(57)【要約】【課題】  小胞体ストレスを与えずにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路を活性化する分子や薬剤を探索する手法を提供すること。【解決手段】  本発明は、（ａ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および（ｂ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；が共導入された、トランスジェニック細胞または非ヒトトランスジェニック動物を提供する。これらを用いると、ＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路またはＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路の活性化を引き起こし得る物質について、小胞体ストレスの有無を確認することが可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および
（ｂ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；
が共導入された、トランスジェニック細胞。
【請求項２】
前記第１のレポータータンパク質および前記第２のレポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項１に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項３】
（ａ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および
（ｂ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；
が共導入された、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記第１のレポータータンパク質および前記第２のレポータータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質のスクリーニング方法であって、
請求項１または２に記載のトランスジェニック細胞と候補物質とを接触させる工程；
該トランスジェニック細胞において、第１のリポータータンパク質および第２のリポータータンパク質の活性を測定する工程；および
該トランスジェニック細胞において該第１のリポータータンパク質または該第２のリポータータンパク質のいずれか一方の活性のみが測定された候補物質を、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質として選択する工程；
を含む、方法。
【請求項６】
小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質のスクリーニング方法であって、
請求項３または４に記載の非ヒトトランスジェニック動物に候補物質を投与する工程；
該非ヒトトランスジェニック動物において、第１のリポータータンパク質および第２のリポータータンパク質の活性を測定する工程；および
該非ヒトトランスジェニック動物において該第１のリポータータンパク質または該第２のリポータータンパク質のいずれか一方の活性のみが測定された候補物質を、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質として選択する工程；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレスの有無を検査するシステムに関する。より詳細には、小胞体ストレスと小胞体シャペロンの発現誘導とを同時に検査できるシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞には、小胞体と呼ばれる細胞内小器官が存在する。小胞体の主な機能には、分泌タンパク質や膜タンパク質の合成、修飾、および輸送がある。小胞体が正常に機能することにより、恒常性も正常に保たれる。しかし、細胞がある種の環境（ストレス）に曝されると、変性したタンパク質が小胞体内に蓄積し、細胞の機能が低下する。この状態を小胞体ストレスという。細胞には、このような小胞体ストレス状態を克服するためのいくつかの機能が備わっている。その１つは、折り畳み異常タンパク質応答（ＵＰＲ）と呼ばれる応答反応であり、小胞体分子シャペロンの発現を上昇させる。分子シャペロンは、小胞体内の変性タンパク質の正常化、無毒化、および分解を促進し、小胞体ストレスを解除する。
【０００３】
図１に、小胞体ストレスおよびその解除のメカニズムの概念を模式的に示す。ＵＰＲは、現在、以下のような分子メカニズムにより生じると考えられている。変性タンパク質が蓄積することにより引き起こされる小胞体ストレスは、３つの小胞体膜タンパク質ＡＴＦ６、ＩＲＥ１、およびＰＥＲＫにより感知される。小胞体ストレスの感知後、ＡＴＦ６は大きく２つに切断され、活性型ＡＴＦ６タンパク質に変換される（非特許文献１）。ＩＲＥ１はＸＢＰ１のスプライシングを誘導し、活性型ＸＢＰ１タンパク質の産生を促進する（非特許文献２）。ＰＥＲＫはｅＩＦ−２αをリン酸化して機能を低下させ、それによってＡＴＦ４の合成を促進する（非特許文献３）。最終的に、活性型ＡＴＦ６、活性型ＸＢＰ１、およびＡＴＦ４は、小胞体分子シャペロン遺伝子の転写誘導因子として働く。そのため、小胞体ストレスの検出は、従来、ある種の小胞体分子シャペロンの発現量を測定することによって行われてきた。例えば、小胞体分子シャペロンであるＢｉＰやカルレティキュリンのｍＲＮＡの発現レベルをノーザンブロットで検出することなどによって、インビトロで行われている。
【０００４】
