(57)【要約】【課題】麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた、麹菌の培養方法の提供に当たって、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の発現機構等を解明する。【解決手段】麹菌の液体培養では、発酵原料によるカタボライトリプレッションが酵素生産性に大きく関与していることを解明し、麹菌難分解性糖質を発酵原料とすることによって、このカタボライトリプレッションを制御し、グルコアミラーゼをはじめとする種々の酵素の生産性を調整することができる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌の液体培養において、発酵原料によるカタボライトリプレッションを制御して、前記麹菌の液体培養によって発現する糖質分解酵素の生産性を調整する酵素生産性調整方法。
【請求項２】
前記カタボライトリプレッションを抑制して、前記糖質分解酵素の生産性を向上させる請求項１記載の酵素生産性調整方法。
【請求項３】
前記カタボライトリプレッションを促進させて、前記糖質分解酵素の生産性を抑制する請求項１記載の酵素生産性調整方法。
【請求項４】
前記発酵原料を、前記麹菌の難分解性糖質を含むものとする請求項１から３いずれか記載の酵素生産性調整方法。
【請求項５】
前記難分解性糖質を、前記糖質分解酵素による分解率が０．０１％以上５０％以下の糖質とする請求項４記載の酵素生産性調整方法。
【請求項６】
前記難分解性糖質を、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロース、及び、プルランよりなる群から選ばれる少なくとも一種とする請求項４又は５記載の酵素生産性調整方法。
【請求項７】
前記糖質分解酵素は、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及び、β−グルコシダーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１から６いずれか記載の酵素生産性調整方法。
【請求項８】
微生物による発酵生産において、発酵原料によるカタボライトリプレッションを制御して、前記微生物による発酵生産によって発現する酵素の生産性を調整する酵素生産性調整方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌の液体培養において、発酵原料によるカタボライトリプレッションを制御して、酵素の生産性を調整する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の酒類又は発酵食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。この固体培養法は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus・kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus・awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus・niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus・oryzae）、又は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus・sojae）等の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる培養方法である。
【０００３】
例えば、焼酎の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus・kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus・awamori）等の固体麹が広く用いられている。しかしながら、固体培養法は、原料や麹菌体が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多く、雑菌による汚染といった品質管理面での注意も要する。
【０００４】
これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易ではあるが、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少ない。ここで、液体培養法で得られる培養物とは、液体培養法で得られる培養物そのもの（以下、液体麹ともいう）、培養液、菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物をいう。
【０００５】
液体培養法で得られる培養物が利用されない大きな理由として、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが知られている（非特許文献１及び２参照）。
【０００６】
通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素である。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、グルコアミラーゼの活性は著しく低いことが知られている（非特許文献３及び４参照）。
【０００７】
