(57)【要約】      （修正有）【課題】心不全の診断および管理のマーカーであるＮ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）を免疫学的に迅速に測定する方法を提供する。【解決手段】ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する２つの抗体を用いて免疫学的サンドイッチ法を行う。抗体のうちの一つはモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を用いる。抗体の組み合わせはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸配列の異なる２箇所のエピトープを認識する２抗体を用いる。種々のエピトープの組み合わせが可能である。方法として免疫クロマトグラフィーで測定を行う。【選択図】  図１
2005181304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための免疫学的サンドイッチ試験であって、
少なくとも１つがＭＡＢである、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する少なくとも２つの抗体を使用し、
これらの抗体の１つは、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸３８〜５０を含むエピトープの部分に対するものであり、
これらの抗体の１つは、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１〜３７又は４３〜７６を含むエピトープの部分に対するものであり、
上記抗体により認識されるエピトープはわずかに重複していてもよい、
ことを特徴とする、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための免疫学的サンドイッチ試験。
【請求項２】
以下の抗体の組み合わせ：
ＡＢ（３９−５０）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（１３−１６）又はＡＢ（２２−３８）又はＡＢ（２７−３１）又はＡＢ（５１−７６）又はＡＢ（６４−６７）との組み合わせ；あるいは
ＡＢ（３８−４２）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（２２−３７）又はＡＢ（４３−７６）との組み合わせ；あるいは
ＡＢ（４４−５０）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（２２−４３）又はＡＢ（５１−７６）との組み合わせ
の１つを使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項３】
以下のＰＡＢ／ＭＡＢの組み合わせ：
ＰＡＢ（３９−５０）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（１３−１６）又はＭＡＢ（２２−３８）又はＭＡＢ（２７−３１）又はＭＡＢ（５１−７６）又はＭＡＢ（６４−６７）との組み合わせ；あるいは
ＰＡＢ（３８−４２）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（２２−３７）又はＭＡＢ（４３−７６）との組み合わせ；あるいは
ＰＡＢ（４４−５０）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（２２−４３）又はＭＡＢ（５１−７６）との組み合わせ
の１つを使用することを特徴とする、請求項１又は２記載の免疫学的試験。
【請求項４】
以下の抗体の組み合わせ：
ＭＡＢ １８．４．３４（２７−３１）と、ＰＡＢ（３９−５０）又はＰＡＢ（３８−４２）又はＰＡＢ（４４−５０）との組み合わせ；あるいは
ＭＡＢ １７．３．１（１３−１６）と、ＰＡＢ（３９−５０）又はＰＡＢ（３８−４２）又はＰＡＢ（４４−５０）との組み合わせ
を使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項５】
以下の抗体の組み合わせ：
ＭＡＢ １８．４．３４（２７−３１）とＭＡＢ（３８−４２）との組み合わせ；あるいは
ＭＡＢ １８．９．８（２７−３１）とＭＡＢ（３８−４２）との組み合わせ
を使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項６】
ＭＡＢ（３８−４２）がＭＡＢ １６．１．３９（３８−４２）であることを特徴とする、請求項５記載の免疫学的試験。
【請求項７】
免疫学的迅速試験であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的試験。
【請求項８】
抗体の１つが抗体−金結合体として存在することを特徴とする、請求項７記載の免疫学的迅速試験。
【請求項９】
抗体がビオチニル化抗体として存在することを特徴とする、請求項７記載の免疫学的迅速試験。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫学的試験を用いることを特徴とする、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）を測定するための、サンドイッチ分析試験、特に試験成分、及び特にサンドイッチ法の原理を利用した免疫クロマトグラフィー試験ストリップの形態に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰは、心不全の診断及び管理のための非常に有望なマーカーである。心不全及びこの疾患のためのマーカー物質としてのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの重要性に関する概説は、例えばＷＯ００／４５１７６号の第１〜４頁（該参考文献は本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されている。さらに、米国特許第５，７８６，１６３号、同第６，４６１，８２８号、同第６，１１７，６４４号、ＥＰ １ １５１ ３０４号、ＷＯ０２／０８３９１３号及びＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（２００３年５月１２日、Ｋｌｅｍｔら）の文献は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、これに対する抗体、及び測定方法に関する。
