(57)【要約】【課題】  本発明は、動脈硬化ならびに総コレステロール値の上昇の危険因子の検査方法の提供を課題とする。【解決手段】  動脈硬化、あるいは総コレステロール値の上昇の危険因子として有用なクラステリン(clusterin)遺伝子における多型-6316 del T（I/D）多型-が明らかにされた。この多型のジェノタイプを同定し、被検者が特定のジェノタイプである場合に、被検者が動脈硬化や総コレステロール値が高いハイリスク群である可能性が高いと予測される。危険因子を有すると判定された被検者の、総コレステロール値の上昇を防止することにより、動脈硬化をより効果的に予防、あるいは進展を遅らせることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因の検査方法。
(a)  女性被検者が有する、クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)  (a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を予測する工程
【請求項２】
多型が１塩基多型である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
クラステリン遺伝子の多型が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型が、Ｔの欠損であり、Ｔの欠損アレルを有する被検者は、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を有すると予測される請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）  被検者の生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）  クラステリン遺伝子における塩基部位であって、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基のジェノタイプを決定する工程
（ｃ）  クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型が、Ｔの欠損であり、そのジェノタイプとしてＴの欠損アレルを有する場合に動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を有すると予測する工程
【請求項６】
クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因検査用のプライマー。
【請求項７】
多型部位が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型である請求項６に記載のプライマー。
【請求項８】
クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因検査用のプローブ。
【請求項９】
多型部位が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基である請求項８に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、総コレステロール値の上昇、ならびに動脈硬化の危険因子の検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈の肥厚や弾力性が失われた状態を動脈硬化と言う。動脈硬化は、血管の狭窄や閉塞、あるいは血管の破裂などの原因となる。血液の供給ルートである動脈の障害は、障害が起きた臓器に大きなダメージを与える。脳や心臓のような重要な臓器における梗塞や出血は、死亡原因にもなりうる。事実、脳血管疾患や心疾患は、多くの先進国において、がんと並ぶ主要な死亡原因である。動脈硬化によって引き起こされるこれらの疾患は、動脈硬化性疾患と呼ばれている。
動脈硬化は、さまざまな要因が複合的に作用して進行する病態である。たとえば次のような因子は、動脈硬化の危険因子として重要視されている。
高血圧
高脂血症
糖尿病
加齢
【０００３】
動脈硬化の中でも、動脈の内膜下に見られる斑点状の肥厚(atherom)によって特徴付けられる血管病変を、特にアテローム性動脈硬化(atherosclerosis)と呼ぶ。アテローム性動脈硬化病巣は、プラークで構成されている。アテローム性のプラークは、脂質の細胞内外への蓄積、平滑筋細胞、結合組織、そしてグリコサミノグリカンからなっている。早期のアテローム性動脈硬化病変では、脂肪線条(fatty streak)が見られる。脂肪線条は、脂質を貪食した泡沫細胞である。症状の進行に伴い、アテローム性（粥状性）のプラークは、やがて線維性プラークへと発展する。線維性プラークは、結合組織で覆われた内膜平滑筋細胞および細胞内外の脂質からなる病巣である。アテローム性動脈硬化の進行によって、血管の弾力性が失われる。
【０００４】
アテローム性動脈硬化の発症には、いくつかの要因の複合的な関与が指摘されている。たとえば、血液中の脂質は、動脈硬化の主な危険因子（リスクファクター）の一つである。動脈壁内へ透過した血漿低比重リポ蛋白（LDL）は、マクロファージに貪食される。脂質を取り込んだマクロファージは、泡沫細胞となってプラークを形成する。特にLDLの酸化によって生成される酸化LDLは、マクロファージの遊走を刺激し、泡沫細胞への転化を促進する原因となる。
【０００５】
高コレステロール食を与えた実験動物モデルにおいては、ヒトのアテローム性動脈硬化病巣とよく似た血管障害症状が観察されることが確認されている。すなわち、総コレステロール値の上昇の誘発にともなって、マクロファージは血管内膜下に遊走する。そして内皮組織中で脂質を貪食したマクロファージは、泡沫細胞となる。平滑筋細胞も増殖し，脂質を蓄積する。脂肪線条および線維性プラークも拡大する。このように、血中脂質は、アテローム性動脈硬化の発症メカニズムに密接に関連している。特に、血清総コレステロールおよびLDLコレステロール濃度と冠動脈疾患リスクとの相関は直接的かつ連続的である。
【０００６】
血管内皮における物理的な損傷も、アテローム性動脈硬化の要因であることが指摘されている。内皮組織が高血圧などの原因によって損傷を受けると、その修復機構として、種々の血液細胞の遊走と、各種の増殖因子の産生が誘導される。その結果として血管平滑筋の過形成がもたらされ、動脈硬化が進行する。更に喫煙や運動不足などの生活習慣、あるいは加齢も動脈硬化の危険因子であることが明らかにされている。実際には、これらの要因が複合的に作用して、動脈硬化が進行すると考えられている。たとえば高血圧患者において高脂血症を合併すると、心血管疾患を発症する割合は、血清脂質が正常である高血圧患者に比べて５倍程度に上昇することが知られている。
【０００７】
動脈硬化は、狭窄、血栓、動脈瘤、あるいは塞栓などの障害が起きるまで、無症候である。しかし血管内腔が狭くなるのにつれて、徐々に血流量が減少し、罹患組織の機能不全につながるようになる。アテローム性動脈硬化は太い血管で進行する疾患であることから、その血流量の低下はしばしば重篤な症状につながる。血管が閉塞した場合には、脳梗塞や心筋梗塞などの虚血性疾患を起こす。
【０００８】
現在のところ、進行した動脈硬化に対する有効な治療方法は無い。したがって、危険因子を早期に発見して取り除くことが、動脈硬化性疾患の有効な対策であると言ってよい。たとえば先に述べたように高コレステロール血症は、動脈硬化の重要な危険因子である（非特許文献１）。そして、高脂血症は血液の分析によって容易に診断することができる。血清脂質は、食習慣の改善や投薬によってコントロールすることができる。つまり危険因子のコントロールが可能である。脂質濃度に与える遺伝的な素因の影響を予測することができれば、危険因子をコントロールするうえで有用な情報となる。血中の脂質濃度は、各個体の代謝機能の影響を強く受けている。たとえば、脂質合成に関与する因子の遺伝的素因は、脂質代謝機能を決定する大きな要因の一つである。
【０００９】
高脂血症の原因として、脂質合成に関わる多数の因子の遺伝子素因が報告されている。心筋梗塞および脳梗塞等の心血管合併症の独立した危険因子となる遺伝子多型が明らかにされている。動脈硬化の危険因子に関連する遺伝子素因が明らかになれば、遺伝子診断によって動脈硬化のリスクを予測することができる。動脈硬化リスクが高いと予測された場合には、予防的に生活習慣の改善などの対応を行えば、動脈硬化の進行を遅らせることができる。あるいは既に高脂血症や高血圧症状を有する患者においても、動脈硬化のリスクが予測できれば、治療方針の決定において、重要な情報となる。
【００１０】
