(57)【要約】【課題】            有効性と安全性に優れた新たな悪性腫瘍の治療剤の本態を提供する。【解決手段】        内皮細胞特異的プロテインＣレセプター（Endothelial Protein C Receptor：ＥＰＣＲ）との結合を介し、内皮細胞との結合性を示さず、悪性腫瘍細胞に特異的に結合することによって、in vivoでの悪性腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体を創製する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞特異的プロテインＣレセプター（Endothelial Protein C Receptor;以下、ＥＰＣＲと称することがある）の糖鎖介在性の結合を介し、内皮細胞との結合性を示さず、悪性腫瘍細胞に特異的に結合することによって当該悪性腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体。
【請求項２】
悪性腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
内皮細胞及び乳腺上皮細胞との反応性を示さない請求項２記載の抗体。
【請求項４】
受託番号第１９６３６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３６）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマが産生する抗体である請求項１から請求項３のいずれかに記載のモノクローナルな抗体。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗体を産生し得る単離された細胞。
【請求項６】
ハイブリドーマである請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
受託番号第１９６３６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３６）として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された請求項６記載の細胞。
【請求項８】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の抗体または当該抗体に起因する改変抗体を主たる構成成分とする悪性腫瘍細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には悪性腫瘍細胞増殖抑制剤に関し、さらに詳細には、内皮細胞特異的プロテインＣレセプター (Endothelial Protein C Receptor;ＥＰＣＲ) との糖鎖介在性の結合を介し、内皮細胞には結合せず悪性腫瘍細胞に特異的に結合することによって当該悪性腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体を薬剤の本態とする悪性腫瘍細胞増殖抑制剤及び当該悪性腫瘍細胞増殖抑制剤を用いた悪性腫瘍の治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＰＣＲは２３８アミノ酸からなり、ＣＤ１/主要組織抗原複合体とホモロジーを持つ１型膜貫通型糖タンパク質であり、その性状は以下のとおりである。
プロテインＣ/活性化プロテインＣ（以下、各々ＰＣ/ＡＰＣと称することがある）と高親和性を持ち、ＰＣのＧｌａドメインと結合し、機能的には膜上でのＰＣの活性化を促進する(非特許文献１参照)。ＥＰＣＲは生体内では大血管の内皮細胞に主に発現し、毛細血管では発現していない(非特許文献２参照)。また、その他の正常細胞の組織での発現は確認されていない。そして、福留らは当該レセプターがとりわけ乳癌細胞に高率に発現することを見出した(非特許文献３参照)。また、Scheffer等は薬剤耐性の悪性腫瘍の半数にＥＰＣＲが発現していることを見出した(非特許文献４参照)。ＥＰＣＲが乳癌もしくは薬剤耐性の悪性腫瘍の組織に高率に発現している事実は、これらの悪性腫瘍の治療に高い有用性をもたらす。また、ＥＰＣＲは内皮細胞に発現することより、副作用の観点から、抗体の結合は癌特異的である事が望ましい。また、福留等の報告によると白血病細胞(UNo.937)のＥＰＣＲの糖鎖が通常の細胞に比べて多く付加されていることが示されている(非特許文献５参照)。よって、癌細胞においてはＥＰＣＲの糖鎖構造が異なっていることが予測され、その構造の違いを認識すれば、有用な癌特異的抗体が作製できる。
【０００３】
【非特許文献１】Fukudome K. et al., J. Biol. Chem. Vol.269, p26486-264No.91,1994
【非特許文献２】Laszik Z. et al., Circulation, vol.96, p3633-3640,1997
【非特許文献３】Tsuneyoshi N et al., Thromb Haemost., vol. 85(2), p.356-361,2001
