(57)【要約】【課題】  微生物を用いて有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解する方法並びにこれに用いる微生物及びそのスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  有機ヒ素化合物を、プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを特徴とする有機ヒ素化合物の分解方法；並びにこれに用いる微生物及びそのスクリーニング方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機ヒ素化合物を、プロテオバクテリア(Proteobacteria)又はArthrobacter属に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを特徴とする有機ヒ素化合物の分解方法。
【請求項２】
プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項３】
γ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がシュードモナス属に属する微生物である請求項２記載の分解方法。
【請求項４】
プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がβ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項５】
β−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がComamonas属に属する微生物である請求項４記載の分解方法。
【請求項６】
プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がα−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である請求項１記載の分解方法。
【請求項７】
α−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がBrevundimonas属に属する微生物である請求項６記載の分解方法。
【請求項８】
有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有するＫ−１′株。
【請求項９】
有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する１２Ｍ２０株。
【請求項１０】
有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する７Ｍ５株。
【請求項１１】
微生物を含有する試料溶液を、有機ヒ素化合物を含有する培地に添加し、培養し、培養物中に無機ヒ素を生成させた微生物、又は培養物中の有機ヒ素化合物濃度を減少させた微生物を探索することを特徴とする有機ヒ素分解菌のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害物質である有機ヒ素化合物の分解方法並びにこれに用いる微生物及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機ヒ素化合物の人体への摂取は、ガンの誘発、皮膚の発疹、嘔吐の原因となる。有機ヒ素化合物は、農業用殺虫剤、殺菌剤、抗菌剤として環境中に散布され環境中に残留したり、化学兵器の成分であるルイサイトやジフェニルクロロアルシンとして化学兵器工場跡の土壌に残存し続けている。環境中の残存有機ヒ素化合物は、水圏環境を通じて飲料水へと混入し、人体に対しヒ素中毒を引き起こす。また、有機ヒ素化合物は、無機化されても毒性を示すため、ヒ素汚染環境においてヒ素を回収除去する抜本的対策を打ち出す必要がある。
【０００３】
ヒ素の防除技術として、土壌中の金属を吸収し蓄積する能力を有する植物（以下「金属濃縮型植物」という。）にヒ素を蓄積させ、植物体ごとヒ素を回収する手法が考えられる。金属濃縮型植物は無機ヒ素を根から吸い上げ高濃度で蓄積する。しかし、植物によって有機ヒ素化合物は吸収されにくく、無機ヒ素に較べ吸収効率は低い。従って、環境中の有害有機ヒ素化合物を除去するには、金属濃縮型植物の使用は困難であると考えられる。
【０００４】
しかしながら、有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解する技術を金属濃縮型植物と併用すれば、有機ヒ素化合物の除去が可能になる。
【０００５】
有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解する技術としては、水性媒体中の有機ヒ素化合物に、鉄イオン、銅イオン、コバルトイオン及びマンガンイオンからなる群より選ばれる少なくとも１種の金属イオンの存在下、過酸化水素を反応させて、有機ヒ素化合物を無機ヒ素に酸化分解する方法が知られている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、この方法は、金属イオンを使用するため、環境汚染の問題がある。また、微生物を用いて有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解する技術はほとんど報告されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１５８６２２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、微生物を用いて有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解する方法並びにこれに用いる微生物及びそのスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）有機ヒ素化合物を、プロテオバクテリア(Proteobacteria)又はArthrobacter属に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物から選ばれる少なくとも１種で処理することを特徴とする有機ヒ素化合物の分解方法。
