(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトの癌の半数以上において、ｐ５３蛋白質の遺伝子に変異が検出されていることから、正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質とを識別する方法を提供する。【解決手段】任意のリン酸化酵素蛋白質のアミノ酸配列とその核酸配列を用いて、正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質とを識別する。また、ｐ５３蛋白質が結合する任意の蛋白質として、例えば現在ワクチンとして使われているウイルス又は微生物関連のリン酸酵素蛋白質等を用いることができる。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意のリン酸化酵素蛋白質のアミノ酸配列とその核酸配列を用いて、正常型蛋白質と異常型蛋白質とを識別することを特徴とする蛋白質の識別方法。
【請求項２】
蛋白質が結合可能なＤＮＡ配列を普遍的なコドン表に基づいて作製した３種類の仮想アミノ酸配列を用いて、正常型蛋白質と異常型蛋白質とを識別することを特徴とする蛋白質の識別方法。
【請求項３】
前記蛋白質はｐ５３蛋白質であることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛋白質の識別方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の蛋白質の識別方法を用いたことを特徴とする癌の特定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質との識別に好適な蛋白質の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの正常型ｐ５３蛋白質は腫瘍抑制効果ばかりか、多くの細胞機能に関与していること、特に細胞に負荷を与える種々のストレスに反応して、細胞又は個体にもたらされる危機を回避する重要な要になっていることが明らかとなってきた。一方、ヒトの癌の半数以上において、ｐ５３蛋白質の遺伝子に変異が検出されている。このことから、より優れた癌治療のために正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質を区別する実用的診断方法の開発が望まれている。
【０００３】
【非特許文献１】N. Numao et al., Chem. Parm. Bull., 51, 550-559(2003); ibidem,1217-1219(2003); ibidem, 52, 377-379 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、本発明の目的は、正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質とを識別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討した結果、転写因子かつアポトーシスに関与する正常型ｐ５３蛋白質又は異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質のアミノ酸配列（又は核酸配列）及び種々のリン酸化酵素蛋白質のアミノ酸配列（又は核酸配列）に対して、非特許文献１に記載の数理的計算方法に基づいた計算を行うことにより、ｐ５３蛋白質の正常型又は異常（点突然変異）型の何れか一方と選択的結合しうる相手を推定できることを見出した。但し、非特許文献１には異常（点突然変異）型の蛋白質については全く記載されていない。
【０００６】
本発明者は、更に鋭意検討した結果、ｐ５３蛋白質が結合するＤＮＡ配列（転写領域）を仮想アミノ酸配列に置き換え、非特許文献１に記載の数理的計算方法に基づいた計算を行うことにより、ｐ５３蛋白質の正常型又は異常（点突然変異）型の何れか一方と選択的結合しうる相手を推定できることを見出した。
【０００７】
そして、本発明に係る第１の蛋白質の識別方法は、任意のリン酸化酵素蛋白質のアミノ酸配列とその核酸配列を用いて、正常型蛋白質と異常（点突然変異）型蛋白質とを識別することを特徴とする。
【０００８】
本発明に係る第２の蛋白質の識別方法は、蛋白質が結合可能なＤＮＡ配列を普遍的なコドン表に基づいて作製した３種類の仮想アミノ酸配列を用いて、正常型蛋白質と異常（点突然変異）型蛋白質とを識別することを特徴とする。
【０００９】
本発明に係る癌の特定方法は、上記のいずれかの蛋白質の識別方法を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、正常型蛋白質と異常（点突然変異）型蛋白質とを、特に正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質とを識別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明においては、ｐ５３蛋白質が結合する任意の蛋白質として、例えば、現在ワクチンとして使われている（若しくは過去において使用されたことのある）ウィルス又は微生物関連のリン酸化酵素蛋白質、及びｐ５３蛋白質が結合する既知のウィルス又は微生物関連の転写領域のＤＮＡ配列を用いることが好ましい。
【００１２】
