(57)【要約】【課題】泳動高速化・高分解能化が可能な末端検出型のキャピラリー電気泳動装置を得る。【解決手段】キャピラリーの内径が２０μｍ以上８０μｍ以下、かつ、内径／ガラス外径≧０．３４を満たす電気泳動装置とする。【効果】高い蛍光検出感度を維持しつつ、分析が高速化されるとともに，分離能も向上する。【選択図】図１０
2005274365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０  かつ  Ｄ１／Ｄ２≧０．３４
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項２】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．０以上であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項３】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．２以上であって，Ｄ１／Ｄ２≧０．４３であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項４】
前記分離媒体の屈折率は、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項1に記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項５】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記ガラス製キャピラリーの外表面の少なくとも一部は、ポリマーでコーティングされ，前記ポリマーの屈折率をｎｃ，前記分離媒体の屈折率をｎｐ，前記レンズのＦナンバーをＦとするとき，
０．５／（ｎｐ２−ｎｃ２）０．５≦Ｆ
であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項６】
ｎｐは、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項７】
前記コーティングの厚さは１０μｍ以上であることを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項８】
前記ポリマーの屈折率は、前記分離媒体の屈折率よりも小さいことを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項９】
前記キャピラリーは複数設けられ、前記一方の端部は２次元的に配置されていることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１０】
前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１１】
前記キャピラリーは複数設けられ、前記複数のキャピラリーに光ビームを照射する光源と、前記光源と前記キャピラリーとの間に、前記光ビームを前記キャピラリーが並ぶ方向に広げるレンズとを有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１２】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーを延長した方向から、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０  かつ
Ｄ２≦−０．０００３２８Ｄ１３＋０．０６０４Ｄ１２＋０．７１６Ｄ１―１５
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１３】
前記分離媒体の屈折率は、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項1２に記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１４】
前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有することを特徴とする請求項１２記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１５】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
（Ｄ１＝７５±３かつＤ２≦２５３）または
（Ｄ１＝５０±３かつＤ２≦１４４）または
（Ｄ１＝４０±３かつＤ２≦１０２）
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１６】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．０以上であることを特徴とする請求項１５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１７】
円筒状のガラス製キャピラリーであって，その内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，  ２０≦Ｄ１≦８０  かつ  Ｄ１／Ｄ２≧０．３４  であることを特徴とするキャピラリー。
【請求項１８】
前記キャピラリーは、
（Ｄ１＝７５±３かつＤ２≦２５３）または
（Ｄ１＝５０±３かつＤ２≦１４４）または
（Ｄ１＝４０±３かつＤ２≦１０２）
であることを特徴とする請求項１７記載のキャピラリー。
【請求項１９】
前記キャピラリーは、アレイ状に形成されていることを特徴とする請求項１７記載のキャピラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光標識されたＤＮＡ，ＲＮＡや蛋白などの試料を電気泳動により分離し，レーザー励起蛍光検出することにより，ＤＮＡの塩基配列，塩基長など、試料を分析するキャピラリー及び電気泳動装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、蛍光標識されたDNAなどの試料を電気泳動によって分子量分離し、試料にレーザを照射して蛍光標識から発する蛍光を検出し、検出される一連の信号を解析する、いわゆる電気泳動装置が用いられている。
蛍光の検出には、様々な方法があるが、特開平９―９６６２３号（特許文献１）では，キャピラリー中を電気泳動するＤＮＡにレーザビームを照射し，ＤＮＡから放射された蛍光を試料の泳動方向に直交する方向から検出している。本願明細書では、このように、試料の泳動方向に対して直交する方向から検出する蛍光検出方法を、「直交検出」と呼ぶ。
【０００３】
一方、特開平８―２６１９８８号（特許文献２）では，泳動板中を電気泳動するＤＮＡにレーザビームを照射し，ＤＮＡから放射された蛍光をＤＮＡが泳動する方向から検出している。同様に、Electrophoresis 2000, vol.21, pp. 3290-3304.（非特許文献1）及びＷＯ 00/04371（特表２００２−５２０６１６号報、特許文献３）、特開平１０−１９８４６号（特許文献４）では，キャピラリー中を電気泳動するＤＮＡにレーザビームを照射し，ＤＮＡから放射された蛍光をＤＮＡが泳動する方向から検出している。非特許文献1及び特許文献３、４では，蛍光をキャピラリー自身を導波路としてキャピラリー末端まで伝送し，キャピラリー末端から放射された蛍光を液槽を介して検出している。以下ではこの蛍光検出法を「末端検出」と呼ぶ。
【０００４】
末端検出における蛍光伝送は，キャピラリー中での内部全反射現象に基づいている。一方，キャピラリー電気泳動（Capillary Electrophoresis, ＣＥ）によるＤＮＡシーケンシングでは，ポリマーでコーティングされた屈折率１．４６の石英ガラスキャピラリーを使用し，内径には屈折率約１．４（１．３６〜１．４２）のＤＮＡ分離媒体が充填される。この場合，内径中媒体の屈折率よりガラスの屈折率が高いので，内径内から放射された蛍光は内径／ガラス界面では全反射しない。従って末端検出をＤＮＡシーケンシングに適用するには，蛍光をポリマー／ガラス界面で全反射させなければならない。そのためには，屈折率が１．４より小さいポリマーでコーティングされたキャピラリーを使用する必要がある。このようなキャピラリーは， Polymicro Technology LLCから型番TSU100375またはTSU075375の標準品として供給されている。これらのキャピラリーはいずれも屈折率１．３１のフッ素系ポリマーでコーティングされ，コーティングを含めた外径は３７５μｍ，コーティングの厚さは１５μｍ，従ってガラス外径は３７５―１５×２＝３４５μｍである。また，TSU100375及びTSU075375の内径はそれぞれ，１００μｍ及び７５μｍである。非特許文献1及び特許文献３では，内径１００μｍのTSU100375が使用されている。
【０００５】
末端検出は，発光点を励起ビーム照射位置でのキャピラリー配置にかかわり無く２次元的に配置でき，多数のキャピラリーの集積に適している。非特許文献1では91本のTSU100375を集積し，91個のDNA試料の同時シーケンシングに成功している。
また、Analytical Chemistry 1998, vol.70, pp. 3996-4003（非特許文献２）やElectrophoresis 2001, vol.22, pp. 629-643（非特許文献３）では、内径が８０μｍより小さいキャピラリーの場合、分解能が良い旨記載されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平９―９６６２３号報。
【０００７】
【特許文献２】特開平８―２６１９８８号報。
【０００８】
【特許文献３】ＷＯ 00/04371（特表２００２−５２０６１６号報）
【０００９】
【特許文献４】特開平１０−１９８４６号
【非特許文献１】Electrophoresis 2000, vol.21, pp. 3290-3304.
