(57)【要約】      （修正有）【課題】  ヒトの異常型プリオン蛋白質に結合する抗体およびその調製方法を提供する。【解決手段】  ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、特定の配列における所定のアミノ酸配列またはその一部の配列がエピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体、その調製方法、該抗体を使用する異常型プリオン蛋白質検出システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４９として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６６として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項３記載の抗体。
【請求項５】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体。
【請求項６】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項５記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４６として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマまたは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４８として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項５または６記載の抗体。
【請求項８】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体。
【請求項９】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４７として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項８または９記載の抗体。
【請求項１１】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体。
【請求項１２】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６５として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項１１または１２記載の抗体。
【請求項１４】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１３５〜１７４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体。
【請求項１５】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１４３〜１５２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする請求項１４記載の抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４３として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項１４または１５記載の抗体。
【請求項１７】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１３５〜２２４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体。
【請求項１８】
配列表の配列番号４２における第１３５〜１４９番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２０８〜２１６番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項１７または１８記載の抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４４として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項１７ないし１９のいずれかに記載の抗体。
【請求項２１】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１６３〜２２４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体。
【請求項２２】
配列表の配列番号４２における第１７１〜２１６番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする請求項２１記載の抗体。
【請求項２３】
配列表の配列番号４２における第１７１〜１７９番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２０８〜２１６番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする請求項２１記載の抗体。
【請求項２４】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項２１ないし２３のいずれかに記載の抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４２として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項２１ないし２４のいずれかに記載の抗体。
【請求項２６】
ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１６３〜１９７番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体。
【請求項２７】
配列表の配列番号４２における第１６３〜１７１番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第１８６〜１９７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする請求項２６記載の抗体。
【請求項２８】
エピトープが、立体配置的（コンフォメーショナル）エピトープであることを特徴とする請求項２６または２７記載の抗体。
【請求項２９】
モノクローナル抗体であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４５として寄託されるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから調製される請求項２６ないし２８のいずれかに記載の抗体。
【請求項３０】
ヒトプリオン蛋白質が、異常型であることを特徴とする請求項１ないし２９のいずれかに記載の抗体。
【請求項３１】
標識物質で標識された請求項１ないし３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項３２】
標識物質がビオチン、サイダイ（Cydye）、フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンであることを特徴とする請求項３１記載の抗体。
【請求項３３】
標識物質がペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β―ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼまたはルーシフェラーゼであることを特徴とする請求項３１記載の抗体。
【請求項３４】
不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質を免疫して得られる脾臓細胞とミエローマ細胞との間で細胞融合を行い、得られる融合細胞からモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることを特徴とする、抗ヒトプリオン抗体の調製方法。
【請求項３５】
不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質が、配列表の配列番号４１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項３４記載の調製方法。
【請求項３６】
ヒトの異常型プリオン蛋白質と結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３７】
不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質を免疫して得られる脾臓細胞とミエローマ細胞との間で細胞融合を行うことによって得られたものである、請求項３６記載のハイブリドーマ。
