(57)【要約】【課題】  癌の予防、癌の再発予防のために使用し得る健康食品、および癌予防または癌の再発予防のための医薬組成物を提供する。【解決手段】ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための健康食品、生のダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する癌を予防するための健康飲料、及びダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための医薬組成物。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための健康食品。
【請求項２】
前記ダイコンの種子もしくはスプラウトが乾燥したものである請求項１記載の健康食品。
【請求項３】
前記抽出物が、ダイコンの種子もしくはスプラウトのホモジネートを一定時間インキュベートして酵素反応を進行させた後に水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物により抽出したものである請求項１記載の健康食品。
【請求項４】
前記化合物もしくはその誘導体が、下記式Iで表される化合物またはその誘導体である請求項１記載の健康食品。
【化１】
2005206495.tif 000006
【請求項５】
生のダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する癌を予防するための健康飲料である請求項１記載の健康食品。
【請求項６】
ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための医薬組成物。
。
【請求項７】
前記ダイコンの種子もしくはスプラウトが乾燥したものである請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抽出物が、ダイコンの種子もしくはスプラウトのホモジネートを一定時間インキュベートして酵素反応を進行させた後に水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物により抽出したものである請求項６記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物もしくはその誘導体が、下記式Iで表される化合物またはその誘導体である請求項６記載の医薬組成物。
【化２】
2005206495.tif 000007
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発癌抑制作用を有する、癌の予防のための健康食品及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発癌物質の解毒酵素は第一相酵素と第二相酵素に分類されている。このうち、第二相酵素は、ＤＮＡの変異を起こす発癌物質を不活性化することが知られている。第二相酵素の一つにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼがあり、これを活性化することにより、癌を予防し得ることが知られている。癌は主要な死因の一つであり、これを予防することは非常に重要である。また、癌は、完治した後も再発のおそれがあるため、これを予防する必要もある。
癌の治療は、外科手術による切除、放射線治療、抗癌剤の投与等により行われるが、予防については、個人が食生活等の生活習慣に気を付ける等の努力により行うしかない。そこで、より効果的に且つ安全に癌の予防に寄与することができる健康食品の開発が望まれている。そのような健康食品のための有効成分として、ブロッコリーに含まれる成分が第二相酵素（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとキノンリダクターゼ）の誘導作用を有することが報告されている (A major inducer of anticarcinogenic protective enzymes from broccoli: isolation and elucidatin of structure, Zhang Y, Talalay, P.,Cho. C.-G, Posner, G.H.) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89 March; 2399-2403)。
また、特開平９−１１０７０１号には、ダイコンの成分であるグルコシノレートが発癌抑制作用を有することが開示されている。
【特許文献１】特開平９−１１０７０１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、ダイコン中のグルコシノレートを単離するためには、あらかじめミロシナーゼを失活させた上で抽出し、精製する必要がある。従って、製造コストが高く、健康食品として使用するには実用性に欠ける。また、上記ダイコン以外にも、ブロッコリーの成分等の発癌抑制作用を有する種々の植物成分が報告されているが、いずれも含有量及び効果の点で十分ではない。従って、さらに優れた発癌抑制作用を有し、しかも製造コストが低い健康食品の開発が望まれていた。
