(57)【要約】    【課題】  ブロッティングメンブレンから膜片を確実に分離するとともに、この膜片をカッター内部に保持し、採取容器に配置することが可能なピッキング方法を提供すること。    【解決手段】  タンパク質が転写されたブロッティングメンブレンの一部を採取するブロッティングメンブレンのピッキング方法について、処理対象となるブロッティングメンブレンを、耐圧縮性を有し、破断容易な基材上に配置する第１工程と、先端開口が鋭利な筒状のカッターを前記ブロッティングメンブレンに向けて近接させ、前記カッターの先端をブロッティングメンブレンに貫通させるとともに、前記基材の表面を破断してその内部に進入させることで、ブロッティングメンブレンの一部を切り取る第２工程と、前記カッターの内部に減圧することで、切り取ったブロッティングメンブレンの膜片を前記カッターで保持する第３工程と、前記膜片を保持した状態で前記カッターを移動させ、前記膜片を採取容器中に配置する第４工程とで構成した。  【選択図】    図１
2005172529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質が転写されたブロッティングメンブレンの一部を採取するブロッティングメンブレンのピッキング方法であって、
処理対象となるブロッティングメンブレンを、耐圧縮性を有し、破断容易な基材上に配置する第１工程と、
先端開口が鋭利な筒状のカッターを前記ブロッティングメンブレンに向けて近接させ、前記カッターの先端をブロッティングメンブレンに貫通させるとともに、前記基材の表面を破断してその内部に進入させることで、ブロッティングメンブレンの一部を切り取る第２工程と、
切り取ったブロッティングメンブレンの膜片を前記カッターで保持する第３工程と、
前記膜片を保持した状態で前記カッターを移動させ、前記膜片を採取容器中に配置する第４工程と
を有していることを特徴とするピッキング方法。
【請求項２】
前記第３工程において、前記カッターの内部を減圧することで、前記カッターによるブロッティングメンブレンの膜片を引き寄せて保持することを特徴とする請求項１に記載のピッキング方法。
【請求項３】
前記基材が、発泡プラスチックによって形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のピッキング方法。
【請求項４】
前記第４工程に先立って、前記採取容器の内部に予め有機溶媒を含む液体を収容し、
前記第４工程において、前記カッターの先端を前記採取容器中の液体に浸した状態で、前記カッターの内部を加圧することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のピッキング方法。
【請求項５】
前記カッターは、その内壁の周方向全体に密着して摺動する摺動部材を備えていることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のピッキング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質が転写された膜の一部を切り取って採取するためのピッキング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、タンパク質を添加したゲルを電気泳動法により分離することで、添加されたタンパク質の特性を解析するタンパク質解析方法がある。（例えば特許文献１）
【０００３】
前述のようなタンパク質の分離を行った後に、より詳細にその機能及び構造を解析する場合、ペプチドマスフィンガープリント法を用いることが知られている。この方法の手順を図３を用いて説明する。まず、ＳＴＥＰ１において、電気泳動後のゲルをブロッティングメンブレンの一例であるＰＶＤＦ（ポリビリニデンジフルオライド）膜上に接触させた状態で、ゲル及びＰＶＤＦ膜に所定の電流を流し、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写する。次に、タンパク質転写後のＰＶＤＦ膜の一部を切り取って膜片を採取し、この膜片を所定の採取容器内に移す（ＳＴＥＰ２）。そして、採取容器内の膜片に所定の前処理を施した後（ＳＴＥＰ３）、トリプシン等の酵素を膜片上に転写されたタンパク質と反応させる（ＳＴＥＰ４）。この反応によって得られた反応液を、質量分析等によって分析することで、タンパク質の詳細な解析を行う（ＳＴＥＰ５）。
【０００４】
一方、ＰＶＤＦ膜はタンパク質を極めて吸着し易い性質を有しているため、ＰＶＤＦ膜の一部を切り取って膜片を採取し、採取容器に移す作業において、手で直接触れることができない。従って、一般的には膜片の採取の際には、特別なピッキング装置を用いて膜片を採取する作業が行われている。
【０００５】
