(57)【要約】【課題】  食品等の製造に供しても安全であって、高イオン強度下や広範なｐＨ域で安定であり、さらに、高分子電解質や疎水性物質が基質である場合やこれらの物質が基質中に共存する場合も、酵素の安定な吸着が保たれ且つ充分な活性を発現する固定化酵素の製造方法を提供すること。【解決手段】  イオン結合法若しくは物理的吸着法において、吸着工程、洗浄工程及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びに特定温度での加熱処理工程、特定濃度の有機溶媒水溶液を用いる有機溶媒処理工程及びタンパク質溶液処理工程からなる安定化処理工程群から選択される少なくとも一工程を具備し、上記安定化処理工程は、上記吸着工程、上記洗浄工程及び上記後処理工程の少なくとも一工程において行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン結合法若しくは物理的吸着法において、
担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びに加熱処理工程を具備し、
上記加熱処理工程は、上記吸着工程、上記洗浄工程及び上記後処理工程の少なくとも一工程において、５０〜１００℃の温度で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項２】
イオン結合法若しくは物理的吸着法において、
担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びに有機溶媒処理工程を具備し、
上記有機溶媒処理工程は、上記吸着工程において、２０〜８５体積％の親水性有機溶媒水溶液中で行うか、又は上記洗浄工程及び／若しくは上記後処理工程において、２０体積％以上の親水性有機溶媒水溶液中で若しくは親水性有機溶媒中で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項３】
イオン結合法若しくは物理的吸着法において、
担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びにタンパク質溶液処理工程を具備し、
上記タンパク質溶液処理工程は、上記洗浄工程及び／又は上記後処理工程において、タンパク質溶液中で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか二項以上を組み合わせて実施することを特徴とする固定化酵素の製造方法。
【請求項５】
上記固定化担体が水不溶性多孔性担体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項６】
上記固定化担体がイオン交換樹脂であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項７】
上記固定化担体がキトサン又はキトサン誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項８】
上記酵素がホスホリパーゼであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項９】
上記酵素がタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法で得られたことを特徴とする固定化酵素。
【請求項１１】
請求項１０記載の固定化酵素で処理したことを特徴とする酵素処理卵黄。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素の製造方法、該製造方法により得られた固定化酵素及び該固定化酵素で処理した酵素処理卵黄に関するものであり、該製造方法により製造された固定化酵素は、食品や化粧品、医薬品等の製造に好適に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
従来から、物質の合成や変換の触媒として酵素が利用されてきており、製品から容易に酵素が除去出来ることや、繰り返し使用できること等の利点から、酵素を固定化する技術が研究され、実用化されている。
【０００３】
酵素の固定化方法は、例えば非特許文献１では、担体結合法、架橋法及び包括法の３種類に分類されており、担体結合法は、さらに共有結合法、イオン結合法及び物理的吸着法に分類されている。これらの中で、共有結合法では、担体を臭化シアンやヒドラジン等の活性化試薬で処理して活性基を導入し、酵素を共有結合で結合させるのが一般的であり、また、架橋法や共有結合法の一部では、グルタールアルデヒド等の多官能性架橋剤を用いるのが一般的である。しかし、食品や化粧品、医薬品等、人体に直接使用される素材、原料等の加工において固定化酵素を使用する場合、これらの化学物質の使用は必ずしも好ましいとは言えなかった。
【０００４】
また、包括法の場合も、化学物質を酵素溶液中で重合させて酵素を包括するため、実質的に食品や化粧品、医薬品等の用途には好ましいとは言えなかった。また、包括法には、カラギーナンやアルギン酸等、食用天然高分子原料を用いる方法もあるが、柔らかく、脆く崩れやすい等の問題があった。さらに、基質がタンパク質等の高分子の場合、内部に包括された酵素と基質の接触に拡散律速が生じ、反応速度が極めて遅くなるという問題もあった。
【０００５】
