(57)【要約】【課題】  L-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンを、高収率及び高純度で生成する方法を提供する。【解決手段】  ラセミのトレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（アミノ基が、ベンゼン環において任意に置換されているフェニルアセチル基によって保護されている）を、ペニシリンアシラーゼによって酵素加水分解する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(Ｂ)
【化１】
2005204644.tif 000012
（式中、２つのＸ'は、共に水素であるか、又は共にカテコール官能基の保護基である）で表される(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸誘導体の製法であって、一般式(Ｂ')
【化２】
2005204644.tif 000013
（式中、Ｘは、ベンゼン環において任意に置換されたフェニルアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたフェノキシアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたマンデロイル基、ベンゼン環において任意に置換されたα-アミノフェニルアセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(2-チエニル)アセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(3-チエニル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(2-フリル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(3-フリル)アセチル基、又は2-(5-テトラゾリル)アセチル基であり；２つのＸ'は前記の定義のとおりである）で表されるラセミのトレオ形化合物又はその塩を、ペニシリンアシラーゼの存在下における酵素加水分解に供することを特徴とする(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸誘導体の製法。
【請求項２】
原料物質の一般式(Ｂ')における２つのＸ'が、一緒になって、メチレン基を形成し、Ｘがフェノキシアセチル基である請求項１記載の製法。
【請求項３】
酵素加水分解を、ペニシリンＶアシラーゼの存在下で行う請求項１記載の製法。
【請求項４】
一般式(AA')
【化３】
2005204644.tif 000014
（式中、２つのＲ'は、共に水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成する）で表される(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸誘導体を生成するため、一般式(Ｉ)
【化４】
2005204644.tif 000015
（式中、Ｒは、水素又は酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基であり；２つのＲ'は前記の定義のとおりである）で表されるラセミのトレオ形化合物又はその塩を、ペニシリンＧアシラーゼの存在下における酵素加水分解に供する請求項１記載の製法。
【請求項５】
原料物質として、一般式(Ｉ)（式中、Ｒ及び両Ｒ'が水素である）で表される化合物又はその塩を使用する請求項４記載の製法。
【請求項６】
原料物質として、一般式(Ｉ)（式中、Ｒが水素であり；２つのＲ'が、一緒になって、メチレン基を形成する）で表される化合物又はその塩を使用する請求項４記載の製法。
【請求項７】
酵素加水分解を、溶液中に存在する又はペニシリンＧアシラーゼを結合できる官能基を含有する樹脂マトリックスに共有結合的に不動化させた、大腸菌（Escherichia coli）又はアルスロバクター・ビスコサス（Arthrobacter viscosus）からのペニシリンＧアシラーゼを使用して行う請求項４〜６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項８】
樹脂マトリックスが、エポキシ基を含有するポリメタクリル樹脂でなる群から選ばれるものである請求項７記載の製法。
【請求項９】
ドロキシドパの製法であって、アミノ基が、任意に置換されたフェニルアセチル基によって保護されているDL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はその塩を、順に又は任意の順序で、
(ａ)ペニシリンＧアシラーゼによる酵素加水分解に供し；及び
(ｂ)ルイス酸によるメチレン基の除去に供する
ことを特徴とするドロキシドパの製法。
【請求項１０】
アミノ基が、未置換又はメチル基によって置換されたフェニルアセチル基によって保護されている請求項９記載の製法。
【請求項１１】
ドロキシドパの製法であって、
(ａ°)DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリンを、ベンゼン環において、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を任意に有するフェニル酢酸の官能誘導体にて処理し；及び、ベンゼン環において、任意に、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン又はその塩を、順に又は任意の順序で、
(ａ)ペニシリンＧアシラーゼによる酵素加水分解に供し；及び
(ｂ)ルイス酸によるメチレン基の除去に供する
ことを特徴とするドロキシドパの製法。
【請求項１２】
工程(ａ°)において、任意に置換されたフェニル酢酸の官能誘導体として、ジシクロヘキシルカルボジイミドにて、メルカプトベンゾトリアゾールにて又はベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートにて活性化した、酸ハロゲン化物、無水物、混合無水物、活性エステル又は遊離酸自体を使用する請求項１１記載の製法。
【請求項１３】
任意に置換されたフェニル酢酸の官能誘導体として、塩化フェニルアセチルを使用する請求項１１記載の製法。
【請求項１４】
工程(ａ)において、酵素加水分解を、溶液中に存在する又はペニシリンＧアシラーゼを結合できる官能基を含有する樹脂マトリックスに共有結合的に不動化させた、大腸菌又はアルスロバクター・ビスコサスからのペニシリンＧアシラーゼを使用して行う請求項９〜１３のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１５】
工程(ａ)において、ペニシリンＧアシラーゼを、エポキシ基を含有するポリメタクリル樹脂でなる群から選ばれるマトリックスに、共有結合的に不動化させる請求項９〜１４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１６】
工程(ｂ)において、使用するルイス酸が塩化アルミニウムである請求項９〜１５のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１７】
