(57)【要約】【課題】  共凝集反応を直接的に確認することができるスカトールを指標とする細菌の共凝集反応判定方法を提供する。【解決手段】  本発明は口腔内試料中のスカトールを指標とする口腔内細菌の共凝集反応判定方法である。口腔内細菌は、ストレプトコッカス  ミュータンス、ストレプトコッカス  ソブリヌス、アクチノバチルス  アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィノモナス  ジンジバリス、プレボテラ  インターメディア、フゾバクテリウム  ヌクレアタムからなる群より選ばれた１種又は２種以上である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔内試料中のスカトールを指標とする口腔内細菌の共凝集反応判定方法。
【請求項２】
前記口腔内細菌が、ストレプトコッカス  ミュータンス、ストレプトコッカス  ソブリヌス、アクチノバチルス  アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィノモナス  ジンジバリス、プレボテラ  インターメディア及びフゾバクテリウム  ヌクレアタムからなる群より選ばれた１種又は２種以上である請求項１に記載の共凝集反応判定方法。
【請求項３】
口腔内試料が、だ液、舌苔、歯垢、呼気、又は口気である請求項１又は２に記載の共凝集反応判定方法。
【請求項４】
口腔内試料中のスカトール量を測定する、口腔内の衛生環境、歯周病及び／又はう蝕の進行程度又は改善状況の判定方法。
【請求項５】
口腔内試料中のスカトール量を測定することによって、口腔内の衛生環境、歯周病及び／又はう蝕の進行程度又は改善状況を判定する判定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌の共凝集反応を直接的に判定する方法に関し、更に詳細には、だ液中などのスカトールの産生の有無を測定するによって、細菌の共凝集反応を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕、歯周病、口臭などの口腔疾患には、口腔内の細菌が関与している。う蝕の関連細菌としては、ストレプトコッカス  ミュータンス(Streptococcus mutans、（以下Ｓｍ菌））、ストレプトコッカス  ソブリヌス（Streptcoccus sobrinus（以下Ｓｓ菌））が、歯周病の原因菌としてはアクチノバチルス  アクチノマイセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans、以下Ａａ菌））、ポルフィノモナス  ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis（以下Ｐｇ菌））、プレボテラ  インターメディア（Prevotella intermedia、（以下Ｐｉ菌））があり、また、口臭にはフゾバクテリウム  ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum、（以下Ｆｎ菌））がある。
【０００３】
口腔疾患や感染症の大半は、病原細菌が凝集をし、歯垢として網目構造を形成するという共凝集反応が起こり、寄主の歯などの硬組織や舌、歯周ポケットなどの口腔粘膜の上皮細胞に付着して開始されるということが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
細菌の共凝集反応を確認する方法としては、非特許文献１に記載されているような細菌凝集アッセイ法が一般的である。すなわち、口腔内から採取した細菌を分離し、分離したそれぞれの細菌同士を試験管などに添加し、４℃で３０分間反応（放置）した後に目視で確認する、あるいは、菌液の吸光度を測定して細菌同士の凝集率を推定するという方法である。
【０００５】
また、歯周疾患の検査方法として、特許文献１に、口腔内のγ−グルタミルトランスペプチターゼ（以下、γ―ＧＴＰ）の活性の程度をγ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、γ−グルタミル−α−ナフチルアミン、γ−グルタミル−ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノアニリド、γ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドなどを合成基質と反応させた後に、ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド（ｐ−ジメチルアミノケイ皮アルデヒド）、３−メチル−２−ベンゾアゾリノンヒドラゾン、１−ナフトール−２−スルホン酸塩等の発色試薬を用いて視覚化する方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の方法は、γ−ＧＴＰと反応させる基質の取り扱いや入手が容易でないこと、さらには、γ−ＧＴＰと反応させた基質を発色させるために発色試薬を添加する際に酵素賦活剤を用いる必要があるなど、検査条件の制御が難しい。
