(57)【要約】【課題】  動植物素材によることなく、品質が安定しており且つ安定的に供給可能な真菌類素材を用いて、大量にセレブロシドを工業生産する。【解決手段】  ビートモラセス培地で酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、糸状菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、キノコ（例えばマイタケＧｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｄｏｓａ）等の真菌類を大量培養し、菌体を有機溶媒抽出することによりセレブロシドを工業生産する。また、溶媒抽出液を冷凍処理すれば、更にセレブロシドの純度を高めることができるし、菌体にストレスを与えることによりセレブロシドの蓄積量を高めることもできる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレブロシド生産性酵母又は糸状菌の培養中及び／又は培養した後ストレス環境下にて処理すること、を特徴とするセレブロシド含有酵母又は糸状菌の製造方法。
【請求項２】
ストレス環境下での処理が、下記（Ａ）〜（Ｃ）の少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
（Ａ）窒素源及び／又は炭素源を含まない培地での処理。
（Ｂ）食塩及び／又はアルコールを添加した培地での処理。
（Ｃ）アルカリ性培地での処理。
【請求項３】
該処理が培養及び／又はインキュベート処理であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
セレブロシド生産性酵母又は糸状菌をビートモラセスを炭素源として含有する培地で培養すること、を特徴とするセレブロシド含有酵母又は糸状菌の製造方法。
【請求項５】
ｐＨ５〜９の培地で培養すること、を特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セレブロシド含有酵母又は糸状菌を、破壊し又は破壊することなく有機溶媒抽出し、抽出物からセレブロシド含有画分を分画、採取すること、を特徴とするセレブロシド含有物の製造方法。
【請求項７】
有機溶媒が、エタノール、含水エタノール、メタノール、含水メタノール、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、クロロホルム−メタノール混液、ベンゼン、イソプロパノールから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セレブロシド含有酵母又は糸状菌を、破壊し又は破壊することなく、エタノール抽出し、分離したエタノール溶液を冷凍処理して、セレブロシド含有物の沈殿を得ること、を特徴とするセレブロシド含有物の製造方法。
【請求項９】
冷凍処理が、零下２０℃に１２時間以上保存し、セレブロシド含有物の沈殿を得ることを特徴とする請求項８記載のセレブロシド含有物の製造方法。
【請求項１０】
請求項８で得られたセレブロシド含有物の沈殿が含まれるエタノール含有液を、下記する（１）〜（５）の工程の少なくともひとつで処理すること、を特徴とするセレブロシド含有物の製造方法。
（１）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（２）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物をアセトン及び／又はヘキサンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
（３）工程（２）において、洗浄処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（４）工程（１）において得た固体又は粉体をアセトン及び／又はヘキサンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
（５）工程（２）において、アセトン及び／又はヘキサンにて洗浄処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
【請求項１１】
セレブロシド含有酵母又は糸状菌が請求項１〜５のいずれかの方法で製造したものであること、を特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
酵母がサッカロマイセス属及び／又はクルイベロマイセス属に属する酵母であること、を特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
酵母がサッカロマイセス・クルイベリ及び／又はクルイベロマイセス・ラクチスであること、を特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られたセレブロシド高含有酵母。
【請求項１５】
