(57)【要約】    【課題】  発酵法により有機酸アンモニウム溶液を効率よく製造する。    【解決手段】  マグネシウム化合物の存在下に有機酸生産能を有する微生物を用いて有機酸マグネシウムを含む発酵液を得る工程、該発酵液に含まれる有機酸マグネシウムをアンモニア化合物を用いて塩交換することにより、有機酸アンモニウムを生成させるとともにマグネシウム化合物を生成させる工程、及び、生成したマグネシウム化合物を分離すると共に、有機酸アンモニウム溶液を得る工程を行うことにより、有機酸アンモニウム溶液を製造する。    【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マグネシウム化合物の存在下に有機酸生産能を有する微生物を用いて有機酸マグネシウムを含む発酵液を得る発酵工程、該発酵液に含まれる有機酸マグネシウムをアンモニア化合物を用いて塩交換することにより、有機酸アンモニウムを生成させるとともにマグネシウム化合物を生成させる塩交換工程、及び、生成したマグネシウム化合物を分離すると共に、有機酸アンモニウム溶液を得るマグネシウム分離工程を含む、有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項２】
マグネシウム分離工程で得られたマグネシウム化合物を発酵工程においてマグネシウム化合物として再利用する、請求項１に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項３】
前記マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムであり、かつ、前記アンモニア化合物が炭酸アンモニウムである、請求項１又は２に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項４】
前記塩交換工程において、発酵液に二酸化炭素及びアンモニアを供給することにより生成した炭酸アンモニウムをアンモニア化合物として用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項５】
二酸化炭素を、発酵液中のマグネシウムに対し０．３〜１０モル倍量の量で供給する、請求項４に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項６】
さらに、前記マグネシウム分離工程で得られた有機酸アンモニウム溶液を加熱し、該溶液中に存在する過剰のアンモニアと二酸化炭素を気化して分離し、分離されたアンモニア及び二酸化炭素を前記塩交換工程に再利用する、請求項４に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項７】
前記マグネシウム分離工程において分離された炭酸マグネシウムを二酸化炭素と酸化マグネシウムに熱分解し、該酸化マグネシウムに水を加えて水酸化マグネシウムを生成させ、該水酸化マグネシウムをマグネシウム化合物として発酵工程に再利用することを特徴とする、請求項１に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項８】
前記マグネシウム化合物が水酸化マグネシウム、又は水酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムの混合物であり、前記塩交換工程においてアンモニアを用いることを特徴とする、請求項１に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項９】
前記マグネシウム分離工程で得られた有機酸アンモニウム溶液に炭酸アンモニウムを添加して、有機酸アンモニウムおよび炭酸マグネシウムを生成させ、該炭酸マグネシウムを分離して有機酸アンモニウム溶液を得る工程をさらに含む、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記塩交換工程をｐＨ７〜１２の範囲で行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項１１】
有機酸が琥珀酸であり、かつ有機酸アンモニウムが琥珀酸アンモニウムである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項１２】
マグネシウム分離工程によって得られたマグネシウム化合物に含まれる炭酸マグネシウム及び炭酸アンモニウムの複塩を加熱または乾燥することによって、該複塩から炭酸アンモニウムを除去して炭酸マグネシウムを得、該炭酸マグネシウムを発酵工程に循環させる、請求項１に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項１３】
該複塩中のアンモニア含量がマグネシウムに対してモル比で10分の１以下になるように炭酸アンモニウムを除去する、請求項１２に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項１４】
該複塩中のアンモニア含量がマグネシウムに対してモル比で30分の１以下になるように炭酸アンモニウムを除去する、請求項１２に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【請求項１５】
複塩を１６０℃以上で加熱する、請求項１２に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、琥珀酸アンモニウム溶液などの有機酸アンモニウム溶液の製造方法に関する。更に詳しくは、生物由来のグルコース、ブドウ糖、セルロースなどを原料として、微生物変換により有機酸を製造する場合に好適な、有機酸アンモニウム溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸にはフマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、琥珀酸などが含まれ、その中でも琥珀酸又はその誘導体は、生分解性ポリエステル、ポリアミドなどのポリマーの原料、または、食品、医薬品、及び化粧品などの原料として広く用いられている。
【０００３】
琥珀酸などの有機酸は、従来、石油由来の原料であるマレイン酸を水添することにより工業的に製造されてきた。しかし、近年では、発酵操作を利用した技術により、植物由来の原料から有機酸を製造することも検討されている。
【０００４】
発酵による有機酸の製造においては、有機酸の生成とともに培地のｐＨが低下するが、発酵に用いられる微生物は一般に低いｐＨ条件下では十分な活性を示さないことから、発酵液を中和する必要があり、一般には、中和剤として、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、アンモニア、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、尿素、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムなどが用いられてきた。しかし、このような中和剤を用いた場合、発酵槽から得られる有機酸はアルカリとの塩を形成しているため、一般的な分離・精製手法である蒸留操作を用いることができなかった。
【０００５】
このような状況のもと、発酵により生成した有機酸塩から有機酸を分離・精製する方法としては、電気透析を用いる方法（例えば、特許文献１参照）、イオン交換樹脂を用いる方法（例えば、特許文献２参照）、水酸化カルシウムで中和しながら発酵生産して得られた琥珀酸カルシウムを硫酸で分解する方法（例えば、特許文献３参照）硫酸を用いる塩の交換反応で反応晶析を行う方法（例えば、特許文献４又は５参照）、反応抽出法（特許文献６）などが提案されている。
【０００６】
発酵においては、菌の性質によって特に好ましい中和剤が制約される。一方で、上記の精製方法はどのような中和剤に対しても汎用的に用いる事が出来るとは限らず、それぞれ使える中和剤が限定されている。そのため、発酵における中和剤の選定と精製における中和剤の制約とを合致させるのが、絶対的に必要である。
【０００７】
電気透析を用いる方法では、中和剤は１価のカチオンでなければならない。２価のカチオンは電気透析膜において、石膏として析出し、著しくその膜性能を損なう。したがって、アンモニア、ナトリウム、及びカリウムが中和剤として好ましい。
【０００８】
イオン交換樹脂を用いる方法では、副生塩が発生するため、中和剤が安定的に供給され、市場価格が安価なものを選ばなければなければならない。したがって、アンモニア及びナトリウムが好ましく、次いで、カリウム及びカルシウム、そしてマグネシウムの順となる。それでも、副生塩の発生は処理費用を発生させるため、あまり好ましい方法とは言えない。
【０００９】
アミンによる反応抽出を用いる方法では、水相に中和剤が炭酸塩として残るため、中和
剤の炭酸塩の水への溶解度があまり小さいと、その場で析出してしまい、高圧抽出塔の操作ができなくなる。したがって、アンモニア、ナトリウム及びカリウムが中和剤として好ましい。
【００１０】
硫酸による酸析を用いる方法では、硫酸塩が副生する（石膏法：特許文献３）。従って、通常は、中和剤が安定的に供給され、イオン交換樹脂を用いる方法と同様に、市場価格が安価なものを選ばなければなければならない。また、副生塩の発生は処理費用を発生させるため、あまり好ましい方法とは言えない。
これの問題に対して、特許文献４又は５においては３００℃以上で硫酸アンモニウムの熱分解を行い、硫酸モノアンモニウム塩として再利用し、アンモニアを中和剤として用いる方法を提案している。そのためにはナトリウム中和であってもアンモニア中和に変換する方法を提案している。
【００１１】
即ち、硫安の形であれば、アンモニアを中和剤とすると副生塩を発生させないという利点を持っているという事であり、これはイオン交換樹脂法であっても硫酸モノアンモニウム塩を樹脂再生に用いれば、同様の事が可能になる。
