(57)【要約】【課題】  腫瘍特異的Ｔ細胞を製造するための新規な方法を提供すること。【解決手段】  非特異的に活性化誘導した抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞に、腫瘍抗原を認識する抗体遺伝子、活性化シグナル伝達分子の遺伝子および補助刺激分子の遺伝子を導入することより、ＭＨＣの関与なしに直接腫瘍細胞に結合して活性化が可能な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞およびＴｃ１細胞を製造する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に癌関連抗原を認識する抗体の遺伝子を導入することにより抗原特異性を付与する工程とを含む、細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項２】
癌関連抗原が、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ１からなる群より選択される、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項３】
Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞の活性化に必要な補助刺激分子の遺伝子を、抗体の遺伝子に連結してＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に導入することを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項４】
補助刺激分子が、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３４、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＲＡＮＫＬからなる群より選択される、請求項３に記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項５】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程が、Ｔ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下で培養することにより行われる、請求項１記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項６】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の比率を高める工程をさらに含む、請求項１−５のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項７】
抗原特異性を付与されたＴ細胞の比率を高める工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項６記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項８】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の比率を高める工程が、セルソーターを使用することにより行われる、請求項６記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項９】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む、請求項１−５のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１０】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、抗体磁気ビーズを使用することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１１】
抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程が、セルソーターを使用することにより行われる、請求項９記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【請求項１２】
分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む、請求項９−１１のいずれかに記載の細胞治療用の細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的に活性化した抗腫瘍活性を有するＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に、腫瘍抗原を認識する抗体遺伝子および活性化シグナル伝達分子の遺伝子、補助刺激分子の遺伝子を導入することにより、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）分子の関与なしに腫瘍抗原と直接結合し、効果的に活性化して腫瘍細胞を傷害しうる細胞医薬の製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本特許において癌とは悪性新生物をいい、また癌と腫瘍は、同義として扱うものとする。
【０００３】
末梢血より分離した単核球をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下で培養することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞抵抗性の腫瘍に対して幅広く抗腫瘍活性をもつリンフォカイン活性化キラ−（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋｉｌｌｅｒ、ＬＡＫ）細胞を誘導することができる（例えば、非特許文献１参照）。その後、遺伝子組み換え技術により大量のＩＬ−２が入手可能となり（例えば、非特許文献２参照）、腫瘍に対するＬＡＫ細胞を用いた養子免疫療法の臨床応用がなされ、その有用性が示された（例えば、（非特許文献３参照）。
【０００４】
