(57)【要約】【課題】メラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質と、それをコードする遺伝子、およびそれらの用途の提供。【解決手段】ヒトメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質をコードするcDNAを単離した。新規蛋白質であるメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の提供により、この蛋白質を用いた結合実験が可能となった。結合実験に基づくメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する化合物のスクリーニングによって、この蛋白質を標的とする医薬開発が可能となる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、またはその同効物。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項２記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項４記載の宿主細胞を培養することを特徴とする請求項１に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項７】
請求項１記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程を含むことを特徴とする、該蛋白質の活性を修飾する物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
請求項１記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程を含むことを特徴とする、肥満または摂食障害予防および／または治療剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なメラニンコンセントレーティングホルモン受容体のポリペプチド、この新規なポリペプチドをコードしているDNA、該DNAを含有するベクター、該ベクターを含有する形質転換細胞及び該細胞を使用した薬物スクリーニング法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メラニンコンセントレーティングホルモン(Meranin-Concentrating-Hormone)は、鮭の下垂体より初めて単離された環状ペプチドホルモンである(Kawauchi, H. et al. (1983) Nature 305, 321-323)。魚類においてはメラノサイトスティミュレーティングホルモンと機能的に拮抗し、メラノフォアの凝集を引き起こし体色の適応変化に関与している(Bittencourt, J.C. et al. (1992) J.Comp.Neurol. 319, 218-245 )。その後、ラット、ヒトなどでもメラニンコンセントレーティングホルモン前駆体cDNAのクローニングが行われ(Nahon, J.L. et al. (1989) Endocrinology 125, 2056-2065, Presse, F. et al. (1990) Mol. Endocrinol. 4, 632-637)、エネルギーホメオスタシスの調節など幅広い生理機能を果たすことが明らかになってきた。
【０００３】
メラニンコンセントレーティングホルモンは、ラット、ヒトなどでは、主に外側視床下部、不確帯で発現されている(Bittencourt, J.C. et al. (1992) J.Comp.Neurol. 319, 218-245, Viale, A. et al. (1997) Brain Res Mol Brain Res 46, 243-255)。外側視床下部はその破壊により摂食抑制や体重減少をひきおこすことから、古くから摂食中枢として働くことが知られていた(Bray, G.A. & York, D.A. (1979) Physiol.Rev. 59, 719-809, Flier, J.S. & Maratos-Flier, E. (1998) Cell 92, 437-440)。体脂肪量を感知し、これを適正な量に維持する作用をもつホルモン、レプチンの遺伝子に変異が生じ肥満を呈したob/obマウスや絶食したマウスの視床下部においてメラニンコンセントレーティングホルモン遺伝子の発現が亢進することが報告されている(Qu, D. et al. (1996) Nature 380, 243-247)。
【０００４】
実際に、メラニンコンセントレーティングホルモンをラットの脳室内に投与すると用量依存的な摂食の亢進がおきる(Qu, D. et al. (1996) Nature 380, 243-247, Ludwig, D.S. et al. (1998) Am.J.Physiol. 274, E627-E633)。メラニンコンセントレーティングホルモン遺伝子を欠失したマウスは野生型マウスに比べ、体脂肪の減少に基づく体重減少が観察され、摂食量の減少や体重あたりの酸素消費量の増加が観察された(Shimada, M. et al. (1998) Nature 396, 670-674)。また、メラニンコンセントレーティングホルモンは他のエネルギーホメオスタシスに関与する因子と調節関係にあることも知られている。メラノサイトスティミュレーティングホルモンはMC4Rを介して、摂食抑制作用を示し、体内へのエネルギ−蓄積量を減少させることが知られている(Friedman, J.M. (1997) Nature 385, 119-120, Lu, D. et al. (1994) Nature 371, 799-802, Huszar, D. et al. (1997) Cell 88, 131-141)。
【０００５】
魚類の体色変化における拮抗関係と同様に、ほ乳類の摂食行動においても、メラニンコンセントレーティングホルモンとメラノサイトスティミュレーティングホルモンは互いに相反する作用を示す。メラニンコンセントレーティングホルモンにより誘発された摂食亢進はα-MSHにより抑制され、逆にα-MSHによる摂食抑制作用はメラニンコンセントレーティングホルモンにより解除される(Ludwig, D.S. et al. (1998) Am.J.Physiol. 274, E627-E633)。しかし、メラニンコンセントレーティングホルモン自身はMC4Rに親和性はなく、α-MSHとMC4Rの結合を阻害できないことから、独自の受容体を介してその作用を示すものと推察されていた(Ludwig, D.S. et al. (1998) Am.J.Physiol. 274, E627-E633)。
【０００６】
メラノコルチン系が不全となっているAy/aマウスやMC4Rの内在性阻害蛋白であるAGRPを投与したラットでは外側視床下部でメラニンコンセントレーティングホルモン遺伝子の発現上昇がおきる(Hanada, R. et al. (2000) 268, 88-91)。また、メラニンコンセントレーティングホルモンによる摂食亢進作用は、レプチン、ニューロテンシン、GLP-1などの摂食抑制因子によって抑制される(Sahu, A. (1998) Endocrinology 139, 4739-4741, Tritos, N.A. et al. (1998) Diabetes 47, 1687-92)。
以上の様な事実から、生体内でメラニンコンセントレーティングホルモンは種々のエネルギーホメオスタシス調節因子と関係しあいながら、それ自身は摂食亢進作用やエネルギー消費抑制作用を示しエネルギーバランスの調節を担っているものと考えられている。
【０００７】
メラニンコンセントレーティングホルモンは以上の様な作用の他にも、受動回避において記憶の消去を促進する作用(McBride, R.B. et al. (1994) Peptides 15, 757-759)、メスのラット内側視索前部や腹内側核へ投与すると、性的受容性を亢進する作用(Gonzalez, M.I. et al. (1996) Peptides 17, 171-177)、ラット内側視索前部へ投与すると、不安を惹起する作用(Gonzalez, M.I. et al. (1996) Peptides 17, 171-177)、聴覚刺激誘発海馬応答を抑制する作用(Miller, C.L. (1993) Peptides 14, 431-440)、羊の脳室内に投与すると、利尿作用、尿中へのナトリウム、カリウムの排泄を促進する作用(Parkes, D.G. (1996) J.Neuroendocrinol. 8, 57-63)が報告されている。
【０００８】
