(57)【要約】【課題】概日リズム調節方法を提供する。【解決手段】塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２を用いることを特徴とする、Ｅボックス・エンハンサを通してＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御すること、および、塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子DEC2／SHARP1／BHLHB3を用いることを特徴とする、ラット肝におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ、およびラノステロール１４−脱メチル酵素の概日リズムの調節におけるDBPによる促進作用を制御する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２を用いることを特徴とする、Ｅボックス・エンハンサを通してＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御する方法。
【請求項２】
塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子DEC2／SHARP1／BHLHB3を用いることを特徴とする、ラット肝におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ、およびラノステロール１４−脱メチル酵素の概日リズムの調節におけるＤＢＰによる促進作用を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１またはＤＥＣ２を用いることを特徴とする概日リズムの調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２による概日性の制御については十分知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
視交叉上核（SCN）および肝における、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２による新規な概日性制御方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、視交叉上核（SCN）、および肝における塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２による顕著な概日性制御性を見いだし、かかる知見に基づき本発明を完成した。
すなわち、本発明は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２を用いることを特徴とする、Ｅボックス・エンハンサを通してＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御する方法に関する。
【０００５】
また、本発明は、塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子DEC2／SHARP1／BHLHB3を用いることを特徴とする、ラット肝におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ、およびラノステロール１４−脱メチル酵素の概日リズムの調節におけるＤＢＰによる促進作用を制御する方法に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本明細書では、以下の省略語を使用した。ｂＨＬＨ＝塩基性へリックス−ループ−へリックス（basic helix-loop-helix）、ＰＡＲ＝プロリンおよび酸性アミノ酸に富む（proline and acidic amino acid-rich）、ＤＢＰ＝Ｄ部位結合タンパク質（D- site binding protein）、ＣＹＰ＝シトクロムＰ４５０（cytochrome P450）。なお、ＳＨＡＲＰとＳｔｒａ１３はそれぞれラットとマウスのオーソロガス遺伝子として命名されているが、本明細書では便宜上動物種によらずＤＥＣ１およびＤＥＣ２の名称を使用した（ヒト遺伝子の命名委員会はＤＥＣ１とＤＥＣ２の遺伝子記号にそれぞれＢＨＬＨＢ２とＢＨＬＨＢ３を割り当てている（http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/）。
【０００７】
(Ｉ) 視交叉上核（SCN）
自己調節性転写翻訳フィードバック・ループは概日リズム発生の細胞内機構モデルである。哺乳類では分子時計のコア・ループに、ＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１がポジティブ因子として、そしてＰｅｒおよびＣｒｙがネガティブ因子として含まれる。
【０００８】
本発明者は、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２がＥボックス・エンハンサを通してＣｌＯＣＫとＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化に及ぼす影響を調べた結果その活性化を抑制することを認めた。
【０００９】
ＤＥＣ１による抑制はＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＣＲＹ１およびＣＲＹ２による抑制と同程度だったが、ＤＥＣ２による抑制はかなり強かった。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２は哺乳類の概日時計部位である視交叉上核（SCN）において、それぞれ主観的昼の初期および中期にピークを有する概日変動で発現する。３０分間の光刺激によって視交叉上核にＤＥＣ１発現が誘発されたが、ＤＥＣ２発現は誘発されず、位相依存性だった。本発明者らはＤＥＣ１およびＤＥＣ２抑制性が分子時計の自己調節性フィードバック・ループの新規成分候補であることを確認できた。さらにＤＥＣ１が光同調に含まれることが示唆される。
【００１０】
概日リズムは細菌からヒトへと進化的に保存されている。哺乳類では概日ペースメーカが視床下部の視交叉上核（SCN）に位置している。自己調節性転写翻訳フィードバック・ループがいくつかの時計遺伝子を分子時計仕掛けとして含む概日リズム発生の機構であることが、In vitro試験によって示唆されている。ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１はヘテロ二量体を形成し、CACGTGであるＥボックス・エンハンサを通してPer遺伝子の転写を活性化する。Ｐｅｒ遺伝子のタンパク質産物はＣＲＹタンパク質とともにそれ自体の転写を阻害する。そのためＣＬＯＣＫおよびＢＭＡＬ１はポジティブ因子として作用し、ＰＥＲおよびＣＲＹはネガティブ因子として作用する。しかしモデルは生きた細胞における概日リズムの安定性と正確性を説明するまでにはまだ至っていない。視交叉上核ニューロンは培養状態でさえ発火リズムに活発な安定した周期性を示す。このため、他の成分を含む連動した多数のフィードバック・ループは分子機構を安定化させると考えられる。
【００１１】
ＤＥＣ１（Stra13、Sharp2）およびＤＥＣ２（Sharp1）はラットのＨＥＳ、ショウジョウバエのHairyおよび分裂亢進因子（E (spl)）に関連する塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（bHLH）型転写因子をコード化する。本発明者らは胚性軟骨細胞におけるｃＡＭＰ誘導性遺伝子であるヒトＤＥＣ１、そしてＤＥＣ１相同遺伝子を検索する発現配列タグ（EST）によってヒト、マウス、およびラットのＤＥＣ２をクローン化した。HES／hairy／E（spl) サブグループの他のメンバーに反し、ＤＥＣ１およびＤＥＣ２はコリプレッサ結合部位であるＣ端「ＷＲＰＷドメイン」を欠いている。末梢組織における概日発現プロフィールならびに、ＤＥＣ１およびＤＥＣ２がＥボックス共通配列に結合して標的遺伝子の発現を制御するホモ二量体を形成する可能性が、哺乳類の概日系におけるＤＥＣの役割を調査する動機となった。本発明は、ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１が仲介する転写に対するＤＥＣ１およびＤＥＣ２のIn vitro活性、ならびにラット視交叉上核におけるＤＥＣ遺伝子の概日発現および光応答性を調べた結果得られた知見に基づくものである。
【００１２】
分子時計におけるＤＥＣ遺伝子の役割を、ＴＫプロモータ上流に結合する３つのＥボックス配列（CACGTG）からなるE54−TKというプラスミドを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞中のルシフェラーゼ測定により調べた。プラスミドはさらにｐＧＬ３基本ベクターに挿入した。ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１コトランスフェクションはルシフェラーゼ活性を顕著に誘発した（図１）。発光は他のすべてのグループよりも著しく強かった。ここで、相対ルシフェラーゼ活性はＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１でのE54−TK平均発光量のパーセント値として計算した。データはそれぞれ４重測定データからなる２実験の平均（±標準誤差）で示した。
