(57)【要約】【課題】  休眠期間が短縮された植物、休眠期間が短縮され、かつ、出芽または発芽時期の揃った植物、および、そのような植物の作出法を提供すること。【解決手段】  植物において細胞内の2-OG含量を増大させる、特に、植物の細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることにより細胞内の2-OG含量を増大させる。より具体的には、GDH遺伝子の発現を増強し得る核酸構築物、特にGDH遺伝子を発現し得る核酸構築物、を植物に導入し、GDH遺伝子を過剰発現させることにより細胞内の2-OG含量を増大させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において細胞内の2-OG含量を増大させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法。
【請求項２】
さらに出芽または発芽時期の揃う植物を作出する請求項１記載の方法。
【請求項３】
植物において細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法。
【請求項４】
さらに出芽または発芽時期の揃う植物を作出する請求項３記載の方法。
【請求項５】
植物において細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることが、GDH遺伝子の発現を増強し得る核酸構築物の導入によって行われる、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
植物において細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることが、GDHを発現し得る核酸構築物の導入によって行われる、請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
核酸構築物が、配列番号２または４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
核酸構築物が、配列番号１または３記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDH活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
植物がカラスムギ、レタス、バレイショ、モモ、ツバキ、イネ、ムギ、ラミー、ラッカセイ、レスクグラス、スムーズブロムグラス、ダイコン、レタス、ナス、シソ、グロキシニア、カランコエ、プリムラ、二ゲラ、イチゴ、ウド、タマネギ、ワケギ、ホウレンソウ、花の球根からなる群より選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
植物がバレイショである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
細胞内の2-OG含量が増大しており、かつ、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物。
【請求項１２】
さらに出芽または発芽時期の揃う、請求項１１記載の植物。
【請求項１３】
細胞内のGDH遺伝子が過剰発現し、その結果天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物。
【請求項１４】
さらに出芽または発芽時期の揃う、請求項１３記載の植物。
【請求項１５】
核酸構築物が、配列番号２または４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４記載の植物。
【請求項１６】
核酸構築物が、配列番号１または３記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDH活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項１３または１４記載の植物。
【請求項１７】
カラスムギ、レタス、バレイショ、モモ、ツバキ、イネ、ムギ、ラミー、ラッカセイ、レスクグラス、スムーズブロムグラス、ダイコン、レタス、ナス、シソ、グロキシニア、カランコエ、プリムラ、二ゲラ、イチゴ、ウド、タマネギ、ワケギ、ホウレンソウ、花の球根からなる群より選ばれる、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の植物。
【請求項１８】
バレイショである請求項１７記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、休眠期間が短縮した植物に関する。特に本発明は休眠期間が短縮し、かつ収量の増大した植物に関する。
また、本発明は休眠期間が短縮した植物を作出する方法に関する。さらに本発明は、休眠期間が短縮し、かつ収量の増大した植物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水分、温度などの環境条件が植物の芽や種子の発芽に適していても、発芽しない状態を休眠という。休眠は種子や球根、落葉果樹等で広く認められる。休眠は、植物が劣悪な環境から身を守り、種を維持していくために重要な機能と考えられる。しかし、一方、今日の農業において、温室栽培やマルチ栽培の普及により栽培環境が改善され、この休眠が栽培の障壁となっていることも少なくない。このため、多くの植物においては、休眠が無いまたは休眠期間の短い品種の育成が盛んに行われており、大きな成果も得られている。
【０００３】
また、人工的な処理を施すことにより植物の休眠を打破する方法も開発されてきた。休眠は、アブシジン酸などの発芽抑制物質の蓄積が主要な原因と考えられている。休眠から覚めるためには発芽抑制物質が減少するか、これと拮抗作用を示すジベレリンが増加することが必要と考えられている。したがって、植物にジベレリン処理を行うことによる、休眠打破効果が期待される。
実際、ジベレリンはカラスムギ、レタスなどの休眠種子、バレイショ、モモ、ツバキなどの休眠芽に対して発芽誘導効果を示す(新しい植物ホルモンの科学， 小柴 共一， 神谷 勇治， 講談社， 2002)。また、イネ、ムギ類、ラミー、ラッカセイ、レスクグラス、スムーズブロムグラス、ダイコン、ブラシカ類、レタス、ナス、シソ、グロキシニア、カランコエ、プリムラ、ニゲラ等の種子やイチゴ、ウド等でも著しい発芽促進効果が認められている（野菜園芸大辞典，養堅堂，1977）。ジベレリンとの関連性については明らかにされていないが、タマネギ、ワケギ、ホウレンソウ、花の球根なども休眠を有する代表的な植物としてあげられる。
【０００４】
バレイショも休眠を有する植物であり、収穫後3ヶ月程度は出芽が見られない。しかし、前述のとおり、ジベレリン処理を施すことによって、休眠期間を短縮できることが報告されており（徳島農試研報，2000，36:7-17.）、休眠の制御機構と内生ジベレリン含量との関連性を調べる上で適した材料と考えられる。
バレイショは世界で2000万ヘクタール余りの作付けがあり、10a当りの平均収量が1.48トン、全体で約3億トンを生産している。作付面積が最大なのはロシアで、続いて中国とポーランドが多く、生産量もこの順である。日本では約13万ヘクタールを作付けし、約400万トンを生産している。消費利用はデンプン原料量が44％、ついで生食用が21％、加工食品用が13％となっている。しかし、とうもろこしやコムギの輸入自由化により、低価格でデンプンが入手できるようになり、この厳しい価格競争に勝つためには、バレイショの栽培方法をさらに改善し、質・量共に優れた生産体制を確固する必要がある。具体的には、平均デンプン価13％を18％に上昇し、平均単収を4トンから7トンに増収し、さらに生産コストを半減する必要があるとされる。
【０００５】
塊茎が形成され、肥大を開始する時期のデンプン価はおよそ0.8％で、その後、塊茎の肥大と共に増加する。このため、塊茎のデンプン価を向上させるためには、塊茎の肥大期間を十分に取ることが重要である。また、デンプン価は地温が高くなるに従い、急激に低下するため、地温（地下10cm）17−22℃が塊茎肥大時期の最適温度とされている。このため、塊茎形成が始まる、開花時期の温度が18℃前後になるように栽培時期を設定するのが好ましく、具体的には春植えは気温が10℃となる7−10日前、秋植えでは平均気温が23℃となる10日前頃に植付けを行うのが良いとされる。