糸状菌がアスペルギルス属、ペニシリウム属、モナスクス属の少なくともひとつに属する糸状菌であること、を特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
糸状菌がアスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ニガー、ペニシリウム・ロックフォルティ、モナスクス・アンカから選ばれるものであること、を特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって得られたせセレブロシド高含有糸状菌。
【請求項１８】
請求項６〜１３、１５、１６のいずれか１項に記載の方法で製造してなるセレブロシド含有物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌類から抽出するセレブロシドの製造法に関する。
本発明で使用するグルコシルセラミド等セレブロシド画分を抽出する原料となる真菌類は、グルコシルセラミド等セレブロシドを含有するものであり、抽出原料となる部位は特に限定されることがない。抽出原料となる真菌類の例として、酵母、カビ、及びキノコが挙げられる。
酵母の例として、サッカロマイセス属、具体的にサッカロマィセス・クルイヴェリ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  IFO 1685）など、クルイヴェロマィセス属、具体的にクルイヴェロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  IFO 1090）、クルイヴェロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ  IFO 10067）、クルィヴェロマイセヌ・ワルティ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａ１ｔｉｉ  IFO 1666）、クルイヴェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  IFO 0617）、クルイヴェロマイセス・ウィッケルハミ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ  IFO 1675）など、チゴサッカロマイセス属、具体的にチゴサッカロマイセス・シドリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｄｒｉ  IFO 1990）、チゴサッカロマイセス・フェルメンタティ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ  IFO 1996）などがある。
また、カビの例として、アスベルギルス属、具体的にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  IFO 30104）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）など、リゾープス属、具体的にリゾープス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  IFO 31005）などがある。
また、キノコとしては食用できるキノコであれば特に制限はなく、子実体、菌糸体のいずれも使用することができる。キノコの例としてマイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ  ｅｄｏｄｅｓ  IFO 31866）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓ  IFO 30776）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、タモギタケ（Ｐｌｕｅｒｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｕｃｏｐｉａｅ  IFO 30528）、エノキダケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ  IFO 31862）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｎａｍｅｋｏ  IFO 30373）、ツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓ  IFO 30874）などがある。
抽出原料としては、これらの材料の粉砕物が好ましく使用できる。中でも好ましくは、送風乾燥粉砕物、熱風乾燥粉砕物、スプレードライ物、フレンチプレス乾燥物、凍結乾燥粉砕物などが使用される。
【背景技術】
【０００２】
