(57)【要約】【課題】植物害虫を抑制する植物害虫防除方法を提供する。【解決手段】本発明は、トマトの葉から単離した細菌、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＫＰＭ−０１８Ｐを用いた防除剤を植物体に噴霧することにより、植物害虫を効果的に抑制する。シュードモナス・フルオレッセンス  ＫＰＭ−０１８Ｐは、キチナーゼを分泌し、摂取した昆虫を致死させる効果を有する。さらに、ＫＰＭ−０１８Ｐはバイオサーファクタントを生成し、植物体上で安定したコロニーを形成する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２５号の細菌であるシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＫＰＭ−０１８Ｐ。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌を含む植物害虫防除剤であって、該植物害虫防除剤は、前記細菌が分泌するキチナーゼによって植物害虫を致死させることを特徴とする植物害虫防除剤。
【請求項３】
前記植物害虫は甲虫目の昆虫である、請求項２に記載の植物害虫防除剤。
【請求項４】
前記甲虫目の昆虫は、テントウムシ、ヒメコガネ、および、キスジノミハムシから成る群から選択される、請求項３に記載の植物害虫防除剤。
【請求項５】
前記植物害虫は鱗翅目の昆虫である、請求項２に記載の植物害虫防除剤。
【請求項６】
前記鱗翅目の昆虫は、ハスモンヨトウ、オオタバコガ、コナガ、および、ウリノメイガから成る群から選択される、請求項５に記載の植物害虫防除剤。
【請求項７】
前記植物害虫は半翅目の昆虫である、請求項２に記載の植物害虫防除剤。
【請求項８】
前記半翅目の昆虫は、オンシツコナジラミ、シルバーリーフコナジラミ、ワタアブラムシ、および、モモアカアブラムシから成る群から選択される、請求項７に記載の植物害虫防除剤。
【請求項９】
前記植物害虫はアザミウマ目の昆虫である、請求項２に記載の植物害虫防除剤。
【請求項１０】
前記アザミウマ目の昆虫は、ミカンキイロアザミウマである、請求項９に記載の植物害虫防除剤。
【請求項１１】
請求項２に記載の植物害虫防除剤を用いた植物害虫防除方法であって、前記生細菌を含む液体状の植物害虫防除剤を植物体に噴霧することを特徴とする植物害虫防除方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の植物害虫防除方法であって、前記植物はトマトである植物害虫防除方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の植物害虫防除方法であって、前記液体状の植物害虫防除剤が前記細菌の培養液であることを特徴とする植物害虫防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の昆虫病原性細菌シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KPM-018Pを用いた植物害虫の防除剤および防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の葉の表面に安定してコロニーを形成する微生物は、葉面病原体または植物害虫を抑制する生物学的薬剤として使用できる可能性を有している。本発明者らは、先の研究において温室トマトから単離したキチン分解性葉面細菌を封入したアルギン酸ゲル状ビーズを使用し、植物食性テントウムシによる葉の摂食および産卵を抑制することに成功した（非特許文献１および２）。このような抑制は、主として細菌を処理したトマトの葉を摂食した害虫の中腸において、キチン性の囲食膜が酵素的に分解されたことによっている。この処理は簡便且つ効果的ではあるが、成虫のテントウムシしか抑制できなかった。本発明者らのトマト栽培系では、幼虫と成虫の両方によって移植前の苗の葉が著しく摂食されている。そのため、本発明者らは更に、定植前の段階のトマトの苗の葉に定住している細菌に焦点をあてて効果的な生物資材をスクリーニングする必要があった。本明細書では、トマトの葉から単離同定した葉面細菌シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）について開示し、さらに植物食生害虫に対する昆虫病原性細菌としてのその有効性について開示する。
【０００３】
シュードモナス・フルオレッセンスの株の中には、内部寄生性の生物資材として広く調査されているものもあり、植物病原性細菌及び真菌に対して、宿主の耐性を誘起することによる抗菌活性を示すものもあり、また、種々の発達段階にある虫の成長および発達に影響を及ぼすものもある（非特許文献３）。例えば、ある種のシュードモナス・フルオレッセンスは、細菌処理した植物の塊茎および芽を摂食させることによって、コロラドポテトムシ（Leptinotarsa decemlineata）やライスリーフホルダー（Cnaphalocrocis medinalis）のような害虫を制御するために使用されている。BeattieおよびLindow（１９９５）は、細菌が葉の表面の特定部分、即ち、トリコーム、気孔、および表皮細胞壁の接合点に局在することを示した。シュードモナス・フルオレッセンスの拮抗性株を用いて植物葉病原体を生物学的に制御する試みにおいては、細菌コロニーを持続的に形成させるために、葉に粉末形態の細菌細胞懸濁液が噴霧された（非特許文献４〜６）。
【０００４】
細菌を用いる本研究者らのアプローチも、害虫が摂食するトマトの葉の表面において、細菌が安定に生き残るための能力に基づいている。最近の分子的な技術、特に緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｇｆｐ）をレポーターとして使用して標的細菌のコロニー化を植物上で可視化する技術により、細菌をレポーター遺伝子で標識化し観察することが可能になった。このｇｆｐを用いた細菌の標識化技術は、本発明者らのシステムにおいても、処理した葉における細菌の持続的なコロニー形成を追跡するために使用された。これらのアプローチによって、本発明者らは、植物食性害虫に対する昆虫病原性細菌シュードモナス・フルオレッセンスの使用可能性を評価した。
【非特許文献１】Otsu. Y., Matsuda, Y., Shimizu, H., Ueki, H., Mori, H., Fujiwara, K., Nakajima, T., Miwa, A., Nonomura, T., Sakuratani, S., Tosa, Y, Mayama, S. & Toyoda, H. (2003a) Biological control of phytophagous ladybird beetles Epilachna vigintioctopunctata (Coleoptera: Coccinellidae) by chitinolytic phylloplane bacteria Alcaligenes paradoxus entrapped in alginate beads. Journal of Applied Entomology (in press).
