(57)【要約】【課題】  非特異吸着を抑制した固体基板の製造方法、特に、非特異吸着を制御した表面プラズモン共鳴分析などに使用するセンサー用基板の製造方法を提供すること。【解決手段】  固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる工程を含む、センサー用固体基板の製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる工程を含む、センサー用固体基板の製造方法。
【請求項２】
得られた固体基板を表面修飾する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液が、前記ポリマーの良溶剤と貧溶剤とを含む混合液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液の液温が、前記混合液を前記疎水性ポリマー溶液と同じ疎水性ポリマー濃度とした場合に疎水性ポリマー沈殿物を発生させない下限液温に対して、１℃以上５０℃以下高い液温である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
疎水性ポリマー溶液の溶剤と、ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液の溶剤とが同一の有機溶剤組成である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記表面修飾が、共有結合を生成することのできる官能基を導入する表面修飾である、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
疎水性ポリマー溶液に接触させる固体基板が、金属表面あるいは金属膜でコーティングされている固体基板である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
センサー用固体基板が、表面プラズモン共鳴分析に使用される基板である、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８の何れかに記載の方法によりセンサー用固体基板を製造する工程、及び得られたセンサー用固体基板の表面に生理活性物質を接触させて固定化する工程を含む、生理活性物質が表面に結合したセンサー用固体基板の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から８の何れかに記載の方法によりセンサー用固体基板を製造する工程、得られたセンサー用固体基板の表面に生理活性物質を接触させて固定化する工程、及び得られた生理活性物質が表面に結合したセンサー用固体基板と被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体基板の製造方法に関する。より詳細には本発明は、センサー用固体基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生体関連物質に不活性な薄膜、さらに生理活性物質を固定化できる官能基からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と生体関連物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
上記の技術においては、基板または粒子の表面上に生理活性物質を固定化して、生理活性物質と検体物質間の特異認識反応を行わせることで生体関連物質を検出する。一方、検体物質は必ずしも単一成分ではなく、例えば細胞抽出液中などのような不均一系で検体物質を測定することも要求される。その場合、種々の蛋白質、脂質などの夾雑物が検出表面に非特異的な吸着を起こすと、測定検出感度が著しく低下する。上記の検出表面では、非特異吸着が極めて起こりやすく問題があった。
【０００６】
基板の検出表面への非特異吸着を抑制するため、いくつかの方法が検討されている。例えば、金属表面に自己組織化分子の膜を形成し、物理吸着を抑制する方法も使用されてきた（特許文献１を参照）。しかしながら、この方法は膜のピンホール発生、自己組織化分子の脱離の問題がある。
【０００７】
生体関連物質に不活性な疎水性ポリマー薄膜をセンサー基板表面に形成することでも、前記非特異吸着を抑制することができる。センサー基板上に疎水性ポリマー薄膜を形成する方法としては、従来、スピン塗布、エアナイフ塗布、キャスト塗布スプレー塗布などでポリマー溶液を基板上に塗布し、溶媒を乾燥除去する方法が行われてきたが、乾燥時に薄膜にピンホールや厚みの不均一が発生し易い問題があった。また、塗布ムラを発生させないために基板表面を平板にする制約があった。金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜が報告されているが、モノマー原料は塗布されるため、前述と同様の問題が残る（特許文献２を参照）。モノマー原料を蒸着し基板上で重合させる方法も報告されているが、モノマー種が限定される問題がある（特許文献３を参照）。
【０００８】
浸漬吸着法を用いてＱＣＭのセンサー表面に疎水性ポリマーを単独溶剤溶液から吸着させる方法が報告されている（非特許文献１を参照）。しかし、単独溶剤では、ポリマーの溶液への溶解とセンサー表面への吸着を両立させる溶剤の探索が困難であり、種々の疎水性ポリマーへの適応が困難である。さらに、この表面を更に修飾し、生体分子間の相互作用の分析するための方法は現在のところ報告されていない。
【０００９】
【特許文献１】特開平８−１９３９４８号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【特許文献３】特開２００３−２１２９７４号
【非特許文献１】Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００１，１７、５５１３−５５１９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、非特異吸着を抑制した固体基板の製造方法、特に、非特異吸着を制御した表面プラズモン共鳴分析などに使用するセンサー用基板の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に、前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる工程を含む表面形成方法により、種々の疎水性ポリマーを固体基板表面に吸着させ、非特異吸着を抑制した固体基板を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明によれば、固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる工程を含む、センサー用固体基板の製造方法が提供される。
好ましくは、得られた固体基板を表面修飾する工程をさらに含む、センサー用固体基板の製造方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液は、前記ポリマーの良溶剤と貧溶剤とを含む混合液である。
