(57)【要約】【課題】本発明は従来技術の課題を背景になされたもので、微生物を宿主細胞として使用し、可溶性蛋白質として酵素活性を有するシステインジオキシゲナーゼを取得することを目的とするものである。【解決手段】糖結合性蛋白質、ＨｉｓタグおよびＤｎａＫのうちいずれかより選ばれたタグ部分と、ヒトまたはマウスのいずれかに由来するシステインジオキシゲナーゼ部分を含む融合蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を担持するベクター、該ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体を用いる融合蛋白質の製造方法、および、該融合蛋白質の安定化方法。  【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ部分とシステインジオキシゲナーゼ部分を含む融合蛋白質。
【請求項２】
タグ部分が糖結合性蛋白質、ＨｉｓタグおよびＤｎａＫのうちいずれかより選ばれたものである請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
システインジオキシゲナーゼ部分がヒトまたはマウスのいずれかに由来する請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
システインジオキシゲナーゼ部分が完全にヒト由来である請求項１〜３のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項５】
システインジオキシゲナーゼ部分のアミノ酸配列が、
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列、または、
（ｂ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシステインジオキシゲナーゼ活性を有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項６】
糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質（ＭＢＰ）である請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項７】
ＭＢＰとシステインジオキシゲナーゼ部分の間にプロテアーゼ耐性配列が介在している請求項〜６に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項９】
システインジオキシゲナーゼ部分の遺伝子配列が、
（ａ）配列表・配列番号８に記載された塩基配列、または、
（ｂ）配列表・配列番号８に記載された塩基配列（ａ）において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつシステインジオキシゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の遺伝子を担持してなるベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターが微生物に導入されてなる形質転換体。
【請求項１２】
微生物が大腸菌である請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
大腸菌がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の形質転換体を培養することにより、得られる培養液から融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質を採取することを特徴とする融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
プロテアーゼの影響を低減させることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の融合蛋白質の安定化方法。
【請求項１６】
プロテアーゼ阻害剤を共存させることを特徴とする、請求項１５に記載の融合蛋白質の安定化方法。
【請求項１７】
プロテアーゼ阻害剤がＰＭＳＦであることを特徴とする請求項１６記載の安定化方法。
【請求項１８】
融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質にプロテアーゼ阻害剤を共存させ、更に弱アルカリ性のｐＨで保持することを特徴とする請求項１５記載の安定化方法。
【請求項１９】
ｐＨ８．５で保持することを特徴とする請求項１８記載の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システインを酸化してＬ−システインスルフィン酸を生成する反応を触媒する酵素であるシステインジオキシゲナーゼを安価に、効率よく生産する方法に関する。詳細には、大腸菌体内でシステインジオキシゲナーゼを融合タンパク質として製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
システインジオキシゲナーゼは、システイン分解の主要経路の第一段階であるＬ−システインのチオール基を酸化してＬ−システインスルフィン酸を生成する反応を触媒する酵素であり、哺乳動物を始めとして多くの動物に分布している。また、ラット肝臓、ヒトの肝臓を由来とするシステインジオキシゲナーゼのｃＤＮＡ配列がそれぞれ明らかとなっている（特許文献１，２参照）。その一方で、微生物を宿主として用いた組換え型酵素の発現に関してはこれまで報告されていない。
【特許文献１】特開平３−２７２６８８
【特許文献２】特開平４−１３１０８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は従来技術の課題を背景になされたもので、微生物を宿主細胞として使用し、可溶性蛋白質として酵素活性を有するシステインジオキシゲナーゼを取得することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、遂に本発明を完成するに到った。即ち本発明は
項１．  タグ部分とシステインジオキシゲナーゼ部分を含む融合蛋白質。
項２．  タグ部分が糖結合性蛋白質、ＨｉｓタグおよびＤｎａＫのうちいずれかより選ばれたものである、項１記載の融合蛋白質。
項３．  システインジオキシゲナーゼ部分がヒトまたはマウスのいずれかに由来する、項１または２に記載の融合蛋白質。
項４．  システインジオキシゲナーゼ部分が完全にヒト由来である、項１〜３のいずれかに記載の融合蛋白質。
項５．  システインジオキシゲナーゼ部分のアミノ酸配列が、
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列、または、
（ｂ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシステインジオキシゲナーゼ活性を有するものである、項１〜４のいずれかに記載の融合蛋白質。
項６．  糖結合性蛋白質がマルトース結合性蛋白質（ＭＢＰ）である、項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質。
項７．  ＭＢＰとシステインジオキシゲナーゼ部分の間にプロテアーゼ耐性配列が介在している、項１〜６に記載の融合蛋白質。
項８．  項１〜７のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子。
項９．  システインジオキシゲナーゼ部分の遺伝子配列が、
（ａ）配列表・配列番号８に記載された塩基配列、または、
（ｂ）配列表・配列番号８に記載された塩基配列（ａ）において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつシステインジオキシゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
項１０．  項８又は９に記載の遺伝子を担持してなるベクター。
項１１．  項１０記載のベクターが微生物に導入されてなる形質転換体。
項１２．  微生物が大腸菌である、項１１記載の形質転換体。
項１３．  大腸菌がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９であることを特徴とする、項１２記載の形質転換体。
