(57)【要約】【課題】フラン環を有する１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光に最適な発光方法を提供する。また酵素免疫測定用基質試薬としても使用可能な、熱安定性に優れ、高感度測定を可能にする化学発光用組成物を提供する。【解決手段】式１【化１】2005077142.tif 000012で表される１，２−ジオキセタン誘導体［代表的化合物の例示：５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩］を、活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を共存させる。また上述の式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体、カチオン性界面活性剤、および蛍光性物質を含有する化学発光用組成物。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
【化１】
2005077142.tif 000008
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基またはアリール基である。また、Ｒ２とＲ３およびＲ４とＲ５は一体となり、それぞれ独立に環状アルキル基を形成することもできる。Ｒ６はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ８Ｒ９Ｒ１０）（ただし、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１１（ただし、Ｒ１１はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）を、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択した活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を共存させることを特徴とする、化学発光方法。
【請求項２】
カチオン性界面活性剤が、式２
【化２】
2005077142.tif 000009
（式中、Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４およびＲ１５のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍ＋は正電荷を帯びた窒素原子またはリン原子を示す。Ｘ−はハロゲンイオンを表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式１
【化３】
2005077142.tif 000010
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基またはアリール基である。また、Ｒ２とＲ３およびＲ４とＲ５は一体となり、それぞれ独立に環状アルキル基を形成することもできる。Ｒ６はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ８Ｒ９Ｒ１０）（ただし、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１１（ただし、Ｒ１１はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）、カチオン性界面活性剤、および蛍光性物質を含有することを特徴とする、化学発光用組成物。
【請求項５】
カチオン性界面活性剤が、式２
【化４】
2005077142.tif 000011
（式中、Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４およびＲ１５のうち一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍ＋は正電荷を帯びた窒素原子またはリン原子を示す。Ｘ−はハロゲンイオンを表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩であることを特徴とする、請求項４に記載の化学発光用組成物。
【請求項６】
カチオン性界面活性剤が臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムであることを特徴とする、請求項４又は５に記載の化学発光用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１，２−ジオキセタンの化学発光を増強する方法および化学発光用組成物に関する。本発明による方法は生体成分、酵素、化学品などの高感度分析に有用であり、本発明による化学発光用組成物は酵素免疫測定用基質試薬として好適に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
１，２−ジオキセタン構造を有する水溶性化学発光物質は、生体成分の分析などのようにプロトン性溶媒を用いる条件下で極めて有用な化合物であり、近年ますますその需要は高まっている。しかしながら、プロトン性溶媒中において１，２−ジオキセタンを単独で用いた場合、非常に低い発光効率しか得られず、臨床検査のための免疫測定に使おうとしても、実用に耐えうる程の化学発光強度を得ることが出来なかった。このため、水溶性化学発光性ジオキセタンの化学発光を増強する必要があった。本願明細書では、化学発光性化合物の発光強度を高めるのに有用な物質を、電子エネルギーの移動に直接関わるか否かによらず、広く増感剤またはエンハンサーと呼ぶこととする。
【０００３】
従来、２個のカルボニル含有化合物に分解すると共に電子エネルギーを放出して光を発生する１，２−ジオキセタンに対するエンハンサーとして、カチオン性界面活性剤（例えば特許文献１参照）、カチオン性界面活性剤と蛍光性物質の混合物（特許文献２参照）、ビニルベンジル４級アンモニウム塩ポリマー（例えば特許文献３参照）およびポリカチオン性の高分子ホスホニウム塩（特許文献４参照）が提案されてきた。また、アクリジニウムエステルの化学発光系に第４級ホスホニウム塩を添加した例（特許文献５参照）がある。
【０００４】
しかしながら、本発明で用いられる式１で表されるようなフラン環を有する１，２−ジオキセタン誘導体（例えば特許文献６参照）は、発光の際２つの化合物に分解しない熱安定性に優れた化学発光物質であるが、その化学発光強度を高めるのに最適な増感剤は現在に至るまで報告されていない。
【０００５】
【特許文献１】特公平７−１２１２３７号公報
【０００６】
【特許文献２】特公平７−９１５３６号公報
【特許文献３】特公平７−３１２０１号公報
【特許文献４】特許第２６４８４２３号公報
【特許文献５】特開平５−７９９８５号公報
