(57)【要約】【課題】  コーヒー豆由来の安全性の高い新規なアポトーシス誘導剤、これを含有した飲食品及び薬品並びにアポトーシス誘導剤の製造方法を提供する。【解決手段】  本発明のアポトーシス誘導剤はコーヒー果実の種子部分である生コーヒー豆又は焙煎コーヒー豆から含水エタノールを用いて抽出した抽出物を有効成分とする。このアポトーシス誘導剤は天然植物由来であり安全性が高く確実なアポトーシス誘導作用を示す。本発明の飲食物は、コーヒー豆抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤を０．０５％含有する。本発明の薬品はコーヒー豆抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤を成人に１回１ｍｇを投与できる量を含有する。アポトーシス誘導剤の製造方法は粉砕したコーヒー豆を５０℃、５０％含水エタノールで２時間還流抽出する。次いで濾過し乾燥する。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー豆抽出物を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
上記コーヒー豆が焙煎コーヒー豆である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
上記コーヒー豆が生コーヒー豆である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
上記抽出物の抽出溶媒が、エチルアルコールの体積と水の体積合計を１００体積％とした場合に、３０〜７０体積％のエチルアルコールである請求項１乃至３のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
上記抽出物の抽出温度が５〜９５℃である請求項１乃至４のいずれか1項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
上記請求項１乃至５のいずれか1項に記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする飲食物。
【請求項７】
上記請求項１乃至５のいずれか１項に記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする薬品。
【請求項８】
コーヒー豆抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤を製造することを特徴とするアポトーシス誘導剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導剤、これを含有する飲食品及び薬品並びにアポトーシス誘導剤の製造方法に関する。更に詳しくは、コーヒー豆から抽出されるアポトーシス誘導剤及びこれを含有した飲食品、薬品並びにアポトーシス誘導剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は死亡原因第一位の病気であり、その予防に対する人々の関心は非常に高い。癌を予防する為に日常的に有効成分を取り入れる方法が数多く提案されている。   近年、癌研究の分野ではアポトーシス、すなわち癌細胞自滅に関する研究が盛んになりつつある。アポトーシスは生物個体発生における組織、臓器の形成、また生体の恒常性維持や防御に重要な働きをしている。さらには多くの病気の発生に深い関係があることが解明されつつある。   
【０００３】
細胞のアポトーシスによる制御作用の異常は、癌形成における一つの原因であると考えられている。本来死滅すべき細胞が、アポトーシス、つまり細胞自滅を起こすことなく生き残ると、その細胞が様々な刺激を受けて染色体上に変異を重ね、最終的に癌細胞になるとされている。癌細胞は、アポトーシスの耐性機構を獲得して初めて増殖を可能にするのである。つまり、種々の遺伝子変異を伴う細胞の癌化はアポトーシスに対する耐性獲得と関連がある。
従来から植物由来の新規のアポトーシス誘導剤の製造が模索されていた。例えば下記特許文献１及び特許文献２がある。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１５１６８号公報
【特許文献２】特開２００２−３０８７６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これまでに発見された植物由来のアポトーシス誘導剤は、限られた植物種から得られるものであり、確実に作用するアポトーシス誘導剤をより多くの生物から発見することが必要である。   また、ヒトなどに対して処方される植物由来のアポトーシス誘導剤を含む薬剤は、その効能が処方部位や個人差によって変わる可能性があるため、より多くの植物種等から抽出された多種類の有効成分を開発する必要がある。   そこで、本発明者は、コーヒー豆の抽出成分ついて各種実験を行い、生化学的・医学的な見地から鋭意研究に努めた結果、コーヒー豆抽出物が癌細胞に対して顕著なアポトーシス誘導作用を示すことを見出した。
