(57)【要約】【課題】本発明は、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定化した粒子を固相基板に配置した粒子アレイの製造において、該粒子を固相基板上の任意の反応領域に精度良く供給できる製造装置及び粒子アレイの製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、生体関連物質が表面に固定された粒子を含む液体を収容する手段と、固相基板上の任意の位置に前記粒子を含む液体を吐出する手段と、を備える、粒子アレイ製造装置を提供するものである。また、本発明は、前記粒子アレイ製造装置を用いて粒子アレイを製造する方法であって、前記粒子を含む液体を前記収容する手段に保持し、前記固相基板上の任意の位置に前記液体を吐出することにより、反応領域を形成する、粒子アレイの製造方法を提供するものである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体関連物質が表面に固定された粒子を含む液体を収容する手段と、固相基板上の任意の位置に前記粒子を含む液体を吐出する手段と、を備える、粒子アレイ製造装置。
【請求項２】
前記液体を吐出する手段がインクジェット法を用いる手段である、請求項１に記載の粒子アレイ製造装置。
【請求項３】
前記収容する手段が、２以上の異なる種類の液体をそれぞれ個別に収容する手段である、請求項１又は２記載の粒子アレイ製造装置。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の粒子アレイ製造装置を用いて粒子アレイを製造する方法であって、前記粒子を含む液体を前記収容する手段に保持し、前記固相基板上の任意の位置に前記液体を吐出することにより、反応領域を形成する、粒子アレイの製造方法。
【請求項５】
単一種の生体関連物質が固定された２個以上の粒子からなる、前記反応領域を形成する、請求項４に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項６】
単一種の生体関連物質が固定された２種以上の相異なる粒子群からなる、前記反応領域を形成する、請求項４に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項７】
前記生体関連物質が表面に固定され、識別可能なシグナルを有する粒子を含む液体を、前記収容する手段に個別に保持し、固相基板上に前記液体を吐出する請求項４に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項８】
前記識別可能なシグナルが、粒子サイズ、粒子密度、粒子の着色、蛍光、磁性、及び放射線マーカーからなる群から選ばれる少なくとも1つである、請求項７に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項９】
前記生体関連物質が核酸またはタンパク質である、請求項４に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項１０】
前記粒子の粒径が、０．０２〜１０μである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項１１】
前記粒子の粒径が、０．２〜５μである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項１２】
前記固相基板がマイクロタイタープレートである、請求項４に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項１３】
前記反応領域が基板表面のウェルに形成され、粒子直径より小さいギャップを介して基板のウェル側に密着されるカバープレートを更に有する、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法。
【請求項１４】
前記固相基板およびカバープレートがガラスである請求項１３に記載の粒子アレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体関連物質を表面に固定した粒子を含むマイクロアレイの製造装置、及びその製造方法と標的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子やたんぱく質の解析技術はめざましいものがあり、特定の病気やガンに関与する機構も明らかになってきている。マイクロアレイはこれらの知識をもとに疾病の診断・体質検査等を迅速に行うために用いられている。マイクロアレイには、ＤＮＡマイクロアレイやプロテインマイクロアレイがある。
【０００３】
