(57)【要約】【課題】  ＢＲＭの薬効を評価することができるインビボモデル非ヒト動物及び該動物を用いたＢＲＭの抗腫瘍効果の評価方法等を提供する。【解決手段】  抗腫瘍作用の評価方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法：（１）モルモットリンパ節転移モデル動物を作製する工程；（２）（１）のモデル動物に被験物質を投与する工程；（３）（２）のモデル動物におけるリンパ節重量を測定する工程；及び（４）前記（１）〜（３）の工程を複数のモデル動物について実施し、（３）の測定結果から作成するヒストグラムの２相性の分布に基づき決定される閾値を指標として、被験物質の抗腫瘍作用を評価する工程。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍作用の評価方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法：
（１）モルモットリンパ節転移モデル動物を作製する工程；
（２）（１）のモデル動物に被験物質を投与する工程；
（３）（２）のモデル動物におけるリンパ節重量を測定する工程；及び
（４）前記（１）〜（３）の工程を複数のモデル動物について実施し、（３）の測定結果から作成するヒストグラムの２相性の分布に基づき決定される閾値を指標として、被験物質の抗腫瘍作用を評価する工程。
【請求項２】
抗腫瘍作用が癌のリンパ節転移抑制作用である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
被験物質が細菌細胞壁骨格成分である、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳである、請求項３に記載の評価方法。
【請求項５】
２相性の分布に基づき決定される閾値が、約９３０ｍｇである、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
抗腫瘍作用を示すＢＲＭの同定方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法：
（１）モルモットリンパ節転移モデル動物を作製する工程；
（２）（１）のモデル動物に被験物質を投与する工程；
（３）（２）のモデル動物におけるリンパ節重量を測定する工程；及び
（４）前記（１）〜（３）の工程を複数のモデル動物について実施し、測定結果から作成するヒストグラムが２相性を示すか否かを指標として、抗腫瘍作用を示すＢＲＭを同定する工程。
【請求項７】
抗腫瘍作用が、癌のリンパ節転移抑制作用である請求項６に記載の同定方法。
【請求項８】
ＢＲＭが細菌細胞壁骨格成分である、請求項６又は７に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法治療剤として有用な、生体反応修飾物質（BRM）の抗腫瘍作用の評価方法等を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の免疫療法剤として、微生物死菌、細菌の細胞壁骨格成分、ムラミルジペプチド（MDP）、リポ多糖（LPS）等の細菌菌体成分等からなる、BRM(biological response modifier, 生体反応修飾物質)と呼ばれる一連の物質がある。これらは自然免疫を賦活する免疫療法剤として用いられている。これらのうち、細菌細胞壁骨格成分（以下、細菌−ＣＷＳと略する場合がある）は、例えば動物を用いる実験的腫瘍系およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。しかも、菌体成分が鉱物油等の油状物質中に分散された場合に、特に優れた免疫賦活作用による、抗腫瘍効果や感染防御効果を示すことが知られている。菌体成分としては、例えば生菌そのものであるBCG(Bacille Calmette-Guerin)菌、またはBCG菌体を破砕して遠沈分画して得た細胞壁から調製された細胞骨格成分（cell- wall skeleton, CWS）、すなわちBCG-CWSが免疫療法剤として使用されている（非特許文献１を参照）。
BRMの薬効をイン  ビボで評価する方法としては皮下移植腫瘍に被験物質を腫瘍内投与する原発巣退縮モデルとげっ歯類動物の尾静脈に腫瘍細胞を経尾静脈投与する実験的癌転移モデルが知られていた（非特許文献３及び４を参照）。
