(57)【要約】      （修正有）【課題】  オルガネラ内包物流出の新規な検出方法、およびオルガネラ放出物の新規な検出方法を提供する。【解決手段】  本発明のオルガネラ内包物流出の検出方法は、オルガネラを担体に吸着させる工程を有し、吸着剤を用いて吸着させることができる。吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができ、オルガネラとしてはミトコンドリアを用いることができる。担体としては容器を用いることができ、検出方法は、オルガネラから流出する色素を検出する工程が含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルガネラを担体に吸着させる工程を有する
ことを特徴とするオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項２】
吸着剤を用いて吸着させる
ことを特徴とする請求項１記載のオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項３】
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項２記載のオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項４】
オルガネラはミトコンドリアである
ことを特徴とする請求項１記載のオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項５】
担体は容器である
ことを特徴とする請求項１記載のオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項６】
オルガネラから流出する色素を検出する工程を有する
ことを特徴とする請求項１記載のオルガネラ内包物流出の検出方法。
【請求項７】
吸着剤と、色素またはその溶液とを有する
ことを特徴とするオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項８】
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項７記載のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項９】
容器と緩衝液とを有する
ことを特徴とする請求項７記載のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項１０】
吸着剤をコーティングした容器と、色素またはその溶液とを有する
ことを特徴とするオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項１１】
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項１０記載のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項１２】
緩衝液を有する
ことを特徴とする請求項１０記載のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キット。
【請求項１３】
オルガネラを担体に吸着させる工程を有する
ことを特徴とするオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１４】
吸着剤を用いて吸着させる
ことを特徴とする請求項１３記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１５】
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項１４記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１６】
オルガネラはミトコンドリアである
ことを特徴とする請求項１３記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１７】
担体は容器である
ことを特徴とする請求項１３記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１８】
オルガネラからの放出物を検出する工程を有する
ことを特徴とする請求項１３記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項１９】
放出物は、ATP, シトクロムｃ、AIF(apoptosis inducing factor)、リン酸、リンゴ酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、αケトグルタル酸、カルニチン、カルシウムイオン、 またはプロトンである
ことを特徴とする請求項１８記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項２０】
放出物はATPである
ことを特徴とする請求項１８記載のオルガネラ放出物の検出方法。
【請求項２１】
吸着剤と放出物検出用試薬とを有する
ことを特徴とするオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【請求項２２】
放出物検出用試薬はATP検出用試薬であり、
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項２１記載のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【請求項２３】
容器と緩衝液とを有する
ことを特徴とする請求項２１記載のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【請求項２４】
吸着剤をコーティングした容器と、放出物検出用試薬とを有する
ことを特徴とするオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【請求項２５】
放出物検出用試薬はATP検出用試薬であり、
吸着剤はポリフェノール蛋白質である
ことを特徴とする請求項２４記載のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【請求項２６】
緩衝液を有する
ことを特徴とする請求項２４記載のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルガネラ内包物流出の検出方法に関する。
また、本発明は、オルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キットに関する。
また、本発明は、オルガネラ放出物の検出方法に関する。
また、本発明は、オルガネラ放出物の検出に用いる測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリア内膜に生じる膜透過性遷移孔の形成を検出するために、あらかじめミトコンドリア内部に取り込ませた親水性の蛍光色素であるcalceinのミトコンドリア外への流出を、ミトコンドリア内部のcalceinの蛍光強度の減少を測定して求める方法がある（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。calcein分子は高い親水性を保持するため、ミトコンドリア内膜に非特異的に物質を透過させる大きな穴（膜透過性遷移孔）が生じた場合のみ、ミトコンドリアから漏れ出る性質を持つ。calceinをミトコンドリアに取り込ませる方法は、つぎの通りである。高い親水性を持つcalceinにアセトキシメチル(AM)基をエステル結合させて両親媒性にした化合物であるcalcein-AM（molecular probes 社製）をミトコンドリア内部に取り込ませ、esteraseによるエステル結合の切断により親水性のcalceinを生じさせる(化１参照)。
【０００３】
【化１】
2005274562.tif 000002
【０００４】
一方、ポリフェノール蛋白質（商品名:Cell-Tak, Becton Dickinson社製）膜でコーティングした基板上にミトコンドリアを吸着させる技術が報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００５】
なお、発明者は、本発明に関連する技術内容を開示している（例えば、非特許文献４〜７参照。）。
【０００６】
