(57)【要約】【課題】    電気泳動に付される試料に所望の処理を簡便に行なう方法を提供すること。【解決手段】  本発明の電気泳動方法では、電気泳動にかける試料に所望の処理を行なう処理剤を含み、かつ、試料が通過可能な多孔性の処理剤含有部材を、電気泳動媒体の試料添加部と接触させる。試料を前記処理剤含有部材上に添加し、前記処理剤含有部材を通過した後の試料を電気泳動媒体に接触させる。【効果】  電気泳動に付される試料に対し、アルキル化のような所望の処理を極めて簡便な操作で、かつ、少量の処理剤を用いて行なうことができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動にかける試料に所望の処理を行なう処理剤を含み、かつ、前記試料が通過可能な多孔性の処理剤含有部材を、電気泳動媒体の試料添加部と接触させ、前記試料を前記処理剤含有部材上に添加し、前記処理剤含有部材を通過した後の試料を電気泳動媒体に接触させることを含む、電気泳動方法。
【請求項２】
前記処理剤が、チオール基のアルキル化剤、標識剤、特定物質除去剤又はタンパク質分解酵素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記処理剤が、チオール基のアルキル化剤である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記アルキル化剤が、ヨードアセトアミドである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記電気泳動が、二次元電気泳動であり、前記処理は、一次元目の電気泳動の前に行なわれる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記処理剤含有部材が、処理剤を含有するろ紙又はフィルターである請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
液状の試料が、前記処理剤含有部材に直接滴下される請求項６記載の方法。
【請求項８】
液状の試料が、ろ紙又はフィルターに含浸され、含浸後のろ紙又はフィルターが前記処理剤含有部材上に載置される請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記処理剤含有部材上に導くガイド部材を用いて、液状の試料を前記処理剤含有部材上に添加する請求項７記載の方法。
【請求項１０】
底部が開口したすり鉢状のガイド部と、該すり鉢状のガイド部材の底部に配置され、前記開口を覆う前記処理剤含有部材とを具備する一体型のガイド付き処理剤含有部材を用い、液状の試料を、ガイド部の内側に添加する、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法に用いられる処理剤含有部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動方法及びそれに用いられる処理剤含有部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオーム解析において、２次元電気泳動は最も頻繁に使用されているツールである。従来の２次元電気泳動では、電気泳動中にタンパク質分子中のシステイン残基のチオール(-SH)基同士がジスルフィド結合してタンパク質分子同士が架橋されることを防止するために、１次元目の電気泳動が終了した段階で、ゲルを還元剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理し、さらにヨードアセトアミドのようなアルキル化剤で処理した後、二次元目の電気泳動が行なわれる。
【０００３】
しかしながら、この方法は、１次元目終了後にゲルをアルキル化剤で処理するため、操作が煩雑である上に、多量のアルキル化剤が必要である。この問題を解決すべく、チオール系還元剤であるジチオスレイトール(DTT)を電気泳動媒体であるゲル中に含めることが行なわれており、このような等電点電気泳動用ゲルも市販されている。しかし、DTTは、pH８〜９以上で負に帯電し、塩基性から酸性側に移動するため、塩基性側でDTT濃度が低下し、チオール基同士のジスルフィド結合による分子間架橋が起きやすくなり、これに起因する縦すじが２次元目の電気泳動で確認される。また、不規則な酸化により非特異的スポットも確認されることがある。すなわち、従来の二次元電気泳動法用ゲルを用いると、塩基性側の分離が悪くなる。なお、チオール基のアルキル化剤としてはヨードアセトアミドが好ましいので、ヨードアセトアミドをゲル中に含めておくことも考えられるが、ヨードアセトアミドをゲル中に含ませると、電気泳動中に大きな電流がゲルに流れ、ゲルが焦げてしまう。
【０００４】
DTTを含むゲルを用いた場合に塩基性側の分離が悪くなるという問題を解決すべく、チール基の保護剤をゲル中に含ませたものが提案され、市販されている。しかし、この方法でも、塩基性側の分離能は、必ずしも満足できるものではない。
【０００５】
【非特許文献１】Toda T, Morimasa T, Kobayashi S, Nomura K, Hatozaki T, Hirota M. A proteomic approach to determination of the singificance of protein oxidation in the ageing of mouse hippocampus.  Applied Genomics and Proteomics 2003, 2, 43-50
