(57)【要約】      （修正有）【課題】脳組織からの、アルツハイマー病の特異的、病理学的構造物であるアミロイドプラークの高純度単離精製方法、当該プラーク、及び当該プラークに含まれるアルツハイマー病関連因子の探索法の提供。【解決手段】以下の工程：（１）脳組織を粉砕、緩衝液中、約５万ｇの遠心分離によりペレットを分取（２）前記ペレットを緩衝液に懸濁、約３０％スクロース溶液に加え、約５万ｇで遠心分離、アミロイドプラーク含有画分を分取（３）前記アミロイドプラーク含有画分を、約６０％スクロース溶液に加え、約１６万６千ｇで遠心分離、ペレットを分取（４）前記ペレットを緩衝液に懸濁、約４０μｍメッシュのフィルターでろ過（５）前記ろ液から、約１万６千ｇの遠心分離により得られるペレットを分取、及び、（６）前記ペレットを、約１０％スクロース溶液に加え、約４千ｇで遠心分離、アミロイドプラーク含有画分を分取、を含むアミロイドプラークの精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（１）脳組織を粉砕し、緩衝液中、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（２）（１）で得られるペレットを緩衝液に懸濁して得られる懸濁液を、約３０％スクロース溶液に加え、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
（３）（２）で得られるアミロイドプラーク含有画分を、約６０％スクロース溶液に加え、約１６６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（４）（３）で得られるペレットを緩衝液に懸濁し、約４０μｍメッシュのフィルターでろ過する工程、
（５）（４）で得られるろ液を、約１６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、及び
（６）（５）で得られるペレットを、約１０％スクロース溶液に加え、約４０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
を含むことを特徴とするアミロイドプラークの精製方法。
【請求項２】
工程（５）において、ペレットを約１％ＳＤＳで洗浄する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の精製方法で得られるアミロイドプラーク。
【請求項４】
以下の工程：
（１）請求項３に記載のアミロイドプラークに含まれるポリペプチドを同定する工程、
（２）（１）で同定されたポリペプチドとβアミロイドペプチドが特異的に結合するか否かを調べる工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、βアミロイドペプチドと特異的に結合するポリペプチドを、アルツハイマー病関連因子の候補物質として選択する工程、
を含むことを特徴とする、アルツハイマー病関連因子の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病治療薬の探索等に有用な、アミロイドプラーク（老人斑）の精製方法に関する。より詳細には、本発明はアルツハイマー病患者の脳等の病理組織から病因因子であるβアミロイドペプチド及びアミロイドプラーク結合蛋白質等を含むアミロイドプラークを高純度で単離するための精製方法、当該精製方法により得られる高純度のアミロイドプラーク、及び精製された当該アミロイドプラークに含まれるアルツハイマー病関連因子の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、進行性の記憶障害、知能低下などを主症状とする脳の変性疾患であり、いくつかの要因が重なって発病する多因子性の疾患である。発症の危険因子として遺伝的因子、環境因子に関する報告がいくつかあるが、最大の危険因子は脳の老化であると考えられている。
アルツハイマー病患者の脳の病理学的変化には、シナプスの変性・脱落、ニューロン死、又は大脳皮質や海馬等への老人斑、すなわちアミロイドプラークの沈着など共通する病理が多い。前記老人斑の主要構成成分として、βアミロイドペプチド（Aβ）が単離されている。また、前記Aβの前駆体として、アミロイド前駆体蛋白質(amyloid precursor protein; APP）が単離されている。
【０００３】
アルツハイマー病は、前記Ａβの持つ神経細胞毒性が、シナプスの脱落や神経細胞死を引き起こすことにより生じるという仮説があり、かかる仮説は、「βアミロイド仮説」と呼ばれている。この仮説は、（１）実際に神経細胞内でAPPからＡβが生成すること、（２）家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として同定されているAPP遺伝子、プレセニリン1（PS1）遺伝子及びプレセニリン２（PS2）遺伝子の変異が、いずれもAβの生成に影響を及ぼすこと、（３）Aβがin vivo、in vitroで神経細胞毒性を示すこと、（４）家族性アルツハイマー病随伴変異型APP導入動物で脳への老人斑様構造蓄積および学習記憶能の障害が認められること、（５）前記動物において老人斑様構造除去により学習記憶障害が軽減されること、などの知見から、現在広く支持されている。
