(57)【要約】      （修正有）【課題】多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞の分離及びその作製方法を提供すること。【解決手段】ヒト角膜実質細胞由来であり、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有さない幹細胞。この幹細胞を含有する培養物。ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培地中で浮遊培養することを含む、ヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト角膜実質細胞由来であり、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有さない幹細胞。
【請求項２】
前記幹細胞は、β−チューブリン及びGFAPに対する免疫反応性を有する請求項１に記載の幹細胞。
【請求項３】
前記幹細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地内での接着培養において、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチン陽性間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化する、請求項１または２に記載の幹細胞。
【請求項４】
前記幹細胞は、直径２００マイクロメータ未満の球状物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の幹細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の幹細胞を含有する培養物。
【請求項６】
ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培地中で浮遊培養することを含む、ヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法。
【請求項７】
前記増殖因子が、Ｂ２７、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
前記培地がメチルセルロースゲルマトリクスを含有する、請求項６または７に記載の作製方法。
【請求項９】
前記ヒト角膜実質細胞が、コラーゲンを含有する細胞分離用培地に角膜輪部組織を溶解させ、ＥＤＴＡ／ＰＤＳ溶液で細胞を分散させて単離されたものである請求項６〜８のいずれか１項に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記単離された実質細胞が、角膜上皮細胞の混入のないものである請求項９に記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多分化能及び自己再生能（自己複製能）を有するヒト角膜実質幹細胞及びその作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
重篤な角膜疾患に対する従来の治療方法は、提供角膜による角膜移植である。しかし、少なくとも日本国内では、角膜ドナ−および提供が極端に不足しているという現状がある。またさらに、他人から移植になるため、拒絶反応の問題もあり、角膜移植による治療は、万全な治療法とは言い難い。
【０００３】
角膜１は、図５に示すように、複数の層状構造で形成されており、それらは、角膜上皮２、ボーマン膜３、角膜実質４、デスメ膜５及び角膜内皮細胞６からである。最表層にある角膜上皮２は、厚さ約５０μｍの５〜６層の非角化重層扁からなり、角膜実質４は、密な間隔で整然と配列したコラーゲン組織と実質細胞からなり、高い透明性を有している。角膜内皮細胞６は、角膜の最内層に配列する一層の細胞である。角膜内皮細胞は、ポンプ機能を有し、角膜内の水分含有率を適切に維持する機能を有する。
【０００４】
