(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、広範な悪性リンパ腫・白血病細胞を増殖抑制または死滅させることができるガン治療用薬剤、及び当該ガン治療用薬剤を用いてガン細胞を死滅させる方法を提供することにある。【解決手段】  本発明にかかるガン治療用薬剤は、ＣＭＶプロモーター１と、ＨＡタグ２と、ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）３と、ポリＡ付加シグナル４と、ＳＶ４０プロモーター５と、ジェネティシン／Ｇ４１８耐性遺伝子６と、ポリＡ付加シグナル７と、アンピシリン耐性遺伝子８とを連結して作製した遺伝子構築物ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  １０を有効成分としている。上記遺伝子構築物が導入されたヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞の腫瘍源性は有意に消失するとともに、該細胞はアポトーシスによる細胞死が起こりやすくなる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも発現用プロモーターと、ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を有効成分とするガン治療用薬剤。
【請求項２】
少なくとも発現用プロモーターと、改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を有効成分とするガン治療用薬剤。
【請求項３】
上記ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のガン治療用薬剤。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載のガン治療用薬剤。
（ｃ）配列番号４または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号４または７に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
上記発現用プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のガン治療用薬剤。
【請求項６】
上記遺伝子構築物が、配列番号３に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項５に記載のガン治療用薬剤。
【請求項７】
上記遺伝子構築物が、配列番号６または９に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項５に記載のガン治療用薬剤。
【請求項８】
ＳＨＰ１タンパク質を有効成分とするガン治療用薬剤。
【請求項９】
改変型ＳＨＰ１タンパク質を有効成分とするガン治療用薬剤。
【請求項１０】
上記ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８に記載のガン治療用薬剤。
【請求項１１】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項９に記載のガン治療用薬剤。
【請求項１２】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２または５または８に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質であることを特徴とする請求項９に記載のガン治療用薬剤。
【請求項１３】
少なくとも発現用プロモーターと、ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を、標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴とするガン細胞の死滅方法。
【請求項１４】
少なくとも発現用プロモーターと、改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を、標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴とするガン細胞の死滅方法。
【請求項１５】
上記ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項１３に記載のガン細胞の死滅方法。
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有する遺伝子。
【請求項１６】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｇ）または（ｈ）に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項１４に記載のガン細胞の死滅方法。
（ｇ）配列番号４または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｈ）配列番号４または７に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１７】
上記発現用プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターであることを特徴とする請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項１８】
上記遺伝子構築物が、配列番号３に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１７に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項１９】
上記遺伝子構築物が、配列番号６または９に示される塩基配列を有することを特徴とする請求項１７に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２０】
ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴とするガン細胞の死滅方法。
【請求項２１】
改変型ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴とするガン細胞の死滅方法。
【請求項２２】
上記ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２０に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２３】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２１に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２４】
上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２または５または８に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質であることを特徴とする請求項２１に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２５】
上記標的ガン細胞が、造血器腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１３ないし２４のいずれか１項に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２６】
上記造血器腫瘍細胞が、悪性リンパ腫細胞または白血病細胞であることを特徴とする請求項２５に記載のガン細胞の死滅方法。
【請求項２７】
さらに、アポトーシス誘導工程を含むことを特徴とする請求項１３ないし２６のいずれか１項に記載のガン細胞の死滅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガン治療用薬剤及びその利用方法に関するものである。より詳細には、広範な悪性リンパ腫・白血病細胞を増殖抑制または死滅させることができるガン治療用薬剤、及び当該ガン治療用薬剤を用いてガン細胞を死滅させる方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
悪性リンパ腫・白血病細胞の中には、難治性で極めて予後の悪いものから比較的予後の良いものまで様々である。現在、かかる悪性リンパ腫・白血病の治療方法としては、化学療法・放射線療法・免疫療法・骨髄移植療法、等々の治療方法を行なっているが、特に予後の悪い病型については有効な治療方法が無い。
【０００３】
