(57)【要約】【課題】  高純度で効率よく１，３−プロパンジオールを製造できる方法を提供する。【解決手段】  ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造することからなる、１，３−プロパンジオールの製造方法。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造することからなる、１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項２】
ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酸化して、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することからなる、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【請求項３】
ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを製造することからなる、アクロレインの製造方法。
【請求項４】
ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化してアクリル酸を製造することからなる、アクリル酸の製造方法。
【請求項５】
ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化的エステル化してアクリル酸エステルを製造することからなる、アクリル酸エステルの製造方法。
【請求項６】
該デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニット及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該菌体処理物は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなるトルエン処理菌体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該菌体処理物は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる固定化菌体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジオールの製造方法ならびにアクリル酸及びアクリル酸エステルの製造方法に関するものである。特に、本発明は、高純度で効率よく１，３−プロパンジオールを製造できる方法ならびに高純度で効率よくアクリル酸及びアクリル酸エステルを製造できる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、ポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとしてならびに環状化合物の合成用出発材料としてなど、広範な用途を有する有用な化合物である。
【０００３】
１，３−プロパンジオールの合成方法としては、従来、化学合成による方法および発酵による方法双方が公知である。前者の方法としては、例えば、エチレンオキシドをロジウム触媒を用いてカルボニル化して、１，３−プロパンジオールを製造する方法（例えば、特許文献１〜３参照）や得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元して、１，３−プロパンジオールを製造する方法（例えば、特許文献４参照）などが知られている。
【０００４】
また、後者の方法は、シトロバクター(Citrobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、エンテロバクター(Enterobacter)、イリオバクター(Ilyobacter)、クレブシエラ(Klebsiella)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、およびペロバクター(Pelobacter)等の１，３−プロパンジオール産生菌を用いて、グリセロールの発酵から１，３−プロパンジオールを製造する方法である。この方法は、脱水酵素によりグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）および水に転換する段階及びＮＡＤ+−リンク−酸化還元酵素により３−ＨＰを１，３−プロパンジオールに還元する段階の２段階反応からなる。また、所望の１，３−プロパンジオールの収率を上げるために、遺伝子組換え微生物を用いて、グリセリンから１，３−プロパンジオールを製造する方法が開示されている（例えば、特許文献５〜８参照）。
【０００５】
一方、アクリル酸は、アクリル繊維共重合体用、あるいはエマルションとして粘接着剤に用いられる他、塗料、繊維加工、皮革、建築用材等として広範な用途を有する。アクリル酸の製造方法は、従来公知であり、一般的にプロピレンからアクロレイン、アクロレインからアクリル酸という２段気相接触酸化によって製造される。この際中間材料として使用されるアクロレインは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを酸性条件下にすることによっても製造される。このため、アクリル酸を高純度でかつ安価に製造するために、アクロレイン、さらには３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを高純度にかつ効率よく製造することが好ましい。
【特許文献１】米国特許第４，８７３，３７８号明細書
【特許文献２】米国特許第４，８７３，３７９号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９３５，５５４号明細書
【特許文献４】米国特許第２，４３４，１１０号明細書
【特許文献５】特表２００１−５０４３３８号公報
【特許文献６】特表２００２−５１４４２６号公報
【特許文献７】米国特許第６，０２５，１８４号明細書
【特許文献８】国際公開第０１／１２８３３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記１，３−プロパンジオールの製造方法のうち、前者の化学合成による方法は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの転化率及び選択率が不十分であり、副生成物を除去するための精製工程を必要とし、経済的に好ましくない。加えて、また、原料としての３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが副生成物を含む場合には、次工程の１，３−プロパンジオールの製造工程で二次生成物がさらに副生する場合があり、二次生成物の種類によっては、精製が困難になったり、その後にこの１，３−プロパンジオールを原料として用いて繊維を製造した際に繊維等の製品に変色や重合不良をもたらす原因になる恐れがある。このため、１，３−プロパンジオールの製造における原料として使用される３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドにおける副生成物含量は可能なかぎり少ないことが望ましい。
【０００７】
また、後者の発酵による製造方法は、一般的な発酵によるグリセリンから１，３−プロパンジオールへの転化率が５０％程度と低く、十分ではないという問題がある。このような問題を解消するために、遺伝子組換え微生物を用いた１，３−プロパンジオールの製造も報告されているが、このような微生物を用いたとしても、高い転化率を達成することはきわめて困難である。さらに、発酵培養液には、一般的に、培養液中に含まれる栄養素や他の微生物産物などの、多くの副生成物を含む。このため、発酵を用いた方法では、化学合成による以上に精製工程が複雑になり、やはり経済的に好ましくない。上記問題に加えて、上記発酵による方法では、目的産物である１，３−プロパンジオールの精製工程において、シクロヘキサン等の有機溶剤が使用される場合が多いが、環境を考慮するとこのような有機溶剤の後処理がさらに必要であるという問題もある。
