(57)【要約】【課題】  新規甘味物質ならびに新規味覚修飾物質、特に甘味変調活性を有する物質を提供すること。【解決手段】  クルクリゴ果実由来の新規タンパク質クルクリン２、ならびにクルクリゴ果実抽出成分中の味覚変調活性本体である、クルクリンＢ（クルクリン１）とクルクリン２とからなるヘテロダイマー、及びその製造方法を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共にヘテロダイマータンパク質を構成することにより、味覚修飾活性を呈するポリペプチド。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項２】
味覚修飾が甘味変調である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のポリペプチドおよび配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるヘテロダイマータンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のポリペプチドと、配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとをリフォールディングすることを含む、味覚修飾活性を有するへテロダイマータンパク質の製造方法。
【請求項５】
味覚修飾が甘味変調である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドと、配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが１：１〜１：５の割合で、前記リフォールディングが行われることを特徴とする請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
リフォールディングにおいてグアニジル基を有する化合物を使用することを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項９】
配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマーを構成するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３記載の塩基配列
（Ｂ）配列番号３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項１０】
味覚修飾が甘味変調である、請求項８または９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１記載のポリペプチドの前駆体であって、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項１２】
請求項１１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１３】
下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有する請求項１２記載のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【請求項１４】
請求項８〜１０、１２、１３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
請求項８〜１０、１２、１３のいずれか１項に記載のＤＮＡと、配列番号５または７あるいはそれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとを共発現している微生物を培養し、該培養物から味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質を採取することを特徴とする、味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質の製造方法。
【請求項１７】
味覚修飾が甘味変調である、請求項１６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甘味タンパク質および味覚修飾物質（特に甘味変調物質）、ならびにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マレーシア原生植物であるクルクリゴ・ラチフォリア（Ｃｕｒｃｕｌｉｇｏ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）の果実由来のタンパク質であるクルクリン同族体（以下、クルクリンという）は、それ自身が甘味を有するとともに、それを味わった後は、様々な呈味（無味の水、有機酸の酸味など）が全て甘味として感じられるようになる、いわゆる味覚変調活性を有することが知られている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
一方、その構造に関しては種々の研究がなされており、クルクリンBがその主要な構成物として認知されている（特許文献１）。クルクリンBはN末端にシグナルペプチドを含み、更にC末端に延長ペプチドを含む、配列番号６記載のアミノ酸配列からなる前駆体の形で産生され、プロセシングにより配列番号８記載の成熟クルクリンB（配列番号６記載のアミノ酸配列においてアミノ酸番号２３〜１３６位で表されるアミノ酸配列）になるものと推定されている（特許文献１）。クルクリンBは天然ではジスルフィド結合によるホモダイマーとして存在し、かつその活性本体はモノマーであるという説も提示されているものの（特許文献２）、天然のクルクリゴ抽出物中にはその他の甘味タンパク成分の存在も示唆されており（非特許文献４）、その活性本体については未だ不明である。
【特許文献１】特開平０６−１８９７７１号公報
【特許文献２】特開平０６−２０９７３６号公報
【非特許文献１】栗原良枝，外２名、「味覚修飾活性を有する新規甘味タンパク質、クルクリンの活性と安定性（Activity and stability of a new sweet protein with taste-modifying action, curculin）」、ケミカル  センシズ（Chemical Senses），１９９５年４月，第２０巻，第２号，ｐ．２３９−２４３
【非特許文献２】栗原良枝，「甘味タンパク質および甘味誘導タンパク質」，生化学，１９９１年１１月，第６３巻，第１１号，ｐ．１３４０−１３４４，総説
【非特許文献３】栗原良枝，外５名，「味覚修飾活性を有する新規甘味タンパク質、クルクリンの精製と完全アミノ酸配列（Purification and complete amino acid sequence of a new type of sweet protein taste-modifying activity, curculin）」，ザ  ジャーナル  オヴ  バイオロジカル  ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry），１９９０年９月１５日，第２６５巻，第２６号，ｐ．１５７７０−１５７７５
【非特許文献４】日本農芸化学会誌、２００１年，第７５巻，臨時増刊号、ｐ．１６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、クルクリンの活性本体の解明ならびにその製造方法、より詳細には大量生産を可能とする製造方法の確立および提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討を行った結果、クルクリンB以外の新規配列を有するタンパク質がクルクリゴ抽出物中に含有されていることを見出し、さらに当該新規配列を有するポリペプチドとクルクリンB配列を有するポリペプチドとのジスルフィド結合によるヘテロダイマー構造を有するタンパク質がクルクリンの活性本体であることを見出した（以下、クルクリンBをクルクリン１といい、当該新規配列を有するポリペプチドをクルクリン２という）。
【０００６】
さらに、本発明者らは、クルクリン２の配列を新たにクローニングし、クルクリン１およびクルクリン２を遺伝子工学的に大量発現させ、インビトロでリフォールディングを行い、クルクリン１とクルクリン２のジスルフィド結合によるヘテロダイマーを再構成したところ、当該ヘテロダイマーが天然抽出物同様の味覚修飾作用を呈することを見出した。即ち、クルクリン活性本体がクルクリン１およびクルクリン２のヘテロダイマーであることを見出した。
【０００７】
本発明者らは、かかる知見に基づき、新規甘味タンパク質および新規味覚修飾物質（特に甘味変調物質）、ならびにその製造方法を得て本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共にへテロダイマータンパク質を構成することにより、味覚修飾活性を呈するポリペプチド。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔２〕味覚修飾が甘味変調である、上記〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕上記〔１〕記載のポリペプチドおよび配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドから構成されるヘテロダイマータンパク質。