本発明は、コーヒー豆由来の安全性の高い新規なアポトーシス誘導剤及びこれを含有した飲食品、薬品並びにアポトーシス誘導剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するため、コーヒー豆から含水エタノールを溶媒として抽出された成分を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤を得た。このアポトーシス誘導剤は、後述の実験結果からも明らかのように、これを増殖する病態細胞に接触させることによってＤＮＡの断片化を起こし、癌細胞の増殖を阻害して細胞核の凝縮及び細胞の縮小を起こし、すなわちアポトーシス誘導作用がある。   
【０００７】
本発明は以下に示す通りである。
（１）コーヒー豆抽出物を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
（２）上記コーヒー豆が焙煎コーヒー豆である上記（１）記載のアポトーシス誘導剤。
（３）上記コーヒー豆が生コーヒー豆である上記（１）記載のアポトーシス誘導剤。
（４）上記抽出物の抽出溶媒が、エタノールと水の合計を１００体積％とした場合に、エタノール濃度３０〜７０体積％（以下単に「％」ということもある）のエタノール／水である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
（５）上記抽出物抽出温度が５〜９５℃である（１）乃至（４）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
（６）上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする飲食物。
（７）上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする薬品。
（８）コーヒー豆抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤を製造することを特徴とするアポトーシス誘導剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のコーヒー豆の抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤は、植物由来の新規なアポトーシス誘導剤であり、確実にアポトーシス誘導作用があり、安全性が高く、簡易に効率よく製造でき且つ安価に提供できる。
また、コーヒー豆が焙煎したものである場合には、取り扱いが容易であるためにアポトーシス誘導剤が容易に抽出できる。
更に、コーヒー豆が生のものである場合には、コーヒー豆を焙煎する必要が無いために安価に製造できる。
また、抽出物の抽出溶媒がエタノール濃度３０〜７０体積％のエタノール／水である場合には、効率的にアポトーシス誘導剤が効率的に得られる。
更に、抽出物抽出温度が５〜９５℃である場合には、更に効率的にアポトーシス誘導剤が効率的に得られる。
また、本願発明のアポトーシス含有食品は確実にアポトーシス誘導作用があり且つ安全性が高い。
更に、本願発明のアポトーシス含有薬品は確実にアポトーシス誘導作用があり且つ安全性が高い。
また、本願発明の製造方法によれば、簡易、且つ効率的にアポトーシス誘導剤の製造ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明について、以下詳細に説明する。
［１］アポトーシス誘導剤
本願アポトーシス誘導剤はコーヒー豆抽出物を有効成分とする。
コーヒー果実は種子部分とこれを包囲する果肉部及び果皮部で構成される。本願における「コーヒー豆」はこの種子部分をいう。コーヒー果実が生産される木は、主にアラカビ種、カネホラ種及びリベリカ種である。本願に使用されるコーヒー豆はいずれの木から生産されるものでも良く、生産地も特に限定されない。
このコーヒー豆は焙煎したものであってもよいし、生のものであってもよい。さらには焙煎したコーヒーから温水を用いてコーヒー飲料を抽出した後の残渣であってもよい。ここで焙煎コーヒーとは、風味を増すために生コーヒー豆をいわゆるローストしたものをいい、生コーヒー豆とは焙煎する前のコーヒー豆をいう。生コーヒー豆はコーヒー果実の種子を乾燥したもの及び乾燥前のものも含む。
【００１０】
本発明における、「コーヒー豆抽出物」はコーヒー豆から既知の方法で得ることができる。コーヒーからの抽出に使用する溶媒は例えば、アルコール、エステル、エーテル、アセトン等が挙げられる。アルコールとしては、メチルアルコール、エチルアルコール、ブチルアルコール及びプロピルアルコール等の１価のアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコールが挙げられる。エステルとしては酢酸エチルエステルなどの低級アルキルエステル、エーテルとしてはエチルエーテル等が挙げられる。またこれら溶媒は、１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。これらのうちで、好ましい抽出溶媒としては、水と混和する溶媒の水溶液、例えば、エタノール、メタノール、アセトンなどの水溶液が挙げられる。これらのうちで特に好ましくはエタノール水溶液である。
【００１１】
上記溶媒の水溶液濃度は、好ましくは溶媒濃度３０〜７０％、より好ましくは溶媒濃度３５〜６５％、更に好ましくは、溶媒濃度４０〜６５％、より更に好ましくは溶媒濃度４５〜６５％である。上記範囲であるとアポトーシス誘導剤の有効成分が効率的に抽出できるためである（図８参照）。
また、抽出時の溶媒水溶液の温度は、好ましくは５〜９５℃、より好ましくは１５〜８０℃、更に好ましくは２０〜６０℃、より更に好ましくは２０〜４０℃である。上記範囲であると効率的に抽出物を抽出できるからである。抽出液の溶媒水溶液の温度が５℃以下であると抽出時間が長くなる。また、１００℃以上であるとアポトーシス誘導作用有効成分が分解するおそれがある。
