(57)【要約】【課題】  環境に対する影響が小さく、且つ製造が容易な生体物質蛍光標識剤及び生体物質蛍光標識方法、並びにその生体物質蛍光標識剤を用いたバイオアッセイ方法及びその装置を提供する。【解決手段】  生体物質蛍光標識剤を構成する量子ドットは、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成されている。この量子ドットで蛍光標識されたサンプルＤＮＡを含有する溶液を予め種々のプローブＤＮＡが固定化されたバイオアッセイ基板に滴下してハイブリダイゼーション反応を起こさせることで、サンプルＤＮＡの生化学分析を行うことができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットの粒子表面に、生体物質に結合する有機分子が結合していることを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
【請求項２】
上記生体物質は、生体から採取されたヌクレオチド鎖又はタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の生体物質蛍光標識剤。
【請求項３】
励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットを、有機分子を介して生体物質に結合させることを特徴とする生体物質蛍光標識方法。
【請求項４】
上記生体物質は、生体から採取されたヌクレオチド鎖又はタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の生体物質蛍光標識方法。
【請求項５】
表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数の検出物質が所定の各反応領域内に固定化されたバイオアッセイ基板に対して、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットで標識された標的物質を滴下して相互反応させる反応工程と、
上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記量子ドットから発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記標的物質の生化学分析を行う分析工程と
を有することを特徴とするバイオアッセイ方法。
【請求項６】
上記反応工程における相互反応後に、未反応の標的物質を上記バイオアッセイ基板の各反応領域から除去する除去工程をさらに有することを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ方法。
【請求項７】
上記検出物質及び上記標的物質は、ヌクレオチド鎖であり、上記相互反応は、ハイブリダイゼーション反応であることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ方法。
【請求項８】
表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数の検出物質が所定の各反応領域内に固定化されたバイオアッセイ基板を保持する保持手段と、
上記バイオアッセイ基板に対して、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットで標識された標的物質を滴下する滴下手段と、
上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記量子ドットから発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記標的物質の生化学分析を行う分析手段と
を備えることを特徴とするバイオアッセイ装置。
【請求項９】
上記検出物質と上記滴下手段で滴下した標的物質とを相互反応させた後、未反応の標的物質を上記バイオアッセイ基板の各反応領域から除去する除去手段をさらに備えることを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ装置。
【請求項１０】
上記検出物質及び上記標的物質は、ヌクレオチド鎖であり、上記相互反応は、ハイブリダイゼーション反応であることを特徴とする請求項８記載のバイオアッセイ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばＤＮＡチップ等のバイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において有用な生体物質蛍光標識剤及び生体物質蛍光標識方法、並びにその生体物質蛍光標識剤を用いたバイオアッセイ方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップと総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の突然変異、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖や、ｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析手法は、例えばＤＮＡチップ上に固相化（固定化）されたプローブＤＮＡに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡ（messenger RNA）を逆転写ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅して生成したサンプルＤＮＡを滴下し、ＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーション反応を行わせ、所定の光検出器で蛍光検出を行うものである。
【０００５】
また、近年では、ＤＮＡチップの形状を従来のような矩形状ではなく円板状として、光ディスクの分野で培われた基板技術をＤＮＡ解析に応用することが提案されている（特許文献１参照）。
【０００６】
この光ディスクの技術が応用されたＤＮＡ解析を行う場合、例えば円板状にしたＤＮＡチップを回転させながら、ハイブリダイゼーション反応後の２本鎖ＤＮＡから発生する蛍光を光検出器で検出し、その蛍光の発光位置をアドレッシング技術で特定するといったサーボ技術を適用することが可能となり、被処理サンプル物質数の増大、並びに検出精度及び検出速度の向上を図ることができる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２３８６７４号公報
