密なハイブリダイゼーション条件の具体例として、４２℃で５×ＳＳＰＥ、５０％のホルムアミド、または６８℃で５×ＳＳＰＥが挙げられる。厳密な洗浄条件は、しばしば予備実験で実験的に判定されるが、通常、塩と、Ｔｍより低い約１２℃〜２５℃の温度との組み合わせを含む。高度に厳密な洗浄条件の１つの例は、６０℃で１×ＳＳＣである。非常に高度に厳密な洗浄条件の例は、４２℃で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳである。Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984)。極度に厳密な洗浄条件の例は、５０℃〜６５℃で０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳである。１つの好適な実施形態において、高度に厳密な洗浄は、１×ＳＳＣおよび６０℃の条件下で行われる。別の好適な実施形態、ハイブリダイゼーションは、１３．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（ナトリウム塩）、１２．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（遊離酸）、１０ｇ／Ｌのラウリル硫酸リチウム、２１．２ｇ／ＬのＬｉＣＩ、１０．０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１．５ｇ／Ｌのカゼイン、１０．０ｇ／ＬのＢＲＩＪ−３５、２．０ｇ／ＬのＭｇＣｌ2、０．００１３６ｇ／ＬのＺｎＣｌ2、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００で作られた０．５×ハイブリダイゼーション緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、４０℃で行われる。次いで、洗浄用緩衝液（０．４×ＳＳＣ、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００、ｐＨ７．７）が、室温で、反応系に数回かけられる。当該分野で十分理解されるとおり、様々な要因の組み合わせが、実質的に等価な厳密性の条件をもたらし得る。そのような等価な条件は、本発明発見の範囲内である。
【００７６】
１つの実施形態において、捕獲プローブは、厳密な条件、より一般的には高度に厳密な条件、または非常に厳密な条件、あるいは極度に厳密な条件下、標識ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。捕獲プローブは、約５〜約１００、好ましくは約６〜約７５、または約８〜約６５、または約１０〜約５０、または約１５〜約４０、または約１６〜約３５、または約１８〜約３０のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを含む。捕獲プローブは、米国特許第４，９７３，６７９号（これはその全体が参照として援用される）に記載されるものなどのポリヌクレオチド合成について当該分野で既知の技法により容易に合成され得る。あるいは、捕獲プローブは、多数の販売元に注文可能である。
【００７７】
別の実施形態において、捕獲プローブは、以下に限定されないが、マイクロビーズ、クロマトグラフィービーズ、アフィニティービーズ、遺伝子チップ、プレーナー型導波路、膜、マイクロリットルプレート（microliter plate）、ガラスプレート、プラスチックプレートなどの固体支持体に結合され得る。１つのより好適な実施形態において、捕獲プローブは、マイクロビーズ、好ましくはルミネックス（Luminex）マイクロビーズに結合される。１つの実施形態において、捕獲プローブは、既知のカルボジイミドカップリング手順により単独のマイクロビーズ（a single the microbeads）に結合される。ルミネックスマイクロビーズは、米国特許第６，２６８，２２２号（これは本明細書中に参照として援用される）に広く記載されている。マイクロビーズまたはマイクロスフェアは、小さな個別の粒子である。ビーズの組成は、捕獲プローブのクラスおよび合成法に応じて変化する。適したビーズ組成物として、ペプチド、核酸、および有機部分合成に用いられるものが挙げられ、プラスチック、セラミックス、ガラス、ポリスチレン（polysteyrene）、５メチルスチレン、アクリル性重合体、常磁性材料、ソリアルゾル（thorial sol）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたは架橋デキストラン（セファロースなど）、セルロース、ナイロン、架橋ミセル、およびテフロンが挙げられるが、これらに限定されない。マイクロビーズは、１種または複数の蛍光色素で染色された重合性ナノ粒子を組み込んでいる。所定の集団中のナノ粒子は全て、同濃度の色素で、そしてこれらのナノ粒子をマイクロビーズに既知の量で組み込むことにより染色される。異なる集団のナノ粒子の量および比を変更することにより、独自の発光スペクトルを持つマイクロビーズ（マイクロスフェア）の大量の別個の集団を確立および識別することが可能である。使用される蛍光色素は、５５０ｎｍ〜９００ｎｍの間の発光波長を持つ、シアニン色素として既知の一般的なクラスのものである。これらの色素は、メチン基を含むことがある。メチン基の数は色素のスペクトル特性に影響を及ぼす。ピリジンであるモノメチン色素は、一般的に青〜青緑の蛍光発光を有するが、一方、キノリンは緑〜黄緑の蛍光発光を有する。トリメチン色素類似体は、赤色波長に実質的に移動しており、そしてペンタメチン色素はそれよりさらに移動して、しばしば赤外蛍光発光を呈する。しかしながら、ビーズの組成物と適合性である任意の色素が使用され得る。
