(57)【要約】【課題】  従来の一次元電気泳動に加え、任意の選択的固相をもった、第二の次元方向に電気泳動をすることによって、より分解能の高い電気泳動チップを提供する。【解決手段】  微小流路を一対の電極方向に泳動分離することのできる電気泳動手段と該電気泳動手段とは直角の方向に電気泳動する第二の泳動手段で構成される二次元電気泳動法において、第二の泳動手段が、予め施された選択的固相の上を泳動することのできる、電気泳動チップ。【選択図】  図１
2005172453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流路を一対の電極方向に泳動分離することのできる電気泳動手段と該電気泳動手段とは直角の方向に電気泳動する第二の泳動手段で構成される二次元電気泳動法において、分析すべき検体が予め施された選択的固相の上を泳動することのできる、電気泳動チップ。
【請求項２】
微小流路を一対の電極方向に泳動分離することのできる電気泳動手段において、分析すべき検体が予め施された選択的固相の上を泳動することのできる、電気泳動チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンス、バイオテクノロジーなどの分野で、核酸、蛋白質等の分析に汎用される、電気泳動に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ライフサイエンス、バイオテクノロジーなどの分野では、電気泳動による分析が必須の方法として定着している。その中でもLab-On-ChipやμTASといった、よりコンパクトな分析、電気泳動モジュールが、使い勝手の良さから市場に広まりつつある。一例としてあげれば、アジレントテクノロジー社のLabChipや、（株）島津製作所のマイクロチップ電気泳動装置などが相当し、これらはTAS（total  solution  analysis）の形態としては、いずれも従来の、最も基本的な一次元の電気泳動の形態を小型化しているのみで、従来の電気泳動手法として考案されてきた数々、その他の要素は、TASの機能として盛り込まれていない。これらは現在のところ、どれも途上段階にあるといってよい。
【０００３】
一方マイクロチップの形態として、電気泳動ではないけれども、DNAマイクロアレイや、プロテインチップ等にみられる、一度に多項目を同時に調べる方法が実現されている。(例えば、特許文献１参照)
【特許文献１】特開平１１−１８７９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来のマイクロチップの一次元電気泳動の形態に加え、二次元方向に複数の特異的固相を施し、その方向に第二の電気泳動を行うことによって、一次元のみの通常の電気泳動では得ることの出来なかった、その泳動物質の性状、つまり特異的固相との相互作用の有無、に関する情報を取得、付加し、分析結果としてフィードバックできるチップを提供することができる。
【０００５】
したがって本提案の特異的固相と相互作用する検体側の必要条件としては、特別なヒートディネーチャーなどを必要としない、一本鎖の核酸、例えばｍRNAや一本鎖のnon-coding RNA、抗体や蛋白質といったものが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明のマイクロチップには、サンプルを注入するための注入口を有し、該注入口に接続される流路を挟み込むように、かつ泳動分離するために必要な距離を空けて設置された一対の電極と、該一対の電極で示される方向に対して望ましくは直角方向に配置される第二の一対の電極と第二の一対の電極にはさまれるように配置された第二の流路と、該第二の流路の壁面に選択的固相を施したことを特徴とする電気泳動チップ。
【発明の効果】
【０００７】
観察の結果、選択的固相と相互作用しているものとそうでないものを、識別することが出来た。また5S  RNAと18S  RNAなど、沈降定数（分子量）による違いと両者間の特異的固相との相互作用の違いについても識別することが出来た。
【０００８】
したがって本発明は、従来の一次元電気泳動に加え、任意の選択的固相をもった、第二の次元方向に電気泳動をすることによって、より分解能の高い電気泳動チップを提供することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．電気泳動セル
図１は、本実施例の二次元電気泳動セルをあらわしたもので、高さ約100μmの液室を持っている。液室の高さは望ましくは1000μmから数μｍで、数ミリ角のサンプル注入口を持っている。材質は紫外光を透過するものが望ましく、260nmの光を透過できるものが最も好適で、ポリメタクリルメチレートなどのプラスチック材料も使用できる。ガラス材の場合、厚さ数十μｍ程度の液室を作るには、数十％程度のフッ酸溶液で、カタログ等のエッチングレートを参考にエッチングすればよく、プラスチックの場合はプラスチック整形で型を起こすのが適当である。液室基板側の材質も、平坦に研磨されたガラス、もしくはポリメタクリルメチレートが適当である。