さらにＩＬ−２に抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を加えて培養することにより、少量の末梢血から得られた単核球よりＬＡＫ活性をもつ細胞を大量に培養することが可能となった（例えば、非特許文献４参照）。
【０００５】
末梢のＴリンパ球は細胞表面にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と共にＣＤ３分子を発現しており、ＣＤ４またはＣＤ８分子の発現の違いにより、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に分類される。
【０００６】
細胞表面に発現した分子（たとえばＣＤ４分子、ＣＤ８分子）に対するＭｏＡｂと磁気ビーズを用いることにより、目的の細胞表面抗原を有する細胞を濃縮または除去することができる（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
Ｔｈ細胞はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２などのサイトカインを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ−４、ＩＬ−１０などのサイトカインを産生するＴｈ２細胞に分けられ（例えば、非特許文献５参照）、Ｔｈ１細胞は細胞性免疫のエフェクターとして働き、Ｔｈ２細胞は体液性免疫の調節を担っている。またＴｈ１細胞が産生するＩＦＮ−γはＴｈ２細胞を抑制し、Ｔｈ２細胞が産生するＩＬ−４はＴｈ１細胞を抑制する（例えば、非特許文献６参照）。
【０００８】
初期のＴｈ細胞活性化の際にＩＬ−１２の存在によりＴｈ１細胞の分化が起こり（例えば、非特許文献７参照）、ＩＬ−４の存在によりＴｈ２細胞の分化が起こる（例えば、非特許文献８参照）。
【０００９】
一方、ＣＴＬは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞と同様のサイトカイン産生パターンにより、Ｔｃ１細胞とＴｃ２細胞とに分類され、ＩＬ−１２またはＩＬ−４の存在によりＴｃ１細胞またはＴｃ２細胞へ分化する（例えば、非特許文献９参照）。
【００１０】
Ｔ細胞はＴＣＲによりＭＨＣ分子／抗原ペプチド複合体を認識して腫瘍細胞、感染細胞
、抗原提示細胞などの標的細胞に結合するが、ＣＴＬはＭＨＣクラスＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し（ＭＨＣクラスＩ拘束性）、Ｔｈ細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみしか結合できない（ＭＨＣクラスＩＩ拘束性）。
【００１１】
抗体分子はＭＨＣの関与なしに直接抗原に結合することができるため、Ｔ細胞に抗体遺伝子を導入することにより、抗体分子をＴ細胞レセプターに代わるレセプターとしてＴ細胞表面に発現させることができる（例えば、非特許文献１０参照）。しかし、このようにして培養して得られたＴ細胞は、抗体分子を発現する細胞の比率が低く、それぞれの細胞の機能と性状は明らかではなかった。
【００１２】
通常Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプターからのシグナルが活性化シグナル伝達分子により細胞内に伝達されることにより活性化するため、レセプターとして抗体分子を発現したＴ細胞に、同様の活性化シグナル伝達を起こさせる必要がある。そのために抗体遺伝子と活性化シグナル伝達分子の遺伝子を連結して導入し、Ｔ細胞表面に発現した抗体分子からのシグナルをＴ細胞内に効率良く伝達させる。さらにＴ細胞は、標的細胞とＴ細胞レセプターを介して結合すると同時に補助刺激分子を介した結合により、より強く活性化することが知られているため、抗体遺伝子および活性化シグナル分子の遺伝子と同時に補助刺激分子の遺伝子を導入することにより、Ｔ細胞をより強く活性化させる（例えば、非特許文献１１参照）。
【００１３】
さらに抗体分子を発現させたＴ細胞にＩＬ−１２を添加して培養することにより、抗腫瘍効果を増強することができる（例えば、非特許文献１２参照）。
【特許文献１】特許番号  第２５３０９６６号
【非特許文献１】Ｇｒｉｍｍら，１９８２．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５５：１８２３−１８４１
【非特許文献２】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，１９８３．Ｎａｔｕｒｅ，３０２：３０５−３１０
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，１９８５．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３：１４８５−１４９２
【非特許文献４】Ｏｃｈｏａら，１９８７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７２８−２７３３
【非特許文献５】Ｍｏｓｍｓｎｎら，１９８６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６：２３４８−２３５７
【非特許文献６】Ｍａｇｇｉら，１９９２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２１４２−２１４７
【非特許文献７】Ｓｅｄｅｒら，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０１８８−１０１９２
【非特許文献８】Ｈｓｉｅｈら，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：６０６５−６０６９
【非特許文献９】Ｍｏｓｍａｎｎら，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１７：１３８−１４６
【非特許文献１０】Ａｒａｋａｗａら，２００２，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２２：４２８５−４２９０
【非特許文献１１】Ｈｏｍｂａｃｈら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：６１２３−６１３１
