(57)【要約】【課題】  ガラス基板上に固定されたオリゴDNAを、飛行時間型二次イオン質量分析（TOF-SIMS）法により分析する新規な方法を提供する。【解決手段】  核酸塩基配列を決定する方法であって、  （１）塩基配列に含まれない元素もしくは元素群で標識された塩基配列の解析を所望する核酸が固定された基板を用意する工程；  （２）基板上に固定されている核酸を飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）によって測定する工程；  （３）該標識物質を含んだ前記核酸配列の断片が、鎖長の異なる核酸配列を含むことを利用して、標識物質の分子量からの分子量増加に基づき核酸の塩基配列を明らかにする工程；  少なくとも、上記（１）〜（３）の各工程を有することを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸塩基配列を決定する方法であって、
（１）塩基配列に含まれない元素もしくは元素群で標識された塩基配列の解析を所望する核酸が固定された基板を用意する工程；
（２）基板上に固定されている核酸を飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）によって測定する工程；
（３）該標識物質を含んだ前記核酸配列の断片が、鎖長の異なる核酸配列を含むことを利用して、標識物質の分子量からの分子量増加に基づき核酸の塩基配列を明らかにする工程；
少なくとも、上記（１）〜（３）の各工程を有することを特徴とする核酸塩基配列の決定方法。
【請求項２】
前記核酸が、3'末端もしくは5'末端によって標識され、かつ標識されていない方の側で基板上に固定されている請求項１に記載の配列決定方法。
【請求項３】
前記標識物質を含んだ核酸配列の断片で、標識物質と核酸一つを含んだ断片の分子量から、標識されている側の末端核酸がAGTCのどれであるかを判定し、また標的物質を核酸２つを含んだ断片の分子量から、標識されている側の末端から2番目の核酸がAGTCのどれであるかを判定するという作業を繰り返すことを特徴とする、請求項１に記載の塩基配列決定法。
【請求項４】
前記標識物質がフッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲン元素であることを特徴とする請求項１に記載の配列決定方法。
【請求項５】
前記標識物質が4種類の核酸やそれらの和の分子量と大きく異なり、質量分析において混同される危険性の少ないことを特徴とする請求項１に記載の配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸塩基配列の決定方法に関し、特に基板上に固定された塩基配列解析において、飛行時間型二次イオン質量分析法を利用する核酸塩基配列の決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列決定法に関しては、さまざまな手法が考案され、かつ改良が重ねられてきた。現在はSangerらによって開発されたジデオキシ法（Proceeding of the National Academy of Sciences, USA 74, 5463, 1977）を基本とし、4種の色素を用いるダイ（色素）ターミネーション法とキャピラリー電気泳動法を組み合わせた手法が主流となり、簡便に操作が可能な装置等も開発されている。
【０００３】
これに対し、近年マトリクス援助レーザー脱着/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）法を用いた手法が考案されている。これらは基板上の固定されたプライマーに、シークエンシングを行いたい核酸をハイブリダイズさせ基板上で伸長反応を行う。その際にサンガー法と同様に、それ以上伸長されない核酸（ターミネーター）が混入されていて、それによってランダムな長さまで伸長された核酸が基板上に固定された状態で生成される。この基板をきれいに洗い流して不純物を取り除いたのちに、酸または光によって、基板に結合された核酸のプライマー部分の結合を切断する。その切断されたランダムな長さの核酸をMALDI-TOF  MS法によって質量分析することにより、一塩基ずつ伸長されたヌクレオチドの質量がわかり、それによってシークエンシングを行う。
【０００４】
飛行時間型二次イオン質量分析（TOF-SIMS）法は、近年多用されるようになった固体試料最表面の質量分析法であり、（１）最表面の1原子層の1/105程度の極微量成分の検出能があること、（２）有機物、無機物のどちらにも適用できること、（３）表面に存在するすべての元素や化合物を測定できること、（４）試料表面に存在する物質からの二次イオンのイメージングが可能であることなどの特徴がある。
【０００５】
