(57)【要約】【課題】  振動および光学設計に影響を受けず、かつ高精度の分析が可能な、サンプルの分析方法を提供する。【解決手段】  サンプルの分析方法において、リガンドを含むサンプルをそのリガンド特異的に結合しうるレセプターとを結合させ、前記レセプターに外部振動を与えながら、前記レセプターと前記リガンドとの結合により生じた変化を、表面プラズモン共鳴角の周波数特性を測定することにより、分析する。このサンプルの分析方法は、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用である。【選択図】  図１
2005208051.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを含むサンプルと、
前記リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定化され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、
計測光を照射する照射手段と、
前記計測光の反射光を受光する受光手段と、
前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを準備し、
前記サンプルと前記金属薄膜とを接触させて前記サンプル中の前記リガンドを前記レセプターに結合させ、
前記照射手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射し、
前記受光手段により、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光し、
前記分析手段により、前記反射光から、前記金属薄膜近傍の誘電率の変化により生じた表面プラズモン共鳴角の変化を検出する、サンプル中の前記リガンドの分析方法であって、
前記レセプターが固定された領域に外部振動を印加する印加手段を準備し、
前記照射手段により前記計測光を照射しながら、前記印加手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加し、
前記分析手段により、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、その周波数特性から前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドを分析することを特徴とする方法。
【請求項２】
レセプターとリガンドの少なくとも一方が電荷を帯びている請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記印加手段が、電気的振動、磁気的振動および機械的振動の少なくとも一つを印加する手段である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段である請求項３に記載の方法であって、
前記分析手段が、前記反射光から、前記リガンドの物理学的物性を分析することを更に含む方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法であって、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析する方法。
【請求項６】
前記分析手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較する比較手段を更に含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、
前記周波数特性を得る工程が、前記比較手段により、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点を検出することにより行われる方法。
【請求項７】
前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測する計測手段をさらに準備し、
前記計測手段により前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測することにより、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを検出する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射させる光学手段をさらに準備し、
前記光学手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射させる請求項１〜７のいずれかに記載の方法であって、
前記受光手段により受光される前記計測光の反射光が、前記光学手段により前記金属薄膜の前記面上で複数回反射された前記計測光の反射光である方法。
【請求項９】
レセプターとリガンドとの組み合わせが、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素または酵素と酵素基質である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定化され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、
計測光を照射する照射手段と、
前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光可能な受光手段と、
前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを含むサンプル中のリガンドを分析する装置であって、
前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加可能な印加手段をさらに含み、
