(57)【要約】【課題】  本発明は、植物のペルオキシソームの機能に着目して、植物の発芽のみが抑制され、発芽後は正常に生育することができる植物の発芽抑制方法、及び発芽のみが抑制された新規な植物を提供する。【解決手段】  本発明は、タンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させた植物、その作出方法に関する。また、本発明は、植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させて、ショ糖の存在しない培地での植物の発芽を抑制する方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させた植物。
【請求項２】
遺伝子の欠損が、遺伝子の発現の阻害である請求項１に記載の植物。
【請求項３】
遺伝子の欠損が、ＲＮＡｉ法によるものである請求項２に記載の植物。
【請求項４】
植物が、高等植物である請求項１〜３のいずれかに記載の植物。
【請求項５】
植物が、植物の種子である請求項１〜４のいずれかに記載の植物。
【請求項６】
植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させて、発芽時の生育にショ糖を必要とするが、生育に必要な他の機能は備えている植物を作出する方法。
【請求項７】
タンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させる方法が、ＲＮＡｉ法によるものである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＰＮＡｉ法が、ヘアピンループ型の２本鎖ＲＮＡを産生するＤＮＡの導入によるものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させて、ショ糖の存在しない培地での植物の発芽を抑制する方法。
【請求項１０】
遺伝子の欠損が、遺伝子の発現の阻害である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子、即ちＰＥＸ７遺伝子を欠損させることによる植物の発芽を抑制する方法に関する。また、本発明は、ＰＥＸ７遺伝子の発現が抑制された形質転換植物に関し、本発明の形質転換植物は、脂肪酸分解能を失っているために発芽時にショ糖を要求するが、その余の機能に異常はなく、発芽後は正常に生長することができる。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞では、さまざまな代謝機能が生体膜によって区画化されたオルガネラ（細胞内小器官）に存在する。個体が成長するうえで、各種のオルガネラが固有の機能を果たしつつ、協調的に働くことが必要不可欠である。これらのオルガネラは決して静的な状態のまま細胞内に存在しているのではなく、細胞の成長・分化に伴い生成、変換、消失するなどきわめて動的な状態にある。そして、多種多様に分化した真核細胞からなる高等動植物では、個々に分化した細胞内に存在するオルガネラが動的に変化し、それぞれ特殊化した機能をもちあわせている。逆にみれば、これはオルガネラの機能分化こそが真核細胞の多様化を可能にしているといえる。この事実は、動植物が示すさまざまな生理現象を解明していくうえで、オルガネラレベルでの解析が重要であることを示している。
【０００３】
ペルオキシソームは、真核細胞に普遍的に存在する直径０．５〜１．０μｍほどのオルガネラである。１９５０年代にマウスの肝臓組織で発見されて以来、機能をもたないオルガネラと考えられてきた。しかしながら、高等植物のペルオキシソームが脂質代謝に関与するという証明がなされ、さらにその後の研究によってこの機能が生物界全般のペルオキシソームに普遍化されることにより、一躍注目されるオルガネラとなりつつある。
高等植物細胞のペルオキシソームは、それぞれの機能により少なくとも次に示す（１）〜（３）の３種類に細分される（非特許文献１参照）。
（１）黄化子葉などに観察されるグリオキシソーム。
（２）光合成器官に存在する緑葉ペルオキシソーム。
（３）根などの器官にみられる特殊化していないペルオキシソーム。
これらの分化したペルオキシソームは高等植物のさまざまな器官において、それぞれの代謝系に必要な特異的な酵素群を内包している。
グリオキシソームは主に脂肪性種子の発芽段階における胚乳や子葉のような貯蔵器官細胞に存在している（非特許文献２参照）。このグリオキシソームは脂肪酸β酸化とグリオキシル酸回路の酵素群を有しており、貯蔵脂肪からショ糖への変換過程において中心的な役割を担っている。対照的に、緑葉ペルオキシソームは光合成器官の細胞に広く分布している。この緑葉ペルオキシソームにはいくつかのグリコール酸経路の諸酵素が含まれており、緑葉ペルオキシソーム、葉緑体、ミトコンドリア間における酵素反応によって光呼吸系を成立させている（非特許文献３参照）。一方、特殊化していないペルオキシソームに関する報告はあまり多くはなく、今のところ際だった生理的機能は不明である。
【０００４】
興味深いことに、グリオキシソーム、緑葉ペルオキシソーム、特殊化していないペルオキシソームは、個体の成長などの環境変化に応じてその機能を他のペルオキシソームに転換させることが知られている（非特許文献２参照）。この現象は植物ペルオキシソーム固有のものであり、酵母や哺乳類などのペルオキシソームではみられない。黄化子葉のグリオキシソームは、光照射により子葉が緑化していく過程で、直接緑葉ペルオキシソームへと変化する。この過程においてイソクエン酸リアーゼやリンゴ酸合成酵素のような脂質代謝酵素は特異的に分解される。そして、グリコール酸酸化酵素やヒドロキシピルビン酸還元酵素などの光呼吸酵素が新規に合成され、それらがペルオキシソームに輸送されることにより、グリオキシソームから緑葉ペルオキシソームへの機能転換が完了する。さらに、興味深いことに、この植物ペルオキシソームの機能転換は可逆的であり、老化段階にある子葉細胞では緑葉ペルオキシソームからグリオキシソームへの逆の機能転換が観察されている。このような植物ペルオキシソームの可逆的な分化は、これを支えるペルオキシソームへのタンパク質輸送系がたいへん柔軟に機能していることを想像させる。
【０００５】
このように植物のペルオキシソームは、その成長過程において可逆的に機能転換することが知られているオルガネラであるが、このような機能転換に関与している物質やペルオキシソームの機能に関与しているタンパク質については十分解明されていない。
ペルオキシソームの機能の転換の過程や、それぞれの機能を発現している場合の当該機能に関与しているタンパク質類を解明するために、ペルオキシソームの機能の欠損した変異体が製造されてきた。
【０００６】
例えば、本発明者らは植物細胞におけるペルオキシソーム機能制御に関連した遺伝子を同定するため、脂肪性種子植物のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いてペルオキシソーム機能を欠損した突然変異体の製造を行っている。例えば、グリオキシソームの形態が大きく変化した変異体を製造してきた（特許文献１参照）。
また、このような突然変異体としてグリオキシソームの脂肪酸β酸化系を欠損したシロイヌナズナ突然変異体（ｐｅｄ１〜３）を開発してきた（非特許文献４参照）。この変異体ｐｅｄは、２，４−ジクロロフエノキシ酪酸（2,4-dichlorophenoxy-butyric acid；２，４−ＤＢ）に対して耐性を示す。野生型では、２，４−ＤＢの酪酸鎖は脂肪酸β酸化系に基質として認識され、切断され、その結果として、除草剤である２，４−ジクロロフエノキシ酢酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid；２，４−Ｄ）に代謝され、死滅する。しかしながら、この変異体では脂肪酸β酸化系が欠損しているためこの変換が行われず、結果として変異個体は生き残る。
本発明者らは、この選抜方法により、独立した３つの突然変異体ｐｅｄ１〜３の単離に成功した。これらの変異体を、それぞれｐｅｄ１〜３（peroxisome defective;ped）と命名した。ｐｅｄ１は、脂肪酸β酸化酵素の１種であるチオラーゼ（thiolase）を欠損するものであったが、ｐｅｄ２は脂肪酸β酸化系の欠損だけでなく、光呼吸活性の低下も招いていた（非特許文献５参照）。このために、発芽時にショ糖を要求するだけでなく、発芽後も酸素の存在する大気中では成長が抑制される結果となっていた。
