(57)【要約】【目的】一般的な臨床検査用酵素として、Ｋｍ値の小さい、好ましくは約１５．０以下のクレアチンアミジノヒドロラーゼを提供する。【構成】アルカリゲネス属細菌由来のクレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子を用いて、該遺伝子に変異を導入して、蛋白質工学的手法により、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼおよびその製法ならびに該酵素を使用するクレアチンまたはクレアチニン定量用試薬。    作用：クレアチン＋Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素    至適温度：約４０〜５０℃    至適ｐＨ：約８〜９    熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）    ザルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを共役酵素として活性測定を    行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：３．０〜１０．０ｍＭ    分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）    等電点：約４．５【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
【請求項２】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約４．５±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
【請求項３】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約６．５±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
【請求項４】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ。
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約９．０±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
【請求項５】
下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物を栄養培地にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法。
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
【請求項６】
請求項１記載の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチン定量用試薬。
【請求項７】
クレアチニンアミドヒドロラーゼ、請求項１記載の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法及び該酵素を使用するクレアチンまたはクレアチニン定量用試薬に関する。
【０００２】
クレアチニンおよびクレアチンは血液または尿中に見い出され、その量を迅速かつ正確に検出測定することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常に重要である。このような診断を行うために、血液または尿中のクレアチン及びクレアチニンを定量することは頻繁に行われている。
従来のクレアチンの定量法としては、試料中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチンを定量する。また、クレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチニンを定量する方法などがある。
一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼは微生物界に広く見い出されており、既に工業的に製造され、臨床検査薬として使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、公知の各種菌体から製造されたクレアチンアミジノヒドロラーゼは熱安定性が低く、またクレアチンに対するＫｍ値も大きかった。例えばバチルス属由来の酵素（特公昭６１−１７４６５号公報）は、熱安定性は４０℃以下と低い。さらにシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さいが(ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515 (1976))、活性測定法が異なっており、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチンに対するＫｍ値は不明であった。コリネバクテリウム属、ミクロコッカス属、アクチノバチルス属、バチルス属由来の酵素（特公平３−７６９１５号公報）は、熱安定性は５０℃以下であるが、クレアチンに対するＫｍ値は約２０ｍＭと大きかった。
上記の問題点を解決するため、本発明者らは既にアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属に属する細菌が熱安定性に優れ、かつ、クレアチンに対するＫｍ値が比較的小さい（Ｋｍ値：約１５．２）クレアチンアミジノヒドロラーゼを生産することを見い出した（特願平６−６３３６３号）。さらに、該菌株よりクレアチンに対するＫｍ値の比較的小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を単離し、グラム陰性細菌を宿主として、大量に該酵素を生産する技術を確立した（特願平７−１１７２８３号）。
また、同じアルカリゲネス属細菌から、高ｐＨ領域において安定であり、また、Ｋｍ値の小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼが報告されている（特開平７−１７０９７９号公報）。
【０００４】
しかし、これらのクレアチンアミジノヒドロラーゼは、一般的な臨床検査薬である酵素としては、まだＫｍ値が大きく、更にＫｍ値の小さい、望ましくは約１５．０以下のクレアチンアミジノヒドロラーゼが要望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記目的を達成するために、鋭意検討した結果、アルカリゲネス属由来の上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用い、蛋白工学的手法により、クレアチンに対するＫｍ値のより小さい新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを創出することに成功した。
【０００６】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
【０００７】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
また、本発明は下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物を栄養培地にて培養し、新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを採取することを特徴とする新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼの製造法である。
【０００８】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
本発明は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチン定量用試薬である。
【０００９】
また、本発明はクレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有することを特徴とする試料中のクレアチニン定量用試薬である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により診断薬用酵素として有用な、Ｋｍ値の小さい新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを創出し、工業的に大量に該クレアチンアミジノヒドロラーゼを生産できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