前記印加手段により外部振動を印加しながら、前記照射手段が、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射可能であり、
前記分析手段が、前記反射光から表面プラズモン共鳴角の変化を検出し、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、その周波数特性から前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドを分析可能であることを特徴とする装置。
【請求項１１】
前記レセプターと前記リガンドの少なくとも一方が、電荷を帯びている請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記印加手段が、電気的振動、磁気的振動および機械的振動の少なくとも一つを印加する手段である請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段である請求項１２に記載の方法であって、
前記分析手段が、前記反射光から、更に、前記リガンドの物理学的物性を分析可能である装置。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の装置であって、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析する装置。
【請求項１５】
前記分析手段が、比較手段を更に含む請求項１０〜１４のいずれかに記載の装置であって、
前記比較手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点を検出可能である装置。
【請求項１６】
計測手段をさらに含む請求項１５に記載の装置であって、
前記計測手段が、前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測することにより、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを検出可能である装置。
【請求項１７】
光学手段を更に含む請求項１０〜１６のいずれかに記載の装置であって、
前記光学手段が、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射可能であり、
前記受光手段により受光される前記計測光の反射光が、前記光学手段により前記金属薄膜の前記面上で複数回反射された前記計測光の反射光である装置。
【請求項１８】
レセプターとリガンドとの組み合わせが、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素または酵素と酵素基質である請求項１０〜１７のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のリガンドの分析方法およびサンプル中のリガンドを分析する装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生化学的反応においては、レセプターとリガンドとの結合という反応が重要である。例えば抗原抗体反応では、レセプターとして抗体が、リガンドとして抗原と結合する。また、例えば酵素反応では、レセプターとして酵素が、リガンドとして酵素基体と結合する。このような反応を利用すれば、サンプル中に含まれるリガンドを、検出することが可能である。
【０００３】
例えば、金属薄膜表面に、レセプターを結合させておき、リガンドがレセプターに結合すると、その金属薄膜近傍の誘電率が変化する。表面プラズモン共鳴現象を利用して、その変化を検出し、リガンドとレセプターの結合量を分析する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。この方法ではまず、前記のような金属薄膜に、レセプターが結合されている表面の裏から、全反射条件を満たす角度で光を照射する。その入射光により励起された表面プラズモンの波数と、励起光に由来するエバネッセント波の波数が一致する特定の入射角の時だけに、入射光の光量の一部が表面プラズモンの励起に使われ、反射光の光量が減少する。金属薄膜近傍の誘電率の変化を、例えば、入射光の角度を変化させて反射光を計測し、吸収が最大になる入射光の角度を求める方法や、入射光の角度を一定に保ち、吸収が最大になる反射光の角度を求める方法が知られている。また、レセプターが固定されている金属薄膜の裏面に電気的振動である電界を印加する事で金属薄膜に試料の分離及び移動制御する技術（例えば、特許文献１参照）や金属薄膜の屈折率の変化を利用して多量の試料を一度に計測する技術が提案されている(例えば、特許文献２参照)。
【０００４】
しかし、これらの方法では、レセプターに結合したリガンドの量を、表面プラズモンが励起して光量が減少する微小な角度変化量から解析している。従って、これらの方法においては、照射光が反射される金属薄膜（例えば、数nm程度の厚みを有する)の表面は均一である必要がある。また、光量変化から微小な角度変化量を測定することから、光学軸のずれがなく受光できる高精度な光学部材の調整が必要である。その結果、これらの方法を利用する装置には、光学設計に影響を受けやすいとなるという問題があった。また、微小な変化を検出することから、測定時に装置が振動を受けると、読み取り精度が著しく悪化する。そのため、これらの方法を利用した装置を携帯可能に小型化することは困難であった。
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，７０，２０１９−２０２４．
【特許文献１】特開２００３−６５９４７号公報