角膜移植に代わる方法の１つとして、角膜細胞の細胞を用いた角膜の再生が試みられている。中でも、角膜上皮幹細胞を用いた再生は、臨床応用も行われている。具体的には、患者自身の健康な角膜輪部の一部の角膜上皮細胞を採取し、羊膜上で培養し、それを移植し再生を促す方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、角膜実質細胞については、幹細胞の存在が現状では確認されておらず、かつその培養法についても知られていない。従って、角膜実質が損傷を受けた場合には、依然として同種移植に頼るしかなく、上記のような問題（ドナー不足及び拒絶反応）が未解決である。多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞の存在が確認され、かつその培養法が確立され、それを入手できれば、培養して、移植することも可能になる。また、幹細胞を培養物として入手できれば、増殖も容易に行えるし、長期間の保存も可能になると考えられる。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、これらの問題を解決するために、多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞の分離及びその作製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は以下の通りである。
（１）ヒト角膜実質細胞由来であり、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有さない幹細胞。
（２）前記幹細胞は、β−チューブリン及びGFAPに対する免疫反応性を有する（１）に記載の幹細胞。
（３）前記幹細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地内での接着培養において、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチン陽性間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化する、（１）または（２）に記載の幹細胞。
（４）前記幹細胞は、直径２００マイクロメータ未満の球状物である（１）〜（３）のいずれかに記載の幹細胞。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の幹細胞を含有する培養物。
（６）ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培地中で浮遊培養することを含む、ヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法。
（７）前記増殖因子が、Ｂ２７、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、（６）に記載の作製方法。
（８）前記培地がメチルセルロースゲルマトリクスを含有する、（６）または（７）に記載の作製方法。
（９）前記ヒト角膜実質細胞が、コラーゲンを含有する細胞分離用培地に角膜輪部組織を溶解させ、ＥＤＴＡ／ＰＤＳ溶液で細胞を分散させて単離されたものである（６）〜（８）のいずれかに記載の作製方法。
（１０）前記単離された実質細胞が、角膜上皮細胞の混入のないものである（９）に記載の作製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、多分化能及び自己再生能を有する角膜実質幹細胞を提供することができ、角膜移植によらずに角膜の再生が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ヒト角膜実質細胞由来の幹細胞及びこの幹細胞を含む培養物であり、この幹細胞は、ネスチン及びビメンチンに対する免疫反応性を有し、ｐ７５ＮＴＲに対する免疫反応性を有する。
【００１０】
ネスチンは、脳神経幹細胞のマーカーであり、最近では組織幹細胞においても検出されている。本発明の幹細胞を分化誘導すると、ネスチンに対する免疫反応性を有するようになる。このことは、本発明の幹細胞が脳神経幹細胞に分化つまり、多分化能を有していることを示す。
【００１１】
また、ビメンチンは、間葉系細胞に現れる非特異的なフィラメントであり間葉系細胞のマーカーである。本発明の幹細胞を分化誘導すると、ビメンチンを発現する。このことは、本発明の幹細胞が間葉系細胞に分化つまり、多分化能を有していることを示す。
【００１２】
さらに、p75 NTRは、神経栄養因子ニューロトロフィンの受容体である。ニューロトロフィンは、末梢神経系のミエリン形成の重要な調節因子である。本発明の幹細胞を分化誘導すると、p75 NTRに対する免疫反応性を有さないということは、本発明の幹細胞が、末梢神経系のミエリン形成しないことを示す。
【００１３】
さらに本発明の幹細胞は、β−チューブリン及びGFAP（glial fibrillary acidic protein）に対する免疫反応性を有する。これらは神経細胞のマーカーであり、本発明の幹細胞がこれらに対する免疫反応性を有するということは、本発明の幹細胞が、多分化能を有していることを示す。
【００１４】