【００１２】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約４．５±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
また、別な実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
【００１３】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約６．５±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
さらに、別な実施態様は、下記理化学的性質を有する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼである。
【００１４】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約９．０±１．０
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法の１つは、野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、蛋白工学的手法により、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する方法である。
【００１５】
変異を導入するための野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子は特に限定されないが、本発明の一実施態様では、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes
faecalis)ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２３７）由来の配列表・配列番号２のクレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を用いた。
【００１６】
本発明の別な実施態様は、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入して、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べてクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった新規クレアチンアミジノヒドロラーゼを製造する。
【００１７】
野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子に変異を導入する方法は、既知のいかなる方法でも用いることができる。例えば、野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子ＤＮＡと変異源となる薬剤を接触させる方法や紫外線照射による方法などから、蛋白工学的な手法、例えばＰＣＲ法や部位特異的変異などの方法を用いることができる。また、遺伝子修復機構が欠損されたため、高頻度に遺伝子に変異が起こる大腸菌を用いたinvivoでの変異の導入も可能である。
【００１８】
上記のようにして得られた変異クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子を例えば大腸菌に形質転換した後、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地(J.Ferment. Bioeng.,Vol.76 No.2 77-81(1993)) に塗布し、発色の強いコロニーを選抜する。選抜したコロニーは、栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で一晩培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。
菌体を破砕する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば超音波処理やガラスビーズ破砕の様な物理的破砕法やリゾチームの様な溶菌酵素を用いる方法が利用できる。この粗酵素液を用いて、２種類の基質濃度の異なる活性測定反応液によりクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定し、両者の活性比率を野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼと比較することにより、クレアチンに対するＫｍ値の小さくなったクレアチンアミジノヒドロラーゼをスクリーニングすることができる。
上記方法により選抜された菌株から精製クレアチンアミジノヒドロラーゼを取得する方法は、公知のいかなる手法を用いても良く、例えば下記方法がある。
栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から硫安沈澱によりクレアチンアミジノヒドロラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテク）ゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。
この操作の後、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア・バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一のバンドを示す程度に純化される。
本発明において使用する新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼを生産する微生物としては、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７４）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７５）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７６）が例示される。
これらの微生物を培養し、該培養物から本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを採取する方法は特に限定されるものではなく、通常の方法に従う。
本発明の上記製法により得られた新規クレアチンアミジノヒドロラーゼは、下記理化学的性質を有する。
【００１９】
作用：クレアチン  ＋  Ｈ2 Ｏ  →  ザルコシン  ＋  尿素
至適温度：約４０℃〜５０℃
至適ｐＨ：約８．０〜９．０
熱安定性：約５０℃以下（ｐＨ７．５、３０分間）
ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測
定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値：約３．５〜１０．０ｍＭ
分子量：約４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
等電点：約４．５
本発明におけるＫｍ値は、ザルコシンオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共役酵素として、活性測定を行う場合のクレアチンに対するＫｍ値である。従来のシュードモナス・プチダ由来の酵素は、クレアチンに対する見かけのＫｍ値は１．３３ｍＭと小さいが(ArchivesBiochemistry and Biophysics 177, 508-515
(1976))、活性測定法は、反応液中の残存したクレアチンをα−ナフトールとジアセチルにより定量する方法であり、臨床検査薬で汎用されているザルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼを共役酵素として用いた活性測定法でのクレアチンに対するＫｍ値は不明であった。
【００２０】
本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼは、ザルコシンオキシダーゼ及び過酸化水素検出用組成物を組み合わせて、クレアチンの測定に使用することができる。またクレアチニンアミドヒドロラーゼを共存させて、クレアチニンを定量することができる。
【００２１】
