(57)【要約】【課題】培養した細胞層を、該細胞層中の細胞の成長・増殖を阻害することなく剥離する、透明性のある細胞培養担体の提供。【解決手段】支持体である高分子含水ゲル層、及び細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層と該細胞接着性ゲル層との間にアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を有する細胞培養担体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体である高分子含水ゲル層、及び細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層と該細胞接着性ゲル層との間にアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を有する細胞培養担体。
【請求項２】
細胞接着性ゲル層とアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層との間に高分子含水ゲル層を有さない請求項１に記載の細胞培養坦体。
【請求項３】
細胞培養面側最表面層とアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層が隣接している請求項１又は２に記載の細胞培養坦体。
【請求項４】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層がアルギン酸ゲル層である請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
アルギン酸ゲル層の乾膜厚が0.01μm以上50μm以下である請求項４に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
アルギン酸ゲルがアルギン酸カルシウムゲルである請求項４又は５のいずれか一項に記載の細胞培養担体。
【請求項７】
電子線、γ線、紫外線のいずれかまたは複数を照射することで滅菌された請求項１〜６いずれか一項に記載の細胞培養担体。
【請求項８】
高分子含水ゲルがキトサンゲルである請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞培養担体。
【請求項９】
細胞培養面側最表面層が細胞接着性コラーゲンゲル層である請求項１〜８のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培養担体を用いる細胞培養方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シート。
【請求項１２】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化を多価金属カチオンが存在しない培地又は多価金属カチオンの総和モル数に対して90モル%以上のキレート剤を添加した培地を用いて行う請求項１１に記載の細胞シート。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法により得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を多価金属カチオンが存在しない培地又は多価金属カチオンの総和モル数に対して90モル%以上のキレート剤を添加した培地を用いて可溶化処理して細胞シートを得る細胞培養方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法により得られる細胞培養物を他の細胞培養担体上でさらに培養する細胞転写法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の細胞転写法によって得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理して得られる重層化細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載の細胞転写法により得られる細胞培養物を他の培養細胞上でさらに培養する細胞重層化法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養の技術に関し、具体的には、細胞培養担体、該細胞培養担体を利用した細胞の培養方法、該培養方法により得られる細胞培養物、細胞シート、該細胞培養物を利用した細胞転写法、細胞重層化法、該重層化方法により得られる重層化細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子含水ゲルは、生体に類似した構造を持ち、温度、酸性・アルカリ性等の外部条件によって膨張、収縮する性質を有するため、人工筋肉などの人工臓器・組織への応用、内部に薬剤を封入して放出量をコントロールする医療分野への応用のみならず、各種サイトカイン等を含むゲルとして細胞を培養する際に細胞成長の足場としての利用も試みられている。
【０００３】
高分子含水ゲルの中でも温度応答性高分子であるN-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide）（以下「NIPAM」と称する）は、低温では膨潤して液状であるが、34℃付近で相転移し急激に収縮しゲル化する。従来、培養細胞の階層化を行うに当たり、37℃の温度条件下、ゲル化したNIPAM上で培養した細胞をNIPAMごと別の細胞層に重ね、その後34℃以下に下げることによりNIPAMを液状化させて取り除き、細胞同士を直接重ねるという手法が取られていた（非特許文献１から５参照）。
【０００４】
NIPAM上で細胞培養を行った場合、通常、細胞は単層状に成長する。この際、隣り合った細胞同士ではコラーゲン等の細胞外マトリックス（Extracellular Matrix）（以下「ECM」と称する）が形成される。そして、細胞が増殖するためには、ECMに接着する必要がある。しかし、細胞の上部及び細胞と基底層であるNIPAM間は他の細胞と接着しておらず、細胞接着に必要なECMは形成されない。
従って、NIPAM上で培養した単層の細胞層同士を重層し、細胞層を34℃以下の条件下でNIPAMを可溶化して取り除き、細胞同士が直接接するように重ねても、上部に重ねた細胞は、増殖するための足場が十分でなく、従って安定した増殖は望むことができなかった。
