(57)【要約】      （修正有）【課題】  作用ｐＨ範囲が広く、特にアルカリ性条件下での作用ｐＨ及び作用温度が高いものであって、従来のキシラナーゼとの比較においてアルカリ条件下での安定性に特に優れたキシラナーゼ、その製造方法、該キシラナーゼを産生する微生物、該キシラン処理剤及び該キシラナーゼによるキシランの処理法を提供すること。【解決手段】  新規のフリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1及びsp.TDL-KO1、これらを培養して得られ、アルカリ性で安定なキシラナーゼ。【選択図】  図１
2005102603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４から１２のいずれのｐHでも作用することを特徴とするキシラナーゼ。
【請求項２】
ｐH９．０、４５℃で１時間保持した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも６０％である請求項１に記載のキシラナーゼ。
【請求項３】
キシラナーゼを産生することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌。
【請求項４】
前記キシラナーゼが、請求項１又は２に記載されるものである、請求項３に記載のフリゴリバクテリウム属細菌。
【請求項５】
FERM  P-１９５２８又はFERM  P-１９５２９である、請求項４に記載のフリゴリバクテリウム属細菌。
【請求項６】
請求項５に記載の細菌から得られた配列番号６又は７に規定される配列と、少なくとも９５％の相同性を有する配列を１６ＳｒＤＮＡとして有することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌。
【請求項７】
請求項３乃至６の何れか一項に記載のフリゴリバクテリウム属細菌を培養することを含むことを特徴とするキシラナーゼの産生方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のキシラナーゼを含有することを特徴とする、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤。
【請求項９】
前記材料がパルプである請求項８に記載のキシラン処理剤。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のキシラナーゼ、又は請求項８又は９に記載のキシラン処理剤をパルプに作用させることを特徴とするパルプの処理方法。
【請求項１１】
前記キシラナーゼをパルプに作用させる前に、パルプのｐＨを４乃至１２の範囲に調整する工程を含む請求項１０に記載の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規キシラナーゼ、及び該キシラナーゼを産生するフリゴリバクテリウム属細菌、及び該キシラナーゼの産生方法、並びに該キシラナーゼを利用したキシラン処理剤及びパルプの処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシラナーゼはキシランを分解する酵素であり、製紙用パルプの漂白前処理用酵素として、更には機能性キシロオリゴ糖の製造用として用いられる有用酵素である。パルプ製造工程におけるキシラナーゼによる漂白性向上効果が1986年フィンランドのウィイカリ(Viikari)らにより提唱されて以来、北欧、北米で実用化され、国内においても一部の製紙会社が自前でキシラナーゼを生産してパルプ漂白工程への応用が試みられている（非特許文献１）。
【０００３】
とくに最近は、印刷古紙を用いて再生紙を製造する場合に、再生紙の白色度を向上させるためにキシラナーゼを利用する方法が試みられている。キシラナーゼを生産する微生物としては、スエヒロタケ(Schizophyllum commune)、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、カイニア(Chainia)属、アウレオバシジウム(Aureobasidium)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ルミノコッカス(Ruminococcus)属など数多くの微生物が報告されている（非特許文献２）。
【０００４】
また、アルカリ側のpH領域で活性を有するアルカリ性キシラナーゼを生産する微生物も知られており、例えば、好アルカリ性バチルス(Alkalophilic Bacillus)属(非特許文献３)、バチルス(Bacillus)属(非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７)、アエロモナス(Aeromonas)属(非特許文献８)に属する微生物が知られている。
