(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の方法では検出できなかったビールを混濁させ得る乳酸菌を検出する方法、及び当該菌を含めた様々な乳酸菌を同時に検出・識別する方法を提供する。【解決手段】乳酸菌由来の特定の塩基配列からなるポリヌクレオチド。このポリヌクレオチドが乳酸菌の検出用プライマー又は検出用プローブとして使用される場合には、ヌクレオチドの長さが１０〜３０（好ましくは１５〜２５）であるオリゴヌクレオチドであることが望ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５に示す塩基配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactbacillus hexosus）検出用プライマーセット。
【請求項３】
配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactbacillus pseudocollinoides）検出用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号３０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、からなる乳酸菌の検出・識別用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号１５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、からなる乳酸菌の検出・識別用プローブセット。
【請求項７】
請求項５記載のプライマーセット及び請求項６記載のプローブセットを含むことを特徴とする乳酸菌の検出・識別用キット。
【請求項８】
請求項２記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactbacillus hexosus）の検出方法。
【請求項９】
請求項３記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactbacillus pseudocollinoides）の検出方法。
【請求項１０】
請求項４記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）の検出方法。
【請求項１１】
請求項５記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片と請求項６記載のプローブセットとのハイブリッドの融解温度を測定する工程を含むことを特徴とする乳酸菌の検出・識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の検出・識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のビールの生ビール化への流れは、ビール鮮度という新たな価値観をもたらした。こうした背景から、ビール製造会社にとっては、ビールの製造から出荷までの時間を劇的に短縮するために、ビールを混濁させる菌（ビール混濁菌）の汚染を迅速かつ正確に判定する必要が高まっている。
【０００３】
汚染事例が最も多いビール混濁菌として乳酸菌が挙げられる。乳酸菌の迅速な検出方法として、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）、ＦＩＳＨ法（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法）を利用した各種検出法が既に知られている（例えば、特許文献１〜５参照）。
【特許文献１】特開平５−１５４００号公報
【特許文献２】特開平６−１４１８９９号公報
【特許文献３】特開平７−２８９２９５号公報
【特許文献４】特開平１０−２１０９８０号公報
【特許文献５】特開平１４−０３４５７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、本発明者らは、ビールを混濁させる新規な乳酸菌を発見し、上記従来技術の方法では当該菌を検出できない可能性があることを見出した。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、従来の方法では検出できなかったビールを混濁させ得る乳酸菌を検出する方法を提供することにある。本発明の目的は、さらに、当該菌を含めた様々な乳酸菌を同時に検出・識別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１〜５に示す塩基配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明は、また、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactbacillus hexosus）検出用プライマーセット、並びに、当該プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるラクトバチルス・ヘキソーサス（Lactbacillus hexosus）の検出方法を提供する。
【０００８】
本発明は、また、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactbacillus pseudocollinoides）検出用プライマーセット、並びに、当該プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるラクトバチルス・シュードコリノイデス（Lactbacillus pseudocollinoides）の検出方法を提供する。
【０００９】