【非特許文献２】Analytical Chemistry 1998, vol.70, pp. 3996-4003.
【非特許文献３】Electrophoresis 2001, vol.22, pp. 629-643.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、非特許文献１では、内径１００μｍのキャピラリーを１００Ｖ／ｃｍの電界強度で使用しており、その結果，１５４ベースの平均泳動時間３８分，最大解読長４３０ベースを得ている。しかし、今日の大規模ＤＮＡ解析では，同時処理可能な試料数の大きさとともに，より高速かつ高分離能な分析が求められており、泳動時間、最大解読長共に十分でない。
また、末端検出では、キャピラリーの内径から蛍光検出しなければならないので、集光効率を下げることなく、良好な感度を維持することに留意しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
まず、本願の発明の構成を開示する前に、キャピラリーの内径／外径比と感度について説明する。
ジュール熱の影響が無視できる限り，電界強度が高いほど，分離能は向上し，分析時間は短縮される。つまり，より短時間で長塩基長まで解読できる。それゆえ最近のＣＥベースのＤＮＡシーケンシングでは，非特許文献１の１００Ｖ／ｃｍよりも高い電界強度，１５０Ｖ／ｃｍ以上が一般的に用いられている。同時に，ジュール熱の増加による電気泳動的分離能の低下を避けるため，内径を小さくする。
【００１２】
即ち、非特許文献１に記載のシステムを実用的なものとするには，ジュール熱の増加による電気泳動的分離能の低下を避けるため、８０μｍ以下に変更する必要がある。この変更は，TSU100375の替わりにTSU075375を使用すれば可能である。しかしながら，末端検出では，ガラス外径をそのままにして内径のみを小さくすると蛍光の集光効率が下がり，感度が低下する。感度を維持しつつ内径を小さくするには，同時にガラス外径を小さくすることが必須である。これは以下のように説明される。
【００１３】
図1は末端検出を用いたキャピラリー電気泳動装置の基本構成を示す。レーザー２から射出された励起光は照射レンズ３でキャピラリー１に集光される。キャピラリー内で励起された蛍光は内部全反射により端面まで伝送される。端面から放射された蛍光は液槽４を介して集光レンズ６で平行光束にされ，フィルタ７で蛍光以外の光を遮断した後に，結像レンズ８でＣＣＤカメラ９の光電面上に結像される。高圧電源２６によって液槽４と液槽５の間に電圧が印加され，キャピラリー中を検体分子が電気泳動する。図２はキャピラリー断面の拡大図である。石英ガラス製のキャピラリーは，内径にＤＮＡ分離媒体が充填され，周囲にはポリマーがコーティングされている。本明細書では，図２に示したように，内径をＤ１，石英ガラスの外径をＤ２，コーティングを含めた最外径をＤ３で表す。
【００１４】
図３は蛍光を検出する側のキャピラリー端部の拡大図であり，末端検出における光線の伝播経路を示す。キャピラリー末端近傍ではキャピラリー中心軸と集光レンズ光軸は一致するので，以下では単に光軸と呼ぶ。レーザビームの照射点においては，光軸に対して同一の角度θで放射された２本の蛍光光線（光線１，光線２）を考える。図に示したように，末端検出では，蛍光は内径とガラス部の両方を伝播し，末端においてもこの両方から放射される。光線１は最終的に内径から放射される場合，光線２はガラス部から放射される場合に対応する。光線１及び光線２が，キャピラリー末端から放射され，液槽４底面を透過して空気中に出た時に光軸となす角度をそれぞれφ1，φ2とする。光線１及び２がガラス内に入ったときに光軸となす角は両方の光線について共通であるので，これをθｇとする。内径内のＤＮＡ分離媒体の屈折率（≒１．４）＜ガラスの屈折率（１．４６）なので，光線はθ＜θｇとなるように屈折する。光線１のように，内径内に戻ってキャピラリー端面を出てゆく場合は，再度の屈折により，光線が光軸となす角はθに戻る。一方，光線２のようにガラス内に入ったまま端面から出てゆく場合には，屈折がほとんどおこらず，光線が光軸となす角はほとんどθｇのままである。
【００１５】
この結果，最終的に空気中に出て行った状態においても，φ1＜φ2となる。励起点では光軸に対して同一の角度θで放射された光線でも，内径から放射されれば集光レンズで集光され，ガラスから放射されると集光されない，ということがおこる。つまり，ガラス部から放射された光線に対する末端検出の効率は，内径から放射された光線に対するものに比べ低くなる。なお，内径から放射された光線に対する末端検出の集光効率は従来の直交検出の集光効率と実質的に同等である。以上の問題を定量的に議論するため，以下では図1の構成において，総量１の蛍光が励起点において等方的に放射され，端面から放射されて集光レンズ６で補足された蛍光はフィルタ７を１００％透過し，ＣＣＤカメラ９の光電面上に倍率１でキャピラリー端面の蛍光像が結像されると仮定する。さらにＣＣＤ上では，端面像と同心の直径ｄの円形の領域で電荷をビニングする。このとき，ＣＣＤで検出される蛍光の量Ｓは以下の数１で表される。
【００１６】
【数１】
2005274365.tif 000003
ここで
【００１７】
【数２】
2005274365.tif 000004
ｎｇは石英ガラスの屈折率＝１．４６、ｎＰはＤＮＡ分離媒体の屈折率≒１．４（１．３６〜１．４２），ｎｃはキャピラリーのコーティングの屈折率＝１．３１，Ｆは集光レンズのＦナンバーである。図４は非特許文献１と同一の集光レンズ（Ｆ＝０．９５）の場合における，ｄに対するＳのプロットである。一般にＳのプロットはｄ＝Ｄ1において折れ曲がる折れ線となり，その傾きは
