(57)【要約】    【課題】  非筋細胞である皮膚線維芽細胞において発生する力と老化との関係を解明し、当該細胞の発生力を増大することによって皮膚の老化を防止又は改善する皮膚老化防止・改善剤及び老化防止・改善方法を提供する。    【解決手段】  Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質を含有する皮膚老化防止・改善剤。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質を含有する皮膚老化防止・改善剤。
【請求項２】
Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質が、アルテア、ウコン、キウイ、ゲンチアナ、サンザシ、ジオウ、チョウジ、トウキンセンカ、ノバラ、パセリ、ハマメリス、サイシン、タイム、オトギリソウ、クララ、センキュウ、タイソウ、チンピ、トウキ、ヒバマタ、ボダイジュ、ホップ、レモン、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サンシュユ、ビャクジュツ及びマクリから選ばれる植物又はその抽出物である請求項１記載の皮膚老化防止・改善剤。
【請求項３】
アルテア、ウコン、キウイ、ゲンチアナ、サンザシ、ジオウ、チョウジ、トウキンセンカ、ノバラ、パセリ、ハマメリス、サイシン、タイム、オトギリソウ、クララ、センキュウ、タイソウ、チンピ、トウキ、ヒバマタ、ボダイジュ、ホップ、レモン、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サンシュユ、ビャクジュツ及びマクリから選ばれる植物又はその抽出物を含有するＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤。
【請求項４】
Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現を増加させることを特徴とする皮膚老化防止・改善方法。
【請求項５】
皮膚線維芽細胞と被検物質を共にインキュベートし、当該細胞におけるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量を測定することを特徴とするしわ及びたるみ改善剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現を増大することによって皮膚の老化を防止又は改善する皮膚老化防止・改善剤及び老化防止・改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の老化、特に皮膚の老化は、しわ、たるみの発生、はりの減少等の外観変化を伴うことから、それを防御改善する要望は高い。従来、しわ等の発生については、特に紫外線との関連性が強いとされ、紫外線照射により生じた皮膚の老化を光老化と称して、種々研究されてきたが、未だ紫外線吸収剤又は紫外線防禦剤に代わるような化粧料は開発されていない。また、しわの発生防止を目的としてコラーゲンを配合した化粧料も使用されているが、その効果は充分ではない。
【０００３】
一方、近年、アクチン及びミオシンに代表される細胞骨格蛋白が、筋肉の細胞だけではなく一般の非筋細胞、例えば線維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞等、様々な細胞において、細胞に力を発生し、形態等を制御する役割を担っていることが見出された。すなわち、非筋細胞は、力を発生する際、アクチンからなる線維とミオシンからなる線維を合わせてストレスファイバーと呼ばれる線維構造体を形成し、これが非筋細胞の筋原線維とも言うべく機能を有し、ある種の刺激に応じて力を発生することが明らかにされている。また最近では、線維芽細胞と血管内皮細胞において発生する力が平滑筋等の筋細胞と同様の機構で起こっていることや、線維芽細胞が比較的強い力を発生し、力の発生に特化した筋細胞の１０分の１〜１００分の１の力を発生することも報告されている(例えば、非特許文献
１、２参照)。これらストレスファイバー等の細胞骨格系が出す力は、個々の細胞で見れ
ば細胞分裂、細胞遊走、形態変化、細胞の接着等に、またinvivo的には、例えば血管内皮細胞では血管収縮による血流制御、皮膚線維芽細胞では傷における創収縮等において重要な機能を発揮していると考えられる。すなわち、筋肉に発生する力と同様、非筋細胞の発生する力そのものが生態系で使われ、機能していると考えられる。
【０００４】
他方、老化により筋力の低下が起こることは周知の事実であり、加齢によって骨格筋細胞や一本の筋線維から発生する力が低下することや収縮速度が低下するという報告は数多く認められているところである(例えば、非特許文献３、４参照)。従って、非筋細胞の力の発生と機能もまた、加齢と密接に関連しているものと考えられる。
