(57)【要約】【課題】本発明の目的は、モナコリンK生合成遺伝子を提供することである。【解決手段】紅麹カビによって産生されたコレステロール阻害剤であるモナコリンKは、ポリケチドの二次代謝物である。本発明は、モナコリンK生合成遺伝子クラスターに対して特異的なプローブを提供する。推定のモナコリンK遺伝子クラスターを有するBACクローンを、BAC（細菌性人工染色体）ライブラリからスクリーニングして、シークエンシングを行い、これらのクローンに関して注釈づけを行った。結果から、モナコリンK合成に関連するポリケチドシンターゼ（PKS）遺伝子2個および調節遺伝子7個が得られたことが示される。次に、これらの遺伝子の全長cDNAをRT-PCRによって得て、これらの遺伝子を発現させるために発現ベクターにクローニングした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：1のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子。
【請求項２】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離DNA分子：
（a）mkAであって配列番号：2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：8のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：10のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【請求項３】
（a）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項４】
（b）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項５】
（c）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項６】
（d）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項７】
（e）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項８】
（f）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項９】
（g）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項１０】
（h）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項１１】
（i）である、請求項2記載の単離DNA分子。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、請求項3記載の単離DNA分子。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドがノナケチドシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項12記載の単離DNA分子。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、請求項4記載の単離DNA分子。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドがジケチドシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項14記載の単離DNA分子。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドがP450モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項5記載の単離DNA分子。
【請求項１７】
ポリヌクレオチドがオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項6記載の単離DNA分子。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドがデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項7記載の単離DNA分子。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドがトランスエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項8記載の単離DNA分子。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項9記載の単離DNA分子。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが転写因子活性を有するポリペプチドをコードする、請求項10記載の単離DNA分子。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドが流出ポンプ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項11記載の単離DNA分子。
【請求項２３】
請求項2記載の単離DNA分子を含むシャトルベクター。
【請求項２４】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離DNA分子：
（a）mkAであって配列番号：19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：27のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：26のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【請求項２５】
（a）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項２６】
ポリペプチドがノナケチドシンターゼ活性を有する、請求項25記載の単離DNA分子。
【請求項２７】
（b）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項２８】
ポリペプチドがジケチドシンターゼ活性を有する、請求項27記載の単離DNA分子。
【請求項２９】
（c）であって、P450モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３０】
（d）であって、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３１】
（e）であって、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３２】
（f）であって、トランスエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３３】
（g）であって、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３４】
（h）であって、転写因子活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３５】
（i）であって、流出ポンプ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項24記載の単離DNA分子。
【請求項３６】
請求項24記載の単離DNA分子を含む発現ベクター。
【請求項３７】
以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによって形質転換した細胞：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：8または27のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：10または26のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）これらの組み合わせ。
【請求項３８】
細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌である、請求項37記載の細胞。
【請求項３９】
紅麹カビ種である、請求項37記載の細胞。
【請求項４０】
モナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、請求項37記載の細胞。
【請求項４１】
モナスクスBCRC 38072である、請求項37記載の細胞。
【請求項４２】
以下を含む、モナコリンK産生を増大させる方法：
I）以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによって形質転換したモナコリンK産生細胞を培養する段階：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（h）これらの組み合わせ；ならびに
II）細胞からモナコリンKを回収する段階。
【請求項４３】
細胞が真菌である、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
細胞が紅麹カビ種である、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
細胞がモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４６】
細胞がモナスクスBCRC 38072である、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドが（g）である、請求項42記載の方法。
【請求項４８】
以下の段階を含む、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生法：
I）以下を含む、ポリヌクレオチドによって形質転換したHMG-CoAレダクターゼ阻害剤産生細胞を培養する段階：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（d）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；ならびに
II）細胞からHMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。
【請求項４９】
HMG-CoAレダクターゼ阻害剤がモナコリンKである、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
細胞が真菌である、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
細胞が紅麹カビ種である、請求項48記載の方法。
【請求項５２】
細胞が、モナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５３】
細胞がモナスクスBCRC 38072である、請求項48記載の方法。
【請求項５４】
細胞が、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってさらに形質転換される、請求項48記載の方法：
（i）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ii）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（iii）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（iv）これらの組み合わせ。
【請求項５５】
以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離DNA分子：
（a）配列番号：11のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号：12のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（c）配列番号：13のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（d）配列番号：14のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（e）配列番号：15のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（f）配列番号：16のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（g）配列番号：28のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（h）配列番号：17のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（i）配列番号：18のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【請求項５６】
ポリペプチドが（a）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項５７】
ポリペプチドがノナケチドシンターゼ活性を有する、請求項56記載の単離DNA分子。
【請求項５８】
ポリペプチドが（b）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項５９】
ポリペプチドがジケチドシンターゼ活性を有する、請求項58記載の単離DNA分子。
【請求項６０】
ポリペプチドが（c）であって、P450モノオキシゲナーゼ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６１】
ポリペプチドが（d）であって、オキシドレダクターゼ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６２】
ポリペプチドが（e）であって、デヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６３】
ポリペプチドが（f）であって、トランスエステラーゼ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６４】
ポリペプチドが（g）であって、HMG-CoAレダクターゼ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６５】
ポリペプチドが（h）であって、転写因子活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６６】
ポリペプチドが（i）であって、流出ポンプ活性を有する、請求項55記載の単離DNA分子。
【請求項６７】
請求項55記載の単離DNA分子を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モナコリンK生合成遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、モナコリンK（monacolin K）生合成遺伝子に関する。
【０００３】
紅麹カビ（Monascus）は、中国において何千年ものあいだ食品産業に応用されている。近年、紅麹カビがいくつかの生物活性物質を産生することが発見された。これらの生物活性物質は、主に紅麹カビの二次代謝物であり、これらには、高血圧症を低下させる物質、モナシジン（monascidin）のような抗腐敗菌物質、抗癌物質、血糖値を低下させる物質、エルゴステラル、抗酸化剤、およびモナコリンのようなコレステロール合成阻害剤が含まれる。したがって、紅麹カビは、近年、機能的健康食品としての価値が認められている。
【０００４】
モナコリンKは、紅麹カビによって産生されたコレステロール合成阻害剤であり、サンキョウ株式会社（SANKYO CO., LTD）によってモナスクス・ラバー（Monascus rubber）の培地から初めて単離された。次に、メルク社（Merck & Co., Inc）が、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）の培地から同じ物質を発見してこれをロバスタチンと命名し、これはHMG-CoAレダクターゼ阻害剤として作用した。モナコリンKは、ポリケチドに属し、その構造はHMG-CoAとの類似性を有する。したがって、モナコリンKがコレステロール合成をHMG-CoAと競合的に阻害して、HMG-CoAレダクターゼがHMG-CoAを触媒してメボロネートを生成することができず、それによってコレステロール合成が減少する。
【０００５】
真菌によって産生されたポリケチドの二次代謝物は、他の細菌には存在しない構造的多様性および独自の特徴を発現する（非特許文献1参照）。これらの特徴はまた、ポリケチド合成の酵素多様性において発現されている。紅麹カビによって産生されたモナコリンKは、ポリケチドグループのメンバーであり、ポリケチドシンターゼ（PKS）によって触媒されるアセチルCoAの縮合によって様々なポリケチドが産生されることが判明している（非特許文献2および3参照）。コンビナトリアル生合成と組み合わせたポリケチドシンターゼの研究から、新規ポリケチドの開発は大きな可能性を有し（非特許文献4参照）、新規ポリケチドは、有効な投薬をスクリーニングするためのもう一つの新しい経路となると考えられる。
【０００６】
【非特許文献１】O'Hagan、1995
【非特許文献２】Kennedy J, Auclair K, Kendrew SG, Park C, Vederas JC, Hutchinson CR. Modulation of polyketide synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis. Science 1999, May 21; 284 (5418) : 1368-72 .
