(57)【要約】【課題】従来の結晶化方法では良質な結晶を得ることが困難であった膜蛋白質などの結晶化を高い成功率で可能にする方法を提供する。【解決手段】溶液分注口１４に注入された蛋白質溶液を、二次元結晶核形成部１０の平坦面２２上に流入させ薄層状に展開させて蛋白質の二次元結晶核を形成させ、沈殿剤分注口３２に注入された沈殿剤を二次元結晶核形成部内へ導入して二次元結晶核を二次元結晶核形成部から溶出させ、結晶化用セル３８内において二次元結晶核を三次元結晶に成長させる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化方法において、
生体高分子を含む溶液を平坦面上に流入させ薄層状に展開させて、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる第１の工程と、
この第１の工程で得られた前記二次元結晶核を結晶化溶媒中に導入して、二次元結晶核を三次元結晶に成長させる第２の工程とを有することを特徴とする生体高分子の結晶化方法。
【請求項２】
生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化方法において、
互いに対向する一対の電極間に生体高分子を含む溶液を保持し、その溶液に対して一対の電極により電場を印加して、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる第１の工程と、
この第１の工程で得られた前記二次元結晶核を結晶化溶媒中に導入して、二次元結晶核を三次元結晶に成長させる第２の工程とを有することを特徴とする生体高分子の結晶化方法。
【請求項３】
生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化装置において、
生体高分子を含む溶液を分注して導入する溶液分注部と、
前記溶液を薄層状に展開させる平坦面を有し、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる二次元結晶核形成部と、
前記溶液分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第１の流路と、
この第１の流路の途中に介挿され、前記二次元結晶核形成部内へ所定量の前記溶液を流入させるように調整する流量制御部と、
結晶化溶媒を分注して導入する溶媒分注部と、
この溶媒分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第２の流路と、
この第２の流路の途中に介挿され、結晶化溶媒を一旦溜めるトラップ部と、
前記二次元結晶核を結晶化溶媒中で三次元結晶に成長させる結晶化用セル部と、
前記二次元結晶核形成部と前記結晶化用セル部とを流路接続する第３の流路と、
を備え、
駆動手段により、前記溶液分注部から前記第１の流路を通り前記流量制御部を経て前記二次元結晶核形成部内へ前記溶液を流入させ、および、前記トラップ部から前記第２の流路を通り前記二次元結晶核形成部内へ前記結晶化溶媒を流入させて、結晶化溶媒と共に前記二次元結晶核を二次元結晶核形成部から流出させ、前記第３の流路を通って前記結晶化用セル部内へ結晶化溶媒と共に二次元結晶核を流入させるようにすることを特徴とする生体高分子の結晶化装置。
【請求項４】
生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化装置において、
生体高分子を含む溶液を分注して導入する溶液分注部と、
互いに対向する一対の電極を有し、その一対の電極間に保持される前記溶液に対して一対の電極により電場を印加して、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる二次元結晶核形成部と、
前記溶液分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第１の流路と、
この第１の流路の途中に介挿され、前記二次元結晶核形成部内へ所定量の前記溶液を流入させるように調整する流量制御部と、
結晶化溶媒を分注して導入する溶媒分注部と、
この溶媒分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第２の流路と、
この第２の流路の途中に介挿され、結晶化溶媒を一旦溜めるトラップ部と、
前記二次元結晶核を結晶化溶媒中で三次元結晶に成長させる結晶化用セル部と、
前記二次元結晶核形成部と前記結晶化用セル部とを流路接続する第３の流路と、
を備え、
駆動手段により、前記溶液分注部から前記第１の流路を通り前記流量制御部を経て前記二次元結晶核形成部内へ前記溶液を流入させ、および、前記トラップ部から前記第２の流路を通り前記二次元結晶核形成部内へ前記結晶化溶媒を流入させて、結晶化溶媒と共に前記二次元結晶核を二次元結晶核形成部から流出させ、前記第３の流路を通って前記結晶化用セル部内へ結晶化溶媒と共に二次元結晶核を流入させることを特徴とする生体高分子の結晶化装置。
【請求項５】