【特許文献２】特開２００３−７５３３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、従来よりも振動および光学設計に影響を受けず、かつ高精度の分析が可能なサンプル中のリガンドの分析方法およびサンプル中のリガンドを分析する装置の提供を、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、リガンドを含むサンプルと、前記リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定化され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、計測光を照射する照射手段と、前記計測光の反射光を受光する受光手段と、前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを準備し、前記サンプルと前記金属薄膜とを接触させて前記サンプル中の前記リガンドを前記レセプターに結合させ、前記照射手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射し、前記受光手段により、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光し、前記分析手段により、前記反射光から、前記金属薄膜近傍の誘電率の変化により生じた表面プラズモン共鳴角の変化を検出する、サンプル中の前記リガンドの分析方法であって、前記レセプターが固定された領域に外部振動を印加する印加手段を準備し、前記照射手段により前記計測光を照射しながら、前記印加手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加し、前記分析手段により、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、その周波数特性から前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドを分析することを特徴とする。
【０００７】
また、本発明の装置は、リガンドと特異的に結合しうるレセプターがその片面上に固定化され、その裏面に光学プリズムが配置された、表面プラズモン共鳴を起しうる金属薄膜と、計測光を照射する照射手段と、前記金属薄膜の面上で反射された前記計測光の反射光を受光可能な受光手段と、前記レセプターと結合したリガンドを分析する分析手段とを含むサンプル中のリガンドを分析する装置であって、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面に外部振動を印加可能な印加手段をさらに含み、前記印加手段により外部振動を印加しながら、前記照射手段が、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面と逆の面に、計測光を照射可能であり、前記分析手段が、前記反射光から表面プラズモン共鳴角の変化を検出し、さらに、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得、その周波数特性から前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドを分析可能であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
このように、本発明の分析方法および装置では、外部振動を与え、この外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得る。この外部振動により、前記金属薄膜近傍の誘電率が変化する。その誘電率の変化のため、表面プラズモン共鳴角は変化する。このように、本発明の分析方法および装置はこの表面プラズモン共鳴角の周波数特性を測定するので、表面プラズモン共鳴角の微細な変化を測定する必要がなく、その結果、振動および光学設計に影響をあまり受けず、かつ高精度の分析が可能となる。さらに、振動に強いため、本発明の装置は小型化が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の分析方法および装置において、レセプターとリガンドとしては、少なくとも一方が、荷電を帯びているのが好ましい。外部振動として電気的振動を与える際に、前記金属薄膜表面の誘電率が変化しやすくなるからである。レセプターとリガンドの組み合わせとしては、例えば、抗原と抗体、抗体と抗原、ホルモンとホルモン受容体、ホルモン受容体とホルモン、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド受容体、ポリヌクレオチド受容体とポリヌクレオチド、酵素阻害剤と酵素、酵素と酵素阻害剤、酵素基質と酵素、酵素と酵素基質等が挙げられる。
【００１０】
本発明者らは、金属薄膜近傍の誘電率変化のメカニズムを以下のように推察している。前記レセプターおよび前記リガンドに外部振動を与えると、金属薄膜に追従し、前記レセプターおよび前記リガンドが前記金属薄膜表面に密集する。そうすると、前記金属薄膜におけるエバネッセント領域の分子密度が変化する。この分子密度の変化により、エバネッセント領域の誘電率が変化、すなわち前記金属薄膜近傍の誘電率が変化すると推察している。
【００１１】