本発明は、また、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）検出用プライマーセット、並びに、当該プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）の検出方法を提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、配列番号３０及び１１〜１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなる乳酸菌の検出・識別用プライマーセット、配列番号１５〜１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなる乳酸菌の検出・識別用プローブセット、当該プライマーセット及び当該プローブセットを含むことを特徴とする乳酸菌の検出・識別用キット、並びに、当該プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片と当該プローブセットとのハイブリッドの融解温度を測定する工程を含むことを特徴とする乳酸菌の検出・識別方法を提供する。
【００１１】
本発明者らは、既知の方法では検出できないビールを混濁させ得る乳酸菌であるL. hexosus及びL. pseudocollinoidesを分離することに成功し、L. hexosus SBC8050株（未承認名）及びL. pseudocollinoides SBC8057株（未承認名）の１６Ｓ  リボソーマルＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列が、それぞれ、配列番号１及び３に示す塩基配列であることを明らかにし、ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列の一部が、それぞれ、配列番号２及び４に示す塩基配列であることを明らかにした。また、ビール中で増殖し得る乳酸菌であるペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）のｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列の一部が、配列番号５に示す塩基配列であることを明らかにした。L. hexosusSBC8050株及びL. pseudocollinoides SBC8057株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、寄託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５２９及びＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５３０である。
【００１２】
L. hexosus検出用プライマーセット、L. pseudocollinoides検出用プライマーセット又はP. damnosus検出用プライマーセットを用いることにより、それぞれ、L. hexosus、L. pseudocollinoides又はP. damnosusのｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅することができるため、それぞれ、L. hexosus、L. pseudocollinoides又はP. damnosusを検出することが可能となる。
【００１３】
また、乳酸菌の検出・識別用プライマーセットを用いることにより、様々な乳酸菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子又はｇｙｒＢ遺伝子を増幅することができる。そして、得られた核酸断片と乳酸菌の検出・識別用プローブセットとのハイブリッドの融解温度を測定することにより、核酸断片の由来している混濁菌の種類の違いによって融解温度が異なるため、融解温度の違いにより乳酸菌の検出及び識別することが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
従来の方法では検出できなかったビールを混濁させ得る乳酸菌を検出する方法及び当該菌を含めた様々な乳酸菌を同時に検出・識別する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
＜ポリヌクレオチド＞
まず、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１〜５に示す塩基配列の全部又は一部からなることを特徴とするが、配列番号１〜５に示す塩基配列の相補配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチドをも含む。ここで、配列番号１及び３は、それぞれ、L. hexosus及びL. pseudocollinoidesの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を表わす。また、配列番号２、４及び５は、それぞれ、L. hexosus、L. pseudocollinoides及びP. damnosusのｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列の一部を表わす。本発明のポリヌクレオチドは、以下に述べるように、上記乳酸菌を検出する上で有用であり、乳酸菌の検出用プライマー、プライマーにより増幅された核酸断片、検出用プローブ等として使用可能である。また、本発明のポリヌクレオチドは蛍光物質等により化学修飾されていてもよい。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドが乳酸菌の検出用プライマー又は検出用プローブとして使用される場合には、ヌクレオチドの長さが１０〜３０（好ましくは１５〜２５）であるオリゴヌクレオチドであることが望ましい。プライマーの設計は、当業者であれば容易に行うことができ、必要があれば、プライマー設計支援ソフトウェアを利用して設計することも可能である。