工程(ｂ)において、ルイス酸を、アルキルメルカプタン又はチオフェノールの存在下で使用する請求項９〜１６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１８】
アルキルメルカプタンが、炭素原子６〜１８個を含有するものである請求項１７記載の製法。
【請求項１９】
一般式(Ｂ')
【化５】
2005204644.tif 000016
（式中、Ｘは、ベンゼン環において任意に置換されたフェニルアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたフェノキシアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたマンデロイル基、ベンゼン環において任意に置換されたα-アミノフェニルアセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(2-チエニル)アセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(3-チエニル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(2-フリル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(3-フリル)アセチル基、又は2-(5-テトラゾリル)アセチル基であり；２つのＸ'は、共に水素であるか、又は共にカテコール官能基の保護基である）で表される化合物又はその塩。
【請求項２０】
一般式(Ｂ')（式中、２つのＸ'が一緒になって、メチレン基を形成する）で表される請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
一般式(Ｉ)
【化６】
2005204644.tif 000017
（式中、Ｒは、水素又は酵素加水分解及びメチレンジオキシ基の脱保護の条件下において不活性である置換基であり；２つのＲ'は、水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成する）で表されるDL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン誘導体又はその塩。
【請求項２２】
一般式(Ｉ)（式中、Ｒが水素又はメチレン基である）で表される請求項２１記載のDL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン誘導体又はその塩。
【請求項２３】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はその塩。
【請求項２４】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン又はその塩。
【請求項２５】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンナトリウム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素ルートによる、L-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの調製に関する。さらに詳述すれば、本発明は、任意に、カテコールヒドロキシル基において保護され、2-置換アセチル基にて、有利には、任意に置換されたフェニルアセチル基にてN-置換されたDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの酵素加水分解に関する。
【背景技術】
【０００２】
式(Ａ)
【化１】
2005204644.tif 000002
で表されるL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン、すなわち、(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロピオン酸（国際一般的名称「ドロキシドパ」として、よく知られている）は、起立性低血圧症の治療において使用され、また、パーキンソン病の治療に関しても提案されている、ノルアドレナリン（「ノルエピネフリン」としても知られている）の前駆体である合成アミノ酸である。
【０００３】
ドロキシドパは、例えば、米国特許第4,480,109号に開示されている化学合成によって調製される。この化学合成は、ピペロナールを原料とし、グリシンによる処理、続く、DL-トレオ形のみの単離を可能にする条件下におけるアミノ基のベンジルオキシカルボニル基（カルボベンゾイル、CBZ又は単にＺと称される）による保護によるものであり、ラセミのトレオ-N-ベンジルオキシカルボニル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを生成し、この化合物を、光学活性の塩基、例えば、エフェドリンによる塩の形成によって単離し、このようにして得られたL-トレオ-N-ベンジルオキシカルボニル-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリンをN,O-脱保護化し、ドロキシドパを単離する。しかし、この合成法は、収率が低いとの欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明者らは、ラセミのトレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン、すなわち、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（ここで、アミノ基は、ベンゼン環において任意に置換されたフェニルアセチル基によって置換される）を、ペニシリンＧアシラーゼ（PGA）にて処理することによって、L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンが、良好な収率及び高純度で得られるとの知見を得た。任意にアルキルメルカプタンの存在下における、メチレン基の三塩化アルミニウムでの除去によって、ドロキシドパが生成する。
【０００５】
発明者らは、初めに、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（ここで、アミノ基は、任意に置換されたフェニルアセチル基によって保護される）のメチレン基を、三塩化アルミニウムにて除去し、続いて、得られたDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ここで、アミノ基は、任意に置換されたフェニルアセチル基によって保護される）をPGAによる酵素加水分解に供することによって、ドロキシドパが得られるとの知見も得た。
【０００６】
最後に、発明者らは、DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ここで、カテコール官能基はフリーの状態にあるか、又は二保護化され、アミノ基は2-置換アセチル基によって保護される）を、ペニシリンアシラーゼの存在下における酵素加水分解に供することができるとの知見を得た。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このように、第１の態様によれば、本発明は、一般式(Ｂ)
