(57)【要約】      （修正有）【課題】核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】試験物質が下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質と核内受容体との結合を抑制又は促進できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングし、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする。（ａ）特定のアミノ酸配列からなる核内受容体と結合できるタンパク質。（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質が下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
【請求項２】
試験物質が下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質とユビキチンとの結合を抑制できるか否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
【請求項３】
試験物質が下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質による核内受容体のユビキチン化を抑制できるか否かを判別し、前記ユビキチン化を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【請求項４】
試験物質が下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【請求項５】
前記核内受容体がエストロゲン受容体である請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験物質が下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質と核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
【請求項７】
試験物質が下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質とユビキチンとの結合を促進できるか否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
【請求項８】
試験物質が下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質による核内受容体のユビキチン化を促進できるか否かを判別し、前記ユビキチン化を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【請求項９】
試験物質が下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【請求項１０】
前記核内受容体がエストロゲン受容体である請求項６〜９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核内受容体は糖尿病、骨粗鬆症、高血圧、ホルモン依存性癌（例えば、乳癌、子宮体癌、前立腺癌等）等の疾患と密接に関連しているため、核内受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストが治療薬として注目されている。
【０００３】
しかしながら、核内受容体は組織によって機能が異なり、リガンドに対する反応性も組織によって異なる。したがって、核内受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニストは、ある組織では治療効果を発揮するが、他の組織では副作用を発揮する可能性がある。例えば、エストロゲン受容体の場合、エストロゲン依存性乳癌の増殖を抑制するタモキシフェンは、骨ではアンタゴニストとして作用しないため、骨量の減少を招かないという利点がある一方、エストロゲン依存性子宮体癌の増殖を促進するという副作用を招く。そこで、別の視点から核内受容体の機能を制御することが求められており、その中の１つとして、核内受容体の分解を抑制又は促進することにより核内受容体の機能を制御することが考えられている。
【０００４】
一方、非特許文献１では、サイロイドホルモン受容体に結合するタンパク質を酵母interaction trap法により網羅的に獲得している。その中の１つとしてＴＲＩＰ１２と命名されたタンパク質を獲得しており、このＴＲＩＰ１２は配列番号２記載のアミノ酸配列からなる。しかしながら、ＴＲＩＰ１２と核内受容体の分解との関連性については明らかになっていない。
【非特許文献１】リー（Lee）JW 等，「モレキュラー エンドクリノロジー（Molecular Endocrinology）」，1995年，9(2)，p.234-254
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、核内受容体の分解が、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と核内受容体との結合、当該タンパク質とユビキチンとの結合、当該タンパク質による核内受容体のユビキチン化等を経て進行するという新たな知見に基づいて完成されたものであり、上記課題を解決するために、本発明は、以下の核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法を提供する。
【０００７】
（１）試験物質が下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質と核内受容体との結合を抑制できる否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
【０００８】
（２）試験物質が下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質とユビキチンとの結合を抑制できるか否かを判別し、前記結合を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
【０００９】
（３）試験物質が下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質による核内受容体のユビキチン化を抑制できるか否かを判別し、前記ユビキチン化を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【００１０】
（４）試験物質が下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制できる否かを判別し、前記発現を抑制できる試験物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解抑制物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【００１１】
（５）前記核内受容体がエストロゲン受容体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００１２】
（６）試験物質が下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質と核内受容体との結合を促進できる否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
【００１３】
（７）試験物質が下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質とユビキチンとの結合を促進できるか否かを判別し、前記結合を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
【００１４】
（８）試験物質が下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質による核内受容体のユビキチン化を促進できるか否かを判別し、前記ユビキチン化を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【００１５】
（９）試験物質が下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進できる否かを判別し、前記発現を促進できる試験物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングする工程を含む、核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質
【００１６】
（１０）前記核内受容体がエストロゲン受容体である前記（６）〜（９）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、核内受容体分解抑制物質又は核内受容体分解促進物質のスクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
試験物質の種類は特に限定されるものではなく、天然に存在する物質であってもよいし、人工的に合成された物質であってもよい。試験物質としては、例えば、高分子化合物、低分子化合物、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、無機塩類、金属錯体、これらの複合体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
【００１９】
「核内受容体」とは、主として、標的遺伝子のプロモーター上流に結合することにより核内受容体リガンド依存的に標的遺伝子の転写を制御する因子を意味する。但し、核内受容体リガンドのない核内受容体も存在する。したがって、核内受容体リガンドのない核内受容体であっても、その構造及び機能の相同性から核内受容体遺伝子スーパーファミリーに属するものは「核内受容体」に含まれるものとする。核内受容体としては、例えば、エストロゲン受容体（ER）、ビタミンＤ受容体（VDR）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPAR）、肝臓Ｘ受容体（LXR）、レチノイン酸受容体（RAR）、レチノイドＸ受容体（RXR）、アンドロゲン受容体（AR）、グルココルチコイド受容体（GR）、ファルネソイドＸ受容体（FXR）、ミネラルコルチコイド受容体（MR）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
「核内受容体リガンド」とは、核内受容体に結合することにより、核内受容体の標的遺伝子の転写活性化能を制御する物質を意味する。核内受容体リガンドは、天然に存在する物質であってもよいし、人工的に合成された物質であってもよい。エストロゲン受容体のリガンドとしては、例えば、エストロゲンが挙げられ、ビタミンＤ受容体のリガンドとしては、例えば、ビタミンＤが挙げられる。なお、全ての核内受容体について内在性の核内受容体リガンドが明らかになっているわけではない。
