(57)【要約】【課題】  トロンビン活性試験のための対照血漿の提供。【解決手段】  定められた様式で設定され、かつ正常なヒト血漿の濃度に比べてより低いかまたは高い値であるプロトロンビン濃度を有する、脱脂化血漿調製物は、ＥＴＰ試験のようなトロンビン活性試験およびトロンビン生成試験の、換算用、標準化および対照に適している。この血漿調製物は、例えば正常血漿から免疫吸着法により得られた、プロトロンビン欠失血漿を用いて製造され、さらに、緩衝物質、蛋白分解酵素阻害剤、抗凝固剤、安定化剤および／または他の、血漿を製造する際に慣用的に用いられている補助物質および添加物を含むことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照血漿、好ましくはヒト対照血漿であって、定められた様式で、正常血漿と比較して、好ましくはヒト正常血漿と比較して、変更されたプロトロンビン濃度を有する対照血漿。
【請求項２】
プロトロンビン濃度が正常血漿の該濃度より低いかまたはより高いかである、請求項１の対照血漿。
【請求項３】
プロトロンビン濃度が１.４μＭより高く、好ましくは１.５から５μＭであり、特に好ましくは１.６から４μＭであり、さらに特に好ましくは１.７から３μＭである、請求項１または２に記載の対照血漿。
【請求項４】
プロトロンビン濃度が１.４μＭより低く、好ましくは０から１.３μＭであり、特に好ましくは０.１から１.２μＭであり、さらに特に好ましくは０.２から１.０μＭである、請求項１または２に記載の対照血漿。
【請求項５】
１またはそれ以上の抗凝固剤、１またはそれ以上の緩衝物質、１またはそれ以上の蛋白分解酵素阻害剤、１またはそれ以上の安定化剤、および／または、血漿を製造する際に慣用的に用いられている補助物質および添加物を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項６】
使用される抗凝固剤がクエン酸ナトリウム、ヘパリンまたはＥＤＴＡである、請求項１〜５のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項７】
使用される緩衝物質がヘペスおよび／またはトリスである、請求項１〜６のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項８】
蛋白分解酵素阻害剤を用いる、請求項１〜７のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項９】
使用される安定化剤が糖および／または糖アルコール、好ましくはマンニトールである、請求項１〜８のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項１０】
脱脂化されている、請求項１〜９のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項１１】
脱繊維素化されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項１２】
凍結乾燥されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の対照血漿。
【請求項１３】
ＦＩＩ濃度が対応する正常血漿の５％未満、好ましくは１％未満である、脱脂化ヒトまたは脱脂化動物ＦＩＩ欠失血漿。
【請求項１４】
脱繊維素化されている、請求項１３のＦＩＩ欠失血漿。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の対照血漿を製造するための、請求項１３または１４に記載のＦＩＩ欠失血漿の使用。
【請求項１６】
トロンビン活性試験用、トロンビン生成試験用、プロトロンビン試験用、または、トロンビン活性もしくはトロンビン濃度がプロトロンビン活性化により測定できる酵素試験用の換算、標準化および／または対照のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の対照血
漿の使用。
【請求項１７】
ＥＴＰ試験の換算、標準化および／または対照のための、請求項１６の使用。
