(57)【要約】【課題】  標的物質の検出や定量等を精度よく行うことのできるマイクロアレイを提供する。【解決手段】  多種類のプローブをプローブ担体上に固定したマイクロアレイであり、担体上のプローブがいくつかのマトリクス状のプローブ群（ブロック）に分けて固定されていて、該ブロックがマイクロアレイ全体のどの位置にあるかを示すアドレスを示すマーカー物質が付加されていることを特徴とするマイクロアレイ。【選択図】  図１
2005164546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種類のプローブをプローブ担体上に固定したマイクロアレイであり、担体上のプローブがいくつかのマトリクス状のプローブ群（ブロック）に分けて固定されていて、該ブロックがマイクロアレイ全体のどの位置にあるかを示すアドレスを示すマーカー物質が付加されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
該アドレスを示すマーカー物質が蛍光性物質である請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
該アドレスを示すマーカー物質が核酸である請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
該プローブが一本鎖のDNA,RNA,PNAである請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
多種類のプローブが固定されたマイクロアレイの観察法であり、該プローブがいくつかのマトリクス状のプローブ群（ブロック）に分けて固定されていて、該ブロックに、マイクロアレイ全体のどの位置にあるかを示すアドレスマーカーが付加されていることを利用して、ブロックごとの観察から、マイクロアレイ全体の情報を構成することを特徴とするマイクロアレイの観察法。
【請求項６】
該アドレスマーカーをプローブからなるグリッドの一部とみなし、プローブと特異的に結合可能な標的物質とのハイブリダイゼーションをしたプローブからの蛍光と同時に観察することを特徴とする請求項５に記載のマイクロアレイの観察法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多種類のプローブを基板上に結合させ、これらプローブに特異的に結合可能な標的物質の検出を行うマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、固相プローブアレイを用いた標的物質の検出、定量に関する研究、開発が精力的に行われてきている。例えば、米国特許公報5,445,936にはフォトリソグラフィーを用いて作製された固相オリゴヌクレオチドアレイが示されている。一方、PCT公開公報95/25116、米国特許公報5,688,642にはインクジェット法を用いた固相DNAプローブアレイの作製方法が示されている。このような技術の応用として、さまざまなタイプのマイクロアレイが開発され、マトリクス状に並べられたプローブの基板上への配列の仕方等に工夫が重ねられてきた。
【０００３】
特に、基板上のスポットのうち比較的少ない数のサイトからしか蛍光が観察されない場合の、プローブ配列のグリッド位置を示すマーカー物質の利用について、ＰＣＴ公開公報00/270896に述べられている。以降このような目的で用いられているマーカーを、本発明と区別するために、グリッドマーカーと呼ぶ。
【０００４】
ところで多種類のプローブを固定したマイクロアレイを用いて標的物質の検出や定量を行う場合、個々のプローブのIDを、局所的な観察からでも把握できることが重要である。特に細部の観察を行うような場合には、基板全体の観察を同時に行うことは困難であり、従来のプローブ配置のように基板全体の中の相対位置としてしか位置を特定できない場合には、観察結果がどのプローブに対応するかを観察の際に逐次確認し、記録しておく必要があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は各種方法によって作成されたプローブアレイを用いて標的物質の検出、定量等を行う技術について検討を重ねてきた結果、以下のようなこれまでには認識されてこなかった新たな課題を見出すに至った。それは、多種類のプローブが高密度に固定されたマイクロアレイによる標的物質の検出を蛍光観察で行うに際し、基板の一部分のみを高倍率で観察したい場合に、実際に観察しているのが全体のどの部分であるかの把握が困難になることである。
【０００６】
マイクロアレイの構成はプローブがマトリックス上に基板に固定されているために、一部分のみを観察した際にはどの部分も類似度が高く、それのみからはどの部分が記録されているのか判断ができない。しかし、一つの基板上に多数のプローブを固定したマイクロアレイが作製される中で、その一部のみを高精細に観察し、記録に残しておく必要がでてきている。例えば、ツァイス社製の共焦点型顕微鏡を用いた場合、高倍率での観察や、多種類波長でレーザー励起ができる反面、そのトレードオフとして狭い視野しか実現されない。この場合観察時にマイクロアレイの端から順番に位置をずらしつつ観察を行ったが、観察する基板が多数枚になる場合には、測定の最中に混乱することも多かった。
