(57)【要約】 【課題】   アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)由来のphbCAB 遺伝子を持った形質転換された組換え大腸菌及び前記大腸菌を利用したポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoate)の大量生産方法を提供する。 【解決手段】 アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された組換え大腸菌 MG1655/pTZ18U-PHBまたはJIL938/pTZ18U-PHB、及びアルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された大腸菌を製造する工程、該組換え大腸菌を培地に接種して、細胞培養する工程(細胞生長期)、前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエート生成を誘導する工程(細胞静止期及び産物生成期)、及び前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエートの細胞外分泌を誘導する工程を含むポリヒドロキシアルカノエートの大量生産方法。 【選択図】  図１  
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を有する、形質転換された大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBまたはJIL938/pTZ18U-PHB。 
【請求項２】
１) アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を有する、形質転換された組換え大腸菌を製造する工程、 
２) LB培地に1ml当たり105個以下の細胞数の前記組換え大腸菌を前記培地に接種して、細胞培養する工程、 
３)前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエート生成を誘導する工程、及び 
４) 前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエートの細胞外分泌を誘導する工程、を含むPHAの製造方法。 
【請求項３】
phbCAB遺伝子中のphbC遺伝子の塩基配列が、配列番号1で記載される塩基配列であることを特徴とする、請求項2に記載の製造方法。 
【請求項４】
phbCAB遺伝子中のphbA遺伝子の塩基配列が、配列番号２で記載される塩基配列であることを特徴とする、請求項2に記載の製造方法。 
【請求項５】
phbCAB遺伝子中phbB遺伝子の塩基配列が、配列番号３で記載される塩基配列であることを特徴とする、請求項2に記載の製造方法。 
【請求項６】
phbCAB遺伝子の塩基配列が、配列番号1で示される塩基配列、配列番号２で示される塩基配列、及び配列番号３で示される塩基配列の順序で示される塩基配列であることを特徴とする、請求項３乃至請求項５のいずれかに記載の製造方法。 
【請求項７】
phbCAB遺伝子を含むpTZ18U-PHBプラスミドを用いることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項８】
組換え大腸菌が、MG1655/pTZ18U-PHBであることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項９】
組換え大腸菌が、ldh遺伝子が突然変異した菌株であることを特徴とする、請求項2に記載の製造方法。 
【請求項１０】
組換え大腸菌が、JIL938/pTZ18U-PHBであることを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。 
【請求項１１】
細胞生長期に接種する細胞数が、LB培地1ml当たり2×104個以下であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項１２】
ブドウ糖を前記細胞生長期のLB培地には添加せずに、細胞静止期及び産物生成期に添加することを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項１３】
細胞生長期のLB培地に、ブドウ糖を10％以下の濃度で添加することを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項１４】
ブドウ糖濃度が、7％以下であることを特徴とする、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
LB培地が、LB/7％以下のブドウ糖/アンピシリンを含む組成であることを特徴とする、請求項１３または請求項１４に記載の製造方法。 
【請求項１６】
ポリヒドロキシアルカノエートが、ポリヒドロキシ酪酸であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項１７】
LB培地が、1l当たり、10g以上のバクト-トリプトン、5g以上のバクト-酵母抽出物、10g以上のNaClを含むことを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。 
【請求項１８】
LB培地が、1l当たり、10〜20gのバクト-トリプトン、5〜10gのバクト-酵母抽出物、10〜20gのNaClを含み、21％以下のブドウ糖をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換された組換え大腸菌及び該大腸菌を利用したポリヒドロキシアルカノエート(polyhydroxyalkanoate)の大量生産方法に関するものである。より詳細には、アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された組換え大腸菌及び該大腸菌を利用したポリヒドロキシアルカノエートの製造方法、とくに大量生産方法に関するものである。 
【背景技術】
【０００２】
この数十年間、石油化学由来の難分解性プラスチック(non-biodegradable plastic)は、現代社会に無くてはならない必需品になり、このような便利な環境で人類が生きられるようにしてきたが、段々増加するプラスチック使用は、プラスチック廃棄物処理問題を惹起し、深刻な環境汚染を引き起こして、ついには、人類の生命を脅威するようになった。このような難分解性プラスチックの有害性を克服しようとする努力の一環として、親環境的生分解性プラスチック(biodegradable plastic)の開発競争が、全世界的に進行してきている。  
【０００３】
その中で、微生物由来の生分解性プラスチックは、伝統的な石油化学プラスチックに比べて非常に大きな利点を持っている。これらは、生分解性、生体適合的な特性を持ち、生物学的に再生産が可能であるため、既存の合成プラスチックを代替する最大有望株として有望視されてきた(非特許文献１、非特許文献２)。生分解性プラスチックの適用範囲は、包装材料、使い捨て織物、衛生品、消費材、農業用工具、精密化学、其他使い捨て用品等であり、段々にその適用範囲と消費量が増加している(非特許文献３)。 
【０００４】
微生物由来の生分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカノエート(polyhydrodorxyalkanoate：以下「PHA」と略称する)は、既存の合成プラスチックに似た物性を持っていて、二酸化炭素と水で完全分解できるために合成プラスチックを代替する有望株として大きな関心を集めてきた(非特許文献４、非特許文献５)。米国のメタボリックス(Metabolix)社からバイオポル(BIOPOL)の名前でPHAが販売されているが、今までPHAの商用化は、生産単価が高いために極度に制限されている(非特許文献５)。 
【０００５】
微生物醗酵によりPHAを生産する時、その生産単価は、化学合成のポリエチレンより少なくても5倍以上高価であるため、該高い生産単価により微生物由来のPHAの使用は、一部範疇に限定されている。そのような理由で、たとえ生分解性プラスチックの潜在的な利点が大きくても、既存の石油合成プラスチックより価格競争力が劣るため、生分解性プラスチックの広範囲な使用は、まだ程遠いのが実情である(非特許文献６、非特許文献７)。  
【０００６】
それで、PHAを商用化するために、さらに優秀な微生物宿主菌株の開発、進歩した醗酵工程の開発及び開発効果的な分離精製工程の開発を通じて生産単価を下落させる努力が幅広く進行してきている(非特許文献６)。 
【０００７】
