(57)【要約】  【課題】  ２型糖尿病モデル動物、このモデル動物を用いる糖尿病治療薬のスクリーニング方法などを提供すること。  【解決手段】  上記課題は、活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAが導入され、膵臓β細胞における活性型SREBP-2タンパク質の過剰発現により２型糖尿病の症状を呈する、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物、このトランスジェニック動物を用いて糖尿病の治療薬をスクリーニングする方法などによって達成される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAが導入され、膵臓β細胞における活性型SREBP-2タンパク質の過剰発現により２型糖尿病の症状を呈する、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記２型糖尿病の症状が、コレステロール代謝異常と膵臓β細胞におけるインスリン分泌障害を含む前記請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがヒト活性型SREBP-2ｃDNAである、前記請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記プロモーターがラットインスリンI遺伝子のプロモーターである、前記請求項１又は２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記組換えDNAに、さらに遺伝子マーカーが導入されている、前記請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記遺伝子マーカーが緑色蛍光タンパク質である、前記請求項５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
マウス、ラット又はウサギである前記請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
マウスである前記請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
前記請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック動物を用いる、２型糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記トランスジェニック動物に、試験化合物を投与した後に糖尿病の症状の変化を観察する工程を含む、前記請求項９に記載の２型糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ヒト活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAを構築し、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーを非ヒト動物の受精卵に導入し、得られた受精卵を偽妊娠非ヒト哺乳動物に移植し、その動物を飼育し、前記遺伝子マーカーの発現産物を指標として、生まれた仔から前記組換えDNAを有する仔を選択する、２型糖尿病の症状を呈するトランスジェニック動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物、このモデル動物を用いる糖尿病治療薬のスクリーニング方法、２型糖尿病モデル動物の作製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は現在生活慣習病の中核として現代の国民病と呼ばれ、その予防・治療方法の開発は急務である。糖尿病の発症機構は解明されていないが、血糖を低下させるホルモンであるインスリンの不足（インスリン分泌不全）とインスリン作用障害（インスリン抵抗性）という２つの病態が混在していると言われている。また、通常、糖尿病は、（１）インスリンをつくる膵臓のβ細胞まで破壊され、インスリンを補充し続けなければならない１型；（２）インスリンの分泌不足やインスリンの働きが悪くなっている２型；（３）特定の原因によるその他の糖尿病；（４）妊娠糖尿病等に分類されている。
【０００３】
１型糖尿病は、自己免疫疾患の一つであり、臨床的にインスリン依存型糖尿病と呼ばれることもある。１型糖尿病では、インスリンを分泌する膵臓のβ細胞が自己の免疫系から攻撃を受け破壊される。インスリンは、血液中の糖を細胞に吸収させ、血糖値を下げる働きをもっているホルモンで、その分泌が減ると、血液中の糖は増え、細胞中の糖は不足する。この状態が続くと、細胞は生命活動を維持できなくなるので、さまざまな臓器障害、失明や足の壊死がもたらされることになる。１型糖尿病のモデルマウスは公知であり、そのモデルマウスを用いて１型糖尿病の治療に関する研究も進んでいる（例えば、Science. 2003 Nov 14;302(5648):1223-7参照）。
【０００４】
２型糖尿病は、臨床的視点からインスリン非依存型糖尿病と呼ばれることもあり、膵臓のβ細胞におけるインスリン分泌不全と、インスリン抵抗性とによって発症する。インスリン分泌不全とインスリン抵抗性のどちらが強く関わっているかは個々の症例あるいは
