(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、複数種類の標的核酸が混在したサンプル中における各標的核酸の存在比率、または複数サンプル中に各々存在する同種類の標的核酸の存在比率を簡便且つ高信頼度で決定することを可能とする、標的核酸の存在比率の決定方法を提供すること。【解決手段】  サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率を決定する方法であって、特定のタグ付きプライマー核酸を用い該タグ配列が付加された核酸生成物を含む混合物を形成することと、前記タグ配列の変異如何にかかわらず、ハイブリダイゼーションにより前記核酸生成物が前記プローブに結合する条件下において、混合物でプローブアレイを飽和させることと、プローブが飽和された前記プローブアレイを、前記プローブに対して完全に相補的なタグ配列を有する核酸生成物のみが前記プローブに結合する条件下に置くことにより、前記プローブに結合している核酸生成物のうち、前記変位部分が前記プローブとマッチしていないものを除去すること、を含む方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸であって、各々が独特の配列を有する複数種類の標的核酸の存在比率を決定する方法であって、
ａ）前記複数種類の標的核酸の各々を伸長または増幅するために、各々の標的核酸に対応するプライマー配列および該プライマー配列に連結された少なくとも１つのタグ配列からなるタグ付きプライマー核酸であって、前記タグ配列が任意の共通配列及び各プライマーに固有の変異部分からなるタグ付きプライマー核酸を準備することと；
ｂ）前記複数のタグ付きプライマー核酸を用いて、前記複数種類の標的核酸を伸長または増幅することにより、前記標的核酸の各々について、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率に対応した比率で、各標的核酸の前記独特の配列に前記タグ配列が付加された核酸生成物を含む混合物を形成することと、
ｃ）前記各々のタグ配列に対して完全に相補的な配列を有する核酸プローブを固相担体上に植設した、複数種類のプローブアレイを準備することと；
ｄ）前記タグ配列の変異如何にかかわらず、前記タグ配列の共通配列によるハイブリダイゼーションにより前記核酸生成物が前記プローブに結合する条件下において、前記プローブアレイの各々に対して前記混合物を反応させることにより、前記プローブアレイにおけるプローブを飽和させることと；
ｅ）前記プローブが飽和されたプローブアレイを、前記プローブに対して完全に相補的なタグ配列を有する核酸生成物のみが前記プローブに結合する条件下に置くことにより、前記プローブに結合している核酸生成物のうち、前記変位部分が前記プローブとマッチしていないものを除去することと；
ｆ）前記複数のプローブアレイの各々について、前記工程ｅ）後の前記核酸生成物によるプローブ飽和度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的核酸の存在比率を決定することと、
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのタグ配列が、２種以上の核酸配列が隣接してなる核酸配列であり、該２種以上の核酸配列の各々が任意の共通配列及び固有の変異部分からなり、前記核酸配列の一方が結合するプローブには、他方の核酸配列は結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法を用い、サンプル中に含まれる濃度未知の標的核酸の濃度を測定する方法であって、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸が濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸とからなり、請求項１又は２に記載の方法を用いてサンプル中に含まれる濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸の存在比率を決定すること、該存在比率と濃度既知の標的核酸の濃度に基づき濃度未知の標的核酸の濃度を測定すること、を含む方法。
【請求項４】
前記プライマー、タグ、プローブ及び標的核酸が、ＤＮＡ、ＰＮＡ又は核酸配列を認識可能な核酸類似体である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の標的核酸の存在比率を決定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療、農産物、食物および植物に関連する分野で、遺伝子検出が行なわれている。  
通常、検出対象となるサンプル中に含まれる核酸配列は様々なものであり、多種類の配列を持つ核酸鎖が混在している。また、1個体由来のサンプルであったとしても、そのサンプルができる過程で複数個体由来の核酸が混入しているサンプルとなることが多々ある。
【０００３】
例えば、米、その他食物等の出荷にあたり、多品種、多品目のものが混入している場合などである。この場合、他品目の混入を目視で判断することが困難であり、多品種、他品目のものがどのくらい混入しているか、検査を行なう必要がある。
【０００４】