ポリヒドロキシ酪酸(polyhydroxybutyrate：以下「PHB」と略称する)は、最も良く知られたPHAの一種で、多様な微生物により炭素源及びエネルギー源として蓄積される細胞貯蔵物質であり、その物性は、ポリプロピレンに似た3-ヒドロキシ酸(hydroxy acid)で構成されたポリエステルの一種である(非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献７)。PHBは、次のようなの3工程酵素的反応によりアセチル-CoA(acetyl-CoA)から合成される(非特許文献８、非特許文献１１)。β-ケトチオラーゼ(ketothiolase)によりアセチル-CoA二分子の重合が起き、その結果、アセトアセチル-CoA(acetoacetyl-CoA)を形成する。アセトアセチル-CoA還元剤は、アセトアセチル-CoAをβ-ヒドロキシブチリル-CoA(hydroxybutyryl-CoA)に還元させて、その後、PHB合成酵素(synthase)により鎖伸長が起きるようになる。PHBの生合成に関与する三つの遺伝子がアルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)菌株からクローニングされた(非特許文献８、非特許文献１２、非特許文献１１)。 
【０００８】
多様な宿主菌株が、PHAを生産する候補菌株として研究され、それらの中で、ユートロファス(A. eutrophus)、ラツス(A. latus)、メチロトロフ(methylotroph)、アゾトバクタービネランデイ(Azotobacter vinelandii)及び組換え大腸菌(Escherichia coli)等が、優れたPHB生産源とされてきた(非特許文献５、非特許文献１３、非特許文献７)。特に、ユートロファス(A. eutrophus)由来のPHA合成遺伝子を持った組換え宿主菌株でのPHB生産に対する研究がいくつかのグループで進められてきた(非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６)。 
【０００９】
併せて、PHBの生産性を増加させるために多様な醗酵工程の開発がいくつかの研究グループで進められてきた。PHBが安定なプラスミドを持った組換え大腸菌を利用した流加培養(fed-batch)により高濃度で生産されることが報告され、細胞乾燥重量(dry cell weight; 以下「DCW」と略称)の80％以上のPHB含量(PHB content, P/X)が示された(非特許文献７、非特許文献１７)。 
【００１０】
また、数多くのPHA分離/精製方法が提示された。クロロホルム、メチルクロライド、クロロエタンのような有機溶媒を利用して純度の高いPHAを抽出できるが、前記方法は、莫大な量の毒性有機溶媒の使用を必要とするため、付加的な環境問題を惹起させる(非特許文献１８、非特許文献１９)。このような分離/精製費用は、PHA含量を増加させることによって下げられるが、高い回収費用を惹起させる低いPHA含量は、主にPHAを分離させるために莫大な量の有機溶媒の使用とそれによる廃棄物処理費用の増加を惹起させる(非特許文献２０)。 
【００１１】
上述した因子の他にも炭素源は、PHAの総生産単価に大きく影響を及ぼすため、安価な炭素源の供給は、生産単価を下げる重要な因子として作用する(非特許文献２１、非特許文献２２)。安価な炭素源を利用するのと同様に、炭素転換率(carbon conversion rate, 供給された炭素源質量当たり生成されるPHB質量、YPHB)もまた、総生産単価に大きな影響を及ぼす。理想的な方法は、供給される炭素源が100％PHBに転換されることであり、炭素源がブドウ糖の場合、ブドウ糖転換率が理論値の0.38に到達する。 
【００１２】
特に、PHBは、微生物等で細胞貯蔵物質として蓄積され、既存の石油化学プラスチックを代替する生分解性プラスチックとして脚光を浴びている。しかし、その高い生産単価は、PHBの産業への適用を極度に制限しており、既存の石油化学プラスチックに比べて競争力が弱いのが実情である。このような理由で、全世界的にPHBの生産単価を下げるために多くの努力が注がれてきてはいるが、いまだにPHBの商用化には、程遠いのが実情である。 
【００１３】
産業的規模のPHBを生産するためのこのような努力にもかかわらず、PHBの生産単価はまだ、既存の合成プラスチックに比べて4〜5倍高価であるため、PHBの産業的生産には、程遠いのが実情である。 
【００１４】
これらのことに鑑みて、本発明者等は、低い細胞接種濃度(initial low inoculum)で細胞の乳酸(lactate)の生成を抑制させることによって効果的なPHB生成を誘導できることを見出して、PHBの高生産のために不足する培地成分を二倍量供給し、高濃度のブドウ糖を添加することによりPHBの産業的生産を増加させると同時に細胞内PHB含量を最大化させ、併せて培地内へPHBの自発的分泌を誘導することにより分離/精製費用を大きく下げ、PHBの生産単価を下げることに成功し、その方法を通じたPHBの産業的規模の大量生産方法を開発することにより本発明を完成した。 
【非特許文献１】Steinbuchel, A. ＆ Fuchtenbusch, B., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999年、第51巻、P.13-21
【非特許文献２】Poirier, Y., Curr. Opin. Biotechnol., 1999年、第10巻、P.181-185
【非特許文献３】Gross, R,A, and Kalra, B., Science, 2002年、第297巻、P.803-807
【非特許文献４】Holmes, P.A., Phyl. Technol., 1985年、第16巻、P.32-36
【非特許文献５】Lee, SY. Biotechnol. Bioeng., 1996年、第49巻、P.1-14
【非特許文献６】Choi, J. ＆ Lee, SY. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999年、第51巻、P.13-21
【非特許文献７】Lee, SY.,  Nature Biotechnol., 1997年、第15巻、P.17-18
【非特許文献８】Schubert, P. 等, J. Bacteriol., 1998年、第170巻、P.5837-5847
【非特許文献９】Hai, T. 等, Microbiology, 2001年、第147巻、P.3047-3060
【非特許文献１０】Anderson, A.J. ＆ Dawes, E.A., Microbiol. Rev., 1990年、第54巻、P.450-472
【非特許文献１１】Slater, S.C. 等, J. Bacteriol., 1988年、第170巻、P.4431-4436
【非特許文献１２】Peoples, O.P. ＆ Sinskey, A.J., J. Biol. Chem., 1989年、第264巻、P.15298-15303
【非特許文献１３】Lee, SY., Trends Biotechnol., 1996年、第14巻、P.431-438
【非特許文献１４】Fidler, S. ＆ Dennis, D., FEMS Microbiol. Rev., 1992年、第9巻、P.231-235
【非特許文献１５】Lee, SY. 等, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1994年、第721巻、P.43-53
【非特許文献１６】Lee, SY. 等, Biotechnol. Bioeng., 1994年、第44巻、P.1337-1347
【非特許文献１７】Wang, F. ＆ Lee, SY., Appl. Environ. Microbiol., 1997年、第63巻、P.4765-4769
【非特許文献１８】Ramsay, J.A. 等, Biotech. Tech., 1994年、第8巻、P.589-594
【非特許文献１９】Choi, J. ＆ Lee, SY., Bioprocess Eng., 1997年、第17巻、P.335-342
【非特許文献２０】Lee, SY. ＆ Choi J., Polymer Degrad. Stabil., 1998年、第59巻、P.387-393
【非特許文献２１】Yamane, T. 等, Biotechnol. Bioeng., 1996年、第50巻、P.197-202
【非特許文献２２】Yamane, T., Biotechnol. Bioeng., 1993年、第41巻、P.165-170
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、生分解性プラスチックであるPHBの生産を阻害する因子を解明して、産業的生産を阻害するマイナス因子を効果的に除去することにより、簡単な回分培養方法によりPHBを大量生産してその生産単価を下げる方法を提供し、既存の合成プラスチックと競争可能な産業的規模のPHBの大量生産方法を提供することである。 
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、アルカリゲネス・ユートロファス(Alcaligenes eutrophus)由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された大腸菌 MG1655/pTZ18U-PHBまたはJIL938/pTZ18U-PHBを提供する。 