【化２】
2005204644.tif 000003
（式中、２つのＸ'は、共に水素であるか、又は、共にカテコール官能基の保護基である）で表される(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸の製法であって、一般式(Ｂ')
【化３】
2005204644.tif 000004
（式中、Ｘは、ベンゼン環において任意に置換されたフェニルアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたフェノキシアセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたマンデロイル基、ベンゼン環において任意に置換されたα-アミノフェニルアセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(2-チエニル)アセチル基、チオフェン環において任意に置換された2-(3-チエニル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(2-フリル)アセチル基、フラン環において任意に置換された2-(3-フリル)アセチル基、又は2-(5-テトラゾリル)アセチル基であり；２つのＸ'は前記の定義のとおりである）で表されるラセミのトレオ形化合物又はその塩を、ペニシリンアシラーゼの存在下における酵素加水分解に供することを特徴とする製法を提供する。
【０００８】
一般式(Ｂ')で表される上記化合物及びその塩は新規な中間体であり、これらは本発明の他の態様を構成する。
【０００９】
上記の一般式(Ｂ)及び(Ｂ')における置換基Ｘ'によって示される保護基は、(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸の安定性を考慮して、フェノール及びカテコール官能基を保護でき、かつアミド基の存在下において容易に除去される基のいずれかである。好適な保護基は、文献、T.W. Greene及びP.G.M. Wutz, "有機合成における保護基", 第３版, 1999, John Wiley & Sons, Inc., p246-292に開示されている。
【００１０】
フェノール官能基の保護基Ｘ'の中でも、未置換又はベンゼン環において置換されたベンジル基（例えば、p-クロロベンジル基）、又は炭素原子３又は４個を有するアルケニル基（例えば、アリル基及び3-ブテニル基）を使用できる（ヨーロッパ特許第375574号にも開示されている）。
【００１１】
カテコール官能基も、カテコールの両ヒドロキシ基を同時にブロックする置換基によって保護される。このタイプの保護基としては、例えば、メチレン、2,2,2-トリメチルエチリデン、イソプロピリデン、シクロヘキシリデン、ジフェニルメチレン、エトキシメチレンがある。その導入及び除去は、上記文献のp287-291に開示されている。好ましくは、２つのＸ'は、一緒になって、メチレン基を形成する。
【００１２】
本発明のこの態様による有利な化合物は、上記一般式(Ｂ')において、２つのＸ'が、共に水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成しているものである。これらの化合物［一般式(BB')
【化４】
2005204644.tif 000005
（式中、２つのＲ'は、共に水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成し；Ｘは上記の定義のとおりである）で表される］又はその塩は、本発明のさらに他の態様を構成する。
【００１３】
有利な塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、有機第３級塩基及びアンモニウム塩との塩である。
【００１４】
一般式(BB')で表される化合物は、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（これら自体は、米国特許第4,480,109号に開示されているようにして調製される）を、酸
X-COOH
（ここで、Ｘは上記の定義のとおりである）の官能誘導体、例えば、酸塩化物にて処理することによって調製される。DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンも、DL-トレオ-N-ベンジルオキシカルボニル-3-(3,4-ジベンジルオキシフェニル)セリン（米国特許第4,319,040号又はB. Hegedusら, Helv. Chim. Acta, 1975, 58, 147-162）を原料として、ベンジル基及びベンジルオキシカルボニル基の同時除去を伴う接触水素化によって調製される。
【００１５】
酵素加水分解において触媒として使用されるペニシリンアシラーゼは、ペニシリンの6-(置換)アセトアミド基を加水分解して6-アミノペニシラン酸とすることができるアシラーゼの１つである。実際に、ペニシリンＧアシラーゼは、ベンゼン環において任意に置換されたフェニルアセチル基及びマンデロイル基及びチオフェン環又はフラン環において任意に置換された2-(2-チエニル)アセチル基、2-(3-チエニル)アセチル基、2-(2-フリル)アセチル基、2-(3-フリル)アセチル基、ベンゼン環において任意に置換されたα-アミノ-2-フェニルアセチル基及び(5-テトラゾリル)アセチル基を加水分解できる。ペニシリンＶアシラーゼは、ベンゼン環において任意に置換されたフェノキシアセチル基を加水分解できる。ベンゼン環において任意に置換されたα-アミノ-2-フェニルアセチル基は、α-アミノ酸エステルヒドロラーゼ（本発明の記載では、ペニシリンアシラーゼに含まれる）の存在下において加水分解される。
【００１６】
好適な具体例によれば、一般式(BB')（ここで、Ｘは、酵素加水分解及びメチレンジオキシ基の脱保護の条件下において不活性である置換基によって任意に置換されたフェニルアセチル基である）で表される化合物又はその塩を、原料物質として使用し、酵素加水分解をペニシリンＧアシラーゼの存在下で行う。
【００１７】
このように、特に、本発明は、一般式(AA')
【化５】
2005204644.tif 000006
（ここで、Ｒ'は、共に水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成する）で表される(-)-(2S,3R)-2-アミノ-3-ヒドロキシ-3-フェニルプロピオン酸の製法であって、一般式(Ｉ)
【化６】
2005204644.tif 000007
（ここで、Ｒは、水素又は酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基であり；及び２つのＲ'は、前記の定義のとおりである）で表されるラセミのトレオ形化合物又はその塩を、ペニシリンＧアシラーゼの存在下における酵素加水分解に供することを特徴とする製法を提供する。
【００１８】