ＤＮＡマイクロアレイは、配列のわかっている塩基配列を持つ核酸プローブのスポットを固相基板表面に多数並べたもので、相補核酸鎖の相互作用（ハイブリダイゼーション）を利用して、標的となる核酸を捕捉し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や蛍光分子標識により核酸を検出する。核酸の検出されたスポットの核酸プローブの塩基配列は予めわかっているため、調べたい遺伝子の含まれた試料のＤＮＡの塩基配列を特定することができる。
【０００４】
プロテインマイクロアレイは、血清、尿、髄液、関節液、唾液、組織ホモジネートなどの生体サンプルや細胞培養上清、培養細胞破砕液など、タンパク質を含有する多様なサンプルの中から、プロテインマイクロアレイのスポット表面に対する親和性を利用して標的のタンパク質を捕捉するのに用いられる。
【０００５】
核酸やタンパク質からなるプローブの固定場所に関しては、平坦な固相基板上にスポット状に直接固定化する方法の報告（例えば特許文献１参照）、多種類の生体関連物質を表面に固定した粒子（ビーズ）を、マイクロタイタープレートのウェルに収容し、光ファイバーの先端に粒子を固定し識別するとともに、粒子表面での生体関連物質の反応を検出する方法の報告がある。（例えば特許文献２参照）
【特許文献１】特開２００１−１８６８８０、段落番号００１２、００１３
【特許文献２】特表２００２−５３３７２７、段落番号０００９、００１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸やタンパク質からなるプローブを粒子（ビーズ）表面に固定化して使用する方法は、平坦な基板上にスポットとして直接プローブを固定化して使用する方法と比較して、プローブの存在する固体表面積を大きくすることができて感度が高い、隣接スポット間での相互汚染のリスクが少ない、乾燥による生体関連物質の失活が起こりにくい、固相表面の処理を固定する生体関連物質の種類に応じて変えることができる、などの利点がある。しかしながら、少量の粒子をマイクロタイタープレートのウェルのような反応領域に、単一種あるいは任意の混合比からなる複数種を適時選択しながら、正確に反応領域に配置することは難しかった。
【０００７】
即ち、本発明の目的は、核酸やタンパク質からなるプローブを表面に固定化した粒子を固相基板に配置した粒子アレイの製造において、該粒子を固相基板上の任意の反応領域に精度良く供給できる製造装置及び粒子アレイの製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は、[１]生体関連物質が表面に固定された粒子を含む液体を収容する手段と、固相基板上の任意の位置に前記粒子を含む液体を吐出する手段と、を備える、粒子アレイ製造装置；[２]前記液体を吐出する手段がインクジェット法を用いる手段である、[１]に記載の粒子アレイ製造装置；[３]前記収容する手段が、２以上の異なる種類の液体をそれぞれ個別に収容する手段である、[１]又は[２]に記載の粒子アレイ製造装置；[４]前記[１]〜[３]の何れかに記載の粒子アレイ製造装置を用いて粒子アレイを製造する方法であって、前記粒子を含む液体を前記収容する手段に保持し、前記固相基板上の任意の位置に前記液体を吐出することにより、反応領域を形成する、粒子アレイの製造方法；[５]単一種の生体関連物質が固定された２個以上の粒子からなる、前記反応領域を形成する、[４]に記載の粒子アレイの製造方法；[６]単一種の生体関連物質が固定された２種以上の相異なる粒子群からなる、前記反応領域を形成する、[４]に記載の粒子アレイの製造方法；[７]前記生体関連物質が表面に固定され、識別可能なシグナルを有する粒子を含む液体を、前記収容する手段に個別に保持し、固相基板上に前記液体を吐出する[４]に記載の粒子アレイの製造方法；[８]前記識別可能なシグナルが、粒子サイズ、粒子密度、粒子の着色、蛍光、磁性、及び放射線マーカーからなる群から選ばれる少なくとも1つである、[７]に記載の粒子アレイの製造方法；[９]前記生体関連物質が核酸またはタンパク質である、[４]に記載の粒子アレイの製造方法；[１０]前記粒子の粒径が、０．０２〜１０μである、[４]〜[６]のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法；[１１]前記粒子の粒径が、０．２〜５μである、[４]〜[６]のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法；[１２]前記固相基板がマイクロタイタープレートである、[４]に記載の粒子アレイの製造方法；[１３]前記反応領域が基板表面のウェルに形成され、粒子直径より小さいギャップを介して基板のウェル側に密着されるカバープレートを更に有する、[４]〜[１２]のいずれか１項に記載の粒子アレイの製造方法；[１４]前記固相基板およびカバープレートがガラスである[１３]に記載の粒子アレイの製造方法