【０００５】
しかしながら、非筋細胞に発生する力と老化との関連はこれまでに全く明らかにされていない。
【非特許文献１】Kolodney MS, Wysolmerski RB, J.Cell Biol.,117, 73-82(1992)
【非特許文献２】Kolodney MS, Elson EL, J.Biol.Chem., 268, 23850-5, 5(1993)
【非特許文献３】Larsson L, Li X, Frontera W R, Am.J.Physiol., 272, C638-C649(1997)
【非特許文献４】Ladora V, Brown M, J.Appl.Physiol., 86, 881-886(1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、非筋細胞である皮膚線維芽細胞において発生する力と老化との関係を解明し、当該細胞の発生力を増大することによって皮膚の老化を防止又は改善する皮膚老化防止・改善剤及び老化防止・改善方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、皮膚線維芽細胞が発生する力の加齢における変化について検討したところ、当該細胞のような非筋細胞においても加齢により発生する力が低下すること、そして老化した細胞では、Ｒｈｏキナーゼ（ＲｏｃｋＩ、ｐ１６０Ｒｏｃｋ）又はミオシン軽鎖キナーゼというミオシン軽鎖のリン酸化酵素の蛋白発現が低下していることを見出した。そして、当該酵素の発現量を増加させる物質を用いることにより、皮膚のたるみ、はりの減少、しわ等の皮膚老化を防止又は改善できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質を含有する皮膚老化防止・改善剤を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、アルテア、ウコン、キウイ、ゲンチアナ、サンザシ、ジオウ、チョウジ、トウキンセンカ、ノバラ、パセリ、ハマメリス、サイシン、タイム、オトギリソウ、クララ、センキュウ、タイソウ、チンピ、トウキ、ヒバマタ、ボダイジュ、ホップ、レモン、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サンシュユ、ビャクジュツ及びマクリから選ばれる植物又はその抽出物を含有するＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現を増加させることを特徴とする皮膚老化防止・改善方法を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、皮膚線維芽細胞と被検物質を共にインキュベートし、当該細胞におけるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量を測定することを特徴とするしわ及びたるみ改善剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤は、皮膚におけるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量を増加し、皮膚線維芽細胞の細胞発生力を増大させることにより皮膚の老化を防止又は改善効果を発揮する。従って、これを用いることにより、皮膚のたるみ、しわの発生、はりの減少等を防止又は改善することができる。また、本発明のしわ及びたるみ改善剤のスクリーニング方法によれば、皮膚のしわ、たるみ改善に有効な素材を簡易且つ効率的に評価・スクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
皮膚線維芽細胞のような非筋細胞には、筋細胞と異なり力の発生の基礎となるアクチン-ミオシンの重合した筋原線維のようなものは通常存在せず、そのため力の発生には専ら
アクチン線維とミオシン線維から構成されるストレスファイバーの形成が必須となっている。通常、非筋細胞ではアクチン、ミオシン分子は細胞内にばらばらの状態で存在しており、ミオシン軽鎖分子のリン酸化によって引き起こされるアクチン、ミオシン等蛋白の重合、ストレスファイバーの形成、エネルギーの受け渡しと、ミオシン線維のスライド運動による一連の過程によりはじめて力が発生する。その力の発生の引きがねとなる部分はミオシン軽鎖のリン酸化であると考えられ、このリン酸化が細胞の力の発生には必須である(非特許文献１及び２)。一方、ミオシン軽鎖のリン酸化は、リン酸化する酵素であるミオシン軽鎖キナーゼ及びＲｈｏキナーゼ（ＲｏｃｋＩ、ｐ１６０Ｒｏｃｋ）が担っていることが知られている(AmanoM, Chihara K, Kimura K, Fukata Y, Nakamura N, Matsuura Y, Kaibuchi K. Science,275, 1308-11(1997)、Totsukawa G, Yamakita Y, Yamashiro S, Hartshorne DJ, SasakiY, Matsumura F. J Cell Biol. 150, 797-806 (2000)、実験医学 Vol.17,No7(1999))。
