(57)【要約】【課題】  オオムギ等のイネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用法を提供する。【解決手段】  オオムギの詳細な連鎖地図を作成し、ＱＴＬ解析を行うことにより、オオムギ１Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーと、オオムギ２Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーと、オオムギ３Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーと、オオムギ４Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーと、オオムギ５Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーとを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記小穂段数に関与する遺伝子座から０ないし８センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝マーカー。
【請求項４】
上記ゲノムＤＮＡが１Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項６】
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項７】
上記ゲノムＤＮＡが２Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項８】
配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または７に記載の遺伝マーカー。
【請求項９】
配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または７に記載の遺伝マーカー。
【請求項１０】
上記ゲノムＤＮＡが３Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１１】
配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１０に記載の遺伝マーカー。
【請求項１２】
配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１０に記載の遺伝マーカー。
【請求項１３】
上記ゲノムＤＮＡが４Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１４】
配列番号１３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１５】
配列番号１５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第八プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１６】
上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項１７】
配列番号１７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１６に記載の遺伝マーカー。
【請求項１８】
配列番号１９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または１６に記載の遺伝マーカー。
【請求項１９】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とするＤＮＡ断片の単離方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の単離方法により得られた上記小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とする小穂段数改変イネ科植物の生産方法。
【請求項２１】
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項２０に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法。
【請求項２２】
上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項２１に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法。
【請求項２３】
請求項２０ないし２２のいずれか１項に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法によって得られた小穂段数改変イネ科植物。
【請求項２４】
請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを指標として、小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーと、その利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネ科植物の「小穂段数」とは穂についている粒の数のことである。二条オオムギの収量はｍ2当たりの穂数×小穂段数×１粒重で表すことができるため、「小穂段数」は収量を推定する際の目安となる。したがって同じ穂数と１粒重を有する場合、小穂段数が多い品種ほど、その収量が高いといえる。よって栽培品種においては小穂段数が多いことが好ましい形質であるといえる。
【０００３】
従来、作物の育種は目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、小穂段数が多い形質を目標とした場合には、選抜対象集団を栽培し、各個体が出穂した後に小穂段数を実際に測定することにより、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。また、目標形質が栽培環境因子に影響を受けやすい形質であれば、選抜個体が発現している目標形質が遺伝子の表現型であるか否かの判定が困難であった。
【０００４】
そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減、有用遺伝子の確実な選抜を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により幼苗段階で選抜が可能となり、目標形質の有無の確認も容易となる。したがって、遺伝マーカーを利用すれば効率的な育種が実現可能である。そして、遺伝マーカーを利用した育種を実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。
【０００５】
ところで、農業上重要な形質の多くは、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は、時間や長さなどの量的な尺度で測定されるので量的形質と呼ばれている。上記小穂段数も量的形質の１つであることが知られている。量的形質は一般に、単一主働遺伝子支配の形質ではなく、複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多い。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質であることが多い。
【０００６】
このような量的形質を司る遺伝子が染色体上に占める遺伝的な位置をＱＴＬ（Quantitative Trait Loci、量的形質遺伝子座）と称する。ＱＴＬを推定する方法として、ＱＴＬの近傍に存在する遺伝マーカーを利用するＱＴＬ解析が用いられる。１９８０年代後半にＤＮＡマーカーが登場すると、ＤＮＡマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進み、その地図に基づいて多くの生物でＱＴＬ解析が行われるようになった。
【０００７】
以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバーできる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高いＱＴＬ解析により可能となり、得られた遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。
【０００８】
上記遺伝マーカーに関する技術としては、オオムギを例に挙げると、１）オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術（特許文献１参照）や、２）オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット（特許文献２参照）とその利用に関する技術等が、本発明者らによって提案されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４７４号公報（２００２（平成１４）年１０月８日公開）
