(57)【要約】【課題】  造血幹細胞をその機能を保ったまま生体外にて増幅させることができるようにするために必要とされるストローマ細胞のシグナル伝達に関連するタンパク質を特異的に検出・同定できる物質の提供。【解決手段】  本発明は、ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域のアミノ酸配列であって、シグナル配列（１−１７番目）及び免疫グロブリン様領域以外の部分の部分配列からなるペプチドを抗原として使用することを特徴とする抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体、より詳細には、抗原として使用するペプチドが、ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹのアミノ酸配列を含有するものである抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体、及びその製造方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域のアミノ酸配列であって、シグナル配列（１−１７番目）及び免疫グロブリン様領域以外の部分の部分配列からなるペプチドを抗原として使用することを特徴とする抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗原として使用するペプチドが、１５〜５０個のアミノ酸を有するペプチドである請求項１に記載の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗原として使用するペプチドが、ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹのアミノ酸配列を含有するものである請求項１又は２に記載の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載された抗原ペプチドを動物に感作させ、当該動物の免疫細胞との融合細胞を製造し、これをスクリーニングすることからなる請求項１〜３のいずれかに記載の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
感作させる動物が、ラットである請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄ストローマ細胞が造血微小環境（ｎｉｃｈｅ）を形成し造血因子・接着因子を介して造血前駆細胞の増殖・分化を制御する際の重要な役割を果たしているｍＫｉｒｒｅ（Genbank Accession Number; AY169782）に対するモノクローナル抗体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄内に存在する造血幹細胞及び間葉系幹細胞は終生に渡り、それぞれ血球系細胞、骨・軟骨、脂肪細胞等に分化し、それらを供給し続けることで成体の生命を維持している。しかし近年、これら臓器特異的幹細胞がある条件下で多臓器の細胞（神経、肝臓、肺、腸管、心筋、筋肉等）にも分化し得る可能性が示され、その増殖機構の解明が、移植治療及び再生医療への応用という見地からも大変に重要であると考えられている。
これまで生体外にて造血幹細胞を増幅する試みが数多くなされ、一定の成果を挙げつつある。骨髄造血組織においては、骨髄ストローマ細胞が造血微小環境（ニッチ：ｎｉｃｈｅ）を形成し造血因子・接着因子を介して造血前駆細胞の増殖・分化を制御していると考えられている。ストローマ細胞の産生する造血因子として、ＩＬ−３，ＩＬ−６などのサイトカイン、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３  各種のリガンドなどの受容体型チロシンキナーゼリガンド（非特許文献１参照）、分化抑制因子であるノッチ（Ｎｏｔｃｈ）リガンドのｊａｇｇｅｄ−１（非特許文献２参照）が報告されている。
しかしながら、造血に重要な膜結合型因子・接着分子に関してはまだ多くが未同定であり、現在までの技術では造血幹細胞をその機能を保ったまま生体外にて増幅させることはできず、ストローマ細胞の伝達するシグナルについて、より深い知見が必要と考えられ、これらの物質の探索が行われている。
【０００３】
本発明者らは、シグナル配列単離法を用い、ストローマ細胞株ＯＰ９より複数の膜・分泌タンパク質を単離、その中の一つｍＫｉｒｒｅにストローマ細胞の造血支持機能を増強する機能があることを発見し報告してきた（非特許文献３、及び特許文献１参照）。このｍＫｉｒｒｅは、特許文献１ではＳＤＨＦ−４として記載されており、そのアミノ酸配列は、特許文献１の配列表の配列番号８に記載されている。この配列を本明細書に引用して取り込む。