【０００７】
また得られた画像にはその位置情報を記録して保存するが、その場合にも、該記録の紛失や記録の際の間違いなどで情報が不正確になった場合に、観察結果（たとえば蛍光観察の結果としての画像）のみからでは、それらプローブのマイクロアレイ全体の中の位置を確認することはできなかった。
【０００８】
本発明はかかる新たな技術課題の認定に基づきなされたものであって、その目的は標的物質の検出や定量等を精度よく行うことのできるマイクロアレイを提供する点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成することのできるプローブ結合基板は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブが基板表面の第１の位置に結合されているプローブ結合基板において、該第一の位置に属するプローブ群を特定可能な第２や第３の位置に、該プローブ群ごとに異なるアドレス情報をもったマーカー物質が結合されていることを特徴とする。ＰＣＴ公開公報00/270896では、各プローブのグリッド上での位置を示すためにマーカーが用いられていたが、本発明ではそれを発展させて、ブロックごとに異なるアドレス情報を、マーカーの配列に付加するなどして持たせている。
【００１０】
上記目的を達成することのできるプローブ結合基板の製造方法は、標的物質に対して特異的に結合可能であり、且つ基板表面が担持している第一の官能基に対して結合可能な第二の官能基を有するプローブを含む液を該基板表面の第１の位置に結合させる工程を有するプローブ結合基板の製造方法において、該第一の官能基と直接若しくは間接的に結合可能な第三の官能基を有するマーカー物質を含む液を、該基板表面の第２や第３の位置に供給し、該マーカー物質を該基板表面の該第２や第３の位置に結合させて、それぞれのプローブ群のアドレスに対応した情報を持たせることを特徴とする。
【００１１】
上記目的を達成することのできる標的物質の検出方法は、サンプル中に含まれている可能性のある標的物質に対して特異的に結合するプローブを基板上に互いに独立した複数のスポットとして有し、且つ該基板表面に該スポットの集合としてのプローブ群（ブロック）の全体の中での位置を特定可能な様にアドレスマーカーが付与されているプローブアレイの各々のスポットと、該サンプルとを接触させ、何れかのスポットにおける該プローブと該標的物質との反応物の有無を検出して該サンプル中の該標的物質の有無を検出する方法であって、該反応物の存在が検出された場合に、その反応物が存在するプローブの属するブロックの位置を、該基板表面の該アドレスマーカー物質からの情報を読み取ることで特定することを特徴とする。
【００１２】
また該検出を行う際に、ブロックごとに順番に検出を行う中で、該アドレスマーカーの情報から該プローブ群の種類を判別し、マイクロアレイ全体の検出結果を構成していくことを特徴とする。
【００１３】
この様な発明によれば、基板上の複数のプローブ全体を観察することなく一部のブロックのみを観察した場合でも、観察しているブロックに属するプローブが全体のどの部分であるのかを特定でき、所望のプローブの測定を迅速かつ高精細に行うことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ブロックごとの観察であっても、該ブロックがマイクロアレイ上のどの位置に対応するものなのかを把握することが可能になった。これにより、マイクロアレイ上の細部を拡大して観察することが必要な場合でも、標的物質を簡便に、信頼性良く検出することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明を図面を用いて詳細に説明する。
【００１６】
図１は基板上に多種のプローブをスポット状に結合させたプローブアレイの構成図である。複数個プローブとマーカー物質のスポットの一群がブロックとしてまとめられ、それが基板上に図のように並んでいる。101はプローブのスポット、102はグリッドマーカーのスポットであって、該プローブのスポット101のグリッド位置を特定可能な様に配置されている。103が本発明によるアドレスマーカーであり、ブロックごとに異なる配置をとることによって、ブロックのみの観察からでも、該ブロックが基板内のどの位置にあるものかを特定できるようになっている。103の位置は、102とは別にその周囲に配置されるものや、102の中に埋め込まれるようなものが可能である。
【００１７】
