(57)【要約】【課題】局所照明絞りの像が二重像にならない顕微鏡の照明装置を提供する。【解決手段】照明装置は、局所照明光を生成する局所照明光学系２と、観察用照明光を生成する蛍光観察用照明光学系３と、局所照明光の光路と観察用照明光の光路とを合成する照明光合成用ダイクロイックミラー１３と、標本Ｓからの光を結像して標本像Ｍを形成する観察光学系１の光軸１ａ上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラー５とを備えている。局所照明光学系２は局所照明絞り１２を含み、蛍光観察用照明光学系３は視野絞り１８を含んでいる。照明光合成用ダイクロイックミラー１３はおもて面１３ａとうら面１３ｂを有し、うら面１３ｂがおもて面１３ａに対して傾斜角を有し、おもて面１３ａは、局所照明光学系２から射出される局所照明光を反射し、蛍光観察用照明光学系３から射出される励起光を透過する。【選択図】      図１
2005316289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の照明装置であり、
観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、
局所照明光を生成する局所照明光学系と、
観察用照明光の光路と局所照明光の光路とを合成する照明光合成用ミラーであり、照明光合成用ミラーはおもて面とうら面とを有し、おもて面は観察用照明光と局所照明光の一方である第一照明光を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方である第二照明光を少なくとも透過し、うら面はおもて面に対して傾斜角を有している照明光合成用ミラーと、
標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている、顕微鏡の照明装置。
【請求項２】
請求項１において、照明光合成用ミラーのおもて面に対するうら面の傾斜角は、第一照明光のうち照明光合成用ミラーのおもて面を透過しうら面で反射された光を観察光学系の対物レンズに到達する前に観察光学系から完全に除外させる角度である、照明装置。
【請求項３】
請求項１において、観察用照明光学系は、観察用照明光の照明範囲を規制する視野絞りを備え、視野絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口サイズと光軸に垂直な面内における開口位置とが可変であり、
局所照明光学系は、局所照明光の照明範囲を規制する局所照明絞りを備え、局所照明絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口形状と開口サイズと光軸方向位置と光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である、照明装置。
【請求項４】
請求項１において、観察用照明光の光路と局所照明光の光路のずれを補正する補正用光学素子を備えており、補正用光学素子は、照明光合成用ミラーを透過する第二照明光を生成する照明光学系と照明光合成用ミラーとの間に配置され、補正用光学素子はおもて面とうら面を有し、そのうら面はおもて面に対して傾斜角を有し、補正用光学素子のおもて面に対するうら面の傾斜角は照明光合成用ミラーのおもて面に対するうら面の傾斜角に等しく、補正用光学素子と照明光合成用ミラーは厚さの広がる方向が互いに逆向きに配置されている、照明装置。
【請求項５】
顕微鏡の照明装置であり、
観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、
局所照明光を生成する局所照明光学系と、
観察用照明光の光路と局所照明光の光路を合成する照明光合成用接合プリズムであり、照明光合成用接合プリズムは接合面を有し、接合面は観察用照明光と局所照明光の一方を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方を少なくとも透過する照明光合成用接合プリズムと、
標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている、顕微鏡の照明装置。
【請求項６】
請求項５において、観察用照明光学系は、観察用照明光の照明範囲を規制する視野絞りを備え、視野絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口サイズと光軸に垂直な面内における開口位置とが可変であり、
局所照明光学系は、局所照明光の照明範囲を規制する局所照明絞りを備え、局所照明絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口形状と開口サイズと光軸方向位置と光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である、照明装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡の照明装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物細胞内の蛋白や小器官の動態および機能を解析する研究において、細胞内の特定の部位に光を照射し、それによる反応を観察する実験が広く行なわれている。この実験では、観察対象となる細胞内の特定物質に光照射反応の主体となる蛍光試薬を抗体染色や遺伝子導入によって標識した蛍光標本を用いる。そして、さまざまな蛍光試薬の光照射反応の態様に応じて、その特徴を活かした実験手法が考案されている。
【０００３】
実験手法の代表的な例として、「Caged compound」と呼ばれる試薬（以降、Caged試薬と称する）を用いた実験（以降、Caged実験と称する）が挙げられる。Caged試薬は蛋白と結合してその蛋白の活動を不活性化させる機能を持っているが、ＵＶ光（中心波長３６０ｎｍ程度の光）を照射することにより蛋白との結合が解除され、抑制されていた蛋白の活動が活性化される。この特徴を利用すれば、ＵＶ光を照射した部分だけを活性化させることができるため、細胞内の蛋白を活性化させたい場所と時間をコントロールする手法として広く用いられている。
【０００４】
Caged実験では、蛍光観察の過程で所望の場所に所望のタイミングでＵＶ光を照射し、その前後で蛍光の動態がどのように変化するか、また細胞内にどのように伝播するかを観察する。従って、Caged実験を行なうためには、標本の観察範囲中の所望の位置に局所的にＵＶ光を照射するCaged試薬解除用局所照明光学系と、観察範囲の全体を励起光照射する蛍光観察用照明光学系との二種類の照明光学系が必要である。特に、Caged試薬解除後の活性化現象が１秒以下という早い時間内に起こる場合には、Caged試薬解除を行ないながら同時に蛍光観察を行なうことが可能である必要がある。
【０００５】
特開平７−５６０９２号公報は、Caged試薬解除を行ないながら同時に蛍光観察を行なうことを可能にする照明装置を開示している。この照明装置は、局所照明絞りを備えたCaged試薬解除用の局所照明光学系と、視野絞りを備えた励起光照射用の蛍光観察用照明光学系と、局所照明光学系から射出される局所照明光の光路と蛍光観察用照明光学系から射出される蛍光観察用照明光の光路とを合成する照明光合成手段としてのダイクロイックミラーとを備えており、標本上に局所照明光と蛍光観察用照明光を同時に照射することができる。
【特許文献１】特開平７−５６０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特開平７−５６０９２号公報の照明装置はCaged実験用に構成されているため、ＵＶ光による局所照明を行なうことを前提としており、従って可視光励起による蛍光観察用照明との合成手段としてダイクロイックミラーを用いている。一方で、Caged実験以外の実験手法にも目を向けると、局所照明に必要とされる光はＵＶ光に限らない。例えばＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching）という実験手法は、標本の所望の位置に局所的に強力な励起光を照射して褪色させた後に、蛍光標識された物質が周辺から流入する様子を観察することによって、特定の蛋白などの物質の移動や拡散を可視化する手法である。ＦＲＡＰにおいては、褪色用局所照明と蛍光観察用照明には同一波長の励起光が用いられる。従ってこの場合には、合成手段にはダイクロイックミラーではなくハーフミラーを用いるのが適当である。
