(57)【要約】【課題】呼吸器感染症起因菌の迅速検出法およびそのキットを見出す。【解決手段】肺炎球菌の自己溶菌酵素（LytA）をコードするlytA遺伝子、インフルエンザ菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、化膿レンサ球菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、マイコプラズマ  ニューモニエの16SｒRNAをコードする遺伝子のそれぞれに由来するプライマーセットを用いて、4種類の呼吸器感染症起因菌を同時に検出する方法およびそのキットを提供する。さらに、上記4種類の菌株と同時に、クラミジア  ニューモニエの16SｒRNAをコードする遺伝子、レジオネラ菌の16SｒRNAをコードする遺伝子およびレジオネラ  ニュモフィラの病原因子である蛋白質MIPをコードするmip遺伝子のそれぞれに由来するプライマーセットを用いて、6種類の呼吸器感染症起因菌を同時に検出する方法ならびにそのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎球菌の自己溶菌酵素（LytA）をコードするlytA遺伝子、インフルエンザ菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、化膿レンサ球菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、マイコプラズマ  ニューモニエの16SｒRNAをコードする遺伝子のそれぞれに由来するプライマーセットを用いて、4種類の呼吸器感染症起因菌を同時に検出する方法。
【請求項２】
遺伝子がDNAである請求項1に記載の方法。
【請求項３】
検出する方法が遺伝子増幅法である請求項1あるいは請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子増幅法が、ポリメラーゼ増幅反応法である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
プライマーが配列番号1〜配列番号８で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項4に記載の方法。
【請求項６】
請求項５に記載のプライマーを含むことを特徴とする、4種類の呼吸器感染症起因菌の存在を迅速に判定するためのキット。
【請求項７】
肺炎球菌の自己溶菌酵素（LytA）をコードするlytA遺伝子、インフルエンザ菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、化膿レンサ球菌の16SｒRNAをコードする遺伝子、マイコプラズマ  ニューモニエの16SｒRNAをコードする遺伝子、クラミジア  ニューモニエの16SｒRNAをコードする遺伝子、レジオネラ菌の16SｒRNAをコードする遺伝子およびレジオネラ  ニュモフィラの病原因子である蛋白質MIPをコードするmip遺伝子のそれぞれに由来するプライマーセットを用いて、6種類の呼吸器感染症起因菌を同時に検出する方法。
【請求項８】
遺伝子がDNAである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
検出する方法が遺伝子増幅法である請求項７あるいは請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子増幅法が、ポリメラーゼ増幅反応法である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プライマーが配列番号1〜配列番号14で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプライマーを含むことを特徴とする、6種類の呼吸器感染症起因菌の存在を迅速に判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，呼吸器感染症の治療対策上重要な細菌である肺炎球菌，インフルエンザ菌，化膿レンサ球菌，マイコプラズマ肺炎菌（Mycoplasma pneumoniae），クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae），レジオネラ属の菌株（Legionella pneumophilaなど）の存在を同時かつ迅速に検出する方法およびそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器感染症の原因菌は，患者の年齢，感染部位，免疫機能，基礎疾患の有無，あるいは患者のおかれた環境によって著しく異なる。一般社会生活を送っている人に見られる肺炎（市中肺炎）の起因菌は，基礎疾患を有しないヒトではマイコプラズマ肺炎菌やクラミジア・ニューモニエの関与する割合が相対的に高く，基礎疾患を有する高齢者においては肺炎球菌やインフルエンザ菌の割合が比較的高いとされる。