一方、ミトコンドリア内側から外側に輸送された放出物例えばATPの量を計測し、ミトコンドリア膜蛋白質の輸送活性を測定する方法が報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。これらの方法には、例えば、適当な緩衝液にミトコンドリアを懸濁し、ミトコンドリアから放出されたATP量を懸濁液の状態で測定する方法、あるいは、放出されたATPとミトコンドリアを遠心分離操作により分離し、ミトコンドリアの上清に含まれるATP量を測定する方法などがある。
【０００７】
【非特許文献１】Huser, J., C. E. Rechenmacher, and L. A. Blatter 1998. Imaging the permeability pore transition in single mitochondria. Biophys. J.74:2129-2137
【非特許文献２】Petronilli, V., G. Miotto, M. Canton, M. Brini, R. Colonna, P. Bernardi, and F. Di Lisa. 1999. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calceinfluorescence. Biophys. J. 76:725-734
【非特許文献３】Nakayama, S., T. Sakuyama, S. Mitaku, and Y. Ohta. 2002. Fluorescence imaging of metabolic responses in single mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun.290:23-28
【非特許文献４】太田善浩  他3名、第77回日本生化学会、平成16年10月16日「基盤に吸着させたミトコンドリアにおける膜透過性遷移の検出」
【非特許文献５】上地悠紀子  他3名、第42回日本生物物理学会年会、平成16年12月15日「基盤に吸着させたミトコンドリアの活性計測」
【非特許文献６】吉岡久史  他3名、第4回日本ミトコンドリア研究会年会、平成16年12月17日「基盤に吸着させたミトコンドリアを用いた膜透過性遷移の検出」
【非特許文献７】Hattori 他4名、“Repetitive transient depolarizations of the inner mitochondrial membrane induced by proton pumping.”平成17年1月14日、[平成17年2月22日検索]、インターネットURL:http://www.biophysj.org/aheadofprint.shtml）、Biophysical Journal
【非特許文献８】市川文登  他2名、第4回日本ミトコンドリア研究会年会、平成16年12月17日「生理的濃度のコルチコステロンが単離ミトコンドリアATP合成に及ぼす影響」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述したミトコンドリア内膜に生じる膜透過性遷移孔の形成を検出する方法には、以下のような問題点がある。
【０００９】
ミトコンドリア内部を外部と区別して測定するため、ミトコンドリア内部に高濃度のcalceinを取り込ませる。そのため内部では自己消光が起こっており、calceinが流出してもミトコンドリア内部の蛍光強度は僅かしか変化しない状態にある。この理由により、calceinの流出による蛍光強度減少の検出が困難であり、特に、膜透過性遷移孔の形成が単時間しか形成されない場合など、大量にcalceinが流出しない場合は、検出自体が不可能である。
【００１０】
calceinのミトコンドリアからの流出を時間分解測定することは、膜透過性遷移孔の形成に関する詳細な情報を与える。しかしながら、ミトコンドリア内に閉じ込められたcalceinの蛍光強度減少を時間分解測定するためには、従来法ではcalceinに励起光を照射し続ける必要があり、calceinの退色を生じさせる。この退色による蛍光強度減少と流出による蛍光強度減少と区別がつかず、精度の高い測定ができていない。
【００１１】
細胞内小器官であるミトコンドリアは大変小さく（直径約1μm）、ミトコンドリア内外のcalceinの蛍光強度を区別して測定するには、顕微鏡による測定が必要である。そのため、焦点を合わせるなどの手作業が必要となり、また、その箇所を自動化しても極めて高価な装置が必要となる上、上述の問題が残る。
【００１２】
一方、ミトコンドリア内側から外側に輸送されたATP量を計測し、ミトコンドリア膜蛋白質の輸送活性を測定する方法には、以下のような問題がある。
【００１３】
従来法のうち、ミトコンドリアを懸濁液から分離しない方法では、測定の際にATPが作られたり分解されたりする影響が無視できず、精度の高い測定が不可能である。また、ミトコンドリアとATPの分離を行う方法では、遠心分離操作に10分以上要したので、輸送されたATPの量を測るのに時間分解能が悪かった。更に、遠心分離操作は手間がかかるので、放出されたATPをロボットを用いて大量に測定する際に障害となっていた。
【００１４】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、オルガネラ内包物流出の新規な検出方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、オルガネラ内包物流出の検出に用いる新規な測定キットを提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明は、オルガネラ放出物の新規な検出方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、オルガネラ放出物の検出に用いる新規な測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明のオルガネラ内包物流出の検出方法は、オルガネラを担体に吸着させる工程を有することを特徴とする。
【００１７】
ここで、オルガネラは吸着剤を用いて吸着させることができる。吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。オルガネラとしてはミトコンドリアを用いることができる。担体としては容器を用いることができる。検出方法は、オルガネラから流出する色素を検出する工程を含めることができる。
【００１８】
本発明のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キットは、吸着剤と、色素またはその溶液とを有することを特徴とする。
【００１９】
ここで、吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。測定キットには、容器と緩衝液とを含めることができる。
【００２０】
本発明のオルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キットは、吸着剤をコーティングした容器と、色素またはその溶液とを有することを特徴とする。
【００２１】
ここで、吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。測定キットには緩衝液を含めることができる。
【００２２】
本発明のオルガネラ放出物の検出方法は、オルガネラを担体に吸着させる工程を有することを特徴とする。
【００２３】
ここで、オルガネラ吸着剤を用いて吸着させることができる。吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。オルガネラとしてはミトコンドリアを用いることができる。担体としては容器を用いることができる。検出方法は、オルガネラからの放出物を検出する工程を含めることができる。放出物としては、ATP, シトクロムｃ、AIF(apoptosis inducing factor)、リン酸、リンゴ酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、αケトグルタル酸、カルニチン、カルシウムイオン、 またはプロトンを適用することができる。
【００２４】
本発明のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キットは、吸着剤と放出物検出用試薬とを有することを特徴とする。
【００２５】
ここで、放出物検出用試薬してはATP検出用試薬を用いることができ、吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。測定キットには、容器と緩衝液とを含めることができる。
【００２６】
本発明のオルガネラ放出物の検出に用いる測定キットには、吸着剤をコーティングした容器と、放出物検出用試薬とを有することを特徴とする。
