(57)【要約】【課題】本発明は、殺虫剤としての活性を有する物質を特定するための方法に関するものである。【解決手段】本発明は、特に、膜調製物での標識フタル酸ジアミドを用いる結合アッセイ、および、非標識試験物質によるこれらの標識フタル酸ジアミドの置換に関係する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）
【化１】
2005114718.tif 000007
｛式中、
Ｋはハロゲン、シアノ、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシまたはハロゲノアルコキシを表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素、シアノ、場合によってハロゲンで置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキル、または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１は、場合によって置換されたアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンを表し、
Ｑは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロゲノアルキル、それぞれのケースで場合によって置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキル、アルキルカルボニルもしくはアルコキシカルボニル、それぞれのケースで場合によって置換されたフェニル、ヘタリール、または基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｍ−または
【化２】
2005114718.tif 000008
を表し、
Ｒ４は水素、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、フェニル、フェニルアルキル、フェニルアルコキシ、ヘタリール、ヘタリールアルキルを表し、
Ｒ５は水素、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、フェニルカルボニルまたはフェニルアルコキシカルボニルを表す）
を表し、
ｋは１から４までの数字を表し、
ｍは０から２までの数字を表す］
の基を表し、または
Ｒ１とＲ２は、ヘテロ原子で場合によって中断されていてよい、場合によって置換された４員から７員の環を共に形成しており、
Ｌ１およびＬ３は、互いに独立して水素、ハロゲン、シアノ、または、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルコキシ、アルク−Ｓ（Ｏ）ｍ−、フェニル、フェノキシもしくはヘタリールオキシを表し、
Ｌ２は水素、ハロゲン、シアノ、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲノアルキル、シクロアルキル、フェニル、ヘタリール、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、フェニルまたはヘタリールを表す］
を表し、または
Ｌ１とＬ３、またはＬ１とＬ２は、ヘテロ原子で場合によって中断されていてよい、場合によって置換された５員から６員の環を場合によって共に形成している｝
の化合物の分子標的を包含した膜調製物または細胞系での、ｉ）一般式（Ｉ）で示される標識化合物の置換、または、ｉｉ）一般式（Ｉ）の化合物と同じ結合部位へ結合する標識化合物の置換が測定されることを特徴とする、殺虫剤としての活性を有する物質を特定するための方法。
【請求項２】
Ｋがフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシまたはＣ１−Ｃ６−ハロゲノアルコキシを表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素、シアノ、場合によってハロゲンで置換されたＣ３−Ｃ６−シクロアルキル、または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１はＣ１−Ｃ８−アルキレン、Ｃ３−Ｃ６−アルケニレンまたはＣ３−Ｃ６−アルキニレンを表し、
Ｑは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロゲノアルキルを表し、または、フッ素、塩素、Ｃ１−Ｃ６−アルキルもしくはＣ１−Ｃ６−アルコキシで場合によって置換され、１つの環員または直接的に隣接していない２つの環員が酸素及び／又はイオウで場合によって置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキルを表し、または、それぞれがハロゲンで場合によって置換されたＣ１−Ｃ６−アルキルカルボニルもしくはＣ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、フェニルもしくはヘタリール環のそれぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって置換されている、５個から６個の環原子を有する該フェニルもしくはヘタリールを表し、または基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｍ−または
【化３】
2005114718.tif 000009
を表し、
Ｒ４は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ８−アルキル、Ｃ３−Ｃ８−アルケニル、Ｃ３−Ｃ８−アルキニル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ２−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、それぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、ニトロもしくはシアノ、５個から６個の環原子を包含するヘタリールで場合によって一つから四つまでの置換が為されたフェニル、Ｃ１−Ｃ４−フェニルアルキル、Ｃ１−Ｃ４−フェニルアルキルオキシ、ヘタリールもしくはヘタリールアルキルを表し、