【請求項３８】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列を含む、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項３９】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４９として寄託されている、請求項３８に記載のハイブリドーマ。
【請求項４０】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列を含む、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項４１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６６として寄託されている、請求項４０に記載のハイブリドーマ。
【請求項４２】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列を含む、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項４３】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４６としてまたは受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４８として寄託されている、請求項４２に記載のハイブリドーマ。
【請求項４４】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列を含む、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項４５】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４７として寄託されている、請求項４４に記載のハイブリドーマ。
【請求項４６】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列を含む、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項４７】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６５として寄託されている、請求項４６に記載のハイブリドーマ。
【請求項４８】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１３５〜１７４番目のアミノ酸配列中に含まれる、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項４９】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４３として寄託されている、請求項４８に記載のハイブリドーマ。
【請求項５０】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１３５〜２２４番目のアミノ酸配列中に含まれる、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項５１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４４として寄託されている、請求項５０に記載のハイブリドーマ。
【請求項５２】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１６３〜２２４番目のアミノ酸配列中に含まれる、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項５３】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４２として寄託されている、請求項５２に記載のハイブリドーマ。
【請求項５４】
該モノクローナル抗体が認識・結合するエピトープが、配列表の配列番号４２における第１６３〜１９７番目のアミノ酸配列中に含まれる、請求項３６または３７に記載のハイブリドーマ。
【請求項５５】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４５として寄託されている、請求項５４に記載のハイブリドーマ。
【請求項５６】
請求項１ないし３０のいずれかに記載の抗体若しくは請求項３１ないし３３のいずれかに記載の標識抗体、またはこれらの組み合わせからなる抗体を使用することを特徴とする異常型プリオン検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトプリオン蛋白質に特異的に結合する抗ヒトプリオン抗体に関する。更に詳細には、不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質を抗原として免疫されたマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と細胞融合して得られるモノクローナル抗体産生細胞、該モノクローナル抗体産生細胞が生産する抗異常型ヒトプリオン抗体およびこれらの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロイツフェルト・ヤコブ病（以下、「ＣＪＤ」と称することもある）は、１００万人に１人の割合で孤発性または家族性に生じ、脳組織の海綿（スポンジ）状変性を特徴とする疾患である。ＣＪＤは１９２０年代初頭、ドイツの神経病理学者クロイツフェルトとヤコブによって記述された。現在では成因からプリオン病、また病理から伝達性海綿状脳症（transmissible spongiform encephalopathy；「ＴＳＥ」）として哺乳類の神経疾患群にひとくくりにされている。近年、プリオン病またはＴＳＥの感染性がクローズアップされ、社会的に認知されている。
【０００３】
プリオンとは蛋白質性感染粒子（proteinaceous infectious particle）のことで、ＴＳＥの核酸を含まない感染性病原体をさす造語で、米国のプルシナー博士によって１９８２年に提唱された。プルシナー博士は１０年の歳月をかけ、プリオン病の罹患脳から幅４ｎｍ、長さ数１００ｎｍ程度の感染性の微細線維状物質を濃縮していき、プリオン説を唱えるに到った。この微細線維状物質は、現在、宿主プリオン蛋白質が異常構造体へ変換され、凝集することによって形成されていると考えられている。
【０００４】
プリオン病では、異常構造を有する異常プリオン蛋白質が中枢神経系に蓄積し、不可逆的な致死性神経障害を生じる。ヒトプリオン病の大半を占めるのは孤発性ＣＪＤである。プリオンには感染性があり、感染性プリオン病としてクールー（Kuru）、（新）変異型ＣＪＤ（(new) variant CJD；「ｖＣＪＤ」）、移植後ＣＪＤがある。１９９６年に英国で発表され、ヨーロッパおよび世界中をパニックに陥れたのはｖＣＪＤである。これは牛海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy；「ＢＳＥ」）に起因していると考えられている。一方、プリオン遺伝子に変異を持ち、異常プリオン蓄積の原因となる疾患に遺伝性ＣＪＤ、クールー斑状沈着を特徴とするゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（fatal familial insomnia；「ＦＦＩ」）などがある。
【０００５】
動物のプリオン病には、１８世紀にすでに知られていたヒツジのスクレイピー（scrapie）、シカ慢性消耗病（chronic wasting disease；「ＣＷＤ」）、ミンク伝達性脳症（ＴＭＥ）、日本でも７頭見つかっているＢＳＥ、ネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）などがある。
プリオン病の病因は、神経細胞表面にある可溶性の正常プリオン蛋白質が異常構造体へ変換後、不溶性となった異常プリオン蛋白質の蓄積が生じ、神経細胞が変性した結果であるといわれている。プリオン蛋白質（prion protein）は、正常型（細胞型）プリオン蛋白質と異常型（感染型）プリオン蛋白質に分類されている。正常型プリオン蛋白質はＣ末端部で細胞膜へ連なり、正常型から異常型への変換は細胞膜上、または細胞質への再取り込み後に起こると考えられている。異常型プリオン蛋白質の形成は正常型プリオン蛋白質の構造的な変換によって生じるので、異常型プリオン蛋白質の集積には正常型プリオン蛋白質の存在が不可欠である。正常型プリオン蛋白質に多いらせん状構造（αヘリックス）が板状構造（βシート）へ変換した結果、異常型プリオン蛋白質になる。この構造変換によってプリオン蛋白質は伝達性を獲得すると考えられている。
【０００６】
異常構造の伝達は、種々の宿主因子が関与しながら、異常構造体を核として正常プリオン蛋白質が変換され凝集体が形成されていく数種のモデルによって説明されている。この構造変換に伴い、プリオン蛋白質は伝達性に加え蛋白質分解酵素耐性を獲得する。
【０００７】
プリオン蛋白質は２５３個のアミノ酸より構成されており、その全アミノ酸配列（配列番号４２）もすでに知られており（例えば、非特許文献１参照）、ヒトのプリオン蛋白質遺伝子はヒト第２０染色体の短腕上に存在し、単一エクソンからなる。