【００１２】
また、この抽出時間は特に限定されない。好ましくは０．５〜６時間、より好ましくは１〜５時間、更に好ましくは１．５〜５時間、より更に好ましくは２〜４時間である。上記範囲内にあると、アポトーシス有効成分の抽出率が高いためである。
【００１３】
溶媒の水溶液濃度と温度と抽出時間との組合せは、好ましくは溶媒濃度３０〜７０％、５〜９５℃且つ０．５〜６時間、より好ましくは溶媒濃度３５〜６５％、１５〜８０℃且つ１．０〜５時間、更に好ましくは溶媒濃度４０〜６５％、２０〜６０℃且つ１．５〜５時間、より更に好ましくは溶媒濃度４５〜６５％、２０〜４０℃且つ２〜４時間である。
【００１４】
上記溶媒がエタノール等の一定の溶媒である場合には、上記コーヒー豆祖抽出液を、アポトーシス誘導剤としてそのままで飲食品又は薬品として使用することができる。通常この粗抽出液を乾燥して粗抽出粉末を得る。この乾燥方法としては、既知の方法が使用できる。例えば、減圧濃縮法、減圧乾燥法及び凍結乾燥法が挙げられる。更に、必要に応じて、エタノール等の溶媒、その他の余分の成分を取り除き精製粉末を得る。更に、必要に応じて滅菌等して種々の形態で飲食品又は薬品に添加して使用する。例えば、半固体状、粉状、粒状及び固形状に調整される。
【００１５】
［２］アポトーシス誘導剤含有飲食品
本発明の「アポトーシス誘導剤含有飲食品」には、飲料及び固形食品等が含まれる。飲食品の形態としては、例えば、特定の保健効果が認められる飲食品、又は生体調整成分の機能を生かして作られる機能性飲食品等とすることができる。   
【００１６】
本発明のアポトーシス誘導剤を飲食品に適用する場合、上記コーヒー豆の抽出物をそのまま飲食品の形態にしてもよいが、所要量の上記コーヒー豆抽出物を飲食品原料に加えて一般の製造法によりアポトーシス含有飲食品を加工製造することができる。例えば、上記コーヒー豆抽出物を飲料に添加物として直接添加するか、又はビスケットのような固形食品に添加してアポトーシス誘導剤含有の癌予防飲食品、健康飲食品あるいは機能性飲食品等として提供することができる。
【００１７】
また、上記コーヒー豆抽出物をアポトーシス誘導剤として、例えば、油脂、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン又はこれらの混合物に溶解して液状にし、飲料に添加するか、又は固形食品に添加することが可能である。さらに、必要に応じてアラビアガム、デキストリン等のバインダーと混合して粉末状又は顆粒状等にし、飲料に添加するか又は固形食品に添加することも可能である。本発明のアポトーシス誘導剤を添加する飲食品の種類は特に限定されない。   
【００１８】
飲食品に上記コーヒー豆抽出物をアポトーシス誘導剤として添加する場合、コーヒー豆抽出物の添加量に特に制限はないが、健康食品、機能性食品としての摂取は、病気予防、健康維持に用いられるので、年齢、体重、性別により適宜添加量を調整する。被添加飲食物と上記コーヒー抽出物の合計を１００質量％とした場合、コーヒー豆抽出物が精製乾燥粉末である場合には、好ましくは０.０１〜２０質量％、より好ましくは０.０１〜１５質量％、更に好ましくは０.０１〜１０質量％である。
【００１９】
例えば、次の処方により癌予防に有効な飲食品を製造することができる。
（１）ソフトカプセル
玄米胚芽油                            ８７．０wt％
乳化剤                                １２．０
コーヒー豆抽出物（精製乾燥粉末）        １．０
合計                                １００．０wt％
【００２０】
（２）清涼飲料 
果糖ブドウ糖液糖                      ３０．０wt％
乳化剤                                  ０．５
コーヒー豆抽出物（精製乾燥粉末）        ０．０５
香料                                        微量
精製水                                      残余
合計                              １００．０wt％
【００２１】
（３）錠剤
乳糖                                  ５４．０wt％
結晶セルロース                        ３０．０
澱粉分解物                            １０．０
グリセリン脂肪酸エステル                ５．０
コーヒー豆抽出物（精製乾燥粉末）        １．０
合計                                １００．０wt％
【００２２】
（４）錠菓
砂糖                                  ７６．４wt％
グルコース                            １９．０
ショ糖脂肪酸エステル                    ０．２
コーヒー豆抽出物（精製乾燥粉末）        ０．５
精製水                                  ３．９
合計                                １００．０wt％