【０００８】
したがって、本発明は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを選択率良くかつ高い転化率で製造でき、このような３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから高純度でかつ高い収率で１，３−プロパンジオールを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明の他の目的は、精製工程に有機溶剤を使用しない１，３−プロパンジオールの製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる他の目的は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを選択率良くかつ高い転化率で製造でき、このような３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから高純度でかつ高い収率で、アクロレイン、アクリル酸及びアクリル酸エステルを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を行なった結果、グリセリンに、ジオール／グリセロールデヒドラターゼならびにジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を有する菌体やトルエン処理菌体や固定化菌体を作用させると、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドがグリセリンから高い収率で製造でき、かつグリセリンをほとんど単独で使用するため、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを高純度で製造できるため、このようにして得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において水素添加することによって、所望の１,３−プロパンジオールが高純度でかつ高収率で製造できることを知得した。
【００１２】
また、本発明者らは、上記したようにしてほとんど副生成物を含まずに得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを酸性条件下で反応させることによって、アクロレインが得られるが、このアクロレインも、出発原料に副生成物がほとんど含んでいないため、高純度で製造でき、ゆえにこのアクロレインからアクリル酸が高純度で製造できることも知得した。加えて、本発明者らは、アクロレインの酸化的エステル化を行なうことによって、アクリル酸エステルが高純度で製造できることも知得した。
【００１３】
上記知見に基づいて、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、上記諸目的は、下記（１）〜（１０）によって達成される。
【００１５】
（１）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造することからなる、１，３−プロパンジオールの製造方法。
【００１６】
（２）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酸化して、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することからなる、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
【００１７】
（３）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを製造することからなる、アクロレインの製造方法。
【００１８】
（４）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化してアクリル酸を製造することからなる、アクリル酸の製造方法。
【００１９】
（５）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化的エステル化してアクリル酸エステルを製造することからなる、アクリル酸エステルの製造方法。
【００２０】
（６）上記デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（７）上記デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、前記（６）に記載の方法。
【００２２】
（８）上記デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニット及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される、前記（７）に記載の方法。
【００２３】
（９）上記菌体処理物は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなるトルエン処理菌体である、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（１０）上記菌体処理物は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる固定化菌体である、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の１,３−プロパンジオールの製造方法は、（１）ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼ（本明細書中では、一括して「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ」、または単に「デヒドラターゼ」とも称する）ならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子（本明細書中では、一括して「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」、または単に「デヒドラターゼ再活性化因子」とも称する）を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、（２）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加することを有することを特徴とするものである。当該方法によると、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを、発酵法によらずに、即ち、菌体内部のジオール／グリセロールデヒドラターゼ及びジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をグリセリンに作用させて製造するため、得られる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは副生成物をほとんど含まずに製造できる。さらにこのような方法によると、ほとんどのグリセリンを反応に使用できるため、高い転化率が達成できる。したがって、本発明の方法によると、このようなほとんど副生成物を含まない３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを原料として液相において水素添加することができるため、得られた１,３−プロパンジオールは高純度を有する。上記利点に加えて、反応終了後には、１，３−プロパンジオール及び水が主に残るのみであるため、精製に有機溶剤を使用する必要がないため、有機溶剤の回収や後処理が不用であり、また、環境の面でも好ましい。
【００２６】