好ましくは、前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液は、前記混合液を前記疎水性ポリマー溶液と同じ疎水性ポリマー濃度とした場合に疎水性ポリマー沈殿物を発生させない下限液温に対して、１℃以上５０℃以下高い液温で使用される。
さらに好ましくは、疎水性ポリマー溶液の溶剤とポリマーを含まない液の溶剤とが同一の溶剤である。好ましくは、前記表面修飾は、共有結合を生成することのできる官能基を導入する表面修飾である。好ましくは、疎水性ポリマー溶液に接触させる固体基板は、金属表面あるいは金属膜でコーティングされている固体基板である。好ましくは、上記センサー用固体基板は、表面プラズモン共鳴分析に使用される基板である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法によりセンサー用固体基板を製造する工程、及び得られたセンサー用固体基板の表面に生理活性物質を接触させて固定化する工程を含む、生理活性物質が表面に結合したセンサー用固体基板の製造方法が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の方法によりセンサー用固体基板を製造する工程、得られたセンサー用固体基板の表面に生理活性物質を接触させて固定化する工程、及び得られた生理活性物質が表面に結合したセンサー用固体基板と被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の固体基板の製造方法により、種々の疎水性ポリマーを固体基板の表面に吸着させ、非特異吸着を抑制したセンサー用基板を提供することが可能になった。また、固体基板の平面形状に依らず非特異吸着を抑制したセンサー用基板を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のセンサー用固体基板の製造方法は、固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に前記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させることによって表面を形成することを特徴とする。
【００１８】
本発明で用いる疎水性ポリマーとは、水に実質的に不溶なものであり、具体的には、水に対する溶解度が０．１％未満のものである。本発明の疎水性ポリマーは、形成するモノマーの２５℃の水に対する溶解度が０重量％以上２０重量％以下であるモノマーを３０重量％以上１００重量％以下含有することが好ましい。
【００１９】
疎水性ポリマーを形成する疎水性モノマーとしては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性ポリマーとしては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００２０】
本発明で好ましく用いられる疎水性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００２１】
本発明で用いるポリマー溶解用溶剤は特に限定されず、疎水性ポリマーの一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
【００２２】
固体基板に接触させる疎水性ポリマー溶液は、ポリマーが完全に溶解しても、ポリマー不溶解成分を含む懸濁液でもよいが、完全に溶解している方が好ましい。液温は、疎水性ポリマーの一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、ポリマーが沈殿物を発生する液温より高い液温が好ましい。基板を疎水性ポリマー溶液に接触させている間に液温を変動させてもよい。溶液のポリマー濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。
【００２３】
固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。
【００２４】
本発明の方法では、固体基板を上記の疎水性ポリマー溶液に接触させた後に、上記ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる。本発明で言うポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液とは、ポリマーを含まない有機溶剤を意味する。好ましくは、ポリマーの良溶媒と貧溶媒の混合液である。ポリマーを含まない溶剤の好ましい液温は、ポリマー凝集物を発生させない下限液温に対して１℃以上５０℃以下高い液温である。さらに、好ましくは、疎水性ポリマー溶液の溶剤とポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液とは、同一の溶剤組成である。
【００２５】
本発明で言う良溶媒とは、ポリマーの溶解度が０．１％以上の溶剤であり、本発明で言う貧溶剤とはポリマーを実質的に溶解させない溶剤を示す。例えば、ポリマーとしてポリメチルメタクリレートを使用する場合には、良溶剤としてはアセトン、アセトニトリル、ベンゼン、２−ブタノン、テトラヒドロフラン、酢酸、酢酸エチル、クロロホルム、クロロベンゼン、メチレンクロライド、シクロヘキサノン、ジオキサン、２−エトキシエタノール、などが挙げられる。貧溶剤としては、シクロヘキサン、ジメチルエーテル、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、エタノール、四塩化炭素、クレゾール、ナフタレンなどが挙げられる。疎水性ポリマーの良溶媒と貧溶媒として、例えば、Ｊ．Ｂｒａｎｄｒｕｐ、Ｅ．Ｈ．Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，Ｅ．Ａ．Ｇｒｕｌｋｅ編「ＰＯＬＹＭＥＲ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＦＯＵＲＴＨ  ＥＤＩＴＩＯＮ」第VII
章４９７〜５４５項、ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ社（１９９９年）に記載のものなどが挙げられる。
【００２６】
本発明におけるポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液の液温は特に制限されないが、当該混合液を、本発明でも用いる疎水性ポリマー溶液と同じ疎水性ポリマー濃度とした場合に、疎水性ポリマー沈殿物を発生させない液温が好ましい。具体的には、ポリマー沈殿物を発生させない下限液温に対して、１℃以上高い液温が好ましい。さらに、液温を高くすることで発生する疎水性ポリマーの固体基板からの脱離を防止する目的で、前記下限液温に対して５０℃以下の高さの液温が好ましい。
【００２７】
基板を、ポリマーを含まない２種以上の有機溶剤の混合液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
