(57)【要約】【課題】  本発明は、生体の中で免疫機構の調整に関与しているタンパク質を同定し、生物の免疫機構、特に植物免疫機構の異常な活性化を抑制することができるタンパク質を提供するものである。即ち、本発明は、生物の免疫機構の活性抑制剤を提供するものである。【解決手段】  本発明は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物を含有してなる、免疫機構の活性化抑制剤に関する。また、本発明は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子が欠損したｃａｄ１変異体に関する。さらに、本発明は、前記したシロイヌナズナのｃａｄ１変異体を生育させて、これに被検物質を導入して、ｃａｄ１変異体の壊死病斑を測定することからなる、被検物質の免疫機構の活性化抑制作用をスクリーニングする方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物を含有してなる、免疫機構の活性化抑制剤。
【請求項２】
シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子が、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子を含有するものである請求項１に記載の免疫機構の活性化抑制剤。
【請求項３】
シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物が、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項１に記載の免疫機構の活性化抑制剤。
【請求項４】
免疫機構が、植物の免疫機構である請求項１〜３のいずれかに記載の免疫機構の活性化抑制剤。
【請求項５】
請求項５に記載のｃａｄ１変異体を生育させて、これに被検物質を導入して、ｃａｄ１変異体の壊死病斑を測定することからなる、被検物質の免疫機構の活性化抑制作用をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物を含有してなる、免疫機構の活性化抑制剤に関する。また、本発明は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子が欠損したｃａｄ１変異体に関する。さらに、本発明は、前記したシロイヌナズナのｃａｄ１変異体を生育させて、これに被検物質を導入して、ｃａｄ１変異体の壊死病斑を測定することからなる、被検物質の免疫機構の活性化抑制作用をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の免疫機構において抗体やキラー細胞は、重要な役割を担っている。補体は、抗体のFc部分を認識することで、抗原の細胞膜を破壊する。パーフォリン蛋白質は、キラー細胞から放出され細胞膜に穴を開け、抗原となる細胞を崩壊させる。この様に、補体とパーフォリン蛋白質は、致死性の蛋白質として機能する点において類似しており、そして、両者は相互に保存されたMACPFドメインからなるアミノ酸配列を持っている点においても類似している。
最近、ヒトにおいて、パーフォリンの欠損が家族性血球貧食性リンパ組織急増多症の原因の一つであると同定された。この疾患は、免疫系の過剰な活性化を特徴とし、パーフォリン蛋白質は、細胞障害のみならず、免疫系細胞の活性抑制に関与する可能性が指摘されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Susan E. Stepp et al., Perforin Gene Defects in Familial Hemophagocytic Lymphohistiocytosis Science, 286: 1957-1959 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
生物は外界からの各種の傷害に対して個体を守る手段を保有している。その一つが免疫機構であるが、免疫機構が異常を起こせば個体自身が自己の免疫機構により死滅又は壊死することが起こる。このように免疫機構の異常な活性化は、個体自身にとっても非常に危険な存在であり、個体の中では免疫機構の適正な調節が行われている。
本発明は、生体の中で免疫機構の調整に関与しているタンパク質を同定し、生物の免疫機構、特に植物免疫機構の異常な活性化を抑制することができるタンパク質を提供するものである。即ち、本発明は、生物の免疫機構の活性抑制剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、シロイヌナズナの免疫機構に関連する各種の遺伝子の機能について検討してきたが、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子が、免疫機構の異常な活性化を抑制し、生体内の免疫機構の適正化を調整している作用を有していることを見出した。
【０００６】
本発明は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物を含有してなる、免疫機構の活性化抑制剤に関する。