ｍＫｉｒｒｅは、生体内においては脳と骨髄、骨髄内においては骨髄ストローマ細胞に限局して発現しており、ｍＫｉｒｒｅのシグナルはストローマ細胞の造血幹細胞支持能において重要な役割を果たしている。このｍＫｉｒｒｅは、細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞内領域を有する膜タンパク質であるが、一部のｍＫｉｒｒｅは細胞外領域が切断され分泌される可能性のあることが知られている。
また、多くの白血病細胞はインビトロ（in vitro）での増殖には限界があるにも関わらず、骨髄内では効率よく無制限に増殖できる事が知られている。これは、白血病細胞が正常な造血幹・前駆細胞の性質を一部保持しており、造血微小環境を占拠することで正常の造血を抑制すると同時にストローマ細胞からのシグナルを受けて増殖しているためと考えられている。ｍＫｉｒｒｅのシグナルはストローマ細胞の造血幹細胞支持能において重要であることから、ｍＫｉｒｒｅを介して伝達されるシグナルを阻害することにより、白血病など骨髄内で増殖する悪性腫瘍に対する抗腫瘍剤を開発できる可能性がある。
【０００４】
造血器官におけるストローマ細胞の造血幹細胞支持能を解析したり、その機能阻害するために、これらのタンパク質の抗体の開発が行われてきている。例えば、抗ＣＤ３４抗体などの骨髄内造血幹細胞を濃縮する抗体が開発されてきているが、造血支持細胞であるストローマ細胞を濃縮することができる抗体は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ０３／０１８８０５号
【非特許文献１】Gibson, F. M. et al., Br. J. Haematol., Vol.91, pp551-561  1995
【非特許文献２】Varnum-Finney, B. et.al., Blood, Vol.91, pp4084-4091 1998
【非特許文献３】Ueno H, et al. Nature Immunology, Vol.4, pp457-463 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、造血幹細胞をその機能を保ったまま生体外にて増幅させことができるようにするために必要とされるストローマ細胞のシグナル伝達に関連するタンパク質を特異的に検出・同定できる物質を提供することを目的としている。
即ち、本発明は、ストローマ細胞の造血幹細胞支持能に重要な役割を果たしているタンパク質を同定し、このタンパク質に対する抗体、より詳細にはモノクローナル抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、複数の造血幹細胞増殖因子を骨髄ストローマ細胞から見出し、既に特許出願してきた（特許文献１参照）。そして、その中のひとつのＳＤＨＦ−４（ｍＫｉｒｒｅ）（Genbank Accession Number; AY169782）が、造血幹細胞の造血支持機能を増強する機能を有していることを見出した。そして、この抗体、特にモノクローナル抗体が得られれば、ストローマ細胞などのＫｉｒｒｅを発現する細胞を濃縮・純化するために有用であるばかりでなく、白血病患者における白血病細胞の急激な増殖を抑えることが可能となる。
ｍＫｉｒｒｅはＩ型タイプＡの膜タンパク質（アミノ基末端側より、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞内領域という順の構造）を有しており、生細胞に発現されるｍＫｉｒｒｅを認識する抗体を作製することにしたが、Ｋｉｒｒｅは骨髄内に発現しているタンパク質であり、普段から免疫担当細胞に暴露しているため、一般的に抗原性が低く抗体が出来にくく、さらに、Ｋｉｒｒｅの配列は現在までのところ配列の判明しているマウス、ヒトで比較すると細胞外領域においてアミノ酸レベルにて９８％以上の相同性を有しており、ウサギ、ラットなどの免疫動物にても高い相同性が予想され、さらに免疫動物においても抗原性が低く、Ｋｉｒｒｅの細胞外領域を認識する抗体の作製は困難であった。
しかしながら、本発明者らは、各種の試行錯誤を繰り返した後に、マウスのＫｉｒｒｅ（ｍＫｉｒｒｅ）の特定の部分を抗原としてラットの感作させることにより、極めて優れたモノクローナル抗体を得ることができることを見出した。
【０００８】