項１４．  項１１〜１３のいずれかに記載の形質転換体を培養することにより、得られる培養液から融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質を採取することを特徴とする融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質の製造方法。
項１５．プロテアーゼの影響を低減させることを特徴とする、項１〜７のいずれかに記載の融合蛋白質の安定化方法。
項１６．プロテアーゼ阻害剤を共存させることを特徴とする、項１５に記載の融合蛋白質の安定化方法。
項１７．プロテアーゼ阻害剤がＰＭＳＦであることを特徴とする、項１６記載の安定化方法。
項１８．融合化されたシステインジオキシゲナーゼ蛋白質にプロテアーゼ阻害剤を共存させ、更に弱アルカリ性のｐＨで保持することを特徴とする、項１５記載の安定化方法。
項１９．ｐＨ８．５で保持することを特徴とする、項１８記載の安定化方法
である。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によるシステインジオキシゲナーゼを用いてＬ−システインの定量または、システインの消去等に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のシステインジオキシゲナーゼの製造方法は、システインジオキシゲナーゼをＭＢＰまたはＨｉｓタグまたはＤｎａＫとの融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、システインジオキシゲナーゼを可溶性タンパク質として活性を持った状態で生成させるのを可能にしたことを特徴とする。
【０００７】
本発明において、システインジオキシゲナーゼとの融合タンパク質（ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼ、システインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグ、システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫ）は、融合タンパク質の状態においてシステインジオキシゲナーゼが本来の酵素活性を有するものである。
【０００８】
本発明において、システインジオキシゲナーゼとの融合蛋白質として発現させるに際しては、様々なタグが使用可能である。タグとしては、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴ（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰ（タンデムアフィニティーピュリフィケーション）タグなど、どのタグを採用しても良く、必要に応じて任意のタンパク質を融合して用いても良い。
【０００９】
本発明の方法において、ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは、ＭＢＰをコードするＤＮＡとシステインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写・翻訳されるように−すなわちインフレームに（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）−連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。また、Ｈｉｓタグ、ＤｎａＫについても同様である。
【００１０】
本発明において、システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはマウス由来、さらに好ましくはヒト由来である。
【００１１】
システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、公知のシステインジオキシゲナーゼ遺伝子配列［例えば、ヒトシステインジオキシゲナーゼ  ｃＤＮＡ（特許文献２，上述）の配列等］に基づいて、自体公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のシステインジオキシゲナーゼ遺伝子配列をもとに、システインジオキシゲナーゼのコード領域の全部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、システインジオキシゲナーゼを発現する細胞または組織から抽出した全ＲＮＡもしくはポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後のベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
【００１２】
あるいは、公知のシステインジオキシゲナーゼ遺伝子配列をもとに適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてシステインジオキシゲナーゼを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００１３】
さらに、システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたシステインジオキシゲナーゼの全部または一部を抗原として常法により抗体を作製し、これを用いてシステインジオキシゲナーゼを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
【００１４】
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のシステインジオキシゲナーゼ遺伝子配列をもとにＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
【００１５】
本発明の好ましい態様においては、システインジオキシゲナーゼ  をコードするＤＮＡは、ヒト肝臓由来システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡの全部を含むものである。
【００１６】
本発明において、ＭＢＰをコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。  また、該ＤＮＡは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
【００１７】
大腸菌由来のＭＢＰはペリプラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナルコドン）を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを含む場合であっても、発現したＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。
【００１８】
本発明でいう特異的プロテアーゼ耐性配列とは、血液凝固因子Ｘａ、トロンビン、エンテロキナーゼ、あるいは臓器抽出物などに存在する比較的特異性の低いプロテアーゼの影響を受けないような配列をいう。特異的プロテアーゼの認識配列を考慮し、アルギニン、リジンなどの塩基性アミノ酸、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、プロリンなどを一般的なアミノ酸配列と比較して減じたものであればよい。したがって、連結部に例えばグリシン−セリンの繰り返し配列、あるいはグルタミン酸とアスパラギン酸の組み合せ配列などを使用することができる。これらの配列は糖結合性タンパク質とシステインジオキシゲナーゼタンパク質が立体障害的に配置しないようまた十分な発現量が確保できるよう留意されておれば、他に制限は無い。
【００１９】
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列［例えば、大腸菌由来ＭＢＰ（Ｄｕｐｌａｙ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９：  １０６０６−１０６１３  （１９８４））等］をもとに、システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ耐性配列およびスペーサー配列を導入することができる。また、大腸菌由来ＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製のｐＭＡＬ−ｐ２（シグナルコドンを含む）あるいはｐＭＡＬ−ｃ２（シグナルコドンを欠失する）のような市販のベクターから得ることができる。一方で、上記ｐＭＡＬ−ｐ２やｐＭＡＬ−ｃ２のような市販のベクターにシステインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、更に、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン製）を用いてＭＢＰのＣ末端側にあるプロテアーゼ認識配列をプロテアーゼ耐性配列に置換することができる。
