(57)【要約】  【課題】    無細胞反応液中で複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成する方法を提供する。従来法ではこのようなタンパク質の発現量は水溶性タンパク質の発現に比較して低く、特に疎水性の高いサブユニットの発現が著しく低かった。  【解決手段】    最も疎水性の高いサブユニットを導入するベクターとして、少なくともバクテリアのＰ４５０上流の非翻訳領域、最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列及び任意に選択マーカー配列を５’側から順に挿入したベクターを用いる。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成する方法であって、最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクター、その他のサブユニットを導入した発現ベクター及び細胞膜断片並びに任意にアミノ酸以外の機能成分を含有する無細胞反応液中でこれら発現ベクターを発現させることから成り、該最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクターがバクテリアのＰ４５０上流の非翻訳領域、最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列及び任意に選択マーカー配列を５’側から順に挿入した発現ベクターであることを特徴とする膜タンパク質の合成方法。
【請求項２】
前記非翻訳領域が配列番号１で表される塩基配列又は該塩基配列がコードするアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードしP450cam上流の非翻訳領域と同等の機能を有する塩基配列である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクターにおいて、該最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列の下流にその他のサブユニットをコードする配列が組み込まれ、該その他のサブユニットの上流にそれぞれリボソーム結合配列が組み込まれた請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクターに対して、その他のサブユニットを導入した発現ベクターをより多く加える請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記膜タンパク質がチトクロムc酸化酵素であり、前記最も疎水性の高いサブユニットがそのサブユニット１であり、前記その他のサブユニットがそのサブユニット２及び３である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成するための発現ベクターであって、バクテリアのＰ４５０上流の非翻訳領域、最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列及び任意に選択マーカー配列を順に挿入した発現ベクター。
【請求項７】
前記非翻訳領域が配列番号１で表される塩基配列又は該塩基配列がコードするアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードしP450cam上流の非翻訳領域と同等の機能を有する塩基配列である請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列の下流にその他のサブユニットをコードする配列が組み込まれ、該その他のサブユニットの上流にそれぞれリボソーム結合配列を含む請求項６又は７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記膜タンパク質がチトクロムc酸化酵素であり、前記最も疎水性の高いサブユニットがそのサブユニット１であり、前記その他のサブユニットがそのサブユニット２及び３である請求項６〜８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、無細胞反応液中で複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成する方法に関する。