また、本発明は、前記したシロイヌナズナのｃａｄ１変異体を生育させて、これに被検物質を導入して、ｃａｄ１変異体の壊死病斑を測定することからなる、被検物質の免疫機構の活性化抑制作用をスクリーニングする方法に関する。
【０００７】
本発明者らは、The Salk Institute Genome Analysis Laboratoryにより提供された、シロイヌナズナのＣＡＤ１（constitutively activated cell death 1）遺伝子上にＴ−ＤＮＡが挿入された劣性の変異体（ｃａｄ１変異体）を用いた。
この変異体ｃａｄ１を生育させて、その形質を観察した。その結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１のａ（図１中の上段の左側）は、発芽後１４日目の野生型とｃａｄ１変異体の全体像を示し、左側は野生株コロンビアを示し、右側はｃａｄ１変異体を示す。  図１のｂ（図１中の上段の右側）は、発芽後１４日目の野生型とｃａｄ１変異体の第３葉を拡大して示し、左側は野生株コロンビアを示し、右側はｃａｄ１変異体を示す。図１のｃ（図１中の下段）は、発芽後１４日目のｃａｄ１変異体の全体像を拡大して示したものである。この結果、ｃａｄ１変異体では、発芽後１４日目において顕著な壊死病斑が形成され、生育できなくなる。
このように、ｃａｄ１変異体は、発芽後１０日目頃から壊死病斑が形成され始め、発芽後２０日程経過した個体では、ほぼ全ての組織が壊死した。
【０００８】
植物の免疫機構は、植物体内に侵入してきた病原体などを認識した後、感染特異的遺伝子の発現と壊死病斑の形成によって実現されている。この壊死病斑は、侵入してきた病原体などの拡大を防ぐために、侵入者に汚染されたされた部分を壊死させる重要な植物免疫機構の一部である。
図１に示されるｃａｄ１変異体に生起した壊死病斑は、この免疫機構の過剰な活性化により生起したものであり、これはＣＡＤ１遺伝子の欠損により誘導されたことが明らかになった。
シロイヌナズナのＰＲ(pathogenesis related gene)遺伝子は、病原体の感染と共に発現レベルの上昇が観察される。この様なことから、このＰＲ遺伝子は、病原体感染のマーカー遺伝子として解析に用いられている。例えば、野生株コロンビアとｃａｄ１−１変異体（発芽後１０日）におけるＰＲ１、ＰＲ２遺伝子の発現解析を行うと次のとおりの結果が得られる。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２は、定量的ＲＴ−ＰＣＲの後、サザンブロット解析によってＰＲ１、ＰＲ２、及びＥＦ１αのシグナルを検出したものである。図２の左側のレーンは野生株コロンビアの場合を示し、右側のレーンはｃａｄ１−１変異体を示す。ＥＦ１α（Elongation Factor １α）は、コントロールである。この結果、ｃａｄ１−１変異体のＰＲ遺伝子が恒常的に発現していることが分かる。
したがって、ＣＡＤ１遺伝子は、植物免疫機構の過剰な活性化を抑制する作用を有するものである。
【０００９】
シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子は、５６１個のアミノ酸から成るタンパク質をコードしている。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。また、図３にはそのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示す。
また、この遺伝子の翻訳産物は、動物の免疫機構に関わる補体やパーフォリン蛋白質に保存されたＭＡＣＰＦドメインを持っている。即ち、ＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物の１４５番目から３０１番目には、補体やパーフォリン蛋白質に保存されたＭＡＣＰＦドメインが存在している。ＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物の１４５番目から３０１番目のアミノ酸配列と、補体やパーフォリン蛋白質に保存されたＭＡＣＰＦドメインのアミノ酸配列の比較を図４に示す。図４の上段はＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物の１４５番目から３０１番目を示し、下段はＭＡＣＰＦドメインのコンセンサス配列のアミノ酸配列を示す。
一般に、ＭＡＣＰＦドメインを持つたんぱく質は、このドメインのみに類似性があり、その他の配列にコンセンサスはない。シロイヌナズナのＣＡＤ１蛋白質も、この例外ではなくＭＡＣＰＦドメインのみに補体やパーフォリン蛋白質との類似性が保存されている。また、これまでに、植物のタンパク質にＭＡＣＰＦドメインを持つ遺伝子の機能について報告された例は無く、本発明が初めて植物におけるＭＡＣＰＦドメインを持つ遺伝子の機能を報告するものである。
【００１０】