〔４〕上記〔１〕記載のポリペプチドと、配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとをリフォールディングすることを含む、味覚修飾活性を有するへテロダイマータンパク質の製造方法。
〔５〕味覚修飾が甘味変調である、上記〔４〕記載の製造方法。
〔６〕上記〔１〕記載のポリペプチドと、配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが１：１〜１：５の割合で、前記リフォールディングが行われることを特徴とする上記〔５〕記載の製造方法。
〔７〕リフォールディングにおいてグアニジル基を有する化合物を使用することを特徴とする上記〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔９〕配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマーを構成するポリペプチドをコードするＤＮＡであって、下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３記載の塩基配列
（Ｂ）配列番号３記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
〔１０〕味覚修飾が甘味変調である、上記〔８〕または〔９〕記載のＤＮＡ。
〔１１〕上記〔１〕記載のポリペプチドの前駆体であって、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
〔１２〕上記〔１１〕記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔１３〕下記（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有する上記〔１２〕記載のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１記載の塩基配列
（Ｂ）配列番号１記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
〔１４〕上記〔８〕〜〔１０〕、〔１２〕、〔１３〕のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
〔１５〕上記〔１４〕記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
〔１６〕上記〔８〕〜〔１０〕、〔１２〕、〔１３〕のいずれかに記載のＤＮＡと、配列番号５または７あるいはそれらの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとを共発現している微生物を培養し、該培養物から味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質を採取することを特徴とする、味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質の製造方法。
〔１７〕味覚修飾が甘味変調である、上記〔１６〕記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の新規甘味タンパク質または新規味覚修飾物質により、クルクリゴ抽出物同様の甘味物質または味覚修飾物質を提供することが出来る。また、本発明の新規甘味タンパク質または新規味覚修飾物質の製造方法により、クルクリゴ抽出法によらず、遺伝子工学的に大量にクルクリンを生産することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドは、配列番号２記載のアミノ酸配列又は同アミノ酸配列においてアミノ酸番号２３〜１３６位で表されるアミノ酸配列（配列番号４記載のアミノ酸配列）と同一かもしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドへとプロセシングされる。配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同等の活性（後述）を有し、且つ配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列とそれぞれ約８５％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。相同性（％）は、当該分野で慣用のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、相同性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれており、相同性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ又はＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、並びにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４、およびｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５若しくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。
【００１１】
配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列において、上記した程度の相同性を維持し得る範囲内で１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、且つ配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するものである。本発明者らは配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号２記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを総称して前駆体クルクリン２と命名し、配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号４記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する有するポリペプチドを総称して、クルクリン２と命名した。
【００１２】
実質的に同質の活性としては、前記配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるクルクリン１とともに、味覚修飾活性を呈するへテロダイマータンパク質（以下クルクリンへテロダイマー又は単にヘテロダイマーという）を構成し得る能力であり、実質的に同質とはヘテロダイマーを構成し得る能力が配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるクルクリン２のそれと同等であることを示している。上記の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度、ポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、本発明において、クルクリン１は、配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド以外に、配列番号８記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、且つクルクリン２と一緒になって味覚修飾活性を有するヘテロダイマーを構成するものであってもよい。具体的には配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、且つクルクリン２と一緒になって味覚修飾活性を有するヘテロダイマーを構成するポリペプチドであってもよい。
【００１３】
本発明のクルクリンへテロダイマーは、クルクリン１およびクルクリン２がジスルフィド結合により結合したヘテロダイマーであって、味覚修飾活性を有する、クルクリゴ果実中に含まれるクルクリンの活性本体である。ここに、味覚修飾活性とは、主として無味あるいは酸味を甘みと感じる活性（甘味変調）をいうが、これに制限されるものではなく、クルクリゴ果実あるいはクルクリンによる味覚修飾効果として知られている効果は全て含まれる。また、上述したように、本発明のクルクリンへテロダイマーは、味覚修飾活性を呈する限りにおいて、クルクリン１又は２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するものであってもよいが、クルクリン１と２の配列中の相違する部分については活性発現に必要であると推定されるため、当該１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位は、それぞれ配列番号８または４の２，１１，１３，１７，１８，２０，２８，３６，４４，４７，４８，５１，５７，６３，６７，７０，７１，７６，８０，８３，９０，９３，１０３，１０６，１１１，１１２位に存在する計２６個の残基のうち少なくとも１箇所以外の位置に限られる。
【００１４】