また、本発明は、上記したようなほとんど副生成物を含まない３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを酸性条件下で反応させてアクロレインを得、さらにアクロレインを酸化してアクリル酸を製造する方法；および上記したようなほとんど副生成物を含まない３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを酸性条件下で反応させてアクロレインを得、さらにアクロレインを酸化的エステル化してアクリル酸エステルを製造する方法に関するものである。当該方法によると、原料たる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは副生成物が少ないため、これを用いて製造されるアクロレイン、さらにこれから製造されるアクリル酸やアクリル酸エステルもまた、高純度を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明の第一は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造することからなる、１，３−プロパンジオールの製造方法に関するものである。
【００２９】
本発明において、「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ」または「デヒドラターゼ」とは、グリセリンを脱水して、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（本明細書中では、「３−ＨＰ」とも称する）及び水に変換する触媒作用を有する酵素であり、このような作用を有するものであれば、特に制限されることなく、公知のものが使用できる。これらのうち、酵素の寿命を考慮すると、グリセロールデヒドラターゼが好ましく使用される。
【００３０】
本発明において、グリセロールデヒドラターゼは、特に制限されることなく、この酵素を有する／発現するいずれの源由来であってもよい。具体的には、Klebsiella属、Citrobacter属、Clostridium属、Lactobacillus属、Enterobacter属、Caloramator属、Salmonella属及びListeria属に属する微生物があり、より詳しくは、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter pneumoniae、Clostridium pasteurianum、Lactobacillus leichmannii、Citrobacter intermedium、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus brevis、Enterobacter agglomerans、Clostridium butyricum、Caloramator viterbensis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus hilgardii、Salmonella typhimurium、Listeria monocytogenes、及びListeria innocua由来のグリセロールデヒドラターゼなどが挙げられる。これらのグリセロールデヒドラターゼは、単独で使用されてもあるいは２以上の混合物として使用されてもあるいは下記に詳述されるジオールデヒドラターゼと組み合わせて使用されてもよい。
【００３１】
上記源からグリセロールデヒドラターゼを単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００３２】
また、本発明において、ジオールデヒドラターゼもまた、特に制限されることなく、この酵素を有する／発現するいずれの源由来であってもよい。具体的には、Klebsiella属、Propionibacterium属、Clostridium属、Lactobacillus属、Salmonella属、Citrobacter属、Flavobacterium属、Acetobacterium属、Brucella属、及びFusobacterium属に属する微生物があり、より詳しくは、Klebsiella pneumoniae、Propionibacterium freudenreichii、Clostridium glycolicum、Lactobacillus brevis、Salmonella typhimurium、Citrobacter freundii、Lactobacillus buchneri、Brucella melitensis、Fusobacterium nucleatum、Klebsiella oxytoca、Propionibacterium freudenreichii、Salmonella typhimurium、Listeria monocytogenes、及びListeria innocua由来のジオールデヒドラターゼなどが挙げられる。これらのジオールデヒドラターゼは、単独で使用されてもあるいは２以上の混合物として使用されてもあるいは上記グリセロールデヒドラターゼと組み合わせて使用されてもよい。
【００３３】
上記源からジオールデヒドラターゼを単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００３４】
本発明において、「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」または「デヒドラターゼ再活性化因子」とは、グリセリン→３−ＨＰ＋Ｈ２Ｏの反応を触媒して失活したデヒドラターゼの活性を再度促す（再活性化する）因子を意味する。より詳細には、デヒドラターゼが触媒するグリセリン→３−ＨＰ＋Ｈ２Ｏの反応には、補酵素Ｂ１２が関与しているが、デヒドラターゼは、グリセリン→３−ＨＰ＋Ｈ２Ｏの反応を展開・触媒すると、補酵素Ｂ１２がつぶれて、活性中心が失活してしまうが、ここでデヒドラターゼ再活性化因子がつぶれた補酵素Ｂ１２を新たな補酵素Ｂ１２と置換して、デヒドラターゼの活性を再度促して（再活性化して）、デヒドラターゼをグリセリンの脱水反応に再使用できるようにする。このようにデヒドラターゼを再活性化する作用を有するものを、本発明においては、「ジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」または「デヒドラターゼ再活性化因子」と称する。このデヒドラターゼ再活性化因子は、上記したような作用を有するものであれば、特に制限されることなく、公知の、不活化したグリセロールデヒドラターゼを活性化するグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び不活化したジオールデヒドラターゼを活性化するジオールデヒドラターゼ再活性化因子が使用される。なお、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子は、上記したもののいずれの組み合わせで使用されてもよい。好ましくは、デヒドラターゼ再活性化因子は、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成され、より好ましくは、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成され、特に好ましくはジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニット及びジオールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットから構成される。これらの再活性化因子は、単独で使用されてもあるいは２以上の混合物として使用されてもよい。
【００３５】
