(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便且つ安価にＤＮＡ等のバイオ関連物質や、環境関連物質を光導波路法により定性的、定量的に分析する方法及び光導波路を提供する。【解決手段】光導波路表面に極微小物質（金を初めとする種々の物質のナノドット、ナノ粒子、ナノライン等）を光が通る程度の間隔をあけて多数配置することにより、この隙間から表面にエバネッセント光が滲みだし、微小物質の表面に結合した成分にエバネッセント光が作用するようにする事により導波路表面から滲み出たエバネッセント光がＤＮＡにより吸収され、ＤＮＡの濃度に比例した吸光度を示す。即ち、吸光度から定性・定量分析が可能である。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光導波路表面に、被測定検体（ＤＮＡ、バイオ関連物質、環境ホルモン等）を固定した数〜数百ｎｍ程度の大きさの基体を光が通過する程度の間隔を置いて配置したことを特長とする検出用素子
【請求項２】
被測定検体を固定する基体が金のナノドットであることを特徴とする請求項１の検出用素子
【請求項３】
被測定検体を固定する基体が金のナノ粒子であることを特徴とする請求項１の検出用素子
【請求項４】
被測定検体を固定する基体が金薄膜のナノラインであることを特徴とする請求項１の検出用素子
【請求項５】
被測定検体を固定する基体が金以外の物質で構成された請求項１の検出素子
【請求項６】
複数に分岐した光導波路において、それぞれ任意の被測定検体（ＤＮＡ等）を吸着した導波路表面に含まれる蛍光物質を同時に励起することを特徴とする請求項１の検出素子
【請求項７】
請求項６に示される検出素子において、半導体等のエリアセンサーを受光部とし、複数の導波路の発光強度を同時に測定することを特長とする請求項１の検出システム
【請求項８】
単数、又は複数に分岐した光導波路において、それぞれ任意の被測定検体（ＤＮＡ等）を吸着した導波路により吸収される吸光度を測定することを特徴とする検出システム
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、光を通さない物質（金等）であっても、その表面に固定した被測定検体（ＤＮＡ等）を光導波路法により微量の試料で安価に定性・定量測定する方法を提供する。【０００２】  ▲１▼光導波路基盤全面に金等の薄膜層を設け、この上に被測定検体を固定・結合させる方式では、エバネッセント光は薄膜によって吸収され、薄膜表面に到達することは出来ない。そのため、光を通さない物質に被測定検体を結合させて測定しようとする方法は光導波路法に適用できない欠点があった。【０００３】  ▲２▼具体的な一例を次に示す。
チオール基（−ＳＨ）を一方の端に修飾したＤＮＡプローブは、−ＳとＡｕ（１１１）面との結合により金薄膜上に固定される。一般に使用されているＤＮＡチップは、ガラス、プラスチック、シリコン単結晶等の基盤の上にＣｒ，Ｔｉ等の下地層を設け、其の上に金薄層を積層しＡｕ（１１１）面を最表面に形成するようにした構造を有している。この構造の薄層を光導波路表面全面に形成すると、膜厚が厚い為、エバネッセント光は吸収され金の表面にとどかない。其の為、金の表面に固定したＤＮＡに修飾した蛍光物質を励起することは出来ない。又、同様に金の表面に固定したＤＮＡによるエバネッセント波の吸収を測定することは出来ない。【０００４】  ▲３▼金薄層上Ａｕ（１１１）面に固定したＤＮＡプローブに、未知試料中のターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。この二本鎖ＤＮＡに特定の挿入剤をインターカレートし、電極基盤との間に流れる電流を測定する方法がある。この方法では電極の構造が複雑且つ高度の製造技術を必要とするため、チップのコストが非常に高くなるという欠点がある。【０００５】  ▲４▼金薄層上Ａｕ（１１１）面にチオール基を介してＤＮＡプローブを固定し、これにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。こうして形成された二本鎖ＤＮＡを表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定する方法がある。この方法は使用する試料の量が多いという欠点がある。【０００６】  ▲５▼金ナノ粒子にチオール基を介してＤＮＡプローブを固定し、ここにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。この複数の金ナノ粒子を凝集させ、その濃淡からＤＮＡを検出する方法がある。この方法では複数の種類のＤＮＡを特定することは出来ない。又、必要とする試料の量も多い。