【００２１】
以下、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を「タンパク質（ａ）」と、配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体と結合できるタンパク質を「タンパク質（ｂ）」と、配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、ユビキチンと結合できるタンパク質を「タンパク質（ｃ）」と、配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、核内受容体をユビキチン化できるタンパク質を「タンパク質（ｄ）」という。
【００２２】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、核内受容体と結合できる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合は、核内受容体リガンド依存的（核内受容体リガンドの存在が必要）であってもよいし、核内受容体リガンド非依存的（核内受容体リガンドの存在は不要）であってもよい。例えば、タンパク質（ａ）とエストロゲン受容体との結合は、核内受容体リガンド（エストロゲン）依存的である。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合は、直接結合であってもよいし、他の物質（例えば核内受容体リガンド）を介した間接結合であってもよい。例えば、タンパク質（ａ）とエストロゲン受容体との結合は、直接結合である。
【００２３】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）は、ユビチキンと結合できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合は、チオエステル結合を介した直接結合である。
【００２４】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）は、核内受容体をユビキチン化できる（すなわち、ユビキチンリガーゼ活性（標的基質にユビキチンを連結させる活性）を有する）。タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビチキン化には、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）及びＥ２（ユビキチン結合酵素）が必要である。すなわち、ユビキチンがＡＴＰ依存的にＥ１に結合した後、Ｅ１からＥ２に転移され、次いで、Ｅ３（ユビキチンキナーゼ）として機能するタンパク質（ａ）又は（ｄ）によって核内受容体に転移される。
【００２５】
タンパク質（ａ）はヒト由来タンパク質であり、天然に存在するタンパク質である。タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質であってもよいし、タンパク質（ａ）に対して欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質又はそれに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質であってもよい。タンパク質（ａ）に対して欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質、ヒトにおいて多型等によって生じ得るタンパク質が挙げられる。
【００２６】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質（ｂ）に関しては核内受容体と結合できる限り特に限定されるものではなく、タンパク質（ｃ）に関してはユビキチンと結合できる限り特に限定されるものではなく、タンパク質（ｄ）に関しては核内受容体をユビキチン化できる限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個である。その具体的な範囲は、通常１〜４００個、好ましくは１〜２００個、さらに好ましくは１〜１００個である。このとき、タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００２７】
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、タンパク質（ｂ）に関しては核内受容体と結合できる限り特に限定されるものではなく、タンパク質（ｃ）に関してはユビキチンと結合できる限り特に限定されるものではなく、タンパク質（ｄ）に関しては核内受容体をユギキチン化できる限り特に限定されるものではない。
【００２８】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするオープンリーディングフレームとその３'末端側に位置する終止コドンとを含む。タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいてもよい。また、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）が融合タンパク質として発現されるように、他のタンパク質又はペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでいてもよい。
【００２９】
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列は、タンパク質（ａ）をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１１０〜１１２番目の塩基配列に位置し、終止コドンは６０８６〜６０８８番目の塩基配列に位置する。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子の塩基配列は、タンパク質（ａ）をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００３０】
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ核内受容体と結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００３１】
タンパク質（ｃ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつユビキチンと結合できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００３２】
タンパク質（ｄ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ核内受容体をユビキチン化できるタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００３３】
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００３４】
配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち１１０〜６０８５番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００３６】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を促進できると判別できる。
【００３７】
細胞内における核内受容体の分解は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を経て進行すると考えられるので（例えば、細胞内におけるエストロゲン受容体の分解は、タンパク質（ａ）とエストロゲン受容体との結合を経て進行する）、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００３８】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制又は促進できる物質は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体の一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを解離させることができる物質であってもよい。
【００３９】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００４０】
in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００４１】
in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００４２】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｂ）として、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の誘導体、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用してもよい。核内受容体についても同様である。
【００４３】
誘導体の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）については核内受容体に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、核内受容体についてはタンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、Ｃｙ系色素、Ａｌｅｘａ系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素等の蛍光性化合物；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステル等の化学発光性化合物；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光性化合物；３２Ｐ、３５Ｓ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）等が挙げられる。
【００４４】
融合タンパク質の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）については核内受容体に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、核内受容体についてはタンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドとしては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ−ｔａｇ）、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、Ｔ７遺伝子１０タンパク質、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質、ストレプトアビジン、ＶＳＶ−Ｇ−ｔａｇ等が挙げられる。