【０００７】
さらに、本発明者らは、ペルオキシソームの形態の変異を解明するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がペルオキシソームに蓄積されるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の変異体を開発してきた。即ち、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＣ末端側にペルオキシソームへの移行シグナル配列（ＰＴＳ１）を有する、ＤＬＫＡＬＥＬＰＶＳＫＬからなるアミノ酸配列を付加したタンパク質が発現するように遺伝子を改変した変異体を製造してきた（非特許文献６及び７参照）。
この変異体は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するが、当該タンパク質にはＣ末端にペルオキシソーム移行シグナル配列が付加されているために、発現したＧＦＰはペルオキシソームに蓄積され、その結果ペルオキシソームの形態を緑色の蛍光により確認することができるものである。同時に、付加したペルオキシソーム移行シグナル配列がペルオキシソームへのタンパク質の移行をおこなうものであることが確認された。
【０００８】
一方、生物のペルオキシソームにおけるタンパク質輸送因子として、これまでにＰｅｘ１ｐ〜Ｐｅｘ２５ｐが報告されてきており、シロイヌナズナにおいてはＰｅｘ１ｐ〜Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ〜Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、及びＰｅｘ１９ｐの１５種類が同定されてきている。ヒトにおいては、これらのタンパク質をコードする遺伝子（ＰＥＸｓ）の欠損は、先天性の異常を引き起こすことが知られている。一方、シロイヌナズナでは、ＰＥＸ２、ＰＥＸ１０、又はＰＥＸ１６の欠損は致命的であるが、ＰＥＸ５及びＰＥＸ１４ポイントミューテーションによっては致命的なことにはならないことが知られている。そして、このうち、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、及びＰｅｘ１４ｐについてはそれらの相互の結合関係が明らかにされてきた（非特許文献８参照）が、これらのタンパク質輸送因子の詳細な機能については未だ解明されていない。
このように、植物のペルオキシソームは、非常に複雑な機能転換の過程や、脂質の分解やタンパク質の蓄積や光合成にも関与などの種々の重要な機能を果たしているオルガネラであり、ペルオキシソームの機能を解明することは脂質の分解などの単一の機能の応用だけでなく、植物の生育の制御のためにも必要なことであり、ペルオキシソームの機能の解析のための各種の変異体の製造が求められている。
【０００９】
ところで、近年になって、特定の遺伝子の発現を抑制する手法のひとつとしてＲＮＡｉ（RNA interference）法が開発されてきた。ＲＮＡｉは、もともと２本鎖ＲＮＡの導入により、それと相同なＲＮＡの発現が強力に抑制されるという生命現象として１９９８年に発見されたものであり、この現象を利用して２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）の導入により標的とする特定の遺伝子の発現を抑制する方法である。
【００１０】
【特許文献１】特願２００３−６９２７１号
【非特許文献１】ベアバーズ  エイチら、アヌアル  レビュー  プラント  フィジオロジー、３０巻、１５９−１９３頁  （１９７９年）（Beavers, H.: Annu. Rev. Plant Physiol. 30, 159-193 (1979)）
【非特許文献２】ニシムラ  エムら、セル  ストラクチャー  ファンクション、２１巻、３８７−３９３頁  （１９９６年）（ Nishimura, M. et al.: Cell Struct. Funct. 21, 387-393 (1996)）
【非特許文献３】トルバート  エヌ  イー、エヌワイ  アカデミック  サイエンス、３８６巻、２５４−２６８頁  （１９８２年）（Tolbert, N.E.: Ann. NY Acad. Sci. 386, 254-268 (1982)）
【非特許文献４】ハヤシ  エムら、プラントセル、１０巻、１８３−１９５頁  （１９９８年）（ Hayashi M., et al.: Plant Cell 10, 183-195 (1998)）
【非特許文献５】ハヤシ  エムら、エムボ  ジャーナル、１９巻、５７０１−５７１０頁  （２００２年）（Hayashi, M., et al., (2000) EMBO J., 19, 5701-5710）
【非特許文献６】マノ、エス、及びハヤシ、エムら、１９９９年、プラント  ジェー、１７巻、３０９−３２０頁（Mano,S., Hayashi,M., et al., (1999) Plant J., 17, 309-320）
【非特許文献７】マノ、エス、及びナカモリ、シーら、２００２年、プラント  セル  フィジオロ、４３巻、３３１−３４１頁（Mano,S., Nakamori,C., et al., (2002) Plant Cell Physiol., 43, 331-341）
【非特許文献８】ニト  ケーら、プラントセルフィジオロジー、４３巻、３５５−３６６頁  （２００２年）（Nito, K., et al., (2002) Plant Cell Physiol, 43, 355-366）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、植物細胞におけるペルオキシソームの機能転換に関与している物質やペルオキシソームの機能に関与しているタンパク質を解明することを目的として、ペルオキシソームの機能に関連する新規な変異体を提供するものである。
また、本発明は、植物のペルオキシソームの機能に着目して、植物の発芽のみが抑制され、発芽後は正常に生育することができる植物の発芽抑制方法、及び発芽のみが抑制された新規な植物を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ペルオキシソームの機能転換に関与している物質やペルオキシソームの機能に関与しているタンパク質を解明するために、ペルオキシソームにおけるタンパク質輸送因子である各種のＰｅｘの機能を検討してきた。その中でＰｅｘ５ｐ及びＰｅｘ７ｐに着目して、それらの機能を解明するためにこれらのタンパク質をコードしている遺伝子であるＰＥＸ５及びＰＥＸ７の欠損株を製造した。また、Ｐｅｘ５ｐのＣ末端の７１アミノ酸を欠損させた、Ｐｅｘ５ｐの１番目のメチオニン（Met）から６５７番目のチロシン（Tyr）までのアミノ酸配列（１Ｍ−６５７Ｙ）を過剰発現させるためのＰＥＸ５Δ７を構築することにより、これらのタンパク質の機能を種々の観点から検討してきた。その結果、驚くべきことに、Ｐｅｘ７ｐは植物の光呼吸の機能に影響を与えることなく、植物の発芽時の生育における脂肪酸の代謝のみに影響を与える因子であることを見出した。したがって、Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子であるＰＥＸ７のみを欠損させることにより、通常の培地では発芽することができないが、ショ糖を含有する培地では発芽することができ、その後は正常に生育することができる植物、形質転換植物を創製することに成功した。
【００１３】
即ち、本発明は、タンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させた植物に関する。
また、本発明は、植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させて、ショ糖の存在しない培地での植物の発芽を抑制する方法に関する。
さらに、本発明は、植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させて、発芽時の生育にショ糖を必要とするが、生育に必要な他の機能は備えている植物を作出する方法に関する。
