(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、細胞レベルの微細試料のＣＴ画像を得るために用いられ、微細試料を安定して支持することができると共に、回転駆動に際し回転中心がぶれることのないホルダを提供すること、また、そのホルダを用いて微細試料のＣＴ画像を得られるシステムを提供することにある。【解決手段】    本発明の微細試料支持回転ホルダは、直径がミクロンオーダーのガラス管先端部分に、ＦＩＢ−ＣＶＤ法を用いて微細な皿状の構造を付加作成する。本発明は上記手法によって作製した微細試料支持回転ホルダを試料台に載置すると共に、横方向からＸ線を照射する透過像撮像機構を配置し、マイクロマシン回転駆動機構によって回転させつつ複数の透過像を取得するナノバイオ対応ＣＴシステムを提供する。【選択図】    図１ 
2005221426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラス細管に張力を掛けた状態で加熱し、先端部の直径がミクロンオーダーとなる微細構造を作るステップと、該ガラス管微細先端部分にＦＩＢ−ＣＶＤ法を用いて管軸に直交する方向に広がる微細な皿状の構造体を付加作成するステップとからなる微細試料支持ホルダを作製する方法。
【請求項２】
当初はガラス管微細先端部分にＦＩＢを照射してＣＶＤを用い、ＦＩＢの照射位置を順次螺旋状に偏向走査して管軸に直交する方向に広がる微細な皿状の構造体を形成するものである請求項１に記載の微細試料支持ホルダを作製する方法。
【請求項３】
直径がミクロンオーダーの微細構造となったガラス細管の先端部に、微細試料に対応した寸法で管軸に直交する方向に広がる皿状の構造体が設けられ、前記ガラス管の太径他端はマイクロマシンの回転駆動機構の回転軸に接続されている微細試料回転支持ホルダ。
【請求項４】
請求項３に記載の微細試料回転支持ホルダの皿状構造体の横方向からＸ線が照射されるように透過型Ｘ線顕微鏡を配置すると共に、マイクロマシンの回転駆動機構の回転角に対応した複数の顕微鏡像を演算処理してＣＴ像を合成する手段と、該ＣＴ像情報を受けて画像表示する表示部とを備えたナノバイオ対応ＣＴシステム。
【請求項５】
微細試料回転支持ホルダが少なくともＸＹ二次元駆動機構を備えた試料台上に載置されると共に、皿状構造体の上方には顕微鏡を配備したものであって、回転に伴う試料の位置ズレを前記顕微鏡により検知すると共に、前記試料台のＸＹ二次元駆動機構によって検知したズレ分の位置補正を行う機能を備えたものである請求項４に記載のナノバイオ対応ＣＴシステム。
【請求項６】
微細試料回転支持ホルダ固有の偏心量を予め計測して記憶しておき、回転量に対応させて試料台のＸＹ二次元駆動機構に補正信号を出力させて偏心による試料の位置ズレを補正する請求項５に記載のナノバイオ対応ＣＴシステムを作動させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミクロンオーダの試料を顕微鏡観察する際に用いられる微細試料を回転可能に支持するホルダとそのホルダを採用したナノバイオ対応ＣＴシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、１個の細胞を生きたまま内部微細構造を調べたいという要望が高まり、ナノバイオ対応ＣＴ(コンピュータトモグラフィ)が必要とされるようになってきた。そのナノバイオ対応ＣＴとしては軟Ｘ線顕微鏡を用いるＣＴ等がその侯補となっている。細胞内部の微細構造を三次元画像情報として取得するためには、細胞という微細な試料を回転中心に支持する微細試料ホルダが必要である。従来、そのような目的に適した微細試料支持回転ホルダは存在していない。
【０００３】