【０００８】
ＣＪＤの診断・治療の新しい展開は以下のとおりである。
（１）キナクリンの治験開始
異常プリオンの持続感染細胞を用いた研究でアクリジンの誘導体で抗マラリア薬のキナクリンがプリオンの増殖を抑制するとの報告がなされている（例えば、非特許文献２参照）。変異型ＣＪＤの患者１例にキナクリンを投与したところ臨床症状の改善がみられたとの非公式報告もなされている。現在、米国と英国において臨床治験が開始されている。
【０００９】
（２）抗プリオン抗体によるプリオン増殖の抑制
プリオン構成蛋白質の中、抗原性のあるフラグメントを合成し、これに対する抗体が作製されている。この抗体を異常プリオン持続感染細胞の培養液に添加したところ、プリオンの増殖が顕著に抑制されたとして、将来、ＣＪＤ患者への応用が期待されている（例えば、非特許文献３参照）。
【００１０】
（３）protein-misfolding cyclic amplification（ＰＭＣＡ）による微量異常プリオン蛋白質の検出法
異常プリオン蛋白質を微量に含む組織と正常プリオン蛋白質とを混和し、ついで超音波処理して分解する。この混和、超音波処理を繰り返すことによって高感度に異常プリオン蛋白質を検出することができる（例えば、非特許文献４参照）。
【００１１】
（４）プリオン病における赤芽球分化関連因子（ＥＤＲＦ）のＲＮＡの減少：早期診断への応用
異常プリオン感染動物では接種の早期から脾臓中のＥＤＲＦ ＲＮＡの発現が特異的に減少することが報告されており、早期診断への応用が期待されている（例えば、非特許文献５参照）
【００１２】
輸血、血漿分画製剤、あるいは臓器移植において、クロイツフェルト・ヤコブ病の病原体による汚染を防ぐことは医療上重要なことである。それには、抗原抗体反応を利用して、ＣＪＤに関与するとされる異常型ヒトプリオンを検出するスクリーニング試験が有用である。
【００１３】
ところで、正常型ヒトプリオンには様々な遺伝的多型が知られている。また異常型プリオン蛋白質には、異なるコンホメーションを取っているものが複数存在すると考えられている（例えば、非特許文献６参照）。従って、十数残基程度の短いアミノ酸配列を認識する抗体を１種類用いるのみでは、野外に存在する異常型ヒトプリオン蛋白質をもれなく検出することはできない。特異度の高いスクリーニング試験を実施するためには、プリオン蛋白質上の異なる領域を認識する抗体を複数用いることが必要である。それらの抗体が認識する部位は遺伝的多型がない領域であることが望ましい。また、同一のアミノ酸配列を認識する抗体であっても、異常型プリオンの株により反応性が相互に異なるものであれば、それらの抗体は併用する意味がある。
【００１４】
ヒトプリオン蛋白質に対するモノクローナル抗体「３Ｂ５」、「３Ｆ４」、「６Ｈ４」、および「１２Ｆ１０」が、それぞれヒトプリオン蛋白質の部分アミノ酸配列（配列番号４２ におけるアミノ酸番号５４〜６９、１０９〜１１１、１４４〜１５２、および１５０〜１６５）に結合することを示唆する記載がある（例えば、非特許文献７〜１０参照）。また、それぞれヒトのヒトプリオン蛋白質の部分アミノ酸配列（配列番号４２ におけるアミノ酸番号８６〜１１４、８０〜９８）に特異的に結合する抗体が開示されている（例えば、特許文献１および２参照）。
【００１５】
今日では、細胞、動物組織・体液等から遺伝子を抽出、クローニングし、目的の遺伝子を増幅し、得られた目的遺伝子を微生物に生産させる、などの基本的な遺伝子組換え技術（例えば、非特許文献１１参照）に基づき、遺伝子クローニング・発現ベクターを始めとする種々の遺伝子研究試薬やキットが開発・市販されている。
【００１６】
また、モノクローナル抗体を作製するための細胞融合技術（例えば、非特許文献１０参照）は、診断やスクリーニング試薬の研究・開発に広く利用されており、モノクローナル抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法など種々の検出方法およびこれらの技術に適用するための様々な標識試薬も多数開発されている。
【００１７】
【特許文献１】特表平７−５０１７９８号公報
【特許文献２】特開２０００−６０５５１号公報
【非特許文献１】クレツシュマール（Kretzschmar HA, et al.）, “DNA”, 1986, 5, p.315-324
【非特許文献２】“Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 2001, 98: p.9836-41
【非特許文献３】“Nature”, 2001, 412: p.739
【非特許文献４】“Nature” 2001, 411: p.810
【非特許文献５】“Nature Medicine”, 2001, 7: p.361
【非特許文献６】ファイファー（Pfeifer, A.）ら、“Science”, 1996, 274: p.2079-2082
【非特許文献７】クレースマン（Krasemann, S.）ら、“Journal of Immunological Methods”, 1996, 199: p.109-111
【非特許文献８】カザック（Kascsak, R. J.）ら、“Journal of Virology”, 1987, 61: p.3688-3693
【非特許文献９】コース（Korth, C.）ら、“Nature”, 1997, 390: p.74-77
【非特許文献１０】クレースマン（Krasemann, S.）ら、“Molecular Medicine”, 1996, 2: p.725-734
【非特許文献１１】サムブルック（Sambrook et al.）, “Molecular Cloning, A Labora-tory Manual”, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989
【非特許文献１２】ミルシュタイン（Milstein）,“Method in Enzymology”, 1981, 73, p.3-46
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上述したように、異常型プリオン蛋白質は、可溶性の正常型プリオン蛋白質が構造変化を起こし、凝集することによって形成されると考えられている。したがって、不溶性のプリオン蛋白質を免疫抗原として用いることにより、異常型プリオン蛋白質を認識する抗体を取得できることが期待される。
【００１９】
本発明の目的は、ヒトプリオン蛋白質、特にヒトの異常型プリオン蛋白質に結合する抗体およびその調製方法を提供することにある。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、疑陰性の少ない異常型プリオン蛋白質の検出システムを構築するための材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質（以下、「ｒｈＰｒＰ」と称することもある）で免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合してモノクローナル抗体産生細胞を得、該モノクローナル抗体産生細胞から生産されるモノクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット法および免疫組織染色法により、ＣＪＤ発症脳組織との反応性を調べたところ、陽性であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
したがって、本発明は、ＣＪＤ発症脳組織、すなわち、ヒトの異常型プリオンと結合するモノクローナル抗体を包含する。
【００２３】
また、本発明は、不溶性のｒｈＰｒＰで免疫されたマウス脾臓細胞を用いたヒトの異常型プリオン蛋白質に結合するモノクローナル抗体の調製方法を包含する。
【００２４】
本発明はさらに、ヒトの異常型プリオンと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、とりわけ不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質を免疫して得られる脾臓細胞とミエローマ細胞との間で細胞融合を行うことによって得られるハイブリドーマをも包含する。
【００２５】
また、本発明は、上記モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法によるヒトの異常型プリオンの検出方法を包含する。
【００２６】
また、本発明は、好ましい態様として以下の抗体を包含する。
（１）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体（１００Ａ１）；
（２）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体（１２５Ａ）；
（３）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体（６３Ａ１；６６Ａ１）；
（４）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第４３〜６２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体（６４Ａ）；