【００２０】
ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、ＭＢＰをコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、システインジオキシゲナーゼのＮ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、ＭＢＰをコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００２１】
本発明の発現ベクターは、上記のＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼをコードするキメラＤＮＡが大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【００２２】
本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、Ｍ１３  ｏｒｉ等が挙げられる。
【００２３】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００２４】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００２５】
発現ベクターの宿主細胞への導入は，  従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ  らの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９：  ２１１０  （１９７２）］  、プロトプラスト法  ［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８：  １１１  （１９７９）］、コンピテント法  ［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５６：  ２０９  （１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２６】
ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは、上記のＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物からＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを回収することにより得ることができる。
【００２７】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，バクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など〕を培地中に添加してもよい。
【００２８】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００２９】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００３０】
ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．８〜１．２になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加濃度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
【００３１】
ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、マルトース残基を含むリガンドを結合した不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付すことにより、一段階で達成することができる。ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを欠失している場合、ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティークロマトグラフィーに用いる。一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを有する場合、発現したＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは分泌されてペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティークロマトグラフィーに用いる。
【００３２】
アフィニティークロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製のＡｍｙｌｏｓｅ  ｒｅｓｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンドおよび他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリマー等）を使用してもよい。ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度のマルトースを含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填してＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼ含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度のマルトースを含む溶離液をアプライしてカラムに吸着したＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを溶出させることによって得ることもできる。
【００３３】
上記のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いない場合でも、ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを精製することができる。培養菌体からの抽出液を例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、により、精製されたＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを得ることができる。
【００３４】
精製されたＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼは、プロテアーゼ耐性配列を介して連結された構造をとるが、１００％プロテアーゼの影響を回避できるわけではない。融合蛋白質を安定化するために以下の方法で安定化することができる。
【００３５】
例えば、ＰＭＳＦ，ＥＤＴＡ，ロイペプチン，ペプスタチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することにより安定化することができ、その添加濃度はプロテアーゼ活性を阻害できる濃度範囲で添加すればよく特に限定されるものではない。また、プロテアーゼ阻害剤を組み合わせることによって更に安定化することも可能である。
【００３６】
一方で、精製されたＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼをアルカリ性側のｐＨ溶液中で保存することにより融合蛋白質を安定化することができる。より好ましくは弱アルカリ性のｐＨで保存することが望ましい。これは、弱アルカリ性のｐＨにシフトさせることにより、プロテアーゼが作用するｐＨ範囲から外れ、融合蛋白質の分解が抑制されるためと推測される。
【００３７】
本発明において、Ｈｉｓタグとシステインジオキシゲナーゼとの融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築は以下の方法によって構築することが可能である。