【請求項１８】
免疫吸着法により完全にまたは部分的に血漿からプロトロンビンを除去する工程を含む、正常血漿より低いＦＩＩ濃度を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の対照血漿またはＦＩＩ欠失血漿の製造方法。
【請求項１９】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体を免疫吸着法のために用いる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
好ましくは脂肪親和性物質への吸着により完全にまたは部分的にリポプロテインを除去する工程を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の対照血漿またはＦＩＩ欠失血漿の脱脂化の方法。
【請求項２１】
以下の工程；
（ａ）ＦＩＩ欠失血漿に正常血漿の定められた部分を添加すること、または
（ｂ）ＦＩＩ欠失血漿に純粋プロトロンビンおよび／またはプロトロンビン濃縮物を添加すること、
を含み、さらに該添加を逆順で実施してもよい、請求項１〜１２のいずれかに記載の対照血漿の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれかに記載の、２またはそれ以上の異なったＦＩＩ濃度の対照血漿を含む、換算用セット。
【請求項２３】
１.３から３.９μＭの間のＦＩＩ濃度を有する請求項１〜１２のいずれか１つの対照血漿、および、好ましくはＦＩＩ欠失血漿である希釈溶液を含む、換算用セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は参照血漿製品（reference plasma product）に関し、特に一定量のプロトロンビン濃度およびトロンビン活性を有する参照血漿製品であって、特にトロンビン活性試験およびトロンビン生成試験の対照と換算のために用いることができる。本血漿製品は、好ましくは、内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ試験）の測定方法において用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の意味でのＥＳＴ試験はトロンビンの生成および阻害を測定するために用いることができる、包括的な血液凝固試験である。内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）とはサンプル中に本来存在している（内因性の）、すなわち血漿サンプルの場合は血漿に本来存在している、酵素的に活性な遊離トロンビンを生成および阻害する活性（ポテンシャル）を意味するものと理解される。
【０００３】
内因性トロンビンポテンシャル（文献でも「内因性トロンビンポテンシャル（endogenous thrombin potential）」とよばれている）を定量的に測定するために好ましいパラメーターは、時間／濃度積分値またはトロンビン生成曲線下面積である（ＥＰ−０４２０３３２−Ｂ１を参照）。このパラメーターは、凝固する血液または血漿のサンプルにおいてゼロ時（ｔ＝０）から存在している内因性トロンビンの量および活性の尺度である。
【０００４】
内因性トロンビンポテンシャルの測定は、例えば、ヒトや動物での抗凝固薬による効果的な治療を行うために、および、治療期間を通してこのポテンシャルの信頼性のあるモニタリングを行うための重要な前提条件である。ＥＴＰ試験は全ての抗凝固薬に関して広範に用いることができ、その結果、公知例として知られている組織トロンボプラスチンを用いた凝固時間の測定（プロトロンビン時間＝ＰＴ）または接触活性化因子とリン脂質を用いた凝固時間の測定（活性化部分トロンボプラスチン時間＝ＡＰＴＴ）のような他の凝固試験より優れている。かくしてＰＴ試験は経口抗凝固剤に対しては感受性があるがヘパリンに対してはない。一方、ＡＰＴＴ試験はヘパリンと経口抗凝固剤に対しては感受性があるが低分子量ヘパリンおよびデルマタン硫酸に対して感受性が全くないかまたは実質的にない。さらに、ＥＴＰは従来の包括試験（global test）では調べることができなかった血栓形成性（thrombogenic）危険因子、例えば経口避妊薬（「ピル」の摂取）、喫煙または妊娠に起因する血栓形成の危険性の増加をもカバーする。