【００１２】
これらより、アンモニア中和が最も多様な精製法を適用可能であり、特許文献４又は５に記載の方法を応用すれば、副生塩を発生させないという利点を持つ中和剤であると言える。
ナトリウムは特許文献４又は５に記載の方法により、アンモニアに変換する事が出来、また、そのままでも多様な精製をその環境に応じて用いる事が可能である。
即ち、発酵液として、アンモニア塩・ナトリウム塩であれば、世界の多様な経済的環境、気候的環境に最も適した精製法を選択する事が可能になる事を示している。
【００１３】
また、カルシウムは特許文献３に示されるように経済合理性の比較的良い中和剤である。以上より、極めて限定された精製しか行う事ができないマグネシウムは、菌体反応に必修の金属イオンの一つであるにも関わらず、中和剤として用いる検討がされる事は少なかった。
【特許文献１】特開平２−２８３２８９号公報
【特許文献２】米国特許第６，２８４，９０４号明細書
【特許文献３】特開平３−０３０６８５号公報
【特許文献４】特表２００１−５１４９００号公報
【特許文献５】米国特許第５，９５８，７４４号明細書
【特許文献６】国際公開第９８／０１４１３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は有機酸アンモニウム溶液の効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述したような状況の下、本発明者らは、多様な経済的な環境において、最も適した有機酸の精製法を選択できるようにするためには、有機酸のマグネシウム塩をアンモニア塩に変換する事ができればよいと考え、鋭意検討した。その結果、マグネシウム化合物を発酵培地に添加して微生物を培養し、生成した有機酸マグネシウム塩をアンモニア化合物で塩置換することにより、有機酸アンモニウム溶液を効率的に製造できることを見出した。
更に検討を続けた結果、副生する炭酸マグネシウム・炭酸アンモニウム複塩を加熱することにより、アンモニアをほとんど含まない炭酸マグネシウムを得ることができ、これによりマグネシウム化合物をリサイクルし、廃棄物を出さずに有機酸のアンモニア塩を製造
できることを見出した。
以上により、本発明を成すに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）マグネシウム化合物の存在下に有機酸生産能を有する微生物を用いて有機酸マグネシウムを含む発酵液を得る発酵工程、該発酵液に含まれる有機酸マグネシウムをアンモニア化合物を用いて塩交換することにより、有機酸アンモニウムを生成させるとともにマグネシウム化合物を生成させる塩交換工程、及び、生成したマグネシウム化合物を分離すると共に、有機酸アンモニウム溶液を得るマグネシウム分離工程を含む、有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（２）マグネシウム分離工程で得られたマグネシウム化合物を発酵工程においてマグネシウム化合物として再利用する、（１）に記載の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（３）前記マグネシウム化合物が炭酸マグネシウムであり、かつ、前記アンモニア化合物が炭酸アンモニウムである、（１）または（２）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。（４）前記塩交換工程において、発酵液に二酸化炭素及びアンモニアを供給することにより生成した炭酸アンモニウムをアンモニア化合物として用いることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかの有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（５）二酸化炭素を、発酵液中のマグネシウムに対し０．３〜１０モル倍量の量で供給する、（４）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（６）さらに、前記マグネシウム分離工程で得られた有機酸アンモニウム溶液を加熱し、該溶液中に存在する過剰のアンモニアと二酸化炭素を気化して分離し、分離されたアンモニア及び二酸化炭素を前記塩交換工程に再利用する、（４）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（７）前記マグネシウム分離工程において分離された炭酸マグネシウムを二酸化炭素と酸化マグネシウムに熱分解し、該酸化マグネシウムに水を加えて水酸化マグネシウムを生成させ、該水酸化マグネシウムをマグネシウム化合物として発酵工程に再利用することを特徴とする、（１）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（８）前記マグネシウム化合物が水酸化マグネシウム、又は水酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムの混合物であり、前記塩交換工程においてアンモニアを用いることを特徴とする、（１）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（９）前記マグネシウム分離工程で得られた有機酸アンモニウム溶液に炭酸アンモニウムを添加して、有機酸アンモニウムおよび炭酸マグネシウムを生成させ、該炭酸マグネシウムを分離して有機酸アンモニウム溶液を得る工程をさらに含む、（８）の製造方法。
（１０）前記塩交換工程をｐＨ７〜１２の範囲で行うことを特徴とする、（１）〜（９）のいずれかの有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（１１）有機酸が琥珀酸であり、かつ有機酸アンモニウムが琥珀酸アンモニウムである、（１）〜（１０）のいずれかの有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（１２）マグネシウム分離工程によって得られたマグネシウム化合物に含まれる炭酸マグネシウム及び炭酸アンモニウムの複塩を加熱または乾燥することによって、該複塩から炭酸アンモニウムを除去して炭酸マグネシウムを得、該炭酸マグネシウムを発酵工程に循環させる、（１）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（１３）該複塩中のアンモニア含量がマグネシウムに対してモル比で10分の１以下になるように炭酸アンモニウムを除去する、（１２）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（１４）該複塩中のアンモニア含量がマグネシウムに対してモル比で30分の１以下になるように炭酸アンモニウムを除去する、（１２）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
（１５）複塩を１６０℃以上で加熱する、（１２）の有機酸アンモニウム溶液の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は新規な有機酸アンモニウム溶液の製造方法を提供するものであり、本発明の方
法によれば、中和剤や塩交換に用いる炭酸、アンモニア等を再利用して、効率よく琥珀酸アンモニウム溶液などの有機酸アンモニウム溶液を製造することができる。本発明によって製造される琥珀酸アンモニウム溶液から得られる琥珀酸は、生分解性ポリエステル、ポリアミドなどのポリマー、食品、医薬品、及び化粧品などの原料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の製造方法は、マグネシウム化合物の存在下に有機酸生産能を有する微生物を用いて有機酸マグネシウムを含む発酵液を得る発酵工程、該発酵液に含まれる有機酸マグネシウムをアンモニア化合物を用いて塩交換することにより、有機酸アンモニウムを生成させるとともにマグネシウム化合物を生成させる塩交換工程、及び、生成したマグネシウム化合物を分離して発酵工程に循環させると共に、有機酸アンモニウム溶液を得るマグネシウム分離工程を含む、有機酸アンモニウム溶液の製造方法である。
【００１９】
有機酸アンモニウムの種類は、微生物によって発酵生産される有機酸のアンモニウム塩であれば特に限定されないが、ジカルボン酸、トリカルボン酸のアンモニウム塩が好ましい。ジカルボン酸としては、琥珀酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタル酸、グルタミン酸、アジピン酸、スベリン酸、イタコン酸、テレフタル酸などを、トリカルボン酸としてはクエン酸などを例示することができる。
なお、本発明において「有機酸アンモニウム」は、有機酸モノアンモニウム、有機酸多価アンモニウムを含む。
【００２０】
発酵工程では、マグネシウム化合物の存在下、有機酸生産能を有する微生物を用いて、有機酸マグネシウムを含む発酵液を得る。
用いる微生物は、「有機酸生産能を有する微生物」である。「有機酸生産能を有する微生物」とは、微生物を後述するような炭素源を含む培地で培養したときに、培地中に有機酸を生成蓄積する能力を有する微生物である。このような微生物としては、例えば、アナエロビオスピリラム（Anaerobiospirillum）属細菌（米国特許第5143833号明細書）、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌（米国特許第5504004号明細書）、エシェリヒア（Escherichia）属細菌（米国特許第5770435号明細書）等の通性嫌気性細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属等に属するコリネ型細菌（特開平１１−１１３５８８号公報）などの好気性細菌が挙げられる。更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium  flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium  ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium  lactofermentum）に分類される微生物が挙げられる。
