(57)【要約】    【課題】  血液中のヘモグロビンＡ１ｃの測定に用いられ、ヘモグロビン標準試料溶液の調製・保存に際してのヘモグロビン標準試料の劣化が生じ難く、検査コストを低減することができるヘモグロビン標準試料調製液及び該ヘモグロビン標準試料溶液を用いたヘモグロビン類の測定方法を提供する。    【解決手段】  ヘモグロビン濃度が２０ｍｇ／ｄＬ〜８００ｍｇ／ｄＬの範囲にあり、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含有しており、アジ化ナトリウムを含有しておらず、ｐＨが５．５〜９．５の範囲にあるヘモグロビン標準試料溶液並びに該ヘモグロビン標準試料溶液を用いて液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するヘモグロビン類の測定方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン濃度が２０ｍｇ／ｄＬ〜８００ｍｇ／ｄＬであり、アジ化ナトリウムを含有しておらず、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する緩衝剤を含有しており、ｐＨが５．５〜９．５の範囲であることを特徴とするヘモグロビン標準試料溶液。
【請求項２】
前記緩衝剤の濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲にあることを特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン標準試料溶液
【請求項３】
アミン系化合物、アルコール系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤をさらに含むことを特徴とする請求項１また２に記載のヘモグロビン標準試料溶液。
【請求項４】
乾燥ヘモグロビンを溶解してヘモグロビン標準試料溶液を調整するために用いられるヘモグロビン標準試料調製液であって、
ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する緩衝剤を含有しており、アジ化ナトリウムを含有しておらず、２０ｍｇ／ｄＬ〜８００ｍｇ／ｄＬの濃度にヘモグロビンを溶解した場合にｐＨが５．０〜１０．０とされることを特徴とするヘモグロビン標準試料調製液。
【請求項５】
前記緩衝剤の濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲にある請求項４に記載のヘモグロビン標準試料調製液。
【請求項６】
アミン系化合物、アルコール系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤をさらに含むことを特徴とする請求項４または５に記載のヘモグロビン標準試料調製液。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘモグロビン標準試料溶液または請求項４〜６のいずれか１項に記載のヘモグロビン標準試料調製液を用いて液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定することを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類の測定に用いられるヘモグロビン標準試料溶液及び該ヘモグロビン標準試料溶液を得るのに用いられるヘモグロビン標準試料調製液、並びにこれらを用いたヘモグロビン類の測定方法に関し、特に、保存安定性に優れたヘモグロビン標準試料溶液を得ることを可能とするヘモグロビン標準試料調製液、該ヘモグロビン標準試料溶液及びこれらを用いたこれらの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）は、血液中の糖が赤血球に入った後に、ヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡと略す）と化学的に結合することにより生成され、過去１〜２ヶ月間の血液中の平均的な血糖値（血液中のグルコース濃度）を反映する。従って、ＨｂＡ１ｃは、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するために、糖尿病診断の指標として広く用いられている。
【０００３】
上記ＨｂＡ１ｃの測定には、高速液体クロマトグラフィーが広く用いられており、測定に際しての校正には、キャリブレータと称されているヘモグロビン試料が用いられており、精度管理にはコントロール血液が用いられている。キャリブレータやコントロール血液は、通常、乾燥ヘモグロビンの形態で供給されている。そして、使用に際して、専用の溶解液にキャリブレータが溶解され、かつ希釈され、ＨｂＡ１ｃ標準試料溶液としてのキャリブレータ溶液が用意されている。
【０００４】
他方、コントロール血液は、通常、精製水に溶解され、ＨｂＡ１ｃ標準試料溶液としてのコントロール血液希釈液が用意される。
【０００５】