【００１４】
そこで、これらリン酸化酵素に着目し、老化による力発生の低下のメカニズムと当該酵素との関係について検討したこところ、実施例１〜２に示すように、老化した線維芽細胞では、若い細胞と比較して細胞発生力が有意に低下しており、更に老化した線維芽細胞では、ミオシン軽鎖をリン酸化する酵素であるＲｈｏキナーゼ（ＲｏｃｋＩ、ｐ１６０Ｒｏｃｋ）及びミオシン軽鎖キナーゼの蛋白発現が若い細胞に比べて低下していた。従って、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量を増加させれば皮膚の老化を防止又は改善することができ、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現増加物質は、皮膚の老化防止・改善剤となり得る。また、皮膚線維芽細胞と被検物質を共にインキュベートし、当該細胞におけるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現増加量を測定することにより、例えば皮膚たるみ改善剤をスクリーニングすることができる。
【００１５】
本発明において、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼとは、線維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞等の非筋細胞、特に皮膚繊維芽細胞において、ミオシン軽鎖をリン酸化する酵素をいい、Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質とは、当該Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの蛋白の発現量を増加して、当該非筋細胞、特に皮膚線維芽細胞における細胞発生力を増大させることにより、皮膚等の組織の老化を防止又は改善し、皮膚のたるみ、はりの減少、しわ等の発生防止又は改善効果を有する物質をいう。
【００１６】
斯かるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質は、天然物、合成化合物の何れでもよいが、好適には、例えばアルテア(ビロウドアオイ  Althaeaofficinalis)、ウコン（Curcuma longa）、キウイ（Actinidia chinensis）、ゲンチアナ（Gentiana lutea）、サンザシ（Crataeguscuneata）、ジオウ（アカヤジオウ Rehmannia glutinosa）、チョウジ(グローブ Syzygium aromaticum)、トウキンセンカ（マリーゴールドCalendula officinalis）、ノバラ（ローズヒップ、Rose canina）、パセリ（オランダゼリ Petroselinium sativum）、ハマメリス（Hamamelisvirginiana）、サイシン（Asiasarum sieboldii）、タイム（ワイルドザイム、タチジャコウ Thymus serpyllum）、オトギリソウ（セイヨウオトギリソウHypericum perforatum）、クララ（Sophora flavescens）、センキュウ（Cnidium offcinale）、タイソウ（ナツメZizyphus jujuba）、チンピ（Citrus unshiu）、トウキ（Angelica acutiloba）、ヒバマタ（Fucusvesiculosus）、ボダイジュ（ナツボダイジュ Tilia platyllos）、ホップ（Humulus lupulus）、レモン（Citruslimon）、ケツメイシ（Cassia obatusifolia）、コウボク（Magnolia obovata）、ゴシュユ（Evodia rutaecarpa）、ゴミン（Schisandrachinensis）、サンシュユ（Cornus officinalis）、ビャクジュツ（Atractylodes japonica）、マクリ（Digeneasimplex）等の植物又はその抽出物が挙げられる。
【００１７】