【非特許文献４】Scheffer G.L. et al., European Journal of Cancer., vol. 38, p.1535-1542,2002
【非特許文献５】Tsuneyoshi N. et al., Thromb Haemost vol 85, p356-361, 2001
【非特許文献６】Robin J. et al., Molecular Immunology Vol.21, p321-327,1984
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
悪性腫瘍の治療に於いては、化学療法、放射線療法、免疫療法等様々な治療法が確立されているが、未だ各治療法に抵抗性を示す致死性の悪性腫瘍が存在する。現在、悪性腫瘍による死亡率は極めて高率である。従って、悪性腫瘍とりわけ乳癌の新たな治療剤または治療法が望まれており、本願発明は新たな治療剤の本態を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以上の課題を解決するために、本願発明者らは鋭意研究を重ねた結果、内皮細胞との結合性を示さず、悪性腫瘍細胞に特異的に結合することによって、in vivoでの悪性腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体の創製に係る新知見を見出し、当該抗体を本態とする新たな悪性腫瘍細胞増殖抑制剤を提供する本願発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本願発明の特徴は、ＥＰＣＲへの結合性を示すが内皮細胞へは反応せず、標的たる悪性腫瘍細胞を特異的に認識し、当該悪性腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体の創製にある。
【発明の効果】
【０００７】
本願発明によれば、ＥＰＣＲに対する結合抗体を本態とする薬剤を用いて、従来奏功性に乏しかった悪性腫瘍の治療を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本願発明の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の本態は、前記ＥＰＣＲとの結合を介した腫瘍細胞特異的結合抗体である。また、ＥＰＣＲそのものはアミノ酸配列が既知の物質であるが、前記抗体は、人種及び個人差からプロテインＣもしくは活性化プロテインＣに結合能を示すレセプターに対する結合を示すものであれば、前記ＥＰＣＲのアミノ酸配列もしくは発現部位からの制約を受けない。
【０００９】
本願発明のＥＰＣＲ結合活性を有する悪性腫瘍細胞増殖抑制抗体の作製法は、概略下記の通りである。
ａ）ＥＰＣＲをコードし、哺乳動物由来の細胞で複製、転写及び翻訳されうるＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及び哺乳動物由来宿主-ベクター発現系を準備し、形質転換、形質導入及びトランスフェクションからなる群から選択される方法により、組換えプラスミド発現ベクターを哺乳動物由来の細胞に導入し、哺乳動物にその細胞を完全アジュバントと共に免疫する。免疫した哺乳動物の脾臓及びリンパ節よりリンパ球を取り出し、不死化した細胞とハイブリドーマを形成し、癌細胞に結合し、内皮細胞に結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する。ヒトの治療に応用する場合は、その抗体をヒト型化する。
【００１０】
ｂ）ＥＰＣＲをコードし、哺乳動物由来の細胞で複製、転写及び翻訳されうるＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド発現ベクター、及び哺乳動物由来細胞よりなる宿主-ベクター発現系を準備し、形質転換、形質導入及びトランスフェクションからなる群から選択される方法により、組換えプラスミド発現ベクターを哺乳動物由来の細胞に導入、培養しその上清を回収する。その上清より可溶性ＥＰＣＲ（以下、sＥＰＣＲと記述することがある）を各種クロマトグラフィー等で精製し、哺乳動物に免疫し、数週間後にリンパ節もしくは脾臓を取り出しリンパ球を取り出し、不死化した細胞とハイブリドーマを形成し、癌細胞に結合し、内皮細胞に結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
ヒトの治療に応用する場合は、その抗体をヒト型化する。
【００１１】
ｃ）ヒトの抗体ファージライブラリーを動物細胞由来のsＥＰＣＲを抗原としてスクリーニングし、癌細胞に結合し、内皮細胞に結合しないファージを選択する。そのファージもしくはそのファージが感染した大腸菌に含まれる抗体のＶ領域遺伝子をＰＣＲにより増幅する。その増幅された遺伝子を用いてヒト型化抗体を作製する。
これらを常法により製剤化し抗体製剤とする。本願発明の対象となる悪性腫瘍細胞は、ＥＰＣＲを細胞表面に発現するものがその範疇であり、乳癌細胞または薬剤耐性の悪性腫瘍が主たる対象となる。かくして対象疾患の代表例は乳癌であって、前記製剤は、患者の疾患の病態、体重等を勘案した医師の裁量による好ましい処方により投与される。
