(57)【要約】【課題】ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）活性を有する新規ポリペプチド、該ＰＤＥポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ポリペプチドを認識する抗体を利用し、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の診断、予防または治療のための医薬を提供すること。【解決手段】本発明によれば、ＰＤＥ活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを組み込んで得られる組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有する活性を変動させる物質のスクリーニング法および該ＤＮＡあるいは該抗体を用いた糖尿病、脳疾患、腎疾患または癌等の疾患の診断、予防または治療のための医薬等が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド：
（Ａ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列：又は
（Ｂ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ：
（Ａ）配列番号２または配列番号１６に記載の塩基配列：又は
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞から成る群から選ばれる形質転換体である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
微生物がEscherichia属に属する微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７６を有する、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に請求項１に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項２または３に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれらセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドを認識する抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの免疫組織染色法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するホスホジエステラーゼ活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られる化合物。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項１２に記載の方法を用いて請求項１に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することにより、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現の変動を検出することを特徴とする、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１５に記載の方法を用いて請求項１に記載のポリペプチドを検出することにより、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現の変動を検出することを特徴とする、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られる化合物。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御するプロモーターＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項２４に記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２６】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子から成る群から選ばれる遺伝子である、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の方法により得られる化合物。
【請求項２８】
請求項１に記載のポリペプチドを含有する、医薬。
【請求項２９】
請求項１０または１１に記載のオリゴヌクレオチドを含有する、医薬。
【請求項３０】
請求項１４に記載の抗体を含有する、医薬。
【請求項３１】
請求項１９、２３または２７に記載の化合物を含有する、医薬。
【請求項３２】
糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍の予防または治療のための医薬である、請求項２８から３１の何れか１項に記載の医薬。
【請求項３３】
糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍の診断のための医薬である、請求項２８から３１の何れか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ホスホジエステラーゼポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体および該ホスホジエステラーゼポリペプチドの製造方法に関する。本発明はまた、該ポリペプチドの利用方法、例えば、該ポリペプチドまたはその抗体を用いたアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法、並びに該ポリペプチド又はその抗体を含む医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
環状ヌクレオチドはＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）からの刺激をはじめとする多くの細胞外刺激による細胞応答を仲介することが知られている。環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、３’，５’−環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）および３’，５’-環状グアノシンモノホスフェート（ｃＧＭＰ）などの３’，５’−環状ヌクレオチドを加水分解し、対応するヌクレオシド５’モノホスフェートを生成することで細胞内のこれらの環状ヌクレオチドの濃度調節に重要な役割を果たしている〔Pharmac. Ther., 51, 13 (1991)〕。すなわち、ＰＤＥは、細胞内の定常状態でのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ濃度、さらには環状ヌクレオチドを介したシグナルの大きさおよび持続時間を調節している。多くの実験結果よりＰＤＥ活性は他のシグナル伝達系からの多種類の情報により制御されていることが示されており、シグナル伝達経路間の“cross-talk”および細胞内制御ネットワークの重要な位置を占めている〔Trend. Pharmacol. Sci., 22, 217 (1997)、Physiol. Rev., 75, 725 (1995)、Arch. Biochem. Biophys., 322, 1 (1995)、及びEndocrinol. Rev., 16, 370 (1995)〕。
【０００３】
脊椎動物のＰＤＥは構造、局在、制御、選択的ＰＤＥ阻害剤に対する感受性等の異なるサブタイプおよびそれらのアイソフォームからなる大きなスーパーファミリーを形成している〔Trend. Pharmacol. Sci., 11, 150 (1990)、Physiol. Rev., 75, 725 (1995)、Arch. Biochem. Biophys., 322, 1 (1995)、Endocrinol. Rev., 16, 370 (1995)、Kidney International, 55, 29 (1999)、Cyclic Nucleotide  Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, New York (1990)、及びPhosphodiesterase Inhibitors, Academic Press, New York (1996)〕。ＰＤＥスーパーファミリーは現在までに生化学的特性、酵素学的特性、さらには対応するｃＤＮＡのクローン化によるアミノ酸配列の比較等により、以下の１０種類のファミリー（ＰＤＥ１〜ＰＤＥ１０）に分類されている〔Kidney International, 55, 29 (1999)、J. Biol. Chem., 274, 18438 (1999)、Gene, 234, 109 (1999)、及びProc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7071 (1999)〕。
【０００４】
１．Ca2+／カルモジュリン依存性ＰＤＥ（ＰＤＥ１）
２．ｃＧＭＰで刺激されるＰＤＥ（ＰＤＥ２）
３．ｃＧＭＰで阻害されるＰＤＥ（ＰＤＥ３）
４．ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ４）
５．ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ５）
６．ｃＧＭＰ特異的フォトレセプターＰＤＥ（ＰＤＥ６）
７．高親和性、ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ７）
８．高親和性、ｃＡＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ８）
９．ｃＧＭＰ特異的ＰＤＥ（ＰＤＥ９）
１０．ｃＡＭＰ ＰＤＥ、ｃＡＭＰで阻害されるｃＧＭＰ ＰＤＥ（ＰＤＥ１０）
【０００５】
多くのファミリーは、異なる遺伝子によりコードされるサブタイプおよびそれらのスプライスバリアント（アイソフォーム）からなる〔Kidney International, 55, 29 (1999)、Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, New York (1990)、及びBiochem. Biophys. Res. Commun., 261, 551 (1999)〕。いくつかのＰＤＥアイソフォームについては組織および細胞特異的な発現が報告されている〔Trend. Pharmacol. Sci., 22, 217 (1997)、Physiol. Rev., 75, 725 (1995)、及びArch. Biochem. Biophys., 322, 1 (1995)〕。現在までに、３０種以上のＰＤＥ分子種が報告されているが、さらなる未知のＰＤＥの存在が想定されている。
【０００６】
ＰＤＥは通常３つの機能ドメインからなる構造を有している〔Trend.  Pharmacol. Sci., 22, 217 (1997)、 Physiol. Rev., 75, 725 (1995)、Arch. Biochem. Biophys., 322, 1 (1995)、及びEndocrinol. Rev., 16, 370 (1995)〕。中央からＣ末端側にかけて存在する約２７０アミノ酸よりなる領域(catalytic core domain)はすべての脊椎動物由来ＰＤＥで保存されており、触媒ドメインを構成する。この領域は個々のＰＤＥファミリー内の遺伝子間でよく保存されており、アミノ酸配列で８０％以上の一致が認められる。また、異なるＰＤＥ遺伝子ファミリー間ではアミノ酸配列で２５％〜４０％程度一致している。catalytic core domainには２つのZn2+結合モチーフが存在している〔J. Biol. Chem., 269, 22477 (1994)〕が、ＰＤＥ３ファミリーのcatalytic core domainには、他のＰＤＥファミリーには存在しない４４アミノ酸の挿入があるために最初のZn2+結合モチーフが破壊されている。全てのＰＤＥの触媒ドメインにＨＤＸＸＨＸＸＸＸＮ（アミノ酸残基は一文字表記で示す。Ｈ；ヒスチジン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｎ；アスパラギン、Ｘ；任意のアミノ酸残基）の保存されたモチーフが見出されている。
【０００７】
ＰＤＥ４のcatalytic core domainを含む領域は大腸菌で発現し、ＰＤＥ活性を有していることが示された〔J. Biol. Chem., 267, 18929(1992)〕。保存されている触媒ドメインにはＰＤＥファミリー特異的な基質親和性や阻害剤に対する感受性を規定する配列が含まれている〔J. Biol. Chem., 274, 4839 (1999)〕。触媒ドメインがよく保存されているのに対してＮ末端側の制御ドメインはＰＤＥサブタイプ、アイソフォーム間で構造および大きさが異なっている〔Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action, John Wiley & Sons, New York (1990)〕。このドメインには、リガンド結合部位、リン酸化部位、膜結合部位、蛋白-蛋白相互作用に関与する配列等が含まれている。
相対的に小さいＣ末端ドメインの機能的な重要性については十分には明らかにされていない。PDE4B2Bアイソフォームの４８７番目のセリン残基がmitogen-activated protein kinaseによりリン酸化を受けることが報告されている〔Biochem. J., 316, 751 (1996)〕。
【０００８】