（２）プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がγ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である前記（１）に記載の分解方法。
（３）γ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がシュードモナス属に属する微生物である前記（２）に記載の分解方法。
（４）プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がβ−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である前記（１）に記載の分解方法。
（５）β−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がComamonas属に属する微生物である前記（４）に記載の分解方法。
（６）プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物がα−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物である前記（１）に記載の分解方法。
（７）α−プロテオバクテリア(Proteobacteria)に属する微生物がBrevundimonas属に属する微生物である前記（６）に記載の分解方法。
（８）有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有するＫ−１′株。
（９）有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する１２Ｍ２０株。
（１０）有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する７Ｍ５株。
（１１）微生物を含有する試料溶液を、有機ヒ素化合物を含有する培地に添加し、培養し、培養物中に無機ヒ素を生成させた微生物、又は培養物中の有機ヒ素化合物濃度を減少させた微生物を探索することを特徴とする有機ヒ素分解菌のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物を用いて有機ヒ素化合物を無機ヒ素に分解することができる。従って、金属濃縮型植物と併用することにより、有機ヒ素化合物の除去が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に用いる微生物としては、プロテオバクテリア(Proteobacteria)又はArthrobacter属に属し、かつ有機ヒ素化合物を無機ヒ素に変換しうる能力を有する微生物であれば、特に制限はない。
【００１２】
本発明に用いる微生物は、微生物を含有する試料溶液を、有機ヒ素化合物を含有する培地に添加し、培養し、培養物中に無機ヒ素を生成させた微生物、又は培養物中の有機ヒ素化合物濃度を減少させた微生物を探索することを特徴とする本発明のスクリーニング方法により得ることができる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下のようにして実施することができる。
【００１４】
（最確数法（ＭＰＮ法; Most Probable Number）による有機ヒ素化合物分解菌の分離；図１）
（１）微生物を含有する試料溶液を滅菌水で希釈し、希釈度の異なる希釈試料溶液を調製する。
（２）有機ヒ素化合物、例えばモノメチルアルソン酸、ジメチルアルシン酸を含有するスクリーニング培地を調製する。
（３）前記（１）の希釈試料溶液及び前記（２）のスクリーニング培地をマイクロプレートの２４ｗｅｌｌ毎に分注する。このマイクロプレートを２０℃で数日間培養する。
（４）白濁したｗｅｌｌの数より最確数法を用いて細菌数を算出する。更に、白濁したｗｅｌｌの培養物を寒天培地に画線し、最も希釈度の高いｗｅｌｌから細菌を分離する。
【００１５】
（塗沫平板法による有機ヒ素化合物分解菌の分離）
（１）前記スクリーニング培地に細菌培地用の寒天を加え蒸留水で調整し、滅菌する。これを寒天プレートに注ぎ入れ、固体となるまで常温で冷却する。
（２）前記（１）のスクリーニング寒天培地に試料水を分注し、コンラージ棒を用いて塗沫する。数日後、形成されたコロニー数から試料水中の細菌数を計算するとともに、コロニーを新しい寒天培地に画線することで細菌を分離する。
【００１６】
（還元気化原子吸光法による無機ヒ素及び有機ヒ素化合物の定量）
ガラス製Ｕ字管を加熱し、ヘリウムガスを流し脱気した後、試料の測定を開始する。試料溶液、ＥＤＴＡ及び塩酸を混合し、ヘリウムガスで脱気する。この間に、Ｕ字管を液体窒素に浸し、冷却する。次に、３％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を混合溶液に注入し、ヒ素を水素化させることで、冷却したＵ字管で水素化ヒ素（アルシン）を捕集する。水素化ホウ素ナトリウム水溶液の注入を止めた後、ヘリウムガスの流速を上げ、Ｕ字管を速やかに液体窒素から離し、Ｕ字管を加熱して捕集したアルシンを再気化させた。この際、無機ヒ素、有機ヒ素化合物の順に気化する性質を利用して、各ヒ素化学種を原子吸光度計で定量する。
