(57)【要約】【課題】反応系中に原料ナフタレンを高濃度で仕込むことができ、目的とする１−ナフトールを高い生産性で得ることができる方法を提供する。【解決手段】ナフタレンを、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ２ＭＯ１００１で形質転換して得られた形質転換微生物など）の共存下、水系の媒体と有機溶媒よりなる二相系の反応溶媒中で、分子状酸素により酸化させることにより、目的とする１−ナフトールを製造する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナフタレンを、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物の共存下、水系の媒体と有機溶媒よりなる二相系の反応溶媒中で、分子状酸素により酸化させることを特徴とする、１−ナフトールの製造方法。
【請求項２】
モノオキシゲナーゼがトルエン２−モノオキシゲナーゼである請求項１に記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項３】
微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子を発現する微生物である請求項１または２に記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項４】
微生物がＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌よりなる群から選ばれる請求項１〜３いずれかに記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項５】
微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２である請求項１〜４いずれかに記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項６】
有機溶媒が、６以上の炭素を有するエステル類、脂肪族炭化水素類、ケトン類、高級アルコール類、及びこれらのうち一以上を成分とする混合溶媒よりなる群から選ばれる請求項１から５いずれかに記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項７】
有機溶媒が、二塩基酸エステル類あるいはこれを一成分とする混合溶媒である請求項１から６いずれかに記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項８】
二塩基酸エステル類が、ジオクチルフタレート、ジブチルフタレート、及びジオクチルアジペートよりなる群より選ばれる請求項７に記載の１−ナフトールの製造方法。
【請求項９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ２ＭＯ１１で形質転換したことを特徴とする、形質転換微生物。
【請求項１０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ２ＭＯ１００１で形質転換したことを特徴とする、形質転換微生物。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の微生物を用いる、請求項１から８いずれかに記載の１−ナフトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学的方法を用いてナフタレンを分子状酸素により酸化することにより１−ナフトールを高選択的に得る新規な方法を提示するものである。
【背景技術】
【０００２】
１−ナフトールは染料、香料、医農薬の各領域において重要な中間原料化合物であり、その工業的な製造法はすでに確立されているが、いずれの方法もナフタレンを原料とした多段階反応によっている。最も確立された方法のひとつはナフタレンを硫酸でスルホン化してナフタレン１−スルホン酸を得、これに炭酸ナトリウムを加えてナトリウム塩とし、これを水酸化ナトリウムとともに融解してナトリウムアルコラートとし、再び硫酸を加えて１−ナフトールを得る方法である。この製法は多くの素反応からなることに加え、多量の酸、アルカリ、及び工業塩類を必要とすることから、エネルギー的にも物質収支的にも効率が悪い。従ってナフタレンから一段階の酸化反応で１−ナフトールを得ることが望ましいが、通常の有機合成的な酸化反応では１位の特異的な水酸化を行なうことが極めて困難であるため、カルボン酸を反応させて１−ナフトエステルを得、これを加水分解するなど（例えば特許文献１参照）、いくつかの代替方法が考案されている。
【０００３】
一方生体内では異物であるナフタレンを代謝するプロセスの初発反応として１−ナフトール及び２−ナフトールが生成することが古くから知られており、これを利用した生物工学的な手法が考案されている。すなわち微生物によってはこの酸化反応の位置選択性が高く、ナフタレンから１−ナフトールが選択的に生成するという現象が利用されている（例えば特許文献２及び非特許文献１参照）。こうした反応を触媒できる酵素は分子状酸素を酸化剤として用いるモノオキシゲナーゼに限定されており、チトクロムＰ４５０を含むいくつかのモノオキシゲナーゼにそうした活性が見出されている（例えば非特許文献２参照）。ただしナフタレンを基質とした反応において生成する１−ナフトールと２−ナフトールの割合は酵素ごとに異なっており、いずれの酵素を用いた場合にも高い選択性で１−ナフトールが得られるわけではない（例えば非特許文献３、４、及び５参照）。
【０００４】
モノオキシゲナーゼは分子状酸素を酸化剤として有機化合物に一原子の酸素を添加する反応を触媒する酵素の総称であり、前述したチトクロムＰ４５０以外にも多くの種類のものがある。これらには反応時に還元型のピリジンヌクレオチド、より具体的にはＮＡＤＨ（還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）あるいはＮＡＤＰＨ（還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）をコファクターとして必要とするという共通の特徴があり、このため実用化に際してはこれらコファクターを適当な栄養源、特に糖類などの安価な炭素源から合成できる生細胞が用いられる。すなわちモノオキシゲナーゼの実用化に際しては還元型コファクターを生成させながら分子状酸素を用いた酸化反応を行なわせる必要があり、このために通常の酵素反応に比べて反応を維持させることが難しい上、反応液組成や基質及び生成物の濃度は生細胞の許容範囲内に限定されるという一般的な特徴がある。