しかしながら、皮下移植腫瘍に被験物質を直接投与する方法の場合、臨床現場で用いられる被験物質の投与ルートと一致しないという問題点があった。また、実験的転移モデルの場合、104-105個の腫瘍細胞が瞬時に血中に投与されることや原発巣における腫瘍細胞の増殖、周辺組織への浸潤および血管内への侵入、遊離という転移における最初のステップが省略されているという点で自然転移とは異なっているという問題点があり、更に優れた方法が求められていた。
【特許文献１】国際公開第９８／３９０１７号パンフレット
【非特許文献１】Hayashi, A. et al., Proc. Japan Acad., 74, Ser. B, 50-55, 1998
【非特許文献２】林  昭著、免疫1999-2000、220-229  （2001)
【非特許文献３】Zbar B. et al., Sciense,172, 271 (1971)
【非特許文献４】Poste G. et al., Cancer Res., 40, 1636 (1980)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、ＢＲＭの薬効を評価することができるインビボモデル動物及び該動物を用いたＢＲＭの抗腫瘍効果の評価方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者らは、モルモットの実験的癌転移モデルを用いて、ＢＲＭの抗腫瘍作用の評価試験を行い、結果を解析する方法について鋭意検討を行った。すなわち、モルモットに腫瘍細胞を皮内注射により注入した後、ＢＣＧ−ＣＷＳを腫瘍細胞を注入した部位とは異なる部位に皮内投与する試験を行い、リンパ節を摘出しその重量を測定してリンパ節転移の有無を調べる方法を検討した。しかし、免疫賦活剤の中にはそれ自体リンパ節重量を増大させる効果を有するものがある。そのため、癌転移モデル動物においてリンパ節重量が増大した場合、免疫賦活作用に基づいてリンパ節に腫脹が生じたのか、あるいは癌転移によりリンパ節重量が増大したのか判断が困難であるという問題があった。
発明者らが鋭意検討した結果、ＢＣＧ−ＣＷＳを投与した場合、リンパ節重量に対する個体数の分布は正規分布せず、２つの極大値を有する２相性の分布を示すことがわかった。また、リンパ節重量値が小さい分布に属する個体はリンパ節転移が抑制されており、リンパ節重量値が大きい分布に属する個体はリンパ節転移していることがわかった。
以上の知見から、上記２相性の分布における２つのピークの境界値を統計解析により求めることにより、ＢＲＭの癌転移モデル動物における抗腫瘍作用を当該境界値以下のリンパ節重量を示すか否かにより評価できる。また、癌転移モデル動物に被験物質を投与した場合、上記のような２相性の分布を示すか否かを指標として当該被験物質がＢＲＭであることを同定できる。本発明は上記の知見を元に完成するに至ったものである。
【０００５】
即ち本発明は、
〔１〕  抗腫瘍作用の評価方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法：
（１）モルモットリンパ節転移モデル動物を作製する工程；
（２）（１）のモデル動物に被験物質を投与する工程；
（３）（２）のモデル動物におけるリンパ節重量を測定する工程；及び
（４）前記（１）〜（３）の工程を複数のモデル動物について実施し、（３）の測定結果から作成するヒストグラムの２相性の分布に基づき決定される閾値を指標として、被験物質の抗腫瘍作用を評価する工程；
〔２〕  抗腫瘍作用が癌のリンパ節転移抑制作用である、〔１〕に記載の評価方法；
〔３〕  被験物質が細菌細胞壁骨格成分である、〔１〕又は〔２〕に記載の評価方法；
〔４〕  細菌細胞壁骨格成分がＢＣＧ−ＣＷＳである、〔３〕に記載の評価方法；
〔５〕  ２相性の分布に基づき決定される閾値が、約９３０ｍｇである、〔４〕に記載の評価方法；
〔６〕  モルモットがＳｔｒａｉｎ２系統であり、腫瘍細胞がline10である、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の評価方法；
