(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、ＤＮＡチップの各測定サイトを短時間で測定することに関する。【解決手段】    本発明は、ＤＮＡチップ上を発光ダイオード（ＬＥＤ）により照射し、各測定サイトの蛍光色素を励起し、各測定サイトから放射された蛍光をＣＣＤカメラにより一括検出することに関する。本発明により、ＤＮＡチップ上の各測定サイトを一度に測定することが可能となる。さらに、各測定サイトの測定条件がほぼ同ーとなり、測定精度も向上する。また、読取機構が省スペース、安価となり、故障率も低下し、メンテナンスもほとんど不要となる。【選択図】  図４
2005181145.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成を含む核酸分析装置；
複数の測定サイトを備えるＤＮＡチップを保持できるＤＮＡチップインターフェイス；
複数の測定サイトに対して励起光を照射する発光ダイオード；
複数の測定サイトから放射された蛍光を検出できるＣＣＤカメラ。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析装置であって、
一のＤＮＡチップに対して、複数の発光ダイオードから同時に励起光を照射する核酸分析装置。
【請求項３】
請求項２記載の核酸分析装置であって、
一のＤＮＡチップに対して、ＤＮＡチップまでの距離がほぼ等しい対向する一組の発光ダイオードから、それぞれの励起光の光軸と複数の測定サイトを含む平面との成す角がほぼ等しくなるように、励起光を照射する核酸分析装置。
【請求項４】
以下の構成を含む核酸分析装置；
複数の測定サイトを備えるＤＮＡチップを保持できるＤＮＡチップインターフェイス；
複数の測定サイトに対して励起光を照射できる発光ダイオード；
ＣＣＤカメラと、複数の測定サイトから放射された蛍光をＣＣＤ上へ結像できるレンズ群を納め、その側面に開口部が設けられた鏡筒と、波長選別できる複数の光学フィルタを備え、前記開口部にその一部が挿入されたフィルタ部材とを含み、該フィルタ部材を動かすことによりレンズ群に挿入される光学フィルタを切り換えるを鏡筒の一部に設けた貫通穴を当して切り替える光学系機構。
【請求項５】
請求項４記載の核酸分析装置であって、
前記光学系機構が、前記ＣＣＤカメラ、前記鏡筒、及び前記フィルタ部材を保持するフレームを備え、前記ＤＮＡチップは固定し、該フレームを動かすことによりフォーカシングを行う核酸分析装置。
【請求項６】
請求項６記載の核酸分析装置であって、
前記光学系機構が、前記フレームの移動と、ＣＣＤカメラの測定を繰り返すことにより、フォーカシングを行う核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析装置に関し、例えば、精製されたＤＮＡ試料の一塩基多型(ＳＮＰ)解析をするＳＮＰ解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記特許文献１には、従来のＤＮＡアレイチップの読取方法及び装置が開示されている。ここでは、ＤＮＡチップと励起光源を相対的に移動して、ＤＮＡチップをレーザ光により走査し、蛍光を光電子増倍管（ＰＭＴ）により検出し、ＤＮＡチップを読み取る技術が開示されている。
【特許文献１】特開２０００−１３１２３７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
励起光源にレーザー発振器、検出器に光電子増倍管を使用した従来の読取方式では、ＤＮＡチップ上の各点の情報のみが得られるの為、ＤＮＡチップの２次元情報を得るためにはＤＮＡチップ内を走査する仕組みが必要となる。また、測定対象となる蛍光色素が２種類となると、レーザー発振器及び光電子増倍管を２組用いる必要がある。したがって、ＤＮＡチップを読み取る為には、ＤＮＡチップ上の測定サイト数だけＤＮＡチップを走査し、さらに、測定サイト毎に、検出すべき蛍光色素の数だけ、光源及び検出器を切り替えて測定することとなり、測定時間が長くなる。ＤＮＡチップ自身の高集積化も、測定時間の長期化に拍車をかけている。
本発明の目的は、ＤＮＡチップの各測定サイトを短時間で測定することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＤＮＡチップ上を発光ダイオード（ＬＥＤ）により照射し、各測定サイトの蛍光色素を励起し、各測定サイトから放射された蛍光をＣＣＤカメラにより一括検出することに関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、ＤＮＡチップ上の各測定サイトを一度に測定することが可能となる。さらに、各測定サイトの測定条件がほぼ同ーとなり、測定精度も向上する。また、読取機構が省スペース、安価となり、故障率も低下し、メンテナンスもほとんど不要となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の核酸分析装置について、特にＳＮＰ解析装置を例にとり、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
【０００７】
