(57)【要約】【課題】  標的蛋白質、ペプチド、核酸あるいは低分子化合物などの生理活性物資を特異的に抽出する、または免疫診断、分子生物研究、医薬候補物質のスクリーニング、あるいは有用バイオ物質の分離などなどに使用されるバイオアッセイ用およびバイオセパレーション用ポリマー粒子を得る。【解決手段】  ａ）グリシジルメタクリレートおよびグリシジルアクリレートから選ばれるモノマーならびにｂ）架橋性モノマーとを共重合してなる担体粒子【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）グリシジルメタクリレートおよびグリシジルアクリレートから選ばれるモノマー
ならびに
ｂ）架橋性モノマー
とを共重合してなる担体粒子。
【請求項２】
架橋性モノマーがエチレングリコールジメタクリレートまたはテトラメチレングリコールジメタクリレートである請求項１記載の担体粒子。
【請求項３】
さらにｃ）シクロヘキシル（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、オリゴエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、2-メトキシエチル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート  から選ばれるすくなとも１種をさらに共重合してなる請求項１記載の担体粒子。
【請求項４】
ｄ）さらにカルボキシル基およびアミノ基のいずれかを有するモノマーを共重合させてなる請求項１−３いずれにかに記載の担体粒子。
【請求項５】
請求項１−４いずれかの担体粒子を加水分解してなる担体粒子。
【請求項６】
請求項１−５いずれかの担体粒子にスペーサーを化学結合させたことを特徴とする担体粒子。
【請求項７】
請求項１−６いずれかの担体粒子に生理活性物質を化学結合させたことを特徴とする担体粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的蛋白質、ペプチド、核酸あるいは低分子化合物などの生理活性物資を特異的に抽出する、または免疫診断、分子生物研究、医薬候補物質のスクリーニング、あるいは有用バイオ物質の分離などなどに使用されるバイオアッセイ用およびバイオセパレーション用架橋ポリマー粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、各種の診断やバイオ研究、医薬スクリーニング用途において細胞、血液、尿などの検体から遺伝子、タンパク質、糖鎖などの特定のマーカー、リガンド、受容体を分離・精製あるいはＢ／Ｆ分離して診断、解析、スクリーニングなどの各種アッセイが行われている。あるいは前記検体からバイオセバレーションによる分離精製物をベースにして増幅、バイオ操作、バイオ合成などによる治療や医薬品、あるいは各種バイオ産生化学品などの有用物質の生産などが行われ始めている。
これらのバイオアッセイあるいはバイオセパレーションでは生体内物質と特異的に作用する生理活性物質をプローブとして固体化した固定化担体が使用され、固定化担体を使用したいわゆるＢ／Ｆ分離操作が広く行われている。ここで使用される固定化担体としては各種のプレート、アフィニティークロマトカラム充填剤やイムノアッセイ粒子などが使用されている。これらの中では粒子は表面積が大きいこと、溶液中で使用される場合は検体との反応性が高いことから多用されている。
ここで使用されるプローブ付き粒子は、プローブは相互作用する特異的な物質だけを捕捉する機能を担うのに対して、担体粒子は非特異物質にたいして相互作用しないことが望ましい。
担体粒子に検体物質中の非特異的が相互作用するとバックグラウンドとなりＳ／Ｎ比を低下させる、あるいは分離効率が低下するためである。しかしながら担体には特異的物質、非特異的物質の識別能力を認識する機能を持たせる事は困難であり、特異物質、非特異物質の両方を含むすべての検体に対して相互作用しない担体であることが次善の策としては求められている。
従来これらのB/F分離用担体粒子としては、セファロースなどのセルロース系のゲル、シリカ、ポリスチレン／ジビニルベンゼンなどのビーズ、あるいはスチレンジビニルベンゼンと磁性粒子のハイブリッド粒子などが使用されてきた。
現在使用されている担体粒子は検体物質と相互作用するという点では課題があり、バックグラウンドや分離精製では精製効率の低下の問題点が指摘されており、より相互作用の少ない担体粒子が求められている。これらの問題点を改良すべく、たとえば特開昭５８−１７１６７０では、グリシジル（メタ）クリレートの微粒子にアミノ基を有する免疫活性物質が共有結合によって固定化されている免疫活性物質が開示されている。この微粒子は、従来のスチレン系のビーズの持つタンパク質の非特異吸着の問題点を解消するとの記載がなされている。