【００１８】
【数３】
2005274365.tif 000005
で与えられる。ガラス部分からの集光効率が低いことに対応して，つねにｍ1＞ｍ２である。一方，ＤＮＡ濃度が希薄な場合のＣＣＤのノイズはビニング領域の直径dの関数として以下の数４のようにあらわされる。
【００１９】
【数４】
2005274365.tif 000006
ここでid は単位面積あたりのＣＣＤの暗電流，T はサンプリング間隔，Nr はリードアウトノイズである。ＤＮＡシーケンサにおける典型的な条件として，浜松ホトニクス社製の冷却ＣＣＤ７０１ｘシリーズを０℃冷却，サンプリング間隔1秒で用いた場合（idＴ= 0.0347 electron/mm2 , Ｎｒ＝8electrons）における，Ｎ（ノイズ）とｄの関係を図５に示す。
【００２０】
一般にＮはdに対して単調に増加し，ｄが十分大きい時は直線的に増加する。図６は，図４と図５に基づいて求めた，Ｓ/Ｎとｄの関係を示す。図６はＤ1＝１００の場合であるが，一般にＳ/Ｎはｄ＝Ｄ1において最大となる。つまり末端検出においては，ビニング領域は内径とほぼ同程度にするのが良く，ビニング領域を広げて端面のガラス部分から放射された蛍光まで検出するとＳ/Ｎが下がってしまう。いいかえれば末端検出ではガラス部分から放射される蛍光は検出しても無駄であり，感度を高めるには内径から放射される蛍光の量を増やさなければならない。もし，ガラス外径を同一のまま，内径を小さくすると，蛍光のガラス部から放射される割合が増加し，内径から放射される割合が減少してしまう。これが内径を小さくしたとき，同時にガラス外径も小さくしなければならない理由である。
【００２１】
一方，すでに述べたように，末端検出の集光効率は，内径から放射される蛍光に対しては直交検出と同一である。従って，端面で内径から蛍光が放射される割合が１００％である場合に，トータルでの集光効率が末端検出と直交検出で同一になる。現実にはガラス部を無くすことはできないので，ガラス部から放射される割合を０％とすることは不可能である。つまり，末端検出の集光効率は常に直交検出に若干劣っている。非特許文献1ではＤＮＡシーケンシングが成功しているが，当業者としては、従来の直交検出方式のＤＮＡシーケンサーのユーザーにとってはこれ以上の集光効率及び感度の低下は容認しがたいと考えるのが一般的である。そこで以下では，内径を８０μｍ以下にし，なおかつ非特許文献1と同等以上の集光効率及び感度を維持する条件について詳細に検討する。
【００２２】
Ａ．まず、第１の構成を以下に述べる。
上で述べたように，末端検出では内径から放射されて検出される蛍光のみが有効であり，この量が末端検出の集光効率を表す。この光量はビニング領域の直径ｄ＝Ｄ1としたときのＳとして式（１）から求められ，
【００２３】
【数５】
2005274365.tif 000007
となる。図７はＦ０．９５，Ｆ１．１及びＦ１．２のそれぞれの場合における，Ｓ０とＤ１／Ｄ２の関係を示す。Ｆ＝０．９５，Ｄ１／Ｄ２＝０．２９の点が非特許文献1及び特許文献３の場合に相当する。
【００２４】
一方，Ｆ＜1であるようなレンズは一般に収差が大きく，焦点距離及び作動距離が小さくて視野が狭いなどの短所が有る。非特許文献1ではＦ＝０．９５，焦点距離２５ｍｍのレンズを使用して，キャピラリー間クロストーク０．４％を実現しているが，医療応用などを考慮すると，ＤＮＡシーケンサーのクロストークはより低いことが望ましい。それには焦点距離が５０ｍｍ以上の低収差のカメラレンズが望ましいが，このようなレンズは一般にＦ≧1であり，実用的にはＦ＝１．１か１．２が限界である。図７が示すように，このようなレンズを用いる場合，非特許文献１（Ｆ＝０．９５，Ｄ１／Ｄ２＝０．２９）と同等以上のＳ０が得られる条件はＤ１／Ｄ２≧０．３４となる。特に，工業的に製造しやすく低コストなＦ≧１．２のレンズを用いる場合には，Ｄ１／Ｄ２≧０．４３が必要である。
【００２５】
ここで、２０μｍより小さい内径は，つまり易い，レーザビームを照射しにくい，などの理由のため、内径は２０μｍ以上にする必要がある。また、高電界を用いて分離能を高め、かつジュール熱の増加による電気泳動的分離能の低下を避けるために、内径を８０μｍ以下とする。
【００２６】
また，従来の直交検出では，集光レンズのＦナンバーＦを小さくすればするほど集光効率が向上する。しかしながら，末端検出では光軸となす角が，ＤＮＡ分離媒体の屈折率ｎｐとキャピラリーコーティングの屈折率ｎｃで決まるある値より大きい光線は全反射されず，伝送されない。その結果，Ｆをｎｐとｎｃで決まるある値より小さくしても集光効率が上がらなくなる。集光効率はあがらなくても，Ｆが小さい明るいレンズほどコストは増大する。つまり，ある所定の値よりＦを小さくすると全く無駄なコストが発生する。この無駄なコストを避ける条件は，
【００２７】
【数６】
2005274365.tif 000008
で与えられる。非特許文献１ではｎｐ＝１．４，ｎｃ＝１．３１，Ｆ＝０．９５であるので，式（６）を満たしておらず，無駄なコストを発生させている。Ｆ≧１．０例えばＦ1.1またはＦ１．２またはＦ１．４のレンズを用いれば，この無駄を無くすことができる。あるいは，例えばコーティングとしてｎｃ＝１．２９のＡＦ２４００（デュポン）を使うことにより回避される。
以上のように、本願第１の構成は、Ｄ１／Ｄ２≧０．３４で２０μｍ≦Ｄ１≦８０μｍとすることである。
【００２８】