【非特許文献３】Abe Y, Suzuki T, Ono C, Iwamoto K, Hosobuchi M, Yoshikawa H. Molecular cloning and characterization of an ML-236B (compactin) biosynthetic gene cluster in Penicillium citrinum. 2002. Mol. Genet. Genomics. 267:636-646.
【非特許文献４】McDaniel R, Thamchaipenet A, Gustafsson C, Fu H, Betlach M, Ashley G: Multiple genetic modifications of the erythromycin polyketide synthase to produce a library of novel ‘unnatural’ natural products. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:1846-1851.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、モナコリンK生合成遺伝子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る単離DNA分子においては、（１）配列番号：1のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む、単離DNA分子であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２）以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離DNA分子であることを特徴とする：
（a）mkAであって配列番号：2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：8のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：10のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【００１０】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３）（a）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（４）（b）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５）（c）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６）（d）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（７）（e）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（８）（f）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（９）（g）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１０）（h）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１１）（i）である、上記(2)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１２）ポリヌクレオチドが、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、上記(3)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１３）ポリヌクレオチドがノナケチドシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(12)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１４）ポリヌクレオチドが、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、上記(4)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１５）ポリヌクレオチドがジケチドシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(14)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１６）ポリヌクレオチドがP450モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(5)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１７）ポリヌクレオチドがオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(6)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１８）ポリヌクレオチドがデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(7)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（１９）ポリヌクレオチドがトランスエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(8)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２０）ポリヌクレオチドが、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(9)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２１）ポリヌクレオチドが転写因子活性を有するポリペプチドをコードする、上記(10)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２２）ポリヌクレオチドが流出ポンプ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(11)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係るシャトルベクターにおいては、（２３）上記(2)記載の単離DNA分子を含むシャトルベクターであることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２４）以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離DNA分子であることを特徴とする：
（a）mkAであって配列番号：19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：27のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：26のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【００３２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２５）（a）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２６）ポリペプチドがノナケチドシンターゼ活性を有する、上記(25)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２７）（b）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２８）ポリペプチドがジケチドシンターゼ活性を有する、上記(27)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（２９）（c）であって、P450モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３０）（d）であって、オキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３１）（e）であって、デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３２）（f）であって、トランスエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３３）（g）であって、HMG-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００４１】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３４）（h）であって、転写因子活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００４２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（３５）（i）であって、流出ポンプ活性を有するポリペプチドをコードする、上記(24)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００４３】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（３６）上記(24)記載の単離DNA分子を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００４４】
また、本発明に係る細胞においては、（３７）以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによって形質転換した細胞であることを特徴とする：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkGであって配列番号：8または27のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（h）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（i）mkIであって配列番号：10または26のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（j）これらの組み合わせ。
【００４５】
また、本発明に係る細胞においては、（３８）細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌である、上記(37)記載の細胞であることを特徴とする。
【００４６】
また、本発明に係る細胞においては、（３９）紅麹カビ種である、上記(37)記載の細胞であることを特徴とする。
【００４７】
また、本発明に係る細胞においては、（４０）モナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、上記(37)記載の細胞であることを特徴とする。
【００４８】
また、本発明に係る細胞においては、（４１）モナスクスBCRC 38072である、上記(37)記載の細胞であることを特徴とする。
【００４９】
また、本発明に係る方法においては、（４２）以下を含む、モナコリンK産生を増大させる方法であることを特徴とする：
I）以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによって形質転換したモナコリンK産生細胞を培養する段階：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（d）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（e）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（f）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（g）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（h）これらの組み合わせ；ならびに