【００３８】
ＱＩＡＧＥＮ社製のｐＱＥ−３０（Ｎ末端にＨｉｓタグが付加されるベクター）やｐＱＥ−６０（Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるベクター）のマルチクローニングサイトに、システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることによりＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼ融合蛋白質あるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグ融合蛋白質を発現するための発現ベクターを構築できる。
【００３９】
本発明の発現ベクターは、上記のＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−ＨｉｓタグをコードするキメラＤＮＡが大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−ＨｉｓタグをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【００４０】
本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、Ｍ１３  ｏｒｉ等が挙げられる。
【００４１】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００４２】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００４３】
発現ベクターの宿主細胞への導入は，  従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ  らの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９：  ２１１０  （１９７２）］  、プロトプラスト法  ［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８：  １１１  （１９７９）］、コンピテント法  ［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５６：  ２０９  （１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４４】
Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグは、上記のＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−ＨｉｓタグをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物からＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグを回収することにより得ることができる。
【００４５】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，バクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など〕を培地中に添加してもよい。
【００４６】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００４７】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００４８】
Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．８〜１．２になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加濃度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
【００４９】
Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーに付すことにより、一段階で達成することができる。培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティークロマトグラフィーに用いる。
【００５０】
金属キレートアフィニティークロマトグラフィーには例えば、ＱＩＡＧＥＮ社製のＮｉ−ＮＴＡ  ＡｇａｒｏｓｅやＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗを使用することができる。Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度のイミダゾールを含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填してＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグ含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度のイミダゾールを含む溶離液をアプライしてカラムに吸着したＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグを溶出させることによって得ることもできる。
【００５１】
上記のようなアフィニティークロマトグラフィーに用いない場合でも、Ｈｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグを精製することができる。培養菌体からの抽出液を例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、により、精製されたＨｉｓタグ−システインジオキシゲナーゼあるいはシステインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグを得ることができる。
【００５２】
本発明において、ＤｎａＫとシステインジオキシゲナーゼとの融合蛋白質を発現するための発現ベクターの構築は以下の方法によって構築することが可能である。
【００５３】
本発明において、ＤｎａＫをコードするＤＮＡは、好ましくは大腸菌由来である。また、該ＤＮＡは、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
【００５４】
ＤｎａＫとシステインジオキシゲナーゼを連結するに際して、スペーサー配列を挿入することが望ましい。ＤｎａＫタンパク質とシステインジオキシゲナーゼタンパク質が立体障害的に配置しないようまた十分な発現量が確保できるよう留意されておればよく、その鎖長、配列に関しては他に制限は無い。
【００５５】
ＤｎａＫをコードするＤＮＡは、公知のＤｎａＫ遺伝子配列をもとに、システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＤｎａＫのＮ末端側に上記のスペーサー配列を導入することができる。
【００５６】
システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、ＤｎａＫをコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。システインジオキシゲナーゼをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、システインジオキシゲナーゼのＣ末端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、ＤｎａＫをコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
【００５７】
本発明の発現ベクターは、上記のシステインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫをコードするキメラＤＮＡが大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【００５８】
本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、Ｍ１３  ｏｒｉ等が挙げられる。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