また、液状化したNIPAMが細胞毒として作用するため細胞の正常な成長を阻害する現象も認められるため、細胞の階層化の手段としては極めて不向きで不安定な技術であった。これまでに各種ゲル上に細胞外マトリックス成分を重層化しゲル化させた培地での細胞培養は成功例がなく、重層後に不要となったゲルを容易に除去できるような培地を使用した培養系確立の試みが続けられていた。
【０００５】
この問題の解決法として多孔質膜と該多孔質膜上にアルギン酸ゲル層と細胞外マトリックス成分ゲル層又は細胞外マトリックス成分スポンジ層を重層化させたことを特徴とする細胞培養担体が提案されているが（特許文献１）、細胞外マトリックス層が厚く、乾燥膜の状態で細胞培養担体を保管することが不可能であった。また、細胞の重層化操作にも邪魔になり安定に重層化細胞を得られない問題があった。また、この方法ではアルギン酸ゲル層の溶解にEDTA水溶液を用いて細胞培養物を細胞培養担体から剥離しているが、このときの侵襲により細胞がダメージを受ける問題があった。
さらに、該特許に記載されている多孔質膜は透明性がなく、細胞培養中に生きた細胞の育成状況を目視または顕微鏡等により直接観察することができないという問題があった。このため、シャーレ上に置いた細胞培養担体の周りのシャーレ上での細胞の育成状態から細胞担体上の細胞の状況を同等状態であると類推していたが、細胞培養担体の周りのシャーレ上での細胞の育成状態は、細胞担体上の細胞の状態と必ずしも一致せず、細胞の増殖が不足していたり、オーバーコンフルエントであったりする不都合があった。
従って、細胞の育成状態を確実に把握するために、細胞培養担体には通常の細胞培養で用いるシャーレのように、透明な細胞培養担体が望まれていた。
【特許文献１】特許第3261456号
【非特許文献１】清水達也、岡野光夫、バイオサイエンスとバイオインダストリー、58(12)、851頁(2000)
【非特許文献２】大和雅之、岡野光夫、臨外、56(1)、53頁（2001）
【非特許文献３】大和雅之、岡野光夫、Materials Integration、13(2)、58頁(2000)
【非特許文献４】大和雅之、串田愛、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(10)、72頁(2000)
【非特許文献５】大和雅之、廣瀬志弘、播元正美、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(13)、162頁(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞の育成状態を確実に把握でき、かつ培養した細胞層を、該細胞層中の細胞の成長・増殖を阻害することなく剥離できる、透明性のある細胞培養担体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、支持体である高分子含水ゲル層、及び細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層と該細胞接着性ゲル層との間にアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を有する細胞培養担体が、透明性を有し細胞の生育状況の観察を簡便に行え、かつ細胞層の剥離性に優れることを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、支持体である高分子含水ゲル層、及び細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層と該細胞接着性ゲル層との間にアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を有する細胞培養担体を提供するものである。本発明の好ましい態様によれば、細胞接着性ゲル層とアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層との間に高分子含水ゲル層を有さない上記の細胞培養坦体；細胞培養面側最表面層とアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層が隣接している上記いずれかの細胞培養坦体が提供される。本発明のさらに好ましい態様によれば、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層がアルギン酸ゲル層である上記のいずれか一項に記載の細胞培養担体；アルギン酸ゲル層の乾膜厚が0.01μm以上50μm以下である上記細胞培養担体；アルギン酸ゲルがアルギン酸カルシウムゲルである上記細胞培養担体が提供される。
【０００９】
本発明の特に好ましい態様によれば、電子線、γ線、紫外線のいずれかまたは複数を照射することで滅菌された上記いずれかの記載の細胞培養担体；高分子含水ゲルがキトサンゲルである上記いずれかの細胞培養担体；細胞培養面側最表面層が細胞接着性コラーゲンゲル層である上記いずれの細胞培養担体が提供される。
【００１０】
また、別の観点からは、上記いずれかの細胞培養担体を用いる細胞培養方法が提供される。
さらに別の観点からは、上記の方法により得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シートが提供される。この発明の好ましい態様によれば、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化を多価金属カチオンが存在しない培地又は多価金属カチオンの総和モル数に対して90モル%以上のキレート剤を添加した培地を用いて行う上記の細胞シートが提供される。
【００１１】