一方，小児の肺炎においては，免疫機構の未熟性から6歳以下では肺炎球菌やインフルエンザ菌の占める割合が圧倒的に高いが，7歳以上になるとマイコプラズマ肺炎菌やクラミジア・ニューモニエの関与する例が相対的に高い割合で認められる。
このような起因微生物のうち，培養が比較的容易な細菌の検索には，依然として培養検査が日常的に行われ，それが困難な細菌の検出にはPCR法が応用されつつある。しかし，一般的にはマイコプラズマ肺炎菌やクラミジア・ニューモニエの確定診断は，発症7日目以降における抗体価の上昇を検査することによって行われている。
【０００３】
細菌感染症が疑われる患者に対する治療用抗菌薬の選択は，本来起因菌の検査結果に基づいて選択されるべきである。その理由は，肺炎球菌やインフルエンザ菌による感染症と，マイコプラズマ肺炎菌やクラミジア・ニューモニエあるいはレジオネラ属による感染症では治療抗菌薬が本質的に異なることによる。しかし，現実的には培養による細菌検査では結果の判明までに少なくとも3日以上を要することから，初診時におけるＸ線写真や白血球数，およびC-反応性タンパク(CRP)量などの所見と，患者に対する問診による症状から経験的に起因菌が推定され，当該菌に対する有効性が期待される抗菌薬が選択されているのが現状である。従って誤った菌が起因菌と推定されれば，当然治療効果は期待できず入院期間は長引くことになる。
感染初期に最も臨床効果の期待できる適切な抗菌薬を選択して治療を行うためには，起因微生物を短時間で確実に検出することが最も必要なことである。
【０００４】
発明者は上記に示した視点に立脚し，呼吸器感染症の起因微生物として頻度の高い菌種をPCRによって同時に検出する方法を確立することを目的として，臨床検査材料中の肺炎球菌，インフルエンザ菌，化膿レンサ球菌，マイコプラズマ肺炎菌，クラミジア・ニューモニエおよびレジオネラ属菌の６種類を，PCR法によって同時にしかも2.5時間で検出する方法を種々検討して，本発明を完成させた。
【０００５】
従来，これらの菌種についてPCR法を用いて各々を単独に検出する方法は多数考案されている。例えば，本発明者はペニシリン耐性肺炎球菌を迅速に検出する方法を考案し，ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology,）,  vol.34, No.3, 592-596, 1996 （非特許文献１）に報告すると共に，特開平８−９８６９９号公報（特許文献１）に開示した。本発明においても，肺炎球菌を検出するための標的遺伝子は特開平８−９８６９９号公報で用いたものと同じ肺炎球菌自己溶解酵素( LytA)をコードする遺伝子としたが，プライマーは本発明の諸条件に合致することを目的に新たに設計したものを用いた。
【０００６】
インフルエンザ菌のPCRによる検出方法として，本発明者はインフルエンザ菌に特徴的な外膜蛋白質であるP6蛋白質をコードする遺伝子を標的遺伝子とする検出方法を特開２０００−３４２２６８号公報（特許文献２）に開示している。本発明では，インフルエンザ菌の１６S rRNAの遺伝子を標的遺伝子とし，本発明の条件設定に合致するようプライマーを新たに設計した。
【０００７】
化膿レンサ球菌の検出方法に用いる標的遺伝子として，本発明では，化膿レンサ球菌の１６S rRNA遺伝子を用いた。本発明で用いたプライマー遺伝子は，本発明の諸条件に合致するよう新たに設計したものである。
【０００８】
マイコプラズマ・ニューモニエの検出には標的遺伝子として１６S rRNAの遺伝子を用いた。本プラマーについては，日本化学療法学会雑誌  第５１巻，第５号，２８９〜２９８頁，２００３年（非特許文献２）にすでに発明者らが発表した。
【０００９】
クラミジア・ニューモニエの検出には標的遺伝子として１６S rRNAの遺伝子を用いた。同様の手法が特表２００２−５２６０８８号公報（特許文献４）に開示されている。本特許公報には，呼吸器感染症を引き起こす微生物の検出方法が開示されており，クラミジア・ニューモニエの他，マイコプラズマ肺炎菌，レジオネラ菌に加えて，ウイルスについての検出方法が開示されている。しかし，本発明と異なり，肺炎球菌，インフルエンザ菌および化膿レンサ球菌の検出方法は開示されていない。
【００１０】