（５）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１５３〜１６７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１５８〜１７２番目のアミノ酸配列またはその一部の配列、第１６３〜１７７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列および第２１３〜２２７番目のアミノ酸配列またはその一部の配列が、エピトープの構成部分として含まれることを特徴とする前記抗体（８２Ａ１）；
（６）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１３５〜１７４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体（５Ａ１）；
（７）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１３５〜２２４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体（９Ａ１）；
（８）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１６３〜２２４番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体（４Ａ１）；および
（９）ヒトプリオン蛋白質と結合する抗体であって、配列表の配列番号４２における第１６３〜１９７番目のアミノ酸配列上のエピトープを認識することを特徴とする前記抗体（１２Ａ１）。
【発明の効果】
【００２７】
本発明による抗ヒトプリオン抗体は、ヒトプリオン蛋白質のアミノ酸配列上の新規なエピトープを認識し、ヒトの異常型プリオン蛋白質に対して安定した反応性を有する。このように新規なエピトープを認識する本発明抗体は、不溶性のプリオン蛋白質を免疫抗原として用いることによって得ることができた。
【００２８】
本発明の抗ヒトプリオン抗体はまた、ウエスタンブロット法および免疫組織染色法によりＣＪＤ発症脳組織との反応性を調べた結果、陽性を示し、異常型プリオン蛋白質の検出に利用できることが示された。
【００２９】
さらに、本発明の抗ヒトプリオン抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行ったところ、組換えヒトプリオン蛋白質を高感度で検出することができた。
【００３０】
ヒトプリオン蛋白質には様々な遺伝的多型が知られており、また異常型プリオン蛋白質には異なるコンホメーションをとっているものが複数存在すると考えられている。このため、１種類の抗体を用いた検出系では異常型プリオン蛋白質を漏れなく検出することはできず、様々なエピトープを認識する新規な抗体が望まれていた。本発明は、このような様々なエピトープを認識する抗ヒトプリオン抗体を提供するものであり、これまでの既知の抗体とは異なるエピトープを認識し、その認識部位は既知抗体には少ないプリオンの構造変化に影響を与えるＣ末端側の領域である抗体も多い。
【００３１】
また、本発明による抗ヒトプリオン抗体には立体構造を認識するものも含まれており、立体構造の変化により正常型から異常型に変わるプリオンを検出するのに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明について詳述する。
本発明の方法は、不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質で免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合し、ヒトプリオンと結合するモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることを特徴とするものである。この方法を実施することにより、異常型プリオン蛋白質に結合する抗体を取得することができる。
【００３３】
ヒトプリオン蛋白質をコードするｃＤＮＡは、常法に従って、以下のように調製される。まず、ヒト脳遺伝子ライブラリーから全ＲＮＡを抽出し、この中からｍＲＮＡを精製する。得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後、大腸菌に導入する。大腸菌コロニーの中からヒトプリオン蛋白質をコードするｃＤＮＡを含有するクローンを選択する。該クローンの選択は、標識したヒトプリオン蛋白質をコードする遺伝子断片または合成ヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーションにより行うことができる。上記の全ＲＮＡの抽出には、市販のTRIzol試薬（インビトロジェン社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）、StrataPrep Total RNA Purification Kit（東洋紡）等の試薬、ｍＲＮＡの精製には、mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit（東洋紡）、mRNA Separator Kit（クロンテック社）などのキット、ｃＤＮＡへの変換には、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning（インビトロジェン社）、cDNA Synthesis Kit（宝酒造）、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits（クロンテック社）、Directionary cDNA Library Construction Systems（ノバジェン社）などのｃＮＤＡライブラリー作製キットがそれぞれ使用される。
【００３４】
また、ヒトプリオン蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（例えば、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）377型）により決定することができる。配列表の配列番号４１は、本発明で使用したｃＤＮＡの塩基配列から推測されるアミノ酸配列を示す。
【００３５】
このようにして得られたヒトプリオン蛋白質をコードするｃＤＮＡを、宿主に導入し、可溶性蛋白質との融合蛋白質として発現させる。
【００３６】
上記の宿主として、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、枯草菌および昆虫細胞などを挙げることができるが、好ましくは、大腸菌である。発現ベクターのプロモータ、マーカー遺伝子などは、使用する宿主によって適宜選択される。
【００３７】
可溶性の融合蛋白質としては、マルトース結合蛋白質、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡおよびアルブミン等の蛋白質が挙げられるが、好ましくは、マルトース結合蛋白質である。大腸菌を宿主とする場合は、発現ベクターとして、例えば、マルトース結合蛋白質（以下、「ＭＢＰ」と称することもある）発現ベクター（pMALc2x、New England Biolab社製）が挙げられる。配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを挿入したＭＢＰ発現ベクターで大腸菌（JM109株、BL21株等）を形質転換し、ヒトプリオン蛋白質を生産する形質転換大腸菌を培養することにより、ＭＢＰ−ヒトプリオン蛋白質（以下、「ＭＢＰ−ＰｒＰ」と称することもある）の融合蛋白質を生産する組換え型大腸菌を得ることができる。上記の一連の操作は、pMALc2xキットに添付の方法に従って行われる。得られたＭＢＰ−ＰｒＰ産生大腸菌は、通常使用される組換え型大腸菌の培養条件下で培養した後、遠心分離することによって回収される。
【００３８】
ＭＢＰ−ＰｒＰの精製は、蛋白質化学において通常使用される方法、例えば、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜選択して行えば良い。より具体的には、ＭＢＰ−ＰｒＰ産生大腸菌を破砕し、遠心分離により上清を採取し、これをアミロースレジンに接触させてＭＢＰ−ＰｒＰを吸着させる。洗浄後、マルトース含有緩衝液でＭＢＰ−ＰｒＰを溶出させる。
【００３９】
得られた可溶性のＭＢＰ−ＰｒＰは、不溶性のヒトプリオン蛋白質とするために、活性化第Ｘ因子で処理される。この処理によって、切断されたＰｒＰは不溶化して沈殿し、ＭＢＰは上清中に残る。不溶性のＰｒＰは、適当な緩衝液を用いて懸濁と遠心分離を繰り返すことによって精製される。
【００４０】
ヒトプリオン蛋白質をコードするｃＤＮＡの５'側または３'側を適当な制限酵素またはエキソヌクレアーゼで除去したｃＤＮＡを用いれば、Ｎ末側またはＣ末側が欠失した切断型ヒトプリオン蛋白質を生産することができる。こうして得られる種々の長さの切断型ヒトプリオン蛋白質は、後述のエピトープマッピングに使用される。