【００４５】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、核内受容体リガンドの有無、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の濃度、核内受容体の濃度、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、両者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無等が挙げられる。
【００４６】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを接触させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを接触させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）の濃度及び核内受容体の濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）が結合する核内受容体の領域と同一の領域に結合し、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と競合するコアクティベーター又はコリプレッサー；リン酸化その他の修飾によりタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合を制御するタンパク質等が挙げられる。
【００４７】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合が核内受容体リガンド依存的である場合、両者を接触させる際、核内受容体リガンドを共存させる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合が核内受容体リガンド非依存的である場合には核内受容体リガンドを共存させる必要はない。タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合が核内受容体リガンド依存的である否かは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との組み合わせによって異なり、例えば、タンパク質（ａ）とエストロゲン受容体との結合は、エストロゲン依存的である。
【００４８】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量は、例えば、両者の結合によって形成される結合体量、両者の結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。
【００４９】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって形成される結合体量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体の一方又は両方に標識物質を付加しておき、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とを接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合体を分離し、当該結合体が有する標識物質量を指標として測定できる。具体的には、GST pull down法を利用して次のように測定できる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体の一方にＲＩを付加するとともに他方をＧＳＴとの融合タンパク質としておき、両者を接触させた後、両者の結合体をグルタチオンセファロースカラムに吸着させる。カラムを洗浄した後、カラムに結合したタンパク質を溶出する。溶出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合体を分離した後、当該結合体が有するＲＩ量を指標として当該結合体量を測定する。
【００５０】
また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって形成される結合体量は、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）あるいは核内受容体に反応できる抗体又はその断片を使用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等によって測定できる。なお、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。
【００５１】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって生じるシグナルの種類は特に限定されるものではないが、例えば、レポーター遺伝子の発現、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子の振動数移動による局所密度変化の検出等が挙げられる。
【００５２】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって生じるシグナルがレポーター遺伝子の発現である場合、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量は、例えば、核内受容体の転写活性化能を利用して次のように測定できる。
【００５３】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、核内受容体をコードする遺伝子を含む発現ベクターと、レポーター遺伝子及び該レポーター遺伝子の上流に連結された核内受容体依存性プロモーターを含む発現ユニットとを宿主細胞に導入し、レポーター遺伝子の発現によって生じるレポーター活性量を測定する。レポーター遺伝子の上流に連結されるプロモーターとしては、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって、核内受容体による活性化の度合いが変化するものが選択される。したがって、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体とが結合すると、核内受容体によるプロモーターの活性化の度合いが変化し、レポーター遺伝子の発現量が変化する。すなわち、レポーター遺伝子の発現によって生じるレポーター活性量の変化が、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量の指標となる。
【００５４】
レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター活性としては、例えば、βガラクトシダーゼ活性、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性等が挙げられる。
【００５５】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって生じるシグナルが蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である場合、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量は、例えば、次のように測定できる。
【００５６】
タンパク質（ａ）又は（ｂ）及び核内受容体の一方を蛍光タンパク質（ドナー）と融合するとともに他方を蛍光タンパク質（アクセプター）と融合しておき、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合によって生じる蛍光量を測定する。この際、蛍光タンパク質（ドナー）としては、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、蛍光タンパク質（アクセプター）としては、ＹＦＰ（yellow fluorescent protein）を使用できる。蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ある分子の蛍光団（ドナー）から他の分子の蛍光団（アクセプター）へ励起エネルギーが移動する現象で、励起された蛍光団はそのエネルギーを熱や新たな蛍光として放出する。蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が効率良く起こるためには、２つの分子がある程度近くにある必要があるので、細胞内で起こるタンパク質間の相互作用を検出する有効な手段として利用できる。
【００５７】
試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００５８】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を促進できると判別できる。
【００５９】
細胞内における核内受容体の分解は、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を経て進行すると考えられるので（例えば、細胞内におけるエストロゲン受容体の分解は、タンパク質（ａ）とユビキチンとの結合を経て進行する）、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００６０】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制又は促進できる物質は、タンパク質（ａ）又は（ｃ）及びユビキチンの一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを解離させることができる物質であってもよい。
【００６１】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００６２】
in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）及びユビキチンとして、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００６３】
in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）及びユビキチンとして、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００６４】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、タンパク質（ａ）又は（ｃ）の誘導体、タンパク質（ａ）又は（ｃ）と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用してもよい。ユビキチンについても同様である。
