(57)【要約】【課題】  複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる細胞分離装置を提供する。【解決手段】  異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、この細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する２以上の細胞分離室１、３と、２以上の細胞分離室１、３間で細胞を移動させるための移動流路５と、細胞分離室１、３毎に設けられ、細胞分離室１、３へ液体を注入する注入流路７、１７及び細胞分離室１、３内の液体を導出する導出流路９、１９、２１とを備え、細胞分離室１、３は、各々、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部３５、３７を有し、移動流路５は、移動流路５を開閉する移動流路開閉手段５ａを有している構成とする。【選択図】        図１
2005295969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、該細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する２以上の細胞分離収容室と、該２以上の細胞分離収容室間で細胞を移動させるための移動流路と、少なくとも１つの前記細胞分離収容室に連結され、前記細胞分離収容室へ液体を注入する注入流路及び前記細胞分離収容室内の液体を導出する導出流路とを備え、前記細胞分離収容室の少なくとも１つは、各々、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、前記移動流路は、該移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している細胞分離装置。
【請求項２】
前記注入流路には、該注入流路を開閉する注入流路開閉手段が、前記導出流路には、該導出流路を開閉する導出流路開閉手段が各々設けられていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記各細胞分離室内の付着部は、間隔が０.１−５００μｍで形成された複数の柱状の突起を有していることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記各細胞分離室内の付着部は、温度変化に応じて細胞への接着性が変化し、細胞周囲の環境温度の変化によって細胞の付着及び剥離が制御できる温度感受性の細胞接着性材料で形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離して回収する細胞分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
異なる複数種の細胞を含む細胞含有液から目的とする細胞を分離する方法として、細胞の付着性を利用し、細胞含有液を入れた容器に付着した細胞以外の細胞を培養液または洗浄液などで洗い流して取り除く分離操作を行う方法や、細胞の大きさや表面抗原などを尺度に、セルソーターなどの機器によって目的の細胞を分離する方法が用いられている。このような細胞の分離方法の中で、細胞の付着性を利用した方法は、セルソーターなどの機器を用いる必要がないため、セルソーターなどの機器を用いる方法に比べて操作が簡便であり、また、コストを低減できる点などで有利である。
【０００３】
付着性を利用した細胞の分離では、例えば、主に哺乳類などの動物の骨髄液から付着性細胞である間葉系幹細胞つまりＭＳＣなどの細胞を分離して細胞株として得る場合、取り出した骨髄細胞を細胞培養液に希釈して培養することにより、付着性を有するＭＳＣなどの細胞を培養容器の内壁などに付着させる。そして、培地や洗浄液などで付着していない浮遊状態の細胞を洗い流すことで、付着したＭＳＣなどの細胞と浮遊状態の細胞とを分離する。このような細胞の付着性を利用した細胞の分離操作は、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なっている。
【０００４】
ところで、ここに例示したような骨髄液からのＭＳＣなどの細胞の分離などでは、異なる３種類以上の細胞を分離する場合がある。この場合、上記のような細胞を付着させた後、浮遊状態の細胞を洗い流すという操作を、複数回繰り返すことになる。このため、上記のような分離操作を作業者がピペットなどを用いて複数回行うことになり、コンタミネーションの発生の確率が高くなるため、得られる細胞の品質や生産性などに関する懸念が生じる。特に、再生医療などに用いる細胞の生産などのための分離操作である場合、得られる細胞の品質や生産性などに関する問題は大きい。したがって、分離操作を複数回行なってもコンタミネーションの発生を抑制できる細胞分離装置が必要とされている。
【０００５】