【０００５】
キシラナーゼによるパルプの漂白の際、木材チップを蒸解した後の未晒パルプはpHが高くその後の酸素晒もアルカリ性で行われるので、中性以下に至適のある酵素を使用する場合には大量の酸によりpHを下げる必要があった。従って、通常工程の利用に適した酵素は反応pHが高い方が望ましいことが文献には記載されている（非特許文献９）。このような反応pHが高い酵素として、例えばｐＨ９．５以上のアルカリ条件下で作用するキシラナーゼが知られている（特許文献１）。また、高度の白色度を有する脱インキパルプを製造する場合においてもアルカリ浸漬工程が不可欠であることが知られており、アルカリ性キシラナーゼを添加する方法が知られている（特許文献２、特許文献３）。しかしながら上記いずれのキシラナーゼも作用ｐＨ範囲が狭く、特にアルカリ条件下での作用ｐＨや作用温度が低く、さらにはアルカリ条件下での安定性も低く、実用面からまだ十分満足できるものではなかった。
【特許文献１】特許第３３５３８９３号公報（特表平７−５０９１２５）
【特許文献２】特開平８−１７３１４８号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５６６５号公報
【特許文献４】特開平８−１２０５８０号公報
【非特許文献１】杉浦ら、「最新酵素利用技術と応用展開」、シーエムシー発行、２００１年、１２６頁
【非特許文献２】杉浦ら、「最新酵素利用技術と応用展開」、シーエムシー発行、２００１年、１２８頁
【非特許文献３】ナカムラら（Nakamura, S. et al.,） Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994年、58巻, ｐ.78
【非特許文献４】ホンダら（Honda, H. et al.,） Can. J. Microbiol. 1985年、31巻, ｐ.538
【非特許文献５】ホリコシら（Horikoshi, K., et al.,） Agri. Biol. Chem. 1973年、37巻, ｐ.2097
【非特許文献６】グプタら（Gupta, N. et al.,） Biotechnol Lett. 1992年、14巻、 ｐ.1045
【非特許文献７】オカザキら（Okazaki, W. et al.,） Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984年、19巻、ｐ.335
【非特許文献８】クドウら（Kudo, J. et al.,） J. Gen. Microbiol. 1985年、13巻、 ｐ.2825
【非特許文献９】杉浦ら、「最新酵素利用技術と応用展開」、シーエムシー発行、２００１年、１２７〜１２９頁
【非特許文献１０】クルカルニら（Kulkarni, N. et al.,） FEMS Microbiol. Rev. 1999年、23巻、pp.411-456
【非特許文献１１】ベーレントら（Behrendt, U., et al.,） Int. J. Sys. Evl. Microbiol. 2002年、52巻pp.1441-1454
【非特許文献１２】Kampfer, F.A., et al., Int. J. Sys. Evl. Microbiol. 50, (2000), pp.355-363
【非特許文献１３】バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology ）1984年、
【非特許文献１４】インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・アンド・エボルショナリー・マイクロバイオロジー(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)、 2000年、50巻、ｐ.355
【非特許文献１５】インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・アンド・エボルショナリー・マイクロバイオロジー(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)、2002年、52巻、ｐ.1441
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って本発明が解決しようとする課題は、作用ｐＨ範囲が広く、特にアルカリ条件下での作用ｐＨ及び作用温度が高いものであって、従来のキシラナーゼとの比較においてアルカリ条件下での安定性に特に優れたキシラナーゼ、その製造方法、該キシラナーゼを産生する微生物、該キシラン処理剤及び該キシラナーゼによるキシランの処理法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、斯かる課題を解決すべく、当該酵素を生産する微生物の探索を広く行った。その結果、従来知られていない菌学的性質を有するフリゴリバクテリウム属に属する微生物が、作用ｐＨ範囲が広く、特にアルカリ条件下での作用ｐＨ及び作用温度が高く、更にはアルカリ条件下での安定性に優れた新規キシラナーゼを産生することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、下記のものを提供する。
