(57)【要約】【課題】発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹の製造に用いる液体種麹の製造方法と、該液体種麹を使用した液体麹の製造方法を提供する。【解決手段】液体麹の製造に使用される液体種麹を穀類の使用量が４％（ｗ／ｖｏｌ）から１２％（ｗ／ｖｏｌ）に調製された液体培地で麹菌株を培養して製造する。また、得られた前記液体種麹が、前記液体麹を培養する液体培地に対して０．５％（ｖ／ｖｏｌ）から５％（ｖ／ｖｏｌ）植菌された後、麹菌を培養して液体麹を製造する。これによって、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が高い液体麹が製造できる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体麹の製造に使用される液体種麹の製造方法であって、穀類の使用量が４％（ｗ／ｖｏｌ）から１２％（ｗ／ｖｏｌ）に調製された液体培地で麹菌株を培養する液体種麹の製造方法。
【請求項２】
前記穀類は、大麦である請求項１に記載の液体種麹の製造方法。
【請求項３】
前記穀類は、米である請求項１に記載の液体種麹の製造方法。
【請求項４】
請求項１から３いずれか１項に記載の方法で得られた前記液体種麹が、前記液体麹を培養する液体培地に対して０．５％（ｖ／ｖｏｌ）から５％（ｖ／ｖｏｌ）植菌されて培養される液体麹の製造方法。
【請求項５】
前記液体麹を培養する液体培地は、穀類の使用量が０．１％（ｗ／ｖｏｌ）から２０％（ｗ／ｖｏｌ）に調製されたものである請求項４に記載の液体麹の製造方法。
【請求項６】
前記液体培地に前記液体種麹を植菌して、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、を同時に生成、蓄積させる請求項４または５に記載の液体麹の製造方法。
【請求項７】
請求項４から６いずれか１項に記載の方法で得られた前記液体麹を用いて発酵飲食品を製造する発酵飲食品の製造方法。
【請求項８】
発酵飲料の製造は、全工程が液相で行なわれる請求項７に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項９】
発酵飲料の製造は、外界との遮蔽状態が保たれた状態の液相で行なわれる請求項７または８に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項１０】
発酵飲料の製造は、前記液体麹に掛け原料を仕込んで一次もろみを製造する請求項７から９いずれか記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項１１】
前記発酵飲食品が、焼酎である請求項７から１０いずれか記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項１２】
少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、が増強された液体麹を培養するものである液体麹製造用の液体種麹。
【請求項１３】
少なくとも、グルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性と、を有する発酵飲食品用の液体麹のセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹の製造に用いる液体種麹の製造方法と、該液体種麹を使用した液体麹の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類等の製造に用いられる麹は、蒸煮等の処理後の原料に糸状菌の胞子を接種して培養する固体麹と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調製し、これに麹菌の胞子又は前培養した菌糸等を接種して培養する液体麹がある。
【０００３】
従来の酒類又は発酵食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。この固体培養法は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus  kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus  awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus  oryzae）、又は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus  sojae）等の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる培養方法である。
【０００４】
例えば、焼酎の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus  kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus  awamori）等の固体麹が広く用いられている。しかしながら、固体培養法は、原料や麹菌体が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多く、雑菌による汚染といった品質管理面での注意も要する。そのため大規模製造には不向きな方法ともいえる。
【０００５】
これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易であり、効率的な生産に適した培養形態であるが、例えば焼酎醸造に必要な酵素活性が十分に得られない等で、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少ない。ここで、液体培養法で得られる培養物とは、液体培養法で得られる培養物そのもの（以下、液体麹ともいう）、培養液、菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物であってもよい。
【０００６】