前記Aβは、単一ペプチドではなくオリゴマーやプロトフィブリルに重合した後に神経細胞毒性を発現することが、最近の知見により明らかになりつつある（非特許文献１を参照）。また、Ａβは疎水性アミノ酸を多く含むペプチドであるが、生理的に産生され細胞外に排出される濃度においては凝集することなく可溶性を保っている。Ａβの重合開始、凝集には何等かの病的な要因が関与すると考えられており、多数の蛋白質、すなわちアミロイドプラーク結合蛋白質がアミロイドプラークにおいてＡβと結合していることが示唆されているが（非特許文献２を参照）、Ａβの凝集のメカニズムについて詳細は不明のままである。
【０００４】
従って、アルツハイマー病に特異的な病理学的構造物であるアミロイドプラークを単離し、老人斑構造物の構成成分を解析、同定することは、Ａβの凝集・蓄積のメカニズムを解明するために、ひいてはＡβの凝集を促進あるいは抑制してアルツハイマー病の発症又は発症の抑制に関与する物質を探索するために非常に有用である。
さらに、最近の医療現場では、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきており、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する遺伝子・蛋白質（疾患マーカー）が必須であり、その探索並びに開発は極めて重要である。
【０００５】
従来、アミロイドプラーク結合蛋白質の探索は、純度の低いプラークを材料として用いたものであり、アミロイドプラーク結合蛋白質の大部分は免疫組織学的検討により見出されたもののみであった。すなわち、アミロイドプラークに含まれる未知の蛋白質を同定することは困難であった。
また、脳組織から高純度のアミロイドプラークを単離・精製することは技術的に困難であった。
【０００６】
【非特許文献１】セイレ（Sayre,L.M.）ら、Chem.Res.Toxicol.,10,518-526,  (1997)
【非特許文献２】アトウッド（Atwood, C.S.）ら、Peptides, 23, 1343-1350,  (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、脳組織から、アルツハイマー病を特異的に反映した病理学的構造物であるアミロイドプラークを高純度で単離する精製方法、当該精製方法により得られる高純度のアミロイドプラーク、及び当該アミロイドプラークに含まれるアルツハイマー病関連因子の探索方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、Ａβが凝集して形成されるアミロイドプラークを高純度で単離、精製する方法を鋭意検討した結果、溶解度、密度、サイズおよび沈殿粘度（sedimentation velocity）の違いを利用して、図１に示す手順で脳組織を精製することによって、アミロイドプラークを高純度に単離、精製できることを見出した。更に、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析等を応用した方法で精製したアミロイドプラークを分析することにより、アミロイドプラークを構成する蛋白質を同定できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成するに至ったものである。
即ち本発明は、
〔１〕  以下の工程：
（１）脳組織を粉砕し、緩衝液中、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（２）（１）で得られるペレットを緩衝液に懸濁して得られる懸濁液を、約３０％スクロース溶液に加え、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
（３）（２）で得られるアミロイドプラーク含有画分を、約６０％スクロース溶液に加え、約１６６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（４）（３）で得られるペレットを緩衝液に懸濁し、約４０μｍメッシュのフィルターでろ過する工程、
（５）（４）で得られるろ液を、約１６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、及び
（６）（５）で得られるペレットを、約１０％スクロース溶液に加え、約４０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
を含むことを特徴とするアミロイドプラークの精製方法。
〔２〕  （５）において、ペレットを約１％ＳＤＳで洗浄する工程を更に含むことを特徴とする、〔１〕に記載の精製方法；
〔３〕  〔１〕又は〔２〕に記載の精製方法で得られるアミロイドプラーク；及び
〔４〕  以下の工程：
（１）請求項３に記載のアミロイドプラークに含まれるポリペプチドを同定する工程、
（２）（１）で同定されたポリペプチドとβアミロイドペプチドが特異的に結合するか否かを調べる工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、βアミロイドペプチドと特異的に結合するポリペプチドを、アルツハイマー病関連因子の候補物質として選択する工程、