また、イオン結合法は、担体に酵素をイオン結合によって吸着させるため、活性化試薬や架橋剤を使用する必要はないが、イオン強度の高い条件や特定のpH域で使用すると、酵素が担体から遊離する場合がある。さらに、固定化酵素を作用させる基質がタンパク質のような高分子電解質の場合や、基質中にタンパク質のような高分子電解質が共存する場合、酵素タンパク質と高分子電解質との置換によって、酵素の遊離が起こるという問題があった。これは、酵素の主体がタンパク質であるが故、予め担体に吸着している酵素タンパク質と、固定化酵素と接触する基質、生成物等の酵素以外のタンパク質あるいは高分子電解質とで、化学的性質が極めて類似していることに起因している。酵素の遊離は、生成物中に酵素が混入して品質の低下を引き起こす一方、固定化酵素自体の寿命が短くなる。
【０００６】
また、物理的吸着法は、主に担体と酵素との疎水性相互作用等による吸着を利用しているため、化学薬品を使用する必要はないが、イオン結合法よりもさらに担体と酵素との相互作用が弱く、酵素が担体から脱離しやすいという問題があった。例えば、疎水性相互作用による吸着では、基質や基質中に共存する疎水性タンパク質や油脂のような疎水性物質や界面活性作用を有する物質が存在する環境では、酵素の脱離を引き起こし、イオン吸着法と同様の問題があった。
【０００７】
要するに、食品や化粧品、医薬品の製造に用いられる固定化酵素は、活性化試薬や架橋剤のような化学物質を一切使用せず、安全性が確認され、且つ物理的強度の高い担体を使用したもの、すなわち、実質的にイオン結合法若しくは物理的吸着法に限定され、しかも酵素の脱離が起こらず安定であることが必要である。しかしながら、従来このような要求を満たす固定化酵素はなかった。
【０００８】
なお、特許文献１には酵素を含有するコラーゲン−酸性多糖複合体（固定化酵素）に対して、また特許文献２にはコラーゲン−酵素複合体（固定化酵素）に対して、それぞれ乾燥した後に４０〜６０℃での加熱処理を施し、それぞれ固定化酵素の硬化処理、架橋処理によって固定化酵素を安定化する方法について述べられているが、これらは加熱処理によってタンパク質間の熱による凝集を利用したものであり、本発明のように、イオン吸着や物理的吸着によるところの固定化酵素が、加熱処理によって安定化することは全く予見できないことである。
【０００９】
また、特許文献３には、陽イオン交換樹脂の担体に酵素を固定化させる際に、担体及び酵素溶液のｐHを調整する旨の記載があるが、ｐHを調整しても、反応基質溶液のｐHの変動で酵素の脱離が起こり、安定な固定化酵素を得ることはできない。
【００１０】
【特許文献１】特開昭５２−１３９７８３号公報
【特許文献２】特開昭５２−１３９７８２号公報
【特許文献３】特開２０００−２８７６４５号公報
【非特許文献１】生物化学実験法28・バイオリアクター実験入門(学会出版センター)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、食品や化粧品、医薬品の製造に供しても安全であって、高イオン強度下や広範なｐＨ域で安定であり、さらに、タンパク質やペプチド、油脂等の高分子電解質や疎水性物質が基質である場合や、これらの物質が基質中に共存する場合においても、酵素の安定な吸着が保たれ、且つ充分な活性を発現する固定化酵素の製造方法を提供すること、さらに、該製造方法で得られた固定化酵素及び該固定化酵素で処理した卵黄を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イオン結合法若しくは物理的吸着法において、担体への酵素吸着後の洗浄時若しくは洗浄後に、一定の温度条件下に置くことにより、また、酵素の担体への吸着若しくは吸着後の洗浄を一定の親水性有機溶媒水溶液内で行うか、若しくは洗浄後に一定の親水性有機溶媒水溶液で浸漬等の処理をすることにより、また、酵素の担体への吸着後に、ある種のタンパク質溶液に接触させることにより、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明に到達した。
【００１３】
本発明（請求項１記載の発明）は、イオン結合法若しくは物理的吸着法において、担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びに加熱処理工程を具備し、上記加熱処理工程は、上記吸着工程、上記洗浄工程及び上記後処理工程の少なくとも一工程において、５０〜１００℃の温度で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明（請求項２記載の発明）は、イオン結合法若しくは物理的吸着法において、担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びに有機溶媒処理工程を具備し、上記有機溶媒処理工程は、上記吸着工程において、２０〜８５体積％の親水性有機溶媒水溶液中で行うか、又は上記洗浄工程及び／若しくは上記後処理工程において、２０体積％以上の親水性有機溶媒水溶液中で若しくは親水性有機溶媒中で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明（請求項３記載の発明）は、イオン結合法若しくは物理的吸着法において、担体に酵素を接触させ吸着させる吸着工程、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する洗浄工程、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理工程、並びにタンパク質溶液処理工程を具備し、上記タンパク質溶液処理工程は、上記洗浄工程及び／又は上記後処理工程において、タンパク質溶液中で行うことを特徴とする固