Ｒ５は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、それぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、ニトロもしくはシアノで場合によって一つから四つまでの置換が為されたフェニルカルボニルもしくはフェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキルオキシカルボニルを表す）
を表し、
ｋが１から３までの数字を表し、
ｍが０から２までの数字を表す］
の基を表し、または
Ｒ１とＲ２が、酸素またはイオウ原子で場合によって中断されていてよい、５員から６員の環を形成しており、
Ｌ１およびＬ３が、互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ４−ハロアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、フェノキシ、ピリジルオキシ、チアゾリルオキシもしくはピリミジルオキシを表し、
Ｌ２が水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノを表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルを表し、または、フッ素もしくは塩素で場合によって置換されたＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、ピリジル、チエニル、ピリミジルもしくはチアゾリルを表し、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ８−アルキル、Ｃ２−Ｃ８−アルケニル、Ｃ３−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、ピリジル、ピリミジルもしくはチアゾリルを表す］
を表し、または
Ｌ１とＬ３、またはＬ１とＬ２が、それぞれのケースにおいて、１個もしくは２個の酸素原子で場合によって中断されていてよい、フッ素及び／又はＣ１−Ｃ２−アルキルで場合によって置換された５員から６員の環を共に形成している、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｋが塩素、臭素またはヨウ素を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３が、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１はＣ１−Ｃ８−アルキレン、Ｃ３−Ｃ６−アルケニレンまたはＣ３−Ｃ６−アルキニレンを表し、
Ｑは水素、フッ素、塩素、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキルまたは基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ４は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって一つから三つまでの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ６−アルケニル、Ｃ３−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表す）
を表し、
ｋは１から３までの数字を表し、
ｍは０から２までの数字を表す］
の基を表し、
Ｌ１およびＬ３が、互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルコキシを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一置換または二置換されたフェニルもしくはフェノキシを表し、
Ｌ２が水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノを表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって一つから三つまでの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって１個から１３個までの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから二つまでの置換が為されたフェニルもしくはピリジルを表す］
を表す、
ことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一般式（Ｉ）の化合物が以下の化合物：
【化４】
2005114718.tif 000010
であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
一般式（Ｉ）の化合物が放射性同位体で標識されることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）の化合物がトリチウム化されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の段階：
ａ１）成体生物もしくは前記生物の幼虫から始めて膜調製物を生成する段階、または
ａ２）一般式（Ｉ）の化合物の分子標的を発現する細胞から始めて膜調製物を生成する段階、
ｂ）上記膜調製物から始めてタンパク質溶液を調製する段階、
ｃ）上記タンパク質溶液と一般式（Ｉ）の標識化合物を、該標識化合物が前記分子標的へ結合するのを許容する条件下において接触させる段階、
ｄ）段階ｃ）で調製された混合物を非標識試験物質と接触させる段階、
ｅ）上記試験物質による前記標識化合物の置換が起こっているかどうかを測定する段階、および、適切な場合には
ｆ）該試験物質の殺虫剤としての特性を試験する段階、