なお本特許出願は、平成１５年度新エネルギー産業技術総合開発機構「生体高分子立体構造情報解析」に係わる委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願である。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質・酵素の供給源として、大腸菌など生細胞を宿主とするタンパク質発現系が汎用されている。しかし、外来性のタンパク質発現が細胞毒となる場合、あるいは、細胞からタンパク質を抽出する手間を省く場合、無細胞タンパク質発現系が採用される。さらに、この系を用いると、非天然型アミノ酸の部位特異的導入が可能であるため、蛍光色素や安定同位体含有アミノ酸でタンパク質を標識化できる。こうした標識化されたタンパク質・酵素は、種々の分光法を用いてタンパク質の構造や反応に伴うその変化の計測を可能にする。したがって、無細胞タンパク質合成系は、タンパク質の機能とその制御機構の理解を目指した基礎研究に、また創薬のツールなどとして産業利用にも有効な系である。
無細胞タンパク質合成系での膜タンパク質の機能発現は、タンパク質が強い疎水性を示すため、難しく成功例はまだ限られている（非特許文献１、２）。更にこれらの成功例はいずれも１種のサブユニットからなる単純な膜タンパク質であり、多種のサブユニットから構成され、更にアミノ酸以外の機能を担う成分、例えばヘム、フラビンなど補欠分子族を含む複雑な膜タンパク質の機能発現の報告はこれまでない。
【０００３】
【非特許文献１】Nature vol.360, 166-169, 1992
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, vol.274, No.36, 25675-25681, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明者らは、チトクロム酸化酵素の機能発現を大腸菌の無細胞系で試みた結果、従来
複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を無細胞系で機能発現した例がない理由として、以下の解決すべき課題に気づいた。１）市販の発現用ベクターに、チトクロム酸化酵素のS1、S2、S3遺伝子を挿入し、大腸菌無細胞系で発現させると、発現に影響を及ぼすプロモーターの転写活性に関わらずタンパク質の発現量が、水溶性タンパク質の発現に比較して低く、特に疎水性の高いS1が著しく低い。２）合成時に膜が必要で、本酵素の活性発現に適した膜系の選択する必要がある。３）機能発現に必須のヘムAと銅イオンのタンパク質内への取り込む方法を考える必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、上記課題を検討した結果、以下の方法により解決できることを見出した。課題１）については、最も疎水性の高いサブユニットを発現するためのベクターとしてＰ４５０上流（５’側）の非翻訳領域を有する発現ベクターを用いてその発現量を増加させ、その他のサブユニットについては別の発現ベクターを利用してその発現量を補う。２）については、宿主本来の膜に類似した膜を選択し、発現の場とするが、サブユニットが膜の一方から挿入されるような細胞膜断片を反応液に懸濁させる。３）については、無細胞系に含まれないアミノ酸以外の機能成分を反応液に添加する。
その結果、本発明者らは、大腸菌無細胞系において、３種の相異なるサブユニットから構成され、機能を担う成分として２分子のヘム、３原子の銅イオンを含む膜タンパク質（チトクロム酸化酵素）の機能発現に成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成する方法であって、最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクター、その他のサブユニットを導入した発現ベクター及び細胞膜断片並びに任意にアミノ酸以外の機能成分を含有する無細胞反応液中でこれら発現ベクターを発現させることから成り、該最も疎水性の高いサブユニットを導入した発現ベクターがバクテリアのＰ４５０上流の非翻訳領域、最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列及び任意に選択マーカー配列を５’側から順に挿入した発現ベクターであることを特徴とする膜タンパク質の合成方法である。
また本発明は、複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質を合成するための発現ベクターであって、バクテリアのＰ４５０上流の非翻訳領域、最も疎水性の高いサブユニットをコードする配列及び任意に選択マーカー配列を順に挿入した発現ベクターである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法により大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系で土壌細菌Paracoccus denitrificansの呼吸系末端酸化酵素、チトクロムc酸化酵素を機能発現できた。本酵素は、３つの相異なるサブユニットからなり、しかも膜貫通部分が生体内のタンパク質でも最も多いグループのタンパク質で、分子量も12万と大きい。加えて活性中心に複数ヘムAや銅原子をもつ。このような膜タンパク質を機能発現できたことは、本発明の方法により生体内のどのような膜タンパク質でも無細胞系で機能発現できることを示している。