立体選択的加水分解に関して使用されるペニシリンＧアシラーゼ（PGA）は、溶液中に存在する又はペニシリンＧアシラーゼを結合できる官能基（好ましくは、エポキシ基）を含有する樹脂マトリックス上に、例えば、エポキシ基を含有するスチレン及びジビニルベンゼン樹脂（例えば、Lewaqtit（登録商標）R259K又はR260K、又はDiaion（登録商標）HP-40）上に、又はエポキシ基を含有するポリアクリル樹脂（例えば、FP 4000）上に、又はエポキシ基を含有するポリメタクリル樹脂（例えば、Sepabeads（登録商標）FP-EP又はEupergit（登録商標）Ｃ）上に共有結合的に不動化された、微生物から得られたペニシリンＧアシラーゼのいずれか、例えば、大腸菌（Escherichia coli）又はアルスロバクター・ビスコサス（Arthrobacter viscosus）からの市販ペニシリンＧアシラーゼである。
【００１９】
酵素加水分解は、水性溶媒中、緩衝剤（例えば、炭酸塩又はリン酸塩緩衝剤）の存在下、任意に、適度の量の水混和性溶媒（例えば、メタノール、エタノール又はアセトニトリル）を使用して実施される。反応のｐＨは、６.０〜１０、有利には６.５〜９.５、好ましくは６.５〜９である。酵素反応の温度は、４〜３０℃の範囲で変動できる。
【００２０】
代表的には、一般式(Ｉ)で表される化合物の緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝剤）溶液に、算定した量の酵素（任意に上記の如く不動化される）を、混合物を上記のｐＨ及び温度に維持し、かつ加水分解の過程を220〜280nmにおいてHPLCによって制御しながら添加する。一般に、HPLCによる反応のコントロールは、適切なサイズのカラム及び溶離剤として約１０％アセトニトリルを含有するリン酸塩緩衝剤を使用して、温度２５〜３０℃において行われる。
【００２１】
加水分解が５０％生じたことが観察された時点で、触媒の濾過（反応が高ｐＨで行われる場合）又はｐＨ値の上昇及び触媒の濾去によって、反応を停止する。加水分解のコントロールは、エナンチオ選択率が未知の場合に好適であるが、酵素の起源を適切に選択すること及び、任意に、不動化用に適切な支持体を選択することによって、非常に高いエナンチオ選択率を得ることが可能であり、これによって、酵素反応は、所望のL-トレオ鏡像異性体が加水分解されると停止する。
【００２２】
残りの溶液から、鏡像異性体純度９５〜９９％を有するL-トレオ形異性体を、公知の方法に従って、例えば、酸性化、非加水分解鏡像異性体（D-トレオ異性体でなる）の濾過による除去、加水分解の間に生成したフェニル酢酸の好適な溶媒（例えば、酢酸エチル又はジクロロメタン）による抽出、及び一般式(AA')で表されるL-トレオ形誘導体の冷時酸性化による沈澱によって単離する。
【００２３】
好適な他の具体例によれば、本発明は、アミノ基が、任意に置換されたフェニルアセチル基にて保護されているDL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はその塩を、順に又は任意の順序で、
(ａ)ペニシリンＧアシラーゼによる酵素加水分解に供し；及び
(ｂ)ルイス酸によるメチレン基の除去に供する
ことを特徴とするドロキシドパの製法を提供する。
【００２４】
表現「順に又は任意の順序で」とは、アミノ基が、任意に置換されたフェニルアセチル基にて保護されているDL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、順序(ａ)−(ｂ)又は(ｂ)−(ａ)で、２つの工程を交互に行うことを意味する。
【００２５】
この好適な具体例によるプロセスは、スキーム１によって表される。
【００２６】
スキーム１
【化７】
2005204644.tif 000008
ここで、Ｒは、水素又は酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基であり、化合物(I')及び(I''）はラセミのトレオ形である。
【００２７】
プロセスを(ａ)−(ｂ)の方向で実施する場合には、工程(ａ)では、PGAでの酵素加水分解による、任意に置換されたフェニルアセチル基の除去により、L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンが提供される。このようにして得られた化合物を、三塩化アルミニウムでの処理によるメチレン基の除去に供して、直接ドロキシドパを生成する。
【００２８】
プロセスを(ｂ)−(ａ)の方向で実施する場合には、工程(ｂ)では、三塩化アルミニウムでの処理によるメチレン基の除去により、DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ここで、アミノ基は、任意に置換されたフェニルアセチル基によって保護されている）が生成される。このようにして得られた生成物を、PGAでの酵素加水分解に供し、これにより、直接的にドロキシドパが生成される。
【００２９】
本発明のプロセスの工程(ａ)（すなわち、酵素加水分解）は、溶液中に存在するか、又は、好ましくは不活性支持体（例えば、Eupergit C）上に不動化されたPGA（９９％以上の鏡像異性体を、高変化率及び高純度で得ることを可能にする）を使用することによって、N-(任意に置換された)フェニルアセチル-DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はN-(任意に置換された)フェニルアセチル-DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンについて行われる。
【００３０】
代表的には、一般式(I')又は(I'')で表される化合物の緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝剤）溶液に、算定した量の酵素（任意に不動化又は上記のように処理される）を添加する。このようにして得られた生成物（L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン又はL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンでなる）を、常法に従って単離する。
【００３１】
工程(ｂ)（すなわち、メチレン基の除去）は、N-フェニルアセチル-DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(I'））又はL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(A'））について、米国特許第4,480,109号に記載されているように、これら物質を、有利には、アルキルメルカプタン（好ましくは、炭素原子６〜１８個を含有する）又はチオフェノールの存在下、ハロゲン化溶媒（例えば、ジクロロメタン）中、又は炭化水素溶媒（例えば、トルエン）中において、ルイス酸（例えば、三塩化又は三臭化アルミニウム）にて処理することによって行われる。脱保護反応の終了時、DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（一般式(I'')）を、通常の技術に従って、遊離酸又はナトリウム塩として単離する。実際には、反応混合物を、水性又は水性−有機媒体中で酸性化し、水相から、ｐＨを２〜５.５に好適に調節することによって、DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンを回収する。