(57)【要約】【課題】  製剤にするための製造が容易であり、長期保存が可能な血小板凝集抑制剤、及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供すること。【解決手段】  フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物を有効成分とすること。フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物の分子量が10,000ダルトン以下であるものを有効成分とすること。前記フィブリンがフィブリノーゲンとトロンビンを反応させて得らるものであること。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物を有効成分とすることを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項２】
フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物の分子量が10,000ダルトン以下であるものを有効成分とすることを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項３】
フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物を有効成分とすることを特徴とする血小板凝集抑制に有効な保健食品。
【請求項４】
フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物の分子量が10,000ダルトン以下であるものを有効成分とすることを特徴とする血小板凝集抑制に有効な保健食品。
【請求項５】
前記フィブリンがフィブリノーゲンとトロンビンを反応させて得られたことを特徴とする請求項１又は２記載の血小板凝集抑制剤。
【請求項６】
前記フィブリンがフィブリノーゲンとトロンビンを反応させて得られたことを特徴とする請求項１又は２記載の血小板凝集抑制に有効な保健食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血小板凝集抑制剤、特にフィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られたフィブリン分解物を有効成分とする血小板凝集抑制剤、その保健食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ナットウキナーゼは、生体由来のプラスミンと同様にフィブリン（血栓）を直接分解する血栓溶解酵素でることは知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００３】
又、ナットウキナーゼが血小板凝集抑制作用があることは本発明者のうち森山、及び高岡が発明し、出願した特願2003-111081に記載されている。
【非特許文献１】高岡晋作：ジャパンフードサイエンス  Vol.39, 9月号2000年別刷
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ナットウキナーゼがフィブリンを分解するということは前記のように知られていたが、しかし、この分解して出来た分解物がどのような作用、効果をもっているかは知られていなかった。
一方、前記のように、ナットウキナーゼが血小板凝集抑制作用をもつならばナットウキナーゼがフィブリンを分解して得られた分解物にも血小板凝集抑制作用があるのではないかと考えた。
このことに関し、先行技術を調査したが、ナットウキナーゼがフィブリンを分解して得られた分解物について血小板凝集抑制作用があるかどうか記載されている先行技術文献が存在しなかった。
【０００５】
この分解物は、ペプタイド（ペプチド）であって、酵素であるナットウキナーゼよりも安定しているため、製剤にするための製造が容易であり、長期保存が可能である。
したがって、当該分解物が血小板凝集抑制作用をもつということになれば、血小板凝集抑制剤、及びナットウキナーゼは納豆として、何百年も前から食されており、その安全性が証明されているゆえに、保健食品（健康食品）を得ることも出来る、と考えて本発明者等は鋭意研究を行い本発明を完成したものである。
【０００６】
したがって、本発明は、製剤にするための製造が容易であり、長期保存が可能な血小板凝集抑制剤、及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するため本発明の血小板凝集抑制剤は、
フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物を有効成分とすることからなる。
又、フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物の分子量が10,000ダルトン以下であるものを有効成分とすることからなる。
【０００８】
又、本発明の血小板凝集抑制に有効な保健食品は、フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物を有効成分とすることからなる。
又、フィブリンをナットウキナーゼにより反応させて得られた分解物の分子量が10,000ダルトン以下であるものを有効成分とすることからなる。
【０００９】
前記フィブリンがフィブリノーゲンとトロンビンを反応させて得られたことからなるのが好適である。
【００１０】
本発明において、分子量が10,000ダルトン以下としたのは製剤にするのに好適だからである。即ち、分子量が大きくなると安定性が悪くなり製剤に不適となるからである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は以上の構成を有するので、製剤にするための製造が容易であり、長期保存が可能な血小板凝集抑制剤、及び血小板凝集抑制に有効な保健食品を提供することが出来るものである。
