(57)【要約】      （修正有）【課題】第二銅イオンに対する選択性が高く、第二銅イオンを高感度に測定することができる第二銅イオン測定用プローブ及びそれを用いた第二銅イオンの測定方法を提供すること。【解決手段】下記式[VI]で示されるような、特定のイオウ含有カルボニル化合物から成る第二銅イオン測定用プローブを提供する。また、本発明は、上記本発明の第二銅イオン測定用プローブを、第二銅イオンを含む検体と接触させ、検体中の第二銅イオンと結合した該プローブの吸光度又は蛍光を測定することを含む、検体中の第二銅イオンの測定方法を提供する。2005201773.tif 000016【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式[I]
【化１】
2005201773.tif 000010
（ただし、式中、R1は-CH2-を表し、R2は水素原子若しくは一般式[I]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基を表し、又はR1とR2は協働して環を形成し、Ａは式中の炭素原子１及び２と共に環式構造を形成する原子団、Ｘは色素原子団であって、Ａを含む環と縮合環を形成していてもよい）
で表される構造を有する第二銅イオン測定用プローブ。
【請求項２】
一般式[I]中のR1とR2が協働して環を形成している請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
下記一般式[II]
【化２】
2005201773.tif 000011
（ただし、式中、Ａ及びＸは一般式[I]と同義、Y1は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）を表し、ｎは１又は２の整数を表し、Ｓを含む環を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい）
で表される構造を有する請求項２記載のプローブ。
【請求項４】
一般式[II]において、Y1が-S-、nが１であり、Ｓを含む環構造を構成する炭素原子に置換基が結合していない請求項３記載のプローブ。
【請求項５】
下記一般式[III]
【化３】
2005201773.tif 000012
（ただし、式中、Y1及びｎは一般式[II]と同義、Y2は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）、X'は存在していても存在していなくてもよく、存在する場合には一般式[III]中の縮合環構造と協働して色素を形成する原子団であってベンゼン環と縮合していてもよく、一般式[III] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[III]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい）
又は下記一般式[IV]
【化４】
2005201773.tif 000013
（ただし、式中、Y1及びｎは一般式[II]と同義、Y3は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[IV]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）、Ｚは-CH=又は-N=を表わし、一般式[IV] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[IV]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい）
で表わされる構造を有する請求項３記載のプローブ。
【請求項６】
下記一般式[V]
【化５】
2005201773.tif 000014
（ただし、式中、Y1、ｎ及びY2は一般式[III]と同義、一般式[V] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[V]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい）
で表わされる構造を有する請求項５記載のプローブ。
【請求項７】
下記式[VI]
【化６】
2005201773.tif 000015
で表わされる構造を有する請求項６記載のプローブ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の第二銅イオン測定用プローブを、第二銅イオンを含む検体と接触させ、検体中の第二銅イオンと結合した該プローブの吸光度又は蛍光を測定することを含む、検体中の第二銅イオンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第二銅イオン測定用プローブ及びそれを用いた第二銅イオンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
銅イオンは、人体における必須重金属イオンの中で三番目に多く、ヘモグロビン合成などの酵素活性に関与しており、銅の欠乏によって貧血、過剰によってヘモグロビン尿症などの症状が起こる。また、環境や人体への影響から水田中の銅濃度に関して基準が定められている。また、ブドウ酒中の銅の定量、工業材料における銅の定量などが行われている。
【０００３】
吸光、蛍光といった分光学的手法では、高速、簡便、高感度に測定対象を定量可能である。銅の定量においては、従来、比色抽出試薬として、Bathocuproine (2,9-ジメチル -4,7-ジフェニル-1,10-フェナントロリン）などが使われてきた。BathocuproineはCu+に選択的である。また、Cu2+に対してのクロモイオノフォアおよびフルオロイオノフォアの報告例もいくつか存在する。
