(57)【要約】【課題】  細胞、組織又は生体高分子と生理活性物質との反応性を評価するバイオアッセイプレート及びそれを用いたバイオアッセイ方法の提供。【解決手段】  ゲル状物からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレート、及び多孔質材からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレート。本発明のプレートにより、分析時間短縮、経費削減、省力化が可能となり、さらには実験の誤差を回避することができるハイスループットのスクリーニングを可能にする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル状物からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレート。
【請求項２】
多孔質材からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレート。
【請求項３】
請求項２記載の多孔質材の多孔部にゲル状物が保持されているプレート。
【請求項４】
保液材にウェルが形成されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプレート。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のプレートが、支持体上に配置されているプレート。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプレートに検体を添加し、前記検体と生理活性物質とを反応させることを含む、バイオアッセイ方法。
【請求項７】
検体と生理活性物質との反応を、化学発光、生物発光又は蛍光により検出することを含む請求項６記載のバイオアッセイ方法。
【請求項８】
検体が、組織、細胞又は生体高分子である請求項６又は７記載のバイオアッセイ方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプレートと、検体ハンドリングシステムと、検体と生理活性物質との反応を検出する検出装置とを含むバイオアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、組織又は生体高分子と生理活性物質との反応性を評価するバイオアッセイプレート及びそれを用いたバイオアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー、医学、化学物質のスクリーニング等の各種分野において、生体物質の生化学反応を検出するために各種試験・分析が行われている。
【０００３】
現在、このような試験・分析を効率的に行うために、検体や試薬等を収納するウェルを多数設けたプレート、例えば多くのサンプルを同時に分析することができるマイクロタイタープレートが用いられている。
【０００４】
ところで、細胞に対するストレス現象の解析は、病気の診断や治療を適切に行うための手段として年々重要性が高まっており、上記解析結果は病因の解明に繋がるものと考えられている。従って、現在は、薬剤、環境ホルモン、アレルギー性物質等の各種ストレス因子に対するスクリーニングテストが日常的に行われている。
【０００５】
上記ストレス因子の細胞への影響を定量的に評価するには、ストレス因子の種類・濃度等のパラメータを多数設けて検討する必要がある。
【０００６】
そこで、従来の方法として、マイクロタイタープレートに設けられた各ウェルに検体等を添加し、これに、様々な濃度に調整された生理活性物質溶液（例えばストレス原因物質が含まれたもの）を添加して、各種濃度の生理活性物質溶液と添加された検体との反応を観察するハイスループット分析方法が知られている。
【０００７】
しかしながら、前記方法は、様々な濃度に生理活性物質を調整し、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加していくため、実験者にとって多くの手間、時間、費用等の負担がかかる。また、そのような作業は、実験データの誤差原因を誘発する原因となる。
【０００８】
さらに、データの誤差を減らすために、同じ条件のデータを複数回、取得する必要があり、多くの再現性実験データが必要となる。
【０００９】
また、マイクロタイタープレート上の各ウェルの底面積は比較的大きいため、ウェル内に添加された検体が２次元に広がってしまう。そのため、所定の検出を行うためには、比較的多くの量の検体を必要とする不都合もあった。
【００１０】
以上のことから、簡便かつハイスループットのスクリーニング法の開発が望まれるようになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような状況下、分析時間短縮、経費削減、省力化、さらには実験データの誤差を回避のために、分析操作に必要な検体や生理活性物質を微量化し、一度に多数の細胞、組織および生体高分子に、生理活性物質を異なった添加量で反応させ、その結果を簡便かつ迅速に分析可能とする方法の開発が課題となる。
