(57)【要約】【課題】純粋人工培養において、高収量をあげることのできる菌根菌の培養方法を提供する。【解決手段】本発明に係る菌根菌の培養方法は、高濃度の糖源をもつ培地Ａと、これよりも低濃度の糖源をもつ培地Ｂとを隣接して配置し、菌根菌を該両培地Ａ、Ｂに跨るように接種して、培養を行うことを特徴とする。【選択図】図１
2005102536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高濃度の糖源をもつ培地と、これよりも低濃度の糖源をもつ培地とを隣接して配置し、菌根菌を該両培地に跨るように接種して、培養を行うことを特徴とする菌根菌の培養方法。
【請求項２】
前記両培地を、仕切壁で仕切ることを特徴とする請求項１記載の菌根菌の培養方法。
【請求項３】
前記高濃度側の培地の糖濃度を２５ｇ／ｌ以上とすることを特徴とする請求項１または２記載の菌根菌の培養方法。
【請求項４】
前記高濃度側の培地に１ｇ／ｌ以上の窒素源を含むことを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の菌根菌の培養方法。
【請求項５】
少なくとも前記高濃度側の培地にリン酸塩を含むことを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の菌根菌の培養方法。
【請求項６】
前記高濃度側の培地の糖に、グルコースもしくはフルクトース、またはグルコースとフルクトースの混合物を用いることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載の菌根菌の培養方法。
【請求項７】
培養容器内に、高濃度の糖源をもつ培地と、これよりも低濃度の糖源をもつ培地とを隣接して配置したことを特徴とする菌根菌培養装置。
【請求項８】
前記両培地を、仕切壁で仕切ったことを特徴とする請求項７記載の菌根菌培養装置。                                                   
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌根菌培養方法および菌根菌培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハナイグチ、アミタケなどのイグチ類、マツタケ、ホンシメジなど外生菌根菌には優秀な食用菌が多く、荒廃地の植林などに菌根菌の利用が期待されている。しかし、菌根菌は一般に純粋人工培養では生育が悪く大量の菌糸体の調整が困難であり、そのため技術開発が要望されている。
天然では、菌根菌は栄養分の低い土壌中においても高い菌糸密度を保っているが、純粋人工培養では糖源などの濃度の低い培地では低い菌糸密度にしかならず、菌根菌の培養をすすめる上でこれを克服する技術開発が必要である。
【特許文献１】特開２００１−１６９６５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記要望に応えるべくなされたものであり、その目的とするところは、純粋人工培養において、高収量をあげることのできる菌根菌の培養方法および菌根菌の培養装置を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明に係る菌根菌の培養方法は、高濃度の糖源をもつ培地と、これよりも低濃度の糖源をもつ培地とを隣接して配置し、菌根菌を該両培地に跨るように接種して、培養を行うことを特徴とする。
前記両培地を、仕切壁で仕切るようにすることができる。
前記高濃度側の培地の糖濃度が２５ｇ／ｌ以上であると好適である。
また、前記高濃度側の培地に１ｇ／ｌ以上の窒素源を含むようにするとよい。
また、少なくとも前記高濃度側の培地にリン酸塩を含むようにすると好適である。
前記高濃度側の培地の糖に、グルコースもしくはフルクトース、またはグルコースとフルクトースの混合物を用いるようにすることができる。
【０００５】
また、本発明に係る菌根菌の培養装置では、培養容器内に、高濃度の糖源をもつ培地と、これよりも低濃度の糖源をもつ培地とを隣接して配置したことを特徴とする。
前記両培地を、仕切壁で仕切ることができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、低濃度培地側にも旺盛に菌糸体を繁殖させることができ、菌糸体の収量を増加できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下添付図面を参照し、本発明の好適な実施の形態を詳細に説明する。