本発明において、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子は、その源は特に制限されることなく、上記したようなグリセロールデヒドラターゼを有する微生物のゲノム上にコードされており、ラージサブユニット及びスモールサブユニットから構成されている。具体的には、Lactobacillus属、Klebsiella属、Citrobacter属、Clostridium属、及びEnterobacter属に属する微生物由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子があり、より詳しくは、Lactobacillus sp.、Klebsiella pneumoniae、Lactobacillus leichmannii、Citrobacter freundii、Citrobacter intermedium、Lactobacillusreuteri、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus brevis、Clostridium pasteurianum、Enterobacter agglomerans、及びClostridiumbutyricumなどが挙げられる。これらのうち、Lactobacillusに属する微生物、例えば、Lactobacillus sp.、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus brevis由来のものが好ましく使用され、特にLactobacillus sp.及びLactobacillus reuteri由来のものが好ましく使用される。なお、グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子との源は、同一であってもあるいは異なるものであってもよい。
【００３６】
上記源からグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００３７】
また、本発明において、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子は、その源は特に制限されることなく、上記したようなジオールデヒドラターゼを有する微生物ゲノム上にコードされており、ラージサブユニット及びスモールサブユニットから構成されている。なお、このジオールデヒドラターゼ再活性化因子は、グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラターゼ双方を再活性化できるため、本発明においては好ましく使用される。具体的には、Klebsiella属、Citrobacter属、Propionibacterium属、Lactobacillus属、Flavobacterium属、及びAcetobacterium属に属する微生物由来のジオールデヒドラターゼ再活性化因子があり、より詳しくは、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter freundii、Propionibacterium freudenreichii、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Flavobacterium sp.、及びAcetobacterium sp.などが挙げられる。これらのうち、Lactobacillusに属する微生物、即ち、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、特にLactobacillus brevis由来のジオールデヒドラターゼ再活性化因子が好ましく使用される。なお、ジオールデヒドラターゼとジオールデヒドラターゼ再活性化因子との源は、同一であってもあるいは異なるものであってもよいが、再活性化能が優れるという点で、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットが好ましく使用され、ゆえに、ジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットならびにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはジオールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットの組み合わせが、より好ましく使用される。
【００３８】
上記源からジオールデヒドラターゼ再活性化因子を単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００３９】
または、デヒドラターゼおよび／またはデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を含む組換え微生物、ならびにデヒドラターゼおよび／またはデヒドラターゼ再活性化因子の活性が向上するように変異をかけられた微生物を、上記デヒドラターゼ／デヒドラターゼ再活性化因子を有する／発揮する微生物源として使用してもよい。このような組換え微生物は、公知の方法を用いることにより作製でき、例えば、デヒドラターゼを発現する微生物としては、具体的には、特表２００１−５０４３３８号公報、特表２００２−５１４４２６号公報、特表２００１−５０３６３６号公報、米国特許第６，０２５，１８４号明細書、国際公開第０１／１２８３３号パンフレット、国際公開第９６／３５７９５号パンフレット、国際公開第０１／０４３２４号パンフレット、FEMS Microbiology Letters 164 (1998) 21-28, Applied and Environmental Microbiology, Jan. 1998, p.98-105, Applied and Environmental Microbiology, Dec. 1991, p.3541-3546などに開示されるものがある。また、デヒドラターゼの活性が向上するように変異をかけられた微生物は、公知の方法を用いることにより作製でき、例えば、デヒドラターゼ活性が向上した変異微生物としては、具体的には、国際公開第００／７００５７号パンフレットなどに開示されるものがある。
【００４０】
本発明において、ジオール／グリセロールデヒドラターゼならびにジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを製造する。この際、「菌体」及び「菌体処理物」は、グリセリンを微生物のエネルギー源として用いることがないため、非常に高い転化率を達成することができ、また、得られる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは副生成物が少ない。本発明では、菌体処理物が好ましく使用される。これは、菌体処理物を使用すると、発酵以外の方法によりグリセリンから３−ＨＰへの変換が可能であり、高い転化率や低い副生成物含量が達成できるためである。
【００４１】
なお、本明細書において、「菌体」とは、本発明による反応後、適当な培地に戻した場合に、その菌体が増殖能を有するか否かは問題ではなく、グリセリンを含む反応系においてグリセリンの資化及びグリセリンをエネルギー源にした増殖を行なわないものをいう。例えば、培養後回収した菌体で本発明による反応中でグリセリンの資化、グリセリンを用いた増殖を行なわないものなどが、本発明による菌体に該当する。より具体的には、適当なホストへジオール／グリセロールデヒドラターゼ形質およびジオール／グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子形質を導入した組換え菌体などが挙げられる。また、「発酵」とは、グリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得る反応系中で、同時に、グリセリンの資化および／またはグリセリンをエネルギー源にした増殖および／またはグリセリンの酸化等を行なう微生物の活動を意味する。このため、本発明において、「発酵以外の方法」とは、グリセリンを含む本発明による反応系でグリセリンの脱水による３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成と同時に、グリセリンの資化およびグリセリンをエネルギー源にした増殖およびグリセリンの酸化を伴わない反応方法を意味する。さらに、「菌体処理物」とは、本発明の反応に使用しやすいように菌体に何らかの処理を行なったものを意味する。具体的には、菌体処理物の例としては、上記したようなデヒドラターゼの固定化物及びデヒドラターゼ再活性化因子の固定化物（例えば、固定化酵素）；上記したようなデヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子を含む菌体をトルエン等の有機溶剤で処理したトルエン処理菌体；ならびに上記したようなデヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子を有する菌体の固定化菌体などが挙げられる。これらのうち、トルエン処理菌体及び固定化菌体が好ましく使用される。因子の固定化物の製造における固定化方法は、特に制限されることなく、不溶性担体に因子を共有結合、イオン結合、吸着等によって結合させる方法；因子を相互に架橋させる方法；高分子の網目構造の内部に因子を包括する方法などの、公知の方法が使用される。