しかしこれらの粒子は、グリシジルメタクリレートのガラス点移転がＸＸ℃と低いために凝集しやすく、機械的な強度が不足して安定性や、再分散が困難であるという問題点が存在する。
特開昭５５−１１０１１８や特開平４−２１８７７２ではスチレンとグリシジルメタクリレートとの共重合体粒子が開示されている。これらの粒子は従来のスチレンジビニルベンゼン粒子よりも非特異結合低減効果を有する、が前記特開昭５８−１７１６７０によれば、グリシジルメタクリレート基のホモポリマーに比し、非特異結合性は劣ると記載されている。
【０００３】
また特許第２７５３７６２および３０８６４２７にはスチレングリシジルメタクリレート粒子の表面をさらにグリシジルメタクリレートで覆った粒子が開示されている。この粒子は、コア粒子にスチレンが共重合されているために機械的な強度や凝集の問題が解消され、かつ表面がポリグリリジルメタクリレートであるために蛋白非特異吸着も低下するものと推定される。このスペーサーを介して薬剤を結合させた粒子は、表面がグリシジルメタクリレートで覆われていないスチレングリシジルメタクリレートよりもバックグラウンドが極めて低いとされている。
この粒子はスチレングリシジルメタクリレート粒子を作成した後にさらにグリシジルメタクリレートを添加して得られた重合体の表面を完全に被覆する、いわゆる二段重合により得られる。
一般に二段目重合において、コア粒子の表面にシエル重合体が均一に覆われたかどうかの確認は困難であり、完全に覆われていない粒子か゛一部存在する可能性は否定できない。そのような粒子が存在する場合はバックグラウンドや分離性の低下の原因となる。
【特許文献１】特開昭５８−１７１６７０
【特許文献２】特開昭５５−１１０１１８
【特許文献３】特開平４−２１８７７２
【特許文献４】特許第２７５３７６２
【特許文献５】特許第３０８６４２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、現在の担体粒子においては、（１）蛋白などの検体と相互作用が低く、しかもその性能が安定して実現し (２）粒子の機械的な強度、や安定性、の（１）（２）の両立の点で問題があり、このような両方の特性を持つ粒子が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、非芳香族ビニル化合物とエポキシ基含有（メタ）アクリレートを一段で共重合して、得られた粒子を架橋することで機械的な強度や安定性のクリアーが可能なことを見出し、さらにタンパク質などの吸着の安定的な低減と機械的な強度や安定性を両立した安定した粒子が得られることを見出し本発明を完成したものである。
本発明は  ａ）グリシジルメタクリレートおよびグリシジルアクリレートから選ばれるモノマー
ならびにｂ）架橋性モノマーとを共重合してなる担体粒子を提供するものである。
架橋性モノマーとしては、シビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、オリゴエチレングリコールジメタクリレート、テトラメチレングリコールジメタクリレートなどがあげられるが、架橋性モノマーとしては、芳香族系よりも非芳香族系のエチレングリコールジメタクリレート、テトラメチレングリコールジメタクリレートなどが好ましく、添加量は全単量体量中の３０モル％以下、好ましくは１０モル％以下である。
但しエチレングリコールジメタクリレート、テトラメチレングリコールジメタクリレート、オリゴエチレングリコールジメタクリレートなどの多官能アクリレートは架橋性モノマーとしてのみならず、担体粒子を構成する単量体としても使用可能であり、その場合は、これらの単量体は上記範囲を超えて使用可能である。
【０００６】
これらのモノマーの重合方法としては、乳化重合、ソープフリー重合、サスペンジョン重合、沈殿重合、分散重合、ミニエマルジョン重合、Ugelstadらの二段膨潤重合、膜乳化重合などがあげられるが、特に直接的にポリマー粒子を得る方法としてしては乳化重合、ソープフリー重合、二段膨潤重合が好ましい。以下乳化重合を例にとって説明する。ここで用いられる単量体の添加方法は特に制限はなく、一括添加する重合方法のほか、分割添加、あるいは連続添加、いずれも可能である。
ここで用いられる乳化剤はいわゆるソープフリー重合も可能であり、また通常の陰イオン乳化剤、陽オン乳化剤、非オン乳化剤のいずれも使用可能である。陰イオン乳化剤としてはドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ、ラウリル硫酸ソーダ、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウムなど、陽イオン乳化剤としてはセチルトリメチルアンモニウムクロライドなど、非イオン乳化剤としてはポリオキシエチレンラウリルエーテルなどが使用可能である。