以下に、本発明について実施例に基づいて具体的に説明するが、正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質とを区別するために、以下の実施例には記載されていないウィルス若しくは微生物関連のリン酸化酵素蛋白質、又はｐ５３蛋白質が結合するＤＮＡ配列等を用いて数理的計算方法を行ってもよいことは容易に推測できる。従って、以下の実施例に記載されていない蛋白質（又はＤＮＡ配列）を用いて本発明に係る方法で解析するかぎり、この方法は本発明の技術的範囲に属する。
【００１３】
更に、本発明に係る方法をｐ５３蛋白質以外の任意の正常型蛋白質と異常（点突然変異）型蛋白質との識別に応用することが可能であることも容易に推測できる。従って、このような方法も本発明の技術的範囲に属する。
【００１４】
更にまた、本発明に係る方法によって、ｐ５３以外の色々な転写因子の正常型蛋白質と異常（点突然変異）型蛋白質との識別や、未知の新規ＤＮＡ配列を探索できることも可能であることは容易に推測できる。更に、任意の転写領域と思われるＤＮＡ配列からそれに結合する転写因子の探索も容易に推測できる。従って、以下の実施例に記載されていないｐ５３以外の転写因子又ＤＮＡ配列に本発明に係る方法を適用することも本発明の技術的範囲に属する行為である。
【実施例１】
【００１５】
−ウィルス又は微生物由来の任意の蛋白質を用いて正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質を区別する方法−
２０種類のアミノ酸側鎖及び核酸残基の物理化学的パラメータとして電気陰性度（アミノ酸は１文字表記とする。L = 2.9396, I = 0.29396, N = 2.9846, G = 3.059, V = 2.9426, E = 2.9738, P = 2.9297, H = 2.9223, K = 2.9571, A = 2.962, Y = 2.8883, W = 2.8663, Q = 2.9695, M = 2.9161, S = 3.0126, C = 2.8998, T = 2.9815, F = 2.865, R = 2.9719, D = 2.9927；核酸残基は１文字表記とする。U = 2.9506, c = 2.9487, a = 2.929, g = 2.9481）を使い、非特許文献１に記載の数理的計算方法に従って計算した結果を図１−１及び図１−２の表に示す。ここで、具体的な操作法について、正常型ｐ５３蛋白質及び異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質を取り上げ、ヒト由来のリン酸化酵素ＣＨＫ２に対するそれら特異的結合の相違を説明する。
【００１６】
正常型ｐ５３蛋白質に対して、
操作（１）；３９３個のアミノ酸で構成された正常型ｐ５３蛋白質の各アミノ酸残基に対して、上記の電気陰性度数値を与えて電気陰性度の数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数２０４８で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（２）；正常型ｐ５３の３９３残基のアミノ酸配列をコードしている１１７９塩基のｍＲＮＡ配列の各核酸側鎖に対して、上記の電気陰性数値を与え数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数２０４８で離散的フーリエ解析を行う。作製された数値列についてポイント数２０４８で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（３）；上記（２）で記載したｍＲＮＡ配列に対応する相補的な（又はアンチ）ｍＲＮＡに対して上記の電気陰性数値を与え数値列を作製する。作製された数値列についてポイント数２０４８で離散的フーリエ解析を行う。そして、解析結果について、縦軸を相対強度、横軸を出現頻度数（又は周波数値；０〜０．５）とする図形を描く。
操作（４）；上記（３）で作製された相補的なアンチｍＲＮＡに対して普遍的コドンを用いて翻訳された仮想の（又は相補的な）３９３個のアミノ酸配列の各アミノ酸残基に対しても上記の電気陰性度数値を与えて電気陰性度の数値列を作製する。そして、作製された数値列について、ポイント数２０４８で離散的フーリエ解析を行う。
操作（５）；上記の操作１と操作２のスペクトルを数理的に掛け合わせたクロススペクトルを作製する。そして、出現したピークのうち高いピーク１５本を選択する。
操作（６）；上記の操作３と操作４のスペクトルを数理的に掛け合わせたクロススペクトルを作製する。そして、出現したピークのうち高いピーク１５本を選択する。
操作（７）；操作（６）で得られた１５本のピークの出現頻度定数値に対して０．５から出現頻度定数値を引いた数値を与える。
操作（８）；操作５で選択された１５本のピークから、操作６で得られた１５本のピークの出現頻度数値と一致乃至近似な値を持つピークを選択する（正常型ｐ５３蛋白質の対称性１を有するピークと称す）。
操作（９）；操作５で選択された１５本のピークから、操作７で得られた１５本のピークの出現頻度数値と一致乃至近似な値を持つピークを選択する（正常型ｐ５３蛋白質の対称性２を有するピークと称す）。
次に、異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質のアミノ酸配列（アミノ酸３９３残基）と核酸配列（核酸１１７９塩基）についても、上記の一連の操作（１）〜（９）を行い、操作（８）の段階で異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質に対する対称性１を有するピークを選択する。また、操作（９）の段階で異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質に対する対称性２を有するピークを選択する。