本発明は、ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域のアミノ酸配列であって、シグナル配列（１−１７番目）及び免疫グロブリン様領域以外の部分の部分配列からなるペプチドを抗原として使用することを特徴とする抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体、より詳細には、抗原として使用するペプチドが、ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹのアミノ酸配列を含有するものである抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体、及びその製造方法に関する。
【０００９】
以下、本発明に至った経緯を含めて本発明を説明する。
一般に、抗体を作成する際の抗原としては、抗原となるタンパク質の細胞外領域を全領域に渡って哺乳類細胞株に発現させて作製したリコンビナントタンパク質が、生体内の当該タンパク質の立体構造や糖鎖修飾を含めてより近い構造を有しているために、これを抗原とした方が結果として得られる抗体が、天然のタンパク質をよりよく認識できる可能性が高く、抗原として有利であると考えられている。
ｍＫｉｒｒｅは、配列表の配列番号１に示される様に、７６６個のアミノ酸からなるタンパク質である。このうち、１−５２３番目までが細胞外領域であると考えられる。そこで、ｍＫｉｒｒｅのシグナル配列を除くアミノ酸番号１８−５２３の細胞外領域のタンパク質とヒト免疫グロブリンＦｃ領域との融合タンパク質（ＳＤＨＦ−４−ΔＴＭ−Ｆｃ）を用いて、ラットに３日毎に３回フットパット免疫して細胞融合法によりモノクローナル抗体の作製を試みたところ、抗原反応が陽性の５クローン、即ち、１Ａ３、１Ｈ９、２Ｂ１、２Ｆ１、及び２Ｈ８が得られた。得られた５クローンの抗体をＥＬＩＺＡ法により、ｍＫｉｒｒｅ−ヒトＦｃ及びヒトＩｇＧ（ネガティブコントロール）と、それぞれ交叉反応された。結果を次の表１に示す。
【００１０】
【表１】
2005218340.tif 000002
【００１１】
この結果、得られた抗体は、いずれもより抗原性の高いＦｃ領域に対するものばかりであり、ｍＫｉｒｒｅを認識する抗体は全く得られなかった。
【００１２】
次に、細胞外領域の全領域では抗体を作成することができないので、抗原性の高い範囲を絞り込み抗原を大量に免疫する方法で抗体の作製を試みた。一般にタンパク質のアミノ基末端側がタンパク質の表面に露出している可能性が高いため、ｍＫｉｒｒｅのアミノ酸番号１８−１３９からなるタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌を用いて作製した。このタンパク質を抗原とし、ウサギに免疫して同様な方法でポリクローナル抗体の作製を試みた。比較として特許文献１にＳＤＨＦ−５として記載されているタンパク質を同様に使用して作成した抗体を使用した。得られたポリクローナル抗体の抗体価をＥＬＩＺＡ法により測定した。この結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１の上側はＳＤＨＦ−５を抗原として用いた場合の結果を示し、下側はｍＫｉｒｒｅの場合を示す。各写真の右側は着色状況を示す写真であり、左側はそのスコアーを示す。各検体は上から１０１〜１０８の８段階の濃度であり、右側の３列は抗原コーティングの場合を示し、左側の３列はブランクを示す。各列は左から０日目、２４日目、３８日目のものを示す。
この結果、同時に作製したＧＳＴ−ＳＤＨＦ−５の免疫効果と比べてＧＳＴ−ｍＫｉｒｒｅでは抗体価の上昇が悪いことがわかる。このように、ＳＤＨＦ−５に対する抗体に比べて抗体価の極めて悪いものしか作成することができなかったが、一応ｍＫｉｒｒｅを認識するポリクローナル抗体を作製することができる可能性があることはわかった。
【００１３】
次に、ｍＫｉｒｒｅのｃＤＮＡのカルボキシル末端側にＦＬＡＧタグを付加したコンストラクトを構築して、これをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させた。これを、図１に示した抗ｍＫｉｒｒｅ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体にてウェスタン解析を行った。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の左側は抗ｍＫｉｒｒｅ抗体の場合を示し、右側は抗ＦＬＡＧ抗体の場合を示す。各写真の左側のレーンはモック（ｍｏｃｋ）の場合を示し、右側のレーンはｍＫｉｒｒｅの場合を示す。９７ｋＤａ付近の矢印は、ｍＫｉｒｒｅ−ＦＬＡＧを示す。
この結果、抗ＦＬＡＧ抗体にてｍＫｉｒｒｅ−ＦＬＡＧの発現が確認されるが、抗ｍＫｉｒｒｅ抗体にてはバックグラウンドが高くｍＫｉｒｒｅ−ＦＬＡＧの発現は確認できなかった。ウェスタン解析の結果から、この方法による抗体は、極めてバックグラウンドの高い、質の悪い抗体でしかないことがわかる。