【００１０】
また最も簡単な方法としては、メッキ法などで作った電極の高さを液室の高さとして、上下２枚の平板を、電極を挟んでサンドイッチ状にしても構わない。このとき接着剤で上下平板を接着しても良いし、接着せずに、場合によっては電極より若干厚い程度のシリコンゴムシート（厚さ50μmから入手可能である）をOリング状の液漏れ防止材としてサンドイッチし、上下からスクリューネジなどで締め付け可能なホルダーを用意しても構わない（図２）。Oリングは充填するポリマーゲルによっては、必ずしも必要でない。
【００１１】
２．特異的固相
表面にアミノ基を導入して、核酸とのスポットを固定化するには、ガラスの場合、γアミノプロピルシラン等、アミノシランカップリング剤を使用することが出来る。シランカップリング剤はアルコキシドによる加水分解反応で、容易にシートを形成し、その後ベーキング処理をすればよい。プラスチックの場合にはポリLリジンをディップコートし、乾燥させればよい。ＤＮＡ等、核酸のスポッティングには、インクジェット法、ピン法などの市販の装置を使ってスポッティングできる。スポッティング後、UVクロスリンカーを使って固定化し、無水コハク酸で未反応部をつぶす。以上の工程はよく知られたプロトコールで、例えば、「必ずデータが出るＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル  林埼良英 監修 岡崎康司編集  羊土社」等で参照することが出来る。またより短い、オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた場合にも、アミノ基、SH基、カルボキシル基などを導入したオリゴヌクレオチドを、固相側に導入した官能基と反応させる。この組み合わせは、例えばグルタルアルデヒドのアルデヒド基とオリゴヌクレオチド側のアミノ基、エポキシ環の亀裂反応とアミノ基、マレイミド基とＳＨ基、カルボキシル基の場合はカルボジイミドといったん反応させた後、アミノ基を持ったオリゴヌコレオチドと反応させる。
【００１２】
また蛋白質の場合にも、蛋白質側のアミノ基やＳ-Ｓ結合を切断して作ったＳＨ基と同様に反応させることが出来る。切断は2−メルカプとエタノールやパパインなど一般の実験書籍で参照できる。
【００１３】
また一次元方向の分離情報を必要とせず、多数サンプルを消化したい場合には、図３の実施形態であっても構わない。
【００１４】
３．プロセス
液室形成のための接合については、プラスチックであれば粘性の低いタイプの接着剤でよい。またガラスであれば陽極接合を使うことが出来る。陽極接合は市販の装置で行うことが出来る。陽極接合の注意点としては、接合するもの同士の材質が違うと、室温に戻った後、熱膨張率の関係で歪んだり破損したりするので、接合には性質がなるべく等しいものを選ぶ。プローブの固定、液室の接合に先立って、一組の電極を上下いずれかの基板側に作製する。電極を注入口のある基板側に作った場合で、かつ液室の接着（接合）を行わない場合には、すでに固相化の終了した市販マイクロアレイをもう一つの基板として用意しても良いことになる。液室の厚さが数十μのときは、メッキ法が適当である。数百を超えるときはワイヤーを図の位置に接着等で固定すればよい。材質はともに白金が適当である。メッキ法で白金電極を作製する場合、電極パターンのマスクを作り、スパッタまたは蒸着装置で白金薄膜層を形成し、それを下地に電解メッキする。その際PMMAやSU-8などのレジストで土手を作っておく。所望の膜厚まで成長したら、専用の溶剤でレジスト除去する。レジストが露光時かなり強固に硬化した場合、アッシャー等の併用が効果的である。
【００１５】
４．ゲルの充填
次に形成した液室にポリマーゲルを試料注入口から充填する。ポリマー剤としてはポリアクリルアミドの0.01％〜6％、ヒドロキシアルキルセルロースまたはポリビニルアルコールまたはアガロースまたはデキストランの1％〜15％などが使用できる。緩衝液は、電気泳動で一般的に使用される緩衝液で構わない。例えばＴＡＥ、ＴＢＥ、トリスグリシン緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等が挙げられる。蛋白質の泳動にはＳＤＳを0.1％程度添加しても良い。また蛋白を染色する場合、クマジーブリリアントブルーを緩衝液に添加しても良い。ＤＮＡであればＥＢ（エチジウムブロマイド）や、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉ、ＲＮＡであればＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  IIなどが使用できる。またＲＮＡや1本鎖ＤＮＡなどの泳動には尿素やホルムアミドといった変性剤を緩衝液に添加すると分子内会合を防ぐことが出来る。