【００６５】
誘導体の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｃ）についてはユビキチンに対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、ユビキチンについてはタンパク質（ａ）又は（ｃ）に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の具体例は上記と同様である。
【００６６】
融合タンパク質の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｃ）については核内受容体に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではなく、ユビキチンについてはタンパク質（ａ）又は（ｃ）に対する結合能が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドの具体例は上記と同様である。
【００６７】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度、ユビキチンの濃度、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１及びＥ１の有無、Ｅ１及びＥ２の濃度、Ｅ２の種類、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、両者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無等が挙げられる。
【００６８】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを接触させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとを接触させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度、ユビキチンの濃度、並びにＥ１及びＥ２の濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）が結合するユビキチンの領域と同一の領域に結合し、タンパク質（ａ）又は（ｃ）と競合するコアクティベーター又はコリプレッサー；リン酸化その他の修飾によりタンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合を制御するタンパク質等が挙げられる。
【００６９】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合量は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量と同様にして測定できる。
【００７０】
試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００７１】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）と核内受容体とユビキチンとを試験物質の存在下又は不存在下で反応させた後、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化量を測定し、試験物質の存在下におけるユビキチン化量と試験物質の不存在下におけるユビキチン化量とを比較する。その結果、試験物質の存在下におけるユビキチン化量が試験物質の不存在下におけるユビキチン化量よりも少なければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下におけるユビキチン化量が試験物質の不存在下におけるユビキチン化量よりも多ければ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を促進できると判別できる。
【００７２】
細胞内における核内受容体の分解は、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を経て進行すると考えられるので（例えば、細胞内におけるエストロゲン受容体の分解は、タンパク質（ａ）による核内受容体のユビキチン化を経て進行する）、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００７３】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制又は促進できる物質は、タンパク質（ａ）又は（ｃ）、核内受容体及びユビキチンのうち、１種類に作用する物質であってもよいし、２種類以上に作用する物質であってもよい。タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を抑制できる物質には、タンパク質（ａ）又は（ｄ）と核内受容体との結合を抑制できる物質、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とユビキチンとの結合を抑制できる物質、核内受容体とユビキチンとの結合を抑制できる物質等が含まれる。核内受容体とユビキチンとの結合を抑制できる物質は、解離状態にある核内受容体とユビキチンとの結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にある核内受容体とユビキチンとを解離させることができる物質であってもよい。
【００７４】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）と核内受容体とユビキチンとは、in vitroで反応させてもよいし、in vivoで反応させてもよい。
【００７５】
in vitroで反応させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）、核内受容体及びユビキチンとして、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００７６】
in vivoで反応させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）、核内受容体及びユビキチンとして、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００７７】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）と核内受容体とユビキチンとを反応させる際、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、タンパク質（ａ）又は（ｄ）の誘導体を使用してもよいし、タンパク質（ａ）又は（ｄ）と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質を使用してもよい。核内受容体及びユビキチンについても同様である。
【００７８】
誘導体の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｄ）については核内受容体及びユビキチンに対する反応性が保持される限り特に限定されるものではなく、核内受容体についてはタンパク質（ａ）又は（ｄ）及びユビキチンに対する反応性が保持される限り特に限定されるものではなく、ユビキチンについてはタンパク質（ａ）又は（ｃ）及び核内受容体に対する反応性が保持される限り特に限定されるものではない。このような誘導体化としては、例えば、標識物質の付加；リン酸基、メチル基、アセチル基等による修飾等が挙げられる。標識物質の具体例は上記と同様である。
【００７９】
融合タンパク質の種類は、タンパク質（ａ）又は（ｄ）については核内受容体及びユビキチンに対する反応性が保持される限り特に限定されるものではなく、核内受容体についてはタンパク質（ａ）又は（ｄ）及びユビキチンに対する反応性が保持される限り特に限定されるものではなく、ユビキチンについてはタンパク質（ａ）又は（ｃ）及び核内受容体に対する反応性が保持される限り特に限定されるものではない。融合させる他のタンパク質又はペプチドの具体例は上記と同様である。
【００８０】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）と核内受容体とユビキチンとを反応させる際、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化に影響を与える条件を調節し、タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化が試験物質の有無に依存するようにする。
【００８１】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１及びＥ２の有無、タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度、ユビキチンの濃度、核内受容体の濃度、Ｅ１及びＥ２の濃度、Ｅ２の種類、核内受容体の種類、核内受容体とユビキチンとの結合をモジュレートする介在タンパク質（すなわち、両者の結合に直接的又は間接的に影響を与え、当該結合を促進、阻害又は調節するタンパク質）の有無、核内受容体の翻訳後修飾の有無と種類等が挙げられる。
【００８２】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）と核内受容体とユビキチンとを反応させる際の温度は、例えば、０〜５０℃に設定できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）と核内受容体とユビキチンとを反応させる際の溶媒としては、例えば、１価又は２価の塩類を含むｐＨ５．５〜８．５の緩衝液；エタノール、エチレングリコール、グリセリン、ＤＭＳＯ等を添加して疎水性を調節した緩衝液等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度、ユビキチンの濃度、核内受容体の濃度、並びにＥ１及びＥ２の濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌに設定できる。介在タンパク質としては、例えば、ユビキチンが結合する核内受容体の領域と同一の領域に結合し、ユビキチンと競合するコアクティベーター又はコリプレッサー；リン酸化その他の修飾により核内受容体とユビキチンとの結合を制御するタンパク質等が挙げられる。核内受容体の翻訳後修飾としては、例えば、リン酸基、メチル基、アセチル基等による翻訳後修飾が挙げられる。
【００８３】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビチキン化には、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）及びＥ２（ユビキチン結合酵素）が必要である。したがって、タンパク質（ａ）又は（ｃ）と核内受容体とユビキチンとを反応させる際、Ｅ１及びＥ２を共存させる。
