(57)【要約】【課題】  臨床検査や食品検査において、迅速、簡便に検査を行うことができる微生物の迅速検査装置およびそれを用いた微生物の迅速検査方法を提供する。【解決手段】  試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材７を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置１１からなる微生物の迅速検出装置であり、好ましくは、基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置が、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)イメージセンサまたはＣ−ＭＯＳ(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサを含む装置である前記した微生物の迅速検出装置。【選択図】  図２
2005172680.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置からなる微生物の迅速検出装置。
【請求項２】
目的微生物を特異的に捕捉する物質が、抗体である請求項１記載の微生物の迅速検出装置。
【請求項３】
基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置が、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)イメージセンサまたはＣ−ＭＯＳ(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサを含む装置である請求項１又は２記載の微生物の迅速検出装置。
【請求項４】
試料と、該試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材とを接触して該基板材上に目的微生物を捕捉し、捕捉した目的微生物を光学的に検出して計数することを特徴とする微生物の迅速検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査、食品検査、環境検査の分野で利用される試料中に存在する微生物の迅速検出装置及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査や食品検査において試料中の微生物の検査は、正確にかつ迅速に行われる必要がある。微生物検査で一般的に行われている培養検査法では、検査に熟練を要する上、10〜16時間の増菌培養、18〜24時間の分離培養が必要で、検体入手後検査成績が判明するまでには膨大な時間を要するものであり、これまで高感度で迅速な検査法の開発が望まれていた。
【０００３】
近年、これら培養検査法の問題点を解決する手段として、ＤＮＡプローブ法、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction ）法等の分子遺伝学的検査法やＥＬＩＳＡ法、逆受身ラテックス凝集反応法（ＲＰＬＡ法）、イムノクロマト法に代表される免疫学的検査法が開発され研究が進められている。これらの方法はいずれも、特異性、迅速性、簡便性等の点で優れ、しかも直接検体から検出できる可能性を有しているので、極めて迅速に診断が可能となり得るものとして期待されており、実用化されているものもいくつかある。これらの中でも免疫学的検査法は、抗原−抗体反応を利用するため特異性の点で特に優れているとされている。
しかし、ＰＣＲ法にはサーマル・サイクラーと呼ばれる温度制御装置が必要であり、ＤＮＡプローブ法、ＥＬＩＳＡ法なども蛍光検出装置や吸光光度計などが必要であった。また、逆受身ラテックス凝集反応法やイムノクロマト法は感度が低いため、大量の微生物や毒素が無ければ検出できない問題があった。さらに、これらの検出方法はいずれも特定の遺伝子や蛋白質を検出するものであり、ＤＮＡの抽出を必要としたり、遺伝子に変異が入っているものの検出感度が著しく低下したり、蛋白質の発現量が少ない場合に検出感度が低下する問題があった。反対に蛋白質の量が多く、陽性と判定されても、微生物はすでに死滅している場合もあった。
【０００４】
このような課題を解決する手段として、近年フローサイトメトリーを用いて微生物をカウントする装置（例えば、特許文献１参照）や、蛍光染色法によって微生物を直接蛍光染色して画像として取り込む装置（例えば、特許文献２参照）が開発されている。
【特許文献１】特開２００２−１８１８２３号公報