本発明のポリペプチド（クルクリン２）ならびに本発明のポリペプチドと一緒になって味覚修飾活性を有するクルクリンヘテロダイマーを構成するポリペプチド（クルクリン１）は、それぞれ塩として存在するものであってもよい。本発明で用いられる各ポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。後述するがクルクリン１とクルクリン２とをリフォールディングすることによって味覚修飾活性を有するクルクリンヘテロダイマーを製造する場合に、塩としての存在が不都合な場合には遊離の状態に戻して使用する。
【００１５】
クルクリン１および／またはクルクリン２は、（１）該ポリペプチドを産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術等により各ポリペプチドを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明において各ポリペプチドの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち適当な液体培地中で、各ポリペプチドを発現している細胞を培養し、得られる培養物から公知の方法で抽出、精製する。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
【００１６】
具体的には次のようにして行なわれる。まず、培養物をそのまま濾過又は遠心分離等の常法に付して細胞又は上清を回収する。細胞中に該ポリペプチドが蓄積されている場合には、当該回収した細胞を適当な緩衝液剤中に懸濁して、さらに界面活性剤を適当な濃度で加えて膜を可溶化する。採取対象となる細胞が細胞壁を有する場合、リゾチームや超音波による前処理が必要である。界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）等が挙げられるが、これらは強力なタンパク質変性作用を有するので、タンパク質が生物活性を持つように折り畳まれるためには、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の穏やかな非イオン性界面活性剤を用いることが好ましい。次いで得られる粗抽出液を、必要ならば界面活性剤の存在下で、一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって該ポリペプチドを単離精製する。
【００１７】
該ポリペプチドが培養培地中に存在する場合には、まず培養物を濾過又は遠心分離に付して沈澱物（細胞等の固形物）を除去することにより、溶液部分のみを得、それを一般に用いられる方法を適宜組み合わせることによって目的物質を単離精製する。塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。より具体的には、例えば、減圧濃縮、凍結乾燥、常用の溶媒による抽出、ｐＨ調整、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の常用の吸着剤による処理、結晶化、再結晶化等の慣用の方法によって分離、精製することができる。
【００１８】
化学合成による場合は、例えばクルクリン１であれば配列番号５（前駆体型）あるいは配列番号７（成熟型）に示される塩基配列を基にして、あるいはクルクリン２であれば配列番号１（前駆体型）あるいは配列番号３（成熟型）に示される塩基配列を基にして、該配列の全部または一部がコードするアミノ酸を特定し、該アミノ酸をペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。前駆体として合成した場合には適当にプロセシングすることにより成熟型とするのが好ましい。
【００１９】
本発明はまた、クルクリン２および前駆体クルクリン２をコードするＤＮＡを提供する。クルクリン２をコードするＤＮＡは、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号8記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマーを構成するポリペプチド（クルクリン２）をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号４記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列（アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位が施される数は１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度である。）
一方前駆体クルクリン２をコードするＤＮＡは、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、かつプロセシングにより生じる成熟型ポリペプチドが配列番号８記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと共に、味覚修飾活性を呈するへテロダイマーを構成するポリペプチド（前駆体クルクリン２）をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列（アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位が施される数は１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらに好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度である。）
これらのＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、該ポリペプチドを発現している細胞・組織由来のｃＤＮＡ、該ポリペプチドを発現している細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。本発明のクルクリン２をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列又は同塩基配列において塩基番号６７〜４０８（配列番号３）、１〜４０８若しくは６７〜４７７位で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表される塩基配列又は同塩基配列において塩基番号６７〜４０８（配列番号３）、１〜４０８若しくは６７〜４７７位で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含有し、クルクリン２をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
【００２０】
配列番号１で表される塩基配列又は同塩基配列において塩基番号６７〜４０８（配列番号３）、１〜４０８若しくは６７〜４７７位で表される塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列又は同塩基配列において塩基番号６７〜４０８（配列番号３）、１〜４０８若しくは６７〜４７７位で表される塩基配列と約９５％以上、好ましくは約９８％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
【００２１】
本発明はまた、クルクリン２をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターに関する。組換えベクターに挿入されるＤＮＡは、クルクリン２をコードするＤＮＡに代えて、クルクリン２をコードする塩基配列を含むＤＮＡを用いることができ、このようなＤＮＡとしては、例えば、「成熟体型」クルクリン２をコードする塩基配列（配列番号１の塩基配列において塩基番号６７〜４０８位で表される塩基配列、すなわち配列番号３の塩基配列）からなるＤＮＡ、シグナルペプチド及び延長ペプチドの両方を含む「前駆体型」クルクリン２をコードする塩基配列（配列番号１の塩基配列）からなるＤＮＡ、シグナルペプチドを含むが延長ペプチドが欠損している「延長ペプチド欠損−前駆体型」クルクリン２をコードする塩基配列（配列番号１の塩基配列において塩基番号１〜４０８位で表される塩基配列）からなるＤＮＡ、又は延長ペプチドを含むがシグナルペプチドが欠損している「シグナルペプチド欠損−前駆体型」クルクリン２をコードする塩基配列（配列番号１の塩基配列において塩基番号６７〜４７７位で表される塩基配列）からなるＤＮＡなどを用いることができる。さらに所望の活性を有するポリペプチドが得られる範囲内で、各塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを用いることもできる。
本発明の組換えベクターは、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当分野において入手可能なクローニングベクターまたは発現ベクターに上記のいずれかのＤＮＡを適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって調製することができる。
【００２２】