上述のように、小胞体ストレスを感知したＩＲＥ１は、ＸＢＰ１のスプライシングを誘導する。この反応を利用して、小胞体ストレスをインビボで検査できるシステム（ＥＲＡＩシステムという）が開発されている（非特許文献４）。図２に、ＥＲＡＩシステムを模式的に表す。このＥＲＡＩシステムでは、ＩＲＥ１依存的にスプライシングされるイントロンを含むＸＢＰ１のｃＤＮＡの（部分）配列と、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子とを、終止コドンを挟んで連結した人工遺伝子を作製し、遺伝子組換え技術を用いて培養細胞や動物に導入する。この人工的遺伝子を有する細胞や動物は、通常、この終止コドンまででその翻訳が終わり、レポータータンパク質は発現しない。しかし、小胞体ストレスに曝された場合、２６塩基からなるイントロンがスプライシングされるため、結果としてフレームシフトが生じて終止コドンの読みがずれ、（部分）ＸＢＰ１とレポーターとの融合タンパク質が産生されて、細胞や動物は、レポーター活性を示すようになる。これにより、小胞体ストレスを容易に検査することが可能になる。
【０００５】
一方、小胞体ストレスを感知したＰＥＲＫは活性化され、上述のようにｅＩＦ−２αをリン酸化することによりその機能を低下させて、ＡＴＦ４遺伝子の翻訳が促進される。すなわち、ＡＴＦ４の発現が誘導される。この現象を解明するために利用されたシステム（ＵＭＡＩシステムという）を図３に示す。このＵＭＡＩシステムは、ＡＴＦ４の真翻訳開始点のコード領域にレポーター遺伝子を導入した人工遺伝子により構築され、ＡＴＦ４遺伝子の転写メカニズムを利用する。すなわち、ＡＴＦ４のｍＲＮＡ中には複数の翻訳開始点が存在し、ストレスがない通常状態時、つまりｅＩＦ−２αが正常に機能しているときには、ＡＴＦ４は偽の上流翻訳開始点から翻訳され、ＡＴＦ４は翻訳されない。しかし、小胞体ストレスによりｅＩＦ−２αの機能が低下しているときには、真の翻訳開始点から翻訳される（非特許文献３）。したがって、上記ＥＲＡＩシステムと同様にレポーター活性を測定することによって、小胞体ストレスを容易に検査することが可能である。
【０００６】
小胞体ストレスは、細胞・分子レベルで古くから非常によく研究されており、最近では、小胞体ストレスがある種の神経変性疾患や循環器系疾患に関与すると報告されている。そのため、小胞体ストレスの鎮静剤、特に小胞体ストレスを与えずに小胞体分子シャペロンの発現を誘導できる薬剤は、これらの疾患の治療薬として期待されている。これまでに、ＩＲＥ１αの活性化により小胞体分子シャペロンの発現が誘導されることが知られている（非特許文献５）。
【非特許文献１】Yoshida H.ら、J. Biol. Chem.，1998年，273巻， pp.33741-33749
【非特許文献２】Yoshida H.ら、Cell，2001年，107巻, pp.881-891
【非特許文献３】Harding H. P.ら、Mol. Cell，2000年，6巻， pp.1099-1108
【非特許文献４】Iwawaki T.ら、Nature Medicine，2004年，10巻，pp.98-102
【非特許文献５】Iwawaki T.ら、Nat. Cell Biol.，2001年，3巻, pp.158-164
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、近年、小胞体ストレスがある種の神経変性疾患や循環器系疾患に関与すると報告されていることから、小胞体ストレスを与えずに小胞体分子シャペロンの発現を誘導できる薬剤は、これら疾患の治療薬として期待されている。そこで、本発明は、小胞体ストレスを与えずにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路を活性化する分子や薬剤を探索する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ両システムを併用できる系の開発を行った。この系において、両方のレポーターが同時に活性化されれば、小胞体ストレスがあることを示し、一方、いずれか一方のみが活性化されれば、小胞体ストレスを与えずに活性化されたことを示す。すなわち、ＥＲＡＩシステム由来のレポーターだけが活性化されれば、小胞体ストレスを与えずにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路が活性化されたことになる。また、ＵＭＡＩシステム由来のレポーターだけが活性化されれば、小胞体ストレスを与えずにＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路が活性化されたことになる。したがって、このような小胞体ストレスの２元的検査システムを用いれば、「小胞体ストレスそのもの」と「小胞体ストレスを与えないＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路やＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路の活性化」とを区別することが可能になる。この点は、ＥＲＡＩシステムまたはＵＭＡＩシステムを単独で使用する場合と大きく異なる。
【０００９】
そこで、本発明は、
（ａ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および
（ｂ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；
が共導入された、トランスジェニック細胞を提供する。
【００１０】
好適な実施態様では、上記トランスジェニック細胞において、上記第１のレポータータンパク質および上記第２のレポータータンパク質は、蛍光タンパク質である。
【００１１】
本発明はまた、
