(57)【要約】【課題】  電気泳動した後のゲル中に分離された濃度の薄いバンドから微小なスポットに濃縮する方法と装置を提供する。【解決手段】  （１）電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定のバンドに転写用膜を接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜により小さなスポットとして濃縮して転写する、（２）該バンドに濃縮用筒を接触させ、該濃縮用筒を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写用膜に転写する、または（３）複数のバンドに転写用膜を複数回接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜に濃縮して転写する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定のバンドに転写用膜を接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜により小さなスポットとして濃縮して転写することを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項２】
請求項１に記載の電気泳動ゲル濃縮方法において、前記泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定のバンドと、前記転写用膜の間に濃縮用スポットを有する濃縮用シートを介することを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項３】
電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定のバンドに濃縮用筒を接触させ、該濃縮用筒を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写用膜に転写することを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項４】
電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定の複数のバンドに転写用膜を複数回接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜に濃縮して転写することを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項５】
請求項４に記載の電気泳動ゲル濃縮方法において、前記電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定の複数のバンドを、複数のゲル片として切り出して用いることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項６】
請求項５に記載の電気泳動ゲル濃縮方法において、前記複数のゲル片を格納した筒を用いることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項７】
請求項５に記載の電気泳動ゲル濃縮方法において、前記複数のゲル片を格納する穴を複数有するプレートを用いることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮方法。
【請求項８】
電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートと、該ゲルシートの所定のバンドに対応する穴を有する濃縮用シートと、該濃縮用シートの穴を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写する転写用膜が積層されたことを特徴とする電気泳動ゲル濃縮装置。
【請求項９】
請求項８に記載の電気泳動ゲル濃縮装置において、前記濃縮用シートと前記転写用膜が一体化されて積層されていることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮装置。
【請求項１０】
電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートと、該ゲルシートの所定のバンドに対応して配置された濃縮用筒と、該濃縮用筒を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写する転写用膜が積層されたことを特徴とする電気泳動ゲル濃縮装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の電気泳動ゲル濃縮装置において、前記濃縮用筒を２重以上の多層構造とし、バンドの大きさに応じた所定の直径に調整可能であることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮装置。
【請求項１２】
請求項８または９に記載の電気泳動ゲル濃縮装置において、前記転写用膜が、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜から選択されることを特徴とする電気泳動ゲル濃縮装置。
【請求項１３】
請求項８乃至１２に記載の電気泳動ゲル濃縮装置が、前記電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートから、転写用膜への濃縮を促進するための電圧印加手段を有することを特徴とするブロッティング装置。
【請求項１４】
電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートと、該ゲルシートの所定のバンドに対応する穴を有する濃縮用シートと、該濃縮用シートの穴を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写する転写用膜が積層された電気泳動ゲル濃縮装置に用いる転写用膜。
【請求項１５】