このような同一サンプル中に含まれる複数種の核酸の存在比を測定する方法のひとつとしてリアルタイムＰＣＲが挙げられる。しかし、リアルタイムＰＣＲを用いた場合、混入可能性のある複数の標的核酸鎖をそれぞれ異なるチューブで各標的核酸鎖を増幅するか、複数の蛍光色素などのリポータ分子を用い、複数の標的核酸鎖を分別する必要があった。
また、複数の標的核酸の濃度をそれぞれ単独で測定する場合、その測定方法の検出可能範囲により、正確な混合比が得られない場合があった。
【０００５】
また、例えば、正常細胞と癌細胞等の異常細胞との差違をある標的核酸を指標として比較および評価する場合がある。このような場合、比較対象となる細胞同士を比較するために、これと同数の種類の蛍光色素などのリポータ分子を用い、複数の標的核酸鎖を分別する必要があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、複数種類の標的核酸が混在したサンプル中における各標的核酸の存在比率、または複数サンプル中に各々存在する同種類の標的核酸の存在比率を簡便且つ高信頼度で決定することを可能とする、標的核酸の存在比率の決定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、タグオリゴマー配列中に一塩基変異を含む４種類（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）のタグオリゴマーがプライマーに連結されたタグ付きプライマー核酸を用いて伸長または増幅した産物を利用することにより、簡便且つ高信頼度で複数種類の標的核酸の存在比率を決定し得ることを見出した。すなわち、各種核酸生成物に含まれるタグがプローブとハイブリダイズする際における、各種タグ同士の競合反応を利用して各種核酸生成物の存在比率を決定し、その鋳型となる各種標的核酸の存在比率を決定することができる。本発明は、かかる知見に基づき開発されたものであり、本発明により、
サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸であって、各々が独特の配列を有する複数種類の標的核酸の存在比率を決定する方法であって、
ａ）前記複数種類の標的核酸の各々を伸長または増幅するために、各々の標的核酸に対応するプライマー配列および該プライマー配列に連結された少なくとも１つのタグ配列からなるタグ付きプライマー核酸であって、前記タグ配列が任意の共通配列及び各プライマーに固有の変異部分からなるタグ付きプライマー核酸を準備することと；
ｂ）前記複数のタグ付きプライマー核酸を用いて、前記複数種類の標的核酸を伸長または増幅することにより、前記標的核酸の各々について、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率に対応した比率で、各標的核酸の前記独特の配列に前記タグ配列が付加された核酸生成物を含む混合物を形成することと、
ｃ）前記各々のタグ配列に対して完全に相補的な配列を有する核酸プローブを固相担体上に植設した、複数種類のプローブアレイを準備することと；
ｄ）前記タグ配列の変異如何にかかわらず、前記タグ配列の共通配列によるハイブリダイゼーションにより前記核酸生成物が前記プローブに結合する条件下において、前記プローブアレイの各々に対して前記混合物を反応させることにより、前記プローブアレイにおけるプローブを飽和させることと；
ｅ）前記プローブが飽和されたプローブアレイを、前記プローブに対して完全に相補的なタグ配列を有する核酸生成物のみが前記プローブに結合する条件下に置くことにより、前記プローブに結合している核酸生成物のうち、前記変位部分が前記プローブとマッチしていないものを除去することと；
ｆ）前記複数のプローブアレイの各々について、前記工程ｅ）後の前記増幅核酸生成物によるプローブ飽和度に基づいて、前記サンプル中に含まれる標的核酸の存在比率を決定することと、
を含んでなることを特徴とする方法が提供される。
【０００８】
かかる標的核酸の存在比率決定方法は、一サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率を決定する場合のみならず、複数サンプル中に各々存在する同種類の標的核酸であって、各サンプル中における該標的核酸の存在比率を決定する場合にも用いることができる。
【０００９】
本発明の一態様において、前記少なくとも１つのタグ配列は、２種以上の核酸配列が隣接してなる核酸配列であって、該２種以上の核酸配列の各々が任意の共通配列及び固有の変異部分からなり、前記核酸配列の一方が結合するプローブには、他方の核酸配列は結合しない核酸配列が隣接してなるものである。
【００１０】
また、本発明により、サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の中で濃度未知の標的核酸の濃度を測定する方法であって、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸が濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸とからなり、請求項１又は２に記載の方法を用いてサンプル中に含まれる濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸の存在比率を決定すること、該存在比率と濃度既知の標的核酸の濃度に基づき濃度未知の標的核酸の濃度を測定すること、を含む方法が提供される。
【００１１】
