(57)【要約】      （修正有）【課題】効率よくかつ安全に、さらに畑地での実際の栽培においても用いうる馬鈴薯を含む農作物のそうか病防除効果を有する物質を提供する。【解決手段】バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養液成分であり、分子量が１０２２、１０３６または１０５０である、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなるアシルペプチド化合物成分を提供する。さらに前記成分と農業用資材とを含む、馬鈴薯を含む農作物のそうか病防除用組成物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養液成分であり、分子量が１０２２、１０３６または１０５０である、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸を含む成分。
【請求項２】
分子量１０２２の成分の組成式がＣ５２Ｈ９１Ｎ７Ｏ１３、分子量１０３６の成分の組成式がＣ５３Ｈ９３Ｎ７Ｏ１３、分子量１０５０の成分の組成式がＣ５４Ｈ９５Ｎ７Ｏ１３である、請求項１記載の成分。
【請求項３】
アミノ酸として、１分子のバリン、１分子のグルタミン酸、４分子のロイシンおよび１分子のアスパラギン酸を含む、請求項１または２記載の成分。
【請求項４】
請求項１記載の分子量１０２２の成分であって、図１３の１ＨＮＭＲスペクトルを示す、前記成分。
【請求項５】
展開溶媒クロロホルム：メタノール：アンモニア＝７０：２５：４でのシリカゲルプレートＴＬＣ分離によるＲｆ値が０．１〜０．３である、請求項１〜４のいずれか一項記載の成分。
【請求項６】
バチラス・サブチリス培養液の酢酸エチル抽出相に含まれる、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の成分。
【請求項７】
バチラス・サブチリスが、バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７６１）である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の成分。
【請求項８】
以下の工程を含む方法により得られる成分：
１）バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養液を酢酸エチルと混合・攪拌する工程；
２）得られた酢酸エチル抽出液をサンプルとして用い、展開溶媒クロロホルム：メタノール：アンモニア＝７０：２５：４でのシリカゲルプレートＴＬＣによるＲｆ値が０．１〜０．３である成分を分離する工程。
【請求項９】
請求項１ないし６のいずれか一項に記載の成分の製造方法であって、
１）バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養液を酢酸エチルと混合・攪拌する工程；
２）得られた酢酸エチル抽出液をサンプルとして用い、展開溶媒クロロホルム：メタノール：アンモニア＝７０：２５：４でのシリカゲルプレートＴＬＣによるＲｆ値が０．１〜０．３である成分を分離する工程、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載の成分と、農業用資材とを含むことを特徴とする、馬鈴薯を含む農作物のそうか病防除用組成物。
【請求項１１】
農業用資材が食品産業廃棄物である請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
食品産業廃棄物がコーヒー抽出残滓および／または茶類抽出残滓である請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
農業用資材がゼオライトである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖を阻害するための、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の成分の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、馬鈴薯を含む農作物のそうか病の病原菌であるストレプトマイセス属菌に対する抗菌性を示す微生物由来の成分、および当該成分を利用した馬鈴薯を含む農作物のそうか病の防除用組成物に関する。
【０００２】
従来の技術
ジャガイモそうか病は、ストレプトマイセス属菌によって引き起こされる難防除土壌病害の一つで、世界各地で古くから発生が確認されている。発病した馬鈴薯の塊茎部表面には、赤褐色のかさぶた状の病斑が生じ、その組織はコルク化して小突起や小亀裂を生じる。その結果、生食・加工用としての商品価値を著しく損ない、重度に発病した場合には澱粉価が大幅に低下する。北海道では、１９８０年代以降に発生地域の拡大に伴う被害の増加により、馬鈴薯の安定供給を維持する上で大きな障害となっていることから、ジャガイモそうか病に関する研究が進められてきた。
【０００３】
従来より、馬鈴薯そうか病に対する防除対策としては、種芋をストレプトマイシン等の抗生物質で消毒処理する方法や、クロルピクリンやペンタクロロニトロベンゼン等の合成薬剤を用いて土壌を殺菌消毒する方法がとられてきた。
【０００４】
しかしながら、馬鈴薯そうか病の感染源は主に土壌であるので、前者のように単に種芋を消毒するだけでは顕著な効果が得られない。一方、後者のように合成薬剤による土壌殺菌は、土壌伝染性の病原菌に拮抗性を有し発病抑止能力示す土壌微生物までも殺菌してしまい、かえって発病が助長される場合もある。また、土壌中に有害な化学物質が蓄積されたり、更には薬剤散布作業者の健康を損なう危険性がある等、薬害による労働災害や環境破壊の原因になるという大きな問題がある。
【０００５】
他の防除策としては、そうか病病原菌であるストレプトマイセス属菌の生育適性ｐＨ領域を外すために、土壌のｐＨを低下させる方法があるが、収量が大きく低下したり、馬鈴薯の後に栽培する作物にも悪影響を及ぼす等の問題があり、適用が極めて制限される。