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において用いる「生体関連物質」とは、核酸、タンパク質いずれでもよく限定されない。核酸はそれぞれ一部または全部が修飾（置換を含む）されていてもよく、且つ更にそれぞれ１本鎖または２本鎖である、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、好ましくはそれぞれ一部または全部が修飾（置換を含む）されていてもよい１本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。当該核酸における好適な例をあげると、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ(ペプチド核酸)、ＣＮＡ（アミノシクロヘキシルエタン酸核酸）、ＨＮＡ（ヘキシトール核酸）、ｐ−ＲＮＡ（ピラノシルＲＮＡ）、前記核酸からなるポリヌクレオチド、等から選ばれる核酸である。たんぱく質は、少なくとも２個のアミノ酸が共有結合したものを意味し、タンパク質類、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。タンパク質は天然に存在するアミノ酸とペプチド結合から、あるいは合成ペプチド擬似構造からできていてもよい。
【００１０】
前記核酸、タンパク質は、蛍光標識することにより、蛍光強度の変化によって標的物質を検出、定量することができる。蛍光標識用の蛍光分子の好適例をあげると、FITC（Fluorescein  isothiocyanate）、RITC（Rhodamine  isothiocyanate）、TMRITC（Tetramethyl   Rhodamine  isothiocyanate）、Cy3（Carboxymethyl  indocyanin）、PE（Phycoerythrin）等の蛍光分子がある。
【００１１】
本発明において用いる「粒子」の材質としては、プラスチック、セラミック、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ガラス、シリカ、ラテックス、磁性ビーズ等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明における粒子の粒径は、好適には０．０２〜１０μｍが使用可能であり、より好適には０．２〜５μｍが用いられる。「粒子」は、球状でなくても良く、表面積を増加させるために多孔質であっても良い。粒径に分布があっても良いが、前記数値範囲に含まれるのが好ましい。
【００１２】
前記「粒子」の表面には、プローブとしての前記「生体関連物質」が固定化される。生体関連物質は、粒子上で直接合成しても良いし、あるいは合成後に粒子に付着させても良い。粒子表面は、予め化学修飾されていても良く、表面化学基の例として、限定されるものではないが、脂肪族及び芳香族アミンを包含するアミノ酸、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネート、サルフェート等があげられる。
【００１３】
固定化の為の加熱の方法としては、ヒータ、レーザー光、赤外線、電磁波等を用いることができる。固定化の反応温度は、通常０〜４０℃付近であり、好適には２０〜３５℃付近である。反応時間も特に限定されないが、通常、３０分から２４時間で十分であり、好適には１時間〜１２時間である。
【００１４】
本発明において用いる「識別方法」は、粒子表面に固定された核酸、タンパク質からなるプローブを判別するために、個々の粒子に持たせることができる。「識別方法」としては、粒子サイズ、粒子密度、粒子の着色、蛍光、磁性、及び放射線マーカー等を用いることができ、それぞれを組み合わせて用いることも可能である。好適には、蛍光シグナルが用いられる。
【００１５】
本発明において用いる「固相基板」は、「粒子」表面の「生体関連物質」の働きを妨げない限りにおいて、限定されずどんな基板でもよい。例えば、ガラス基板、シリコン基板、金属基板（例えば金、銀、銅、アルミニユウム、白金等）、金属酸化物基板（例えばＳｒＴｉＯ３、ＬａＡｌＯ３、ＮｄＧａＯ３、ＺｒＯ２、酸化ケイ素等）、樹脂基板（例えばポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート）、等から選ばれる材料である。「固相基板」の表面は、平坦でもよいが、反応領域として粒子が供給されるウェル（凹部）がエッチングや成型で多数形成されたものを用いるのが好ましい。その中で、ガラス基板は入手の容易さ、コストの点で好ましく用いることができる。また、樹脂基板の好適な具体例としては、市販のマイクロタイタープレートを用いることができる。
【００１６】
当該「固相基板」の材料、種類及びそれらの厚さの選択は、核酸やタンパク質プローブの種類、検出のために採用するシグナル検出手段等に依存して、当業者が最適な条件を選択することが可能である。
【００１７】