本発明において前記標的核酸は、ＤＮＡ又はＰＮＡであり得、あるいはその他核酸配列を認識可能な核酸類似体であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により一サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率を、また複数サンプル中に含まれる同種類の標的核酸の存在比率を簡便且つ高信頼度において決定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、各々が独特の配列を有する複数種類の標的核酸が混在するサンプル中における各種標的核酸の存在比率を決定する方法であって、上述の通り、タグ付きプライマー核酸を用いて複数種類の標的核酸各々を伸長または増幅して得られる各種核酸生成物に含まれるタグが、プローブとハイブリダイズする際における、各種タグ同士の競合反応を利用して各種核酸生成物の存在比率を決定し、その鋳型となる各種標的核酸の存在比率を決定するというものである。また、かかる標的核酸の存在比率決定方法は、複数サンプル中に各々存在する同種類の標的核酸の存在比率を決定する場合にも用いることができる。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１４】
本発明の複数種標的核酸の存在比率決定方法においては、タグ付きプライマー核酸を準備することが重要である。本発明においてタグ付きプライマー核酸とは、サンプル中に混在する複数種類の標的核酸各々に対応するプライマー配列および該プライマー配列に連結された少なくとも１つのタグ配列からなるタグ付きプライマー核酸を言う（以下、「本発明のタグ付きプライマー核酸」と称する。）。
【００１５】
本発明の方法は、本発明のタグ付きプライマー核酸を用い、サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸、または複数サンプル中に含まれる同種の標的核酸各々を伸長または増幅する。伸長の手段は、ＤＮＡからＲＮＡへの逆転写反応、ＤＮＡからＤＮＡへの伸長等、標的核酸の配列を反映する手段であれば特に限定されない。増幅の手段は、ＰＣＲでもよいし、逆転写反応、その他ＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ、ＩＣＡＮ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＴＲＣ、ＴＭＡ等標的核酸配列を含む核酸断片を増幅するものであれば特に限定されない。かかる伸長または増幅により、前記標的核酸の各々について、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率に対応した比率で、各標的核酸の前記独特の配列に前記タグ配列が付加された核酸生成物を含む混合物が形成される。したがって、得られた核酸生成物各々の存在比率を決定することにより、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率が決定される。
【００１６】
更に、本発明では、前記各々のタグ配列に対して完全に相補的な配列を有する核酸プローブを固相担体上に植設した、複数種類のプローブアレイを準備する。該複数種類のプローブアレイを用い、タグ配列における塩基変異の相違に由来する、タグとプローブとの結合力の差違を利用し、以下に示す２段階の条件を設定し、複数種類の標的核酸の存在比率を決定する。
【００１７】
すなわち、まず、前記タグ配列の変異如何にかかわらず、前記タグ配列の共通配列によるハイブリダイゼーションにより前記核酸生成物が前記プローブに結合する条件（第１の条件）下において、前記プローブアレイの各々に対して前記混合物を反応させることにより、前記プローブアレイにおけるプローブを飽和させる。
【００１８】
次いで、前記プローブが飽和されたプローブアレイを、前記プローブに対して完全に相補的なタグ配列を有する核酸生成物のみが前記プローブに結合する条件（第２の条件）下に置くことにより、前記プローブに結合している核酸生成物のうち、前記変位部分が前記プローブとマッチしていないものを除去する。
【００１９】
そして、前記複数のプローブアレイの各々について、前記除去後の前記核酸生成物によるプローブ飽和度に基づいて、前記サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の存在比率を決定する。
【００２０】
本発明において、タグ付きプライマー核酸におけるタグは、上述したように、任意の共通配列および各プライマーに固有の変異部分からなるが、これには、任意の共通配列および各プライマーに固有の変異部分からなる２種以上の核酸配列が隣接してなるタグ配列が含まれ、この場合において、該２種以上の核酸配列は、一方の核酸配列が結合するプローブには、他方の核酸配列は結合しない関係を有することが必要である。例えば、プライマーに付加するタグが、任意の共通配列および各プライマーに固有の変異部分からなる核酸配列２種が隣接してなる場合には、該タグ付きプライマー核酸を用いてサンプル中に含まれる１６種類の標的核酸の混合比率を決定することができる（図１および図２参照）。なお、タグを構成する２種以上の核酸配列における、一方の核酸配列が結合するプローブには、他方の核酸配列は結合しない関係としては、一の核酸配列と比較して配列相同性が９０％以下である１又は２種以上の核酸配列の関係を挙げることができる。
【００２１】