【０００７】
重合開始剤は通常に乳化重合で使用される重合開始剤が使用可能である。これらの重合開始剤としては例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、過酸化水素／塩化第一鉄等のレドックス重合触媒、アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ系開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ｔ−ブチルハイドロペルオキシド等の過酸化物開始剤等が使用可能である。
【０００８】
これらの乳化重合の条件は、通常２０℃から８０℃の温度範囲で好ましく、単量体の重合液中の濃度は通常１〜５０重量％が好ましく、５０重量％を超える場合は重合粒子が凝集し、また  １重量％未満の場合は、粒子濃度が希薄で生産性が悪い。
乳化重合の後、必要があればスチームストリツプ等で単量体の除去を行い、ｐＨ調整、透析、限外ろ過・遠心分離などで粒子表面を調整することが好ましい。
【０００９】
本発明において、担体粒子を重合する際に、上記ａ）成分およびｂ）成分以外のモノマーとしてｃ）非芳香族ビニル化合物をさらに使用することもできる。
これらの非芳香族ビニル化合物としては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート，メトキシプロピル（メタ）アクリレート，メトキシブチル（メタ）アクリレート，エトキシメチル（メタ）アクリレート，エトキシエチル（メタ）アクリレート，エトキシプロピル（メタ）アクリレート, エトキシブチル（メタ）アクリレート，プロポキシメチル（メタ）アクリレート，プロポキシエチル（メタ）アクリレート，プロポキシプロピル（メタ）アクリレート，プロポキシブチル（メタ）アクリレート、アルコキシアルキル（メタ）アクリレートとしては、メトキシメチル（メタ）アクリレート，メトキシエチル（メタ）アクリレート，メトキシプロピル（メタ）アクリレート，メトキシブチル（メタ）アクリレート，エトキシメチル（メタ）アクリレート，エトキシエチル（メタ）アクリレート，エトキシプロピル（メタ）アクリレート, エトキシブチル（メタ）アクリレート，プロポキシメチル（メタ）アクリレート，プロポキシエチル（メタ）アクリレート，プロポキシプロピル（メタ）アクリレート，プロポキシブチル（メタ）アクリレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレートが挙げられる。これらは単独であるいは２種以上を用いても良い。これらの
これらの非芳香族ビニル化合物は、ａ）成分と共重合可能であり、さらにスチレンモノマーとは異なり、蛋白との非特異吸着がホモポリグリシジルメタクリレートと同程度に少ないことが必要である。  
【００１０】
上記非芳香族ビニル化合物中で、シクロヘキシル（メタ）アクリレートおよび2-メトキシエチル（メタ）アクリレートは、スチレンモノマーと比較して蛋白との相互作用が極めて低くなる。さらにまたシクロヘキシル（メタ）アクリレートは高Ｔｇであり、スチレンモノマーと同等の機械的な強度が実現可能である。
また、シクロヘキシル（メタ）アクリレートおよび2-メトキシエチル（メタ）アクリレートは疎水性のアクリレートであるにもかかわらず、グリシジルメタクリレートの単独重合体と同様に蛋白非特異吸着が少ないことは特筆すべきことである。
【００１１】
本発明において、担体粒子が有するエポキシ基は、生理活性物質がアミノ基を持つ場合は、直接化学結合基として使用することが可能であり、また後述の様に、アンモニアなどを利用してアミノ基を結合して、末端にエポキシ基を持つスペーサーと結合することも可能である。
また生理活性物質を直接あるいはスペーサーなどを介して担体粒子と結合した後に、未結合のエポキシ基がタンパク質と非特異的に結合するのを防止するために、各種のブロッキング剤にてブロックする、塩酸エタノールアミン処理する、あるいは後述のように加水分解してグリコール基に変換するなどの方法を使用することが望ましい。ここで一般に用いられるブロックキング剤としては、検体と相互作用することのない配列の核酸、牛血清アルブミン（ＢＳＡ），ゼラチン、グリシン、アラニンなどを用いることができる。
【００１２】
本発明においては、さらに担体粒子がカルボキシル基、アミノ基のいずれかを有することが好ましい。
これらの基は、担体粒子をメタクリル酸、アクリル酸、フマル酸、イタコン酸などのカルボン酸モノマー、ビニルベンジルアミン等のアミノ基含有モノマーなどを共重合して製造することにより導入することができる。
【００１３】
本発明においては、エポキシ基およびさらにカルボン酸やアミノ酸などの他の極性基を利用して生理活性物質と担体粒子を結合することができる。