【００１６】
５．泳動方法
サンプル注入口にサンプルを注入し、およそ泳動方向長さあたり10Ｖ/ｃｍ〜500Ｖ/ｃｍの電界強度で電圧を印加する。次に、電極を切り替え、二次元方向に電気泳動する。各泳動方向の泳動時間は、ＢＰＢ等のマーカー位置で判断できる。また泳動中は、発熱を伴うので、少なくとも６０℃以下になるように、ペルチェ素子等の温度コントロール可能な冷却媒体上で、電気泳動することが望ましい。
【００１７】
６．その他
電極上での気泡発生を逃がすために、電気泳動セルには、ちょうど電極の付近に気泡を逃がすための穴を設けても良い。
【００１８】
電気泳動セルの詳細形状は、Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂなど、市販のＤＮＡマイクロアレイ読み取り装置のホルダーにセットできるようにしても良い。この際、光学的焦点面がうまく合致するよう配慮する。
【００１９】
１．プロセス
75×25mmの無蛍光ガラス（松浪製）に、CO2レーザー加工機で図１の位置に6.4mm角のサンプル注入口を作った。そのガラス基板に次のスパッタ条件で10分間、
（白金膜のスパッタ条件）
パワー                          400W
スパッタガス          アルゴン  100％
ガス圧                          ２Ｐａ
基板温度                        450℃
製膜した。AZ1500（クラリアント社）をスピンコート、プリベーク後、図１のマスクパターンによって露光、現像した。次に水：塩酸：硝酸＝5：10：1（容量比）のエッチング液にて、電極以外の部分をエッチングした。次に専用のリムーバ（AZリムーバ100）で、レジストを剥離させた。出来上がった電極パターン（幅2ｍｍ）をメッキ下地電極として、白金メッキ液（田中貴金属工業）を用いて、6時間メッキを行った。
【００２０】
（白金メッキ条件）
温度：50℃
電流密度：2Ａ／dm2
２．マイクロアレイ
次に同じ無蛍光ガラスを用意し、特異的固相を持ったマイクロアレイを作製した。プローブの選定はSH基を修飾したオリゴヌクレオチド6merの全種類（4の6乗＝4096）とし、100μm間隔で64×64ドットを1ブロックとし、これを1次元方向の泳動部分を除いて、図１のように縦8×横2ブロック計16ブロック、特異的固相をもった部分を作製した。各ブロックの境界はわかりやすいように1ドット分空けた。尚作製にあたっては、改造したインクジェットプリンタ（キャノン製）を用い、スポッティングしてマイクロアレイ化を行う固相方法の詳細は、特開平１１−１８７９００号公報の実施例に記載される手順に従った。
【００２１】
３．測定
上述１及び２で作製したスライドガラスをお互いに重ね合わせ、液室とした。そこに暖めた1％アガロースゲル（TBE  Buffer（89ｍMトリス、89ｍMホウ酸、1ｍM  EDTA、ｐH8.0）、ゲル量に対し1/10000の SYBR  Green  I添加）を充填した。ゲルが硬化した後、サンプル注入口部のゲルを切り取り吸引除去した。
【００２２】
一方、サンプルとしてHep-2細胞（大日本製薬）を10×10６に調整し、TRIzol試薬（インビトロジェン社）を使って、添付マニュアルにしたがって、トータルRNAを抽出した。これをサンプルとして、70℃5分、0℃5分の前処理を行った後、BPB（ブロモフェノールブルー）添加済みローディングバッファー（タカラ社）を0.5μｌ+サンプル4.5μｌをサンプル注入口に入れ、10℃のペルチェプレート上で、50Vの電圧を印加してBPBマーカーが端に移動するまで電気泳動した。次に電極を二次元方向に切り替え、20Vの電圧を印加してBPBマーカーが端に移動するまで電気泳動した。
【００２３】
以上を終了した電気泳動マイクロチップを蛍光顕微鏡の上に移し、観察を行った。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本実施例の二次元電気泳動セル。
【図２】上下２枚の平板を、電極を挟んでサンドイッチ状にした例。
【図３】実施形態。
【符号の説明】
【００２５】
１  サンプル注入口
２  特異的固相
３  下基板
４  上基板
５  二次元方向の電極
６  一次元方向の電極
７  ネジ
８  ホルダー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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