【０００４】
【非特許文献１】Roland Kraemer, Angew.Chem.Int.Ed. 1998, 37, No.6,pp772-773
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、公知のCu2+選択性クロモイオノフォアおよびフルオロイオノフォアでは選択性、感度が低く、他のイオンの共存による妨害や、着色物質の妨害を受けやすかった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、第二銅イオンに対する選択性が高く、第二銅イオンを高感度に測定することができる第二銅イオン測定用プローブ及びそれを用いた第二銅イオンの測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、環構造上のラクトンを構成する酸素原子と、該ラクトンに隣接する炭素原子に、１個の炭素原子を介して結合するイオウ原子とを含む構造が、第二銅イオンと高度に選択的に結合することを見出し、さらに、この構造を吸光性又は蛍光性の色素原子団に結合すれば、前記構造が第二銅イオンと結合した際の吸光度又は蛍光の変化を測定することにより試料中の第二銅イオンを選択的かつ高感度に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式[I]
【０００９】
【化１】
2005201773.tif 000002
【００１０】
（ただし、式中、R1は-CH2-を表し、R2は水素原子若しくは一般式[I]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基を表し、又はR1とR2は協働して環を形成し、Ａは式中の炭素原子１及び２と共に環式構造を形成する原子団、Ｘは色素原子団であって、Ａを含む環と縮合環を形成していてもよい）
で表される構造を有する第二銅イオン測定用プローブを提供する。また、本発明は、上記本発明の第二銅イオン測定用プローブを、第二銅イオンを含む検体と接触させ、検体中の第二銅イオンと結合した該プローブの吸光度又は蛍光を測定することを含む、検体中の第二銅イオンの測定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、第二銅イオンに対する選択性が高く、第二銅イオンを高感度に測定することができる新規な第二銅イオン測定用プローブ及びそれを用いた第二銅イオンの測定方法が提供された。下記実施例において具体的に記載されるように、本発明のプローブは、第二銅イオンと接触すると、他の金属陽イオンと接触した場合には見られない吸光ピークが特定の波長において現れ、また、他の金属陽イオンと接触した場合には見られない蛍光強度の変化が見られる。従って、本発明のプローブにより、第二銅イオンを選択的に高感度に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の第二銅イオン測定用プローブは、上記一般式[I]で表される構造を有する。一般式[I]中に示されるラクトンを構成する酸素原子と、炭素原子２に結合している基中のイオウ原子とが第二銅イオンとの結合に重要であり、これらの原子の間に第二銅イオンが挟まれて錯結合されるものと考えられる。従って、R2は水素原子又は一般式[I]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない基であれば任意の基であってよい。このような基の例として、ハロゲン、低級（炭素数１〜６、以下同じ）アルキル基、低級アルコキシル基、アリール基（フェニル基、ナフチル基等）を挙げることができる。もっとも、イオウ原子が堅固に保持されることが好ましいので、R1とR2は協働して環を形成することが好ましい。環は５員環又は６員環が好ましく、特に、プローブが下記一般式[II]で表される構造を有するものであることが好ましい。
【００１３】
【化２】
2005201773.tif 000003
【００１４】
式中、Ａ及びＸは一般式[I]と同義、Y1は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）を表す。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、ハロゲン、アルキル基（好ましくは低級（炭素数１〜６、以下同じ）アルキル基）、置換アルキル基（好ましくは置換低級アルキル基（置換基の例としては１又は複数のニトロ基、ハロゲノ基、スルホン酸基等）、アルコキシル基（好ましくは低級アルコキシル基）、アリール基（フェニル基、ナフチル基等）、置換アリール基（置換基の例としてはニトロ基、アルキル基（好ましくは低級アルキル基）、ハロゲノ基、スルホン酸基）アミノ基、ニトロ基等を挙げることができる。ｎは１又は２の整数を表し、すなわち、Ｓを含む環が５員環又は６員環である。また、Ｓを含む環を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記したR3及びR4の「任意の基」の好ましい例を挙げることができる。なお、Ｓを含む環を構成する炭素原子（Y1が-CR3R4-である場合には、-CR3R4-中の炭素原子も包含する）には、上記の通り置換基が結合していてもよいが、これらの置換基は不要であるので、合成の簡便さやコストを考慮すると、これらの置換基は存在しないことが好ましい。