異なる二つの環境の間に位置する膜タンパク質は、創薬のターゲットとして重要視されている。この膜タンパク質を無細胞系で発現させる一般的な方法が提供されたため、創薬のツールとして産業に与える効果は大きい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法の対象である「複数の異なるサブユニットから成る膜タンパク質」として、例えば、バクテリア呼吸系のチトクロム酸化酵素（サブユニット数：４、うち１つはなくても機能に影響はない。必要なのは３つのサブユニットである）、動物ミトコンドリア呼吸系のチトクロム酸化酵素（サブユニット数：１３）、bc1複合体（サブユニット数：１１）、植物光合成系のphotosystem I（サブユニット数：少なくとも１４）、photosystem II（サブユニット数：少なくとも１７）などが挙げられる。
【０００９】
「最も疎水性の高いサブユニット」とは、通常膜貫通回数の最も多いサブユニットをいう。
「発現ベクター」としていかなる発現ベクターを使用してもよいが、プロモーターとしてＴ３、Ｔ７、ａｒａＢＡＤ、ｔｒｃ、ＰＬ．ＳＰ６等を持つものが好ましい。
「バクテリア」は、今回選択したP450の非翻訳領域と類似の構造と機能を発揮するDNA配列をもつバクテリアであり、例えば、Pseudomonas putidaなどの土壌菌等が挙げられる。
「Ｐ４５０」は酸素添加反応を行う酵素であり、特にカンファー系化学物質を分解する酵素である。実施例で使用したものは、Pseudomonas putidaに存在するカンファー水酸化酵素で、通常P450camあるいはCYP101とも表記される。5'UTRとは、この酵素遺伝子の上流-155bpにあるPst I部位から開始コドンのATGまでを示す(J. Biol. Chem. 261, 1158-1163 (1986))。
「非翻訳領域」はリボゾーム結合部位配列を含む。この非翻訳領域は、例えば、Pseudomonas putidaの核外CAM遺伝子群にふくまれるP450cam遺伝子の上流配列（配列番号１、最後のATGはP450camの開始コドンを示す。）又はこの領域と類似の構造と機能を発揮する非翻訳領域をいう。また、この非翻訳領域は配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードしP450cam上流の非翻訳領域と同等の機能を有する塩基配列であってもよい。この非翻訳領域をベクターのプロモーターの下流に挿入する。
【００１０】
その配列の組み合わせ及びその挿入順序の例を以下に示すが、これらに限られることを意味しない。挿入箇所はベクターのプロモーターの下流である。ＡはＰ４５０上流の非翻訳領域、Ｂはリボソーム結合配列、Ｓ１〜Ｓｎは膜タンパク質のサブユニット１〜ｎ、但し、Ｓ１はＳ１〜Ｓｎの中で最も疎水性の高いサブユニット、Ｍは選択マーカー配列を示す。
（１）ベクター１：ＡＳ１Ｍ
ベクター２：ＢＳ２
ベクター３：ＢＳ３
---------
ベクターｎ：ＢＳｎ
（２）ベクター１：(ＡＳ１Ｍ)(ＢＳ２)
ベクター２：ＢＳ３
---------
ベクターｎ−１：ＢＳｎ
（３）ベクター１：(ＡＳ１Ｍ)(ＢＳ２)(ＢＳ３)
ベクター２：ＢＳ２
ベクター３：ＢＳ３
---------
ベクターｎ：ＢＳｎ
【００１１】
上記の組み合わせ例における各ベクターの混合比（ベクターのモル比）はベクター１を１とした場合に、ベクター２〜ベクターｎはそれぞれ０．５以上、好ましくは１．０〜１．５であるが、ベクターの構成によって最適の比をとる必要がある。上記（１）の場合にようにベクター１にサブユニット１以外を含まない場合には、ベクター２〜ベクターｎはそれぞれ１．０以上であることが好ましい。また、上記（２）や（３）の場合にようにベクター１に他のサブユニットを含む場合には、ベクター２〜ベクターｎはそれぞれ０．５以上であることが好ましい。例えば、サブユニット数（ｎ）が３の場合、上記（３）のベクター１のみでは、サブユニット１以外のサブユニット２や３の発現量が十分でないため、十分な膜タンパク質を構成することができない。そのため、ベクター２以下でサブユニット２以下の発現量を確保する必要がある。
【００１２】
