(57)【要約】【課題】メチシリン高度耐性を付与するポリペプチド、それらをコードしているポリヌクレオチド、及びおよび該タンパク質のそれらの阻害物質を提供する。【解決手段】配列番号３（HmrA）又は配列番号４（HmrB）のポリペプチド、及びこれらのポリペブチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドのアンタゴニスト。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２のポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２のポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ｄ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｅ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列のポリペプチド。
【請求項６】
請求項４又は５のポリペプチドの活性又は発現を阻害するアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は黄色ブドウ球菌のメチシリン高度耐性に関与するポリヌクレオチド、新規ポリペプチド及びそれらの変種、及び該ポリペプチドに対するアンタゴニストに関する。
【０００２】
【従来の技術】
黄色ブドウ球菌は、ペニシリン,  セフェム、カルバペネムなどのβ−ラクタム系抗菌薬に耐性を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）を含み、MRSA感染治療は、もっぱらバンコマイシンなどのグリコペプチド系抗生物質に頼っている。しかし、１９９７年にグリコペプチドに低感受性を示すMRSA（VRSA; vancomycin-resistant Staphylococcus aureusまたは、VISA, vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus; GISA, glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureusと呼ばれる）株が、本発明者らによって、日本の病院から検出された。さらに、同様の菌株が米国、韓国、ヨーロッパでも検出され、もはやMRSA一般に有効な抗生物質は存在せず、MRSA感染症は、現代医療の大きな問題となっている。
【０００３】
メチシリン耐性を起こす遺伝子mecAは、外来性遺伝子であり、その構成的な発現によって、ほとんどすべてのβ−ラクタム薬に耐性を付与する。しかし、一部の、黄色ブドウ球菌に強い抗菌力を持ったβ−ラクタム薬  (イミペネム、セフメタゾール、フロモキセフなど)は、mecAの発現があっても、なお、臨床的に有効な抗菌活性を有する。その理由は、mecA遺伝子の発現のみによっては、高度な耐性（homo-resistance）が達成できないことと相関している。
【０００４】
MRSAの高度耐性の発現のためには、mecA遺伝子の発現に加えて、黄色ブドウ球菌の染色体上の他の遺伝子の関与が必要であることが示されており、その遺伝子の探索が行われている。従来、高度耐性MRSA株を、トランスポゾンによる変異（transposon mutagenesis）により、耐性度の低下した変異株を得、トランスポゾンの挿入した部位に存在する遺伝子をクローン化し、高度耐性に関与する遺伝子の探索が行われてきた。現在までに、fem遺伝子群、aug遺伝子群として、数十の遺伝子が知られている。
【０００５】
しかし、上記の方法でクローン化された遺伝子は、そのほとんどが、細胞壁合成系など、本来細菌の生理に必須である酵素をコードしたものであり、実際の臨床分離MRSAにおける、高度耐性に関与しているかどうか不明である。すなわち、このようにして同定された遺伝子を感受性菌に導入して、明らかにメチシリン耐性度が増加することが示された例はない。また、この方法では、致死的な遺伝子のクローン化は、困難である。すなわち、その遺伝子がトランスポゾンで破壊されると、死滅するような遺伝子は、このトランスポゾンによる変異株として得ることが難しい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
黄色ブドウ球菌のメチシリン高度耐性をおこす遺伝子産物が同定されれば、その蛋白質に対する阻害薬を開発することにより、MRSAのβ−ラクタム薬に対する耐性を軽減し、イミペネムなどの抗黄色ブドウ球菌抗菌力の強いβ−ラクタム薬を併用することにより、治療効果を得ることができる。また、当該遺伝子産物の機能が黄色ブドウ球菌の生理に必須の機能を持っている場合には、阻害薬単独でも治療効果を有する。
従って、本発明の目的はこのようなメチシリン高度耐性をおこす遺伝子及び遺伝子産物、及びそれらの阻害物質を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記本発明の目的は下記のポリヌクレオチド、ポリペプチド、該ポリペプチドの活性又は発現を阻害するアンタゴニストによって達成される。
即ち、本発明は下記のとおりである。
【０００８】
