(57)【要約】      （修正有）【課題】肝細胞増殖因子をコードする核酸配列の投与により、弁および植皮生着を向上させるための、方法および組成物を提供する。【解決手段】一般的に血管形成および創傷治癒を促進するための増殖因子をコードする核酸配列の使用に関する。特に、特定の組織及び細胞型に対する増殖因子として機能する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードする核酸配列を含有するベクターを投与することにより、臓器移植、筋皮弁または植皮生着を向上させる方法及び組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織の生着を向上させる方法であり、それが必要な被験者への肝細胞増殖因子をコードする核酸配列を含有するベクターを投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
上記組織が弁および植皮からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記の弁が皮膚弁、筋肉弁、筋皮弁および軟骨皮弁からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも3〜14日前に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも5〜10日前に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも7日前に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
未処理の被験体と比較して、弁または植皮の生着が少なくとも10〜30％向上する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
上記ベクターが、弁もしくは植皮の移植部位またはその近辺の筋肉内に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
上記ベクターが腹直筋に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記ベクターが配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ベクターが、pcDNA3.1(-)およびpVAX1からなる群より選択されるプラスミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記ベクターが配列番号２の配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ベクターが配列番号３の配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における臓器移植生着を向上させる方法であって、治療的に有効な量の、HGFをコードする核酸配列を含有する組成物を、それが必要な被験体へ投与することを含む上記方法。
【請求項１５】
上記組成物がさらに製薬上許容され得る賦形剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組織生着を向上させる方法であって、肝細胞増殖因子をコードする核酸配列を含有するベクターを、それが必要な被験体に投与することを含み、該ベクターの投与が血流の向上をもたらすことを特徴とする、上記方法。
【請求項１７】
上記組織が弁および植皮からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記組織が移植臓器である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、一般的に血管形成および創傷治癒を促進するための増殖因子をコードする核酸配列の使用に関する。特に、本明細書に記載するものは、肝細胞増殖因子をコードする核酸配列の投与により、弁および植皮生着を向上させる方法および組成物である。
【背景技術】
【０００２】
2. 発明の背景
肝細胞増殖因子（HGF）は、特定の組織および細胞型に対する増殖因子として機能する。HGFは初めに肝細胞の分裂促進因子として同定された。Michalopoulosら, Cancer Res., 44:4414-4419(1984)、Russelら, J. Cell. Physiol., 119:183-192(1984)、Nakamuraら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 122:1450-1459(1984)。Nakamuraら（前記）は、一部肝切除されたラットの血清からのHGFの精製を報告した。次に、HGFがラット血小板から精製された場合のHGFのサブユニット構造が決定された。Nakamuraら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6489-6493(1986)、Nakamuraら, FEBS Letters, 224:311-316(1987)。ヒトHGF（「huHGF」）もまたヒト血漿から精製されている。Gohda, J. Clin. Invest., 81:414-419(1988)。
【０００３】
ラットHGFおよびヒトHGFのアミノ酸配列の比較により、この2つの配列が高度に保存され、かつ同じ特徴的な構造特性を有することが明らかとなった。例えば、ラットHGF内の4つのクリングル領域の長さはhuHGF内のそれと正確に同じであり、そしてシステイン残基の位置は正確に同じ位置である。このことは、この2つのタンパク質の三次元構造が類似しているという指標である。Okajimaら, Eur. J. Bioch., 193:375-81(1990)、Tashiroら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3200-4(1990)。
【０００４】
さらに、いくつかの報告はHGFと分散因子（scatter factor）（SF）との間の密接した配列相同性を明らかにした。GherardiおよびStoker, Nature, 346:228(1990)、Weidnerら, J. Cell Biol., 111:2097-2108(1990)、Cofferら, Biochem J., 278:35-41(1991)。SFは、単層培養における上皮細胞コロニーの解離を誘発するポリペプチドである。Gherardiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5844-5848(1989)。実際に、現在この2つの因子が同一である（これらは構造および生物学的活性において同一である）ことを示す証拠がある。Weidnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7001-5(1991)、Bhargavaら, Cell Growth Differ. 3:11-20(1992)、Naldiniら, EMBO J., 10:2867-78(1991)、Furlongら, J. Cell Sci., 100:173-7(1991)。HGFおよびHGF変異体は、さらに米国特許第5,227,158、5,316,921および5,328,837号に記載される。
【０００５】
HGFのその受容体への結合は、HGF分子のN末端部分に位置する機能領域によって導かれると考えられている。Matsumotoら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 181:691-699(1991)、Hartmannら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89:11574-11578(1992)、Lokkerら, EMBO J., 11:2503-2510(1992)、LokkerおよびGodowski, J. Biol. Chem., 268:17145-17150(1991)。HGF受容体は通常は「c-Met」または「p190MET」と呼ばれ、かつ典型的にはその天然型において190-kDaへテロ二量体（ジスルフィド結合化50-kDaα鎖および145-kDaβ鎖）膜架橋チロシンキナーゼタンパク質を含む。Parkら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6379-6383(1987)。c-Metタンパク質はHGF結合すると、145-kDaβサブユニットのチロシン残基においてリン酸化される。
【０００６】
種々の生物学的活性がHGFおよびその受容体に関して記載されてきた。一般的には、Chanら, HEPATOCYTE GROWTH FACTOR-SCATTER FACTOR(HGF-SF)AND THE C-MET RECEPTOR, GoldbergおよびRosen編, Birkhauser Verlag-Basel(1993), pp.67-79)参照)。例えば、HGFは特定の細胞型（メラニン形成細胞、腎尿細管細胞、ケラチン生成細胞、特定の内皮細胞および上皮由来の細胞を含む）に関する分裂促進因子であることが示されてきた。Matsumotoら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:45-51(1991)、Igawaら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:831-838(1991)、Hanら, Biochem., 30:9768-9780(1991)、Rubinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:415-419(1991)。HGFはまた上皮形態形成因子（an epithelial morphogen）として記載されており（Montesanoら, Cell, 67:901-908(1991)）、従ってHGFは腫瘍浸潤において重要であると推定されてきた（Comoglio, HEPATOCYTE GROWTH FACTOR-SCATTER FACTOR(HGF-SF)AND THE C-MET RECEPTOR, GoldbergおよびRosen編, Birkhauser Verlag-Basel(1993), pp.131-165）。現在まで、弁および植皮生着を促進するためのHGF遺伝子の筋肉内送達は記載されていない。
【０００７】
皮膚弁の使用は、他の手術形式の過程のみならず再建外科において、許容性および使用を向上させてきた。しかしながら、これらの技術が少なくとも一部において手術部位における非効率的な血管形成のためである皮膚弁の生着に伴う課題によって、依然として悩まされている。実際に、いくつかのアプローチが皮膚弁生着の向上のために考慮または評価されてきた。例えば、Watersら（様々なモデルおよび種において、皮膚弁生着の増強のための医薬の5つのクラスの能力の比較解析を提供する）を参照せよ。Annals of Plastic Surgery, 23(2):117-22(1989)。にも関わらず、弁および植皮の生着を向上させる組成物および方法についての技術における必要性が依然として残っている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
従って、本発明は弁または植皮の生着を向上させるためのHGFをコードする核酸配列の使用を記載する。
【０００９】
特に、本明細書に記載するのは組織生着（弁または植皮手術後の弁または植皮の生着を含む）を向上させる方法であり、肝細胞増殖因子をコードする核酸配列を含むベクターを必要とする被験体への投与を含む。特定の実施形態において、ベクターは筋肉内に投与され、かつ弁もしくは植皮手術の少なくとも約3〜14日前、手術の少なくとも約5〜10日前または手術の少なくとも約7日前に投与される。本発明は、皮膚弁、筋肉弁、筋皮弁もしくは軟骨皮弁（cartilocutaneous flap）等の弁または植皮の生着を向上させるのに適している。弁または植皮の生着は、未処理の被験体と比較して少なくとも約10〜30％向上し得る。
【００１０】
1つの実施形態において、ベクターは配列番号１によって示されるHGF核酸配列を含む。ベクターはまた、配列番号２に示すようなpcDNA3.1(-)プラスミドまたは配列番号３に示すようなpVAX1プラスミドを含む。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は被験体における臓器移植生着を向上させる方法を開示し、HGFをコードする核酸配列を含む治療上効果的な量の組成物を必要とする被験体への投与を含む。