TOF-SIMS法以前の質量分析法である動的二次イオン質量分析法（dynamic-SIMS）は、二次イオンが生成する過程で有機化合物が小さいフラグメントイオン、または粒子にまで分解してしまい、質量スペクトルから得られる化学構造情報が乏しくかった。そのため核酸やたんぱく質などの生体高分子の分析には適しておらず、本発明のような応用も困難であった。
【０００６】
TOF-SIMS法の原理は、高真空中で高速のイオンビーム（一次イオン）を固体試料表面に照射することで固体中にフォノンのモードを励起し、その格子振動のエネルギーによって表面の構成成分を真空中に放出する。このとき発生する正または負の電荷を帯びたイオン（二次イオン）を電場によって一方向に収束し、ある距離を飛行した後観察される。二次イオンは試料表面の組成に応じて様々な質量をもつフラグメントとなり、質量に反比例した加速度を受けて速度がきまるため、二次イオンが発生してから検出されるまでの時間（飛行時間）を測定することで、発生した二次イオンの質量を分析することができる。
【０００７】
現在用いられている一次イオンはGaイオンなどであるが、今後はさらに質量の大きな金のイオンがより頻繁に用いられると考えている。金は三量体を形成することもあってさらに質量の大きな一次イオンとなり、そのために、生成される2次イオンの質量も大きくなる。つまり、検出される二次イオンはますますもとの構造を保ったまま観測されるようになるため、より大きな高分子、つまり生体分子などの観測には適している。
【０００８】
今後は、さらに大きな分子のままイオン化する技術が発展していくと思われ、本発明による方法での解析はより簡易化されると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、これらの手法は液層系での反応を基本とし、またオリゴヌクレオチドと呼ばれる短い核酸の配列を解析することはできなかった。
【００１０】
現在はゲノム情報の増加に伴い、遺伝子の発現量や多型性を調べる研究が大規模に進められている。そのようなHigh-ThroughPutのゲノム解析に良く用いられるものとして、核酸をガラス基板上に高密度に固定したDNAマイクロアレイが挙げられる。従来ガラス基板上に固定されていたのはｃDNAと呼ばれる鎖長の長い核酸が主流であったが、現在は十数〜数十塩基長をもつオリゴ核酸配列がよく用いられている。
【００１１】
このようなオリゴDNAを用いてアレイを作成した場合に、作成者が意図した位置に、意図したオリゴヌクレオチドが固定されているかどうかを確認する技術は大変重要になる。マイクロアレイは、ターゲットとのハイブリダイゼーションの後蛍光観察を行って、ターゲット中に、アレイ上のプローブと相補的な配列を含む遺伝子が存在するかどうかを判定するデバイスであるためプローブの位置がずれていれば、それはそのまま間違った遺伝子の検出につながる。もしもこれが診断用に作製マイクロアレイであれば、それは誤った診断につながりその影響は計り知れない。
【００１２】
それにもかかわらず、マイクロアレイ作製プロセスでは、そのような誤りの原因となりうる要因がいくつも存在する。オリゴDNAは、ほぼ同じ長さで配列が異なる場合に、外観からみられる違いは存在せず、それらを大量にエッペンドルフで管理する過程でなんらかの取り違いが存在した場合に、それを検地し修正するのは非常に困難になる。
【００１３】
また、管理段階での間違いは防げたとしても、それらの中から使用する配列を選び出し、インクジェットによる基板上への吐出作業のために、インクジェット・ヘッドへ詰める操作の過程で間違いが生じる可能性は多分にある。
【００１４】
このような状況を考えると、基板上に吐出され、固定されたオリゴ核酸の配列を確認する方法があれば、それは最も直接的で、正確な確認方法だと言える。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ここでは、ガラス基板上に固定されたオリゴDNAを、飛行時間型二次イオン質量分析（TOF-SIMS）法により分析する新規な方法を提供する。
【００１６】
TOF-SIMS法は、固体試料の最表面を調べるための分析方法であり、最表面の1原子層の1/105に相当する微量成分の検出能があるという特徴がある。また表面に存在するすべての元素や化合物が測定でき、表面上の2次元的空間分解能も高い。
【００１７】
従来のdynamic-SIMSでは、イオン化の際に有機化合物が小さいフラグメントまたは粒子にまで分解してしまうという難点があったが、TOF-SIMSでは一次イオン照射量が少ないために、ある程度の大きさをもったフラグメントとしてイオン化され、質量スペクトルを観察することができる。
【００１８】