レジオネラ属菌の検出には，標的遺伝子として１６S rRNA遺伝子を用いた。プライマーはアプライド・アンド・エンバイロメント・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology） vol.67, No.9, 3985-3993,  2001,（非特許文献３）に記載されたものを使用した。レジオネラ・ニューモフィラの検出には，病原因子として重要なＭＩＰ蛋白質をコードするmip遺伝子を標的遺伝子とした。用いたプライマーはジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology,）, Vol.39, No.7, 2618-2626,  2001（非特許文献４）に記載されたものを使用した。
【００１１】
本発明に類似する特許出願として，臨床検体から細菌および真菌性病原体に関連する遺伝子を迅速に検出および同定するための種特異的，属特異的および普遍的プローブおよびプライマーが特表２００１−５０４３３０号公報（特許文献５）に開示されている。しかしながら，呼吸器感染症起因菌として重要なインフルエンザ菌やマイコプラズマ肺炎菌などの菌種の検出方法が開示されておらず，呼吸器感染症の起因菌や検出方法としては不十分である。
【特許文献１】特開平８−９８６９９
【特許文献２】特開２０００−３４２２６８
【特許文献３】特開平６−２７９４９８
【特許文献４】特表２００２−５２６０８８
【特許文献５】特表２００１−５０４３３０
【非特許文献１】J. of Clinical Microbiology,  vol.34, No.3, 592-596 (1996)
【非特許文献２】日本化学療法学会雑誌  第５１巻，第５号  ２８９〜２９８頁，  ２００３年
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology. 2001, vol.67, No.9, 3985-3993
【非特許文献４】Journal of Clinical Microbiology, 2001, Vol.39, No.7, 2618-2626
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記した技術背景から，呼吸器感染症の起因微生物として頻度の高い菌種である肺炎球菌，インフルエンザ菌，化膿レンサ球菌，マイコプラズマ肺炎菌，クラミジア・ニューモニエおよびレジオネラ属菌の６種類の細菌を，同時かつ迅速に検出・同定する方法を確立することを課題とした。ここで，本発明が解決する課題として強調すべきことは，６種類の細菌を同じ条件で一度に検出する方法を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決する手段として，発明者は上記６種類の細菌について遺伝子増幅法によって迅速に検出・同定することを試みた。各々の細菌を検出する方法は，すでに背景技術の項で述べたように種々の方法が開示されているが，６種類の菌株を同時に検出するためには，各々のプライマーが同一条件下に同様の効率で標的遺伝子を増幅し，かつ増幅されたＤＮＡ断片の大きさが異なり，結果判定の際に明瞭に区別されることが必須条件である。条件をクリアしたプライマーは将来の全自動解析システムに応用できる。
【００１４】
上記条件を満たす手段として発明者は下記の手法を試みた。すなわち，肺炎球菌の自己溶菌酵素( Lyt A )をコードするlytA遺伝子，インフルエンザ菌の１６S rRNAをコードする遺伝子，化膿レンサ球菌の１６S rRNAをコードする遺伝子，マイコプラズマ・ニューモニエの１６S rRNAをコードする遺伝子，クラミジア・ニューモニエの１６S rRNAをコードする遺伝子，レジオネラ属菌に共通の１６S rRNAをコードする遺伝子およびレジオネラ  ニューモフィラの病原因子である蛋白質MIPをコードするmip遺伝子のそれぞれの一部分を増幅することを目的とするプライマーセットを設計した。このプライマーセットを用いた起炎菌の検索結果が，臨床検査で用いられている培養法，あるいは抗体価測定によって確定診断されたマイコプラズマ・ニューモニエやクラミジア・ニューモニエの結果と一致することを確認し，本発明を完成させた。
【発明の効果】
【００１５】
呼吸器感染症の治療対策上重要な肺炎球菌，インフルエンザ菌，化膿レンサ球菌，マイコプラズマ肺炎菌，クラミジア・ニューモニエ，レジオネラ属菌の存在を同時かつ迅速に検出・同定することが可能となる。従来法の培養によっては起炎菌が明らかになるまで通常3日以上を要しているため，起炎菌不明のままに経験的に抗菌薬が選択され治療が行われている(Empiric  therapy)。特に培養に１週間以上を要すマイコプラズマ・ニューモニエ，クラミジア・ニューモニエ，レジオネラ属菌が起炎菌の患者に対しては，経験的化学療法が施行されているのが現実である。6菌種PCRは，例えば肺炎例の約半数程度しか起因菌が確定できないままに終わるという現実問題を少なくとも75%程度まで確定診断率を上げることができ，しかも感染初期から確実に有効性の期待できる適切な抗菌剤を選択して治療をすることが可能となる。