【００１４】
このように、ｍＫｉｒｒｅの抗体は通常の手法では作成することが困難であり、この原因としては次の２点が考えられる。（１）ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域は極めて抗原性が低い（図１参照）こと、及び（２）免疫グロブリン様領域という多くのタンパク質に存在するモチーフをｍＫｉｒｒｅが有しており、これに反応する抗体ができるとｍＫｉｒｒｅ特異性が失われる（表１参照）。
そこで、免疫グロブリン様領域を避け、抗原性の高いペプチド配列部分を想定する方法を検討した。免疫グロブリン様領域を避け、抗原性の高いペプチド配列部分を想定するためにコンピュータソフトウェアを用いた。用いたソフトウェアはマックベクター（MacVector）、ペプツール（Peptool）、及びスキャンプロサイト（Scan Procite）の３種類である。その結果、最終的にタンパク質から切り離されるシグナル配列（１−１７）、及び免疫グロブリン様領域を除外した細胞外領域においては、アミノ酸配列で３２−４８番目の（ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹ）領域を想定することができた。この領域の平均疎水性値は−１３．３で、電荷密度（Charge Density）は０．５３であった。この値は、検討した配列の中で最良の結果を示すものであった。
このアミノ酸配列をヒトの配列と比較すると、１００％一致していたが、免疫動物であるラットと比較するとアミノ酸配列３２−３３において異なっており（マウスＧＹ、ラットＡＴ）、抗原としても有利であると考えられた。
【００１５】
そこで、このアミノ酸配列（ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹ）をペプチドを合成し、ＫＬＨキャリアタンパク質に結合させ、７週齢のラット(♀)のフットパッドに計３回免疫した（初回免疫後、３日目、７日目）。初回免疫後９日目にラットの鼠経リンパ節を採取し、リンパ球をＰＥＧ法にてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させて、融合細胞を作製した。ＨＡＴ培地中で培養し、ハイブリドーマを選択した。ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によるＥＬＩＳＡ反応にて陽性細胞集団を選択した。
これら陽性細胞集団から最終的に単クローンにて抗原ペプチドとの反応性を示すモノクローナル抗体を安定的に産生するハイブリドーマを３クローン（１Ａ８、４Ａ８、及び４Ｂ１０）樹立することができた。これらのクローンは、それぞれＦＥＲＭ  Ｐ−１９６３２、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６３３、及びＦＥＲＭ  Ｐ−１９６３４として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。
得られたモノクローナル抗体の各クローンについて抗原とした合成ペプチドによるＥＬＩＳＡ反応を測定した。結果を次の表２に示す。
【００１６】
【表２】
2005218340.tif 000003
【００１７】
これらのクローンは全て限界希釈法にて一個の細胞から樹立されたものであり、また、ミエローマ細胞はマウス由来であり、このＥＬＩＳＡ反応がラット特異的２次抗体を使用していることから、得られたモノクローナル抗体が、ラット由来であり、且つｍＫｉｒｒｅペプチドを認識していることが証明された。
また、抗原として用いたペプチド配列（ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹ  マウスｍＫｉｒｒｅのアミノ酸配列の３２−４８番目）は、ヒトホモログであるＫＩＡＡ１８６７のアミノ酸配列３２−４８と完全に一致しており、本発明のモノクローナル抗体は、マウス由来ではあるが、ヒトのＫｉｒｒｅをも認識することができるものである。
【００１８】
本発明は、ストローマ細胞が造血微小環境（ニッチ：ｎｉｃｈｅ）を形成し造血因子・接着因子を介して造血前駆細胞の増殖・分化を制御している場において、重要な役割を果たしているＫｉｒｒｅタンパク質を特異的に認識することができる抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体を提供するものである。