特に、本発明の組換えベクターはクルクリン２をコードするＤＮＡを機能的に含む発現ベクターである。ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドが産生され得るように該ＤＮＡが配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、環状リポペプチドアシラーゼまたはその各サブユニットをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。用いられる発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子を発現させ得るプロモーター領域と、該遺伝子の転写を終結させるシグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが少なくとも１つのユニークな制限酵素認識部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。さらに所望により、該発現ベクターは開始コドンおよび終止コドンを、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含んでいてもよい。
【００２３】
クルクリン２をコードするＤＮＡを機能的に含む発現ベクターをクルクリンへテロダイマーの製造の為に使用する場合には、当該ＤＮＡに加えてクルクリン１をコードするＤＮＡを宿主細胞内で発現し得る形態で含有する発現ベクターを用いてもよい。クルクリン１をコードするＤＮＡ、クルクリン２をコードするＤＮＡはそれぞれ別のプロモーターの制御下に置かれていても良く、あるいは同一のプロモーターの制御下にタンデムに配置されていてもよい。あるいは、クルクリン２をコードするＤＮＡを機能的に含む発現ベクターによって形質転換された形質転換体を培養することによって得られるクルクリン２と、クルクリン１をコードするＤＮＡを機能的に含む発現ベクターによって形質転換された形質転換体を培養することによって得られるクルクリン１とをインビトロでリフォールディングすることによっても本発明のクルクリンへテロダイマーを製造することができる。
【００２４】
本発明において、クルクリン１をコードするＤＮＡとしては、配列番号８記載のアミノ酸配列または配列番号８記載のアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２０個程度、さらには１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有し、かつクルクリン２と共に、味覚修飾活性を呈するヘテロダイマーを構成するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するものであればいかなるものであってもよくゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、該ポリペプチドを発現している細胞・組織由来のｃＤＮＡ、該ポリペプチドを発現している細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。本発明のクルクリン１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含有し、クルクリン１をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記したクルクリン２をコードするＤＮＡの場合と同様な条件である。
【００２５】
組換えベクターに挿入されるＤＮＡは、クルクリン１をコードするＤＮＡに代えて、クルクリン１をコードする塩基配列を含むＤＮＡを用いることができ、このようなＤＮＡとしては、例えば、「成熟体型」のクルクリン１をコードする塩基配列（配列番号５の塩基配列において塩基番号７７〜４１８位で表される塩基配列、すなわち配列番号７の塩基配列）からなるＤＮＡ、シグナルペプチド及び延長ペプチドの両方を含む「前駆体型」クルクリン１をコードする塩基配列（配列番号５の塩基配列）からなるＤＮＡ、シグナルペプチドを含むが延長ペプチドが欠損している「延長ペプチド欠損−前駆体型」のクルクリン１をコードする塩基配列（配列番号５の塩基配列において塩基番号１１〜４１８位で表される塩基配列）からなるＤＮＡ、又は延長ペプチドを含むがシグナルペプチドが欠損している「シグナルペプチド欠損−前駆体型」のクルクリン１をコードする塩基配列（配列番号５の塩基配列において塩基番号７７〜４８４位で表される塩基配列）からなるＤＮＡなどを用いることができる。
クルクリン２をコードするＤＮＡならびにクルクリン１をコードするＤＮＡに代えて各前駆体型クルクリンをコードするＤＮＡを用いる場合には適切なプロセシングを経た後リフォールディングを行う。
【００２６】
クルクリン１をコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターは、上記したクルクリン２をコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターと同様、そのベクターに適合する宿主細胞内で該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドが産生され得るように該ＤＮＡが配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、環状リポペプチドアシラーゼまたはその各サブユニットをコードする遺伝子、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。用いられる発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子を発現させ得るプロモーター領域と、該遺伝子の転写を終結させるシグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが少なくとも１つのユニークな制限酵素認識部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。さらに所望により、該発現ベクターは開始コドンおよび終止コドンを、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含んでいてもよい。
【００２７】
本発明は、味覚修飾活性、特に甘味変調活性を有するクルクリンヘテロダイマーを製造する方法を提供する。
簡便にはクルクリン１とクルクリン２のリフォールディングによるハイブリッド形成によって製造される。本発明においてリフォールディングとは、通常の意味に従って解釈されるが、一般的には単量体タンパク質や多量体タンパク質、分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を製造する際に、活性を有する天然型のタンパク質と同じ高次構造へ再構成することである。具体的なリフォールディングの手順は、当分野で通常タンパク質のリフォールディングを行う場合に用いられる手順で行うことができ、特に限定されるものではないが、例えば「タンパク質のフォールディング  原理・機構・応用  第９章  バイオテクノロジーにおけるタンパク質のフォールディング」（Ｒ．Ｈ．ペイン編  シュプリンガー・フェアクラーク東京）や「Mechanism of Protein Folding」（Edited by Roger H. Pain, 1994 Oxford University Press, Inc., New York）に記載の方法を用いることが出来る。本発明のクルクリンへテロダイマーの製造にあたっては、上述のように（１）該ポリペプチドを産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術等により各ポリペプチドを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得されるクルクリン２とクルクリン１をそれぞれ調製し、一旦塩酸グアニジン等の変性剤により変性させた後、ＧＳＨ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの各クルクリン分子中に存在するチオール基の保護剤、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、グアニジル基を有する化合物、ＬｉＣｌ、ＮａＣｌ等の塩類、エチレングリコールやグリセロールなどのポリオール類を含有するリフォールディングバッファーに溶解させ、ジスルフィド結合交換反応を行うことにより、リフォールディングを行うことができる。この際、グアニジル基を有する化合物の濃度としては０．４〜２Ｍ、塩類の濃度としては１Ｍ〜２Ｍ、ポリオール類の濃度としては５０％〜６０％程度が好ましい。また、ヘテロダイマーの製造に当たっては、好ましくはクルクリン２とクルクリン１との量比が１：１〜１：５であり、特に好ましくは１：３の割合でリフォールディングを行う。またグアニジル基を有する化合物の存在下でリフォールディングを行うことが一層好ましい。グアニジル基を有する化合物としては具体的には塩酸グアニジン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン等が挙げられる。リフォールディングが行われた溶液からのクルクリン２とクルクリン１の回収、精製には、陽イオンクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の公知の方法を適宜用いることが出来るが、一例として、Method in Enzymology, volume 182, Guide to Protein Purification（Edited by Murray P. Deutscher, 1990 Academic Press, Inc., London）記載の方法が挙げられる。
【００２８】