前記溶液分注部、二次元結晶核形成部、第１の流路、流量制御部、溶媒分注部、第２の流路、トラップ部、結晶化用セル部および第３の流路が円形薄板材にそれぞれ形成されて、前記第１の流路、第２の流路および第３の流路がそれぞれ前記円形薄板材の厚み方向と交差する方向に配置され、
前記駆動手段が、遠心力により前記各流路内で前記溶液および前記結晶化溶媒を流動させるものである請求項３または請求項４記載の生体高分子の結晶化装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛋白質に代表される生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化方法、ならびに、その方法を実施するために使用される結晶化装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質に代表される生体高分子の三次元立体構造を明らかにすることは、その生体高分子の、生体中における生理機能を解明することができるばかりでなく、合理的な医薬品の開発（ドラッグデザイン）を進める上でも極めて有用である。この生体高分子の三次元立体構造を解析する実用的な手法としては、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法とＸ線結晶構造解析法とがあるが、解析上、生体高分子の分子量に制限の無いＸ線結晶構造解析法が、今後は特に有効であると考えられている。ところが、このＸ線結晶構造解析法では、解析に供するための生体高分子の単結晶を作成しなければならない。しかも、構造解析の分解能を向上させるためには、結晶性の良い単結晶を作成する必要がある。
【０００３】
ところで、蛋白質には、大別して水溶性蛋白質と膜蛋白質とがある。このうちの膜蛋白質は、精製の過程で分子表面の疎水性部分に界面活性剤が結合すること、蛋白質を含む水溶液（蛋白質溶液）中に多量の界面活性剤が浮遊していることなどの理由から、分子同士が空間的な配列構造を形成しにくいため、三次元結晶化が非常に困難である。膜蛋白質の立体構造情報は、医薬品の開発上において非常に重要であるが、膜蛋白質の三次元結晶化が困難であることが構造解析上の障害になっている、といった現状である。
【０００４】
膜蛋白質の結晶化の方法は、水溶性蛋白質のそれと同様であり、膜蛋白質の結晶化方法としては、従来、蒸気拡散法やマイクロバッチ法と呼ばれる方法が広く採用されている。図８は、蒸気拡散法、特にハンギングドロップ蒸気拡散法と呼ばれる結晶化方法を説明するための模式的断面図であり、この方法では、１μｌ程度の少量の蛋白質溶液を、カバーガラス１の下面側となる面に滴下して液滴２を付着させ、容器３の内部に沈殿剤４を収容しておき、カバーガラス１によって容器３の上部開口を密閉する。これにより、液滴２を形成する蛋白質溶液と沈殿剤４とが蒸気平衡の状態へ移行する過程で蛋白質溶液が過飽和状態となり、その蛋白質溶液中で蛋白質の結晶化が進行することとなる（例えば、特許文献１参照。）。また、図９は、マイクロバッチ法を説明するための模式的部分断面図であり、この方法では、複数個の微小な容器状凹部（ウエル）５の内部に蛋白質溶液と沈殿剤との混合溶液６をそれぞれ収容し、各ウエル５の上部開口をカバーガラス７によって密閉する。これにより、溶液中の蛋白質の溶解度が低下して、限られた条件の過飽和状態に達し、蛋白質の結晶化が進行することとなる（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−２３３７０２号公報（第２−３頁）
特開平１０−２９８９８号公報（第３頁）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来の結晶化方法には、次のような問題点がある。すなわち、結晶化の初期過程である二次元結晶核の形成は確率的な事象であり、わずかな結晶化条件の相違により結晶核形成の再現性が得られなくなってしまう。また、巨大な分子量の膜蛋白質では、重力の影響により溶液中で沈降とそれに伴う対流が発生し、この結果、良質の結晶が得られにくくなる。さらに、蛋白質溶液中に界面活性剤が多量に存在するため、精製段階において溶液を濃縮すると界面活性剤も濃縮されてしまい、この濃縮された界面活性剤が不純物として作用し、膜蛋白質の結晶成長を阻害する、といった問題点がある。
【０００７】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、従来の結晶化方法では良質な結晶を得ることが困難であった膜蛋白質などの結晶化を高い成功率で可能にする生体高分子の結晶化方法を提供すること、ならびに、その方法を好適に実施することができる結晶化装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化方法において、生体高分子を含む溶液を平坦面上に流入させ薄層状に展開させて、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる第１の工程と、この第１の工程で得られた前記二次元結晶核を結晶化溶媒中に導入して、二次元結晶核を三次元結晶に成長させる第２の工程とを有することを特徴とする。
【０００９】