即ち、液体培養法で得られる培養物を、実際の焼酎製造に利用するためには、培養工学的手法による麹菌のグルコアミラーゼ活性の向上や、焼酎仕込み方法の改良等が必須となる。これに関して、液体培養法で得られる麹菌体あたりのグルコアミラーゼ生産性が低い場合、高密度菌体培養することにより、培養物全体の活性を焼酎製造に十分なレベルまで増強させる方法が考えられる。しかしながら、麹菌の高密度菌体培養は、麹菌の形態制御をはじめとする種々の培養制御が必要とされるため、麹菌を高密度菌体培養することは容易ではない（非特許文献５及び６参照）。
【０００８】
従って、液体培養法で得られる培養物の焼酎製造への利用には、比較的培養が容易な低密度菌体培養によって、グルコアミラーゼ活性が増強された培養物が得られることが望ましいが、これまでに知られている方法では、厳密な制御又は特殊な培養装置が必要であり、実用的でない（特許文献１参照）。
【０００９】
一方、麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、麹菌培養系内にデンプン、デキストリン、又は、マルトース等の麹菌によって容易に分解、資化される糖質を添加する方法が知られており、遺伝子レベルでその発現機構も解明されつつある（非特許文献７参照）。しかしながら、実際の酒類等の製造においては、添加したこれらの糖質が麹菌によって速やかに資化されてしまうため、培養液中の麹菌密度が増加してしまい、培養液の粘性の上昇による通気不足、撹拌不十分といった現象が生じる。前述したように、麹菌の高密度培養の培養制御は困難であるため、上記糖質の添加培養も実用的な方法ではない。
【００１０】
また、麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、焙炒した穀類を麹菌培養液に添加する方法（特許文献２参照）も報告されているが、この方法では、穀類を焙炒するという、新たな製造工程が加わることになる。実際の焼酎製造においては、麹歩合を上げる、即ち、単一仕込み当たりの麹菌培養物の使用量を増やした仕込み方法も有効であると考えられるが、麹歩合の上昇は製麹プロセスの省力化、低コスト化という観点から望ましい方法ではない。また、酵素活性の低い液体麹を濃縮する方法や、市販酵素を添加する方法も報告されているが、安価な方法ではない（非特許文献８参照）。
【００１１】
そこで、本発明者らは、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた、麹菌の培養方法に関する発明を提案した（特許文献３参照）。この発明によれば、麹菌の液体培養において、酒類又は発酵食品の製造に使用可能な、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便且つ安価に培養することができる。
【特許文献１】特開平１１−２２５７４６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２１１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５１６５号公報
【非特許文献１】Iwashita  K.  et  al:“Biosci.Biotechnol.Biochem”.,62,（1998）1938−1946
【非特許文献２】山根雄一ら:“日本醸造協会誌”.,99，（2004）84−92
【非特許文献３】Ishida  H.  et  al:“J.Ferment.Bioeng”.,86,（1998）301−307
【非特許文献４】Morimura  S.  et  al:“J.Ferment.  Bioeng”.,71,（1991）329−334
【非特許文献５】Julie  M.  et  al:“Biotech.Bioeng”.,59,（1998）407−418
【非特許文献６】Pedersen  H.  et  al:“Appl.Microbiol.Biotechnol”.,53,（2000）272−277
【非特許文献７】Y.Hata  et  al:“Curr.Gent”.,22,（1992）85−91
【非特許文献８】土谷ら：“熊本県工業技術センター研究報告”.,（1994）58−61
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、本発明者らは、この発明の原理、即ち、如何なる機構によって、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物が得られるのかを解明するまでには至っていない。従って、本発明の目的は、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた、麹菌の培養方法の提供に当たって、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の発現機構等を解明することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、麹菌の液体培養では、発酵原料によるカタボライトリプレッション（異化産物抑制）が酵素生産性に大きく関与していることを突き止めるとともに、麹菌難分解性糖質を発酵原料とすることによって、このカタボライトリプレッションを制御し、グルコアミラーゼをはじめとする種々の酵素の生産性を調整することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１５】
（１）  麹菌の液体培養において、発酵原料によるカタボライトリプレッションを制御して、前記麹菌の液体培養によって発現する糖質分解酵素の生産性を調整する酵素生産性調整方法。
【００１６】