ここでクルクリンヘテロダイマーの製造に用いるクルクリン１あるいはクルクリン２は、ジスルフィド結合によって味覚修飾活性を呈するクルクリンへテロダイマーを形成するものであれば、その由来等は特に限定されるものではなく、上述のように（１）該ポリペプチドを産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法または（３）遺伝子組換え技術等により各ポリペプチドを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得されたものであってもよい。各手法による各ポリペプチドの採取方法も上述のとおりである。
【００２９】
本発明のクルクリンへテロダイマーの製造方法としては、上記したインビトロでのリフォールディング以外に、クルクリン１をコードしているＤＮＡとクルクリン２をコードしているＤＮＡを共発現する微生物（宿主細胞）を培養し、該培養物から味覚修飾活性を呈するクルクリンへテロダイマーを採取することを特徴とする方法も包含される。クルクリン１をコードしているＤＮＡとクルクリン２をコードしているＤＮＡを共発現する微生物（宿主細胞）は、上記したようなクルクリン１をコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターとクルクリン２をコードするＤＮＡを機能的に含有する発現ベクターとの共形質導入やクルクリン１をコードするＤＮＡとクルクリン２をコードするＤＮＡとを、宿主細胞内で活性を有した状態で発現し得るような形態で含有する発現ベクターによる形質転換等によって調製することができる。
【００３０】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。プロモーター領域には、プロモーター、オペレーターおよびShine-Dalgarno（ＳＤ）配列が含まれる。例えば、宿主が大腸菌の場合には、プロモーター領域としてＴｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が、また、宿主が枯草菌の場合には、プロモーター領域としてＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が、宿主が放線菌の場合には、ｍｅｌＣ、ｔｉｐＡ、ｅｒｍＥ、ａｐｈＩ等が挙げられる。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。また、選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、チオストレプトン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。開始コドンとしては通常ＡＴＧが用いられるが、場合によってＧＴＧを使用することもできる。終止コドンとしては常用のＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧが用いられる。
【００３１】
本発明の形質転換体、あるいは本発明において使用する形質転換体は、クルクリン２および／またはクルクリン１をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。宿主細胞は使用する組換えベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、当分野で通常使用される天然に存在する細胞あるいは人工的に作製された変異体細胞もしくは組換え体細胞など種々の細胞が利用できる。好ましくは細菌、特に大腸菌、枯草菌、放線菌およびそれらの類縁菌等である。
【００３２】
組換えベクターの宿主細胞への導入は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、宿主が大腸菌や枯草菌等の細菌の場合には、Cohenらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)]、プロトプラスト法[Mol. Gen. Genet.,168: 111 (1979)]およびコンピテント法[J. Mol. Biol., 56: 209 (1971)] 等が挙げられる。
宿主が放線菌の場合は、Transformation Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual. The John Innes Foudation, Norwich, UK,1985に記載されている方法(PEG-assisted protoplast transformation)等が挙げられる。
用いられる栄養培地としては、炭素源としてグルコース、キシロース、ガラクトース、グリセリン、スターチ、デキストリン等のような炭水化物が挙げられ、他の炭素源としてはマルトース、ラムノース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム、フルクトース、マンニトール、グルシトール、ラクトース、ソルボース、シュクロース等が挙げられる。
好ましい窒素源としては、無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物、大豆粉、小麦胚芽、ポテトプロテイン、米ぬか、ピーナッツパウダー、グルテン、コーン抽出物等）を含んでいてもよい。さらに所望により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１ ）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン、チオストレプトン）等〕を培地中に添加してもよい。
特に培養培地が著しく発泡する場合には、必要に応じて液状パラフィン、脂肪油、植物油、シリコーン等の消泡剤を添加してもよい。
形質転換体の培養は、通常ｐＨ４〜９、好適にはｐＨ６〜７、１５〜３５℃、好適には２５〜３５℃で１０〜１４４時間で行われる。
【００３３】
さらにクルクリン２をコードするＤＮＡおよびクルクリン１をコードするＤＮＡ、ならびに各種の前駆体型クルクリンをコードするＤＮＡから無細胞系で各ポリペプチドを合成し、次いでクルクリンへテロダイマーを製造することもできる。
【００３４】
本発明のクルクリンへテロダイマーは、それ自体甘味を有し、且つ味覚（特に甘味）変調活性を有しているので食品添加物として、また苦味を有する医薬品の苦味マスク効果が得られると考えられ、医薬品への添加物としても有用である。さらに本発明は天然物由来である為安全性が高いことが期待される。
【実施例】
【００３５】
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
【００３６】
実施例１：クルクリン２のクローニング
クルクリンＩＩ遺伝子の解析
天然のクルクリゴ抽出物中には複数種の甘味タンパク質成分の存在も示唆されている。従来報告されているクルクリンメジャー成分とは別の成分（クルクリンマイナー成分）のクローニングを行った。
解析１．
Ｃ．ｌａｔｉｆｏｌｉａの果実より調製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりクルクリンマイナー成分遺伝子をコードする遺伝子を増幅した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＩ（ＣＵＲ−２）およびオリゴヌクレオチドＩＩ（Ｃ４）を用いた。
オリゴヌクレオチドＩ（ＣＵＲ−２）  ｓｅｎｓｅ  （配列番号９）
【００３７】
５’−ＧＧＩ ＣＡＡ ＡＣＩ ＣＴＩ ＴＡＴ ＧＣＩ ＧＧ−３’
（Ｇ）                  （Ｃ）
【００３８】
オリゴヌクレオチドＩＩ（Ｃ４）  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  （配列番号１０）
【００３９】
５’−ＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴ−３’
【００４０】
オリゴヌクレオチドＩ（ＣＵＲ−２）はＮ末端アミノ酸一次配列解析の結果から推測されたマイナー成分クルクリンのアミノ酸部分配列（Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ；配列番号１１）をもとに、マイナー成分クルクリン遺伝子に特異的にアニーリングするよう設計した。４種類のコドンによって指定されるアミノ酸に対するコドンは３塩基目にイノシンを使用し、２種類のコドンによって指定されるアミノ酸に対するコドンには３塩基目を２種類の混合物として設計した。最後のグリシンに対するコドンは２塩基目までを使用した。この結果、オリゴヌクレオチドＩ（ＣＵＲ−２）は４種類のオリゴヌクレオチドからなる混合物とした。
【００４１】
オリゴヌクレオチドＩＩ（Ｃ４）はメジャー成分クルクリン遺伝子をもとにＣ末端延長ペプチドの２０塩基にアニーリングするように設計されたものである。各プライマーの位置を図１〜図３に示す。
ＰＣＲ条件は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑを用い、９４℃、７分間に続いて９４℃、１分間、５０℃、１分間、７２℃、３分間を３０回繰り返した後、７２℃、７分間を行った。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離した。