【００１３】
ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１コトランスフェクションを伴うE54−TKの発光と、伴わない場合の発光との差は１２５倍だった。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２ともにＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１が誘発する転写活性化を量依存的に抑圧した。それぞれ５０ngのＤＮＡでコトランスフェクションした場合、ＤＥＣ１は１３.３±１.０％（平均±標準誤差）までルシフェラーゼ活性を抑制し、一方ＤＥＣ２は５.９±０.５％まで抑圧した。６.２５ngでもＤＥＣ２はＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１が誘発する転写活性化を１４.６±１.１％まで抑圧した。
【００１４】
ＤＥＣ１およびＤＥＣ２による抑制を主時計の既知ネガティブ因子であるＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＣＲＹ１およびＣＲＹ２と比較した。５０ngのＤＮＡをトランスフェクトした場合、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１転写活性化がＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＣＲＹ１およびＣＲＹ２でそれぞれ５４.２±４.２、２９.５±５.３、１２.７±２.５および１４.３±２.９％にまで抑制された。ＣＲＹ１およびＣＲＹ２による抑制はＤＥＣ１に匹敵したが、ＤＥＣ２による抑制はこれらのどのネガティブ因子よりも強かった。
【００１５】
ＤＥＣ遺伝子発現の概日パターンを明暗条件（LD、6:00〜18:00に照明）だけでなく連続暗条件（DD）でも測定した。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２はともに概日変動で視交叉上核に発現された（図２(ａ)〜(ｈ)）。
昼（LD）あるいは主観的明期（DD）の間に強いシグナルがあり、LDだけでなくDDでも両方の遺伝子で有意なリズム（ｐ＜０.００１）が認められた。
【００１６】
脳の他領域と比べ、視交叉上核ではＤＥＣ１の発現が弱く、一方ＤＥＣ２シグナルは強かった（図２(ｃ)〜(ｆ)）。発現ピークはＤＥＣ１では8:00でありＤＥＣ２では12:00だった。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２ともにDL条件下とDD条件下との間で遺伝子発現に２元配置ＡＮＯＶＡ［分散分析］によって有意な差が認められなかった。post hoc検定により、ＤＥＣ２リズムの１時点以外、統計的に有意な差のある時点は示されなかった（ｐ＜０.０５）。
【００１７】
本来の概日期間を２４時間昼夜サイクル（同調）にリセットすることは概日時計の重要な機能である。網膜視床下部路を通って視交叉上核に投影された光信号は位相依存的に概日時計を位相変位する。ラット・コロニーにおける３０分照明の位相反応曲線により、概日時間（CT）１１〜１９の照明はCT２０〜２２の境界時刻で概日運動活性リズムを位相後退させ、CT２２〜１の照明は位相前進させることが示され、一方CT２〜１０ではリズムを変位しなかった。
【００１８】
本実施例では３日間DD条件にしたラットに１日６時点のいずれかに３００ルクスの照明を３０分間当て、照明開始１時間後に視交叉上核中のＤＥＣ１およびＤＥＣ２シグナルを調べた。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２は３０分照明刺激に異なる応答をした（図３(ａ)、(ｂ)）。ここで図３において、視交叉上核におけるＤＥＣ１（ａ）およびＤＥＣ２（ｂ）の光応答性の概日変動を示し、白縦棒：３０分光刺激開始1時間後のｍＲＮＡ相対量であり、黒縦棒：光照射のない対照ラットでの量を示す。データは５匹の平均(標準誤差。*および**：対照に対してｐ＜０.０５および０.０１とする。
【００１９】
視交叉上核中のＤＥＣ１発現はそれぞれCT１４とCT２２に相当する20:00と4:00の間の照明により高められたが、遺伝子発現はCT２とCT１０に相当する8:00と16:00の間の照明では変化しなかった。その結果から、位相をリセットする光のみが視交叉上核中のＤＥＣ１発現を増加させることが示される（図３(ａ)、(ｃ)、(ｄ)）。
【００２０】
一方、視交叉上核中のＤＥＣ２発現は試験したどの時間でも光により影響されなかった（図３(ｂ)、(ｅ)、(ｆ）)。対照ラットにおけるＤＥＣシグナルの概日パターンは最初の実験結果を確証している（図２(ａ)、(ｂ)、３(ａ)、(ｂ)）。
【００２１】
視交叉上核以外のいくつかの脳構造におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２のシグナルの概日プロフィールも調べた。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２シグナルの両方が種々の脳領域で発現されたが、発現部位は２つの遺伝子で異なっていた（図２(ｃ)〜(ｆ)、図４(ａ)、(ｂ)）。嗅球、梨状皮質、海馬および視交叉上核を含む視床下部核のような領域で強く発現された。他方、２つの遺伝子は他領域で別々に発現される。つまりＤＥＣ１は皮質、特に第５層と帯状皮質、視床、および上丘で、そしてＤＥＣ２は尾状被殻、松果体、および小脳顆粒細胞層で発現される。視交叉上核を含む冠状切片におけるｍＲＮＡ量を調べた。ここで、図４において、LDサイクルの12:00における正中近傍矢状切片でのＤＥＣ１（ａ）およびＤＥＣ２（ｂ）in situハイブリダイゼイションの代表的なオートラジオグラフ像を示す。ここで１目盛は５mm。Ｐ：松果体、ＯＣ：視交叉、ＯＮ：視神経、ＳＣ：上丘を示す。概日遺伝子発現パターンをLD（白丸）およびDD（黒丸）条件下で、信号の強い脳領域つまりＤＥＣ１では壁皮質（ｃ）と梨状皮質（ｄ）について、ＤＥＣ２では尾状被殻（ｅ）と梨状皮質（ｆ）について調べた。データは５匹の平均±標準誤差。*および**：LDに対してｐ＜０.０５および０.０１である。
【００２２】
壁皮質および梨状皮質におけるＤＥＣ１シグナル、ならびに梨状皮質および尾状核・被殻（線条）におけるＤＥＣ２シグナルを測定した。試験したすべての構造において、統計的に有意な概日変動がLDだけでなくDDでも認められた（図４(ｃ)〜(ｆ)）。試験したすべての構造で両遺伝子とも位相ピークは20:00で認められた。リズムは視交叉上核に対して位相がほぼ１８０°(変位していた。DDでの概日パターンはLDと統計的に有意な差がなく基本的に同じである。視交叉上核と視交叉上核外との間のｍＲＮＡリズムの位相関係はＰＥＲ１、ＰＥＲ２およびＢＭＡＬ１のような他の時計遺伝子リズムと類似している。最近の研究によって視交叉上核以外の脳構造あるいは中枢神経外の他の末梢組織はIn vitroで少なくとも数サイクルの時計遺伝子リズムを発現でき、さらにｒａｔ−１線維芽細胞のような細胞ラインが血清ショックによって数サイクルで概日リズムを発現する。視交叉上核外のＤＥＣ１およびＤＥＣ２のリズム発現がこれらの構造における生理学的な役割を反映する可能性がある。
【００２３】
本知見から、ｂＨＬＨ転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２は概日変動で視交叉上核中に強く発現されるが、特異的なＥボックス共通配列であるCACGTGを通してＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１による転写活性化を抑制する。ＤＥＣ１による抑制は既知のネガティブ因子であるＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＣＲＹ１およびＣＲＹ２と同程度だったが、ＤＥＣ２による抑制はどの既知のネガティブ因子よりもかなり強かった。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２のタンパク量はまだ調べられていないが、２つの遺伝子は分子時計における重要なネガティブ・レギュレータであると考えられる。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２のシグナルは両方とも昼に高かったが、このパターンは既知のネガティブ因子であるＰＥＲ１、ＰＥＲ２およびＣＲＹ１と同じだった。
【００２４】