【００１７】
また、簡易法として以下の方法を用いることもできる。
試験管に試料溶液３．０ｍｌ、２Ｍヨウ化カリウム水溶液１．０ｍｌ及び２Ｍ塩酸１．０ｍｌを入れ、１０分間攪拌後、ポリプロピレン容器に移し、３％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を注入し、発生する気体を、０．５％ジエチルジチオカルバミン酸銀・ピリジン溶液に吹き込み、次いで、前記と同様にして、各ヒ素化学種を原子吸光度計で定量する（図２）。
【００１８】
（細菌による有機ヒ素化合物の分解）
予め有機ヒ素化合物を含有する培地で細菌を前培養する。培地を容器に注ぎ、オートクレーブ処理した後、前培養物を接種する。培養後、前記の還元気化原子吸光法によって培養内の無機ヒ素及び有機ヒ素化合物を定量する。なお、分子量が大きいフェニルアルソン酸は還元気化原子吸光法で定量することができないため、フェニルアルソン酸をペルオキソ二硫酸カリウム水溶液で分解し、無機ヒ素として定量する。
【００１９】
本発明者らは、前記のスクリーニング方法に従って、木場潟、河北潟からそれぞれ１４株及び５０株のジメチルアルシン酸を代謝する細菌株が得た。また、大久野島及び金沢大学工学部敷地内からは、ジメチルアルシン酸を代謝すると考えられる細菌株がそれぞれ４８株及び１２株が得られた。
【００２０】
大久野島から得られた株のうち、IV−１株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌Pseudomonas pavonanceに対し、１００％の相同性を示し、γ−Proteobacteria群のシュードモナス属に属すると同定された。IV−１株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９１で、２００４年２月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。
【００２１】
IV−１株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、透明のコロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００２２】
金沢大学工学部敷地内から得られた株のうち、Ｋ−１′株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌中、最も高い相同性を示したPseudomonas sp. Fa2に対する相同性が９９．６％であることから、γ−Proteobacteria群のシュードモナス属に属する新菌株と同定された。Ｋ−１′株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８８で、２００４年２月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２３】
Ｋ−１′株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、透明のコロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００２４】
河北潟から得られた株のうち、Ｋ８株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌Comamonas testosteroniに対し、１００％の相同性を示し、β−Proteobacteria群のComamonas属に属すると同定された。Ｋ８株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託を試みたが、バイオセーフティーレベル２に該当するとの理由で、受託を拒否されたので、出願人自身が保存し、その分譲を保証する。
【００２５】
Ｋ８株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、白いコロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００２６】
河北潟から得られた株のうち、１２Ｍ１７株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌Aeromonas hydrophilaに対し、１００％の相同性を示し、γ−Proteobacteria群のAeromonas属に属すると同定された。１２Ｍ１７株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託を試みたが、バイオセーフティーレベル２に該当するとの理由で、受託を拒否されたので、出願人自身が保存し、その分譲を保証する。
【００２７】
１２Ｍ１７株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、白いクリーム状コロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００２８】