Ｂ．次に、第２の構成を述べる。
ビーム照射点での蛍光の放射量とＣＣＤのノイズの影響を計算に入れ，最終的に非特許文献1と同等以上のＳ/Ｎが得られる条件を検討する。ビームが十分に絞られている場合，蛍光の発光量は内径に比例する。ＣＣＤのノイズは図５と同一とする。内径がそれぞれ５０，７５，１００μｍである場合のガラス外径とＳ/Ｎの関係を図８に示す。図８が示すように，非特許文献1の内径１００μｍ，ガラス外径３４５μｍの場合と同等のＳ/Ｎを得るには，内径５０及び７５μｍの場合には，ガラス外径をそれぞれ１２８μｍ以下及び２４７μｍとしなければならないことがわかる。図９は８０μｍ以下の内径と，非特許文献1と同等以上のＳ/Ｎが維持できるガラス外径の上限値の関係を示す。内径が２０μｍ以下の場合は，ガラス外径を内径より小さくしなければならないので，キャピラリーが存在し得ない。図９の曲線は２０≦Ｄ1≦８０の範囲で，
Ｄ２＝−０．０００３２８Ｄ１３＋０．０６０４Ｄ１２＋０．７１６Ｄ１―１５
でほぼ完全に近似される。したがって，同等のＳ/Ｎを得つつ，良好な電気泳動性能を達成しうる条件は
２０≦Ｄ1≦８０かつ
Ｄ２≦−０．０００３２８Ｄ１３＋０．０６０４Ｄ１２＋０．７１６Ｄ１―１５
と表すことができる。
【発明の効果】
【００２９】
末端検出の構成で，蛍光検出感度を維持しつつ内径を小さくすることができる。内径を小さくすることにより，高電界の使用が可能となり，分析が高速化されるとともに，分離能も向上する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下では本発明を実施するための最良の形態について具体的に記載する。
【実施例１】
【００３１】
本発明の第一の実施例の基本構成は図１に示した通りである。ただし，キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０        （７）
かつ  
Ｄ１／Ｄ２≧０．３４        （８）
を満たすキャピラリーを用いる。また，キャピラリーのガラス表面は屈折率が１．４（分離媒体の屈折率）より小さいポリマーで少なくとも１部をコーティングされていなければならない。本実施例におけるコーティングの素材は屈折率ｎｃ＝１．３１の無色透明のテフロン（テフロンは登録商標）ＡＦ１６００（デュポン）である。もちろん屈折率ｎｃ＝１．２９のテフロンＡＦ２４００（デュポン）でコーティングされたキャピラリーも好適に用いることができる。図１０は本実施例で用いたキャピラリーの断面図と要求仕様を示す。コーティングの厚さは末端検出の性能に関係無いが，キャピラリーの機械的強度を保つために１０μｍ以上が好ましく，１５μｍ以上がより好ましい。本実施例ではＤ１＝７５，Ｄ２＝２２０，Ｄ３＝２５０であり，式（７）と（８）は満たされている。その結果，良好な電気泳動性能と集光効率を同時に得ることができる。また，コーティングの厚さを１５μｍとした結果十分な強度を得ることができた。Ｄ１とＤ2のペアーとしては式（７）と式（８）を満たす任意の組合せを用いることができ，例えば，（Ｄ１，Ｄ2）＝（４０，１１０），（５０，１３０），（６０，１７５）などを好適に用いることができる。
【００３２】
キャピラリーのコーティングを含めた外径は，３７５μｍと１５０μｍが規格化されて最も広く用いられている。非特許文献1においても外径３７５μｍのキャピラリーが用いられている。一方，末端検出においてはコーティングの厚さは１０μｍ以上なら任意であり，性能には関係が無い。例えばコーティング厚さを７７．５μｍとしてＤ１＝７５，Ｄ２＝２２０，Ｄ３＝３７５のキャピラリーを使用しても良い。このキャピラリーは最外径が非特許文献１と同一であるから，非特許文献1で用いられた電気泳動システムに，設計を変更すること無く，そのまま取り付けて使用することが可能である。しかも集光効率を維持したまま電気泳動性能が向上するという効果を得ることができる。
【００３３】
本実施例ではＤＮＡ分離媒体の屈折率ｎｐ＝１．４０，キャピラリーのコーティングの屈折率屈折率ｎｃ＝１．３１または１．２９，集光カメラレンズのＦ＝１．１としたので
【００３４】
【数９】
2005274365.tif 000009
を満たしており，無駄なレンズのコストも発生していない。
【実施例２】
【００３５】
図１１に本発明の第２の実施例の構成を示す。本実施例では、３８４本のキャピラリーを集積化し、キャピラリーアレイ１０１を形成している。また，各キャピラリーの全長は４０ｃｍである。各キャピラリー１−１〜１−３８４の、試料を導入する側を始端部１０２、電気泳動によって試料がキャピラリー内部を泳動し、溶出する側を終端部１０３と呼ぶ。各キャピラリー１０１の始端部１０２の端面より３０ｃｍ（終端部１０３の端面より１０ｃｍ）の位置をレーザ照射位置とし、その部分のキャピラリーのテフロンコーティングを除去してある。４個のガラス基板１４−１〜１４−４上のそれぞれに，９６本のキャピラリー１−1〜１−９６，１−９３〜１−１９２, １−1９３〜１−２８８及び１−２８９〜１−３８４のレーザ照射位置を並べ、４組のキャピラリー配列を形成する。各ガラス基板１４−１〜１４−４上では、各キャピラリー１−1〜１−３８４が互いにほぼ平行、かつガラス基板１４−１〜１４−４にほぼ平行に配列され、各レーザ照射位置が各キャピラリー１−1〜１−３８４とほぼ垂直で、かつ一直線上に配列されている。
【００３６】
