(57)【要約】 【課題】  培養工程において細胞の増殖能力を判断して、時間とコストの無駄が発生することを未然に防止する。【解決手段】  提供された細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程に先立って、提供された細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長Ｔを測定するテロメア長測定ステップＳ２と、該テロメア長測定ステップＳ２において、所定値より小さいテロメア長Ｔが測定されたときに、培養を中止すべき旨の判定を行う判定ステップＳ３とを備える培養検査方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
提供された生体試料から細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程に先立って、
提供された生体試料から細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、
該テロメア長測定ステップにおいて所定値より小さいテロメア長が測定されたときに、培養を中止すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法。
【請求項２】
提供された生体試料から細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程において、
培養終了後に細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、
該テロメア長測定ステップにおいて所定値より小さいテロメア長が測定されたときに、出荷を中止すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法。
【請求項３】
提供された生体試料から細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程において、
培養途中の所定培養時間経過後に細胞数を測定する細胞数測定ステップと、
該細胞数測定ステップにおいて、所定の細胞数より少ない細胞数が測定された場合に、細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、
該テロメア長測定ステップにおいて所定値より大きいテロメア長が測定されたときに、培養条件を変更すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法。
【請求項４】
前記判定ステップが、細胞に添加する薬品の濃度を調整するよう判定する請求項３に記載の培養検査方法。
【請求項５】
前記判定ステップが、細胞に添加する薬品を変更するよう判定する請求項３に記載の培養検査方法。
【請求項６】
前記判定ステップが、培地の交換タイミングを変更するよう判定する請求項３に記載の培養検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ドナーから提供された生体試料から取り出した細胞を必要細胞数まで増殖させる培養工程に適用される培養検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨腫瘍摘出や外傷等によって生じる骨の欠損部に、骨補填材を補填して骨を修復させる技術がある。しかしながら、骨粗鬆症のように、骨が次第にもろくなっていく場合や、欠損部が非常に広域である場合等には、上記方法では問題を解決することが難しい。
【０００３】
そこで、近年、患者から骨髄を採取し、この採取した骨髄に含まれる間葉系幹細胞から人為的に骨芽細胞を十分に増殖させた後に、再び患者の体内に戻すという新たな試みが要請されている。この場合、患者自身から採取した骨髄から骨芽細胞を増殖させ、該患者の体内に戻すため、免疫反応を生じることなく骨の形成を活性化させることができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】吉川，「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」，バイオインダストリー，株式会社シーエムシー出版，２００１年，第１８巻，第７号，ｐ．４６−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ドナーから提供された細胞を必要な細胞数にまで増殖させる培養工程には、所定の培地とともに培養容器内に投入して、所定の培養条件下に維持する工程、培養途中において、複数回にわたり培地を交換する工程、種々の成長因子や、分化誘導因子を供給する工程および細胞の成長状態を検査する工程等の種々の工程を行う必要がある。
これらの工程は、それぞれ一定の時間を要するため、ドナーから提供された細胞の培養を開始してから培養が終了する全培養工程には、現状では２〜３週間の時間を要する。
【０００５】
この場合において、培養開始から２〜３週間経過した後に、所望の必要細胞数まで細胞が増殖していればよいが、必要細胞数まで増殖していない場合には問題がある。すなわち、細胞を培養するのは、患者の病巣部が顕在化している場合が多く、可能な限り迅速な細胞の移植が必要とされているのに対し、２〜３週間の培養期間経過後に移植できないとの判断がなされると、移植手術が大幅に遅延して、病巣部を悪化させてしまう不都合がある。また、２〜３週間の培養工程を行うには、多くのコストが必要であるが、培養工程を行った後に必要細胞数まで達し得ないことがわかると、要したコストが全く無駄になるという不都合もある。