【実施例】
【００１２】
以下、製造方法、加工例、実施例について述べる。
（製造方法）
100ml容三角フラスコに生理食塩水（0.85％NaCl）14ml及び9.6mg/ml フィブリノーゲン（シグマ製、フィブリノーゲン  フラクションI  Type  I-S、牛血漿由来、PRODUCT NUMBER F-8630）4mlを量りとり、37±0.3℃の恒温水槽で10分間加温した後、20U/ml  トロンビンを1ml加え、よく撹拌した。この液を37℃で20分間放置後、ナットウキナーゼ溶液1mlを加え、よく撹拌し、37±0.3℃で放置した。ナットウキナーゼ溶液を添加して20、40、60、80、100分後によく撹拌し、120分後に沸騰水中で10分間煮沸を行うことでフィブリン分解産物溶液（FDP溶液と略す）を調製した。FDP溶液はアドバンテック製ULTRA FILTER UNIT  USY-5（分画分子量  50,000）で限外ろ過を行った。得られた透過液を更にULTRA FILTER UNIT  USY-1（分画分子量  10,000）で限外ろ過し、分画分子量10,000以下のFDP溶液を得た。尚、全ての試薬類は0.85％生理食塩水で調製した。
【００１３】
（加工例）
前記フィブリン分解物乾燥粉末は、カプセル、錠剤、ドリンク、顆粒、ペーストなどの形態に加工できるものであり、以下加工例を示す。
【００１４】
ソフトカプセルは、例えば、フィブリン分解物乾燥粉末を36.7mg、大豆レシチンを10mg、大豆油を133.3mg、ミツロウを15mg、グリセリン脂肪酸エステルを15mgの計210mgを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン100mg、グリセリン30mgの計130mgで構成された皮膜に充填し、総重量340mgのソフトカプセルが出来る。
【００１５】
同様にハードカプセルの場合、フィブリン分解物乾燥粉末を36.7mg、デキストリンを209.8mg、ショ糖脂肪酸エステルを13.5mgの計260mgを混合したものを内容物とし、２号ゼラチンハードカプセル(70mg)に充填し、総重量330mgのハードカプセルが出来る。
【００１６】
腸溶カプセル（耐酸性コートを含む）は、例えば、フィブリン分解物乾燥粉末を36.7mg、大豆レシチンを10mg、大豆油を133.3mg、ミツロウを15mg、グリセリン脂肪酸エステルを15mgの計210mgを混合乳化したものを内容液とし、ゼラチン100mg、グリセリン30mgの計130mgで構成された皮膜に充填し、総重量340mgのソフトカプセルを作成する。これに、ゼインを30mgコーティングし、総重量370mgの腸溶カプセルを作成する。
【００１７】
その他、打錠品、ドリンク、顆粒、ペースト等に応用出来る。
【００１８】
（実施例1）
実験方法：
フィブリン分解産物溶液を凍結乾燥したものを、生理食塩水で100mg、50mg、10mgになるように希釈した。
【００１９】
健常人、男：1  女：2を対象に採血して血小板凝集抑制能を測定した。血液採取はいずれも3.8％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、21G針にて上腕正中静脈より行った。得られた血液検体は180×ｇ、10分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（PRP）とし、残りの検体は1600×ｇ、15分間遠心分離して、乏血小板血漿（PPP）とした。PRPをPPPにて希釈し、血小板数25±3×104／μlに調製して検体とした。凝集惹起剤にはコラーゲン（エム・シー・メディカル（株））を使用し、最終濃度は2μg／mlとした。
検体300μlに、フィブリン分解液24μl又は生理食塩水24μl（コントロール）を加え、１分間37℃で撹拌、インキュベート後、凝集惹起剤を36μl添加した。
【００２０】
血小板凝集測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測定型血小板凝集能測定装置（PA-20：興和（株））を用いた。PA-20は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の2乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほかに血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できるものである。また、従来の吸光度法では、数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数10個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れている。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、25ｍV＜（粒径9〜25μm）＜200ｍV、200ｍV＜中凝集塊(粒径25〜50μm)＜600ｍV、600ｍV＜大凝集塊（粒径50〜70μm）＜2,047ｍVの3つに分類した。［Hoshi K., Zhou X.,Terazono M., Satou Y.,Yamazaki  M.,  Miyake  F.,  Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther., 32, 223-230(2001)］。
【００２１】
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−X／Y）×100
X：フィブリン分解物添加後のコラーゲンを添加した散乱強度又はOD（吸光度）
Y：フィブリン分解物添加前のコラーゲンを添加した散乱強度又はOD
[Moriyama H., Iizuka T., Nagai M., Hoshi K., Biol. Pharm. Bull., 26, 1361-1364(2003).]