【０００７】
さらに、特許文献２には、歯周病の進行度及び口臭を簡易に判定することができる口腔予備検診システム、口腔予備検診方法が開示されている。また、特許文献２には、インターネットを介してユーザの携帯電話から受信した属性データとユーザから採取した呼気データとを解析し、歯周病の進行度との相関を表す相関値から歯周病の進行度を判定する方法が開示されている。さらに、特許文献２には、歯周病予備検診では、呼気の測定及び解析により歯周病原因菌が産出するガスの検知を行うので、間接的に口臭チェックを行うことが可能であることが開示されている。
【０００８】
また、特許文献２には、「呼気測定器２に内蔵されている半導体ガスセンサＰＡ２、Ｔ５０／３、Ｐ１０／９、Ｐ４０／１は、…スカトール以外の全ての物質を測定・認識することができる」ことが開示されている。
【非特許文献１】Ｐ．Ｅ．Ｋｏｌｅｎｂｒａｎｄｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９９５、２５３、３８５−３９７
【特許文献１】特開平４−２２９１９８号公報
【特許文献２】特開平１５−１５９２６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、口腔内で起こる細菌の共凝集反応を直接的に確認することができる共凝集反応判定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
Ｆｎ菌と種々の口腔病原性細菌（例えば、Ｓｓ菌、Ａａ菌、Ｐｉ菌など）との間に共凝集反応が起こると、歯垢が形成される。歯垢が口腔内に沈積、堆積して、口腔内衛生環境を悪化させ、口腔疾患の原因になる。本発明者らは、前記共凝集反応と口臭成分の一つであるスカトールの産生量との間に高い相関があることを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき、スカトールを検出することにより、Ｆｎ菌と種々の口腔病原性細菌との共凝集反応を直接的に確認することを可能にした。
【００１１】
すなわち、本発明は口腔内試料中のスカトールを指標とする細菌の共凝集反応判定方法である。前記細菌は、口腔内細菌であってもよく、前記口腔内細菌はストレプトコッカス  ミュータンス、ストレプトコッカス  ソブリヌス、アクチノバチルス  アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィノモナス  ジンジバリス、プレボテラ  インターメディア、フゾバクテリウム  ヌクレアタムからなる群より選ばれた１種又は２種以上であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明によれば、口腔内試料中のスカトール量を測定することにより、口腔内細菌の共凝集反応の有無を検出することができる。また、前記スカトール量に基づき、口腔内細菌の凝集の程度を把握することができる。その結果、口腔内の衛生環境、歯周病及び／又はう蝕の進行程度または改善状況を簡易な方法で把握することができ、う蝕、歯周病の早期発見、予防及び口臭の予防に寄与することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、口腔内試料中のスカトールを直接的に測定することにより、細菌の共凝集反応を容易に判定することを可能にする。また、口腔内細菌の場合は、スカトールを検出することによって口腔内細菌の共凝集反応の有無の確認をすることができる。さらに、口腔内試料中のスカトール量を定量することにより、口腔内細菌の共凝集の状況を把握することを可能にする。
【００１４】
口腔内の健康あるいは衛生状態、さらには口腔疾患の予防に対し、だ液や呼気などを簡易に測定することにより、口腔内の衛生状態及び口腔環境の悪化状態の監視、さらには、う蝕、歯周病、口臭などの口腔疾患の早期発見、またはその予防をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係る細菌は、例えば、口腔内細菌、腸内細菌などの細菌を挙げることができる。