本発明のｍＫｉｒｒｅに対するモノクローナル抗体は、ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域のアミノ酸配列であって、シグナル配列（１−１７番目）及び免疫グロブリン様領域以外の部分の部分配列からなるペプチドを抗原として使用することを特徴とするものである。本発明の抗原として使用するペプチドとしては、ｍＫｉｒｒｅの細胞外領域のアミノ酸配列であって、シグナル配列（１−１７番目）及び免疫グロブリン様領域以外の部分の部分配列からなるペプチドであって、アミノ酸数で１５〜５０個、１５〜３０個、１５〜２０個程度のものが好ましい。アミノ酸数が少ないと抗原としての認識が十分できないし、長すぎると特異性が小さくなることから、アミノ酸数が２０個程度のペプチドを抗原とするのが好ましい。本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体を製造するに使用される好ましいペプチドとしては、ｍＫｉｒｒｅの３２−４８番目のアミノ酸配列（ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹ）を有するペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではなく、このペプチドにさらに１〜５個、好ましくは１〜３個程度のアミノ酸がさらに付加したペプチド、１〜５個、好ましくは１〜３個程度のアミノ酸が欠失もしくは置換されたペプチド、又は、これらの付加、欠失、置換が組み合わされてなるペプチドであって、ｍＫｉｒｒｅを特異的に認識することができるモノクローナル抗体を製造することができるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００１９】
本発明は、抗原とするペプチドのアミノ酸配列を適正に選択すれば、当該ペプチドを抗原とした各種のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができる。一般的な方法としては、前述してきた、細胞融合法が挙げられるがこれに限定されるものではない。例えば、本発明は、前記した抗原ペプチドを動物に感作させ、当該動物の免疫細胞との融合細胞を製造し、これをスクリーニングすることからなる抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体の製造方法を提供する。感作させる動物としては、ラット、ハムスターなど各種の動物であってよいが、ラットが好ましい。免疫細胞としては、脾臓細胞やリンパ球などを使用することができる。融合細胞を製造する際に使用される細胞としては、各種の腫瘍細胞が挙げられるが、ミエローマ細胞が好ましい。本発明の製造方法は、公知の細胞融合法による手順に従って行うことができる。
本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体と同様に使用することができるが、ｍＫｉｒｒｅを検出、同定する際の試薬や診断薬として使用されるだけでなく、ｍＫｉｒｒｅを発現する細胞、例えばストローマ細胞を濃縮・純化する際のマーカーとして、また、血病など骨髄内で増殖する悪性腫瘍に対する抗腫瘍剤として使用することができる。本発明のモノクローナル抗体を使用する際には、これをこのまま使用することができるが、必要により、製薬上許容される担体や、試薬に適した担体などと共に組成物として使用することもできる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、ストローマ細胞が造血微小環境（ニッチ：ｎｉｃｈｅ）を形成し造血因子・接着因子を介して造血前駆細胞の増殖・分化を制御している場において、重要な役割を果たしているＫｉｒｒｅタンパク質を特異的に認識することができるモノクローナル抗体を提供するものである。即ち、本発明は、（１）Ｋｉｒｒｅタンパク質がストローマ細胞における造血幹細胞の造血支持機能を増強する機能を有し重要な役割を担っていることを見出したこと、そして（２）Ｋｉｒｒｅタンパク質を特異的に認識することができる抗体を作成するためには、特定のアミノ酸配列を有する部分配列を使用しなければならないことを見出したものである。本発明のモノクローナル抗体を使用することにより、ｍＫｉｒｒｅを発現する細胞を濃縮・純化することが可能となり、例えば、現在骨髄移植のための採血を、インビトロでの造血幹細胞の培養で行うことが可能となる。また、白血病患者における白血病細胞の急激な増殖は、ｍＫｉｒｒｅの関与が考えられ、本発明のモノクローナル抗体を用いてｍＫｉｒｒｅ活性を抑えることが可能であることから、白血病など骨髄内で増殖する悪性腫瘍に対する抗腫瘍剤として利用が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