を特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階ａ１）における膜調製物が、種  イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の成体昆虫から始めて生成されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ１）における膜調製物が、種  タバコバドウォーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の成体昆虫または前記昆虫の幼虫から始めて生成されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺虫剤活性化合物を特定するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フタル酸ジアミドのクラスからの化合物（ＥＰ−Ａ−１  ９１９，５４２号、ＥＰ−Ａ−１  ００６，１０７号、ＷＯ第０１／００５７５号、ＷＯ第０１／００５９９号、ＷＯ第０１／４６１２４号、ＪＰ第２００１−３３．５５５．９号、ＷＯ第０１／０２３５４号、ＷＯ第０１／２１５７６号、ＷＯ第０２／０８８０７４号、ＷＯ第０２／０８８０７５号、ＷＯ第０２／０９４７６５号、ＷＯ第０２／０９４７６６号、ＷＯ第０２／０６２８０７号参照）は、非常に強力な殺虫剤である。これらの化合物が作用するメカニズムはまだ公認されておらず、新たな活性原理を構成している。それ故、これと同じメカニズムに支配されている活性化合物を特定するための高効率のスクリーニング方法は非常に有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明の目的は、これらのフタル酸ジアミドの場合と同じ標的に作用することによって機能する殺虫剤活性化合物を特定することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目的は、以下の一般式（Ｉ）：
【０００５】
【化５】
2005114718.tif 000002
｛式中、
Ｋはハロゲン、シアノ、アルキル、ハロゲノアルキル、アルコキシまたはハロゲノアルコキシを表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素、シアノ、場合によってハロゲンで置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキル、または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１は、場合によって置換されたアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンを表し、
Ｑは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロゲノアルキル、それぞれのケースで場合によって置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキル、アルキルカルボニルもしくはアルコキシカルボニル、それぞれのケースで場合によって置換されたフェニル、ヘタリール（ｈｅｔａｒｙｌ）、または基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｍ−または
【０００６】
【化６】
2005114718.tif 000003
を表し、
Ｒ４は水素、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキル−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、フェニル、フェニルアルキル、フェニルアルコキシ、ヘタリール、ヘタリールアルキルを表し、
Ｒ５は水素、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、フェニルカルボニルまたはフェニルアルコキシカルボニルを表す）
を表し、
ｋは１から４までの数字を表し、
ｍは０から２までの数字を表す］
の基を表し、または
Ｒ１とＲ２は、ヘテロ原子で場合によって中断されていてよい、場合によって置換された４員から７員の環を共に形成しており、
Ｌ１およびＬ３は、互いに独立して水素、ハロゲン、シアノ、または、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルコキシ、アルク（ａｌｋ）−Ｓ（Ｏ）ｍ−、フェニル、フェノキシもしくはヘタリールオキシを表し、
Ｌ２は水素、ハロゲン、シアノ、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロゲノアルキル、シクロアルキル、フェニル、ヘタリール、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれのケースで場合によって置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、フェニルまたはヘタリールを表す］
を表し、または
Ｌ１とＬ３、またはＬ１とＬ２は、ヘテロ原子で場合によって中断されていてよい、場合によって置換された５員から６員の環を場合によって共に形成している｝
の化合物の分子標的を包含した膜調製物または細胞系での、ｉ）一般式（Ｉ）で示される標識化合物の置換、または、ｉｉ）一般式（Ｉ）の化合物と同じ結合部位へ結合する標識化合物の置換が測定されることを特徴とする方法を提供することにより達成される。
【０００７】
一般式（Ｉ）で特定されている好適な置換基または一連の遊離基は以下で例証される。
【０００８】
Ｋは、好適にはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシまたはＣ１−Ｃ６−ハロゲノアルコキシを表す。
【０００９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、好適には、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素、シアノ、場合によってハロゲンで置換されたＣ３−Ｃ６−シクロアルキル、または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１はＣ１−Ｃ８−アルキレン、Ｃ３−Ｃ６−アルケニレンまたはＣ３−Ｃ６−アルキニレンを表し、
Ｑは水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ハロゲノアルキルを表し、または、フッ素、塩素、Ｃ１−Ｃ６−アルキルもしくはＣ１−Ｃ６−アルコキシで場合によって置換され、１つの環員または直接的に隣接していない２つの環員が酸素及び／又はイオウで場合によって置換されたＣ３−Ｃ８−シクロアルキルを表し、または、それぞれがハロゲンで場合によって置換されたＣ１−Ｃ６−アルキルカルボニルもしくはＣ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、フェニルまたはヘタリール環のそれぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって置換されている、５個から６個までの環原子を有するこれらのフェニルもしくはヘタリールを表し、または基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｍ−または