【特許文献６】特開平９−２１６８８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、フラン環を有する１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光に最適な発光方法を提供することを目的とする。また本発明は、酵素免疫測定用基質試薬としても使用可能な、熱安定性に優れ、高感度測定を可能にする化学発光用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、式１
【０００９】
【化１】
2005077142.tif 000002
で表される１，２−ジオキセタン誘導体（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基またはアリール基である。また、Ｒ２とＲ３およびＲ４とＲ５は一体となり、それぞれ独立に環状アルキル基を形成することもできる。Ｒ６はヒドロキシル基、アルコキシル基、アラルキルオキシ基、−ＯＳｉ（Ｒ８Ｒ９Ｒ１０）（ただし、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基、リン酸塩基またはＳ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１１（ただし、Ｒ１１はアルキル基またはアリール基である。）で表される基であり、Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシル基である。）を、塩基、酸、塩、フッ素化合物、酵素、触媒およびアミン化合物からなる群から選択した活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を共存させることを特徴とする、化学発光方法である。
【００１０】
また本発明は、上述の式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体、カチオン性界面活性剤、および蛍光性物質を含有することを特徴とする、化学発光用組成物である。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１１】
はじめに、式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体について説明する。
【００１２】
置換基のアルキル基としては、炭素数１〜２０個の直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基、または環状になった基を例示することができる。これらのアルキル基は、さらに置換基を有していてもよく、例えば、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アリール基等が置換していてもよい。
【００１３】
アリール基としては、例えばフェニル、ナフチル基等の炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素基、および、フリル、チエニル、ピリジル基等の環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。アルコキシル基としては、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メトキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基等の炭素数１〜２０個のアルコキシル基が直鎖状または分枝状に１〜５個結合したもの等を挙げることができる。アラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ基等の炭素数７〜２０の基が例示でき、ハロゲン原子としてはフッ素、塩素、臭素等が例示できる。
【００１４】
このような置換基を有する式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体として、具体的には５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩、リン酸モノ−［５−（５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプト−１−イル）−２−クロロフェニル］エステル  ジナトリウム塩などがあげられる。
【００１５】
本発明で使用される活性化剤は、式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体を発光させるために使用するが、式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体の基Ｒ６に作用して不安定なオキシド中間体を経てカルボニル化合物に変化させると同時に化学発光を生じさせることのできるものであれば特に限定はない。例えばＲ６がヒドロキシル基ならば塩基が、またＲ６が−ＯＳｉ（Ｒ８Ｒ９Ｒ１０）（ただし、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は互いに独立にアルキル基又はアリール基である。）で表される基ならばテトラブチルアンモニウムフルオライドが活性化剤として好適に使用できる。式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体を酵素免疫測定の基質として使用する場合は、活性化剤として各種酵素たとえば、アルカリ性ホスファターゼ、アリールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼおよびガラクトシダーゼなどが好適に使用できる。
【００１６】
本発明で使用されるカチオン性界面活性剤としては、後述の蛍光性物質と共に式１で表される１，２−ジオキセタンの化学発光を増強する効果をもつものであれば特に限定はない。好適なカチオン性界面活性剤として、例えば市販のＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ（ＴＲＯＰＩＸ社製）に含有されるポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリドや、式２
【００１７】
【化２】
2005077142.tif 000003
（式中、Ｒ１２，Ｒ１３，Ｒ１４およびＲ１５のうち、一つは炭素数８〜２０のアルキル基または炭素数８〜２０のアリール基であり、他の三つは互いに独立に炭素数１〜８のアルキル基、ベンジル基またはフェニル基である。Ｍ＋は正電荷を帯びた窒素原子またはリン原子を示す。Ｘ−はハロゲンイオンを表す。）で示される第４級アンモニウム塩または第４級ホスホニウム塩があげられる。
【００１８】