図１は、菌根菌培養装置１０の一例を示す説明平面図、図２はその説明断面図、図３は仕切壁の説明図である。
１２はシャーレ状の培養容器、１４は蓋体である。
培養容器１２内は、切り欠き部１６を有する仕切壁１８によって２つの部位に仕切られている。
【０００８】
培養容器１２の、仕切壁１８で仕切られた一方の部位内には、高濃度の糖源をもつ培地Ａが収容され、他方の部位内には、培地Ａよりも低濃度の糖源をもつ培地Ｂが収容され、両培地Ａ、Ｂは、切り欠き部１６における境界部で接触するように隣接して培養容器１２内に収容されている。なお、両培地Ａ、Ｂは、若干の間隔をおいて、例えば、仕切壁１８の厚み分を隔てて隣接、配置してもよい。
また、固体培地の場合には仕切壁１８は必ずしも設けるを要しない。要は培地Ａと培地Ｂとを隣接して配置すればよい。
培地Ｂを、培地Ａの周りを取り囲むようにリング状に設けてもよい。
あるいは培地Ａと培地Ｂとを重ね合わせるようにして配置してもよい。
【０００９】
培地の種類は特に限定されるものではないが、少なくとも高濃度の糖源をもつ培地Ａに寒天培地からなる太田培地を用いると好適である。
培地Ａの糖源の濃度は２５ｇ／ｌ以上とするのがよい。
培地Ｂは寒天培地でなく、土やバーミキュライトを用いることもできる。
【００１０】
一般的な太田培地（寒天培地）を下記に示す。
組成                    濃度（  ／１０００ｍｌ）
グルコース                            １０ｇ
クエン酸                                １ｇ
酒石酸アンモニウム                      １ｇ
KH2PO4                              １ｇ
MgSO4・7H2O                          １ｇ
CaCl2・2H2O                        ５０ｍｇ
HEPES                                  ７ｇ
ミネラル液                            １０ｍｌ
ビタミン液                            １０ｍｌ
pＨ                                約５．１
【００１１】
なお、
HEPES：N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N´-エタンスルホン酸、
ミネラル液（／1000ml）：FeCl3  5mg、MnSO4・4-6H2O  50mg、
ZnSO4・7H2O  300mg、CoSO4・7H2O  50mg、CuSO4・7H2O  1０0mg、
NiSO4・6H2O  200mg、アセチルアセトン  3ml
ビタミン液（／1000ml）：塩酸チアミン  300mg、ニコチン酸  5mg、葉酸  3mg、ビオチン  5mg、ピリドキシン塩酸  0.5mg、Carnitine chloride 1mg、Adenine・
H2SO4・2H2O  3mg、Choline chloride 3mg
【００１２】
本実施の形態では、この太田培地をベースに、糖源がリッチな培地Ａと、糖源がプアーな培地Ｂとを調整し、両培地Ａ、Ｂを培養容器１２内に隣接配置して、菌根菌を接種するのである。なお、糖源は、グルコースもしくはフルクトース、またはグルコースとフルクトースの混合物を好適に用いることができる。
菌根菌２０は、図１に示すように両培地Ａ、Ｂに跨るように接種し、以後無菌状態で所要条件で培養を行うのである。
培養条件は菌根菌の種類にもよるが、温度は１０℃〜３０℃、湿度は６５％以上（好ましくは９０％程度の高湿度条件がよい）、培養期間は２０日〜３ヶ月程度である。ハナイグチの場合には、１５℃程度の比較的低温条件下の方がよかった。
【００１３】
菌根菌を両培地Ａ、Ｂに跨るように接種することにより、図１に示すように、高濃度培地Ａばかりでなく、低濃度培地Ｂ上にも菌根菌が生育し、コロニーを形成することがわかった。
このように低濃度培地Ｂ上にも菌根菌が生育する理由は、高濃度側から菌糸を通して順次栄養分が伝達され、菌糸は低濃度培地Ｂを足場として生育するからと考えられる。
天然の場合において、外生菌根菌は一般にセルロースなどの多糖を利用できず、糖源を宿主である樹木に依存している。樹木の篩部液は糖を多く含み、共生下にある菌糸体の糖利用性は植物生体内における糖濃度の影響を強く受けていると考えられる。この天然の場合において、菌根菌は、糖を多く含む篩部液等から栄養分を受け取り、その周囲の土中にまで菌糸が生育蔓延し、子実体として成長する。