本発明の試料中のクレアチン定量用試薬は、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有する。
【００２２】
本発明の試料中のクレアチニン定量用試薬は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、上記クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよび過酸化水素検出用組成物を含有する。
【００２３】
本発明のクレアチンまたはクレアチニンの定量に使用するザルコシンオキシダーゼは、アースロバクター属、コリネバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、マイクロコッカス属、バチルス属等の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販されている。
【００２４】
クレアチニンアミドヒドロラーゼとしては、シュードモナス属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、ペニシリウム属等の起源の微生物より得ることができ、これらのいくつかは既に市販されている。
【００２５】
過酸化水素検出用組成物はペルオキシダーゼ活性を有する酵素及び色原体、緩衝液を含む。ペルオキシダーゼ活性を有する酵素としては、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ブロムペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ等が挙げられる。色原体は更に水素受容体およびカプラーよりなる。水素受容体は過酸化水素、ペルオキシダーゼ、カプラーとの反応に際し、水素を受容する化合物であれば良く、例えば４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンソチアゾリン−ヒドラジン誘導体等が挙げられる。またカプラーとしては、アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）などのアニリン誘導体、フェノール、ｐ−クロロフェノールなどのフェノール誘導体が挙げられる。
【００２６】
本発明のクレアチン定量用試薬中、各成分の好ましい量はクレアチンアミジノヒドロラーゼ約５〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ約１〜１００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０１〜５０Ｕ／ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カプラー約０．１〜５０ｍＭである。
【００２７】
本発明のクレアチニン定量用試薬中、各成分の好ましい量はクレアチニンアミドヒドロラーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ約１０〜３００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ約１〜１００Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ約０．０１〜５０Ｕ／ｍｌ、水素受容体約０．１〜１０ｍＭ、カプラー約０．１〜５０ｍＭである。
【００２８】
本発明のクレアチンまたはクレアチニン定量用試薬は、通常、ｐＨ約６〜８の緩衝液とともに使用する。例えばリン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
【００２９】
本発明の試薬には必要によりアスコルビン酸オキシダーゼまたはカタラーゼを添加してもよい。更に本発明の試薬には酵素反応または呈色反応を円滑に行わせるために他の化合物を添加しても良い。このような化合物としては、例えば安定化剤、界面活性剤、賦形剤等が挙げられる。
【００３０】
本発明は以下の測定反応を利用する。
【００３１】
【化１】
2005192538.tif 000002
【００３２】
【化２】
2005192538.tif 000003
【００３３】
【化３】
2005192538.tif 000004
【００３４】
生成したキノンイミン色素は通常、５００〜６５０ｎｍの波長で吸光度測定を行う。クレアチンの定量法としては、エンド法およびレート法で行われるが、エンド法を用いるのが一般的である。
【００３５】
本発明のＫｍ値が小さいクレアチンアミジノヒドロラーゼは、従来の酵素に比べて、クレアチンまたはクレアチニンの定量において、検査試薬中の使用酵素量を約１／３〜１／４に減少させることが可能であり、かつ、反応後半の反応性が良好となる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３７】
実施例中、クレアチンアミジノヒドロラーゼの活性測定は以下のようにして行った。なお、本発明の酵素活性の定義は、下記条件下に１分間に１μモルのザルコシンを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
反応混液組成
０．３Ｍ      ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６
０．００５％  ４アミノアンチピリン
０．０１５％  フェノール
１．８    ％  クレアチン
６Ｕ／ｍｌ    ザルコシンオキシダーゼ
６Ｕ／ｍｌ    ペルオキシダーゼ
上記反応混液３ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に取り、３７℃で約３分間予備加温する。次に酵素液０．１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度変化を５分間記録し、その２〜５分の直線部分から１分間あたりの吸光度変化を求める（△ＯＤテスト）。
【００３８】
盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）０．１ｍｌを加え上記と同様に操作を行って、１分間当たりの吸光度変化を求める（△ＯＤブランク）。
計算式
【００３９】
【数１】
2005192538.tif 000005
【００４０】
１３．３：キノンイミン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
（ｃｍ2 ／μＭ）
１／２ ：酵素反応で生成した過酸化水素１分子から形成するキノンイミン色素は１／２分子であることの係数
１．０ ：光路長（ｃｍ）
０．１  ：添加酵素液量（ｍｌ）
参考例１  染色体ＤＮＡの分離
アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。
【００４１】
該菌体（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４２３７）を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で３０℃一晩振盪培養した後、遠心分離（８０００ｒｍｐ，１０分間）により集菌した。１０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７℃１５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェノール溶液（１：１）を加え、攪拌混合し、１０，０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離で水層と溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり攪拌しながら、ＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。
【００４２】
このＤＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
参考例２
クレアチニンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
