(57)【要約】【課題】免疫賦活物質やＱＯＬ向上剤として注目されている３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とするオリゴ糖の一種である、α−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖およびこれを含有する製剤組成物を提供する。【解決手段】基質であるムタンすなわちα−１，３−グルカンに対して、該グルカンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖を得る。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質であるムタンに対して、該ムタンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得ることを特徴とするα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記ムタナーゼが、プロテアーゼ産生が陰性であるバシラス属細菌により産生され、かつ（１）ムタンを基質としてｐＨ４〜６の範囲で高い加水分解活性を示し、（２）ムタンを基質としてｐＨ５で反応させる場合、温度５０〜６５℃において高い加水分解活性を示すことを特徴とする請求項１に記載のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記ムタナーゼが、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子が翻訳されることにより得られたものであることを特徴とする請求項１または２に記載のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記ムタナーゼが、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法により製造されたα−１，３−グルコオリゴ糖。
【請求項６】
請求項５に記載のα−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活物質やＱＯＬ向上剤として注目されている３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位とするオリゴ糖の一種であるα−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖およびこれを含有する製剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫賦活物質として３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類が注目されている。このような３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類としては、例えば、少なくとも１つ以上のα−１，３−グルコシド結合を含むグルコース重合度２程度以上のオリゴ糖が挙げられ、好ましくはグルコース重合度２〜１０程度のオリゴ糖、より好ましくは重合度２〜７程度のオリゴ糖であるニゲロオリゴ糖が挙げられている（下記特許文献１および２参照）。また、α−１，３−グルカン及びその誘導体には抗腫瘍活性があること（下記非特許文献１参照）が報告されている。さらに、α−１，３−グルコオリゴ糖にもまた、免疫賦活、抗腫瘍活性、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）向上などの生理活性があること（下記特許文献１および２参照）が報告されている。
以上のような免疫賦活などの生理活性を持つ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類の中で、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース及びニゲランテトラサッカライドの製造方法としては、α−１，３−結合をもたらす糖転移酵素を用いた方法が開示されている（下記特許文献３参照）。また、α−１，３−グルカンの製造方法（下記特許文献４）や修飾α−１，３−グルカンの製造方法は既に知られている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００２−２６５３８５号公報
【特許文献２】特開２００２−０８０３６４号公報
【特許文献３】特開平７−０５９５５９号公報
【特許文献４】特開２０００−３１６５７１号公報
【非特許文献１】ピンイ・チャン（Pingyi Zhang）、他１名、「強力な項腫瘍剤としてのレンチナス・エドーデス由来硫酸化α−（１→３）−Ｄ−グルカンの評価（Evaluation of Sulfated Lentinus Edodes α-(1-3)-D-Glucan）」、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Biosci.Biotechnol.Biochem.）、２００２年、第６６巻、第５号、１０５２−１０５６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、免疫賦活作用が期待されるα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖であるα−１，３−グルコオリゴ糖については未だその効率的な製造方法が知られていない。
【０００５】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、α−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖およびこれを含有する製剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意研究を重ねた結果、α−１，３−グルカンであるムタンのムタナーゼによる加水分解反応を制御することにより、免疫賦活活性を有する重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることができることを知見し、本発明をなすに至った。
【０００７】
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、基質であるムタンに対して、該ムタンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることを特徴とする。
この製造方法においては、前記ムタナーゼとして、プロテアーゼ産生が陰性であるバシラス属細菌により産生され、かつ（１）ムタンを基質としてｐＨ４〜６の範囲で高い加水分解活性を示し、（２）ムタンを基質としてｐＨ５で反応させる場合、温度５０〜６５℃において高い加水分解活性を示すタナーゼを用いることが好ましい。
また、前記ムタナーゼとして、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子が翻訳されることにより得られるムタナーゼ、および配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いることが好ましい。
【０００８】
また、以上の製造方法により製造されるα−１，３−グルコオリゴ糖も本発明の対象である。
【０００９】