を含むことを特徴とする、アルツハイマー病関連因子の探索方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、アルツハイマー病の病態の解析に有用な老人斑（アミロイドプラーク）を高純度に精製することが可能となった。また、精製されたアミロイドプラークを用いてアルツハイマー病を検出（診断）するために有用な遺伝子・蛋白質や、アルツハイマー病の治療薬、改善薬もしくは要望薬として有効な物質をスクリーニングするために有用な遺伝子・蛋白質を探索することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書において、原料として用いられる「脳組織」とは、哺乳動物の脳組織であれば特に限定は無く、大脳新皮質、小脳、海馬、好ましくは、海馬等が含まれる。また、本発明において用いられる脳組織の由来哺乳動物は、通常アルツハイマー病に罹患した哺乳動物である。具体的にはアルツハイマー病患者の脳組織（バイオプシ、あるいはオートプシ脳）、およびアルツハイマー病の動物モデルにおける脳組織を挙げられる。アルツハイマー病の動物モデルとしては、例えば、正常および変異ＡＰＰのトランスジェニック動物、正常および変異ＰＳのトランスジェニック動物（針谷ら、「細胞、３２、１３０−１３４(２０００)」）、高コレステロール食負荷動物（スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）ら、「Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００、１１０６５−１１０６９(２００３)」）、およびこれらアルツハイマー病の病態動物モデルと新たに交配して作製される動物等が挙げられる。
「アミロイドプラーク」とは、アミロイドが沈着して形成される脳の変成部位を表し、その主要成分はアミロイドβ蛋白質（Ａβ）である［井原ら、「生化学、７４、４４９−４５４（２００２）」；ベック（Beck）ら、「Ｂｉｏｃｈiｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ａｃｔａ、１３５１、１７−２１(１９９７)」］。アミロイドプラークは、免疫組織化学的な公知の方法や、コンゴレッドで染色する方法（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、「Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、７５５、１９３−２０１（１９９７)」）で染色することによって、識別することができる。
【００１１】
以下に本発明の実施の態様を詳細に説明する。
本発明の第１の態様は、アミロイドプラークの精製方法に関する。すなわち、以下の工程：
（１）脳組織を粉砕し、緩衝液中、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（２）（１）で得られるペレットを緩衝液に懸濁して得られる懸濁液を、約３０％スクロース溶液に加え、約５００００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
（３）（２）で得られるアミロイドプラーク含有画分を、約６０％スクロース溶液に加え、約１６６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、
（４）（３）で得られるペレットを緩衝液に懸濁し、約４０μｍメッシュのフィルターでろ過する工程、
（５）（４）で得られるろ液を、約１６０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットを分取する工程、及び
（６）（５）で得られるペレットを、約１０％スクロース溶液に加え、約４０００ｇで遠心分離することにより得られるペレットのうち、アミロイドプラーク含有画分を分取する工程、
を含むことを特徴とするアミロイドプラークの精製方法に関する。
【００１２】
前記工程（２）、（３）及び（６）において用いられる、約３０％、約６０％又は約１０％スクロース溶液は、密度勾配遠心分離に用いられるものであり、濃度を変えることによって、所定の密度の溶液を得ることができる。約３０％スクロース溶液としては２５〜３５％スクロース溶液を、約６０％スクロース溶液としては５５〜６５％スクロース溶液を、約１０％スクロース溶液としては５〜１５％スクロース溶液を、それぞれ挙げることができる。
前記（１）の工程において、脳組織を粉砕する方法としては、特に限定は無く、ホモゲナイザー等を用いることができ、好ましくは、蛋白質の分解を抑制するためにプロテアーゼ阻害剤を添加して粉砕する。前記プロテアーゼ阻害剤としては、生体組織中に存在するプロテアーゼに対する阻害剤を複数混合した、コンプリート（Roche  Diagnostic社製）等の市販のプロテアーゼ阻害剤カクテルを用いればよい。具体的なプロテアーゼ阻害剤としては、AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、EDTA、ロイペプチン、ペプスタチンA、ペプスタチンA等が挙げられる。
