(57)【要約】【課題】  自家蛍光のみを測定して病変組織の画像を取得するのではなく、腫瘍親和性物質から発せられる蛍光も測定して、自家蛍光と腫瘍親和性物質から放出される蛍光の強度の除算を行い、それによって腫瘍部を高精度でしかも術中リアルタイムで計測可能な腫瘍画像検出方法と腫瘍画像検出装置を提供する。【解決手段】  腫瘍親和性物質の投与工程Ｓ１と、この腫瘍親和性物質を励起する波長と腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する波長を含む電磁波の照射工程Ｓ２と、励起された腫瘍親和性物質から発せられる蛍光強度を測定する第１の測定工程Ｓ３と、励起された自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光強度を測定する第２の測定工程Ｓ４と、腫瘍親和性物質の蛍光強度と自家蛍光タンパク質の蛍光強度の比を演算する演算工程Ｓ５と、蛍光強度の比を表示する表示工程Ｓ６を有する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍親和性物質の投与工程と、この腫瘍親和性物質を励起する波長と腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する波長を含む電磁波の照射工程と、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる蛍光強度を測定する第１の測定工程と、励起された前記自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光強度を測定する第２の測定工程と、前記第１の測定工程で測定された腫瘍親和性物質の蛍光強度と前記第２の測定工程で測定された自家蛍光タンパク質の蛍光強度の比を演算する演算工程と、この演算工程で演算された蛍光強度の比を表示する表示工程とを有することを特徴とする腫瘍画像検出方法。
【請求項２】
腫瘍親和性物質の投与工程と、この腫瘍親和性物質を励起する波長を含む電磁波を照射する第１の照射工程と、腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する波長を含む電磁波を照射する第２の照射工程と、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる蛍光強度を測定する第１の測定工程と、励起された前記自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光強度を測定する第２の測定工程と、前記第１の測定工程で測定された腫瘍親和性物質の蛍光強度と前記第２の測定工程で測定された自家蛍光タンパク質の蛍光強度の比を演算する演算工程と、この演算工程で演算された蛍光強度の比を表示する表示工程とを有することを特徴とする腫瘍画像検出方法。
【請求項３】
腫瘍親和性物質を励起する第１の波長と腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する第２の波長の電磁波を照射する能力を備える電磁波発生部と、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光と励起された前記自家蛍光タンパク質から発せられる第２の蛍光を分離する蛍光分離部と、前記第１の蛍光及び／又は第２の蛍光を受光する蛍光受光部と、前記第１の蛍光と第２の蛍光の蛍光強度の比を演算する演算部と、この演算部で演算された蛍光強度の比を表示する表示部とを有することを特徴とする腫瘍画像検出装置。
【請求項４】
腫瘍親和性物質を励起する第１の波長の電磁波を照射する能力を備える第１の電磁波発生部と、生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する第２の波長の電磁波を照射する能力を備える第２の電磁波発生部と、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光と励起された前記自家蛍光タンパク質から発せられる第２の蛍光を分離する蛍光分離部と、前記第１の蛍光及び／又は第２の蛍光を受光する蛍光受光部と、前記第１の蛍光と第２の蛍光の蛍光強度の比を演算する演算部と、この演算部で演算された蛍光強度の比を表示する表示部とを有することを特徴とする腫瘍画像検出装置。
【請求項５】
前記蛍光分離部と前記蛍光受光部に代えて、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光を受光する第１の蛍光受光部と、励起された前記自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光を受光する第２の蛍光受光部とを備えることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の腫瘍画像検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、正常部位と病変部位を正確に知るための腫瘍画像検出方法とその装置に係り、特に腫瘍親和性物質と生体自家蛍光たんぱく質が紫外線などの電磁波によって励起されて放出される２種類の蛍光を測定することでより鮮明な腫瘍境界を示して高精度の腫瘍画像検出を可能とする腫瘍画像検出方法とその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】  腫瘍に関する手術、特に脳腫瘍手術では、病変部位を正確に知り過不足なく切除することが患者の予後を決定すると言われている。悪性腫瘍の場合、５年生存率は全摘出の場合４５．８％であるのに対し、５０％摘出では１７．５％程度であると報告する文献もある。さらに、摘出率はＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を左右する重要な要素でもある。しかし、腫瘍境界が不鮮明なことが多く、特に悪性脳腫瘍では、正常脳組織の中に浸潤しながら発育するため、腫瘍摘出時に正常組織と腫瘍組織を肉眼で識別することは非常に困難である。
