(57)【要約】【課題】 機能が未知、あるいは機能が十分に解明されていない、多数の遺伝子について、細胞内、組織内または生体内機能解析を効率よく行なうためのプラスミドベクターの集合体、及び、該集合体から抽出したプラスミドベクターを利用する遺伝子の網羅的機能解析方法を提供する。【解決手段】   配列が既知のｃＤＮＡの発現ユニットを有するプラスミドベクターの集合体であって、前記プラスミドベクターが、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有し、かつ１００クローン以上含まれていることを特徴とする集合体、及び、所定の目的に基づいて選択された遺伝子群に対応するｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを、上記集合体から抽出して、上記ｃＤＮＡを導入して発現させることによる、遺伝子の網羅的機能解析方法。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が既知のｃＤＮＡの発現ユニットを有するプラスミドベクターの集合体であって、前記プラスミドベクターが、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有し、かつ１００クローン以上含まれていることを特徴とする集合体。
【請求項２】
前記プラスミドベクターが、１０００クローン以上含まれている、請求項１記載の集合体。
【請求項３】
前記プラスミドベクターが、１００００クローン以上含まれている、請求項１記載の集合体。
【請求項４】
所定の目的に基づいて選択された遺伝子群に対応するｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを、請求項１〜３のいずれかに記載の集合体から抽出して、上記ｃＤＮＡを導入して発現させることによる、遺伝子の網羅的機能解析方法。
【請求項５】
上記所定の目的のために請求項１〜３のいずれかに記載の集合体から抽出したプラスミドベクターの亜集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、機能が未知、あるいは機能が十分に解明されていない、多数の遺伝子について、細胞内、組織内または生体内機能解析を効率よく行なうためのプラスミドベクターの集合体、および該集合体から抽出したプラスミドベクターを利用する遺伝子の網羅的機能解析方法、および前記方法に用いるプラスミドベクターの亜集合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト等生物のゲノム情報が解読され、莫大な数の遺伝子の配列が決定されているが、そのコードしているたんぱくの機能が解析されているものはごく一部であり、多くの遺伝子は産物の機能が全く未知、あるいは十分には知られていない。生命のしくみを解明するためには、個々の遺伝子の産物が実際に細胞や組織でどのような役割を果たしているかを調べることが必要不可欠である。機能のよく分からない遺伝子の機能を推測する手段として、機能がすでに分かっている遺伝子やたんぱくとのヌクレオチド配列、アミノ酸配列の相同性、または立体構造上の類似性や特色を解析する手法がとられるが、実際に細胞や組織に遺伝子を導入し発現させなければ、遺伝子産物の機能はよく分からない。膨大な数の遺伝子の機能を調べるためには、網羅的な遺伝子導入実験を行なうテクノロジーが必要である。
【０００３】
また、ポストゲノム時代において、悪性腫瘍、慢性疾患など、さまざまな疾患を対象として、DNAマイクロアレイ（DNAチップ）、プロテオソーム解析等による疾患関連遺伝子の検索が行なわれている。その結果、それぞれの疾患に関与する可能性がある「候補」遺伝子は莫大な数が報告されてきており、その情報量は今後も爆発的に増加すると考えられる。しかしながら、これら候補遺伝子のほとんどが上記のように生理的・病理的機能が不明であるために、疾患の診断や治療、治療薬の開発等に十分に役立てられるまでには至っていない。その最大の原因は、網羅的機能解析に適した遺伝子導入のためのツールと方法が、なかったことにある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この問題を解決するために、配列が既知のｃDNAを一つずつ組み込んだベクターの集合体であって、しかも個々のクローンにアノテーションが付けられたものを、あらかじめ作成しておくことが考えられる（アノテーションとは、塩基配列のみならず、遺伝子や遺伝子産物の名称、それぞれの遺伝子がどの組織のどの細胞がどの発現しているか、どうような刺激で発現が亢進し、あるは減弱するのか、また遺伝子産物のアミノ酸配列、遺伝子産物がアミノ酸配列上どのような機能ドメインを有しているか、遺伝子産物の既知の機能としてはどのような機能があるか、など、その遺伝子と遺伝子産物に関する既知の情報のことである）。この集合体は、個々のクローンにアノテーションが添付されており、原則として完全長のｃＤＮＡを含んでいるため、いわゆるcDNAライブラリーよりも進んだツールである。（本明細書では、この集合体をｃDNA発現ミュージアムと呼ぶ）。この集合体のベクターを、実際に細胞や組織に導入して遺伝子を発現させることによって、網羅的に遺伝子の機能を調べることができると考えられる。また、配列情報等の情報に応じて、任意のｃDNAを含んだベクターの亜集合を、その集合体の中から選び出したのちに、その亜集合のベクターを実際に細胞や組織に導入して遺伝子を発現させることによって、網羅的に遺伝子の機能を調べることが考えられる。
【０００５】
網羅的発現実験を迅速に効率よく行なうためには、遺伝子導入効率の良いベクターが好ましい。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルス性ベクターが、プラスミドベクターを用いた非ウイルス性ベクターよりも比較的導入効率の高いベクターとして知られているが、これらのベクターはウイルスの種類によって種々の短所があり、たとえばｃDNAが染色体に組み込まれてpositional effectsが現れる、挿入できるｃDNAのサイズに制限がある、発現期間が短い、免疫原性が高い、複製可能な組換え型ウイルスが出現する可能性があるなどの問題がある。
【０００６】
さらに、感染力を有するウイルスを用いるためにバイオハザード上の制約があり、どこの実験室でも簡単に行なえるというわけにはいかない。とくに動物へのin vivo導入は、物理的封じ込めのレベルが高い動物飼育室を要するため、数多くの動物への感染実験は実際上極めて行ないにくい。
そのため、ウイルス性ベクターを、網羅的実験を行うための研究ツールとして用いることは極めて困難である。そこで、ウイルス性ベクターでなく、プラスミドベクターを用いることが考えられる。
【０００７】
既に、プラスミドベクターを基本骨格として、ここに配列が既知のｃDNAの発現ユニットを挿入した集合体（以下、従来型集合体と呼ぶ）は、市販されている。しかしながら、この従来型集合体を用いて網羅的機能解析を行うことは、実際には非常に困難である。その理由は、従来型集合体から選び出したプラスミドベクターを、培養細胞に対してin vitroで導入しても、cDNAにコードされる遺伝子の発現は非常に低く、また発現が検出される細胞は全細胞のごく一部にすぎないためである。成体や胎児、胎仔等の生体から得たプライマリーやセカンダリーなどの株化されていない細胞（以下生体由来細胞と呼ぶ）に対しては、導入効率は培養細胞に対するよりもさらに低い。また、動物の組織・臓器に直接in vivo導入した場合にも、導入・発現は十分に得ることができない。したがってこれらの実験を行なっても、導入した遺伝子の機能を解析するには不十分である。なお、本明細書では、生体外で細胞や組織に遺伝子導入することをin vitro遺伝子導入、生体内に直接遺伝子導入することをin vivo遺伝子導入と呼ぶ。
【０００８】
この困難さを解決する手段として、通常は発現ベクターに薬剤耐性遺伝子を組み込んでおき、または発現ベクターによる遺伝子導入時に同時に薬剤耐性遺伝子発現ベクターを細胞に共導入し、薬剤耐性遺伝子を発現する細胞（安定形質転換細胞株）を選択するという手段がとられてきた。しかしこのプロセスには時間と労力、コストを要するため、非常に多くの遺伝子について網羅的に行なうのには適さない。また生体由来の細胞のように、増殖能が低い細胞では行なうことが困難、あるいは不可能である。また、細胞増殖を抑制する遺伝子や細胞死を導く遺伝子などの解析はできない。
【０００９】
さらに遺伝子は導入細胞の染色体上にランダムに組み込まれるため、組み込まれる位置によってホスト遺伝子の発現を異常に増強し、あるいはホスト遺伝子を分断し、その結果目的とする遺伝子の作用を修飾しあるいはマスクする可能性がある。このpositional effectsを除くためには、各遺伝子について複数の安定形質転換細胞株を得て比較実験を行なわなければならないが、多数の遺伝子についてそれぞれ多くの安定形質転換細胞株を得るのはさらに労力とコストを要し、実用的でない。
【００１０】
また、遺伝子の機能解析を生体内で解析するためには、実験動物にin vivo遺伝子導入する必要があるが、in vivo遺伝子導入はin vitroにおける細胞への導入よりもさらに遺伝子導入効率が低く、培養細胞のように薬剤選択をすることも通常はできないので、実際に導入した遺伝子の効果を解析するのはほとんど不可能である。
【００１１】
本発明者らは、非ウイルス的手法によるプラスミドベクターの細胞への導入と遺伝子発現の効率について検討した結果、プラスミドベクターの導入効率の向上、発現の上昇をもたらす為には、プラスミドの核内移行、核内維持を達成することが重要であることを見い出した。
すなわち、非ウイルス的手法によって従来型プラスミドを細胞に導入する場合、プラスミドは細胞内まで導入されても、そのほとんどは分解されてしまい、一部のプラスミドが核まで到達しても、その後強力な発現に繋がることなく分解され、あるいは核外に排出される。したがって、核内への到達と維持が、非ウイルス的導入手法による遺伝子導入の律速段階であり、これを向上させない限り、細胞内への導入技術がいくら革新、進歩しても導入、発現の効率は顕著な改善を示さない。