本発明者らのラット・コロニーでは、ＤＥＣ１発現はＰＥＲ１と同様に8:00にピークを示し、ＤＥＣ２は16:00にピークを示すＰＥＲ２よりも早く12:00にピークを示した20,23。LDおよびDD条件下の発現リズムはほとんど両遺伝子で同じであり、DECリズムの本来の性質を示した。視交叉上核外ではＤＥＣ２は心臓、脳および骨格筋のようなある種の器官で特異的に発現された。視交叉上核において他の脳領域よりも高いシグナルだけでなく強い抑制を示すことから、ＤＥＣ２の分子時計機構における重要な役割が示唆される。他方ＤＥＣ１はＤＥＣ２と異なり、分子時計に対するインプット経路に関連することが示唆される。既知の時計遺伝子では、ＰＥＲ１が光同調に関連すると考えられるが、これはその発現が位相後退させる光および位相前進させる光の両方により増加し、ＰＥＲ１に対するアンチセンスが光刺激によって位相変位を阻害したためである。
【００２５】
一方ＰＥＲ２発現は位相後退させる光によってのみ増加する。ＤＥＣ１は位相後退させる光および前進させる光の両方に応答するが、連続的昼の光には応答せず、このことからＰＥＲ１に加えＤＥＣ１が分子時計の光同調に関連していることが示唆される。グルタミン酸は網膜視床下部路の主要な神経伝達物質であり、そしてＭＡＰキナーゼまたはＣａＭキナーゼあるいはその両方の活性化による細胞内カルシウム増加は、カルシウム／ｃＡＭＰ応答性因子による遺伝子発現を含む分子時計へのインプット経路にあるように思える。ＣＲＥ［ｃＡＭＰ応答配列］はＤＥＣ１を含む様々な遺伝子の上流に認められるが、ＤＥＣ１およびＰＥＲ１だけは位相をリセットする光に応答して認められる。２つの遺伝子のプロモータ領域における類似性は分子時計をリセットする光応答因子を識別する端緒である可能性がある。
【００２６】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼ測定
縦列に結合した３つのＥボックスからなり、ＴＫプロモータの上流でNheI−Xho部位に結合したE54−TKを、トランスフェクション前に２４時間２４ウェルにまいた（３.４(１０4細胞／ウェル）ｐＧＬ３基本ベクター（Promega）ＮＩＨ３Ｔ３細胞に連結した。
【００２７】
レポータ・ベクター（E54−TK、２ng／ウェル）、マウス（ｍ）ＣＬＯＣＫおよびｍＢＭＡＬ１ｂ（各50ng／ウェル）をリプレッサ・ベクター（ｍＤＥＣ２、ｍＰＥＲ１、ｒＰＥＲ２、ｈＣＲＹ１またはヒト (ｈ)ＣＲＹ２、各５０ng／ウェル）の１種類と共に、あるいは伴わず、Lipofectamine Plus（Gibco−BRL）を使用し、製造業者の取扱い説明に従ってトランスフェクトした。ＤＥＣ抑制の量に対する応答実験では、ＤＥＣ１およびＤＥＣ２プラスミドを５０、２５、１２.５および６.１２５ng／ウェルで加えた。ＤＮＡの全濃度はｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）で１５２.２ng／ウェルに調整した。本来の標準として、ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（Promega）０.２ngを各ウェルにトランスフェクトした。トランスフェクトした２４時間後、細胞をCell Lysis Buffer（Promega）で溶解し、renilla［ウミシイタケ］およびfirefly［ホタル］ルシフェラーゼの発光をDual Reporter Assay Reagent（Promega）により試験し、発光分光度計（Atto、JNR-2000）で測定した。
【００２８】
発現ベクターは下記のように、得た各プラスミドをｐｃＤＮＡ３（Invitorgen）に挿入して作製した。ｍＣＬＯＣＫ（AF000998）およびｍＢＭＡＬ１ｂ（AB012601）のコード領域はＲＴ−ＰＣＲにより得た。ｍＰＥＲ１のプラスミドはDr. Tei（Hidaら）から、そしてｒＰＥＲ２（AB016532）、ｈＣＲＹ２（AB014558）のプラスミドはDr.Nagaseから厚意により提供された。ｈＣＲＹ２の５'端での１３−ｂｐ欠如はＥＳＴクローン（AL040215）の配列に従いＰＣＲにより加えた。ｈＣＲＹ１のプラスミドはDr. Ikedaから厚意により提供された。
【００２９】
動物取扱いおよび組織採取
ウィスター系雄ラットを２から２.５月齢で使用した。これらは環境条件を他で報告したように管理した（6:00〜18:00に照明）筆者らの動物飼育室で出生され飼育された。
【００３０】
第１実験では、LDサイクル条件下で、あるいは8:00、12:00、16:00、20:00、24:00および4:00で６回昼にしたDD条件の３日目に各３０匹ずつのラットを断頭した。さらに矢状切片のためLDサイクルで12:00に３匹断頭した。
【００３１】
第２実験では、３日間DD条件にしたラット（ｎ＝３０）を３００ルクスの照明に30分間当てた。そしてDDに戻し、光刺激開始1時間後の9:00、13:00、17:00、21:00、1:00および5:00に断頭した。対照ラット（ｎ＝３０）は光を当てずDD条件下で断頭した。組織採取は既に報告した方法で実施した。
【００３２】
定量的in situハイブリダイゼイション
in situハイブリダイゼイションは既に報告したように視交叉上核を含む厚さ２０μmの連続的な冠状切片で実施した。各ラットから得られた１２切片を35Ｓ−ｄＡＴＰ（NEN）で放射性標識したＤＥＣ１あるいはＤＥＣ２プローブ（それぞれ、
5'ACATACAAGCACACGCACGCGCACTCACACACTCACTCTCACACA3'あるいは
5'AAAGGGTAGAGGGTGGGGTGGCAGAAGGGTGAGAAAGGGGCAAAA3）のどちらかでハイブルダイズした。さらに視交叉上核レベルでの矢状切片を３つの脳で確保した。ハイブリダイゼイションの信号をMicrocomputer Imaging Device（Imaging Reseach）を用いて分析した。対象構造の光学密度（OD）を測定した。測定した信号を同一カセットで14Ｃ−アクリル標準を用いて相対信号強度（kBq／ｇ）に転化した。信号密度は既に報告されているように、同一切片における脳梁の光学密度を減じて補正した。
【００３３】
統計処理
概日リズムは１元配置ＡＮＯＶＡを用いて統計的に分析した。２実験間の差はボンフェローニ・ダンpost hoc検定を用いた２元配置ＡＮＯＶＡにより分析した。光刺激の前後の量はスチューデントのｔ検定により評価した。
【００３４】
(II) 肝
本発明者は、ラット肝におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ、およびラノステロール１４−脱メチル酵素の概日リズムの調節におけるＤＢＰによる促進作用に対する、塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子ＤＥＣ２／SHARP1／BHLHB3の相反する作用を検討した。
【００３５】
上と同じく軟骨細胞の増殖および分化にかかわる新規遺伝子を探索する過程で、２種の塩基性へリックス−ループ−へリックス（bHLH）転写因子をクローン化し、ヒト軟骨細胞にちなんでＤＥＣ１およびＤＥＣ２と命名した。
【００３６】
ここでヒトＤＥＣ１はその一次構造から、マウス神経細胞Ｐ１９およびラットの最終分化ニューロンからそれぞれ単離されたＳｔｒａ１３およびＳＨＡＲＰ−２のオーソログであると考えられている。またヒトＤＥＣ２は、ラット脳からクローニングされたＳＨＡＲＰ−１のオーソログ遺伝子であると考えられている。
【００３７】
DEC1／SHARP2／Stra13とDEC2／SHARP-1の一次構造は相互に密接に関連しており、ｂＨＬＨドメインにおいて、ラットのＨＥＳ１、ＨＥＳ２、ＨＥＳ５、ショウジョウバエのhairy、およびEnhancer of spilt m7と比較的高い相同性（４０〜４５％）を示すが、系統樹上はｂＨＬＨ遺伝子群の他のグループとは全く異なる枝に位置する。
【００３８】
塩基性へリックス−ループ−へリックス転写因子群は、発生過程における増殖および分化を制御する際に極めて重要な役割を果たす。これらのタンパク質はホモダイマーまたはへテロダイマーを形成して、Ｅ−ｂｏｘやＮ−ｂｏｘなど対応するＤＮＡコンセンサス配列に結合して標的遺伝子群の発現を調節する。
【００３９】
ヒトＤＥＣ１のオーソログであるマウスのＳｔｒａ１３およびラットのＳＨＡＲＰ−２は、神経形成において機能することが報告されているが、Ｓｔｒａ１３はＥ−ｂｏｘおよびＮ−ｂｏｘのコンセンサスモチーフに直接結合しないことが報告されている。Ｓｔｒａ１３は細胞の成長停止に関与し、ヒストンデアセチラーゼコリプレッサー複合体の成分と直接相互作用し、ヒストン尾部の脱アセチル化を介して転写抑制を誘導する可能性があることが報告されている。
【００４０】
最近の研究ではヒトDEC1／Stra13が、発癌に関連するヒッペル−リンドウ腫瘍抑制タンパク質の標的遺伝子の一つであり、ホモダイマーを形成して機能を発現することが報告されている。ＮＧＦ、カイニン酸、ＰＤＧＦ、レチノイン酸、ｃＡＭＰなど多様な刺激を受けて、DEC1／Stra13／SHARP-2のｍＲＮＡの発現は、極初期遺伝子として１時間以内に速やかに誘導される。このように、DEC1／Stra13／SHARP-2の機能と調節に関連する知見は蓄積しつつある。