（ａ）ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている、発現ベクター；および
（ｂ）ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含む発現ベクターであって、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている、発現ベクター；
が共導入された、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００１２】
好適な実施態様では、上記非ヒトトランスジェニック動物において、上記第１のレポータータンパク質および上記第２のレポータータンパク質が、蛍光タンパク質である。
【００１３】
本発明はさらに、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質のスクリーニング方法を提供し、この方法は、
上記のトランスジェニック細胞と候補物質とを接触させる工程；
該トランスジェニック細胞において、第１のリポータータンパク質および第２のリポータータンパク質の活性を測定する工程；および
該トランスジェニック細胞において該第１のリポータータンパク質または該第２のリポータータンパク質のいずれか一方の活性のみが測定された候補物質を、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質として選択する工程；
を含む。
【００１４】
本発明はさらに、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質の他のスクリーニング方法を提供し、この方法は、
上記の非ヒトトランスジェニック動物に候補物質を投与する工程；
該非ヒトトランスジェニック動物において、第１のリポータータンパク質および第２のリポータータンパク質の活性を測定する工程；および
該非ヒトトランスジェニック動物において該第１のリポータータンパク質または該第２のリポータータンパク質のいずれか一方の活性のみが測定された候補物質を、小胞体ストレス応答分子の活性を制御し得る物質として選択する工程；
を含む。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ両システムを導入した細胞とマルチウェルルミノメーターとを用いて、薬剤ライブラリーや遺伝子ライブラリーに対してハイスループットスクリーニングを行うことにより、目的の「小胞体ストレスを与えずにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路を活性化する薬剤や分子」の探索を容易に高速で行うことが可能になる。これにより発見された薬剤や分子は、小胞体ストレス関連疾患の治療法の開発だけでなく、ＩＲＥ１やＸＢＰ１などの小胞体ストレス応答分子の基礎的な分子生物学研究にも大いに役立ち得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（本発明の原理）
本発明の原理は、以下のとおりである。本発明のトランスジェニック細胞または非ヒトトランスジェニック動物は、２種類の発現ベクター（ａ）および（ｂ）が共導入されている。発現ベクター（ａ）は、上記のＥＲＡＩシステムが作動し得るように構築され、具体的には、ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている。一方、発現ベクター（ｂ）は、上記のＵＭＡＩシステムが作動し得るように構築され、具体的には、ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている。小胞体ストレスの存在下では、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ両システムが作動して、第１および第２の両方のレポータータンパク質が発現する。小胞体ストレスなしにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路が活性化される場合は、第１のレポータータンパク質のみ発現する。一方、小胞体ストレスなしにＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路が活性化される場合は、第２のレポータータンパク質のみが発現する。このように、ＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路またはＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路の活性化を引き起こし得る物質について、トランスジェニック細胞または非ヒトトランスジェニック動物における小胞体ストレスの有無を確認することが可能である。
【００１７】
（ＥＲＡＩシステム用の遺伝子）
発現ベクター（ａ）は、図２に示すように、ＥＲＡＩシステムが作動するように構築されている。発現ベクター（ａ）は、ＸＢＰ１遺伝子と第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該ＸＢＰ１遺伝子がスプライシングを受けた場合のみ、ＸＢＰ１タンパク質と該第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように配置されている。
【００１８】