【００１２】
本発明者らはさらに、上記positional effectsの問題を検討した結果、エピゾームとして存在できるプラスミドベクターを用いてこの問題を解決することに想到した。すなわち、細胞に導入された後、染色体に組み込まれず、エピゾームとして存在・維持するプラスミドベクターを用いれば、positional effectsの発生を防ぐことが可能である。
【００１３】
本発明者らは、以上のような知見を得、in vivoとin vitroの両方で高い導入効率・発現効率を実現でき、且つ様々な導入方法によっても高い導入効率・発現効率が達成でき、さらに導入細胞内でエピゾームとして存在するプラスミドベクターを見出したので、これを用いるプラスミドベクターの集合体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターの発現ユニット内に、既知のｃＤＮＡを組み込んだクローンを作成し、このプラスミドベクターのクローンからなる集合体を構成することにより、上記課題を解決した。すなわち、本発明は、配列が既知のｃＤＮＡ発現ユニットを有するプラスミドベクターの集合体であって、前記プラスミドベクターが、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有し、かつ１００クローン以上含まれていることを特徴とする集合体である。
【００１５】
前記集合体は、集合体に含まれるプラスミドベクターのクローンが多いほど、ｃＤＮＡが多種類揃うことになるため、好ましい。より好ましくは、前記プラスミドベクターを１０００クローン以上含む集合体であり、さらに好ましくは、１００００クローン以上含む集合体である。
【００１６】
プラスミドベクターに、EBNA1遺伝子とoriP配列を導入した場合、EBNA1-oriPの作用によってプラスミドが核内に輸送、維持され、高導入効率と高発現を達成できる。EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターをヒト由来細胞への外来遺伝子導入に用いると、従来のプラスミドベクターに比し、遺伝子導入の効率が非常に高まり、また発現量が極めて強くなった。また、プラスミドの複製を起こすことができないマウスやラットの細胞にin vitroで導入した場合でも、導入効率の飛躍的な向上、発現の上昇が認められた。さらにマウス、ラット等動物の臓器、組織にin vivo導入した場合にも、同様に導入効率の向上、発現の上昇を認めた。また、プラスミドベクターをこれら細胞に導入するための手段として、電気穿孔法、粒子銃法、カチオニックポリマー法、カチオニックリピッド法、超音波法、naked DNA法など、さまざまな方法を用いたが、どの方法を用いても極めて良好な結果を得た。
【００１７】
さらに、positional effectsについて検討した結果、導入後短期間の細胞内では、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターは染色体にはほとんど組み込まれることなくエピゾームとして存在することが分かった。さらに制限酵素処理等を行なわずにclosed circleのままでヒト細胞に導入した場合には、薬剤選択を行なって安定形質転換細胞株を樹立した場合でも、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターは染色体にはほとんど組み込まれることなくエピゾームに維持されていた。したがって、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターを用いた場合positional effectsが発生する可能性は非常に低い。
【００１８】
EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターをin vitroでのｃDNA導入に用いると、非常な高効率導入、高発現が得られるため、導入後半日から数日後という短期間の後に導入遺伝子の機能解析を開始することが可能である。この際薬剤選択は必要としないため、通常数週間の薬剤選択を経て安定形質転換細胞株を樹立したのちに機能解析を開始できる従来型のプラスミドベクター（エプスタインバールウイルス（EBV）のEBNA1遺伝子とoriPの両方を含まないプラスミドベクター）の場合に比して、実験・解析の迅速性、労力とコストの削減が多大であり、多数のクローンの網羅的な解析に極めて適している。また、in vivoでも高い導入・発現効率を示すため、in vitroとin vivoの両方における遺伝子の機能解析に用いることができる。また、positional effectsが発生しないため、個々の遺伝子について複数の系統を樹立して比較検討する必要がない。さらに、電気穿孔法、粒子銃法、カチオニックポリマー法、カチオニックリピッド法、超音波法、naked DNA法など、さまざまな方法で高い遺伝子導入・発現効率を示すため、遺伝子の機能解析の際に、導入方法による制限を受けない。従って、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有するプラスミドベクターが１００以上からなる集合体であって、各ベクターに配列が既知の異なるｃＤＮＡ発現ユニットが一つずつ組み込まれているプラスミドベクターの集合体を構成することにより、網羅的な遺伝子発現解析に好適なゲノム機能解析用のツールを提供することができる。
【００１９】
また、本発明は、所定の目的に基づいて選択された遺伝子群に対応するｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを、上記集合体から抽出して、上記ｃＤＮＡを導入して発現させることによる、遺伝子の網羅的機能解析方法である。たとえば、ある病気に関連する遺伝子をスクリーニングする目的で、その病気の患者と健常者のサンプルを用いてDNA解析を行ない、その解析の結果から患者で高発現している遺伝子群（あるいは患者で低発現している遺伝子群）を選択して、該遺伝子群に対応するｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを上記集合体から抽出し、該プラスミドベクターを用いて、迅速かつ高効率的にｃＤＮＡを導入し発現させることによって、どの遺伝子が病気に関連しているのかを、網羅的に解析することができる。
【００２０】
また、本発明は、上記所定の目的のために上記集合体から抽出したプラスミドベクターの亜集合体である。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したことから明らかなように、本発明の集合体を構成するプラスミドベクターは、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するため、プラスミドが核内に輸送、維持され、高導入効率と高発現を達成できる。また、染色体に組み込まれることなく、エピゾームで存在しているため、positional effectが発生することがほとんどない。さらに、in vivoとin vitroの両方で高い導入効率・発現効率を実現でき、且つ様々な導入方法で高い導入効率・発現効率を実現できる。従って、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有するプラスミドベクターに、配列が既知のひとつのｃＤＮＡの発現ユニットを組み込み、そのようなプラスミドベクターを多数揃えることによって、多種類のｃDNA発現ユニットを有するプラスミドベクターの集合体を構成でき、網羅的遺伝子発現解析に実用できる全く新しいゲノム機能解析用のツールを提供することができる。
【００２２】
また、所定の目的に基づいて選択された遺伝子群に対応するｃＤＮＡの発現ユニットを有するプラスミドベクターを上記集合体から抽出して、上記ｃＤＮＡを導入して発現させることにより、遺伝子の網羅的機能解析を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明において、ｃＤＮＡ発現ユニットは、プロモーターとポリAの間に正しい向きにｃＤＮＡを挿入した配列およびその配列を有するDNA（すなわちプロモーター＋ｃＤＮＡ＋ポリAの一連の配列およびその配列を有するDNA）を指す。
【００２４】
本発明にかかるプラスミドベクターに含まれるｃDNAは、望ましくは哺乳類細胞から得られたものであり、より望ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ細胞から得られたものであるが、哺乳類以外の高等動物、たとえばニワトリ、ウズラ、メダカ、アフリカツメガエルから得られたものでもよい。ひとつの遺伝子について、2つ以上のオルタナティブ・スプライスト・フォームが存在する場合には、それぞれのオルタナティブ・スプライスト・フォームに対応するｃDNAを含む別々のプラスミドベクターが、本発明のプラスミドベクターの集合体には含まれていることが望ましい。またこのｃDNAは、何らかのプロモーター・エンハンサーの下流に挿入されている必要があるが、そのプロモーター・エンハンサーは、望ましくはサイトメガロウイルス・プロモーター由来の配列を含むものがよい。また本発明において、ｃDNAは配列が既知であるものと限定しているが、この配列が既知であるという意味には、非常に少数のヌクレオチド（たとえば全長の1%以下）が未決定、あるいは確認されていないという場合であっても構わない。
【００２５】
