(57)【要約】  【課題】  マイクロチップの分離流路中で成分分離された試料の一部又は全体を高い感度でイメージング検出する。  【解決手段】  電気泳動チップ１０の分離流路１８に流す試料は予め蛍光標識しておき、レーザ光源２０から出射した光を、チップ１０下側の透明平板と分離流路１８中の試料液との境界面に対して臨界角以上の全反射角θで以て照射する。その境界面で全反射した光によって、境界面の向こう側つまり試料液内には近接場光のしみ出しが生じ、その近接場光を励起光として試料液中の蛍光物質が蛍光を発する。この蛍光をＣＣＤセンサ２４で検出し、その蛍光像をモニタ２９上に表示する。光の照射範囲を適宜設定することで、分離流路１８のごく一部（１点検出）の蛍光スポットのほか、流路１８全体の蛍光像を得ることもできる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)蛍光標識された試料液が流通する過程で成分分離を行うため微小の分離流路が形成されて成るマイクロチップと、
b)前記マイクロチップの分離流路の少なくとも一部を近接場光で照明するために、該マイクロチップに対して所定角度で以て且つ所定範囲に対して光を照射する光照射手段と、
c)前記光照射手段による照射光により生じる近接場光を励起光として前記分離流路中に存在する蛍光標識された試料液から放出される蛍光を受光する光検出手段と、
を備えることを特徴とするマイクロチップを用いた成分分析装置。
【請求項２】
a)蛍光標識された試料液が流通する過程で成分分離を行うため微小の分離流路が形成され、且つ該分離流路の少なくとも一部を近接場光で照明するための光導波路が設けられたマイクロチップと、
b)前記マイクロチップの光導波路の境界面で全反射が生じるように該光導波路に対して光を導入するべく光を照射する光照射手段と、
c)前記照射光によって前記光導波路の境界面の外側に生じる近接場光を励起光として前記分離流路中にある試料液から放出される蛍光を受光する光検出手段と、
を備えることを特徴とするマイクロチップを用いた成分分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として生化学、分子生物学、臨床医学、特にＤＮＡやタンパク質の解析分野等で利用されるに好適な、マイクロチップを用いた成分分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
キャピラリ電気泳動法（ＣＥ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、糖類等の生体成分の分析のほか、光学分割、同位体の分離等、構造が類似している成分を分離するのに適した方法であり、臨床医学や医薬品、環境物質のモニタリング等の用途に広く利用されている。特に、フォトリソグラフィ技術等を利用して微小流路を形成したマイクロチップ型の装置（マイクロチップ電気泳動装置）は取扱いが非常に容易であり、近年、ＤＮＡの解析等に盛んに利用されるようになっている。
【０００３】
図８は例えば特許文献１、２などにより従来から知られている電気泳動チップの一例を示す平面図、図９はこの電気泳動チップの外観斜視図である。電気泳動チップ１０は、ガラス板、石英ガラス板などから成る一対の透明平板１１、１５から構成される。下側の透明平板１１の上表面には、試料延伸溝１２と泳動溝１３とが交差する（これを「交差部１４」とする）ように形成され（図８（ｂ）参照）、上側の透明平板１５にはその両溝１２、１３の各端部に対応する位置にそれぞれ貫通孔１６が穿孔されている（図８（ａ）参照）。溝１２、１３は、透明平板１１の表面に例えばエッチングにより形成されており、溝部分の幅は１０〜１００μｍ程度、深さは５〜５０μｍ程度である。
【０００４】
図８（ｃ）に示すように、上述の一対の透明平板１１、１５は、溝１２、１３を内側にして貼り合わされる。これによって、電気泳動チップ１０の内部には、貫通孔１６により形成される第１及び第２リザーバＲ１、Ｒ２で以て外部と連通する試料導入流路１７と、第３及び第４リザーバＲ３、Ｒ４で以て外部と連通する分離流路１８とが形成されている。各リザーバＲ１〜Ｒ４は、外部より泳動液などの液体を導入するためのキャピラリを受け入れるようになっており、また、そこに貯留している泳動液に電圧を印加するための電極（図示しない）がそれぞれ設けられている。この電極は、例えば一方の透明平板の表面にフォトリソグラフィにより形成された導電性薄膜から成り、連続してその透明平板の端面に至るように形成されているものとすることができる。