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明（請求項４記載の発明）は、請求項１〜３のいずれか二項以上を組み合わせて実施することを特徴とする固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明（請求項５記載の発明）は、上記固定化担体が水不溶性多孔性担体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項６記載の発明）は、上記固定化担体がイオン交換樹脂であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項７記載の発明）は、上記固定化担体がキトサン又はキトサン誘導体であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明（請求項８記載の発明）は、上記酵素がホスホリパーゼであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法を提供するものである。
また、本発明（請求項９記載の発明）は、上記酵素がタンパク質分解酵素であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法を提供するものである。
【００１９】
また、本発明（請求項１０記載の発明）は、請求項１〜９のいずれかに記載の固定化酵素の製造方法で得られたことを特徴とする固定化酵素を提供するものである。
また、本発明（請求項１１記載の発明）は、請求項１０記載の固定化酵素で処理したことを特徴とする酵素処理卵黄を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の効果は、特に食品や化粧品、医薬品の製造プロセスにおける酵素処理に好適な安全且つ安定な固定化酵素を製造する方法を提供できることにある。さらに該方法により得られた固定化酵素により、優れた性能を有する酵素処理卵黄を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明について詳述する。
【００２２】
本発明の固定化酵素の製造方法において、酵素の固定化は、イオン結合法若しくは物理的吸着法により行なわれる。
【００２３】
酵素の固定化に用いる担体としては、イオン結合法による場合は、イオン交換基をもつ水不溶性の担体であれば特に限定されず、例えば、イオン交換樹脂（強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂）や、ジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルＳｅｐｈａｄｅｘ（架橋デキストラン）、トリエチルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等、イオン交換基をもつ多糖類等が挙げられるが、特に樹脂の物理的な強度の点から、イオン交換樹脂が好ましい。また、物理的吸着法による場合は、疎水性表面をもつ水不溶性担体であれば特に限定されず、例えば、活性炭、多孔性ガラス、アルミナ、シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、キトサン又はそれらの誘導体等が挙げられるが、これらの中でも、物理吸着以外にイオン交換的な吸着性も得られ、より高い吸着量を得られる点から、キトサン又はキトサン誘導体が好ましく、また、水不溶性担体は、特に水不溶性多孔性担体であることが好ましい。いずれにしろ、担体は、用いる酵素の性質により、充分な吸着量が得られ且つ充分な活性発現が得られるように適宜選択すればよい。
【００２４】
本発明に用いる酵素は、その起源により特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれを起源とするものであってもよく、また、遺伝子組換え等の技術によって異種の起源の遺伝子を導入し、発現・生産させたものを用いることも出来る。また、酵素の種類は、分解酵素、異性化酵素、合成酵素等、どのような酵素でも可能であるが、好ましい酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、ブロメライン、パンクレアチン、サブチリシン、サーモライシン、コラゲナーゼ等のタンパク質加水分解酵素、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤ、リパーゼ等の脂質加水分解酵素が挙げられる。
【００２５】
本発明の固定化酵素の製造方法は、担体に酵素を接触させ吸着させる工程（以下、吸着工程ともいう）、吸着工程において担体に吸着しなかった未吸着物を洗浄する工程（以下、洗浄工程ともいう）、及び必要に応じて洗浄工程の後に実施する後処理の工程（以下、後処理工程ともいう）を具備する。
【００２６】
本発明（請求項１記載の発明）の固定化酵素の製造方法は、酵素の吸着を安定化させる方法として、加熱処理を、吸着工程、洗浄工程及び後処理工程のうち、一乃至二工程以上において行う。該加熱処理は、５０〜１００℃の温度で行なう。
【００２７】
また、本発明（請求項２記載の発明）の固定化酵素の製造方法は、酵素の吸着を安定化させる方法として、酵素及び担体を親水性有機溶媒水溶液に接触させる処理（以下、有機溶媒処理ともいう）を、吸着工程、洗浄工程及び後処理工程のうち、一乃至二工程以上において行う。該有機溶媒処理を吸着工程において行なう場合、使用する親水性有機溶媒水溶液の濃度は２０〜８５体積％であり、該有機溶媒処理を洗浄工程及び／又は後処理工程において行なう場合、使用する親水性有機溶媒水溶液の濃度は２０体積％以上であり、親水性有機溶媒１００％でもよい。