ところで本発明者等は、広い範囲の悪性の造血器腫瘍においてプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１タンパク質の発現抑制が極めて高頻度で見られ、しかも悪性度の高い造血器腫瘍ほど、上記ＳＨＰ１タンパク質（以下、ＳＨＰ１タンパク質と称する）の発現抑制の傾向が強くなることを発見した。さらに、かかるＳＨＰ１タンパク質の発現抑制のメカニズムについて検討を行った結果、悪性リンパ腫や白血病患者では、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子（以下、ＳＨＰ１遺伝子と称する）のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域（高等真核生物において、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ部分）がメチル化されており、ＳＨＰ１タンパク質が発現できずに細胞増殖の制御が効かなくなるということを明らかにした。（例えば非特許文献１参照）
さらに本発明者等は、プロモーター領域がメチル化されていない正常ＳＨＰ１遺伝子を造血器腫瘍細胞株へ導入することによって、当該細胞の増殖を抑制することができることをin vitro の系において発見した（非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Oka Takashi, Ouchida Mamoru, Koyama Maho, Ogama Yoichiro, Takada Shinichi, Nakatani Yoko,  Tanaka Takehiro, Yoshino Tadashi,  Hayashi Kazuhiko, Ohara Nobuya , Kondo Eisaku, Takahashi Kiyoshi, Tsuchiyama Junjiro, Tanimoto Mitsune, Shimizu Kenji and Akagi Tadaatsu. Gene silencing of the tyrosine phosphatase SHP1 gene by aberrant in leukemias/lymphomas. Cancer Research.  62, 6390-6394 (2002)
【非特許文献２】Maho Koyama, Takashi Oka, Mamoru Ouchida, Yoko Nakatani, Ritsuo Nishiuchi, Tadashi Yoshino, Kazuhiko Hayashi, Tadaatsu Akagi, and Yoshiki Seino: “Activated Proliferation of B-cell Lymphomas/Leukemias with the SHP1 Gene Silencing by Aberrant CpG Methylation ”, LABORATORY INVESTIGATION, Vol.83. No.12, 1849-1858, (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の通り、悪性リンパ腫や白血病細胞等の造血器腫瘍へ、正常ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子（ＳＨＰ１遺伝子）を導入することによる造血器腫瘍の増殖抑制効果については、in vitro の実験において明らかとなったが、正常ＳＨＰ１タンパク質や正常ＳＨＰ１遺伝子が導入された悪性リンパ腫や白血病細胞等の造血器腫瘍が、患者体内における（in vivo ）作用・効果については全く予測できず、当該ＳＨＰ１タンパク質及びＳＨＰ１遺伝子が、ガン治療用薬剤として利用可能であるかは不明である。
【０００５】
また現行のガン治療法である化学療法・放射線療法・免疫療法・骨髄移植療法、等々の治療方法では予後の悪い病型については効果が低い場合が多い。
【０００６】
本発明は上記課題に鑑みられたものであって、その目的は、ガン細胞、特に広範な悪性リンパ腫・白血病細胞等の造血器腫瘍細胞を増殖抑制または死滅させることができるガン治療用薬剤、及び当該ガン治療用薬剤を用いてガン細胞を死滅させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。より具体的には、正常ＳＨＰ１遺伝子が導入された造血器腫瘍細胞株を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）に移植し、当該マウスにおいて腫瘍形成が全く認められないという知見を得た。さらには、正常ＳＨＰ１遺伝子が導入された造血器腫瘍細胞株は、有意にアポトーシスによる細胞死が強く誘導されることを発見した。本発明は上記検討及び新規知見により、完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明にかかるガン治療用薬剤は、少なくとも発現用プロモーターと、ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を有効成分としている。
【０００９】
ＳＨＰ１タンパク質が、標的ガン細胞において発現することによって、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができるため、有効なガン治療用薬剤となる。
【００１０】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、少なくとも発現用プロモーターと、改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を有効成分とすることが好ましい。
【００１１】
ＳＨＰ１タンパクの改変、例えば、標的タンパク質特異性を維持した形でのホスファターゼドメインの制御、特にホスファターゼ活性の抑制に関与する領域を削除、置換等の改変を行なうことによって、標的ガン細胞内において高効率なガン抑制機能を有するタンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質）を発現させることができる。よってさらに有効なガン治療用薬剤を提供することができる。
【００１２】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）に記載の遺伝子であることが好ましい。
【００１３】
（ａ）配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
【００１４】
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１５】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載の遺伝子であることが好ましい。
【００１６】
（ｃ）配列番号４または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
【００１７】
（ｄ）配列番号４または７に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００１８】
上記構成とすることによって、より効率良く、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。それゆえ、より有効なガン治療用薬剤を提供することができる。
【００１９】
本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記発現用プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターであることが好ましい。
【００２０】
上記サイトメガロウイルスプロモーターは、ヒトサイトメガロプロモーターウイルス早期プロモーター・エンハンサー領域のことであり、相対的に細胞特異性が低いこと、動物細胞において特に強いプロモーター活性を有していることより、標的ガン細胞においてＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質を含む）を高発現することが可能となる。それゆえ標的ガン細胞を増殖抑制または死滅させることができ、より有効なガン治療用薬剤を提供することができる。
【００２１】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記遺伝子構築物が、配列番号３に示される塩基配列を有することが好ましい。
【００２２】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記遺伝子構築物が、配列番号６または９に示される塩基配列を有することが好ましい。
【００２３】
上記構成とすることによって、より効率良く、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。それゆえ、より有効なガン治療用薬剤を提供することができる。
【００２４】
一方、本発明にかかるガン治療用薬剤は、ＳＨＰ１タンパク質を有効成分としてもよい。
【００２５】