工程(ｂ)をDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(I')）について行うことによって、アルキルメルカプタンの存在下における三塩化アルミニウムとの反応による脱保護の終了後、工程(ｂ)の終了時に得られた生成物を、疎水性樹脂を収容する分取カラムを使用する精製に供することによって純粋な形でN-フェニルアセチル-DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（一般式(I'')）が単離される。使用する疎水性樹脂は、スチレンジビニルベンゼン、ポリアクリル又はポリメタクリルタイプの重合体又は共重合体である。上記樹脂の１つによる精製は、順序(ｂ)−(ａ)における工程(ｂ)の間に、脱保護反応の終了時に溶液中に存在するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンを単離することなく実施され、実質的に純粋な生成物を含有する溶液は、直接、酵素加水分解に供される。
【００３２】
原料物質として使用されるDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ここで、アミノ基は、任意に置換されたフェニルアセチル基によって保護される）（一般式(I')）又はその塩は、遊離のDL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（それ自体、公知の方法に従って調製される）を原料として、例えば、米国特許第4,480,109号に記載されているように、メタノール中におけるPd/Ｃ触媒水素化分解によるDL-トレオ-N-ベンジルオキシカルボニル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンのベンジルオキシカルボニル基の除去によって調製される。このようにして得られたラセミのトレオ-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、ベンゼン環において任意に置換されたフェニル酢酸の官能誘導体にて処理して、対応するN-保護化生成物を得る。
【００３３】
原料である、任意に置換されたフェニルアセチル基によってN-保護されたラセミのトレオ-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(I')）及び順序(ｂ)−(ａ)による工程(ｂ)の終了時に得られた、任意に置換されたフェニルアセチル基によってN-保護化されたラセミのトレオ-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン及びその塩は、本発明の方法におけるキーとなる中間体として有用な新規な化合物である。
【００３４】
このように、他の態様によれば、本発明は、一般式(Ｉ)
【化８】
2005204644.tif 000009
（ここで、Ｒは水素又は酵素加水分解及びメチレンジオキシ基の脱保護の条件下において不活性である置換基であり；及び２つのＲ'は、共に水素であるか、又は、一緒になって、メチレン基を形成する）で表されるDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン誘導体又はその塩が提供される。
【００３５】
有利には、Ｒは水素又は炭素原子１〜４個を含有するアルキル基であり、好ましくは、Ｒは水素又はメチル基である。
【００３６】
好適な化合物は、DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン誘導体又はその塩、DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン誘導体又はその塩、特に、ナトリウム塩である。
【００３７】
有利な塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、有機第３級塩基及びアンモニウム塩との塩である。ナトリウム、カリウム及びトリエチルアミン塩が好適である。
【００３８】
実際には、一般式(Ｉ)（ここで、２つのＲ'は、一緒になって、メチレン基を形成している）で表される化合物の調製について、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、一般式(II)
【化９】
2005204644.tif 000010
（ここで、Ｒは、上記の定義のとおりである）で表される、任意に置換されたフェニル酢酸の官能誘導体にて処理し、このようにして得られたアミドを、常法に従って単離する。
【００３９】
官能誘導体として塩化物が使用される。このような場合、例えば、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、塩基性媒体中、温度２〜４℃において、塩化フェニルアセチルと反応させる。このようにして高収率及び高純度で得られたN-フェニルアセチル-DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、反応媒体の酸性化によって単離する。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、本発明は、ドロキシドパの製法であって、
(ａ°)DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリンを、ベンゼン環において、任意に、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を有するフェニル酢酸の官能誘導体にて処理し；及び、ベンゼン環において、任意に、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン又はその塩を、順に又は任意の順序で、
(ａ)ペニシリンＧアシラーゼによる酵素加水分解に供し；及び
(ｂ)ルイス酸によるメチレン基の除去に供する
ことを特徴とする製法を提供する。
【００４１】
好適な態様によれば、この方法は、スキーム２（ここで、Ｒは上記の定義のとおりであり、及び化合物I°、I'及びI''はラセミのトレオ形である）に従って行われる。
【００４２】
スキーム２
【化１０】
2005204644.tif 000011
【００４３】
工程(ａ°)において、ベンゼン環において、任意に、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を有するフェニル酢酸の官能誘導体は、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドにて、メルカプトベンゾトリアゾールにて、又は、いわゆる「BOP試薬」、すなわちベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートにて好適に活性化された、その酸ハロゲン化物、無水物、混合無水物、活性エステル又は遊離酸自体である。任意に置換されたフェニル酢酸の有利な官能誘導体は、遊離酸と塩化チオニルとの反応によって得られ、直接、「その場において」、DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンと反応される酸塩化物である。