【０００６】
また、培養工程終了後に必要細胞数まで達していた場合においても、その時点において既に分裂能力を失い、それ以上の分裂ができない状態になっている場合には、製品価値がなく、患者に移植されても患部を修復することができない。したがって、そのような細胞の出荷を中止すべきことを判断する必要もある。
【０００７】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養工程において細胞の増殖能力を判断して、時間とコストの無駄が発生すること、あるいは、製品価値のない細胞が出荷されることを未然に防止することができる培養検査方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、提供された生体試料から細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程に先立って、提供された生体試料から細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、該テロメア長測定ステップにおいて、所定値より小さいテロメア長が測定されたときに、培養を中止すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法を提供する。
【０００９】
この発明によれば、提供された生体試料から取り出した細胞を培養する培養工程に先立って行われるテロメア長測定ステップにより細胞のテロメア長が測定される。テロメアは染色体の安定化や複製に関与する構造物であり、染色体末端部に存在するＴＴＡＧＧＧの６塩基を単位とする反復配列からなる。正常細胞では１回の細胞分裂によって約５０〜２００ｂｐずつ短縮し、一定長まで短縮したときに細胞は増殖を停止することが知られている。そこで、この発明は、このテロメア長を、培養工程において培養された後に細胞が十分に機能し得るか否かを判定するために利用する。測定されたテロメア長が所定値より小さいときには、判定ステップにおいて培養を中止すべき旨の判定が行われる。テロメア長の測定は１〜２日程度と短期間で行うことができるので、従来のように長期にわたって行われる培養工程が工程終了後に徒労に帰し、コストと時間とが無駄になってしまうのを防止することができる。
【００１０】
また、本発明は、提供された生体試料から取り出した細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程において、培養終了後に細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、該テロメア長測定ステップにおいて、所定値より小さいテロメア長が測定されたときに、出荷を中止すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法を提供する。
【００１１】
この発明によれば、培養により細胞が必要細胞数まで増殖した状態で、培養工程が終了するが、テロメア長測定ステップにより、この時点での細胞のテロメア長が測定される。テロメア長が分裂とともに短縮していき、一定長まで短縮したときに細胞の増殖が停止することを利用して、培養終了した細胞が、その後、分裂能力を有しているか否かを、テロメア長の測定により判定する。測定されたテロメア長が、既に分裂可能な最低限のテロメア長近傍であるときには、出荷の中止を判定し、製品価値のない細胞が出荷されることを未然に防止することが可能となる。
【００１２】
さらに、本発明は、提供された生体試料から取り出した細胞を培養して必要細胞数まで増殖させる培養工程において、培養途中の所定培養時間経過後に細胞数を測定する細胞数測定ステップと、該細胞数測定ステップにおいて、所定の細胞数より少ない細胞数が測定された場合に、細胞の一部を取り出して、該細胞のテロメア長を測定するテロメア長測定ステップと、該テロメア長測定ステップにおいて、所定値より大きいテロメア長が測定されたときに、培養条件を変更すべき旨の判定を行う判定ステップとを備える培養検査方法を提供する。
【００１３】
本発明によれば、細胞数測定ステップにおいて、培養開始から所定培養時間経過後の細胞数が測定される。培養工程の進行とともに、細胞数が増えていくが、その増加速度が小さい場合には、分裂能力が低いか、他の培養条件に問題があるかのいずれかである。そこで、細胞数が所定の細胞数より少ないと測定されたときに、細胞のテロメア長を測定し、所定値より大きいテロメア長が測定されたときには、培養条件に問題があると判断することができる。これにより、元来分裂能力が低いために増殖が十分に行われない場合には、その後の培養工程の続行を停止して、時間とコストの無駄の発生を防止することができる。また、分裂能力が十分である場合には、培養条件を改善して、適正な増殖速度で細胞を培養することが可能となる。
【００１４】
上記発明においては、前記判定ステップが、細胞に添加する薬品の濃度を調整するよう判定することとしてもよい。また、判定ステップが、細胞に添加する薬品を変更するよう判定することとしてもよい。さらに、判定ステップが、培地の交換タイミングを変更するよう判定することとしてもよい。