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質の分子間架橋やチオール基の非特異的酸化を簡便に防止することができる電気泳動法を提供することである。さらに、本発明の目的は、これに限定されず、電気泳動に付される試料に所望の処理を簡便に行なう方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヨードアセトアミドを含浸させたろ紙を、一次元目の電気泳動ゲルの試料添加部上に載置し、このろ紙に試料を添加し、ろ紙を通過させた試料を一次元目の電気泳動に付すことにより、極めて簡便に塩基性側の分離能を改善できることを見出した。さらに、本願発明者らは、この方法を、アルキル化剤以外の任意の所望の処理にも適用可能であることに想到し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、電気泳動にかける試料に所望の処理を行なう処理剤を含み、かつ、前記試料が通過可能な多孔性の処理剤含有部材を、電気泳動媒体の試料添加部と接触させ、前記試料を前記処理剤含有部材上に添加し、前記処理剤含有部材を通過した後の試料を電気泳動媒体に接触させることを含む、電気泳動方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法に用いられる処理剤含有部材を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、電気泳動に付される試料に対し、アルキル化のような所望の処理を極めて簡便な操作で、かつ、少量の処理剤を用いて行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記の通り、本発明の方法では、電気泳動にかける試料に所望の処理を行なう処理剤を含み、かつ、前記試料が通過可能な多孔性の処理剤含有部材を、電気泳動媒体の試料添加部と接触させる。ここで、所望の処理を行なう処理剤の例としては、チオール基のアルキル化剤（例えば、ヨードアセトアミド、アクリルアミド、4-ビニルピリジン等）、タンパク質を蛍光標識するような標識剤（例えば、フルオレッセイン、サクシンイミジルエステル、Alexa Flourサクシンイミジルエステル等）、試料から特定の物質を除去するための特定物質除去剤（例えば、特定のタンパク質に対する抗体（抗血清アルブミン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗アクチン抗体等）、及びタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、リジルエンドペプチターゼC、V8プロテアーゼ 等）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
なお、ポリペプチド中のシステイン残基のチオール基と、アルキル化剤であるヨードアセトアミドは次のように反応する。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
上記反応式から明らかなように、「アルキル化生成物」において、チオール基に結合しているものはCH2CONH2であり、エチル基の２位の炭素は、=O及び-NH2により置換されているから、正確には「置換アルキル化」であるが、このようなものもこの分野においては、「アルキル化」と呼ばれている。従って、本明細書及び特許請求の範囲において、「アルキル化剤」とは、純化学的な意味でのアルキル化剤の他に、上記のような=Oや-NH2、さらにはピリジル基等で置換されているアルキル基を付加する、この分野で「アルキル化剤」と呼ばれているものも「アルキル化剤」に包含される。
【００１４】
多孔性の処理剤含有部材を構成する多孔性材料としては、ろ紙、ガラス繊維や合成繊維フィルターのようなフィルター、多孔性の水不溶性樹脂等を例示することができる。これらのうち、ろ紙及びフィルターが簡便で好ましい。
【００１５】
処理剤含有部材の形状は何ら限定されず、円形、矩形等を例示することができる。また、処理剤含有部材のサイズも何ら限定されるものではなく、円形の場合の直径や、矩形の場合の一辺の長さは、通常、１mm〜10mm程度である。厚さは、市販のろ紙やフィルターの厚さであってよく、通常、0.1mm〜2mm程度である。
【００１６】
処理剤含有部材は、上記多孔性材料に、処理剤を含ませることにより調製することができ、通常、処理剤を含む溶液を多孔性材料に含浸させることにより簡便に調製することができる。もっとも、多孔性材料に、処理剤を共有結合等で結合させることも可能である。
【００１７】
処理剤含有部材に含有させる処理剤の量は、処理剤の種類等に応じて適宜設定され、例えばヨードアセトアミドの場合、通常、10mg〜100mg程度である。
【００１８】
処理剤含有部材は、電気泳動媒体（例えば、アガロースゲル、アクリルアミドゲル等のゲル、ろ紙、セルロースアセテート膜等の膜等）の試料添加部と接触して配置され、処理剤含有部材上に試料が添加される。これは、例えば、液状の試料を、処理剤含有部材上にスポイト等により滴下することによっても行うことができるし、液状の試料をろ紙等に含浸させ、これを処理剤含有部材上に載置することによっても行うことができる。液状の試料を添加する場合、底部が開口したすり鉢状のガイドを用い、このガイドの底部を処理剤含有部材に当て、底部開口部を介して試料が処理剤含有部材に添加されるようにしてもよい。このようにすることにより、操作性が向上すると共に、誤って無処理の試料が電気泳動媒体に添加されることを防止することができる。なお、すり鉢状のガイドに、細長いハンドルを設け、このハンドルを指でつまんでガイドを移動し、配置することもできる。
【００１９】