本発明の幹細胞は、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地内で接着培養すると、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチ陽性の間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化する。このことは、本発明の幹細胞が、多分化能を有していることを示す。
【００１５】
本発明の幹細胞は、後述する実施例で示すように、１次スフェアをばらばらにして、培養したところ、２次スフェアが形成されたことから、自己再性能（自己複製能）がある細胞である。
【００１６】
本発明の幹細胞は、直径２００マイクロメータ未満のニューロスフェアと言う球状細胞塊である。
【００１７】
以下に本発明のヒト角膜実質幹細胞の分離、作製方法について説明する。
本発明のヒト角膜実質幹細胞培養物の作製方法は、ヒト角膜実質細胞を、増殖因子を含有する培養液中で浮遊培養する。増殖因子は、Ｂ２７、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むものである。
【００１８】
B27はもともと海馬、その他の中枢神経系ニュ−ロンを長期安定、培養するために開発された血清の代替え添加物である。無血清でなければ細胞が未分化な状態を保てないという点から、本細胞培養は無血清で行う必要がある。このため血清の代替であるB27を必要とする。
【００１９】
前記培養液には、細胞の再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリクスを含有することが好ましい。
【００２０】
培養に用いるヒト角膜実質細胞は、ヒト角膜実質より、コラ−ゲンをコラゲナ−ゲで酵素処理し、さらにＥＤＴＡ／ＰＤＳ溶液で細胞を単離されたものであることが好ましい。このように単離された実質細胞は、角膜上皮細胞の混入のないものである必要がある。角膜上皮細胞の混入の有無を調べるには、分化した角膜上皮細胞に特異的なマーカー、サイトケラチン３および１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによって確認できる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
［角膜実質細胞の単離］
本研究は、ヘルシンキ宣言に基づいて行われた。死亡直後に摘出されたヒト提供眼から、眼球後極、水晶体、および毛眼体を注意深く除去したものを、セントラル・フロリダ・ライオンズ・アイ・ティシュー・バンク(Central Florida Lions Eye Tissue Bank)から得た。それらは死後７〜８日経過していた。ドナーの年齢は、４１〜７８歳だった。まず角膜から、角膜上皮を注意深く除去した。次に微細なセッシを用いて、デスメ膜ごと角膜内皮を、角膜の内面の周辺部から中心へ向かって、シート状に剥ぎ取った（サカイ(Sakai) 2002）。その後、角膜輪部上皮細胞の混入を回避するために、角膜輪部含む周辺角膜を切除し、直径約１０ｍｍの実質片を作製した。実質片をさらに小片に細断し、０．０２％のコラゲナーゼ（シグマ(Sigma)、セントルイス(St.Louis)、MO）を含む基礎培地（以下に記載）中で、３７℃で一晩インキュベートした。その後PBSによって洗浄し、それら組織を、０．２％ ＥＤＴＡ中で、３７℃で５分間インキュベート、粉砕することによって単一細胞に分けた。遠心分離（１２００ｒｐｍ）後、細胞を、基礎培地中に再懸濁した。細胞の生存を、トリパンブルー（ワコー(Wako)、大阪、日本）によって評価したところ、８０％を超えていた（>８０％）。角膜上皮細胞および内皮細胞の混入なしに、実質細胞のみが単離されたかを調べるために、培養前に、逆転写酵素ポリメラーゼチェーン反応（RT-PCR）によって、角膜上皮マーカーのサイトケラチン(cytokeratin)３および１２の、発現を調べた。
【００２２】
［初代培養；角膜実質細胞からの球状コロニーの単離］
本研究のために使用した、初代細胞培養技術は、ニューロスフェア法（レイノルド（Reynold）およびワイス（Weiss） 1992）であった（トーマ（Toma）  2001）。培養液には、既に記載されているように（グリッティ(Gritti) 1999）、細胞の再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリックスを添加したものを使用した。本研究で使用した基礎培地は、既に記載されているように(ref)、B27（インビトロゲン（Invitrogen）、サンディエゴ、CA）、20ng/mLの上皮増殖因子（EGF、シグマ（Sigma））、および40ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂFGF、シグマ（Sigma））を添加した、DMEM/F12(１：１、シグマ(Sigma))であった。未被覆の２４穴培養プレート（ファルコン(Falcon)）中で、初代組織を、５０Cells/μｌの細胞（1ウェル当たり50,000細胞）播種した。この条件下では、細胞の再凝集は起こらない（グリッティ（Gritti） 1999および我々の未発表報告）。CO2濃度は５％であった。