【０００５】
ＥＴＰ試験では、測定は例えば光度計（光学密度の測定のような）または蛍光計を用いて実施される。適当な自動化凝固分析機器もまたこの目的のために使用できる。それぞれの機器により得られた測定値は最初は参照する系のない絶対値であり、したがって生データとも記載される。このデータは機器に特有のものであり、試薬に特有のものであり、かつ試験に特有のものであるので、互いに直接比較することができず、その結果、特定の生理学的状態に直接結びつけることもできない。ＥＴＰ試験もまた適切な換算用（calibration）試薬が存在しなかったために、これまで標準化からははるかに遠かった。
【０００６】
さらに公知技術と比較した場合のＥＴＰ試験の意義、実施および分析については、例えば、ＥＰ−０４２０３３２−Ｂ１、ＥＰ−０８０２９８６−Ｂ１およびそれらが引用している文献に記載されている。
【０００７】
酵素活性の測定からの絶対的な測定結果を参照系に組み入れるために、定められた値、例えば定められた酵素濃度および／または酵素活性、を有する換算用および／または対照
用の物質に対する必要性が存在している。これにより初めて測定結果を比較し標準化することが可能になる。対照物質はユーザーが該測定系および測定結果が正確か否かを確認するためにも必要である。これはとりわけ病理用サンプルを扱う領域において（例えば抗凝固剤の治療を受けている患者に関連して）試験の工程の正確性および信頼性をモニターするために重要である。
【０００８】
そうした対照物質、および対照血漿もまた公知のＰＴ試験およびＡＰＴＴ試験の場合に知られている。例えば、ＷＯ０１／０７９２１−Ａ２には主成分である霊長類血漿に加えて、非霊長類血漿、ならびに、緩衝物質および繊維素溶解系阻害剤のような安定化剤を含んでいる血漿混合物が記載されている。ＷＯ９５／１２１２７では、国際参照用調製物（international reference preparation; ＩＲＰ）のようなトロンボプラスチン用の特異値を有するサンプルである、ＰＴ試験の換算用の凍結乾燥血漿サンプルをクレームしている。ＷＯ００／０２０５４には異常な血漿、すなわち霊長類血漿および非霊長類血漿ならびに抗凝固剤の混合物、を含む血漿が記載されている。最後に、ＥＰ−０４８２０８８−Ｂ１は非霊長類血漿に加えて有効量の緩衝物質、蛋白分解酵素阻害剤および安定化用炭水化物を含有する安定な対照血漿に関している。
【０００９】
既に上で述べたように、ＥＴＰ試験のようなトロンビン活性試験およびトロンビン生成試験のための対照物質、参照物質または換算用物質はこれまで存在しない。ユーザーは正常血漿または正常血漿プールを測定することにより正常値を設定することで間に合わせなければならない。その後得られたサンプルの値は比率法（proportional method）の線形規則（linear rule）によりこの正常値に関連付けられ、例えば正常値の％、単位（units）または「ｎｍｏｌ × ｍｉｎ」で示される（例えば、ＥＰ−０４２０３３２−Ｂ１中のＥＴＰ試験の記載を参照する）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって本発明の目的は、特に標準化、換算および、好ましくはＥＴＰ試験のようなトロンビン活性試験およびトロンビン生成試験の正確性をチェックするための参照物質または対照もしくは換算用物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的は特許請求の範囲に記載された方法および主題により、とりわけ本発明の血漿製品により達成される。
【００１２】
本発明の血漿製品は１もしくはそれ以上のヒトもしくは動物のプロトロンビン欠失血漿（第ＩＩ因子欠失血漿）またはその混合物を含んでいる。さらに、正常なヒト血漿または動物血漿を含むこともできる。本発明のプロトロンビン欠失血漿、正常血漿および／または血漿製品は好ましくは脱脂化（delipidized）できる。脱脂化血漿は凍結乾燥でき、そのためになんら活性を失うことなく非常に長期にわたって保存できる。