本発明のプラスミドにおいて、EBNA1遺伝子は、何らかのプロモーター・エンハンサーの下流に挿入されているのが望ましく、そのプロモーター・エンハンサーは望ましくはサイトメガロウイルス・プロモーター由来の配列を含むものがよい。oriP配列には、通常family of repeatsとdyad symmetryの2つの領域が存在するが、本発明のプラスミドはfamily of repeatsのみでもよく、dyad symmetryのみでもよいが、望ましくはfamily of repeatsとdyad symmetryの両方を含んでいるのがよく、その場合family of repeatsとdyad symmetryの相対的な向きと距離は任意であり、またfamily of repeatsとdyad symmetryがプラスミドの異なる部位にそれぞれ別個に存在していてもよい。EBNA1遺伝子とfamily of repeatsの相対的な向きと距離、EBNA1遺伝子とdyad symmetryの相対的な向きと距離もいずれも任意である。必要に応じて、本発明のプラスミドからEBNA１遺伝子とoriPを、またはEBNA1遺伝子単独を、またはoriP単独を、切り出すことができる。この目的で、EBNA１遺伝子および/またはoriPを切り出しやすいようにあらかじめプラスミドを設計しておくことができる。たとえばプラスミドのEBNA１遺伝子および/またはfamily of repeatsおよび/またはdyad symmetryを挟む位置に２つ以上のloxP配列を挿入しておき、必要に応じてcreリコンビナーゼで切り出せるように設計しておくことができる。
【００２６】
本発明おいて、クローンとは、個々の遺伝子を挿入したプラスミドベクターのそれぞれ単一の種類のものを指す。一つひとつのプラスミドベクターのクローンは、EBNA1遺伝子の発現ユニットとともに、配列が既知のひとつの遺伝子のｃDNA（望ましくは完全長のｃDNA）の発現ユニットを含んでいる。また、2つ以上の遺伝子の産物が結合してひとつの機能的複合体を構成し、この機能的複合体が実際の生物活性を示すような場合があるが、そのような場合には、その2つ以上の遺伝子をinternal ribosomal entry site配列等を挟んでタンデムに配置し、あるいはそれぞれ独立の発現ユニットとしてひとつのプラスミドベクターに組み込むことによって、その関連した2つ以上の遺伝子をひとつのプラスミドベクターから発現し、それらの産物からなる機能複合体を発現させることもできるが、本明細書では便宜上、そのような場合もこの2つ以上の遺伝子をひとつの「遺伝子」、またはひとつの「クローン」、またはひとつの「ｃDNA」と呼ぶ。たとえば、インターロイキン-12（IL-12）は、ｐ３５とｐ４０の2つの遺伝子の産物からなるヘテロダイマーであって、ｐ３５とｐ４０それぞれ単独ではIL-12としての活性を呈することはできないので、ｐ３５とｐ４０の２つのｃDNAを、便宜上１つの遺伝子と考えて、ｐ３５とｐ４０の両方が組み込まれたひとつのプラスミドベクターを構築することができ、これを上記のプラスミドベクターの集合体の要素として加えることができる。
【００２７】
本発明にかかる集合体は、上記クローンを１００以上含む。クローン数が多いほど好ましく、好ましくは３００クローン以上、より好ましくは５００クローン以上、さらに好ましくは１０００クローン以上、特に好ましくは１００００クローン以上である。
【００２８】
本発明の集合体をより有効に活用する方法として、本発明の集合体と同時に、ｃDNAの塩基配列を提供することが望ましい。また、個々のｃDNAについて、コードするたんぱくのアミノ酸配列、遺伝子とたんぱくがどのような細胞に発現しているか、これまでにわかっている遺伝子/たんぱくの機能、遺伝子/たんぱくの他の種におけるカウンターパートの配列と発現パターンと機能、遺伝子/たんぱくについてこれまで公開されている論文、特許等の情報が同時に提供されるのが望ましい。個々のｃDNAに関するこれらの情報は、データベースに基づいてコンピューターで管理するのが望ましい。
【００２９】
本発明が提供するプラスミドベクターの集合体に含まれる一つひとつのプラスミドベクターのクローンは、EBNA1遺伝子の発現ユニットとともに、配列が既知のひとつの遺伝子のｃDNA（望ましくは完全長のｃDNA）の発現ユニットを含んでいるため、機能解析等の目的でひとつ以上の遺伝子が必要となった際には、この集合体の中からその遺伝子に対応するそれぞれのクローンを提供することができる。この場合、ひとつ以上の遺伝子を指定するためには、遺伝子の名称として指定することもできるし、全長もしくは一部のヌクレオチド配列をもつ遺伝子として指定することもできるし、全長もしくは一部のヌクレオチド配列に相同性を有する遺伝子として指定することもできるし、特定の細胞や細胞集団に発現している遺伝子として指定することもできるし、一定の範囲内のサイズや何らかの塩基配列上の特色を有するものとして指定してもできる。また遺伝子がコードするたんぱくに関して、そのたんぱくの名称で指定することもできるし、その全長あるいは一部のアミノ酸配列をもつたんぱくとして指定することもできるし、その全長あるいは一部のアミノ酸配列に相同性を有するたんぱくとして指定することもできるし、一定の範囲内の分子量、一定の範囲内の親水性・疎水性、一定の範囲内の酸性・塩基性、何らかのアミノ酸配列上の特色（たとえば、膜貫通領域、シグナル配列、核移行シグナルなどの細胞内画分への移送のためのシグナル配列、リン酸化部位など）を有するものとして指定することもできるし、何らかの特徴的な立体構造、機能ドメインやドメイン構造（DNA結合領域、たんぱく−たんぱく相互作用、酵素活性、など）などを有するものとして指定することもできるし、予想される機能（レセプター、チャネル、細胞骨格、シグナル伝達分子など）を有するものとして指定することもできる。このように指定した条件に合ったクローンを、本発明が提供するプラスミドの集合体の中から選択し、それらを機能解析のための実験に供することができる。この選択は、塩基配列、アミノ酸配列、たんぱく立体構造などのデータベースの情報に基づいてコンピューターで選択することができる。
一方で、何らかの実験データによって得られた情報に基づいてクローンを選択することもできる。たとえば、ある病気に関連する遺伝子をスクリーニングする目的で、その病気の患者と健常者のサンプルを用いてDNAマイクロアレイ解析を行ない、その解析の結果から患者で高発現している遺伝子（あるいは患者で低発現している遺伝子）の集合を同定し、その集合のそれぞれに対応するクローンを本発明の提供するプラスミドの集団から選択してもよい。実験データとしては、例えば、病気のモデル動物と正常動物を対比して行なった実験、患者の病変部と健常部より得たサンプルで行なった実験、病気のモデル動物の病変部と健常部より得たサンプルで行なった実験などがある。またこれら実験を、DNAマイクロアレイでなく、プロテオミクス解析等で行なってもよい。別の例として、発生や細胞分化に関連する遺伝子を検索する目的で、異なる細胞系列間（たとえば神経細胞とグリア細胞）や分化段階の異なる細胞間（たとえば神経幹細胞と神経細胞）で発現の異なる遺伝子の集合をスクリーニングし、その集合のそれぞれに対応するクローンを本発明の提供するプラスミドベクターの集団から選択することもできる。
【００３０】
このように、機能解析実験は、（１）比較的簡便でコストの掛からない実験である場合などには、プラスミドベクターの集合体全体を用いて行なうこともできる。また（２）上記のように配列等のデータベース上の情報等に基づいて亜集団を選択してからその亜集団を用いて行なうこともできるし、（３）上記のように実験データに基づいて亜集団を選択してからその亜集団を用いて行なうこともできる。あるいは（４）このような選択の指標が無く、しかも機能解析実験が、簡便ではなく及び／又はコストの掛かる実験である場合などには、当該実験を目的としてプラスミドベクターの集合体全体から適当に（またはランダムに）亜集団を選択してからその亜集団を用いて行なうこともできる。
【００３１】
すなわち、本発明において、「所定の目的に基づいて選択された」とは、上記（２）、（３）のような場合のみならず（４）のような場合も含む。また、本発明において、亜集合体とは、本発明にかかる集合体から抽出されたものであって、集合体より少ない数のクローンからなる集団（すなわち上記（２）、（３）、（４）に示す亜集団に該当する）を指す。
【００３２】
本発明の提供するプラスミドベクターの集合体、または上記のように選択して得られたプラスミドベクターの亜集合体は、電気穿孔法、粒子銃法、カチオニックポリマー法、カチオニックリピッド法など、さまざまな方法を用いてヒトなど由来の培養細胞（たとえば腫瘍細胞、ES細胞、二倍体線維芽細胞など）、ヒトなどの生体由来の細胞（たとえば線維芽細胞、骨髄由来細胞、血液細胞など）、または培養組織（たとえば初期胚、中枢神経組織培養、胎児胸腺組織培養、軟骨組織培養など）にin vitroで導入することができる。このようにin vitroで遺伝子導入した培養細胞、生体由来の細胞、または培養組織を、実験動物（正常動物、または疾患モデル動物）に移植することができる。たとえば遺伝子導入した初期胚を、子宮内に移植することにより発生に関連する遺伝子の機能を解析することができる。また実験動物（正常動物、または疾患モデル動物）の特定の臓器、組織あるいは部位に（たとえば心臓、肝臓、神経、気道、肺、腎臓、皮膚、骨格筋、関節、胸腺、眼球、消化管、血管、腫瘍など）、または全身的に、電気穿孔法、粒子銃法、カチオニックポリマー法、カチオニックリピッド法、超音波法、naked DNA法など、さまざまな方法を用いて導入することができる。
【００３３】
遺伝子の機能を解析する手段としては、in vitroの培養細胞、または生体由来の細胞の場合は、形態的変化、増殖能、細胞周期、アポトーシス、ネクローシス、分化、脱分化、悪性化、脱悪性化、運動能、走化性、酵素活性、遺伝子発現の変化、細胞表面抗原の変化等を指標として測定することができる。あるいは個々の細胞に固有の性質（サイトカインやホルモン等の産生、色素等合成、細胞傷害活性、貪食能、アクションポテンシャル、収縮能など）を指標として測定することができる。実験動物へのex vivo、またはin vivo導入の場合は、全身的変化（形態、摂食・摂水・記憶・刺激に対する反応などの行動、体重、寿命など）のほか、個々の臓器に特有の変化（たとえば心臓の場合には、心拍（変時作用）、心電図変化、収縮力（変力作用）、心拍出量、血圧、冠血行動態、心筋虚血、心筋虚血に対する抵抗性、弁や心筋や心膜の形態的変化、炎症、薬剤等に対する応答性、ホルモン産生能など）を指標として測定することができる。
