(57)【要約】【課題】  Ｎ−ＡＮＰの測定温度範囲が広く、測定値の再現性がよくしかも測定感度が向上した、Ｎ−ＡＮＰの免疫学的測定法を提供する。【解決手段】  Ｎ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体を用いて、Ｎ−ＡＮＰを免疫学的に測定する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ＡＮＰ（Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ）のＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体を用いることを特徴とするＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法。
【請求項２】
第１モノクロナール抗体が標識されており且つ該標識がビオチンでありそして標識第２モノクロナール抗体の標識が酵素、蛍光物質、発光物質またはラジオアイソトープである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体を加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触せしめ、
（iii）工程（ii）の接触後の固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめ、次いで
（iv）工程（iii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法。
【請求項４】
（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体および標識第２モノクロナール抗体を逐次的にあるいは一緒に加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法。
【請求項５】
（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめ、
（ii）工程（ｉ）の接触後の固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とするヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法。
【請求項６】
（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第２モノクロナール抗体を加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰ免疫学的測定法。
【請求項７】
Ｎ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体との組合せからなる、Ｎ−ＡＮＰの免疫学的測定試薬。
【請求項８】
第１モノクロナール抗体が標識されており且つ該標識がビオチンである請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
標識第２モノクロナール抗体の標識が酵素、蛍光物質、発光物質またはラジオアイソトープである請求項７に記載の試薬。
【請求項１０】
第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固体に固定されている請求項７に記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法および測定試薬に関する。さらに詳しくは、Ｎ−ＡＮＰの特定の位置のアミノ酸残基を認識する異なる２種のモノクロナール抗体を用いる、Ｎ−ＡＮＰの免疫学的測定方法および測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
心房性Ｎａ利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）は、主として心房で合成・貯蔵され血中に分泌されるホルモンで、Ｎａ利尿、血管拡張、レニン・アルドステロン分泌抑制、循環血漿量減少など多彩な生理作用を介して生体の体液バランスならびに血圧調節に関与すると考えられている。その分泌は心房圧による心房筋の伸展により刺激されることから、ＡＮＰが高値を呈する場合、心房負荷や循環血漿量増加をきたす病態例えばうっ血性心不全、発作性心房性不整脈・心房細動、急性心筋梗塞、腎不全、ＳＩＡＤＨ、本態性高血圧、原発性アルドステロン症、Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、Ｂａｒｔｔｅｒ症候群の存在が示唆される。
【０００３】
血漿のＡＮＰ濃度は各種心疾患および腎疾患で重症度に平行して高値を示す。実際、心不全患者の心内圧とＡＮＰ濃度は極めてよく相関することが知られている。また、慢性腎不全患者における透析実施に伴うＡＮＰ濃度の低下は除水量を反映し、至適体重（ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ）の設定に際して一つの指標となる。
【０００４】
特許文献１には、α−ＡＮＰ（ｐｒｏ−ＡＮＰ）のＮ−末端の１〜２５番目の２５のアミノ酸残基からなる部分を認識する、ハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−III（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１８８７）により産生されるモノクロナール抗体およびそれを用いる、α−ＡＮＰの免疫学的測定法が開示されている。
【０００５】
また、非特許文献１には、Ｎ−ＡＮＰの１〜３０番目のアミノ酸残基を認識するモノクロナール抗体とＮ−ＡＮＰの７９〜９８番目のアミノ酸残基を認識するモノクロナール抗体とを用いて、サンドイッチ法によりＮ−ＡＮＰを免疫学的に測定する方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら、上記方法ではＮ−ＡＮＰを再現性よく測定することができずまた測定濃度範囲も狭いことが問題であった。