【０００７】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  光を通さない物質（金等）であっても、その表面に固定した被測定検体（ＤＮＡ等）を光導波路法により微量の試料で安価に定性・定量測定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】以上の課題を解決する為の基本的な手段と具体的な応用例について以下に示す。
検体を結合させる物質（金等）をナノオーダの微粒子、薄膜のドット或は細線にし、お互いに光が通る程度の間隔を置くように光導波路表面に配置する。検体を結合させる物質の表面に被測定検体（ＤＮＡ等）を結合させる。微粒子の場合は被検体を表面に結合させてから光導波路表面に配置する方法も可能である。【００１０】ＤＮＡの測定方法を例にして以下に具体的な方法を示す。
エバネッセント光が金の表面に固定したＤＮＡに到達出来る様に光導波路表面に、ある程度の間隔を設けて複数の金のナノドット或いはナノオーダの線を形成し、又はナノ粒子を配置し、この金にチオール基を介してＤＮＡプローブを固定する。ここに試料を滴下し、プローブにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた後試料を洗い流し、ハイブリダイズした二本鎖のターゲットＤＮＡのみ金に固定した状態にする。其の後、この二本鎖ＤＮＡに蛍光物質を吸着させ、光導波路に励起光を入射させる。励起光はドット、又は  粒子の間を通して導波路表面から金表面に固定したＤＮＡに到達し、ＤＮＡに付着した蛍光物質を励起する。蛍光強度は導波路表面に対抗するように設けられた検出器により測定される。蛍光発光強度によりＤＮＡを定性或いは定量する。【００１１】又、ターゲット二本鎖ＤＮＡのみ金表面に固定した後、光導波路に紫外線を入射させ、この光をドット或いは細線、又は  粒子の間を通して導波路表面から金表面に固定したＤＮＡに到達させ、ＤＮＡにより吸収させ、光導波路出射口側に設けた検出器により吸光度を検出し、吸光度の大小によりＤＮＡを定性或いは定量する。
【発明の効果】
【００１２】▲１▼透光性物質に結合した被検体は勿論の事、非透光性物質を利用してその表面に結合した被検体を光導波路法により測定できるようになる。
具体例を次に示す：
金と−ＳＨ基との結合即ちチオレート結合により金にＤＮＡを固定する方法が一般に使用されている。光導波路表面に金の薄膜を形成し、これにＤＮＡを固定する一般の方法では金薄膜の厚さが数百〜数千ｎｍあり、エバネッセント波はこの膜を透過できないため金表面に固定したＤＮＡの測定は出来ない。即ち光導波路分光法はＤＮＡ測定には応用できない。しかし、本発明により光導波路分光法がＤＮＡ測定に利用できるようになる。【００１３】▲２▼光導波路分光法はコストが非常に安いため、安価な測定方法を提供できる。
▲３▼微量の試料で測定が出来る。
▲４▼測定が容易である。
▲５▼複数の試料を１つの導波路チップで測定することが出来る。【００１４】▲６▼チップのコストが安い。
例えば、既に開発されている電流検出方法や、また電気化学発光法でＤＮＡを検出する方法では測定チップのコストが非常に高価であるが、この方法では半分以下にコスト低減できる可能性がある。
▲７▼本発明による方法はバイオ、環境関連物質など広範囲の分野で利用でき、光導波路による分析範囲を大幅に拡大することが出来る。
【発明を実施するための形態】
【００１５】本発明による実施例を次に示す。
光導波路ＤＮＡ検出チップに関する実施例を以下に示す。
【００１６】▲１▼蛍光検出方式用光導波路ナノドットＤＮＡ評価チップ：
図−１に概要図を示す。
ガラス、石英ガラス、プラスチック等の光導波路▲６▼上に金のナノドットを、間隔をあけて多数固定する。この金ドットにＤＮＡプローブを固定し、未知試料中のターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせ、更に蛍光色素を吸着させる。この状態で導波路▲６▼のの側面から励起光▲１▼を入射する。導波路表面には金のナノドット間の隙間を通ってエバネッセント波が導波路表面に浸出し、ＤＮＡ▲３▼に吸着した蛍光色素▲５▼を励起する。こうして励起された蛍光▲４▼を導波路表面に対峙するように設置された検出器（図−９−▲１４▼）により検出する。この蛍光強度は導波路表面に形成された金ナノドットに固定されたｄｓ−ＤＮＡの数に比例するので，定性及び定量分析する事が可能である。