これに対して、継代培養の操作におけるコンタミネーションの発生を抑制するため、作業者がピペットなどを用いて手作業で操作を行なわなくても、培地や培養細胞の供給、回収、排出などができる細胞培養装置として、継代培養を一体化された２つの培養床で行う装置が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平２００１−２７５６５９号公報（第４−９頁、第１図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところが、特許文献１のような細胞培養装置は、継代培養を行なうための装置であり、培養の前などに異なる複数種の細胞からの目的の細胞の分離操作が必要な場合は、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なう必要がある。また、特許文献１のような細胞培養装置では、異なる複数種の細胞からの目的の細胞の分離操作を装置内で行なうことは難しい。したがって、特許文献１のような細胞培養装置は、分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制するのに用いることはできない。
【０００７】
本発明の課題は、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の細胞分離装置は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、この細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する２以上の細胞分離収容室と、これら２以上の細胞分離収容室間で細胞を移動させるための移動流路と、少なくとも１つの細胞分離収容室に連結され、細胞分離収容室へ液体を注入する注入流路及び細胞分離収容室内の液体を導出する導出流路とを備え、細胞分離収容室の少なくとも１つは、各々、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、前記移動流路は、該移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している構成とすることにより上記課題を解決する。
【０００９】
このような構成とすることにより、細胞の付着性の有無や程度に応じて付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。さらに、付着部に付着していない細胞を別の細胞分離収容室内の付着部か、付着した細胞を剥離した後の付着部に付着させることで、再び、細胞の付着性の有無や程度に応じて細胞分離室内の付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。加えて、各細胞分離収容室に設けられた注入流路及び導出流路、細胞分離室間を連通させる移動流路により、細胞分離室内への異なる複数種の細胞を含む細胞含有液や緩衝液、培養液などの注入、細胞分離室からの細胞の回収などを行なうことができる。このため、複数回の分離操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００１０】
また、本発明の細胞分離装置は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、この細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する２以上の細胞分離室と、この２以上の細胞分離室間で細胞を移動させるための移動流路と、細胞分離室に連結され、細胞分離室へ液体を注入する注入流路及び細胞分離室内の液体を導出する導出流路とを備え、細胞分離室は、各々、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、移動流路は、この移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している構成とすることにより上記課題を解決する。
【００１１】
このような構成とすることにより、細胞の付着性の有無や程度に応じて細胞分離室内の付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。さらに、付着部に付着していない細胞を別の細胞分離室に移動流路を介して移動し、移動した細胞分離室内の付着部に付着させることで、再び、細胞の付着性の有無や程度に応じて細胞分離室内の付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。加えて、各細胞分離室に設けられた注入流路及び導出流路、細胞分離室間を連通させる移動流路により、細胞分離室内への異なる複数種の細胞を含む細胞含有液や緩衝液、培養液などの注入、細胞分離室からの細胞の回収などを行なうことができる。このため、複数回の分離操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００１２】