【００７８】
多数の異なるマイクロビーズが本明細書中記載される方法を実施するのに用いられる場合、色素は同一のまたは重なり合う励起スペクトルを有することが好ましいが必ずしもそのように要求されない、しかし識別可能な発光スペクトルを保持する。複数クラスまたは集団の粒子がたった２種の色素から生成され得る。赤／オレンジ色素を持つナノ粒子集団の比は、得られる比が先の比と光学的に重なり合わないように、適切な割合の増加分により変更される。この方法で、多数の異なる蛍光マイクロビーズのクラスが生成される。
【００７９】
核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルを検出および定量するために、様々な方法が用いられ得る。本発明で用いられる検出系として、固相検出器、光電子倍増管、写真フィルム、または目が挙げられるが、これらに限定されず、これらのいずれも、検出系を完成させるために、分光計、照度計顕微鏡、プレートリーダー、蛍光スキャナ、フローサイトメーター、またはそれらの任意の組み合わせなどのさらなる機器の使用と組み合わせて用いられてもよい。
【００８０】
１つの実施形態において、マイクロビーズは、フローサイトメーター、例えば、蛍光活性化細胞選別機を用いて同定され、ここで混合物中の異なるクラスのビーズは各クラスのビーズの蛍光色素同一性、大きさ、および／または形に基づいて互いに物理的に分離され得り、そして標的ポリヌクレオチドの存在は、特定クラスのビーズを含有する選別されたそれぞれのプールについての検出可能な標識の存在に基づいて、定性的または定量的に判定され得る。捕獲プローブとハイブリダイズしたポリヌクレオチドに含まれる粒子と標識の両方を検出することができる任意のフローサイトメーターが用いられ得る。複数の励起レーザーおよび検出器を備えたフローサイトメーターが好ましい。１つの実施形態においてルミネックス１００フローサイトメーターが用いられる。当該分野で既知であるとおり、最適な検出に必要な正確な設定は、用いるフローサイトメーター、用いるポリヌクレオチド標識、および用いる粒子などの要因で変化するだろう。本明細書中開示される方法を実施するためにフローサイトメーターを用いるための設定および条件の最適化は必要以上の実験をすることなしに当業者により達成され得る。フローサイトメーターを用いる上での一般的な手引きは、 Shapiro,「 実践フローサイトメトリー（Practical Flow Cytometry）」、第三版, Wiley-Liss, 1995 および Jaroszeski et al., 「フローサイトメトリープロトコル（ Flow Cytometry Protocols）」, Humana Press, 1998などの教科書に見いだされ得る。蛍光マイクロビーズおよびフローサイトメトリーの使用例は、Smith et al., Clin. Chem., 44:2054-2056 (1998)に見いだされ得る。フローサイトメトリーの使用は、特に、複数の標的ポリヌクレオチドの存在を判定するために１つより多いクラスの粒子および複数の捕獲プローブが同時に用いられる状況（多重分析）において有用である。
【００８１】
１つの実施形態において、核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルの検出および定量は、蛍光色素などの色素と複合したマイクロビーズの使用を含む。例えば、核酸分子上の１箇所の定義されたＣｐＧ部位について、ＭＳＰＥ産物はメチル化起原および非メチル化起原両方の核酸を含む。それゆえ、１つのＣｐＧ部位の相対的メチル化レベルの検出において、所定の蛍光サインは、特定の捕獲プローブに結合したマイクロビーズと複合しており、ここで捕獲プローブは特定のアダプター配列と相補的であり、言及のアダプター配列は核酸分子上の特定のＣｐＧ部位のメチル化状態に対応し、一方、別の所定の蛍光サインは別の特定の捕獲プローブに結合した別のマイクロビーズと複合しており、ここで言及の捕獲プローブは別の特定のアダプター配列と相補的であり、言及のアダプター配列は同じ核酸分子上の同じＣｐＧ部位のメチル化状態に対応している。相対的メチル化レベルの検出は、最初にマイクロビーズ上の蛍光サインを同定すること、次いで標識ＭＳＰＥ伸長産物上の蛍光シグナルの強度を判定および定量することを含む。言及のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルは、メチル化ＭＳＰＥ伸長産物の蛍光シグナルを非メチル化ＭＳＰＥ伸長産物の蛍光シグナルと比較することにより計算される。上記で記載したように、ＭＳＰＥ伸長産物は一次標識または二次標識のいずれかで標識される。
【００８２】