【０００７】
しかし、特開平７−５６０９２号公報の照明装置のダイクロイックミラーをハーフミラーに変更した場合には、以下に述べる不具合が示す発生する。図７は、特開平７−５６０９２号公報の照明装置のダイクロイックミラーをハーフミラーに変更した光学系の一部を模式的に示している。図７において、局所照明光学系の局所照明絞り４５を通った光は合成手段であるハーフミラー３５のおもて面３５ａによって大部分が反射されるとともに、その一部はハーフミラー３５のおもて面３５ａを透過してハーフミラー３５のうら面３５ｂに達し、さらにその一部はハーフミラー３５のうら面３５ｂによって反射される。ハーフミラー３５のうら面３５ｂからの反射光は、ハーフミラー３５のおもて面３５ａからの反射光に対して平行にずれた光となる。ハーフミラー３５のうら面３５ｂからの反射光とハーフミラー３５のおもて面３５ａからの反射光は共に投影レンズ３６とダイクロイックミラー２５と対物レンズ２４を通って標本面Ｓに投影される。このため、ハーフミラー３５のうら面３５ｂからの反射光の投影位置は、ハーフミラー３５のおもて面３５ａからの反射光の投影位置に対してずれたものとなる。その結果、標本面Ｓに投影される局所照明絞り４５の像は二重像になってしまう。
【０００８】
また、特開平７−５６０９２号公報の照明装置を用いてCaged実験を行なう場合でも、以下に示すような問題がある。Caged実験を行なうに当たっては、標本中のCaged試薬解除を行なう位置すなわち標本面上における局所照明絞りの像の投影位置が、実験者の所望する位置と一致しているかどうかを事前に確認しておきたいものである。ただし、ＵＶ光を照射した時点でCaged試薬は解除されてしまうから、局所照明絞りの像の投影位置を事前に確認するためには、Caged試薬が解除されない可視光による照明を行なう必要がある。ところが、合成手段であるダイクロイックミラーはＵＶ光を反射し可視光を透過する特性を有している。詳細に説明すると、局所照明絞りを通った光が可視光である場合、合成手段であるダイクロイックミラーのおもて面で反射される光は５％弱程度であり、大部分はダイクロイックミラーのおもて面を透過してダイクロイックミラーのうら面に達し、同様に５％弱程度の光がダイクロイックミラーのうら面により反射される。この反射率は、コートを施していないガラス面における典型的な物性値である。結果として、前述のハーフミラーを用いた場合と同様に、標本面上に投影される局所照明絞りの像は二重像になってしまう。
【０００９】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、局所照明絞りの像が二重像にならない顕微鏡の照明装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、顕微鏡の照明装置に向けられている。
【００１１】
本発明の照明装置は、観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、局所照明光を生成する局所照明光学系と、観察用照明光の光路と局所照明光の光路とを合成する照明光合成用ミラーであり、照明光合成用ミラーはおもて面とうら面とを有し、おもて面は観察用照明光と局所照明光の一方である第一照明光を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方である第二照明光を少なくとも透過し、うら面はおもて面を透過する第二照明光を少なくとも透過し、うら面はおもて面に対して傾斜角を有している照明光合成用ミラーと、標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている。
【００１２】
本発明の別の照明装置は、観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、局所照明光を生成する局所照明光学系と、観察用照明光の光路と局所照明光の光路を合成する照明光合成用接合プリズムであり、照明光合成用接合プリズムは接合面を有し、接合面は観察用照明光と局所照明光の一方を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方を少なくとも透過する照明光合成用接合プリズムと、標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、局所照明絞りの像が二重像にならない顕微鏡の照明装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１５】
［第一実施形態］
図１は、本発明の第一実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。本実施形態の顕微鏡は、顕微鏡本体と、顕微鏡本体に組み込まれた照明装置とから構成されている。顕微鏡本体は、標本Ｓからの光を結像して標本像Ｍを形成する観察光学系１を備えている。標本Ｓは、Caged試薬によって不活性化されると同時に蛍光試薬によって標識された物質を含むものとする。
【００１６】
観察光学系１は、対物レンズ４と吸収フィルター６と結像レンズ７とから構成されている。対物レンズ４と吸収フィルター６と結像レンズ７は観察光学系１の光軸１ａ上に標本Ｓ側から順に配置されている。標本Ｓからの観察光は、対物レンズ４に入射し、対物レンズ４を通過して平行光束となり、吸収フィルター６を透過して結像レンズ７に入射し、対物レンズ４と結像レンズ７とによって結像され、所定の結像面に標本像Ｍが形成される。標本像Ｍは、標本像Ｍと共役の位置に配置された図示しない接眼レンズやカメラや測光装置によって観察されたり測定されたりする。
【００１７】
照明装置は、局所照明光を生成する局所照明光学系２と、観察用照明光を生成する観察用照明光学系である蛍光観察用照明光学系３と、局所照明光の光路と観察用照明光の光路とを合成する照明光合成用ミラーである照明光合成用ダイクロイックミラー１３と、観察用照明光の光路と局所照明光の光路のずれを補正する補正用光学素子である補正用楔ガラス板１３ｃと、視野絞り投影レンズ１９と、観察光学系１の光軸１ａ上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラー５とを備えている。
【００１８】
局所照明光学系２は、局所照明光光源８とコレクトレンズ９とシャッター１０とバンドパスフィルター１１と局所照明絞り１２とを備えている。局所照明光光源８から射出された光はコレクトレンズ９によってほぼ平行な光束に整形され、シャッター１０の開放時にバンドパスフィルター１１に入射する。バンドパスフィルター１１は、Caged試薬解除用のＵＶ波長帯の光だけを選択的に透過するＵＶバンドパスフィルター１１ｕと、標本Ｓ中の蛍光試薬が発する蛍光の波長帯の光だけを選択的に透過する蛍光バンドパスフィルター１１ａと、ＵＶバンドパスフィルター１１ｕと蛍光バンドパスフィルター１１ａの一方を局所照明光学系２の光軸２ａ上に選択的に配置するバンドパスフィルターチェンジャー１１ｘとを備えている。バンドパスフィルター１１は、所望の局所照明に必要な波長帯の光だけを透過する。言い方を変えると、バンドパスフィルター１１は、必要な照明波長に応じて局所照明光の波長を変更する照明波長変更手段を構成している。その結果、局所照明光が生成される。バンドパスフィルター１１を透過した局所照明光は局所照明絞り１２に入射する。局所照明絞り１２は、標本Ｓと光学的に共役な位置に配置されており、標本Ｓに対する局所照明光の照明範囲を規制する。局所照明絞り１２は、円形のピンホールや細長いスリットなどから開口部の形状を任意に選択できるとともに開口部の大きさを選択できる。局所照明絞り１２はまた、局所照明絞り稼動部１２ｘによって、局所照明光学系２の光軸２ａの方向と光軸２ａと垂直な方向とに移動可能に配置されている。つまり局所照明絞り１２は、開口形状と開口サイズと光軸方向位置と光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である。局所照明絞り１２を通過した局所照明光は照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａに入射する。