【特許文献２】特開平２−１７００５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の従来装置においては、いずれも蛍光染色を必要とし、簡単に持ち運びができないような検出装置を必要とするものであり、簡便性において問題があった。
【０００６】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、臨床検査や食品検査において対象となる微生物を特異的に補捉し、捕捉された微生物を直接光学的に検出することで、迅速、簡便に検査を行うことができる微生物の迅速検査装置およびそれを用いた微生物の迅速検査方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、対象となる微生物を特異的に捕捉する物質を含む基板材と、捕捉した微生物を光学的に検出することができる装置よりなる検出装置において、迅速簡便に対象微生物の検出が行えることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
すなわち、本発明は第一に、試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置からなる微生物の迅速検出装置を要旨とするものであり、好ましくは、目的微生物を特異的に捕捉する物質が、抗体であり、また好ましくは、基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置が、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)イメージセンサまたはＣ−ＭＯＳ(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサを含む装置である前記した微生物の迅速検出装置である。
【０００９】
また、本発明は第二に、試料と、該試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材とを接触して該基板材上に目的微生物を捕捉し、捕捉した目的微生物を光学的に検出して計数することを特徴とする微生物の迅速検出方法を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、医療分野、食品分野、環境分野において問題となる微生物の検査、検出を極めて迅速・簡便に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明において、検出対象となる目的微生物には、ウイルス、細菌、真菌類、藻類などが含まれる。特に臨床分野、食品分野、環境分野において人体にとって有害な微生物およびまたは有用な微生物であって、何らかの方法で検査する必要がある微生物が含まれる。具体的には、結核菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、淋菌、梅毒菌、百日咳菌、破傷風菌、大腸菌、肺炎球菌、緑膿菌、赤痢菌、ジフテリア菌、腸チフス菌、パラチフス菌、セレウス菌、エルシニア属細菌、カンピロバクター、プロビデンシア属細菌、ウエルシュ菌、ディフィシル菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌、ビブリオ・バルニフィカス、ボツリヌス菌、ヘリコバクター、プレシオモナス菌、エロモナス菌、レジオネラ、クラミジア、スピロヘータ等の細菌、カンジダ、酵母、アスペルギルス、カビ等の真菌、肺炎ウィルス、肝炎ウイルス、エイズウィルス、ロタウィルス、ヘルペスウィルス、ＲＳウィルス、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、サイトメガロウィルス、デングウィルス等のウィルス等の病原微生物の他、一般環境下に存在するバチルス菌、放線菌、光合成細菌、古細菌、硝酸菌等の病原性を有さない微生物、藻類等があげられる。
【００１３】
本発明において、検査対象となる試料は、臨床分野、食品分野、環境分野における試料であり、具体的には、臨床分野では血液、体液、喀痰、鼻汁、尿、糞便等をそのままあるいは蒸留水、緩衝液、生理食塩水等に懸濁した溶液が挙げられ、食品分野では、飲料、魚介類、肉類、野菜果物類等の食品類、あるいはこれらの加工食品を蒸留水、緩衝液、生理食塩水等で洗浄した溶液や、ストマッカー処理などにより懸濁した溶液が挙げられる。また、環境分野では海水、河川水、工業用水、飲料水、廃水、下水等自然環境下に存在する水系、土壌等を蒸留水、緩衝液、生理食塩水等に懸濁した溶液が挙げられる。これらの試料はそのまま用いても良いし、あらかじめ微生物が通り抜けるサイズのフィルターによってろ過し、夾雑物を除いて用いてもよい。