一方クラステリン（アポリポプロテイン J）は動脈硬化巣において発現が誘導される糖蛋白質である。クラステリンには抗アポトーシス作用や補体活性化の抑制等のような多様な作用が見出されている。血中では主にアポリポプロテインA-1、ならびにコレステロールエステル輸送蛋白と共にHDLコレステロールを構成し、末梢組織からのコレステロールの回収に関わることが示唆されている（非特許文献２）。血液あるいは血管組織に存在するため、クラステリンの局在は全身性である。クラステリンの遺伝子多型と血中リポ蛋白質との関連について調べた報告がある（非特許文献３）。またアフリカ系黒人ではクラステリン遺伝子多型（Asn317His, Asp328Asn）が血中HDLレベルと相関することが報告されている（非特許文献４）。しかしその遺伝子多型と、血清コレステロールや動脈硬化との関連性は知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】Ross R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999; 340: 115-126. Review.
【非特許文献２】Gelissen IC, Hochgrebe T, Wilson MR, Easterbrook-Smith SB, Jessup W, Dean RT, Brown AJ. Apolipoprotein J (clusterin) induces cholesterol export from  macrophage-foam cells: a potential anti-atherogenic function?  Biochem J. 1998; 331: 231-237.
【非特許文献３】Kamboh MI, Harmony JA, Sepehrnia B, Nwankwo M, Ferrell RE. Genetic studies of human apolipoproteins. XX. Genetic polymorphism of apolipoprotein J and its impact on quantitative lipid traits in normolipidemic subjects. Am J Hum Genet. 1991; 49: 1167-1173.
【非特許文献４】Nestlerode CS, Bunker CH, Sanghera DK, Aston CE, Ukoli FA, Kamboh MI.Apolipoprotein J polymorphisms and serum HDL cholesterol levels in African blacks. Hum Biol. 1999; 71: 197-218.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、動脈硬化、あるいは総コレステロール値の上昇の危険因子の検査方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
動脈硬化、あるいは動脈硬化の重要な危険因子である脂質代謝機能と関連する遺伝的素因を明らかにするために、本発明者らは、日本人本態性高血圧患者においてクラステリン遺伝子における多型の同定を試みた。そして、血中脂質レベルおよび動脈硬化との関連を検討した。動脈硬化は、頸動脈の内膜中膜複合体厚(IMT)を指標として評価した。その結果、特定の遺伝子多型と動脈硬化の進行、あるいは総コレステロール値の上昇と関連していることを見出した。クラステリン遺伝子において見出されたこれらの多型を指標として、動脈硬化の進展、あるいは総コレステロール値の上昇の遺伝的素因の検査が可能であることを明らかにし本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の検査方法、ならびにそのための試薬に関する。
【００１４】
〔１〕次の工程を含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因の検査方法。
(a)  女性被検者が有する、クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)  (a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を予測する工程
〔２〕多型が１塩基多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕クラステリン遺伝子の多型が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型である、〔２〕に記載の検査方法。
〔４〕クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型が、Ｔの欠損であり、Ｔの欠損アレルを有する被検者は、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を有すると予測される〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法。
（ａ）  被検者の生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）  クラステリン遺伝子における塩基部位であって、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基のジェノタイプを決定する工程
（ｃ）  クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型が、Ｔの欠損であり、そのジェノタイプとしてＴの欠損アレルを有する場合に動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因を有すると予測する工程
〔６〕クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因検査用のプライマー。
〔７〕多型部位が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基の多型である〔６〕に記載のプライマー。
〔８〕クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因検査用のプローブ。
〔９〕多型部位が、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基である〔８〕に記載のプローブ。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明者らは、女性高血圧患者において、脂質代謝関連因子であるクラステリン遺伝子上に動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇と関連性がある多型が存在することを明らかにした。そして、これらクラステリン遺伝子上の多型に基づいて、女性高血圧患者が動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因を有することを判定することができる。
【００１６】
従来、総コレステロール値の上昇素因を予測する手法は知られていなかった。そのため、実際に血清脂質の測定値の異常が見られるまで、総コレステロール値の上昇を検査することはできなかった。本発明によれば、上記クラステリン遺伝子の多型に基づいて、総コレステロール値の上昇素因を予測することが可能となった。高血圧患者の総コレステロール値の上昇の合併は、動脈硬化性疾患のリスクを大きく高める要因である。したがって、総コレステロール値の上昇素因を発症前に知り、総コレステロール値の上昇を予防できることの意義は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因の検査方法を提供する。本発明の検査方法には、少なくとも、次の(a)、および(b)の工程が含まれる。すなわち、
(a)女性被検者が有する、クラステリン遺伝子における動脈硬化および／または総コレステロール値の上昇素因と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
(b)(a)で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因を予測する工程である。
【００１８】
本発明において、「動脈硬化素因」とは、動脈硬化が進展する可能性のある素因を意味する。本発明における動脈硬化は、特にアテローム性のものを言う。アテローム性動脈硬化病巣は、プラークで構成されている。早期のアテローム性動脈硬化病変では、脂肪線条(fatty streak)が見られる。そして症状の進行に伴い、アテローム性（粥状性）のプラークは、やがて線維性プラークへと発展する。統計学的にこれらの動脈硬化病変を生じる可能性が高いことが予測されることを、動脈硬化素因を有すると言う。
【００１９】