通常、組織の色調や硬さなどの術者の主観及び経験と勘による識別がほとんどであり、客観的な手法が確立されていない。
ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）の術前データによる手術ナビゲーションも行われているが、術中では髄液の排出や腫瘍切除などに伴う脳の偏位、また患者固定位置の変化のため、腫瘍部位を正確にモニタリングすることは不可能である。このため、術中ＭＲＩなどのリアルタイム計測機器の開発が盛んに行われているが、使用手術機器の制限だけでなく高額であることから、現段階では導入が容易ではない。【０００３】  一方、悪性腫瘍の治療に光線力学治療法（ＰＤＴ：Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ）の開発が進んでいる。これは、腫瘍親和性薬品を投与することによって選択的に病変部位に薬物を集積させ、特定波長光の照射による光化学反応を用いて腫瘍細胞を破壊する治療である。ＰＤＴに用いられる薬品の多くは蛍光を発する染料であり、光線力学診断（ＰＤＤ：Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）に利用することも可能である。
このＰＤＤの例としては、生体組織に含まれるいくつかの自家蛍光タンパク質は紫外線の照射を受けて励起され、蛍光を放出するが、その蛍光の強度が一般的には腫瘍部位にて低下することが知られており、正常部位と病変部位における自家蛍光強度を測定してそのコントラストから腫瘍部を検出する方法や装置が開発されている。【０００４】  例えば、特許文献１には、「規格化画像生成方法及び装置」として、互いに異なる波長帯域の蛍光画像の少なくとも１つに所望のオフセットを付加し、そのオフセットの付加された互いに異なる波長帯域の蛍光画像の比に基づいて規格化演算を行う際に規格化基準値が蛍光画像の検出手段と生体組織との距離に依存せず一定となるように規格化蛍光画像を生成する方法と装置に関する発明が開示されている。
この発明がなされる背景として従来の技術に記載されるとおり、生体内在色素の励起光波長領域にある励起光を生体組織に照射した場合に、正常組織と病変組織とでは発する蛍光強度が異なる旨の記載がある。また、２種類の異なる波長の蛍光を用いて、オフセットを付加して、除算値を求め規格化蛍光画像を求めてＳ／Ｎ比を向上させる技術についても説明がある。
しかしながら、オフセットの大きさによってはＳ／Ｎ比の改善を損ねる場合もあり、この発明では、規格化画像に所定の補正関数を用いて生体組織と画像検出手段との距離に起因する画像の変動量を補正する距離補正を施して補正規格化画像を生成するようにしている。よって、オフセットの付加による規格化演算値のＳ／Ｎ比の向上を図ることができる。また、画像検出手段と生体組織との距離に依存することなく、その距離が変化した場合でも一定の規格化演算値を得ることができる。【０００５】  また、特許文献２には、「蛍光診断装置」として生体組織に自家蛍光を発生させる第１の励起光と該励起光の照射により生体組織から発生した自家蛍光の照射により生体組織から発生した自家蛍光の波長領域の中間波長帯の波長を持つ第２の励起光とを同時に生体組織に照射する照射手段と、２つの励起光の照射により生体組織から発生した自家蛍光を検出する検出手段と、検出手段によって検出された蛍光の強度に基づいて診断のための特徴量を求める演算を行う演算手段を備える発明が開示されている。
この発明では、自家蛍光の波長領域の中間波長帯に第２の励起光を照射することにより、自家蛍光の長波長側の発光強度を高めて自家蛍光を検出して得られる強度値に含まれるノイズの割合を相対的に減少させることで、生体の組織性状を正確に捉える演算結果を得ることができる。【０００６】  さらに、特許文献３には「蛍光判定方法及び装置」として、既知正常組織の蛍光特性と比較することによって測定部の蛍光特性を判定する蛍光判定装置において、広い波長域に亘る蛍光情報を利用した演算エラーを起こしにくい安定した演算処理により蛍光特性を判定し、判定精度を向上させる発明が開示されている。【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３６４３６号公報
【特許文献２】特開２００１−１９８０７９号公報
【特許文献３】特開２００１−１０４２３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  しかしながら、上述の特許文献１乃至特許文献３に開示された発明においては、いずれも生体組織の自家蛍光を測定することによって、正常な生体組織であるかあるいは病変組織であるかという判断を行うものである。
特許文献１に開示された発明においては、波長の異なる蛍光を測定してオフセットを付加して除算して比を求めてＳ／Ｎ値を向上させる技術についても記載があるものの、自家蛍光の測定には変わりない。