【００１２】
発明の詳細な説明
1. 序論
本発明者らは驚くべきことに、弁、植皮または臓器移植手術の前にHGFをコードする核酸配列で前処理した被験体における組織の生着が、対照の被験体における移植組織と比較して有意に向上することを発見した。
【００１３】
2. 定義
特に記載しない限り、「a」または「an」は1以上を指す。
本明細書で用いる用語「肝細胞増殖因子」および「HGF」は、ヒト由来の肝細胞増殖因子（「huHGF」）およびラットHGFを含むあらゆる非ヒト哺乳動物種のHGFを含む。本明細書で用いる用語「HGF」は、成熟型、プレ体、プレプロ体（pre-pro）およびプロ体型（pro forms）を含み、天然資源から精製された型および化学的に合成されたまたは組換え的に産生されたHGFを含む。
【００１４】
本明細書において、「配列同一性」はブラスト2アルゴリズムの参照により定義され、これはデフォルトパラメーターを用いてNCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）で利用できる。このアルゴリズムに関する参照は、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_referencws.html、Altschulら, J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)、GishおよびStates, Nature Genet. 3:266-272(1993)、Maddenら, Meth. Enzymol. 266:131-141(1996)、Altschulら, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)ならびにZhangおよびMadden, Genome Res. 7:649-656(1997)
で見られるものを含む。
【００１５】
用語「変化」「アミノ酸変化」「変異体」および「アミノ酸配列変異体」は、天然のヒトHGFと比較してそのアミノ酸配列が多少異なるHGF分子を指す。通常、変異体は、天然のヒトHGFと少なくとも約95％相同的または少なくとも約99％相同的な配列を含む天然のヒトHGFの領域と、少なくとも約80％、85％または90％の相同性を有する。
【００１６】
3. 肝細胞増殖因子核酸配列およびその変異体
本発明で使用するHGFをコードする核酸配列は、肝実質細胞増殖因子をコードし得る。コードされるHGFは6つのドメインを持つ構造を有し得る（フィンガー、クリングル1、クリングル2、クリングル3、クリングル4およびセリンプロテアーゼドメイン）。
【００１７】
本発明において使用に適するヒトHGF核酸配列は、本明細書の配列番号１として示す。他のヒトHGF核酸もまた本発明における使用に適しており、それらはKitamuraら, 米国特許第5,500,354号に開示される肝実質細胞増殖因子配列等である。
【００１８】
同様に非哺乳動物HGF核酸は本発明における使用に適している。例えば、ラットHGFはヒトHGFと同じ構造的特徴を共有し、かつTashiroら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87(8):3200-4(1990)およびGenBank受託番号NM_017017に記載される。
【００１９】
他の実施形態において、本発明において有用なHGFをコードする核酸は、天然の哺乳動物HGF遺伝子と少なくとも約80％配列同一性、少なくとも約85％配列同一性、少なくとも約90％配列同一性、少なくとも95％配列同一性または少なくとも99％配列同一性を有する。例えば、配列番号１と少なくとも約80％配列同一性、少なくとも約85％配列同一性、少なくとも約90％配列同一性、少なくとも約95％配列同一性または少なくとも約99％配列同一性を有する遺伝子が本発明において使用され得る。本明細書において使用する、2つの核酸分子またはタンパク質が「有意な配列同一性を共有する」と言うのは、この2つが遺伝子の全長に渡り90％以上の配列（アミノ酸または核酸）同一性を有する領域を含む場合である。
【００２０】
本発明はまた天然のHGFタンパク質の変異体であるHGFをコードする核酸配列を含む。例えば、そのようなHGF変異体は配列番号１に示される核酸配列によってコードされるタンパク質と、少なくとも約80%配列同一性または少なくとも約85％配列同一性、少なくとも約90％同一性、少なくとも95％同一性または少なくとも約99％配列同一性を有し得る。公知の遺伝子コードならびに組換えおよび合成DNA技術があれば、当業者なら容易に本明細書に記載する保存されたアミノ酸変異体をコードするDNAを構築することが可能である。適切な変異体の例示を以下に記載する。
【００２１】
HGFの断片は、6つのドメイン全て（フィンガー、クリングル1、クリングル2、クリングル3、クリングル4およびセリンプロテアーゼドメイン）より少ないHGFを構成する。HGFの変異体はHGFが反復したドメインをいくつか有し得る。断片および変異体の双方が本発明の範囲内に含まれるのは、当技術分野において公知の方法によって決定されるHGF受容体を結合するそれら個々の能力をそれらが依然として保持している場合である。
【００２２】
置換されたHGF変異体とは、対応する野生型HGF配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、かつ同じ部位の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は1つ（分子内の1アミノ酸のみが置換されている）であり得るか、または複数（2つ以上のアミノ酸が同一分子内で置換されている）であり得る。保存的置換が本発明において意図される。例えば、（a）無極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンなどであり、（b）極性の中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンなどであり、（c）正電荷（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンなどであり、かつ（d）負電荷（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸などであるが、典型的には（a）〜（d）群内においてなされる置換である。さらに、グリシンおよびプロリンは、いずれもα-ヘリックスを分断する能力があるため、互いに置換可能である。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジン等の特定のアミノ酸が、より一般的にα-ヘリックス内に見られる一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、より一般的にβ-シート内で見られる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンは、一般的にターンにおいて見られる。いくつかの好ましい置換は、以下の群の間に作製され得る：（i）SおよびT、（ii）PおよびGならびに（iii）A、V、LおよびI。
【００２３】
挿入性HGF変異体は、野生型HGF分子における特定の位置にあるアミノ酸に直接隣接して挿入された1以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に直接隣接するとは、アミノ酸のα-カルボキシまたはα-アミノ基のいずれかに結合されていることを意味する。1以上のアミノ酸の挿入であってよい。通常、挿入は1または2つの保存性アミノ酸から構成されるであろう。上記のように、挿入部位に隣接したアミノ酸と電荷および／または構造が類似したアミノ酸を保存性と定義する。或いはまた、本発明は、挿入部位に隣接したアミノ酸とは実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を包含する。
【００２４】
欠失変異体は、野生型HGF分子における1以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変異体はHGF分子の特定の領域において1または2つのアミノ酸が欠失している。そのような欠失変異体もまた本発明に包含される。
【００２５】
本発明で使用する全ての変異体はHGF活性を保持する。そのような活性は、当業者によって公知の方法に従ってアッセイすることが可能である。
【００２６】
4. 組換えベクター作出
組換えベクターの作出は当技術分野において公知の方法によるが、以下に簡単に要約した例示を示す。
概して、本発明の構築物は、オープンリーディングフレームを有するゲノミックDNAまたはDNA断片またはcDNAがいずれかの方向に挿入されているプラスミド、またはウイルスベクター等のベクターを包含する。本発明はさらにこれらのベクターを含む細胞を包含する。
【００２７】
細菌での発現
細菌での発現に有用なベクターは、機能的プロモーターにより作動しうるリーディング部分に適切な翻訳開始および終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築され得る。ベクターは1以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を保証し、かつ望ましければ宿主内での増幅を提供する複製起点を含み得る。形質転換のために適切な原核生物宿主は、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、サルモネラ菌（Salmonella typhimurium）ならびにシュードモナス、ストレプトマイセスおよびブドウ球菌属の様々な種を含むが、しかし他のものを選択して使用してもよい。1つの実施形態において、原核生物宿主は大腸菌である。
【００２８】
細菌ベクターは例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドに基づいたものであってもよい。これらのベクターは、典型的には公知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017）のエレメントを含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得る。そのような市販のベクターは例えば、pGEM 1（Promega Biotec, Madison, WI, USA)、pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（Stratagene）；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540およびpRIT5（Pharmacia）を含む。
【００２９】
これらの「基幹」部は、適切なプロモーターおよび発現させる構造配列を結合させてもよい。細菌プロモーターは、lac、T3、T7、λPRまたはPL、trpおよびaraを含む。
【００３０】
これらのベクターは、随意に組換えタンパク質産生に用いてもよい。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖の後に、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）により抑制解除／誘導してもよく、かつ細胞をさらなる期間にわたって培養してもよい。細胞は典型的には遠心分離により回収し、物理学的または化学的方法により破壊し、かつ生じた粗抽出物は組換えタンパク質のさらなる精製および単離のために保存される。
【００３１】
真核生物発現ベクター
1つの実施形態において、HGF cDNAは哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングされる。様々な哺乳動物細胞培養系を、組換えタンパク質発現のために使用することができる。哺乳動物発現系の例示は、チミジンキナーゼ陰性（TK）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性（APRT）細胞等の選択されたマウスL細胞を含む。他の例示は、サル腎臓線維芽細胞のCOS-7系（Gluzman, Cell 23:175(1981)によって記載される）ならびに適合性ベクターを発現可能な他の細胞系、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにあらゆる必然的なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終止配列および5'側非転写配列もまた含み得る。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライシング部位およびポリアデニル化部位を必要な非転写遺伝子エレメントを付与するために用いてもよい。
