(57)【要約】【課題】  ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いてアルカジエンからアルカジエンハロヒドリンまたはアルカジエンエポキシドを製造する方法を提供する。【解決手段】  反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を作用させることによりアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを生成させ、更に該化合物を含む反応溶液をアルカリ条件にすることでアルカジエンモノエポキシドまたはアルカジエンジエポキシドを製造する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を作用させることによりアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを製造する方法。
【請求項２】
反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を作用させることにより生成したアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを含む反応溶液をアルカリ条件にすることでアルカジエンモノエポキシドまたはアルカジエンジエポキシドを製造する方法。
【請求項３】
反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物をアルカリ条件で作用させることによりアルカジエンモノエポキシドまたはアルカジエンジエポキシドを製造する方法。
【請求項４】
炭素数６以下のアルカジエンを基質とした場合はアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンモノエポキシドを優位に生産し、炭素数８以上のアルカジエンを基質とした場合はアルカジエンジハロヒドリンまたはアルカジエンジエポキシドを優位に生産する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
アルカジエンが１，３―ブタジエン、１，５―ヘキサジエンまたは１，７―オクタジエンである請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来である請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来である請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ
ＩＦＯ８８８５由来である請求項７の製造方法。
【請求項９】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる請求項８の製造方法。
【請求項１０】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物が配列番号１に記載の塩基配列を含む遺伝子を持つ微生物または配列番号１に記載の塩基配列を含む遺伝子によって形質転換された微生物である請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるノンヘム型ハロペルオキシダーゼ。
【請求項１２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるノンヘム型ハロペルオキシダーゼ遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いたアルカジエンからアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハロペルオキシダーゼの反応は、過酸化水素によってハロペルオキシダーゼの活性中心が活性化され、活性化された活性中心がハロゲンイオンと反応して次亜ハロゲン酸イオンを生成し、生成した次亜ハロゲン酸イオンが求核化合物と反応することでハロヒドリンやハロゲン化フェノールを生成する、と推測されている（非特許文献１）。活性中心には金属が配位しており、ポルフィリンが配位しているヘム型とバナジウムやコバルトが配位しているノンヘム型に分類される（非特許文献２）。
【０００３】
ヘム型ハロペルオキシダーゼとしては、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼ（ＥＣ．１．１１．１．１０）が良く知られており、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼを用いた１，３―ブタジエンよりブタジエンハロヒドリンを製造する方法が報告されている（特許文献１）。Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼは、至適ｐＨが２．７５であるためにｐＨ３．０でハロヒドリン化反応を行っている。生成したブタジエンハロヒドリンよりブタジエンエポキシドを生産しようとした場合、アルカリ条件にする為に添加する塩基量は中性付近で反応させた場合と比較して多量に必要であり、そのために副生する塩の処理はエポキシ化プロセスにおいて大きな問題となる。
【０００４】
また、１，３―ブタジエンを基質とした場合の生成物は、１―ブロモ―３―ブテン―２―オール、２―ブロモ―３―ブテン―１―オール、１，４―ジブロモ―２，３―ブタンジオールが９８：１：１の比で生成すると記載されている。しかし、生成したブタジエンハロヒドリンを閉環してブタジエンエポキシドを生産する場合、アルカジエンモノハロヒドリンである１―ブロモ―３―ブテン―２―オールと２―ブロモ―３―ブテン―１―オールが閉環して生成するブタジエンモノエポキシドと、アルカジエンジハロヒドリンである１，４―ジブロモー２，３―ブタンジオールが閉環して生成するブタジエンジエポキシドが混在してしまい、好ましくない。
【０００５】
さらに、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼとノンヘム型であるＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来ハロペルオキシダーゼの次亜ハロゲン酸に対する安定性を比較した結果が報告されている（特許文献２）。次亜ハロゲン酸は過酸化水素により活性化された活性中心とハロゲンイオンが反応して生成する中間体である。その例では、２分間の０．５ｍＭ次亜ハロゲン酸処理において、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼは２％の活性残存率に対し、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来ハロペルオキシダーゼは７５％の活性残存率だったと報告されている。また、過酸化水素に対する比較でも、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来ハロペルオキシダーゼは０．０１％過酸化水素処理において１時間以内にほぼ失活してしまうのに対し、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来ハロペルオキシダーゼは１％過酸化水素処理において２５時間経過してもほとんど失活が見られなかった、と報告されている。このように、基質として必須の過酸化水素および反応中間体である次亜ハロゲン酸に対してヘム型ハロペルオキシダーゼが不安定であるのに対し、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼはかなり安定である。