アルゴンイオンレーザー光源２から発振したレーザ光（波長４８８ｎｍ、および５１５ｎｍ、出力１００ｍＷ）は、ミラー１０，ビームスプリッター１２−１〜１２−３およびミラー１３によって４本に分割され、それぞれが照射レンズ３−１〜３−４（ｆ＝４０ｍｍ）によってレーザ幅を絞られ、４組のキャピラリー配列を側面から照射する。各レーザビームは、ガラス基板１４−１〜１４−４に平行、かつ各キャピラリー１−1〜１−３８４に垂直になるように調節されてキャピラリー配列に照射される。電気泳動の分離能の低下を抑えるために、キャピラリー配列に照射されるレーザ幅は、キャピラリーの内径（５０μｍ）程度かそれ以下にすることが望ましい。各キャピラリー１−1〜１−３８４の内部が分離媒体であるＤＮＡ分離媒体（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社ＰＯＰ−７，屈折率１．４）で満たされている状態で上記のレーザ照射を行うと、特許文献1に記載されているように、レーザビームがキャピラリー配列中を伝搬するため、すべてのキャピラリーを同時に効率良く照射することができる。
【００３７】
キャピラリーアレイ１０１の終端部１０３は、３８４本のキャピラリー１−1〜１−３８４が束ねられ、各キャピラリー１−1〜１−３８４の終端部１０３の端面は実質的に同一平面に並び、検出平面を形成する。検出平面上で各キャピラリー検出端面は９６×４の格子状に配列（２次元的に配列）する。ここで、各キャピラリー１−1〜１−３８４の始端部１０２における位置とキャピラリー検出端面における位置を対応させておく。
【００３８】
キャピラリーアレイ１０1は、液槽４に接続されている。液槽４にはＤＮＡ分離媒体ＰＯＰ７が充填されており，液槽４からキャピラリーにＰＯＰ７が充填される。液槽４は、アクリル樹脂製であり、内部に流路が形成されている。この内部にＤＮＡ分離媒体が満たされている。チューブ１９は、緩衝液（３７００ ｂｕｆｆｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の入った液槽２１につながっている。本実施例ではＤＮＡ分離媒体として非架橋の粘性流体であるＰＯＰ７を用いたが，屈折率が同程度の架橋ゲルが充填されたキャピラリーも使用可能であることは云うまでも無い。
【００３９】
キャピラリー検出端面から出射された蛍光は、ＤＮＡ分離媒体で満たされた流路、検出窓がはめ込まれた液槽４の底面を介し、液槽４下方向から、集光レンズ６（Ｆ＝１．２、ｆ＝５０）、フィルター７、プリズム２８、結像レンズ８（Ｆ＝１．２、ｆ＝５０）、５１２×５１２画素の２次元ＣＣＤカメラ９で構成される検出部１０７によって検出される。
【００４０】
試料からの蛍光以外の、液槽４を構成する材料等から蛍光や散乱光を減らすため、検出窓の材料は無蛍光の石英ガラスとする。検出窓として、背蛍光や励起光を除外できる光学フィルターを使用しても良い。また、液槽４全体を無蛍光かつ透明な材料で作製し、液槽４と検出窓を一体化しても良い。本実施例では、検出平面から検出窓の外表面までの距離は２０ｍｍとし、集光レンズ６の焦点距離５０ｍｍより小とした。
【００４１】
キャピラリー始端部１０２を緩衝液に浸し、緩衝液槽２１と液槽５との間に高圧電源５０６によって電圧を印加し、各キャピラリー１−1〜１−３８４に注入された試料を終端部１０３方向に電気泳動する。この際、キャピラリー１−1〜１−３８４内のＤＮＡ分離媒体が圧力差により移動しないように、緩衝液槽２１に入った緩衝液と液槽５に入った緩衝液の液面の高低差がないようにした。
【００４２】
各キャピラリー１−1〜１−３８４内を電気泳動する試料は、キャピラリー１−1〜１−３８４のレーザ照射位置においてレーザ照射される。レーザ照射により、試料に標識された蛍光体が励起され、その蛍光の一部はキャピラリー１−1〜１−３８４の内表面で全反射してキャピラリー１−1〜１−３８４内部を伝播し、各キャピラリー１−1〜１−３８４の検出端面より出射する。出射した蛍光は、液槽４の検出窓を介し、集光レンズ６により平行光束とされ、フィルター７により背蛍光および励起光が除外され、プリズム２８によって波長分散され、結像レンズ８により２次元ＣＣＤカメラ９上に結像される。また、集光レンズ６の代わりに対物レンズを使用しても良い。集光レンズ６とキャピラリー検出端面の距離は５０ｍｍとした。各キャピラリー１−1〜１−３８４からの蛍光が波長分散された像は、２次元ＣＣＤカメラ９上の異なる位置に結像するようにする。これにより、各キャピラリー１−1〜１−３８４からの蛍光を独立かつ一括して検出できるようにする。また、この検出を連続的に繰り返すことにより、各キャピラリー１−1〜１−３８４からの蛍光の時間変化を計測する。得られた計測結果をコンピュータに記録し、解析することにより、複数種類の試料を分析できる。
【００４３】
蛍光検出時に外部からの迷光が検出部１０７に入ると、キャピラリー検出端面から出射した蛍光検出の感度の低下につながる。そこで、キャピラリー１−1〜１−３８４のレーザ照射位置から液槽４および検出部１０７の領域を外部から遮光することが望ましい。本実施例では、上記領域全体を暗箱で覆った。上記３つの領域に分けて暗箱で覆っても良い。また液槽４の材質を黒いアクリル樹脂にする、もしくは黒いプラスチックにし、外部からの迷光を遮断する方法でも良い。
【００４４】
図１２にキャピラリー１−１〜１−３８４の断面と必要仕様を示す。本実施例で使用したキャピラリーに要求される仕様は第一の実施例におけるものとほぼ共通であるが，Ｆ＝１．２のレンズを用いているので，
Ｄ１／Ｄ２≧０．４３            （１０）