【００１７】
また、本発明は、アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された組換え大腸菌を製造する工程、LB培地1ml当たり105個以下の細胞数の前記組換え大腸菌を培地に接種して、細胞培養する工程(細胞生長期)、前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエート生成を誘導する工程(細胞静止期及び産物生成期)、及び前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエートの細胞外分泌を誘導する工程（産物分泌及び精製期）を含むポリヒドロキシアルカノエートの大量生産方法を提供する。 
【００１８】
本発明では、低い細胞接種濃度を使用することにより細胞内にPHBを安定的に大量生産する方法を提供する。併せて、培地にブドウ糖を高濃度で添加してもPHBの大量生産を可能にすることにより、醗酵培養時の炭素源の供給を調節する既存の努力を最小化する方法を提供する。また、PHBの大量生産を誘導するために不足な培地成分を二倍供給することによりPHBの大量生産を可能にする方法を提供する。 
【００１９】
最終的に、本発明は、生長非依存性(non-growth dependent)PHBの生成を誘導することにより単位細胞当たりPHB含量を極大化させることにより分離精製に要する労力を最小化する方法を提供する。 
【００２０】
以下、本発明をより詳細に説明する。 
本発明は、アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBまたはJIL938/pTZ18U-PHBを提供する。
MG1655菌株は、大腸菌K-12菌株の一種で野生型菌株である。JIL938菌株は、前記のMG1655菌株のldh遺伝子を突然変異させて製造された菌株である。前記JIL938 菌株は、まずSE1752(ldh:Tn10)菌株にバクテリオファージ(bacteriophage)P1virを感染させP1(ldh:Tn10)を取得し、母菌株MG1655に前記P1(ldh:Tn10)を再感染させて、LB/テトラサイクリン(tetracycline)固体培地に塗抹し、生長した菌株を選択することにより製造する。
【００２１】
また、本発明は、アルカリゲネス・ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を持った形質転換された組換え大腸菌を製造する工程、LB培地1ml当たり105個以下の細胞数の前記組換え大腸菌を培地に接種して、細胞培養する工程(細胞生長期)、前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエート生成を誘導する工程(細胞静止期及び産物生成期)、及び前記組換え大腸菌からポリヒドロキシアルカノエートの細胞外分泌を誘導する工程を含むポリヒドロキシアルカノエートの大量生産方法を提供する。 
【００２２】
この時、LB培地の組成は、バクト-トリプトン(Bacto tryptone)、バクト-酵母抽出物(Bacto-yeast extract)、NaClを含むことが好ましい。 
【００２３】
A. ユートロファス(A. eutrophus)由来のphbCAB遺伝子は、その順次的な3工程の酵素的反応によりPHBを合成する。前記遺伝子を含有したpTZ18U-PHBプラスミドで大腸菌野生型菌株MG1655を形質転換させて組換え宿主菌株を製造する。前記組換え大腸菌菌株を複合培地のLB/ブドウ糖/ampで培養時、細胞接種濃度が105細胞/ml以下の場合PHBを蓄積する。好ましくは、細胞接種濃度が2×104細胞/ml以下の場合にPHBを効率的に蓄積する。 
【００２４】
本発明では、前記のLB/ブドウ糖/amp培地で高濃度の細胞(ml当たり105細胞)を接種すると、約4時間後にPHBを蓄積するが、培養が進行してもそれ以上のPHBは蓄積されない。しかし、低濃度の細胞(ml当たり104細胞)を接種すると、約6時間後にPHBを蓄積し、細胞内に蓄積された顆粒の大きさが培養時間にしたがって安定に増加する。 
【００２５】
本発明において、phbCAB遺伝子は、phbC遺伝子、phb遺伝子およびphbB遺伝子によって構成される。そして、前記phbCAB遺伝子においては、phbC遺伝子が配列番号1として記載される塩基配列を有するものが好ましく、phbA遺伝子が配列番号2として記載される塩基配列を有するものが好ましく、phbB遺伝子が配列番号3として記載される塩基配列であることが好ましく、phbCAB遺伝子全体は、配列番号1、配列番号2及び 配列番号3の順序で記載される塩基配列を有するものであることがより好ましい。
【００２６】
また、前記phbCAB遺伝子を含むpTZ18U-PHBプラスミドを使用することが好ましい。また、本発明の前記組換え大腸菌は、MG1655/pTZ18U-PHBまたは、ldh遺伝子が突然変異した菌株であることが好ましく、JIL938/pTZ18U-PHBであることがより好ましい。
【００２７】
また、本発明の前記細胞生長期に接種する細胞数は、LB培地1ml当たり2×104個以下であることが好ましい。 
【００２８】
また、ブドウ糖を前記細胞生長期のLB培地には添加しないで、細胞静止期及び産物生成期に添加したり、前記細胞生長期のLB培地にブドウ糖を10％以下の濃度で添加することが好ましく、この時、ブドウ糖濃度は、7％以下であることがより好ましく、前記LB培地の組成は、LB/7％以下のブドウ糖/エンピシリンを含むことが最も好ましい。 
【００２９】
また、前記PHAは、ポリヒドロキシ酪酸(polyhydroxybutyrate, PHB)であることが好ましい。 
【００３０】
また、前記LB培地は、1l当、10g以上のバクト-トリプトン、5g以上のバクト-酵母抽出物、10g以上のNaClを含むことが好ましく、1l当、10〜20gのバクト-トリプトン、5〜10gのバクト-酵母抽出物、10〜20gのNaClを含み、21％以下のブドウ糖を追加的に含有することがより好ましい。 
【００３１】
本発明の好ましい態様においては、A. ユートロファス由来のphbCAB遺伝子を含有したpTZ18U-PHBプラスミドを大腸菌に導入することにより新しい組換え大腸菌宿主菌株を製造し、該組換え大腸菌をLB培地で培養して種菌に利用する。前記種菌を各々低濃度及び高濃度で接種して培養した結果、コロニー形態が異なるだけではなく、「低濃度」細胞周囲にだけ多量のPHBが生成される(図1のa、b及びc参照)。   
【００３２】
本発明の他の好ましい態様においては、組換え大腸菌を低濃度で接種して上記の培地で培養時、6時間後にはそれ以上細胞の分裂が起こらず、培養液の吸光度だけが増加する。また、細胞接種濃度によるPHB生成の差を確認した結果、細胞接種濃度が低いほど吸光度と最終PHB生産量が増加する。即ち、低い細胞接種濃度では安定的に細胞内にPHBが蓄積し、培養時間にしたがって顆粒の大きさが増加する(図2及び図3参照)。   
【００３３】
また、本発明の他の好ましい態様においては、PHBの合成において、低い細胞接種濃度が重要であることを調べるために、多様な条件下におけるPHBの合成の有無を調査する。前記の目的を達成するために、細胞の分裂がそれ以上進行しない8時間培養液と8時間培養した細胞を収去して実験する。その結果、低濃度で接種して8時間培養した細胞は、培地条件に関係なくPHBを高濃度で蓄積する。それに対して、高濃度で接種して培養した細胞は、実験したすべての条件でPHBを安定的に蓄積できない。併せて、細胞生長を吸光度で測定した場合にも細胞培養期初期には高い細胞接種濃度の細胞生長が高いが、一定時点以後にはPHBの蓄積により、低い細胞接種濃度の吸光度が高くなる(図４、図５及び図６参照)。このことから、PHBの蓄積は細胞自体に起因することを確認し、「能力ある(capable)」細胞の確保がPHBの蓄積に重要な因子として作用し、前記能力ある細胞は、低い細胞接種濃度を適用して培養した場合に効率的に得られ、一旦PHBを合成できる能力を持った細胞は、培地状態に関係なくPHBを効率的に生産できる。 
【００３４】
さらに、本発明の他の好ましい態様においては、低い細胞濃度で接種した時、PHB蓄積が高濃度で起きる理由を調べるために、PHB合成経路と競合関係にある乳酸生成経路を通じた乳酸の生成を調査する。即ち、PHBの生産のための前駆物質として作用するピルベート(pyruvate)は、PHB生産経路と乳酸生成経路の分岐させる物質として作用する。低い細胞接種濃度の場合、高い接種濃度に比べて約1/2の乳酸生成率を示す(表1参照)。また、乳酸の生成によるPHBの合成抑制効果を調べるために、乳酸生成に関与するldh遺伝子を除去した新しい菌株を製作した後、pTZ18U-PHBプラスミドを導入して新しい組換え菌株を完成する。この時、ldh組換え菌株は、初期細胞接種濃度に関係なくPHBを高濃度で蓄積する。即ち、乳酸生成経路の存在がPHB生成にマイナス効果を及ぼす(図7参照)。 