II）細胞からモナコリンKを回収する段階。
【００５０】
また、本発明に係る方法においては、（４３）細胞が真菌である、上記(42)記載の方法であることを特徴とする。
【００５１】
また、本発明に係る方法においては、（４４）細胞が紅麹カビ種である、上記(42)記載の方法であることを特徴とする。
【００５２】
また、本発明に係る方法においては、（４５）細胞がモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、上記(42)記載の方法であることを特徴とする。
【００５３】
また、本発明に係る方法においては、（４６）細胞がモナスクスBCRC 38072である、上記(42)記載の方法であることを特徴とする。
【００５４】
また、本発明に係る方法においては、（４７）ポリヌクレオチドが（g）である、上記(42)記載の方法であることを特徴とする。
【００５５】
また、本発明に係る方法においては、（４８）以下の段階を含む、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生法であることを特徴とする：
I）以下を含む、ポリヌクレオチドによって形質転換したHMG-CoAレダクターゼ阻害剤産生細胞を培養する段階：
（a）mkAであって配列番号：2または19のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（b）mkBであって配列番号：3または20のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（c）mkEであって配列番号：6または23のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（d）mkFであって配列番号：7または24のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；ならびに
II）細胞からHMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。
【００５６】
また、本発明に係る方法においては、（４９）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤がモナコリンKである、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。
【００５７】
また、本発明に係る方法においては、（５０）細胞が真菌である、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。
【００５８】
また、本発明に係る方法においては、（５１）細胞が紅麹カビ種である、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。
【００５９】
また、本発明に係る方法においては、（５２）細胞が、モナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、およびモナスクス・プルプレウスからなる群より選択される、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。
【００６０】
また、本発明に係る方法においては、（５３）細胞がモナスクスBCRC 38072である、上記(48)記載の方法であることを特徴とする。
【００６１】
また、本発明に係る方法においては、（５４）細胞が、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってさらに形質転換される、上記(48)記載の方法であることを特徴とする：
（i）mkCであって配列番号：4または21のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ii）mkDであって配列番号：5または22のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（iii）mkHであって配列番号：9または25のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；および
（iv）これらの組み合わせ。
【００６２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５５）以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離DNA分子であることを特徴とする：
（a）配列番号：11のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）配列番号：12のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（c）配列番号：13のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（d）配列番号：14のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（e）配列番号：15のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（f）配列番号：16のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（g）配列番号：28のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（h）配列番号：17のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（i）配列番号：18のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【００６３】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５６）ポリペプチドが（a）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質からなる群より選択される活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６４】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５７）ポリペプチドがノナケチドシンターゼ活性を有する、上記(56)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６５】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５８）ポリペプチドが（b）であって、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼからなる群より選択される活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６６】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（５９）ポリペプチドがジケチドシンターゼ活性を有する、上記(58)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６７】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６０）ポリペプチドが（c）であって、P450モノオキシゲナーゼ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６８】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６１）ポリペプチドが（d）であって、オキシドレダクターゼ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００６９】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６２）ポリペプチドが（e）であって、デヒドロゲナーゼ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００７０】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６３）ポリペプチドが（f）であって、トランスエステラーゼ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００７１】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６４）ポリペプチドが（g）であって、HMG-CoAレダクターゼ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００７２】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６５）ポリペプチドが（h）であって、転写因子活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００７３】
また、本発明に係る単離DNA分子においては、（６６）ポリペプチドが（i）であって、流出ポンプ活性を有する、上記(55)記載の単離DNA分子であることを特徴とする。
【００７４】
また、本発明に係る発現ベクターにおいては、（６７）上記(55)記載の単離DNA分子を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００７５】
本発明により、モナコリンK生合成遺伝子が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
したがって、本発明の一つの態様は、配列番号：1のヌクレオチド配列またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む、単離されたDNA分子を提供することである。
【００７７】
本発明のもう一つの態様は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む単離DNA分子を提供する：（a）mkAであって配列番号：2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（b）mkBであって配列番号：3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（c）mkCであって配列番号：4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（d）mkDであって配列番号：5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（e）mkEであって配列番号：6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（f）mkFであって配列番号：7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（g）mkGであって配列番号：8のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（h）mkHであって配列番号：9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（i）mkIであって配列番号：10のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および（j）ストリンジェントな条件下で（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）、（g）、（h）、または（i）のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【００７８】
本発明のさらにもう一つの態様は、先に定義した単離DNA分子を含むベクターを提供する。
【００７９】