【０００５】
こうした電気泳動チップ１０を用いた一般的な測定手順は次の通りである。すなわち、まず、流路全体に泳動液を充填する。次いで、第１リザーバＲ１に試料を微量（１〜２μＬ程度）注入し、流路デザインと泳動条件が最適化された高電圧を各リザーバＲ１〜Ｒ４に印加する。一例としては、まず第１及び第４リザーバＲ１、Ｒ４に０．６ｋＶ、第３リザーバＲ３に０．３ｋＶの電圧を印加し、第２リザーバＲ２を接地する。すると電位差によって、第１リザーバＲ１に注入された試料は試料導入流路１７に入り、交差部１４を通過して第２リザーバＲ２の方向へ移動する。このとき、第３及び第４リザーバＲ３、Ｒ４からもそれぞれ第２リザーバＲ２の方向へ泳動液が移動するので、このような試料導入期間中に試料が分離流路１８側へと拡散することはない。
【０００６】
続いて、第１及び第２リザーバＲ１、Ｒ２に０．２ｋＶ、第３リザーバＲ３に０．５ｋＶの電圧を印加し、第４リザーバＲ４を接地する。すると電位差によって、交差部１４に存在する試料が分離流路１８内に導入され、第４リザーバＲ４の方向へと泳動する。試料導入流路１７内では、交差部１４よりも第１リザーバＲ１側に存在する試料は第１リザーバＲ１へ戻るように移動し、交差部１４よりも第２リザーバＲ２側に存在する試料は第２リザーバＲ２へ向かって移動する。したがって、交差部１４の容積に依存する所定量の試料のみが分離流路１８に導入される。
【０００７】
上述のように試料が分離流路１８内を泳動する際に、その試料に含まれる各種成分は分離される。こうして分離された試料に対して、落射蛍光光学系を有する蛍光分光検出器による１点蛍光度検出や紫外可視吸収検出器を用いた１点ＵＶ吸光度検出により、横軸を泳動時間としたエレクトロフェログラムが取得される。
【０００８】
しかしながら、こうした分離流路１８上の１個所のみにおける検出では、分離流路１８に沿って広がった試料成分の分離・移動状態の全体像をイメージとして捉えることができない。特許文献１に開示されているような紫外可視吸収検出器を利用したＵＶイメージング検出を用いれば、分離流路１８に沿った所定範囲の試料成分の広がりを画像として捉えることが可能ではあるものの、試料自体による吸光を利用したＵＶ検出では蛍光検出に比べて検出感度がかなり悪く、成分濃度が低い場合やもともと吸光度が低いような成分を充分に検出することが難しいという問題がある。また、蛍光検出はＵＶ検出と比較すれば背景光の影響を受けにくいものの、さらに分析感度や精度を高める上では背景光の影響が無視できない。
【０００９】
【特許文献１】特許第３０７７６０９号公報
【特許文献２】特許第３４１７３４４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はかかる課題に鑑みて成されたものであり、その主たる目的とするところは、電気泳動や送液ポンプなどを利用して試料成分を分離する成分分析用マイクロチップを用いた成分分析装置において、分離された試料成分をそのマイクロチップの分離流路上の１点ではなくその流路に沿った所定範囲にわたって、且つ高感度で検出することができるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本願発明者は、全反射蛍光顕微鏡などで利用されている近接場光を励起光として、分離流路中に存在する蛍光標識した試料成分から発せられる蛍光や散乱光を検出することに想到した。
【００１２】
すなわち、本発明に係る第１のマイクロチップを用いた成分分析装置は、
a)蛍光標識された試料液が流通する過程で成分分離を行うため微小の分離流路が形成されて成るマイクロチップと、
b)前記マイクロチップの分離流路の少なくとも一部を近接場光で照明するために、該マイクロチップに対して所定角度で以て且つ所定範囲に対して光を照射する光照射手段と、
c)前記光照射手段による照射光により生じる近接場光を励起光として前記分離流路中に存在する蛍光標識された試料液から放出される蛍光を受光する光検出手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１３】
また、本発明に係る第２のマイクロチップを用いた成分分析装置は、