本発明の核酸分析装置では、例えば、アフィメトリックス社製ＤＮＡチップに代表される一般的なＤＮＡチップが分析対象とされる他、ナノチップと呼ばれる半導体チップも好適に分析対象とされる。ナノチップとは、マトリックス状に電極が配置され、その表面が透過層構造にてコーティングされた半導体チップであり、ユーザが所望のオリゴヌクレオチド−アレイを構築し、そのオリゴヌクレオチド−アレイに試薬をスパイクして、ＰＣＲ生成物であるサンプルを分析する。一般的なＤＮＡチップの場合、ＤＮＡチップメーカが、既知の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド−アレイを備えるＤＮＡチップを供給する。このＤＮＡチップは、ガラス基板等を用い、ガラス基板の所定位置に、オリゴヌクレオチドの前駆体である４種類の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を配置し、オリゴヌクレオチド−アレイを形成する。つまり、ガラス基板上でオリゴヌクレオチドを伸長させ、オリゴヌクレオチド−アレイを作成する。一方、ナノチップでは、寒天質の透過層構造に表面が覆われた半導体チップを用い、この透過層構造に、予め作成した核酸を固定することで、核酸アレイを構成する。
【実施例】
【０００８】
図１は、本実施例にかかるＤＮＡチップを用いるＳＮＰ解析装置の分解斜視図である。以下、図１を参照して、ＳＮＰ解析装置の概要を説明する。
【０００９】
ＳＮＰ解析装置は、主にＤＮＡのＳＮＰを検出することを目的としている。ＳＮＰはSingle Nucleotide Polymorphismの略で一塩基多型と呼ばれ、一塩基だけ異なる遺伝子のことを指す。このＳＮＰが病気と関連していると考えられ、さまざまな病気と関連するＳＮＰの探索が精力的に行われている。
【００１０】
本ＳＮＰ解析装置の最終的な出力は、次の３状態である。サンプルＤＮＡにおいて着目するＳＮＰが両対立遺伝子で存在する、又は存在しない状態（ホモ）と、片方の対立遺伝子のみに存在する状態（ヘテロ）である。これらを判定する方法として、例えば、着目するＳＮＰを持つサンプルと反応し結合する（ハイブリダイズする）試薬を第1番目の蛍光色素により標識しておき、それを持たないサンプルとハイブリダイズする試薬を第１番目とは励起波長、蛍光波長の異なる第２番目の蛍光色素により標識しておく。サンプルＤＮＡに対し前記両試薬を反応させる。第１番目と第２番目の蛍光色素からの蛍光を検出し、それぞれの検出強度の比を求める。この比をもとに、着目するＳＮＰに対する前記３つの状態を判定する。
【００１１】
ここで、上記ナノチップを用いたＰＣＲ生成物であるサンプルを分析する手順を説明する。分析手順は、”Amplicaon Down Format”と”Capture Down Format”の２種類がある。
【００１２】
Amplicaon Down Formatでは、まず、半導体チップ上に、一部の塩基配列が不明であり、一端がビオチン化された分析対象ＰＣＲ生成物（Sample Oligos）を供給し、半導体チップ上の所定の電極に電圧を印可する。すると、そのSample Oligosは、当該電極に引き寄せられ、半導体チップ表面の透過層構造と接触する。そして、Sample Oligosのビオチン標識と透過層構造が反応し（avidin-biotin反応）、Sample Oligosは透過層構造に固定される。半導体チップ表面を洗浄し、別のSample Oligosを用いて上述の工程を繰り返すことにより、半導体チップ上に、Sample Oligosから成る所望のオリゴヌクレオチド−アレイを形成する。Sample Oligosがマトリックス状に配置されたオリゴヌクレオチド−アレイを形成した後、その上に、一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（Reporter Oligos）を供給する。Reporter Oligosは、相補的配列を有するSample Oligosとハイブリダイズする。半導体チップ表面を洗浄後、半導体チップ上に励起光を照射する。これにより、Sample OligosとハイブダイズしたReporter Oligosから蛍光が発生する。この蛍光パターンを検出し、解析することで、Sample Oligosの塩基配列を分析することができる。
【００１３】
一方、Capture Down Formatでは、まず、半導体チップ上に、既知の塩基配列を有し、一端がビオチン化されたオリゴヌクレオチド（Capture Oligo）を供給し、半導体チップ上の所定の電極に電圧を印可する。すると、そのCapture Oligoは、当該電極に引き寄せられ、半導体チップ表面の透過層構造と接触する。そして、Capture Oligoのビオチン標識と透過層構造が反応し（avidin-biotin反応）、Capture Oligoは透過層構造に固定される。半導体チップ表面を洗浄し、別のCapture Oligoを用いて上述の工程を繰り返すことにより、半導体チップ上に、Capture Oligoから成る所望のオリゴヌクレオチド−アレイを形成する。Capture Oligoがマトリックス状に配置されたオリゴヌクレオチド−アレイを形成した後、その上に、一部の塩基配列が不明である分析対象ＰＣＲ生成物（Sample Oligos）を供給する。Sample Oligosは、相補的配列を有するCapture Oligoとハイブリダイズする。これにより、Sample Oligosは、Capture Oligoを介して、半導体チップ上に固定される。半導体チップ表面を洗浄し、一端が蛍光標識されたオリゴヌクレオチ（Reporter Oligos）を供給する。Reporter Oligosは、相補的配列を有するSample Oligosとハイブリダイズする。半導体チップ表面を洗浄後、半導体チップ上に励起光を照射する。これにより、Sample OligosとハイブリダイズしたReporter Oligosから蛍光が発生する。この蛍光パターンを検出し、解析することで、Sample Oligosの塩基配列を分析することができる。
【００１４】