【特許文献２】特開２００３−１１１５９３号公報（２００３（平成１５）年４月１５日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、イネ科植物の小穂段数はイネ科植物の収量に関与しているため、小穂段数の改変は重要な育種目標の１つである。しかし、小穂段数は栽培環境因子に影響を受けやすい形質であり、複数の遺伝子座が関与する場合が多いため、実際に小穂段数を調査する選抜方法では小穂段数に関与する遺伝子（遺伝子座）を確実に選抜しているか否かを確認することが困難である。そこで小穂段数を改変した植物の育種には遺伝マーカーを利用することが非常に有効である。小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーが開発され、利用可能となれば、小穂段数改変植物の育種の大幅な効率化を実現することが可能となる。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、イネ科植物、特にオオムギにおける小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーと、その代表的な利用法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列に基づいてプライマーセットを設計し、当該プライマーセットにより増幅されるオオムギゲノム断片の多型の有無により遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を開発した。さらに、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」の交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（doubled haploid、以下「ＤＨ」と略記する。）集団を材料として、上記遺伝マーカー間の連鎖を検出して、当該ＤＨ系統の連鎖地図を作成し、この連鎖地図に基づいて小穂段数に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行った。その結果、小穂段数に関与する遺伝子座を１Ｈ染色体上，２Ｈ染色体上，３Ｈ染色体上，４Ｈ染色体上，５Ｈ染色体上にそれぞれ１つづつ検出した。本発明者等はさらに解析を進め、これら小穂段数に関与する遺伝子座にそれぞれ連鎖する新規遺伝マーカーを見いだした。したがって本発明は、上記新規知見により完成されたものであり、以下の発明を包含する。
【００１２】
すなわち本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、上記小穂段数に関与する遺伝子座から０ないし８センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴としている。上記遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと小穂段数に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率は低い。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、例えば小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変イネ科植物の生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００１３】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記イネ科植物がムギ類であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギ・コムギ等のムギ類において小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変ムギ類の生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００１４】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ムギ類がオオムギであることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギにおいて小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００１５】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが１Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの１Ｈ染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００１６】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００１７】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００１８】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが２Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの２Ｈ染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００１９】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第三プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００２０】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第四プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００２１】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが３Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの３Ｈ染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００２２】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第五プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００２３】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第六プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。
【００２４】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが４Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの４Ｈ染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００２５】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第七プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００２６】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第八プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。
【００２７】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの５Ｈ染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産（作出）・判別等を行うことが可能となる。
【００２８】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第九プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。
【００２９】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第十プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。
【００３０】
一方、本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴としている。本発明にかかる遺伝マーカーは小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するものであり、上記遺伝マーカーを目標にクローニングを行えば、小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を容易に単離することが可能となる。
【００３１】
また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の生産方法は、上記本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法により得られた上記小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴としている。上記イネ科植物はムギ類であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。当該生産方法により、小穂段数改変イネ科植物を生産することが可能となる。
【００３２】
また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物は、上記本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の生産方法によって得られることを特徴としている。特に小穂段数が多くなった改変イネ科植物は、該作物の収量を増加させることができる。
【００３３】
また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として、小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法である。上記本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと小穂段数に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率が非常に低い。それゆえ上記遺伝マーカーを検出することによって、試験対象植物における小穂段数に関与する遺伝子座の遺伝子型を容易に判別することができ、選抜すべき個体を容易に見出すことが可能となる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座と連鎖するため、当該遺伝マーカーを指標として小穂段数を改変したイネ科植物の育種を可能とする。したがって、小穂段数改変植物の効率的な育種が実現できるという効果を奏する。より具体的には、幼苗段階で目的個体を選抜できるため、実際に植物個体の小穂段数を観察した後に目的の個体を選抜する必要がなくなり、育種期間を短縮できるという効果を奏する。また、複数の遺伝子座を同時に選抜できるために、観察によって選抜するよりも、確実に目的とする遺伝子型を得ることができる。さらに、労働力および圃場面積を縮減できるという効果を奏する。