【非特許文献１２】Ｅｍｔａｇｅら，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：９７−１０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
生体外で腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導するためには、手術によって患者本人の腫瘍組織を得る必要がある。また最近では腫瘍抗原ペプチドを用いた腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導が可能となっているが、限られた既知の腫瘍抗原ペプチドと限られたタイプのＭＨＣを有する患者しか適応できない。
【００１５】
したがって、本発明は、癌の治療に用いるための腫瘍特異的Ｔｈ１およびＴｃ１細胞を製造する新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、タイプ１培養条件で非特異的に活性化誘導した抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に、腫瘍抗原を認識する抗体遺伝子、活性化シグナル伝達分子（たとえばＣＤ３ζ鎖分子）の遺伝子および補助刺激分子（たとえばＣＤ２８分子）の遺伝子などを導入することにより、発現した抗体分子により腫瘍細胞に対する特異性を付与されたＴ細胞を製造しうることを見いだした。
【００１７】
本発明は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に癌関連抗原を認識する抗体の遺伝子を導入することにより抗原特異性を付与する工程とを含む、細胞治療用の細胞の製造方法を提供する。好ましくは、癌関連抗原は、ＷＴ１、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ＣＡ７２−４、ＳＣＣ、ＭＫ−１、ＭＵＣ−１、ｐ５３、ＨＥＲ２、Ｇ２５０、ｇｐ−１００、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＳＡＲＴ、ＭＡＲＴ、ＭＹＣＮ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＲＰ、ＬＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ１からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の好ましい態様においては、Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞の活性化に必要な補助刺激分子の遺伝子を、抗体の遺伝子に連結してＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に導入する。好ましくは、補助刺激分子は、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３４、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＲＡＮＫＬからなる群より選択される。
【００１９】
本発明の好ましい態様においては、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程は、患者の末梢血などから採取したＴ細胞を含む材料を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下で培養することにより行われる。
【００２０】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の比率を高める工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴ細胞の比率を高める工程は、抗体磁気ビーズまたはセルソーターを使用することにより行われる。
【００２１】
別の態様においては、本発明の方法は、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程をさらに含む。好ましくは、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離する工程は、抗体磁気ビーズまたはセルソーターを使用することにより行われる。
【００２２】
別の態様においては、本発明の方法は、分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を任意の割合で混合する工程をさらに含む。
【００２３】
本発明の方法により製造されるＴｈ１細胞は、腫瘍表面のＭＨＣ分子の表出に関係なく腫瘍抗原を認識して活性化することができる。さらに、この抗体レセプターを有するＴｈ１細胞は、ヘルパー活性をもつと同時に腫瘍細胞を傷害することができる。また、本発明の方法により製造されるＴｃ１細胞は腫瘍に対する強い細胞傷害活性をもち、本発明のＴｈ１細胞と同時に投与することにより相乗効果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の細胞治療用の細胞の製造方法は、非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導する工程と、そのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に癌関連抗原を認識する抗体の遺伝子を導入することにより抗原特異性を付与する工程とを含む。
【００２５】