a)蛍光標識された試料液が流通する過程で成分分離を行うため微小の分離流路が形成され、且つ該分離流路の少なくとも一部を近接場光で照明するための光導波路が設けられたマイクロチップと、
b)前記マイクロチップの光導波路の境界面で全反射が生じるように該光導波路に対して光を導入するべく光を照射する光照射手段と、
c)前記照射光によって前記光導波路の境界面の外側に生じる近接場光を励起光として前記分離流路中にある試料液から放出される蛍光を受光する光検出手段と、
を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る成分分析装置においては、試料液中の試料成分を適宜の方法によって蛍光標識し、これを分離流路に流すことで成分分離させる。こうして分離流路中に存在する蛍光標識された試料成分に対し、その一部又は全体を近接場光により励起することで蛍光を放出させて光検出手段により検出する。近接場光を発生させるために、第１の成分分析装置において、光照射手段はマイクロチップに対して所定角度で以て且つ所定範囲に対して光を照射する。光はマイクロチップのガラス、石英などの透明の基体を透過して分離流路に到達し、分離流路中に充満している試料液と上記基体との境界面に対して臨界角以上の角度で入射して全反射する。その際に、その境界面の向こう側、つまり試料液中に近接場光のしみ出しが生じる。
【００１５】
一方、第２の成分分析装置では、近接場光を発生させるために、マイクロチップ自体に少なくともガラス、石英などの基体よりも高い屈折率を有する光導波路を設けている。光照射手段はこの光導波路に対して光を導入し、導入された光は光導波路の両境界面で全反射しながら進行する。その際に、その境界面の向こう側、つまりマイクロチップの基体内部に近接場光のしみ出しが生じ、基体内部を透過して分離流路に達する。
【００１６】
いずれにしても近接場光は光が全反射した個所のごく近傍にのみ局所的に発生するので、試料液からの蛍光や散乱光の検出に影響を与えるような背景光が非常に少なくて済む。その結果、きわめて高いＳ／Ｎ比で以て試料液に由来する光を検出することができ、高い分析感度、分析精度を達成することができる。
【００１７】
また、光の照射範囲や光導波路の設置範囲を適宜に定めることにより、分離流路中の１点のみならずその一部又は全体に亘って近接場光を発生させ、それによってその流路中の試料液の蛍光物質を励起することができる。したがって、１点検出が可能であるのはもちろんのこと、分離流路に沿った広い範囲における試料の分離・移動状態をイメージ検出することができる。しかも、蛍光によるイメージ検出であるので、ＵＶイメージ検出に比べて格段に高感度であり、試料の分離状態をリアルタイムで的確に把握するのにも好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［第１実施例］
本発明の第１実施例である成分分析装置について、図１〜図５を参照して説明する。
【００１９】
図１は本実施例による成分分析装置の要部の概略構成図、図２は電気泳動チップ１０の概略縦断面図である。図１において、電気泳動チップ１０は基本的に、既に説明したような従来の構成のものを使用することができる。但し、本装置における検出は蛍光方式であるので、分析対象である試料は予め何らかの手段で蛍光標識しておく。具体的には、例えば対象成分がｄｓＤＮＡであれば、インターカレータ、蛍光プライマ、蛍光標識された基質などを利用することができる。
【００２０】
図１において、電圧印加部２８は電気泳動チップ１０の各リザーバＲ１〜Ｒ４に対し、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）２５により具現化される制御部２７からの指示に従って順次、高電圧を印加するためのものである。この電気泳動チップ１０の下方には、光照射手段として励起用レーザ光源２０とビームエキスパンダ２１とが配置され、レーザ光源２０から発せられたレーザ光はビームエキスパンダ２１により光の照射範囲が適宜に調節されて電気泳動チップ１０の下面の所定範囲に照射される。照射光は下側の透明平板１１の内部に侵入し、試料液が充満している分離流路１８に到達する。このとき、透明平板１１と分離流路１８中の試料液との境界面に対してその臨界角θcよりも大きな全反射角で以て照射光が入射するように、上記光照射手段の配置が定められている。
【００２１】
一般に臨界角θcは次の式で求まる。
sinθc＝ｎ２／ｎ１