【００３５】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを指標として選抜育種を行えば、栽培環境因子による表現型への影響を排除することが可能となる。したがって、有用遺伝子（遺伝子座）の確実な選抜ができるという効果を奏する。
【００３６】
また、上記遺伝マーカーを指標として選択的に育種された小穂段数改変植物、特に小穂段数が多くなった改変植物は、該作物の収量を増加させることできるという効果を奏する。さらには小穂段数を指標として種や品種の識別が容易となり、異種または異品種の混入を排除できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
本発明は、イネ科植物における小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用の一例とに関するものである。以下、本発明にかかる遺伝マーカー、本発明の有用性、並びに本発明の利用の一例について説明する。
【００３９】
（１）本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。
【００４０】
「小穂段数」とは、イネ科植物の「小穂段数」とは穂についている粒の数のことである。二条オオムギの収量はｍ2当たりの穂数×小穂段数×１粒重で表すことができるため、「小穂段数」は収量を推定する際の目安となる。したがって同じ穂数と１粒重を有する場合、小穂段数が多い品種ほど、その収量が高いといえる。よって栽培品種においては小穂段数が多いことが好ましい形質であるといえる。したがって優良形質を有する品種を育種する際には、なるべく小穂段数の多いものを選抜する必要がある。
【００４１】
またイネ科植物において小穂段数は種や品種によってその長さが異なることが知られている。したがって、他の品種と異なる小穂段数を有する品種を育成すれば、異品種等の混入を容易に識別することもできる。よって小穂段数の改変は重要な育種目標の１つであるといえる。
【００４２】
小穂段数は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。量的形質はＱＴＬ解析により当該量的形質に関与している遺伝子座の染色体上の位置を推定することができる。以下、本発明者らがオオムギにおいて開発した小穂段数に関与する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーについて詳細に説明する。なお、本発明に係る遺伝マーカーはこれらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明者らは、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」との交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を用いて、高密度連鎖地図を作成した。すなわち、本発明者らが有するオオムギＥＳＴ（expressed sequence tag）配列に基づいて設計されたプライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを増幅し、「はるな二条」と「Ｈ６０２」との間に増幅断片長の多型を有するものや、増幅断片長の制限酵素による消化のパターンが異なる多型を有するものを特定し、これらのＤＮＡマーカーを含む約５００遺伝子座からなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図および本発明者らが測定した上記ＤＨ集団９３個体についての小穂段数のデータに基づいて、小穂段数に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行った。その結果、小穂段数に関与する遺伝子座を１Ｈ染色体上、２Ｈ染色体上、３Ｈ染色体上、４Ｈ染色体上、５Ｈ染色体上にそれぞれ１つづつ検出した。本発明にかかる遺伝マーカーは、１Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、２Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、３Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、４Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、５Ｈ染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーである。発明者らは１Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０３５８２」および「ｋ００５９１」、２Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０７７３２」および「ｋ０７４３０」、３Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０６９３７」および「ｋ０２５３８」、４Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０３２８９」および「ｋ０１３０１」、５Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０２３２１」および「ｋ００８３５」と命名した。
【００４４】
ｋ０３５８２は、
ＣＧＴＣＧＣＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＴＧＡＡ（配列番号１）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧ（配列番号２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されるＤＮＡマーカーであり、上記１Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約０センチモルガン（以下ｃＭと表示する）の位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：bah13o05、配列番号２１）に基づいて設計されている。図１に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１）および上記プライマー配列（配列番号２）の相補配列である。
【００４５】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間には、ＳＮＰ（single nucleotide polymorphisms；一塩基多型）がある。図２に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号２２）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号２３）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＸｈｏＩの認識配列（ＣＴＣＧＡＧ）を示す。図２から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＸｈｏＩの認識配列（ＣＴＣＧＡＧ）を有しているためＸｈｏＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（ＣＴＴＧＡＧ）制限酵素ＸｈｏＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０３５８２は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第一プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＸｈｏＩ切断により、対象個体が当該１Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００４６】
ここで、栽培品種である「はるな２条」は小穂段数が少ない形質（以下適宜「少小穂段数型」と称する）を有し、野生品種である「Ｈ６０２」は小穂段数が多い形質（以下適宜「多小穂段数型」と称する）を有する。よって第一プライマーセットを用いて得られる増幅産物が、制限酵素ＸｈｏＩによって切断されれば、当該試験対象植物はるな二条型、すなわち少小穂段数型であると判別でき、逆に当該制限酵素によって切断されなければＨ６０２型、すなわち多小穂段数型であると判断できる。
【００４７】
上記制限酵素による切断の有無の確認は、特に限定されるものではないが、例えば上記制限酵素ＸｈｏＩで消化したものと、未消化のものを電気泳動にかけ、そのときにみられるＤＮＡ断片バンドの数が未消化のものに比して増加していれば上記ＸｈｏＩで切断されたと判断でき、変化がなければ上記ＸｈｏＩで切断されないと判断できる。なお以下に示す他のプライマーセットを用いたその他の遺伝マーカーの検出・判別においても同様に行なえばよい。
【００４８】
またｋ００５９１は、
ＣＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記１Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約０ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：baak36b12、配列番号２４）に基づいて設計されている。図３に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号３）および上記プライマー配列（配列番号４）の相補配列である。