ヒトにおけるメラニンコンセントレーティングホルモン受容体として、SLC-1が報告されている(Nature Vol.400, 265-268, 1999)。SLC-1は、もともとG蛋白質共役型受容体の一つであるソマトスタチン受容体との相同性に基づいて単離された遺伝子である(FEBS Lett.398, 253-258,1996)。ソマトスタチン受容体遺伝子との相同性は約４０％程度で、ソマトスタチンとの結合活性は見出されなかったが、その後の研究によりリガンドがメラニンコンセントレーティングホルモンであることが明らかにされた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、新規なヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体または該受容体と同等の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供することである。また、本発明の別の目的は、該遺伝子を用いて発現させたヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体または該受容体と同様の機能を有するポリペプチドを提供することである。さらに、ヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体のポリペプチドを使用したメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する薬物のスクリーニング法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、新規なヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードする遺伝子を単離する事に成功し、ヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質のアミノ酸配列、ヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードするDNA配列を決定した。さらに、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体を発現させ、組み換え蛋白質の生産を可能にし、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該宿主細胞を用いたメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体に対する抗体の製造法を確立した。
【００１１】
これにより、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体および該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する物質のスクリーニング、及びメラニンコンセントレーティングホルモンの関与する疾患、例えば、肥満、摂食障害予防及び／または治療剤のスクリーニングを可能にし、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、
〔１〕配列番号：２記載のアミノ酸配列を有する蛋白質、またはその同効物、
〔２〕〔１〕記載の蛋白質をコードする遺伝子、
〔３〕〔２〕記載の遺伝子を含むベクター、
〔４〕〔３〕記載のベクターを含む宿主細胞、
〔５〕〔４〕記載の宿主細胞を培養することを特徴とする〔１〕に記載の蛋白質の製造方法、
〔６〕〔１〕記載の蛋白質に結合する抗体、
〔７〕〔１〕記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程を含むことを特徴とする、該蛋白質の活性を修飾する物質をスクリーニングする方法、
〔８〕〔１〕記載の蛋白質と被検化合物を接触させる工程を含むことを特徴とする、肥満または摂食障害予防および／または治療剤をスクリーニングする方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明で使用される用語につき説明する。
本明細書中で使用される「メラニンコンセントレーティングホルモン受容体」は「メラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質」を表す。
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の「同効物」とは、配列番号：２記載のアミノ酸配列中のいずれかの１乃至複数個の部位において、１乃至複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または挿入されていてもよく、かつ配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するメラニンコンセントレーティングホルモン受容体と同一の活性を示す蛋白質をいう。
【００１４】
本発明におけるメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の同効物としては、好ましくは配列番号：２記載のアミノ酸配列において１乃至１０個、更に好ましくは１乃至７個、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸でアミノ酸の置換、欠失および／または挿入があるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：２記載のアミノ酸配列で示される蛋白質と同一の活性を有するメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を挙げることができる。特に、配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドが最適である。本発明の蛋白質は、配列番号：２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに加え、その同効物を含む。
【００１５】
配列番号：２記載のアミノ酸配列で示される蛋白質と同一の活性を有することは、たとえば実施例３記載の方法で確認することができる。すなわち、メラニンコンセントレーティングホルモンによる容量依存的な細胞内Ca++濃度の上昇を指標として、該蛋白質と同一の活性を有することを確認することができる。
また、本発明の蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子は、配列番号：２記載のアミノ酸配列で示されるメラニンコンセントレーティングホルモン受容体、あるいは、それらの同効物をコードする塩基配列を有する遺伝子なら何れでもよい。好ましくは、配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子である。さらに好ましくは、配列番号：１記載の塩基配列の１番目から１０２３番目を有する遺伝子である。
【００１６】
本発明の蛋白質をコードする遺伝子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の蛋白質、本発明の蛋白質の活性を修飾する物質のスクリーニング方法、本発明の蛋白質に反応する抗体について、以下１）〜４）に記載する。
【００１７】
１） 本発明のヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体遺伝子の製造方法
ａ）第１製造法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織からｍＲＮＡを抽出する。次いでこのｍＲＮＡを鋳型として該受容体ｍＲＮＡまたは一部のｍＲＮＡ領域をはさんだ２種類のプライマーを作製する。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＲＴ−ＰＣＲという）を行うことにより、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体ｃＤＮＡまたはその一部を得ることができる。さらに、得られたヒトのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体ｃＤＮＡまたはその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、該受容体蛋白質を製造することができる。
【００１８】
まず、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の産生能力を有する細胞あるいは組織、例えばヒト脾臓から該蛋白質をコードするものを包含するｍＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法としては、グアニジン・チオシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン・塩酸法等が挙げられるが、好ましくはグアニジン・チオシアネート塩化セシウム法が挙げられる。該蛋白質の産生能力を有する細胞あるいは組織は、該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部を用いたノーザン  ブロッティング法、該蛋白質に特異的な抗体を用いたウエスタン  ブロッティング法などにより特定することができる。
【００１９】
ｍＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えばｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着・溶出させ、精製することができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡをさらに分画することもできる。また、ｍＲＮＡを抽出せずとも、市販されている抽出済ｍＲＮＡを用いても良い。