【００３５】
さらにまた、本発明の他の好ましい態様においては、培養が完了した時点で細胞数の増加なしに顆粒の大きさが増加することにより吸光度が増加する現象を説明するために、生長非依存性PHB合成有無を調査する(図５参照)。 
【００３６】
PHBの生産が生長依存的なのか(growth-dependent)、生長非依存的なのかを試験するために、正常的なphbCAB遺伝子を含有しない新規なプラスミドpPHB-nを製造して、正常phbCAB遺伝子を持った形質転換大腸菌とphbCAB遺伝子が欠乏した形質転換大腸菌を製造して培養する(図８参照)。また、正常phbCAB遺伝子を持った形質転換大腸菌を培養中に一定時点にブドウ糖を供給することによりPHBは、細胞接種濃度に無関係に細胞生長後期に生長非依存的に蓄積されることを確認する(図９及び図１０参照)。併せて、培養初期にPHBを合成できる能力ある細胞の製造が重要である(図１１参照)。 
【００３７】
またさらに、本発明の他の好ましい態様においては、最適ブドウ糖濃度を決定するために多様な濃度のブドウ糖を添加した培地で前記組換え大腸菌のブドウ糖利用効率及び、それによるPHB生成量を比較する(図１２及び図１３参照)。また、適切なブドウ糖濃度でPHBの生産単価に及ぼす様々な因子を調べる(図１４、図１５、図１６及び図１７参照)。また、自発的分泌(autolysis)の程度を調査して、培養時間別PHBの蓄積様相を光学顕微鏡で観察する(図１８参照)。その結果、細胞内PHB顆粒は、培養時間に比例して増大し、結局は自発的に細胞外へ分泌されることを観察する。 
【００３８】
また、本発明の他の好ましい態様においては、実験室規模でPHBの産業的規模の大量生産を完成するために、ブドウ糖の追加添加及び培地の不足分を補充するための高濃度の複合培地を使用する。1×LBを使用した場合と比べて2×LBを使用した場合、吸光度とブドウ糖消費程度が大きく増加して、顆粒の大きさが増加し、その細胞内PHB含量が増加する(図１９、図２０、図２１及び図２２参照)。また、光学顕微鏡観察によれば、2×LBで培養された細胞が培地及びブドウ糖の添加により、1×LBで培養された細胞より大きく、細胞内のPHB濃度が非常に高い(図２３、図２４及び図２５参照)。あわせて、これを走査電子顕微鏡及び透過電子顕微鏡でも確認する(図２６、図２７及び図２８参照)。そして、本発明の他の好ましい態様においては、前記の方法で蓄積されたPHBが効率的に分離、精製されるかどうかを調べる為に細胞培養液を蒸溜水で単純処理することによりその分離精製の容易性を試験する。 
【発明の効果】
【００３９】
本発明による生産方法は、PHBの生産単価に及ぼす様々な要因を効果的に解決することにより、PHBの産業的利用可能性を高める。因って、本発明は、産業的にPHBの大量生産を可能にすることはもちろん、培養工程の単純化をはかることができ、簡単な分離精製過程により、PHBの商用化を大きく前進させることができる。あわせて、他の物性を持った共重合体(copolymer)にも同様な方法で適用可能であるために、PHBだけではなく多様な種類の生分解性プラスチック及びその共重合体の開発とその商用化にも有効に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。 
［実施例１］ 
【００４１】
PHB遺伝子を含有した形質転換大腸菌及び種菌製造 
<1-1> 形質転換大腸菌の製造 
phbCAB遺伝子を含むプラスミドpTZ18U-PHBは、ドイツのミュンスター大学のシュタインビュチェル(Alexander Steinbuchel)から提供受け、西江大学校イ・ジョングク教授が保有していたものを分譲してもらい使用した。この際、phbCAB遺伝子はphbC遺伝子、phbA遺伝子及びphbB遺伝子からなり、各遺伝子の配列は、各々配列番号1, 配列番号2及び配列番号3で記載される塩基配列からなる。 
大腸菌K-12誘導菌株の野生型MG1655(CGSC, Coli Genetic Stock Center, Yale University)を形質転換のための宿主菌株に使用した。公知のCaCl2方法(Sambrook, J. ＆ Russell, D.W., Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 2001年)により、前記菌株を先に製造したpTZ18U-PHB プラスミドで形質転換(transformation)した。前記形質転換体をLB/amp培地に塗抹して、前記培地で生長する菌株を最終形質転換体として選別した。
【００４２】
<1-2> 形質転換大腸菌の培養による種菌製造 
前記実施例<1-1>方法により製造した組換え大腸菌から形成されたコロニーをLB培地(1l当、10gのバクトトリプトン(Bacto tryptone)、5gのバクト-酵母抽出物(Bacto-yeast extract)、10gのNaCl)で12時間培養した。この時、抗生剤のテトラサイクリン(tetracycline)とアンピシリン(ampicilin; 以下「amp」と略称する)を各々最終濃度が20μg/ml及び100μg/mlになるように前記培地に追加的に添加して培養した。前記培地で生成されたコロニーを一つ取って、LB/amp培地に接種して600nmで吸光度が0.2になるまで培養した。その後、細胞を集めて最終細胞数が、5×108 cfu/mlになるようにLB/20％グリセロール培地に懸濁した。前記懸濁液を0.1mlずつマイクロ遠心分離チューブ(microcentrifuge tube)に分注した後、使用する前まで-80℃に保管して種菌(stock seed)に使用した。 
【００４３】
前記マイクロ遠心分離チューブの一つを開封して室温で溶解させた後、20μlを取ってLB/amp培地に接種して、37℃、200rpmで振盪培養で種菌を培養した。前記で製造した種菌を10mlのLB/ブドウ糖/ampを含有した250ml三角フラスコに一定の細胞になるように接種した。その後、37℃、200rpmで前記種菌をさらに振盪培養した。 
［実施例２］ 
【００４４】
細胞接種濃度がPHB生産に及ぼす効果 
<2-1>細胞接種濃度によるコロニー形態 
前記実施例<1-1>の方法で製造したpTZ18U-PHBプラスミドを含有した組換え大腸菌MG1655宿主菌株を、LB/7％ブドウ糖/amp寒天培地にストリーキング(streaking)すると接種濃度が高く細胞が互いに密着して、大腸菌の典型的な明るいベージュ色をおびた「高濃度(high)」部位のコロニーと接種濃度が低く細胞が互いに離れていて、白く不透明な色をした「低濃度(low)」部位のコロニーの、二種類のコロニーが観察された(図１のa)。この時、「高濃度」細胞部位では、PHB(polyhydroxybutrate)が観察されない反面、「低濃度」細胞部位では多量のPHBが観察された(図１のb及び図１のc)。 
【００４５】
<2-2>細胞接種濃度によるPHB生成 
前記実施例<2-1>で観察された現象が細胞接種濃度の差によるものであるかどうかを確認するために、104〜105細胞/mlの範囲で細胞接種濃度を変化させてPHBの蓄積の様相を確認した(図２)。この時、細胞内PHB量は、ガスクロマトグラフィ(gas chromatography, Varian 3300, 米国)を利用して測定した。 
【００４６】
詳細には、まず、実施例<1-2>で製造した-80℃に保管中のマイクロ遠心分離チューブ中の種菌(stock seed)の一つを室温で溶解させた後、20μlを取って10mlのLB/amp培地を含有した125ml三角フラスコに接種した。前記細胞を37℃、200rpmで培養した後、10mlのLB/7％ブドウ糖/amp培地を含有した250ml三角フラスコに多様な細胞濃度で接種した。その結果、細胞接種濃度が低いほど、細胞生長を示す600nmでの吸光度及び最終PHB生産量が増加した。特に、ml当たり104個の細胞を接種した場合に、最も高いPHB生産量を示した。前記結果を通して、細胞接種濃度がPHB生産に重要な決定因子として作用することを確認した。 
［実施例３］
【００４７】
細胞数変化及び能力ある(capable)細胞の確保 
低い細胞接種濃度がPHB生産に有効であるということを立証するために、初期細胞生長期間にわたり、光学顕微鏡で細胞形態の変化及びPHB蓄積の様相を観察した(図３)。その結果、低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)の場合、培養8時間後に細胞内にPHBが蓄積されたことを確認した。対照的に、高い細胞接種濃度(ml当たり105細胞)の場合、培養初期(培養4時間後)にPHBの蓄積は見られたが、PHBを蓄積する細胞とそうでない細胞が混在していた。 
【００４８】