【００３４】
本発明の成果は、生物学・医学基礎研究のみならず、ゲノム創薬、遺伝子治療、再生医療、遺伝子診断などにつながる。
生物学・医学基礎研究への応用例を述べると、たとえばある細胞にある遺伝子（単数、または複数）を導入し、フェノタイプの変化を観察する実験を行なう必要が生じた場合、その遺伝子について、発現プラスミドベクターを新たに構築するのは時間と労力を要する。また従来型のプラスミドベクターで作成すると、導入・発現効率が悪く、また薬剤選択のためにさらに時間が掛かることがある。そこで本発明を用いると、研究者は希望する遺伝子を指定するだけでその遺伝子の高効率の発現プラスミドベクターを即座に入手し、直ちに導入実験を開始することができる。また、ある特徴を有するひとつまたは一群の遺伝子（たとえばサイトカイン遺伝子のすべて）を導入実験に用いたいような必要が生じたときも、それらｃＤＮＡ群のすべてを入手して発現ベクターを構築するのは容易ではないが、本発明を用いると、研究者はコンピューター検索にてそのような遺伝子群を指定し、それら遺伝子に対応するクローンをプラスミドベクターの集合体から選んでその亜集合体を即座に入手し、直ちに導入実験を開始することができる。このように、本発明は遺伝子機能解析研究を飛躍的に加速することができる。
ゲノム創薬への応用例を述べると、たとえばある疾患（たとえば心臓の疾患）において、正常に比して病気の心筋で強発現している遺伝子群を，DNAマイクロアレイやプロテオミクス解析によって見つけた場合、これら遺伝子群のうちのいくつかは，疾患の発症や進展に重要な役割を担っており，その遺伝子産物の機能を抑制することによって疾患の軽減や治療に繋がるような，そのような遺伝子である可能性がある．そこで本発明を用いて、これら遺伝子群のそれぞれを、正常動物の心筋に導入し、そのフェノタイプの変化を解析することによって、どの遺伝子が実際に病態発現に関与しているかを検索することができる。このようにして候補遺伝子が絞られた場合、そのコードしているたんぱくを標的とする薬剤をスクリーニングすることにより、その疾患に対する治療薬として効果がある新薬を創出することができる。
遺伝子治療への応用例を述べると、たとえばある疾患（たとえば心臓の疾患）において、正常に比し病気の心筋で発現減弱している遺伝子群を，DNAマイクロアレイやプロテオミクス解析によって見つけた場合、これら遺伝子のうちのいくつかは，心筋に導入することにより，疾患を抑制ないしは軽減できるような，治療遺伝子として有用な可能性がある（前述のゲノム創薬のときと逆である．すなわち，言い方を変えると，病気のときに発現が増加しているような遺伝子は発症に関連している可能性があり，分子標的医療のターゲットとなりうる一方，病気のときに発現が減弱しているような遺伝子は，発症に負に相関しているので，遺伝子治療のターゲットとなりうる）．そこで本発明を用いて、これら遺伝子を疾患モデル動物に導入（たとえば心筋にnaked DNA法で導入）し，その生理活性や病態に対する作用を解析することにより，実際に治療的価値のある遺伝子を見つけ出すことができる．
再生医療への応用例を述べると、たとえば再生医学では幹細胞（たとえばES細胞など）から組織細胞（たとえば神経細胞など）への分化を誘導、制御するシステムが必要とされている。そこで本発明を用いて、ある幹細胞を支持細胞と共培養する実験系に応用し、神経細胞への分化を誘導する可能性のある遺伝子群（神経細胞の分化や増殖に関わることが分かっている遺伝子あるいはそれらに相同性がある遺伝子群、または、胎児神経組織に発現する遺伝子群など）を支持細胞に個々に導入し、幹細胞から神経細胞への分化を促進するような遺伝子を検索同定できれば、その遺伝子産物を用いた神経組織の再生技術の確立、神経疾患への治療的応用に貢献できる。
【００３５】
以下の実験により、ｃＤＮＡ発現ユニットおよび、ＥＢＮＡ１遺伝子とoriＰ配列を有するプラスミドベクターの有用性を確認する。
【００３６】
[実験例１]
EBNA1とoriPは、in vitroにおいても、それぞれトランスとシスに作用することにより、遺伝子導入・発現効率の向上をもたらすことを確認する。
複製開始起点oriPは転写活性を調節すると言われているFamily of repeatsと複製に寄与すると考えられている Dyad symmetryで構成されている。遺伝子発現の増強には、そのいずれが関与しているのかについて調べるために、SV40 minimum promoter とその下流にluciferaseの遺伝子を組み込んだベクターPGV-Pをベースとして、そこにoriP , FR ,または DSを組み込んだ三種類のプラスミドを構築した（図１Ａ）。またインターナルコントロールとしてCAG promoterの下流にベータガラクトシダーゼ（beta-galactosidase）（beta-gal）遺伝子を配したベクターpGβを構築した（図１Ｂ）。
ヒト由来のHeLa、マウス由来の3T3およびCT26にEBNA1遺伝子を恒常的に発現する細胞（それぞれ、HLE、3T3E、CT26E）を作成した。これらの細胞に上記構築したプラスミドを電気穿孔法で導入した。導入後経時的に細胞を回収し、細胞エキストラクトを調整し、ルシフェラーゼアッセイとベータガラクトシダーゼアッセイを行って検討した。ルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼの活性の比を遺伝子発現とした。その結果を図２に示す。
ヒト由来の細胞株では、HeLaにルシフェラーゼ発現プラスミドを導入しても、導入後1-3日という短期間に薬剤選択なしに検出した場合、極めて低い酵素活性が認められたのみであった（図２A）。これに対して、EBNA1を発現するHLEにoriP全長を含むプラスミドを導入した場合には、oriPがない場合、あるいはEBNA1が存在しない場合に比し、劇的な遺伝子発現の増強が認められ、その増強の効果は導入第3日において約320倍であった（図２B）。これとは対照的に、FR、あるいはDSの配列のみを挿入したプラスミドを導入した場合には遺伝子発現の増強効果は認めなかった（図２B）。また、EBNA1ネガティブの細胞株HeLaでは、いずれのプラスミドを導入した場合でも増強は認めなかった（図２A）。
同様の結果は、マウス由来の3T3、CT26、およびそれら由来のEBNA1発現細胞株でも認められた。EBNA1を発現する3T3E、あるいはCT26EにpGV-P-oriPを導入した場合には著明な発現の増強が認められ、その増強の効果は導入第3日において約42倍（CT26）、あるいは64倍（3T3）であったのに対して、oriP全長の代わりにFR、あるいはDSの配列のみがルシフェラーゼベクターに挿入された場合、あるいはEBNA1が発現していない場合には、発現量は極めて低かった（図２C-F）。
これらの結果は、（１）EBNA1遺伝子がトランスに存在、発現している細胞に、oriPの全長を含むプラスミドを導入すると、oriP に対してシスに導入・発現効率の向上が起こる、（２）この導入・発現効率の向上は、ヒト由来の細胞でもマウス由来の細胞でも同様に起こる、（３）この導入・発現効率の向上には、oriPの全長が必要であり、FRのみ、あるいはDSのみでは起こらない、ことを示している。
【００３７】
[実験例２]
EBNA1遺伝子とoriPによる、遺伝子導入・発現効率の向上は、プラスミドの核内移行と転写活性化によってもたらされることを確認する。
遺伝子導入・発現の増強には、プラスミドの核内移行と転写活性化が寄与する可能性がある。そこでそれぞれの寄与の程度を評価する目的で、まず転写活性の上昇だけを評価する実験を行なった。oriPの下流にルシフェラーゼ遺伝子を持つplasmid、oriP-Lucを構築し、これを制限酵素処理によりリニアライズしたDNAを、同様にリニアライズしたハイグロマイシン発現ベクターpHygとともにHeLa、3T3、およびCT-26に共導入し、ハイグロマイシンにて選択することによりHeLa/oriP-Luc, 3T3/oriP-LucおよびCT-26/oriP-Luc細胞を樹立した。これらトランスフェクタントにEBNA1を発現させることでマーカー遺伝子の発現に変化があるかどうかを検討した。すなわちEBNA1発現ユニットをもつプラスミドpOS.E（図１Ｃ）、またはpOS.EのEBNA1遺伝子にフレームシフトを入れてEBNA1を発現しないように変異させたpOS.fE（図１Ｄ）を、pG.βと共導入後、３日目にルシフェラーゼアッセイとベータガラクトシダーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼの活性の比を遺伝子発現とした結果を図３に示す。
いずれの細胞株でも、EBNA1遺伝子を導入しない場合に比して、pOS.Eを導入した場合では16-20倍の遺伝子発現増強が認められた。これとは対照的に、pOS.fEではそのような増強効果は全く得られなかった。同様の結果は、それぞれの細胞について独立の3つ以上のトランスフェクタントのクローンを用いても再現された（データは示さない）。この実験で用いたトランスフェクタントにおいては、染色体にoriP-Lucの配列がインテグレートしているので、実験例１とは異なりルシフェラーゼの活性は、oriP依存性の転写活性化能に依存する。したがって、EBNA1がトランスに発現した場合に、oriPは転写プロモーター・エンハンサーとして働き、16-20倍の発現増強をもたらしたと考えられる。
【００３８】
[実験例３]
DNA複製は、EBNA1/oriP依存性の遺伝子導入・発現効率の向上には必須ではないことを確認する。