ところで、上記キャリブレータは、カラムの交換時や測定装置のメンテナンス時のように、測定条件が変更されるおそれがある場合に、測定システムを校正するために用いられている。
【０００６】
他方、コントロール血液は、測定システムの精度管理、すなわち、装置の測定性能を把握するために用いられる。具体的には、ＨｂＡ１ｃが正常値域にある第１のコントロール血液と、正常値域を越える高値域にある第２のコントロール血液とを用い、適当な間隔を開けて測定を行なう。この測定値の推移を管理図などにプロットすることにより測定システムの状態が把握される。
【０００７】
通常、キャリブレータやコントロール血液は、いずれも、人赤血球由来の凍結乾燥処理された凍結乾燥Ｈｂを用いて構成されている。また、上記キャリブレータ及びコントロール血液は、より具体的には以下のようにして溶解・希釈され、用いられている。
【０００８】
市販のキャリブレータを用いるに際しては、二点構成を行なうために、正常値域濃度及び高値域濃度が明示された２種類のキャリブレータが用意されている。キャリブレータは、バイアル中に凍結乾燥Ｈｂを収納することにより構成されている。使用に際しては、バイアル中の凍結乾燥Ｈｂが、アジ化ナトリウムを含有している専用の溶解液で溶解され、かつ同時に希釈される。このようにして、Ｈｂ標準試料溶液としてのキャリブレータ溶液が用意される。
【０００９】
他方、コントロール血液の使用に際しては、例えば、国際試薬株式会社製、コントロー
ル血液（品番「グリコＨｂコントロール、１１８４０」や「ＧＨｂトロールＩＸ・ＩＩＸ、品番１１９００」）を用いる場合、バイアル中に収納された凍結乾燥Ｈｂを元のＨｂ濃度付近に戻すために、バイアルに精製水２００μＬを添加し、Ｈｂ溶液を得る。このように、凍結乾燥Ｈｂを添付文書通りに精製水に溶解すると、ヘモグロビン濃度は、それぞれ、「グリコＨｂコントロール、１１８４０」では、８ｇ／ｄＬとなり、「ＧＨｂトロールＩＸ・ＩＩＸ、品番１１９００」では、１０ｇ／ｄＬとなる。これらのコントロール血液が精製水で溶解された標準試料溶液を４〜８℃で冷蔵保存した場合、１週間程度安定である。
【００１０】
上述したキャリブレータ溶液やコントロール血液の精製水溶液は、冷蔵保存した場合ある程度の期間は安定であるが、１週間程度を越えると、Ｈｂが劣化し、使用できなくなる。従って、高価なキャリブレータやコントロール血液を再度用いて、キャリブレータ溶液やコントロール血液の精製水溶液を用意しなければならず、検査コストが高くつくという問題があった。
【００１１】
他方、下記の特許文献１には、ヘモグロビン（ヘムタンパク質）の変性・分解作用に対して有効な新規なヘムタンパク質の安定化方法が開示されている。ここでは、有機酸に加えて、アジ化物を添加することにより、検体中のヘムタンパク質を安定化させることができる旨が述べられている。上記アジ化物としては、具体的には、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウム及びアジ化リチウムなどが挙げられている。
【特許文献１】特開２００３−１９４８２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
キャリブレータ及びコントロール血液を使用するに際しては、いずれの場合においても、Ｈｂ溶解後には、冷蔵保存したとしてもＨｂは経時的に劣化すなわち変性する。
【００１３】
ＨｂＡ１ｃを高精度に測定するには、測定システムを正確に校正することが必要であり、かつ日常の精度管理も高精度に維持されていることが重要である。そのためには、キャリブレータ溶液やコントロール血液の精製水溶液のようなＨｂ標準試料溶液の調製及び保存に際し、Ｈｂの劣化が生じないようにする必要がある。しかしながら、従来、これらのＨｂ標準試料溶液におけるＨｂの劣化を防止するための有効な技術は知られていなかった。上述した特許文献１では、上記のようにヘムタンパク質の安定化方法として、アジ化物を検体に加えることが述べられているに過ぎなかった。
【００１４】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、キャリブレータ溶液やコントロール血液の精製水溶液のようなＨｂ標準試料溶液の調製及び保存に際し、Ｈｂの劣化が生じ難い、Ｈｂ標準試料溶液、該Ｈｂ標準試料溶液を調製するためのＨｂ標準試料調製液並びにこれらを用いたヘモグロビン類の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液は、ヘモグロビン濃度が２０ｍｇ／ｄＬ〜８００ｍｇ／ｄＬであり、アジ化ナトリウムを含有しておらず、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する緩衝剤を含有しており、ｐＨが５．５〜９．５の範囲であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液では、好ましくは、緩衝剤濃度は０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭの範囲とされる。
