(57)【要約】【課題】  in vitroでの結果を反映し、実験誤差が少なくしかも再現性良く結果を得ることができる、全血を用いた簡便な血液適合性評価方法を提供することを課題とした。さらに、適用患者特有の血液性状をも反映できる評価方法を提供することを課題とした。【解決手段】医療材料の血液適合性評価法であって、該医療材料を適用する患者血液中の成分で健常者血液中濃度と比べ1.3倍以上濃度が高い血液成分の少なくとも一つについて、あらかじめ医療材料にコートした後、評価に用いる血液に１Ｕ/ml以上１００Ｕ/ml以下の濃度でヘパリンを混合したものを用い、医療材料と該血液を接触させ、医療材料表面へ付着した血液成分の量や形態の観察や定量を行うことを特徴とする評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療材料の血液適合性評価法であって、該医療材料を適用する患者血液中の成分で健常者血液中濃度と比べ1.3倍以上濃度が高い血液成分の少なくとも一つについて、あらかじめ医療材料にコートした後、評価に用いる血液に１Ｕ/ml以上１００Ｕ/ml以下の濃度でヘパリンを混合したものを用い、医療材料と該血液を接触させ、医療材料表面へ付着した血液成分の量や形態の観察や定量を行うことを特徴とする評価方法。
【請求項２】
該血液がヒト由来のものであることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
該健常者血液中濃度と比べ1.3倍以上濃度が高い血液成分が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、vwf（フォンウィルブラント因子）、コラーゲン（タイプ１および３）から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項４】
あらかじめ医療材料にコートする際、コートすべき蛋白質溶液に同じ種由来の蛋白質であるアルブミンを混合することを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項５】
該医療材料表面へ付着した血液成分が、血小板、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、vwf（フォンウィルブラント因子）、白血球、赤血球、コラーゲン（タイプ１および３）から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療用途に用いられる材料の血液適合性評価方法に関する。医療用途としては、血液透析、血漿分離、吸着、血液濾過、また、カテーテル類、血液回路、人工肺、人工心臓などが挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
従来、医療用途に用いられる材料の血液適合性評価方法には、ヒトの血液や、動物（犬、牛、馬、豚などの大型動物、ウサギ、モルモットの中型動物、マウス、ラットの小型動物など）の新鮮血液を用い、クエン酸やＥＤＴＡを添加後血小板多血漿（ＰＲＰ）を調製したり（例えば非特許文献１参照）、１から５Ｕ程度のヘパリンを混合して血液凝固活性を落とした状態で新鮮血液を被験材料に接触させて行っていた（例えば非特許文献２参照）。しかしかかる方法では、血小板の付着性を見てもin vitroでの結果と大きく異なる場合が多く、また実験誤差が大きく安定的に評価できなかった。抗凝固剤を全く含まない新鮮血を用いての解析が不可欠であろうとも言われていた（例えば非特許文献３参照）。
また、適用患者新鮮血液を定常的に入手することはできないため、血液成分の違い、医療材料との反応性の違いなどについて評価する手段はなかった。
【非特許文献１】高山崇ら  糖側鎖を有するポリスチレン誘導体の抗血小板粘着作用、生体材料、日本、1990年3月  VOL.８、３号  122頁
【非特許文献２】田中  賢、新しい生体適合性材料の分子設計と人工臓器への応用［ online］、〔2002年9月5日検索〕http://www.es.hokudai.ac.jp/pdf/h12/tanaka02#49341.pdf
【非特許文献３】片岡  一則、他２名、血小板血栓系の評価法、第１５回医用高分子研究会・第６回医用材料研究会  講演要旨集、日本、1982年6月25日、P31-34、
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