【００４２】
また、固定化菌体の製造における固定化方法もまた、特に制限されることなく、上記したようなデヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子を有する微生物を不溶性担体に担持する方法；当該微生物をゲルマトリックスで吸収または包括して固定化する方法；内部空間に閉じ込める方法などの、公知の方法が使用される。
【００４３】
さらに、トルエン処理菌体の製造方法もまた、特に制限されることなく、上記したようなデヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子を有する微生物に、トルエンを添加、攪拌することによって、因子は菌体外に出ない位の大きさの孔を細胞壁に形成する方法などの、公知の方法が使用される。上記方法においては、トルエン処理菌体を製造するのに、トルエンを使用したが、トルエンの代わりに、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル等の有機溶剤を使用してもよい。これらのうち、トルエンが好ましく使用される。この際、上記有機溶剤の添加量は、菌体に対して、０．１〜１０質量％、より好ましくは０．２〜５質量％である。
【００４４】
本発明において、固定化菌体及び固定化因子は、どのような形態で使用されてもよく、具体的には、膜状、粒子状、ひも状、ひだ状などがある。操作の容易性などを考慮すると、ひも状及び粒子状が好ましく使用される
このように菌体および／または菌体処理物を使用することによって、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子を含む菌体および／または菌体処理物の安定化が図れる；特に菌体処理物を使用する際には、これらの連続反復使用が可能であるという利点に加えて、培養液を使用せずにグリセリンを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに簡便に変換できるので、所望の３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの純度及び収率が向上できるという利点がある。
【００４５】
本発明において、グリセリンの３−ＨＰへの変換方法は、特に制限されず、因子、固定化菌体及び固定化因子を用いて従来公知の物質変換方法と同様の方法が使用できる。本発明によるグリセリンの３−ＨＰへの変換は、菌体および／または菌体処理物（例えば、トルエン処理菌体や固定化菌体など）を用いて行なわれるため、発酵法による場合とは異なり、得られる３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドは副生成物をほとんど含まず、さらにほとんどのグリセリンが反応に使用されるため、高い転化率が達成できる。また、従来の化学法に比しても、やはり原料は、ほとんどすべてがグリセリンであるため、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの転化率及び選択率が非常に高く、また、純度も高いので、副生成物を除去するための精製工程が簡便に行なうことができ、また、経済的に非常に有利である。
【００４６】
本発明において、ジオールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼを始めとするデヒドラターゼは、上記したように、補酵素Ｂ１２に依存型であり、グリセリンの３−ＨＰへの変換には補酵素Ｂ１２の存在が必須である。グリセリンの３−ＨＰへの変換における補酵素Ｂ１２の存在量は、グリセリンの３−ＨＰへの変換が十分進行する量であれば特に制限されず、基質濃度などによって異なる。補酵素Ｂ１２の存在量は、基質濃度５０ｍＭあたり、補酵素Ｂ１２濃度が１〜１０００μＭ、より好ましくは１０〜８００μＭとなるような量であることが好ましい。また、菌体および／または菌体処理物の量は、使用される形態（菌体、固定化菌体及び固定化因子）、ならびにこれらの源、基質（グリセリン）濃度及び反応液量などによって異なり、また、グリセリンの３−ＨＰへの変換が十分進行する量であれば特に制限されない。例えば、菌体および／または菌体処理物を回分式で使用する場合には、酵素が、基質５０ｍｍｏｌあたり、１０〜１００万Ｕ、より好ましくは５０〜５０万Ｕ程度存在するような量であることが好ましい。また、例えば、固定化菌体を流通反応により使用する場合には、菌体および／または菌体処理物の量は、使用される微生物の種類、酵素の寿命や反応液の流速（ＬＨＳＶ）などによって異なり、また、グリセリンの３−ＨＰへの変換が十分進行する量であれば特に制限されないが、回分式の場合の量に比べておよそ１０〜１００倍量が通常、使用される。すなわち、固定化菌体を流通反応式で使用する場合には、基質５０ｍｍｏｌあたり、１００〜１億Ｕ、より好ましくは５００〜５０００万Ｕ程度存在するような量であることが好ましい。なお、上記酵素の単位は、ジオール／グリセロールデヒドラターゼ酵素活性を示す菌体および／または菌体処理物が１分間あたり１μｍｏｌの１，２−プロパンジオールをプロピオンアルデヒドに変換できる能力を、「１Ｕ」と定義し、その測定方法は、１，２−プロパンジオールからのプロピオンアルデヒドの生成が検出可能な方法であれば特に制限されずに使用できる。なお、本発明においては、プロピオンアルデヒド、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成は、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩を用いて検出する方法を用いて検出した。
【００４７】
以下、本発明によるグリセリンの３−ＨＰへの変換の好ましい一実施態様を記載する。例えば、粒子状の固定化菌体および／または固定化因子を使用する場合には、適当な緩衝液（例えば、リン酸カリウムバッファー）、上記したような適当量の補酵素Ｂ１２、グリセリンなどを含む混合溶液中に、上記したような適当な酵素が存在するように、当該粒子を入れて、１０〜９０℃で、より好ましくは１５〜８５℃で、１〜３６０分間、好ましくは５〜１２０分間、攪拌することによって、３−ＨＰを形成する。このようにして生成した３−ＨＰは、粒子上の固定化菌体と混合した状態にあるが、瀘過、限外瀘過、沈降などの公知の方法によって、固定化菌体と容易に分離できる。または、粒子状の固定化菌体および／または固定化因子を充填したカラムに、適当な緩衝液（例えば、リン酸カリウムバッファー）、上記したような適当量の補酵素Ｂ１２、グリセリンなどを含む混合溶液を、１０〜９０℃で、より好ましくは１５〜８５℃で、０．１〜５０ＬＨＳＶの流速で、好ましくは０．２〜４０ＬＨＳＶの流速で、流すことによって、３−ＨＰを形成してもよい。この際、グリセリンの濃度は、因子による作用を十分受けられるような濃度であれば特に制限されないが、好ましくは０．１〜５０（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．２〜４０（ｗ／ｖ）％である。また、上記方法において、グリセリンを溶解するのに使用される液体は、グリセリンが溶解するものであれば特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、リン酸カリウムバッファー、クエン酸カリウムバッファー、リン酸緩衝液、グッドの緩衝液、トリス緩衝液等の、各種緩衝液などが挙げられる。これらのうち、水、リン酸カリウムバッファー、リン酸緩衝液が好ましく使用される。本発明では、酵素活性のために、反応系中にカリウムイオンが存在することが好ましい。反応系中にカリウムイオンを存在させるために、反応媒体として、リン酸カリウムバッファー、クエン酸カリウムバッファー、その他のカリウム塩水溶液等のカリウム塩を含む緩衝液を使用することが特に好ましい。カリウムイオンの濃度は、特に制限されないが、好ましくは５ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００４８】