【００４９】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図４に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号２５）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号２６）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＢｃｎＩの認識配列（ＣＣ［ＧまたはＣ］ＧＧ）を示す。図４から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＢｃｎＩの認識配列（ＣＣＧＧＧ）を有しているためＢｃｎＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＧがＡに変異しているため（ＣＣＧＧＡ）制限酵素ＢｃｎＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ００５９１は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＢｃｎＩ切断により、対象個体が当該１Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００５０】
またｋ０７７３２は、
ＣＴＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＧＣ（配列番号５）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣ（配列番号６）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記２Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約３．５ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：BaGS20M01、配列番号２７）に基づいて設計されている。図５に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号５）および上記プライマー配列（配列番号６）の相補配列である。
【００５１】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図６に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号２８）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号２９）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（ＧＡＴＡＴＣ）を示す。図６から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列（ＧＡＴＡＴＣ）を有しているためＥｃｏＲＶで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＧに変異しているため（ＧＡＴＡＴＧ）制限酵素ＥｃｏＲＶで切断されない。
すなわち、本遺伝マーカーｋ０７７３２は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第三プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＥｃｏＲＶ切断により、対象個体が当該２Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００５２】
またｋ０７４３０は、
ＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＧＴＴＴＧ（配列番号７）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＡＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡ（配列番号８）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記２Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約０ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：baet18F0911、配列番号３０）に基づいて設計されている。図７に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号７）および上記プライマー配列（配列番号８）の相補配列である。
【００５３】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図８に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号３１）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号３２）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨａｅＩＩＩの認識配列（ＧＧＣＣ）を示す。図８から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＨａｅＩＩＩの認識配列（ＧＧＣＣ）を有しているためＨａｅＩＩＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＧがＡに変異しているため（ＧＡＣＣ）、制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断されない。
すなわち、本遺伝マーカーｋ０７４３０は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第四プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨａｅＩＩＩ切断により、対象個体が当該２Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００５４】
またｋ０６９３７は、
ＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡ（配列番号９）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧ（配列番号１０）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記３Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約３．４ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：BaAL7B16、配列番号３３）に基づいて設計されている。図９に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号９）および上記プライマー配列（配列番号１０）の相補配列である。
【００５５】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図１０に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号３４）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号３５）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＦｏｋＩの認識配列（ＣＡＴＣＣ）を示す。図１０から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＦｏｋＩの認識配列（ＣＡＴＣＣ）を有しているためＦｏｋＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＡに変異しているため（ＣＡＴＡＣ）制限酵素ＦｏｋＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０６９３７は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第五プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＦｏｋＩ切断により、対象個体が当該３Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００５６】
またｋ０２５３８は、
ＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＡ（配列番号１１）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＴＴＴＧＴＧＡＣＧＧＣＴＴＡＣＡＣＣＡＣ（配列番号１２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記３Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約３ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：bags22g10、配列番号３６）に基づいて設計されている。図１１に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１１）および上記プライマー配列（配列番号１２）の相補配列である。
【００５７】
はるな二条の増幅パターンとＨ６０２の増幅パターンとの間に多型があり、はるな二条のゲノムＤＮＡを鋳型として約４５０ｂｐの断片が増幅されてくるのに対して、Ｈ６０２のゲノムＤＮＡを鋳型としては該ＤＮＡ断片は増幅されてこない。図１２に第六プライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図１２（ａ）左端から順に、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団の１〜２１の増幅断片である。図１２（ｂ）は、左端から順に、ＤＨ集団の２２〜４５の増幅断片である。図１２（ｃ）は、左端から順に、ＤＨ集団の４６〜６９の増幅断片である。図１２（ｄ）は、左端から順に、ＤＨ集団の７０〜９３の増幅断片である。図１２から明らかなように、約４５０ｂｐの増幅産物を確認することにより、対象個体が当該３Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００５８】