あるいは、核酸分子上の、または異なる核酸分子上であってさえも、複数ＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルは、複合マイクロビーズを用いて、同様の検出工程に従うことにより同時に判定され得る。例えば、識別可能なアダプター配列それぞれが、１つのＣｐＧ部位を含有する核酸分子のメチル化状態または非メチル化状態のいずれかと結合する。さらに、識別可能なアダプター配列それぞれが、各定義されたＣｐＧ部位に対応するように設計される。最終的に、識別可能なマイクロビーズは、各識別可能なアダプター配列に特異的な色素と複合する。同様に、検出工程は、最初にマイクロビーズ上の識別可能な蛍光サインを同定すること、次いで標識ＭＳＰＥ伸長産物上の蛍光シグナルの強度を判定および定量することを含む。上記で記載したように、ＭＳＰＥ伸長産物は一次標識または二次標識のいずれかで標識される。
【００８３】
別の実施形態において、核酸分子上の複数ＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルの検出および定量はまた、高処理様式で、例えばマイクロアレイで行われ得る。マイクロアレイに基づく相対的メチル化レベルの分析は、１回に１つまたはいくつかのＣｐＧ部位ではなく、多数のＣｐＧ部位を同時に処理することを可能にする。ＤＮＡマイクロアレイは、標準的な顕微鏡スライドフォーマットに、１ｃｍ2などの小スペース中、通常は直角配置で配列された、既知の配列のＤＮＡ分子の順序づけられたセットで構成される。例えば、２００×２００のアレイは、各点が既知の配列のプローブに対応する４０，０００点を含む。そのようなマイクロアレイは、様々な条件下、所定の細胞型の４０，０００個の核酸の発現を同時にモニタリングするのに使用される可能性がある。プローブは通常、ｃＤＮＡ、ＥＳＴまたはオリゴヌクレオチドの形態をとる。３０〜２００塩基対の長さの範囲のＥＳＴおよびオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション用の理想的な基質を提供するので、最も好ましい。チップとしても既知の、これらのマイクロアレイを構築する２つのアプローチが存在し、一方はあらかじめ合成したプローブの共有結合付加を含み、他方はチップ上に直接プローブを構築または合成することを含む。試料または検査材料は、通常、ＰＣＲにより増幅されている核酸から成る。ＰＣＲは、出発物質を増幅すること、ならびに蛍光タグを導入させることの二重の目的を果たす。マイクロアレイ技法の詳細な記載については、例えば、Graves, Trends Biotechnol. 17: 127-134 (1999)を参照。
【００８４】
メチル化はまた、高密度マイクロアレイにより検出され得る。高密度マイクロアレイは、その多くが市販されている高精度機械を用いて、極めて少量のＤＮＡ溶液をアレイ上の正確な場所に堆積させることにより構築される。Packard Instrumentsにより開発された代替アプローチは、インクジェットプリンターが紙に点を堆積させるのとほとんど同じ方法で、ＤＮＡの堆積を可能にする。高密度ＤＮＡマイクロアレイは、Affymetrix, Incyte, Mergen, Genemed Molecular Biochemicals, Sequenom, Genomic Solutions, Clontech, Research Genetics, Operon および Stratageneなどの多数の供給元から市販されている。最近では、ＤＮＡマイクロアレイ分析のための標識に蛍光が関与しており、これは同時に複数の独立したシグナルが読まれることを可能にする。これにより、異なる蛍光色素で標識された２つの試料を持つ同一チップの同時ハイブリダイゼーションが可能となる。各点での蛍光比の計算は、２種の異なる条件下での、各遺伝子の発現、またはその中の相対的メチル化レベルの相対的変化の判定を可能にする。例えば、このアプローチを用いた、正常組織と対応する腫瘍組織との比較は、発現が著しく変わった遺伝子の同定を助ける。したがって、この方法は、２種またはそれより多くの条件下、同一細胞の遺伝子発現プロファイルが比較されるべきである場合に特に強力な道具を提供する。様々な波長で蛍光をモニタリングする性能を持つ高分解能スキャナは市販されている。
【００８５】
それぞれが１つの標的ＣｐＧ部位に特異的である、多数のクラスのアダプター配列が同時に使用可能であるため、１つの実験で数百のまたは数千のＣｐＧ部位の相対的メチル化レベルを定性的または定量的に検出することが可能である。例えば、異なるアダプター配列に相補的な異なる捕獲プローブは、固体支持体に固定されて、異なるアダプター配列がアレイ上の異なる位置に配置されているようにして、アレイを形成する。検出目的のため、異なるＣｐＧ部位に由来するＭＳＰＥ伸長産物の混合物がアレイに塗布され、各特定ＣｐＧ部位はアレイ上の特定位置で特定捕獲プローブに結合する。特定位置での標識ＭＳＰＥ産物のシグナル強度は、当該分野で既知の方法で判定され得り、そしてこれらＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルは、１つの特定ＣｐＧ部位のメチル化状態および非メチル化状態に対応する２か所の位置でのシグナル強度を比較することにより計算され得る。上記で記載したように、ＭＳＰＥ伸長産物は一次標識または二次標識のいずれかで標識される。
【００８６】