【００１４】
本発明は、植物のペルオキシソームにおけるタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐの機能を欠損させることを特徴とする形質転換植物を提供するものである。本発明におけるＰｅｘ７ｐの機能を欠損させる手法としては、当該タンパク質をコードする遺伝子を欠損させる方法が挙げられる。
本発明における遺伝子を欠損させる手法としては、当該遺伝子の発現を阻害できる方法であれば特に制限はなく、ジーンターゲッティング法などにより、ゲノム中の当該遺伝子の転写又は正常な発現を阻害することによってもよいし、また、アンチセンスやＲＮＡｉ法によりその発現を阻害するだけでもよい。
ＲＮＡｉ法としては、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入してもよいが、ヘアピンループ型の２本鎖ＲＮＡが細胞内で生成されるように、当該ＲＮＡへの転写が可能なＤＮＡを細胞内又はゲノム中へ導入してもよい。
当該ヘアピンループ型のＲＮＡとしては、標的となるＰＥＸ７のＲＮＡの塩基配列の全部または一部の塩基配列部分が２本鎖になるように設計され、それぞれの末端がスペーサー配列、例えばバー遺伝子などの塩基配列で結合されているものが挙げられる。このような塩基配列を有するＤＮＡを、てきとうなプロモーターに結合してゲノム中に挿入することにより、当該遺伝子がＲＮＡに転写され、当該スペーサー部分の両端には互いに相補的な配列が結合されていることから、転写後には、スペーサー配列部分で折れ曲がり、２本鎖のＲＮＡ部分を有するヘアピンループ型のＲＮＡが生成されることになる。
当該ヘアピンループ型のＲＮＡにおける２本鎖部分の塩基配列は、ＰＥＸ７の発現を抑制することができる十分な長さを有しているならば、ＰＥＸ７の全長である必要はなく、部分長でよい。スペーサー配列も特に制限はなく、ヘアピンループにおけるループを形成するに十分な長さがあればよい。
当該ＲＮＡを転写させるプロモーターとしては、常に転写活性を有するものであってもよいし、特定の条件下のみで転写活性を有するものであってもよい。
【００１５】
本発明における植物としては、ペルオキシソームを含有する植物であって、Ｐｅｘ７ｐが機能しているものであれば特に制限はないが、穀物植物などの食糧用植物、花などの観賞用植物などの高等植物が実用性の観点から好ましい。
本発明の形質転換植物は、Ｐｅｘ７ｐの機能の欠損により発芽時にショ糖を必要することを特徴とするものであり、ショ糖を含有する培地で発芽させた後は、生育に必要な他の機能は備えていることから通常の培地で正常に生育させることができる。したがって、穂の形質転換植物は、苗として製造することができるが、当該植物から得られる種子は、ショ糖を含有する培地でないと発芽することはできず、当該種子は通常の培地、例えば耕作地では発芽させることができないので、種子を採取しても次世代の生育ができないという特異的な性質を有するものである。
したがって、本発明の植物の消費者は常に苗の供給を受けなければ、仮に当該植物の種子を採取したとしても本発明の植物を発芽・生育させることはできないことになる。
【００１６】
また、本発明は、植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐの有する新たな機能を見出したものである。植物のタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐは、輸送シグナル配列としてＰＴＳ２を含有するタンパク質のみを介在していることを見出した。したがって、Ｐｅｘ７ｐの欠損はＰＴＳ２−依存性タンパク質のみの機能を低下させることになる。そして、これらのＰＴＳ２−依存性タンパク質は、脂肪酸β酸化に関与する酵素が包含されているが、光呼吸に関与する酵素は深く関与しておらず、その結果として、Ｐｅｘ７ｐをコードする遺伝子を欠損させることにより、ショ糖の存在しない培地での植物の発芽を抑制することができる方法を見出したものである。
【００１７】
以下に、本発明による知見を確認するための詳細な説明を行うが、本発明はこれらの具体的な事項に限定されるものではなく、本発明の技術的な内容を具体的に説明するための事項に過ぎない。
ＰＥＸ５及びＰＥＸ７の遺伝子転写産物の発現を阻害するために、２本鎖のＲＮＡｉ（ＲＮＡ interference）（ｄｓＲＮＡｉ）を用いた。シロイヌナズナにｄｓＲＮＡｉを導入するために、ｐｅｘ５ｉ及びｐｅｘ７ｉと命名した２種類の人工遺伝子を構築した。これらの人工遺伝子は、標的遺伝子に特異的な配列の２本鎖のＲＮＡを形成するようにレビンらの方法（Levin, J.Z., et al., (2000) Plant Molecular Biology, 44, 759-775.）に準じて作成した。構築された人工遺伝子ｐｅｘ５ｉ及びｐｅｘ７ｉの概要を図１に示す。図１は、ＰＥＸ５Δ７の構築の概要も示している。
これらの遺伝子は対応するタンパク質の一部分のアミノ酸配列をコードするセンス鎖とアンチセンス鎖からなる同じ配列を含んでおり、これらの配列はバー遺伝子（bar gene）により相互に結合して２本鎖を形成する。ｐｅｘ５ｉは、シロイヌナズナのＰｅｘ５ｐの２８番目のロイシン（Leu）から２０７番目のグルタミン（Gln）までのアミノ酸配列（２８Ｌ−２０７Ｑ）をコードするＤＮＡフラグメントのセンス鎖とアンチセンス鎖の方向（図１中の四角枠の矢印はその方向を示している。）で、５５０−ｂｐのバー遺伝子（図１中では中央の四角枠で示されている。）に結合されている。同様に、ｐｅｘ７ｉは、シロイヌナズナのＰｅｘ７ｐの５０番目のグリシン（Gly）から２３９番目のバリン（Val）までのアミノ酸配列（５０Ｇ−２３９Ｖ）をコードするＤＮＡフラグメントが使用されている（図１中では斜線入りの四角枠で示されている。）。
これらの遺伝子は、それぞれカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（図１中では、３５ＳＰと記入された大きな矢印枠で示されている。）の下流にインサートされている。これらの遺伝子の末端には、ノパリンシンターゼ（nopaline synthase）（図１中では、ｎｏｓＴと記入された四角枠で示されている。）が結合されている。
【００１８】
また、Ｐｅｘ５ｐのＣ末端の７１アミノ酸を欠損させた、Ｐｅｘ５ｐの１番目のメチオニン（Met）から６５７番目のチロシン（Tyr）までのアミノ酸配列（１Ｍ−６５７Ｙ）を過剰発現させるためのＰＥＸ５Δ７を構築した。この概要を図１の下段に示す。図１中のＰＥＸ５Δ７の欄の３５ＳＰと記入された大きな矢印枠はカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを示し、黒抜きの四角枠は１Ｍ−６５７Ｙをコードする遺伝子部分を示し、３５ＳＴと記入された四角枠は３５Ｓターミネーターを示す。
これらの人工遺伝子を、植物を選択するときのマーカーとなるハイグロマイシン（hygromycin）耐性遺伝子を含有しているＴｉベクターにインサートした。そして、アグロバクテリウムによる形質転換法により、カナマイシン耐性形質転換植物である２種類の、即ちＡｔＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＡｔＰＴＳ２−ＧＦＰのゲノム中に組み込んだ。ＧＦＰ−ＰＴＳ１は、そのＣ末端にヒドロキシピルビン酸還元酵素のＣ末端側の１０アミノ酸残基を含有するＧＦＰ−融合タンパク質を発現するものであり、またＰＴＳ２−ＧＦＰはそのＮ末端にクエン酸生成酵素のＮ末端側の４９アミノ酸残基を含有するＧＦＰ−融合タンパク質を発現する（Mano, S., et al., (2002) Plant Cell Physiol, 43, 331-341）。なお、Ａｔはシロイヌナズナであることを示している。このために、これらの形質転換体の親の代はペルオキシソームによる緑色の蛍光を有している。
【００１９】