微細試料支持回転ホルダを製作するためには、まず微細な回転軸を準備しなければならない。従来、微細な軸構造物としては細胞組織から癌細胞を引き出したり、細胞組織に対して局部的に試薬や染料を付けるために開発された微細キャピラリの製造装置がある。この装置は、外径１ｍｍ程度のガラス管の上端を固定し下端に重しを付けて張力をかけ、中央部をヒータで加熱して引伸ばすことにより１ミクロン程度の微細先端径を持ったガラス管を作るものであり、既に市販されている。ガラス管が錘によって鉛直方向に引かれ、最後に下方側がちぎれて落ちることになるが、この際にガラス管の上端固定側と下端錘側とに微細直管構造が作製される。この装置は最近では透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の試料を移送するプローブやプローブ顕微鏡の探針製作にも利用されているところである。この装置によって作られる微細直管構造をそれぞれの用途に応じて更に加工が加えられ、使用されている。
【０００４】
また、微細構造物の造形手法としては光重合反応を利用したマイクロ光造形法や、原料ガスを噴射させた試料面に集束イオンビームを照射することにより固体を析出させるＦＩＢ−ＣＶＤ法が公知である。本発明者らは集束イオンビームを照射するＣＶＤ法によってイオン源方向へのデポジション成長とイオンビーム垂直方向までのデポジションが可能であることに基き、先に特願2000-333368号「梁状の膜パターン形成方法」（特許文献１）を出願した。この発明は、集束イオンビーム装置を用いたデポジション技術であって、原料ガスとしてフェナントレンを、イオンとして液体金属イオン源からの５乃至１００ｋｅＶのガリウムもしくは金、シリコン、ベリリウム等のイオンを用い、ガス吹きつけ密度を従来のデポジションの場合より５〜１０倍程度高くし、ガス吹き付け方向を等方向もしくは対称的にして実行する方法である。図５のＡに示すようにデポ層の先端側が庇のように形成されている状態の時、傾斜面DS部分を重ねるようにして先端側に照射領域をシフトさせて次回のデポジションを実行すると、第２回のときのデポ層は図５のＡに破線ａで示したようにやはり傾斜面DSをもって形成される。その状態に至った時点で更に先端側に照射領域をシフトし、順次デポ層を先端側に成長させていく。この方法による膜形成は図５のＢに示したように各短冊のデポ層は階段状にはならず下面の位置が一定の長い片持ち梁状体の形成が可能となる。真横に成長し薄膜厚さの１０倍以上のものまででき、しかもその厚さは一様でかつ平坦に形成できることを確認したと記載されている。この方法により、ドリルやコイルといった立体形状のマイクロマシンを形成することを可能にした。
【特許文献１】特開２００２−１３９８２７号公報  「梁状の膜パターン形成方法」  平成１４年５月１７日公開  段落番号［０００５］，図２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、細胞レベルの微細試料のＣＴ画像を得るために用いられ、微細試料を安定して支持することができると共に、回転駆動に際し回転中心がぶれることのないホルダを提供すること、また、そのホルダを用いて微細試料のＣＴ画像を得られるシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は直径がミクロンオーダーのガラス管先端部分に、ＦＩＢ−ＣＶＤ法を用いて微細な皿状の構造を付加作成することにより、上記目的に適合した微細試料支持回転ホルダを作製する方法を提示するものである。
皿状の構造を細管先端部に付加作成する手法として、ガラス管の太径側をＦＩＢ装置の試料ホルダに支承させ、当初はガラス管微細先端部分にＦＩＢを照射してＣＶＤを用い、ＦＩＢの照射位置を順次螺旋状に偏向走査して管軸に直交する方向に広がる微細な皿状の構造体を形成する方法を提示する。
本発明は上記手法によって作製した微細試料支持回転ホルダを試料台に載置すると共に、横方向からＸ線を照射する透過像撮像機構を配置し、マイクロマシン回転駆動機構によって回転させつつ複数の透過像を取得するナノバイオ対応ＣＴシステムを提供する。
更に本発明では、試料台上方に顕微鏡を配備して回転に伴う試料に位置ズレを検知すると共に、試料台によってズレ分の位置補正を行うようにした。