【００１２】
そこで本発明は、ハイスループットのスクリーニングを実現させ、バイオアッセイに要する手間、時間等の負担を軽減することができるバイオアッセイプレート、バイオアッセイ用システム及びバイオアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、濃度勾配を利用し、生理活性物質を保持することにより、検体を迅速かつ簡易にアッセイし得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、ゲル状物からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレートである。また、多孔質材からなる保液材に、生理活性物質が濃度勾配を形成して保持されているバイオアッセイプレートである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、バイオアッセイプレートが提供される。本発明のプレートにより、分析時間短縮、経費削減、省力化が可能となり、さらには実験の誤差を回避することができるハイスループットのスクリーニングを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、生理活性物質が含まれる溶液を保持することができるゲル状物や多孔質材からなる保液材を準備し、この保液材に生理活性物質を、濃度勾配をもって浸透させバイオアッセイプレートを作成する。このプレートを検体と反応させることにより、多数の検体を迅速かつ簡易に測定しようとするものである。
【００１８】
図１において、バイオアッセイプレート１は、保液材２を含む構成となっている。図１に示すプレート１のA−A断面を、平面図の下に示す。
【００１９】
ゲル状物及び多孔質材の分子構造は網目状となっているため、網目構造の空間（隙間）に溶媒や生理活性物質を浸透させて、保持することができる。本発明においては、そのようなゲル状物及び多孔質材を「保液材」という。なお、図１のプレートは保液材２のみから構成されているが、その場合は、本明細書において説明の便宜上保液材２をプレート１と同義の意味に使用することもある。
【００２０】
本発明は上記保液材２（プレート１）に生理活性物質を浸透させて濃度勾配を形成させることを特徴とする（図１）。保液材２は液体を通すことができる状態（通液可能な状態）である。予め保液材２を、生理活性物質を溶解させることができる溶媒で満たしておくことも可能である。図１は、プレート１の右側面（図１の矢印方向）から生理活性物質を浸透させて濃度勾配を形成させた図である。A−A断面図の下に、濃度勾配の模式図を示した。
【００２１】
図１左に示すように、プレート１内には、検体を添加するためのウェル３を形成しておくことができる。このウェル３に検体を添加することにより、そのウェル３の位置における所定の濃度の生理活性物質と検体とを反応させ、これを所定の検出手段により検出する。
【００２２】
また、本発明においては、検体を塗布した針状体をプレート１に刺して、生理活性物質と検体とを反応させることもできる。よって、必ずしもプレート１にウェルを設ける必要はない（図１右：平板プレート１’）。平板プレート１’を用いる場合は、針状体を刺す位置を一定にするために、プレート１’に縦線と横線とが直交して方眼を形成するように予め線を施しておくことが好ましい。この場合、針状体を刺す位置を、縦線と横線との交点にしておくことがその交点における生理活性物質の濃度を算出しやすい点で便利である。また、検体を塗布する針状体を剣山状にしておくと、１回の操作で多数の検体をプレート１’に添加することができる。
【００２３】
１．保液材
(1) ゲル状物
プレートを構成する保液材に用いることのできるゲル状物は、前記生理活性物質を溶解できる溶媒（生理活性物質溶解用溶媒）を保持する性質を有する限り特に限定されるものではない。当該性質を有するゲル状物としては、例えば、ポリアクリルアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N-アクリロイルアミノエトキシエタノール、N-アクリロイルアミノプロパノール、N-メチロールアクリルアミド、N-ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の１種類または２種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を共重合したゲル、アガロースゲル等が挙げられる。
【００２４】