【０００３】
現在、診断市場ではｉｎ−ｖｉｔｒｏでのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験しか入手可能ではなく、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製の完全自動化Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験であり、これは、電気化学発光検出を用いたサンドイッチ反応に基づいている。この試験は、巨大な中央研究所において使用する目的で設計されており、また、正確に計量した液体試薬を使用するため、液体を計量し、また試験を行うためには発光シグナルを検出するための比較的複雑な機械が必要である。必要であれば評価装置を使用することなく可視的に評価することのできる、取扱いが簡便なＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの迅速試験は現在市場にはない。
【０００４】
物質を免疫学的に検出するための迅速試験は、長い間、例えばＷＯ９７／０６４３９号、ＥＰ ０ ２９１ １９４号、米国特許第５，５９１，６４５号、同第４，８６１，７１１号、同第５，１４１，８５０号、同第６，５０６，６１２号、同第５，４５８，８５２号、同第５，０７３，４８４号に記載されるように、多くの種々のパラメーターについて知られている。これらの場合、免疫学的検出試薬（本質的には、標識及び未標識の抗体又は抗原）は、通常、支持体上又は支持体中に存在する液体サンプル（特に、血液、血清、血漿、尿、唾液などの体液）の移動が可能となるよう支持体上に乾燥形態で提供される。この目的のため、支持体は、好ましくは毛管作用を有するもの、例えばキャピラリー溝を備えた膜又はプラスチック製支持体である。当業者においては、これらは免疫クロマトグラフィー試験ストリップ又は試験装置と呼ばれることが多い。
【０００５】
急性呼吸窮迫症の患者においては、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの測定をできる限り迅速に行って、呼吸困難が原因で生じる心不全を排除又は診断し、適切な処置を開始することが好ましい。Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験は中央研究所においてのみ実施できるものであるため、日常の時間外でＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを迅速に測定することは困難である。従って、日常の時間外に救急病棟内で直接実施することができる迅速試験が利用可能であれば、救急病棟に特に利益がもたらされるだろう。しかしながら、この迅速試験は、実際に行われる試験の種類とは無関係に結果が良好な適合性を満たすように、中央研究所の基準方法（Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）と同じ基準範囲及びカットオフ値を保証する必要がある。
【０００６】
Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験で使用されるポリクローナル抗体（ＰＡＢ）は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの非常に特別な分画を認識するものである（「ネイティブ」ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ；ＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（２００３年５月１２日、Ｋｌｅｍｔら）、この試験では、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１−２１（ＡＡ１−２１）及び３９−５０（ＡＡ３９−５０）を含むエピトープを認識する）。しかしながら、これらのポリクローナル抗体は、標識としてコロイド金などの粒状標識を使用するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ迅速試験には不適切であることが判明した。その理由は、これらの標識が、迅速試験の成分（例えば、支持部材、マトリックスなど）との物理−化学的相互作用によりシグナル発生において高い変動を示すが、これは好ましくないためである。このため、バッチ間で試験の質に顕著な変動が生じる。
【特許文献１】ＷＯ００／４５１７６号
【特許文献２】米国特許第５，７８６，１６３号
【特許文献３】米国特許第６，４６１，８２８号
【特許文献４】米国特許第６，１１７，６４４号
【特許文献５】ＥＰ １ １５１ ３０４号
【特許文献６】ＷＯ０２／０８３９１３号
【特許文献７】ＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（２００３年５月１２日、Ｋｌｅｍｔら）
【特許文献８】ＷＯ９７／０６４３９号
【特許文献９】ＥＰ ０ ２９１ １９４号
【特許文献１０】米国特許第５，５９１，６４５号
【特許文献１１】米国特許第４，８６１，７１１号
【特許文献１２】米国特許第５，１４１，８５０号
【特許文献１３】米国特許第６，５０６，６１２号
【特許文献１４】米国特許第５，４５８，８５２号
【特許文献１５】米国特許第５，０７３，４８４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、本発明の目的は、従来技術の不都合点を解消することである。特に、再現性をもって実施され、かつ研究室で用いられる方法と良好な相関を示す、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための迅速試験を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、本発明により達成される。
【０００９】
本発明は、免疫学的試験、特に、特許請求の範囲の独立項に記載されるような分析試験用成分などの迅速試験の形態に関する。従属項に記載される実施形態が好ましい。