一方、塊茎収量に関しても、塊茎の肥大期間を十分に取ることが望ましく、肥大期間中は、10a当り一日約60-70kgずつ収量が増加するとされており、前記デンプン価の最適温度を考慮すると、圃場への植付けはできるだけ早く行うことが望ましい。
【０００６】
また、通常、塊茎から芽が出るまでの期間（出芽期）のばらつきが15日間にもおよぶことも少なくない。初めに出芽した株に対して遅れて出芽してきた株は、十分な塊茎肥大期間が得られないため、一般に収量が減少する。15日間出芽が遅れることで、株当たりの収量が24％も減収すると見積もられている。このように出芽期のばらつきは、収量減少の大きな要因になっている。塊茎からの出芽が早く、さらに出芽がよく揃い、その結果生育のばらつきが少ないことが、バレイショの収量を増加させるのに重要な要因となっている(ジャガイモ百科, 吉田 稔 著, 農山漁村文化協会, 1988)。
【０００７】
ジベレリンの合成は、酢酸に由来するメバロン酸からイソペンテニル二リン酸を経て合成されるメバロン酸経路と、グルコース由来のピルビン酸とグリセルアルデヒド3-リン酸から生成するイソペンテニル二リン酸を経て合成される非メバロン酸経路とが考えられている。イソペンテニル二リン酸はゲラニル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、ent-コパリル二リン酸を経て、４環性の炭化水素ent-カウレンに変換される。次に、ent-カウレンは３段階の酸化を受けてent-カウレン酸となり、さらに３段階の酸化を受けてGA12が合成される。GA12以降の生合成段階は２-オキソグルタル酸を共基質とする二原子酸化添加酵素により触媒される。現在では、遊離型ジベレリンとして100種以上が登録されていが、そのままの形で生理活性を持つ活性型ジベレリンはそのうちの一部である（GA1, GA3, GA4等）。
【０００８】
ジベレリンの生理作用を調べるために、ジベレリン合成に関与した遺伝子の植物への導入も試みられている。Huangらは、シロイヌナズナ（Arabidopsis）より単離した20-オキシダーゼ遺伝子をセンス方向にArabidopsisに導入し、過剰発現させた形質転換体を作出した。この形質転換体は、非形質転換体に比べて、GA1, GA9, GA20含量が増加し、開花時期が早まること及び種子の休眠期間が短縮されることが報告されているが、一方、胚軸および茎が伸張し、植物体の顕著な形態的異常が認められることも報告されている（Plant Physiology 1998 118: 773-781）。また、Carreraらは、GA20-オキシダーゼをコードする遺伝子をバレイショより単離し（StGA20ox1）、バレイショにセンス方向及びアンチセンス方向に導入した。センス方向に導入し、過剰発現させた場合、節間が伸張し、さらに塊茎からの出芽時期が早まったことを報告した（Plant Journal 2000 22: 247-256）。しかし、GA20-オキシダーゼをコードする遺伝子がセンス方向に導入され、休眠期間が短縮した形質転換体では、塊茎数および塊茎重量が大きく減少し、生産性の向上には結びつかなかった。また、GA20-オキシダーゼをコードする遺伝子がアンチセンス方向に導入されたバレイショの塊茎からの出芽時期は非形質転換体の塊茎と差異がななかったことから著者らはGA20-オキシダーゼと休眠の関連性はないことを示唆している。
【０００９】
一方、このような研究とは独立に、グルタミン酸脱水素酵素（GDH）遺伝子を導入したトランスジェニック植物が作出されており、大腸菌由来NADP依存型GDH遺伝子（gdhA）を、除草剤ホスホノスリシン耐性付与を目的にタバコとトウモロコシに導入したところ、乾燥重量や全アミノ酸含量、水溶性炭水化物含量が有意に増加したことが報告されている（Lightfootら, カナダ、CA2180786, 1996）。同様にTianら（中国、CN00109779.2）は、Neurospora由来NADP依存型GDH遺伝子をタバコに導入し、遺伝子を導入していないタバコに比べて、生育が良好であったことを報告した。さらに、Aspergillus nidulans（アスペルギルス・ニジュランス）由来NADP依存型GDH遺伝子をトマトに導入し、果実中の遊離アミノ酸含量が増加したこと（Kisakaら 特開2001-238556）及び同遺伝子をバレイショに導入し、塊茎の重量及び塊茎数が増加したことが報告されている（JP2000-404322）。しかし、いずれの報告においても、ジベレリン含量の変化に関する記載はなく、また、休眠に関する調査も行われていない。
【００１０】
【特許文献１】カナダ、CA2180786
【特許文献２】中国、CN00109779.2
【特許文献３】特開第2001-238556号公報
【非特許文献１】小柴 共一， 神谷 勇治、新しい植物ホルモンの科学 講談社， 2002年
【非特許文献２】野菜園芸大辞典，養堅堂，1977年
【非特許文献３】徳島農試研報，2000年、第36巻、第7-17頁
【非特許文献４】吉田 稔、ジャガイモ百科,農山漁村文化協会, 1988年
【非特許文献５】Plant Physiology、 1998年、第118巻、第773-781頁
【非特許文献６】Plant Journal、 2000年、第22巻、第247-256頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、休眠期間が短縮された植物を提供することを目的とする。
また、本発明は休眠期間が短縮された植物を作出する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、植物の休眠期間を短縮する方法を提供することを目的とする。
特に、本発明は、休眠期間が短縮され、かつ、出芽または発芽時期の揃った植物を提供することを目的とする。
また、本発明は、休眠期間が短縮され、かつ、出芽または発芽時期の揃った植物を作出する方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、植物の休眠期間を短縮し、出芽または発芽時期の揃った植物を作出する方法を提供することを目的とする。
特に本発明は、休眠期間が短縮され、出芽または発芽時期が揃い、その結果として収量性が増大した植物を提供することを目的とする。
本発明はまた、植物の休眠期間を短縮し、出芽または発芽時期が揃い、その結果として収量性が増大した植物を作出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、グルタミン酸脱水素酵素（以下GDHと略す）遺伝子を植物細胞内で過剰に発現させることによって、細胞内の2-OG含量を増加させることを既に見出している（Kisakaら、特許出願2003-198559）。GDHはグルタミン酸を生成するため2-OGへアンモニアを取り込ませる場合と、逆に2-OGを生成するためにグルタミン酸からアンモニアを解離させる場合と可逆的な反応を触媒する。しかし、一般的にGDHはアンモニアに対して高いKm値を有するため、細胞内においては、2-OGにアンモニアを取り込み、グルタミン酸を生成する反応より、グルタミン酸を2-OGとアンモニアに分解する方向に働くと考えられ、その反応の結果、2-OG含量の増加が生じたものと考えられる。
一方、本発明者らは、植物内の内生ジベレリン活性を高めることで、休眠期間を短縮させ、その効果として、発芽時期を早め、生育の揃った株が得られ、さらには、この効果により収量を向上させることができると思案した。より具体的には、GA12以降のジベレリン生合成段階は2-オキソグルタル酸（2-OG）を共基質とする二原子酸化添加酵素により触媒されるため、植物のグルタミン酸脱水素（GDH）遺伝子を過剰発現させることによって、2-OGを安定的に過剰供給し、塊茎内のジベレリン活性を高めることができ、その結果、実際に休眠期間を短縮させ、出芽または発芽時期を早め、出芽または発芽時期の揃う株、従って生育の揃った株が得られること、さらには、収量を向上させることができることを見出した。