さらに、本発明の態様は、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換された細胞を提供する：（a）mkAであって配列番号：2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（b）mkBであって配列番号：3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（c）mkCであって配列番号：4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（d）mkDであって配列番号：5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（e）mkEであって配列番号：6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（f）mkFであって配列番号：7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（g）mkGであって配列番号：8のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（h）mkHであって配列番号：9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（i）mkIであって配列番号：10のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および（j）これらの組み合わせ。
【００８０】
その上、本発明の態様は、ベクターによって形質転換された細胞を培養する段階、および細胞からモナコリンKを回収する段階を含む、モナコリンK産生を増大させる方法を提供する。ポリヌクレオチドを含むベクターは以下からなる群より選択される：（a）mkAであって配列番号：2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（b）mkBであって配列番号：3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（c）mkCであって配列番号：4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（d）mkDであって配列番号：5のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（e）mkEであって配列番号：6のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（f）mkFであって配列番号：7のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（g）mkHであって配列番号：9のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および（h）これらの組み合わせ。
【００８１】
その上、本発明の態様は、ベクターによって形質転換された細胞を培養する段階、および細胞からHMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階を含む、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法を提供する。ベクターは、先に定義したとおりである。
【００８２】
さらに、本発明の態様は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生法を提供する。本方法は、以下の段階を含む：（a）配列がそれぞれノナケチドシンターゼ（nonaketide synthase）、ジケチドシンターゼ（diketide synthase）、デヒドロゲナーゼ、およびトランスセステラーゼ活性を有するタンパク質をそれぞれコードする、配列番号：2（mkAゲノムDNA）、配列番号：3（mkBゲノムDNA）、配列番号：6（mkEゲノムDNA）、および配列番号：7（mkFゲノムDNA）のヌクレオチド、これらの配列と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）形質転換した細胞をヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養する段階；ならびに（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。
【００８３】
さらに、本発明の態様は、ベクターによって形質転換した細胞を培養する段階、および細胞からモナコリンKを回収する段階を含む、モナコリンKの産生法を提供する。ベクターは先に定義した通りである。
【００８４】
詳細な説明
紅麹カビに対して特異的なプローブは、Nicholson（Nicholson TP, Rudd BA, Dawson M, Lazarus CM, Simpson TJ, Cox RJ. Design and utility of oligonucleotide gene probes for fungal polyketide synthases. Chem Biol 2001, Feb; 8 (2) :157-78 .）によって公表されたアスペルギルス・テレウスのロバスタチンに対する縮重プライマーに従って設計した。モナコリンK合成に関連する遺伝子は、コロニーハイブリダイゼーションによって紅麹カビBACライブラリからクローニングして、シークエンシングし、注釈をづけを行った。二つのPKSの完全長cDNAをRT-PCRによって増幅して、発現ベクターにそれぞれクローニングした。そうして本発明が達成された。
【００８５】
1980年代に紅麹カビによって産生されたコレステロール阻害剤が発見されて以来、血圧、血糖、およびコレステロールの低下における紅麹カビの作用に関してますます関心が高まってきている。モナコリンKの他にも、コレステロールを低下させる他の物質、例えばモナコリンJ、L、M、およびXが紅麹カビから単離された（Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species. J Antibiot (Tokyo) 1979, Aug; 32(8) :852-4.、Endo A, Hasumi K, Negishi S. Monacolins J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber. J Antibiot (Tokyo) 1985, Mar; 38 (3) :420-2.、Endo A, Hasumi K, Nakamura T, Kunishima M, Masuda M. Dihydromonacolin L and monacolin X, new metabolites which inhibit cholesterol biosynthesis. J Antibiot (Tokyo) 1985, Mar; 38 (3) :321-7 .、Endo A, Komagata D, Shimada H. Monacolin M, a new inhibitor of cholesterol biosynthesis. J Antibiot (Tokyo) 1986, Dec; 39(12) :1670-3.、およびKomagata D, Shimada H, Murakawa S, Endo A. Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin L to monacolin J by a monooxygenase of Monascus ruber. J. Antibiot (Tokyo) 1989, Mar; 42 (3) :407-12.）。モナコリンJおよびLは、モナコリンKの前駆体である。モナコリンKによるコレステロール合成阻害のメカニズムは、モナコリンKとHMG-CoAとの構造的類似性に基づく。モナコリンKは、HMG-CoAレダクターゼに結合して、HMG-CoAからのメボロネートの形成に関するその触媒活性を阻害する可能性があり、それによってコレステロール合成は大きく減少すると考えられる。モナコリンK以外の、コレステロールを阻害するために生体内変換または化学改変を利用する他の方法も市販されており、例えばプラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、またはアトルバスタチンは全てHMG-CoAと構造的類似性を有する。
【００８６】
したがって、本発明の主な目的は、紅麹カビからのモナコリンK産生に関連する遺伝子を提供することである。本発明において分析した被験体は、紅麹カビ種、BCRC 38072であり、これは以下の特徴を有することが認められる：
肉眼的特徴：
CYA 25℃、7日。コロニーの直径25〜26 mm、最初は菌糸が白色であるが、淡い赤みを帯びたオレンジ色となり、暗い赤みを帯びたオレンジ色に変化する。
MEA、25℃、7日。コロニーの直径48 mm、明るい赤みを帯びたオレンジ色から、はっきりした赤みを帯びたオレンジ色となる。
G25N、25℃、7日。コロニーの直径28〜29 mm、暗い赤みを帯びたオレンジ色、中心部は暗い黄色を帯びたオレンジ色。
顕微鏡的特徴：
アレウリオ型分生子が一つまたは時に短い鎖で現れ、形状は倒洋なし型から球形、10〜13×8〜10 μm。球状の閉鎖子嚢果、直径37〜72 μm。ヒアリンの子嚢胞子、楕円形、4.6〜6.3（-6.6）×3.3〜4.2 μm。
【００８７】
Hawksworth & Pitt（1983）の分類系によれば、BCRC 38072は以下のように同定された：
形態学的特徴：
BCRC 38072は、M.ピロサス（M. pilosus）とM.ルベル（M. ruber）のあいだである。
1．BCRC 38072のコロニーの色および増殖速度は、M.ピロサスと類似である。
2．BCRC 38072の子嚢胞子の形態は、M.ルベルと類似である。
配列分析：
BCRC 38072、M.ルベル、およびM.ピロサスは、rDNA ITS断片およびβ-チューブリン遺伝子において100％の配列類似性を有する。
種の同定：
BCRC 38072は、一時、Monascus pilosus K. Sato ex D.Hawksw. & Pittと命名された。
【００８８】
モナスクス・ピロサス（Monascus pilosus）BCRC 38072の分析から、長さが226 bpでケトシンターゼの保存領域に対して特異的なプローブ（配列番号：1）を、コロニーのハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、およびPCRのために設計した。さらに、プローブは紅麹カビのスクリーニングのために用いることができる。完全長のBAC DNA配列の注釈づけおよび予測は、BLASTおよびベクターNTIによって行った。アスペルギルス・テレウスによって産生されたロバスタチン遺伝子クラスターと54％を超える高い類似性を有する遺伝子9個を、表1に示すBACライブラリによって得た。
【００８９】
（表１）紅麹カビのmk遺伝子クラスター、アスペルギルス・テレウスのlov遺伝子クラスター、およびペニシリウム・シトリヌムのmlc遺伝子クラスターの類似性の比較
2005185283.tif 000002
【００９０】
モナコリンK遺伝子クラスターおよびペニシリン・シトリヌム（Penicillin citrinum）から合成されたコンパクチン（compactin）遺伝子クラスターは、49％を超える高い類似性を示す。遺伝子9個には、二つのポリケチドシンターゼ遺伝子が含まれ、一つは、ノナケチド合成に関与し、もう一つはジケチド合成に関与する。その上、モノオキシゲナーゼ遺伝子、オキシドレダクターゼ遺伝子、デヒドロゲナーゼ遺伝子、トランスエステラーゼ遺伝子、HMG-CoAレダクターゼ遺伝子、転写因子遺伝子、および流出ポンプ遺伝子が含まれる。紅麹カビのフォスミド（fosmid）ライブラリを構築して、フォスミド末端配列比較によってスクリーニングした二つのクローンを、mkB、mkD、mkE、mkF、mkG、mkHを含むpMPF001として、およびmkA、mkC、mkD、mkE、mkF、mkG、mkH、およびmkIを含むpMPF002として特許の寄託所に寄託した。pMPF001は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）においてPTA-5685として寄託され、pMPF002は、PTA-5686として寄託された。ノナケチドシンターゼ遺伝子およびジケチドシンターゼ遺伝子の機能的領域は、アスペスギルス、ペニシリウム、コクリオボルス（Cochliobolus）、およびジベレラ（Gibberella）の既知のポリケチド合成遺伝子、ならびにラットの脂肪酸合成（FAS）遺伝子との比較によってさらに分析した。結果は、図1に示すように、これらの二つの遺伝子の機能的領域がアスペルギルス・テレウスによって産生されたロバスタチン、およびペニシリウム・シトリヌムによって産生されたコンパクチンの機能的領域と類似であることを示している。紅麹カビから抽出した全RNAのノーザンブロット分析は、図2に示すようにこれらの遺伝子の転写レベルでの発現を示している。