また、本発明にかかるガン治療用薬剤は、改変型ＳＨＰ１タンパク質を有効成分とすることが好ましい。
【００２６】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００２７】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００２８】
また本発明にかかるガン治療用薬剤は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２または５または８に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質であることが好ましい。
【００２９】
ＳＨＰ１タンパク質または改変型ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入することによっても、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。それゆえ、より有効なガン治療用薬剤を提供することができる。
【００３０】
一方、本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、少なくとも発現用プロモーターと、ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を、標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。
【００３１】
ＳＨＰ１タンパク質が、標的ガン細胞において発現することによって、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。
【００３２】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、少なくとも発現用プロモーターと、改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物を、標的ガン細胞に導入する工程を含むことが好ましい。
【００３３】
ＳＨＰ１タンパクの改変、例えば、標的タンパク質特異性を維持した形でのホスファターゼドメインの制御、特にホスファターゼ活性の抑制に関与する領域を削除、置換等の改変を行なうことによって、標的ガン細胞内において高効率なガン抑制機能を有するタンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質）を発現させることができる。
【００３４】
また本発明にかかるガン細胞の治療方法は、上記ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｅ）または（ｆ）に記載の遺伝子であることが好ましい。
【００３５】
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
【００３６】
（ｆ）配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有する遺伝子。
【００３７】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ｇ）または（ｈ）に記載の遺伝子であることが好ましい。
【００３８】
（ｇ）配列番号４または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
【００３９】
（ｈ）配列番号４または７に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００４０】
上記構成とすることによって、より効率良く、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。
【００４１】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記発現用プロモーターが、サイトメガロウイルスプロモーターであることが好ましい。
【００４２】
上記サイトメガロウイルスプロモーターは、ヒトサイトメガロプロモーターウイルス早期プロモーター・エンハンサー領域のことであり、相対的に細胞特異性が低いこと、動物細胞において特に強いプロモーター活性を有していることより、標的ガン細胞においてＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質を含む）を高発現することが可能となる。それゆえ標的ガン細胞を増殖抑制または死滅させることができる。
【００４３】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記遺伝子構築物が、配列番号３に示される塩基配列を有することが好ましい。
【００４４】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記遺伝子構築物が、配列番号６または９に示される塩基配列を有することが好ましい。
【００４５】
上記構成とすることによって、より効率良く、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。
【００４６】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴としてもよい。
【００４７】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、改変型ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入する工程を含むことが好ましい。
【００４８】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００４９】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００５０】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記改変型ＳＨＰ１タンパク質が、配列番号２または５または８に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質であることが好ましい。
【００５１】
ＳＨＰ１タンパク質または改変型ＳＨＰ１タンパク質を標的ガン細胞に導入することによっても、標的ガン細胞の増殖抑制または死滅させることができる。
【００５２】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記標的ガン細胞が、造血器腫瘍細胞であることが好ましい。
【００５３】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記造血器腫瘍細胞が、悪性リンパ腫細胞または白血病細胞であることが好ましい。
【００５４】
ＳＨＰ１タンパク質は、特に悪性リンパ腫、白血病等の造血器腫瘍患者において発現が抑制されているタンパク質であり、また悪性リンパ腫細胞、白血病細胞等の造血器腫瘍細胞の増殖抑制効果を有している。よって、特に上記悪性リンパ腫細胞、白血病細胞等の造血器腫瘍細胞を、効率良く死滅させることができる。
【００５５】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、さらに、アポトーシス誘導工程を含むことが好ましい。ＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質を含む）が発現、または導入されたガン細胞は、アポトーシスの誘導がかかりやすくなっている。それゆえ、紫外線照射・放射線照射・薬剤処理等のアポトーシス誘導を行なうことによって、さらに効率良くガン細胞を死滅させることができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明にかかるガン治療用薬剤をガン細胞（特に悪性リンパ腫細胞や白血病細胞等の造血器腫瘍細胞）に導入することで、当該ガン細胞の腫瘍源性を有意に消失させることができる。さらには、当該ガン細胞のアポトーシスによる細胞死を有意に誘導することができる。それゆえ、ガン、特に広範な悪性リンパ腫・白血病等の造血器腫瘍に対して有効なガン治療用薬剤を提供することができるという効果を奏する。
【００５７】
また、本発明にかかるガン細胞の死滅方法によれば、ガン細胞（悪性リンパ腫細胞や白血病細胞等の造血器腫瘍細胞）を有意に死滅させることができる。それゆえ、ガン、特に広範な悪性リンパ腫・白血病等の造血器腫瘍に対して有効なガン治療方法を提供することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
（Ｉ）本発明にかかるガン治療用薬剤
本発明にかかるガン治療用薬剤は、ガン、特に悪性リンパ腫や白血病細胞等の造血器腫瘍の抑制因子であるＳＨＰ１タンパク質、または少なくとも発現用プロモーターと、当該タンパク質をコードする遺伝子（ＳＨＰ１遺伝子）とを連結してなる遺伝子構築物を有効成分として含むものであり、当該本発明にかかるガン治療用薬剤をガン細胞に導入することによって、ガン細胞の増殖を抑制または、死滅させるというものである。