ＳＮＰ解析装置は主に、分注ユニット、流路系ユニット、インターフェイスユニット、光学系ユニットおよび電源ユニットから構成され、図示しない外部機器（ＰＣ）により制御される。ＳＮＰ解析装置は、ＤＮＡチップを備えたカートリッジを装着し、分析を行う。カートリッジは、その内部に半導体素子からなるＤＮＡチップを配置したフローセルを内蔵している。ＤＮＡチップは、最大４００の核酸プローブを所定位置に配置し、所望のプローブアレイを構築できる。尚、ＤＮＡチップ上への核酸プローブの貼り付けから、測定までを自動で行え、オペレータがサンプル毎に装置を操る必要はない。例えば、９６個のサンプルの分析は、およそ３時間で行える。
【００１５】
ＳＮＰ解析装置（１０１）は、トップカバー（１０２）、カバー（１０３）、装置本体（１０４）、フロントパネル（１０５）から成る。
【００１６】
分注ユニットは、サンプルや試薬を配置保管できるサンプルハンドリングステーション（１０６）と、サンプル及び試薬を所定位置へ搬送するためのロボットアーム（１１２）を含む。サンプルハンドリングステーション（１０６）は、サンプルや試薬が入っているサンプルトレイ（１１１）を２つ、Ｒｅａｇｅｎｔボトルを４つ搭載できる。また、反応酵素を冷却保管できる反応酵素冷却部を備えている。そして、溶液を吸引吐出できるプローブチップを備えたロボットアーム（１１２）を用い、所定のサンプルや試薬を分注し、注入ポートに投入できる。
【００１７】
流路系ユニットは、３台のシリンジポンプを駆動し、注入ポートから投入されたサンプルや試料、水ボトルに蓄えられた水等を、自動的にフローセル内のＤＮＡチップへ搬送できる。また、洗浄ポートによりプローブチップを洗浄したり、フローセル内や流路を洗浄できる。更に、装置内から生じた廃液を、装置外に配置された廃液ボトルへ排出できる。
【００１８】
インターフェイスユニットはカートリッジを着脱保持でき、カートリッジにニードルを挿入し、ニードルを介して流路接続できる。これにより、所定のサンプルや試薬をフローセル内に搬送することが可能となる。また、ＤＮＡチップと電気的接続することにより、核酸プローブの配置場所等を制御可能とする。更に、ＤＮＡチップと熱的接続することにより、フローセル内の温度を制御可能とする。
【００１９】
光学系ユニットは、ＤＮＡチップ上に存在する蛍光試薬を励起できる光源と、蛍光試薬から生じた蛍光を検出できる検出器を含み、ＤＮＡチップ上の画像を出力できる。
電源ユニットは、各ユニットへ駆動電力を供給し、電源電圧として、１００、１１０、１２０、２００、２２０、２３０、２４０ＶＡＣが使用可能であり、電流値は４Ａ以下で、周波数は５０／６０Ｈｚに対応している。
【００２０】
ＳＮＰ解析装置（１０１）の装置側面には外部機器接続部（１１０）が配され、図示しないパーソナルコンピュータ（ＰＣ）及びバーコードリーダーを接続できる。ＰＣは、ＳＮＰ解析装置（１０１）の操作、測定結果の表示、解析、保存を担う。ＳＮＰ解析装置（１０１）とＰＣはイーサネットによって接続される。ハブを介することで１台のＰＣが最高４つのＳＮＰ解析装置（１０１）を操作することも可能である。また、バーコードリーダーは、サンプルの入ったサンプルトレイやカートリッジに貼付されたバーコードを読み取り、ＰＣへ送信することで測定されるサンプル、試薬、カートリッジの管理を容易にする。
【００２１】
図２は、本実施例のＳＮＰ解析装置の概略図である。以下、図２を参照して装置全体の機構部を説明する。尚、図２では、装置本体にカートリッジ（２１８）が挿入され、装置本体とフローセル（２１９）がニードル（２１１）により接続された状態を示している。
【００２２】
流路系ユニットは、ロボットアーム（２０４）のプローブチップ（２０５）、水ボトル（２０１）、ヒスチジンボトル（２０２）、廃液ボトル（２０３）、水ポンプ（２０６）、ヒスチジンポンプ（２０７）、カートリッジポンプ（２０８）、洗浄ポート（２０９）、注入ポート（２１０）、及びニードル（２１１）が複数の流路で結ばれた構造となっている。
【００２３】
プローブチップ（２０５）は、サンプル及び溶液を吸引吐出する配管が接続され、ロボットアーム（２０４）によりその先端を所定位置に移動させることができる。そして、サンプルハンドリングステーション上に配置されたサンプルトレイ、Ｒｅａｇｅｎｔボトル及び反応酵素冷却部から、所定のサンプルや試薬を分注し、注入ポートへ投入できる。ここで、注入ポート（２１０）は、サンプル及び溶液をカートリッジ（２１８）内フローセル（２１９）に送り込む前に存在するポートタンクである。注入ポート（２１０）は、40℃から60℃の範囲で温度制御可能である。導入試料温度とカートリッジ内温度が異なる状態で試料を導入するとスパイクノイズが発生するが、注入ポート（２１０）より試料導入前に温調することで、スパイクノイズを軽減できる。また、プローブチップ（２０５）は、洗浄ポート（２０９）において洗浄することができる。
【００２４】
水ポンプ（２０６）は、水ボトル（２０１）からプローブチップ（２０５）に水を送ること、プローブチップ（２０５）によりサンプル及び試料の吸引・吐出を行うこと、廃液ボトル（２０３）に溶液を送ることができる。
【００２５】
また、ヒスチジンポンプ（２０７）は、ヒスチジンボトル（２０２）からヒスチジンを注入ポート（２１０）に送ること、水ボトル（２０１）から注入ポート（２１０）に水を送ること、注入ポート（２１０）に空気を送ること、廃液ボトル（２０３）にシリンジ内溶液を送る事ができる。
【００２６】
また、カートリッジポンプ（２０８）は、注入ポート（２１０）からカートリッジ（２１８）内フローセル（２１９）に溶液及び空気を送ること、カートリッジ（２１８）内のフローセル（２１９）からカートリッジポンプ（２０８）に溶液及び空気を送ることができる。
【００２７】
装置内で生成された廃液は、接続部を介して着脱可能に搭載されている装置外部の廃液ボトル（２０３）へ排出できる。
【００２８】