【非特許文献２】Otsu, Y., Mori, H., Komuta, K., Shimizu, H., Nogawa, S., Matsuda, Y., Nonomura, T., Sakuratani, S., Tosa, Y., Mayama, S. & Toyoda, H. (2003b) Suppression of leaf feeding and oviposition of phytophagous ladybird beetles (Coleoptera: Coccinellidae) by chitinase gene-transformed phylloplane bacteria and their specific bacteriophages entrapped in alginate gel beads. Journal of Economic Entomology 96, 555-563
【非特許文献３】Ramamoorthy, V.,  Viswanathan, R.,  Raguchander, T.,  Prakasam, V. & Samiyappan, R.  (2001)  Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases. Crop Protection 20, 1-11.
【非特許文献４】Gnanamanickam, S. S.  &  Mew, T. W. (1992)  Biological control of host disease of rice (Oryza sativa L.) with antagonistic bacteria and its mediation by a Pseudonzonas  antibiotic. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 380-385.
【非特許文献５】Chatterjee,A.,Valasubramanian,R.,Ma,W-L., Vachhani,A.K., Gnanamanickam, S.& Chatterjee, A. K. (1996) Isolation of ant mutants of Pseudomonas fluorescens strain Pf7-14 altered in antibiotic production, cloning of ant＋DNA, and evaluation of the role of antibiotic production in the control of blast and sheath blight of rice. Biological Control 7, 185-195.
【非特許文献６】Vidhyasekaran, P., Rabindran R., Muthamilan, M., Nayar, K., Rajappan, K.,Subramanian, N. & Vasumathi, K  (1997)  Development of a powder formulation of Pseudomonas fluorescens for control of rice blast. Plant Pathology  46, 291-297.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、新規の昆虫病原性細菌を用いて植物害虫を防除することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５２５号の細菌であって、キチナーゼおよびバイオサーファクタントを生成する性質を有することを特徴とする、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＫＰＭ−０１８Ｐを提供する。
【０００７】
また、本発明は、前記細菌を含む植物害虫防除剤であって、前記細菌が分泌するキチナーゼによって植物害虫を致死させることを特徴とする植物害虫防除剤を提供する。  
本発明の一つの側面に従って、前記植物害虫は甲虫目の昆虫であり、特に、テントウムシ、ヒメコガネ、および、キスジノミハムシから成る群から選択される昆虫である。  
また、本発明のもう一つの側面に従って、前記植物害虫は鱗翅目の昆虫であり、特に、ハスモンヨトウ、オオタバコガ、コナガ、および、ウリノメイガから成る群から選択される昆虫である。  
また、本発明のもう一つの側面に従って、前記植物害虫は半翅目の昆虫であり、特に、オンシツコナジラミ、シルバーリーフコナジラミ、ワタアブラムシ、および、モモアカアブラムシから成る群から選択される昆虫である。  
また、本発明のもう一つの側面に従って、前記植物害虫はアザミウマ目の昆虫であり、特に、ミカンキイロアザミウマである。
【０００８】