口腔内細菌としては、Capuocytophaga属細菌群、例えば、C.sputigena, C.ochraceaなど；Eubacterium属細菌群、例えば、E.alactolyticumなど；Treponema属細菌群、例えば、T.denticolaなど；Prevotella属細菌群、例えば、P.intermedia、P.denticolaなど；Actinomyces属細菌群、例えば、A.naeslundii,  A.israelliなど；Propionibacterium属細菌群、例えば、P.acnesなど；Veillonella属細菌群、例えば、V.atypicaなど；Haemophilus属細菌群、例えば、H.parainluenza,など；Porphyromonas属細菌群、例えば、P.gingivalisなど；Fusobacterium属細菌群、例えば、F.nucleatumなど；Streptococcus属細菌群、例えば、S.mutans、S.sobrinus、S.oralis、S.mitis、S.gordonii、S.sanguisなど；Actinobacillus属細菌群、例えば、A.actinomycetemcomitansなど；からなる群より選ばれた１種又は２種以上を挙げることができる。
【００１６】
さらに、口腔内細菌として、ストレプトコッカス  ミュータンス、ストレプトコッカス  ソブリヌス、アクチノバチルス  アクチノマイセテムコミタンス、ポルフィノモナス  ジンジバリス、プレボテラ  インターメディア、フゾバクテリウム  ヌクレアタムからなる群より選ばれた１種又は２種以上を挙げることができる。
【００１７】
本発明の判定対象である口腔内試料としては、口腔内から採取できる試料であればよく、例えばだ液、洗口だ液、舌苔、歯垢、呼気、口気等が挙げられる。
【００１８】
本発明に係るスカトールの検出は、６〜７ｍＬのイオン交換水、蒸留水で３０秒〜６０秒洗口した洗口だ液、あるいは直接採取しただ液等の口腔内試料を用いて、各種分析方法によって行うことができる。
【００１９】
洗口だ液や直接採取しただ液を、直接分析機器に投入して分析することが好ましいが、ヘッドスペース部のみを分析してもよい。また、エーテル、ヘキサン、塩化メチレンなどの溶媒で液液抽出したものを分析することもできる。
【００２０】
呼気中のスカトールを測定する場合には、におい袋（近江オドエアサービス社製など）に採取した呼気を直接、ガスクロマトグラフィー−質量分析法、ＡＥＤ−質量分析法などの分析方法により分析することができる。採取した試料を濃縮して前述の分析方法に従って分析すると、より精度を高めることができる。
【００２１】
口気中のスカトールを測定する場合には、被験者に鼻呼吸をしてもらっている状態で、ガスタイトシリンジや注射筒等の気体採取装置に口腔内に挿入して口腔内の気体を採取し、採取した試料を直接、ガスクロマトグラフィー−質量分析法、ＡＥＤ−質量分析法などの分析方法により分析することができる。さらに、採取した試料を濃縮して前述の分析方法に従って分析すると、より精度を高めることができる。
【００２２】
スカトールの分析方法としては、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、赤外分光法、吸光度分析法、蛍光分析法など一般的な分析方法を用いることができる。より高い精度で分析する方法として、ガスクロマトグラフィー−質量分析法、固層吸着（ＳＰＭＥ）−質量分析法、ＡＥＤ−質量分析法、液体クロマトグラフィー−質量分析法、赤外分光−質量分析法、放射線照射発光法などを用いることができる。また、スカトールをより簡易に検出する方法として、スカトールと反応して発色する方法やスカトールを特異的に吸収する微生物センサーなどを利用する方法を用いることができる。
【００２３】
本発明に係るスカトールの定量方法として、だ液、洗口だ液、舌苔、歯垢、呼気、口気等の口腔内試料のうち、好ましくは６〜７ｍＬのイオン交換水、蒸留水で３０秒〜６０秒洗口した洗口だ液あるいは、被験者から直接採取しただ液１ｍＬから、ヘキサン、塩化メチレン、ジエチルエーテルなどの有機溶剤を用いてスカトールを抽出し、前述の各種分析方法を用いて分析することができる。特に好ましくは、洗口だ液あるいは直接採取しただ液から、ヘキサンを用いてスカトールを抽出し、ガスクロマトグラフィー−質量分析法を用いてスカトールを定量することができる。
【００２４】
本発明に係る口腔内の衛生環境、歯周病及び／又はう蝕の進行程度又は改善状況の判定方法は、口腔内試料中のスカトール量を測定することにより行うことができる。スカトール量の測定結果から、細菌の共凝集反応の有無及び前記歯周病等を判定するには、口腔内試料中のスカトール量を健常人のそれと対比することにより行なわれる。
【００２５】
本発明に係る口腔内の衛生環境、歯周病及び／又はう蝕の進行程度又は改善状況を判定する判定キットとして、だ液、呼気、口腔粘膜などからスカトールを検出することができるものであれば、特に限定しないが、例えば、スカトールと反応して色が変わる及び／または発色する化合物などを予め担体に担持させたものなどを挙げることができる。前記担体は、前記化合物を担持できるものであれば特に限定はしないが、例えば、紙；ニトロセルロース、ナイロン、PVDF（ポリビニリデンジフロライド）などの膜；などが挙げられる。