これら自家蛍光の測定は、いずれの特許文献にも記載されているとおり、微弱な発光を捉える必要があり、その精度を高めるための技術が数多く開発されているものの、依然として精度が十分でないという課題を有していた。【０００９】  本発明はかかる従来の事情に対処してなされたものであり、これまでの自家蛍光のみを測定して病変組織の画像を取得するのではなく、腫瘍親和性物質から発せられる蛍光も測定して、自家蛍光と腫瘍親和性物質から放出される蛍光の強度の除算を行い、それによって腫瘍部を高精度でしかも術中リアルタイムで計測可能な腫瘍画像検出方法と腫瘍画像検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明の請求項１に記載の腫瘍画像検出方法においては、上述の問題点を解決するため、腫瘍親和性物質の投与工程と、この腫瘍親和性物質を励起する波長と腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する波長を含む電磁波の照射工程と、励起された前記腫瘍親和性物質から発せられる蛍光強度を測定する第１の測定工程と、励起された自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光強度を測定する第２の測定工程と、第１の測定工程で測定された腫瘍親和性物質の蛍光強度と第２の測定工程で測定された自家蛍光タンパク質の蛍光強度の比を演算する演算工程と、この演算工程で演算された蛍光強度の比を表示する表示工程とを有している。【００１１】  また、請求項２に記載の発明である腫瘍画像検出方法においては、腫瘍親和性物質の投与工程と、この腫瘍親和性物質を励起する波長を含む電磁波を照射する第１の照射工程と、腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する波長を含む電磁波を照射する第２の照射工程と、励起された腫瘍親和性物質から発せられる蛍光強度を測定する第１の測定工程と、励起された自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光強度を測定する第２の測定工程と、第１の測定工程で測定された腫瘍親和性物質の蛍光強度と第２の測定工程で測定された自家蛍光タンパク質の蛍光強度の比を演算する演算工程と、この演算工程で演算された蛍光強度の比を表示する表示工程を有している。
以上、請求項１及び請求項２に開示された構成の腫瘍画像検出方法においては、腫瘍部に対して腫瘍親和性物質を投与し、この腫瘍親和性物質と自家蛍光タンパク質に対してそれぞれを励起する電磁波を照射するため、自家蛍光よりも比較的大きな蛍光を発生させる腫瘍親和性物質が、蛍光強度の比を精度よく演算可能に作用する。【００１２】  さらに、請求項３に記載の発明である腫瘍画像検出装置においては、腫瘍親和性物質を励起する第１の波長と腫瘍部の生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する第２の波長の電磁波を照射する能力を備える電磁波発生部と、励起された腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光と励起された自家蛍光タンパク質から発せられる第２の蛍光を分離する蛍光分離部と、第１の蛍光及び／又は第２の蛍光を受光する蛍光受光部と、第１の蛍光と第２の蛍光の蛍光強度の比を演算する演算部と、この演算部で演算された蛍光強度の比を表示する表示部を有するものである。【００１３】  請求項４に記載の発明である腫瘍画像検出装置においては、腫瘍親和性物質を励起する第１の波長の電磁波を照射する能力を備える第１の電磁波発生部と、生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起する第２の波長の電磁波を照射する能力を備える第２の電磁波発生部と、励起された腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光と励起された自家蛍光タンパク質から発せられる第２の蛍光を分離する蛍光分離部と、第１の蛍光及び／又は第２の蛍光を受光する蛍光受光部と、第１の蛍光と第２の蛍光の蛍光強度の比を演算する演算部と、この演算部で演算された蛍光強度の比を表示する表示部を有するものである。
上記構成の請求項３及び請求項４に記載の腫瘍画像検出装置においては、電磁波発生部において発生される第１の波長と第２の波長の電磁波がそれぞれ腫瘍親和性物質と生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質を励起してそれぞれ異なる波長の蛍光を発生する。蛍光分離部では第１と第２の蛍光を分離して、蛍光受光部では第１の蛍光及び／又は第２の蛍光を受光する。なお、構成として蛍光分離部は、波長の異なる蛍光を分離してその分離された蛍光を蛍光受光部に導いてもよいし、蛍光受光部によって受光された後に波長の異なる蛍光を分離してもよい。
演算部では第１の蛍光と第２の蛍光の比を演算してその演算結果を表示部が表示する作用を有する。この第１の蛍光は腫瘍親和性物質から放出される蛍光であり、通常、自家蛍光よりも高い強度を備えており、よって、演算部はより高い精度を有する蛍光比を演算する作用を有する。【００１４】  請求項５に記載の発明である腫瘍画像検出装置は、請求項３又は請求項４に記載された腫瘍画像検出装置において、蛍光分離部と蛍光受光部に代えて、励起された腫瘍親和性物質から発せられる第１の蛍光を受光する第１の蛍光受光部と、励起された自家蛍光タンパク質から発せられる蛍光を受光する第２の蛍光受光部とを備えるものである。
上記構成の腫瘍画像検出装置においては、請求項３及び請求項４とは異なり、蛍光分離部によって波長の異なる蛍光を分離することなく、予め２つの蛍光受光部を備えてそれぞれが異なる波長の蛍光を受光するように作用する。また、腫瘍親和性物質から放出される蛍光を受光することには変わりなく、絵演算部が高い精度を有する蛍光比を演算するという作用は担保される。