本発明の担体粒子に結合することができる生理活性物質としては、オリゴヌクレオチド、タンパク質、糖蛋白、脂質、糖鎖、レクチン，細胞、タンパク質発現細胞、アプタマー、ウィルス、酵素、転写因子、薬理活性を有するリード化合物、あるいは特定の生理活性作用を持つか、これを持つ可能性のある化学物質などを使用することができる。
粒子担体の極性基と生理活性物質との結合方法は、本発明において基本的に化学結合で行われえることが好ましい。たとえば、蛋白質、核酸等の生理活性分子、または分離すべき目的物質と親和反応できるリード化合物のもつカルボン酸、アミノ碁、SH基、OH基、アルデヒド基を利用して、担体粒子表面のエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基、水酸基とを化学反応することで、固定することができる。また、プローブ物質の生理活性を維持するために、必要に応じてスペーサーを介して所定の官能基を導入することもできる。    
またこれらの極性基を利用して生理活性物質と粒子を結合した後には、粒子表面の残存エポキシ基が蛋白質と非特異的に結合することを防止するために、前記と同様に残存エポキシの不活性化処理をすることが望ましい。
【００１４】
本発明の担体粒子は加、必要に応じて水分解することにより、エポキシ基をグリコール基に変換することもできる。
この加水分解は、酸にてｐH3以下にする、あるいはアルカリにてｐH9.5以上にすることで実施することが可能であり、例えば具体的には担体粒子の水分散体中で塩酸によりｐH2に調整し、室温で24時間処理することで可能である。60から100℃に加温することで加水分解反応を促進することも可能である。
エポキシ基を加水分解してグリコール基とすることにより、エポキシ基含有粒子よりもさらに蛋白非特異吸着を低減することが可能となる。
エポキシ基は一般に溶液中では不安定であり、漸次開環する可能性があり、開環を遅らせるためにエポキシ基を表面に持つ粒子は一般に粉末粒子として保存され（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ２７０Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ株式会社）），検体との反応の際にはさらに水系溶液に分散させて使用される。しかし粉末粒子化する工程、再分散する工程などの追加操作が必要であり、さらに粉末粒子保存時の凝集などによる再分散性不良などの懸念があり、加水分解してグリコールとすることでこれらの追加操作あるいは懸念は払拭される。
【００１５】
これらのスペーサーとしては、塩基数が２から２０の二本鎖ＤＮＡ、連鎖数が２から４０までのエチレングリコール誘導体、炭素鎖が５から３０のシランカップリング剤などが使用可能である。
これらのスペーサーを使用してさらにスペーサーの末端に生理活性物質を結合させることにより、ポリマー粒子の立体障害による生理活性物質と検体中の特異物質との相互作用の低下を最小限にすることが可能である。
具体的には例えば、二本鎖ＤＮＡとしては末端がアミノ基、チオール基のもの、エチレングリコール誘導体としては、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＡ（和光純薬株式会社製）、デナコール（長瀬ケムテック株式会社製）、末端がアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒト基，サクシイミド基のエチングリコール（日本油脂株式会社製）、などが使用可能である。
【００１６】
本発明では担体粒子表面あるいはスペーサー末端に生理活性物質を化学結合させることができる。
本発明での担体粒子に担持することができる生理活性物質は、生理活性があるものであれば特に限定はなく、具体的には前記の生理活性物質が使用可能である。これらの生理活性物質との結合方法は、粒子表面のエポキシ基と結合させる場合は一般に生理活性物質のアミノ基との結合が用いられ、そのほかカルボキシル基の場合はカルボジイミド化合物が、アミノ基の場合は生理活性物質のカルボニル基が使用可能である。
スペーサーを介して生理活性物質をつける場合は、スペーサー末端にエポキシ、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基、サクシイミド基などが用いられる。  
【発明の効果】
【００１７】
以上の結果により、本発明品が蛋白質による非特異吸着がほとんどなく、一方、固定化すべきプローブとの結合反応が効率的で、プローブを多く結合できるため免疫測定において高いシグナル強度が得られた。夾雑物、不純物が多く含まれる生体検体、バイオアッセイ検体から、目的物を効率的に抽出、分離、検出に適している担体であることがわかる。
実施例１