【００４１】
一方DEC2／SHARP1は当初、HairyやＤＥＣ１との配列類似性から同定された。DEC2／SHARP1は他の多くのｂＨＬＨタンパク質とは異なり、神経組織分化の後期に発現されることから、神経発生の初期決定ではなく最終的な神経分化で役割を果たす可能性が考えられる。DEC2／SRARP1の分布は、脳、骨格筋、肺、心臓など成体マウスおよびヒトのいくつかの組織に限られているが、DEC1／SHARP2／Stra13は、これまで調べられたヒトおよびラットの組織で普遍的に検出されている。最近、Ｍ１ムスカリン性アセチルコリン受容体がＳＨＡＲＰ１の標的遺伝子であることが報告された。しかしながら従来、DEC2／SHARP1が果たす役割および調節機構に関する知見は十分得られていなかった。
そこで発明者らは鋭意研究し、顕著な概日リズムが肝臓におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２のｍＲＮＡ発現にあることを見出したものである。
【００４２】
肝臓においては、ＰＡＲ（プロリンおよび酸性アミノ酸に富む）塩基性ロイシンジッパー転写因子の一種であるＤＢＰが、ＣＹＰ７Ａ（コレステロール７α−ヒドロキシラーゼ）、Ｃｙｐ２ａ４（ステロイド１５α−ヒドロキシラーゼ）、およびＣｙｐ５ａ（クマリン７−ヒドロキシラーゼ）など複数の酵素の概日リズムの正の調節に機能することが知られている。ラットのＣＹＰ７Ａ遺伝子は、概日リズムを夜間に高く、日中は低く示し、これは摂食時間を考えればラットなどの夜行動物にとって妥当である。というのは、ＣＹＰ７Ａは脂質消化プロセスに不可欠な胆汁酸の生合成を調節する酵素の一種であるからである。胆汁酸の生成では、ＣＹＰ８Ｂ（ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ）が、胆汁に含まれるコール酸とケノデオキシコール酸との比を決定するもうひとつの重要な酵素であり、顕著な概日リズムを示すこともわかっているが、そのリズムの位相は、ＣＹＰ７Ａの場合とは反対方向に動く。ＣＹＰ８Ｂの概日リズムは、それぞれ強力な抑制因子および活性化因子であるインスリンおよびｃＡＭＰによって調節されることが示唆されている。血清インスリン値および肝臓におけるｃＡＭＰ形成は、顕著な概日リズムを示すことが知られている。
【００４３】
本発明者らは肝臓におけるＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１（ラノステロール１４−脱メチル化酵素）を含むステロール代謝酵素群の調節にＤＥＣ１およびＤＥＣ２が果たす役割について検討し、ＤＥＣ２のみが、正の調節因子ＤＢＰによる発現増加を打ち消し、３種すべての酵素に対する強力な抑制因子であることを見出し、本発明を完成した。
【００４４】
材料および方法
α−[32Ｐ]ｄＣＴＰ（111 TBq／mmol）は、Du Pont- New England Nuclearから入手した。オリゴラベリング・キットは、Pharmacia Biotechnology Inc.（ウプサラ）の製品を使用した。
【００４５】
肝臓のポリ(Ａ)+ ＲＮＡの単離は以下のように行った。 ２カ月齢の雄のウィスター・ラットを自然光条件下（6:00〜18:00）で飼育し、通常の研究用ラット用固形飼料および水道水を自由に摂取させた。肝臓を速やかに除去し、グアニジン塩酸法で全RNAを抽出し、オリゴ (dT)−セルロースカラムクロマトグラフィーを行ってポリ(Ａ)+ ＲＮＡを濃縮した。
【００４６】
ｃＤＮＡプローブの調製は以下のように行った。ハイブリダイゼーション用プローブとして使用したラットのｃＤＮＡクローン、およびＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ａ、ＣＹＰ５１およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）はそれぞれ公知の文献の方法に従って調製した。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２のラットｃＤＮＡは、それぞれラット肝および脳のｍＲＮＡを元に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）で調製した。プライマー対は、ＤＥＣ１用に5'TCCTACCCGAACATCTC3'および5'GACTCACAGACCAAGACTTTGAAG3'を、ＤＥＣ２用に5'AAAATCTCTCCAGGCGACCGT3'および5'TCTTGTCTAGCCAGGGCTGTA3'をそれぞれ使用した。プライマーは、ヒトＤＥＣ１配列（EMBL／GenBank／DDBJ No. AB004066）およびマウスＤＥＣ２配列（EMBL／GenBank／DDBJ No. AB044090）を元に合成した。
ＰＣＲ産物を、pGEM T-Easyベクター（Promega Corp.、ウィスコンシン州マジソン）にサブクローニングし、塩基配列を決定して同一であることを確認した。
【００４７】
ノーザン・ブロット解析は以下のように行った。ポリ(Ａ)+ ＲＮＡ調製物（１〜２ (ｇ／レーン）を、公知の文献に従って、２.２Ｍのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲルで電気泳動し、Nytranメンブレン（Schleicher & Schuell GmbH、ダッセル）にトランスファーした。このメンブレンを、６×SSC、５×デンハート液、１０mMＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、０.５mg／ml超音波処理済サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で32Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。このメンブレンを、０.５％ＳＤＳを含む０.１×ＳＳＣで５０℃で洗浄後、Kodak BMXフィルムを−８０℃で感光させた。ハイブリッドを形成した部分の放射能を、バイオイメージング・アナライザ・システムBAS2000（Fuji Photo Film Co. Ltd.、東京）で定量した。
【００４８】
リアル・タイム定量RT-PCR分析は以下のように行った。ＤＥＣ１およびＤＥＣ２を対象としたリアル・タイム定量RT−PCR分析は、ABI PRISM 7700配列検出システム装置およびソフトウェア（PE Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて行った。このシステムによるRT-PCR分析の原理およびプロトコールは文献に記載されている［Held, 1996 #37、Gibson, 1996 #36］。first-strand cDNAはラットのポリ(Ａ)+ ＲＮＡ（０.１μg）を元に、SuperScript II逆転写酵素（Life Technologies, Inc.、メリーランド州ロックビル）を用いて合成した。増幅におけるバラツキを制御するための内部標準として ( アクチンを選択した。この分析に使用した全プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。ＤＥＣ１ｃＤＮＡ増幅用
（5'GCAAGGAAACTTACAAACTGCC3'および5'CAATGCACTCGTTAATCCGGT3'）、ＤＥＣ２ ｃＤＮＡ増幅用
（5'ATTGCTTTACAGAATGGGGAGCG3'および5'AAAGCGCGCGAGGTATTGCAAGAC3'）、
βアクチンｃＤＮＡ増幅用（5'ACGGCCAGGTCATCATCACTATTG3'および
5'CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA3'）。使用したＴａｑｍａｎTM蛍光プローブの配列は、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、およびβアクチンのそれぞれについて、
5'6FAMCACCGGCTGATTGAGAAAAAGAGACGTTAMRA3'、
5'6FAMCGGTCCAGGCCGACTTGGATGCGTTCCACTCGGTAMRA3'、
5'6VICCAACGAGCGGTTCCGATGCCCTAMRA3'とした。
【００４９】
発現プラスミドおよびレポータープラスミドの構築は以下のように行った。ヒトＤＥＣ１、ヒトＤＥＣ２、マウスＤＥＣ２（コード領域全体を含む）のＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３.１／Ｚｅｏ(＋)発現プラスミドベクター（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）に挿入した。ラットのＤＢＰ発現プラスミドｐＣＭＶ−ＤＢＰは、ジュネーブ大学（スイス）のUeli Schibler博士から供与を受けた。ラットのＰｅｒ２発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ｒＰｅｒ２は、Ishida博士より入手した。