また、サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸の中で濃度既知の標的核酸と濃度未知の標的核酸が含まれている場合には、本発明の複数種標的核酸の存在比率決定方法を用いることにより、濃度未知の標的核酸の濃度を測定することができる。すなわち、サンプル中に含まれる複数種類の標的核酸が濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸とからなる場合に、本発明の複数種標的核酸の存在比率決定方法を用いてサンプル中に含まれる濃度未知の標的核酸と濃度既知の標的核酸の存在比率を決定し、該存在比率と濃度既知の標的核酸の濃度に基づき濃度未知の標的核酸の濃度を測定することができる。
【００２２】
（実施例）
以下に、本発明を実施例を用いて説明する。  
（１）核酸プローブ固定化電極の作成
核酸プローブの塩基配列を以下に示した。
【００２３】
G-プローブ: TCCGGGCGCAGAAAC
T-プローブ: TCCGGGAGCAGAAAC
G-プローブ及びT-プローブは、標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列を持ち、互いに一塩基異なる配列を有する。また、上記の核酸プローブはそれぞれ3’末端をSH基で標識されているものを用いた。
【００２４】
この標識プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置後、超純水で洗浄後、風乾し、プローブ固定化電極とした。
【００２５】
（２）核酸プローブへの標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
標的オリゴヌクレオチドは、変異を含むプライマーで増幅した産物を想定し、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
【００２６】
Allele G
GAGCTAGGTTTCGTTTCTGCGCCCGGAGCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTCTTCGCGGCGCGGGGCGGGGCTGGGCGCGGGGTGAAAGAGGCGAAGCGAGAGCGGAGGCC
Allele T
GAGCTAGGTTTCGTTTCTGCTCCCGGAGCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTCTTCGCGGCGCGGGGCGGGGCTGGGCGCGGGGTGAAAGAGGCGAAGCGAGAGCGGAGGCC。
【００２７】
（２−１）比較例
1×1013 copy / mL、3×1013 copy / mL、1×1014 copy / mL、3×1014 copy / mL、1×1015 copy / mL のAllele Gをそれぞれ含む溶液中に（１）で作製した核酸プローブ固定化電極を浸漬し35℃で30 分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、バッファで洗浄を行った。この電極を挿入剤であるヘキスト33258溶液を50μM含むリン酸緩衝液中に15分間浸漬した後、ヘキスト33258分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を図３に示す。
【００２８】
ターゲットがプローブに結合することにより得られる電流値増加は、1×1014 copy / mL付近でほぼ飽和に達し、これより高い濃度を測定することは不可能であった。
【００２９】
（２−２）本発明例
1×1014 copy / mL のAllele Tと、1×1013 copy / mL、3×1013 copy / mL、1×1014 copy / mL、3×1014 copy / mL、1×1015 copy / mL のAllele Gとがそれぞれ含まれる5種類のターゲット溶液を調製し、(2-1)と同様にハイブリダイゼーション反応を行い、電流値測定を行なった。その結果を図４に示した。
【００３０】
Allele GとAllele Tとを競合させることにより、1×1014 copy / mLより高い濃度において、濃度に依存した電流値の変化がみられた。プローブG固定化電極から得られた電流値とプローブT固定化電極から得られた電流値との比を算出すると図５のようになる。
【００３１】
以上の結果から、同一サンプル中に含まれる2種類のターゲットの混合比率を測定することが可能であった。
【００３２】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の一態様に係る１６種類の標的核酸の混合比率を決定する場合の概念図。
【図２】本発明の一態様に係る１６種類の標的核酸の混合比率を決定する場合の概念図。
【図３】従来技術を用い各種濃度を有する標的核酸について酸化電流応答を測定した結果を示すグラフ。
【図４】本発明の一態様を用い各種濃度を有する標的核酸について酸化電流応答を測定した結果を示すグラフ。
【図５】図４に示すグラフに基づきプローブG固定化電極から得られた電流値とプローブT固定化電極から得られた電流値との比を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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