次に、精製されたｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い第１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は常法によって行うことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてＰＣＲに供し、目的とするメラニンコンセントレーティングホルモン受容体DNAを増幅する。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、上記ＤＮＡを制限酸素等で切断し、接続することによって目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。
【００２０】
ｂ）第２製造法
本発明の遺伝子は上述の製造法の他、常法の遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。まず、前述の方法で得たｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方法としてはＳ１ヌクレアーゼ法（Efstratiadis, A. et al. (1976) Cell, 7, 279-288)、Land法(Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266)、 O. Joon Yoo法(Yoo, O. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053)、Okayama-Berg法(Okayama, H. and Berg, P. (1982) Mol. Cell. Biol., 2, 161-170)などが挙げられる。
【００２１】
次に、上述の方法で得られる組換えプラスミドを大腸菌、例えばＤＨ５α株に導入して形質転換させて、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を指標として組換体を選択することができる。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合にはHanahanの方法(Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol., 166, 557-580)、すなわちCaCl2やMgCl2またはRbClを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換えDNA体を加える方法により実施することができる。なお、ベクターとしてはプラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターも用いることができる。
上記により得られる形質転換株から、目的のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質のＤＮＡを有する株を選択する方法としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。
【００２２】
(1)合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の全部または一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列または考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列のどちらでもよく、また後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプローブ（32Pまたは33Pで標識する）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これを選択する。
【００２３】
(2)ポリメラーゼ連鎖反応により作製したプローブを用いるスクリーニング法本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の一部に対応するセンスプライマーとアンチセンスプライマーのオリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応(Saiki, R. K. et al. (1988) Science 239, 487-491)を行い、目的のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の全部または一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用いる鋳型ＤＮＡとしては、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体を産生する細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを用いることができる。このようにして調製したＤＮＡの断片を32Pまたは33Pで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより目的のクローンを選択する。
【００２４】
(3)他の動物細胞でのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を産生させてスクリーニングする方法
形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白を細胞表面に産生させる。本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質に対する抗体を用いて該蛋白質を検出することにより、元の形質転換株より目的のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードするｃＤＮＡを有する株を選択する。
【００２５】
(4)本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に対する抗体を用いて選択する方法
あらかじめ、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株表面で蛋白を産生させ、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に対する抗体および該抗体に対する２次抗体を用いて、所望のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体産生株を検出し、目的の株を選択する。
【００２６】
(5)本発明のメラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体に対するメラニンコンセントレ−ティングホルモンの結合を指標として選択する方法
あらかじめ、ｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株表面で蛋白を産生させ、標識した[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレ−ティングホルモンを用いて所望のメラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体産生株を検出し、目的株を選択する。
【００２７】
(6)セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トランスレーションの系を用いる方法
形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロースフィルター等にブロットし本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体産生細胞からのｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合したｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白に翻訳させる。本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に対する抗体や標識した[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモンを用いて検出して、目的の株を選択する。
【００２８】
得られた目的の形質転換株より本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法(Maniatis, T. et al.(1982):" Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY)に従い実施できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行ない得る。
【００２９】
ｃ）第３製造法
配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子は、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによっても製造できる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機（例えば、Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman社)、あるいは、394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems社)など）を用いて合成することができる。