本発明の別の態様はまた、核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルの検出用キットを提供する。キットは、（１）非メチル化シトシンヌクレオチドを修飾する薬剤、（２）核酸分子の増幅用プライマー、（３）メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー（標識または未標識のいずれか）、（４）非メチル化ＣｐＧ含有核酸用ＭＳＰＥプライマー（標識または未標識のいずれか）、（５）標識ｄＮＴＰおよび未標識ｄＮＴＰ、（６）標識ｄｄＮＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ、ならびに（７）標識または未標識逆プライマーを含み得る。キットはさらに、核酸増幅緩衝液およびＭＳＰＥ反応用試薬を含み得る。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する薬剤は重亜硫酸化合物である。
【００８７】
本発明の別の態様はまた、核酸分子上の１つまたは複数のＣｐＧ部位での相対的メチル化レベルを判定すること、および被検体の相対的メチル化レベルを、疾患または障害の素因を有さない対照被検体（または標準）からの言及の核酸分子の相対的メチル化レベルと比較することを含み、相対的メチル化レベルにおける有意差が、被検体における疾患または障害の素因を示す、被検体において、疾患または障害の素因を判定するための、あるいは疾患または障害を診断および／または予知するための、あるいは薬物または化合物の治療的応答をモニタリングするための方法を提供する。
【実施例１】
【００８８】
ｐ１６遺伝子のプロモーター配列をモデル系として用いた。その配列は以下に記載される：
５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣ３’（配列番号３）
【００８９】
細胞株、ＨＴ２９およびＬＮＣａＰからのゲノムＤＮＡは、既に実験的に確認されたとおり、メチル化陽性対照および陰性対照として用いた。
【００９０】
Frommer法に従って、ゲノムＤＮＡを最初に修飾した（Frommer, M., L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, G. W. Grigg, P. L. Molloy, and C. L. Paul, 「個々のＤＮＡ鎖における５−メチルシトシン残基の陽性表示をもたらすゲノム配列決定プロトコル（A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands）」, Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 89:1827-1831 (1992))。簡単に述べると、細胞株ＨＴ２９およびＬＮＣａＰのそれぞれから得られた１μｇのゲノムＤＮＡを蒸留Ｈ2Ｏで５０μｌに希釈し、５．５μｌの２ＭＮａＯＨを加え、そして３７℃で１０分間インキュベートした（一本鎖ＤＮＡを作成するため）。３０μｌの新たに調製した１０ｍＭのヒドロキノン（Sigma）を各管に加えた。次いで、５２０μｌの新たに調製したｐＨ５．０の３Ｍ重亜硫酸ナトリウム（Sigma Ｓ−８８９０）を加えた。試薬を完全に混合し、次いで鉱物油で覆って５０℃で１６時間インキュベートした（より長いほどメチル化ＣがＴに変換し始める）。鉱物油を除去した後、１ｍｌのＷｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ樹脂 (PromegaＡ７２８０）を各管に加えてから、ＤＮＡ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎｕｐキットのミニプレップカラムに混合物をかけた。カラムを２ｍｌの８０％イソプロパノールで洗い、そして５０μｌの熱水（６０℃〜７０℃）で溶出させた。５．５μｌの３ＭＮａＯＨを各管に加えて、室温で５分間インキュベートした。次いで、キャリアとして１μｌのグリコーゲン、３３μｌの１０ＭＮＨ4Ａｃ、そしてＤＮＡ沈澱用の３倍体積のエタノールを加えた。ぺレットを遠沈させて７０％エタノールで洗い、乾燥させ、そして２０μｌの水に再懸濁させた。各ＰＣＲ反応に１μｌのＤＮＡを用いた。
【００９１】
重亜硫酸塩修飾後、配列は、以下：
５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＹＧＧＡＴＹＧＹＧＴＧＹＧＴＴＹＧＧＹＧＧＴＴＧＹＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＹＧＧＧＹＧＧＹＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＹＧＧＹＧＧＹＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＹＧＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＹＧＧＴＹＧＹＧＧＴＴＹＧＧＧＧＴＹＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＹＧＧＧＹＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＹＧＧＧＧＧＹＧＴＴＧＴＴＴＡＡＹＧＴＡＴＹＧＡＡＴＡＧＴＴＡＹＧＧＴＹＧＧＡＧＧＴＹＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＹＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＧＹＧＧＧＹＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＹＧＡＡＧＴＴＴＧＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＧＴＡＧＹＧＴ３’（配列番号４）
