(57)【要約】    【課題】  紙パルプ製造の省資源、省エネルギー化を目的に、リグノセルロース材料を予めリグニン分解菌で処理するにあたり、実用的に嫌気的な条件下で行うことができる方法、また、紙パルプ工程で生じる排水中に含まれるリグニンを実用的に嫌気的条件下で分解できる方法を提案する。    【解決手段】  単離したリグニン分解菌により嫌気的条件下でリグニンを分解することを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法。単離したリグニン分解菌がカンジダ属に属する酵母であり、特には、カンジダ・トロピカリスに属する。  上記菌により、パルプ排水中に着色物質として存在しているリグニンを嫌気的分解し脱色することができる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したリグニン分解菌により嫌気的条件下でリグニンを分解することを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法。
【請求項２】
単離したリグニン分解菌がカンジダ属に属する酵母であることを特徴とする請求項１に記載のリグニンの嫌気的分解方法。
【請求項３】
リグニン分解菌がカンジダ・トロピカリスに属することを特徴とする請求項２に記載のリグニンの嫌気的分解方法。
【請求項４】
パルプ排水中に着色物質として存在しているリグニンを分解し脱色することを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれかに記載のリグニンの嫌気的分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主としてパルプ製造に関連して使用される、微生物によるリグニンの分解方法に関する。より具体的には、木材中のリグニンを微生物により嫌気的に分解する方法、パルプ製造排水中のリグニンを微生物により嫌気的に分解し、脱色する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグニンはリグノセルロース材料（木質材料）の重量のおおよそ４分の１を占める主要成分の１つであり、紙パルプ産業にとって、リグニンの嫌気性分解はパルプ化エネルギーの削減や漂白薬品の削減、またこの結果として排水負荷の低減をもたらすものである。
リグノセルロース材料からセルロース、ヘミセルロースを取り出す場合、様々なリグニンの溶出方法が開発され、紙パルプの製造に実用化されている技術の一例としてクラフト法、亜硫酸塩法などがある。
中でもクラフト法は使用する薬品を高度に回収する方法が開発され、主要なパルプ製造方法となっている。この方法で溶出したリグニンが強く着色するため、パルプの漂白が必要になっている。このため、酸素脱リグニン、アルカリ抽出、二酸化塩素、過酸化水素、オゾン等の漂白剤による処理を組み合わせた多段漂白が行われている。これらの漂白排液は向流洗浄によって、清浄度の高い方から低い方に向かって再利用されているが、塩素系薬品による漂白後の排液は、活性汚泥槽、単沈槽などによる排水処理の後、工場から排出されている。しかしながら、着色成分はしばしば完全に除かれないため、工場周辺の景観を損ねることが懸念される。着色の主たる原因は排水中に含まれるリグニンによるため、このリグニンを除去する安価な方法が望まれている。
【０００３】
このような方法として、パルプ排水の処理方法（特許文献１）、紙パルプ排水の処理方法及び処理設備（特許文献２）、紙パルプ排水処理方法（特許文献３）、過酸化水素含有排水の処理方（特許文献４）が知られているが、これらの方法だけでは着色成分を十分に除去することはできず、もしくは実用化する上でコストなどの問題があり、さらにリグニンを分解する有効な手段の開発が望まれている。
【０００４】
リグニンは自然界では微生物の働きによって分解されており、このような微生物を利用した処理は常温、常圧で行われるため、環境への負荷が小さく、かつ安価な方法を提供できる可能性がある。これまで高分子のリグニンを低分子化できるリグニン分解菌として単離された菌は、いずれも白色腐朽菌と呼ばれる一群のキノコであり、これらのキノコからリグニン分解酵素も数種類単離されてきた。
【０００５】
リグニンを紙パルプの製造工程に先だって分解することは、省エネルギー化、省資源化が期待できる方法である。このような試みとして、菌処理の為の植菌方法（特許文献５）、木材腐朽菌を用いた木材チップの前処理法（特許文献６）がある。
【０００６】
これらの方法のいずれもリグニンの分解は好気的に行われるため、処理期間中空気をチップの堆積物に通気を行う必要があり、通気のための設備、エネルギーが、この微生物の処理により得られる効果より小さいことが実用化をする上で必要である。これまで単離されたリグニン分解菌は好気性であり、リグニン分解を効果的に進めるためには酸素の供給が必要である。またこれまで知られるリグニン分解酵素はいずれも酸化的にリグニンを分解する機構によるもので、酵素を利用する上でも酸素もしくは過酸化水素の供給が必要である。通気や酸素の供給は大量の排水の処理や、バイオマスからのリグニンの除去に利用するためには、設備、通気にかかる運転コストがしばしば工業的利用の障害となっている。