【００３０】
ｄ）第４製造法
本発明の遺伝子を利用して遺伝子工学的手法により得られる物質が本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の機能を発現するためには、必ずしも配列番号：２に示されるアミノ酸配列のすべてを有するものである必要は無く、例えばその一部の配列であっても、あるいは他のアミノ酸配列が付加されていても、それが配列番号：２に示されるアミノ酸配列で示されるのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体と同一の活性を示す限り、それらの蛋白質もまた本発明の蛋白質に包含される。
【００３１】
また、一般に真核生物の遺伝子はインターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を示すと考えられ（例えば、Nishi, T. et al. (1985) J. Biochem., 97, 153-159を参照）、この多型現象によって１または複数個のアミノ酸が置換される場合もあれば、ヌクレオチド配列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。したがって、配列番号：２で示されるアミノ酸配列の中の１もしくは複数個の部位において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または挿入されている蛋白質でも配列番号：２記載のアミノ酸配列で示されるメラニンコンセントレーティングホルモン受容体と同一の活性を有していることがありえる。これらの蛋白質は、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の同効物と呼び、本発明に含まれる。
【００３２】
これらの本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の同効物をコードする塩基配列を有する遺伝子はすべて本発明に含まれる。このような各種の本発明の遺伝子は、上記本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の情報に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法(Hunkapiller, M. et al.(1984) Nature, 10, 105-111)等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる(Crantham, R. et al.(1981) Nucleic Acids Res.,9 r43-r74)。さらに、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用したサイトスペシフィック・ミュータジェネシス(site specific mutagenesis)(Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666)等に従うことができる。
【００３３】
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の同効物を調製するための方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4)を利用して本発明の蛋白質をコードするDNA配列（配列番号：１）またはその一部をもとに同種または異種生物由来のDNA試料から、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNAから配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行いうることである。このように本発明の蛋白質をコードするDNAとハイブリダイズするDNAによりコードされる蛋白質であって、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明に含まれる。
【００３４】
このような蛋白質を単離するための生物としては、ヒト以外に、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３５】
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の同効物をコードするDNAを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３６】
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAがコードする蛋白質は、通常、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の配列の相同性を指す。相同性の特定は、BLAST検索アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００３７】
また、遺伝子増幅技術（PCR）（Current protocols in Molecular Biology  edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）を用いて本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質をコードするDNA配列（配列番号：１）の一部を基にプライマーを設計し、本発明の蛋白質をコードするDNA配列と相同性の高いDNA断片を単離し、該DNAを基に本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。
【００３８】
以上、ａ）乃至ｄ）により得られるＤＮＡの配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980):" Methods in Enzymology "65, 499-559)やＭ１３を用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法(Messing, J. and Vieira, J (1982) Gene, 19, 269-276)等により行うことができる。
また、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体は、下記の方法によって得ることができる。
【００３９】
２）本発明の蛋白質の組み換え蛋白質の製造方法
単離された本発明の蛋白質をコードする遺伝子を含む断片は、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、他の真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能である。
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞(Gluzman, Y. (1981) Cell, 23, 175-182)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220)、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞および同細胞にEpstein Barr VirusのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Invitrogen社）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol., 1, 854-864)、ヒトのelongation factorプロモーターを有するpEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322)、cytomegalovirusプロモーターを有するpCEP4(Invitrogen社）等を例示できるが、これに限定されない。
【００４１】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモーター、転写終結シグナルおよびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 pME18S、 (Maruyama, K. and Takebe,Y. (1990) Med. Immunol., 20, 27-32)、pEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322)、 pCDM8(Seed, B. (1987) Nature, 329, 840-842) 等が挙げられる。該発現ベクターはＤＥＡＥ−デキストラン法(Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308)、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973) Virology, 52, 456-457)、 FuGENE6(Boeringer Mannheim社）を用いた方法、および電気パルス穿孔法(Neumann, E. et al.(1982) EMBO J., 1, 841-845)等によりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００４２】