【特許文献２】特表２００２−５２５３９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、これまでのＤＮＡ解析には、一般に、蛍光標識剤として有機蛍光色素が用いられていた。
【０００９】
しかしながら、蛍光検出のために有機蛍光色素を用いる場合、一定以上の光強度でπ電子のＬＵＭＯからＨＯＭＯへの遷移が過飽和状態となってしまい、一定強度以上の蛍光を得ることができなかった。また、有機蛍光色素は、光励起により活性状態となると、周囲の水等と反応して分解してしまうため退色の効果が大きい。そのため、蛍光検出のために有機蛍光色素を用いる場合には、大きな強度の励起光で励起したり、繰り返して蛍光検出をすることができなかった。さらに、有機蛍光色素は、励起できる波長範囲が狭いため、励起光の波長が限定されてしまうという問題があった。
【００１０】
一方、蛍光標識剤として、蛍光強度の大きい量子ドット（半導体ナノ結晶或いは半導体超微粒子ともいう）を利用することも提案されている（特許文献２参照）。
【００１１】
しかしながら、一般にこのような量子ドットは、III-Ｖ族化合物半導体やII-VI族化合物半導体といった化合物半導体を用いており、環境に対する悪影響が大きい。また、量子ドットの結晶成長の際にも有機金属溶液等を用いるため、その取り扱いが難しく、製造が容易でないという問題があった。
【００１２】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、環境に対する影響が小さく、且つ製造が容易な生体物質蛍光標識剤及び生体物質蛍光標識方法、並びにその生体物質蛍光標識剤を用いたバイオアッセイ方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述した目的を達成するために提案された本発明に係る生体物質蛍光標識剤は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットの粒子表面に、生体物質に結合する有機分子が結合したものである。
【００１４】
また、上述した目的を達成するために提案された本発明に係る生体物質蛍光標識方法は、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットを、有機分子を介して生体物質に結合させるものである。
【００１５】
ここで、上記生体物質としては、生体から採取されたヌクレオチド鎖又はタンパク質が挙げられる。
【００１６】
また、上述した目的を達成するために提案された本発明に係るバイオアッセイ方法は、表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数の検出物質が所定の各反応領域内に固定化されたバイオアッセイ基板に対して、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットで標識された標的物質を滴下して相互反応させる反応工程と、上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記量子ドットから発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記標的物質の生化学分析を行う分析工程とを有する。
【００１７】
また、上述した目的を達成するために提案された本発明に係るバイオアッセイ装置は、表面に複数の反応領域が形成され、既知の複数の検出物質が所定の各反応領域内に固定化されたバイオアッセイ基板を保持する保持手段と、上記バイオアッセイ基板に対して、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径のシリコン結晶からなるコアと、該コアを被覆する酸化シリコンからなるシェル層とで構成される量子ドットで標識された標的物質を滴下する滴下手段と、上記バイオアッセイ基板に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記量子ドットから発生される所定の波長の蛍光の有無を検出することにより、上記標的物質の生化学分析を行う分析手段とを備える。
【００１８】
ここで、このバイオアッセイ方法及びその装置は、上記標的物質を上記バイオアッセイ基板に滴下して上記検出物質と相互反応させた後に、未反応の標的物質を上記バイオアッセイ基板の各反応領域から除去する除去工程（手段）を有する。
【００１９】
上記検出物質及び上記標的物質としてはヌクレオチド鎖を用いることができ、この場合、上記相互反応はハイブリダイゼーション反応である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る生体物質蛍光標識剤を構成する量子ドットは、シリコンと酸化シリコンとから構成されるため、環境への影響が少なく扱いが容易であり、特にシリコン結晶からなるコアの周囲に酸化シリコンからなるシェル層が形成されたコアシェル構造となされているため、コアをなすシリコン結晶の量子効果が安定化する。また、本発明に係る生体物質蛍光標識方法では、有機分子を介してこの量子ドットを生体物質に結合させるものであるため、生体物質の蛍光標識が容易であり、且つ励起光を照射した際の蛍光強度が大きくなる。
【００２１】
また、バイオアッセイ方法及びその装置は、上述の量子ドットを用いて標的物質を標識しているため蛍光強度が大きく、さらに有機色素を用いた場合と比較して光損傷が小さく退色が少ないため、分析の精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態は、本発明を、生体物質であるＤＮＡの蛍光標識に用いる生体物質蛍光標識剤を構成するＳｉ（シリコン）量子ドット及びそのＳｉ量子ドットを用いたＤＮＡの標識方法に適用したものである。本実施の形態において、Ｓｉ量子ドットは、ＤＮＡ解析用のバイオアッセイ基板に固相化された多種多数のプローブＤＮＡ（検出物質）と滴下したサンプルＤＮＡ（標的物質）とのハイブリダイゼーション反応の有無を蛍光により検出してサンプルＤＮＡを解析する際に用いられる。
【００２３】
ここで、本実施の形態における「ＤＮＡの蛍光標識」とは、Ｓｉ量子ドットをサンプルＤＮＡに直接結合させて蛍光標識する場合のみならず、Ｓｉ量子ドットをインターカレータに結合させ、このインターカレータがハイブリダイゼーション反応を行った２本鎖ＤＮＡに挿入結合することで、間接的にＤＮＡを蛍光標識する場合をも含む。
【００２４】
以下では、先ず、このＳｉ量子ドット及びその製造方法、並びにそのＳｉ量子ドットを用いたＤＮＡの標識方法について説明し、次いで、サンプルＤＮＡ溶液が滴下されるＤＮＡ解析用のバイオアッセイ基板、及びこのバイオアッセイ基板を用いてＤＮＡ解析を行うバイオアッセイ装置について説明する。なお、本明細書において「バイオアッセイ」とは、ハイブリダイゼーションその他の物質間の相互作用に基づく生化学分析を意味する。