最初の形質転換体をＴ０植物とする。カナマイシン及びハイグロマイシンの両方の耐性を示す子孫のＴ１は、それぞれｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、ｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、ｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、ｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、ＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、及びＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰとして表記する。これらを各種の分析に使用した。子孫のＴ１は外来遺伝子のヘテロ接合体であるから、以下に記述する全ての表現型は優性であった。
【００２０】
子孫のＴ１における外来遺伝子の作用効果を免疫ブロット分析で試験した。形質転換植物及びその親の植物の葉からサンプルを抽出し、全タンパク質の量が１０μｇになるようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。免疫ブロットは各々のタンパク質の抗体を用いて行った。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２のコントロール（cont）は親の植物（ＡｔＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＡｔＰＴＳ２−ＧＦＰ）の場合を示し、ｐｅｘ５ｉ、ｐｅｘ７ｉ及びＰＥＸ５Δ７は、それぞれ、前記で構築した人工遺伝子で形質転換した植物の場合を示し、それぞれの１及び２は親の植物、即ち１は親の植物がＡｔＧＦＰ−ＰＴＳ１である場合を、２は親の植物がＡｔＰＴＳ２−ＧＦＰである場合を示している。図２中の矢印はそれぞれのタンパク質を示し、黒三角印はＰＥＸ５Δ７を示す。
この結果、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰは、いずれもＡｔＰｅｘ５ｐの量が極度に減少しているが、ＡｔＰｅｘ７ｐの量の変化はほとんど観察されなかった。これに対してｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰは、いずれもＡｔＰｅｘ７ｐの量が極度に減少しているが、ＡｔＰｅｘ５ｐの量の変化はほとんど観察されなかった。一方、ＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、及びＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰは、ＰＥＸ５Δ７をコードするポリペプチドの分子量に相応する箇所にバンドが現れており、ＡｔＰｅｘ７ｐの量の変化はほとんど観察されなかった。
このように、本発明で使用したＲＮＡｉ法により、遺伝子特異的に標的遺伝子のＰｅｘ５ｐやＰｅｘ７ｐの発現を阻害することができることが確認された。
【００２１】
形質転換植物であるｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰにおけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの非細胞膜（subcellular）への局在化を共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図３のＰＴＳ１と示されている上段はｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている中段はｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもであり、ｃｏｎｔと示されている下段の左側は野生型にＧＦＰ−ＰＴＳ１を発現させるようにした親の形質転換体の葉の表皮細胞からのものであり、その右側は野生型にＰＴＳ２−ＧＦＰを発現させるようにした親の形質転換体の根の細胞からのものである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図３右下に示すバーは２０μｍを示す。
この結果、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１の葉及び根の細胞は、周辺部のみに緑色の蛍光が観察され（図３の上段参照）、中央の液胞の周囲の細胞質ゾルでも同時に起こっている。同様な蛍光イメージは、ハイグロマイシン／カナマイシン耐性を示す２０のＴ１世代の中からｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１として独立して単離された１９の形質転換体においても観察された。細胞質ゾルの蛍光は、４２のＴ１世代の中からｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰとして独立して単離された３５の形質転換体においても観察された（図３の中段参照）。細胞質ゾルに蛍光を示すＴ１世代はＰｅｘ５ｐの量が減少している（図２参照）。これらのデータは、Ｐｅｘ５ｐが細胞内から消失すれば、ＰＴＳ１−及びＰＴＳ２−含有タンパク質の両者の細胞内輸送の能力が阻害されることを示している。
【００２２】
同様に、形質転換植物であるｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰの葉及び根の細胞におけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの非細胞膜（subcellular）への局在化を共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図４のＰＴＳ１と示されている上段はｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている下段はｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図４右下に示すバーは２０μｍを示す。
この結果、ｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１として独立して単離された５５全ての形質転換体は、Ｐｅｘ７ｐの量が減少している（図２参照）にもかかわらず、これらの親の植物と同様にペルオキシソームに対応する箇所に蛍光を観察することができた（図４の上段参照）。一方、３４のＴ１世代の中からｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰとして独立して単離された３２の形質転換体の細胞は、細胞質ゾルのみに緑色の蛍光を観察することができた（図３の下段参照）。細胞質ゾルに蛍光を示すＴ１世代はＰｅｘ７ｐの量が減少している（図２参照）。これらのデータは、Ｐｅｘ７ｐが細胞内から消失すれば、ＰＴＳ２−含有タンパク質のみの細胞内輸送の能力が阻害されることを示している。
このような蛍光タンパク質によるイメージングにより、ＰＴＳ１−依存性タンパク質はＰｅｘ５ｐによってのみ介在されるが、ＰＴＳ２−依存性タンパク質はＰｅｘ５ｐ及びＰｅｘ７ｐの両者によって介在されることが明らかになった。
【００２３】
シロイヌナズナのＰｅｘ５ｐは、カルボキシ末端におけるＴＰＲ（tetratricopeptide repeat）モチーフを有している（Brickner, D.G., et al., (1998) Plant Physiol., 118, 330）。ＴＰＲモチーフはＰＴＳ−１に作用するのに必要なモチーフであり（Brocard, C., et al., (1994) Biochemical and Biophysical Research Communications, 204, 1016-1022.）、７個の双頭の共通アミノ酸配列からなっている。ＰＥＸ５Δ７遺伝子の産物であるＰＥＸ５Δ７ｐは、このＴＰＲモチーフの最後の繰り返し部分を欠損している。
