(57)【要約】【課題】  擬似患者の試料から微生物（特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出するためのアッセイ系、キットおよび方法を提供すること、  さらに、核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および同機器における熱制御を行うための機器を提供すること。【解決手段】  （ａ）ハイブリダイゼーションチューブの中で微生物ｃＤＮＡを微生物特異的プローブとハイブリダイズさせること、かつ当該プローブは、磁気ビーズに連結していること；（ｂ）ハイブリダイゼーションチューブを洗浄のために磁気ウェルに移動すること；（ｃ）チューブにブロッキング溶液を加えること；（ｄ）チューブにアビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体を加えること；（ｅ）洗浄反応を行い、磁場を用いて妨害物質を除去すること；（ｆ）磁気ビーズを懸濁すること；および（ｇ）酵素の基質を加えた後に発光または色の変化を検出すること。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物ＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーションチューブの中で微生物ｃＤＮＡを微生物特異的プローブとハイブリダイズさせること、かつ当該プローブは、磁気ビーズに連結していること；
（ｂ）ハイブリダイゼーションチューブを洗浄のために磁気ウェルに移動すること；
（ｃ）チューブにブロッキング溶液を加えること；
（ｄ）チューブにアビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体を加えること；
（ｅ）洗浄反応を行い、磁場を用いて妨害物質を除去すること；
（ｆ）磁気ビーズを懸濁すること；および
（ｇ）酵素の基質を加えた後に発光または色の変化を検出することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
微生物が、ミコバクテリウム  チュバールキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であることを特徴する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物ｃＤＮＡが、生物活性プライマーによって介在されるＰＣＲ増幅から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）におけるストレプトアビジン酵素複合体が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
磁気ビーズを懸濁するステップ（ｆ）を、チューブを渦攪拌することによって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｇ）の検出をルミノメーターまたは分光光度計によって行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）〜（ｇ）を同一のチューブで行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されていることを特徴とする機器。
【請求項９】
容器の温度を制御するための手段が、温度変化に従って容器を加熱し、核酸二本鎖の解離を行うことを特徴とする請求項８に記載の機器。
【請求項１０】
容器の磁力を制御するための手段が、磁気ビーズの磁気変化を行い、容器内のハイブリダイゼーション、洗浄および磁気ビーズの分離を容易にすることを特徴とする請求項８に記載の機器。
【請求項１１】
微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質
を含むことを特徴とするキット。
【請求項１２】
生物活性プライマーを、ＤＮＡ標識試薬をプライマーと反応させることによって作製することを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
ＤＮＡ標識試薬が、式Ｆｕ−ＢＥ−Ｄを有する化合物であり、式中、Ｆｕは、アンゲリシン誘導体およびソラレン誘導体からなる群から選択されるフロクマリン誘導体を表し、ＢＥは、何も表さないか、Ｃ４〜１２アルキル、アルケニル、ポリアルキルアミンおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される結合エンハンサーを表し、Ｄは、ビオチン、フルオレセイン、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム−９−カルボキサミドからなる群から選択される検出可能な基を表すことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＤＮＡ標識試薬が９−（４”−（アミノメチル）−４’，５”−ジメチル−アンゲリシン）アクリジニウムカルボキサミドであることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
微生物を検出するためのアッセイ系であって、
（ｉ）微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質を含むキットと、
（ｉｉ）核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されている機器と、
（ｉｉｉ）容器の壁に磁気ビーズを結合するための磁気ラックと、
（ｉｖ）検出器と
を含むことを特徴とするアッセイ系。
【請求項１６】
生物活性プライマーを、ＤＮＡ標識試薬をプライマーと反応させることによって作製することを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ系。
【請求項１７】
キットにおけるストレプトアビジン酵素複合体が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）であることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ系。