【００２３】
培養７日後に、細胞が成長して細胞塊、即ち、球状細胞塊、が形成された。それら球状コロニ−を、固定するまえに、１０μM／ｍＬのブロモデオキシウリジン（BrdU、シグマ（Sigma））をラベルするために一晩処理した。さらに免疫染色およびRT-PCRを用いて、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、ニューロフィラメントM（NFM）、グリア線維性酸性蛋白質（GFAP）、およびBrdUの発現の有無を観察した。
【００２４】
培養７日後に、初代球状細胞塊数を数えた。生きの悪い細胞塊から増殖し球状細胞塊と区別するために、５０μｍを超える直径を有する細胞集団のみを数えた。継代は、初代球状細胞塊（培養7日後）を、０．５％のEDTAによってばらばらにし、50細胞／μｌの濃度で、２４穴培養プレ−ト内に播種した。培養液はメチルセルロースゲルマトリックスを含む基礎培地中で、７日間培養し、初代細胞から増殖した、２世代目のスフェア数を数えた。
【００２５】
［生成された球状コロニーの接着(adherent)培養］
単離された球状コロニーの多分化能を評価するために、各ウェル中に５０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、シグマ(Sigma)）および１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＢＤバイオサイエンス(Biosciences)、サンホセ、CA）を被覆したカバーガラス入れ、個々の初代球状細胞塊（７ DIV）を播種した。分化を促進するために、１％のウシ胎児血清（FBS）を、基礎培地（トロペペ(Tropepe) 2000）へ添加し、を日間培養した。それぞれの実験では、固定前に、１０μＭ／ｍＬのＢｒｄＵ（シグマ(Sigma)）によって、次世代を処理した。その後、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、NF-M、GFAP、およびBrdUの発現を調べた。
【００２６】
RT-PCRでは、球状細胞塊を大量に培養、即ち、３０個の球状細胞塊を、PLL／フィブロネクチンで被覆した、６０ｍｍの培養皿に播種し培養、培養７日後に、これら細胞から、ｍRNAを抽出し、ネスチン、ビメンチン、β−チューブリン、NF-M、およびGFAPの発現を調べた。
【００２７】
［免疫組織化学］
カバーガラス上で、７日間培養した、細胞塊およびそれらから分裂した次世代を用いて、免疫組織化学分析を行った。PBSを用いて４％濃度にしたパラホルムアルデヒド（ワコー(Wako)）を用いて、培養細胞を１０分間固定した。PBSで洗浄した後、非特異反応を防ぐために３％のウシ血清アルブミン（BSA；シグマ（Sigma））、３０分間反応させ、さらに０．０３％のツイ−ン（Tween） ２０（BSA/PBST）で賦活化し、それぞれの一次抗体と室温で２時間反応させた。
【００２８】
使用した抗体は：
マウスモノクローナルアンチビメンチン抗体（１：３００；ダコ（Dako））、
マウスモノクローナルアンチネスチン抗体（１：２００；BD）、
マウスモノクローナルアンチニューロフィラメント１４５抗体（NFM、１：４００；ケミコン（Chemicon）、テメキュラ、CA）、
ウサギポリクローナルアンチβ−IIIチューブリン抗体（１：５００；コバンス（Covance））、
ウサギポリクローナルアンチGFAP抗体（１：４００；ダコー（Dako））、
マウスモノクローナルアンチO4抗体（１：１０；ケミコン（Chemicon））、
マウスモノクローナルアンチｐ６３抗体（１：１０００、イムゲネクス（Imgenex））、
マウスモノクローナルアンチサイトケラチン３／１２抗体（１：４０００；プロゲン（Progen））、
ウサギポリクローナルアンチｐ７５NTR抗体（１：１０００；プロメガ（Promega））、
ウサギポリクローナルアンチペリフェリン(peripherin)抗体（１：１００；ケミコン（Chemicon））、
マウスモノクローナルアンチαＳＭＡ抗体（１：２５０；シグマ(Sigma)）、