【００１４】
本発明の微生物の迅速検出装置は、微生物を特異的に捕捉する物質が結合した基板材を備えている。ここで、微生物を特異的に捕捉する物質とは、目的とする微生物を特異的に捕捉できるようなものであれば特に制限されないが、好ましい例としては、目的微生物に対して作製された抗体、ゼオライト、珪藻土、シリカゲルなどの無機多孔体、ポリスチレン多孔体などの有機多孔体、キレート樹脂、ポリリジン、ポリアクリル酸などの電荷を有するポリペプチド類、電荷を有する有機合成物質などが挙げられ、これらの中で特異性の高い抗体が特に好ましい。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ペプチド抗体のいずれでも良く、目的微生物全体を免疫して作製したものでもよいし、外膜蛋白質、繊毛、鞭毛などに対して作製されたものでもよいが、少なくとも微生物表面と反応するものであることが必要である。
【００１５】
本発明に用いられる基板材の材料は、微生物を特異的に捕捉する物質を結合することができるものであれば特に制限されないが、透明なものが好ましい。かかる材料の具体例としては、ガラス板、石英板、シリコンなどの無機材料、ポリエチレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリカーボネート、セルロース、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル、ナイロンなどの高分子およびまたはその誘導体からなるフィルム、シート、板、チューブ、ロッドなどが好ましい。基板材のサイズは、特に限定されないが、厚みは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましく、操作しやすいように大きさは２００ｍｍ×２００ｍｍより小さいものが好ましい。
【００１６】
微生物を特異的に捕捉する物質は、基板材の表面に結合することが好ましく、そのための方法としては、微生物を特的に捕捉する物質を基板材の表面に塗布してもよいし、化学反応によって結合させてもよい。例えば、微生物を特異的に捕捉する物質が抗体である場合には、基板材の表面をポリリジンコート、シランカップリング処理、酸無水物処理などを行い、化学的に抗体を結合することが好ましい。
【００１７】
本発明の微生物の迅速検出装置は、上記した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置からなるものである。ここで、捕捉された目的微生物を光学的に検出する装置は、特に限定されず、画像として捕らえ検出するものや、光の透過度によるもの、レーザー光の干渉や反射角の変化を利用して検出するものなどが含まれる。画像として捕らえ検出する装置については、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)イメージセンサ、Ｃ−ＭＯＳ(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサ、人口網膜ＬＳＩなどの技術を利用することが好ましい。微生物は小さいため、映像は光学ズームおよびまたはデジタルズームによって１０倍から１００００倍に拡大して分析することが好ましく、検出結果は映像における微生物の数をカウントして出してもよいし、明暗比などで出してもよい。また、夾雑物が存在する可能性が考えられることからコンピューターにより対象とする微生物の大きさや形を識別し、それ以外の形状を持つ夾雑物を排除する処理を行うこともできる。
【００１８】
本発明の微生物の迅速検出装置において、ＣＣＤイメージセンサやＣ−ＭＯＳイメージセンサを用いる場合、本発明の効果を損なわない限り画素数は特に限定されないが、１万画素から１０００万画素のものを用いることが好ましい。画素数が１万画素より少ないと、微生物を認識できない可能性があり、１０００万画素より多いと本発明の装置がいたずらに高価なものになる問題がある。
【００１９】
本発明の装置において、検出結果の表示方法は特に限定されない。例えば検出された微生物の数をカウントして表示してもよいし、微生物が検出しようとする領域に占める面積割合で表示してもよい。また、対象とする微生物を検出したかしないかのみの表示や３段階以上での微生物の検出頻度の表示、パーセント表示を行ってもよい。いずれの検出も目視で行ってもよいが、装置に微生物をカウントまたは微生物の占める割合の計算をさせて自動的に表示することが好ましい。この時、夾雑物を除外するために、あらかじめ微生物の光学的な特徴を入力しておき、画像処理の時点で夾雑物と考えられる画像を除外することが好ましい。