【００２７】
ここで、放出物検出用試薬としてはATP検出用試薬を用いることができ、吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。測定キットには緩衝液を含めることができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、以下に記載されるような効果を奏する。
本発明は、オルガネラを担体に吸着させる工程を有するので、オルガネラ内包物流出の新規な検出方法を提供することができる。
【００２９】
本発明は、吸着剤と、色素またはその溶液とを有するので、オルガネラ内包物流出の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【００３０】
本発明は、吸着剤をコーティングした容器と、色素またはその溶液とを有するので、オルガネラ内包物流出の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【００３１】
本発明は、オルガネラを担体に吸着させる工程を有するので、オルガネラ放出物の新規な検出方法を提供することができる。
【００３２】
本発明は、吸着剤と放出物検出用試薬とを有するので、オルガネラ放出物の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【００３３】
本発明は、吸着剤をコーティングした容器と、放出物検出用試薬とを有するので、オルガネラ放出物の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明する。
まず、オルガネラ内包物流出の検出方法にかかる、発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００３５】
オルガネラ内包物流出の検出方法において、最初の操作では、吸着剤を担体にコーティングする。
【００３６】
担体としては、容器を用いることができる。具体的には容器として、培養皿、マイクロプレート、組織培養用フラスコなどを用いることができる。
【００３７】
吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。吸着剤はこのポリフェノール蛋白質に限定されない。このほか、ニトロセルロース膜などを用いることができる。
【００３８】
コーティングの方法は、吸着剤の希釈液を培養皿に滴下し、培養皿の底面に満遍なく行き渡るように培養皿をゆすり、その後所定温度で所定時間放置する。その後、培養皿の表面を超純水で洗浄する。
【００３９】
コーティングの方法は、上述の方法に限定されない。このほか、吸着剤をスポット状に滴下し、その後所定温度で所定時間放置するなどの方法を採用することができる。
【００４０】
つぎの操作では、吸着剤でコーティングした培養皿にオルガネラを吸着させる。
【００４１】
オルガネラとしては、ミトコンドリアを用いることができる。オルガネラは、このミトコンドリアに限定されない。このほか、核、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム、葉緑体などを用いることができる。
【００４２】
オルガネラの調整方法は、一般的な方法を採用することができる。具体的には、遠心分離法、密度勾配遠心分離法などを採用することができる。
【００４３】
オルガネラを培養皿に吸着させる方法は、オルガネラを懸濁した緩衝液１を培養皿に加え、培養皿の底に満遍なく行き渡るようにゆすり、所定温度で所定時間放置する。つぎに、オルガネラを吸着させた培養皿表面を、緩衝液２で洗浄し付着したゴミや吸着されなかったオルガネラを洗い落とす。
【００４４】
緩衝液１としては、超純水にTrisaminomethaneを終濃度 10mM、Sucroseを終濃度250mM 、EGTA を終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、β-NAD＋を1mMになるように溶解し、pHはHCｌ水溶液を使用して7.4に調製した緩衝液を用いることができる。緩衝液１は上述の緩衝液に限定されない。このほか、緩衝能をもつ物質としてHepesやMopsなど、浸透圧を整える物質としてmannitolやKClなど、２価の金属イオンのキレート剤としてEDTAなどを上記の代わりに用いることができる。また、目的に応じて、SucroseやDithiothreitol、EGTA、β-NAD＋は除くこともできる。
【００４５】
緩衝液２としては、超純水にTrisaminomethaneを終濃度10 mM, Sucroseを終濃度250mM, EGTAを終濃度2mM, Dithiothreitolを終濃度0.1mMになるように溶解し、pHは7.4に調製した緩衝液を用いることができる。緩衝液２は上述の緩衝液に限定されない。このほか、緩衝能をもつ物質としてHepesやMopsなど、浸透圧を整える物質としてmannitolやKClなど、２価の金属イオンのキレート剤としてEDTAなどを上記の代わりに用いることができる。また、目的に応じて、SucroseやDithiothreitol、EGTAは除くこともできる。
【００４６】
オルガネラを培養皿に吸着させる場合、温度は0 〜10 ℃の範囲にあることが好ましい。温度が0 ℃以上であると、水が凍らないという利点がある。温度が10 ℃以下であると、ミトコンドリアの活性が低下しないという利点がある。
【００４７】
オルガネラを培養皿に吸着させる場合、時間は30 〜120分の範囲にあることが好ましい。時間が30分以上であると、十分量のミトコンドリアが担体に吸着するという利点がある。時間が120分以下であると、ミトコンドリアの活性が低下しないという利点がある。
【００４８】
オルガネラを培養皿に吸着させる方法は、上述したオルガネラを懸濁した緩衝液１を培養皿に加え、所定温度で所定時間放置する方法に限定されない。このほか、遠心操作による吸着などの方法を採用することができる。
【００４９】
つぎの操作では、吸着したオルガネラに色素を取り込ませる。
【００５０】
オルガネラに色素を取り込ませる方法は、色素溶液を緩衝液２に溶解する。この溶液を、オルガネラが吸着している培養皿に添加し、所定温度で所定時間放置する。その後、培養皿表面を緩衝液２で洗浄する。
【００５１】
色素としては、calcein-AM（molecular probes社製）を用いることができる。色素はこのcalcein-AMに限定されない。このほか、5-carboxyfluorescein diacetate, 6-carboxyfluorescein diacetate, 5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate, Oregon Green 488 carboxylic acid diacetateなどを用いることができる。
【００５２】
緩衝液２は、上述したとおりである。
【００５３】
オルガネラに色素を取り込ませる方法は、上述した色素を溶解した緩衝液２を、オルガネラが吸着している培養皿に添加し、所定温度で所定時間放置する方法に限定されない。このほか、ミトコンドリアを緩衝液２に懸濁した状態で色素を取り込ませ、色素を取り込んだミトコンドリアを上述の方法で担体に吸着させるなどの方法を採用することができる。
【００５４】
つぎの操作では、オルガネラから流出する色素を検出する
【００５５】
オルガネラから流出する色素の検出方法は、色素を取り込んだオルガネラを吸着した培養皿に、試験をしたい物質を溶解した緩衝液２を加え、撹拌する。この上澄みを所定量回収し、試料とする。所定の条件で、この試料の蛍光を測定する。
【００５６】
緩衝液２は、上述したとおりである。
【００５７】
オルガネラから流出する色素の検出方法は、上述したオルガネラを吸着した培養皿に、試験をしたい物質を溶解した緩衝液２を加え、この上澄みを試料として、その蛍光を測定する方法に限定されない。このほか、試料の吸光度を測定する、及び試料中に含まれる流出した内包物を適当な方法で定量するなどの方法を採用することができる。
【００５８】
つぎの操作では、オルガネラ数をカウントする。
オルガネラ数をカウントする方法は、容器に吸着しているオルガネラ数をカウントする。この作業により、検出された色素量を担体に吸着したオルガネラ数で標準化できるため、オルガネラに生じた質的な変化を検出できるようになる。
【００５９】
本発明の適用は、オルガネラ内包物流出の検出に限定されない。このほか、オルガネラ膜の輸送蛋白質による物質やイオンの輸送の検出などに適用することができる。