請求項２に係る発明は、生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化方法において、互いに対向する一対の電極間に生体高分子を含む溶液を保持し、その溶液に対して一対の電極により電場を印加して、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる第１の工程と、この第１の工程で得られた前記二次元結晶核を結晶化溶媒中に導入して、二次元結晶核を三次元結晶に成長させる第２の工程とを有することを特徴とする。
【００１０】
請求項３に係る発明は、生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化装置において、生体高分子を含む溶液を分注して導入する溶液分注部と、前記溶液を薄層状に展開させる平坦面を有し、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる二次元結晶核形成部と、前記溶液分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第１の流路と、この第１の流路の途中に介挿され、前記二次元結晶核形成部内へ所定量の前記溶液を流入させるように調整する流量制御部と、結晶化溶媒を分注して導入する溶媒分注部と、この溶媒分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第２の流路と、この第２の流路の途中に介挿され、結晶化溶媒を一旦溜めるトラップ部と、前記二次元結晶核を結晶化溶媒中で三次元結晶に成長させる結晶化用セル部と、前記二次元結晶核形成部と前記結晶化用セル部とを流路接続する第３の流路と、を備え、駆動手段により、前記溶液分注部から前記第１の流路を通り前記流量制御部を経て前記二次元結晶核形成部内へ前記溶液を流入させ、および、前記トラップ部から前記第２の流路を通り前記二次元結晶核形成部内へ前記結晶化溶媒を流入させて、結晶化溶媒と共に前記二次元結晶核を二次元結晶核形成部から流出させ、前記第３の流路を通って前記結晶化用セル部内へ結晶化溶媒と共に二次元結晶核を流入させるようにすることを特徴とする。
【００１１】
請求項４に係る発明は、生体高分子を含む溶液中で生体高分子の三次元結晶を生成させる生体高分子の結晶化装置において、生体高分子を含む溶液を分注して導入する溶液分注部と、互いに対向する一対の電極を有し、その一対の電極間に保持される前記溶液に対して一対の電極により電場を印加して、前記溶液中で生体高分子の二次元結晶核を形成させる二次元結晶核形成部と、前記溶液分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第１の流路と、この第１の流路の途中に介挿され、前記二次元結晶核形成部内へ所定量の前記溶液を流入させるように調整する流量制御部と、結晶化溶媒を分注して導入する溶媒分注部と、この溶媒分注部と前記二次元結晶核形成部とを流路接続する第２の流路と、この第２の流路の途中に介挿され、結晶化溶媒を一旦溜めるトラップ部と、前記二次元結晶核を結晶化溶媒中で三次元結晶に成長させる結晶化用セル部と、前記二次元結晶核形成部と前記結晶化用セル部とを流路接続する第３の流路と、を備え、駆動手段により、前記溶液分注部から前記第１の流路を通り前記流量制御部を経て前記二次元結晶核形成部内へ前記溶液を流入させ、および、前記トラップ部から前記第２の流路を通り前記二次元結晶核形成部内へ前記結晶化溶媒を流入させて、結晶化溶媒と共に前記二次元結晶核を二次元結晶核形成部から流出させ、前記第３の流路を通って前記結晶化用セル部内へ結晶化溶媒と共に二次元結晶核を流入させることを特徴とする。
【００１２】
請求項５に係る発明は、請求項３または請求項４記載の結晶化装置において、前記溶液分注部、二次元結晶核形成部、第１の流路、流量制御部、溶媒分注部、第２の流路、トラップ部、結晶化用セル部および第３の流路が円形薄板材にそれぞれ形成されて、前記第１の流路、第２の流路および第３の流路がそれぞれ前記円形薄板材の厚み方向と交差する方向に配置され、前記駆動手段が、遠心力により前記各流路内で前記溶液および前記結晶化溶媒を流動させるものであることを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の好適な実施形態について図１ないし図７を参照しながら説明する。
【００１４】
図１は、第１の発明の実施形態の１例を示し、生体高分子、例えば膜蛋白質の三次元結晶を生成させるために使用される結晶化装置（結晶化デバイス）の概略構成を模式的に示す図であって、各構成要素の平面的な配置を示す図である。この結晶化装置は、溶液の流れを利用して二次元結晶核を形成し、その二次元結晶核を三次元結晶に成長させる構成であって、蛋白質溶液を平坦面上に流入させ薄層状に展開させて蛋白質溶液中で膜蛋白質の二次元結晶核を形成させる二次元結晶核形成部１０と、この二次元結晶核形成部１０で得られた二次元結晶核を三次元結晶に成長させる三次元結晶生成部１２とを備えている。
【００１５】