【００１８】
なお、本発明において「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びＰＮＡ（ペプチド核酸）を含む意味で用いられる。また、本発明のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト法等の公知の方法により合成することが可能である。
【００１９】
＜L. hexosusの検出＞
次に、本発明のL. hexosus検出用プライマーセット及びそれを用いたL. hexosusの検出方法について説明する。本発明のL. hexosus検出用プライマーセットは、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とし、両オリゴヌクレオチドはL. hexosusのｇｙｒＢ遺伝子に特異的な塩基配列を有していることから、L. hexosusのｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅することができるため、L. hexosusを特異的に検出することが可能である。
【００２０】
本発明の検出方法によりL. hexosusの検出を行うには、まず、試料（例えば、ビールや発泡酒などの麦芽飲料）から核酸を抽出する。核酸の抽出は、当技術分野で公知の方法を使用することによりでき、具体的には例えば、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法などによりＤＮＡを抽出することができ、ＡＧＰＣ法やグアニジン・塩化セシウム超遠心法などによりＲＮＡを抽出することができる。
【００２１】
次に、得られた核酸を鋳型とし、前記プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する。増幅方法として、当技術分野で公知の増幅方法を用いることができるが、特に、ＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。ＰＣＲ法では、抽出されたＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、ｇｙｒＢ遺伝子のうちプライマーセットに挟まれた部分の塩基配列からなる核酸断片が増幅される。ＰＣＲ法では、変性、アニーリング、相補鎖合成からなるサイクルを繰り返すことにより核酸断片（二本鎖ＤＮＡ）が、各工程の温度や時間、サイクル数等のＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法では、抽出されたＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行うものである。
【００２２】
次に、増幅された核酸断片を検出する。すなわち、増幅された核酸断片がL. hexosusに特異的なものか否かを判定する。検出は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば、L. hexosusに特異的にハイブリダイズするプローブを用いたハイブリダイゼーションにより行うことが可能である。
【００２３】
＜L. pseudocollinoidesの検出＞
次に、本発明のL. pseudocollinoides検出用プライマーセット及びそれを用いたL. pseudocollinoidesの検出方法について説明する。本発明のL. pseudocollinoides検出用プライマーセットは、配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とし、両オリゴヌクレオチドはL. pseudocollinoidesのｇｙｒＢ遺伝子に特異的な塩基配列を有していることから、L. pseudocollinoidesのｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅することができるため、L. pseudocollinoidesを特異的に検出することが可能である。
【００２４】
L. pseudocollinoidesの検出方法は、上記のL. hexosusの検出方法と同様に行うことが可能である。
【００２５】
＜P. damnosusの検出＞
次に、本発明のP. damnosus検出用プライマーセット及びそれを用いたP. damnosusの検出方法について説明する。本発明のP. damnosus検出用プライマーセットは、配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とし、両オリゴヌクレオチドはのｇｙｒＢ遺伝子に特異的な塩基配列を有していることから、P. damnosusのｇｙｒＢ遺伝子を特異的に増幅することができるため、P. damnosusを特異的に検出することが可能である。
【００２６】
P. damnosusの検出方法は、上記のL. hexosusの検出方法と同様に行うことが可能である。
【００２７】
＜乳酸菌の検出・識別＞
最後に、本発明の乳酸菌の検出・識別用プライマーセット、プローブセット及びキット並びにそれらを用いた乳酸菌の検出・識別方法について説明する。
【００２８】
本発明の乳酸菌の検出・識別用プライマーセットは、配列番号３０及び１１〜１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。なお、配列番号３０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマーである。本発明のプライマーセットを用いることにより、様々な乳酸菌の核酸断片を増幅することが可能である。
【００２９】
本発明の乳酸菌の検出・識別用プローブセットは、配列番号１５〜１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。本プローブセットは、以下に述べるように、様々な乳酸菌の核酸断片を検出するのに用いることができ、乳酸菌を検出・識別することが可能である。