EBNA1はoriPを起点とするDNA複製を起こすことが、ヒト細胞では知られているが、げっ歯類細胞ではDNA複製は起こらないと言われている。この点を検証する目的で、HLE、3T3E、CT26EにpGVP-oriPを導入し、3日目にHirt法にて染色体外DNAを抽出、制限酵素処理ののちoriP 全長をプローブとするSouthern解析を行なった。dam  依存性methylation の有無により哺乳類細胞内で複製したoriP配列は大腸菌内で複製した場合と異なりMboIでは約0.7  kbのfragments２本と1.1  kbのfragment１本に切断される。またDpnIでは切断されないため2.5  kbのfragmentがハイブリダイズする（図４A）。結果を図４Bに示す。HLEでは、導入72時間後でMbo感受性、DpnI悲感受性のoriPフラグメントが検出されたのに対して、3T3E、CT26Eでは、そのようなバンドは認められなかった。したがって、従来報告されていたとおり、我々の細胞と実験系においても、oriPのDNA複製はヒト由来細胞の中でのみ起こり、マウス由来細胞では起こらないことが確認できた。実験例１，２の結果と合わせると、EBNA1−oriP依存性の遺伝子導入・発現効率の向上は、DNA複製には非依存性であることが明らかにされた。
【００３９】
[実験例４]
プラスミドDNAが核内移送されることとエピゾームとして存在していることを確認する。
oriPを含むプラスミドが、導入後EBNA1依存性に核内に移送されることを直接証明する目的で、EBNA1を発現しないK562、またはEBNA1を恒常的に発現するヒト白血病細胞株K562由来トランスフェクタント、KE細胞を、1日間の血清のdeprivationの後、5
mg/ml aphidicolinで処理し、細胞周期をG1/Sにシンクロナイズした（図５Bにセルサイクルアナリシスを示す）。pGVP-oriPを導入し、８時間後に細胞を細胞質と核に分画し、それぞれからDNAを抽出してoriPをプローブとするサザン解析を行なった。図５Aに示すように、KE細胞株より抽出した核からは、プラスミドが検出されたのに対して、K562細胞の核からは検出されなかった。一方、細胞質からは、いずれの細胞株からもプラスミドが検出された。この実験では細胞周期がG1/Sにシンクロナイズしてあるため、遺伝子導入8時間の時点でも核膜はインタクトであり、したがって、EBNA1が存在するときにのみ、oriPを有するプラスミドが核膜を通過して核内に移送されたことが示された。また、その泳動度から、プラスミドは染色体には組み込まれておらず、エピゾームとして存在していることが分かった。
【００４０】
[実験例５]
EBNA1とoriPは、in vivoにおいても、それぞれトランスとシスに作用することにより、遺伝子導入・発現効率の向上をもたらすことを確認する。
図６に示す５つのプラスミドを構築した。すなわち、EBNA1発現ユニット、beta-gal（ベータガラクトシダーゼ）発現ユニットとoriPを有するpGEG.beta（図６Ａ）、beta-gal発現ユニットを有するpG.beta（図６Ｂ）、beta-gal発現ユニットとoriPを有するpOG.beta（図６Ｃ）、EBNA1発現ユニットとoriPを有するpOG.E（図６Ｄ）、pOG.EのEBNA1コーディング配列内にフレームシフト変異を導入したpOG.fE（図６Ｅ）である（このフレームシフト変異は、pOG.E内のユニークなAccIII認識サイトをAccIIIで消化後、dNTP存在下でT4 DNA polymerase処理し、その後T4 DNA ligaseにてligationすることにより導入した）。
これらプラスミド10 pmolを単独、または２つのプラスミドを10 pmolずつ混ぜ、1.6 mlの生理的食塩水に溶解し、８週齢メスのBalb/cマウスに尾静脈より5秒以内で注入した。24時間後、マウスを安楽死させ、肝臓を採取し、湿重量200 mgの組織を1 mlの0.25 M Tris-HCl, pH 8.0内でホモジェネイトした。4゜Cで10分間、15,000 rpm 遠心後、その上清をbeta-galアッセイ、およびたんぱく濃度測定に用いた。それぞれのサンプルのbeta-galの活性（IU）をたんぱく量（mg）で補正し、遺伝子発現量とした。図７にその結果を示す。pGEG.betaはpG.beta、pOG.betaに比して、著明に高い発現を示した。oriPを有するpOG.betaからのbeta-galの発現は、pOG.Eの共導入により有意に向上したが、この上昇はpOG.fEの共導入によっては得られなかった。一方、oriPを持たないpG.betaからのbeta-galの発現は、pOG.Eの共導入によっても影響されなかった。このことは肝臓へのin vivo導入においても（１）EBNA1遺伝子とoriPの両方が共存すれば、遺伝子の導入・発現効率は向上する、（２）EBNA1遺伝子はトランスに働き、EBNA1のたんぱくが作用する、（３）oriPはシスに働く、ことが明白に示された。
【００４１】
[実験例６]
EBNA1遺伝子とoriPを含むプラスミドベクターによる、遺伝子導入効率と遺伝子発現効率の向上を確認する。
図８に示した、ポリリンカー配列（合成オリゴマー由来。BglII、SalI、NotI認識配列を含む）を有する４つのプラスミドを構築した。すなわちpGEG.4（図８Ｂ）とpSES.4（図８Ａ）はEBNA1遺伝子の発現ユニットとoriPを含むプラスミドベクター、pG.4（図８Ｄ）とpS.4（図８Ｃ）はこれらのEBV由来エレメントを含まない従来型のプラスミドベクターである。pSES.4はポリリンカーの上流とEBNA1遺伝子の上流にSRaプロモーターを有し、pS.4はポリリンカーの上流にSRaプロモーターを有する。pGEG.4はポリリンカーの上流とEBNA1遺伝子の上流にCAGプロモーター（Niwaらが開発したもの。Niwa H, et al., Gene 108: 193-199, 1991）を有し、pG.4はポリリンカーの上流にCAGプロモーターを有する。これらベクターを基本として、さまざまな遺伝子を挿入したプラスミドをin vivo , in vitro導入実験に用いた結果を以下に示す。すなわち、同じ遺伝子を含むpSESとpSの比較、あるいはpGEG.とpG.の比較により、EBNA1遺伝子とoriPが遺伝子導入の効率に及ぼす効果が検定できる。
まず、in vitroの電気穿孔法の実験結果を示す（図９）。pS.CD8a、およびpSES.CD8aは、それぞれpS.4、およびpSES.4のポリリンカーサイトに、マウスCD8a遺伝子cDNAを挿入したものであるが、これらを400 microlitterのK-PBS（30 mM NaCl, 120 mM KCl, 3 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2）に懸濁したKE細胞に電気穿孔法にて導入した（BioRad社、GenePulserII、0.41ｋV、500 microF、電極間距離10 mm）。２日間の培養後、細胞を回収し、phycoerythrin標識した抗マウスCD8a抗体で染色し、FACS  Caliburで解析した（薬剤選択は行なっていない）。pS.CD8a導入細胞では25%の細胞がCD8aを弱く発現するのみであったが（図９Ａ）、pSES.CD8a導入細胞はpS.CD8a導入細胞に比して3.4倍多くの細胞がCD8aを発現していた（86.8%）。さらに平均の蛍光強度（mean fluorescence intensity；MFI）を比較すると、pSES.CD8a導入細胞ではpS.CD8a導入細胞の75倍にも達していた（図９Ｂ）。これらの結果は、EBNA1とoriPを有するプラスミドの導入によって、従来型のプラスミドに比し、より多くのパーセントの細胞に導入することができること（導入効率の向上）、さらに導入された細胞における発現量を比較した場合、個々の細胞における発現の程度を強めることができること（発現効率の向上）が示された。
【００４２】
以下に示す実験例７〜１３によって、様々な導入方法で、またin vitroとin vivo の両方で、高い遺伝子導入効率と遺伝子発現効率が得られることを確認する。
【００４３】
[実験例７]
電気穿孔法によるin vitro導入
pGEG.4、およびpG.4に、ルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いた（それぞれpGEG.Luc、およびpG.Luc）。マウス由来悪性黒色腫細胞株、B16に、実験例６と同様に、電気穿孔法を施行し、pGEG.LucまたはpG.Lucを導入した。導入後経時的に細胞を回収し、細胞エキストラクトを調整し、ルシフェラーゼアッセイとたんぱく濃度の測定を行った（薬剤選択は行なっていない）。ルシフェラーゼ活性をたんぱく量で補正した数値を図10に示す。pG.Lucの導入では、非常に低いレベルのルシフェラーゼの発現が見られるのみであったが、pGEG.Lucの導入では、導入後2―6日で認められ、導入4日後のピーク時には約31倍高い発現が認められた。
【００４４】
[実験例８]
カチオニックリピッドによるin vitro導入
pGEG.4、およびpG.4に、マウスIL-12遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いた（それぞれpGEG.mIL-12、pG.mIL-12）（この場合、IL-12はｐ３５とｐ４０の2つの遺伝子の産物からなるヘテロダイマーであるので、ｐ３５とｐ４０の２つのｃDNAがinternal ribosomal entry site配列を挟んでタンデムに配置された、bicistronicな発現ユニットが挿入されている）。また、pGEG.4、およびpG.4に、マウスIL-18遺伝子を挿入したプラスミドベクターを構築した（それぞれpGEG.mIL-18、pG.mIL-18）。２ microgramのこれらプラスミドを、カチオニックリピッド10 microlitterとインキュベーション後、B1６に添加した。４日間の培養後、培養上清を回収し、ELISA法にてIL-12とIL-18の濃度を測定した（それぞれ、マウスIL-12 ELISA kit (R&D Systems Inc.)、マウス IL-18 ELISA kit (MBL, Nagoya, Japan)を用いた）。その結果を図11に示す。pGEG.mIL-12導入細胞はpG.mIL-12導入細胞に比し、約50倍高濃度のIL-12を産生していた（図１１Ａ）。また、pGEG.mIL-18導入細胞はpG.mIL-18導入細胞に比し、約60倍高濃度のIL-18を産生していた（図１１Ｂ）。