【００６０】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、オルガネラを担体に吸着させる工程を有するので、オルガネラ内包物流出の新規な検出方法を提供することができる。
【００６１】
つぎに、オルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キットにかかる、発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００６２】
測定キットには、吸着剤が含まれる。吸着剤は、上述したとおりである。
測定キットには、容器が含まれる。容器は、上述したとおりである。容器は、あらかじめ吸着剤をコーティングしたものであってもよい。
測定キットには、色素またはその溶液が含まれる。色素は、上述したとおりである。
測定キットには、緩衝液１が含まれる。緩衝液１は、上述したとおりである。
測定キットには、緩衝液２が含まれる。緩衝液２は、上述したとおりである。
【００６３】
測定キットは、吸着剤と、色素またはその溶液とを有することが好ましい。また、測定キットは、さらに容器、緩衝液１、および緩衝液２を有することがさらに好ましい。
【００６４】
測定キットは、吸着剤をコーティングした容器と、色素またはその溶液とを有することが好ましい。また、測定キットは、さらに緩衝液１および緩衝液２を有することがさらに好ましい。
【００６５】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、吸着剤と、色素またはその溶液とを有するので、オルガネラ内包物流出の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【００６６】
本発明を実施するための最良の形態によれば、吸着剤をコーティングした容器と、色素またはその溶液とを有するので、オルガネラ内包物流出の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【００６７】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【００６８】
つぎに、オルガネラ放出物の検出方法にかかる、発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００６９】
オルガネラ放出物の検出方法において、最初の操作では、吸着剤を担体にコーティングする。
【００７０】
担体としては、容器を用いることができる。具体的には容器として、培養皿、マイクロプレート、組織培養用フラスコなどを用いることができる。
【００７１】
吸着剤としてはポリフェノール蛋白質を用いることができる。吸着剤はこのポリフェノール蛋白質に限定されない。このほか、ニトロセルロース膜などを用いることができる。
【００７２】
コーティングの方法は、吸着剤の希釈液を培養皿に滴下し、培養皿の底面に満遍なく行き渡るように培養皿をゆすり、その後所定温度で所定時間放置する。その後、培養皿の表面を超純水で洗浄する。
【００７３】
コーティングの方法は、上述の方法に限定されない。このほか、吸着剤をスポット状に滴下し、その後所定温度で所定時間放置するなどの方法を採用することができる。
【００７４】
つぎの操作では、吸着剤でコーティングした培養皿にオルガネラを吸着させる。
【００７５】
オルガネラとしては、ミトコンドリアを用いることができる。オルガネラは、このミトコンドリアに限定されない。このほか、核、小胞体、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム、葉緑体などを用いることができる。
【００７６】
オルガネラの調整方法は、一般的な方法を採用することができる。具体的には、遠心分離法、密度勾配遠心分離法などを採用することができる。
【００７７】
オルガネラを培養皿に吸着させる方法は、オルガネラを懸濁した緩衝液１を培養皿に加え、培養皿の底に満遍なく行き渡るようにゆすり、所定温度で所定時間放置する。つぎに、オルガネラを吸着させた培養皿表面を、緩衝液２で洗浄し付着したゴミや吸着されなかったオルガネラを洗い落とす。緩衝液１および緩衝液２は、上述したとおりである。
【００７８】
オルガネラを培養皿に吸着させる場合、温度は0 〜10 ℃の範囲にあることが好ましい。温度が0 ℃以上であると、水が凍らないという利点がある。温度が10 ℃以下であると、ミトコンドリアの活性が低下しないという利点がある。
【００７９】
オルガネラを培養皿に吸着させる場合、時間は30 〜120分の範囲にあることが好ましい。時間が30分以上であると、十分量のミトコンドリアが担体に吸着するという利点がある。時間が120分以下であると、ミトコンドリアの活性が低下しないという利点がある。
【００８０】
オルガネラを培養皿に吸着させる方法は、上述したオルガネラを懸濁した緩衝液１を培養皿に加え、所定温度で所定時間放置する方法に限定されない。このほか、遠心操作による吸着などの方法を採用することができる。
【００８１】
つぎの操作では、ATP測定用緩衝液を添加する。
ATP測定用緩衝液を添加する方法は、ATP測定用緩衝液を所定量添加して、所定時間所定温度で静置する。なお、ここで説明した操作は省略してもかまわない。この操作を省略して、つぎの操作に進めることができる。
【００８２】
ATP測定用緩衝液は、超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mMになるように溶解した緩衝液である。ATP測定用緩衝液は、この緩衝液に限定されない。このほか、Trisaminomethaneの代わりにHEPESやMOPS、Sucroseの代わりにmannitolやKCｌ、EGTAの代わりにEDTAを用いることができる。また、Dithiothreitolは除くことができる。
【００８３】
つぎの操作では、ATP放出測定用緩衝液を添加する。
ATP放出測定用緩衝液を添加する方法は、ATP放出測定用緩衝液を所定量添加し、均一になるようによく攪拌する。
【００８４】
ATP放出測定用緩衝液としては、超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mM、リンゴ酸を終濃度5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した緩衝液、または、超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した緩衝液がある。ATP放出測定用緩衝液は、これらの緩衝液に限定されない。このほか、Trisaminomethaneの代わりにHEPESやMOPS、Sucroseの代わりにmannitolやKCｌ、EGTAの代わりにEDTAを用いることができる。また、Dithiothreitolは除くことができる。また、リンゴ酸の代わりに、ピルビン酸、クエン酸、αケトグルタル酸、グルタミン酸、コハク酸、tetramethyl-p-phenylenediamineなどを用いることができる。
【００８５】
つぎの操作では、サンプリングをする。
サンプリングをする方法は、前の操作直後に上清を所定量採取する。つぎに、所定時間間隔で上清を所定量ずつ採取する。
【００８６】
サンプリングの時間間隔は5秒〜２分の範囲内にあることが好ましい。また、時間間隔は15秒〜1分の範囲内にあることがさらに好ましい。
【００８７】
時間間隔が５秒以上であると、ミトコンドリア上清をしっかりと攪拌できるという利点がある。時間間隔が15秒以上であると、この効果がより顕著になる。
【００８８】
時間間隔が2分以下であると、遠心分離法を用いた際には検出できなかった放出速度の時間依存性が観察できるという利点がある。時間間隔が1分以下であると、この効果がより顕著になる。
【００８９】
つぎの操作では、放出物を定量する。
放出物を定量する方法は、各時刻で採取した上清に含まれる放出物を、放出物検出用試薬を用いて定量する。放出物検出用試薬としては、一例としてATP検出用試薬を用いることができる。ATP検出用試薬としては、ルシフェラーゼ-ルシフェリンを用いることができる。 
【００９０】
つぎの操作では、オルガネラ数をカウントする。
オルガネラ数をカウントする方法は、容器に吸着しているオルガネラ数をカウントする。オルガネラは、一例としてミトコンドリアを採用することができる。この作業により、検出されたATP量を担体に吸着したオルガネラ数で標準化できるため、オルガネラ吸着量が異なる担体間でも結果が比較できるようになる。
【００９１】