【００５９】
既述のとおり、悪性リンパ腫や白血病等の造血器腫瘍患者では、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ領域（高等真核生物において、ゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ部分）がメチル化されており、ＳＨＰ１タンパク質が発現できない。それゆえガン細胞（腫瘍細胞）の増殖抑制が効かない。また健康な人の体の中では、抗体産生による体液性免疫や貪食作用のような細胞性免疫システムが絶えず働いているが、造血器腫瘍患者の場合、本来腫瘍増殖を押さえる働きを持つ免疫システムに異常を生じてしまうため、ガン細胞（腫瘍細胞）の増殖を許しやすい傾向にあると言える。
【００６０】
本発明にかかるガン治療用薬剤は、（ａ）ＳＨＰ１遺伝子を発現可能な状態で、ガン細胞に導入することによって、造血器腫瘍患者において欠如しているＳＨＰ１タンパク質をガン細胞内で発現させて補い、ガン細胞の増殖抑制または死滅させるというもの、または（ｂ）ＳＨＰ１タンパク質をガン細胞内に導入して補い、ガン細胞の増殖抑制または死滅させるというものである。
【００６１】
（Ｉ−ａ）ＳＨＰ１遺伝子を用いた本発明にかかるガン治療用薬剤
ＳＨＰ１遺伝子を本発明にかかるガン治療用薬剤として利用する場合には、導入したＳＨＰ１遺伝子がガン細胞内で発現するようにデザインされていればよく、少なくともＳＨＰ１遺伝子の発現用プロモーターとＳＨＰ１遺伝子とが連結されてなる遺伝子構築物（以下、ＳＨＰ１遺伝子構築物）である必要がある。
【００６２】
前記発現用プロモーターとしては、標的となるガン細胞内でプロモーター活性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えばサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０プロモーター、ベータアクチンプロモーター、RSVプロモーター、SRαプロモーター、Elongation Factor 1α プロモーター,CAGプロモーター、レトロウイルスLTR等が利用可能である。またプロモーターは、恒常的にプロモーター活性を有する恒常的プロモーターであっても、メタロチオネインプロモーターやMMTVプロモーターのような誘導可能な転写誘導プロモーターであってもよい。
【００６３】
一方、上記プロモーターに連結されるＳＨＰ１遺伝子は、全長のＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子、すなわち配列番号１に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子であってもよいし、また配列番号１に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、ガン抑制機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００６４】
なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃において２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行なうことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（つまり、ハイブリダイズし難くなる）。
【００６５】
また本発明にかかるガン治療用薬剤に用いるＳＨＰ１遺伝子は、全長のＳＨＰ１タンパク質をコードしている必要はなく、ＳＨＰ１タンパク質の一部をコードしている遺伝子であってもよい。また全長のＳＨＰ１タンパク質のアミノ酸配列または、一部のＳＨＰ１タンパク質のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたＳＨＰ１タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお本発明においては、全長ＳＨＰ１タンパク質の一部のタンパク質、及び全長のＳＨＰ１タンパク質のアミノ酸配列または、一部のＳＨＰ１タンパク質のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたＳＨＰ１タンパク質を総じて「改変型ＳＨＰ１タンパク質」と称する。また当該「改変型ＳＨＰ１タンパク質」をコードする遺伝子を「改変型ＳＨＰ１遺伝子」と称する。なお、上記の「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００６６】
上記改変型ＳＨＰ１遺伝子の例としては、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から数アミノ酸を欠失させたタンパク質をコードする遺伝子や、同じくＳＨＰ１タンパク質のＣ末端から数アミノ酸を欠失させたタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。上記のごとく、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から数アミノ酸をコードする遺伝子領域、及びＣ末端からアミノ酸をコードする領域には、ホスファターゼドメインの制御、特にホスファターゼ活性の抑制調節に関与する領域が含まれている。それゆえ、かかる遺伝子領域を欠失させることによって、標的ガン細胞におけるＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質）の標的タンパク質特異性は変化させずにホスファターゼ活性が高くなる。よって上記改変を行なうことは、より好ましい態様であるといえる。
【００６７】
なおＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から欠失させるアミノ酸の数は、４個以上１１０個以下が好ましい。またＳＨＰ１タンパク質のＣ末端から欠失させるアミノ酸の数は、６０個以下が好ましい。
【００６８】
上記改変型ＳＨＰ１遺伝子の具体例としては、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする改変型ＳＨＰ１遺伝子（配列番号４参照）や、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させ、さらにＳＨＰ１タンパク質のＣ末端から３２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする改変型ＳＨＰ１遺伝子（配列番号７参照）が挙げられる。
【００６９】
また上記ＳＨＰ１遺伝子構築物には、この他に任意のタンパク質をコードする遺伝子挿入用のクローニングサイト（好ましくはマルチクローニングサイト）・ベクター配列・ターミネーター・薬剤耐性マーカー・蛍光タンパク質遺伝子等のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。かかるＳＨＰ１遺伝子構築物の調製方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。
【００７０】
上記のようにして構築した本発明にかかるガン治療用薬剤の有効成分であるＳＨＰ１遺伝子構築物の一例として、ＣＭＶプロモーター  １と、ＨＡタグ  ２と、全長ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）  ３と、ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）  ４と、ＳＶ４０プロモーター  ５と、ジェネティシン／Ｇ４１８（Geneticin/G418）耐性遺伝子（neomycin resistant gene）  ６と、ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）  ７と、アンピシリン耐性遺伝子（ampicillin resistant gene）  ８とを連結して作製したｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ  １０を図１に示す。全長ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）  ３は、ＣＭＶプロモーター  １によって発現される。
【００７１】