ＸＢＰ１遺伝子は、刺激応答遺伝子の一種であり、小胞体ストレス下でＩＲＥ１によって２６ヌクレオチドのイントロンがスプライシングされる。例えば、ヒト、ウシ、マウス、アフリカツメガエル、およびゼブラダニオ（ｚｅｂｒａ  ｆｉｓｈ）のＸＢＰ１のｃＤＮＡ配列が知られており、ＥＳＴデータベース上に、それぞれＢＥ１７０１１９、ＡＶ６０４６６７、ＢＦ１４３０１９、ＡＦ３５８１３３、およびＡＦ３９９９１８として登録されている。本発明においては、ＸＢＰ１のｃＤＮＡとして、ＮＣＢＩの登録番号ＡＢ０７６３８３のヒトＸＢＰ１のｃＤＮＡ（配列番号１）を例に挙げて説明する。非スプライシング時には、配列番号１の９位〜７９４位がコード領域となり、２６１アミノ酸残基からなるＸＢＰ１タンパク質（短縮型）に翻訳される（配列番号２）。一方、ｃＤＮＡのイントロンは、配列番号１の５０２位〜５２７位の塩基配列である。ＩＲＥ１によるＸＢＰ１遺伝子のスプライシングによってフレームシフトが起こり、配列番号１の９位〜５０１位および５２８位〜１１６５位がコード領域になり（配列番号３の９位〜１１３９位）、３７６アミノ酸残基からなる活性型ＸＢＰ１タンパク質に翻訳される（配列番号４）。
【００１９】
第１のレポータータンパク質をコードする遺伝子は、スプライシングによって発現する活性型ＸＢＰ１タンパク質コード領域の下流側の適切な位置に、読み枠が一致するように融合される。すなわち、発現ベクター（ａ）は、ＩＲＥ１によってスプライシングされた場合のみ、活性型ＸＢＰ１タンパク質と第１のレポータータンパク質との融合タンパク質が発現するように、構築される。
【００２０】
第１のレポータータンパク質としては、その発現を確認できるタンパク質であれば特に限定されない。インビボで容易に確認可能な点で、蛍光タンパク質であることが好ましい。蛍光タンパク質としては、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、それらの改変体などが挙げられる。ルシフェラーゼとしては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどが挙げられる。グリーン蛍光タンパク質およびその改変体としては、オワンクラゲグリーン蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（enhanced green fluoro protein）、ＹＦＰ（yellow fluoro protein）、ＢＦＰ（blue fluoro protein）、ＲＦＰ（red fluoro protein）などが挙げられる。これらはいずれも市販されており、容易に入手可能である。
【００２１】
（ＵＭＡＩシステム用の遺伝子）
発現ベクター（ｂ）は、ＡＴＦ４遺伝子と第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子を含み、該第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子が該ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置されている。
【００２２】
小胞体ストレス下では、上述のように、ＰＥＲＫが活性化され、ｅＩＦ−２αがリン酸化されてｅＩＦ−２αの機能が低下して、ＡＴＦ４のｍＲＮＡ中の複数の翻訳開始点のうち最も下流にある真の翻訳開始点からの翻訳が促進される。例えば、ヒト、マウス、アメフラシなどのＡＴＦ４のｃＤＮＡ配列が知られており、ＥＳＴデータベース上に、それぞれＨＳＵ０３７１２、ＮＭ＿００９７１６、およびＡＣＵ４０８５１として登録されている。本発明においては、ＡＴＦ４のｃＤＮＡとして、ＮＣＢＩの登録番号ＢＣ０１１９９４のヒトＡＴＦ４のｃＤＮＡ（配列番号５）を例に挙げて説明する。ＡＴＦ４のｃＤＮＡはｍＲＮＡに転写された後、通常状態時、つまりｅＩＦ−２αが正常に機能しているときには、ＡＴＦ４は偽の複数の上流翻訳開始点から、翻訳される。すなわち、それぞれ配列番号５の４位〜９位、６７位〜７８位、および１６６位〜３４５位が翻訳される。一方、ＰＥＲＫが活性化されると、ＡＴＦ４のｍＲＮＡの真の翻訳開始点である配列番号５の２６３位〜１３１８位が翻訳される。
【００２３】
第２のレポータータンパク質をコードする遺伝子は、ＡＴＦ４遺伝子の真の翻訳開始点よりも下流に配置される。例えば、ＮＣＢＩの登録番号ＨＳＵ０３７１２のヒトＡＴＦ４のｃＤＮＡを例に挙げると、配列番号５の２６３位よりも下流に、より具体的には、真の翻訳開始コドン（配列番号５の２６３〜２６５位）よりも下流に配置される。そのため、ＰＥＲＫが活性化されて真の翻訳開始点から翻訳される場合のみ、第２のレポータータンパク質が発現する。
【００２４】
第２のレポータータンパク質としては、上記の第１のレポータータンパク質と同様に、その発現を確認できるタンパク質であれば特に限定されない。インビボで容易に確認可能な点で、蛍光タンパク質であることが好ましい。また、第１のレポータータンパク質の発現と容易に区別可能なように、第１のレポータータンパク質とは異なるタンパク質とすべきである。第１のレポータータンパク質と第２のレポータータンパク質との組み合わせは、例えば、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼ、ＥＧＦＰとＲＦＰなどの組み合わせが好ましい。
【００２５】
（発現ベクターおよび発現ベクターの導入）
本発明において、上記のシステムを含む発現ベクター、発現ベクターが導入される細胞および非ヒト動物、および発現ベクターの導入方法は、特に限定されず、当業者が通常用いる手段によって行われ得る。
【００２６】
発現ベクターが導入され得る細胞としては、例えば、細菌（大腸菌、乳酸菌など）、酵母（発芽酵母、分裂酵母など）のような単細胞、ならびにヒト由来細胞（ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙなど）、マウス由来細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３など）のような培養細胞が挙げられる。これらはいずれも市販されているか、あるいは公共の研究機関より入手可能である。あるいは、受精卵、胚、器官、組織などに導入してもよい。
【００２７】