【００１３】
本発明の血漿製品は好ましくは脱繊維素化（defibrinated）できる。トロンビン生成およびトロンビン阻害の連続的測定、好ましくは発色性トロンビン生成試験の実施の間にフィブリン塊が生じることを防ぐために、フィブリン凝集もしくはフィブリン重合化の阻害剤（血塊阻害剤（clot inhibitors）とよばれる）を反応混合物に加えることができ、あるいは、あらかじめ血漿からフィブリンを除去しておくことができる。適切な血塊阻害剤の例には、Ｐｅｆａｂｌｏｃ(R)ＦＧ Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＯＨ−ＡｃＯＨ（Pentapharm社（Ltd.）、スイス）、またはＥＰ−０４５６１５２−Ｂ１に記載されたようなペプチドアミドがあげられる。
【００１４】
血漿は当該分野の専門家に知られている様々な方法で脱繊維素化ができ、この方法には、例えば、バトロキソビン（batroxobin）のような蛇毒による方法、熱処理による方法、沈殿による方法または免疫アフィニテイクロマトグラフィーによる方法があげられる。
【００１５】
本発明の血漿製品の脱繊維素化により、一般的な方法で、血塊阻害剤を用いた試験および血塊阻害剤なしの試験の両方で換算用血漿を使用することが可能になる。
【００１６】
好ましい実施態様では、異なった定められたプロトロンビン濃度（プロトロンビン＝第ＩＩ因子＝ＦＩＩ）またはトロンビン活性（トロンビン＝第ＩＩａ因子＝ＦＩＩａ）を含むヒト由来の血漿製品が調製される。血漿中のこれらの異なったトロンビン活性は、異なった定められた濃度のプロトロンビンを血漿中に添加することによって作成され、または定められた様式で設定される。このために、血漿のプロトロンビン濃度およびそれによるトロンビン活性は低い値から極めて高い値まで設定することができ、すなわち本発明の血漿製品のプロトロンビン濃度またはトロンビン活性は正常血漿のまたは正常血漿プールの対応する値の上の値または下の値のいずれかとすることができる。これらの決められた血漿製品の内因性トロンビンポテンシャルの定量的測定は、血漿のプロトロンビン濃度またはトロンビン活性と比較される測定値（ＥＴＰの生の値）をもたらす。これにより、未知のサンプルまたはそれらの測定値を適切な数学的アルゴリズムの援助により決定できる換算用曲線が得られる。
【００１７】
正確に同じ方法で、正常値より低いか、正常か、もしくは高いプロトロンビン濃度またはトロンビン活性を含む個々の血漿を、測定系の正確性をチェックするための対照血漿として用いることができる。
【００１８】
簡略にするために、本発明の血漿製品は、全体としておよびそれらの考えられる用途の如何に拘わらず、対照血漿であるとして記載される。従って、本発明の対照血漿は、例えば、トロンビン活性を決定するための酵素活性試験を標準化および換算するために用いることができる。このことが、濃度および／または活性が正常のプロトロンビン濃度および／またはトロンビン活性より低いかまたは高い、未知のサンプルのプロトロンビン濃度および／またはトロンビン活性を定量することを可能とする。
【００１９】
これにより、特に、下記の領域：ＥＴＰ試験のようなトロンビン生成試験用、トロンビン活性試験用、プロトロンビン試験用、または、トロンビン活性もしくはトロンビン濃度がプロトロンビン活性化により測定できる酵素試験用、の換算、標準化および／または対照用、で該対照血漿を適用できる。さらに、対照血漿は病理的な凝固状態をシュミレートするためにも適している。変化したプロトロンビン生成またはトロンビン生成に起因する、凝固亢進状態またはさもなければ凝固低下状態を表現する（portray）ことができる。
【００２０】
換算用曲線または参照用曲線は、異なった濃度のＦＩＩを含んでいる本発明の対照血漿を少なくとも２個含む換算用セットを用いるか、または高度に濃縮した対照血漿を適当な希釈溶液で希釈することによって、作成することができる：