液体培養法で得られる培養物が利用されない大きな理由として、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素である。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、グルコアミラーゼの活性は著しく低く、生産挙動も固体培養とは大きく異なることが知られている（非特許文献２参照）。
【０００８】
麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、菌糸の生育にストレスを与えながら麹菌を培養する方法（特許文献１参照）、焙炒した穀類を麹菌培養液に添加する方法（特許文献２参照）等が報告されている。また、本発明者らは、麹菌の難分解性糖質を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法に関する発明を提案している（特許文献３参照）。
【０００９】
一方、耐酸性α−アミラーゼについては、最近、分子生物学的な解析が詳細に行われ始めている（非特許文献３参照）。それによれば、白麹菌は非耐酸性のα−アミラーゼと耐酸性のα−アミラーゼという性質の異なる２種類のアミラーゼ遺伝子を有しているが、その発現様式は大きく異なっており、液体培養においては、非耐酸性α−アミラーゼはよく生産されるものの、焼酎醸造の鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼはほとんど生産されないことが報告されている。
【００１０】
焼酎製造では、焼酎もろみの腐造防止のために低ｐＨ環境下で醸造する。非耐酸性のα−アミラーゼは、低ｐＨ条件では速やかに失活してしまうため、焼酎醸造の糖質分解にはほとんど貢献しない。焼酎醸造の糖質分解に寄与していると考えられる耐酸性のα−アミラーゼを、液体培養で大量に生成させることが、焼酎製造のために不可欠である。
【００１１】
過去には、液体培養における耐酸性α−アミラーゼの生産挙動を検討した報告があるものの、その方法はペプトンやクエン酸緩衝液を含む合成培地を用いているし、培養時間が１００時間以上かかるなど、実際の焼酎醸造に適用できるような液体麹の製造方法であるとは言い難い（非特許文献４参照）。
【００１２】
また、麹菌を液体培地で培養する液体麹の製造において、麹菌の接種は、穀類を使用した液体培地に麹菌の胞子を直接接種する方法と、液体培地で麹菌を前培養して菌糸状にしたものを接種する方法とがあり、大容量のタンクで培養するときには液体種麹で植菌するのが好ましいとされている。この液体種麹を植菌して液体麹を培養する方法は既に一般的に行われていることである（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６参照）。
【特許文献１】特開平１１−２２５７４６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２１１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５１６５号公報
【特許文献４】特開２０００−８８号公報
【特許文献５】特開２００２−２１８９７０号公報
【特許文献６】特開２００３−４７４５５号公報
【非特許文献１】Iwashita  K.  et  al:  Biosci.  Biotechnol.  Biochem.，62，1938-1946（1998）、山根雄一ら:  日本醸造協会誌.，99，84-92(2004)
【非特許文献２】Hata  Y.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，84,532-537(1997)、Hata  Y.  et  al:  Gene.，207，127-134(1998)、Ishida  H.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，86，301-307(1998)、Ishida  H.  et  al:  Curr  Genet.，37，373-379(2000)
【非特許文献３】Nagamine  K.  et  al:  Biosci.  Biotechnol.  Biochem.，67，2194-2202（2003）
【非特許文献４】Sudo  S.  et al:  J.  Ferment.  Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo  S.  et  al:  J.  Ferment.  Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら:  日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献１に開示の方法は、多孔性膜上又は空隙を有する包括固定化剤中で培養してグルコアミラーゼをコードする新規遺伝子ｇｌａＢを発現させて同酵素活性を高めるもので、厳密な制御又は特殊な培養装置が必要であり、実用的ではない。また、特許文献２に開示の方法は、原料の少なくとも一部に焙炒した穀類を用いた液体培地で麹菌を培養するもので、穀類を焙炒するという、新たな製造工程が加わることになる。また、特許文献３ではグルコアミラーゼの活性が高い麹菌培養物は難分解性糖質を加えて調製された液体培地で培養されるもので、酒類又は発酵食品の製造に使用可能な、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便且つ安価に培養することができるが、穀類等の培養原料で調製された普通の液体培地から培養されるものでない。
【００１４】
一方、グルコアミラーゼの活性が高い麹菌培養物を液体培地で培養する技術は開示されているが、アルコール発酵におけるもう一つの鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を液体培地から培養するという技術が開示されたものはない。この耐酸性α−アミラーゼは液体培養では生成されない酵素であると一般的にいわれており、これまでに耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹は開発されていない。