【００２５】
（Ｓｉ量子ドット）
先ず、生体物質であるＤＮＡの蛍光標識に用いるＳｉ量子ドット及びその製造方法について説明する。
【００２６】
量子ドットとは、半導体原子が数百個から数千個集まった十数ｎｍ程度の小さな塊である。量子ドットは、バルクサイズの連続的なバンド構造ではなく、離散的、不連続なエネルギ準位を取るため、電子のエネルギが３次元量子井戸に強く閉じこめられる。そのため、電子を閉じこめている障壁となっている量子ドットのサイズが小さくなればなるほど、伝導体（ＬＵＭＯ）のエネルギが上がり、価電子帯（ＨＯＭＯ）のエネルギが下がり、価電子帯と伝導体との間のバンドギャップエネルギが増大する。つまり、価電子体から伝導体へ電子を励起するエネルギが増大する。量子ドットには、このようなサイズに応じてバンドギャップエネルギが変化するという効果（量子サイズ効果）がある。
【００２７】
さらに、蛍光体は、光等を吸収するとバンド内に電子-ホール対（励起子）を発生するが、蛍光体のサイズがバルクサイズである場合、そのバンド構造が連続的となり、生成された電子とホールとが別々に運動をするため、励起子の発生は不安定である。一方、蛍光体のサイズが量子ドットサイズの場合、非常に狭い空間に電子とホールとが発生するため、電子とホールとの波動関数の重なりが大きくなり、励起子の発生が安定化している。したがって、量子ドットの場合、電子-ホール対の遷移確率すなわち振動子強度がバルクサイズの直接バンド間遷移型半導体よりも非常に大きくなる。つまり、量子ドットの場合には、励起光強度に対する蛍光強度が非常に大きくなる。量子ドットには、このような電子-ホール対の遷移確率が高くなり、蛍光強度が大きくなるという効果（閉じこめ効果）がある。このような閉じこめ効果が現れるのは、励起子ボーア半径の４倍以下の結晶径であるといわれている。
【００２８】
量子ドットには、以上のような閉じこめ効果があるため、量子ドットを蛍光標識剤として用いると、励起光の強度を大きくしても蛍光強度が飽和せず、高い蛍光強度を得ることができる。したがって、蛍光標識剤として量子ドットを用いた場合、照射する励起光を対物レンズにより集光して照射することが可能となる。このため、より強度の小さい励起光を用いて強い蛍光を検出することができる。
【００２９】
本実施の形態では、III-Ｖ族化合物半導体やII-VI族化合物半導体といった化合物半導体と比較して環境への影響が少なく、扱いが容易なＳｉを量子ドットに用いている。このＳｉは、間接バンド間遷移型半導体であるが、励起子ボーア半径程度のＳｉ結晶を製造すると、量子サイズ効果によるバンドギャップエネルギの増大と、フォノンのモードの変化とにより、可視域で発光を示すようになる。このＳｉからなるＳｉ量子ドットは、ｐ型シリコンウエハーの陽極化成、ＳｉＨ４のプラズマ中分解、或いは熱処理ＳｉＯｘ（ｘ−１．９９）のフッ酸中溶解等の公知の技術を用いて製造することができる。
【００３０】
ここで、量子ドットを内核（コア）と外殻（シェル）とからなるいわゆるコアシェル構造とし、シェル層の物質としてコアの物質よりもバンドギャップエネルギの大きいものを選択することで、コアをなす半導体結晶の量子効果が安定化することが知られている。
【００３１】
そこで、本実施の形態におけるＳｉ量子ドットは、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ２からなるシェル層が形成されたコアシェル構造となされている。特に、本実施の形態では、酸化され易い性質を有するＳｉをコアの物質として用いているため、ＳｉＯ２からなるシェル層の形成が容易である。
【００３２】
このＳｉ量子ドットは、例えば次のように製造することができる。
【００３３】
熱処理ＳｉＯｘ（ｘ−１．９９９）のフッ酸中溶解によりＳｉ量子ドットを製造する場合、先ず、プラズマＣＶＤによりシリコンウエハー上に成膜したＳｉＯｘ（ｘ−１．９９９）を不活性ガス雰囲気中で１１００℃、１時間程度アニールを行う。これにより、ＳｉＯ２膜中にＳｉ結晶が析出する。次に、このシリコンウエハーを室温で１％程度のフッ酸水溶液で処理することによりＳｉＯ２膜を除去し、液面に凝集した数ｎｍサイズのＳｉ結晶を回収する。なお、このフッ酸処理により、結晶表面のＳｉ原子のダングリングボンド（未結合手）が水素終端され、Ｓｉ結晶が安定化する。その後、回収したＳｉ結晶の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ２からなるシェル層を形成する。
【００３４】
また、ｐ型シリコンウエハーの陽極化成によりＳｉ量子ドットを製造する場合、先ず、フッ酸（４６％）、メタノール（１００％）及び過酸化水素水（３０％）を１：２：２の割合で混合した溶液中で、ｐ型シリコンウエハー及び白金を対向電極として３２０ｍＡ／ｃｍ２で約１時間通電し、Ｓｉ結晶を析出させる。このようにして得られたＳｉ結晶のフォトルミネッセンススペクトルを図１に示す。その後、回収したＳｉ結晶の表面を酸素雰囲気中で自然酸化し、又は加熱して熱酸化し、Ｓｉ結晶からなるコアの周囲にＳｉＯ２からなるシェル層を形成する。
【００３５】
以上のように製造されたＳｉ量子ドットによってＤＮＡを標識する場合、Ｓｉ量子ドットとＤＮＡとの双方に、互いに結合する官能基等を導入する。
【００３６】
例えば、メルカプト基（ＳＨ基）同士の結合を利用してＳｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる場合、先ず、上述のＳｉ量子ドットを３０％Ｈ２Ｏ２中に１０分間分散させ、結晶表面を水酸化させる。次に、溶剤をトルエンに置換し、メルカプトプロピルトリエトキシシランをトルエンの２％加えて、２時間程度かけてＳｉ量子ドットの最表面のＳｉＯ２をシラン化すると共にメルカプト基を導入する。続いて、溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加し、さらに一端にメルカプト基の導入されたＤＮＡを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、Ｓｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる。このＳｉ量子ドットと１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とが結合している状態を図２に模式的に示す。
【００３７】
なお、この例では、メルカプト基が導入されたシランカップリング剤を用いたが、アミノ基やアルデヒド基が導入されたシランカップリング剤を用いることも可能である。この場合には、それぞれ一端にアルデヒド基、アミノ基が導入されたＤＮＡと結合させることができる。