水ポンプ（２０６）とカートリッジポンプ（２０８）を駆動することにより、注入ポートに投入された試薬や洗浄液を、カートリッジ流路を介して、フローセル（２１９）内へ搬送できる。カートリッジ流路は、ヒスチジンポンプ（２０７）とカートリッジポンプ（２０８）を駆動することにより、ヒスチジンによって洗浄される。ヒスチジンポンプ（２０７）から注入ポート（２１０）及びカートリッジポンプ（２０８）までの流路は、ヒスチジン溶液から水に置換できる構造と成っている。水により流路を洗浄することでヒスチジン溶液が流路配管内に析出することを回避している。
【００２９】
尚、水ボトル（２０１）とヒスチジンボトル（２０２）には、それぞれと１Ｌの水とヒスチジンを入れることが可能である。この為、９６サンプルの貼り付けから測定までの間、水やヒスチジンをユーザーが追加する必要がない。
【００３０】
インターフェイスユニットは、カートリッジ（２１８）内のフローセル（２１９）と装置本体を結ぶ流路となるニードル（２１１）、カートリッジ冷却ペルチェ（２１２）、およびポゴピン（２１３）を含んでいる。カートリッジ冷却ペルチェは、カートリッジと接触し、フローセル（２１９）の温度を制御できる。ポゴピン（２１３）は、カートリッジ（２１８）に設けられた端子に接続され、装置本体とＤＮＡチップの電気的接続を行う。ポゴピン（２１３）の本数は、１２本と少数である為、カートリッジへの接続が容易となっている。
【００３１】
光学系ユニットは、ＣＣＤカメラ（２１４）、ＥＭフィルタ（２１５）、ＥＸフィルタ（２１６）、及びＬＥＤ（２１７）を含む。ＬＥＤ（２１７）は、ＥＭファイル（２１５）により波長特性でフィルターされ、フローセル（２１９）内のＤＮＡチップ上の蛍光体に光を照射できる。蛍光体から生じた蛍光は、ＥＸフィルター（２１６）により波長特性でフィルターされ、フローセル（２１９）の映像はＣＣＤカメラ（２１４）により取得される。光源としてＬＥＤ（２１７）を使用しており、光源の寿命は従来のレーザーの場合より十分長くい為、装置寿命中の光源交換作業を回避でき、メンテナンスが容易となる。
【００３２】
以下、光学系ユニットの構成について詳細に説明する。図３に光学系ユニット概略図を示す。光学系ユニットは主にＬＥＤ（３０１）、励起用フィルタ（３０２）、検出用フィルタ（３０３）、レンズユニット（３０４）、ＣＣＤカメラ（３０５）、移動ステージ（３０６）、オートフォーカス駆動部（３０７）からなる。
【００３３】
ＤＮＡチップ上に存在する蛍光色素を励起するための光源として複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いており、２種類の蛍光色素に対応して発光波長の異なる２種類のＬＥＤを採用している。ＬＥＤ（３０１）から放射された光は励起用フィルタ（３０２）を透過し、ＤＮＡチップ（３０８）全面に同時照射される。ＤＮＡチップ上に分布した蛍光色素から放出された蛍光は、複数枚のレンズによって構成されるレンズユニット（３０４）により検出器上に結像される。本実施例の場合、レンズは5枚で構成されており、第１レンズと第２レンズ間に、検出用ファイタ（３０３）が挿入される。ここに挿入される検出用フィルタには３種類あり、測定の目的に応じて自動で切り替えられる。検出器には電荷結合素子（ＣＣＤ）を採用する。レンズユニット（３０３）、検出用フィルタ（３０４）、ＣＣＤカメラ（３０５）は、ボールネジ及びステッピングモータによって構成されるオートフォーカス駆動部（３０７）によって光軸方向に移動可能な移動ステージ（３０６）上にまとめて配置され、焦点合わせのため移動する。
【００３４】
図４に光学系の外観図を示す。前述のように、本実施例では、励起光源にＬＥＤ（４０１）、検出器にＣＣＤ（４０２）を用いている。これにより、一定濃度以上の蛍光体の有無を測定でき、病気との関連が既知のＳＮＰを検出し、病気の診断を行うことができる。
【００３５】
一方、従来技術では、励起光源にレーザー発振器、検出器に光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用した共焦点光学系となっている。この方式では、光源と検出器の各点を対応させるために、ＤＮＡチップ上の各点の情報のみが得られるので、ＤＮＡチップの2次元情報を得るためにはＤＮＡチップ内を走査する仕組みが必要となる。また、本実施例同様、測定対象となる蛍光色素は２種類であるため、レーザー発振器及び光電子増倍管を２組用いている。したがって、実際に蛍光測定を実施する際には、ＤＮＡチップ上の測定サイト数だけＤＮＡチップを走査し、測定サイト毎に、検出すべき蛍光色素の数だけ、光源及び検出器を切り替えて測定することになるため、測定時間が長くなる。一般的にＤＮＡチップは、それ自身を高集積化し、より多くのサンプルを一枚のＤＮＡチップ上に載せ、それを短い測定時間で読み取ることが望まれている。上記従来技術で使用するＤＮＡチップの測定サイト数は100箇所であるが、本実施例で説明する装置では、その４倍の400箇所の測定サイト数を持つＤＮＡチップを読み取るため、従来技術の光学系では、測定時間が４倍になってしまう。また、レーザー発振器、光電子増倍管は非常に高価であるため、コストが高くなってしまう問題がある。さらにレーザー発振器は、その種類によっては、寿命がそれほど長くないこと、また故障率も他の光源と比較して高いことから、信頼性の面でも問題がある。
【００３６】
上記理由から、本実施例では励起光源にＬＥＤ（４０１）を、検出器にＣＣＤ（４０２）を用いている。これにより、低コスト、省スペース、高スループットを図ることが可能となる。ＬＥＤは、レーザー発振器と比較して非常に安価であり、大きさも非常に小さいことから大幅なコスト削減、省スペース化を図ることが可能となる。また、寿命の面でもＬＥＤはレーザー発振器を含む他の光源と比較して長寿命であり、故障率も極めて低いことから、交換等のメンテナンスの必要性がほとんど発生しない。また、ＬＥＤ（４０１）により励起光はＤＮＡチップ（４０３）全面に同時照射され、蛍光検出もＣＣＤ（４０２）によりＤＮＡチップ（４０３）全面について同時に行われるため、上記従来技術に対して、大幅に測定時間を短縮することが可能となる。