【００２８】
疎水性ポリマー層の厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。
【００２９】
本発明の方法においては、固体基板を疎水性ポリマー溶液に接触させた後に前記ポリマーを含まない液に接触させ、次いで、得られた固体基板を表面修飾する。表面修飾の方法としては、化学薬品、カップリング剤、界面活性剤、表面蒸着などを使用した化学処理、加熱、紫外線、放射線、プラズマ、イオンなどを使用した物理的処理から適宜選択することができる。
【００３０】
したがって、疎水性ポリマー層には、表面修飾により共有結合を生成することのできる官能基を導入することが好ましい。好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。
【００３１】
表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する疎水性高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ3基を含有する疎水性高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。また、例えばポリスチレンコーティング層に、ＵＶオゾン処理すると最表面に−ＣＯＯＨ基および−ＯＨ基が発生する。
【００３２】
本発明で言う固体基板とは、最も広義に解釈され、機能を有する材料を支持する架台となるものを指し、硬質なものだけでなく、フィルム、シートなどフレキシブルなものも含む。
【００３３】
本発明で用いる固体基板は、金属表面、あるいは金属膜を疎水性ポリマーでコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００３４】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。
【００３５】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００３６】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３７】
本発明で言うセンサー用基板とは最も広義に解釈され、物質間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。本発明のセンサー用基板は、バイオセンサーとして使用することができる。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【００３８】
上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
【００３９】
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００４０】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００４１】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００４２】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００４３】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００４４】
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。
【００４５】
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００４６】
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【００４７】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【００４８】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【００４９】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５０】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【００５１】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【００５２】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【００５３】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【００５４】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００５５】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【００５６】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【００５７】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【００５８】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【００５９】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【００６０】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【００６１】
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(1)
（１）ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー溶液（０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(1)）の調製
ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（数平均分子量６００００、ポリメチルメタクリレート：ポリスチレン＝１：１（重量比））０.１ｇを２−ブタノン６０ｍＬとエタノール４０ｍＬの混合溶液に溶解、０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(1)を調製した。
この溶液のポリマー沈殿物を発生しない下限液温は、１８℃であった。
【００６３】
（２）金ブロックの作成
特開２００１−３３０５６０号公報の図２３に記載の誘電体ブロックに金膜の厚さが５００オングストロームになるよう金を蒸着し、金ブロックを得た。
【００６４】
（３）ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(1)の作成
金ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、金蒸着表面上に０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(1)を滴下し、１５分間静置した。続いて、２５℃の２−ブタノン３０ｍＬとエタノール２０ｍＬの混合溶液に１分間ずつ５回浸漬することにより、金蒸着表面の０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔを２−ブタノン３０ｍＬとエタノール２０ｍＬの混合溶液に置換した。置換後、ブロック表面の混合溶液を窒素ブローで除去し、真空下１６時間乾燥した。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ膜の厚さは５０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(1)と呼ぶ。
【００６５】
実施例２：ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(2)
（１）ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー溶液（０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(2)）の調製
ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（数平均分子量６００００、ポリメチルメタクリレート：ポリスチレン＝１：１（重量比））０.１ｇを２−ブタノン４５ｍＬとアセトニトリル５５ｍＬの混合溶液に溶解、０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(2)を調製した。
この溶液のポリマー沈殿物を発生しない下限液温は、２０℃であった。
【００６６】
（２）ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(2)の作成
０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(1)の代わりに０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(2)、２−ブタノン３０ｍＬとエタノール２０ｍＬの混合溶液の代わりに２−ブタノン４５ｍＬとアセトニトリル５５ｍＬの混合溶液を使用した以外、実施例１（３）と同じ操作で、サンプルを作成した。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ膜の厚さは５０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(2)と呼ぶ。
【００６７】
実施例３：ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(3)
混合溶液の液温を６０℃とした以外は、実施例１（３）の操作でサンプルを作成した。ＰＭＭＡ／ＰＳｔ膜の厚さは３０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ／ＰＳｔブロック(3)と呼ぶ。
【００６８】
実施例４：ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(1)
ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(1)をNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄し、窒素ブローで水を除去した。エリプソメトリー法での測定により、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨ膜の厚さは５０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(1)と呼ぶ。
【００６９】
実施例５：ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(2)
ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(2)に実施例４の操作を実施し、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(2)を得た。エリプソメトリー法での測定により、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨ膜の厚さは５０オングストロームであった。
【００７０】
実施例６：ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(3)
ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(3)を実施例４の操作を実施し、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(3)を得た。エリプソメトリー法での測定により、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨ膜の厚さは１０オングストロームであった。
【００７１】
比較例１：ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(4)
（１）ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー溶液（０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(4)）の調製
ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（数平均分子量６００００、ポリメチルメタクリレート：ポリスチレン＝１：１（重量比））０.１ｇを２−フェノキシエタノール１００ｍＬに溶解、０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔ(4)を調製した。
【００７２】
（２）ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロックの作成
金ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、金蒸着表面上に０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔを滴下し、１５分間静置した。続いて、５０ｍＬの２−フェノキシエタノールで１分間ずつ５回浸漬することにより、金蒸着表面の０.１％ＰＭＭＡ/ＰＳｔを２−フェノキシエタノールに置換した。さらに、５０ｍＬのエタノールで１分間ずつ５回浸漬することにより、金蒸着表面の２−フェノキシエタノールをエタノールに置換した。置換後、ブロック表面のエタノールを窒素ブローで除去し、真空下１６時間乾燥した。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ＰＭＭＡ/ＰＳｔ膜の厚さは１０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(4)と呼ぶ。