【００２１】
１．異なったＦＩＩ濃度のいくつかの対照血漿を含む換算用血漿セットを用いる：
異なったＦＩＩ濃度を含む特定の数の対照血漿の内因性トロンビンポテンシャルを測定し、ついでそれぞれの対照血漿の対応するプロトロンビン濃度に当てはめる。測定された測定値と対照血漿のプロトロンビン濃度との間には直接に比例する線形関係が存在している。未知のサンプルのプロトロンビン濃度あるいはプロトロンビン活性は適切なアルゴリズムを用いて計算することができる。
【００２２】
２．高いＦＩＩ濃度の対照血漿および希釈溶液を含む換算用血漿セットを用いる：
高いプロトロンビン濃度の対照血漿は好ましくはＦＩＩ欠失血漿により連続的に希釈される。理想的には、希釈される対照血漿のプロトロンビン濃度は予期されるサンプルの最大値を超えなければならない。正常の約３倍の濃度であれば、凝固亢進したサンプルを測定する場合であっても十分で、参照用曲線の最大値以下になるであろう。内因性トロンビンポテンシャルは定量的に測定され、そして個別の希釈段階の対応する濃度に当てはめられる。測定された測定値と異なった希釈段階のプロトロンビン濃度との間には直接に比例する線形関係が存在している。未知のサンプルのプロトロンビン濃度あるいはプロトロンビン活性は適切なアルゴリズムを用いて計算することができる。
【００２３】
本発明の対照血漿を製造する方法をさらに詳しく以下に記載する：
ａ）正常値以下から正常値までのトロンビン活性値を有する対照血漿を製造する：
正常血漿プールおよび／または個々の正常血漿は、明らかに健康である血液供血者（ヒトまたは動物）を選んで調製される。正常血漿プールまたは正常血漿を、例えばプロトロンビン特異的モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いた吸着によって、プロトロンビンを完全にまたはほとんど除去し、ＦＩＩ欠失血漿とよばれるものが得られる。以下の方法Ａ）またはＢ）のいずれかが、この特定のＦＩＩ濃度および活性のＦＩＩ欠失血漿を得るために用いられる。
Ａ）正常血漿または正常血漿プールの定められた量をＦＩＩ欠失血漿に加え、それによりほぼ健常人血液供血者のＦＩＩ濃度に至るまでのＦＩＩ濃度を達成することが可能になる。
Ｂ）精製したプロトロンビンまたはプロトロンビン濃縮物をＦＩＩ欠失血漿に加える。
【００２４】
ｂ）正常値より高いトロンビン活性を有する対照血漿を製造する：
正常血漿プール、正常血漿またはＦＩＩ欠失血漿中での、正常値を超えるＦＩＩ濃度を得るために精製したＦＩＩまたはプロトロンビン濃縮物を用い、それにより、好ましくは、１.４μＭを超えるＦＩＩ濃度または１Ｕ／ｍＬを超えるＦＩＩａ活性を達成した。１Ｕは、正常値の７０〜１３０％である正常な凝固時間（トロンボプラスチン時間またはクイック値（Quick value））を得るために必要なＦＩＩａの活性である。血漿１ｍＬ当り９０μｇのＦＩＩ濃度、または１.４μＭ、または血漿１ｍＬ当り１単位のＦＩＩａの活性が正常なＦＩＩ値に相当する。
【００２５】
ヒト、動物または組換え法により製造されたプロトロンビンは、本発明の対照血漿用に使用することができる。組換え法で製造されたヒトプロトロンビンはとりわけ好ましい。
【００２６】
本発明の対照血漿は新鮮なままで用いることができる。もし数週間を超えるような比較的長期に渡って保存する必要がある場合は、対照血漿は冷凍保存または凍結乾燥で保存しなければならない。
【００２７】
適切な安定化剤（例えば、ヘペスまたはトリス；ＷＯ０１／０７９２１−Ａ２、第８頁参照）を添加することで、対照血漿は長期的に保存可能になるように製造できる。対照血漿は好ましくは凍結乾燥または凍結状態で保存する前に、脱脂化するべきである。これにより、対照血漿は発色性検出法、例えば発色性ＥＴＰ試験、に用いることができるという利点を有する。
【００２８】
本発明の血漿製品の脱脂化（例えば、脂肪親和性物質への吸着、または遠心分離による浮遊化、または非水溶性の有機物質への溶解による清澄化によって）は、凍結乾燥したまたは解凍した生成物を再構成した後の、沈殿や液体コロイドによる混濁化を防止するために有利である。そうした液体コロイドは、例えば、トロンビン生成反応速度の分光学的測定に重大な干渉をもたらす（例えば、ＥＰ−０４２０３３２−Ｂ１参照）。