【請求項１８】
エム.チュバールキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をエム.マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム.エイビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）およびエム.イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）と区別できることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ系。
【請求項１９】
検出器がルミノメーターまたは分光光度計であることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ系。
【請求項２０】
キット中のＤＮＡ標識試薬が９−（４”−（アミノメチル）−４’，５”−ジメチル−アンゲリシン）アクリジニウムカルボキサミドであることを特徴とする請求項１５に記載のアッセイ系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬似患者の試料から微生物（特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出するためのアッセイ系、キットおよび方法に関する。また、本発明は、熱的および磁気制御を組み込んでおり、ハイブリダイゼーション時間を大きく短縮する機器にも関する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）は、青少年および成人の主要な感染性死因であり、世界中で最も一般的な感染症である。現在、世界の人口の三分の一が感染しており、感染者のうち二千万人が活動性症例であり、ＴＢは、この十年間で三千万の人々を死亡させるであろう。すでに、五千万人を超える人々がＴＢの多剤耐性（ＭＤＲ）株に感染している可能性がある。薬剤耐性は、公衆衛生部門の無頓着さおよび管理が不十分なＴＢ管理プログラムのために引き起こされてしまった。ＭＤＲ結核以前に、薬物併用治療の成功率は、ＡＩＤＳ患者においてでさえ９０％を超えていた。しかしながら、ＭＤＲ結核は、感染性が高いばかりでなく、基本的に治癒の可能性はなく、死亡率は５０％にのぼる。現在、ＴＢは、ＨＩＶ陽性の人々の中で主な死因になりつつあり、はるかに急速に死亡させ、致死率は８０％にのぼる。
【０００３】
結核は、バチルス菌であるミコバクテリウム  チュバールキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の感染によって引き起こされる。結核は、エアロゾル液滴によって広がり、不可逆的な肺の破壊を引き起こす。結核が肺から抜け出した場合、骨、関節、肝臓、脾臓、胃腸管および脳を含む多くの器官を冒す全身性疾患を引き起こすことがある。エム.チュバールクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に曝露した人々のうち５０％がこの細菌に感染し、感染者のうち１５％が疾患を発症する。貧困、栄養不良および人口過剰は、結核の存続および野放図な拡散に劇的に寄与している。
【０００４】
ＴＢを制御する過去の手段は、抗生物質を組み合わせて使用するものであった。現在は、多剤耐性菌株による合併症のため、患者が保有している菌株に応じて、投与する抗生物質の数および組合せを個別に調整しなければならない。極端な場合には、肺の感染部位を外科的に摘出する必要がある。
【０００５】
伝統的に、ＴＢの診断は、臨床所見および胸部Ｘ線検査に基づいて行われ、ＴＢ桿菌を示す喀痰または組織スメアによって確認されていた。これらの方法は、診断にとっては依然として「最も基準になる検査（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」であるが、ＤＮＡプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ、および液体培地の開発は、今やより敏感かつ迅速な診断を可能にしている。残念なことに、迅速な技法の感度増加は、必ずしも特異性の向上を伴うとは限らない。
【０００６】
皮膚試験は、他の臨床所見と併せて用いるべきであり、患者がＢＣＧのワクチン接種を受け、または結核菌以外のミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に感染している場合には、診断を行うための高感度でかつ特異的な試験ではない。肺外のＴＢでは、部位特異的組織もしくは体液試料または双方がスメア、培養、および組織学的分析のために提出される。通常、結核性病変の組織学的特徴には、巨細胞と共に乾酪性および非乾酪性肉芽腫（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔａ）が含まれる。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ臨床分離株の薬物感受性を識別しかつ測定するための迅速な実験室試験は、共同社会におけるＴＢの効果的診断、治療、および制御に不可欠である。
【０００７】
結核の拡散を制御するのに都合の良い診断が重要であることは明らかである。喀痰試料は、先ず直接の顕微鏡評価（スメア）によって評価され、容易に検出される抗酸性蛍光色素オーラミンＯ、またはより特異的なチール−ネルゼン染色により可視化される。標本は、固体培地（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎスラント）上で培養されるか、ＢＡＣＴＥＣ自動放射分析システムなどの液体培地中で増殖させる。次に、生化学的または核酸プローブ試験を用いて様々な菌株を同定する。一般的に使用される抗結核薬に対する耐性について臨床分離株を試験するが、これには、従来の寒天希釈法よりむしろ液体ブロス中の感受性試験の新しい方法を使用することが多い。
【０００８】
チール−ネルゼン石炭酸フクシンまたはキニョウン石炭酸フクシン染色は、この１００年間はＴＢ診断に不可欠であった。培養より感度は低いものの、抗酸性スメアは、最小限の設備で実施することができる迅速かつ安価な試験であり、マイコバクテリアに極めて特異的である。細菌の量により、単一の喀痰スメアの感度は２２％から８０％であるが、複数の喀痰標本を検査する場合には歩留まりが改善する。
