(57)【要約】  【課題】  サンプル水溶液を微小な反応領域に送り込むための新規技術、並びに、物質の高次構造調整、移動、固定化、不要物質の除去等を自在に行うことができる検出部等を提供すること。  【解決手段】  物質間の相互作用の場を提供する反応領域２と、該反応領域２中に収容された水溶液やゲルなどの媒質に対して電界印加可能に対向配置された少なくとも一対の対向電極Ｅ１，Ｅ２と、前記反応領域２へ前記物質を含む媒質を毛細管現象によって送り込むための吸入孔３及び外気連通孔４と、が設けられている物質間の相互作用検出部を提供し、ＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板等に用いる。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域中に収容された媒質に対して電界印加可能に対向配置された少なくとも一対の対向電極と、前記反応領域へ前記物質を含む媒質を毛細管現象によって送り込むための吸入孔及び外気連通孔と、
が設けられている物質間の相互作用検出部。
【請求項２】
前記対向電極の前記反応領域側表面は、絶縁膜で覆われていることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項３】
前記吸入孔の上方開口部の周辺表面領域が疎水性であることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項４】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の表面を、検出用物質を固定化表面としたことを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項５】
前記第１電極は透明な導電体から形成されていることを特徴とする請求項４記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項６】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の面積が、対向する他方の第２電極の面積よりも狭小に形成されていることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項７】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の前記反応領域に臨む部分の面積が、対向する他方の第２電極の面積よりも狭小であることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項８】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の表面が、粗面状又は凹凸状であることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項９】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の表面に導電性の微粒子が分散されていることを特徴とする請求項１記載の物質間の相互作用検出部。
【請求項１０】
請求項１記載の相互作用検出部が設けられたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
【請求項１１】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域中に収容された媒質に対して電界印加可能に対向配置された少なくとも一対の対向電極と、前記反応領域へ前記物質を含む媒質を毛細管現象によって送り込むための吸入孔及び外気連通孔と、が設けられている物質間の相互作用検出部を用いる方法であって、
所定の検出用物質を前記水溶液に含有させて前記反応領域中に送り込み、前記対向電極間に電界を印加しながら電極表面に前記検出用物質を固定化することを特徴とする検出用物質の固定化方法。
【請求項１２】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域中に収容された媒質に対して電界印加可能に対向配置された少なくとも一対の対向電極と、前記反応領域へ前記物質を含む媒質を毛細管現象によって送り込むための吸入孔及び外気連通孔と、が設けられている物質間の相互作用検出部を用いる方法であって、
標的物質を前記水溶液に含有させて前記反応領域中に送り込む第１手順と、前記対向電極間に電界を印加しながら、検出用物質が固定化された電極表面に対して前記標的物質を移動させる第２手順と、検出用物質と標的物質との間の相互作用を進行させる第３手順と、を含む物質間の相互作用促進方法。
【請求項１３】