マウスモノクローナルアンチBrdUフルオレセイン抗体（１：１００；ロシュ・ダイアグノスティクス（Roch Diagnostics、ベイサル（Basal）、スイス）
であった。
【００２９】
１次抗体との反応終了の後、PBSで洗浄、室温で１時間、BSA/PBSTで希釈した二次抗体と、細胞を反応させた。使用した二次抗体は：標識化ヤギアンチマウスIgG抗体（アレクサ・フロー(Alexa Flour) ４８８、１：２００；モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）、標識化ヤギアンチウサギIgG抗体（アレクサ・フロー(Alexa Flour) ５９４、１：２００；モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）。対比染色はヘキスト(Hoechst) ３３３４２（１：２０００、モレキュラー・プローブズ(Molecular Probes)）を用いて行った。その後PBSで洗浄し、レーザー走査型共焦点顕微鏡（フルオビュー(Fluoview) FV300  オリンパス Ver 4.2）によって、染色の程度を見た。アンチO4抗体およびp75NTR抗体を使用した場合、細胞の浸透処理は省略した。BrdUおよび神経マーカーβ−IIIチューブリンによる二重免疫染色は、最初にβ−IIIチューブリンによって染色し、赤色蛍光色素（アレキサ(Alexa) ５９４）によって可視化した。次いで、２M HCｌによって６０分間処理した後、FITC標識アンチBrdU抗体反応させた。倍率２００倍で、対比染色のみ陽性細胞と細胞とそれぞれの抗体陽性細胞の数を数えることによって、定量化した。1ウェル当たりの合計細胞数は、約５００であった。１実験当たり、２つの球状細胞塊を分析した（n=2の実験）。
【００３０】
［ＲＮＡの調製およびＲＴ−ＰＣＲ］
ＲＮＡの抽出は市販のキット（ＩＳＯＧＥＮ；ニッポンジーン、東京、日本）を用いて、初代球状細胞塊およびそれらから分裂した次世代を用いて行った。その後逆転写システム（プロメガ社(Promega Corporation)、東京、日本）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。２０ｍｌ容量中の全ＲＮＡから、１ｍｇのｃＤＮＡを合成することができた。ＰＣRの反応液は、全量５０ｍｌとし、アンプリ・タック・ゴールド(Ampli Taq Gold)（パーキン・エルマー・セタス(Perkin Elmer Cetus)、エメリービル(Emeryville)、ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲは、まず、９５℃での９分間反応させDNAを一本鎖にした、その後９４℃で３０秒間の変性、次いで、６０℃で３０秒間の伸展を、サーマルサイクラー（Ｉ−サイクラー（Ｃｙｃｌｅｒ）；バイオラドラボラトリーズ(Bio Lad Laboratories)、ハーキユリーズ(Hercules)、ＣＡ）を用いて行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し増幅を確認した。Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲは、オプティカルスキャナーを使用して、バンド密度を測定し、ＰＣＲ生成物中のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を定量した。３サイクル間隔で、各試料のＰＣＲ生成物の増幅率を調べた。増幅の線形範囲内で、適当な循環条件下、６組のＰＣＲ生成物を調製し、バンド密度を比較した。逆転写酵素をいれなかった試料は、生成物をまったく生成しなかった。このことは、ゲノムＤＮＡの汚染がないことを示唆する。使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2005229870.tif 000002
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
【００３２】
結果
［角膜実質からの球状コロニーの単離］
