(57)【要約】【目的】  微量の銅イオンを検出するための新たな手段を提供する。【構成】  試料中の銅イオンを検出する方法であって、以下の工程：(１)少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子であり、(a)配列番号３および４における全てのCys残基のSer残基へのアミノ酸置換；および(b)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換、を有する変異型V1-ATPaseを調製する工程；(２)銅を含有する可能性のある試料溶液を変異型V1-ATPaseと接触させる工程、を含み、試料溶液と接触した変異型V1-ATPaseの活性が低下した場合に、試料中に銅イオンが含有されていると判定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の銅イオンを検出する方法であって、以下の工程：
(１)少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子であり、
(a)配列番号３および４における全てのCys残基のSer残基へのアミノ酸置換；および
(b)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換、
を有する変異型V1-ATPaseを調製する工程；
(２)銅を含有する可能性のある試料溶液を変異型V1-ATPaseと接触させる工程、
を含み、試料溶液と接触した変異型V1-ATPaseの活性が低下した場合に、試料中に銅イオンが含有されていると判定することを特徴とする銅イオンの検出方法。
【請求項２】
変異型V1-ATPaseが固体プレート上に固定されており、プレート上で銅を検出する請求項１の方法。
【請求項３】
以下の要素：
（a）少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子であり、
(a)配列番号３および４における全てのCys残基のSer残基へのアミノ酸置換；および
(b)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換、
を有する変異型V1-ATPase：
（b）ATPaseの活性を測定するための試薬、
を含むことを特徴とする銅イオン検出キット。
【請求項４】
変異型V1-ATPaseが固体プレート上に固定されている請求項３の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、環境中に存在する銅イオンを検出するための方法である。さらに詳しくは、この出願の発明は、極微量のタンパク質（例えばタンパク質一分子）を用いて銅イオンを検出するための方法と、そのための検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
銅（Cu）は、鉛、亜鉛、クロム、ニッケル、マンガン、カドミウム等と並び、土壌や水質汚染の原因となる重金属である。このため、土壌品質や水質検査においては銅イオンの検出測定が必須となっており、そのための検査試薬や検査キットが市販されている。
【０００３】
また、銅は耐食性、加工性、熱伝導性などにおいて優れた性質を有しているため、給排水や熱交換器の配管材料として広く使用されている。しかしながら、硬度が高い給湯系や一過性の軟水（シリカの多い地下水など）では孔食（直径数mm以下の微小部分に腐食が集中する現象）や潰食（馬蹄形状にえぐられるように腐食する現象）が生じやすく、またCl-、SiO2を多く含む軟水では開放型蓄熱槽を使用する空調配管（冷水、温水系）に腐食が発生することが知られている。さらには、酸性雨などによっても銅管が腐食することも知られている。そしてこのような銅管の腐食は、そのまま放置すれば管破壊をまねき、重大な機材損壊や人的被害をも招きかねない。そこで、腐食の初期に発生する銅イオン遊離を検出する必要があるが、市販の土壌・水質検査用の銅検出キット等ではそのような微量銅イオンの検出には限界がある。
【０００４】
さらに、生体内において銅イオンはヘモグロビンや赤血球の形成、コレステロールの形成等に重要な役割を果たしており、その不足は心臓発作や児童の虚弱体質の原因となることが知られている。このため、健康状態の指標の一つとして、毛髪や体液を対象とする銅イオンの検出が行われている。また、尿中の銅イオン測定によるウイルソン病の診断も提案されている（非特許文献１）。
【０００５】
このような生体試料中の銅イオンの検出は、例えば、4-(3,5-dibrome-2-pridylazo)-N
-ethyl-N-sulfopropylanilineがラウリル硫酸の存在下で銅イオンと反応し、安定なキレート化合物を生成することを利用する方法（非特許文献１）などによって行われているが、検出手順が煩雑であり、また少量の生体試料や微量銅イオンの検出のためには、さらに改良された銅イオン検出系が求められている。
【０００６】
一方、微小単一分子を利用したナノスケールセンサーの開発が精力的な展開を見せており、特にタンパク質分子を利用した重金属の検出系としては、変異型F1-ATPaseの活性や回転を指標とする亜鉛検出（非特許文献２）や、α-ヘモリシン自己集合体を用いてプロメタジン（抗ヒスタミン剤）やイミノプラン（抗うつ剤）、２価金属イオン（d2+、Zn2+、Co2+）の検出（非特許文献３）等が知られている。ただし、銅イオンを検出することのできるナノスケールセンサーは存在せず、またその検出のための微小単一分子も全く知られていない。
【０００７】
なお、ナノスケールセンサーと同様に単一分子を利用するマイクロマシンやナノマシン等においては、その駆動系として利用可能な単一モーター分子として、鞭毛モーター、ATPase（ATP合成酵素）、ミオシンモーター、微少管系モーター、核酸合成酵素の運動タンパク質等の生体分子が知られている。
【０００８】