【００１０】
【化７】
2005114718.tif 000004
を表し、
Ｒ４は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ８−アルキル、Ｃ３−Ｃ８−アルケニル、Ｃ３−Ｃ８−アルキニル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル−Ｃ１−Ｃ２−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、それぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、ニトロもしくはシアノ、５個から６個までの環原子を包含し、特にフラニル、ピリジル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、ピリミジル、チアゾリルもしくはチエニルを表すヘタリールで場合によって一つから四つまでの置換が為されたフェニル、Ｃ１−Ｃ４−フェニルアルキル、Ｃ１−Ｃ４−フェニルアルキルオキシ、ヘタリールもしくはヘタリールアルキルを表し、
Ｒ５は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ６−アルキルカルボニル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシカルボニルを表し、または、それぞれがハロゲン、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、ニトロもしくはシアノで場合によって一つから四つまでの置換が為されたフェニルカルボニルもしくはフェニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキルオキシカルボニルを表す）
を表し、
ｋは１から３までの数字を表し、
ｍは０から２までの数字を表す］
の基を表す。
【００１１】
また、Ｒ１とＲ２は、酸素またはイオウ原子で場合によって中断されていてよい、５員から６員の環を形成することもできる。
【００１２】
Ｌ１およびＬ３は、好適には、互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ４−ハロアルキル−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、フェノキシ、ピリジルオキシ、チアゾリルオキシもしくはピリミジルオキシを表す。
【００１３】
Ｌ２は、好適には水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノを表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ１０−アルキル、Ｃ２−Ｃ１０−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルを表し、または、フッ素もしくは塩素で場合によって置換されたＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、ピリジル、チエニル、ピリミジルもしくはチアゾリルを表し、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって置換されたＣ１−Ｃ８−アルキル、Ｃ２−Ｃ８−アルケニル、Ｃ３−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから三つまでの置換が為されたフェニル、ピリジル、ピリミジルもしくはチアゾリルを表す］
を表す。
【００１４】
また、Ｌ１とＬ３、またはＬ１とＬ２は、それぞれのケースにおいて、適切な場合には１つもしくは２つの酸素原子で中断されていてよい、フッ素及び／又はＣ１−Ｃ２−アルキルで場合によって置換された５員から６員の環を共に形成することもできる。
【００１５】
Ｋは、特に好適には塩素、臭素またはヨウ素を表す。
【００１６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、特に好適には、それぞれのケースにおいて互いに独立して水素または式Ｍ１−Ｑｋ：
［式中、
Ｍ１はＣ１−Ｃ８−アルキレン、Ｃ３−Ｃ６−アルケニレンまたはＣ３−Ｃ６−アルキニレンを表し、
Ｑは水素、フッ素、塩素、シアノ、トリフルオロメチル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキルまたは基Ｔ−Ｒ４：
（式中、
Ｔは−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ４は水素を表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって一つから三つまでの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ６−アルケニル、Ｃ３−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表す）
を表し、
ｋは１から３までの数字を表し、
ｍは０から２までの数字を表す］
の基を表す。
【００１７】
Ｌ１およびＬ３は、特に好適には、互いに独立して水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルコキシを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルキル、Ｃ１−Ｃ２−ハロゲノアルコキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一置換または二置換されたフェニルもしくはフェノキシを表す。
【００１８】
Ｌ２は、特に好適には水素、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノを表し、または、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって一つから三つまでの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または基Ｍ２−Ｒ６：
