(57)【要約】【課題】テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供する。【解決手段】被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とし、被験物の毛髪への作用を鑑別する。細胞周期は、サイクリン類の発現状況により判別する。前記サイクリン類としては、サイクリンＡ及び／又はサイクリンＤ１を用いることが好ましい。かかるサイクリン類の発現状況は、免疫組織染色やフローサイトメトリを用いることにより判別出来る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とすることを特徴とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項２】
細胞周期が、サイクリンＡ及び／又はサイクリンＤ１の発現によって推定されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項３】
外毛根鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも短い場合に於いて、前記被験物を育毛物質と鑑別することを特徴とする、請求項１又は２に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【請求項４】
外毛根鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも長い場合に於いて、前記被験物を育毛抑制物質と鑑別することを特徴とする、請求項１又は２に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被験物の毛髪への影響の鑑別法に関し、更に詳細には、細胞周期を指標とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
毛髪に関するアイデンティティーは非常に高く、毛髪が薄いことに、大きな負い目を感じる人は少なくない。この様な状況を背景に、種々の育毛剤、養毛剤が世に出されている。かかる育毛剤、養毛剤のメカニズムとしては、テストステロン−５α−リダクターゼ阻害などが知られている（例えば、特許文献１参照）が、薄毛、脱毛のメカニズムがテストステロンの異常発現に尽くされているわけではなく、かかるテストステロン５αリダクターゼ阻害剤によって効を奏さない薄毛、脱毛も少なくない。同様の状況が発毛促進、或いは育毛作用のメカニズムについても存する。言い換えれば、テストステロンに起因しない薄毛、脱毛を的確に鑑別し、その対応策を講じることが望まれていた。一方、サイクリン類は細胞周期に関与した蛋白質であり、核酸合成に関与したり、細胞分裂を成業したりしていることが知られており（例えば、特許文献２、３参照）、そのファミリーとしてはＡ〜Ｉ及びＴが存することが知られている。サイクリン類と毛関連細胞との関連については、キューティクルの形成にはサイクリン依存性キナーゼが関与していること（例えば、非特許文献１参照）、或いは、サイクリン依存性キナーゼが、毛関連細胞をアポトーシスから保護していること（例えば、非特許文献２参照）が知られている。しかしながら、毛周期とサイクリン類の発現の間の関係については全く知られていない。
【０００３】
シクロスポリンＡについて、発毛促進作用が存することが知られている（特許文献４）が、本発明者らの検討によれば、該シクロスポリンＡは外毛根鞘のイン・ビトロの培養では、細胞増殖を抑制することを見出しており、いかなるメカニズムによって発毛促進を奏するのかは、今まで全く不明であった。
【０００４】
毛関連細胞の細胞周期を揃えて、同調培養する技術については既に知られており（山本卓也、宍戸まゆみ、荒瀬誠治（徳島大）、第５２回日本皮膚科学会西部支部総会（２０００年、徳島）、「同調化ラット髭外毛根鞘細胞の細胞周期移行に対するシクロスポリンＡの影響」参照）、汎用技術となっている。
【０００５】
他方、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とし、被験物の毛髪への影響を鑑別する方法は全く知られていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平８−１５０２２１号公報
【特許文献２】
特開平１１−号３０８９９７公報
【特許文献３】
特開平７−３１６１９６号公報
【特許文献４】
特開平１１−１７４０４１号公報
【非特許文献１】
Ｍｉｔｓｕｉ  Ｓ．  ｅｔ．  ａｌ．  ，  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｓｃｉ．  ，  （２００１），  ２５（２），  １６４−９
【非特許文献２】
Ｔｕｒｃｈｉｎｓｋｙ  Ｃ．  ｅｔ．  ａｌ．  ，  Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．  ，  （１９９９），  ２８（１０−１１），  ９１３−２４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題の解決手段】
この様な状況に鑑みて、本発明者ら、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とすることにより、該被験物の毛髪への影響が鑑別することを見出し、発明を完成させるに至った。
（１）被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とすることを特徴とする、被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（２）細胞周期が、サイクリンＡ及び／又はサイクリンＤ１の発現によって推定されるものであることを特徴とする、（１）に記載の被験物の毛髪への影響に鑑別法。
（３）外毛根鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも短い場合に於いて、前記被験物を育毛物質と鑑別することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
（４）外毛根鞘細胞を、被験物のプレートには被験物を共存させて、コントロールのプレートにはベヒクルを共存させて、同調培養し、細胞周期を測定し、被験物の共存下における細胞周期の方が、ベヒクル共存下における細胞周期よりも長い場合に於いて、前記被験物を育毛抑制物質と鑑別することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の被験物の毛髪への影響の鑑別法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の被験物の毛髪への影響の鑑別法は、被験物の存在下及び非存在下に於ける、毛髪関連細胞の細胞周期を指標とすることを特徴とする。細胞周期は、細胞の形態、例えば、核の存在状況、染色体の存在状況などの細胞周期に特徴的な事象を指標に判定することが出来るが、より好ましくは、細胞周期に関与するサイクリン類の発現状況を指標に判定することが好ましい。サイクリン類は細胞周期を回すエンジンにあたるタンパク質として正確づけられており、その発現状況は、ウエスタンブロット、ノーザンブロットなどのブロットによって知ることが出来るし、或いは標識抗体などを用いた組織染色により知ることが出来る。抗サイクリン標識抗体は既に市販されているものが存するのでそれを購入して使用することが出来る。かかる判定に用いるサイクリン類としては、Ｓ期に特徴的に発現するサイクリンＡ、Ｇ１期に特徴的に発現するサイクリンＤ１等を用いることが好ましい。