【０００６】
そこで、上記のような問題を生じない植物病害の防止策として、微生物を利用する生物学的防除の方法があり、これまでに多くの事例が報告されているが、馬鈴薯そうか病に対する生物学的防除の例は数少ない。その例としては、バチラスＫＦ−４４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＦ−４４）菌株の懸濁液に馬鈴薯等の植物体を浸漬処理する方法（特開平２−４８５０９）、シュードモナス・フルオレッセンスバイオバーＶ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｂｉｏｖａｒＶ）、シュードモナス・フルオレッセンスＭＤ−４ｆ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＤ−４ｆ）、シュードモナスＦ１３−１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  Ｆ１３−１）、エンテロバクター・アグロメランス  ２−３Ｂ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ｓｐ．２−３Ｂ）、アシネトバクターＭ２４−１（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｍ２４−１）の少なくとも１種類を含む懸濁液に種芋を浸漬したり、細菌を乾燥粉末又はスラリーとして種芋に塗布或いは散布したり、馬鈴薯栽培土壌に散布する方法（特開平１−１９３２０３）が報告されている。また、ストレプトマイセス  ＣＨ−３３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＨ−３３）の培養物もしくはその処理物によって豚糞を処理することを特徴とする抗植物病原性豚糞肥料の製造方法が特開昭６３−２６０８８６に示されている。
【０００７】
【特許文献１】特開平２−４８５０９
【特許文献２】特開平１−１９３２０３
【特許文献３】特開昭６３−２６０８８６
【０００８】
しかしながら、上記のいずれの微生物による方法も、実験室段階では病原菌に対して抗菌性を発揮するにも拘わらず、畑地での実際の栽培においては、馬鈴薯そうか病の防除対策として全く用いられていない。また、実際にいかなる物質が病原菌であるストレプトマイセス属菌に対する抗菌性を有するのかについては何ら開示されていない。
【０００９】
一方、特開２００１−２４５６５６は、馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属放線菌の増殖を阻害することができるバチラス・サブチリスに属する細菌について開示している。圃場での施肥試験においても効果を有することが確認されているが、実際にいかなる物質が抗菌性を有するのかについては開示されていない。
【００１０】
尚、現在までに報告されているバチラス・サブチリス由来の抗菌化合物には、一般的によく知られるＩｔｕｒｉｎＡ（非特許文献１）、3-OH脂肪酸を含んだＳｕｒｆａｃｔｉｎ（非特許文献２）などの環状ペプチド化合物が知られているが、そうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害能を有する物質は知られていない。
【００１１】
【特許文献４】特開２００１−２４５６５６
【非特許文献１】Peypoux et al. Biochemistry, 17, 3992-3996 (1978)
【非特許文献２】Vollenbroich et al. Appl. Environ. Microbiol., 63(1):44-9 (1997)
【００１２】
発明が解決しようとする課題
本発明は、上記の現状に鑑み、効率よくかつ安全に、さらに畑地での実際の栽培においても用いうる馬鈴薯を含む農作物のそうか病防除効果を有する物質、具体的にはバチラス・サブチリスに属する細菌の培養液由来の抗菌性を有する物質、すなわち農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖を阻害することができる物質および該物質を含む組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
課題を解決するための手段
本発明者はかかる課題を解決するために、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡＭ２２６７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７６１）培養液からの活性成分の分離精製および構造について鋭意検討した結果、該培養液の溶媒抽出、シリカゲルによる分離、阻害活性測定などにより、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなる成分が農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌に対して抗菌性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
したがって、本発明は、馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害物質である。すなわち本発明は、バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌培養液の酢酸エチル抽出、前記酢酸エチル抽出層のＶＬＣ（Vacuum Liquid  Chromatography）でのヘキサン：酢酸エチル＝１：２での溶出、得られた溶出成分の展開溶媒クロロホルム：メタノール：アンモニア＝７０：２５：４でのシリカゲルプレートＴＬＣ分離によるＲｆ値が０．１〜０．３である、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなる馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害物質である。