各症例の経過によって異なるが混在していることも多い。インスリン分泌不全は、正常な場合は、食事をとりブドウ糖が吸収され血糖値が上がり始めると、それに対応して瞬時にインスリンが分泌されるが、インスリン分泌不全の状態では、この反応が欠如し、血糖の上昇に遅れてインスリンが分泌される。なお、インスリンが分泌されているのに、様々な原因でインスリンの作用が障害された状態をインスリン抵抗性があるという。１型糖尿病は免疫学的機序が明確で病態を反映したモデルマウスは前述のように既に報告されている。しかし、２型糖尿病モデルマウスに関しては、成因が複雑であるためヒトの病態を十分に説明するモデルは、未だに報告されていない。
【０００５】
一方、SREBP（Sterol Regulatory Element Binding Protein）ファミリーは、ステロール合成制御転写因子ファミリーで、コレステロール合成系酵素群、LDLレセプター遺伝子プロモーター領域に共通する特異配列SREに結合し転写発現を制御する。SREBPにはSREBP-1a, SREBP-1c及びSREBP-2の２つのサブファミリーがあることが知られている。今までの研究によって生体内では、SREBP-1cが脂肪酸、中性脂肪（トリグリセリド）の合成を、SREBP-2がコレステロールの合成を担っていることが知られている（J Clin Invest  1996;98:1575-  1584；J Clin Invest  1997;99:846-854; J Clin Invest  1998;101:2331-2339; 総説Cell. 1997;89:331-40(非特許文献１)）。しかしながら、SREBP-2と糖尿病、特に２型糖尿病との関係については未だ報告されていない。
【０００６】
また、特表２００３−５０１１０２号公報（特許文献１）には、SREBPタンパク質を発現させ又は異常な発現をさせるために遺伝学的に修飾されたハエ又は線虫である動物モデルが開示されている。しかし、この公報に記載された実験動物（ハエ又は線虫）モデルは、脂質代謝に関する研究用に用いられるものである。いずれにしろ、この公報にも、SREBPタンパク質と糖尿病との関係については何ら示唆されていない。
【特許文献１】特表２００３−５０１１０２号公報
【非特許文献１】総説Cell. 1997;89:331-40
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
国内の糖尿病患者数は６〜7００万人と推定され、その予備軍も同数いると言われている。糖尿病の発症機序は解明されておらず、有効な治療薬もないのが現状である。特に、わが国では２型糖尿病が９０〜９７％と圧倒的に多く、この２型糖尿病の治療方法あるいは治療薬の開発が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、ヒト活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAをマウスに導入することにより、インスリン分泌細胞である膵臓のβ細胞に特異的にSREBP-2を強制的に過剰発現させたマウスを作製した。この場合、想定される変化は膵臓β細胞内でのコレステロール代謝の変動（合成の活性化）のみであったところ、驚くべきことに、このマウスでは、コレステロール代謝異常に加えて顕著なインスリン分泌の低下をきたし血糖が上昇し、明確に２型糖尿病に類似する症状を呈することを見出した。このような病態は、細胞に脂肪酸過剰状態、中性脂肪（トリグリセリド）が蓄積してインスリン分泌が低下するという、従来の脂肪毒性学説による作用機序とは異なるものである。つまり、コレステロール代謝の変動ないしはSREBP-2そのものが２型糖尿病の病因として考えられるということであり、コレステロール代謝がらみでのインスリン分泌低下や糖尿病との関連について今までに報告がなかったことを考慮すると、この発見は極めて画期的なものと言える。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づいて完成されたもので、次に示す、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物、このモデル動物を用いる糖尿病治療薬のスクリーニング方法、２型糖尿病モデル動物の作製方法等を提供する。
【００１０】
（１）活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAが導入され、膵臓β細胞における活性型SREBP-2タンパク質の過剰発現により２型糖尿病の症状を呈する、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物。
（２）前記２型糖尿病の症状が、コレステロール代謝異常と膵臓β細胞におけるインスリン分泌障害を含む前記（１）に記載のトランスジェニック動物。
（３） 前記前記活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがヒト活性型SREBP-2ｃDNAである、前記（１）に記載のトランスジェニック動物。
（４） 前記プロモーターがラットインスリンI遺伝子のプロモーターである、前記（１）又は（２）に記載のトランスジェニック動物。
【００１１】