【０００５】
特許文献２及び非特許文献１はＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌を用いて生物工学的に１−ナフトールを合成する手段を提供したものであり、対ナフタレン収率として最高２７％を報告している。しかしながらこの値から算出される反応液中の生成物濃度は０．１９ｍＭであり、より高濃度の基質を用いて生産性を向上させることが望ましい。ところでナフタレン及び１−ナフトールは生体に対する毒性が高く、高濃度での仕込みは生細胞の活動度と該酸化反応に関与する酵素活性をともに低下させる傾向がある。またナフタレンは水に難溶であり、反応系中に多量に加えても水に溶ける濃度は約０．２ｍＭときわめて低い。
【０００６】
微生物を生体触媒として化合物変換を行なおうとする場合には、化合物が微生物の生育あるいは生存に及ぼす影響や化合物の水に対する溶解度の低さがしばしば問題になる。この問題を解決あるいは軽減する手段として、有機溶媒を用いた二相系反応が開発されている（例えば特許文献３、４及び非特許文献６、７、８）。しかしながらかかる方法が１−ナフトールの製造法として検討された例はなく、特に毒性の高いナフタレン及び１−ナフトールを高濃度で許容しうる実験系の存在は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】特開昭５４−１６０３５５号公報
【０００８】
【特許文献２】特開平７−２９８８９０号公報
【非特許文献１】井上智実ら、日本化学会誌、１９９８、（３）（１９６−２００頁）
【非特許文献２】Ｂｒｕｓｓｅａｕ  Ｇ．Ａ．ら、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、１９９０、１、（１９−２９頁）
【非特許文献３】Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐ．Ａ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒ、１９９８、４２４（３）、（２７１−２７４頁）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ  Ｓ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、２００２、１３（６）、（３７３−３８１頁）
【非特許文献５】Ｃａｎａｄａ  Ｋ．Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２、１８４（２）、（３４４−３４９頁）
【特許文献３】特開平８−９８６９６号公報
【特許文献４】特開平９−９９５６号公報
【非特許文献６】Ａｏｎｏ  Ｒ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４、６０（７）、（２５１８−２５２３頁）
【非特許文献７】Ｐｒｉｃｈａｎｏｎｔ  Ｓ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８、２２、（４７１−４７９頁）
【非特許文献８】Ｂｕｈｌｅｒ  Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００３、８１（６）、（６８３−６９４頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記のような課題に鑑みてなされたものであり、高濃度でのナフタレンの仕込みと高い１−ナフトールの生産性を実現しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、ナフタレンを、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物の共存下、水系の媒体と有機溶媒よりなる二相系の反応溶媒中で、分子状酸素により酸化させることを特徴とする、１−ナフトールの製造方法である。また本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ２ＭＯ１１で形質転換したことを特徴とする、形質転換微生物である。更に本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２を、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むプラスミドｐＴ２ＭＯ１００１で形質転換したことを特徴とする、形質転換微生物である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１１】
本発明において、モノオキシゲナーゼとしては特に限定されないが、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４から単離された酵素（トルエン２−モノオキシゲナーゼ）のように９９％以上の１−ナフトール選択性を有するものの方が（非特許文献５参照）、分離が困難な１−及び２−ナフトール異性体を分離する工程を必要としないことから、好ましいものである。
【００１２】
このトルエン２−モノオキシゲナーゼは該酵素を暗号化する遺伝子を異種微生物に導入し、産生させることによっても得ることができる。用いる異種微生物は特に限定されないが、現在の生物工学的な技術を簡便に適用できるものとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌がまずあげられる。しかしながら、有機溶媒に対する耐性の高さなどを考慮して適当な微生物を用いることは有効であり、酵素源となった微生物Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４と類縁で、かつ簡便な形質転換系が知られている微生物、すなわちＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属細菌に属する微生物群がより好ましい。
【００１３】