またｋ０３２８９は、
ＴＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ（配列番号１３）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号１４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記４Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約２．５ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：bags3h19、配列番号３７）に基づいて設計されている。図１３に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１３）および上記プライマー配列（配列番号１４）の相補配列である。
【００５９】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図１４に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号３８）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号３９）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＳａｃＩＩの認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を示す。図１４から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＳａｃＩＩの認識配列（ＣＣＧＣＧＧ）を有しているためＳａｃＩＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（ＣＣＧＴＧＧ）、制限酵素ＳａｃＩＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０３２８９は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第七プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＳａｃＩＩ切断により、対象個体が当該４Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００６０】
またｋ０１３０１は、
ＡＴＣＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＣＣＡ（配列番号１５）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＡＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＧＧＴＣＡＧＡＧＡ（配列番号１６）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第八プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記４Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約４．６ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：baal39f20、配列番号４０）に基づいて設計されている。図１５に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１５）および上記プライマー配列（配列番号１６）の相補配列である。
【００６１】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図１６に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号４１）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号４２）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（ＣＣＡＴＧＧ）を示す。図１６から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（ＣＣＡＴＧＧ）を有しているためＳａｃＩＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＴがＣに変異しているため（ＣＣＡＣＧＧ）、制限酵素ＮｃｏＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０１３０１は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第八プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＮｃｏＩ切断により、対象個体が当該４Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００６２】
またｋ０２３２１は、
ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＧＡＴＴＴＧＧＧＡＴ（配列番号１７）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＣ（配列番号１８）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約７．６ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：bags19i06、配列番号４３）に基づいて設計されている。図１７に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１７）および上記プライマー配列（配列番号１８）の相補配列である。
【００６３】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にはＳＮＰがある。図１８に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号４４）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号４５）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＡｆａＩの認識配列（ＧＴＡＣ）を示す。図１８から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＡｆａＩの認識配列（ＧＴＡＣ）を有しているためＡｆａＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（ＧＴＡＴ）、制限酵素ＡｆａＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０２３２１は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第九プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＡｆａＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００６４】
またｋ００８３５は、
ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＡ（配列番号１９）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣ（配列番号２０）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約３．９ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：baak46e06、配列番号４６）に基づいて設計されている。図１９に上記ＥＳＴの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１９）および上記プライマー配列（配列番号２０）の相補配列である。
【００６５】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間に断片長多型があり、はるな二条のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約８９０ｂｐ、Ｈ６０２のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約８７０ｂｐと異なる。図２０に第十プライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図２０（ａ）及び（ｂ）の両端は分子量マーカーである。図２０（ａ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団の１〜４５の増幅断片である。図２０（ｂ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、ＤＨ集団の４６〜９３の増幅断片である。図２０から明らかなように、増幅産物のサイズを確認することにより、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００６６】
ここで、１センチモルガン（１ｃＭ）とは、２つの遺伝子座の間に１％の頻度で交叉が起きるときの、両遺伝子座間の距離を表す単位である。
【００６７】
ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの幼苗期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。さらに、幼苗段階で個体の選抜が可能となり、育種期間を大幅に短縮できる点が挙げられる。
【００６８】
またオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーの組み合わせを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００６９】