「細胞膜断片」として、少なくとも細胞膜の内膜又はそれに相当する膜成分が必要であり、この内膜が外部に開かれている必要がある。このような成分は、生体膜を破砕して得てもよいし、合成してもよい。また、この様な膜成分を無細胞反応液中に懸濁させてもよいし、また特定の支持体に固定してもよい。
「無細胞反応液」として、小麦胚芽、網状赤血球、大腸菌のそれぞれ抽出液が市販され、水溶性タンパク質の機能発現に利用されている。
「アミノ酸以外の機能成分」とは、ヘムＡ、ヘムＢ等のヘム類、各種フラビンなど酵素タンパク質の働きを補助する低分子物質（補酵素）、銅イオンなど各種金属などをいう。
上記のベクターをこのような無細胞反応液に入れると各サブユニットを発現する。また反応液に含まれたヘムＡ等の機能成分は各サブユニットが膜タンパク質を構成する際に適切に取り込まれる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００１３】
本実施例では、チトクロム酸化酵素の３種のサブユニット遺伝子を含む発現ベクターを大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系に添加しタンパク質合成させた。反応系に、発現の場として、部分破砕の大腸菌（本来の外膜が外に細胞膜が内にある膜構造を保つ）、そしてヘムA、銅イオンを加えタンパク質合成させ、初めて機能をもつタンパク質複合体が合成された。３種のサブユニットは、膜に存在し、1:1:1の複合体を形成した。界面活性剤で膜から遊離させた複合体は、酵素本来の機能である還元型チトクロムcの酸化活性を示し、同時に酵素に特徴的な可視吸収スペクトルを示した。
【００１４】
膜タンパク質として土壌細菌の一つParacoccus denitrificansのチトクロム酸化酵素を用いた。この酵素は、膜に存在する呼吸系の末端酸化酵素で、酸素分子を水に還元する反応と、その反応に共役した膜の内から外への水素イオン能動輸送を触媒する。３種のサブユニット（SI、SII、SIII）が1:1:1で集合して機能単位を構成するが、酸素の還元反応は、SI部分のヘムAと銅イオンを含む活性中心で起こり、反応に必須の電子は、電子供与体である還元型チトクロムc（補欠分子族のヘム鉄が2価の状態を還元型、電子を相手に供与してヘム鉄が3価になると酸化型と呼ぶ）から、それぞれSIIとSIに含まれる２原子の銅イオン、そしてヘムAの２つの酸化還元中心を介して、酸素還元部位に伝達される。ちなみにSIは、12回膜貫通型、SIIとSIIIはそれぞれ、2、7回膜貫通型であり、膜タンパク質の中で疎水性が非常に高い群に入り、無細胞系での機能発現が最も難しいと見られる。
【００１５】
遺伝子のクローニング
土壌細菌Paracoccus denitrificans（ATCC #19367）からchromosomal DNAを調製し、そこからサブユニットSI、II及びIII遺伝子をPCR法により増幅した。PCRに用いるプライマーとして、制限酵素認識部位を含む以下のものを合成した。SIにはセンスプライマーとして、EcoRI部位を含む5'GCCGGCCAGCCGAATTCCTAGGGAGTCCAG3'（配列番号２）、アンチセンスプライマーとしてBamHI部位含有の5'TAGGGCATCGTTGGATCCATGCGGGGATCA3'（配列番号３）を、SIIにはセンスプライマーとしてHindIII部位を持つ5'CAGGGGCCTGCCGGCGGCAAGCTTGGCAACGGGATGGGATGA3'（配列番号４）、アンチセンスプライマーとしてBamHI部位含有の5'TATGCGTTGATATCGGCCAGGGGATCCTTACTCTGCCGAGGCCAGCTT3'（配列番号５）を、SIIIにはセンスプライマーとしてEcoRI含有の5'CCGTAAACTGAGCAACAAGAATTCGCAACAGCCGGAAATGCAGCC3'（配列番号６）、アンチセンスプライマーとしてBamHI部位を持つ5'ATCTGCCCCGCGCCGTGGAAATCTGGATCCGGATCAGCGGCCCCAGATATA3'（配列番号７）をそれぞれ用いた（プライマー塩基配列の下線部分は、各々の制限酵素認識部位を示す）。増幅後、制限酵素処理で得られたDNA断片のうち、SIとSIII遺伝子を含むものはプラスミドpUC18に、SIIはpUC19にそれぞれ挿入し、プラスミドpUC18/SI、pUC19/SII及びpUC18/SIIIを得た（図１Ａ参照）。なおpUC19のマルチクローニングサイトの配列と必要な制限酵素認識部位を図１Ａの下に示した。pUC18はpUC19と同じベクターだが、ただマルチクローニングサイトはpUC19と逆方向になっている。これら２種のベクターはタカラバイオ株式会社（京都）から購入した。
【００１６】
塩基配列の付加と発現ベクターの構築、ヒスチジンタグの付加