（１）４から１２のいずれのｐHでも作用することを特徴とするキシラナーゼ。
（２）キシラナーゼを産生することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌。
（３）上記（２）等のフリゴリバクテリウム属細菌を培養することを含むことを特徴とするキシラナーゼの産生方法。
（４）上記（１）等に記載のキシラナーゼを含有することを特徴とする、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤。
（５）上記（１）等に記載のキシラナーゼや、上記（４）等に記載のキシラン処理剤をパルプに作用させることを特徴とするパルプの処理方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のキシラナーゼは、非常に広いｐＨ範囲での活性を有するのみならず、従来は安定性を維持することが出来なかったアルカリ性のｐＨでも長時間作用を発現するものとなっており、このキシラナーゼ酵素は、本発明において同定されたフリゴリバクテリウム属の細菌を培養することにより産生することが可能である。
【００１０】
本発明のキシラナーゼは、キシラン処理剤として、パルプの処理などに利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明について詳細に説明する。
（菌株について）
本発明の微生物は、キシラナーゼの生産能を有するフリゴリバクテリウム属の細菌であり、好ましくは当該キシラナーゼが、４から１２のいずれのｐHでも作用すること、更にはｐH９．０、４５℃で１時間処理した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも６０％であるキシラナーゼを産生する細菌である。
本発明の微生物は、好ましくはFERM  P-１９５２８又はFERM  P-１９５２９である。本発明の微生物は更に、FERM  P-１９５２８又はFERM  P-１９５２９から得られた、配列番号６又は７に規定される配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する配列を１６ＳｒＤＮＡとして有することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌とすることもできる。
【００１２】
（キシラナーゼについて）
本発明は、４から１２の何れのｐＨでも作用することを特徴とするキシラナーゼを提供するものである。ここで「作用」とは、キシラナーゼが、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を基質として分解することを意味し、より具体的には、例えば下記の「キシラン分解活性測定」に示される方法における活性を有していることを意味する。本発明のキシラナーゼは、公知のキシラナーゼが作用する中性領域のみならず、アルカリ性の条件下でも作用することが可能であり、少なくとも４から１２の範囲内においては有意な活性を有している。更に本発明のキシラナーゼは、少なくとも５〜６０℃の範囲内において活性を示し、５５℃前後において高い活性を有している。
本発明のキシラナーゼは更に、ｐH９．０、４５℃で１時間処理した後の残存キシラナーゼ活性が、処理前活性の少なくとも６０％、好ましいものでは少なくとも８０％であり、公知のキシラナーゼと比較してアルカリにおける安定性が非常に高いものとなっている。
【００１３】
（キシラナーゼの産生方法について）
本発明のキシラナーゼは、本願に開示される細菌に限らず、どのような手段によって産生してもよいが、本発明のフリゴリバクテリウム属細菌、より具体的には、FERM  P-１９５２８又はFERM  P-１９５２９により産生させるか、或いは、FERM  P-１９５２８又はFERM  P-１９５２９から得られた、配列番号６又は７に規定される配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する配列を１６ＳｒＤＮＡとして有することを特徴とするフリゴリバクテリウム属細菌により産生させることも可能である。
【００１４】
本発明のキシラナーゼを産生する場合の細菌の培養方法としては、液体培養、固体培養等の通常の細菌培養方法を用いることができる。とりわけ、経済性の見地から、好気的に液体培養する方法が好ましく、その例としては好気的条件下での通気撹拌培養法や振盪培養法等が挙げられる。