【００１５】
上記一般式[II]中のＳを含む環は、Y1が-S-でｎが１であり、Ｓを含む環構造を構成する炭素原子に置換基が結合していないものが特に好ましい。
【００１６】
一般式[I]中、Ａを含む環構造は、ラクトンの酸素原子が結合している炭素原子１及びイオウを含む基が結合している炭素原子２を堅固に保持することに役立っており、これに色素原子団Ｘが結合している。色素原子団Ｘは、Ａを含む環と縮合環を形成していてもよく、この場合には色素原子団ＸとＡを含む環との縮合環が色素を構成する。従って、「色素原子団」は、それ自体で色素を構成するものであってもよいし、Ａを含む環と協働して色素を形成するものであってもよい。ここで、「色素」は、吸光性又は蛍光性を示すものである。一般に、吸光性又は蛍光性を示す化合物は、金属イオン等と結合するとその吸光特性（吸光度及び／若しくは最大吸収波長）又は蛍光特性（蛍光強度及び／若しくは蛍光波長）が変化するので、その変化を利用して金属イオン等を測定することが可能である。従って、Ａを含む環及び色素原子団Ｘの構造は、吸光性又は蛍光性を有するものであれば特に限定されるものではない。プローブの好ましい例として、下記一般式[III]又は[IV]で表されるものを挙げることができる。
【００１７】
【化３】
2005201773.tif 000004
【００１８】
式中、Y1及びｎは一般式[II]と同義、Y2は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[II]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）を示す。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記した、一般式[II]におけるＳを含む環上の置換基の好ましい例を挙げることができるが、水素原子が好ましい。式中の縮合環が色素であるので、X'は存在していても存在していなくてもよく、存在する場合には一般式[III]中の縮合環構造と協働して色素を形成する原子団であってベンゼン環と縮合していてもよい。一般式[III] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[III]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記した、一般式[II]における環上の置換基の好ましい例を挙げることができるが、上記と同様、このような置換基は不要であるので存在しない方が合成の簡便さやコストの観点から好ましい。
【００１９】
【化４】
2005201773.tif 000005
【００２０】
式中、Y1及びｎは一般式[II]と同義、Y3は-O-、-S-、-CR3R4-（ただし、R3及びR4は互いに独立に水素原子又は一般式[IV]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基）を示す。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記した一般式[II]におけるＳを含む環上の置換基の好ましい例を挙げることができるが、水素原子が好ましい。Ｚは-CH=又は-N=を表わす。一般式[IV] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[IV]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記した、一般式[II]におけるＳを含む環上の置換基の好ましい例を挙げることができるが、上記と同様、このような置換基は不要であるので存在しない方が合成の簡便さやコストの観点から好ましい。
【００２１】
一般式[III]及び[IV]において、aで示す炭素原子に置換基が結合している場合、該置換基は、上記した「任意の基」であってよいが、特にNR5R6（ただし、R5及びR6は互いに独立に水素原子又は一般式[III]又は[IV]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基（ここで「任意の基」の好ましい例としては、上記した、一般式[II]におけるＳを含む環上の置換基の好ましい例）であり、水素原子が好ましい）、水酸基、アリール基（フェニル基、ナフチル基等）、置換アリール基（ここで、置換基の好ましい例としては１又は複数のニトロ基、アルキル基、ハロゲノ基、スルホン酸基等）、アミノ基、ニトロ基、アルキル基（好ましくは低級アルキル基）、置換アルキル基（好ましくは低級置換アルキル基、置換基の好ましい例としては１又は複数のニトロ基、ハロゲノ基、スルホン酸基等）を好ましい例として挙げることができる。
【００２２】
上記一般式[III]で表される化合物の好ましい例として、下記一般式[V]で表されるものを挙げることができる。
【００２３】
【化５】
2005201773.tif 000006
【００２４】
式中、Y1、ｎ及びY2は一般式[III]と同義である。一般式[V] 中の環構造を構成する任意の１又は２以上の炭素原子に結合している各水素原子は、一般式[V]で表される化合物と第二銅イオンとの結合を妨害しない任意の基で置換されていてもよい。ここで、「任意の基」の好ましい例としては、上記した、一般式[II]における環上の置換基の好ましい例を挙げることができるが、上記と同様、このような置換基は不要であるので存在しない方が合成の簡便さやコストの観点から好ましい。一般式[V]で表される化合物のうち、特に好ましい例として、下記式[VI]で表されるもの(「KCU-1」と命名）を挙げることができる。