（２）本発明の利用
〔小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０３５８２、ｋ００５９１）は、オオムギ１Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０７７３２、ｋ０７４３０）は、オオムギ２Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０６９３７、ｋ０２５３８）は、オオムギ３Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０３２８９、ｋ０１３０１）は、オオムギ４Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０２３２１、ｋ００８３５）は、オオムギ５Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものである。
【００７０】
よって、ｋ０３５８２、ｋ００５９１の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ１Ｈ染色体上に検出された一方の小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ０７７３２、ｋ０７４３０の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ２Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ０６９３７、ｋ０２５３８の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ３Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ０３２８９、ｋ０１３０１の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ４Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ０２３２１、ｋ００８３５の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ５Ｈ染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
【００７１】
単離とは、目的のＤＮＡ断片、すなわち小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をクローニングすることを意味することはいうまでもないが、広義には交雑Ｆ１集団から戻し交配等により、両親のうち一方の小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する個体を選抜し、その遺伝子座領域のみを目的品種に導入する同質遺伝子系統の作製も単離に含まれる。
【００７２】
本発明にかかる遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては特に限定されるものではないが、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００７３】
オオムギでは本発明者らが開発を進めている「はるな二条」を含めて、ゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが２種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、小穂段数に関与する遺伝子座と当該遺伝子座に連鎖する本発明の遺伝マーカーとで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的に小穂段数に関与する遺伝子座に到達することができる。
【００７４】
また、上述のように、交雑Ｆ１に一方の親を戻し交配することにより、他方の親の小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を目的品種に導入して（広義の）単離をすることができる。
【００７５】
なお、上記方法をはじめとする小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する際には、目的とする小穂段数に関与する遺伝子座に対してなるべく近傍に座乗する遺伝マーカーを選択して用いることが好ましい。目的とする小穂段数に関与する遺伝子座と遺伝マーカーの間で組み換えが起こる確率がより低くなり、より確実に小穂段数に関与する遺伝子座を含む断片を単離することができるからである。
【００７６】
〔小穂段数改変植物の生産方法、および当該生産方法によって得られた小穂段数改変植物〕
上記本発明にかかる小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法によって得られた小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって、小穂段数改変イネ科植物を生産することが可能である。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。また、例えば、オオムギから単離された小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をオオムギ以外のイネ科植物に導入することも可能であり、同一属間のみでの単離、導入に限定されるものではない。
【００７７】
上記ＤＮＡ断片を導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。より具体的には、例えばアグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いてイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって生産すればよく、これにより、小穂段数改変品種が得られることとなる。例えば、雑誌The Plant Journal(1997) 11(6),1369-1376 には、Sonia Tingay等により、Agrobacterium tumefaciens を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを生産可能である。
【００７８】
また、目的とする小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する植物個体と、当該ＤＮＡ断片を導入しようとする植物個体との交雑により、小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、植物に導入することも可能である。この方法では、交雑が可能である限りにおいて、他の種や属の植物が有する小穂段数に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の導入が可能である。
【００７９】
本発明にかかる小穂段数改変植物は、上記本発明にかかる生産方法により得られるものである。当該小穂段数改変植物は、小穂段数を多くする表現型（多小穂段数型）を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には、元の品種の小穂段数より多い小穂段数を有する品種となり、小穂段数を少なくする表現型（少小穂段数型）を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には、元の品種の小穂段数より少ない小穂段数を有する品種となる。ただし、上述のごとく収量の観点から栽培品種としては、前者の多小穂段数型の品種が好ましい。
【００８０】
〔小穂段数イネ科植物の選抜方法〕
本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の選抜方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の作物育種法を利用することができる。
【００８１】
より具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を指標として植物を選抜する方法が挙げられる。遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、対象とする植物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として上記第一ないし第十プライマーセットのいずれかを用いて増幅したＤＮＡ断片について、断片長または断片の制限酵素消化パターンの観察を挙げることができる。
【００８２】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８３】
〔使用植物〕
醸造用オオムギ「はるな二条」（Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo）と野生オオムギ「Ｈ６０２」（Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602）との交配から得られたＦ１の花粉を培養して半数体（haploid）を育成し、自然倍加した倍加半数体（doubled haploid）９３個体からなる集団を使用した。
【００８４】
〔連鎖地図の作成〕
本発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列約１２万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って３’端約６万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とＨ６０２との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、３９種類の制限酵素に対してＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）化が可能なものをマーカーとして選択した。
【００８５】
以上により、上記はるな二条とＨ６０２との交雑Ｆ１由来のＤＨ集団について、合計４９９遺伝子座のマーカーからなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図の平均マーカー密度は3.0cM/locus、全長は1,470cMである。