SIサブユニットのC末端に、ヒスチジン6残基からなるタグ（His-tag）を付加させるため、M13プライマー（タカラバイオ社製、配列番号８）とXbaI部位含有プライマー5'GATCGCGCACACGCGCATCATCATCATCATCATTGATCTAGAGTCGACCTG3'（配列番号９）をアンチセンスプライマー（図１ＢのM13 primerとHis-tag primer参照）として用い、PCRでSI遺伝子を増幅した。プライマーの波下線はHis-tagの塩基配列、下線はXbaI認識部位である。増幅後、DNA断片をEcoRIとXbaI処理し、pUC18にクローニングしプラスミドpUC18/SI-Hisを構築した（図１Ｂ参照）。
【００１７】
P450cam遺伝子5'UTRの付加
図２に示したようにプラスミドpUC18/SI-His及びpUC19/P450camの翻訳開始部位をTaKaRa LARAC in vitro Mutagenesis kitを用いて変異させ、新たにNdeI（CATATG）制限酵素認識部位を作製した。作製したプラスミドをそれぞれpUC18/(N)SI-His、pUC19/(N)P450camと名付けた。つぎにpUC19/(N)P450camを鋳型として、P450cam遺伝子をPCRで増幅した。センスプライマーとしてEcoRI部位含有5'GGAATTCTGCAGGATCGTTATC3'（配列番号１０）を、アンチセンスプライマーとして、市販のM13プライマー（配列番号８）を用いた。つぎにP450cam遺伝子DNAを、EcoRIとNdeI処理し、生じた5'UTR（5' untranslated region、5'側非翻訳領域、配列番号１）DNA断片を、同じ制限酵素で切断したpUC18/(N)SI-Hisに連結させ、P450cam遺伝子の5'UTRをSI遺伝子の5'UTRとしてもつpUC18/5'UTR-SI-Hisを構築した。
【００１８】
発現ベクターの構築
図３に示したように、プラスミドpUC18/5'UTR-SI-His（図２）をEcoRIとHindIIIで、pUC19/SII（図１Ａ）をHindIIIとBamHIでそれぞれ切断し、得られた5'UTR-SI-HisとSII遺伝子をEcoRIとHindIIIで開裂させたpUC18上で前後に連結させ、pUC18/5'UTR-SI-His-SIIを構築した。つぎに、pUC18/SIII（図１Ａ）をEcoRIとBamHIで切断しpBluescriptにクローニングして5'側に新たにKpnIサイトを作り（図３右側）、改めてKpnIとBamHIでSIII遺伝子を切り出した。これをKpnIとBamHIで開裂させたpUC18/5'UTR-SI-His-SIIに連結した。これにより、lacプロモーターを持つ発現ベクターpUC18/5'UTR-SI-His-SII-SIIIを構築した。各サブユニット遺伝子の5'側非翻訳領域は、それぞれリボゾーム結合部位をもつ。
【００１９】
発現ベクターの調製
プラスミドpUC18/5'UTR-SI-His-SII-SIII、pUC19/SII及びpUC18/SIIIをそれぞれ大腸菌JM109に挿入（形質転換）した。形質転換株をTB培地で増殖させた後、菌体からアルカリ法で各プラスミドDNAを抽出し、塩化セシウム密度勾配遠心法によって精製した。得られたベクターを1mg/mlの濃度に調製した後、pUC18/5'UTR-SI-His-SII-SIII：pUC19/SII： pUC18/SIII＝２：１：１のモル比で混合し、混合液を次に述べるタンパク質合成反応液に鋳型として添加した。
なお上記のTB培地は、トリプトン12 g/l、酵母エキス24 g/l、グリセロール4 ml/lを含む液とKH2PO4 2.31g/100 ml、K2HPO412.54 g/100 mlを含む液をそれぞれ別に滅菌し、使用時に9:1に混ぜ調製したものである。また次に記載するLB培地は、トリプトン10 g/l、酵母エキス5 g/l、NaCl 10 g/l NaCl を含み,1N NaOHでpHを7.5に調製してから滅菌し使用した。
【００２０】
無細胞合成系の反応液の調製、大腸菌膜画分の調製
大腸菌BL21のグリセロールストックをLB培地40mlに加え、37℃で一夜培養し、それをTB培地2Lに移して、同じ温度で更に８時間培養した。培養液を氷水で冷やしたのち遠心で集菌した。以下の操作は4℃で行った。菌体を1mM EDTAを含む10mM Tris-HCl(pH7.5)緩衝液（以後、緩衝液Aと呼ぶ）で洗浄し、最後に菌体と同量の40 mM KClを含む緩衝液Aに懸濁した。懸濁液を500kg/cm2でフレンチプレスにかけ細胞を破砕した後、7,000xgで15分間遠心した。上清を回収し、それを100,000xgで1時間遠心した。上清を捨て、沈殿した膜画分（柔らかい沈殿部分）を滅菌した緩衝液Aに懸濁し、20,000xgで15分遠心した。膜画分は沈殿し、それを緩衝液Aに再び懸濁した。この遠心、懸濁をさらに5回繰り返した。懸濁液の濁度（500 nmの吸光度）を分光光度計(Simadzu MPS-2000)で測定し（装置内に２カ所ある測定用セルホルダーのうち、エンドオン型光電管に接した方を使用）、最終的に吸光度を0.2に調製した。調製した懸濁液を１回使用分ごとに分け、液体窒素で凍らせ、-80℃で保存した。