【００１５】
本発明の菌株の培養に使用する培地は、炭素源、窒素源として、本発明のキシラナーゼが産生される条件を兼ね備えたものでありさえすれば、公知慣用のいずれのものも用いることができる。例えば炭素源としては、キシランもしくはキシランを含む稲藁、小麦ふすま、パルプ、バガス、コーンファイバー、その他の農産廃棄物や植物繊維等を使用することができる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン類、各種アミノ酸、大豆、コーンスチープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用いることができる。また、各種の塩類やビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。
【００１６】
培養温度及びｐＨは、本発明のキシラナーゼ生産菌が生育してキシラナーゼを生産する範囲であればいずれでもよいが、通常、培養温度は４℃から３７℃、好ましくは１５℃から３０℃、ｐＨは８から１１、好ましくは９から１０である。
【００１７】
本発明のキシラナーゼ生産菌から粗酵素を調製するには、培養した後、菌体を分離した培養上清液を粗酵素として用いればよい。また、必要に応じて、該粗酵素液から目的の酵素を精製することもできる。この場合、一般的に酵素精製に使用される種々の方法（例えば塩析法、溶媒沈殿法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニイティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、HPLCなど）を単独かまたはこれらを組み合わせて精製酵素を得ることができる。
【００１８】
（キシラン処理剤について）
本発明は更に、本発明のキシラナーゼを含有し、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を含む材料を処理するためのキシラン処理剤をも提供する。ここで、「処理する」とは、キシラン、又はキシランを構成要素とする多糖を基質として分解する工程にかけることを意味し、より具体的には、例えば下記の「キシラン分解活性測定」に示される方法において示されるような活性を利用してキシラン等を含有する材料を分解することを意味する。
【００１９】
キシランを構成要素とする多糖の例としては、パルプを挙げることができる。従って本発明のキシラン処理剤の例としては、パルプ処理剤を挙げることができる。本発明のキシラン処理剤は、含まれるキシラナーゼを利用して、パルプなどの材料を適度に分解することが可能なものとなっている。キシラナーゼを利用すると、パルプ中のセルロースの損傷を抑え、パルプの白色度の向上、品質の向上、塩素系漂白剤の使用量削減や、印刷古紙の脱インキなどを目的とするパルプ処理を行うことが可能になる。
【００２０】
本発明のキシラン処理剤は、本発明のフリゴリバクテリウム属細菌の培養物自体、適宜これを精製したもの、及び精製したキシラナーゼにその他の成分を添加した組成物の何れをも含む。その他の成分としては、キシラナーゼの作用を阻害することのないものであれば特に限定されることはないが、キシラナーゼの作用と併用することにより処理効果をあげることが可能なものを含めることが好ましい。より具体的には、二酸化塩素、苛性ソーダ、珪酸ソーダ、種々の界面活性剤、及び過酸化水素などがあり、これらを該技術分野で使用されている濃度で使用することが可能である。
【００２１】
（パルプ処理方法について）
本発明のパルプの処理方法においては、本発明のキシラナーゼ、及び本発明のキシラン処理剤を使用することができる。本発明のパルプ処理方法の具体的用途としては、古紙再生方法におけるパルプの漂白を挙げることができる。
パルプの処理方法においては、例えば
（１）印刷古紙に水を加える工程；
（２）印刷古紙をパルパーにかけて当該古紙を離解する工程；
（３）パルパー処理物の水分濃度を６５乃至９０％の範囲にまで濃縮する工程；
（４）パルパー処理物のｐHを４乃至１２、好ましくは５乃至１１、更に好ましくは６乃至１０．５、最も好ましくは８乃至１０の範囲にする工程；
（５）本発明のキシラナーゼ又はキシラン処理剤を添加する工程；
を行うことによりパルプ漂白を行うことができる。
【００２２】
本発明のパルプの処理方法においては、キシラナーゼの添加前にｐHをアルカリ側から中性側へと調整する必要がないことを除いては、従来のパルプの漂白方法と同様の手順で行うことができる。従来の方法としては、例えば特許文献２乃至４にも記載されている。
【００２３】