【００４１】
マウスの免疫は、一般的な方法により、例えば、上記の不溶性のＰｒＰを、通常のアジュバントと併用して、マウスに腹腔内投与、皮下投与、皮内投与あるいは静脈内投与することにより行われる。免疫に用いるマウスは、マウスプリオン蛋白質を発現している通常のマウスまたはマウスプリオン遺伝子が除去されたノックアウトマウスのいずれでもよい。
【００４２】
ノックアウトマウスは、マウスプリオン蛋白質遺伝子のエクソン３を含むＥｃｏＲＩフラグメント（約２ｋｂｐで蛋白翻訳領域を含む）をｐｇｋ−ｎｅｏ遺伝子に置換したベクターを用いて、相同組換えを行うことにより作製することができる。
【００４３】
アジュバントとしては、フロイントの完全・不完全アジュバント、水酸化アルミゲルなどを使用できるが、好ましくは、フロイントの不完全アジュバントである。より具体的には、不溶性のＰｒＰとフロイントの不完全アジュバントとを等量混合してエマルジョンにした後、これを免疫抗原として、７週令のBalb/c雌マウスに皮下に投与し、１週間後に同様に調製した抗原を皮下に２回追加投与する。免疫の程度は、最終投与後の各マウスの尾血管から採血し、この血液中の抗体価の上昇を確認することによって行われる。抗体価の測定は、通常使用されるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法などの方法に従って行えば良い。
【００４４】
マウスミエローマ細胞としては、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１、Ｘ６３−Ａｇ８.６５３などが使用される。不溶性のＰｒＰで免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスミエローマとの融合反応は、ミルシュタインらの方法（ミルシュタイン、“Method in Enzymology”, 73, 1981, p.3-46）に準じて行うことができる。すなわち、融合反応は、リンパ細胞の培養に通常用いられる培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地中に、約１０７個のマウスミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞に対して１〜１０倍程度の脾臓細胞および融合促進剤として３０〜５０％（Ｗ／Ｖ）濃度のポリエチレングリコール（分子量１,０００〜６,０００）を含む懸濁液を３７℃で加温することにより行われる。
【００４５】
ハイブリドーマは、未融合細胞が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間、ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）培地中で培養することにより得られる。このようにして得られるハイブリドーマに対し、その培養上清を用いて、上述の抗体価測定方法に従い、目的とする抗体産生株の選択およびクローン化が行われる。より具体的には、ＭＢＰ−ＰｒＰまたはＰｒＰ固相化プレートとＭＢＰ固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法を行うことにより、ｒｈＰｒＰに特異的なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを取得できる。
【００４６】
異常型プリオン蛋白質に対する結合性は、ＣＪＤ発症脳組織に対するウェスタンブロット分析またはＣＪＤ発症脳組織切片を用いた免疫学的染色を行うことにより確認される。ＣＪＤ発症脳組織として、ＣＪＤ患者または人工的にＣＪＤを発症させたトランスジェニック動物の脳組織が使用される。トランスジェニック動物のＣＪＤ発症脳組織は、例えば、ヒトプリオン蛋白質を発現しているトランスジェニックマウスにＣＪＤ病原体を脳内接種し、発症後の脳組織を採取することにより得られる。
【００４７】
ウェスタンブロット分析には、採取した脳組織をホモジナイズし、遠心分離により核画分を除去し、プロテネースＫ処理したものが使用される。また、免疫学的染色には、採取したＣＪＤ発症脳組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋したものが使用される。ウェスタンブロット分析および免疫学的染色は、常法に従って行われる。
【００４８】
かくして得られたヒトの異常型プリオン蛋白質に結合する抗体は、該抗体産生ハイブリドーマを大量培養した培養上清からまたは該抗体産生ハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、数日後に貯留した腹水から採取される。モノクローナル抗体の精製は、前述の蛋白質化学において通常使用される方法を適宜選択して行えば良い。
【００４９】
抗体のアイソタイピングは、市販のマウスイムノグロブリンアイソタイピングキット（アマシャムバイオサイエンス社）を用い、添付の方法に従って決定することができる。
【００５０】
得られた抗体の抗原認識部位は、Ｎ末端側若しくはＣ末端側を欠失させた種々の長さの切断型ヒトプリオン蛋白質または適当な長さの合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ドットブロット、ウェスタンブロット等の方法でエピトープマッピングを実施することにより決定することができる。より具体的には、ビオチン標識したヒトプリオンアミノ酸配列を有する合成ペプチドを、ストレプトアビジン固相化プレートに加え、ビオチン化ペプチドでコーティングされたプレートを作製する。これに、適当濃度のモノクローナル抗体を添加し、抗原抗体反応をさせた後、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを反応させ、発色基質を添加して発色させることにより行われる。前記の合成ペプチドの標識物質としては、ビオチン以外に、蛍光物質、例えばサイダイ（Ｃｙｄｙｅ）、フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンなどを使用できる。
【００５１】
以上の操作を実施することにより、ヒトプリオン蛋白質のアミノ酸配列の特定領域を認識し、且つ、ヒトの異常型プリオン蛋白質に結合するモノクローナル抗体を取得することができる。得られたモノクローナル抗体の種類とヒトプリオン蛋白質のアミノ酸配列上の認識部位を表５および実施例８に示した。なお、表５に記載されたモノクローナル抗体４Ａ１、９Ａ１、１００Ａ１、６４Ａ、５Ａ１、１２Ａ１、６３Ａ１および６６Ａ１を産生するハイブリドーマは２００３年５月１３日に、８２Ａ１および１２５Ａを産生するハイブリドーマは２００３年５月２１日に、それぞれ以下の受託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に出願人により寄託されている。
【００５２】
４Ａ１：    ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４２
９Ａ１：    ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４４
１００Ａ１：ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４９
６４Ａ：    ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４７
５Ａ１：    ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４３
１２Ａ１：  ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４５
６３Ａ１：  ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４６
６６Ａ１：  ＦＥＲＭ Ｐ−１９３４８
８２Ａ１：  ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６５
１２５Ａ：  ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６６
【００５３】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、上記の標識物質に加え、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β―ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、またはルーシフェラーゼなどの酵素で標識され、免疫組織染色、酵素免疫測定法またはウェスタンブロット法等の方法に基づく、ヒトの異常型プリオン検出システムを構築するための構成成分として使用される。
【００５４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、これに限定されるものではない。
実施例１：不溶性の組換え型ヒトプリオン蛋白質抗原の調製