ＰＤＥサブタイプあるいはアイソフォーム特異的なアゴニストあるいはアンタゴニストは、細胞内環状ヌクレオチド量の変動が関与している多種類の疾患に対して、予防的あるいは治療的な効果が期待される。例えば免疫および炎症応答に関する多くの機能は細胞内ｃＡＭＰを増加させる薬剤により阻害される〔Mol. Pharmacol., 47, 1164 (1995)〕。一方、ｃＧＭＰは、平滑筋、肺および脳細胞の機能に関与している〔Pharmac. Ther., 51, 13 (1991)〕。非特異的ＰＤＥ阻害剤、さらにはＰＤＥサブタイプに選択性を示す阻害剤が合成され、それらのうちいくつかについては治療薬としての可能性が実験的あるいは臨床的に検討されている〔Trends Pharmacol. Sci., 22, 217 (1997)、Physiol., Rev., 75, 725 (1995)、Phosphodiesterase Inhibitors, Academic Press, New York (1996)〕。例えば、ＰＤＥ３阻害剤は、抗血栓剤、降圧剤およびうっ血性心不全治療に有用な強心剤として開発されている。最近、ＰＤＥ３Ｂがレプチンのインスリン分泌阻害に関与していることが報告された〔J. Clin. Invest., 102, 869 (1998)〕。ＰＤＥ４阻害剤としては、rolipramが鬱病治療薬として用いられている。TNF-αはin vitroでHIV-1の複製を促進することが報告されている。rolipramはlipopolysaccharide刺激によるTNF-α産生を抑制することから、HIV-1複製を阻害する可能性が指摘されている〔AIDS, 9, 1137 (1995)〕。また、TNF-α、インターフェロンγなどのサイトカイン産生を抑制する活性を有していることから、脳脊髄炎(encephalomyelitis)、多発性硬化症（ＭＳ）、遅発性運動異常(tardive dyskinesia)などに対する効果も期待されている。ＰＤＥ４阻害剤は、抗炎症作用を有することからリウマチなどの治療薬として、また抗炎症作用のみならず気管支拡張作用も有することから喘息の治療薬として、その可能性が評価されている〔Clin. Exp. Immunol., 100, 126 (1995)、Am. J. Respir. Crit. Care Med., 157, 351 (1998)〕。ＰＤＥは多くの細胞の増殖に関与しており、悪性腫瘍の治療薬のターゲットとしても興味が持たれている〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5330 (1994)〕。また、ラットメサンギウム細胞を用いた系で、ＰＤＥ３阻害剤がメサンギウム細胞の分裂抑制作用を有すること〔J. Clin. Invest., 96, 401 (1995)〕、ＰＤＥ４阻害剤が活性酸素代謝産物(reactive oxygen metabolite)の産生を抑制することが報告されている〔J. Biol. Chem., 272, 9854 (1997)〕。さらに、抗Thy-1腎炎ラットでＰＤＥ阻害剤が蛋白尿の進展を抑制することが示された〔J. Clin. Invest., 98, 262 (1996)〕。
【０００９】
糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍などのような環状ヌクレオチドを介したシグナル伝達の異常が発症および病態の進展に関与している可能性のある疾患を予防あるいは治療するために、その疾患に関与するＰＤＥサブタイプ、さらにはアイソフォーム選択的なアゴニスト、アンタゴニストの開発が求められている。非特異的な薬剤は目的とする組織および細胞以外の組織、細胞におけるｃＡＭＰあるいはｃＧＭＰを介するシグナル伝達系への影響が問題になるのであまり望ましくない。
【００１０】
ＰＤＥの場合、酵素の存在量が極微量であること、基本的に同様の反応を触媒しており、基質特異性が重複していることなどから組織あるいは細胞からのアイソフォームの精製及び単離は容易ではない。古典的な酵素学的手法を用いた新規なアイソフォームの単離は、現在用いられている精製法の限界および単一の精製酵素標品が得られたことを確認することの困難さにより阻まれている。他のアプローチとして、アイソフォーム選択的なアッセイ条件を用いることや、免疫学的な手法を用いたサブタイプやアイソフォームの分離及び同定が行われてきた。これらのアプローチには、サブタイプやアイソフォームを同定するために必要な判定基準の確立が必要であり、時間と労力を要するばかりでなく、技術的に困難な場合もある。結果として、多くの研究は、複数のサブタイプあるいはアイソフォームを含む部分精製ＰＤＥ標品を用いて行われてきた。
組織あるいは細胞特異的な新規ＰＤＥアイソフォームを組換えＤＮＡ技術を用いて大量に調製することができれば、これらの困難を克服でき、より特異的かつ安全なアゴニストおよびアンタゴニスト開発が可能になることが期待される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規ＰＤＥポリペプチド及び該ＰＤＥポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。本発明はまた、該ＰＤＥポリペプチド又は該ポリペプチドを認識する抗体などを利用して、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の予防及び／又は治療のための医薬を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、HepG2細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製しランダムに塩基配列の解析を行った。ヒトPDE10A（GenBank:AB020593）の遺伝子配列情報を基に、このようにして取得したヒトｃＤＮＡ配列に対して、BLASTサーチ相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、ヒトPDE10AおよびヒトPDE5Aの触媒部位と相同性の認められる部分配列を見出した。これらの配列を解析し、ポリペプチドを発現させてＰＤＥ活性を検出することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は以下の（１）〜（３３）の発明に関する。
（１）下記の何れかのアミノ酸配列から成るポリペプチド：
（Ａ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列：又は
（Ｂ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
【００１４】
（２）  （１）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（３）  下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ：
（Ａ）配列番号２または配列番号１６に記載の塩基配列：又は
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（４）  （２）または（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）  （４）に記載の組換えベクターを保有する形質転換体。
（６）  形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞から成る群から選ばれる形質転換体である、（５）に記載の形質転換体。
（７）  微生物がEscherichia属に属する微生物である、（６）に記載の形質転換体。
（８）  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７６を有する、（７）に記載の形質転換体。
（９）  （５）〜（８）のいずれかに記載の形質転換体を培地で培養し、培養物中に（１）に記載のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、（１）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１５】
（１０）  （２）または（３）に記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびこれらセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（１１）  オリゴヌクレオチド誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、（１０）に記載のオリゴヌクレオチド。
【００１６】
（１２）  （１０）または（１１）に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、（１）に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出する方法。
（１３）  （１０）または（１１）に記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、（１）に記載のポリペプチドの発現を抑制する方法。
（１４）  （１）に記載のポリペプチドを認識する抗体。
（１５）  （１４）に記載の抗体を用いることを特徴とする、（１）に記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
（１６）  （１４）に記載の抗体を用いることを特徴とする、（１）に記載のポリペプチドの免疫組織染色法。
（１７）  （１４）に記載の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
【００１７】
（１８）  （１）に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するホスホジエステラーゼ活性を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（１９）  （１８）に記載の方法により得られる化合物。
（２０）  （１）に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（２１）  （１２）に記載の方法を用いて（１）に記載のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することにより、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現の変動を検出することを特徴とする、（２０）に記載のスクリーニング方法。
（２２）  （１５）に記載の方法を用いて（１）に記載のポリペプチドを検出することにより、該ポリぺプチドをコードする遺伝子の発現の変動を検出することを特徴とする、（２０）に記載のスクリーニング方法。
（２３）  （２０）〜（２２）のいずれかに記載の方法により得られる化合物。
【００１８】
（２４）  （１）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を制御するプロモーターＤＮＡ。
（２５）  （２４）に記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを保有する形質転換体と被験試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング方法。
（２６）  レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子から成る群から選ばれる遺伝子である、（２５）に記載のスクリーニング方法。
（２７）  （２５）または（２６）に記載の方法により得られる化合物。
【００１９】
（２８）  （１）に記載のポリペプチドを含有する、医薬。
（２９）  （１０）または（１１）に記載のオリゴヌクレオチドを含有する、医薬。
（３０）  （１４）に記載の抗体を含有する、医薬。
（３１）  （１９）、（２３）または（２７）に記載の化合物を含有する、医薬。
（３２）  糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍の予防または治療のための医薬である、（２８）から（３１）の何れかに記載の医薬。
（３３）  糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍の診断のための医薬である、（２８）から（３１）の何れかに記載の医薬。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、下記の何れかのアミノ酸配列から成ることを特徴とする。
（Ａ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列：又は
（Ｂ）配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列。
配列番号１または配列番号１５に記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）活性を有するポリペプチドは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング 第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662 (1984)、Science, 224, 1431 (1984)、国際公開WO85／00817号、及びNature, 316, 601 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号１または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
【００２１】
欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明のポリペプチドがホスホジエステラーゼ活性を有するためには、配列番号１または１５に記載のアミノ酸配列との相同性がＢＬＡＳＴ〔J.Mol.Biol., 215, 403(1990)〕やＦＡＳＴＡ〔Methods in Enzymology, 183, 63（1990）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることが好ましい。
ただし、本発明のポリペプチドには、公知のポリペプチドは含まれない。
【００２２】
本発明はまた、上記した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供するものである。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの具体例として、下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
（Ａ）配列番号２または配列番号１６に記載の塩基配列：
（Ｂ）上記（Ａ）に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００２３】
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつホスホジエステラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列」とは、配列番号２または配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００２４】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー、ＤＮＡ Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２５】