【００１５】
本発明者らは、前記そうか病病原菌ストレプトマイセス属菌増殖阻害成分の分子量測定により、分子量を１０２２、１０３６または１０５０と決定し、さらにはアミノ酸としてバリン、グルタミン酸、ロイシンおよびアスパラギン酸が含まれることを明らかにした。
【００１６】
即ち本発明は、分子量が１０２２、１０３６または１０５０である、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなる馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害物質である。また、本発明は、分子量１０２２で組成式Ｃ５２Ｈ９１Ｎ７Ｏ１３、分子量１０３６で組成式Ｃ５３Ｈ９３Ｎ７Ｏ１３、分子量１０５０で組成式Ｃ５４Ｈ９５Ｎ７Ｏ１３である、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなる馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害物質である。そして本発明は、アミノ酸が、バリン、グルタミン酸、ロイシンおよびアスパラギン酸を含む、３−ＯＨ脂肪酸とアミノ酸からなる馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害物質である。
【００１７】
また本発明は、馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖を阻害するための前記成分の使用である。
さらに本発明は、前記成分の少なくとも１種類と、農業用資材とを含む、馬鈴薯を含む農作物のそうか病防除用組成物である。
【００１８】
発明の実施の形態
バチラス・サブチリス培養液由来成分
本発明の成分は、微生物の培養、培養液からの当該成分の抽出・分離により得ることができる。
【００１９】
培養する微生物は、本発明の成分を生産する微生物であれば何れも用いることができる。たとえば、バチラス・サブチリスに属する菌株が好ましく、具体的にはバチラス・サブチリスＳＡＭ２２６６株、ＳＡＭ２２６７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７６１）、ＳＡＭ２２６９株、およびＳＡＭ２２７０株、並びにそれらの特性を有する細菌、さらにはそれらを親株とし親株と同様に馬鈴薯そうか病病原菌のストレプトマイセス属菌の増殖を阻害する活性を有する変異種であれば用いることができる。
【００２０】
上記バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６６株、ＳＡＭ２２６７株、ＳＡＭ２２６９株およびＳＡＭ２２７０株は、いずれも普通ブイヨン培地を用い、振とう培養することができる。例えば、３０℃で２日間、または３７〜４０℃で１日培養することで、菌濃度として約１０9cfu/mLの菌液を得ることができる。
【００２１】
本発明の成分の培養液からの抽出は、溶媒抽出、特に酢酸エチルもしくは酢酸エチルより若干極性が高い溶媒を使用するのが好ましい。培養液と溶媒の体積比は、何ら制限されるものではないが、抽出効率を考慮すると培養液１に対して溶媒１〜３程度が好ましい。抽出操作は、混合液を十分に混合できる装置であれば用いることができ、例えばシェーカー、往復振とう機が挙げられる。また、溶媒抽出は、その本発明の成分の回収率を向上させる観点から、複数回実施することもできる。
【００２２】
本発明成分の分離は、当業者によく知られた方法により、またはそれらの組合せにより行うことができる。例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより、分離精製することができる。一例を示せば、展開溶媒クロロホルム：メタノール：アンモニア＝７０：２５：４でのシリカゲルプレートＴＬＣにより、本発明成分はＲｆ値が０．１〜０．３の成分として分離される。
【００２３】
分離された成分の構造は、ＮＭＲ、ＧＣ−ＭＳ、ＩＲなどの一般的な分析手段の組合せにより確認することができる。
本発明成分の馬鈴薯そうか病病原菌であるストレプトマイセス属菌に対する増殖阻害活性は、当業者に周知の抗菌活性試験法により確認することができる。例えば、あらかじめ滅菌したペーパーディスクに分画した化合物をしみ込ませた後に乾燥させ、これをストレプトマイセス属菌の胞子プレートの中央に置き、培養して染み込ませ、一定期間培養後の阻止円の半径を測定することにより評価することができる。
【００２４】
そうか病防除用組成物
本発明のそうか病防除用組成物は、上記バチラス・サブチリス培養液由来成分と、農業用資材とを含む。
【００２５】
上記バチラス・サブチリス培養液由来成分は、上述の方法により分離精製することができるが、ほぼ単一の物質にまで精製されている必要はなく、土壌中に投与して問題のない成分であれば本発明のそうか病防除用組成物に含まれていてもよい。
【００２６】
上記バチラス・サブチリス培養液由来成分は、そうか病防除用組成物中に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ含まれるのが望ましい。
農業用資材には、農作物の栽培のために用いることのできる、土壌、バーミキュライト、などの土壌代替物、ゼオライトなどの土壌改良資材、肥料、食品産業廃棄物などの有機質資材、およびこれらを発酵（好ましくは好気発酵）させた発酵物、並びにこれらの組み合わせが含まれる。中でも食品産業廃棄物、ゼオライトが好ましい。
【００２７】