本発明の分析方法において、前記印加手段は、電気的振動、磁気的振動および機械的振動の少なくとも一つを印加する手段であるのが好ましく、少なくとも電気的振動を印加する手段であるのがより好ましい。この際、前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段であって、前記分析手段は、前記反射光から、前記リガンドの物理学的物性を分析することを更に含むのが好ましい。前記リガンドの物理学的物性が、容易に分析可能となるからである。同様に、本発明の装置において、前記印加手段は、電気的振動、磁気的振動および機械的振動の少なくとも一つを印加する手段であるのが好ましく、少なくとも電気的振動を印加する手段であるのがより好ましい。この際、前記印加手段が、電気的振動を少なくとも印加する手段であって、前記分析手段は、前記反射光から、更に、前記リガンドの物理学的物性を分析可能であるのが好ましい。従来、別の装置を用いて分析する必要があった、前記リガンドの物理学的物性が、同時に可能になるからである。この電気的振動として、交流電界を用いるのが更に好ましい。交流電界を印加すると、例えば、前記リガンドおよび前記レセプターの少なくとも一方が有する電荷数、電気抵抗値等の電気化学的な物性の評価を同時に行うことができるからである。
【００１２】
本発明の分析方法において、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析するのが好ましい。同様に、本発明の装置においては、前記レセプターと結合した前記サンプル中のリガンドの量を分析するのが好ましい。
【００１３】
本発明の分析方法において、前記分析手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較する比較手段を更に含み、前記周波数特性を得る工程が、前記比較手段により、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点（追従周波数限界）を検出することにより行われるのが好ましい。周波数特性の変極点を検出することにより、表面プラズモン共鳴角の変化を計測する方法に比べて、測定精度の高い結果を得ることができるからである。同様に、本発明の装置において、前記分析手段が、比較手段を更に含み、前記比較手段が、前記外部振動の位相と、前記反射光に含まれる前記外部振動の信号成分の位相とを比較して、前記周波数特性の変極点（追従周波数限界）を検出可能であるのが好ましい。周波数特性の変極点を検出することにより、表面プラズモン共鳴角の変化を計測するのに比べて、測定精度の高い結果を得ることができるからである。
【００１４】
本発明の分析方法において、前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測する計測手段をさらに準備し、前記計測手段により前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測することにより、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを検出するのが好ましい。前記レセプターと前記リガンドとの結合の進行度合いを測定することが可能になるからである。同様に、本発明の装置において、計測手段をさらに含み、前記計測手段が、前記周波数特性の変極点の時間的変化を計測することにより、前記レセプターと前記リガンドとの結合の度合いを検出可能であるのが好ましい。前記レセプターと前記リガンドとの結合の進行度合いを測定することが可能になるからである。
【００１５】
本発明の分析方法において、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射させる光学手段をさらに準備し、前記光学手段により、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射させる方法であって、前記受光手段により受光される前記計測光の反射光が、前記光学手段により前記金属薄膜の前記面上で複数回反射された前記計測光の反射光であるのが好ましい。複数回反射されることにより、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅し、高感度な測定が可能になるからである。同様に、本発明の装置において、光学手段を更に含み、前記光学手段が、前記金属薄膜の前記レセプターが固定された面上で反射された前記計測光の反射光を、更に前記面に複数回照射可能であり、前記受光手段により受光される前記計測光の反射光が、前記光学手段により前記金属薄膜の前記面上で複数回反射された前記計測光の反射光であるのが好ましい。複数回反射されることにより、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅し、高感度な測定が可能になるからである。
【００１６】
（第１の実施形態）
本実施形態では、本発明の装置の好ましい一形態について、説明する。図１は、本発明の装置の一例の模式図である。図１において、１は光源、２はプリズム、３は計測光、４は受光装置、５は反射光、６はプラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部、７は金属薄膜兼上側電極、８は下側電極、９は金属膜兼上側電極７に固定されたレセプター、１０は交流源、１１は交流源１０の周波数を分ける分周器、１２及び１６は特定周波数のみを通すアクティブフィルター、１３は外部振動、１４はコンデンサー、１５は増幅器、１７は外部振動の位相（θ0）と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ1）を比較する検出器、１８は検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター、３９はリガンド、θは入射角である。
【００１７】