〔７〕  抗腫瘍作用を示すＢＲＭの同定方法であって、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法：
（１）モルモットリンパ節転移モデル動物を作製する工程；
（２）（１）のモデル動物に被験物質を投与する工程；
（３）（２）のモデル動物におけるリンパ節重量を測定する工程；及び
（４）前記（１）〜（３）の工程を複数のモデル動物について実施し、（３）の測定結果から作成するヒストグラムが２相性を示すか否かを指標として、抗腫瘍作用を示すＢＲＭを同定する工程；
〔８〕  抗腫瘍作用が、癌のリンパ節転移抑制作用である〔７〕に記載の同定方法；
〔９〕  ＢＲＭが細菌細胞壁骨格成分である、〔７〕又は〔８〕に記載の同定方法；
〔１０〕  モルモットがＳｔｒａｉｎ２系統であり、腫瘍細胞がline10である、〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の評価方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ＢＲＭの薬効を評価することができるモデル動物及び該動物を用いたＢＲＭの抗腫瘍効果の評価方法を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本明細書において、ＢＲＭ(biological response modifier, 生体反応修飾物質)とは、細菌由来の免疫賦活物質を表し、具体的なＢＲＭとしては、細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、該ＣＷＳの部分構造であるムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、レンチナン等が挙げられる。
細菌細胞壁骨格成分（細菌−ＣＷＳ）とは、細菌由来の細胞壁骨格成分を含有するものであれば特に制限は無く、ヒト型結核菌の死菌等の微生物死菌そのものや、ある程度単離された細胞壁骨格成分（ＣＷＳ)などを含む概念である。ＣＷＳの由来細菌としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌などが挙げられる。「ミコバクテリウム属細菌」とは、抗酸菌のミコバクテリウム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌のMycobacterium tuberculosis（結核菌）、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌、ＢＣＧ菌を含む）、Mycobacterium africanum（アフリカ菌）、Mycobacterium microti（ネズミ型結核菌）があり、この他、Mycobacterium leprae（ライ菌)、非結核性抗酸菌群であるMycobacterium kansasii、Mycobacterium avium、Mycobacterium phlei等が挙げられる。中でも好ましいものとして、ミコバクテリウム属ウシ型結核菌であるBCGおよびノカルディア・ルブラを挙げることができる。
単離された細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）とは、細菌を物理的に粉砕した後、除核酸、除蛋白、脱脂などの精製工程を経て、不溶性残渣として得られるものを表し、その製法は公知である（J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)  ）。
【０００８】
「モルモットリンパ節転移モデル動物」とは、モルモット腹側皮内に腫瘍細胞を移植し、約1ヵ月後に所属リンパ節への転移を伴う原発巣増殖が観察されるモルモットを指す。ここで用いられるモルモットの種類は好ましくは腫瘍細胞の系統と同一であり、具体的にはStrain2系モルモット及びline10腫瘍細胞の組み合わせを例示することができる。モルモットは、通常５〜８週齢、好ましくは５〜６週齢のものを用いる。
本明細書において、「抗腫瘍作用」とは、リンパ節転移抑制活性および原発巣退縮活性のいずれかまたは両方を含む作用を指す。