本発明の方法によると、このようにして得られた３−ＨＰは、液相（好ましくは、水溶液中で）化学合成法によってさらに水素添加されて、所望の１,３−プロパンジオールが形成する。この際、「化学合成法」とは、発酵法によらない化学的な合成方法を意味する。本発明によるように、発酵法によらずに、化学合成法を用いて３−ＨＰから１，３−プロパンジオールを製造することによって、所望の１，３−プロパンジオールの純度及び収率が向上できるという利点がある。３−ＨＰから１,３−プロパンジオールを製造するための化学合成法は、特に制限されるものではなく、公知の方法が使用される。例えば、パラジウムカーボンを加え、気相部を水素で置換し、攪拌しながら水素で水素化する方法；３０〜１８０℃の温度、５〜３００バール水素圧力で、ｐＨ値２．５〜７．０の水溶液中で、酸化物担体上にルテニウムが担持された不均一触媒存在下で３−ＨＰを水素化する方法（例えば、特表２００２−５１６６１４号公報）；酸化チタン上に白金が担持された担体触媒上で、水溶液中の５〜１００重量％濃度の３−ＨＰを、ｐＨ値２．５〜６．５で、温度３０〜１８０℃及び水素圧５〜３００バールで、水素添加する方法（例えば、特開平５−２１３８００号公報）；３−ＨＰを、水溶液中で、ＰｔがＴｉＯ２に担持した触媒やＮｉ／Ａｌ２Ｏ３／ＳｉＯ２−触媒等の触媒の存在下に、水素圧５〜３００バール、ｐＨ値２．５〜６．５及び温度３０〜１８０℃で、接触水素添加する方法（例えば、特開平６−４０９７３号公報）などが挙げられる。
【００４９】
本発明の方法によると、１，３−プロパンジオール及び水が主に生成し、そのほかの副生成物や二次生成物はほとんど存在しない。このため、精製が主に水の除去のみであり、複雑でなく、その後に１，３−プロパンジオールを原料として用いて繊維を製造した際にも繊維等の製品に変色や重合不良をもたらす恐れがない。この際使用できる１，３−プロパンジオールの精製方法としては、特に制限されず、公知の精製方法が使用できるが、例えば、蒸留、逆浸透膜等の方法が使用できる。
【００５０】
本発明によると、上記と同様にして得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酸化することによって、３−ヒドロキシプロピオン酸が製造される。したがって、本発明の第二は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酸化して、３−ヒドロキシプロピオン酸を製造することからなる、３−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法に関するものである。なお、第二の態様において、グリセリンから３−ＨＰの製造については、上記第一の態様と同様であるため、ここでは説明を省略する。
【００５１】
本発明において、３−ＨＰから３−ヒドロキシプロピオン酸の製造は、液相で（好ましくは、水溶液中で）３−ＨＰを酸化することによって、行なわれるが、この際使用される方法は、特に制限されるものではなく、プラチナカーボン、パラジウムカーボン等を使用した方法などの、公知の方法が使用できる。具体的には、パラジウムカーボンを加え、気相部を酸素で置換し、攪拌しながら酸素で酸化する方法；３−ＨＰ反応液に触媒として、プラチナカーボンと炭酸水素ナトリウムを入れ、酸素と接触させて反応させる方法などが挙げられる。
【００５２】
本発明の方法によると、３−ヒドロキシプロピオン酸が主に生成する。このため、精製が容易である。この際、精製は必ずしも必要ではないが、使用する際の３−ヒドロキシプロピオン酸の精製方法としては、特に制限されず、公知の精製方法が使用できるが、例えば、蒸留、逆浸透膜等の方法が使用できる。
【００５３】
また、本発明によると、上記と同様にして得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを酸性条件下で反応することによって、アクロレインが製造される。したがって、本発明の第三は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを製造することからなる、アクロレインの製造方法に関するものである。また、本発明によると、本発明の第三の態様で得られたアクロレインを液相において酸化することによって、アクリル酸が製造される。したがって、本発明の第四は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化してアクリル酸を製造することからなる、アクリル酸の製造方法に関するものである。なお、第三及び第四の態様において、グリセリンから３−ＨＰの製造については、上記第一の態様と同様であるため、ここでは説明を省略する。
【００５４】
本発明において、３−ＨＰからアクロレインの製造は、３−ＨＰを酸性条件下で反応させることによって、容易に達成される。例えば、３−ＨＰを含む溶液に、ｐＨが１〜５、好ましくは１．５〜４．５となるように、塩酸、硫酸、硝酸等の酸、好ましくは塩酸を、添加・混合した後、５〜９０℃、好ましくは７〜８５℃で、１〜３６０分間、好ましくは２〜１２０分間、静置することによって、アクロレインが効率よく製造できる。この工程では、酸以外の成分は使用しないため、副生成物がほとんど存在せず、また、上記反応は高い転化率及び選択率を有するため、アクロレインは、高純度でかつ高収率で製造できる。
【００５５】
本発明において、このようにして形成したアクロレインは、次に触媒の存在下で酸化されて、アクリル酸となる。この際、アクロレインからアクリル酸の製造方法は、特に制限されるものではなく、特開昭６４−６３５４３号公報、特開昭６３−１４６８４１号公報などの、公知の方法が使用できる。具体的には、アクロレインを酸化してアクリル酸とするのに使用される触媒は、特に制限されるものではなく、公知の触媒が単独であるいは組み合わせて使用される。例えば、モリブデンおよびバナジウムを含むものが使用でき、好ましくは一般式Ｍｏａ−Ｖｂ−Ｗｃ−Ｃｕｄ−Ａｅ−Ｂｆ−Ｃｇ−Ｏｘ（Ｍｏはモリブデン、Ｖはバナジウム、Ｗはタングステン、Ｃｕは銅、Ａはアンチモン、ビスマス、スズ、ニオブ、コバルト、鉄、ニッケルおよびクロムから選ばれる少なくも一種の元素を表し、Ｂはアルカリ金属およびアルカリ土類金属から選ばれる少なくとも１種の元素を表し、Ｃはケイ素、アルミニウム、ジルコニウムおよびチタニウムから選ばれた少なくとも１種の元素を表し、Ｏは酸素を表し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇおよびｘは、それぞれＭｏ、Ｖ、Ｗ、Ｃｕ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＯの原子比を表し、ａ＝１２としたとき、ｂ＝２〜１４、ｃ＝０〜１２、ｄ＝０．１〜５、ｅ＝０〜５、ｆ＝０〜５、ｇ＝０〜２０であり、ｘは各元素の酸化状態により定まる値である）で示されるものが例示できる。また、この際使用される触媒の調製方法および混合成形方法もまた、特に限定されるものではなく、一般に用いられている方法および原料を採用することができる。また、触媒の形状についても特に限定されず、球状、円柱状、円筒状などとすることができ、成形方法も担持成形、押し出し成形、打錠成形などを用いることができ、更に耐火用担体にこれらの触媒物質を担持させた形態のものも有用である。
【００５６】
また、アクロレインからアクリル酸への反応条件もまた特に制限されないが、例えば、アクロレインを、アクリル酸に転化するのに要する酸素及びスチームと混合し、このアクロレイン含有ガスを、反応圧力が常圧から０．５ＭＰａの範囲、空間速度３００〜５，０００ｈｒ-1（ＳＴＰ）の範囲で供給し、反応温度は２００〜４００℃、好ましくは２２０〜３８０℃に制御して行なう。