【００５０】
レポータープラスミドｐＣＹＰ７−ＬｕｃのＤＮＡ断片（1823bp）は、プライマーとして5'GGACGCGTTCTATATTGTGATTTGATGC3'および
5'GGAGATCTGGGGAGACTCTTTGCCTAGC3'を、またテンプレートとしてラットのゲノムクローン (Ｇ４を用いてＰＣＲで増幅し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Promega Corp.、ウィスコンシン州マジソン）のMluI-BglII部位にクローニングした（図８(Ａ)参照））。レポータープラスミドｐＣＹＰ８Ｂ−ｌｕｃの構築には、ＤＮＡ断片（1771bp）をマウスの全ゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲで得た。第１プライマーとして5'GTATTGAGTAGAGGGATGTC3'および5'AGCGTCATGGCTAGGCTCCA3'を、またネステッドプライマーとして5'ACGCGAGTCTCCCCACTGGATACT3'および5'AGGCTGAGCTCCACTTGTCAGTCGAC3'を使用し、ＰＣＲ産物をｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターのMluI-SalI部位にクローニングした（図８(Ｂ)参照）。ＰＣＲに用いたプライマーは、マウスのＣＹＰ８Ｂ遺伝子の配列を元に合成した。ラットのゲノムクローンＣＹＰ５１（RG40）に由来するＤＮＡ断片（925bp）をHindlIIIで切断し、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃベクターのHindlIII部位にクローニングしてレポータープラスミドｐＣＹＰ５１−ｌｕｃを構築した（図５(Ｃ)参照）。
【００５１】
細胞培養およびルシフェラーゼアッセイは以下のように行った。ヒト肝癌HepG2細胞を、５×１０4細胞／ウェル（直径１６mm）となるように２４穴のマルチウェル・プラスチック・プレート上に接種し、１０％ウシ胎児血清（PBS）、５０(ｇ／mlアスコルビン酸、３２Ｕ／mlペニシリン、４０(ｇ／mlストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（日水、東京）中で培養した。細胞接種から２４時間後に、ＴｒａｎｓＩＴ２ポリアミン（Mirus Corp.ウィスコンシン州マジソン）を用いたリポフェクション法でルシフェラーゼコンストラクト（２０ng／アッセイ）を、内部対照プラスミドｐＲＬ−ＴＫ（２０ng／アッセイ）および発現プラスミドとともにＨｅｐＧ２細胞にＤＮＡトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に細胞を回収し、細胞溶解液を対象にデュアルルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega Corp.ウィスコンシン州マジソン）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。各コンストラクトについて２個のウェルを測定し、ルシフェラーゼ活性を内部対照値に対して標準化した。値は平均値と標準偏差で表した。少なくとも２回の独立したトランスフェクションを行った。
【００５２】
結果
ラット肝におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２の概日リズムを図５(ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡの1日の種々の時間におけるレベル)に示した。ここで、ラットを標準的な条件下で飼育し、指示した時間に解剖した。各時点で３匹のラットの肝臓から取ったＲＮＡ試料を混ぜ合わせ、ポリ(Ａ)+ ＲＮＡ標本を「材料と方法」の記載通りに作った。ＤＥＣ１ (図５(Ａ))、ＤＥＣ２(図５(Ｂ))、グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼ (図５(Ｃ)) に対するｍＲＮＡレベルを「材料と方法」の記載通りノーザン・ブロット解析によって決定した。ブロット膜のメチレン・ブルー染色によって、その各列にＲＮＡ標本が等しく載っていることを確認した (図５(Ｄ))。
【００５３】
結果は露出したフィルム画像（上パネル）と、Bio-imaging Analyzer System BAS 2000（Fuji Photo Film Co. Ltd., Tokyo）を用いて各々の定量化した値（下パネル）で示した。定量化した値は各グループの最低値に対する相対的値であった。ハイブリダイズしたｍＲＮＡの大きさを各々のパネルの左側に示した。すべての実験は異なる試料を用いて３回以上繰り返し、再現性のある結果を作った。図５(Ｅ)には ＤＥＣ１とＤＥＣ２のｍＲＮＡのリアル・タイム定量RT−PCR解析を示した。各ｍＲＮＡの量を、ラットＤＥＣ１とＤＥＣ２のｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを、その標準として用いて計算した。すべての値は各時点での３匹のラットの平均であった。
以上の結果から以下のことが明らかとなった。
【００５４】
ＤＥＣ１とＤＥＣ２の両方のｍＲＮＡレベルで顕著な概日リズムが認められた。図５(Ａ)に示すように、ＤＥＣ１ｍＲＮＡのレベルは、22:00に最大となって7:00まで維持し、1:00にわずかなトラフが認められ、10:00〜16:00に減少して最小となった。最大値と最小値の比は約５であり、SCNで認められた比と同等であった。ＤＥＣ２ｍＲＮＡのリズムには19:00と7:00に２回のピークがみられ（図５(Ｂ)）、２回のトラフが13:00と1:00にみられた。ＳＣＮにおけるｍＲＮＡの増分は４〜５倍であったが、ＤＥＣ２ｍＲＮＡの増分は約８倍であった。ＳＣＮでは、ＤＥＣ１とＤＥＣ２の両方に日中のピークがみられ、有意な２回目のピークは認められなかった。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡレベルに有意な変動は認められなかった（図５(Ｃ)）。また、ブロットしたメンブレンをメチレン・ブルーで染色したところ、各レーンのｍＲＮＡ試料の添加量は等しいことが判明した（図５(Ｄ)）。またリアル・タイム定量RT−PCR実験でＤＥＣ１とＤＥＣ２のｍＲＮＡ量を比較した。その結果、概日リズムのパターンに再現性が認められた（図５(Ｅ)）。ＤＥＣ１／ＤＥＣ２比は約３〜６の範囲を変動し、肝臓に含まれるＤＥＣ１およびＤＥＣ２のｍＲＮＡの最大量は、それぞれ１ｇのポリ(Ａ)+ ＲＮＡあたり、６８０ngおよび１８０ngと算出された。なお肝臓核画分中のＤＥＣ２タンパクレベルも２２時に高く１０時で低かった(図５(Ｅ))。
【００５５】
ＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１、ＤＢＰ、Ｐｅｒ２の概日リズムについては、既に報告された通り、ＣＹＰ８Ｂと同様にＣＹＰ７ＡのｍＲＮＡレベルの顕著な概日リズムには再現性が認められたが、それらの位相は相対してシフトしていた（図６(Ａ)および(Ｂ)）。ここで、図６（ＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１のｍＲＮＡの1日の種々の時間におけるレベル）においては、ＣＹＰ７Ａ (Ａ)、ＣＹＰ８Ｂ (Ｂ)、ＣＹＰ５１ (Ｃ) に対するｍＲＮＡのレベルは「材料と方法」と図５(Ａ)〜(Ｄ)の説明通りノーザン・ブロット解析で決定した。結果は露出フィルム画像（上パネル）と対応する定量化した値（下パネル）で示した。定量化した値は各グループの最低値に対しての相対的値であった。ハイブリダイズしたｍＲＮＡの大きさを各々のパネルの左側に示している。すべての実験は異なる試料を用いて３回以上繰り返し、再現性のある結果を作った。
【００５６】
ＣＹＰ７ＡｍＲＮＡのレベルは22:00に最大となった後、急激に低下して10:00に最小となった（図６(Ａ)）。これは過去に得られた結果と一致していた。これとは対照的に、ＣＹＰ８Ｂ ｍＲＮＡのレベルは13:00〜16:00に最大となり、1:00に最小となり、小さいものの有意なピークが4:00に認められた。ＣＹＰ７ＡおよびＣＹＰ８ＢのｍＲＮＡの振幅（最大値／最小値の比）はそれぞれ約８.５と８であった。３本の明瞭に異なるバンド（２.３、２.７、３.１kb）が、肝臓のＣＹＰ５１ｍＲＮＡに認められ、並行して変動した。ＣＹＰ５１ｍＲＮＡの概日リズムの存在はまた、振幅はやや小さい（約３）ものの明瞭であった。より高いレベルのＣＹＰ５１ｍＲＮＡが19:00から7:00まで持続し、19:00と4:00に２回のピークがみられ、これはＤＥＣ１およびＤＥＣ２のパターンと同様であった（図５）。
【００５７】