【特許文献１】特許第２５６１５１３号公報
【非特許文献１】Ｕｐｓａｌａ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０２  ９９−１０８（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、Ｎ−ＡＮＰの新たな免疫学的方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、Ｎ−ＡＮＰの測定濃度範囲が広く、測定値の再現性が高くしかも測定感度が向上した、Ｎ−ＡＮＰの免疫学的測定法を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、Ｎ−ＡＮＰの新たな免疫学的測定試薬を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、Ｎ−ＡＮＰ（Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ）のＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体を用いることを特徴とするＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法（以下、第１測定法ということがある）によって達成される。
【００１２】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体を加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触せしめ、
（iii）工程（ii）の接触後の固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめ、次いで
（iv）工程（iii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法（以下、第２測定法ということがある）によって達成される。
【００１３】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第３に、（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体および標識第２モノクロナール抗体を逐次的にあるいは一緒に加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法（以下、第３測定法ということがある）によって達成される。
【００１４】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第４に、（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめ、
（ii）工程（ｉ）の接触後の固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とするヒト血清中のＮ−ＡＮＰの免疫学的測定法（以下、第４測定法ということがある）によって達成される。
【００１５】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第５に、（ｉ）Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第２モノクロナール抗体を加えて混合し、
（ii）得られた血清混合物を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめ、次いで
（iii）工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定する、
ことを特徴とする、ヒト血清中のＮ−ＡＮＰ免疫学的測定法（以下、第５測定法ということがある）によって達成される。
【００１６】
さらに、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、最後に、Ｎ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体との組合せからなる、Ｎ−ＡＮＰの免疫学的測定試薬によって達成される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＮ−ＡＮＰ測定試薬は、高感度で測定範囲も広く、さらに、測定再現性も良好である。加えて、本発明の測定方法において測定結果を得るための総所要時間を、例えば約１２分で終了することができ、迅速なＮ−ＡＮＰ測定が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳述する。
【００１９】
本発明のＮ−ＡＮＰ（Ｎ−末端ｐｒｏ−ＡＮＰ）の免疫学的測定法（第１測定法）は、Ｎ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体を用いて行われる。
【００２０】
これらの第１モノクロナール抗体および第２モノクロナール抗体は例えばＭｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社から市販されており、容易に入手可能である。第１モノクロナール抗体は標識されていてもされていなくてもよい。第１モノクロナール抗体の標識物質は、好ましくはビオチンである。該標識物質に対する抗体との免疫学的反応を利用して第１モノクロナール抗体を固体に固定化することができる。また、第２モノクロナール抗体の標識は例えば酵素、蛍光物質、発光物質あるいはアイソトープであることができる。Ｎ−ＡＮＰと免疫学的反応をした第２モノクロナール抗体の標識を測定することにより、Ｎ−ＡＮＰの存在を定性的にあるいは定量的に検出することができる。第１モノクロナール抗体および第２モノクロナール抗体への標識付けはそれ自体公知の方法により行うことができる。例えば標識酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましく用いられる。