【００１７】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液では、好ましくは、アミン系化合物、アルコー
ル系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤がさらに含有される。
【００１８】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液は、乾燥ヘモグロビンを溶解してヘモグロビン標準試料溶液を調製するために用いられるヘモグロビン標準試料調製液であって、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する緩衝剤を含有しており、アジ化ナトリウムを含有しておらず、２０ｍｇ／ｄＬ〜８００ｍｇ／ｄＬの濃度にヘモグロビンを溶解した場合にｐＨが５．０〜１０．０とされることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液では、好ましくは、前記緩衝剤の濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭである。
【００２０】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液では、好ましくは、アミン系化合物、アルコール系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤がさらに含有される。
【００２１】
本発明に係るヘモグロビン類の測定方法は、本発明に従って構成された上記ヘモグロビン標準試料溶液またはヘモグロビン標準試料調製液を用いて液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液は、アジ化ナトリウムを含有しておらず、ｐＨが５．０〜１０．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含有しており、ｐＨが５．５〜９．５の範囲とされているため、Ｈｂの劣化が生じ難い。すなわち、かなりの期間に渡り冷蔵保存された場合でも、Ｈｂの劣化が生じ難いため、キャリブレータ溶液やコントロール血液希釈溶液を長期間に渡り保存し、使用することができ、それによってＨｂの検査コストを低減することが可能となる。
【００２３】
また、ヘモグロビン標準試料溶液中の緩衝剤の濃度が０．１〜１００ｍＭの範囲にある場合には、緩衝剤の濃度が低いため、Ｈｂの経時による劣化がより一層生じ難い。
【００２４】
さらに、ヘモグロビン標準試料溶液において、アミン系化合物、アルコール系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤が含有されている場合には、ヘモグロビン標準試料溶液の安定性がより一層高められる。
【００２５】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液では、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する緩衝剤を含有しており、アジ化ナトリウムを含有しておらず、２０〜８００ｍｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度のヘモグロビン標準試料溶液を調製した場合、ｐＨが５．５〜９．５の範囲となるため、Ｈｂの劣化が生じ難い。すなわち、１週間以上の長期間に渡りＨｂＡ１ｃ標準試料溶液を冷蔵保存した場合であってもＨｂの劣化が生じ難く、従って検査コストを低減することができる。
【００２６】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液において、緩衝剤の濃度が０．１〜１００ｍＭである場合には、ヘモグロビン標準試料溶液を調製した場合の該ヘモグロビン標準試料溶液におけるＨｂの経時による劣化がより一層生じ難い。
【００２７】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液にアミン系化合物、アルコール系化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも一種の保存剤が含有されている場合には、ＨｂＡ１ｃ標準試料溶液を調製した際の該ヘモグロビン標準試料溶液の安定性をより一層高めることができる。
【００２８】
本発明に従って構成されたヘモグロビン標準試料溶液またはヘモグロビン標準試料調製液を用いて液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定する本発明に係るヘモグロビンの測定方法では、ヘモグロビン標準試料溶液またはヘモグロビン標準試料調製液の安定性が高められるため検査コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００３０】
以下、本明細書においては、コントロール血液やキャリブレータなどの乾燥ヘモグロビンを、精製水や希釈液などで所定のＨｂ濃度に溶解させた溶液をヘモグロビン溶液と称することとする。安定型ＨｂＡ１ｃなどのコントロール血液及びキャリブレータは、必要に応じて、「標準試料」と称する。