【００３８】
また、ビオチンとアビジンとの結合を利用してＳｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる場合、先ず、上述のＳｉ量子ドットを濃硫酸と過酸化水素水との３：１混合液中で１０分程反応させ、結晶表面を水酸化させる。水洗後、水とエタノールの１：１混合溶液中でアミノプロピルトリエトキシシランをＳｉ量子ドットの最表面の水酸基と反応させ、Ｓｉ量子ドットにアミノ基を導入する。反応後水洗し、溶媒をアセトンに置換して１ｍｏｌ/ｌの濃度になるようにマレイン酸を加え、３０〜４５分程度、沸点近くまで加熱・還流することで、アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基とマレイン酸のカルボキシル基とを結合させる。反応後水洗し、８６９ｍＭのＮ-ヒドロキシスクシンイミド水溶液と、５２２ｍＭのＮ-(３-ジメチルアミノプロピル)-Ｎ'-エチルカルボジイミド-ヒドロクロライド水溶液の１：１混合液に分散させ、１０分程度反応させる。反応後水洗し、室温・水溶液中で２．２１μＭのアビジンと２時間程度反応させた後、１ｍＭのエタノールアミンを加え、室温で１０分間攪拌する。これにより、Ｓｉ量子ドットにアビジンが結合される。水洗後、溶媒を純水に置換してバッファ塩を１０ｍＭとなるように添加し、さらに一端にビオチンが導入されたＤＮＡを１μＭとなるように加えて放置することで、Ｓｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる。このＳｉ量子ドットと１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とが結合している状態を図３に模式的に示す。
【００３９】
なお、Ｓｉ量子ドットを直接ＤＮＡに結合させて標識する例に限定されず、例えばＳｉ量子ドットをインターカレータに結合させ、ハイブリダイゼーション反応によって形成された２本鎖ＤＮＡに挿入結合させるようにしても構わない。
【００４０】
例えば、メルカプト基（ＳＨ基）同士の結合を利用してＳｉ量子ドットとインターカレータとを結合させる場合、上述と同様にしてＳｉ量子ドットの表面を水酸化し、最表面のＳｉＯ２をシラン化すると共にメルカプト基を導入することで、例えば図４に示すようなメルカプト基が導入されたインターカレータと結合させることができる。この場合にも、アミノ基やアルデヒド基が導入されたシランカップリング剤を用いることで、それぞれアルデヒド基、アミノ基が導入されたインターカレータと結合させることができる。
【００４１】
（バイオアッセイ基板）
次に、サンプルＤＮＡを含む溶液が滴下されるバイオアッセイ基板１について説明する。図５は、バイオアッセイ基板１の上面を模式的に示したものである。
【００４２】
バイオアッセイ基板１の中心には、中心孔２が形成されている。中心孔２には、当該バイオアッセイ基板１が後述するバイオアッセイ装置に装着されたときに、当該バイオアッセイ基板１を保持及び回転させるためのチャッキング機構が挿入される。
【００４３】
バイオアッセイ基板１は、図６に示すように、下層側から、基板層３と、透明電極層４と、固相化層５と、ウェル形成層６とから形成された層構造となっている。なお、バイオアッセイ基板１のウェル形成層６側の表面を上面１ａ、基板層３側の表面を下面１ｂというものとする。
【００４４】
基板層３は、詳細を後述する励起光及び制御光並びに蛍光の波長の光を透過する材料である。例えば、基板層３は、石英ガラス、シリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の円盤状に成型可能な合成樹脂、好ましくは射出成型可能な合成樹脂で形成されている。なお、安価な合成樹脂基板を用いることで、従来のガラス基板に比して低ランニングコストを実現できる。
【００４５】
透明電極層４は、基板層３上に形成された層である。透明電極層４は、例えばＩＴＯ（インジウム-スズ-オキサイド）やアルミニウム等の光透過性があり且つ導電性を有する材料から形成されている。透明電極層４は、基板層３上に例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着等により２５０ｎｍ程度の厚さに成膜されて形成される。
【００４６】
固相化層５は、透明電極層４上に形成された層である。固相化層５は、プローブＤＮＡの一端を固相化させるための材料から形成されている。本例では、固相化層２４は、シランにより表面修飾可能なＳｉＯ２が、例えばスパッタリングや電子ビーム蒸着により５０ｎｍ程度の厚さに成膜された層となっている。
【００４７】
ウェル形成層６は、固相化層５上に形成された層である。ウェル形成層６は、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション反応を起こさせる複数のウェル７が形成された層である。ウェル７は、バイオアッセイ基板１の上面１ａが開口したくぼみ状となっており、サンプルＤＮＡが含まれた溶液等が滴下されたときにその溶液を保留することができる程度の深さ及び大きさとなっている。例えば、ウェル７は、開口部が１００μｍ四方の大きさに形成され、深さが５μｍ程度とされて、底面９に固相化層５が露出している。このようなウェル形成層６は、例えば、固相化層５上に感光性ポリミイドをスピンコート等で５μｍ程度の厚さに塗布し、塗布した感光性ポリミイドを所定のパターンでフォトマスクを用いて露光及び現像することで形成される。
【００４８】
さらに、ウェル７は、一端が官能基により修飾されたプローブＤＮＡが底面９（固相化層５が露出した部分）に結合するように、当該底面９が官能基により表面修飾されている。例えば、ウェル７は、図７に示すように、メルカプト基（ＳＨ基）１０を有するシラン分子１１により、底面９（ＳｉＯ２から形成されている固相化層５）が表面修飾されている。このため、ウェル７の底面９には、例えばメルカプト基で一端が修飾されたプローブＤＮＡを結合させることができる。このようにバイオアッセイ基板１では、ウェル７の底面９に、プローブＤＮＡの一端を結合させることができるので、図８に示すように、底面９から垂直方向に鎖が伸びるように、プローブＤＮＡ（Ｐ）を結合させることができる。
【００４９】
また、バイオアッセイ基板１では、図５に示すように、複数のウェル７が、主面の中心から外周方向に放射状に向かう複数の列上に、例えば４００μｍ程度の間隔で等間隔に並んで配置されている。
【００５０】