【００１９】
蛍光観察用照明光学系３は、励起光光源１４とコレクトレンズ１５とシャッター１６と励起フィルター１７と視野絞り１８とを備えている。励起光光源１４から射出された光はコレクトレンズ１５によってほぼ平行な光束に整形され、シャッター１６の開放時に励起フィルター１７に入射する。励起フィルター１７は、標本Ｓ上の蛍光試薬を励起するのに必要な波長帯の光だけを選択的に透過する。その結果、観察用照明光である励起光が生成される。励起フィルター１７を透過した励起光は視野絞り１８に入射する。視野絞り１８は、標本Ｓと光学的に共役な位置に配置されており、標本Ｓに対する励起光の照明範囲を規制する。視野絞り１８は、視野絞り稼動部１８ｘによって蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと垂直な方向に移動可能であり、また図示しない視野絞り開閉部によって開口部の径を変えることができる。つまり視野絞り１８は、開口サイズと光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である。視野絞り１８を通過した励起光は補正用楔ガラス板１３ｃを透過して照明光合成用ダイクロイックミラー１３にうら面１３ｂの側から入射する。
【００２０】
局所照明光学系２と蛍光観察用照明光学系３はそれらの光軸２ａと光軸３ａが互いにほぼ直交するように配置されている。
【００２１】
照明光合成用ダイクロイックミラー１３は、楔形状のガラス板として構成されている。従って、照明光合成用ダイクロイックミラー１３はおもて面１３ａとうら面１３ｂを有し、うら面１３ｂは、おもて面１３ａに対して平行ではなく、所定の傾斜角を有している。照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａは、局所照明光学系２から射出される局所照明光を少なくとも反射し、蛍光観察用照明光学系３から射出される励起光を少なくとも透過する。その結果、局所照明光の光路と観察照明光である励起光の光路とが合成される。
【００２２】
より詳しくは、照明光合成用ダイクロイックミラー１３は、そのおもて面１３ａが局所照明光学系２の光軸２ａに対しても蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａに対してもほぼ４５度の傾きを持つように配置されている。照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａには、ほぼ４５度の入射角で入射するＵＶ光をほぼ１００％反射し、ほぼ４５度の入射角で入射する可視光を９５％以上透過する波長特性を有する干渉膜コートが施されている。
【００２３】
照明光合成用ダイクロイックミラー１３と補正用楔ガラス板１３ｃは、ミラー稼動部１３ｘによって一体的に抜き差しされる。つまり照明装置は、照明光合成用ダイクロイックミラー１３と補正用楔ガラス板１３ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上に挿入したり蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上から退避させたりするミラー稼動部１３ｘをさらに備えている。
【００２４】
補正用楔ガラス板１３ｃは、照明光合成用ダイクロイックミラー１３を透過する蛍光観察用照明光である励起光を生成する蛍光観察用照明光学系３と照明光合成用ダイクロイックミラー１３との間に配置されている。補正用楔ガラス板１３ｃはおもて面とうら面を有し、そのうら面はおもて面に対して傾斜角を有している。補正用楔ガラス板１３ｃのおもて面に対するうら面の傾斜角は照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａに対するうら面１３ｂの傾斜角に等しい。さらに、補正用楔ガラス板１３ｃと照明光合成用ダイクロイックミラー１３は、厚さの広がる方向が互いに逆向きに配置されている。
【００２５】
このため、蛍光観察用照明光学系３から射出された励起光は、補正用楔ガラス板１３ｃを通過することによって屈折されるが、その後、照明光合成用ダイクロイックミラー１３を通過することによって逆方向に屈折される。その結果、照明光合成用ダイクロイックミラー１３を通過した後の励起光の進行方向が、補正用楔ガラス板１３ｃに入射する前の励起光の進行方向に対してほぼ平行に補正される。従って、ミラー稼動部１３ｘによって照明光合成用ダイクロイックミラー１３と補正用楔ガラス板１３ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上から退避させたときの励起光の光路と、蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上に挿入したときと励起光の光路とはほぼ平行である。その結果、照明光合成用ミラーと補正用楔ガラス板を一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上に挿入したときと蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上から退避させたときとの標本上における視野絞りの投影像の位置ずれが極めて少なくなる。
【００２６】
蛍光観察用照明光学系３からの励起光は、補正用楔ガラス板１３ｃと照明光合成用ダイクロイックミラー１３を透過して蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａにほぼ平行な方向に進み、視野絞り投影レンズ１９を通過して蛍光観察用ダイクロイックミラー５に入射する。また、局所照明光学系２からの局所照明光は、後述するようにバンドパスフィルター１１のフィルターの種類に応じて挙動の詳細は異なるが大まかには、照明光合成用ダイクロイックミラー１３で反射されて蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａにほぼ平行な方向に進み、視野絞り投影レンズ１９を通過して蛍光観察用ダイクロイックミラー５に入射する。
【００２７】
蛍光観察用ダイクロイックミラー５は光学的に透明な平行平板で構成されている。従って、蛍光観察用ダイクロイックミラー５はおもて面５ａとうら面５ｂを有し、おもて面５ａとうら面５ｂは互いに平行である。蛍光観察用ダイクロイックミラー５は、そのおもて面５ａが観察光学系１の光軸１ａに対してほぼ４５度の傾きを持つように配置されている。また、観察光学系１の光軸１ａは蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａにほぼ直交している。従って、蛍光観察用ダイクロイックミラー５は、照明光合成用ダイクロイックミラー１３から入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系１の光軸１ａと同軸に標本Ｓに導光する。
【００２８】
蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａには、ほぼ４５度の入射光に対して、励起フィルター１７で選択された励起光の波長帯を含む比較的短い波長の光をほぼ１００％反射し、励起光により励起される標本Ｓ上の蛍光試薬が発する蛍光の波長帯を含む比較的長い波長の光を９５％以上透過する波長特性を有する干渉膜コートが施されている。蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａで反射された励起光は対物レンズ４を通過した後、視野絞り１８で規制された標本Ｓ上の範囲に照射される。励起光によって励起された標本Ｓ内の蛍光試薬が発する蛍光は、対物レンズ４と蛍光観察用ダイクロイックミラー５と吸収フィルター６と結像レンズ７を透過し、対物レンズ４と結像レンズ７とによって結像されて標本像Ｍを形成する。