二次元結晶核形成部１０の上流には、蛋白質溶液を分注するための溶液分注口１４が設けられている。溶液分注口１４には、溶液供給流路（第１の流路）１６および補助流路１８がそれぞれ連通するように接続されており、溶液分注口１４と二次元結晶核形成部１０とが溶液供給流路１６によって流路接続されている。そして、溶液供給流路１６の途中に流量制御部２０が配設されている。このような流路構成を有していることにより、溶液分注口１４に注入した蛋白質溶液が、溶液供給流路１６を通って二次元結晶核形成部１０内へ所定量だけ流入するように調整され、余剰分が補助流路１８を通って排出されて、二次元結晶核形成部１０に所定量の蛋白質溶液が分取されるようになっている。
【００１６】
二次元結晶核形成部１０には、蛋白質溶液を薄層状に展開させる平坦面２２が形設され、蛋白質溶液中で膜蛋白質の二次元結晶核を形成させる機能を有している。この二次元結晶核形成部１０には、溶液供給流路１６に連通した溶液流入口２４のほか、沈殿剤流入口２６および溶液流出口２８が設けられている。沈殿剤流入口２６には、沈殿剤供給流路（第２の流路）３０が連通接続されており、沈殿剤供給流路３０は、二次元結晶核形成部１０の上流に設けられて沈殿剤を分注するための沈殿剤分注口３２に流路接続されている。そして、沈殿剤分注口３２に分注された沈殿剤が、毛管現象により沈殿剤供給流路３０を通して二次元結晶核形成部１０の沈殿剤流入口２６へ導かれ、沈殿剤流入口２６を通って結晶核形成部１０内へ流入することにより、二次元結晶核形成部１０で作成された二次元結晶核が沈殿剤によって溶出されるようになっている。沈殿剤供給流路３０の途中には、沈殿剤を一旦溜めるトラップ部３４が介挿されている。このトラップ部３４は、過剰量の沈殿剤が二次元結晶核形成部１０内へ流入しないように止めるためのものである。このように沈殿剤供給流路３０の途中にトラップ部３４が介挿されていることにより、沈殿剤分注口３２に注入した沈殿剤が適量分だけ二次元結晶核形成部１０内へ流入する。
【００１７】
二次元結晶核形成部１０の溶液流出口２８には、送液用流路（第３の流路）３６が連通接続されており、送液用流路３６は、二次元結晶核形成部１０の下流に設けられて溶液中で二次元結晶核を三次元結晶に成長させる三次元結晶生成部１２をなす結晶化用セル３８に流路接続されている。そして、送液用流路３６の途中に溶液混合用流路４０が設けられている。このような流路構成により、沈殿剤によって溶出された二次元結晶核は、二次元結晶核形成部１０の溶液流出口２８から送液用流路３６内へ流入し、溶液混合用流路４０を通過する間に沈殿剤と十分に混合させられた後、結晶化用セル３８へ導かれるようになっている。さらに、結晶化用セル３８と沈殿剤分注口３２とは、連絡用流路４２によって流路接続されており、連絡用流路４２の途中にトラップ部４４が介挿されている。このような流路構成により、結晶化用セル３８とトラップ部４４との間で沈殿剤の蒸気平衡の状態が達成され、結晶成長が蒸気拡散の条件下で行われるようになる。なお、結晶化用セル３８と沈殿剤分注口３２とを流路接続することは、必ずしも必要では無い。
【００１８】
上記したような構成を有する結晶化デバイスは、例えば、図２に断面図を示すように３枚の円板状の基板から構成され、図３に断面図を示すように３枚の基板を積層し接合することにより作製することができる。すなわち、２枚のガラス基板４６、４８と１枚のシリコン基板５０とを、両ガラス基板４６、４８の間にシリコン基板５０を挟むようにして相互に接合することにより、上記結晶化デバイスが作製される。
【００１９】
上層側のガラス基板４６には、溶液分注口１４、沈殿剤分注口３２、流量制御部２０およびトラップ部３４、４４などとなる複数個のスルーホール（貫通孔）５２ａ〜５２ｆがそれぞれ厚み方向に形成されるとともに、各流路１６、１８、３０、３６、４２となる凹状溝５４ａ、５４ｂが下面側にそれぞれ形成される。もう少し具体的に説明すると、スルーホール５２ａ、５２ｆは、沈殿剤分注口３２となり、スルーホール５２ｂ、５２ｄは、溶液分注口１４となる。これらのスルーホール５２ａ〜５２ｆや凹状溝５４ａ、５４ｂは、ブラスト、超音波等の機械的エッチング処理、あるいは薬品を用いた化学エッチング処理などによって形成される。また、中間層のシリコン基板５０にも、複数個のスルーホール５６、５８がそれぞれ厚み方向に形成され、そのうちの１つのスルーホール５８が結晶化用セル３８となる。また、シリコン基板５０の表面には細溝が６０が形成され、その細溝６０に囲まれて島状に残されたシリコン基板５０の表面部分６１が、二次元結晶核形成部１０の平坦面２２となる。これらのスルーホール５６、５８や細溝６０も、ブラスト、超音波等の機械的エッチング処理、あるいは薬品を用いた化学エッチング処理などによって形成される。また、下層側のガラス基板４８は、シリコン基板５０に形成されたスルーホール５８を封止する役目を果たす。以上の３枚の基板４６、４８、５０は、所要のエッチング処理を施した後に、陽極接合によって容易に相互に接合することが可能である。
【００２０】