（２）  前記カタボライトリプレッションを抑制して、前記糖質分解酵素の生産性を向上させる（１）記載の酵素生産性調整方法。
【００１７】
（３）  前記カタボライトリプレッションを促進させて、前記糖質分解酵素の生産性を抑制する（１）記載の酵素生産性調整方法。
【００１８】
（４）  前記発酵原料を、前記麹菌の難分解性糖質を含むものとする（１）から（３）いずれか記載の酵素生産性調整方法。
【００１９】
（５）  前記難分解性糖質を、前記糖質分解酵素による分解率が０．０１％以上５０％以下の糖質とする（４）記載の酵素生産性調整方法。
【００２０】
（６）  前記難分解性糖質を、難消化性デキストリン、ポリデキストロース、水溶性セルロース、及び、プルランよりなる群から選ばれる少なくとも一種とする（４）又は（５）記載の酵素生産性調整方法。
【００２１】
（７）  前記糖質分解酵素は、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及び、β−グルコシダーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種である（１）から（６）いずれか記載の酵素生産性調整方法。
【００２２】
（８）  微生物による発酵生産において、発酵原料によるカタボライトリプレッションを制御して、前記微生物による発酵生産によって発現する酵素の生産性を調整する酵素生産性調整方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、麹菌の液体培養において、麹菌分解性糖質を発酵原料として使用することで、培養系内のグルコースを低濃度に保ちながら培養することが可能であり、ひいては、発酵原料によるカタボライトリプレッションを抑制し、酵素生産性を著しく向上させることができる。従来、カタボライトリプレッションを抑制する目的で、基質の流加培養法やパルスフィード法等の培養制御技術が検討されていたが、本法を用いれば、簡単な回分培養法で同等の酵素生産性を得ることができる。麹菌難分解性糖質を断続的に培養系内に流加した場合にあっては、さらに酵素生産性を向上させることができる。また、本発明は麹菌に限らず、カタボライトリプレッションにより物質生産が抑制されるような各種微生物を用いた発酵生産においても利用が期待できる。例えば、麹菌の酵素分泌システムを用いた高付加価値な異種タンパク質の生産においても、グルコアミラーゼプロモーターやα−アミラーゼプロモーターを強発現プロモーターとして利用している場合には、利用が期待できる。
【００２４】
また、本発明を利用した麹菌の培養方法によれば、液体培養によって、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及び、β−グルコシダーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素活性が増強された麹菌培養物を提供することができる。液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、品質が安定した麹を安価に製造することができる。液体培養によって得られる培養物そのものは、液体麹として利用することができ、固体麹を使用する従来の焼酎製造とは異なり、全工程を液相のままで行うことが可能なので、従来に比べ効率的かつ安定的な焼酎製造システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
＜麹菌＞
本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及び、β−グルコシダーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素生産能を有する麹菌であり、例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus・kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus・awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus・niger）等に代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus・oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus・sojae）等に代表される黄麹菌等が挙げられる。また、培地に接種する麹菌の形態は任意であり、胞子又は菌糸を用いることができる。
【００２６】
＜液体培地＞
本発明で使用する液体培地は、上記の麹菌が生育し、且つ、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地であればいずれでもよく、例えば、麹菌の難分解性糖質、及び、糸状菌の培養に一般的に用いられる窒素源、無機塩類等を含む液体培地が挙げられる。また、上記の麹菌が生育し、且つ、該麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地であれば、天然培地又は合成培地のいずれであってもよい。
【００２７】
上記窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物等を用いることができる。
【００２８】
上記無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００２９】
＜難分解性糖質＞