【００１５】
また、液体種麹を植菌して液体麹を培養することは特許文献２〜６に記載されているが、これらはアルコール等といった別の物質を添加して培養するものであったり、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼの酵素とは別の酵素活性が高い液体麹を製造するものであって、穀類等の培養原料で調製された普通の液体培地からグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が増強された液体麹を簡便に培養するものでない。また、液体種麹を培養する前培養の条件やどの程度の量の種麹を植菌して本培養するかということについての報告はなされていない。
【００１６】
本発明の目的は、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造のアルコール発酵における鍵酵素となるグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を培養するのに使用する液体種麹を特殊な糖質等を加えたり、焙炒処理された原料を使用するといった特別の液体培地でなく、穀類等の原料を使用した液体培地で培養して製造する方法、並びにこの液体種麹を使用して液体麹を製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、穀類を使用した液体培地で麹菌を前培養して麹菌が菌糸状に生育した液体種麹を得、この液体種麹を植菌して本培養することで、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が増強された液体麹が製造されることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１８】
より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【００１９】
（１）  液体麹の製造に使用される液体種麹の製造方法であって、穀類の使用量が４％（ｗ／ｖｏｌ）から１２％（ｗ／ｖｏｌ）に調製された液体培地で麹菌株を培養する液体種麹の製造方法。
【００２０】
（２）  前記穀類は、大麦である（１）に記載の液体種麹の製造方法。
【００２１】
（３）  前記穀類は、米である（１）に記載の液体種麹の製造方法。
【００２２】
（４）  （１）から（３）いずれか１項に記載の方法で得られた前記液体種麹が、前記液体麹を培養する液体培地に対して０．５％（ｖ／ｖｏｌ）から５％（ｖ／ｖｏｌ）植菌された後、麹菌を培養する液体麹の製造方法。
【００２３】
（５）  前記液体麹を培養する液体培地は、穀類の使用量が０．１％（ｗ／ｖｏｌ）から２０％（ｗ／ｖｏｌ）に調製されたものである（４）に記載の液体麹の製造方法。
【００２４】
（６）  前記液体培地に前記液体種麹を植菌して、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、を同時に生成、蓄積させる（４）または（５）に記載の液体麹の製造方法。
【００２５】
（７）  （４）から（６）いずれか記載の方法で得られた前記液体麹を用いて発酵飲食品を製造する発酵飲食品の製造方法。
【００２６】
（８）  発酵飲料の製造は、全工程が液相で行なわれる（７）に記載の発酵飲食品の製造方法。
【００２７】
（９）  発酵飲料の製造は、外界との遮蔽状態が保たれた状態の液相で行なわれる（７）または（８）に記載の発酵飲食品の製造方法。
【００２８】
（１０）  発酵飲料の製造は、前記液体麹に掛け原料を仕込んで一次もろみを製造する（７）から（９）いずれか記載の発酵飲食品の製造方法。
【００２９】
（１１）  前記発酵飲食品が、焼酎である（７）から（１０）いずれか記載の発酵飲食品の製造方法。
【００３０】
（１２）  少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼと、が増強された液体麹を培養するものである液体麹製造用の液体種麹。
【００３１】
（１３）  少なくとも、グルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性と、を有する発酵飲食品用の液体麹のセット。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、穀類の使用量が４％（ｗ／ｖｏｌ）から１２％（ｗ／ｖｏｌ）に調製された液体培地で麹菌を培養して麹菌が菌糸状に生育した液体種麹を得、該液体種麹を培養容量に対して０．５％（ｖ／ｖｏｌ）から５％（ｖ／ｖｏｌ）植菌して麹菌を本培養することでグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が増強された液体麹が製造できる。液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、品質が安定した麹菌培養物を安価に製造することができる。
【００３３】
また、本発明により製造した液体麹を用いると、従来の固体麹を用いた焼酎もろみと同程度の発酵性が得られ、製造された焼酎は固体麹を用いて製造された焼酎と同程度の品質を有し、官能的にも遜色ない焼酎を製造することができる。
【００３４】
また、本発明の液体種麹を使用して液体麹を培養し、得られた液体麹を用いて焼酎を製造する場合に、固体麹を使用する従来の焼酎製造とは異なり、全工程を液相のままで行うことが可能なので、従来に比べ効率的かつ安定的な焼酎製造システムを提供することができる。
【００３５】
また、本発明の液体種麹は麹菌が菌糸状に生育しているので、この液体種麹を植菌して麹菌を本培養すると、胞子状の麹菌株を植菌して液体麹を培養する方法に比べて、麹菌の培養時間を短縮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００３７】