なお、図２および図３に示した例では、３枚のガラス基板４６、４８と１枚のシリコン基板５０との合計３枚の基板を用いて結晶化デバイスを作製するようにしているが、基板の枚数や材質は、上記説明のものに限定されることはなく、適当に基板の枚数と材質を変更して結晶化デバイスを作製することが可能である。また、上記した例では、結晶化デバイスの材質としてガラスやシリコンといった無機材料を用いているが、このような無機材料に限定されることはなく、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル、ポリカーボネート等の有機高分子系化合物を用いることも可能である。
【００２１】
図１に示した結晶化デバイスにおいて、二次元結晶核形成部１０は、ガラス、シリコン等の無機材料、プラスチックス、金属などの材質からなる平坦な基板を用いて形設される。また、これらの基板の表面に物理的または化学的修飾を施すことによって基板表面を改質することも可能である。基板表面の物理的な修飾法としては、真空蒸着法、スパッタリング法、化学的気相成長法（ＣＶＤ法）、イオン注入法などがある。これらの方法によって基板表面に誘電体、絶縁体、金属などの薄膜を形成することにより、基板表面を改質する。基板表面に種々の薄膜を形成する場合において、薄膜の厚みは、１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であることが好ましく、さらには１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることがより好ましい。
【００２２】
基板表面の化学的な修飾法としては、基板上に形成された金表面と反応してＡｕ−Ｓ結合を形成し得るアルカンチオール化合物の単分子膜を作成する方法を利用することが可能である。また、このアルカンチオール化合物の分子末端にアミノ基、カルボキシル基またはフェロセニル基を導入することにより、蛋白質分子との結合の選択性を変えることも可能である。
【００２３】
また、図１に示した結晶化デバイスにおいて、溶液分注口１４および沈殿剤分注口３２は、外部から蛋白質溶液および沈殿剤をそれぞれピペット等により分注するための開口部である。これらの分注口１４、３２の開口径は、分注される溶液量によって決定されるが、この結晶化方法において用いられる蛋白質溶液の量がナノリットルレベルであることを考慮すると、通常、０．１ｍｍ〜１０ｍｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．２ｍｍ〜５ｍｍの範囲である。また、沈殿剤のトラップ部３４、４４の開口径についても、分注口１４、３２の開口径と同様である。また、流量制御部２０の大きさは、例えば幅および長さがそれぞれ２ｍｍ〜１０ｍｍ程度である。
【００２４】
さらに、図１に示した結晶化デバイスにおいて、各流路１６、１８、３０、３６、４２は、各種の溶液を流入あるいは流出させるための通路となるものであり、ガラス基板、シリコン基板等の基板面に凹状溝５４ａ、５４ｂとして形成される。これらの凹状溝５４ａ、５４ｂの幅および深さは、通常、それぞれ０．００１ｍｍ〜５ｍｍの範囲であることが好ましく、さらには０．０１ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲であることがより好ましい。
【００２５】
そして、図１に示した結晶化デバイスにおいて、分注された各種溶液を上流から下流に向かって流し流すための外部圧力（駆動力）としては、例えば遠心力を利用する。遠心力を利用して溶液を下流へ押し流す場合において、加えるべき力の大きさは、溶液の粘性および比重、加えるべき位置、流路の寸法（断面積）、流路を形成する材質の表面特性などに依存する。この結晶化デバイスでは、▲１▼純水、▲２▼１００％エタノール、▲３▼１００％グリセロール、▲４▼濃度１０ｍｇ／ｍｌの蛋白質溶液のそれぞれの溶液について解析と検討を行った結果、直径が１２０ｍｍである基板の場合には、回転数が５００ｒｐｍ〜２５００ｒｐｍの範囲であれば、駆動力を制御することが可能であることが分かった。
【００２６】
次に、図４に基づいて上記構成の結晶化デバイスにおける一連の動作を説明する。
（１）溶液分注口１４に蛋白質溶液Ａを注入する。分注された蛋白質溶液Ａは、溶液供給流路１６を通って流量制御部２０に到達する（図４の（ａ））。
（２）流量制御部２０に到達した蛋白質溶液Ａに対し、下流に向けて圧力Ｇ１を加える。これににより、所望量の蛋白質溶液Ａのみが流量制御部２０より下流側に流れる（図４の（ｂ））。
（３）二次元結晶核形成部１０の溶液流入口２４に到達した蛋白質溶液Ａに対し、下流に向けてさらに高い圧力Ｇ２を加える。これにより、蛋白質溶液Ａは、二次元結晶核形成部１０の平坦面２２上に蛋白質の薄層（二次元膜）となって展開する（図４の（ｃ））。
（４）沈殿剤分注口３２に所定の沈殿剤Ｂを注入する。分注された沈殿剤Ｂは、毛管現象により上流に向かって流れ、トラップ部３４まで進む（図４の（ｄ））。
（５）トラップ部３４まで進んだ沈殿剤Ｂに対し、下流に向けて圧力Ｇ２を加える。これにより、沈殿剤Ｂは、二次元結晶核形成部１０内へ流入し、上記（３）で作成された蛋白質の薄層（二次元膜）と混合されて、蛋白質の二次元膜と沈殿剤との混合溶液Ｃが下流に向かって流れる（図４の（ｅ））。