ＤＢＰの転写物レベルは肝臓でしっかりしたリズムを示しており、最大値は19:00に、最小値は10:00にみられ（図７(Ａ)）、振幅は約百倍であった。ここで図７（ＤＢＰとＰｅｒ２のｍＲＮＡの1日の種々の時間におけるレベル）において、ＤＢＰ (Ａ) とＰｅｒ２ (Ｂ) のｍＲＮＡレベルは「材料と方法」と図５(Ａ)〜(Ｄ)の説明通りに、ノーザン・ブロット解析によって決定した。結果は露出フィルム画像（上パネル）と対応する定量化した値（下パネル）で示した。定量化した値は各グループの最低値に対しての相対的値であった。ハイブリダイズしたｍＲＮＡの大きさを各々のパネルの左側に示している。すべての実験は異なる試料を用いて３回以上繰り返し、再現性のある結果を作った。
【００５８】
４０倍を超える増分が16:00に既に認められており、これはＤＥＣ１、ＤＥＣ２、ＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ５１、Ｐｅｒ２と比べて若干早くみられた。
Ｐｅｒ２ｍＲＮＡは、19:00〜7:00に高い概日リズムを示した（図７(Ｂ)）。
【００５９】
ＤＥＣ２はＤＢＰにより促進されたＣＹＰ７Ａの転写活性の抑制については、２種の転写因子ＤＥＣ１およびＤＥＣ２が肝臓で顕著な概日リズムを示したことから、これがＤＢＰの存在下または非存在下で、振動性の酵素であるＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１の転写に影響を及ぼすか否かを検討した。１.８kbpのＣＹＰ７Ａの５'フランキング領域を含む断片をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（ベクター）に挿入して、ルシフェラーゼレポータープラスミド（図８(Ａ)）を構築し、ＨｅｐＧ２細胞培養液のルシフェラーゼ活性をアッセイした。ラットのＣＹＰ７Ａプロモーターの基礎転写活性は低いので、ｈＤＥＣ１、ｈＤＥＣ２、ｍＤＥＣ２による有意な影響は受けなかったが、ｒＰｅｒ２によりわずかに促進された（図９(Ａ)の左のパネル）。ＤＢＰを細胞培養液に添加したところ、ラットＣＹＰ７Ａの基礎転写活性はＤＢＰにより４０〜６０倍促進された（図９(Ａ)の右のパネルおよび（Ｂ）。これは既に報告された通り、上記領域が複数のＤＢＰ結合部位を含むためである（図８(Ａ)）。
【００６０】
ＤＢＰに対して１６分の1量のｈＤＥＣ２をアッセイ系に添加したところ、ＤＢＰによって促進されたプロモーター活性の９０%が抑制された。この抑制は用量依存的であり、ＤＢＰと等量のｈＤＥＣ２を添加したところ、ほぼ完全にプロモーター活性は失われた。マウスのオーソログであるｍＤＥＣ２で同様の結果が得られたことから、ＤＥＣ２によるラットＣＹＰ７Ａの抑制が、ＤＥＣ２の由来に左右されないことが明らかとなった。
【００６１】
活性化型のＣＹＰ７Ａのプロモーター活性にｒＰｅｒ２が及ぼす作用についても比較する目的で調べた。その結果、ＤＢＰによって促進されたプロモーター活性をｒＰｅｒ２は有意に抑制するが、この作用はＤＥＣ２の場合よりもかなり小さいことがわかった。図９は、ＤＥＣ２はラットのＣＹＰ７Ａプロモーターの転写活性を抑制するが、ＤＥＣ１はそれには影響しないことを示すものである。(Ａ) ＤＢＰ、ｈＤＥＣ１、ｍＤＥＣ２、ｒＰｅｒ２（左パネル）のｐＣＹＰ７Ａ−Ｌｕｃ（２０ng）、内部制御ｐＲＬ−ＴＫ（２０ng）および各発現プラスミド（０.２μg）と、ＨｅｐＧ２細胞はコトランスフェクションした。ＤＢＰプラスミド（０.２μg）の存在下で、hＤＥＣ２発現プラスミド（０.０１２５、０.０５、０.２μg、第二パネル）、ｍＤＥＣ２発現プラスミド（０.０１２５、０.２μg、第三パネル）またはｒＰｅｒ２2発現プラスミド（０.０１２５、０.２μg、右パネル）の量を追加増量した。(Ｂ) ＤＢＰまたはｈＤＥＣ１（左パネル）のｐＣＹＰ７Ａ−Ｌｕｃ（２０ng）、内部制御ｐＲＬ−ＴＫ（２０ng）および各発現プラスミド（０.２μg）がＨｅｐＧ２にコトランスフェクションされた。ＤＢＰプラスミド（０.２ μg）の存在下で、ｈＤＥＣ１発現プラスミド（０.０１２５、０.０５、０.２μg、右パネル）の量を追加増量した。(Ｃ) レポータープラスミドｐＤＥＣ１−Ｌｕｃ（２０ng）およびｈＤＥＣ１発現プラスミド（０.２μg）は、ＨｅｐＧ２にコトランスフェクションされた。ルシフェラーゼ活性は内部制御ｐＲＬ−ＴＫの活性によって標準化し、重複定量による平均値＋／−標準偏差は、各実験のレポータープラスミド単独による、基本ルシフェラーゼ活性に対する比率として表した。他の実験においても類似したパターンが再現した。
【００６２】
ＤＥＣ２が強力な抑制作用をもつこととは対照的に、ｈＤＥＣ１はＣＹＰ７Ａの基礎プロモーター活性またはＤＢＰにより促進された活性に対して有意な作用を及ぼさなかった（図９(Ｂ)）。ＤＥＣ１は、それ自体のプロモーター活性を負に自己調節することが報告されている。ｈＤＥＣ１によるヒトＤＥＣ１プロモーターの負の自己調節は、本研究で用いた同条件で確認され（図９(Ｃ)）、トランスフェクトしたｈＤＥＣ１発現プラスミドが機能していることがわかった。
【００６３】
さらに、ＤＥＣ２は、ＣＹＰ８ＢおよびＣＹＰ５１の基礎転写活性および促進された転写活性の両方を抑制した。図１０には、ＤＥＣ２はラットのＣＹＰ８ＢプロモーターとＣＹＰ５１プロモーターの転写活性を抑制するが、ＤＥＣ１はそれらのプロモーターには影響しなかったことを示す。(Ａ) ＤＢＰ、ｈＤＥＣ１、ｍＤＥＣ２、およびｒＰｅｒ２（左パネル）のｐＣＹＰ８Ｂ−Ｌｕｃ（２０ng）、内部制御ｐＲＬ−ＴＫ（２０ng）や各発現プラスミド（０.２μg）で、ＨｅｐＧ２2細胞はコトランスフェクションした。ＤＢＰプラスミド（０.２μg）の存在下で、ｈＤＥＣ２発現プラスミド（０.０１２５、０.２μg）、ｍＤＥＣ２発現プラスミド（０.２μg）、 ｈＤＥＣ１発現プラスミド（０.２μg）または ｒＰｅｒ２発現プラスミド（０.２μg）を追加した。(Ｂ) ＤＢＰ、ｈＤＥＣ１、ｍＤＥＣ２およびｒＰｅｒ２（左パネル）のｐＣＹＰ５１−Ｌｕｃ（２０ng）、内部制御ｐＲＬ−ＴＫ（２０ng）および各発現プラスミド（０.２μg）と、ＨｅｐＧ２細胞がコトランスフェクションした。ＤＢＰプラスミド（０.２μg）の存在下で、ｈＤＥＣ２発現プラスミド（０.０１２５、０.２μg）、ｍＤＥＣ２発現プラスミド（０.２μg）、ｈＤＥＣ１発現プラスミド（０.２μg）またはｒＰｅｒ２発現プラスミド（０.２μg）を追加した。その他の条件は図９の説明に記述した通りであった。他の実験でも類似したパターンが再現した。
【００６４】
ＣＹＰ８Ｂプロモーターの基礎転写活性（図１０(Ｂ)の左パネル）は、系外から発現プラスミドを添加しなくとも極めて高値であった。ｈＤＥＣ２とｍＤＥＣ２はいずれも、ＣＹＰ８Ｂプロモーターの基礎転写活性をＤＢＰ非存在下で強く抑制した（約８０％）。これはＣＹＰ７Ａの場合と対照的である（図９(Ａ)）。一方hＤＥＣ１およびｒＰｅｒ２は、ＣＹＰ８Ｂプロモーターの基礎活性に影響を及ぼさなかった（図１０(Ａ)、(Ｂ)の左パネル）。ＤＢＰ発現プラスミドを細胞培養液に添加したところ、ＣＹＰ７Ａの場合と比較して有意ではあるがかなり小さなプロモーター活性の促進（３〜４倍）が認められた（図１０(Ａ）、(Ｂ)の右パネル）。
【００６５】
ＤＢＰによって促進された転写活性は、ｈＤＥＣ２とｍＤＥＣ２の両方によって顕著に抑制された。ＤＢＰプラスミドに対して１６分の１量のＤＥＣ２プラスミドも抑制作用を示したが、ＣＹＰ７Ａの場合と比べて程度は小さかった（図９(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)）。ＣＹＰ８Ｂの促進型転写活性は、ｈＤＥＣ１による影響を全く受けなかったが、程度はＤＥＣ２より低いながらもｒＰｅｒ２により抑制された。
【００６６】
ＣＹＰ５１プロモーターの転写活性に関する結果（図１０(Ｂ)）は、ｒＰｅｒ２による作用を除いてＣＹＰ８Ｂの場合と同等であった。ＣＹＰ５１プロモーターの基礎転写活性も、系外から発現プラスミドを添加しなくとも高値であり、ｈＤＥＣ２およびｍＤＥＣ２により有意に抑制された（約７０％）。ＤＢＰによるＣＹＰ５１プロモーターの促進（３倍）およびＤＥＣ２によるその抑制（約８０％）もまた、ＣＹＰ８Ｂプロモーターの場合と同様に認められた（図１０(Ａ)、(Ｂ)）。ＤＢＰによるＣＹＰ５１の基礎活性および促進型転写活性は、ＣＹＰ７ＡおよびＣＹＰ８Ｂの場合と同様にｈＤＥＣ１による影響を受けなかった（図９(Ｂ)および１０(Ａ）。ＣＹＰ８Ｂの場合とは対照的に、ｒＰｅｒ２はＣＹＰ５１プロモーターのはたらきを約２倍、有意に促進した。その一方でｒＰｅｒ２は、ＤＢＰにより促進された転写活性を有意に抑制したものの、その程度は低かった（約５０％）。
【００６７】
すなわち、生物組織すべてにおいて、その発生と分化の多くの局面を調節するのに、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子が重要である。ＤＥＣ１とＤＥＣ２とは構造的に互に関連があるが、HAIR1Y／E (sp1))／HES bHLH（ヘリックス−ループ−ヘリックス）蛋白とは異なるものである。それらの機能については神経組織発生や軟骨形成と関連して研究がなされている。しかし、それらの標的遺伝子やそれら自身による転写調節の分子機構やそれら自身の調節については、今もすべて判っているわけではない。
【００６８】