ここで、全長ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）  ３の上流に存在するＨＡタグ  ２は、９アミノ酸からなるHemagglutininタンパク質の一部であり、免疫染色の際に抗原となったり、免疫沈降する際に用いられる。また全長ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）  ３の下流に連結されたポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）  ４は、ｍＲＮＡの安定化のために用いられている。またＳＶ４０プロモーター  ５の下流に、形質転換体の選抜に用いるジェネティシン／Ｇ４１８（Geneticin/G418）耐性遺伝子（neomycin resistant gene）  ６が連結され、さらにその下流に、ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）  ７が連結されている。なお、アンピシリン耐性遺伝子（ampicillin resistant gene）  ８は、ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ  １０を大腸菌等に形質転換する際に用いる薬剤耐性遺伝子である。ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ  １０の塩基配列を配列番号３に示す。
【００７２】
また改変型ＳＨＰ１遺伝子を用いて構築したＳＨＰ１遺伝子構築物の例としては、上述の、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする改変型ＳＨＰ１遺伝子（以下、ＳＨＰ１  Ｎ５３遺伝子；配列番号４参照）を用いて構築したｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３（配列番号６参照）や、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させ、さらにＳＨＰ１タンパク質のＣ末端から３２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質をコードする改変型ＳＨＰ１遺伝子（以下、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２遺伝子；配列番号７参照）を用いて構築したｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２（配列番号９参照）が挙げられる。
【００７３】
図５に、上記ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３、及びｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２の構築方法の概略を示す。発現ベクターｐＭＯ１４のＨＡタグ  ２の下流であって、ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）  ４の上流に、全長ＳＨＰ１遺伝子（同図中、ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ遺伝子）または、ＳＨＰ１  Ｎ５３遺伝子、またはＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２遺伝子を挿入して、ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２を構築する。構築方法は、通常の遺伝子工学的手法を用いて行なえばよい。なお、図５中、部材番号１，２，４，５，６，７，８は、図１に示すものと同様である。また図１中ＳＨ２はリン酸化チロシン結合領域（Src homology domain 2）であり、ＰＴＰはプロテインチロシンホスファターゼ領域（Protein tyrosine phosphatase domain）を示す。
【００７４】
なお上記ＳＨＰ１遺伝子を用いて構築したＳＨＰ１遺伝子構築物の標的ガン細胞への導入方法は、特に限定されるものではなく、パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクター等のウイルスベクターを用いてＳＨＰ１遺伝子構築物を構築し、遺伝子導入を行なってもよい。
【００７５】
さらには、上記の本発明にかかるガン治療用薬剤（ＳＨＰ１遺伝子構築物を有効成分とする）を用いてガン患者の治療を行なう場合は、本発明にかかるガン治療用薬剤（上記遺伝子構築物）を標的ガン細胞に直接導入する、いわゆる in vivo 法を用いることが可能である。例えば、例えばガン患者の腫瘤に注射器等でインジェクションする方法が挙げられる。
【００７６】
また上記レトロウイルスベクターを導入方法に用いる場合においては、静脈注射による方法が可能である。本発明にかかるガン治療用薬剤の有効成分である上記遺伝子構築物を、標的細胞（造血器腫瘍細胞）で特異的に機能するようにデザインしておくことで、本発明にかかるガン治療用薬剤（遺伝子構築物）が、標的の造血器腫瘍細胞で機能することとなる。なお、上記デザインの具体的手段としては、造血器腫瘍細胞もしくは造血器細胞特異的なレセプターを認識し感染するようにパッケージング細胞を調整することによって、造血器腫瘍特異的に本発明にかかるガン治療用薬剤が機能することができる。
【００７７】
また、上記の本発明にかかるガン治療用薬剤（ＳＨＰ１遺伝子構築物を有効成分とする）を用いたガン治療法としては、上記 in vivo 法のほかに、本発明にかかるガン治療用薬剤（上記遺伝子構築物）を生体外で標的細胞（造血器腫瘍である場合は悪性リンパ腫細胞、骨髄細胞等の造血器腫瘍細胞）に導入し、その後生体内に戻す、いわゆる ex vivo 法であってもよい。この場合、周りのガン治療用薬剤（上記遺伝子構築物）が導入されていない造血器腫瘍細胞もbystander effectにより増殖を抑制または、死滅することが期待される。
【００７８】
また本発明にかかるガン治療用薬剤（ＳＨＰ１遺伝子構築物を有効成分とする）の有効な投与量は、ＳＨＰ１遺伝子の形態（改変されているか否か）や、導入方法、ガン細胞の種類、ガンの進行度等によって異なるため限定されるものではないが、例えば、ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌを造血器腫瘍細胞にリポフェクション法を用いて導入する場合は、１０6細胞あたり１００ｎｇ以上１０μｇ以下の上記ＳＨＰ１遺伝子構築物を投与することが好ましい。
【００７９】
またｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３を造血器腫瘍細胞にリポフェクション法を用いて導入する場合は、１０6細胞あたり１００ｎｇ以上１０μｇ以下の上記ＳＨＰ１遺伝子構築物を投与することが好ましい。
。
【００８０】
さらには、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２を造血器腫瘍細胞にリポフェクション法を用いて導入する場合は、１０6細胞あたり１００ｎｇ以上１０μｇ以下の上記ＳＨＰ１遺伝子構築物を投与することが好ましい。
。
【００８１】
また上記レトロウイルスベクターを導入方法に用いる場合においては１０3から１０5 CFU／mlの濃度で投与することがのぞましい。CFUはColony Forming Unitである。
【００８２】
また上記アデノウイルスベクターを導入方法に用いる場合においては１０9から１０11PFUで投与することが望ましい。PFUはPlaque Forming Unitである。
【００８３】
なお、上記ＳＨＰ１遺伝子構築物を有効成分とする本発明にかかるガン治療用薬剤には、上記ＳＨＰ１遺伝子構築物の他の成分として、リン酸緩衝液が含まれていてもよい。
【００８４】
（Ｉ−ｂ）ＳＨＰ１タンパク質を用いた本発明にかかるガン治療用薬剤
本発明にかかるガン治療用薬剤のもう一つの態様は、ガン抑制因子であるＳＨＰ１タンパク質をガン細胞内に導入して補い、ガン細胞の増殖抑制または死滅させるというものである。
【００８５】
本発明にかかるガン治療用薬剤に用いるＳＨＰ１タンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する全長ＳＨＰ１タンパク質であってもよいし、既述の改変型ＳＨＰ１タンパク質であってもよい。かかる改変型ＳＨＰ１タンパク質としては、例えば、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質（以下、ＳＨＰ１  Ｎ５３タンパク質；配列番号５参照）や、ＳＨＰ１タンパク質のＮ末端から５２アミノ酸を欠失させ、さらにＳＨＰ１タンパク質のＣ末端から３２アミノ酸を欠失させた改変型ＳＨＰ１タンパク質（以下、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質；配列番号８参照）が挙げられる。
【００８６】