【００９１】
本発明の二つのポリケチドシンターゼ遺伝子は、多機能酵素である：mkA遺伝子は、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質の機能を有する；mkB遺伝子は、図1に示すように、上記の六つの機能およびさらにエノイルレダクターゼ機能を有する。二つの遺伝子の全長cDNAをRT-PCRによって得た後、ポリケチド産物を発現させるためにピチア・パストリス（Pichia pastoris）発現系にクローニングした。ポリケチドシンターゼ遺伝子は、多機能酵素を発現することから、本発明の完全長のcDNAからのシャッフリング（shuffling）のようなDNA組換えによって、様々なポリケチド産物を産生することができる。この方法は、新しい新薬スクリーニング経路である。米国特許第6,221,641号および第6,391,594号のようないくつかの特許が細菌における発現のための類似の方法を開示している。しかし、真菌によって産生されるポリケチドの二次代謝物は、構造の多様性および複雑性を示す。したがって、本発明において得られたpPICZamkA（図3A）およびpPICZamkB（図3B）は、シャッフリングによって様々なポリケチド産物を発現させるための発現プラスミドとして用いることができる。
【００９２】
したがって、本発明は以下のDNA分子、ベクター、および方法を提供する。
【００９３】
（I）モナコリンK合成に関連した遺伝子をスクリーニングするためのプローブ
本発明は、配列番号：1のヌクレオチド配列を含む、モナコリンK合成に関連する遺伝子をスクリーニングするためのプローブを特徴とする。プローブは、紅麹カビBCRC 38072に対して特異的であって、Nicoholson（2001）によって設計されたアスペルギルス・テレウスのロバスタチン合成遺伝子の縮重プライマーから設計した。本発明のプローブを用いてハイブリダイゼーションのような既知の方法によって、モナコリンKと類似の遺伝子を単離または精製することは当業者にとって容易である。
【００９４】
（II）ノナケチドシンターゼ（mkAゲノムDNA）
本発明の一つの局面は、配列番号：2のヌクレオチド配列（mkAゲノムDNA）、または配列番号：2と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列はBCRC 38072から単離した。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。ストリンジェントな条件に関する記載は、欧州特許第1,325,959 A1 P7号[0036]に認められうる。ノナケチドシンターゼは、酢酸1個とマロネート8個とを触媒してノナケチドを形成する。この遺伝子は、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、およびアシル担体タンパク質を含む多機能領域を有する。この遺伝子を他の種からの機能的領域と比較すると、紅麹カビBCRC 38072のmkA機能的領域が、アスペルギルス・テレウスのlovB遺伝子およびペニシリウム・シトリヌムのmlcA遺伝子と高い類似性を有することを示している。
【００９５】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：2のヌクレオチド配列（mkAゲノムDNA）、または配列番号：2と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするベクターを特徴とする。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるかまたは宿主細胞、例えば、プラスミド、ファージ、もしくはウイルスにおいて染色体に組み込まれうる分子配列が含まれる；好ましくはベクターはシャトルベクターである。本発明のベクターはさらに、シャッフリングによって様々なポリケチド産物を産生する。シャッフリングに関する記載は、米国特許第6,221,641号および第6,391,594号において認められうる。
【００９６】
本発明のもう一つの局面はまた、配列番号：2のヌクレオチド配列、または配列番号：2と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む形質転換体であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする形質転換体、および形質転換体を構築するための宿主細胞を特徴とする。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル（Monascus ruber）、またはモナスクス・プルプレウス（Monascus purpureus）、より詳しくはBCRC 38072となりうる。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【００９７】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：2のヌクレオチド配列（mkAゲノムDNA）、または配列番号：2と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【００９８】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：2のヌクレオチド配列、または−配列番号：2と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【００９９】
（III）ジケチドシンターゼ（mkBゲノムDNA）
本発明は、配列番号：3のヌクレオチド配列（mkBゲノムDNA）、または配列番号：3と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列は、BCRC 38072から単離した。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。ストリンジェントな条件に関する記載は、欧州特許第1,325,959 A1 P7号[0036]に認められうる。ジケチドシンターゼは、モナコリンKの分岐、すなわちジケチドまたは2-メチルブチレートと呼ばれる分岐を生合成する。この遺伝子は、β-ケトアシルシンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デヒドラターゼ、メチルトランスフェラーゼ、ケトレダクターゼ、アシル担体タンパク質、およびエノイルレダクターゼを含む多機能領域を有する。この遺伝子を他の種からの機能的領域と比較すると、モナスクス・ピロサスBCRC 38072のmkB機能的領域がアスペルギルス・テレウスのlovF遺伝子およびペニシリウム・シトリヌムのmlcB遺伝子と高い類似性を有することが示される。
【０１００】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：3のヌクレオチド配列、または配列番号：3と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むベクターであって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするベクターに関する。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるか、または宿主細胞の染色体、例えばプラスミド、ファージ、もしくはウイルスの染色体に組み入れられうる分子配列が含まれる。本発明のベクターはさらに、シャッフリングによって様々なポリケチド産物を産生する。シャッフリングに関する記載は、米国特許第6,221,641号および第6,391,594号において認められうる。
【０１０１】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：3のヌクレオチド配列、または配列番号：3と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする形質転換体、および形質転換体を構築するための宿主細胞に関する。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【０１０２】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：3のヌクレオチド配列、または配列番号：3と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１０３】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：3のヌクレオチド配列、または配列番号：3と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１０４】
（IV）転写因子（mkHゲノムDNA）
本発明は、配列番号：9のヌクレオチド配列（mkHゲノムDNA）、または配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列は、BCRC 38072から単離した。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。ストリンジェントな条件に関する記載は、欧州特許第1,325,959 A1 P7号[0036]に認められうる。mkH遺伝子は、ベクターNTIの比較からZn（II）Cys6二核モチーフとして同定されている。この遺伝子の保存配列は、図4に示されるように
2005185283.tif 000003
である。
【０１０５】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：9のヌクレオチド配列、または配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、転写因子活性を有するタンパク質をコードするベクターに関する。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるか、または宿主細胞、例えば、プラスミド、ファージ、もしくはウイルスにおいて染色体に組み入れられうる分子配列が含まれる。好ましくは本発明のベクターは発現ベクターである。
【０１０６】
本発明のもう一つの局面はまた、配列番号：9のヌクレオチド配列、または配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、転写因子活性を有するタンパク質をコードする形質転換体、および形質転換体を構築するための宿主細胞に関する。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【０１０７】
本発明のもう一つの局面は発現系に関する。本発現系は、配列番号：9のヌクレオチド配列、配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびヌクレオチド配列を発現させるための宿主細胞を含む。配列は形質転換によって宿主細胞に形質転換される。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれる。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。