に変化した（非メチル化シトシンはウラシルに変換されてしまってチミンとして認識され、メチル化シトシンはシトシンとして無処置のままであるので、ＹはＣ／Ｔを表す）。
【００９２】
標準プロトコルを用いてＰＣＲ反応を行った。１μｌの化学処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅テンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応において、９５℃で１０分間の初期変性、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを合計４０サイクルという手順を用いた。約２０ｎｇの重亜硫酸塩変換ＤＮＡ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの最終濃度の各プライマー、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ５０μｌの体積中、ＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ｐｌ６ＨｍｏｄｌＦ  ５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧ３’（配列番号５）／ｐｌ６ＨｍｏｄｌＲ  ５’ＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＣＣ３’（配列番号６）であった。単位複製配列をＡｇｒｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で定量した。
【００９３】
様々な比での２種の単位複製配列の一連の混合物（表１）を、ビオチン化ｄＧＴＰの組み込みを用いて、ツープレックス（two-plex）ＭＳＰＥ反応でのテンプレートとして用いた。反応を９５℃で１０分間の初期変性で開始し、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを合計３０サイクル続けた。２５μｌの反応系は、以下、様々な比であらかじめ混合した単位複製配列２．５μｌ（表１に記載される）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、８μＭの各未標識ｄＮＴＰ、４μＭのビオチン化ｄＧＴＰ、１００ｎＭの最終濃度の各ＭＳＰＥプライマー、および２５ｎＭの各逆プライマー、および０．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを含んだ。プライマーは、以下：
１５１８３  ＣＥ−メチル＿１３６Ｕ２２    ５’  ＧＡＦ  ＧＣＴ  ＪＴＪ  ＡＣＣ  ＴＦＡ  ＪＡＧ  ＣＪＴ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  Ｃ  ３’  （配列番号７）（式中、最初の２４ヌクレオチドはジップコード配列である）、
１５１８４  メチル＿２５２Ｌ２３    ５’  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡ  ３’  （配列番号８）
１５１８５  ＣＥ−非メチル＿１３４Ｕ２４    ５'  ＪＣＧ  ＪＣＡ  ＴＦＡ  ＧＣＦ  ＴＣＴ  ＪＧＡ  ＧＦＡ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  Ｔ  ３’  （配列番号９）（式中、最初の２２ヌクレオチドはジップコード配列である）、
１５１８６  非メチル＿２５２Ｌ２４    ５’  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ３’  （配列番号１０）
（Ｊ＝イソＧ、Ｆ＝イソＣ、２つのＡＥＧＩＳ（商標）塩基（イソＣおよびイソＧ）、独自の非標準塩基対、開発元EraGen Biosciences、Bayer Corporationにより許可。「Ｊ」および「Ｆ」の両方を、ＷＩＰＯ標準に準拠して記載される配列上の「ｎ」として表す。記号「Ｊ」および「Ｆ」の使用は配列番号１０および配列番号１１にも適用される。）であった。
【００９４】
【表１】
2005204652.tif 000002
【００９５】