【００３２】
哺乳動物プロモーターは、CMV最初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、レトロウイルス由来のLTRsならびにマウスメタロチオネイン-Iプロモーターを含む。1つの実施形態において、HGF cDNAは、発現がCMVプロモーターによって駆動されるあらゆる発現ベクター内にサブクローニングされる。例示的な哺乳動物ベクターは、pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（Pharmacia）を含む。ある特定の実施形態において、哺乳動物発現ベクターはpcDNA3.1またはpVAX1である。
【００３３】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスに基づく発現系を利用してもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象のコード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば後期プロモーターおよびトリパタイト（tripartite）リーダー配列）に結合してもよい。このキメラ遺伝子は次にin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入してもよい。ウイルスゲノムの不可欠でない領域（例えば領域E1またはE3）内への挿入は、生存可能かつ感染宿主における標的タンパク質発現が可能な組換えウイルスを生じるだろう。（例えば、Loganら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659を参照）。ウイルスベクターが送達ビヒクルとして選択される場合、それは遺伝子が永続的に発現できるようにするために宿主ゲノム内に組み込むことが可能であるものでもよい。ベクターが宿主ゲノム内に組み込まれない場合、遺伝子の発現は永続的というよりむしろ一過的となり得る。
【００３４】
アデノウイルスベクター（「Ad」）は現在、in vitroおよびin vivo送達のどちらにとっても最も効果的な遺伝子移行ビヒクルの1つであるが、しかし、多くの遺伝子治療での利用への第1世代Adの使用が制限されるのは、これらのベクターによって獲得した導入遺伝子発現の一過的な性質のためである。Ad仲介遺伝子発現の持続時間ならびに「リーキーな」ウイルスタンパク質の発現および導入遺伝子送達を含むこれらのベクターの免疫原性については、いくつかの因子が寄与および調節していることが示されている。全てのウイルスタンパク質コード配列を欠失したAdベクターの開発は、潜在的により安全で、より免疫原性の低い、約37 kbまでの挿入許容量を有するベクターの可能性を提供する。このベクターは、パッケージングおよびレスキューのためのウイルス調節および構造タンパク質のトランス的な（in trans）補充が必要であり、従ってヘルパー依存的（HD）である。これはさらにParksら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13565-13570(1996)に記載されている。
【００３５】
タンパク質発現のためのレトロウイルスベクターの使用もまた当技術分野において公知である。例えば、Veresら, J. Virol., 72:1894-1901(1998)、Agarwalら, J. Virol., 72:3720-3728, (1998)、Forestellら, Gene Therapy, 4:600-610(1997)、Plavecら, Gene Therapy, 4:128-139, 1997、Forestellら, Gene Therapy, 2:723-730(1995)およびRiggら, J. Virol., 218:290-295, 1996を参照せよ。組換えレトロウイルスベクターのゲノムは、ウイルスプロモーター／エンハンサーおよび転写開始部位として働く両端の末端反復（LTR）配列ならびにビリオンパッケージングシグナルおよび選択マーカー遺伝子として働くPsi部位を含む。1つの実施形態において、本明細書に開示するHGFポリヌクレオチド配列は、レトロウイルスゲノムにおける適切なクローニングサイト内へクローニングすることができる。発現はレトロウイルスLTRの転写制御下である。組織特異性は、ウイルスゲノム（例えば、肉腫ウイルス、白血病ウイルスまたは哺乳動物腫瘍ウイルス）の起源およびウイルスのパッケージングに用いる細胞系の双方により決定される。
【００３６】
本発明において有用な組換えベクターは、外来性DNA、および標的細胞内へ導入に際したコード産物（例えばHGF）の発現に必要かつ十分な調節配列を含み得る。本発明の1つの実施形態において、ベクターは所望の産物（すなわちHGF）をコードする外来性DNA、および随意に選択マーカーをコードするDNAを、標的細胞における該外来性DNAの発現に必要な付加的な配列とともに含む。1つの特定の実施形態において、配列番号１の核酸配列およびpcDNA3.1(-)プラスミドまたはpVAX1プラスミドを含むベクターを使用する。例えば、配列番号２および３を参照せよ。なお別の実施形態において、ベクターはエンハンサーエレメントを含まない。さらに、本発明において、標的細胞における外来性DNA配列を発現するために、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルスベクター等の感染性ベクターを使用することができる。
【００３７】
本発明において、HGFをコードするベクターは、筋肉内注入または静脈内、腹腔内、経口もしくは皮下的方法または他の送達方法によって投与され得る。適切な力価は、特定のベクター選択、宿主および使用するプロモーターの強度等のいくつかの因子に依存する。
【００３８】
本発明において、HGFをコードするベクターは、臓器移植、皮膚弁または植皮手術の前に、手術の1週間前までまたはそれ以上前に（例えば筋肉内注入によって）投与される。臓器移植または弁もしくは植皮手術の少なくとも約3日、少なくとも約4日、少なくとも約5日、少なくとも約6日、少なくとも約7日、少なくとも約8日、少なくとも約9日または少なくとも約10日前での投与が、本発明において特に意図および包含される。臓器移植または弁もしくは植皮手術の約14日前までの投与もまた、本発明において意図および包含される。この文脈における用語「約」は、ある日数の1日前までを意味する。例えば、語句「少なくとも約3日」は、HGFをコードする構築物が臓器移植または弁もしくは植皮手術の前の2〜3日の間に投与されることを意味する。従って、手術のちょうど3日前の2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22または24時間前が、該用語「約」の意味に包含される。
【００３９】
HGFをコードするベクターの投与は、直接注入（すなわち弁、移植または臓器移植部位またはその近辺への）によってでもよい。1つの実施形態において、HGFをコードする構築物は、腹直筋内といった筋肉内的に投与される。
【００４０】
本明細書に記載する本発明の方法は、未処理の対照被験体と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％もしくは少なくとも約30％またはそれ以上、弁または植皮の生着を向上させる。この文脈における用語「約」は、ある割合の前後5％までの範囲を意味する。従って、語句「約10％」は5％〜15％の範囲を指すが、しかしまた特定的に10％を含む。
【００４１】
5. 製薬上許容され得る製剤
本明細書に記載されるようなHGFベクターまたはHGF核酸配列組成物は、製薬上有用な組成物を調製するために公知の方法に従って調剤することができるが、ここで、本発明の組成物またはそれらの機能性誘導体は製薬上許容され得る担体ビヒクルと共に混和剤に混合される。他のヒトタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む適切なビヒクルおよびそれらの調剤は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（第16版, Osol, A., Ed., Mack, Easton PA(1980))において記載される。効果的な投与のために適切な製薬上許容され得る組成物を作製するために、そのような組成物は効果的な量の本発明の1以上のベクターを適切な量の担体ビヒクルと共に含む。
【００４２】
本発明において使用する医薬組成物は、従来の方法において1以上の製薬上許容され得る担体または賦形剤を用いて調剤され得る。従って、本明細書に記載されるHGFベクターまたはHGF核酸配列組成物、およびそれらの生理学的に許容され得る塩および溶媒和化合物は、吸入もしくはガス注入（口もしくは鼻から）による投与、または経口、口腔内、直腸、皮下または筋肉内投与のために調剤され得る。1つの実施形態において、HGF核酸配列またはHGFベクター組成物は筋肉内投与のために調剤される。
【００４３】
経口投与用の医薬組成物は例えば、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、フィラー（例えばラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の製薬上許容され得る賦形剤とともに従来の方法によって調製される錠剤またはカプセルの形態を取り得る。錠剤は当技術分野で公知の方法によりコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップもしくは懸濁液の形態を取ってもよく、またそれらは使用前に水もしくは他の適切なビヒクルとともに構成するための乾燥産物として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えばレクチンまたはアカシア）、非水溶性ビヒクル（例えばアーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは画分化植物油）および保存料（例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）等の製薬上許容され得る添加剤とともに従来の方法により調製され得る。調製物はまた、緩衝塩、香料、着色料および甘味料を適切に含み得る。経口投与用の調製物は、活性化合物の放出が制御されるよう適切に調剤され得る。口腔内投与のために、組成物は従来の方法で調剤される錠剤またはトローチ剤の形態を取り得る。
【００４４】
吸入による投与のために、本発明で使用するHGFベクターまたはHGF核酸配列組成物は、加圧パックまたは噴霧器より供給されるエアロゾルスプレーの形態で、適切な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）を用いて都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、単位用量は一定量を送達するためのバルブの規定により決定され得る。吸入器または吹入器で使用する、例えばゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物とラクトースまたはデンプン等の適切な粉末基剤との混合粉末を含んで調剤され得る。
【００４５】
HGFベクターまたはHGF核酸配列組成物は、注射（例えばボーラス注射または継続的な注入による）による静脈内、皮下または筋肉内投与用に調剤され得る。注入用の製剤は単位用量形態中、例えばアンプルまたは多数回用量用の容器中に保存料とともに提供され得る。HGF組成物は、懸濁液、油性もしくは水溶性のビヒクル中の溶液またはエマルジョン等の形態を取ってもよく、かつ懸濁化剤、安定剤および／または分散剤等の調剤薬を含んでもよい。或いはまた、使用前に適切なビヒクル（例えば無菌的な発熱物質不含水）で構成するために、活性成分は粉末形態であり得る。
【００４６】