【００２０】
装置上での表示媒体は特に限定されず、液晶表示、ランプによる表示などを用いることができる。また、装置には検出結果の数値や頻度での表示のほかに、光学的に得られた画像をそのまま表示することもできる。
【００２１】
本発明の微生物の迅速検出装置の大きさや消費電力、電源は特に限定されないが、持ち運びできる大きさにすることで、より簡便に微生物の検査を行うことができる。そのため、大きさは４００ｍｍ×４００ｍｍ×２００ｍｍより小さく、重さは２０ｋｇより軽くすることが好ましい。また、環境での検査においては高電圧の電源が得られない場合もあるため、電池で機能する装置であることが好ましい。かかる電池とは、乾電池のみをさすものではなく、２次電池、燃料電池、太陽電池なども含まれる。このように消費電力が少なくポータブルな形状にするにあたっては、光学的に検出することができる装置としてＣ−ＭＯＳイメージセンサを使用することで可能となりうる。
【００２２】
以下、本発明の微生物の迅速検出装置の一例を図面に基づき説明する。
【００２３】
検出装置１は図１に示すような外観となっており、基板差込口２、画像の液晶表示板３、結果表示画面４、測定開始ボタン５、電源スイッチ６を含む。内部の測定機器は図２のようになっており、基板材固定用クリップ７で基板材８をしっかりと固定し、焦点の補正を可動式台座９で行える。対物レンズ１０は２００倍の画像が光学的に得られるものである。対物レンズ１０と画像処理部１１及び本体１２はそれぞれ固定具１３、固定具１４で固定されている。光源には透過式の照明装置１５を使用しており、これにはハロゲンランプを用いた。得られた画像は３０万画素のＣ−ＭＯＳイメージセンサ１６で取り込みを行い、得られた画像はさらにデジタルズームにより４倍に拡大できるようにしている。本装置は乾電池で動くものであり、電池ボックス１７を含む。基板の固定部分は図３に示すように、検出領域１８（２００μｍ×２００μｍ）にかからないように基板固定用クリップで押さえてある。得られた画像は装置の上部に設置した液晶表示板３によって映し出される。また、微生物数をカウントした結果は結果表示画面４に表示される。
【００２４】
次に、本発明の第二の微生物の迅速検出方法について説明する。まず、検査試料を微生物を特異的に捕捉する物質が結合された基板材に接触させて検査試料の存在する微生物を捕捉する。この時の接触時間は１０秒から４時間が好ましく、３０秒から２時間がより好ましい。検査試料を接触させる時間が１０秒より短い場合検査試料中の微生物が十分に捕捉されない可能性があり、４時間より長い場合もはや新たな微生物の捕捉は無く、迅速性を低下させるだけである。検査試料の接触は攪拌しながら接触させても良いし、静置しても良い。
【００２５】
上記のように検査試料を接触させ、微生物を捕捉した基板材は、検査試料中の夾雑物を除くために、洗浄することが好ましい。洗浄に使用する洗浄液は本発明の効果を損なわない限り特に限定されず、例えば蒸留水、滅菌水、脱イオン水、ろ過滅菌水などの水、およびこれらの水に、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＩＣＩ社商標名Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ＩＣＩ社商標名Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などの界面活性剤を加えた洗浄水、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、トリズマ塩基、ピロリン酸ナトリウム、食塩などの塩類を加えた緩衝液を用いることができる。洗浄方法は捕捉した微生物を脱離させない方法であれば特に限定されないが、上記の洗浄液１０ｍｌ〜２０００ｍｌを優しくかけ流し洗浄するか、または上記の洗浄液中に浸漬することが好ましい。洗浄は1回でも良いが、２回〜１０回行うことが好ましい。
【００２６】
洗浄した基板材は特に乾燥させることなく、捕捉した微生物を光学的に検出することができる装置にて検出することができる。このとき、水滴による干渉や水層の厚みの違いによる干渉を避けるために、基板材を水または緩衝液の入った容器に入れた状態で検出することもできるし、フィルムやカバーガラスなどで覆うこともできる。
【００２７】