【０００７】
嫌気性条件下でリグニンを分解できる菌があれば、通気を必要とせず、通気に必要な設備、エネルギーを要せずしてリグニンを分解できる可能性があり、実用化を考えた上で有利である。
このような嫌気的な条件下でリグニンを分解できる微生物の存在も知られている（特許文献７、特許文献８）。また天然のリグニンから嫌気的にメタンを生成することは知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの菌によるリグニン分解の速度は遅く、工業的な利用には分解の能力を上げる必要がある。また、これまで報告されている方法は複合的な微生物の集合体によって行われるものであり、分解の能力を上げる等、工業的な利用に向けた研究は容易でない。
【特許文献１】特許公開２００２−１８４８３号公報
【特許文献２】特許公開平１０−２４９３５８号公報
【特許文献３】特許公開２０００−１５２７３号公報
【特許文献４】特許公開２００２−８６１５８号公報
【特許文献５】特開昭６３−０９１０７７号公報
【特許文献６】米国特許５６２０５６４号公報
【特許文献７】特許公開昭６０−０３１８９２号公報
【特許文献８】特許公開昭６０−０６９１８４号公報
【非特許文献１】Bennerら、“Appl. Environ. Microbiol., 第４７巻９９８−１００４（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
紙パルプ製造の省資源、省エネルギー化を目的に、リグノセルロース材料を予めリグニン分解菌で処理するにあたり、実用的に嫌気的な条件下で行うことができる方法は未だ提案されていない。また、紙パルプ工程で生じる排水中に含まれるリグニンを実用的に嫌気的条件下で分解できる方法は提案されていない。本発明はこれらの課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は上記課題を解決するため、嫌気的条件下でリグニンを分解する能力を持つ菌を純粋培養できる単離した菌として取り出し、これを使用する方法を提供する。
またこの菌のリグニン分解力を排水処理や紙パルプ製造の前処理に利用することである。即ち、本発明は以下の（１）〜（４）の発明からなる。
（１）  単離したリグニン分解菌により嫌気的条件下でリグニンを分解することを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法。
（２）  上記（１）の方法において、単離したリグニン分解菌がカンジダ属に属する酵母であることを特徴とするリグニンの嫌気的分解方法。
（３）  リグニン分解菌がカンジダ・トロピカリスに属することを特徴とする（２）に記載のリグニンの嫌気的分解方法。
（４）  パルプ排水中に着色物質として存在しているリグニンを分解し脱色することを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載のリグニンの嫌気的分解方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の嫌気性条件下でリグニンを分解する微生物は、リグニンの生分解において、これまで必要とされていた酸素を必要とせず、通気のための設備や通気の運転コストをかけずにリグニンを分解することができ、リグノセルロース材料からのリグニンや、パルプ製造工程から排出されるリグニンを安価に分解する方法を提供することが可能となった。
このような微生物としてリグニンの分解能力を高めることができる単離された微生物が好ましい。単離された微生物が得られれば、そのリグニン分解機構を解明し、この菌を人為突然変異や遺伝子組み換えなどの技術を利用して、その能力を高めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の微生物のリグニン分解能力を高め、あらかじめ増殖可能な培地で嫌気性、もしくは好気性条件下で増殖させ、その菌体を集菌後、水に懸濁し、あるいは適宜補間する栄養源を加え、適当なｐＨにあわせた溶液に懸濁し、リグノセルロース材料に噴霧した後、通気をせずに、もしくは密閉して放置する。リグニンが好ましい程度の分解されたら、リグノセルロース材料を取り出し、その後のパルプ化工程や漂白工程、ないしはバイオマスの糖化工程に利用する。
また、パルプ製造工程の着色した排液に増殖させた菌体を接種し、通気をせずにもしくは密閉して放置し、好ましい程度に脱色させた後に、次の排水処理工程に放流する。
【００１２】