前記観察は、細胞生長を吸光度で測定した場合にも同様であった(図４)。初期培養期(培養0〜6時間)には、高い細胞接種濃度の場合、細胞生長がより高かったが(600nmでの吸光度が高い)、8時間培養以後には、かえって低い細胞接種濃度の場合の吸光度の方が、高い細胞接種濃度の場合より高かった。前記現象は、低い細胞接種濃度で起きる効率的なPHBの蓄積のためであると推測した。 
【００４９】
このことを確認するために、生菌数(viable cells, cfu/ml)を測定した。詳細には、多様な培養時間で試料を取って、PBS(phosphate buffered saline, リン酸緩衝食塩水)で前記試料を稀釈した後、LB/5％ブドウ糖/amp固形培地に前記試料を塗抹して37℃で24時間培養した。前記培養で生長した細胞数を数えて生菌数を決定した。その結果、低い細胞接種濃度の場合、培養6時間に最大細胞数に到達し、その後には、それ以上細胞数が増加しなかった(図５)。それにもかかわらず、吸光度は継続して増加して、48時間後に約80に到達した。これは、細胞内PHBの蓄積のために起きた結果である。 
【００５０】
先に言及したように、低い細胞接種濃度の場合、培養8時間以後には、細胞数がそれ以上増加しなかったが、吸光度とPHB濃度は増加した。このような機序を説明するために、下記の追加的実験を行った(図６)。 
【００５１】
１番目は、低濃度(ml当たり104細胞)で細胞を接種して8時間培養した後、前記細胞を集めて、前記細胞を低濃度(ml当たり104細胞)の細胞を接種して8時間培養した培地に再接種(「低濃度細胞/低濃度培地(low cell/low medium)」以下Aと称する)した。 
【００５２】
２番目は、低濃度(ml当たり104細胞)で細胞を接種して8時間培養した後、前記細胞を集めて、前記細胞を高濃度(ml当たり105細胞)の細胞を接種して8時間培養した培地に再接種(「低濃度細胞/高濃度培地(low cell/high medium)」以下、Bと称する)した。 
【００５３】
３番目は、高濃度(ml当たり10５細胞)で細胞を接種して8時間培養した後、前記細胞を集めて、前記細胞を低濃度(ml当たり104細胞)の細胞を接種して8時間培養した培地に再接種(「高濃度細胞/低濃度培地(high cell/low medium)」以下、Cと称する)した。 
【００５４】
４番目は、高濃度(ml当たり105細胞)で細胞を接種して8時間培養した後、前記細胞の1/10を集めて、前記細胞を低濃度(ml当たり104細胞)の細胞を接種して8時間培養した培地に再接種(「1/10高濃度細胞/低濃度培地(1/10 high cell/low medium)」以下、Dと称?する)した。 
【００５５】
５番目は、高濃度(ml当たり105細胞)で細胞を接種して8時間培養した後、前記細胞の1/100を集めて、前記細胞を低濃度(ml当たり104細胞)の細胞を接種して8時間培養した培地に再接種(「1/100高濃度細胞/低濃度培地(1/100 high cell/low medium)」以下、Eと称する)した。 
【００５６】
前記AとBの実験は、PHBを蓄積できる能力が細胞の自体に起因するものであるのか、培地によるものであるかを確認するためのもので、C、D、Eの場合は、高濃度の細胞を接種して8時間培養した場合が、低濃度の細胞を接種して培養した場合より細胞数が多いのでこれを適切に稀釈して再接種するためである。その結果、AとB実験の場合は、吸光度と最終PHB生産量が各々80と30g/ｌの水準に到達したが、C、D、Eの場合、吸光度が顕著に低いだけではなく、PHBもほとんど蓄積されなかった（図６）。 
【００５７】
前記結果を通じて、PHBの蓄積は細胞の能力自体に依存することを確認した。したがって、「能力ある(capable)」細胞の確保がPHBの蓄積に重要な因子として作用し、前記能力ある細胞は、低い細胞接種濃度を適用して培養した場合により得られる。一旦、PHBを合成できる能力を持った細胞は、培地状態に関係なしにPHBを効率的に生産できることを確認した。 
［実施例４］  
【００５８】
ldh突然変異菌株の製造 
<4-1> 乳酸生成とPHB生産の関連性調査 
PHBの生産のための前駆物質として作用するピルベート(pyruvate)は、PHB 生産経路と乳酸生成経路の分岐点において作用する。したがって、組換え大腸菌をLB/ブドウ糖/amp培地で培養する時、炭素源の流れが、PHBと乳酸醗酵経路間で互いに競合するものと判断した。 
【００５９】
したがって、高い細胞接種濃度を適用した場合には、低い細胞接種濃度の場合に比べて多量の乳酸が生成され、それにしたがって、培地pHも初期に下がるものと考えられる。前記推測の正確性を確認するために、細胞接種濃度が異なる二種の培養液での乳酸濃度と培地内pHを測定した。詳細には、各々低濃度(ml当たり104)及び高濃度(ml当たり105)の細胞をLB/7％ブドウ糖/amp培地に接種して、8時間培養した後、前記培地の乳酸濃度とpHを測定した(表1)。 
【００６０】
この時、培養液内の乳酸濃度は細胞培養液一定量を取った後、遠心分離して上澄み液を集め、0.2μmろ紙でこして、該ろ過液を高性能液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography, HPLC)を利用して分析した。また、移動相には、0.1％の過塩素酸(perchloric acid)を使用した。使用したカラムは、シム-パック102H(Shim-Pack 102H、島津、日本)で、RI検出器(Waters社、米国)を使用して分析した。 
【００６１】
【表１】
2005295993.tif 000003
【００６２】
その結果、高い細胞接種濃度(ml当たり105)の場合、低い細胞接種濃度(ml当たり104)の場合より、乳酸の濃度は約2倍以上高く、pHの減少は、1程度で水素イオン濃度が10倍程度増加したことを確認した。したがって、本発明者らの前記推測が妥当であることを確認した。 
【００６３】
<4-2> 乳酸生成が遮断されたldh突然変異菌株の製造 
高濃度の細胞(ml当たり105)を接種する場合にも乳酸生成経路を遮断してpHの下落を緩和させれば、PHBの生産に乳酸が及ぼすマイナス効果を除去できると判断した。 
【００６４】
そこで、本発明者らは、乳酸生成に関与するldh遺伝子に突然変異を誘発させた新しい突然変異菌株をP1-形質導入((transduction)方法) (Miller, J.H., Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1972年)により製造した。即ち、大腸菌K-12誘導菌株である野生型大腸菌SE1752(Bunch, P.K. Microbiology , 1997年、第143巻、P.187-195)から乳酸脱水素化酵素(lactate dehydrogenase)を欠損したJIL938(MG1655, ldh:Tn10)菌株(以下、「JIL938」または「JIL938/pTZ18U-PHB」と称する)を製造した。 
【００６５】
詳細には、ldh突然変異を含有したP1ファージを野生型SE1752菌株に導入した後、抗生剤テトラサイクリン(tetracycline)を含有したLB培地に前記菌株を塗抹し、前記培地で成長したコロニーの表現型を確認することにより、ldh突然変異菌株JIL938を製造した。また、前記製造された突然変異菌株JIL938にpTZ18U-PHBプラスミドを導入した後、LB/amp寒天培地に塗抹して前記培地で生長した菌株を選択することにより新しい組換え宿主菌株JIL938/pTZ18U-PHBを製造した。 
【００６６】
前記突然変異組換え菌株を実施例1で製造した組換え大腸菌MG1655/pTZ18U-PHB種菌の保管と同様にLB/20％グリセロールに懸濁させた後、-80℃で保管して後の実験に使用した。
【００６７】
pTZ18U-PHBプラスミドを含有したldh突然変異組換え宿主菌株(JIL938/pTZ18U-PHB)は、LB/7％ブドウ糖/amp培地で細胞接種濃度に関係なくPHBを効率的に蓄積した。これは、乳酸生成経路の存在がPHB生成にマイナス効果を及ぼすことを意味する(図７)。 
［実施例５］ 
【００６８】
生長非依存性PHB生成有無の確認 
6〜8時間培養以後には、組換え大腸菌の吸光度は増加しても、生菌数はそれ以上増加しない。これは、組換え大腸菌宿主が生長非依存的(non-growth dependent)にPHBを蓄積できるという可能性を示している(図５)。 
【００６９】
PHBの生産が生長依存的(growth-dependent)であるか生長非依存的であるか試験するために、正常的なphbCAB遺伝子を含有していない新規なプラスミド pPHB-nを製造した。
【００７０】
pPHB-nプラスミドは、まず、pTZ18U-PHBプラスミドをPstI制限酵素で切断して得られたphbC一部分とphbAB遺伝子全体を含む3.38kb断片を除去して残ったベクター部分をT4 DNAリガーゼ(ligase)で接合して製造した。 
【００７１】