また、バイオアッセイ基板１には、バイオアッセイ基板１の下面１ｂ側からレーザ光を照射することにより読み取り可能なアドレスピット８が形成されている。アドレスピット８は、バイオアッセイ基板１の平面上における各ウェル７の位置を特定するための情報である。アドレスピット８から情報を光学的に読み取ることによって、複数存在するウェル７のうち、現在レーザ光を照射している位置の１つのウェル７がどれであるかを特定することが可能となる。このようなアドレスピット８が設けてあることによって、後述する滴下装置による溶液の滴下位置の制御や、対物レンズによる蛍光検出位置の特定を行うことができる。
【００５１】
以上のようなバイオアッセイ基板１では、円板状に形成されているため、光ディスクシステムと同様の再生システムを利用することにより、レーザ光のフォーカシング位置を制御するためのフォーカシングサーボ制御、半径方向に対するレーザ光の照射位置や滴下装置による滴下位置の制御のための位置決めサーボ制御、並びに、アドレスピット８の情報検出処理をすることができる。つまり、アドレスピット８に記録してある情報内容と、そのアドレスピット８の近傍にあるウェル７とを対応させておくことにより、アドレスピット８の情報を読み出すことで、特定の１つのウェル７に対してのみレーザ光を照射して蛍光が発光しているウェル７の位置を特定したり、特定の１つのウェル７の位置と滴下装置との相対位置を制御して、その特定の１つのウェル７に対して溶液を滴下したりすることができる。
【００５２】
（バイオアッセイ装置）
次に、上述したバイオアッセイ基板１を用いてＤＮＡ解析を行うバイオアッセイ装置２１について、図９を参照して説明する。
【００５３】
バイオアッセイ装置２１は、図９に示すように、バイオアッセイ基板１を保持して回転させるディスク装填部２２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ基板１のウェル７にその溶液を滴下する滴下部２３と、バイオアッセイ基板１のウェル７から励起光を検出するための励起光検出部２４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御/サーボ部２５とを備えている。
【００５４】
ディスク装填部２２は、バイオアッセイ基板１の中心孔２内に挿入して当該バイオアッセイ基板１を保持するチャッキング機構３１と、チャッキング機構３１を駆動することによりバイオアッセイ基板１を回転させるスピンドルモータ３２とを有している。ディスク装填部２２は、上面１ａ側が上方向となるようにバイオアッセイ基板１を水平に保持した状態で、当該バイオアッセイ基板１を回転駆動する。
【００５５】
滴下部２３は、試料溶液Ｓを貯留する貯留部３３と、貯留部３３内の試料溶液Ｓをバイオアッセイ基板１に滴下する滴下ヘッド３４とを有している。滴下ヘッド３４は、水平に装填されたバイオアッセイ基板１の上面１ａの上方に配置されている。さらに、滴下ヘッド３４は、図５記載のバイオアッセイ基板１のアドレスピット８から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアッセイ基板１との相対位置を半径方向に制御し、プローブＤＮＡと、上述のＳｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡ、又はサンプルＤＮＡ及びＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータとを含有する試料溶液Ｓを所定のウェル７に正確に追従して滴下する構成とされている。
【００５６】
励起光検出部２４は、光学ヘッド４０を有している。光学ヘッド４０は、水平に装填されたバイオアッセイ基板１の下方側、すなわち、下面１ｂ側に配置されている。光学ヘッド４０は、例えば、図示しないスレッド機構等により、バイオアッセイ基板１の半径方向に移動自在とされている。
【００５７】
光学ヘッド４０は、対物レンズ４１と、対物レンズ４１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ４２と、導光ミラー４３とを有している。対物レンズ４１は、その中心軸がバイオアッセイ基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ４２に支持されている。したがって、対物レンズ４１は、バイオアッセイ基板１の下方側から入射された光束を当該バイオアッセイ基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ４２は、バイオアッセイ基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ基板１の半径方向の２方向に対物レンズ４１を移動可能に支持している。２軸アクチュエータ４２を駆動することにより、対物レンズ４１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。したがって、この光学ヘッド４０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。
【００５８】
導光ミラー４３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド４０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー４３には、励起光Ｐ及び制御光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー４３は、励起光Ｐ及び制御光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ４１に入射する。対物レンズ４１に入射された励起光Ｐ及び制御光Ｖは、当該対物レンズ４１により集光されてバイオアッセイ基板１に照射される。また、導光ミラー４３には、蛍光Ｆ及び制御光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ基板１から対物レンズ４１を介して入射される。導光ミラー４３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。なお、光学ヘッド４０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ４２を駆動する駆動信号は、制御/サーボ部２５から与えられる。
【００５９】
また、励起光検出部２４は、励起光Ｐを出射する励起光源４４と、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ４５と、コリメータレンズ４５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー４３に照射する第１のダイクロックミラー４６とを有している。