反応後、ＭＳＰＥ産物を、アミン誘導化オリゴ（それぞれ、１５１８９  ＣＰ３２−３ａ  ５’  ＣＧＡ  ＡＦＧ  ＣＴＦ  ＴＪＡ  ＧＧＴ  ＦＡＦ  ＡＧＣ  ＪＴＣ  Ｓｐ−ＬＣＡ  ３’  （配列番号１１）／１５１９０  ＣＰ３３−３ａ  ５’  ＧＴＪ  ＣＴＣ  ＦＡＧ  ＡＪＧ  ＣＴＪ  ＡＴＧ  ＦＣＧ  Ｆ−Ｓｐ−ＬＣＡ  ３’  （配列番号１２））と複合させてあるルミネックス（登録商標）ビーズを含むビーズプールに移した。標準プロトコルを用いて、複合を行い、そしてビーズを１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）中５，０００μｌに再懸濁させた。同時に四重（Quadruplicate）ハイブリダイゼーションを行った。基本的には、４μｌのＭＳＰＥ産物を、０．５×ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにルミネックス（登録商標）ビーズ８およびルミネックス（登録商標）ビーズ９（各２，０００個のビーズ）を含む５０μｌハイブリダイゼーション反応系中に移した。緩衝液は、１３．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（ナトリウム塩）、１２．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（遊離酸）、１０ｇ／Ｌのラウリル硫酸リチウム、２１．２ｇ／ＬのＬｉＣＩ、１０．０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１．５ｇ／Ｌのカゼイン、１０．０ｇ／ＬのＢＲＩＪ−３５、２．０ｇ／ＬのＭｇＣｌ2、０．００１３６ｇ／ＬのＺｎＣｌ2、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００、ｐＨ７．５で作られた。反応系を、９６℃で２分間、４０℃で３０分間インキュベートした。ビーズを、それぞれ１００μｌおよび２００μｌの洗浄緩衝液（０．４×ＳＳＣ、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００、ｐＨ７．７）で１回ずつ洗った。５０μｌの１：５００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ、１ｍｇ／ｍｌ）を各反応系に加え、室温で１５分間（遮光して）穏やかに混合し、そして１００μｌの洗浄緩衝液で再度洗った。ビーズを、８０μｌのＴＴＬ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、４００ｍＭのＬｉＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁させ、そしてルミネックス（登録商標）１００（商標）機器で測定を行った。
【００９６】
【表２】
2005204652.tif 000003
【００９７】
結果は、限られた量のテンプレートでメチル化および非メチル化シグナルの両方について優れた読み出しを示した（ｎｇレベル、表２を参照）。メチル化および非メチル化シグナルのバックグラウンドは、それぞれ最小の、１．０３ＭＦＵおよび１８．０３ＭＦＵであった。シグナル対ノイズ比は、＞２２倍であった（４０１．４８／１８．０３、表２を参照）。メチル化および非メチル化シグナルの両方が、四重（quadruplet）反応間で最小のばらつき（＜９．５３％）で明らかに判別された。両方のシグナル強度は同等の範囲にあり、そして二項（binomal）曲線に厳密に一致する（Ｒ2＞０．９９５）。
【実施例２】
【００９８】
ｐ１６遺伝子のプロモーター配列をモデル系として用いた。その配列は以下に記載される：
５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣ３’（配列番号３）
【００９９】
細胞株、ＨＴ２９およびＬＮＣａＰからのゲノムＤＮＡは、既に実験的に確認されたとおり、メチル化陽性対照および陰性対照として用いた。
【０１００】
Ｆｒｏｍｍｅｒ法に従って、ゲノムＤＮＡを最初に修飾した（Frommer, M., L. E. McDonald, D. S. Millar, C. M. Collis, F. Watt, G. W. Grigg, P. L. Molloy, and C. L. Paul, 「個々のＤＮＡ鎖における５−メチルシトシン残基の陽性表示をもたらすゲノム配列決定プロトコル（A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands）」, Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 89:1827-1831 (1992))。簡単に述べると、細胞株ＨＴ２９およびＬＮＣａＰのそれぞれから得られた１μｇのゲノムＤＮＡを蒸留Ｈ2Ｏで５０μｌに希釈し、５．５μｌの２ＭＮａＯＨを加え、そして３７℃で１０分間インキュベートした（一本鎖ＤＮＡを作成するため）。３０μｌの新たに調製した１０ｍＭのヒドロキノン（Sigma）を各管に加えた。次いで、５２０μｌの新たに調製したｐＨ５．０の３Ｍ重亜硫酸ナトリウム（Sigma Ｓ−８８９０）を加えた。試薬を完全に混合し、次いで鉱物油で覆って５０℃で１６時間インキュベートした（より長いほどメチル化ＣがＴに変換し始める）。鉱物油を除去した後、１ｍｌのＷｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎｕｐ樹脂 (PromegaＡ７２８０）を各管に加えてから、ＤＡＮ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎｕｐキットのミニプレップカラムに混合物をかけた。カラムを２ｍｌの８０％イソプロパノールで洗い、そして５０μｌの熱水（６０℃〜７０℃）で溶出させた。５．５μｌの３ＭＮａＯＨを各管に加えて、室温で５分間インキュベートした。次いで、キャリアとして１μｌのグリコーゲン、３３μｌの１０ＭＮＨ4Ａｃ、そしてＤＮＡ沈澱用の３倍体積のエタノールを加えた。ぺレットを遠沈させて７０％エタノールで洗い、乾燥させ、そして２０μｌの水に再懸濁させた。各ＰＣＲ反応に１μｌのＤＮＡを用いた。