ＤＥＣ１1とＤＥＣ２は哺乳類の概日センタである視交差上核（SCN）において発現すること、またそれらのｍＲＮＡは明白な概日リズムを示し、それはＰＥＲ遺伝子のリズムに類似している。さらにＤＥＣ１蛋白とＤＥＣ２蛋白とは周期Period1レポーター遺伝子の転写活性を抑制した。この遺伝子は陽性ヘテロダイマーClock／BMAL1によって活性化されるのであり、これにはＰＥＲ１、ＰＥＲ２、ＰＥＲ３、ＣＲＹ１、ＣＲＹ２などの他の多くの陰性因子をもったコア・フィードバック・ループが含まれており、主要なリズムを作ると思われている。これらの結果から、ＤＥＣ１とＤＥＣ２もまた哺乳類の概日センタのコア・フィードバック・ループに関与している分子発振器であるといえる。本知見によれば、ＤＥＣ１とＤＥＣ２のｍＲＮＡの肝臓発現もまた概日リズムを現わした。これは夜間に高く、19:00〜22:00と4:00〜7:00に2つのピークが現れた。ＳＣＮで観察されるそれらの発現の反対部位に、これらの位相は移行したのである。肝臓では、アルブミンやコレステロール７ａ−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ）遺伝子、ＣＹＰ２ａ４、ＣＹＰ２ａ５、ＣＹＰ２ｃ６遺伝子などの数種のシトクロームＰ４５０イソ酵素は概日リズムを現わし、ＤＢＰ、ＴＥＦ、ＨＬＦなどの正の調節ＰＡＲ遺伝子のなかの標的遺伝子であると考えられている。したがって、我々が調べたのは、ＤＢＰの存在下でのＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１の転写活性に対するＤＥＣ１、ＤＥＣ２の影響であった。そして我々が判ったことは、ＤＥＣ２だけが３種すべてのＣＹＰの転写を抑制し、ＤＢＰによるその促進を抑えたことである。
【００６９】
ＤＢＰ蛋白によってＣＹＰ７Ａの転写促進が著しいこと（４０〜６０倍）は、ＣＹＰ７Ａ概日リズムの振幅が大きいこと（８〜１０倍）と一致しており、図８(Ａ)にある複数のＤＢＰ応答配列が存在することと合致している。発現プラスミドの１６分の１量を培養系に加えた時でさえ、ＤＥＣ２蛋白によって転写が強く抑制されたのである（図９(Ａ)）。ＤＥＣ２ｍＲＮＡ発現の上昇はＤＢＰのそれとほぼ同時に起き、1:00には一度減少するが夜を通して7:00まで続いた。Yamaguchi他の最近の研究によれば、ＤＢＰ蛋白レベルのピークはＤＢＰｍＲＮＡレベルの場合より２時間だけ遅く、そのｍＲＮＡレベルと平行して減少した。このことは肝臓の場合と同じようである。というのは、ＣＹＰ７ＡｍＲＮＡはＤＢＰｍＲＮＡの場合より２、３時間だけ遅れて上昇したからである。ＤＥＣ２の蛋白レベルの変動は決定されなかったが、ＤＥＣ２ ｍＲＮＡの発現パターンが指摘していることは、ＤＢＰによるＣＹＰ７Ａの転写活性促進を抑制するように、ＤＢＰ蛋白が減少している時間（22:00〜7:00）に、ＤＥＣ２蛋白が蓄積する可能性があることである。したがって、ＤＢＰによるＣＹＰ７Ａ転写促進とＤＥＣ２によるその抑制は、ＣＹＰ７ＡのｍＲＮＡ発現の鮮明な概日リズムを現わすための調節には重要なものである。
【００７０】
ＣＹＰ８Ｂの概日リズムは、13:00〜16:00に大きいピークを示し、4:00には小さいピークを示し、両者のピークはＣＹＰ７Ａのピークから移行したものであることを本発明者の以前の知見が例証した。それ故に、ＤＢＰもＤＥＣ２もＣＹＰ８Ｂの調節には関与していないと思われた。しかし、本研究が明白に指摘したことは、ＣＹＰ７Ａの場合より程度が非常に低いが、ＣＹＰ８Ｂ転写はＤＢＰによって促進されること、さらに、促進活性ならびにＣＹＰ８Ｂの基本転写はＤＥＣ２によって強く抑制されたことである。既に明らかなように、ＣＹＰ８Ｂの概日リズムは、血清インスリンと肝ｃＡＭＰ（サイクリックアデノシン３' ５'一燐酸）によって優位的に調節され、これらが4:00〜6:00に高い概日リズムを現わし、各々、優勢抑制因子と有力誘導因子である。13:00〜16:00のＣＹＰ８ＢｍＲＮＡレベルのピークは、13:00〜16:00に最低値になる血清インスリンの抑制から開放されて促進するのであろう。4:00の小さいピークは恐らく肝ｃＡＭＰの誘導活性であり、4:00〜6:00の高レベル血清インスリンによる、有力な抑制に拮抗しているのである。本研究に使用したマウスＣＹＰ８Ｂ遺伝子の５'フランキング・フラグメント（1711kbp）には、サイクリックＡＭＰ応答配列（CRE）、インスリン作用による抑制的調節に係わる２つの標準インスリン応答配列（IRS）、そして配列状のＤＢＰ応答配列の可能性のあるもの１つが含まれている（図８(Ｂ)）。ＤＥＣ２に対する応答配列は未だに判定されていないが、少なくとも４因子がその概日リズムを現わすため、ＣＹＰ８Ｂの調節に関わっているのであろう。したがって、ＣＹＰ８Ｂのリズムは血清インスリンと肝ｃＡＭＰとが組み合って優勢的に形成されるのであろうし、ＤＢＰとＤＥＣ２のそれに関る度合は前者２因子の度合より大部少ないであろう。さらに、ＣＹＰ７Ａの転写と比較してＣＹＰ８Ｂ転写の高い基本活性から示唆されることは、ＣＹＰ８Ｂ調節に対して他に正の調節因子（単／複）が存在するかもしれないことである。
【００７１】
ＣＹＰ５１のｍＲＮＡレベルは夜間早く（19:00）と遅く（4:00）に２つのピークを示したが、それはＤＥＣ１とＤＥＣ２のピークと類似している。そのリズム振幅は約３であり、ＤＢＰによるＣＹＰ５１転写促進の度合と一致している（約３）。ＣＹＰ５１転写のＤＢＰによる促進およびＤＥＣ２による有意的な抑制から、19:00のＣＹＰ５１ｍＲＮＡレベルの最初のピークが説明出来たが、4:00の第二ピークはＤＢＰとＤＥＣ２による同じ機構では説明出来なかった。それに代わって、それはＣＹＰ８ＢならびにcAMPによって調節されることがある。というのは、ラットのＣＹＰ５１遺伝子の5'フランキング領域には、４個のＣＲＥ部位があり、ＣＹＰ５１は卵巣のＰＭＳＧなどのｃＡＭＰ発生因子によって誘発可能であるからである。さらにまた、精巣にあるヒトＣＹＰ５１のcAMP／cAMP−応答配列モジュレータＣＲＥＭ依存性調節が以前に明らかになっていた。
【００７２】
ＤＥＣ１の概日リズムの調節機構は、ＤＥＣ１プロモーターがＤＢＰによって活性化し、基本転写と促進転写はＤＥＣ１自身によって抑制されると考えられる。このことは19:00〜22:00のピーク形成に関与していると思われ、本研究で調べた３つのＣＹＰに類似した機構である。さらにまた、ＤＥＣ１もｃＡＭＰPによって誘導されると報告されているので、4:00の第二ピークは恐らくＣＹＰ５１、ＣＹＰ８Ｂならびに肝ｃＡＭＰによって形成されるのであろう。
【００７３】
ＤＥＣ２の概日リズムは、ＤＥＣ１やＣＹＰ５１の場合と同じ機構で調節されることがある。なぜならＤＥＣ２の振動パターンがＤＥＣ１やＣＹＰ５１のそれに似ているからである。4:00のＤＥＣ２の第二ピークはＤＥＣ１の場合もそうであるように、ＳＣＮでは明瞭ではなかった。肝臓では上述のように、ＤＢＰによって標的遺伝子の転写を促進するが、その促進を抑制する拮抗的効果を現わすのに、その第二ピークがより重要であると思われる。
【００７４】
最近ＤＥＣ２はＴＡＴＡ包含とＴＡＴＡ欠如のプロモーターを抑制することが証明されたが、これは本知見と一致するものである。即ち、ＣＹＰ７ＡとＣＹＰ８ＢはＴＡＴＡ含有遺伝子であり、一方ＣＹＰ５１はＴＡＴＡ欠如遺伝子である（図８(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)）。ＤＥＣ２による調節の分子機構に関して報告されていることは、ＤＥＣ２はホモダイマーになり、Ｃ末端の１ドメインによる抑制はヒストンデアセチラーゼ依存性機構であるが、一方ヘリックス−ループ−ヘリックス（bHLH）ドメインによる抑制はヒストンデアセチラーゼ独立性機構であることである。
【００７５】
【発明の効果】
塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス型転写因子であるＤＥＣ１およびＤＥＣ２を用いることにより、Ｅボックス・エンハンサを通してＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１の誘発する転写活性化を制御することができ、またラット肝におけるコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ、ステロール１２α−ヒドロキシラーゼ、およびラノステロール１４−脱メチル酵素系においてＤＢＰによる促進作用を制御することができる。
【００７６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Yukio Kato
<110> Kenichi Honma
<120> Method for regulation of Circadian Rhythm
<130> NP-1258
<160> 22
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
acatacaagc acacgcacgc gcactcacac actcactctc acaca       45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