【００４４】
塩化フェニルアセチルは、任意に置換されたフェニル酢酸の好適な官能誘導体として使用される。
【００４５】
このように単離された、ベンゼン環において、任意に、酵素加水分解及びメチレン基の除去の条件下において不活性である置換基を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを、上述のように、工程(ａ)及び(ｂ)に、順に又は任意の順序で供する。特に、工程(ａ)では、酵素加水分解は、溶液中に存在する又は不動化された大腸菌又はアルスロバクター・ビスコサスからのペニシリンＧアシラーゼを使用して有利に行われる。好ましくは、PGAは、エポキシ基を含有するスチレン及びジビニルベンゼン樹脂、エポキシ基を含有するポリアクリル樹脂及びエポキシ基を含有するポリメタクリル樹脂でなる群から選ばれるマトリックス上に不動化される。工程(ｂ)において、有利に使用されるルイス酸は、任意にアルキルメルカプタン又はチオフェノールの存在下における三塩化アルミニウムである。好ましくは、アルキルメルカプタンは炭素原子６〜１８個を含有する。
【００４６】
以下の実施例は、本発明を説明するものである。
【００４７】
調製
DL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン
オートクレーブ（１Ｌ）に、室温で、メタノール100ml、DL-トレオ-N-ベンジルオキシカルボニル-3-(3,4-ジベンジルオキシフェニル)セリン（B. Hegedusら, Helv. Chim. Acta, 1975, 58, 147-172）６.０ｇ（0.1137モル）及び脱塩水３.４mlにて希釈した濃HCl１.５mlを導入し、ついで、水分５０％の１０％Pd/Ｃ０.５ｇを添加した。オートクレーブを水素にて２回浄化した後、水素化を、撹拌（機械的振盪）下、圧力３バールにて開始した。水素化の終了（２時間）後、混合物を濾過し、メタノールにて洗浄し（２×１５ml）、溶液を、減圧下で約５０〜６０mlに濃縮した。溶液のｐＨを、撹拌下、２Ｎ水酸化ナトリウムにて５.０〜５.５に調整した。沈澱を含有する混合物を、温度約４℃にて３時間静置し、ついで、濾過し、メタノールlにて（２×１０ml）、続いて、アセトンにて洗浄した。減圧下、５０℃にて恒量となるまで乾燥した後、基準試料と同一のDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン１.９ｇが得られた。
【実施例１】
【００４８】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン（一般式(I')）
水250ml中にDL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン塩酸塩26.2ｇ（０.１モル）を含有する溶液に、水５０mlにNaOHペレット８.０ｇ（０.２モル）を溶解することによって得られた溶液を添加した。撹拌下、約２０℃の一定温度において、１５％水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを８.５〜９.５に維持しながら、塩化フェニルアセチル17.0ｇ（0.11モル）を添加した。添加後、安定したｐＨが達成されるまで、反応を、４０〜５０分間攪拌下に維持した。１５％HClによって、ｐＨを２.０±０.１の値に調整し、これによって、生成物を沈殿させた。濾過し、水にて洗浄し、減圧下、５５℃にて恒量となるまで乾燥した後、HPLC純度≧９８％をもつDL-トレオ-N-フェニルアセチル-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン24.8ｇが得られた。融点＝166〜168℃。
1HNMR（DMSO）δ（ppm）：3.41(AB４重項系, 2H), 4.42(d, 1H), 5.10(d, 1H), 5.95(s, 2H), 6.6-7.4(芳香族, 8H), 8.17(d, 1H)
【実施例２】
【００４９】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（一般式(I'')）
完全に無水のバルーン（500ml）に、窒素流動下、粉末状の無水三塩化アルミニウム５.３ｇ（0.04モル）及び無水のジクロロメタン７０mlを導入した。０/＋５℃に冷却した混合物に、攪拌しながら、1-ドデカンチオール８.１ｇ（0.04モル）を添加し、ついで、１５分間攪拌した後、得られた黄色がかった溶液に、温度０/＋５℃において、実施例１において記載したようにして得られたDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン3.43ｇ（0.01モル）を添加した。添加の開始時、生成物は溶液中に溶解したが、反応の終末に向かって、多量のゲル状沈殿が生成し、この沈殿は撹拌速度を低下させた。０/＋５℃において４時間攪拌した後、酢酸エチル１５mlを添加して、溶液を発熱反応に導き、該発熱反応を、温度を１０℃以下に維持することによって制御した。得られた溶液を、別に調製した、水７５ml、３７％HCl ３.６ml、アセトン２０ml及び酢酸エチル７５mlでなる混合物に注いだ。１０分間攪拌した後、相を分離した。水相を酢酸エチル５０mlにて抽出し、一方、有機相を、この抽出液に添加した。集めた有機相を、水４０ml中に炭酸水素ナトリウム１.５ｇを含有する溶液にて抽出した。溶液のｐＨを、酢酸エチル５０mlの存在下において、１５％HClにて、２.０±０.１の値に調整した。相を分離した後、水相を、再度、酢酸エチル３０mlにて抽出し、一方、有機相を、この抽出による有機相に添加した。集めた有機相を減圧下で濃縮して、オイルを得た。得られたオイル（DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンでなる）をアセトン３０mlにて採取し、アセトン１５ml中に２-ヘキサン酸ナトリウム１.５ｇを含有する溶液を添加した後、ナトリウム塩の白色沈澱が得られ、２時間静置した後、これを濾過した。アセトンで洗浄し、減圧下、５５℃において恒量となるまで乾燥した後、HPLC純度91.6％を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンナトリウム１.８ｇが得られた。
1HNMR（D2O）δ（ppm）：2.85(AB４重項系, 2H), 4.55(d, 1H), 5.24(d, 1H), 6.4-7.7(芳香族, 8H)
【００５０】
他の調製法では、得られたオイル（DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンでなる）を、ジクロロメタン、酢酸エチル、メタノール、水及び酢酸、それぞれ、７７、１５、８、１.２及び１〜１.５部（容量）でなる溶媒混合物１０mlにて採取し、得られた溶液を、同じ溶媒混合物を溶離液として使用する、シリカゲル６０、240〜400メッシュでのフラッシュクロマトグラフィーに供した。TLC（同じ溶媒混合物を溶離液として使用する）においてただ１つのスポットを示すフラクションを集め、減圧下において、溶媒を留去した。得られたオイルを、結晶化に適したエチルエーテルにて処理した。冷所（約４℃）において３〜１５時間静置した後、純度98.76％を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン遊離酸を、濾過、エーテルでの洗浄及び乾燥によって単離した。