【００４５】
[実験例９]
カチオニックポリマーによるin vitro遺伝子導入
pGEG.4、およびpG.4に、大腸菌ベータガラクトシダーゼ（beta-gal）遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いた（それぞれpGEG.beta、pG.beta）。2 microgramのこれらプラスミドを、牛胎仔血清と抗生物質を含まないRPMI1640培地に溶解し、20 microgramのポリアミドアミン・デンドリマー（Qiagen, Germany）とともにインキュベートした。これをヒト由来前立腺癌細胞株、PC-3に添加後、培養し、その後経時的に細胞を回収した。細胞のライセート中のbeta-gal酵素活性（Units）とたんぱく濃度を測定し、たんぱく量で補正したbeta-gal酵素活性を図１２に示す。いずれのタイムポイントにおいてもpGEG.beta導入群がpG.beta導入群よりも高いbeta-gal活性を示し、ピーク時でのその差は約20倍であった。
【００４６】
[実験例１０]
naked DNA法による肝臓へのin vivo導入
pGEG.4、およびpG.4に、ルシフェラーゼGL3遺伝子を挿入したプラスミドベクターを用いた（それぞれpGEG.GL3、pG.GL3）。10 microgramのpGEG.4、またはpG.4を、1.6 mlの生理的食塩水に溶解し、８週齢メスのBalb/cマウスに尾静脈より5秒以内で注入した。その後マウスを経時的に安楽死させ、肝臓を採取後、そのエキストラクトをルシフェラーゼアッセイ、およびたんぱく濃度測定に用いた。それぞれのサンプルのルシフェラーゼ量（pg）をたんぱく量（mg）で補正し、遺伝子発現量とした。図13にその結果を示す。導入8時間後ではpG.GL3導入群でも極めて高いGL3の発現が見られたが、その後発現は激減した。pGEG.GL3群では、導入8時間後にはpG.GL3群に比し、約1.6倍の高発現が見られたが、その後も発現は比較的保たれたため、導入5日から60日後までは、48―170倍の高発現が認められた。
【００４７】
[実験例１１]
カチオニックポリマーによる腫瘍へのin vivo導入
ヒト前立腺癌細胞株PC-3を6 x 106個、50 microlitterのMatrigel  (Becton-Dickinson, NJ, USA)とともに8−9週齢のSCIDマウス側腹部に注入した。7日後に60 mm3以上の腫瘍が認められた（この日を第0日とした）。10 microgramのpGEG.Luc、またはpG.Lucを、90 microgramのポリアミドアミン・デンドリマー（Qiagen, Germany）とともにインキュベートしたものを、第0、2、4日に腫瘍の中に注入し、第7日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を切除した。実験例7と同様に腫瘍のライセートのルシフェラーゼ活性（RLU）とたんぱく濃度を測定した結果を図１４に示す。pGEG.Luc導入群において、pG.Luc導入群よりも8.6倍高い発現が得られた。
【００４８】
[実験例１２]
電気穿孔法による腫瘍へのin vivo導入
マウス悪性黒色腫細胞株B16を106個、5―6週齢のメスC57BL6マウスの側腹部に注射した。4日後に約75 mm3の腫瘍が認められた（この日を第0日とした）。5.5 pmolのpGEG.Luc、またはpG.Lucを50 microlitterのK-PBS（30 mM NaCl, 120 mM KCl, 3 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2）に溶解し、腫瘍内に注入後7本針の電極を装着し、CUY21（ネッパジーン）にて6回の電気パルスを与えた（フリケンシー=1s-1、パルス幅＝100 ms、電圧＝50 V、最初の3回と後の3回は極性を逆にした）。コントロールとして、pGEG.Lucを注入したが電気パルスを与えなかった群も作成した。この処理を第0日と第2日に行なった後、第4日にマウスを安楽死させ、腫瘍を切除した。実験例7と同様に腫瘍のラーセートのルシフェラーゼ活性（RLU）とたんぱく濃度を測定した結果を図１５に示す。pGEG.Luc導入群において、pG.Luc導入群よりも約20倍高い発現が得られた。pGEG.Lucを注入したが電気パルスを与えなかった群（E（−））は、有意な発現を認めず、電気パルスが導入に必要であることを示している。
【００４９】
[実験例１３]
遺伝子銃による心臓へのin vivo導入
10―12週齢のオスWistarラットを50 mg/kg体重のペントバルビタールの腹腔内投与により全身麻酔し、呼吸管理下に置いた。開胸後、左心室に遺伝子銃による導入を行なった。すなわち、20 microgramのpSES.betaまたはpS.betaを、5 mgの金粒子（直径1.0 micrometer）とともにエタノール沈殿した後、500 microlitterのエタノールに懸濁し、その20 microlitterを25 mm厚のチタンプレートに塗抹した。このチタンプレートをTF-1遺伝子銃装置（日本医科器械製作所）に装着し、1.05 MPaのヘリウム圧で心臓に爆撃した。同様の処置を2回行なったのち、縫合した。７日後、ラットを安楽死させ、心臓の切片を実験例１２と同様にX-gal染色し、実体顕微鏡下で観察した。図１６に示されるように、pSES.betaを導入した心筋の方が、pS.betaを導入した心筋よりも広範囲に、そして多くの細胞が、強く染まっており、EBNA1とoriPによって導入効率が高まったことが確認できた。
【００５０】
実験例７〜１３により、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターが、様々な導入方法で、またin vitroでもin vivoでも、高い遺伝子導入効率と遺伝子発現効率を示すことが確認できた。
【００５１】
以上の実験例１〜１３により、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターが、核内への移行と維持、および転写の亢進を達成できること、導入細胞内でエピゾームとして存在すること、さらにin vivoとin vitroの両方で高い導入効率・発現効率を実現できることが確認できた。従って本発明者らは、遺伝子の網羅的機能解析を行うために最適なプラスミドベクターとして、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターを選択し、本発明にかかる集合体を構成した。
【００５２】
以下の実施例１および２において、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターの集合体を用いて、実際に、多数の遺伝子の網羅的な機能解析を行い、その有用性を検討する。
【実施例１】
【００５３】
遺伝子の網羅的機能解析における有用性の検討1（in vitroケモタクシスアッセイ）
配列が既知の109種類のマウスcDNAをそれぞれpGEG.4に組み込んで、109のプラスミドベクターを作成し、この109種類の遺伝子をケモタクシスアッセイに供して、遺伝子の網羅的機能解析を行った。
【００５４】
Balb/cマウスを安楽死させ、骨髄細胞を10%牛胎仔血清を添加したRPMI1640培地（ナカライテスク、京都）で懸濁し、リコンビナント顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF），およびIL-4（eBioscience）（それぞれ10 ng/ml）存在下で培養した（第0日）。8日後、リポポリサッカライド（LPS）（10 microgram/ml）(Sigma)を加えてさらに1日培養し、成熟樹状細胞（成熟DC）とした。第７日に、上記プラスミドの集合体の個々のクローン由来のDNA（それぞれ5 microgram）とポリアミドアミン・デンドリマー（SuperfectTM、Qiagen, ドイツ）（50 microliter）の複合体を形成せしめ、それらをB16細胞に添加後、2時間後にPBS（−）でリンス後、10%牛胎仔血清を添加したRPMI培地内で培養した。第９日に、TranswellTM（diameter：6.5 mm, pore size：5.0 micrometer）（Corning）の個々のLower chamberに、上記B16それぞれの上清を600 microliter加え、Upper chamberに2×105/100 microliterの成熟DCを加え、5% CO2インキュベーター内で37Cで3時間インキュベートした。Lower chamber内に遊走した細胞を回収し、FACS Calibur（Becton-Dickinson）にて解析した。その際サンプル圧を最大とし、20 秒間サンプルを流す間の生細胞のゲートに入るイベント数を計測した．また、2×105/600 microliterに調製した成熟DCを同様にFACS解析し、このイベント数をMAXとした。また、Upper chamberに2×105/100 microliterの成熟DCを加え、Lower chamberに10%牛胎仔血清を添加したRPMI培地を600 microliter加えたTranswellを準備し、5% CO2、37Cで3時間インキュベートした後、Lower chamberに移動した細胞を回収し，同様にFACS Caliburで解析してそのイベント数をSPONTとした。それぞれのクローンの「遊走細胞の率（％）」を以下の式に従って求めた。遊走細胞の率（％）＝100ｘ（Sample−SPONT）／（MAX−SPONT）