本発明者は、ダイコンの種子またはスプラウトが、ダイコン成体には含まれないか、または極めて微量にしか含まれない独特の成分を多量に含み、著しく高いグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性化作用を有することを見出した。また、本発明者は、ダイコンの種子もしくはスプラウト、またはその水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、特に、酵素反応を進行させた後に抽出される抽出物によるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ活性化作用が、ダイコン成体やその他の植物に比べて著しく高いことを見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１に、本発明は、下記の健康食品に関する。
（１）ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための健康食品。
（２）前記ダイコンの種子もしくはスプラウトが乾燥したものである（１）の健康食品。
（３）前記抽出物が、ダイコンの種子もしくはスプラウトのホモジネートを一定時間インキュベートして酵素反応を進行させた後に水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物により抽出したものである（１）の健康食品。
（４）前記化合物もしくはその誘導体が、下記式Iで表される化合物またはその誘導体である（１）の健康食品。
【０００５】
【化３】
2005206495.tif 000002
【０００６】
（５）生のダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する癌を予防するための健康飲料である（１）の健康食品。
【０００７】
また、本発明は、下記の医薬組成物に関する。
（６）ダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、または該抽出物に含有される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有する癌の予防のための医薬組成物。
（７）前記ダイコンの種子もしくはスプラウトが乾燥したものである（６）の医薬組成物。
（８）前記抽出物が、ダイコンの種子もしくはスプラウトのホモジネートを一定時間インキュベートして酵素反応を進行させた後に水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物により抽出したものである（６）の医薬組成物。
（９）前記化合物もしくはその誘導体が、上記式Iで表される化合物またはその誘導体である（６）の医薬組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、癌の予防のために使用し得る健康食品および医薬組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、ダイコンは、Raphanus属、Sativus種のダイコンを意味する。本発明の健康食品または医薬組成物において、原料となるダイコンの種子またはスプラウトは、生でも乾燥したものでも良い。
本発明の健康食品または医薬組成物の製造に使用される抽出溶媒は、水、有機溶媒または有機溶媒と水との混合物である。有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、ｎ−もしくはイソプロパノール、ｎ−、イソ、第二もしくは第三ブタノール、ｎ−、イソ、第二もしくは第三ペンタノール、ｎ−、イソ、第二もしくは第三ヘキサノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル等のエステル類、クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素、ジエチルエーテル等のエーテル類、ヘキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素またはこれらの混合物が挙げられ、好ましくはエタノールであるが、これらに限定されない。
抽出温度は、好ましくは１００℃以下、より好ましくは６０℃以下、例えば２０〜４０℃である。
【００１０】
抽出方法は、水、有機溶媒または水と有機溶媒との混合物中での冷浸、温浸、還流冷却下での加熱等であり得る。抽出は、連続式で行ってもバッチ式で行ってもよく、例えば常温から溶媒の沸点の範囲の温度で、加圧、常圧または減圧下で行う。抽出時間は、抽出方法、抽出溶媒等に応じて、適宜決定し得る。例えば、２０〜４０℃での抽出の場合、１分間〜２時間、好ましくは３０分間〜６０分間である。
抽出に先立って、ダイコン種子またはスプラウトの乾燥、破砕、恒温処理等の前処理を適宜行うのが好ましい。これは、その後の酵素反応を効率良く進行させるためである。
破砕は、例えばｐＨ３〜１２の緩衝液中、ホモジネーター、ミキサー等の機器を用いて破砕することにより行われる。
恒温処理は、例えば約５〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃の温度に、１分間〜２時間、好ましくは３０分間〜１時間維持することにより行われる。
【００１１】
本発明の健康食品または医薬組成物に使用される抽出物は、水、有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出操作後、濾過、乾燥、分画などの処理を行うことによりさらに精製されたものであってもよい。濾過、乾燥、分画は当業者に周知の方法により行うことができる。