【００２８】
また、本発明（請求項３記載の発明）の固定化酵素の製造方法は、酵素の吸着を安定化させる方法として、酵素を吸着させた担体をタンパク質溶液に接触させる処理（以下、タンパク質溶液処理）を、洗浄工程及び後処理工程のうち、一乃至二工程において行う。
【００２９】
さらに、本発明（請求項４記載の発明）固定化酵素の製造方法は、上記加熱処理、上記有機溶媒処理及び上記タンパク質溶液処理のうちの二種以上の処理を組み合わせて行う。その際、吸着工程、洗浄工程及び後処理工程のいずれの工程において、いずれの処理を行なうかは任意であり、例えば、吸着工程、洗浄工程及び後処理工程のうちの一工程で二種以上の処理を同時に又は任意の順序で行なってもよく、吸着工程、洗浄工程及び後処理工程のうちの二工程以上において、各工程間で異なる処理を行なってもよい。
【００３０】
本発明の固定化酵素の製造方法について、吸着工程、洗浄工程、後処理工程の工程順に沿って、以下にさらに詳細に説明する。
【００３１】
上記吸着工程において、担体に酵素を吸着させる方法は、酵素溶液と担体とを接触させることが出来れば特に限定されず、例えば、酵素溶液と担体とを混合して撹拌する方法や、担体をカラム状の筒に詰め、酵素溶液を通す若しくは循環させる方法等が挙げられる。ここで、酵素溶液とは、酵素の水溶液若しくは塩水溶液であり、本工程で有機溶媒処理を兼ねる場合は、酵素の親水性有機溶媒水溶液とすることも出来、さらには酵素及び塩を添加した親水性有機溶媒水溶液とすることも出来る。
【００３２】
担体に吸着させる酵素の量は、特に限定されず、担体の性能に応じて適宜決めればよい。吸着工程における担体に対する酵素溶液の量は、特に限定されないが、担体を酵素溶液に充分接触させるために、容量比で担体に対して１〜２０倍量、特に２〜５倍量とするのがよい。また、担体をカラム状の筒に詰め、酵素溶液を通す又は循環させる場合の速度は、空間速度（ＳＶ）で０．１〜２０が適当である。また、酵素溶液中の酵素の濃度は、好ましくは２〜５０ｍｇ／ｍｌである。
【００３３】
吸着工程の温度は、酵素溶液の凝固点より高く５０℃以下、特に１０〜４０℃がよく、吸着工程の時間は１０分〜５０時間、好ましくは３０分〜５時間がよい。また、吸着工程において、上記条件で担体に酵素溶液を接触させて酵素を吸着させた後で洗浄工程前に加熱処理を実施する場合は、５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃で加熱処理すればよく、好ましい処理時間は１０分〜２４時間、より好ましくは６時間〜２０時間である。また、加熱処理の条件下で担体と酵素溶液とを接触させることも出来、その場合の加熱処理温度は５０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃であり、好ましい処理時間は３０分〜６時間である。
【００３４】
なお、上記塩水溶液に用いる塩の種類は、特に限定されず、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム等の塩化物、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩等を用いることが出来、これらの塩は二種以混合して用いることも出来る。特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムが好ましい。
【００３５】
上記塩水溶液のイオン強度は、０．５以上２０以下が好ましく、より好ましくは１以上５以下である。但し、吸着工程において塩水溶液に溶解した酵素タンパク質が塩の塩析作用によって不溶化するのは好ましくなく、酵素が不溶化しない塩濃度でなければならない。
【００３６】
また、上記吸着工程において上記有機溶媒処理を行なう場合、親水性有機溶媒水溶液に用いる親水性有機溶媒の種類は、特に限定されず、エタノール、アセトン、メタノール、プロパノール、グリセロール等が挙げられるが、特にエタノールが好ましい。
【００３７】
上記親水性有機溶媒水溶液の濃度は、低濃度では本発明の効果が得られず、高濃度では酵素タンパク質が不溶化するため、２０〜８５体積％であり、３０〜８０体積％が好ましく、５０〜７５体積％が特に好ましい。
【００３８】
なお、上記酵素溶液には、上記塩や上記親水性有機溶媒以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、還元剤（チオールプロテアーゼの活性化剤）等、酵素の活性化剤や安定剤等を適宜添加することができる。
【００３９】
本発明の固定化酵素の製造方法においては、上記吸着工程を行なった後、洗浄工程を行なう。上記洗浄工程において、洗浄方法は、酵素を吸着させた担体と洗浄液とを接触させることが出来れば特に限定されず、例えば、撹拌槽内で酵素を吸着させた担体と洗浄液とを撹拌する方法や、酵素を吸着させた担体をカラム状の筒に詰め、洗浄液を通す若しくは循環させる方法が挙げられる。ここで、洗浄液とは、水若しくは塩水溶液であり、本工程で有機溶媒処理を兼ねる場合は、親水性有機溶媒水溶液とすることも出来、さらには塩を添加した親水性有機溶媒水溶液とすることも出来る。
【００４０】