さらに別の観点からは、上記の方法により得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を多価金属カチオンが存在しない培地又は多価金属カチオンの総和モル数に対して90モル%以上のキレート剤を添加した培地を用いて可溶化処理して細胞シートを得る細胞培養方法；上記の方法により得られる細胞培養物を他の細胞培養担体上でさらに培養する細胞転写法；該細胞転写法によって得られる細胞培養物のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理して得られる重層化細胞；該細胞転写法により得られる細胞培養物を他の培養細胞上でさらに培養する細胞重層化法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、細胞シートの剥離性に優れた細胞培養担体が提供される。従って本発明の細胞培養担体を用いて細胞層の重層化を容易に行なうことができる。また、本発明の細胞培養担体は、透明性を有し、細胞培養中の細胞の生きた状態を直接観察できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
「細胞培養担体」とは、細胞を培養する際の担体又は支持体となり得るものを意味する。
「アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層」とはアルギン酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸などのアニオン性多糖類とこれらのゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンを含むゲル層をあらわすが、本発明においてはアルギン酸ゲル層が好ましい。
【００１４】
「アルギン酸ゲル」とは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味し、「アルギン酸ゲル層」とは、層状のアルギン酸ゲルを意味する。アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成し、ゲル化すると考えられている。アルギン酸のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、バリウム（Ba）、鉛（Pb）、銅（Cu）、ストロンチウム（Sr）、カドミウム（Cd）、カルシウム（Ca）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）、コバルト（Co）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、マグネシウム（Mg）等の金属イオンを例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンを例示できる。また、「アルギン酸ゲル」はアルギン酸とカチオン残基を有する有機高分子化合物のポリイオンコンプレックスゲルでも良い。ここでいうカチオン残基を有する有機高分子化合物の例としては、ポリリジン、キトサン、ゼラチン、コラーゲンなどの複数のアミノ基を有する化合物が挙げられる。
【００１５】
アルギン酸のゲル化は、常法に従って行なうことができる。アルギン酸のゲル化は、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じ、アルギン酸カルシウムゲルが得られる。より具体的には、0.2〜５％アルギン酸ナトリウム水溶液を、高分子含水ゲル（例えば、キトサン）の膜上に塗布後0.01〜1.0M 塩化カルシウム水溶液中に浸漬して塩化カルシウムをしみ込ませ、20〜30℃で3分〜３時間放置することによりアルギン酸カルシウムゲル層が得られる。このように高分子含水ゲルを用いてアルギン酸のゲル化を行なえば、高分子含水ゲル膜と該高分子含水ゲル膜上に形成されたアルギン酸ゲル層とを含む細胞培養担体を得ることができる。
【００１６】
アルギン酸ゲル層の乾膜の厚さは0.01μm以上50μm以下であることが好ましく、0.1μm以上10μm以下が好ましく、0.5μm以上5μm以下であることがさらに好ましい。アルギン酸ゲル層の固形分量が少なすぎると充分な膜を形成できず穴が空いてしまい、多すぎると乾燥膜でのカールや割れの発生、培養工程での変形やアルギン酸ゲル溶解工程での溶解不良といった問題が生じる。
【００１７】
本明細書において、ゲル層の厚さは充分に乾燥した状態で計測した値であり、電子顕微鏡断面像、膜厚計、エリプソメーター、角度可変XPSなど、好ましくは電子顕微鏡断面像から計測した値である。
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖又は細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばD.potatorum）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばA.nodosum）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばL.flavikans）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。アルギン酸のG/Mの比は特に限定されないが、G/Mの比が大きいほどゲル形成能が大きいので、G/Mの比は大きい方が好ましく、具体的には0.1〜１であるのが好ましく、0.2〜0.5であるのがさらに好ましい。
【００１８】
「細胞接着性ゲル層」とは、層状の細胞接着性を有するハイドロゲルを意味し、細胞毒性が無く、通常の培養条件で細胞が付着するゲルであれば天然、合成の化合物いずれでも良いが、好ましくは層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。ここで「細胞接着性ゲル層」にキトサンは含まれない。細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）p.570,東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。「細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックスの構成成分を意味し、その具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸など）、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）、ヒアルロン酸を例示できる。最も好ましいのはコラーゲンである。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を37℃で10〜20分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。コラーゲンゲル層の乾膜の厚さは0.005μm以上5.0μm以下であり、0. 005μm以上1.0μm以下が好ましく、0. 005μm以上0.5μm以下がさらに好ましい。コラーゲンゲル層が厚いと乾燥時に膜に亀裂が発生するばかりか、細胞の転写が著しく困難になる。