さらに、以上のα−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物も同様に本発明の対象である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、α−１，３−グルカンのムタナーゼによる加水分解反応を制御することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造することが可能となり、免疫賦活活性を有するα−１，３−グルコオリゴ糖および該α−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、基質であるムタンに対して、該ムタンに対するエンド型の加水分解作用を有するムタナーゼを作用させて、該ムタンを加水分解することにより、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得ることを特徴とする。この製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖は、重合度が２から４のα−１，３−グルコシド結合のみからなることを特徴とし、免疫賦活活性を有するため有用である。
【００１２】
前記製造方法で用いられる基質のムタンとは、グルコースがα−１，３−結合のみでつながった水不溶性の高分子多糖すなわちα−１，３−グルカンのことをいう。本発明に用いる高純度のムタンは、組換え体由来のムタン合成酵素をショ糖に作用させることにより得ることができる（特開２０００−３１６５７１号公報）。
【００１３】
前記製造方法で用いられるムタナーゼとは、ムタンの加水分解酵素であり、本発明においては、エンド型の加水分解作用をもつムタンの加水分解酵素をいう。本発明のムタナーゼは、ムタンの末端からムタンを加水分解するエキソ型の加水分解作用をもつムタナーゼとは異なり、ムタンをランダムに加水分解するため、α−１，３−グルコオリゴ糖の製造に適している。
【００１４】
前記製造方法においては、前記エンド型の加水分解反応の反応条件であるｐＨ、温度、時間などの諸条件を適宜調整し、重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得ることができるように、ムタンの加水分解を制御することが重要である。
【００１５】
前記製造方法において、「重合度が２〜４のα−１，３−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖を得る」とは、ムタンの加水分解反応後の反応溶液を、例えば、薄層クロマトグラフィーで分析した場合に、重合度が２〜４以外のα−１，３−グルコオリゴ糖がほぼ観察されないことである。
【００１６】
前記α−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法としては、具体的には、例えば、５％のα−１，３−グルカン懸濁液と最終濃度４０００Ｕ／ｍＬのムタナーゼを混合し、攪拌しながら反応させる方法を挙げることができる。
反応温度は３５℃〜５０℃で、好ましくは４０℃がよい。反応時間は１時間以上３時間以内、好ましくは２時間反応させることがよい。これにより、グルコースの重合度が２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖を得ることができる。
【００１７】
本発明にもちいるムタナーゼとしては、前述のように、基質であるムタンに対してエンド型の作用性をもつものが良く、好ましくはプロテアーゼ産生が陰性であるバシラス属によって産生され、以下の理化学的性質を有するムタナーゼであることが好ましい（バチルス・エスピーＲＭ１株生命研菌寄第１４８３６号：特開平第８−３０８５５８号公報）。
（１）基質特異性：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を良く分解する。
（２）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０分間反応させる場合、ｐＨ４において作用が至適であり、ｐＨ４〜６の範囲で高い加水分解活性を示す。
（３）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。
（４）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させる場合、温度６０℃において作用が至適である。
（５）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、６０℃以下で加水分解活性は安定であり、７５℃で失活する。
（６）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約１５万である。
（７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水銀、銀、または３価の鉄によって作用が阻害される。
（８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害される。
【００１８】
さらに、後述の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列によりコードされる遺伝子が翻訳されることにより得られるムタナーゼ（特開平第１０−２０１４８３号公報）がより好ましい。
【００１９】
ここで、前記配列番号１の遺伝子がコードするムタナーゼのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。当業者であれば、本明細書において開示された配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに変異を導入し、これを基に配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する改変酵素の調製を容易に行うことができる。本発明のＤＮＡには、このように配列番号：２に記載のムタナーゼの改変体であってムタンのα−１，３−グルコシド結合を分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡも含まれる。
【００２０】
前記のムタナーゼを改変する方法としては、例えば、亜硫酸（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４５７（１９８３））、亜硝酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４２５８（１９８２））などを用いた化学処理による変異体の作製や、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９９５））やＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｕａｌ  Ａｍｂｅｒ法（Ｇｅｎｅ，１５２，２７１（１９９５））、ＰＣＲ法を応用した部位特異的変異による変異体の作製などの方法が当業者によく知られている。
【００２１】
なお、ＤＮＡの変異は自然界においても生じ、これにより天然型のムタナーゼとアミノ酸配列の異なる酵素が生じうる。このような酵素をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２２】
また、当業者にとってはハイブリダイゼーション技術（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３（１９７５））などを用いて、配列番号：１に記載のＤＮＡ配列（またはその一部）を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する酵素を得ることも常套手段であるといえる。
【００２３】
本発明のＤＮＡには、配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードする酵素であって、ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分解する活性を有する酵素をコードするＤＮＡも含まれる。
【００２４】