【００３１】
また、コントロール血液やキャリブレータなどの標準試料を希釈するための希釈液を、「ヘモグロビン標準試料調製液」と総称することとする。そして、標準試料がヘモグロビン標準試料調製液で希釈された液体、すなわち凍結乾燥Ｈｂ溶液、コントロール血液溶液及びキャリブレータ溶液などを「ヘモグロビン標準試料溶液」と総称することととする。コントロール血液とは、公知のＨｂＡ１ｃの測定用のコントロール血液であればよく、特に限定されるものではない。また、キャリブレータについても公知のＨｂＡ１ｃ測定用キャリブレータであればよく、特に限定されるものではない。
【００３２】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液の使用方法としては、以下の（１）乾燥ヘモグロビンからヘモグロビン標準試料調製液の調製、及び（２）ヘモグロビン溶液からのヘモグロビン標準試料溶液の調製が挙げられる。
【００３３】
（１）乾燥ヘモグロビンからのヘモグロビン標準試料溶液の調製
例えば、市販のキャリブレータ（アークレイ社製、商品名：ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃキャリブレータ）などに、本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液をメーカー指定量に応じて添加し、ヘモグロビン標準試料溶液を調製する。
【００３４】
（２）ヘモグロビン溶液からのヘモグロビン標準試料溶液
例えば、市販のコントロール血液（国際試薬社製、品番：グリコＨｂコントロール）などの乾燥ヘモグロビンに専用溶解液を添加してヘモグロビン溶液を得た後、一定量の該溶液と本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液をメーカー指定希釈量に応じて添加し、ヘモグロビン標準試料溶液を調製する。
【００３５】
本発明に係るヘモグロビン標準試料調製液は、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を持つ緩衝剤を含有し、アジ化ナトリウムを含有していない。アジ化ナトリウムを含有していないため、ヘモグロビン標準試料調製液を用いて調製されたヘモグロビン標準試料溶液におけるＨｂの経時による劣化が生じ難く、ヘモグロビン標準試料調製液の安定性が高められる。
【００３６】
上記ヘモグロビン標準試料調製液は、ヘモグロビン濃度が２０〜８００ｍｇ／ｄＬの範
囲にあるヘモグロビン標準試料溶液の調製に用いられる。この場合、最終的に標準試料溶液のｐＨは、５．５〜９．５の範囲にあることが必要であり、好ましくは６．０〜８．０であることが望ましい。最終的に得られたヘモグロビン標準試料溶液のｐＨが５．５より低いと、ヘモグロビン標準試料の安定性が悪く、ヘモグロビン標準試料溶液のｐＨが９．５よりも高い場合においてもヘモグロビン標準試料溶液の安定性が悪くなる。
【００３７】
上記ヘモグロビン標準試料調製液は、精製水などの水に、下記緩衝剤を溶解することにより構成されるが、該緩衝剤としては、ｐＨ５．０〜１０．０で緩衝能を有する限り特に限定されない。このような緩衝剤としては、以下に示す無機酸及びその塩、有機酸及びその塩並びに有機物などが挙げられる。
【００３８】
上記無機酸としては、例えば、リン酸またはホウ酸などが挙げられる。
【００３９】
上記有機酸及び有機物としては、例えば、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸などが挙げられる。
【００４０】
上記カルボン酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸などが挙げられる。上記ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸などが挙げられる。上記カルボン酸誘導体としては、例えば、β，β−ジメチルグルタル酸、バルビツール酸などが挙げられる。上記ヒドロキシカルボン酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、乳酸などが挙げられる。上記アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、ヒスチジンなどが挙げられる。上記無機酸または有機酸の塩としては、従来公知のものが用いられ、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩などが挙げられる。
【００４１】