【０００６】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼとしては、先に示したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来（非特許文献３）やＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ由来（特許文献３）ハロペルオキシダーゼが知られている。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ由来ハロペルオキシダーゼに関しては、アリルクロライドおよびアリルアルコールを基質としたハロヒドリン化反応例が報告されているが（特許文献２、特許文献４）、アルカジエンのハロヒドリン化反応例は報告されていない。
【０００７】
ヘム型ハロペルオキシダーゼを用いたアルカジエンのハロヒドリン化反応においては、アレン、１，３―ブタジエン、１，４―ペンタジエン、イソプレン、１，７―オクタジエンに対する反応性が既知である（特許文献１、特許文献５）。しかしながら、アルカジエンの鎖長によって優先的に生成するアルカジエンハロヒドリンがアルカジエンモノハロヒドリンなのかアルカジエンジハロヒドリンなのかを調べた例はない。ましてや、特異的なハロペルオキシダ−ゼにより、基質であるアルカジエンの鎖長に依存してアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンの生成が制御できることなど思いも及ばせない。１，７―オクタジエンを反応させた際の主生成物はモノハロヒドリンでありジハロヒドリンは微量生成物である、と報告されている（特許文献６）。これは、Ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来であるヘム型ハロペルオキシダーゼを用いて反応させた場合の生成物組成であり、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼもしくはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来ハロペルオキシダーゼを用いて反応させた場合に得られる生成物の組成とは異なる。
【特許文献１】ＵＳ４２４７６４１
【特許文献２】ＵＳ４７０７４４６
【特許文献３】ＷＯ９７／０４１０２
【特許文献４】ＵＳ４７０７４４７
【特許文献５】ＵＳ４２８４７２３
【特許文献６】特開昭５５―１３９０７号公報
【特許文献７】ＵＳ４９３７１９２
【非特許文献１】Ｄ．Ｊ．Ｓｈｅｆｆｉｅｌｓ，Ｔ．Ｈａｒｒｙ，Ａ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｊ．Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，１９９３
【非特許文献２】Ｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａｘｌｅｙ，Ｐａｕｌ  Ｋｅｎｉｇｓｖｅｒｇ，Ｌｏｗｅｌｌ  Ｐ．Ｈａｇｅｒ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６１，１９８６
【非特許文献３】Ｔｅ−Ｎｉｎｇ  Ｅｒｎｉｅ  Ｌｉｕ，Ｔｈａｂｉｓｏ  Ｍ．Ｔｉｍｋｕｌｕ，Ｊｏｈｎ  Ｇｅｉｇｅｒｔ，Ｂｅｖｅｒｌｙ  Ｗｏｌｆ，ＳａｕｌＬ．Ｎｅｉｄｌｍａｎ，Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｓｌｉｖａ，Ｊｅｎｎｉｅ  Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，  Ｂｉｏ．ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４２，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いてアルカジエンからアルカジエンハロヒドリンまたはアルカジエンエポキシドを製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の目的は、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いることで、炭素数６以下のアルカジエンを基質とした場合には一方の二重結合のみがハロヒドリン化されたアルカジエンモノハロヒドリンを、炭素数８以上のアルカジエンを基質とした場合には両方の二重結合がハロヒドリン化されたアルカジエンジハロヒドリンを優位に生産することにある。
【００１０】
本発明の目的は、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いることで、炭素数６以下のアルカジエンを基質とした場合には一方の二重結合のみがエポキシ化されたアルカジエンモノエポキシドを、炭素数８以上のアルカジエンを基質とした場合には両方の二重結合がエ
ポキシ化されたアルカジエンジエポキシドを優位に生産することにある。
【００１１】
本発明の目的は、基質として必須の過酸化水素および反応中間体である次亜ハロゲン酸に対して耐性を有するノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いたアルカジエンからアルカジエンハロヒドリンまたはアルカジエンエポキシドへの製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、アルカジエンのハロヒドリン化技術について鋭意検討した結果、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼ、特にＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来ハロペルオキシダーゼを用いることで、基質となるアルカジエンの鎖長によってアルカジエンモノハロヒドリンおよびアルカジエンジハロヒドリンへと選択的に制御して変換する能力を見出した。これまでノンヘム型ハロペルオキシダーゼにおいて、アルカジエンに対するハロヒドリン化能は知られていなかった。すなわち本発明は以下に示すとおりである。
【００１３】
（１）反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を作用させることによりアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを製造する方法。
（２）反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物を作用させることにより生成したアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンジハロヒドリンを含む反応溶液をアルカリ条件にすることでアルカジエンモノエポキシドまたはアルカジエンジエポキシドを製造する方法。（３）反応溶液中にハロゲンイオン源、過酸化水素源を存在させた条件下において、アルカジエンに対してノンヘム型ハロペルオキシダーゼまたはノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物をアルカリ条件で作用させることによりアルカジエンモノエポキシドまたはアルカジエンジエポキシドを製造する方法。
（４）炭素数６以下のアルカジエンを基質とした場合はアルカジエンモノハロヒドリンまたはアルカジエンモノエポキシドを優位に生産し、炭素数８以上のアルカジエンを基質とした場合はアルカジエンジハロヒドリンまたはアルカジエンジエポキシドを優先的に生産する請求項１〜３の製造方法。