【００２１】
琥珀酸生産能を有するコリネ型細菌の例として、具体的には、以下のようなものが挙げられる。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下したブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh株（特開平１１−２０６３８５号公報）や、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が強化されたブレビバクテリウム・フラバムMJ233/pPCPYC株（国際公開第01/27258号パンフレット）、またブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6872、コリネバクテリウム・グルタミカム  ATCC31831、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。
【００２２】
なお、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３は、1975年4月28日に通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。また、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6872等は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  12301  Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）より分譲を受けることが出来る。
【００２３】
発酵工程に用いる微生物は、有機酸生産能が増強するように改変された微生物であってもよい。琥珀酸生産能が増強するように改変された微生物としては、例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現が増強された微生物（特開平１１−１９６８８８号公報）、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された微生物（特開平１１−２０６３８５号公報）等が挙げられる。また、後述の参考例に示すようなフマレートレダクターゼ遺伝子の発現が増強された微生物を用いることもできる。
なお、本発明において用いることのできる有機酸生産能を有する微生物は上記のものには限定されず、その他の琥珀酸生産菌、公知の方法によって得られるリンゴ酸生産菌、フマル酸生産菌、クエン酸生産菌、イソクエン酸生産菌などを使用することができる。
また、本発明において用いることのできる有機酸生産能を有する微生物は２種類以上の有機酸の生産能を有するものであってもよい。
【００２４】
微生物の培養に用いる液体培地は炭素源を含むものである。ここで、炭素源は、微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、ガラクトース、ラクトース、グルコース、マルトース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質を挙げることができる。このうち好ましくは、グルコース、フルクトース、グリセロールを用いることができ、特に好ましくはグルコースを用いることができる。また、より広義の植物由来原料としては、紙の主成分であるセルロースを好ましく用いることができる。さらに、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの炭素源は、単独で用いても２種以上を組み合わせて用いても良い。
【００２５】
上記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、反応の進行に伴う上記炭素源の減少にあわせ、炭素源の追加添加を行っても良い。
【００２６】
液体培地は、上記炭素源に加えて、窒素源や無機塩などを含むものであることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加するとよい。また、反応時の発泡を抑えるために、反応水溶液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００２７】
このような液体培地中で上記微生物を培養するに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養した微生物を直接用いても良いが、上記微生物を予め液体培地で培養（種培養）して得た菌体を用いるのが好ましい。この場合、反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、通常、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２
０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。
【００２８】
発酵反応が進行するにしたがって、有機酸が生成するため培養液のpHは低下する。そのために、培養液には中和剤を加える。中和剤にはアルカリ土類金属の化合物、好ましくはマグネシウム化合物を用いる。マグネシウム化合物は琥珀酸の生産量を増加させ、pHの変動幅が少ないため有利である。マグネシウム化合物としては、水溶液中で電離してアルカリ性を示すものが好ましく、例えば、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）2）、炭酸マグネシウム（ＭｇＣＯ3）、重炭酸マグネシウム（Ｍｇ（ＨＣＯ3）2）などが挙げられるが、ｐH調整の容易さの点においては、水酸化マグネシウムが特に好ましい。なお、マグネシウム化合物は２種類以上用いてもよい。
【００２９】
マグネシウム化合物を添加する方法は、適切なｐＨに制御できる限り特に限定されないが、例えば、これらのマグネシウム化合物を粉末で添加することができる。マグネシウム化合物は、培養開始時に培地に添加しておいてもよいし、培養中に加えてもよい。また、培養開始時に培地に添加しておき、必要に応じてさらに培養中に加えてもよい。これらのマグネシウム化合物による調整ｐＨ値は、用いる微生物の種類に応じて、その有機酸生成活性が最も有効に発揮される範囲に調整されるが、一般的には、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９程度に調整される。
【００３０】
発酵工程における温度、圧力等の培養条件は、用いる微生物によって異なるが、有機酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すれば良い。例えば、培養時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００３１】
培養終了後の発酵液には微生物によって生産された有機酸と中和剤に含まれるマグネシウムによって形成される有機酸マグネシウム（有機酸イオンとマグネシウムイオンに電離していてもよい）が含まれる。該発酵液は、遠心分離等により微生物菌体等を除去した後に、塩交換工程に用いることが好ましい。菌体を分離した発酵液については、さらに精製操作を行った後に、塩交換工程に用いてもよい。また、濃縮操作を行った後に、塩交換工程に用いてもよい。濃縮は、常法を用いれば良く、例えば、ケトル式リボイラや蒸発缶が用いることができる。大規模生産でエネルギー消費が重要となれば、多重効用缶を用いても良い。
【００３２】
塩交換工程は、発酵液に含まれる有機酸マグネシウムをアンモニア化合物を用いて塩交換することにより、有機酸アンモニウムを生成させるとともに、炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウムの複塩、水酸化マグネシウムなどのマグネシウム化合物を生成析出させる工程である。なお、この工程で生成する有機酸アンモニウムは有機酸イオンとアンモニウムイオンに電離していてもよい。
【００３３】
アンモニア化合物としては、アンモニアや炭酸アンモニウムなどが挙げられる。アンモニアと炭酸アンモニウムの両方を添加してもよい。塩交換工程に用いる装置は、例えば、攪拌槽、ドラフトチューブ、クリスタルオスロ型晶析槽、ダブルプロペラなどの一般的に用いられる晶析槽を用いることが出来る。ただし、固液平衡現象により結晶を得る事ができる装置であれば、その形状、手法、晶析段数は問わない。
【００３４】
以下、琥珀酸マグネシウムの塩交換について説明するが、他の有機酸マグネシウムについても同様にして塩交換を行うことができる。また、当業者の知識の範囲内で反応条件を適宜変更してもよい。
まず、炭酸アンモニウムを用いた塩交換について説明する。炭酸アンモニウムを用いた塩交換は、炭酸アンモニウムを添加することによって行ってもよいし（下記反応式（I）
）、アンモニアと二酸化炭素を添加することにより行ってもよい（下記反応式（II））。
【００３５】
Succinate-Mg＋（NH４）２CO３→Succinate(NH4)2＋Mg CO３↓  （I）
Succinate-Mg＋2NH３＋CO２＋H２O→Succinate(NH4)2＋Mg CO３↓（II）
【００３６】