【０１０８】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：9のヌクレオチド配列、または配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１０９】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：9のヌクレオチド配列、配列番号：9と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。宿主細胞には原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。
【０１１０】
（V）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤とモナコリンK産生
本発明は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を産生する方法に関し、好ましくはモナコリンKを産生する方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：2（mkAゲノムDNA）、配列番号：3（mkBゲノムDNA）、配列番号：6（mkEゲノムDNA）、および配列番号：7（mkFゲノムDNA）のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階であって、これらの配列がノナケチドシンターゼ活性、ジケチドシンターゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性、およびトランスエステラーゼ活性を有するタンパク質をそれぞれコードする段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；ならびに（c）モナコリンKを回収する段階。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。Hutchinsonら（Hutchinson C.R., Kennedy J., Park C., Kendrew S., Auclair K. および Vederas J. Aspects of the biosynthesis of non-aromatic fungal by iterative polyketide synthases. Antonie van Leeuwenhoek 2000, 78:287-295.）は、異種発現の場合、ロバスタチン合成には4種の遺伝子、すなわちノナケチドシンターゼ、ジケチドシンターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびトランスエステラーゼが必要であることを提唱した。これらの中で、ノナケチドシンターゼおよびデヒドロゲナーゼは、ロバスタチン前駆体の産生に関与し、ジケチドシンターゼは、2-メチルブチレートの産生を補助し、産生された2-メチルブチレートはトランスエステラーゼによってノナケチドに結合して、完全なロバスタチンを形成する。
【０１１１】
先に述べた方法にはさらに、配列番号：4（mkCゲノムDNA）、配列番号：5（mkDゲノムDNA）、配列番号：8（mkGゲノムDNA）、配列番号：9（mkHゲノムDNA）、および配列番号：10（mkIゲノムDNA）のヌクレオチド配列、これらの配列と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列が含まれ、ここで、これらの配列は、P450モノオキシゲナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、HMG-CoAレダクターゼ活性、転写因子活性、および流出ポンプ活性を有するタンパク質をそれぞれコードする。
【０１１２】
（VI）ノナケチドシンターゼ（mkA cDNA）
本発明は、配列番号：19（mkA cDNA）のヌクレオチド配列、配列番号：19と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列はBCRC 38072から単離された。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。
【０１１３】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：19（mkA cDNA）のヌクレオチド配列、配列番号：19と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むベクターであって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするベクターに関する。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるか、または宿主細胞の染色体、例えばプラスミド、ファージ、もしくはウイルスの染色体に組み入れられうる分子配列が含まれる。好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。より好ましくは、本発明のベクターはpPICZαA（Invitrogen）である。本発明の構築物は、配列番号：19のヌクレオチド配列を含むpPICZamkAである。構築物pPICZamkAは、“Molecular Cloning”に記載される方法に従って、mkA遺伝子の全長cDNAをpPICZαAにクローニングすることによって得られた。本発明のベクターを用いたシャッフリングによって、様々なポリケチド産物を産生することができる。シャッフリングに関する記載は、米国特許第6,221,641号および同第6,391,594号に見出すことができる。
【０１１４】
本発明のもう一つの局面はまた、配列番号：19のヌクレオチド配列、配列番号：19と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む形質転換体であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする形質転換体に関し、かつ形質転換体を構築するための宿主細胞にも関する。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【０１１５】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：19のヌクレオチド配列、配列番号：19と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１１６】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：19のヌクレオチド配列、配列番号：19と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ノナケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１１７】
（VII）ジケチドシンターゼ（mkB cDNA）
本発明は、配列番号：20（mkB cDNA）のヌクレオチド配列、配列番号：20と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列はBCRC 38072から単離された。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。
【０１１８】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：20（mkB cDNA）のヌクレオチド配列、配列番号：20と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むベクターであって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするベクターに関する。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるか、または宿主細胞の染色体、例えばプラスミド、ファージ、もしくはウイルスの染色体に組み入れられうる分子配列が含まれる。好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。より好ましくは、本発明のベクターはpPICZαC（Invitrogen）である。本発明の構築物は、配列番号：20のヌクレオチド配列を含むpPICZamkBである。構築物pPICZamkBは、“Molecular Cloning”に記載される方法に従って、mkB遺伝子の全長cDNAをpPICZαCにクローニングすることによって得られた。本発明のベクターを用いたシャッフリングによって、様々なポリケチド産物を産生することができる。シャッフリングに関する記載は、米国特許第6,221,641号および同第6,391,594号に見出すことができる。
【０１１９】
本発明のもう一つの局面はまた、配列番号：20のヌクレオチド配列、配列番号：20と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む形質転換体であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードする形質転換体に関し、かつ形質転換体を構築するための宿主細胞にも関する。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【０１２０】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：20のヌクレオチド配列、配列番号：20と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１２１】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：20のヌクレオチド配列、配列番号：20と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、ジケチドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１２２】
（VIII）転写因子（mkH cDNA）
本発明は、配列番号：25（mkH cDNA）のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むDNA配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に関する。本DNA配列はBCRC 38072から単離された。さらに、本発明の開示に従ってPCRまたはハイブリダイゼーションのような既知の方法を用いることにより、当業者は本発明のDNA配列を得ることができる。ストリンジェントな条件に関する記載は、欧州特許第1,325,959 A1 P7号[0036]に認められうる。
【０１２３】
本発明のもう一つの局面は、配列番号：25のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むベクターであって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするベクターに関する。本発明のベクターを構築するためのツールには、自己複製可能であるか、または宿主細胞の染色体、例えばプラスミド、ファージ、もしくはウイルスの染色体に組み入れられうる分子配列が含まれる。好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターである。より好ましくは、本発明のベクターはpMSである。本発明の構築物は、配列番号：25のヌクレオチド配列を含むpMSmkHである。構築物pMSmkHは、mkH遺伝子の全長cDNAを、“Molecular Cloning”に記載される方法に従ってpMSにクローニングすることによって得られた。
【０１２４】
本発明のもう一つの局面はまた、配列番号：25のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む形質転換体であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードする形質転換体に関し、かつ形質転換体を構築するための宿主細胞にも関する。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。形質転換は、現行の既知の宿主-ベクター系を用いて、アスペルギルス属に属する糸状菌の形質転換法を適用することによって行うことができる。欧州特許第1,325,959 A1 P5号[0022]を参照されたい。