また、２−（Ｎ−モリホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス−（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、Ｂｉｓｔｒｉｓｐｒｏｐａｎｅ、ＡＣＥＡ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、グリシルグリシン、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ等の一般にグッド（Ｇｏｏｄ）の緩衝液と言われているものも使用できる。  本発明において上記緩衝剤の濃度は、必ずしも限定されず、水に溶解された状態で上記緩衝作用が発現する範囲であればよい。もっとも、好ましくは緩衝剤のヘモグロビン標準試料調製液における濃度は、０．１〜１００ｍＭであり、より好ましくは１〜５０ｍＭである。
【００４２】
緩衝剤濃度が０．１ｍＭより低いと、凍結乾燥コントロール血液を溶解した際に、ヘモグロビン標準試料溶液のｐＨが５．５〜９．５の範囲とならず、ヘモグロビン標準試料の安定性が悪くなることがある。また、緩衝剤濃度が１００ｍＭより高い場合には、ヘモグロビン標準試料を溶解し、ヘモグロビン標準試料溶液を得た場合のｐＨは５．５〜９．５の範囲となるものの、塩濃度が高いため、ヘモグロビン標準試料の安定性が悪くなることがあり、安定型ＨｂＡ１ｃ分離性能が悪化し、測定精度が悪くなることがある。
【００４３】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液では、好ましくは、以下に示す保存剤が含有される。
【００４４】
上記保存剤とは、アミン系化合物、アルコール化合物、アルデヒド系化合物、カルボン酸系化合物、フェノール系化合物、アミド系化合物、有機ハロゲン系化合物、イソチアゾロン系化合物、有機金属化合物、ＥＤＴＡ類及びホウ酸からなる群から選択された少なくとも１種の保存剤である。これらの具体例は特に限定されず、例えば以下に示すものが挙げられる。
【００４５】
アミン系化合物としては、例えば、２−（４−チアゾリル）ベンツイミダゾール等のイミダゾール系化合物、２，３，５，６−テトラクロロメチルスルホニルピリジン、（２−ピリジルチオ−１−オキシド）ナトリウム等のピリジン系化合物、トリアルキルトリアミン等が挙げられる。
【００４６】
アルコール系化合物としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロパノール、２−フェノキシエタノール、２−フェノキシプロパノール、２−フェニルエタノール等が挙げられる。
【００４７】
アルデヒド系化合物としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等が挙げられる。
【００４８】
カルボン酸系化合物としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、１０−ウンデシレン酸、ウンデシレン酸亜鉛、マグネシウム２水素ビスモノペルオキシフタラート等が挙げられる。
【００４９】
フェノール系化合物としては、例えば、チモール、イソプロピルメチルフェノール、オルトフェニルフェノール、オルトフェニルフェノールナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロフェノール等が挙げられる。
【００５０】
アミド系化合物としては、例えば、２−クロロアセタミド等が挙げられる。
【００５１】
有機ハロゲン系化合物としては、例えば、２，４，５，６−テトラクロロイソフタロニトリル、Ｎ−（フルオロジクロロメチルチオ）−フタルイミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’（フルオロジクロロメチルチオ）−Ｎ’−フェニルスルファミド等が挙げられる。
【００５２】
イソチアゾロン系化合物としては、例えば、１，２−ベンゾチアゾリン−３−オン等が挙げられる。
【００５３】
有機金属化合物としては、例えば、１０，１０−オキシビスフェノキシアルシン等が挙げられる。
【００５４】
ＥＤＴＡ類としては、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ類のナトリウム塩、ＥＤＴＡのカリウム塩などが挙げられる。
【００５５】
上記保存剤の含有割合は、特に限定されないが、通常、ヘモグロビン標準試料調製液中、０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．０００５〜５重量％とされる。
【００５６】
上記保存剤は、１種のみを用いられてもよく、２種以上併用されてもよい。また、２種以上併用される場合においても、含有割合の合計が上記の範囲であることが好ましい。
【００５７】
上記保存剤の含有割合が０．０００１重量％に満たない場合には、十分な抗菌性が得られず、ヘモグロビン類の安定性に悪影響が出る場合がある。また、含有割合が１０重量％を超えると、保存剤の溶解性が悪くなったり、ヘモグロビン類の測定系に悪影響が出て、安定型ＨｂＡ１ｃを正確に測定できないことがある。
【００５８】
上記保存剤は、ヘモグロビン標準試料調製液に十分に溶解することが好ましく、単独で溶解性が悪い保存剤を用いる場合には、ヘモグロビン類の測定系に悪影響が出ない量まで含有量を低めるか、あるいは複数の保存剤を組み合わせて用いるなどの方法を採用することが望ましい。