【００８４】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化量は、例えば、核内受容体とユビキチンとの結合量を指標として測定できる。核内受容体とユビキチンとの結合量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合量と同様にして測定できる。
【００８５】
試験物質がタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を抑制できるか否か又は促進できるか否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００８６】
in vivoにおいては、例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が発現しているモデル動物に試験物質を投与した後、モデル動物から検体（タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が発現している細胞又は組織）を採取し、当該検体における当該遺伝子の発現レベルを測定し、試験物質の投与前における発現レベルと試験物質の投与後における発現レベルとを比較する。その結果、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも小さければ、試験物質が当該遺伝子の発現を抑制できると判別できる。一方、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも大きければ、試験物質が当該遺伝子の発現を促進できると判別できる。
【００８７】
モデル動物としては、例えば、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子を人為的に発現させたトランスジェニック動物を使用できる。トランスジェニック動物は、例えば、(i) タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子と卵とを混合してリン酸カルシウムで処理する方法、(ii) 位相差顕微鏡下で前核期卵の核にタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、(iii) 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等の公知の方法によって作製できる。
【００８８】
in vitroにおいては、例えば、検体（タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子が発現している細胞又は組織）に試験物質を接触させた後、当該検体における当該遺伝子の発現レベルを測定し、試験物質の投与前における発現レベルと試験物質の投与後における発現レベルとを比較する。その結果、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも小さければ、試験物質が当該遺伝子の発現を抑制できると判別できる。一方、試験物質の投与後における発現レベルが試験物質の投与前における発現レベルよりも大きければ、試験物質が当該遺伝子の発現を促進できると判別できる。
【００８９】
試験物質を接触させる細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等由来の細胞株、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子を人為的に発現させた細胞を使用できる。このような細胞は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより作製できる。
【００９０】
細胞内における核内受容体の分解は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）と核内受容体との結合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）とユビキチンとの結合、あるいはタンパク質（ａ）又は（ｄ）による核内受容体のユビキチン化を経て進行すると考えられるので、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を抑制できる物質は核内受容体分解抑制作用を有する可能性があり、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を促進できる物質は核内受容体分解促進作用を有する可能性がある。したがって、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を抑制できる物質を核内受容体分解抑制物質としてスクリーニングでき、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を促進できる物質を核内受容体分解促進物質としてスクリーニングできる。
【００９１】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現を抑制又は促進できる物質は、当該遺伝子の転写過程及び翻訳過程の一方を抑制又は促進できる物質であってもよいし、両方を抑制又は促進できる物質であってもよい。
【００９２】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現レベルには、当該遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。したがって、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡの存在量又はタンパク質の存在量に基づいて測定できる。
【００９３】
ｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用できる。
【００９４】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用でき、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常７〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常３０〜６４２８塩基、好ましくは５０〜３０００塩基である。
【００９５】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等に特異的にハイブリダイズできることが好ましい。「特異的にハイブリダイズできる」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００９６】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計できる。プライマーの５'末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加でき、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加できる。
【００９７】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズできるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードするｍＲＮＡの存在量を測定できる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００９８】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用できる。
【００９９】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、(i) 反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば32Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(iii) ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定できる。
【０１００】
蛍光色素を用いた定量方法としては、(i) 二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（EtBr）、SYBR GreenI、PicoGreen等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、(ii) 蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定できる。
【０１０１】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に反応できる抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用できる。
【０１０２】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に反応できる抗体又はその断片を用いて、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、化学発光測定法（CLIA）、蛍光免疫測定法(FIA)、組織免疫染色法等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を捕捉した後、捕捉されたタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を、固相担体に固定化した抗体とはタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量できる。
【０１０３】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の存在量の測定は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の活性を測定することによって行うこともできる。タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の活性は、例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に反応できる抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定できる。
【０１０４】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しないタンパク質（例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
【０１０５】