食品産業廃棄物は、原料由来、製品中身由来、製造工程由来または排水由来のもの等で、直接または醗酵などの処理を行った後に、土壌に還元できるものであれば、特に限定されない。例えば、ビール工場等から排出される糖化残滓や酵母廃棄物、麦根（麦芽製造工程で発生する麦芽由来の副産物）、ブドウの絞りかす、活性炭および汚泥、並びにこれらの組み合わせなどが挙げられる。中でも、コーヒー抽出残滓および／または茶類抽出残滓は好適な例である。コーヒー抽出残滓または茶類抽出残滓は、例えば、飲料製造工場、あるいは喫茶店、ファーストフード店等の外食産業において発生する、コーヒーまたは茶類の抽出済みの残滓をいう。コーヒー抽出残滓または茶抽出残滓は、単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。
【００２８】
本発明の組成物は、農作物を栽培するための土壌に混合して用いることができる。本発明の組成物は、土壌のｐＨが中性、酸性またはアルカリ性であっても土壌に混合して用いることができる。本発明の組成物の土壌への１ｍ2当たりの添加量は、組成物中の当該成分の濃度にもよるが、好ましくは、０．０１〜０．５ｋｇ程度、より好ましくは０．１〜０．２ｋｇ程度とすることが望ましい。本発明の組成物は、農作物の栽培開始前に土壌中に単回添加するのみで、農作物の栽培期間中の継続的な抗菌効果を発揮しうる。
【００２９】
なお、本発明の成分および組成物は、ストレプトマイセス属菌を病原菌とする農作物のそうか病の防除に有用である。本発明でいう農作物には、テンサイ、ニンジン、大根および馬鈴薯など、そうか病にかかりうるすべての農作物が含まれる。本発明は、特にテンサイ、ニンジン、大根および馬鈴薯のそうか病の防除に有用であり、馬鈴薯のそうか病の防除にとりわけ有用である。
【００３０】
本発明を実験例及び実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００３１】
実施例
実施例１．バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株の抗菌化合物の分画  
Ａ．方法
１）使用菌株
バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７６１）
ストレプトマイセス・ターギディスカビーズ 91sy-12（Streptomyces turgidiscabies 91sy-12）（ジャガイモそうか病菌）
【００３２】
２）培地
２−１．枯草菌用最少培地（Spizizen培地）（バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株の培養に使用）
【００３３】
【表１】
2005314410.tif 000002
I液、II液をそれぞれ500 mLの蒸留水に溶かし、オートクレーブ滅菌して冷却後、無菌的に混合して調製した。
【００３４】
２−２．NASm培地（バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株の保存用に使用）
普通寒天培地（栄研化学）を３５ｇ／Ｌの濃度に溶かし、オートクレーブ（１２１℃、２０分）した後、ストレプトマイシンを終濃度１０μg／mLとなるように加えた。尚、ストレプトマイシンストック溶液は蒸留水で１０mg／mLに調製後、フィルター（アドバンテック社製酢酸セルロース、φ0.20mm）濾過滅菌した。
【００３５】
２−３．放線菌用SSY培地（91sy-12の保存と胞子プレートに使用）
【００３６】
【表２】
2005314410.tif 000003
500 mL容ビーカーに蒸留水を入れ、上記のAgar以外の試薬を加えた。Starchは溶けにくいのでスターラーで攪拌しながら塊にならないように少しずつ加えた。ラップフィルムでフタをして約20分程混ぜた後、1N NaOHでpH調製(pH7.0±0.1)し、Agarを入れた500 mL容三角フラスコに移した後、オートクレーブ(121℃、20分)して調製した。
【００３７】
３）抗菌活性試験
３−１．ストレプトマイセス  ターギディスカビーズ 91sy-12胞子懸濁液の作成
十分胞子が着生した91sy-12の保存プレートに滅菌水約10 mLを注ぎ、滅菌した竹串で培地表面の胞子を懸濁させた。この懸濁液を滅菌した200 mL容三角フラスコに集めて超音波処理し(240 W、20分間)、胞子と培地とを分離させた。
胞子懸濁液は滅菌したガーゼで濾過し、50 mLコニカルチューブに分注して４℃で保存した。
【００３８】
３−２．ストレプトマイセス  ターギディスカビーズ 91sy-12胞子プレートの作成
オートクレーブ（121℃、20分）したSSY培地約50℃に冷ました後、シャーレ１枚（SSY培地約30 mL）当たり、ストレプトマイセス  ターギディスカビーズ 91sy-12胞子懸濁液を4 mL（胞子数7.2×107個）加えてよく混合し、胞子プレートを作成した。胞子プレートは４℃で保存した。
【００３９】
３−３．抗菌活性測定法
あらかじめ滅菌したペーパーディスク（ADVANTEC、直径8 mm）に培養した菌類または分画した化合物（100 μg以上）を50 μLしみ込ませた後に、吸引デシケーターの中に入れ、乾燥させた。これを胞子プレートの中央に置きTritonX-100を50 μL染み込ませた。30℃で9日間培養し、阻止円の半径を測定した。TritonX-100を加えることにより、非極性の化合物も寒天プレート状で広がることが可能になるようにした。
４）バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株培養菌液からの抗菌性化合物の抽出および分画
【００４０】
４−１．  培養
バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株をSpizizen培地40 mLに植菌して、旋回培養により、前培養（100 mL容三角フラスコ、37℃、120 rpm、16 hour）を行った。前培養菌液全量をSpizizen培地1Lに加え、旋回培養により、本培養（3L容三角フラスコ、30℃、120 rpm、4 days）を行った。
【００４１】
４−２．酢酸エチル抽出
バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株培養液2Lと酢酸エチル500 mLを3L容分液漏斗に入れて激しく混合した。静置して二層に分離させた後、下層(水相)はコックから取り出し、上層（酢酸エチル相）は上から取り出した。水相を分液漏斗に戻し、再び酢酸エチルを加え、溶媒抽出操作を３回行った。そして、酢酸エチル相を回収して、ロータリーエバポレーター（40℃）で濃縮乾固した後、得られた試料の重量を測定した。
【００４２】
４−３．シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーによる分画
シリカゲル（Wakogel C-200）2 gをヘキサン−酢酸エチル（1:1）と混合し、底に脱脂綿を入れたカラム（SIBATA 300 mm long、φ10 mm）に充填した。コックを開きシリカゲルの上面まで溶媒を落下させた後、静かにサンプルをシリカゲルの上面に乗せ、コックを開けて染み込ませた。次の４種類の溶媒20 mLで溶出した。
１．ヘキサン−酢酸エチル（1:1）
２．酢酸エチル
３．アセトン
４．メタノール
各画分をロータリーエバポレーター（40℃）で濃縮乾固した後、得られた試料の重量を測定し、それぞれの画分において抗菌試験を行った。（サンプルをメタノール5 mLに溶解させたうちの50 μL使用した。）
【００４３】
４−４．VLCによる分画
アスピレーターを接続したデシケーターにカラム（SIBATA 15AG4、97 mm long、φ20 mm）を取りつけ、シリカゲル（Wakogel C-300）を57 mmの高さまで充填した。シリカゲル（Wakogel C-200）にサンプルを吸着させたもの（サンプルの２倍量）を充填し（24 mm）、少量のシリカゲル（Wakogel C-200）で覆った（2 mm）。次の６種類の溶媒150 mLで溶出した。
１．ヘキサン−酢酸エチル（2:1）
２．ヘキサン−酢酸エチル（1:1）
３．ヘキサン−酢酸エチル（1:2）
４．酢酸エチル
５．アセトン
６．メタノール
各溶出画分をロータリーエバポレーター（40℃）で濃縮乾固した後、重量を測定し、それぞれの画分において抗菌試験を行った。（サンプルをメタノール5 mLに溶解させたうちの50 μL使用した。）
５）TLCによる分画と分析
【００４４】
５−１．シリカゲル薄層板の作成
ガラスプレート（20 cm×20 cm）を敷き詰めて固定した。共栓付き200 mL容フラスコにシリカゲル（Wakogel B-5）を37 g、蒸留水81 mLを入れ、激しく攪拌した。時々空気を抜くために栓を開けた。懸濁液を展着器に注ぎ込み、0.25 mm、0.5 mm、0.75 mmの厚さに塗布した。厚さは用途により適切なものを用いた。プレートの下から軽く振動を与えて均一に矯正した。作製したプレートは、風乾後、120℃で２時間乾燥して活性化した後、分析に使用した。
【００４５】
５−２．展開溶媒の選択
下記の混合した溶媒系を必要に応じて使用した。
Ｉ．クロロホルム−メタノール−水（60:16:2）
II. クロロホルム−メタノール−28%アンモニア水（70:25:4）
III．ヘキサン−ジエチルエーテル−酢酸（80:20:1）
IV. クロロホルム−メタノール−酢酸−水（20:3.5:2.3:0.7）
Ｖ．ヘキサン−ジエチルエーテル（80:20）
【００４６】
５−３．検出試薬
構成炭素の検出は、炭化法として、50％硫酸を噴霧し200℃、30分加熱した。定性試薬として、遊離のアミノ基の検出にはニンヒドリン試薬（赤紫色に発色）、糖の検出にはアンスロン試薬（紫色に発色）、リンの検出にはDittmer-Lester試薬（青色に発色）を使用し、噴霧後、200℃で数分間加熱した。また、スポットのかきとりには非破壊的なヨウ素蒸気を使用した。
【００４７】
５−４．TLCスポットのかきとりと抽出
TLC展開後、ヨウ素蒸気により発色させて確認できるスポットの周りに針で印をつけた後、吸引デシケーターの中に入れ十分ヨウ素を取り除いた。ヘラでスポットのシリカゲルをかき取り、共栓付きガラス遠沈管に移し、シリカゲルの２〜３倍容のクロロホルム−メタノール（2:1）を入れよく攪拌し、遠心分離（1,000 rpm、10分）した。同様に３回抽出した。300 mL容の分液漏斗を用いホルチ分配法に従い総雑物を除いた後、水洗するために、その４分の１容の水を加え激しく混合して静置して、二層に分離させた。得られた下層（クロロホルム層）を濃縮乾固した。
【００４８】
尚、前記ホルチ分配とは、クロロホルム：メタノール：水＝8：4：3の比になるように水を加えると、上層が水とエタノールの層となり、下層がクロロホルム層となる。脂溶性サンプルは下層に移行することである。
【００４９】
６）TLC [1]のHPLC分析
サンプルTLC [1]をφ0.20 μmのメンブランフィルターでろ過した後、逆相HPLC分析を以下の条件で行った。
検串器；多波長紫外可視分光光度計検出器（SHIMADZU SPD-10Avp）
検出波長；200 nm〜400 nm
分析カラム；DAISO SP-120-5-ODS-BP（6.0 mmφ×250 mmL）
移動相；メタノール−水（7:3）
流速；1.7 mL/min
【００５０】
Ｂ．結果
１）中性画分と酸性画分
Spizizen培地で培養したバチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株の培養菌液4L分を酢酸エチルで抽出して濃縮乾固した後、収量を測定すると107.6 mg得られた。その抽出残渣をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにより分画した。サンプルの収量からシリカゲル量は2 gを用いた。中性１（ヘキサン：酢酸エチル＝1:1）、中性２（酢酸エチル）、中性３（アセトン）、中性４（メタノール）の４種類で溶出した。濃縮乾固した後、収量を測定するとそれぞれ中性１ 2.4 mg、中性２ 59.5 mg、中性３ 17.1 mg、中性４ 15.7 mg得られた。そして、それぞれの画分について抗菌活性試験を行った結果、中性１では阻止円が見られなかったが、中性２〜４で大きな阻止円が、中性２においてはクリアな阻止円が観察された（図１）。