を満たさなければならない。本実施例ではＦ＝１．２であるが，Ｆ＝１．４やＦ＝１．８の場合も式（10）を当然満たさなければならない。本実施例ではＤ１＝５０，Ｄ2＝１００，Ｄ３＝１３０として式（10）が満たされるようにした。Ｄ１とＤ2のペアーとしては式（６）と式（10）を満たす任意の組合せを用いることができ，例えば，（Ｄ１，Ｄ2）＝（４０，８５），（６０，１３０），（７５，１６５）などを好適に用いることができる。
【００４５】
本実施例では，ｎｐ＝１．４，ｎｃ＝１．３１，Ｆ＝１.２であるので式（６）が満たされており，第一の実施例同様無駄なレンズコストは発生していない。
本実施例では，内径を非特許文献１の半分とすることにより，３倍以上（320Ｖ/ｃｍ）の高電界を使用して安定なＤＮＡシーケンシングができるようになった。本実施例では非特許文献1の4倍以上の３８４本のキャピラリーを集積化して，３８４試料の同時分析を可能とした。図１３に，代表キャピラリー１−３５７で得られたシーケンシング波形を示す。試料は，ＲＯＸプライマーで標識された，Ｍ13ｍｐ１８をテンプレートとする単色シーケンシング反応生成物である。５２９ベースまでの単一塩基分離が１０分以内で達成された。つまり約５００ベースを１０分以内で解読できる。また，１５４ベースの平均泳動時間は６分であり，非特許文献1の６倍以上の高速分析が実現した。これらの性能は他の３８３本のキャピラリーでも同等であった。従ってトータルでは非特許文献1の２５倍のスループットが，同等の集光効率を維持したまま実現された。
【００４６】
本実施例では、キャピラリーをビーム照射部及び検出部のいずれにおいても９６本×４列で配置したが，別の配置，例えば１２８本×３列，1９２本×２列なども可能であり，ビーム照射部と検出部で別々の配置を取ることも可能である。例えば照射部で１２８本×３列，検出部で９６×４列にすれば，レーザビームの照射効率が向上し，かつ，検出平面の幅はかわらないので，Ｆ1.2の明るい集光レンズを使うことが可能であり，一層高い感度を得ることができる。
本実施例では終端部１０３から液槽４を介して蛍光を検出したが，始端部１０２から液槽５を介して検出することも可能である。
【００４７】
本実施例ではレーザビームをキャピラリーが配列する平面に平行に照射したが，図１４に示したように，レーザのビームをシリンドリカルレンズ３１で広げてキャピラリー１−1〜１−９６に照射してもよい。この場合，照射部でキャピラリーが精密に配置される必要が無いので，キャピラリーアレイが安価に製造できるという効果がある。レーザビームをキャピラリーが配列する方向にスキャンすることによっても同様な効果を得られる。検出端でのキャピラリー配置を一列にするとプリズムのかわりに回折格子を用いることもできる。
【実施例３】
【００４８】
図１５は本発明の第三の実施例におけるキャピラリーの断面図及び要求される仕様を示す。本実施例におけるキャピラリー電気泳動装置全体の構成は第一の実施例もしくは第二の実施例と同一である。キャピラリー内径内には屈折率約１．４のＤＮＡ分離媒体が充填される。本実施例ではキャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０    （１１）              
かつ
【００４９】
【数１２】
2005274365.tif 000010
を満たし，キャピラリーのガラス表面は屈折率が１．４より小さいポリマーでコーティングされている。本実施例におけるコーティングの素材は屈折率約１．３１の無色透明のテフロンＡＦ１６００（デュポン）である。もちろん屈折率１．２９のテフロンＡＦ２４００（デュポン）でコーティングされたキャピラリーも好適に用いることができる。コーティングの厚さは末端検出の性能に関係無いが，キャピラリーの機械的強度を保つために１０μｍ以上が好ましく，１５μｍ以上がより好ましい。これらの条件を満たすよう，本実施例ではＤ１＝５０，Ｄ2＝１２０，Ｄ３＝１５０とした。Ｄ１とＤ2のペアーとしては式（11）と式（1２）を満たす任意の組合せを用いることができ，例えば，（Ｄ１，Ｄ2）＝（４０，８５），（６０，１６０），（７５，２００）などを好適に用いることができる。このようなキャピラリーを用いた結果，非特許文献１と同等のＳ/Ｎを維持しつつ，安定した電気泳動分離を半分以下の時間で得ることができた。
【００５０】
本実施例では，ｎｐ＝１．４，ｎｃ＝１．３１であり，Ｆ≧１.２，つまり例えばＦ＝１．４等であるので式（６）が満たされており，第一の実施例同様無駄なレンズコストは発生していない。
【実施例４】
【００５１】
本実施例では，キャピラリー電気泳動装置全体の構成は第一の実施例もしくは第二の実施例と同一であり，キャピラリー内径内には屈折率約１．４のＤＮＡ分離媒体が充填され，キャピラリーのガラス表面は屈折率が１．４より小さいポリマーでコーティングされている。電気泳動用のキャピラリーとしては，内径の呼び径７５，５０及び４０μｍのキャピラリーが規格化され，なおかつ電気泳動的に好ましいことから広く用いられている。キャピラリーの外径やコーティングが変化しても内径が同一ならば，ほぼ共通の電気泳動条件を適用できるという利点がある。そこで第四の実施例では，内径を７５，５０または４０μｍに固定して，式（８）を満たすキャピラリーを使用する。製造上，キャピラリーの内径は±３μｍ程度の誤差が避けられない。キャピラリーの内径を Ｄ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とすると，呼び径７５，５０または４０μｍに対応するＤ１の範囲はそれぞれ７５±３，５０±３及び４０±３である。これらの範囲のＤ１に対してＤ１／Ｄ２≧０．３４を満たすＤ２の範囲はそれぞれ，Ｄ２≦２２９，Ｄ２≦１５６及びＤ２≦１２６である。従って本実施例におけるキャピラリーが満たすべき仕様は
