(57)【要約】【課題】  生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、未反応の官能基をブロッキングすることで、信頼性の高いデータを得ることのできるバイオチップを得る。【解決手段】  チップ上の官能基（Ａ）と対象分子が有する官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上に対象分子を固定化したのちに、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするバイオチップ作製方法【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップ上の官能基（Ａ）と対象分子が有する官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上に対象分子を固定化したのちに、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするバイオチップ作製方法
【請求項２】
末端のみに官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を用いる請求項１記載の方法
【請求項３】
親水性高分子の分子量が４００以上である請求項１〜２いずれか記載の方法
【請求項４】
親水性高分子がポリエチレングリコールである請求項１〜３いずれか記載の方法
【請求項５】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法
【請求項６】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性高分子をブロッキングすることで生体分子の非特異的吸着を抑制したバイオチップの作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。
【０００３】
相互作用を観察する際に、問題になるのが、非特異的吸着である。すなわち、本来であれば、相互作用しない分子へ、対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、デキストラン、ポリエチレングリコールなどの親水性高分子が表面に固定化されたバイオチップが開発されている。親水性高分子は生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。
【０００４】
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリクスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリクスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。ただし、形成したスクシンイミド基は１００％反応しないため、残存したスクシンイミドをブロッキングする必要がある。ここではエタノールアミンを用いて、スクシンイミド基のブロッキングを行っており、ブロッキング材料に親水性高分子を用いる手法は示されていない。
【０００５】
生体分子を固定化した後に、基板上に親水性高分子を反応させる手段は公知である（特許文献１）。しかし、ここではチップ上のマレイミド基と対象分子が有するチオール基を反応させて、チップ上に対象分子を固定化しているが、その後、マレイミド基をブロッキングする工程は全く含んでいない。そのため、マレイミド基が残存したまま残っており、非特異的吸着の問題を引き起こす心配があった。また、固定化した生体分子と反応しうる親水性高分子を用いるため、生体分子が改質し変性する恐れがあった。
【０００６】
本発明は対象分子の固定化に使用した官能基を、対象分子を変性させることなく、効率よくブロッキングし、非特異的吸着を抑制する手段を提供する。
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【特許文献１】米国特許６１２７１２９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に蛋白質との相互作用解析に用いた際でも、正確に相互作用を評価できるチップを得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．チップ上の官能基（Ａ）と対象分子が有する官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上に対象分子を固定化したのちに、チップ表面に残存する官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて、官能基（Ａ）を共有結合的にブロッキングするバイオチップ作製方法
２．末端のみに官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を用いる１記載の方法
３．親水性高分子の分子量が４００以上である１〜２いずれか記載の方法
４．親水性高分子がポリエチレングリコールである１〜３いずれか記載の方法
５．チップ表面が金であることを特徴とする１〜４いずれか記載の方法
６．チップの基板が透明基板であることを特徴とする１〜５いずれか記載の方法
【発明の効果】
【００１０】
本発明のバイオチップの作成方法を採用することにより、非特異的吸着が抑制されたバイオチップを簡便に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のバイオチップ作製方法は、チップ上の官能基（Ａ）と対象分子が有する官能基（Ｂ）を反応させて、チップ上に対象分子を固定化する手法に関して、固定化反応に使われずにチップ上に残存している官能基（Ａ）を、官能基（Ｃ）を有する親水性高分子を反応させて共有結合的にブロッキングするバイオチップの作製方法である。従って、物理吸着やイオン吸着によるブロッキング方法は本発明には含まれない。
【００１２】
官能基（Ａ）は固定化する対象分子が有する官能基（Ｂ）と反応することができ、親水性高分子が有する官能基（Ｃ）とも反応することができる。
官能基（Ａ）、官能基（Ｂ）、官能基（Ｃ）は特に限定されるものではないが、カルボキシル基、アミノ基、スクシンイミド基、硫酸化スクシンイミド基、マレイミド基、エポキシ基、チオール基、アルデヒド基、ビニル基、トシル基、トレシル基、無水酢酸基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、アシルアジド基、塩化硫酸基、イミドエステル基などが挙げられる。ここで官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）、官能基（Ａ）と官能基（Ｃ）は反応しうるペアである。官能基（Ａ）と官能基（Ｂ）、官能基（Ａ）と官能基（Ｃ）は基本的に異なる官能基であるが、官能基（Ｂ）と官能基（Ｃ）は同一であっても異なる官能基であってもよい。