本発明で用いる麹菌の難分解性糖質とは、麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素によって、分解され難い性質を有する、α−結合を主鎖とするグルコースポリマーであり、水溶性の性質を有するものであれば如何なるものでもよい。具体的には、糖質分解酵素による分解率が50%以下の糖質、好ましくは0.01%〜50%の糖質、より好ましくは0.1%〜40%の糖質、さらに好ましくは0.5%〜30%の糖質、特に好ましくは1%〜20%の糖質である。これらの糖質は、全く分解されないのではなく、徐々に分解されてグルコースを放出する性質を有する。
【００３０】
本発明で用いる麹菌の難分解性糖質として、具体的には、麹菌を液体培養したときに発現する糖質分解酵素による分解率が50%以下である水溶性グルコースポリマーが挙げられる。より具体的には、難消化性デキストリン（製品名パインファイバー）、ポリデキストロース（製品名ライテス）、プルラン及び水溶性セルロース等が挙げられる。例えば、一般的な麹菌用合成培地であるツァペックドックス培地を改変し、炭素源として2%麹菌難分解性デキストリン（パインファイバーもしくはポリデキストロース）を添加した培地を用いて液体培養を行うと、通常よく用いられる酵素誘導基質であるデキストリンを用いた場合に比べて、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、その他の酵素の生産性を２倍〜１３倍に向上させることができる。
【００３１】
［糖質分解酵素による分解率］
また、上記の糖質分解酵素による分解率は、次の方法により決定される。即ち、1gの糖質を、10mmol/L酢酸緩衝液（10mmol/L酢酸：10mmol/L酢酸ナトリウム＝3.2:6.8の比で混合したもの、pH5.0）10mLに溶解し、121℃、20分間、オートクレーブ処理する。これに麹菌酵素液10mLを投入し、30℃で12時間処理した後、該処理液の上清（以下、処理上清という）の還元糖量を測定する方法により決定される。
【００３２】
麹菌酵素液としては、以下の方法により調製したものを用いる。先ず、改変ツァペックドックス培地［マルトース2％、ポリペプトン（Difco）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、硫酸鉄7水和物0.01%］100mlを、容量500mlのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、その後の実際の酒類又は発酵食品の製造に用いる麹菌、例えば焼酎の製造にアスペルギルス・カワチ（Aspergillus・kawachii）IFO4308を用いる場合は、このIFO4308を接種し、30℃、100rpmにて48時間培養する。この培養液をろ紙（アドバンテック社製、No.5A）にてろ過し、その上清10mLを透析膜に入れ、10mmol/L酸緩衝液（10mmol/L酢酸：10mmol/L酢酸ナトリウム＝3.2:6.8の比で混合、pH5.0）に対して低温で一晩透析した後、水で10mLにしたものを、麹菌酵素液とする。
【００３３】
処理上清の還元糖量は、例えば第四回改正所定分析法注解［注解編集委員会編、日本醸造協会（1993）］に記載の方法に従い測定できる。具体的には、フェーリング溶液10mLを300mL容三角フラスコにとり、水40mL及びブドウ糖標準溶液約18mLを加えて電気コンロ上で沸騰させ、なお沸騰を続ける程度に火力を弱めて2分間沸騰を続けた後、ビューレットよりブドウ糖標準溶液を滴下し、硫酸銅の青色がなくなってから、メチレンブルー溶液4滴を加えて煮沸しつつ、さらに液を滴下して青色が消失したところを終点とする。滴定は沸騰を始めてから3分以内に終わらせる。ここで使用したブドウ糖標準液の全量をｂｍLとする。
【００３４】
次に、フェーリング溶液10mLを再び三角フラスコにとり、処理上清の適当量（糖量50mg以下を含むようにようにする）をピペットで加え、前記の操作に従ってブドウ糖標準溶液を用いて滴定し、このmL数をｍとすれば還元糖は、以下の数式１により求められる。
【００３５】
【数１】
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【００３６】
なお、上記で用いるメチレンブルー溶液は、メチレンブルー1gを水に溶かして調製する。また、フェーリング溶液はＡ液とＢ液の２種類の溶液を調製し、これを5mLずつ加えて調製する。Ａ液は、硫酸銅・5水和物34.639ｇを水に溶かして500mLとし、2日間放置後ろ過して使用する。Ｂ液は酒石酸カリウム・4水和物173gと水酸化ナトリウム50gを水に溶かして500mLとし、これを2日間放置後ろ過して使用する。ブドウ糖標準液は、ブドウ糖2.046gと安息香酸1gを水に溶かして１Lとしたものを使用する。
【００３７】
前記の方法によって求めた処理上清還元糖の値から、糖質の分解率を以下の数式２に従って算出する。
【００３８】
【数２】
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【００３９】
麹菌の難分解性糖質の培地への添加量は特に制限されないが、好ましくは0.1〜5%（重量／容量）、より好ましくは1〜2%（重量／容量）である。また、糖質の添加時期については、培養初発から添加することが好ましいが、菌体増殖が定常期に入る培養1日〜2日目に添加してもよい。また、難分解性糖質が、断続的もしくは連続的に培養系内に添加される培養方法であってもかまわない。
【００４０】
＜培養＞