本発明の評価方法において被験物質はＢＲＭを含む任意の化合物又は組成物であり、複数のＢＲＭの混合物、ＢＲＭと油との混合物、ＢＲＭの水縣濁液、ＢＲＭと油を含むエマルション溶液等も含まれる。ここで油としては、スクワラン、白色鉱物油（流動パラフィン等が例示される）、スクワレン、大豆油、オレイン酸エチル等の脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記エマルション溶液は、適宜マンニトール等の賦形剤や、ポリソルベート80等の界面活性剤を含んでいても良い。
【０００９】
以下、本発明の態様について詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、被験物質の抗腫瘍作用の評価方法に関する。以下各工程について延べる。
工程（１）において、モルモットリンパ節転移モデルの作製は、公知の方法に準じて行えばよく、具体的な手順については本明細書実施例及びHanna M.G. et al.,J Nat Cancer Inst.,48,1441,1972に記載されている。
工程（２）において、当該モデル動物に被験物質を投与する方法としては、皮下投与、皮内投与、経静脈投与、腫瘍内投与、経口投与等が挙げられ、好ましくは皮内投与が挙げられる。当該モデル動物を飼育する条件は特に限定されないが、飼育期間は通常30日間〜50日間である。飼育環境は、通常温度が20℃以上26℃以下、湿度が30%以上70%以下であり、明暗サイクルについては例えば午前8時点灯、午後8時消灯の12時間明期および12時間暗期に設定することができる。
工程（３）において「リンパ節重量」は、当該モデル動物の腫瘍移植部位の所属リンパ節（腋窩リンパ節）の重量を表し、当該動物から摘出して秤量すればよい。ここで、所属リンパ節とは、皮内に投与された腫瘍がリンパ液とともに生体内を移動する際に、最初に到達するリンパ節を表す。
工程（４）において、測定結果から作成するヒストグラムとは、横軸にリンパ節重量の常用対数変換値を、縦軸にモルモットの個体数をプロットしたヒストグラムを表し、当該ヒストグラムの２相性の分布とは、２つの極大ピークを示すことを表す。被験物質がＢＲＭである場合、前記ヒストグラムは２相性の分布を示す。
ここで、「閾値」とは、前記２つの極大ピークの境界の値、すなわち極小値を表し、被験物質を投与されたモデル動物のリンパ節重量が、あらかじめ決定された当該閾値よりも小さければ、被験物質は抗腫瘍作用を示すと評価することができる。
閾値を算出する方法としては、本発明実施例に挙げた数学的解析により閾値を算出する方法などが挙げられる。
具体的な閾値として、例えば被験物質がBRMの一種である細菌細胞壁骨格成分、BCG-CWSの場合には、約９３０ｍｇ（例えば９００ｍｇ〜９６０ｍｇ）を用いることができる。
本発明の第２の態様は、抗腫瘍作用を示すＢＲＭの同定方法に関する。すなわち、前記第１の態様と同様に工程（１）〜（４）を実施し、作成されたヒストグラムが2相性を示す場合、当該ＢＲＭは抗腫瘍作用を示すと判断することができる。具体的な抗腫瘍作用の程度は、ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションを用いた場合を陽性対照として用いることにより測定することができる。
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１０】
モルモットline10ヘパトーマリンパ節転移モデルにおける薬理試験
１）材料
動物：日本SLC株式会社より雄性Strain 2モルモットを購入して用いた。検疫期間は検収後7日間とし、不良動物の発見と動物の環境への馴化を図った。餌はオリエンタル酵母株式会社のGOC4を使用した。給水は自動給水装置で行った。
細胞：腹水肝臓癌細胞株line10（Rapp HJ, Churchill WH JR, Kronman BS, Rolley RT, Hammond WG and Borsos T.、J Natl Cancer Inst 41:1, 1968）を雄性Strain2モルモットの腹腔内に移植し、イン  ビボで継代したものを用いた。