配列番号：２に記載のムタナーゼと同等の機能を有する酵素をコードするＤＮＡは、通常、配列番号：１に記載のＤＮＡと高い相同性を有する。ここでいう高い相同性とは、配列番号：１に記載のＤＮＡと、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を指す。
なお、単離される酵素によっては、機能的に重要な領域（例えば、活性中心や基質結合部位）で高い相同性を有し、他の領域では比較的相同性が低いため、全体としては配列番号：２に記載のＤＮＡと１０％程度の配列の同一性でありうるが、このような酵素をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２５】
このような機能的に同等な酵素をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件の一例を示せば、温度条件としては、Ｔｍ値より２０〜２５℃低い温度、好ましくは１０〜２０℃低い温度、さらに好ましくは５〜１０℃低い温度である。
【００２６】
ここで、本発明において利用できるα−１，３−グルカンとしてはとしては、α−１，３−グルコシド結合のみからなるグルカンであれば特に限定されるものではないが、特開２０００−０８３６６５号及び特開２０００−３１６５７１号公報記載の方法、即ち組換え体由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉを用いて製造したムタン、即ちα―１，３−グルカンを用いることが望ましい。
【００２７】
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、１，３−グルコシド結合のみからなる重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖であり、以上のようなα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法により取得することができる。α−１，３−グルコオリゴ糖は、免疫賦活活性を有する化合物として有用である。
【００２８】
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖をヒト由来の繊維芽細胞に添加すると、免疫細胞であるＴ−細胞を活性化する因子として知られているＬｉｇｈｔ（Ｉｍｕｎｉｔｙ．８(1)２１−３０  １９９８）の発現を、該オリゴ糖無添加の細胞に比べ約１１倍増加させることができる。この試験結果より、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は免疫賦活活性を有することがわかる。
【００２９】
本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の混合物として用いることもでき、さらにこの混合物をカラムクロマトグラフィーなどの分離手段により分離精製して、それぞれ重合度２〜４の重合度をもつ単一のα−１，３−グルコオリゴ糖としても用いることができる。分子量分画する方法は一般に行われている方法で問題はなく、ゲル濾過やフィルター濾過などの手法を用いることができる。分画後の液は、凍結乾燥等の乾燥工程による手法によりパウダー化して保存することが好ましい。
【００３０】
また、以上のα−１，３−グルコオリゴ糖を含有する製剤組成物も同様に本発明の対象である。このような製剤組成物としては、ＱＯＬ向上組成物、抗腫瘍剤組成物などの諸種の免疫賦活活性を有する製剤組成物を挙げることができる。ここで、ＱＯＬ向上組成物とは、いわゆる生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を向上させる製剤組成物のことをいい、そのような組成物として免疫賦活活性成分を配合した諸種の剤型を設計することが可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、製造例と実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕α−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法の検討
α−１，３−グルカン５ｇをリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）１００ｍＬに採り、５％α−１，３−グルカン懸濁液を用意した。この懸濁液にムタナーゼ（最終濃度４０００Ｕ／ｍＬ）を入れ反応液とした。
上記反応液を攪拌しながら４０℃でインキュベートした。インキュベート開始から１，２，３，４，６，１２時間後にサンプルを採取し、下記の薄層クロマトグラフィー条件で採取サンプルを分析し、表１に各反応時間後に生成したα−１，３−グルコオリゴ糖の重合度の分布を示した。
【００３２】
薄層クロマトグラフィー条件
溶媒：メタノール／クロロホルム／水＝５０：５０：１２
薄層クロマト：シリカゲル６０（メルク社製）
展開後、濃硫酸を噴霧し、１００℃で焼き付けた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
反応液の分画精製
得られた反応液１００ｍＬをビバスピン（ザルトリウス社製）により分子量分画し、分子量５０００以下の分画８０ｍＬを採取した。この分画液を凍結乾燥し、α−１，３−グルコオリゴ糖の粉末２．５ｇを得た。
【００３５】
本製造方法により得られたオリゴ糖は、グルコースの重合度が２〜４のオリゴ糖であることを薄層クロマトグラフィーにより確認した。
また、表１の各反応時間後に生成したα−１，３−グルコオリゴ糖の重合度の分布の結果より、グルコースの重合度が２〜４のオリゴ糖を得るためには、反応時間を１時間以上３時間以内とすることが好適で、さらには２時間とすることがさらに好適である事が分かった。
【００３６】
〔実施例２〕本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の免疫賦活作用の検討
繊維芽細胞として、正常ヒト新生児包皮皮膚繊維芽細胞（倉敷紡績株式会社製）を、培養液として、ＬＳＧ（クラボウ社製：Ｓ−００３−１０）添加Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ（倉敷紡績株式会社製：Ｍ−１０６−５００Ｓ）を用いて、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖の免疫賦活作用を検討した。
３７℃、５％ＣＯ2環境下で前記繊維芽細胞が飽和するまで培養した。その後、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖を生理食塩水に溶解し、最終濃度０．１％になる様に添加した。対照となる細胞培養液には生理食塩水のみを添加した（オリゴ糖無添加細胞）。１６時間後に前記繊維芽細胞を回収し、ＤＮＡアレイ解析（ジェネティックラボ社製）に供した。ＤＮＡアレイ解析の結果、本発明のα−１，３−グルコオリゴ糖は、免疫細胞であるＴ−細胞を活性化する因子として知られているＬｉｇｈｔ（Ｉｍｕｎｉｔｙ．８(1)２１−３０  １９９８）の発現を、該オリゴ糖無添加の細胞に比べ約１１倍増加させることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
以上のように、本発明にかかるα−１，３−グルコオリゴ糖の製造方法は、α−１，３−グルコシド結合のみからなる重合度２〜４のα−１，３−グルコオリゴ糖の効率的な製造方法として有用であり、該製造方法により得られるα−１，３−グルコオリゴ糖は免疫賦活作用を有し、これを含有する製剤組成物は免疫賦活製剤組成物として、特に適している。
【配列表フリーテキスト】
【００３８】
配列番号：１  バチルス・エスピーＲＭ１株由来のムターゼ遺伝子
配列番号：２  バチルス・エスピーＲＭ１株由来のムターゼ
【配列表】
2005185182000001.app