アドレスマーカーのスポット103は、プローブのスポット101やグリッドマーカースポット102と同様に、例えばマーカー物質を含む液体を基板上に、インクジェット法を用いて付与することによって形成可能である。これら各スポットのインクジェット法による形勢を同一の工程で行うことで、プローブのスポット101の行または列と、グリッドマーカー102、アドレスマーカー103の間での位置ずれが生じることを防ぐことができ、好ましい。
【００１８】
アドレスマーカーとして用いられる物質としては、グリッドマーカーとして用いられる物質と同様、基板上に付与せしめた状態で検出可能な情報（例えば蛍光等）を発するのもであれば特に限定されるものでない。このため、ＰＣＴ公開公報00/270896で述べられているように、フルオレセイン、ローダミンB、テトラメチルローダミン、ローダミンX、テキサスレッド、Cy5などの蛍光色素に、基板上に付着可能なように、基板表面との各々に互いに反応性の高い官能基を導入しておくことが好ましい。
【００１９】
また、マイクロアレイを核酸プローブを用いて構成する場合には、アドレスマーカー物質としてプローブの中の一種を用いることも可能である。但しこの場合には、標的とするサンプル内に必ずそのプローブと反応する核酸が含まれているような、いわゆるポジティブコントロールとなるプローブを用いる必要がある。
【００２０】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
【００２１】
実施例１、２で示すようなアドレスマーカー配置をもつ基板を特開平11-187900号公報に記載の方法に準じて作製した。
（１）基板洗浄
1x3インチ角で厚さが1mmの合成石英基板をラックにいれ、純水で軽くすすぎスピンドライによって乾燥させた後、5分間のUV洗浄を行った。その後洗剤中で2分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水中で再び超音波洗浄を2分間行った。
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、N-β-（アミノエチル）-γ-アミノプロピルトリメトキシシラン  KBM603（信越化学工業）の0.1％水溶液を室温下で20分攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。ついでこの溶液を上記（1）で得た基板にスピンコート法により湿布したのち、150℃に加熱したオーブン中で一時間ベークして、最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００２２】
ついでN-マレイミドカプロイオキシスクシニミド（EMCS）1.5mgをヂオキサン１５mLに溶解し、（2）で得た基板にスピンコート法により湿布した。この段階で、シランカップリング剤によって基板表面に担持されているアミノ基とEMCS溶液のスクシイミド基が反応し、基板表面にはEMCS由来のマレイミド基が存在することになる。
（３）核酸プローブDNAの合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して配列番号：１の一本鎖核酸を合成した。
配列番号：１
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACT-GGC-CGT-CGT-TTT-ACA  3'
これらのDNAの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ社）を用いる事によってチオール（SH）基を導入した。なお、脱保護、DNAの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
【００２３】
またマーカーとしては、グリッドマーカー、アドレスマーカー両者とも、テトラメチルローダミン（テトラメチルローダミン  タダベリン  化合物IV  フナコシ薬品株式会社）に、公開公報00/270896に記載の方法でチオール基を導入したものを用いた。
（４）インクジェット方式によるDNA及びマーカーの吐出  および基板への結合
上記配列の一本鎖DNAを8μMの濃度でグリセリン15.0wt％、尿素15.0wt％、ジエチレングリコール9.0wt％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールEH;川研ファインケミカル（株）社製）0.01wt％を含む溶液のそれぞれ溶解した。マーカーに関しても、DNAと同様に上記の成分をもつクリアインクに溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたプリンター(商品名：BJF-850；キヤノン社製)用のプリンターヘッド（商品名：BC-50；キヤノン社製）を数100μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドの改造タンク部に上記DNA溶液を注入した。吐出描画機に（3）で作製した基板を装着し、ここにDNA溶液をスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は4pl/dropletで、スポッティングの範囲は基板の中央部に10mmx10mmの範囲に200dpiすなわち127μmのピッチで吐出した。この条件では、スポッティングされたドットの直径は約50μmであった。