このうち、ATP合成酵素は、真核生物のミトコンドリア内膜、葉緑体のチラコイド膜、原核細胞膜などに普遍的に存在する膜タンパク質であり、細胞の消費するATPの大部分を合成している。そしてこのATPaseの1種であるFoF1-ATPaseは２種類のトルク発生装置を備えた回転分子として機能することがでる（非特許文献４）。またこの出願の発明者らは、このFoF1-ATPaseを改良して、広範な回転速度の制御が可能な改変型FoF1-ATPaseとその利用発明を既に発明し、特許出願している（特許文献１）。さらにこの出願の発明者らは、別のATPaseであるVoV1-ATPaseもトルク発生装置を備えた回転分子であることを見出し、既に特許出願している（特願2002-337212：2002年11月20日出願、特願2003-103432：2003年4月7日出願）。ただし、これらのATPaseと銅イオンとの関係はこれまで全く知られていない。
【特許文献１】特開2003-334070号公報
【非特許文献１】厚生省心身障害研究報告書  平成7年度
【非特許文献２】HYPERLINK Liu H, Schmidt JJ, Bachand GD, Rizk SS, Looger LL, Hellinga HW, Montemagno CD. Control of a biomolecular motor-powered nanodevice with an engineered chemical switch. Nat Mater. 1(3):173-7 2002.
【非特許文献３】Braha O, Gu LQ, Zhou L, Lu X, Cheley S, Bayley H. Simultaneous stochastic sensing of divalent metal ions. Nat Biotechnol. 18(9):1005-7 2000.
【非特許文献４】Noji, H. et al. Direct observation of the rotation of F1-ATPase. Nature 386:299-302, 1997.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この出願の発明は、前記の従来技術の問題点に鑑みてなされたものであって、試料中の微量銅イオンを検出するための新しい手段として、単一分子を検出系として利用する方法と、検出キットを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この出願は、前記の課題を解決するための第1の発明として、試料中の銅イオンを検出する方法であって、以下の工程：
(１)少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子であり、
(a)配列番号３および４における全てのCys残基のSer残基へのアミノ酸置換；および
(b)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換、
を有する変異型V1-ATPaseを調製する工程；
(２)銅を含有する可能性のある試料溶液を変異型V1-ATPaseと接触させる工程、
を含み、試料溶液と接触した変異型V1-ATPaseの活性が低下した場合に、試料中に銅イオンが含有されていると判定することを特徴とする銅イオンの検出方法を提供する。
【００１１】
この第1発明の方法においては、変異型V1-ATPaseが固体プレート上に固定されており、プレート上で銅を検出することを一つの実施形態としている。
【００１２】
またこの出願は、第2の発明として、以下の要素：
（a）少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子であり、
(a)配列番号３および４における全てのCys残基のSer残基へのアミノ酸置換；および
(b)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換、
を有する変異型V1-ATPase：
（b）ATPaseの活性を測定するための試薬、
を含むことを特徴とする銅イオン検出キットを提供する。
【００１３】
この第2発明の検出キットは、変異型V1-ATPaseが固体プレート上に固定されていることを実施形態の一つとしている。
【００１４】
すなわちこの出願の発明者らは、前記先願発明（特願2002-337212）において作成した改変型V1-ATPaseが銅イオンによってそのATPase活性を低下させることを見出してこの発明を完成させた。
【００１５】
以下、発明の実施形態を示し、前記各発明について詳しく説明するが、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等の記載を参考にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
この発明において使用する変異型V1-ATPaseは、細菌や真核生物のオルガネラ（液胞、リソソーム、ゴルジ体、細胞膜、被覆小胞、分泌顆粒等）に存在するＶ型（液胞膜型）ATPase（VoV1-ATPase）の、V1部分（Ａサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個、およびＤサブユニットに結合したＦサブユニット１個からなる複合体）の特定アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変位型分子である。従って、あらゆる生物由来のV1-ATPaseを改変することによって作成することができるが、工業的な利用の観点から、耐熱性分子であることが好ましい。従って、65℃以上で生育するThermus属、Methanococcus属やSulfolobus属等の細菌由来のV1-ATPaseを改変すること、さらには70℃以上でも生育することができる好熱菌Thermus thermophilus由来のV1-ATPaseを改変したものであることが特に好ましい。
【００１７】
V1-ATPaseのＡサブユニットは配列番号３、Ｂサブユニットは配列番号４、Ｄサブユニットは配列番号５のアミノ酸配列を有している。そして、この発明に使用する変位型V1-ATPaseは以下の特徴を有している。
(i)少なくとも、配列番号３のポリペプチド３個、配列番号４のポリペプチド３個、配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体分子である。ＤサブユニットにＦサブユニット１個が結合したものであってもよい。