工程（１）における緩衝液としては、中性領域（ｐＨ7〜7.8）であれば特に限定はなく、トリスバッファー（ＴＢＳ）等が例示される。緩衝液の濃度は通常１０ｍＭ〜２００ｍＭであり、脳組織１ｇに対して最終１０〜６０ｍｌ用いることができる。遠心分離を行う回転数としては、４００００〜６００００ｇが挙げられ、２０〜４０分間、好ましくは約３０分間遠心分離を行う。遠心分離を行った後、上清を除去してペレットを分取することができる。
【００１３】
工程（２）において、ペレットを懸濁するために用いられる緩衝液としては、通常工程（１）と同じものを用いればよい。
工程（２）において、遠心分離を行う回転数としては、４００００〜６００００ｇが挙げられ、３０分以上、好ましくは４０分〜１２０分、更に好ましくは５０分〜７０分間遠心分離を行う。遠心分離を行った後、アミロイドプラークを含む画分を分取する。
具体的には、まずペレットを複数の画分、具体的には５〜１０個の画分に分画した後、コンゴレッド等のアミロイドプラークを識別できる色素で染色する。次いで、染色された部位を選別して、工程（３）に用いる。
【００１４】
工程（３）において、工程（２）で得られるアミロイドプラークを含有する画分を前記スクロース溶液上に乗せ、遠心分離を行う。
遠心分離を行う回転数としては、１６００００〜１７００００ｇが挙げられ、１時間以上、好ましくは２〜４時間、さらに好ましくは３時間遠心分離を行う。遠心分離を行った後、アミロイドプラークを含む画分を分取する。
【００１５】
工程（４）において用いられる緩衝液としては、通常前記工程（１）と同じものを、脳組織１ｇから得られる前記アミロイドプラークを含む画分に対して、通常約１  ｍｌ〜１０ｍｌを用いればよい。またフィルターは３５〜４５μｍ、好ましくは４０μｍメッシュのフィルターであれば特に限定は無いが、例えばナイロン製のフィルター等を用いることができる。フィルター上に付着している目的物を回収するために、通常約１〜２ｍｌの緩衝液でフィルターを洗浄してろ液に合わせる操作を行う。
工程（５）において、遠心分離を行う回転数としては、１５０００〜１７０００ｇが挙げられ、５〜１５分、好ましくは１０分間遠心分離を行う。遠心分離を行った後、上清を除去して得られるペレットは、０．５〜２％ＳＤＳ、好ましくは１％ＳＤＳで１〜３回、好ましくは２回洗浄してもよい。
工程（６）において、工程（５）で得られるペレットを前記スクロース溶液上に載せ、遠心分離を行う。
遠心分離を行う回転数としては、３０００〜５０００ｇ、好ましくは４０００ｇが挙げられ、２０分以上、好ましくは２０〜６０分間、更に好ましくは３０分間遠心分離を行う。遠心分離を行った後、１０〜２０の画分に分画し、前記工程（２）で行ったアミロイドプラークを識別するための染色に基づいて、染色された画分を選択する。
前記工程により選択された画分から、染色されたアミロイドプラークを指標に、レーザーキャプチャーマイクロスコピー等の公知の方法を用いて更に高純度のアミロイドプラークを調製することができる。
【００１６】
前記工程（６）により得られる画分は、夾雑物をほとんど含まない、高純度のアミロイドプラークを含有しており、当該アミロイドプラークはそれ自体新規である。
すなわち、本発明の第２の態様は、上記の精製方法により得られるアミロイドプラークに関する。
【００１７】
本発明のアミロイドプラークは、Ａβの凝集、蓄積過程のメカニズムを解明するために極めて有用である。
例えば、本発明のアミロイドプラークは、アミロイドプラークに含まれる構成成分の機能解析に用いることができる。例えば、本発明のアミロイドプラークと、ラジオアイソトープ等により標識したＡβとをインキュベートすることにより両者の結合様式の解析等に用いることができる。
また、本発明のアミロイドプラークは、生化学的手法を用いたアミロイドプラークの構成成分の同定解析に用いられる。すなわち、アミロイドプラークに含まれる、Ａβ結合蛋白質等の微量の構成成分を同定するために必須である。
Ａβ結合蛋白質は、アミロイドプラークの形成に機能的に関与していると考えられている。従って、Ａβ結合蛋白質は、アルツハイマー病に伴い生成する、アルツハイマー病関連因子であると考えられる。すなわち、本発明の第３の態様は、前記アミロイドプラークを用いたアルツハイマー関連因子の探索方法に関する。当該探索方法として、具体的には以下の工程：
（１）本発明のアミロイドプラークに含まれるポリペプチドを同定する工程、
（２）（１）で同定されたポリペプチドとＡβが特異的に結合するか否かを調べる工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、Ａβと特異的に結合するポリペプチドを、アルツハイマー病関連因子の候補物質として選択する工程、
を含む方法が挙げられる。
【００１８】