嫌気性でリグニンを分解する菌の選抜は次のようにして行うことができる。木材チップをクラフト蒸解した後の排液に適当な酸、例えば硫酸を加えてｐＨを５以下にしてリグニンを沈殿させる。生じた沈殿を濾別し、水に懸濁して洗浄後、乾燥する。このようにして得たリグニンを秤取り、適当なアルカリ溶液例えば水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した後、このリグニンを０．１％、また適当な栄養源として、酵母エキス、イーストナイトロジェンベース、大豆タンパク、カゼイン、麦芽エキスなどを適宜加えた培地を所望のｐＨ、例えば6.5に調整し、密栓できる容器に入れ、気相を純窒素で置換した後、オートクレーブで滅菌する。冷却後、この容器に土壌などの試料をいれ、気相を純窒素などの酸素を含まない空気に置換し、密栓して所望の温度例えば４０℃で振盪培養する。
【００１３】
脱色が見られた培養液から、培養液の一部を空気の出入りを遮断し、純窒素で置換した嫌気性フードの中で採って、リグニンを０．１％含み、また上記振盪培養と同じ成分を含む寒天培地に試料を塗布し、嫌気性条件下でハロウの生成の有無を指標としてリグニンを脱色する菌を選抜することができる。
【００１４】
嫌気性でリグニンを分解する菌の単離は次のようにして行う。リグニンを含む培養液中で嫌気性条件下で培養した培養液を激しく攪拌し、この１部を採取して還元剤としてシステインを含み、気相を純窒素に置換した新鮮な培地で１０分の１希釈し、さらにこの希釈液を同様に１０分の１希釈をするという操作を１０回以上繰り返し、それぞれを嫌気性条件下で培養する。最も高い希釈液でリグニンの脱色が起こる試料が、単離した嫌気性菌を含む培養液である。
【００１５】
このようにして得た嫌気性菌が単離されていることの確認は次のようにして行う。最も高い希釈率で脱色が起きた培養液から遠心分離により菌体を回収し、その一部を採って染色体ＤＮＡを単離し、細菌類であれば16SリボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）、酵母であれば２８SｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２ドメイン（６００塩基対）の配列など、微生物の同定に一般的に利用される塩基配列を分析する。単離された菌の試料からは１種類のｒＤＮＡしか検出されないことで確認できる。
【００１６】
このようにして単離したリグニンを嫌気的に分解できる菌として、カンジダ属に属する菌株がある。更に詳しくはカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）に属する菌株がある。
【００１７】
この菌は、ポテトーデキストロース培地（日水製薬、ディフコ社製など）、ＬＢ培地（日水製薬、ディフコ社製など）で培養可能であるが、培地としては特に培養可能なものであれば良く、限定されるものではない。培養温度は１５℃から３７℃が好ましく、更に好ましくは３０℃が好適である。増殖は好気的条件で行うことも可能である。
【００１８】
リグニンの分解は次のように測定することができる。木材チップを蒸解した後の排液から調整したリグニンを１Ｎ水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液で溶解した後、このリグニンを固形分として０．１％、酵母エキスを１％含む培地を被検菌に適したｐＨに調整し、気相を純窒素で置換した後、植菌して、被検菌に適した温度で振盪培養する。培養後、培養液の一部を無菌的に採取し、遠心分離によって菌体を除去し、その上清の色度を測定する。
【実施例】
【００１９】
＜実施例１＞
（１）嫌気性リグニン分解菌のスクリーニング
スクリーニング用培地の調製と培養方法；
木材チップをクラフト蒸解した後の排液を中和してｐＨを５に調整し、生じた沈殿を濾別し、水に懸濁して洗浄後、乾燥した。このようにして得たリグニンを秤取り、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した後、このリグニンを０．１％、酵母エキスを１％、Ｌ−システイン０．０５％を含む培地をｐＨを6.5から８の範囲で０．５おきに調整し、気相を純窒素で置換した後、土壌などの試料を嫌気性条件下で加えて３０℃ないしは５０℃で振盪培養した。
【００２０】
（２）嫌気性リグニン分解菌の選抜
脱色が見られた培養液から、培養液の一部を採って、リグニンを０．１％含み、食塩0.85%、酵母エキスを１％含む寒天培地に試料を塗布し、嫌気性条件下でハロウの生成の有無を指標としてリグニンを脱色する菌を選抜した。
【００２１】
（３）嫌気性リグニン分解菌の単離
嫌気性でリグニンを分解する菌の単離は次のようにして行った。リグニンを含む培養液中で嫌気性条件下で培養した培養液を激しく攪拌し、この１部を採取して還元剤としてシステインを含み、気相を純窒素に置換した新鮮な培地で１０分の１希釈し、さらにこの希釈液を同様に１０分の１希釈をするという操作を１０回繰り返し、それぞれを嫌気性条件下で培養した。