本発明のキシラナーゼをかかるパルプ処理に用いる場合、０．０１〜１０００Ｕ／ｇ乾燥パルプ、好ましくは０．０５〜１０Ｕ／ｇ乾燥パルプの範囲で使用すればよい（酵素活性１Ｕとは、１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）に相当する還元糖を生成する酵素量を言うものとする）。
【００２４】
本発明によるパルプ処理方法において、温度、ｐＨ、圧力、時間等の、酵素をパルプに作用させる処理条件は、所望の酵素作用が発現され、それによりパルプの白色度向上などの所望の効果を生じる条件であればいずれの範囲でも良いが、通常、処理温度は２０〜６０℃の範囲であればよく、好ましくは４０〜５０℃の範囲がよい。処理ｐＨは４〜１２の範囲であればよく、好ましくは５〜１１、更に好ましくは６〜１０．５、最も好ましくは８〜１０の範囲がよい。従来はパルパー処理後にアルカリ性であった処理物を、使用する酵素の安定性のために酸性にする必要があったが、本発明のキシラナーゼは、アルカリ性ｐＨにおいても非常に安定して使用することができるため、このパルパー処理後のｐＨ調整工程を省くことができる。
【００２５】
また、処理圧力は、パルプ漂白その他の通常のパルプ処理工程において用いられる圧力であればよく、とくに制限はないが、経済性の見地から常圧で行うことが好ましい。処理時間としては１０分〜５０時間の範囲であればよく、好ましくは１〜２４時間の範囲がよく、さらにより好ましくは１〜５時間の範囲がよい。
【実施例】
【００２６】
Ａ．菌株の単離
本発明のフリゴリバクテリウム属菌株は、次のようにして分離した。
スクリーニング源として甲虫幼虫を選び、甲虫幼虫の糞及び生息する腐葉土を下記表１に示す選択培地組成のうち寒天を除いた液体培地に加えて３０℃の恒温振盪機にて２〜３日間集積培養後、表１に示す選択培地を用い３０℃の恒温機にて培養しキシラン分解菌の単離を行った。この選択培地は、キシラン以外の炭素源が最小限に抑えられており、キシラン分解性の細菌が選択的に増殖するものとなっている。
【００２７】
【表１】
2005102603.tif 000003
【００２８】
選択培地上で増殖したコロニーのうち、甲虫幼虫が生息していた腐葉土中の菌由来のもの、及び甲虫幼虫の糞中の菌由来のものをそれぞれ選択し、菌学的性質を調べた。また、下記の「キシラナーゼの活性測定」に記載の方法により各菌株のキシラナーゼ産生能力を同定した。更に各菌株試料からDNAを分離し、分離したDNAを鋳型とし、配列番号１〜５に示されるオリゴDNAをプライマーとし、PCRにより１６SｒＤＮＡを増幅し、配列を決定した（結果は、配列番号６及び７に示す；詳細は下記の「１６ＳｒＤＮＡの配列解析」を参照）。
【００２９】
菌学的性質、キシラナーゼ産生能、及び１６ＳｒＤＮＡの配列において公知の菌株とは明らかに異なる菌株を二つ同定した。これら２つの菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に２００３年９月２４日付で、フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２８）、及びフリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２９）として寄託した。
【００３０】
Ｂ．菌学的性質
上記の寄託された二つの菌株の菌学的性質は以下のとおりであった。
フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1を、上記表１の増殖培地において２８℃で生育させ、非特許文献１３乃至１５に記載された方法に基づいて調べた。
【００３１】
（１）形態
（ア）細胞の形及び大きさ：桿菌で大きさは１μｍ以下
細胞の多形性：なし
（ウ）運動性：なし
（エ）胞子形成能：なし
（オ）グラム染色性：陽性。
【００３２】
（２）培地における生育状況
（ア）肉汁寒天平板培養：通常条件のpH 7.2では生育状態不良、pH10.0で良く生育し、以下の生育状況を示す。
表面状態  平滑
色      黄色の半透明
周縁    全縁
（イ）肉汁寒天斜面培養：通常条件のpH7.2では生育不良、pH10.0では良く生育し、以下の生育状況を示す。
なめらかなつやつやとして帯状に生育する
（ウ）肉汁液体培養：pH7.2では混濁無し、液面の生育無し、沈殿無し。
pH10.0では培地全体の生育及び沈殿が認められる。
表面被膜の形成はない。
（エ）肉汁ゼラチン穿刺培養：試験用培地pH7.2に生育せず、液化しない。（−）
pH10.0の培地では生育し、液化する。（＋）
（オ）リトマスミルク：生育しない。
【００３３】
（３）生理学的性質
生育範囲：ｐＨアルカリ性（ｐＨ９〜１０）付近で生育し、中性では生育しない。温度４〜３７℃で生育する
酸素に対する態度：絶対好気性。
【００３４】
（４）その他