本発明のナノバイオ対応ＣＴシステムは、ガラス管の太径他端がマイクロマシンの回転駆動機構の回転軸に接続された微細試料回転支持ホルダを用いるものであって、該微細試料回転支持ホルダの皿状構造体の横方向からＸ線が照射されるように透過型Ｘ線顕微鏡を配置すると共に、マイクロマシンの回転駆動機構の回転角に対応した複数の顕微鏡像を演算処理してＣＴ像を合成する手段と、該ＣＴ像情報を受けて画像表示する表示部とを備えるようにした。
また、微細試料回転支持ホルダが少なくともＸＹ二次元駆動機構を備えた試料台上に載置されると共に、皿状構造体の上方には顕微鏡を配備することにより、回転に伴う試料の位置ズレを前記顕微鏡により検知すると共に、前記試料台のＸＹ二次元駆動機構によって検知したズレ分の位置補正を行う機能を備えるようにした。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は直径がミクロンオーダーのガラス管先端部分に、ＦＩＢ−ＣＶＤ法を用いて微細な皿状の構造を付加作成することにより、上記目的に適合した微細試料支持回転ホルダを作製する方法を提供するものであるから、ミクロンオーダーのガラス直管製作技術とＦＩＢ−ＣＶＤの横方向造形成長技術を組み合わせることにより、微細な回転軸上へ軸方向に直交する皿状の微細試料を載置するテーブルを造形することができ、ナノバイオに対応可能な微細試料支持回転ホルダを実現できる。
本発明では皿状の構造を細管先端部に付加作成する具体的手法として、当初はガラス管微細先端部分にＦＩＢを照射してＣＶＤを用い、ＦＩＢの照射位置を順次螺旋状に偏向走査して管軸に直交する方向に広がる微細な皿状の構造体を形成するものであるから、微細試料を載置するに十分な広さの平坦部を作ることも試料がズレ落ちないように周囲を高くすることも自在に対応できる。
【０００８】
本発明は上記手法によって作製した微細試料支持回転ホルダを試料台に載置すると共に、横方向からＸ線を照射する透過像撮像機構を配置し、マイクロマシン回転駆動機構によって回転させつつ複数の透過像を取得するものであるから、細胞レベルの微細試料について３６０度回転させながら多数の透過像を得てナノバイオ対応ＣＴシステムを実現することができる。
更に本発明のシステムでは、試料台上方に顕微鏡を配備することにより、回転に伴う試料の位置ズレを検知することができると共に、試料台の駆動機構によってズレ分の位置補正を行うことが可能であり、微細回転軸を直線加工する工作上の限界をカバーさせることができる。この機能によって回転ズレのない鮮明なＣＴ画像を取得することができる。更に微細試料回転支持ホルダ固有の偏心量を予め計測して記憶しておけば、回転量に対応させて試料台のＸＹ二次元駆動機構に補正信号を出力させて偏心による試料の位置ズレを自動的に補正することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者は前述したように細胞レベルの微細試料のＣＴ画像を得るために用いられ、微細試料を安定して支持することができると共に、駆動に際しては回転中心がぶれることのないホルダを提供することを課題として研究開発を始めた。そしてホルダの回転軸製作には直径がミクロンオーダの細管構造を作ることができるガラス細管加工手段を用いることと、微細試料を載置するテーブル部材製作にはＦＩＢ−ＣＶＤの手法を用いることに想到したものである。期待される微細試料支持回転ホルダの構造としては微細な回転軸の一端に軸方向に直交する平坦な皿状体を想定した。但し細胞のような微細試料を載置する際に安定して保持できなければならないので周囲を高くして皿形状とするが、ＣＴ画像を得ようとする場合横方向からのＸ線照射を考えているため、周囲を高くして深皿形状にすると断層画像の取得範囲を狭めてしまうことになる。したがって、その微細試料に対応した皿形状として加工する。
【００１０】
以下に本発明による微細試料支持回転ホルダの作製手順を述べる。