【００５９】
また、溶解性を高めるために、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶剤が混合されて用いられてもよい。この場合、これらの有機溶媒の濃度は、ヘモグロビンの安定性及びヘモグロビン類の測定系に悪影響を与えない程度の濃度に調製されることが好ましい。
【００６０】
本発明のヘモグロビン標準試料調製液には、必要に応じて、非イオン性界面活性剤が含有される。非イオン性界面活性剤は特に限定されるわけではないが、例えば、ポリオキシエチレン類（以下、ポリオキシエチレンをＰＯＥ、エチレンオキシド付加モル数を（ｎ）で表す。）、ＰＯＥ（７）デシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ドデシルエーテル、ＰＯＥ（１０）トリデシルエーテル、ＰＯＥ（１１）テトラデシルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）セチルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オレイルエーテル、、ＰＯＥ（１７）セチルーステアリルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）オクチルフェニルエーテル、ＰＯＥ（ｎ）ノニルフェニルエーテル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノラウリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノパルミチン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ（ｎ）モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル等が挙げられる。また、オキシエチレン−オキシプロピレンブロック共重合体等の高分子化合物も用いることができる。
【００６１】
上記界面活性剤は、1種のみが用いられてもよく、２種以上併用されて用いられてもよ
い。また、１種あるいは２種以上の界面活性剤の合計含有割合は、好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００６２】
本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液は、上記ヘモグロビン標準試料調製液を用いてヘモグロビン標準試料を溶解及び／またはヘモグロビン溶解液を希釈することによって調製される。
【００６３】
本発明に係るヘモグロビン類の測定方法は、本発明に係るヘモグロビン標準試料溶液を用いて液体クロマトグラフィーにより行なわれる。この液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法は、特に限定されず、公知の液体クロマトグラフィーによるヘモグロビン類の測定方法であれば任意の方法を用いることがてきる。好ましくは、イオン交換基を有する充填剤が充填されたカラムを用いた液体クロマトグラフィー法が好適に用いられる。
【００６４】
次に、具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をより明らかにする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
［用意した材料］
（１）キャリブレータ
キャリブレータとして、アークレイ社製、商品名ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃキャリブレータ（低値４．８％及び高値１０．８％の２種）を用意した。
【００６６】
（２）コントロール血液
国際試薬社製、ロットナンバー１２７６の正常域５．０％〜５．６％及び高値域１０．２％〜１１．２％の２種のコントロール血液を用意した。
【００６７】
（３）キャリブレータ用溶解液
アークレイ社製、品番：ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃキャリブレータ専用溶解液
（４）精製水
大塚製薬社製、注射用精製水
（５）測定システム
アークレイ株式会社製，自動ヘモグロビン測定装置「ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃＨＡ−８１６０」
以下の実施例１〜３及び比較例１〜６では、下記の標準試料調製液を用意した。
【００６８】
（実施例１）
５ｍＭリン酸（ｐＨ７．５０）水溶液。
【００６９】
（実施例２）
１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５０）水溶液。
【００７０】
（実施例３）
５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５０）水溶液に、保存剤として、２−フェノキシエタノール０．１重量％を添加したもの。