動物と植物の免疫機構では、異なるシステムで構成されているが、本発明のＣＡＤ１遺伝子の欠損による形質は、致死性の蛋白質として細胞障害に機能するものであり、ヒトにおけるパーフォリンの欠損による家族性血球貧食性リンパ組織急増多症（非特許文献１参照）に類似するものである。そして、本発明のＣＡＤ１蛋白質は、パーフォリン蛋白質や補体に保存されたＭＡＣＰＦドメインを持っていることから、本発明のＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物は、シロイヌナズナだけに限定されるものではなく、植物や動物に共通する免疫機構に関与していると考えられる。
【００１１】
本発明の免疫機構の活性化抑制剤は、免疫機構が過剰に活性化され、自己免疫により傷害が生じている生物、特に植物の免疫機構を正常化し、免疫機構の過剰な活性化による傷害を治癒し、又は予防するための有効成分として使用される。
本発明の免疫機構の活性化抑制剤は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物からなるものである。シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質からなるが、５６１個のアミノ酸が必ずしもこの種類で、この順番である必要はなく、少なくともシロイヌナズナの免疫機構の過剰な活性化を抑制できる性質を有し、かつＭＡＣＰＦドメインのアミノ酸配列が保持されているものであれば、全長アミノ酸の５０％以上、好ましくは７０％以上、又は８０％以上、また９０％以上のアミノ酸が残されている限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換されていてもよいし、他のアミノ酸が付加されていてもよいし、また一部のアミノ酸が欠失されていてもよく、これらの置換、付加、及び欠失が組み合わされていてもよく、このようなアミノ酸配列を有するタンパク質である限りにおいて、本発明のシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物に包含されるものである。
本発明におけるシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子としては、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するも遺伝子からなるものであるが、これに限定されるものではなく、前記した本発明のシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子の翻訳産物のアミノ酸配列をコードしているものであれば、いずれも本発明のＣＡＤ１遺伝子に包含されるものである。本発明のＣＡＤ１遺伝子は、翻訳領域のみからなるものであってもよいし、その上流側にプロモーターなどの制御領域を有するものであってもよいし、またその下流側にさらに必要な塩基配列を有したものであってもよいし、これらが組み合わされたものであってもよい。
また、本発明におけるシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子は、本発明の免疫機構の活性化抑制剤の有効成分を生体内で発現させる遺伝子として使用されるので、これを各種のウイルスやプラスミドなどのベクターに含有させたものであってもよい。
【００１２】
本発明の免疫機構の活性化抑制剤は、免疫機構の活性化抑制用の農薬組成物や医薬組成物における有効成分として使用される。農薬組成物としては、前記したシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物からなる有効成分と、農薬上許容される担体とからなるものである。農薬上許容される担体としては、固形剤などにするための賦形剤や、液剤などにおける溶剤などが挙げられる。また、医薬組成物としては、前記したシロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子又はその翻訳産物からなる有効成分と、製薬上許容される担体とからなるものである。製薬上許容される担体としては、注射剤などにおける精製水や、安定化剤、ｐＨ調節剤などが挙げられる。
【００１３】
本発明のｃａｄ１変異体は、ＣＡＤ１遺伝子の機能が欠損したものであれば、ホモ体でも、ヘテロ体であってもよい。ＣＡＤ１遺伝子の機能を欠損させる方法としては、例えば、野生型のＣＡＤ１遺伝子をジーンターゲッティング法などにより特異的に欠損させてもよいし、突然変異によるものからスクリーニングしてきてもよい。また、ＣＡＤ１遺伝子を取り除いたものであってもよいが、通常はＣＡＤ１遺伝子が発現できない状態であればよい。ＣＡＤ１遺伝子の全長の発現を阻害してもよいし、ＭＡＣＰＦドメインを含む部分の発現を阻害するだけであってもよい。
本発明のｃａｄ１変異体は、免疫機構が過剰に活性化されているものであり、免疫機構の解明や、免疫機構の過剰な活性化を抑制できる物質をスクリーニングするためのモデル植物として使用することができる。このようなスクリーニング方法として、本発明のｃａｄ１変異体を生育させて、これに被検物質を導入して、発芽後の壊死病斑を観察することにより行うことができる。壊死病斑の縮小が観察されれば、当該被検物質が免疫機構の過剰な活性化を抑制する作用を有していることになる。本発明のｃａｄ１変異体は、動物の補体やパーフォリン蛋白質と同種のＭＡＣＰＦドメインを有する遺伝子の欠損によるものであることから、植物だけでなく、動物における免疫機構に作用する被検物質のスクリーニングにも応用することが可能である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の免疫機構の活性化抑制剤は、免疫機構の過剰な活性化を抑制し、免疫機構を正常な状態に調整する作用を有するものであり、植物の免疫機構の過剰な活性化による壊死を防止することができるだけでなく、本発明の免疫機構の活性化抑制剤は動物におけるＭＡＣＰＦドメインを有するものであることから、ヒトなどの動物に対する自己免疫疾患などの免疫機構の過剰な活性化による各種の疾患の治療や予防剤とすることも可能である。