前記プラスミドを利用してphbCAB遺伝子が欠乏した形質転換大腸菌 MG1655/pPHB-nを製造した。即ち、MG1655菌株に前記pPHB-nプラスミドを感染させた後、LB/amp寒天培地に前記形質転換体を塗抹して前記培地で生長した菌株を選別することによりMG1655/pPHB-n宿主菌株を製造した。
【００７２】
前記製造した大腸菌と前記実施例<1-1>で製造した大腸菌を利用して比較実験を行った。詳細には、LB/7％ブドウ糖/amp培地で各々4、6、8時間培養した後、得られた培地上澄み液に正常のphbCAB遺伝子を欠損したpPHB-nプラスミドを含有した組換え大腸菌宿主菌株(MG1655/pPHB-n)と正常なphbCAB遺伝子を含有したMG1655/pTZ18U-PHBを低い初期接種量(ml当たり104細胞)で適用した後、培養した(図８)。 
【００７３】
その結果、MG1655/pPHB-nは、4時間培養液では正常に生長したが、6時間培養液ではゆっくり生長し、8時間培地では、それ以上生長できなかった。これは、8時間培養液では、細胞の生長がそれ以上進行できないことを意味する。これに対して、正常に正常な生長をした。これは、PHBが明白に生長非依存的に合成されることを意味する。 
【００７４】
本実験で、PHBが生長非依存的に合成されることを証明するために、また異なる実験を行った。即ち、ブドウ糖が添加されないLB/amp培地にMG1655/pTZ18U-PHBを低濃度で接種(ml当たり104細胞)した後、8時間培養した後、前記細胞培養液に7％のブドウ糖を供給した(図９)。この時、ブドウ糖の添加により細胞培養液の混濁度が増加し、PHBが効率的に合成された。これは、初期培養時間には、PHBの生産なしに細胞数が増加し、その後、PHBは生長後期に生長非依存的に蓄積されることを意味する。 
【００７５】
先に説明したように、LB/7％ブドウ糖/amp培地で8時間生長した「能力ある(capable)」細胞は、PHBを効率的に蓄積でき、よって細胞接種濃度に関係なしにPHBを蓄積できるものと判断した。これを確認するために、LB/7％ブドウ糖/ampで8時間培養したMG1655/pTZ18U-PHB細胞を種菌に使用して、接種濃度を変化させて新しいLB/ブドウ糖/amp培地に接種した。
【００７６】
その結果、PHBは接種濃度に関係なく効率的に蓄積された(図１０)。同様に、前記の能力ある細胞を前記の培養条件で8時間培養した後、得られた培養液に1.5倍量をさらに接種した場合、最終PHB生産量は40g/l に達した(図１１)。前記結果を通して、培養初期(0〜8時間培養)には、PHBを合成できる能力を得ることが重要であり、一旦細胞がPHB合成能力を得ることができれば、PHBは生長非依存的に蓄積されることを意味するものであると解釈される。 
［実施例６］ 
【００７７】
初期ブドウ糖濃度の効果及び色々な因子の測定 
初期グルコース濃度の効果を調査した。 
詳細には、培地内のブドウ糖濃度を測定するために細胞培養液一定量を取って遠心分離した後、上澄み液だけを別に集めた後、前記上澄み液内のブドウ糖量をブドウ糖分析キット(Sigma社, 510-DA)を利用して酵素的方法で決定した。 
【００７８】
組換え大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBは、0〜7％濃度で供給されたブドウ糖を完全に消費した。8〜10％濃度で供給した時は、各々大略1〜3％のブドウ糖が消費されずに培地内に残っていた(図１２)。また、各場合において、最終PHB生産量を測定した。その結果、ブドウ糖濃度0〜7％までブドウ糖濃度に比例してPHBの生産量が増加した(図１３)。興味深いことに、単位細胞内PHB含量もまたPHB濃度に比例した。これは、ブドウ糖がさらに供給されればされるほどPHBの生産量が増加し、PHB含量が増加することを意味する。前記結果から、組換え大腸菌で利用できる最大ブドウ糖濃度は、7％で、7％以下のブドウ糖供給は、炭素源の不足を招来してPHB生産量とPHB含量を低下させる原因として作用するものと見られた。 
【００７９】
一方、7％を越えるブドウ糖は、使用されずに培地内に残っている。これは、MG1655/pTZ18U-PHB菌株の培養のために添加するべきブドウ糖の最大量は、7％であることを意味する。 
【００８０】
また、本実施例では、PHB生産性に及ぼす多様な要因を調べた。まず、LB/7％ブドウ糖/amp培地で総培養時間による吸光度とブドウ糖使用量を調査した(図１４)。最終吸光度は、約80に到達し、培地内に供給した7％のブドウ糖をすべて使用した。細胞乾燥重量(dry cell weight; 以下「DCW」と称する)とPHB生産量も調査した。最終PHB生産量は、30g/lに達した(図１５)。DCWは、細胞培養液1mlを蒸溜水で2回洗浄した後、遠心分離して集めた沈殿物を前もって重さを計っておいたマイクロ遠心分離チューブに入れて80℃乾燥器で48時間乾燥した重量を測定した。 
【００８１】
生菌数の測定では、培養6時間までは、増加してその後には減少した(図１６)。 PHB含量(P/X)は、DCWとPHB量を基準にして調査した。その結果、約96％の含量を示した(図１７)。同様に、自発的分泌(autolysis)の程度を調査した。自発的分泌は、総β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase; 以下「β-gal」と略称する)活性と培養液内のβ-gal活性を比較することにより測定した。即ち、細胞培養液の一定量を取ってβ-gal活性を測定し、また細胞培養液を遠心分離した後、その上澄み液内のβ-gal活性を測定して、その２つの値を比較して自発的分泌の程度を決定した。 
【００８２】
β-gal活性の測定は、さらに詳細には、次のように実施した。Z-バッファー(16.1gのNa2HPO4・7H2O; 5.5gのNaH2PO4・H2O; 0.75gのKCl; 0.246gのMgSO4・7H2O; 2.7mlのβ-メルカプトエタノール; pH7.0)0.9mlに細胞試料を入れて、0.1％のSODと10μlのクロロホルムを添加した。添加直後に10秒間強く振盪して細胞試料を破砕した。28℃恒温水槽で5分間静置した後、ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)0.2mlを添加することによりβ-gal活性を測定した。β-gal活性の単位(Miller unit)は、下記の式で計算した。 
【００８３】
β-gal活性(Miller unit) = (600nmでの吸光度×1.75×1000/420nmでの吸光度) ×時間(分)×容量(volume, ml) 
【００８４】
その結果、細胞は、約30時間以後に破壊され(lysed)、蛋白質が細胞の外に分泌されていた。60時間培養時には、約50％のβ-gal蛋白質が細胞の外に自発的に分泌された（図１７）。 
【００８５】
培養時間による細胞の模様をクリスタルバイオレット(crystal violet)で染色して光学顕微鏡で観察した(図１８)。この時、細胞内PHB顆粒は、染色されないで残る。前記顆粒の大きさは、培養時間が経つほど段々大きくなり36時間以後には、非常に高い水準のPHB含量を示し、結局は自発的に細胞の外へ分泌されることが観察された。 
［実施例７］ 
【００８６】
培地組成の調節によるPHB生産の極大化 
図１２及び図１３で見たように、ブドウ糖が多く供給されればされるほど多くのPHBが生産された。しかし、7％以上濃度のブドウ糖を供給してもPHBは、それ以上蓄積されない。これは、単に7％のブドウ糖だけが使用され余分のブドウ糖は使用されないで培地内に残っているからである。このような現象は、２つの可能性に因って起きる。一つは、高濃度のブドウ糖添加によるブドウ糖のマイナス効果のためで、もう一つは、ブドウ糖の他にPHB生産のために供給された、培地内のある成分の不足のためである(例えば、LB成分の不足)。しかし、ブドウ糖のマイナス効果を遮断するためと総10％のブドウ糖を間欠的に供給しても、最終PHB生産量は、7％ブドウ糖を供給した時と同じだった。前記結果は、7％ブドウ糖を使用できる上限点が存在する理由は、ブドウ糖のマイナス効果ではなく、培地内のある成分の不足のためであることを意味する。   
【００８７】
このような理由により、解明されていない前記ある成分をさらに供給すればPHBの生産に役立つと判断した。この仮説を証明するために基本培地に使用するLBの量を増加させてみた。即ち、MG1655/pTZ18U-PHB菌株を2×LB(l当たり20gのバクト-トリプトン、10gのバクト-酵母抽出物、10gのNaCl)/7％ブドウ糖/amp培地で培養した。この場合、1×LB/7％ブドウ糖/amp培地の場合と同様の吸光度とブドウ糖消費程度が示された(図１９)。しかし、2×LB/7％ブドウ糖/amp培地でのPHB含量と自発的分泌の程度は、約94％と40％程度で、1×LB/7％ブドウ糖/amp培地で見られた値より低かった(図２０)。前記現象は、細胞内にPHBの蓄積過多による自発的分泌が、培地成分を大量供給することによって遅延されたことを意味する。よってこの場合、自発的分泌を増加させるためには細胞内にさらに多量のPHBが蓄積されることが要求される。 