【００５１】
水相に6N HClを加えpH 2.0〜2.5に調製した後、酢酸エチルで再度抽出した。濃縮乾固した後、重量を測定すると194.9 mg得られた。中性酢酸エチル相よりも酸性酢酸エチル相の方が２倍多くの収量が得られた。同じく、抽出残漬をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにより分画した。サンプルの収量からシリカゲル量は6 gを用いて、溶媒は酸性１（ヘキサン：酢酸エチル＝1:1）、酸性２（酢酸エチル）、酸性３（アセトン）、酸性４（メタノール）の４種類で溶出した。濃縮乾固した後収量を測定すると、それぞれ酸性１ 17.2 mg、酸性２ 108.1 mg、酸性３ 41.4 mg、酸性４ 13.7 mg得られた。シリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーの結果、中性画分と酸性画分は全体の収量のおよそ60％が酢酸エチル画分に溶出されたことがわかった。抗菌試験の結果、酸性２においてクリアな阻止円が観察されたが、その他の酸性画分では阻止円が見られなかった（図１）。
【００５２】
２）VLCによる分画
バチラス・サブチリスＳＡＭ２２６７株菌液31 L分を酢酸エチルで抽出して濃縮乾固した後、重量を測定すると1642.3 mg得られた。先程のシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーで分画した結果、酢酸エチル相に多くの化合物が回収されたことから、さらに極性により活性画分を分離させるため、溶媒を６種類に増やした。オープンカラムクロマトグラフィー時のサンプル量より、抽出残渣の量が多いためVLCで分画を行った。サンプルの収量から判断してシリカゲル約3.2 mgに吸着させた。
【００５３】
抽出残渣をVLC [1]（ヘキサン：酢酸エチル；2:1）、VLC [2]（ヘキサン：酢酸エチル＝1:1）、VLC [3]（ヘキサン：酢酸エチル=1:2）、VLC [4]（酢酸エチル）、VLC [5]（アセトン）、VLC [6]（メタノール）の６種類で溶出した。それぞれの画分を濃縮乾固した後、収量を測定すると、VLC [1] 48.7 mg、VLC [2] 121.9 mg、VLC [3] 1113.5 mg、VLC [4] 197.6 mg、VLC [5] 91.1 mg、VLC [6] 83.9 mg得られた。VLC [1]〜VLC [6]において抗菌試験を行った結果VLC [2]〜VLC [5]には比較的大きな阻止円が観察された。VLC [6]は小さな阻止円であった。また、VLC [1]には阻止円がみられなかった（図２）。これらの結果からVLC [3]は収量と活性が十分に高いことがわかった。
【００５４】
３）TLCによる分画
VLC [1]〜VLC [6]のTLC分析を行った（図３）。展開溶媒IIで、発色試薬は50％硫酸を使用した。50％硫酸を噴霧した後、加温して約15分でVLC [1]、VLC [5]、VLC [6]におけるスポットが確認されたのに対し、VLC [2]〜VLC [5]において見られる３スポットは60分以上加温した後、確認された。VLC [3]における３スポットのかきとり抽出を行い、その粗画分をTLC [1]〜[4]として抗菌試験を行った（図４）。TLC [2]はネガティブコントロールであり、TLC [1]、[3]、[4]はいずれもストレプトマイセス・ターギディスカビーズに対して抗菌活性が確認された。
【００５５】
収量の最も多かったTLC [1] （Ｒｆ値０．１〜０．３）をODSカラムの逆相条件で、溶離液をメタノール−水（7:3）、温度を40℃、流速は1.7 mL/minにおいてHPLC分析を行ったところ、大きなピークが一つ確認された（図５）。
【００５６】
実施例２．TLC [1]の構造解析  
Ａ．方法
１）TLC [1]のMALDI-TOFMS分析
MALDI-TOFMS（Shimadzu/KRATOS KOMPACT MALDI I、Workstation SPARC station）を使用した。サンプルをサンプルプレートにのせてドライヤーボックスで乾燥させた。50％エタノールで1 mg/mLの濃度に調製したマトリックス溶液2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸、DHBA、SIGMA）を1 μLのせ、再びドライヤーボックスで乾燥させてからMALDI-TOF-MS分析を行った。照射レーザーは337 nmの窒素レーザーを用い、Positive modeで測定した。質量校正にはペプチド化合物のアンギオテンシンを用いた。
【００５７】
２）脂肪鎖解析
２−１．TLC [1]のメタノリシス処理
TLC [1]を窒素ガスエバポレーターで濃縮乾固して、5％塩酸メタノールHClを2 mL加えた。100℃で５時間の処理をして放冷した後、脂溶性画分と水溶性画分に分ける場合、1 mLの水を加えてよく振り、ヘキサンを3 mL加えてよく振って二層に分離した（上層はヘキサン相で脂溶性画分、下層が水メタノール相で水溶性画分）。ヘキサン抽出操作は３回行った。ヘキサン相を回収して、総雑物を除くために、水を等量加え、遠心（フラッシュ）にかけた。上層のヘキサン相をとり、濃縮乾固して少量のヘキサンに溶解させた。溶けない場合は少量のジエチルエーテルを加えた。
【００５８】
２−２．TMS化処理
メタノリシス処理したTLC [1]のヘキサン相約8 mgをマイクロチューブに入れて乾固した後、一晩水流ポンプのついたデシケーターの中に入れ十分に乾燥させた。ジエチルエーテル0.25 mLに溶解させ、1-トリメチルイミダゾールを10 μL加えた。シリンジはすぐ洗わないと固まってしまうため、直ちにドライピリジン（ピリジン, 脱水）でよく洗浄した。よく混合した後、60℃、10分間の処理を行った。
【００５９】
２−３．GC-MS分析
以下の条件で行った。
分析機種；島津GC-9Aガスクロマトグラフ（島津製作所）