目的とするタンパク質（例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）、核内受容体、ユビキチン等）を発現できる組換えベクターは、例えば、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製できる。目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列は、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように塩基を置換しておくことが好ましい。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
【０１０６】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【０１０７】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等を使用できる。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【０１０８】
宿主細胞として使用できる細菌としては、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌が挙げられる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターや、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを使用できる。
【０１０９】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【０１１０】
宿主細胞として使用できる酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用できる。
【０１１１】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
【０１１２】
宿主細胞として使用できる動物細胞としては、例えば、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が挙げられる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
【０１１３】
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
【０１１４】
宿主細胞として使用できる昆虫細胞としては、例えば、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等が挙げられる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。
【０１１５】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入できる限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【０１１６】
組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１１７】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化できる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地及び合成培地のいずれを使用してもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
【０１１８】
形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は通常３０〜３７℃、培養時間は通常１２〜１６時間であり、培養期間中はｐＨを６．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１２０】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、α-MEM培地、DMEM培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３０〜３７℃で１〜７日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２１】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、TC-100 培地 (Gibco BRL社製)、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる。形質転換体の培養は、通常２５〜２８℃で４８〜９６時間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１２２】
目的とするタンパク質は、形質転換体の培養物から抽出できる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出できる。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合、培養上清から目的とするタンパク質を抽出できる。抽出したタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等を利用して精製できる。
【０１２３】
目的とするタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等を利用して化学合成できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
【０１２４】
目的とするタンパク質は、in vitro転写・翻訳系を利用して合成できる。in vitro転写・翻訳系は、in vitroにおいて核酸からｍＲＮＡへの転写を行うことができるin vitro転写系と、in vitroにおいてｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を行うことができるin vitro翻訳系とからなり、in vitro転写・翻訳系には、転写及び翻訳に必要な全ての要素（例えば、ポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ等）が含まれる。in vitro転写・翻訳系の具体例としては、真核細胞及び原核細胞の抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられ、無細胞転写・翻訳系の具体例としては、大腸菌（例えば大腸菌Ｓ３０）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液から調製された無細胞転写・翻訳系が挙げられる。
【０１２５】
目的とする遺伝子（例えば、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子、核内受容体をコードする遺伝子、ユビキチンをコードする遺伝子）は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得ることができる。
【０１２６】
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）の細胞又は組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用できる。
【０１２７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Gibco BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社製）等を使用できる。
【０１２８】
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、目的とする遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的とするＤＮＡを得ることができる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン等で標識したものを使用できる。目的とするＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
【０１３０】
取得されたＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できるが、通常は、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer社製）等の塩基配列分析装置を用いて配列決定する。
【０１３１】
目的とする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成できる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【０１３２】
目的とする遺伝子がタンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子である場合、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子に人為的に変異を導入する公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法等を使用できる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。
【０１３３】
目的とするタンパク質に反応できる抗体は、目的とするタンパク質を免疫用抗原として利用することより作製できる。
【０１３４】
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫の際には、抗体産生を誘導するために、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回免疫する。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント(FCA)の他、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できる。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。最終免疫日から数日後に、目的とするタンパク質に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等により行うことができる。
【０１３５】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【０１３６】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から数日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【０１３７】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【０１３８】