また、架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−（２−ポリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４，４’−ジチオジピリジン、その他公知の架橋剤が用いられる。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて、既知の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明の第２測定法は、上記のとおり、工程（ｉ）〜（iv）からなる。工程（ｉ）において、Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体を加えて混合する。標識第１モノクロナール抗体はリン酸緩衝液で希釈して例えば０．５〜５０μｇ／ｍｌの濃度の水溶液に調製して用いられる。この水溶液には牛血清アルブミンあるいはカゼイン、およびマウス血清をそれぞれ例えば０．１〜５％および０．５〜２０％で含有させるのが好ましい。工程（ｉ）で得られた血清混合物中にはＮ−ＡＮＰと標識第１モノクロナール抗体との免疫学的反応生成物が形成される。工程（ii）ではこの血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質例えばビオチンに対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触させる。
【００２２】
抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に使用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまたは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボール）、カップ、チューブ、プレートなどを用いることができる。これらの担体に抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッファー中、ｐＨ６〜１０、好ましくは中性付近で室温下に一夜放置することにより行う。抗体を吸着した担体は、アジ化ナトリウムなどの防腐剤の存在下、冷所に保存する。アビジンの固定化も同様にして行うことができる。上記接触に際しては、上記固定化固体を予めリン酸緩衝液等で湿潤せしめておくことが好ましく、接触は例えば１秒〜６０分間で十分である。工程（ii）の接触後の固体の表面には、固定化された抗体すなわち標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体あるいはアビジンと、Ｎ−ＡＮＰと標識第１モノクロナール抗体との免疫学的反応生成物との間に、当該標識物質を介して結合が生成し、該免疫学的生成物が固定される。
【００２３】
工程（iii）では、工程（ii）の接触後の上記固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめる。標識第２モノクロナール抗体は、リン酸緩衝液で希釈して例えば０．１〜５μｇ／ｍｌの濃度の水溶液に調製して用いられる。この水溶液には牛血清アルブミンあるいはカゼイン、およびマウス血清をそれぞれ例えば０．１〜５％および０．５〜２０％で含有させるのが好ましい。
【００２４】
標識第２モノクロナール抗体は、工程（ii）で固定化されたＮ−ＡＮＰを免疫学的に反応する。
【００２５】
従って、工程（iv）において、工程（iii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定することにより、Ｎ−ＡＮＰの存在が定性的にあるいは定量的に検出することができる。標識の測定は標識の違いによってそれぞれそれ自体公知の方法により実施することができる。
【００２６】
本発明の第３測定法は、前記のとおり、工程（ｉ）〜（iii）からなる。工程（ｉ）において、Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第１モノクロナール抗体および標識第２モノクロナール抗体を逐次的にあるいは一緒にを加えて混合する。標識第１モノクロナール抗体と標識第２モノクロナール抗体は、Ｎ−ＡＮＰと、それぞれが認識するアミノ酸残基の部位で免疫学的に反応してＮ−ＡＮＰと結合する。
【００２７】
工程（ii）では、工程（ｉ）で得られた血清混合物を、標識第１モノクロナール抗体の当該標識物質に対する抗体またはアビジンを固定した固体に接触せしめる。この工程（ii）において、第１測定法の工程（iii）において生成される同じ生成物が生成されることが理解されよう。
【００２８】
次いで、工程（iii）では、工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定が行われる。
【００２９】
本発明の第４測定法は、前記のとおり、工程（ｉ）〜（iii）からなる。
【００３０】
工程（ｉ）においてＮ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめる。工程（ｉ）で用いられる第１モノクロナール抗体が固定化された固体は、第１モノクロナール抗体が認識するアミノ酸残基の部位で固体に固定化されたものではなく、第１モノクロナール抗体が認識するアミノ酸残基の部位とは異なる他の部位で固体に固定化されたものである。このような固定化は、第２測定法の工程（ii）において説明した固定化と同様にして行うことができる。固定化された第１モノクロナール抗体は、そのため、工程（ｉ）においてＮ−ＡＮＰと免疫学的に反応することができる。
【００３１】
工程（ii）において、工程（ｉ）の接触後の固体を標識第２モノクロナール抗体と接触せしめる。工程（ii）において、工程（ｉ）において上記の如く固定化されたＮ−ＡＮＰに対し標識第２モノクロナール抗体が免疫学的に反応して固定化される。
【００３２】
次いで工程（iii）では、工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定が行われる。
【００３３】
本発明の第４測定法は、前記のとおり、工程（ｉ）〜（iii）からなる。
【００３４】