【００１３】
すなわち、本発明は細胞内の2-OG含量が増大し、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物、および、植物において細胞内の2-OG含量を増大させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法である。
また、本発明は細胞内の2-OG含量が増大し、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽または発芽の揃う植物、および、植物において細胞内の2-OG含量を増大させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽または発芽の揃う植物を作出する方法である。
【００１４】
本発明は細胞内のGDH遺伝子が過剰発現し、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物、および、植物において細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法でもある。
また、本発明は細胞内のGDH遺伝子が過剰発現し、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽および／または発芽の揃う植物、および、植物において細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽および／または発芽の揃う植物を作出する方法である。本発明の植物、および本発明の方法によって作出される植物は、休眠期間が短縮され、出芽および／または発芽の揃った結果、生育が揃い、収量性も増大している。
特に、本発明は、GDH遺伝子の発現を増強し得る核酸構築物が導入され、細胞内のGDH遺伝子が過剰発現することができ、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物である。また、本発明は、GDH遺伝子の発現を増強し得る遺伝子を植物に導入し、前記植物の細胞内のGDH遺伝子を過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法である。
特に、本発明は、核酸構築物が、配列番号２または４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、上記方法又は植物である。また、本発明は、核酸構築物が、配列番号１または３記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDH活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、上記方法または方法である。
特に本発明は、本発明の植物、および本発明の方法によって作出される植物がバレイショである上記植物および植物を作出する方法である。
【発明の効果】
【００１５】
植物の休眠は、栽培時期を制限するのみでなく、植物の生育や生産性を左右する障壁となっている。従って、本発明により、植物の形態に顕著な異常を生じさせることなく、植物の休眠期間を短縮させることによって、栽培時期の制約を解消し、さらに、出芽または発芽が早まり、出芽または発芽がよく揃うことで、その結果生育も揃い、農業上、植物の栽培を容易にするのみでなく、さらに生育や収量・品質が向上した植物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
前述のように、本発明はグルタミン酸脱水素酵素(GDH)遺伝子を植物の細胞内において過剰発現することができ、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物（それらの子孫を含む）、および、GDH遺伝子を植物の細胞内において過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物を作出する方法である。
また、本発明はGDH遺伝子が細胞内において過剰発現することができ、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽および／または発芽の揃う植物（それらの子孫を含む）、および、GDH遺伝子を植物の細胞内において過剰発現させることにより、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮され、出芽および／または発芽の揃う植物を作出する方法である。
本明細書において、「天然の同種の植物」とは、生物学的分類上、本発明によって作出される植物と同じ種に属し、かつ、自然界に見出される、人為的な操作を行ったことが確認されない、または、人為的な行為の結果生じたことが確認されない植物をいう。
【００１７】
特に、本発明の一つの実施態様において、GDH遺伝子の発現を増強し得る遺伝子が植物に導入され、それにより細胞内のGDH遺伝子が過剰発現することができ、天然の同種の植物と比較して休眠期間が短縮された植物が得られる。
本発明の一つの実施態様においては、GDHを含む核酸構築物を植物に導入し、得られた形質転換植物においてGDHを発現させることにより、2-OG含量が増加し、ジベレリン活性が高まり、その効果として、休眠期間が短縮し、出芽または発芽の揃った植物を得ることができる。GDHはグルタミン酸を酸化的に脱アミノし、2-OGとアンモニアを生成する反応とその逆反応である2-OGとアンモニアとを縮合しグルタミン酸を生成する反応を可逆的に触媒する。しかし、一般的にアンモニアに対するKm値が高いことから、生体内においては、グルタミン酸の分解、すなわち、グルタミン酸から2-OGとアンモニアを生成する反応を優先的に触媒すると考えられる。一般に、ジベレリンが過剰に存在したり、急激に細胞内濃度が上昇すると植物の生育や収量に悪い影響を与えることがあるが、本発明においては、直接に外部からジベレリンが供給されるのではなく、GDH遺伝子を過剰発現させることにより2-OGレベルの上昇を介して内在性ジベレリンレベルが上昇する。従って、本発明によれば、2-OGの増加を介して緩やかに内在性ジベレリン活性が増加するため、形態の異常を含む顕著な弊害を生じさせずに休眠期間が短縮され、発芽または出芽が揃う。典型的には、収穫はほぼ同一条件下で栽培された所定の時期に植物全体について一斉に行うため、発芽または出芽の遅れやバラツキはそのまま収穫時に収量の減少につながる。従って、本発明により、典型的にはさらに収量の安定的向上という利益も得られる。
【００１８】
本発明においては、植物の2-OG含量を増大させ、その結果としてジベレリン活性を高めるためには、GDH遺伝子の導入に限るものではなく、当該酵素とは異なる、グルタミン酸から2-OGを生成する酵素の遺伝子を導入してもよい。そのような遺伝子が導入された植物では、2-OG含量が増大し、その結果、ジベレリン活性が緩やかに上昇するであろう。例えば、そのような酵素として、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやアラニンアミノトランスフェラーゼ等をあげることができる。
本発明で用いられる2-OG含量を増大させ得る酵素、例えばGDHは、特にその由来が限定されるものではないが、より好ましくはアスペルギルス属微生物に由来する酵素、例えばアスペルギルス属微生物に由来するGDHが用いられる。さらに、好ましくは、アスペルギルス・ニデュランス、およびアスペルギルス・アワモリに由来するGDHが用いられる。さらに、上述した酵素活性、例えばGDH活性を有する限り、当該酵素タンパク質において１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有する改変された酵素およびその遺伝子、例えば改変GDHおよび改変GDH遺伝子も本発明において利用することができる。
これらの１以上の遺伝子を過剰発現させるためには、直接これらを発現し得る核酸構築物を導入する以外に、植物に内在するこれらの遺伝子の発現を増強させてもよい。そのような手段には、例えば、強力なプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む内在性遺伝子の発現を増強させるcis作用性核酸構築物の導入、これらの遺伝子の発現を増強し得るtrans作用性因子の導入が含まれる。