また、本発明の健康食品または医薬組成物に使用される抽出物は、上記のように抽出し、所望により精製した後、濃縮または乾固、または凍結乾燥し、所望によりさらに滅菌操作を行ったものであってもよい。濃縮または乾固は、常圧または減圧下、好ましくは１００℃以下、より好ましくは６０℃以下の温度で行う。１２０℃を超えると抽出すべき成分が分解する場合があるからである。
ただし、本発明の健康食品及び医薬組成物は、上記の抽出・精製方法により得られた抽出物を含有するものに限定されず、ダイコンの種子またはスプラウトの精油成分を含むものであればよい。
【００１２】
本発明の健康食品または医薬組成物は、上記式Iで表される化合物もしくはその誘導体を有効成分として含有するものであってもよい。該化合物は、抽出物から単離されたものであっても、合成により得られた化合物であってもよい。
【００１３】
本発明で使用されるダイコンの種子もしくはスプラウト、またはその水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物は、高活性及び低毒性なので医療に安全に用いることができる。
【００１４】
（健康食品）
本発明の「健康食品」は、上記本発明のダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、特にミロシナーゼ等による酵素反応を進行させた後に得られる抽出物（以下、場合により単に抽出物と記す）、または上記式Iで表される化合物等の上記抽出物中に含まれる化合物もしくはその誘導体（以下、場合により本発明の活性物質と記す）を有効成分とするエキス剤（軟エキス剤、乾燥エキス剤）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤等の形態であってもよい。これらは当該分野で知られている方法により製剤化することができる。これらの製剤の形態の健康食品は、下記で医薬組成物について列挙した補助剤を含有することができる。本発明の健康食品において、本発明の活性物質の配合量は、剤形により異なる。また、一日あたりの有効成分服用量は、例えば、種子またはスプラウトの乾燥重量として、例えば５０〜５００ｇ、好ましくは１００〜３００ｇ、抽出物の凍結乾燥重量として、例えば１〜４０ｇ、好ましくは２〜２０ｇ、化合物もしくはその誘導体の場合、例えば０．５〜２０ｇ、好ましくは１〜１０ｇとなる量である。
【００１５】
また、本発明の健康食品は、一般加工食品等の食品に、本発明の活性物質を添加した食品、いわゆる機能性食品であってもよい。そのような食品としては、例えば、上記本発明の活性物質を添加した飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等が挙げられる。さらに、本発明の健康食品は、前記ダイコンの種子またはスプラウト及び所望によりその他の材料を飲用アルコールに漬けた健康酒をも含む。
そのような機能性食品である場合は、各々の食品原料に上記本発明の活性物質の所要量を添加すること以外は、その加工食品の通常の製造方法により製造することができる。この場合、本発明の活性物質の配合量は添加する食品等により異なるが、例えばダイコンの種子またはスプラウトの乾燥重量として、例えば５〜５０重量％、好ましくは１０〜３０重量％、抽出物の凍結乾燥重量として、例えば０．１〜４重量％、好ましくは０．２〜２重量％である。また、化合物もしくはその誘導体として配合する場合は、例えば０．０５〜２重量％、好ましくは０．１〜１重量％である。
【００１６】
本発明の健康食品が、生のダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する癌を予防するための健康飲料である場合、ダイコンスプラウト汁、その濃縮還元汁またはダイコンのスプラウトもしくは種子の水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物の含有量は、例えば１重量％以上、好ましくは１０重量％以上である。また、該健康飲料は、トマト、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ニンニク、タマネギ、アスパラガス、ピーマン、赤ピーマン、ニンジン、ホウレン草、パセリ、レタス、ビート、クレソン、カボチャ等の野菜、リンゴ、ミカン、オレンジ、レモン、ブドウ、グレープフルーツ、ピーチ、パイナップル、洋ナシ、巨峰等の果実の野菜汁または果実汁またはその濃縮還元汁、ビタミン類、アミノ酸類、糖類等の他の活性成分を含んでいてもよく、また香料、調味料、保存料等の食品添加物を含んでいてもよい。
【００１７】
（医薬組成物）
本発明の「医薬組成物」は、有効成分として、上記本発明のダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、特にミロシナーゼ等による酵素反応を進行させた後に得られる抽出物、または上記式Iで表される化合物等の上記抽出物中に含まれる化合物もしくはその誘導体を含む。剤形は特に限定されないが、例えばエキス剤（軟エキス剤、乾燥エキス剤）、カプセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等であり得る。本発明の医薬組成物への本発明の活性成分の配合量は剤形により異なる。また、一日あたりの有効成分投与量は、ダイコンの種子またはスプラウトの乾燥重量として、例えば５０〜５００ｇ、好ましくは１００〜３００ｇ、抽出物の凍結乾燥重量として、例えば１〜４０ｇ、好ましくは２〜２０ｇである。また、化合物もしくはその誘導体として配合する場合は、例えば０．５〜２０ｇ、好ましくは１〜１０ｇである。