【００１３】
チップ上に官能基（Ａ）を導入する手段は特に限定されるものではない。基板表面に分子を整列させる自己組織化表面の手法、反応試薬を用いて導入する方法、官能基を有する物質をチップ上にコーティングする手段などが挙げられる。また、表面に導入しておいた官能基を起点として、架橋剤を用いて官能基（Ａ）を導入する手段なども含まれる。
【００１４】
対象分子における官能基（Ｂ）の位置も特に限定されるものではなく、対象分子内の末端部分、側面部分、不特定多数箇所のいずれでもよい。
親水性高分子における官能基（Ｃ）は高分子末端に存在していることが好ましく、片末端であるとさらに好ましい。高分子の主鎖もしくは主鎖から多数分岐した側鎖に官能基（Ｃ）が存在していると、固定化した対象分子に対して立体障害を与える恐れがあるため、好ましくない。また、主鎖もしくは側鎖に多数の官能基（Ｃ）が存在すると、官能基（Ａ）と反応しブロッキングされてもなお、官能基（Ｃ）が残存する。官能基（Ｃ）も非特異的吸着を引き起こす可能性は否定できない。従って、末端にのみ官能基（Ｃ）が存在していることが好ましい。さらに好ましくは片末端のみに官能基（Ｃ）があり、もう一つの末端には活性の低いメトキシ基やヒドロキシル基を有する親水性高分子が好ましい。
【００１５】
親水性高分子の分子量は４００以上が好ましく、１，０００以上であるとさらに好ましい。分子量／繰り返し単位が多い方が、非特異的吸着を抑制する効果が強いためである。ただし、分子量が５０，０００以上であると固定化した対象分子に対して立体障害を与え、悪影響を及ぼす場合があるため、好ましくない。
【００１６】
親水性高分子とは水に可溶もしくは、水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。
具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。
【００１７】
しかしながら、本発明における親水性高分子は非特異的吸着を抑制するのが目的であるため、どちらかというとイオン性の官能基を有する化合物は好ましくないことがある。これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール（ポリオキシエチレンと呼ぶこともある）は親水性が高く、反応性の有する官能基がないため非特異吸着を抑制する効果が高い。
【００１８】
本発明におけるチップはさまざまな用途に応用可能であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着しなければ、正確に測定できていると判断することができる。
【００１９】
しかし、ラベルフリーな光学的検出方法においては、どのような物質がチップ上に吸着してもシグナルとして検出される。すなわち、測定対象ではない物質が非特異的に吸着するのと、特異的な吸着を区別することが難しい。よって、よりシビアに非特異的な吸着を抑制する手段が求められるため、本発明の共有結合によるブロッキング方法は非常に効果的である。
【００２０】
ＥＬＩＳＡ法やラベル物質を用いる相互作用解析方法においてはブロッキング方法として牛血清アルブミンやカゼインなどの物理吸着が一般的に選択されている。物理吸着の方法は容易ではあるが、安定しておらず、経時的にチップ表面から脱離する。上記の光学的検出方法にはブロッキング剤の脱離さえも検出するため、共有結合によるブロッキングが必要である。
【００２１】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００２２】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層をあらかじめ基板にコーティングしておいてもよい。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２４】
［実施例］
（二本鎖ＤＮＡ固定化）
末端官能基がチオール基である４ａｒｍＰＥＧ（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。４ａｒｍＰＥＧの分子量は１０，０００であり、中心からほぼ同等の長さのＰＥＧ鎖が四つ存在する分子であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの４つの末端はすべてチオール基であり、特に金に対する金属結合性を示す。
【００２５】
１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記４ａｒｍＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体に４ａｒｍＰＥＧチオールを結合させた。
【００２６】
このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部の４ａｒｍＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクには０．５ｍｍ四方の穴が９６個あいており、穴の間隔は１ｍｍとなっている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されパターン化される。照射されなかった部分は、４ａｒｍＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００２７】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，Ｎｅｋｔａｒ社製）をリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させた。８−ＡＯＴのアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができた。
【００２８】