前記工程（１）において、ポリペプチドを同定する方法としては、当業者に周知のプロテオーム解析方法（「ポストゲノム時代の実験講座 2：タンパク質発現・機能解析の先端技術とゲノム医学・創薬（実験医学 別冊、礒辺俊明/高橋信弘著、羊土社、2000）」；「Methods in Molecular Biology Vol.146：Mass Spectrometry of Proteins and Peptides（John R. Chapman著、HUMANA PRESS、2000）」；「Proteome Research: Mass Spectrometry（Peter James編、Springer、2001）」）が挙げられる。具体的には、アミロイドプラークを電気泳動により分画し、個々の画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析する方法（蛍光ディファレンシャル二次元電気泳動法（2D-DIGE））や、アミロイドプラークをプロテアーゼで処理してペプチド断片を形成させ、これをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析する方法（18Oラベル化ディファレンシャルMS解析法）等が挙げられる。ここで、本発明のアミロイドプラークは、必要に応じて更に精製もしくは分画してプロテオーム解析に用いてもよい。
例えば、本発明のアミロイドプラークのサンプルを等電点電気泳動展開を行い、切り出したスポットを文献（Proteomics 2003, 3,13181324）に記載されている方法等を用いてゲル内酵素消化を行い、LC-Q/MS分析した後得られたデータをMASCOT等で解析して、同定を行うことができる。あるいは、本発明のアミロイドプラークのサンプルをトリプシン等の酵素を用いて消化し、LC-MSを用いて定量解析を行う。具体的にはMS/MS解析を行って得られるデータに基づき、MASCOT等で解析して同定を行うことができる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析された配列情報に基づき、Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）、Swissplot（http://www.ebi.ac.uk/swissprot/）等の公共の配列データベースを用いてホモロジー検索を行うことにより、目的とするポリペプチドの配列を同定することもできる。
【００１９】
前記工程（２）において、工程（１）で同定したポリペプチドを、当業者に公知の方法で実験に必要な量調製し、これをＡβとの結合活性の測定に用いることができる。当該ポリペプチドの調製方法としては、例えば、「モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition；Sambrook J.ら著；コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press））」等を参照して遺伝子工学的に調製する方法や、「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善、1985年）」等を参照して合成化学的に調製する方法が挙げられる。工程（２）においてＡβとの結合活性の測定は、当業者に公知の蛋白相互作用を検出する方法、例えば限定されるものではないが、固相化したＡβを用いる方法（ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５０,１５３１（１９９７））により実施することができる。
すなわち、３７℃にて１日インクベートした０．１ｍｇ／ｍｌの合成Ａβ（Ｂａｃｈｅｍ社、米国）を５０μｌづつ９６穴マイクロウェルプレートに固着させ、乾燥させる。続いてブロッキング液として１％ゼラチン（和光純薬、日本）液にてブロッキング後、良く洗浄する。工程（１）で同定したポリペプチドの調製液あるいは媒体のみを加え、数時間室温で反応させ、その後良く洗浄する。工程（１）で同定したポリペプチドに対する抗体を加え、室温で数時間反応させ、その後よく洗浄する。ペルオキジダーゼ標識二次抗体液を加え、室温で１時間反応後、良く洗浄し、ＴＭＢ発色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国）にて発色させる。その結果、工程（１）で同定したポリペプチドの調製液を加えた群は、媒体のみを加えた群と比較して強い発色を示す。
前記「工程（１）で同定したポリペプチド」に対する抗体は、当業者に周知の方法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した当該ポリペプチドを用いて、あるいは常法に従って当該ポリペプチドの部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した当該ポリペプチド、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００２０】
前記探索方法により同定されたアルツハイマー病関連因子は、アルツハイマー病への罹患の有無を判断するための疾患マーカーとして、アルツハイマー病を検出（診断）するために用いることができる。また、前記アルツハイマー病関連因子は、アルツハイマー病の改善薬、治療薬もしくは予防薬をスクリーニングするための標的因子となり得る。すなわち、前記アルツハイマー病関連因子もしくはアルツハイマー病関連因子をコードする遺伝子の発現又は機能を制御する物質が、アルツハイマー病の改善薬、治療薬もしくは予防薬となり得る。
【００２１】
以下の実施例において、本発明を具体的に説明するが、本発明はもとよりこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