【００１９】
本明細書において「細胞接着性ゲル層」は、培養面側の最表層に位置するが、これは種類の異なる細胞接着性ゲル層が複数積層している態様も含む。また、本発明の細胞培養担体においては「アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層」と「細胞接着性ゲル層」が隣接しているのが好ましい。この２層の間に中間層が存在すると細胞の培養時に培地成分や酸素の供給が不足して細胞の成長や増殖を阻害する場合や、細胞が生存できなくなる場合がある。さらに、前述の「アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層」の可溶化処理時にその溶解性に影響する場合がある。また、細胞シートを剥離した際に細胞接着性層以外の層が残存し、重層化における細胞間の相互作用に影響を与える場合がある。
【００２０】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル上に細胞接着性ゲル層を形成する際には、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルと細胞接着性ゲル層とを別々に作製した後、両者を重ねてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル上にと細胞接着性ゲル成分含有水溶液を添加した後、該水溶液をゲル化させるのが好ましい。細胞接着性ゲル層は脱着を行なうのに十分な物理的強度を有していないため、細胞接着性ゲル層を形成させた容器（例えばディッシュ、シャーレ等）から細胞接着性ゲル層を剥離するのは困難だからである。また、極薄層の細胞接着性ゲル層は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを再簿接着性成分の溶液に浸漬すること（浸漬法）や塗布すること（塗布法）、またはキャストすること（キャスト法）で簡便に得ることができるが、本発明の細胞培養担体の作成においては、これらのいずれの方法を用いてもよい。このうちキャスト法が好ましく用いられる。例えばアルギン酸ゲル上にコラーゲンゲル層を形成する場合には、市販の0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を必要により適当な濃度に希釈し、上記の方法で作成したアルギン酸カルシウムゲル上にこの溶液をキャストし、乾燥することで得られる。
【００２１】
本発明の細胞培養担体はアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層と細胞接着性ゲル層との間にキトサンゲルなどの高分子含水ゲル層を有さないことが好ましい。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層と細胞接着性ゲル層との間に高分子含水ゲル層を有するとアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化による細胞シートの剥離が悪くなり、剥離できなくなる場合がある。
【００２２】
「高分子含水ゲル」とは親水性高分子を意味し、特に水には溶解しないが高分子中に水を含み系全体にわたって2次元的または３次元的な支持構造を有する吸水性高分子を意味する。例えば、「高分子含水ゲル」とは、アルギン酸ゲルは透過させないが、キレート化剤は透過させ得る膜を意味する。「高分子含水ゲル」は、アルギン酸ゲルは透過させないが、キレート化剤は透過させ得る膜である限り特に限定されず、合成高分子であっても、天然高分子、生体高分子であってもよい。さらに本発明に用いられる高分子含水ゲルは透明性を有するものが好ましい。「高分子含水ゲル」の例としては、アクリルアミドゲル、架橋アクリル酸ゲル、寒天、ゼラチン、コラーゲン、デキストラン、キトサン、シリカゲルなどがある。本発明では、キトサンを用いることが好ましい。なお、本発明において高分子含水ゲル上に被覆する被覆層の数（高分子含水ゲル層上の積層の層の数）は９以下が好ましく、６以下がさらに好ましい。
【００２３】
本発明の細胞培養担体で培養し得る細胞の具体例としては、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞等を例示でき、好ましいものとしては繊維芽細胞を例示できる。細胞の培養の際には、通常、細胞濃度１〜1.5万cells/mlの培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を細胞接着性ゲル層上に添加する。細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。コラーゲンゲル層上で細胞を培養する場合には、通常、コラーゲンゲル層上にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行なう。
【００２４】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養は具体的には次のようにして行なうことができる。細胞培養担体をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち12〜24時間放置し、培養液を細胞培養担体中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体の細胞接着性ゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加する。37℃で１〜２時間放置し、細胞接着性ゲル層に保持（接着）させた後、37℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養0.5〜２日ごとに培養液を交換する。