(ii)配列番号３および４における全てのCys残基がSer残基に置換されている。
(iii)配列番号３における第232番目Ser残基のCys残基への置換および第235番目Thr残基のSer残基への置換の少なくとも一方のアミノ酸置換を有している。
【００１８】
このような変異型V1-ATPase（以下「TSSC変異体」と記載することがある）は、例えば、野性型V1-ATPaseをコードするポリヌクレオチド（例えばThermus thermophilus V1-ATPase cDNA:配列番号１）における所定のアミノ酸残基をコードするトリプレットを、ミューテーション・キット等を使用する方法、変異導入型のPCR法、ポリヌクレオチド合成法（例えば、Nucleic Acid Res. 25:3440-3444, 1997等）によって置換し、この変異型ポリヌクレオチドを遺伝子工学的方法によって発現させることによって取得することができる。例えば、RNAポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターに変異型V1-ATPaseポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、所定のアミノ酸置換を有するTSSC変異体をインビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼプロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示できる。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pBluescript IIなどが例示できる。また、変異型V1-ATPaseポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、TSSC変異体を大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに変異型ポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のTSSC変異体分子を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発現システムなどが例示できる。さらに、ポリヌクレオチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的のTSSC変異体を得ることができる。発現ベクターとしては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたTSSC変異体を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１９】
第１発明の銅イオン検出方法は、このようにして作成したTSSC変異体に試料溶液を接触させ、TSSC変異体のATPase活性を測定する。後記の実施例に示したように、TSSC変異体は銅イオンの存在下でそのATPase活性を低下させるため、TSSC変異体のATPase活性によって、試料中に銅イオンが存在するか否かを判定することができる。ATPase活性の測定は公知の手段で行うことができる。例えば、測定用試薬（ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼおよびNADまたはNADH含有）を用い、ADPからATPの生成に伴って生じるNAD/NADH酸化還元反応を吸光度測定する方法によって行うことができる。
【００２０】
そして、この検出方法は、液相系でも実施することができ、またはTSSC変異体を固体プレートに固定した固相系でも実施することができる。液相系で行う場合には、容器内でTSSC変異体（１〜100分子程度）、試料溶液、ATPase活性測定用試薬を混合し、一定時間反応させた後、溶液の吸光度を測定することによって、銅イオンの存否を判定する。また、一定量のTSSC変異体を充填した容器と、測定用試薬とのセットによって、第2発明の検出キットが構成される。このキットには、例えば、簡易型の比色計等を備えるようにしてもよい。
【００２１】
一方、固相系で行う方法は、TSSC変異体を固体プレートに固定し、このプレート上に試料および測定用試薬を接触させて試料中銅イオンの存否を判定する。プレートに固定するTSSC変異体分子の数量を変えることによって、より緻密な検出が可能となる。例えば、プレートの微小ウイルのそれぞれに様々な数のTSSC変異体を固定し、各ウエル内でそれぞれにATPase活性を測定することによって、試料中の銅イオンの定量が可能となる。また、このようなプレートには、他のタンパク質分子（例えば、非特許文献２の亜鉛反応性FoF1-ATPaseなど）を配置することによって、様々な物質の検出が可能となる。
【００２２】
TSSC変異体をプレートに固定する場合には、タンパク質チップ作成の一般的方法に従って、表面にリンカーを塗布したプレートに、ピン方式やインクジェット方式で変異型V1-ATPaseを滴下すればよい。あるいは、TSSC変異体の一部（例えばＡサブユニットのＮ端）にHisタグ（ヘクタヒスチジン）を結合させ、このHisタグをNi-NTAスライドに結合する方法（Nature 386:299-302, 1997； FEBS Letters 470:244-248, 2000）を採用することもできる。
【００２３】
このようにしてTSSC変異体を固定化したプレート、測定試薬等を組み合わせることによって、第2発明の一態様でる検出キットが提供される。
【００２４】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
（1）材料と方法
（1-2）TSSC変異体タンパク質の調製