さらに、本発明は、前記植物害虫防除剤を利用した植物害虫防除方法であって、前記生細菌を含む液体状の植物害虫防除剤を植物体に噴霧することを特徴とする植物害虫防除方法を提供する。好ましくは、前記植物はトマトである。前記液体状の植物害虫防除剤は前記細菌の培養液であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）ＫＰＭ−０１８Ｐを使用することにより、植物害虫を効果的に抑制する植物害虫防除剤および植物害虫防除方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、トマトの葉から細菌をスクリーニングし、キチン分解性を有する新規の細菌シュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐを単離することに成功した。単離したシュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐは、キチナーゼの分泌、および、バイオサーファクタントを生成する性質を有する。ＫＰＭ−０１８Ｐが形成するコロニーは、滑らかで円形であり、蛍光性および光沢を有し、３７℃では淡黄色、２５℃では赤色に変化する。キチンを含む固体培地では、細菌が分泌するキチナーゼによってキチンが加水分解され、コロニーの周りに透明ゾーンが形成される。また、アンピシリン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに耐性であり、カナマイシンおよびストレプトマイシンに感受性である。後に詳述するように、このＫＰＭ−０１８Ｐは、植物害虫に対する昆虫病原性を有することが示された。
【００１１】
本発明において植物害虫とは、植物体の葉やその他の部分を摂食し、または汁液を吸引し、その植物に被害を及ぼす虫を意味する。この虫は、例えば甲虫目の昆虫であり、特に、テントウムシ、ヒメコガネ、および、キスジノミハムシ等である。また他には、例えば鱗翅目の昆虫であり、特に、ハスモンヨトウ、オオタバコガ、コナガ、および、ウリノメイガ等である。その他、例えば半翅目の昆虫であり、特に、オンシツコナジラミ、シルバーリーフコナジラミ、ワタアブラムシ、および、モモアカアブラムシ等である。さらに、例えばアザミウマ目の昆虫であり、特に、ミカンキイロアザミウマ等である。
【００１２】
これらの植物害虫は、ＫＰＭ−０１８Ｐを摂取することにより致死することが示された。これは、ＫＰＭ−０１８Ｐが分泌するキチナーゼが害虫の中腸において、キチン性の囲食膜を分解することによるものと考えられる。本発明では、このようなＫＰＭ−０１８Ｐの昆虫病原性を利用し、ＫＰＭ−０１８Ｐの生菌を含んだ植物害虫防除剤を提供することができる。
【００１３】
この防除剤を利用して植物害虫を防除する方法は、この防除剤を植物に散布し、これを植物とともに害虫に摂取させることによる。
【００１４】
この害虫防除剤の有効性を持続させるためには、散布されたＫＰＭ−０１８Ｐが植物体上に定着することが重要である。この際、ＫＰＭ−０１８Ｐの生成するバイオサーファクタントが有利に働き、植物体上におけるＫＰＭ−０１８Ｐのコロニー形成に安定性を賦与し、ＫＰＭ−０１８Ｐの安定かつ持続的な定着を可能にする。
【００１５】
植物防除剤の形態は、ＫＰＭ−０１８Ｐの生菌を植物に散布できる何れの形態でも良い。例えば、細菌を凍結乾燥した粉末でもよく、また細菌を封じたアルギン酸ゲル状ビーズのような担体の懸濁液でもよい。しかしながら、ＫＰＭ−０１８Ｐが生成するバイオサーファクタントを有効に利用するためには液体状の形態が好ましく、ＫＰＭ−０１８Ｐの生菌を含む懸濁水溶液が好ましい。特に、ＫＰＭ−０１８Ｐを培養した培養液はバイオサーファクタント濃度が最も高いと考えられるため、このようなＫＰＭ−０１８Ｐの生菌を含む培養液を用いた防除剤が最も好ましい。
【００１６】
上記の植物害虫防除剤を植物体に散布する方法としては、液体状の防除剤であれば、スプレーを用いて噴霧することができる。２日間培養したＫＰＭ−０１８Ｐの懸濁液（１０9細胞／ｍｌ）を、トマトの葉に１０4〜１０5細胞／１ｃｍ2の細菌密度で噴霧し、７日間にわたって細菌数を測定した結果、葉上の細菌個体群は接種後７日以内で有意に減少しないことが示唆された。従って、防除剤を少なくとも週に１回処理することによってＫＰＭ−０１８Ｐを植物体上に定着させることが可能であり、害虫防除効果を得ることができる。ここで示した防除剤中のＫＰＭ−０１８Ｐ細菌密度は、比較的高密度のものであるが、これに限らず任意の密度の懸濁液または培養液を用いることもできる。
【００１７】
本発明の植物害虫防除剤によって害虫を防除することができる代表的な植物はトマトであり、トマトの葉において害虫のテントウムシが効果的に抑制されることが示された。
【００１８】
［実施例］
以下、本発明の実施例を記載する。
【００１９】
１．材料および方法
＜植物および昆虫＞
発芽したトマトを、バーミキュライトを入れた１２ｃｍのポットに移し、390ｎｍ以下のＵＶスペクトルを遮断する透明ビニルフィルムで上方および側方を覆った育成箱に静置した。この育成箱は、２６±４℃に制御された温室に静置した。育成箱中の相対湿度の変動は５０〜９０％であった。
【００２０】
ニジュウヤホシテントウEpilachna vigintioctopunctata（甲虫目、テントウムシ科）の成虫を野外のトマトから捕集し、育成チャンバー（２６±１℃、明期１６時間）中の発芽後１ヶ月のトマトの苗で飼育した。
【００２１】
＜昆虫病原性細菌の単離と同定＞