本発明に用いられる水系の媒体としては、微生物の生育に適当なものであれば特に限定はなく、生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類などを適宜含んでいてもよい。また適当な緩衝能を持つものであってもよい。
【００１４】
用いる有機溶媒としては、水と均一に混和せず、用いる微生物の生育又は生存に重大な影響を与えず、また原料と生成物について水に対する分配係数が高いものが好ましく選択される。この選択に際して有機溶媒の物性値であるｌｏｇＰは有効な指標となり得る（例えば、Ｗｅｂｅｒ  Ｆ．Ｊ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３、５９（１０）、（３５０２−３５０４頁）や、Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｌ．とＤａｕｇｕｌｉｓ  Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９９７、５５（１）、（１５５−１６１頁）や、Ｓａｒｄｅｓｓａｉ  Ｙ．とＢｈｏｓｌｅ  Ｓ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１５３、（２６３−２６８頁）などを参照）。
【００１５】
一般に低いｌｏｇＰ値の有機溶媒は毒性が高く、特に３以下のｌｏｇＰ値を持つ有機溶媒に耐える微生物は少ない。従って、有機溶媒は耐性限界のｌｏｇＰ値よりもいくぶん高いほうが細胞や酵素に与える影響がより軽度であることから、望ましい酵素活性を得る上で都合が良い。こうした要請から、有機溶媒は、６以上の炭素を有するエステル類、脂肪族炭化水素類、ケトン類、高級アルコール類またはこれらのうち１以上を成分とする混合溶媒が好ましい。その中でも、二塩基酸エステル類あるいはこれを一成分とする混合溶媒が更に好ましく、具体的にはジオクチルフタレート、ジブチルフタレート、及びジオクチルアジペートなどが例示される。
【００１６】
なおトルエン２−モノオキシゲナーゼは非置換及び置換芳香族化合物の芳香環を水酸化する恐れがあることから、芳香族の有機溶媒は一般に好ましくない。しかしながら芳香環の置換基の立体障害が大きく、あるいは親水性の置換基が酵素の基質認識を弱め、そのためにかかる水酸化反応がおきないような化合物は溶媒として利用可能であり、ジオクチルフタレート（別名ビス（２−エチルヘキシル）フタレート）またはジブチルフタレートなどをこうしたものの好適な例として示すことができる。さらに用いる有機溶媒は混合溶媒とすることが可能であり、特定の性質を付与し、及び／又はｌｏｇＰ値を調整するために好適に用いられる。なお混合溶媒のｌｏｇＰ値は、Ｌａａｎｅ  Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、３０、（８１−８７頁）に記載された式を用いることによって、構成成分の組成から簡便に推測することが可能である。最適な有機溶媒は用いる微生物によって異なり、一に限定することはできないが、上記の規則を適用することにより最適な有機溶媒を簡便に見出すことが可能である。
【００１７】
本発明者らはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４由来のトルエン２−モノオキシゲナーゼの遺伝子がすでに単離され、また大腸菌において活性を持って発現されるという報告に基づき（例えば非特許文献５）、上記菌株をドイツＤＳＭＺより入手して遺伝子のクローニングを行なった。そして単離された遺伝子の全域を、大腸菌で働くプロモーターの下流に置いた構成を有する組換えプラスミドを作製し、このＤＮＡを用いて各種大腸菌の形質転換を行なったところ、形質転換された大腸菌にはナフタレンを酸化して１−ナフトールを生成する能力が認められた。
【００１８】
本発明者らはさらにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を含む広範なグラム陰性細菌で維持可能なシャトルベクターを利用することにより、Ｐｓｅｕｏｄｏｍｏｎａｓ属細菌の形質転換に成功し、ナフタレンを酸化して１−ナフトールを生成する組換え微生物を得ることができた。こうした手法は他の微生物の形質転換にも利用でき、有機溶媒耐性をはじめとして各種の望ましい性質を有する微生物にナフタレン酸化能を付与することができる。
【００１９】
なお微生物と有機溶媒のｌｏｇＰ値の関係については、例えばｌｏｇＰ値が２．３以上の有機溶媒であればＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２は耐性を示すが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １１１７２が耐える有機溶媒はｌｏｇＰ値３．２以上のものに限定される。従ってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２を用いる場合にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＡＴＣＣ  １１１７２に比べて幅広い溶媒の選択が可能であり、また同じ溶媒に対してはより影響を受けにくい。この観点からＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２は優れた微生物であり、その特性がよく研究されていることからも好ましく選択される。
【発明の効果】
【００２０】
反応系中に原料ナフタレンを高濃度で仕込むことができ、目的とする１−ナフトールを高い生産性で得ることができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００２２】
実施例１  トルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子の単離