以上、オルガネラ放出物の検出方法について説明した。放出物の一例としてATPについて説明した。本発明は、ATPの検出に限定されるものではない。このほか、放出物としては、シトクロムｃ、AIF(apoptosis inducing factor)、リン酸、リンゴ酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、αケトグルタル酸、カルニチン、カルシウムイオン、 またはプロトンなどに適用することができる。
【００９２】
シトクロムCは抗体を用いたwestern blottingあるいは比色定量により、AIFは抗体を用いたwestern blottingにより、リンゴ酸、クエン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、αケトグルタル酸はHPLCで分離後、アミノ酸の比色法により、リン酸はモリブデン青法により、カルニチンは酵素法による比色定量、カルシウムはカルシウム感受性蛍光色素により、プロトンはｐHメーターにより定量する。
【００９３】
また、本発明の適用は、オルガネラからの放出物の検出に限定されない。オルガネラ外の液に含まれる物質の濃度を測定することで、当該物質がオルガネラに取り込まれる速度を測定することもできる。候補の物質としては、ピルビン酸、オルニチン、アシルカルニチン、グルタミンなどが上げられる。
【００９４】
本方法においては、オルガネラとその上清を迅速・簡易に分離することができる。オルガネラを担体に吸着させることで、その上清を採取するだけでオルガネラと上清を分離できるので、従来法の遠心分離と比較して簡易・迅速な分離が可能となる。その結果、本方法では、短時間の分解能で測定できる。また、広範囲のオルガネラ膜蛋白質による物質の輸送活性を簡易に測定できる。
【００９５】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、オルガネラを担体に吸着させる工程を有するので、オルガネラ放出物の新規な検出方法を提供することができる。
【００９６】
つぎに、オルガネラ放出物の検出に用いる測定キットにかかる、発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００９７】
測定キットには、吸着剤が含まれる。吸着剤は、上述したとおりである。
測定キットには、容器が含まれる。容器は、上述したとおりである。容器は、あらかじめ吸着剤をコーティングしたものであってもよい。
測定キットには、放出物検出用試薬が含まれる。放出物検出用試薬は、上述したとおりである。
測定キットには、緩衝液１が含まれる。緩衝液１は、上述したとおりである。
測定キットには、緩衝液２が含まれる。緩衝液２は、上述したとおりである。
測定キットには、ATP測定用緩衝液が含まれる。ATP測定用緩衝液は、上述したとおりである。
測定キットには、ATP放出測定用緩衝液が含まれる。ATP放出測定用緩衝液は、上述したとおりである。
【００９８】
測定キットは、吸着剤と放出物検出用試薬とを有することが好ましい。また、測定キットは、さらに容器、緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝液を有することがさらに好ましい。
【００９９】
測定キットは、吸着剤をコーティングした容器と、放出物検出用試薬とを有することが好ましい。また、測定キットは、さらに緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝液を有することがさらに好ましい。
【０１００】
以上のことから、本発明を実施するための最良の形態によれば、吸着剤と放出物検出用試薬とを有するので、オルガネラ放出物の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【０１０１】
本発明を実施するための最良の形態によれば、吸着剤をコーティングした容器と、放出物検出用試薬とを有するので、オルガネラ放出物の検出に用いる新規な測定キットを提供することができる。
【０１０２】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【０１０３】
オルガネラ内包物流出の検出方法にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【０１０４】
実施例１（膜透過性遷移孔が形成されない条件での測定）
最初の操作では、ポリフェノール蛋白質（商品名：Cell-Tak，Becton Dickinson社製）を希釈し、培養皿をCell-Takでコーティングした。具体的な操作は以下の通りである。0.1 Mの濃度で超純水に溶解した炭酸水素ナトリウムを用いて、Cell-Takを50倍に希釈し、撹拌した。つぎに、作製したCell-Takの希釈液を、直径35mm の培養皿に800μl滴下し、培養皿の底面に満遍なく行き渡るように培養皿をゆすり、その後室温で30分間放置した。その後、培養皿の表面を超純水で2度洗浄し、余分な水分を吸い取ってから4℃で保存した。
【０１０５】
つぎの操作では、Cell-Takでコーティングした皿にミトコンドリアを吸着させた。あらかじめ緩衝液１に蛋白濃度0.2mg/mlになるように懸濁したミトコンドリア１mlを培養皿に加え、培養皿の底に満遍なく行き渡るようにゆすり、氷上で90分放置した。なお、緩衝液１とは、超純水にTrisaminomethaneを終濃度 10mM、Sucroseを終濃度250mM 、EGTA を終濃度２mM、Dithiothreitol を終濃度0.1mM、β-NAD＋を1mMになるように溶解し、pHはHCl水溶液を使用して7.4に調製した緩衝液である。つぎに、ミトコンドリアを吸着させた培養皿表面を、緩衝液２（10 mM trisaminomethane, 250mM sucrose, 2mM EGTA,0.1mM dithiothreitol,pH7.4）で静かに2回洗浄し付着したゴミや吸着されなかったミトコンドリアを洗い落とした。
【０１０６】
つぎの操作では、吸着したミトコンドリアにcalceinを取り込ませた。具体的な操作は以下の通りである。1mMの濃度でDMSOに溶解したcalcein-AM（molecular probes社製）3μlを997μlの緩衝液２に加え、よく撹拌した。つぎにミトコンドリアが吸着している培養皿に1mlを添加し、遮光しながら25℃で20分間放置し、calcein-AMをミトコンドリアに取り込ませ、calceinへと変換させた。その後、培養皿表面を緩衝液２で洗浄した。
【０１０７】
つぎの操作では、ミトコンドリアから流出したcalceinを検出した。calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、0.5mMのADPを溶解した緩衝液２を2000μl加え、撹拌した。この上澄みを750μl回収し、時刻0分における試料とした。また、10分後に上澄みを750μl回収し、時刻10分における試料とした。以上の実施は、すべて暗中で行った。
【０１０８】
励起光493nm蛍光520nmの条件で、時刻0分、10分における試料の蛍光を測定した。また、時刻0分の値に対する時刻10分の値の比をとり、時刻10分における値とした。比を求めるのは、ミトコンドリアの量の差による流出量の差を補正するためである。
【０１０９】
実施例２（短時間の膜透過性遷移孔の形成が頻繁に繰り返される条件での測定）
calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、緩衝液２を2000μl加え、撹拌する。この上澄みを750μl回収し、時刻0分における試料とした。つぎに、最終濃度5mMになるようにリンゴ酸30μlを加えよく撹拌した後、10分後に上澄みを750μl回収し、時刻10分における試料とした。このほかは、実施例１と同じである。
【０１１０】
実施例３（膜透過性遷移孔が安定して形成される条件での測定）
calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、終濃度50μMになるようにCaCl2を溶解した緩衝液２を2000μl加え、撹拌した。この上澄みを750μl回収し、時刻0分における試料とする。つぎに、最終濃度5mMになるようにリンゴ酸30μlを加えよく撹拌した後、10分後に上澄みを750μl回収し、時刻10分における試料とした。このほかは、実施例１と同じである。
【０１１１】
実施例４（阻害剤を用いてCa2+による膜透過性遷移孔の安定な形成を阻害した条件での測定）
calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、終濃度50μMのCaCl2、2μM cyclosporin Aを溶解した緩衝液２を2000μl加え、撹拌した。この上澄みを750μl回収し、時刻0分における試料とする。つぎに、最終濃度5mMになるようにリンゴ酸30μlを加えよく撹拌した後、10分後に上澄みを750μl回収し、時刻10分における試料とした。このほかは、実施例１と同じである。