湿性条件（２６±６℃、相対湿度７０±２０％）下の温室で２ヶ月育成したトマトから、完全に成長した葉を無作為に収集した。摘み取った葉の上面を、Ｍ９最小寒天培地（１０００ｍｌの水に、１２．８ｇのＮａ2ＨＰＯ4７Ｈ2Ｏ、３ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．５ｇのＮａＣｌ、１ｇのＮＨ4Ｃｌ、および４ｇのグルコース)に押し付け、２分放置した。その倍地に増殖した細菌コロニーを、コロイド状のキチンを含むＭ９培地（Ｃｈｉ−Ｍ９培地）に移した。コロイド状キチンは、HiranoおよびNagao(１９８８)の方法に従って調製した。２６℃で３日間インキュベーションした後、ハロ（細菌が分泌するキチナーゼによってキチンが加水分解されて、倍地中でコロニーの周りに形成された透明ゾーン）を形成した細菌コロニーを、抗生物質を標準濃度（テトラサイクリン  ２０μg/ml、アンピシリン  ５０μg/ml、ストレプトマイシン  ５０μg/ml、カナマイシン  ５０μg/ml、およびクロラムフェニコール  １００μg/ml）で含むＣｈｉ−Ｍ９培地に移した。単離した菌をコロニーの色および抗生物質感受性に基づいて１８のタイプに分類した。分類した細菌をそれぞれ蒸留水に懸濁し、次に説明する予備スクリーニングにおいてテントウムシの幼虫に対する病原性を試験した。その結果単離および同定したＫＰＭ−０１８Ｐは、昆虫病原性活性を有し、後述のようにBergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th Ed.)によって微生物学的特徴を決定した。
【００２２】
＜ＫＰＭ−０１８Ｐの単離およびその昆虫病原性活性試験＞
昆虫病原性細菌ＫＰＭ−０１８Ｐの予備スクリーニングに、４虫齢の幼虫を、相対湿度１４〜１５％に保ったデシケーターに隔離して１２時間飢餓状態にし、細菌懸濁液（滅菌水に１０9細胞／ｍｌを懸濁、血球計算盤および位相差顕微鏡で確認）に浸漬した紙に３０分置いた。幼虫の腹部が膨張したことによって細菌の接種を確認した後、新鮮な葉を摘んで入れたペトリ皿にその幼虫を放置し、次の蛹段階が終了するまでインキュベートした（１０日間）。この予備スクリーニングに基づいて、ＫＰＭ−０１８Ｐを単離した。
【００２３】
単離したＫＰＭ−０１８Ｐの昆虫病原性活性試験を、直接注入方によって試験した。即ち、餓えた幼虫をガラススライド上の１.５%の寒天（重量／体積）上に仰向けに置き、立体顕微鏡下でマイクロピペット（チップ径１０μｍ）を用いて、滅菌水に懸濁した２μｌの細菌懸濁液を幼虫の口内に直接注入した。細菌を接種した幼虫は、上記と同様に葉を入れたペトリ皿に１０日間放置した。大腸菌ＨＢ１０１／アンピシリン耐性（ＨＢ１０１にｐＵＣ１１９を形質転換）およびアルカリジェネス・パラドキサス（Alcaligenes paradoxus）ＫＰＭ−０１２Ａをネガティブコントロール細菌として使用し、同様に処理した。ＫＰＭ−０１２Ａは、以前にトマトの葉の表面から得られたものである（Otsu et al.,2003a）。
【００２４】
＜細菌感染幼虫における酵素活性評価＞
４−メチルウンベリフェリー（methylumbellifery）−β−Ｄ−Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´−トリアセチルキトトリオシド（triacetylchitotrioside）[４ＭＵ−（ＧｌｃＮＡｃ）３]（シグマ）を基質として用いたMcCreathおよびGoody（１９９２）の方法によって、キチナーゼ活性を測定した。細菌を接種した幼虫および接種していない幼虫をそれぞれ蒸留水にホモジナイズし、そのホモジネート  １００μｌを遠心分離し、上清を９００μｌのMcIlvaineバッファー（ｐＨ７、０.１mol/Lのクエン酸  １７．８ｍｌ、および０．２mol/Lの第二リン酸ナトリウム  ８２．２ｍｌ）と混合した。次いで、０．１３４mg/mlの４ＭＵ−（ＧｌｕＮＡｃ）３を５０μｌ加えて反応を開始した。３７℃で１０分インキュベーションした後、１mol/Lのグリシン／ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．６）を1.2ｍｌ加えて反応を停止させ、４−メチルウンベリフェロン（methylumbelliferon）（４ＭＵ）の放出による蛍光を分光蛍光光度計（ＲＦ−５０００；Shimazu,Kyoto,Japan）を用いて観察した。４ＭＵの量は、同一のバッファー（ｐＨ７．０）中の標準４ＭＵによる検量線に従って評価した。
【００２５】
タンパク質分解活性はＢｏｗｅｎ他（２０００）の方法に従って、アゾカゼイン（Ｓｉｇｍａ）を基質に用いて測定した。幼虫を５０ｍＭのトリスバッファー生理食塩水（ｐＨ８．０）でホモジナイズし、ホモジネートの上清（２０μｌ）を、アゾカゼイン１０mg/mlを含む同バッファー５００μｌに添加し、３０℃で４時間、軌道型振盪器でインキュベートした。１０％トリクロロ酢酸  ５００μｌを添加して非加水分解アゾカゼインを沈殿させた。混合物を遠心分離し、得られた上清の吸光度（４４０ｎｍの）を測定した。上昇した吸光度によりタンパク質分解活性が示された。
【００２６】
＜細菌によるバイオサーファクタント生成の評価＞