非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞は、以下のようにして誘導することができる。ヒトの末梢血から比重遠心法等の方法により回収した単核球を、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２の存在下、好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４抗体の存在下、さらに好ましくは抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、抗ＩＬ−４抗体およびＩＦＮ−γの存在下に、培地（ＡＩＭ−Ｖ：インビトロジェン社、ヒト血清添加：ＡＢ型血清、培養細胞と同一血液型、好ましくは自己血清を０．１〜３０％、好ましくは５〜１０％）で培養する。各サイトカインの好ましい濃度は、終濃度で、ＩＬ−２については、１０〜２０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは５０〜５００ＩＵ／ｍｌであり、ＩＬ−１２については、１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ＩＵ／ｍｌであり、ＩＦＮ−γについては、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌであり、抗ＩＬ−４抗体については、０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１０μｇ／ｍｌである。このようにして、抗原非特異的に活性化したＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を誘導することができる。
【００２６】
次に、このようにして得られた非特異的な抗腫瘍活性をもつＴｈ１細胞とＴｃ１細胞に腫瘍細胞に対する抗原特異性を付与する。Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞に抗原特異性を付与するための工程は、癌関連抗原を認識する抗体の遺伝子を導入して、抗体またはその一部をそのＴｈ１細胞とＴｃ１細胞表面上で発現させることにより行う。
【００２７】
抗体遺伝子は、目的とする癌関連抗原を認識することができるモノクローナル抗体から抗体の単鎖可変部位（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子をクローニングすることにより容易に得ることができる。
【００２８】
抗体遺伝子は、種々のウイルスベクターを用いてＴ細胞に導入することができる。このようなベクターとしては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、リポソーム等が挙げられる。ベクターは、Ｔ細胞中で抗体遺伝子が発現されるような様式で配列された、プロモーター領域、開始コドン、終止コドンおよびターミネーター領域等を含む。抗体遺伝子を組み込んだウイルスベクターは、適宜パーケージングプラスミド、ヘルパープラスミド等を利用して、上述の抗原非特異的に活性化したＴ細胞に導入することができる。このようにして、腫瘍細胞に対する特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞を得ることができる。
【００２９】
本発明においては、抗体遺伝子に加えて、Ｔ細胞レセプターからのシグナルを細胞内に伝達するための活性化シグナル伝達分子をコードする遺伝子もＴ細胞に導入する。活性化シグナル伝達分子としては、例えば、ＣＤ３ζ鎖分子、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγ等が挙げられる。活性化シグナル伝達分子をコードする遺伝子は、抗体遺伝子と別々のベクター上にあってもよく、同じベクター上にあってもよい。さらに、Ｔ細胞をより強く活性化させるために、補助刺激因子をコードする遺伝子を同時にＴ細胞に導入することが好ましい。補助刺激因子としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３４、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢおよびＲＡＮＫＬが挙げられる。
【００３０】
Ｔｈ１細胞およびＴｃ１細胞が誘導されたことは、得られた細胞を蛍光標識した抗ＣＤ
４抗体と抗ＣＤ８抗体を用いてデュアルカラー染色を行い、フローサイトメーターにてＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の割合を測定することにより、または、得られた細胞をブルフェルジンＡ存在下に抗ＣＤ３抗体で刺激した後にＩＦＮ−γの産生を測定することにより、確認することができる。
【００３１】
さらに、上述のようにして得られた活性化Ｔｈ１細胞とＴｃ１細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の比率を高めてもよい。この工程は、例えば、抗体磁気ビーズまたはセルソーターを使用して、抗原特異性を有する細胞を単離することにより行うことができる。
【００３２】
また、上述のようにして得られた活性化Ｔ細胞の集団において、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とを分離してもよい。この工程は、ＣＤ４またはＣＤ８抗体を結合した磁気ビーズ、またはセルソーターを使用して、抗原特異性を有するＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞を単離することにより行うことができる。このようにして分離されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞とは、癌の治療において、最適な効果が得られるように任意の割合で混合することができる。
【００３３】
本発明の方法により得られた、抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の抗原特異性は、Ｔｈ１細胞またはＴｃ１細胞を、この抗原を発現することが知られている抗原陽性腫瘍細胞をマイトマイシンＣ処理して不活性化したものと共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量を測定することにより、測定することができる。
【００３４】
また、本発明の方法により得られた抗原特異性を付与されたＴｈ１細胞とＴｃ１細胞の細胞障害活性は、Ｔｈ１細胞またはＴｃ１細胞を、51Ｃｒ標識した抗原陽性腫瘍細胞と一定時間接触させ、放出される51Ｃｒの量を測定することにより評価することができる。
【００３５】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００３６】
抗体遺伝子を含有するウイルスベクターの作製