前記第３手順では電界オフとすることを特徴とする請求項１１記載の物質間の相互作用促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毛細管現象を利用して、サンプル水溶液を所定の反応領域に送り込むための技術に関し、加えて、物質が相互作用する前記反応領域に対向電極を配置して所定の電界を印加することによって、前記物質の高次構造調整、移動、固定化、不要物質の除去等を行うための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明に関する主たる背景技術を説明する。まず、第一の背景技術（従来技術）は、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板に関する技術である（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。このＤＮＡチップ技術は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。このためＤＮＡチップは、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。ＤＮＡチップ以外にも、基板上にタンパク質を固定したプロテインチップや種々の物質間の相互作用を解析するためのバイオセンサーチップなども開発されている。
【０００３】
第二の背景技術は、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術である。具体的には、ヌクレオチド鎖（核酸分子）は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られており、その原理は、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は電気力線が集中する部位に向かって移動する（非特許文献１参照）。また、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、この「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定されることが知られている（非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開平４−５０５７６３号公報。
【特許文献２】特表平１０−５０３８４１号公報。
【非特許文献１】Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。
【非特許文献２】鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記したＤＮＡチップ技術は、液相中での物質間の相互作用の場を提供する反応領域を基板に予め設定しておき、この反応領域中にプローブＤＮＡ等の検出用ヌクレオチド鎖を固定しておくことによって、この検出用ヌクレオチド鎖と相補的な標的ヌクレオチド鎖との間の相互作用であるハイブリダイゼーションを解析する技術である。
【０００５】
しかし、微小な容積の前記反応領域に対して、所定微容量のサンプル水溶液を的確に投入する技術については改善の余地があった。特に、サンプル水溶液の蒸発の抑制やコンタミネーション防止等の目的から、今後、前記反応領域をより閉塞された空間に形成する工夫が試みられていくものと予想されるが、この場合においては、普及したノズル滴下方式（スポッテイング方式）をそのまま用いて、サンプル水溶液を反応領域へ送り込むのは困難であるという技術的課題が生じる。
【０００６】
次に、従来のＤＮＡチップでは、ハイブリダイゼーションの効率が悪いため、同反応に長時間を要する点や、擬陽性や偽陰性の発生するため検出精度が低いなどの問題があった。これらの問題の主要因は、相互作用を示す対象物質の高次構造に起因する立体障害、物質と周辺表面との干渉（例えば、付着や接触）、検出用励起光の照射ターゲットとなる検出部位における検出精度低下の要因となり得る物質の存在、などを挙げることができる。
【０００７】
そこで、本発明は、サンプル水溶液を微小な反応領域に送り込むための新規技術の提供と、物質の高次構造調整、移動、固定化、不要物質の除去等を自在に行うことができる検出部、該検出部を用いる方法及びバイオアッセイ用基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一に、本発明では、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域中に収容された、例えば、バッファー水溶液やゲルなどの媒質に対して電界印加可能に対向配置された少なくとも一対の対向電極と、前記反応領域へ前記物質を含む水溶液やゲルなどの媒質を毛細管現象によって送り込むための吸入孔及び外気連通孔と、が設けられている物質間の相互作用検出部と該検出部が設けられたＤＮＡチップを含むバイオアッセイ用基板を提供する。当該発明では、吸入孔に滴下された所定微容量の前記水溶液を反応領域に向けて確実に送液することができる。