（１）配列番号１又は２のポリヌクレオチド。
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｂ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（３）前記（１）又は（２）のポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【０００９】
（４）配列番号３又は４のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（５）以下の（ｄ）〜（ｅ）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチド。
（ｅ）配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列のポリペプチド。
（６）前記（４）又は（５）のポリペプチドの活性又は発現を阻害するアンタゴニスト。
【００１０】
【発明の実施の形態】
配列番号１及び２の本発明のポリヌクレオチドは配列番号３及び４の黄色ブドウ球菌由来のポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドはいずれも新規なものである。本発明者は配列番号３及び４のポリペプチドをそれぞれHmrA及びHmrBと命名した。
【００１１】
配列番号１及び２のポリヌクレオチドは黄色ブドウ球菌の染色体上にある。配列番号１及び２のポリヌクレオチドを、メチシリン軽度耐性黄色ブドウ球菌に導入すると、後述の実施例に示すようにメチシリン高度耐性が発現する。したがって、これらのポリヌクレオチドのコードする配列番号３及び４のポリペプチドHmrA及びHmrBは、黄色ブドウ球菌のメチシリン高度耐性の原因となっていることが示された。
【００１２】
本発明においては配列番号３又は４のポリペプチドに限らず、このポリペプチド活性を有する１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のポリペプチドをふくむ。また、配列番号３又は４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上同一であり、配列番号３又は４のポリペプチド活性を有するポリペプチドも含む。
【００１３】
また、本発明は配列番号１及び２のポリヌクレオチドのみならず、前記の配列番号３及び４のポリペプチド又は配列番号３又は４のポリペプチド活性を有しこれらと５０％、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらと７０％以上、好ましくは９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドも含む。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、配列番号１又は２のポリヌクレオチドを用いて公知の方法によって得ることができる。例えば、大腸菌の発現ベクタープラスミド上のプロモーターの下流に、本ヌクレオチドを挿入し、大腸菌に、形質転換法により導入し、本発明のポリペプチドを産生することができる。
【００１５】
本発明のもうひとつの形態は、これらのポリペプチドに対する阻害剤、即ちアンタゴニストである。アンタゴニストは、いくつかの公知の方法によって得ることができる。例えば、（１）まず、これらのポリペプチドに部位特異的なアミノ酸変異を導入したポリペプチドを発現する組換えプラスミドを複数作製し、メチシリン軽度耐性黄色ブドウ球菌株、あるいは、N315のようにメチシリン耐性遺伝子mecAをもちながら、メチシリンに感受性を示す株（pre-MRSA株）に導入する。それぞれの形質転換株のメチシリン耐性度を測定し、これらのポリペプチドのメチシリン耐性を増強する機能に必要な部位、すなわち活性中心部位を推定することができる。ただし、HmrBポリペプチドの場合は、acyl-carrier proteinの既知の活性中心からの類推で、prosthetic groupの結合部位セリンが活性中心であると推定される。次に、精製されたこれらポリペプチドの結晶を作製し、Ｘ線構造解析により３次元構造を決定する。その上で、活性部位に相当する部分の３次元構造に結合し得る化学物質の構造を推定し、合成する。あるいは、（２）精製された、これらポリペプチドとアンタゴニストの候補化学物質を反応させ、例えば、結合による蛍光のクエンチングを測定することにより、これらポリペプチドと高い親和性で結合する化学物質を得ることができる。この物質がこれらポリペプチドの持つ活性を阻害するかどうかは、hmrAあるいは、hmrB遺伝子を導入しメチシリン（及び、他のβムラクタム薬）の耐性度が増強した形質転換株の耐性度が、当該物質を添加した培地を用いてメチシリンあるいは他のβムラクタム薬の感受性テスト（例えばMIC測定）を行った場合に低下することを観察することにより、確認することができる。
【００１６】
本発明のアンタゴニストは、HmrA及びHmrBの活性発現を阻害するため、単独で又は他のβ−ラクタム薬のような抗生物質と併用することにより、高度耐性MRSA感染症の治療に有用である。
【００１７】
【実施例】
以下に本発明を実施例で説明する。
実施例１