aaagggtaga gggtggggtg gcagaagggt gagaaagggg caaaa       45
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
tcctacccga acatctc                                      17
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gactcacaga ccaagacttt gaag                              24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
aaaatctctc caggcgaccg t                                        21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
tcttgtctag ccagggctgt a                                        21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gcaaggaaac ttacaaactg cc                                22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caatgcactc gttaatccgg t                                        21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
attgctttac agaatgggga gcg                               23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
aaagcgcgcg aggtattgca agac                24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
acggccaggt catcatcact attg                24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caagaaggaa ggctggaaaa ga                  22
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caccggctga ttgagaaaaa gagacgt                    27
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
cggtccaggc cgacttggat gcgttcc actcgg      36
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
caacgagcgg ttccgatgcc c                          21
<210> 16
<211>  28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
ggacgcgttc tatattgtga tttgatgc            28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
ggagatctgg ggagactctt tgcctagc            28
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
gtattgagta gagggatgtc                            20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
agcgtcatgg ctaggctcca                            20
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
acgcgagtct ccccactgga tact                24
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400>
aggctgagct ccacttgtca gtcgac                     26
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＬＯＣＫとＢＭＡＬ１が誘発したE54−TKリポータ活性の、ＤＥＣ１およびＤＥＣ２による量依存的な抑制と他のネガティブ因子による抑制との比較を示す図示である。
【図２】視交叉上核におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２発現の概日プロフィールを示す図である。ここで、(ａ)〜(ｈ)はそれぞれ、ＤＥＣ１(ａ)とＤＥＣ２(ｂ)ｍＲＮＡ相対値のサーカディアン変動(○：LD、●：DD)、DDにおけるＳＣＭを含む冠状断切片のオートラジオグラム(ＤＥＣ１：１２ｈ(ｃ、*大脳皮質測定部位、↑は梨状皮質)、２４ｈ(ｄ)、ＤＥＣ２：１２ｈ(ｅ、矢印はSCN)、２４ｈ(ｆ、*は尾状被殻)、スケールは２mm)、DDにおけるSCN部位でのオートラジオグラム(g：ＤＥＣ1,ｈ:ＤＥＣ２、スケールは１mm)を示す。
【図３】  30分照明に対するＤＥＣ１およびＤＥＣ２の応答を示す図である。ここで、(ａ)〜(ｆ)はそれぞれ、DD（黒棒）と光照射開始1時間後（白棒）のＤＥＣ１(ａ)、ＤＥＣ２(ｂ)シグナルのサーカディアン変動、１２時における光照射前と照射開始1時間後のSCN部位のオートラジオグラム(ｃ：ＤＥＣ１、ｄ：ＤＥＣ２)。
【図４】  視交叉上核以外の脳構造におけるＤＥＣ１およびＤＥＣ２発現の概日変動を示す図示ある。ここで、(ａ)〜(ｆ)はそれぞれ、ＤＥＣ1(ａ)、ＤＥＣ２(ｂ)のオートラジオグラム(スケールは５mm)、LD(○)とDD(●)でのｍＲＮＡ相対値のサーカディアン変動（ｃ：大脳皮質のＤＥＣ１、ｄ：梨状皮質のＤＥＣ１、ｅ：尾状被殻のＤＥＣ２。ｆ：梨状皮質のＤＥＣ１）を示す。ｈｉ：海馬、ｏｂ：嗅球、ｏｃ：視交叉、ｐ：松果体、ｓｃ：上丘、ｓｃｎ：視交叉上核、ｖｍ：視床下部腹内側核。
【図５】肝臓でのＤＥＣ１、ＤＥＣ２、グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡの１日の種々の時間におけるレベルを示す図である。ここで、(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)はＤＥＣ１、ＤＥＣ２、グリセルアルデヒド３−燐酸デヒドロゲナーゼを示す。また、(Ｄ)は確認用を示す。(Ｅ)はリアルタイムRT−PCR、(Ｆ)はＤＥＣ２タンパクのウエスタン分析を示す。
【図６】  肝臓でのＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１のｍＲＮＡの1日の種々の時間におけるレベルを示す図である。ここで、(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)はＣＹＰ７Ａ、ＣＹＰ８Ｂ、ＣＹＰ５１を示す。
【図７】肝臓でのＤＢＰとＰｅｒ２のｍＲＮＡの１日の種々の時間におけるレベルを示す図示もである。ここで、(Ａ)、(Ｂ)はＤＢＰ、Ｐｅｒ２を示す。
【図８】プロモーター用のレポータープラスミドの構築を示す図示もである。ここで、(Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)は、ＣＹＰ７Ａ 、８Ｂ、５１を示す。
【図９】  ＤＥＣ２はラットのＣＹＰ７Ａプロモーターの転写活性を抑制するが、ＤＥＣ１はそれには影響しないことを示す図である。(Ａ)Ｃｙｐ７Ａ、(Ｂ)Ｃｙｐ７Ａ、(Ｃ)ＤＥＣ１を示す。
【図１０】  ＤＥＣ２はラットのＣＹＰ８Ｂプロモーター(Ａ)とＣＹＰ５１プロモーター(Ｂ)の転写活性を抑制するが、ＤＥＣ１はそれらのプロモーターには影響しないことを示す図である。
【図１】
2005204501.tif 000002
【図２】
2005204501.tif 000003
【図３】
2005204501.tif 000004
【図４】
2005204501.tif 000005
【図５】
2005204501.tif 000006
【図６】
2005204501.tif 000007
【図７】
2005204501.tif 000008
【図８】
2005204501.tif 000009
【図９】
2005204501.tif 000010
【図１０】
2005204501.tif 000011