【０００９】
そして、該反応領域中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止するために、対向電極の応領域側の表面を絶縁膜で覆うように工夫する。絶縁層は、例えば、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＳｉＣ、ＴｉＯ２などの材料によって形成することができる。
【００１０】
また、前記吸入孔の上方開口部の周辺表面領域を疎水性としておくことによって、該周辺表面領域に（滴下されて）液滴状態で存在する親水性の媒質を、親水性である反応領域中にスムーズに送液することができるようになる。
【００１１】
前記対向電極を構成する一方の第１電極の表面を、検出用物質を固定化表面として用いることができる。この場合、第１電極の表面は、アビジン−ビオチン結合又はジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）を介した結合などの所望する固定化反応に適した所定の表面処理を施しておく。このような構成では、当該電極は、検出用の励起光を透過できる電極となるので、当該電極の裏面側からも励起光照射が可能となる。
【００１２】
検出部に配置された前記対向電極を構成する一方の第１電極の面積を、対向する他方の第２電極の面積よりも狭小に形成したり、前記第１電極の前記反応領域に臨む部分の面積を、対向する他方の第２電極の面積よりも狭小になる構成を採用したり、あるいは、第１電極の表面を粗面状又は凹凸状に形成したり、第１電極の表面に導電性の微粒子が分散された構成を採用したりすることによって、対向電極間に形成される電気力線が集中し易い凸部位を第１電極の表面に形成できる。この結果、第１電極表面近傍に不均一電界を形成できる。
【００１３】
次に、本発明では、上記検出部を用いて、所定の検出用物質を前記水溶液に含有させて前記反応領域中に送り込み、前記対向電極間に電界を印加しながら電極表面に前記検出用物質を固定化するように工夫した検出用物質の固定化方法を提供する。
【００１４】
この方法では、ＤＮＡプローブ等の検出用物質を電界に沿って、伸長させながら移動させ、所定の電極表面に対して整列固定化することが可能となる。
【００１５】
並びに、本発明では、標的物質を前記水溶液に含有させて前記反応領域中に送り込む第１手順と、前記対向電極間に電界を印加しながら、検出用物質が固定化された電極表面に対して前記標的物質を移動させる第２手順と、検出用物質と標的物質との間の相互作用を進行させる第３手順と、を含む物質間の相互作用促進方法を提供する。
【００１６】
この方法によれば、固定化されている検出用物質と特異的に作用する一本鎖ＤＮＡなどの標的物質を、電界の作用で伸長させながら前記検出用物質が固定化されている電極表面領域に集めることができるので、相互作用の効率を高めることができる。
【００１７】
印加する前記電界は、ＤＮＡ等の核酸を伸長させながら電界の強い特定の場所へ移動させることができることから交流電界が適している。また、前記第３手順においては、電界オフとすることによって、自然な物質の自然なブラウン運動に委ねたハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させることができる。
【００１８】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。まず、本発明において用いられる「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーションを含む。
【００１９】
次に、「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を意味する。
【００２０】
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００２１】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味し、本発明では、しばしば「ミスハイブリ」と略称する。
【００２２】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどの媒質を貯留又は保持できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。一例を挙げれば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。