【００２２】
（４）嫌気性菌の同定
最も薄い濃度の希釈液でリグニンの脱色が起こった培養液から遠心分離により菌体を回収し、その一部を採って染色体ＤＮＡを単離し、酵母の２８SｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２ドメイン（６００塩基対）の配列を分析した。単離された菌の試料からは１種類のｒＤＮＡしか検出されなかった。単離された微生物のｒＤＮＡの配列を下記の配列番号１に示す。
【００２３】
このｒＤＮＡの配列はカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）ＫＣＴＣ７８３０株の２８SｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２ドメイン（６００塩基対）と１００％一致した。この結果から単離したリグニンを嫌気的に分解できる菌は、カンジダ属に属するカンジダ・トロピカリスと同定した。これらの近縁種間の分子系統樹を図２に示した。なお本実施例で得られた菌株をＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｎｏ．８０−１１と名づけて生命工学工業技術研究所に寄託申請したが、その受託が拒否された。
【００２４】
（５）単離したリグニン分解菌による排水中のリグニンの脱色
広葉樹クラフトパルプの漂白排水に酵母エキスを１％、Ｌ−システイン０．０５％添加し、ｐＨを７に調製した後、純窒素でバブリングして培養容器内の空気を置換し、121℃２０分オートクレーブで滅菌した。滅菌後、上記単離菌を接種し、３７℃に静置した。３０日後に菌を接種した培地は脱色が見られた。コントロールでは脱色が見られなかった（図１参照）。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の微生物を用いて、リグノセルロース材料を嫌気性条件下で処理することにより、パルプ製造工程の省エネルギー化、省薬品が可能となる。また、パルプ製造工程からの排水の脱色による景観の改善、環境負荷の低減が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】右がコントロールのリグニン溶液であり、菌を接種せずに嫌気性条件下で放置したもの。左が実施例１で嫌気性菌により脱色されたリグニン溶液である。
【図２】本発明の菌と類縁菌群の２８ＳｒＤＮＡの配列から求めた近隣結合法による分子系統樹を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００２７】
＜配列番号１＞
SEQUENCE LISTING
<110> Oji Paper Co., Ltd.
<120> Method for anaerobic degradation of lignin
<130> 03P01208
<160> 1
<210> 1
<211> 570
<212> DNA
<213> Candida tropicalis
<400>   1
aaaccaacag ggattgcctt agtagcggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaat     60
ctggctcttt cagagtccga gttgtaattt gaagaaggta tctttgggtc tggctcttgt    120
ctatgtttct tggaacagaa cgtcacagag ggtgagaatc ccgtgcgatg agatgatcca    180
ggcctatgta aagttccttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg    240
gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg    300
gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa    360
gggcttgaga tcagacttgg tattttgtat gttacttctt cgggggtggc ctctacagtt    420
tatcgggcca gcatcagttt gggcggtagg agaattgcgt tggaatgtgg cacggcttcg    480
gttgtgtgtt atagccttcg tcgatactgc cagcctagac tgaggactgc ggtttatacc    540
taggatgttg gcataatgat cttaagtcgc                                     570
【図１】
2005185907.tif 000002
【図２】
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