【００１９】
また、GDHの植物細胞の細胞内小器官に関する局在性についても、細胞質にかぎらず、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシゾームなどに局在させたものを用いることができる。したがって、これらの細胞内小器官に当該酵素タンパク質を移行させるためのシグナル、またはトランジット・ペプチドをそのＮ末端、またはＣ末端に付加したGDHも本発明において利用することができる。
このような遺伝子またはcDNAは公開された配列情報に基づき、当業者であれば、比較的容易に調製することができる。例えば、アスペルギルス・ニデュランスのGDH遺伝子は、そのcDNAのヌクレオチド配列がGenbankのアクセッション番号X16121にその配列が公開されている。アスペルギルス・ニデュランス由来のGDH遺伝子のヌクレオチド配列(cDNA配列)を配列番号１に、GDHのアミノ酸配列を配列番号２に示す。その配列に基づきタンパク質をコードする部分を含むようにDNA断片が増幅するようなPCRプライマーを合成し、アスペルギルス・ニデュランスの培養菌体より抽出したRNAを鋳型にRT-PCRを行えば、容易にGDH cDNAを得ることができる。アスペルギルス・ニデュランスは、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにATCC10074、あるいはATCC11267などとして登録されており、入手が可能である。また、アスペルギルス・アワモリのGDH cDNAについても、その配列はGenbankにアクセッション番号Y15784として公開されている。アスペルギルス・アワモリはATCC10548、あるいはATCC11358などとしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに登録されており、入手した株を用いて上述したのと同様な方法によりGDH cDNAを取得することができる。アスペルギルス・アワモリ由来のGDH遺伝子のヌクレオチド配列(cDNA配列)を配列番号３に、GDHのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２０】
本発明においては、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む核酸構築物を使用することができる。また、配列番号１または３と少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上のホモロジーのあるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、GDH活性を有するポリペプチドをコードする核酸構築物も本発明に使用することができる。このような相同性は、例えばFASTA等の当業者によく知られたプログラムを標準的なパラメータと共に用いて計算することができる。例えば、国立遺伝学研究所  生命情報・DDBJ研究センター(DDBJ/CIB)（http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）からFASTA等が提供されている（これらを、例えば、スコアー：100、アラインメント：100として使用することができる）。２以上の配列間のホモロジーを計算するためのその他のアルゴリズムおよびプログラムは、それらの標準的なパラメータと共に当業者にはよく知られたものである。このような核酸分子は、「ストリンジェントな条件」下で、これらの配列、特に配列番号１または３に記載の配列を有する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子としても理解することができる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を言う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば70％以上の相同性を有するDNA同士が優先的にハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士が有意にはハイブリダイズしない条件、より具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件が50℃、２ｘSSC、0.1％SDS、好ましくは１ｘSSC、0.1％SDS、より好ましくは0.1ｘSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。これらと同等な条件も当業者には容易に理解できるであろう（例えば、Sambrookら、 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)などに見ることができる。）。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には、途中にストップコドンが発生したものや活性中心の変異を失ったものも含まれるが、それらについては市販の活性発現ベクターにつなぎ酵素活性を測定することにより容易に取り除くことができる。
配列番号１および３は、Genetyx Ver3.2を用いて計算したところ、互いに66％のホモロジーを有していた。また、同様に、配列番号２と４については87％のホモロジーを有していた。
【００２１】
たとえば、GDHの活性はAmezianeら（Plant and Soil, 2000, 221: 47-57）の方法に従って行うことができる。より具体的には植物の組織例えば葉を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の5倍量の抽出緩衝液｛200mM Tris (pH8.0), 14mM β-メルカプトエタノール、10mM L-システイン-HCl、0.5mM PMSF｝を加える。これを遠心チューブに移し、4℃、12,000 rpmで30分間遠心した後、上清を限外濾過（Millipore，ウルトラフリー0.5フィルターユニット、バイオマックス-10）し、更に、抽出緩衝液で数回洗浄する。これに、100mM Tris (pH8.5)、20mM 2-オキソグルタル酸、10mM CaCl2、0.2mM NADH, 200mM NH4Clを含む反応液に、先に抽出した素酵素液を加え、波長340nmにおける吸光度の減少を測定することによってGDHの活性を測定することができる。抽出した粗酵素液中のタンパク質濃度は、例えば牛血清アルブミン（BSA）を標準タンパク質として、Bradford法のようなこの分野でよく知られた方法により測定することができる。
なお、本発明において、植物の2-OG含量を増大させ、ジベレリン活性を高める手段はGDH遺伝子の導入に限るものではなく、グルタミン酸から2-OGを生成するGDH以外の酵素の遺伝子を導入することによっても、2-OG含量が増大し、ジベレリン活性が高まった植物を得ることができる。そのような酵素の例には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやアラニンアミノトランスフェラーゼ等が含まれる。
【００２２】
本発明において使用する核酸構築物は当業者によく知られた方法を使用して作成することができる。核酸構築物を単離し、その配列を決定する方法を含む分子生物学的手段については、例えば、Sambrookら、Molecular cloning-Laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressのような文献を参照することができる。あるいは、本発明に使用しうる核酸構築物を作成するためにPCR法をはじめとする遺伝子増幅が必要になることもあるが、そのような手法については、F.M.Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)などを参照することができる。