洗浄工程における担体に対する洗浄液の量は、特に限定されないが、担体を洗浄液に充分接触させるためには、容量比で担体に対して１〜２０倍量、特に２〜５倍量とするのがよい。また、担体をカラムに詰め、洗浄液を通す若しくは循環させる場合の速度は、空間速度（ＳＶ）で０．１〜２０が適当である。洗浄効果を高めるため、バッチ式の場合は洗浄液を２乃至１０回交換することが出来、カラム式の場合は洗浄液を循環するのではなく、常時新しい洗浄液を導入することが出来る。さらに、バッチ式の場合は洗浄液を交換する毎に洗浄液の種類や濃度を変えることができ、カラム式の場合は導入する洗浄液の種類や濃度を適宜変えながら行うことが出来る。
【００４１】
洗浄工程の温度は、洗浄液の凝固点より高く５０℃以下、特に５〜４０℃がよく、洗浄工程の時間は５分〜５時間、特に１０分〜１時間がよい。また、洗浄工程において、上記条件で固定化酵素を洗浄した後で後処理工程前に加熱処理を実施する場合は、５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃で加熱処理すればよく、好ましい処理時間は１０分〜２４時間、より好ましくは６時間〜２０時間である。また、加熱処理の条件下で洗浄することもでき、その場合の加熱処理温度は５０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃であり、好ましい処理時間は３０分〜６時間である。
【００４２】
なお、洗浄液としての塩水溶液に用いることができる塩の種類は、特に限定されず、前記酵素溶液に用いることができる前記の塩を挙げることが出来るが、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウムが好ましい。塩水溶液のイオン強度は、特に限定されないが、吸着強度に影響する場合には、担体及び酵素の性質により適宜選択する。
【００４３】
また、洗浄液としての親水性有機溶媒水溶液に用いる親水性有機溶媒の種類は、特に限定されず、前記酵素溶液に用いることができる前記の親水性有機溶媒を挙げることが出来るが、特にエタノールが好ましい。洗浄液としての親水性有機溶媒水溶液の濃度は、特に限定されないが、本工程で有機溶媒処理を兼ねる場合は、２０体積％以上、好ましくは
８５体積％以上であり、高濃度の方が酵素と担体の吸着をより強固にする場合があるため、親水性有機溶媒１００％でも構わない。
【００４４】
なお、上記洗浄液には、上記塩や上記親水性有機溶媒以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、還元剤（チオールプロテアーゼの活性化剤）等、酵素の活性化剤や安定剤等を適宜添加することができる。
【００４５】
また、上記洗浄工程において、酵素を吸着させた担体を洗浄液で洗浄する前に、上記タンパク質溶液処理を行なうこともできる。上記タンパク質溶液処理においては、酵素を吸着させた担体をタンパク質溶液中に完全に浸漬した状態にすればよく、必要に応じて処理の効果にムラが生じないよう、撹拌等をすればよい。タンパク質溶液処理において、処理温度はタンパク質溶液の凝固点〜５０℃、特に１０〜４０℃が好ましく、処理時間は１０分〜５０時間、特に３０分〜５時間が好ましい。
【００４６】
上記タンパク質溶液処理に用いるタンパク質としては、その起源に特に限定されず、動物、植物又は微生物由来のもの、すなわち、乳タンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質、大豆タンパク質、畜肉・魚肉タンパク質等が挙げられ、具体的には、カゼイン、β-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、ホスビチン、リポタンパク質、グルテン、グリアジン、グルテニン、コングリシニン、アクチン、ミオシン、トロポニン、グロビン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられ、これらの加水分解物やトランスグルタミナーゼ等で修飾したタンパク質、人工的に合成してなるポリペプチド等も含まれ、特に、水溶性の高いβ-ラクトグロブリン、α-ラクトアルブミン、オボアルブミン、コラーゲン、ゼラチンが好ましい。さらに、これらのタンパク質の塩類も利用でき、これらのタンパク質から選択される二種類以上の混合物も利用できる。タンパク質は担体に充分吸着させる必要があるため、タンパク質の使用量は、担体の吸着量に対して充分過剰量とし、タンパク質溶液の濃度としては好ましくは０．５〜５重量％である。なお、実質的に酵素もタンパク質であることから、酵素溶液をタンパク質溶液処理に用いることもできるが、固定化を目的とする酵素とは区別しなければならない。タンパク質分解酵素を固定化した場合のタンパク質溶液処理は、タンパク質の分解を引き起こすものの、その程度は小さく、さらに、固定化した酵素に対して基質特異性の低いタンパク質で処理すれば全く問題ない。また、タンパク質溶液の溶媒としては、水、前記酵素溶液に用いることができるものと同様の塩水溶液等を使用することができ、タンパク質の親水性有機溶媒水溶液若しくは塩を添加した親水性有機溶媒水溶液を用いることにより、本工程で有機溶媒処理を兼ねることもできる。
【００４７】
タンパク質溶液で処理することによって固定化酵素が安定化する理由は、完全に解明されているわけではないが、酵素が未吸着の担体の官能基にタンパク質溶液処理におけるタンパク質が吸着し、官能基が完全に塞がれ、基質が必要以上に固定化酵素と接触することが防止されるため、及び固定化時に不安定に吸着した酵素がタンパク質溶液処理によって脱離し、安定に吸着した酵素のみが残存すると推察される。