セレブロシドは、スフィンゴ糖脂質ともいわれ、スフィンゴイドと脂肪酸から構成されるセラミドに糖が結合した糖脂質であって、糖がグルコースの場合はグルコシルセラミド（グルコセレブロシド）ともいわれ、皮膚の角質層に多く含まれるスフィンゴ糖脂質であり、皮膚の保湿性や柔軟性にかかわっていると言われている。従来は安価な供給源として牛脳が用いられていたが、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）の発症の原因であるプリオンが脳幹部位に蓄積していることが明らかとなって以来、食品・化粧品用途での利用は不可能となった。
【０００３】
牛脳の代替供給源として現在では、大豆油さいやビール粕、米や小麦などの穀類の胚芽、コンニャク芋などからの抽出が行われているが、含有量が微量であることから、抽出精製のコストがかかるため、製品が高価となり、セレブロシド自体の用途が限られてしまうという問題があった（特許文献１、２）。
【０００４】
一方、ある種の酵母にセレブロシドが含有されていることは知られているが（非特許文献１）、含有量が少なかったり、酵母を大量に培養する技術が未だ開発されておらず、工業的に安定してセレブロシドを酵母から大量生産する方法は確立されていない。もちろん、ビートモラセスを用いてセレブロシド含有酵母を大量培養したり、ストレスを与えることによりセレブロシドの生産量、蓄積量を高めたり、溶媒抽出と冷凍処理の併用によって高純度のセレブロシドを効率的に製造したりすることは、いずれも、従来知られているものではない。ましてや、糸状菌について何も知られていない。  
【特許文献１】特開平４−２８２３１７号公報
【特許文献２】特開平１１−１９３２８３号公報
【非特許文献１】ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４９６（２００２）１−６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培養という均一手段により、簡単に、しかも大量に培養でき、含有量の多い酵母菌体を選択することにより、均一なセレブロシドを大量に抽出することを目的とした。また、高純度セレブロシドを効率的に工業生産することも目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的達成のため、本発明者らは各方面から検討した結果、安価な糖源である糖蜜、特にまた、ビート糖の製造時に副生するビート糖蜜（ビートモラセス）に着目して、セレブロシド含有酵母を培養したところ、培養が可能であるだけでなく、培養方法を改良することによって該酵母の大量培養が可能であることをはじめて見出し、セレブロシド含有菌体を大量に生産することにより、セレブロシド抽出の工業的原料として使用可能であることをはじめて見出した。
【０００７】
動物由来素材や植物由来素材ではなく、培養菌体を使用する利点は抽出する原料としての品質が一定であることから、抽出工程の管理を自動化することも可能となり、抽出コストの低減化も可能となる。また、培養に用いる菌株はパン酵母など食品用として古くから使用されているサッカロマイセス属等の酵母であることから供給源としても安全である。
【０００８】
そして更に本発明者らは研究をすすめ、酵母を大量培養するだけでなく、酵母菌体内におけるセレブロシドの蓄積量を高める点に着目し、各方面から検討、研究を行った結果、酵母にストレスを与えることでそれが可能となることをはじめて見出した。
【０００９】
そして更に本発明者らは、酵母培養後のセレブロシドの抽出の面についても着目し、鋭意研究の結果、エタノール抽出した後にこの抽出液を冷凍処理することにより、高純度のセレブロシドを効率よく得ることもはじめて見出した。また、本発明者らは、これらの有用新知見を糸状菌（カビ）及び担子菌（キノコ）についてもはじめて見出した。
【００１０】
本発明は、これら有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものである。
以下、酵母を代表例にとり本発明について詳しく述べる。
【００１１】
北海道の主要畑作物であるビート（甜菜）とそこから砂糖を生産するビート糖業は地域の基幹産業となっている。ビート糖製造に際して副生されるビートモラセスは全量で年間約１２，９００ｔ産出されているが、用途が限られている。本発明ではこのビートモラセスを発酵原料として利用し、アトピー性皮膚炎の改善や大腸ガン発生予防などの機能性や薬効が期待されるセレブロシドを蓄積する酵母サッカロマイセス・クルイベリを大量に培養するための技術を開発するとともに、セレブロシドの蓄積量を増加させる培養条件を見いだした。
【００１２】
大量培養するための方法としてはビートモラセスに含まれる糖を炭素源として、副原料として窒素源、燐酸源、グロースファクターとしてコーンスティープリカー（ＣＳＬ）を添加した培地を用いることで安価な培地組成での大量培養を可能にした。ビートモラセス含有培地で大量培養可能な酵母としては、サッカロマイセス・クルイベリ（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＩＦＯ  １６８５）等サッカロミセス属菌や、クルイベロマイセス・ラクチス（例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＩＦＯ  １０９０）等クルイベロマイセス属菌その他セレブロシド生産性を有する酵母が挙げられる。