１）市販のガラス管加工装置により、外径１ｍｍφのガラス管の上端部を固定保持すると共に下端部に錘を付けて中間部分を加熱加工して一端を１ミクロン程度の径に細く引伸ばす。錘の作用で鉛直方向に引っぱられ、高温となった中間位置で細管が伸び下側がちぎれて分離したところで上下両方のガラス管を回収し、もとの１ｍｍ径の部分を１０ｍｍ程度把持部として残してカットする。
２）スパッタコータ等の膜付け装置により、上記加工したガラス管表面に導電膜を付けるが、これは、後のＦＩＢ−ＣＶＤ加工時にイオン照射によってガラス管が帯電するのを防止する為である。試料が帯電状態となるとイオンが静電力を受けて所定の位置に照射できなくなる不都合が生じる。
３）この帯電防止処理したガラス管を、極微細端側を上にして、ＦＩＢ装置の試料台に取付ける。これはもとの１ｍｍ径の部分を試料台のホルダで保持させればよい。極微細管の先端部分の形状をＦＩＢエッチングによって整える。
４）次にＦＩＢ−ＣＶＤ法により、上記ガラス管の微細先端部上に、皿状の微細構造を作製する。皿状の微細構造を作製する具体的方法は、原料ガスを極微細端に吹付けながらＦＩＢを極微細端部に照射してデポジション形成させる。イオンビームを円形回転走査をして中心部から外側に皿状構造体をデポジション成長させれば良い。最初はガラス管微細端状に乗るように円形走査の径を小さくしてＦＩＢ−ＣＶＤを開始し、次第に回転半径を大きくして螺旋状に走査することによって皿状の微細構造を作製することが出来る。皿状の微細構造体の直径は、ＣＴ計測する被測定微小体が載置できる同程度の寸法にすれば良い。被測定物が生きた単一細胞の場合は、普通、外径１０ミクロン程度なので皿状構造体の径もその値を目安にデポジション形成する。皿の深さは、細胞が落ちないように周囲を高くするが、皿は浅い方が広い範囲のＣＴ像が得られるので好都合である。
【実施例１】
【００１１】
次に、本発明に係る微細試料支持回転ホルダの実施例を示す。外径１ｍｍ、長さ数１０ｍｍ程度のガラス管を引伸ばし切断する市販の装置を用い、これにより先端径１ミクロン程度の微細な先端を有するガラス管をまず得る。この微細先端部の微細な穴が塞がっていたり、凹凸形状になっているような場合ＦＩＢスパッタリングでトリミング加工し所望形状に整える。この上にＦＩＢ−ＣＶＤにより図１に示したような浅い試料受皿を形成するのであるが、この微小受皿形成において、このガラス管の他端の太径側をＦＩＢ装置の試料台の回転駆動軸に芯合わせしてホルダにチャッキングさせた形態で加工する。試料受皿はその基台となる微細ガラス管上に中央の微細な穴を残して外側に皿をＣＶＤ成長させて形成する。この実施例の特徴は、中央の前記微細な穴、ガラス管を通して試料を吸引保持出来るようにした点にある。そのことによって試料の安定保持を図り、皿の縁を低く押さえることができる。また、上記試料受皿の素材は、軟Ｘ線透過性の高いアモルファスカーボンで形成するようにし、皿の縁の陰となる部分についてもある程度のＸ線透過が得られるようにした。上記試料受皿の寸法は、被測定試料寸法に応じた寸法となるようにＣＶＤ加工する。なお、この例ではガラス管微細先端の中央部に微細穴を設けるようにしたが、この構成は必ずしも必須ではなく、微細穴をなしとすることができることはいうまでもない。
【００１２】
このようにして作られた本発明のナノバイオ対応ＣＴに適した試料ホルダ３は、図１に示されるようなものである。すなわち、外径が１ｍｍのガラス細管１の一方は先端径がミクロンオーダとなるまでテーパ状に細くされた形状とされ、その先端部分に試料を載置する皿状体２が形成されている。拡大図から判るようにガラス細管１の微細径の先端部は平坦にＦＩＢエッチング加工された後、螺旋状にデポジションを進める加工手順によって試料を保持する部分が皿形体２として形成されている。この例では１個の生細胞を載置する皿状体２は浅い弓弧状に加工してある。このようにして微細試料支持回転ホルダとして試料ホルダ３が形成される。
