(57)【要約】【課題】  ＮＯＸのみならず、ＣＯ２の吸収能に優れたＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物及びその育成方法を提供する。【解決手段】  本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法は、キュウリのＮＯ２−トランスポーターのｃＤＮＡをベクターｐＢＩ１２１に組み込んで組換えベクターを得て、この組換えベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、このアグロバクテリウムをシロイナズナの細胞に感染させて形質転換体を得て、その後、この形質転換体を培養することにより、植物体を再生させることを特徴とする。本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、上記ＮＯ２−トランスポーターが、植物体の細胞の形質膜上に発現しており、上記ＮＯ２−トランスポーターを発現させていない非形質転換植物体に比べて１．２倍以上のＣＯ２吸収能及び１．１倍以上のＮＯ２吸収能を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを植物細胞に導入することにより形質転換体を得て、次いで該形質転換体から植物体を再生させることを特徴とするＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
【請求項２】
上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、ベクターに上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡが連結されている組換えベクターにより、上記植物細胞に導入される請求項１記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
【請求項３】
上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、ベクターに上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡが連結されている組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを上記植物細胞に感染させることにより、上記植物細胞に導入される請求項１記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
【請求項４】
上記ＮＯ２−トランスポーターを、植物体の細胞の形質膜上に発現させる請求項１乃至３のいずれかに記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法により得られることを特徴とするＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
【請求項６】
上記ＮＯ２−トランスポーターが、植物体の細胞の形質膜上に発現している請求項５記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
【請求項７】
上記ＮＯ２−トランスポーターを発現させていない非形質転換植物体に比べて１．２倍以上のＣＯ２吸収能及び１．１倍以上のＮＯ２吸収能を有する請求項５又は６記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＯＸのみならず、ＣＯ２の吸収能に優れたＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物及びその育成方法に関する
【背景技術】
【０００２】
大気中の窒素ガスは化学的には不活性であり、生物にとって有害ではない。しかし、還元剤である化石燃料を圧縮した大気で燃焼させると、排気ガスから窒素酸化物（ＮＯＸ）が大気中に排出される。また、かかる窒素酸化物、例えばＮＯ２は、特に光化学スモッグ中に多く含まれることが知られている。かかるＮＯ２は、酸性雨の原因となり、また、強い酸化力を有することから、オゾン層を破壊するという弊害をもたらすおそれがあることが指摘されている。しかも、かかるＮＯ２は、水に溶解してＮＯ２−を生成し、これがヘモグロビンと結合することによりメトヘモグロビン化が進み、また、このヘモグロビン・ＮＯ２複合体の光動力学効果により生体内でラジカル種が生成することにより、生体に有害な作用を及ぼすおそれがあることが知られている。
【０００３】
このようなＮＯＸ等の大気汚染物質を除去するために、現在までに種々の化学的、物理的方法が開発されているが、従来からある化学的、物理的方法ではなく、大気汚染物質を吸収する能力を有する植物により、大気汚染物質を吸収して除去する生物学的方法が開発されている（下記特許文献１及び非特許文献１）。即ち、ＮＯ２−は、植物が硝酸を吸収し、アンモニアに還元する硝酸同化の中間体としても生成するが、生成したＮＯ２−は、直ちに葉緑体に輸送されて、アンモニアに還元され消費される。大気中のＮＯ２−をこのような植物の代謝機能を利用して除去することができれば、大気汚染を解決することができる。このような生物学的方法による大気浄化方法に関連して、下記特許文献１には、通常の同種植物に比べて孔辺細胞の大きさが増大しているか又は四倍体化しており、大気汚染物質の吸収能力が向上している植物及びその育成方法が記載されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−３１７７３９号公報