in vitroでの結果を反映し、実験誤差が少なくしかも再現性良く結果を得ることができる、全血を用いた簡便な血液適合性評価方法を提供することを課題とした。さらに、適用患者特有の血液性状をも反映できる評価方法を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、本発明は、下記の構成を有する。すなわち、
（１）医療材料の血液適合性評価法であって、該医療材料を適用する患者血液中の成分で健常者血液中濃度と比べ1.3倍以上濃度が高い血液成分の少なくとも一つについて、あらかじめ医療材料にコートした後、評価に用いる血液に１Ｕ/ml以上１００Ｕ/ml以下の濃度でヘパリンを混合したものを用い、医療材料と該血液を接触させ、医療材料表面へ付着した血液成分の量や形態の観察や定量を行うことを特徴とする評価方法。
【０００５】
（２）血液がヒト由来のものであることを特徴とする（１）記載の評価方法。
【０００６】
（３）該健常者血液中濃度と比べ1.3倍以上濃度が高い血液成分が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、vwf（フォンウィルブラント因子）、コラーゲン（タイプ１および３）から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする（１）記載の評価方法。
【０００７】
（４）あらかじめ医療材料にコートする際、コートすべき蛋白質溶液に同じ種由来の蛋白質であるアルブミンを混合することを特徴とする（１）記載の評価方法。
【０００８】
（５）該医療材料表面へ付着した血液成分が、血小板、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、vwf（フォンウィルブラント因子）、白血球、赤血球、コラーゲン（タイプ１および３）から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする（１）に記載の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
in vitroでの結果を反映し、実験誤差が少なくしかも再現性良く結果を得ることができる、全血を用いた簡便な血液適合性評価方法を提供することを課題とした。さらに、適用患者特有の血液性状をも反映できる評価方法を提供することを課題とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明は血液と接触する使用方法を有する医療用材料表面の血液適合性評価方法である。ここでは人工透析膜を例に説明するが、これに縛られるものではない。
【００１２】
まず、評価すべき中空糸膜を１０本程度以上束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成する。中空糸膜の本数は任意であるが、多くなれば、循環するための溶液量が増えるだけであり無駄であるため３０本より多くする必要はない。該ミニモジュールの直径は約７mm、長さは約１２cmである。このミニモジュールに例えばコラーゲン（タイプ１および３）を前もってコートする。コラーゲンのみをpH7.2等張のリン酸緩衝液（PBS）に溶解し、ミニモジュールに環流すると、どのような膜を用いてもあまりコーティング量に差はでないため、同じ種由来のアルブミンを共存させた溶液を用いる必要がある。例えばヒトアルブミン３％PBS溶液に、ヒトコラーゲンタイプ１およびタイプ３を各１０μｇ/ｍｌ溶解したものを用いることができる。しかしこの濃度ではコラーゲンの付着量は少なくなりすぎるため、好ましくは、ヒトアルブミン1％PBS溶液に、さらに好ましくは0.05％PBS（等張リン酸緩衝液pH7.2）に、ヒトコラーゲンタイプ１およびタイプ３を各１０μｇ/ｍｌ溶解したものを用いると良い。この濃度に設定すれば、例えば腎不全の患者血液性状と類似の状態を実現できる。これら蛋白質をプレコートする際重要なのは、これら蛋白質が高価であるため、なるべく少量で血液適合性評価を行うことであり、上記濃度範囲が望まれる。コラーゲン以外の蛋白質についても濃度設定の考え方は同じであって、より確実にするためには一度臨床で使用した中空糸膜に吸着した蛋白質量を酵素抗体法で定量した値と、プレコートした膜に吸着した所望の蛋白質量がほぼ同じになるように設定すればよい。中空糸膜に付着した蛋白質の付着の程度は、検出したい蛋白質に対する抗体を用いてＥＩＡ法（酵素抗体法）により測定することができる。例えば、血液に接した中空糸膜を生理食塩水で洗浄し、１ｍｍ長程度に細かく切断する。３％過酸化水素水に浸漬して洗浄後、１％牛アルブミンPBS溶液や市販のブロッキング用の溶液を用いて、４℃で１２時間以上浸漬して抗体の非特異結合を抑制させる。この膜に、ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、通常の方法で市販の発色試薬（ＴＭＢ）を反応させ、分光光度計で測定し吸着量を測定する。