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行い、培養温度は15〜45℃が好ましく、より好ましくは30〜40℃である。撹拌数や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよい。培養時間は通常1〜7日間である。また、本発明の培養方法では、ペレット状の菌形態で培養が進行するため、デキストリン等の糖質添加培養のようにパルプ状の菌形態を示す培養に比べ、格段に液体培地の粘性が低く、撹拌不足による酸素律速等の培養工程における障害が回避され、培養工程の管理が容易である。
【００４１】
ここで、ペレット状とは、液体培養における糸状菌が示す形態の一種で、1個ずつが独立し、肉眼で容易に確認できる大きさの菌糸塊であって、球状又は球状に近似した形状を示す菌形態である。また、パルプ状とは、繊維状の菌糸群が液中にほぼ均一に分散している菌形態とされている［Aspergillus,  Plenum  Press,  New  York（1994）］。上記の培養法で得られる培養物及び培養物の処理物としては、培養物そのもの、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、麹菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等が挙げられる。
【００４２】
＜酒類又は発酵食品の製造＞
培養物又は培養物の処理物は、酒類又は発酵食品の製造に用いることができる。例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各醪仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、醪仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、みそを製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、培養物又は培養物の処理物を固体麹の代わりに用いることができる。
【００４３】
また、上記した培養物若しくは該培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等を用いて酒類又は発酵食品の製造に用いる場合には、全行程を液相で行うことができる。全工程を液相で行う酒類の製造方法としては、例えば焼酎を製造する場合、とうもろこし、麦、米、いも、さとうきび、黒糖等を原料に用い、該原料を約80℃の高温で耐熱性酵素剤を使って溶かした後、これに上記した培養物若しくは該培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物、及び酵母を添加することでアルコール発酵させた発酵液を、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。
【００４４】
また、清酒の製造法としては、米を原料に用い、原料を約80℃の高温で耐熱性酵素剤を使って溶かした後、これに上記した培養物若しくは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物、及び酵母を添加することでアルコール発酵させ、発酵液を圧搾等によりろ過して製造する方法が挙げられる。グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、及び、β−グルコシダーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素を含有する麹菌培養物は、上記した液体培地、培養方法に従って麹菌を培養することにより製造できる。グルコアミラーゼ活性とα−グルコシダーゼ活性は、キッコーマン（株）製の糖化力分別定量キットを用いて、α−アミラーゼは、キッコーマン（株）製のα−アミラーゼ測定キットを用いて、β−グルコシダーゼ活性はｐ−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドを基質とする岩下らの方法［Iwashita.K.,  et.al.,  Biosci  Biotechnol  Biochem,62,10,1938-46(1998)］に従って測定することができる。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例で用いているアスペルギルス・オリーゼ（RIB40）は、独立行政法人酒類総合研究所の保有菌株リストに記載されており、請求により分譲を受けることができる。また、アスペルギルス・アワモリ（IFO4388）、アスペルギルス・カワチ（IFO4308）は、財団法人発酵研究所発行のカタログに記載されており、請求により分譲を受けることができる。
【００４６】
各酵素の比活性は、麹菌体量並びに酵素活性量をそれぞれ測定した後、以下の数式３により決定した。
【００４７】
【数３】
2005295871.tif 000005
【００４８】