【００２３】
「検出用物質」とは、前記反応領域中に予め添加等されて、該反応領域中に遊離して存在する物質、あるいは該反応領域の所定表面部位に固定化されて存在する物質であって、当該物質と特異的な相互作用を示す物質を捕捉して検出するための物質であり、ＤＮＡプローブ等の検出用の核酸を含む。
【００２４】
「標的物質」とは、前記検出用物質との間での相互作用の標的とされる物質を意味し、例えば、ＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を有する核酸を含む。
【００２５】
「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、媒質手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本願では、ハイブリダイゼーション）が起こりにくくなる現象を意味する。
【００２６】
「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００２７】
「バイオアッセイ用基板」は、生物化学的、あるいは分子生物的な分析や解析を目的に使用される情報集積基板を意味し、いわゆるＤＮＡチップを含む。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、相互作用を検出する部位が単純な構成又は構造であるので、製造が容易である。所定量のサンプル水溶液を検出部の反応領域に確実に送り込むことができるので、サンプル水溶液のロスがない。また、サンプル水溶液を微細な孔から毛細管現象を利用して反応領域に送り込むので、反応領域の開口面積を小さくできるので、前記水溶液の蒸発を抑えることができる。
【００２９】
電界、特に交流電界の作用で電極表面に検出用物質や標的物質を集めることができる結果、物質濃度が高まるので両物質間の相互作用の効率を高めることができる。電界印加の作用により、ＤＮＡプローブなどの検出用の核酸や標的となる核酸の高次構造をランダムコイル状から伸長状態に調製できるため、相互作用の際の立体障害を回避できる。この結果、相互作用の効率と精度が高めることができるため、作業時間を短縮でき、かつ偽陽性や偽陰性の発生を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。まず、図１は、本発明に係る物質間の相互作用検出部（以下、「検出部」と略称。）の基本構成の概念を簡略に示す上方視平面図及び上図Ｉ−Ｉ線矢視断面図である。図２は、図１の断面図に示されたＩＩ−ＩＩ線位置で、上方から見た平面図である。
【００３１】
図１中の符号１ａは、検出部の好適な一実施形態の要部の構成を示している。この検出部１ａは、例えば、ガラスや合成樹脂等で形成される基板などの上に形成されており、物質間の相互作用を検出するために工夫された部位である。この検出部１ａのサイズは、例えば、幅縦１００μｍ×横１００μｍ×高さ（深さ）５μｍ程度のものであり、前記高さ（深さ）は、使用するプローブＤＮＡ等の検出用物質の分子長に応じて適宜決定すればよい（検出部の他実施形態でも同様）。
【００３２】
この検出部１ａや後述する他の検出部１ｂ等には、まず、物質間の相互作用の場となる水溶液を貯留できる反応領域２と、この反応領域２と外気とを連通する１０μｍ×２０μｍ程度のサイズの孔３、４（後述）と、反応領域２を上下でサンドイッチするように配置された一対の対向電極Ｅ１，Ｅ２と、が設けられている（図１の断面図参照）。
【００３３】
対向電極Ｅ１，Ｅ２の少なくとも一方の電極（例えば、電極Ｅ１）、あるいは両電極Ｅ１，Ｅ２を、例えばＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）のような透明な導電体で形成することもできる。この透明な導電体で電極を形成すれば、検出用の励起光を透過する電極となるので、光学的手段で反応領域２中の相互作用を発光強度測定に基づいて検出する場合に好適である。
【００３４】
対向電極Ｅ１，Ｅ２の反応領域２を臨む側の各表面は、それぞれ絶縁層５ａ，５ｂで覆われており（図１の断面図参照）、反応領域２中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止する役割を果たす。なお、この絶縁層５ａ，５ｂは、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＳｉＣ、ＴｉＯ２など材料によって形成できる。また、図示された対向電極Ｅ１の下側層は、合成樹脂などで形成された基板６ａであり、同様に図示された対向電極Ｅ２の上側層は、合成樹脂などで形成された基板６ｂである（図１の断面図参照）。従って、電極Ｅ１は絶縁層５ａと基板６ａによって挟持されており、一方の電極Ｅ２は、絶縁層５ａと基板６ａによって挟持された構成を備えている。