【０１２５】
本発明のもう一つの局面は発現系に関する。本発現系は、配列番号：25のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含みかつ、ヌクレオチド配列を発現させるために適した宿主細胞を含み、ここで配列は、形質転換によって宿主細胞に形質転換される。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。
【０１２６】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、モナコリンKの産生を増大させる方法に関する：（a）配列番号：25のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；および（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１２７】
本発明のもう一つの局面は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生を増大させる方法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：25のヌクレオチド配列、配列番号：25と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でそれとハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であって、転写因子活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；および（c）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤を回収する段階。好ましくは、宿主細胞は当初、モナコリンK産生細胞である。
【０１２８】
（IX）HMG-CoAレダクターゼ阻害剤とモナコリンK産生
本発明は、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤の産生法、好ましくはモナコリンKの産生法に関する。本方法は以下の段階を含む：（a）配列番号：19（mkA cDNA）、配列番号：20（mkB cDNA）、配列番号：23（mkE cDNA）、および配列番号：24（mkF cDNA）のヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を、宿主細胞に形質転換する段階であって、ノナケチドシンターゼ、ジケチドシンターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびトランスエステラーゼ活性を有するタンパク質をそれぞれコードする段階；（b）ヌクレオチド配列の発現に適した条件下で形質転換細胞を培養する段階；ならびに（c）モナコリンKを回収する段階。宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または糸状菌が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌は、紅麹カビ種、特にモナスクス・ピロサス、モナスクス・ルベル、またはモナスクス・プルプレウスであってよく、より具体的にはBCRC 38072であってよい。Hutchinsonら（Hutchinson C.R., Kennedy J., Park C., Kendrew S., Auclair K. および Vederas J. Aspects of the biosynthesis of non-aromatic fungal by iterative polyketide synthases. Antonie van Leeuwenhoek 2000, 78:287-295.）は、異種発現の場合、ロバスタチン合成には4種の遺伝子、すなわちノナケチドシンターゼ、ジケチドシンターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびトランスエステラーゼが必要であることを提唱した。これらの中で、ノナケチドシンターゼおよびデヒドロゲナーゼは、ロバスタチン前駆体の産生に関与し、ジケチドシンターゼは、2-メチルブチレートの産生を補助し、産生された2-メチルブチレートはトランスエステラーゼによってノナケチドに結合して、完全なロバスタチンを形成する。
【０１２９】
先に述べた方法にはさらに、配列番号：21（mkC cDNA）、配列番号：22（mkD cDNA）、配列番号：25（mkH cDNA）、および配列番号：26（mkI cDNA）のヌクレオチド配列、またはこれらの配列と95％の相同性を有するヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下でこれらの配列とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列が含まれ、ここで、これらの配列は、P450モノオキシゲナーゼ、オキシドレダクターゼ、転写因子、および流出ポンプ活性を有するタンパク質をそれぞれコードする。
【実施例】
【０１３０】
実施例1：紅麹カビの培養
紅麹カビを、斜面PDA（ジャガイモデキストロース寒天）に接種して30℃で培養した。菌糸および胞子を掻き取って、培地（7％グリセロール、3％グリセロール、3％MSG、1.2％ポリペプトン、0.2％NaNO3、0.1％MgSO4・7H2O）50 mlに接種して、振動させながら25℃で培養した。
【０１３１】
実施例2：紅麹カビBACライブラリの構築
A. 紅麹カビ核の調製
紅麹カビ細胞を回収して、ddH2Oで洗浄し、空気抽出（air-extraction）によって乾燥させた。10倍量の予冷洗浄緩衝液（HB緩衝液＋1.5％β-メルカプトエタノール）を乾燥細胞に加えて、細胞をブレンダー中でホモジナイズした。紅麹カビの核は、ミラクロス濾過によって得た。
【０１３２】
B. プラグと染色体DNAの調製
1.8％低融点アガロースをHB緩衝液中で調製して、50℃の水浴に入れた。等量のアガロースと核溶液を十分に混合してプラグ状の鋳型（Bio-Rad）に加えた。不純物はプロテイナーゼK（1 mg/ml）によって処理した。プラグを小片に切断して、HindIIIによって部分消化した。制限酵素反応後、パルス電気泳動のためにプラグを1％アガロースゲルにおいて分析した。200 kbのDNA断片を電気的溶出によって回収した。
【０１３３】
C. 紅麹カビライブラリの構築
pIndigoBAC-5 HindIIIレディ（Epicentre）を、回収したDNAとライゲーションするためのベクターとして用いた。次に、ライゲーション反応物質をコンピテント細胞にエレクトロポレーションした（Epicentre、TransforMax（商標）EC 100（商標）エレクトロコンピテント大腸菌）。マイクロプレート384枚においてコロニーを保存した。
【０１３４】
実施例3：プローブ用プライマーの設計およびプローブの調製
PCRおよびシークエンシングを縮重プライマーによって行い、得られたDNA配列を、配列番号：1に示す226 bpのプローブ用プライマーを設計するための基礎として用いた。プライマーを設計するためにソフトウェアVectorNTIを用い、設計されたプライマーを下記に示す。
2005185283.tif 000004
【０１３５】
DIG-dUTP（Roche、PCR DIGプローブ合成キット）を含むDNA配列をPCRによって増幅して、これをプローブとして用いた。
【０１３６】
実施例4：コロニーハイブリダイゼーションの分析およびBAC DNAの抽出
方向の目印としてナイロンメンブレン（Roche）の角を切断して、コロニーを含むプレート上にナイロンメンブレンを載せた。コロニーのある側を上にしたナイロンメンブレンを、溶解液（2 N NaOH、0.1％SDS）（5分間）、0.5 M NaOH/1.5 M NaCl溶液（5分間）、1.5 M NaCl/0.5 Mトリス塩酸（pH 7.4）（5分間）、および2×SSC（5分間）と、連続的に接触させた。次に、DNAをUV光によってナイロンメンブレン上に固定した。得られたナイロンメンブレンを、ハイブリダイゼーションおよび免疫検出（Roche）に用いた。その後、反応から得られたコロニーを培養して、BAC DNAをLarge-Constructキット（Qiagen）を用いて抽出した。
【０１３７】
実施例5：ショットガン配列の分析
A. ショットガンライブラリの調製
3 μg〜5 μgのBAC DNAを、1〜2 kbとなるように適切な超音波条件下で超音波処理して、結果を電気泳動によって確認した。次に、DNAをBal 31ヌクレアーゼおよびT4 DNAポリメラーゼによって修復して平滑末端とし、1 kb〜2 kbのDNA断片を電気泳動によって回収した。ベクターとしてpUC18/SmaI/CIAP（50 ng/μL）（Pharmacia）を用いてライゲーションを行い、ライゲーション反応物を大腸菌DH5αにエレクトロポレーションした。
【０１３８】
B. DNAシークエンシングおよび分析
プラスミドDNAを、96ウェルマイクロプレートを用いて高処理抽出して、得られたプラスミドDNAをABI Bigdye v 3.0キットによってシークエンシングした。配列分析は、範囲10倍のABI 3700シークエンサーによって行った。
【０１３９】
実施例6：DNA配列アセンブリおよびアノテーション
DNA配列アセンブリは、フィルグリーン（Phil Green）研究所で開発されたPhred-Phrap-Consedによって実施した。VectorNTIおよびBLASTを用いて、完全長のBACをさらにアノテーション（annotation）した。
【０１４０】
実施例7：紅麹カビ全RNAの抽出とRT-PCR反応
紅麹カビの菌糸0.2 gを乳鉢に入れて、液体窒素中で凍結してから粉末にした。トリゾール試薬（Invitrogen）およびクロロホルムを用いて全RNAを抽出して、DEPC-H2Oに溶解した。RNAを逆転写のための鋳型として用いて（Promega、ImProm-IITM逆転写システム）、完全長のcDNAを得た。完全長のcDNAをTAベクター（Promega、pGEM-Tベクターシステム）にライゲーションした。
【０１４１】
実施例8：RNA電気泳動およびノーザンブロット
A. RNA電気泳動
ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液およびホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルを調製した。RNAを、ホルムアルデヒドゲル泳動緩衝液、ホルムアルデヒド（37％）、およびホルムアミドと十分に混合した。RNA電気泳動を行って、ゲルをETBrによって染色した。
【０１４２】
B. RNAの転写
ナイロンメンブレンをゲルと同じ大きさに切断して、方向の目印としてナイロンメンブレンの角を切断した。RNAをゲルからナイロンメンブレンへとの転写し、UV光によってRNAをナイロンメンブレンに固定した。得られたナイロンメンブレンを、ハイブリダイゼーションおよび免疫検出（Roche）のために用いた。
【０１４３】
実施例9：プローブ用プライマーの設計およびプローブの調製
ノーザンブロットに用いられるプローブを調製するために、BAC DNA配列に従ってプライマーを設計した。設計されたプライマーを下記に記載する。
mkA遺伝子
2005185283.tif 000005
（プローブ長：229 bp）
mkB遺伝子
2005185283.tif 000006
（プローブ長：167 bp）
mkC遺伝子
2005185283.tif 000007
（プローブ長：304 bp）
mkD遺伝子
2005185283.tif 000008
（プローブ長：175 bp）
mkE遺伝子
2005185283.tif 000009
（プローブ長：246 bp）
mkF遺伝子
2005185283.tif 000010
（プローブ長：166 bp）
mkG遺伝子
2005185283.tif 000011
（プローブ長：217 bp）
mkH遺伝子
2005185283.tif 000012