なお、本願発明で提供されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの好適な例は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号第１９６３６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６３６）として寄託されている。
【００１２】
以下に実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
《実施例１：モノクローナル抗体の作製》
ＥＰＣＲの動物細胞用発現プラスミドを構築した。pCAGG-S1 dhfr（WO 03/004641）のSalIサイトにＥＰＣＲの細胞外領域をコードする遺伝子を挿入した。このＥＰＣＲ発現プラスミドを乳癌細胞MDA231に形質転換し、G418によりプラスミド導入細胞を選択した。その発現細胞の上清より可溶性ＥＰＣＲを精製した。その精製産物を完全アジュバントと共にマウスの足蹠に注射した。その1-2週間後、膝下リンパ節よりリンパ球を採取し、マウスのP3U1細胞とポリエチレングリコールを用いて融合させた。そのハイブリドーマをHAT培地により選択した(Galfreら, Nature. 266:550-552)。その上清をMDA231細胞のCell ELISAによりアッセイした。ELISAは以下に示す手順にて実施した。96well培養プレートを1%BSA/PBSでブロッキングした後、4.5X104細胞播種し、一晩培養する。その後、培養液を捨て、ハイブリドーマ培養上清を50μlアプライし、室温で2時間反応させる。反応終了後、洗浄液（0.05％ Tween-20/PBS）200μlにて3回洗浄を行った。その後、パーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を1%BSA/PBSで5000倍に希釈し、100μl各ウェルにアプライし、室温で1時間反応させた。反応終了後、洗浄液200μlにて3回洗浄を行った。発色は0.4mg/mlTMBZを0.5mMEDTA, 4.3mM過酸化水素溶液で溶解した溶液を100μl アプライし室温で20分反応させた。反応終了後、１規定硫酸 100μlで反応を停止した。反応停止後30分以内に、プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて、450nm-650nmの吸光度を測定した。細胞の播種されていないウェルの吸光度と比較して高い値を示したウェルを陽性として、クローンを選択した。また、その陽性クローンを内皮細胞(HUVEC;三光純薬  CC2517)に反応させた。そのELISAは細胞播種前のブロツキング反応が無い以外は上記と同じ操作である。その反応性の陰性のクローンを選択し、そのハイブリドーマを培養した。その培養上清の抗体を硫安沈殿とイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【００１４】
《実施例２：担癌マウスへの患部への抗体の投与》
乳癌細胞であるMDA231細胞(107個)をD-MEM(10%FCS)により10cm ディシュで培養した。その細胞をPBSにより洗浄し、その後、10mMEDTA/PBSを添加した。細胞をピペッティングによりはがし、チューブに回収し、1500回転の遠心を行った。上清を捨て、その細胞に抗体(200μg)を200μl PBSに縣濁した。投与された抗体は乳癌細胞(MDA231)に反応し、内皮細胞(HUVEC)に反応しない3種類の抗ＥＰＣＲ抗体(No.88, No.91, No.93)である。尚、コントロールとして抗体を含まないBuffer(20mM phosphate, 0.5M NaCl)のみで細胞を懸濁した。それを5週齡ヌードマウスの背部皮下に投与した。ヌードマウスは５匹使用した。その後、抗体(200μg)を含む200μl Bufferを悪性腫瘍部に５回投与した。また、対照として抗体を含まないBufferのみをマウスに投与した。悪性腫瘍細胞を投与して23日目にヌードマウスに対して、腹腔内にネンブタール100μl投与して、死亡させた。そのマウスの背部皮下の悪性腫瘍を採取し、その重量を計測した。その結果を図１に示す。その結果、No.88のクローンが明確な抗腫瘍効果を示した(図１)。これらのクローンのサブタイプをIsostrip(Roche;Cat. N. 1 4No.93 027)により調べた結果、No.88がIgG2b, No.91とNo.93はIgG1であった。マウスの抗体に於いてIgG2bの補体結合能(C1q)はIgG1に比べて8倍以上あることが報告されている(非特許文献６参照)。No.88と他のクローンとの効果の差は、Fcの細胞障害における機能の違いを反映している可能性がある。よって、臨床応用を考えた場合、ヒトのFcとキメラ化する場合は有効な細胞障害能を有するサブタイプを選択するとその抗腫瘍効果が期待できる。
【００１５】
《実施例３：抗腫瘍効果を有する抗体の性状解析》