【００５７】
このようにして得られたアクリル酸は、常法によって回収される。例えば、アクリル酸生成ガスを熱交換器で冷却した後、重合禁止剤を含む捕集溶剤と向流接触させて、アクリル酸水溶液を得、これを抽出、蒸留、共沸蒸留等の方法によって、アクリル酸として単離される。
【００５８】
また、本発明において、上記第三の態様で得られたアクロレインは、次に触媒の存在下で酸化的エステル化されて、アクリル酸エステルとなる。したがって、本発明の第五は、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子および／またはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセリンを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、該３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから液相中で酸性条件下でアクロレインを得、さらに該アクロレインを液相において酸化的エステル化してアクリル酸エステルを製造することからなる、アクリル酸エステルの製造方法に関するものである。この際、アクロレインからアクリル酸エステルの製造方法は、特に制限されるものではなく、上記アクリル酸の製造において使用されたのと同様の触媒が使用できる。また、アクロレインからアクリル酸エステルへの反応条件もまた特に制限されないが、例えば、上記アクリル酸の製造において使用されたのと同様の条件が使用できる。このようにして得られたアクリル酸エステルは、常法によって回収される。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明の実施例により具体的に説明する。
【００６０】
実施例１
E. coli JM109をホストとして、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点から順に、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロモーターの構成を有するベクター１のｔａｃプロモーターの下流側に、Klebsiella pneumoniae ATCC25955のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子を組み込んだベクター１(DD)と、ｐ１５Ａ由来の複製開始点から順に、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロモーターの構成を有するベクター２のｔａｃプロモーターの下流側に、同じくKlebsiella pneumoniae ATCC25955のジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を組み込んだベクター２(ddrAddrB)を導入した菌株JM109/ベクター１(DD)/ベクター２(ddrAddrB)を、アンピリシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１５時間培養した。この培養液を、アンピリシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地  ２００ｍｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養開始後、ＯＤ６６０＝０．８になった時、１ｍＭの濃度となるようにＩＰＴＧを培養液に加え、さらに５時間培養した後、培養を停止した。菌体は、遠心分離機にて回収した。回収した菌体をｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで２度洗浄し、ＯＤ６６０＝０．２となるように、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーに懸濁し、この菌体懸濁液を粗酵素液とした。
【００６１】
この粗酵素液４ｍｌに、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファー３ｍｌ、２Ｍグリセリン１ｍｌ、０．５Ｍ  ＫＣｌ  １ｍｌ、１５０μＭ補酵素Ｂ１２  １ｍｌを加えて、３７℃で６０分間反応を行なった。反応液の一部をとり、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量を行なった。反応液に対して１倍量の０．１Ｍクエン酸カリウムバッファー（ｐＨ３．０）を添加して、反応を停止した。これに、１倍量の水を加え、０．５倍量の０．１％３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩一水和物水溶液を添加し、３０５ｎｍの吸光度を測定し、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの濃度を決定した。この結果、反応液中には０．１Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが生成した。残りの反応液を瀘過し、濾液を蓋つきの試験管に入れた後、５％パラジウムカーボン０．０１５ｇを加え、気相部を水素で置換し、常圧で５００ｍｌの水素を風船に入れて、気相部に接続して密閉し、攪拌しながら５時間、６０℃の湯浴中で反応を行なった。反応液を分析した結果、１，３−プロパンジオールが０．０９８Ｍの濃度で確認された。
【００６２】
実施例２
E. coli JM109をホストとして、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点から順に、アンピシリン耐性遺伝子、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロモーターの構成を有するベクター１のｔａｃプロモーターの下流側に、Klebsiella pneumoniae ATCC25955のグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を組み込んだベクター１(GD)と、ｐ１５Ａ由来の複製開始点から順に、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ｌａｃＩ遺伝子、ｔａｃプロモーターの構成を有するベクター２のｔａｃプロモーターの下流側に、同じくKlebsiella pneumoniae ATCC25955のジオールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を組み込んだベクター２(ddrAddrB)を導入した菌株JM109/ベクター１(GD)/ベクター２(ddrAddrB)を、アンピリシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で１５時間培養した。この培養液を、アンピリシン５０μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地  ２００ｍｌに接種し、３７℃で振盪培養した。培養開始後、ＯＤ６６０＝０．８になった時、１ｍＭの濃度となるようにＩＰＴＧを培養液に加え、さらに５時間培養した後、培養を停止した。菌体は、遠心分離機にて回収した。回収した菌体をｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで２度洗浄し、ＯＤ６６０＝０．２となるように、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁液に、最終濃度が１％となるようにトルエンを加え、ボルテックスミキサーで５分間攪拌した後、遠心分離にて菌体を回収した。菌体を、ＯＤ６６０＝０．２となるように、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁液を、トルエン処理菌体液とした。
【００６３】