ＳＨＰ１タンパク質を有効成分とする本発明にかかるガン治療用薬剤を用いてガン患者の治療を行なう場合には、当該ガン治療用薬剤（ＳＨＰ１タンパク質）を標的ガン細胞に導入する。本発明にかかるガン治療用薬剤（ＳＨＰ１タンパク質）を標的ガン細胞へ導入する方法としては、公知のProtein Transduction Domainを用いたタンパク質導入法、Saint-MIX profection試薬等を用いて行なえばよい。より具体的には、５個から１１個の塩基性アミノ酸をＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質を含む）と融合させた形で作成し、細胞に投与を行なえばよい。
【００８７】
また本発明にかかるガン治療用薬剤（ＳＨＰ１タンパク質）の有効な投与量は、ＳＨＰ１タンパク質の形態（改変されているか否か）や、導入方法、ガン細胞の種類、ガンの進行度等によって異なるため限定されるものではないが、例えば、全長ＳＨＰ１タンパク質を造血器腫瘍細胞にSaint-MIX profection試薬を用いて導入する場合は、１０4細胞あたり２μｇの上記ＳＨＰ１タンパク質を投与することが好ましい。
【００８８】
また、ＳＨＰ１  Ｎ５３タンパク質を造血器腫瘍細胞にSaint-MIX profection試薬を用いて導入する場合は、１０4細胞あたり２μｇの上記ＳＨＰ１タンパク質を投与することが好ましい。
【００８９】
また、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質を造血器腫瘍細胞にSaint-MIX profection試薬を用いて導入する場合は、１０4細胞あたり２μｇの上記ＳＨＰ１タンパク質を投与することが好ましい。
【００９０】
なお、上記ＳＨＰ１タンパク質を有効成分とする本発明にかかるガン治療用薬剤には、上記ＳＨＰ１タンパク質の他の成分として、リン酸緩衝液が含まれていてもよい。
【００９１】
（ＩＩ）本発明にかかるガン細胞の死滅方法
本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、（ａ）少なくとも発現用プロモーターと、ＳＨＰ１タンパク質（または改変型ＳＨＰ１タンパク質）をコードする遺伝子とを連結してなる遺伝子構築物、（ｂ）またはＳＨＰ１タンパク質（または改変型ＳＨＰ１タンパク質）を、標的ガン細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。
【００９２】
すなわち、本発明にかかるガン細胞の死滅方法は、上記（Ｉ）の項で説示した本発明にかかるガン治療用薬剤の有効成分である（ａ）ＳＨＰ１遺伝子構築物、または（ｂ）ＳＨＰ１タンパク質（または改変型ＳＨＰ１タンパク質）を標的ガン細胞に導入する工程（以下、導入工程と称する）を含むものである。よって、ＳＨＰ１遺伝子（改変型ＳＨＰ１遺伝子）及びＳＨＰ１遺伝子構築物、並びにＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質）は、上記（Ｉ）の項で説示したものを使用すればよい。また本発明にかかるガン細胞の死滅方法には、上記（Ｉ）の項で説示した本発明にかかるガン治療用薬剤を標的ガン細胞に導入する工程を含むものであってもよい。
【００９３】
上記導入工程によって、ＳＨＰ１遺伝子（改変型ＳＨＰ１遺伝子）、またはＳＨＰ１タンパク質（改変型ＳＨＰ１タンパク質）が導入された標的ガン細胞は、後述する実施例において示すように腫瘍形成能が消失し、さらにアポトーシスの誘導がかかりやすくなっている。それゆえ、上記標的ガン細胞は、増殖が抑制されている上に、さらに自然界に存在する紫外線等の影響によってアポトーシスが起こり、結果としてガン細胞が死滅することとなる。
【００９４】
ただし本発明にかかるガン細胞の死滅方法には、上記導入工程に加えて、さらにアポトーシス誘導工程が含まれていてもよい。ここで「アポトーシス」とは、生理条件下において細胞が自ら積極的に引き起こす細胞死のことをいい、壊死（ネクローシス）とは異なる。また「アポトーシス誘導工程」とは、上記アポトーシスが起こり易くするために、カルシウム・イオノホア等の薬剤を添加したり、紫外線照射・放射線照射等を行なうことである。この他、熱、制癌剤、ある種の特異的レセプターへの刺激、細胞内カルシウム濃度の変動、増殖因子除去の刺激によってもアポトーシスを誘導することができる。上記アポトーシス導入工程を行うことで、標的ガン細胞をより効果的に死滅させることができる。
【００９５】
また本発明にかかるガン細胞の死滅方法には、上記ＳＨＰ１遺伝子構築物を構築する構築工程（構築工程）が含まれていてもよい。当該構築工程は、少なくともＳＨＰ１遺伝子（改変型ＳＨＰ１遺伝子）と発現用プロモーターとを連結する工程が含まれていればよい。またこの他、薬剤耐性遺伝子、ターミネーター、蛍光タンパク質遺伝子等のＤＮＡセグメントを挿入・連結する工程を含んでいてもよい。また市販の発現用ベクターに目的とするＳＨＰ１遺伝子（改変型ＳＨＰ１遺伝子）を挿入する工程も上記構築工程に含まれる。なお、上記構築工程における遺伝子の切断・連結・挿入等の手法は、公知の遺伝子工学的手法を適宜選択の上、用いればよい。
【００９６】
上記（ａ）ＳＨＰ１遺伝子構築物、または（ｂ）ＳＨＰ１タンパク質（または改変型ＳＨＰ１タンパク質）を標的ガン細胞に導入することで、ガン抑制遺伝子、またはガン抑制因子をガン細胞内に導入して補い、ガン細胞の増殖抑制または死滅させるというものである。これは既述のとおり、本発明者等の検討により得られた新規知見、すなわち正常ＳＨＰ１遺伝子が導入された造血器腫瘍細胞株を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）に移植すると、当該マウスにおいて腫瘍形成が全く認められないということ、さらには、正常ＳＨＰ１遺伝子が導入された造血器腫瘍細胞株は、有意にアポトーシスによる細胞死が強く誘導されるということに基づいている。
【００９７】
本発明にかかるガン細胞の死滅方法における導入工程は、（ａ）ＳＨＰ１遺伝子構築物、または（ｂ）ＳＨＰ１タンパク質（または改変型ＳＨＰ１タンパク質）が標的ガン細胞に導入することができる方法であれば特に限定されるものではなく、上記（Ｉ）の項で説示した導入方法を適宜選択の上用いればよい。
【００９８】
本発明にかかるガン細胞の死滅方法における標的ガン細胞の「ガン細胞」とは、広義に解し、悪性腫瘍細胞のみならず良性腫瘍細胞を含む意味である。また悪性腫瘍についても上皮性悪性腫瘍細胞であっても、非上皮性悪性腫瘍細胞であってもよい。ここで標的ガン細胞としては、上記ガン細胞であれば特に限定されるものではないが、広い範囲の悪性の造血器腫瘍（悪性リンパ腫、白血病細胞）においてＳＨＰ１タンパク質の発現抑制が極めて高頻度で見られるという理由から、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞等の造血器腫瘍細胞がより有効であり、好ましいといえる。
【００９９】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１００】
〔実施例１〕
本発明者等は、これまでにほとんどの造血器腫瘍において、ＳＨＰ１遺伝子は異常メチル化により発現が抑制されていること、及びin vitro の実験からＳＨＰ１遺伝子を導入した造血器腫瘍細胞の増殖能が抑制されることを明らかにしてきた。そこでＳＨＰ１遺伝子導入により、造血器腫瘍の遺伝子治療が可能か否かを検討する目的で以下の実験を行なった。
【０１０１】
（全長ＳＨＰ１遺伝子発現用ベクターｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１の構築）
全長ＳＨＰ１遺伝子を標的ガン細胞内で発現させるために用いる発現用ベクターｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１（以下、単にｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１と称する）は、以下のようにして構築した。簡単には、正常末梢血由来のｍＲＮＡを用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを作成し、ＳＨＰ１遺伝子に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行なった。このＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列を確認後、ｐＭＯ１４ＺベクターのＨＡタグ(Hemagglutinin-tag)の下流にアミノ酸のフレームが合うようにクローニングすることにより作製した。
【０１０２】
なお構築したｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１の概略図を図１に示し、その全塩基配列を配列番号３に示した。
【０１０３】
（標的ガン細胞へのＳＨＰ１遺伝子導入）
ヒト骨髄性白血病培養細胞株Ｋ５６２細胞に対して、前記で取得したｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１、及びコントロール・ベクター（すなわちＳＨＰ１遺伝子を導入していないベクター）をX-tremeGENE Q2 Transfection Reagent（Roche Diagnostics Corporation社製：登録商標）を用いて遺伝子導入した。