【００１０】
サンドイッチ形式の免疫学的試験、特にＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)の基準方法と十分に相関する迅速試験を実施するための本発明の解決手段は、少なくとも１つの抗体はモノクローナル抗体（ＭＡＢ）である、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する少なくとも２つの抗体を含む特定の抗体の組み合わせを使用するものである。本発明に係るサンドイッチ試験の別の抗体は、ＭＡＢであってもよいし又はポリクローナル抗体（ＰＡＢ）であってもよい。この点に関し、これらの抗体（ＡＢと略す）の１つは、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸３８〜５０を含むエピトープの部分に対して作製されたものである（以下、ＡＢ（３８−５０）又はＭＡＢ（３８−５０）又はＰＡＢ（３８−５０）と略す）。別の少なくとも１つの抗体は、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１〜３７又は４３〜７６を含むエピトープの部分に対して作製されたものである（以下、ＡＢ（１−３７）若しくはＡＢ（４３−７６）又はＭＡＢ（１−３７）若しくはＭＡＢ（４３−７６）又はＰＡＢ（１−３７）若しくはＰＡＢ（４３−７６））。上記抗体により認識されるエピトープは、わずかに重複していてもよく、好ましくは５アミノ酸未満、特に好ましくは２アミノ酸未満が重複していてもよい。
【００１１】
抗体の組み合わせは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する少なくとも１つのポリクローナル抗体（ＰＡＢ）と１つのモノクローナル抗体（ＭＡＢ）を含む（いわゆるＰＡＢ／ＭＡＢ組み合わせ）ことが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本特許出願において使用するＰＡＢ（Ｘ−Ｙ）という用語は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸Ｘ〜Ｙを含むエピトープに対して作製されたポリクローナル抗体を意味する。ＭＡＢ（Ｘ−Ｙ）は対応するモノクローナル抗体である。ＡＢ（Ｘ−Ｙ）は、一般的にはＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸Ｘ〜Ｙを含むエピトープに対して作製された抗体（例えばＰＡＢ又はＭＡＢ）を意味する。
【００１３】
ＭＡＢ ａ．ｂ．ｃ．（Ｘ−Ｙ）は、寄託細胞系ａ．ｂ．ｃから得られる、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸Ｘ〜Ｙを含むエピトープに対して作製されたモノクローナル抗体である。
【００１４】
抗体と標識との結合体の品質の再現性を保証するために、ＭＡＢを、粒状標識、特に金標識上に固定化することが好ましい。他の好適な粒状標識としては、例えば、着色ラテックス、他の金属ゾル標識、ポリマー標識又は半導体ナノ結晶（いわゆる量子ドット）などがある。ＭＡＢ−標識結合体は、例えば、好適な支持部材（フリース、膜など）を浸漬することにより、サンプル液体により迅速分析装置から分離できるように迅速試験装置に提供することが好ましい。しかしながら、ＭＡＢ−標識結合体は、溶液として迅速試験に添加することも可能である。
【００１５】
哺乳動物、特にヒツジ、ヤギ又はウサギを免疫することにより好ましく得られるＰＡＢは、ビオチン誘導体として迅速試験に提供することが好ましく、アビジン又はストレプトアビジン検出系に結合させてもよい。しかしながら、迅速試験装置においてＰＡＢを直接固定化することも可能であり、例えば適当なクロマトグラフィー膜上の検出系の形態で固定化することが可能である。
【００１６】
本発明においては、それほど好ましくはないが、標識ＡＢ、特に標識ＭＡＢと、第二抗体、特に迅速試験のための溶液（１種又は複数）中の第二ＭＡＢ又はＰＡＢを使用することも可能である。適当に標識されたＡＢを捕捉することができる結合パートナーを試験装置の検出ゾーンに配置して、それにより第一抗体、分析対象物及び第二抗体を含むサンドイッチ複合体を迅速試験の固相に結合させることもできる。
【００１７】
本発明において使用されるＭＡＢは、基準系（Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)試験）と良好な相関を満たすために、該基準系において検出されるエピトープ（ＡＡ１−２１）を認識する必要は必ずしもない。請求項１に示される抗体の組み合わせ、特にＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）及びＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）のＭＡＢ／ＰＡＢ組み合わせは、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのエピトープＡＡ１−２１及びＡＡ３９−５０に対するポリクローナル抗体（（ＰＡＢ（１−２１）及びＰＡＢ（３９−５０））を使用するＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)基準系と十分に相関する。
【００１８】
ＰＡＢ（１−２１）及びＰＡＢ（３９−５０）などのポリクローナル抗体は、当業者に公知の方法、特にＷＯ００／４５１７６号の実施例２と類似の方法により取得し、特性決定し、同定することができる。
【００１９】
ＭＡＢ（３８−４２）及びＭＡＢ（４４−５０）などのモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、特にＷＯ００／４５１７６号の実施例３、又はＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（Ｋｌｅｍｔら、２００３年５月１２日）の実施例３と類似の方法により取得し、特性決定し、同定することができる。
【００２０】