（５）前記組換えDNAに、さらに遺伝子マーカーが導入されている、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（６） 前記遺伝子マーカーが緑色蛍光タンパク質である、前記（５）に記載のトランスジェニック動物。
（７）マウス、ラット又はウサギである前記（１）〜（６）のいずれかに記載のトランスジェニック動物。
（８）マウスである前記（７）に記載のトランスジェニック動物。
【００１２】
（９） 前記（１）〜（８）のいずれかに記載のトランスジェニック動物を用いる、２型糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
（１０） 前記トランスジェニック動物に、試験化合物を投与した後に糖尿病の症状の変化を観察する工程を含む、前記（９）に記載の２型糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
（１１）ヒト活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAを構築し、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーを非ヒト動物の受精卵に導入し、得られた受精卵を偽妊娠非ヒト哺乳動物に移植し、その動物を飼育し、前記遺伝子マーカーの発現産物を指標として、生まれた仔から前記組換えDNAを有する仔を選択する、２型糖尿病の症状を呈するトランスジェニック動物の作製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のトランスジェニック動物は、新規の２型糖尿病モデル動物として、糖尿病の発症機構の研究ならびに糖尿病治療薬のスクリーニングのツールとして有用である。特に、他の既存の糖尿病モデル動物は  糖尿病の発症要件として高脂肪食負荷を必要とするものや著明な肥満をきたしているものが多いが、本発明の好ましい態様によるトランスジェニックマウスは、自然発症し、かつ肥満をきたしておらず、日本人に多い２型糖尿病の病態に類似している。したがって、本発明によるトランスジェニックマウスはそのような病態の２型糖尿病モデルマウスとして有用である。
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．２型糖尿病モデル動物としての非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、膵臓β細胞にコレステロール合成制御転写因子SREBP-2を過剰発現させることによりインスリン分泌能が低下する新規な2型糖尿病のモデル動物を提供するものである。このようなモデル動物は、２型糖尿病の発症機序解明および治療薬開発に有用である。
具体的には、本発明の第１の態様によれば、活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAが導入され、膵臓β細胞におけるSREBP-2の強制過剰発現により２型糖尿病の症状を呈する、２型糖尿病モデルとしての非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【００１６】
本明細書において、「SREBP-2タンパク質」は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（Sterol Regulatory Element Binding Protein）であるSREBPのサブファミリーの一つであり、コレステロール合成の制御に関与する公知の膜結合型タンパク質である。SREBP-2遺伝子及びSREBP-2タンパク質は、例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Dec 15;90(24):11603-7等の文献に記載されている。特に、ヒトSREBP-2タンパク質のアミノ酸配列は、NCBIにAccession No. AAA50746として登録されており、配列番号１で示される。ヒトSREBP-2cDNAの塩基配列はGenBankにAccession No. U02031として登録されており、配列番号２で示される。
【００１７】
SREBP-2の内因性発現に関しては、多少の強弱はあるもののほとんどの組織にあまねく発現している。ただし、転写因子としては、極めてユニークであるが、SREBP-2は膜結合型タンパク質として存在しており、そのままでは転写因子として活性を発揮できない。その細胞がコレステロールの要求が高まった時だけ、活性部分が切断され、核内に移行し、コレステロール合成系の遺伝子群の発現を高め、コレステロールを供給する。逆にコレステロールが十分の際は、切断されず、SREBP-2の転写活性は発揮されない。このシステムにより細胞内のコレステロール量は適切にコントロールされている。
【００１８】