更に、正常型ｐ５３蛋白質と異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質を識別するために用いたＣＨＫ２蛋白質のアミノ酸配列（５４３残基）と核酸配列（１６２９塩基）についても、上記の一連の操作を行い、操作（８）と（９）に対応する対称性１のピークと対称性２のピークを選択する。
最後に、ＣＨＫ２蛋白質の正常型ｐ５３蛋白質に対する特異的結合能を検討するために、先ずｐ５３蛋白質の対称性１を有するピーク値とＣＨＫ２蛋白質の対称性１を有するピーク値とが一致するピーク値を数理的処理によって求める。次に、ｐ５３蛋白質の対称性２を有するピーク値とＣＨＫ２蛋白質の対称性２を有するピーク値のいずれか一方のピーク値に対して、０．５から出現頻度数値を引く操作を行い、互いに一致するピーク値を数理的処理によって求める。こうして、正常型ｐ５３蛋白質又はＣＨＫ２蛋白質の何れか一方の蛋白質において対称性１を有するピーク値と対称性２を有するピーク値の総和が約０．５になれば特異的結合とする。但し、少なくとも両蛋白質が同時に一本成立することは除外する。この場合は、ＣＨＫ２蛋白質と正常型ｐ５３蛋白質との間には特異的な結合を示唆するピークはなかった。
他方、ＣＨＫ２蛋白質（ｆ＝０．０３８６，０．４４５８）と異常型ｐ５３Ｌ３５Ｆ蛋白質（ｆ＝０．０３３２）を上記と同じ条件で検討すると、一つの特異的なピーク（ｆ＝０．０３８６，０．０３３２）が観察された。
【００１７】
上記ＣＨＫ２以外の、結核菌由来のリン酸化酵素「ＰＫＮＡ」〜「ＰＫＮＩ」、ヒト由来の蛋白質分解酵素の「ＵＳＰ７」、パピローマウィルス由来の癌蛋白質の「ＨＰＶ１６Ｅ６」、ヒト由来の転写アダプターの「ＴＤＡ３Ｌ」、ヒト由来のワクチニアウィルス関連のリン酸化酵素「ＶＲＫ１」〜「ＶＲＫ３」、ワクチニアウィルス由来のリン酸化酵素の「ＶＰＫ１」及び「ＶＰＫ２」並びにヒト由来の標識蛋白質の「ＣＨＫ２」についても同様の操作を行った。この結果を図１−１及び図１−２の表に示す。表中の（＋）は特異的結合を示し、（Ｈ）はヘテロダイマー結合を示す。表の縦軸には正常型ｐ５３蛋白質及び変異（点突然変異）型ｐ５３蛋白質を示す。
【００１８】
図１−１及び図１−２に示すように、この計算結果より、「Ｐ５３Ｇ２４５Ｃ」及び「Ｐ５３Ｒ３３７Ｈ」の特異的結合相手として、「ＰＫＮＢ」、「ＰＫＮＩ」及び「ＶＲＫ１」が明らかとなった。加えて、「Ｐ５３Ｌ３５Ｆ」及び「Ｐ５３Ｌ３４４Ｐ」は「ＣＨＫ２」と特異的に結合する。また、「Ｐ５３Ｐ１５１Ｓ」は「ＰＫＮＡ」、「ＰＫＮＩ」、「ＨＰＶ１６Ｅ６」、「ＶＲＫ２」、「ＶＰＫ２」及び「ＣＨＫ２」とヘテロダイマー結合することが示唆された。
【実施例２】
【００１９】
−ＭＤＭ２転写配列（ＤＮＡ配列）を用いて正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質を区別する方法−
２０種類のアミノ酸側鎖及び核酸残基の物理化学的パラメータとして電気陰性度を使い、非特許文献１に記載の数理的計算方法に従って計算した結果を図２の表に示す。表記の方法は図１−１及び図１−２と同様である。本実施例では、２つｐ５３応答領域（ｐ５３−ＲＥ１、ｐ５３−ＲＥ２）が含まれる２３０塩基（A. Zauberman et al., Nucleic Acids Res., 23, 2584-2592 (1995)）から普遍的なコドン表に基づいて３種類のアミノ酸配列（ＭＤＭ２  Ｐ１、ＭＤＭ２  Ｐ２、及び、ＭＤＭ２  Ｐ３）を作製し、計算を行った。具体的な操作法は実施例１で説明したＣＨＫ２に代わりにＭＤＭ２転写配列（ＤＮＡ配列）の２３０塩基を使って作製した３種類のアミノ酸配列を実施例１と同じ操作法で行えばよい。この結果を図２の表に示す。
【００２０】
図２に示すように、この計算結果より、「Ｐ５３Ｖ１４３Ａ」、「Ｐ５３Ｇ２４５Ｃ」及び「Ｐ５３Ｒ３３７Ｈ」が「ＭＤＭ２」の転写領域と特異的に結合することが明らかとなった。また、「Ｐ５３Ｐ１５１Ｓ」は「ＭＤＭ２」の転写領域とヘテロダイマー結合することが示唆された。
【実施例３】
【００２１】
−Ｂ型肝炎ウィルスのエンハンサー領域のＤＮＡ配列を用いて正常型ｐ５３蛋白質と異常（点突然変異）型ｐ５３蛋白質を区別する方法−
本実施例では、既知文献（A. Ori et al., EMBO J., 17, 544-553 (1998)）を参考にして、Ｐ５３蛋白質が結合する領域を含む２１０塩基から普遍的なコドン表に基づいて３種類のアミノ酸配列（ＨＢＶ  Ｐ１、ＨＢＶ  Ｐ２、及び、ＨＢＶ  Ｐ３）を作製し、実施例２と同様にして計算を行った。この結果を図３の表に示す。表記の方法は図１−１及び図１−２等と同様である。
【００２２】
本実施例では、「Ｐ５３Ｖ１４３Ａ」のみがＢ型肝炎ウィルスのエンハンサー領域と特異的に結合することが明らかとなった。また、「Ｐ５３Ｐ１５１Ｓ」はその領域とヘテロダイマー結合することが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】実施例１の結果を示す図である。
【図１−２】同じく、実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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