これを切り出して精製を行い、Ｔベクターとして市販されており精製したＰＣＲ産物を直接組み込むことが可能なＴＡＫＡＲＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いてプラスミドｐＭＯＳＢｌｕｅに組み込み、塩基配列を解析した。この塩基配列解析は、Ｄｉｄｅｏｘ法を用いて一色蛍光プライマー法によりＤＮＡ配列分析計を用いて行った。
その結果、マイナー成分クルクリン遺伝子のうち３５３塩基対を確定することができた。これをクルクリン２と命名し、従来のメジャー成分クルクリン（クルクリンＢ）をクルクリン１と呼び分けることとし、ｃＤＮＡのクルクリン２ポリペプチドをコードする遺伝子領域をクルクリンＩＩ遺伝子と呼ぶことにした。またクルクリン１ポリペプチドをコードする遺伝子領域をクルクリンＩ遺伝子と呼ぶことにした。
【００４２】
解析２．
上流の未知塩基配列を解析するためにＣ．ｌａｔｉｆｏｌｉａの果実より調製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりクルクリンＩＩ遺伝子をコードする遺伝子を増幅した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＩＩＩ（Ｎ１）およびオリゴヌクレオチドＩＶ（Ｕ−ＲＡＣＥ  ５）を用いた。
【００４３】
オリゴヌクレオチドＩＩＩ（Ｎ１）  ｓｅｎｓｅ  （配列番号１２）
【００４４】
５’−ＧＧＡＴＣＣＡＣＣ  ＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴ−３’
クルクリンＮ末端延長ペプチド
【００４５】
オリゴヌクレオチドＩＶ（Ｕ−ＲＡＣＥ  ５）  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  （配列番号１３）
【００４６】
５’−ＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧ−３’
【００４７】
オリゴヌクレオチドＩＩＩ（Ｎ１）はメジャー成分クルクリンＩ遺伝子をもとにＮ末端延長ペプチドの２０塩基にアニーリングするよう設計されたものである。
オリゴヌクレオチドＩＶ（Ｕ−ＲＡＣＥ  ５）は解析１．にて解析された塩基配列より新たに設計したものであり、クルクリンＩＩ遺伝子にアニーリングするように設計したものである。各プライマーの位置関係を図１〜３に示す。
【００４８】
ＰＣＲ条件は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑを用い、９４℃、７分間に続いて９４℃、３０秒間、５５℃、３０秒間、７２℃、３分間を３０回繰り返した後、７２℃、７分間を行った。
得られたＰＣＲ産物を解析１．と同様の手法を用いて塩基配列を解析した。その結果、解析されたものは解析１．において解析した塩基配列と同じものと推定でき、クルクリンＩＩ遺伝子を新規に１０４塩基対、確定することができた。
【００４９】
解析３．
下流の未知塩基配列を解析するためにＣ．ｌａｔｉｆｏｌｉａの果実より調製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりクルクリンＩＩ遺伝子をコードする遺伝子を増幅した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＩ（ＣＵＲ−２）およびオリゴヌクレオチドＶ（ＨＤ−１）を用いた。
オリゴヌクレオチドＶ（ＨＤ−１）  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  （配列番号１４）
【００５０】
５’−ＡＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＡＡＴＣ−３’
【００５１】
オリゴヌクレオチドＶ（ＨＤ−１）は阿部らにより解析されたクルクリンＩ  ｃＤＮＡ塩基配列(Abe, K., Yamashita, H., Arai, S., and Kurihara, Y., Biochimica et Biophysica Acta, 1130, 232-234(1992))の非翻訳領域より推定し合成したものである。プライマーの位置関係を図１および図３に示す。
【００５２】
ＰＣＲ条件は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑを用い、９４℃、７分間に続いて９４℃、３０秒間、４５℃、１分間、７２℃、５分間を３０回繰り返した後、７２℃、７分間を行なった。
得られたＰＣＲ産物を解析１．と同様の手法を用いて塩基配列を解析した。その結果、解析されたものは解析１．および解析２．において解析した塩基配列と同じものと推定でき、クルクリンＩＩ遺伝子を新規に２０塩基対、確定することができた。
以上の塩基配列の解析によりクルクリンＩＩ遺伝子全域が確定された。クルクリンＩＩ遺伝子は合計４７７塩基対からなることが明らかになった。クルクリン１のアミノ酸配列情報との比較から、このうち、Ｎ末端６６塩基対は前駆体のＮ末端延長ペプチド、３４２塩基対がクルクリンＩＩ成熟体、ついで６６塩基対が前駆体のＣ末端延長ペプチドをコードしており、残り３塩基は停止コドンであると考えられる（図２、配列番号１）。すなわち、配列番号２記載の前駆体クルクリン２配列のうち、アミノ酸番号２３〜１３６位がクルクリン２（成熟型）に相当するが、これは後述する質量分析によっても確認された。
【００５３】
この確定されたクルクリンＩＩ遺伝子はクルクリンＩ遺伝子に存在するＳｐｈ  Ｉサイトを持たないことを確認した。
クルクリンＩＩ遺伝子全域を単離するためにＣ．ｌａｔｉｆｏｌｉａの果実より調製されたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりクルクリンＩＩ遺伝子をコードする遺伝子を増幅した。プライマーとしてオリゴヌクレオチドＩＩＩ（Ｎ１）およびオリゴヌクレオチドＩＩ（Ｃ４）を用いた。
【００５４】
ＰＣＲ条件は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑを用い、９４℃、７分間に続いて９４℃、３０秒間、５０℃、３０秒間、７２℃、５分間を３０回繰り返した後、７２℃、７分間を行なった。
【００５５】
このＰＣＲ産物にはクルクリンＩ、ＩＩ遺伝子ともに含有されているはずであるので、Ｓｐｈ  Ｉを用いてクルクリンＩのみ消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離した。これをＴベクター  ｐＭＯＳＢｌｕｅに組み込んだ。解析１．に記載した手法を用いて塩基配列を解析した。その結果、クルクリンＩＩ遺伝子が単離できたことが確認された。このクルクリンＩＩ遺伝子をインサートとして持つｐＭＯＳＢｌｕｅをｐＣＵＲＩＩと命名した。
【００５６】
実施例２：クルクリン１およびクルクリン２の大量発現
Ｉ．クルクリン１発現プラスミドの構築
１）クルクリン１の合成ＤＮＡのデザイン
合成ＤＮＡをベクターに組み込むときに用いる制限酵素の認識部位が、クルクリンをコードするＤＮＡの中に存在していると、目的とするプラスミドを作製することができない。そこで、情報処理ソフトＧＥＮＥＴＹＸを用い、クルクリン１をコードするＤＮＡ配列（阿部ら、上述）について、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ認識部位を解析した。その結果、両制限酵素認識部位が存在していなかったため、ＮｄｅＩを５’末端に、ＢａｍＨＩを３’末端に組み込んだ合成ＤＮＡをデザインすることができた。クルクリン１はＢｒａｚｚｅｉｎ等と比べ分子量がおよそ倍以上の１１４アミノ酸残基（成熟タンパク質）の甘味タンパク質である。そして、経験上、相補鎖重複部分は〔１〕１７ｂｐ以上、〔２〕Ｔｍ値  ５０〜６０℃という条件のもと、クルクリンＩの配列を７０〜８０ｂｐずつの断片に分け、計６本のクルクリンプライマーを設計した（クルクリンプライマー  ａ．ａ’，ｂ，ｂ’，ｃ，ｃ’；配列番号１５〜２０）。また、その両端に導入する制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩのプライマーも同様に設計し（クルクリン−ＮｄｅＩ；配列番号２１、クルクリン−ＢａｍＨＩ；配列番号２２）、上記と合わせて計８本のプライマー（合成ＤＮＡ）を作製した。
【００５７】
２）クルクリン１をコードするＤＮＡ断片の作製
最初、合成ＤＮＡ  ６本（ａ，ａ’，ｂ，ｂ’，ｃ，ｃ’）を全て同時に混合してＰＣＲを行い、クルクリンをコードするＤＮＡ断片の作製を試みたが、一部の塩基配列に欠落が起こることがわかった。。理由としては、ポリメラーゼ反応が精度良く進行しなかったことが挙げられる。そこで、６本の合成ＤＮＡの混合方法を再検討することとした。具体的には、６本の合成ＤＮＡのうち２本ずつをＰＣＲし、得られたＡ（＝［ａ−ａ’］）、Ｂ（＝［ｂ−ｂ’］）、Ｃ（＝［ｃ−ｃ’］）の断片を以下の４通りの方法で接合させた際に、目的とするＤＮＡ断片（［ａ−ａ’−ｂ−ｂ’−ｃ−ｃ’］＝［Ａ−Ｂ−Ｃ］）が得られる条件を探索した。
〔１〕ＡとＢとのＰＣＲから［Ａ−Ｂ］を作製。得られた［Ａ−Ｂ］とＣのＰＣＲから、［Ａ−Ｂ−Ｃ］を作製する方法。
〔２〕Ａ、Ｂ、Ｃを同時にＰＣＲすることにより［Ａ−Ｂ−Ｃ］を作製する方法。
〔３〕Ａ、Ｂ、Ｃに制限酵素サイト（クルクリン−ＮｄｅＩ，クルクリン−ＢａｍＨＩ）を導入したＤＮＡを加え、ＰＣＲを行う方法。
〔４〕[Ａ−Ｂ］とＣに制限酵素サイトを導入し、ＰＣＲを行う方法。