このことは医療経済上極めて注目すべきことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明で用いたプライマーの特徴は，それぞれのアニーリング最適温度が53℃付近になるように設計しつつ，増幅産物のDNA断片の長さに差をつけ識別を容易にしたことである。肺炎球菌の自己溶菌酵素( LytA)をコードするlytA遺伝子，インフルエンザ菌の１６S rRNAをコードする遺伝子，化膿レンサ球菌の１６S rRNA遺伝子，マイコプラズマ・ニューモニエの１６S rRNAをコードする遺伝子，クラミジア・ニューモニエの１６S rRNAをコードする遺伝子，レジオネラ属菌の１６S rRNAをコードする遺伝子およびレジオネラ・ニューモフィラの病原因子である蛋白質MIPをコードするmip遺伝子のそれぞれに由来するプライマーセットを設計した。レジオネラ属菌とその中のレジオネラ・ニューモフィラは起炎菌としての意味が異なることからそれらを識別するため，このレジオネラ属菌のみ２組のプライマーセットを用いて検出することとした。
なお、本発明で開示するPCRのプライマーセットを適宜組み合わせることにより6菌種より少ない呼吸器感染症起因菌の検出方法およびそのキットを提供することが可能である。肺炎球菌、インフルエンザ菌、化膿レンサ球菌およびマイコプラズマ・ニューモニエの4菌種を検出するプライマーセットを組み合わせることにより４菌種の検出が可能となる。呼吸器感染症起因菌の中で特に陽性率の高いこれら4種の細菌を検出する方法ならびにキットは実用的かつ有用である。
【００１７】
本発明で用いたプライマーのセットは下記に列挙した通りである。
肺炎球菌の自己溶菌酵素( LytA)をコードするlytA遺伝子の98番目から416番目に相当する319塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号１．CAACCGTACAGAATGAAGCGG (21mer)  センス
配列番後２．TTATTCGTGCAATACTCGTGCG (22mer)  リバース
【００１８】
インフルエンザ菌の１６S rRNA遺伝子の455番目から621番目に相当する167塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号３．TTGACATCCTAAGAAGAGCTC (21mer)  センス
配列番号４．TCTCCTTTGAGTTCCCGACCG (21mer)  リバース
【００１９】
化膿レンサ球菌の１６S rRNAをコードする遺伝子の108番目から394番目に相当する287塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号5．GGGGCAATTGCTCCACTATG  (20mer)  センス
配列番後6．TAGTTACCGTCACTTGGTGG  (20mer)  リバース
【００２０】
マイコプラズマ肺炎菌のゲノムDNAの１１８３８８番目から１１８６１２番目に相当する（１６S rRNAの一部分）２２５塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号７．GTAATACTTTAGAGGCGAACG (21mer)  センス
配列番後８．TACTTCTCAGCATAGCTACAC (21mer)  リバース
【００２１】
クラミジア・ニューモニエの１６S rRNA遺伝子の９２０番目から１３８４番目に相当する４６５塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号９．TGACAACTGTAGAAATACAGC (21mer)  センス
配列番後１０．CGCCTCTCTCCTATAAATAG (20mer)  リバース
【００２２】
レジオネラ属の１６S rRNA遺伝子の４５１番目から８３７番目に相当する３８６塩基のDNAを増幅するプライマーセット。
配列番号１１．AGGGTTGATAGGTTAAGAGC (20mer)  センス
配列番後１２．CCAACAGCTAGTTGACATCG (20mer)  リバース
【００２３】
レジオネラ・ニューモフィラのMIP蛋白質をコードするmip遺伝子の２２０番目から３６３番目に相当する１４４塩基のDNAを増幅するプライマーセット
配列番号１３．ACCGAACAGCAAATGAAAGA (20mer)  センス
配列番後１４．AACGCCTGGCTTGTTTTTGT (20mer)  リバース
【００２４】