（５）アルカジエンが１，３―ブタジエン、１，５―ヘキサジエンまたは１，７―オクタジエンである請求項１〜４の製造方法。
（６）ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来である請求項１〜５の製造方法。
（７）ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来である請求項１〜６の製造方法。
（８）ノンヘム型ハロペルオキシダーゼがＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ ＩＦＯ８８８５由来である請求項１〜７の製造方法。
（９）ノンヘム型ハロペルオキシダーゼが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１〜８の製造方法。
（１０）配列番号１に記載の塩基配列を含む遺伝子を持つ微生物または配列番号１に記載の塩基配列を含む遺伝子によって形質転換された微生物もしくはそれらの処理物を用いる請求項１〜９の製造方法。
（１１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるノンヘム型ハロペルオキシダーゼ。
（１２）配列番号１に記載の塩基配列からなるノンヘム型ハロペルオキシダーゼ遺伝子。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、産業上実用的なノンヘム型ハロペルオキシダーゼを用いてアルカジエンからアルカジエンハロヒドリンまたはアルカジエンエポキシドを製造する方法を提供することができる。また、本生産方法により、アルカジエンの炭素数が６以下の場合には一方
の二重結合のみがハロヒドリン化されたアルカジエンモノハロヒドリンまたはエポキシ化されたアルカジエンモノエポキシドを、炭素数が８以上の場合には両方の二重結合がハロヒドリン化されたアルカジエンジハロヒドリンまたはエポキシ化されたアルカジエンジエポキシドを優位に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明でいうノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物もしくはその処理物とは、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物であれば何でも用いることができるが、好ましくはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ属に属する微生物であり、例えばＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘが挙げられる。反応に用いる場合は、培養したＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘの菌体または菌体処理物もしくはそれらを固定化した状態で使用することができる。ここで言う菌体処理物とは、アセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、加圧減圧処理、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物等であり、また必要に応じて硫安沈澱やアセトン沈澱、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いてもよい。
【００１６】
上記微生物を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育し得るものであるならば何でも使用できる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース、シュクロース、マルトース等の糖類、窒素源としてペプトン、肉エキス、麦芽エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸等の天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。またこの他に、必要に応じて、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が適宜使用される。上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ５〜９、１９〜３４℃、好ましくはｐＨ７．２、２４℃にて好気的に１日〜１４日間培養するとよい。
【００１７】
ノンヘム型ハロペルオキシダーゼは培地によっては菌体外へ分泌されるため、培溶液をろ過したのち、硫安沈澱などによって容易に回収することができる。また活性化剤であるバナジウムイオンを培地に添加しておくと、培地中で活性発現させるとができる。上記要領で得た酵素を用いてアルカジエンをハロヒドリン化する場合、活性化剤であるバナジウムイオンを反応液中に存在させる必要があり、好ましくは予めバナジウムイオンで処理しておくとよい。バナジウムイオンは０．１〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭの濃度で存在させるとよい。
【００１８】
本発明でいうアルカジエンは、Ｃ３〜Ｃ２０の炭化水素、好ましくはＣ３〜Ｃ２０の直鎖状炭化水素、より好ましくはＣ４〜Ｃ８の直鎖状炭化水素中に、２つの二重結合、好ましくは両端に二重結合を持つアルカジエンである。具体的には１，３―ブタジエン、１，４―ペンタジエン、１，５―ヘキサジエン、１，６―ヘプタジエンや１，７―オクタジエン等が挙げられる。反応溶液中に存在させるアルカジエン濃度は、５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜２０ｍＭで行うのがよい。１，３―ブタジエンはガスであるため、密閉した容器の気相部分に１，３―ブタジエンガスを充填して反応することとなる。そのためできるだけ多くの１，３―ブタジエンガスを充填した方がよく、また十分な撹拌によって反応溶液と気相部の接触面積が大きくなる方がよい。撹拌している反応溶液中にノズルの先を沈め、そこから１，３―ブタジエンガスをバブリングすることによって供給してもよい。
【００１９】
本発明でいう反応溶液とは、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼが活性を示すことができればどのような反応溶液でもよい。しかしながら、ノンヘム型ハロペルオキシダーゼによる反応は水中で行われる一方でここに示したアルカジエンは水に難溶性であるため、有機溶媒、好ましくは水溶性有機溶媒を反応溶液に添加することよって、効率よく反応させることができるようになる。ここでいう有機溶媒とは、ハロペルオキシダーゼ活性を失活させないような有機溶媒であれば特に限定されないが、具体的にはメチルアルコール、エチ