【００１３】
次に、上記の方法であらかじめ蛋白質をコートした中空糸膜を１０cm長程度に切り、両面接着テープ等で、平らなフィルム上に貼り付ける。フィルムの材質は問わないが、ポリエチレンテレフタレート、ウレタン等の容易に手に入るものが好ましい。まずフィルムに両面接着テープを貼り、その上に中空糸膜数本を長さ方向をそろえ、貼り付ける。この中空糸膜の直径の約半分の厚みの隙間ゲージを中空糸膜の両側に置き、片歯カミソリまたは、ミクロトーム用の刃を用いて２枚にそぐように切り、中空糸膜の内表面を露出させる。このサンプルを例えば直径２cmの円形に打ち抜いて資料サンプルとする。直径２cm程度のチューブの底に資料サンプルを貼り付け、内側に血液を保持できるように加工する。中空糸膜状のものであれば上記手法によって加工可能であり、その他の形状のものでも、上記に倣って、血液接触面を上になるようにフィルム上に貼り付ければよい。
【００１４】
次に、ヒト新鮮血を準備する。ヘパリン量が１から１００Ｕ/ｍｌの濃度になるようあらかじめシリンジ内にヘパリン所定量を取り、ボランティア採血者から所定量の血液を採血する。採血に用いる針は２０Ｇ以下の太いものを用い、２０ｍｌ/min程度のゆっくりした速度で採血することが、血液の活性化を起こしにくく、より好ましい。ヘパリンと混和させ、室温に保ったまま、先のチューブ内に１ml入れ、３７℃６０min振盪させながら浸漬する。振盪速度はなるべく遅く、液が攪拌され、赤血球の沈降が起こらない程度に設定する。６０min経過後、血液をデカンテーションで除き、等張であるＰＢＳ（リン酸緩衝液）でリンスする。このとき、サンプルの中空糸膜内表面に直接液がかからないように注意して行う。３度洗い、２．５％グルタルアルデヒドＰＢＳ溶液に浸漬し、固定作業を行う。室温で、１０時間以上行うことが好ましい。この後、水で洗浄し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡で血小板や赤血球などの血球の付着状態や、フィブリンなどの凝固関連蛋白質の付着状態を観察する。
ヒト由来以外の血液として、兎や犬などの中大型動物の血液を採血することでも可能であるが、種の違いによる結果の食い違いに十分注意することが必要である。種の違いを詳細に把握できている場合には有効であるが、ヒト由来のものを用いることが好ましい。
【００１５】
凝固関連蛋白質の付着の程度は、検出したい蛋白質に対する抗体を用いてＥＩＡ法（酵素抗体法）により定量することができる。フィブリノーゲン、フィブロネクチン、vwf（フォンウィルブラント因子）、コラーゲン（タイプ１および３）などの抗体は市販のものを利用できる。本評価法以外で評価した場合は、血小板などの活性化状態が評価の度に大きく変化するためばらつきが大きく、臨床での結果と異なる結果を出しやすい。このため、これら凝固関連蛋白質の付着量についても本法を用いて評価することで、臨床での結果を反映した結果を得ることができる。
【００１６】
以下、実施例によってさらに詳細に説明する。
【００１７】
（モジュールの作成）
ポリスルホン（アモコ社  Ｕｄｅｌ?Ｐ３５００）１６部、ポリビニルピロリドン（インターナショナルスペシャルプロダクツ社；以下ＩＳＰ社と略す）  Ｋ３０  ４部、ポリビニルピロリドン（ＩＳＰ社Ｋ９０）２部をジメチルアセトアミド７７部、水１部を加熱溶解し、製膜原液とした。
【００１８】
原液粘度は５０℃で1．4Pa・secであった。この原液を温度５０℃の紡糸口金部へ送り、外径０．３５ｍｍ、内径０．２５ｍｍの２重スリット管から芯液としてジメチルアセトアミド70部、水30部からなる溶液を吐出させ、中空糸状を形成させた後、温度３０℃、露点２８℃で調湿し、１０ミクロン以下のドライミストを加えた２５０ｍｍのドライゾーン雰囲気を経て、ジメチルアセトアミド２０重量％、水８０重量％からなる温度４０℃の凝固浴を通過させ、８０℃15分の水洗工程を通過させ、グリセリン４０wt%付着させ乾燥した後、巻き取り束とした。中空糸内径は200μｍ、膜厚40μｍである。膜面積１．６ｍ２になるように、ケースに充填し、ポッティングし、端部を両面開口させて、血液浄化モジュールとした。モジュールを15分間水洗し、モジュール１を得た。