本発明のキットは，上記の方法を用いて呼吸器感染症の治療の上で重要な肺炎球菌，インフルエンザ菌，化膿レンサ球菌，マイコプラズマ肺炎菌，クラミジア・ニューモニエ，レジオネラ菌の存在を判定するものである。本キットは上記のような７種類のプライマー(配列番号１〜配列番号1４)を具備してなるもので，必要に応じて各プライマーに検出可能な任意の標識物を導入してもよい。また，本発明のキットは，必要に応じてPCR反応試薬と合わせることもできる。以下，これらの試薬類について具体的に説明する。
【００２５】
(A)遺伝子増幅反応を行うための試薬
特定の遺伝子増幅反応を行うための前記プライマー，DNA鎖を合成（増幅）するための単位DNA及びDNA伸長酵素を含むものである。DNA伸長酵素としては，任意のDNAポリメラーゼを用いることができるが，Tth DNAポリメラーゼを用いることにより，最も高い感度で特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる。
【００２６】
(B)遺伝子増幅反応生成物を固定化するための担体
本発明により増幅されたDNAを固定可能な固相担体で，具体的にはマイクロタイターウエル，アガロースビーズ，ラテックス粒子，磁性ラテックス粒子等の固相材料が挙げられる。好ましくは操作性及び機械化に優れたマイクロタイターウエル又は磁性ラテックス粒子が適している。これらの固相担体にDNAを非特異的吸着，共有結合，イオン結合，化学結合等の任意の結合様式で固定化することができる。
【００２７】
(C)その他の試薬類
洗浄液は未反応プライマー，PCR反応試薬等を除去するための洗浄液であって，本検出反応に影響がないものであれば特に限定されない。一般にリン酸緩衝液を用いることができる。
増幅反応生成物のDNAに結合した標識プライマーを間接的に測定するための試薬は，プライマーに直接検出可能な標識以外の標識を導入した場合，その標識を間接的に測定するための試薬類を含むものである。例えば，標識がハプテンである場合，a)ハプテンと特異的に結合する抗体に酵素を結合させたもの，b)当該酵素の基質等が挙げられる。これらの具体例としては，酵素がアルカリフォスファターゼの場合，基質として4-メチルウンベリフェリルフォスフェート，4-ニトロフェニルフォスフェート，NADP等が挙げられる。
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
検体からのDNA抽出
細菌による呼吸器感染症が疑われた患者より「シードスワブ2号（栄研）」などを用いて適切に採取された検査材料の内訳は，上咽頭ぬぐい液（n=768）, 咽頭ぬぐい液（n=210）, 耳漏（n=7）, 喀痰（n=4）, 扁桃（n=7）,その他（n=7）であった。到着後の検体は，0.7%グルコースを含む1.5mlのPPLO broth（Difco社）へ絞り出し，1.5mlのエッペンチューブへ移しかえた後，直ちに4℃で5,000rpm ，5分の遠心操作を行った。上清部分は無菌的に捨て去り，沈渣部分は150μlに調整した。軽くミキシングした沈渣の5μlを，あらかじめ準備した30μlのLysis液｛0.1M Tris buffer (pH8.9)，0.225 (V/V) % Nonidet P-40， 0.225(V/V) % Tween 20， Proteinase K 200μg / 1ml｝を含むエッペンチューブへ加えた。それらのチューブはDNA増幅機器（Gene Amp PCR system 9600-R,Perkin Elmer社製）へセットし，60℃, 20分，続いて94℃, 5分の温度処理を行い，溶菌反応を行った。反応後の液を鋳型DNA液とした。
【００３０】
ポリメラーゼ増幅反応
遺伝子増幅法には下記に示すPCR法を用いた。すなわち，鋳型DNA液の各3μlずつは，30μl のPCR反応液が分注されたエッペンチューブへ加え，直ちにPCRを実行した。PCR 反応液の組成は，1ml中に(i) 100μlの×10 反応用緩衝液 100mM トリス塩酸  (pH8.9), 800mM KCl, 15mM MgCl2, 1% トライトンX-100, 1% コール酸ナトリウム, 5mg/ml BSA , (ii) 100μl の25mM dNTP 混合液, (iii)1〜 2μlの各プライマー, (iv) 40U Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡社製）とした。PCRの1 サイクルは94℃:15秒， 53℃:15秒， 72℃:15秒の温度設定とし，40 サイクル実行するが，1サイクル目の94℃，終了直前の72℃は２分間実行した。PCR終了後の反応産物は3%アガロースゲル電気泳動，あるいはiチップ（日立コスモアイ社製, SV1210）にて解析した。検査材料の処理から結果を得るまでの所要時間は，前者で約2.5時間，iチップで約2時間であった。
【００３１】
検出限界感度・特異度