アテローム性動脈硬化と、コレステロール値の上昇との密接な関連が指摘されている。しかし本発明において予測される動脈硬化素因は、コレステロール値の上昇とは独立して予測される素因である。先に述べたように、動脈硬化の進展には、さまざまな要因が関与している。したがって、コレステロール値が正常範囲であっても、動脈硬化の進展は起こりうる。本発明によれば、コレステロール値の上昇とは無関係に、被検者が動脈硬化の進展傾向を有している群（ハイリスク群）に属していることを明らかにすることができる。
【００２０】
また「総コレステロール値の上昇素因」とは、総コレステロール値が上昇する可能性のある素因を意味する。総コレステロール値は、血液に含まれるエステル型と遊離型の両方のコレステロールの合計値である。現在のところ１３０〜２２０mg/dLが総コレステロールの正常範囲とされている。本発明における総コレステロール値の上昇とは、正常値とは無関係に、総コレステロール値の高い群（ハイリスク群）に属していると言うこともできる。血中コレステロール値は、総コレステロールの測定によって評価することができる。一般的には、コレステロールオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法による酵素的な測定方法が利用されている。前記正常値は、この酵素的な測定方法に基づく測定値である。
【００２１】
「クラステリン遺伝子」は、本願発明者らによってその遺伝子上に動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇との関連性のある多型が見出された。本発明において、「遺伝子」とはアミノ酸配列をコードする構造遺伝子に加え、構造遺伝子の転写に必要な発現制御領域を含む。したがって、「遺伝子」は、構造遺伝子に限定されずプロモータやオペレータなどの制御機能をもつ領域を含む。更に構造遺伝子とは、エキソンとイントロンによって構成される。実際に、本願発明者らが総コレステロール値の上昇との関連性を見出した多型は、イントロン内の多型である。
【００２２】
多型とは、遺伝学的には、人口中1％以上の頻度で存在している1遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、1％未満の塩基の変化であっても本発明の「多型」に含まれる。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型(SNPs)から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００２３】
上述の通り、本願発明者らにより、クラステリン遺伝子上に動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇と関連性を有する多型の存在が見出された。当業者は、本願発明の知見に基づいて、クラステリン遺伝子上の動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇の素因と関連する多型を明らかにすることができる。たとえば、女性高血圧患者において、総コレステロール値の上昇を有する患者における多型の頻度を解析し、有意性を有する多型を、総コレステロール値の上昇素因の指標として選択することができる。
【００２４】
本発明において動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因と関連するクラステリン遺伝子上の多型は望ましくは１塩基多型(SNPs)である。SNPsは、ヒトゲノム上に、１０００塩基に１つの割合で存在すると考えられている。したがって、およそ２０kbからなるクラステリン遺伝子座には、理論的には約２０のSNPsが存在していると考えられる。これらのSNPsから、連鎖解析によって動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因との関連性を有するSNPsを見出すことができる。
【００２５】
本発明における好ましい多型として、クラステリン遺伝子の６３１６位の塩基における多型を示すことができる。塩基の部位を示す数字は、ゲノムにおける転写開始点を１とした場合の数字である。クラステリン遺伝子は、６３１６位に多型（T/-）を有している。つまり、６３１６位のTを欠損したアレルが見られる。この多型を本明細書においては「６３１６ del T」と記載する。また本明細書においては、Tが欠損していないアレルをIアレル、Tを欠損したアレルをDアレルと記載する。
【００２６】
本発明者らの解析によれば、クラステリン遺伝子にDアレルを有する女性高血圧患者は、動脈硬化の進展を有する割合が有意に高かった。また同様に、クラステリン遺伝子にDアレルを有する女性高血圧患者は、そうでない患者と比較して、総コレステロール値が有意に高かった。したがって、Dアレルを有する患者は、動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因を有する。
【００２７】
クラステリン遺伝子のゲノム全長配列は配列番号：１に示す。この塩基配列はすでにデータバンクに登録され(GeneBank accession# NT_023666)ている。配列番号：１に示した塩基配列は、NT_023666の塩基配列上の塩基番号5828744から5848744に位置している。配列番号：１において翻訳開始点は６３７１に相当する。したがって、多型部位として示した６３１６は、配列番号：１の塩基配列においては１２６８６位に位置する。
【００２８】
被検者によっては、配列番号：１における６３１６位のTの位置が欠損や挿入によってずれる可能性がある。転写開始点からの塩基数がずれていても、当業者は配列番号：１に示した６３１６位のTの前後の塩基配列との整列によって、タイピングすべき塩基の位置を特定することができる。このようにして照合することができる塩基の位置を、相同な位置と言う。６３１６位のTに相同な位置の塩基のジェノタイピングによって、本発明の方法を実施することもできる。
【００２９】
被検者の「ジェノタイプの決定」は、まず一例を挙げれば、被検者のクラステリン遺伝子座の塩基配列を明らかにすることにより実施することができる。ジェノタイピングを行うためには、被検者からDNA試料を調製する。DNA試料は、例えば被検者の生体試料から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。生体試料としては、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便、および毛髪等を利用することができる。ここで調製されたDNA試料を用いてクラステリン遺伝子における動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因と関連する多型を有する部位の塩基配列を決定する。
【００３０】
より具体的には、本発明者らが見出した動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因と関連する多型６３１６ del Tのジェノタイピングは、当該領域の塩基配列を決定し、いずれの塩基であるかを確認する。本発明においては、被検者が６３１６位におけるTを欠損したアレルを有するとき、被検者は動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因を有すると判定される。
【００３１】
更に、ハプロタイプブロックのようにこれら多型と連鎖不平衡の関係を有するタグとなる多型に基づいて、間接的にこれらジェノタイプを決定することができる。ハプロタイプブロックは、連鎖不平衡の関係にある一群の多型を示す用語である。ハプロタイプを構成する多型は、高い確率で連鎖して遺伝する。したがって、本発明者らが見出した動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因と関連している多型である６３１６ del Tとともにハプロタイプブロックを構成する他の多型を指標として、６３１６ del Tのジェノタイプを決定することもできる。ゲノム解析の結果に基づいて、ハプロタイプ地図の整備が進んでいる。この解析の成果に基づいて、６３１６ del Tを含むハプロタイプブロックを同定し、当該ブロック内の他の多型に基づいて、本発明におけるジェノタイピングを実施することもできる。
【００３２】
このようにクラステリン遺伝子における動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇と関連する多型のジェノタイプが決定されると、次に、動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因に関連する多型として同定されたジェノタイプと比較され、これらの素因が予測される。ここで、動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因を有すると予測された被検者は、動脈硬化の進行、あるいは総コレステロール値が上昇するハイリスク群として管理することにより、コレステロール値の予防的な管理、あるいは動脈硬化への進行を防止または遅延させることが可能となる。なお、総コレステロール値の上昇は、動脈硬化の危険因子のひとつである。したがって、総コレステロール値の上昇素因を有することは、動脈硬化の危険因子を有していると言うこともできる。ハイリスク群に対しては、たとえば投薬、生活習慣の改善などの予防手段が有効と考えられる。