ここでｎ１は反射面の手前側の物質（本例では透明平板１１）の屈折率、ｎ２は反射面の向こう側の物質（本例では試料液）の屈折率である。例えば、いま透明平板１１の材質がガラス（ｎ＝１．５２）で試料液が水（ｎ＝１．３３）と看做せる場合には、臨界角θcは約６１°である。なお、実際には、光が大気中（又は真空中）から透明平板１１に入射する際に屈折を生じるから、この屈折を考慮して上記全反射条件が満たされるように光照射手段の配置を決める。
【００２２】
上記全反射条件の下では、図２に示すように、透明平板１１と分離流路１８中の試料液との境界面で照射光は全反射するが、その際に、反射面の向こう側つまり試料液の内部側に近接場光と呼ばれる光のしみ出しが存在する。試料液に含まれる試料成分は蛍光標識されているため、近接場光がこの蛍光物質を励起し、自発的な蛍光が放出される。このときの蛍光を、波長フィルタ２２、対物レンズ２３を介して光検出手段であるＣＣＤセンサ２４に導入して検出する。波長フィルタ２２は目的とする蛍光の波長のみを選択するためのものである。ＣＣＤセンサ２４により得られた受光信号はデータ処理部２６に入力され、制御部２７の制御の下に例えば画像処理などが行われ、それによって作成された２次元画像がモニタ２９上に表示される。
【００２３】
近接場光は光の照射位置のごく近傍にのみ存在するから、光の照射範囲に応じて分離流路１８中の試料成分による蛍光画像の範囲を決めることができる。図３〜図５は、そうした測定の各種形態を概念的に示す図である。
【００２４】
図３は、分離流路１８中での成分分離や移動の状態に関する情報を得るために分離流路１８に沿った或る所定範囲（分離流路１８の一部又は全体）のイメージングを行う場合の一例である。ＣＣＤセンサ２４により取得される２次元画像Ｂ上では、分離流路１８の延伸方向に沿った線状の蛍光像Ａ１が現れる。データ処理部２６において、所定時間間隔毎にＣＣＤセンサ２４で取得された信号を処理することで、時々刻々と変化する分離過程をリアルタイム又はそれに近い形でモニタすることができる。なお、こうした蛍光像Ａ１の取得を目的とするのであれば、光検出手段として必ずしもＣＣＤイメージセンサを利用する必要はなく、ＣＣＤリニアセンサやリニアＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）検出器などを利用してもよい。
【００２５】
図４は、分離流路１８中での或る位置での１点検出を行う場合の一例である。ＣＣＤセンサ２４により取得される２次元画像Ｂ上では、分離流路１８上の検出点に対応した蛍光スポットＡ２が現れる。データ処理部２６において、所定時間間隔毎に取得された蛍光スポットＡ２の蛍光強度を処理することで、エレクトロフェログラムを作成することも可能である。なお、こうした１点検出を目的とするのであれば、光検出手段として必ずしもＣＣＤイメージセンサを利用する必要はなく、光電子増倍管、フォトダイオード検出器、アバランシェ・フォトダイオード検出器などを利用してもよい。
【００２６】
図５は、分離流路１８中での成分分離や移動の状態に関して、より詳細な情報を得るために分離流路１８に沿った或る所定範囲における分光画像のイメージングを行う場合の一例である。この場合には、図１において、波長フィルタ２２に代えてＣＣＤセンサ２４の手前に透過型の波長分散素子３０を設置する。この波長分散素子３０は分離流路１８の延伸方向と略直交する方向に波長を分散させる作用を有する。ＣＣＤセンサ２４により取得される２次元画像Ｂ上では、Ｌ軸方向に分離流路１８の延伸方向に沿った各位置情報を、これに直交するλ軸方向に各位置の蛍光の波長情報を有する２次元分光画像Ａ３が現れる。これにより、異なる発光波長を有する複数の蛍光物質を利用して、複数の成分の移動・分離状態を詳細に把握することが可能となる。
【００２７】
［第２実施例］
上記第１実施例による成分分析装置では、既に述べたように、電気泳動チップ１０自体は従来の構成のものをそのまま利用することができる。これに対し第２実施例による成分分析装置は、電気泳動チップ１０自体の構成を変更することにより、第１実施例とは異なる手法により近接場光を生じさせ、分離流路１８中の試料成分を標識している蛍光物質を励起するものである。
【００２８】