【００２３】
［３］アポトーシス誘導剤含有薬品
本発明の「アポトーシス誘導剤含有薬品」は、医薬品および医薬部外品を含む。上記コーヒー豆抽出物のアポトーシス誘導能を利用することにより癌治療薬とすることができる。   本発明による薬品の投与方法は経口投与することが望ましい。一般的には錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤及びシロップ剤等の形態とすることができる。   
【００２４】
本発明による薬品を非経口剤として投与してもよい。非経口剤として投与する場合、溶液の状態、又は分散剤、懸濁剤、安定剤等を添加した状態で、注射剤、坐剤などに調製することができる。   
【００２５】
有効成分の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に１．０〜１０００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与される。
なお、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要のある場合もある。   
【００２６】
本発明の有効成分である抽出物は、従来食品中より見出した抽出物であり、安全性の面からも優れているのは明らかである。
【００２７】
［４］アポトーシス誘導剤の製造方法
コーヒー豆抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤を製造する場合には、まず、必要に応じてコーヒー豆を破砕する。更に必要に応じて篩等を用いて粒度を調整する。次に、このコーヒー豆から水溶性成分を抽出する。この抽出方法は特に制限されない。例えば、このコーヒー豆に水を添加した後、攪拌しながら水可溶分を抽出する。この抽出時の水温は２０〜９５℃の範囲内であるのが好ましい。より好ましくは２０〜８０℃、更に好ましくは４０〜６０℃である。この水温が２０℃未満の場合には、コーヒー豆中の水可溶性成分が効率的に抽出されない。逆に１００℃を越える場合には、有効成分としての活性が消失してアポトーシス誘導効果が充分に発揮されないおそれがある。また、以下に記載する作業において、有効成分の活性消失を抑制するために、９５℃以下の温度で取り扱われるのが好ましい。この水可溶性成分抽出時間は特に制限はない。コーヒー豆の粒度、水温によって適宜決定する。通常は上記温度範囲で２〜６時間である。
【００２８】
その後、コーヒー豆が懸濁された懸濁液を個液分離し、固体分を回収する。この個液分離方法は、既知の方法を使用できる。例えば、フィルタプレス及び遠心分離等が挙げられる。
更に、この固体分に水と混和する溶媒の水溶液、例えば、エタノール、メタノール、アセトンなどの水溶液、好ましくは含水エタノールを加えて攪拌しながらアポトーシス誘導体を抽出する。このエタノール水溶液濃度は、抽出時の温度及び抽出時間は前記詳述したものが適用できる。
【００２９】
次いで、コーヒー豆が懸濁された懸濁液をフィルタプレス等により個液分離し、液体分を回収する。また、必要に応じて、遠心分離によって残渣及び不溶解物を取り除く。更に、必要に応じて濾紙等を用いて濾過することもできる。この粗抽出液をそのまま使用する事もできるが、通常はこれを乾燥・精製する。乾燥及び精製方法は、前記詳述したものが適用できる。
【実施例】
【００３０】
［アポトーシス誘導剤の製造］
原料には、生コーヒー豆を使用した。まず、生コーヒー豆を破砕し、この生コーヒー豆１０００ｇを、５０℃の水５０００ｍｌで３時間還流し、コーヒー豆の水可溶性成分を取り除いた。
次いで、この水可溶性成分を取り除いたコーヒー豆を３０℃の５０％含水エタノール５０００ｍｌで２時間還流し、エタノール抽出液を得た。このエタノール抽出液をＮｏ．５Ｃの濾紙を用いて濾過し、得られた濾液を減圧乾燥し、淡黄色粉状のコーヒー豆抽出物を得て試料１とした。
【００３１】
［試験例１：ヒト胃ガン細胞に対する増殖抑制活性］
試料１について、ヒト胃ガン細胞に対する増殖抑制活性を試験した。
（ａ）Ａ／Ｊマウス（♀）へ、ベンゾ（α）ピレン１．５ｍｇを１００μｌのコーンオイルに溶かしたものを１週間に１度ゾンデにて、胃腔内へ４週間連続投与した。
（ｂ）ベンゾ（α）ピレンを連続投与した上記Ａ／Ｊマウスに、以下のＡ、Ｂ、Ｃ群に給水ビンに入れて５ヶ月間自由飲水投与をした。
Ａ群：コントロール群には水道水
Ｂ群：コーヒー豆抽出物試料を０．５％になるように懸濁・溶解したもの
Ｃ群：コーヒー豆抽出物試料を１％になるように懸濁・溶解したもの
（ｃ）胃癌腫瘍が確認した後、胃を取り出してアルミ箔上に胃を拡張固定し、腫瘍（直径２ｍｍ以上）の数を計測し、マウス１匹あたりの腫瘍の数を算出した。その結果を図１に示した。この結果によると、コントロール群Ａではマウス１匹あたりの腫瘍数は約８．５である。
これに対して、試験群Ｂでは約５．２、試験群Ｃでは約３．８である。
（ｄ）また、上記胃癌腫瘍を切り取り集め重量を測定し、マウス１匹あたりの腫瘍の重量を算出した。その結果を図２に示した。この結果によると、コントロール群Ａではマウス１匹あたりの腫瘍の質量は約０．２２ｇである。
これに対して、試験群Ｂでは約０．１２ｇ、試験群Ｃでは約０．０８ｇである。
（ｅ）以上より、試料１のコーヒー豆抽出物はヒト胃ガン腫瘍の発生数及び発生質量共にコントロール群に比較して少なく、ヒト胃ガン細胞に対する増殖抑制活性が認められた。
【００３２】