【００３３】
上記ジェノタイプを決定する手法として、直接、動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因に関連する多型部位の塩基配列を決定する方法を例示した。塩基配列を決定する以外にも、より迅速にジェノタイプを決定することができるさまざまな方法が公知である。PCR法を応用した解析方法としては、TaqMan PCR法、AcycroPrimer法、蛍光磁気ビーズ法、１分子蛍光分析システムの利用、およびMALDI-TOF/MS法等を利用することができる。またPCRに依存しないジェノタイピングのための方法としては、Invader法やRCA法が知られている。更にDNAアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明におけるジェノタイピングに応用できる。
【００３４】
［TaqMan PCR法］
TaqMan PCR法の原理は次のとおりである。TaqMan PCR法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、TaqManプローブを利用した解析方法である。TaqManプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計されている。
【００３５】
TaqManプローブのTmに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってTaqManプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。TaqManプローブの存在下でPCR法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたTaqManプローブに到達する。このときDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって、TaqManプローブはその5'末端から分解される。TaqManプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、TaqManプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、TaqManプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにTaqManプローブのハイブリダイズが低下すればTaqManプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
【００３６】
多型に対応するTaqManプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時にジェノタイプを判定することもできる。たとえば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのTaqManプローブに6-carboxy-fluorescein(FAM)を、アレルＢのプローブにVICを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、FAMまたはVICのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡまたはアレルＢのホモであることが明らかになる。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。TaqMan PCR法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてPCRとジェノタイピングを同時に行うことができる。そのため、TaqMan PCR法は、大量の被検者のジェノタイピング方法として有用である。
【００３７】
［Acyclo Prime法］
PCR法を利用したジェノタイピング方法として、Acyclo Prime法も実用化されている。Acyclo Prime法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、SNPs検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムのSNPsを含む領域をPCRで増幅する。この工程は、通常のゲノムPCRと同じである。次に、得られたPCR産物に対して、SNPs検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。SNPs検出用のプライマーは、検出対象となっているSNPsに隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
【００３８】
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ3'-OHをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、SNPsに相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光(Fluorescence polarization;FP)の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のSNPsが２種類の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。
【００３９】
［MALDI-TOF/MS法］
PCR産物をMALDI-TOF/MSで解析することによってジェノタイプを解析することもできる。MALDI-TOF/MSは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、蛋白質のアミノ酸配列や、DNAの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。MALDI-TOF/MSによるジェノタイピングのためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をPCRで増幅する。次いで増幅産物を単離してMALDI-TOF/MSによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
【００４０】
MALDI-TOF/MSを利用したジェノタイピングには、PCR産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確なジェノタイピングが期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
【００４１】
［IIs型制限酵素を利用したSNPs特異的な標識方法］
PCR法を利用した更に高速でジェノタイピングが可能な方法も報告されている。たとえば、IIs型制限酵素を利用してSNPsのジェノタイピングが行われている。この方法においては、PCRにあたり、IIs型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（II型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してIIs型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。したがって、この塩基数の分だけ離れた位置にIIs型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、IIs型制限酵素によってちょうどSNPsの部位で増幅産物を切断することができる。
【００４２】
IIs型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、SNPsの塩基を含む付着末端(conhesive end)が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、SNPsに対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物はSNPs部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
【００４３】