【０１０１】
重亜硫酸塩修飾後、配列は、
５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＴＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＹＧＧＡＴＹＧＹＧＴＧＹＧＴＴＹＧＧＹＧＧＴＴＧＹＧＧＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＡＧＧＴＡＧＹＧＧＧＹＧＧＹＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＹＧＧＹＧＧＹＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＹＧＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＹＧＧＴＹＧＹＧＧＴＴＹＧＧＧＧＴＹＧＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＹＧＧＧＹＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＧＹＧＧＧＧＧＹＧＴＴＧＴＴＴＡＡＹＧＴＡＴＹＧＡＡＴＡＧＴＴＡＹＧＧＴＹＧＧＡＧＧＴＹＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＹＧＧＧＡＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＧＹＧＧＧＹＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＹＧＡＡＧＴＴＴＧＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＧＴＡＧＹＧＴ３’（配列番号４）
に変化した（非メチル化シトシンはウラシルに変換されてしまってチミンとして認識され、メチル化シトシンはシトシンとして無処置のままであるので、ＹはＣ／Ｔを表す）。
【０１０２】
標準プロトコルを用いてＰＣＲ反応を行った。１μｌの化学処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅テンプレートとして用いた。ＰＣＲ反応において、９５℃で１０分間の初期変性、続いて９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを合計４０サイクルという手順を用いた。約２０ｎｇの重亜硫酸塩変換ＤＮＡ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．０）、２．０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの最終濃度の各プライマー、および１単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ５０μｌの体積中、ＰＣＲ反応を行った。プライマーは、ｐｌ６ＨｍｏｄｌＦ  ５’ＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧ３’（配列番号５）／ｐｌ６ＨｍｏｄｌＲ  ５’ＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＡＣＣＣＡＣＣ３’（配列番号６）であった。単位複製配列をＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）で定量した。
【０１０３】
様々な比での２種の単位複製配列の一連の混合物（表１）を、ビオチン化ｄＧＴＰの組み込みを用いて、ツープレックスＭＳＰＥ反応でのテンプレートとして用いた。反応を９５℃で１０分間の初期変性で開始し、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを合計３０サイクル続けた。２５μｌの反応系は、以下、様々な比であらかじめ混合した単位複製配列２．５μｌ（表１に記載される）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、８μＭの各未標識ｄＮＴＰ、４μＭのビオチン化ｄＧＴＰ、１００ｎＭの最終濃度の各ＭＳＰＥプライマー、および２５ｎＭの各逆プライマー、および０．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを含んだ。プライマーは、
１５１８３  ＣＥ−メチル＿１３６Ｕ２２    ５’  ＧＡＦ  ＧＣＴ  ＪＴＪ  ＡＣＣ  ＴＦＡ  ＪＡＧ  ＣＪＴ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  Ｃ  ３’  （配列番号７）（式中、最初の２４ヌクレオチドはジップコード配列である）、