培養物の酵素活性は、以下の方法により測定した。即ち、グルコミラーゼ活性とα−グルコシダーゼ活性は、キッコーマン（株）製の糖化力分別定量キットを用いて測定し、α−アミラーゼ活性は、キッコーマン（株）製のα−アミラーゼ測定キットを用いて測定した。また、β−グルコシダーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドを基質とする岩下らの方法に従って測定［Iwashita.K.,  et.al.,  Biosci  Biotechnol  Biochem,62,10,1938-46(1998)］した。詳しくは、4ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド溶液0.25ｍｌに50ｍＭ酢酸緩衝液(pH5.0)0.5ｍｌの混合溶液を37℃で約5分間予備加温した後、酵素溶液（麹菌培養物から遠心分離により菌体を除いた培養上清）0.25ｍｌを加え、よく混合して反応を開始した。37℃で正確に15分間反応させた後、200ｍＭ炭酸ナトリウム溶液2.0ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止させた。この反応終了液を吸光度測定用セルに入れ、波長410nmで吸光度（Es）を測定した。ブランク値の測定として、上記反応液を37℃で20分間加熱した後、200ｍＭ炭酸ナトリウム溶液2.0ｍｌを加えてよく混合した液の吸光度（Eb）を測定した。測定値を基にして、β−グルコシダーゼ活性（U/ml）は以下の式により求めた。なお、β−グルコシダーゼ活性１Uは、ｐ−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドに作用して37℃、1分間に１nmolのｐ−ニトロフェノールを遊離する力価と定義した。
【００４９】
【数４】
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【００５０】
培養物の麹菌体量は、培養物中の麹菌体を溶菌酵素で分解した後、遊離するＮ−アセチルグルコサミンを、キッコーマン（株）製麹菌体量測定キットを用いて測定して求めた。また、培養系内のグルコース濃度測定は、培養上清（培養物を遠心分離により固液分離した上清）のグルコース濃度を和光純薬工業（株）製のグルコースB−テストワコーキットを用いて測定した。
【００５１】
＜試験例１＞
糖質の分解率は、上記した方法により麹菌酵素液を調製し、麹菌酵素液を用いて上記した第四回改正所定分析法注解に記載の方法に従い、還元糖量を測定することにより決定した。糖質には、イソマルトース、マルトトリオース、デキストリン、可溶性デンプン、ポリデキストロース（カルター・フードサイエンス社製のライテス）、難消化性デキストリン（松谷化学工業製のパインファイバー）、水溶性セルロース（日本食品化工社製のセルエース）及びプルラン（林原商事社製）を用いた。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2005295871.tif 000007
【００５３】
＜実施例１＞
［改変ツァペックドックス培地を用いた酵素活性が増強された麹菌培養物の製造］
ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、硫酸鉄7水和物0.01%を含有する培地に、グルコース、マルトース、デキストリン、パインファイバー（難消化性デキストリン、松谷化学工業製）またはライテス（ポリデキストロース、カルター・フードサイエンス社製）を2％になるように加えた培地（ｐＨ無調整）100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコにはり込み、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・オリーゼ（RIB40）の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、振とう速度100rpmにて72時間培養を行なった。培養終了後、培養物の菌体量並びにグルコアミラーゼ活性、α−アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性を測定し、菌体量あたりの比活性を評価した。表２に各炭素源における培養物の各酵素の比活性を示した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
その結果、パインファイバー並びにライテスを添加した区においては、酵素発現誘導能が高いことが知られているデキストリン添加区に比べ、グルコアミラーゼ活性が５．６倍、５．４倍、α−アミラーゼ活性が５．８倍、６．１倍、α−グルコシダーゼ活性が１．６倍、１．８倍に上昇した。
【００５６】
＜実施例２＞
［改変ツァペックドックス培地を用いた酵素活性が増強された麹菌培養物の製造］
ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム７水和物0.05%、硫酸鉄７水和物0.01%を含有する培地に、グルコース、マルトース、デキストリン、パインファイバー（難消化性デキストリン、松谷化学工業製）またはライテス（ポリデキストロース、カルター・フードサイエンス社製）を2％になるように加えた培地（ｐＨ無調整）100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコにはり込み、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・アワモリ（IFO4388）の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、振とう速度100rpmにて72時間培養を行なった。培養終了後、培養物の菌体量ならびにグルコアミラーゼ活性、α−アミラーゼ活性、α−グルコシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性を測定し、菌体量あたりの比活性を評価した。表３に各炭素源における培養物の各酵素の比活性を示した。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