【００２１】
ヘムAの調製
精製ウシ心筋チトクロム酸化酵素に含まれるヘムAを塩酸アセトン法で以下のように抽出した。酵素液を、-20℃に冷えた塩酸アセトン液（アセトンと濃塩酸の量比は、500:1）に、攪拌しながら少量ずつ滴下し、加え終わってからさらに30分攪拌を続ける。その後8,000xgで30分間遠心し、上層の緑褐色を呈したアセトン層を、なす型フラスコに移しロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液は、酸性なので1M NaOHを少量ずつ添加し、pHを7近くまで上げた後、1M Tris-HCl (pH7.5)を加え、pHを7.5に調節した。ヘム濃度はピリジンヘモクローム法で測定した。ヘムAの分子吸光係数として、酸化還元差スペクトル（還元型−酸化型）の587 nmと620 nmの吸光度差、25.0/mM/cmを使った。ヘムA濃度を3μMに調製し、液体窒素で凍らせて-80℃で保存した。
【００２２】
CuSO4の調製
硫酸銅（CuSO4）１Ｍを、100mM Tris-HCl (pH7.5)で10mMに希釈し、更にmiliQ水で希釈し、Tris-HCl濃度を5 mMにした。これを0.22μMのフィルターで滅菌濾過したものを、使用時まで-4℃保存した。
【００２３】
無細胞合成系でのタンパク質合成
Promega社製、E.coli S30 Extract System for Circular DNA (L1020)に含まれるamino acid mixture、S30 premix w/o amino acidsと、調製したDEPC水（diethylpyrocarbonate飽和水）、それに上述した膜画分、ヘムA、CuSO4、つづいてS30 extract、最後に発現ベクターの順に反応用チューブに加え、32℃で4時間、2500 rpmで振とうしながら反応させた。添加する各成分の量比を表１に示す。
【表１】
2005295914.tif 000002
表中Amino Acid Mixture, S30 Premix, Water treated with DEPC及びS30 extractは無細胞反応液、Templateはベクターを示す。
タンパク合成後、35S-メチオニン存在下、合成タンパク質をアセトン沈澱させ、SDS-PAGEした結果を図４のレーン３に示す。
【００２４】
膜タンパク質の精製  タンパク質の可溶化
タンパク質合成後、ただちに反応液を4℃に冷却した。つづいて、反応液を20,000xg、15分間遠心した。上清は捨て、沈殿を冷えた緩衝液Aでよく洗浄した。洗浄した沈殿画分に、40 mM KClとn-β-D-dodecylmaltoside（最終濃度2 %、以下dodecylmaltosideと記載する）を含む10 mM Tris-HCl (pH8.0)を加え、ヴォルテックスでときどき攪拌して氷中で30分間可溶化した。
【００２５】
Ni２+-NTAカラム
可溶化したタンパク質溶液を20,000xgで15分間遠心し、上清をNi２+-NTAスピンカラム (QIAGEN)に載せて、液がカラム内に沈んだ後１分間静置して遠心した。カラムはあらかじめ、KCl 40 mM、イミダゾール10 mM、dodecylmaltoside 0.1 %をおのおの含む10 mM Tris-HCl (pH8.0)緩衝液（緩衝液B）で平衡化した。遠心後カラム通過液を、さらに2回上と同様にしてカラムを通した。カラムを緩衝液Bで2回洗浄した後、緩衝液Bのイミダゾール濃度を250mMに上げ、カラムに吸着したタンパク質を溶出した。これを酵素液として後の測定に用いた。以上の操作はすべて4℃で行った。また、得られた酵素液は、液体窒素中で保存した。
【００２６】
ウエスタンブロット解析
上述のNi２+-NTAスピンカラムから溶出されたタンパク質（試料）と、対照として精製Paracoccus denitrificansチトクロム酸化酵素を同時にSDS-PAGEで分画し、サブユニットSI及びSIIに対する抗体を用いてウエスタンブロット解析した（図５のレーン1,2）。  レーン１は、対照の結果で、二つのバンドが観察され、矢印で示すように上のバンドがSI、下がSIIである。レーン２が試料で、対照のSI、SIIに対応する位置にバンドが観察された。レーン２では、これら２つのバンド以外に数本の弱いバンドが観察されるが、抗体と非特異的に反応するタンパク質と解釈される。以上の結果は、本発現系でSI及びSIIが合成され、しかもNi２+-NTAカラムに結合するのはSIなので、SIIが観察されたことは、両者が複合体を形成していることを示す。今回、SIIIに対する抗体がないのでSIIIの検出ができなかった。しかし、次項に示すようにSIIIは、SI、SIIと同様に合成され、しかも両サブユニットと複合体を形成することが確認された。