【００３５】
図１などに示された符号７は、ＳｉＯ２などの無機物やポリイミドなどの合成樹脂などで形成したスペーサである。即ち、このスペーサ７の厚みが、反応領域２の高さ（深さ）を規定し（図１参照）、スペーサ７の形状が反応領域２の形状や容量を規定している（図２参照）。なお、図３に示す変形形態である検出部１ｂのように、孔３、４の符号３１、４１で示す各壁面と面一となる形状サイズのスペーサ７１を採用して、図３に示されたような形態の反応領域２１を形成することができる。
【００３６】
続いて、図４は、検出部１ａの反応領域２に対して、検出用物質の代表例であるＤＮＡプローブＤ１を投入したときの様子を模式的に示すＩ-Ｉ線矢視断面図である。この場合では、スイッチＳはオフとされ、電源Ｖによる電極Ｅ１，Ｅ２への印加はなされていない状態である（図３参照）。
【００３７】
ＤＮＡプローブＤ１を含む水溶液Ｌは、符号Ｎで示すノズルから吸入孔３に対して滴下された後、毛細管現象によって反応領域２へ送り込まれる。このとき符号４で示された孔は、前記毛細管現象を作用させるための外気連通孔として機能する。なお、滴下されたＤＮＡプローブＤ１は、ランダムコイル状の高次構造を有している。
【００３８】
続いて、図５は、検出用物質Ｄの代表例であるＤＮＡプローブＤ１が電極Ｅ１の表面部位に整列固定された状態を模式的に示す図であって、図１中のＩＩＩ−ＩＩＩ線矢視断面図である。
【００３９】
この図５では、ＤＮＡプローブＤ１を含む水溶液Ｌが反応領域２中に送られてきた直後に（図４参照）、スイッチＳをオンとして電源Ｖにより対向電極Ｅ１，Ｅ２へ、高周波交流電界（図３中の符号Ｐ）を印加したことによって、前記ＤＮＡプローブＤ１が電気力線に沿って伸長しながら電極Ｅ１の表面に整列固定された状態を示している。なお、この場合の電界は、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚが好適である（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。固定化された状態のＤＮＡプローブは、図５中に符号Ｄ２で示されており、符号Ｔは、伸長固定化されたＤＮＡプローブＤ２と相補的な塩基配列を備える標的ＤＮＡを示している。
【００４０】
電極Ｅ１の表面を、ストレプトアビジンによって表面処理した場合には、ビオチン化されたＤＮＡプローブの末端の固定に適している。あるいは、電極Ｅ１の表面を、チオール（ＳＨ）基によって表面処理した場合には、チオール基が末端に修飾されたＤＮＡプローブをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。なお、上方側の電極Ｅ２を固定化用電極として利用してもよい。
【００４１】
ここで、図６に示す検出部１ｃのように、固定化用の電極Ｅ１の面積を対向する電極Ｅ２の面積よりも狭小に設計することによって、電界Ｐを該電極Ｅ１１により集中させて、該電極Ｅ１１表面に不均一電界を形成するように工夫してもよい。これにより、誘電泳動の効果を高めることができる。
【００４２】
また、図７に示す検出部１ｄでは、スペーサ７２の反応領域２２に臨む端面７２１を斜めに形成することによって、電極Ｅ１の反応領域２２に臨む部分（符号Ｅ１２参照）の面積を狭小にすることによって、前記同様の誘電泳動の効果を高めることができる。
【００４３】
図８に示す検出部１ｅは、反応領域２等をサンドイッチするように、電極が上下に対向配置された検出部１ａ〜１ｄとは異なって、反応領域２の底面に、電界印加可能な一対の電極Ｅ１，Ｅ２が、互いのエッジ部分を対向するように配置された実施形態を示している。この実施形態では、上側の基板６ｂには電極が設けられていないので、その構成は簡略になる。この検出部１ｅにおいても、図６と同様に電気泳動の効果を高めることを目的として、いずれか一方の電極を対向する他方の電極よりも狭小に形成してもよい。なお、検出部１ｅに関する他の符号部分の説明は、既述した実施形態と同様であるので割愛する。
【００４４】
ここで、図９〜図１１に示すように、本発明では、固定化用の電極Ｅ１の表面を、電界（電気力線）が集中し易い形状に加工しておくことも可能である。具体的には、図８に示すように、電極Ｅ１の凹凸パターンを形成しておくと、その凹凸部位に電界が集中する。このような凹凸パターン形成方法は、まず、下部基板６ａにフォトリソグラフィーにより、例えばＩＴＯで任意形状の電極パターンを作製し、その上に、再度ＩＴＯを成膜した後、ＳｉＯ２などで絶縁層５ａを成膜することで、図９のような凹凸パターンからなる電極Ｅ１を形成することができる。
【００４５】