【非特許文献１】植物細胞工学別冊１「環境問題と植物バイオテクノロジー」７６〜８６頁（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、ＮＯＸのみならず、ＣＯ２の吸収能に優れたＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物及びその育成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討した結果、外来ＮＯ２−トランスポーター遺伝子を導入してＮＯ２−トランスポーターを発現させた形質転換植物が、ＮＯＸ吸収能に優れるだけでなく、全く意外にも、ＣＯ２吸収能にも優れていることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下に示す通りである。
〔１〕ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを植物細胞に導入することにより形質転換体を得て、次いで該形質転換体から植物体を再生させることを特徴とするＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
〔２〕上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、ベクターに上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡが連結されている組換えベクターにより、上記植物細胞に導入される上記〔１〕記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
〔３〕上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、ベクターに上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡが連結されている組換えベクターを導入したアグロバクテリウムを上記植物細胞に感染させることにより、上記植物細胞に導入される上記〔１〕記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
〔４〕上記ＮＯ２−トランスポーターを、植物体の細胞の形質膜上に発現させる上記〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法。
〔５〕上記〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法により得られることを特徴とするＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
〔６〕上記ＮＯ２−トランスポーターが、植物体の細胞の形質膜上に発現している上記〔５〕記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
〔７〕上記ＮＯ２−トランスポーターを発現させていない非形質転換植物体に比べて１．２倍以上のＣＯ２吸収能及び１．１倍以上のＮＯ２吸収能を有する上記〔５〕又は〔６〕記載のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の育成方法によれば、ＮＯＸ吸収能のみならず、ＣＯ２の吸収能にも優れた植物を容易に育成することができる。
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、ＮＯＸ吸収能に優れていることから、大気中の汚染物質であるＮＯＸを効率的に吸収除去することができ、しかも、植物体はチッ素肥料の一部として利用することができる。また、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、同時にＣＯ２吸収能にも優れていることから、温暖化の原因となるＣＯ２を吸収することができ、それに伴い、植物体の生育を促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）ＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法では、ＮＯ２−トランスポーターをコードする遺伝子を植物細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
上記ＮＯ２−トランスポーターは、通常、葉緑体の包膜に存在し、細胞質側から葉緑体内にＮＯ２−を濃度勾配に逆らって輸送する機能を有することで知られている。本発明において、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡの種類には特に限定はなく、必要に応じて種々のＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを用いることができる。通常は、硝酸同化能の高いキュウリ由来のＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡが使用される。また、上記ＮＯ２−トランスポーターは、宿主である植物細胞から再生される植物体に含まれているＮＯ２−トランスポーターと同種でもよいが、異種でもよい。例えば、宿主である植物細胞としてイネ又はシロイヌナズナの細胞を用い、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡとして、キュウリのＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを用いることができる。尚、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡの塩基配列等の情報は、European Molecular Biology Laboratory (EMBL)により管理されているジーンバンク等の各種データベース等を利用することにより得ることができる。例えば、キュウリのＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡは、上記ジーンバンクの受付番号Ｚ６９３７０２で登録されている。
【００１０】