また、必要に応じて、捕捉した微生物を染色することもできる。染色には可視光の色素、蛍光色素を用いることができ、可視光の色素としては例えばアクリジンオレンジ、アミドブラック、キシレンシアノール、ギムザ、クリスタルバイオレット、クレゾールレッド、チモールブルー、トリパンブルー、ニュートラルレッド、フェノールレッド、ブリリアントグリーン、ブリリアントブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールブルー、マラカイトグリーン、メチルオレンジ、メチルレッドなどを用いることができ、この中でギムザを用いることが特に好ましい。蛍光色素としては、例えばアミノメチルクマリン基、テトラメチルローダミン基、アントラニロイル基、N−メチルアントラニロイル基、ニトロベンズオキサジアノール基、ジメチルアミノフタレン基などの蛍光団を持つものを用いることができ、それらの中でアクリジンオレンジ、Ｂ−フィコエリスリン、クマリン６、ＤＡＰＩ、２'-７'-ジクロロフルオレセイン、６−ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ＧＦＰ、ヘキスト３３３４２、ヘキスト３３２５８、フィコシアニン−Ｃ、ローダミンＢ、ローダミンＢイソチオシアネイト、５ＴＡＭＲＡ、６ＴＡＭＲＡ、チアゾールオレンジなどを用いることが好ましく、ＤＡＰＩ、ヘキスト３３３４２、ローダミンＢ、チアゾールオレンジを用いることが特に好ましい。染色は所定の色素を０．０００１質量％〜１０質量％含む染色液に1分〜5時間浸漬し、洗浄液で余剰の染色液を洗い流す方法などを用いることができる。
【００２８】
また、本発明においては、検出装置にて検出する操作の前に、捕捉した微生物を固定化しても構わない。固定化作業は工程が増えるために迅速性を要するときには省略することができる。固定化試薬としては特に限定されず、例えば０．５％〜１０％のパラホルムアルデヒド水溶液、メタノールのほか、種々の市販の固定化試薬を用いることができる。固定化は、試料中の微生物を基板材に捕捉し洗浄した後、所定の固定化試薬に１分〜１時間浸漬し、洗浄液で余剰の固定化試薬を洗い流す方法などを用いることができる。
【実施例】
【００２９】
以下実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
実施例で用いた微生物を以下に示す。
（１）腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）血清型Ｏ１５７（ＲＩＭＤ０５０９９３９）
（２）毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）（ＲＩＭＤ０５０９２６６）
（３）サルモネラ・エンテリティディス（ＲＩＭＤ１９３３００６）
（４）赤痢菌（Shigella flexneri）（ＲＩＭＤ３１０２００２）
（５）腸炎ビブリオ(神奈川現象陽性株)（ＲＩＭＤ２２１０６３３）
（６）枯草菌（ＲＩＭＤ０２２５０１２）
（７）黄色ブドウ球菌（ＲＩＭＤ３１０９００７）
（８）腸球菌（ＲＩＭＤ３１１６００１）
（９）ＤＨ−５α（大腸菌Ｋ１２株であり病原性はない）
なお、これらの微生物はすべて大阪大学微生物病研究所にて保存されており、ＲＩＭＤは同研究所エマージング感染症研究センター微生物株保存室の菌株保存番号を示す。
【００３１】
また、（１）〜（５）、（７）、（８）の微生物は「健康又は環境に対し害を及ぼし、又は及ぼす恐れのある性質を有する微生物」に該当するため、工業技術院微生物工業研究所に寄託することができないものである。
参考例１〔抗体の作製〕
抗体の作製は以下のように行った。上記（１）〜（９）の微生物をそれぞれLuria-Bertani（ＬＢ）寒天培地に植菌して３７℃、１５時間培養した。出現したコロニーを滅菌白金耳で回収し、１５ｍｌの滅菌チューブに入れ、０．５質量％ホルマリン５ｍｌに懸濁して４℃で２日間静置した。２日後に懸濁液０．２ｍｌを抜き取り、ＬＢ培地に植菌して３７℃、１５時間培養し、コロニーが出現しないことを確認した。コロニーが出現しないことを確認後、懸濁液は８０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を除去した。その後菌体に３ｍｌの生理食塩水を加えて再懸濁し、再び８０００ｒｐｍで１５分間遠心した。この洗浄操作はさらに２回繰り返し、死菌の生理食塩水懸濁液を得た。該懸濁液は吸光光度計によりＯＤ６００＝０．８になるように希釈し、０．１ｍｌをあらかじめ１週間予備飼育しておいたウサギ（New Zealand White種、メス、２．０〜２．５ｋｇ）に耳静脈注射した。ウサギはそのまま飼育し、１週間後にさらに前回の倍量の懸濁液を接種した。その後同様に毎週前週の倍量を接種し、５回目の接種を行った１週間後に全採血した。