ｍＫｉｒｒｅのアミノ酸配列の３２−４８番目（ＧＹＭＡＫＤＫＦＲＲＭＮＥＧＱＶＹ）を有する合成ペプチドを製造し、逆層カラムにて精製後、ＫＬＨキャリアタンパク質に結合させ、７週齢のラット(♀)のフットパッドに計３回免疫した（初回免疫後、３日目、７日目）。
初回免疫後９日目にラットの鼠経リンパ節を採取し、ステンレスメッシュにて充分ほぐしてリンパ球を採取し、これをマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１とＰＥＧ法にて細胞融合させて融合細胞を製造した。細胞比はリンパ球：ミエローマ細胞＝５：１とした。得られた融合細胞をＨＡＴ培地中で培養し、ハイブリドーマを選択した。
得られたハイブリドーマを小数の細胞集団ごとに分割して、それらの上清に産生される抗体と、抗原ペプチドをコーティングした９６穴プレートと反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）によるＥＬＩＳＡ反応にて陽性細胞集団を選択した。
これら陽性細胞集団を、限界希釈法にてさらに細かい細胞集団に分けていった。最終的に単クローンにて抗原ペプチドとの反応性を示すモノクローナル抗体を安定的に産生するハイブリドーマを３クローン（１Ａ８、４Ａ８、及び４Ｂ１０）樹立した。
抗原とした合成ペプチドを用いて、ＥＬＩＳＡ反応を行った。結果を表２に示す。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体は、マウスやヒトのＫｉｒｒｅタンパク質を特異的に認識することができるモノクローナル抗体である。ｍＫｉｒｒｅは生体内においては脳と骨髄、骨髄内においては骨髄ストローマ細胞に限局して発現しており、本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体は免疫染色、フロ一サイトメトリー、ウェスタンプロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＺＡ等の方法にてｍＫｉｒｒｅの検出、同定に有用であるばかりでなく、ｍＫｉｒｒｅの発現部位を解析し、ｍＫｉｒｒｅ発現細胞の分離・純化、ｍＫｉｒｒｅシグナル伝達阻害実験など、骨髄造血微小環境による造血の制御機構の解析のための重要なツールとして極めて有用なものである。
また、本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体は造血支持細胞を分離・純化し、それらと造血幹細胞を共培養することでインビトロで造血幹細胞を増幅することを可能にするものである。さらに、多くの白血病細胞はインビトロでの増殖には限界があるにも関わらず、骨髄内では効率よく無制限に増殖できる事が知られている。これは、白血病細胞が正常の造血幹・前駆細胞の性質を一部保持しており、造血微小環境を占拠することで正常の造血を抑制すると同時にストローマ細胞からのシグナルを受けて増殖しているためと考えられている。ｍＫｉｒｒｅのシグナルはストローマ細胞の造血幹細胞支持能において重要であることから、本発明の抗ｍＫｉｒｒｅモノクローナル抗体がｍＫｉｒｒｅを介して伝達されるシグナルを阻害し、白血病など骨髄内で増殖する悪性腫瘍に対する抗腫瘍剤としても有用な可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ｍＫｉｒｒｅのアミノ酸番号１８−１３９からなるタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として抗原として、ウサギに免疫して製造したポリクローナル抗体、及びどうような方法で製造したＳＤＨＦ−５タンパク質のポリクローナル抗体の抗体価をＥＬＩＺＡ法により測定した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、ｍＫｉｒｒｅのｃＤＮＡのカルボキシル末端側にＦＬＡＧタグを付加したコンストラクトを構築して、これをＣＯＳ７細胞に一過性に発現させ、図１に示した抗ｍＫｉｒｒｅ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体にてウェスタン解析を行った結果を示す、図面に代わる写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００２５】
配列番号１：ｍＫｉｒｒｅの全アミノ酸配列
配列番号２：ｍＫｉｒｒｅの３２−４８番目のアミノ酸配列
【図１】
2005218340.tif 000004
【図２】
2005218340.tif 000005
【配列表】
2005218340000001.app