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSVneo(Sambrook, J. et al. (1989): " Molecular Cloning-A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY)やpSV2-neo(Southern, P. J. and Berg,P. (1982) J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341)等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することによりメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、Epstein Barr Virusの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なpCEP4(Invitrogen社）などの発現ベクターを用いて所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００４３】
上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内または細胞表面に本発明の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記ＣＯＳ細胞であればRPMI-1640培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地に必要に応じ牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したものを使用できる。また、上記２９３−ＥＢＮＡ細胞であれば牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えたものを使用できる。
【００４４】
上記により、形質転換体の細胞内または細胞表面に生産される本発明の蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した後、通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示できる。
なお、膜分画は常法に従って得ることができる。例えば本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を表面に発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし遠心分離することにより得られる。また、できるだけ緩和な可溶化剤（CHAPS、 Triton X-100、ジキトニン等）でメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を可溶化することにより、可溶化後も受容体の特性を保持することができる。
【００４５】
本発明の蛋白質はマーカー配列とインフレームで融合して発現させることで、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体の発現の確認、細胞内局在の確認、精製等が可能になる。マーカー配列としては、例えば、FLAG epitope、Hexa-Histidine tag、Hemagglutinin tag、myc epitopeなどがある。また、マーカー配列とメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の間にエンテロキナーゼ、ファクターXa、トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリン受容体とHexa-Histidine tagとをトロンビン認識配列で連結した報告がある（Hayashi, M.K. and Haga, T. (1996) J. Biochem., 120, 1232-1238）
【００４６】
３）本発明の蛋白質の活性を修飾する物質（化合物、ペプチド及び抗体）のスクリーニング方法
本発明にはメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体のスクリーニング法が包含される。該スクリーニング法は、前記により構築されたメラニンコンセントレーティングホルモン受容体を用いて、該受容体蛋白質の生理学的な特性に応じた該受容体蛋白質の修飾の指標を測定する系に被験薬を添加し、該指標を測定する手段を含む。該測定系は、具体的には、以下のスクリーニング方法が挙げられる。また、被験薬はケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Terrett, N.K., et al. (1995) Tetrahedron, 51, 8135-8137）によって得られた化合物群やファージ・ディスプレイ法（Felici, F., et al. (1991) J. Mol. Biol., 222, 301-310）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。あるいは本発明のスクリーニング法により選択された化合物またはペプチドを化学的または生物学的に修飾した化合物またはペプチドを用いうる、がそれらに限らない。
【００４７】
ａ）リガンド結合アッセイ法を利用したスクリーニング方法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に結合する化合物、ペプチド及び抗体はリガンド結合アッセイ法によりスクリーニングする事ができる。該受容体蛋白質を発現させた細胞膜、あるいは該受容体蛋白質精製標品を調製する。緩衝液、イオン、pHのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で同受容体蛋白質を発現させた細胞膜、あるいは該受容体蛋白質精製標品を、標識リガンド、例えば[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモンを被検薬と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性をγカウンター等で測定する。得られた放射活性リガンドの結合阻害を指標に該受容体蛋白質のアゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体、アンタゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。
たとえば実施例２記載のアッセイ条件で、Kiが１０μM以下、更に好ましくはKiが１μM以下の結合親和性の物質を選択することができる。
【００４８】
ｂ） GTPγS結合法を利用したスクリーニング方法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体はGTPγS結合法によりスクリーニングすることが可能である（Lazareno, S. and Birdsall, N.J.M. (1993) Br. J. Pharmacol. 109, 1120-1127）。該受容体を発現させた細胞膜を20 mM HEPES (pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM GDP溶液中で、35Sで標識されたGTPγS 400 pMと混合する。被検薬存在下と非存在下でインキュベーション後、ガラスフィルター等で濾過し、結合したGTPγSの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。被検薬存在下における特異的なGTPγS結合の上昇を指標に、該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体のアゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。また、被検薬存在下における、メラニンコンセントレーティングホルモンによるGTPγS結合上昇の抑制を指標に該受容体蛋白質のアンタゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。
【００４９】