１５１８４  メチル＿２５２Ｌ２３    ５’  ＧＣＴ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＡ  ３’  （配列番号８）
１５１８５  ＣＥ−非メチル＿１３４Ｕ２４    ５'  ＪＣＧ  ＪＣＡ  ＴＦＡ  ＧＣＦ  ＴＣＴ  ＪＧＡ  ＧＦＡ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  Ｔ  ３’  （配列番号９）（式中、最初の２２ヌクレオチドはジップコード配列である）、
１５１８６  非メチル＿２５２Ｌ２４    ５’  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ３’  （配列番号１０）
であった。
【０１０４】
反応後、ＭＳＰＥ産物を、アミン誘導化オリゴ（それぞれ、１５１８９  ＣＰ３２−３ａ  ５’  ＣＧＡ  ＡＦＧ  ＣＴＦ  ＴＪＡ  ＧＧＴ  ＦＡＦ  ＡＧＣ  ＪＴＣ  Ｓｐ−ＬＣＡ  ３’  （配列番号１１）／１５１９０  ＣＰ３３−３ａ  ５’  ＧＴＪ  ＣＴＣ  ＦＡＧ  ＡＪＧ  ＣＴＪ  ＡＴＧ  ＦＣＧ  Ｆ−Ｓｐ−ＬＣＡ  ３’  （配列番号１２））と複合させてあるルミネックス（登録商標）ビーズを含むビーズプールに移した。標準プロトコルを用いて、複合を行い、そしてビーズを１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）中５，０００μｌに再懸濁させた。同時に四重ハイブリダイゼーションを行った。基本的には、４μｌのＭＳＰＥ産物を、０．５×ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにルミネックス（登録商標）ビーズ８およびルミネックス（登録商標）ビーズ９（各２，０００個のビーズ）を含む５０μｌハイブリダイゼーション反応系中に移した。緩衝液は、１３．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（ナトリウム塩）、１２．０ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ（遊離酸）、１０ｇ／Ｌのラウリル硫酸リチウム、２１．２ｇ／ＬのＬｉＣＩ、１０．０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１．５ｇ／Ｌのカゼイン、１０．０ｇ／ＬのＢＲＩＪ−３５、２．０ｇ／ＬのＭｇＣｌ2、０．００１３６ｇ／ＬのＺｎＣｌ2、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００、ｐＨ７．５で作られた。反応系を、９６℃で２分間、４０℃で３０分間インキュベートした。ビーズを、それぞれ１００μｌおよび２００μｌの洗浄緩衝液（０．４×ＳＳＣ、１．０ｇ／ＬのＳＤＳ、０．５０ｇ／Ｌのナトリウムアジド、０．５０ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ−３００、ｐＨ７．７）で１回ずつ洗った。５０μｌの１：５００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ、１ｍｇ／ｍｌ）を各反応系に加え、室温で１５分間（遮光して）穏やかに混合し、そして１００μｌの洗浄緩衝液で再度洗った。ビーズを、８０μｌのＴＴＬ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、４００ｍＭのＬｉＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁させ、そしてルミネックス（登録商標）１００（商標）機器で測定を行った。
【０１０５】
【表３】
2005204652.tif 000004
【０１０６】
予測比対インプットテンプレート比は、二項曲線に厳密に一致し（Ｒ2＝０．９９９４）、アッセイの高い定量能力を示す。比は、標準曲線を用いて、ルミネックス（登録商標）１００（商標）読み出しから直接計算した。予測力（predictive power）は、標的の組成（０％〜１００％のメチル化）から独立して、ほぼ１００％である。
【０１０７】
他の実施形態
他の実施形態は当業者に明らかであるだろう。上述の詳細な記載が明瞭化のためにのみ提供され、かつ例にすぎないことが理解されるはずである。本発明の精神および範囲は、上記の例に制限されないが、以下の特許請求の範囲により包括される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】メチル化および非メチル化ＤＮＡテンプレート両方の蛍光読み出しを示す。
【図２】観測に対して予測されるメチル化の比を示す。
【図３】アッセイの予測力（計算された比対予測される比）を示す。
【図４】本発明の概略図を示す。
【図１】
2005204652.tif 000005
【図２】
2005204652.tif 000006
【図３】
2005204652.tif 000007
【図４】
2005204652.tif 000008
【配列表】
2005204652000001.app
【外国語明細書】
2005204652000001.pdf