さらに、本発明の細胞分離装置は、異なる複数種の細胞を含む細胞含有液を収容し、この細胞含有液に含まれる細胞から目的の細胞を分離する細胞分離室と、この細胞分離室で分離した細胞を含む細胞含有液を一時的に収容する細胞収容室と、細胞分離室及び細胞収容室間で細胞を移動させるための移動流路と、細胞分離室に連結されてこの細胞分離室内へ液体を注入する注入流路及びこの細胞分離室内の液体を導出する導出流路とを備え、細胞分離室は、収容した細胞含有液に含まれる細胞のうち、付着性を有するか、または、付着性が他の細胞よりも強い細胞を付着させる付着部を有し、移動流路は、この移動流路を開閉する移動流路開閉手段を有している構成とすることにより上記課題を解決する。
【００１３】
このような構成とすることにより、細胞の付着性の有無や程度に応じて細胞分離室内の付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。さらに、付着部に付着していない細胞を細胞収容室に移動流路を介して移動した後、細胞分離室内の付着部に付着した細胞を回収し、細胞収容室内の細胞を再び移動流路を介して細胞分離室に移動し、細胞を付着部に付着させる。これにより、再び、細胞の付着性の有無や程度に応じて細胞分離室内の付着部に付着した細胞と付着部に付着していない細胞とに分離することができる。加えて、各細胞分離室に設けられた注入流路及び導出流路、細胞分離室間を連通させる移動流路により、細胞分離室内への異なる複数種の細胞を含む細胞含有液や緩衝液、培養液などの注入、細胞分離室からの細胞の回収などを行なうことができる。このため、複数回の分離操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００１４】
また、注入流路には、この注入流路を開閉する注入流路開閉手段が、前記導出流路には、該導出流路を開閉する導出流路開閉手段が各々設けられている構成とする。このような構成とすれば、各細胞分離室に液体を出し入れする流路が全て各流路開閉手段で閉塞でき、また、必要な流路のみを開いて液体の出し入れができるため、細胞分離室や細胞増殖室などの空間の滅菌状態を維持し易くなり、コンタミネーションの発生をより確実に抑制できる。
【００１５】
ところで、付着性の細胞を培養した場合、培養後に細胞を培養容器の内壁面などから剥離するため、トリプシンなどの蛋白質分解酵素を加えている。ところが、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素は、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力を低下させてしまう場合がある。このため、細胞分離室の付着部に付着した細胞が目的の細胞であるとき、目的の細胞を付着部から剥離する必要があるが、この目的の細胞の剥離にトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いると、細胞が有している能力が低下することにより、その後の細胞の培養で得られる細胞の品質が損なわれる場合がある。
【００１６】
これに対して、各細胞分離室内の付着部は、間隔が０.１−５００μｍで形成された複数の柱状の突起を有している構成とする。このような構成とすれば、柱状の突起に細胞が付着することにより、細胞分離室内に液体を通流させることや、振動を与えると言ったような比較的弱い物理的な力で付着している細胞を付着部から剥離することができる。このため、目的の細胞の剥離にトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いる必要がなく、細胞の品質の低下を抑制しながら、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００１７】
また、各細胞分離室内の付着部は、温度変化に応じて細胞への接着性が変化し、細胞周囲の環境温度の変化によって細胞の付着及び剥離が制御できる温度感受性の細胞接着性材料で形成されている構成とする。これにより、温度変化により細胞を付着部から剥離することができるため、目的の細胞の剥離にトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いる必要がなく、細胞の品質の低下を抑制しながら、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００１８】
さらに、細胞分離室内の付着部は、植物細胞特有の成分で、酵素分解可能な成分を含む細胞接着性材料で形成されている構成とする。これにより、動物細胞に影響を与え難い蛋白質分解酵素により細胞を付着部から剥離することができるため、目的の細胞の剥離にトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いる必要がなく、細胞の品質の低下を抑制しながら、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（第１の実施形態）