【００１３】
同様に、糸状菌としては、アスペルギルス・オリーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＦＯ  ３０１０４）、アスペルギルス・ニガー（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＩＦＯ  ４４１４）等アスペルギルス属菌や、ペニシリウム・ロックフォルティ（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ  ＩＦＯ  ８８８９）等ペニシリウム属菌や、モナスクス・アンカ（例えば、Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ａｎｋａ  ＩＦＯ  ６５４０）等モナスクス属菌その他セレブロシド生産性を有する糸状菌が挙げられる。
【００１４】
ビートモラセス含有培地で該酵母を培養することにより、大量培養が可能となるが、培地をアルカリ性にすると更なる大量培養が可能となる。培地ｐＨとしてはｐＨ５〜９が好ましく、更に好ましくはアルカリ性ｐＨ、例えば７．５〜８．８であり、特に限定するものではないが、通常、ｐＨ８．５前後で行われる。
【００１５】
このようにして本発明においては酵母を大量に培養、取得してセレブロシドを大量に製造するほか、個々の酵母自体におけるセレブロシドの生産量ないし蓄積量を高めることによりセレブロシドを大量に製造するシステムも包含するものである。
【００１６】
そのためには、セレブロシド生産性酵母の培養中に及び／又は培養した後に、培養した後に、ストレス環境下にて処理する必要がある。
【００１７】
ストレス環境下での処理としては、（Ａ）飢餓条件、例えば窒素源及び／又は炭素源を含まない培地での処理、（Ｂ）食塩及び／又はエタノール添加培地（添加量は、それぞれ、０．５〜５％、好ましくは０．７〜３．５％、特に限定するものではないが、通常は１〜２％程度）での処理、（Ｃ）アルカリ性培地（そのｐＨは上記と同じ）での処理の少なくともひとつが挙げられる。これらストレス環境下での処理には、通気攪拌培養、静置培養その他の培養処理、及び、インキュベート処理の少なくともひとつが包含される。
【００１８】
このように、本発明によれば、大量培養を行う際に培地をアルカリ性にすることや塩濃度を高める事によって、炭素源や窒素源、グロースファクターの組成が同じであっても、セレブロシド含量を増加させることも可能である。
【００１９】
菌体内のセレブロシド蓄積量を増加させるもう一つの方法としては、上記したように、大量培養した菌体を回収、必要に応じて水洗した後、飢餓条件で再培養する方法も可能である。この方法によれば菌体が大量に取得できてもセレブロシド含量が低いという菌株があった場合に、予め大量の菌体を取得しておけば、後段の飢餓条件でセレブロシド蓄積量を高めることが可能となる。この飢餓条件は窒素源を含まない培地および炭素源を含まない培地によっても達成することが可能である。
【００２０】
これらの酵母からセレブロシドを抽出するには、酵母を超音波処理等常法にしたがって破壊した後（例えばセレブロシドが菌体内に蓄積される場合）又は破壊することなく（例えば、セレブロシドが菌体外に分泌される場合）、有機溶媒で抽出し、所望する場合、クロマトグラフィー処理等の常法により更に精製することができる。なお、菌体内にセレブロシドが蓄積される場合であっても、菌体を破壊することなく直接溶媒を用いて抽出することも可能である。菌体としては、乾燥菌体でも湿潤菌体のいずれでもよい。
【００２１】
溶媒抽出は次のようにして行えばよい。
エタノール量：２〜１００倍、好ましくは３〜１０倍量。
抽出温度：特に限定されていないが、一般に２０〜１００℃、５０〜７０℃が好ましく、常温でも可能。
時間：５分〜２４時間、好ましくは３０分〜４時間。
抽出回数：１〜１０回、好ましくは１〜３回であるが、連続抽出も可能。
有機溶媒種類：エタノールまたは含水エタノール（７０〜９９％エタノールが好ましいが；エタノール、含水エタノール、メタノール、含水メタノール、ヘキサン、アセトン、クロロホルム、クロロホルム−メタノール混液、ベンゼン、イソプロパノール等も使用可能。）
抽出方法：攪拌抽出、還流抽出、浸漬抽出、振とう抽出、超音波抽出。
【００２２】
このようにして得られた抽出液は、適当な濃縮操作により、例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮し、濃縮液を得ることができる。さらに濃縮乾燥させて、濃縮乾固物を得ることもできる。このようにして得た濃縮乾固物は、通常、黄色の固形油脂の形状である。