【００２５】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養により得られる細胞培養物は、本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞層とを含む。「細胞培養担体に保持された細胞層」は細胞接着性ゲル層上に形成された細胞層である。
【００２６】
細胞培養物は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理することにより、培養された細胞層を含む細胞シートとして脱離させることができる。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを構成するカチオン成分を除去することにより実施でき、カチオン種が多価金属イオンの場合はリン酸などの多価金属カチオンと錯形成もしくは難溶性塩を形成するイオンの添加、キレート剤水溶液の使用、倍地中の多価金属イオンの低減、倍地中の多価金属イオンのキレート剤による隠蔽によって実施できる。通常、細胞培養用の培地にはリン酸イオンが多く存在するため、予め多価金属イオンを除去した培地もしくは多価金属カチオンの総和モル数に対して90モル%以上のキレート剤を添加した培地に浸漬することが細胞への侵襲を低減する観点から好ましく用いられる。該キレート剤の濃度は90モル%以上10000モル%以下が好ましく、90モル%以上1000モル%以下がさらに好ましい。
【００２７】
本発明のキレート剤としては下記化合物が挙げられる。すなわちエチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、1,3-ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸（edta）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸(egta)、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸、1,1-ジホスホノエタン-2-カルボン酸、2-ホスホノブタン-1,2,4-トリカルボン酸、1-ヒドロキシ-1-ホスホノプロパン-1,3,3-トリカルボン酸、カテコール-3,5-ジスルホン酸、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムが挙げられ、特に好ましくは例えばジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、1,3-ジアミノプロパノール四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、2-ホスホノブタン-1,2,4-トリカルボン酸、1,1-ジホスホノエタン-2-カルボン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、エチレンジアミンテトラホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタホスホン酸、1-ヒドロキシプロピリデン−1,1-ジホスホン酸、1-アミノエチリデン-1,1-ジホスホン酸、1-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸やこれらの塩がある。これらのうち好ましいものとしてはedta、egta、エチレンジアミンテトラホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸がある。
【００２８】
キレート化剤を用いたアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、高分子含水ゲルからキレート化剤をしみこませて行なうのが好ましい。これによって、高分子含水ゲルとアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層とを容易に分離することができ、細胞培養物を高分子含水ゲルから容易に脱離させることができる。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理によってアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を完全に除去する必要はなく、可溶化されなかったアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層が残っていてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層はできるだけ可溶化して除去するのが好ましい。
【００２９】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養により得られる細胞培養物は、細胞層を含んでいるので、細胞層の重層化ならびに転写に使用できる。細胞層の重層化の際には、予め培養した細胞上に荷重をかけた状態で培養したのちアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを可溶化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シート同士を重層化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シートを別に作製した細胞層に重層化してもよい。重層化する細胞層の細胞の種類は、同一であっても異なっていてもよい。重層化する細胞層の数は特に限定されないが、通常１〜10、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３である。また、細胞層の転写の際には、別の細胞培養用基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを可溶化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シートを他の媒体に転写してもよい。好ましい重層化ならびに転写方法としては予め培養した細胞上もしくは別の細胞培養基材上に荷重をかけた状態で培養したのちアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを溶解する方法である。