上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、上記ＮＯ２−トランスポーターが発現している植物体から得られ、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードする全ＲＮＡから逆転写酵素により合成され、必要に応じてスクリーニング又はＰＣＲ法等による増幅を行うことにより得られるｃＤＮＡでもよい。上記植物体から上記全ＲＮＡを得る方法には特に限定はなく、従来公知の方法により行うことができる。また、上記方法により得られたｃＤＮＡから上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするｃＤＮＡを単離する方法も特に制限されず、例えば、従来公知のクローニング方法によって行ってもよいし、また、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡの情報に基づいて、適当なプライマーを作製し、ＰＣＲ等の方法によって調製することもできる。
【００１１】
また、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡは、市販品やＲＮＡから合成されたｃＤＮＡをそのまま用いてもよく、あるいは、必要に応じて遺伝子の組換えを行った組換えＤＮＡを用いることもできる。更には、上記ＮＯ２−トランスポーターの特性を損なわない範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加を行ってもよい。例えば、キュウリ由来のＮＯ２−トランスポーター遺伝子（ＣｓＮｉｔｒ１）は、水素イオン濃度勾配を利用して、細胞質で生成したＮＯ２−を葉緑体内に送り込む輸送タンパク質をコードすると共に、Ｎ末端に葉緑体移行シグナル配列を有する。そして、ＣｓＮｉｔｒ１が発現してＮＯ２−トランスポーターが合成されると、ＮＯ２−トランスポーターが機能する場所である葉緑体包膜に組み込まれ、その時にＮ末端のシグナル配列が除かれて機能構造になると考えられるが、キュウリの分化のある段階では、シグナル配列が除かれた細胞膜型のＮＯ２−トランスポーター（ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓ）が存在する。この細胞膜移行型組換えＤＮＡを用いてもよい。
【００１２】
また、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡについて、植物中で発現させるための各種プロモーターやターミネーターを連結させ、発現頻度や場所を調整することができる組換えＤＮＡを用いてもよい。このような組換えＤＮＡとしては、例えば、ＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡ、特にはキュウリ由来のＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡに、ＣａＭＶ３５Ｓ（カリフラワーモザイクウィルスの３５ｓＲＮＡ）等のカリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーター、ｒｂｃＳ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ  １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの小サブユニット）、又はｃａｂ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ／ｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等のプロモーターを連結させた組換えｃＤＮＡが挙げられる。かかる組換えｃＤＮＡを用いると、ＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡを恒常的に、また、後二者については組織特異的に発現させることができ、その結果、ＣＯ２及びＮＯＸ吸収を向上させることができるので好ましい。
【００１３】
上記植物細胞の種類については特に限定はなく、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡの導入方法等に応じて適宜選択することができる。上記植物細胞として、例えば、プロトプラストからの再生系が確立している植物の細胞を用いると、上記外来ＮＯ２−トランスポーター遺伝子の導入を容易に行うことができ、その結果、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物を容易に育成することができるので好ましい。また、後述のアグロバクテリウム法により上記外来ＮＯ２−トランスポーター遺伝子を導入する場合、上記植物細胞としては、アグロバクテリウムに感染性を示す植物の細胞であることが好ましく、例えば、各種の双子葉植物やアセトシリンゴンを共存させた時の単子葉植物等が挙げられる。上記植物細胞として具体的には、例えば、シロイヌナズナ、タバコ、イネ等の細胞が挙げられる。尚、上記植物細胞は、植物組織や植物細胞そのままでもよく、あるいはカルスやプロトプラスト等も含まれる。
【００１４】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法において、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを上記植物細胞に導入する方法には特に限定はなく、上記植物細胞の種類等に応じて適宜の方法を選択することができる。例えば、植物細胞に外来遺伝子を直接導入する方法として、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。
【００１５】
上記エレクトロポレーション法は、目的とするＤＮＡとプロトプラストとを混合し、電気刺激により細胞膜に穴をあけることにより、ＤＮＡを導入する方法である。本方法は再現性が高いことから、プロトプラストの培養が安定且つ容易であり、プロトプラストから植物体の再生が容易な植物細胞に好適に用いることができる。