コロニー形態：コロニー表面形状は平滑、コロニーの形は円形、コロニーの隆起は凸状、コロニー周辺の形状は全縁
（イ）細胞壁組成：糖組成・・・ラムノース、ガラクトース
ジアミノ酸・・・ジアミノピメリン酸−
アシル型・・・アセチル型：N-アセチルムラミン酸
リン脂質・・・PG=PE>PS>UN（３種）
（＊）PG:フォスファチジルグリセロール、PE:フォスファチジルエタノールアミン、PS:フォスファチジルセリン、UN:未知物質
（ウ）キノン分析：メジャーキノン・・・MK-10
マイナーキノン・・・MK-12、MK-13、MK-11、MK-9、MK-8
（エ）GC含量：0.667
【００３５】
フリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1の菌学的性質についても上記と同様にして調べた。
【００３６】
形態
（ア）細胞の形及び大きさ： 桿菌で大きさは1μｍ以下
細胞の多形性：なし
運動性：なし
胞子形成能：なし。
グラム染色性：陽性。
【００３７】
（２）培地における生育状況
（ア）肉汁寒天平板培養：通常条件のpH 7.2では生育状態不良、pH10.0で良く生育し、以下の生育状況を示す。
表面状態  平滑
色      黄色の半透明
周縁    全縁
（イ）肉汁寒天斜面培養：通常条件のpH7.2では生育不良、pH10.0では良く生育し、以下の生育状況を示す。
なめらかなつやつやとして帯状に生育する
（ウ）肉汁液体培養：pH7.2では混濁無し、液面の生育無し、沈殿無し。
pH10.0では培地全体の生育及び沈殿が認められる。
表面被膜の形成はない。
（エ）肉汁ゼラチン穿刺培養：試験用培地pH7.2に生育せず、液化しない。（−）
pH10.0の培地では生育し、液化する。（＋）
（オ）リトマスミルク：生育しない。
【００３８】
（３）生理学的性質
（ア）生育範囲：ｐＨアルカリ性（ｐＨ９〜１０）付近で生育し、中性では生育しない。温度４〜３７℃で生育する
（イ）酸素に対する態度： 絶対好気性。
【００３９】
（４）その他
（ア）コロニー形態：コロニー表面形状は平滑、コロニーの形は円形、コロニーの隆起は凸状、コロニー周辺の形状は全縁
（イ）細胞壁組成：糖組成・・・ラムノース、ガラクトース
ジアミノ酸・・・ジアミノピメリン酸−
アシル型・・・アセチル型：N-アセチルムラミン酸
リン脂質・・・PG=PE>PS>UN（３種）
（ウ）キノン分析：メジャーキノン・・・MK-10
マイナーキノン・・・MK-12、MK-13、MK-11、MK-9、MK-8
（エ）GC含量：0.685
【００４０】
Ｃ．キシラナーゼの活性測定
上記の二つの寄託済菌株についての、キシラナーゼ活性の測定方法及び結果は以下のとおりであった。
キシラナーゼ粗酵素液の調製
キシラン  ０．５％、ポリペプトン  ０．５％、酵母エキス  ０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、からなる液体培地を３００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ仕込み、シリコン栓をした後、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。冷却後、別殺菌したＫ２ＣＯ３  １０％水溶液をクリーンベンチ内で１０ｍｌ添加（培地中１％濃度に相当）し、培地ｐＨをおよそ１０．０に調整した（表１に記載の増殖培地のうち寒天を除いたものに相当）。その後フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1株（ＦＥＲＭ−１９５２８）を１白金耳植菌し、２７℃で往復振盪培養した。６０時間培養終了後、冷却付遠心分離機にて４℃にて遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分）して培養上清を分離し、キシラナーゼＵ１粗酵素液を得た。
同様の方法により、フリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1株（ＦＥＲＭ−１９５２９）を用いてキシラナーゼＫＯ１粗酵素液を得た。
尚、本明細書においては、上記フリゴリバクテリウム属sp.SOL-U1及びフリゴリバクテリウム属sp.TDL-KO1により生産されるキシラナーゼを各々キシラナーゼＵ１及びキシラナーゼＫＯ１と呼ぶ。
【００４１】
キシラン分解活性測定
上記のようにして得た二種類のキシラナーゼ粗酵素液について、キシラン分解活性を以下の条件、方法で調べた。
活性測定条件（酵素反応液  １ｍＬ）
基質濃度：０．５％還元β−１，４−キシラン（キシランの還元末端をＮａＢＨ４で還元してバックグラウンドを低く抑えた基質）
緩衝液：２５ｍＭ  ＧＴＡ緩衝液、ｐＨ９．０
酵素添加量：５０μｇ（１ｍｇ・ｍＬ水溶液５０μＬ）
反応温度：３０℃