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ（J.Mol.Biol., 215, 403, 1990）やＦＡＳＴＡ（Methods in Enzymology, 183, 63-69）等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２または配列番号１６で表される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
ただし、本発明のＤＮＡには、公知のＤＮＡは含まれない。
【００２６】
以下、本発明の実施方法および利用方法について詳細に説明する。
[１]本発明のＤＮＡの取得およびオリゴヌクレオチドの調製
ヒトPDE10A(GenBank：AB020593)のアミノ酸配列と相同性をもつ遺伝子を、遺伝子データベース、蛋白質データベースより、Blast、Smith-Waterman法等を利用したプログラムあるいはフレームサーチ〔イスラエル、コンピュジェン（Compugen）社製〕相同性検索ソフトウェアを利用して検索する。
データベースとしてはGenBank、Swiss-Plot等の公的なデータベースを利用することができる。
また私的に持っているｃＤＮＡライブラリー中のクローンのｃＤＮＡを、ランダムかつ大規模に塩基配列決定し、得られた配列データを集積し、作製した私的なデータベースを利用することもできる。
得られた、ヒトPDE10A（GenBank:AB020593）と相同性をもつ遺伝子が、ＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）のように、遺伝子の一部の塩基配列のみである場合は、以下のようにしてそのｃＤＮＡの全長を得ることができ、該ｃＤＮＡより本発明のＤＮＡを取得することができる。
本発明のＤＮＡの起源が特に制限されることはないが、好ましくは哺乳動物であり、特に好ましくはヒトである。
【００２７】
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、適切な細胞または組織より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製する。
全ＲＮＡを調製する方法として、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法〔Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)〕、酸性グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホルム（AGPC）法〔Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987)、及び実験医学 9, 1937 (1991)〕等を用いることができる。全ＲＮＡからポリ（Ａ）+ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法として、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）やオリゴｄＴラテックスを用いる方法等を用いることができる。
【００２８】
ファースト・トラック・ｍＲＮＡ単離キット〔Fast Track mRNA Isolation Kit；インビトロジェン（Invitrogen）社製〕、クイック・プレップ・ｍＲＮＡ精製キット〔Quick Prep mRNA Purification Kit；ファルマシア（Pharmacia）社製〕等のキットを用いて組織や細胞から直接ｍＲＮＡを調製することもできる。適切な細胞または組織として、データベースから見出されたＥＳＴ等が含まれていたｃＤＮＡライブラリーの種類を調べ、該ライブラリーを構築するために用いた細胞または組織、あるいは該組織由来の細胞株等を用いることが好ましい。
【００２９】
得られた全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを用い、常法によりｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ｃＤＮＡライブラリー作製法として、モレキュラー クローニング 第２版やカレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー、ＤＮＡ Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔SuperScript Plasmid System for ｃＤＮＡ Synthesis and Plasmid Cloning；ギブコＢＲＬ（Gibco BRL）社製〕やザップ−ｃＤＮＡ ・シンセシス・キット〔ZAP-ｃＤＮＡ Synthesis Kit、ストラタジーン社製〕を用いる方法等をあげることができる。
【００３０】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。
具体的には、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社製）、λgt10、λgt11〔ＤＮＡ Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック社製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)〕、ｐＵＣ１８ 〔Gene, 33, 103 (1985)〕、ｐＡＭｏ〔J. Biol. Chem., 268, 22782-22787 (1993)、別名pAMoPRC3Sc（特開平05-336963）〕等を挙げることができる。
【００３１】
宿主微生物としては、大腸菌Escherichia coliに属する微生物であればいずれも用いることができる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、Escherichia coli C600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、Escherichia coli Y1088〔Science, 222, 778 (1983)〕、Escherichia coli Y1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、Escherichia coli NM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、Escherichia coli K802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、Escherichia coli JM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、Escherichia coli SOLRTM Strain（ストラタジーン社製）、Escherichia coli LE392（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
上記方法により作製したｃＤＮＡライブラリーに加え、市販のｃＤＮＡライブラリーも利用することができる。
市販のｃＤＮＡライブラリーとして、クローンテック社、ライフテックオリエンタル社等のヒト、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等由来の各臓器ｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
【００３２】
（２）本発明のＤＮＡの取得
上記（１）で作製したｃＤＮＡライブラリーより、本発明のＤＮＡ又はその一部を含有するｃＤＮＡクローンを、アイソトープあるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法〔モレキュラー クローニング 第２版〕等により選択することができる。
プローブとしては、一部明らかになっている塩基配列に基づいたプライマーを用いて、ＰＣＲ〔ＰＣＲ Protocols, Academic Press (1990)〕を利用した方法でｃＤＮＡの一部を増幅した断片や、一部明らかになっている塩基配列に基づいたオリゴヌクレオチドを利用することができる。
【００３３】
プライマーとして、全長ｃＤＮＡの５’末端側および３’末端側の両方の塩基配列がＥＳＴ等により明らかになっている場合には、その塩基配列に基づいて調製したプライマーを用いることができる。
該ｃＤＮＡの両端にアダプターを付加し、このアダプターの塩基配列と一部明らかになっている塩基配列に基づいたプライマーでＰＣＲを行う５’−ＲＡＣＥ(rapid amplification of ｃＤＮＡ ends)および３’−ＲＡＣＥ〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)〕により、プライマーに用いた配列よりも５’末端側および３’末端側のｃＤＮＡ断片を得ることができる。
得られたｃＤＮＡ断片を連結することにより、本発明の全長ＤＮＡを取得することができる。
また、上記ｃＤＮＡライブラリーから取得されたｃＤＮＡが完全長のポリペプチドをコードしていない場合は、以下のようにして完全長のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得ることもできる。
各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡライブラリーまたは上記記載の方法で作製できるｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、該ｃＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行うことにより、該ｃＤＮＡに対応する遺伝子を発現する臓器や細胞を特定し、特定された臓器あるいは細胞由来のｃＤＮＡライブラリーに対し、該ｃＤＮＡをプローブにしてコロニーハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより改めて該ｃＤＮＡの全長を含むｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーから選択することができる。
各種臓器または各種細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡライブラリーは、常法または市販されているキットに従って作製することができるが、例えば以下に示す方法で作製できる。
各種臓器または各種細胞からグアニジウム  チオシアネート  フェノール−クロロホルム法〔Anal. Biochem., 162, 156 (1987)〕により全ＲＮＡを抽出する。必要に応じて、全ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（Life Technologies社製）で処理し、混入の可能性がある染色体ＤＮＡを分解する。得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いてSUPERSCRIPTTM Preamplification System for First Strand cDNA System（Life Technologies社製）により、一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを作製できる。
【００３４】
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕あるいはパーキン・エルマー社（Perkin Elmer：３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー）、ファルマシア社、ライコア（LI-COR）社等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。上記方法により取得された本発明のＤＮＡおよびその一部を含むプラスミドとして、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を有するプラスミドhep10314、および配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部を有するプラスミドp23-1k、p23-2kをあげることができる。
プラスミドhep10314を含有する大腸菌 Escherichia coli JM109/hep10314は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９７６として、平成１１年１２月２２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305-8566）に寄託されている。
【００３５】
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、他の組織あるいは、他の動物由来、例えばヒトおよびマウス由来の目的とするＤＮＡを取得することができる。
上記方法により得られた塩基配列情報に基づき、ＤＮＡ合成機で化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。ＤＮＡ合成機としては、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、ホスホアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等をあげることができる。
得られた塩基配列の新規性に関しては、BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、GenBank、EMBLおよびDDBJ等の塩基配列データベースを検索することにより確認することができる。
新規な塩基配列については、アミノ酸配列に変換したのちＦＡＳＴＡ、フレームサーチ（FrameSearch）等の相同性検索プログラムを用いて、GenPept、PIR、Swiss-Prot等のアミノ酸配列データベースを検索することにより、相同性をもつ既存の遺伝子を検索することができる。
【００３６】
（３）本発明のオリゴヌクレオチドの調製
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはＤＮＡ断片を用いて、常法あるいは上記のＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号２または配列番号１６で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。
該オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号１０または１１で表されるオリゴヌクレオチドをあげることができる。
【００３７】
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（本明細書中では、オリゴヌクレオチド誘導体とも言う）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学, 16, 1463 (1997)〕。