上記パーティクルガン法は、目的とするＤＮＡを微細な金属粒子に付着させ、高速で細胞に打ち込むことにより、ＤＮＡを導入する方法である。本方法は、宿主細胞の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難か、又はプロトプラストからの再生系が確立されていない植物細胞に好適に用いることができる。
上記ポリエチレングリコール法は、目的とするＤＮＡとプロトプラストとを混合し、ポリエチレングリコールで処理することにより、ＤＮＡを導入する方法である。
【００１６】
また、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを上記植物細胞に導入する方法として、ベクターを用いて導入する方法も用いることができる。即ち、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで組換えベクターを得て、これを上記植物細胞内に導入することにより、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを上記植物細胞に導入することができる。
【００１７】
この場合、用いるベクターの種類には特に限定はなく、通常はプラスミドベクター、より好ましくはバイナリーベクターが用いられる。上記ベクターとして具体的には、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩ２２１等が挙げられる。この中で、ｐＢＩ１２１が特に好ましく用いられる。また、上記ベクターは、組換えベクターの選択を容易にするために、例えば、カナマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性等の抗生物質耐性の選択マーカーを有していることが好ましい。また、上記ベクターは、上記植物細胞内で上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡの発現を制御できるプロモーターやエンハンサー等の塩基配列を含んでいてもよい。例えば、上述のバイナリーベクターｐＢＩ１２１は、ベクター自体に上述のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが組込まれている。
【００１８】
上記組換えベクターは、上記ベクターのＤＮＡ及び上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを制限酵素、例えばＸｂａＩやＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、及びＳａｃＩ等を作用させて消化し、得られたＤＮＡ断片をＴ４リガーゼ等の公知の方法で連結することにより得ることができる。
【００１９】
上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを上記植物細胞に導入する方法として、ベクターを用いて導入する場合、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法又はポリエチレングリコール法等により、上記組換えベクターをそのまま宿主である上記植物細胞に導入してもよいが、通常は、アグロバクテリウムを用いるアグロバクテリウム法が用いられる。該アグロバクテリウム法は、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを含む組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、以下、「アグロバクテリウム・ツメファシエンス」という。）に導入し、得られた形質転換体を上記植物細胞に感染させることにより、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを上記植物細胞に導入する方法である。
【００２０】
上記アグロバクテリウム法において、アグロバクテリウム及び組換えベクターを構成するベクターの種類には特に限定はなく、必要に応じてＴ−ＤＮＡ領域を持つ種々のものを用いることができる。例えば、上記アグロバクテリウムとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４等を用いることができる。また、上記組換えベクターを構成するベクターとしては、例えば、上記のｐＢＩ１２１等のベクターを用いることができる。
【００２１】
上記アグロバクテリウム法において、上記ＮＯ２−トランスポーターをコードするＤＮＡを含む組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入する方法には特に限定はない。例えば、組換えプラスミドを有する大腸菌、接合能を有するプラスミド（ヘルパープラスミド）を持つ大腸菌とアグロバクテリウムとを混合培養し、大腸菌の接合能を利用して導入する方法が挙げられる。また、エレクトロポレーション法によって組換えベクターを直接アグロバクテリウムに導入することもできる。
上記組換えベクターを導入して得られた上記アグロバクテリウムの形質転換体は、例えば、カナマイシンやストレプトマイシン等の抗生物質を含む培地で培養し、抗生物質耐性により生育したコロニーを選抜することにより得ることができる。
【００２２】
上記アグロバクテリウム法において、得られた上記アグロバクテリウムの形質転換体を上記植物細胞に感染させる方法には特に限定はない。例えば、上記アグロバクテリウムの形質転換体の懸濁液に、宿主である上記植物細胞を浸漬する等の方法により、上記アグロバクテリウムの形質転換体の懸濁液と上記植物細胞とを接触させ、必要に応じてインキュベートすることにより感染させることができる。また、生育させた植物を上記アグロバクテリウムの形質転換体の懸濁液中で減圧後、常圧に戻すことにより感染させるバキュームインフィルトレーション法を用いてもよい。上記バキュームインフィルトレーション法は、従来の組織培養法に比べて操作が容易であり、少ない手間で一度に多数の植物を処理することができることから、特に多数の植物を処理する場合に好適に用いることができる。