【００２９】
図２は、蛍光観察用ダイクロイックミラー５・吸収フィルター６・ＵＶバンドパスフィルター１１ｕ・蛍光バンドパスフィルター１１ａ・照明光合成用ダイクロイックミラー１３・励起フィルター１７の波長透過率特性と、標本Ｓ内の蛍光試薬の励起スペクトルＥｘ・蛍光スペクトルＥｍとの関係の一例を示している。
【００３０】
局所照明光学系２からの局所照明光は、その波長によって挙動が２通りに分別される。
【００３１】
局所照明光学系２の光軸２ａ上にＵＶバンドパスフィルター１１ｕが配置されている場合は、局所照明光学系２からの局所照明光は照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａでほぼ１００％の光が反射されて蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと平行な方向に進み、視野絞り投影レンズ１９を通過し、蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａでほぼ１００％の光が反射され、対物レンズ４を通過し、標本Ｓ上における局所照明絞り１２で規制された照明範囲に照射され、その照明範囲内のCaged試薬が解除される。
【００３２】
また、局所照明光学系２の光軸２ａ上に蛍光バンドパスフィルター１１ａが配置されている場合は、局所照明光学系２からの局所照明光は照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａでほぼ５％弱の光だけが反射され、残りの光はおもて面１３ａを透過する。おもて面１３ａで反射された光は蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと平行な方向に進み、視野絞り投影レンズ１９を通過し、蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａでほぼ５％弱の光だけが反射され、対物レンズ４を通過し、標本Ｓ上における局所照明絞り１２で規制された照明範囲に照射される。標本Ｓに照射された光のうちごく僅かな成分は、標本Ｓのカバーガラスと水溶液の境界面で全反射し、対物レンズ４と蛍光観察用ダイクロイックミラー５と吸収フィルター６と結像レンズ７を透過し、対物レンズ４と結像レンズ７とによって結像されて標本像Ｍを形成する。
【００３３】
一方で、照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａを透過した９５％強の光のうち５％弱の光は照明光合成用ダイクロイックミラー１３のうら面１３ｂで反射される。この反射率は、前述したように、コートを施していないガラス面における典型的な物性値である。しかし、照明光合成用ダイクロイックミラー１３のうら面１３ｂはおもて面１３ａに対して傾斜角を有しているため、うら面１３ｂで反射された光は、蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと平行な方向から外れていき、視野絞り投影レンズ１９と蛍光観察用ダイクロイックミラー５を通って対物レンズ４に到達する前に観察光学系１から完全に除外される。言い方を変えると、照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａに対するうら面１３ｂの傾斜角は、局所照明光のうち照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａを透過しうら面１３ｂで反射された光を対物レンズ４に到達する前に観察光学系１から完全に除外させる角度である。この角度は、視野絞り投影レンズ１９の焦点距離と、照明光合成用ダイクロイックミラー１３から視野絞り投影レンズ１９までの距離とに依存して決定される。
【００３４】
他方で、蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａを透過した９５％強の光のうち５％弱の光は蛍光観察用ダイクロイックミラー５のうら面５ｂで反射され、おもて面５ａで反射された光と平行にずれた光として対物レンズ４に入射する。しかし、対物レンズに平行に入射した光は同一の位置に結像するので、標本Ｓ上での局所照明絞り１２の投影像は合致する。以上のことから、標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像は二重像にならない。
【００３５】
この観察形態は、標本Ｓ上の蛍光試薬が発する蛍光とほぼ同一の波長帯で、局所照明絞り１２の標本Ｓ上への投影像を落射明視野観察している状態として説明できる。標本像Ｍの位置での局所照明絞り１２の落射明視野観察像の光量の総和は、局所照明絞り１２を透過した局所照明光の光量の総和の１万分の１以下の微弱なものであるが、実験の主目的である蛍光観察像の光量の総和に比べれば十分に大きい。しかも、蛍光バンドパスフィルター１１ａを透過する光の波長帯は標本Ｓ上の蛍光試薬の励起波長域から外れているので、蛍光試薬の褪色を極めて少なくできる。また、蛍光バンドパスフィルター１１ａを透過する光の波長帯はＵＶ波長域から離れているので、Caged試薬が解除される心配もない。
【００３６】
次に、以上に述べた本実施形態の顕微鏡の動作手順について説明する。標本Ｓを観察するとき以外は、シャッター１０とシャッター１６は閉じておく。まず、蛍光観察用照明光学系３のシャッター１６を開放し、標本Ｓの蛍光像を観察しながら対物レンズ４の焦点を合わせる。蛍光像の観察範囲の設定は、視野絞り稼動部１８ｘを操作して視野絞り１８の投影像を視野のほぼ中心に合わせるとともに、視野絞り開閉部を操作して視野絞り１８の投影像の径を所望の大きさに調整することにより行なう。次に、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作して蛍光バンドパスフィルター１１ａを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置してからシャッター１０を開放する。このとき観察される像は、標本Ｓの蛍光像の中に、局所照明絞り１２の落射明視野投影像が光っている状態になる。この局所照明絞り１２の落射明視野投影像の光の波長域すなわち蛍光バンドパスフィルター１１ａを透過する光の波長域は、先に述べたように、標本Ｓ上の蛍光試薬の励起波長域からは外れているので、蛍光試薬の褪色は極めて少なく、また、ＵＶ波長域から離れているので、Caged試薬が解除される心配もない。この像を見ながら、局所照明絞り稼動部１２ｘを操作して、局所照明絞り１２の投影像の焦点を標本Ｓ上に合わせるとともに、標本Ｓ上の所望の位置すなわちCaged試薬を解除したい位置に移動させる。このとき標本Ｓ自体を移動させてもよい。位置が決まったら局所照明光学系２のシャッター１０を閉じ、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作してＵＶバンドパスフィルター１１ｕを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置した後、所望のタイミングでシャッター１０を開放してCaged解除を行なう。
【００３７】
なお、Caged実験のような局所照明を必要としない通常の蛍光観察を行なう場合には、ミラー稼動部１３ｘを操作して照明光合成用ダイクロイックミラー１３と補正用楔ガラス板１３ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａから退避させることにより、観察用照明の効率を上げることができる。ここで、ミラー稼動部１３ｘの挿入時と退避時では励起光の光路が僅かにシフトするため視野絞り１８の投影像は僅かに横ずれを起こすが、このずれは視野絞り稼動部１８ｘを操作することによって容易に補正できる。