反応時間：１５ｍｉｎ以上１８時間までの適当な時間
定量方法：Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法またはＤＮＳ法
酵素活性１Ｕは１分間に１マイクロモル（μｍｏｌ）に相当する還元糖を生成する酵素量をいうものとする。
【００４２】
活性測定方法
３０℃で一定時間酵素反応後Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法の銅試薬を１ｍｌ加えて反応を停止させ、１００℃で１５分間加熱後、５分間氷冷し、Ｎｅｌｓｏｎ試薬を１ｍｌ加え、よく撹拌してから室温で１５分間放置し発色させた。３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心で未反応のキシランを沈殿させ、上澄みの吸光度を５００ｎｍで測定した。反応時間ゼロで銅試薬を添加した反応液を対照試験として用い、標準物質としてはキシロース１００μｇを使用し、キシランの代わりにキシロースを添加した反応液の発色を基準にユニット数を計算した。
【００４３】
結果
＜酵素活性＞
キシラナーゼ粗酵素液のキシラン分解活性を測定した結果、６０時間培養液のキシラナーゼＵ１粗酵素の活性は約０．２４ｍＵ／ｍｇであり、キシラナーゼＫＯ１粗酵素の活性は約０．２３ｍＵ／ｍｇであった。
＜作用＞
キシランまたはキシラン系多糖に作用し、そのβ−１，４−キシロシド結合を加水分解してキシロースを生成した。
＜至適ｐＨ範囲＞
キシラナーゼＵ１はｐＨ４未満から１２の間で活性があった。キシラナーゼＫＯ１は、ｐＨ４未満から１２の間で活性があった。（図１及び２）。双方共に、特にｐＨが８〜１０の範囲で活性が高かった。
＜作用温度及び至適温度範囲＞
キシラナーゼＵ１及びＫＯ１はともに５５℃で最も高い活性を示した。３０℃での活性を１００％として各温度での比活性を比較すると５０〜５５℃の間で２５０％という高い活性を示した（図３及び４）。
＜安定性＞
キシラナーゼＵ１及びＫＯ１はともにｐＨ９．０、４５℃、１時間の加熱ではほとんど失活せず、特にキシラナーゼＫＯ１では８０％以上の高活性を維持していた（図５及び６）。
キシラナーゼＵ１及びＫＯ１はともにｐＨ４〜１２の間でほとんど失活せず、ｐＨ４〜１０．５の間で８０％以上の高活性を維持していた（図７及び８）。
ｐＨ９．０のＧＴＡ緩衝液または炭酸水素ナトリウム緩衝液を用いて４５℃以下で１時間保持した後の残存キシラナーゼ活性を測定した場合、６０％以上、特にすぐれたものは８０％以上の活性を維持した。特にキシラナーゼＵ１では３０℃で１００％以上の活性を維持し、３７℃では９０％以上の活性を維持し、４５℃では８０％以上の活性を維持した。一方、キシラナーゼＫＯ１は３０℃で９８％以上の活性を維持し、３７℃では９０％以上の活性を維持し、４５℃では８５％以上の活性を保持していた。
【００４４】
Ｄ．１６ＳｒＤＮＡの配列解析
寄託した二つの菌株よりＤＮＡを取得し、これをテンプレートとしてＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡの配列を増幅させた。ＰＣＲに使用したプライマーの配列を配列番号１乃至５に示した。配列番号１の配列は、１６ＳｒＤＮＡの最後の部分（約１５００ｂｐ付近）から前方へ向かうものであり、配列番号２の配列は、０ｂｐから後方へ向かうものであり、配列番号３の配列は、３３８ｂｐ付近から後方へ向かうものであり、配列番号４の配列は、７８６ｂｐ付近から前方へ向かうものであり、配列番号５に記載の配列は、７８６ｂｐ付近から後方へ向かうものである。
ＰＣＲは、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で２分間の処理を３５サイクル行い、７２℃で１０分間処理した後、４℃で試料を保存した。
ＰＣＲ後、増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とするバンドを切り出し、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮ（Bio 101 Systems社製）をマニュアルに記載されているようにして使用してＤＮＡを精製した。
精製したＤＮＡ試料を用いて配列を決定した。まずＤＮＡ試料を１００℃で８分間煮沸してから反応液に入れた。配列決定反応条件は、９６℃ホットスタート、９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で４分間を２４サイクル行い、４℃で保存した。これをシークエンサーにかけて配列を決定した。得られた結果を配列番号６及び７に示した。
【００４５】
Ｅ．属の同定及び分類