本発明に使用するGDHおよび上述のいずれかの酵素をコードする核酸構築物は一般に、植物細胞で機能する適切なプロモーター、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーター（CaMV35S）、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターなどの適切なターミネーター、その他の発現に必要な、あるいは有利な配列、例えばエンハンサー、及び、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子、例えば、カナマイシン耐性、G418耐性、ハイグロマイシン耐性のような薬剤耐性遺伝子を含んでよい。
【００２３】
そのような構築物に使用しうるプロモーターは構成的プロモーターであっても器官特異的または生育ステージ特異的プロモーターであってもよく、使用する宿主、必要とする発現量、発現を特に意図する器官、または、生育ステージに依存して選択することができる。本発明の好ましい実施態様においては、器官、及び生育ステージに非特異的に発現する強力なプロモーターが使用され、それらには例えば、CaMV35Sプロモーターが含まれる。器官特異的プロモーターには、例えば、ファゼオリン遺伝子プロモーターやパタチン遺伝子プロモーターなどが含まれる。本発明の最も好ましい実施態様においては、CaMV35Sプロモーターのような強力な構成的プロモーターによりGDH遺伝子が駆動される核酸構築物が使用される。
【００２４】
本発明において使用しうる遺伝子導入法は特に限定されず、植物細胞、あるいは植物体への遺伝子導入法として当業者に知られた方法を宿主に応じて選択することができる。例えば、本発明の実施態様の一つにおいては、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法が利用される。このような形質転換系には、バイナリーベクターを使用することが望ましい。アグロバクテリウムを利用する場合は、形質転換に用いる核酸構築物は植物細胞に導入すべきDNA配列に隣接するT-DNA領域をさらに含む。好ましい実施態様においては移入された配列は左右のT-DNAボーダー配列の間に挿入される。このようなT-DNAをベースとする形質転換ベクターの適切な設計及び構築は当業者によく知られたものである。また、そのような核酸構築物を有するアグロバクテリウムを植物に感染させるための条件も当業者によく知られたものである。
本発明においては、他の遺伝子導入法を利用することもできる。使用しうる遺伝子導入方法の例としては、ポリエチレングリコールやカルシウムを用いたDNAのプロトプラストへの導入法、エレクトロポーレーションによるプロトプラスト形質転換法、パーティクルガンによる導入法等を挙げることができる。
次に上述したように操作された植物細胞等は、形質転換について選抜される。この選抜は、例えば、形質転換に使用した核酸構築物上に存在したマーカー遺伝子の発現に基づいて行うことができる。例えば、マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、適当な濃度の抗生物質、または除草剤等を含む培地上で操作された植物細胞等を培養、または生育させることにより選択することができる。あるいは、マーカー遺伝子が、β-グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などの場合はその活性についてスクリーニングすることにより形質転換体を選抜することができる。このようにして同定された形質転換体が植物体以外、例えば、プロトプラスト、カルス、外植片等である場合は植物体への再生がおこなわれる。この再生には使用する宿主植物について当業者に知られた方法を利用することができる。
【００２５】
このようにして得られた植物体は通常の方法、すなわち、非形質転換体と同様の条件で栽培してよく、本発明の核酸構築物を含む形質転換植物を同定するために、前述のマーカー遺伝子に基づく選抜に加えて、種々の分子生物学的手法を利用することができる。例えば、組換えDNA挿入断片の有無及びその構造を検出するためにはサザンハイブリダイゼーションやPCRを利用することができる。導入した核酸構築物に由来するRNA転写産物を検出または測定するためには、ノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCRなどを利用することができる。
【００２６】
次に得られた形質転換体の導入遺伝子の発現については、当該導入遺伝子にコードされるタンパク質、例えばGDHのタンパク質量、mRNA量、あるいは酵素活性の測定により評価される。例えば、タンパク質の量はウェスタンブロット等の方法により、mRNA量はノーザンブロット、定量的RT-PCR法によって評価することができる。また、植物抽出液中の前述の酵素活性測定は常法に従って行えばよい。例えばGDHの活性は、Amezianeらの方法に従って測定することができる(Ameziane R., Bernhard K., and Lightfood D., Plant and Soil, 221:47-57, 2000)。
【００２７】
このようして、導入遺伝子、例えばGDH遺伝子の発現が確認された形質転換植物について、さらに2-OG含量について評価される。2-OG含量は例えば、形質転換植物体全体またはその一部を破砕し、その抽出液を調製し、例えば、酵素法で定量することができる。植物抽出液の調製、および、2-OGの定量は、例えば、Usudaの方法に従って行うことができる(Usuda H., Plant Physiol, 78:859-864, 1985)。より具体的には、植物体から適切な方法によってサンプルを調製し、例えば、475μlの反応液｛0.1M Tris-HCl (pH8.5), 1.0mM CaCl2, 0.2mM NADPH, 0.2M NH4Cl｝に抽出したサンプル20μlを加え、340nmの吸光度を測定した後、GDHを5μl（10 unit）加え、37℃で10分間反応させる。再度340nmの吸光度を測定し、酵素液を加えた後の吸光度値と酵素を加える前の吸光度値の差から、2-OG酸含量を算出することができる。通常の栽培条件において、その地上部(葉部、茎部、あるいはその両方、あるいは花器、果実の一部)、あるいは地下部(根、塊茎)における2-OG含量が遺伝子導入の元株とした系統（非形質転換体）より、1.2倍以上増大した場合に2-OG含量が増加したと判定することができる。
【００２８】
ジベレリンの定量には2つのケースが考えられる。一つは、分析対象のジベレリンの種類があらかじめ決まっている場合で、この場合は、必要な精製を行ったのち、GC/MS法などの機器分析を行うことができる。もう一つは、分析試料に含まれるジベレリンの種類や存在量が分かっていない場合で、この場合は、精製および／または分画したのち、例えば、Chenらの方法に従ってバイオアッセイ（生物検定）を行うことができる。バイオアッセイのためには、ジベレリンに対して鋭敏に反応するイネの矮性突然変異体の短銀坊主を用いた点滴法が主に用いられている。簡単に言えば、モミを剥いだ玄米種子を70％エタノールで1分、2％次亜塩素酸ナトリウムで15分間処理し、表面殺菌した後、滅菌水で数回濯ぎ、滅菌水に浸漬し30℃で約2日間インキュベートする。次に発芽種子を、再度同様に滅菌処理した後、寒天培地（0.6％寒天）に播種し、25℃、16時間日長で約5日間培養を行い、生育が揃った芽生えのみ選抜し、第一葉と子葉鞘の間に被検液を2μl点滴する。前述の条件で、更に5日間培養した後、第二葉鞘の長さを測定することによってジベレリンの量を定量することができる。ジベレリンの定量は機器分析およびバイオアッセイのいずれの方法でもよく、機器分析において対照に比べて活性型ジベレリン含量が増加した場合またはバイオアッセイにおいて対照に比べてイネの節間伸張が統計的に有意に（例えば有意水準５％）促進された場合に、ジベレリン活性が増加したと判断することができる。
【００２９】
このようにして、内生の2-OG含量及びジベレリン活性が増加し、対照となる非形質転換体より休眠期間が短縮した形質転換植物が同定されたならば、その形質が遺伝的に安定に保持されるか否かが調べられる。このためには、通常の条件に従い植物体を育成・栽培・採種、またはバレイショのような場合は無性的に繁殖した塊茎を得て、後代における形質、その分離を解析すればよい。後代における導入核酸構築物の有無、その位置、その発現等は初代(T1世代)形質転換体と同様に解析することができる。