【００２７】
免疫沈降
無細胞系に放射性35Sメチオニンをトレーサーとして加え、SI-IIIをタンパク質合成させた。上の方法で得た可溶化画分と精製Paracoccus denitrificansチトクロム酸化酵素をSDS-PAGEで分離した結果のオートラジオグラムには、精製酵素のSI、SII、SIIIに相当する位置に明確にバンドが観察された。またHis-tag抗体を用いて上の可溶化画分を免疫沈降させ、得られた沈殿をSDS-PAGEで分画すると、精製酵素のSI、SII、SIIIに対応する位置に３つのバンドが明瞭に観察された（図５、レーン３）。抗体はSIに特異的に結合するので、この結果は、SIはSII、SIIIと複合体を形成していることを示す。３本のバンドの中で、SIの強度が比較的強いのは、可溶化画分にSI単独のものが存在するためと解釈される。
Ni２+-NTAカラムからの溶出液をBlue-native PAGEすると、分子量12万の所にタンパク質が観察され、２次元目のSDS-PAGEで、それがSI（分子量62kDa）、SII（分子量29kDa）、SIII（分子量31kDa）からなることが判明したので、複合体のサブユニット量比は1:1:1と結論される。括弧内の分子量の値は、アミノ酸組成からの推定値である。
【００２８】
チトクロム酸化活性
Ni２+-NTAスピンカラムから溶出された酵素画分の還元型シトクロムc酸化活性を還元型シトクロムに特異的な550nmの吸光度の減少で測定した（図６）。反応液として、0.1 % dodecylmaltosideと20μM還元型シトクロムcを含む50 mM sodium phosphate（pH 6.2）緩衝液（緩衝液C）を用い、酵素画分を添加して反応を始めた。対照は、酵素画分の代わりに緩衝液C、あるいは無細胞系でのタンパク質合成反応を、発現ベクターを除いて行い、上と同様にNi２+-NTAカラム処理した画分を用いた。両者に差は殆どなかった。対照の場合、顕著なチトクロムcの酸化は認められないが、酵素画分では顕著に酸化された。この酸化は呼吸毒の青酸によって抑制されたのでチトクロム酸化酵素が触媒する反応である。
【００２９】
可視吸収スペクトル
Ni２+-NTAスピンカラムから溶出された酵素画分の可視吸収スペクトルをオーシャンオプティクス製の自記分光光度計で光路長10cmのキャピラリータイプのキュベット(World Precision Instruments, USA社製)を使用して測定した（図７）。スペクトルはNa-dithioniteで還元して得られた。図に示した605nm吸収極大は、酵素の構造に敏感で、これが600nm以下に低波長シフトすると、活性がなくなることが知られている。今回の測定では、本来の酵素が示す極大と一致したことから、酵素本来の構造ができていると推定される。しかも上述したようにチトクロムｃ酸化活性がみられたことから無細胞系で機能発現されたと結論される。本測定では、キャピラリー内を光が全反射して進行するため、実際の光路長は10cmより長い。したがって図の吸光度単位を適当とした。
【００３０】
比較例１、２
実施例１の発現ベクターにおいて、5'UTR（5' untranslated region、5'側非翻訳領域）DNA断片を省き、その代わりにlac promoter又はT7 polymerase promoterを導入して実施例と同様の操作を行った。タンパク合成後、35S-メチオニン存在下、合成タンパク質をアセトン沈澱させ、SDS-PAGEした結果を図４のレーン１と２に示す。レーン１は、市販の強力なプロモーターであるlac promoterを、レーン２は、市販の最強のプロモーターとして知られるT7 polymerase promoterをそれぞれ使用した。P450cam遺伝子上流のリボゾーム結合配列を含む150bpの非翻訳領域を用いない場合は、疎水性の高いサブユニットI合成量が低いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
細胞は外部環境と、あるいは内部の異種環境と膜を介して区切られているので、膜タンパク質は、異なる環境に対する最前線としての役割をもつ。したがって、膜タンパク質には、外部の物質（シグナル）を感知して応答するセンサー機能（レセプターと呼ばれる）を有するものや、外部と内部の物質交換に働く（チャネル、トランスポーターなど）もの、あるいは細胞種の目印となる標識を担うものなどがあり、そのため創薬のターゲットとして用いることができる。