［式中、
Ｍ２は−Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）ｍ−を表し、
Ｒ６は、それぞれがフッ素及び／又は塩素で場合によって１個から１３個までの置換が為されたＣ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニルもしくはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルを表し、または、それぞれがフッ素、塩素、臭素、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、シアノもしくはニトロで場合によって一つから二つまでの置換が為されたフェニルもしくはピリジルを表す］
を表す。
【００１９】
一般式（Ｉ）の化合物は、特に非常に好適には以下の化合物である：
【００２０】
【化８】
2005114718.tif 000005
【００２１】
一般式Ｉの化合物は、以下の出版物（ＥＰ−Ａ−０  ９１９  ５４２号、ＥＰ−Ａ−１  ００６  １０７号、ＷＯ０１／００５７５号、ＷＯ０１／００５９９号、ＷＯ０１／４６１２４号、ＪＰ２００１−３３５５９号、ＷＯ０１／０２３５４号、ＷＯ０１／２１５７６号、ＷＯ０２／０８８０７４号、ＷＯ０２／０８８０７５号、ＷＯ０２／０９４７６５号、ＷＯ０２／０９４７６６号、ＷＯ０２／０６２８０７号参照）に記載または包含されている既知の化合物である。これらの化合物は、これらの出版物に記載されている方法により調製することができる。
【００２２】
従って、本発明は、フタル酸ジアミドの分子標的を包含した適切な生物体の膜調製物または細胞系での、標識フタル酸ジアミドを用いる結合アッセイ、および、非標識試験物質によるこれらの標識フタル酸ジアミドの置換に関係する。原則的に、このような試験化合物または候補化合物は、非常に異なる化合物タイプに属し得るあらゆる化合物であってよい。当業者は、本発明による方法に適した化合物を含む多種多様なソースを熟知している。原理的に適したソースは、例えば、すべての実行可能な物質ライブラリーであり；低分子量化合物のライブラリー、特に小さな有機化学化合物が好適である。適切であれば、試験物質により、高い特異性を持って標的に結合するフタル酸ジアミド化合物を結合部位から置換することができる。標識は、検出を容易化するために行われる、置換される分子における修飾を意味するものとして一般的に理解されている。例として、放射能標識、蛍光標識または発光標識を挙げることができる。
【００２３】
本発明は、フタル酸ジアミドの分子標的が膜結合性であり、結合ストリッピング置換アッセイによる標的と為すことができるという知見に基づいている。
【００２４】
以下の文章は、本発明による方法の理論的なバックグラウンドを説明するものである。一般式（Ｉ）の化合物を「配位子」とも呼ぶ。
【００２５】
単純占有理論により、一次速度則の形態における可逆的な配位子−受容体結合が説明付けられる。結合実験においては、配位子は、通常、受容体濃度に比べて大量に過剰な状態で存在し、従って、遊離配位子の濃度は、一次近似において一定とみなすことができる。それ故、この結合速度論は、受容体濃度にのみ依存する（擬一次速度則）。
【００２６】
質量作用の法則は、結合平衡の位置が解離定数（会合定数の逆数）Ｋｄ＝Ｋａ−１＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝［Ｒ］・［Ｌ］／［ＲＬ］により記述されることを明記している：ｋｏｆｆは解離率であり、ｋｏｎは会合率であり、［Ｒ］は遊離受容体の濃度であり、［Ｌ］は非結合配位子の濃度であり、［ＲＬ］は受容体−配位子複合体の濃度である。これは、結合自由エネルギー：ΔＧ０＝Ｒ・Ｔ・ｌｎＫｄに比例する；ΔＧ０はギブスの結合自由エネルギーであり、Ｒは普遍気体定数：８．３１５Ｊ・ｍｏｌ−１・Ｋ−１であり、Ｔは絶対温度（ケルビン単位）である［Ｒｅｐｋｅ，Ｈ．、Ｃ．Ｌｉｅｂｍａｎｎ；Ｍｅｍｂｒａｎｒｅｚｅｐｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｉｈｒｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍｅ［膜受容体およびこれらのエフェクターシステム］；ＶＣＨ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、１９８７］。従って、ファクター１０だけ低減されたＫｄは、−５．７１ｋＪ・ｍｏｌ−１・Ｋ−１の自由結合エネルギーの利得を得ることを意味している。
【００２７】
特異的に結合した配位子の濃度［ＲＬ］は、飽和結合実験において、一定の受容体濃度における配位子濃度［Ｌ］の関数として決定される。この濃度を決定するため、配位子は、例えば放射性同位体を組み込むことにより、または発蛍光団で置換することにより標識される。［ＲＬ］対［Ｌ］をプロットすることにより典型的な飽和曲線が与えられる。［Ｌ］＝Ｋｄ、［ＲＬ］＝１／２［Ｒｔ］の場合；［Ｒｔ］、全受容体濃度は、遊離受容体の濃度［Ｒ］と受容体−配位子複合体の濃度［ＲＬ］の総和である。飽和性配位子濃度の存在下においては、受容体−配位子複合体の濃度は全受容体濃度に一致し、最大結合（Ｂｍａｘ）と呼ばれることも多い。
【００２８】
速度論的平衡パラメーターＫｄおよびＢｍａｘは、適切なＰＣプログラム、例えばＥＢＤＡ／ＬＩＧＡＮＤ（ＢｉｏＳｏｆｔ）またはＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳＰＳＳ）の助けを借りて、データを双曲線モデルに当てはめることにより算出される。
【００２９】
競合実験により、標識配位子の結合に及ぼす非標識試験物質（阻害剤、Ｉと呼ぶ）の影響が示される。最も単純ケースでは、阻害剤は、阻害剤と標識配位子が共有する結合部位を求めて標識配位子と競合する。
【００３０】
標識配位子の特異的結合の低減は、阻害剤濃度の関数として実験的に決定される。特異的結合対阻害剤濃度の対数をプロットすることにより特性Ｓ字状曲線が与えられ、この曲線の変曲点は、配位子結合の５０％が阻害される（ＩＣ５０値）阻害剤濃度を特徴的に示す。阻害剤の解離定数Ｋｉは、配位子濃度［Ｌ］および標識配位子の解離定数Ｋｄと以下の関係を有している：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（Ｉ＋［Ｌ］／Ｋｄ）［Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．、Ｗ．Ｈ．Ｐｒｕｓｏｆｆ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２、３０９９−３１０８（１９７３）］。