ルアルコール、プロピルアルコール、ブチルアルコール、ジオキサン、メチルエチルケトンおよびジメチルスルホキシド等の極性溶媒や、１―ヘキサノール、２―メチル―１―ペンタノール、４―メチル―２―ペンタノール、２―エチル―１―ブタノール、１―ヘプタノール、２―ヘプタノール、３―ヘプタノール、１―オクタノール、２―オクタノール、１―ノナノール等のアルコール類、ペンタン、ヘキサン、２―メチルヘキサン、２，２―ジメチルブタン、２，３―ジメチルブタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、へプタン、シクロへプタン、オクタン、シクロオクタン、イソオクタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、クメン、ナフタレン等の炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、ジベンジルエーテル等のエーテル類、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ―ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等のエステル類、Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ―ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ―ジメチルベンズアミド等のアミド化合物が挙げられる。反応溶液中に存在させる有機溶媒濃度は、水溶性有機溶媒の場合は５％〜２０％（ｗ／ｗ）、好ましくは５％〜１０％（ｗ／ｗ）で、非水溶性有機溶媒の場合は５％〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２０％〜３０％（ｗ／ｗ）がよい。
【００２０】
反応溶液中に存在させるハロゲンイオン源に関しては、反応溶液に可溶なハロゲン化合物であれば何でもよく、塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム等が挙げられる。反応溶液中でのハロゲンイオン濃度は０．１ｍＭ〜２０００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１０００ｍＭ、より好ましくは０．３ｍＭ〜１００ｍＭがよい。
【００２１】
反応溶液中に存在させる過酸化水素源に関しては、直接過酸化水素を添加してもよく、また、グルコースとグルコースオキシダーゼによって過酸化水素を生成させ、それを利用してもよい。反応溶液中での過酸化水素濃度は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭがよい。
【００２２】
本発明の反応温度は２０〜７０℃、好ましくは２５〜４０℃、より好ましくは３０℃で行うのがよい。
【００２３】
本発明の反応ｐＨは４．０〜９．０、好ましくは５．０〜８．０であり、アルカジエンよりアルカジエンハロヒドリンを生成する場合は５．０〜６．０で行うのがより好ましく、アルカジエンよりアルカジエンエポキシドを生成する場合は７．０〜８．０で行うのがより好ましい。
【００２４】
このような条件において得られる反応生成物のアルカジエンハロヒドリンの例としては、１，３―ブタジエンを基質とした際は、１―ブロモ―３―ブテン―２―オール、２―ブロモ―３―ブテン―１―オール、１，３―ジブロモ―２，４―ブタンジオール、１，４―ジブロモ―２，３―ブタンジオールが、１，４―ペンタジエンを基質とした際は、１―ブロモ―４―ペンテン―２―オール、２―ブロモ―４―ペンテン―１―オール、１，４―ジブロモ―２，５―ペンタンジオール、１，５―ジブロモ―２，４―ペンタンジオールが、１，５―ヘキサジエンを基質とした際は、１―ブロモ―５―ヘキセン―２―オール、２―ブロモ―５―ヘキセン―１―オール、１，５―ジブロモ―２，６―ヘキサンジオール、１，６―ジブロモ―２，５―ヘキサンジオールが、１，６―ヘプタジエンを基質とした際は、１―ブロモ―６―ヘプテン―２―オール、２―ブロモ―６―ヘプテン―１―オール、１，６―ジブロモ―２，７―ヘプタンジオール、１，７―ジブロモ―２，６―ヘプタンジオールが、１，７―オクタジエンを基質とした際は、１―ブロモ−７―オクテン―２―オール、２―ブロモ―７―オクテン―１―オール、１，７―ジブロモ―２，８―オクタンジオ
ール、１，８―ジブロモ―２，７―オクタンジオールが挙げられる。
【００２５】
かくして水溶液中に生成、蓄積したアルカジエンハロヒドリンは公知の方法を用いて採取および精製することができる。例えば酢酸エチルなどの溶媒によって抽出を行い、減圧下において溶媒を除去することによってアルカジエンハロヒドリンを得ることができる。また、反応終了後に反応溶液をｐＨ９以上にし、常温、常圧において３０分以上撹拌することで、生成したアルカジエンハロヒドリンをエポキシ化合物にすることができる。Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来ハロペルオキシダーゼは弱アルカリｐＨ領域にて反応を行うことができるため、生成したアルカジエンハロヒドリンを自然閉環させてエポキシ化合物を得ることができる。このエポキシ化合物も同様の方法を用いて精製することができる。得られるアルカジエンエポキシドの例としては、１，２―エポキシ―３―ブテン、１，２，３，４―ジエポキシブタン、１，２―エポキシ―４―ペンテン、１，２，４，５―ジエポキシペンタン、１，２―エポキシ―５―ヘキセン、１，２，５，６―ジエポキシヘキサン、１，２―エポキシ―６―ヘプテン、１，２，６，７―ジエポキシへプタン、１，２―エポキシ―７―オクテン、１，２，７，８―ジエポキシオクタンが挙げられる。
【００２６】
尚、本発明においては、炭素数６以下のアルカジエンを基質として使用した場合にはアルカジエンモノハロヒドリンがアルカジエンジハロヒドリンに比べて優位に生産され、結果的にアルカジエンモノエポキシドがアルカジエンジエポキシドに比べて優位に生産される。また、炭素数８以上のアルカジエンを基質として使用した場合には上記とは逆に、アルカジエンジハロヒドリンがアルカジエンモノハロヒドリンに比べて優位に生産され、結果的にアルカジエンジエポキシドがアルカジエンモノエポキシドに較べて優位に生産される。
【００２７】
本発明で用いるノンヘム型ハロペルオキシダーゼは、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属由来ノンヘム型ハロペルオキシダーゼ、好ましくはＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ由来ノンヘム型ハロペルオキシダーゼ、より好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるノンヘム型ハロペルオキシダーゼである。当該酵素をコードする遺伝子は、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。例えばＣｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘより常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、該遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる。該遺伝子をｃＤＮＡライブラリーからスクリーングする方法も特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、ｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質特異的抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組み合わせが例示できる。ここで用いられるプローブとしては、該遺伝子のＤＮＡ配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ配列等が一般低に挙げられるが、既に取得された遺伝子そのものやその断片も利用できる。