以下、本発明を適用してなる細胞分離装置の一実施形態について図１乃至図５を参照して説明する。図１は、本発明を適用してなる細胞分離装置の細胞分離を行なう細胞分離室を含むユニット部分の概略構成を模式的に示す平面図である。図２は、本発明を適用してなる細胞分離装置の概略構成を模式的に示す斜視図である。図３は、本発明を適用してなる細胞分離装置の細胞分離室に設けられた付着部の構造を模式的に示す断面図である。図４は、本発明を適用してなる細胞分離装置を用いた細胞の分離操作を示すフロー図である。図５は、本発明を適用してなる細胞分離装置を用いた細胞の別の分離操作を示すフロー図である。
【００２１】
本実施形態の細胞分離装置は、図１に示すように、３種類以上の異なる種類の細胞を含む細胞含有液から各細胞を分離するため、２つの細胞分離室、つまり第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３を備えている。また、第１細胞分離室１と第２細胞分離室３との間は、第１細胞分離室１で分離した細胞を第１細胞分離室１から第２細胞分離室３へ移動させるための移動管路５によって連結されている。さらに、移動管路５には、移動管路５内の流路を開閉する移動流路開閉手段となり、電動で開閉が可能なコック５ａが設けられている。したがって、第１細胞分離室１と第２細胞分離室３とは、移動管路５によって連通可能な状態となっている。
【００２２】
第１細胞分離室１には、プランジャーポンプ６によって第１細胞分離室１内へ洗浄液を注入するための第１注入管路７、そして、第１細胞分離室１内の液体を導出する第１導出管路９が連結されている。第１注入管路７には、第１注入管路７内の流路を開閉する移動流路開閉手段となり、電動で開閉が可能なコック７ａが、第１導出管路９には、第１導出管路９を開閉する導出流路開閉手段となり、電動で開閉が可能なコック９ａが設けられている。したがって、第１細胞分離室１とプランジャーポンプ６の洗浄液が収容されるシリンダ室６ａとは、第１注入管路７を介して連通可能になっている。第１導出管路９は、第１回収室１１に連結されており、これにより、第１細胞分離室１と第１回収室１１とは、第１導出管路９を介して連通可能になっている。
【００２３】
また、第１細胞分離室１には、第１細胞分離室１内へ細胞を含有する細胞含有液を注入するための注入ポート１２が設けられている。注入ポート１２は、細胞含有液注入時以外は閉塞可能になっている。第１回収室１１には、第１回収室１１内の細胞を細胞が浮遊している液と一緒に回収するための回収ポート１３が設けられている。回収ポート１３は、細胞回収時以外は密閉状態で閉塞可能になっている。
【００２４】
同様に、第２細胞分離室３には、プランジャーポンプ１４によって第２細胞分離室３内へ洗浄液を注入するための第２注入管路１７、そして、第２細胞分離室３内の液体を導出する２本の導出管路、つまり、第２導出管路１９と第３導出管路２１とが連結されている。第２注入管路１７には、第２注入管路１７内の流路を開閉する注入流路開閉手段となり、電動で開閉が可能な電動で開閉が可能なコック１７ａが、第２導出管路１９と第３導出管路２１とには、各々、第２導出管路１９、第３導出管路２１を開閉する導出流路開閉手段となり、電動で開閉が可能なコック１９ａ、２１ａが設けられている。したがって、第２細胞分離室３とプランジャーポンプ１４の洗浄液が収容されるシリンダ室１４ａとは、第２注入管路１７を介して連通可能になっている。
【００２５】
第２導出管路１９は、第２回収室２３に連結されており、第２細胞分離室３と第２回収室２３とは、第２導出管路１９を介して連通可能になっている。一方、第３導出管路２１は、第３回収室２５に連結されており、第２細胞分離室３と第３回収室２５とは、第３導出管路２１を介して連通可能になっている。
【００２６】
また、第２細胞分離室３には、第２細胞分離室３内へ液体を注入するための注入ポート２７が設けられている。注入ポート２７は、液体注入時以外は閉塞可能になっている。第２回収室２３及び第３回収室２５には、各々、各回収室２３、２５内の細胞を細胞が浮遊している液と一緒に回収するための回収ポート３１、３３が設けられている。各回収ポート３１、３３は、細胞回収時以外は密閉状態で閉塞可能になっている。
【００２７】
本実施形態では、第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３には、第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３内に収容される細胞含有液に含まれる細胞を付着させるための付着部３５、３７が各々設けられている。付着部３５、３７は、例えば第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３を形成する壁の底面となる部分に設けられている。付着部３５、３７は、図３に示すように、第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３の底面１ａ、３ａに複数の柱状の突起４１を形成した構造となっている。
【００２８】