【００６０】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
【００６１】
発現ベクターの宿主細胞への導入は，  従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎ  らの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９：  ２１１０  （１９７２）］  、プロトプラスト法  ［Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １６８：  １１１  （１９７９）］、コンピテント法  ［Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５６：  ２０９  （１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００６２】
システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫは、上記のシステインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物からシステインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫを回収することにより得ることができる。
【００６３】
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，バクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など〕を培地中に添加してもよい。
【００６４】
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
【００６５】
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた種培養を大型タンク中に接種するのが好ましい。
【００６６】
システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．８〜１．２になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加濃度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
【００６７】
システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫは、常法により精製することができる。培養菌体からの抽出液を例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、により、精製されたシステインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫを得ることができる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００６９】
実施例１  システインジオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
システインジオキシゲナーゼ遺伝子はインビトロジェン社から市販されているｃＤＮＡライブラリー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号１および２に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよびｃＤＮＡ  １μｌとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIにて消化し、ｐＭａｌ−ｃ２ｅ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへＴ４ライゲース（東洋紡績製）を用いて連結し、コンピテントなエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（東洋紡績製）に４２℃、４５秒間で形質転換した。
形質転換後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に撒き、３７℃にて終夜静置した。生じたコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管）に接種し、３０℃で終夜培養した。終夜培養した培養液１００μＬを、０．２％のグルコース、１０ｍＭのＬ−システイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１００ｍｌ仕込み／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に植え継ぎ、約４時間、３０℃にて培養した。ＯＤ６６０ｎｍでの吸光度が０．８〜１．２の間にあることを確認した後、１００ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）１００μＬを加え、３０℃で４時間誘導培養した。この培養菌体よりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により目的の配列が挿入されていることを確認した。取得したプラスミドをｐＭａｌＣＤＯ１と命名した。
【００７０】
実施例２  システインジオキシゲナーゼ活性の確認
上記培養液から菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この粗酵素液を用いて下記活性測定方法に従い、システインジオキシゲナーゼの活性を確認した。０．２Ｕ／ｍｌのシステインジオキシゲナーゼ活性を確認した。
【００７１】
システインジオキシゲナーゼ活性の測定方法
測定原理
Ｌ−システイン  ＋  酸素  →  システインスルフィン酸  （ＣＤＯ）
システインスルフィン酸  ＋  α−ケトグルタル酸  →  グルタミン酸  ＋  スルフィニルピルビン酸  （ＧＯＴ）
スルフィニルピルビン酸  ＋  ＮＡＤＨ  →  スルフィニル乳酸  ＋  ＮＡＤ＋      （ＬＤＨ）
ＣＤＯ：システインジオキシゲナーゼ、ＧＯＴ：グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ＬＤＨ：Ｌ−乳酸脱水素酵素
ＮＡＤＨの減少量を３４０ｎｍの吸光度変化で測定した。
単位の定義
１単位（Ｕ）は、以下に記載の条件下で１分当たり１マイクロモルのＮＡＤＨが酸化されるＣＤＯの酵素量をいう。
【００７２】
（試薬の調製）
下記組成からなる測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５
０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ
３００Ｕ／ｍｌ  ＬＤＨ（東洋紡社製ＬＣＤ−２０９）
６０Ｕ／ｍｌ  ＧＯＴ（和光社製）
第二試薬
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５
１０ｍＭ  Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎ
酵素希釈液
２０ｍＭ  イミダゾール−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ６．５
【００７３】
（測定法）
日立７０６０型自動分析機を用いた。試料４μｌに第一試薬２００μｌ添加し３７℃にて約８０秒間インキュベートションし第一反応とした。その後第二試薬を２００μｌ添加し約１２０秒間インキュベーションし第二反応とした。測定開始後１１９．５３秒後と１９９．２１秒後の吸光度を測定し、一分間当りの吸光度変化量を算出した。
活性値の算出は、下記式に従い求めた。
（計算）
Ｕ／ｍｌ＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤテスト−  ΔＯＤブランク）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（６．２２×Ｖｓ）
Ｖｔ：総体積（０．４０４ｍｌ）
Ｖｓ：サンプル体積（０．００４ｍｌ）
６．２２：ＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数