［試験例２：ヒト胃ガン細胞に対するアポトーシス誘導作用］
試料１（生コーヒー豆抽出物）について、ヒト胃ガン細胞に対するアポトーシス誘導作用を確認するため、細胞が形態変化する様子を観察した。ヒト胃ガン細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。５×１０5Ｃｅｌｌｓ/ｍｌに調整したヒト胃ガン細胞にサンプル２ｍｇ／ｍｌを添加した。これらを３７℃、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ2の条件下で３日間培養し、遠心分離により細胞を集めた。集めた細胞の核を染色し、蛍光顕微鏡で形態を観察した。その結果を図４に示す。
なお、対照として、溶媒（８０％含水エタノール）のみを添加したものについて同様な条件で細胞の形態を観察した。その結果を図３に示す。   
【００３３】
図３に示すように、無添加の対照には細胞の形態変化が見られない。これに対し、試料１（コーヒー豆抽出物）を添加したものは、図４に示すようにアポトーシス誘導の特徴であるアポトーシス小体が認められた。
以上より、試料１の生コーヒー豆抽出物はアポトーシス誘導作用が認められる事が解る。
【００３４】
［試験例３：ＤＮＡ断片化の解析］
細胞にアポトーシスが誘導されるとＤＮＡの断片化が生じる。試験例３では、試料１を添加した細胞からＤＮＡを抽出して電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。
（ａ）ヒト胃ガン細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。５×１０5Ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したヒト胃ガン細胞に所定濃度のサンプルをそれぞれ添加した。これらを３７℃、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、遠心分離して上清を除き細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。細胞ペレットにｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加え、細胞を懸濁させた。ここにＲＮａｓｅを加え５０℃で２.５時間反応させてからプロテアーゼＫ溶液を加え、５０℃で２.５時間反応させた。ＤＮＡ断片を抽出し、ＤＮＡ抽出液とゲルローディング液を混合して２％アガロースゲル板のウェルに添加し、１００Ｖで電気泳動を行った。ゲルを水に浸しＵＶトランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を発したＤＮＡを検出した。
なお、対照として、溶媒（５０％含水エタノール）のみを添加したものについて同様な条件でＤＮＡ断片化の様子を観察した。
（ｂ）コーヒー豆抽出物の添加濃度とアポトーシス誘導作用の関係についてその結果を図５に示す。図５中のＭ及び括弧内の数字は以下のものを示す。
Ｍ  ：ＤＮＡ分子量マーカー
（１）：コントロール（５０％エタノールのみ添加）
（２）：試料１（生コーヒー抽出物）０．５ｍｇ／ｍｌ添加
（３）：試料１（生コーヒー抽出物）１．０ｍｇ／ｍｌ添加
（４）：試料１（生コーヒー抽出物）２．０ｍｇ／ｍｌ添加
この結果によれば、コントロール、０．５ｍｇ／ｍｌ添加及び１．０ｍｇ／ｍｌ添加では、鮮明なラダーが示されなかった。
一方、２．０ｍｇ／ｍｌ添加では鮮明なラダーが示され、アポトーシス誘導作用が認められた。
【００３５】
（ｃ）試料１を添加したヒト胃ガン細胞培養日数をＤＮＡの断片化の様子を観察した。その結果を図６に示す。図６中のＭ及び括弧内の数字は以下のものを示す。
Ｍ  ：ＤＮＡ分子量マーカー
（１）：コントロール（５０％エタノールのみ添加）
（２）：試料１（生コーヒー抽出物）２．０ｍｇ／ｍｌ添加、１日間培養
（３）：試料１（生コーヒー抽出物）２．０ｍｇ／ｍｌ添加、２日間培養
（４）：試料１（生コーヒー抽出物）２．０ｍｇ／ｍｌ添加、３日間培養
この結果によれば、試料１を２．０ｍｇ／ｍｌ添加、１日間培養したものには、鮮明なラダーが示されなかった。
これに対して、３日間培養したものは鮮明なラダーが示され、培養日数の経過に伴い、ＤＮＡの断片化の程度が大きくなりアポトーシス誘導作用が認められる。
【００３６】
（ｄ）生コーヒー抽出物の５０％エタノール画分の添加によってヒトの胃癌細胞において、上記の結果よりアポトーシスが誘導されることが明らかにされた。どの物質がアポトーシス誘導作用を示すのかを同定するためにコーヒー豆に含まれていると報告されているポリフェノールであるＣａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ，Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ及びＱｕｎｉｃ  ａｃｉｄの４種類の化合物についてアポトーシス誘導能を調べた。その結果を図７に示す。図７中のＭ及び括弧内の数字は以下のものを示す。
Ｍ  ：ＤＮＡ分子量マーカー
（１）：コントロール（５０％エタノールのみ添加）
（２）：Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ、        １．０ｍｇ／ｍｌ添加、３日間培養
（３）：Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ、        ２．０ｍｇ／ｍｌ添加、３日間培養