こうして得られた抽出物から適当な精製手段によりグルコシルセラミド画分を得ることができる。例えば、該抽出物をシリカゲルカラムにてクロロホルム−メタノールを用いて、数回精製し、固形油脂状のグルコシルセラミド画分を得ることができる。
【００２３】
こうして得られたグルコシルセラミド画分におけるグルコシルセラミドを定量するには、例えばＨＰＬＣ−光散乱検出器を使用することができる。実際、上記の抽出操作により、グルコシルセラミドを８０〜９９質量％程度含有するグルコシルセラミド画分を得ることができる。同様にして、他のセラミド画分も分画、入手することができる。
【００２４】
また更に、本発明は、酵母及び／又はその破砕物（菌体溶解物を含む）を有機溶媒（アルコール、特にエタノールが好適）抽出し、分離した有機溶媒溶液を冷凍処理して、セレブロシド（以下、スフィンゴ糖脂質ということもある）含有物の沈殿を得ることにより、セレブロシド（スフィンゴ糖脂質）濃度の高い同含有物を製造するシステムも包含するものである。
【００２５】
本発明は、例えば、乾燥した酵母素材１重量部に対して、エタノールを２〜５重量部を加えて、５０〜６０℃にて抽出した後、固形分を分離し、得られたエタノール抽出液を零下２０℃以下に１２時間以上保存して、スフィンゴ糖脂質含有物の沈殿物を得るスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法を包含するものである。また更に、得られたスフィンゴ糖脂質含有物の沈殿物を、エタノール液より分離し、その沈殿物をアセトン及び／又はヘキサンにより混合洗浄して、スフィンゴ糖脂質以外の脂質を除去することによる高純度のスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法を包含するものである。
【００２６】
後者の具体的態様としては、次のものが例示される。すなわち、素材をエタノール処理及び冷凍処理し、得られたスフィンゴ糖脂質含有物の沈殿が含まれるエタノール含有物を、下記する（１）〜（５）の工程の少なくともひとつで処理すること、を特微とするスフインゴ糖脂質の製造方法。
（１）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（２）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物をアセトン及び／又はヘキサンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
（３）工程（２）において、アセトン及び／又はヘキサンにて洗浄処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（４）工程（１）において得た固体又は粉体をアセトン及び／又はヘキサンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
（５）工程（２）において、アセトン／又はヘキサンにて洗浄処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
【００２７】
酵母から得られたスフィンゴ糖脂質は、セラミドに糖としてグルコースが結合したグルコシルセラミド（グルコセレブロシド）のほか、セラミドに各種の糖が結合したもの、例えば、更に単糖結合よりも糖鎖の大きい、ガングリオシド、ラクトシルセラミド、グロボシセラミド、その他、セラミドやスルファチド等からなるものであって、スフィンゴ糖脂質含有物ということができる。グルコシルセラミドの分子種の一例として、２−ヒドロキシ脂肪酸残基が炭素原子数１８からなる飽和脂肪酸であり、スフィンゴイド塩基部位が９−メチル−４−トランス，８−トランス−スフィンガジエニンからなるグルコシルセラミド（１８ｈ：０−９Ｍｅ  ｄ１８：２4t,8t−Ｇｌｃ）が挙げられる。
【００２８】
酵母由来素材としては、ビートモラセス培地で大量培養した酵母、該培地及び／又は通常の培地で培養した酵母をストレス処理して得た酵母、湿潤酵母、乾燥酵母（凍結乾燥、加熱乾燥、熱風乾燥、天然乾燥等常法にしたがって乾燥した酵母）その破砕物の少なくともひとつが適宜使用されるが、以下、乾燥酵母を例にとって説明する。他の場合はこの例に準じて抽出その他の処理を行えばよい。
【００２９】
本発明を実施するには、酵母由来素材を有機溶媒で抽出する必要があるが、本発明で使用するスフィンゴ糖脂質の抽出用有機溶媒としては、アルコール、特にエタノールが好適である。エタノールは水分がない市販のものが好ましいが、回収したエタノールでも水分５％以下のものであれば使用が可能である。エタノールの添加量は、原料素材１重量部に対して１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。エタノールの添加量が少なければ、その後の操作が容易になるが、あくまでも各素材のスフィンゴ糖脂質の抽出率を高くする添加量を選ぶべきである。
【００３０】