【００５５】
その結果、109クローン中の１つのクローンについて、成熟DCの遊走を有意に促進する活性を見出した。そこでこのクローンについて、さらに遊走活性を詳細に検討した。すなわちLPSで成熟させたDCに加えて、LPSの代わりにO-K-432（10 microgram/ml）(中外製薬)の添加により成熟させたDC、またBalb/c由来骨髄細胞をリコンビナントGM-CSFおよびIL-4存在下で8日間培養したのち，さらに１日間同じ条件で培養することにより得られた未熟DC、またBalb/c由来脾細胞を用いて、同様の実験を行なったところ、図１７に示すように、このクローンの上清は、未熟DC、成熟DCの両方に有意な遊走能亢進活性を示したが、成熟DCに対する方が未熟DCに対するよりもより強力な走化性誘導能を示した。一方、脾細胞を標的としたときには、その遊走を刺激する活性は全く認めず、したがってT細胞、B細胞の走化性に対しては影響を与えないことが分かった。
【００５６】
本実施例により、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターを利用したｃＤＮＡ発現プラスミドの集合体を用いることによって、多数の遺伝子の中から、DCの走化性に関与するたんぱくの遺伝子を極めて迅速に特定することができた。
【実施例２】
【００５７】
遺伝子の網羅的機能解析における有用性の検討（２）
実施例１の109のプラスミドベクターからなる集合体を利用して、上記109種類の遺伝子の網羅的機能解析を行い、この109種類の遺伝子のそれぞれの産物が、抗癌剤による腫瘍細胞のアポトーシス誘導を促進するか否かを検討する。
【００５８】
アクチノマイシンDは腫瘍細胞にアポトーシスを誘導するが、癌患者に高濃度の薬剤を投与すると、強い副作用を起こす可能性がある。そこでサブオプティマルのアクチノマイチンD処理と共存することによって、アクチノマイチンDのアポトーシス誘導能を著明に向上させるようなたんぱくが見つかれば、癌の化学療法を効果的に施行できるのみならず、抗癌剤による全身的副作用を軽減できる新しい癌治療のプロトコールを樹立できる可能性がある。
上記109のプラスミドベクター由来のDNA（それぞれ5 microgram）とポリアミドアミン・デンドリマー（SuperfectTM、Qiagen, ドイツ）（50 microliter）の複合体を形成せしめ、それらをB16細胞に添加後、2時間後にPBS（−）でリンス後、10%牛胎仔血清を添加したRPMI培地内で培養した。2日後に培養上清を回収した。マウス大腸がん細胞株CT-26をRPMI培地に懸濁し、6 well plateの3つのwellに、1 x 105/wellの濃度で撒いた（コントロール）。またCT-26をアクチノマイシンDを10 ng/mlの濃度に加えたRPMI培地に懸濁し、6 well plateの3つのwellに、1 x 105/wellの濃度で撒いた。またCT-26をアクチノマイシンDを20 ng/mlの濃度に加えたRPMI培地に懸濁し、6 well plateに1 x 105/wellの濃度で撒き、ここにさらに上記の遺伝子導入B16細胞の上清それぞれを50%加えたwellを作成した（アクチノマイチンDの最終濃度は10 ng/ml）（各クローン1 well）。24時間後、細胞を回収し、抗アネキシンV抗体で染色後、FACS Calibur（Becton-Dickinson）で解析した。コントロール細胞はアネキシンV陽性細胞は５％以下であったのに対し、アクチノマイチンD添加細胞は１５−２５％がアネキシンV陽性であった。
【００５９】
その結果、109クローン中の１つのクローンについて、10 ng/mlのアクチノマイチンDとともに遺伝子導入B16細胞の上清を加えた場合に、３５％以上のCT-26細胞がアネキシンV陽性となったため、このクローンについてさらに詳細に検討した。すなわち上記と同様の実験を、コントロール群、アクチノマイシンD（10 ng/ml）添加群、アクチノマイシンD（10 ng/ml）と遺伝子導入B16細胞の上清を加えた群のほかに、新たに遺伝子導入B16細胞の上清を加えアクチノマイシンDは加えない群も準備し、いずれの群もトリプリケートで行なった。上記と同様に、培養後24時間の細胞に対して抗アネキシンV抗体を用いたFACS解析を行ったところ、図１８に示す結果を得た。アネキシンV陽性のアポトーシス細胞は、アクチノマイシンD処理単独でも約18.3％認められるものの、遺伝子導入B16細胞の上清を共存させることで、約48.3％に著増した。一方、遺伝子導入B16細胞の上清単独では細胞死はほとんど誘導しなかった。
【００６０】
本実施例により、EBNA1遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターをベースとした、多くのｃＤＮＡ発現ベクターのクローンからなる集合体を利用して、多くの遺伝子の中からサブオプティマルの抗癌剤と相乗的に働いて腫瘍細胞死を有効に導く遺伝子を迅速に発掘することができた。
【００６１】
実施例１および２により、本発明の集合体を利用して、多数の遺伝子の機能解析を迅速かつ効率的に行うことができることが実証され、これにより本発明の集合体が、遺伝子の網羅的機能解析に非常に有効であることが証明された。
【００６２】
実施例３において、本発明の集合体から得られた亜集合体を用いた一実施例を示す。
【実施例３】
【００６３】
DNAワクチンin vivoモデル系を用いたEBV cDNA発現ミュージアムの応用例
実施例１のプラスミドベクターの集合体から、個々のクローンの遺伝子産物の機能をin vivoで検証するスクリーニング実験の例として、この集合体由来のDNAをDNAワクチンのアジュバントとして用いた。
【００６４】
実施例１のプラスミドベクターの集合体から、データベース上の情報（配列・構造上の特色と機能的情報）から免疫応答に関与する可能性があると考えられるｃDNAを含むプラスミドを２８クローン抽出し、この亜集合体を用いて、以下のスクリーニングを行なった。ヘルペスI型ウイルス（HSV-1）のglycoproteinB（gB）をpGEG.4のポリリンカー部位に組み込んだプラスミドベクター、pGEG.gBを構築した。pGEG.gB（1 microgram）、またはpGEG.gB（1 microgram）とプラスミドの亜集合体由来の各クローンのDNA（1 microgram）のミクスチャーを、1.6 mlの生理的食塩水に溶解し、８週齢メスのBalb/cマウスに尾静脈より5秒以内で注入した（各群6匹）（第-10日目）。7日後、各マウスに同じDNA、または同じDNAの組み合わせを、同じ方法で静注した（第-3日目）。コントロールのマウスは、第-10日目と第-3日目に1.6mlの生理的食塩水のみを同じ方法で静注した。第0日目に、105 プラーク形成ユニット（pfu）/mlのHSV-1懸濁液を0.1 ml、マウスに腹腔内注入し、その後のマウスの生存率を経時的に観察した。
【００６５】
その結果、28クローン中の１クローンについて、DNAワクチンの効果を増強する活性が見出された。図１９に示すとおり、生理的食塩水のみを注入したコントロール群では、9日以内にすべてのマウスが死亡し、このHSV-1感染がマウスに致死的な急性感染を引き起こすことが分かった。pGEG.gBを注入した群では、6匹中5匹は13日以内に死亡したが、1匹は35日以上生き延びた。これはgB遺伝子導入がワクチンとして働き、6匹中1匹のマウスの急性感染が防御できた可能性があるが、コントロール群と統計的には有意差はなく、ワクチンの効果ははっきりしない。以前出願人らは、5 microgramのpGEG.gBを同様のスケジュールで投与すると、80%のマウスをHSV接種後の感染死から守れることを見出しており、したがってpGEG.gBの静脈内投与はワクチンとして有効な手段ではあるが、1 microgramのpGEG.gBでは十分ではないと考えられる。ところがプラスミドの集合体由来の各クローンのDNA（1 microgram）を共導入したマウスでは、１つのクローンについて、6匹中6匹がHSV-1感染後も35日以上生き延びた。したがってこのクローンがコードするたんぱくが、gBの遺伝子ワクチンに対してアジュバント的に働いて、マウスがウイルスに対して完全な抵抗性を獲得したものと考えられる。
【００６６】
この結果は、本発明にかかる集合体をin vivoのスクリーニング実験に供することにより、多くのクローンの中からDNAワクチンの抗ウイルス免疫誘導能を増強する活性を示すクローンを発掘することが可能であるということを示している。
【００６７】
実施例３により、EBNA１遺伝子とoriP配列を有するプラスミドベクターに、配列が既知のｃDNA発現ユニットを一つずつ組み込んだ集合体を構成しておくことにより、この集合体から所望のｃDNAを有するプラスミドベクターを選び出し、その亜集合体を用いて遺伝子機能を迅速に調べることができることが実証できた。すなわち、所定の目的に基づいて選択された遺伝子群に対応するｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを、上記集合体から抽出して亜集合体を作り、その亜集合体を使った導入・発現実験を行なうことにより、遺伝子の網羅的機能解析を非常に迅速かつ効率的に行うことができることが実証された。
実施例１，２，３により、本発明にかかる集合体が、遺伝子の網羅的実験を行うために非常に有用な研究ツールとなることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】プラスミドのマップ。複製開始起点oriPはFamily of repeats（FS）と Dyad symmetry（DS）で構成されている。SV40ミニマムプロモーター とその下流にルシフェラーゼの遺伝子を組み込んだベクターPGV-Pをベースとして、そこにoriP , FR ,DSをそれぞれ組み込んだ三種類のプラスミドを構築した。またインターナルコントロールとしてCAG プロモーターの下流にベータガラクトシダーゼの遺伝子を配したベクターpGβを構築した。ポリA＝ポリA付加シグナル。EBNA1＝EBNA1遺伝子。