【００６０】
励起光源４４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源４４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４５は、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー４６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及び制御光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー４６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ４５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー４３に励起光Ｐを照射している。
【００６１】
また、励起光検出部２５は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード４７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ４８と、光学ヘッド４０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード４７に照射する第２のダイクロックミラー４９とを有している。
【００６２】
アバランジェフォトダイオード４７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード４７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ４８は、アバランジェフォトダイオード４７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー４９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第１のダイクロックミラー４６の後段に配置されている。したがって、第２のダイクロックミラー４９には、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー４９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、制御光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第２のダイクロックミラー４９は、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ４８を介してアバランジェフォトダイオード４７に蛍光Ｆを照射する。
【００６３】
アバランジェフォトダイオード４７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御/サーボ部２５に供給する。
【００６４】
また、励起光検出部２４は、制御光Ｖを出射する制御光源５０と、制御光源５０から出射された制御光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ５１と、制御光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路５２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路５２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ５３と、制御光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ５４とを有している。
【００６５】
制御光源５０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、制御光Ｖの波長は、アドレスピット８が検出できる波長に設定されている。さらに、制御光Ｖの波長は、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なった波長に設定されている。このような波長であれば、制御光Ｖの波長は、７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ５１は、制御光源７０から出射された制御光Ｖを平行光束にする。平行光束とされた制御光Ｖは光セパレータ５４に入射される。
【００６６】
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及び、アドレスピット８の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、制御光Ｖがバイオアッセイ基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、制御光Ｖと同一の７８０ｎｍである。
【００６７】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ４１により集光された光の合焦位置とバイオアッセイ基板１の基板層３との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ４１とバイオアッセイ基板１との間の距離が最適となる。位置決めエラー信号は、所定のウェル７の位置と焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。位置決めエラー信号が０となったときに、制御光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が所定のウェル７に一致したこととなる。アドレスピット８の再生信号は、バイオアッセイ基板１に記録されているアドレスピット８に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在、制御光Ｖを照射しているウェル７を特定することができる。
【００６８】
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット８の再生信号を制御/サーボ部２５に供給する。
【００６９】
シリンドリカルレンズ５３は、フォトディテクト回路５２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路５２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。
【００７０】