得られた各ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動を行った結果、〔１〕および〔４〕のように［Ａ−Ｂ］を作製した後にＣと接合する方法ではいずれも目的物は得られなかった。一方、〔２〕および〔３〕のように、各断片を同時に接合させていく方法では、目的とするＤＮＡ断片（［Ａ−Ｂ−Ｃ］）の生成を確認することができた。続いて、両者のうち、制限酵素サイト部位を含む、〔３〕の方法で得られたＤＮＡ断片を、ベクターへの組み込みに用いることとした。
【００５８】
３）ＤＮＡ断片をベクターに組み込みクルクリン１発現用プラスミドを作製する。
ベクター（ｐＥＴ２２ｂ）を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで切断し、上記１．で得られたクルクリンＩのＤＮＡ断片とライゲーションを行うことにより、クルクリン１発現用プラスミド（以下ｐＣＵＲＩと呼ぶ）を作製した。トランスフォーメーション（大腸菌ＪＭ１０９へのプラスミド導入）、コロニーピックアップ、培養を経て２５個のプラスミドを抽出後、適切な分子量であった２１個について塩基配列の確認を実施した。その結果、少なくとも２つについて、クルクリンＩの塩基配列と完全に一致し、クルクリンＩ  ｃＤＮＡを含んだポリペプチド発現ベクターｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥＴ２２ｂの作製に成功した。
【００５９】
４）クルクリン１の発現を確認する。
上記３）で得られたクルクリン１発現用プラスミドｐＥＴ２２ｂを大腸菌ＢＬ２１へトランスフォーメーションし、ＬＢ培地にて培養を行った。このとき、培養液のＯＤ６００＝約０．６でＩＰＴＧを添加している。菌体を集菌、可溶化後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、分子量約１２ｋのクルクリン１の発現を確認することができた。
【００６０】
ＩＩ．クルクリン１および２の大量発現
実施例１で得たクルクリンＩＩ  ｃＤＮＡを含んだベクターであるｐＣＵＲＩＩを用い、下記のプライマーを用いたＰＣＲによりＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトを付加したクルクリンＩＩ  ｃＤＮＡを増幅した。
【００６１】
５’−ＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ（配列番号２３）
３’−ＴＧＣＣＧＣＡＧＴＣＴＴＡＡＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号２４）
【００６２】
上記のプライマーを用いたＰＣＲにより、得られたクルクリンＩＩ  ｃＤＮＡをｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入し、クルクリンＩＩｃＤＮＡを含んだポリペプチド発現ベクターｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥＴ２２ｂを得た。
【００６３】
クルクリンＩおよびクルクリンＩＩを含んだｐｌａｓｍｉｄ  ｐＥＴ２２ｂをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にトランスフォームし、クルクリン１およびクルクリン２の大量発現用大腸菌をそれぞれ調製した。
【００６４】
形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを５０μｇ／ｍｌ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ｗａｋｏ）を含むＬｕｒｉａｎ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃にて培養し、対数増殖期後期（ＯＤ６００＝約０．８）において、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加した。誘導開始２時間後に集菌し、５０ｍｌのｂｒｅａｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。超音波処理により菌体を破砕後、１４，０００ｒｐｍ，３０分間遠心し、上清（可溶画分：Ｓ）と沈殿（不溶画分：Ｐ）に分離した。沈殿を１５ｍｌのｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で懸濁し、１４，０００ｒｐｍ，３０分間遠心することにより洗浄した。なお、洗浄は３回繰り返した。Ｓと洗浄後のＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた結果、クルクリン１およびクルクリン２はともに不溶画分に含まれ、クマシー染色後のクルクリンのバンドの濃さより、発現量はそれぞれ、約１００ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌと見積もられた。
【００６５】
実施例３：リフォールディングおよび精製
洗浄済みの不溶画分Ｐを６Ｍ塩酸グアニジン溶液ｐＨ  ２．２に溶解し、１５，０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清に変性したクルクリンサンプルを得た。
１）クルクリン１ホモダイマーのリフォールディングおよび精製
変性クルクリン１の濃度を約３ｍｇ／ｍｌに調整した後、リフォールディングバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１．５６Ｍ塩酸グアニジン、３ｍＭ  ＧＳＨ（還元型グルタチオン）、０．３ｍＭ  ＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）で１０倍希釈し、２５℃、２４時間、酸化的にリフォールディングを行った。リフォールディング後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０に対して透析し、生じた沈殿を１１，０００ｒｐｍ  ３０分間の遠心操作により除去した。
上清を陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ｍｏｎｏＳ）で分離し、クルクリン１ホモダイマーを含むフラクションを得た。陽イオン交換ＨＰＬＣにて得られたフラクションについて還元下、あるいは非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クルクリン１ホモダイマーの生成を確認した。
【００６６】
２）クルクリン２ホモダイマーのリフォールディングおよび精製
変性クルクリン２のサンプルをリフォールディングバッファーＡで１０倍希釈し、２５℃、２４時間インキュベートした。生じた沈殿を１１，０００ｒｐｍ  ３０分間遠心して集めた。この沈殿にはほとんどクルクリン２のみが含まれていた。沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，６Ｍ塩酸グアニジン、４０ｍＭ  ＤＴＴに溶解し、３０℃、１時間インキュベートして全還元・変性クルクリン２のサンプルを得た。変性サンプルの濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整した後、リフォールディングバッファーＢ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，６０％エチレングリコール，１Ｍ  ＬｉＣｌ，５ｍＭ  ＧＳＨ，１ｍＭ  ＧＳＳＧ）で１００倍希釈し、１６℃、２４時間インキュベートして酸化的にリフォールディングを行った。その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析し、陰イオン交換ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ，ＤＥＡＥ）によりクルクリン２ホモダイマーを含むフラクションを得た。陰イオン交換ＨＰＬＣにて得られたフラクションについて還元下、あるいは非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クルクリン２ホモダイマーの生成を確認した。
【００６７】
３）クルクリン１／２ヘテロダイマーのリフォールディングおよび精製
変性クルクリン１と変性クルクリン２のサンプルをモル比が３：１となるように混合し、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ塩酸グアニジン  ｐＨ２．０で希釈した。この変性サンプルをリフォールディングバッファーＡで１０倍希釈し、１６℃、２４時間酸化的リフォールディングを行った。生じた沈殿を１１，０００ｒｐｍ  ３０分間遠心して除去した後、上清を２０ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。その後、陽イオン交換ＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ｍｏｎｏＳ）により、クルクリン１／２ヘテロダイマーを含むフラクションを得た（図４）。陽イオン交換ＨＰＬＣにて得られたフラクションについて還元下、あるいは非還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クルクリン１／２ヘテロダイマーの生成を確認した（図５）。クルクリン１およびクルクリン２の理論上の分子量は、それぞれ約１２．７ＫＤａおよび約１２．５ＫＤａとなり、また、クルクリン１／１ホモダイマーおよびクルクリン１／２ヘテロダイマーの理論上の分子量は、それぞれ約２５．４ＫＤａおよび約２５．３ＫＤａと計算されるところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、クルクリン１／１ホモダイマーからは、還元下で単一のクルクリン１のバンドが現れ（図５、ｃ）、一方、クルクリン１／２へテロダイマーからは還元下においてクルクリン１のバンドよりも低分子側にクルクリン２のバンドが確認され（図５、ａ、ｂ）、理論上の分子量差と符合した。