これらの製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、希釈剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化される。また、本発明の医薬組成物は、本発明の活性物質に加えて、他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００１８】
固形の製剤は、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、糖衣錠等であり、有効成分としての本発明の活性物質と、希釈剤（例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉等）、滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等）、結合剤（例えば澱粉類、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、離散剤（例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩等）、飽和剤、着色料、甘味料、湿潤剤（例えばレシチン、ポリソルベート、硫酸ラウリル塩等）等を含有することができる。これらは、既知の方法、例えば混合、粒状化、錠剤化、糖衣化等の方法により製剤化することができる。
【００１９】
液状の製剤は、例えばシロップ、溶液、乳濁液及び懸濁液の形態とすることができる。
懸濁液及び乳濁液は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等を含有することができる。
近年、癌の治療において、外科手術、抗癌剤投与、放射線治療等の治療法に加えて、食事療法、漢方による治療等を併用する療法が注目されている。本発明の健康食品または医薬組成物は、そのような治療方法において、外科手術、抗癌剤投与及び／または放射線治療と組み合わせて用いることも考えられる。また、外科手術等による腫瘍組織の切除、抗癌剤投与及び／または放射線治療等により癌を完治させた後の再発予防のための療法の一つとして用いることも考えられる。従って、本発明は、上記本発明の医薬組成物を投与することからなる癌の治療方法または予防方法、特に癌の再発の予防方法にも関する。また、本発明は、癌の治療または予防のためのダイコンの種子もしくはスプラウト、その水、有機溶媒もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出物、特にミロシナーゼ等による酵素反応を進行させた後に得られる抽出物、または上記式Iで表される化合物等の上記抽出物中に含まれる化合物もしくはその誘導体の使用にも関する。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１：ダイコンスプラウト抽出液の調製
スプラウトは、植物組織培養ユニット内で、２６℃、昼夜各１２時間の明暗サイクルで、平均２，０６７ルクス照射（管下４０mm）で生育させ、発芽後３日目のもの及び２週間目のものを使用した。
（精油の抽出）
ミキサーに上記で栽培したスプラウト５０ｇ、純水１５０ｍｌ、氷少量を加え、１分間ホモジナイズした後、ナスフラスコに移した。これを３７℃で３０分間インキュベートすることにより酵素反応を進行させた。吸引ろ過により不純物を除去した後、三角フラスコに移した。これに、内部標準としてフェニルイソチオシアネート１０μｌを溶かした２００ｍｌのジクロロメタンを添加し、混合した。精油成分を十分に抽出するために、スターラーを用いて１２時間攪拌し続けた。
１２時間後、その溶液を分液ロートに移し、エマルジョン層とジクロロメタン層に１０，０００ｘｇ、１５分間の遠心分離を行い、ジクロロメタン層を回収した。このジクロロメタン層を硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、１ｍｌのジクロロメタンで回収してこの溶液をガスクロマトグラフィーにより分析した。
得られた精油成分中のイソチオシアネート類の同定は、標準品とのガスクロマトグラフィーリテンションタイムの比較、GC/MSにおける分子イオンピーク、フラグメントイオンピークの開裂パターンおよび、GC/MSライブラリーとの比較により行った。
分析結果を下記の表１に示す。
【００２１】
実施例２：ダイコン種子抽出液の調製
スプラウト５０ｇの代わりに、コーヒーミルで粉砕したダイコンの種子５０ｇを用いること以外は、実施例１と同じ方法によりダイコン種子抽出液を調製し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。分析結果を下記の表１に示す。
【００２２】
比較例：ダイコン成体抽出液の調製
スプラウト５０ｇの代わりにダイコン成体５０ｇを用いること以外は、実施例１と同じ方法によりダイコン成体抽出液を調製し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。分析結果を下記の表１に示す。
【００２３】
【表１】
2005206495.tif 000003
【００２４】
表より明らかなように、いくつかの成分については種子及びスプラウトのみで検出されており成体では検出されておらず、また、いくつかの成分については成体における含有率よりも種子及びスプラウトにおける含有率が著しく高い。
【００２５】
試験例１：ダイコンスプラウトのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果
１．ダイコンスプラウト水抽出粉末及びブロッコリースプラウト水抽出粉末の調製