【図２】in vitroにおけるEBNA1遺伝子とoriPの協調作用。HeLa、3T3、CT26、およびそれらの細胞にEBNA1遺伝子を恒常的に発現するトランスフェクタント（HLE、3T3E、CT26E）に、ルシフェラーゼ発現プラスミドとpG.βを電気穿孔法で共導入した。導入後1-3日後の細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイとベータガラクトシダーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼの活性の比を示す。
【図３】EBNA1/oriPによる転写活性化能。HeLa、3T3、CT26それぞれにoriP-Lucを導入したトランスフェクタント（HeLa/oriP-Luc、3T3/oriP-Luc、CT26/oriP-Luc）に、pOS.EまたはpOS.fEとpG.βを電気穿孔法で共導入した。導入後３日後の細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイとベータガラクトシダーゼアッセイを行ったルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼの活性の比を示す。
【図４】DNA複製は遺伝子導入・発現効率の上昇に必須ではない。A．oriPの模式図。bp＝base pair。kb＝kilo base pair。B. HLE、3T3EまたはCT26EにpGVP.oriPを導入し、3日後にHirt  lysateを抽出した。DNAをXhoI、Xho1とMboI、Xho1とDpnI、またはXho1とSau3AIで処理後、1% agarose gelで電気泳動し、ナイロンメンブレンにブロット後oriPプローブとハイブリダイズした。2.5 kb、1.1 kb、0.7 kbのバンドの位置を右に示す。また、哺乳細胞内で複製したoriP配列に由来するバンド（DpnI消化後の2.5 kbのバンド、およびMboI消化後の1.1 kbと0.7 kbのバンド）の位置を、HLEのパネル内に三角矢印で示す。
【図５】EBNA1/oriPによる核内移行。K562、またはKE細胞を、1日間の血清のdeprivationの後、5 microgram/ml のaphidicolinで処理することにより、細胞周期をG1/Sにシンクロナイズした。pGVP-oriPを導入し、８時間後に細胞を細胞質と核に分画し、それぞれからDNAを抽出して1% agarose gelで電気泳動し、ナイロンメンブレンにブロット後oriPをプローブとするサザン解析を行なった（A）。一方、トランスフェクション前の細胞の一部をPropidiumiodideを用いたセルサイクルアナリシスに供した（B）。
【図６】プラスミドのマップ。ベータガラクトシダーゼ＝大腸菌ベータガラクトシダーゼ遺伝子、EBNA1＝EBNA1遺伝子、アンピシリン耐性＝アンピシリン耐性遺伝子、ポリA＝ポリA付加シグナル。
【図７】in vivoにおけるEBNA1遺伝子とoriPの協調作用。10 pmolのプラスミド、または10 pmolずつの２つのプラスミドを、マウスに高圧下尾静脈内注入した。24時間後の肝臓のベータガラクトシダーゼ活性を示す（たんぱく量で補正してある）。各群のマウスの数は、N=5。バーは±S.D.
【図８】プラスミドのマップ。EBNA1＝EBNA1遺伝子、アンピシリン耐性＝アンピシリン耐性遺伝子、ポリA＝ポリA付加シグナル。
【図９】EBNA1遺伝子とoriPの作用で、遺伝子導入効率と発現効率の両方が向上する。KE細胞に電気穿孔法でpSES.CD8a、またはpS.CD8aをin vitro導入後、2日目に抗CD8a抗体で染色してFACS解析を行なった。横軸は平均蛍光強度（対数）、縦軸は相対頻度。
【図１０】電気穿孔法によるin vitro導入。B16細胞に電気穿孔法でpGEG.Luc、またはpG.Lucをin vitro導入後、経時的に細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイを行なった。ルシフェラーゼの活性（RLU）はたんぱく量で補正し、平均±S.D.（クアドロプリケート）で表している。
【図１１】カチオニックリピッドによるin vitro導入。B16細胞にカチオニックリピッドにてpGEG.mIL-12またはpG.mIL-12（A）、またはpGEG.mIL-18またはpG.mIL-18（B）をin vitro導入後、4日目に培養上清を回収し、ELISAにてIL-12（A）、またはIL-18（B）の濃度を測定した。平均±S.D.（トリプリケート）で表している。
【図１２】カチオニックポリマーによるin vitro導入。PC-3細胞にポリアミドアミンデンドリマーにてpGEG.beta、またはpG.betaをin vitro導入後、経時的に細胞を回収し、ベータガラクトシダーゼ・アッセイを行なった。ベータガラクトシダーゼの活性（Units）はたんぱく量で補正し、平均±S.D.（ヘキサプリケート）で表している。
【図１３】Naked DNA法による肝臓へのin vivo導入。pGEG.GL3、またはpG.GL3を、マウスに高圧下尾静脈内注入したのち、経時的に肝臓のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ量（pg）はたんぱく量で補正し、平均±S.D.で表している。各群のマウスの数は、N=5。バーは±S.D.  *P＜0.005, **P ＜0.001（Student's t test）。
【図１４】カチオニックポリマーによる腫瘍へのin vivo導入。pGEG.Luc、またはpG.Lucを、ポリアミドアミンデンドリマーにてマウスに移植したPC-3腫瘍にin vivo導入した。第0、2、4日に導入後、第7日に腫瘍を摘出し、肝臓のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性（RLU）はたんぱく量で補正し、平均±S.D.で表している。各群のマウスの数は、N=6。バーは±S.D.
【図１５】電気穿孔法による腫瘍へのin vivo導入。pGEG.Luc、またはpG.Lucを、マウスに移植したB16腫瘍に注入した後、電気パルスを与える（E（＋））または与えない（E（-））処置を行なった。第0、2日に導入後、第4日に腫瘍を摘出し、肝臓のルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性（RLU）はたんぱく量で補正し、平均±S.D.で表している。各群のマウスの数は、N=4。バーは±S.D.  有意差はStudent's t testにて行なった。
【図１６】遺伝子銃による心筋へのin vivo導入。ラット心筋に、pSES.beta、またはpS.betaを遺伝子銃にてin vivo導入した。導入後7日目の心臓を回収し、切片をX-galで染色後、実体顕微鏡下で観察した。濃く見えるのは、X-galに染色した心筋。
【図１７】DCに選択的に走化活性を示すcDNAクローンの発掘。トランスウェルのUpper chamberに加えた全脾細胞、未熟DC、LPS処理DC、またはO-K-432処理DCが、Lower chamberに加えたプラスミドの集合体由来のcDNAクローンを導入B16の上清によって遊走するか否かをスクリーニングしたところ、１０９クローン中１つのクローンについて、図に示す遊走活性を各細胞に対して示した。遊走細胞の率（％）はトリプリケートの平均を示す。
【図１８】サブオプティマルの抗癌剤と相乗的に働いて腫瘍細胞のアポトーシスを促進するcDNAクローンの発掘。CT26大腸癌細胞を、10 ng/mlのアクチノマイチンD存在下で培養し、そこにさらにプラスミドの集合体由来のcDNAクローンを導入したB16の上清を加えた際に、24時間培養後にアネキシンV陽性細胞が増加するようなクローンをスクリーニングしたところ、１０９クローン中１つのクローンについて、図に示す活性を得た。アネキシンV陽性細胞をアポトーシス細胞とした。
【図１９】DNAワクチンの抗ウイルス免疫応答誘導能を増強するcDNAクローンの発掘。pGEG.gB、またはpGEG.gBとプラスミドの集合体由来のプラスミドの亜集合体のcDNAクローンをマウスにnaked DNA法にて導入後、致死量のHSV-1を感染させた。感染後のマウスの生存率を追跡したところ、28クローン中の１クローンについて、図の黒丸に示すように全マウスがHSV-1に抵抗性を呈し、DNAワクチンに対して強力なアジュバント作用を有する遺伝子が発掘できることが分かった。
【図２】
2005295809.tif 000002
【図３】
2005295809.tif 000003
【図６】
2005295809.tif 000004
【図７】
2005295809.tif 000005
【図９】
2005295809.tif 000006
【図１０】
2005295809.tif 000007
【図１１】
2005295809.tif 000008
【図１２】
2005295809.tif 000009
【図１４】
2005295809.tif 000010
【図１７】
2005295809.tif 000011
【図１８】
2005295809.tif 000012
【図１９】
2005295809.tif 000013
【図１】
2005295809.tif 000014
【図４】
2005295809.tif 000015
【図５】
2005295809.tif 000016
【図８】
2005295809.tif 000017
【図１３】
2005295809.tif 000018
【図１５】
2005295809.tif 000019
【図１６】
2005295809.tif 000020