前記IIs型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー(capture primer)を組み合せてPCR法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。たとえばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、ジェノタイプを決定することができる。
【００４４】
［磁気蛍光ビーズを使った多重化SNPsタイピング］
複数のアレルを単一の反応系で並行して解析することができる技術も公知である。複数のアレルを並行して解析することは、多重化と呼ばれている。一般に蛍光シグナルを利用したタイピング方法では、多重化のために異なる蛍光波長を有する蛍光成分が必要である。しかし実際の解析に利用することができる蛍光成分は、それほど多くない。これに対して、樹脂等に複数種の蛍光成分を混合した場合には、限られた種類の蛍光成分であっても、相互に識別可能な多様な蛍光シグナルを得ることができる。更に、樹脂中に磁気で吸着される成分を加えれば蛍光を発するとともに、磁気によって分離可能なビーズとすることができる。このような磁気蛍光ビーズを利用した、多重化SNPsタイピングが考え出された(バイオサイエンスとバイオインダストリー, Vol.60 No.12, 821-824)。
【００４５】
磁気蛍光ビーズを利用した多重化SNPsタイピングにおいては、各アレルの多型部位に相補的な塩基を末端に有するプローブが磁気蛍光ビーズに固定化される。各アレルにそれぞれ固有の蛍光シグナルを有する磁気蛍光ビーズが対応するように、両者は組み合せられる。一方、磁気蛍光ビーズに固定されたプローブが相補配列にハイブリダイズしたときに、当該アレル上で隣接する領域に相補的な塩基配列を有する蛍光標識オリゴDNAを調製する。
【００４６】
アレルを含む領域を非対称PCRによって増幅し、上記の磁気蛍光ビーズ固定化プローブと蛍光標識オリゴDNAをハイブリダイズさせ、更に両者をライゲーションする。磁気蛍光ビーズ固定化プローブの末端が、SNPsに相補的な塩基配列であった場合には効率的にライゲーションされる。逆にもしも多型のために末端の塩基が異なれば、両者のライゲーション効率は低下する。その結果、各磁気蛍光ビーズには、試料が当該磁気蛍光ビーズに相補的なジェノタイプであった場合に限り、蛍光標識オリゴDNAが結合する。
【００４７】
磁気によって磁気蛍光ビーズを回収し、更に各磁気蛍光ビーズ上の蛍光標識オリゴDNAの存在を検出することにより、ジェノタイプが決定される。磁気蛍光ビーズは、フローサイトメーターでビーズ毎に蛍光シグナルを解析できるので、多種類の磁気蛍光ビーズが混合されていてもシグナルの分離は容易である。つまり、多種類のSNPsを単一の反応容器で並行して解析する「多重化」が達成される。
【００４８】
［Invader法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。たとえばInvader法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、およびFRETプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、cleavaseと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、ジェノタイピングを実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはFRETプローブのみである。   アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの5'側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは多型部位の3'側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
【００４９】
一方、インベーダープローブは、多型部位の5'側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって3'末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
【００５０】
多型部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入(invasion)した構造が形成される。cleavaseは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってcleavaseによるフラップの切断が起こらない。
【００５１】
FRETプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。FRETプローブは5'末端側に自己相補配列を有し、3'末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。FRETプローブの3'末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがFRETプローブにハイブリダイズすると、FRETプローブの自己相補配列の5'末端部分にフラップの3'末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。cleavaseは侵入構造を認識して切断する。FRETプローブのcleavaseによって切断される部分を挟んで、TaqMan PCRと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、FRETプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
【００５２】
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもFRETプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、FRETに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、FRETプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
【００５３】
Invader法に基づいてジェノタイプを決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのFRETプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、TacMan PCR法と同様の考えかたによって、ジェノタイプを解析することができる。
【００５４】
Invader法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがFRETプローブのみであることである。FRETプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。したがって、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、けっきょくジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
【００５５】
［RCA法］
PCR法に依存しないジェノタイピングのための方法として、RCA法を挙げることができる。鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが、環状の１本鎖DNAを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくDNAの増幅方法が、Rolling Circle Amplification(RCA)法である(Lizardri PM et al.,Nature Genetics 19, 225, 1998)。RCA法においては、環状DNAにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
【００５６】
RCA法には、鎖置換作用を有するDNAポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より5'側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。たとえば環状DNAを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖DNAが生成される。一方、環状DNAを鋳型として生成した長い１本鎖DNAには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。RCA法において生成される１本鎖DNAは、環状のDNAを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。したがって、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、DNAの増幅が達成される。