【発明の効果】
【００１５】  本発明の腫瘍画像検出方法や腫瘍画像検出装置においては、自家蛍光タンパク質による蛍光のほか、腫瘍親和性物質による蛍光を受光してこれらの蛍光の強度に関して除法演算を行い蛍光の強度比を求めるため、一般的に自家蛍光よりも高い強度で放出される腫瘍親和性物質の蛍光によって精度の高い腫瘍画像検出を行うことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下に本発明を実施するための最良の形態について説明する。
まず、今回の発明の実施の形態に係る腫瘍画像検出方法の原理について説明する。電磁波としてレーザを用いたレーザ誘起蛍光法がその原理となる。このレーザ誘起蛍光法とは、レーザなどの照射光によって分子を蛍光発光させ、可視化又は蛍光強度から物理量を計測する手法である。測定対象に取り込まれた染料が対象表面から発する蛍光強度Ｉｆは、照射光侵達厚さが薄い場合、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則に従う。一般に、生体組織は強い散乱特性を有するが、紫外光を照射した場合は、約１ｍｍの表層部にのみ照射光は侵達するため、散乱の影響を無視した式（１）を用いて考察できると考えられる。【００１７】
【数１】
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ここで、Ｉ０は照射光強度、εはレーザ照射光波長における染料の吸収係数、Ｃは染料の濃度、φは染料の量子効率、Δｚは照射光の侵達組織厚さを表す。【００１８】  腫瘍親和性染料のみを用いた通常の光線力学診断法（ＰＤＤ）の場合、腫瘍部位における染料濃度Ｃは高いため、その濃度分布に応じた蛍光濃度Ｉｆを用いて腫瘍部位の定性的な検出を行う。しかし、式（１）から明らかなように、入射光強度Ｉ０（ｘ，ｙ，ｚ）は時空間的に変動しているだけでなく、照射光強度Ｉ０と染料濃度Ｃに応じて照射光侵達組織厚さΔｚも時空間分布を持つことになる。このため、Ｉｆは染料濃度分布Ｃ以外にも依存し、定量的に腫瘍部位を検出することはできない。
本実施の形態では、腫瘍親和性物質としての腫瘍親和性染料によるＰＤＤと自家蛍光を同時観察する２色レーザ誘起蛍光法を用いて、蛍光の計測精度及び腫瘍部コントラストを高める定量的な腫瘍画像検出方法とその装置を提供する。【００１９】  以下、図１を参照しながら本実施の形態に係る腫瘍画像検出方法とその装置における腫瘍画像検出の原理についてさらに説明を加える。
図１は腫瘍親和性染料と自家蛍光タンパク質の蛍光発光スペクトル及び照射光スペクトル（励起光）を示すグラフである。図１において、３５０ｎｍから４１０ｎｍの紫外光を照射した場合、腫瘍組織では腫瘍親和性染料ＮＰｅ６（明治製菓製；ｍｏｎｏ−Ｌ−ａｓｐａｒｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｅ６）が約４０５ｎｍの近紫外光（励起光）を吸収し、約６７０ｎｍで蛍光発光する。ＮＰｅ６は腫瘍親和性が高くほとんど腫瘍組織でのみ蛍光観察が可能である。
一方、約３５０ｎｍの紫外光（励起光）の照射により、生体組織内タンパク質であるＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が約４５０ｎｍにおいて自家蛍光発光する。脳組織の大部分を示す白質組織には、ＮＡＤＨが比較的一様に存在すると考えられ、蛍光観察が可能であるが、腫瘍組織では正常組織に比較して蛍光強度が減少することが知られている。このことは図１を見ても理解される。
この自家蛍光とＮＰｅ６による蛍光の蛍光画像を同時に取得し、２色蛍光法を適用した脳腫瘍部位の同定を行う。式（２）に基づいて、両蛍光画像から割り算画像を算出する。【００２０】
【数２】
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【００２１】  明らかなように、照射光強度Ｉ０と照射光侵達厚さΔｚはキャンセルされ、蛍光強度比Ｒは蛍光物質濃度分布ＣＮＰｅ６とＣＮＡＤＨにのみ依存する。このため、測定対象の凹凸などによる入射光強度分布の影響を除去することができる。さらに図１に示すように腫瘍組織では、ＮＰｅ６の蛍光強度ＩＮＰｅ６が高く、自家蛍光強度ＩＮＡＤＨが減少するのに対し、正常組織では、ＩＮＰｅ６が減少し、ＩＮＡＤＨは増加する。
この蛍光特性を利用すると、蛍光強度比Ｒは腫瘍組織において増大し、正常組織では減少するため、腫瘍境界のコントラストを上昇させることが可能となる。
【実施例１】
【００２２】  ここで、本発明の実施例１に係る脳腫瘍画像検出方法について図２を参照しながら説明する。図２は、実施例１の脳腫瘍画像検出方法の工程図である。図２において、ステップＳ１では脳腫瘍親和性物質を脳腫瘍組織に投与する工程である。前述のＮＰｅ６などの脳腫瘍親和性物質を静脈注射して脳腫瘍に親和させる。ステップＳ２では、脳腫瘍組織とその周辺の正常組織に対して紫外光などの電磁波を照射する。このステップＳ２の操作で脳腫瘍組織に親和された脳腫瘍親和性物質と生体組織に含まれる自家蛍光タンパク質が励起され、それぞれ波長の異なる蛍光を放出する。例としては先に説明したとおり、ＮＰｅ６から放出される６７０ｎｍの蛍光とＮＡＤＨから放出される４５０ｎｍの蛍光がある。