抗体は、当業者に公知の方法により、例えば金又は他の標識、ビオチンなどで標識する（ＷＯ００／４５１７６号の実施例２、ＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（Ｋｌｅｍｔら、２００３年５月１２日）の実施例２を参照）。金を用いた標識は、例えばＥＰ−Ａ ０ ８９８ １７０号に詳細に記載されている。
【００２１】
特に、好ましいモノクローナル抗体ＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）、ＭＡＢ１６．１．３９（３８−４２）、ＭＡＢ１８．２９．２３（６４−６７）及びＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）は、ＥＰ特許出願第０３ ０１０ ５９１．０号（Ｋｌｅｍｔら、２００３年５月１２日出願）の実施例３に従って取得することができる。対応する細胞系は、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＺＭ）」に以下の受託番号及び受託日で寄託されている：ＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）についてはＤＳＭ ＡＣＣ２５９１（２００３年５月７日）；ＭＡＢ１６．１．３９（３８−４２）についてはＤＳＭ ＡＣＣ２５９０（２００３年５月７日）；ＭＡＢ１８．２９．２３（６４−６７）についてはＤＳＭ ＡＣＣ２５９３（２００３年５月７日）；及びＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）についてはＤＳＭ ＡＣＣ２５９２（２００３年５月７日）。
【００２２】
ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）の組み合わせは、ＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）の組み合わせを用いる基準試験と比較的良好な相関を示す（実施例２も参照）。
【００２３】
さらに、ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）の組み合わせが本発明に係る試験に特に有利であると証明された。この組み合わせによって、迅速試験に特に好適な機能曲線を使用し得る（実施例３参照）。相対的に、ＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）の組み合わせは試験感度が良好ではないことが示された。
【００２４】
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに説明する。
【実施例１】
【００２５】
全血からＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための試験装置の準備（図１参照）
試験装置（図１）は、サンプル導入ゾーン（１）、赤血球分離ゾーン（２）、検出ゾーン（３）、及び吸引ゾーン（４）が備え付けられた支持部材（５）から構成される。赤血球分離ゾーン（７）と部分的に重複するサンプル導入マトリックス（６）は、サンプル導入ゾーン（１）に配置されている。次に、赤血球分離マトリックス（７）は、線状に固定化物質が塗布されている（９）検出マトリックス（８）（検出ゾーン）と若干重複している。吸引マトリックス（１０）は検出マトリックス（８）と若干重複している。検出しようとする分析対象物との複合体を形成するために必要なすべての試薬は、サンプル導入マトリックス（６）に供給する。この場合、サンプル導入ゾーンは、重なり合う２つのフリースからなり、第１フリース（金フリース）はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１））に対する金標識抗体を含浸させたものであり、第２フリース（ビオチンフリース）はＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ＰＡＢ（３９−５０））に対するビオチニル化抗体を含有する。ストレプトアビジンで作製された線（９）は検出ゾーン（３）内に設ける。
【００２６】
３５０μｍ厚のプラスチック薄片（Ｐｕｔｚ）を支持層（５）として使用する。３６０μｍ厚のポリエステルフリース（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をサンプル導入マトリックス（６）の「金フリース」及び「ビオチンフリース」として使用する。１．８ｍｍ厚のガラスファイバーフリース（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を赤血球分離マトリックス（７）として使用する。１４０μｍ厚のニトロセルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を検出マトリックス（８）として使用する。１．８ｍｍ厚のガラスファイバーフリース（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を吸引マトリックス（１０）として使用する。個々の構成要素（６、７、８、１０）を、図１に示すように、若干重複させて熱溶解接着剤で支持層（５）上に接着する。
【００２７】
「金及びビオチンフリース」の含浸製剤は、以下のとおりである：
「ビオチンフリース」：１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１％ Ｔｗｅｅｎ(登録商標)、２０μｇ／ｍｌビオチニル化ＰＡＢ（３９−５０）
「金フリース」：１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、ＯＤ４ ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）金結合体
【実施例２】
【００２８】
Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)形式におけるエピトープ／抗体の組み合わせＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）及びＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）と、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験キットの相関（図２及び３参照）
ＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）とＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）のＭＡＢ／ＰＡＢ組み合わせとＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)試験キット（ＰＡＢ（１−２１）／ＰＡＢ（３０−５０））との相関を、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)２０１０（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて電気化学発光イムノアッセイにおいて調べた。このため、ＰＡＢ（３９−５０）をビオチニル化捕捉試薬として使用し、ＭＡＢのルテニウム付加Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを検出試薬として使用した。２０μｌのサンプル又は標準物質をそれぞれ、７５μｌの２つの抗体試薬と共に、３７℃にて９分間インキュベートした。その後、３５μｌのストレプトアビジン被覆磁性ポリスチレン粒子を添加し、さらに室温にて９分間インキュベートした。インキュベーション溶液のアリコートの電気発光シグナルを慣用法に従ってＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)２０１０で測定し、標準曲線を用いて濃度シグナルに変換した。
【００２９】
この時点で、心不全患者由来の臨床サンプルを２つのＭＡＢ／ＰＡＢ改変試験とＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)キットを用いて測定した。結果を図２及び３に示す。両方のＭＡＢ／ＰＡＢ改変試験を用いて、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)キットに対する非常に良好な相関（ｒ＝０．９７８及びｒ＝０．９５７）が達成された。
【実施例３】
【００３０】
２つの異なるＭＡＢ／ＰＡＢ組み合わせを用いたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験ストリップの機能曲線
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験ストリップを実施例１と同様にして準備した。試薬フリースのために以下の含浸製剤を使用した：
「ビオチンフリース」：１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ(登録商標)、
２０μｇ／ｍｌビオチニル化ＰＡＢ（３９−５０）
「金フリース」：１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、ＯＤ４  ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）又はＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）金結合体
【００３１】
健常ドナーからのヘパリン添加血液サンプルに心不全患者のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含有血清を混合し、等分した。１５０μｌの混合血液サンプルを試験ストリップにピペットで導入し、標準法に従ってＣＡＲＤＩＡＣ Ｒｅａｄｅｒ(登録商標)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。サンプル検出後の反応時間は１２分とした。サンプルのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度を測定するために、１つのアリコートから血漿を遠心分離し、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて測定した。２つの改変試験ストリップＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）及びＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）を用いて得られた機能曲線を図４に示す。ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）改変試験は顕著に急勾配の標準曲線を示し、より高感度な試験といえる。
【実施例４】
【００３２】
Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験キットに対するＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験ストリップとＡＢ組み合わせ（Ａｕ−ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／Ｂｉ−ＰＡＢ（３９−５０））の相関
心不全患者からのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ含有血清を健常ドナー由来のヘパリン添加血液サンプルに添加し、等分した。１５０μｌのこれらの「混合（ｓｐｉｋｅｄ）」血液サンプルを試験ストリップにピペットで導入し、ＣＡＲＤＩＡＣ Ｒｅａｄｅｒ(登録商標)（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で標準的な方法に従って測定した。同じサンプルに由来する血漿を遠心分離し、Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰキットを用いてＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)１０１０分析システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で測定した。６０サンプルをこのようにして調製し、両方のシステムで測定した。図５は、両方のシステムで測定した値を示す。相関はｒ＝０．９５で非常に良好であった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係る迅速試験装置の免疫クロマトグラフィー試験ストリップの形態の好ましい実施形態の概略を示す。