また、図１０のように、ＩＴＯなどから形成された電極Ｅ１の表面に対して、絶縁層５ａを形成する前に、導電性の微粒子８を分散させておくことによって、凹凸パターンを形成することもできる。なお、微粒子８としては、金属、導電性ポリマー、ＳｉＯ２などの無機物などからなる微粒子を採用できる。
【００４６】
さらに、図１１のように、ＩＴＯなどから形成された電極Ｅ１の表面に対して、ＳｉＯ２などで絶縁層５ａを形成する場合において、この絶縁層５ａの表面粗さを成膜条件によりコントロールし、表面粗さが大きな膜を形成して、その凹凸を利用し局部的に電界が集中するようにできる。なお、表面粗さをコントロール際には、一度成膜した絶縁層５ａ上に、例えば、１０ｎｍ以下のＳｉＯ２を島状に再度成膜することで、表面に凹凸を形成してもよい。
【００４７】
以上のようにして、電極Ｅ１等の表面に電界を集中させてＤＮＡプローブをクーロン力により引き付けて固定化した後は、所定の洗浄用の水溶液を、反応領域２に対して前記水溶液Ｌ同様の方法に送り込んだり、強制的にインジェクション等で注入したり、あるいは上方側の電極基板を取り外して反応領域２を一旦開口状態にしてから投入する等の手段によって、余剰なＤＮＡプローブや非特異的に吸着したプローブＤＮＡを反応領域２から除去し、乾燥させることができる。
【００４８】
このようにして得られた検出部１ａ等の反応領域２等に対して、符号Ｔで示す標的ＤＮＡを含む水溶液を吸入孔３から毛細管現象を利用して送り込む。ここで、この標的ＤＮＡに対して、電界を印加することで、ＤＮＡプローブの場合と同様に、ランダムコイル状の高次構造から伸長構造に調整し、固定化用の電極Ｅ１等の表面に移動（誘電泳動）させることができる。そして、電界を一旦オフの条件をつくり、自然のブラウン運動の下に、ハイブリダイゼーションを進行させるようにする。
【００４９】
このハイブリダイゼーションは、例えば、ＤＮＡプローブにラベルされた蛍光物質や二本鎖ＤＮＡに挿入結合する蛍光インターカーレータ等に所定波長の励起光を照射し、その蛍光強度に基づき検出することができる。なお、前記蛍光インターカーレータは、標的物質が含有する水溶液に混入させておいてもよいし、ハイブリダイゼーション後に反応領域２に滴下してもよい。
【００５０】
ここで、図１２に示されたような変形形態の検出部１ｆには、ハイブリダイゼーションによって生成した二本鎖ＤＮＡが符号Ｄｔで模式的に示されている。しかし、ハイブリダイゼーション後には、余剰のインターカーレータＣが存在したり、符号Ｍで示すミスハイブリしたＤＮＡも存在したりするため、検出精度低下の原因となる。
【００５１】
そこで、この図１２に示すように、電極Ｅ１−Ｅ２と対向軸が交差する対向電極ｅ１−ｅ２を配置し、これに高周波交流電界を印加することによって、余剰のインターカーレータＣや符号Ｍで示すミスハイブリしたＤＮＡを電ｅ１やｅ２側に引き寄せて、これらの物質Ｃ，Ｍを電極Ｅ１表面近傍から除去しておくように工夫し、検出精度を向上させることもできる。なお、図１２中の符号Ｓ２は、対向電極ｅ１−ｅ２に対して、符号Ｖ２で示された電源を介して電圧印加するためのスイッチを示している。
【００５２】
図１３、図１４は、本発明に係る上記検出部１ａ〜１ｆに対して共通に適用できる水溶液Ｌの好適な送液方法を説明するための図である。なお、これらの図１３、図１４は、図４に示す吸入孔３周辺を示すＸ部分の拡大図である。
【００５３】
上部基板６ｂの全域、あるいは少なくとも吸入孔３の周辺表面をアルキルシラン等で処理し、疎水性層９を予め形成しておく（図１３参照）。そして、この吸入孔３の上方からノズルＮにより、符号Ｌで示すサンプル水溶液（検出用物質Ｄ又は標的物質Ｔを含む。）をインクジェット方式やディスペンサー方式で滴下し、図１３中に点線で示すような液滴Ｙを形成する。この液滴Ｙは水溶液であるから、疎水性層９と逆の親媒性となり、速やかに毛細管現象の作用を受けて、反応領域２へ吸い込まれていく。
【００５４】
あるいは、図１４に示す構成のように、上部基板６ｂの全域、あるいは少なくとも吸入孔３の周辺表面をアルキルシラン等で処理し、疎水性層９を予め形成した後に、吸入孔３周辺のみに紫外線照射して親水性層９１を形成しておいてもよい。この場合、親水性層９１で、滴下されてきた一旦液滴Ｙを確実に吸入孔３周辺に保持させた後に、この液滴９１を毛細管現象の作用で反応領域２へ送り込むことが可能となる。
【００５５】
このような方法を用いると、水溶液Ｌの使用量は反応領域２に必要なだけ送り込むことができるので、水溶液のロスを抑えることができる。また、毛細管現象を利用して送り込まれた水溶液Ｌは、開口部の少ない反応領域２に閉じ込められるため、その蒸発を抑えることもできる。この点で言えば、吸入孔３や外気連通孔４はできるだけ小さな孔が望ましい。
【００５６】