光セパレータ５４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面５４ａと１/４波長板５４ｂとにより構成されている。光セパレータ５４では、１/４波長板５４ｂの逆側から入射された光を光分離面５４ａが透過し、その透過光の反射光が１/４波長板５４ｂ側から入射された場合には光分離面５４ａが反射する機能を有している。光セパレータ５４は、光分離面５４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第２のダイクロックミラー４９の後段に配置されている。したがって、光セパレータ５４では、コリメータレンズ５１から出射された制御光Ｖを透過して光学ヘッド４０内の導光ミラー４３に対してその制御光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ５３を介してフォトディテクト回路５２に反射光Ｒを照射する。
【００７１】
制御/サーボ部２５は、励起光検出部２４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット８の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。
【００７２】
すなわち、制御/サーボ部２５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１とバイオアッセイ基板１との間の距離を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御/サーボ部２５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１をバイオアッセイ基板１の半径方向に移動制御し、位置決めエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御/サーボ部２５は、アドレスピット８の再生信号に基づき光学ヘッド４０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ４１を移動させる。
【００７３】
以上のような構成のバイオアッセイ装置２１では、バイオアッセイを行う場合には、次のような動作を行う。
【００７４】
Ｓｉ量子ドットを直接サンプルＤＮＡに結合させて標識する場合、バイオアッセイ装置２１は、バイオアッセイ基板１を回転させながら、図１０に示すようにウェル７上にＳｉ量子ドット（Ｄ）で標識されたサンプルＤＮＡ（Ｓ）が含有した溶液を滴下し、図１１に示すようにプローブＤＮＡ（Ｐ）と標識サンプルＤＮＡ（Ｓ）とを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。
【００７５】
また、Ｓｉ量子ドットをインターカレータに結合させる場合、バイオアッセイ装置２１は、バイオアッセイ基板１を回転させながら、図１２に示すようにウェル７上にサンプルＤＮＡ（Ｓ）が含有した溶液を滴下し、プローブＤＮＡ（Ｐ）とサンプルＤＮＡ（Ｓ）とを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。また、ハイブリダイゼーション反応の終了したバイオアッセイ基板１上にＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータＭを含んだバッファ溶液を滴下して、図１３に示すようにプローブＤＮＡ（Ｐ）とサンプルＤＮＡ（Ｓ）との２重らせん内にＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータＭを挿入して結合させる。
【００７６】
その後、バイオアッセイ装置２１は、Ｓｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡ、又はサンプルＤＮＡ及びＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータが滴下された後のバイオアッセイ基板１を回転させ、励起光Ｐを当該バイオアッセイ基板１の下面１ｂ側から入射させてウェル７内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ基板１の下方から検出する。
【００７７】
ここで、バイオアッセイ装置２１では、励起光Ｐと制御光Ｖとを同一の対物レンズ４１を介してバイオアッセイ基板１に照射している。そのため、バイオアッセイ装置２１では、制御光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。
【００７８】
（ＤＮＡ解析方法）
次に、ＤＮＡ解析方法について説明する。
【００７９】
最初に、バイオアッセイ基板１をバイオアッセイ装置２１のディスク装填部２２に水平に装填する。
【００８０】
続いて、バイオアッセイ装置２１により、アドレスピット８に基づく位置制御を行いながらバイオアッセイ基板１を回転させ、滴下ヘッド３４から、一端がメルカプト基等で修飾されたプローブＤＮＡが含有した溶液を所定のウェル７に対して滴下する。このとき、１つのバイオアッセイ基板１に対して、複数種類のプローブＤＮＡが滴下する。但し、１つのウェル７内には１種類のプローブＤＮＡが入るようにする。なお、各ウェル７に何れの種類のプローブＤＮＡを滴下するかは、予めウェルとプローブＤＮＡとの対応関係を示す配置マップ等を作成しておき、その配置マップに基づき滴下制御する。
【００８１】
続いて、バイオアッセイ基板１の上面１ａ側から、電極をウェル７内の溶液に挿入して、１ＭＶ/ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を各ウェル７に印加する。このように交流電界を印加すると、プローブＤＮＡがバイオアッセイ基板１に対して垂直方向に伸張するとともに、プローブＤＮＡをバイオアッセイ基板１に垂直方向に移動させて、予め表面修飾処理がされた底面９に対して、プローブＤＮＡの修飾端を結合させ、ウェル７内にプローブＤＮＡを固相化（固定化）することができる（Masao Washizu and Osamu Kurosawa: “ Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures ”, IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No26,P.1165-1172(1900) 参照）。
【００８２】