さらに単離精製されたハロペルオキシダーゼの部分アミノ酸配列情報に基づき、センスプライマー、アンチセンスプライマーをスクリーニング用プライマーとして用いることもできる。また、該遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合に、レース法の採用が好適である。かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、既に明らかにされた該遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従い合成することができる。かかるプライマーの一態様として、参考例で用いたプライマーが好適に例示される。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は前記の通り常法に従うことができ、具体的には例えばゲル電気泳動法等が挙げられる。上記で得られる該遺伝子あるいは各種ＤＮＡ断片は、常法に従ってその塩基配列決定することができる。具体的には、ジデオキ法やマキサムーギルバート法等が例示され、また簡便には、市販のシークエンスキット等を用いてもよい。
【００２８】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のハロペルオキシダーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となった。かかる技術水準に鑑み、配列番号１に記載のような配列を持つ遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌が生産するハロペルオキシダーゼも本発明のハロペルオキシダーゼに抱合されるものとする。
【００２９】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボソーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボソームＲＮＡの３‘末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、ハロペルオキシダーゼの上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミテーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、ハロペルオキシダーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３―３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【００３０】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではなく枯草菌（Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００３１】
酵母を宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、ｅｎｏ−１プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アルコールオキシダーゼプロモーター等が挙げられる。プラスミドの具体例としては、酵母内で自律複製可能なｐＥＳＣ、ｐＰＩＣ、ｐＡＯ、ｐＭＥＴ、ｐＹＥＳ、ｐＴＥＦ、ｐＮＭＴ等が挙げられるが、これらは大腸菌内でも自律複製可能である。宿主の具体例としては、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｓやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ等が挙げられる。
【００３２】
カビを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、ＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、アスパラギン酸プロテアーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター、グルコアミラーゼプロモーター、リパーゼプロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アセトアミダーゼプロモーター等が挙げられる。プラスミドの具体例としては、ｐＢＡＮｅ６等が挙げられる。宿主の具体例と
しては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓやＦｕｓａｒｉｕｍ等が挙げられる。
【００３３】
ハロペルオキシダーゼの活性は主としてモノクロロジメドンを基質とする確認が一般的だが、フェノールレッドを基質とする確認法もあり、その活性値はモノクロロジメドンを基質とした場合の活性値と相関を示す（特許文献７）。フェノールレッド法では、ハロゲンイオン源として臭素イオンを用いることで目視による活性確認を行うことができるため、ハロペルオキシダーゼ活性を有する微生物を自然界からスクリーニングする場合や遺伝子組換え微生物をスクリーニングする場合に適した簡便な方法である。
【００３４】
以下、参考例、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこの例のみに限定されるものではない。酵素反応の実施例の中では、分析標品となるアルカジエンハロヒドリン試薬の入手が困難なため、入手しやすいアルカジエンエポキシド試薬を標品として、アルカジエンエポキシドの生成を分析した例もあるが、生成したアルカジエンハロヒドリンをアルカリ又は酵素処理等の適当な手段によってアルカジエンエポキシドに変換し、そのアルカジエンエポキシドを分析することで、ハロヒドリン化反応が進行していることを示す。
【００３５】
［参考例１］
水に対して３％  グルコース、０．８％  酵母エキス、０．２％  リン酸水素ニカリウム、０．１％  硫酸マグネシウム、０．０００１％  オルソバナジン酸ナトリウムからなる液体培地をバッフル付フラスコに調製して、１２０℃、２０分間殺菌後、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ ＩＦＯ８８８５株を接種し、２４℃、１００ｒｐｍで１０日間振とう培養を行った。この培養液２Ｌをろ過して菌体を除去した後、飽和硫安濃度が８０％となるように硫安を加えてタンパク質を沈澱させ、遠心分離後、沈殿物を５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に懸濁した。懸濁液を透析によって一昼夜脱塩した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア）を担体としたカラムクロマトグラフィ−を行った。担体にハロペルオキシダ−ゼを吸着し洗浄後、塩化カリウム濃度０〜０．５Mのグラジエト溶出を行った。その結果、塩化カリウム濃度０．２〜０．３Ｍ付近で活性画分が溶出し、２．８ｍｇの粗精製ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを得た。
【００３６】
［参考例２］