しかし、反応領域２に開口部があれば、水溶液Ｌの蒸発は避けられないので、検出用物質Ｄや標的物質Ｔをゲル中に分散させて、吸入孔３めがけて滴下し、毛細管現象で反応領域２へ送り込むように工夫することもできる。このようにすれば、水溶液をゲルの網目構造に閉じ込めて蒸発を抑えることができる。
【００５７】
また、水溶液Ｌの蒸発を防止するために、反応領域２へ水溶液Ｌを送り込んだ後に、吸入孔３や外気連通孔４に速乾性のポリマー等を滴下して孔を封止してしまうことも可能である。この場合、インターカーレータを用いる場合では、標的物質Ｔを含む水溶液中に該インターカーレータを混入させておくのが望ましい。
【００５８】
以上説明した符号１ａ〜１ｆなどの検出部を基板上に所定の配列で配設しておくことによって、短時間でハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させることができ、かつ網羅的解析が可能なＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板を提供できる。
【００５９】
図１５は、前記バイオアッセイ用基板の一例を示す図である。この図１５に示すように、例えば、円盤状をなす基板１０には、多数の検出部１ａなどをグループ分け可能に配設していくことができる。
【００６０】
なお、基板１０上に設けられたいずれかの検出部１ａ等において進行した相互作用の検出は、電極Ｅ１表面に固定された検出用物質Ｄに予め標識されている蛍光物質や相互作用を示した物質（二本鎖核酸）に挿入結合する蛍光インターカーレータ等に対して、所定波長の蛍光励起光を照射し、これを検出する公知の光学的検出手段によって、実施することができる。あるいは、検出部１ａ等の発光画像を撮影し、その画像から得られる光量を定量的に解析し検出するようにしてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、該検出部におけるハイブリダイゼーション等の相互作用の効率が良いので、該相互作用の時間も大幅に短縮することができる。また、精度の高い相互作用が進行し易い環境を形成できるので、擬陽性や偽陰性の発生を少なく抑えることができる。このため、相互作用検出のためのアッセイ作業の効率に優れ、かつ検出精度が高いという特性を備えたＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明に係る物質間の相互作用検出部（１ａ）の基本構成の概念を簡略に示す上方視平面図及び上図Ｉ−Ｉ線矢視断面図である。
【図２】図１の断面図に示されたＩＩ−ＩＩ線位置で、上方から見た平面図である。
【図３】変形形態である検出部（１ｂ）の構成を図１のＩ−Ｉ線に対応する位置で矢視する断面図である。
【図４】検出部（１ａ）の反応領域（２）にＤＮＡプローブ（Ｄ１）投入したときの様子を模式的に示すＩ-Ｉ線矢視断面図である。
【図５】ＤＮＡプローブ（Ｄ１）が電極（Ｅ１）の表面部位に整列固定された状態が模式的に示された図１中のＩＩＩ−ＩＩＩ線矢視断面図である。
【図６】変形形態である検出部（１ｃ）の構成を図１のＩ−Ｉ線に対応する位置で矢視する断面図である。
【図７】変形形態である検出部（１ｄ）の構成を図１のＩ−Ｉ線に対応する位置で矢視する断面図である。
【図８】変形形態である検出部（１ｅ）の構成を図１のＩ−Ｉ線に対応する位置で矢視する断面図である。
【図９】固定化用の電極（Ｅ１）の変形形態を示す部分断面図である。
【図１０】固定化用の電極（Ｅ１）の別の変形形態を示す部分断面図である。
【図１１】固定化用の電極（Ｅ１）のさらに別の変形形態を示す部分断面図である。
【図１２】変形形態である検出部（１ｆ）の構成を図１のＩ−Ｉ線で矢視する断面図である。
【図１３】本発明に係る検出部（１ａ〜１ｆ）に対して共通に適用できる水溶液（Ｌ）の好適な送液方法を説明するための拡大図である。
【図１４】本発明に係る検出部（１ａ〜１ｆ）に対して共通に適用できる水溶液（Ｌ）の好適な別の送液方法を説明するための拡大図である。
【図１５】本発明に係る検出部（１ａ〜１ｆ）が配設された円盤上の基板（１０）の例を示す図である。
【符号の説明】
【００６３】
１ａ〜１ｆ  物質間の相互作用検出部（略称、検出部）
２，２１，２２  反応領域
３  吸入孔
４  外気連通孔
５ａ，５ｂ  絶縁層
７，７１，７２  スペーサ
８  微粒子
９  疎水性層
１０  バイオアッセイ用基板
Ｄ  検出用物質（例、ＤＮＡプローブ）
Ｅ１，Ｅ１  対向電極
Ｔ  標的物質（例、標的ＤＮＡ）
Ｌ  水溶液（媒質）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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