化合物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の従来の坐薬基剤を含む坐薬または貯留浣腸等の直腸用組成物中にも調剤され得る。
【００４７】
上述の調剤に加え、HGFベクターまたはHGF核酸配列組成物はまた、デポー製剤として調剤され得る。そのような長時間作用性の製剤は（例えば皮下もしくは筋肉内への）移植または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば化合物は、適切な重合体もしくは疎水性物質（例えば適切な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂とともに、或いは難溶解性誘導体として（例えば難溶解性塩として）調剤され得る。
【００４８】
必要に応じて、組成物は活性成分を含有する1以上の単位用量の剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れて提供され得る。パックは例えばブリスターパック等の金属箔またはプラスチック箔を含み得る。パックまたはディスペンサー装置には投与のための説明書が添付され得る。
【００４９】
本発明は、HGF核酸配列を使用した臓器移植、弁および植皮生着を向上させるための治療を記載する。特に、HGFをコードする核酸配列は、臓器移植、弁または植皮手術の前に投与され得る。本発明はあらゆるタイプの臓器移植、弁または植皮手術において有用である。例えば、本発明は、幅広い種類の臓器の移植との組み合わせに有用であり、それらは皮膚、腎臓、心臓、肝臓、脾臓、骨髄、膵臓、肺およびランゲルハンス島を含む。皮膚の欠損、筋肉の欠損、皮下組織の欠損および骨の欠損を処置するのに使用され得る多くの異なる種類の弁がある。例えば、HGF法および本発明の組成物は、皮膚弁、筋肉弁、筋皮弁または軟骨皮弁手術（の前も含む）と併用され得る。同様に、HGF法および本発明の組成物は、植皮手術（の前も含む）と併用され得る。
【００５０】
本発明の治療方法は、本明細書に記載する治療的に有効な量のHGFベクターまたはHGF核酸配列組成物を、治療が必要な被験体へ投与することを包含する。本明細書で使用する「治療的に有効な」は、血管形成の促進および創傷治癒の促進に十分な量のHGF組成物の量を表す。特に、臓器移植、筋皮弁または植皮生着を向上させるHGF組成物の治療的に有効な量を投与することが好ましい。いくつかの方法は公知の薬剤或いは治療法（これらもまた血管形成または臓器もしくは弁生着を促進する）との混合療法を包含する。
【００５１】
本発明の大半において使用するHGF組成物の治療的に有効な量は、特定の患者の特性、投与経路および治療すべき疾患の性質（臓器移植の種類、サイズ、位置および対象の弁または植皮の厚さ等）に依存するだろう。一般的な手引きは、例えばInternational Conference on Harmonisationの刊行物ならびにREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 27および28章, pp. 484-528（Mack Publishing Company 1990)において見ることができる。さらに、治療的に有効な量は毒性および薬剤の有効性等の因子に依存し得る。毒性は当技術分野で公知の方法および前述の引用文献に見られる方法を用いて決定され得る。有効性は以下の実施例に記載する方法と組み合わせた同様の手引きを利用して決定され得る。従って、薬剤的に有効な量は、毒物学的に耐性であり、さらに有効であると臨床家によって判断される量である。例えば、有効性は壊死の減少或いは血管形成、或いは臓器移植または弁もしくは移植片生着の向上によって評価することができる。前述の引用文献で示されるように、治療的に有効な量の決定は、本開示によって指導するように、当業者によって決定され得る。
【００５２】
1つの実施形態において、治療的に有効な量は治療当たり約0.1〜約50mg、例えば、治療当たり約0.5〜約25mgおよび治療当たり約1〜10mgである。特定の実施形態において、1回の治療の一環としてプラスミドはいくつかの注射で体の同じ場所に投与される。
【００５３】
患者はヒトもしくは非ヒト哺乳動物または別の動物であり得る。患者は典型的には弁または植皮手術を受けると予定される場合に治療が必要となるであろう。
【００５４】
本発明はさらに例証のためだけに提供される以下の実施例に対する引用文献によって記載される。本発明は実施例に限定されることなく、むしろ本明細書に提供される技術から明白な全てのバリエーションを含む。
【実施例】
【００５５】
実施例1.  プラスミド構築物
ヒトHGFはpcDNA3.1(-)（Invitrogen）内のNotI部位にサブクローニングし、これはCMVプロモーターの制御下でヒトHGFタンパク質を産生する。例えば配列番号２を参照せよ。HGF遺伝子プラスミド濃縮物は通常の生理食塩水溶液（NSS）で再構築して1μg/μlの濃度を得る。
【００５６】
実施例2.  HGF核酸配列は弁生着を向上させる
本実験は、the Institute of Animal and Experimental Sciences, Osaka Universityの動物実験室によって定められた指針に従って行う。24匹のオスのSD（Sprague-Dawley）ラット（体重300〜350グラム）を用い、かつ3つの群に等分する（N=8）。動物をペントバルビタールの腹腔内注射（2mg/100ｇ）で麻酔する。第1群は250μlのNSSを左腹直筋に注射し、一方、250μg（1μg/μl）の空プラスミド（pcDNA3.1(-)）および250μg（1μg/μl）のプラスミドを含むHGF遺伝子を、第2群および第3群における同じ部位に各々注射する。7日後、4.5cm×9cmに計測した模擬の横型腹直筋皮（TRAM）弁を取り上げる。キャリアーとして左腹直筋（left rectus abdominus muscle）を基礎としたTRAM弁および血管椎弓根としての上腹部血管を腹部の下半分に策定する。弁を本来の位置に縫合し、かつ感染、壊死および弁生着について1週間に渡りモニターする。全ての動物は腹腔内へペントバルビタールを過剰投与することにより屠殺される。透明な計量テンプレート（transparent metric template）を用いて、壊死および弁生着範囲において直接的な計測がなされる。
【００５７】
データは、手術後1週間の弁生着に関して以下に示す。
【表１】
2005314404.tif 000002
【００５８】
HGFをコードする遺伝子でTRAM弁を前処理することの優位性もまた図2に例証される。図2は、弁手術の少なくとも7日前にHGFをコードする遺伝子を受けた動物（「H」動物と命名する；n=8）における手術後1週間の弁生着が、対照動物（「C」動物と命名；n=8）および空ベクターで処理した動物（「V」動物と命名；n=8）と比較して著しく向上することを示す（文字「H」、「C」または「V」の後の番号は動物番号を表す）。
【００５９】
別の実験において、20匹のSDラットを無作為に5つの群に、群当たり4匹入れ、かつ125μg、250μgまたは500μgのHGFをコードするプラスミド、NSSまたは空ベクターを（TRAM弁部位であろう）左腹直筋内に直接注射した。注入の1週間後に、血流速度および毛細管密度との関係を測定するレーザーカラードップラー（Laser Doppler Imager, Moor Instrument）によって皮膚血流測定を行った。結果は、HGF処理群の処理範囲における血流は、NSSまたは空ベクターを与えた群と比較してより高いことを示した（図3および表2）。
【表２】
2005314404.tif 000003
【００６０】
図3はレーザードップラーのレーザー画像を定量的に変換し、y軸が血流量、およびx軸が各実験群、すなわちNSS、空ベクター、H1（125μg HGF）、H2（250μg HGF）またはH3（500μg HGF）動物であるヒストグラムを作出することにより作成した。血管を可視化し、かつ血流を測定するためのレーザードップラーの使用は、Wongら, Gastrointest. Endosc., 55(1):88-95（2002）に記載される。
【００６１】
さらなる実施形態が本発明の範囲に入れられる。例えば、本発明はさらに以下の番号の実施形態で示される：
【００６２】
１．組織生着を向上させる方法であり、弁または植皮手術後の弁または植皮の生着を含み、それが必要な被験体への肝細胞増殖因子をコードする核酸配列を含有するベクターの投与を含む上記方法。
２．上記の弁が皮膚弁、筋肉弁、筋皮弁および軟骨皮弁からなる群より選択される、実施形態１に記載の方法。
３．上記ベクターが筋肉内に投与される、実施形態１に記載の方法。
４．HGFをコードする上記核酸が配列番号１で表される、実施形態１に記載の方法。
５．上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも3〜14日前に投与される、実施形態４に記載の方法。
６．上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも5〜10日前に投与される、実施形態４に記載の方法。
７．上記ベクターが、弁または植皮手術の少なくとも7日前に投与される、実施形態４に記載の方法。
８．上記ベクターが、pcDNA3.1(-)およびpVAX1からなる群より選択されるプラスミドである、実施形態５に記載の方法。
９．上記ベクターが配列番号２の配列を含む、実施形態５に記載の方法。
１０．上記ベクターが配列番号３の配列を含む、実施形態５に記載の方法。
１１．未処理の被験体と比較して、弁または植皮の生着が少なくとも10〜30％向上する、実施形態１に記載の方法。
１２．被験体における臓器移植生着を向上させる方法であって、HGFをコードする核酸を含有する治療的に有効な量の組成物をそれが必要な被験体へ投与することを含む上記方法。
１３．上記ベクターが腹直筋内に投与される、実施形態３に記載の方法。
１４．弁または植皮手術後の弁または植皮の生着を含む、組織生着を向上させる方法であって、肝細胞増殖因子をコードする核酸配列を含有するベクターを、それが必要な被験体に投与することを含み、ここで該ベクターの投与が血流の向上をもたらす上記方法。
【００６３】
前述が特定の好ましい実施形態に言及するにも関わらず、本発明がそれ程限定されないことが理解されるであろう。様々な改変が本明細書に開示される実施形態においてなされ得、かつその様な改変は本発明の範囲内であることが意図されることに、当業者は気付くであろう。出版物、特許出願および本明細書で引用される特許の全ては、参照により本明細書にその全体を組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図1は、通常の生理食塩水溶液、空ベクターまたはHGFをコードする核酸配列を含むベクターによる前処理をした後の、哺乳動物モデルにおける筋肉弁生着を比較する。
【図２】図2は、手術の7日前に（A）通常の生理食塩、（B）空ベクターまたは（C）HGFをコードする核酸配列を含むベクターによる前処理をした、ラットにおける横型腹直筋皮（TRAM）弁の生着（手術後1週間）を示す（各々の群についてN＝8）。
【図３】図3は、通常の生理食塩水（NSS）、空ベクターまたはHGFをコードする核酸配列を含むベクターを与えた哺乳動物における、注入の1週間後の平均血流率（mean percentage blood flow）を示すヒストグラムである。群H1、H2およびH3は各々125μg、250μgおよび500μgのHGFで処理した実験群を示す。
【図１】
2005314404.tif 000004
【図２】
2005314404.tif 000005
【図３】
2005314404.tif 000006
【配列表】
2005314404000001.app
【外国語明細書】
1. Field of the Invention 
This invention generally relates to the use of nucleic acid sequences encoding growth factors to promote angiogenesis and wound healing.  In particular, described herein are methods and compositions for enhancing flap and skin graft survival by administering a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor.