【００８８】
2×LB/7％ブドウ糖/amp培地でブドウ糖が不足する可能性を考慮してさらに多量のブドウ糖を添加した。この場合、ブドウ糖のマイナス効果を考慮して7％のブドウ糖を各々36時間と60時間培養時間後にさらに添加して、総計21％のブドウ糖を供給した。その結果、最終吸光度は120に達し、供給された21％のブドウ糖が完全に消費された(図２１)。併せて、最終DCWとPHB濃度は、各々85.5g/l及び85.2g/lに達した。これは既存の醗酵槽を利用した流加培養(fed-batch)法によるものと充分に比肩し得る生産性を示す結果である。供給された21％のブドウ糖が完全に消費された結果、PHB含量と自発的分泌は、各々99.7％と80％に達した。これは、大量のブドウ糖添加によりPHBが細胞内に高濃度で蓄積され、このような高濃度で蓄積されたPHBによる細胞破壊により細胞内のPHB顆粒が培地内へ効率的に分泌されて出ることができることを意味する(図２２)。また、光学顕微鏡観察の結果、2×LBで培養された細胞が培地及びブドウ糖の添加により1×LBで培養された細胞の大きさより大きくなり、各細胞内にPHBがほとんど100％水準でPHBが密に入っていることを観察できた(図２３及び図２４)。 
【００８９】
自発的分泌の程度を他の方法で調査した。1×LB/7％ブドウ糖/amp培地で培養されたMG1655/pPHB-n(1)、1×LB/7％ブドウ糖/amp培地で培養された MG1655/pTZ18U-PHB(2)、2×LB/7％ブドウ糖/amp培地で培養されたMG1655/pTZ18U-PHB(3)、及び2×LB/ブドウ糖21％/amp培地で培養されたMG1655/pTZ18U-PHB(4)の、4種類の培養細胞を蒸溜水で一回洗浄して、80℃乾燥器で48時間乾燥した後、写真撮影をした。これらの中で、正常なphbCAB遺伝子を持たないMG1655/pPHB-nは、細胞内にPHBを蓄積できないため暗い褐色を示し、96％のPHB含量を持った1×LB/7％ブドウ糖/amp培地で培養した MG1655/pTZ18U-PHBは、明るい褐色を示した。94％のPHB含量を示した2×LB/7％ブドウ糖/amp培地で培養したMG1655/pTZ18U-PHB細胞は、褐色を示し、99.7％のPHB含量を示した2×LB/21％ブドウ糖/amp培地で培養した MG1655/pTZ18U-PHBは、白くて不透明な色を示した(図２５)。前記結果は、2× LB/21％ブドウ糖/amp培地で培養したMG1655/pTZ18U-PHBは、細胞の大部分がPHBが密に詰まっていて、培養過程中PHBの自発的分泌によりPHBが効率的に培地の外へ分離されて出たことを意味し、よって分離精製が容易であることを意味する。
【００９０】
2×LB/21％ブドウ糖/amp培地で培養されたMG1655/pTZ18U-PHB細胞を走査電子顕微鏡(図２６)及び透過電子顕微鏡(図２７及び図２８)で観察した。 
【００９１】
電子顕微鏡観察のためにPHB顆粒を含む細胞培養液を2.5％のパラホルムアルデヒドを含有した2.5％(v/v)グルタアルデヒド(glutaraldehyde)で固定した後、1％の四酸化オスミウム(osmium tetroxide)で固定した。試料の脱水のために、多様な濃度のエタノールを処理した。走査電子顕微鏡観察のために、試料を金でコーティングした後、イメージをJSM6300 SEM(JEOL Ltd. 日本)を利用して得た。透過電子顕微鏡観察のために、試料をエポン(Epon)812に詰めた後、試料の断片をLKB2008ウルトラトーム(Ultratome)Vを利用して製造した。前記薄膜試料(厚み80nm)を200メッシュグリッド(mesh grid)に載せて、エネルギーフィルターリングTEM(120kV EM912 Omega, Carl Zeiss Co. ドイツ)を利用して観察した。
【００９２】
図２６に見られるように、PHB顆粒が細胞内に密に詰まっていて(a)、細胞膜の一方の部分が破裂して、細胞内に大量に蓄積されていたPHB顆粒が、細胞の外へ噴出されて出ている様子を観察できた(b、矢印)。 
【００９３】
また、前記現象を透過電子顕微鏡観察でさらに詳細に確認した。PHB顆粒が細胞内に密に詰まっているだけではなく(図２７)多量のPHB顆粒の蓄積により細胞膜が破れてPHB顆粒が細胞の外へ効率果的に噴出されて出ていた(図２８、矢印)。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
前記で詳しく見たように、本発明の生産方法は、単純な回分培養によりポリヒドロキシ酪酸等のポリヒドロキシアルカノエートの大量生産を可能にするだけではなく、高い濃度のポリヒドロキシアルカノエート生産により、分離精製が容易である。また、醗酵工程の単純化及び供給されるブドウ糖のポリヒドロキシアルカノエートへの転換率が優れ非常に経済的であるため、既存の難分解性合成プラスチックを代替できる生分解性ポリヒドロキシアルカノエートの、産業的利用を容易にする。 
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】組換え大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBをLB/5％ブドウ糖/amp/1.5％寒天固体培地で培養した際の、細胞接種濃度による宿主菌株の表現型(a)、接種濃度が高い(high)部位で生長する宿主菌株の光学顕微鏡写真(b)、及び接種濃度が低い(low)部位で生長する宿主菌株の図面代用光学顕微鏡写真(c)(この時、各倍率はすべて×1,000倍)である。
【図２】フラスコ回分培養で、細胞接種濃度による細胞の生長を示した600nmでの吸光度(a)とPHBの生産量(b)を比較したグラフである(この時、cfu/mlは、ml当たりのコロニー形成単位(colony forming units, 生菌数)を示す)。
【図３】組換え大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地で培養した際の、低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)(a)及び高い細胞接種濃度(ml当たり105細胞)(b)の培養時間別の光学顕微鏡写真(倍率；×1,000)である。
【図４】LB/7％ブドウ糖/amp培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞、●)及び高い細胞接種濃度(ml当たり105細胞、○)による細胞生長を、600nmでの吸光度で示した細胞生長曲線グラフである。
【図５】LB/7％ブドウ糖/amp培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)による培養時間別の生菌数の変化(●)、及び細胞生長を600nmでの吸光度で示した生長曲線(○)グラフである。
【００９６】
【図６】培養条件による最終(48時間培養)培養後の、細胞生長を示した600nmでの吸光度(左側)及びPHBの生産量(右側)を比較して示したグラフである。      A : LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で8時間培養後、取得した「細胞」全体を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で8時間培養後、得られた「培養液」に再接種。      B : LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度で8時間培養後、取得した「細胞」全体を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に高い細胞接種濃度(ml当たり105細胞)で8時間培養後、得られた「培養液」に再接種。      C : LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に高い細胞接種濃度(ml当たり105細胞)で8時間培養後、取得した「細胞」全体を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度で8時間培養後、得られた「培養液」に再接種。      D : LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に高い細胞接種濃度で8時間培養後、取得した「細胞」全体を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度で8時間培養後、得られた「培養液」に1/10倍の濃度で再接種。      E : LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に高い細胞接種濃度で8時間培養後、取得した「細胞」全体を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度で8時間培養後、得られた「培養液」に1/100倍の濃度で再接種。