発芽後３日目の各スプラウトから種の殻を除去した後、収穫したスプラウトと同量の水を加え、１分間ジューサーミキサーでホモジナイズした。このホモジネートを適当な容量のナス型フラスコに移して密栓し、３７℃で３０分間インキュベートすることにより酵素反応させ、イソチオシアネートを生成させた。氷冷してイソチオシアネートを安定させた後、ガーゼろ過、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ，１５分間）を行って、残渣を取り除き、上清を回収した。この上清を凍結乾燥し、スプラウト水抽出物粉末を得た。
２．肝臓の採取・解毒酵素の抽出
５週齢のSD系SPF雌ラット（日本クレア株式会社から購入）２１匹を、実験用飼料（American Institute of Nutritionによるマウス・ラット用標準配合AIN-76（組成：シュークロース５０％、カゼイン２０％、ＤＬ−メチオニン０．３％、コーンスターチ１５％、セルロース５％、コーン油５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ７６ビタミン混合１％、重酒石酸コリン０．２％），ＤＬ−メチオニン及び重酒石酸コリンは和光純薬株式会社から購入、その他の成分はオリエンタル酵母株式会社から購入）を与え、3日間予備飼育した。これを、７匹ずつ３群（普通食群、ダイコンスプラウト食群、ブロッコリー食群）に分け、実験群とした。さらに、これらを金網製個別ゲージに１匹ずつ入れ、１２時間の明暗サイクルの飼育室で７日間飼育した。飲料水としては水道水を与え、飼料としては、普通食群には、上記実験用飼料を与え、ダイコンスプラウト食群には上記実験用飼料のシュークロースの４％を同量の上記で調製したダイコンスプラウト水抽出粉末に換えた飼料を与え、ブロッコリースプラウト食群には上記実験用飼料のシュークロースの４％を同量の上記で調製したブロッコリースプラウト水抽出粉末に換えた飼料を与えた。飲料水としては水道水を与え、これを自由摂取させた。飼料は１日２０ｇに制限し、解剖前１８時間のみ絶食させた。
【００２６】
７日間の飼育後、ジエチルエーテルにより麻酔をかけ、肝臓灌流を行った。脱血後に肝臓を摘出し、重量を測定した。その後、ポッター型ホモジナイザーを用いてその４倍量のホモジナイズ緩衝液（０．２５Ｍショ糖を含む０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で肝臓をホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ，１５分間）し、上清（粗タンパク溶液）を得た。さらに、この上清を超遠心分離（４℃、１００．０００ｘｇ，６０分間）し、得られた上清を上清画分とした。また得られた沈殿をホモジナイズ緩衝液に溶解し、さらに超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ，６０分間）を行い、ここで得られた沈殿をミクロソーム画分とした。
３．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性測定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性測定の方法は、「入門薬物代謝（１９８７）・講談社」の方法を参考にして行った。
２ｍｌ用の分光光度計用セルに３０ｍＭグルタチオン６０μｌ（グルタチオン（ナカライ）１６ｍｇを超純水に溶かして２ｍｌとして調製）、３０ｍＭジニトロクロロベンゼン／エタノール６０μｌ（ジニトロクロロベンゼン（和光純薬）６２ｍｇをエタノールに溶かして１０ｍｌとして調製）、及び０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐH７．４）を１．４８ｍｌそれぞれ加え、混合撹拌し、この時の３４０ｎｍにおける吸光度を初期値とした。１０００倍希釈した上清画分を３００μｌ加えて反応を開始させ、３４０ｎｍにおける吸光度の上昇を１分間記録した（終了値）。３４０ｎｍにおける初期値と終了値の吸光度差を求め、１分間当たりに生成した２，４−ジニトロフェニルグルタチオン生成量、すなわち酵素活性を求めた。なお、タンパク質量はＦｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法により求めた。
結果を図１に示す。
図１に示されるように、ダイコンスプラウト食群において、酵素活性の著しい上昇が認められた。
【００２７】
試験例２：ダイコンスプラウトのシトクロムＰ４５０の比含量測定
分光光度計の対照セルと試料セルそれぞれに、０．１Mリン酸バッファー（ｐH７．４）適量で希釈した試験例１で得たミクロソーム画分の溶液１．６ｍｌを入れ、５１０〜４００ｎｍ間のスペクトラムを記録した。次に両セルにハイドロサルファイトナトリウム約２ｍｇをゆっくり混合させながら添加し、ミクロソーム中ヘムタンパク質のヘム鉄部位を還元させた。
試料セル中の還元させたミクロソーム溶液中に２．０ｍｌの一酸化炭素を通じ、還元したヘムタンパクと一酸化炭素を結合させた。この溶液を再び分光光度計に挿入し、５１０〜４００ｎｍ間のスペクトラムを記録した。この値から一酸化炭素を通じる前のスペクトラム値を差し引き、４９０から４５０ｎｍ付近の吸光度の変化を求め、次の式に代入した。
【００２８】
【数１】
2005206495.tif 000004
【００２９】
この値をFolin−Lowry法により求めた試料溶液中のタンパク質量で割ることで比含量を算出した。
結果を図２に示す。