【実施例３】
【００５１】
DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（一般式(I'')）
脱塩水４０ml及び上記「調製」の項において記載したようにして得たDL-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン１.５ｇ（0.0074モル）でなる懸濁液に、水３ml中にNaOHペレット0.285ｇを含有する溶液を添加した。このようにして得られた、ｐＨ11.5〜12.0を有する溶液に、酢酸エチル５ml中に溶解した塩化フェニルアセチル１.２ｇ（0.0077モル）を、５Ｎ水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを８.０〜８.５に維持しながら、１５分間で添加し、ついで、TLC（溶離液：メタノール／酢酸エチル／酢酸の１０／１０／１混合物）にて反応を制御しながら、混合物を１時間反応させた。反応終了時、混合物を酢酸エチル２５mlにて洗浄し、水溶液のｐＨを、酢酸エチル２５mlの存在下、２Ｎ HClにて１.９〜２.０に調整した。５分後、相を分離した。水相を酢酸エチル２０mlにて抽出し、一方、有機相を、この有機抽出液に添加した。集めた有機相を濃縮して、オイル１.８ｇとし、これを水３０ml中に懸濁させた。懸濁液のｐＨを、撹拌下、１０％NaOHにて７.５に調整し、これによって、淡褐色の溶液を得た。活性炭による脱色、１５分間の撹拌、濾過及びフィルター上での水数mlによる洗浄の後、溶液を減圧下で濃縮して油状残渣とし、これを無水エタノールにて採取して（４×１５ml）、水を除去し、ついで、酢酸エチル２０mlにて採取した。溶液を、室温にて一夜静置し、ついで、結晶化した生成物をアセトンにて洗浄し、減圧下、５０℃で乾燥して、恒量とした。このようにして、DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンナトリウム塩１.２ｇが得られた。
【実施例４】
【００５２】
L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(A')）
ｐＨ６.５の１０mMリン酸塩緩衝剤５０ml中に、実施例１において記載したようにして得たDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン1.716ｇ（５ミリモル）を含有する溶液に、予め水にて洗浄し、ｐＨ６.５の１０mMリン酸塩緩衝剤にてコンディショニングした、Eupergit Ｃ（Recordati）上に不動化させた大腸菌からのPGAの市販誘導体４ｇ（296酵素単位に相当する）を添加した。反応混合物を室温において静置し、カラムWaters Symmetry（150×４.６mm；５μn）及び(Ａ)１０mM KH2PO4緩衝剤９０％、アセトニトリル１０％及び(Ｂ)アセトニトリル９０％、水１０％でなる溶離液、グラディエント：０〜２分＝100％(Ａ)；２〜３分＝９５％(Ａ)-５％(Ｂ)（ステップ）；３〜４分＝９０％(Ａ)-１０％(Ｂ)（ステップ）；４〜９分＝６０％(Ａ)-４０％(Ｂ)（線状）；９〜１４分＝100％(Ａ)（ステップ）、及びフラックス：１.２ml/分［DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの外部基準の注入濃度：２mM；DL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：２分；フェニル酢酸の保持時間（220nm）：９分；DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：１０分］を使用する３０℃におけるHPLC（λ＝220〜280nm）によって監視した。３時間３０分後、反応は加水分解５０％を達成した。触媒の濾過によって反応を停止し、塩基性ｐＨの水によって洗浄した後、濾液を集めた。触媒の効率（すなわち、エナンチオ選択率）を、物質の２つの鏡像異性体を分離できるキラルHPLC分析［カラム：AGP Chromtech（100×４mm；５μn）；溶離液：１０mM KH2PO4緩衝剤９０％、イソプロパノール１０％（ｐＨ４.１）；フラックス：０.９ml／分；λ＝280nm；Ｔ＝２５℃；L-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：８.５分；D-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：１.５分］によって評価した。未反応物質に対する鏡像異性体過剰の値（９５％）を算定し、反応によって達成された変化率値（５０％）を知ることによって、酵素のエナンチオ選択率（Ｅ）を評価した（Ｅ＝145）。未加水分解DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの析出を容易なものとするため、冷所において、濾液のｐＨを酸性値（このアッセイでは約１.５）に調整した。生成した沈殿を濾過し、反応の間に生成したフェニル酢酸を除去するため、酸性ｐＨに維持しながら、得られた液をジクロロメタンにて抽出した。L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを含有する水相を、冷所において、ｐＨ３.２とし、沈殿したL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを濾過によって単離した。単離された生成物の質量：300mg；純度（HPLCによって評価）：９７％。
1HNMR（D2O中のDMSO）δ（ppm）：3.4(d, 1H), 5.0(d, 1H), 5.9(s, 2H), 6.8(s, 2H), 7.0(s, 1H)
【実施例５】
【００５３】
L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン（一般式(A')）
ｐＨ６.５の１０mMリン酸塩緩衝剤５０ml中に、実施例１において記載したようにして得たDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリン340mg（１ミリモル）を含有する溶液に、予め水にて洗浄し、ｐＨ６.５の１０mMリン酸塩緩衝剤にてコンディショニングした、Eupergit Ｃ上に不動化させたアルスロバクター・ビスコサスからの市販PGA 3700mg（IB-AVE1G誘導体：220酵素単位に相当する）を添加した。実施例４において記載したようにHPLCにて監視しながら、室温（２５℃）において、わずか３０分間維持した後では、加水分解は４９％に達した。180分後では、反応は加水分解５０％に達した。反応を６時間続けたが、加水分解率は変化せず、これは、所望のL-トレオ異性体のみが加水分解されたために、反応が停止したことを表している。触媒の濾過及び塩基性ｐＨの水による洗浄の後、濾液を集めた。実施例４において記載したようなキラルHPLC分析の結果、算定された鏡像異性体過剰（ees）は９９％以上であり、算定されたエナンチオ選択率（Ｅ）は200以上であった。実施例４において記載したようにして、L-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンを単離した。