これらの蛍光のうち、ステップＳ３では脳腫瘍親和性物質から放出される６７０ｎｍの蛍光強度を測定し、ステップＳ４では自家蛍光タンパク質から放出される４５０ｎｍの蛍光強度を測定する。もちろん、ステップＳ３とステップＳ４で測定される蛍光強度は逆でもよい。さらに、これらのステップＳ３，４は同時に実行されるものでもよい。【００２３】  ステップＳ５は、ステップＳ３，４で測定された脳腫瘍親和性物質から放出される蛍光強度を自家蛍光タンパク質から放出される蛍光強度で割り算して蛍光強度比を求める工程である。もちろんこの逆数を求める割り算としてもよい。脳腫瘍親和性物質と自家蛍光タンパク質は脳腫瘍組織と正常組織のいずれにおいて含まれるが、それぞれの強度は前述のとおり組織において逆の特性を示している。したがって、脳腫瘍親和性物質と自家蛍光タンパク質からの蛍光強度を測定してその比を取ることによって、より強いコントラストを得ることができ脳腫瘍境界に関する高い精度を獲得することができる。
ステップＳ６はこのステップＳ５で演算された蛍光強度比を画像として表示する工程である。
以上のステップにおいて、蛍光強度の測定は、蛍光を受光するセル毎に行い、蛍光強度比の演算もセル毎に実行することもできる。したがって、その蛍光強度比の表示も画像セル毎に行うことができる。
このような工程を備える実施例１の腫瘍画像検出方法は、自家蛍光に関する測定のみならず、脳腫瘍親和性物質を投与してこの脳腫瘍親和性物質に紫外光を照射して励起によって放出される蛍光を測定することで、より高いコントラストと精度を有する画像を提供することができる。よって、腫瘍境界を明確に検出することができる。
【実施例２】
【００２４】  次に、本発明の実施例２に係る脳腫瘍画像検出方法について図３を参照しながら説明する。図３は、実施例２の脳腫瘍画像検出方法の工程図である。実施例２は、実施例１におけるステップＳ２をステップＳ２−１とステップＳ２−２に分割するものである。
実施例１では、電磁波の照射は、脳腫瘍親和性物質を励起する紫外光と自家蛍光タンパク質を励起する紫外光の２種類を含むものとして行ったが、本実施例では、それぞれの周波数に近いスペクトルの紫外光をそれぞれ別個に照射する工程として備えるものである。実施例１では他の波長の紫外光や可視光も含まれ、ノイズの原因となるため実施例２ではそれぞれの物質を励起する波長の紫外光のみを作用させることができるようにステップＳ２−１とステップＳ２−２としたものである。
ステップＳ２−１、２−１は別個に実行されるが、逆の工程としてもよいし、別個同時に実行するものであってもよい。いずれにしても本実施例のように、ステップＳ２−１とステップＳ２−２を別個に実施する場合には、それぞれの紫外光の照射強度に差異がないかという点に特に留意する必要がある。あた、ステップＳ２−１とステップＳ２−２を時間差をおいて実行する場合は、試料の劣化速度や試料のズレなどを考慮すると可能な限り時間間隔をあけずに実施することが望ましい。
これらステップＳ２−１，２−２以降のステップについては、実施例１と同様であるのでその工程の説明を省略する。また、この実施例２に関する効果も実施例１と同様であるため説明を省略する。
【実施例３】
【００２５】  本発明に係る腫瘍画像検出装置について実施例３として図４を参照しながら説明する。図４は、実施例３の脳腫瘍画像検出装置の概念図である。図４において、脳腫瘍画像検出装置１は、紫外光線ランプ２と蛍光フィルタ３を備えるカメラアダプタ４に接続される蛍光用カメラ５と、この蛍光用カメラ５にカメラケーブル６で接続される除法演算部７とこの除法演算部７で演算された結果の画像を表示する表示部８と結果をデータとして格納するデータ格納部９を有する。
この脳腫瘍画像検出装置１は、生体組織１０中に存在する脳腫瘍１１に対して、紫外光線ランプ２を照射して発生する蛍光を受光、強度測定して演算するものであるが、使用する前の段階として予め脳腫瘍１１に親和される脳腫瘍親和性物質を患者に投与しておく必要がある。
この脳腫瘍親和性物質が十分に腫瘍組織に親和した後に、紫外光線ランプ２を生体組織１０と脳腫瘍１１に照射する。この紫外光線ランプ２は、脳腫瘍１１に親和性を有する脳腫瘍親和性物質を励起可能な第１の波長の紫外光線と、生体組織１０に含まれる自家蛍光タンパク質を励起可能な第２の波長の紫外光線の双方をスペクトル中に含むものでなければならない。但し、第１の波長の紫外光線を照射可能な紫外光線ランプ２と第２の波長の紫外光線を照射可能な紫外光線ランプ２の２つを備えてもよく、あるいは一体の紫外光線ランプ２であっても切替スイッチなどによって第１の波長の紫外光線と第２の波長の紫外光線を照射可能なものであってもよい。【００２６】  紫外光線ランプ２によって励起されて放出される蛍光は蛍光分離部として蛍光フィルタ３を備えたカメラアダプタ４を介して蛍光用カメラ５によって受光される。この蛍光フィルタ３は、脳腫瘍親和性物質から放出される第１蛍光の波長の近傍スペクトルのみ透過するものと自家蛍光タンパク質から放出される第２蛍光の波長の近傍スペクトルのみを透過するものを含むフィルタである。したがって、このフィルタは２枚であることも考えられるが、この２枚のフィルタの交換はフィルタホイールなどを用いて自動化しておくと、撮像面を変化させることもないので望ましい。
カメラアダプタ４は蛍光フィルタ３を直接蛍光用カメラ５に接続可能であれば必ずしも必要ではない。