【００３８】
［２］本発明のポリペプチドの調製
（１）形質転換体の作製
上記［１］に記載の方法により取得した本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコル・イン・モレキュラ・バイオロジー等に記載された方法を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換えベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
【００３９】
宿主細胞としては、微生物（細菌、酵母等）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、本発明のポリペプチド遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４０】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（ファルマシア社）、pSE280（インビトロジェン社）、pGEMEX-1〔プロメガ(Promega)社〕、pQE-8（キアゲン(QIAGEN)社）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK (-)（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、pGEX（ファルマシア社）、pET-3（ノバジェン社）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Invitrogen社）、ｐＭＡＬ−ｃ２（New England Biolabs社）等を挙げることができる。
【００４１】
プロモーターとしては、大腸菌や枯草菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター（Ｐtrp ｘ２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４２】
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniageneses、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。
【００４３】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法〔Gene, 17, 107 (1982)、Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)〕等を挙げることができる。酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等を用いることができる。
【００４４】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods in Enzymology, 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)〕、酢酸リチウム法〔Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
【００４５】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329, 840 (1987)〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３（特開平2-227075）等が用いられる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００４６】
動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞またはNamalwa KJM-1細胞〔Cytotechnology, 1, 151 (1988)〕、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、SP2/0、NSO等、ラット・ミエローマ細胞としてはYB2/0等、ヒト胎児腎臓細胞としてはHEK293(ATCC: CRL-1573)等、ヒト白血病細胞としては、BALL-1等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはCOS-1、COS-7等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法等をあげることができる。
【００４７】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、モレキュラー・バイオロジー・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Biology, A Laboratory Manual）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００４８】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ・ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等をあげることができる。
【００４９】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
【００５０】
酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
また、患者の生体内から採取した細胞に、適切な本発明のポリペプチドを発現させるための発現ベクターを導入した後、細胞を生体内に戻すことにより、本発明のポリペプチドを患者の生体内で発現させることもできる。
【００５１】
（２）形質転換体の培養
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００５２】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、EagleのMEM培地〔Science, 122, 501 (1952)〕、DMEM培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５５】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地〔ファーミンジェン（Pharmingen）社製〕、Sf-900 II SFM培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ExCell400、ExCell405〔いずれもJRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）社製〕、Grace's Insect Medium〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５６】
（３）発現させたポリペプチドの単離精製
上記形質転換体の培養液から、上記方法により発現させたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００５７】
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まない溶液あるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドあるいはその糖鎖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００５８】
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes & Dev., 4, 1288 （1990）〕、特開平05-336963、WO94/23021に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦｌａｇペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes & Dev., 4, 1288 （1990)〕。更に、該ポリペプチドに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００５９】
更に、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。
また、アドバンスト・ケムテック（Advanced ChemTech）社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテイン・テクノロジー・インストゥルメント（Protein Technology Instrument）社、シンセセル・ベガ（Synthecell-Vega）社、パーセプティブ（PerSeptive）社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
【００６０】
[３]  本発明のポリペプチドを認識する抗体の調製
（１）ポリクローナル抗体の調製
上記［２］に記載の方法により取得した本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。
該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（keyhole limpet haemocyanin）や牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
【００６１】
該抗原の投与は、1 回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊 1976年、Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、該血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
【００６２】
（２）モノクローナル抗体の調製
(2-1)抗体産生細胞の調製
上記(1)において、免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。
該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
【００６３】
(2-2)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)〔Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978)、Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14(SP-2)〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653(653)〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3-X63-Ag8(X63)〔Nature, 256, 495 (1975)〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０7個以上用いる。
【００６４】
(2-3)ハイブリドーマの作製
(2-1)で取得した抗体産生細胞と(2-2)で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０8抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。
添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０-4ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０-5ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０-7ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μＬ／穴ずつ分注し、５％ ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【００６５】
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter14 (1988)〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの全長または部分断片精製標品を適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の(2-4)で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
【００６６】
(2-4)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Pristane）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、(2-3)で取得した本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞５〜２０×１０6細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【００６７】
［４］本発明のポリペプチドのＰＤＥ活性の測定
［２］に記載の方法により、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を宿主として、本発明のポリペプチドを発現させたもの、あるいは、アフリカツメガエル卵母細胞にＤＮＡあるいはin vitroで調製したcＲＮＡを用いてマイクロインジェクション法〔Methods in Enzymology, 207, 225 (1992)、Methods in Enzymology, 254, 458 (1995)〕により発現させたもの、in vitro翻訳産物等をＰＤＥ活性の測定に用いる。ＰＤＥ活性は検出可能な試薬（例えば、放射性試薬、蛍光試薬または比色試薬）で標識された環状ヌクレオチド（例えば、[3Ｈ]ｃＡＭＰあるいは[3Ｈ]ｃＧＭＰ）の３’−ホスホエステル結合を加水分解して生成するヌクレオシド５’−モノホスフェート（例えば、[3Ｈ]５’ＡＭＰあるいは[3Ｈ]５’ＧＭＰ）の分離、定量、あるいはさらに、５’ヌクレオチダーゼ処理した後、生成物を分離、定量することにより測定する［J. Biol. Chem., 257, 1973 (1982), Methods in Enzymology, 159, 457 (1988)］。また、内在性の２つのＰＤＥ（ｐｄｅ１、ｐｄｅ２）を欠損した酵母［例えば、Saccharomyces cerevisiae strain PP5 (ATCC number 96135)、Saccharomyces cerevisiae strain 10DAB (ATCC number 74049)］中で本発明のポリペプチドを発現させ、熱ショック感受性、窒素欠乏に対する感受性などの回復を指標にＰＤＥ活性を検出することもできる[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11970 (1993)、J. Biol. Chem., 274, 4839 (1999)]。