光源１は、そこから発せられた計測光３が、金属薄膜兼上側電極７に照射できる位置に配置される。その照射される金属薄膜兼上側電極７の照射面の裏面には、レセプター９が固定されている。受光装置４は、金属薄膜兼上側電極７で反射された反射光５を受光できる位置に配置される。下側電極８は、金属薄膜兼上側電極７に固定されたレセプター９に、外部振動を印加しうるように配置される。下側電極８は、分周器１１およびアクティブフィルター１２を介して、交流源１０と接続しており、交流源１０は、さらに別のアクティブフィルター１６と接続している。このアクティブフィルター１６は、コンデンサー１４および増幅器１５をこの順で介して、受光装置４と接続されている。アクティブフィルター１６と、アクティブフィルター１２の両方は、検出器１７を介して、Ａ／Ｄコンバーター１８と接続している。図１において、金属薄膜兼上側電極７を装置の上側、下側電極８を装置の下側に配置したが、その上下を逆転しても、または装置の左右側に配置しても有効であることは言うまでもない。
【００１８】
光源１から発せられた計測光３は、ビームスプリッター（図示せず）によりｐ偏光の光のみで、入射角θを変化させながらプリズム２（例えば、日本電子レーザ社製のプリズム）を通して金属薄膜兼上側電極７に照射される。金属薄膜兼上側電極７に照射された計測光３は、金属薄膜兼上側電極７で全反射し、反射光５が生じる。ある特定の入射角θで金属薄膜兼上側電極７に計測光３が照射されると、エバネッセント波が発生し、表面プラズモン共鳴と言われるプラズモン波の励起に光量の一部が使われ、光量が減少した反射光暗部６が発生する。反射光５の強度を電圧に変換する受光装置４を用いて、反射光暗部６を含むその反射光５の強度を検出する。
【００１９】
さらに金属薄膜兼上側電極７及び下側電極８に、交流源１０と分周器１１からなるユニットを接続する。交流源１０によりｎｆの周波数が発生され、分周器１１によりｆの周波数に変換され、下側電極８によりｆの周波数を持った外部振動１３が、金属薄膜兼上側電極７に印加される。その結果、レセプター９は、分子の方向転換により振動する。ここでエバネッセント波領域の計測光に対する誘電率を支配しているのはレセプター分子が有する電子分極成分である。外部振動１３により金属薄膜兼上側電極７表面のエバネッセント領域のレセプター９が方向転換すれば、電子の密度中心も変化するので誘電率が変わり、よってプラズモン共鳴が生じる反射光暗部６の特定の角度も受光装置４を囲む範囲で変化する。
【００２０】
また、金属薄膜兼上側電極７近傍のレセプター９にリガンド３９が結合すると、リガンド３９の分子量だけ、レセプター９の重さが増大する。その結果、レセプター９とリガンド３９の結合体の誘電率は、レセプター９のみの誘電率から変化する。このリガンド３９が結合したレセプター９に外部振動１３を印加すると、外部振動１３に対するレセプター９の方向転換により、振動の周波数特性が変化する。
【００２１】
反射光暗部６を含む反射光５は受光装置４で検出され、その交流成分が増幅器１５を通し増幅される。アクティブフィルター１６で外部振動の信号成分以外が除去され、検出器１７で外部振動の位相（θ0）と反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ1）が比較される。得られたアナログ信号はＡ／Ｄコンバーター１８によりデジタル信号に変換される。
【００２２】
本発明の装置において、表面プラズモン共鳴角の周波数特性を計測すれば、レセプターへ結合したリガンドを分析、例えばレセプターに結合したリガンドの量を分析することができる。このように、本発明の装置においては、反射光暗部６の微小な角度変化を読む必要が無いので、プリズム２、金属薄膜兼上側電極７等の測定治具の光学的平面度が緩和される。さらに、本発明の装置においては、受光装置４の設置位置は、反射光暗部６の変化範囲内にあれば良いのでノイズの影響が低減され高感度な測定が実現可能である。
【００２３】
また、測定治具の光学的平面度、部品精度、光学軸の精度の緩和により、本発明の装置の低価格化が実現するだけでなく、振動に強い携帯型の小型化が可能である。さらに、外部振動として電気的振動を印加することにより、従来同時に評価できなかったリガンドの物理学的物性、例えば電荷数、電気抵抗値等の評価が実現可能である。例えば、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時流れる電流を計測することで図２（ａ）に示すインピーダンスの周波数特性が得られる。サンプルに含まれているリガンドは、図２（ｂ）に示すような抵抗（Ｒ）及び容量（Ｃ）等といった等価回路の組み合わせに置き換えが可能で、インピーダンスＺは、直列に配置された形では、Ｚ＝Ｒ＋ｊＸ、並列に配置された形では、Ｚ＝ＲＸ2／（Ｒ2＋Ｘ2）＋ｊＲ2Ｘ／（Ｒ2＋Ｘ2）と表される（前記式中、Ｘ＝―１／（２πｆＣ））。例えば、図２（ａ）に示されたインピーダンスの周波数特性に、これらの式を当てはめ、解析することで、それぞれの物性の評価を実現することができる。なお、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時流れる電流を計測する方法を例示したが、交流源１０から発生される周波数を変化させながら、金属薄膜兼上側電極７と下側電極８との間に一定の電圧を印加し、その時加わる電圧を計測することによっても、前記方法を行うことができる。なお、図２（ｂ）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、リガンド内、リガンド間および電極のそれぞれの抵抗、Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3は、リガンド内、リガンド間および電極のそれぞれの容量である。
【００２４】