蛍光用カメラ５ではそれぞれの蛍光フィルタ３を透過して受光した蛍光を電気信号としてカメラケーブル６を介して除法演算部７に伝送する。蛍光用カメラ５の受光部は多数の受光セルから構成されており、その各々において受光された蛍光の電気信号が除法演算部７に送信される。【００２７】  除法演算部７では、先に式（２）として示したように第１蛍光の強度を第２蛍光の強度で除する演算を実行する。これによって照射光強度と照射光侵達厚さはキャンセルされ、蛍光強度の比は、蛍光物質濃度分布にのみ依存することになるが、自家蛍光タンパク質から放出される自家蛍光（第２蛍光）のみならず、脳腫瘍に親和性のある脳腫瘍親和性物質から放出される第１蛍光を受光してそれらの強度比を演算するため、脳腫瘍組織と正常組織のより鮮明なコントラストが得られる。また、この除法演算部７において表示部８に送信されるコントラスト画像を生成する。
除法演算部７で得られた蛍光強度比は、表示部８に伝送され精度の高い脳腫瘍画像として表示される。この表示部は、画像を液晶やプラズマなどのディスプレイ上に表示するものであってもよいし、画像を紙などに印刷するものであってもよい。
また、除法演算部７にはデータ格納部９が接続されており、蛍光強度比の演算結果やそのコントラスト画像、蛍光用カメラ５で受光した蛍光に関する電気信号をデータとして保存することができる。
この実施例３に示す脳腫瘍画像検出装置１によれば、自家蛍光タンパク質のみならず、脳腫瘍親和性物質からの蛍光を受光してその強度比を演算するため、より高いコントラストと精度を備えた脳腫瘍画像を得ることができる。よって、これまでは明確に判定することが困難であった腫瘍境界を明確に検出することができる。【００２８】  なお、本実施例においては、蛍光分離部として蛍光フィルタ３を示して、蛍光用カメラ５に受光される前の段階で分離したが、蛍光用カメラ５では第１蛍光と第２蛍光の双方を受光しておき、その後に除法演算部７への伝送前の段階でそれぞれの受光信号を電気的に分離可能な蛍光分離部を備えてもよい。すなわち、蛍光用カメラ５と除法演算部７の中間に蛍光分離部を備えてもよい。電気的に分離した後に除法演算部７において割り算を行うのである。このように蛍光用カメラ５の後段で分離を行うことによれば、受光信号は同時に得られたものであるため、よりリアルタイム性を向上させることができる。
【実施例４】
【００２９】  本発明の実施例４に係る腫瘍画像検出装置について図５を参照しながら説明する。図５は、実施例４に係る脳腫瘍画像検出装置の概念図である。図５において、図４と同一部分については同一符号を付し、その構成の説明については省略する。
本実施例では、カメラアダプタ２３に蛍光波長分離部２２を備えておき、脳腫瘍親和性物質から放出される第１蛍光と自家蛍光タンパク質から放出される第２蛍光をその波長によって蛍光波長分離部２２で分離し、カメラアダプタ２３に接続された別個独立の脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４と自家蛍光用カメラ２５によって受光するというものである。
すなわち、脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４では、生体組織１０及び脳腫瘍１１に存在する脳腫瘍親和性物質から放出される第１蛍光を、自家蛍光用カメラ２５では生体組織１０及び脳腫瘍１１に存在する自家蛍光タンパク質から放出される第２蛍光を受光するのである。
脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４で受光された第１蛍光は電気信号としてカメラケーブル２６を介し、自家蛍光用カメラ２５で受光された第２蛍光は電気信号としてカメラケーブル２７を介して除法演算部２８に伝送される。
除法演算部２８における作用、効果は実施例３と同様である。【００３０】  なお、本実施例においては蛍光波長分離部２２によって蛍光をその波長によって分離したが、予め脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４は第１蛍光のみを、自家蛍光用カメラ２５は第２蛍光のみを受光するように設定可能であったり、それぞれの波長のみを透過するバンドパスフィルタを設置可能であったりする場合には、蛍光波長分離部２２は設ける必要がない。
本実施の形態においては別個独立の蛍光カメラを設けることによって、受光によって得られる信号を同時に発生させることができるため、実施例３の効果に加えて画像のリアルタイム性を向上させることができる。【００３１】  次に、図６を参照しながら本実施例３，４を手術顕微鏡と組合せることによって構成される脳腫瘍画像検出システムについて説明する。
図６は脳腫瘍画像検出システムの概念図である。図６において、図４，５と同一部分については同一符号を付してその構成の説明は省略する。この脳腫瘍画像検出システムは、手術顕微鏡５１の視野に存在する生体組織１０と脳腫瘍１１に紫外光線ランプ２の照射光を導入し、その紫外光線によって放出される蛍光５２をカメラアダプタ２３に接続されたカメラで受光するものである。蛍光は脳腫瘍親和性物質からの第１蛍光と自家蛍光タンパク質からの第２蛍光に分離され、脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４と自家蛍光用カメラ２５でそれぞれ受光し、ここでは図示していない除法演算部７、表示部８及びデータ格納部９を用いて蛍光強度比を求めて、表示部８に画像として表示すると同時に、データ格納部９には蛍光カメラからの受光信号や演算結果に関するデータや画像に関するデータを格納するものである。
表示部８は術者の近傍に備えておき、術者は手術顕微鏡５１で見える脳腫瘍の像と表示部８に表示される画像をリアルタイムに比較しながら手術を行うことができる。