上記のSERBP-2に起因するコレステロール調節機構は、細胞一般に働いているシステムであり、正常のβ細胞内でも同様の機構が働いていると推測される。本発明のトランスジェニック動物では、核内に移行する部分のみ、つまり活性型のSREBP-2を強制過剰発現しているので、上記フィードバックがかからず、強制的にコレステロールの合成が高まった状態になる。つまり、本発明のトランスジェニック動物は、β細胞特異的に持続活性化しており、その結果、２型糖尿病の症状を呈するのである。ここで、２型糖尿病の症状としては、コレステロール代謝異常（過剰合成）、膵臓β細胞におけるインスリン分泌障害の他、高血糖、尿糖陽性、肥満をきたさないなどの症状が挙げられる。これらの症状は、公知の手法に基づいて判断することができる。例えば、高血糖及びインスリンの分泌障害については、ブドウ糖負荷試験において高血糖およびインスリン低下等の傾向を調べることによって判断することができる。これらの症状を呈しているか否かについては、当業者の判断によって行なうことができる。例えば、コレステロールの過剰合成については、マウスの膵臓からランゲルハンス氏島（以下、「ラ氏島」ともいう）を単離し、脂質抽出し、コレステロール含量を測定した場合に、正常動物群と比較してモデル動物群のラ氏島中のコレステロール量が１０％以上、より明確には２０％以上、さらに明確には３０％以上増加している場合にコレステロールが過剰合成されていると判断することができる。また、インスリン分泌障害については、例えば、マウスの膵臓からラ氏島を単離し、高グルコースの培養液中におけるインスリン分泌量を測定した場合に、正常動物群と比較してモデル動物群の培養液中インスリン量が２０％以上、より明確には３０％以上減少している場合にインスリン分泌障害であると判断することができる。あるいは、生体におけるインスリン分泌能の低下については、糖負荷試験すなわちマウス個体にブドウ糖を負荷し、経時的に採血し、血中インスリン濃度を測定し、正常動物群と比較してモデル動物群のインスリン濃度が、統計的有意差をもって低下している場合に個体としてインスリン分泌障害であると判断することができる。また、高血糖については、上記糖負荷試験あるいは繰り返し採血を行い、正常動物群と比較してモデル動物群の血糖値が、統計的有意差をもって高値であるときに高血糖と判断することができる。糖尿病の診断は、ヒトの診断基準を単純に当てはめられないため、安定して高血糖を呈し、尿糖が陽性の場合に糖尿病といえる。インスリン分泌低下型の糖尿病の場合は、上記インスリン分泌能の低下も、糖尿病の診断を強く支持する。
【００１９】
ここで、本明細書でいう「活性型SREBP-2タンパク質」は、上記のようにして切断されたSREBP-2タンパク質の活性部分あるいはその変異タンパク質をいう。より詳しくは、「活性型SREBP-2タンパク質」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜４６０番目のアミノ酸残基を有するタンパク質（ヒト活性型）、またはその変異タンパク質であって、コレステロール合成関与遺伝子に対する転写因子としての活性を有するものをいう。本発明でいう活性型SREBP-2タンパク質は、いずれの種由来のものでもよいが、好ましくはヒト由来である。ここで、「変異タンパク質」は、コレステロール合成関与遺伝子に対する転写因子としての機能を有する限り特に限定されないが、例えば、上記ヒトタンパク質のアミノ酸配列に対して欠失、置換、挿入、及び／または付加が生じたアミノ酸配列からなる変異タンパク質である。アミノ酸の変異部位および個数は、変異タンパク質が転写活性を保持している限り特に制限はないが、変異個数は通常１〜３０アミノ酸残基、好ましくは１〜１０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜数個（例えば６個）である。
【００２０】
本発明においては、対象とする動物の種類は特に限定されないが、好ましい動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどが挙げられる。この中では、作製が容易であることからマウスが最も好ましい。
【００２１】
２．トランスジェニック動物の作製
本発明は上記トランスジェニック動物の作製方法も提供する。具体的には、本発明のトランスジェニック動物の作製方法は、（１）ヒト活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAがプロモーターの制御下に配置されている組換えDNAを構築し、（２）前記組換えDNA及び遺伝子マーカーを非ヒト動物の受精卵に導入し、（３）得られた受精卵を偽妊娠非ヒト哺乳動物に移植し、（４）その動物を飼育し、（５）前記遺伝子マーカーの発現産物を指標として、生まれた仔から前記組換えDNAを染色体中に有する仔を選択し、交配によりラインを確立後、組換えDNA由来のタンパクが目的の組織に安定して発現しているラインを選択する工程を含む。
【００２２】
トランスジェニック動物（例えば、マウス）の作製方法はよく知られており、例えば、（１）Methods in Enzymology Vol 225"Guide totechniques in mouse development" edited by Paul M. Wassarman, Melvin L.DePamphilis, Academic Press, INC.；（２）羊土社「ジーンターゲッテイングの最新技術」；（３）Gordon, J. W. (1993) Guide to Techniques in Mouse Development (Wassarman, P. M., and DePamphilis, M. L., Eds.), Academic Press, San Diegoなどに詳細に記載されている。また、本発明に用いられるPCR、プライマーの作製、ゲノムDNAの調製、クローニング、酵素処理等の方法は、当業者によく知られている通常の方法により行うことができる（"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(2001年)等参照）。
