(57)【要約】【課題】    物質・薬物の中枢移行性と受容体結合能を同時かつ定量的に予測可能な試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）スクリーニング法を提供する。【解決手段】  細胞膜を通過可能な薬物は中枢内に移行可能であるという前提に基づき、無傷細胞（Ｉｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ）の細胞膜を血液脳関門に見立て、ある物質・薬物が実際に細胞膜を通過し、細胞膜の内側にある細胞内受容体に結合する能力を実際に測定することによって、その物質・薬物の中枢移行能と受容体結合能を同時かつ定量的に調べることができる。その実施例として、ヒト・アストロサイトーマ細胞を用い、中枢移行性の高い鎮静性抗ヒスタミン薬（第一世代抗ヒスタミン薬）と中枢移行性の低い非鎮静性抗ヒスタミン薬（第二世代抗ヒスタミン薬）の新規スクリーニング法を確立し、この方法により新規抗ヒスタミン薬の鎮静性／非鎮静性を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調べることが可能となる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷細胞を用いた受容体結合実験（Ｉｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ法）によって、ある物質・薬物の細胞膜透過性及び細胞内受容体への結合能を測定し、その物質・薬物の中枢移行性（中枢作用・中枢副作用）を試験する方法。
【請求項２】
受容体刺激などによって、受容体の細胞膜表面／細胞内分布を変化させると、中枢移行性の高い物質・薬物の受容体結合能は影響されないが、中枢移行性の低い物質・薬物の受容体結合能は低下する現象に基づき、ある物質・薬物の中枢移行性（中枢作用・中枢副作用）を試験するＩｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ法。
【請求項３】
高濃度ヒスタミン刺激により細胞表面ヒスタミンＨ１受容体の細胞内移行を誘発したヒト・アストロサイトーマ細胞とヒスタミン未刺激の対照細胞を用い、鎮静性／非鎮静性抗ヒスタミン薬を選別スクリーニングできるＩｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、物質や薬物の中枢移行能を検定する試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】  実際に動物に物質・薬物を投与して、行動薬理学的にその物質・薬物の中枢移行性を試験する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験があり、発現する中枢症状を観察する方法として用いられている。【０００３】  一方、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で中枢移行性を推定する方法としては、薬物の水溶性／脂溶性の指標となる水／油分配係数を測定する方法や人工血液脳関門を用いた試験法がある。
【特許文献１】特許公開２００２−２８４７００
【特許文献１】特許公開２００１−２３８６８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  中枢移行性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験として行われる水／油分配係数を測定する方法や人工血液脳関門を用いた試験法では、物質・薬物の中枢移行性と受容体結合能を同時かつ定量的に調べることはできない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  血液脳関門は、タイトジャンクションで結合した血管内皮細胞とアストログリア細胞（アストロサイト）で構成されており、細胞膜を通過可能な脂溶性／疎水性薬物は、これらの細胞を通過して中枢内に移行し中枢神経系に作用を及ぼすと考えられることから、無傷細胞（Ｉｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ）の細胞膜を血液脳関門に、細胞外を末梢に、細胞内を中枢内に見立て、ある物質・薬物が実際に細胞膜を通過し、細胞膜の内側にある細胞内受容体にどの程度結合・占有するかを実際に測定することによって、その物質・薬物の中枢移行性／中枢作用の強さを調べる。
【発明の効果】
【０００６】  本試験法は、血液脳関門形成に関与する細胞としてヒト・アストロサイトのがん化細胞株（ヒトＵ３７３  ＭＧアストロサイトーマ細胞）を用い、鎮静性（中枢移行性）及び非鎮静性（末梢性）抗ヒスタミン薬（ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬）を単純・明解かつ定量的に示すことのできるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法であり、今後の新規抗ヒスタミン薬の開発にとって有益な手段となる。【０００７】  さらに、細胞表面と細胞内に分布する受容体への薬物結合性から中枢移行性を検定する本試験法の試験原理は、基本的にはどのような受容体作用薬においても応用可能であり、その物質・薬物の潜在的中枢移行能を定量的に測定することができる極めてｉｎ  ｖｉｖｏに近いｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験として利用価値が高い。【０００８】  特に、アストロサイト、血管内皮細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などに特定の受容体遺伝子を導入した受容体強制発現細胞を用いることで、あらゆる受容体作用薬の中枢移行性に関する情報を取得可能となり、医薬品開発のための重要な手段と成りうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  以下、本発明の実施の形態を図１及び図２に基づいて説明する。【００１０】  まず、ヒトＵ３７３  ＭＧアストロサイトーマ細胞を二群（対照とヒスタミン処理用）に分け、対照細胞はヒスタミン非存在下で、ヒスタミン処理用細胞は０．