撹拌器つきの四ツ口ガラスフラスコにイオン交換水3000部、ドデシルベンゼンスルホン酸ソーダ0.2部を入れ、系のｐHを6.5に調整した。窒素置換して75℃に昇温し、グリシジルメタクリレート99部、エチレングリコールジメタクリレート1部と2,2'-アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）2部を添加して75℃で6時間の重合を行なった。冷却後調べたところ、系のｐHは6.2、重合転化率99.5％、得られたポリマー粒子の粒子径は0.35μmであった。ここで得られた粒子を実施例１の粒子とする。
【００１８】
実施例２
実施例１のモノマー組成と開始剤を、グリシジルメタクリレート９８部、エチレングリコールジメタクリレート2部、開始剤をBPO２部とした以外は実施例１と同様にして粒子を得た。
【００１９】
実施例３
実施例１でのモノマーを、グリシジルメタクリレート７０部、シクロヘキシルメタクリレート３０部とした以外は実施例１と同様にして粒子を得た。
【００２０】
実施例４
実施例１でのモノマーを組成を、グリシジルメタクリレート  70部、オリゴエチレングリコール(n=20)ジメタクリレート  30部，ＡＩＢＮの代わりにベンゾイルペルオキシド（ＢＰＯ）２部とした以外は実施例１と同様にして粒子を得た。
【００２１】
実施例５
実施例１でのモノマー組成を  グリシジルアクリレート  90部、エチレングリコールジメタクリレート10部，AIBN  3部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
【００２２】
比較例１
実施例１でのモノマー組成を、グリシジルメタクリレート  ７０部、スチレン３０部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
比較例２
実施例１でのモノマー組成を、グリシジルアクリレート  90部、ジビニルベンゼン１０部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
【００２３】
実施例６
実施例１でのモノマー組成を  グリシジルメタクリレート  95部、メタクリル酸5部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
実施例７
実施例１でのモノマー組成を  グリシジルメタクリレート  70部、メトキシエチルアクリレート30部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
実施例8
実施例１でのモノマー組成を  グリシジルメタクリレート  70部、グリセリンモノメタクリレート（GLM）30部とした以外は実施例と同様にして、粒子を得た。
実施例９
実施例１，６，７の粒子の分散液を1重量％水酸化ナトリウムでｐH11に調整し、98℃で6時間の加熱処理を行なって粒子のエポキシ基の加水分解処理を行なった。冷却後ｐH8に調整し、粒子を得た。
【００２４】
比較例３
比較例１および２の粒子の分散液を１重量％水酸化ナトリウムでｐH11に調整し、98℃で6時間の加熱処理を行なって粒子のエポキシ基の加水分解処理を行なった。冷却後ｐH8に調整し粒子を得た。
【００２５】
実施例10
実施例１，２，３，４の粒子の分散液を1N塩酸水溶液でｐH２に調整し、25℃で48時間の酸処理を行なって粒子のエポキシ基の加水分解処理を行なった。冷却後ｐH8に調整し、これを実施例３の粒子を得た。
比較例４
比較例１，２の粒子の分散液を1N塩酸水溶液でｐH２に調整し、25℃で48時間の酸処理を行なって粒子のエポキシ基の加水分解処理を行なった。冷却後ｐH8に調整し粒子１４を得た。
比較例５
実施例１でのモノマー組成を、スチレン１００部とした以外は実施例１と同様にして粒子を得た。
【００２６】
以上の操作にて得られた粒子は以下の表１のとおりである。
【００２７】
【表１】
2005232237.tif 000002
【００２８】
【表２】
2005232237.tif 000003
【００２９】
実施例１０  粒子担体と蛋白質によるγＩｇＧの非特異吸着評価
上記実施例および比較例で得られたそれぞれの粒子（No1-20）の１０％分散液を2ｍｌ（粒子ドライ量は0.2ｇ）取り、15000rpmx1時間で遠心し、透明になった上澄を除去してから、滅菌蒸留水で２ｍｌにメスアップし、ボルテックスで分散してから、再び同一条件で遠心する。この操作を３回繰り返し、粒子分散液中に含まれる可溶性成分を除去した。