上記の菌学的性質から、両菌株の分類学的地位を非特許文献１３乃至１５に従い検索し、両菌株とも黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能、及び上記の１６ＳｒＤＮＡの解析結果から、更に特許文献１０乃至１２に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、本発明において同定された菌株がフリゴリバクテリウム属（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であると定義した。
【００４６】
上述のごとく、本発明はアルカリ条件下できわめて高い安定性を有するキシラナーゼを提供するとともに、斯かるキシラナーゼを産生する細菌をも提供するものである。斯かる細菌は、本明細書で記載される菌学的性質を有するものであり、更には、本発明のキシラナーゼを産生することが可能なものであり、より具体的には特許生物寄託センターに寄託されたものである。また本発明の細菌には、配列番号６又は７に示される配列を１６ＳｒＤＮＡとして有するもの、及びこれらの配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性を有する配列を１６ＳｒＤＮＡとして有するものが含まれる。少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％の相同性があれば、同種である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のキシラナーゼは、アルカリ条件下での作用ｐＨ及び作用温度が高く、さらに、ｐＨ９以上のアルカリ条件下で長時間極めて安定であるので、パルプの漂白や印刷古紙の脱インキ工程で利用でき、酵素失活が従来酵素に比べて抑えられ、結果的に酵素コストが低減できるので産業上の利用の可能性は高い。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】この図は、異なるｐＨにおけるキシラナーゼＵ１の比活性の測定結果を示すものであり、ｐＨ９．０の時の活性を１００％としたものである。
【図２】この図は、異なるｐＨにおけるキシラナーゼＫＯ１の比活性の測定結果を示すものであり、ｐＨ９．０の時の活性を１００％としたものである。
【図３】この図は、異なる温度におけるキシラナーゼＵ１の比活性の測定結果を示すものであり、３０℃の時の活性を１００％としたものである。
【図４】この図は、異なる温度におけるキシラナーゼＫＯ１の比活性の測定結果を示すものであり、３０℃の時の活性を１００％としたものである。
【図５】この図は、ｐＨ９．０で、３０℃、３７℃、又は４５℃で、０〜６０分間、キシラナーゼＵ１を処理した時の比活性を測定した結果を示すものであり、０分時の活性を１００％としたものである。
【図６】この図は、ｐＨ９．０で、３０℃、３７℃、又は４５℃で、０〜６０分間、キシラナーゼＫＯ１を処理した時の比活性を測定した結果を示すものであり、０分時の活性を１００％としたものである。
【図７】この図は、異なるｐＨでキシラナーゼＵ１を処理した時の比活性を示すものである。
【図８】この図は、異なるｐＨでキシラナーゼＫＯ１を処理した時の比活性を示すものである。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
<210> SEQ. ID NO: 6
<223> 
この配列を有する菌株の菌学的性質を非特許文献１３乃至１５に従い検索し、黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能を有するという観点から、更に特許文献１０乃至１２に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、この配列を１６ＳｒＤＮＡの配列として有する菌株がフリゴリバクテリウム属（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であるとした。
<210> SEQ ID NO: 7
<223>
この配列を有する菌株の菌学的性質を非特許文献１３乃至１５に従い検索し、黄色のコロニーをつくるグラム陽性桿菌であること、好気性であること、胞子を形成しないこと等の観点から、そして、キシラナーゼ産生能を有するという観点から、更に特許文献１０乃至１２に記載の公知のフリゴリバクテリウム属の種の特徴との比較から、我々出願人は、この配列を１６ＳｒＤＮＡの配列として有する菌株がフリゴリバクテリウム属（Ｆｒｉｇｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属する細菌であるとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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