炭酸アンモニウムを添加する場合、炭酸アンモニウムは、反応槽に供給される発酵液中のマグネシウムに対し、０．３から１０モル倍、好ましくは０．５から５モル倍、更に好ましくは１から４モル倍となるように添加することが望ましい。ここで、「発酵液中のマグネシウム」とは、発酵液中の琥珀酸マグネシウム及びマグネシウム化合物に含まれるマグネシウム、並びにマグネシウムイオンの総和を意味する。アンモニアと二酸化炭素を添加する場合、反応槽に供給される二酸化炭素の量は、反応槽に供給される発酵液中のマグネシウムに対し、０．３から１０モル倍、好ましくは０．５から５モル倍、更に好ましくは１から４モル倍となるようにすることが好ましい。また、アンモニアは、二酸化炭素が所定の溶解度を維持できるようなｐＨの範囲、すなわち、ｐＨが７〜１２のアルカリ性になるような量を加えることが好ましい。より好ましくはｐＨが７．５〜１１、特に好ましくはｐＨが８〜１０となるような量を加える。塩交換反応の時間は琥珀酸マグネシウム反応液の量によって異なり特に制限されないが、０．１〜４時間が好ましい。塩交換は、好ましくはｐHが７から１２、より好ましくはｐHが７．５から１１、更に好ましくはｐHが８から１０の範囲で行い、攪拌しながら行うことが好ましい。
【００３７】
なお、炭酸アンモニウムを用いた塩交換（反応式（I）又は（II））においては、マグネシウムの回収率は９０％以上であり、琥珀酸の収率もこの値にほぼ相当する。したがって、琥珀酸マグネシウムを含む溶液から効率よく琥珀酸アンモニウムの生成、及びマグネシウムの回収を行うことができる。
【００３８】
次に、アンモニアを用いた塩交換について説明する。この場合、以下の反応式（III）で琥珀酸アンモニウム及び水酸化マグネシウムが生成する。
【００３９】
Succinate-Mg＋2NH３＋2H２O→Succinate(NH4)2＋Mg(OH)2↓    （III）
【００４０】
加えるアンモニアの量は発酵液中のマグネシウムに対して２〜１５モル倍が好ましい。塩交換の時間は琥珀酸マグネシウムを含む発酵液の量によって異なり特に制限されないが、０．１〜4時間が好ましい。塩交換は、好ましくはｐHが７から１２、より好ましくはｐHが７．５から１１、更に好ましくはｐHが８から１０の範囲で行う。アンモニアを用いた塩交換では、水酸化マグネシウムが生成する。したがって、発酵液に加えるマグネシウム化合物としては、水酸化マグネシウム、又は水酸化マグネシウム及び炭酸マグネシウムの混合物を用いることが好ましい。
【００４１】
なお、アンモニアを用いた塩交換（反応式（III））においては、琥珀酸アンモニウム水溶液中に溶存するマグネシウムの濃度はおよそ０．５ｗｔ％程度である。更に回収率を上げるには、溶媒である水を少なくする必要があるが、琥珀酸アンモニウムの溶解度以上に濃縮をすることはできない。よりマグネシウムの少ない琥珀酸アンモニウム水溶液を得るには、さらに、反応式（III）の塩交換後の濾液に、炭酸アンモニウムを加えてさらに反応式（I）又は（II）の塩交換を行い、炭酸マグネシウムを生成析出させ、該炭酸マグネシウムを除去することにより、溶液中のマグネシウム濃度を０．０１ｗｔ％程度にまで減らすことができる。
【００４２】
マグネシウム分離工程は、生成した炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウムの複塩、水酸
化マグネシウムなどのマグネシウム化合物を分離して発酵工程に循環させると共に、有機酸アンモニウム溶液を得る工程である。これらのマグネシウム化合物は水にほとんど溶けないため、ろ過等の常法によって除去することができる。完全にろ過する場合は、加圧濾過、減圧濾過、遠心ろ過などが用いることができる。また、沈降分離し、上澄み液と高濃度スラリーとしてポンプ移送しても良い。このようにしてマグネシウム化合物を除去することにより、有機酸アンモニウム水溶液を得ることができる。
【００４３】
除去されたマグネシウム化合物は、発酵槽に中和剤としてリサイクル利用することもできる。すなわち、マグネシウム分離工程で得られたマグネシウム化合物は、発酵工程においてマグネシウム化合物として再利用することが経済的で好ましい。この場合には雑菌による汚染を防ぐために一般には加熱殺菌を行っているが、特に高濃度スラリーとして移送すれば通常の熱交換器、例えば多管式熱交換器やプレート式熱交換器による加熱で殺菌が可能となる。加熱殺菌の後にろ過をしても良いし、直接発酵槽に供給しても良い。完全にろ過をした場合であっても蒸気を直蒸して殺菌することができる。
【００４４】
また、炭酸マグネシウムは二酸化炭素と水酸化マグネシウムの形で再利用することもできる。すなわち、まず、炭酸マグネシウムを熱分解して二酸化炭素と酸化マグネシウムにする。得られた二酸化炭素は、上記反応式（II）の塩交換に再利用することができる。一方、酸化マグネシウムについては、水を反応させて水酸化マグネシウムにし、第1の工程にマグネシウム系中和剤として再利用することができる。
【００４５】
なお、炭酸マグネシウムは特公平１−１３３９１９或いはｒｅｖｅｕ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  ｍｉｎｅｒａｌｅ  ｔ：２２，  １９８５，ｐ．６９２−６９８に示されるように二酸化炭素が多い条件では複塩となる事が知られている。したがって、炭酸アンモニウムをアンモニウム化合物として用いた場合、塩交換工程によって生成するマグネシウム化合物の一部は炭酸マグネシウム及び炭酸アンモニウムの複塩として存在する。この工程ではマグネシウムを出来るだけ少なくした琥珀酸アンモニウムを回収する事が好ましいが、二酸化炭素の量を少なくすると、溶解度積から、マグネシウムの溶解量が増加することは明らかである。そのため、複塩の生成は不可避である。一方で、マグネシウムは、複塩のままリサイクルすることは困難である。そこで、該複塩を含むスラリーを分離し、加熱または乾燥することによって、該複塩から炭酸アンモニウムを除去して炭酸マグネシウムを得、該炭酸マグネシウムを発酵工程に循環させることが好ましい。
【００４６】
複塩を含むマグネシウム化合物は定法によって分離される。完全に濾過する場合は、加圧濾過、減圧濾過、遠心濾過などが用いられる。また、沈降分離し、上澄み液と高濃度スラリーとしてポンプ移送しても良い。こうして得られる結晶やスラリーは、一般に、アンモニア等で洗浄して有機物を除去したのち、次の加熱操作のために加熱装置に供給する事が好ましい。
【００４７】
炭酸マグネシウム及び炭酸アンモニウムを含む複塩を加熱することにより、炭酸アンモニウムが選択的に分解され、高純度の炭酸マグネシウムを得ることができる。加熱温度は１０８℃〜２１０℃が好ましく、１２０℃〜１８０℃がより好ましい。加熱時間は複塩の量、加熱装置によって異なり特に制限されないが、１５分から２時間が好ましく、３０分から１時間がより好ましい。複塩を加熱して得られる炭酸マグネシウムは純度１００％である必要はなく、微量の炭酸アンモニウムが残存していてもよい。この場合、複塩中のアンモニアがマグネシウムの１／１０モル以下であることが好ましく、複塩中のアンモニアがマグネシウムの１／３０モル以下であることがより好ましい。
【００４８】
使用する加熱装置は、結晶を所定の温度を越える温度にまで加熱できるものであれば、どのような形式のものであってもよい。キルン、乾燥機、加熱機などが挙げられる。結晶
がフレーク状になっても良い場合、ホットプレートやベルト型のような加熱機、焼成機を用いても良い。通常、中和剤として用いる場合、粉体である方が分散性が良く、扱いやすい。このような場合、ロータリーキルンや流動乾燥機を用いるのが好ましい。
【００４９】
なお、有機酸マグネシウムを炭酸アンモニウムで塩交換することによって生成する複塩を加熱する場合は、複塩から有機酸を除くためにアンモニア水で洗浄した後に加熱することが好ましい。アンモニア水の濃度は特に制限されず、例えば、25%の工業用アンモニア水などを使用することができる。このような洗浄は１回でもよいし、複数回行ってもよい。
【００５０】
複塩を加熱して炭酸アンモニウムを除去した後に回収される炭酸マグネシウムを再利用することで有機酸発酵生産の効率化を図ることができる。すなわち、炭酸マグネシウムを発酵工程に中和剤として再利用してもよいし、又は上述のように水酸化マグネシウムと二酸化炭素に変換し、水酸化マグネシウムを発酵工程に、二酸化炭素を塩交換工程に再利用してもよい。
【００５１】
一方、マグネシウム分離工程により得られた有機酸アンモニウム溶液には、過剰に加えられた未反応の二酸化炭素（溶液中では炭酸イオン（ＨＣＯ3-）として存在）とアンモニアが含まれている場合があるが、その場合は、二酸化炭素とアンモニアの溶解度が温度依存性の強いという性質を利用して、加熱により容易に蒸発・気化させて分離することができる。この場合、二酸化炭素とアンモニアが同時に気化するため、冷却されると炭酸アンモニウムとして析出し、反応槽が閉塞を起こしてしまうおそれがある。そのため気化したガスの温度は、炭酸アンモニウムの融点１０８℃よりも高いことがより望ましい。ただし、１０８℃よりも低くても、例えば、常圧であれば８０℃以上、好ましくは９０℃で、炭酸アンモニウムは十分に除去できる。８０℃の場合、常圧では十分な量の水蒸気が得られない事が多く、放冷の度合いによっては閉塞を起こすことがあるが、この場合でも、圧力を制御して幾らかの水蒸気を同伴させることができれば、閉塞する事は無い。従って、１０８℃以下の場合には、同伴される水の量を圧力によって制御することが必要である。特に好ましい条件としては、気化した時点で１０８℃以上、即ち１０８℃以上に有機酸アンモニウム水溶液を加熱して炭酸とアンモニアを気化させ、若干の水を同伴させるのが良い。
【００５２】
気化した炭酸とアンモニアを回収し、リサイクルする方法としては、炭酸アンモニウムとして全量を溶解するのに十分な水を用いて吸収させ、バッファタンクに保存し、バッファタンクから塩交換反応槽に供給するなどの方法が安全である。しかし、この方法では炭酸アンモニウムを溶解するのに必要とされる水が同時に塩交換反応槽に供給されてしまう。したがって、省エネルギーの観点からはガスのまま塩交換反応槽に供給・再利用するのが好ましい。１０８℃以上で有機酸アンモニウム水溶液から分離した炭酸とアンモニアは若干の加圧条件のガスとして塩交換反応槽に供給される。