本発明にかかる、「任意の位置に粒子含む液体を吐出する手段」としては、色々な方法を採用することができる。好適な例として、吐出する手段を備えた吐出ヘッドを、Ｘ軸方向に移動可能なキャリッジに搭載し、固相基板をＸ軸と直交するＹ軸に移動可能なテーブルに乗せ、キャリッジとテーブルの移動により、目標とする座標に吐出ヘッドを移動する方法をあげることができる。この方法は、数値制御が行いやすく、正確に吐出ヘッドをコントロールすることができる。また、装置全体の構造も簡単でコンパクトに構成できる。
【００１８】
本発明にかかる、「液体を吐出する手段」としては、少量の液体を精度良く供給することが可能なインクジェット法を用いることができる。インクジェット法には、液体を吐出する方法として、ピエゾ素子を用いたピエゾジェット法、サーマル素子を用いたサーマルジェット法、振動板と電極間の静電力を利用した静電アクチュエータ法がある。いずれの方法を用いても良いが、好適には、温度に敏感な生体関連物質を扱うには、吐出される液体に高温がかからないピエゾジェット法、静電アクチュエータ法を用いることができる。
【００１９】
本発明にかかる、「液体を収容する手段」は、２以上の異なる種類の液体を個別に収容し、液体はそれぞれ個別の吐出する手段で吐出される。液体を収容する手段と吐出する手段は、別々に離して備えても良いが、好適な例として、吐出ヘッドに、液体を収容する手段と吐出する手段を一体化して設ける方法がある。一体化することにより、吐出ヘッドを簡単な構造で構成することができ、収容する手段から吐出する手段への経路も短くすることができるため、消費する液体を少なくすることができる。また、吐出ヘッドを着脱することにより、吐出する液体の変更が可能になる。
「粒子」を含む液体としては、一種類の生体関連物質を固定した粒子を含む液体を複数用いるのが、粒子混合時の制御の行いやすさから好ましい。種類の異なる液体は、それぞれお互いに混ざらないように個別に収容手段に収容され、個別に制御されながら吐出される。吐出制御を個別に行うことにより、単一種で反応領域を形成することや、種類の異なる液体を単一の反応領域内で任意の割合で混合し、２個以上の相異なる種類の粒子群からなる反応領域を形成することが可能である。
【００２０】
液体の溶媒としては、水、各種リン酸緩衝液、ＴＥ緩衝液等、塩化ナトリウムを含む緩衝液、ポリマーを含む水溶液を用いることができる。また、添加物により、インクジェット法に適した粘度、表面張力に調整することが好ましい。粘度は、２０cp以下、表面張力は２０〜４０ｄｙｎ/ｃｍが好ましい。さらに、プローブであるタンパク質を希釈した液体は、予め脱気操作を通して液体中の溶存気体を取り除いたものを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明において、粒子を含む液体の基板上への供給位置は、平板上に供給してスポットを形成することも可能であるが、粒子アレイの性能を引き出すには、固相基板上のウェルに粒子を含む溶液を供給する方法が好ましい。粒子の供給された前記ウェル上からカバーをして、各ウェルが微小な反応チャンバーとして使用することができる。このような構成にすることにより、粒子がウェル内で自由に分析用液体中で動けるようになり、反応面積、反応効率が向上する。
【００２２】
前記構成の組み立て方法として、以下に好適な例をあげる。固相基板上のウェルの形成された面外周にギャップ形成とカバー接着のための樹脂皮膜等を形成する。樹脂皮膜等の厚さは粒子の直径よりも小さくする。次に、カバープレートを樹脂皮膜等に密着させて蓋をすれば、各ウェルが粒子の直径より小さなギャップを介してつながった、反応チャンバーを形成することが可能である。粒子は、ギャップが狭いので隣接するウェルに移動することはない。また、カバープレートに、対象試料や反応試薬等を供給するための供給口とそれらを排出する排出口を形成すれば、シリンジや自動化されたアッセイ装置を使って送液し、反応試験を行うことができる。カバーはどんなものであっても良いが、標的物質の検出に光を用いる場合、ガラスが好ましい。反応試験後、標的物質の検出を行って標的物質の有無や定量を行う。
【００２３】
本発明にかかる、「標的物質の検出方法」は、さまざまな方法を用いることができるが、好適な例として、蛍光標識された分子の量を検出する方法、酵素反応による色素を検出する方法をあげることができる。
【００２４】
本願明細書において用いる語句の意義、並びに本発明の詳細な説明は以上の通りであるが、本発明への理解を更に容易にすべく、本発明の特徴を以下に記す。
【００２５】
まず、本発明の第1の特徴は、インクジェット法を用いて、生体関連物質を表面に固定した粒子を含む複数種の液体を個別に収容して、任意の位置に吐出することのできる製造装置にある。
【００２６】
本発明の第2の特徴は、粒子を含む液体を個別に収容し、固相基板上の任意の位置に前記粒子を含む液体を吐出し、反応領域を形成する、粒子アレイの製造方法にある。単一種、または複数種の少量の液体を、任意の反応領域に供給することが可能となった。