【００７３】
比較例２：ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(4)
ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロック(4)を用いて実施例４と同じ操作でサンプルを作成した。ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨ膜の厚さは１０オングストロームであった。このサンプルをＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロック(4)と呼ぶ。
【００７４】
比較例３：ＳＡＭブロック
金蒸着膜が５０ｎｍの金ブロックをオゾンクリーナーで30分処理した後、1mMの7−カルボキシ−１−ヘプタンチオールのエタノール溶液に浸して、18時間表面処理を行った。その後、エタノール５回、エタノール/水混合溶媒で１回、水で５回洗浄した。この操作によりＳＡＭ化合物（7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール）で被覆処理したＳＡＭブロックを得た。
【００７５】
比較例４：金ブロック
実施例１に記載の方法で作製した金ブロックを比較例４とした。
【００７６】
評価１：蛋白質の非特異吸着
バイオセンサー表面に対する非特異的な蛋白質の吸着はノイズの原因となる為、極力少ないほうが好ましい。ＢＳＡ（シグマ製）、アビジン（ナカライテスク製）の非特異吸着性を測定した。
【００７７】
エタノールブロック処理
ＰＭＭＡ/ＰＳｔ/ＣＯＯＨブロックおよびＳＡＭプロックを、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）に設置し、エタノールアミンでブロック処理した後測定を行った。エタノールアミンによるブロック処理は、ブロックのセンサー表面上に１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を滴下し、６０分静置して実施した。さらに水で洗浄後、エタノールアミン・HCｌ溶液（１M、ｐH8.5）を各測定ブロックに添加し、２０分間静置した。さらにHBS-EPバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）で洗浄した。なお、上記で用いたHBS-EPバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/l、ＥＤＴＡ 0.003mol/l、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０ 0.005重量％である。
【００７８】
非特異吸着の測定
ＰＭＭＡ/ＰＳｔブロックおよびエタノールアミンブロック処理を行った各ブロックを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、HBS-EPバッファーで洗浄した。その後、ＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、HBS-EPバッファー）あるいはアビジン溶液（２ｍｇ／ｍｌ、HBS-EPバッファー）を添加し、１０分間静置した。その後、HBS-EPバッファーで洗浄し、３分後の共鳴シグナル変化量を測定した。変化量は金ブロック（比較例４）での変化量に対する相対値で評価した。
【００７９】
【表１】
2005195488.tif 000002
【００８０】
評価２：蛋白質・検体化合物間の相互作用の測定
実施例４〜６、比較例２、３の各測定プロックにニュートラルアビジン（PIERCE製、以降N-アビジンと記す）を固定化し、D-ビオチン（ナカライテスク製）との相互作用測定を以下の方法で行った。
【００８１】
測定ブロックに、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、HBS-Nバッファー（ビアコア社製、pH7.4）で洗浄した。次に、N-アビジン溶液（１００μｇ／ｍｌ、HBS-Nバッファー）を添加し、３０分静置後、HBS-Nバッファーで洗浄した。以上の操作により、N-アビジンを各測定チップ表面に共有結合で固定化した。N-アビジンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル変化量をN-アビジンの固定化量とし、ＳＡＭブロック（比較例３）での変化量に対する相対値で評価した。評価結果を表２に示した。変化量の相対値が大きいほど固定化量が多いことを示し、好ましい。なお、上記で用いたHBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/ｌである。
【００８２】
さらに、エタノールアミン・HCl溶液（１M、ｐH8.5）を測定ブロックに添加後、HBS-Nバッファーで洗浄することにより、N-アビジンと反応せずに残存したＣＯＯＨ基をブロックした。
【００８３】
次に、測定ブロックを本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、D-ビオチン（０．５μｇ／ｍｌ、HBS-Nバッファー））を測定ブロックに添加し、１０分間静置後、HBS-Nバッファーで洗浄した。D-ビオチンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル変化量をN-アビジンに対するD-ビオチンの結合量とし、ＳＡＭブロック（比較例３）での変化量に対する相対値で評価した。評価結果を表２に示した。変化量の相対値が大きいほど検出感度が高いことを示し、好ましい。
【００８４】
【表２】
2005195488.tif 000003
【００８５】
表１の結果から、本発明の表面形成方法は、極めて蛋白質の非特異吸着の少ない表面プラズモン共鳴基板を提供できることがわかる。各サンプル表面を蛍光標識基質ＦＩＴＣ−アビジン溶液（１ｍｇ／ｍＬ、ＨＢＳ−ＥＰバッファー）に１５分浸漬後、水洗、蛍光顕微鏡観察すると、ＳＡＭブロックはＦＩＴＣ由来の蛍光が観察されるのに対し、本発明のサンプルは蛍光が観察されず、本発明の表面形成方法は、非特異吸着の極めて少ない表面を提供することがわかった。
【００８６】
表２の結果から、本発明の表面形成方法により作製したセンサー基板は、蛋白質の固定化および検体化合物の検出が可能であった。
【００８７】
また、単独溶剤を使用して作成した比較例１の測定プロックは、非特異吸着を抑制する表面を形成させるため、約５０種の溶剤についてポリマーの溶解性、作成した測定ブロックの非特異吸着の評価が必要で、測定ブロックの開発に多大な作業を要した。一方、本発明の測定ブロック作成は、ポリマーの任意の良溶媒と貧溶媒を混合することで開発でき、開発時間および作業の大幅な削減が行われた。