【００５３】
本発明の方法によって得られた有機酸アンモニウムを用いることにより、有機酸を得ることができる。有機酸アンモニウムから有機酸を得る方法は特に制限されないが、例えば、電気透析を用いる方法（特開平２−２８３２８９号公報）、イオン交換樹脂を用いる方法（米国特許第６，２８４，９０４号明細書又はＷＯ０１／６６５０８号）、水酸化カルシウムで中和しながら発酵生産して得られた有機酸カルシウムを、硫酸で分解する方法（特開平３−０３０６８５号公報）硫酸を用いる塩の交換反応で反応晶析を行う方法（特表２００１−５１４９００号公報又は米国特許第５，９５８，７４４号明細書参照、）、反応抽出法（WO98/01413）、酢酸を用いる方法（WO03/95409）などを採用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ここでは、琥珀酸アンモニウム溶液の製造について示すが、他の有機酸マグネシウムについても同様にして行うことができる。
まず、実施例１、２では塩交換工程以降を示す。
＜実施例１：アンモニアを用いた塩交換＞
（１）琥珀酸Ｍｇ液の合成（琥珀酸Ｍｇ濃度１２．３ｗｔ％、３０ｋｇ）
１００Ｌの撹拌容器に蒸留水２５．３５ｋｇを仕込み、アンカー翼で30rpmで撹拌を行った。この撹拌容器はジャケットに水を流通させることで常温に制御した。水酸化マグネシウム（和光試薬）１．５４ｋｇを撹拌槽に投入し懸濁溶液とした。この懸濁液に琥珀酸（和光試薬）３．１２ｋｇを液温を監視しながら少しずつ添加した。この中和反応にて琥珀酸マグネシウム水溶液３０ｋｇを得た。
【００５５】
（２）アンモニア水による塩交換反応
上記操作に引き続いて、琥珀酸マグネシウム水溶液（３０ｋｇ）に２５％アンモニア水（和光試薬）を混合し塩交換を行った。混合方法は、アンモニア水（25%）１５ｋｇを約１時間かけて投入し、投入終了後更に６０分撹拌を行い、塩交換反応を完了させた。これにより、水酸化マグネシウムが析出したスラリー液（４５ｋｇ）を得た。このスラリー液を少量採取し、０．２μｍのメンブランフィルタ（ミリポア社製）で濾過を行った。得られた琥珀酸アンモニウムを含む濾液中のＭｇ濃度をイオンクロマトグラフィー（電気伝導度検出器）で分析した。その結果、Ｍｇ濃度は０．３９ｗｔ％であった。
【００５６】
（仕込みＭｇ量）    ２．１４（ｗｔ％）／１００×３０（ｋｇ）＝０．６４２（ｋｇ）（上澄み液Ｍｇ量）  ０．３９（ｗｔ％）／１００×４５（ｋｇ）＝０．１７６（ｋｇ）（Ｍｇ除去率）        （１−０．１７６／０．６４２）×１００＝７２．６（％）
【００５７】
（３）スクリューデカンターによるスラリーの固液分離
上記操作で得られたスラリー液を固液分離した。固液分離には、巴工業社製のスクリューデカンター（シャープレススーパーデカンター  型式Ｐ−６６０）を使用した。デカンターの内筒、外筒は３９００、５１００ｒｐｍに設定した。この条件でスラリー液を毎時３０Ｌで流通させ連続的に固液分離を実施した。液排出口からは出てくる液には若干の粉が見られた。この液を一部サンプリングし、粉を溶解させる為に酒石酸を少量添加した上でＭｇ濃度の分析を行った。その結果は０．４９ｗｔ％であった。同様に排出される固体についてもＭｇ濃度の分析を実施した。固体を蒸留水で５０倍に希釈し、更に、固体が完全に溶解するまで酒石酸を添加することで均一溶液にした。この溶液を分析した結果、Ｍｇ濃度は１４．６ｗｔ％であった。また、琥珀酸濃度の分析を回収液及び回収固体について行ったところ、それぞれ、６．７９％及び７．８９％であった。最終的に固液分離で回収された液は４２ｋｇ、固体は３ｋｇであった。
【００５８】
（回収液のＭｇ量）    ０．４９（ｗｔ％）／１００×４２（ｋｇ）＝０．２０６（ｋｇ）
（回収固体のＭｇ量）  １４．６（ｗｔ％）／１００×  ３（ｋｇ）＝０．４３８（ｋｇ）
（仕込みＭｇ基準のＭｇ回収率）  （１-０．２０６/０．６４２）×１００＝６７．９（％）
（回収液の琥珀酸量）  ６．７９（ｗｔ％）／１００×４２（ｋｇ）＝２．８５（ｋｇ）（回収固体の琥珀酸量）  ７．８９（ｗｔ％）／１００×３（ｋｇ）＝０．２４（ｋｇ）（仕込み琥珀酸基準の琥珀酸回収率）  ２．８５／３．１２×１００＝９１．５％
【００５９】
＜実施例２：炭酸アンモニウムを用いた塩交換＞
（１）琥珀酸Ｍｇ液の合成（琥珀酸Ｍｇ濃度１２．３ｗｔ％、１０ｋｇ）
１５Ｌの撹拌容器に蒸留水８．４５ｋｇを仕込み、傾斜パドル翼で200rpmで撹拌を行った。この撹拌容器はジャケットに水を流通させることで常温に制御した。水酸化マグネシウム（和光試薬）０．５１ｋｇを撹拌槽に投入し懸濁溶液とした。この懸濁液に琥珀酸（和光試薬）１．０４ｋｇを液温を監視しながら少しずつ添加した。この中和反応にて琥珀酸マグネシウム水溶液１０ｋｇを得た。
【００６０】
（２）炭酸アンモニウムによる塩交換反応
上記操作に引き続いて、琥珀酸マグネシウム水溶液（１０ｋｇ）に炭酸アンモニウム（和光試薬）を混合し塩交換を行った。混合方法は、炭酸アンモニウム２．１ｋｇを約１時間かけて投入し、投入終了後更に６０分撹拌を行い、塩交換反応を完了させた。これにより、水酸化マグネシウムが析出したスラリー液（１２．１ｋｇ）を得た。このスラリー液を少量採取し、０．２μｍのメンブランフィルタ（ミリポア社製）で濾過を行った。得られた琥珀酸アンモニウムを含む濾液中のＭｇ濃度をイオンクロマトグラフィー（電気伝導度検出器）で分析した。その結果、Ｍｇ濃度は０．０１ｗｔ％であった。
【００６１】
（仕込みＭｇ量）    ２．１４（ｗｔ％）／１００×１０（ｋｇ）＝０．２１４（ｋｇ）（上澄み液Ｍｇ量）  ０．０１（ｗｔ％）／１００×１２．１（ｋｇ）＝０．００１２（ｋｇ）
（Ｍｇ除去率）    （１−０．００１２／０．２１４）×１００＝９９．４（％）
【００６２】
（３）加圧濾過機によるスラリーの固液分離
上記操作で得られたスラリー液を固液分離した。固液分離には、アドバンテック社製の１０Ｌ加圧濾過機を使用した。濾紙にはアドバンテック社製の高純度濾紙Ｎｏ．５Ｃを使用した。濾過は２回に分けて連続して実施した。濾過圧はゲージ圧４ｋｇで行い、液が出なくなったところで常圧に戻し、次のスラリー液を仕込んだ。この条件でスラリー液の固液分離を実施した。回収される濾液には固形分は確認できなかった。この濾液をＭｇ分析したところＭｇ濃度は０．０１ｗｔ％であった。同様に回収される固体についてもＭｇ濃度の分析を実施した。固体を蒸留水で５０倍に希釈し、固体が完全に溶解するまで酒石酸を添加することで均一溶液にした。この溶液を分析した結果、Ｍｇ濃度は７．４８ｗｔ％であった。また、琥珀酸濃度の分析を回収液及び回収固体について行ったところ、それぞれ、１０．１％及び４．４％であった。最終的に濾過で回収された液は９．１ｋｇ、固体は２．８ｋｇであった。
【００６３】
（回収液のＭｇ量）    ０．０１（ｗｔ％）／１００×９．１（ｋｇ）＝０．０００９１（ｋｇ）
（回収固体のＭｇ量）  ７．４８（ｗｔ％）／１００×２．８（ｋｇ）＝０．２０９（ｋｇ）
（仕込みＭｇ基準のＭｇ回収率）  （１−０．０００９１／０．２１４）×１００＝９９．６（％）
（回収液の琥珀酸量）  １０．１（ｗｔ％）／１００×９．１（ｋｇ）＝０．９１９（ｋｇ）
（回収固体の琥珀酸量）  ４．４（ｗｔ％）／１００×２．８（ｋｇ）＝０．１２３（ｋｇ）
（仕込み琥珀酸基準の琥珀酸回収率）  ０．９１９／１．０４×１００＝８８．４％
【００６４】
アンモニアを用いた塩交換及び炭酸アンモニウムを用いた塩交換のいずれによっても琥珀酸マグネシウムからマグネシウムを回収して、琥珀酸アンモニウム溶液を得ることができた。アンモニアを用いた塩交換に比べて、炭酸アンモニウムを用いた塩交換の方が、より効率よく、ほぼ完全にマグネシウムを回収することができた。
【００６５】
以下、実施例３では、発酵工程、塩交換工程、マグネシウム分離工程、及びマグネシウム分離工程で得られた炭酸マグネシウム・炭酸アンモニウム複塩から炭酸マグネシウムを得る工程について示す。実施例４ではさらに、複塩から得られた炭酸マグネシウムの発酵工程への再利用についても示す。
＜実施例３：発酵による琥珀酸マグネシウム溶液の調製及び複塩の調製＞
（１）菌体調製
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ添加し、後述の参考例に従って作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。なお、この株はフマレートレダクターゼ及びピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の発現が増強され、かつ、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊された株である。
【００６６】
尿素：１２ｇ、硫酸アンモニウム：４２ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：６０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：６０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：６００μｇ、塩酸チアミン：６００μｇ、酵母エキス３ｇ、カザミノ酸３ｇ、消泡剤（アデカノールＬＧ２９４：旭電化製）：１ｍＬ及び蒸留水：２５００ｍＬの培地を５Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、あらかじめ滅菌した１２％グルコース水溶液を５００ｍＬ添加し、これに前述の種培養液を全量加えて、３０℃に保温した。通気は毎分５００ｍＬ、攪拌は毎分５００回転で培養を行った。１２時間後にグルコースがほぼ消費されていた。この液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離し、上澄みを破棄し、発酵反応に用いる菌体を得た。