発現ベクターとしては、当業者が通常用いる市販の組換え発現用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）が用いられ、その種類は、ベクターを導入すべき細胞などにおいて、所望のタンパク質を発現し得る機能を有するものであれば、特に限定されない。通常、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン、複製開始点などを有し、さらに既知の制限酵素部位を有し、そして栄養要求性、薬剤耐性、温度感受性などのマーカーを有する。例えば、哺乳動物細胞発現ベクターは、ＳＶ４０、ウシ・パピローマウイルスなどの腫瘍ウイルスのプロモーター部分が使用され得る。さらに、ヒト・サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサーを有してもよい。
【００２８】
このような組換え発現用ベクターに、上記の各システムの遺伝子（ＤＮＡ断片）を組込む方法は、特に限定されない。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製など）を用いることができる。
【００２９】
所望のＤＮＡ断片を組込んだ発現ベクターを、所望の細胞に導入する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）に記載の方法などが挙げられる。例えば、リン酸カルシウム法、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などの方法が挙げられる。発現ベクターが導入された細胞、組織などは、適切な選択条件下で培養されて、発現ベクターが正しく導入されたもののみ選択され得、さらに適切な条件下で培養・成長させ得る。
【００３０】
（ＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路を活性化する能力の有無のスクリーニング）
このようにして得られたトランスジェニック細胞または非ヒトトランスジェニック動物は、種々の薬剤について、ＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路および／またはＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路を活性化する能力の有無をスクリーニングするために用いられ得る。
【００３１】
例えば、トランスジェニック細胞は、当業者が通常用いる適切な培地中、適切な条件下で培養された後、スクリーニングすべき薬剤と接触させる。接触の手段としては、例えば、薬剤を培地に添加すること、薬剤を細胞に注入することなどが挙げられる。細胞と薬剤とを一定の期間接触させた後、第１のレポータータンパク質および第２のレポータータンパク質の発現について測定する。各レポータータンパク質の発現の測定は、通常、発現したタンパク質の活性を測定する。例えば、レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合は、細胞の蛍光強度を測定する。
【００３２】
第１のレポータータンパク質の活性のみが上昇している場合は、小胞体ストレスなしにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路のみが活性化されることを示す。逆に、第２のレポータータンパク質の活性のみが上昇している場合は、小胞体ストレスなしにＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路のみが活性化されることを示す。また、第１および第２の両方のレポータータンパク質の活性が上昇している場合は、小胞体ストレスが生じていることを示し、両方の活性がない場合は、小胞体ストレスを生じないが、これらの経路の活性化も生じないことを示す。なお、対照として小胞体ストレスを生じさせる薬剤を用いてもよく、このような薬剤としては、例えば、ツニカマイシン、タプシガルジン、ジチオスレイトールなどが挙げられる。
【００３３】
また、非ヒトトランスジェニック動物については、スクリーニングすべき薬剤を、投与して、第１のレポータータンパク質および第２のレポータータンパク質の発現を測定する。投与方法は、特に限定されず、当業者が通常用いる方法によって行われ得る。例えば、薬剤を適切な媒体とともに、適切な位置に注射または塗布、あるいは経口投与され得る。レポータータンパク質の発現の測定は、動物そのままについて行ってもよいが、動物から採取した細胞について行ってもよい。
【実施例】
【００３４】
ホタルのルシフェラーゼをＥＲＡＩシステムの第１のレポータータンパク質としたＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクター、およびウミシイタケのルシフェラーゼをＵＭＡＩシステムの第２のレポータータンパク質としたＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクターを、以下のように作製し、両ベクターをＨｅＬａ細胞に安定的に共遺伝子導入した。
【００３５】
（ＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクターの作製）
ＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクター（ｐＣＡＸ−Ｆ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｌｕｃ）は、図４に示すように、ＤＮＡ結合ドメインが欠失しているＦＬＡＧタグ付きヒトＸＢＰ１の部分的ｃＤＮＡ断片（Ｆ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤで示す）と、ホタルルシフェラーゼｃＤＮＡ断片（ｌｕｃで示す）とを、ｐＣＡＸベクターに挿入して作製した。ｐＣＡＸは、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびニワトリベータアクチンプロモーターを有し、哺乳動物細胞で下流の遺伝子を高発現させることができる（図５）。