例えば、ポリアクリルアミドゲルの作製の場合には、アクリルアミドと、架橋剤としてのN，N ’−メチレンビスアクリルアミドと、緩衝剤とを溶解したモノマー水溶液を調製する。これに、重合開始剤N，N，N',N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)、過硫酸アンモニウム水溶液を添加する。このとき、重合反応前に、モノマー水溶液の溶解酸素を10分間以上の脱気により除去することが、均質のゲル状物を作製できる点で好ましい。緩衝液の種類は、緩衝域に入る限り特に限定せず、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液をはじめとするグッドの緩衝液がある。
【００２５】
アガロースゲルの作製の場合には、例えば緩衝液100gにアガロース0.5gを溶解させ、100℃に過熱し、冷却してゲル化させる。
【００２６】
本発明では、プレートの損傷を防止するために、プレートの底面に支持体４（図２）を備えておくことが好ましい。支持体と一体となったプレートは、例えばゲル状物の原料となるモノマー液に支持体を沈め、その後、重合開始剤をモノマー液に添加してモノマー液をゲル化させ、ゲル状物と支持体を一緒に切り出すことにより製造することができる。
【００２７】
ゲルの厚さは、ゲル状物に設けられるウェルの深さや、生理活性物質の浸透の程度によって決定されるが、0.01〜3cm、好ましくは0.05〜1cmである。
【００２８】
また、前記保液材としてアガロースゲルを用いる場合は、緩衝液100gにアガロース0.5gを溶解させて100℃に加熱し、上述の方法と同様に支持体を前記溶液に沈めてから、室温で冷却することによってプレートを作製することができる。
【００２９】
プレートは湿潤状態で、低温（例えば5℃〜20℃）保存できる。
【００３０】
（２）多孔質材
保液材として用いられる多孔質材は特に限定されず、例えば、セルロイド、ベークライト、ユリア樹脂、スチレン樹脂、酢酸ビニル樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアセタール樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミド、ポリプロピレンポリエステル、ポリイソブチレン等が挙げられる。これらの多孔質材の内部は隙間が存在するため、その隙間に液体を浸透させることが可能である。
【００３１】
２．支持体
本発明のプレートに含まれる支持体の種類は特に限定されないが、スライドガラスやプラスチックシートなど適度の親水性を持った材質を用いることが好ましい。これにより、支持体とゲル状物の接着性を高め、安定したプレート基板を作製することができる。具体的には、支持体として、ポリマー（プラスチック）、ガラス、金属、またはこれらの材質から選ばれる１以上の組み合わせを用いることができる。
【００３２】
３．ウェル
プレートにウェルを設ける場合は、例えば、管状体を保液材に刺して、検体を添加するためのウェルを作製する。使用する管状体はその壁部（肉厚部）が0.01cm以下であることが好ましい。管状体の材質は、ガラス製、金属製、プラスチック製等、である。代表的な管状体として、中空繊維が挙げられる。
【００３３】
ウェルは、マトリックス状に複数配置されることが好ましい。例えば、図１に示すようにウェルは縦２列、横３列の等間隔で配置されている。ウェル３の直径は、0.01〜0.3cm、好ましくは0.025cm〜0.1cmである。
【００３４】
ウェル同士の距離（中心間距離）は、その距離が大きくなればなるほど、添加する生理活性物質濃度の差を大きくすることができる。前記ウェル間距離は、バイオアッセイの使用目的に依存するが、0.04cm以上であり、好ましくは0.1〜0.2cmである。
【００３５】
なお、プレートの淵にウェルを形成すると、拡散による濃度勾配が乱れ得る虞がある。よって、ウェルはゲル状物の淵から0.3cm以上離れた距離に配置することが望ましい。
【００３６】
ウェルの数は特に限定されるものではなく、384個（24×16）、144(12×12)個などの数を設けることができる。
【００３７】
また、前述したように、針状体の先端に検体を付着させ、そのまま、プレート（図１ではプレート１’）に刺し込むことで、検体をプレートへ添加することができる。
【００３８】
４．濃度勾配
バイオアッセイに用いられる生理活性物質溶液を用意し、所定の濃度に調整する。次に、プレートの一つの平面が、前記生理活性物質溶液に接触するように、プレートを生理活性物質溶液に浸す。
【００３９】
生理活性物質には、薬剤、環境ホルモン、アレルギー性物質等が含まれる。また、生理活性物質溶液に用いられる溶媒は、生理活性物質を溶解させることができ、かつ、検体及び支持体に影響を与えないものであれば特に限定されるものではない。例えば、前記溶媒として緩衝液、有機溶媒、緩衝液と有機溶媒との混合液等を用いることができる。
【００４０】