式２において、炭素数８〜２０のアルキル基としては、炭素数８〜２０個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数１〜８のアルキル基としては、炭素数１〜８個の直鎖状または分枝鎖状のアルキル基をいい、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの直鎖の基、又はこれらのアルキル基が適宜分枝状に結合した基を例示することができる。炭素数８〜２０のアリール基としては、例えばナフチル基等の炭素数８〜２０個の芳香族炭化水素基、又は環内に１〜５個の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有するヘテロアリール基等を挙げることができる。ハロゲンイオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン等が例示できる。
【００１９】
以上のような置換基を有する、式２で表される第４級アンモニウム塩の好適な例として、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムがあげられる。また第４級ホスホニウム塩の好適な例は、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウム、臭化エチルトリフェニルホスホニウム、臭化トリヘプチルフェニルホスホニウムおよび臭化テトラデシルトリフェニルホスホニウムがあげられる。その中でも、臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムがきわめて望ましい。
【００２０】
本発明で用いられる蛍光性物質としては、カチオン性界面活性剤と共に式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体の化学発光を増強する効果を持つものであれば特に限定はないが、例えばフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体（フルオレセインナトリウム、アミノフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）色素、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、Ｒｈｏｄｏｌ  ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（登録商標）およびヒドラジド、５−（および−６）−カルボキシ−２'，７'−ジクロロフルオレセインが挙げられる。その中でも、フルオレセインが特に望ましい。
【００２１】
本発明において、使用する１，２−ジオキセタン誘導体の濃度は、測定対象のゼロ濃度およびポジ（陽性）濃度の標準溶液に対する測定値が濃度対測定値の略直線関係が成り立つ範囲で適宜決定すればよい。好適にはその濃度は０．１〜１．２ｍＭの範囲に設定することができる。この範囲より著しく低い濃度領域では、ポジ濃度に対する測定値が頭打ちの状態になり測定範囲の上限が低下してしまう恐れがある。逆にこの範囲より著しく高い濃度領域では、ゼロ濃度に対する測定値のバックグラウンドが上がり、測定対象の低濃度領域の検出感度が悪化する恐れがある。
【００２２】
使用するカチオン性界面活性剤の濃度は０．００２５％〜２．０％の範囲とするのが好適である。最適な発光量を得るためには０．０１〜０．１０％とするのが特に好ましい。使用する蛍光性物質の濃度は、１，２−ジオキセタン誘導体の濃度が高ければそれにつれて高くする必要があるが、約０．００２５〜０．２５％とすることが増感効果を高める点で好ましい。
【００２３】
本発明では、式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体を、上述の活性化剤により化学発光させる際に、カチオン性界面活性剤および蛍光性物質を共存させる。これにより従来法と同等以上の発光量を得ることができる。
【００２４】
化学発光の検出は特に限定はないが、例えば上記の各成分すなわち、１，２−ジオキセタン誘導体、カチオン性界面活性剤、蛍光性物質および活性化剤をすべて接触させてインキュベートし、その反応溶液を一定時間後に発光検出器に導入することができる。発光検出器としては、シングルフォトンカウンターを装備したルミノメーターが好適に使用できる。増感剤等により強度の高い発光が得られるときは、シリコンフォトダイオードや写真フィルムが使用できる。活性化剤として酵素を用いるときは、反応溶液を発光検出器に導入する前に酵素反応停止剤を添加してもよい。
【００２５】
また、酵素反応の進行と同時に進行する化学発光反応を連続的にモニターし、発光量の増加率を測定することができる。増加率が一定の時間領域であれば、酵素反応開始時すなわち化学発光反応開始時と発光検出時との間の時間を厳密に規定する必要がなくなる。化学発光反応を連続的にモニターする場合、化学発光性基質との酵素反応の至適ｐＨと、それに引き続いて起こる化学発光反応の至適ｐＨとは、できるだけ一致していることが好ましい。例えば活性化剤がアルカリ性ホスファターゼのときは、酵素反応の至適ｐＨと化学発光反応の至適ｐＨとはほぼ一致し、ｐＨ約１０の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液またはジエタノールアミン緩衝液を使用することが好適である。
【００２６】
一方、本発明の化学発光用組成物は、式１で表される１，２−ジオキセタン誘導体、カチオン性界面活性剤、および蛍光性物質を含有するものである。さらにｐＨ調整剤や、保存安定性を確保するためにアジ化ナトリウムなどの保存剤を適宜含有していてもよい。この化学発光用組成物は固体で供してもよく、また溶液の形態で例えば水性緩衝液中に溶解させて供してもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明による発光方法は、従来の方法と同等またはより以上の発光量を得ることを可能にする。特にカチオン性界面活性剤として臭化トリ―ｎ―ブチルヘキサデシルホスホニウムを使用した場合、従来の方法より高い発光量を得ることができる。また本発明による化学発光用組成物は活性化剤を作用させたとき、従来のものと同等またはより以上の発光量を得ることを可能にするばかりでなく、きわめて高い保存安定性を保持する。
【実施例】
【００２８】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明する。しかし本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
実施例１〜１１
式３
【００３０】
【化３】
2005077142.tif 000004