【０１１２】
実施例１〜４の測定結果について比較する。結果は、図１に示すとおりである。ここで、各実施例は、それぞれ３個のサンプルについて測定した。図１に示す棒グラフは、測定値の平均値を示すものである。棒グラフの上端に記載されている細い線は、標準誤差をしめす。それぞれの実施例における値は、平均値±標準誤差で実施例１が1.26±0.04、実施例２が1.99±0.09、実施例３が5.94±0.91、実施例４が1.60±0.16である。
【０１１３】
実施例１はミトコンドリア膜透過性遷移がもっとも生じにくい条件下で、calcein流出を測定したものである。10分経過してもほとんどcalceinが流出されていない。実施例２は膜透過性遷移が短時間生じる条件で行われた例で、わずかなcalceinの流出から膜透過性遷移がわずかに生じていることがわかる。また、実施例３は膜透過性遷移が長時間持続する条件であり、calceinの流出が最大になっている。実施例４は実施例３の条件に、長時間の膜透過性遷移を阻害する試薬cyclosporin Aを加えたもので、実施例２と同様にわずかなcalceinの流出が認められる。
【０１１４】
本実施例と従来の方法を、測定方法について比較してみる。従来の方法では、ミトコンドリア内膜に生じる膜透過性遷移孔の形成を検出するために、あらかじめミトコンドリア内部に取り込ませた親水性の蛍光色素であるcalceinのミトコンドリア外への流出を、ミトコンドリア内部のcalceinの蛍光強度の減少を測定して求めている（例えば、Huser, J., C. E. Rechenmacher, and L. A. Blatter 1998. Imaging the permeability pore transition in single mitochondria. Biophys. J. 74:2129-2137）。
【０１１５】
ミトコンドリアに5μMの濃度でcalcein-AMを取り込ませた後、カバーガラスに設置する。その後、10mM succinate を含んだ緩衝液（140mM KCl, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 0.5 mM KH2PO4, 0.5 mM EGTA, pH = 7.4）を加える。その後の個々のミトコンドリアにおけるcalceinの蛍光強度を、励起光498nm蛍光515-525nmで測定して求める。
【０１１６】
従来の方法では、発明が解決しようとする課題で述べた理由により検出力が低い。一方、本方法ではミトコンドリアの外に放出されたcalceinの蛍光強度を測定するため、低濃度で測定でき自己消光の影響をうけない。また、任意の時間で光を照射せずに上澄み液を抽出して測定できるので、光照射による退色の影響を受けずに、時間分解測定できる。また、顕微鏡を用いる必要がないので自動化が容易にでき、多量の試料を測定することができる。
【０１１７】
本実施例と従来の方法を、自動化の可能性について比較する。マイクロウェルに溶液を分注・採取でき、その溶液の蛍光強度を測定できる市販の装置を用いれば、本発明により膜透過性遷移検出の自動化が可能になる。本発明では、ミトコンドリアはあらかじめ容器内に固定されているため、遠心分離の操作を必要とせずに、ミトコンドリア外に流出された蛍光色素を回収できる点が、自動化の上で大きな役割を果たす。測定の手順は、ミトコンドリアをマイクロウェルの底に吸着させ、calceinを取り込ませる。洗浄後、調べたい条件の溶液をミトコンドリアに添加し、一定時間で上澄みを自動的に回収して、蛍光を検出するというシンプルなものである。自動化により大量の試料を調べることができ、創薬の際のスクリーニング等に効果的に用いることが可能になる。
【０１１８】
また、従来の方法を自動化するためには、基板上に設置されたミトコンドリア内部の蛍光を測定しなくてはならず、顕微鏡による計測を自動化することになる。このような装置は存在するが大変高価であり、普及に問題がある。
【０１１９】
つぎに、ミトコンドリアの膜透過性遷移孔の形成を時間経過として測定した。
【０１２０】
実施例５（膜透過性遷移孔の形成を時間経過として測定）
時間分解測定は、実施例１の条件に準じて、つぎのように行った。
calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、0.5mMのADPを溶解した緩衝液２を2000μl加え、撹拌した。この上澄みを500μl回収し、時刻0分における試料とした。また、5分後、10分後に上澄みをそれぞれ500μl回収し、時刻5分、10分における試料とした。
励起光493nm蛍光520nmの条件で、時刻0分、5分、10分における試料の蛍光を測定した。また、時刻0分の値に対する時刻5分、10分の値の比をとり、それぞれ時刻5分、10分における値とした。
【０１２１】
実施例６（膜透過性遷移孔の形成を時間経過として測定）
時間分解測定は、実施例２の条件に準じて、つぎのように行った。
calceinを取り込んだミトコンドリアが吸着した培養皿に、緩衝液２を2000μl加え、撹拌した。この上澄みを500μl回収し、時刻0分における試料とした。つぎに、最終濃度5mMになるようにリンゴ酸30μlを加えよく撹拌した後、5分後、10分後に上澄みをそれぞれ500μl回収し、時刻5分、10分における試料とした。
【０１２２】
励起光493nm蛍光520nmの条件で、時刻0分、5分、10分における試料の蛍光を測定した。また、時刻0分の値に対する時刻5分、10分の値の比をとり、それぞれ時刻5分、10分における値とした。
それぞれの実施例における値は、平均値±標準誤差で実施例５の5分が1.19±0.06、10分が1.29±0.06、実施例６の5分が1.55±0.14、10分が1.74±0.19である。なお、このデータは、それぞれ3回の測定の平均値である。
【０１２３】
測定結果は図２に示すとおりである。本実施例では従来の方法と異なり、ミトコンドリア外のcalceinを検出する。そのため、励起光を試料に連続照射する必要がなく、光照射によるcalceinの退色の影響なく時間分解測定ができる利点がある。
【０１２４】
実施例７（オルガネラ内包物流出の定量的測定）
カルセイン放出量の定量的測定について説明する。
【０１２５】
まず、培養皿にポリフェノール蛋白質（商品名：Cell-Tak，Becton Dickinson社製）でコーティングした。具体的な操作は以下の通りである。0.1Mの濃度で超純水に溶解した炭酸水素ナトリウムを用いて、Cell-Takを50倍に希釈し、攪拌した。次に作製したCell-Takの希釈液を、直径35mmの培養皿に800μl滴下し、培養皿底面に満遍なく行き渡るようにし、室温で30分間放置した。その後、培養皿底面を超純水で2回洗浄し、吸着しなかったCell-Takを洗い流し、余分な水分を吸い取ってから、4℃で保存した。
【０１２６】
つぎに、コーティングした培養皿にミトコンドリアを吸着した。具体的な操作は以下の通りである。コーティングした培養皿を底面が傾かないように氷上に静置した。次に氷上で緩衝液１（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度２mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、β−NAD＋を終濃度１mMになるように溶解し、pHはHCl水溶液を使用して7.4に調製した）に単離ミトコンドリアを蛋白終濃度0.1mg/ml、蛋白終濃度0.12mg/ml、または蛋白終濃度0.15mg/mlになるように懸濁したミトコンドリア懸濁液を、培養皿底面に満遍なく行き渡るように１ml滴下し、氷上で約2時間静置した。
【０１２７】
つぎに、培養皿に吸着していないミトコンドリアを、緩衝液２（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM,pH7.4）で二回洗浄し、ミトコンドリアが吸着している培養皿底面に触れないようにアスピレーターを用いて吸引し、洗浄液及び吸着しなかったミトコンドリア取り除いた。
【０１２８】
つぎに、緩衝液２（trisaminomethane終濃度10mM, Sucrose終濃度250mM、EGTA 終濃度2mM、Dithiothreitol終濃度0.1mM、pH 7.4）997μlに１mMの濃度でDMSOに希釈したcalcein-AMを3μl加え、よく攪拌した。次にミトコンドリアが吸着している培養皿に1mlを添加し、遮光しながら25℃で20分間静置し、ミトコンドリアにCalcein-AM を取り込ませ、calceinへと変換させた。その後培養皿を、緩衝液２で洗浄し、余分な水分を吸い取った。