【００２３】
本発明において好ましく用いられる動物は上述したようにマウスであるから、以下、トランスジェニックマウスの作製を例に挙げて本発明の非ヒトトランスジェニック動物の作製方法について説明する。
【００２４】
本発明のトランスジェニックマウスの作製に際しては、まず、本発明で用いる活性型SREBP-2遺伝子がプロモーターの制御下に配置されるように組換えDNA（又はDNAコンストラクト）を構築する。本発明で用いる活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAは、DNA合成、ｃDNAクローニング、ゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、及び、これらの手段の組合せを含む多数の製法により製造され得る（例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(2001年)等参照)。
【００２５】
本発明で用いる活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAは、通常の遺伝子組換え技術により構築することができる。例えば、既知のアミノ酸配列及び塩基配列情報等をもとに設計し、合成したプライマーやプローブを用い、ＰＣＲ法やハイブリダイズ法によりｃDNAライブラリーをスクリーニングして得ることができる。このようにして得られる目的のDNAを適当なプロモーターの下流に連結したDNAコンストラクト又は発現ベクターを作成することにより、適当な宿主中でSREBP-2タンパク質を発現させることができる。なお、本発明で用いる活性型SREBP-2タンパク質をコードするDNAは、好ましくはヒト活性型SREBP-2ｃDNAである。
【００２６】
ここで用いられるベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス(ファージを含む)等が挙げられる。このベクターもまた、通常の遺伝子組換え技術を用いて、設計、構築することができる。このベクターにおいて、通常、プロモーター及びヒト活性型SREBP-2遺伝子が発現可能なように５'から３'方向に連結される。プロモーターとしては、SREBP-2遺伝子を膵臓β細胞特異的に発現可能であれば特に限定されないが、例えば、ラットインスリンＩ遺伝子のプロモータ−(Alpert S, Hanahan D, Teitelman G. Cell. 1988 Apr 22;53(2):295-308)、アミリンプロモーター等が例示される。本発明においては、ラットインスリンＩ遺伝子のプロモータ−が特に好ましい。なお、目的遺伝子が適格に発現するように、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、ポリＡ付加シグナルなどを発現ベクター中に組み込むことができる。
【００２７】
好ましくは、上記ベクターに、本発明で用いるDNAと共に、遺伝子マーカーを導入することが好ましい。そのような遺伝子マーカーとして、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ等）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等が挙げられる。上記DNAと共に遺伝子マーカーを発現ベクターに導入した場合は、仔マウスに発現している遺伝子マーカーの発現産物を指標とすることにより、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーの導入、発現の有無を効率良く確認することができる。
【００２８】
このようにして得られる組換えDNAを受精卵に導入する方法としては、マイクロインジェクション法、レトロウィルス・ベクターによる方法、又は、胚性幹細胞を用いる方法等が挙げられるが、マイクロインジェクション法が通常用いられる。なお、本発明に用いられる受精卵の培養、マイクロインジェクション、受精卵の移植等の方法は、当業者によく知られている通常の方法により行うことができる。
次いで、マイクロインジェクションによって上記組み換えDNAを導入した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植する。そして、そのマウスを飼育し、生まれた仔マウスから前記組換えDNAを有する仔マウスを選択することによって本発明のトランスジェニックマウスを得ることができる。生まれた仔マウスからの組換えDNAを有する仔マウスの選択は、例えば、マウス尾より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ヒトSREBP-2遺伝子の塩基配列や発現に要する随伴する塩基配列上その他の一部を有する特異的なプライマーを用いたPCRにて、前記組換えDNAの導入の有無を内因性マウスSREBP-2とは識別して確認する方法により行うことができる。また、遺伝子マーカーを発現ベクターに導入した場合は、遺伝子マーカーの発現産物を指標とすることにより、前記組換えDNA及び遺伝子マーカーの導入の有無を確認することができる。