このうち、Ｒｈｏキナーゼ発現増加物質としては、アルテア、ウコン、キウイ、ゲンチアナ、サンザシ、ジオウ、チョウジ、トウキンセンカ、ノバラ、パセリ、ハマメリス、オトギリソウ（セイヨウオトギリソウ）、クララ、センキュウ、タイソウ（ナツメ）、チンピ、トウキ、ヒバマタ、ボダイジュ(ナツボダイジュ)、ホップ、レモン、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サンシュユ、ビャクジュツ、マクリが好ましく、ミオシン軽鎖キナーゼ発現増加物質としては、アルテア、サイシン、キウイ、ゲンチアナ、タイム、チョウジ、トウキンセンカ、ノバラ、パセリが好ましい。
【００１８】
上記植物は、その植物の全草、葉、樹皮、枝、果実又は根等をそのまま又は粉砕して用いることができるが、アルテアについては根、根茎又は葉を、ウコンについては根茎を、キウイについては果実を、ゲンチアナについては根又は根茎を、サンザシについては果実を、ジオウについては根を、チョウジについてはつぼみを、トウキンセンカについては頭花を、ノバラについては果実を、パセリについては葉を、ハマメリスについては葉又は樹皮を、サイシンについては根又は根茎を、タイムについては地上部を、オトギリソウについては地上部を、クララについては根を、センキュウについては根茎を、タイソウについては果実を、チンピについては果皮を、トウキについては根を、ヒバマタについては全藻を、ボダイジュについては花又は葉を、ホップについては雌花穂を、レモンについては果実を、また、ケツメイシ、コウボク、ゴシュユ、ゴミン、サンシュユ、ビャクジュツ及びマクリについては日本薬局方収載の部位を使用するのが好ましい。
【００１９】
斯かる植物の抽出物としては、上記植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられ、当該抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、これらは混合物として用いることができる。
【００２０】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００２１】
また、液々分配等の技術により、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去して用いることもでき、本発明においてはこのようなものを用いることが好ましい。これらは、必要により公知の方法で脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。
【００２２】
尚、本発明の植物又はそれらの抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２３】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤における有効成分の含有量は、上記植物を用いる場合、乾燥重量換算で当該組成物中に０．００００１〜５重量％、特に０．０００１〜３重量％とするのが好ましく、抽出物としては、固形分換算で０．００００１〜５重量％、特に０．０００１〜２重量％とするのが好ましい。
【００２４】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤は、外用剤の他、内服剤、注射剤等、種々の形態の製剤とすることができるが、通常は、医薬品、医薬部外品、化粧品等の外用剤として用いることが好ましい。
【００２５】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤には、上記植物又はその抽出物以外に紫外線吸収剤、紫外線防禦剤、コラーゲン、保湿剤、抗炎症剤、抗酸化剤等の成分を配合できるが、皮膚老化防止・改善の観点から、特に紫外線吸収剤及び／又は紫外線防禦剤を配合することが好ましい。
【００２６】
紫外線吸収剤としては、ベンゾフェノン系、パラアミノ安息香酸系、ｐ−メトキシ桂皮酸系（ｐ−メトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル等）又はサリチル酸系紫外線吸収剤が挙げられる。紫外線防禦剤としては、酸化チタン、酸化亜鉛等が挙げられる。紫外線吸収剤、紫外線防禦剤等は、皮膚老化防止・改善の観点から、本発明の皮膚老化防止・改善剤中に０．０１〜２０重量％、特に０．１〜１０重量％配合することが好ましい。
【００２７】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤の具体的な剤型としては、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、溶液、パック、ファンデーション等が挙げられ、これらの剤型とするにあたって各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、キレート剤、増粘剤、色素、香料、水等を配合できる。
【００２８】