ｃ）細胞内Ca++およびcAMP濃度の変動を利用したスクリーニング方法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体の活性を修飾する化合物、ペプチド及び抗体は、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体を発現させた細胞の細胞内Ca++またはcAMP濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。細胞内のCa++濃度の測定はfura2やfluo3等を用いて測定することができる。またcAMP濃度の測定は、市販のcAMP測定キット(Amersham社等)を用いて測定できる。あるいは、Ca++やcAMP濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出することにより、間接的にCa++およびcAMP濃度を測定することが可能である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法においては、該蛋白質を発現させた細胞と発現させていない宿主細胞（コントロール細胞）に化合物、ペプチド、抗体等を一定時間作用させ、Ca++およびcAMP濃度を直接あるいは間接的に測定する。コントロール細胞と比較して、該蛋白質を発現させた細胞特異的なCa++の上昇および／またはcAMP濃度の上昇または低下を指標にアゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。また、被検薬存在下における、メラニンコンセントレ−ティングホルモンによるCa++の上昇および／またはcAMP濃度の上昇または低下の阻害作用を指標に該メラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体のアンタゴニスト活性を有する化合物、ペプチド及び抗体をスクリーニングすることができる。
たとえば実施例３に記載の条件で、ED50=１００μM以下の物質を、更に好ましくは ED50=１０μM以下の物質をアゴニスト活性を有する物質として、選択することができる。また、実施例３に記載のアッセイ条件に被験薬を追加することにより、IC50が１０μM以下の物質を、更に好ましくはIC50が１μM以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
【００５１】
４）本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に反応する抗体の作成方法
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に反応する抗体、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体は、各種動物に該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体や該メラニンコンセントレーティングホルモン受容体の断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードする遺伝子を導入したプラスミドを用いてDNAワクチン法（Raz, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523; Donnelly, J. J. et al. (1996) J. Infect. Dis., 173, 314-320）によっても得ることができる。
【００５２】
ポリクローナル抗体は該蛋白質またはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁し、腹腔、皮下また静脈等に免疫して感作した動物、例えばウサギ、ラット、ヤギ、またはニワトリ等の血清または卵から製造される。このように製造された血清または卵からポリクローナル抗体は常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。そのような方法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE-セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインAアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。
以上のように分離精製された抗体につき、常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、F(ab')2、Fab、Fab'、Fvを得ることができる。
【００５３】
モノクローナル抗体は、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Nature, 256, 495-497）により当業者が容易に製造することが可能である。
本発明の蛋白質またはその断片をフロイント完全アジュバントなどの適当なアジュバントに乳濁した乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下または静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製する。
【００５４】
ハイブリドーマを得るためのミエローマ細胞としては、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損やチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを持つミエローマ細胞、例えば、マウスミエローマ細胞株P3X63Ag8.U1、を利用する。また、融合剤としてはポリエチレングリーコールを利用する。さらにはハイブリドーマ作製における培地として、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、RPMI-1640などの通常よく用いられているものに適宜10〜30%の牛胎児血清を加えて用いる。融合株はHAT選択法により選択する。ハイブリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、ELISA法、免疫組織染色法などの周知の方法または前記のスクリーニング法により行い、目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択する。また、限界希釈法によって、サブクローニングを繰り返すことによりハイブリドーマの単クローン性を保証する。このようにして得られるハイブリドーマは培地中で2〜４日間、あるいはプリスタンで前処理したBALB/c系マウスの腹腔内で10〜20日培養することで精製可能な量の抗体が産生される。
このように製造されたモノクローナル抗体は培養上清あるいは腹水から常法の蛋白質単離精製法により分離精製することができる。そのような方法としては例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、DEAE-セルロース、ハイドロキシアパタイト、プロテインAアガロース等によるクロマトグラフィー法が挙げられる。また、モノクローナル抗体またはその一部分を含む抗体断片は該抗体をコードする遺伝子の全部または一部を発現ベクターに組み込み、大腸菌、酵母、または動物細胞に導入して生産させることもできる。以上のように分離精製された抗体につき、常法により、ペプシン、パパイン等の蛋白質分解酵素によって消化を行い、引き続き常法の蛋白質単離精製法により分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、F(ab')2、Fab、Fab'、Fvを得ることができる。
【００５５】
さらには、本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体に反応する抗体を、クラクソンらやゼベデらの方法（Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352, 624-628; Zebedee, S. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179）によりsingle chain FvやFabとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Lonberg, N. et al. (1994) Nature, 368, 856-859）に免疫することでヒト抗体を得ることも可能である。
【００５６】
本発明には、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体または前記スクリーニング法により選択された該蛋白質の活性を有意に修飾する化合物、ペプチド及び抗体を有効成分とする医薬が包含される。
本発明のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体活性修飾化合物、ペプチド、抗体または抗体断片を有効成分とする製剤は、該有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製されうる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液剤などによる経口投与、あるいは静注、筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、経粘膜投与剤などによる非経口投与が挙げられる。特に胃で消化されるペプチドにあっては静注等の非経口投与が望まれる。
【００５７】
本発明による経口投与のための固体組成物は、一つまたはそれ以上の活性物質が少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解乃至溶解補助剤などを含有していてもよい。錠剤や丸剤は必要により糖衣または胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆していてもよい。
経口のための液体組成物は、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールを含む。該組成物は不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００５８】
非経口のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を含む。水溶性の溶液剤や懸濁剤には、希釈剤として例えば注射用蒸留水、生理用食塩水などが含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０等を含む。該組成物はさらに湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解乃至溶解補助剤、防腐剤などを含んでいてもよい。組成物は例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、または照射によって無菌化される。また、無菌の固体組成物を製造し、使用に際し無菌水その他の無菌用注射用媒体に溶解し使用することもできる。
投与量は前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して適宜決定される。
【００５９】
本発明はまた、診断薬としてのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体をコードするＤＮＡの使用法が包含される。機能障害と関連したメラニンコンセントレーティングホルモン受容体遺伝子の変異型の検出は、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体の過少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾患またはその罹病性の診断に利用される。すなわち本発明は、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNAに関する。本発明のDNAと「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは厳格な条件下で、本発明のDNAとハイブリダイズし、他のDNAとはハイブリダイズしないことを意味する。このようなDNAは、本発明のDNAを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のDNAを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜40bpの鎖長を有する。プライマーとして好ましい塩基配列を、配列番号：５（フォワードプライマー）および配列番号：６（リバースプライマー）に示した。また、プローブとして用いる場合には、本発明のDNAの少なくとも一部若しくは全部の配列（またはその相補配列）を有し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。
【００６０】
診断用のＤＮＡは、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ることができる。欠失および挿入変異は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識メラニンコンセントレーティングホルモン受容体ヌクレオチドとハイブリダイズさせることで同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるまたは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検出できる（Myers, R. M.  et al. (1985) Science. 230, 1242-1246）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確認できる（Cotton et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401）。
【００６１】
また、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体のヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。このアレイ技法は公知で、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を解析するために用いられている(Chee, M. et al. (1996) Science, .274, 610-613）。さらに、被験者から得られたサンプルからのメラニンコンセントレーティングホルモン受容体のレベルの異常な低下または増加を測定する方法により、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体の過少発現、過剰発現または変化した発現により生ずる疾患またはその罹病性の診断に利用される。発現の低下または増加は、当業者で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮＡレベルで測定することができる。
【００６２】
その他、被験者から得られたサンプル中のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体のような蛋白質のレベルの低下または増加は当業者で公知のアッセイ法により測定できる。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。
【００６３】
また、「配列番号：１に記載のDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するDNA」には、本発明のタンパク質の発現を抑制するためのアンチセンスDNAが含まれる。アンチセンスDNAは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、通常、3000bp以内、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。このようなアンチセンスDNAには、本発明のタンパク質の異常（機能異常や発現異常）などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。該アンチセンスDNAは、例えば、本発明のタンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：１に記載のDNA）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, 1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209-21 (1988)）などにより調製することが可能である。本発明によるアンチセンスDNAを用いてメラニンコンセントレーティングホルモン受容体遺伝子をノックアウトすることにより、メラニンコンセントレーティングホルモン受容体が関与する疾患の解明を進めることができる。
【００６４】
本発明のDNAまたはアンチセンスDNAは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与を行う。
【００６５】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Maniatis, T. at al. (1982) : "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY）に従って実施可能である。
【００６６】
（実施例１）新規Ｇ蛋白質共役型受容体GPRv17をコードする遺伝子の単離
新規Ｇ蛋白質共役型受容体GPRv17をコードする全長cDNAは、PCRにより取得した。GPRv17をコードする遺伝子の増幅には、ヒト胎児脳由来のMarathon Ready cDNA（Clontech）を鋳型cDNAに、フォワードプライマーとして5'-ATGAATCCATTTCATGCATCTTGTTGGA-3'（配列番号：３）、リバースプライマーとして5'-CTAAAAGTGTGATTTCAGAGTGTTTCCC-3'（配列番号：４）を用いた。PCRはPyrobest DNA polymerase（宝酒造）を用い、94℃（2.5分）の後、94℃（5秒）／72℃（4分）のサイクルを5回、94℃（5秒）／70℃（4分）のサイクルを5回、94℃（5秒）／68℃（4分）のサイクルを25回繰り返した。その結果、約１ kbpのDNA断片が増幅された。この断片をpCR2.1 plasmid（Invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりABI377 DNA Sequencer（Applied Biosystems社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号：１に示す。
【００６７】