細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。
【０１３９】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等によってスクリーニングできる。
【０１４０】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用できる。      
【０１４１】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【０１４２】
スクリーニングされた核内受容体分解抑制物質は、核内受容体の分解を抑制できるので、骨粗鬆症、肥満、糖尿病、高脂血症、更年期障害、ホルモン依存性癌その他のホルモン性疾患等の予防・治療に有用である。また、スクリーニングされた核内受容体分解促進物質は、核内受容体の分解を促進できるので、骨粗鬆症、肥満、糖尿病、高脂血症、更年期障害、ホルモン依存性癌その他のホルモン性疾患等の予防・治療に有用である。
【実施例】
【０１４３】
以下の試験例において、細胞の培養、組換えベクターの構築、一過性トランスフェクション、細胞核抽出液の調製、ＧＳＴプルダウン、免疫沈降及びウェスタンブロッティングは次のように行った。
【０１４４】
（１）細胞の培養
ＨｅＬａ細胞及びヒト乳癌由来ＭＣＦ−７細胞は、１０％ ＦＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５％（分圧）の炭酸ガスを含む加湿空気中、３７℃で培養した。
【０１４５】
（２）組換えベクターの構築
ＮＲＤＦをコードするｃＤＮＡ（配列番号１参照）をｐＣＤＮＡ３（invitrogen社製）に挿入して組換えベクターを構築した。また、アミノ酸番号１９５９のシステインをグリシンに変異させたＮＲＤＦの変異体（ＮＲＤＦ（ＣＧ）；図２（ａ）参照）をコードするｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３に挿入して組換えベクターを構築した。
【０１４６】
（３）一過性トランスフェクション
目的とするＤＮＡをOptiMEM培地（Life Technologies, Inc.）１００μＬで希釈した。ＤＮＡ量はブランクのベクターを補って総量１μｇに調節した。リポフェクタミン試薬（Life Technologies, Inc.）１０μＬも同様にOptiMEM培地１００μＬで希釈した。室温で５分静置した後、両液を混合してさらに２０分間静置して複合体を形成させた。次いで、１２穴プレートに播種し、０．２％活性炭処理ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで４０〜５０％コンフレントまで培養した細胞に、この混合液を直接滴下してトランスフェクションを行った。トランスフェクション６時間後に通常の培地に交換し、さらに２４時間培養してからリガンドを添加した。
【０１４７】
（４）細胞核抽出液の調製
細胞核抽出液の調製は公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に修正を加えて行った。
【０１４８】
（５）ＧＳＴプルダウン及び免疫沈降
ＧＳＴプルダウンは公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に従って行った。約５０μｇのＭＣＦ−７細胞核抽出液をそれぞれ５０μｇのグルタチオンセファロースビーズ又は抗Ｆｌａｇタグ抗体（Santa Cruz Biotechnology）ビーズとともに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭ トリス緩衝生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）中、４℃で１時間インキュベートした。タンパク質が結合したビーズを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭ トリス緩衝生理食塩水で４回洗浄し、５０００回転で１分間遠心分離してビーズを回収した。ビーズからのタンパク質の溶出は、ローディング緩衝液中で煮沸して行った。
【０１４９】
（６）ウェスタンブロッティング
各抗体を用いたウェスタンブロッティングは、公知の方法（Yanagisawa, J. et. al., Molecular Cell (2002) Mar : 9(3) : 553-562）に若干の変更を加えて行った。ＭＣＦ−７細胞の各抽出液１０μｇを８％又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでニトロセルロース膜に転写した。その膜を、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２５ｍＭトリス緩衝生理食塩水（Ｔ−ＴＢＳ）中に１％ＢＳＡ（bovine serum albumin）及び５％スキムミルクを加えたブロッキング溶液中で１時間インキュベートし、次いで２５℃で１時間、各抗体と反応させた。２５℃のＴ−ＴＢＳで３回、各１０分間洗浄後、膜をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体とともに２５℃で１分間インキュベートした。抗体と反応したタンパク質は、アマシャム・ファルマシア社製の高感度化学発光検出システム（ＥＣＬ）を用いて可視化した。
【０１５０】
〔試験例１〕エストロゲン受容体にエストロゲン依存的に結合するユビキチンリガーゼの単離
ＨｅＬａ細胞抽出液からエストロゲン受容体（ＥＲ）に結合するタンパクを精製した。エストロゲン受容体α（ＥＲα）のリガンド結合ドメインとＧＳＴとの融合タンパクをグルタチオンセファロースビーズ（アマシャム・ファルマシア製）カラムに固定し、１００ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液で平衡化した。ＨｅＬａ細胞から核抽出液を調製し、上記グルタチオンセファロースビーズカラムに添加した。公知の方法（Yanagisawa, J., et. al., Molecular Cell (2002) Mar ; 9(3) : 553-562）に従って洗浄及び溶出を行った。溶出画分を７．５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で展開し、ＣＢＢ染色後、各バンドを切り出した。切り出したバンドからタンパク質を溶出し、トリプシン分解後、ＭＡＲＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（アプライド製）によりＭＳフィンガープリントを得た。それぞれのタンパク質のＭＳフィンガープリントを公開データベース（カリフォルニア大学）で検索したところ、ユビキチンリガーゼに特徴的なＨＥＣＴ配列及びＷＷＥ配列を持つ、分子量２２０ｋＤａのタンパク質を発見した。以下、このタンパク質を「ＮＲＤＦ」と呼ぶ。ＮＲＤＦのアミノ酸配列を配列番号２に示し、ＮＲＤＦをコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【０１５１】
〔試験例２〕ＮＲＤＦはリガンド依存的に核内受容体と結合することを示す試験
図１（ａ）に示す構成を有するＧＳＴ−ＥＲαＡＦ−２融合タンパク質、ＧＳＴ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質及びＧＳＴ−ＶＤＲ（ビタミンＤ受容体）融合タンパク質を作製した。
ＧＳＴ−ＥＲαＡＦ−２融合タンパク質は、ＧＳＴにＥＲαのリガンド結合領域を融合させたタンパク質であり、リガンドが結合することによってヘリックス１２の構造変化を起こす（転写活性型となる）。一方、ＧＳＴ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＥＲα融合タンパク質のヘリックス１２部分を欠失させたタンパク質であり、リガンドは結合するが、リガンドが結合しても転写活性に必要な構造変化は誘起されない。
【０１５２】
３５Ｓ−メチオニンを含有するウサギ網状赤血球抽出液中に、ＮＲＤＦをコードするｃＤＮＡを添加して３０℃で２時間反応させ、３５Ｓ標識ＮＲＤＦをin vitro合成した。ＧＳＴ−ＥＲαＡＦ−２融合タンパク質、ＧＳＴ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質及びＧＳＴ−ＶＤＲ融合タンパク質をそれぞれ３５Ｓ標識ＮＲＤＦと混合し、核内受容体リガンド（１０ｎＭ エストロゲン又は１０ｎＭ ビタミンＤ）存在下又は非存在下、４℃で１時間インキュベートした。次いで、グルタチオンビーズを添加し、５０００回転で１分間遠心分離して、ビーズに結合したタンパク質を回収した。その後、各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーで３５Ｓ標識ＮＲＤＦを検出した。結果を図１（ｂ）に示す。なお、図１（ｂ）中、「＋」は核内受容体リガンド存在下、「−」は核内受容体リガンド非存在下を表す。
【０１５３】
図１（ｂ）に示すように、ＧＳＴ−ＥＲαＡＦ−２融合タンパク質は、核内受容体リガンド（エストロゲン）存在下ではＮＲＤＦと強く結合したが、核内受容体リガンド（エストロゲン）非存在下ではＮＲＤＦと結合しなかった。ＧＳＴ−ＶＤＲ融合タンパク質は、核内受容体リガンド（ビタミンＤ）存在下ではＮＲＤＦと強く結合し、核内受容体リガンド（ビタミンＤ）非存在下ではＮＲＤＦと弱く結合した。これに対して、ＧＳＴ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質は、核内受容体リガンド（エストロゲン）存在下でも非存在下でもＮＲＤＦと結合しなかった。
【０１５４】
〔試験例３〕ＮＲＤＦがユビキチンリガーゼ活性を有することを示す試験
ＮＲＤＦがユビキチンリガーゼ活性を有することを示す目的で、ＮＲＤＦの自己ユビキチン化を測定した。３５Ｓ−メチオニンを含有するウサギ網状赤血球抽出液中に、ＮＲＤＦをコードするｃＤＮＡを添加して３０℃で２時間反応させ、３５Ｓ標識ＮＲＤＦをin vitro合成した後、同反応液にＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｕｂ）を添加し、５分間インキュベートした。その後、グルタチオンビーズを加え５０００回転で１分間遠心分離し、ＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質に結合した３５Ｓ標識ＮＲＤＦを回収した。その後、各サンプルを２分割し、一方は無処理、他方はＤＴＴ処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、オートラジオグラフィーでＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質に結合した３５Ｓ標識ＮＲＤＦ（ＧＳＴ−Ｕｂ−ＮＲＤＦ）を検出した。その結果を図２（ｂ）に示す。なお、図２（ｂ）中、ＧＳＴ−Ｕｂに関する「＋」はＧＳＴ−Ｕｂを添加した場合を表し、ＧＳＴ−Ｕｂに関する「−」はＧＳＴ−Ｕｂを添加しなかった場合を表し、ＤＴＴに関する「＋」はＤＴＴで処理した場合を表し、ＤＴＴに関する「−」はＤＴＴで処理しなかった場合を表す。