１ｍＭヒスタミン存在下で３７℃で３０分間保温する（図１）。【００１１】  この操作によって、ヒスタミン処理細胞では細胞膜表面Ｈ１受容体の細胞内移行が誘発される（図２）。【００１２】  次に、急速に氷冷し、誘発された受容体の細胞内分布の変化を維持するとともに、遊離のヒスタミンを洗浄により除去する（図１）。【００１３】  次に、氷冷下（４℃）、５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン単独及び５ｎＭ［３Ｈ］メピラミンと各種濃度の抗ヒスタミン薬を含む緩衝液中で１２０分間処理し、細胞膜表面／細胞内Ｈ１受容体に［３Ｈ］メピラミンを結合させて受容体を標識する（図１）。【００１４】  この時、［３Ｈ］メピラミン単独の場合は、［３Ｈ］メピラミンは細胞膜表面／細胞内Ｈ１受容体に同じように結合できるが、抗ヒスタミン薬が共存すると、抗ヒスタミン薬が結合したＨ１受容体には［３Ｈ］メピラミンは結合できなくなることことから、抗ヒスタミン薬の濃度が高くなるに従って、［３Ｈ］メピラミン結合量は減少する（図２）。【００１５】  次に、氷冷下（４℃）、遊離の［３Ｈ］メピラミンを洗浄により除去し、細胞に残っている結合型［３Ｈ］メピラミンの放射活性を測定する。【００１６】  ５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン単独の結合量（放射活性）を１００％として、各濃度の抗ヒスタミン薬存在下での５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン結合量（放射活性）を算出し、縦軸に５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン結合量を、横軸に抗ヒスタミン薬濃度をとってグラフを作成する。【００１７】  作成されたグラフにおいて、抗ヒスタミン薬濃度が高くなるに従い、５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン結合量が減少する曲線が得られる（５ｎＭ［３Ｈ］メピラミン結合に対する抗ヒスタミン薬の置換曲線）。
【実施例】
【００１８】  以下に、本発明の実施の形態により得られた結果を図３及び図４に基づいて説明する。【００１９】  図３は、眠気・鎮静などの中枢性副作用が強いことが既に知られている第一世代抗ヒスタミン薬（Ａ：クロルフェニラミン、Ｂ：ケトチフェン）の置換曲線を示し、１００％から減少した部分の割合が、これらの抗ヒスタミン薬のＨ１受容体への結合に相当する。【００２０】  ヒスタミン未処理の対照細胞（図３：○）とＨ１受容体の細胞内移行を誘発したヒスタミン前処理細胞（図３：●）に対するこれらの第一世代抗ヒスタミン薬の置換曲線には変化が認められなかったことから、これらの第一世代抗ヒスタミン薬は、細胞膜表面／細胞内Ｈ１受容体を区別できずに結合することがわかる。【００２１】  一方、図４は、眠気・鎮静などの中枢性副作用が弱いことが既に知られている第二世代抗ヒスタミン薬（Ａ：エピナスチン、Ｂ：オロパタジン）の置換曲線を示し、１００％から減少した部分の割合が、これらの抗ヒスタミン薬のＨ１受容体への結合に相当する。【００２２】  ヒスタミン未処理の対照細胞に対するこれらの第二世代抗ヒスタミン薬の置換曲線は二相性を示し（図４：○）、これらの抗ヒスタミン薬が低濃度でも結合可能な高親和性結合部位と高濃度でないと結合できない低親和性結合部位との二つが存在することがわかる。【００２３】  Ｈ１受容体の細胞内移行を誘発したヒスタミン前処理細胞に対するこれらの第二世代抗ヒスタミン薬の置換曲線では（図４：●）、ヒスタミン未処理の対照細胞（図４：○）に比べて、高親和性結合部位の減少と低親和性結合部位の増加が認められることから、これらの第二世代抗ヒスタミン薬は、受容体の細胞内移行によって受容体への結合に変化が現れることがわかる。【００２４】  ここで、第二世代抗ヒスタミン薬の高親和性結合部位は細胞膜表面Ｈ１受容体であり、高濃度でないと結合できない低親和性結合部位は細胞内Ｈ１受容体である。【００２５】  即ち、Ｈ１受容体の細胞内移行を誘発したヒスタミン前処理細胞では、細胞膜表面Ｈ１受容体の減少と細胞内Ｈ１受容体の増加によって、高親和性結合部位の減少と低親和性結合部位の増加がもたらされることになる。【００２６】  従って、図５に示すように、Ｈ１受容体の細胞内移行を阻害することが知られている高張条件下では、ヒスタミン前処理をしても受容体の分布の変化が生じないため、非鎮静性抗ヒスタミン薬の結合性には変化が表れない。【００２７】  以上、図６に示すように、抗ヒスタミン薬の受容体への結合性がヒスタミン前処理によりどの程度変化するかを測定することによって、細胞膜を通過しやすい第一世代（中枢移行性）抗ヒスタミン薬と第二世代（末梢性）抗ヒスタミン薬とを選別し、鎮静性／非鎮静性の新規抗ヒスタミン薬をスクリーニングすることができる。【００２８】  さらに、図７に示すように、無傷細胞（Ｉｎｔａｃｔ  Ｃｅｌｌ）の細胞膜を血液脳関門に、細胞外を末梢に、細胞内を中枢内に見立てて行うこの試験原理は、基本的にはすべての受容体作用薬の中枢移行性試験に応用可能である。【００２９】  即ち、細胞表面／細胞内受容体を区別せずに結合できる放射性リガンドを用い、受容体刺激物質で前処理した細胞（受容体の細胞���移行を誘発して受容体分布を変化させた細胞）に対する対象物質・薬物の結合性変化を調べることにより、対象物質・薬物の中枢移行能及び中枢移行後の受容体結合能を同時にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験手順
【図２】試験原理
【図３】鎮静性抗ヒスタミン薬のＨ１受容体への結合性変化
【図４】非鎮静性抗ヒスタミン薬のＨ１受容体への結合性変化
【図５】受容体の細胞内移行と非鎮静性抗ヒスタミン薬のＨ１受容体への結合性変化
【図６】鎮静性／非鎮静性抗ヒスタミン薬のスクリーニング原理
【図７】薬物の細胞内受容体結合能に基づく中枢移行能試験
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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