【００２９】
本願発明のトランスジェニックマウスが２型糖尿病モデルマウスとして使用可能か否かについては、そのマウスにまず導入遺伝子の膵臓β細胞における発現を確認し、その直接の効果としてβ細胞におけるコレステロール代謝異常（過剰合成）を検討する。さらに最終的には膵臓β細胞におけるインスリン分泌障害の他、高血糖、多尿、尿糖陽性等の糖尿病としての表現型が現われているか否かによって判断する。
【００３０】
３．スクリーニング方法
本願発明者らが作製したトランスジェニックマウスは、後述の実施例において確認されているように、所見上も、検査上もさらに病理学的にも２型糖尿病のモデルマウスであると結論づけることができる。したがって、本発明のトランスジェニックマウスは２型糖尿病の動物モデルとして２型糖尿病の発症機序を解明し、その治療法及び治療薬を開発するためのスクリーニングツールとして有用である。
【００３１】
したがって、本発明の他の態様によれば、前記トランスジェニック動物に、試験化合物を投与した後に糖尿病の症状の変化を観察する工程を含む、２型糖尿病治療薬のスクリーニング方法が提供される。具体的には、本願発明のトランスジェニックマウスを被験マウス群、及び、非トランスジェニック同胞を対照マウス群にわけ、被験マウス群に試験する試験化合物を投与し、その後、被験マウス群、及び、対照マウス群のそれぞれから尿及び血液を採取し、尿中の糖含有量、血糖値等を測定し、これらの測定値を比較・検討することによって、試験化合物が２型糖尿病の治療薬として有効であるか否かを的確に判断することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例及び実験例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（１）インスリンプロモーター制御下SREBP-2遺伝子発現ベクターの作製  
分子生物学的手法一般に関しては、標準的手法に従って行った（Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York(2001年)等参照）。トランスジェニックマウス作製に必要なマイクロインジェクション用DNAの調整のため、インスリンプロモーター制御下SREBP-2遺伝子発現ベクターの作製を行った。図１にその構成を示す。
【００３４】
（プロモーター：）
導入遺伝子の生体内でβ細胞における特異的発現のため、過去のTgマウスにおいて発現実績のあるラットインスリンプロモーターI  (Alpert S, Hanahan D, Teitelman G. Cell. 1988 Apr 22;53(2):295-308)を発現プロモーターとして用いた。ラットゲノムDNAをテンプレートとして下記プライマーを用いて、-715 bpから+31 bp部分をPCRにより得た。
5'プライマー：5'-TCTCAACTCCTTGAAAATAGCTACCT-f-3'（配列番号３）
3'プライマー：-GGTCTATGATTGTAGCTGGTCACTTA-r-3'（配列番号４）
なお、DNAポリメラーゼとしては、platinum Pfx DNA polymerase (インビトロゲン社)を用いた。
【００３５】
（発現cDNA）
ヒトSREBP (Sterol Regulatory Element-Binding Protein) のcDNAは、ヒトSREBP-2cDNA発現ベクターpCMVhSREBP-2（ヒトSREBP-２の転写活性部分１〜４６０アミノ酸残基を含むcDNAの発現ベクター、Amemiya-Kudo M, Shimano H, Hasty AH, Yahagi N, Yoshikawa T, Matsuzaka T, Okazaki H, Tamura Y, Iizuka Y, Ohashi K, Osuga J, Harada K, Gotoda T, Sato R, Kimura S, Ishibashi S, Yamada N.  J Lipid Res. 2002 43(8):1220-35.）より用いた。
【００３６】
転写を終了させるポリAシグナルについては、上記発現ベクター中のヒト成長ホルモンのポリAシグナルを用いた。以上のDNAをプラスミドブルースクリプトII SK(+/-) (ストラタジーン社)内に図1の様に融合させ、発現ベクターを構築した。PCRより得たDNA部分に関しては、DNAシークエンシングにより塩基配列を確認した。発現ベクターの機能は、β細胞のセルラインにトランスフェクションしてSREBP-2の転写活性をルシフェレースリポーターアッセイならびに発現タンパクをウェスタンブロット法で確認した。
【００３７】
（２）マイクロインジェクション用DNAの調整
キアゲン社のプラスミド精製キットを用いて、上記のプラスミドDNAを大量精製し、制限酵素NotI, XhoIで切断し、図１に示す注入DNA部分をアガロース電気泳動にて分離後、QIAEX II Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて精製した。
【００３８】
（３）トランスジェニックマウス の作製