2. Background of the Invention 
Hepatocyte growth factor (HGF) functions as a growth factor for particular tissues and cell types.  HGF was initially identified as a mitogen for hepatocytes.  Michalopoulos et al., Cancer Res., 44:4414-4419 (1984); Russel et al., J. Cell. Physiol., 119:183-192 (1984); Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 122:1450-1459 (1984).  Nakamura et al. (supra), reported the purification of HGF from the serum of partially hepatectomized rats.  Subsequently, the subunit structure of HGF was determined when HGF was purified from rat platelets.  Nakamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6489-6493 (1986); Nakamura et al., FEBS Letters, 224:311-316 (1987).  Human HGF ("huHGF") has also been purified from human plasma.  Gohda et al., J. Clin. Invest., 81:414-419 (1988).
Comparisons of the amino acid sequence of rat HGF and huHGF revealed that the two sequences are highly conserved and have the same characteristic structural features.  For example, the length of the four kringle domains in rat HGF is exactly the same as in huHGF, and the location of cysteine residues are in exactly the same positions.  This is an indication that the three-dimensional structure of the two proteins is similar.  Okajima et al. Eur. J. Bioch., 193:375-81 (1990); Tashiro et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:3200-4 (1990).
Furthermore, several reports revealed close sequence homology between HGF and scatter factor (SF).  Gherardi and Stoker, Nature, 346:228 (1990); Weidner et al., J. Cell Biol., 111:2097-2108 (1990); Coffer et al., Biochem J., 278:35-41 (1991).  SF is a polypeptide that stimulates dissociation of epithelial cell colonies in monolayer culture.  Gherardi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5844-5848 (1989).  In fact, there now is evidence indicating that the two factors are identical; they are identical in structure and biological activity.  Weidner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7001-5 (1991); Bhargava et al., Cell Growth Differ. 3:11-20 (1992); Naldini et al., EMBO J., 10:2867-78 (1991); Furlong et al., J. Cell Sci., 100:173-7 (1991).  HGF and HGF variants are described further in U.S. Pat. Nos. 5,227,158, 5,316,921, and 5,328,837.
Binding of HGF to its receptor is believed to be conveyed by a functional domain located in the N-terminal portion of the HGF molecule.  Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181:691-699 (1991); Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89:11574-11578 (1992); Lokker et al., EMBO J., 11:2503-2510 (1992); Lokker and Godowski, J. Biol. Chem., 268:17145-17150 (1991).  The HGF receptor is usually referred to as "c-Met" or "p190MET " and typically comprises, in its native form, a 190-kDa heterodimeric (a disulfide-linked 50-kDa α-chain and a 145-kDa β-chain) membrane-spanning tyrosine kinase protein.  Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6379-6383 (1987).  The c-Met protein becomes phosphorylated on tyrosine residues of the 145-kDa β-subunit upon HGF binding. 
Various biological activities have been described for HGF and its receptor.  See, generally, Chan et al., HEPATOCYTE GROWTH FACTOR-SCATTER FACTOR (HGF-SF) AND THE C-MET RECEPTOR, Goldberg and Rosen, eds., Birkhauser Verlag-Basel (1993), pp. 67-79).  For example, HGF has been shown to be a mitogen for certain cell types, including melanocytes, renal tubular cells, keratinocytes, certain endothelial cells and cells of epithelial origin.  Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:45-51 (1991); Igawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174:831-838 (1991); Han et al., Biochem., 30:9768-9780 (1991); Rubin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:415-419 (1991).  HGF has also been described as an epithelial morphogen, Montesano et al., Cell, 67:901-908 (1991), and therefore, HGF has been postulated to be important in tumor invasion, Comoglio, HEPATOCYTE GROWTH FACTOR-SCATTER FACTOR (HGF-SF) AND THE C-MET RECEPTOR, Goldberg and Rosen, eds., Birkhauser Verlag-Basel (1993), pp. 131-165.  Until now, the intramuscular delivery of an HGF gene to promote flap and skin graft survival has not been described.
The use of skin flaps has gained increased acceptance and use in the course of reconstructive surgery, as well as in other forms of surgery.  However, these techniques continue to be plagued by problems having to do with survival of the skin flaps which is, at least in part, due to the inefficient revascularization at the surgical site.  Indeed, a number of approaches have been considered or evaluated for improving skin flap survival.  See, for example, Waters et al., which provides a comparative analysis of the ability of five classes of pharmacological agents to augment skin flap survival in various models and species.  Annals of Plastic Surgery, 23(2):117-22 (1989).  Nevertheless, there still remains a need in the art for compositions and methods for enhancing survival of flap and skin grafts.
SUMMARY OF THE INVENTION
Therefore, the present invention describes the use of  a nucleic acid sequence encoding HGF to enhance the survival of a flap or a skin graft.  
In particular, described herein is a method for enhancing tissue survival, including survival of a flap or a skin graft following flap or skin graft surgery, comprising administering to a subject in need thereof a vector that comprises a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor.  In specific embodiments, the vector is administered intramuscularly and is administered at least about 3-14 days prior to flap or skin graft surgery, at least about 5-10 days prior to surgery, or at least about 7 days prior to surgery.  The instant invention is suitable for enhancing the survival of a flap, such as a skin flap, a muscle flap, a myocutaneous flap, or a cartilocutaneous flap, or a skin graft.  Survival of the flap or skin graft may be enhanced by at least about 10-30% as compared to an untreated subject.
In one embodiment, the vector comprises the HGF nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO. 1.  The vector also may comprise the pcDNA3.1(-) plasmid, as set forth in SEQ ID NO. 2 or the pVAX1 plasmid, as set forth in SEQ ID NO. 3.
In another embodiment, the present invention discloses a method for enhancing organ transplant survival in a subject comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a composition that comprises a nucleic acid sequence encoding HGF.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1 compares musculocutaneous flap survival in an animal model after pre-treatment with normal saline solution, an empty vector, or a vector comprising a nucleic acid sequence encoding HGF.
Figure 2 depicts the survival (1 week after surgery) of a transverse rectus abdominis musculocutaneous (TRAM) flap in rats pre-treated 7 days prior to the surgery with (A) normal saline, (B) empty vector or (C) vector comprising a nucleic acid sequence encoding HGF.  (N=8 for each group).
Figure 3 is a histogram representing mean percentage blood flow in animals given normal saline solution (NSS), empty vector, or a vector comprising a nucleic acid sequence encoding HGF one week post-injection.  Groups H1, H2 and H3 represent the experimental groups treated with 125 μg, 250 μg, and 500 μg HGF, respectively.  
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
1. Introduction
The inventors have surprisingly discovered that pre-treating subjects with a nucleic acid sequence encoding HGF prior to flap, skin graft or organ transplant surgery significantly enhances survival of the tissue as compared to transplanted tissue in control subjects.
2. Definitions 
Unless otherwise specified, “a” or “an” means one or more.
The terms "hepatocyte growth factor" and "HGF" as used herein include hepatocyte growth factor from humans ("huHGF") and any non-human mammalian species of HGF, including rat HGF.  The term “HGF” as used herein includes mature, pre, pre-pro, and pro forms, including forms purified from a natural source, and chemically synthesized or recombinantly produced HGF.  
"Sequence identity" is defined herein with reference the Blast 2 algorithm, which is available at the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), using default parameters.  References pertaining to this algorithm include those found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_references.html; Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Gish & States, Nature Genet. 3: 266-272  (1993); Madden et al., Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996);  Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997), and Zhang & Madden, Genome Res. 7: 649-656 (1997).  
The terms "alteration," "amino acid alteration," "variant," and "amino acid sequence variant" refer to HGF molecules with some differences in their amino acid sequences as compared to a native human HGF.  Ordinarily, the variants will possess at least about 80%, 85%, or 90% homology with the domains of native human HGF, including sequences at least about 95% homologous or at least about 99% homologous to native human HGF.
3. Hepatocyte Growth Factor Nucleic Acid Sequence and Variants Thereof 
The nucleic acid sequences encoding HGF for use in the present invention may encode a hepatic parenchymal cell growth factor.  The encoded HGF may have a structure with six domains (finger, Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3, Kringle 4 and serine protease domains).  