【０００９】
米国における大部分の実験室は、オーラミン−ローダミン染色などの蛍光染色を用いている。これらの技法により、マイコバクテリアは、鮮やかなオレンジ色の蛍光を発し、低拡大率の顕微鏡上で容易に見ることができ、スメアの感度を高める。
【００１０】
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｔｅｓｔ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）は、転写介在増幅によるもので、マイコバクテリアのリボソームＲＮＡを標的としている。この試験は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ菌種に極めて特異的なＤＮＡプローブを使用する。抗酸性桿菌スメアが陽性で培養が進行中である患者において最も良好に使用されている（このような患者においてのみ使用が承認されている）。スメア陽性患者であっても特異性は１００％未満であるため、通常は非結核性のマイコバクテリア感染の患者で偽陽性の結果が生じることがある。
【００１１】
この技法は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓコンプレックスＤＮＡの所定の標的領域のうち極めて小部分でも増幅する。この試験は、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、脳脊髄液、胸水、または他の体液および組織試料からわずか１個の生物体を迅速に検出することができる自動システムを用いており、肺疾患においてほぼ９０％の感度および特異性を示した。
【００１２】
マントー試験は、ＴＢを検出するための好ましくかつ標準的な皮膚試験である。この試験は、精製したタンパク質誘導体（ＰＰＤ、ツベルクリン）５ＴＵ、通常０．１ｍＬを皮内注射するものである。次いで、４８または７２時間目に硬結を評価する。硬結（紅斑ではない）の程度は、直角に２つの直径を計り、２つの測定値を平均しなければならない。異なる観察者によるばらつきは、ボールペンを用い、硬結の領域の外側から中心に向かって注意深く移動させることによって減らすことができる。硬結の領域が近づくにつれて抵抗が増し、硬結の外縁でマーキングが停止するはずである。しかしながら、活動性ＴＢ患者のうち約２０％は、皮膚試験が陰性であることがあり、一部の集団では、偽陰性結果の発生率が高いことさえある。例えば、進行したＨＩＶ感染患者では、５０％までの偽陰性率が報告されている。あるいは、他の非結核性マイコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍコンプレックス）に感染している患者では、偽陽性結果が生じることがある。したがって、陰性皮膚試験はＴＢを決して除外するものではなく、陽性皮膚試験は、単独で診断を確立するものではない。
【００１３】
米国疾病対策予防センターおよび世界保健機関は、世界中に薬剤耐性が出現していることから、すべてのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ臨床分離株に対して初期感受性試験を推奨している。
【００１４】
この巧妙なアッセイは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中に遺伝的に移植されたホタルの蛍光能力を使用している。この手順は、数時間でマイコバクテリアの薬物感受性を試験する可能性を提供する。開発段階ではあるが、ここ数年中に広く利用できるようになる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記のことを考えると、現在利用できるアッセイは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを迅速かつ完全に検出することはできない。入手可能な試料からＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するための特異性および感度の高い迅速なアッセイが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、擬似患者の試料から微生物（特に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を検出するためのアッセイ系、キットおよび方法に関する。
また、本発明は、機器であって、核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および同機器における熱制御を行うための機器に関する。
【００１７】
さらに本発明は、
微生物ＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーションチューブの中で微生物ｃＤＮＡを微生物特異的プローブとハイブリダイズさせること、かつ当該プローブは、磁気ビーズに連結していること；
（ｂ）ハイブリダイゼーションチューブを洗浄のために磁気ウェルに移動すること；
（ｃ）チューブにブロッキング溶液を加えること；
（ｄ）チューブにアビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体を加えること；
（ｅ）洗浄反応を行い、磁場を用いて妨害物質を除去すること；
（ｆ）磁気ビーズを懸濁すること；および
（ｇ）酵素の基質を加えた後に発光または色の変化を検出することを含むことからなる方法である。
又、微生物が、ミコバクテリウム  チュバールキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）であることが好適である。
又、微生物ｃＤＮＡが、生物活性プライマーによって介在されるＰＣＲ増幅から得られることが好適である。
又、ステップ（ｄ）におけるストレプトアビジン酵素複合体が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）であることが好適である。