このＰｅｘ５Δ７ｐの、ＰＴＳ−１タンパク質、Ｐｅｘ７ｐ、及びＰｅｘ１４ｐとの結合活性をニトらが報告した方法（Nito, K., et al., (2002) Plant Cell Physiol, 43, 355-366.）に準じた酵母ツーハイブリッド分析法により分析した。各々のタンパク質をＧａｌ４−ＡＤ又はＧａｌ４−ＢＤと融合させ、酵母の試験株ＰＪ６９−４Ａ（James, P., et al., (1996) Genetics, 144, 1425-1436.）で発現させた。タンパク質間相互作用をＨＩＳ３及びβ−ガラクトシダーゼをレポーター遺伝子としたＧａｌ４依存性の転写活性により測定した。この結果を図５に図面に代わる写真で示す。形質転換体をヒスチジンを含まない培地（−Ｈｉｓ）で培養して、β−ガラクトシダーゼ活性を定量した。図５中のＢＤはＧａｌ４−ＢＤとの融合を示し、ＡＤはＧａｌ４−ＡＤと融合を示し、−Ｈｉｓはヒスチジンを含まない培地での培養結果を示し、β−gal activityはβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）を示す。
この結果、ＨＩＳ３及びβ−ガラクトシダーゼからなるレポーター遺伝子の顕著な転写活性が見られなかったことから、Ｐｅｘ５Δ７ｐはＰＴＳ−１を含有するタンパク質と結合できないことが判明した。しかしながら、Ｐｅｘ５Δ７ｐとＰｅｘ７ｐとの結合活性は、Ｐｅｘ５ｐとＰｅｘ７ｐとの結合活性と同じであった。一方、Ｐｅｘ１４ｐは弱いながらもＰｅｘ５ｐよりもＰｅｘ５Δ７ｐとの結合活性が示された。
【００２４】
また、形質転換植物であるＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰの葉及び根の細胞におけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの非細胞膜（subcellular）への局在化を共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図６のＰＴＳ１と示されている上段はＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている下段はＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図６右下に示すバーは２０μｍを示す。
この結果、ＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰの両者の葉及び根の細胞は細胞質ゾルのみに緑色の蛍光を有していた（図６の上段参照）。同様な蛍光イメージは、１０のＴ１世代の中からＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１として独立して単離された５の形質転換体においても観察され、８Ｔ１世代の中からＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰとして独立して単離された６の形質転換体においても観察された。これらのデータは、ＰＥＸ５Δ７の遺伝子産物が細胞内で過剰発現すれば、ＰＴＳ１−及びＰＴＳ２−含有タンパク質の両者の細胞内輸送の能力が減少することを示している。
【００２５】
また、本発明者らは、グリオキシソームの脂肪酸β酸化機能を欠失した植物は２，４−ジクロロフェノキシ酪酸（２，４−ＤＢ）に対して耐性となり、発芽の生育にショ糖を必要とすることを報告してきた（Hayashi, M., et al., (1998) Plant Cell, 10, 183-195）。グリオキシソームの機能を解析するために、細胞質ゾルに蛍光を発するＴ１植物の子孫であるＴ２植物を用いて、２，４−ＤＢを含有する培地での生育試験を行った。ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、ｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、並びに、ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰのＴ２世代の種子を２，４−ＤＢを０．２μｇ／ｍｌ含有する培地（２，４−ＤＢ）、ショ糖を含有しない培地（−sucrose）、及び通常の培地（ＧＭ）でそれぞれ１０日間生育させた。発芽後は、培地から寒天プレートに移植した。
結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７中のｐｅｘ５ｉ、ｐｅｘ７ｉはそれぞれの変異体を示し、contは、コントロールとしての親株からのＧＦＰ植物の場合を示し、それぞれの１及び２はＰＴＳ１についとＰＴＳ２についてを示す。図７の上段は２，４−ＤＢを０．２μｇ／ｍｌ含有する培地（２，４−ＤＢ）の場合を示し、中段はショ糖を含有しない培地（−sucrose）の場合を示し、下段は通常の培地（ＧＭ）の場合をそれぞれ示す。
この結果、２，４−ＤＢに耐性を示すＴ２の実生は、その７１％が発芽後に伸長した根を有していた。一方、これらの変異体の親株からのものは（図７中のcont）、その親株と同様に強い生育阻害を示し、実生は休眠状態であった（図７の上段参照）。加えて、Ｔ２の実生のほとんどは、発芽後の生育にショ糖を必要とし、ショ糖の欠如した条件下では正常に生育することができなかった（図７の中段参照）。発芽時に２，４−ＤＢ耐性を示し、かつショ糖を必要とする全てのものは、細胞質ゾルに緑色の蛍光を示し、ハイグロマイシン及びカナマイシンの両者に耐性があった。
【００２６】
次に、ｐｅｘ５ｉ及びｐｅｘ７ｉによる形質転換体における光呼吸活性について検討した。
まず、光を照射しながら、野生型（cont）、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１（pex5i）及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ（pex7i）を、通常の大気下（３６ＰａＣＯ２）、又は１０００ＰａＣＯ２を含有する大気下で、８週間生育させた。その結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８の左側から、通常大気下での野生型（air cont）、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１のＣＯ２存在下（CO2 pex5i）、同通常の大気下（air pex5i）、ｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰのＣＯ２存在下（CO2 pex7i）、同通常の大気下（air pex7i）をそれぞれ示している。
この結果、通常の大気下でｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１（図８の中央）及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ（図では示されていない。）を生育させた場合には、野生型（図８の左端）に比べて葉が黄緑色となり、矮小形の形態となった。このフェノタイプは、この植物をＣＯ２の条件で生育させた場合には回復した（図８のCO2 pex5i参照）。おなじようなフェノタイプは、ＰＥＸ１４遺伝子が欠損し、光呼吸能が減少したｐｅｄ２でも観察されている（非特許文献５参照）。これに対して、ｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１（図８の右端）及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ（図では示されていない。）は、通常の大気下であっても正常に生育することができた。これらのことから、光呼吸能においては、Ｐｅｘ５ｐのみが影響しており、Ｐｅｘ７ｐは影響を与えないことがわかった。
【００２７】