突起４１は、細胞への接着性を有するポリスチレン製の柱状の立体的な構造を有する突起であり、幅つまり径が０.１−５００μｍ、高さが１０−１００００ｎｍ、隣り合う突起４１間の間隔が０.１−５００μｍで、例えばナノピラー技術などを用いて形成したものである。なお、突起４１の幅や間隔は、分離しようとする細胞の大きさに応じて適宜幅選択することが望ましい。また、突起は、柱状であれば、円錐状や角錐状、円柱状や角柱状など様々な形状で形成することができる。
【００２９】
なお、本実施形態では、細胞に対する接着性が第１細胞分離室１の方が第２細胞分離室３よりも高い材質を用いている。しかし、目的に応じ第１細胞分離室１の付着部３５と第２細胞分離室３の付着部３７の細胞に対する接着性は同一でも構わない。
【００３０】
本実施形態では、第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３、第１細胞分離室１に連結された第１注入管路７及び第１導出管路９、第２細胞分離室３に連結された第２注入管路１７、第２導出管路１９、そして、第３導出管路２１、移動管路５、第１回収室１１、第２回収室２３、第３回収室２５、各管路に設けられたコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａ、プランジャーポンプ６、１４などは、１つのカセット型のユニット４３として形成されている。
【００３１】
この場合、例えば、第１細胞分離室１、第２細胞分離室３、第１回収室１１、第２回収室２３、第３回収室２５となる各容器、さらに、プランジャーポンプ６、１４を、ユニット４３の外郭を形成する容器内に取り付け、移動管路５、第１注入管路７及び第１導出管路９、第２細胞分離室３に連結された第２注入管路１７、第２導出管路１９、第３導出管路２１などとなるチューブを配管し、これにコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａなど取り付けることで形成する。
【００３２】
また、１つの透明な樹脂製のユニット４３として、金型などを用いて、第１細胞分離室１及び第２細胞分離室３、第１細胞分離室１に連結された第１注入管路７及び第１導出管路９、第２細胞分離室３に連結された第２注入管路１７、第２導出管路１９、そして、第３導出管路２１、移動管路５、第１回収室１１、第２回収室２３、第３回収室２５を形成し、これにコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａ、プランジャーポンプ６、１４など取り付けることで形成した構成などにすることもできる。
【００３３】
このようなユニット４３の側壁の外面には、この側壁を貫通したプランジャーポンプ６、１４の駆動軸６ｂ、１４ｂが突出しており、また、電気的な接続を行うためのコネクタ４５が取り付けられている。コネクタ４５には、コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａからの配線４７が接続されている。
【００３４】
本実施形態では、図２に示すように、このようなユニット４３を、温度調整などが可能で、ユニット４３を収容可能な形態のインキュベータ４９内に設置する。インキュベータ４９には、プランジャーポンプ６、１４の駆動軸６ｂ、１４ｂに連結される駆動機構やコネクタ４５に接続されるコネクタなどを含み、これらの駆動機構やコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａ、インキュベータなどの動作を制御する制御部５１が連結されている。そして、ユニット４３がインキュベータ４９の所定の位置に設置されると、制御部５１の駆動機構とプランジャーポンプ６、１４の駆動軸６ｂ、１４ｂが連結され、コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａが制御部５１とコネクタ４５を介して電気的に接続される。なお、制御部５１は、制御部５１に分離操作の種々の条件などを入力し、また、制御部５１の動作を制御するためのコンピュータ５３に配線５５を介して電気的に接続されている。
【００３５】
また、本実施形態は、プランジャーポンプ６のシリンダ室６ａや、プランジャーポンプ１４のシリンダ室１４ａに、予め必要な種類の溶液を必要量入れておく構成となっている。しかし、剥離剤、緩衝液、培養液などといったような複数の溶液を注入する場合や、プランジャーポンプ６のシリンダ室６ａ及びプランジャーポンプ１４のシリンダ室１４ａに収容できる溶液の容量で足りない場合などには、プランジャーポンプ６のシリンダ室６ａや、プランジャーポンプ１４のシリンダ室１４ａに、各々、配管を介してこれらの液体を含む複数の容器を連結した構成にすることもできる。
【００３６】
このような構成の細胞分離装置による分離操作について説明する。ここでは、このような構成の細胞分離装置を用いて、骨髄細胞から付着性細胞である間葉系幹細胞つまりＭＳＣを分離、抽出するプロセスの中で、細胞の付着性の有無及びその程度の大小により３種類の細胞に分離する場合を例示する。また、分離操作を開始する時、コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａは閉じられており、注入ポート１２、２３、回収ポート１３、３１、３３は閉塞された状態になっている。