【００４８】
本発明の固定化酵素の製造方法において、上記洗浄工程の後には、必要に応じて後処理工程を行なう。後処理工程においては、加熱処理、有機溶媒処理及びタンパク質溶液処理から選択される一以上の処理を行なうことができる。
【００４９】
本工程で加熱処理を行なう場合は、固定化酵素を水若しくは塩水溶液に浸漬した状態で、５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃で、好ましくは１０分〜２４時間、より好ましくは６時間〜２０時間加熱すればよい。塩水溶液を使用する場合、塩の種類及び塩水溶液のイオン強度は、前記酵素溶液と同様とすることができる。
【００５０】
本工程で有機溶媒処理を行なう場合は、固定化酵素を親水性有機溶媒水溶液中に完全に浸漬した状態にすればよく、必要に応じて本工程の処理の効果にムラが生じないよう、撹拌等をすればよい。親水性有機溶媒水溶液の濃度は、２０体積％以上、好ましくは８５体積％以上であり、高濃度の方が酵素と担体の吸着をより強固にする場合があるため、親水性有機溶媒１００％でも構わない。使用する親水性有機溶媒の種類は、前記酵素溶液に用いることができる親水性有機溶媒と同様である。また、処理温度は溶媒の凝固点〜５０℃、処理時間は１０分〜６時間がそれぞれ好ましい。また、固定化酵素を親水性有機溶媒水溶液に浸漬させて上記加熱処理を行なうこともできる。
【００５１】
本工程でタンパク質溶液処理を行なう場合は、固定化酵素をタンパク質溶液中に完全に浸漬した状態にすればよく、必要に応じて本工程の処理の効果にムラが生じないよう、撹拌等をすればよい。使用するタンパク質の種類、タンパク質溶液の濃度、処理時間及び処理温度は、前記洗浄工程において説明したものと同様とすることができる。また、本工程でタンパク質溶液処理を行なう場合は、タンパク質溶液処理の後に、前記洗浄工程と同様の方法で洗浄を行なうことが好ましい。
【００５２】
なお、後処理工程で固定化酵素を浸漬する液には、本発明の効果を損なわない範囲で、還元剤（チオールプロテアーゼの活性化剤）等、酵素の活性化剤や安定剤等を適宜添加することができる。
【００５３】
本発明の固定化酵素の製造方法において、加熱処理の温度は５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃であり、好ましい処理時間は１０分〜２４時間、より好ましくは６時間〜２０時間である。また、酵素の吸着中や、洗浄中に同時に加熱処理を行う場合は、前述したように吸着工程と洗浄工程、それぞれの好ましい温度及び時間を考慮して、加熱処理の好ましい温度及び時間を選択すればよく、具体的には、吸着しながら加熱処理をする場合は、５０〜７０℃が好ましく、３０分〜６時間がさらに好ましく、洗浄しながら加熱処理をする場合は、５０〜７０℃が好ましく、３０分〜６時間時間がさらに好ましい。
【００５４】
上記の加熱処理温度域では、一般的にタンパク質が熱変性を引き起こし、従来の知見ではタンパク質の一種である酵素は熱失活し、その効果を失いかねないと判断してしまうため、この加熱処理条件を見出すことは非常に困難なものである。
【００５５】
本発明の製造方法で得られた固定化酵素は、安定であり、基質そのものあるいは基質中に、イオン、高分子電解質、疎水性物質、界面活性作用を有する物質が含まれていても酵素の脱離が起こることがない。
【００５６】
本発明の製造方法で得られた固定化酵素は、従来の固定化酵素と同様にして用いることができるが、特に食品や医薬品の製造プロセスにおける酵素処理に好ましく用いることができ、例えば、酵素処理卵黄の製造や油脂のエステル交換、タンパク質素材のプロテアーゼやトランスグルタミナーゼ処理による機能改質等に好ましく使用できる。特にプロテアーゼ及び／又はホスホリパーゼを固定化した固定化酵素は、卵黄の酵素処理に好適に用いられ、該酵素処理卵黄は従来のものと比べて、安定性、乳化性、風味等に優れたものとなる。本発明の製造方法で得られた固定化酵素を用いて卵黄の酵素処理をする際、固定化酵素の使用量は卵黄１ｋｇに対して２〜２０ｍｌの割合が好ましく、また、処理温度は２５〜６０℃、処理時間は１〜２４時間がそれぞれ好ましい。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【００５８】
〔実施例１〕
表１に示した条件によって固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００５９】
【表１】
2005295851.tif 000002
【００６０】
〔実施例２〕
表２に示した条件によって固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００６１】
【表２】
2005295851.tif 000003
【００６２】
〔実施例３〕
表３に示した条件によって固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００６３】
【表３】
2005295851.tif 000004
【００６４】
〔実施例４〕
表４に示した条件によって固定化ホスホリパーゼＡ１を調製した。
【００６５】
【表４】
2005295851.tif 000005
【００６６】
〔実施例５〕
表５に示した条件によって固定化プロテアーゼを調製した。
【００６７】
【表５】
2005295851.tif 000006
【００６８】
〔実施例６〕
表６に示した条件によって固定化プロテアーゼを調製した。
【００６９】
【表６】