それぞれのプライマーの検出限界感度は各菌種の臨床分離株を用いて検討した。クラミジア・ニューモニエのみ，分与を受けた基本小体(EB；Elementary body)を用いて検討した。特異度については，呼吸器感染症から分離される可能性のある種々の細菌より抽出した鋳型DNAを用いて実施した。
【００３２】
細菌培養
PCRと細菌培養の結果を比較するための培養検査は，血液寒天培地(BD社)，チョコレート寒天培地(BD社)，ドリガルスキー改良培地(栄研)，マンニット食塩培地(栄研)を用いて実施した。検査材料から調製した沈渣の5μlずつを各培地へ塗布し，血液寒天培地とチョコレート寒天培地は5%CO2培養を20時間行い，ルーチンの方法で菌種の同定を行った。マイコプラズマ肺炎菌の培養はPPLO培地(Difco)を用いて実施した。レジオネラ・ニューモフィラはB-CYE培地(BD社)を使用して分離した。
【００３３】
６菌種，7セットプライマーの感度・特異度
PCR反応チューブあたり陽性と判定される限界のコロニー形成ユニット（CFU）は、3回実測した平均値で，肺炎球菌が1CFU，インフルエンザ菌が2CFU，化膿レンサ球菌が7CFU，マイコプラズマ肺炎菌標準株M129株で2CFU，レジオネラ・ニュモフィラでは7CFU，クラミジア・ニューモニエの基本小体を用いた場合1CFUであった。これらは検査材料中に各細菌が103 CFU/ml以上存在すれば陽性と判定される感度である。特異度の検討は，ヒトの呼吸器から分離されることのある黄色ブドウ球菌(MRSAを含む)，化膿レンサ球菌，モラキセラ・カタラーリス，腸内細菌，およびブドウ糖非発酵菌より抽出した鋳型DNAを用いて行ったが，DNAは増幅されず特異性の高いことが確認された。
【００３４】
次に実際の臨床検査材料を用いた検討結果を示し、培養法などと本発明の方法との比較結果を記述する。
使用した臨床検査材料は上咽頭７６８、咽頭２１０、耳漏７、喀痰４、扁桃７、その他５、不明２の合計１００３検体である。
PCR法、培養法ともに陽性の検体数を培養法での陽性検体数で除した値を感度（陽性率）、PCR法、培養法ともに陰性の検体数を培養法での陰性検体数で除した値を特異度（陰性率）として記載した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
上記したとおり、肺炎球菌、インフルエンザ菌、化膿レンサ球菌、マイコプラズマ・ニューモニエの4種類の細菌を同時に同一条件でPCR法を用いて検出した結果、培養法と比較して感度、特異度ともに高い値を示し、本発明の方法が信頼性の高い呼吸器感染症の起因菌の迅速な検出方法であることが確認できた。
【００３７】
クラミジア・ニューモニエではPCR法での陽性例が１０検体であった。PCR陽性例のみ抗体価を測定したが、６例のみ測定可能であり、測定できた検体ではいずれも抗体価陽性の結果であった。
レジオネラ菌では、レジオネラ・ニューモフィラ以外の菌株がPCR法、培養法ともに１例のみ陽性であった。
【００３８】
以上のとおり、本発明の方法により、肺炎球菌、インフルエンザ菌、化膿レンサ球菌、マイコプラズマ肺炎菌、クラミジア・ニューモニエおよびレジオネラ・ニューモフィラ菌株を、同時に同一条件でPCR法を用いて、臨床検査材料から検出することができることを確認するとともに、培養法などの結果と比較して、感度、特異度ともに高いことを確認した。
【００３９】
肺炎の３６９症例では、PCR法により肺炎球菌とインフルエンザ菌がともに検出された検体が１７．９％、肺炎球菌のみが２０．９％、インフルエンザ菌のみが１７．９％、化膿レンサ球菌が０．３％、マイコプラズマ・ニューモニエ単独が１０．３％、マイコプラズマ・ニューモニエと他の菌が検出された割合が７．９％、クラミジア・ニューモニエが１．６％、不明が２０．３％であった。
同様に急性気管支炎２５１例では、PCR法により肺炎球菌とインフルエンザ菌がともに検出された検体の割合は１９．９％、肺炎球菌のみが２８．７％、インフルエンザ菌のみが２０．３％、化膿レンサ球菌が０．４％、マイコプラズマ・ニューモニエが３．２％、マイコプラズマ・ニューモニエと他の菌がともに検出された割合が２．８％、クラミジア・ニューモニエが１．２％、不明が２３．５％の結果であった。
【００４０】
細菌感染症が疑われる患者に対する治療用抗菌薬の選択は，本来起因菌の検査結果に基づいて選択されるべきである。上記のとおり本発明の方法により、患者検体より呼吸器感染症の起因菌として重要な、肺炎球菌、インフルエンザ菌、化膿レンサ球菌、マイコプラズマ肺炎菌、クラミジア・ニューモニエおよびレジオネラ・ニューモフィラを迅速に検出することが可能となり、適切な抗菌薬の選択に有用である。
【配列表】
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