トランスジェニックマウスの作製は成書Methods in Enzymology Vol 225"Guide totechniques in mouse development" edited by Paul M. Wassarman, Melvin L.DePamphilis, Academic Press, INC.に準じて行った。概要はB6SJL / F2マウス間の自然交配によって得られた受精卵（ＢＤＦ2）の雄性前核に（１）で得られた発現遺伝子を、調整し、マイクロインジェクション（micro-injection）法（オハイオ大学発明の米国特許４８７３１９１に基づき施行）にて、約1000コピー共導入後、ICR偽妊娠マウス（0.5dpc）の卵管内に移植し作製した。受精卵移植後19.5dpcで妊娠マウスから帝王切開で生存仔を摘出または自然出産させ、45匹のF0マウスを得た。
【００３９】
得られた45匹から尾DNAを抽出し後述のPCR法にて５匹のF0マウスのゲノムDNAに注入遺伝子の導入を確認した。以後このPCRはジェノタイピングのスクリーニングにも用いた。
具体的には、尾DNAを鋳型に、導入遺伝子部分に特異的な下記プライマーセットを用いて以下の反応条件で行った。
【００４０】
プライマー：
（hBP-2側,sense）：5'AGCTTCTAAAGGGCATCGACCTA3'（配列番号５）
(hGH側,antisense)：5'TAGAGGACACCTAGTCAGACAAAATGAT3'（配列番号６）
【００４１】
ＰＣＲ条件：
94℃  ×  4min.   ×   1cycle
94℃  ×  1min.   ×  35cycle
60℃  ×  1min.   ×  35cycle
72℃  ×  1min.   ×  35cycle
72℃  ×  4min.   ×   1cycle
【００４２】
（４）発現ラインの特定
上記の結果、染色体DNAへの導入が認められた５匹のファウンダーマウスにC57BL6/Jマウス（クレア社より購入）を交配し、子孫に上記同様の尾DNAのPCRにて、遺伝子の導入を確認して、ラインを確立した。
各ラインの子孫マウスの膵臓よりラ氏島を分離して、総RNAをTRIzol (インビトロゲン社)を用いて抽出し、さらにリアルタイム PCR法により、ヒトSREBP-2の発現を検討した。発現の最も多いラインAを確定し、C57BL6/Jマウスとの交配を繰り返し、繁殖ならびに遺伝子背景をC57BL6/Jストレインのそれに近付けるように戻し交配を繰り返した。
この交配の期間中、ジェノタイピングより得たトランスジェニックマウスと非トランスジェニック同胞マウスを対照に初期解析を行った。トランスジェニックマウスラインAは安定して、メンデルの法則に従って同胞中５０％に近い陽性率を示し、導入遺伝子の染色体組み込みが安定して伝搬していることが確認された。またラ氏島（単離方法後述）由来RNAから定量性リアルタイムPCR法用いて、ヒトSREBP-2mRNAの発現を測定すると（方法後述ならびに図５参照）個体間のばらつきなく安定して確認され、β細胞特異的ヒトSREBP-2過剰発現トランスジェニックマウスラインが確立したと考えられた。
【００４３】
なお、定量性リアルタイムPCR法は次のようにして行なった。各サンプルをTrizolを用いてRNAを抽出、これよりcDNA の合成は、サーモスクリプト（インビトロゲン社）を使用し、TaqMan (Applied Biosystems、ABI社)による定量性 PCR (50°C 2分, 95°C 10 分の後 、95°C 15 秒, 60°C 1 分を４０サイクル) を ABI Prism 7000 PCR instrument (Applied Biosystems)を用いて施行した。 用いたプライマーならびにプローブは、次の通りである。
【００４４】
ヒトSREBP-2:
5'-CCAACTCTGCAAGTCAAGGTTTCT-f-3' （配列番号７）
5'-GCGTGATCATTACCGTCTGTTGT-r-3'  （配列番号８）
マウスHMGCoA合成酵素：
5'-AGGAAACTTCGCTCACACCT-f-3'     （配列番号９）
5'-GCCATGTATCTGTTTTGGCC-r-3'     （配列番号１０）
プローブ：
CAGCAGCCCAGCAGAGGTTTTCTACAATC      （配列番号１１）
サイクロフィリン：
5'- TGGCTCACAGTTCTTCATAACCA-f-3' （配列番号１２）
5'- ATGACATCCTTCAGTGGCTTGTC-r-3' （配列番号１３）
プローブ：
5'-TCCATGCCCTCTAGAACTTTGCCGAA-3' （配列番号１４）
【００４５】
（５）作製マウスの表現型：糖尿病の確認
上記のようにして得たトランスジェニックマウスラインAは普通食にて飼育中、尿糖陽性、多尿を認め、糖尿病の発症が示唆された。図２に示すように空腹時血糖を測定すると（グルコース測定キット、和光純薬）、トランスジェニックマウス群では174 mg/dlと非トランスジェニック同胞対照群の99 mg/dlに比して有意に高値を示し、インスリン値（ELISAキット、シバヤギ）は測定感度以下であった。通常の摂食下では、300〜500 mg/dlと明らかに糖尿病の血糖値を示した。
【００４６】