【００５７】
RCA法に必要な環状１本鎖DNAがSNPsの塩基に応じて生成されれば、RCA法を利用してSNPsをタイピングすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、5'末端と3'末端に検出すべきSNPsの両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。SNPs部分がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をDNAリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、RCA法の反応がトリガーされる。DNAリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。したがって、ライゲーションの有無をRCA法で確認することによって、SNPsのジェノタイピングが可能である。
【００５８】
RCA法は、DNAを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければジェノタイプを決定することができない。これらの点をジェノタイピング用に改良した方法が公知である。たとえばモレキュラービーコンを利用して、RCA法に基づいて１チューブでジェノタイピングを行うことができる。モレキュラービーコンは、TaqMan法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの5'末端と3'末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、RCA法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはRCA法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
【００５９】
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブでジェノタイピングが可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
【００６０】
［１分子蛍光分析システム(Single molecule fluorescence spectroscopy)］
1fL(femtoliter)という微小領域の蛍光分析を可能とするシステムが実用化されている。このシステムを用いれば、蛍光標識プライマーの伸長を、並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出することができる。タイピングの対象となるアレルに対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するプライマーを用意する。各プライマーには、それぞれ識別可能な蛍光標識を結合しておく。このプライマーを使ってPCRを行い、増幅産物を蛍光相関分析法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)によって蛍光測定する。サンプルがプライマーに相補的な塩基配列を有していれば、PCRによってプライマーは伸長する。伸長したプライマーは分子が大きくなるために、蛍光の揺らぎを生じる。この蛍光の揺らぎが並進拡散時間(translational diffusion time)の増大として検出される。プライマーに相補的な塩基配列がサンプル中に含まれなければ、PCRの増幅産物が生成しないので、蛍光変化は起きない。
【００６１】
具体的には、２つのアレルＡとＢに対して、それぞれ異なる蛍光標識を有するプライマーを用いて、同じ反応液中でＰＣＲを行う。増幅産物の蛍光測定において、ＡまたはＢのいずれか一方の蛍光シグナルの変化が観察されれば、いずれかのホモ、両方の蛍光シグナルが変化すればヘテロであることが確認できる(PharmaGenomics, July/August 46-48, 2003)。正確で迅速な解析方法として評価されている。
【００６２】
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。MALDI-TOF/MSを除けば、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らないジェノタイピングも古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。
【００６３】
RFLPは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるDNA断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、RFLPの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
【００６４】
標識プローブを必要としない方法として、DNAの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。PCR-SSCPでは、１本鎖DNAの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している(Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11. Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.、Detection of p53 gene mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.、Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling.、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282.)。PCR-SSCP法は、PCR産物を１本鎖DNAに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖DNAの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
【００６５】
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis： DGGE法）等を例示することができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってDNA断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
【００６６】
具体的には、まずPCR法等によってSNPs部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブDNAをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブDNAとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたDNA断片では、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
【００６７】
更にDNAアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる（細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」,秀潤社,2000.4/20発行,pp97-103「オリゴDNAチップによるSNPの解析」,梶江慎一 ）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNA（あるいはRNA）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、たとえば、多数のSNPsを同時に解析するには、DNAアレイは有用である。
【００６８】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
【００６９】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、検出すべきSNPsを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。更に、一般にDNAアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ(MM)プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（PM)プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