図４は、このようなピッキング装置を構成するカッターを概略的に示す断面図であって、カッターがＰＶＤＦ膜の一部を切り取る様子を示している。図４に示すように、ピッキング装置は、先端開口に刃部１１ａを備えた円筒形状のカッター１１と、カッター１１の内部からを加圧または減圧可能なピストン１２とを備えている。カッター１１は下方に移動し、刃部１１ａがタンパク質の転写されたＰＶＤＦ膜２０を貫通することで、その一部（膜片）を切り取ることができる。カッター１１がＰＶＤＦ膜２０を貫通した後、吸引部１２によってカッター１１の内部を減圧し、カッター１１内部に切り取った膜片を保持する。ＰＶＤＦ膜の膜片を保持した状態で、ピッキング部１０を採取容器（図示しない）の上に移動させ、吸引部１２を停止することによってカッター１１内部を加圧し、膜片を採取容器内部に吐出する。
【特許文献１】特開２００２−３６５１７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の方法では、カッター１１によって切り取ったＰＶＤＦ膜２０の膜片が、カッター１１の内部にうまく保持されず、ＰＶＤＦ膜２０から膜片を分離できないことがある。そのため、ＰＶＤＦ膜の膜片を採取し、この膜片を採取容器に移動させることが確実に行われず、タンパク質の迅速な解析を遅延させる要因となっている。
【０００７】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、ブロッティングメンブレンから膜片を確実に分離するとともに、この膜片をカッター内部に保持することが可能なピッキング方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記目的を達成するために、タンパク質が転写されたブロッティングメンブレンの一部を採取するブロッティングメンブレンのピッキング方法であって、処理対象となるブロッティングメンブレンを、耐圧縮性を有し、破断容易な基材上に配置する第１工程と、先端開口が鋭利な筒状のカッターを前記ブロッティングメンブレンに向けて近接させ、前記カッターの先端をブロッティングメンブレンに貫通させるとともに、前記基材の表面を破断してその内部に進入させることで、ブロッティングメンブレンの一部を切り取る第２工程と、切り取ったブロッティングメンブレンの膜片を前記カッターで保持する第３工程と、前記膜片を保持した状態で前記カッターを移動させ、前記膜片を採取容器中に配置する第４工程とを有していることを特徴とするピッキング方法を提供する。（請求項１）
【０００９】
また、前記第３工程において、前記カッターの内部に減圧することで、前記カッター内部にブロッティングメンブレンの膜片を引き寄せるようにしてもよい。（請求項２）
【００１０】
また、前記基材の材質は、発泡プラスチックによって形成することが好適である。（請求項３）
【００１１】
また、本発明は、前記第４工程に先立って、前記採取容器の内部に予め有機溶媒を含む液体を収容し、前記第４工程において、前記カッターの先端を前記採取容器中の液体に浸した状態で、前記カッターの内部を加圧するようなピッキング方法をも提供する。（請求項４）
【００１２】
さらに、前記カッターは、その内壁の周方向全体に密着して摺動する摺動部材を備えるように構成されていてもよい。（請求項５）
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、カッターがブロッティングメンブレンを貫通し、基材上面を破断してその内部に進入するため、ブロッティングメンブレンの膜片をブロッティングメンブレンから完全に分離することができる。さらに、カッターがブロッティングメンブレンを貫通した後に、破断した基材によって、ブロッティングメンブレンから分離した膜片がカッター内部に押し込まれるため、切り取られた膜片はカッターによって確実に保持される。なお、ここでいう「耐圧縮性及び破断容易性を有している」とは、通常の押圧に対しては材料表面の結合力が働いて圧縮しにくいにも係わらず、一部を切り取られて押圧されると、適度に圧縮する性質をいう。このような材質としては、例えば発泡スチロール、発泡ウレタン、発泡ポリプロピレン等の発泡プラスチックが挙げられる。（請求項３）
【００１４】
また、請求項２に記載の発明によれば、前記カッターが膜片を切り取った際に、膜片を減圧によって引き寄せることができるので、前記膜片をカッター内に確実に保持することができる。
【００１５】
また、請求項４に記載の発明によれば、カッターの先端に保持された膜片が採取容器中の液体に浸された状態で、カッター内部からの圧力により膜片を外部へ押し出すため、膜片を採取容器内に容易に配置することができる。
【００１６】
また、請求項５に記載の発明によれば、摺動部材の上下方向の摺動により、カッター内部を簡単に減圧することができるため、カッターで膜片を保持する操作を容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について添付図面を参照しつつ説明する。なお説明に用いる図面においては、同一又は同種の部分に同じ番号を付して説明を省略することがある。