工程（ｉ）において、Ｎ−ＡＮＰの存在する可能性のあるヒト血清に標識第２モノクロナール抗体を加えて混合する。工程（ｉ）で得られた血清混合物中にはＮ−ＡＮＰと標識第２モノクロナール抗体との免疫学的反応生成物が形成される。工程（ii）では、工程（ｉ）で得られた血清混合物を、第１モノクロナール抗体がＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固定された固体に接触せしめる。工程（ii）で用いられる第１モノクロナール抗体が固定化されたこの固体は、第３測定法の工程（ｉ）で用いられる第１モノクロナール抗体が固定化された固体と同じものである。工程（ii）において、固定化された第１モノクロナール抗体が工程（ｉ）において形成された免疫学的反応生成物のＮ−ＡＮＰと第１モノクロナール抗体を認識するアミノ酸残基の部位で免疫学的に反応して固定化する。
【００３５】
次いで、工程（iii）では、工程（ii）の接触後の固体について標識第２モノクロナール抗体の当該標識について測定が行われる。
【００３６】
本発明によれば、本発明の上記測定法の説明から理解されるように、Ｎ−ＡＮＰの有用な免疫学的測定試薬として、Ｎ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する第１モノクロナール抗体およびＮ−ＡＮＰのＮ−末端の６５〜８４番目の２０個のアミノ酸残基を認識する標識第２モノクロナール抗体との組合せが提供される。この試薬において、例えば第１モノクロナール抗体は標識されており且つ該標識がビオチンであることができ、標識第２モノクロナール抗体の標識は酵素、蛍光物質、発光物質またはラジオアイソトープであることができる。
【００３７】
また、Ｎ−ＡＮＰの測定に用いられるときには、上記第１モノクロナール抗体はＮ−ＡＮＰのＮ−末端の１〜３０番目の３０個のアミノ酸残基を認識する部位以外の部位で固体に固定されることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
（１）Ｎ−ＡＮＰの１−３０番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（第１モノクローナル抗体）のビオチン化
第１モノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）のビオチン化は以下の手順で行なった。
【００４０】
第１モノクローナル抗体を２ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いて希釈して総量２５０μＬの第１モノクローナル抗体溶液を調製した。該溶液にビオチン化試薬（５０ｍＭ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＣ5−ＯＳｕ、同仁化学（株）製）を３０μＬ添加して混合後、２５℃にて４時間インキュベーションした。その後、０．１５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と表記することもある）で平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャムファルマシア製）に、上記反応液２５０μＬに２．２５ｍＬのＰＢＳを加えた溶液をアプライした。続いて、３．５ｍＬのＰＢＳをアプライし、カラムから出てくる溶液をビオチン化第１モノクローナル抗体として回収した。
【００４１】
（２）Ｎ−ＡＮＰの６５−８４番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（第２モノクローナル抗体）のペルオキシダーゼ標識
第２モノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）のペルオキシダーゼ標識は以下の手順で行なった。
【００４２】
５ｍｇのペルオキシダーゼ（ＲＺ＞３．０、東洋紡績社製）を１．２ｍＬの水に溶解し、０．１Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．３ｍＬ添加して、２５℃で２０分静置した。その後、該反応液を１０ｍＭの酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）に対して４℃で一晩透析し、活性化ペルオキシダーゼ溶液を得た。次に、１０ｍｇ／ｍＬの第２モノクローナル抗体を含む２０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍＬを調製し、該抗体溶液と上記活性化ペルオキダーゼ溶液を混合し、２５℃で２時間攪拌した。得られた反応液に４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ加えて４℃で２時間静置した後、ＰＢＳに対して一晩透析してペルオキシダーゼ標識第２モノクローナル抗体を得た。
【００４３】
（３）第１試薬の調製
（１）で調製したビオチン化第１モノクローナル抗体の濃度が５μｇ／ｍＬとなるように、また牛血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度、およびマウス血清濃度がそれぞれ１％、１０％となるようにＰＢＳに添加して第１水溶液とした。
【００４４】
（４）第２試薬の調製
（２）で調製したペルオキシダーゼ標識第２モノクローナル抗体の濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、またマウス血清濃度、および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度がそれぞれ１０％、１％となるようにＰＢＳに添加して第２試薬とした。
【００４５】
（５）被検体溶液の測定
リコンビナントＮ−ＡＮＰ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を含むか若しくは含まないＰＢＳを被検体溶液として以下の測定に使用した。また、以下の測定は市販の酵素免疫測定装置ＭＩ０１（（株）エイアンドティー製）を用いて行なった。
【００４６】