【００２２】
実験の結果
下記の表１は透過率（ＯＤ）を用い抑制率を示しており、コラーゲンによる凝集惹起を高い濃度のフィブリン分解物により（6.70mg/ml）血小板の凝集を顕著に抑制したことを示している。また、抑制率はフィブリン分解物の濃度に依存することも判明した。
2005314232.tif 000002
【００２３】
さらに、下記の表２は血小板凝集塊のサイズ分布を示しているが、高い濃度のフィブリン分解物を添加したサンプルでは大凝集塊の発現率が低く、逆に小凝集塊の発現率が高く、フィブリン分解物には大凝集塊の形成を抑えることが明らかになった。この結果、フィブリン分解物には血小板抑制作用があることが明らかになった。
2005314232.tif 000003
【００２４】
（実施例2）
実験方法：
フィブリン分解産物溶液を減圧乾燥し粉にしたものを、生理食塩水で100mg、50mg、10mgになるように希釈した。
【００２５】
健常人、男：1  女：2を対象に採血して血小板凝集抑制能を測定した。血液採取はいずれも3.8％クエン酸ナトリウム加チューブを用い、21G針にて上腕正中静脈より行った。得られた血液検体は180×ｇ、10分間遠心分離し、その上清を多血小板血漿（PRP）とし、残りの検体は1600×ｇ、15分間遠心分離して、乏血小板血漿（PPP）とした。PRPをPPPにて希釈し、血小板数25±3×104／μlに調製して検体とした。凝集惹起剤にはADP[エム・シー・メディカル（株）]を使用し、最終濃度は5μMとした。
検体300μlに、フィブリン分解液24μl又は生理食塩水24μl（コントロール）を加え、１分間37℃で撹拌、インキュベート後、凝集惹起剤を36μl添加した。
【００２６】
血小板凝集測定には、レーザー散乱光を用いた粒子計測定型血小板凝集能測定装置（PA-20：興和（株））を用いた。PA-20は、直進する光が細かい粒子にあたって生じる散乱光強度が、粒子径の2乗に比例して増大するという原理を応用して開発された装置で、血小板凝集率のほかに血小板凝集塊の大きさとその生成数も算定できるものである。また、従来の吸光度法では、数千個の血小板からなる凝集塊が形成されてはじめて吸光度が低下したが、この装置では、血小板数10個からなる小凝集塊でも測定でき検出感度に優れている。なお、血小板凝集塊サイズは散乱光強度により、25ｍV＜（粒径9〜25μm）＜200ｍV、200ｍV＜中凝集塊(粒径25〜50μm)＜600ｍV、600ｍV＜大凝集塊（粒径50〜70μm）＜2,047ｍVの3つに分類した。［Hoshi K., Zhou X.,Terazono M., Satou Y.,Yamazaki  M.,  Miyake  F.,  Jpn. J. Clin. Pharmacol. Ther., 32, 223-230(2001)］。
【００２７】
次の式を用い血小板抑制率を計算した。
血小板抑制率（％）＝（１−X／Y）×  100
X：フィブリン分解物添加後のADPを添加した散乱強度又はOD（吸光度）
Y：フィブリン分解物添加前のADPを添加した散乱強度又はOD
[Moriyama H., Iizuka T., Nagai M., Hoshi K., Biol. Pharm. Bull., 26, 1361-1364(2003).]
【００２８】
実験結果：
前記表１は透過率（ＯＤ）を用い抑制率を示しており、ＡＤＰによる凝集惹起を高い濃度のフィブリン分解物により（6.70mg/ml）血小板の凝集を顕著に抑制したことを示している。また、抑制率はフィブリン分解物の濃度に依存することも判明した。
【００２９】
さらに、下記の表３は血小板凝集塊のサイズ分布を示しているが、高い濃度のフィブリン分解物を添加したサンプルでは血小板の大凝集塊の発現率が低く、逆に小凝集塊の発現率が高く、フィブリン分解物には大凝集塊の形成を抑えることが明らかになった。この結果、フィブリン分解物には血小板抑制作用があることが明らかになった。
2005314232.tif 000004