その結果、パインファイバー並びにライテスを添加した区においては、酵素発現誘導能が高いことが知られているデキストリン添加区に比べ、グルコアミラーゼ活性が２．９倍、２．１倍、α−アミラーゼ活性が３．８倍、６．３倍、α−グルコシダーゼ活性が３．２倍、２．３倍、β−グルコシダーゼ活性が１３．０倍、８．５倍に上昇した。
【００５９】
＜実施例３＞
［改変ツァペックドックス培地を用いた酵素活性が増強された麹菌培養物の製造］
ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム７水和物0.05%、硫酸鉄７水和物0.01%を含有する培地に、デキストリン、難消化性デキストリンである松谷化学工業製のパインファイバーを2％になるように加えた培地（ｐＨ無調整）3Lを（株）丸菱バイオエンジ製5Lジャーファーメンターにはり込み、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・カワチ（IFO4308）の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種した。その後、温度30℃、撹拌数200rpm、通気量0.5vvmにて72時間培養を行なった。培養途中に経時的にサンプリングを行い、培養物のグルコアミラーゼ活性及び培養上清中のグルコース濃度を測定した。図１及び図２にその結果を示した。
【００６０】
図１及び図２に示す通り、麹菌難分解性糖質であるパインファイバーを添加した培養においては、培養系のグルコース濃度を培養全般にわたって低く維持することが可能であり、グルコアミラーゼ活性を増強することが可能であった。つまり、流加培養法や連続培養法を行なわずとも、簡単な回分培養法でもカタボライトリプレッションを解除しながら培養可能であることが示された。
【００６１】
＜実施例４＞
［改変ツァペックドックス培地を用いた麹菌培養におけるグルコアミラーゼ遺伝子の発現解析］
グルコース2％、ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、硫酸鉄7水和物0.01%を含有する培地（pH無調整）100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコにはり込み、オートクレーブ滅菌後、アスペルギルス・カワチ（IFO4308）の胞子懸濁液を1×106胞子数/mlになるように接種し、30℃、振とう速度100rpmにて、24時間培養した。培養した菌体を無菌的に回収後、生理食塩水にて3回洗浄し、グルコアミラーゼ遺伝子を誘導する培地へ植菌した。即ち、ポリペプトン（Difco社製）1％、リン酸水素2カリウム0.1%、塩化カリウム0.05%、硫酸マグネシウム7水和物0.05%、硫酸鉄7水和物0.01%を含有する培地に、デキストリン、もしくはパインファイバー（難消化性デキストリン、松谷化学工業製）を2％になるように加えた培地（ｐＨ無調整）100mlを容量500mlのバッフル付三角フラスコにはり込み、オートクレーブ滅菌後、上記のアスペルギルス・カワチ（IFO4308）の培養菌体を全量接種し、37℃、振とう速度100rpmにて培養することで、グルコアミラーゼ遺伝子の発現を誘導した。続いて、遺伝子の転写発現解析法であるノーザン解析を行うために、培養3時間目、6時間目、12時間目、24時間目に無菌的に一部の菌体を回収し、それぞれの全RNAを調製した。全RNAの調製にはRNA抽出試薬であるRNeasy  Plant  Kit（アマシャムバイオサイエンス製）を用いた。続いて常法に従い、約20μgの全RNAを、ホルムアミドアガロース（1％）ゲルを用いて電気泳動を行った後、Hybond−N＋ナイロンメブラン（アマシャムバイオサイエンス製）へ転写した。ハイブリダイゼーション、プローブの標識、核酸の検出には、標識・検出試薬であるAlk  Phos  Direct（アマシャムバイオサイエンス製）を用い、LAS−1000plus（富士写真フィルム工業製）にて検出した。また、標識プローブには、アスペルギルス・カワチ（IFO4308）のゲノミックDNAを鋳型にPCRで増幅したグルコアミラーゼ遺伝子（gla−１）の約2.3kbのフラグメントを用いた。図３に、グルコアミラーゼ遺伝子のノーザン解析の結果を示した。
【００６２】
麹菌難分解性糖質であるパインファイバーを添加した培養においては、デキストリンを添加したときに比べ、グルコアミラーゼ遺伝子の発現が顕著に上昇していることがわかった。特に、図中に破線で囲んだ発現誘導後3時間目には、シグナル強度に顕著な差異が確認され、麹菌難分解性糖質が遺伝子の転写発現を活性化する作用を有していることが示された。これは、培養系内のグルコース濃度が低いために、グルコースを介したカタボライトリプレッションが解除され、グルコアミラーゼ遺伝子の転写が活性化したためであると考えられる。
【００６３】
本実施例により、回分培養法においても簡便に培養系内のグルコース濃度を低く維持することが可能であり、それによって通常カタボライトリプレッションを受けやすい酵素群が顕著に増強されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例３における培養物のグルコアミラーゼ活性を示す図面である。
【図２】実施例３における培養上清中のグルコース濃度（％）を示す図面である。
【図３】実施例４におけるグルコアミラーゼ遺伝子のノーザン解析結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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