One human HGF nucleic acid sequence suitable for use in the present invention is represented as SEQ ID NO:1 herein.  Other human HGF nucleic acids also are suitable for use in the present invention, such as the hepatic parenchymal cell growth factor sequence disclosed in Kitamura et al., US Patent No. 5,500,354.  
Likewise, non-mammalian HGF nucleic acids are suitable for use in the present invention.  Rat HGF, for example, shares the same structural features as human HGF and is described in Tashiro et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 87(8):3200-4 (1990) and GenBank Accession No. NM_017017.
In other embodiments, the nucleic acid encoding HGF useful in the present invention has at least about 80% sequence identity, at least about 85% sequence identity, at least about 90% sequence identity, at least about 95% sequence identity, or at least 99% sequence identity with a native mammalian HGF gene.  For example, genes having at least about 80% sequence identity, at least about 85% sequence identity, at least about 90% sequence identity, at least about 95% sequence identity, or at least about 99% sequence identity to SEQ ID NO:1 can be used in the present invention.  As used herein, two nucleic acid molecules or proteins are said to "share significant sequence identity" if the two contain regions which possess greater than 90% sequence (amino acid or nucleic acid) identity over the entire length of the gene.
The invention also includes nucleic acid sequences that encode HGF proteins that are variants of a native HGF protein.  For example, such HGF variants may have at least about 80% sequence identity, at least about 85% sequence identity, at least about 90% identity, at least 95% identity, or at least about 99% sequence identity to the protein encoded by the nucleic acid sequence represented in SEQ ID NO. 1.  Given the known genetic code, and recombinant and synthetic DNA techniques, the skilled scientist readily can construct DNAs encoding the conservative amino acid variants described herein.  Examples of suitable variants are described below.
Fragments of HGF constitute HGF with fewer than all six domains (finger, Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3, Kringle 4 and serine protease domains).  Variants of HGF may have some of the domains of HGF repeated.  Both fragments and variants are included within the scope of the invention if they still retain their respective ability to bind a HGF receptor, as determined by means known in the art.  
Substituted HGF variants are those that have at least one amino acid residue in the corresponding wild-type HGF sequence removed and a different amino acid inserted in its place at the same position.  The substitutions may be single, where only one amino acid in the molecule has been substituted, or they may be multiple, where two or more amino acids have been substituted in the same molecule.   Conservative substitutions are contemplated in the present invention.  For example, (a) nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, and methionine; (b) polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine; (c) positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine; and (d) negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid, and substitutions typically may be made within groups (a)-(d).  In addition, glycine and proline may be substituted for one another based on their ability to disrupt α-helices.  Similarly, certain amino acids, such as alanine, cysteine, leucine, methionine, glutamic acid, glutamine, histidine and lysine are more commonly found in α-helices, while valine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan and threonine are more commonly found in β-pleated sheets.  Glycine, serine, aspartic acid, asparagine, and proline are commonly found in turns.  Some preferred substitutions may be made among the following groups: (i) S and T; (ii) P and G; and (iii) A, V, L and I.  
Insertional HGF variants are those with one or more amino acids inserted immediately adjacent to an amino acid at a particular position in the wild-type HGF molecule.  Immediately adjacent to an amino acid means connected to either the α-carboxy or α-amino functional group of the amino acid.  The insertion may be of one or more amino acids.  Ordinarily, the insertion will consist of one or two conservative amino acids.  As stated above, amino acids similar in charge and/or structure to the amino acids adjacent to the site of insertion are defined as conservative.  Alternatively, this invention includes insertion of an amino acid with a charge and/or structure that is substantially different from the amino acids adjacent to the site of insertion. 
Deletional variants are those with one or more amino acids in the wild-type HGF molecule removed.  Ordinarily, deletional variants will have one or two amino acids deleted in a particular region of the HGF molecule.  Such deletional variants are also contemplated in the present invention.
All variants suitable for use in the present invention retain HGF activity.  Such activity can be assayed by one of skill in the art according to known methods.  
4. Recombinant Vector Production
Recombinant vector production is well known in the art and is outlined in a brief exemplary fashion below.  
Generally speaking, the constructs of the present invention comprise a vector, such as a plasmid or viral vector, into which a genomic DNA or DNA fragment or cDNA bearing an open reading frame is inserted, in either orientation.  The invention further contemplates cells containing these vectors.   
Bacterial Expression
Useful vectors for bacterial expression may be constructed by inserting a structural DNA sequence encoding a desired protein, together with suitable translation initiation and termination signals in operable reading phase with a functional promoter.  The vector may comprise one or more phenotypic selectable markers and an origin of replication to ensure maintenance of the vector and, if desirable, to provide amplification within the host.  Suitable prokaryotic hosts for transformation include E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium and various species within the genera Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus, although others may also be employed as a matter of choice.  In one embodiment, the prokaryotic host is E. coli.
Bacterial vectors may be, for example, bacteriophage-, plasmid- or cosmid-based.  These vectors can comprise a selectable marker and bacterial origin of replication derived from commercially available plasmids typically containing elements of the well known cloning vector pBR322 (ATCC 37017).  Such commercial vectors include, for example, pGEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA), pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pKK232-8, pDR540, and pRIT5 (Pharmacia).  
These "backbone" sections may be combined with an appropriate promoter and the structural sequence to be expressed.  Bacterial promoters include lac, T3, T7, lambda PR or PL, trp, and ara.  
These vectors optionally may be used for recombinant protein production.  Following transformation of a suitable host strain and growth of the host strain to an appropriate cell density, the selected promoter may be derepressed/induced by appropriate means (e.g., temperature shift or chemical induction) and cells may be cultured for an additional period.  Cells are typically harvested by centrifugation, disrupted by physical or chemical means, and the resulting crude extract retained for further purification and isolation of the recombinant protein.
Eukaryotic Expression Vectors
In one embodiment, HGF cDNA is subcloned into a mammalian expression vector.  Various mammalian cell culture systems can be employed to express recombinant protein.  Examples of mammalian expression systems include selected mouse L cells, such as thymidine kinase-negative (TK) and adenine phosphoribosyl transferase-negative (APRT) cells.  Other examples include the COS-7 lines of monkey kidney fibroblasts, described by Gluzman, Cell 23: 175 (1981), and other cell lines capable of expressing a compatible vector, for example, the C127, 3T3, CHO, HeLa and BHK cell lines.  Mammalian expression vectors may comprise an origin of replication, a suitable promoter and enhancer, and also any necessary ribosome binding sites, polyadenylation site, splice donor and acceptor sites, transcriptional termination sequences, and 5' flanking non-transcribed sequences.  DNA sequences derived from the SV40 viral genome, for example, SV40 origin, early promoter, enhancer, splice, and polyadenylation sites may be used to provide the required non-transcribed genetic elements.
Mammalian promoters include CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, LTRs from retrovirus, and mouse metallothionein-I.  In one embodiment, the HGF cDNA is subcloned into any expression vector in which the expression is driven by a CMV promoter. Exemplary mammalian vectors include pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL (Pharmacia).  In one specific embodiment, the mammalian expression vector is pcDNA3.1 or pVAX1.  pcDNA3.1 (Invitrogen) or pVAX1 (Invitrogen).  pVAX1 is a 3.0 kb plasmid vector designed for use in the development of DNA vaccines.  HGF cDNA can be inserted, for example, into a multiple cloning site of the pVAX1 vector.  pcDNA3.1(-) has the same multiple cloning site as pcDNA3.1(+) but in a reverse orientation.  
In mammalian host cells, a number of viral-based expression systems may be utilized.  In cases where an adenovirus is used as an expression vector, the coding sequence of interest may be ligated to an adenovirus transcription/translation control complex, e.g., the late promoter and tripartite leader sequence.  This chimeric gene may then be inserted in the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination.  Insertion in a non-essential region of the viral genome (e.g., region E1 or E3) will result in a recombinant virus that is viable and capable of expressing a target protein in infected hosts.  (See, e.g., Logan et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659).  If a viral vector is chosen as the delivery vehicle it may be one which is capable of integrating into the host genome so that the gene can be expressed permanently.  In cases where the vector does not integrate into the host genome, the expression of the gene may be transient rather than permanent.  
Adenoviral  vectors (“Ad”) are currently among the most efficient gene transfer vehicles for both in vitro and in vivo delivery, but the utilization of a first generation Ad for many gene therapy applications is limited due to the transient nature of transgene expression obtained by these vectors.  Several factors have been shown to contribute to and modulate the duration of Ad-mediated gene expression as well as the immunogenicity of these vectors, including "leaky" viral protein expression and the transgene delivered.  The development of Ad vectors, deleted in all viral protein coding sequences offers the prospects of a potentially safer, less immunogenic vector with an insert capacity of up to approximately 37 kb.  This vector requires supplementation of viral regulatory and structural proteins in trans for packaging and rescue and is therefore helper dependent (HD).  This is further described in Parks et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 93:13565-13570 (1996).