【００３７】
一般的にＬＥＤからの発光は指向性がないため、それ自身だけでは所望の範囲に限定して光を照射することは困難である。そのため、ＬＥＤから放出される励起光はレンズによりＤＮＡチップ上に集光される。このとき、ＤＮＡチップ上での励起光強度が測定サイトの位置によって異なるという現象が発生する。前述のように本装置は、２種類の蛍光色素に対する蛍光強度比から、３状態あるＳＮＰの有無を判定する。したがって、２種類のＬＥＤのＤＮＡチップ上での励起光強度分布が測定サイトによって異なっていると、仮にＤＮＡチップ上の異なる測定サイトに全く同じサンプルが存在していたとしても、２波長の蛍光強度比が測定サイトによって異なってしまうという問題が発生する。その対策として、本装置ではあらかじめ２波長それぞれのＬＥＤに対し、ＤＮＡチップ上での励起光強度分布を記憶しておき、得られた測定結果をその分布に従って補正するという方法を採用している。これにより、励起光強度の大小の差によって生じる検出強度の差をキャンセルすることが可能となる。
【００３８】
ＬＥＤによる励起光は、そのままではＤＮＡチップ上で反射し、検出すべき蛍光とともに検出器へ到達する。この励起光の反射成分は、微弱な蛍光検出の大きなバックグラウンドとなる。そのため、本実施例では、励起光の反射成分を排除するため、各蛍光色素に対して透過波長帯の異なる２種類のバンドパスフィルタを組み合わせて使用する。第１のバンドパスフィルタを透過することのできる光は、第２のバンドパスフィルタを透過することができない。逆も同様である。第１のバンドパスフィルタである励起用フィルタ（３０２）、図４中には図示していない）はＬＥＤ（４０１）の発光波長域に透過波長帯を持ち、ＬＥＤ発光の一部を透過させる。一方、第２のバンドフィルタである検出用フィルタ４０４は、蛍光色素の蛍光波長帯域に透過波長帯を持ち、蛍光の一部を透過させる。励起用フィルタ（３０２）は、ＬＥＤ（４０１）とＤＮＡチップ（４０３）の間に挿入され、これを透過した波長成分のみが励起光としてＤＮＡチップ（４０３）上に照射される。検出用フィルタ（４０４）は、ＤＮＡチップ（４０３）とＣＣＤ（４０２）の間に挿入され、ＤＮＡチップ上で反射した励起光は、検出用フィルタ（４０４）によって透過を禁止され、蛍光のみがレンズユニット（４０５）を通して検出器であるＣＣＤ（４０２）上に結像される。
【００３９】
図５にＬＥＤ（５０１）及び励起用フィルタ（５０２）で構成されるＬＥＤ光源部の詳細を示す。本実施例では、１枚の基板上に発光波長が同一のＬＥＤを４個実装し、それぞれのＬＥＤに対して球状のレンズが実装されている。この球状レンズによって、同一基板上に実装された各ＬＥＤからの発光が、ＤＮＡチップ上に集光される。この基板を２波長それぞれについて２枚ずつ使用し、合計４枚の基板がＤＮＡチップの鉛直方向に対して45°の角度に配置される。また、それぞれの基板は、ＤＮＡチップを中心に90°間隔で配置され、同一波長の基板が向かい合うように配置される。１枚の基板上に複数のＬＥＤを実装させる理由は、ＬＥＤ光源を励起用フィルタと組み合わせて使用するためである。使用している励起用フィルタ（５０２）は干渉フィルタであるため、その透過特性は光の入射角によって変化する。そのため、励起光は励起用フィルタ（５０２）に対して一定の入射角で入射させる必要があるが、例えば、すべてのＬＥＤをばらばらな位置に設置すると、それぞれのＬＥＤに対して励起用フィルタを設置する必要が生じる。そのため、励起用フィルタの数を最小限に留めるため、４個のＬＥＤを１枚の基板上に最密実装し、その基板に対して１枚の励起用フィルタを平行に配置させる構造としている。
【００４０】
この励起用フィルタ（５０２）は、光の入射角が90°のときに最適な透過特性を示すよう設計されているが、光源にＬＥＤを採用している以上、90°より低角度で入射する成分が少なからず含まれる。干渉フィルタの特性として、入射角が小さくなれば、透過帯が低波長側へシフトするという性質がある。そのため、90°より低角で入射する光は、より低波長成分のみが励起光としてＤＮＡチップ上に照射されるため、励起光率は若干減少する。しかし、この影響はＬＥＤの個数を調整することで容易に補うことが可能である。本実施例の場合、合計８個のＬＥＤを２枚の基板に分けることで、励起用フィルタの数を２枚に抑えている。また、この透過帯のシフトは必ず低波長側へ現れるため、検出用フィルタの透過帯と重なり、励起光の反射成分が検出用フィルタを透過して、バックグランドを上昇させるといった問題は発生しない。
【００４１】
ＬＥＤ（５０１）と励起用フィルタ（５０２）を取り付けためのＬＥＤ設置台（５０３）には位置決め用の基準穴が設けられており、装置側にはこれに対応する位置決めピンが設けられている。これにより、設置台を取り外しても容易に元の位置に戻すことが可能となり、ＤＮＡチップ上での励起光強度分布を変化させることなく、照射系の脱着が可能な構造となっている。
【００４２】
また、本実施例では励起光の輝度を調節する機能を有する。ＬＥＤは、それを点灯駆動するためのＰＷＭ信号のＤｕｔｙ比を調節することで10段階（10〜100%, 10% step, 0%はLED Off）に輝度を調節することが可能となっている。これは、反射光及び蛍光の検出強度を調節するために使用される。同様の機能として、ＣＣＤの露光時間を調節することで、検出強度を調節することが可能である。
【００４３】