【００３７】
オートクレーブ滅菌やγ線滅菌などによって滅菌した状態のユニット４３の第１細胞分離室１に、図１及び図４に示すように、骨髄細胞を含む細胞含有液を第１細胞分離室１の注入ポート１２から注入することで細胞を播種する（ステップ１０１）。そして、３７℃前後の温度、湿度及び適切な気相条件にて保持するため、ユニット４３をインキュベータ４９内に設置する。ユニット４３をインキュベータ４９内に設置し、細胞が成育できる条件化で一定時間経過すると、播種した３種類の細胞のうち、例えば、付着性が最も弱いか、または、付着性がない細胞以外の２種の付着性を有する細胞が第１細胞分離室１の付着部３５に付着する（ステップ１０２）。
【００３８】
ステップ１０２で２種の細胞が第１細胞分離室１の付着部３５に付着したら、第１注入管路７のコック７ａ及び第１導出管路９のコック９ａを開き、プランジャーポンプ６の駆動により、プランジャーポンプ６のシリンダ室６ａ内の洗浄液を、付着部３５に付着した細胞が剥離しない程度の流量で第１細胞分離室１内に緩やかに流し込む（ステップ１０３）。このとき、本実施形態では洗浄液としてヒト間葉系幹細胞専用培地を用いるが、洗浄液は、他の培地やＰＢＳ（−）などの緩衝液などであっても構わない。
【００３９】
ステップ１０３では、プランジャーポンプ６から緩やかに洗浄液を第１細胞分離室１に注入することから、付着部３５に付着した２種の細胞は剥離されず、第１細胞分離室１内で浮遊する１種の細胞、この場合主に血球系の浮遊細胞のみが、洗浄液によって第１回収室１１に移送される（ステップ１０４）。ステップ１０３からステップ１０４で細胞移送終了後、第１注入管路７のコック７ａ及び第１導出管路９のコック９ａを閉じる。その後、必要に応じて第１回収室１１の回収ポート１３から、第１回収室１１内に移送された細胞を回収する（ステップ１０５）。
【００４０】
一方、ステップ１０４の後、第１注入管路７のコック７ａ及び移動管路５のコック５ａを開け、プランジャーポンプ６により、洗浄液を第１細胞分離室１に、第１細胞分離室１の付着部３５に付着している細胞が剥離するような強めの流量で注入する（ステップ１０６）。第１細胞分離室１の付着部３５は、複数の微細な柱状の突起４１を有していることから、洗浄液を第１細胞分離室１へ強めに注入することで、付着していた細胞は洗浄液の流れから受ける力で剥離される。そして、剥離された細胞は、洗浄液と共に移動管路５を介して、第２細胞分離室３に移送される（ステップ１０７）。
【００４１】
ステップ１０７で細胞移送後、第１注入管路７のコック７ａ及び移動管路５のコック５ａを閉じる。そして、細胞が成育できる条件化で一定時間経過すると、播種した２種類の細胞のうち、付着性がより強い細胞が第２細胞分離室３の付着部３７に付着する（ステップ１０８）。ステップ１０８で付着性がより強い細胞が第２細胞分離室３の付着部３７に付着したら、第２注入管路１７のコック１７ａ及び第２導出管路１９のコック１９ａを開き、プランジャーポンプ１４の駆動により、プランジャーポンプ１４のシリンダ室１４ａ内の洗浄液を、付着部３７に付着した細胞が剥離しない程度の流量で第２細胞分離室３内に緩やかに流し込む（ステップ１０９）。このとき、本実施形態では洗浄液としてヒト間葉系幹細胞専用培地を用いるが、洗浄液は、他の培地やＰＢＳ（−）などの緩衝液などであっても構わない。
【００４２】
ステップ１０９では、プランジャーポンプ１４から緩やかに洗浄液を第２細胞分離室３に注入することから、付着部３７に付着した細胞は剥離されず、第２細胞分離室３内で浮遊する付着性のより弱い細胞のみが、洗浄液によって第２回収室２３に移送される（ステップ１１０）。ステップ１０９からステップ１１０で細胞移送終了後、第２注入管路１７のコック１７ａ及び第２導出管路１９のコック１９ａを閉じる。その後、必要に応じて第２回収室２３の回収ポート３１から、第２回収室２３内に移送された細胞を回収する（ステップ１１１）。
【００４３】
一方、ステップ１１０の後、第２注入管路１７のコック１７ａ及び第３導出管路２１のコック２１ａを開け、プランジャーポンプ１４により、第２細胞分離室３の付着部３７に付着している細胞が剥離するような流量で、洗浄液を第２細胞分離室３へ強めに注入する（ステップ１１２）。テップ１１２で、第２細胞分離室３の付着部３７は、第１細胞分離室１と同様に、複数の微細な柱状の突起４１を有していることから、洗浄液を第２細胞分離室３へ強めに注入することで、付着していた細胞は洗浄液の流れから受ける力で剥離される。そして、剥離された細胞は、洗浄液と共に第３導出管路２１を介して、第３回収室２５に移送される。
【００４４】
細胞移送後、第２注入管路１７のコック１７ａ及び第３導出管路２１のコック２１ａを閉じ、その後、必要に応じて第３回収室２５の回収ポート３３から、第３回収室２５内に移送された細胞を回収する（ステップ１１３）。また、第３回収室２５の内部に何らかの細胞培養のための処理を行なっておくことで、第３回収室２５内に移送された細胞を回収せずに、第３回収室２５内でそのまま培養を行なうこともできる。