本発明の皮膚老化防止・改善剤及びＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼ発現増加剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ2当たり０．０１〜１０ｍｇ、液状製剤の場合、同じく０．０１〜１０ｍｇ使用するのが好ましい。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法は、皮膚線維芽細胞と被検物質を共にインキュベートし、当該細胞におけるＲｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量を測定するものである。
ここで、当該細胞を培養する条件としては、これらの細胞を培養できる常用の培地を使用することができ、例えばイーグル基礎培地（ＢＭＥ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ培地、１９９アール培地、ＲＰＭＩ１６４０改変培地等が挙げられるが、特にＭＥＭ、ＤＭＥＭが好ましい。これらの培地には牛胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、牛新生子牛血清（ＮＢＳ）等を添加するが、特にＦＢＳ又はＦＣＳを添加することが好ましい。加える量としては細胞継体、増殖時は３−１５％、好ましくは５−１０％が、また、被検物質作用時には０％（無血清）−５％、好ましくは０．５％−５％がよい。
【００３０】
皮膚線維芽細胞の播種時の初期濃度は、デッシュ面積あたりで表すと１万個細胞／cm2
〜５万個細胞／cm2とするのが好ましく、例えば直径６０mmのデッシュであれば１デッシ
ュ当り２７万個〜１４５万個の細胞を播種するのが好ましい。デッシュは通常の培養用でもコラーゲンコートされたデッシュでもよい。
【００３１】
インキュベーションは、上記細胞に０．０００００１％（蒸発残分重量％）〜０．１％（蒸発残分重量％）、望ましくは０．０００１％（蒸発残分重量％）〜０．０１％（蒸発残分重量％）の被検物質を培地中に添加して、あるいは蒸発残分重量％が不明の被検物質の場合には、その抽出液を０．０００１％から５％（体積％）、望ましくは０．０１％から５％（体積％）で適宜コントロールした濃度で作用させ、通常の細胞培養用の条件、例えば５％ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間〜９６時間、好ましくは２４時間〜４８時間程
度培養するのがよい。
【００３２】
Ｒｈｏキナーゼ又はミオシン軽鎖キナーゼの発現量の測定は、抗Ｒｈｏキナーゼ抗体又はミオシン軽鎖キナーゼ抗体を用いて、例えばドットブロット、ウェスタンブロッティング、エンザイムイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等により行なえるが、ウェスタンブロッティングが簡便でより望ましい。
【００３３】
コントロールとしては、被検物質を含有しない溶媒のみを添加した群を作り、これをコントロールとして１００％とし、その発現変化を比較するのが好適である。シグナル強度の定量は目視による増減のコントロールとの比較評価でも十分であるが、画像解析処理により定量化することが望ましい。
【実施例】
【００３４】
実施例１  In vitro老化による線維芽細胞発生張力の低下
（１）細胞
ヒト皮膚線維芽細胞（男性、腹部由来、継代数２−３）を大日本製薬より購入し、購入時の継代数を３として、５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭでコンフルエント到達時にスプリット比１：４で継代培養した。継代数５−７を若年層（Young）、継代数１６−１９にin vitro 老化させた老年層（Old）として比較した。
【００３５】
（２）細胞発生力測定
コラーゲンゲル培養系で力の測定法はKolodenyらの方法に従って行った。簡単には、線維芽細胞包埋コラーゲンゲル（1.5×106cells, 1.5mg/mL collagen，新田ゼラチンTypeI-A）を３７℃に保温した無血清培地５０mL中に固定し、安定化させた後、無血清ＤＭＥＭで最終濃度の５０倍程度の濃度に調整した物質を１mL添加(最終濃度：トロンビン＝0.2U/mL、ＬＰＡ（リソフォスファチジン酸）＝10μM)し、発生する力の変化を発生する力はIsotonic Transducerで計測し、ＭＰ１００Ａ−ＣＥ（BIOPACSystems, Santabarbara）で記録した。結果を図１に示す。
図１に示したごとく、in vitro老化させた老化線維芽細胞では若い線維芽細胞と比較し、トロンビン、ＬＰＡの刺激により細胞の発生する力が有意に低下することが確認された。細胞数は同一であることから加齢により個々の細胞の発生力が低下したと考えられる。