【００７１】
DNAアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体DNAから、DNA試料を調製することができる。判定すべきSNPsを含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体DNAの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスPCR法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスPCR法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるPCR法である。複数のSNPsを解析するときには、マルチプレックスPCR法が有用である。
【００７２】
一般にDNAアレイ法においては、PCR法によってDNA試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。たとえば、まずSNPsを含む領域に特異的なプライマーセットによるPCR法でゲノムDNAを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングPCR法によって、ビオチンラベルされたDNAを合成する。こうして合成されたビオチンラベルDNAを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたDNAを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
【００７３】
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド(ASO)は、検出すべきSNPsが存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ASOを試料DNAにハイブリダイズさせるとき、多型によってSNPs部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
【００７４】
本発明はまた、上記検査方法のためのプローブまたはプライマーを提供する。上述したジェノタイプの解析方法では、上記多型配列に又はその近傍の配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドをプライマーやプローブとして用いることが多い。したがって、当該多型部位の塩基を明らかにするためのプローブあるいはプライマーは、本発明の検査方法に重要な要素であり、有用である。
【００７５】
プライマーは、多型部位を含むDNAを鋳型として、多型部位を含むように相補鎖合成を開始し得るように設計される。プライマーの長さは１５〜１００範囲であり、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は、任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。また、多型部位上にプライマーがハイブリダイズするようにプライマーを設計してもよい。この場合、動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇素因を有すると判定される多型の配列のみハイブリダイズし、他の多型上にはハイブリダイズしない（あるいは、ハイブリダイズし難い）配列に設計してもよい。また、プライマーを構成する塩基配列は、配列番号：１に示したクラステリン遺伝子の配列に基づいて選択することができる。ただし、本発明のプライマーは、鋳型と完全に相補する配列に限定されず、また、相補的な配列に適宜変更を加えてもよい。例えば、配列を変更する場合を例示すれば、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に、任意の塩基配列を付加することである。ここで付加する配列としては、IIs型制限酵素の認識配列などが挙げられる。IIs型制限酵素の認識配列を付加することにより、IIs型制限酵素を利用した多型解析のプライマーとして使用し得る。
【００７６】
また、本発明のプライマーは物理的に修飾したものも含まれる。物理的な修飾の例としては、同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンまたはジゴキシンなどの結合親和性物質による標識などが挙げられる。こうした標識プライマーは各種のジェノタイピング方法において有用となる。
【００７７】
また、本発明のプローブは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズし得るように設計される。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。したがって、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
【００７８】
また、ハプロタイプブロック解析によりジェノタイプを決定するためのプローブは、動脈硬化素因あるいは総コレステロール値の上昇素因に関連を有する多型配列あるはそれと隣接する配列にはハイブリダイズしなくとも、タグ多型を検出し得るように、タグ多型配列あるいはタグ多型に隣接する配列にハイブリダイズし得るようなプローブも本発明に含まれる。本発明のプローブには、プライマーと同様に、鋳型と完全に相補する配列に限定されず、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。たとえばInvader法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、配列番号：１に記載のクラステリン遺伝子座の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。なお、プローブの長さは、上記DNAアレイ法の説明で記載した長さとほぼ同様であり、１５〜１００の範囲内であり、一般には１５〜５０、通常は１５〜３０である。
【００７９】
上記プライマーおよびプローブの合成は、当業者において用いられている任意の方法によって合成することができる。修飾プライマー、修飾プローブの合成においては、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用してオリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することは公知である。また、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。これらオリゴヌクレオチドの修飾は市販のキットなどを用いて行うこともできる。
【実施例】
【００８０】
本態性高血圧患者における遺伝子解析による総コレステロール値の上昇素因の同定
書面にて遺伝子解析に対し同意した患者のうち、高脂血症治療薬を服用していない女性の本態性高血圧患者２５１例（平均年齢６５±１０歳）を対象とした。全例に対し血清脂質濃度を測定し、頸動脈エコー検査にてプラーク(最大IMT＞＝１．１mm)の有無の確認を行った。糖尿病（HbA1c ＞ ６．０% あるいは糖尿病薬服薬中）および腎機能障害（血清クレアチニン＞１．３ mg/dL）の患者は除外した。まず一部のサンプルでクラステリン遺伝子の全配列を解析し、同定された一塩基多型（SNP）および挿入／欠失（I/D）多型のうち主要なものを全症例でタイピングした。
【００８１】
同定されたクラステリン遺伝子多型のうち各アレル頻度が20%以上の3つのcommon variantについて血清脂質レベルおよび頸動脈硬化度との関連を調べた。その結果、女性において6316 del T（I/D）多型で年齢、BMI、高血圧歴、収縮期および拡張期血圧、空腹時血糖、血清クレアチニン、C-反応性蛋白（CRP）濃度のいずれにも差を認めなかったが、血清総コレステロール濃度に有意差を認めた（表１）。
【００８２】
頚動脈プラークの有無で比較すると6316 del T（I/D）多型のDアレル群ではプラークを有する人が有意に多かった（表２、表３）。また、頚動脈プラーク形成に関与する因子を考慮したロジスティック回帰分析でも6316 del T（I/D）多型のDアレルはIMTと有意な相関を認め、動脈硬化形成の独立した規定因子であった（表４、表５）。
【００８３】
6316 del T（I/D）多型のDアレル群ではIアレル群と比べ血清総コレステロール濃度が高値を示し、頚動脈硬化の独立した規定因子であった。この多型を遺伝子診断に応用することで、高血圧患者における動脈硬化の進展、あるいは高コレステロール血症の発症を予知または予防できる可能性があると期待される。
【００８４】
上記の総コレステロール値の上昇、プラークあるいはIMTとの関連性を有していた多型（6316 del T（I/D）多型）を解析するためのPCR条件およびシークエンス条件は次のとおりである。