【０１０４】
なお、今回標的ガン細胞への遺伝子導入に用いた X-tremeGENE Q2 Transfection Reagent は、Roche Diagnostics Corporation社により開発された培養細胞への遺伝子導入試薬（Transfection Reagent）である。このX-tremeGENE Q2 Transfection Reagentは、ＨｅＬａ細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞，Ｋ５６２細胞に対して高い遺伝子導入効率を有し、かつタンパク質高発現のために至適化されデザインされた試薬である。一方、他の市販されているリポソーマル、ノンリポソーマルな遺伝子導入試薬は、幅広い細胞タイプに遺伝子を導入することが可能であるが、ヒト由来のＨｅＬａ細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞，Ｋ５６２細胞等のある種の細胞に対しては、遺伝子導入効率が低いと言われている。以下に当該X-tremeGENE Q2 Transfection Reagentを用いて、Ｋ５６２細胞にｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１を導入する方法を示す。
【０１０５】
(1)血清の入っていないＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＦＭ；Serum Free Medium）でＫ５６２細胞を１×１０5細胞／ｍｌになるように調整し、２４穴プレートに０．５ｍｌづつ分注した。
【０１０６】
(2)６８μｌのX-tremeGENE Q2 Transfection Reagentを７８２μｌのＳＦＭで希釈した。
【０１０７】
(3)３１μｇのｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１を８５０μｌのDNA dilution bufferで希釈し、室温で１０分間放置した。
【０１０８】
(4)上記(2)と(3)を混合後、１０分間放置した。
【０１０９】
(5)上記(1)の２４穴プレートに(4)の混合液を４０μｌ（６穴）、６０μｌ（６穴）、８０μｌ（６穴）、１００μｌ（６穴）を加え、３７℃のＣＯ2インキュベーターで４時間放置した。
【０１１０】
(6)その後、２０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を０．５ｍｌ加え、同様に４８時間インキュベートを行なった。
【０１１１】
(7)抗生物質Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％牛胎児血清を含む）を１ｍｌづつ加え、Ｇ４１８耐性遺伝子プラスミドが導入された細胞が増殖してくるのを待った。
【０１１２】
(8)Ｇ４１８耐性のコロニーが増えてきたら、独立したコロニーとして分離した。
【０１１３】
ここで、ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１が導入されたＫ５６２細胞のことを便宜上、「Ｋ５６２ＳＨＰ１」と称し、コントロール・ベクターが導入されたＫ５６２細胞のことを便宜上、「Ｋ５６２ＥＦ」と称する。
【０１１４】
（マウスへの移植試験）
上記で取得したＫ５６２ＳＨＰ１（１×１０7個）・Ｋ５６２ＥＦ（１×１０7個）をそれぞれ免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、４週齢、メス）の皮下に移植し、腫瘍形成能を観察した。
【０１１５】
（結果）
図２に、Ｋ５６２ＳＨＰ１またはＫ５６２ＥＦを移植後、４週間目のマウスの写真を示す。図２（ａ）は、Ｋ５６２ＥＦ（１×１０7個）をＳＣＩＤマウスの皮下に移植し腫瘍形成が観察されマウスの写真を示し、同図（ｂ）は、Ｋ５６２ＳＨＰ１（１×１０7個）をＳＣＩＤマウスの皮下に移植し腫瘍形成が観察されなかったマウスの写真を示す。同図によれば、腫瘍が形成されたマウスとされていないマウスは、目視によって判定できることがわかる。
【０１１６】
また図３に、各細胞（Ｋ５６２ＳＨＰ１またはＫ５６２ＥＦ）をＳＣＩＤマウスの皮下へ移植後に形成された腫瘍の体積（平均値、ｎ＝６）の経時変化を示す。同図の横軸は、移植後の期間（週）を示し、縦軸には平均腫瘍体積（ｍｍ3）を示す。同図によれば、Ｋ５６２ＥＦを移植したマウスの４週間後の平均腫瘍体積は、約１０００ｍｍ3であるのに対して、Ｋ５６２ＳＨＰ１を移植したマウスの平均腫瘍体積は、０ｍｍ3であった（すなわち、腫瘍形成は見られなかった）。したがってＫ５６２ＳＨＰ１を移植したマウスは、Ｋ５６２ＥＦを移植したマウスに比して、明らかに腫瘍形成（腫瘤形成）が抑制されているということがわかった。
【０１１７】
また表１に各細胞（Ｋ５６２ＳＨＰ１またはＫ５６２ＥＦ）が移植されたＳＣＩＤマウスについて腫瘍形成率を示した。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
表１によれば、Ｋ５６２ＥＦが移植されたＳＣＩＤマウスには、６６．７％（４／６）の腫瘍形成が認められた。一方Ｋ５６２ＳＨＰ１を移植したＳＣＩＤマウスには、腫瘍形成が全く認められなかった（０％：０／６）。このことは、ＳＨＰ１遺伝子の導入によりヒト骨髄性白血病細胞株の腫瘍源性が有意に消失したことを意味している。よって白血病等の造血器腫瘍に対してＳＨＰ１遺伝子（ＳＨＰ１遺伝子構築物）が、白血病等の造血器腫瘍に対して有効な新規治療薬となりうることがわかった。特に遺伝子治療においての利用が考えられる。
【０１２０】
〔実施例２〕
実施例１に示した方法と同様にして、ヒト骨髄性白血病培養細胞株Ｋ５６２細胞に全長ＳＨＰ１遺伝子発現ベクターｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１、及びコントロール・ベクターをX-tremeGENE Q2 Transfection Reagentを用いて遺伝子導入を行なった。上記で取得した各細胞にカルシウム・イオノフォアであるＡ２３１８７（和光純薬工業株式会社製）を２μＭ又は２０μＭとなるように培養液に添加し、アポトーシスの誘導について経時観察を行った。
【０１２１】
（結果）
図４にその結果を示す。同図横軸は、アポトーシス誘導後の時間（０，７，２４ｈｒ）を示し、縦軸にアポトーシス誘導率（％）を示す。また、斜線を付した棒グラフは、Ａ２３１８７を添加していない、つまりアポトーシスの誘導を行なっていない場合の結果であり、黒塗りの棒グラフはＡ２３１８７を２μＭ添加してアポトーシスの誘導を行なった場合の結果であり、白抜きの棒グラフはＡ２３１８７を２０μｍＭ添加してアポトーシスの誘導を行なった場合の結果である。
【０１２２】
図４の結果より、Ｋ５６２ＳＨＰ１（ＳＨＰ１遺伝子の発現ベクターを導入したＫ５６２細胞）は、有意にアポトーシスによる細胞死が強く誘導されることが明らかとなった。
【０１２３】
したがって、ＳＨＰ１遺伝子が導入された腫瘍細胞は、Ａ２３１８７処理によりアポトーシスによる細胞死が非常に起こりやすくなっていると考えられる。２５４ｎｍの紫外線を用いてアポトーシスを誘導しても、同様にアポトーシスによる細胞死が非常に起こりやすくなっていることが発明者らによって確認されている。この事実は、上記実施例１において、Ｋ５６２ＳＨＰ１（ＳＨＰ１遺伝子の発現ベクターを導入したＫ５６２細胞）をＳＣＩＤマウスに移植したin vivo の系において、腫瘍形成能が消失していた事実と良く対応している。よってＳＨＰ１遺伝子を標的ガン細胞に導入する治療法（ＳＨＰ１遺伝子治療法）と、他の化学療法、放射線療法などを併用することにより低濃度の抗癌剤あるいは低線量の放射線療法によって有効に腫瘍細胞を除去（死滅）することができることが期待される。
【０１２４】
〔実施例３〕
２４穴プレートのwellあたりに、Ｋ５６２細胞（１×１０7）を０.５ｍｌづつまいた。プラスミドｐＭＯ１４ベクター、ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２およびｐＥＧＦＰ（蛍光蛋白遺伝子プラスミド）それぞれ１μｇを、血清無添加培地５０μｌの入ったサンプルチューブに別々に加えた(A)。
【０１２５】
ＤＮＡ細胞導入試薬TransFectin Lipid Reagent （BioRad社製）２μｌを血清無添加培地５０μｌの入った別のサンプルチューブに加えた(B)。
【０１２６】
(A)と(B)を混合後、２０分間放置し、それぞれを細胞に添加した。
【０１２７】
６時間後にＰＢＳで細胞を洗浄し再び培地を加えて培養した。
【０１２８】
Transfection ２４時間後に、ＧＦＰ（蛍光タンパク質）がどのくらいの割合で細胞に発現しているかを観察することによりＤＮＡの導入効率を調べた。Ｋ５６２細胞の蛍光顕微鏡写真（一例）を図６に示す。