図６はこの第２実施例による成分分析装置に利用される電気泳動チップ１０の斜視図、図７は蛍光発生状態を示す概略縦断面図である。この電気泳動チップ１０では、下側の透明平板１１の下面に薄膜状（例えば厚さ２００〜５００μｍ程度）の光導波層１００を積層させ、その下に透明平板１１と同じ又は同等程度の屈折率を有する材料から成る平板１０１を密着して張り合わせる。すなわち、光導波層１００は透明平板１１と平板１０１との間に挟まれた状態となる。
【００２９】
この光導波層１００を構成する材料はその屈折率が透明平板１１及び平板１０１よりも高いことが必要であるが、好ましくは、できるだけ屈折率が高いものとするとよい。例えば波長５５０ｎｍ近傍での屈折率が約２．１である五酸化タンタル（Ｔａ2Ｏ5）、同じく波長５５０ｎｍ近傍での屈折率が約２．２である酸化セリウム（ＣｅＯ2）などを利用するとよい。
【００３０】
図７に示すように、上述したようなレーザ光源２０などを含む光照射手段から光導波層１００の端部に対して所定角度で光が入射される。光導波層１００と両側の透明平板１１及び平板１０１との境界面における臨界角θcよりも大きな全反射角で以て光が境界面に当たるように当初の光の入射角度を定めておけば、光は両境界面で全反射を繰り返しつつ光導波層１００の内部を進行する。全反射する際に、光導波層１００と透明平板１１との境界面の上側には近接場光のしみ出しが生じる。このときの近接場光の強度は上記境界面から離れるに従い弱まるが、透明平板１１の厚さが充分に薄ければ、その近接場光が分離流路１８に達した時点でも、該分離流路１８中の試料成分に結合している蛍光物質を励起するのには充分な光強度が得られる。それによって、試料液から蛍光発光が生じ、第１実施例と同様に各種の蛍光像を得ることができる。
【００３１】
光導波層１００の屈折率が高ければ高いほど臨界角θcは小さくなり、全反射角を小さくすることができる。全反射角が小さければ、それだけ全反射の繰り返し密度を高くすることができる。上述したように、近接場光は光が全反射した境界面のごく近傍に発生するから、全反射の繰り返し密度が高ければ近接場光の強度が高く、しかも密度が均一に近くなり、それだけ蛍光物質の励起をむらなく行うことができる。
【００３２】
なお、光導波層１００は透明平板１１の下面全体に設ける必要はなく、少なくとも蛍光像を得たい分離流路１８の下面に設けられていれば充分である。また、透明平板１１の厚さが厚いと分離流路１８に到達したときの近接場光はそれだけ弱まることになるから、透明平板１１の厚さは可能な限り薄いほうが好ましい。
【００３３】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更、修正、追加などを行っても本願発明に包含されることは明らかである。例えば、上記実施例はマイクロチップが電気泳動を利用して試料液を流通させるものあったが、それ以外にも、送液ポンプや流路両端の圧力差を利用して試料液を流通させるものにも本発明を適用することができる。すなわち、マイクロチップにおける成分分離の方法やその手順などについては特に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の第１実施例である成分分析装置の要部の概略構成図。
【図２】第１実施例の成分分析装置における電気泳動チップの概略縦断面。
【図３】第１実施例の成分分析装置における測定の形態例を示す概念図。
【図４】第１実施例の成分分析装置における測定の形態例を示す概念図。
【図５】第１実施例の成分分析装置における測定の形態例を示す概念図。
【図６】本発明の第２実施例である成分分析装置における電気泳動チップの斜視図。
【図７】第２実施例の成分分析装置における電気泳動チップの概略縦断面図。
【図８】従来知られている電気泳動チップの平面図。
【図９】従来知られている電気泳動チップの斜視図。
【符号の説明】
【００３５】
１０…電気泳動チップ
１１、１５…透明平板
１７…試料導入流路
１８…分離流路
１００…光導波層
１０１…平板
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４…リザーバ
２０…レーザ光源
２１…ビームエキスパンダ
２２…波長フィルタ
２３…対物レンズ
２４…ＣＣＤセンサ
２５…パーソナルコンピュータ
２６…データ処理部
２７…制御部
２８…電圧印加部
２９…モニタ
３０…波長分散素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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