【００２５】
【化６】
2005201773.tif 000007
【００２６】
KCU-1は、可視領域に吸収を持ち明るい蛍光を発するクマリン骨格を有し、ラクトンのα位にジチオアセタール構造を有するものである。下記実施例において具体的に示されるように、KCU-1は、第二銅イオンの存在下において、波長533nm及び578nmに特異的な（すなわち、他の金属イオンの存在下においては見られない）吸収極大を示す。従って、これらの特性を利用して第二銅イオンを選択的に測定することが可能である。また、第二銅イオンの存在下において、波長480nmの蛍光強度が特異的に減少するので、検体中に第二銅イオン以外の金属イオンが存在しないことがわかっている場合には蛍光強度の減少を利用して検体中の第二銅イオンを測定することができる。
【００２７】
本発明のプローブは、炭素原子２にシアノ基等の官能基が結合した環式色素を出発物質とし、これにアルキルチオアルコールを反応させる公知の手法に基づいて合成することができ、その具体例は下記実施例に詳述されている。
【００２８】
本発明のプローブは、検体にプローブを作用させ、吸光度を測定するか又は励起光を当てて蛍光を測定するという、従来の吸光プローブ又は蛍光プローブと全く同様な方法によって使用することができる。例えば、アセトニトリルのような、極性有機溶媒に溶解したものを検体に加え（又は検体にこれを加え）て、吸光を測定するか又は励起光を当てて蛍光を測定することができる。極性有機溶媒中のプローブ濃度は、特に限定されないが、通常、1 nMないし1 mM程度、好ましくは、1μMないし１０μM程度である。反応温度は、特に限定されず、各検体に適した温度が適宜選択できるが、通常、０℃〜４０℃程度であり、室温が簡便で好ましい。室温で混合するだけで速やかに錯形成が起きる。なお、本発明における「測定」には、定量と検出の両者が包含される。
【００２９】
検体は、第二銅イオンを測定することが望まれるいずれのものであってもよく、例えば水田の水のような種々の環境由来の検体、中間体を包含する各種工業材料、ワイン等の飲食品、体液等の生体由来試料等を挙げることができる。
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
KCU-1の合成
(1)10-オキソ-2,3,5,6-テトラヒドロ-1H,4H,10H-11-オキサ-3a-アザ-ベンゾ [デ]アントラセン-9-カルボアルデヒドの合成
【００３２】
【化７】
2005201773.tif 000008
【００３３】
アルゴン置換した50 ml二口ナスフラスコに，Coumarin337 (1) (市販品、500 mg, 1.88 mmol, 1 eq.)を入れ、ギ酸 (4.5 ml) に溶解した。この溶液にRaney Ni (0.625 ml, 4.51 mmol)を加え、130℃で1.5時間還流した。反応系をろ過し、水を加えてクロロホルムで2回抽出し、有機層をNaHCO3aq、NaClaqで2回洗浄後、芒硝乾燥した。溶媒を減圧留去し、黒褐色の化合物4 (441 mg, 収率；87.1 ％)を得た。
【００３４】
薄層クロマトグラフィー(TLC); Rf=0.5(溶離液;クロロホルム/酢酸エチル= 10/1, v/v=1/1)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.) 
δ(ppm)  1.98 (s, 4H, -CH2-), 2.76 (t, J = 6.2Hz, 2H, -CH2-), 2.89 (t, J = 6.3 Hz, 2H, -CH2-), 3.24 (q, J = 5.5 Hz, 4H, -CH2-), 3.37 (q, J = 4.2 Hz, 2H, -CH2-), 6.98 (s, 1H, ArH), 8.14 (s, 1H, ArH)
【００３５】
(2)   9-[1,3]ジチオラン-2-イル-2,3,5,6-テトラヒドロ-1H,4H-11-オキサ-3a-アザ-ベンゾ[デ]アントラセン-10-オン (KCU-1)の合成
【００３６】
【化８】
2005201773.tif 000009
【００３７】
Ar置換した100 ml三口ナスフラスコに，化合物4 (200 mg, 0.743 mmol, 1 eq.)を加え、塩化メチレン (2.78 ml) に溶かした。さらに1,2-エタンジチオール (5) (0.111 g, 1.18 mmol, 1.5 eq.)を加えた。この溶液に三フッ化ホウ素エーテレート (18.6 mg, 0.131 mmol, 0.176 eq.) を加え、65℃で加熱した。24 時間後に三フッ化ホウ素エーテレート (33.4 mg, 0.235mol, 0.317 eq.)加え、さらに15時間後に1,2-ジクロロエタン (10 ml)，および塩化メチレン (2.78 ml) を加えた。その後105 時間還流した。反応系に飽和NaHCO3水溶液を加え、クロロホルムで2回抽出し、NaClaqで2回洗浄後、芒硝乾燥した。溶媒を減圧留去し、粗生成物6 を得た。カラムクロマトグラフィ(SiO2, クロロホルム：ヘキサン = 4 : 1 v/v)で精製し、褐色固体 6 (136.2 mg, 収率 : 53.1 %) を得た。
【００３８】
TLC ; Rf = 0.2 (溶離液; クロロホルム/酢酸エチル= 4/1, v/v=1/1)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r. t.) 