又、磁気ビーズを懸濁するステップ（ｆ）を、チューブを渦攪拌することによって行うことが好適である。
又、ステップ（ｇ）の検出をルミノメーターまたは分光光度計によって行うことが好適である。
又、ステップ（ａ）〜（ｇ）を同一のチューブで行うことが好適である。
さらに、本発明の機器は、
核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されていることからなる。
又、容器の温度を制御するための手段が、温度変化に従って容器を加熱し、核酸二本鎖の解離を行うことが好適である。
又、容器の磁力を制御するための手段が、磁気ビーズの磁気変化を行い、容器内のハイブリダイゼーション、洗浄および磁気ビーズの分離を容易にすることが好適である。
さらに、本発明のキットは、
微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質
を含むことからなる。
又、生物活性プライマーを、ＤＮＡ標識試薬をプライマーと反応させることによって作製することが好適である。
又、ＤＮＡ標識試薬が、式Ｆｕ−ＢＥ−Ｄを有する化合物であり、式中、Ｆｕは、アンゲリシン誘導体およびソラレン誘導体からなる群から選択されるフロクマリン誘導体を表し、ＢＥは、何も表さないか、Ｃ４〜１２アルキル、アルケニル、ポリアルキルアミンおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される結合エンハンサーを表し、Ｄは、ビオチン、フルオレセイン、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム−９−カルボキサミドからなる群から選択される検出可能な基を表すことが好適である。
又、ＤＮＡ標識試薬が９−（４”−（アミノメチル）−４’，５”−ジメチル−アンゲリシン）アクリジニウムカルボキサミドであることが好適である。
さらに、本発明のアッセイ系は、
微生物を検出するためのアッセイ系であって、
（ｉ）微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質を含むキットと、
（ｉｉ）核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されている機器と、
（ｉｉｉ）容器の壁に磁気ビーズを結合するための磁気ラックと、
（ｉｖ）検出器と
を含むことからなる。
又、生物活性プライマーを、ＤＮＡ標識試薬をプライマーと反応させることによって作製することが好適である。
又、キットにおけるストレプトアビジン酵素複合体が、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）であることが好適である。
又、エム.チュバールキュロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をエム.マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム.エイビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）およびエム.イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）と区別できることが好適である。
又、検出器がルミノメーターまたは分光光度計であることが好適である。
又、キット中のＤＮＡ標識試薬が９−（４”−（アミノメチル）−４’，５”−ジメチル−アンゲリシン）アクリジニウムカルボキサミドであることが好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、以下の説明および添付の図面を参照することにより、より完全に理解することができる。
【００１９】
本発明は、微生物ＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーションチューブの中で微生物ｃＤＮＡを微生物特異的プローブとハイブリダイズさせること（プローブは、磁気ビーズに連結している）；
（ｂ）ハイブリダイゼーションチューブを洗浄のために磁気ウェルに移動すること；
（ｃ）チューブにブロッキング溶液を加えること；
（ｄ）チューブにアビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体を加えること；
（ｅ）洗浄反応を行い、磁場を用いて妨害物質を除去すること；
（ｆ）磁気ビーズを懸濁すること；および
（ｇ）酵素の基質を加えた後に発光または色の変化を検出することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の方法は、ウイルス、細菌、真菌などを含むどのような微生物にも適用することができる。本発明の方法は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出するのに特に適している。
【００２１】
一般に、ＣＳＦ、血清、血液、喀痰、胸水、咽頭スワブおよび便などのどのような体液も臨床検査で使用することができる。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ用の好ましい試料は、ＣＳＦ、血清、血液、喀痰、胸水、咽頭スワブからの試料である。
【００２２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｓａｉｋｉ他（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０  １３５０頁に記載されている。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼによってもたらされるプライマー伸長反応のサイクルを繰り返すことからなる。標的ＤＮＡを熱変性させ、増幅するＤＮＡの反対の鎖にある標的配列を囲む２種のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて使用するプライマーとなる。このＤＮＡをプライマー伸長によってコピーし、両鎖の第２のコピーを作成する。熱変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返すことにより、約２から４時間のうちに標的ＤＮＡを百万倍以上に増幅することができる。ＰＣＲは、増幅の結果を判定するために検出技法と併せて用いなければならない分子生物学のツールである。本発明では、ＰＣＲ増幅にビオチン標識プライマー対を用いる。