このようなTOF-SIMSの特徴を利用し、基板上に固定された標識入りのオリゴDNAを測定する際に、検出されるさまざまな大きさのオリゴDNA断片のうち、該標識を含むものの測定値から該オリゴDNAの塩基配列を求めることを特徴とする、核酸配列の決定方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて、基板上に固定された核酸の標識を含むフラグメントを分析することにより、核酸の塩基配列を知ることができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、TOF-SIMSを用いて核酸の塩基配列の決定を行うにあたり、核酸の一端が標識され、別の一端が基板上に固定された状態で、標識を含む核酸のさまざまな大きさの断片をTOF-SIMS法によって検出することにより上記の目的を達成するものである。
【００２１】
標識に使われる元素および元素群は、質量分析の観点から核酸から生じる断片と相同でないものが好ましく、またTOF-SIMSでの測定の際に標識自身がフラグメント化されてさまざまな質量を生じる可能性の小さいものがよい。
【００２２】
そのような観点から、ハロゲン原子は標識に適している。またハロゲン原子はイオン化効率も高くTOF-SIMSでの検出感度の向上も期待できる。
【００２３】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子を挙げることができる。これらはTOF-SIMS法で検出可能であり、また核酸のヌクレオチドの塩基に結合させるなどして核酸プローブに導入することができる。
【００２４】
核酸の基板への固定化には公知の方法が利用でき、基板に一面に固定してもよいし、スポット状の独立領域に、多種類の核酸を所定の間隔をおいてマトリクス状に配置しても構わない。
【００２５】
核酸の標識されていない側は、基板表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、核酸が有する基板表面に結合可能な構造は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基などの有機官能基が好ましい。また、核酸側の基板への結合に必要な構造に応じて、基板表面に必要とされる処理、例えばチオール基用のマレイミド基、アミノ基用のエポキシ基などを基板表面に形成する処理を施すことで共有結合による核酸の固定が可能になる。
【実施例１】
【００２６】
核酸配列の固定された基板を特開平11-187900号公報に記載の方法に準じて作製した。
【００２７】
（１）基板洗浄
1×3インチ角で厚さが1mmの合成石英基板をラックにいれ、純水で軽くすすぎスピンドライによって乾燥させた後、5分間のUV洗浄を行った。その後洗剤中で2分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水中で再び超音波洗浄を2分間行った。
【００２８】
（２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、N-β-（アミノエチル）-γ-アミノプロピルトリメトキシシランKBM603（信越化学工業）の0.1％水溶液を室温下で20分攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。ついでこの溶液を上記（1）で得た基板にスピンコート法により湿布したのち、150℃に加熱したオーブン中で一時間ベークして、最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００２９】
ついでN-マレイミドカプロイオキシスクシニミド（EMCS）1.5mgをヂオキサン１５mLに溶解し、（2）で得た基板にスピンコート法により湿布した。この段階で、シランカップリング剤によって基板表面に担持されているアミノ基とEMCS溶液のスクシイミド基が反応し、基板表面にはEMCS由来のマレイミド基が存在することになる。
【００３０】
（３）核酸プローブDNAの合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して、配列番号１の一本鎖核酸を合成した。
配列番号：１
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACT-GGC-CGT-CGT-TTT-ACAU（Bｒ）3'
ここでATGCはそれぞれ塩基としてアデニン、チミン、グアニン、シトシンをもつヌクレオチドを示し、またUBｒは5-ブロモ-2’-デオキシウリジンであり、合成時に以下に示すフォスフォオアミダイト体（グレンリサーチ社）を用いて導入した。
【００３１】
【化１】
2005172501.tif 000002
【００３２】
なお、3'末端のUBｒはUBｒ結合CPGカラム（グレンリサーチ社）を用いて導入した。