得られた表面に自動スポッター装置（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ  Ｓｐｏｔｔｅｒ：東洋紡績製）を用いて、２種類のＤＮＡをアニールしてからスポッティングを行った。二種類の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を固定化するスポットと、何も固定化しないスポット（Ｂｌａｎｋ）を作製した。使用したＤＮＡの配列を表１に示す。固定化側ＤＮＡの配列は５’チオール末端からチミン１５塩基スペーサーを介した後、目的の配列が入るように設計されている。相補側ＤＮＡの配列は固定化側ＤＮＡの目的配列に相補的な部分のみの配列を有しており、チオールとチミン１５塩基スペーサーは有していない。ここでＧＡＴＡｒｅｇはＧＡＴＡ−１が認識して結合することのできる配列であり、５’側からＧＡＴＡ配列が中心に含まれている。一方ＧＡＴＡｍｕｔ配列はＧＡＴＡの代わりにＡＧＴＡとＧとＡが入れ代わった配列となっており、一般的にＧＡＴＡ−１は認識できない配列である。
チップの表面に形成させたマレイミド基と固定化側ＤＮＡのチオール基が反応し、ＤＮＡを共有結合的に表面に固定化することができる。
【００２９】
【表１】
2005140576.tif 000002
【００３０】
ＤＮＡのアニーリングの条件は、×５ＳＳＣ溶液（７５ｍＭクエン酸ナトリウム、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に５’チオール末端ＤＮＡが２５μＭ、その相補側ＤＮＡを１００μＭになるように溶液を調製し、沸騰浴中にて５分、０℃に急冷し１５分、その後３７℃で三時間インキュベートした。アニールしたｄｓＤＮＡを約１０ｎｌスポッティングし、１５時間反応させてｄｓＤＮＡを表面に固定化した。
【００３１】
（未反応マレイミド基のブロッキング）
ｄｓＤＮＡを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、片末端の官能基がチオール基、もう一方の官能基がメトキシ基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解して、２５０μｌをチップ上に注出し、一時間反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００であり、親水性が非常に高く、非特異吸着を抑制する効果が期待できる。
【００３２】
（ＳＰＲイメージング法による測定）
こうして得られたｄｓＤＮＡ固定化チップを、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＺｎＣｌ2、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．９の転写因子測定用緩衝液をフローセル内に流した。
ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、転写因子ＧＡＴＡ−１を１０μＭの濃度で上記の転写因子測定用緩衝液に調製してＳＰＲ装置内のセルへ注入した。ＧＡＴＡ−１を注入する際には、緩衝液にｐｏｌｙｄＩｄＣを１００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、核酸への非特異的吸着を抑制した。セル内に１０分間１００μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、さらに転写因子を含まない緩衝液を流し、結合と解離のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、ＧＡＴＡｒｅｇ、ＧＡＴＡｍｕｔに加え、ＢｌａｎｋとＢａｃｋｇｒｏｕｎｄで実施した。
【００３３】
（観察の結果と考察）
シグナル変化のグラフを図２に示す。ここで、ＧＡＴＡｒｅｇの配列にはＧＡＴＡ−１が結合し、ＧＡＴＡｍｕｔにはほとんど結合しない様子を観察することができた。このグラフにおけるＢｌａｎｋ部分（マレイミド基をＰＥＧチオールでブロッキング）とＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分（４ａｒｍＰＥＧ）はシグナル変化がみられておらず、ＧＡＴＡ−１がほとんど結合しなかったことを示している。
こうして、マレイミド基をＰＥＧチオールでブロッキングしたＢｌａｎｋ部分でＧＡＴＡ−１が非特異的に結合するのを抑制することが可能であった。この結果ＧＡＴＡｒｅｇとＧＡＴＡｍｕｔの結合データには非特異的吸着によるシグナルが含まれていないと考えることができ、データの信頼性が高まっていると言える。
このように表面の官能基を共有結合的に親水性高分子でブロッキングすることによって、非特異的吸着が抑制されたバイオチップを容易に得ることができた。
【００３４】
［比較例］
（二本鎖ＤＮＡ固定化）
実施例と同様に行った。
（未反応マレイミド基のブロッキング）
ここではブロッキング操作は行わず、そのまま次のステップに進んだ
（ＳＰＲイメージング法による測定）
実施例と同様に行った。
【００３５】
（観察の結果と考察）
シグナル変化のグラフを図３に示す。ここで、ＧＡＴＡｒｅｇの配列にはＧＡＴＡ−１が結合し、ＧＡＴＡｍｕｔに結合する量が少ない傾向は実施例と同様であるが、このグラフにおけるＢｌａｎｋ部分（マレイミド基）において、シグナル増加がみられており、ＧＡＴＡ−１の非特異的吸着がおこったことを示している。
ただし、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分（４ａｒｍＰＥＧ）はシグナル変化がみられておらず、ＧＡＴＡ−１がほとんど結合しなかったことを示されており、Ｂｌａｎｋへの非特異的吸着は、表面に残ったマレイミド基によるものと考えることができる。ＧＡＴＡｍｕｔへのＧＡＴＡ−１の結合によるシグナルは、実施例と比べて大きい傾向にあるが、これはＧＡＴＡｍｕｔ配列への結合ではなく、表面に残ったマレイミド基によるものとみなすことができる。
したがって、反応せずに残った官能基によって、非特異的吸着が生じ、誤った結果を導く恐れがある。この結果ではデータの信頼性は低いと言わざるを得ない。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の方法により作製されたバイオチップは、非特異的吸着が抑制され、正確な測定が可能となる。また、作成方法も容易であり、産業界に寄与すること大である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例、比較例で使用したフォトマスク
【図２】実施例におけるＳＰＲシグナル変化
【図３】比較例におけるＳＰＲシグナル変化
【図１】
2005140576.tif 000003
【図２】
2005140576.tif 000004
【図３】
2005140576.tif 000005