抽出温度は、室温程度から７０℃、さらに望ましくは５０〜６０℃の範囲がよい。抽出時間は、１〜２４時間、望ましくは２〜５時間程度である。抽出中の攪拌などで時間を短縮でき、溶剤によって抽出時間が異なってくる。次に、抽出残渣の分離除去を行う。分離方法は特に限定されたものではなく、固液分離装置、例えば、遠心分離機、フィルタープレス、シリンダープレスなどによれば良い。
【００３１】
このようにして得られたエタノール抽出液は、本発明の冷凍処理を行う。冷凍処理は、冷凍温度は−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下が好ましい。そして、その冷凍温度にてエタノール抽出液を静置状態にて６〜２４時間、好ましくは１２〜２４時間保存する。この冷凍処理により、エタノール抽出液中にスフィンゴ糖脂質を含む沈殿物が生成してくる。
【００３２】
このようにして、エタノール抽出液の凍結処理によって沈殿を生成せしめ、これを固液分離システムによって液体（エタノール溶液部）と沈殿物に分離する。なお、本明細書においては、生成した沈殿を液体部と分離して得たものを沈殿物といい、液体部と分離しないものは、単に沈殿という。
【００３３】
上記凍結処理によって得られた沈殿物（すなわち、凍結処理によって生成した沈殿を分離した物）は、そのままあるいは乾燥して（固体及び／又は粉末化してもよい）スフィンゴ糖脂質含有液として提供することができる。
【００３４】
また、更に純度を高めたスフィンゴ糖脂質含有物を得るためには、凍結処理による沈殿物、及び／又は、これを乾燥したもの（固体あるいは所望に応じて粉末化したもの）をアセトン及び／又はヘキサン洗浄すればよい。洗浄処理は、沈殿物及び／又はその乾燥物にアセトン及び／又はヘキサンを添加、混合、攪拌した後、固液分離して液体部を除去し、その残部（沈殿物という）を取得すればよい。例えば、凍結処理による沈殿物の場合、沈殿物１重量部にアセトン及び／又はヘキサンの１〜２０重量部、好ましくは５〜１０重量部と混合攪拌して、その後液体部を除去することにより、純度を高めることができる。乾燥物の洗浄の場合も、上記した沈殿物の洗浄にならって適宜実施すればよい。
【００３５】
このようにして洗浄した後、沈殿物はそのままスフィンゴ糖脂質含有物として提供できるが、上記と同様にこれを乾燥して（固体及び／又は粉末化して）もよい。なお、洗浄溶媒としてアセトンとヘキサンの混液を使用する場合には、等量混合を含む１：９９〜９９：１の比率で混合した混液を使用することができる。
【００３６】
本発明においては、食品添加物として認可されている有機溶媒（エタノール、アセトン、ヘキサン）のみを用いて、エタノール抽出液の凍結処理（沈殿物の取得）、アセトン及び／又はヘキサンによる洗浄処理を行うことにより、容易に食用の高純度スフィンゴ糖脂質含有物を得ることを見出し、本発明を完成させた。また、スフィンゴ糖脂質含有物のスフィンゴ糖脂質純度を更に上げるためには、クロマトグラフィー等の処理を施せばよい。
【００３７】
クロマトグラフィー処理は、常法にしたがって行えばよく、例えばクロマト分離法としては、その分離装置は固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）、半連続方式（固定床方式と連続方式の組合せ）が適用できる。その装置の充填イオン交換樹脂としては、クロマト用のＮａ形、Ｋ形、Ｃａ形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。その樹脂は均一粒径のスチレンジビニルベンゼン系樹脂等が用いられる。イオン交換樹脂のメーカーから種々のクロマト用樹脂が販売されているので、適宜選択してクロマト処理すればよい。
【発明の効果】
【００３８】
動植物から抽出するのではなく、真菌類、例えば酵母や糸状菌の培養という手段を使用し、工業的に大量、且つ、均一なセレブロシドを得ることができる。また、酵母又は糸状菌自体におけるセレブロシドの蓄積量を高めることもでき、更に、飲食品用途にも使用可能な抽出、精製法も提供される。しかも、ビート糖製造時に多量に副生するビートモラセスについても有用な新規用途が開発された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に、本発明の実施例によって更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
〔ＹＰＤ培地でのセレブロシド蓄積〕
供試菌株としてサッカロマイセス  クルイベリの菌株番号ＮＢＲＣ１６８５、ＮＢＲＣ１８１１、ＮＢＲＣ１８９２、ＮＢＲＣ１０８４７、ＮＢＲＣ１０８４８、ＮＢＲＣ１０９５５、ＣＢＳ２８６１、ＣＢＳ４１０４、ＣＢＳ４５６６、ＣＢＳ４５６８、ＣＢＳ４５６９、ＣＢＳ４５７０、ＣＢＳ４７９８、ＣＢＳ４７９９、ＣＢＳ４８００、ＣＢＳ４８０１、ＣＢＳ５８２８、ＣＢＳ６５４５、ＣＢＳ６５４６、ＣＢＳ６５４７、ＣＢＳ６５４８、ＣＢＳ６６２６を使用し、ＹＰＤ培地（イーストエキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）１０ｍｌで３０℃、２４時間培養したものを種培養とし、同組成の培地１００ｍｌで３０℃、３６時間の振とう培養を行ない、培養終了後の菌体を遠心分離・水洗後、凍結乾燥し菌体重量を測定した。