本発明における液体種麹、並びに液体麹の製造方法は、穀類等の原料を使用して調製された液体培地で麹菌を前培養して液体種麹を製造する工程、並びに該液体種麹を本培養の液体培地に植菌して麹菌を本培養してグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が増強された液体麹を製造する工程を包含するものである。ここで、前培養とは、菌糸状に生育した液体種麹を製造する際の培養のことをいい、本培養とは、該種麹を植菌して液体麹を製造する際の培養をいう。
【００３８】
［液体種麹の製造］
液体種麹を培養する液体培地に使用される原料としては、大麦、米、小麦、そば、ヒエ、アワ、コウリャン、トウモロコシ等の穀類を挙げることができる。これらの原料の形状には特に限定はなく、未精白物、精白物、粒状物、粉体物等を用いることができる。原料は水と混合して液体培地を調製する。原料の配合割合は、水に対して穀類を４〜１２％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは８％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。
【００３９】
原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等常法に従って行えばよい。尚、後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温度以上に加熱する場合はこのときにでん粉が糊化されるので同時に行うこともできる。
【００４０】
前述の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を添加するのが好ましい。これら添加物は麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）程度、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）程度添加するのが好ましい。このようにして得られた液体培地は必要に応じて滅菌処理を行ってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２０℃で２５分間行えばよい。
【００４１】
滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、麹菌を液体培地に接種する。本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ生産能、耐酸性α−アミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus  kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus  awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus  niger）等に代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus  oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus  sojae）等に代表される黄麹菌等が挙げられる。これらの麹菌は一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、麹菌胞子１×１０４〜１×１０６個程度接種することが好ましい。
【００４２】
麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行うのがよい。培養温度が低いと麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は１２〜４８時間、より好ましくは１８〜２４時間で培養するのが好ましい。培養装置は液体培養を行うことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を行う必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行う必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
【００４３】
これによって、胞子で接種された麹菌株が菌糸状に生育した液体種麹を製造することができる。
【００４４】
［液体麹の製造］
次に上記の液体種麹を使用して液体麹を製造する方法について説明する。
【００４５】
穀類が添加されて調製された本培養の液体培地に、上記の方法で製造した液体種麹を植菌して、麹菌を本培養して液体麹を製造する。
【００４６】
この本培養の液体培地に使用される原料は固体麹を製造する場合と同様の原料であれば特に限定はない。具体的には、大麦、米、小麦、そば、ヒエ、アワ、コウリャン、トウモロコシ等の穀類を挙げることができる。これらの原料の形状には特に限定はなく、未精白物、精白物、粒状物、粉体物等を用いることができる。原料は水と混合して液体培地を調製する。原料の配合割合は、水に対して穀物を０．１〜２０％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２〜１０％（ｗ／ｖｏｌ）添加した液体培地に調製される。
【００４７】
原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等常法に従って行えばよい。尚、後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温度以上に加熱する場合はこのときにでん粉が糊化されるので同時に行うこともできる。
【００４８】
前述の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を添加するのが好ましい。これら添加物は麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）程度、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）程度添加するのが好ましい。このようにして得られた液体培地は必要に応じて滅菌処理を行ってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２０℃で２５分間行えばよい。