図６にレンズ及び検出用フィルタの詳細図を示す。図６（ａ）に示すように、本実施例で使用するレンズ（６０１）は５枚構成となっており、これらすべてのレンズが一つの鏡筒（６０３）内に保持される。これにより、光軸に対する個々のレンズの位置調整やレンズ間の間隔調整が容易になる。さらに鏡筒（６０３）は、装置への脱着時の位置再現性が無調整で確保される構造となっているため、一度、装置外で個々のレンズ調整を実施しておけば、装置に組み入れた際、装置内で個々のレンズの位置調整を実施する必要がなく便利である。
【００４４】
図６（ｂ）に示すように、ＤＮＡチップから検出器までの光路中に挿入される検出用フィルタ（６０２）は、前述の励起用フィルタと同様に光の入射角によってその波長特性が変化するため、検出器上で結像されるすべての光が検出用フィルタに対してある許容範囲内の角度で入射されなければならない。このため、ＤＮＡチップからレンズに入射する光を第１レンズによって一旦平行にし、その直後に検出用（６０２）フィルタを挿入する。検出用フィルタは３種類あるため、これを切り替える必要がある。そのため、図６（ｃ）に示すように、鏡筒（６０３）の第１レンズと第２レンズの間に貫通穴を設け、その穴を通して３枚の検出用フィルタ（６０２）を保持している回転板（６０４）が回転する構造となっている。これにより、レンズ鏡筒を取りはずことなく、フィルタ回転機構を脱着することが可能である。３枚の検出用フィルタ（６０２）は、蛍光検出のための２種類のバンドパスフィルタと、広い波長域で一定の透過率を示すＮＤフィルタから構成される。ＮＤフィルタは、励起光の反射像を取得する際に使用される。反射像は、主にオートフォーカスを実施する際に取得する。これら３枚の検出用フィルタの切替は、それらを保持する回転板をステッピングモータにより回転させて行う。
【００４５】
図７に検出用フィルタの位置検出方法について示す。各図は、それぞれの検出用フィルタ（７０１）が実際に挿入されている様子をＤＮＡチップ側から見た図である。回転板（７０２）の基準位置は図７（ａ）に示す位置であり、またその位置は、ＮＤフィルタの挿入位置と一致している。基準位置への移動は、機械式ストッパ（７０３）に衝突させることにより実施される。このとき、ステッピングモータは回転板（７０２）がどの位置にいても機械式ストッパ（７０３）まで十分到達するだけのパルス数だけ常に回転する。図７（ｂ）及び（ｃ）に示すように、その基準位置から45°ずつ回転させることにより、他の２種類のバンドパスフィルタの挿入位置へ順に移動する。
【００４６】
装置を診断目的で使用する場合、このフィルタが正しく挿入されずに蛍光測定が行われると、正しいデータが得られないため、最悪の場合、誤診につながる可能性が考えられる。そこで、これら３種類のフィルタが正しく挿入されていることを確認するために、ホトインタラプタ（７０４）を使用している。検出用フィルタ（７０１）が設置されている回転板（７０２）と同一の回転軸上に、もう一枚の位置検出用回転板（７０５）が取り付けられており、２枚の回転板は同時に回転する。３種類の検出用フィルタ（７０１）は回転板（７０２）の回転軸を中心に45°の間隔で取り付けらおり、位置検出用回転板（７０５）にも45°の間隔でスリット（７０６）が設けてある。位置検出用回転板（７０５）は、各検出用フィルタ（７０１）が正しく挿入されているときに、対応するスリット（７０６）がホトインタラプタ（７０４）の位置に挿入されるよう調整されている。この状態でのホトインタラプタ（７０４）の出力信号の状態をＯＮした場合、検出用フィルタ（７０１）が正しい位置に挿入されなかった場合は、スリット（７０６）の位置がずれるため、ホトインタラプタ（７０４）の信号がＯＦＦとなる。さらに、ホトインタラプタ（７０４）が故障し出力が常にＯＮとなっている場合を想定し、検出用フィルタ（７０１）を切り替える際は、検出用フィルタ（７０１）が完全に挿入される直前で一旦停止し、ホトインタラプタ（７０４）の出力がＯＦＦになっていることを確認した後、正しい挿入位まで回転させ、再度ホトインタラプタ（７０４）の信号がＯＮに切り替わることを確認する。この動作によりステッピングモータが脱調する等の不具合により、検出用フィルタ（７０１）が正しい挿入位置へ回転しなかった場合は、装置はその時点でエラー状態となり停止する。また、位置確認のためのホトインタラプタ（７０４）が故障している場合についてもエラーとなるため、誤ったデータを取得する危険性は回避される。
【００４７】
検出器にはＣＣＤ（４０２）を用いている。ノイズ低減のためＣＣＤ（４０２）はペルチェ素子によって冷却される。冷却によるＣＣＤ（４０２の結露を防ぐため、ＣＣＤ（４０２）の周囲の空間は密閉され、非常に乾燥したアルゴンガスによって置換されている。また、フルフレーム型ＣＣＤを採用しているため、電荷転送のための機械式シャッタをＣＣＤ前面に有している。
【００４８】
図３に示すように、前述のレンズユニット（３０４）、検出用フィルタ（３０３の切替機構、ＣＣＤ（３０５）は全て同一の検出系設置台（３０９）に取り付けられ、この検出系設置台（３０９）はリニアガイド、ボールネジ、ステッピングモータで構成される駆動系の移動ステージ（３０６）上に取り付けられる。この移動ステージ（３０６）は主にオートフォーカスために移動する。検出系設置台（３０９）は前述のＬＥＤ設置台（５０３）と同様に位置決めのための２つの基準穴が設けられている。一方、移動ステージ側にはこの基準穴に対応する基準ピンが設けられており、これらのはめ合いにより、検出系設置台の脱着再現性を確保する構造となっている。このように、レンズユニット（３０４）、検出用フィルタ（３０３）の切替機構、ＣＣＤ（３０５）の検出系光学部品を全て同一の部品上に設置することで、検出系全体を容易に脱着することが可能となる。これにより、個々の検出系光学部品の交換、位置調整等の作業を装置外で実施することが可能となり、大幅にメンテナンス性を向上させることができる。