ｄｆ：希釈係数
【００７４】
実施例３  プロテアーゼ耐性配列への置換
実施例１で取得したプラスミドｐＭａｌＣＤＯ１を鋳型ＤＮＡとした。配列番号３及び配列番号４の合成オリゴヌクレオチドとＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン製）を用いて、ＭＢＰとシステインジオキシゲナーゼとの連結部分のリジン残基をグルタミン酸残基に変更し、特異的プロテアーゼ（エンテロキナーゼだけでなく、トリプシンなどのプロテアーゼ）の標的となりうる配列を消滅させた。反応条件などはキットのプロトコール記載の方法に従って実施し、変異を導入した発現ベクターを担持したシングルコロニーを取得した。得られたシングルコロニーを実施例１、２に準じて培養、粗酵素を抽出し酵素活性を確認したところ、０．１９Ｕ／ｍｌの活性が確認された。また、培養液からプラスミドを抽出してシークエンスを実施したところ、目的とする変異が導入されていることを確認した。取得したプラスミドをｐＭａｌＣＤＯ２と命名した。
【００７５】
実施例４  ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの精製
実施例３で得られたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管）に接種し、３０℃で終夜培養した。終夜培養した培養液全量を、０．２％のグルコース、１０ｍＭのＬ−システイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５００ｍｌ仕込み／２Ｌ−坂口フラスコ）に植え継ぎ、約４時間、３０℃にて通気攪拌培養した。ＯＤ６６０ｎｍでの吸光度が０．８〜１．２の間にあることを確認した後、１００ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）５００μＬを加え、３０℃で４時間誘導培養した。上記菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液をＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ（アマシャム−ファルマシア）イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。次いで終濃度が１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加した。次にＨｉＴｒａｐ−Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ（アマシャム−ファルマシア）疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーにより分離・精製した。最後に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に置換して精製酵素標品を得た。本方法により得られた標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示した。
【００７６】
実施例５  ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの安定性確認
実施例４で得られた精製酵素を４℃一週間保存した。保存前の酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した写真を図１に示す。精製酵素は、ほぼ単一なバンドを示している。また、一週間保存後の酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した写真を図２に示す。図１と同分子量付近にあるバンドのほかに、分子量の低い部分に主に２本バンドが観察される。この２本の低分子量のバンドは元の蛋白質がプロテアーゼにより分解されてできた分解産物と考えられる。
【００７７】
実施例６  ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの安定化−１
実施例４で得られた精製酵素に終濃度が０．１ｍＭになるようにＰＭＳＦを添加して４℃一週間保存後の酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した写真を図３に示す。図２と図３の比較から、図３の方が分子量の低い部分にみられるバンドが薄くなっており、ＰＭＳＦの添加によるＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの安定化効果が認められる。
【００７８】
実施例７  ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼの安定化−２
実施例４で得られた精製酵素に終濃度が０．１ｍＭになるようにＰＭＳＦを添加後、ｐＨを８．５に調整した後、４℃一週間保存後の酵素液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した写真を図４に示す。図２、図３及び図４の比較から、図４では分子量の低い部分のバンドが消滅していることから、ＰＭＳＦの添加に加えて弱アルカリ性のｐＨ溶液で保存することによりＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼが更に安定化されたことが認められる。
【００７９】
実施例８  システインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグの調製
システインジオキシゲナーゼ遺伝子はインビトロジェン社から市販されているｃＤＮＡライブラリー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号５および６に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよびｃＤＮＡ  １μｌとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、ｐＱＥ−６０  （ＱＩＡＧＥＮ社製）のＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩサイトへＴ４ライゲース（東洋紡績製）を用いて連結し、コンピテントなエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（東洋紡績製）に４２℃、４５秒間で形質転換した。
形質転換後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に撒き、３７℃にて終夜静置した。生じたコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管）に接種し、３０℃で終夜培養した。終夜培養した培養液１００μＬを、０．２％のグルコース、１０ｍＭのＬ−システイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１００ｍｌ仕込み／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に植え継ぎ、約４時間、３０℃にて培養した。ＯＤ６６０ｎｍでの吸光度が０．８〜１．２の間にあることを確認した後、１００ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）１００μＬを加え、３０℃で４時間誘導培養した。この培養菌体よりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により目的の配列が挿入されていることを確認した。取得したプラスミドをｐＱＥ−ＣＤＯと命名した。
【００８０】
実施例９  システインジオキシゲナーゼ活性（システインジオキシゲナーゼ−Ｈｉｓタグ）の確認
上記培養液から菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この粗酵素液を用いて下記活性測定方法に従い、システインジオキシゲナーゼの活性を確認した。０．１６Ｕ／ｍｌのシステインジオキシゲナーゼ活性を確認した。
【００８１】
実施例１０  システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫの調製