被験物質：BCG-CWSは、J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)  に記載された方法に準じて調製したものを用いた。BCG−CWS2.64gをスクワラン35.2gおよび10%エタノール／90%ヘプタン400mLの混合液に加え室温で分散した。その後、60℃に加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、0.02w/w%ポリソルベート80水溶液924gを添加し、粗乳化（7,000rpm（逆回転）/min×5分間）を行い、さらに、36.6gの10w/w%ポリソルベート80水溶液を添加し本乳化（12,000rpm（正転）/min×10分間）を行った。最後に、1.5gの10w/w%ポリソルベート80溶液を添加混合し攪拌（7,000rpm（逆回転）×1分間）し、ポリソルベート80最終濃度を0.4w/w%に調整し、水中油型エマルションを得た。その後、4w/w%マンニトール水溶液3500gを添加し、4000gの最終製剤を得た。この水中油型エマルション製剤を凍結乾燥した。ＢＣＧ−ＣＷＳ凍結乾燥製剤を得た。得られた凍結乾燥製剤 1.2mgに2mLの注射用蒸留水を添加して攪拌した溶液を被験物質水縣濁液として用いた。
HANKS液：インビトロジェン社より購入したものを用いた。
純水：大塚製注射用蒸留水を用いた。
２）方法
(i)腫瘍移植
HANKS液を用いて、腫瘍細胞1 x 107個/mLの細胞浮遊液を調製した。無麻酔下で、モルモットの腹側部をバリカンで剃毛し、細胞浮遊液を26G注射針と1 mLシリンジを用いてモルモット腹側皮内（図1）に移植し（1 x 106個/0.1mL）、飼育を継続した。
(ii）被験物質投与
被験物質懸濁液（0.1ml）を、腫瘍移植日、腫瘍移植3日後および腫瘍移植6日後の計3回、または腫瘍移植日、腫瘍移植7日後および腫瘍移植14日後の計3回、モルモット腹側皮内に投与した。ただし、被験物質投与部位は図2に示すように、腫瘍移植同側かつ、腫瘍移植部位とは離れた部位に投与した。
（iv）薬効評価
腫瘍移植28-33日後にモルモットをエーテル高濃度吸引により安楽死させ、腫瘍移植側の所属リンパ節（accessory axillary lymph node）を摘出し、微量天秤(METTLER製、AE200)を用いて各リンパ節の重量を測定した。被験物質未処置群、ビークル投与群、被験物質投与群の3群について、ヒストグラムおよびQ−Qプロットを作成して比較した。
３）結果
被験物質未処置群(n=93)、ビークル投与群（n=109）、被験物質投与群(n=486)に分け、それぞれのヒストグラムを図３に示した。薬剤未処置群およびビークル投与群のヒストグラムはほぼ正規分布を示した。一方、BCG-CWS投与群のヒストグラムは2相性を示した。リンパ節重量値の大きい方のピークは癌細胞（line 10）が転移した群であり、リンパ節重量値の小さい方のピークは癌細胞（line 10）の転移が抑制されている群である。すなわち、BCG-CWS投与により、薬効を示す個体ではリンパ節転移が抑制され、一方で薬効を示さなかった個体では全く効果が観察されなかった。
【実施例２】
【００１１】
モルモットline10ヘパトーマリンパ節転移モデルにおける薬効評価基準の設定
１）薬効評価結果の解析方法
実施例１の結果に基づき、被験物質未処置群、ビークル投与群、被験物質投与群の3群について、ヒストグラムおよびQ−Qプロットを作成して比較した。
更に、Q-Qプロットに近似曲線（6次の多項式近似）を追加し、R-2乗値および6次方程式を求めた。6次方程式を2回微分し、得られた4次関数について、複数の制約条件に基づいて目標の値を数式から得るために数式に代入すべき値を求める最適化分析法（ソルバー）を用いて解を求め、これを変曲点とした。
２）結果
被験物質未処置群(n=93)、ビークル投与群（n=109）、被験物質投与群(n=486)に分け、それぞれのヒストグラムを図３に示した。更にQ-Qプロットを図４〜図６に示した。
上記の結果から、前述のとおり、薬剤未処置群およびビークル投与群のヒストグラムはほぼ正規分布を示した。一方、BCG-CWS投与群のヒストグラムは2相性を示し、Q-Qプロットは直線性を示さなかった。すなわちBCG-CWS投与群は2つのリンパ節重量値に極大ピークを示した。リンパ節重量値の大きい方のピークは癌細胞（line 10）が転移した群であり、リンパ節重量値の小さい方のピークは癌細胞（line 10）の転移が抑制された群である。すなわち、BCG-CWS投与により、薬効を示す個体ではリンパ節転移が抑制され、一方で薬効を示さなかった個体では全く効果が観察されなかった。このことから、当該モデルで細菌−ＣＷＳに代表される細菌菌体成分（ＢＲＭ）の抗腫瘍作用、特には癌転移抑制作用を評価する場合、癌転移抑制するかしないかを頻度データとして評価することが可能であることが示された。