【００３２】
得られた血液は３７℃で１時間静置した後、４℃で１６時間静置した。その後、４℃で４０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清に抗血清を得た。得られた抗血清は５０％硫酸アンモニウムを加えて沈殿を生じさせる操作を２回繰り返し、得られた沈殿を１０ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、同緩衝液で透析して得られた免疫グロブリンをポリクローナル抗体として用いた。
参考例２〔抗体固定化基板材（Ａ）の作製〕
基板材料にはポリスチレン製の２０ｍｍ×５０ｍｍ×厚み１ｍｍの透明板を用いた。これを洗浄後、ろ過滅菌済みの１００μｇ／ｍｌのポリリジン水溶液に５分間浸漬し、滅菌水により２回洗浄した。次に、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭリン酸水素２ナトリウム、２ｍＭリン酸２水素カリウムからなるｐＨ７．４の緩衝液（以下ＰＢＳと略す）に５０μｇ／ｍｌの濃度で抗体を溶解した液に室温で１時間浸漬し、抗体を固定化した。次にＰＢＳにポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ICI社商標名Ｔｗｅｅｎ２０）を０．０２質量％添加した洗浄液によって1回洗浄し、さらにＰＢＳによって1回洗浄した。続いて、ＰＢＳに1質量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えたブロッキング液に1時間浸漬した。この基板は使用前に洗浄液２により1回洗浄して抗体固定化基板（Ａ）とした。
参考例３〔抗体固定化基板材（Ｂ）の作製〕
以下に示すように、Norio Koike et.al., Microbiol. Immunol.,43(11), 1057-1060の方法に準じて作製した。
【００３３】
基板材料にはナイロン製の２０ｍｍ×５０ｍｍ×厚み１ｍｍの透明板を用いた。これを洗浄後、３０℃で２．５規定の塩酸に３０分浸漬した。滅菌水中に１５分間浸漬する洗浄操作を３回繰り返した後、１．２５質量％ポリエチレンイミン、１．２５質量％ジシクロヘキシルカルボジイミドを含む水溶液に室温で２．５時間浸漬した。滅菌水で再び１５分間３回の洗浄操作を行い、次に２質量％のスチレン−無水マレイン酸共重合体の無水アセトン溶液に室温下２．５時間浸漬した。これを無水アセトンで１５分間、３回洗浄した。この基板をＰＢＳに抗体を２μｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液に２５℃で１６時間浸漬した。次に、非特異反応を防止するため２質量％牛血清アルブミンのＰＢＳ溶液に浸漬してブロッキングを行った。この基板は使用前にＰＢＳにより１回洗浄して抗体固定化基板（Ｂ）とした。
参考例４〔抗体固定化基板材（Ｃ）の作製〕
抗体を固定化する材料として１ｍ×２ｍ×厚み７５μｍのナイロンフィルムを用いる以外は参考例３と同様に抗体の固定化を行った。このように抗体を固定化したナイロンフィルムは１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断し、２００００枚の抗体固定化フィルム片を作製した。このフィルム片は１枚ずつ２０ｍｍ×５０ｍｍ×厚み１ｍｍの透明ガラスにエポキシ樹脂系接着剤を用いて貼り付け、抗体固定化基板（Ｃ）とした。抗体固定化基板（Ｃ）は２００００枚と簡単に大量生産できた。
参考例５〔抗体固定化基板材（Ｄ）の作製〕
抗体を固定化する材料としてアクリル樹脂板を用いた以外は参考例３と同様に抗体の固定化を行い、得られた基板を抗体固定化基板（Ｄ）とした。
実施例１
上述の図１〜図３で説明した装置を用いて微生物の検出を行った。なお、実施例で使用した細菌の大きさは概ね１μｍ〜３μｍであり、捕捉された微生物は図４のように輪郭が黒く中心部は光が透過するような画像が得られるため、このような画像の数をカウントする機能を付与した。検出結果の表示は検出領域内の微生物数をカウントし、結果表示画面４に微生物数を表示させた。なお本装置の検出領域は２００μｍ×２００μｍであった。
【００３４】