【００３３】
【化２】
2005172501.tif 000003
【００３４】
またこれらのDNAの５’末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ社）を用いることによってチオール（SH）基を導入した。なお、脱保護、DNAの回収は定法により行い、また精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
【００３５】
（４）インクジェット方式によるDNA及びマーカーの吐出および基板への結合
上記配列の一本鎖DNAを8μMの濃度でグリセリン15.0wt％、尿素15.0wt％、ジエチレングリコール9.0wt％、及びアセチレンアルコール（商品名：アセチレノールEH;川研ファインケミカル（株）社製）0.01wt％を含む溶液のそれぞれ溶解した。マーカーに関しても、DNAと同様に上記の成分をもつクリアインクに溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット（登録商標）法を用いたバブルジェット（登録商標）プリンターBJF-850（キヤノン）用のプリンターヘッドBC-50（キヤノン）を数100μｌの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドの改造タンク部に上記DNA溶液を注入した。吐出描画機に（３）で作製した基板を装着し、ここにDNA溶液をスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は4pl/dropletで、スポッティングの範囲は基板の中央部に10mm×10mmの範囲に200dpiすなわち127μmのピッチで吐出した。この条件では、スポッティングされたドットの直径は約50μｍであった。
【００３６】
スポッティング終了後、基板を30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を超純水中で保存した。
【００３７】
（５）TOF-SIMSによる測定
このように作製した基板をION TOF社 TOF-SIMSを用いて測定した。
【００３８】
一次イオンはAuガンから発生するイオンを用いた。
【００３９】
ここで核酸の質量について考察する。核酸はA,T,G,Cの4種類の塩基をもつデオキシリボヌクレオチドによって構成されている。4種類の塩基部分の構造は以下に示す通りである。
【００４０】
【化３】
2005172501.tif 000004
【００４１】
【化４】
2005172501.tif 000005
【００４２】
これに対して、ヌクレオチドの糖とリン酸部分の構造は以下のようになっている。
【００４３】
5-ブロモ-2’-デオキシウリジンの塩基部分はチミンのメチル基がBrに置き換わっているので、塩基部分の分子量は以下のようになる。
ブロモウラシル：C4N2O2H4Br                  分子量：191
塩基が糖部分に結合するときにHが一つはずれるので、それらを考慮すると、核酸のフラグメントとしてのヌクレオチド一つ分の質量は
アデノシン-5リン酸    ：312
グアノシン-5リン酸          ：328
シチジン-5リン酸            ：288
チミジン-5リン酸            ：303
5-ブロモ-2’-デオキシウリジン：385（3’末端の官能基がOHとなって終端する。）
となる。
【００４４】
これらの値を基準にTOF-SIMSでの測定データを見てみると。ヌクレオチド二つ分のフラグメントに対応するシグナルとしては、AU(Br)に対応するものが、それ以外のTU(Br)、GU(Br)、CU(Br)に対応するものに比べて5倍ほど多く、またヌクレオチド３つ分に対応するフラグメントに対しても、CAU(Br)に対応するシグナルが他の塩基の組み合わせよりも有意に大きく測定された。
【００４５】
ちなみに、Gaイオンを用いたTOF-SIMSでも測定してみたが、Gaイオンの場合にはAuの場合のように大きなフラグメントは観察されず、分子量300以上でのシグナル自体も非常に弱いものになるため、例えばAU(Br)とそれ以外TU(Br)、GU(Br)、CU(Br)の間に有意な差は検出できなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】基板上の核酸配列決定法イメージ図。
【符号の説明】
【００４７】
１０１  核酸の固定された基板
１０２  Br標識された核酸配列
１０３  Brを含み、2塩基分の情報を含んで途中で切断された核酸断片
１０４  Brを含み、1塩基分の情報を含んで途中で切断された核酸断片
【図１】
2005172501.tif 000006
【配列表】
2005172501000001.app