【００２３】
本明細書で使用する「プローブ」とは、特定の標的によって特異的に認識することができる物質、例えば分子である。一般に、プローブを固体支持体に連結させ、ＤＮＡの分離を容易にするものとする。本発明では、磁気ビーズに連結しているプローブ（Ｍａｇ Ｐｒｏｂｅ）が好ましい。Ｍａｇ Ｐｒｏｂｅにおけるプローブの配列は、アミン−ＴＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧである。
【００２４】
一般に用いられる標識には、ビオチン、蛍光分子、放射性分子、色素生産性基質、化学発光などが含まれるが、これらに限定されるものではない。核酸をビオチン標識する方法は、オリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドに蛍光分子および放射性分子を導入する方法と同様、当技術分野でよく知られている。
【００２５】
ビオチンを用いる場合、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの検出可能なマーカーに結合させたアビジン、ストレプトアビジンなどによってビオチンを検出する。酵素コンジュゲートは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。ストレプトアビジンはビオチンと高い親和性で結合するので、結合していないストレプトアビジンを洗い流し、次いで、ペルオキシドおよび適切な緩衝液の存在下、発光基質を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の存在を検出する。生成物は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出することができる。
【００２６】
蛍光、放射性、化学発光、色素産生性標識、ならびに他の一般的に使用される標識に関する検出方法はよく知られている。手短に言うと、化学発光は、それらの発光波長および強度により直接識別し定量することができる。
【００２７】
操作を容易にする一機器に熱的および磁気制御を組み込むために、本発明はまた、核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されている機器を提供する。
【００２８】
具体的には、容器の温度を制御するための手段は、温度変化に従って容器を加熱し、核酸二本鎖の解離を行う。熱制御装置は、デバイス市場から容易に購入される。ハイブリダイゼーション後の大部分の操作手順にＭａｇ Ｐｒｏｂｅが関わるため、容器の磁力を制御するための手段を熱制御装置と一緒に組み込み、本発明の機器を作製する。特に、容器の磁力を制御するための手段は、磁気ビーズの磁気変化を遂行し、容器内のハイブリダイゼーション、洗浄および磁気ビーズの分離を容易にする。
【００２９】
また、本発明は、微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質
を含むキットを提供する。
【００３０】
このキットでは、ＤＮＡ標識試薬をプライマーと反応させることによって生物活性プライマーを作製する。ＤＮＡ標識試薬は、ＤＮＡを標識する一試薬である。好ましい試薬は、式Ｆｕ−ＢＥ−Ｄを有する化合物であるが、これに限定されるものではない［式中、Ｆｕは、アンゲリシン誘導体およびソラレン誘導体からなる群から選択されるフロクマリン誘導体を表し、ＢＥは、何も表さないか、Ｃ４〜１２アルキル、アルケニル、ポリアルキルアミンおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される結合エンハンサーを表し、Ｄは、ビオチン、フルオレセイン、アクリジニウムエステルおよびアクリジニウム−９−カルボキサミドからなる群から選択される検出可能な基を表す］。最も好ましいＤＮＡ標識試薬は、９−（４”−（アミノメチル）−４’，５”−ジメチル−アンゲリシン）アクリジニウムカルボキサミドである。
【００３１】
微生物を検出するためのアッセイ系は、
（ｉ）微生物ｃＤＮＡを検出するための診断キットであって、
（ａ）磁気ビーズと連結しているプローブ；
（ｂ）生物活性プライマー；
（ｃ）アビジン酵素複合体またはストレプトアビジン酵素複合体；および
（ｄ）酵素基質を含むキットと、
（ｉｉ）核酸二本鎖の解離、ハイブリダイゼーション、洗浄、磁気ビーズの分離、および機器における熱制御を行うための機器であって、
（ａ）反応容器を取り付けるための手段；
（ｂ）容器の温度を制御するための手段；および
（ｃ）容器の磁力を制御するための手段を含み、
容器の温度を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されており、容器の磁力を制御するための手段は、反応容器を取り付けるための手段と連結されている機器と、
（ｉｉｉ）容器の壁に磁気ビーズを結合するための磁気ラックと、
（ｉｖ）検出器と
を含む系である。
【００３２】
本発明のアッセイ系では、キットはさらに、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄緩衝液およびブロッキング緩衝液を含む。これらの緩衝液は、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｌａｂ、Ｑｉａｇｅｎなどの市販用製品から容易に購入される。一般に、本発明のアッセイ系は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出の全過程を５時間未満までに短縮することができる。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、非限定的であり、本発明の様々な態様および特徴を代表しているに過ぎない。
【００３４】
材料および方法
主要キットＩ：
（１）溶解緩衝液Ｉ（５ｍｌ）
（２）溶解緩衝液ＩＩ（４ｍｌ）
（３）ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｍｌ）