ＥＧＦおよびｂＦＧＦ応答性前駆細胞を角膜実質から単離するために、我々は、神経幹細胞を分離する為に考案された技術、sphere forming assayを使用した。またこれらは多分化能角膜上皮幹細胞、多分化能皮膚前駆細胞、および内耳からの多分化能幹細胞の分離も可能である。（トロペペ(Tropepe) 2000、トーマ（Toma） 2001）。角膜実質から実質細胞を単離し、細胞密度（ミリリッター当たり５０個の生存細胞）を、未被覆ウェルで培養した。培養液には再凝集を防ぐために、メチルセルロースゲルマトリックス含有基礎培地を使用した。サイトケラチン３および１２遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果から、角膜上皮細胞の混入なく、実質細胞が単離された（図１Ａ）。完全に単一細胞化されたことを、２細胞塊および３細胞塊の割合を数えることによって確認した。これにより、９９％を超える細胞が、単一細胞であることが示唆された（図１Ｂ）。培養3日後、小さな球状の浮遊細胞塊が形成された（図１Ｃ）。培養7日後、球状細胞塊はより大きく成長したのに対し、他の非増殖細胞は死滅した（図１Ｃ）。同一培養条件下において、ほとんどの球状細胞塊は、もともとあった細胞の凝集によるものではなく、増殖によって得られることが示唆された（グリッティ（Ｇｒｉｔｔｉ）ら １９９６、およびイノウエ(Inoue) Yら、未公表の観察）。また、細胞塊の大きさの増加が、増殖によるものであることを確認するために、培養期間の６日目と７日目の間に、ＢｒｄＵ、チミジンアナログを標識し、７日後に、大きくなった細胞塊内で、いくつかの細胞が、ＢｒｄＵの発現を確認した（図１Ｃ）。このことは、細胞が細胞塊に分かれたことを示す。同時に、これらの結果は、この方法で単離された、個々のＥＧＦおよびｂＦＧＦ応答性球状細胞塊のほとんどが、単一角膜実質細胞由来であったことを示唆する。
【００３３】
角膜実質から単離することができた球状細胞塊数を、培養物７日後に、数えた（図１Ｂ）。それにより、１ウェル当たり、１２５８±３５８個の球状細胞塊が生成されたことが分かった（５０，０００細胞）。一般的に１０ｍｍ径の角膜実質から、１．８×１０5個の細胞が単離され、それらは培養７日後には、合計で約５０００個の球状細胞塊を生成出来る。またこれらの球状細胞塊の直径は、おおよそ２００μｍ未満（<２００μｍ）であった。
【００３４】
［球状コロニーおよびそれらの子孫における未成熟間葉細胞に対するマーカーの発現］
ネスチンは、脳、皮膚、網膜、および内耳由来の多分化能球状コロニー内の未成熟細胞に特異的ではないにもかかわらず、そのような未成熟細胞中で発現されるので、我々は、その後、ネスチンに対して、球状物を免疫染色した（レンダール(Lendahl) 1990、ゲージ(Gage) 2002）。更に、角膜実質細胞は、神経冠間葉線維芽細胞から得られるので、ビメンチン、間葉細胞に対するマーカー（図２B）、および、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ ＮＴＲ）、神経冠幹細胞（ＮＣＳＣ類）に対するマーカー、の発現を、免疫細胞化学によって調べた。それらの結果から、球状物中のほとんどの細胞が、ネスチンおよびビメンチンに対する免疫反応性を有していたが、ｐ７５ポジティブではなかったことが示された。更に、５０個を超える球状コロニーを、ネスチンおよびビメンチンに対する免疫細胞化学分析に付したところ、それらの結果から、すべての球状コロニー中で、ネスチンおよびビメンチンが検出されたことが示された。ネスチンおよびビメンチンの発現も、ＲＴ−ＰＣＲによって検出されたのに対し、ｐ７５ ＮＴＲの発現は、球状物では検出されず、免疫細胞化学分析の結果が確認された。
【００３５】
球状細胞物から分裂した次世代が、間葉細胞の特徴を有するかを調べるために、培養７後の球状細胞塊を、ＰＬＬ／フィブロネクチンコ−トカバーガラスをひいた２４ウェルプレート中に播種し、１％ＦＢＳを含む分化培養液中で培養した。７日後、多くの細胞が、球状コロニーから伸展した。球状細胞塊から伸展した細胞の約９０％は、ビメンチン標識された。ビメンチン陽性細胞は、形態学的には、線維芽細胞の特徴を有していた。このことは、この条件下で、球状細胞塊が間葉線維芽細胞に分化誘導された事を示す（図３）。これに対して、分化７日後には、球状物から伸展した、ごくわずかな分化細胞だけが、ネスチン陽性であった（図３）。間葉系細胞のその他の特徴は、筋線維芽細胞を生じることであり、それらは、αＳＭＡによって免疫染色される。しかし、今回の条件下では、球状細胞塊およびそれらの次世代細胞は、それらは観察できなかった。Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ネスチンｍＲＮＡは、球状細胞塊中に十分あったが、分化した次世代では減少した。これに対し、ビメンチン遺伝子の発現は、次世代中では増加したことが免疫細胞化学の結果から確認された。まとめると、未成熟細胞のマーカーは、球状細胞塊中で、それらの次世代と比べて高レベルで発現されるのに対し、間葉細胞マーカーは、球状細胞塊中よりも、それらの子孫において、より高レベルで発現される。
【００３６】