【００４１】
供試菌株をＹＰＤ培地にて３回培養した結果ではサッカロマイセス  クルイベリの収量はほとんどが０．８ｇ／１００ｍｌ〜１．０ｇ／１００ｍｌに分布していた（表１）。
【００４２】
【表１】
2005185126.tif 000002
【００４３】
また、この凍結乾燥菌体をクロロホルム−メタノール混液で抽出した脂質を水洗・弱アルカリ処理後、光散乱検出器付き逆相ＨＰＬＣでセレブロシドを定量した。
その結果、菌体のセレブロシド含量（ＣＭＨ含量）は最高でも１．３３ｍｇ／ｇ乾燥菌体となった（表２）。
【００４４】
【表２】
2005185126.tif 000003
【実施例２】
【００４５】
〔ビートモラセス培地でのセレブロシド蓄積〕
供試菌株としてサッカロマイセス  クルイベリの菌株番号ＮＢＲＣ１６８５、ＮＢＲＣ１８１１、ＮＢＲＣ１８９２、ＮＢＲＣ１０８４７、ＮＢＲＣ１０８４８、ＮＢＲＣ１０９５５、ＣＢＳ２８６１、ＣＢＳ４１０４、ＣＢＳ４５６６、ＣＢＳ４５６８、ＣＢＳ４５６９、ＣＢＳ４５７０、ＣＢＳ４７９８、ＣＢＳ４７９９、ＣＢＳ４８００、ＣＢＳ４８０１、ＣＢＳ５８２８、ＣＢＳ６５４５、ＣＢＳ６５４６、ＣＢＳ６５４７、ＣＢＳ６５４８、ＣＢＳ６６２６を使用し、ＹＰＤブロス１０ｍｌで３０℃、２４時間培養したものを種培養とし、ビートモラセス培地（硫酸アンモニウム０．３％、尿素０．１９％、燐酸１カリウム０．０７５％、硫酸マグネシウム０．０７５％、コーンスティープリカー０．５％、ビートモラセス１０％）１００ｍｌで３０℃、３６時間の振とう培養を行ない、培養終了後の菌体を遠心分離・水洗後、凍結乾燥し菌体重量を測定した（表３）。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
ビートモラセス培地で培養した菌株の乾燥菌体重量はサッカロマイセス  クルイベリの標準株ＮＢＲＣ１６８５株と比較してＮＢＲＣ１８１１、ＮＢＲＣ１０８４８、ＮＢＲＣ１０９５５、ＣＢＳ４５６６、ＣＢＳ４７９８、ＣＢＳ４７９９、ＣＢＳ４８０１、ＣＢＳ６５４５、ＣＢＳ６５４７、ＣＢＳ６６２６が高収量であった。
【００４８】
また、この凍結乾燥菌体をクロロホルム−メタノール混液で抽出した脂質を水洗・弱アルカリ処理後、光散乱検出器付き逆相ＨＰＬＣでセレブロシドを定量した。標準株ＮＢＲＣ１６８５株よりＣＭＨ含量が高い株として４菌株（ＮＢＲＣ１０８４７、ＣＢＳ４８００、ＣＢＳ４５６８、ＣＢＳ６５４６）が得られた。この中でＮＢＲＣ１０８４７、ＣＢＳ６５４６株のＣＭＨ含量はＮＢＲＣ１６８５株の約１．５倍であった（表４）。
【００４９】
【表４】
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【実施例３】
【００５０】
〔飢餓条件によるセレブロシド蓄積量変化〕
ＮＢＲＣ１０８４７を使用し、菌体収得後の培養処理がセレブロシド蓄積量に与える影響を調べた。ビートモラセス培地にて培養した菌体０．７ｇを数種の飢餓培養培地１００ｍｌに接種して、４８時間振とう培養を行いセレブロシド蓄積量を調べた。その結果、炭素源および窒素源を含まない水培地、炭素源を含まないイーストニトロゲンベース単独培地、２％食塩を含む培地においてセレブロシド蓄積量の増加が見られた（表５）。有意差ありとはならなかったが、エタノール１％及びエタノール２％の培地でもセレブロシド蓄積量は増加する傾向が見られた。
【００５１】
【表５】
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【実施例４】
【００５２】
〔培地食塩の影響〕
標準株ＮＢＲＣ１６８５を用いてＹＰＤブロス１０ｍｌで３０℃、２４時間培養したものを種培養とし、食塩濃度を０％、１％、２％としたビートモラセス培地（硫酸アンモニウム０．３％、尿素０．１９％、燐酸１カリウム０．０７５％、硫酸マグネシウム０．０７５％、コーンスティープリカー０．５％、ビートモラセス１０％）１００ｍｌで３０℃、４３時間の振とう培養を行なった。培養終了後の菌体を遠心分離・水洗後・凍結乾燥し、凍結乾燥菌体をクロロホルム−メタノール混液で抽出した脂質を水洗・弱アルカリ処理後、光散乱検出器付き逆相ＨＰＬＣでセレブロシドを定量した。食塩の添加によりセレブロシド含量は有意に増加することが分かった（表６）。
【実施例５】
【００５３】
〔培地アルカリ化の影響〕
標準株ＮＢＲＣ１６８５を用いてＹＰＤブロス１０ｍｌで３０℃、２４時間培養したものを種培養とし、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０としたビートモラセス培地（硫酸アンモニウム０．３％、尿素０．１９％、燐酸１カリウム０．０７５％、硫酸マグネシウム０．０７５％、コーンスティープリカー０．５％、ビートモラセス１０％）１００ｍｌで３０℃、４３時間の振とう培養を行なった。培養終了後の菌体を遠心分離・水洗後、凍結乾燥し、凍結乾燥菌体をクロロホルム−メタノール混液で抽出した脂質を水洗・弱アルカリ処理後、光散乱検出器付き逆相ＨＰＬＣでセレブロシドを定量した。培地ｐＨを８．０とすることでセレブロシド含量は有意に増加することが分かった。実施例５の条件との併用効果は明確にはならなかったが、コントロールと比べてセレブロシド含量が増加した（表６）。