Use of retroviral vectors for protein expression are also known in the art.  See, for example, Veres, et al., J. Virol., 72:1894-1901 (1998); Agarwal et al., J. Virol., 72:3720-3728 (1998); Forestell et al., Gene Therapy, 4:600-610 (1997); Plavec et al., Gene Therapy, 4:128-139, 1997; Forestell et al., Gene Therapy, 2:723-730 (1995); and Rigg et al., J. Virol., 218:290-295, 1996.  The genome of a recombinant retroviral vector is comprised of long terminal repeat (LTR) sequences at both ends which serve as a viral promoter/enhancer and a transcription initiation site, and a Psi site which serves as a virion packaging signal and a selectable marker gene.  In one embodiment, the HGF polynucleotide sequences disclosed herein can be cloned into a suitable cloning site in the retroviral genome.  Expression is under the transcriptional control of the retroviral LTR.  Tissue selectivity is determined by both the origin of the viral genome (e.g., sarcoma virus, leukemia virus, or mammary tumor virus) and the cell line used to package the virus.
The recombinant vector useful in the present invention may include the exogenous DNA and regulatory sequences necessary and sufficient for expression of the encoded product (e.g., HGF) upon entry into the target cell.  In one embodiment of the present invention, the vector includes exogenous DNA encoding the desired product (i.e., HGF), and, optionally, DNA encoding a selectable marker, along with additional sequences necessary for expression of the exogenous DNA in a target cell.  In one specific embodiment, the vector comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO. 1 and a pcDNA3.1(-) plasmid or a pVAX1 plasmid is used.  See, e.g., SEQ ID NOs. 2 and 3.  In yet another embodiment, the vector does not comprise an enhancer element.  Additionally, infectious vectors can be used in the present invention, such as adenoviral, retroviral, and adenovirus-associated viral vectors, to express the exogenous DNA sequence in a target cell. 
In accordance with the invention, a vector encoding HGF may be administered by intramuscular injection, or by intravenous, intraperitoneal, oral or subcutaneous means, or by other means of delivery.  Suitable titers will depend on a number of factors, such as the particular vector chosen, the host, and the strength of promoter used.
In accordance with the invention, the vector encoding HGF is administered (for example, by intramuscular injection) prior to organ transplant, skin flap or skin graft surgery, up to a week or more prior to surgery.  Administration at least about 3 days, at least about 4 days, at least about 5 days, at least about 6 days, at least about 7 days, at least about 8 days, at least about 9 days, or at least about 10 days  prior to organ transplant or flap or skin graft surgery is expressly contemplated and included within the invention.  Administration up to about 14 days prior to organ transplant or flap or skin graft surgery is also contemplated and included within the invention.  The term “about” in this context connotes up to one day before the specified number of days.  For example, the phrase “at least about 3 days” means that the construct encoding HGF is administered between 2-3 days prior to organ transplant or flap or skin graft surgery.  Thus, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24 hours prior to precisely 3 days before the surgery is within the meaning of the term “about.”  
Administration of the vector encoding HGF may be by direct injection, i.e., at or near the site of the flap, graft or organ transplant.  In one embodiment, the construct encoding HGF is administered intramuscularly, such into the rectus abdominus muscle.
The inventive methods described herein enhance flap or skin graft survival by at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, or at least about 30% or more compared to an untreated control subject.  The term “about” in this context connotes a range of up to 5% before or after the specified percentage.  Thus, the phrase “about 10%” refers to a range of 5%-15%, but also specifically includes 10%.  
5. Pharmaceutically Acceptable Formulations
The HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions as described herein can be formulated according to known methods to prepare pharmaceutically useful compositions, whereby the inventive compositions, or their functional derivatives, are combined in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier vehicle.  Suitable vehicles and their formulation, inclusive of other human proteins, e.g., human serum albumin, are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980)).  To form a pharmaceutically acceptable composition suitable for effective administration, such compositions will contain an effective amount of one or more of the vectors of the present invention, together with a suitable amount of carrier vehicle.
Pharmaceutical compositions for use in accordance with the present invention may be formulated in conventional manner using one or more physiologically acceptable carriers or excipients.  Thus, the HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions described herein, and their physiologically acceptable salts and solvate, may be formulated for administration by inhalation or insufflation (either through the mouth or the nose) or oral, buccal, rectal, subcutaneous or intramuscular administration.  In one embodiment, the HGF nucleic acid sequence or HGF vector compositions are formulated for intramuscular administration.
For oral administration, the pharmaceutical compositions may take the form of, for example, tablets or capsules prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable excipients such as binding agents (e.g., pregelatinised maize starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropyl methylcellulose); fillers (e.g., lactose, microcrystalline cellulose or calcium hydrogen phosphate); lubricants (e.g., magnesium stearate, talc or silica); disintegrants (e.g., potato starch or sodium starch glycolate); or wetting agents (e.g., sodium lauryl sulphate).  The tablets may be coated by methods well known in the art.  Liquid preparations for oral administration may take the form of, for example, solutions, syrups or suspensions, or they maybe presented as a dry product for constitution with water or other suitable vehicle before use.  Such liquid preparations may be prepared by conventional means with pharmaceutically acceptable additives such as suspending agents (e.g., sorbitol syrup, cellulose derivatives or hydrogenated edible fats); emulsifying agents (e.g., lecithin or acacia); non-aqueous vehicles (e.g., almond oil, oily esters, ethyl alcohol or fractionated vegetable oils); and preservatives (e.g., methyl or propyl-p-hydroxybenzoates or sorbic acid).  The preparations may also contain buffer salts, flavoring, coloring and sweetening agents as appropriate.  Preparations for oral administration may be suitably formulated to give controlled release of the active compound.  For buccal administration the composition may take the form of tablets or lozenges formulated in conventional manner.
For administration by inhalation, the HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions for use according to the present invention are conveniently delivered in the form of an aerosol spray presentation from pressurized packs or a nebulizer, with the use of a suitable propellant, e.g., dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas.  In the case of a pressurized aerosol the dosage unit may be determined by providing a valve to deliver a metered amount.  Capsules and cartridges of, e.g. gelatin for use in an inhaler or insufflator may be formulated containing a powder mix of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
The HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions may be formulated for intravenous, subcutaneous or intramuscular administration by injection, e.g., by bolus injection or continuous infusion.  Formulations for injection may be presented in unit dosage form, e.g., in ampules or in multi-dose containers, with an added preservative.  The HGF compositions may take such forms as suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles, and may contain formulatory agents such as suspending, stabilizing and/or dispersing agents.  Alternatively, the active ingredient may be in powder form for constitution with a suitable vehicle, e.g., sterile pyrogen-free water, before use.
The compounds may also be formulated in rectal compositions such as suppositories or retention enemas, e.g., containing conventional suppository bases such as cocoa butter or other glycerides.
In addition to the formulations described previously, the HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions may also be formulated as a depot preparation.  Such long acting formulations may be administered by implantation (for example subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection.  Thus, for example, the compounds may be formulated with suitable polymeric or hydrophobic materials (for example as an emulsion in an acceptable oil) or ion exchange resins, or as sparingly soluble derivatives, for example, as a sparingly soluble salt.
The compositions may, if desired, be presented in a pack or dispenser device which may contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient.  The pack may for example comprise metal or plastic foil, such as a blister pack.  The pack or dispenser device may be accompanied by instructions for administration.
The present invention describes therapy with HGF nucleic acid sequences to enhance organ transplant, flap and skin graft survival.  In particular, a nucleic acid sequence encoding HGF can be administered prior to organ transplant, flap or skin graft surgery.  The invention is useful in any type of organ transplant, flap or skin graft surgery.  For example, the invention is useful in conjunction with transplantation of a wide variety of organs, including skin, kidney, heart, liver, spleen, bone marrow, pancreas, lung, and islet of langerhans.  There are many different kinds of flaps that can be used to address cutaneous defects, defects of muscle, defects of subcutaneous tissues, and defects in bone.  For example, the HGF methods and compositions of the present invention can be used in conjunction with (including prior to) a cutaneous flap, muscle flap, myocutaneous flap, or cartilocutaneous flap surgery.  Likewise, the HGF methods and compositions of the present invention can be used in conjunction with (including prior to) skin graft surgery.
The therapeutic methods of the present invention involve administering to a subject in need of treatment a therapeutically effective amount of the HGF vector or HGF nucleic acid sequence compositions described herein. “Therapeutically effective” is employed here to denote the amount of the HGF composition that is of sufficient quantity to promote angiogenesis and accelerate wound healing.  In particular, it is desirable to administer a therapeutically effective amount of an HGF composition that will enhance organ transplant, musculocutaneous flap or skin graft survival.  Some methods contemplate combination therapy with known medicaments or therapies that also promote angiogenesis or organ or flap survival.  
