(57)【要約】【課題】フローサイトメトリー法による微量細胞群の高感度（１×１０−６レベル）検出方法を提供すること。【解決手段】下記の方法を含む、モノクローナル抗体とフローサイトメトリーを用いた微量細胞群の高感度（１０−６レベル）検出方法。（ａ）フローサイトメトリーを用いた測定方法において、新規性のあるｒｅｇｉｏｎ（領域）設定方法（図１）とそれを用いた５０００万カウント測定、及び（ｂ）蛍光陽性細胞群（微量細胞群）の同定方法として、ＦＬ４のパラメーター（ＡＰＣ標識モノクローナル抗体を使用）を用いた新規性ある有用な同定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の方法を含む、モノクローナル抗体とフローサイトメトリーを用いた微量細胞群の高感度（１０−６レベル）検出方法。フローサイトメトリーを用いた測定方法において、新規性のあるｒｅｇｉｏｎ（領域）設定方法とそれを用いた５０００万カウント測定。
【請求項２】
請求項１の方法を用いた５０００万カウント測定において、蛍光陽性細胞群（微量細胞群）の同定方法として、ＦＬ４（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ４，蛍光４）のパラメーター〔ＡＰＣ（Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，アロフィコシアニン）標識モノクローナル抗体を使用〕を用いた新規性のある有用な同定方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、浮遊液中に存在する微量細胞群を、モノクローナル抗体とフローサイトメーターを用いて、高感度に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】従来、フローサイトメトリー法を用いた微量細胞群測定においては、時に１００万カウント測定が行われていた。（非特許文献  宮崎  年恭、西川  潔：末梢血幹細胞のアッセイ法〜特にＣＤ３４抗体を用いた方法について〜，日常診療と血液５：１７３〜１７６、１９９５）
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】１００万カウント測定では、陽性細胞集団が１００個（識別可能な個数）の場合で、測定感度が１００個／１００万個（１０−４の感度）であり、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ポリメラーゼ連鎖反応法）（１０−５〜１０−６の感度）に比べて感度が低く、感度上問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】フローサイトメトリー法による測定感度を１０−６レベルまで上げる為に、５０００万カウント測定法を発明した。その為に、（１）フローサイトメトリーを用いる測定方法において、新規性のあるｒｅｇｉｏｎ（領域）設定方法を発明した。（２）微量細胞群（蛍光陽性細胞群）の同定方法として、ＦＬ４のパラメーター（ＡＰＣ標識モノクローナル抗体を使用）を用いた新規性のある有用な同定方法を発明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】フローサイトメーターを用いた５０００万カウント測定方法と解析方法を次に記載する。詳細については、実施例の項で更に詳細に説明する。
Ａ）測定方法
（１）フローサイトメーターとして２つのレーザーの装備されたＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒＴＭ（ＢＤ社製）を使用した。第１レーザーはアルゴンレーザーで、第２レーザーはダイオードレーザーであった。
（２）ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒのＦＡＣＳ  ＳｔａｔｉｏｎＴＭ（Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃ  Ｇ４）のＲＡＭ（メモリー）を１．５ギガバイトに増設した。
（３）測定解析ソフト（Ｃｅｌｌ  ＱｕｅｓｔＴＭ）の設定条件
ＣｅｌｌＱｕｅｓｔは全て英語で記述されているので、ソフト上の用語はそのまま英語を用いた。
１）Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔの使用サイズを８００メガバイトに設定した。
２）Ｒ１  ｒｅｇｉｏｎを図１のように右下方（細胞集団のほとんど出現しない位置）に設定した。
３）Ａｃｑｕｉｓｉｏｎ＆Ｓｔｏｒａｇｅにおいて
▲１▼Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣｒｉｔｅｒｉａをＥｖｅｎｔ  ｃｏｕｎｔに設定した。
▲２▼Ａｃｑｕｉｓｉｏｎ数を限界値の２０００万に設定し、ＡＬＬではなくＧ１＝Ｒ１を選択した。
▲３▼次の６パラメーターを設定した。