【００１９】
（サンプル調製）
ポリエチレンテレフタレート0.1mm厚のフィルムに両面接着テープを貼り、その上に中空糸膜５本を長さ方向をそろえ、貼り付けた。この中空糸膜の直径の約半分の厚みの隙間ゲージを中空糸膜の両側に置き、ミクロトーム用の刃を用いて２枚にそぐように切り、中空糸膜の内表面を露出させた。このフィルムを直径２cmの円形に打ち抜いて資料サンプルとした。１８ｍｍφのポリスチレンチューブの底に資料サンプルを貼り付け、内側に血液を保持できるように加工した。
【００２０】
（血液適合性評価法）
腎不全患者の血液中にコラーゲンが存在しているが健常者血液中ではほとんど検出できない。ここではコラーゲンタイプ１および３をプレコートした例について示す。
評価すべき中空糸膜を３０本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの直径は約７mm、長さは約１２cmである。このミニモジュールを0.05％PBS（等張リン酸緩衝液pH7.2）に、ヒトコラーゲンタイプ１およびタイプ３を各１０μｇ/ｍｌ溶解した溶液１０mlを用い、３７℃で６０min灌流し、コラーゲンタイプ１および３をコートした。この中空糸膜を用い、上記（サンプル調製）法に倣い、評価サンプルを作成した。
【００２１】
次に、ヘパリン量が５０Ｕ/ｍｌの濃度になるようあらかじめシリンジ内にヘパリン所定量を取り、ボランティア採血者から血液を採血した。採血に用いる針は２０Ｇのものを用い、２０ｍｌ/minの速度で採血した。ヘパリンと混和させ、室温に保ったまま、サンプルチューブ内に１ml入れ、３７℃６０min振盪速度１２０回/minで浸漬した。そのあと、血液をデカンテーションで除き、等張であるＰＢＳ（リン酸緩衝液）でリンスする。このとき、サンプルの中空糸膜内表面に直接液がかからないように注意して３度洗い、２．５％グルタルアルデヒドＰＢＳ溶液に浸漬し、室温で、２４時間固定作業をおこなった。
（血小板付着数のカウント）
血液適合性評価し、固定作業の後、水で洗浄し、凍結乾燥後、スパッタリングにより、Ｐｔ?Ｐｄの薄膜を試料に形成させた。走査型電子顕微鏡（日立社製Ｓ８００）にて試料表面を観察し（フィルムと円筒管の接着部は血液が溜まりやすいので、主としてフィルム中央部を３０００倍で観察した）、１．１２×１０4μｍ2の面積中の付着血小板数を１０視野について数え、その平均値から１０3μｍ2あたりの血小板付着数を計算した。
【実施例１】
【００２２】
モジュール１を水充填状態でγ線照射（２５ＫＧｙ）を行ない滅菌し、得られた膜を切り出し、ミニモジュールを作成した。直径は約７mm、長さは約１２cm、中空糸本数は３０本である。サンプル調製し、血液適合性評価を行った。血小板付着数のカウントにより、血小板数が35（個／１０3μｍ2）であった。
このモジュールを臨床使用した結果、76（個／１０3μｍ2）の血小板付着が見られた。
【実施例２】
【００２３】
モジュールに、0.5wt％グリセリン水を充填し、γ線照射（２５ＫＧｙ）を行ない滅菌し、得られた膜を切り出し、サンプル調製し、血液適合性評価を行った。  血小板付着数のカウントにより、血小板数が59（個／１０3μｍ2）であった。
このモジュールを臨床使用した結果、135（個／１０3μｍ2）の血小板付着が見られた。
【実施例３】
【００２４】
モジュールに、0.１wt％ポリビニルピロリドン（インターナショナルスペシャルプロダクツ社；以下ＩＳＰ社と略す）  Ｋ９０、０．１％エタノール水溶液を充填し、γ線照射（２５ＫＧｙ）を行ない滅菌し、得られた膜を切り出し、サンプル調製し、血液適合性評価を行った。血小板付着数のカウントにより、血小板数が1.2（個／１０3μｍ2）であった。
このモジュールを臨床使用した結果、3（個／１０3μｍ2）の血小板付着が見られた。
実施例１から３の結果を図に示した。相関係数が高く、臨床での結果を非常に良く反映することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】血液適合性評価と臨床結果との相関を示す。
【図１】
2005070020.tif 000002