（６）上記（５）で生成された蛋白質の二次元膜と沈殿剤との混合溶液Ｃに対し、下流に向けて圧力Ｇ３を加える。これにより、混合溶液Ｃは、結晶化用セル３８内に流入する。この際、沈殿剤分注口３２に残存する沈殿剤Ｂは、沈殿剤分注口３２と結晶化用セル３８とが連絡用流路４２を介して連通しているため、蒸気平衡の状態となる。また、混合溶液Ｃの蒸発を防止するために、溶液分注口１４にオイルＤを注入して上流側をシールする（図４の（ｆ））。
【００２７】
次に、上記（３）〜（６）の各工程において、蛋白質の二次元結晶核が形成され、その二次元結晶核から三次元結晶が生成される動作原理を図５に基づいて説明する。
【００２８】
図５の（ａ）に模式的に部分拡大断面図を示すように、二次元結晶核形成部１０の平坦面２２上に蛋白質溶液Ａが流入すると、蛋白質溶液Ａは、矢印Ｆで示すように下流方向（図５の紙面上では左から右に向かう方向）に向けて加えられる圧力Ｇ２の作用により、流れ方向に展開して、蛋白質溶液Ａの液滴が薄層化する。そして、図５の（ｂ）に示すように、蛋白質溶液Ａの薄層状の液滴が最も薄くなる外周部における気−液界面において、蛋白質分子が二次元的に集積化して二次元結晶核ａが形成される。その後、図５の（ｃ）に示すように、二次元結晶核形成部１０内へ適量の沈殿剤が導入されることにより、平坦面２２上に形成された二次元結晶核ａが沈殿剤で洗い流され、蛋白質の二次元結晶核ａと沈殿剤との混合溶液Ｃが下流に向かって流れ、二次元結晶核ａが結晶化用セル３８内へ送り込まれる。結晶化用セル３８の内部は、沈殿剤中に二次元結晶核ａを含んだ蛋白質溶液が添加された状態であり、二次元結晶核ａから三次元的な結晶成長が進行して、膜蛋白質の三次元結晶が生成される。
【００２９】
図６は、第２の発明の１実施形態を示し、結晶化デバイスの構成要素の１つである、互いに対向する一対の電極６２、６２の拡大図を示している。この第２の発明に係る結晶化デバイスは、二次元結晶核形成部１０の構成および蛋白質の二次元結晶核の形成原理が、上記した第１の発明に係る結晶化デバイスと異なるだけであり、それ以外の構成および動作は第１の発明に係る結晶化デバイスと全く同じである。
【００３０】
第２の発明に係る結晶化デバイスは、二次元結晶核形成部１０に一対の対向する電極６２、６２を備えている。一対の電極６２、６２は、その間に微量の蛋白質溶液を保持し、かつ、その蛋白質溶液を沈殿剤によって溶出することが可能である構造を有している必要がある。このような構造の１例として、図６には、対向する先端部が細くなった截頭円錐形の電極６２を示している。このような形状の電極６２を作製するには、例えば、シリコン基板の裏面に金電極膜を被着形成しておき、そのシリコン基板を機械的あるいは化学的エッチング処理する、といった方法を採用することができる。金電極膜は、シリコン基板の裏面に真空蒸着法あるいはスパッタリング法などによりＴｉ／Ａｕ薄膜を形成し、その後にシンタリング（焼結）を行うことにより形成される。シリコン基板の裏面に形成されるＴｉ／Ａｕ薄膜の膜厚は、一般的には１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であることが望ましく、さらには１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることが、密着性やオーミック接触を得る上からは望ましい。図６中の符号６４が金電極膜である。
【００３１】
上記したような一対の対向する電極６２、６２が設けられた二次元結晶核形成部１０に上流から蛋白質溶液が流入してくると、蛋白質溶液は一対の電極６２、６２間に保持され、それに続いて、一対の電極６２、６２によって蛋白質溶液に対し電場が印加されることにより、蛋白質溶液中で二次元結晶核が形成される。一対の電極６２、６２間に保持された蛋白質溶液中で二次元結晶核が形成されると、二次元結晶核形成部１０内へ上流から沈殿剤を流入させることにより、沈殿剤によって蛋白質の二次元結晶核を下流に溶出させる。
【００３２】
次に、二次元結晶核形成部１０において蛋白質の二次元結晶核が形成され、その二次元結晶核から三次元結晶が生成される動作原理を図７に基づいて説明する。
【００３３】
図７の（ａ）に模式的に部分拡大断面図を示すように、二次元結晶核形成部に上流から流入してきた蛋白質溶液Ａは、一対の対向する電極６２、６２間に表面張力によって保持される。この後に、図７の（ｂ）に示すように、一対の電極６２、６２間に交播電場が印加されると、蛋白質分子は双極子と見なされるため、蛋白質分子は、電場の極性に追随してその配向方向を変え、さらに電極６２、６２間にトラップされる。電極６２、６２間において前記の配向運動が繰り返されることにより、蛋白質分子に運動エネルギーが付与され、マイグレーション（分子の再配向のための並進・回転運動）が促進される。これにより、蛋白質の二次元結晶核の形成が進むことが期待される。一対の電極６２、６２間に保持された蛋白質溶液Ａ中で二次元結晶核が形成されると、二次元結晶核形成部１０内へ上流から適量の沈殿剤を導入することにより、図７の（ｃ）に示すように、二次元結晶核ａは、対向電極６２、６２間の位置から沈殿剤によって洗い流され、蛋白質の二次元結晶核ａと沈殿剤との混合溶液Ｃが下流に向かって流れ、二次元結晶核ａが結晶化用セル３８内へ送り込まれる。結晶化用セル３８の内部は、沈殿剤中に二次元結晶核ａを含んだ蛋白質溶液が添加された状態であり、二次元結晶核ａから三次元的な結晶成長が進行して、膜蛋白質の三次元結晶が生成される。