［個々の球状細胞塊の子孫は、線維芽細胞、ニューロンおよびグリアに分化する］
次いで、我々は、球状細胞塊が、神経系細胞に分化するか否かを調べた。ＦＢＳを添加した培養液中で分裂した次世代を用いて培養した、球状細胞塊およびそれらの子孫を免疫細胞化学検索することにより、いくつかの細胞が、ニューロン、β-ＩＩＩチューブリンのマーカーに反応することが確認された（図３）。球状細胞塊および接着性子孫を、NF-M、成熟神経マーカーおよびペリフェリン、末梢神経中のニューロンのマーカーで免疫染色したところ、球状細胞塊の細胞の小さな部分、および、  1.0％の接着性子孫は、ＮＦ−Ｍに対して免疫反応陽性であったが（図３）、ペリフェリンに対しては陰性であった。予想したように、扁平な形態を有する、球状細胞塊内のいくつかの細胞および次世代細胞は、グリア細胞マーカーＧＦＡＰ陽性であった（図３）。球状コロニーおよび接着性子孫中には、Ｏ４、稀突起膠細胞に対するマーカー、に対して免疫反応性を有する細胞はなかった。我々は、１０個を超える球状細胞塊を分析することにより、個々の球状細胞塊のすべてが、ビメンチン陽性細胞、β-ＩＩＩチューブリンＮＦ−Ｍ陽性細胞、およびＧＦＡＰ陽性細胞を分化することが出来、これらのマーカー陽性細胞の割合は同様であったことを見出した。このことは、球状細胞塊間では、分化能の相違ないことを示唆する。
【００３７】
Semiquantitative ＲＴ−ＰＣＲにより、球状細胞塊および接着性子孫中で、β-ＩＩＩチューブリン遺伝子が同レベルで発現され、ＮＦ−ＭおよびＧＦＡＰ遺伝子は、接着性子孫と比べて、球状コロニー中で高レベルで発現されたことが示された。また、角膜輪部上皮細胞中で発現され、特に、インビボで、角膜輪部前駆体中に豊富に含まれる、Ｐ６３、サイトケラチン３、サイトケラチン１２分子に対する遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲでは検出されなかった(図4)。
【００３８】
上記の結果から、角膜実質細胞は、インビトロで単離した場合、ＥＧＦおよびｂＦＧＦに応答して球状細胞塊を形成する、細胞の分離した亜集団（角膜実質前駆細胞；ＣＳＰ類）を含むことが示された。球状細胞塊は、ネスチンおよびビメンチンの発現を特徴とする。ＦＢＳの存在下での培養では、球状細胞塊は、ネスチンを発現しなくなり、ビメンチン陽性間葉線維芽細胞ならびにニューロンおよびグリアに分化した。総合すると、我々の結果から、単離した角膜実質細胞は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ反応性細胞を含み、インビトロで間葉線維芽細胞およびニューロンに分化できる、球状細胞塊を生成することが示された。
【００３９】
ＣＳＰ類は、多分化能を有していた。即ち、単一ＣＰＳ類に由来する、すべての球状細胞塊またはそれらの接着性子孫は、線維芽細胞およびニューロンに分化出来る。他の成体組織幹細胞の多分化能は、大人の脳、皮膚、角膜リンバル上皮および内耳からの、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ反応性多分化能細胞の単離を示した研究に報告されている。ＣＰＳ類および角膜輪部縁の上皮から単離された神経前駆細胞（チャオ（Zhao）ら、2002）の性質は類似しているものの、多少相違点もあった。球状細胞塊は、ｐ６３を発現しなかった。このことは、CSP類は幹細胞とは異なることを示す。
【００４０】
いくつかの研究は、成体の脳、皮膚、角膜リンバル上皮、および内耳からの、ニューロンおよびグリアを生成する能力を有する多数の子孫を生み出し得る、EGFおよびｂFGF反応性細胞の単離を報告している。単離した球状細胞塊は、未成熟細胞、系統制限(lineage restricted)前駆細胞、および分裂終了細胞を含む、その他の細胞からなると考えられる。例えば、近年の研究により、成体のネズミの前脳から単離した球状細胞塊が、成熟アストログリア(astroglial)マーカー、GFAPを発現することが示された。また、ヒトの脳から単離した球状細胞塊は、成熟ニューロンおよびグリアマーカーの免疫細胞化学によって示されるように、成熟ニューロンを含むその他細胞種を含むことが示された。このことは、培養中に、ヒトの組織から分離された球状細胞塊は、未成熟状態を維持するよりもむしろ、分化する傾向を有することを示唆する。球状細胞塊内の未成熟細胞は、娘コロニーを生じるので、CSP類が、二次球状細胞塊を生じなかったという事実は、ヒトＣＳＰ類の球状細胞塊は、系統関連(lineage-committed)細胞または分裂終了細胞からなることを示唆する。成熟神経細胞マーカーは、球状細胞塊と比べて、ビメンチンを高レベルで発現し、ＮＦ−ＭおよびＧＦＡＰを低レベルで発現する、分裂した次世代においても検出される。このことは、線維芽細胞は、神経細胞よりも、接着培養物中で、顕著に成長することを示唆する。総合的には、これらの結果は、ＣＳＰ類からの球状コロニーが、比較的低い増殖能を有する系統関連ニューロンまたは成熟ニューロンおよび強い増殖能を有する線維芽細胞を含むことの根拠となる。