【０１２９】
つぎに、暗室中で、緩衝液２（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mMで溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した。）を2ml添加し、均一になるように良く攪拌し、室温に10分間静置したのち、上清を750μl採取した。
【０１３０】
つぎに、培養皿に吸着しているミトコンドリア数をカウントした。具体的には以下の通りで行った。倒立型システム顕微鏡（IX 70）のステージ上に、測定に使用しミトコンドリアの吸着した培養皿を固定し、透過光を用いて目視によりミトコンドリアに焦点を合わせた。冷却CCDカメラを用いて培養皿底面の吸着しているミトコンドリアの画像（約40,000μm2）を、一皿辺り三枚、ランダムに取得した。各画像において吸着しているミトコンドリア数をカウントし画像三枚で平均を算出、画像一枚辺りの面積（約40,000μm2）における吸着しているミトコンドリア数から、培養皿一枚辺り（9cm2）の吸着しているミトコンドリア数を概算した。
【０１３１】
上記で採取したミトコンドリア上清に含まれるCalcein蛍光強度を別途測定した。分光光度計（FP-6500型）を用い励起光493nm蛍光520nmの条件で、各サンプルに含まれるCalceinの蛍光強度の測定を行った。各サンプルはサンプル700μlを緩衝液２(1300μl)で希釈し、蛍光強度を測定した。
【０１３２】
この結果を、横軸に吸着ミトコンドリア数、縦軸にカルセイン蛍光強度をプロットしたものが、図３である。図３は、ミトコンドリア上清中のカルセイン蛍光強度とミトコンドリア吸着量の関係を示す。ミトコンドリアの吸着密度が0.19〜0.29 x 107個/cm2の範囲では、膜透過性繊維が生じない状態でミトコンドリア内部から上清に漏出するカルセイン量はミトコンドリアの個数に比例して増加する。この事実に基づき、膜透過性遷移の際に放出されたカルセインの蛍光強度を、膜透過性遷移誘導前に漏出したカルセインの蛍光強度で標準化することで、吸着したミトコンドリアの数に影響を受けることなく、ミトコンドリアに膜透過性遷移が生じた程度を比較することができる。
【０１３３】
つぎに、オルガネラ内包物流出の検出に用いる測定キットにかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【０１３４】
実施例８
測定キットには、ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）、マイクロウェル、色素（calcein-AM）または色素溶液（3μM calcein-AMを溶解した緩衝液２）、緩衝液１、および緩衝液２が含まれている。なお、緩衝液１および緩衝液２は、実施例１と同様である。
【０１３５】
この測定キットを用いる、オルガネラ内包物流出の検出はつぎの手順で行う。
ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）を希釈し、96ウェルのプレートのウェル内部をCell-Takでコーティングする。
実験者が用意したミトコンドリアを蛋白質濃度0.2 mg /mlの濃度になるように緩衝液１で希釈する。
希釈したミトコンドリア200μl を、Cell-Takで内部をコーティングした96ウェルのプレートに入れ90分間、氷上で放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
色素溶液を付加し、室温で20分放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
実験者の行いたい条件の緩衝液２をミトコンドリアに付加し、この緩衝液２を入れた直後と10分後のミトコンドリア上澄みのcalceinの蛍光強度を測定し、その比を測定する。
【０１３６】
本実施例によれば、従来、実験者の技量によっていた膜透過性遷移の測定を、技量にあまり依存しない簡便な方法で行うことができる。また、膜透過性遷移を定量的に調べる従来の方法と比較しても、簡便でかつ使用するミトコンドリアの量が１/50程度になる利点がある。
【０１３７】
実施例９
測定キットには、ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）をコーティングしたマイクロウェル、色素（calcein-AM）または色素溶液（3μM calcein-AMを溶解した緩衝液２）、緩衝液１、および緩衝液２が含まれている。なお、緩衝液１および緩衝液２は、実施例１と同様である。
【０１３８】
この測定キットを用いる、オルガネラ内包物流出の検出はつぎの手順で行う。
実験者が用意したミトコンドリアを蛋白濃度0.2 mg /mlの濃度になるように緩衝液１で希釈する。
希釈したミトコンドリア200μl を、Cell-Takで内部をコーティングした96ウェルのプレートに入れ90分間、氷上で放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
色素溶液を付加し、室温で20分放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
実験者の行いたい条件の緩衝液２をミトコンドリアに付加し、この緩衝液２を入れた直後と10分後のミトコンドリア上澄みのcalceinの蛍光強度を測定し、その比を測定する。
【０１３９】
本実施例によれば、実施例８の効果を得ることができる上に、測定キットには、あらかじめポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）をコーティングしたマイクロウェルが用意されているので、操作をより簡便にすることができる。
【０１４０】
オルガネラ放出物の検出方法にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【０１４１】
実施例１０，１１（ADP/ATP交換輸送体によるATP輸送活性の測定）
ATP放出速度の測定について説明する。
まず、培養皿にポリフェノール蛋白質（商品名：Cell-Tak，Becton Dickinson社製）でコーティングした。具体的な操作は以下の通りである。0.1Mの濃度で超純水に溶解した炭酸水素ナトリウムを用いて、Cell-Takを50倍に希釈し、攪拌した。次に作製したCell-Takの希釈液を、直径35mmの培養皿に800μl滴下し、培養皿底面に満遍なく行き渡るようにし、室温で30分間放置した。その後、培養皿底面を超純水で2回洗浄し、培養皿底面に吸着しなかったCell-Takを洗い流し、余分な水分を吸い取ってから、4℃で保存した。
【０１４２】
つぎに、コーティングした培養皿にミトコンドリアを吸着した。具体的な操作は以下の通りである。コーティングした培養皿を底面が傾かないように氷上に静置した。次に氷上で緩衝液１（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、β−NAD＋を終濃度１mMになるように溶解し、pHはHCl水溶液を使用して7.4に調製した）に単離ミトコンドリアを蛋白終濃度0.2mg/mlになるように懸濁したミトコンドリア懸濁液を培養皿底面に満遍なく行き渡るように1ml滴下し、氷上で90分間静置した。
【０１４３】
つぎに、培養皿に吸着していないミトコンドリアを、緩衝液２（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM,pH7.4）で二回洗浄し、ミトコンドリアが吸着している培養皿底面に触れないようにアスピレーターを用いて吸引し、洗浄液及び吸着しなかったミトコンドリア取り除いた。
【０１４４】
つぎに、ATP測定用緩衝液(超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM)を１ml添加して、10分間室温で静置し、室温に戻した。
【０１４５】
つぎに、ATP放出測定用緩衝液（実施例１０：超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mM、リンゴ酸を終濃度5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整、または実施例１１：超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した。）を１ml添加し、均一になるようによく攪拌してから、上清を200μl採取した。採取したサンプルを時刻0におけるATP放出量とした。
【０１４６】