【００４９】
図８は、装置の処理フローを示す図である。以下、図７を参照して装置の処理フローを説明する。
装置をＰｏｗｅｒ−ｏｎし、初期化（８０１）を行う。水−ボトル内の水容量確認とヒスチジン−ボトル内のヒスチジン容量確認を行う。
【００５０】
サンプル等準備（８０２）として、バーコードリーダーで、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＮａＯＨ、サンプルが入ったサンプルトレイ、カートリッジのバーコードを各々読み、そのたびにＬＥＤが点灯するので、その場所に各々を正しく設置する。
【００５１】
サンプルＤＮＡの貼り付け（８０３）を以下のように行う。ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動させ、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップを目的のサンプル位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからサンプルを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動させ、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、サンプルをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジＡｃｔｉｖｅ  Ｃｈｉｐ内の目的の位置に、およそ０．２ｍＡの電流を６０秒印加する。ヒスチジン−ポンプを稼動させ、ヒスチジンを注入ポートに送る。カートリッジ−ポンプを稼動させ、カートリッジフローセル洗浄のためにヒスチジンをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、ヒスチジンを廃液ボトルに移動させる。
【００５２】
レポータＤＮＡの導入（８０４）を以下のように行う。ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動させ、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップをＨｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからＨｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動後、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動後、カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを廃液ボトルに移動させる。
【００５３】
ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動させ、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップを蛍光体がついたＤＮＡ（レポータＤＮＡ）位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからレポータＤＮＡを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動後、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、レポータＤＮＡをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、レポータＤＮＡをカートリッジフローセルに移動させ、およそ６０秒維持する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、レポータＤＮＡを廃液ボトルに移動させる。
【００５４】
ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動させ、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップをＨｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからＨｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動後、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを廃液ボトルに移動させる。カートリッジフローセルの温度を設定温度に上昇させ、およそ６０秒維持する。
【００５５】
非特異的吸着レポータＤＮＡの洗浄（８０５）を以下のように行う。ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動させ、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップをＬｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからＬｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動後、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。注入ポートの温度を設定温度に上昇させ、およそ６０秒維持。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを廃液ボトルに移動させる。
【００５６】