東北大学大学院医学研究科病態神経学教授  北本哲之博士より分与された、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトプリオン蛋白質をコードするポリヌクレオチド（以下、「ｃＤＮＡ」と称することもある）を、組換え型ヒトプリオン蛋白質の調製に使用した。
【００５５】
上記のｃＮＤＡを、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）発現ベクター（pMALc2x、New England Biolab社製）のEco RIサイトに挿入した。この発現ベクターで大腸菌（JM109株、BL21株等）を形質転換し、アンピシリン含有寒天培地に播種した。得られたコロニーをスクリーニングし、cDNAが順方向に挿入されているクローンを選択した。
【００５６】
選択されたクローンを一夜前培養し、300mlの培地に一夜培養液を1/100容添加して本培養を開始した。菌体が対数増殖期に入った時点でイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに2−4時間培養した。集菌後、菌体を破砕し、遠心分離後上清を採取した。この上清をアミロースレジンカラムにアプライしてＭＢＰ−ＰｒＰを吸着させた。カラムを洗浄後、10mMマルトース含有緩衝液でMBP-PrPを溶出した。
【００５７】
MBP-PrP溶液に活性化第X因子を添加し、4℃で1−3日間反応させた。この間に、切り出されたヒトプリオン蛋白質部分は不溶化して沈殿し、MBP部分は可溶化状態を保持していた。反応溶液を遠心し、上清を除去後、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）で沈殿を懸濁し、再度遠心した。上清を除去後、PBSに懸濁したものを抗原とし、使用直前まで−80℃で保存した。
【００５８】
本抗原調製時に、Eco RIサイトを使用したため、配列番号１で示されたアミノ酸配列のＮ末にＩＳＥＦの４残基が付加された。
【００５９】
実施例２：モノクローナル抗体の作製
（１）免疫
抗原とする蛋白質溶液を、PBSで５倍に希釈し、500μlづつ分注後凍結保存して随時免疫に供した。免疫は、抗原溶液500μlとフロイント不完全アジュバント500μlとを混合し、７週令のBalb/c 雌マウス10匹に100μlづつ皮下投与した。１週間後前回同様に抗原を投与し、３回目の免疫後各マウスの尾血管より採血して抗体測定に用いた。ノックアウトマウスに対しても同様に免疫した。
【００６０】
（２）抗体価測定
抗体価測定は、酵素免疫法（以下、「ＥＩＡ」という）で行った。96穴のイムノプレート（Nunc社）に、MBP-PrPを150ng/wellづつ固相化し、対照用にMBPのみを100ng/wellづつ固相化した。各プレートは洗浄してウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という）でブロッキング後、乾燥して４℃で保存した。10匹のマウス血清を400倍から51,200倍まで２倍希釈系列を作成し、各希釈血清を各プレートに50μlづつ添加し、37℃で30分間インキュベートした。PBSで３回洗浄後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンG抗体を全てのwellに50μlづつ添加し、37℃で30分間清置した。次いでPBSで３回洗浄後、o-フェニレンジアミンを添加し、室温で15分間インキュベートした。塩酸を添加して呈色反応を停止させ、490nmで吸光度を測定した。
【００６１】
（３）融合
抗体価の上昇が認められたマウス３匹に抗原を50μlづつ静脈注射した。静脈注射の４日後に各マウスを屠殺して脾臓を摘出した。脾臓細胞を採取し、マウスミエローマ細胞（X63-Ag8.653）とポリエチレングリコール法によって細胞融合させ、96穴プレートに播種した。
【００６２】
（４）１次スクリーニング
ＨＡＴ培地を用いて融合細胞を選択した。ヒポキサンチン・チミジン培地に替え、融合２週間目に全wellの上清をMBP-PrP固相化プレート（以下、「ポジプレート」という）、およびMBP固相化プレート(以下、「対照プレート」という)に各々50μlづつ分注し、４℃で一夜インキュベートした。洗浄後、抗体価測定と同様の手順で、測定した。
【００６３】
（５）１次クローニング
ポジプレートで測定値が1.8以上で、かつ、対照プレートで測定値が0.09以下の細胞から、生育状況の良好なもの23クローンを選択した。各細胞を限界希釈法によりサブクローニングを行った。
【００６４】
（６）２次スクリーニング
培養上清を用いて、１次スクリーニングと同様の手順で測定した。
その結果、２Ａ１、４Ａ１、５Ａ１、９Ａ１、１２Ａ１、１６Ａ３、６３Ａ１、６４Ａ、６６Ａ１、７６Ａ、７８Ａ、８０Ａ、８２Ａ１、９０Ａ、９９Ａ、１００Ａ１、１０３Ａ、１１９Ａ、１２０Ａ、１２５Ａ、１３５Ａ、１４２Ａおよび１７４Ａとして示されるモノクローナル抗体が得られた。
【００６５】
実施例３：モノクローナル抗体のアイソタイピング
マウスイムノグロブリンアイソタイピングキット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、抗体のサブタイプを決定した。その結果、各抗体のサブタイプは以下のとおりであった。
【００６６】
表１：各抗体のアイソタイプ
2005023074.tif 000002
【００６７】
実施例４：エピトープ重複確認試験
マルトース結合蛋白質−ヒトプリオン蛋白質融合蛋白質をマイクロプレートに固相化した。5μg/mlの各精製抗体を50μlづつ分注し、37℃で30分間、ブロッキングした。プレートを洗浄後、20μg/mlのビオチン標識した抗体を50μlづつ分注し、37℃で30分間インキュベートした。プレートを洗浄後、アビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼを添加し、室温で30分間反応させた。プレートを洗浄後、o-フェニレンジアミンで発色させ、490nmにおける吸光度を測定した。
【００６８】
ビオチン標識抗体単独使用時の吸光度をA、非標識抗体でブロッキング後、ビオチン標識抗体を反応させたときの吸光度をBとして、以下の式で結合抑制率を計算した：抑制率（％）＝（Ａ − Ｂ）／Ａ  ×  １００
各抗体の抑制率を表２に示した。
【００６９】
表２：各抗体の結合抑制率
2005023074.tif 000003
【００７０】
表２：各抗体の結合抑制率（続き）
2005023074.tif 000004
【００７１】
表２：各抗体の結合抑制率（続き）
2005023074.tif 000005
【００７２】
実施例５：ウエスタンブロッティング
（１）ｒｈＰｒＰに対するウエスタンブロッティング
抗原として用いた不溶性のｒｈＰｒＰをポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、PVDF膜にブロッティングし、1%スキムミルク含有TBS緩衝液（25mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl）でブロッキングした。抗体産生ハイブリドーマ細胞をマウスに接種して得られた腹水を200倍希釈したものを一次抗体とし、抗マウスIgG抗体を2次抗体として用いて、インキュベートした。膜を洗浄後、ECLシステムで化学発光させた。各抗体は、ｒｈＰｒＰを認識した。その結果を図１に示す。
【００７３】
（２）ＣＪＤ患者脳に対するウエスタンブロッティング
脳ホモジネートをブロッティング後、1000倍希釈した腹水を一次抗体、パーオキシダーゼ標識抗マウスIgGを二次抗体として用い、ECLシステムで化学発光させた。その結果を図２に示す。図２から明らかなように、各抗体は、異常型プリオン蛋白質に特徴的な３本のバンド認識していた。
【００７４】
（３）ＣＪＤ病原体接種後、発症したマウスの脳ホモジネートに対するウエスタンブロッティング
ヒトプリオン蛋白質を発現するトランスジェニックマウスに、ＣＪＤ病原体を脳内接種した。発症後、脳を採取してホモジナイズし、核画分を除去後、プロテネースＫ処理した。電気泳動、メンブランへ転写後、各抗体でウエスタンブロッティングした。その結果を図３に示す。
【００７５】
図３から明らかなように、２Ａ１、５Ａ１、９Ａ１、および１６Ａ３の各抗体は、異常型プリオン蛋白質に特徴的な３本のバンドを、また、４Ａ１、および１２Ａ１は、異常型プリオン蛋白質に特徴的な３本のバンドのうち最も分子量の大きい糖鎖が２本付加したバンドを除く２本を認識していた。さらに、１２Ａ１はフラグメンテッドプリオン蛋白質といわれる分子量の小さいバンドも認識していた。
【００７６】
実施例６：ＣＪＤ患者脳組織切片に対する免疫組織染色