【００３０】
本発明の乳酸菌の検出・識別用キットは、前記プライマーセットと前記プローブセットを含むことを特徴とする。本キットは、さらに、反応バッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素などを含んでいてもよく、ＤＮＡ抽出試薬などを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明の検出・識別方法により乳酸菌を検出・識別するには、まず、試料（例えば、ビールや発泡酒などの麦芽飲料）から核酸を抽出する。核酸の抽出は、前述の方法と同様の方法により行うことができる。
【００３２】
次に、得られた核酸を鋳型とし、前記プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する。増幅は、前述の方法と同様の方法により行うことができ、ＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。
【００３３】
次に、得られた核酸断片と前記プローブセットとのハイブリッドを形成させ、ハイブリッドの融解温度を測定する。融解温度の測定原理の概要は次のとおりである。配列番号１５〜１６及び１７〜１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、それぞれ、５’末端が蛍光物質であるＬＣ  Ｌｅｄ６４０及びＬＣ  Ｌｅｄ７０５で標識されている（以下、それぞれ「Ｌｅｄ６４０プローブ」及び「Ｌｅｄ７０５プローブ」という。）。一方、配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、３’末端がＦＩＴＣで標識されている（以下、「ＦＩＴＣプローブ」という。）。そして、各プローブは、ＦＩＴＣプローブの３’末端とＬｅｄ６４０プローブ及びＬｅｄ７０５プローブの５’末端とが近接して乳酸菌の核酸断片とハイブリダイズするように設計されている。核酸断片にＦＩＴＣプローブとＬｅｄ６４０プローブ（又はＬｅｄ７０５プローブ）とがともにハイブリダイズしている状態で、ハイブリッドにＦＩＴＣの励起波長の光を照射すると、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）が生じ、Ｌｅｄ６４０（又はＬｅｄ７０５）の蛍光波長の光が観察される。この状態から温度を上昇させていくと、ＦＩＴＣプローブ及び／又はＬｅｄ６４０プローブ（又はＬｅｄ７０５プローブ）が融解して核酸断片から剥がれていき、それに従ってＦＲＥＴが生じなくなりＬｅｄ６４０（又はＬｅｄ７０５）の蛍光強度が減少していく。そして、各温度における蛍光強度を測定し、横軸に温度をとり、縦軸に蛍光強度（変化率も含む）をとれば、融解曲線が得られる。このようにして得られた融解曲線を解析することにより、ハイブリッドの融解温度を求めることができる。
【００３４】
ＦＩＴＣプローブ及び／又はＬｅｄ６４０プローブ（又はＬｅｄ７０５プローブ）は、核酸断片とのミスマッチの程度が乳酸菌の種類によって差が生じるように設定してある。したがって、乳酸菌の種類によって、それぞれのプローブの示す融解曲線及び融解温度が異なるため、その違いに基づいて乳酸菌の種類を判別することが可能である。具体的には、L. brevis SBC8003株は約６０℃、L. hexosusSBC8050株は約５６℃及び約６３℃、P. damnosusJCM5886株は約６２℃、L. pseudocollinoides SBC8057株は約６４℃、L. collinoides JCM1123株は約５８℃の融解温度を示す。試料の融解温度とこれらの融解温度を比較することにより、試料中に含まれている乳酸菌の検出・識別を行うことができる。
【００３５】
なお、本発明のプローブセットは、核酸断片を増幅する反応溶液に混ぜておくことができるため、核酸断片の増幅反応が終了後ただちに融解温度を測定することができる。したがって、本発明の乳酸菌の検出・識別方法は、１つのチューブやキャピラリー内で核酸断片を増幅する工程と融解温度を測定する工程を連続して行えるという利点がある。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）  L. hexosus及びL. pseudocollinidesの植菌によるビールの混濁
L. hexosus SBC8050株及びL. pseudocollinides SBC8057株を、それぞれ、ＭＲＳ寒天培地（べベクトン・ディッキンソン社）で増殖させた。１白金耳量の各菌株を、それぞれ、瓶入りの全麦芽ビール（ｐＨ４．５、苦味価３０、アルコール５％、容量３５０ｍＬ）に植菌し、ビール瓶に打栓をし、３０℃にて約１ヶ月間培養を行ったところ、ビールが混濁した。
【００３８】
表１は培養１ヶ月後の混濁ビール中の有機酸の濃度（正常ビールに対する比率（％））を示したものである。L. hexosus SBC8050株を植菌した混濁ビールは、正常ビールに比べ、乳酸の濃度が約３倍になった。このことから、L. hexosusはホモ発酵タイプの乳酸菌であることが分かった。一方、L. pseudocollinides SBC8057株を植菌した混濁ビールは、正常ビールに比べ、乳酸の濃度が約４倍になり、酢酸の濃度が約２倍になった。このことから、L. pseudocollinidesはへテロ発酵タイプの乳酸菌であることが分かった。
【００３９】
【表１】
2005229839.tif 000002
【００４０】
（実施例２）  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及びｇｙｒＢ遺伝子のシークエンス
（ゲノムＤＮＡの調製）