The therapeutically effective amount of the HGF composition for use in this invention largely will depend on particular patient characteristics, the route of administration, and the nature of the disorder being treated (such as the type of organ transplant or the size, location, and thickness of the flap or skin graft at issue).  General guidance can be found, for example, in the publications of the International Conference on Harmonisation and in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (Mack Publishing Company 1990). In addition, the therapeutically effective amount may depend on such factors as toxicity and efficacy of the medicament.  Toxicity may be determined using methods well known in the art and found in the foregoing references.  Efficacy may be determined utilizing the same guidance in conjunction with the methods described below in the Examples.  A pharmaceutically effective amount, therefore, is an amount that is deemed by the clinician to be toxicologically tolerable, yet efficacious.  Efficacy, for example, can be measured by the decrease in necrosis, or the increase in angiogenesis or organ transplant or flap or graft survival.  As illustrated by the foregoing references, the determination of a therapeutically effective amount can be determined by those skilled in the art, as guided by this disclosure.
In one embodiment, the therapeutically effective amount is from about 0.1 to about 50 mg per treatment, such as from about 0.5 to about 25 mg per treatment, and from about 1 to about 10 mg per treatment.  In a specific embodiment, the plasmid is administered in several injections to the same area of the body as part of a single treatment.
The patient may be a human or non-human mammal, or another animal.  A patient typically will be in need of treatment when scheduled to receive flap or skin graft surgery.
Examples 
The invention is further described by reference to the following examples, which are provided for illustration only.  The invention is not limited to the examples but rather includes all variations that are evident from the teachings provided herein.
Example 1.  Plasmid Constructs
Human HGF is subcloned into the pcDNA3.1(-) (Invitrogen) into the NotI site, which produces the human HGF protein under the control of the CMV promoter.  See, e.g., SEQ ID NO. 2.  The HGF gene plasmid concentrate is reconstituted with normal saline solution (NSS) to obtain a 1 μg/μl concentration.
Example 2.  HGF Nucleic Acid Sequence Enhances Flap Survival
The experiment is conducted following the guidelines set by the animal laboratory of the Institute of Animal and Experimental Sciences, Osaka University.  Twenty four male Sprague-Dawley rats weighing 300-350 grams are used and equally divided into three groups (N=8).  Animals are anesthetized with an intraperitoneal injection of pentobarbital (2mg/100g).  In group 1, 250 μl of NSS is injected into the left rectus abdominus muscle, while 250 μg (1μg/μl) of empty plasmid (pcDNA3.1(-)) and 250 μg (1μg/μl) of HGF gene containing plasmid is injected into the same site in Group 2 and Group 3, respectively.  After 7 days, a simulated transverse rectus abdominus musculocutaneous (TRAM) flap measuring 4.5 cm x 9cm is elevated.  TRAM flap based on the left rectus abdominus muscle as the carrier and the superior epigastric vessels as the vascular pedicle are designed on the lower half of the abdomen.  The flap is sutured to its original location and monitored for 1 week for infection, necrosis and flap survival.  All the animals are sacrificed using an overdose of pentobarbital given intraperitonally.  Direct measurement is made on the area of necrosis and flap survival using a transparent metric template.
The data indicate the following with regard to flap survival one week post-surgery:
Table 1
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
NSS                Empty Vector          HGF IM          
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
% Flap Survival       54.125                53.875               87.75
Standard Deviation  22.96853438          25.41336825        17.88654722
Sample Size            8                    8                      8            
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
The superiority of pre-treating a TRAM flap with a gene encoding HGF is also exemplified in Figure 2.  Figure 2 demonstrates that flap survival is markedly enhanced one week post-surgery in animals receiving a gene encoding HGF (designated as “H” animals; n=8) at least 7 days prior to flap surgery, compared to control animals (designated as “C” animals; n=8) and animals treated with the empty vector (designated as “V” animals; n=8).  (The number following the letters “H,” “C” or “V” indicate the animal number.)  
In a separate study, 20 Sprague Dawley rats were randomized into 5 groups, 4 rats per group, and were directly injected with 125 μg, 250 μg, or 500 μg of a plasmid encoding HGF, NSS, or an empty vector into the left rectus abdominus muscle, (the likely TRAM flap cite).  One week post-injection, skin blood flow measurements were taken by a laser color Doppler (Laser Doppler Imager, Moor Instruments), which determines blood flow velocity and correlates with capillary density.  The results indicated that blood flow was higher in the treated area for the HGF treated groups compared to the groups given NSS or the empty vector (Figure 3 and Table 2).  
Table 2
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Empty      HGF IM        HGF IM      HGF IM
NSS      Vector     (125μg)      (250μg)      (500μg)      
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――
Mean % Blood Flow    282.675    278.175    343.333     392.900        396.725
Standard Error       5.923593   16.7246   15.59202    37.70972      33.55604
Sample Size          4            4          4           4              4            
――――――――――――――――――――――――――――――――――――――――  
Figure 3 was generated by quantitatively converting the laser images from the laser Doppler, creating a histogram with the amount of blood flow provided on the y-axis and each experimental group, i.e., animals given NSS, the empty vector, H1(125 μg HGF), H2 (250 μg HGF) or H3 (500 μg HGF), on the x-axis.  Use of the laser Doppler to visualize blood vessels and measure blood flow is described in Wong et al., Gastrointest. Endosc., 55(1): 88-95 (2002).
Additional embodiments are within the scope of the invention.  For example, the invention is further illustrated by the following numbered embodiments: 
1. A method for enhancing tissue survival, including survival of a flap or a skin graft following flap or skin graft surgery, comprising administering to a subject in need thereof a vector that comprises a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor.
2. The method of embodiment 1, wherein said flap is selected from the group consisting of a skin flap, a muscle flap, a myocutaneous flap and a cartilocutaneous flap.
3. The method of embodiment 1, wherein said vector is administered intramuscularly.
4. The method of embodiment 1, wherein said nucleic acid encoding HGF is represented by SEQ ID NO. 1.
5. The method of embodiment 4, wherein said vector is administered at least 3-14 days prior to flap or skin graft surgery.
6. The method of embodiment 4, wherein said vector is administered at least 5-10 days prior to flap or skin graft surgery.
7. The method of embodiment 4, wherein said vector is administered at least 7 days prior to flap or skin graft surgery.
8. The method of embodiment 5, wherein said vector is a plasmid selected from the group consisting of pcDNA3.1(-) and pVAX1.
9. The method of embodiment 5, wherein said vector comprises the sequence of SEQ ID NO. 2.
10. The method of embodiment 5, wherein said vector comprises sequence of SEQ ID NO. 3.
11. The method of embodiment 1, wherein the survival of the flap or skin graft is enhanced by at least 10-30% as compared to an untreated subject.
12. A method for enhancing organ transplant survival in a subject comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a composition that comprises a nucleic acid encoding HGF.
13. The method of embodiment 3, wherein said vector is administered in the rectus abdominus muscle.
14. A method for enhancing tissue survival, including survival of a flap or a skin graft following flap or skin graft surgery, comprising administering to a subject in need thereof a vector that comprises a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor, wherein administration of the vector results in enhanced blood flow. 
Although the foregoing refers to particular preferred embodiments, it will be understood that the present invention is not so limited.  It will occur to those of ordinary skill in the art that various modifications may be made to the disclosed embodiments and that such modifications are intended to be within the scope of the present invention.  All of the publications, patent applications and patents cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.
What is Claimed:
1. A method for enhancing tissue survival, comprising administering to a subject in need thereof a vector that comprises a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor.
2. The method of claim 1, wherein said tissue is selected from the group consisting of a flap and a skin graft.
3. The method of claim 2, wherein said flap is selected from the group consisting of a skin flap, a muscle flap, a myocutaneous flap and a cartilocutaneous flap.
4. The method of claim 2, wherein said vector is administered at least 3-14 days prior to flap or skin graft surgery.
5. The method of claim 2, wherein said vector is administered at least 5-10 days prior to flap or skin graft surgery.
6. The method of claim 2, wherein said vector is administered at least 7 days prior to flap or skin graft surgery.
7. The method of claim 2, wherein the survival of the flap or skin graft is enhanced by at least 10-30% as compared to an untreated subject.
8. The method of claim 2, wherein said vector is administered intramuscularly, at or near the planned cite of flap or skin graft.
9. The method of claim 8, wherein said vector is administered in the rectus abdominus muscle.
10. The method of claim 1, wherein said vector comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO. 1.
11. The method of claim 10, wherein said vector is a plasmid selected from the group consisting of pcDNA3.1(-) and pVAX1.
12. The method of claim 11, wherein said vector comprises the sequence of SEQ ID NO. 2.
13. The method of claim 11, wherein said vector comprises sequence of SEQ ID NO.3.
14. A method for enhancing organ transplant survival in a subject comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of a composition that comprises a nucleic acid sequence encoding HGF.
15. The method of claim 14, wherein said composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.
16. A method for enhancing tissue survival, comprising administering to a subject in need thereof a vector that comprises a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor, wherein administration of the vector results in enhanced blood flow. 
17. The method of claim 16, wherein said tissue is selected from the group consisting of a flap and a skin graft.
18. The method of claim 16, wherein said tissue is a transplanted organ.
Abstract
The present invention relates to the use of growth factors in improving tissue survival.  In particular, the invention describes methods for enhancing organ transplant, musculocutaneous flap or skin graft survival by administering a nucleic acid sequence encoding hepatocyte growth factor.
Figure 1
2005314404.tif 000007
Figure 2
2005314404.tif 000008
Figure 3
2005314404.tif 000009
【配列表】
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