【００３４】
【実施例】
以下、この発明のより具体的な実施例について説明する。
【００３５】
〔結晶化デバイス−１の作製例〕
図１に示した構成の結晶化デバイスを、以下のようにして作製した。
【００３６】
厚みが０．６ｍｍで、直径が１２０ｍｍである円板状の耐熱性ガラス基板を２枚と、厚みが０．５ｍｍで、直径が１２０ｍｍである円板状のシリコンウエハを１枚用いた。上層側となる耐熱性ガラス基板には、スルーホールおよび流路をブラストエッチングにより形成した。下層側となる耐熱性ガラス基板には、エッチング処理を行わない。また、中間層となるシリコンウエハには、二次元結晶核形成部（平坦面の長さおよび幅がそれぞれ５ｍｍおよび２５ｍｍである）を成す細溝をブラストエッチングにより形成した。さらに、中間層のシリコンウエハには、スルーホールを形成して、それを結晶化用セルとした。
【００３７】
以上のようにして作製された３枚の基板を、積層して陽極接合により互いに接合した。次に、二次元結晶核形成部のみに、真空蒸着法によりＴｉ／Ａｕをそれぞれ５０ｎｍ（Ｔｉ）および１００ｎｍ（Ａｕ）の膜厚となるように成膜した。この後に、チオール誘導体として、８−アミノ−１−オクタンチオールハイドロクロライドの、濃度１ｍＭのエタノール溶液を調製し、その溶液中に基板を浸漬させることにより、金表面に配向膜を作成した。
【００３８】
〔結晶化デバイス−２の作製例〕
厚みが０．６ｍｍで、直径が１２０ｍｍである円板状の耐熱性ガラス基板を２枚と、厚みが０．５ｍｍで、直径が１２０ｍｍである円板状のシリコンウエハを１枚用いた。上層側となる耐熱性ガラス基板には、スルーホールおよび流路をブラストエッチングにより形成した。下層側となる耐熱性ガラス基板には、エッチング処理を行わない。また、中間層となるシリコンウエハには、二次元結晶核形成部（平坦面の長さおよび幅がそれぞれ５ｍｍおよび２５ｍｍである）を成す細溝をブラストエッチングにより形成した。さらに、中間層のシリコンウエハには、スルーホールを形成して、それを結晶化用セルとした。
【００３９】
以上のようにして作製された３枚の基板を、積層して陽極接合により互いに接合した。次に、二次元結晶核形成部に、対向電極としてシリコン製のチップ（長さ（先端面から底面までの高さ）が０．６ｍｍで、先端部の直径が０．０５ｍｍで、底面部の直径が１ｍｍである）  を、一対の電極の各先端部間の間隔が０．１ｍｍとなるように、エレクトロンワックスにより固定した。さらに、底面の電極部に一対のリード線を取り付けた。
【００４０】
〔結晶化デバイス−１を用いた結晶化テスト〕
結晶化テスト用のモデル蛋白質として、マルトース・トランスポート・プロテイン（ＭＴＰ）の、濃度７ｍｇ／ｍｌの溶液を調製して用いた。溶液分注口に２μｌのＭＴＰ溶液を注入した後、３０秒が経過した時点で、結晶化デバイスを５００ｒｐｍの回転数で回転させ、溶液供給流路を通って二次元結晶核形成部の溶液流入口までＭＴＰ溶液を流動させた。続いて、結晶化デバイスを７００ｒｐｍの回転数で回転させ、二次元結晶核形成部にＭＴＰ溶液を流入させた後、さらに１分間継続して結晶化デバイスを回転させた。なお、この際、予め二次元結晶核形成部の上方のスルーホールに透明テープでシールを施しておいた。
【００４１】
結晶化デバイスの回転を止めた後、沈殿剤分注口に以下の組成の沈殿剤を１μｌ注入した。
【００４２】
２Ｍ  １，６−ヘキサンジオール
緩衝溶液：０．１Ｍ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ヘペス）  ｐＨ７．５
０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
【００４３】
沈殿剤分注口に上記組成の沈殿剤を分注してから１分が経過した後に、再び結晶化デバイスを７００ｒｐｍの回転数で回転させた。これにより、分注された沈殿剤が、二次元結晶核形成部に滞留していたＭＴＰ溶液と共に、送液用流路３６を通り溶液混合用流路４０を経由して結晶化用セル内に流入した。
【００４４】
結晶化デバイスの回転を止めた後、沈殿剤分注口と結晶化用セルの上部に透明テープでシールを施すとともに、溶液分注口に２μｌのパラフィンオイルを注入して上流側をシールした。なお、別途行ったテストから、以上のような操作で結晶化用セル内に分注されたＭＴＰ溶液および沈殿剤の各容量は、いずれも１１０ｎＬであることが確認された。
【００４５】
以上のような操作を行った後に、結晶化デバイスを２０℃のインキュベータ内に保管した。３日が経過した後に結晶化用セル内の溶液を観察したところ、幅が約０．０５ｍｍで、長さが約０．１ｍｍの針状結晶の成長が認められた。
【００４６】
〔結晶化デバイス−２を用いた結晶化テスト〕