システインジオキシゲナーゼ遺伝子はインビトロジェン社から市販されているｃＤＮＡライブラリー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号７および８に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよびｃＤＮＡ  １μｌとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。ＤｎａＫ遺伝子は大腸菌Ｋ−１２株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。具体的には、ＤｎａＫ全長ではなく３８４番目のグリシンから６３８番目のリジンまでのフラグメントを増幅した。増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号９および１０に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよび大腸菌ＤＮＡ  １００ｎｇとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。次いで、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号７および１０に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよび両増幅産物各１μｌを加えて反応液を調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。こうして、システインジオキシゲナーゼとＤｎａＫとのキメラ遺伝子を調製した。
増幅したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（東洋紡製）のＨｉｎｃIIサイトへＴ４ライゲース（東洋紡績製）を用いて連結し、コンピテントなエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（東洋紡績製）に４２℃、４５秒間で形質転換した。
形質転換後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に撒き、３７℃にて終夜静置した。生じたコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管）に接種し、３０℃で終夜培養した。終夜培養した培養液１００μＬを、０．２％のグルコース、１０ｍＭのＬ−システイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１００ｍｌ仕込み／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に植え継ぎ、約４時間、３０℃にて培養した。ＯＤ６６０ｎｍでの吸光度が０．８〜１．２の間にあることを確認した後、１００ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）１００μＬを加え、３０℃で４時間誘導培養した。この培養菌体よりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により目的の配列が挿入されていることを確認した。取得したプラスミドをｐＣＤＯ−ＤｎａＫと命名した。
【００８２】
実施例１１  システインジオキシゲナーゼ活性（システインジオキシゲナーゼ−ＤｎａＫ）の確認
上記培養液から菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この粗酵素液を用いて下記活性測定方法に従い、システインジオキシゲナーゼの活性を確認した。０．１５Ｕ／ｍｌのシステインジオキシゲナーゼ活性を確認した。
比較例  システインジオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング（ｎａｔｉｖｅ）
システインジオキシゲナーゼ遺伝子はインビトロジェン社から市販されているｃＤＮＡライブラリー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ）を鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号１および２に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよびｃＤＮＡ  １μｌとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIにて消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIIIサイトへＴ４ライゲース（東洋紡績製）を用いて連結し、コンピテントなエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（東洋紡績製）に４２℃、４５秒間で形質転換した。
形質転換後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に撒き、３７℃にて終夜静置した。生じたコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管）に接種し、３０℃で終夜培養した。終夜培養した培養液１００μＬを、０．２％のグルコース、１０ｍＭのＬ−システイン、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（１００ｍｌ仕込み／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に植え継ぎ、約４時間、３０℃にて培養した。ＯＤ６６０ｎｍでの吸光度が０．８〜１．２の間にあることを確認した後、１００ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ：ナカライテスク製）１００μＬを加え、３０℃で４時間誘導培養した。この培養菌体よりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により目的の配列が挿入されていることを確認した。取得したプラスミドをｐＣＤＯと命名した。
上記培養液から菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した後、超音波処理により破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。この粗酵素液を用いて実施例２に記載の方法で、システインジオキシゲナーゼの活性を確認したが、システインジオキシゲナーゼ活性は検出できなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の融合化されたシステインジオキシゲナーゼは、Ｌ−システインの定量に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】精製ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ（コード番号１７−０４４６−０１）を用いた。
【図２】精製ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼを４℃、１週間保存した溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ（コード番号１７−０４４６−０１）を用いた。
【図３】精製ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼに終濃度０．１ｍＭのＰＭＳＦを添加後４℃、１週間保存した溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ（コード番号１７−０４４６−０１）を用いた。
【図４】精製ＭＢＰ−システインジオキシゲナーゼに終濃度０．１ｍＭのＰＭＳＦを添加し、溶液のｐＨを８．５に調製した後４℃、１週間保存した溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製ＬＭＷ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ（コード番号１７−０４４６−０１）を用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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