【００４９】
滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、上記の液体種麹を液体培地に植菌する。液体種麹の液体培地への植菌量は、液体培地１００ｍｌ当り液体麹０．５〜５ｍｌ（０．５〜５％（ｖ／ｖｏｌ））、好ましくは１ｍｌ（１％（ｖ／ｖｏｌ））である。
【００５０】
麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行うのがよい。培養温度が低いと麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は２４〜７２時間で培養するのが好ましい。培養装置は液体培養を行うことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を行う必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行う必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
【００５１】
これによって、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が増強された液体麹が製造されることになる。尚、上記の培養法で得られる液体麹は、培養したそのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等としてもよい。
【００５２】
［発酵飲食品の製造］
本発明の製造方法で得られた液体麹或いは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等は、酒類又は発酵食品の製造に用いることができる。例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹或いは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等を固体麹の代わりに用いることができる。
【００５３】
また、上記した液体麹或いは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等を用いて酒類又は発酵食品の製造に用いる場合には、全工程を液相で行うことができる。全工程を液相で行う酒類の製造方法としては、例えば、焼酎を製造する場合、とうもろこし、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した液体麹、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５５】
＜実験例１＞［液体種麹の製造における穀類使用量の検討］
大麦の配合割合を表１に示すように変えた７種類の液体培地を調製し、それぞれの液体培地で麹菌を前培養して液体種麹を製造し、得られたそれぞれの液体種麹について、大麦を使用した液体培地に植菌して麹菌を本培養し、液体麹を製造した。
【００５６】
まず、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が２、４、６、８、１０、１２、１６％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えて７種類の液体培地を調製した。それぞれの液体培地について、液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、河内菌白麹（河内源一郎商店製）の胞子を液体培地に対して１×１０６個になるように接種した。尚、大麦は国産２条大麦を７０％精白したものを使用した。
【００５７】
その後、温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて２４時間前培養を行って、それぞれの液体培地について液体種麹を製造した。
【００５８】
次に、上記の大麦の使用量別の液体培地で前培養して得られたそれぞれの液体種麹について、大麦を２％（ｗ／ｖｏｌ）使用した液体培地に植菌して麹菌を本培養し、液体麹を製造した。得られたそれぞれの液体麹について、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を測定した。
【００５９】
すなわち、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が２％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えた本培養の液体培地を７個調製し、この調製された液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、各液体培地に上記のそれぞれの液体種麹を培養容量に対して１％（ｖ／ｖｏｌ）植菌した。尚、大麦は国産２条大麦を７０％精白したものを使用した。
【００６０】
その後、それぞれの液体種麹を植菌した液体培地について、温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて４８時間本培養を行って液体麹を製造した。
【００６１】
得られたそれぞれの液体麹について、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を測定し、その結果を表１及び図１に示した。尚、グルコアミラーゼの酵素活性の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いた。また、耐酸性α−アミラーゼの酵素活性の測定は、＜非特許文献４＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理にすることで非耐酸性α−アミラーゼを失活させた後、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて耐酸性α−アミラーゼを分別測定した。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行うことで、非耐酸性α−アミラーゼを失活させた後に、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて、耐酸性α−アミラーゼのみを分別測定した。