【００１８】
図１は、本実施形態に係るピッキング方法を実施するためのピッキング装置全体を概略的に示す側面図であり、図２は、前記ピッキング装置の一部を構成するカッターの内部を示す断面図である。また、図３は前記ピッキング装置によってブロッティングメンブレンの一例であるＰＶＤＦ膜の一部（膜片）が採取される工程を示す側面図である。
【００１９】
図１に示すように、ピッキング装置１は、先端開口が刃部１１ａを構成する筒状のカッター１１と、ピッキング対象のＰＶＤＦ膜２０を載置するステージ３０とを備えている。カッター１１は、その上方に配置された移動機構４０に対して、軸回りに回転自在に支持されており、上下方向、水平方向に移動可能になっている。なお、移動機構４０は、ＸＹテーブルやシリンダ、ボールネジ等の公知の駆動手段で構成することができる。
【００２０】
また、カッター１１の内部には、カッター１１の内壁１１ｂの周面に密接するプランジャ（摺動部材）１３が設けられている。プランジャ１３は、移動機構４０によってカッター１１の上下動に伴って移動するとともに、移動機構４０に設けられた駆動部（図示せず）からの動力を受けて、カッター１１の内壁１１ｂに沿って上下に摺動することができる。なお、プランジャ１３はカッター１１の先端から約１ｍｍ程度内側に入った状態を最も低い位置としている。
【００２１】
図１に示すように、ステージ３０上には、発泡プラスチック材料の一つである発泡スチロールからなる基材３１が敷かれており、この基材３１上には、表面に予めタンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜２０が載置される。ＰＶＤＦ膜の表面状態は、ＰＶＤＦ膜２０の上方に設けられた、ＣＣＤカメラ等の撮影装置６０によって、撮影されている。
【００２２】
また、ステージ３０上のＰＶＤＦ膜２０に隣接した位置には、ＰＶＤＦ膜２０から採取した膜片２０ａ（図示せず）を採取するためのマイクロプレート１００が設置されている。このマイクロプレート１００は、膜片２０ａを収容するための複数のウェル１０１を備えており、各ウェル１０１には、予めアセトニトリル等の有機溶媒１０２がカッター１１の先端が浸る程度（例えば１００μｌ程度）収容されている。
【００２３】
なお、ピッキング装置１は、その内部または外部に演算処理部５０を備えており、この演算処理部５０からの信号に応じて、駆動部１４や移動機構４０が動作する。また、演算処理部５０には、撮影装置６０によって撮影されたＰＶＤＦ膜２０の表面の画像情報を取り込んで表示するディスプレイ７０が接続されている。
【００２４】
続いて、図１に示すようなピッキング装置１を用いて、ＰＶＤＦ膜２０から膜片２０ａを切り取り、この膜片２０ａをマイクロプレート１００に設けられたウェル１０１中に採取する手順を図１及び図２を用いて説明する。なお、図２においては、移動機構４０や演算処理部５０，撮影装置６０等は図示を省略している。
【００２５】
まず、図１に示すようにステージ３０上にＰＶＤＦ膜２０を載置した状態で、撮影装置６０によってＰＶＤＦ膜２０の表面を撮影し、取り込んだ画像からＰＶＤＦ膜２０のピッキング部分を位置決めする。
【００２６】
次に、図２（Ａ）に示すように、カッター１１を軸方向に回転させながらＰＶＤＦ膜２０に向けて下降させ、ステージ３０上に載置されたＰＶＤＦ膜２０に貫通させる。このとき、カッター１１の刃部１１ａが基材３１の表面を破断し、その内部に進入するまでカッター１１を下降させ、ＰＶＤＦ膜２０の一部を完全に切り取る。刃部１１ａが基材３１の表面を破断し、その内部に進入すると、破断した基材３１は耐圧縮性を失い、カッター１１の下降によって適度に圧縮する。カッター１１の内部においては、プランジャ１３と、膜片２０ａと、カッター１１内部によって微小な閉空間Ｓが形成される。
【００２７】
次に、プランジャ１３をカッター１１の内壁１１ｂに沿って上方に摺動させ、カッター１１内部の閉空間Ｓを減圧する。閉空間Ｓは、その容積が微小であるため、減圧に忠実に膜片２０ａが引き寄せる。引き寄せられた膜片２０ａは、適度に圧縮した基材３１から力を受け、カッター１１の先端開口部分から内部に押しやられる。なお、カッター１１によってＰＶＤＦ膜２０を切り取る際に、プランジャ１３によって閉空間Ｓを減圧しなくとも膜片２０ａがカッター１１内部に保持される場合は、特にプランジャ１３を操作する必要はない。
【００２８】