6316 del T解析のためのPCRおよびシークエンシング：PCRには各対象者から採取したゲノムDNA（２０ng）を試料とし、全量２０μlの反応系で実施した。PCR用プライマーは配列番号：２（Forwardプライマー：agagagtcacctgagcctggaag）、配列番号：３（Reverseプライマー：aaaggctgcagagctggaatc）を用い、反応系に最終濃度として各250nM添加した。また、酵素はFastStart Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を用いた。PCRの反応条件は、反応サイクルに入る前に変性（９５℃、４分）させた後、変性（９５℃／３０秒）→アニーリング６４℃/３０秒→伸長７２℃/６０秒の反応サイクルを３０サイクル繰り返した。増幅産物は、DyeEX 96 Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)で精製して、シークエンス反応に用いた。
【００８５】
シークエンス用プライマーは上記PCRプライマーの一つ（配列番号：２）を用いた。反応はBigDye Terminator Cycle Seqencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて実施した。反応後の配列決定にはシークエンサーABI PRISM 3700 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を使用した。
【００８６】
上記全症例のジェノタイプは、TaqManPCR法により決定した。TaqManPCR法は、TaqMan反応試薬（TaqMan Universal PCR Master Mix, No UNG (Applied Biosystems)を用い、後述する、いずれかのプローブ100nMおよびプライマー各800nM存在下で行った。反応条件は、反応酵素の活性化と鋳型DNAの変性ステップ（95℃/10 分）後、DNA変性ステップ（92℃/15秒）→アニーリングおよび伸長反応ステップ（58℃/1 分）のサイクルを40サイクル行った。
【００８７】
TaqMan用PCRプライマーおよびプローブの塩基配列は次の通りである。6316 del Tジェノタイピング用のPCRプライマーとして、tgcggatgaaggaccagtg（配列番号：４）、gtctgactccataaaggcagca（配列番号：５）を用いた。Iアレル解析用のプローブとして、Fam-ccgtcccccctgatcccttgt-TAMRA（配列番号：６）を用いた。Dアレル解析用のプローブとして、Vic-cgtccccccgatcccttgtg-TAMRA（配列番号：７）を用いた。すなわち、Iアレル解析にはレポーター色素としてFamを、クエンチャーにTAMRAを用い、一方、Dアレル解析用にはレポーター色素としてVicを、クエンチャーにTAMRAを用いて、同時にIアレル、Dアレルを解析し、Iホモ、Dホモ、I/Dへテロのいずれであるかを同定した。
【００８８】
表１  クラステリン遺伝子6316 del T（I/D）多型間での臨床背景
（女性のみ、分散分析）
======================================================================
I/I        I/D            D/D         P
----------------------------------------------------------------------
例数                         43        130             78
年齢 （歳）               65.6±10.4   65.2±9.6    64.0±12.4   .677
BMI （kg/m2）             23.5±4.5    22.5±4.8    24.1±3.6    .096
喫煙率（％）                 13.9         16.7        19.2       .665
高血圧歴 （年）           16.1±11.8   17.1±11.2   16.9±10.9   .886
収縮期血圧(mm Hg)        142.0±22.1  140.6±19.6  143.4±7.5    .669
拡張期血圧(mm Hg)         82.1±12.6   82.5±11.4   84.7±10.7   .389
脈拍数 （回/分）          63.2±10.2   65.7±12.3   64.2± 9.4   .549
総コレステロール(mg/dL)  195.2±31.1  204.8±27.6  213.4±30.8   .004
HDLコレステロール(mg/dL)  54.6±13.8   64.5±12.3   58.3±17.7   .580
LDLコレステロール(mg/dL) 117.3±25.5  123.4±31.2  134.0±26.0   .004
中性脂肪(mg/dL)          111.2±53.7  109.2±52.6  110.4±49.4   .898
空腹時血糖(mg/dL)         97.3±14.1   98.2±17.2   96.8±14.5   .878
クレアチニン(mg/dL)       0.61±0.24   0.64±0.18   0.65±0.18   .878
CRP(mg/dL)                0.10±0.09   0.15±0.41   0.12±0.15   .821
======================================================================
【００８９】
表２： 6316 del T（I/D）多型と頚動脈プラークとの関連（カイ2乗検定）
====================================
I/I      I/D     D/D
------------------------------------
プラークなし    30       46      28
プラークあり    13       74      50
合計         43      120      78
------------------------------------
カイ2乗値 15.22、P値 0.0005
====================================
【００９０】
表３  各アレル頻度と頚動脈プラークとの関連（カイ2乗検定）
=======================================
I allele   D allele   合計
----------------------------------------
プラークなし     76        74      150
プラークあり     87       124      211
合計        163       198      361
----------------------------------------
オッズ比   0.553、95% 信頼区間 0.383-0.798
カイ2乗値 10.11、P値 0.001
=======================================
【００９１】
表４ 6316 del T I/D多型と頚動脈プラークとの関連
（ロジスティック回帰分析  アレル間比較）
2005110608.tif 000002
【００９２】
表５ 6316 del T  I/D多型と頚動脈プラークとの関連
（ロジスティック回帰分析  DD vs. I/D+II）
2005110608.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００９３】
上述の通り、本発明によりクラステリン遺伝子上の多型である6316 del Tが本態性高血圧症の女性患者における動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇と関連していることが明らかにされた。この関連遺伝子多型を高血圧患者に対する遺伝子診断として応用することにより、動脈硬化あるいは総コレステロール値の上昇という高血圧性臓器障害のリスクを予測することができる。一般に、動脈硬化のような多因子性の疾患のリスク予測は難しいとされている。したがって、その遺伝的な素因を予測できることの意義は大きい。更に高血圧のような環境因子に加えて、総コレステロール値の上昇の遺伝的なハイリスク群を明らかにできることは、リスク予測においてきわめて有用な情報を提供することを意味している。
【配列表】
2005110608000001.app