（プローブ長：179 bp）
mkI遺伝子
2005185283.tif 000013
（プローブ長：127 bp）
【０１４４】
実施例10：ピチア・パストリスの形質転換
PKSの完全長cDNA（mkAおよびmkB）をそれぞれ、pPICZαAおよびC（Invitrogen）にライゲーションした。形質転換は、ピチアEasyCompキット（Invitrogen）を用いて実施した。
【０１４５】
実施例11：サザンブロット
酸脱プリンは、ゲルを0.25 M HCl中で平坦なシェーカー上で10分間振とうしながら浸すことによって行い、ゲルをddH2Oで洗浄した。次に、ゲルを2回振とうさせながらNaCl/NaOH溶液（1.5 M NaCl、0.5 N NaOH）に15分間浸すことによって変性を行い、ゲルをddH2Oで洗浄した。中和は、ゲルを2回振とうさせながらNaCl/トリス塩酸溶液（1.5 M NaCl、1 Mトリス-塩酸、pH 7.4）に15分間浸すことによって最後に行った。ゲルと同じ大きさのナイロンメンブレンを調製して、方向の目印としてナイロンメンブレンの角を切断した。DNAをゲルからナイロンメンブレンに転写して、UV光によってナイロンメンブレンに固定した。得られたナイロンメンブレンはハイブリダイゼーションおよび免疫検出（Roche）のために用いることができる。下記のプライマーを、サザンブロット用のプローブを調製するために設計した。
mkA遺伝子
2005185283.tif 000014
（プローブ長：293 bp）
mkB遺伝子
2005185283.tif 000015
（プローブ長：167 bp）
【０１４６】
実施例12：ポリケチドの産生
異種ポリケチドシンターゼ発現の宿主としての大腸菌および放線菌（Streptomyces）の有用性は、Bedford（Bedford, D. J., Schweizer, E., Hopwood, D.A., Khosla, C. Expression of a functional fungal polyketide synthase in the bacterium Streptomyces coelicolor A3(2). 1995. J. Bacteriol. 177, 4544-4548.）、Gokhale（Gokhale, R.S., Tsuji, S.Y., Cane, D.E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. 1999. Science. 284, 482-485.）およびPfeifer（Pfeifer, B.A., Admiraal, S.J., Gramajo, H., Cane, D.E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. 2001. Science. 291, 1790-1792.）によって研究されている。その上、大腸菌および放線菌において細菌ポリケチドシンターゼの発現に成功しており、検出されるポリケチドの収率はより低レベルである。一般的に、大腸菌における翻訳後改変が欠如することにより、機能的ポリケチドシンターゼの異種発現が阻害される。したがって、ポリケチド産生のためにPKSのholo-ACP（アシル担体タンパク質）ドメインを産生するためには、4'-ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（PPTase）によってPKSを同時発現させることが妥当である（Mootz, H.D., Finking, R., Marahiel, M.A. 4’-Phosphopantetheine transfer in primary and secondary metabolism of Bacillius subtilis. 2001. J. Biol. Chem. 40, 37289-37298.）。本発明の発現ベクターの発現効果をさらに調べるために、枯草菌のsfp遺伝子（PPTase）をクローニングして、発現ベクターpCDF-1b（図6）に導入しかつ大腸菌においてPKS、mkA遺伝子（図5）を同時発現させることに成功している。SDS-PAGEの結果により、PKS可溶性タンパク質（342 kDa）の収率がより低レベルであったことが示された（図7）。しかし、Sfpタンパク質のほとんどが可溶性であるため、29 kDaのタンパク質が発現した。
【０１４７】
1. 発現プラスミドの構築
mkA遺伝子の部分的cDNA断片（フォワードプライマーp3
2005185283.tif 000016
（配列番号：49）およびリバースプライマーp4
2005185283.tif 000017
（配列番号：50）を有する6.5 kbのcDNA）を、紅麹カビの第一鎖cDNAからRT-PCRによって増幅した。6.5 kbのcDNA断片をpGEM-Tベクターに導入して、制限酵素反応によってEcoRI-NotI断片を得た。次に、断片をpET30とライゲーションして、pETmkA1を得た。5' mkA遺伝子と相補的な23塩基を含みかつEcoRI制限酵素部位を導入されたフォワードプライマーp1
2005185283.tif 000018
（配列番号：51）、およびリバースプライマーp2
2005185283.tif 000019
（配列番号：52）を有する一組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、RT-PCRによって3.0 kbの部分的cDNAを増幅した。3.0 kbのEcoRI-EcoRI cDNA断片をpETmkA1にライゲーションして、pETmkAを得た（図6）。
【０１４８】
5' sfp遺伝子と相補的な20塩基を含みかつBamHI制限酵素部位を導入されたフォワードプライマー
2005185283.tif 000020
（配列番号：53）、および、5' sfp遺伝子と相補的な20塩基を含みかつNotI制限酵素部位を導入されたリバースプライマー
2005185283.tif 000021
（配列番号：54）を有する一組のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、枯草菌168のゲノムDNAからsfp遺伝子を増幅した。BamHI-NotI sfp遺伝子をpCDF-1bとライゲーションして、pCDFsfpを得た（図7）。
【０１４９】
2. 大腸菌におけるmkAおよびsfpの同時発現
pETmkAおよびpCDFsfpを大腸菌BL21（DE3）に同時形質転換して、シングルコロニーをLB培地に接種して一晩培養した。次に、LB培地を、10％グリセロールを添加したATCC培地765に移して、OD600が0.6〜0.8に達するまで培養物を増殖させた。最終濃度1.0 mMとなるようにイソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）を加えることによって遺伝子の同時発現を誘導し、培養物を20℃で48時間インキュベートした。細胞ペレットを回収して、液体窒素中で凍結させて42℃で融解させ、細胞を溶解した。溶解を促進するために、リゾチームを細胞ペレットに加えた。全細胞タンパク質および可溶性タンパク質のSDS-PAGE（7.5％ゲル）によってタンパク質発現をモニタリングした後、コロイド状クーマシーブルー染色を行った。
【０１５０】
参考文献
その他の文献は以下に示す通りである。
1. Hendrickson L, Davis CR, Roach C, Nguyen DK, Aldrich T, McAda PC & Reeves CD. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terreus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a multifunctional polyketide synthase gene. 1999, Chem. Biol. 6: 429-439.
2. O'Hagan D. Biosynthesis of fatty acid and polyketide me-tabolites. Nat Prod Rep. 2001, 12:1-32.
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
本発明の態様は、以下の説明および添付の図面を参照することにより十分に理解され、さらなる長所が明らかとなりうる。
【図１Ａ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、ケトアシルシンターゼの比較を示す図である。
【図１Ｂ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、アシルトランスフェラーゼの比較を示しす図である。
【図１Ｃ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、デヒドラターゼの比較を示す図である。
【図１Ｄ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、メチルトランスフェラーゼの比較を示す図である。
【図１Ｅ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、エノイルレダクターゼの比較を示す図である。
【図１Ｆ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、ケトアシルレダクターゼの比較を示す図である。
【図１Ｇ】紅麹カビまたは他の真菌からのポリケチドシンターゼ、およびラット由来の脂肪酸シンターゼのモチーフの配列比較を示す図であって、アシル担体タンパク質の比較を示す図である。
【図２】3〜14日での紅麹カビmk遺伝子クラスターの発現を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、pPICZamkAおよびpPICZamkBのマップをそれぞれ示す。
【図４】ベクターNTIによって分析したMKHアミノ酸配列および推定のZn（II）Cy6二核モチーフを示す。枠の中のアミノ酸配列は、Zn（II）Cys6二核モチーフを示し；6 Cysは、灰色で示す。
【図５】ポリケチドシンターゼmkA遺伝子を含む大腸菌発現ベクターの構築を示す。RT-PCRによってmkA遺伝子の部分的cDNA（6.5 kb）を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマー（p3およびp4）1組を設計した。p1およびp2のプライマーは、RT-PCRによってmkA遺伝子の部分的cDNA（3.0 kb）を増幅するために設計した。
【図６】枯草菌（B. subtilis）由来の4'-ホスホパンテテイントランスフェラーゼsfp遺伝子を含む大腸菌発現ベクターの構築を示す。
【図７】大腸菌におけるmkAおよびsfpの発現を示す。対照プラスミドpCDF-1bおよびpET30（レーン1）ならびに発現プラスミドpCDFsfp（sfp遺伝子）およびpETmkA（mkA遺伝子）（レーン2）を有する大腸菌の全タンパク質を、添加液において沸騰させて、これにSDS-PAGEを行った。タンパク質をコロイド状クーマシーブルーによって染色した。矢印は、SfpおよびmKAの位置を示す。溶解タンパク質をProBond（商標）精製システム（Invitrogen）によって精製した。レーン3は、3000×gで60分間遠心分離する溶解物を示し、レーン4は、Ni-カラムによって精製したタンパク質である。
【図１Ａ】
2005185283.tif 000022
【図１Ｂ】
2005185283.tif 000023
【図１Ｃ】
2005185283.tif 000024
【図１Ｄ】
2005185283.tif 000025
【図１Ｅ】
2005185283.tif 000026
【図１Ｆ】
2005185283.tif 000027
【図１Ｇ】
2005185283.tif 000028
【図２】
2005185283.tif 000029
【図３】
2005185283.tif 000030
【図４】
2005185283.tif 000031
【図５】
2005185283.tif 000032
【図６】
2005185283.tif 000033
【図７】
2005185283.tif 000034
【配列表】
2005185283000001.app