【００３０】
荷重をかけた細胞の培養法は細胞が転写される細胞もしくは基材にムラが生じない程度に充分荷重がかけられていればいかなる方法でもよい。ここで、荷重をかける際に細胞が密閉されると窒息をすることから、転写する側もしくは受ける側の少なくとも一方の細胞培養基材が水透過性のゲルや高分子含水ゲルもしくはこれらの組み合わせでできていることが好ましい。また、ムラ無く転写するには細胞面を充分に覆う状態で荷重をかける必要があるが、均一に接触することで酸素の拡散を妨害することとなるため、不織布（ナイロン、ポリエステル、ステンレスなど）等を介して酸素の拡散を妨げないで荷重することが好ましい。
荷重をかけた細胞の培養法の荷重は0.１g/cm2以上50g/ cm2以下であることが好ましく、0.5g/ cm2以上10g/ cm2以下であることがさらに好ましい。荷重をかけた細胞の培養の時間は充分な細胞の転写が実現できればいかようでもよいが4時間以上72時間以下が好ましく、6時間以上48時間以下がさらに好ましい。
【００３１】
本発明の細胞培養担体を調製する際にカルボジイミド類を含んだ調製液を用いて調製することにより密着性が改善できる。カルボジイミド類およびN-ヒドロキシコハクイミドはいかなる層の調製液に添加してもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層調製液もしくは予め高分子含水ゲルに含浸させておくこと、あるいはアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層塗布後に塩化カルシウムと共溶解した液に浸漬することが好ましい。該カルボジイミド類は水溶性のものが好ましく、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩などが挙げられる。該カルボジイミドの濃度としては0.1mg/l以上200g/l以下が好ましく、1mg/l以上100g/ml以下である。このときN-ヒドロキシコハクイミドを触媒として使用してもよく、濃度としては該カルボジイミドに対して1重量%以上50重量%以下が好ましい。
【００３２】
本発明の細胞培養担体は、いかなる方法で滅菌されてもよいが、電子線、γ線、X線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、電子線、γ線、紫外線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。本発明の電子線滅菌の照射線量としては0.1kGy以上65kGy以下が好ましく、1kGy以上40kGy以下が特に好ましい。EOG滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性ゲル層やアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルを分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。
滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施されても良く、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００３３】
重層化する細胞層として、例えば、血管内皮細胞層、肝細胞層を使用すれば、肝臓の３次元組織構造物を構築できる。この３次元組織構造物は、in vitroにおける薬物の透過性試験へ適用できるとともに、動物実験代替モデルや移植用臓器へ応用できる。重層化した細胞層は、細胞層を構成する細胞の種類に応じた培養条件で培養することができる。培養の際には、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地等の培地を使用できる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００３５】
〔実施例１〕細胞培養担体の作製
（１）含水キトサンゲル層の調製
キトサン（和光純薬製CT-100）  20ｇを1重量％の酢酸水溶液1000ｇに徐々に添加して40℃で３時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。
ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、あらかじめ用意しておいたポリエチレンテレフタレートフイルム（フイルム厚200ミクロン）上にアプリケータでウェット膜厚300ミクロンとなるように塗布し、40℃にて3時間乾燥した。
乾燥したキトサンゲル層を、10重量％の水酸化ナトリウムのメタノール溶液に60分間浸漬し、引き続きPBS（Dulbecco's Phosphate buffered Saline）溶液に60分間浸漬した。その後、流水下で60分洗浄後、キトサンゲルを得た。こうして得た含水キトサンゲル層をイオン交換水中室温にて保存した。
【００３６】
（２）アルギン酸カルシウム層の形成
含水キトサンゲル層/アルギン酸カルシウム層積層膜の調製
（１）で得た含水キトサンゲル膜を、0.1Mの塩化カルシウム水溶液に5分浸漬したのちスポンジローラーで水分を拭い、２重量%のアルギン酸ナトリウム水溶液を100ml/m2の厚さで塗布した。この塗布物を0.4Mの塩化カルシウムと10mg/lのWSCを含む水溶液に60分浸漬したのち、流水で30分洗浄することで含水キトサンゲル/アルギン酸カルシウム積層ａ−２を得た。アルギン酸ゲル層乾膜の厚さは電子顕微鏡断面像から計測すると1.0μmであった。
【００３７】
また、アルギン酸ナトリウム水溶液の塗布膜厚を50、250、500ml/ m2  に変更して同様のサンプルａ−１、ａ−３、ａ−４を作成した。
【００３８】
（３）コラーゲンゲル層修飾(極薄層コラーゲンゲル層修飾)