酵素活性は、モノクロロジメドン（ε＝１９９００Ｍ−１ｃｍ−１、ｐＨ６．０）からモノクロロモノブロモジメドンへの変化を２９０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより求めた。５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム、６０μＭ  モノクロロジメドン、５ｍＭ  過酸化水素、参考例１で得られたハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液５０μＬから成る反応溶液を調製した。ＣＰＥ―コントローラー（島津製作所）によって３０℃に保ちながら反応させ、Ｂｉｏｓｐｅｃ―１６００（島津製作所）を用いて２９０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。１ユニット（Ｕ）の定義を１分間に１μｍｏｌのモノクロロジメドンを消費する酵素量とした。その結果、参考例１で得た粗精製ノンヘム型ハロペルオキシダーゼは２．６Ｕの活性を有していた。
【実施例１】
【００３７】
（１，３―ブタジエン反応例）
５００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ―Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム、６Ｕ  グルコースオキシダーゼ、５６ｍＭ  グルコース、参考例１で調製した１Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液を含む反応溶液１０ｍＬを調製し、反応液をバイアルに入れて密閉後、気相部に１，３―ブタジエンガスを１０ｍＬ注入した。３０℃で２４時間反応させた後、等量の酢酸エ
チルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、５０℃で５分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２５０℃で１０分間保持した。この分析条件において、ブタジエンモノハロヒドリンは１７．３分、ブタジエンジハロヒドリンは２８．９分に検出され、ブタジエンモノハロヒドリン（東京化成工業）、ブタジエンジハロヒドリン（東京化成工業）の標準物質のガスクロマトグラフィー分析結果とそれぞれ一致した。その結果、３７．２ｍＭのブタジエンモノハロヒドリンが生成し、ブタジエンジハロヒドリンは生成していなかった。
【実施例２】
【００３８】
（アルカリｐＨ条件での１，３―ブタジエンの反応例）
５００ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ―Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム、６Ｕ  グルコースオキシダーゼ、５６ｍＭ  グルコース、参考例１で調製した１Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液を含む反応溶液１０ｍＬを調製し、反応液をバイアルに入れて密閉後、気相部に１，３―ブタジエンガスを１０ｍＬ注入した。３０℃で２４時間反応させた後、等量の酢酸エチルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、５０℃で５分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２５０℃で１０分間保持した。この分析条件において、ブタジエンモノエポキシドは６．０分、ブタジエンジエポキシドは１５．１分、ブタジエンモノハロヒドリンは１７．３分、ブタジエンジハロヒドリンは２８．９分に検出され、ブタジエンモノエポキシド（東京化成工業）、ブタジエンジエポキシド（東京化成工業）ブタジエンモノハロヒドリン（東京化成工業）、ブタジエンジハロヒドリン（東京化成工業）の標準物質のガスクロマトグラフィー分析結果とそれぞれ一致した。その結果、１．２５ｍＭのブタジエンモノハロヒドリンと共に１．２１ｍＭのブタジエンモノエポキシドが生成し、ブタジエンジハロヒドリンおよびブタジエンジエポキシドは生成していなかった。
【実施例３】
【００３９】
（１，３―ブタジエン反応例）
１００ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ
オルソバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ  過酸化水素、参考例１で調製した２Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液を含む反応溶液１０ｍＬを調製し、反応液をバイアルに入れて密閉後、気相部に１，３―ブタジエンガスを１０ｍＬ注入した。３０℃で３時間反応させ、水酸化ナトリウムによって反応溶液をｐＨ１０以上にした後、等量の酢酸エチルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１７０１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、４０℃で９分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２５０℃で５分間保持した。この分析条件において、ブタジエンモノエポキシドは７．７分、ブタジエンジエポキシドは３１．０分に検出され、ブタジエンモノエポキシド（東京化成工業）、ブタジエンジエポキシド（東京化成工業）の標準物質のガスクロマトグラフィー分析結果とそれぞれ一致した。その結果、２．５４ｍＭのブタジエンモノエポキシドが生成し、ブタジエンジエポキシドは生成していなかった。
【実施例４】
【００４０】
（１，５―ヘキサジエン反応例）
１００ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ
オルソバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ  過酸化水素、参考例１で調製した２Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液、メタノールで調製した１，５―ヘキサジエン溶液を１，５―ヘキサジエン濃度が１０ｍＭとなるように添加した反応溶液１０ｍＬを調製した。３０℃で３時間反応させ、水酸化ナトリウムによって反応溶液をｐＨ１０以上にした後、等量の酢酸エチルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１７０１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、５０℃で５分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２６０℃で９分間保持した。この分析条件において、ヘキサジエンモノエポキシドは１１．６分、ヘキサジエンジエポキシドは１８．４分に検出され、ヘキサジエンモノエポキシド（東京化成工業）、ヘキサジエンジエポキシド（東京化成工業）の標準物質のガスクロマトグラフィ−分析結果とそれぞれ一致した。その結果、２．１７ｍＭのヘキサジエンモノエポキシドが生成し、ヘキサジエンジエポキシドは生成していなかった。
【実施例５】
【００４１】
（１，７―オクタジエン反応例）
１００ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ
オルソバナジン酸ナトリウム、５ｍＭ  過酸化水素、参考例１で調製した２Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液、メタノールで調製した１，７―オクタジエン溶液を１，７―オクタジエン濃度が１０ｍＭとなるように添加した反応溶液１０ｍＬを調製した。３０℃で３時間反応させ、水酸化ナトリウムによって反応溶液をｐＨ１０以上にした後、等量の酢酸エチルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１７０１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、５０℃で５分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２６０℃で９分間保持した。この分析条件において、これは、同分析条件において、オクタジエンモノエポキシドは１７．０分、オクタジエンジエポキシドは２２．６分に検出され、オクタジエンモノエポキシド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）、オクタジエンジエポキシド（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）の標準物質のガスクロマトグラフィ−分析結果とそれぞれ一致した。その結果、１．１５ｍＭのオクタジエンジエポキシドが生成し、オクタジエンモノエポキシドは生成していなかった。
【００４２】
［参考例３］
粗精製したノンヘム型ハロペルオキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列を解析したが、Ｎ末端がブロックされていたため解析できなかった。そこで、内部アミノ酸配列の解析を行った。１０％ｓｐ―Ａ２０９０分離ゲルを用いてＳＤＳ―ＰＡＧＥを行い、染色後に６０ｋＤａ付近のバンドを切り出した。そのゲル片にリジルエンドペプチダーゼを含むトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えて３５℃で２０時間処理し、逆相ＨＰＬＣによって分離した。ＨＰＬＣにおいて、カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ―８０Ｔｓ  ＱＡ（東ソー）を用い、０．１％  トリフルオロ酢酸溶液と０．０９％  トリフルオロ酢酸を含む９０％
アセトニトリル溶液によるグラジエント溶出を行った。分離されたアミノ酸断片を含むフラクションをアミノ酸配列分析に供した。ＨＰ  Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍおよびＰｒｏｃｉｓｅ  ４９４ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍによって解析を行い、配列番号２：Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ、配列番号３：Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ、配列番号４：Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌの３断片のアミノ酸配列を決定した。
【００４３】
［参考例４］
実施例１に示した培地を用いて、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ ＩＦＯ８８８５株を２４℃で１日間培養した。培養液からろ過により菌体を回収後、クライオプレス（マイクロテック・ニチオン）を用いて菌体を破砕した。破砕した菌体１０ｍｇよりＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｄ―７０００Ａ（Ｇｅｎｔｒａ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いてトータルＤＮＡを抽出し、４．９μｇのトータルＤＮＡを得た。
【００４４】
［参考例５］
参考例３で決定したアミノ酸配列をもとに、配列番号５：５‘―ｇｔｎｇａｒｇａｒｃｃｎａａｙｃｃｎａａｙｃｃ―３’，配列番号６：５‘―ａｃｎｇｔｎｇｃｎｃｃｙｔｔｙｔｔｙｔｃ―３’の２種のプライマーを合成し、実施例７により得たトータルＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で２分間、６５℃で２分間、６８℃で２分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、約１．２ｋｂの増幅断片が得られたので、その断片の塩基配列を決定した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ（ＩｎｆｏｒＭａｘ）を用いた配列比較の結果、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓａ由来ノンヘム型ハロペルオキシダーゼと高い相同性を示した。そこで、これら２株由来ノンヘム型ハロペルオキシダーゼの塩基配列をもとに配列番号７：５‘―ｇａｔｃｇａｔｇａａｃｃｃｇａａｇａｇｔａ―３’と配列番号８：５‘―ｔｇｔｔｇａｃｔｔｃｇｃｔｇｔｔｇｇｃａａ―３’，配列番号９：５‘―ｔａｔａｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇａｔｇｇｇｔ―３’と配列番号１０：５‘―ａｔｃｔｃｇａｔａｃｃｃａｇｒｇｇｃａｃａ―３’の４種のプライマーを合成し、トータルＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で２分間、６５℃で３０秒間、６８℃で２分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、１ｋｂと０．９ｋｂの増幅断片を得た。その断片をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）により塩基配列解析を行った結果、開始コドン及び終止コドンは検出されなかったため、引き続きインバ−スＰＣＲ法によるクロ−ニングを継続した。
【００４５】
［参考例６］
ノンヘム型ハロペルオキシダ−ゼ遺伝子の５‘上流領域の解析を行った。トータルＤＮＡをＥｃｏＲIで完全に消化し、その消化した断片５００ｎｇに対しライゲーション溶液２５０μＬを添加し、トータル量を５００μＬにして１４℃で１４時間セルフライゲーションを行った。ノンヘム型ハロペルオキシダーゼの内部配列をもとに、配列番号１１：５‘―ａｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｔｔｃｃｔｃｔａｃｃｇｇｃ―３’、配列番号１２：５’―ｇａａｇｃｃｔｔｔｃｃｇｔｃａｇｔａｃｃａｔｇｃｃ―３‘のプライマーを合成し、セルフライゲーションにより得た断片を鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で２分間、５５℃で２分間、６８℃で３分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。さらに、配列番号１３：５’―ｔｃａｇｃａｔｃａｇｇｔｇａｇａｇａａａｇｇｔｇｇ―３‘、配列番号１４：５’―ｔｔｃｔｇｇｇｃｃｔａｃｇａｔｇｇｇｔｃａａａｃｃ―３‘のプライマーを合成し、１回目のＰＣＲの増幅断片を鋳型にして２回目のＰＣＲを行った。同組成の反応溶液を作成し、鋳型となる１回目ＰＣＲの増幅断片は全量用いた。９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、６８℃で１０分間保持した。２回目のＰＣＲの増幅断片をＱＩＡ―ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて末端を平滑化した。その後、あらかじめＨｉｎｃＩＩで消化し、ＣＩＡＰ処理により脱リン酸化しておいたｐＵＣ１８に連結した。作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形質転換体に対してコロニーＰＣＲを行った。その結果、目的断片を保持していると思われる形質転換体があることが分かったので、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）によりそれらプラスミドの塩基配列解析を行った結果、未解析領域だったノンヘム型ハロペルオキシダーゼの開始コドン領域の解析に成功した。