2005295851.tif 000007
【００７０】
〔実施例７〕
表７に示した条件によって固定化プロテアーゼを調製した。
【００７１】
【表７】
2005295851.tif 000008
【００７２】
〔比較例１−１〕
実施例１における後処理工程を実施しなかったこと以外、実施例１と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７３】
〔比較例１−２〕
実施例１における後処理工程をヒーティングブロックにより１１０℃に設定し、実測温度１０３℃としたこと以外、実施例１と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７４】
〔比較例１−３〕
実施例１における後処理工程を４８℃としたこと以外、実施例１と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７５】
〔比較例２−１〕
実施例２における洗浄工程で、９９．５体積％エタノール水溶液４０ｍｌを加え、７０℃、３０分間撹拌したことに替え、水４０ｍｌを加え、２５℃、３０分間撹拌した以外、実施例２と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７６】
〔比較例２−２〕
実施例２における洗浄工程で、９９．５体積％エタノール水溶液４０ｍｌを加え、７０℃、３０分間撹拌したことに替え、１９体積％エタノール水溶液４０ｍｌを加え、４７℃、３０分間撹拌した以外、実施例２と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７７】
〔比較例３〕
実施例３における後処理工程において、５重量％卵白アルブミン溶液に替えて１０重量％硫酸ナトリウム水溶液としたこと以外、実施例３と同様に固定化ホスホリパーゼＡ２を調製した。
【００７８】
〔比較例４−１〕
実施例４の吸着工程を５５℃で実施したことに替えて４５℃で実施した以外、実施例４と同様に固定化ホスホリパーゼＡ１を調製した。
【００７９】
〔比較例４−２〕
実施例４の吸着工程を５５℃で実施したことに替えて１０５℃で実施した以外、実施例４と同様に固定化ホスホリパーゼＡ１を調製した。
【００８０】
〔比較例５−１〕
実施例５の洗浄工程で使用したグリセロールの濃度を１９体積％とし、後処理工程を実施しなかったこと以外、実施例５と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８１】
〔比較例５−２〕
実施例５の洗浄工程で使用したグリセロールの濃度を１９体積％とし、後処理工程の温度を４７℃としたこと以外、実施例５と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８２】
〔比較例５−３〕
実施例５の洗浄工程で使用したグリセロールの濃度を１９体積％とし、後処理工程の温度を１０３℃としたこと以外、実施例５と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８３】
〔比較例６−１〕
実施例６の吸着工程におけるアセトン濃度を１９体積％としたこと以外、実施例６と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８４】
〔比較例６−２〕
実施例６の吸着工程におけるアセトン濃度を８６％としたこと以外、実施例６と同様に固定化プロテアーゼを調製した。但し、８６％アセトン水溶液には酵素は溶解せず、白濁状態のまま吸着工程に供した。
【００８５】
〔比較例７−１〕
実施例７の吸着工程におけるエタノール濃度を１９体積％とし、洗浄工程における乳ホエータンパク質溶液に替えて２０重量％ＮａＣｌとし、後処理工程を実施しなかったこと以外、実施例７と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８６】
〔比較例７−２〕
実施例７の吸着工程におけるエタノール濃度を１９体積％とし、洗浄工程における乳ホエータンパク質溶液に替えて２０重量％ＮａＣｌとし、後処理工程における加熱温度を４８℃としたこと以外、実施例７と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８７】
〔比較例７−３〕
実施例７の吸着工程におけるエタノール濃度を１９体積％とし、洗浄工程における乳ホエータンパク質溶液に替えて２０重量％ＮａＣｌとし、後処理工程における加熱温度を１０４℃としたこと以外、実施例７と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８８】
〔比較例７−４〕
実施例７の吸着工程におけるエタノール濃度を８６体積％とし、洗浄工程における乳ホエータンパク質溶液に替えて２０重量％ＮａＣｌとし、後処理工程における加熱温度を４８℃としたこと以外、実施例７と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００８９】
〔比較例７−５〕
実施例７の吸着工程におけるエタノール濃度を８６体積％とし、洗浄工程における乳ホエータンパク質溶液に替えて２０重量％ＮａＣｌとし、後処理工程における加熱温度を１０４℃としたこと以外、実施例７と同様に固定化プロテアーゼを調製した。
【００９０】
〔試験例〕固定化酵素による卵黄の加水分解