生理活性物質溶液は、プレートと該溶液の接触面から徐々に浸透する。所定の時間が経過すると、接触面から近い場所では生理活性物質濃度が高く、接触面から離れた場所では生理活性物質溶液濃度に低くなることにより濃度勾配が形成される。
【００４１】
例えば、保液材として25％アクリルアミドゲルを用い、生理活性物質として分子量342の0.2mMショ糖溶液を使用する場合、ゲル状物の一つの平面をショ糖溶液と接触させてから、約１日〜２日で濃度勾配が形成される。保液材の厚さ、プレートの大きさ、形状等にも依存するが、生理活性物質の分子量が1000以下であれば0.5〜2日で濃度勾配が形成される。よって、１日以上４日以内でウェルに検体を添加してバイオアッセイを行うことが好ましい。
【００４２】
１種類の生理活性物質の影響を見るときは、上述のごとく添加物質を溶解させた溶液を、プレートの一つの平面に接触させ、一定時間放置することで、プレート内に濃度勾配を形成させる。複数の生理活性物質の効果を見るときは、複数の平面にそれぞれの溶液を接触させ、一定時間放置することで、プレート内に、濃度勾配を形成させる。
【００４３】
例えば図３に示すように、プレートの一つの平面に生理活性物質aを、他の平面に生理活性物質ｂを浸透させることで、２種類の生理活性物質について濃度勾配を形成させることができる。
【００４４】
但し、生理活性物質を浸すプレートの位置は、平面に限定されるものではなく、例えばプレートの角であってもよい。
【００４５】
なお、保液材に濃度勾配を形成させる際、均一な濃度勾配の形成及びゲル表面の保護の観点から、分析面２’はフィルムで覆うことが好ましい。
【００４６】
５．検体の添加及び検出
次に、濃度勾配が形成されたプレートの各ウェルに検体を添加する。各ウェル３において、その周囲の保液材に保たれている生理活性物質溶液がウェルの内部に染み出してくる。それによって、ウェル内にある検体と所定の濃度の生理活性物質溶液とを反応させることができる。保液材には濃度勾配が設けられているため、ウェルの位置によって保液材からウェル内にしみ出てくる生理活性物質溶液の濃度が異なる。各ウェルの位置における濃度は、浸透初期の溶液濃度、拡散速度及び拡散時間によって算出することが可能である。これにより、１つのプレートにおいて、一度に、様々な濃度の生理活性物質溶液と検体とを反応試験を行うことができる。
【００４７】
反応時間は、各ウェルに検体を添加し、検体と生理活性物質溶液との反応を開始してから、約10〜30分程度である。
【００４８】
反応終了後、各ウェル内における反応の検出には、既知の検出法の利用が可能である。たとえば、蛍光顕微鏡にて活性酸素量に対応した蛍光量を観察する。
【００４９】
他の方法では、化学発光物質、生物発光物質等の発光物質、ラジオアイソトープなどの標識体を作用させ、この標識体を検出する。例えば、図１において、生理活性物質としてのリガンドを、検体として標識された前記リガンドを含む溶液を添加して反応させ、標識体を検出することができる。また、図３において、生理活性物質aとして抗原αに対する１次抗体を、生理活性物質bとして標識物質を結合した２次抗体を浸透させておき、検体として抗原αを添加すれば、ELISAと同様の検出操作を行うことができる。ただし、これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来から公知の各種手段を用いることができる。
【００５０】
蛍光物質としては、例えばAlexa系、Cy2、Cy3、FITC、ローダミン、テキサスレッド等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、ジオキセタン等が挙げられる。生物発光物質としては、例えばルシフェラーゼ、GFP（Green Fluorescence Protein）等が挙げられる。
【００５１】
６．バイオアッセイシステム
本発明は、プレートと、前記プレートの保液材に添加される検体を自動的に添加する検体ハンドリングシステムと、前記検体と前記生理活性物質との反応を検出する検出装置とを有するバイオアッセイシステムを提供する。
【００５２】
前記検体ハンドリングシステムとは、たとえば、保液材上のウェルに検体を添加する手段、検体を針状体の先端に付着させ保液材中に挿入する手段等を含むものである。
【００５３】
また、前記検出装置としては、たとえば、検体と生理活性物質との反応結果を化学発光、生物発光、蛍光を検出できる装置である。また当該装置は、当該検出を経時的に実施することができる。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【００５５】
（１）バイオアッセイプレートの製造
本実施例は、保液材としてポリアクリルアミドゲルを用い、支持体として一辺が2cmの正方形で、厚さが0.06cmであるスライドガラスを用い、バイオアッセイプレートを製造したものである。
【００５６】