［HmrA及びHmrBをコードするポリヌクレチド］
HmrA及びHmrBをコードするポリヌクレチドは、以下のようにして得られた。メチシリンに高度耐性を示すMRSA株N315h4からDNAを抽出し、Sau3A1を用いて不完全に消化した。
これを大腸菌と黄色ブドウ球菌のシャトルベクターであるpYT3のBamH1部位にligaseを用いて挿入した。これを用いて大腸菌株JM109を形質転換し、テトラサイクリン10 mg/lを含む寒天平板で選択し、2,871の形質転換株からなるライブラリーを得た。
【００１８】
形質転換株からプラスミドを抽出し、セシウムクロライド（Cs-Cl）による密度勾配遠心法によりプラスミドを精製し、N315h4の親株であるメチシリン感受性黄色ブドウ球菌株N315に、電気穿孔法（electropolation）を用いて導入した。 これをテトラサイクリン10 mg/lで選択し、22,580の形質転換株を得た。
それぞれの形質転換株のコロニーを、メチシリン10 mg/l 及び100mg/lを含む寒天平板にレプリカし、30℃で48時間培養し、100 mg/lのメチシリンの存在下で、10mg/lのメチシリン存在下でよりも大きなコロニーを形成する形質転換株を探した。その結果３株の形質転換株を得た。
【００１９】
これら３株からプラスミドDNAを抽出し、挿入されたDNAの制限酵素地図を作成し、その塩基配列を決定した。このうち２つは、同一プラスミドであることがわかり、合計２種の組み替えプラスミドpHMRA及び pHMRBを得た。
【００２０】
実施例２
［メチシリン高度耐性を規定するopen reading frameの特定］
図１に示すように、メチシリン高度耐性を付与する機能をもつ組換えプラスミドの挿入DNAを、種々の制限酵素を用いて断片化し、サブクローニングし、N315株に電気穿孔法により導入し、メチシリン耐性の増強（Eaglephenotype）を確認した。また、pHMR-A4では、特異的プライマーセットを用いて、orf1を増幅し、クローン化したものである。さらに、orf1のNdeI制限酵素部位を切断し、Klenov酵素で平滑断端化した後ligationを行い、orf1にframe shiftを起こさせた。これらの組換えプラスミドのメチシリン耐性増強機能の有無を調べ、orf1のコードする推定タンパクHmrAが、メチシリン耐性増強の機能を持っていることを確認した。同様に、組換えプラスミドpHMR-Bのメチシリン耐性増強機能は、orf2に局在化され、この遺伝子のコードするタンパクHmrBがメチシリン耐性増強の機能を持っていることを確認した。pHMRAの挿入DNA上の機能を持ったopen readingframeを、hmrAと命名し、pHMRBのそれをhmrBと命名した。
【００２１】
hmrAの塩基配列から推測される遺伝子産物HmrAは、従来の既存のタンパクとの相同性は低く、新規なポリペプチドであった。HmrBは、acyl carrier protein(ACP)との相同性が高く黄色ブドウ球菌のACPであると判断された。ACPは、細菌における脂質の合成、糖鎖の合成に関与している重要なタンパクであるが、従来ACPがメチシリンなどのβ−ラクタム薬の耐性に関与するという報告はない。ACP機能の、薬剤耐性の領域での知見は、今回の実験で初めて得られたものである。
【００２２】
実施例３
[pHMRA、 pHMRBのメチシリン軽度耐性黄色ブドウ球菌株LR5Pへの導入とMIC測定]
組み替えプラスミドpHMRA,pHMRBを、メチシリン軽度耐性黄色ブドウ球菌株LR5Pにelectroporationにより導入し、テトラサイクリン１０mg/Lの存在下で選択を行い、形質転換株LR5P(pHMRA)、LR5P(pHMRB)を得た。ベクターのみによる形質転換株LR5P(pYT3)、及び、親株LR5P、とともに、これらの形質転換株のメチシリン、イミペネムMICを測定した。結果を表１に示す。表１に示すように、hmrA,hmrBを含むポリヌクレオチドを導入した場合に,メチシリン、イミペネム耐性度が上昇した。このことから、これらの遺伝子産物が、preMRSA株をEagle-typeの高度メチシリン耐性を起こすだけでなく、軽度耐性（あるいはhetero-type methicillin resistance）のMRSA株を高度耐性化（homo-typemethicillin resistance） に変換することができることがわかった。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
【発明の効果】
以上のように、HmrA及びHmrBは黄色ブドウ球菌のメチシリン高度耐性に関与する新規な遺伝子産物である。従って、本発明のHmrA及びHmrBのアンタゴニストは、単独で又は他のβ−ラクタム薬のような抗生物質と併用して、高度耐性MRSA感染症の治療薬として用いることができる。
【００２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１A: hmrA遺伝子を含むクローン化されたDNA断片の制限酵素地図
図１B: hmrB遺伝子を含むクローン化されたDNA断片の制限酵素地図
【図１】
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