【００６７】
（２）発酵反応
リン酸１カリウム：０．３６ｇ、リン酸２カリウム０．３６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．８ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：７２ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：７２ｍｇ、Ｄ−ビオチン：７２０μｇ、塩酸チアミン：７２０μｇ及び蒸留水：２６００ｍＬの培地を５ＬのＪＡＲに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２６００ｍＬとあらかじめ滅菌した３６％グルコース溶液１０００ｍＬを５ＬのＪＡＲに入れ、４炭酸マグネシウム１水酸化マグネシウム５水和物：３４９ｇ、琥珀酸アンモニウム２７ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分３００回転で攪拌しながら反応を行った。発酵終了後、培養液を８０００ｒｐｍ、５分の遠心分離し、上澄みを発酵液として残し、沈降した菌体を回収した。この回収した菌体を用いて、同様の発酵反応操作、分離操作を６回行い、２０Ｌの上澄み液を得た。６回の平均で琥珀酸蓄積は89.5g/L、収率は８２％であった。更に、分子分画量２００００のＵＦ膜を用いてろ過し、琥珀酸マグネシウムを含む発酵液（ブロス）を得た。
【００６８】
（３）塩交換
上記、発酵法によって得られた琥珀酸マグネシウム水溶液２０Lを５０Lの攪拌槽に入れ、常温常圧の条件下、炭酸アンモニウム（和光純薬社製特級試薬）を４．０ｋｇ入れた。攪拌を行うと直ちに結晶が析出した。１２０分攪拌を行った後、巴社製スクリューデカンター（３０００Ｇ）を用いて遠心分離した。１９．９ｋｇの琥珀酸アンモニウム溶液と４．１ｋｇの炭酸マグネシウム・炭酸アンモニウム複塩を得た。
【００６９】
（４）複塩分解
上記で得られた複塩を分取して使用し、以下のようにして洗浄、加熱操作を行った。洗浄回数、加熱温度、加熱時間を変えて検討を行った。各実験例における温度・時間・洗浄回数等の条件は表１のとおりである。
【００７０】
（洗浄）
上記ソルベイ法塩交換によって得られた炭酸マグネシウム・炭酸アンモニウム複塩をビーカーに分取し、この複塩と同じ重量の２５％の工業用アンモニア水（三菱化学社製）を加え懸洗した。得られた懸濁液はヌッチェで吸引濾過を行う事で固液を分離し、固体を回収した。この洗浄と濾過操作を１回もしくは２回行った。
【００７１】
（加熱）
洗浄操作によって得られた固体を全量５００ｍLのナス型フラスコに投入し、ロータリーエバポレータを用いて所定の温度、時間にて加熱を行った。得られた加熱固体中のＭｇ、アンモニアと琥珀酸の含有量を分析した。
【００７２】
得られた加熱固体の分析結果を表１に示す。実験No.１〜６より、１２０〜１８０℃の範囲で複塩を加熱した場合、複塩中のアンモニアの割合が著しく減少し、マグネシウムの割合が増加した。このことから、複塩から炭酸アンモニウムが効率的に除去され、純度の高い炭酸マグネシウムが得られたことがわかった。一方、９０℃で加熱した場合（実験No. 7）は、アンモニアは複塩中にかなりの量が残存しており、十分除去することはできなかった。また、25%アンモニア水で洗浄することによって複塩に付着した琥珀酸を除去することができたが、洗浄回数は、本実施例においては２回行ったほうが琥珀酸をより除去できることがわかった。
【００７３】
【表１】
2005295998.tif 000002
【００７４】
＜実施例４：複塩分解によって得られた炭酸マグネシウムの発酵工程への再利用＞
まず、実施例３に記載の（１）の方法によって発酵反応に用いる菌体を得た。次に、上記実施例３の複塩分解工程で得られた炭酸マグネシウムを中和剤として発酵反応を行った。リン酸１カリウム：０．０４ｇ、リン酸２カリウム０．０．０４ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇ及び蒸留水：２００ｍＬの培地を５００の三角フラスコに入れ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、上記の培養により集菌した菌体に添加して、Ｏ．Ｄ．（６６０ｎｍ）が６０になるように再懸濁した。この懸濁液２００ｍＬとあらかじめ滅菌した２０％グルコース溶液２００ｍＬを１ＬのＪＡＲに入れ、炭酸マグネシウム（実施例１（４）にて得られたもの、又は市販のもの）４２ｇ、琥珀酸アンモニウム３ｇを添加して混合した。この反応用懸濁液を３５℃に保温し、毎分４００回転で攪拌しながら反応を行った。反応開始後９時間でグルコースはほぼ消費され、琥珀酸は９１ｇ／Ｌ蓄積されていた。収率は８３％であった。
【００７５】
結果を表２に示す。表２における実験Ｎｏ．１，２，４，５は、表１の対応する実験No.の実験において得られた炭酸マグネシウムを中和剤としてリサイクル使用して、上記琥珀酸発酵生産を行ったときの実験結果を示している。また試薬１、２は、市販の炭酸マグネシウムを使用して上記琥珀酸発酵生産を行ったときの実験結果を示している。反応結果の欄を見るとわかるように、複塩を加熱することによって得られた炭酸マグネシウムを用
いて琥珀酸発酵生産を行った場合も、市販の炭酸マグネシウムを用いた場合と同程度の琥珀酸を得ることができた。このことから、複塩を加熱することによって得られた炭酸マグネシウムを効率的に再利用できることがわかった。
【００７６】
【表２】
2005295998.tif 000003
【００７７】
［参考例］
ここでは、実施例３，４の発酵反応に使用した微生物の構築方法について示す。
［参考例１］遺伝子破壊用ベクターの構築
（Ａ）枯草菌ゲノムDNAの抽出
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００７８】
（Ｂ）ＰＣＲによるＳａｃＢ遺伝子の増幅およびクローニング
枯草菌ＳａｃＢ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、既に報告さ
れている該遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
Ｎｏ．Ｘ０２７３０）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ：ＳＴＲＡＴＥＧＥＮＥ製）のＥｃｏＲＶ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、次に５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。ＳａｃＢ遺伝子が大腸菌内で機能的に発現する株は、ショ糖含有培地にて生育不能となるはずである。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断することにより、約２ｋｂの挿入断片が認められ、該プラスミドをｐＢＳ／ＳａｃＢと命名した。
【００７９】
（Ｃ）クロラムフェニコール耐性ＳａｃＢベクターの構築
大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６（宝酒造：クロラムフェニコール耐性マーカー）５００ｎｇに制限酵素ＰｓｈＢＩ１０ｕｎｉｔｓを３７℃で一時間反応させた後、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿により回収した。これを、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造製）により両末端を平滑化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカー（宝酒造）を連結、環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。得られたクローンから常法によりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素ＭｌｕＩの切断部位を有するクローンを選抜し、ｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕと命名した。一方、上記（B）にて構築したｐＢＳ／ＳａｃＢを制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断した後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化した。これにライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いてＭｌｕＩリンカーを連結したのち、０．７５％アガロースゲル電気泳動によりＳａｃＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＳａｃＢ遺伝子断片を、制限酵素ＭｌｕＩ切断後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）にて末端を脱リン酸化したｐＨＳＧ３９６Ｍｌｕ断片とライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。こうして得られたコロニーを、次に３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび１０％ショ糖を含むＬＢ寒天培地に移し３７℃２４時間培養した。これらのクローンのうち、ショ糖を含む培地で生育できなかったものについて、常法によりプラスミドＤＮＡを精製した。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩ切断により解析した結果、約２．０ｋｂの挿入断片を持つことが確認