【０１５５】
図２（ｂ）に示すように、回収画分中には、ＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質に結合した３５Ｓ標識ＮＲＤＦ（ＧＳＴ−Ｕｂ−ＮＲＤＦ）のバンドが確認された（レーン４）。ＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質を添加していないコントロール実験（レーン２）では、このバンドは検出できないので、このバンドはグルタチオンビーズに対する非特異的吸着によるものではない。このバンドはＮＲＤＦの本来の分子量より高分子量側にシフトしているが、ＤＴＴ処理による還元でＮＲＤＦの分子量に復帰した（レーン５）。このことは、ＮＲＤＦとユビキチンの結合が、ユビキチンとタンパク質との一般的な結合様式であるチオエステル結合であることを示している。
【０１５６】
一方、ＮＲＤＦの代わりに、ＨＥＣＴ配列中のユビキチン結合部位に位置するシステイン（アミノ酸番号１９５９）をグリシンに置換したＮＲＤＦ（ＣＧ）を使用した場合（図２（ａ）参照）、図２（ｂ）に示すように、ＮＲＤＦ（ＣＧ）とＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質との結合は検出されなかった（レーン８）。このことは、ＮＲＤＦとユビキチンとの結合がＨＥＣＴ配列の存在で予測された様式に従うことを示している。
なお、上記実験系において、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１及びＥ２は、網状赤血球抽出液から供給されている。
【０１５７】
〔試験例４〕in vitroにおいてＮＲＤＦがエストロゲン受容体αをユビキチン化することを示す試験
ＥＲα（ＭＢＬ社製）、ＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｕｂ）、ユビキチン転移系タンパク質Ｅ１及びＥ２（ボストン・バイオケム社製）、並びにＮＲＤＦを混合し、３７℃で１時間反応させた後、グルタチオンビーズを添加して５０００回転で１分間遠心分離し、ビーズに結合したタンパク質を回収した。回収した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、抗ＥＲα抗体を用いたウェスタンブロッティングを行い、回収画分中のＥＲα量を測定した。結果を図３に示す。
【０１５８】
図３に示すように、ＥＲα、ＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質、Ｅ１、Ｅ２及びＮＲＤＦの全てを反応液に添加した場合（レーン５）のみ、ポリユビキチン化されたＥＲαのスメアなバンドが検出された。Ｅ１及びＥ２を欠く場合（レーン３）、ＥＲαのユビキチン化が観察されなくなることから、ＥＲαのユビキチン化が通常のタンパク質ユビキチン化経路によると考えられる。また、ＮＲＤＦを欠く場合（レーン４）、ＥＲαのユビキチン化が観察されなくなることから、ＮＲＤＦがＥＲαにユビキチンを転移するユビキチンリガーゼであることが示された。
【０１５９】
〔試験例５〕in vivoにおいてＮＲＤＦがエストロゲン受容体αをユビキチン化することを示す試験
ＭＣＦ−７細胞に、Ｆｌａｇタグ−ＥＲα融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドと、ＮＲＤＦ又はその不活性型であるＮＲＤＦ（ＣＧ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドとをコトランスフェクションし、２４時間培養後、１０ｎＭ エストロゲンを添加して、さらに２４時間培養し、細胞を集めて核抽出液を調製した。調製した核抽出液からＥＲαを抗Ｆｌａｇタグ抗体で免疫沈降し、得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、抗ユビキチン抗体でウェスタンブロッティングを行い、ユビキチン化ＥＲαを選択的に検出した。その結果を図４に示す。
【０１６０】
図４に示すように、検出されるバンドはポリユビキチン化で分子量が不均一になることを反映してスメアになった。核抽出液中には内在性のＥＲαユビキチン化酵素系が存在するため、精製タンパク質の系と異なりＮＲＤＦをトランスフェクトしていない状態でもＥＲαのユビキチン化は生じるが、ＥＲαのユビキチン化量はエストロゲンで処理した場合（レーン３）の方がエストロゲンで処理しない場合（レーン２）より多かった。そこに、ＮＲＤＦを発現させると、添加したプラスミド量（０．２又は０．５μｇ）に対応してＥＲαのユビキチン化量も増加した（レーン４〜６）。
【０１６１】
一方、不活性型ＮＲＤＦ（ＣＧ）を発現させた場合には、ＥＲαのユビキチン化量はバックグラウンドと比較して変化が見られなかった（レーン７）。
なお、細胞内でのＥＲα及びＮＲＤＦの発現量をウェスタンブロッティングにより検出し、ＥＲαの発現量に差がないこと及びＮＲＤＦ発現量が添加したプラスミド量に対応していることを確認した（データは示さない）。
【０１６２】
これらの結果から、ＮＲＤＦは細胞内でＥＲαをユビキチン化する活性を有すること及びこの活性がＨＥＣＴ配列に依存することが示された。以上の結果を総合すると、ＮＲＤＦはＥＲαをユビキチン化するユビキチンリガーゼであると考えられる。
【０１６３】
〔試験例６〕in vivoにおいてＮＲＤＦがエストロゲン依存的にＥＲαの分解を促進することを示す試験
ＭＣＦ−７細胞に、Ｆｌａｇタグ−ＥＲα融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドと、ＮＲＤＦをコードするＤＮＡを含むプラスミドとを一過性にトランスフェクトした。また、対照としてＦｌａｇタグ−Ｓｍａｄ１をコードするＤＮＡを含むプラスミドも同時にトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間培養した後、培地に１０ｎＭ エストロゲンを添加し、更に２４時間培養した。その後、細胞を回収し、核抽出液を調製して、抗Ｆｌａｇタグ抗体でウェスタンブロッティングを行った。ＮＲＤＦは発現量が少なかったため、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫沈降で濃縮してからウェスタンブロッティングを行った。発現させた全てのタンパクにＦｌａｇタグを付加したのは、内在性のものと区別して検出し、測定の精度を増すためである。結果を図５に示す。
【０１６４】
図５（ａ）に示すように、エストロゲン存在下では、ＮＲＤＦの発現量（０．０５〜０．５μｇ；トランスフェクションしたプラスミドの質量）が高くなるに従ってＥＲα量は減少したが（レーン３〜６）、図５（ｂ）に示すように、エストロゲン非存在下では、ＮＲＤＦの発現量（０．０５〜０．５μｇ；トランスフェクションしたプラスミドの質量）が変化してもＥＲα量は変化しなかった。このことは、ＮＲＤＦがエストロゲン依存的なＥＲαの分解を促進することを示す。
【０１６５】
また、エストロゲンと同時にプロテアソーム抑制剤であるＭＧ１３２を培地に添加したところ、図６（ａ）に示すように、ＮＲＤＦの発現量（０．０５〜０．５μｇ；トランスフェクションしたプラスミドの質量）が変化してもＥＲα量は変化しなかった。このことから、ＥＲα量の減少は、ＥＲαの発現量低下によるものではなく、通常のユビキチン化タンパク質と同様にプロテアソームによる分解であることが示された。さらに、図６（ｂ）に示すように、不活性型ＮＲＤＦ（ＣＧ）の発現量（０．０５〜０．５μｇ；トランスフェクションしたプラスミドの質量）を変化させてもＥＲα量が変化しなかったことから、ＥＲαの分解にはＮＲＤＦのユビキチン転移活性が必要なことが示された。
【０１６６】
〔試験例７〕ＮＲＤＦによるエストロゲン依存的なＥＲαの分解は転写活性化とリンクしていることを示す試験
エストロゲン受容体の部分的アゴニストであるタモキシフェン（ＯＨＴ）はＥＲαと結合した場合でもその転写活性化能の一部しか活性化しないため、ホルモン依存性乳癌に対する化学療法剤として利用されている。ＥＲαにエストロゲンとＯＨＴが結合した場合、ＥＲαの立体構造変化に差があることが知られており、特にＥＲαのＣ末端にあるヘリックス１２の構造変化が転写活性化能の違いに重要であると言われている。ヘリックス１２を欠く変異体であるＥＲαΔＡＤは、ＮＲＤＦと結合しない（図１参照）ので、ＥＲαとＮＲＤＦとの結合にもヘリックス１２は重要であると考えられる。そこで、ＯＨＴがＮＲＤＦによるＥＲα分解におよぼす影響を調べる目的で、上記と同様の一過性トランスフェクション実験を１０ｎＭ ＯＨＴを添加して行った。結果を図７に示す。
【０１６７】
図７（ａ）に示すように、エストロゲンの場合と異なりＯＨＴはＥＲαのリガンド依存的分解を促進しなかった（レーン５）。また、図７（ｂ）に示すように、ＥＲαΔＡＤはＥＲαが分解される条件でも分解を受けないことから（レーン５）、転写活性化と同様、ＥＲαのリガンド依存的分解にもヘリックス１２が重要であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】（ａ）は、ＧＳＴ−ＥＲαＡＦ−２融合タンパク質、ＧＳＴ−ＥＲαΔＡＤ融合タンパク質及びＧＳＴ−ＶＤＲ融合タンパク質の構成を示す模式図であり、（ｂ）は、核内受容体リガンド（エストロゲン）存在下又は不存在下におけるＮＲＤＦと各融合タンパク質との結合の有無を示す図である。
【図２】（ａ）は、ＮＲＤＦ及びＮＲＤＦ（ＣＧ）の構成を示す模式図であり、（ｂ）は、ＮＲＤＦ又はＮＲＤＦ（ＣＧ）とＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｕｂ）との結合の有無を示す図である。
【図３】Ｅ１、Ｅ２及びＮＲＤＦの存在下又は不存在下におけるＥＲαとＧＳＴ−ユビキチン融合タンパク質（ＧＳＴ−ＵＢ）との結合の有無を示す図である。
【図４】抗ユビキチン抗体を用いたウェスタンブロッティングによりユビキチン化ＥＲαを選択的に検出した結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、エストロゲン存在下におけるＮＲＤＦの発現量とＥＲα量との関係を示す図であり、（ｂ）は、エストロゲン不存在下におけるＮＲＤＦの発現量とＥＲα量との関係を示す図である。
【図６】（ａ）は、エストロゲン及びＭＧ１３２存在下におけるＮＲＤＦの発現量とＥＲα量との関係を示す図であり、（ｂ）は、エストロゲン存在下におけるＮＲＤＦ（ＣＧ）の発現量とＥＲα量との関係を示す図である。
【図７】（ａ）は、ＥＲαのリガンド依存的分解に対するタモキシフェン（ＯＨＴ）の影響の有無を示す図であり、（ｂ）は、ＥＲα△ＡＤの分解の有無を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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