に示す５員環ジオキセタンりん酸エステル（正式名称５−ｔ−ブチル−４，４−ジメチル−１−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−２，６，７−トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプタンジナトリウム塩）を特開平９−２１６８８７号公報の記載に基づいて製造し、キレート樹脂を用いて精製したもの０．４ｍＭ、蛍光性物質としてフルオレセインを表１に記載の濃度で、およびアジ化ナトリウム０．０２％をそれぞれ含む、０．１〜０．２Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ｐＨ１０．０）またはジエタノールアミン緩衝溶液（ｐＨ１０．０）に、表１に記載のカチオン性界面活性剤を表１に記載の濃度となるように加えた。この溶液を化学発光用組成物溶液とする。なお実施例１１は、蛍光性物質及びカチオン性界面活性剤として市販のＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ［ＴＲＯＰＩＸ社製。カチオン性界面活性剤ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド、及び蛍光性物質フルオレセインナトリウム含有。］を用いて行った。
【００３１】
この化学発光用組成物溶液５０μＬと、アルカリ性ホスファターゼ１０−１８モル／ｍＬ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液１０μＬと、を反応させ、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖ（検出器：シングルフォトンカウンター；測定波長領域：３８０〜６３０ｎｍ）を使用し、測光条件は化学発光用組成物と上記の酵素の溶液とを混合した５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。結果を表１に示す。また後述の比較例１（界面活性剤および蛍光性物質が無添加の場合）の発光量を基準にした発光量の比を増幅率として表１の最右欄に示した。
【００３２】
表１からも明らかなように、カチオン性界面活性剤を添加した場合、発光の増幅率はどれも１０倍以上を示した。また、三つのメチル基を有する４級アンモニウム塩である臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）および塩化テトラデシルトリメチルアンモニウムと、前記メチル基の一つがベンジル基に置き換わった塩化テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム（塩化ベンザルコニウム）および塩化ヘキサデシルジメチルベンジルアンモニウムとを比較した場合、後者の方が高い増幅率を示した。すなわち、Ｎ＋近傍の親水部位の置換基の疎水性を高めると、発光の増幅率が高くなる傾向を示した。
【００３３】
また、トリフェニルホスホニウム塩（エチル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−テトラデシル）を比較すると、アルキル鎖の長いものほど発光の増幅率は高い結果を示した。親水部位の置換基が疎水性の高いトリ−ｎ−ブチル基で、長鎖アルキル基であるヘキサデシル基をもつ臭化トリ−ｎ−ブチルヘキサデシルホスホニウムを使用した場合、最も高い増幅率４３０．４９倍を記録した。この値は、エンハンサとして市販されているＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭを用いた場合の増幅率９７．５３倍よりも高いものであった。
【００３４】
比較例１〜８
実施例１と同様にして、但し、比較例１は界面活性剤および蛍光性物質を添加せずに、比較例２〜８はカチオン性界面活性剤の代わりに表１に記載のアニオン性、ノニオン性、又は両性界面活性剤を表１に記載の濃度使用して、それぞれ行った。結果を表１に示す。
【００３５】
アニオン性界面活性剤のＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）（比較例２）、ノニオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（比較例３）、Ｔｗｅｅｎ８０（比較例４）、Ｔｗｅｅｎ２０（比較例５）や両性界面活性剤であるｎ−ドデシルジメチル（３―スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド（比較例６）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）（比較例７）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）（比較例８）を使用した場合、界面活性剤および蛍光性物質を添加しなかった比較例１と比較して、発光の増幅率が５倍以下とほとんど効果が無かった。
【００３６】
比較例９，１０
市販品との比較のため、実施例１の化学発光用組成物溶液の代わりに、化学発光基質ＣＳＰＤ（登録商標）（ＴＲＯＰＩＸ社製。フラン環を有しない１、２−ジオキセタン化合物）を使用し、界面活性剤および蛍光性物質を使用しなかった場合（比較例９）、および実施例１の化学発光用組成物溶液の代わりに、Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭ［ＴＲＯＰＩＸ社製。カチオン性界面活性剤ポリ（ベンジルトリブチル）アンモニウムクロリド、及び蛍光性物質フルオレセインナトリウム含有。］を添加したＣＳＰＤ（登録商標）（ＴＲＯＰＩＸ社製。フラン環を有しない１、２−ジオキセタン化合物）を使用した場合（比較例１０）の、それぞれの発光量を測定した。結果を表２に示す。前者と後者の発光量の比を増幅率として表２の最右欄に示した。
【００３７】
【表１】
2005077142.tif 000005
【００３８】
【表２】
2005077142.tif 000006
実施例１２，１３
実施例１０で作製した化学発光用組成物溶液（実施例１２）、および実施例４で作製した化学発光用組成物溶液（実施例１３）を、保存安定性試験のためそれぞれ４℃と４０℃のインキュベータ内で遮光下にて４日間保存した。その後、これらの溶液５０μＬに対して、１０−１８モル／ｍＬアルカリ性ホスファターゼ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ゼラチン加水分解物、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％ＮａＮ３を含む酵素溶液１０μＬとを反応させ、その発光量を測定した。発光測定にはベルトールド社製ルミノメーターＬＢ９６Ｖを使用し、測光条件は上記の反応開始５分後の１秒間の発光量（カウント数）を測定した。結果を表３に示す。表３からも明らかなように、４０℃４日間の保存後でもそれぞれ９７．５％（実施例１２）、１０１．５％（実施例１３）と、ほとんど発光量の低下は見られなかった。
【００３９】
比較例１１
実施例１２と同様にして、但し化学発光用組成物溶液の代わりに比較例１０で使用したＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩＴＭを添加したＣＳＰＤ（登録商標）（ＴＲＯＰＩＸ社製）を用いて行った。結果を表３に示す。表３からも明らかなように、４０℃で４日間保存することにより、４℃で４日間保存した場合の８６．６％まで発光量が低下した。
【００４０】
【表３】
2005077142.tif 000007