上記の９種類の微生物をそれぞれ２ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振とう培養した。これをＰＢＳにより１０4倍希釈したものを試料として用いた。これらの試料に、それぞれの目的微生物に対する抗体を固定化した抗体固定化基板材（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）および抗体を固定化していない基板材を１０分間浸漬し、これを２００ｍｌのＰＢＳが入ったビーカー中に１分間浸漬する洗浄操作を３回行い、上記の検出装置に導入し、表示された微生物数を読み取った。結果を表１に示す。いずれの基板材を用いても好適に検出できた。また、検出に要した時間は１４分であった。
【００３５】
【表１】
2005172680.tif 000003
比較例１
実施例１において、微生物の存在しないＰＢＳに浸漬した以外は実施例１と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表１に示すが、いずれの基板においてもほとんど微生物数はカウントされなかった。
実施例２
実施例１において、試料に基板材を浸漬する時間を１分とし、洗浄の浸漬時間を１０秒とした以外は実施例１と同様に微生物の検出を行った。結果を表２に示す。いずれの基板材を用いても好適に検出できた。また、検出に要した時間は２分と非常に短いものであった。
【００３６】
【表２】
2005172680.tif 000004
比較例２
実施例２において微生物の存在しないＰＢＳに浸漬した以外は実施例２と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表２に示すが、いずれの基板材においてもほとんど微生物数はカウントされなかった。
実施例３
微生物（１）ＥＨＥＣを２ｍｌのＬＢ培地で３７℃１６時間振とう培養し、これにＰＢＳを導入し、２Ｌにしたものを６セット作製した。これら２Ｌの菌液はそれぞれナイロン袋に入れ、その中にレタス、ブロッコリー、牛肉（ローススライス）、鶏肉（胸肉かたまり）、スズキ切り身および車海老剥き身をそれぞれ１００ｇ入れて軽くかき混ぜた後、静置した。これらの食材は１時間後に取り出し、２Ｌの水道水に５秒浸漬することにより軽く洗浄して食品擬似サンプルとした。各食品擬似サンプルは９００ｍｌのＰＢＳを加えてストマッカーで破砕処理を行い、２５ｇを採取し１０μｍの目開きのフィルターによってろ過を行った。ろ液にＥＨＥＣに対する抗体を固定化した抗体固定化基板材を１０分間浸漬し、ＰＢＳで３回洗浄して検出装置に導入した。得られた結果を表３に示す。いずれの食品においてもＥＨＥＣによる汚染が確認できた。
【００３７】
【表３】
2005172680.tif 000005
比較例３
実施例３において、それぞれの食材を微生物が入っていないナイロン袋に入れた以外は実施例３と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表３に示すが、いずれの食材からも微生物はほとんど確認されなかった。
実施例４
下痢症患者から研究に用いる旨を説明し、同意を得た上で採取し、保存された患者便検体３人分（それぞれＥＨＥＣ、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌感染の患者便であった）および、健常人便検体２人分、各０．１ｇをそれぞれ２０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、上記の９種類の微生物に対して作製した抗体固定化基板材の検出領域内にそれぞれ１００μｌ滴下した。１０分間静置した後、ＰＢＳで３回洗浄して検出装置に導入した。結果を表４に示す。いずれの患者便においても感染源の特定が可能であった。
【００３８】
【表４】
2005172680.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の迅速検出装置の外観を示す正面図である。
【図２】本発明の迅速検出装置の内部構造を示す図である。
【図３】本発明の迅速検出装置の基板材を固定する部分の平面図である。
【図４】本発明の迅速検出装置の液晶表示部に映し出される微生物の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００４０】
１  迅速検出装置
２  基板材差込口
３  画像の液晶表示部
４  結果表示画面
８  基板材
１１  画像処理部
【図１】
2005172680.tif 000007
【図２】
2005172680.tif 000008
【図３】
2005172680.tif 000009
【図４】
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