トランスジェニックマウス群において、糖負荷試験（1g／kg体重（２０％溶液）のブドウ糖を尾静脈より注射、経時的（前, 5, 15, 30分）に眼窩静脈より採血、血糖ならびに血中インスリン値を測定）を施行すると、インスリン分泌障害型の糖尿病パターンを示した（図３）。すなわち、各時間ポイントで対照に比し、有意の高値を示し、糖負荷に対する高血糖が遷延した。  また対照群で認められた血糖上昇に応じた血中インスリン値の上昇も、トランスジェニックマウス群ではほとんど認められず、インスリン分泌障害が著明であった。
【００４７】
さらにインスリン分泌障害を直接に確認する目的で、膵臓ラ氏島を分離すると、ラ氏島の個数、個々のサイズに約５０％程度の減少を認めており、さらにその形態に異常を認め、ラ氏島の障害が認められた。分離した後、サイズをそろえた上で個々のラ氏島に関して培養時におけるインスリン分泌能を検討したところ、図４に示すように培養液中のブドウ糖に対するインスリン分泌も５０％低下しており、個々のラ氏島に関してもインスリン分泌能の低下を認めた。
なお、ラ氏島の単離は、次のようにして行なった。マウスを頚椎脱臼にて屠殺し、胆管結紮後、コラゲナーゼ溶液 (4mg/ml、10mM HEPES (pH 7.4) 0.5% BSA (KRBH )  2.5 mlを膵管に注入し膨潤した膵臓をさらに 37°C で3.5分培養し、KRBHで洗浄後、単離したラ氏島を実体顕微鏡下で、採取した。
【００４８】
以上より、確立したラットインスリンプロモーターヒトSREBP-2トランスジェニックマウスでは、インスリン分泌障害による糖尿病を呈することが確認された。ライン別の発現量の検討の際、図５に示すようにヒトSREBP-2発現量がラインAよりも少ないが発現の認められたラインBに関しても同様の検討を一部行い、発現量がより少ないことに合致して、糖尿病に関する各検討事項が軽度に存在することが確認された。すなわち導入遺伝子SREBP2の発現量に応じた表現系を呈していることがわかり、ラインAの表現系が遺伝子導入による非特異的効果でなく、発現したSREBP-2の量依存性の効果であることが確認された。
【００４９】
（６）作製マウス糖尿病の病態
上記のようにして作製されたトランスジェニックマウスにおいては、１型糖尿病に認められるようなβ細胞廃絶によるインスリンの枯渇ではなく、基礎分泌よりもむしろブドウ糖刺激に対する応答分泌が障害されている点において、2型糖尿病の病態を呈している。またこのマウスは、体重や、外見、解剖上の脂肪組織重量は正常と同等で、肥満を認めない。すなわち同じ2型糖尿病でも肥満糖尿病モデルやインスリン抵抗性モデルマウスとは明かに病態が異なり、日本人に比較的多く認められる非肥満性インスリン分泌障害型の2型糖尿病モデルマウスとなる。図５に示すように導入遺伝子の発現量に応じてコレステロール合成系の鍵酵素であるHMGCoA合成酵素の発現も誘導されており、本マウスのβ細胞ではコレステロール合成が活性化されていると考えられ、糖尿病発症との関連が推測された。
上記のようにして作製されたトランスジェニックマウスは、インスリン分泌障害の新しい機序により糖尿病を発症しており、糖尿病発症の新しい概念を包含している。従来よりインスリン分泌障害の病因として、β細胞に中性脂肪が蓄積することが注目されてきた。本マウスでは、コレステロールが蓄積することが予想され、コレステロール代謝とインスリン分泌障害という全く新しい病体機序の可能性を示唆している点でも新規性の高い糖尿病モデルといえる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、２型糖尿病の発症機構の研究ならびに２型糖尿病の治療薬のスクリーニング用ツールとして有用である。本発明の好ましい態様によるトランスジェニックマウスは、繁殖の際、子孫の半数が病態マウス、半数が正常対象群として利用できるため、研究に好都合である。また他に知られている2型糖尿病に近い病態を示すモデル動物は肥満が著明であったり、インスリン抵抗性が前面にでており糖尿病を発症させるのに長期に高脂肪食などの特別負荷食を投与しなければならない点で不便であった。本マウスは、肥満を呈しておらず、また普通食において、若年時よりインスリン分泌を低下した糖尿病を発症する利便性にすぐれたモデルである。またさらに上記負荷食を与えることにより、より重篤な糖尿病を惹起することもできる利点もある。
以上より、本発明の他の態様によるスクリーニング方法は、日本人に多いとされる２型糖尿病の治療薬をスクリーニングする際に有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、SREBP-2遺伝子発現ベクターの構成を示す。
【図２】図２は、SREBP-2トランスジェニックマウスの空腹時血糖値と空腹時インスリン値を示すグラフである。
【図３】図３は、経静脈糖負荷試験における血糖値の変化及び血中インスリン値の変化を示すグラフである。
【図４】図４は単離ラ氏島グルコース刺激時のインスリン分泌能を示す。
【図５】図５は、導入遺伝子ヒトSREBP-2とHMGCoA合成酵素の発現量の比較を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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