【００１４】
本実施の形態では、接種した菌根菌の一部が高濃度培地Ａに接するのであり、天然に近い状態の生育環境が形成され、低濃度培地Ｂ側にも菌糸が生育していくものと想定されるのである。このように、一方の側が低濃度培地でよい（上記のように場合によっては土、バーミキュライト等でよい）ことは、培養の容易化、コストの低減化が図れることになる。天然のものでは土の上に子実体を形成する。子実体の形成には低栄養の培地に菌糸を良く繁殖させることが肝要と考えられ、子実体の形成が期待される。しかし、今回は、子実体の形成をみるまでには至らなかったが、菌糸体を収量よく得ることができた。
なお、高濃度培地の糖濃度を高くすればするほど、低濃度培地側への生長が相対的にも絶対的にもよくなることがわかっている。
【００１５】
菌根菌は、チチアワタケ、シロヌメリイグチ、ヌメリイグチ、ハナイグチ、アミハナイグチ、カラマツベニハナイグチ、アミタケ、マツタケ、ホンシメジなどの菌根菌の培養が行える。これらは自然界で自生し、いずれの菌も容易に採取できる。以下に示す実施例でも、自然界より採取した菌根菌を用いた。もちろん、マツタケなどは市販しているので、市販菌を用いてもよい。
【実施例】
【００１６】
太田培地を基本培地として液体培養を行った。低濃度培地Ｂはいずれもグルコース濃度１ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度１ｇ／ｌとした。
培養はいずれも無菌下、常温で行った。
培養日数は４０日、いずれも低濃度培地Ｂにおける収量で比較した。
【００１７】
実施例１：
ヌメリイグチの一菌株は、高濃度培地Ａが、グルコース濃度１００ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム（窒素源）濃度５ｇ／ｌで最もよい生長を示し、普通の太田培地での単なる培養に比較して約３倍（乾燥重量）の菌糸体の収量を得た。
【００１８】
実施例２：
図４、図５はハナイグチの培養例であり、横軸に高濃度培地Ａの糖源（Ｇ：グルコース）と窒素源（ＡＴ）の濃度、縦軸に低濃度培地Ｂ側での菌糸体の収量（ｇＤＷ：乾燥重量ｇ）を示す。
高糖濃培地Ａの糖濃度が高くなるにつれて飛躍的に収量が増加した。すなわち、糖濃度が１０ｇ／ｌ、３３．３ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌの場合、糖濃度が１ｇ／ｌのものに比して、それぞれ約４培、８倍、１２倍の収量を得た。一方、窒素源の濃度にはそれほど影響されていないことがわかる（図４、図５）。
【００１９】
実施例３：
図６、図７はチチアワタケの培養例であり、横軸に高濃度培地Ａの糖源（Ｇ：グルコース）と窒素源（ＡＴ）の濃度、縦軸に低濃度培地Ｂ側での菌糸体の収量（ｇＤＷ：乾燥重量ｇ）を示す。
高糖濃培地Ａの糖濃度が高くなるにつれて飛躍的に収量が増加した。すなわち、糖濃度が１０ｇ／ｌ、３３．３ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌの場合、糖濃度が１ｇ／ｌのものに比して、それぞれ約２培、４倍、１２倍の収量を得た。一方、窒素源の濃度にはそれほど影響されていないことがわかる（図６、図７）。
【００２０】
実施例４：
図８、図９はアミタケの培養例であり、横軸に高濃度培地Ａの糖源（Ｇ：グルコース）と窒素源（ＡＴ）の濃度、縦軸に低濃度培地Ｂ側での菌糸体の収量（ｇＤＷ：乾燥重量ｇ）を示す。
高糖濃培地Ａの糖濃度が高くなるにつれて飛躍的に収量が増加した。すなわち、糖濃度が１０ｇ／ｌ、３３．３ｇ／ｌ、１００ｇ／ｌの場合、糖濃度が１ｇ／ｌのものに比して、それぞれ約２培、４倍、１２倍の収量を得た。一方、窒素源の濃度にはそれほど影響されていないことがわかる（図８、図９）。
【００２１】
実施例５：
図１０は、Ａサイドのグルコース濃度を１ｇ／ｌ、Ｂサイドのグルコース濃度を１ｇ／ｌとし、図１１は、Ａサイドのグルコース濃度を１００ｇ／ｌ、Ｂサイドのグルコース濃度を１ｇ／ｌとして、それぞれアミタケ（Suillus bovinus）を接種し、２５℃暗黒下で４０日間培養した結果を示す。図１１に明らかなように、Ａサイドのグルコース濃度を高くした培地において、低濃度側にも菌糸が旺盛に繁殖していることがわかる。
【００２２】
実施例６：
図１２は、高濃度培地Ａ、低濃度培地Ｂにそれぞれリン酸塩（リン酸２水素カリウム）を添加して、ハナイグチを培養した場合の低濃度側における菌糸体の収量を示す。