【００２９】
特に、脱脂化およびそれに続く凍結乾燥により、定められたプロトロンビン濃度のおよびその結果としての定められたトロンビン活性を有し、１２ヶ月さえ超えられる非常に長期間保存可能な、対照血漿を製造することが可能になる。
【００３０】
脱脂化の工程を省くこともまた可能である。しかし、生成物から、再構成後に生成する脂肪コロイドおよび変性タンパク質を、例えば遠心分離、吸着または濾過によって除去しなければならない。
【００３１】
本発明の対照血漿は、クエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡのような抗凝固剤；ヘペスまたはトリスのような緩衝物質；Trasylol(R)（アプロチニン）のような蛋白分解酵素阻害剤；糖または糖アルコールのような凝固因子の安定化剤、および／または他の血漿製造に慣用の補助物質および添加物を含むことができる。上記の物質のクラスの他の例は当業者に周知で、例えばＷＯ０１／０７９２１−Ａ２（特に、その中の第８および９頁）に記載されており、この文献は参照により明示的にここに組み込まれる。
【００３２】
本発明の対照血漿の製造は以下に、実施例により詳細に記載されているが、この実施例の範囲に本発明を限定しようという意図はない。記載された製造方法、および特定された本発明の対照血漿の使用も、同様に本発明の課題の部分を構成する。
【００３３】
実施例：
実施例１：安定化血漿プールの製造
血液は健康であることが明らかな供血者から採血した。血液は０.１０５ｍｏｌ／Ｌ濃度のクエン酸ナトリウムを用いて抗凝固処理された。血漿を得るために、サンプルを１５００×ｇ、＋１０℃で２０±２分間、ブレーキを使わず遠心分離した。遠心分離は血液採取後４時間以内に実施した。個々の供血者からの血漿画分を混合してプールを作成した。このプールは４０％濃度（strength）のヘペス（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ’−〔２−エタンスルホン酸〕）溶液（１０ｍＬ／Ｌ血漿）およびTrasylol(R)（１００００ＫＩＥ／ｍＬ；２ｍＬ／Ｌ血漿）を添加して安定化し、次いで濾過した。正常血漿プールのｐＨは正常範囲内、好ましくはｐＨ７.３±０.２としなければならない。
【００３４】
実施例２：第ＩＩ因子欠失血漿の製造
実施例１に記載したように製造された正常血漿の一部分を、ＣＮＢｒ活性化セファロースに結合したＦＩＩ特異的モノクローナル抗体（Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）を含むクロマトグラフィーカラムにポンプで送り込んだ。ＦＩＩ活性が正常値の１％未満である溶出液の画分を集めた。あるかも知れないＦＶＩＩＩの欠失（正常値の７０％未満）については、ＦＶＩＩＩ濃縮物（例えば、ヘマーテ（Haemate(R)）、Aventis Behring社(GmbH)、ドイツ）を添加することにより補正した。安定化のために、Ｄ（−）−マンニトール（血漿１リットル当り２０ｇ）を混合物に、泡の形成を避けるようにゆっくり攪拌しながら添加した。
【００３５】
実施例３：脱脂化血漿
脱脂化するための血漿を、セファロースＣＩ２Ｂに共有的に結合させたTriton(R)Ｘ−１００に通した。セファロースＣＩ２Ｂに共有結合したTriton(R)Ｘ−１００を作成するために、エチルエーテル化ホウ素三フッ化物の触媒作用を用いて、Triton(R)Ｘ−１００のグリシジルエーテル（Roche Applied Science社、ドイツ）を共有的にセファロースＣＩ２Ｂ（Pharmacia  Biotech社、スエーデン）に結合させた。Triton(R)Ｘ−１００はリポプロテインに結合し、一方他の蛋白質は吸着剤に結合せず通過し、例えばＥＴＰ参照用血漿の製造のために適した、透明で安定化した血漿が得られた。
カラムに負荷できる血漿量はTriton(R)Ｘ−１００の結合能に依存する。これは、理論結合能の８０％を超えるべきではない。