結晶化テスト用のモデル蛋白質として、濃度７ｍｇ／ｍｌのＭＴＰ溶液を調製して用いた。溶液分注口に２μｌのＭＴＰ溶液を注入した後、３０秒が経過した時点で、結晶化デバイスを５００ｒｐｍの回転数で回転させ、溶液供給流路を通って二次元結晶核形成部の溶液流入口までＭＴＰ溶液を流動させた。続いて、結晶化デバイスを７００ｒｐｍの回転数で回転させ、二次元結晶核形成部の対向電極間にＭＴＰ溶液を導入して保持させた後、結晶化デバイスの回転を止めた。この際の、二次元結晶核形成部へのＭＴＰ溶液の分注量は、約１２０ｎＬであった。続いて、対向電極間に以下の条件で交流電場を印加した。なお、この際、予め二次元結晶核形成部の上方のスルーホールに透明テープでシールを施しておいた。
【００４７】
対向電極間距離：０．１ｍｍ
印加電圧：１０Ｖ
印加周波数：１ＫＨｚ
印加時間：５分
【００４８】
次に、沈殿剤分注口に以下の組成の沈殿剤を１μｌ注入した。
【００４９】
１０％ＭＰＤ（２−メチル−２，４−ペンタンジオール）
緩衝溶液：０．１Ｍ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５
０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
【００５０】
沈殿剤分注口に上記組成の沈殿剤を分注してから１分が経過した後に、再び結晶化デバイスを７００ｒｐｍの回転数で回転させた。これにより、分注された沈殿剤が、二次元結晶核形成部に滞留していたＭＴＰ溶液と共に、送液用流路３６を通り溶液混合用流路４０を経由して結晶化用セル内に流入した。
【００５１】
結晶化デバイスの回転を止めた後、沈殿剤分注口と結晶化用セルの上部に透明テープでシールを施すとともに、溶液分注口に２μｌのパラフィンオイルを注入して上流側をシールした。なお、別途行ったテストから、以上のような操作で結晶化用セル内に分注されたＭＴＰ溶液および沈殿剤の各容量は、いずれも１００ｎＬであることが確認された。
【００５２】
以上のような操作を行った後に、結晶化デバイスを２０℃のインキュベータ内に保管した。２日が経過した後に結晶化用セル内の溶液を観察したところ、幅が約０．０５ｍｍで、長さが約０．１ｍｍの針状および柱状の各結晶の成長が認められた。
【００５３】
【発明の効果】
請求項１および請求項２に係る各発明の生体高分子の結晶化方法によると、従来の結晶化方法では良質な結晶を得ることが困難であった膜蛋白質などの結晶化を高い成功率で実現することができる。
【００５４】
請求項３および請求項４に係る各発明の結晶化装置を使用すると、請求項１および請求項２に係る各発明の結晶化方法を好適に実施することができ、上記した効果が得られる。
【００５５】
請求項５に係る発明の結晶化装置は、その作製が比較的容易であり、また、各流路内で溶液や結晶化溶媒を流動させるための駆動力の制御が比較的簡単である。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の発明の実施形態の１例を示し、生体高分子の三次元結晶を生成させるために使用される結晶化装置の概略構成を模式的に示す図である。
【図２】図１に示した結晶化装置の作製方法を説明するための断面図である。
【図３】同じく、図１に示した結晶化装置の作製方法を説明するための断面図である。
【図４】図１に示した結晶化装置における一連の動作を説明するための模式図である。
【図５】図１に示した結晶化装置により、蛋白質の二次元結晶核が形成され、その二次元結晶核から三次元結晶が生成される動作原理を説明するための模式的部分拡大断面図である。
【図６】第２の発明の１実施形態を示し、結晶化装置の構成要素の１つである、互いに対向する一対の電極を示す拡大図である。
【図７】図６に示した対向電極を備えた結晶化装置により、蛋白質の二次元結晶核が形成され、その二次元結晶核から三次元結晶が生成される動作原理を説明するための模式的部分拡大断面図である。
【図８】従来の結晶化方法の１つであるハンギングドロップ蒸気拡散法を説明するための模式的断面図である。
【図９】従来の結晶化方法の１つであるマイクロバッチ法を説明するための模式的部分断面図である。
【符号の説明】
１０  二次元結晶核形成部
１２  三次元結晶生成部
１４  溶液分注口
１６  溶液供給流路（第１の流路）
２０  流量制御部
２２  二次元結晶核形成部の平坦面
３０  沈殿剤供給流路（第２の流路）
３２  沈殿剤分注口
３４、４４  トラップ部
３６  送液用流路（第３の流路）
３８  結晶化用セル
４０  溶液混合用流路
４２  連絡用流路
４６、４８  ガラス基板
５０  シリコン基板
５２ａ〜５２ｆ、５６、５８  スルーホール
５４ａ、５４ｂ  凹状溝
６０  細溝
６１  シリコン基板の島状の表面部分
６２  対向する電極
Ａ  蛋白質溶液
Ｂ  沈殿剤
Ｃ  蛋白質の二次元結晶核と沈殿剤との混合溶液
Ｄ  シール用のオイル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005023039.tif 000008
【図７】
2005023039.tif 000009
【図８】
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【図９】
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