（４）洗浄緩衝液（６０ｍｌ）
（５）溶解チューブ（１．８ｍｌ、２５管）
（６）ハイブリダイゼーションチューブ（１２×７５ｍｍ、５０管）
（７）伸長緩衝液（３ｍｌ、到着後−２０℃で保存）
【００３５】
主要キットＩＩ：（５０反応／キット、４℃で保存）
（１）ＭａｇＰｒｏｂｅ（４５０μｌ、到着後４℃で保存）
【００３６】
検出キットＩ：（２５０反応／キット、４℃で保存）
（１）ブロッキング緩衝液（０．５％、６０ｍｌ、４℃で保存）
（２）基質Ａ（７．５ｍｌ、４℃で保存）
（３）基質Ｂ（７．５ｍｌ、４℃で保存）
【００３７】
検出キットＩＩ：（２５０反応／キット、−２０℃で保存）
（１）生物活性触媒（ＢＣ；１ｍｇ／ｍｌ、１５μｌ、−２０℃で保存）
【００３８】
他の材料および設備：
（１）磁気ラック
（２）ＮＡＬＣ（Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン）
（３）４％ＮａＯＨ溶液
（４）２．９４％クエン酸ナトリウム溶液
（５）ＰＢＳ、ｐＨ７．０
（６）０．１％ＰＢＳＴ（０．１％ツイーン−２０を含むＰＢＳ）
（７）０．５％ＰＢＳＴ（０．５％ツイーン−２０を含むＰＢＳ）
（８）磁気乾燥浴
（９）ＰＣ接続のＢｅｒｔｈｏｌ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ
【００３９】
手順：
Ｉ．臨床試料の汚染除去（各病院によりＰ３レベルの実験室で実施）
（１）臨床試料を採集し、４℃の冷蔵庫内に保存する。
（２）ＮＡＬＣ１ｇを滅菌４％ＮａＯＨ１００ｍｌおよび２．９４％クエン酸ナトリウム溶液１００ｍｌに溶かす（毎日調製）。
（３）各臨床試料に等体積のＮａＯＨ−クエン酸塩−ＮＡＬＣを加える。
（４）３０秒間渦攪拌し、試料チューブを数回反転させる。室温（ＲＴ）で１５分間保つ。
（５）試料チューブの５０ｍｌのレベルまでＰＢＳを加え、次いで３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。
（６）上清を除去し、ＰＢＳ１ｍｌを用いて沈殿を再懸濁させる。
【００４０】
ＩＩ．沈殿の溶解（Ｐ２実験室内で行うことができる）
（１）ｄｄＨ２Ｏ１０ｍｌを再懸濁した沈殿１ｍｌと混ぜる。２０秒間渦攪拌し、次いで３，８００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
（２）上清を除去し、溶解緩衝液Ｉ  １５０μｌを加え、１分間渦攪拌する。ＲＴで１０分間保つ。
（３）溶解チューブを１００℃の水浴中に２０分間保ち、次いで溶解緩衝液ＩＩ  １２５μｌを加える。
（４）１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＮＡライセートを集め、−２０℃のフリーザー中に保存する。
【００４１】
ＩＩＩ．標的の増幅：２ステップ
ステップＩ：
（１）以下の試薬を加えることにより新たな０．２ｍｌ微量遠心管をセットする：
試薬                                                      体積
ＤＮＡ                                                    １μｌ
反応混合物＊                                             ４９μｌ
＊反応混合物は、以下のカクテルを含有する：
試薬                                                      体積
１０Ｘ伸長緩衝液                                          ５μｌ
＃４プライマー（ＴＧＡＧＧＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＡ）      ５μｌ
＃５プライマー（ＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＡＡ）      ５μｌ
ｄＮＴＰ                                                  １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）                  ０．５μｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                               ３２．５μｌ
１．フタの加熱を作動して、以下のプログラムを開始する。
【００４２】
2005172789.tif 000003
【００４３】
ステップＩＩ：
１．以下を加えることにより新たな０．２ｍｌ微量遠心管をセットする：
試薬                                                      体積
ステップ１からのＰＣＲ産物                               １５μｌ
反応混合物＊                                              ３５μｌ
＊反応混合物は、以下のカクテルを含有する：
試薬                                                      体積
１０Ｘ伸長緩衝液                                          ５μｌ
＃６プライマー（ＧＡＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＡＧＧＧＣ）      ５μｌ
＃７プライマー（ＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＧＡＡＣＣＣＴ）        ５μｌ
ｄＮＴＰ                                                  １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）                  ０．５μｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                               １８．５μｌ