ＫＰＭ−０１８Ｐによるバイオサーファクタントの生成を、急速水滴崩壊試験（Jain et al.,1991）によって評価した。細菌を液体Ｍ９培地（寒天なし）、２５℃で振盪培養し、１０μｌの細菌培養液または培養液を遠心分離した上清を疎水性膜（Ｐａｒａｆｉｌｍ）またはトマト葉表面上に滴下し、液滴の形を調べた。対照として、ポジティブコントロールに合成界面活性剤（１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）を含む液滴を用いた。また、ネガティブコントロールにはバイオサーファクタントを生成しない大腸菌ＨＢ１０１／アンピシリン耐性、およびアルカリジェネス・パラドキサスＫＰＭ−０１２Ａを２日間培養した培養液を使用した。
【００２７】
＜ｇｆｐ遺伝子を用いた細菌の遺伝子標識化による観察＞
オリジナルプラスミドｐＵＴｇｆｐ（Tombolini et al.,1997）をＮｏｔ  Ｉによって消化し、ｇｆｐ遺伝子を切除した。切除したｇｆｐ遺伝子を、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene ,CA ,USA）に選択マーカーとして挿入した。先に開示された（Toyoda et al.,1991）エレクトロポレーション法に従って、この新しいプラスミド（ｐＢｌｕｅ／ｇｆｐ）をＫＰＭ−０１８Ｐに導入した。アンピシリン  １５０μｇ／ｍｌを含むＬブロスで培養したコロニーにＵＶを照射し、緑色蛍光の生成を試験した。この試験で選択されたＧＦＰ標識細菌（ＫＰＭ−０１８Ｐ／ｇｆｐ）を２日間培養し、その培養液（１０9細胞／ｍｌ）を苗の葉に噴霧した。苗を育成箱で７日間インキュベーションした後、細菌を噴霧した葉を採取し、Olympus fluorescence microscope BX-60（ＢＰ４６０−４９０励起フィルターおよびＢＡ５１０ＩＦ吸収フィルターによるＩＢ励起）によって直接観察した。
【００２８】
＜葉上噴霧した細菌の回収＞
ＫＰＭ−０１８Ｐが植物体上に定着していることを確認するために、以下の試験を行った。  
１ヶ月齢のトマト苗（２０小葉を有する６葉）にＫＰＭ−０１８Ｐ懸濁液（２日間培養、１０9細胞／ｍｌ）を、葉の１ｃｍ2当たりの細菌密度が１０4〜１０5細胞になるように噴霧した。この細菌を噴霧したトマトの苗から、７日間の試験期間にわたって葉を毎日採取し、滅菌水にホモジナイズして希釈し、噴霧した細菌の生存をモニターするための抗生物質を含むＣｈｉ−Ｍ９培地上に塗布した。２日間のインキュベーション後、細菌のコロニー形成数を葉の１ｃｍ2当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ）として測定した。この細菌は、それらのコロニーの外見、即ちキチン加水分解能および抗生物質耐性に基づいて識別した。ＫＰＭ−０１８Ｐはアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性で、赤いコロニーを形成し、キチン加水分解陽性である。ＫＰＭ−０１２Ａは、カナマイシン耐性であり、淡黄色のコロニー、キチン加水分解陽性である。そして、大腸菌ＨＢ１０１／アンピシリン耐性は、アンピシリン耐性を有し、白色コロニー、キチン加水分解陰性である。
【００２９】
＜細菌処理した葉の昆虫による摂食＞
上記の方法でＫＰＭ−０１８Ｐ懸濁液を噴霧した１ヶ月齢の苗の葉に、テントウムシの３虫齢の幼虫を苗木あたり１０匹ずつ放した。このテントウムシがついた苗は、育成キャビネットの中の透明箱に別々に静置した。２週間の実験期間の間毎日、苗木を細菌噴霧済みの新しい苗木に交換し、幼虫の生存および幼虫による葉の摂食を記録した。大腸菌ＨＢ１０１／アンピシリン耐性およびアルカリジェネス・パラドキサスＫＰＭ−０１２Ａの懸濁液も、非病原性対照として使用した。テントウムシによる葉の摂食の程度を評価するため、各植物の全ての葉の摂食された領域を０〜４のスケールにスコア分類した。０は摂食なし、１は摂食された葉の領域が２５％以下、２は５０％以下、３は７５％以下、４は７５〜１００％とした。各植物の摂食の重症度は次の式を用いて決定した。
【００３０】
[（０Ａ＋１Ｂ＋２Ｃ＋３Ｄ＋４Ｅ）／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ＋Ｅ）]
ここで、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，およびＥは、それぞれスコア（０，１，２，３、および４）に対応する葉の数である。幼虫の段階の間に供給された全ての苗木の葉は、この段階が終了するまでスコア分類した。
【００３１】
２．結果
植物食生テントウムシは、本発明者らのトマト畑から捕集し、研究室の条件下でトマトの葉によって飼育することに成功した。成虫の甲虫はトマトの葉で飼育でき、多数の卵を産卵する(Otsu et al. ,2003a)。これらの条件下（２６±１℃、３０００ルクス、１６時間の光照射）で、卵の段階の期間は２．８±０．９日間、孵化率は７７．５±１３．３％であった。幼虫が成長する期間は、１虫齢が２．９±０．４日間、２虫齢が２．３±０．５日間、３虫齢が２．６±０．５日間、および４虫齢が４．１±０．４日間である。蛹の段階は４．５±０．７日間であり、蛹からの成虫発生率は９８．５±７．７％であった。３および／または４虫齢は活発的であり同調的にトマトの葉を摂食するため、これらを実験に使用した。
【００３２】