【００２７】
本発明の第３の特徴は、反応領域が基板表面のウェルに形成され、粒子直径より小さいギャップを介して、カバープレートが基板のウェル側に密着される粒子アレイの製造方法である。この方法で作製された粒子アレイは単一の反応チャンバー内に、複数の反応領域が形成されているため、多数の生体関連物質と対象試料との反応を同時に行うことができる。
【００２８】
本発明においてはインクジェット法を用いることが好ましく、該インクジェット法を用いた場合には、少量の粒子で高密度のアレイが形成できる。そのため反応に必要な試料や試薬の量を削減できる。また、基板上にスポットを形成するマイクロアレイと比較して、固体表面積が大きいので感度が高い。さらに、プローブ試料を予め粒子表面に固定することができるので、多種の試料に対応するとともに、乾燥により生体関連物質の活性が損なわれることがなく、隣接する反応領域間での相互汚染が起こらない。
【００２９】
単一種の粒子群を各反応領域に配置した場合には、その面内の配置から粒子の種類を識別できるため、粒子の識別手段を必要としない。また、複数種の粒子群を混合した、領域ごとに粒子群を識別する場合には、反応領域数（ウェル数）×識別粒子種類の多数の反応を一括して行うことができる。
【００３０】
以下に示す本発明の実施例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００３１】
図１は、本実施例で用いたマイクロアレイ製造装置の概要を示す斜視図である。マイクロアレイ製造装置１０は、基台１１上に、Ｘ軸上に往復移動するカートリッジホルダー（キャリッジ）１２と、Ｘ軸に直交するＹ軸方向に往復移動するテーブル１３と、カートリッジホルダー１２のホームポジション（テーブル１３の可動領域以外の領域における格納位置）に吐出液充填用の吸引ユニット１４と、キャリッジ及びテーブル駆動部１５を備えている。駆動部１５で、タイミングベルト機構やボールネジ機構等を用いて、カートリッジホルダー１２及びテーブル１３を数値制御方式等で移動し、マイクロアレイ基板１６への吐出液供給位置を決めることができる。カートリッジホルダーには吐出ヘッド（図示せず）が搭載されている。
【００３２】
本実施例では、静電アクチュエータを用いた吐出ヘッドを用いた。図２、図３に吐出ヘッド基板とその断面図を示す。吐出ヘッド２０は、吐出手段２１と収容部２２が一体となって形成されている。吐出手段は振動板２３を壁に持つ加圧室と吐出口から形成される。各収容部には、種類の異なるプローブ試料を表面に固定した粒子を含む液体が収容される。吐出手段と収容部は経路２４で連結されており、振動板の駆動により、加圧室から液体が吐出され、次の駆動で収容部から液体が供給される。
【００３３】
以下に示す粒子を含む液体を、ガラス基板３０上の図４に示す配置のエッチングによって形成された１２０個のウェル３１に、吐出ヘッドが搭載されたキャリッジを連動させて、供給した。吐出は、駆動周波数１６ｋＨｚ、１滴あたり２０ｐｌの条件で行い、１つのウェルに単一種の液体の供給と同一ウェルに異なる種類の液体を供給し、異なる粒子の混合も行った。その結果、１つのウェルには、500〜1000個の粒子が供給された。
（粒子を含む液体）
４μの直径のポリスチレンからなる球形ビーズに抗体タンパク質を固定化したものを数種類用意した。粒子はリン酸緩衝液に分散して粒子を含む液体（懸濁液）とした。
【００３４】
インクジェット法による粒子の供給後、図５に示すようにカバーガラス３２を、ギャップ３４を介してエポキシ樹脂の接着剤３３を３μの厚さで、ウェル側に貼り付けた。
【００３５】
カバーガラスには、対象試料、反応試薬等の流入口３５、流出口３６が空けられており、流入口３５から供給された、これらの液体は、ウェル３１に保持された粒子と反応を行った後、流出口３６から排出される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の粒子アレイ製造装置の概略斜視図
【図２】吐出ヘッドの平面図
【図３】吐出ヘッドの断面図
【図４】マイクロアレイ基板断面図
【図５】マイクロアレイ基板平面図
【符号の説明】
【００３７】
１０：粒子アレイ製造装置
１１：基体
１２：キャリッジ
１３：テーブル
１４：吸引ユニット
１５：キャリッジ及びテーブル駆動部
１６：マイクロアレイ基板
２０：吐出ヘッド
２１：吐出手段
２２：収容部
２３：振動板
２４：経路
３０：ガラス基板
３１：ウェル
３２：カバーガラス
３３：エポキシ接着剤
３４：ギャップ
３５：流入口
３６：流出口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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