同配列は1023塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号：１の第1番目から第1023番目）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（340アミノ酸）を配列番号：２に示す。予想アミノ酸配列は、G蛋白質共役型受容体の特徴である7個の膜貫通ドメインと思われる疎水性領域を有していることから、本遺伝子がG蛋白質共役型受容体をコードすることが判明した。
【００６８】
更に「GPRv17」のアミノ酸配列でのSWISS-PROTに対するBLAST検索を行った。その結果、「GPRv17」は既知G蛋白質共役型受容体の中ではHUMAN PROBABLE G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR GPR24 (Q99705, 402aa)に対して、38%で最も高い相同性を示した。このことから「GPRv17」が新規G蛋白質共役型受容体であることが判明した。GPR24は、本発明の蛋白質と同様にメラニンコンセントレーティングホルモンをリガンドとする蛋白質であることが明らかにされている(Nature Vol.400, 265-268, 1999)。しかし両者のアミノ酸配列における相同性はわずかに３８％であり、本発明の蛋白質は新規なものと考えられた。
【００６９】
（実施例２）293細胞によるGPRv17蛋白質の発現と[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモン との結合実験
以下の実験によってGPRv17がコードする蛋白質のメラニンコンセントレーティングホルモン受容体活性を確認した。まずこのcDNAがコードするGPRv17蛋白質を発現させるために、当該cDNAをヒト脳由来のpoly(A)+ RNA (Clontech社)を鋳型としてRT-PCRにより取得し、発現ベクターに組み込んだ。
【００７０】
実際には、GPRv17蛋白質をコードする全長cDNAの増幅には、フォワードプライマーとして5'-GGTCTAGAATGAATCCATTTCATGCATCTTGTT-3'（配列番号：５）、リバースプライマーとして5'-GGTCTAGACTAAAAGTGTGATTTCAGAGTGTTT-3'（配列番号：６）を用いた（それぞれの5'末端にはXbaI siteが付加してある）。RT-PCRはEx Taq DNA polymerase（宝酒造社）を用い5% DMS0存在下で94 ℃（30秒）／55 ℃（30秒）／72 ℃（2分）のサイクルを34回繰り返した。その結果、約1.0 kbpのDNA断片が増幅された。この断片をXbaIで消化した後、pEF-BOS plasmid（Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res., 18, 5322）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列はジデオキシターミネーター法によりABI377 DNA Sequencer（Applied Biosystems社）を用いて解析した。得られたプラスミドはpEF-BOS-GPRv17とした。
【００７１】
TypeI Collagenをコートした10cm培養シャーレ(旭テクノグラス社)に293細胞を1x106細胞で播種して24時間培養後、9μgのpEF-BOS-GPRv17及び1μgの pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen社)をFuGENE6（Boeringer Mannheim社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入30時間後に新たに10cm培養シャーレに播種しなおし、40μg/mlのzeocin (Invitrogen社)で選択し、生き残ってコロニ−を形成した細胞を回収し、本発明のGPRv17蛋白質安定発現293細胞を得た。
該細胞を回収し洗浄後、0.32M sucroseに懸濁してDounce homogenizerにてホモジェナイズした。1,300xgで10分間遠心して脱核を行い、その上清を再度12,000xgで15分間遠心して沈殿画分を得た。これを、0.0075%のTriton-X100を含む50mM Tris.HCl（pH7.4）に懸濁し、4度で30分間ゆっくり攪拌を行った後、12,000xgで15分間遠心し、得られた沈殿を5mM Tris.HCl（pH7.4）で一回、50mM Tris.HCl（pH7.4）, 10mM MgCl2, 2mM EGTA, aprotinin, pepstatin Aで二回洗浄し、これを膜画分とした。
【００７２】
膜画分20μgに [Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモン （NEN Life Science Products, Inc）を最終濃度0.07〜5.7x10-9 Mになるように加え、50mM Tris.HCl（pH7.4）, 10mM MgCl2, 2mM EGTA, 1mg/ml bacitracin, 1mg/ml ovalbumin, 10KIU/ml aprotinin, 1μg/ml pepstatin Aからなる溶液200μl中で室温30分間インキュベーションし、セルハーベスターにてグラスフィルターに回収した。グラスフィルターに回収された放射活性をγカウンターで測定し、膜画分への総結合量を定量した。
さらに、前述の試験に最終濃度1μMのメラニンコンセントレーティングホルモン（Bachem社）を加えることで、膜画分への非特異的結合量を測定した。pEF-BOS-GPRv17を安定に導入した293細胞の膜画分への[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモンの総結合量と非特異的結合量から特異的結合を検出した結果、0.07〜5.7x10-9 Mの[Phe13,[125I]Tyr19]-メラニンコンセントレーティングホルモン濃度で特異的結合が観察された。
【００７３】
（実施例３）GPRv17蛋白質安定発現293細胞のメラニンコンセントレーティングホルモンによる細胞内Ca++濃度の変化
96well Black/clear bottom plat, collagen I coated (BECTON DICKINSON社製)にGPRv17蛋白質安定発現293細胞を１ウェルあたり2x104細胞で播種して24時間培養後、培地を廃棄し、4μM Fluo-3,AM(Molecular Probe社製)、0.004% pluronic acidおよび10%FBSを含むDMEMを１ウェルあたり100μl添加し、37℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を20mM HEPESを含むHanks BSS(GIBCO社製)で４回洗浄して、１ウェルあたり100μlの20mM HEPESを含むHanks BSSを添加した。
【００７４】
細胞内Ca++濃度の変化はFLIPR（Moleucular Device社製）を用いて経時的に測定した。すなわち、測定開始10秒後にメラニンコンセントレーティングホルモン（Bachem社）を最終濃度2x10-6 Mから1x10-12 Mになるように添加し、添加後、５０秒間は1秒ごとに、さらに4分間は6秒ごとに蛍光強度を測定した。GPRv17蛋白質安定発現293細胞は、2 x10-6〜1 x10-10 Mのメラトニンコンセントレーティングホルモン濃度で容量依存的な細胞内Ca++濃度の変化が観察された。以上のように、GPRv17蛋白質はメラニンコンセントレーティングホルモン受容体であることが確認できた。
本メラニンコンセントレーティングホルモン受容体で形質転換した細胞の細胞内Ca++濃度の変化を測定することでアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングが可能となった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明は新規なヒトのメラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体を提供する。本発明の受容体は、ヒトのメラニンコンセントレ−ティングホルモンの関与する疾患、肥満及び摂食障害例えばカケクチア、拒食症、過食症の予防及び／または治療剤としての該受容体の活性を修飾する薬物の探索及び評価に有用であり、該受容体の関与する疾患に対する治療薬を提供することができる。また、本発明のメラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体をコードするDNAはメラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体の製造に利用されるのみならず、メラニンコンセントレ−ティングホルモン受容体の変異や異常な発現変動に起因する疾患の診断に有用である。該受容体のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は該受容体作用薬、診断薬またはポリペプチドの分離精製の手段等に有用である。
【００７６】
【配列表】
2005229804.tif 000002
2005229804.tif 000003
2005229804.tif 000004
2005229804.tif 000005
2005229804.tif 000006
2005229804.tif 000007