Triton(R)Ｘ−１００セファロースカラムは、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液＋０.９％塩化ナトリウム、ｐＨ７.４により平衡化される。血漿プールは最大流量で（at maximum flow）で負荷される。
血漿プールを完全に通した後、全ての非結合蛋白質を溶出するためにカラムをゲルベット容積と等容積以上のクエン酸ナトリウムで洗浄する。ゲルベット容積の０.９以下（血漿＋溶出緩衝液）を流した後、画分を回収する。０.７を超えるＵＶ吸収値（２８０ｎｍ／１ｃｍ経路長）を有するそれらに隣接する（flanking）領域の全ての画分を、泡の生成を防ぎながら回転して混合した。
【００３６】
実施例４：脱繊維素化血漿
ここで使用される方法は、ボトロップス・アトロックス（Bothrops atrox）蛇毒（バトロキソビン（Batroxobin）、Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）を用いた脱繊維素化を伴う。血漿を室温で３０分間、適切な濃度（例えば、１：２０から１：５０）のバトロキソビン試薬と一緒にインキュベートした。血漿はつぎに二回遠心分離し（８００×ｇ、１５分間）つぎに上清を回収した。最後に、上清をガーゼを通して濾過した。
【００３７】
実施例５：本発明の対照血漿の製造（ＦＩＩ欠失血漿へのＦＩＩ濃縮物の添加）
どのような任意のプロトロンビン濃度および活性も、プロトロンビンをプロトロンビン非含有血漿（ＦＩＩ欠失血漿）に添加することで作成できる。この方法を正常を越えるＦＩＩ値の血漿製品を作成するために使用することもできる。
例として、６個の異なった、すなわちレベル１から６の、以下に記載されたプロトロンビン濃度を有する換算用血漿を、脱脂化ＦＩＩ欠失血漿（実施例２参照）、および、プロトロンビン濃縮物（プロトロンビンの５０ｍＭトリス塩酸溶液〔カタログ番号（cat#）２０−２６７、Milan、CH-1634 La Rocheより入手〕）から製造された。
ＦＩＩ欠失血漿中のプロトロンビン濃縮物の標準化：
レベル１：    ０μｇプロトロンビン／ｍＬ
レベル２：  １８μｇプロトロンビン／ｍＬ
レベル３：  ５４μｇプロトロンビン／ｍＬ
レベル４：  ９０μｇプロトロンビン／ｍＬ
レベル５：１２６μｇプロトロンビン／ｍＬ
レベル６：１８０μｇプロトロンビン／ｍＬ
混合されたＦＩＩ欠失血漿とプロトロンビン濃縮物の対応する比率は与えられたプロトロンビンのバッチの最初の濃度に依存しそれに応じて算出されなければならない。混合物は、均一に混合するまで泡が生成しないように注意深く攪拌される。
保存のために、対照血漿は凍結乾燥または冷凍保存（−７０℃）される。
【００３８】
実施例６：本発明の対照血漿の製造（正常血漿へのＦＩＩ欠失血漿の添加）
ＦＩＩ欠失血漿（実施例２を参照）を正常血漿（実施例１を参照）に添加することにより、正常なＦＩＩ値（約１.４μＭのＦＩＩ）を超えないプロトロンビン濃度および活性を作成することができる。
混合されたＦＩＩ欠失血漿と正常血漿（ＮＰ）の対応する比率は、それに応じて算出される。この関連で、正常ヒト血漿の活性は１Ｕ／ｍＬであると定められる。１Ｕは、正常値の７０〜１３０％の正常な凝固時間（トロンボプラスチン時間またはクイック値）を達成するために必要とされるＦＩＩａの活性である。このことから、以下の活性が得られる：
例：
レベル１：  ８容量部のＦＩＩ欠失血漿＋２容量部のＮＰ→０.２Ｕ／ｍＬ
レベル２：  ６容量部のＦＩＩ欠失血漿＋４容量部のＮＰ→０.４Ｕ／ｍＬ
レベル３：  ４容量部のＦＩＩ欠失血漿＋６容量部のＮＰ→０.６Ｕ／ｍＬ
レベル４：  ２容量部のＦＩＩ欠失血漿＋８容量部のＮＰ→０.８Ｕ／ｍＬ
レベル５：  ＮＰ→１.０Ｕ／ｍＬ
混合物は、均一に混合するまで泡が生成しないように注意深く攪拌される。保存のために、対照血漿は凍結乾燥または冷凍保存（−７０℃）される
【００３９】
実施例７：ＦＩＩ活性の測定