これらの発明によれば、簡易に培養条件を改善することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、培養工程において細胞の増殖能力を判断して、時間とコストの無駄が発生すること、あるいは、製品価値のない細胞が出荷されることを未然に防止することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る培養検査方法について図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養検査方法は、細胞の培養工程に先立って、ドナーからの細胞の受け入れ時に行われる検査方法であって、図１に示されるように、ドナーから提供された細胞の一部を採取するサンプリングステップＳ１と、採取された細胞のテロメア長Ｔを測定するテロメア長測定ステップＳ２と、測定されたテロメア長Ｔに基づいて培養工程を開始すべきか否かを判断する判定ステップＳ３とを備えている。
【００１７】
テロメア長測定ステップＳ２は、例えば、採取された細胞に対し、フィッシュ法あるいはサザンブロット法により測定する。また、これらのフィッシュ法あるいはサザンブロット法によりテロメア長Ｔの測定を行う場合には、採取された細胞に対し、塩化アンモニウム溶液あるいは市販の溶血試薬（例えば、ベックマン・コールター社製等）を用いて溶血処理を行い測定してもよい。この場合、測定における赤血球の影響を取り除くことができる。
判定ステップＳ３は、テロメア長測定ステップＳ２において測定されたテロメア長Ｔが、所定のしきい値Ｍａｖ１に対して大きいか否かを判断することにより行われる。
【００１８】
ヒト体細胞のテロメア長Ｔは、平均的に１０ｋｂｐ程度の長さを有しており、１回分裂するごとに短縮していく。そして、５ｋｂｐ程度まで短縮すると、それ以上の分裂ができなくなる。また、テロメア長Ｔは年齢や細胞の種類等の種々の条件によってばらつき、また、その短縮幅も１回の分裂ごとに５０〜２００ｂｐとばらついている。そこで、本実施形態においては、最短テロメア長Ｔを５ｋｂｐ、短縮幅ΔＴを１００ｂｐと設定し、標準偏差ＳＤを２０％とするとともに、培養工程における分裂回数および移植後の活性維持が可能であることを考慮して、２０回以上の分裂可能回数Ｎが必要であるとして上記しきい値Ｍａｖ１を以下の通りに設定した。
Ｍａｖ１＝ΔＴ×Ｎ＋３×ＳＤ＋Ｔ＝８２００ｂｐ
【００１９】
すなわち、培養工程に先立って行われる本実施形態に係る培養検査方法によれば、受け入れ検査時に行われたテロメア長測定ステップＳ２において、８２００ｂｐより小さいテロメア長Ｔが測定された場合には、培養工程終了段階において既に増殖能力が失われ、あるいは、その後の移植後に活性が維持できないと判断され、ステップＳ４において培養を中止する旨の判定がなされることになる。
また、テロメア長測定ステップＳ２において、８２００ｂｐ以上のテロメア長Ｔが測定された場合には、判定ステップＳ３において、培養工程終了段階においても十分に増殖能力を備えた細胞となると判断され、ステップＳ５において培養工程を開始すべき旨の判定がなされることになる、
【００２０】
このように、本実施形態に係る培養検査方法によれば、培養工程終了段階において増殖能力を有しないことが明らかな細胞について、培養工程を開始する前に、あるいは、培養工程開始後の比較的早期の段階において、その培養を中止することができるので、長期間にわたる培養工程を行うことが防止される。特に、テロメア長Ｔの測定は比較的短時間ですむので、時間とコストの無駄をなくすことができ、また患者に対する負担を防止することができるという効果がある。
【００２１】
次に、本発明の第２の実施形態に係る培養検査方法について、図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養検査方法は、図２に示されるように、培養終了後に培養された細胞の一部を採取するサンプリングステップＳ１１と、採取された細胞のテロメア長Ｔを測定するテロメア長測定ステップＳ１２と、測定されたテロメア長Ｔに基づいて出荷すべきか否かを判断する判定ステップＳ１３とを備えている。
【００２２】
テロメア長測定ステップＳ１２は、例えば、採取された細胞に対し、フィッシュ法あるいはサザンブロット法により測定する。
判定ステップＳ１３は、テロメア長測定ステップＳ１２において測定されたテロメア長Ｔが、所定のしきい値Ｍａｖ２に対して大きいか否かを判断することにより行われる。
【００２３】
第１実施形態において説明したように、ヒト体細胞のテロメア長Ｔは、平均的に５ｋｂｐ程度まで短縮するとそれ以上の分裂ができなくなる。また、テロメア長Ｔは年齢や細胞の種類等の種々の条件によってばらつき、また、その短縮幅も１回の分裂ごとに５０〜２００ｂｐとばらついている。そこで、本実施形態においても、最短テロメア長Ｔを５ｋｂｐ、短縮幅ΔＴを１００ｂｐと設定し、標準偏差ＳＤを２０％とするとともに、移植後の活性維持が可能であることを考慮して、３回以上の分裂可能回数Ｎが必要であるとして上記しきい値Ｍａｖ２を以下の通りに設定した。
Ｍａｖ２＝ΔＴ×Ｎ＋３×ＳＤ＋Ｔ＝５４８０ｂｐ
【００２４】