なお、本脳腫瘍画像検出システムのカメラアダプタ２３、脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ２４及び自家蛍光用カメラ２５については、実施例３及び実施例４のいずれの構成でも可能であることは言うまでもない。但し、手術中は撮影の対象の移動・変形が顕著であることから、自家蛍光タンパク質を励起する紫外光線と腫瘍親和性物質を励起する紫外光線を同時に照射し、それぞれから放出される蛍光を同時に受光可能でリアルタイム性に優れた構成を用いる方が望ましい。【００３２】  最後に、本発明に係る腫瘍画像検出方法と腫瘍画像検出装置に関して効果の確認のための実験を実施したので、図７乃至図１４を参照しながら説明する。
図７は実験装置の構成図である。実験は、脳腫瘍を植え込んだ体重約３００ｇのＷｉｓｔａｒラットを用い、脳腫瘍組織におけるＮＰｅ６による蛍光とＮＡＤＨによる自家蛍光を測定して実施された。装置は図７に示されるように、２５０Ｗ出力の高圧水銀ランプを紫外光線ランプ３１として使用し、その端部には赤外線と可視光を排除するカットフィルタと、さらに３５０ｎｍ〜４５０ｎｍ透過のバンドパスフィルタを組合せたフィルタ３２を設置し、近紫外光のみを照射した。
なお、計測対象には凹凸があるが、なるべく一様に照射することが望ましいため、照射部先端には均一照射レンズを組み込んでいる。受光部には微弱蛍光を撮影するために白黒高感度冷却型のＣＣＤカメラ３６を用いた。ＣＣＤカメラ３６にはフィルタホイール３５を装着し、光学フィルタ３４を自動交換することで撮像面を変化させることなく２色蛍光を受光可能としている。
この光学フィルタ３４にはＮＰｅ６からの蛍光とＮＡＤＨからの自家蛍光を測定するためにそれぞれ６１０ｎｍ〜６９０ｎｍと４４０ｎｍ〜４８０ｎｍのバンドパスフィルタを使用した。また、紫外光線ランプ３１の照射光に計測域の可視光が混入していないことも確認した。【００３３】  実験は、ラット脳３３を検査台４２の上に載置し、紫外光線ランプ３１をラット脳３３に照射して、支持具４３の設置テーブル４４に設けられたＣＣＤカメラ３６によって蛍光を受光した。その蛍光の強度に関する信号をケーブル３９を介してコンピュータ３７に送信し、コンピュータ３７で２色蛍光の強度比などを演算した。
フィルタホイール３５にはケーブル４０を介してフィルタホイールコントローラ３８が設けられており、前述の光学フィルタ３４の交換はフィルタホイールコントローラ３８によって制御される。さらに、このフィルタホイールコントローラ３８はコンピュータ３７に接続されており、操作はコンピュータ３７のキーボードやマウスなどの入力装置から行うことが可能である。
ラット脳３３は、ＤＭＥＭ溶液にて培養したＣ６ラット・グリオーマ細胞（約３０×１０６個／μｌ）を蛍光観察日の２週間前に右脳に植え付け脳腫瘍ラットモデルを作成して得たものである。
蛍光撮影実験９０分前に大腿部静脈より濃度４ｍｇ／ｍｌのＮＰｅ６生理食塩水を１．０ｍｌ注入し脳腫瘍に親和させた後、開頭手術により脳を取り出して観察を行った。【００３４】  蛍光観察を行ったラット脳３３において、腫瘍部位を判定するために病理検査を行った。針を用いて脳表にマーキングを施し、ハロゲン照明による撮影を行った。図８にその撮影された脳の画像を示す。マーカーの場所は、図８に示される画像中の（Ｘ，Ｙ）＝（５５０，１９０）［Ｐｉｘｅｌ］と（Ｘ，Ｙ）＝（５５０，６４０）［Ｐｉｘｅｌ］である。そのままラット脳をホルマリン固定しパラフィン・サンプルを作成した。マーカー位置を基準としてＹ＝１９０〜６４５［Ｐｉｘｅｌ］にかけて、厚さ６μｍの脳断片組織をクライオスタットを用いて作成し、ヘマトキシリン・イオジン染色を施した後に顕微鏡で組織観察を行った。組織のパラフィン・作成する際に、脱水処理により組織の縮小が発生するが、等方性縮小の仮定の下でサンプル画像におけるマーカー位置を対応させ、画像Ｙ軸方向に関して腫瘍細胞の存在位置を確認した。
図８において、画像左にある右脳の前頭部に腫瘍が存在している。外部から腫瘍を植えつけたラットの場合、浸潤性の高い腫瘍は発生しないため、医師の目視では比較的境界がはっきりしていると判断されるかもしれないが、客観的には腫瘍境界は不明瞭である。なお、病理検査の結果、Ｙ＝２００［Ｐｉｘｅｌ］とＹ＝６００［Ｐｉｘｅｌ］付近の組織には腫瘍組織は確認されなかったが、Ｙ＝２３０〜５４０［Ｐｉｘｅｌ］の範囲では腫瘍組織が検出された。【００３５】  図９と図１０に、ＮＡＤＨによる自家蛍光とＮＰｅ６による蛍光の蛍光画像を示す。これらの画像は、元の蛍光画像に以下のようなノイズ処理を施したものである。実験前後に撮影した暗電流画像２０枚を画素ごとに平均し、この初期ノイズ画像を撮影蛍光画像から減算することにより、暗電流ノイズの低減を行った。またショット・ノイズの低減のため、上記の処理画像に空間フィルタとして５×５［Ｐｉｘｅｌ］のメディアン・フィルタをかけている。
両図から明らかなように、病理検査によって判定された腫瘍部において、自家蛍光は減光し、ＮＰｅ６による蛍光は発光している。但し、腫瘍部から正常部への移行部位では、ぼやけておりコントラストは低いことが理解される。また、画像左上側から紫外光を照射しているため、左側の脳表凸面での蛍光強度が高く、右下側にかけて蛍光強度が低減していることがわかる。
これらを定量的に評価するため、病理検査により正常部位と判断した画像中（Ｘ，Ｙ）＝（５５０，６００）［Ｐｉｘｅｌ］における蛍光強度値を基に規格化を行い、Ｘ＝５５０［Ｐｉｘｅｌ］におけるＹ軸方向蛍光強度分布を図１１に示す。一点鎖線は腫瘍親和性染料からの規格化蛍光強度値を示し、二点鎖線は規格化自家蛍光強度値を示す。また、実線は、規格化割り算強度値を示す。病理検査結果による腫瘍部位Ｙ＝２３０〜５４０［Ｐｉｘｅｌ］を除いて、入射光強度むらの影響により両蛍光強度は共にＹ＝６００［Ｐｉｘｅｌ］以上になると強度が増加し、腫瘍部と誤認識する可能性がある。すなわち、一般のＰＤＴや蛍光内視鏡に利用されている単色蛍光を用いた計測法では、定量的な腫瘍同定は困難であることがわかる。