【００６８】
［５］本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの探索・同定および治療薬としての利用
上記［４］の活性測定に用いることのできる細胞、あるいは、後述［７］の方法で本発明のポリペプチドあるいはｍＲＮＡを発現していることの確認された組織、細胞等を用い、被験試料を添加し、上記［４］記載の方法で、ＰＤＥ活性を測定する。
被験試料の添加の有無における、本発明のポリペプチドのＰＤＥ活性の比較、あるいは、本発明のポリペプチドを発現させた内在性ＰＤＥ欠損酵母を用いたバイオアッセイにより、被験試料の中からＰＤＥ活性を増強する物質（アゴニスト）および阻害する物質（アンタゴニスト）をスクリーニングすることができる。
【００６９】
被験試料としては、合成化合物、天然に存在する蛋白質、人工的に合成された蛋白質、ぺプチド、糖質、脂質、これらの修飾体、誘導体を、また哺乳動物(例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト等)の尿、体液、組織抽出物、細胞培養上清、細胞抽出物を、更に、非ぺプチド性化合物、発酵生産物、植物その他の生物の抽出物等をあげることができる。
上記の方法により取得される、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、治療薬として単独で用いることが可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として用いることが望ましい。
【００７０】
該治療薬の投与方法としては、治療に際し最も効果的な方法を使用することが望ましく、経口投与または、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与による方法を用いることができる。
該治療薬の剤形としては、軟膏剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、テープ剤等をあげることができる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等をあげることができる。
【００７１】
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造することができる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用い製造することができる。
【００７２】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、例えば、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製することができる。
座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製することができる。
噴霧剤は、上記で取得されたアゴニストまたはアンタゴニストをそのまま噴霧剤として用いることが可能であるが、受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製した噴霧剤が好ましい。
担体として、具体的には乳糖、グリセリン等を例示することができる。
【００７３】
上記で取得されたアゴニストまたはアンタゴニスト、および担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤を調製することが可能である。
これらの非経口剤においても、経口剤で添加剤として例示した成分を添加することができる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
【００７４】
[６]本発明のポリペプチドの発現を調節する化合物（以下、発現調節化合物と略す）の探索および同定
(１)本発明の抗体を用いた発現調節化合物の探索および同定
本発明のポリペプチドを発現する細胞を被験試料と接触させた後、本発明の抗体を用いることにより、本発明のポリペプチドの発現調節化合物を探索、同定することができる。
細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞、細胞株、組織ならいかなるものでも用いることができる。
例えば、下記［７］に記載した抗体により免疫学的に検出する方法あるいはｍＲＮＡを検出する方法を用い、該ポリペプチドの発現が認められた細胞、細胞株あるいは組織を用いることができる。
好適な細胞株として、例えば、HepG2細胞をあげることができる。
被験試料としては上記［５］の被験試料であげたものを用いることができる。
【００７５】
本発明のポリペプチドを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞と接触させた後、本発明の抗体を用い、該細胞の発現したポリペプチド含量を定量する。定量する方法としては、例えば下記の免疫細胞染色を利用した方法をあげることができる。
培養付着細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０．０５％ トリプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ(エチレンジアミン４酢酸)を含むＰＢＳ緩衝液３ｍＬを加え、余分な溶液を除いた後、３７℃、５分間インキュベートすることによりフラスコより細胞を剥がす。
浮遊細胞については培養細胞をそのまま用いることができる。該細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄後、固定液に懸濁する。固定液としては例えば３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ緩衝液を挙げることができる。室温にて３０分インキュベート後、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し膜透過性反応液に懸濁する。膜透過性反応液としては例えば０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ緩衝液を挙げることができる。
【００７６】
該処理を行った細胞を免疫細胞染色用緩衝液（１％ ＢＳＡ、０．０２％ ＥＤＴＡ、０．０５％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）等に懸濁し、１〜２０×１０5個ずつ丸底９６穴プレートに分注する。
該プレートに、本発明のモノクローナル抗体を分注する。
モノクローナル抗体としては、［３］(2-3)で取得した本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清、［３］(2-4)で取得した精製モノクローナル抗体をあげることができる。更に、該モノクローナル抗体を標識した抗体も用いることができる。
モノクローナル抗体を標識した抗体としては、例えばビオチン標識した抗体をあげることができる。
ビオチン標識した抗体は公知の方法（酵素抗体法：学際企画刊1985年）で調製することができる。
上記抗体を、免疫細胞染色用緩衝液あるいは１０％動物血清を含む免疫細胞染色用緩衝液を用いて０．１〜５０μｇ／ｍＬの濃度になるように希釈する。
該希釈抗体を２０〜５００μＬ／穴となるように分注し、氷冷下で３０分間放置する。
【００７７】
標識されていない抗体を用いた場合には、上記プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞を洗浄する。ＦＩＴＣ（fluorescein  isothiocyanate）あるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体あるいは抗ラットイムノグロブリン抗体を０．１〜５０μｇ／ｍＬ程度の濃度で含む免疫細胞染色用緩衝液を５０〜５００μＬ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
ビオチン標識した該モノクロ−ナル抗体を用いた場合には、上記プレートにＦＩＴＣあるいはフィコエリスリン等の蛍光色素で標識したストレプトアビジンを５０〜５００μＬ／穴ほど分注し、氷冷下で３０分間遮光して放置する。
両ケースとも、放置後、プレートに免疫細胞染色用緩衝液を添加し、細胞をよく洗浄し、蛍光顕微鏡、セルソーター等により解析する。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明のポリペプチド含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
【００７８】
（２）本発明のポリペプチド遺伝子の転写産物定量系を用いた探索および同定
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現する細胞を被験試料と接触させた後、該ｍＲＮＡ含量を定量することにより発現調節化合物を探索、同定することができる。
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドｍＲＮＡを発現する細胞としては、例えば上記［６］(1)記載の細胞株を、被験試料としては上記［５］のものを用いることができる。
本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現する細胞を、該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現した該ｍＲＮＡの含量を、通常のノーザンハイブリダイゼーション法、ＲＮＡのドットブロットハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法等を用い定量する。
【００７９】
ハイブリダイゼーション法等に用いることのできるプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ法等に用いることのできるプライマーとして、本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子断片をあげることができる。
具体的には、配列番号２または配列番号１６に記載の塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。
被験試料を添加しない系と比較し、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
【００８０】
（３）レポーター遺伝子を用いた探索および同定
本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子の転写を制御する領域（以下、転写制御領域と略す）の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含むプラスミドで形質転換された形質転換体と被験試料とを接触させた後、レポーター遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現量を定量することにより発現調節化合物を探索、同定することができる。
転写制御領域は、通常、遺伝子の５’上流に含まれることが多い。本発明のポリぺプチドをコードする遺伝子の５’上流領域は、例えばGenome Walker kits（Clontech社製）等を用いて調製することができる。また、該領域を適当な制限酵素を用い、適切な長さに切断した断片を転写制御領域として用いることができる。
【００８１】
レポーター遺伝子としては、該遺伝子の翻訳産物が細胞内で安定であり、該翻訳産物の存在量が容易に定量できるものであればいかなるものでも用いることができ、該遺伝子がコードするポリペプチドとして、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、β-ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β−グルクロニダーゼ、エクオリン、グリーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）等をあげることができる。
該転写制御領域を含むレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、いかなる細胞も用いることができるが、好適には、［６］（１）記載の本発明のポリペプチドあるいは該ポリペプチドｍＲＮＡの発現が認められている細胞株を用いることができる。
【００８２】
被験試料として、上記［５］のものを用いることができる。
転写制御領域の下流に常法によりレポーター遺伝子を連結し、作製したプラスミドを用い、常法により宿主細胞を形質転換する。
また、ポジティブセレクション用マーカー（Ｇ４１８耐性遺伝子等）およびネガティブセレクション用マーカー（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼやジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子等）をつないだジーンターゲティングベクターを作製し、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子の一部をレポーター遺伝子で置換した細胞株を作製することもできる〔Nature, 336, 348 (1988)、Analytical Biochemistry, 214, 77 (1993)、Gene Targeting, The Practical Approach Series, IRL Press (1993)〕。
【００８３】
該形質転換体を、例えば該細胞の増殖することのできる培地に懸濁し、被験試料を該培地に添加し、該細胞を接触させた後、該細胞の発現したレポーター遺伝子にコードされたポリペプチドの量を、該ポリペプチドに適した方法で検出、定量する。
検出、定量法として、ＣＡＴの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６０頁に記載の方法を、β−ｇａｌの場合には、例えば、モレキュラー・クローニング第２版，１６章，６６頁に記載の方法を、ｌｕｃの場合には、例えば、実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ４遺伝子導入と発現・解析法, 89(1994)に記載の方法を、ＧＦＰの場合には、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4653 (1997)記載の方法等をあげることができる。被験試料を添加しない系と比較し、レポーター遺伝子にコードされたポリペプチド含量を増加あるいは減少させる被験試料を探索することにより、発現調節化合物を同定することができる。