【発明の効果】
【００３１】
原理的に自動化が可能であり、従って、高効率の方法で実施することができる競合スクリーニングの助けを借りて、新規な構造および特性を有する受容体配位子が特定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明による方法は、以下で説明されている技術を用いて実施することができる。
【００３３】
配位子（即ち、一般式（Ｉ）の化合物）の放射能標識およびシンチレーション測定：
放射性同位体の組み込みは、過去および現在共に、親和性をベースとした高効率スクリーニングにおける最も常用的な受容体配位子に対する標識技術である。トリチウム（３Ｈ）および１２５Ｉは配位子の高い比放射能要件（＞３０Ｃｉ・ｍｍｏｌ−１）を満たし、これにより、ナノモルアッセイ濃度においてさえ、充分に高い信号対雑音比が可能になる。特にトリチウム化は配位子の生化学的特性を変えず、放射化学的な標準的方法（直接的な組み込み、ハロゲン／トリチウム置換、触媒を利用した水素添加）により比較的簡単で安価に実施することができる。放射化学的安定性の観点における、ヨウ素化と比べたトリチウム化の利点は、長い半減期である（１２．３年；これに比べ：１２５Ｉの半減期は６０日である）。
【００３４】
すべての通常の放射性結合試験は、結合配位子と遊離配位子の分離を必要とするという特徴を共有している。この分離は、平衡透析、遠心分離、ゲル濾過または適切な膜を通じる濾過により果たすことができる［Ｋｅｅｎ，Ｍ．（編集）；受容体結合技術（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１０６、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（１９９９）］。
【００３５】
小型化（マイクロタイタープレートフォーマット）および自動化（ロボット）が重要な意味を持つ上述の方法のうちの一つの技術の例は濾過法である。
【００３６】
広範囲にわたる物質ライブラリーを高効率でスクリーニングする観点から、結合配位子と遊離配位子の分離をせずに済ますことができる均一アッセイ法が開発された。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社からＳｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＳＰＡ）の名で販売されているシステムが広く使用されている。天然組織または遺伝子組換え発現組織から調製された可溶性膜結合受容体が、固相シンチレーターを含有する球形粒子に固定化される。放射性配位子が結合すると、放出されたβ粒子（電子）が上述のシンチレーターに光信号を発生させ、この光信号がβカウンターで測定される［Ｎｅｌｓｏｎ，Ｎ，；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５、２８７−２９３（１９８７）、Ａｌｏｕａｎｉ，Ｓ．；Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８、１３５−１４１（２０００）］。
【００３７】
研究用またはスクリーニング用にＳＰＡ法を使用した受容体の例が下文で詳述されている：ＩＰ３受容体［Ｐａｔｅｌ，Ｓ．ら；Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１５、Ｐｒｏｃ．Ｓｕｐｐｌ．３５ｐ．（１９９５）］、５−ＨＴｌｅ受容体［Ｋａｈｌ，Ｓ．Ｄ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２、３３−４０（１９９５）］、ＥＫＢＰ−１２を用いる配位子スクリーニング［Ｇｒａｚｉａｎｉ，Ｆ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ４、３−７（１９９９）］、α−アドレナリン作動性受容体［Ｇｏｂｅｌ，Ｊ．ら；Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．４２、２３７−２４４（１９９９）］、ＧＡＢＡＢ受容体［Ｕｒｗｙｌｅｒ，Ｓ．ら；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０、９６３−９７１（２００１）］。
【００３８】
受容体がマイクロタイタープレートの凹部に固定化されているＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ）も同様な仕方で機能する。結合された放射性配位子により放出されるβ粒子が、マイクロタイタープレート内の固相シンチレーターを励起する。
【００３９】
蛍光をベースとした様々な検出法の中でもとりわけ、蛍光偏光法（ＦＰ）が結合アッセイに特に適している。内在的に発蛍光性の配位子、または発蛍光団で標識された配位子が直線偏光で励起される。自由に拡散する励起配位子分子により放出される光の異方性は、これらの分子が励起状態寿命中に旋回運動および振動を行うため、かなり低い。これとは対照的に、受容体結合配位子の回転は大幅に制限されるため、これらの配位子が発する蛍光はかなり高い程度の偏光度（異方性）を有しており、この偏光度は、励起放射線の場合と略一致する。蛍光偏光度を測定することにより、結合配位子濃度および遊離配位子濃度の直接的な決定が可能になる［Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｓ．Ｓ．；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、４７−５３（２０００）］。
【００４０】
文献は、可溶性受容体、例えばステロイド受容体［Ｐａｒｋｅｒ，Ｇ．Ｊ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５、７７−８８（２０００）］、および膜結合受容体、例えばＧ−タンパク質結合受容体［Ａｌｌｅｎ，Ｍ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５、６３−７０（２０００）、ＢａｎｋｓＰ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５、１５９−１６８（２０００）］に対する、ＦＰをベースとした高効率の結合アッセイを記載している。