参考例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠心分離法により２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一方、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡製）で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）をバクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡製）により脱リン酸化処理した後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地〔０．５％酵母エキス、０．２％肉エキス、０．５％ポリペプトン、０．１％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ2ＰＯ4 、０．０５％ＭｇＳＯ4 ／７Ｈ2 Ｏ、１．１５％クレアチン、１０Ｕ／ｍｌザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、０．５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（東洋紡製）、０．０１％ｏ−ジアニシジン、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１．５％寒天〕に塗布した。クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。使用したＤＮＡ１μｇ当たり約１×１０5個の形質転換体のコロニーが得られた。
【００４３】
約１２，０００個のコロニーをスクリーニングした結果、６株茶色に染色されるコロニーを見いだした。これらの株をＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定したところ、いずれの株からもクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性が検出された。これらの株のうち、最もクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性の高かった株の保有するプラスミドには、約５ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＲＨ１７とした。
【００４４】
次いでｐＣＲＨ１７の挿入ＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＶ（東洋紡製）とＰｓｔＩ（東洋紡製）にて切り出し、同制限酵素で切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）に連結してｐＣＲＨ１７３を作成した。
実施例１  組換えプラスミドｐＣＲＨ２７３の作製
参考例２の組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３を用い、ベクター由来のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子から挿入ＤＮＡのクレアチンアミジノヒドロラーゼ構造遺伝子上流部分を、配列番号３に記載した合成ＤＮＡと市販の変異導入キット(TransformerTM ; Clonetech 製）により削除して、組換えプラスミドｐＣＲＨ１７３Ｍを作製した。なお、変異の導入の詳細な方法については、キット添付のプロトコールに準拠した。
【００４５】
更にｐＣＲＨ１７３Ｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡製）で切断した後、セルフライゲーションさせてｐＣＲＨ２７３を作製した（図１）。
実施例２  クレアチンアミジノヒドロラーゼ遺伝子への変異の導入
実施例１で作製したｐＣＲＨ２７３で市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．  ｃｏｌｉ
ＸＬＩ−Ｒｅｄ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製）形質転換した後、全量をアンピシリンを含んだ（５０μｇ／ｍｌ；ナカライテスク製）３ｍｌのＬＢ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。この培養液全量から常法によりプラスミドを回収した。このプラスミドで再度市販の大腸菌コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９；東洋紡製）を形質転換し、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性検出用寒天培地に塗布して３７℃一晩培養した。こうして得られた変異クレアチンアミジノヒドロラーゼライブラリーからクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を強く発現している株（着色の強い株）を選抜した。
実施例３  Ｋｍ値の減少したクレアチンアミジノヒドロラーゼのスクリーニング
実施例２で選抜した候補株をアンピシリンを含んだ（２００μｇ／ｍｌ）３ｍｌのＴＢ培地（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．４％グリセロール、０．０２３１％ＫＨ2ＰＯ4 、０．１２５４％Ｋ2 ＨＰＯ4 ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養した。その培養液１ｍｌから遠心分離により菌体を回収し、ガラスビーズ破砕により粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液を用いて前述した活性測定法によりクレアチンアミジノヒドロラーゼを測定した。  また、基質濃度のみを１／１０に減らした活性測定試薬を用いて、同様にクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を測定した。この２種類の活性値の比率（１／１０基質濃度の活性÷常法の活性）が野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べ上昇した株をＫｍ値の減少した変異体として選抜した。
【００４６】
上記の方法により約２０，０００株についてスクリーニングした結果、３株のクレアチンに対するＫｍ値の小さくなった変異体を取得することができ、それぞれの有する組換えプラスミドをｐＣＲＨ２７３Ｍ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７４）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７５）、ｐＣＲＨ２７３Ｍ３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７６）と命名した。
実施例４  エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び２００ｍＭ  ＩＰＴＧ（日本精化製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７４）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は８．７Ｕ／ｍｌであった。
【００４７】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ７．０に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア  バイオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は１８．４Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。
表１にこれまでの精製のまとめを示す。また表２に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
【００４８】
【表１】
2005192538.tif 000006
【００４９】
【表２】
2005192538.tif 000007
【００５０】
実施例５  エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び２００ｍＭ  ＩＰＴＧ（日本精化製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ２）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７５）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は５．６Ｕ／ｍｌであった。