Ｓｈｉｅｌｄｓらの報告（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｍ．Ｓ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、６１（４）、（１３５２−１３５６頁））を参考にしてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４（ＤＳＭ１１７３７）からＤＮＡを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化して得た約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ部位に組み込んで、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９に導入した。寒天プレート上に出現したコロニーの中からカテコール水溶液を噴霧して黄変するものを選択することによって、カテコール酸化活性を有するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼの遺伝子とそれに隣接するトルエン２−モノオキシゲナーゼの遺伝子を有する組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１を得た。
【００２３】
実施例２  トルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子発現大腸菌の作製
実施例１で得た組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１からプラスミドを抽出し、これを鋳型にして配列番号１に記載のプライマーＦと配列番号２に記載のプライマーＲとを用いたＰＣＲで増幅したのち、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化してＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を得た。またＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１から得たプラスミドをＳａｌＩとＫｐｎＩとで消化してＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を得、これを前述のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片とともに、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア  バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位に組み込んでプラスミドｐＴ２ＭＯ１１（図１）を構築した。そのｐＴ２ＭＯ１１を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン社製）を形質転換してトルエン２−モノオキシゲナーゼの活性をもち、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼの活性はないＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１を得た。
【００２４】
実施例３  トルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子発現大腸菌を用いたナフタレンの酸化反応
実施例２で得た組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１を、Ｙｅａｇｅｒ  Ｃ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、６５（２）、（６３２−６３９頁）に記載のｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ（以下ではＢａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＢＳＭと呼ぶ）にチアミン塩酸、グルコース、カルベニシリンナトリウムをそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌになるように加えた培地（ＢＳＴＧ−Ｃａｒｂ培地）１２５ｍｌに植菌して温度３７℃で１６時間振とうして培養した。得られた培養液の密度はＯＤ６００値で１．８であった。これに０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えてさらに２時間振とうし、しかる後に遠心分離によって菌体を集め、ＯＤ６００値が１０となるようにＩＰＴＧを添加したＢＳＴＧ−Ｃａｒｂ培地に懸濁した。
【００２５】
二相系反応を行う実験区においては上記菌体懸濁液１０ｍｌを１２０ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに移し、これに対して１０ｍＭのナフタレンを溶解させたジオクチルフタレート（ｌｏｇＰ値９．６）５ｍｌを添加し、３７℃、１６０ｒｐｍで振とうして反応させた。一方水系反応の対照区においては菌体懸濁液１０ｍｌに粉末状のナフタレン１０．６ｍｇ（全量溶解した場合の濃度として１０ｍＭ）を添加し、同様に反応させた。一定時間後に、実験区においては水相と有機相それぞれに含まれる１−ナフトール量を、対照区においては水相中の１−ナフトール量を、それぞれテトラゾ化ｏ−ジアニシジンとの呈色反応を利用した比色定量法（５２８ｎｍにおける吸光度測定）により算出した。
【００２６】
その結果、図２に示すように、水系反応においては反応が３時間までにほとんど停止しているのに対して二相系反応では反応がより持続し、生成した１−ナフトールの量は２０時間目において最も高かった（約２ｍＭ）。また、二相系反応において生成した１−ナフトールはほとんどが有機相に分配されていた。さらに有機相をＯＤＳ−１２０Ｔ（東ソー社製、４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ）カラムを用いてＨＰＬＣにより分析した結果、１−ナフトールと２−ナフトールの生成比は９８．９：１．１であった。
【００２７】
実施例４  トルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子発現Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌の作製