L. hexosus SBC8050株及びL. pseudocollinides SBC8057株を、それぞれ、ＭＲＳ寒天培地に植菌し、３０℃にて、７〜１４日間、嫌気培養を行った。嫌気培養は、タバイエスペック社製の嫌気培養装置を用い、Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝９０：５：５という条件で行った。嫌気培養した菌株の菌体から、それぞれ、ＤＮＡ抽出液PrepMan Ultra（アプライド・バイオシステムズジャパン社）を用いて、ＤＮＡの抽出を行った。
【００４１】
（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅・解析）
上記方法により調製したＤＮＡ抽出液について、MicroSeq Full Gene 16S rDNAキット（アプライド・バイオシステムズジャパン社）を用いて、各菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のシークエンスをそれぞれ行った。
【００４２】
シークエンスの結果得られたL. hexosus SBC8050株及びL. pseudocollinidesSBC8057株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、それぞれ、配列番号１及び３に示す。本遺伝子配列は、現在までに報告されているビールを混濁させる乳酸菌の遺伝子配列とは、明らかに異なっていた。さらに、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース検索を行ったが、登録されている何れの遺伝子配列とも一致しなかった。したがって、L. hexosus及びL. pseudocollinidesはビールを混濁させる新規な乳酸菌であることが明らかとなった。
【００４３】
（ｇｙｒＢ遺伝子の増幅・解析）
反応液TaKaRa Ex Taq（寶酒造社）に、上記ＤＮＡ抽出液、及びプライマーセット（L.hexosus及びL.pseudocollinoidesについては、配列番号２６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＧＹＰＦ：5’-ggwtayaargtwtcwggtggt-3’）及び配列番号２７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＧＹＰＲ：5’-tcatgygtwcaccttcat-3’）のセットを、Pediococcus damnosusについては、配列番号２８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＧＰ１−Ｆ：5’-attatgntgcnngncaaatncaa-3’）及び配列番号２９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（ＧＰ１−Ｒ：5’-accaccwgawacyttrtawcc-3’）のセットを使用）を加え、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズジャパン社）を用いてＰＣＲを行った。１サイクルを９５℃で３０秒間（ＤＮＡ変性）、５５℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で４５秒間（ＤＮＡ伸長反応）とし、これを３５サイクル行った。
【００４４】
ＰＣＲ終了後後、５μＬの反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物を検出した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド溶液で１０分間染色した後、紫外線を照射して観察することにより、ＤＮＡのバンドを確認した。
【００４５】
ｇｙｒＢ遺伝子の塩基配列の決定は、ＧＹＰＦ及びＧＹＰＲのプライマーセット又はＧＰ１−Ｆ及びＧＰ１−Ｒのプライマーセットを用いて、ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit及びジェネティックアナライザーABI PRISM310（アプライド・バイオシステムズジャパン社）で行った。
【００４６】
シークエンスの結果得られたL. hexosus SBC8050株及びL. pseudocollinidesSBC8057株のｇｙｒＢ遺伝子配列を、それぞれ、配列番号２及び４に示す。また、Pediococcus damnosus SBC8023株のｇｙｒＢ遺伝子配列を、配列番号５に示す。本遺伝子配列についてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース検索を行ったが、登録されている何れの遺伝子配列とも一致しなかった。
【００４７】
（実施例３）  ｇｙｒＢ遺伝子を利用したL.hexosus、L.pseudocollinoides及びP. damnosusの検出及び識別
実施例２と同様の方法により、ビールを混濁させ得る様々な菌株からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡ抽出液について、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。L.hexosus用プライマーセットとして、配列番号６及び７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、L.pseudocollinoides用プライマーセットとして、配列番号７及び８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、及びP. damnosus用プライマーセットとして、配列番号９及び１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。なお、ＰＣＲの反応条件は実施例２と同様であり、また、増幅産物の確認も実施例２と同様の方法で行った。
【００４８】