あるいは、図１に示すように、処理剤含有部材とガイドを一体に構成することもできる。すなわち、図１は、電気泳動媒体１０の試料添加部上に、処理剤含有部材１６とガイド１２を一体に構成したガイド付き処理剤含有部材を載置した状態を模式的に示す断面図である。すり鉢状のガイド１２の底部には、開口１４が設けられており、この開口を覆うように処理剤含有部材１６が、電気泳動媒体１０と接触して配置される。処理剤含有部材１６は、その周縁部が、ガイド１２の底部開口１４の周縁部１２ａ上に載置され、ガイド１２を持ち上げると、処理剤含有部材１６も持ち上がる。処理剤含有部材１６の周縁部をガイド底部開口１２ａの周縁部に固着し、使い捨ての器具にしてもよい。
【００２０】
操作にあたっては、ガイド１２の内側に、試料液を添加する。そうすることによって、試料は、試料液を、容易、簡便に処理剤含有部材に的確に添加することができ、未処理の試料が電気泳動媒体１０に直接添加されることを防止することができる。また、ガイド１２を指でつまんで処理剤含有部材１６を電気泳動媒体１０上の所望の位置に配置することができ、取扱いが容易である。
【００２１】
本発明の電気泳動方法は、処理剤含有部材を介して試料を電気泳動媒体に添加することを除き、従来の電気泳動方法と全く同様に行うことができる。電気泳動方法としては、特に限定されないが、二次元電気泳動が好ましく、特に等電点二次元電気泳動が好ましい。二次元電気泳動の場合には、一次元目の電気泳動に、本発明の方法を適用することが好ましい。そうすれば、一次元目の電気泳動から、処理後の試料を適用することができ、例えば処理剤がチオール基のアルキル化剤である場合には、タンパク質の分離をより明確に行うことができる。また、本発明の方法は、プロテオーム解析のように、多数のタンパク質を含む試料を分離するための電気泳動に適用された場合に、本発明の効果が大いに発揮される。
【００２２】
処理剤含有部材に添加された試料は、処理剤含有部材を通過した後、電気泳動媒体に到達する。処理剤含有部材を通過する時に、処理剤による処理を受けるので、電気泳動媒体に添加される試料は、処理剤による処理後の試料となる。
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
１．  試薬の調製
以下の組成を有する各試薬を調整した。
【００２５】
(1)  抽出バッファー
尿素                                                    0.51 g
10%(w/v)SDS                                             0.02 ml
10%(v/v) Triton X-100（商品名）                         0.20 ml
2-メルカプトエタノール(2-ME)                            0.03 ml
Pharmalyte 3-10（商品名）（担体両性電解質混合物）        0.02 ml
上記試薬を1.5 mlマイクロチューブ内で混和し、超純水（ミリＱ（商品名）水）で1mlにした。
【００２６】
(2)  膨潤バッファー
尿素                                                    14.4 g
チオ尿素                                                 6.1 g
ジチオスレイトール                                      0.08 g
0.1M酢酸/0.1%(w/v)Orange G                              1.0 ml
Pharmalyte 3-10（商品名）（担体両性電解質混合物）         0.4 ml
10%(v/v) Triton X-100（商品名）                          4.0 ml
上記試薬を10 mlビーカー内で混和し、ミリＱ（商品名）水で40 mlにした。
【００２７】
(3)  ヨードアセトアミド溶液
ヨードアセトアミド                                       0.22 g
上記試薬を1.5 mlマイクロチューブ内で混和し、ミリＱ（商品名）水で1mlにした。
【００２８】
(4)  SDS処理液
尿素                                                    14.4 g
1M Tris-HCl pH6.8                                        1.0 ml
ジチオスレイトール                                       0.20 g
10%(v/w) SDSストック                                     8.0 ml
0.1(w/v)ブロムフェノールブルー(BPB)                      1.0 ml
50%(v/v)グリセロール                                    20 ml
上記試薬を100 mlビーカー内で混和した。
【００２９】
(5)  10x濃度の陽極液
Tris                                                    242.2 g
上記試薬を1.0Lビーカー内で約700 mlのミリＱ（商品名）水に溶かし、６規定の塩酸でpH8.8に合わせ、全量を1000mlとした。
【００３０】
(6)  10x濃度の陰極液
Tris                                                     60.5 g
N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン(Tricine（商品名）
89.5 g
SDS                                                      5.0 g
上記試薬を1.0Lビーカー内でミリＱ（商品名）水に溶かし、全量を1000 mlとした。