基本培地（コントロール）は、低濃度培地Ｂが、やはりグルコース濃度１ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度１ｇ／ｌであり、高濃度側培地Ａが、グルコース濃度３３．３ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度５ｇ／ｌである。
Ｐ５０ｍＭ−Ａは、培地Ａ側にリン酸塩を５０ｍＭ添加した意味であり、Ｐ５０ｍＭ−Ｂは、培地Ｂ側にリン酸塩を５０ｍＭ添加した意味である。
図から明らかなように、高濃度培地Ａ側にリン酸塩を添加した場合、収量が増加している。
【００２３】
実施例７：
図１３は、高濃度培地Ａの糖源の種類を変えて、ヌメリイグチを培養した場合の低濃度側における菌糸体の収量を示す。
基本培地（コントロール）は、低濃度培地Ｂが、やはりグルコース濃度１ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度１ｇ／ｌであり、高濃度側培地Ａが、グルコース濃度３３．３ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度５ｇ／ｌである。
いずれも糖源の濃度を３３．３ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度５ｇ／ｌとした。なお２種類混在するものはいずれも等量で、トータルが３３．３ｇ／ｌである。
低濃度培地Ｂは、いずれもやはりグルコース濃度１ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム濃度１ｇ／ｌとしている。
図１３から明らかなように、糖源としては、グルコース、フルクトース、もしくはグルコースとフルクトースの混合物が有効である。
【００２４】
実施例８：
次に、菌の接種方法を検討した。菌根菌を両培地Ａ、Ｂに跨るように接種した場合には、片側のみ、あるいは両培地Ａ、Ｂに独立して（跨らずに）接種した場合に比較してはるかに安定して両側に菌叢を伸長させることができた。
高濃度培地Ａがグルコース濃度３３ｇ／ｌ、酒石酸アンモニウム（窒素源）濃度１ｇ／ｌであった場合、ハナイグチの一菌株にあっては、両培地Ａ、Ｂに跨るように（独立でなく連続するように）接種した場合、片側（高濃度側）のみに接種した場合に比して、低濃度培地側での菌糸体の生育が旺盛になり、約２倍重量の菌糸体を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】培養装置の説明平面図である。
【図２】培養装置の説明断面図である。
【図３】仕切壁の説明図である。
【図４】ハナイグチの培養結果を示すグラフである。
【図５】高濃度側培地組成を変えた場合のハナイグチの培養結果を示すグラフである。
【図６】チチアワタケの培養結果を示すグラフである。
【図７】高濃度側培地組成を変えた場合のチチアワタケの培養結果を示すグラフである。
【図８】アミタケの培養結果を示すグラフである。
【図９】高濃度側培地組成を変えた場合のアミタケの培養結果を示すグラフである。
【図１０】Ａ、Ｂ両サイド共に低糖濃度培地でアミタケを培養した結果を示す写真図である。
【図１１】Ａサイドを高糖濃度培地、Ｂサイドを低糖濃度培地とした培地でアミタケを培養した結果を示す写真図である。
【図１２】培地にリン酸塩を添加した場合の収量への影響を示すグラフである。
【図１３】培地の糖濃度、糖組成を変えた場合の収量への影響を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２６】
１０  培養装置
１２  培養容器
１４  蓋体
１６  切り欠き
１８  仕切壁
２０  菌根菌
【図１】
2005102536.tif 000003
【図２】
2005102536.tif 000004
【図３】
2005102536.tif 000005
【図４】
2005102536.tif 000006
【図５】
2005102536.tif 000007
【図６】
2005102536.tif 000008
【図７】
2005102536.tif 000009
【図８】
2005102536.tif 000010
【図９】
2005102536.tif 000011
【図１２】
2005102536.tif 000012
【図１３】
2005102536.tif 000013
【図１０】
2005102536.tif 000014
【図１１】
2005102536.tif 000015