抗ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）抗体の単鎖可変部位（ｓｃＦｖ）遺伝子およびＣＤ２８遺伝子さらにはＣＤ３ζ鎖遺伝子からなるキメラレセプター遺伝子（ａｎｔｉ−ＣＥＡ  ｓｃＦｖ／ＣＤ２８／ＣＤ３ζ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＥＡ−ＣＩＲ）（図１）をレンチウイルスベクターＣＳＩＩに組み込み大腸菌株ＤＨ１０Ｂに導入後、増殖させたベクターをＣａＣｌ2遠心法
により精製した。
【００３７】
培養中の２９３Ｔ細胞にＣＥＡ−ＣＩＲを組み込んだレンチウイルスベクターＣＳＩＩをパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、Ｒｅｖ発現プラスミドｐＲＶＳ−Ｒｅｖ、ＶＳＶ−ＧプラスミドｐＭＤ．Ｇと共に加えてさらに培養し、フォルスコリン処理後にＣＥＡ−ＣＩＲを組み込んだレンチウイルスベクターを多量に含む培養上清を回収した。
【実施例２】
【００３８】
Ｔ細胞の非特異的活性化
あらかじめ、抗ＣＤ３抗体を培養プレートに固相化させた抗ＣＤ３抗体固相化プレートを準備しておき、末梢血から比重遠心法により回収した単核球を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−１２、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ、２μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４抗体（タイプ１サイトカイン）を加えたタイプ１培養条件で培養した。
【実施例３】
【００３９】
抗体遺伝子を導入したＴ細胞の調製
タイプ１培養条件で２日間培養した単核球に実施例１で得られた培養上清とタイプ１サイトカインを加えて培養し、さらにこの２４時間後にも実施例１で得られた培養上清とタイプ１サイトカインを加えて培養することにより、非特異的に活性化したＴ細胞にＣＥＡ−ＣＩＲ遺伝子を導入した。さらに１０日間培養して、ＣＥＡ−ＣＩＲ遺伝子を導入した活性化Ｔ細胞を増殖させた。
【００４０】
ＣＥＡ−ＣＩＲ遺伝子を導入し、タイプ１培養条件で非特異的に活性化したＴ細胞を市販のＭＡＣＳマイクロビーズＣＤ４またはＭＡＣＳマイクロビーズＣＤ８（ミルテニー・バイオテック社）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１細胞）またはＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｔｃ１細胞）をそれぞれ単離した。
【００４１】
レンチウイルスベクターに同時に組み込んでおいたＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ
Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子の発現を指標に、ＣＥＡ−ＣＩＲ遺伝子が導入されたＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞またはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞をセルソーターにより精製した（図２）。
【実施例４】
【００４２】
抗体遺伝子を導入したＴ細胞の抗腫瘍活性の評価
精製したＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞またはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞を、マイトマイシンＣ処理して不活性化したＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＨＬＣ−１、ＫＡＴＯＩＩＩ）またはＣＥＡ陰性腫瘍細胞株（ＡＺ５２１、ＳＨ−１０、Ｄａｕｄｉ）のいずれかと２４時間の共培養した後、培養上清中のＩＦＮ−γとＩＬ−２の量を測定した。図３に使用した腫瘍細胞株のＣＥＡ抗原の発現パターンを示す。
【００４３】
その結果、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株と共培養したＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞ではＩＦＮ−γとＩＬ−２の強い産生を示し、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株と共培養したＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞ではＩＦＮ−γの強い産生を示したが、ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株と共培養した場合にはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞、ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞いずれにおいてもＩＦＮ−γの産生は見られなかった。また、比較対照のＭｏｃｋ（偽）ベクターを導入したコントロールＴｈ１細胞とコントロールＴｃ１細胞においてはＣＥＡ陽性腫瘍細胞株との共培養によって、ＩＦＮ−γとＩＬ−２の産生は見られなかった（図４）。
【００４４】
ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株との共培養によるＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞のサイトカイン産生が、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞上のＣＥＡ抗原を認識して起こっていることなのか、共培養中に抗ＣＥＡモノクローナル抗体を添加してＣＥＡ−ＣＩＲとＣＥＡ抗原との結合のブロッキング反応により検討した。
【００４５】