なお、光源１としては、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ、色素レーザ等を用いることができ、例えば、ＡｌＧａＡｓダブルへテロ接合可視光半導体レーザ（例えば、ＲＯＨＭ社製）、コリメートレンズ（例えば、松下日東社製）及び偏光ビームスプリッター（例えば、シグマ光機社製）から構成されていてもよい。入射角を変化させる方法としては、光源１を駆動させ、計測光３を金属薄膜兼上側電極７上に走査させてもいいし、光源１を固定させポリゴンミラースキャナー等の反射鏡を駆動させて計測光３を走査させてもいい。
【００２５】
プリズム２としては、円錐形状、半球形状等を用いることができる。
【００２６】
金属薄膜兼上側電極７としては、表面プラズモン共鳴を起こしうるものであれば、限定されず、例えば、白金、金等の金属薄膜、好ましくは金の金属薄膜（例えば、日本電子レーザ社製）を用いることができる。レセプター９は、前述のものを用いることができる。例えば、レセプターを、金属薄膜に直接的または結合用修飾分子により間接的に固定することにより、レセプターがその片面上に固定された金属薄膜を製造することができる。
【００２７】
受光装置４は、ＣＣＤ、Ｓｉ  ＰＩＮ  フォトダイオード（例えば、浜松フォトニクス社製）等にオペアンプ（例えば、ナショナルセミコンダクター社製）及び抵抗素子を用いて反射光５の強度を電圧に変換する装置であってもよい。
【００２８】
図３（ａ）から（ｂ）に、本発明の装置の一例中、金属薄膜上にレセプターを設置せずに測定した表面プラズモン共鳴曲線と、レセプターとして水を設置して測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。それぞれの図において、横軸は計測光３の入射角θの角度であり、縦軸は、反射光５の強度を示す。図３（ａ）は、レセプター無しの場合、図３（ｂ）は、レセプターとして水を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線である。なお、この測定においては、外部振動は印加していない。図３（ａ）および（ｂ）に示されるように、レセプターの有無により、表面プラズモン共鳴の生じる角度が変化する。すなわち、本発明の装置の一例により、金属薄膜近傍の誘電率の変化に伴う表面プラズモン共鳴角の変化を測定できることが示されている。
【００２９】
図４Ａ（ａ）、Ａ（ｂ）、Ｂ（ａ）およびＢ（ｂ）に本発明の装置の一例中、リガンドを含まないサンプルの表面プラズモン共鳴曲線と、リガンドを含むサンプルの表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。それぞれの図において、横軸は計測光３の入射角θの角度であり、縦軸は、反射光５の強度を示す。
【００３０】
測定装置としては、図１に示す本発明の装置の一例を用いた。レセプターとしては、抗アルブミンウシ血清抗体（シグマアルドリッチ社製）を用いた。サンプルとして、リン酸（シグマアルドリッチ社製）に水酸化ナトリウムを添加し、ｐＨ７．０に調製した１％リン酸緩衝液、またはアルブミンウシ血清（シグマアルドリッチ社製）を１０μｇ／ｍｌになるようにリン酸（シグマアルドリッチ社製）に水酸化ナトリウムを添加しｐＨ７．０に調製した１％リン酸緩衝液に調製したものを用いた。外部振動を印加した場合と印加しない場合の両方について、それぞれのサンプルの表面プラズモン共鳴曲線を得た。図４Ａ（ａ）は、リガンド無しの場合の表面プラズモン共鳴曲線、図４Ａ（ｂ）は、図４Ａ（ａ）の一部拡大図、図４Ｂ（ａ）は、リガンドとして、アルブミンウシ血清を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線、図４Ｂ（ｂ）は、図４Ｂ（ａ）の一部拡大図である。
【００３１】
図４Ａ（ａ）および図４Ａ（ｂ）に示されるように、リガンドが含まれていないサンプルについては、電界（外部振動）印加の有無に関わらず表面プラズモン共鳴曲線はほぼ一致していた。一方、図４Ｂ（ａ）および図４Ｂ（ｂ）に示されるように、リガンドが含まれているサンプルでは、電界を印加して得られた表面プラズモン共鳴曲線は、電界を印加しなかった場合に得られる表面プラズモン共鳴曲線からシフトしていた。本発明者らは、この結果は以下の図５（ａ）から（ｃ）に示すメカニズムにより生じたものと推察している。
【００３２】
図５（ａ）から（ｃ）に、本発明の装置中、外部振動の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図を示す。図５（ａ）は、外部振動強度がゼロの状態、図５（ｂ）は、外部振動強度が弱い状態、図５（ｃ）は、外部振動強度が強い状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図である。それぞれの図において、金属薄膜兼上側電極２１、２６および３２の片面上には、レセプター２２、２７および３３が、それぞれ固定されている。計測光１９、２４および３０は、それぞれ金属薄膜兼上側電極２１、２６および３２の表面で反射され、反射光暗部２０、２５および３１が生じる。それぞれの場合、表面プラズモン共鳴角は、θ11、θ12およびθ13である。図５（ａ）から（ｃ）において、２３、２８および３４は、下側電極、２９および３５は外部振動である。
【００３３】
すなわち、外部振動の強度がゼロの状態では、図５（ａ）に示すように、計測光１９を前記金属薄膜兼上側電極２１のレセプター２２が固定された面と逆の面に、照射すると、金属薄膜兼上側電極２１の表面で反射し、反射光暗部２０が発生する。この際、レセプター２２は金属薄膜兼上側電極２１に追従しておらず、表面プラズモン共鳴角は、θ11である。
【００３４】