具体的には、アクリルアミド22g、N，N ’−メチレンビスアクリルアミド3g及びトリス6gを1NのHCl 16mlを溶解させ、水を加えてモノマー溶液100ml（pH6.5）調整した。次いでシャーレの底面にスライドガラス（2cm×2cm）を設置し、スライドグラス上面から液面までの高さが0.05cmになるように前期モノマー溶液を添加して静置した。
【００５７】
10分間の脱気操作の後、N,N,N',N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)  15μlと10重量％過硫酸アンモニウム水溶液150μlを添加し、緩やかに攪拌した後、室温で1時間、重合反応を実施した。
【００５８】
重合反応終了後、スライドガラスとスライドガラス上のゲル状物が一体となるように切り出した。切り出されたプレートは、一辺が2cmの正方形で、上面に厚さ0.06cmのポリアクリルアミドゲルが配置されたものであった。
【００５９】
次に、プレートのゲル部に、中空糸（外径0.25cm、内径0.20cm）を刺して、直径0.20cmで深さが0.06cmの円筒形の穴を100個設けた。各穴の中心間の距離0.04cmとした。
【００６０】
（２）ゲル状物の培地による置換
前記(1)で作製したプレートを、100倍希釈したN-2サプリメントを添加したDMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）培地に浸し、一晩放置することによりポリアクリルアミドゲル内をDMEM培地で置換した。
【００６１】
N-2サプリメントを構成する成分を表１に、DMEMの構成する成分を表２に示す。
【００６２】
【表１】
2005172475.tif 000002
【００６３】
【表２】
2005172475.tif 000003
【００６４】
（３）濃度勾配が形成されたプレートの作成
前記(2)でDMEM培地により置換されたプレートのウェルを設けた表面（分析面２’）を透明フィルムにより保護した。
【００６５】
次に、生理活性物質として0.2mMのresveratrol (3,5,4’-trihydroxy-trans-stilbene)の溶液を用意した。プレートの一平面（側面）を前記生理活性物質溶液に接触するように浸し、恒温恒湿槽内にて50時間、湿度99％で静置した。
【００６６】
（４）細胞（検体）の調製
ポリリジンコートしたディッシュを用いて、ラット好クロム細胞腫(PC12)を、10％加熱処理済ウマ血清と５％のウシ胎児血清を加えたDMEM培地中において、37℃、10％CO2の条件下で２日間培養した。その後、培地を、N-2サプリメントを添加したDMEMに培地交換し、1x106cells/mlに調製したPC12細胞懸濁液を調製した。
【００６７】
（５）resveratrolの濃度と細胞内活性酸素蓄積量についての評価
前記(3)で形成されたプレートの透明フィルムを剥がし、各ウェルに、前記細胞懸濁液を0.4μlずつ注入した。注入後、37℃、10%CO2の条件下で30分間インキュベーションした。
【００６８】
次に、0.2mMのH2O2及びN-2サプリメントを添加したDMEM培地に前記プレートを浸してプレート表面の培地を交換した。
【００６９】
プレートを37℃、10%CO2の条件下で９時間インキュベーションした後、プレートを培地から取り出し、Kreb'sリンガー液によりリンスした。更に10μM DCF-DA（2'-7'-dichilorofluorescein diacetate）をプレート全体に滴下し、37℃、15分間インキュベーションした。
【００７０】
このようにして処理されたプレートを蛍光スキャナー（BIO-RAD社製モレキュラーイメージャーFX）（励起光488 nm）を用いて、活性酸素量に対応した蛍光量を観察することにより、ラット好クロム細胞腫(PC12)のresveratrolによる活性酸素の除去作用を分析することができた。
【００７１】
上記アッセイシステムでは、生理活性物質を各所定濃度に調整する必要がないため、分析時間が短縮できる。また、煩雑な操作による誤差等が回避できる。さらには、従来の方法と比較し短時間で分析可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のプレートは、バイオアッセイのために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明のバイオアッセイプレートの構成を示す図である。
【図２】本発明のバイオアッセイプレートの構成を示す図である。
【図３】２種類の生理活性物質を浸透させたときのプレートの濃度勾配を示す模式図である。
【符号の説明】
【００７４】
１  プレート
１’平板プレート
２  保液材
２’分析面
３  ウェル
４  支持体
５  透明フィルム
【図１】
2005172475.tif 000004
【図２】
2005172475.tif 000005
【図３】
2005172475.tif 000006