ロボット−プローブチップを洗浄ポートに移動後、水−ポンプを稼動させプローブチップを洗浄する。ロボットプ−ローブチップをＬｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒ位置に移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボット−プローブチップからＬｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを吸引する。ロボットをＰＩ検知位置に移動後、キャリブレーションの確認を行う。ロボット−プローブチップを注入ポートに移動後、水−ポンプを稼動させ、ロボットプローブチップから吐出する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動させる。カートリッジフローセルの温度を設定温度にする。
【００５７】
ＣＣＤカメラで画像を取得する（８０６）。
カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒをカートリッジフローセルに移動する。カートリッジ−ポンプを稼動させ、Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｂｕｆｆｅｒを廃液ボトルに移動する。装置終了処理（８０７）後、装置Ｐｏｗｅｒ−ｏｆｆする。
【００５８】
以下、上述のＣＣＤカメラで画像を取得する際の動作について、詳細説明する。
ＤＮＡチップを保持するカートリッジが装置内に挿入されると、カートリッジのフローセル内に専用のＢｕｆｆｅｒ溶液が注入された後、オートフォーカスが実行される。オートフォーカスでは、２波長ある励起光源のどちらか一方を点灯させ、かつ検出用フィルタをＮＤフィルタに切替えて、ＤＮＡチップの反射像を撮影する。この動作を移動ステージを一定間隔で移動させながら繰り返す。得られた反射像は画像処理により像のエッジが強調された後、ＣＣＤの各ピクセルにおける信号量の標準偏差を算出し、その値をオートフォーカスのための評価値とする。評価値が高ければ高いほど、像のコントラストが得られていると解釈することができるため、評価値が最も高い位置を焦点の合った位置とする。実際の動作では、移動ステージを移動させながら、反射像の撮影を繰り返し、同時にそれぞれの画像に対して評価値を算出していく。オートフォーカス中は、撮影毎に移動ステージの位置と評価値を記憶しておき、最終的に評価値が最大値を示した位置へ移動することでオートフォーカスが終了する。オートフォーカス完了後、ＤＮＡチップ上へのサンプルの貼り付け等が行われ、蛍光測定のための準備が行われる。オートフォーカス自体はいつでも実行可能であるが、蛍光色素が光照射により劣化するブリーチングを防ぐため、蛍光色素が存在しない状態でオートフォーカスを実施することが望ましい。サンプルがＤＮＡチップ上の各測定サイト上に貼り付けられ、蛍光測定のための準備が整った後、蛍光像の撮影を実施する。蛍光色素は2種類あるため、それぞれの蛍光色素に対して蛍光像の撮影を実施する。蛍光像の撮影では、検出用フィルタをＮＤフィルタから蛍光検出用のバンドパスフィルタに切り替える。蛍光像を取得後、ＤＮＡチップ上の各測定サイトにおける、2波長の蛍光強度比を算出し、ＳＮＰ判定を行う。
【００５９】
本実施例では、励起光源にＬＥＤを、検出器にＣＣＤを用いることで従来技術に対し、低コスト、省スペース、高スループット、高いメンテナンス性を実現することが可能となる。また、前記構成による光学系を採用するに当たり、ＤＮＡチップ像をＣＣＤ上へ結像させるためのレンズ群を１つの鏡筒内に収め、かつＤＮＡチップから発する反射光又は蛍光を波長選別するための複数の光学フィルタを鏡筒の一部に設けた貫通穴を当して切り替える構造とすることで、レンズ及びフィルタ切替機構の組立調整の作業性を向上させることが可能となる。また、光学系ユニット内で、照射系と検出系全体をそれぞれ個別に脱着可能、かつ容易に位置が再現する構造とすることで、光学系ユニット内での部品構成、配置が簡素化され、組立調整時の作業性を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＤＮＡチップを用いるＳＮＰ解析装置の分解斜視図。
【図２】ＳＮＰ解析装置の概略図。
【図３】光学系ユニット概略断面図。
【図４】光学系外観図。
【図５】ＬＥＤ詳細図。
【図６】レンズユニット断面図及び側面図。
【図７】検出用フィルタの切替および確認方法。
【図８】処理フロー図。
【符号の説明】
【００６１】
３０１  ＬＥＤ
３０２  励起用フィルタ
３０３  検出用フィルタ
３０４  レンズユニット
３０５  ＣＣＤ
３０６  移動ステージ
３０７  オートフォーカス駆動部
３０８  ＤＮＡチップ
３０９  検出系設置台
４０１  ＬＥＤ
４０２  ＣＣＤ
４０３  ＤＮＡチップ
４０４  検出用フィルタ
４０５  レンズユニット
５０１  ＬＥＤ
５０２  励起用フィルタ
５０３  ＬＥＤ設置台
６０１  レンズ
６０２  検出用フィルタ
６０３  鏡筒
６０４  回転板
７０１  検出用フィルタ
７０２  回転板
７０３  機械式ストッパ
７０４  ホトインタラプタ
７０５  位置検出用回転板
７０６  スリット
【図１】
2005181145.tif 000003
【図２】
2005181145.tif 000004
【図３】
2005181145.tif 000005
【図４】
2005181145.tif 000006
【図５】
2005181145.tif 000007
【図６】
2005181145.tif 000008
【図７】
2005181145.tif 000009
【図８】
2005181145.tif 000010