【００９７】
【図７】組換えldh突然変異菌株(JIL938/pTZ18U-PHB)を、LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に多様な細胞接種濃度(ml当たり104〜105細胞)で48時間培養した後の細胞生長を示した最終吸光度(a)及び最終PHBの生産量(b)を示したグラフである。
【図８】組換え大腸菌MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)でLB/7％ブドウ糖/ampに接種した後の、4時間培養(●)、6時間培養(○)及び8時間培養(▼)して得られた培養液に、LB/amp液体培地で培養したMG1655/pPHB-n(左側)またはMG1655/pTZ18U-PHB(右側)を各々低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の生長曲線を示したグラフである。
【図９】PHBの非生長依存性(non-growth dependent)蓄積の様相を示すために、生長静止期にブドウ糖添加の有無による培養時間別生長曲線(左側)及び最終48時間培養後PHBの生産量(右側)を比較して示したグラフである。  ●, no Glc：ブドウ糖が添加されていないLB/amp液体培地にMG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種。  ○, Glc ：LB/amp液体培地にMG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種して細胞を8時間培養した後、7％濃度のブドウ糖添加。
【００９８】
【図１０】LB/7％ブドウ糖/amp液体培地にMG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、8時間培養した細胞を種菌として、再び適切な細胞接種濃度(ml当たり104〜105細胞)で新しいLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に接種して、48時間培養した後の細胞生長を示した最終吸光度(左側)及びPHBの生産量(右側)を示したグラフである。
【図１１】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/ampに低い細胞接種濃度で接種した後の、8時間培養して得られた細胞を、前記同一培地で得られた培養液に濃度別に再接種して48時間培養した後の細胞生長を示した最終吸光度(左側)及びPHBの生産量(右側)を示したグラフである。
【図１２】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/0〜10％のブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、48時間培養した後の細胞生長を示した最終吸光度(棒グラフ)と培地内に残っているブドウ糖量(折れ線グラフ)を示したグラフである。
【図１３】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/0〜10％のブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、48時間培養した後の最終PHBの生産量(棒グラフ)と細胞内PHBの含量(P/X, ％)(折れ線グラフ)を示したグラフである。
【００９９】
【図１４】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、培養時間による細胞生長を示した吸光度(●)及び培地内に残っているブドウ糖量(○)を示したグラフである。
【図１５】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、培養時間による細胞乾燥重量(dry cell weight; DCW, ●)及びPHBの生産量(○)を示したグラフである。
【図１６】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、培養時間による生菌数(cfu/ml)を示したグラフである。
【図１７】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、培養時間による、DCWとPHB量を基準にした細胞内PHBの含量(●)と細胞内 PHBの自発的分解程度(lysis ％, ○)を示したグラフである。
【０１００】
【図１８】MG1655/pTZ18U-PHBをLB/7％ブドウ糖/amp液体培地に低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で接種した後の、培養時間による細胞の図面代用光学顕微鏡写真(倍率1,000)である。
【図１９】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/7％ブドウ糖液体培地に接種したの、培養時間別細胞生長を示した吸光度(●)及び培地内に残っているブドウ糖量(○)を示したグラフである。
【図２０】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/7％ブドウ糖液体培地に接種した後の、最終60時間培養後、最終細胞乾燥重量(DCW)、PHBの生産量、細胞内PHBの含量(P/X、％)及びPHBの自発的分解程度(lysis、％)を示したグラフである。
【図２１】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/総21％ブドウ糖(0、36、60時間に各々7％のブドウ糖を添加)/amp液体培地に接種した後の、培養時間別細胞生長を示した吸光度(●)及び培地内に残っているブドウ糖量(○)を示したグラフである(この時、点線は7％ブドウ糖の追加的な添加による培養液内のブドウ糖濃度変化を示す)。
【０１０１】
【図２２】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/総21％ブドウ糖(0、36、60時間に各々7％のブドウ糖を添加)/amp液体培地に接種した後 60時間培養した後の最終細胞乾燥重量、PHBの生産量、細胞内PHBの含量（P/X,%）及びPHBの自発的分解程度(lysis、％)を示したグラフである。
【図２３】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/7％ブドウ糖/amp液体培地に接種した後の、細胞の図面代用光学顕微鏡写真(倍率；×1,000)である。
【図２４】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2× LB/総21％ブドウ糖/amp液体培地に接種した後の、細胞の図面代用光学顕微鏡写真(倍率；×1,000)である。
【図２５】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で1×または2×LB/ブドウ糖/amp液体培地に接種した後、最終細胞培養液を蒸溜水で1回洗浄して乾燥器で乾燥した後、乾燥した内容物を撮影した図面代用写真である。  1 : 1X LB/amp培地(ブドウ糖を添加しない場合）  2 : 1X LB/7％ブドウ糖/amp培地  3 : 2X LB/7％ブドウ糖/amp培地  4 : 2X LB/総21％ブドウ糖/amp培地
【０１０２】
【図２６】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/総21％ブドウ糖/amp液体培地に接種した後、最終培養液で得た細胞(a)、及び最終培養液内のPHBが自発的に分解する現象(b)を走査電子顕微鏡で観察した図面代用写真である。
【図２７】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種濃度(ml当たり104細胞)で2×LB/総21％ブドウ糖/amp液体培地に接種した後、最終培養液から得た細胞を透過電子顕微鏡で観察した写真及び、MG1655/pPHB-nを同様の条件で培養後の、透過電子顕微鏡で観察した図面代用写真(下段挿入写真)。この時のスケールは１μｍである。
【図２８】MG1655/pTZ18U-PHBを低い細胞接種量(ml当たり104細胞)で2×LB/総ブドウ糖21％/amp液体培地に接種した後、最終培養液からPHBが自発的に分解する現象(図２６のb)を透過電子顕微鏡で観察した図面代用写真である。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図１０】
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【図１８】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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