外部振動の強度が弱い状態では、レセプター２７は金属薄膜兼上側電極２６側にわずかに追従し、図５（ｂ）に示すように、レセプター２７が金属薄膜兼上側電極２６の表面に密集する。そのため、金属薄膜兼上側電極２６におけるエバネッセント領域の分子密度が変化する。従って、計測光２４を前記金属薄膜兼上側電極２６のレセプター２７が固定された面と逆の面に照射すると、金属薄膜兼上側電極２６の表面で反射し、反射光暗部２５が発生する。この領域の分子密度が変わる事で、エバネッセント領域の誘電率も変化し、表面プラズモン共鳴が生じる角度が変化する。この際、表面プラズモン共鳴角は、θ12である。
【００３５】
外部振動の強度が強い状態では、レセプター３３は金属薄膜兼上側電極３２側に追従し、図５（ｃ）に示すように、レセプター３３が金属薄膜兼上側電極３２の表面に密集する。そのため、表面プラズモン共鳴が生じる反射光暗部３１の角度が変化し、表面プラズモン共鳴角は、θ13である。このように、従来の表面プラズモン計測装置では、表面プラズモン共鳴は１つの角度でのみ生じていたが、外部振動を印加する事により、１つではなく経時的に複数の角度でプラズモン共鳴が生じる。よって、表面プラズモン共鳴による暗線が幅を有するようになる。なお、交流電界にし、印加する電界の向きを反転させることでレセプター９が金属薄膜兼上側電極７近傍から離れる。そのため、プラズモン共鳴が生じる反射光暗部６の角度は電界を印加していない場合と同様の表面プラズモン共鳴曲線になる。
【００３６】
表面プラズモン共鳴角の周波数特性を得る一具体例として、外部振動の位相と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相とを比較して、リガンドの周波数特性の変極点を検出する例を以下に説明する。図６（ａ）から（ｄ）は、本発明において、外部振動と、レセプターおよびリガンドの結合との関係を説明する図である。図６（ａ）は、分周器で得られるスイープした外部振動の時間変化を示す図である。図６（ｂ）は、金属薄膜兼上側電極表面上でのリガンドとレセプターの結合量の時間変化を示す図である。図６（ｃ）は、印加した外部振動の位相とプラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を示す図であり、検出器の出力の時間変化を示す。図６（ｄ）は、図６（ｃ）で得られたアナログ信号をＡ／Ｄコンバーターによってデジタル変換した信号を示す図である。
【００３７】
図６（ｃ）に示すように、印加した外部振動の位相と、表面プラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を、時間の変化について測定する。その際、得られた曲線の変極点が、周波数特性の変極点である。例えば、結合率が１０％、１２％および１４％と増加するにつれ、この変極点における周波数は、ｆ1、ｆ2およびｆ3と低下している。従って、周波数特性の変極点の時間変化を計測することにより、リガンドとレセプターの結合の進行度合を計測することが可能になる。
【００３８】
本発明者らは、この結果は以下のメカニズムにより生じたものと推察している。外部振動１３を、金属薄膜兼上側電極７上に固定されたレセプター９に印加すると、外部振動にレセプター９は追従しようとする。低周波数領域ではレセプター９は外部振動１３の位相に遅れることなく追従でき、エバネッセント領域の誘電率が変化するため、表面プラズモン共鳴が生じる角度は幅を持つ。さらに外部振動の周波数を上げていくと、次第にレセプター９は外部振動１３の位相に遅れが生じながら追従し、遂にレセプター９は全く追従できなくなる。レセプター９が追従しなくなれば、金属薄膜兼上側電極７のエバネッセント領域の誘電率が一定になり、表面プラズモン共鳴が生じる角度は1つのみになる。つまり図１の装置においては、追従に遅れが生じた時点で、外部振動１３の位相と表面プラズモン共鳴により生じた反射光５の位相にずれが生じ、外部振動１３の位相及び前記プラズモン共鳴が生じた反射光５の位相の合成波の振幅は減少する。前記周波数特性の変極点とは、すなわち、前記追従に遅れが生じた時点である。リガンドとレセプターの結合量が増加すれば、外部振動にさらされる質量が増え、追従しなくなる周波数（変極点における周波数）は低下するのである（図６（ａ）および（ｂ）参照）。
【００３９】
また、出力された合成波の振幅のアナログ信号を、Ａ／Ｄコンバーター１８によってデジタル信号に変換し検出することで、周波数特性の変極点までの時間を、得ることが可能である。この変極点までの時間ｔ1、ｔ2およびｔ3から、従来プラズモン共鳴が生じる角度で検出していたレセプター９に結合したリガンドの量を、周波数特性を用いて検出できるようになる（図６（ｄ）参照）。
【００４０】
なお、電気的振動を用いた装置について説明したが、磁気的振動または機械的振動を用いた装置に対しても、類似の原理が適用できることは言うまでもない。
【００４１】
（第２の実施形態）
本実施形態では、本発明の装置の別の好ましい一形態について、説明する。図７において、５１は光源、５２は金属膜兼上側電極に固定されたレセプター、５３はリガンド、５４は受光装置、５６は金属薄膜兼電極、５８は反射板、５９は電極、６０は交流源、６１は交流源６０の周波数を分ける分周器、６２及び６６は特定周波数のみを通すアクティブフィルター、５５は外部振動、６４はコンデンサー、６５は増幅器、６７は外部振動の位相（θ0）と、反射光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ1）を比較する検出器、６８は検出器６７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター、７０は計測光、７１は反射光である。
【００４２】