このＦＩＢ−ＣＶＤによる皿状体の形成は試料台の回転機構を用いて実行することも原理的には可能である。しかし、回転駆動が多少とも芯ぶれすることを考えると加工精度が低下する。従って、上記したように微細管がホルダに保持された状態で極微細管先端位置をＦＩＢ装置の顕微鏡機能で検知しＦＩＢ装置の偏向機能でビームを螺旋走査させて加工するのがよい。
【００１３】
次に、このようにして作成した微細試料支持回転ホルダが提供できたことを受け、１個の細胞を生きたままでその内部微細構造を調べたいという要望に応えることができる、ナノバイオ対応ＣＴを得るシステムについて述べる。基本構成としては図２に示すように、作製した試料ホルダ３のガラス管軸太径部1aにマイクロマシン用の回転駆動機構1bを取り付け、この回転駆動機構1bを備えた試料ホルダ３を三次元駆動機構を備えた試料台４上に載置する。ＣＴ試料を載せる該試料ホルダ３の皿状構造体２に対し横方向からＸ線を投射し透過Ｘ線を検出するように投影型のＸ線顕微鏡５を配置する。前記試料ホルダ３のガラス管軸１を中心とした回転を行い、例えば１度毎にＸ線透過顕微鏡像を撮り、撮像した多数の顕微鏡像からコンピュータ計算して断層像を得ることが出来るシステムである。図中5aはＸ線源であり、5bが二次元Ｘ線検出器、5cが集光レンズであり5dが対物レンズそして5fはピンホールスリットである。このＸ線顕微鏡では集光レンズ5cと対物レンズ5dとして機能する要素にウオルターミラー系のものを使用している。回転駆動機構1bの回転駆動の伴い逐次二次元Ｘ線検出器5bによって撮像された顕微鏡像情報は制御演算部６に送られ、蓄積された後コンピュータ計算して断層像情報を得て表示部７に出力して断層画像を表示する。また、この顕微鏡像の検出の際にガラス管１の回転軸中心と微細径の先端部の芯ズレに伴う回転時の試料位置ずれが問題になる場合は、例えば試料上方に顕微鏡を配置して試料位置をモニタし、試料の位置ずれを補償するように試料台をＸＹ二次元駆動させて対応する。
【実施例２】
【００１４】
本発明のナノバイオ対応ＣＴを得るシステムを具体化した実施例を示す。この実施例は単一細胞等の内部構造を観察するためのＸ線顕微鏡ＣＴシステムで、投影型のＸ線顕微鏡として、ウオルターミラー系を用い、試料用の微細試料支持回転ホルダには外径寸法が数ミクロン〜100ミクロン程度のものを採用する。システム構成は図３に示すように、Ｘ線源5aとしてＮｄ−ＹＡＧレーザーをＴｉターゲットに照射することにより放出されるＸ線を用いる。Ｘ線源5aから放射されたＸ線はＡｌフィルターを介してコンデンサレンズ5cに入射され、光束を絞り込まれて前記Ｔｉターゲットから250ｍｍの焦点位置に集光される。この位置に20μｍφのピンホールの背面側となるようにして試料がセットされるように試料ホルダ３を配置する。試料の後方には対物レンズ5dが配置され、それによって試料照射部分の透過情報が拡大結像され二次元Ｘ線検出器5bで検出される。この位置は前記焦点位置から1447ｍｍのところであり、この位置に二次元Ｘ線検出器5bが配置される。回転角に対応して撮像された多数の顕微鏡像は制御演算部で処理されて断層画像を得る。試料ホルダ３には図示されていない回転駆動系が備えられており、その回転に伴う試料の位置ズレは微細試料支持回転ホルダである試料ホルダ３の上方に配置された光学顕微鏡８によって位置検出され、二次元の位置補正用情報として試料台のＸＹ駆動系に送られ、位置補正される。この回転ズレは回転駆動系の回転中心と皿状体２の基台となっているガラス管１の微細端部の位置ズレに起因するもの（偏心量）であり、用いる試料ホルダ３の固有の器差である。したがって、この器差を予め顕微鏡で検出しておきメモリに蓄積しておけば、試料ホルダ３を用いる計測に際して試料台のＸＹ駆動系に送られる補正量は回転駆動に伴い自動調整することができる。
【実施例３】
【００１５】