【実施例】
【００２６】
実施例１
（口腔内細菌の共凝集体とスカトールの関連性）
下記の方法に従い、口腔内細菌の共凝集体とスカトールとの関連性について調べた。
【００２７】
＜方法＞
ブレインハートインヒュージョン培地７ｍＬに、Ｆｎ菌、Ｓｓ菌、Ｐｉ菌、Ｐｇ菌、Ａａ菌の各菌液を０．１ｍＬずつ混合し、３７℃で２０時間培養した。１０ｍＬのふたつき試験管に食塩０．５ｇとり、これに培養液を１ｍＬ分取したのち、ヘキサン／エーテル溶液を２ｍＬ加えて１５秒間振とうして混合した。これを遠心分離機にて３５００ｒｐｍ、１０分間水層と溶媒層に分離し、溶媒層を分取したものをＧＣ−ＭＳ分析に供した。
【００２８】
＜結果＞
表１に、口腔内細菌の混合物から産生したスカトールの分析結果を示した。細菌を加えない系（コントロール）に比べて、各細菌を単独で加えた場合にもスカトールの産生が認められ、特に、Ｆｎ菌とＡａ菌、Ｆｎ菌とＰｉ菌、Ｆｎ菌とＳｓ菌、Ｆｎ菌とＡａ菌とＰｉ菌、Ｆｎ菌とＡａ菌とＰｉ菌とＳｓ菌との混合物はＦｎ菌単独の場合に比べて、１．４〜２倍以上のスカトールが産生されたことが確認できる。
【００２９】
【表１】
2005185236.tif 000002
【００３０】
一方、常法に従い、細菌凝集アッセイ法にてＦｎ菌のみ（図１）、Ｆｎ菌とＡａ菌とＰｉ菌とＳａ菌（図２）を混合したものを観察した。図１に示したように、Ｆｎ菌のみの場合は,その溶液が透明もしくは懸濁の状態で、沈殿物がなく、細菌の凝集が認められなかったが、図２のＦｎ菌とＡａ菌とＰｉ菌とＳａ菌との混合物の場合は、その溶液の中に沈殿物が確認され、これは明らかに凝集反応が起きていることを意味している。
このことから、口腔内試料中のスカトールを測定することにより、Ｆｎ菌、Ａａ菌、Ｐｉ菌、Ｓｓ菌などの口内細菌の共凝集反応を確認することができることがわかった。
【００３１】
実施例２（スカトール測定による歯周疾患の判定）
下記の方法に従い、歯周疾患の罹患状態とスカトール量との関連性を調べた。
＜方法＞
２０歳代から５０歳代被験者７８名の歯周疾患の罹患状態を臨床的に検査する目的で、歯肉の炎症状態を検査するGingival Index（以下、ＧＩ）の測定を行った。対象歯を口腔内の下記に示す代表６歯とし、１歯４面〔唇（頬）側、舌（口蓋）側、近心、遠心〕の歯肉の状態を、０（炎症なし）、１（歯肉の色調と表面の形態のわずかな変化）、２（中等度の歯肉表面の光沢、発赤、浮腫および腫脹圧迫により出血）、３（著しい発赤と腫脹、突発性出血の傾向及び潰瘍）を基準にスコアを与え、４部位の平均を該当歯のＧＩとした。
また、スカトール量の測定は、６〜７ｍＬのイオン交換水を６０秒洗口した洗口だ液をエーテル抽出したものを分析サンプルとし、ガスクロマトグラフィーにて定量した。
【００３２】
＜結果＞
表２に、歯肉の炎症状態と洗口液から抽出されたスカトール量の結果を示した。細菌を加えない系（コントロール）に比べて、歯ぐきの炎症状態が進行するにつれてスカトール量が増加し、ＧＩが１を超えるところからスカトール量が急激に増加していることがわかる。
【００３３】
【表２】
2005185236.tif 000003
【００３４】
実施例３（スカトール量と口腔疾患関連細菌の存在との関連性）
下記の方法で口腔疾患関連細菌の存在とスカトール量の関連性を調べた。
【００３５】
＜方法＞
７８名の被験者（２０歳代〜５０歳代）から安静時のだ液を採取した。前記だ液中に存在するＦｎ菌、Ｐｇ菌、Ｐｉ菌について、Nested ＰＣＲ法を用いて定性分析をした。各細菌が検出された場合を（＋）、検出されなかった場合を（−）とした。また、スカトール量の測定は、６〜７ｍＬのイオン交換水を６０秒洗口した洗口だ液をエーテル抽出したものを分析サンプルとし、ガスクロマトグラフィーにて定量した。
【００３６】
＜結果＞
表３にＦｎ菌とＰｇ菌、表４にＦｎ菌とＰｉ菌の存在とスカトール量の結果を示した。Ｆｎ菌およびＰｇ菌が検出された群でのスカトール量は約３倍以上高く、またＦｎ菌およびＰｉ菌が検出された群においても同様な結果であった。このことから、スカトール産生には、Ｆｎ菌およびＰｇ菌あるいはＰｉ菌の存在が必要であることがわかる。
【００３７】
【表３】
2005185236.tif 000004
【００３８】
【表４】
2005185236.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】Ｆｎ菌のみ存在する場合の溶液の状態を示した図である。
【図２】Ｆｎ菌、Ｓｓ菌、Ｐｉ菌及びＡａ菌の混合物が存在した場合の溶液の状態を示した図である。
【図１】
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【図２】
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