また、本発明のｃａｄ１変異体は、免疫機構が過剰に活性化されている植物モデルであり、生物、特に植物の免疫機構の解明のための材料となるだけでなく、免疫機構の過剰な活性化を抑制する物質をスクリーニングするためのモデル生物と使用することができる。
【００１５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
ＣＡＤ１変異体の作成
ｃａｄ１変異体は、ＣＡＤ１遺伝子上にＴ−ＤＮＡが挿入された変異体である。この変異体は、The Salk Institute Genome Analysis Laboratory (SIGnAL)のＴ−ＤＮＡ挿入変異体作製プロジェクトによって提供されたものである。その詳細はホームページ（http://signal.salk.edu/tabout.html）にて公開されている（参考文献；Alonso et al (2003) Genome-Wide Insertional Mutagenesis of Arabidopsis thaliana, Science 301: 653-657 ）。
この変異体は、ｃａｄ１変異体であることを、野生株コロンビアとｃａｄ１−１変異体（発芽後１０日）におけるＣＡＤ１遺伝子の発現解析をＲＴ−ＰＣＲ法にて行って確認した。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５の左側のレーンは野生株コロンビアの場合を示し、右側はｃａｄ１−１変異体の場合を示す。図５の上段はＣＡＤ１を示し、下段はＥＦ１α（Elongation Factor １α）をコントロールとして示す。
この結果、この変異体は、ＣＡＤ１遺伝子の発現が完全に欠損していることが分った。
【実施例２】
【００１７】
ｃａｄ１変異体の育成試験
実施例１のｃａｄ１変異体を、光条件：連続光下、温度条件：２３℃で栽培した。
結果を図１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
植物の免疫機構を制御することは、農業や林業などの作物の育成において重要なだけでなく、森林保護などの環境学的な観点からも重要なことである。本発明の免疫機構の活性化抑制剤は、植物などの生物の免疫機構を調整することができ、植物の免疫機構の過剰な活性化による壊死を防止し、また各種の自己免疫疾患の治療や予防剤としても可能であり、産業上も極めて有用なものである。また、本発明のｃａｄ１変異体は、ＣＡＤ１遺伝子の欠損により免疫機構が過剰に活性化された植物モデルとなるものであり、免疫機構の活性化を抑制することができる物質を探索（スクリーニング）するためのモデル生物として産業上も有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明のｃａｄ１変異体の形質を野生型と比較した結果を示す図面に代わる写真である。
【図２】図２は、野生株コロンビアとｃａｄ１−１変異体（発芽後１０日）におけるＰＲ１、ＰＲ２遺伝子の発現解析を行った結果を示す図面に代わる写真である。図２の左側のレーンは野生株コロンビアの場合を示し、右側のレーンはｃａｄ１−１変異体を示す。ＥＦ１α（Elongation Factor １α）は、コントロールである。
【図３】図３は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配を、アミノ酸の１文字表記で示したものである。
【図４】図４は、シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子がコードするタンパク質の１４５番目から３０１番目のアミノ酸配と、ＭＡＣＰＦドメインのアミノ酸配列を比較して示したものである。
【図５】図５は、野生株コロンビアとｃａｄ１−１変異体（発芽後１０日）におけるＣＡＤ１遺伝子の発現解析をＲＴ−ＰＣＲ法で行った結果を示す図面に代わる写真である。図５の左側のレーンは野生株コロンビアの場合を示し、右側はｃａｄ１−１変異体の場合を示す。図５の上段はＣＡＤ１を示し、下段はＥＦ１α（Elongation Factor １α）をコントロールとして示す。
【配列表フリーテキスト】
【００２０】
配列番号１：シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号２：シロイヌナズナのＣＡＤ１遺伝子の塩基配列
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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