【００１７】▲２▼多数同時計測用導波路：
上記の導波路を図−２に示すように分岐し複数個の検出部を設けることも出来る。図に示すように導波路を複数個に分岐し，複数個のＤＮＡプローブ固定領域を設け、ここにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせる。更に蛍光色素を吸着させ、左側から入射した励起光により蛍光を発生させる。ここでは４分岐の例を示したが，分岐数には制限はない。
【００１８】▲３▼吸光度測定方式ＤＮＡチップ：
図−３は図−１で説明した蛍光測定用チップの内、蛍光色素▲５▼を吸着させないで、ＤＮＡの光吸収を測定するものである。入射光▲１▼−１は光導波路▲６▼を透過するときそのエバネッセント波（例：波長λ≒２６０ｎｍ）はＤＮＡに吸収される。従って、出射光▲７▼の吸収スペクトルを測定すれば，導波路表面のＤＮＡ濃度を測定することが出来る。
【００１９】▲４▼多数同時測定用吸光度測定方式ＤＮＡチップ：
図−４に示すように、ＤＮＡ固定領域を図−３に示す構造をもった導波路ＤＮＡチップにすることにより複数のＤＮＡを１つのチップに固定し光吸収測定法により測定することが可能である。
【００２０】▲５▼蛍光測定用光導波路ＤＮＡナノ粒子チップ；
図−５に示すように、金ナノ粒子▲２▼−１の表面にチオール基（−ＳＨ）等を介してチオレート結合によりＤＮＡプローブを固定し、これにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせたものを光が透過できる程度の間隔をおいて光導波路表面に置くか接着或いは吸着させる。入射した励起光▲１▼のエバネッセント光はナノ粒子間の隙間を通って伝播し、ＤＮＡに吸着した蛍光色素▲５▼を励起し、蛍光を発する。この蛍光強度を蛍光検出器（図−９−▲１４▼）により測定すれば其の濃度を測定することが出来る。
【００２１】▲６▼吸光度測定用金ナノ粒子ＤＮＡチップ：
図−６に示すように、入射光▲１▼−１のエバネッセント光は金ナノ粒子▲２▼−１の間を通って伝播し、ナノ粒子に固定したＤＮＡ▲３▼の吸収を受けた後、導波路出口から出射する（▲７▼−１）する。ナノ粒子は液体中であっても測定できる。即ち、ＤＮＡ固定ナノ粒子を含む液体を光導波路表面に乗せても良い。
【００２２】▲７▼蛍光測定用金ナノラインチップ；
図−１，３，５，６に示す金ナノドット▲２▼及びナノ粒子▲２▼−１を、線幅、高さ（厚さ）、及び間隔が数ｎｍ〜数百ｎｍ程度の金ナノライン▲２▼−２に置き換えた光導波路チップも同じ目的に応用できる。図−７に一例を模式的に示す。光導波路▲６▼の表面に光の進行方向に直角に、或いは傾斜角をもって金薄膜線▲２▼−２を上記条件を満たすように複数設ける。この金線薄膜の上に既に述べた方法にてＤＮＡ▲３▼を固定し、更に蛍光色素▲４▼を吸着させる。このようにして出来た光導波路チップに励起光▲１▼を入射させ、金ナノライン（金薄膜線）の間を通って表面に滲みだしたエバネッセント波が蛍光色素▲４▼を励起し、ＤＮＡ濃度に応じた蛍光▲５▼を発生する。この蛍光▲４▼強度は導波路の面にお互いに対峙する様に設置された検出器（図−９−▲１４▼）により検出する。
【００２３】▲８▼吸光度測定用金ナノラインチップ；
図−８に示すように、図−７に於いてＤＮＡ▲３▼に蛍光色素▲４▼を吸着させずに、其の儘の状態で入射させた入射光▲１▼のエバネッセント波は金ナノライン▲２▼−２の間を通って滲み出し、金ナノライン表面に固定したＤＮＡ▲３▼に吸収され、出射光▲７▼として光導波路端面から放射される。この光を分光器（図−９−▲１２▼）により吸光度を測定することによりＤＮＡを測定することが出来る。
【００２４】図−５，６，７，８に示す構造のチップを，夫々図−２、及び図−４のＤＮＡ固定領域に設けて、複数のＤＮＡを測定するチップを形成することが出来る。
【００２５】上記のチップを使った測定システムの一例を次に示す。
図−９は本発明によるチップを使用した蛍光測定法と吸光度測定法の両方に関する測定システムの概要を示すものである。