【００３１】
(7)  固定液
メタノール                                            100 ml
酢酸                                                   10 ml
上記試薬を1.0Lビーカー内でミリＱ（商品名）水に溶かし、全量を200 mlとした。
【００３２】
2.  蛋白質の抽出
使用する細胞株(ヒト神経芽腫セルライン (SH-SY5Y))重量の４倍量の抽出バッファーを加え、ペレットミキサーにてすり潰した後に、氷冷下で超音波破砕した。（５秒間 ｘ15回）。15,000 rpm で５分間遠心し、上清を得た。ULTRAFREE UFV5BGC25 (MILLIPORE) の上部サンプル容器に、Milli-Q（商品名）水 0.5 ml を入れ、マイクロ冷却遠心機で15,000 rpm 10℃、30 分間遠心した。上部、下部両方の液を除き、上部サンプル容器にサンプルを入れた。マイクロ冷却遠心機で15,000 rpm 10℃、30分間遠心した。約0.1mlまで濃縮されたら、上部サンプル容器の濃縮液を、別のチューブに移して、次の固定化pH勾配等電点電気泳動に使用した。
【００３３】
3．固定化pH勾配等電点電気泳動
膨潤は以下２種類の方法を比較した。
(1)  ゲル１本当たり 5 ml の膨潤液を膨潤専用トレーに入れ、乾燥ストリップゲル(pH6-9)の保護フィルムを剥がし、ゲル面を上向きにして膨潤液に浸した。
(2)  ゲル１本当たり 5 ml の膨潤液((1)のDTTを添加せず、60μＬのDeStreak Reagent（商品名、市販のチオール基保護剤）を添加)を膨潤専用トレーに入れ、乾燥ストリップゲル(pH6-9)の保護フィルムを剥がし、ゲル面を上向きにして膨潤液に浸した。
【００３４】
Protean IEF Cell 2-D電気泳動レディーゲルシステム(１次元用)（商品名）に膨潤専用トレーを上蓋を開けて設置し、スタートボタンを押した。20℃で８時間以上インキュベートし、ゲルを完全に膨潤させた。膨潤されたストリップゲルを、濾紙の上に立てて、余分の液を取り除き、Protean IEF Cell 2-D電気泳動レディーゲルシステム(１次元用)（商品名）の上蓋を開けて設置した。サンプル濾紙をパラフィルム（商品名）の上に置き、サンプル（蛋白質抽出液）を20μＬしみ込ませ、ピンセットでゲルの端の陽極側に置いた。
【００３５】
(1)の膨潤液では、(1) -1.サンプル添加濾紙と、ヨードアセトアミド溶液を20μＬしみ込ませた濾紙をストリップゲル上に重ねて置く場合（実施例１）と、(1) -2.サンプル濾紙にそのままストリップゲル上に置く場合（比較例１）の２種類を実施した。(2)のDeStreak Solution（商品名）を使用して膨潤した場合は、サンプル濾紙にそのままストリップゲル上に置いた(比較例２)。泳動専用トレーの蓋をかぶせ、Protean IEF Cell 2-D電気泳動レディーゲルシステム（商品名）で下記のプログラムを実施した。
【００３６】
工程    電圧    時間
1     500 V   2 h
2     700 V   1 h
3    1000 V   1 h
4    1500 V   1 h
5    2000 V   1 h
6    2500 V   1 h
7    3000 V   1 h
8    3500 V  12 h
【００３７】
4．SDS処理
泳動終了後、ストリップゲルを取り出し、ミリQ（商品名）水中で軽くすすいでオイルを除いた後に、SDS処理液中に浸し、30分間、室温で振盪しながらインキュベートした。
【００３８】
5.ＳＤＳ電気泳動
SDS処理の終了したストリップゲルを２次元電気泳動用ゲル上に置き、サメの歯状の櫛で押えて、ゲル板とストリップゲルの間を密着させた。あらかじめ、陽極液(x1)を入れておいた泳動槽にゲル板をセットし、陰極液(x1)を満し、１枚当たり 25 mAで泳動した。
【００３９】
6.ゲルの染色
泳動の終了したゲルを40%メタノールで固定した後、SYPRO Ruby（商品名、タンパクゲル用染料）を 250ml 入れて１時間室温で振盪した。染色液を戻し、10%メタノールで30分以上脱色した。
【００４０】
７.画像の取り込み(総蛋白質)
Image Scaner FX（商品名）にて画像を取り込み、それぞれの電気泳動像を比較した。 
【００４１】
結果
電気泳動写真を図２（比較例１）、図３（比較例２）及び図４（実施例１）に示す。これらの写真からわかるように、本発明の実施例１では、特に塩基性側（各写真の右側）領域において、縦すじが少なく、スポットの分離もより明瞭であることがわかる（パソコン出願の図面ではわかりにくいかもしれないが、写真原本では明瞭にわかる）。このことから、ヨードアセトアミド溶液を含浸したろ紙を介して試料をゲルに添加することにより、チオール基同士の結合による分子間架橋が抑制されることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の方法に用いることができる、ガイド付き処理剤含有部材の模式断面図である。
【図２】従来法である比較例１の方法によりプロテオーム解析を行なった等電点二次元電気泳動写真である。
【図３】従来法である比較例２の方法によりプロテオーム解析を行なった等電点二次元電気泳動写真である。
【図４】本発明の実施例１の方法によりプロテオーム解析を行なった等電点二次元電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
2005172491.tif 000005
【図３】
2005172491.tif 000006
【図４】
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