上記アグロバクテリウム法では、感染後、クラフォラン等の抗生物質を含む培地に移してアグロバクテリウムを除去することができる。
【００２３】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法では、上記の方法により形質転換体を得る。通常は、導入処理後の上記植物細胞を、カナマイシン等の抗生物質を含む培地に移して培養することにより、抗生物質耐性を有する上記形質転換体を選抜する。
【００２４】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法では、上記の方法により得られた形質転換体から植物体を再生させることにより、ＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物を育成する。
上記形質転換体から植物体を再生させる方法には特に限定はない。例えば、上記形質転換体を適宜の条件で培養することにより、植物体を再生することができる。より具体的には、例えば、上記形質転換体を、公知の植物分化誘導剤（例えば、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、インドール酪酸、ナフタレン酢酸等のオーキシン類、及びゼアチン、カイネチン、ベンジルアデニン等のカイネチン類等の１種又は２種以上）と、該遺伝子が組み込まれたベクターの有する選抜マーカー遺伝子に対応する抗生物質を含む培地中で脱分化させたカルスから選抜し、その後、必要に応じて他の培地で培養することにより幼植物体を得て、該幼植物体を土壌やバーミュキュライト等に移植して成長させることにより植物体を再生させ、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物を得ることができる。
【００２５】
また、上記バキュームインフィルトレーション法により形質転換体を得た場合では、感染後、植物をそのまま育成して採種し、得られた種子を適当な抗生物質を含む培地に移して育成することにより、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物を選抜、育成することができる。この場合、必要に応じて抗生物質を含まない培地に移植して育成を続け、植物が抽台し始めたら、個体毎にロックウールや土壌に移植して、育成及び採種することができる。
【００２６】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法により、目的とするＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物を育成することができたことは、例えば、以下に記載の方法により確認することができる。即ち、該遺伝子の既知の塩基配列に基づいて設計して作製したオリゴヌクレオチド（例えば、ｎｉｔ−Ｓ〔配列番号１〕及びｎｉｔ−Ａｓ〔配列番号２〕）をプライマーとして、作製した植物から公知の方法により調製したＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、合成されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、期待された長さのＤＮＡの存在により該遺伝子の導入を確認することができる。
【００２７】
（２）ＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物の育成方法により得られる。本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物において、上記ＮＯ２−トランスポーターは、通常は細胞の形質膜上に発現しているが、発現している箇所には特に限定はない。
【００２８】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、外来のＮＯ２−トランスポーターを発現、特に細胞の形質膜に発現させることにより、ＮＯＸ吸収性に優れると共に、ＣＯ２吸収性にも優れる。例えば、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、外来のＮＯ２−トランスポーターを発現させていない非形質転換植物に比べて１．２倍以上、好ましくは１．４倍以上、更に好ましくは１．６倍以上のＣＯ２吸収能を有する。また、例えば、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、外来のＮＯ２−トランスポーターを発現させていない非形質転換植物に比べて１．１倍以上、好ましくは１．１５倍以上、より好ましくは１．２倍以上、特に好ましくは１．３倍以上のＮＯ２吸収能を有する。このＮＯ２吸収能及びＣＯ２吸収能は、実施例に記載の方法により測定することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明について、実施例を挙げて具体的に説明する。
（１）細胞膜移行型ＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡ（ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓ）の調製