電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートと、該ゲルシートの所定のバンドに対応する穴を有する濃縮用シートと、該濃縮用シートの穴を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写する転写用膜が積層された電気泳動ゲル濃縮装置に用いる濃縮用シートであって、該濃縮用シートの穴の面積が該バンドの面積より小であることを特徴とする濃縮用シート。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載された濃縮用シートであって、転写スポットが該濃縮用シートの一部にのみ形成されたことを特徴とする濃縮用シート。
【請求項１７】
請求項１６に記載された濃縮用シートであって、該転写スポットが円形であることを特徴とする濃縮用シート。
【請求項１８】
電気泳動後の蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドを含むゲルシートと、該ゲルシートの所定のバンドに対応して配置された濃縮用筒と、該濃縮用筒を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物のバンドより該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写する転写用膜が積層された電気泳動ゲル濃縮装置に用いる濃縮用筒。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動の手法により分離可能な全ての有機化合物に対応し、泳動用のアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル等由来の夾雑成分を除去して目的の測定物を小さなスポット状に転写膜に濃縮する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質や核酸、有機化合物など生体成分中の分離に電気泳動がよく利用され、多くの分野で使用されている。特に簡易な方法としてSodium-dedecyl-sulfate（SDS）ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）は多用されている。SDS-PAGEは、分子量の違いによって混合物からはしご状（バンド）に各成分ごとに分離される。しかし、泳動中にそれぞれのバンドは拡散して幅広いバンドになることが多く、含有濃度の少ない成分は、拡散により染色しても検出されないことがあり、発色に定量性がない。また、前処理時の容器へのサンプルの吸着により損失が起こりやすい。
【０００３】
検出されたバンドについては、構造解析のために染色されたゲルを切り出し化学的な処理をして、質量分析計やエドマンシーケンサ等の機器分析をする。その場合、拡散して広がったゲルから多くの夾雑成分が溶出して測定感度を低下させる。また、濃度の薄いゲルを構造解析する場合は、SDS-PAGEに添加できるサンプル量が決まっているため、同じサンプルを泳動し、同じ位置のゲルを何枚か切り出して使用する。この方法は、試料濃度は高まるが同時にゲル由来のノイズも増加させるため有効な方法ではない。ノイズ低減にはカラムによるクロマトグラフによる濃縮方法があるが、装置が高価なことや操作が煩雑で有効な手法ではない。特に、濃度が極端に薄い場合は、配管に吸着等が生じ有効に濃縮されない。また、ブロッティングによりゲルから膜に転写することでノイズの低減も試みられているが、転写するさいにゲルバンドとほぼ同じか僅かに拡散して広がることがある。特に、ゲルバンドと同じ四角の形状でブロッティングされた転写膜は、操作中に膜の角の部分から拡散が起こることなどから有効な手法ではない。
【０００４】
下記特許文献１に開示された核酸、蛋白質回収装置は、電気泳動で切り出したゲルを、再度電気泳動にかけて核酸もしくは蛋白質を回収するためのものであり、ブロッティング装置を応用するものではあるが、目的物質を濃縮するには効率が悪い。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２７３４９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明では、電気泳動した後のゲル中に分離された濃度の薄いバンドから微小なスポットに濃縮する方法と装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を達成するため、本発明は、（１）電気泳動後の泳動ゲルから生じた蛋白質、核酸及びその他の有機化合物の所定のバンドに転写用膜を接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜により小さなスポットとして濃縮して転写する、（２）該バンドに濃縮用筒を接触させ、該濃縮用筒を介して該蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を濃縮して転写用膜に転写する、または（３）複数のバンドに転写用膜を複数回接触させ、該蛋白質、核酸及び有機化合物を該転写用膜に濃縮して転写する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の低コストで操作性の高い方法および装置により、電気泳動で分離された蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を効率良く濃縮することが可能となった。濃縮により、極微量のサンプルでも定性分析のみならず、定量分析が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明を実施するには、濃縮用シートとしては、例えば、厚さ０．００１〜０．１ｍｍ、直径０．１〜５ｍｍ程度の穴を開けた樹脂性膜が例示される。また、濃度の薄いゲルバンド片をいくつかまとめて膜転写する場合は、内径１〜５ｍｍ程度、（特に先端濃縮したい場合は、転写膜側にテーパをつくっておくとよい）長さ２〜１０ｍｍ程度の樹脂性チューブに転写したいゲルバンド片をいれてブロッティングできる装置が例示される。さらに複数のゲルバンド片を同時に転写したい場合は、厚さ２〜１０ｍｍ程度、１００ｍｍ四方の樹脂性のプレートに２〜１０ｍｍ程度の穴を開け、そこに測定したいゲルバンド片を詰めてブロッティングできる装置が例示される。