そこで、以下の数学的処理により、ＢＲＭの抗腫瘍作用を評価する場合の閾値を求めた。すなわち、図４に示したQ-Qプロットの近似曲線方程式およびR-2値を求めた（数１）。ただし、近似は２次から６次多項式の内、R-2値が１に最も近い6次多項式近似を適応した。
【００１２】
【数１】
2005201777.tif 000002
上記方程式を2回微分し、得られた4次関数の解が変曲点であると考えられた。また、求めたい変曲点は対数変換値で3.0付近であるので、制約条件（2.5<x<3.5）に基づいて目標の値を数式から得るために数式に代入すべき値を求める最適化分析法（ソルバー）を用いて解を求めた。解は938mgであったので、一の位を切り捨て、930mgをリンパ節転移の閾値とした。すなわち、閾値930mg未満のリンパ節重量値であるモルモットはリンパ節転移抑制個体（被験物質は薬効あり）とし、930mg以上である場合はリンパ節転移個体（被験物質は薬効なし）として評価することが可能である。さらに、上記閾値でBCG-CWS投与群をリンパ節転移抑制群とリンパ節転移群との2群に分類し、それぞれについてQ-Qプロットを作成したところ、それぞれ正規分布であることが確認された。
【実施例３】
【００１３】
実施例１に記載のモルモットリンパ節転移モデルを用いてBRMであるピシバニール（以下、物質Aと示す）を評価することができる。すなわち、物質Aを投与し、飼育を継続する。腫瘍移植28-33日後にモルモットをエーテル高濃度吸引により安楽死させ、腫瘍移植側の所属リンパ節（accessory axillary lymph node）を摘出し、微量天秤(METTLER製、AE200)を用いて各リンパ節の重量を測定する。物質Ａを投与した群における所属リンパ節重量値が930mg未満である個体の頻度が病態コントロール群に対して有意に低ければ、当該物質Aは抗腫瘍作用を有するBRMであると同定できる。一方、有意差がない場合、ネガティブであった場合当該物質Aは抗腫瘍作用を有するBRMでは無いと判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】モルモットline10ヘパトーマリンパ節転移モデルを作製する際、腫瘍細胞を移植する部位（腹部と胸部の境界近傍）を示す図である。矢印は移植部位を示す。
【図２】モルモットline10ヘパトーマリンパ節転移モデルにおいて、被験物質を投与する部位を示す図である。矢印は被験物質投与部位（前肢腋部分近傍）を示す。
【図３】被験物質未処置群、ビークル投与群、被験物質投与群の3群について測定結果を示す、ヒストグラムを示す。区間の幅は対数変換値として0.15とした。
【図４】被験物質（BCG-CWS)投与群の測定結果のQ-Qプロットを示す。Q-Qプロットの正規スコアは累積比率piに対応する標準正規分布のパーセント点zi、すなわち標準正規累積分布関数の逆関数の値とし、リンパ節重量値は対数変換した値を使用した。
【図５】ビークル投与群の測定結果のQ-Qプロットを示す。Q-Qプロットの正規スコアは累積比率piに対応する標準正規分布のパーセント点zi、すなわち標準正規累積分布関数の逆関数の値とし、リンパ節重量値は対数変換した値を使用した。
【図６】被験物質未処置群の測定結果のQ-Qプロットを示す。Q-Qプロットの正規スコアは累積比率piに対応する標準正規分布のパーセント点zi、すなわち標準正規累積分布関数の逆関数の値とし、リンパ節重量値は対数変換した値を使用した。
【図１】
2005201777.tif 000003
【図２】
2005201777.tif 000004
【図３】
2005201777.tif 000005
【図４】
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【図５】
2005201777.tif 000007
【図６】
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