【００６２】
【表１】
2005295873.tif 000002
【００６３】
表１及び図１に示すように、得られた液体麹は、大麦の使用量が４〜１２％（ｗ／ｖｏｌ）において、グルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が高生産され、大麦使用量が８％（ｗ／ｖｏｌ）で最大に生産されている結果で、焼酎製造に必要なグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を有することが確認された。
【００６４】
このようにして、大麦の使用量が４〜１２％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは８％（ｗ／ｖｏｌ）に調製された液体培地で麹菌を前培養することで液体種麹を製造し、この液体種麹を使用することでグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性の増強された液体麹が得られることになる。
【００６５】
＜実験例２＞［液体麹の製造における液体種麹の植菌量の検討］
次に、前記試験例１で得られた液体種麹を用いて、液体麹を製造し、液体種麹の植菌量と製造された液体麹のグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を検討した。
【００６６】
先ず、大麦を８％加えて調製した液体培地で、試験例１と同一方法で麹菌株を前培養して液体種麹を製造する。すなわち、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が８％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えて液体培地を調製し、この液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、河内菌白麹（河内源一郎商店製）の胞子を液体培地に対して１×１０６個になるように接種した。尚、大麦は国産２条大麦を７０％精白したものを使用した。その後、温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて２４時間前培養を行って液体種麹を製造した。
【００６７】
次に、上記のようにして得られた液体種麹について、大麦を使用した液体培地の培養容積に対して表２に示すように割合で培養初発に植菌して麹菌を本培養して、液体麹を製造し、得られたそれぞれの液体麹について、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を測定した。
【００６８】
すなわち、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が２％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えた液体培地を７個調製し、この調製された液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、上記の大麦８％（ｗ／ｖｏｌ）使用の液体培地で前培養して得られた液体種麹を培養容量に対して０．１％（ｖ／ｖｏｌ）、０．５％（ｖ／ｖｏｌ）、１％（ｖ／ｖｏｌ）、２％（ｖ／ｖｏｌ）、５％（ｖ／ｖｏｌ）、８％（ｖ／ｖｏｌ）、１０％（ｖ／ｖｏｌ）となるように、それぞれの液体培地に植菌した。尚、大麦は国産２条大麦を７０％精白したものを使用した。
【００６９】
その後、液体種麹を植菌したそれぞれの液体培地について、温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて４８時間本培養を行って液体麹を製造した。
【００７０】
得られたそれぞれの液体麹について、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を測定し、その結果を表２及び図２に示した。尚、グルコアミラーゼの酵素活性の測定は試験例１と同様に糖化力分別定量キット（キッコーマン製）によった。また、耐酸性α−アミラーゼの酵素活性測定も試験例１と同様に、酸処理後にα−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。
【００７１】
【表２】
2005295873.tif 000003
【００７２】
表２及び図２に示すように、得られた液体麹は、液体種麹の植菌量が０．５〜５％（ｖ／ｖｏｌ）において、グルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が高生産され、植菌量が１％（ｖ／ｖｏｌ）で最大に生産されている結果で、焼酎製造に必要なグルコアミラーゼと耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を有することが確認された。
【００７３】
このようにして、液体種麹の植菌量が０．５〜５％（ｖ／ｖｏｌ）、好ましくは１％（ｖ／ｖｏｌ）で麹菌を本培養することで、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性の増強された液体麹が得られることになる。
【００７４】
＜実施例１＞「液体麹の製造」
先ず、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が８％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えて液体培地を調製し、調製した液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、河内菌白麹（河内源一郎商店製）の胞子を液体培地に対して１×１０６個になるように接種した。その後、温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて２４時間前培養を行って液体種麹を製造した。尚、大麦は国産２条大麦の７０％精白したものを使用した。