【００３８】
以上に述べた本実施形態によれば、局所照明光の波長の如何に関わらず、局所照明絞り１２の標本Ｓ上での投影像は二重像になることがない。加えて、ＵＶ光による局所照明を行なってCaged試薬を解除する前に、標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像の位置を確認して所望の位置に正確に合わせることが可能となる。
【００３９】
［第一実施形態の変形例］
以上、本発明の第一実施形態について述べたが、本実施形態は以下に述べるような変形も可能である。
【００４０】
局所照明光光源８と励起光光源１４は、通常、水銀やキセノンなどの高輝度アーク光源で構成されるが、ＬＥＤ光源のように高速な点滅が可能な光源で局所照明光光源８と励起光光源１４を構成することによってシャッター１０とシャッター１６を省くこともできる。
【００４１】
また、照明光合成用ダイクロイックミラー１３のおもて面１３ａの干渉膜コートの波長特性を反転させて、局所照明光学系２と蛍光観察用照明光学系３の配置を逆にすることも可能である。
【００４２】
また、蛍光観察用ダイクロイックミラー５と吸収フィルター６と蛍光バンドパスフィルター１１ａと励起フィルター１７は、標本Ｓ中の蛍光試薬の波長特性によって任意の波長特性のものを組み合わせてもよく、あらかじめ複数の組み合わせパターンを用意しておきそれらのうちのひとつを組み合わせパターンを選択的に光路中に挿入してもよい。
【００４３】
上記以外にも、本実施形態の主旨を逸脱しない範囲内でさまざまな変形が可能である。
【００４４】
［第二実施形態］
図３は、本発明の第二実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。図３において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００４５】
局所照明絞り１２の開口は微小であるため、対物レンズ４と視野絞り投影レンズ１９の組み合わせによる色収差の影響によって、局所照明光の波長の違いによる標本Ｓ上への投影像の焦点位置ずれが目立つ場合がある。特に、ＵＶ波長帯は対物レンズ４の種類によっては収差が大きくなる。従って、蛍光バンドパスフィルター１１ａからＵＶバンドパスフィルター１１ｕに切り換えたときに、局所照明絞り１２の投影像のボケが生じる場合には、局所照明絞り稼動部１２ｘを局所照明光学系２の光軸２ａの方向に移動させて焦点を補正する必要がある。
【００４６】
図３から分かるように、本実施形態の照明装置は、第一実施形態の照明装置の構成に加えて、照明波長変更手段であるバンドパスフィルター１１の波長選択状態に応じて局所照明光学系２の光軸２ａに沿って局所照明絞り１２を移動させて標本Ｓと光学的に共役な位置に合致させる局所照明絞り補正部２０を備えている。局所照明絞り補正部２０は、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘの波長選択状態を示す電気信号を受け取り、それに対応して局所照明絞り稼動部１２ｘを光軸２ａの方向の指定された位置に移動させて局所照明絞り１２の位置を補正する。
【００４７】
本実施形態の顕微鏡の動作手順について説明する。標本Ｓは、対物レンズ４の焦点を確認する目的で必要なので、ＵＶ光や励起光を当てても支障のない標本を使用する。まず、蛍光観察用照明光学系３のシャッター１６を開放し、標本Ｓを観察しながら対物レンズ４の焦点を合わせる。次に、シャッター１６を閉じ、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作して蛍光バンドパスフィルター１１ａを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置してからシャッター１０を開放する。このとき観察される像は、局所照明絞り１２の落射明視野投影像だけとなる。この像を見ながら、局所照明絞り稼動部１２ｘを操作して局所照明絞り１２の投影像の焦点を標本Ｓ上に合わせ、焦点が合った位置を局所照明絞り補正部２０に記憶させる。次に、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作してＵＶバンドパスフィルター１１ｕを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置し、同様に局所照明絞り稼動部１２ｘを操作して局所照明絞り１２の投影像の焦点を標本Ｓ上に合わせ、焦点が合った位置を局所照明絞り補正部２０に記憶させる。以降は、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作して蛍光バンドパスフィルター１１ａまたはＵＶバンドパスフィルター１１ｕを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置するだけで、局所照明絞り補正部２０によって局所照明絞り稼動部１２ｘが光軸２ａ上に配置されたフィルターに対応した位置に自動的に移動させる。
【００４８】
以上に述べた本実施形態によれば、局所照明光の波長を切り換えたことにより標本Ｓ上への局所照明絞り１２の投影像の焦点位置がずれる場合でも、局所照明絞り補正部２０によって焦点位置が自動的に補正される。蛍光バンドパスフィルター１１ａの透過波長で標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像の位置を確認した後、ＵＶバンドパスフィルター１１ｕに切り換えたときに局所照明絞り１２の投影像がボケることがなく、事前に確認した投影像位置にあるCaged試薬を正確に解除することができる。
【００４９】
［第三実施形態］
図４は、本発明の第三実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。図４において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。また、標本Ｓは、蛍光試薬によって標識された物質を含み、ＦＲＡＰ実験に供されるものとする。
【００５０】
本実施形態の構成は、第二実施形態の構成から、局所照明光学系２中のＵＶバンドパスフィルター１１ｕを励起フィルター１１ｅに変更し、照明光合成用ダイクロイックミラー１３を照明光合成用ハーフミラー１３０に変更したものである。つまり本実施形態の照明装置は、第二実施形態のＵＶバンドパスフィルター１１ｕと照明光合成用ダイクロイックミラー１３とに代えて、励起フィルター１１ｅと照明光合成用ハーフミラー１３０とを備えている。さらに本実施形態の照明装置は、第二実施形態のミラー稼動部１３ｘに代えて、照明光合成用ハーフミラー１３０と補正用楔ガラス板１３ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上に挿入したり蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上から退避させたりするミラー稼動部１３０ｘを備えている。
【００５１】
励起フィルター１１ｅは、蛍光観察用照明光学系３中の励起フィルター１７と同一の波長透過率特性を有し、励起標本Ｓ上の蛍光試薬を励起するのに必要な波長帯の光だけを選択的に透過する。
【００５２】
照明光合成用ハーフミラー１３０は、楔形状のガラス板として構成されている。従って、照明光合成用ハーフミラー１３０はおもて面１３０ａとうら面１３０ｂを有し、うら面１３０ｂは、おもて面１３０ａに対して平行ではなく、所定の傾斜角を有している。照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａは、局所照明光学系２から射出される局所照明光を少なくとも反射し、蛍光観察用照明光学系３から射出される励起光を少なくとも透過する。その結果、局所照明光の光路と観察照明光である励起光の光路とが合成される。
【００５３】