【００４１】
ＦＰ結合アッセイは、一般的に、サブナノモル濃度範囲における高い感度と良好な信号対雑音比により特徴付けられる。しかし、発蛍光性試験物質は信号を妨害する可能性がある。
【００４２】
以下の文章は、本発明による方法のための生物学的材料、特に膜調製物を如何にして得ることができるかを述べている。
【００４３】
動物試験体、特に農学に関連する有害な生物、例えば、生化学的または分子生物学的レベルで充分に研究されている果物バエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ）、イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）およびアメリカゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ならびにバッタおよびイナゴ（Ｌｏｃｕｓｔａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ  ｓｐｐ．）も含むが、植物または種子に害を及ぼす昆虫（特に同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）に属する昆虫）、クモ形動物（特にダニ目（Ａｃａｒｉｎａ））および植物寄生線虫などが、フタル酸ジアミド受容体を含有する生物学的な膜を調製するための適切な生物学的開始材料を構成する。
【００４４】
本発明による方法を実施するため、例えば、調製された昆虫の神経または筋肉組織を中性ｐＨの生物学的標準緩衝液中において均質化することができる。フタル酸ジアミド受容体を含有する膜調製物は分画遠心分離により得ることができる。完全な細胞、大きな細胞膜フラグメントおよび核が、約８００×ｇでの第一遠心分離段階で分離される。ミトコンドリアと大部分の細胞膜が約８０００×ｇのホモジネートから取り除かれる。フタル酸ジアミド受容体を含有する膜を１０５×ｇで沈降させ、適切な生物学的緩衝液中に懸濁させた後、使用するまで−２０℃から−８０℃で保存する。
【００４５】
好適には、種  タバコバドウォーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の成体生物もしくはこれらのＬ５齢生物、または種  イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）から始めて調製された膜調製物が本発明による方法で使用される。
【００４６】
本発明による方法の更なる実施態様では、参考文献［Ｘｕ，Ｘ．ら；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８、１２７０−１２８１（２０００）］からのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＣＧ１０８４４遺伝子または他の生物の対応する遺伝子に基づくｃＤＮＡが一時的または永続的に移入された宿主細胞、特にＣＨＯ細胞からの膜調製物を使用することができる。問題のｃＤＮＡを供給し、適切な宿主細胞内でこのｃＤＮＡを発現させることは、当業者の能力の範囲内である。この問題の遺伝子生成物が、一般式（Ｉ）の化合物の分子標的を構成する。フタル酸ジアミドの分子標的を発現しない細胞、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＳＦ９またはＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞などが宿主細胞として好適に使用される。
【実施例１】
【００４７】
水素をトリチウムで置換することによる、一般式（Ｉ）の標識化合物の調製
【００４８】
【化９】
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【００４９】
この実施例に示されている化合物は、文献から既知の標準的な方法により標識される。この方法によれば、非標識開始化合物（化合物１）が、触媒（１，５−シクロオクタジエン）（ピリジン）（トリシクロヘキシルホスフィン）イリジウム（Ｉ）へキサフルオロホスファートの助けを借りてトリチウム化される。開始材料（化合物１）をジクロロメタン中に溶解し、トリチウム雰囲気の存在下における一定の攪拌によりトリチウム化した。この後、使用した触媒をＨＰＬＣで除去した。これにより化合物２が得られ、この化合物を実施例２の結合実験における標識配位子として使用した。
【００５０】
このトリチウム化された化合物２の殺虫剤としての活性を以下で説明されている生物学的試験により確かめた。この殺虫剤活性は、非標識開始化合物（化合物１）の殺虫剤活性と差異がなかった。
【００５１】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ試験
溶媒：重量で７部のジメチルホルムアミド
乳化剤：重量で２部のアルキルアリールポリグリコールエーテル
適切な活性化合物調剤を生成すべく、重量で１部の活性化合物を上述の量の溶媒および乳化剤と混合し、この濃縮物を、乳化剤含有水で所望の濃度に希釈する。
【００５２】
キャベツの葉（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）を、所望濃度の活性化合物調剤に浸すことにより処理し、まだ葉が湿っているうちにアワヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）青虫を住まわせる。所望時間後、破壊の程度を％単位で決定する。
【実施例２】
【００５３】
殺虫剤活性化合物を特定するための、昆虫膜調製物での結合アッセイ
以下の文章は、試験物質と昆虫膜調製物における一般式（Ｉ）の化合物の結合部位との相互作用を決定するための方法の説明である。この放射性配位子結合法は自動化することができ、この高効率の方法により物質をスクリーニングするのに適している。
【００５４】
１．  ミクロソーム膜の調製
１．１  生物学的材料：
１．１．１  タバコバドウォーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）  Ｌ５齢、成体タバコバドウォーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、成体イエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）