トマトの葉（５００）は１００本の植物トマトから無作為に採集し、細菌をスクリーニングするためのスタンプとして使用した。Ｍ９培地に葉を穏やかに押し付けることによって、９８の葉から８２０の細菌を、３１５の葉から７１１０の酵母（発芽細胞形態）のコロニーを得た。全ての細菌コロニーを抗生物質添加Ｃｈｉ−Ｍ９培地に移し、コロニー形態および抗生物質感受性または耐性に基づいて、キチン分解細菌を１８のタイプに予め分類した。得られた細菌から、予備試験で４虫齢の幼虫に致死活性を有するＫＰＭ−０１８Ｐを単離した。その細菌を摂食した幼虫の７０．５±２１．５％（３回の別々の実験の平均値）が蛹になる前に死滅した。他の単離細菌は、それを摂食した幼虫にいかなる致死効果も持たなかった。従って、ＫＰＭ−０１８Ｐを昆虫病原性細菌として採用し、以後の実験で用いた。
【００３３】
ＫＰＭ−０１８Ｐは滑らかで円形、蛍光性で光沢のあるコロニーを形成し、３７℃では淡黄色で２５℃に移したときに赤く変化する。このＫＰＭ−０１８Ｐのコロニーは固体培地で３日間培養した場合、エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）の生成のために液状になる（Allison et al. ,1998）。この単離菌はアンピシリン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに耐性であり、カナマイシンおよびストレプトマイシンに感受性である。ＫＰＭ−０１８Ｐによるキチナーゼ分泌は高く、培地中のコロイド状キチンを分解して明確な透明ゾーンをコロニーの周囲に生成する（図１）。これらの性質（コロニーの色の変化、ハロの形成、および抗生物質応答性）に従って、ＫＰＭ−０１８Ｐは、抗生物質を添加したＣｈｉ−Ｍ９寒天培地で最初に３７℃で１日間培養し、次いで２５℃で１日間培養することで特異的に検出することができる。
【００３４】
Bergey's Manual of Determinative Bacteriologyの判定基準によって、ＫＰＭ−０１８Ｐはグラムネガティブ、極性鞭毛を有する桿菌（幅０.６〜０.７μｍ）と特長付けられた。増殖至適温度は２５〜３０℃である。この細菌は好気性で、カタラーゼ反応、硝酸還元、アルギニンジヒドロラーゼ反応、およびゼラチン加水分解に陽性で、オキシダーゼ反応、デンプン加水分解、およびエタノールの酢酸への酸化に陰性であった。加えて、この細菌は、Ｄ−グルコースから、およびＤ−グルコース、Ｄ−マニトール、およびＬ−ヒスチジンを炭素源として利用して、好気的に酸を生成した。これらのデータに基づいて、本発明の細菌株をシュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐに帰属させることを提唱した。
【００３５】
ＫＰＭ−０１８Ｐの細菌濃度と、細菌摂食昆虫の致死率の関係をさらに明白にするために、顕微鏡下でピペットを用いて、細菌懸濁液を４虫齢の幼虫の口内に直接投入した（図１Ｂ）。このアプローチでは、各幼虫に注入する懸濁液の容積（２μｌ）を定量化した。幼虫の生存率は、注入した懸濁液のＫＰＭ−０１８Ｐ細胞が増加すると共に減少したが（表１）、非病原性細菌または蒸留水を同様に注入した幼虫では、致死効果は検出されず、従ってピペットによる投入が幼虫に機械的なダメージを与えないことが示された。
【表１】
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【００３６】
細菌を摂食した幼虫の組織病理学的な変化は良く同期した。幼虫は、注入後３６〜４０時間で動作を停止し、幼虫当たり１０7細胞の細菌を投与した場合は特に、体が黄色から濃いピンク色または茶色に変化した（図１Ｃ）。投入された細菌は、最初に減少するが、その後徐々に増加し、幼虫が色を失うとすぐに精力的に増加した（図２）。最初に細菌が減少したのは、注入後に細菌が糞便ペレットとして排出されたためである。ＫＰＭ−０１８Ｐ（１０3〜１０6細菌／ペレット）が、注入から１２時間後に無作為に収集したペレット（３０）から回収された。幼虫内の細菌集団は、注入後４日間で幼虫当たり１０11細胞に達した。この段階で、幼虫は柔らかくなり、感染した幼虫から細菌が噴出した（図１Ｃ）。感染幼虫におけるキチナーゼおよびプロテアーゼの酵素活性は、ＫＰＭ−０１８Ｐの急速な増加と平衡して著しく上昇した。
【００３７】
細菌によるバイオサーファクタントの生成は、細菌が葉の疎水性表皮を介して水に不溶な基質を得、葉の表面に安定したコロニーを形成するための重要な因子であると考えられた（Bunster et al. ,1989）。図３Ａ（上および下）に疎水性膜上の液滴の形の変化を示す。１％より多くのＴｗｅｅｎ２０を含む水滴は界面活性が上昇し球状張力が減少した。同様の効果が、４８時間培養したＫＰＭ−０１８Ｐの上清の液滴でも観察され、細菌が培養液中にサーファクタントを分泌したことが示された。一方、大腸菌もアルカリジェネス・パラドキサスも膜上で液滴の球状形を崩壊するほどのサーファクタントを生成しなかった。同様の結果が、培養液をトマトの葉に滴下した場合でも得られた（図３Ａ；中央）。これらの結果から、４８時間培養したＫＰＭ−０１８Ｐは葉に噴霧するのに適していることが示された。さらに、葉の表面におけるコロニー形成を噴霧後の様々な段階において調査した。図３Ｂは、噴霧から７日後、トマトの葉に生息しているｇｆｐ標識細菌（ＫＰＭ−０１８Ｐ／ｇｆｐ）である。蛍光を有する細菌は、細菌を噴霧した葉の表皮細胞の接合点で多く検出された。さらに、ＫＰＭ−０１８Ｐは、それらの葉を培地に押し付けることによって回収することができた（図３Ｃ）。葉を押し付けた培地から回収された細菌コロニー数は、噴霧から３０分後および７日後の葉１枚あたり、それぞれ５．２±１．１×１０3および３．８±２．６×１０3コロニーであった。さらに、細菌を噴霧した葉のホモジネートから回収された細菌数は、実験期間に渡って４．６±１．８×１０4から２．３±１．２×１０4の範囲にあった（図４）。これらの結果、葉上の細菌個体群は接種後７日以内で有意に減少しないことが示唆された。