【００３６】
実際のＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクターの作製において、まず、Ｆ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤのＤＮＡ断片を、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡを鋳型にして、２つのプライマー（配列番号６および７）を用いたＰＣＲ法により作出した。ｌｕｃのＤＮＡ断片は、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃Ｅ１７５１）を鋳型にして、２つのプライマー（配列番号８および９）を用いたＰＣＲ法により作出した。次に、ｌｕｃ  ＤＮＡ断片を、ｐＣＡＸのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、続いてＦ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤ  ＤＮＡ断片をＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。こうして得られたｐＣＡＸのＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングしたＤＮＡ配列を、配列番号１０に示す。なお、ヒトＸＢＰ１遺伝子およびｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒの配列情報は、それぞれＮＣＢＩ（登録番号：ＡＢ０７６３８３）およびｐｒｏｍｅｇａ社ウェブサイトより入手可能であり、それぞれ配列番号１および１１に示す。
【００３７】
（ＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクターの作製）
ＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ−ｈＡＴＦ４（１−２６５）−ｈＲＬ−ＨＡ）を、図６に示すように、ヒトＡＴＦ４の部分的ｃＤＮＡ断片（ｈＡＴＦ４（１−２６５）で示す：配列番号５の１位〜２６５位）およびＨＡタグ付きウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ断片（ｈＲＬ−ＨＡで示す）を、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社；＃Ｖ８６０２０）に挿入して作製した。ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）はサイトメガロウイルスエンハンサーおよびプロモーターを有し、哺乳動物細胞で下流の遺伝子を高発現させることができる。また、同ベクターはゼオシン薬剤耐性遺伝子も有する。
【００３８】
実際のＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクターの作製において、まず、ｈＡＴＦ４（１−２６５）のＤＮＡ断片を、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡを鋳型にして、２つのプライマー（配列番号１２および１３）を用いたＰＣＲ法により作出した。ｈＲＬ−ＨＡのＤＮＡ断片は、ｐｈＲＬ−ＴＫ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃Ｅ６２４１）を鋳型にして、２つのプライマー（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲ法により作出した。次に、ｈＲＬ−ＨＡ  ＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、続いてｈＡＴＦ４（１−２６５）ＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。こうして得られたｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングされたＤＮＡ配列を、配列番号１６に示す。なお、ヒトＡＴＦ４遺伝子、ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）、およびｐｈＲＬ−ＴＫ  ｖｅｃｔｏｒの配列情報は、それぞれＮＣＢＩ（登録番号：ＨＳＵ０３７１２）、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社ウェブサイト、およびＰｒｏｍｅｇａ社ウェブサイトより入手可能であり、それぞれ配列番号５、１７、および１８に示す。
【００３９】
（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞、ＥＲＡＩシステム導入細胞（後述）、およびＥＲＡＩ／ＵＭＡＩシステム導入細胞（後述）は、特に明記しない限り、α−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社；＃Ｍ４５２６）に、最終濃度４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を加えた培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。
【００４０】
（ＥＲＡＩシステム導入細胞の取得）