【図２】Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)湿潤試験形式における抗体の組み合わせＭＡＢ１７．３．１（１３−１６）／ＰＡＢ（３９−５０）とＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)基準法ＰＡＢ（１−２１）／ＰＡＢ（３９−５０）との相関を示す。
【図３】Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)湿潤試験形式における抗体の組み合わせＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／ＰＡＢ（３９−５０）とＥｌｅｃｓｙｓ(登録商標)基準法ＰＡＢ（１−２１）／ＰＡＢ３９−５０）との相関を示す。
【図４】実施例１に記載した、種々の抗体組み合わせを用いたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験ストリップの機能曲線を示す。
【図５】Ｅｌｅｃｓｙｓ(登録商標)ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験キットに対する、Ａｕ−ＭＡＢ１８．４．３４（２７−３１）／Ｂｉ−ＰＡＢ（３９−５０）の抗体の組み合わせを用いたＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試験ストリップの相関を示す。
【符号の説明】
【００３４】
１  サンプル導入ゾーン
２  赤血球分離ゾーン
３  検出ゾーン
４  吸引ゾーン
５  支持部材
６  サンプル導入マトリックス（ビオチンフリース及び金フリース）
７  赤血球分離マトリックス
８  検出マトリックス
９  線形固定ゾーン
１０  吸引マトリックス
【図１】
2005181304.tif 000003
【図２】
2005181304.tif 000004
【図３】
2005181304.tif 000005
【図４】
2005181304.tif 000006
【図５】
2005181304.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月26日(2004.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための免疫学的サンドイッチ試験であって、
少なくとも１つがＭＡＢである、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰに対する少なくとも２つの抗体を使用し、
これらの抗体の１つは、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸３８〜５０を含むエピトープの部分に対するものであり、
これらの抗体の１つは、少なくともＮＴ−ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸１〜３７又は４３〜７６を含むエピトープの部分に対するものであり、
上記抗体により認識されるエピトープはわずかに重複していてもよい、
ことを特徴とする、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを測定するための免疫学的サンドイッチ試験。
【請求項２】
以下の抗体の組み合わせ：
ＡＢ（３９−５０）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（１３−１６）又はＡＢ（２２−３８）又はＡＢ（２７−３１）又はＡＢ（５１−７６）又はＡＢ（６４−６７）との組み合わせ；あるいは
ＡＢ（３８−４２）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（２２−３７）又はＡＢ（４３−７６）との組み合わせ；あるいは
ＡＢ（４４−５０）と、ＡＢ（１−２１）又はＡＢ（２２−４３）又はＡＢ（５１−７６）との組み合わせ
の１つを使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項３】
以下のＰＡＢ／ＭＡＢの組み合わせ：
ＰＡＢ（３９−５０）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（１３−１６）又はＭＡＢ（２２−３８）又はＭＡＢ（２７−３１）又はＭＡＢ（５１−７６）又はＭＡＢ（６４−６７）との組み合わせ；あるいは
ＰＡＢ（３８−４２）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（２２−３７）又はＭＡＢ（４３−７６）との組み合わせ；あるいは
ＰＡＢ（４４−５０）と、ＭＡＢ（１−２１）又はＭＡＢ（２２−４３）又はＭＡＢ（５１−７６）との組み合わせ
の１つを使用することを特徴とする、請求項１又は２記載の免疫学的試験。
【請求項４】
以下の抗体の組み合わせ：
ＭＡＢ １８．４．３４（２７−３１）と、ＰＡＢ（３９−５０）又はＰＡＢ（３８−４２）又はＰＡＢ（４４−５０）との組み合わせ；あるいは
ＭＡＢ １７．３．１（１３−１６）と、ＰＡＢ（３９−５０）又はＰＡＢ（３８−４２）又はＰＡＢ（４４−５０）との組み合わせ
を使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項５】
以下の抗体の組み合わせ：
ＭＡＢ １８．４．３４（２７−３１）とＭＡＢ（３８−４２）との組み合わせ；あるいは
ＭＡＢ １８．９．８（２７−３１）とＭＡＢ（３８−４２）との組み合わせ
を使用することを特徴とする、請求項１記載の免疫学的試験。
【請求項６】
ＭＡＢ（３８−４２）がＭＡＢ １６．１．３９（３８−４２）であることを特徴とする、請求項５記載の免疫学的試験。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫学的試験を用いることを特徴とする、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの検出方法。
【外国語明細書】
2005181304000001.pdf