【００７１】
（比較例１）
積水化学工業株式会社製ヘモグロビン試料調製液、品番：６０Ｈ［リン酸１０ｍｍｏｌ／ｌ（ｐＨ７．５０）水溶液（アジ化ナトリウムを０．０２Ｗ／Ｗ％の濃度で含む）］
【００７２】
（比較例２）
市販のコントロール血液（グリコヘモグロビンコントロール血液（国際試薬）のレベル２）に蒸留水２００μＬを添加し、室温で３０分に静置した後、冷蔵保存した。
【００７３】
測定直前に、比較例１で用いたヘモグロビン試料調製液６０Ｈ（積水化学工業株式会社製）で添付資料に記載の通り１００倍に希釈した。
【００７４】
（比較例３）
５ｍＭリン酸（ｐＨ５．０）水溶液。コントロール血液溶解後のｐＨは５．０であった。
【００７５】
（比較例４）
５ｍＭリン酸（ｐＨ１１．０）水溶液。コントロール血液溶解後のｐＨは９．５であった。
【００７６】
（比較例５）
０．０５ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）水溶液。コントロール血液溶解後のｐＨは５．０であった。
【００７７】
（比較例６）
５００ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）水溶液。コントロール血液溶解後のｐＨは７．５であった。
【００７８】
［実施例１〜３及び比較例１〜６の評価］
実施例１〜３及び比較例１のヘモグロビン標準試料調製液と、上記コントロール血液（グリコヘモグロビンコントロール血液（国際試薬社製）のレベル２）とを用い、コントロ
ール血液溶液すなわちヘモグロビン標準試料溶液の冷蔵安定性を調べた。具体的には、市販のコントロール血液「グリコヘモグロビンコントロール血液（国際試薬社製）」：凍結乾燥品に精製水２００μＬ添加溶解した場合、総ヘモグロビン濃度は約８ｇ／ｄＬに、蒸留水２００μＬを添加し、室温で３０分間静置した後、実施例１〜３または比較例１及び２のＨｂ標準試料調製液を用いて１００倍に希釈し、それぞれ、ヘモグロビン標準試料溶液を得、冷蔵保存した。希釈直後、４℃で７日間冷蔵保存した後、及び４℃で１４日間冷蔵保存した後に、それぞれ、アークレイ株式会社製、自動グリコヘモグロビン測定装置（品番：ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃＨＡ−８１６０）を用い、ＨｂＡ１ｃを測定した。なお、ｎ＝３と３回測定し、その平均値を求めた。結果を以下に示す。
【００７９】
なお、比較例２では、市販のコントロール血液（グリコヘモグロビンコントロール血液（国際試薬社製）のレベル２）に蒸留水２００μＬを添加し、室温で３０分維持した後、冷蔵保存し、測定直前に、積水化学工業株式会社製標準試料調製液、品番６０Ｈで添付資料に従って１００倍に希釈し、測定を行なった。
【００８０】
なお、以下のＨｂＡ１ｃの測定値は、（ＨｂＡ１ｃ／Ｈｂの全量）×１００（％）で表される値である。
【００８１】
【表１】
2005181128.tif 000002
【００８２】
【表２】
2005181128.tif 000003
上記のように、比較例１〜５では、コントロール血液を溶解した後のヘモグロビン標準試料溶液の安定性が実施例１〜３の場合に比べて悪かった。比較例２では、比較的ヘモグロビン標準試料溶液の安定性はよかったものの、比較例２においても、２週間保存した後には、Ｈｂの劣化が認められた。
【００８３】
これに対して、実施例１〜３では、４℃にＨｂ標準試料溶液を２週間保存した場合であっても、Ｈｂの劣化がほとんど見られず安定であった。従って、上記実施例１〜３のＨｂ標準試料溶液を用いることによりコントロール血液溶液であるヘモグロビン標準試料溶液の安定性を劇的に高め得ることがわかる。
【００８４】
（実施例４）
ヘモグロビン標準試料調製液として、実施例１のヘモグロビン標準試料調製液を用意した。
【００８５】
前述した低値及び高値のキャリブレータを実施例１の５ｍＭリン酸（ｐＨ７．５０）水溶液にそれぞれ溶解し、キャリブレータ溶液を得た。
【００８６】
（キャリブレータ溶液について）
実施例１〜３の測定に用いた測定装置を用いてＨｂＡ１ｃを測定し、かつキャリブレータ溶液を８時間及び２４時間２４℃の温度に保存した後に同様にしてＨｂＡ１ｃを測定した。測定に際しては、ｎ＝３とし、平均値を求めた。結果を下記の表３に示す。
【００８７】
（比較例６）
積水化学工業社製ヘモグロビン標準試料調製液、品番６０Ｈを用いたことを除いては、実施例４と同様にしてＨｂＡ１ｃを測定した。結果を下記の表３に示す。
【００８８】
【表３】
2005181128.tif 000004
上記のように、比較例６では、キャリブレータを溶解した後、２４時間経過後に、溶解直後に比べてＨｂＡ１ｃの値がＬ及びＨにおいて、それぞれ、約０．４％及び０．８％低下した。これに対し、実施例４では、キャリブレータを溶解してから２４時間経過した後でも、Ｌ及びＨにおいて、いずれの場合においても溶解直後ＨｂＡ１ｃの値は同等であった。従って、キャリブレータ血液溶解液であるヘモグロビン標準試料溶液の安定性が、実施例の標準試料調製液を用いることにより効果的に高められることがわかる。