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、品種名「地這い」）の種子を４日間、暗中で吸水発芽させ、次いで、該種子を光照射下に移し、６〜１２時間後に子葉部を採取した。該子葉部を液体窒素中で磨砕し、「ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ」（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を用いて、全ＲＮＡを得た。そして、オリゴ（ｄＴ）１６をプライマーとして、上記全ＲＮＡ２μｇ及び逆転写酵素(Ｔｏｙｏｂｏ製、以下「ＲＴ」と略称する。)を用いて、ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを合成した。そのＲＴ反応２μＬを鋳型にして、以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー（ｎｉｔ−Ｓ／Ｘａ〔配列番号３〕及びｎｉｔ−Ａｓ／Ｓｃ〔配列番号４〕）と共に、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Ｔｏｙｏｂｏ製)を用いたＰＣＲにより、ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを増幅した。上記ＰＣＲは、９４℃４分、（９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分）４０サイクル、７２℃７分の条件に設定して行った。
【００３０】
（２）ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓの制限酵素処理
上記ＰＣＲ反応液に、室温で３倍容のエタノールを加えて遠心し、ＰＣＲ増幅産物を沈殿させた。そして、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄し、その後減圧して残っているエタノールを除いた。得られた沈殿を制限酵素ＸｂａＩバッファー（Ｍ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶解し、これに制限酵素ＳａｃＩ（Ｔｏｙｏｂｏ製）４単位及びＸｂａＩ（Ｔｏｙｏｂｏ製）４単位を加え、３７℃で６時間処理した。この反応液に１／１０容の１０ｘゲルローディング溶液（Ｔｏｙｏｂｏ製）を加えた後、全容を１％アガロースゲル電気泳動した。そして、約１５００塩基対（ｂｐ）のバンドを含むアガロースゲル片を、紫外線イルミネーター上で切り取り、「Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｕｉａｇｅｎ製）を用いて、この製品のマニュアルに従って、ＤＮＡをゲルから回収し１０μＬの滅菌水に溶かした。このＤＮＡ溶液の１μＬを標準マーカーＤＮＡとアガロース電気泳動し、エティジウムブロマイドの染色度を比較してＤＮＡ濃度を決定した。
【００３１】
（３）ベクターの調製
形質転換用のベクターとして、ｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いた。該ｐＢＩ１２１について、上記ＰＣＲ産物の制限酵素処理と同じ反応条件で、ＳａｃＩ及びＸｂａＩで処理した。処理後、フェノール・クロロホルム（１：１）溶液を同容加え、１分間激しく撹拝した後、１０，０００ｘｇで５分間遠心して水層を回収した。得られた水層に３倍容のエタノールを加えてＤＮＡの沈殿を得て、該ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した。次いで該ＤＮＡをアルカリフォスファターゼバッファーに溶解し、１０単位のアルカリファスファターゼ（Ｔｏｙｏｂｏ製  ＣＩＡＰ）を加えて脱リン酸化した。そして、反応液に１／１０容の１０ｘゲルローディングバッファーを加え、０．８％アガロースゲルでＤＮＡを分離した。ゲルからβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を除かれたｐＢＩ１２１の回収と濃度の決定は、上記のＣｓＮｉｔｒ１−Ｓ精製と同じ手順である。
【００３２】
制限酵素処理されたｐＢＩ１２１とＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを等モル数になるように混合して１μＬの溶液を調製した。この溶液に「ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎキット」(Ｔａｋａｒａ製Ｖｅｒ．１)のＡ溶液４μＬ及びＢ溶液１μＬを加えて、１６℃で３時間反応させることにより、ｐＢＩ１２１：：ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓ（ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子ターミネーターの間にＣｓＮｉｔｒ１−Ｓがセンス方向に組み込まれた組換えベクター）を作製した。
【００３３】
（４）形質転換及び植物体の再生
上記組換えベクター溶液２μＬを取り、塩化カルシウム法を用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αコンピテントセルに上記組換えベクターを導入した。形質転換セルは５０μｇ／ｍＬのカナマイシンが含まれるＬＢ寒天プレート上で生育できるコロニーとして選抜し、アルカリリシス法で調製したプラスミドをＳａｃＩ及びＸｂａＩ処理し、ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓに相当するＤＮＡ断片が含まれることを確認し、１６％グリセロール溶液として−８５℃で保存した。
【００３４】
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αから必要に応じてアルカリリシス法で調製した上記組換えベクターを、予め準備し−８５℃で保存しているアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）のエレクトロコンピテントセル２５μＬと一緒にエレクトロポレーションチャンバーの電極間に置き、セルポレーター（ＧｉｂｃｏＢＲＬ製）を用いて２．７ｋＶのパルスを加えることによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に導入した。そして、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び２５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地で３０℃で３〜４日間培養し、生育するコロニーを選抜することにより、形質転換したアグロバクテリウムを選抜した。