形質転換植物は導入したゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列に関してヘミ接合の場合もホモ接合の場合もあり得るが、必要に応じて交配すること等により、後代においてヘミ接合体もホモ接合体も導くことができる。ゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列は後代においてメンデリズムに従い分離する。従って、形質の安定性の観点から子孫植物及び種子を取得するためには、ホモ接合植物を使用することが望ましい。
また、形質転換体は多くの場合、遺伝子座としては、1ヶ所に外来遺伝子が挿入されるが、複数の遺伝子座に挿入された多コピー形質転換体であることも珍しくはない。導入遺伝子の安定性等の理由で、本発明においては単一コピー形質転換体がより好ましい。
【００３０】
そのようにして得られた形質転換植物は、その休眠期間について評価される。休眠期間の短縮の評価は、基準となる植物系統と本発明の植物系統のそれぞれの休眠期間、または基準となる植物系統と本発明によって作出された植物系統のそれぞれの休眠期間を統計的に比較し、有意水準５％として評価することによって行うことができる。一般には、この「基準となる植物系統」は上述した「天然の同種の植物」である。
例えば、形質転換バレイショの場合は、収穫後、常温(15〜25℃)、または低温(4〜8℃)で一般的におこなわれる状態で3ヶ月程度保存し、その後、実際に培養土などに種イモを植えこみ、出芽する種イモの割合を非形質転換植物（例えば、天然に存在する同種の植物を含む、本発明により遺伝子構築物を導入する元となった植物）と比較することにより休眠期間の短縮についての評価がおこなわれる。出芽(催芽)に要する日数は、保存の状態、品種、栽培の条件などにより異なるが、例えば、メークインを親株とする形質転換植物と非形質転換植物を常温で保存すると、本発明のバレイショまたは本発明によって作出されるバレイショの70%以上の種イモは催芽するまでの日数が1〜8週間短縮される。従って、バレイショの場合は、より簡便には、上述の条件下で70%以上の種イモが催芽するまでの日数が天然の同種のバレイショに比較して1〜8週間短縮された場合に休眠期間が短縮されたと判断することもできる。
このように形質転換植物は非形質転換植物に比べて、出芽または発芽が早まり、さらに、よく出芽または発芽が揃うため、生育や収量性を大きく向上させることができる。また、このようにして作製された形質転換植物からその種子を得ることもできる。種子は同種の非形質転換植物と同様な方法によって容易に得ることができる。必要であれば、得られた種子の保存、殺菌、害虫駆除等も当業者によく知られた通常の方法によって行うことが出来る。
【００３１】
休眠期間は、上述のような特定の核酸構築物の導入によるほか、放射線、紫外線、および／または変異原（例えば、エチレンイミン、エチルメタンスルホン酸等のアルキル化剤等）による突然変異の誘発、および必要により続く選抜によって植物細胞内の2-OGを高めることもできる。特に、核酸構築物の導入に依らずに、GDH遺伝子、アスパラギントランスフェラーゼ遺伝子、アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現を増強することによって細胞内2-OG含量を高めることによって植物の休眠期間を短縮させることもできる。一般的に変異を誘発する方法およびそれに使用する試薬は当業者によく知られたものであり、本発明においても使用することができる。そのようにして作製される植物の栽培方法および、2-OG含量、前述の各遺伝子の発現量および／または休眠期間の短縮に関する評価等は形質転換植物について上述したのと同様な方法および様式により行うことができる。
上述の記載からも分かるように、本発明によって一般に休眠期間を有する植物の休眠期間を非形質転換植物、例えば、天然の同種の植物に比較して短縮することができる。本発明は休眠打破にジベレリンが有効である植物に特に適している。そのような植物には、前述した、カラスムギ、レタス、バレイショ、モモ、ツバキ、イネ、ムギ類、ラミー、ラッカセイ、レスクグラス、スムーズブロムグラス、ダイコン、ブラシカ類、レタス、ナス、シソ、グロキシニア、カランコエ、プリムラ、ニゲラ、イチゴ、ウドが含まれるがこれらに限定されない。本発明の休眠期間の短縮された植物として、および、本発明によって作出される植物として特に好ましいのはバレイショである。
本発明は、2-OG含量が増加した植物、特に、GDH遺伝子の過剰発現につき操作された植物の製作、2-OG含量の測定、ジベレリンアッセイ、出芽試験および収量性試験に関する以下の実施例により具体的かつ詳細に説明される。
【実施例１】
【００３２】
アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulansまたはA.nidulans）由来NADP依存型GDH遺伝子の単離とTiプラスミッドベクターの構築
（１）A.nidulans由来NADP依存型GDH遺伝子（Aｎ-GDH）の単離
A.nidulansをポテトデキストロース寒天培地にまき、一晩30℃で培養し、更に得れらたコロニーをデキストロース液体培地で2日間培養し、増殖した菌よりTotal RNAを調整した。
RNAはPoly(A)Quick mRNA Isolation Kit (Stratagene社)を用いてmRNAを精製した後、First-strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Bioscience社)を用いて第１鎖cDNAを作成した。作成したFirst-strand cDNAをテンプレートに用いてPCR反応を行った。PCR反応条件は、94℃-3分；94℃-45秒、59℃-30秒、72℃-90秒、35サイクル；72℃-10分とし、パーキンエルマー社のPCR system 2400を用いて行った。用いたプライマーは、5’-TCT AGA ATG TCT AAC CCC CTT GTT GAG-3’（配列番号５）と5’-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3’（配列番号６）である。その結果、約1.4 kbpのバンドが認められ、予測される遺伝子のサイズと一致した。得られたPCR産物を、TA-Cloning-Kit（Invitrogen社）を用いてクローニングした。シークエンサー（ABI社377A）を用いて得られたクローンのヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオチド配列を配列番号１に、それにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
この配列は既知のA. nidulans由来NADP依存型GDH遺伝子と一致し、これをAn-GDHとした。
【００３３】
（２）Ti-プラスミドベクターの構築
更に、得られた遺伝子に、ミトコンドリアへのトランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列を付加した。ミトコンドリアへのトランジットペプチドをコードするヌクレオチド断片は、トマト由来NAD依存型GDH遺伝子の5’側の配列を鋳型としてプライマー，5’-CTG CAG ATG AAT GCT TTA GCA GCA AC-3’（配列番号７）と5’-TCT AGA TAA ACC AAG AAG CCT AGC TG-3’（配列番号８）を用いてPCRを行うことによって取得した。An-GDH遺伝子とミトコンドリアへのトランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列の連結は、An-GDH遺伝子とトランジットペプチド遺伝子を鋳型として4種のプライマー、5’-TCT AGA ATG AAT GCT TTA GCA GCA AC-3’（配列番号９）、5’-GGG AAG GTT TAG ACA TTA AAC CAA GAA GCC T-3’（配列番号１０）、5’-AGG CTT CTT GGT TTA ATG TCT AAC CTT CCC-3’（配列番号１１）及び5’-GAG CTC TTA CGC CTC CCA TCC TCG AA-3’（配列番号１２）を用いたPCRによって行った。このようにして得られた、ミトコンドリアへのトランジットペプチド配列を付加したGDH遺伝子をMtd-An-GDHとした。このMtd-An-GDH遺伝子を、アグロバクテリウムによる形質転換用のベクター、Tiプラスミド，pIG121-HmのGUS領域と置換することによって、pIG121-Hmに組み込んだ（図１）。得られたTi-プラスミッドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス、EHA101に導入し、バレイショの形質転換に用いた。