T.thermophilus HB8由来V1-ATPaseのＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆの各サブユニットをコードするDNA配列をlacプロモーター支配下に保持しているプラスミッドpUCV1によって形質転換した大腸菌株BL21-CodonPlus-RP(Stragene)を用いて変異型V1-ATPase（TSSC変異体）を発現させた。なお、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆの各サブユニットをコードするDNA配列には、PCR法によって以下の変異を導入するための改変を加えた（アミノ酸位置は配列番号２−５に対応する）。
I：V1-ATPase(A-His8-tags/A&B-Δcys /A-S232C/A-T235S/D/F)
(1)AサブユニットのN端にHisタグを結合（A-His8-tags）
(2)AおよびBサブユニットの本来持っているすべてのCys残基をSer残基に置換（A&B-    Δcys）
(3) Aサブユニットの第232番目SerがCysに置換（A-S232C）
(4) Aサブユニットの第235番目ThrがSerに置換（A-T235S）
(5) Dサブユニットはそのまま。
(6) Fサブユニットはそのまま。
【００２６】
形質転換細胞を、0.3M NaClを含む20mM imidazole/HCI(pH8.0)に懸濁し、65℃で30分間熱処理をした後、熱に不安定なタンパク質を除き、Ni2+-affinity column(Amersham)に供して0.3M NaClを含む0.5M imidazole/HCI(pH8.0)で溶出した。緩衝液をかえ、限外濾過（VIVA-Spin,VIVA science）し、RESOURCE Q columnに供した。V1-ATPaseを含む部分をSuperdex 200 column (Amersham)にかけ、コンタミネーションしているタンパク質を除去した。精製されたV1-ATPaseを調製した。タンパク質濃度はUV測定によって行った。
（1-2）ATPase活性測定
TSSC変異体溶液20μlを2 mlのATPase活性測定溶液にいれ、反応を開始する。ATPase 活性測定溶液の組成は、50 mM Tris-Cl（pH 8.0）、100 mM KCl、5 mM MgCl2、4 mM ATP-Mg、50 μg/mgピルビン酸キナーゼ、50μg/mg乳酸脱水素酵素、10 μM NADHとした。反応温度は25℃、340 nmでの吸光度の変化を測定した（詳細についてはYokoyama K. et al., V-ATPase of Thermus thermophilus is inactivated during ATP hydrolysis but can synthesize ATP. J Biol Chem. 1998 Aug 7;273(32):20504-10参照）。
（1-3）重金属に対する感受性
終濃度１μMのTSSC変異体溶液100μl（50 mM Tris Cl、pH 8.0）に、重金属溶液を終濃度50μMになるように加え、室温で60分間保温した。重金属液は、銅、水銀、銀、鉛、スズ、カドミウム、クロム、鉄、カルシウム、亜鉛、ニッケル、マンガンの塩化物をそれぞれ用いた。保温後、20μlを分取し、ATPase活性測定液に加え、ATPase活性を測定した。
（1-4）DTTの影響
重金属添加の60分後に、DTTもしくはEDTAを終濃度で10 mMになるよう加えた。さらに室温で60分間放置後、20μlを分取し、ATPase活性測定液に加え、ATPase活性を測定した。
（1-5）銅イオンによる阻害のタイムコース
1μMのTSSC変異体溶液200μlに銅溶液を終濃度で50μMになるように加え、所定の時間ごとに20μlずつ分取し、ATPase活性を測定した。
（1-6）銅イオンによる阻害の濃度依存性
終濃度１μMのTSSC変異体溶液100μl（50 mM Tris Cl、pH 8.0）に、銅イオン溶液を所定の終濃度になるよう加え、室温で60分間保温した。保温後、20μlを分取し、ATPase活性測定液に加え、ATPase活性を測定した。
（2）結果
銅イオンとTSSC変異体を混合し、放置すると顕著なATPase活性の低下が観察された。他の重元素ではこのような活性の現象は観察されなかった（図１）。また、野性型のV1-ATPaseや、Ａサブユニット232番目Ser残基がAla残基に置換された変異型（TSSA変異体）では銅イオンによって活性が阻害されなかった（図２）。また、銅イオンによって活性が阻害されたTSSC変異体DTTで処理すると活性が回復することから、銅によるTSSC変異体のATPase活性阻害が可逆的なものであることが示唆された（図２）。
【００２７】
さらに、銅イオンによるTSSC変異体のATPase活性阻害は濃度依存的であり、Kdは約10μMであった。50μMでほぼ完全に酵素を阻害型にした。銅添加後の活性変化の時間依存性を調べたところ、添加後ほぼ10分以内に活性が消失することが確認された（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、微量の銅イオンを検出するための新たな手段が提供される。こによって、土壌・水質検査や、銅管の腐食の早期発見、あるいは診断等を目的として生体試料中の銅イオン検出等に新たな可能性が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】変異型V1-ATPase（TSSC変異体）のATPase活性の対する各種重金属イオン影響を調べた結果である。縦軸は未処理を100とした相対活性、横軸は各種重金属イオンである。
【図２】TSSA変異体とTSSC変異体に対する銅イオンの影響、および銅イオンによって不活性化したTSSC変異体に対するDTTおよびEDTAの影響を調べた結果である。縦軸は未処理の時を100とした相対活性である。なお、STTA変異体は、第232番目Ser残基がAla残基に置換されていることを除き、STTC変異体と同一である。
【図３】銅イオンと接触させた後のTSSC変異体ATPase活性の時間変化を示す。縦軸は未処理時（時間０）での活性を100とした相対活性である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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