アミロイドプラークの精製
アルツハイマー病患者のオートプシ脳（Ｈｕｄｄｉｎｇｅ  Ｂｒａｉｎ  Ｂａｎｋ、スウェーデン）を用い、アミロイドプラークの精製を行った。約２ｇの脳組織をプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ドイツ）を加えた７ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，ｐＨ  ７．４）を用いてホモジネートした。ホモジネート液はＴＢＳを用い最終液量を２５ｍＬに希釈し良く混和した。ホモジネート液を５００００ｇ、３０分間超遠心し、ペレットを得た。ペレットを３ｍＬのＴＢＳと用い良く混合し、ＴＢＳにて最終液量を２５ｍＬに希釈し、５００００ｇ、３０分間超遠心を行った。得られたペレットを同様にＴＢＳにて良く混和し、３０％スクロース液の上に載せ、ＳＷ４１型ローター（ベックマン、アメリカ合衆国）を用い、５００００ｇ、１時間超遠心した。その後超遠心チューブをチューブスライサーを用い５つの画分に分け、５０％飽和コンゴレットにて一晩かけて染色し、偏光（ｐｏｌａｒｉｓｅｄ  ｌｉｇｈｔ）にて観察した。ペレットは６０％スクロース液の上に載せ、ＴＬＳ−５５型ローター（ベックマン社、アメリカ合衆国）を用い、１６６０００ｇ、３時間超遠心した。得られたペレットはＴＢＳにて懸濁後、２５ｍｍシリンジフィルターホルダーを用い、４０μｍナイロンメッシュ（ミリポア社、アメリカ合衆国）にてろ過、１．５ｍＬのＴＢＳにて２回洗浄した。ろ液は１６０００ｇ、１０分超遠心し、得られたペレットを１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ（ＳＤＳ）にて２回洗浄した。ペレットを１２ｍＬの１０％スクロース液上に載せ、４０００ｇ、３０分遠心した。１ｍＬ毎１３画分に分け、各々乾燥させ偏光（ｐｏｌａｒｉｓｅｄ  ｌｉｇｈｔ）にて観察した。
その結果、ペレットに近い画分では、交雑物が少ないコンゴレッドで赤色に染まるアミロイドプラークコアが観察された（図２Ａ）。
【実施例２】
【００２３】
免疫染色
実施例１にて記載した６０％スクロース液による密度勾配超遠心により得られた粒子をコート化スライド（Ｓｕｐｅｒ  Ｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ，Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ社、ドイツ）上にて免疫染色した。非特異的染色は、ＤＡＫＯ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社、アメリカ合衆国）を３０分処理することにより除いた。スライドは、５０ｍＭ  ＴＢＳにて希釈したＡβに対するモノクローナル抗体６Ｅ１０にて、一晩４℃にてインクベートした。その後、抗マウス抗体を２次抗体として用い、Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、アメリカ合衆国）によるアビジン−ビオチン法を施行した。その後、ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ社、アメリカ合衆国）を用い可視化、ＤＰＸ（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ社、英国）にてマウントした。免疫染色の特異性は、６E１０抗体を用いずに同様の手順にて染色作業を行なうスライドの結果と比較することにより実施した。
その結果、コンゴレッドの赤色と共にＡβが茶色に染まり、アミロイドプラークコアにＡβが存在していることが判明した（図２Ｂ）。
【実施例３】
【００２４】
Ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
実施例１にて記載した、交雑物の少ない画分８から１２をまとめ、水にて洗浄後、顕微鏡スライド（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅ）上に広げた。空気中にて乾燥させた後にＬａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（レーザーキャプチャーマイクロスコピー）にセットした。レーザーパルスエネルギーは最大量の８０％を用いた。４０倍対物レンズを用い観察し、アミロイドプラークコアをコンピュータスクリーン上にてマーキング、３０μＬ水の入った０．６ｍＬ  ｔｕｂｅ  ｃａｐ内にｌａｓｅｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃａｐｔｕｌｔｉｎｇにより採取した。代表例として図３にて示すように、コンゴレッドにて染まるアミロイドプラークコアを完全に採取した。
【実施例４】
【００２５】
精製アミロイドプラークの溶解と消化