【００３６】
実施例２  In vitro老化による線維芽細胞ミオシンリン酸化酵素などの発現状態
（１）細胞、抗体
実施例１と同一の細胞を用い、同様にin vitro 老化させた。
抗体はミオシン軽鎖キナーゼ抗体として、Anti-myosin light chain kinase抗体(clone; K36, Sigma, M7905)を、ＲｈｏキナーゼにはAnti-Rock(Ｒｈｏkinase)-1 (clone; H85)を、アクチンはAnti-actin(I-19, 以上Santa Cruz Biotecnology, Inc.)を、ミオシンホ
スファターゼはAnti-myosinphosphatase (PRB-457C,Berkeley antibody Co.) 用いた。２次抗体はペルオキシダーゼ標識Anti-Goat IgG,Anti-Rabbit IgG(以上Santa Cruz Biotecnology, Inc.)等をそれぞれ1次抗体に合わせて用いた。
【００３７】
（２）ウェスタンブロッティング
コラーゲンＴｙｐｅＩコートデッシュ（IWAKI）で培養された継代数７、１１、１３、１７、２０のヒト皮膚線維芽細胞を、コンフルエント状態でサンプルとした。冷ＰＢＳにより洗浄後、氷冷ＲＩＰＡバッファー(1%NP40, 0.5%コール酸Na, 0.1%SDS/PBS溶液)により溶解、２７Ｇシリンジ針を数回通して分解抽出した後、蛋白定量（BCA ProteinAsssay  kit, PIERCE）した。蛋白含量をそろえた後、１０％メルカプトエタノール添加済みｌａｅｍｍｌｉバッファー(Bio Rad)添加後５分間煮沸したものをサンプルとした。
【００３８】
７．５％、１２．５％又は１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（Bio Rad）を用い、各ウェルにアプライし、６０Ｖで３時間電気泳動した。その後にニトロセルロースメンブラン(BioRad)に氷冷下２２０−２５０ｍＡ、１．０−１．５時間でブロッティングした。メンブランを２％スキムミルク／ＰＢＳ溶液中、室温１時間又は４℃で約１２時間ブロッキングした後、Anti-myosinlight chain kinase 抗体(2000倍希釈)、Anti-Rock-1(Anti-Ｒｈｏ kinase, H85、100倍希釈)、Anti-actin抗体（5000倍希釈）Anti-myosin phosphatase抗体(500倍希釈)を室温で１時間作用させた。ＰＢＳ−Ｔ（0.1％ Tween20/PBS溶液）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識２次抗体を１０００倍希釈で作用させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＥＣＬ  ｋｉｔ（アマシャム）にて発色、X-rayフィルム（HyperFILM,アマシャム）により検出した。結果を図２に示す。また、図２の蛋白発現量を画像解析処理（アト−(株)、Densitograph: Lane &Spot Analyzer）により定量化し、継代数のもっとも低い細胞である０７の発現量を１００％とし、継代数を重ねた老化した細胞での発現量を相対値で示した（表１）。尚、図２及び表１中の、ＭＬＣＫはミオシン軽鎖キナーゼを示す。
【００３９】
【表１】
2005206568.tif 000002
【００４０】
図２及び表１に示したごとく、in vitro老化させた老化線維芽細胞では若い線維芽細胞と比較し、ミオシン軽鎖キナーゼ、及びＲｈｏキナーゼ（ＲｏｃｋＩ、ｐ１６０Ｒｏｃｋ）蛋白発現が低下することが確認された。ミオシン軽鎖キナーゼは分子量２００ｋＤａ以上のＬｏｎｇタイプと分子量１４０ｋＤａのＳｈｏｒｔタイプとが存在するが(PoperechnayaA, Varlamova O, Lin PJ, Stull JT, BresnickAR., J Cell Biol, 151, 697-707(2000))、いずれも継代数を重ねたin vitro老化線維芽細胞で低下していることが確認された。一方、ミオシン軽鎖脱リン酸化酵素である、ミオシンフォスファターゼ（MyosinPhosphatase）はin vitro老化により低下は認められるものの、Ｒｈｏキナーゼやミオシン軽鎖キナーゼほどの大きな低下は認められなかった。また、対象としてアクチン（β-actin）蛋白量も定量したが、invitro老化により大きな変化は認められなかった。
【００４１】