次に、これらの植物の光化学系II（Ｆｖ／Ｆｍ）における最大量子収量を測定した。この最大量子収量は、最大蛍光（Ｆｍ）に対する暗所に適応したクロロフィルの蛍光の変化量（Ｆｖ）の比（Ｆｖ／Ｆｍ）として評価することができる（Franklin, L.A., et al., (1992) Planta, 187, 399-408.；Krause, G.H., (1988) Physiologia Plantarum, 74, 566-574.）。そこで、細胞質ゾルにおいて緑色の蛍光を有するｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰと、野生型の暗所に適応した葉のＦｖ／Ｆｍを比較した。光化学系IIで安定電子受容体として働いているＱＡとＱＢキノンが過剰に還元を受け光合成電子伝達反応が停止する原因であると考えられている強光阻害という現象を減少させるために、まず、弱い光（５０μＥｍ−２・ｓｅｃ−１）を照射しながら、１０００ＰａのＣＯ２を含有する大気下で３週間、これらの植物を生育させた。この条件下では全ての植物は正常に生育した。そして、この条件下でのＦｖ／Ｆｍの値は約０．８であると推定された。その後、これらの植物を通常の大気下（３６ＰａＣＯ２）で、強い光（４５０μＥｍ−２・ｓｅｃ−１）を照射した。このような条件下では、リブロース−１，５−二燐酸（ＲｕＢＰ）とＣＯ２から２分子のグリセリン酸−３−燐酸（ＰＧＡ）を生成する反応と，ＲｕＢＰとＯ２からＰＧＡとグリコール酸燐酸を生成する反応とを触媒する酵素であるリブロース−１，５−二燐酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）は、光合成における炭酸固定において必要とされるカルボキシラーゼ活性に加えてオキシゲナーゼとして作用する。オキシゲナーゼの反応による副産物であるホスホグリコレートは光呼吸の酵素により代謝され、最終的にはカルビン−ベンソンサイクル（Calvin-Benson cycle）に戻される。それ故に、野生型の植物におけるＦｖ／Ｆｍの値は、強い光の照射を受けた後も変化することはない。
【００２８】
ＧＦＰ−ＰＴＳ１、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、ＰＴＳ２−ＧＦＰ、ｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、及びｐｅｄ２変異体を、弱い光（５０μＥｍ−２・ｓｅｃ−１）を照射しながら、１０００ＰａのＣＯ２を含有する大気下で４週間生育させた。これらの植物に、通常の大気下（３６ＰａＣＯ２）で、４時間強い光（４５０μＥｍ−２・ｓｅｃ−１）を照射した。０時間照射及び４時間照射のそれぞれの植物の葉における光化学系II（Ｆｖ／Ｆｍ）の最大量子収量を、これらの植物を３０分間暗所に放置した後に測定した。この結果を図９にグラフで示す。図９の左側（０ｈ）は、０時間照射の場合を示し、右側（４ｈ）は４時間照射の場合を示し、それぞれの場合の左側から、野生型としての親株のＧＦＰ−ＰＴＳ１、変異株のｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、野生型としての親株のＰＴＳ２−ＧＦＰ、変異株のｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、及び変異株のｐｅｄ２をそれぞれ示す。図９の縦軸は、Ｆｖ／Ｆｍの値を示す。それぞれのＦｖ／Ｆｍの値は、各植物について６枚の葉からの測定値の平均を示す。棒グラフ中のバーは標準偏差を示す。
【００２９】
この結果、野生型では予想どおり強い光を照射したときもＦｖ／Ｆｍの値はほとんど変化が見られなかったし、ｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰについてもＦｖ／Ｆｍの値の顕著な減少は観察されなかった（図９参照）。これに対して、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１のＦｖ／Ｆｍの値については、顕著な減少が観察された。このような減少は、ＰＥＸ１４オルソログが欠損しているｐｅｄ２についても同様に観察された（図９参照）。
観察されたＦｖ／Ｆｍの値の減少は、光反応とカルビン−ベンソンサイクルの不均衡と対応していることから、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１は、光呼吸の不全により低ＣＯ２／強力な光の条件下ではカルビン−ベンソンサイクルの活性を十分に維持することができないことを示している。
【００３０】
これらの結果は、ｐｅｘ５ｉ及びｐｅｘ７ｉの両変異体は、いずれもグリオキシソームの機能は欠如していることを示している。表現型の分離は、Ｔ２の個体群における遺伝子操作による遺伝子型がヘテロであったためと考えられる。しかし、ハイグロマイシン／カナマイシン耐性は全ての子孫が受け継いだにもかかわらず、Ｔ２の多くは細胞質ゾルにおける蛍光を失い、そして成長と共にペルオキシソームにおける蛍光を回復し、Ｔ３世代の極少数のみが細胞質ゾルにおける蛍光を示しただけであった。
【００３１】
高等植物においては、細胞質アコニターゼ（cytosolic aconitase）を除くグリオキシレートサイクル、及び脂肪酸ベータ酸化の関連する全ての酵素は、グリオキシソームに局在化している。これらの酵素の中の、短鎖アシルＣｏＡオキシダーゼ、中長鎖アシルＣｏＡオキシダーゼ、多機能酵素（multifunctional enzyme）、リンゴ酸合成酵素、及びイソクエン酸リアーゼはＰＴＳ１を含有するタンパク質であり、中鎖アシルＣｏＡオキシダーゼ、長鎖アシルＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及びクエン酸合成酵素はＰＴＳ２を含有するタンパク質である。したがって、Ｐｅｘ５ｐの欠損は、これらの全ての酵素のグリオキシソームへの輸送が阻害されることになる。この結果、グリオキシソームの機能が低下し、２，４−ＤＢに対する耐性が獲得されることになる。そして、発芽に際してはショ糖を必要としてくる。加えて、Ｐｅｘ５ｐの欠損は、葉におけるペルオキシソームの機能をも低下させる（図８及び９参照）。光合成器官における葉のペルオキシソームは光呼吸に関連する酵素を含有しており、これらの酵素はＰＴＳ１を含有するタンパク質であり、ペルオキシソームへの輸送にはＰｅｘ５ｐが介在しているからである。
【００３２】
これに対して、Ｐｅｘ７ｐの欠損は、グリオキシソームの機能を低下させるが、葉のペルオキシソームの機能には大きな影響を与えないことがわかった（図７〜９参照）。即ち、葉のペルオキシソームの機能はＰｅｘ５ｐが介在するＰＴＳ１−を含有するタンパク質によって主として機能しており、これがＰｅｘ７ｐの欠損によっても光呼吸の活性に影響を与えない原因であると考えられる。ただひとつの例外は、リンゴ酸脱水素酵素であり、この酵素はＰＴＳ２を含有しており、この酵素はヒドロキシピルビン酸還元酵素によって触媒される反応に必要なＮＡＤＨを供給している。Ｐｅｘ７ｐの欠損は、ペルオキシソームにおけるこの酵素の機能も低下させると考えられるが、本発明者らの観察では（図７〜９参照）では、ＮＡＤＨの低下は観察されていない。これは、ＮＡＤＨの供給がリンゴ酸脱水素酵のみによりなされるのではなく、他の供給経路が存在していると考えられる。
これらに結果から、Ｐｅｘ７ｐのみの欠損は、グリオキシソームの機能を低下させるが、植物のその他の機能の低下を招かないということになる。即ち、より端的には、Ｐｅｘ７ｐのみの欠損は、発芽時にショ糖を必要とすること以外の植物の機能の低下を招かないということになる。このことは、本発明により初めて明らかにしたものである。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は、植物におけるペルオキシソームのタンパク質輸送因子Ｐｅｘ７ｐの有する新たな機能を明らかにするものであり、当該機能を応用した新規かつ有用な形質転換植物を提供するものである。本発明の形質転換植物は、発芽後は通常の培地で正常に生育することができるが、発芽時のみにショ糖を要求するという特異的な性質を有するものである。このような性質は、通常の消費者においては種子から発芽させることが困難であり、常に苗の供給を必要とされるものであり、植物が生育して仮に種子が採取されても、消費者は苗の供給を必要とし、種子産業における新たな植物の供給手法を提供するものである。
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の野生型はコロンビア（Columbia）の生態種を用いた。
ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰを発現する形質転換体の構築、並びにｐｅｄ２変異体の特性については非特許文献５及び７を参照されたい。