【００６８】
４）還元処理
クルクリン１ホモダイマーおよびクルクリン１／２ヘテロダイマー（５０ｍＭ  Ｎａ，Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０，タンパク質濃度４μＭ）に６０ｍＭ  ＧＳＨ，ｐＨ８．０を加え、３０℃、３０分間インキュベートし、還元処理した。このサンプルについて呈味評価を行った結果、還元処理したクルクリン１ホモダイマーには味覚変調活性は全く認められなかった。還元処理したクルクリン１／２ヘテロダイマーは味覚変調活性をほぼ保持していた。しかし、その活性が増強されることはなかった。
上記の条件で還元処理したクルクリンダイマーをゲル濾過ＨＰＬＣ（ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ）で解析した結果、未処理のダイマーと同じ位置に溶出された。このピークフラクションは非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでダイマーの位置に泳動された。また、還元処理後のサンプルを、残存している還元剤を不活性化するため、１００ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＭ）で３７℃、３０分間処理し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、いずれもダイマーの位置に泳動された。すなわち、この条件ではクルクリンダイマーはほとんど還元されない。より、強い還元条件（４０ｍＭ  ＤＴＴ，３７℃、１時間）で処理した場合、いずれのサンプルもかなりの量の白濁を生じた。遠心により沈殿を分離してＩＡＭ処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、沈殿のほとんどは還元されて生じたモノマーであった。すなわち、還元されてモノマーとなったクルクリンは溶解性が著しく低下し、沈殿することが明らかとなった。
【００６９】
実施例４：クルクリンの呈味評価
呈味評価サンプルとして、クルクリン１ホモダイマー、クルクリン２ホモダイマー、クルクリン１／２ヘテロダイマーそれぞれ４μＭ（５０ｍＭ  Ｎａ，Ｋ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ  中）を調製した。各サンプル５ｍｌを口に含み、１５秒後に呈味評価、３分後に吐出、ミリＱ水で口をゆすいだ後、５０ｍＭ  クエン酸溶液を口に含んで呈味を評価した。その結果、クルクリン１とクルクリン２ホモダイマーはいずれも味覚変調活性は示さなかった。一方、クルクリン１／２ヘテロダイマーはサンプル自体に甘味を感じ、ミリＱ水で口をゆすいだ後、さらにクエン酸を口に含んだ際に強い甘味を感じた。その強さはおよそ、０．３Ｍショ糖溶液に匹敵した。一方、クルクリン１とクルクリン２のホモダイマーを等量混合したサンプルは味覚変調活性を示さなかった。
【００７０】
実施例５：クルクリン１／２ヘテロダイマーおよびクルクリン１／１ホモダイマーの質量分析
実施例３で、ＨＰＬＣから単離して得られたクルクリン１／２ヘテロダイマーを含むサンプル（図４、ピーク１及び２）並びにクルクリン１／１ホモダイマー（図４、ピーク３）を、それぞれ２ｍｇ／ｍＬ（１％ＡｃＯＨ−２５％ＣＨ３ＯＨ  中）に調整し、シリンジポンプを用い、流速３μＬ／分で連続注入した。なお、測定にはマイクロＴＯＦ型質量分析装置（ブルカー・ダルトニクス社製）を用い、この際パラメータは、オフセット電圧−５００Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ電圧−５０００Ｖ、乾燥ガス流速４．０Ｌ／分、乾燥温度２００℃、スキャン範囲５０ｍ／ｚ−３０００ｍ／ｚであった。結果を図６−ａ、ｂに示す。クルクリン１／２ヘテロダイマーの理論上の分子量の計算値（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合４ヶ所（−８Ｈ）として）は２５２９２．４Ｄａであるところ、質量分析の結果、ピーク１成分の分子量の実測値は２５２９１．３Ｄａであり、クルクリン１／２ヘテロダイマーであることが確認された（誤差０．００４％、図６−ａ）。また、ピーク２成分の分子量の実測値は２５５５９．６Ｄａであり、クルクリン１／２ヘテロダイマーに比べて２６８Ｄａ分子量が大きかったが、２６８Ｄａの成分は不明である（データは示さず）。一方、クルクリン１／１ホモダイマーの理論上の分子量の計算値（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合２ヶ所（−４Ｈ）として）は２５４１６．６Ｄａであるところ、質量分析の結果、ピーク３成分の分子量の実測値は２５４１５．９Ｄａであり、クルクリン１／１ホモダイマーであることが確認された（誤差０．００３％、図６−ｂ）。
［配列表の説明］
配列番号１：前駆体クルクリン２をコードするＤＮＡの塩基配列。
配列番号２：前駆体クルクリン２のアミノ酸配列。
配列番号３：成熟型クルクリン２をコードするＤＮＡの塩基配列。
配列番号４：成熟型クルクリン２のアミノ酸配列。
配列番号５：前駆体クルクリン１をコードするＤＮＡの塩基配列。
配列番号６：前駆体クルクリン１のアミノ酸配列。
配列番号７：成熟型クルクリン１をコードするＤＮＡの塩基配列。
配列番号８：成熟型クルクリン１のアミノ酸配列。
配列番号９：プライマー（オリゴヌクレオチドＩ；ＣＵＲ−２）
配列番号１０：プライマー（オリゴヌクレオチドＩＩ；Ｃ４）
配列番号１１：クルクリンマイナー成分のアミノ酸部分配列。
配列番号１２：プライマー（オリゴヌクレオチドＩＩＩ；Ｎ１）
配列番号１３：プライマー（オリゴヌクレオチドＩＶ；Ｕ−ＲＡＣＥ５）
配列番号１４：プライマー（オリゴヌクレオチドＶ；ＨＤ−１）
配列番号１５：プライマー（クルクリンプライマー  ａ）
配列番号１６：プライマー（クルクリンプライマー  ａ’）
配列番号１７：プライマー（クルクリンプライマー  ｂ）
配列番号１８：プライマー（クルクリンプライマー  ｂ’）
配列番号１９：プライマー（クルクリンプライマー  ｃ）
配列番号２０：プライマー（クルクリンプライマー  ｃ’）
配列番号２１：プライマー（クルクリン−ＮｄｅＩ）
配列番号２２：プライマー（クルクリン−ＢａｍＨＩ）
配列番号２３：クルクリンＩＩ  ｃＤＮＡ増幅用プライマー
配列番号２４：クルクリンＩＩ  ｃＤＮＡ増幅用プライマー
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、新規甘味タンパク質ならびに新規味覚修飾物質を提供することが出来るので、食品の分野で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】クルクリンＩ遺伝子上における各プライマーの位置関係を示す図である。
【図２】クルクリンＩＩ遺伝子上における各プライマーの位置関係を示す図である。
【図３】クルクリン遺伝子上における各プライマーの位置関係を模式的に示した図である。
【図４】クルクリン１／２ヘテロダイマーを含む試料のＨＰＬＣチャート図である。  溶出条件は以下のとおり。 Ａ：  ２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）Ｂ：  ２０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）＋１Ｍ  ＮａＣｌ      時間（分）    Ａ％      Ｂ％          ０      １００        ０        ４０        ５０      ５０      流速：１ｍＬ／分      検出：２８０ｎｍａ：ピーク１（ヘテロダイマー［１］）ｂ：ピーク２（ヘテロダイマー［２］）ｃ：ピーク３（クルクリン１ホモダイマー）
【図５】クルクリン１／２ヘテロダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す図である。
【図６−ａ】図４のピーク１のＭＳスペクトルを表す図である。
【図６−ｂ】図４のクルクリン１／１ホモダイマーのＭＳスペクトルを表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−ａ】
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【図６−ｂ】
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【配列表】
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