【００５１】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液，ｐＨ７．０に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア  バイオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は１４．３Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。
表３にこれまでの精製のまとめを示す。また表４に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
【００５２】
【表３】
2005192538.tif 000008
【００５３】
【表４】
2005192538.tif 000009
【００５４】
実施例６  エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）からのクレ
アチンアミジノヒドロラーゼの製造
６ＬのＴＢ培地を１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び２００ｍＭ  ＩＰＴＧ（日本精化製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ３０℃２４時間振盪培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＣＲＨ２７３Ｍ３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５３７６）の培養液６０ｍｌを接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性は８．３Ｕ／ｍｌであった。
【００５５】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。
上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画後セファデックスＧ−２５（ファルマシア  バイオテク）ゲルろ過により脱塩し、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は１４．８Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。
表５にこれまでの精製のまとめを示す。また表６に上記方法により得られたクレアチンアミジノヒドロラーゼの理化学的性質を示す。
【００５６】
【表５】
2005192538.tif 000010
【００５７】
【表６】
2005192538.tif 000011
【００５８】
下記表７に本発明の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼと野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチンに対するＫｍ値をまとめた。表７からも明らかなように本発明の新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼが野生型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて、Ｋｍ値が低下したことが判る。
【００５９】
【表７】
2005192538.tif 000012
【００６０】
実施例７
実施例５にて調製した精製クレアチンアミジノヒドロラーゼと野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを用いて、下記組成を有するクレアチニン測定用試液を調製し、クレアチンアミジノヒドロラーゼのクレアチニン測定用試液での必要量を比較した。
【００６１】
実施例５のクレアチンアミジノヒドロラーゼ      ２０，４０，６０Ｕ／ｍｌ
または野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼ
クレアチニンアミドヒドロラーゼ                １５０Ｕ／ｍｌ
ザルコシンオキシダーゼ                            ７Ｕ／ｍｌ
ペルオキシダーゼ                                  ３ＰＵ／ｍｌ
ＭＯＰＳバッファー                            ０．１Ｍ、ｐＨ８．０
トリトンＸ−１００                            ０．１％
４−アミノアンチピリン                        ０．１５ｍＭ
ＴＯＯＳ（アニリン誘導体）                    ０．２ｍＭ
クレアチニン１００ｍｇ／ｄｌを含有する試料６０μｌに、上記試液３ｍｌを添加し、吸光度変化を３７℃、波長５４６ｎｍで測定した。その測定結果（タイムコース）を図２に示す。図中、Ｗｉｌｄは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを示し、ｐＣＲＨ２７３Ｍ２は本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼを示す。
【００６２】
図２から明らかなように、５分間で測定反応を終結させるとすると、本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼは野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼに比べて、少ない酵素量（約１／３量）で測定が可能であった。また、測定後半の反応性、つまり試料中のクレアチニン量が少なくなった時の反応性が良好であることが確認された。
【００６３】
（配列表）
【００６４】
【数１】
2005192538.tif 000013
【００６５】
【数２】
2005192538.tif 000014
【００６６】
【数３】
2005192538.tif 000015
【００６７】
【数４】
2005192538.tif 000016
【００６８】
【数５】
2005192538.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】組換えプラスミドｐＣＲＨ２７３を示す図面である。
【図２】本発明のクレアチンアミジノヒドロラーゼおよび野性型クレアチンアミジノヒドロラーゼを使用して、試料中のクレアチニンを測定した場合の測定結果（タイムコース）を示す図面である。
【図１】
2005192538.tif 000018
【図２】
2005192538.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月2日(2004.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
クレアチニンおよびクレアチンは血液または尿中に見い出され、その量を迅速かつ正確に検出測定することは、疾病、例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養症などを診断するのに非常に重要である。このような診断を行うために、血液または尿中のクレアチン及びクレアチニンを定量することは頻繁に行われている。
従来のクレアチンの定量法としては、試料中のクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチンを定量する。クレアチンアミジノヒドロラーゼとしては、特許文献１〜３に記載されるようなものが知られている。特許文献４および５には、クレアチンアミジノヒドロラーゼを用いたクレアチンの定量方法が記載されている。また、クレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼおよびザルコシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素測定手段により測定して、試料中のクレアチニンを定量する方法などがある。
一方、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼは微生物界に広く見い出されており、既に工業的に製造され、臨床検査薬として使用されている。
【特許文献１】特開昭６２−９１１８２号公報
【特許文献２】特開平７−２６５０７４号公報
【特許文献３】米国特許第５４５１５２０号公報
【特許文献４】米国特許第３９０７６４４号公報
【特許文献５】米国特許第３８０６４２０号公報