（２）で得た乾燥させていない含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層膜の上にCellmatrix I-C（新田ゼラチン製）の15倍希釈水溶液をキャストしたのち、乾燥することで極薄コラーゲンゲル層修飾膜を得た(上記ａ−１、ａ−２、ａ−３、及びａ−４に対してそれぞれＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、及びＡ−４を得た)。Ａ−２において、コラーゲンゲル層およびアルギン酸ゲル層の厚さの合計は電子顕微鏡写真から1.2μmであり、アルギン酸ゲル層の厚さ1.0μmとの差からコラーゲン層の厚さは0.2μmであった。
また、キトサンの種類をＣＴ-500、ＣＴ-1000（いずれも和光純薬製）に変更しても同様のサンプルが得られた。
＜比較例用細胞培養担体の作製＞
比較例として、下記サンプルを作成した。
（４）高分子含水ゲルの代わりに、含水しない高分子シートを用いたサンプルＢ
上記（１）でキトサンの代わりにナイロンミクロフィルター使用した以外は、（１）と同様にサンプルＢを作成した。
（５）アルギン酸ゲル層を有しないサンプルＣ
上記（２）でアルギン酸を塗布しない以外は、（２）と同様にサンプルＣを作成した。
（６）コラーゲンゲル層とアルギン酸ゲル層との間にキトサン層が存在するサンプルＤ
（２）で得た試料（ａ−２）を上記のろ過したキトサンの酢酸水溶液に1時間浸漬、流水で1時間洗浄後３５℃、３０％ＲＨで乾燥し、上記（３）の工程に用いてサンプルＤを作製した。
【００３９】
〔実施例２〕滅菌
実施例１の膜をUV滅菌1、2、3時間、電子線滅菌20、40、60、80、100kGyの6種類の滅菌を施したところ、いずれも菌が確認されなかった。このとき、滅菌処理を施していないサンプルからは7200個/m2の菌が確認された。
【００４０】
〔実施例３〕細胞培養担体を用いた細胞の培養
次のようにして細胞培養担体を用いた細胞の培養を行なった。
（１）使用細胞
・CHL（チャイニーズハムスター肺由来細胞）
（２）使用培地
・Eagle最小培地、10%牛胎児血清
（３）細胞培養担体
実施例１で作製した細胞培養担体をコラーゲンゲル層を上向にポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いたもの、およびポリスチレン製細胞培養用シャーレのみの比較例をUV滅菌もしくは電子線滅菌を施したのち、培地を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち二晩放置し、培地を細胞培養担体中に浸潤させた。
（４）細胞の播種
予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を40000cell/mlに調製した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数8000cell/cm2となるようにシャーレ内に播種し培地を添加した。
（５）培養
CO2インキュベーターを用いて37℃で３日間培養した。
（６）結果
本発明の実施例１で作製した細胞培養担体をポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いたものは、透明性を有することから細胞培養中の細胞の生育状態が詳細に観察でき、細胞接着性や毒性に問題はなく、ポリスチレン製細胞培養用シャーレのみのサンプルとほぼ同様の状態であった。
また、本発明の細胞培養担体のサンプルにおいては、細胞培養中に高分子含水ゲルからの細胞シートの剥離はなく、問題はなかった。一方、比較例のサンプルＢでは、ナイロンミクロフィルターが不透明であることから細胞培養中の生きた細胞の育成状態が観察できなかった。
細胞の種類をＨＥＰＧ２（ヒト肝癌由来細胞）やＢＡＥ（ウシ大動脈血管内皮細胞）に変更しても同様の結果が得られた。
【００４１】
〔実施例４〕細胞シートの剥離
実施例３で培養したサンプルを下記３種類の剥離液および非剥離液に37℃で10分間浸漬したのちの細胞培養担体からの細胞シートの剥離状況を観察した。次いで、剥離した細胞シートをポリスチレン製細胞培養用シャーレ上に置き培地を添加したのち、CO2インキュベーターを用いて37℃で３日間培養し、光学顕微鏡で観察した。結果を表１に示す。本発明の領域で良好な剥離性を示した。また、細胞の生存率も高かった。
（１）剥離液
(a)10×Dulbecco's Phosphate buffered Salineを蒸留水で10倍希釈したもの
(b)Eagle最小培地にカルシウムイオン、マグネシウムイオンの総モル数に対して100モル%の１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸を添加したもの
（２）非剥離液
(c)Eagle最小培地
【００４２】
【表１】
2005110537.tif 000002
【００４３】
〔実施例５〕細胞層の転写
実施例３で細胞培養担体上に培養したサンプルを担体ごと取り出し、ポリスチレン製細胞培養用シャーレに細胞面が接するように置き、CO2インキュベーターを用いて37℃で1日間培養した。このように培養したものを、実施例４の剥離液に10分間浸漬したのち、液を培地に入れ替え、高分子含水ゲル層をピンセットで引っ張り剥離した。その後、培地を入れ替えCO2インキュベーターを用いてさらに37℃で1日間培養した。この細胞をトリパンブルーで染色したのち、光学顕微鏡で観察した。
結果を表２に示す。
本発明の細胞培養担体で良好な結果を得た。なお、サンプルＣは高分子含水ゲル層が剥離せず転写できなかった。また、剥離液(c)については、高分子含水ゲル層が剥離せず、転写できなかった。
【００４４】
【表２】
2005110537.tif 000003
【００４５】
〔実施例６〕細胞層の重層化
UV滅菌を3時間施したポリスチレン製細胞培養用シャーレに実施例３と同様に以下の細胞を培養した。
・CHL（Chinese Hamster Lung Cell）
・BRL（Buffalo Rat Liver 3A, ATCC No. : CRL 1442）
・BAE（Bovine Aortic Endothelial Cell）
シャーレ上に培養した上記各３種の細胞上に、実施例４の剥離液(b)を用いて実施例５と同様に細胞の転写を行い、重層化細胞を得た。この重層化細胞を倍地中４日間培養したのち、トリパンブルーで染色して光学顕微鏡で状況を確認したところ、いずれの重層化細胞も良好に培養されていることがわかった。