１．１．２  果物バエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）  ＣＧ８２７２−ＲＡ遺伝子のｃＤＮＡが一時的または永続的に移入されたＣＨＯ細胞
１．２  緩衝液および試薬：
緩衝液１：２５ｍＭのＫ−ＰＩＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．３Ｍのスクロース、０．２ＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、商業的プロテアーゼ阻害剤カクテルのアリコート。
【００５５】
緩衝液２：２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．３Ｍのスクロース、１．０ｍＭのジチオトレイトール、０．８％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン。
【００５６】
１．３  調製：
１．３．１  昆虫組織：
Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘにより、幼虫、または成体昆虫の単離胸郭を緩衝液（１０ｍｌ・ｇ−１生物学的材料）中において均質化した。このホモジネートを２層のＭｉｒａｃｌｏｔｈガーゼを通じて濾過し、４℃において５００×ｇで１０分間遠心分離した。この上澄み液を４層のＭｉｒａｃｌｏｔｈガーゼを通じて再び濾過した後、４℃において８０００×ｇで２０分間遠心分離した。最後に、この上澄み液を４℃において１００，０００×ｇで６０分間超遠心分離することにより、ミクロソーム膜を沈降させた。
【００５７】
この沈降物を、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーにより少量の緩衝液２中に再懸濁させ、希釈し、タンパク質含量を１０−２０ｍｇ・ｍｌ−１にした。アリコートを液体窒素中において凍結させ、−８０℃で保管した。
【００５８】
１．３．２  移入細胞の膜調製物：
移入されたＣＨＯ細胞を緩衝液２中に懸濁させ、溶解した、この溶解物を、最初に４℃において５００×ｇで５分間遠心分離した。細胞を含まない上澄み液を４℃において１００，０００×ｇで６０分間遠心分離し、細胞膜を沈降させた。
【００５９】
この沈降物を、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーにより少量の緩衝液２中に再懸濁させ、希釈し、タンパク質含量を５−１０ｍｇ・ｍｌ−１にした。アリコートを液体窒素中において凍結させ、−８０℃で保管した。
【００６０】
２．  結合アッセイ：
２．１  緩衝液および試薬：
緩衝液３：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、８００μＭのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＡＴＰ、１．５ＭのＫＣｌ、０．０５％のウシ血清アルブミン。
【００６１】
緩衝液４：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＫＣｌ、４℃に予冷。
【００６２】
２．２  アッセイの実行：
マイクロタイタープレート（９６穴）に、それぞれのケースにおいて、５０μｌ／穴の適切な濃度（水／１％ＤＭＳＯ最終濃度中、陰性対照１％ＤＭＳＯ、望ましい場合には、陽性対照としての基準化合物）の試験物質溶液を充填した。
【００６３】
それぞれのケースで、１００μｌのタンパク質溶液（緩衝液３中に希釈、最終濃度：５０μｇのタンパク質／アッセイ混合物）と１００μｌの放射性配位子溶液（緩衝液３中に希釈、配位子の解離定数近辺の最終濃度：典型的には２−５ｎＭ）を加えた。
【００６４】
アッセイプレートを正確に２時間２２℃でインキュベートした。この後、ＧＦ／Ｂフィルター（０．１％ポリエチレンイミンで湿らせた）を通じてアッセイ混合物を濾過し、フィルターを２．０ｍｌの緩衝液４で洗った。これらのフィルターをシンチレーター溶液で処理し、結合された放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００６５】
特異的結合は、アッセイ混合物の測定された全放射能（Ｂｔｏｔａｌ）と、放射性配位子が少なくとも１０４倍過剰な量の適切な非標識配位子によって特異的結合部位から定量的に置換されている対照混合物の結合された放射能（＝Ｂｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）との差である。非特異的結合は、典型的には、全結合のうちの５％から２５％であり、最大の特異的結合は、使用した膜タンパク質のうちの１ｐｍｏｌ・ｍｇ−１から３ｐｍｏｌ・ｍｇ−１までの間である。
【００６６】
この濃度との関連における特異的放射性配位子結合の低減を利用して、活性な試験物質を特定することができる。
【００６７】
化学物質ライブラリーの高効率スクリーニングにおいて本方法を使用するときには、試験化合物は個々に検定され、または、特定の濃度、例えば１０μＭにおける８−１２の個々の化合物の混合物として検定される。陰性対照との比較における放射性配位子の結合の有意な低減（＞３０％）を利用して、配位子結合部位と特異的に相互作用する活性な試験化合物を特定することができる。
【実施例３】
【００６８】
濃度との関連における、試験化合物（化合物１）による式（Ｉ）の標識化合物（化合物２）の結合の阻害
図１は、濃度の関数として、試験物質（化合物２）による化合物１の特異的結合の阻害を示している。
【００６９】
データポイント（ＩＣ５０）に合致するＳ字状曲線の変曲点は、特異的配位子結合のうちの５０％が阻害される、この物質の濃度を示している：ＩＣ５０＝２５．１ｎＭ（ｒ２＝０．９５７）。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、濃度の関数として、試験物質（化合物２）による化合物１の特異的結合の阻害を示している。
【図１】
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【外国語明細書】
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