まず、ＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクターを安定的に導入したＨｅＬａ細胞を得るために、リン酸カルシウム法を用いて、ＨｅＬａ細胞に、上記のようにして得たＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクター（ｐＣＡＸ−Ｆ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｌｕｃ）およびｐＴＫ−Ｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社；＃６３１７５０）を質量比４：１で導入した。ｐＴＫ−Ｈｙｇは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの下流でハイグロマイシン耐性遺伝子を発現させるベクターであり、その配列情報はＣｌｏｎｔｅｃｈ社ウェブサイトより入手可能であり、配列番号１９に示す。４８時間後、最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンを培地中に添加し、さらに１週間後、限外希釈法を用いて２４クローンのハイグロマイシン耐性細胞株を取得した。
【００４１】
各クローンにＥＲＡＩシステムが導入されているかどうかを確かめるために、正常条件下および小胞体ストレス条件下でのホタルルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃Ｅ１９１０）およびミトラスＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて測定した。ここで、正常条件は、前述したＨｅＬａ細胞の培養条件で培養し、一方、小胞体ストレス条件は、培地中に最終濃度１μｇ／ｍｌのツニカマイシンを添加して６時間培養した。
【００４２】
正常条件下でのホタルルシフェラーゼ活性値に対する小胞体ストレス条件下でのホタルルシフェラーゼ活性値が最も大きいクローンを、ＥＲＡＩシステム導入細胞（以下、ＥＲＡＩ細胞という場合がある）とした。図７は、正常条件下および小胞体ストレス条件下での、ＥＲＡＩ細胞のホタルルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。データは、独立した３回の試行により得られた数値の平均値±標準誤差で表す。図７からわかるように、小胞体ストレス条件下では、ＥＲＡＩ細胞のホタルルシフェラーゼ活性は、約１０倍上昇していた。
【００４３】
（ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩシステム導入細胞の取得）
次に、リン酸カルシウム法を用いて、上記ＥＲＡＩ細胞に、上記のようにして得たＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ−ｈＡＴＦ４（１−２６５）−ｈＲＬ−ＨＡ）を導入した。４８時間後、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを培地中に添加し、さらに１週間後、限外希釈法を用いて５クローンのゼオシン耐性細胞株を取得した。
【００４４】
各クローンでＥＲＡＩシステムが保持されているかどうか、ならびに新たにＵＭＡＩシステムが導入されているかどうかを確かめるために、正常条件下および小胞体ストレス条件下で、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社；＃Ｅ１９１０）およびミトラスＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて測定した。
【００４５】
正常条件下でのウミシイタケルシフェラーゼ活性値に対する小胞体ストレス条件下でのウミシイタケルシフェラーゼ活性値が最も大きいクローンを、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩシステム導入細胞（以下、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞という場合がある）とした。ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞は、ＥＲＡＩシステムに関して、ＥＲＡＩ細胞と同等のレポーター活性を有していた。図８は、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞の正常条件下と小胞体ストレス条件下でのウミシイタケルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。データは、独立した３回の試行により得られた数値の平均値±標準誤差で表す。図８からわかるように、小胞体ストレス条件下では、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞のウミシイタケルシフェラーゼ活性は、約２０倍上昇していた。
【００４６】
（ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩシステムの独立の確認）