【００３５】
上記形質転換したアグロバクテリウムを用いて、バキュームインフィルトレーション（減圧浸潤）法（文献；Bechtold, N. and Pelletier, G. (1998) In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis  thaliana plants by vacuum infiltration. Arabidopsis Protocols (Martinez-Zapater, J. M. and Salinas, J. eds.) pp. 259-266, Humana Press, New Jersey）に基づいて植物細胞の形質転換を行った。尚、形質転換する植物として、シロイヌナズナを用いた。上記バキュームインフィルトレーション法により得られた形質転換シロイヌナズナの種子を滅菌し、次いで該種子を冷ましておいたアガロース液に入れ、よく混合しながらプレート培地に上層した。アガロースが完全に固まった後、プレートのふたをしてサーディカルテープでシールした。そして一晩４℃においた後、２２℃に移して約１週間育成した。これにより、形質転換したシロイヌナズナの植物体を再生した。これを１個体ずつ土壌に移植して育成することにより、ＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物である本実施例の形質転換シロイヌナズナ（Ｓ１−３株及びＳ４−１株）を得た。
【００３６】
上記Ｓ１−３株及びＳ４−１株について、葉からＲＮＡを抽出し、上述の方法に準じてＲＴ反応を行い、その反応物を鋳型に、ｎｉｔ−Ｓ（配列番号１）とｎｉｔ−Ａｓ（配列番号２）をプライマーとしたＰＣＲによりＣｓＮｉｔｒ１−ＳＤＮＡの増幅を確認するＲＴ−ＰＣＲ法により、キュウリ由来の上記ＮＯ２−トランスポーターが発現していることを確認した。
【００３７】
（５）ＣＯ２及びＮＯＸ吸収能の測定
上記方法により得られたＳ１−３株及びＳ４−１株を用い、以下に記載の方法により、ＣＯ２及びＮＯＸ吸収能の測定を測定した。測定結果を以下の表１に示す。尚、比較例として、形質転換していない野生型のシロイヌナズナを用いた。
【００３８】
赤外線ガス分析計を用い、光照射された本実施例のシロイヌナズナが置かれた閉鎖チャンバーから排出される空気のＣＯ２濃度を測定し、チャンバーに導入する前の値から差し引き、５分間の濃度減少を積算してＣＯ２の吸収量を求めた。この測定を３回繰り返しその平均値によりＣＯ２吸収量を決定した。また、ＣＯ２吸収量測定で用いたチャンバーと同じチャンバーを用い、化学発光ＮＯＸ分析計（堀場製作所ＡＰＮＡ−３５０Ｅ型）を用いてＣＯ２吸収の測定と同様に、チャンバーに注入する前後のＮＯ、およびＮＯＸ濃度をそれぞれ５分間測定して、濃度の変化と流量からＮＯ放出量とＮＯＸ吸収量を積算した。比較例のシロイヌナズナと培地のみについても同じ測定を続いて行い、培地のみによる吸収を除いて本実施例と比較例の吸収、あるいは放出とした。
植物の葉面積は写真像をＮＩＨイメージソフトウェアを用いて計測し、これに基づいて、一定葉面積当たりのＣＯ２及びＮＯＸ吸収量、及びＮＯ放出量を算出した。
【００３９】
【表１】
2005295958.tif 000002
【００４０】
（６）実施例の結果
表１より、形質転換していない野生型と比べて、ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを導入したＳ１−３株及びＳ４−１株は、ＮＯ放出量が４０〜５０％程度低く、ＮＯ２吸収量が１５〜３５％程度高いことが分かる。また、形質転換していない野生型と比べて、ＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを導入したＳ１−３株及びＳ４−１株は、ＣＯ２吸収量が６０％以上高く、ＣＯ２吸収能に特に優れていることが分かる。
以上より、本願発明のＣｓＮｉｔｒ１−Ｓを導入したＳ１−３株及びＳ４−１株は、単にＮＯＸ吸収能に優れているだけでなく、同時にＣＯ２吸収能にも特に優れていることが分かる。
【００４１】
尚、本発明においては、前記具体的実施例に示すものに限られず、目的、用途に応じて種々変更した実施例とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、道路緑化、造園、植林等に利用することによって、植物による大気浄化を促進することができる。また、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、窒素を吸収することから、窒素肥料の一部として利用することができる。更に、本発明のＣＯ２及びＮＯＸ吸収植物は、温暖化の原因となるＣＯ２を吸収することができ、また、ＣＯ２を吸収することから、植物体の生育が早く、植物体の増量及び特にはデンプン等の吸収されたＣＯ２をから生成する成分の増量も期待できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１は、ＮＯ２−トランスポーターの発現を確認に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
配列番号２は、ＮＯ２−トランスポーターの発現を確認に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
配列番号３は、細胞膜移行型ＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡの増幅に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
配列番号４は、細胞膜移行型ＮＯ２−トランスポーターｃＤＮＡの増幅に使用するプライマーとして設計したオリゴヌクレオチドである。
【配列表】
2005295958000001.app