【００３８】
本発明の制御アプローチの有効性を試験するために、細菌または水を噴霧した苗に３虫齢の幼虫を放した。表２は、３および４虫齢の段階の幼虫の致死率、蛹化率および成虫の発生率、並びに試験期間中の幼虫による葉の摂食の重症度を示す。ＫＰＭ−０１８Ｐを噴霧した葉を摂取した幼虫はほとんど全てが効果的に死滅し、わずかに蛹化したものの、成虫は発生しなかった。同時に、幼虫による葉の摂取は著しく減少した。一方で、アルカリジェネス・パラドキサスも大腸菌も全く幼虫を死滅させず、蛹化および成虫の発生も抑制しなかった。これは水を噴霧したものと同様であった。
【表２】
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【００３９】
３．考察
日本において、温室栽培のトマトに新しいうどん粉病が発生したことが報告された（Matsuda et al.,2001;Ksashimoto et al.,2003）。この病原体は、本発明者らの温室においても、特に化学的制御が不十分なトマトの若い苗を荒らした（Matsuda et al.,2001）。それ故、この病気を完全に防ぐために殺菌剤を繰り返し使うことが必要であった。しかしながらこれは、化学農薬の使用を減少させようとする、本発明者らが属する大学のポリシーに反するものである。Abikio（１９７８）は、トマトのうどん粉病のコロニー形成および胞子形成のための至適条件を試験し、高湿度（相対湿度１００％）により、病原体の菌糸体の成長と胞子の形成が抑制されることを報告した。これらの調査に基づいて、苗を移植するまで高湿度で栽培し、湿度を維持するために透明ビニルフィルムで囲った育成箱に苗を入れた。この透明ビニルフィルムは、灰色カビ（Botrytis cinerea）がトマト上で光胞子を形成するために、また急速なコロニー化をするために必須な３００ｎｍ以下のＵＶスペクトルを吸収するものであった（Honda & Yunoki,1978）。無菌トマトの苗は、高湿度育成箱で順調に成育できたものの、箱によって害虫の摂食を防ぐことはできなかった。実際のところ、植物食生テントウムシのような葉を落とす虫にはむしろ好適であった。それ故、本発明者らは植物食生害虫の制御、特にバイオコントロール剤を用いた制御に焦点を当てた。
【００４０】
植物食生テントウムシE.vigintioctopunctataは、ナス科の植物の害虫であり（Shirai & Katakura,1999）、本発明者らの温室および畑で自然発生した。これらのテントウムシはしばしばトマトやナスを荒らし、収量を損なう深刻な被害を引き起こす。本発明者らは実験室で、これらの害虫をトマトの葉上で連続的に飼育し維持するシステムを開発した（Otsu et al.,2003a;2003b）。３および４虫齢の幼虫は特に、それらの活発で同調的な葉の摂食のために、現在の研究における処置に適していた。
【００４１】
ここで、トマトの葉の表面から得られた昆虫病原性菌株シュードモナス・フルオレッセンス（ＫＰＭ-０１８Ｐ）は、インキュベーション温度を３７℃から２５℃に低くしたときコロニーの色が淡黄色から赤に変化することで、容易に検出することができた。細菌を最小培地で数ヶ月間連続して継代培養した後でも、テントウムシの幼虫に対するその病原性は安定であった。ＫＰＭ-０１８Ｐの病原性因子は得られていないものの、葉に噴霧されたあとでも安定な病原性は、生物制御資材としての可能性を秘めている。
【００４２】
マイクロピペットを使用することによって、既知量の細菌懸濁液を幼虫に効果的に投入することができ、病気の進行を同調させるのに有用であった。多量の細菌を注入すると、注入後初期の段階において細菌は糞便ペレット中に排出された。高密度（１０7細胞/幼虫）の細菌懸濁液を注入した場合、幼虫に残存するのは１０4〜１０5細菌細胞/幼虫であったが、これらのレベルは幼虫で病気が発生するために必須であることが示唆された。インキュベーション後に感染幼虫が変色した後、細菌は著しく増殖し、虫は動かなくなる。酵素活性（キチナーゼおよびプロテアーゼ）は、細菌の増殖と平行して上昇し、幼虫の体の軟化を引き起こす。この活性によって、増殖した細菌が幼虫から噴出する。
【００４３】
本発明者らは先に、葉に存在する細菌（アルカリジェネス・パラドキサス）を、葉の表面におけるそのコロニー形成の効率が低いために、アルギニン酸ビーズに封じて散布し、害虫を制御した（Otsu et al.,2003a）。対照的に本発明の新規の菌株は、細胞懸濁液として葉に直接使用した場合にトマトの葉の表面で安定したコロニーを形成することができる。一般に、葉上における細菌のコロニー形成は、乾燥ストレス、またはＵＶ照射ストレスが存在する条件下において生存する細菌の能力に依存する（Andrews,1992;Beattie & Lindow,1995）。ＫＰＭ−０１８Ｐは細菌を噴霧した葉から、噴霧７日後でも回収された。本実施例は、葉の表面において細菌が安定したコロニーを形成することを確証する有効なデータを提供した。