被検体溶液３０μＬと第１試薬３０μＬを混合して４０℃で５分間インキュベーション後、該反応液の５０μＬを１％カゼインを含むＰＢＳで浸潤させた抗ビオチン抗体固相化カップ（（株）エイアンドティー製）に滴下した。次いで、（４）で調製した第２試薬を２０μＬ滴下した。４０℃で２分間該カップをインキュベーション後、８０μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄した。これに０．０５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）と０．０１％の過酸化水素から成るＴＭＢＺ溶液（エイアンドティー製）を３０μＬ滴下し、波長６７０ｎｍにおける単位時間あたりのレーザー光反射強度の変化量（以下、「ΔＫ／Ｓ」と表記する）を測定した。
【００４７】
上記測定を３回行った結果を表１に示した。表１より、Ｎ−ＡＮＰ濃度が０ｐｍｏｌ／Ｌのときの「平均ΔＫ／Ｓ＋２×標準偏差」が、３０ｐｍｏｌ／Ｌのときの「平均ΔＫ／Ｓ−２×標準偏差」と重ならないことから、測定下限は３０ｐｍｏｌ／Ｌであった。また、Ｎ−ＡＮＰ濃度が２０，０００ｐｍｏｌ／Ｌまでは、Ｎ−ＡＮＰ濃度に対してΔＫ／Ｓ値がほぼ直線的に増加していることから、少なくとも２０，０００ｐｍｏｌ／Ｌまでは測定できることが確認できた。さらに、前記非特許文献１に報告されている測定再現性（１０％程度）よりも良好であった（本試薬の測定再現性は２．５−７．５％）。
【００４８】
【表１】
2005114480.tif 000002
【００４９】
実施例２
実施例１において、「（５）被検体溶液の測定」以外はすべて実施例１と同様の方法で行った。被検体溶液の測定は以下の条件、方法にて行った。
【００５０】
測定は、リコンビナントＮ−ＡＮＰ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を含むか若しくは含まないＰＢＳを被検体溶液として、ＭＩ０１（（株）エイアンドティー製）を使用して行なった。
【００５１】
被検体溶液５０μＬと第１試薬５μＬ、第２試薬５μＬを混合して４０℃で５分間インキュベーション後、該反応液の５０μＬを１％カゼインを含むＰＢＳで浸潤させた抗ビオチン抗体固相化カップ（（株）エイアンドティー製）に滴下した。次いで、８０μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄した。これに０．０５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）と０．０１％の過酸化水素から成るＴＭＢＺ溶液（エイアンドティー製）を３０μＬ滴下し、ΔＫ／Ｓを測定した。
【００５２】
上記測定を３回行った結果を表２に示した。表２に示すように、実施例１に記したような２ｓｔｅｐ法のみならず、１ｓｔｅｐ法でも２ｓｔｅｐ法と同等の感度、濃度域、測定再現性を有することが確認できた。
【００５３】
【表２】
2005114480.tif 000003
【００５４】
実施例３
（１）Ｎ−ＡＮＰの１−３０番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（第１モノクローナル抗体）の固定化
第１モノクローナル抗体を０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳを用いて希釈し、反応カップ（（株）エイアンドティー製）１個当たり２５μＬずつ滴下した。これを室温で風乾し、第１モノクローナル抗体固相化カップを作製した。
【００５５】
（２）Ｎ−ＡＮＰの６５−８４番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（第２モノクローナル抗体）のペルオキシダーゼ標識
実施例１と同様の方法で、第２モノクローナル抗体をペルオキシダーゼ標識した。
【００５６】
（３）第２試薬の調製
（２）で調製したペルオキシダーゼ標識第２モノクローナル抗体の濃度が１μｇ／ｍＬとなるように、またマウス血清濃度、および牛血清アルブミン（ＢＳＡ）濃度がそれぞれ１０％、１％となるようにＰＢＳに添加して第２試薬とした。
【００５７】
（４）被検体溶液の測定
リコンビナントＮ−ＡＮＰ（Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を含むか若しくは含まないＰＢＳを被検体溶液として、実施例１と同様、ＭＩ０１（エイアンドティー製）を使用して測定を行なった。
【００５８】
被検体溶液３０μＬを１％カゼインを含むＰＢＳで浸潤させた第１モノクローナル抗体固相化カップ（上記（１）で作製したもの）に滴下した。次いで、（３）で調製した第２試薬を２０μＬ滴下した。４０℃で２分間インキュベーション後、８０μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回洗浄した。これに０．０５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）と０．０１％の過酸化水素から成るＴＭＢＺ溶液（（株）エイアンドティー製）を３０μＬ滴下し、ΔＫ／Ｓを測定した。
【００５９】
上記測定を３回行った結果を表３に示した。表３に示すように、実施例１と同等の感度、測定域を持ったＮ−ＡＮＰ測定試薬が作製できた。また、測定再現性も実施例１と同等であった。
【００６０】
【表３】
2005114480.tif 000004
【００６１】
比較例１
実施例１において、Ｎ−ＡＮＰの６５−８４番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体（第２モノクローナル抗体）をＮ−ＡＮＰの７９−９８番目のアミノ酸を認識するモノクローナル抗体に変えたこと以外はすべて実施例１と同様の方法で行った。
【００６２】
上記測定を３回行った結果を表４に示した。表４に示すように、Ｎ−ＡＮＰ濃度が５０ｐｍｏｌ／Ｌにおいても０ｐｍｏｌ／Ｌとの差がなく、また、５，０００ｐｍｏｌ／Ｌ以上は測定値（ΔＫ／Ｓ）が殆ど同じであることから、測定範囲は１００−５，０００ｐｍｏｌ／Ｌであった。測定再現性も６．５−１３．３％であり、実施例１よりも悪かった。
【００６３】
【表４】
2005114480.tif 000005