より詳しくは、照明光合成用ハーフミラー１３０は、そのおもて面１３０ａが局所照明光学系２の光軸２ａに対しても蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａに対してもほぼ４５度の傾きを持つように配置されている。照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａには、ほぼ４５度の入射光に対して波長に依存せずほぼ９５％を反射する反射率特性を有する誘電体多層膜コートが施されている。
【００５４】
図５は、以上に述べた蛍光観察用ダイクロイックミラー５・吸収フィルター６・励起フィルター１１ｅ・蛍光バンドパスフィルター１１ａ・照明光合成用ハーフミラー１３０・励起フィルター１７の波長透過率特性と、標本Ｓ内の蛍光試薬の励起スペクトルＥｘ・蛍光スペクトルＥｍとの関係の一例を示している。
【００５５】
蛍光観察用照明光学系３からの励起光の挙動は、照明光合成用ハーフミラー１３０を透過して視野絞り投影レンズ１９に入射する光量がほぼ５％に減少することを除けば、第一実施形態で述べた内容と同一である。
【００５６】
また、局所照明光学系２からの局所照明光の挙動は下記のようになる。局所照明光学系２の光軸２ａ上に励起フィルター１１ｅが配置されている場合は、局所照明光学系２からの局所照明光は照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａでほぼ９５％の光が反射され、残りの光はおもて面１３０ａを透過する。おもて面１３０ａで反射されたほぼ９５％の光は蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと平行な方向に進み、視野絞り投影レンズ１９を通過し、蛍光観察用ダイクロイックミラー５のおもて面５ａでほぼ１００％の光が反射され、対物レンズ４を通過し、標本Ｓ上における局所照明絞り１２で規制された照明範囲に照射される。結果として、局所照明光光源８と励起光光源１４の光量がほぼ同一であるとすると、標本Ｓに照射される励起光の単位面積当たりの光量は、局所照明光学系２からの光量と蛍光観察用照明光学系３からの光量の比でほぼ９５対５となる。従って局所照明絞り１２で規制された照明範囲の励起光は相対的に強度過多となり、蛍光試薬の褪色に寄与する。
【００５７】
一方、照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａを透過したほぼ５％の光のうち５％弱の光は照明光合成用ハーフミラー１３０のうら面１３０ｂで反射される。この反射率は、前述したように、コートを施していないガラス面における典型的な物性値である。しかし、照明光合成用ハーフミラー１３０のうら面１３０ｂは、おもて面１３０ａに対して傾斜角を有しているため、照明光合成用ハーフミラー１３０のうら面１３０ｂで反射された光は、蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと平行な方向から外れていき、視野絞り投影レンズ１９と蛍光観察用ダイクロイックミラー５を通って対物レンズ４に到達する前に観察光学系１から完全に除外される。言い方を変えると、照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａに対するうら面１３０ｂの傾斜角は、局所照明光のうち照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａを透過しうら面１３０ｂで反射された光を対物レンズ４に到達する前に観察光学系１から完全に除外させる角度である。この角度は、視野絞り投影レンズ１９の焦点距離と、照明光合成用ハーフミラー１３０から視野絞り投影レンズ１９までの距離とに依存して決定される。
【００５８】
また、局所照明光学系２の光軸２ａ上に蛍光バンドパスフィルター１１ａが配置されている場合の挙動は、照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａでの反射率がほぼ９５％となることを除けば、第一実施形態で述べた内容と同一である。
【００５９】
次に、以上に述べた本実施形態の顕微鏡の動作手順について説明する。標本Ｓを観察するとき以外は、シャッター１０とシャッター１６は閉じておく。まず、蛍光観察用照明光学系３のシャッター１６を開放し、標本Ｓの蛍光像を観察しながら対物レンズ４の焦点を合わせる。蛍光像の観察範囲の設定は、視野絞り稼動部１８ｘを操作して視野絞り１８の投影像を視野のほぼ中心に合わせるとともに、視野絞り開閉部を操作して視野絞り１８の投影像の径を所望の大きさに調整することにより行なう。次に、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作して蛍光バンドパスフィルター１１ａを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置してからシャッター１０を開放する。このとき観察される像は、標本Ｓの蛍光像の中に、局所照明絞り１２の落射明視野投影像が光っている状態になる。この局所照明絞り１２の落射明視野投影像の光の波長域すなわち蛍光バンドパスフィルター１１ａを透過する光の波長域は標本Ｓ上の蛍光試薬の励起波長域からは外れているので、蛍光試薬の褪色は極めて少ない。この像を見ながら、局所照明絞り稼動部１２ｘを操作して、局所照明絞り１２の投影像の焦点を標本Ｓ上に合わせるとともに、標本Ｓ上の所望の位置すなわちCaged試薬を解除したい位置に移動させる。このとき標本Ｓ自体を移動させてもよい。位置が決まったら局所照明光学系２のシャッター１０を閉じ、バンドパスフィルターチェンジャー１１ｘを操作して励起フィルター１１ｅを局所照明光学系２の光軸２ａ上に配置した後、所望のタイミングでシャッター１０を開放して蛍光試薬の褪色を行なう。
【００６０】
なお、ＦＲＡＰ実験のような局所照明を必要としない通常の蛍光観察を行なう場合には、ミラー稼動部１３ｘを操作して照明光合成用ハーフミラー１３０と補正用楔ガラス板１３ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａから退避させることにより、観察用照明の効率を上げることができる。ここで、ミラー稼動部１３ｘの挿入時と退避時では励起光の光路が僅かにシフトするため視野絞り１８の投影像は僅かに横ずれを起こすが、このずれは視野絞り稼動部１８ｘを操作することで容易に補正できる。
【００６１】
以上に述べた本実施形態によれば、局所照明光の波長の如何に関わらず、局所照明絞り１２の標本Ｓ上での投影像は二重像になることがない。加えて、強力な励起光による局所照明を行なって蛍光試薬を褪色させる前に、標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像の位置を確認して所望の位置に正確に合わせることが可能となる。
【００６２】
［第三実施形態の変形例］
以上、本発明の第三実施形態について述べたが、本実施形態は以下に述べるような変形も可能である。
【００６３】
局所照明光光源８と励起光光源１４は、通常、水銀やキセノンなどの高輝度アーク光源またはガスレーザー光源もしくは固体レーザー光源で構成されるが、ＬＥＤ光源またはＬＤ光源のように高速な点滅が可能な光源で局所照明光光源８と励起光光源１４を構成することによってシャッター１０とシャッター１６を省くこともできる。
【００６４】
また、照明光合成用ハーフミラー１３０のおもて面１３０ａの誘電体多層膜コートの波長特性を反転させて、局所照明光学系２と蛍光観察用照明光学系３の配置を逆にすることも可能である。この場合、先に述べたように、コートを施していないガラス面における典型的な物性値は、４５度の入射光に対する透過率がほぼ９５％強であるから、ハーフミラーを用いなくても単なるガラス板で構成できる。
【００６５】
また、蛍光観察用ダイクロイックミラー５と吸収フィルター６と蛍光バンドパスフィルター１１ａと励起フィルター１１ｅと励起フィルター１７は、標本Ｓ上の蛍光試薬の波長特性によって任意の波長特性のものを組み合わせてもよく、あらかじめ複数の組み合わせパターンを用意しておきそれらのうちのひとつの組み合わせパターンを選択的に光路中に挿入してもよい。