ダイコンスプラウト食群において、シトクロムＰ４５０の比含量は上昇していないことが明らかである。
【００３０】
試験例３：ダイコン種子抽出物のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果
１．ダイコン種子及びブロッコリー種子の水抽出物の調製
ダイコン種子及びブロッコリー種子に各々同量の水を加え、１分間ジューサーミキサーでホモジナイズした。このホモジナイズ液を適量のナス型フラスコに移して密栓し、３７℃で３０分間インキュベートし、酵素反応させ、イソチオシアネートを生成させた。５分間氷冷後、ガーゼろ過し、さらに遠心分離（１０，０００ｘｇ、１５分間）を行って残渣を除去し、上清を回収した。この上清を凍結乾燥し、回収したものを種子水抽出物とした。
【００３１】
２．肝臓の採取・解毒酵素の抽出
５週齢のSD系SPF雌ラット（日本クレア株式会社から購入）１５匹を、実験用飼料（American Institute of Nutritionによるマウス・ラット用標準配合AIN-76（組成：シュークロース５０％、カゼイン２０％、ＤＬ−メチオニン０．３％、コーンスターチ１５％、セルロース５％、コーン油５％、ＡＩＮ−７６ミネラル混合３．５％、ＡＩＮ７６ビタミン混合１％、重酒石酸コリン０．２％），ＤＬ−メチオニン及び重酒石酸コリンは和光純薬株式会社から購入、その他の成分はオリエンタル酵母株式会社から購入）を与え、3日間予備飼育した。これを、５匹ずつ３群（普通食群、ダイコン種子食群、ブロッコリー種子食群）に分け、実験群とした。さらに、これらを金網製個別ゲージに１匹ずつ入れ、１２時間の明暗サイクルの飼育室で７日間本飼育した。飲料水としては水道水を与え、飼料としては、普通食群には、上記実験用飼料を与え、ダイコン種子食群には上記実験用飼料のシュークロースの２％を同量の上記で調製したダイコン種子水抽出物に換えた飼料を与え、ブロッコリー種子食群には上記実験用飼料のシュークロースの２％を同量の上記で調製したブロッコリー種子水抽出物に換えた飼料を与えた。飲料水としては水道水を与え、これを自由摂取させた。飼料は１日２０ｇに制限し、解剖前１８時間のみ絶食させた。
【００３２】
７日間の本飼育後、ジエチルエーテルにより麻酔をかけ、肝臓灌流を行った。脱血後に肝臓を摘出し、重量を測定した。その後、ポッター型ホモジナイザーを用いてその４倍量のホモジナイズ緩衝液（０．２５Ｍショ糖を含む０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で肝臓をホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ，１５分間）し、上清（粗タンパク溶液）を得た。さらに、この上清を超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ，６０分間）し、得られた上清を上清画分とした。また得られた沈殿をホモジナイズ緩衝液に溶解し、さらに超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ，６０分間）を行い、ここで得られた沈殿をミクロソーム画分とした。
【００３３】
３．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性測定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性測定の方法は、「入門薬物代謝（１９８７）・講談社」の方法を参考にして行った。
２ｍｌ用の分光光度計用セルに３０ｍＭグルタチオン６０μｌ（グルタチオン（ナカライ）１６ｍｇを超純水に溶かして２ｍｌとして調製）、３０ｍＭジニトロクロロベンゼン／エタノール溶液６０μｌ（ジニトロクロロベンゼン（和光純薬）６２ｍｇをエタノールに溶かして１０ｍｌとして調製）、及び０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐH７．４）を１．４８ｍｌそれぞれ加え、混合撹拌し、この時の３４０ｎｍにおける吸光度を初期値とした。１０００倍希釈した上清画分を３００μｌ加えて反応を開始させ、３４０ｎｍにおける吸光度の上昇を１分間記録した（終了値）。３４０ｎｍにおける初期値と終了値の吸光度差を求め、１分間当たりに生成した２，４−ジニトロフェニルグルタチオン生成量、すなわち酵素活性を求めた。なお、タンパク質量はＦｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法により求めた。
結果を図３に示す。
図３に示されるように、ダイコン種子食群において、酵素活性の著しい上昇が認められた。
【００３４】
試験例４：ウリジン５’−ジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼの活性測定
ウリジン５’−ジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰＧＴ）の活性測定は、「入門薬物代謝（１９８７）・講談社」の方法を参考にして行った。
補助因子溶液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）８．０ｍｌ、０．１５ＭのＭｇＣｌ２１．０ｍｌ、１％ｗ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．５ｍｌ、０．０２Ｍアスコルビン酸１．０ｍｌ、ＵＤＰ−グルクロン酸１０ｍｇ）０．５ｍｌと１ｍＭの２−アミノフェノール０．２５ｍｌを混合し、３７℃の恒温振とう器中で試験例３で得たミクロソーム画分酵素溶液０．２５ｍｌを加えて反応を開始させ、３０分間反応を行った。なお、基質ブランクには２−アミノフェノールの代わりに水０．２５ｍｌを加えた。次に氷冷した２０％トリクロロ酢酸−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ２．７）を０．５ｍｌ加えて反応を停止させ、氷中で５分間放置し、その後遠心分離（４℃、７０００ｘｇ、１０分間）した。