ミオシン軽鎖のリン酸化はミオシン蛋白の重合を促し、さらにはアクチン線維−ミオシン線維の重合によるストレスファイバーの形成を誘導し、同時にミオシンＡＴＰaseを活性化し細胞力の発生を促す。上記リン酸化酵素類の減少はリン酸化ミオシンを相対的に減少させる方向に作用しており、その結果、発生する細胞に力が低下していたことが示唆される。ミオシン軽鎖キナーゼと、Ｒｈｏキナーゼが老化による線維芽細胞の力の低下のキーとなる酵素であることが示された。
【００４２】
実施例３  ミオシン軽鎖キナーゼの蛋白発現増加剤
実施例１及び２で用いた継代数１６−１９を６ウェルデッシュに播種し、２４時間後、表２に示す各種植物抽出液を蒸発固形残分０．０００５％から０．０１％まで適宜コントロールした濃度で、あるいは日本薬局方収載植物に関してはその抽出液を０．０５％から０．２％（体積％）で適宜コントロールした濃度で作用させ、４８時間培養した。その後実施例２記載の方法にてサンプルを採取し、ウェスタンブロッティングを行ない、これと植物抽出液で処理していないコントロールについて、ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白の発現量をみた。得られたシグナルを画像解析処理により定量化した。結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2005206568.tif 000003
【００４４】
表２に示すごとく、各植物抽出はミオシン軽鎖キナーゼの蛋白発現量を増加していた。
【００４５】
実施例４  Ｒｈｏキナーゼの蛋白発現増加剤
実施例３と同様の方法で、表３に示す各植物抽出液で処理したものと、処理していないコントロールについて、Ｒｈｏキナーゼ蛋白の発現量をみた。表３に示すごとく、各植物抽出はＲｈｏキナーゼの蛋白発現量を増加していた。
【００４６】
【表３】
2005206568.tif 000004
【００４７】
尚、上記実施例３及び４で用いた植物抽出物は表４に示すとおりであり、常法に従って調製した。
【００４８】
【表４】
2005206568.tif 000005
【００４９】
実施例５  Rhoキナーゼ発現を増大する植物エキスのしわ改善効果試験
本実施例では、ヘアレスの系統であるHR/HR (Skh-1)の雌マウスと、通常の毛を持つHaM/ICR系統の雄マウスより自家交配により作製したメスのHR/ICR ヘアレスマウスを使用した。マウス（8−10匹／ケージ）にSE20ランプ(Toshiba Co., Ltd., Japan) を用いてUVB を週5回、毎日12週間照射した。照射するUVBのエネルギー量は1週間目は47 mJ/cm2で、1週間に6-7 mJ/cm2づつ4週間目まで段階的に増やした。そして4週間目の照射量(67 mJ/cm2)を照射終了時まで維持した。UVB照射量はUV-ラジオメーター(UVR-305/365D, Tokyo Optical K.K.)にて測定した。4週間目以降の照射量、67 mJ/cm2、は最小紅斑量（1MED）よりやや低い値を示す。
マウスの背部皮膚にしわの形成が確認された後、6−8匹の群に分けた。UVB照射回数を週3回に減らして継続し、表５に示す各植物エキス（３ vol．%）を含むエタノール水溶液(water/ethanol=20/80 vol. %)を、背部皮膚に1日2回、週5日、4週間、1回あたり100μL塗布した。溶媒コントロールとしてエタノール水溶液 (water/ethanol=20/80 vol %) をサンプルと同様に100μL塗布した。
塗布前(0週時)と塗布終了後(4 週時)のしわの程度を目視により観測し、下記に示したような標準スコア（しわスコア）を用いて評価した。スコアの中間の値(1.5, 2.5, 3.5) も本評価には使用した。
【００５０】
しわスコア:
１: しわが観察されない（しわが完全に消失あるいは取り除かれている）; 
２: 弱いしわが観察される; 
３:しわが観察される; 
４:顕著なしわが観察される。
コントロール群とサンプル群とのしわスコアの差(被検サンプルの有効性)は下記式により算出した。結果を表５に示す。
【００５１】
計算式：  ｛サンプル群しわスコア(塗布前)−サンプル群しわスコア(塗布終了後)｝−｛(コントロール群しわスコア(塗布前)−コントロール群しわスコア(塗布終了後)｝
【００５２】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、in vitro老化線維芽細胞のトロンビン及びＬＰＡ刺激による力の発生の低下を示した図である。
【図２】図２は、線維芽細胞ミオシン軽鎖キナーゼ及びＲｈｏキナーゼの発現蛋白量のin vitro老化に伴う変化を示した図である。
【図１】
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【図２】
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