本発明においては、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞に導入された両システムがそれぞれ独立した分子経路で機能することが重要である。すなわち、この細胞中で、ＥＲＡＩシステムはＩＲＥ１の活性に依存的かつＰＥＲＫの活性に非依存的であり、一方、ＵＭＡＩシステムはＰＥＲＫの活性に依存的かつＩＲＥ１の活性に非依存的でなければならない。そこで、これを確認するために、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞に、ヒトＩＲＥ１α発現ベクター（ｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１α：図９に示す）および／またはヒトＰＥＲＫ発現ベクター（ｐＣＡＸ−ｈＰＥＲＫ：図１０に示す）を一過的に導入して、ＩＲＥ１αおよび／またはＰＥＲＫを過剰発現させた。なお、ヒトＩＲＥ１αおよびヒトＰＥＲＫのＤＮＡ配列は、それぞれＮＣＢＩ（登録番号：ＮＭ＿００１４３３およびＮＭ＿００４８３６）から入手可能であり、それぞれ配列番号２０および２１に示す。また対照実験には、空の発現ベクター、ｐＣＡＧ（図１１）およびｐＣＡＸ（図５）を用いた。具体的には、ＩＲＥ１αのみを過剰発現させる場合には、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞に、リン酸カルシウム法を用いて質量比１：１でｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１αおよびｐＣＡＸを導入した。一方、ＰＥＲＫのみを過剰発現させる場合には、質量比１：１でｐＣＡＧとｐＣＡＸ−ｈＰＥＲＫを導入した。また、ＩＲＥ１αおよびＰＥＲＫの両方を過剰発現させる場合は、ｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１αおよびｐＣＡＸ−ｈＰＥＲＫを導入した。結果を、図１２に示す。データは独立した３回の試行により得られた数値の平均値±標準誤差で表す。
【００４７】
ＩＲＥ１αを過剰発現させた場合、ホタルルシフェラーゼ活性、すなわちＥＲＡＩ活性のみが１００〜１５０倍上昇した。ＰＥＲＫを過剰発現させた場合は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性、すなわちＵＭＡＩ活性のみが８〜１０倍上昇した。ＩＲＥ１αおよびＰＥＲＫの両方を過剰発現させた場合は、ホタルルシフェラーゼ活性は１００〜１５０倍上昇し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性も８〜１０倍上昇した。対照としてｐＣＡＧおよびｐＣＡＸを導入した場合は、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性は両方とも上昇しなかった。この結果から、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ両システムの併用により、ＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路の活性化とＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路の活性化とを、小胞体ストレスとは無関係に、独立して検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ両システムを導入した細胞または非ヒト動物を用いて、薬剤ライブラリーや遺伝子ライブラリーに対してハイスループットスクリーニングを行うことにより、小胞体ストレスとは無関係に、ＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路の活性化またはＰＥＲＫ／ＡＴＦ４経路の活性化のみを生じる薬剤や分子を検出できる。特に、ある種の神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病など）の治療に有効と考えられている目的の「小胞体ストレスを与えずにＩＲＥ１／ＸＢＰ１経路を活性化する薬剤や分子の探索」を容易に高速で行うことが可能である。このスクリーニングにより発見された薬剤や分子は、小胞体ストレス関連疾患の治療法の開発だけでなく、ＩＲＥ１やＸＢＰ１などの小胞体ストレス応答分子の基礎的な分子生物学研究にも有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】小胞体ストレス下で生じる細胞内の反応の模式図である。
【図２】ＥＲＡＩシステムにおける遺伝子構築ならびにＥＲＡＩシステムの機構を示す模式図である。
【図３】ＵＭＡＩシステムにおける遺伝子構築ならびにＵＭＡＩシステムの機構を示す模式図である。
【図４】ＥＲＡＩ−ｌｕｃ発現ベクター（ｐＣＡＸ−Ｆ−ｈＸＢＰ１ΔＤＢＤ−ｌｕｃ）の構造を示す模式図である。
【図５】ｐＣＡＸの構造を示す模式図である。図中のＭＣＳはマルチクローニングサイトを示す。
【図６】ＵＭＡＩ−ｒｌｕｃ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ−ｈＡＴＦ４（１−２６５）−ｈＲＬ−ＨＡ）の構造を示す模式図である。
【図７】正常条件下および小胞体ストレス条件下での、ＥＲＡＩ細胞のホタルルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。
【図８】正常条件下および小胞体ストレス条件下での、ＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞のウミシイタケルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。
【図９】ｐＣＡＧ−ｈＩＲＥ１αの構造を示す模式図である。
【図１０】ｐＣＡＸ−ｈＰＥＲＫの構造を示す模式図である。
【図１１】ｐＣＡＸの構造を示す模式図である。
【図１２】ＩＲＥ１αおよび／またはＰＥＲＫを一過的に過剰発現させたＥＲＡＩ／ＵＭＡＩ細胞のホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を示すヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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