【００４１】
我々の結果は、ＣＳＰ類は、それらのニッチ(niche)から除去し、ミトゲンの存在下で培養すると、角膜実質から分化転換し、そして、いくつかの理由で、多分化能を有するようになることを示唆する。第一に、CSP類の次世代は、神経マーカーニューロフィラメントおよびグリアマーカーGFAPによって免疫標識化された。重要なことには、近年の研究により、成体ヒト角膜（の切片）は、ニューロフィラメントおよびGFAPによっては、免疫染色されないことが示された（ハヤシ（Hayashi）ら、１９８６）。第二に、角膜（切片）がこれらのマーカーによって染色されなかったにもかかわらず、球状細胞塊は、ネスチンを発現した。単離した角膜実質細胞は、FBSの存在下で培養すると、ビメンチンを発現するが神経マーカーには反応しない。このことは、単一角膜間葉実質細胞は分裂して、FBSの存在下でより多くの間葉細胞を生み出すことを示唆する。よって、ニュ−ロスフェア法によって増殖された前駆細胞は、次世代の角膜間葉線維芽細胞とは、完全に相違している。
【００４２】
中枢神経系（レイノルズ(Reynolds)  1992；ゲージ（Gage）  2000；ゲージ（Gage）  2002）、骨髄（ウッドバリー（Woodbury）  2000；サンチェス−ラモス(Sanchez-Ramos) 2000）、網膜（トロペペ（Tropepe） 2000、アハマド(Ahmad) 2000）、消化管（クルーガー(Kruger)  2002）、および内耳から単離された幹細胞が、生体神経幹細胞であることが報告された。しかし、 分離や入手が困難であるという問題は、依然として解明されないままである。トーマ（Toma）らは、皮膚は、その分離や入手が容易なことから、成体幹細胞の供給源となり得ることを示した。成体のヒト角膜は、神経幹細胞よりはるかに分離や入手が容易である（ゲージ（Gage）  2002）。更に、ヒト角膜実質細胞の使用は、ヒト胎児組織の使用を取り巻く多くの倫理的な問題を回避出来る可能性がある。従って、角膜実質からの前駆細胞の分離は、神経変性疾患のための、興味深い代替供給源である。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のヒト角膜実質幹細胞の培養物及びその調製方法は、移植可能なヒト角膜実質幹細胞の培養物を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】角膜実質細胞の単離。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲで培養前のヒト角膜実質細胞でケラチン３，１２が検出されなかったことより、単離された細胞に上皮細胞に混ざっていないことが示唆された。St:培養前のヒト角膜実質細胞。Ep:培養ヒト角膜上皮細胞。（Ｂ）細胞播種直後の細胞像。ヒト角膜実質細胞が１つずつに分かれている。（Ｃ）培養１週目の球状細胞塊。球状細胞塊内の細胞はＢｒｄＵ要請であった。Ｂａｒ＝１００μｍ。
【図２】球状細胞塊の免疫染色。（Ａ）典型的な球状細胞塊の像。球状細胞塊は未熟神経前駆細胞のマーカーであるネスチンに陽性（Ｂ）、間葉系細胞マーカーであるビメンチンに陽性（Ｃ），β-ＩＩＩチューブリンに陽性（Ｄ）、ＮＦＭに陽性（Ｅ），ＧＦＡＰに陽性（Ｆ）。ＩｇＧで陰性（Ｇ）。Ｂａｒ＝１００μｍ。
【図３】球状細胞塊から分化した細胞の免疫染色。初代の球状細胞塊をＰＬＬ/フィブロネクチンコートした培養皿に接着させ、分化用培地内で１週間培養した。（Ａ）接着した分化細胞。分化した細胞はビメンチン（Ｂ）、ネスチン（Ｃ），β-ＩＩＩチューブリン（Ｄ）、ＮＦＭ（Ｅ）、ＧＦＡＰ（Ｆ）に陽性であった。細胞核はヘキストで染色され青く見える。Ｂａｒ＝１００μｍ。
【図４】球状細胞塊および接着性子孫のＲＴ−ＰＣＲによる解析。ＲＴ−ＰＣＲにより、球状細胞隗および接着性子孫中での、ビメンチン、ネスチン、β-ＩＩＩチューブリン、ＮＦＭおよびＧＦＡＰ遺伝子の発現が検出された。ケラチン３，１２はどちらでも検出されなかった。
【図５】角膜の断面説明図。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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