【００６６】
上記以外にも、本実施形態の主旨を逸脱しない範囲内でさまざまな変形が可能である。
【００６７】
［第四実施形態］
図６は、本発明の第四実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。図６において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。
【００６８】
本実施形態の構成は、第三実施形態の構成から、照明光合成用ハーフミラー１３０を照明光合成用ハーフプリズム１３１に変更し、補正用楔ガラス板１３ｃを補正用凸レンズ１３１ｃに変更したものである。つまり、本実施形態の照明装置は、第三実施形態の照明光合成用ハーフミラー１３０と補正用楔ガラス板１３ｃとミラー稼働部１３ｘとに代えて、局所照明光の光路と観察用照明光の光路とを合成する照明光合成用プリズムである照明光合成用ハーフプリズム１３１と、照明光合成用ハーフプリズム１３１の挿入・退避による光路長の変化を補正する補正用レンズである補正用凸レンズ１３１ｃと、照明光合成用ハーフプリズム１３１と補正用凸レンズ１３１ｃを一体的に蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上に挿入したり蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａ上から退避させたりするプリズム稼動部１３１ｘとを備えている。
【００６９】
照明光合成用ハーフプリズム１３１は、二つの直角二等辺三角柱プリズムを貼り合わせた立方体の接合プリズムで構成され、接合面１３１ａを有している。照明光合成用ハーフプリズム１３１の接合面１３１ａは、局所照明光学系２から射出される局所照明光を少なくとも反射し、蛍光観察用照明光学系３から射出される励起光を少なくとも透過する。その結果、局所照明光の光路と観察照明光である励起光の光路とが合成される。
【００７０】
より詳しくは、照明光合成用ハーフプリズム１３１は、その接合面１３１ａが局所照明光学系２の光軸２ａに対しても蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａに対してもほぼ４５度の傾きを持つように配置されている。さらに、照明光合成用ハーフプリズム１３１は、局所照明光学系２からの局所照明光が入射する面が局所照明光学系２の光軸２ａに直交し、蛍光観察用照明光学系３からの励起光が入射する面が蛍光観察用照明光学系３の光軸３ａと直交するように配置されている。その結果、局所照明光と励起光が射出する照明光合成用ハーフプリズム１３１の面は局所照明光学系２の光軸２ａに直交している。照明光合成用ハーフプリズム１３１の接合面１３１ａには、ほぼ４５度の入射光に対して波長に依存せずほぼ９５％を反射する反射率特性を有する誘電体多層膜コートが施されている。
【００７１】
補正用凸レンズ１３１ｃは、照明光合成用ハーフプリズム１３１を透過する励起光を生成する蛍光観察用照明光学系３と照明光合成用ハーフプリズム１３１との間に配置されている。補正用凸レンズ１３１ｃは、照明光合成用ハーフプリズム１３１の挿入・退避による光路長の空気換算値の変化を補正して、蛍光観察用照明光学系３の視野絞り１８の投影位置を標本Ｓ上に一致させる。言い方を変えると、補正用凸レンズ１３１ｃは、照明光合成用ハーフプリズム１３１の挿入時における標本Ｓと光学的に共役な位置と、照明光合成用ハーフプリズム１３１の退避時における標本Ｓと光学的に共役な位置とを同一にする。その結果、照明光合成用ハーフプリズム１３１と補正用凸レンズ１３１ｃの挿入時と退避時とにおける標本上の視野絞りの投影像の焦点ずれが極めて少なくなる。
【００７２】
本実施形態における照明光および観察光の挙動は、照明光合成用ハーフミラー１３０のうら面１３０ｂによる反射光が存在しないことを除けば、第三実施形態で述べたものとおおむね同一である。つまり、本実施形態では、照明光合成用ハーフプリズム１３１において、局所照明光学系２からの局所照明光を蛍光観察用ダイクロイックミラー５に導光するための反射面は接合面１３１ａだけである。従って、接合面１３１ａの他の反射面によって局所照明光が蛍光観察用ダイクロイックミラー５に導光される要因が存在しない。従って、標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像が二重像にならない。
【００７３】
また、本実施形態の動作手順は、次に述べるプリズム稼動部１３１ｘの挿入・退避時の処置を除いて、第三実施形態で述べたものとおおむね同一である。具体的に述べると、プリズム稼動部１３１ｘの挿入時と退避時では、補正用凸レンズ１３１ｃの分だけ視野絞り１８の投影倍率が変化するため視野絞り１８の投影範囲は僅かに拡大縮小されるが、その大きさの変化は視野絞り開閉部を操作することにより容易に補正できる。
【００７４】
以上に述べた本実施形態によれば、局所照明光の波長の如何に関わらず、局所照明絞り１２の標本Ｓ上での投影像は二重像になることがない。加えて、強力な励起光による局所照明を行なって蛍光試薬を褪色させる前に、標本Ｓ上における局所照明絞り１２の投影像の位置を確認し、所望の位置に正確に合わせることが可能となる。
【００７５】
［第四実施形態の変形例］
以上、本発明の第四実施形態について述べたが、本実施形態は以下に述べるような変形も可能である。
【００７６】
局所照明光光源８と励起光光源１４は、通常、水銀やキセノンなどの高輝度アーク光源またはガスレーザー光源もしくは固体レーザー光源で構成されるが、ＬＥＤ光源またはＬＤ光源のように高速な点滅が可能な光源で局所照明光光源８と励起光光源１４を構成することによってシャッター１０とシャッター１６を省くこともできる。
【００７７】
また、照明光合成用ハーフプリズム１３１の接合面１３１ａの誘電体多層膜コートの波長特性を反転し、局所照明光学系２と蛍光観察用照明光学系３の配置を逆にすることも可能である。
【００７８】
また、蛍光観察用ダイクロイックミラー５、吸収フィルター６、蛍光バンドパスフィルター１１ａ、励起フィルター１１ｅおよび励起フィルター１７は、標本Ｓ上の蛍光試薬の波長特性によって任意の波長特性のものを組み合わせ可能であるし、複数の組み合わせパターンを用意して選択的に光路中に挿入することが可能である。
【００７９】
また、照明光合成用ハーフプリズム１３１の接合面１３１ａのコートを干渉膜コートにして、ダイクロイックプリズムとすることも可能である。例えば、ほぼ４５度の入射光に対してＵＶ光をほぼ１００％反射し、可視光をほぼ９５％以上透過する波長特性を有する干渉膜コートを施すことにより、第一実施形態で述べたようなCaged実験用の構成とすることもできる。
【００８０】
上記以外にも、本実施形態の主旨を逸脱しない範囲内でさまざまな変形が可能である。
【００８１】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲においてさまざまな変形や変更が施されてもよい。
【００８２】
［結び］
本発明は、顕微鏡の照明装置に向けられており、以下の各項に列記する照明装置を含んでいる。
【００８３】
１．  本発明の照明装置は、観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、局所照明光を生成する局所照明光学系と、観察用照明光の光路と局所照明光の光路とを合成する照明光合成用ミラーであり、照明光合成用ミラーはおもて面とうら面とを有し、おもて面は観察用照明光と局所照明光の一方である第一照明光を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方である第二照明光を少なくとも透過し、うら面はおもて面に対して傾斜角を有している照明光合成用ミラーと、標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている。
【００８４】