２．伸長プログラムを開始する。
＊伸長プログラムは、ステップＩと同じである。
【００４４】
ＩＶ．ハイブリダイゼーション
（１）ハイブリダイゼーションチューブ中で、ｄｄＨ２Ｏ１２５μｌ、ＭａｇＰｒｏｂｅ１５μｌ、ハイブリダイゼーション緩衝液１５０μｌおよび各増幅ＤＮＡ試料１０μｌを混合する。
（２）ハイブリダイゼーションチューブを１００℃の乾燥浴で５分間保つ。
（３）ハイブリダイゼーションチューブを６０℃の乾燥浴に移し、２０分間保つ。
（４）ハイブリダイゼーションチューブを磁気乾燥浴の磁気ウェルに移し、５分間保つ。
（５）ハイブリダイゼーション緩衝液を吸引により除去する。
（６）予熱した６０℃の洗浄緩衝液１ｍｌを各チューブに加え、渦攪拌し、チューブを磁気ウェルに戻して５分間保持する。
（７）ハイブリダイゼーション緩衝液を吸引により除去する。
（８）ステップ６〜７を繰り返す。
（９）ハイブリダイゼーションチューブをＲＴに保つ。
【００４５】
Ｖ．検出
（１）ブロッキング溶液２００μｌを各チューブに加え、渦攪拌する。
（２）新たに調製したＢＣ（０．１％ＰＢＳＴ９９μｌ＋ＢＣストック１μｌ）５μｌを加え、渦攪拌して均一に分散させる。ＲＴにおいて２０分間放置する。光を避ける。
（３）ハイブリダイゼーションチューブを磁気ラックに入れて５分間放置する。次いで、溶液を吸引により除去する。
（４）０．５％ＰＢＳＴ１ｍｌを加え、渦攪拌してチューブを磁気ラックに戻す。５分間放置し、次いで溶液を吸引により除去する。１回繰り返す。
（５）各チューブにＰＢＳ２００μｌを用い、渦攪拌することによって磁気ビーズを再懸濁させる。
（６）ステップ５からの再懸濁溶液２０μｌを採取する。
（７）混合基質５０μｌを各チューブに加える（基質Ａ２５μｌ＋基質Ｂ２５μｌ）。
（８）ルミノメーターにより発光を読み取る。
【００４６】
ＶＩ．結果の解釈
（１）≧１００，０００ＲＬＵ：Ｍ．ｔｂコンプレックスに陽性
（２）＜２５，０００ＲＬＵ：Ｍ．ｔｂコンプレックスに陰性
（３）２５，０００〜１００，０００ＲＬＵ：Ｍ．ｔｂコンプレックスに陽性と考えられる。
再試験を行って結果を検証する。
（４）再試験値≧２５，０００ＲＬＵ：Ｍ．ｔｂコンプレックスに陽性
（５）再試験値＜２５，０００ＲＬＵ：Ｍ．ｔｂコンプレックスに陰性
【００４７】
実施例１
上記手順に従い、Ｍ．ｔｂおよびＭ．ａｖｉｕｍからのマイコバクテリアゲノムＤＮＡ１０フェムトグラム（１０ｆｇ）を分析した。図２においてＭ．ｔｂがＭ．ａｖｉｕｍと区別できたことが明確に示され、この検出キットは、Ｍ．ｔｂの１〜２０という少ないコピー数を検出できることを示唆している。
【００４８】
実施例２
図３に示すように、ＭＴＢアッセイにより、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）、ヒトＤＮＡ（ＨＵ）またはニシン精子ＤＮＡ（ＨＳ）と対照的に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＭＴＢ）が特異的に検出された。
【００４９】
実施例３
本発明のアッセイ系により様々な試料をアッセイした。図４には、ＭＴＢアッセイにより、臨床試料からのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが特異的に検出されたが、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ（Ｍｍａ）、Ｍ．ａｖｉｕｍ（Ｍａｖ）およびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（Ｍｉｎｔ）を含むＭＯＴＴ（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ以外のマイコバクテリア）は検出されなかったことが明確に示されている。
【００５０】
実施例４
スメア試験、培養による確認および入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって判定された陽性と陰性症例の臨床試料を本発明によって検査した。図５の結果は、前述の結果と一致した。これらの結果は、本発明のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ検出キットは、極めて高い感度および特異性を獲得したことを示した。
【００５１】
当業者が本発明を実現し用いるために本発明を十分に詳しく記述しかつ例示してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱しない様々な代替方法、改変、および改善は明らかであろう。
【００５２】
本発明が、目的を遂行し、記述された目標および利点、ならびに本発明に固有の目標および利点を得るのに十分適していることを当業者は容易に理解するであろう。細胞系、胚、動物ならびにそれらを生産するためのプロセスおよび方法は、好ましい実施形態を代表するもので例示的であり、本発明の範囲を制限することを意図していない。本発明における改変および他の使用法は、当業者に思い当たるはずである。これらの改変は、本発明の精神に包含され、特許請求の範囲により定義される。
【００５３】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく本明細書に開示された本発明に対して様々な置換および改変を行えることは、当業者には明らかであろう。
【００５４】
本明細書に記載したすべての特許および出版物は、本発明が関係する当業者のレベルを示している。本明細書では、個々の出版物が参照により具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度に、すべての特許および出版物を参照により組み込む。
【００５５】