【００５４】
【表６】
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【実施例６】
【００５５】
〔ビートモラセス培地を用いたジャー培養〕
フラスコレベルの培養によってセレブロシドの蓄積量が高蓄積であったＮＢＲＣ１０８４７、ＣＢＳ４５６８、ＣＢＳ４８００、ＣＢＳ６５４６、低蓄積であったＣＢＳ４７９８、ＣＢＳ４７９９、ＣＢＳ６６２６、さらに標準株ＮＢＲＣ１６８５を用いてバッチジャー培養を行った。使用機器は千代田製作所製ＴＦＬ５型ジャー培養槽で温度コントロールのみを行い、ｐＨ、溶存酸素濃度（ＤＯ）を計測した。培養にはＹＰＤブロス３５ｍｌで３０℃、２４時間培養したものを種培養として用い、ビートモラセス培地（硫酸アンモニウム０．３％、尿素０．１９％、燐酸１カリウム０．０７５％、硫酸マグネシウム０．０７５％、コーンスティープリカー０．５％、ビートモラセス１０％）３．５Ｌに接種した。培養時の通気量は３．５Ｌで攪拌数は開始時７００ｒｐｍで溶存酸素の変動により変化させた。培養中には１２時間間隔で１００ｍｌずつのサンプリングを行い遠心分離・水洗後、凍結乾燥し菌体重量を測定し、増殖経過を記録した（図１）。
【００５６】
また、この凍結乾燥菌体をクロロホルム−メタノール混液で抽出した脂質を水洗・弱アルカリ処理後、光散乱検出器付き逆相ＨＰＬＣでセレブロシドを定量した（図２）。
【実施例７】
【００５７】
〔ビートモラセス培地で培養した菌体の飢餓処理〕
実施例６で収得した菌体のなかで標準株ＮＢＲＣ１６８５、ＣＢＳ４７９８、ＣＢＳ４７９９、ＣＢＳ６６２６を用いて飢餓処理を行った。飢餓処理はビートモラセス培地での培養終了後、遠心分離・水洗後、滅菌水に懸濁した菌体を７００ｍｇ／１００ｍｌの最終濃度になるようにグルコース２％、チアミン１００ｐｐｍからなる培地３．５Ｌに接種した。飢餓処理時の通気量は３．５Ｌで攪拌数は７００ｒｐｍ一定で行った。培養中には６、１２、２４、４８時間間隔で１００ｍｌずつのサンプリングを行い遠心分離・水洗後、凍結乾燥し菌体重量を測定し、得られた凍結乾燥菌体を用いてセレプロシド含量を測定した。
【００５８】
本実施例で用いた飢餓処理培地は窒素飢餓を目的としたものであり、実施例３では有意なセレブロシド含量の上昇が見られなかった処理条件ではあるが、図３に示した通り、４８時間の飢餓処理で１．７〜２．０倍のセレブロシド蓄積量増加が見られた。
【実施例８】
【００５９】
〔酵母グルコシルセラミドの抽出精製〕
酵母菌体としては、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＮＢＲＣ  １０８４７株を用いた。この酵母乾燥菌体２０ｋｇより、エタノール１２０Ｌで７０℃にて攪拌抽出し、濾過して得られた抽出液を減圧乾固した。得られた抽出物をシリカゲルカラムにてクロロホルム−メタノールを用いて４回精製し、グルコシルセラミド画分１９．９ｇを得た。
【実施例９】
【００６０】
サッカロマイセス・クルイベリ  ＮＢＲＣ  １０８４７株の熱風乾燥菌体１ｋｇを密閉式攪拌槽に投入し、そこにエタノール２．５Ｌを加え、６０℃で６時間攪拌した。その後、吸引ろ過により抽出液と残渣を分離した。エタノール抽出液は冷凍庫（−５０℃）にて１２時間保存した。冷凍処理により得たエタノール抽出液中の沈殿物は遠心分離にて分取し、沈殿物を得た。この沈殿物にアセトン１００ｍｌを加え攪拌混合後、不溶物を遠心分離にて分取し、減圧乾燥機（５０℃）にて乾燥して白褐色の粉末乾固物（セレブロシド含有物）を得た。
【００６１】
以上、サッカロマイセス・クルイベリを例にとって本発明を説明したが、本発明においては、他の酵母、例えばクルイベロマイセス・ラクティスといったクルイベロマイセス属菌も使用可能であるが、他の真菌、例えばアスペルギルス・オリーゼ、同ニガー等の黄麹菌や黒麹菌その他各種のアスペルギルス属菌、ペニシリウム・ロックフォルティ等のペニシリウム属菌、モナスクス・アンカ等のモナスクス属菌も上記と同様に本発明に包含され、本発明において使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】酵母のジャー培養増殖経過を示す。
【図２】酵母におけるセレブロシド蓄積量の経時変化を示す。
【図３】ジャー培養酵母菌体の飢餓処理によるセレブロシド含量の変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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