【００４６】
［参考例７］
ノンヘム型ハロペルオキシダ−ゼ遺伝子の３‘側下流領域の解析を行った。１回目のＰＣＲ用として配列番号１５：５’―ｔｇｃｃｔａｃａｃｇｃｃｃｇｔｔａｔａｇｔａｔｃｇ―３‘、配列番号１６：５’―ｇａｃｔｃｔｇｃｃｔｇｇｇａａｃｔｃａｔｇｔｔｃｇ―３‘のプライマー、２回目のＰＣＲ用として配列番号１７：５‘―ｔｇｔｇｔｔａｇｔａｇｃｔｇｇｇｇｃａｃｃｇａｇｇ―３’、配列番号１８：５‘―ｇａｃｃａａｇｇａｃｇｔｃｔａｔｇｃｃｇｔｃｇａｃ―３’のプライマーを合成し、得られた増幅断片をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）により塩基配列解析を行った。その結果、未解析領域だったノンヘム型ハロペルオキシダーゼの終止コドン領域の解析に成功した。以上のようにして全長解析を行ったノンヘム型ハロペルオキシダーゼの塩基配列を配列番号１に記載する。
【００４７】
［参考例８］
解析した全長配列をもとに、配列番号１９：５‘―ａｔｃｇｇｔａｃｃｇｇｇｇｔｃｔｃｔｔａｃａｃｃｃａｔｃｃｃａｃ―３’，配列番号２０：５‘―ｇａｔａａｇｃｔｔｃａｔｃｔａｃｇｇｃｇｃｃｔｃｃｔｔａａｃｃａｃｔｇｇ―３’の２種のプライマーを合成し、トータルＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。１０ｍＭ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭ  フォワードおよびリバースプライマー、１ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２Ｕ  ＫＯＤ―ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、５０ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡからなる反応溶液を作成し、９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間、６８℃で２分間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果得られた増幅断片の塩基配列を解析した結果、配列番号１に記載の配列と同じであることを確認した。
【００４８】
［参考例９］
参考例８において得られた増幅断片をＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８に連結した。作成したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この形質転換体を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン、１０ｍＭ  イソプロピルーβ―Ｄ（―）―チオガラクトピラノシドを含むＬＢ培地５ｍＬで、３７℃、一晩培養した。培養液１ｍＬより菌体を回収後、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウムを含む５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）５００μＬに懸濁し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（オリンパス）で５分間を破砕した。破砕液を１２０００ｒｐｍで２０分遠心し、その上清液を活性測定に用いた。活性測定は５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ  オルソバナジン酸ナトリウム、２０μｇ／ｍＬ  フェノールレッド、５ｍＭ  過酸化水素から成る反応溶液で行った。その結果、反応溶液が紫色に変色し、組換え大腸菌内でノンヘム型ハロペルオキシダーゼが活性発現していることを確認した。
【００４９】
［参考例１０］
参考例９で作成した形質転換体を、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリン、１０ｍＭ  イソプロピルーβ―Ｄ（―）―チオガラクトピラノシドを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、一晩培養した。その培養液１ｍＬを同組成のＬＢ培地１Ｌに植菌し、同様に３７℃、一晩培養した。培養液より菌体を遠心分離によって回収後、５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に懸濁した。懸濁した菌体をホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５，ＡＶＥＳＴＩＮ）で破砕し、破砕液を遠心分離した。遠心分離後の上清液に対して飽和硫安濃度が４０％となるように硫安を加えて３０分間撹拌した後、遠心分離した。遠心分離後の上清液に対して飽和硫安濃度が８０％となるように硫安を加えて３０分間撹拌した後、遠心分離し、沈殿物を５０ｍＭ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁した。懸濁液を透析によって一昼夜脱塩した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア）を担体としたカラムクロマトグラフィ−を行った。担体にハロペルオキシダ−ゼを吸着し洗浄後、塩化カリウム濃度０〜０．５Mのグラジエト溶出を行った。その結果、塩化カリウム濃度０．２〜０．３Ｍ付近で活性画分が溶出し、２Ｕの粗精製ノンヘム型ハロペルオキシダーゼを得た。
【実施例６】
【００５０】
１００ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  臭化カリウム、１ｍＭ
オルソバナジン酸ナトリウム、６Ｕ  グルコースオキシダーゼ、５６ｍＭ  グルコース、参考例１０で調製した２Ｕのハロペルオキシダーゼ活性を示す溶液を含む反応溶液１０ｍＬを調製し、反応液をバイアルに入れて密閉後、気相部に１，３―ブタジエンガスを１０ｍＬ注入した。３０℃で６時間反応させた後、等量の酢酸エチルで抽出した。分析は、ガスクロマトグラフィーＧＣ―９Ａ（島津製作所）にＤＢ―１のカラム（Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を装着して行った。設定温度は、注入温度が３００℃、検出温度が３００℃、カラムの温度プログラムは、５０℃で５分間保持し、毎分１０℃で昇温した後、２５０℃で１０分間保持した。この分析条件において、ブタジエンモノハロヒドリンは１７．３分、ブタジエンジハロヒドリンは２８．９分に検出され、ブタジエンモノハロヒドリン（東京化成工業）、ブタジエンジハロヒドリン（東京化成工業）の標準物質のガスクロマトグラフィー分析結果とそれぞれ一致した。その結果、４．７ｍＭのブタジエンモノハロヒドリンが生成し、ブタジエンジハロヒドリンは生成していなかった。
【配列表】
2005110573000001.app