【００４５】
このように、本実施形態の細胞分離装置では、細胞の付着性の有無または付着性の程度に応じて第１細胞分離室１内の付着部３５に付着した細胞と付着部３５に付着していない細胞とに分離することができる。さらに、付着部３５に付着していない細胞を第２細胞分離室３に移動管路５を介して移動することで、再度、細胞の付着性の有無または付着性の程度に応じて第２細胞分離室３内の付着部３７に付着した細胞と付着部３７に付着していない細胞とに分離することができる。加えて、各細胞分離室１、３への洗浄液の注入や細胞含有液の移動などは、移動管路５、各注入管路７、１７及び各導出管路９、１９、２１などによって隔離された空間内で行なうことができる。このため、複数回の分離操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００４６】
さらに、目的の細胞の分離にセルソーターなどの高価な機器を用いる必要がないため、目的の細胞を分離するためのコストを低減できる。
【００４７】
さらに、本実施形態の細胞分離装置では、移動管路５には、移動流路開閉手段となるコック５ａが、第１注入管路７には、第１注入流路開閉手段となるコック７ａが、第１導出管路９には、第１導出流路開閉手段となるコック９ａが、第２注入管路１７には、第２注入流路開閉手段となるコック１７ａが、第２導出管路１９には、第２導出流路開閉手段となるコック１９ａが、第３導出管路２１には、第３導出流路開閉手段となるコック２１ａが設けられている。このため、第１細胞分離室１や第２細胞分離室３に液体を出し入れする流路が全て各コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａで閉塞でき、また、必要な管路のみを開いて液体の出し入れができるため、第１細胞分離室１や第２細胞分離室３などの滅菌状態を維持し易くなり、コンタミネーションの発生をより確実に抑制できる。加えて、第１細胞分離室１や第２細胞分離室３などへの液体や細胞の出し入れや、第１細胞分離室１や第２細胞分離室３への細胞の移動などの制御が容易になる。
【００４８】
さらに、移動管路５、第１注入管路７、第１導出管路９、第２注入管路１７、第２導出管路１９、第３導出管路２１にコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａが設け、これらのコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａなどの各流路開閉手段を機械的または電気的に動作を制御しているため、目的の細胞の分離操作や分離した細胞の培地への植付け操作、増殖した細胞の回収操作などの目的の細胞を分離して増殖させるための一連の培養操作を容易に自動化できる。
【００４９】
加えて、本実施形態では、各細胞分離室１、３内の付着部３５、３７は、複数の柱状の突起４１を有している。このため、付着部３５、３７に付着した細胞が目的の細胞である場合、細胞を本実施形態のように水流、また、水流に代えて振動を与えるといったような比較的弱い物理的な力によって付着している細胞を剥離できる。すなわち、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がなく、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力の低下を抑制できる。したがって、分離後の培養によって、要求される品質の細胞を得易くなる。
【００５０】
また、本実施形態では、ユニット４３にプランジャーポンプ６、１４を内蔵した構成としているが、プランジャーポンプは、ユニット４３とは別に設けた構成にすることもできる。また、プランジャーポンプは、細胞を剥離しない程度の流量と、複数の微細な突起４１を有する付着部３５、３７から細胞を剥離できる流量とに流量が調整できれば他のポンプや、水流を発生させる他の手段を用いることができる。例えば、プランジャーポンプに代えてペリスタリックポンプや、ダイヤフラムポンプなどを用いることができる。また、洗浄液などが入った容器を各細胞分離室よりも高い位置に設置し、洗浄液などが入った容器の高さを調整することで水流の強さを調整する構成などにすることもできる。
【００５１】
また、本実施形態では、細胞の剥離、移送などは、水流で行なっているが、ユニット４３などに振動を与えることで細胞の剥離、移送などを行なったり、ユニット４３を傾斜させることで細胞の移送を行ったりすることもできる。また、水流による細胞の剥離、移送を、ユニット４３に振動を与えることや傾斜させることで補助することもできる。
【００５２】