河北潟から得られた株のうち、１２Ｍ２０株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌中、最も高い相同性を示したBrevundimonas sp. KIN166に対する相同性が９９．３％であることから、α−Proteobacteria群のBrevundimonas属に属する新菌株と同定された。１２Ｍ２０株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９０で、２００４年２月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２９】
１２Ｍ２０株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、白く広がるコロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００３０】
木場潟から得られた株のうち、７Ｍ５株は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析により、既知の細菌中、最も高い相同性を示したArthrobacter sp. M4に対する相同性が９９．１％であることから、グラム陽性細菌のArthrobacter属に属する新菌株と同定された。７Ｍ５株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８９で、２００４年２月１６日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３１】
７Ｍ５株は下記の菌学的性質を有する。
寒天培地上で、黄色いコロニーを形成し、有機ヒ素のみを炭素源とする培地で増殖する。
【００３２】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報はＤＤＢＪデータベース中のFASTA SEARCHで既知細菌種との比較を行った(Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D.J. Lipman; Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))。系統樹は、前記データベースで検索された既知細菌種を含め、近隣結合法に基づき作成した。ブーツストラップ値はPCソフトCLUSTAL W ver. 1.7 より決定した(Thompson, J.D., D.G. Higgins and T.J. Gibson; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nuc. Aci. Res. 22: 4673-4680 (1994))。
【００３３】
Ｋ−１′株及びIV−１株について、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いて作成した系統樹を図３に示す。
【００３４】
本発明においては、前記のようにして得られた菌株を変異誘発処理して得られる変異株を用いてもよい。
【００３５】
変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行うことができる。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原を用いてもよい。
【００３６】
前記の微生物の培養に際しては、通常の細菌の培養方法が一般に用いられる。培地としては資化可能な炭素源、窒素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培地、天然培地のいずれでも使用可能である。
【００３７】
炭素源としては、グルコース、澱粉、デキストリン、マンノース、フルクトース、シュクロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが単独又は組合せて用いられる。更に、菌の資化能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用いられる。
【００３８】
窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸、アミノ酸などが単独又は組合せて用いられる。
【００３９】
そのほか、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム・８水和物、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類；チアミン塩酸塩などのビタミン類を加える。
【００４０】
本発明の対象となる有機ヒ素化合物としては、例えばモノメチルアルソン酸等のモノアルキルアルソン酸、ジメチルアルシン酸等のジアルキルアルシン酸、フェニルアルソン酸等のアリールアルソン酸及びこれらの塩（例えば、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）、ジフェニルシアノアルシン、トリメチルアルシンオキシド、ジフェニルクロロアルシン、ルイサイト、アルセノベタイン、アルセノリピド、アルセノシュガー、アルセノコリン、テトラメチルアルソニウムイオンが挙げられる。
【００４１】
本発明の分解方法において、処理時のｐＨは、通常６〜８、好ましくは７．７〜７．８、処理温度は、通常１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃、処理時間は、通常２週間、好ましくは２週間以上である。
【００４２】