表２は、各プライマーセットにより、各種菌株から増幅産物が得られた否かをまとめたものである。
【００４９】
【表２】
2005229839.tif 000003
【００５０】
表２に示した結果から明らかなように、L.hexosus用プライマーセットを用いた場合、L.hexosusに属する菌株のみに増幅産物（３２２ｂｐ）が確認され、L.pseudocollinoides用プライマーセットを用いた場合、L.pseudocollinoidesに属する菌株のみに増幅産物（３６２ｂｐ）が確認され、P. damnosus用プライマーセットを用いた場合、P. damnosusに属する菌株のみに増幅産物（１９４ｂｐ）が確認された。このことから、これらのプライマーセットを用いることにより、L.hexosus、L.pseudocollinoides及びP. damnosusを特異的に検出できることが明らかとなった。なお、使用した一部の菌株（サッポロビール分離株）については、実施例２と同様の方法により、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列からの菌種決定を行った。
【００５１】
（実施例４）  リアルタイムＰＣＲを用いた乳酸菌の検出及び識別
実施例２と同様の方法により調製した様々な菌株からＤＮＡ抽出液について、以下のプライマー及びプローブを用いて、表３に示した反応試薬の組成でＰＣＲを行った。プライマーとして、配列番号３０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のユニバーサルプライマー、5’-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC-3’）及び配列番号１１〜１４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。プローブとして、配列番号１５及び１６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（３’末端をリン酸化し、５’末端をＬＣ  Ｒｅｄ６４０でラベルしてある）、配列番号１７及び１８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（３’末端をリン酸化し、５’末端をＬＣ  Ｒｅｄ７０５でラベルしてある）及び配列番号１９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（３’末端をＦＩＴＣでラベルしてある）を使用した。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
反応装置にLightCyclerクイックシステム330(ロッシュ・ダイアグノスティックス社)を用い、９５℃で１０分間処理した後、１サイクルを９５℃で１５秒間、５０℃で５秒間、７２℃で２０秒間とし、それを４０サイクル繰り返すことによりＰＣＲを行った。
【００５４】
ＰＣＲ終了後引き続いて９５℃まで温度を上昇させた後、直ちに４０℃まで冷却し、同温度を１５秒間保持した後、２０℃／秒の割合で９５℃まで温度を上昇させた。この加熱の間、６４０ｎｍ及び７１０ｎｍの蛍光強度を０．２℃毎に測定し、その値の一次微分の負の値（−ｄＦ／ｄＴ）をプロットして生じるピークにより融解温度を決定した。
【００５５】
図１は及び図２は、蛍光強度の変化率（−ｄＦ／ｄＴ）と温度（℃）との関係を表わす融解曲線である。図１は、６４０ｎｍにおける（ａ）L. brevis SBC8003株及び（ｂ）L. hexosusSBC8050株の融解曲線を表わし、図２は、７１０ｎｍにおける（ｃ）L. collinoides JCM1123株、（ｄ）P. damnosusJCM5886株及び（ｅ）L. pseudocollinoides SBC8057株の融解曲線を表わす。
【００５６】
図１及び図２に示した結果から明らかなように、L. brevis SBC8003株は６４０ｎｍで約６０℃、L. hexosus SBC8050株は６４０ｎｍで約５６℃及び約６３℃、P. damnosusJCM5886株は７１０ｎｍで約６２℃、L. pseudocollinoides SBC8057株は７１０ｎｍで約６４℃の融解温度を示すピークが観察された。また、ビールを混濁させ得る乳酸菌ではないL. collinoides JCM1123株でも７１０ｎｍで約５８℃の融解温度を示すピークが観察されたが、前記のビールを混濁させ得る乳酸菌のピークとは重ならないため、菌の識別が可能であった。なお、本実施例において用いた菌株は表２に示した菌株と同一であるが、上記以外の菌株は、融解曲線においてピークを示さなかった。
【００５７】
このことから、上記プライマー及びプローブを用いることにより、ビールを混濁させ得るすべての乳酸菌を一種類の反応液で検出・識別するできることが明らかとなった。
【００５８】
（実施例５）  リアルタイムＰＣＲを用いた乳酸菌の個別の検出及び識別
実施例４で検出・識別された乳酸菌について、確定試験用の条件を検討した。その結果、表４に示した目的に応じたプライマー及びプローブを用いて実施例４と同様の方法を行うことにより、確定試験を行うことが可能であった。
【００５９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】６４０ｎｍにおける（ａ）L. brevisSBC8003株及び（ｂ）L. hexosus SBC8050株の融解曲線である。
【図２】７１０ｎｍにおける（ｃ）L. collinoides JCM1123株、（ｄ）P. damnosus JCM5886株及び（ｅ）L. pseudocollinoides SBC8057株の融解曲線である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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