（Ｄ１＝７５±３かつＤ２≦２２９）または
（Ｄ１＝５０±３かつＤ２≦１５６）または
（Ｄ１＝４０±３かつＤ２≦１２６）
となる。このようなキャピラリーを用いることにより，従来のＣＥシステムで最適化された電気泳動条件を容易に移植できるという固有の効果が得られる。
【００５２】
本実施例では，ｎｐ＝１．４，ｎｃ＝１．３１であり，Ｆ≧１.２，つまり例えばＦ＝１．４等であるので式（６）が満たされており，第一の実施例同様無駄なレンズコストは発生していない。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は超高スループットのＤＮＡシーケンサーに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】末端検出の概念図。
【図２】キャピラリーの中心軸に垂直な面による断面図。
【図３】キャピラリーの中心軸を通る面による断面図及び蛍光の伝播経路。
【図４】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄと検出される蛍光の量Ｓの関係。
【図５】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄとノイズＮの関係。
【図６】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄとＳ/Ｎの関係。
【図７】集光レンズがＦ0.95とＦ1.2のそれぞれの場合における，集光効率Ｓ０と内径ガラス外径比Ｄ１／Ｄ２の関係。
【図８】内径Ｄ１が50，75，100のそれぞれの場合における，Ｓ/Ｎと外径Ｄ２の関係。
【図９】８０以下の内径Ｄ１に対するＳ/Ｎ維持化能な外径Ｄ２の範囲。
【図１０】実施例１におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【図１１】実施例２の構成。
【図１２】実施例２におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【図１３】実施例２で得られたシーケンシング波形。
【図１４】実施例２におけるビーム照射法の代替法。
【図１５】実施例３におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【符号の説明】
【００５５】
1，１−１〜１−３８４：キャピラリー，２：レーザ，３,３−１〜３−４：照射レンズ，４：液槽，５：液槽，６：集光レンズ，７：フィルタ，８：結像レンズ，９：ＣＣＤカメラ，１０，１２−１〜１２−３：ビームスプリッター，１１， １３：ミラー，１４−１〜１４−４：ガラス基板，１５：シリンジ，１９：チューブ，２０：バルブ，２１：液槽，２６：高圧電源，２８：プリズム，３１：シリンドリカルレンズ。
【図１】
2005274365.tif 000011
【図２】
2005274365.tif 000012
【図３】
2005274365.tif 000013
【図４】
2005274365.tif 000014
【図５】
2005274365.tif 000015
【図６】
2005274365.tif 000016
【図７】
2005274365.tif 000017
【図８】
2005274365.tif 000018
【図９】
2005274365.tif 000019
【図１０】
2005274365.tif 000020
【図１１】
2005274365.tif 000021
【図１２】
2005274365.tif 000022
【図１３】
2005274365.tif 000023
【図１４】
2005274365.tif 000024
【図１５】
2005274365.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月9日(2004.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０  かつ  Ｄ１／Ｄ２≧０．３４
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項２】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．０以上であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項３】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．２以上であって，Ｄ１／Ｄ２≧０．４３であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項４】
前記分離媒体の屈折率は、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項1に記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項５】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記ガラス製キャピラリーの外表面の少なくとも一部は、ポリマーでコーティングされ，前記ポリマーの屈折率をｎｃ，前記分離媒体の屈折率をｎｐ，前記レンズのＦナンバーをＦとするとき，
０．５／（ｎｐ２−ｎｃ２）０．５≦Ｆ
であることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項６】
ｎｐは、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項７】
前記コーティングの厚さは１０μｍ以上であることを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項８】
前記ポリマーの屈折率は、前記分離媒体の屈折率よりも小さいことを特徴とする請求項５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項９】
前記キャピラリーは複数設けられ、前記一方の端部は２次元的に配置されていることを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１０】
前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１１】
前記キャピラリーは複数設けられ、前記複数のキャピラリーに光ビームを照射する光源と、前記光源と前記キャピラリーとの間に、前記光ビームを前記キャピラリーが並ぶ方向に広げるレンズとを有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１２】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーを延長した方向から、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
２０≦Ｄ１≦８０  かつ
Ｄ２≦−０．０００３２８Ｄ１３＋０．０６０４Ｄ１２＋０．７１６Ｄ１―１５
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１３】
前記分離媒体の屈折率は、１．３６以上１．４２以下であることを特徴とする請求項1２に記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１４】
前記キャピラリーは、複数組のキャピラリー配列が形成されるように設けられ、
前記キャピラリー配列毎に、前記キャピラリーの側面から光を照射する光源とを有することを特徴とする請求項１２記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１５】
内部に充填された分離媒体中で、試料が泳動分離される円筒状のガラス製キャピラリーと、
前記キャピラリーの一方の端部側に設けられた液槽と、
前記液槽を介して、前記試料の成分から発する蛍光を検出する検出器とを有し、
前記キャピラリーの内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，
（Ｄ１＝７５±３かつＤ２≦２２９）または
（Ｄ１＝５０±３かつＤ２≦１５６）または
（Ｄ１＝４０±３かつＤ２≦１２６）
であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１６】
前記液槽と前記検出器との間には、前記蛍光を集光するレンズが設けられ、
前記レンズのＦナンバーが１．０以上であることを特徴とする請求項１５記載のキャピラリー電気泳動装置。
【請求項１７】
円筒状のガラス製キャピラリーであって，その内径をＤ１[μｍ]，ガラス外径をＤ２［μｍ］とするとき，  ２０≦Ｄ１≦８０  かつ  Ｄ１／Ｄ２≧０．３４  であることを特
徴とするキャピラリー。
【請求項１８】
前記キャピラリーは、
（Ｄ１＝７５±３かつＤ２≦２２９）または
（Ｄ１＝５０±３かつＤ２≦１５６）または
（Ｄ１＝４０±３かつＤ２≦１２６）
であることを特徴とする請求項１７記載のキャピラリー。
【請求項１９】
前記キャピラリーは、アレイ状に形成されていることを特徴とする請求項１７記載のキ
ャピラリー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
【図１】末端検出の概念図。
【図２】キャピラリーの中心軸に垂直な面による断面図。
【図３】キャピラリーの中心軸を通る面による断面図及び蛍光の伝播経路。
【図４】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄと検出される蛍光の量Ｓの関係。
【図５】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄとノイズＮの関係。
【図６】ＣＣＤ上のビニング領域の直径ｄとＳ/Ｎの関係。
【図７】集光レンズがＦ0.95とF1.1とＦ1.2のそれぞれの場合における，集光効率Ｓ０と内径ガラス外径比Ｄ１／Ｄ２の関係。
【図８】内径Ｄ１が50，75，100のそれぞれの場合における，Ｓ/Ｎと外径Ｄ２の関係。
【図９】８０以下の内径Ｄ１に対するＳ/Ｎ維持化能な外径Ｄ２の範囲。
【図１０】実施例１におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【図１１】実施例２の構成。
【図１２】実施例２におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【図１３】実施例２で得られたシーケンシング波形。
【図１４】実施例２におけるビーム照射法の代替法。
【図１５】実施例３におけるキャピラリーの断面図と必要仕様。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2005274365.tif 000026