すなわち、培養工程終了後に行われる本実施形態に係る培養検査方法によれば、テロメア長測定ステップＳ１２において、５４８０ｂｐより小さいテロメア長Ｔが測定された場合には、このまま出荷されて患者に移植されても活性が維持できず、患部の修復を行うことができないと判断され、ステップＳ１４において出荷を中止する旨の判定がなされることになる。
また、テロメア長測定ステップＳ１２において、５４８０ｂｐ以上のテロメア長Ｔが測定された場合には、移植後も十分に増殖能力を備えた細胞であると判断され、ステップＳ１５において出荷すべき旨の判定がなされることになる、
【００２５】
このように、本実施形態に係る培養検査方法によれば、移植後の活性維持が困難であることが明らかな細胞の出荷を未然に防止することができ、患者への負担を軽減することができるという効果がある。
【００２６】
次に、本発明の第３の実施形態に係る培養検査方法について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養検査方法は、図３に示されるように、培養開始から所定培養時間経過後に細胞数Ｍを測定する細胞数測定ステップＳ２１と、該細胞数測定ステップＳ２１において測定された細胞数Ｍが、所定の細胞数Ｍ０より大きいか否かを判定する細胞数判定ステップＳ２２と、所定の細胞数Ｍ０より小さい細胞数Ｍが測定された場合に、細胞の一部を採取するサンプリングステップＳ２３と、採取された細胞のテロメア長Ｔを測定するテロメア長測定ステップＳ２４と、測定されたテロメア長Ｔが所定値Ｍａｖ３より大きいか否かを判定する判定ステップＳ２５と、テロメア長Ｔが所定値Ｍａｖ３以上であると判定されたときに、培養条件を変更する条件変更ステップＳ２６と、テロメア長Ｔが所定値Ｍａｖより小さい場合に、培養を中止すべき旨の判定を行う中止判定ステップＳ２７と、細胞数Ｍが所定細胞数Ｍ０より大きい場合、および培養条件変更すべき旨の判定がなされた場合に培養を継続すべき旨の判定を行う継続判定ステップＳ２８とを備えている。
【００２７】
細胞数測定ステップＳ２１は、例えば、培養開始後６日後に行われ、細胞数が１×１０５個に増殖しているか否かにより判断する。すなわち、測定時の経過時間を６日とすると、細胞数測定ステップＳ２１において測定された細胞数が１×１０５個以上である場合には、十分な細胞増殖が認められるとして、継続判定ステップＳ２８に進行し、細胞の培養工程が継続される。
【００２８】
また、細胞数判定ステップＳ２１において、上記例の場合に、細胞数が１×１０５個より少ないと判断された場合には、サンプリングステップＳ２３に進んで細胞の一部が採取され、テロメア長測定ステップＳ２４に進行する。
この場合に、判定ステップＳ２５におけるテロメア長Ｔの所定値Ｍａｖ３は、上記第２の実施形態におけるしきい値Ｍａｖ２と同じでよい。
【００２９】
判定ステップＳ２５において、テロメア長Ｔが所定値Ｍａｖ３以上であると判断されたときには、細胞が十分に増殖能力を有しており、細胞数が少ないことは他の培養条件に問題があると考えられるので、条件変更ステップＳ２６に進行する。培養条件としては、例えば、栄養剤や成長因子のような薬剤の濃度や、薬剤の種類、あるいは培地の交換のタイミングなどが挙げられる。そして、条件変更ステップＳ２６において培養条件が変更された後に、継続判定ステップＳ２８に進行し、培養工程が継続されることになる。
【００３０】
一方、判定ステップＳ２５において、テロメア長Ｔが所定値Ｍａｖ３より小さいと判断されたときには、細胞が既に十分な増殖能力を有しておらず、細胞数が少ないことは、増殖能力を有していないことに起因していると判断できるので、これ以上の培養を行わないように、中止判定ステップＳ２７に進行して培養工程が中止される。
【００３１】
このように、本実施形態に係る培養検査方法によれば、培養途中において、細胞数の増殖能力を判断して、増殖速度が低い場合に、培養中止か培養条件の変更を選択できる。したがって、元来分裂能力が低いために増殖が十分に行われない場合には、その後の培養工程の続行を停止して、時間とコストの無駄の発生を防止することができる。また、分裂能力が十分である場合には、培養条件を改善して、適正な増殖速度で細胞を培養することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培養検査方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の第２の実施形態に係る培養検査方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の第３の実施形態に係る培養検査方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３３】
Ｓ２，Ｓ１２，Ｓ２４  テロメア長測定ステップ
Ｓ３、Ｓ１３，Ｓ２５  判定ステップ
Ｓ２１  細胞数測定ステップ
Ｍ  細胞数
Ｔ  テロメア長
【図１】
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【図２】
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【図３】
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