続いて、バイオアッセイ装置２１により滴下ヘッド３４からＳｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡが含有した溶液をバッファ塩を含む溶液とともに、バイオアッセイ基板１上の各ウェル７に滴下する。なお、Ｓｉ量子ドットをインターカレータに結合させた場合、この時点ではサンプルＤＮＡのみが含有した溶液をバッファ塩を含む溶液とともに、バイオアッセイ基板１上の各ウェル７に滴下することができる。
【００８３】
続いて、サンプルＤＮＡの滴下後、バイオアッセイ基板１を恒温層等に移し、ウェル７内を数十度に加熱し、加熱した状態のまま１ＭＶ/ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがバイオアッセイ基板１に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が対応したサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル７内にある場合には、それらがハイブリダイゼーション反応を起こす。
【００８４】
ここで、Ｓｉ量子ドットをインターカレータに結合させた場合には、続いて、バイオアッセイ装置２１により、Ｓｉ量子ドットが結合されたインターカレータを、バイオアッセイ基板１のウェル７内に滴下する。このようなインターカレータは、ハイブリダイゼーション反応を起こしたプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの２重らせんの間に挿入して結合する。
【００８５】
続いて、バイオアッセイ基板１の表面１ａを純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーション反応を起こしていないウェル７内のＳｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡ（あるいはサンプルＤＮＡ及びＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータ）を除去する。この結果、ハイブリダイゼーション反応を起こしたウェル７内にのみ、Ｓｉ量子ドットが残存することとなる。
【００８６】
続いて、バイオアッセイ装置２１により、制御光Ｆを用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらバイオアッセイ基板１を回転させ、励起光Ｐを所定のウェル７に照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。
【００８７】
続いて、バイオアッセイ装置２１は、バイオアッセイ基板１上の各ウェル７の位置と蛍光Ｆの発光の強度を示すマップを作成する。そして、その作成したマップ、並びに各ウェル７にどのような塩基配列のプローブＤＮＡが滴下されていたかを示す配置マップに基づき、サンプルＤＮＡの塩基配列の解析を行う。
【００８８】
以上、本発明を実施するための最良の形態について説明したが、本発明は、上述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱することなく、様々な変更、置換又はその同等のものを行うことができることは当業者にとって明らかである。
【００８９】
例えば、上述の実施の形態では、バイオアッセイ基板を円盤状に形成したが、この形態に限定されるものではなく、楕円状、矩形状その他の平板状の形態を適宜選択決定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
以上説明した本発明に係る生体物質蛍光標識剤を構成する量子ドットは、シリコンと酸化シリコンとから構成されるため環境への影響が少なく扱いが容易であると共に、その製造が容易である。この量子ドットは、蛍光強度が大きく、さらに有機色素を用いた場合と比較して光損傷が小さく退色が少ないという特性を有するため、種々の用途に用いることができるが、例えば生化学分析を行う標的物質を標識する蛍光標識剤として用いることで、分析の精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ｐ型シリコンウエハーの陽極化成により生成したＳｉ結晶のフォトルミネッセンススペクトルを示す図である。
【図２】メルカプト基同士の結合を利用してＳｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる場合における結合状態の一例を示す図である。
【図３】ビオチンとアビジンとの結合を利用してＳｉ量子ドットとＤＮＡとを結合させる場合における結合状態の一例を示す図である。
【図４】メルカプト基が導入されたインターカレータの一例を示す図である。
【図５】本実施の形態の説明に供するバイオアッセイ基板の平面図である。
【図６】同バイオアッセイ基板の断面図である。
【図７】ウェルの底面に修飾されるＳＨ基を有するシラン分子を示す図である。
【図８】ウェルの底面に結合したプローブＤＮＡを示す図である。
【図９】本実施の形態の説明に供するバイオアッセイ装置のブロック構成図である。
【図１０】ウェルに対してＳｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡが含有した溶液を滴下している動作を示す図である。
【図１１】プローブＤＮＡとＳｉ量子ドットで標識されたサンプルＤＮＡとが結合している状態を示す図である。
【図１２】ウェルに対してサンプルＤＮＡ及びＳｉ量子ドットが結合されたインターカレータが含有した溶液を滴下している動作を示す図である。
【図１３】プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとの２重らせん内にインターカレータが挿入結合している状態を示す図である。
【符号の説明】
【００９２】
１  バイオアッセイ基板、３  基板層、７  ウェル、２１  バイオアッセイ装置、２２  ディスク装填部、２３  滴下部、２４  励起光検出部、２５  制御/サーボ部
【図１】
2005172429.tif 000003
【図２】
2005172429.tif 000004
【図３】
2005172429.tif 000005
【図４】
2005172429.tif 000006
【図５】
2005172429.tif 000007
【図６】
2005172429.tif 000008
【図７】
2005172429.tif 000009
【図８】
2005172429.tif 000010
【図９】
2005172429.tif 000011
【図１０】
2005172429.tif 000012
【図１１】
2005172429.tif 000013
【図１２】
2005172429.tif 000014
【図１３】
2005172429.tif 000015