実施例２において行ったと同様に、実施例１で得た組換え大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１からプラスミドを抽出し、これを鋳型にして配列番号３に記載のプライマーＦ２と配列番号２に記載のプライマーＲとを用いたＰＣＲで増幅したのち、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化してＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を得た。またＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１から得たプラスミドをＳａｌＩとＫｐｎＩとで消化してＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を得、これを前述のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片とともに、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア  バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位に組み込んでプラスミドｐＴ２ＭＯ１２を構築した。次にプラスミドｐＴ２ＭＯ１２をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、Ｔ２ＭＯ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を得た。これをＫｏｖａｃｈ  Ｍ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ、１９９５、１６６、（１７５−１７６頁）に記載のグラム陰性細菌広域シャトルベクターであるｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に組み込んでプラスミドｐＴ２ＭＯ１００１（図３）を構築した。このｐＴ２ＭＯ１００１を用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２（ＡＴＣＣ７００８０１）をＣｈｏ  Ｊ．−Ｈ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９５、９（１）、（４１−４４頁）に記載の方法で形質転換してトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性をもつ組換え菌株Ｓ１２／ｐＴ２ＭＯ１００１を得た。
【００２８】
実施例５  トルエン２−モノオキシゲナーゼ遺伝子発現Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌を用いたナフタレンの酸化反応
実施例４で得た組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｓ１２／ｐＴ２ＭＯ１００１を実施例３に記載のＢＳＭにフルクトース、カナマイシンをそれぞれ３６ｍｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌになるように加えた培地（ＢＳＭＦ−Ｋｍ培地）２００ｍｌに植菌して温度３０℃で４８時間振とうして培養した。得られた培養液の密度はＯＤ６００値で２．３であった。この培養液から遠心分離によって菌体を集め、ＯＤ６００値が１０となるようにＢＳＭＦ−Ｋｍ培地に懸濁した。
【００２９】
二相系反応を行う実験区においては上記菌体懸濁液１０ｍｌを１２０ｍｌ容のバッフル付三角フラスコに移し、これに対して１０ｍＭのナフタレンを溶解させたジオクチルフタレート５ｍｌを添加し、３０℃、１６０ｒｐｍで振とうして反応させた。一方水系反応の対照区においては菌体懸濁液１０ｍｌに粉末状のナフタレン１０．６ｍｇ（全量溶解したと仮定した場合の濃度で１０ｍＭ）を添加し、同様に反応させた。一定時間後に、実験区においては有機相、対照区においては水相に含まれる１−ナフトール量を比色定量法により測定した。
【００３０】
その結果、図４に示すように、水系反応においては反応が２時間までに停止し、その後生成物量の緩やかな減少が見られたのに対し、二相系反応では反応が長時間持続し、７２時間後には１−ナフトールの生成量が１．７ｍＭに達した。また、実施例３と同様に有機相をＨＰＬＣで分析した結果、１−ナフトールと２−ナフトールの生成比は９７．３：２．７であった。
【００３１】
実施例６  種類の異なる二塩基酸エステルを有機溶媒として用いた２相系のナフタレン酸化反応
実施例５と同様の操作を、ジオクチルフタレートに加えてジブチルフタレート（ｌｏｇＰ値５．４）、ジオクチルアジペート（ｌｏｇＰ値８．１）を有機溶媒として用い、各実験区において有機相と水相それぞれに含まれる１−ナフトールの量を測定した。その結果、図５に示すようにジブチルフタレートおよびジオクチルアジペートは、ジオクチルフタレートと同様に、２相系のナフタレン酸化反応を行う上で好適な溶媒であることが明らかになった。
【００３２】
実施例７  直鎖状炭化水素を有機溶媒として用いた二相系のナフタレン酸化反応
実施例５と同様の操作を、ジオクチルフタレートの代わりにｎ−ヘキサン（ｌｏｇＰ値４．１）、ｎ−オクタン（ｌｏｇＰ値５．２）、ｎ−ドデカン（ｌｏｇＰ値６．６）、ｎ−ヘキサデカン（ｌｏｇＰ値８．７）の４種の有機溶媒を用いて行い、各実験区において有機相と水相それぞれに含まれる１−ナフトールの量を測定した。その結果、図６に示すように、これら４種の有機溶媒を用いた場合においてもナフタレンの酸化反応は進行したが、ジオクチルフタレートなどを用いた場合に比較して酵素活性は低下し、生成物の有機相／水相中の分配比も低下していた。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例２で行ったプラスミドｐＴ２ＭＯ１１の構成と制限酵素部位を示した図である。
【図２】実施例３で行った酸化反応における１−ナフトールの生成量を示したグラフである。
【図３】実施例４で行ったプラスミドｐＴ２ＭＯ１００１の構成と制限酵素部位を示した図である。
【図４】実施例５で行った酸化反応における１−ナフトールの生成量を示したグラフである。
【図５】実施例６で行った酸化反応における１−ナフトールの生成量を示したグラフである。
【図６】実施例７で行った酸化反応における１−ナフトールの生成量を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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