【００８４】
［７］本発明のＤＮＡ、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストおよび発現調節化合物の利用
（１）本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織や細胞から［１］(1)と同様にして抽出したＲＮＡについてノーザンハイブリダイゼーションを行うことにより、その組織や細胞における本発明のポリペプチド遺伝子のｍＲＮＡを検出あるいは定量することができる。各種の組織でそのｍＲＮＡの発現量を比較することにより本発明のポリペプチドの組織発現分布を知ることができる。
【００８５】
（２）本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡの特異的プライマーとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織や細胞から［１］(1)と同様にして抽出したＲＮＡについてＲＴ-ＰＣＲ〔reverse transcription PCR；PCR Protocols (1990)〕を行うことにより、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの検出や定量を行うことができる。
該ｍＲＮＡを定量する方法は、本遺伝子が関与する病態の診断に用いることができる。
各種病態モデル動物において、該ｍＲＮＡを定量することにより、病態における該遺伝子産物の重要性を明らかにすることができる。また、薬剤の有無による該ｍＲＮＡの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。
【００８６】
（３）本発明のオリゴヌクレオチドは、これをプローブとして用いて、ヒトおよびマウスなど非ヒト哺乳動物の組織切片に対してin situハイブリダイゼーション〔Methods in Enzymology, 254, 419 (1995)〕を行うことにより、組織内での本発明のポリペプチドの発現細胞の特定等のより細かい発現分布を知ることができる。
これらの方法によって得られる、本発明のポリペプチドがどのような組織や細胞で発現しているかに関する情報および細胞がどのような刺激を受けたときに発現量が変化するかに関する情報は、本発明のポリペプチドの生理機能や病態への関与を解析するために有用である。
【００８７】
（４）本発明のＤＮＡをプローブとして用い、ゲノムＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーション〔モレキュラー クローニング 第２版〕を行うことにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することができる。
変異の検出を行うことにより、該遺伝子の変異が原因となっている可能性のある、例えば糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆または悪性腫瘍等の疾患の診断を行うことができる。
【００８８】
（５）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子をＰＣＲ等を用いて増幅して塩基配列を解析することにより、あるいはＤＮＡチップ等を用いて解析を行うことにより、１塩基多型(single nucleotide polymorphisms；ＳＮＰ)などの多型を検出することができる。多型の検出を行うことにより、該遺伝子の多型が関連している可能性のある、例えば糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆または悪性腫瘍等の疾患の診断を行うことができる。
【００８９】
（６）本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド(ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその誘導体)を用い、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写もしくはｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより〔化学, 46, 681 (1991)、Bio/Technology, 9, 358 (1992)〕、該遺伝子が発症に関与している可能性のある、例えば糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の疾患の予防や治療に用いることができる。
【００９０】
上述のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜６０塩基と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳開始領域にある５〜６０塩基と相補的な塩基配列を基にして設計・調製し、生体内に投与する。
本発明のＤＮＡを含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
【００９１】
（７）本発明のＤＮＡを用い、［２］記載の方法により本発明のポリペプチドを取得することができる。
本発明のポリペプチドの用途としては、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の疾患の治療薬または予防薬が考えられる。
本発明のポリペプチドを含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
【００９２】
（８）本発明のオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖としてレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス等のウイルスベクター、その他のベクターに組み込んで遺伝子治療用ベクターとし、遺伝子治療に用いることができる。
【００９３】
（９）本発明のポリペプチドを抗原として用い、［３］記載の方法により本発明のポリペプチドに対する抗体を製造することができる。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、本発明のポリペプチドを免疫学的に検出または定量することができる。
具体的には、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、酵素標識抗体法や蛍光抗体法による免疫組織染色、ウェスタンブロット法等を用いた検出法をあげることができる。
具体的には、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、125I等の放射性同位体で標識した本発明のポリペプチドと本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いるラジオイムノアッセイ法等をあげることができる。
【００９４】
また、本発明の抗体は病理組織切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。
本発明の抗体を用い、健常者および被験者の細胞または組織に存在する本発明のポリペプチドを免疫学的に検出または定量し、その量を健常者と被験者とで比較し、発現量が変化しているかどうかを調べることにより、被験者の糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の病態の診断に用いることができる。
また、本発明の抗体を用いて、各種病態モデル動物の組織および細胞に存在する該ポリペプチドを免疫学的に検出または定量し、正常動物と比較することにより、病態における該ポリペプチドの重要性を明らかにすることができる。さらに、薬剤の有無による該ポリペプチドの発現量を比較することにより薬剤を評価することができる。
【００９５】
（１０）本発明のポリペプチドの機能（ＰＤＥ活性）を阻害する抗体を投与することにより、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の疾患の治療または予防が期待される。
本発明の抗体を含有する医薬は、上記［５］の本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの医薬製剤の調製法と同様な方法を用いて調製することができ、調製された該医薬製剤を上記［５］の場合と同様の方法で投与することができる。
【００９６】
（１１）本発明のアゴニスト、アンタゴニストおよび本発明のポリペプチド遺伝子の発現を調節する化合物は、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症または悪性腫瘍等の疾患の治療または予防に用いることが期待される。
以下の実施例により本発明を具体的に例示するが、本発明の範囲は実施例によって限定されることはない。
【００９７】
【実施例】
実施例１：PDE活性を有する蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ断片のクローン化（１）HepG2細胞由来ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト肝細胞株HepG2から、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989）に記載されているCytoplasmic RNA抽出法およびPolyA(+)RNA精製法に準じmRNAを抽出し、精製した。それぞれのpolyA(+)RNAよりオリゴキャプ法〔M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138, 171 (1994)〕によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号３）およびOligo dT primer（配列番号４）を用いて、文献〔鈴木・菅野, 蛋白質 核酸 酵素, 41, 197 (1996)、 Y. Suzuki et al., Gene, 200, 149 (1997)〕に従ってBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Pyrophosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖ｃＤＮＡの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'末端側と3'末側のPCRプライマー（配列番号５および６）を用いたPCR(polymerase chain reaction)により2本鎖ｃＤＮＡに変換した後、制限酵素SfiIで切断した。該ｃＤＮＡをDraIIIで切断したベクターpME18SFL3（GenBank AB009864, Expression vector, 3392 bp）に組み込み、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡは発現が可能な方向に組み込んだ。
【００９８】
（２）ランダムシークエンス
上記（１）で調製したｃＤＮＡライブラリーの各大腸菌クローンから常法に従ってプラスミドＤＮＡを取得し、各プラスミドが含有するｃＤＮＡの5'末端の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、キット（BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）とDNAシークエンサー（ABI PRISM 377, PE Biosystems社製）を用いて行った。プライマーとしては、配列番号７および８に示す合成ＤＮＡを使用した。
【００９９】
（３）Ｎ末領域のクローン化と相同性検索ソフトウェアを用いた解析
得られた塩基配列についてはヒトPDE10A（GenBank:AB020593）の遺伝子配列情報を基にブラストサーチ相同性検索ソフトウェアを用いて解析し、相同性の認められる配列を見出した。該クローンの全塩基配列を決定した結果、プラスミドhep10314には配列番号２に記載された塩基配列の塩基番号３３９番目からの約2.1kbのｃＤＮＡが含まれ、配列番号１に記載された新規ポリペプチド中の341アミノ酸がコードされていた。
該配列情報をもとに配列番号９および配列番号１０に記載されたDNAプライマーを設計し、Human Pancreas Marathon-Ready ｃＤＮＡキット(クロンテック社製)を用いて、以下に示す方法によりN末領域をPCR増幅した。
【０１００】
即ち、Human Pancreas Marathon-Ready ｃＤＮＡ 2μL、配列番号９およびAP1(キットに添付)のプライマー各々0.2μmol/L、各成分200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合液、Taq Goldポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)2.5単位および1×Taq Gold 緩衝液を含む反応溶液50μLを用い、下記条件下でPCRを行なった。
即ち、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用い、95℃で10分間加熱後、94℃で30秒間、60℃で2分間の工程を1サイクルとして30サイクル行ない、更に72℃で8分間加熱した。続いて、得られた該PCR反応液の100倍希釈液 2μL、配列番号１０およびAP2(キットに添付)のプライマー各々0.2μmol/L、各成分200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合液、Taq Goldポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)2.5単位および1×Taq Gold 緩衝液を含む反応溶液50μLを用いて、上記方法で同様にPCRを行なった。
【０１０１】
得られた該PCR反応液より5μLを分取し、アガロース電気泳動により約0.7kbのDNA断片が増幅されたことを確認後、QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてマニュアルに従ってDNA断片を精製した。
上記で回収したDNA断片50ngおよびpT7Blue T-Vector(Novagen社製)50ngをDNA Ligation Kit Ver.２(宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合反応を行なった。該反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌ＪＭ109株を形質転換し、常法によりプラスミドpT-1を得た。