され、これをｐＣＭＢ１と命名した。
【００８０】
（Ｄ）カナマイシン耐性遺伝子の取得
カナマイシン耐性遺伝子の取得は、大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（宝酒造：カナマイシン耐性マーカー）のＤＮＡを鋳型とし、配列番号３および配列番号４で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ法によって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１ｎｇ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．１μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．５μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６２℃で１５秒、７２℃で１分２０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約１．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した。
【００８１】
（Ｅ）カナマイシン耐性ＳａｃＢベクターの構築
上記（Ｃ）で構築したｐＣＭＢ１を制限酵素Ｖａｎ９１ＩおよびＳｃａＩで切断して得られた約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。これを上記（Ｄ）で調製したカナマイシン耐性遺伝子と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。このカナマイシン含有培地上で生育した株は、ショ糖含有培地にて生育不能であることが確認された。また、同株から調製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄIII消化により３５４、４７３、１８０７、１９９７ｂｐの断片を生じたことから、図１に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＫＭＢ１と命名した。
【００８２】
［参考例２］  ＬＤＨ遺伝子破壊株の作製
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）は、常法（Wolf H et al.,  J. Bacteriol. 1983, 156(3) 1165-1170、Kurusu Y et al., Agric Biol Chem. 1990, 54(2) 443-7）に従って内在性プラスミドを除去（キュアリング）し、得られたプラスミドキュアリング株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株を以後の形質転換に用いた。
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＥＳ株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記参考例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００８３】
（Ｂ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＭＪ２３３株ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、特開平１１−２０６３８５に記載の該遺伝子の塩基配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッ
ファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ
ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨと命名した。
【００８４】
（Ｃ）ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用プラスミドの構築
上記（Ｂ）で作製したｐＧＥＭＴ／ＣｇＬＤＨを制限酵素ＥｃｏＲVおよびＸｂａＩで切断することにより約０．２５ｋｂからなるラクテートデヒドロゲナーゼのコーディング領域を切り出した。残った約３．７ｋｂのＤＮＡ断片の末端をクレノウフラグメントにて平滑化し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて環状化させ、大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたクローンを選抜し、これをｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨと命名した。次に、上記ｐＧＥＭＴ／ΔＬＤＨを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断して生じる約０．７５ｋｂのＤＮＡ断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、欠損領域を含むラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子断片を調製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩにて切断した参考例１にて構築したｐＫＭＢ１と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約０．７５ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨと命名した（図２）。
【００８５】
（Ｄ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株由来ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株の形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨがブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３−ＥＳ株菌体内で複製不可能なプラス
ミドであるため、該プラスミドのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびＳａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりＳａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約１０個得た。この様にして得られた株の中には、そのラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子がｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号７および配列番号８）を用いて分析すると、野生型では７２０ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では４７１ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨと命名した。
【００８６】
［参考例３］  コリネ型細菌発現ベクターの構築
（Ａ）コリネ型細菌用プロモーター断片の調製
コリネ型細菌で強力なプロモーター活性を有することが報告された特開平７−９５８９１の配列番号４に記載のＤＮＡ断片（以降ＴＺ４プロモーターと称する）を利用することとした。本プロモーター断片の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ゲノムＤＮＡを鋳型とし、特開平７−９５８９１の配列番号４に記載の配列を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９および配列番号１０）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は２分とした。増幅産物の確認は、２．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．２５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成した６クローンについて、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、塩基配列を決定した。これ中でＴＺ４プロモーターがｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと逆方向に転写活性を有するように挿入されたクローンを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４と命名した。次に、ｐＵＣ／ＴＺ４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡ断片に、５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１１および配列番号１２）から成り、両末端にそれぞれＢａｍＨＩとＰｓｔＩに対する粘着末端を有するＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。本ＤＮＡリンカーには、リボソーム結合配列（ＡＧＧＡＧＧ）およびその下流に配したクローニングサイト（上流から順に、ＰａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩ）が含まれている。この培地上で白色のコ
ロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤと命名した。この様にして構築したｐＵＣ／ＴＺ４−ＳＤを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することにより生じた約０．３ｋｂのプロモーター断片を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。
【００８７】
（Ｂ）コリネ型細菌発現ベクターの組み立て
コリネ型細菌にて安定的に自立複製可能なプラスミドとして、特開平１２−９３１８３記載のｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを利用する。本プラスミドは、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４株が保有する天然型プラスミドｐＢＹ５０３の複製領域および安定化機能を有する領域と大腸菌ベクターｐＨＳＧ２９８（宝酒造）に由来するカナマイシン耐性遺伝子および大腸菌の複製領域を備える。ｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐを制限酵素ＳｓｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡを、上記（Ａ）で調製したＴＺ４プロモーター断片と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡの中から制限酵素ＮｏｔＩによって切断されるものを選抜し、該プラスミドをｐＴＺ４と命名した（図３に構築手順を示した）。
【００８８】
［参考例４］  ピルベートカルボキシラーゼ活性増強株の作製
（Ａ）ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の取得は、参考例２の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＧＥＭ／ＭＪＰＣと命名した。ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビックダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得
られたＤＮＡ塩基配列を配列番号１５に記載する。本配列から予想されるアミノ酸配列はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株由来のそれと極めて高い相同性（９９．４％）を示すことから、ｐＧＥＭ／ＭＪＰＣの挿入断片がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子であること断定した。
【００８９】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼ活性増強用プラスミドの構築
上記（Ａ）で作製したｐＧＥＭ／ＭＪＰＣを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより生じる約３．７ｋｂからなるピルベートカルボキシラーゼ遺伝子断片を、０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩにて切断した参考例３にて構築したｐＴＺ４と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩおよびＡｐａＩで切断することにより、約３．７ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１と命名した（図４）。
【００９０】
（Ｃ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株内で複製可能なｐＭＪＰＣ１による形質転換用のプラスミドＤＮＡは、上記（Ｂ）で形質転換した大腸菌（ＤＨ５α株）から調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株への形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、グルコース ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【００９１】
［参考例５］  大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出
ＬＢ培地１０ｍＬに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を上記参考例１の（Ａ）に示す方法にてゲノムＤＮＡを調製した。
【００９２】
（Ｂ）大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０００９６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１６および配列番号１７）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ1μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、 ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００を用い、９４℃で２０秒、６８℃で４分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約３．８ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回
収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬX-Galを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＫｐｎＩで切断することにより、約３．９ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＦＲＤ６．０と命名した。ｐＦＲＤ６．０の挿入断片の塩基配列は、アプライドバイオシステム社製塩基配列解読装置（モデル３７７ＸＬ）およびビッグダイターミネーターサイクルシークエンスキットｖｅｒ３を用いて決定した。その結果得られたＤＮＡ塩基配列を配列番号１８に記載する。
【００９３】
［参考例６］  ピルベートカルボキシラーゼ・フマレートレダクターゼ活性増強株の作製（Ａ）ｐＭＪＰＣ１の制限酵素部位改変
参考例３にて構築したｐＭＪＰＣ１を制限酵素ＫｐｎＩにて完全に切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：宝酒造）を反応させて５’末端を脱リン酸化処理して調製したＤＮＡ断片に、  ５’末端がリン酸化された合成ＤＮＡ（配列番号１９および配列番号２０）から成るＤＮＡリンカーを混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡから制限酵素ＮｄｅＩによって切断されるものを選抜し、これをｐＭＪＰＣ１．１と命名した。
【００９４】
（Ｂ）ピルベートカルボキシラーゼおよびフマレートレダクターゼ活性増強用プラスミドの構築
参考例５にて作製したｐＦＲＤ６．０を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断して生じた約３．９ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収した。この様にして調製した大腸菌フマレートレダクターゼ遺伝子を含む断片を、上記（Ａ）で作製したｐＭＪＰＣ１．１を制限酵素ＮｄｅＩで切断後、クレノウフラグメントにて末端を平滑化し、次いで制限酵素ＫｐｎＩで切断することによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した株を、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII消化により５０５、２１３２、２６７５、３７７５、４１９３ｂｐの断片を生じたことから、図５に示した構造に間違いがないと判断し、該プラスミドをｐＦＲＰＣ１．１と命名した。
【００９５】
（Ｂ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換
ｐＦＲＰＣ１．１を用いたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は、参考例４の（Ｃ）に記載の方法にて行い、プラスミドｐＦＲＰＣ１．１を保持することが確認された株を得、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＦＲＤ／ＰＣ／ΔＬＤＨ株と命名した。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】プラスミドｐＫＭＢ１の構築手順と制限酵素地図を示す図。
【図２】プラスミドｐＫＭＢ１／ΔＬＤＨの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドｐＴＺ４の構築手順を示す図。
【図４】プラスミドｐＭＪＰＣ１の構築手順を示す図。
【図５】プラスミドｐＦＲＰＣ１．１の構築手順を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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