【００８６】
〔遺伝子型の判定〕
ＤＨ集団各個体の遺伝子型の判定は、上記ＤＨ集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したＤＮＡを鋳型として、ＥＳＴ配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。断片長多型マーカーについてはＰＣＲ産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーについては、ＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。
【００８７】
〔小穂段数の測定〕
ＤＨ集団の各個体について、登熟後小穂段数を数えて記録した。小穂段数の分布を図２１に示した。また、白矢印ははるな二条、黒矢印はＨ６０２の小穂段数を示している。図２１において、縦軸は個体数を横軸は小穂段数を示す。本ＤＨ集団の小穂段数は１８〜３６段の間に分布した。
【００８８】
〔ＱＴＬ解析〕
ＱＴＬ解析のアルゴリズムには、シンプルインターバルマッピング（simple interval mapping、以下「ＳＩＭ」と略記する。）とコンポジットインターバルマッピング（composite interval mapping以下「ＣＩＭ」と略記する。）を用い、解析ソフトウエアにはそれぞれ、ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬとＱＴＬ Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを用いた。ＬＯＤスコアの閾値を２に設定し、ＬＯＤスコアが２を超えた場合に当該２つのマーカー区間内の最もＬＯＤの大きな位置にＱＴＬの存在を推定した。
【００８９】
〔結果〕
結果を表１に示した。
【００９０】
【表１】
2005229844.tif 000002
【００９１】
表１から明らかなように、ＳＩＭおよびＣＩＭにより小穂段数に関与する５つのＱＴＬが検出された。１Ｈ染色体上に存在するＱＴＬは、ｋ０３５８２およびｋ００５９１によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０３５８２から長腕側に約０ｃＭ、ｋ００５９１から短腕側に約０ｃＭの距離に位置していた。ＬＯＤスコアは２．３である。このＱＴＬで表現型の分散の１１．６％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で小穂段数が２．７段増加する。
【００９２】
また２Ｈ染色体上に存在するＱＴＬは、ｋ０７７３２およびｋ０７４３０によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０７７３２から長腕側に約３．５ｃＭ、ｋ０７４３０から短腕側に約０ｃＭの距離に位置していた。ＬＯＤスコアは２．２である。このＱＴＬで表現型の分散の１１．４％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で小穂段数が２．９段増加する。
【００９３】
また３Ｈ染色体上に存在するＱＴＬは、ｋ０６９３７およびｋ０２５３８によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０６９３７から長腕側に約３．４ｃＭ、ｋ０２５３８から短腕側に約３．０ｃＭの距離に位置していた。ＬＯＤスコアは３．０である。このＱＴＬで表現型の分散の４２．０％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で小穂段数が７．３段減少する。
【００９４】
また４Ｈ染色体上に存在するＱＴＬは、ｋ０３２８９およびｋ０１３０１によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０３２８９から長腕側に約２．５ｃＭ、ｋ０１３０１から短腕側に約４．６ｃＭの距離に位置していた。ＬＯＤスコアは２．７である。このＱＴＬで表現型の分散の１３．５％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で小穂段数が３．６段増加する。
【００９５】
また５Ｈ染色体上に存在するＱＴＬは、ｋ０２３２１およびｋ００８３５によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０２３２１から長腕側に約７．６ｃＭ、ｋ００８３５から短腕側に約３．９ｃＭの距離に位置していた。ＬＯＤスコアは８．３である。このＱＴＬで表現型の分散の３９．１％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で小穂段数が５．０段減少する。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数改変植物の育種、小穂段数に関与する遺伝子の単離等に用いることができ、育種の効率化に大きく貢献することが期待される。したがって、広く農業全般に利用可能であり、さらには、オオムギ等を原料とする食品産業においても有効である。また、生物分野の基礎研究、特に植物ゲノム研究等にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】オオムギＥＳＴクローン：bah13o05の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図２】遺伝マーカーｋ０３５８２における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図３】オオムギＥＳＴクローン：baak36b12の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図４】遺伝マーカーｋ００５９１における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図５】オオムギＥＳＴクローン：BaGS20M01の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図６】遺伝マーカーｋ０７７３２における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図７】オオムギＥＳＴクローン：baet18F0911の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図８】遺伝マーカーｋ０７４３０における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図９】オオムギＥＳＴクローン：BaAL7B16の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１０】遺伝マーカーｋ０６９３７における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１１】オオムギＥＳＴクローン：bags22g10の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１２】図１２（ａ）は遺伝マーカーk０２５３８における、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団（１〜２１）間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図１２（ｂ）は遺伝マーカーk０２５３８における、ＤＨ集団（２２〜４５）間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図１２（ｃ）は遺伝マーカーk０２５３８における、ＤＨ集団（４６〜６９）間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図１２（ｄ）は遺伝マーカーk０２５３８における、ＤＨ集団（７０〜９３）間の断片長多型を示す電気泳動画像である。
【図１３】オオムギＥＳＴクローン：bags3h19の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１４】遺伝マーカーｋ０３２８９における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１５】オオムギＥＳＴクローン：baal39f20の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１６】遺伝マーカーｋ０１３０１における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１７】オオムギＥＳＴクローン：bags19i06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１８】遺伝マーカーｋ０２３２１における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１９】オオムギＥＳＴクローン：baak46e06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図２０】図２０（ａ）は遺伝マーカーｋ００８３５における、Ｈ６０２とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像（前半）であり、図２０（ｂ）は遺伝マーカーｋ００８３５における、Ｈ６０２とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像（後半）でありる。
【図２１】ＤＨ集団各個体の小穂段数の分布を示すグラフである。
【図１】
2005229844.tif 000003
【図２】
2005229844.tif 000004
【図３】
2005229844.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2005229844.tif 000021
【図２０】
2005229844.tif 000022
【図２１】
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【配列表】
2005229844000001.app