精製アミロイドプラークは、９０％  蟻酸にて２４時間攪拌することにより溶解し、−８０℃にて凍結し一晩かけて乾燥させた。０．５μｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にて３７℃、４時間インクベートすることによりトリプシン消化を行ない、ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、アメリカ合衆国）にて脱塩処理を施した。その後結合したペプチドを６μＬの７０％  アセトニトリル／３０％  水／０．２％酢酸により溶出した。溶出液は、５分間かけて真空遠心（Ｈｅｔｏ  Ｌａｂ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ａ／Ｓ社、デンマーク）を実施することにより１から２μＬの溶媒が残るまでエバポレートした。
【実施例５】
【００２６】
ＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ解析
実施例にて調製した測定サンプルは１μＬループを装着したナノ−ＬＣインジェクター（Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アメリカ合衆国）を用い、０．１×１５０ｍｍ  Ｃ１８カラム（ＹＭＣ株式会社、日本）にアプライした。ペプチドは０．２％  Ｆｏｒｍｉｃ  Ａｃｉｄ（蟻酸）を含有した水／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅの混液にて溶出した。混液は１０分間で１０から２０％のａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ、その後1時間で２０から５０％のａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌとなるグラジエントをかけた。流速は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ナノポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アメリカ合衆国）にて４００ｎｌ／分に設定した。ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅを装着したＡｇｉｌｅｎｔ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アメリカ合衆国）とカラムを結合させ分析した。マススペクトラはｍ／ｚ  ２４０から２０００まで記録し、各スペクトラにて大きなピーク３つをMS／MS解析に供した。サイクル時間は１２ｓに設定した。MS／MSスペクトラはＮＣＢＩｎｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａ  ｂａｎｋとＭａｓｃｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国）を用い解析した。解析の際は、Ｆｏｒｍｉｃ  Ａｃｉｄ（蟻酸）によるメチオニンの酸化に考慮した。
ＨＰＬＣ−ＭＳ解析の結果、Ａβの１７から２８残基のペプチド（Ａβ１７−２８）の分子量に相当するピークが観察された。さらにＭＳ/ＭＳ解析を実施したところ、Ａβ１７−２８が同定された。以下の表１は、Ａβ１７−２８のシークエンスとＭＳ/ＭＳ解析により想定されるフラグメントのマス、およびＭＳ/ＭＳ解析により実際に検出されたフラグメントのマス（太字）を示している。
【００２７】
【表１】
2005206479.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、アミロイドプラークコアの単離、精製の簡略な流れを示した図である。組織ホモジネート液は遠心操作と洗浄により、可溶成分を除去する（Ａ）。不溶化ペレットは、３０％スクロース液上にのせ、５００００ｇにて１時間遠心する。その後６０％スクロース液上にのせ、１６６０００ｇにて３時間遠心する（Ｂ）。アミロイドプラークコアを含む画分を１％  ＳＤＳ含有ＴＢＳバッファにて溶解し、４０μｍのナイロンメッシュに通す（Ｃ）。ろ液はＴＢＳにて洗浄し１０％スクロース液上に載せ、４０００ｇ、３０分遠心する（Ｄ）。ペレットに近い画分を集め、Ｌａｓｅｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃａｔａｐｕｌｔｉｎｇに用い、アミロイドプラークコアを単離、精製する（Ｅ）。
【図２】図２は精製したアミロイドプラークコアのコンゴレッドによる染色（Ａ）、および抗Ａβ抗体を用いた免疫染色（Ｂ）の結果を示した図である。
【図３】図３は、Ｌａｓｅｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃａｔａｐｕｌｔｉｎｇの実施例を示した図である。図中白三角印にて示す通り、Ｌａｓｅｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃａｔａｐｕｌｔｉｎｇの後（Ｂ）では、前（Ａ）に観察されたアミロイドプラークコアを完全に採取していることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００２９】
配列番号１：Ａβの部分配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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