すべての種子は表面を０．０２％のトリトンＸ−１００を含む２％ＮａＣｌＯで殺菌し、抗生物質の存在下又は非存在下で生育培地（２．３ｍｇ／ｍＬムラシゲ及びスコグ塩（Murashige and Skoog salts）（和光純薬、大阪、日本）、１％ショ糖、１００μｇ／ｍＬミオイノシトール、１μ／ｍＬチアミン塩酸塩、０．５μｇ／ｍＬピリドキシム、０．５μｇ／ｍＬニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍＬメス−ＫＯＨ（Mes-KOH）、ｐＨ５．７、及び０．８％寒天）で生育した。ただし、実験の内容によって、前記生育培地にさらに０．２μｇ／ｍＬの２，４−ジクロロフェノキシ酪酸を添加したり、ショ糖を取り除いた生育培地とした。発芽後は、パーライトとバーミュキュライトの１：１の混合物を用いて生育させた。生育の条件は、２２℃で、通常の大気下又は１０００ＰａのＣＯ２を含有する大気下で、１６時間光を照射し（１００μＥｍ−２ｓ−１）、８時間暗くするというサイクルであった。
【実施例１】
【００３５】
ｐｅｘ５ｉ及びｐｅｘ７ｉの構築
センス側の配列を、両端にＳｐｅＩ及びＳａｃＩサイトが導入できるようにＰＣＲで増幅した、一方、アンチセンス側は両端がＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩサイトになるように増幅した。センス側及びアンチセンス側のＤＮＡフラグメントをそれぞれ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ−（ストラタジーン、La Jolla,CA,USA）のＳｐｅＩ−ＳａｃＩサイトＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した。バー遺伝子（bar gene）を含有するプラスミドｐＡＲＫ２２におけるバー遺伝子（bar gene）をコードしているＢａｍＨＩ−ＢｇｌIIフラグメントを、前記のプラスミドのＢａｍＨＩサイトにリンカーとして挿入した。
これらのプラスミドから人工的な部分（artificial genes）を切り取り、ｐＢＩ１２１−Ｈｍ−リンカーのＸｈｏＩ−ＳａｃＩサイトに挿入した。このｐＢＩ１２１−Ｈｍ−リンカーは、ＧＵＳ遺伝子をＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ及びＳａｃＩサイトを含有するリンカー配列で置換したｐＢＩ１２１のＴｉベクターから構築されたものである。これは、植物を選択するときのマーカーとなるハイグロマイシン（hygromycin）耐性遺伝子を含有している。
これらの概要を図１に模式的に示す。
【実施例２】
【００３６】
ＰＥＸ５Δ７の構築
Ｐｅｘ５ｐの１番目のメチオニンから６５７番目のチロシン（１Ｍ−６５７Ｙ）をコードするＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅した。このＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン、Carlsbad,CA,USA）に挿入し、これをメーカー（インビトロジェン、Carlsbad,CA,USA）のプロトコルに従って、ＢＰ及びＬＲクロナーゼを用いてｐＧＷＢ２のＴｉベクターに転換した。
これらの概要を図１に模式的に示す。
【実施例３】
【００３７】
アグロバクテリアによる形質転換
実施例１で製造したｐｅｘ５ｉ又はｐｅｘ７ｉをそれぞれ含有するベクターをそれぞれ、カナマイシン耐性を有し、ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰを発現している形質転換イロイヌナズナに、アグロバクテリウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ株Ｒ）を用いて、ベクトールドら（Bechtold, N., et al., (1993) C. R. Acad. Sci., 316, 1194-1199）に記載の真空浸透法により導入した。これらのベクターが導入された形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含有するムラシゲ／スコグ（Murashige／Skoog）プレートで選別した。
【実施例４】
【００３８】
免疫ブロッティング
試料の調製及びＰｅｘ５ｐ又はＰｅｘ７ｐに対する抗体を用いた免疫ブロット分析法は、ニトらの方法（Nito, K., et al., (2002) Plant Cell Physiol, 43, 355-366）に準じて行った。
粗抽出物は、細胞質に緑色の蛍光を有するＴ１植物の３週齢の葉から調製した。免疫ブロッティングには１０μｇのタンパク質を用いた。
結果を図２に示す。
【実施例５】
【００３９】
ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰによる蛍光の分析
根の細胞を分析するために、生育培地で生育しているＴ１植物の１０日齢の根から標本を作製した。また、葉の細胞を分析するために、Ｔ１植物の３週齢の葉から標本を作製した。これらの標本の蛍光イメージ像を、アルゴンレーザー及びＦＩＴＣフィルターセットを有するＬＳＭ５１０レーザースキャニング共焦点顕微鏡（励起波長；４６５−５０５ｎｍ、発光波長；５０５−５５０ｎｍ）（カールツワイス、ドイツ）を用いて測定した。
結果を図３、図４、図６にそれぞれ示す。
【実施例６】
【００４０】
酵母のツーハイブリッドシステムによる分析
ＰＥＸ５Δ７の酵母によるツーハイブリッドシステムによる分析を、既に報告された方法に準じて行った。プラスミドｐＤＯＮＲ中のＰＥＸ５Δ７をコードしているＤＮＡフラグメントを、酵母のツーハイブリッドベクターｐＧＡＤ−ＧＷに転換した。このベクターは、ｐＧＡＤ−Ｃ１（James, P., et al., (1996) Genetics, 144, 1425-1436）のマルチクローニングサイトをゲイトウエイコンバージョンカセット（インビトロジェン、La Jolla,CA,USA）で置換して構築した。他のベクターの構築は、ニトらの方法（Nito, K., et al., (2002) Plant Cell Physiol, 43, 355-366）に準じて行った。
形質転換体をヒスチジンを含有しない５０ｍＭの３−アミノトリアゾールを含有する合成培地で生育し、β−ガラクトシダーゼの活性を定量した。
結果を図５に示す。
【実施例７】
【００４１】
光化学系II（Ｆｖ／Ｆｍ）における最大量子収量の測定
光阻害の効果を減少させるために、植物を４週間１０００ＰａのＣＯ２を含む大気中で、光を少なくした条件（５０μＥｍ−２ｓ−１）で生育させた。これらの植物に、通常の大気下（３６ＰａＣＯ２）で、強力な光（４５０μＥｍ−２ｓ−１）を、それぞれ０、３０、６０、１２０分間、照射した。光の照射後、植物を３０分間暗所に置いた。最大蛍光（Ｆｍ）と変化した蛍光（Ｆｖ）の比（Ｆｖ／Ｆｍ）を、暗所に適応した葉の上側の表面からのクロロフィルの蛍光発色を、パルス増幅調節型蛍光計（pulse amplitude modulation fluorometer）（Mini-PAM;H.Walz, Effeltrich, Germany）を用いて測定した結果から計算した。
結果を図９にグラフ化して示す。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明は、植物のＰＥＸ７遺伝子の発現を抑制することからなる植物の発芽のみを抑制する方法、及び植物のＰＥＸ７遺伝子の発現が抑制され発芽のみが抑制された形質転換植物を提供するものであり、本発明の形質転換植物は、植物の通常の栽培条件下では発芽することができず、発芽にショ糖を必要とすることから、消費者は栽培に当たっては発芽後の苗を入手しなければならず、本発明の形質転換体は農業分野、特に種子産業、において新たな植物の供給形態を提供するものであり、産業上有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明により構築された人工遺伝子ｐｅｘ５ｉ、ｐｅｘ７ｉ、及びＰＥＸ５Δ７の概要を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明によりＲＮＡｉ法のために導入した外来遺伝子の作用効果を免疫ブロット分析で試験したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面に代わる写真である。図２のコントロール（cont）は親の植物（ＡｔＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＡｔＰＴＳ２−ＧＦＰ）の場合を示し、ｐｅｘ５ｉ、ｐｅｘ７ｉ及びＰＥＸ５Δ７は、それぞれ、前記で構築した人工遺伝子で形質転換した植物の場合を示し、それぞれの１及び２は親の植物、即ち１は親の植物がＡｔＧＦＰ−ＰＴＳ１である場合を、２は親の植物がＡｔＰＴＳ２−ＧＦＰである場合を示している。図２中の矢印はそれぞれのタンパク質を示し、黒三角印はＰＥＸ５Δ７を示す。