上記精製した各粒子を最後に1mlの生理食塩水（PBS、ｐH7）に分散し、これらに1ｍｌ  30mgーγG/ml-PBS(Rabbit, Sigma  FrII,III)溶液を加え、ボルテックスしてから、３７℃での恒温槽で１rpm/分の速度で１０分間回転攪拌した。また、γGのチューブ容器壁の吸着量を除外するために、コントロールとして粒子の入っていないチューブを同時に用意し、１ｍｌ粒子分散液の変わりに１ｍｌの滅菌蒸留水を加えて同様な操作を行った。37℃で1時間インキュベートした粒子分散液を15000ｒｐｍx１時間で遠心し、粒子ペレットを崩れないように上澄1.5mlを回収し、新しいチューブに移して再度15000ｒｐｍx１時間で遠心した。続いて、注意深く上澄１ｍｌを新しいチューブに移して、15000ｒｐｍx１時間で3度目の遠心を行った。最終的に透明な上澄0.5mlを採集し、280nmでの吸光度測定を行った。粒子に添加する前の30mg-γG /ml溶液の吸光度、およびコントロールの吸光度を比較、計算することにより、各粒子のγG 吸着量を算出した。その結果は表３に示した。なお、計算において、1mgγG/mlの吸光係数1.4を採用した。粒子表面積は光動的散乱法（大塚電子社、Photal LPA3100）で求められた粒径を用いて幾何学的に求めた。
実施例１１
粒子担体と血清蛋白質の非特異吸着評価
γＧの代わりに、子牛血清(BSA)を使用した以外は、実施例１０と同様な方法で、粒子担体の非特異吸着を評価した。結果を表3に示した。
【００３０】
【表３】
2005232237.tif 000004
実施例１２  
粒子担体の免疫測定への応用-1
実施例１１と同様な方法で全粒子を洗浄し、粒子固形分１０％分散液0.1mlに、０．１M硫酸アンモニア0.1mlを加え、ボルテックスしてから、抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液（０．１ｍｇ/ｍL、１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６））を0.1ｍL加え、３７℃で1rpm/分で一晩回転攪拌した。続いて、１ｍｌPBSで実施例１０と同様な条件で3回洗浄した。次に、粒子に０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）を１ｍL加え室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。その後、実施例、比較例で得られた粒子をすべてリン酸緩衝液（ｐH 7.4）で２回洗浄後、粒子濃度が０．５重量％となるように０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合粒子とした。
この免疫測定用粒子１０μLに１００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを含むサンプル５０μLを加えて攪拌し、室温で５分放置した。遠心分離法により免疫測定用粒子をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄を行った。
次に、アルカリフォスファターゼコンジュゲート抗ＡＦＰ抗体（抗体濃度２．５μg／ｍＬ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μL加えて攪拌し、室温で１０分放置した。同様な方法により洗浄を行った。この粒子にＡＭＰＰＤ２００μg／ｍＬを含む基質液１００μLを加え攪拌の後、１０分間放置後、ルミノメータ（ベルトールド社製）で測定した。表４に抗原濃度０、100ng/mlでの抗体結合量と化学発光強度を示す。
【００３１】
【表４】
2005232237.tif 000005
実施例１２  粒子担体の免疫測定への応用-2
実施例６にて得られた粒子１０％分散液１０ｍｌを70ｍｌ0.01NNaOHに希釈し、0.05N  H2SO4を用いて伝道度滴定法で粒子表面のカルボン酸量を測定した。その結果128ｎｍｏｌ／gであることを確認した。
この粒子の１０％分散液１ｍｌを１０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６）５ｍLに分散させ、実施例１同様な抗ＡＦＰマウスIgG抗体溶液を同量に加え、室温で回転攪拌機にて３０分間攪拌した。これに水溶性カルボジイミド  ５ｍｇを加え、室温で回転攪拌機にて2時間攪拌した。2時間後、上清を除去した。次に、粒子に０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝塩溶液（ｐH 7.4）を１０ｍL加え室温で回転攪拌機にて2時間攪拌し、リン酸緩衝液（ｐH 7.4）で２回洗浄後、粒子濃度が０．５重量％となるように０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ｐH 7.4）に再分散し、抗ＡＦＰＩｇＧ結合磁性粒子とした。実施例１１同様な方法でアッセイを行い、その結果抗原０ng/mlのとき、発光値は１２９、抗原100ng/mlのとき、発光値は477000であった。