プラスミドpT-1に含まれるDNA断片の塩基配列を常法によって決定することにより、挿入DNA断片は挿入断片中のClaＩ部位でhep10314のClaＩ部位と連結可
能であることが判明した。連結した塩基配列を配列番号２に記載した。該配列には、配列番号１に記載された新規ポリペプチドがコードされていた。
また、既知タンパク質配列データベースに対して、該アミノ酸配列のSmith＆Waterman検索を行なったところ、PDE5A、PDE10Aファミリーとの相同性が強く検出された。そこで、各々のファミリーからヒトPDE5Aアミノ酸配列(GenBank：CAA06170)、ヒトPDE10Aアミノ酸配列(GenBank：BAA78034)を選択しアライメントを作製した。図１にヒトPDE5A配列、図２にヒトPDE10A配列とのアライメント結果を示す。PDEに共通したアミノ酸配列であるHDXXHXXXXN配列も認められた(図１、図２の下線部)。
【０１０２】
実施例２：ノーザンハイブリダイゼーションによるmRNAの発現解析
実施例１で決定した塩基配列の情報を基に配列番号１１に示される５'端側DNAプライマーと配列番号１０に示される３'端側DNAプライマーを設計し、合成した。
得られた2種類のプライマー各々0.2μmol/L、実施例１のプラスミド
(hep10314)10ng、各成分200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合液、ExTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)2.5単位および1×ExTaq緩衝液を含む反応溶液50μLを用い、下記条件下でPCRを行なった。
即ち、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用い、95℃で3分間加熱後、94℃で1分間、60℃で1分間の工程を1サイクルとして25サイクル行ない、更に72℃で8分間加熱した。
得られた該PCR反応液より5μLを分取し、アガロース電気泳動により約0.2kbのDNA断片が増幅されたことを確認後、QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN社製)を用いてマニュアルに従ってDNA断片を精製した。
【０１０３】
一方、pBluescript II KS(-)(STRATAGENE社製)2μgを50mmol/Lトリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L ジチオスレイトール（以下、DTTと略記する）、100mmol/L 塩化ナトリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のEcoRV(宝酒造社製)を加え、37℃で3時間消化反応を行った。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、該DNA断片を50mmol/Lトリス−塩酸(pH9.0)、1mmol/L 塩化マグネシウムからなる緩衝液50μLに溶解し、0.5単位のアルカリホスファターゼ（以下、BAPと略記する）(E. coli C75)(宝酒造社製)を加えて60℃で30分間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてpBluescript II KS(-)由来のEcoRV-BAP処理断片(3.0kb)を精製した。
上記で回収したDNA断片50ngおよびpBluescriptII KS(-)由来のEcoRV-BAP処理断片をDNA Blunting Kit(宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合反応を行った。該反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌ＪＭ109株を形質転換し、常法によりプラスミドp200を得た。
【０１０４】
プラスミドp200の2μgを50mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化ナトリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のEcoRI(宝酒造社製)とBstXI(宝酒造社製)を加え、37℃で3時間消化反応を行った。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、該DNA断片をDNA Blunting Kit(宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合反応を行った。該反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌ＪＭ109株を形質転換し、常法によりNorthern解析プローブ作製用プラスミドp200-EBを調製した。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を図３に示す。
調製したプラスミドp200-EB 10μgを10mmol/L トリス−塩酸（pH7.5）、10mmol/L 塩化マグネシウム、50mmol/L 塩化ナトリウム、1mmol/L DTTからなる緩衝液50μLに溶解し、30単位のHindIII(宝酒造社製)を加え、37℃で6時間消化反応を行った。該反応液を用いてフェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、DNA断片を回収した。
【０１０５】
該DNA断片の1μgを、40mmol/Lトリス−塩酸（pH8.0）、6mmol/L 塩化マグネシウム、2mmol/L スペルミジン、10mmol/L DTT、1mmol/L ATP、1mmol/L CTP、1mmol/L GTP、0.65mmol/L UTP、0.35mmol/L ディゴキシゲニン-11-UTPを含む緩衝液50μLに溶解し、40単位のT7 RNAポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を添加し、37℃で2時間in vitro転写反応を行なった。
反応後、得られた該反応液より、エタノール沈殿によりディゴキシゲニン標識cRNAプローブを回収した。
該プローブを用いて、ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のpoly(A)+ RNAフィルター〔Human Multiple Tissue Northern Blotsのフィルター(Clontech社製)〕とヒト心臓、脳、肝臓、膵臓、胎盤、肺のpoly(A)+ RNAフィルター〔Human Normal Tissue ｍRNA blotＩ(Normalized)のフィルター(東洋紡社製)〕に対して、以下に示す条件に従いノーザンハイブリダイゼーションを行った。
【０１０６】
該フィルターを、50％ホルムアミド、5倍濃度のSSC（1倍濃度のSSCの組成は、150mmol/L 塩化ナトリウムおよび15mmol/L クエン酸ナトリウムよりなる）、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSと略記する）、2％ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社製）、0.1mg／mL サケ精子DNAを含む緩衝液（以下、ハイブリダイゼーションバッファーと略記する）中に浸漬し、70℃で2時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
該フィルターを、上述のディゴキシゲニン標識cRNAプローブが１μg／mLの濃度で溶解しているハイブリダイゼーションバッファーに浸漬し、70℃で15時間ハイブリダイゼーションを行なった。
該フィルターを2倍濃度のSSC、0.1％SDSよりなる緩衝液中で70℃、10分間浸漬する条件で1回、0.2倍濃度のSSC、0.1％SDSよりなる緩衝液中で70℃、30分間浸漬する条件で3回洗浄した。
該フィルターを100mmol/L マレイン酸（pH7.5）、150mmol/L 塩化ナトリウムよりなる緩衝液（以下、DIG Ｉ緩衝液と略記する）中で室温、15分間浸漬する条件で2回洗浄し、SDSを除去した。
該フィルターを100mmol/L マレイン酸（pH7.5）、150mmol/L 塩化ナトリウム、1％ ブロッキング試薬よりなる緩衝液（以下、DIGII緩衝液と略記する）に浸漬し、1時間室温にてブロッキングを行った。
【０１０７】
該フィルターを、DIGII緩衝液で10000倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ディゴキシゲニン抗体Fabフラグメント（ベーリンガーマンハイム社製）溶液中に浸漬し、室温で30分間抗原抗体反応を行った。
該フィルターをDIGＩ緩衝液で室温、30分間浸漬する条件で3回洗浄し、余分な抗体を除去した後、100mmol/L トリス−塩酸（pH9.0）、100mmol/L 塩化ナトリウム、50mmol/L 塩化マグネシウムからなる緩衝液（以下、DIGIII緩衝液と略記する）に5分間浸漬し平衡化した。
該フィルターを、DIGIII緩衝液で100倍に希釈した発光基質CDP-Star（ベーリンガーマンハイム社製）溶液中に室温で15分間浸漬し、シグナルを発光させ、CCDカメラ（富士写真フィルム社製）で検出した。
結果を図４に示す。膵臓において約2.6キロヌクレオチドのバンドが認められた。
【０１０８】
実施例３：GST融合蛋白質発現大腸菌を用いたPDE活性の測定
Ａ．GST融合蛋白質発現用プラスミドの構築
実施例１で取得したDNA断片について、PDE活性を有するアミノ酸配列をコードしていることを確認するため、グルタチオンSトランスフェラーゼ(以下、GSTと略記する)融合蛋白質発現大腸菌を作製した。
実施例１で決定した塩基配列の情報をもとに配列番号１２に示される５'端側DNAプライマーと配列番号１３に示される３'端側DNAプライマーを設計し、合成した。
得られた2種類のプライマー各々0.2μmol/L、実施例１のプラスミド(hep10314)10ng、各成分200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）混合液、PLATINUM Pfx DNAポリメラーゼ(ライフテック社製)2.5単位および1×PLATINUM Pfx DNAポリメラーゼ緩衝液を含む反応溶液50μLを用い、下記条件下でPCRを行った。
即ち、サーマルサイクラーPTC-200(MJリサーチ社製)を用い、95℃で3分間加熱後、94℃で1分間、60℃で1分間の工程を1サイクルとして25サイクル行い、更に72℃で8分間加熱した。
【０１０９】
得られた該PCR反応液より5μLを分取し、アガロース電気泳動により約1.0kbのDNA断片が増幅されたことを確認した。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、20mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化カリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のBamHI(宝酒造社製)を加え、37℃で3時間消化反応を行った。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、該DNA断片を10mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、50mmol/L 塩化ナトリウム、0.01% ウシ血清アルブミンからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のXbaＩ(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてBamHI−XbaＩ断片(1.0kb)を精製した。
【０１１０】
一方、プラスミドpVL1393(ファーミンジェン社製)2μgを20mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化カリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のBamHIを加え、37℃で3時間消化反応を行った。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、該DNA断片を10mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、50mmol/L 塩化ナトリウム、0.01% ウシ血清アルブミンからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のXbaＩを加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてBamHI−XbaＩ断片(9.6kb)を精製した。
上記で回収したPCR増幅BamHI−XbaＩ断片(1.0kb)50ngおよびpVL1393由来のBamHI−XbaＩ断片(9.6kb)をDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合反応を行った。該反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌ＪＭ109株を形質転換し、常法によりプラスミド
pPDE-1393を得た。
【０１１１】
該プラスミドpPDE-1393の2μgを50mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化ナトリウム、0.01% ウシ血清アルブミン、0.01% Triton X-100からなる緩衝液50μLに溶解し、それぞれ10単位のClaＩおよびNotＩを加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてClaＩ-NotＩ断片(1.0kb)を精製した。
実施例１で取得したプラスミドpT-1 2μgを50mmol/Lトリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化ナトリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、それぞれ10単位のEcoRVおよびClaＩを加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel
Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてEcoRV−ClaＩ(0.3kb)を精製した。
【０１１２】