（４）：Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  １．０ｍｇ／ｍｌ添加、３日間培養
（５）：Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ  ２．０ｍｇ／ｍｌ添加、３日間培養
この結果によれば、図７に示すようにＣａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄの２．０ｍｇ／ｍｌ添加では、鮮明なＤＮＡラダーではないが、アポトーシスの傾向が見られる。
尚、図７中には示さないが、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ及びＱｕｎｉｃ  ａｃｉｄについても同様な試験を行ったが、上記いずれの化合物にもアポトーシスの傾向は見られなかった。以上より、コーヒー抽出物のアポトーシス有効成分は、上記４種類のポリフェノール以外の化合物であると考察される。
【００３７】
（ｅ）インドネシア産及びブラジル・コロンビア産の焙煎コーヒー豆抽出物について、アポトーシス誘導能について試験を行った。
その結果を図８に示す。図８中のＭ及び括弧内の数字は以下のものを表す。
Ｍ  ：ＤＮＡ分子量マーカー
（１）：コントロール
（２）：インドネシア産            Ｈ２Ｏ画分               ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（３）：インドネシア産、          ４０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（４）：インドネシア産            ５０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（５）：インドネシア産            ６０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（６）：インドネシア産            ８０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（７）：ブラジル・コロンビア産    Ｈ２Ｏ画分               ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（８）：ブラジル・コロンビア産    ４０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（９）：ブラジル・コロンビア産    ５０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（１０）：ブラジル・コロンビア産  ６０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
（１１）：ブラジル・コロンビア産  ８０％エタノール画分    ２．０ｍｇ／ｍｌ添加
この結果によれば、図８に示すように、インドネシア産焙煎コーヒー豆の５０％及び６０％エタノールによる抽出物がアポトーシス誘導作用を示すことがわかる。また、ブラジル・コロンビア産焙煎コーヒーでは、６０％エタノールによる抽出物が強いアポトーシス誘導作用を示すことがわかる。
以上の試験例１、２及び３から総合評価するとコーヒー豆抽出物は原料が生コーヒー豆及び焙煎コーヒー豆に限定されず５０％及び６０％エタノール画分に強いアポトーシス誘導作用を示すことが解る。また、コーヒーの産地についても特に限定されないことが解る。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、保健飲料、健康食品、保健食品、医薬品等において広く利用される。例えば、コーヒー豆抽出物を飲料に添加して抗がん性保健飲料又は医薬品製剤として錠剤、カプセル剤、シロップ剤、筋肉注射、静脈注射及び動脈注射等に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウスにコーヒー豆抽出物を投与した場合の癌腫瘍の数を示す図である。
【図２】マウスにコーヒー豆抽出物を投与した場合の癌腫瘍の質量を示す図である。
【図３】ヒト胃ガン細胞の形態変化の様子を示す蛍光顕微鏡写真を複写して得られた図である。
【図４】ヒト胃ガン細胞の形態変化の様子を示す蛍光顕微鏡写真を複写して得られた図である。
【図５】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真を複写して得られた図である。
【図６】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真を複写して得られた図である。
【図７】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真を複写して得られた図である。
【図８】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真を複写して得られた図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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