２．  本発明の別の照明装置は、第１項において、照明光合成用ミラーのおもて面に対するうら面の傾斜角は、第一照明光のうち照明光合成用ミラーのおもて面を透過しうら面で反射された光を観察光学系の対物レンズに到達する前に観察光学系から完全に除外させる角度である。
【００８５】
３．  本発明の別の照明装置は、第１項において、観察用照明光学系は、観察用照明光の照明範囲を規制する視野絞りを備え、視野絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口サイズと光軸に垂直な面内における開口位置とが可変であり、
局所照明光学系は、局所照明光の照明範囲を規制する局所照明絞りを備え、局所照明絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口形状と開口サイズと光軸方向位置と光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である。
【００８６】
４．  本発明の別の照明装置は、第１項において、観察用照明光の光路と局所照明光の光路のずれを補正する補正用光学素子を備えており、補正用光学素子は、照明光合成用ミラーを透過する第二照明光を生成する照明光学系と照明光合成用ミラーとの間に配置され、補正用光学素子はおもて面とうら面を有し、そのうら面はおもて面に対して傾斜角を有し、補正用光学素子のおもて面に対するうら面の傾斜角は照明光合成用ミラーのおもて面に対するうら面の傾斜角に等しく、補正用光学素子と照明光合成用ミラーは厚さの広がる方向が互いに逆向きに配置されている。
【００８７】
５．  本発明の別の照明装置は、第３項において、照明光合成用ミラーのおもて面は局所照明光を少なくとも反射するとともに観察用照明光を少なくとも透過し、照明装置はさらに、観察用照明光の光路と局所照明光の光路のずれを補正する補正用光学素子と、照明光合成用ミラーと補正用光学素子とを一体的に観察光学系の光軸上に挿入したり観察光学系の光軸上から退避させたりするミラー稼動部を備えており、補正用光学素子は、照明光合成用ミラーを透過する観察用照明光を生成する観察用照明光学系と照明光合成用ミラーとの間に配置され、補正用光学素子はおもて面とうら面を有し、そのうら面はおもて面に対して傾斜角を有し、補正用光学素子のおもて面に対するうら面の傾斜角は照明光合成用ミラーのおもて面に対するうら面の傾斜角に等しく、補正用光学素子と照明光合成用ミラーは厚さの広がる方向が互いに逆向きに配置されている。
【００８８】
６．  本発明の別の照明装置は、第３項において、局所照明光学系がさらに、必要な照明波長に応じて局所照明光の波長を変更する照明波長変更手段を備えており、照明装置がさらに、照明波長変更手段の波長選択状態に応じて局所照明光学系の光軸に沿って局所照明絞りを移動させて標本と光学的に共役な位置に合致させる局所照明絞り補正部を備えている。
【００８９】
７．  本発明の別の照明装置は、観察用照明光を生成する観察用照明光学系と、局所照明光を生成する局所照明光学系と、観察用照明光の光路と局所照明光の光路を合成する照明光合成用接合プリズムであり、照明光合成用接合プリズムは接合面を有し、接合面は観察用照明光と局所照明光の一方を少なくとも反射するとともに観察用照明光と局所照明光の他方を少なくとも透過する照明光合成用接合プリズムと、標本からの光を結像して標本像を形成する顕微鏡の観察光学系の光軸上に配置された蛍光観察用ダイクロイックミラーであり、照明光合成用ミラーから入射する観察用照明光と局所照明光を観察光学系の光軸と同軸に標本に導光する蛍光観察用ダイクロイックミラーとを備えている。
【００９０】
８．  本発明の別の照明装置は、第７項において、観察用照明光学系は、観察用照明光の照明範囲を規制する視野絞りを備え、視野絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口サイズと光軸に垂直な面内における開口位置とが可変であり、
局所照明光学系は、局所照明光の照明範囲を規制する局所照明絞りを備え、局所照明絞りは、標本と光学的に共役な位置に配置され、開口形状と開口サイズと光軸方向位置と光軸に垂直な面内における開口位置とが可変である。
【００９１】
９．  本発明の別の照明装置は、第７項において、照明光合成用接合プリズムの接合面は局所照明光を少なくとも反射するとともに観察用照明光を少なくとも透過し、照明装置はさらに、照明光合成用接合プリズムを観察光学系の光軸上に挿入したり観察光学系の光軸上から退避させたりするプリズム稼動部と、照明光合成用接合プリズムの挿入・退避による光路長の変化を補正する補正用レンズとを備えており、補正用レンズは、照明光合成用接合プリズムを透過する観察用照明光を生成する観察用照明光学系と照明光合成用接合プリズムとの間に配置され、プリズム稼動部によって、照明光合成用ミラーと一体的に観察光学系の光軸上に挿入されたり観察光学系の光軸上から退避されたりする。
【００９２】
１０．  本発明の別の照明装置は、第８項において、局所照明光学系がさらに、必要な照明波長に応じて局所照明光の波長を変更する照明波長変更手段を備えており、照明装置がさらに、照明波長変更手段の波長選択状態に応じて局所照明光学系の光軸に沿って局所照明絞りを移動させて標本と光学的に共役な位置に合致させる局所照明絞り補正部を備えている。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の第一実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。
【図２】図１中の蛍光観察用ダイクロイックミラー・吸収フィルター・ＵＶバンドパスフィルター・蛍光バンドパスフィルター・照明光合成用ダイクロイックミラー・励起フィルターの波長透過率特性と、標本内の蛍光試薬の励起スペクトル・蛍光スペクトルとの関係の一例を示している。
【図３】本発明の第二実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。
【図４】本発明の第三実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。
【図５】図４中の蛍光観察用ダイクロイックミラー・吸収フィルター・励起フィルター・蛍光バンドパスフィルター・照明光合成用ハーフミラー・励起フィルターの波長透過率特性と、標本の蛍光試薬の励起スペクトル・蛍光スペクトルとの関係の一例を示している。
【図６】本発明の第四実施形態の照明装置を備えた顕微鏡の構成を示している。
【図７】特開平７−５６０９２号公報の照明装置のダイクロイックミラーをハーフミラーに変更した光学系の一部を模式的に示している。
【符号の説明】
【００９４】
１…観察光学系、１ａ…光軸、２…局所照明光学系、２ａ…光軸、３…蛍光観察用照明光学系、３…観察用照明光学系、３ａ…光軸、４…対物レンズ、５…蛍光観察用ダイクロイックミラー、５ａ…おもて面、５ｂ…うら面、６…吸収フィルター、７…結像レンズ、８…局所照明光光源、９…コレクトレンズ、１０…シャッター、１１…バンドパスフィルター、１１ａ…蛍光バンドパスフィルター、１１ｅ…励起フィルター、１１ｕ…ＵＶバンドパスフィルター、１１ｘ…バンドパスフィルターチェンジャー、１２…局所照明絞り、１２ｘ…局所照明絞り稼動部、１３…照明光合成用ダイクロイックミラー、１３ａ…おもて面、１３ｂ…うら面、１３ｃ…補正用楔ガラス板、１３ｘ…ミラー稼動部、１４…励起光光源、１５…コレクトレンズ、１６…シャッター、１７…励起フィルター、１８…視野絞り、１８ｘ…視野絞り稼動部、１９…視野絞り投影レンズ、２０…局所照明絞り補正部、１３０…照明光合成用ハーフミラー、１３０ａ…おもて面、１３０ｂ…うら面、１３０ｘ…ミラー稼動部、１３１…照明光合成用ハーフプリズム、１３１ａ…接合面、１３１ｃ…補正用凸レンズ、１３１ｘ…プリズム稼動部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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