続いて、図２（Ｂ）に示すように、カッター１１を上方に引き上げるが、膜片２０ａは、カッター１１の内壁１１ｂとの摩擦によって、落下せずにカッター１１内に保持される。この状態で、図２（Ｃ）に示すように、カッター１１をマイクロプレート１００側に水平移動させ、各ウェルの上方において位置決めをした後に、所定のウェル１０１中の有機溶媒１０２に向けてカッター１１を下降させる。刃部１１ａ及びカッター１１に保持された膜片２０ａが有機溶媒１０２に接触した後、プランジャ１３をカッター１１の内壁１１ｂに沿って下方に摺動させると、カッター１１内部が加圧され、膜片２０ａが有機溶媒１０２中に吐出される。
【００２９】
以上の動作を繰り返し、所望の数の膜片２０ａをウェル１０１中に配置する。なお、有機溶媒１０２は少量であるため短時間で揮発し、ウェル１０１中に膜片２０ａが残る。このようにしてウェル１０１中に採取された各膜片２０ａは、メタノールや蒸留水等で浸し、平衡化等の処置を施すブロッティングによる処置を施された後、質量分析等の手法でより詳細に解析される。また、ＰＶＤＦ膜２０についてのピッキングが全て終了すると、ピッキング装置１を一時停止させ、基材３１及びＰＶＤＦ膜２０を新しいものと交換する。
【００３０】
以上のような実施形態によれば、カッター１１がＰＶＤＦ膜２０を貫通し、基材３０の上面を破断してその内部に進入するため、膜片２０ａをＰＶＤＦ膜２０から完全に分離することができる。さらに、破断した基材３０はカッター１１がＰＶＤＦ膜２０を貫通する際に適度に圧縮し、ＰＶＤＦ膜２０から分離した膜片２０ａをカッター１１の内部に押し込むため、膜片２０ａはカッター１１に確実に保持される。
【００３１】
また、カッター１１の先端に保持された膜片２０ａがウェル１０１中の有機溶媒１０２に浸された状態で、カッター１１の内部を加圧するため、膜片２０ａは外部へ押し出され、ウェル１０１内に容易に吐出される。このため、ＰＶＤＦ膜２０の膜片２０ａを採取する作業が確実に行われ、タンパク質の迅速な解析を行うことができる。
【００３２】
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、基材３１として用いられる、耐圧縮性を有し破断容易な材質としては、発泡スチロールの他、発泡ポリプロピレン、発泡ウエレタン等の発泡プラスチックが挙げられる。これらの材質のうち、特に発泡スチロールは、前述のような性質に加えて、軽量かつ加工容易で、低コストであるため、基材３１として好適である。
【００３３】
また、ブロッティングメンブレンとしては、ＰＶＤＦ膜以外にニトロセルロース膜等の公知のものを用いることができる。
【００３４】
また、ＰＶＤＦ膜２０のピッキングを行われる部分は、ＰＶＤＦ膜２０表面のタンパク質が転写されている部分であり、これらの部分は、撮影装置６０等で撮影された画面から演算処理部５０が自動的に判断するようにしてもよい。
【００３５】
さらに、このようなピッキング装置は、前処理をした膜片を分析する質量分析計等の分析装置に接続してもよいし、一体的に構成されていてもよい。このように構成されていると、前処理を終えた膜片を移動させることなく、迅速に分析することができる。
【００３６】
また、ウェル１０１内の有機溶媒１０２は、膜片２０ａの前処理を行うためにウェル中に満たされている有機溶媒であってもよい。このような有機溶媒は、アセトニトリルの他、メタノールまたはメタノール水溶液等であってもよい。
【００３７】
さらに、前記摺動部材はプランジャ１３に限定されるものではなく、カッター１１の内部を減圧できる手段であればよい。例えば、基材３１を発泡スチロールで構成した場合は、カッター１１の内部をエアーの吸引・吐出によって減圧・加圧する手段を用いることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に係るピッキング装置の全体を概略的に示す側面図である。
【図２】図１に示すピッキング装置を用いて、ＰＶＤＦ膜の一部を切り取って採取する手順を示す側面図である。
【図３】ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写して構造解析を行う際の一般的な手順を示すフローチャートである。
【図４】従来のピッキング装置のピッキング部を概略的に示す側面図である。
【符号の説明】
【００３９】
１  ・・・ピッキング装置
１１  ・・・カッター
１１ａ  ・・・刃部
１１ｂ  ・・・内壁
１３  ・・・プランジャ
１４  ・・・駆動部
２０  ・・・ＰＶＤＦ膜
２０ａ  ・・・膜片
３０  ・・・ステージ
３１  ・・・基材
４０  ・・・移動機構
５０  ・・・演算処理部
６０  ・・・撮影装置
７０  ・・・ディスプレイ
１００  ・・・マイクロプレート
１０１  ・・・ウェル
１０２  ・・・有機溶媒
Ｓ  ・・・閉空間
【図１】
2005172529.tif 000003
【図２】
2005172529.tif 000004
【図３】
2005172529.tif 000005
【図４】
2005172529.tif 000006