キャリアーガス；窒素
検出器；水素炎イオン化検出器
記録計；D-2500型クロマトデータ処理装置（日立製作所）
カラム；CP-Sil 88キャピラリーカラム（クロムパック社製、0.25 mmI.D.×50 m）
温度；カラムオーブン温度を80℃、気化室温度を320℃に設定した。
昇温；80℃（20℃/min）→ 180℃（4℃/min）→ 310℃（30min保持）
【００６０】
３）TLC多重展開法
始め、展開溶媒ＩＶ薄層板の半分位まで展開し、水流ポンプ式吸引デシケーターの中に入れ、薄層板を完全に乾燥させてから、次に、展開溶媒Ｖで上まで展開した（１次元で２回展開する）。ニンヒドリン試薬を噴霧して、200℃で数分間加熱して遊離のアミノ基の発色を確認した後、50％硫酸試薬を噴霧して炭素のスポットを確認した。サンプルにはTLC [1]のメタノリシス処理物を用いたので、スタンダードには、メタノリシス処理をした牛脳スフィンゴミエリン、大豆レシチンセレブロシド、および、コレステロール、そして、アミノ酸（アルキニン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン）とそのメタノリシス処理物を用いた。
【００６１】
４）TLC [1]のHPLCによる単離精製
サンプルTLC [1]をφ0.20 μmのメンブランフィルターでろ過した後、逆相HPLC分析を以下の条件で行った。
検出器；多波長紫外可視分光光度計検出器（SHIMADZU  SPD-10Avp）
検出波長；20 nm〜400 nm
分析カラム；DAISO SP-120-5-ODS-BP（6.0 mmφ×250 mmL）
移動相；アセトニトリル−10 mmol/L酢酸アンモニウム（3:2）
流速；3.0 mL/min
【００６２】
５）P18.205のMALDI-TOFMS分析
以下の条件で測定した。
Mode of operation; Reflector
Polarity; Positive
Calibration matrix; α-cyano-4-hydroxycinnamic acid 
Matrix; 2,5-dihydroxybenzoic acid 
Mass calibration; angiotensin
【００６３】
６）P18.205のFAB-MS分析
装置は、Jeol社のJMS-HX/HX110Aを使用した。
測定は、直接導入法、Ｘｅガスを用いたFAB（高速原子衝突）−陽イオンモードにて行った。
【００６４】
７）P18.205の1HNMR分析
１ＨＮＭＲは以下の条件で行った。
測定装置Ｄｍｘ７５０機（ブルッカ−バイオスピン社製）、溶媒ＤＭＳＯ−d6、プローブ５ｍｍ、温度２９８．０Ｋ。
【００６５】
８）P18.205のアミノ酸分析
P18.205を酸加水分解し、ＨＰＬＣによりアミノ酸分析を行った。
【００６６】
Ｂ．結果
１）総分子量の推定
１−１．TLC [1]のMALDI-TOFMS分析
マトリックス溶液2,5-ジヒドロキシ安息香酸、質量校正にはペプチド化合物のアンギオテンシンを用いて、TLC [1]のMALDI-TOFMS分析を行った（図６）。結果、１０４４、１０５８、１０７２ m/zの３つの質量数ピークが確認された。尚、これらのピークは、Ｍ＋Ｎａによるピークである。
【００６７】
２）TLC [1]の脂肪鎖の解析
２−１．TLC [1]のメタノリシス処理ヘキサン相のTLC分析
TLC [1]をメタノリシス処理したヘキサン相において、実施例１に示す展開溶媒III、発色試薬は50％硫酸を用いてTLC分析を行った（図７）。以上の結果から、コレステロールより極性が低く、2-OH脂肪酸より極性が高い化合物が存在することがわかった。
【００６８】
２−２．TLC [1]のGC-MS解析
TLC [1]のメタノリシスヘキサン相をTMS化処理した後、GC-MSに供した。ガスクロマトグラフィーの結果、複数のピークが確認された。それぞれのピークにおいてマススペクトルを調べた（図８Ａ〜Ｄ）。但し、73 m/zはTMS基のマススペクトルと考えられた。
peak 1,2において、301、285、243、73 m/zのマススペクトルが見られた。
peak 3,4において、315、299、257、73 m/zのマススペクトルが見られた。
peak 5,6において、329、313、271、73 m/zのマススペクトルが見られた。
peak 7,8において、343、327、285、73 m/zのマススペクトルが見られた。
以上の結果から、炭素鎖13〜16の3-OH脂肪酸が同定された。そして、TLC [1]中には、炭素鎖13〜16の3-OH脂肪酸が混在していることがわかった。
【００６９】
３）TLC [1]の多重展開法による組成の解析
メタノリシス処理を行ったTLC [1]においてTLCの多重展開を行った（図９Ａ、９Ｂ）。始め、実施例１に示す展開溶媒IVで展開した後、次に、同展開溶媒Ｖの２種類の溶媒系で２回展開した。発色試薬はニンヒドリンで発色させた後、50％硫酸で行った。スタンダードはメタノリシス処理したセレブロシド、スフィンゴミエリン、および、コレステロール、そして、アミノ酸（アルギニン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン）とそのメタノリシス処理物と比較検討した。
【００７０】
結果から、TLC [1]のメタノリシス処理前は、ニンヒドリン反応が見られなかったのに対して、メタノリシス処理後ではニンヒドリン反応が確認された。そして、ニンヒドリン発色後、50％硫酸で発色後スポットが消失した。メタノリシス処理されたアミノ酸のRf値は、TLC [1]由来のスポットに近づいたことから、アミノ酸である可能性が高いことが示唆された。
【００７１】
４）抗菌化合物の単離および解析
４−１．TLC [1]からのHPLCによる単離精製
ODSカラムの逆相条件で、溶離液をアセトニトリル−10 mmol/L酢酸アンモニウム（2:3）、温度を40℃、流速は3.0 mL/minに設定してHPLC分析を行った。その結果、TLC [1]が複数のピーク成分からなることがわかった（図１０）。そして、主要と思われる保持時間18.205 minのピーク（p18.205）画分を分取した。