ホルマリン固定したパラフィン包埋組織から２.７μm厚の切片を切り出した後、パラフィンを除去した。組織中にもともと存在するパーオキシダーゼをブロックするため、0.3%過酸化水素含有メタノール中で30分間インキュベートした。ステンレス鋼の容器中で組織切片を、蒸留水で希釈した3 mmol/L塩酸に浸漬した状態で121℃、10分間オートクレーブし、常圧、および60℃以下になってから組織切片を取り出し、水道水と50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)で洗浄した。5%スキムミルク含有のTTBS (25 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)、 0.05% Tween 20、0.5 mol/L NaCl)で希釈した抗プリオン抗体（0.5μg/ml）溶液中、4℃でインキュベートし、非標識抗体−ビオチン−ストレプトアビジン法（ICN Immunobiologicals, Costa Mesa, CA）を実施後、ジアミノベンジディンで発色させた。その結果を表３に示す。各抗体は、異常型プリオン蛋白質を特異的に染色していた。
【００７７】
表３
2005023074.tif 000006
【００７８】
実施例７：合成ペプチドによるエピトープマッピング
（１）ビオチン化ペプチドの合成（PepSet）
東洋紡に委託して、ペプセットによりクリーバブルタイプのビオチン化ペプチドを１μmoleづつ合成した。各ペプチドは、ビオチン−ＳＧＳＧ（スペーサ）−１５アミノ酸−アミド（１５アミノ酸部分は表４参照）、但し、第１番目のペプチドのみAmino−１５アミノ酸−ＧＳＧ−Biocytamideとの構造とした。ペプチド本数は合計４０本で、streptavidin固定化プレート５枚を作製した。
【００７９】
表４：合成ペプチド(１５アミノ酸部分)の配列
2005023074.tif 000007
【００８０】
（２）合成ペプチドのコーティング
別個のBIO-RAD racked Titertube Micro Tube内にある、40種類の各乾燥ペプチドに、0.4mLの50/50% acetonitrile/waterを添加した。各チューブを5分間繰り返し逆さにした後、Microrackに移して超音波槽内で超音波処理した。ペプチド溶液を約70倍に希釈するため、1.4mLづつ50/50% acetonitrile/waterをBeckman square well plate (Cat. No. 140504)に分注した。そこへ20μLのペプチド溶液を添加し、混合した。20μLの希釈したペプチド溶液を、duplicateで、あらかじめ各穴に80μLのPBS/0.1%v/v Tween 20/0.1%w/v sodium azideが入ったstreptavidin coated plateの相応する位置の穴に添加した。最終的なペプチド溶液の希釈倍数は、約350倍となった。（注：このペプチド量は、固定化されたstreptavidinのすべての結合サイトを飽和させるのに十分な量である。）プレートは、冷室で一夜インキュベート後、20℃で30分間振とうした。プレートを洗浄後、25℃で30分間乾燥した。プレートは使用するまで-20℃で保存した。
【００８１】
（３）全ての穴がビオチン化ペプチドでコーティングされていることの確認試験
多数のプレートをduplicateでペプチドコーティングした。各穴がビオチン化ペプチドでコーティングされていることを確認するため、各穴に100μLの50ng/mLビオチン化パーオキシダーゼ溶液を添加した。このとき、対照として、ビオチン化ペプチドでコートされていない穴（fully unblocked）と過剰のビオチンで処理した穴（fully blocked）を追加した。その結果を図４に示す。図４中、ＢＬはfully blocked、ＵＮはfully unblockedをそれぞれ意味する。
【００８２】
図４から明らかなように、ペプチドコートした穴は、fully blockedの穴より低いabsorbanceを示した。このことは、各穴がビオチン化ペプチドでコートされていることを示唆している。さらには、ビオチンよりもビオチン化ペプチドの方が、より効果的にビオチン化パーオキシダーゼの結合を阻害することを示唆している。
【００８３】
（４）エピトープマッピング
モノクローナル抗体を終濃度2μg/mLとなるようにPBS/0.1%v/v Tween 20/0.1%w/v sodium azideで希釈した。抗体溶液をペプチドコーティングしたプレートの各穴に100μLづつ分注した。プレートは、４℃で一夜インキュベート後、20℃で30分間振とうした。プレートを洗浄後、各穴に100μLづつ、2.5%カゼイン溶液で2000倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)（Kirkegaard & Perry, Cat. No. 074-1806）を添加した。プレートを20℃で1時間振とうした。各穴を水で洗浄後、残存する液体を除去するため紙タオル上に向け下方向にたたいた。100μLのABTS基質溶液（0.5mg/mL 2,2Azino-di-[3-ethyl-benzthiazolin-sulfonat], 0/01%w/v 過酸化水素水）を添加し、22℃の恒温室で10分まで浸透した。プレートをLabsystems Multiskan Multisoft plate readerを用い、495nmをreference波長とし405nmで測定した。その結果を図５〜図７に示す。
【００８４】
４Ａ１および９Ａ１は、いずれのペプチドにも結合しなかった（図５）。従って、この方法では、これらの抗体のエピトープを推定することはできなかった。６４Ａ、１００Ａ１および１７４Ａは、ペプチド５および６と強く結合し、ペプチド７〜１３とも弱く結合した。さらに、６４Ａはペプチド２８とも結合した（図５）。ペプチド７〜１３は、オクタペプチドのリピートが存在する領域である。これらの抗体は、オクタペプチドの一部をエピトープとしていることが示唆された。
【００８５】
２Ａ１、５Ａ１および１６Ａ３は、ペプチド２４および２５に強く結合した（図６）。１２Ａ１、１２５Ａは、ペプチド２８のみに強く結合した（図６）。６３Ａ１および６６Ａ１は、ペプチド２８に強く結合し、ペプチド２７および２９に弱く結合した。また、これらは、ペプチド５、６および３９にも弱く結合した（図６）。その他の抗体は、ペプチド２８に強く結合し、ペプチド２７、２９および３９にも弱く結合した（図７）。
以上の結果を表５にまとめて示す。
【００８６】
表５：エピトープマッピングの結果
2005023074.tif 000008
＊：Ｓ，Ｍ，Ｗは、それぞれ強、中、弱の結合の程度を表す。
【００８７】
実施例８：欠失変異体によるエピトープマッピング
プロテネースＫ処理後のヒトプリオン蛋白質（アミノ酸番号９５−２３０）のＮ末側、またはＣ末側からの一連の欠失変異体とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質を大腸菌で発現させた。各変異体の構造を図８および図９に示す。これらの蛋白質に対して、各抗体でウエスタンブロッティングを実施した。
【００８８】
２Ａ１によるウエスタンブロッティングでは、Ｃ末側が１７４番目まである変異体（Ｈｕ９５−１７４）は認識したが、それ以上欠失させる（Ｈｕ９５−１４６）と認識しなかった。また、Ｎ末側が１３５番目まである変異体（Ｈｕ１３５−２３０）は認識したが、それ以上欠失させる（Ｈｕ１４９−２３０等）と認識しなかった（図１０）。これらのことから、２Ａ１の認識するエピトープは１３５−１７４残基の間にあると推察された。
【００８９】
以下同様にして、４Ａ１のエピトープは１７１−２１６（または１６３−２２４）残基の間に（図１１）、５Ａ１のエピトープは１３５−１７４残基の間に（図１２）、９Ａ１のエピトープは１３５−２１６残基の間に（図１３）、１２Ａ１のエピトープは１６３−１９７残基の間に（図１４）、１６Ａ３のエピトープは１３５−１７４残基の間に、それぞれあると推察された。
【００９０】
実施例９：ヒトプリオン蛋白質（ｈＰｒＰ）を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
ヒトプリオン蛋白質（ｈＰｒＰ）を検出するため、数種類のモノクローナル抗ｈＰｒＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の確立を行った。
モノクローナル抗体８０Ａと１１９Ａ（PBSで0.5mg/mLに希釈抗体各60μL）を混合し、炭酸緩衝液（pH9.4；1380μL）でそれぞれの最終濃度を20μg/mLとし、ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに50μLを添加した。37℃で2時間吸着させた後、ＥＬＩＳＡプレートを0.05%Tween-PBS（pH7.4；250μL/ウエルで2回）で洗浄後、4倍希釈したブロックエース（1.5mL）を各ウエルに50μLずつ添加して37℃で2時間培養した。実施例１で調製した組換えｈＰｒＰ（200μL）を5％SDS(200μL)と等量混合した後、メタノール（1.6mL）で沈殿させ、10倍希釈したブロックエースで2段階希釈し、各ウエルに50μLずつ添加して4℃で終夜反応させた。各ウエルを0.05%Tween-PBSで洗浄後、Biotin化モノクローナル抗体１００Ａ１（最終濃度5μg）の50μLを添加し、37℃で3時間反応させた。Avidin標識酵素（1.5μL）を10倍希釈したブロックエースで1000倍に希釈し、各ウエルに50μLずつ添加して、37℃で1時間反応させた。各ウエルを0.05%Tween-PBSで洗浄後、o-フェニレンジアミンを添加し、室温で反応させた後、1mol/L塩酸で反応を停止した。各サンプルの測定をデュプリケートで実施した。その結果を図１５に示す。