ＦＳＣ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ，前方散乱光）
ＳＳＣ（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ，側方散乱光）
ＦＬ１（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ１，蛍光１）
ＦＬ２（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ２，蛍光２）
ＦＬ３（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ３，蛍光３）
ＦＬ４（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ４，蛍光４）
▲４▼Ｓｔｏｒａｇｅ  ＧａｔｅにおいてＧ１＝Ｒ１ではなく、ＡＬＬを選択した。
▲５▼Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎを１０２４に設定した。
（４）以上の設定条件を用いて、細胞浮遊液をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて、測定細胞数が５０００万個以上になるまで測定した。
（５）Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔのソフト上の測定数の限界値は２０００万個であるが、Ｒ１  ｒｅｇｉｏｎの位置が、実際にはほとんど細胞が出現しない位置に設定している為、充分に５０００万個以上の測定が可能である。測定数を約５０００万個にとどめた理由は、予備的検討により、６パラメーターを用いて約５０００万個測定すると約６００メガバイトのデータ容量となり、ＭＯ（光磁気ディスク）１枚（６４０メガバイト）に保存可能であり、これが現時点において実用的な容量と考えたからである。
Ｂ）解析方法
自家蛍光（レーザー光による未染色細胞群のみより発せられる蛍光）の程度を検定する為に、予備的検討を行った。
（１）健常人末梢血をヘパリン採血し、溶血剤（塩化アンモニウムが主成分）を用いて前溶血をした。蛍光色素標識モノクローナル抗体と全く反応させない細胞群（白血球）のみを、前述の測定方法を用いて１００万カウント（従来法）と５０００万カウント測定を行い、比較検討した。
（２）ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４それぞれのパラメーターを縦軸と横軸にとり、自家蛍光の発現の程度を検定した（図２）。図２のＡは１００万カウント表示を示すが、ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３の組み合わせでは従来より指摘されている好酸球による自家蛍光が強く見られたが、ＦＬ４のパラメーターでは強い自家蛍光が見られなかった。図２のＢは約５０００万カウント表示を示すが、ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３においては更に強い自家蛍光が見られた。一方ＦＬ４においては、強い自家蛍光は見られなかった。
（３）図３は縦軸にＳＳＣのパラメーターを、横軸にＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４のパラメーターを示し、図３のＡは１００万カウント表示を、図３のＢは約５０００万カウント表示を示す。ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３では、約５０００万カウント表示において強い自家蛍光の発現が見られたが、ＦＬ４では、強い自家蛍光の発現は見られなかった。
（４）以上の結果より、自家蛍光が強く出るＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３のパラメーターでは、蛍光色素標識モノクローナル抗体と反応させた場合の陽性細胞群と陰性細胞群の解離が非常に悪いと考えられた。従って、５０００万カウント測定では、ＦＬ４のパラメーターを用いて解析することが有用であると考えた。
【実施例】
【０００６】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
実施例
〈方法〉
（１）対象  健常人末梢血
（２）モノクローナル抗体  ＡＰＣ（Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，アロフィコシアニン）標識  抗ＣＤ１４抗体
ＡＰＣの色素は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒの第２レーザーによりＦＬ４の検出器で感知される色素である。その為に、ＡＰＣ標識の抗ＣＤ１４抗体（単球と特異的に強く反応する抗体）を用いた。
（３）染色及び方法