【実施例６】
【００５４】
L-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ドロキシドパ：一般式(Ａ)）
ｐＨ６.５の２５mMリン酸塩緩衝剤52.6ml中に、実施例２において記載したようにして得たDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンナトリウム４.７ｇ（13.3ミリモル）を含有する溶液に、予め水にて洗浄し、ｐＨ６.５の２５mMリン酸塩緩衝剤にてコンディショニングした、Eupergit Ｃ（Recordati）上に不動化させた大腸菌からのPGAの市販誘導体５ｇ（680酵素単位（室温にて評価）に相当する）を添加した。反応混合物を室温に維持し、カラムZorbax SB-18（250×４.６mm；５μn）及び(Ａ)１０mM KH2PO4緩衝剤９５％、アセトニトリル５％及び(Ｂ)アセトニトリル９０％、水１０％でなる溶離液、グラディエント：０〜３分＝100％(Ａ)；３〜６分＝100％(Ａ)〜６０％(Ａ)-４０％(Ｂ)（線状）；６〜１６分＝６０％(Ａ)-４０％(Ｂ)；１６〜２８分＝100％(Ａ)（ステップ）、及びフラックス：１ml/分［DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの外部基準の注入濃度：1.25mM；ドロキシドパの保持時間：2.48分；DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの保持時間：１２分；不純なL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：4.95分；不純なDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：16.15分］を使用する２５℃におけるHPLC（λ＝280nm）によって監視した。１７時間後、反応は加水分解５０％を達成した。触媒の濾過後、反応混合物をｐＨ１.５とし、酢酸エチルにて抽出し（３×２０ml）、水相を、減圧下での蒸発によって、微量の有機溶媒をも含まない状態とし、ついで、氷にて冷却し、活性炭400mgにて１５分間処理して脱色した。濾過によって活性炭を除去した後、溶液のｐＨを、酢酸ナトリウムの添加によって４.５とし、得られた生成物が完全に結晶化するまで氷の上に維持した。濾過し、水、ついで、アセトンにて洗浄し、続いて、乾燥した後、純度９９％を有するドロキシドパ１.１ｇが得られた。融点＝225℃。旋光能（２５℃において）：[α]D＝-39.9°（ｃ＝１ １Ｍ HCl中）。
【実施例７】
【００５５】
ドロキシドパ
完全に無水のバルーン（100ml）に、窒素流動下、無水の三塩化アルミニウム粉末2.03ｇ（0.015モル）及び無水のジクロロメタン５０mlを導入した。０/＋５℃に冷却した混合物に、攪拌しながら、1-ドデカンチオール3.05ｇ（0.015モル）を添加した。１５分間攪拌した後、得られた黄色がかった溶液に、温度０/＋５℃において、実施例４において記載したようにして得たL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキフェニル)セリン1.08ｇ（0.01モル）を添加した。添加の開始時、生成物は溶液中に溶解したが、添加の終末に向かって、多量のゲル状沈殿が生成した。温度０/＋５℃において２時間後、メタノール２５mlを添加し、これにより、溶液を発熱反応に導き、該発熱反応を、温度を１０℃以下に維持することによって制御した。溶液を、減圧下で濃縮して、オイルを得た後、このオイルを水３０mlにて採取した。３Ｎ HClの添加によってｐＨ２とし、続いて、酢酸エチルにより抽出し（３×２０ml）、１０分間攪拌した後、相を分離した。水相を、再度、酢酸エチル５０mlにて抽出した。ドロキシドパの沈澱まで、酢酸ナトリウム３水和物を水相に添加した。乾燥後、純度９７％を有するドロキシドパ0.51ｇが得られた。融点：225℃；旋光能：[α]D＝-39.9°（ｃ＝１ 1Ｍ HCL中）。
【実施例８】
【００５６】
L-トレオ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン（ドロキシドパ：一般式(Ａ)）
ｐＨ６.５の２５mMリン酸塩緩衝剤60.5ml中に、実施例２において記載したようにして得た、純度98.76％を有するDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリン遊離酸５ｇ（15.1ミリモル）を含有する溶液に、予め水にて洗浄し、ｐＨ６.５の２５mMリン酸塩緩衝剤にてコンディショニングした、Eupergit Ｃ上に不動化させた大腸菌からのPGAの市販誘導体２ｇ（誘導体IB-ECE1G；232酵素単位（室温にて評価）に相当する）を添加した。反応混合物を室温に維持し、カラムZorbax SB-18（250×４.６mm；５μn）及び(Ａ)１０mM KH2PO4緩衝剤９０％、アセトニトリル１０％（ｐＨ７）及び(Ｂ)１０mM KH2PO4緩衝剤７０％、アセトニトリル３０％（ｐＨ７）でなる溶離液、グラディエント：０〜４分＝100％(Ａ)；４〜７分＝100％(Ａ)〜100％(Ｂ)（線状）；７〜１３分＝100％(Ｂ)；１３〜２０分＝100％(Ａ)（ステップ）、及びフラックス：１ml/分［DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの外部基準の注入濃度：3.29mM；ドロキシドパの保持時間：2.27分；DL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)セリンの保持時間：5.16分；不純なL-トレオ-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：3.40分；不純なDL-トレオ-N-フェニルアセチル-3-(3,4-メチレンジオキシフェニル)セリンの保持時間：11.57分］を使用する２５℃におけるHPLC（λ＝254nm）によって監視した。５時間後、反応は加水分解４５％を達成した。なお触媒を含有する反応バッチのｐＨを、５Ｍ NaOHの添加によって９.５に調整して、ドロキシドパを完全に溶解させた。酵素の濾過後、６Ｎ HClの添加によって、反応混合物をｐＨ１.３とし、酢酸エチルにて抽出し（４×５０ml）、水相を、減圧下での蒸発によって、微量の有機溶媒をも含まない状態とし、ついで、氷にて１０℃に冷却し、温度を２５℃に上昇させながら、活性炭300mgにて３０分間処理して脱色した。濾過によって活性炭を除去した後、溶液に、溶液の容量について１０％質量/容量に相当するNaCl及びアスコルビン酸５０mgを添加した。ついで、溶液を４℃に冷却し、そのｐＨを、酢酸ナトリウムの添加によって４.５とし、得られた生成物が完全に結晶化するまで氷の上に静置した。濾過し、水、ついで、アセトンにて洗浄し、続いて、乾燥した後、純度99.39％を有するドロキシドパを生成0.93ｇが得られた。