また膜タンパク質は、光合成系や呼吸系など生体エネルギー変換系を構成し、効率のよい、しかもクリーンなエンルギー変換反応を触媒するため、地球環境劣化が危惧される現在、クリーンなエネルギー変換系モデルとして産業界から注目を集めている。
本発明の膜タンパク質合成系は、生体のあらゆる膜タンパク質の合成を可能にする。したがって、網羅的に膜タンパク質のアゴニストあるいはアンタゴニストを探索する系の構築に役立つので、創薬のツールとして重要である。具体的には、機能未知あるいは既知を問わず膜タンパク質を本開発系で発現させ、その膜タンパク質に結合する低分子物質または高分子物質を網羅的に探索するが、その際、膜タンパク質に結合するリガンドを鋭敏に検出するため、リガンドに蛍光プローブを付加させておくのみならず、無細胞系で合成するため膜タンパク質そのものにも蛍光プローブを結合させることができる。また膜タンパク質とリガンドを金属基盤の上で反応させ、両者の結合を直接検知できる装置も開発され市販されているので、金属基盤の上に結合させた適当な膜系（リポソームで可能ならさらによい）に直接膜タンパク質を発現させ、不要なものを洗浄すると、そのまま反応にもちいることができる。
また無細胞系でエネルギー変換系膜タンパク質を発現することが可能であるので、サブナノスケールの変換系ユニットを創製できる。エネルギー変換系の生体膜試料そのものを使用する際には、エネルギー変換反応の効率を低下させる不要な膜タンパク質が存在するが、無細胞系では、そのような不要なものがない、いわば純化した変換系を構築できるメリットがある。高熱菌のタンパク質など熱安定性のあるものを利用すると熱にも安定な機能ユニットを構築できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】AはプラスミドpUC18またはpUC19にParacoccus denitrificansチトクロム酸化酵素サブユニットI、II、またはIII遺伝子がそれぞれ挿入されたことを模式的に示す図である。BはサブユニットI遺伝子にPCR法を用いてヒスチジンタグ配列と制限酵素認識部位が付加される過程と完成したベクターを模式的に示す図である。
【図２】ヒスチジンタグが付加されたサブユニットI遺伝子の上流にPeudomonas putidaのカンファー水酸化酵素P450の5'非翻訳領域が挿入される過程を模式的に示す図である。
【図３】図１、２に示したベクターから、Paracoccus denitrificansチトクロム酸化酵素サブユニットI、II、III遺伝子発現ベクターが構築される過程を模式的に示す図である。各サブユニットの５側にはリボソーム結合配列が組み込まれている。
【図４】合成したタンパク質を、35S-メチオニン存在下でアセトン沈澱させてSDS-PAGEした結果を示す図である。レーン１はlac promoterを、レーン２はT7 polymerase promoterを組み込んだベクターを使用して合成した膜タンパク質を示す。レーン３は、lacプロモーターを含む今回開発した5'側非翻訳領域を組み込んだベクターを使用して合成した膜タンパク質を示す。
【図５】Paracoccus denitrificansチトクロム酸化酵素(CcO)サブユニットI、II、III遺伝子を無細胞タンパク合成させた反応液の膜画分を各サブユニットに対する抗体を用いて行ったウエスタンブロットを示す図である。レーン１は、対照となる天然の精製酵素を、レーン２は膜画分を可溶化後、Ni+2-NTAカラムに吸着した分画を、サブユニットI、IIの抗体を用いて、それぞれウエスタンブロット解析し、両サブユニットを検出した。レーン３は、上の可溶性画分をHis-tag抗体で免疫沈降させSDS-PAGEした。なおレーン３のタンパク質は35S-メチオニンで標識化した。
【図６】Ni+2-NTAカラムに吸着した分画のチトクロム酸化活性を示す図である。白抜き四角（□）は合成したタンパク質、黒三角（▲）はこれにKCNを添加した。白抜き三角（△）は、タンパク質を添加しないで緩衝液を添加した結果。グラフ縦軸550 nmの吸収は、反応時間とともに減少し、還元型チトクロムcが酸化されることを示す。合成されたタンパク質がチトクロム酸化活性を持つことを示す。
【図７】Ni+2-NTAカラムに吸着し溶出された酵素画分の可視吸収スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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