この上清１ｍｌを使用時直前に調製した０．１％亜硝酸ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、ボルテックスで混合撹拌し、２分間放置した。次に、不要な亜硝酸ナトリウムを除去する目的で、これに０．５％スルファミン酸アンモニウム溶液０．５ｍｌを加え、ボルテックスで混合撹拌し、室温、遮光条件下で１２０分間放置して呈色反応させた。この溶液を９６穴プレートに１００μｌずつ採取し、マイクロプレートリーダーにより５４０ｎｍの吸光度を測定した。検量線に従って生成物であるアゾ化合物の量を算出し、酵素活性を求めた。
【００３５】
ＵＤＰＧＴ活性測定で検出する２−アミノフェノールグルクロニドは入手が非常に困難なため、同様な性質の呈色反応を示すアニリンを、代わりに検量線用として用いた。０．１ｍＭアニリン−６％トリクロロ酢酸原液を調製し、この原液を０、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１ｍｌずつとり、これらに６％トリクロロ酢酸−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ２．７）を加えて全量を１．０ｍｌにした。次に、使用時直前に調製した０．１％亜硝酸ナトリウム溶液１ｍｌを加え、ボルテックスで混合撹拌、２分間放置した。次に、０．５％スルファミン酸アンモニウム溶液１ｍｌを加え、混合撹拌し、室温、遮光条件下で１２０分間放置して呈色反応させた。この溶液をＵＤＰＧＴ活性測定と同様に９６穴プレートに１００μｌずつ採取し、マイクロプレートリーダー（モデル５５０、日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社・東京）により５４０ｎｍの吸光度を測定した。５４０ｎｍの吸光度により検量線を作成した。
結果を図４に示す。
図４に示されるように、ダイコン種子食群において、ＵＤＰＧＴ活性の著しい上昇が認められた。
【００３６】
実施例３．ダイコンの種子からのスルホラフェンの精製
ダイコンの種子をコーヒーミルにより粉砕し、種子の１０倍量の水を加え、室温にて３０分間酵素反応を進行させた。得られたダイコン種子溶液をガーゼで濾過した後、セライトろ過（Ｎｏ．５４５及びＮｏ．５００の二回）を行った。得られたろ液をＨＰ−２０カラム（直径５ｃｍｘ２７ｃｍ）にかけ、スルホラフェンを吸着させたのち、不純物を水洗した。その後、５０％メタノール溶出画分を回収し、スルホラフェン含有画分を濃縮した。この濃縮物をＯＤＳカラム（展開溶媒：２０％メタノール）にて分離した。ＨＰＬＣでスルホラフェンの確認を行い、純度の高い画分（スルホラフェン含量９３％）をエバポレーターにより濃縮後、凍結乾燥を行った。これを、スルホラフェン含量が１００μｍｏｌ／ｍｌとなるように、超純水で希釈した。
【００３７】
試験例５：スルホラフェンのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果
１．肝臓の採取・解毒酵素抽出
５週齢のSD系SPF雌ラット１４匹を、飼料としてＣＥ−２固形食を１匹当たり２０ｇ／ｄａｙの制限食で与えた。３日間の予備飼育の後、これを、７匹ずつコントロール群とスルホラフェン投与群に分けた。さらに、これらを金網製個別ゲージに１匹ずつ入れ、１２時間の明暗サイクルの飼育室で７日間本飼育した。飲料水としては水道水を与え、自由摂取させた。ただし、解剖前１８時間のみ絶食した。コントロール群には、超純水を、スルホラフェン投与群には１００μＭ／ｍｌのスルホラフェンを１ｍｌずつ７日間経口胃内投与した。
７日間の本飼育後、ジエチルエーテルにより麻酔をかけ、肝臓灌流を行った。脱血後に肝臓を摘出し、重量を測定した。その後、ポッター型ホモジナイザーを用いてその４倍量のホモジナイズ緩衝液（０．２５Ｍショ糖を含む０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４）で肝臓をホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離（４℃、１０，０００ｘｇ，１５分間）し、上清（粗タンパク溶液）を得た。さらに、この上清を超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ，６０分間）し、得られた上清を上清画分とした。また得られた沈殿をホモジナイズ緩衝液に溶解し、さらに超遠心分離（４℃、１００，０００ｘｇ，６０分間）を行い、ここで得られた沈殿をミクロソーム画分とした。
【００３８】
２．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼの活性測定