【００２４】
スポッティング終了後、基板を30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を50ｍMリン酸緩衝液（10mMリン酸緩衝液  pH=7.0、100ｍM  NaClを含む）中で保存した。
（５）ハイブリダイゼーション
次に、塩基配列1と相補的な配列をもち、かつ5‘末端にローダミン標識が施された塩基配列2を、（4）で作製した基板とハイブリダイゼーションを行った。
配列番号：2
5'  (Rho)-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT 3'
ハイブリダイゼーションは標的DNA（配列２）を５ｎMの濃度で含む上記緩衝液を用い、Genomic  Solutions社のハイブリダイゼーション装置を用いて行った。ハイブリのプロトコルは以下に示すとおりである。
1.  O-ring Set       :  65℃  3分
2.  Introduce Probe  :  45℃
3.  Hybridization    :  45℃  2時間
4.  Wash1            :  45℃  flow 30秒、hold 10秒、3 cycle、source 1
5.  Wash2            :  45℃   flow 20秒、hold 10秒、3 cycle、source 2
6.  Last Wash3       :  25℃   flow 20秒、hold 10秒、2 cycle、source 3
7.  Drain slides     :          2分
ここで、洗浄工程（Wash1,2,3）で用いられた洗浄液は以下のとおりである。
【００２５】
Wash1：  2 x SSC, 0.1% SDS
Wash2：  0.1 x SSC, 0.1% SDS
Wash3：  0.1 x SSC
20xSSC：0.3Mクエン酸三ナトリウム＋3.0M塩化ナトリウム
SDS：ドデシル硫酸ナトリウム
（６）蛍光観察
ハイブリダイゼーション終了後、基板を装置からとりはずし、超純水で軽く洗浄したのち、スピンドライによって乾燥した。その後、ツァイス社製の共焦点型顕微鏡LSM510を用いて観察した。この際励起レーザーはヘリウムネオンレーザーで波長543nmを用いた。
観察倍率はFluar10xの対物レンズを使用し、一つのブロックごとに、4x4のタイル処理をして画像を得た。
【実施例１】
【００２６】
グリッドマーカー外部に独立してアドレスマーカーを配置する。
【００２７】
図２に示すように、アドレスマーカーを、グリッドマーカーのスポットの右横部分に配置した。このとき104は行番号を表し、105は列番号を表している。それ以外のスポットは図１と同様にプローブとグリッドマーカーのスポットを示している。図2において、全プローブは16個のブロックが4行4列に配置されているため、アドレスマーカーは行、列それぞれ1,2,3,4の位置を示している。このとき、アドレスマーカーの位置は、グリッドマーカーの下部から1,2,3,4の位置にあわせてあり、グリッドマーカーを参照して、アドレスマーカーの値を読み取っている。
【実施例２】
【００２８】
グリッドマーカーに埋め込んでアドレスマーカーを配置する。
【００２９】
図３に示すように、グリッドマーカーの一部をアドレスマーカーとして利用することも可能である。図３では、グリッドマーカー左中央部分の８スポット（106）を利用し、左下４スポットは行に関する、その上４スポットは列に関する情報を付加している。具体的には、一行目にあるブロックの場合には、4スポットのうち1つ目のスポットが抜けていて、4行目にあるブロックの場合には、4つ目のスポットが抜けている。列に関しても同様である。
【００３０】
グリッドマーカーへのアドレス情報の付加に関しては、グリッドのスポットを2ビット（スポットの有無）として扱うことができるため、その方法は多数考えられる。
【００３１】
この方法は、実施例１に比べてスペースを削減できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】基板上のプローブ群（ブロック）とそれを構成するプローブ、アドレスマーカー等の配置。
【図２】実施例１のアドレスマーカー構成図。
【図３】実施例2のアドレスマーカー構成図。
【符号の説明】
【００３３】
１０１  プローブスポット
１０２  グリッドマーカースポット
１０３，１０４，１０５，１０６  アドレスマーカースポット
【図１】
2005164546.tif 000003
【図２】
2005164546.tif 000004
【図３】
2005164546.tif 000005
【配列表】
2005164546000001.app