【図３】図３は、本発明の形質転換植物であるｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰにおけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの膜への局在化を共焦点エーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した結果を示す図面に代わる写真である。図３の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図３のＰＴＳ１と示されている上段はｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている中段はｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもであり、ｃｏｎｔと示されている下段の左側は野生型にＧＦＰ−ＰＴＳ１を発現させるようにした親の形質転換体の葉の表皮細胞からのものであり、その右側は野生型にＰＴＳ２−ＧＦＰを発現させるようにした親の形質転換体の根の細胞からのものである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図３右下に示すバーは２０μｍを示す。
【図４】図４は、本発明の形質転換植物であるｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰの葉及び根の細胞におけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの局在化を共焦点エーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した結果を示す図面に代わる写真である。図４の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図４のＰＴＳ１と示されている上段はｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている下段はｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図４右下に示すバーは２０μｍを示す。
【図５】図５は、本発明で製造したＰＥＸ５Δ７ｐのＰＴＳ−１タンパク質、Ｐｅｘ７ｐ、及びＰｅｘ１４ｐとの結合活性を酵母ツーハイブリッド分析法により分析した結果を示す図面に代わる写真である。図５中のＢＤはＧａｌ４−ＢＤとの融合を示し、ＡＤはＧａｌ４−ＡＤと融合を示し、−Ｈｉｓはヒスチジンを含まない培地での培養結果を示し、β−gal activityはβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）を示す。
【図６】図６は、本発明の形質転換植物であるＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰの葉及び根の細胞におけるＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰの局在化を共焦点エーザースキャニング顕微鏡を用いて分析した結果を示す図面に代わる写真である。図６の左側の欄の写真は葉の表皮細胞からのものであり、右側の欄の写真は根からのものである。図６のＰＴＳ１と示されている上段はＰＥＸ５Δ７／ＧＦＰ−ＰＴＳ１からのものであり、ＰＴＳ２と示されている下段はＰＥＸ５Δ７／ＰＴＳ２−ＧＦＰからのもである。黒三角印はペルオキシソームで検出された蛍光を示し、矢印は細胞質ゾルにおいて検出された蛍光を示す。これらの写真の拡大率は同じであり、図６右下に示すバーは２０μｍを示す。
【図７】図７は、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ５ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、ｐｅｘ７ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、並びに、ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びＰＴＳ２−ＧＦＰのＴ２世代の種子を、それぞれ１０日間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。図７中のｐｅｘ５ｉ、ｐｅｘ７ｉはそれぞれの変異体を示し、contは、コントロールとしての親株からのＧＦＰ植物の場合を示し、それぞれの１及び２はＰＴＳ１についとＰＴＳ２についてを示す。図７の上段は２，４−ＤＢを０．２μｇ／ｍｌ含有する培地（２，４−ＤＢ）の場合を示し、中段はショ糖を含有しない培地（−sucrose）の場合を示し、下段は通常の培地（ＧＭ）の場合をそれぞれ示す。
【図８】図８は、光を照射しながら、野生型（cont）、本発明のｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１（pex5i）及び本発明のｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ（pex7i）を、通常の大気下（３６ＰａＣＯ２）、又は１０００ＰａＣＯ２を含有する大気下で、８週間生育させた結果を示す図面に代わる写真である。図８の左側から、通常大気下での野生型（air cont）、ｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１のＣＯ２存在下（CO2 pex5i）、同通常の大気下（air pex5i）、ｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰのＣＯ２存在下（CO2 pex7i）、同通常の大気下（air pex7i）をそれぞれ示している。
【図９】図９は、細胞質ゾルにおいて緑色の蛍光を有するｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１及びｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰと、野生型の暗所に適応した葉のＦｖ／Ｆｍを比較した結果を示すグラフである。図９の左側（０ｈ）は、０時間照射の場合を示し、右側（４ｈ）は４時間照射の場合を示し、それぞれの場合の左側から、野生型としての親株のＧＦＰ−ＰＴＳ１、変異株のｐｅｘ５ｉ／ＧＦＰ−ＰＴＳ１、野生型としての親株のＰＴＳ２−ＧＦＰ、変異株のｐｅｘ７ｉ／ＰＴＳ２−ＧＦＰ、及び変異株のｐｅｄ２をそれぞれ示す。図９の縦軸は、Ｆｖ／Ｆｍの値を示す。それぞれのＦｖ／Ｆｍの値は、各植物について６枚の葉からの測定値の平均を示す。棒グラフ中のバーは標準偏差を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１：  シロイヌナズナのＰＥＸ７の塩基配列
配列番号２：  シロイヌナズナのＰｅｘ７ｐのアミノ酸配列
配列番号３：  ｐｅｘ５ｉを導入した遺伝子の塩基配列
配列番号４：  ｐｅｘ７ｉを導入した遺伝子の塩基配列
【図１】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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