２ｍｌ用の分光光度計用セルに３０ｍＭグルタチオン６０μｌ、３０ｍＭジニトロクロロベンゼン／エタノール６０μｌ、及び０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐH７．４）を１．４８ｍｌそれぞれ加え、混合撹拌し、この時の３４０ｎｍにおける吸光度を初期値とした。１０００倍希釈した上清画分を３００μｌ加えて反応を開始させ、３４０ｎｍにおける吸光度の上昇を１分間記録した（終了値）。３４０ｎｍにおける初期値と終了値の吸光度差を求め、１分間当たりに生成した２，４−ジニトロフェニルグルタチオン生成量、すなわち酵素活性を求めた。なお、タンパク質量はＦｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法により求めた。
結果を図５に示す。
図５より、スルホラフェンが単独でもグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ酵素活性を上昇させることが明らかである。
【００３９】
試験例６：ウリジン５’−ジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼの活性測定
補助因子溶液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）８．０ｍｌ、０．１５ＭのＭｇＣｌ２１．０ｍｌ、１％ｗ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．５ｍｌ、０．０２Ｍアスコルビン酸１．０ｍｌ、ＵＤＰ−グルクロン酸１０ｍｇ）０．５ｍｌと１ｍＭの２−アミノフェノール（用時調製）０．２５ｍｌを混合し、３７℃の恒温振とう器中で試験例５で得たミクロソーム画分酵素溶液０．２５ｍｌを加えて反応を開始させ、３０分間反応を行った。なお、基質ブランクには２−アミノフェノールの代わりに水０．２５ｍｌを加えた。次に氷冷した２０％トリクロロ酢酸−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ２．７）を０．５ｍｌ加えて反応を停止させ、氷中で５分間放置し、その後遠心分離（４℃、７０００ｘｇ、１０分間）した。
この上清１ｍｌを使用時直前に調製した０．１％亜硝酸ナトリウム溶液０．５ｍｌを加え、ボルテックスで混合撹拌し、２分間放置した。次に、不要な亜硝酸ナトリウムを除去する目的で、これに０．５％スルファミン酸アンモニウム溶液０．５ｍｌを加え、ボルテックスで混合撹拌し、室温、遮光条件下で１２０分間放置して呈色反応させた。この溶液を９６穴プレートに１００μｌずつ採取し、マイクロプレートリーダーにより５４０ｎｍの吸光度を測定した。検量線に従って生成物であるアゾ化合物の量を算出し、酵素活性を求めた。
結果を図６に示す。
図６に示されるように、スルホラフェンの投与により、ＵＤＰＧＴ活性の著しい上昇が認められた。
【００４０】
試験例７：シトクロムＰ４５０の比含量測定
分光光度計の対照セルと試料セルそれぞれに、０．１Mリン酸バッファー（ｐH７．４）適量で希釈した試験例５で得たミクロソーム画分の溶液１．６ｍｌを入れ、５１０〜４００ｎｍ間のスペクトラムを記録した。次に両セルにハイドロサルファイトナトリウム約２ｍｇをゆっくり混合させながら添加し、ミクロソーム中ヘムタンパク質のヘム鉄部位を還元させた。
試料セル中の還元させたミクロソーム溶液中に２．０ｍｌの一酸化炭素を通じ、還元したヘムタンパクと一酸化炭素を結合させた。この溶液を再び分光光度計に挿入し、５１０〜４００ｎｍ間のスペクトラムを記録した。この値から一酸化炭素を通じる前のスペクトラム値を差し引き、４９０から４５０ｎｍ付近の吸光度の変化を求め、次の式に代入した。
【００４１】
【数１】
2005206495.tif 000005
【００４２】
この値をFolin−Lowry法により求めた試料溶液中のタンパク質量で割ることで比含量を算出した。
結果を図７のグラフに示す。
図より、スルホラフェンがシトクロムＰ４５０の比含量を上昇させないことがあきらかである。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、癌の予防に有効な健康食品および医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ダイコンスプラウトのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果を示すグラフである。
【図２】ダイコンスプラウトのシトクロムＰ４５０に対する作用を示すグラフである。
【図３】ダイコン種子水抽出物のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果を示すグラフである。
【図４】ダイコン種子水抽出物のウリジン５’−ジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼに対する作用を示すグラフである。
【図５】スルホラフェンのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ誘導効果を示すグラフである。
【図６】スルホラフェンのウリジン５’−ジホスフェートグルクロノシルトランスフェラーゼに対する作用を示すグラフである。
【図７】スルホラフェンのシトクロムＰ４５０に対する作用を示すグラフである。
【図１】
2005206495.tif 000008
【図２】
2005206495.tif 000009
【図３】
2005206495.tif 000010
【図４】
2005206495.tif 000011
【図５】
2005206495.tif 000012
【図６】
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【図７】
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