δ (ppm)   1.96 (m, J = 6.0 Hz, 4H, -CH2-), 2.75 (t, J = 6.2 Hz, 2H, -CH2-), 2.87 (t, J = 6.3 Hz, 2H, -CH2-), 3.25 (q, J = 5.5 Hz, 4H, -CH2-), 3.31 (s, 4H, -CH2-), 5.76 (s, 1H, -CH-), 6.87 (s, 1H, ArH), 7.84 (s, 1H, ArH)
【実施例２】
【００３９】
KCU- 1のさまざまなイオンによる吸収・蛍光スペクトル
実施例１で合成したKCU-1を、種々の金属イオンと接触させた際の色素の吸収と蛍光スペクトルを測定した。測定条件、装置条件などの詳細は以下のとおりである。
【００４０】
測定条件
KCU-1終濃度：  1.0 x 10-5 M
金属塩終濃度：  1 x 10-5 M
測定温度：      室温
溶媒：          アセトニトリル
金属塩：      Al(ClO4)3・9H2O, MgCl2, CaCl2, CuCl2, FeCl3, CoCl2, ZnCl2, AgCl,
CrCl3,CdCl2, PbCl2
【００４１】
装置設定
U-2001(吸光光度計)
スキャン速度：      200 [nm/min]
【００４２】
F-4500(蛍光光度計)
スキャン速度：      240 [nm/min]
応答：              自動
バンドパス：        蛍光: 2.5 [nm]
光学倍増管：        700 [V]
【００４３】
結果を図１及び図２に示す。図１に示されるように、KCU-1は、第二銅イオンと接触すると、波長510nm以上でも吸光性を有し、533nm及び578nmに吸光度のピークが現れる。これに対し、他の金属イオンと接触した場合には、波長510nm以上では吸光度はほとんど０になる。従って、510nm以上の波長、好ましくは吸収極大のある波長533nm又は578nmの吸光度を測定することにより、検体中の第二銅イオンを選択的に測定することができる。また、波長400nmの励起光で励起した場合、約480nmにある蛍光強度の極大値が、第二銅イオンと接触した場合にはブランク（金属塩を含まない）に比べて約２５％減少するが、他の金属イオンと接触した場合には、これほどの減少は見られない。従って、蛍光特性も第二銅イオンの存在下では特異的に変化することがわかる。
【実施例３】
【００４４】
種々の濃度の塩化第二銅アセトニトリル溶液を検体とし、実施例２と同様にして励起波長400 nmにおける蛍光スペクトルを測定した。
【００４５】
結果を図３に示す。また、図３に示すデータの塩化第二銅濃度の対数を横軸に、ピーク波長における蛍光強度を縦軸にとったグラフを図４に示す。図４に示されるように、塩化第二銅濃度が5x10-6Mから5x10-3Mの間では、蛍光強度がほぼ直線的に減少しているので、この範囲であれば第二銅イオンを定量できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施例１で合成した第二銅イオン測定用プローブKCU-1を種々の金属イオンと接触させた際の吸光スペクトルを示す。
【図２】本発明の実施例１で合成した第二銅イオン測定用プローブKCU-1を種々の金属イオンと接触させた際の蛍光スペクトルを示す。
【図３】本発明の実施例１で合成した第二銅イオン測定用プローブKCU-1を種々の濃度の第二銅イオンと接触させた際の蛍光スペクトルを示す。
【図４】図３に示すデータの塩化第二銅濃度の対数を横軸に、ピーク波長における蛍光強度を縦軸にとったグラフを示す。
【図１】
2005201773.tif 000017
【図２】
2005201773.tif 000018
【図３】
2005201773.tif 000019
【図４】
2005201773.tif 000020