【００９１】
図１５の結果から明らかなように、モノクローナル抗ｈＰｒＰ抗体を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法の組換えｈＰｒＰに対する検出感度は、３１ｐｇ／５０μＬであり、モノクローナル抗ｈＰｒＰ抗体を利用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法が樹立された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、ヒトプリオン蛋白質のアミノ酸配列上の新規なエピトープを認識し、ヒトの異常型プリオン蛋白質に対して安定した反応性を有する抗体が提供される。このように新規なエピトープを認識する本発明抗体は、不溶性のプリオン蛋白質を免疫抗原として用いることによって得ることができた。ウエスタンブロット法および免疫組織染色法により、ＣＪＤ発症脳組織との反応性を調べた結果、本発明抗体は陽性を示し、異常型プリオン蛋白質の検出に利用できることが示された。
【００９３】
従来の技術の項においても詳述したように、ヒトプリオンには様々な遺伝的多型が知られており、また異常型プリオン蛋白質には、異なるコンホメーションをとっているものが複数存在すると考えられている。従って、１種類の抗体を用いた検出系では異常型プリオン蛋白質を漏れなく検出することはできないため、様々なエピトープを認識する新規な抗体が望まれていた。本発明抗ヒトプリオン抗体は、既知の抗体とは異なるエピトープを認識し、その認識部位は既知抗体には少ないプリオンの構造変化に影響を与えるＣ末端側の領域である抗体も多い。
【００９４】
また、本発明抗体には立体構造を認識する抗体も含まれており、立体構造の変化により正常型から異常型に変わるプリオンの検出において、立体的なエピトープを認識する本発明抗体は異常型プリオン検出系の開発、プリオン異常化に関する研究など様々な面で有用な抗体である。従って、本発明抗ヒトプリオン抗体は、輸血、血液製剤、および臓器移植における異常型プリオン蛋白質のスクリーニングやヒトプリオン蛋白質関連の研究用試薬や診断薬等への利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】組換えヒトプリオン蛋白質に対するウエスタンブロッティングを示す。抗原量の単位はｎｇ（バンド当たり）。矢印は、抗原（組換えヒトプリオン）の位置を示す。７０ｋＤａ付近にみえるバンドはウシ血清アルブミンである。
【００９６】
【図２】ＣＪＤ患者の脳に対するウエスタンブロッティングの結果を示す。
【００９７】
【図３】ＣＪＤ病原体を接種後、発症したマウスの脳ホモジネートに対するウエスタンブロッティングの結果を示す。
【００９８】
【図４】ペプチドコーティングの確認試験の結果を示す。
【００９９】
【図５】ペプチドによるエピトープマッピングの結果を示す。ペプチド１〜４０に対するモノクローナル抗体４Ａ１、９Ａ１、１７４Ａ、１００Ａ１および６４Ａの結合を示す。
【０１００】
【図６】ペプチドによるエピトープマッピングの結果を示す。ペプチド１〜４０に対するモノクローナル抗体２Ａ１、５Ａ１、１６Ａ３、１２Ａ１、１２５Ａ、６３Ａ１、６６Ａ１および７６Ａの結合を示す。
【０１０１】
【図７】ペプチドによるエピトープマッピングの結果を示す。ペプチド１〜４０に対するモノクローナル抗体７６Ａ、７８Ａ、８０Ａ、８２Ａ１、９０Ａ、９９Ａ、１０３Ａ、１１９Ａ、１２０Ａ、１３５Ａおよび１４２Ａの結合を示す。
【０１０２】
【図８】大腸菌で発現させた、ヒトプリオン蛋白質またはそのＣ末端側欠失変異体とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの各融合蛋白質の構造を示す模式図。図中、ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを示し、数値はアミノ酸番号を示す。糖鎖の付加部位をも示してあるが、実際の融合蛋白質は大腸菌発現のため糖鎖はない。
【０１０３】
【図９】大腸菌で発現させた、ヒトプリオン蛋白質またはそのＮ末端側欠失変異体とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの各融合蛋白質の構造を示す模式図。図中、ＧＳＴはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを示し、数値はアミノ酸番号を示す。糖鎖の付加部位をも示してあるが、実際の融合蛋白質は大腸菌発現のため糖鎖はない。
【０１０４】
【図１０】ＧＴＳ−プリオン欠失変異体融合蛋白質に対するモノクローナル抗体２Ａ１によるウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：Ｍｏ９４−２３０；レーン２：Ｈｕ９５−２３０；レーン３：Ｈｕ９５−２２４；レーン４：Ｈｕ９５−２１６；レーン５：Ｈｕ９５−２０８；レーン６：Ｈｕ９５−１９７；レーン７：Ｈｕ９５−１８６；レーン８：Ｈｕ９５−１７４；レーン９：Ｈｕ９５−１４６；レーン１０：ＧＳＴ；レーン１１：Ｈｕ１３５−２３０；レーン１２：Ｈｕ１４９−２３０；レーン１３：Ｈｕ１６３−２３０；レーン１４：Ｈｕ１７１−２３０；レーン１５：Ｈｕ１７９−２３０；レーン１６：Ｈｕ１８７−２３０；レーン１７：Ｈｕ１９７−２３０
【０１０５】
【図１１】ＧＴＳ−プリオン欠失変異体融合蛋白質に対するモノクローナル抗体４Ａ１によるウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：Ｍｏ９４−２３０；レーン２：Ｈｕ９５−２３０；レーン３：Ｈｕ９５−２２４；レーン４：Ｈｕ９５−２１６；レーン５：Ｈｕ９５−２０８；レーン６：Ｈｕ９５−１９７；レーン７：Ｈｕ９５−１８６；レーン８：Ｈｕ９５−１７４；レーン９：Ｈｕ９５−１４６；レーン１０：ＧＳＴ；レーン１１：Ｈｕ１３５−２３０；レーン１２：Ｈｕ１４９−２３０；レーン１３：Ｈｕ１６３−２３０；レーン１４：Ｈｕ１７１−２３０；レーン１５：Ｈｕ１７９−２３０；レーン１６：Ｈｕ１８７−２３０；レーン１７：Ｈｕ１９７−２３０
【０１０６】
【図１２】ＧＴＳ−プリオン欠失変異体融合蛋白質に対するモノクローナル抗体５Ａ１によるウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：Ｍｏ９４−２３０；レーン２：Ｈｕ９５−２３０；レーン３：Ｈｕ９５−２２４；レーン４：Ｈｕ９５−２１６；レーン５：Ｈｕ９５−２０８；レーン６：Ｈｕ９５−１９７；レーン７：Ｈｕ９５−１８６；レーン８：Ｈｕ９５−１７４；レーン９：Ｈｕ９５−１４６；レーン１０：ＧＳＴ；レーン１１：Ｈｕ１３５−２３０；レーン１２：Ｈｕ１４９−２３０；レーン１３：Ｈｕ１６３−２３０；レーン１４：Ｈｕ１７１−２３０；レーン１５：Ｈｕ１７９−２３０；レーン１６：Ｈｕ１８７−２３０；レーン１７：Ｈｕ１９７−２３０
【０１０７】
【図１３】ＧＴＳ−プリオン欠失変異体融合蛋白質に対するモノクローナル抗体９Ａ１によるウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：Ｍｏ９４−２３０；レーン２：Ｈｕ９５−２３０；レーン３：Ｈｕ９５−２２４；レーン４：Ｈｕ９５−２１６；レーン５：Ｈｕ９５−２０８；レーン６：Ｈｕ９５−１９７；レーン７：Ｈｕ９５−１８６；レーン８：Ｈｕ９５−１７４；レーン９：Ｈｕ９５−１４６；レーン１０：ＧＳＴ；レーン１１：Ｈｕ１３５−２３０；レーン１２：Ｈｕ１４９−２３０；レーン１３：Ｈｕ１６３−２３０；レーン１４：Ｈｕ１７１−２３０；レーン１５：Ｈｕ１７９−２３０；レーン１６：Ｈｕ１８７−２３０；レーン１７：Ｈｕ１９７−２３０
【０１０８】
【図１４】ＧＴＳ−プリオン欠失変異体融合蛋白質に対するモノクローナル抗体１２Ａ１によるウエスタンブロッティングの結果を示す。レーン１：Ｍｏ９４−２３０；レーン２：Ｈｕ９５−２３０；レーン３：Ｈｕ９５−２２４；レーン４：Ｈｕ９５−２１６；レーン５：Ｈｕ９５−２０８；レーン６：Ｈｕ９５−１９７；レーン７：Ｈｕ９５−１８６；レーン８：Ｈｕ９５−１７４；レーン９：Ｈｕ９５−１４６；レーン１０：ＧＳＴ；レーン１１：Ｈｕ１３５−２３０；レーン１２：Ｈｕ１４９−２３０；レーン１３：Ｈｕ１６３−２３０；レーン１４：Ｈｕ１７１−２３０；レーン１５：Ｈｕ１７９−２３０；レーン１６：Ｈｕ１８７−２３０；レーン１７：Ｈｕ１９７−２３０
【０１０９】
【図１５】本発明の抗ヒトプリオン抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による組換えヒトプリオン蛋白質の検出を示す。
【図１】
2005023074.tif 000009
【図２】
2005023074.tif 000010
【図３】
2005023074.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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