固定化酵素の評価として、イオン強度が高く、タンパク質を含有する加塩卵黄に対して繰り返し作用させた場合の加水分解度と処理卵黄中への酵素の脱離を分析した。実施例１乃至７、及び比較例１−１乃至７−５で得られた固定化酵素０．１ｍｌを１０重量％加塩卵黄(キューピー（株）)１０ｇ中に加え、５０℃で２０時間（但し、固定化ホスホリパーゼＡ１（実施例４並びに比較例４−１及び４−２）のみ、固定化酵素の添加量を０．２５ｍｌとし、処理時間は５時間）撹拌した。反応終了後、固定化酵素を回収し、２０重量％食塩水で３回洗浄後、再び１０重量％加塩卵黄中に添加し、同様の酵素反応と固定化酵素の回収を繰り返し、合計１０回の固定化酵素処理を繰り返した。以下に示す方法により、担体への酵素の吸着安定性と固定化酵素の活性保持性を評価した。
【００９１】
（担体への酵素の吸着安定性評価）
酵素処理１、３、５、１０回目の酵素処理卵黄中の酵素活性を測定することにより、担体への酵素の吸着安定性を評価した。
固定化酵素から脱離し、卵黄中に遊離酵素として存在するホスホリパーゼ活性は、次に示す通り、固定化酵素処理卵黄の一部を未処理卵黄と混合してインキュベートした時のリン脂質の分解度、すなわち総リン脂質に対するリゾリン脂質含量（リゾ化率）で評価した。未処理液卵黄８ｇ、５Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液０．９ｍｌ、５０重量％塩化カルシウム溶液０．１ｍｌの混合物に対し、酵素処理卵黄サンプル１ｇを加え、５０℃で１時間撹拌した後、４重量％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム溶液２ｍｌ中に０．３ｇサンプリングし、凍結乾燥の後、リン脂質画分を２：１クロロホルム／メタノール溶液で抽出し、ＴＬＣ／ＦＩＤ（薄層クロマトグラフィー/水素炎イオン化検出装置、イアトロスキャンＭＫ−５、（株）ヤトロン）にて総リン脂質に対するリゾリン脂質の割合(リゾ化率)を測定した。本試験においては、固定化酵素からホスホリパーゼが脱離し、卵黄中に存在する遊離のホスホリパーゼ活性が高いほどリゾ化率が高くなる。尚、対照として実施した未処理卵黄での測定値は５．１％であった。結果を表８に示した。
【００９２】
また、固定化酵素から脱離し、卵黄中に遊離酵素として存在するプロテアーゼ活性は、次に示すゼラチン軟化試験により測定した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）でゼラチンを溶解して５重量％ゼラチン溶液を調製し、このゼラチン溶液４５ｍｌと酵素処理卵黄サンプル５ｍｌとを充分混合し、５０℃にて２時間静置した後、５℃にて一晩静置し、硬さとして、ＲＨＥＯＮＥＲ  ＲＥ−３３００５（（株）山電）にて、φ１５ｍｍのプランジャーを用い、サンプル高の１０％貫入時の破断強度を測定した。本試験においては、固定化酵素からプロテアーゼが脱離し、卵黄中に存在する遊離のプロテアーゼ活性が高いほど、ゼラチンが分解されるため、凝固しにくく柔らかくなる。対照として実施した未処理卵黄での測定値を１００として、相対値を表８に示した。
【００９３】
（固定化酵素の活性保持性）
酵素処理１及び１０回目の卵黄の処理度合いを測定することにより、固定化酵素の活性保持性を評価した。
固定化ホスホリパーゼによる卵黄の酵素処理度合いは、処理卵黄リン脂質のリゾ化率によって評価した。リゾ化率の測定は上記の通りであり、結果を表８に表した。
また、固定化プロテアーゼによる卵黄の酵素処理度合いは、処理卵黄の熱凝固耐性を測定することにより評価した。酵素処理卵黄１００ｇを密封して８５℃、４０分加熱後、５℃で一晩放置したものについて、ＦＵＤＯＵ  ＲＥＯＭＥＴＥＲ ＮＭＲ２００２Ｊ（不動工業（株））にて、φ２０ｍｍのプランジャーを用い、侵入深度８ｍｍ、侵入速度２０ｍｍ／ｍｉｎ．の条件で硬さ（ｇ/ｃｍ3）を測定した。本試験では、固定化酵素のプロテアーゼ活性が強いほど、卵黄タンパク質の加水分解度が高く、熱凝固耐性が現れ、硬化し難くなる。対照として実施した未処理卵黄の硬さを１００とし、相対値を表８に示した。
【００９４】
【表８】
2005295851.tif 000009
【００９５】
以上の結果より、本発明によって調製した固定化酵素によって処理した加塩卵黄には酵素活性が殆ど認められず、且つ１０回目の処理においても良好な活性が認められたことに対し、比較例に示した方法で調製した固定化酵素で処理した卵黄中には高い酵素活性が認められ、酵素脱離が起きているか、若しくは脱離酵素活性は低いものの固定化酵素の活性自体も低いことが確認された。
【００９６】
〔実施例８〕
生卵黄１ｋｇに実施例２で調製した固定化ホスホリパーゼＡ２の１０ｍｌを加え、羽根式の攪拌機を使用し、５０℃において１５時間撹拌後、２００μｍのメッシュを通して固定化酵素を除去し、ホスホリパーゼＡ２処理卵黄を製造した。得られた酵素処理卵黄は安定性、乳化性、風味に優れたものであった。
【００９７】
〔実施例９〕
実施例５で調製した固定化プロテアーゼ５０ｍｌを直形５ｃｍのカラムに詰め、５０℃において２０重量％加糖卵黄１ｋｇをＳＶ２０で６時間循環させ、プロテアーゼ処理加糖卵黄を製造した。得られた酵素処理卵黄は熱凝固耐性、安定性、乳化性、風味に優れたものであった。
【００９８】
〔実施例１０〕
１０重量％加塩卵黄１ｋｇに実施例１で調製した固定化ホスホリパーゼＡ２の５ｍｌ、及び実施例６で調製した固定化プロテアーゼ５ｍｌを加え、羽根式の攪拌機を使用し、５０℃において１５時間撹拌後、２００μｍのメッシュを通して固定化酵素を除去し、ホスホリパーゼＡ２及びプロテアーゼ処理加塩卵黄を製造した。得られた酵素処理卵黄は熱凝固耐性、安定性、乳化性、風味に優れたものであった。