土壌汚染の場合、有機ヒ素汚染環境から土壌を処理施設へ運搬した後、土壌に分解細菌培養物を加え、数日間適温で保温する。保温の間に、土壌で金属濃縮型植物、例えばシダ植物（Asplenium adulterum，Pteris vittata）、ナズナ（Thlaspi calaminare）、キク科ブタクサ（Alpine pennucress）、マリーゴールド、ブライダルベールを栽培し、適当な時期に植物を回収除去する。土壌中のヒ素濃度を測定し、ヒ素濃度が基準値以下であれば、土壌を環境中に戻す。
【００４３】
水質汚染の場合、有機ヒ素汚染環境から水を吸い上げ、分解細菌のバイオフィルムを通過させ、有機ヒ素化合物を完全に無機化する。更に、金属濃縮型植物、例えばシダ植物（Asplenium adulterum，Pteris vittata）、ナズナ（Thlaspi calaminare）、キク科ブタクサ（Alpine pennucress）、マリーゴールド、ブライダルベールを繁茂させた土壌に通水し、無機ヒ素を植物に吸収させる。水質を検査した後、ヒ素濃度が基準値以下であれば、水を再び環境に排出する。また、植物に過剰にヒ素が蓄積された場合、植物を植え替える。これらの一連の操作は、水処理施設内に水を循環させることで行う。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
（１）採水
河北潟及び木場潟より試料を滅菌済み５００ｍｌポリカーボネート容器に採取した。また、大久野島及び金沢大学構内の土壌を２０ｍｌプラスチック試験管に適量採取した。
【００４６】
（２）無機ヒ素及び有機ヒ素化合物の定量
ガラス製Ｕ字管を加熱し、ヘリウムガス（０．３Ｌ／ｍｉｎ）を一時間ほど流し脱気した後、試料の測定を開始した。試料水４０ｍｌ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ５ｍｌ及び５Ｍ塩酸５ｍｌを混合し、ヘリウムガス（０．３Ｌ／ｍｉｎ）で３分間脱気した。この間に、Ｕ字管を液体窒素に浸し、冷却した。次に、３％水素化ホウ素ナトリウム水溶液（関東化学、原子吸光分析用）１０ｍｌを９０秒かけて混合溶液に注入し、ヒ素を水素化させることで、冷却したＵ字管で水素化ヒ素（アルシン）を捕集した。水素化ホウ素ナトリウム水溶液の注入を止めて９０秒経過した後、ヘリウムガスの流速を１．２Ｌ／ｍｉｎに上げ、Ｕ字管を速やかに液体窒素から離し、Ｕ字管を加熱して捕集したアルシンを再気化させた。この際、無機ヒ素、モノメチルアルソン酸及びジメチルアルシン酸の順に気化する性質を利用して、各ヒ素化学種を原子吸光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｚ−８１００形偏光ゼーマン原子吸光分光光度計）で定量した。原子化はアセチレン−空気フレームで加熱する方法（R. S. Braman and C. C. Foreback; Methylated forms of arsenic in the environment, Science 182: 1247-1249 (1973)）を用いた。
以下、前記の定量法を「還元気化原子吸光法」又は「ＨＧ−ＡＡＳ」という。
【００４７】
（３）最確数法（ＭＰＮ法; Most Probable Number）による有機ヒ素化合物代謝細菌の計数
培地の調製：有機ヒ素化合物を分解する細菌のスクリーニング培地として、ＳＭＳ培地１００ｍｌに対しグルコースの代わりに０．０２１４ｇのジメチルアルシン酸を加え１０−４Ｍとなるよう調整した（培地組成：培地１００ｍｌ中、ジメチルアルシン酸０．０２１４ｇ、アスパラギン０．２ｇ、リン酸二水素カリウム０．０５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．００２５ｇ、チアミン塩酸塩０．０００５ｇ）。これらを蒸留水により調製し、オートクレーブ（１２１℃、２０ｍｉｎ）で滅菌した。
【００４８】
計数法：試料水を滅菌した純水により１００、１０１、１０２、１０３倍に希釈した。希釈の方法として、培養試験管を４本用いて、そのうちの一本に試料水を２０ｍｌ分注し、残りの三本には滅菌水を１８ｍｌずつ分注した。次に、試料水の入った試験管から２ｍｌ採り、滅菌水の入った試験管一本に移し、よく撹拌した。ここから更に２ｍｌ採って、また別の滅菌水の入った試験管に移す操作を繰り返し、容量が１８ｍｌで濃度が十倍ずつ異なった試験管を４本作成した。それぞれの系を半分に分け、各希釈段階に対して同量のヒ素耐性培地（培地組成：培地１００ｍｌ中、グルコース４ｇ、アスパラギン０．２ｇ、リン酸二水素カリウム０．０５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．００２５ｇ、チアミン塩酸塩０．０００５ｇ、ヒ酸二水素ナトリウム７水和物０．０３ｇ）あるいは前記スクリーニング培地を９ｍｌずつ分注してよく混合した後、一つの系に対し９６穴マイクロプレートの２４ｗｅｌｌ毎にそれぞれ２００μｌずつ分注した。このマイクロプレートを２０℃で静置培養し、数日後白濁したｗｅｌｌの数より最確数法を用いて細菌数を算出した。更に、白濁したｗｅｌｌの培養物を寒天培地に画線し、細菌を分離した（図１）。
【００４９】
（４）塗沫平板法を用いたヒ素の動態に関わる細菌の計数
培地の調製：前記スクリーニング培地に細菌培地用の寒天（和光純薬工業）１．５ｇ／１００ｍｌを加え蒸留水で調整し、オートクレーブ（１２１℃、２０ｍｉｎ）で滅菌した。これを寒天プレートに注ぎ入れ、固体となるまで常温で冷却した。
【００５０】
計数法：前記スクリーニング寒天培地に試料水１００μｌを分注し、コンラージ棒を用いて塗沫した。数日後、形成されたコロニー数から試料水中の細菌数を計算するとともに、コロニーを新しい寒天培地に画線することで細菌を分離した。
【００５１】