【実施例２】
【００３４】
バレイショ形質転換体の作出
バレイショ（品種、メークイン）の形質転換は，Gordonら（Plant Cell Reports，1993， 12：324-327）の方法に従って行った。無菌的に誘導したマイクロチューバーを切り、チューバーディスクを作成し、2mg/lゼアチンと0.1mg/lインドール酢酸を加えたMS寒天培地上に植え、１6時間日長、25℃で24時間培養した。構築した核酸分子を含むアグロバクテリウムを50mg/l カナマイシン及び 50mg/l ハイグロマイシンを含むYEP培地（10g/l バクトトリプトン，10g/l Yeast Extract, 1g/l グルコース）に接種し、28℃で一晩振とう培養した。24時間培養したチューバーディスクにこのアグロバクテリウム液を加え感染させた。10分後、滅菌した濾紙を用いて余分なアグロバクテリウム液を取り除き、先に用いた培地を含むシャーレに移植し、同条件で24時間培養した。その後、チューバーディスクを、50mg/l カナマイシン，300mg/l セファタキシム塩酸塩，2mg/l ゼアチン及び0.1mg/l インドール酢酸を含むMS寒天培地に移植し、形質転換体の選抜を行った。再分化したシュートを再度前記選抜培地に移し、耐性の確認を行った。明らかにカナマイシン抵抗性が認められたシュートを、50mg/l カナマイシン及び300mg/l セファタキシム塩酸塩を含むMS寒天発根培地に移植し、根の分化を誘導した。発根した再分化植物は、最低3回茎頂部を切り取り、選抜発根培地に移植し、カナマイシン抵抗性の確認を行い、キメラ個体を排除した。このようにして得られた5個体を土壌に馴化させ、塊茎を得た。
【実施例３】
【００３５】
導入遺伝子の確認
カナマイシンに抵抗性を示した選抜個体５系統、及び非感染植物よりDNAを抽出した。DNAの抽出はHondaら（Honda and Hirai, 1990, Jpn J Breed 40: 339-348）の方法に従った。抽出したDNAを鋳型として用い、An-GDH遺伝子特異的プライマー、5‘-TCT AGA ATG TCT AAC CCC CTT GTT GAG-3’（配列番号５）と5’-GAG CTC TCA CCA CCA GTC ACC CTG GTC-3’（配列番号６）及びベクター内のNPTII遺伝子を増幅するためのプライマー、5’-CCC CTC GGT ATC CAA TTA GAG-3’（配列番号１３）と5’-CGG GGG GTG GGC GAA GAA CTC CAG-3’（配列番号１４）を用いてPCR分析を行った。反応は、94℃-3分；94℃-45秒、55℃-30秒、72℃-90秒、35サイクル；72℃-10分とし、パーキンエルマー社のPCR system 2400を用いて行った。１%アガロースゲルを用いてPCR産物を電気泳動し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して増幅産物の有無およびサイズを調べた。
その結果、選抜した形質転換バレイショ(図２)にAn-GDH遺伝子特異的なバンド（約1.5 kbp）とNPTII遺伝子特異的なバンド（約1.1kbp）が認められ、非感染植物にはこれらのバンドが認められないことから、An-GDH遺伝子を含むT-DHA領域が形質転換バレイショに導入されていることが確認された。
【実施例４】
【００３６】
導入遺伝子の発現の確認（ノーザン分析）
An-GDH遺伝子が導入されていることが確認された形質転換バレイショを用いて、導入した遺伝子の発現を確認するために、ノーザン分析を行った。
形質転換バレイショの塊茎より、SDS-フェノール法によってRNAを抽出した。抽出したRNAは、18%ホルムアルデヒドを含む1.2%アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。ナイロンメンブラン（HybondN+）にブロッティングした後、UVで固定し、An-GDH遺伝子の全長を含むプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ノーザンブロット及びプローブの作成はロシュ・ダイアグノスティックス社のDIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 及びPCR DIG Probe Synthesis Kitを用いた。
その結果、形質転換バレイショの塊茎において、An-GDH遺伝子特異的バンドが確認された（図３）。形質転換バレイショの葉組織及び塊茎において導入した遺伝子が転写発現していることがわかった。非形質転換バレイショには、これらのAn-GDH特異的バンドは認められなかった。
【実施例５】
【００３７】
導入した遺伝子の発現（NADP-GDH活性）
An-GDH遺伝子が導入されていることが確認された形質転換バレイショを用いて、導入した遺伝子の発現を確認するために、NADP-GDH活性の測定を行った。
活性の測定はAmeziane ら（Plant and Soil, 2000, 221:47-57）の方法に従って行った。形質転換バレイショの葉組織（約0.2g）を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の5倍量の抽出緩衝液｛200mM Tris (pH8.0), 14mM β-メルカプトエタノール、10mM L-システイン-HCl、0.5mM PMSF｝を加えた。この懸濁物を遠心チューブに移し、4℃、12,000 rpmで30分間遠心した後、上清を限外濾過（Millipore，ウルトラフリー0.5フィルターユニット、バイオマックス-10）し、更に抽出緩衝液で3回洗浄し、フィルター上の沈殿を回収し、粗酵素液とした。
活性の反応は、100mM Tris (pH8.5)、20mM 2-オキソグルタル酸、10mM CaCl2, 0.2mM NADH, 200mM NH4Clを含む反応液に、先に抽出した粗酵素液を加え、波長340nmにおける吸光度の減少を測定した。抽出した素酵素液中のタンパク質濃度は、牛血清アルブミン（BSA）を標準タンパク質として、Bradford法で測定した。
その結果、形質転換バレイショからのサンプル中には非形質転換バレイショからのサンプルに比べて約20-50倍の高い活性が認められた（表１）。非形質転換体からのサンプル中には殆んどNADP-GDH活性が認められなかったことから、これらの活性は、導入したAn-GDH遺伝子の発現による活性であると考えられた。
【００３８】
2005229823.tif 000002
【実施例６】
【００３９】
GDH遺伝子導入バレイショの2-オキソグルタル酸（2-OG）含量の測定
形質転換バレイショ(Mtd 8)の葉組織中の2-OG含量の測定を行った。バレイショはパワーソイル500gとバーミキュライト500gの混合土壌で1ヶ月間栽培した生育旺盛な植物体の葉組織を材料に用いた。抽出はAgarieら(Plant Science, 2002, 162:257-265)の方法に従った。葉組織（約0.1g）を、液体窒素を用いて破砕した後、200μlの3% HCO4を加えよく混合した。12,000 rpmで10分間遠心した後、上清を別のチューブに移した。残った沈殿に再度、200μlの3% HCO4を加え、よく混合した。12,000rpmで10分間遠心した後、上清を先のチューブに移した。回収した上清に50-70μlの5M K2CO3を加え、液を中性化した。リトマス試験紙を用いて、液のpHが中性であることを確認した後、滅菌水で液量を600μlに調製し、測定用のサンプルとした。2-OG含量の測定は、Usada ら(文献：前掲)の方法を改変して行った。475μlの反応液｛0.1M Tris-HCl(pH8.5), 1.0mM CaCl2, 0.2mM NADPH, 0.2M NH4Cl｝に抽出したサンプル20μlを加え、340nmにおける吸光度を測定した後、グルタミン酸脱水素酵素(GDH)を5μl（10 unit）加え、更に37℃で10分間反応させた。再度340nmにおける吸光度を測定し、酵素液を加えた後の吸光度値と酵素を加える前の吸光度値の差から、2-OG含量を算出した。