免疫原であるMDA231細胞由来の可溶性ＥＰＣＲとのNo.88クローンの反応性をELISAにより調べた。ELISAは以下に示す手順にて実施した。免疫原であるMDA231由来のsＥＰＣＲを10ng-1000ng/mlにTBS(50mM Tris, 67mM NaCl)で希釈して、100μlをイムノモジュールプレート（ヌンク  C8-445101）にアプライし、37℃に1時間反応させ、固相化を行った。その後、その溶液を捨て、5% スキムミルク/TBS(ブロッキング溶液)を300μlアプライした。37℃に1時間反応させた後、10μg/mlのNo.88のクローン由来の抗体を50, 20, 10μg/mlとなるようブロッキング溶液で希釈し、100μlアプライした。37℃  1時間反応させた後、0.05% Tween20/TBS 300μlで5回洗浄した。その後、ブロッキング溶液5000倍で希釈したマウスHRP標識抗体を100μlアプライした。1時間反応させた後、0.05% Tween20/TBS 300μlで5回洗浄した。発色は0.4mg/mlTMBZを0.5mMEDTA, 4.3mM過酸化水素溶液で溶解した溶液を100μl アプライし室温で20分反応させた。反応終了後、１規定硫酸 100μlで反応を停止した。反応停止後30分以内に、プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて、450nm-650nmの吸光度を測定し、陽性である事を確認した(図２)。このことはこの抗体が乳癌由来の可溶性ＥＰＣＲを認識していることを示している。
【００１６】
このNo.88の抗体(50, 20, 10μg/ml)を実施例1と同様なCELL ELISAを用いてMDA231とHUVECに対する反応性を調べた結果、MDA231特異的に反応した(図３)。また乳腺上皮細胞(HMEC;三光純薬:CC-2551)との反応性を同様にCELL ELISAで調べた結果、陰性であった(図４)。この抗体は内皮細胞や初代乳腺上皮細胞には結合せず、癌細胞に反応していた。よって、癌細胞に優先的に反応していることが示された。
【００１７】
この抗体の認識に糖鎖が関与を調べる為に、糖鎖構造の異なっているＥＰＣＲとの反応性を調べた。ＥＰＣＲ発現細胞を糖転移酵素阻害剤であるSWAINSONINE(1μg/ml)存在下で培養し、その培養上清よりＥＰＣＲを精製した。このＥＰＣＲのAPCに対する結合能は通常のＥＰＣＲと同等であることはAPCの凝固延長の阻害実験より確認された。そのＥＰＣＲはEndoHで切断されたので、マンノースタイプの糖鎖が付加していることが示された。糖転移酵素阻害剤未処理の培養上清由来のＥＰＣＲ(複合型の糖鎖付加)と糖転移酵素阻害剤で処理された培養上清由来のＥＰＣＲをプレートに固相化し、No.88の抗体を10μg/mlと反応させた。その結果より明らかにマンノースタイプのＥＰＣＲに対して反応性が低下していた(図５)。よって、この抗体のＥＰＣＲに対する結合に関して糖鎖が関与していることが推測される。癌細胞では一般に糖鎖が高度に分枝化されていることが知られている。よって、この抗体の癌細胞特異的な反応に、糖鎖構造の違いが反映されているものと推察された。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
悪性腫瘍細胞、とりわけ乳癌細胞の増殖を抑制し得る悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の本態を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】担癌マウスに対する本願発明の抗ＥＰＣＲ抗体の患部投与における悪性腫瘍細胞増殖抑制効果を示す図である。抗体(No.88, No.93, No.91)及びBufferを投与したヌードマウスの悪性腫瘍組織の重さを縦軸にその重さ(ｇ)を示す。（実施例２）
【図２】本願発明の抗ＥＰＣＲ抗体(No.88)の乳癌細胞MDA231由来の組換えＥＰＣＲに対する反応性を示す図である。固相化したMDA231由来の組換えＥＰＣＲの濃度(ng/ml)を横軸に、抗ＥＰＣＲ抗体(No.88)の反応性(吸光度:OD450/650)を縦軸を示す。（実施例３）
【図３】本願発明の抗ＥＰＣＲ抗体(No.88;50, 20, 10μg/ml)の乳癌細胞(MDA231)と初代内皮細胞(HUVEC)に対する反応性(吸光度:OD450/650)を示す図である。（実施例３）
【図４】本願発明の抗ＥＰＣＲ抗体(No.88;10μg/ml)の乳癌細胞(MDA231)と初代乳癌上皮細胞(HMEC)に対する反応性(吸光度:OD450/650)を示す図である。（実施例３）
【図５】本願発明の抗ＥＰＣＲ抗体(No.88)のCHO細胞由来の組換えＥＰＣＲとSWAINSONINE(1μg/ml)存在下で培養したCHO細胞由来の組換えＥＰＣＲに対する反応性を示す図である。固相化したＥＰＣＲの濃度(ng/ml)を横軸に、抗ＥＰＣＲ抗体(No.88)の反応性(吸光度:OD450/650)を縦軸に示す。（実施例３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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