（５）細菌による有機ヒ素化合物の分解
培地：酵母抽出液５０ｍｇ及びペプトン５００ｍｇを超純水１０００ｍｌに溶解させ、有機ヒ素化合物（ジメチルアルシン酸、モノメチルアルソン酸あるいはフェニルアルソン酸）を終濃度１０−３Ｍになるように添加した。
【００５２】
分解試験：予め前記培地で細菌を３日間前培養した。１９．５ｍｌの培地を５０ｍｌポリカーボネート容器に注ぎ、オートクレーブ処理した後、０．５ｍｌの前培養物を接種した。なお、Ｋ８株、１２Ｍ１７株、１２Ｍ２０株及び７Ｍ５株をジメチルアルシン酸を含む培地に接種し、IV−１株及びＫ−１′株をジメチルアルシン酸、モノメチルアルソン酸あるいはフェニルアルソン酸を含む培地に接種した。２０℃で２週間培養し、前記の還元気化原子吸光法（ＨＧ−ＡＡＳ）によって培養内の無機ヒ素、ジメチルアルシン酸及びモノメチルアルソン酸を定量した。また、分子量が大きいフェニルアルソン酸はＨＧ−ＡＡＳで定量することができないため、フェニルアルソン酸をペルオキソ二硫酸カリウム（Ｋ２Ｓ２Ｏ８）水溶液で分解し、無機ヒ素として定量した（詳細は下記を参照）。無機ヒ素の生成量及び有機ヒ素の減少量を考慮して、細菌による有機ヒ素化合物の分解能について検討した。
【００５３】
（参照：フェニルアルソン酸の測定操作）
１００ｍｌテフロンビーカーにサンプル溶液を超純水で２０ｍｌにメスアップしたものを入れ、０．０５Ｍペルオキソ二硫酸カリウム水溶液１０ｍｌを加えた。テフロンビーカーに時計皿をのせ、電子レンジにて５分間加熱した。５Ｍ塩酸１０ｍｌを加え２００℃のホットプレート上で３０分間加熱した。放冷後０．２Ｍ  ＥＤＴＡ５ｍｌを加え超純水で約５０ｍｌにメスアップし原子吸光度計にて定量した。
【００５４】
（６）結果と考察
（分離株）
木場潟、河北潟からそれぞれ１４株及び５０株のジメチルアルシン酸を代謝する細菌株が得られた。得られた株のうち、木場潟の１株（７Ｍ５株）及び河北潟の３株（Ｋ８株、１２Ｍ１７株、１２Ｍ２０株）を分解実験に供した。また、大久野島及び金沢大学工学部敷地内からは、ジメチルアルシン酸を代謝すると考えられる細菌株がそれぞれ４８株及び１２株が得られた。大久野島及び金沢大学工学部敷地内から得られた株のうち、それぞれIV−１株及びＫ−１′株を分解実験に供した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
なお、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列情報を用いた系統分類学的解析によると、７Ｍ５株はグラム陽性細菌群、Ｋ８株はβ−Proteobacteria群、１２Ｍ２０株はα−Proteobacteria群、１２Ｍ１７株、Ｋ−１′株及びIV−１株はγ−Proteobacteria群に属した。また、それぞれの細菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は既知の細菌と９９％以上の相同性を示した。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
（分解実験）
１０００ｎＭのジメチルアルシン酸を含む培地で細菌を２週間培養したところ、Ｋ８株、１２Ｍ１７株及び７Ｍ５株の培養物中のジメチルアルシン酸は著しく減少し、それぞれ２６．０％、３４．８％及び６０．４％の分解率を示した（表３）。また、培地中から無機ヒ素の生成も確認されたことから、確実にジメチルアルシン酸を無機化していると考えられる。一方、１２Ｍ２０株、Ｋ−１′株及びIV−１株では、ジメチルアルシン酸の減少は１０％以下に留まり、その分解能力は低いといえる。ただし、１２Ｍ２０株の培地から３１．０ｎＭの無機ヒ素が検出されたことから、無機化が生じていることは明らかである（表３）。
【００５９】
更に、Ｋ−１′株及びIV−１株をモノメチルアルソン酸を含む培地で培養し、２週間後にヒ素濃度を測定した。その結果、モノメチルアルソン酸が培地中から検出されず、１００％の分解率を示した。フェニルアルソン酸を含む培地で２週間培養したところ、微量の無機ヒ素が検出され、０．６３％及び２．２％の分解率となった。これより、フェニルアルソン酸は難分解性であるが、少しずつ分解されると考えられる（表３）。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
Ｋ−１′株及びIV−１株をモノメチルアルソン酸を含む培地に接種し、培地中のモノメチルアルソン酸と無機ヒ素の濃度を経時的に測定した。Ｋ−１′株では、モノメチルアルソン酸は１週間で検出されなくなり、無機ヒ素が２週間かけて５００ｎＭにまで増加した（図４）。これより、Ｋ−１′株はほぼ１週間でモノメチルアルソン酸を分解すると考えられる。IV−１株では、２週間の間にモノメチルアルソン酸が徐々に減少し、１週間後に無機ヒ素が増加し始めた。この結果、IV−１株はＫ−１′株に較べ、モノメチルアルソン酸の分解速度は遅いことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】最確数法による有機ヒ素化合物代謝細菌の計数と分離を示す図である。
【図２】有機ヒ素化合物分解菌の簡易スクリーニング法を示す図である。
【図３】有機ヒ素化合物分解菌の系統学的位置付けを示す図である。
【図４】有機ヒ素化合物分解菌の培養中のモノメチルアルソン酸（ＭＭＡＡ（Ｖ））と無機ヒ素（Ａｓ（Ｖ））の濃度の経時変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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