同一健常人（場合によっては健常人４名）より末梢血をヘパリン採血し、溶血剤（塩化アンモニウムが主成分）を用いて、前溶血をした。その細胞の一部をＡＰＣ標識抗ＣＤ１４抗体と反応させた。染色細胞集団を残りの未染色細胞集団を用いて段階希釈（１０００倍、１万倍、１０万倍、１００万倍）し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いて、全白血球を前述した測定方法を用いて約５０００万個測定した。
〈結果〉
結果の図（図４〜図７）は、縦軸にＳＳＣをとり、横軸にＦＬ４をとり、以上の２つのパラメーターの結果を２次元のドットプロット表示で示す。希釈前の染色細胞集団中の単球（ＣＤ１４強陽性細胞群）含有率は０．８×１０−１であった（図４，１０万カウント測定）。１０００倍希釈の単球含有数（率）は６２０１個（１．２×１０−４）であった（図５のＡ）。１万倍希釈では、単球含有数（率）は４９７個（１．０×１０−５）であり明らかな細胞集団として認められた（図５のＢ）。１０万倍希釈では、４例（図６の個人Ａ〜Ｄ）において、単球含有数（率）は２９個〜１７６個（０．６×１０−６〜３．５×１０−６）であり、明らかな細胞集団として認識できた。１００万倍希釈（図７のＡ）では、明らかな細胞集団が認められず、未染色細胞のみを測定したバックグラウンド検体（図７のＢ）と差を認めなかった。
〈結論〉
以上より、本法による測定感度の限界は、１×１０−６と判断された。
【発明の効果】
【０００７】本発明によれば、フローサイトメーターを用いた微量細胞群の検出が、従来法（１０−４レベルの感度）に比べて、より高感度（１×１０−６レベル）で行う事が可能である。本法は、６パラメーター測定を用いている為、ＳＳＣとＦＬ４以外の残りの４つのパラメーターを同時に解析に用いることにより、高感度で同定された微量細胞群を更に詳細に解析することも可能である。
【０００８】本発明は、ヒト末梢血や骨髄血に含まれる微量細胞群の検出のみならず、ヒト末梢血や骨髄血以外のヒト検体、又はヒト以外の検体においても、浮遊液中に存在する微量粒子の高感度検出にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＦＳＣ（横軸）とＳＳＣ（縦軸）の２次元の表示で示された図における  Ｒ１  ｒｅｇｉｏｎ（領域）の設定位置。ＦＳＣ：Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ，前方散乱光  ＳＳＣ：Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ，側方散乱光
【図２】ＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４の各パラメーターの２次元の表示で示された図における自家蛍光の程度の比較。  （Ａ）１００万カウント表示  （Ｂ）約５０００万カウント表示  ＦＬ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，蛍光
【図３】縦軸にＳＳＣを、横軸にＦＬ１，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ４のパラメーターをとった２次元の表示で、自家蛍光の程度の比較。  （Ａ）１００万カウント表示（Ｂ）約５０００万カウント表示
【図４】ＡＰＣ標識抗ＣＤ１４抗体と反応させた細胞集団中（１０万カウント測定）の単球群（ＣＤ１４強陽性細胞群）。単球含有率は、７７７２個／１００，０００個（０．８×１０−１）であった。  ＡＰＣ：Ａｌｌｏ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，アロフィコシアニン  ＣＤ：Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ
【図５】１０００倍希釈細胞集団中（Ａ）と、１万倍希釈細胞集団中（Ｂ）の単球群（約５０００万カウント測定）。単球含有率は、Ａでは６２０１個／５０，００８，７３１個（１．２×１０−４）で、Ｂでは４９７個／５０，０１４，７２５個（１．０×１０−５）であった。
【図６】１０万倍希釈細胞集団中の単球群の４例（個人Ａ〜Ｄ）における個人差（約５０００万カウント測定）。単球の含有率は、個人Ａでは５６個／５０，０１１，１８５個（１．１×１０−６）で、個人Ｂでは１７６個／５０，２３２，４８０個（３．５×１０−６）で、個人Ｃでは５３個／５０，０１６，８５５個（１．１×１０−６）で、個人Ｄでは２９個／５０，０９９，１１５個（０．６×１０−６）であった。
【図７】１００万倍希釈細胞集団中の単球群の図（Ａ）と、未染色細胞集団のみの図（Ｂ）（約５０００万カウント測定）。単球含有率は、Ａにおいて４個／５０，０１３，７９５個（０．８×１０−７）であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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