その結果、形質転換バレイショは、非形質転換バレイショに比べて、2-OG含量が1.7倍に増加していた（図４）。
【実施例７】
【００４０】
GDH遺伝子導入バレイショ塊茎のジベレリンのバイオアッセイ
イネの矮性突然変異体, 短銀坊主をアッセイに用いた。アッセイ方法はChenらの方法に従った（Plant Cell and Environment, 2001, 24: 469-476）。モミを剥いだ玄米種子を70％エタノールで1分、2％次亜塩素酸ナトリウムで15分間処理し、表面殺菌した後、滅菌水で3回濯ぎ、滅菌水に浸漬し30℃で2日間インキュベートした。発芽種子を、再度同様に滅菌処理した後、0.6％寒天を蒸留水に加え、オートクレーブ滅菌した後、直径3cmの試験間に25mlずつ分注した寒天培地に播種した。25℃、16時間日長で5日間培養を行い、生育が揃った芽生えのみ選抜し、第一葉と子葉鞘の間に被検液を2μl点滴した。同条件で、5日間培養した後、第二葉鞘の長さを測定した。
収穫後直ちに-80℃保存した塊茎、収穫から2ヶ月目及び収穫から3ヶ月目の塊茎をアッセイ用の材料として用いた。収穫後の塊茎は屋内で保存した。液体窒素を用いて塊茎全体を粉砕した後、生重量の3倍量の80％アセトンを加え抽出を行った。遠心分離により、不純物を取り除いた後、上澄みを凍結乾燥した。20％アセトンを用いて、100μl/g生重量になるように調製した。ジベレリンの特異性を調べるために、ジベレリン拮抗剤であるダミゾジッド 1mg/l液を用いた。形質転換バレイショ塊茎被検液区、非形質転換バレイショ塊茎被検液区及び形質転換バレイショ塊茎被検液にダミゾジットを等量添加した区の３区を設けた。
その結果、形質転換バレイショ塊茎より抽出した被検液を点滴した場合、非形質転換バレイショより抽出した被検液を点滴した場合に比べて、第二葉鞘長の伸張が促進されることが分かった。このことは、非形質転換バレイショ塊茎被検液より形質転換バレイショ塊茎被検液の方が、活性型ベレリン含量が増加していることを示唆していた。また、第二葉鞘長の伸張促進効果が、ダミゾジットを添加することによって抑制されることから、この第二葉鞘長の伸張がジベレリン特異的な効果と考えられた（図5）。さらに、塊茎の保存期間が長くなるに従い、第二葉鞘長の伸張が促進される傾向が認められたことから、長期保存中に塊茎内のジベレリン活性が徐々に増加することによって、休眠が打破されるものと考えられた。
【実施例８】
【００４１】
形質転換バレイショの出芽調査
収穫から3ヶ月目の形質転換バレイショの塊茎及び非形質転換バレイショの塊茎の出芽について調査を行った。形質転換バレイショ塊茎では既に出芽しているものが多数認められた（42個中40個）のに対し、非形質転換バレイショ塊茎には、全く出芽が認められなかった（30個中0個）。さらに、形質転換バレイショ塊茎10個、非形質転換バレイショ塊茎10個を25℃の温室で浴光育芽処理を3日間行った後、バーミキュライトのみの土壌に移植した場合と、同数の塊茎をそのまま、バーミキュライトに移植した場合の、出芽数を測定した。移植した塊茎は、日中24℃、夜間18℃に設定した閉鎖系温室で栽培を行い、1週間ごとに、地表に芽を出した塊茎の数を調査した。
その結果、形質転換バレイショ塊茎は、移植２週間後に出芽が認められ、3週間後では、すべての塊茎から出芽が認められた。これに対し、非形質転換バレイショでは4週間目に、出芽が認められらものの、7週間後でもすべての塊茎から出芽が認められることは無かった（図６）。これらの結果により、形質転換バレイショ塊茎は明らかに出芽が早まり、さらに、出芽がよく揃うことが分かった。
【実施例９】
【００４２】
形質転換バレイショの収量調査
形質転換バレイショ及び非形質転換バレイショの塊茎を用いて収量調査を行った。7号鉢に0.3kgのパワーソイル（呉羽化学工業）と1kgのバーミキュライトを入れ、これに塊茎を１個播種した。形質転換バレイショと非形質転換バレイショそれぞれ8株を用いて3ヶ月間栽培を行い、地上部生重量、塊茎数、塊茎重量の測定を行った。栽培時は、茎数を1本に統一し、追肥を行わずに水掛のみ行った。
その結果、形質転換バレイショは、非形質転換バレイショに比べて、地上部重量が1.13倍、塊茎重量が1.35倍、塊茎数が1.24倍に増加した（表２）。
【００４３】
2005229823.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】構築したプラスミッドベクターを模式的に示したものである。  Nos-Pro：  ノパリンシンターゼプロモーター、NPTII:  ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ、Nos-Ter：  ノパリンシンターゼターミネーター、3５S-Pro：  カリフラワーモザイクウイルス３５Sプロモーター、Mtd-AN-GDH:  ミトコンドリアへのトランジットペプチドを付加したAspergillus nidulans由来グルタミン酸脱水素酵素遺伝子（GDH）、HPT:  ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ、H: HindIII, B: BamHI, X: XbaI, Sp: SpeI, E: EcoRI,LB: レフトボーダー，RB： ライトボーダー
【図２】形質転換バレイショのPCR分析の結果を示す。A: An-GDH遺伝子特異的プライマー使用、B: NPTII遺伝子特異的プライマー使用、レーン1： 100 bpマーカー、レーン2： 非形質転換バレイショ、レーン3： 形質転換バレイショ Mtd 1、レーン4： 形質転換バレイショ Mtd 2、レーン5： 形質転換バレイショ Mtd 3、レーン6： 形質転換バレイショ Mtd 5、レーン7： 形質転換バレイショ Mtd 8．
【図３】形質転換バレイショのノーザン分析の結果を示す。塊茎より抽出した10μg total RNAを電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。An-GDH遺伝子全長をプローブに用いた。レーン1： 非形質転換バレイショ、レーン2： 形質転換バレイショ Mtd 1、レーン3： 形質転換バレイショ Mtd 2、レーン4： 形質転換バレイショ Mtd 3，レーン5： 形質転換バレイショ Mtd 5、レーン6： 形質転換バレイショ Mtd 8
【図４】GDH形質転換バレイショの2-オキソグルタル酸(2-OG)含量を示す(n=3)。Control: 非形質転換バレイショ、Mtd8: 形質転換バレイショ。
【図５】GDH形質転換バレイショ塊茎のジベレリンアッセイの結果を示す。Cont: 非形質転換バレイショ塊茎被検液, Mtd8: 非形質転換バレイショ塊茎被検液，Mtd8+Dami: 形質転換バレイショ塊茎被検液＋ダミノジット液。After 0-M: 収穫直後の塊茎，After 2-M: 収穫から2ヵ月後の塊茎，After 3-M: 収穫から3ヶ月後の塊茎。
【図６】GDH形質転換バレイショ塊茎の出芽試験結果を示す。(A)浴光処理：24℃の温室内で3日間日光にあてた後、バーミキュライトに移植した。(B)無処理：浴光育芽を行わずにバーミキュライトに移植した。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号５〜１４：PCRプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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