つぎに、培養皿を振揺しながら、時刻0で上清を採取した培養皿から30秒または1分間の間隔でミトコンドリア上清を200μlずつ採取した。
【０１４７】
つぎに、各時刻で採取したミトコンドリア上清に含まれるATP量を定量し、各時刻におけるATP放出量及び放出速度を求めた。ATP量は、超純水5.4mlにルシフェラーゼ-ルシフェリン・凍結乾燥品（和光純薬）100mgを溶解したATP検出用試薬を70μlと、採取したサンプル130μlを20秒間泡立たないように注意しながら懸濁し、ATP検出装置であるマイクロルミノリーダー（CORONA ELECTRIC）を用いて各サンプルにおけるルシフェリン発光強度を測定した。
【０１４８】
同様にATP検出用試薬70μlと、緩衝液（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mM、リンゴ酸を終濃度5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した。）にATPを終濃度2μM、終濃度1μM、終濃度終0.5μM、終濃度0.2μM、終濃度0.1μM、または終濃度0.05μMになるように希釈したもの130μlを泡立たないように注意しながら懸濁し、上記のマイクロルミノリーダーを用いて発光強度を取得、この値から既知濃度ATPでの検量線を作成し、各サンプルでのATP合成量を換算した。
【０１４９】
図４は、ミトコンドリア外に放出されたATP量の時間経過を示す図である。ミトコンドリア外ATP濃度は、上清を30秒間間隔で採取して求めた。時間依存的に放出されたATP量が増加している。呼吸基質（リンゴ酸）を添加した条件（実施例１０）では、呼吸基質を添加しない場合（実施例１１）と比べて、ATP放出量が増加している。
【０１５０】
図５は、ATP放出速度の時間経過を示す図である。ATP放出速度は、図４より求めた。実施例１０では、初めはゆっくりと放出し、約2分後から一定の速度で合成を始めることがわかる。初めの2分間は、ミトコンドリア内部で十分量のATPが合成されていないため放出速度が小さく、十分量のATPが合成された後にほぼ一定の速度となる。呼吸基質が存在しない場合（実施例１１）は、ミトコンドリアに内在する呼吸基質を使ってATPを合成するため、ミトコンドリア内部の呼吸基質が枯渇するにつれて、ATPの放出速度が減少する。
【０１５１】
実施例１２（ミトコンドリア量とATP放出量の関係）
ここでは、コーティングした培養皿にミトコンドリアを吸着した。具体的な操作は以下の通りである。コーティングした培養皿を底面が傾かないように氷上に静置した。次に氷上で緩衝液１（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、β−NAD＋を終濃度１mMになるように溶解し、pHはHCl水溶液を使用して7.4に調製した）に単離ミトコンドリア（蛋白終濃度0.1mg/ml、蛋白終濃度0.15mg/ml、または蛋白終濃度0.2mg/ml）になるように懸濁したミトコンドリア懸濁液を培養皿底面に満遍なく行き渡るように１ml滴下し、氷上で90分間静置した。
【０１５２】
また、ATP放出測定用緩衝液（超純水にTrisaminomethaneを終濃度10mM、Sucroseを終濃度250mM、EGTAを終濃度2mM、Dithiothreitolを終濃度0.1mM、KH2PO4を終濃度2mM、ADPを終濃度0.5mM、リンゴ酸を終濃度5mMとなるように溶解し、HCｌ及びKOH水溶液を用いてｐH7.4に調整した。）を１ml添加し、均一になるようによく攪拌してから、240秒後に上清を200μl採取した。
このほかの操作は、実施例１０，１１と同様である。
【０１５３】
また、各培養皿に吸着しているミトコンドリア数をカウントした。具体的には以下の通りで行った。倒立型システム顕微鏡（IX 70）のステージ上に、測定に使用しミトコンドリアの吸着した培養皿を固定し、透過光を用いて目視によりミトコンドリアに焦点を合わせた。冷却CCDカメラを用いて培養皿底面の吸着しているミトコンドリアの画像（約40,000μm2）を、一皿辺り三枚、ランダムに取得した。各画像において吸着しているミトコンドリア数をカウントし画像三枚で平均を算出、画像一枚辺りの面積（約40,000μm2）における吸着しているミトコンドリア数から、培養皿一枚辺り（9.0cm2）の吸着しているミトコンドリア数を概算した。
【０１５４】
図６は、培養皿に吸着したミトコンドリア量とATP放出量の関係を示す図である。ミトコンドリアの吸着密度が0.17〜0.44 x 107個/cm2の範囲では、放出されるATP量はミトコンドリアの個数に比例して増加する。これにより、ミトコンドリア1個あたりのATP放出量を求め、各種のデータを比較することが可能になる。
【０１５５】
つぎに、オルガネラ放出物の検出に用いる測定キットにかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【０１５６】
実施例１３
測定キットには、ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）、マイクロウェル、ATP検出用試薬、緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝が含まれている。なお、緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝は、実施例１０，１１と同様である。
【０１５７】
この測定キットを用いる、オルガネラ放出物の検出はつぎの手順で行う。
ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）を希釈し、96ウェルのプレートのウェル内部をCell-Takでコーティングする。
実験者が用意したミトコンドリアを緩衝液１で希釈する。
希釈したミトコンドリア200μl を、Cell-Takで内部をコーティングした96ウェルのプレートに入れ90分間、氷上で放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
ATP測定用緩衝液を付加し、室温で10分放置する。
ATP放出測定用緩衝液をミトコンドリアに付加し、この緩衝液を入れた直後と所定時間間隔ごとにミトコンドリア上清の発光強度を測定する。
【０１５８】
本実施例によれば、従来、実験者の技量によっていたオルガネラ放出物の測定を、技量にあまり依存しない簡便な方法で行うことができる。また、オルガネラ放出物を定量的に調べる従来の方法と比較しても、簡便でかつ使用するミトコンドリアの量が１/50程度になる利点がある。
【０１５９】
実施例１４
測定キットには、ポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）をコーティングしたマイクロウェル、ATP検出用試薬、緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝液が含まれている。なお、緩衝液１、緩衝液２、ATP測定用緩衝液、およびATP放出測定用緩衝液は、実施例１０，１１と同様である。
【０１６０】
この測定キットを用いる、オルガネラ放出物の検出はつぎの手順で行う。
実験者が用意したミトコンドリアを緩衝液１で希釈する。
希釈したミトコンドリア200μl を、Cell-Takで内部をコーティングした96ウェルのプレートに入れ90分間、氷上で放置する。緩衝液２で2回洗浄する。
ATP測定用緩衝液を付加し、室温で10分放置する。
ATP放出測定用緩衝液をミトコンドリアに付加し、この緩衝液を入れた直後と所定時間間隔ごとにミトコンドリア上清の発光強度を測定する。
【０１６１】
本実施例によれば、実施例１３の効果を得ることができる上に、測定キットには、あらかじめポリフェノール蛋白質（Cell-Tak）をコーティングしたマイクロウェルが用意されているので、操作をより簡便にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】各実施例におけるCalcein流出量を示す図である。
【図２】ミトコンドリア膜透過性遷移によるCalcein流出量の経時変化を示す図である。
【図３】ミトコンドリア上清中のカルセイン蛍光強度とミトコンドリア吸着量の関係を示す図である。
【図４】ミトコンドリア外に放出されたATP量の時間経過を示す図である。
【図５】ATP放出速度の時間経過を示す図である。
【図６】培養皿に吸着したミトコンドリア量とATP放出量の関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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