一方、プラスミドpGEX-5X-1(ファルマシア社製)2μgを33mmol/L トリス−塩酸(pH7.9)、10mmol/L 酢酸マグネシウム、0.5mmol/L DTT、66mmol/L 酢酸カリウムからなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のSmaＩを加え、30℃で3時間消化反応を行った。フェノール抽出とエタノール沈殿の後、該DNA断片を50mmol/L トリス−塩酸(pH7.5)、10mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、100mmol/L 塩化ナトリウム、0.01% ウシ血清アルブミン、0.01%Triton X-100からなる緩衝液50μLに溶解し、10単位のNotＩを加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いてSmaＩ−NotＩ断片(5.0kb)を精製した。
上記で回収したpPDE-1393由来のClaＩ−NotＩ断片(1.0kb)50ng、pT-1由来のEcoRV−ClaＩ断片(0.3kb)50ngおよびpGEX-5X-1由来のSmaＩ−NotＩ断片（5.0kb)50ngをDNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造社製）を用いてマニュアルに従って結合反応を行った。該反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌ＪＭ109株を形質転換し、常法によりプラスミドpGST-PDEを含む大腸菌ＪＭ109/pGST-PDE株を得た。該プラスミドの構築過程および制限酵素地図を図５に示す。
【０１１３】
Ｂ．GST融合蛋白質の大腸菌を用いた発現とPDE活性の測定
200μg/mLのアンピシリンを含むLB培地50mLに該大腸菌前培養液(30℃、200μg/mLのアンピシリンを含むLB培地で一晩培養)を1/100量加え、25℃で振とう培養した。OD550値が0.5になったところで、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(2mmol/L)を添加し、25℃で3時間の条件で発現を誘導した。遠心分離(3,000rpmで10分間)により菌体を回収し、抽出液(20mmol/Lトリス−酢酸(pH7.5)、2mmol/L 塩化マグネシウム、1mmol/L DTT、250unit/mL アプロチニン、40μg/mL フッ化フェニルメチルスルホニル、1μg/mL ペプスタチンA)に懸濁して、超音波破砕機(TOMY model UR-200R)を用いて大腸菌を破壊した。上記抽出液を10,000rpmで30分間遠心分離し、上清をPDE活性測定に用いた。
【０１１４】
Ｃ．PDE活性の測定
PDE活性はKincaid,R.L.とManganiello,V.C.の方法〔Method.Enzymol., 159, 457-470(1988)〕に従って測定した。[3H]-cAMPまたは[3H]-cGMPを基質として300μLの反応液〔50mmol/LのN,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(pH7.2)、1mmol/L塩化マグネシウム、0.1mmol/Lエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸二ナトリウム〕中で行った。基質濃度は、1μmol/Lとした。反応液を30℃で15分インキュベートした後、HClを添加して反応を停止した。反応生成物を5'-ヌクレオチダーゼ(シグマ社製)によってアデノシンに変換し、DEAE-Sephadex A-25カラム(ファルマシア社製)で未反応物と分離した。溶出液をシンチレーションバイアルに移し、ウルチマゴールド(Packard社製)を6mL加え、液体シンチレーションカウンター(Beckman LS6500)を用いて放射活性を測定した。非触媒的水解量は大腸菌可溶性画分を添加しない時の[3H]-cAMPおよび[3H]-cGMP分解量とした。大腸菌可溶性画分による分解量は全分解量から非触媒的水解量を差し引くことにより求めた。蛋白量は、Bio Rad Protein Assay法を用いて定量した。コントロールとしてプラスミドpGEX-5X-1のみを導入した大腸菌可溶性画分を用いた。結果を図６に示す。
以上、本発明のポリペプチドがｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを加水分解するＰＤＥ活性を有することが明白となった。
【０１１５】
実施例４：ＰＤＥ活性を有する蛋白質をコードする全長ヒトｃＤＮＡ断片のクローン化
（１）ヒト胎児腎由来ｃＤＮＡライブラリーからのクローン化
プラスミドpGST-PDE 30μgを、20mmol/L トリス−塩酸（pH8.5）、10mmol/L 塩化マグネシウム、100mmol/L 塩化カリウム、1mmol/L DTTを含む緩衝液50μLに溶解し、40単位のBamHIおよびHpaI（宝酒造社製）を加え、37℃で4時間消化反応を行った。
該反応液をアガロース電気泳動にかけ、約1kbのDNA断片を回収した。
該DNA断片を、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用い、マニュアルに従って精製した。精製された該DNA断片を、ECLダイレクト核酸ラベリング・検出システム(Amersham社製)を用いて、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識し、プローブとして用いた。
【０１１６】
該プローブを用いてヒト胎児腎由来cDNAライブラリー(クロンテック社製、商品名：Human Fetal Kidney 5'-STRETCH PLUS cDNA Library)2×１０5クローンを用いて、プラークハイブリダイゼーションを行い、プローブにハイブリダイズする2個の独立したファージクローン（ベクター：λｇｔ１０）を得た（クローン6-1、23-1）。該ハイブリダイゼーションの操作は、全てECLダイレクト核酸ラベリング・検出システム(Amersham社製)のマニュアルに従って行った。該ファージクローンのうちクローン23-1に含まれるcDNA断片を、ファージベクターからプラスミドベクターへ組み換え直した。
【０１１７】
該ファージクローン23-1のDNA 20μgを、50mmol/L トリス−塩酸（pH7.5）、10mmol/L 塩化マグネシウム、100mmol/L 塩化ナトリウム、１mmol/L DTTを含む緩衝液30μL中に溶解し、15単位のEcoRI（宝酒造社製）を添加し、37℃で4時間消化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、約2kbおよび1kbのDNA断片を回収した。
該DNA断片を、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用い、マニュアルに従って精製した。
pBluescriptII KS(-)(STRATAGENE社製)5μgを50mmol/L トリス−塩酸（pH7.5）、10mmol/L 塩化マグネシウム、100mmol/L 塩化ナトリウム、1mmol/L DTTを含む緩衝液30μLに溶解し、15単位のEcoRI（宝酒造社製）を添加し、37℃で2時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿によりEcoRI消化DNA断片を回収した。
該DNA断片を50mmol/Lトリス−塩酸（pH9.0）、1mmol/L塩化マグネシウムを含む緩衝液30μLに溶解し、0.5単位のBAP（E．coli C75）（宝酒造社製）を添加し、60℃で30分間脱リン酸化反応を行った。該反応液をアガロース電気泳動し、約3.0kbのDNA断片を回収した。該DNA断片を、QIAEX II Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用い、マニュアルに従って精製した。
【０１１８】
上述のクローン23-1より得られた約2.0kb、約1.0kbのEcoRI DNA断片150ngおよびpBluescriptII KS(-)のEcoRI−BAP処理済み断片50ngを66mmol/L トリス−塩酸（pH7.5）、6.6mmol/L 塩化マグネシウム、10mmol/L DTT、0.1mmol/L アデノシン3リン酸を含む緩衝液20μLに溶解し、T4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）175単位を添加し、16℃で16時間結合反応を行った。
該結合反応により得られた組み換えプラスミドDNAを用いて大腸菌JM109株を形質転換し、常法によりプラスミドp23-1kおよびp23-2kを取得した。
該プラスミドに含まれるcDNA断片の塩基配列を決定した結果、プラスミドp23-1kおよびp23-2kの挿入DNA断片はEcoRI部位で連結可能であり、配列番号１６に記載された約3.0kbのcDNAが含まれ、該cDNAには配列番号１５に記載された576アミノ酸よりなる新規のポリペプチドがコードされていた。p23-1kおよびp23-2kの構造を図７に示す。
該ポリペプチドが有するアミノ酸配列を、既知のPDE配列と比較したところ、PDE5Aとの高い相同性が認められた。該アミノ酸配列とヒトPDE5Aアミノ酸配列(GenBank：CAA06170)とのアライメントを図８に示す。
以上の結果から、該配列は新規PDEをコードしていると考えられる。
【０１１９】
(２)RT-PCR法を用いた発現解析
上記した実施例４の(1)で決定した塩基配列の情報を基に配列番号１７に示される５'端側DNAプライマーと配列番号１８に示される３'端側DNAプライマーを設計し、合成した。
2種類のプライマー(配列番号１７および配列番号１８)各々1.0μmol/L、ヒト組織mRNAから作成したcDNAライブラリー2μL、各成分200μmol/LのdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合液、Taq Goldポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)2.5単位および1×Taq Gold緩衝液（Mg plus）を含む反応溶液20μLを用い、下記条件下でPCRを行なった。
【０１２０】
即ち、サーマルサイクラーPTC-200(MJリサーチ社製)を用い、95℃で10分間加熱後、94℃で1分間、60℃で1分間の工程を１サイクルとして38サイクル行い、更に72℃で8分間加熱した。
得られた該PCR反応液より10μLを分取し、アガロース電気泳動により予想される約400bpのDNA断片の増幅を確認した。精巣、前立腺、乳腺、膵臓での発現が認められた。電気泳動結果を図９に示す。
【０１２１】
【発明の効果】
本発明により得られる新規ＰＤＥポリペプチドのＤＮＡを用いることにより、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧、腎炎、膵炎、潰瘍、アレルギー、喘息、リウマチ、骨粗鬆症、痛み、不安症、分裂病、躁鬱病、パーキンソン病、痴呆、感染症、悪性腫瘍等の疾患の診断、予防、治療が可能となる。
【０１２２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの触媒ドメイン内のモチーフ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【０１２３】
【配列表】
2005229806.tif 000002
【０１２４】
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2005229806.tif 000004
2005229806.tif 000005
【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】新規ヒトPDEのアミノ酸配列(上段：アミノ酸番号を数字＋’で記載)と、ヒトPDE5A（GenBank：CAA06170）のアミノ酸配列(下段：アミノ酸番号を数字＋”で記載)との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。(アミノ酸残基は一文字表記で示す。)下線はHDXXHXXXXNモチーフを示す。
【図２】新規ヒトPDEのアミノ酸配列(上段：アミノ酸番号を数字＋’で記載)と、ヒトPDE10A(GenBank：BAA78034)のアミノ酸配列(下段：アミノ酸番号を数字＋”で記載)との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。(アミノ酸残基は一文字表記で示す。)下線はHDXXHXXXXNモチーフを示す。
【図３】プラスミドp200-EBの構築過程および制限酵素地図を示した図である。
【図４】新規ヒトPDEホモログｃDNAの一部の配列（約0.2kb）をプローブとしてヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓のpoly(A)+ RNAフィルター〔Human Multiple Tissue Northern Blotsのフィルター(Clontech社製)〕およびヒト心臓、脳、肝臓、膵臓、胎盤、肺のpoly(A)+ RNAフィルター〔Human Normal Tissue ｍRNA blotＩ(Normalized)のフィルター(東洋紡社製)〕に対してノーザンハイブリダイゼーションを行なった結果を示す図である。
【図５】プラスミドpGST−PDEの構築過程および制限酵素地図を示した図である。
【図６】発現大腸菌可溶性画分におけるPDE活性測定の結果を示す。GSTはベクターのみを導入した大腸菌、GST-PDEはGST-PDE融合蛋白発現大腸菌を示す。
【図７】プラスミドp23−2kおよびp23−1kの構築過程および制限酵素地図を示した図である。
【図８】新規ヒトPDEのアミノ酸配列(上段)と、ヒトPDE5A（GenBank：CAA06170）のアミノ酸配列(下段)との比較を示した図である。アステリスクは一致しているアミノ酸残基、ピリオドは相同性のあるアミノ酸残基を示す。(アミノ酸残基は一文字表記で示す。)下線はHDXXHXXXXNモチーフを示す。
【図９】新規ヒトPDEホモログcDNAの配列情報を基にPCRプライマーを設計し、ヒト膵臓、肺、乳腺、前立腺、骨格筋、精巣各組織のmRNAより調製したcDNAを鋳型にPCRを行なった。増幅産物をアガロース電気泳動した結果を示す。
【符号の説明】
kb：キロ塩基対 (kilobase pairs)
Ap:アンピシリン耐性遺伝子
T7：T7プロモーター
GST:グルタチオンSトランスフェラーゼ
【図１】
2005229806.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005229806.tif 000039
【図８】
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【図９】
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