このトルエン処理菌体液４ｍｌに、ｐＨ８の５０ｍＭリン酸カリウムバッファー３ｍｌ、２Ｍグリセリン１ｍｌ、０．５Ｍ  ＫＣｌ  １ｍｌ、１５０μＭ補酵素Ｂ１２  １ｍｌを加えて、３７℃で２０分間反応を行なった。反応液の一部をとり、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量を行なった。反応液に対して１倍量の０．１Ｍクエン酸カリウムバッファー（ｐＨ３．０）を添加して、反応を停止した。これに、１倍量の水を加え、０．５倍量の０．１％３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩一水和物水溶液を添加し、３０５ｎｍの吸光度を測定し、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの濃度を決定した。この結果、反応液中に０．１９６Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドが生成したことを確認した。また、グリセリンから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの転化率は、９８％であった。残りの反応液を瀘過し、濾液を蓋つきの試験管に入れた後、５％パラジウムカーボン０．０１５ｇを加え、気相部を水素で置換し、常圧で５００ｍｌの水素を風船に入れて、気相部に接続して密閉し、攪拌しながら５時間、６０℃の湯浴中で反応を行なった。反応液を分析した結果、１，３−プロパンジオールが０．１９６Ｍの濃度で確認された。
【００６４】
実施例３
実施例２と同様にして、０．１９６Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（対グリセリン転化率９８％）を製造し、これを含む反応液を、３５％塩酸でｐＨ２に調整し、１時間、常温にて静置した。得られた反応液中のアクロレインを定量したところ、０．１３０Ｍのアクロレインが生成したことを確認した。
【００６５】
実施例４
実施例１と同様にして、０．１８８Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（対グリセリン転化率９４％）を製造し、これを含む反応液を蓋付き試験管に入れた後、５％パラジウムカーボン０．０１５ｇを添加し、気相部を酸素に置換し、常圧で１リットルの酸素を風船に入れて、気相部に接続して密栓し、攪拌しながら、５時間、６０℃で反応を行なった。この反応液を分析した結果、０．１５０Ｍの３−ヒドロキシプロピオン酸が生成したことを確認した。
【００６６】
実施例５
実施例２と同様にして、０．１９６Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（対グリセリン転化率９８％）を製造し、これを含む反応液１０ｍｌを、３５％塩酸でｐＨ２に調整し、１時間、常温にて静置した。得られた反応液中のアクロレインを定量したところ、０．１５０Ｍのアクロレインが生成したことを確認した。
【００６７】
次に、このようにして得られたアクロレインに、メタノールを加え、酸化触媒として５％パラジウムカーボン０．０１５ｇを用いて、良く攪拌しながら、酸素雰囲気下で反応を行なったところ、０．１８８Ｍのアクリル酸メチルが生成した。
【００６８】
実施例６
実施例２と同様にして、０．１９６Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（対グリセリン転化率９８％）を製造し、これを含む反応液を、３５％塩酸でｐＨ２に調整し、１時間、常温にて静置した。得られた反応液中のアクロレインを定量したところ、０．１４８Ｍのアクロレイン（対３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド転化率９６．９％）が生成したことを確認した。
【００６９】
次に、このようにして得られたアクロレインを含む反応液を、蓋付き試験管に入れた後、５％パラジウムカーボン０．０１５ｇを添加し、気相部を酸素に置換し、常圧で１リットルの酸素を風船に入れて、気相部に接続して密栓し、攪拌しながら、５時間、６０℃で反応を行なった。この反応液を分析した結果、０．１２０Ｍのアクリル酸が生成したことを確認した。
【００７０】
実施例７
Klebsiella pneumoniae ATCC25955を、グリセロールを炭素源にして嫌気培養し、対数増殖期まで増殖させた。この時点の菌体培養液を、実施例２で記載されるのと同様にして、１％トルエン処理した後、集菌した。このようにして集められたKlebsiella pneumoniae ATCC25955  湿重量２０ｇ（酵素活性  ４０００Ｕ）の菌体を、１３５μＭ  補酵素Ｂ１２、０．２Ｍグリセリンを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）１リットルに加え、３７℃で１２０分間反応した。この反応液を瀘過した後、その一部をとり、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量を行なったところ、０．１９６Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成が確認された。このようにして得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを、１リットルのセパラブルフラスコに入れ、５％パラジウムカーボン１．５ｇを加え、気相部を酸素で置換し、気相部にわずかの酸素を流通させて外気の侵入を防ぎ、かつ攪拌しながら、６０℃で５時間、反応を行なった。反応液を分析した結果、０．１７８Ｍの３−ヒドロキシプロピオン酸を検出した。
【００７１】
実施例８
Klebsiella pneumoniae ATCC25955を、グリセロールを炭素源にして嫌気培養し、対数増殖期まで増殖させた。この時点の菌体培養液を、実施例２で記載されるのと同様にして、１％トルエン処理した後、集菌した。このようにして集められたKlebsiella pneumoniae ATCC25955  湿重量２０ｇ（酵素活性  ４０００Ｕ）の菌体を、１３５μＭ  補酵素Ｂ１２、０．２Ｍグリセリンを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）１リットルに加え、３７℃で６０分間反応した。この反応液を瀘過した後、その一部をとり、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの定量を行なったところ、０．１９７Ｍの３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成が確認された。このようにして得られた３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを含む反応液を、３５％塩酸でｐＨ２に調整し、常温で１時間、静置した。得られた反応液中のアクロレインを定量したところ、０．１３０Ｍのアクロレインが生成したことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明によると、３−ＨＰが高い転化率及び変換率でかつほとんど副生成物を含まずに製造できるので、これから１，３−プロパンジオール、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクロレイン、アクリル酸及びアクリル酸エステルが高い収率及び純度で製造することができる。このため、このようにして製造された１，３−プロパンジオールは、ポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとしてならび環状化合物の合成用出発材料として利用でき、１，３−プロパンジオールには副生成物がほとんど存在しないので、これを用いて製造された繊維は変色を起こさない。また、このようにして製造されたアクリル酸／アクリル酸エステルは、アクリル繊維共重合体用、あるいはエマルションとして粘接着剤に用いられる他、塗料、繊維加工、皮革、建築用材等として利用できる。