本発明のナノバイオ対応ＣＴを得るシステムを具体化した異なる実施例を図４に示し、説明する。この実施例は投影型のＸ線顕微鏡の線源として、シンクロトロンＳＲを用い、シリコンの平面ミラーに反射させたものを採用する。ＳＲ光源は575ＭeＶ，300ｍＡで稼働させ、フィルターを介して使用する波長域１〜4.4ｎｍのＸ線を放出させる。シリコンの平面ミラーには40ｍradの低い入射角角度から斜めに入射させる。試料用の微細試料支持回転ホルダには先の例と同様に外径寸法が数ミクロン〜100ミクロン程度のものを試料の寸法に合わせて採用する。この実施例の１つの特徴はコンデンサレンズと対物レンズとしてゾーンプレートを用いた点にある。ＳＲ光源位置から70500ｍｍの位置に集光ゾーンプレート5b'を配置するが、この集光ゾーンプレート5b'は直径が９ｍｍで、最外輪帯幅として53.7ｎｍをとってその内側に同心円状に41,890個のＸ線透過ゾーンを形成したものである。厚さ0.1μｍの窒化珪素（ＳiＮ）薄膜基板上に0.3μｍのゲルマニウム（Ｇe）でゾーンのパターンを形成したものである。多数の同心円状のゾーンを透過したＸ線は回折現象により互いに干渉して集光ゾーンプレート5b'位置から146ｍｍ後方位置にピーク点を結ぶが、これは倍率70500/146＝1/483のコンデンサレンズとなる。この位置に20μｍφのピンホールの背面側となるようにして試料がセットされるように微細試料支持回転ホルダである試料ホルダ３を配置する。試料の後方0.7ｍｍの位置には対物ゾーンプレート5d'が配置されるが、この対物ゾーンプレート5d'は直径が50μｍで、最外輪帯幅を45ｎｍとしてその内側に同心円状に277個のＸ線透過ゾーンを形成したものである。厚さ0.1μｍの窒化珪素（ＳiＮ）薄膜基板上に0.13μｍのニッケル（Ｎi）でゾーンのパターンを形成したものである。多数の透過ゾーンからの試料照射部分の透過Ｘ線が干渉しあい、この対物ゾーンプレート5d'の後方460ｍｍの位置に拡大結像される。この像はこの位置に配置された図示していない二次元Ｘ線検出器5bによって検出される。この対物ゾーンプレート5d'は倍率460/0.7＝657の対物レンズとなる。二次元Ｘ線検出器5bには結像面に蛍光物質が配置されたＣＣＤカメラを用い、可視光に変換され受像される。ピクセルサイズは24μｍ×24μｍ，素子サイズは512×512ピクセルで寸法としては12.3×12.3ｍｍとなる。試料ホルダ３の回転に伴う試料の位置ズレは試料ホルダ３の上方に配置された光学顕微鏡８（図示していない。）によって位置検出し、二次元の位置補正用情報として試料台のＸＹ駆動系によって位置補正されるのは先の実施例と同様である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の微細試料支持回転ホルダ主要部の基本構造を示す図である。
【図２】本発明のナノバイオ対応ＣＴシステムの基本構成を説明する図である。
【図３】本発明のナノバイオ対応ＣＴシステムの１実施例を示す図である。
【図４】本発明のナノバイオ対応ＣＴシステムの異なる実施例を示す図である。
【図５】本発明に係る微細試料支持回転ホルダを製作するための基礎となる先行技術を説明する図である。
【符号の説明】
【００１７】
１  ガラス管                        ２  皿状体
３  試料ホルダ                      ４  試料台
５  Ｘ線顕微鏡                      5a  Ｘ線源
5b  二次元Ｘ線検出器                5c  集光レンズ
5d  対物レンズ                      5f  ピンホールスリット
5c'  集光ゾーンプレート              5d'  対物ゾーンプレート
６  制御演算部                      ７  表示部
【図１】
2005221426.tif 000003
【図２】
2005221426.tif 000004
【図３】
2005221426.tif 000005
【図４】
2005221426.tif 000006
【図５】
2005221426.tif 000007