【００１０】
本発明の鑑別法では、細胞周期を判定するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで被験物を動物（人を除く）に処置し、しかる後に処置部位をバイオプシなど行い、組織標本に加工し、これを前記抗サイクリン標識抗体で免疫染色して、細胞周期の状況を判定することも出来るし、動物より採取した、ひげ乃至は体毛の毛乳頭細胞や外毛根鞘細胞を同調培養し、これに被験物を作用させ、しかる後にフローサイトメトリにより、細胞分布像を作成し、これより判定することも出来る。
【００１１】
後記実施例に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏ  検討のラットのひげ或いはマウスの体毛に於いては、成長期初期に外毛根鞘でサイクリンＡ及びサイクリンＤ１が発現していることが認められる。これらの細胞周期と毛の成長サイクルの一致性より、被験物の毛への影響はサイクリン類の発現の状況を指標に鑑別出来ることが判る。
【００１２】
かかるサイクリンの発現状況からの被験物の影響の鑑別としては、次のような判断が例示出来る。
１）サイクリン類の発現が全般にわたって少ない場合には、被験物質は発毛抑制作用を有すると鑑別される。
２）サイクリン類の発現が全般にわたって多い場合には、被験物は発毛促進作用を有すると鑑別される。
３）細胞周期が早まっている場合には、被験物は発毛促進作用を有すると鑑別される。
４）細胞周期が遅くなっている場合は、被験物は発毛抑制作用を有すると鑑別される。
斯くのごとく、サイクリン類の発現状況自体或いは発現状況の変化の仕方を指標に、被験物の毛成長への影響を鑑別することが出来る。
【００１３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【００１４】
＜実施例１＞
成長期初期、成長期中期、退行期〜休止期のマウスの体毛を含む毛周辺組織を採取し、ホルマリン固定、パラフィン包埋後切片を作成し、脱パラフィンした後、ウサギ抗サイクリンＡ免疫グロブリンＧ及びウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧ（何れも一次抗体）で免疫染色し、これを標識抗ウサギ免疫グロブリンＧ（二次抗体）でサンドイッチし、ＤＢＡで発色させた。この詳細な手技は下記に示す。切片の顕微鏡写真を図１に示す。これより、毛成長の周期と細胞周期に関与するサイクリンＡの発現状況に一致性が認められ、毛成長の周期は、細胞周期と関連していることが明らかになった。
（切片の処理の手技）
１．脱パラフィン
キシレン  １０分ｘ３回、１００％ＥｔＯＨ  ３分ｘ２回、９５％ＥｔＯＨ  ３分、７０％ＥｔＯＨ  ３分
２．抗原賦活
Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ダコ社製）中で１２１℃、２０分間オートクレーブ、冷却後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄
３．３７℃で乾燥
４．内因性ペルオキシダーゼのブロック
５．ブロッキング
６．一次抗体（ウサギ抗サイクリンＩｇＧ）で４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ
７．  ＰＢＳ（−）で１０分、３回洗浄
８．二次抗体（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギＩｇＧ）で３７℃、１．５時間
９．  ＰＢＳ（−）で１５分、３回洗浄
１０．ＤＡＢ発色
１１．蒸留水で洗浄
１２．カウンターステイン（マイヤーのヘマトキシリン５分、流水３０分）
１３．脱水、封入
蒸留水洗浄、９５％ＥｔＯＨ  ２分、１００％ＥｔＯＨ  ２分ｘ２回、キシレン５分ｘ２回、封入
【００１５】
＜実施例２＞
実施例１の組織をラットの髭周囲の組織に変えて、同様の検討を行った。但し、抗原賦活は行わなかった。抗サイクリン免疫グロブリンＧとしては、ウサギ抗サイクリンＡ免疫グロブリンＧ、ウサギ抗サイクリンＤ１免疫グロブリンＧ及びウサギ抗サイクリンＴ１免疫グロブリンＧを用いた。結果を図２に示す。これより、ラットの髭周囲の組織に於いても毛成長の周期とサイクリンの発現状況に一致性が認められ、毛成長の周期は、細胞周期と関連していることが確認された。又、成長期初期に於いては外毛根鞘にＳ期に特徴的なサイクリンＡ及びＧ１期に特徴的なサイクリンＤ１が強く発現していることが判る。
【００１６】
＜実施例３＞
外毛根鞘細胞を同調培養し、これにシクロスポリンＡを０Ｍ、１０−８Ｍ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ添加し、フローサイトメトリにより、細胞分布像を求めた。この結果は図３に示す。同量培養の手技に関しては、下記に詳細を示す。これよりシクロスポリンＡの発毛促進のメカニズムが、細胞周期を早くさせることによるものであることが明らかになった。
（同調培養）
２５ｃｍ２培養フラスコに２０万の細胞をまき、翌日にヒドロキシウレアを終濃度１ｍＭで添加した。１５時間後ＰＢＳ（−）で細胞を洗い、ＦＧＦ１無添加培地でリリースした。
【００１７】
＜実施例４＞
マウスの背部にシクロスポリンＡの１０−５ＭＰＢＳ溶液を１日１回０．０２ｍｌずつ５日間投与し、毛周囲の組織を採取し、実施例１と同様の手技で切片を作成し、ウサギ抗サイクリンＡ免疫グロブリンＧで免疫染色した。ＰＢＳのみで処置したコントロール群も同様に処置した。結果を図４に示す。これより、シクロスポリンＡ処置群ではサイクリンＡの著しい発現が認められ、細胞周期が早まっていることが判る。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、テストステロンに以外のメカニズムの薄毛、脱毛を対象にした薄毛、脱毛の鑑別であって、該当するメカニズムを的確に鑑別し、その対応策を講じる手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の結果を示す図である。（図面代用写真）
【図２】実施例２の結果を示す図である。（図面代用写真）
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。（図面代用写真）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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