【００４４】
本実施例において、ｇｆｐで標識したＫＰＭ−０１８Ｐを用いて葉の表面における細菌のＧＦＰ蛍光を直接観察し、それらのコロニーが局在化していることを観察することができた。実験期間を通して、ＧＦＰ蛍光は細菌を噴霧した葉の表皮細胞の接合点で検出された。これらの接合点は、ＫＰＭ−０１８Ｐが生存し、コロニーを形成するための窪みになりやすいと考えられる。
【００４５】
化学的に見た本発明の菌株の性質も、葉の表面における安定的な定住に寄与する。細菌によるバイオサーファクタントの生成は、葉の表面に付着するのに有用であり、細菌細胞と葉の表面の間の疎水性基質と親水性基質のバランスをコントロールすることによって、葉圏におけるコロニー形成を助け（Bunster et al.,1989）、疎水性の上皮に細胞が付着するための水和性を与える（Bunster et al.,1989）。実際、化学的処理によりバイオサーファクタントを欠損したＫＰＭ−０１８Ｐの変異体は、バイオサーファクタントを生成する細菌に比べて葉から回収できた割合が低く（データは示さず）、これらの基質が葉の表面における細菌のコロニー形成に関与していることが裏付けられた。DesaiおよびBanet（1997）は、リポペプチドまたは糖−タンパク質−脂質バイオサーファクタントを生成するシュードモナス・フルオレッセンスのある株を報告した。ＫＰＭ−０１８Ｐが生成するバイオサーファクタントの同定は、現在本発明者らの研究室で進行中である。
【００４６】
加えて、細菌が生成する細胞外ポリサッカリドは、コロニー形成を邪魔する有害な環境要因から細菌を守るバイオフィルムを形成することもある（Allison et al.,1998;Morris et al.,1998）。噴霧された葉においてＫＰＭ−０１８Ｐがバイオフィルムを形成することは、畑において本発明を実施する際に細菌の持続的なコロニー形成を補助するものとして、実用的な観点から興味深い。ＫＰＭ−０１８Ｐ株はトマトの葉で持続的にコロニーを形成し、その病原性は安定して発現される。従って、例えば１週間おきに２ヶ月間、トマトの苗に細菌懸濁液を噴霧するなどの方法で容易に実用化できる。ＫＰＭ−０１８Ｐを用いた植物害虫防除剤の適用は、育成箱の中において、幼虫を致死させ、成虫の発生を抑制することによって苗を完全に保護する。移植した後、葉が繁茂したトマトは、テントウムシの成虫または幼虫に襲われても深刻な被害を受けないが、苗木の段階においてトマトを保護するためには、植物害虫への対策が必要である。
［参考文献］
【００４７】
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【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ａは、昆虫病原性細菌株シュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐのコロニーであり、細菌が分泌したキチナーゼによって培地に含まれるキチンが加水分解されてできた透明ゾーン（矢印）を有する（Ｃｈｉ−Ｍ９で２日間インキュベーション）。Ｂは、細菌懸濁液をマイクロピペットで経口注入した４虫齢の幼虫である。Ｃは、ＫＰＭ−０１８Ｐ感染幼虫であり、左は注入前、中央は注入後２４時間経過したものである。感染した幼虫の体の色は赤または薄い茶色に変化した。右は感染後７２時間の幼虫をＭ９培地に置いたものでありＫＰＭ−０１８Ｐが感染幼虫から浸出している（培地に移してから４８時間後）。
【図２】テントウムシの幼虫にマイクロピペットで注入したシュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐの増殖、およびキナーゼおよびプロテアーゼ活性を示す。Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ、感染幼虫の病理学的変化の期間であり、それぞれ、動作の停止、変色、および幼虫の殻の軟化に続く細菌浸出の期間である。中白の四角および三角は、それぞれ非接種幼虫のキチナーゼおよびプロテアーゼ活性を示す。
【図３】昆虫病原性細菌株シュードモナス・フルオレッセンスＫＰＭ−０１８Ｐによるサーファクタントの生成およびトマト葉上の細菌コロニー形成の試験。Ａは、細菌によるサーファクタントの生成試験（上および下：疎水性膜上の細菌懸濁液の液滴、および、中央：トマト葉上の細菌懸濁液の液滴）。Ｂは、表皮細胞接合部において葉表面にコロニー形成したＧＦＰ蛍光細菌（ＫＰＭ−０１８Ｐ／ｇｆｐ）（噴霧後７日）。Ｃは、細菌を噴霧したトマトの葉を培地に押し付けて回収したＫＰＭ−０１８Ｐのコロニーである。
【図４】細菌懸濁液を噴霧したトマトの苗の葉から回収した細菌。細菌噴霧した葉を毎日５枚採取し、滅菌水でホモジナイズし抗生物質を含むＣｈｉ−Ｍ９培地に塗布した。データは３回別々に行った実験の平均値および標準偏差である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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