【００７５】
次に、硝酸カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸２水素カリウム０．３％（ｗ／ｖｏｌ）が添加された水に大麦が２％（ｗ／ｖｏｌ）になるように加えて本培養の液体培地を調製し、この調製した液体培地１００ｍｌを容量５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌後、上記の液体種麹（大麦８％（ｗ／ｖｏｌ）の液体培地で培養したもの）を培養容量に対して１％（ｖ／ｖｏｌ）植菌した。尚、大麦は国産２条大麦を７０％精白したものを使用した。
【００７６】
その後、液体種麹を植菌した液体培地を温度３７℃、振盪速度１００ｒｐｍにて４８時間本培養を行って、液体麹を製造した。
【００７７】
得られた液体麹について、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性をグルコアミラーゼの酵素活性を糖化力分別定量キット（キッコーマン製）により、また、耐酸性α−アミラーゼを、試験例１と同様の方法でα−アミラーゼ測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した処、グルコアミラーゼは１１２．３Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼが１１．１Ｕ／ｍｌ生成されており、焼酎醸造で使用するのに十分な酵素活性が同時に得られた。また、液体麹は図４に示すように、菌糸形態が１ｍｍ程度の微細なペレット状（球状の菌糸塊）となっていた。尚、図４は、得られた液体麹の菌糸形態をデジタルカメラで撮影した写真を貼り付けた図であって、写真の白丸形状物が、ペレット状の麹菌培養物である。
【００７８】
＜実施例２＞［液体種麹を植菌して製造した液体麹による焼酎の製造］
上記の実施例１で得られた液体麹７０ｍｌを用いて、表３に示した仕込み配合にて、総麦１８６．０ｇの仕込みを行い、発酵温度を２５℃に保ち、一次仕込み５日間、二次仕込み３日間、三次仕込み１５日間の三段仕込みを行った。尚、掛け麦としては、国産２条大麦の７０％精白したものを、水で洗浄後、６０分間浸漬、水切り３０分間行った後、３５分間蒸きょうしたものを用いた。また、一次仕込みにおいて、液体麹からの麦持ち込み量０．７ｇでは発酵を行うのに不十分なため、固体麹仕込みと同量の麦が入るよう掛け麦４３．１ｇを仕込んだ。
【００７９】
【表３】
2005295873.tif 000004
【００８０】
また対照仕込み（固体麹仕込み）として、固体麹の麹麦を用いて、表４に示した仕込み配合で焼酎製造を行った。尚、発酵条件等は上記の本発明仕込み（液体麹仕込み）と同一とした。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
その発酵経過を対照の固体麹仕込みと対比して図３に示した。図３から明らかなように、固体麹を使用した対照仕込みと比較して、液体麹を用いた仕込みにおいても、ほぼ同様の発酵経過を示した。また、得られた最終もろみのアルコール度数は液体麹、固体麹いずれを用いたものも１７．８％で、同一であった。
【００８３】
次に、得られた最終もろみを減圧蒸留して、得られた原酒をアルコール度数２５％に和水したものをパネラー８名による採点法（５点評価法、１：良〜５：悪）により官能評価を行い、その平均点を表５に示した。
【００８４】
【表５】
2005295873.tif 000006
【００８５】
その結果、酒質の差異もほとんど認められず、液体麹を用いても、固体麹を用いたと同様な酒質の焼酎製造が可能であることが確認された。
【００８６】
以上の結果から、本発明によれば、大麦を４〜１２％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは８％（ｗ／ｖｏｌ）使用した液体培地で麹菌を前培養することで液体種麹を製造し、該液体種麹を大麦が使用された液体培地に０．５〜５％（ｖ／ｖｏｌ）、好ましくは１％（ｖ／ｖｏｌ）植菌して本培養することで、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が高い液体麹を得ることができることになった。更に、グルコアミラーゼ活性や耐酸性α−アミラーゼ活性の高い液体麹が、特別な培養装置や特殊な培養工学的手法による厳密な培養制御を行うことなく、簡便な液体培地にて製造することができ、しかも固体培養に比べて極めて厳密な製麹の管理を容易に行うことで、品質の高い麹の安定的な製造が可能になった。更には、麹の液体化により、もろみの流動化による発酵管理の簡易化だけでなく、麹製造プロセス、ひいては焼酎製造プロセスの省力化、効率化も可能となった。
【００８７】
以上に説明したこれらの実施例は、原料として大麦を使用して液体種麹を製造し、その液体種麹を植菌してグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性が高い液体麹を製造する方法について説明したが、原料として大麦以外、例えば米等を使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】液体種麹の大麦使用量と該液体種麹を使用して製造された液体麹のグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性との関係を示す図である。
【図２】液体種麹の植菌量と製造された液体麹のグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性との関係を示す図である。
【図３】液体麹を用いた焼酎製造における発酵経過を対照区と対比して示す図である。
【図４】液体麹の菌糸形態をデジタルカメラで撮影した写真を貼り付けた図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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