【実施例】
【００１０】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施例を説明する。
[濃縮装置１]
図１は本発明のセミドライタイプのブロッティング装置の装置概念図である。
電源１はブロッティング装置に電圧を供給するものであり、電気泳動した目的物質のバンドを含むゲル６と、サンプルを濃縮させるために穴を開けた濃縮用シート５と、目的物質をブロッティングする転写用膜４を積層し、これらを挟み込んだ２枚の電極２から電圧を供給する。
【００１１】
最下部にマイナス電極２がくるようにセットし、電極２上に泳動用緩衝液で十分湿らせた濾紙３をのせ、その上に目的物質を含むゲル６をのせる。さらに上に濃縮用シート５をそれぞれのバンドに穴の位置を合わせてのせる。さらにメタノール処理を施した転写用膜４をのせ、さらに泳動用緩衝液で十分湿らせた濾紙３をのせて、最上部にはプラスの電極２をのせる。電源１により、ゲルの厚みや大きさに応じて１０Ｖ〜３０Ｖの電圧をかけ、３０分から１時間程度通電する。
【００１２】
図２は図１に示した丸囲部分の詳細図である。ゲルバンド内にある目的物質は、ゲルバンドより小さく開けられた穴を有する濃縮用シート５により転写用膜４により小さいスポットとして濃縮される。
【００１３】
[濃縮装置２]
図３は、ウェットタイプのブロッティング装置の装置概念図である。ブロッティングタンク８は、泳動用緩衝液を満たし、電気泳動した目的物質のバンドを含むゲル６と、目的物質をブロッティングする転写用膜４、サンプルを濃縮させるための濃縮用筒７を積層し、これらを挟み込んだ２枚の電極２を漬け込むことのできる上部の開いた樹脂製の箱である。
【００１４】
本装置は濃縮用筒７に数個のゲルバンド片を入れ、プラス側電極に転写用膜４をセットしてから両脇から濾紙３ではさみこみブロッティングタンク内に漬け込む。また、プラスとマイナスの電極２もブロッティング内に漬け込む。ゲルバンド片を濃縮用筒７にセットする場合は、ブロッティングタンクに満たされた泳動用緩衝液と同じ液体中で作業し筒状の中に気泡をいれないようにする。その後、転写用膜４および濾紙３で挟み込む場合も同様に緩衝液中で作業を行なう。全てがブロッティングタンク内に格納された後、電源１によって３０Ｖ〜１００Ｖの電圧を与え、数時間転写を行なう。筒状に詰められたそれぞれゲルバンド片から目的物質が溶出して転写膜に濃縮される。より小さなスポットにしたい場合は、筒を転写膜に対しテーパをつけると小さくなる。
【００１５】
[濃縮装置３]
図４は、濃縮させたいサンプルが多数ある場合に用いる濃縮用プレートである。濃縮用筒７を一枚のプレートに複数設けたもので、濃縮用筒と同様に用い、各穴にゲルバンド片を詰めて複数サンプルの濃縮を同時に行なうことができる。濃縮用プレートの濃縮用筒は、内部の筒を内径の異なるものに取り替えることで、対象サンプルの形状に対応させることが可能である。
【００１６】
［実施例１］
本実施例によりウェットタイプのブロッティング装置を用いて電気泳動ゲルサンプルの濃縮を行った。サンプルにはSDS-PAGE後にクマシーブリリアント（CBB）染色を行った100ngのウシ血清アルブミンを用い、泳動後のゲルから長さ5mm×幅10mm×厚さ1mmのサンプル部分４個を切り出した。ポリサルホン製ブロッティングタンク８に25mMトリス、192mMグリシン、20％メタノールの組成からなる泳動用緩衝液を満たした。直径5mmの穴を開けた10mm厚のポリエステル製プレートの穴に直径5mm、内径3mm、長さ10mmのシリコンチューブをはめ込んだ濃縮用プレートのチューブ内に、空気を入れないようゲルバンド片と泳動用緩衝液を入れた。白金被膜チタン製プラス電極側に転写用PVDF膜４をセットし、両脇から濾紙３ではさみこみ、プラス電極とステンレス製マイナス電極２の間に差し込んだ。全てをブロッティングタンク内に格納した後、電源１によって50Vの電圧を与え、5時間転写を行なった。結果、複数のゲルに含まれる目的物質は直径約5mmのスポットに転写され、目的物質の濃縮効果が得られた。また、肉眼でゲル片よりもCBBの発色が強くなったことからも、目的物質の濃縮効果が得られた。
【００１７】
［実施例２］
図５は、図１で転写膜が一部にのみ形成された転写用紙を用いた場合の詳細図である。濃縮用シート５に開けられた穴よりもやや大きい転写用膜４を転写用紙９上に固定する。ゲル６上のバンドは濃縮用シート５を通過し転写用膜４により小さいスポットとして転写される。
【００１８】
［実施例３］
目的物質を転写用膜にブロッティングした後に、新たに濃縮させたいゲル片が生じた場合は、既にブロッティングした同じ転写用膜に再度ブロッティングを行なった。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
電気泳動で分離された蛋白質、核酸及びその他の有機化合物を効率良く濃縮することが可能となったことにより、プロテオーム解析・ゲノム解析など微量サンプルを扱う生化学分野に効果的に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】セミドライタイプによるブロッティング装置の概念図である。
【図２】図１の丸囲部分の詳細図である。
【図３】ウェットタイプによるブロッティング装置の概念図である。
【図４】濃縮用プレートの図である。
【図５】転写用紙の図である。
【符号の説明】
【００２１】
１…電源、２…電極、３…濾紙、４…転写用膜、５…濃縮用シート、６…ゲル、７…濃縮用筒、８…ブロッティングタンク、９……転写用膜。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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