本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限が存在しなくても実施することができる。用いてきた用語および表現は、制限する用語ではなく説明の用語として使用されたものであり、このような用語および表現の使用が、示しかつ記載した特徴のいずれの等価物またはその一部を除外する意図はないが、様々な改変が特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内にあることは認められるであろう。したがって、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明を開示してきたが、本明細書に開示された概念の改変および変形が当業者によって採用され、そのような改変および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると見なされることは理解されるであろう。
【００５６】
添付の特許請求の範囲には他の実施形態が示されている。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の検出方法の概略を示す図である。
【図２】本発明のキットにより検出されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡを示す図である。
【図３】本発明のアッセイによるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの同定を示す図である。
【図４】本発明のアッセイの特異性を示す図である。
【図５】本発明のキットの特異性および感度を示す図である。
【図６】本発明の機器を示す図である。
【図１】
2005172789.tif 000004
【図２】
2005172789.tif 000005
【図３】
2005172789.tif 000006
【図４】
2005172789.tif 000007
【図５】
2005172789.tif 000008
【図６】
2005172789.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月1日(2005.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本明細書で使用する「プローブ」とは、特定の標的によって特異的に認識することができる物質、例えば分子である。一般に、プローブを固体支持体に連結させ、ＤＮＡの分離を容易にするものとする。本発明では、磁気ビーズに連結しているプローブ（Ｍａｇ Ｐｒｏｂｅ）が好ましい。Ｍａｇ Ｐｒｏｂｅにおけるプローブの配列は、アミン−ＴＡＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧ（配列番号１）である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
ＩＩＩ．標的の増幅：２ステップ
ステップＩ：
（１）以下の試薬を加えることにより新たな０．２ｍｌ微量遠心管をセットする：
試薬                                                      体積
ＤＮＡ                                                    １μｌ
反応混合物＊                                             ４９μｌ
＊反応混合物は、以下のカクテルを含有する：
試薬                                                      体積
１０Ｘ伸長緩衝液                                          ５μｌ
＃４プライマー
（ＴＧＡＧＧＧＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＡ）（配列番号２）      ５μｌ
＃５プライマー
（ＣＧＴＡＧＧＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＡＡ）（配列番号３）      ５μｌ
ｄＮＴＰ                                                  １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）                  ０．５μｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                               ３２．５μｌ
１．フタの加熱を作動して、以下のプログラムを開始する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
ステップＩＩ：
１．以下を加えることにより新たな０．２ｍｌ微量遠心管をセットする：
試薬                                                      体積
ステップ１からのＰＣＲ産物                               １５μｌ
反応混合物＊                                              ３５μｌ
＊反応混合物は、以下のカクテルを含有する：
試薬                                                      体積
１０Ｘ伸長緩衝液                                          ５μｌ
＃６プライマー
（ＧＡＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＡＧＧＧＣ）（配列番号４）      ５μｌ
＃７プライマー
（ＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＧＡＡＣＣＣＴ）（配列番号５）        ５μｌ
ｄＮＴＰ                                                  １μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ／μｌ）                  ０．５μｌ
ｄｄＨ２Ｏ                                               １８．５μｌ
２．伸長プログラムを開始する。
＊伸長プログラムは、ステップＩと同じである。