【００２６】先ず、蛍光測定法について示す。蛍光測定の場合には、一般に蛍光色素の励起波長は可視光領域にある。従って可視光領域（ＶＩＳ）の光源▲８▼；タングステン或いはタングステンハロゲンランプ、又はＬＥＤ等が使われることが多い。光源で発生された光は集光レンズ▲９▼により集光され、光導波路チップ▲１０▼の端面に入射する。この光は図に示すように導波路内で全反射を繰り返しながら導波路内を進み、反対側端面から出射する。途中、導波路表面に滲みだしたエバネッセント光は金微粒子或いはナノドット▲２▼等に固定したＤＮＡ▲３▼に吸着した蛍光色素▲５▼を励起し、蛍光を発生する。この蛍光強度を検出器▲１４▼で計数し、計算機▲１３▼により事前に作成した検量線等を用いて濃度に変換する。
【００２６】次に吸光度測定法について示す。光導波路表面に固定した金ナノ粒子、或いはナノドット▲２▼等にチオレート結合により固定されたＤＮＡ▲３▼は紫外線（波長λ≒２６０ｎｍ）の吸収スペクトルを有している。従ってこの波長での吸光度を測定することによって定性定量測定が出来る。図−９に示す光源▲８▼（ＵＶ光源；ハロゲンランプ等）から発せられた光は蛍光測定法の場合と同様に光導波路チップ▲１１▼の端面に入射させる。この光は導波路内を反射を繰り返しながら進み右端から透過光として出射する。途中エバネッセント光は表面に滲みだし、光導波路表面（下面）に固定された金ナノドット▲２▼或いはナノ粒子▲２▼−１等に固定されたＤＮＡ▲３▼に吸収される。光導波路チップ▲１０▼より出射した透過光はレンズ▲１１▼により集光され分光器▲１２▼により吸収スペクトルの測定が行われる。データは計算機▲１３▼により処理されスペクトルの表示及び濃度への換算が行われる。
【００２７】以上はＡｕ−Ｓ結合（チオレート結合）を利用したＤＮＡの測定について示した。しかし、この方法はチオレート結合のみならず、それ以外の方法でバイオ関連物質一般や環境関連物質（環境ホルモン、残留農薬等）を結合させても、測定することが出来る。其の例を以下に示す。
【００２８】生物特有の抗原抗体反応を利用して環境中の化学物質を種々のナノ粒子に結合させ、光導波路表面に配すことにより、高感度検出する。即ち、抗体或いは抗原をナノ粒子に結合させ、抗原抗体反応により有害化学物質をこれに固定させ、光導波路表面に配する。其の状態で光吸収分光法により測定する、或いは  蛍光物質を修飾して蛍光強度を測定することにより定性・定量分析する。
【００２９】ナノ粒子にペプチドを合成し、これにダイオキシンに蛍光色素を結合した色素複合体を修飾し、光導波路表面に配置し、蛍光測定することによりダイオキシン等が高感度で検出できる。
【００３０】以上のように本発明は種々の物質の測定に応用が開ける可能性を秘めている。
【００３１】「実施形態の効果」
この実施形態によれば、金等の光を通さない物質の表面に固定したＤＮＡの吸光度測定が可能になること、或いは、金等の表面に固定したＤＮＡに吸着させた蛍光色素を励起し発光させＤＮＡを測定することが出来ようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図−１は蛍光計測用導波路ＤＮＡナノドットチップの模式図である。
【図２】図−２は多数同時測定用導波路ＤＮＡチップの模式図である。
【図３】図−３は光吸収測定方式のＤＮＡナノドットチップの模式図である。
【図４】図−４は多数同時測定用吸光度測定方式ＤＮＡナノドットチップの模式図である。
【図５】図−５は蛍光計測用光導波路ＤＮＡナノ粒子チップの模式図である。
【図６】図−６は吸光度測定用光導波路ＤＮＡナノ粒子チップの模式図である。
【図７】図−７は蛍光計測用光導波路ＤＮＡナノラインチップの模式図である。
【図８】図−８は吸光度測定用光導波路ＤＮＡナノラインチップの模式図である。
【図９】図−９は光導波路チップを使ったＤＮＡ測定システムの構成概要図を示す。
【符号の説明】
【００３３】▲１▼励起光、▲１▼−１入射光、▲２▼ナノドット、▲２▼−１ナノ粒子、▲２▼−２金ナノライン、▲３▼ＤＮＡ、▲４▼蛍光、▲５▼蛍光色素、▲６▼光導波路、▲７▼透過光、▲７▼−１出射光、▲８▼光源、▲９▼集光レンズ、▲１０▼光導波路チップ、▲１１▼集光レンズ、▲１２▼分光器、▲１３▼計算機、▲１４▼蛍光検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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