【０１２９】
図６によれば、約３０〜４０％にＤＮＡが導入されていた。
【０１３０】
次にそれぞれの細胞１×１０6を用いて各種ＳＨＰ１遺伝子（ＳＨＰ１遺伝子、ＳＨＰ１  Ｎ５３遺伝子、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２遺伝子）導入、換言すれば、各種ＳＨＰ１タンパク質（ＳＨＰ１タンパク質、ＳＨＰ１  Ｎ５３タンパク質、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質）によるアポトーシス促進効果を測定した。
【０１３１】
アポトーシス誘導刺激としては、（１）血清除去、（２）紫外線照射（２５４ｎｍ、５，０００ｍＪ／ｃｍ2）＋血清除去、を試みた。
【０１３２】
培養１０時間後に、Caspase-Glo 3/7 assay試薬（Promega社製）を用いてアポトーシス測定を行った。培養液に同量のCaspase-Glo 3/7 assay試薬を添加し１時間後に、Luminoskan プレートリーダー（Labsystems社製）を用いてアポトーシス酵素Caspaseの活性を測定した。得られた値からバックグラウンドの値を差し引き、各種ＳＨＰ１タンパク質（ＳＨＰ１タンパク質、ＳＨＰ１  Ｎ５３タンパク質、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質）のアポトーシス誘導率を計算した。図７に、（１）血清除去によるアポトーシス誘導刺激を行なった時のアポトーシス誘導率を示し、図８に（２）紫外線照射（２５４ｎｍ、５，０００ｍＪ／ｃｍ2）＋血清除去によるアポトーシス誘導刺激を行なった時のアポトーシス誘導率を示す。
【０１３３】
なお、TransFectin Lipid Reagent はバイオラッド社の新しい遺伝子導入試薬であり、幅広い細胞に対して高い導入効率と発現活性を示し、他社の製品と比較して細胞毒性を低く押さえてある試薬である。Caspase-GloTM3/7 Assayは、Promega社のカスパーゼ-3/7活性を測定するためのホモジニアスフォーマットを採用した発光検出によるアッセイシステムである。Caspase-GloTMReagentを培養液に直接加えれば、細胞溶解、カスパーゼによる基質の切断、ルシフェラーゼ存在下でのグロータイプ発光シグナルの生成が連続的に起こり、”添加-混和-測定”のシンプルな測定が行える。
（結果）
ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２遺伝子を導入、換言すれば、ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質が発現したＫ５６２細胞（図７,８中ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２で表記）は、血清除去刺激で全長ＳＨＰ１タンパク質導入（図７,８中ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１で表記）の場合に比して約３倍、紫外線照射＋血清除去刺激で約４.７倍アポトーシスを誘導しやすいことが判明した。よって、かかるアミノ酸欠質型ＳＨＰ１遺伝子；ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２遺伝子（タンパク質；ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２タンパク質）を用いると、より高い効率で腫瘍を抑制することができると言える。
【０１３４】
以上の実験事実は、ＳＨＰ１遺伝子の導入により、ヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞の腫瘍源性が有意に消失したことを意味しており、造血器腫瘍においてＳＨＰ１遺伝子が新しい重要な遺伝子治療の標的となりうることを示している。健康な人の体の中では、抗体産生による体液性免疫や貪食作用のような細胞性免疫システムが絶えず働いているが、造血器腫瘍患者の場合、本来腫瘍増殖を押さえる働きを持つ免疫システムに異常を生じてしまうため、腫瘍の増殖を許しやすい傾向にあると言える。このマウスの実験結果は、人工的な環境下で培養するin vitro の結果のみからでは必ずしも容易に類推できるものではなく、in vivoでの実験を行ってみて初めて減弱化された免疫系の監視システムの中においてSHP1遺伝子導入細胞がどの様な挙動をとるのか、また生体内の微小環境の中で遺伝子導入細胞が増殖しうるかどうかなどが明らかとなるものである。
【０１３５】
なお上記実施例では、免疫不全マウスＳＣＩＤマウスを用いて移植実験を行なった結果、ＳＨＰ１遺伝子が導入されたＫ５６２細胞は宿主に生着することができないということが示された。このことは、正常な免疫系を維持している患者のみならず、免疫力が低下している患者においてもＳＨＰ１遺伝子の導入により標的ガン細胞が、in vivoで増殖できなくなることを示す結果である。よって本発明にかかるガン治療用薬剤、及びガン細胞の死滅方法を用いることによって、実際に白血病・悪性リンパ腫等の造血器腫瘍の患者に適用可能な遺伝子治療技術を確立することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
以上のように、本発明にかかるガン治療用薬剤をガン細胞（悪性リンパ腫細胞や白血病細胞等の造血器腫瘍）に導入することで、当該ガン細胞の腫瘍源性を有意に消失させることができる。さらには、当該ガン細胞のアポトーシスによる細胞死を有意に誘導することができる。それゆえ、広範な悪性リンパ腫・白血病に対して有効なガン治療用薬剤を提供することができるという効果を奏する。
【０１３７】
また、本発明にかかるガン細胞の死滅方法によれば、ガン細胞（悪性リンパ腫細胞や白血病細胞等の造血器腫瘍細胞）を有意に死滅させることができる。それゆえ、ガン、特に広範な悪性リンパ腫・白血病等の造血器腫瘍に対して有効なガン治療方法を提供することができるという効果を奏する。
【０１３８】
したがって本発明は、製薬業をはじめとする医療産業において幅広く利用が可能である。また本発明は、ガン細胞の発生・消滅に関する基礎的研究にも大いに寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】全長ＳＨＰ１遺伝子発現用ベクターｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１の概略図である。
【図２】（ａ）は、Ｋ５６２ＥＦ（１×１０7個）をＳＣＩＤマウスの皮下に移植後、4週間目のマウスの写真図であり、（ｂ）は、Ｋ５６２ＳＨＰ１（１×１０7個）をＳＣＩＤマウスの皮下に移植後、４週間目のマウスの写真図である。
【図３】実施例１において、Ｋ５６２ＳＨＰ１またはＫ５６２ＥＦをＳＣＩＤマウスの皮下へ移植後に形成された腫瘍の体積（平均値、ｎ＝６）の経時変化を示す棒グラフである。
【図４】実施例２において、Ｋ５６２ＳＨＰ１、及びＫ５６２ＥＦのアポトーシス誘導率を検討した結果を示す棒グラフである。
【図５】ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１  ｆｕｌｌ、ｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３、及びｐＭＯ１４Ｙ−ＳＨＰ１  Ｎ５３Ｃ３２の構築方法の概略を示す図である。
【図６】細胞への遺伝子導入効率をみるために行った、ＧＦＰ蛍光タンパク質遺伝子の細胞導入結果を示す蛍光顕微鏡写真図である。
【図７】各種ＳＨＰ１遺伝子を導入したＫ２５６細胞について、血清除去によるアポトーシス誘導刺激を行なった時のアポトーシス誘導率を検討した結果を示す棒グラフである。
【図８】各種ＳＨＰ１遺伝子を導入したＫ２５６細胞について、紫外線照射（２５４ｎｍ、５，０００ｍＪ／ｃｍ2）＋血清除去によるアポトーシス誘導刺激を行なった時のアポトーシス誘導率を検討した結果を示す棒グラフである。
【符号の説明】
【０１４０】
１    ＣＭＶプロモーター
２    ＨＡタグ
３    ＳＨＰ１遺伝子（ｃＤＮＡ）
４    ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）
５    ＳＶ４０プロモーター
６    ジェネティシン／Ｇ４１８（Geneticin/G418）耐性遺伝子（neomycin resistant gene）
７    ポリＡ付加シグナル（mRNA polyadenylation signal）
８    アンピシリン耐性遺伝子（ampicillin resistant gene）
１０  ｐＭＯ１４Ｚ−ＳＨＰ１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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