ＦＩＩ活性またはトロンビン活性は、製造者の指示書（第ＩＩ凝固因子欠失血漿、注文番号ＯＳＧＲ、Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）に従って、サンプルのプロトロンビン時間の延長化（ＰＴ）により測定できる。単一因子の測定のためには、ＦＩＩ欠失血漿と測定されるサンプルの混合液のＰＴが測定される。正常値の％で表されるＦＩＩ活性は、正常血漿プールまたは標準ヒト血漿（標準ヒト血漿、注文番号ＯＲＫＬ、Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）のこの欠失血漿による希釈から作成された参照用曲線を用いて確認される。
【００４０】
次に図１〜４によって本発明をさらに説明することにする。
【００４１】
図１および２は、実施例５に記載されたように製造された対照血漿のプロトロンビン濃度と測定されたＥＴＰの生の値（ＢＣＳ(R)機器の測定シグナル）との関連性を示す。プロトロンビン濃度は適切な正常血漿の実際の濃度の値（プロトロンビンμｇ／ｍＬ）で与えられる。ＥＴＰの測定シグナルはプロトロンビン濃度に線形依存し、それにより本発明の対照血漿を用いたＥＴＰ試験の換算、標準化および／または対照のための簡単な可能性が提供される。
Ｒ2：２次元ランダム数量（two-dimensional random quantity）の相関係数。
この相関係数は２つの性質が関連しているかどうかを確定するために用いることができる。
漸増するＦＩＩ濃度を有し、凍結乾燥形態で保存されていた６個の対照血漿を図１の場合に使用し、一方、漸増するＦＩＩ濃度を有し、凍結形態で保存されていた２０個の対照血漿を図２の場合に使用した。
【００４２】
図３は、本発明の対照血漿のＦＩＩ濃度（μｇ／ｍＬ）に依存したＦＩＩ活性（正常値の％で示す）の、図１と類似の代表例を示す。線形依存性が得られ、それによりＦＩＩ試験またはＦＩＩａ試験を換算、標準化および／または対照するための本発明の対照血漿による非常に簡単な可能性が提供される。この場合、凝固時間を用いた方法、フィブリン凝固塊の生成による方法のような間接的に操作されたＦＩＩ活性試験を用いたために、直線的回帰性（linear regression）は、ＥＴＰ試験の場合に比べて著しく悪化した。ＦＩＩ活性試験は、約３０〜１４０μｇ／ｍＬのＦＩＩの濃度範囲でのみ直接に比例するにすぎなかった。試験は、製造者の指示書に従い、イノビン（Innovin）(R)（Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）を用いて、ＢＣＳ(R)機器（Dade Behring Marburg社（GmbH）、ドイツ）上で実施した。
【００４３】
図４は、実施例６に記載されたように製造された対照血漿のプロトロンビン濃度と測定されたＥＴＰの生の値（ＢＣＳ(R)機器の測定シグナル）との関連性を示す。活性は、正常血漿プールを１Ｕ／ｍＬであると定めて、それぞれの対照血漿のＵ／ｍＬとして与えられた。ＥＴＰ測定シグナルはＦＩＩ活性に線形依存することが見いだされ、これにより本発明の対照血漿をＥＴＰ試験の換算および／または対照に用いる簡単な可能性が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】実施例５に記載されたように製造された対照血漿のプロトロンビン濃度と測定されたＥＴＰの生の値（ＢＣＳ(R)機器の測定シグナル）との関連性を示す。
【図２】実施例５に記載されたように製造された対照血漿のプロトロンビン濃度と測定されたＥＴＰの生の値（ＢＣＳ(R)機器の測定シグナル）との関連性を示す。
【図３】本発明の対照血漿のＦＩＩ濃度（μｇ／ｍＬ）に依存したＦＩＩ活性（正常値の％で示す）の、図１と類似の代表例を示す。
【図４】実施例６に記載されたように製造された対照血漿のプロトロンビン濃度と測定されたＥＴＰの生の値（ＢＣＳ(R)機器の測定シグナル）との関連性を示す。
【図１】
2005181326.tif 000002
【図２】
2005181326.tif 000003
【図３】
2005181326.tif 000004
【図４】
2005181326.tif 000005