図７に示す本発明の装置の一例では、金属薄膜兼上側電極７の代わりに金属薄膜兼電極５６が、下側電極８の代わりに電極５９が配置されている以外は、図１に示す本発明の装置の一例と同様である。さらに、計測光７０が、前記金属薄膜兼電極５６の表面上を反射板５８を利用して複数回反射し、その反射光７１が受光装置５４で受光できるように、光源５１と受光装置５４は配置されている。このように配置することにより、本発明の装置では、表面プラズモン共鳴が複数回生じる。その結果、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅し、高感度な測定が実現できる。また、レセプターやリガンドの分子量が低く、そのため表面プラズモン共鳴角の振れ幅が微小な場合であっても、この装置であれば、表面プラズモン共鳴角の振れ幅が増幅されるので、高感度な測定が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上のように、本発明の分析方法および装置は、外部振動に対する表面プラズモン共鳴角の周波数特性を測定するので、振動および光学設計に影響を受けず、かつ高精度の分析が可能となる。従って、本発明の分析方法および装置は、サンプル中のリガンドを分析するのに有用であり、例えば、生物学、医学、薬学、農学等の分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の装置の一例を示した模式図である。
【図２】本発明の装置の一例中、外部振動として電気的振動を印加することによる、物理学的物性の評価方法を説明する図である。図２（ａ）は、測定したリガンドのインピーダンスの周波数特性を示す図である。図２（ｂ）は、リガンドを等価回路の組み合わせとして置き換えた模式図である。
【図３】本発明の装置の一例中、金属薄膜上にレセプターを設置せずに測定した表面プラズモン共鳴曲線と、レセプターとして水を設置して測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。図３（ａ）は、レセプター無しの場合、図３（ｂ）は、レセプターとして水を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線である。
【図４Ａ】本発明の装置の一例中、リガンドを用いずに測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。図４Ａ（ａ）は、リガンド無しの場合の表面プラズモン共鳴曲線、図４Ａ（ｂ）は、図４Ａ（ａ）の一部拡大図である。
【図４Ｂ】本発明の装置の一例中、リガンドを用いて測定した表面プラズモン共鳴曲線の一例を示す。図４Ｂ（ａ）は、リガンドとして、アルブミンウシ血清を用いた場合の表面プラズモン共鳴曲線、図４Ｂ（ｂ）は、図４Ｂ（ａ）の一部拡大図である。
【図５】本発明の装置中、外部振動の強度に応じた金属薄膜近傍の状態の一例を示す模式図である。図５（ａ）は、外部振動強度がゼロの状態、図５（ｂ）は、外部振動強度が弱い状態、図５（ｃ）は、外部振動強度が強い状態での表面プラズモン共鳴の一例を示す模式図である。
【図６】本発明において、外部振動と、レセプターおよびリガンドとの関係を説明する図である。図６（ａ）は、印加した外部振動の時間変化を示す図である。図６（ｂ）は、リガンドとレセプターの結合量の時間変化を示す図である。図６（ｃ）は、印加した外部振動の位相とプラズモン共鳴が生じた反射光の位相の和を示す図である。図６（ｄ）は、図６（ｃ）で得られたアナログ信号をＡ／Ｄコンバーターによってデジタル変換した信号を示す図である。
【図７】本発明の装置の別の一例を示した模式図である。
【符号の説明】
【００４５】
１、５１  光源
２  プリズム
３、１９、２４、３０、７０  計測光
４、５４  受光装置
５、７１  反射光
６、２０、２５、３１  プラズモンの励起により光量の一部が減少した反射光暗部
７、２１、２６、３２  金属薄膜兼上側電極
８、２３、２８、３４  下側電極
５６  金属薄膜兼電極
５８  反射板
５９  電極
９、２２、２７、３３、５２  金属膜兼上側電極に固定されたレセプター
１０、６０  交流源
１１、６１  交流源の周波数を分ける分周器
１２、１６、６２、６６  特定周波数のみを通すアクティブフィルター
１３、２９、３５、５５  外部振動
１４、６４  コンデンサー
１５、６５  増幅器
１７、６７  外部振動の位相（θ0）と、反射した計測光に含まれる外部振動の信号成分の位相（θ1）を比較する検出器
１８、６８  検出器１７により得られたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター
３９、５３  リガンド
θ  入射角
θ11、θ12、θ13    表面プラズモン共鳴角
ｔ1、ｔ2、ｔ3      変極点までの時間
ｆ1、ｆ2、ｆ3      周波数
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3  リガンド内、リガンド間および電極の抵抗
Ｃ1、Ｃ2、Ｃ3  リガンド内、リガンド間および電極の容量
【図１】
2005208051.tif 000003
【図２】
2005208051.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005208051.tif 000007
【図５】
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【図６】
2005208051.tif 000009
【図７】
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