その結果、ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞はＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＨＬＣ−１）との共培養によりＩＦＮ−γを産生し、ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株（ＡＺ５２１）との共培養によってはＩＦＮ−γを産生せず、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株との共培養により産生したＩＦＮ−γは抗ＣＥＡモノクローナル抗体の添加によって産生がブロックされたことより、サイトカイン産生がＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞に発現したＣＥＡ−ＣＩＲがＣＥＡ陽性腫瘍細胞上のＣＥＡ抗原を認識した結果であることが確認された（図５）。なお、抗ＣＥＡモノクローナル抗体とは無関係のコントロール抗体ではブロッキング反応は起こらなかった。
【００４６】
51Ｃｒ標識したＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＨＬＣ−１、ＫＡＴＯＩＩＩ）とＣＥＡ陰性腫瘍細胞株（ＡＺ５２１、Ｄａｕｄｉ）のいずれかを標的細胞として、精製したＣＥＡ−Ｃ
ＩＲ陽性Ｔｈ１細胞またはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞の細胞傷害活性を４時間の51Ｃｒリリースアッセイにて測定した。
【００４７】
その結果、ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞は、いずれにおいてもＣＥＡ陽性腫瘍細胞株には細胞傷害活性を示し、比較のために偽ベクターを導入したコントロールＴｈ１細胞とコントロールＴｃ１細胞では細胞傷害活性を示さなかった（図６上段）。
【００４８】
ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞は、ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株には細胞傷害活性を示さなかった（図６下段）。
【００４９】
ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞のＣＥＡ陽性腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性が、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞上のＣＥＡ抗原を認識して起こっていることなのか、５１Ｃｒリリースアッセイ中に抗ＣＥＡモノクローナル抗体を添加してＣＥＡ−ＣＩＲとＣＥＡ抗原との結合のブロッキング反応により検討した。
【００５０】
その結果、抗ＣＥＡモノクローナル抗体の添加で細胞傷害活性がブロックされたことより、この反応がＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞に発現したＣＥＡ−ＣＩＲがＣＥＡ陽性腫瘍細胞上のＣＥＡ抗原を認識した結果であることが確認された。なお、抗ＣＥＡモノクローナル抗体とは無関係のコントロール抗体ではブロッキング反応は起こらなかった（図７）。
【００５１】
ＲＡＧ−２（−／−）マウスにＣＥＡ陽性腫瘍細胞株（ＨＬＣ−１）と同時に精製したＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞またはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞を移入してＷｉｎｎアッセイを行い、生体内でＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞またはＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞によりＣＥＡ陽性腫瘍細胞株の拒絶か起こるか検討した。
【００５２】
その結果、ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞の単独移入とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞の単独移入では腫瘍の増大を遅らせることはできたが腫瘍の拒絶には至らなかった。ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞との同時移入では腫瘍が拒絶された。なお、比較対照の偽ベクターを導入したコントロールＴｈ１細胞とコントロールＴｃ１細胞との同時移入では拒絶されず、腫瘍細胞のみの移入と同様の腫瘍の増大が見られた（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】抗ＣＥＡ抗体の単鎖可変部位遺伝子、ＣＤ２８遺伝子、ＣＤ３ζ鎖遺伝子からなるキメラレセプター遺伝子
【図２】磁気ビーズ抗体とセルソーターによるＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞の精製
【図３】使用したＣＥＡ陽性腫瘍細胞株とＣＥＡ陰性腫瘍細胞株のＣＥＡ抗原の発現パターン
【図４】ＣＥＡ陽性腫瘍細胞株またはＣＥＡ陰性腫瘍細胞株との共培養によるＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞のサイトカイン産生能の比較
【図５】抗ＣＥＡモノクローナル抗体の添加によるＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞のサイトカイン産生のブロッキング
【図６】ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞のＣＥＡ陽性腫瘍細胞株、ＣＥＡ陰性腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性
【図７】抗ＣＥＡモノクローナル抗体の添加によるＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞の細胞傷害活性のブロッキング
【図８】ＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｈ１細胞とＣＥＡ−ＣＩＲ陽性Ｔｃ１細胞による生体内でのＣＥＡ陽性腫瘍細胞の拒絶
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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