なお、Ｙ＝８００［Ｐｉｘｅｌ］付近において蛍光強度が急激に変化しているが、これは脳表の血管部を表している。血管部では照射紫外光が血液に吸収され自家蛍光に発光が遮蔽されるだけでなく、血中アルブミンと結合しているＮＰｅ６からの蛍光が観察される。【００３６】  次に、式（２）にしたがって２色蛍光割り算画像を算出した結果を図１２に示す。病理検査による腫瘍部位と割り算値の強度分布が、定性的ではあるが良く一致している。また、図９，１０と比較して腫瘍部位が明瞭になりコントラストが向上しているだけでなく、割り算画像には照射光強度むらが確認できないため、腫瘍部位の定量評価の可能性が示唆できる。
そこで、前述した規格化蛍光強度と共に、同様に規格化された割り算値のＸ＝５５０［Ｐｉｘｅｌ］におけるＹ軸方向強度分布を実線で図１１に示している。図１１より、割り算値の強度分布には照射光むらの影響が除去され、割り算値が約１．８以上の領域（Ｙ＝２３０〜５４０［Ｐｉｘｅｌ］）を腫瘍部位と判断した場合、病理検査と良く一致している。
また、腫瘍部位での最高感度値は、自家蛍光及びＮＰｅ６の場合、それぞれ約０．２６、２．２６であるのに対し、２色蛍光法による割り算値は、約１０．０５である。単色蛍光を用いた場合は、照射光の影響により定量評価は不可能であるが、従来法であるＮＰｅ６の蛍光と比較すると、本願発明における腫瘍部コントラストは約４倍程度向上していることが理解される。【００３７】  さらに、図１３と図１４に従来法である単色ＮＰｅ６の強度分布と本願発明における強度分布を２次元表示する。これらの図においては、感度のレンジを同一にして表示している。これより、腫瘍部位でのコントラストが強調され、病変部位のみを定量同定可能であることがわかる。
従来法では、再発性脳腫瘍など腫瘍の種類によってＳ／Ｎ比が極端に低下する場合や、腫瘍部位であっても腫瘍親和性染料からの蛍光が観察できない場合もあることが報告されており、組織感受性を上げることが望まれている。本願発明では、自家蛍光タンパク質からの蛍光と腫瘍親和性物質からの蛍光の２色を用いているため、腫瘍検出の感度を高く維持することが可能であるだけでなく、自家蛍光の情報も取り込むことにより、組織感受性を向上可能であると考えられる。また、腫瘍親和性染料から蛍光強度は組織の悪性度と関係を持っているため、本願発明の定量計測により、腫瘍悪性度の術中モニタリングの可能と考えられる。
なお、本願発明の実施例及び実験においては、脳腫瘍親和性物質としてＮＰｅ６を使用したが、もちろんこの染料に限定するものではなく、脳腫瘍の他の腫瘍に使用される腫瘍親和性物質が存在するならば、その腫瘍においてはそれを用いてもよく、ＮＰｅ６に限定するものではない。
以上、本願発明の実施の効果確認に関する実験について説明した。
【産業上の利用可能性】
【００３８】  本発明に係る腫瘍画像検出方法や腫瘍画像検出装置は、生体組織に浸潤した腫瘍組織の境界を明瞭にして、組織の検査、生体の診断をするための画像を提供可能であり、病院や救急センターなどの医療機関や大学の医学部などの医療研究機関において、病理検査装置や手術中のモニタリングシステムとしての利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】  腫瘍親和性染料と自家蛍光タンパク質の蛍光発光スペクトル及び照射光スペクトルを示すグラフである。
【図２】  実施例１の脳腫瘍画像検出方法の工程図である。
【図３】  実施例２の脳腫瘍画像検出方法の工程図である。
【図４】  実施例３の脳腫瘍画像検出装置の概念図である。
【図５】  実施例４の脳腫瘍画像検出装置の概念図である。
【図６】  脳腫瘍画像検出システムの概念図である。
【図７】  実験装置の構成図である。
【図８】  腫瘍を植えつけられたラット脳をハロゲン照明で撮影した画像である。
【図９】  図８のラット脳においてＮＡＤＨによる自家蛍光を撮影した蛍光画像である。
【図１０】  図８のラット脳においてＮＰｅ６による蛍光を撮影した蛍光画像である。
【図１１】  ラット脳のＸ＝５５０［Ｐｉｘｅｌ］におけるＹ軸方向蛍光強度分布である。
【図１２】  図９と図１０に示された蛍光画像に関して割り算を実施して割り算画像を算出した結果を示す画像である。
【図１３】  ＮＰｅ６からの蛍光のみを基に算出した強度分布画像である。
【図１４】  本願発明によって得られる蛍光強度比を図１３と同一のレベルで表示した画像である。
【符号の説明】
【００４０】  １…脳腫瘍画像検出装置  ２…紫外光線ランプ  ３…蛍光フィルタ  ４…カメラアダプタ  ５…蛍光用カメラ  ６…カメラケーブル  ７…除法演算部  ８…表示部  ９…データ格納部  １０…生体組織  １１…脳腫瘍  ２１…脳腫瘍画像検出装置  ２２…蛍光波長分離部  ２３…カメラアダプタ  ２４…脳腫瘍親和性染料蛍光カメラ  ２５…自家蛍光用カメラ  ２６，２７…カメラケーブル  ２８…除法演算部  ３１…紫外光線ランプ  ３２…フィルタ  ３３…ラット脳  ３４…光学フィルタ  ３５…フィルタホイール  ３６…ＣＣＤカメラ  ３７…コンピュータ  ３８…フィルタホイールコントローラ  ３９，４０，４１…ケーブル  ４２…検査台  ４３…支持具  ４４…設置テーブル  ５１…手術顕微鏡  ５２…蛍光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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