【００７２】
４−２．保持時間18.205 minのピーク（p18.205）成分の解析
ｉ）p18.205のMALDI-TOFMS
マトリックス溶液はα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸、質量校正はペプチド化合物のアンギオテンシンを用いて高分解能のReflector modeでp18.205のMALDI-TOFMS分析を行った（図１１）。
【００７３】
その結果、メインピーク1044.8298 m/zにおける[M+Na]+が確認され、マイナーピーク1066.8193、1082.7993、1088.8011 m/z、それぞれ、[M-H+2Na]+、[M-H+Na+K]+、[M-2H+3Na]+が認められた。この結果は、HPLCにより、TLC [1]が単一の化合物に精製されたことを示すとともに、[M+Na]+の値が1044.8298の化合物であることがわかった。
【００７４】
ii)p18.205の高分解能FAB-FMS
Jeol社のJMS-HX/HX110Aを使用し、直接導入法、Ｘｅガスを用いたFAB（高速原子衝突）−陽イオンモードにて測定した結果を図１２に示す。
【００７５】
その結果、メインピーク1022.6740 m/zに[M+H]+が検出され、上記MALDI-TOFMSでの結果と一致し、分子量は１０２２であること、および組成式がＣ５２Ｈ９１Ｎ７Ｏ１３であると決定された。
【００７６】
iii)p18.205の1HNMR
１ＨＮＭＲスペクトルを図１３に示す。
iv）p18.205のアミノ酸組成分析
p18.205のアミノ酸組成分析の結果、バリン、グルタミン酸、ロイシンおよびアスパラギン酸が存在すること、および分子数としてはバリンが１分子、グルタミン酸が１分子、ロイシンが４分子、アスパラギン酸が１分子存在することが判った。
【００７７】
発明の効果
馬鈴薯を含む農作物のそうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖を阻害することができるバチラス・サブチリスに属する細菌に関する報告はあるが、実際にいかなる物質が抗菌性を有するのかについてはわかっておらず、抗菌作用のメカニズムなど全く知られていなかった。馬鈴薯を含む農作物そうか病の根本的な防除に向けて、抗菌性物質が病原菌を効率良く抑制し、また土壌中の有用な生物や人体にも無害であることを証明する必要がある。本発明は、そうか病病原菌ストレプトマイセス属菌の増殖阻害剤としての効果のみならず、そうか病菌に対する拮抗作用メカニズム解明等にも寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、中性１〜４画分および酸性１〜４画分のストレプトマイセス・ターギディスカビーズ 91sy-12に対する抗菌活性を示す。
【図２】図２は、ＶＬＣ［１］〜［６］画分のストレプトマイセス・ターギディスカビーズに対する抗菌活性を示す。
【図３】図３は、ＶＬＣ画分のＴＬＣ分析結果を示す。
【図４】図４は、ＴＬＣによるＶＬＣ［３］の分画を示す。
【図５】図５は、ＴＬＣ［１］のメタノール−水系によるＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図６】図６は、ＴＬＣ［１］のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析結果を示す。
【図７】図７は、メタノリシス処理したＴＬＣ［１］のＴＬＣ分析結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＴＭＳ化ＴＬＣ［１］のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＴＭＳ化ＴＬＣ［１］のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＴＭＳ化ＴＬＣ［１］のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ピーク１のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、メタノリシス処理したＴＬＣ［１］のＴＬＣによる多重展開分離（ニンヒドリン発色）結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、メタノリシス処理したＴＬＣ［１］のＴＬＣによる多重展開分離（５０％硫酸発色）結果を示す。
【図１０】図１０は、ＴＬＣ［１］のアセトニトリル−酢酸アンモニウム水溶液系によるＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図１１】図１１は、ｐ１８．２０５のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、ｐ１８．２０５の高分解能ＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す。
【図１３】図１３は、ｐ１８．２０５の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
2005314410.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2005314410.tif 000014
【図９Ａ】
2005314410.tif 000015
【図９Ｂ】
2005314410.tif 000016
【図１０】
2005314410.tif 000017
【図１１】
2005314410.tif 000018
【図１２】
2005314410.tif 000019
【図１３】
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