また、本実施形態では、２つの細胞分離室１、３を備えた構成を示したが、細胞分離室は、必要に応じ３以上設けることもできる。例えば、図１の第１細胞分離室１と第１回収室１１との間に第１細胞培養室１と移動管路を介して連結された第３細胞分離室を設けた場合、つまり３つの細胞分離室を設けた場合の細胞の分離操作の一例を図５に示す。第３細胞分離室にもプランジャーポンプが連結されている。ここでは、３つの細胞分離室をしなえた細胞分離装置により４種類の付着性が異なる細胞を得ている。なお、図５において図４と同じ操作を行なうステップは、図４と同じ符号を付して説明を省略している。
【００５３】
図５の分離操作では、ステップ１０６からステップ１１３に示すように、第１細胞分離室の付着部に付着した細胞の取扱は、図４の場合と同じである。しかし、第１細胞分離室の付着部に付着せず浮遊している細胞は、第１細胞分離室に緩やかに注入された洗浄液により、第３細胞分離室に移送される（ステップ１１４）。ステップ１１４で細胞移送後、細胞が成育できる条件化で一定時間経過すると、第３細胞分離室内に播種した２種類の細胞のうち、付着性を有する方の細胞が第３細胞分離室の付着部に付着する（ステップ１１５）。ステップ１１５で付着性を有する細胞が第３細胞分離室の付着部に付着したら、プランジャーポンプの駆動により、洗浄液を、付着部に付着した細胞が剥離しない程度の流量で第３細胞分離室３内に緩やかに流し込む（ステップ１１６）。
【００５４】
ステップ１１６では、プランジャーポンプから緩やかに洗浄液を第３細胞分離室に注入することから、付着部に付着した細胞は剥離されず、第２３細胞分離室内で浮遊する付着性のない細胞のみが、洗浄液によって第１回収室に移送される（ステップ１１７）。その後、必要に応じて第１回収室の回収ポートから細胞を回収する（ステップ１１８）。
【００５５】
一方、ステップ１１７の後、プランジャーポンプにより、第３細胞分離室の付着部に付着している細胞が剥離するような流量で、洗浄液を第３細胞分離室へ強めに注入する（ステップ１１９）。ステップ１１９で、洗浄液を第３細胞分離室へ強めに注入することで、付着していた細胞は洗浄液の流れから受ける力で剥離される。そして、剥離された細胞は、洗浄液と共に別の導出管路を介して、別に設けられた回収室に移送される。その後、必要に応じてこの回収室から細胞を回収する（ステップ１２０）。
【００５６】
（第２の実施形態）
以下、本発明を適用してなる細胞分離装置の第２の実施形態について図４、図６及び図７を参照して説明する。図６は、本発明を適用してなる細胞分離装置の細胞分離を行なう細胞分離室を含むユニット部分の概略構成を模式的に示す斜視図である。図７は、本発明を適用してなる細胞分離装置の概略構成を模式的に示す斜視図である。なお、本実施形態では、第１の実施形態と同一の構成などには同じ符号を付して説明を省略し、第１の実施形態と相違する構成や特徴部などについて説明する。
【００５７】
本実施形態の細胞分離装置が第１の実施形態と相違する点は、付着部が微細な複数の柱状の突起を有する構成に代えて、付着部が温度に応じて細胞との接着性が変化する温度感受性の細胞接着性材料で形成され、付着部を冷却するための冷却手段を細胞分離室の付着部に対応する部分に設けていることにある。また、本実施形態では、各細胞分離室にプランジャーポンプを連結せず、各細胞分離室に異なる種類の液体を注入可能にしている。すなわち、本実施形態の細胞分離装置では、第１細胞分離室１、第２細胞分離室３、第１回収室１１、第２回収室２３、第３回収室２５、移動管路５、第１細胞分離室１に連結された第１注入管路７及び第１導出管路９、第２細胞分離室３に連結された第２注入管路１７、第２導出管路１９、第３導出管路２１、各コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａなどを備えたユニット５７の構成は第１の実施形態と同じである。
【００５８】
しかし、本実施形態の細胞分離装置では、第１細胞分離室１の付着部５９は、温度感受性の細胞接着性材料を有し、第１細胞分離室１の付着部５９を設けた面側には、付着部５９を冷却するための冷却手段となるペルチェ素子６０が設けられている。同様に、第２細胞分離室３の付着部６１も、温度感受性の細胞接着性材料を有し、第２細胞分離室３の付着部６１を設けた面側には、付着部６１を冷却するための冷却手段となるペルチェ素子６２が各々設けられている。ペルチェ素子６０、６２各々からの配線４７は、コネクタ４５に接続されている。また、本実施形態では、第１注入管路７及び第２注入管路１７は、ユニット５７の外郭となる容器の側壁に貫通してユニット５７から突出した状態となっており、突出した端部は、各々、対応する管路を連結するための連結部７ｂ、１７ｂとなっている。
【００５９】
本実施形態の細胞分離装置では、図７に示すように、第１の実施形態と同様、ユニット５７をインキュベータ４９内に設置する。本実施形態のインキュベータ４９には、第１注入管路７及び第２注入管路１７の連結部７ｂ、１７ｂに連結される図示していない管路やコネクタ４５に接続されるコネクタなどを含む制御部６３が連結されている。制御部６３には、異なる溶液を収容した複数の試薬容器６５、６７、６９を設置でき、各試薬容器６５、６７、６９に連結される管路７１、７３、７５を有している。また、制御部６３は、管路７１、７３、７５が連結されて取り出す溶液と、取り出した溶液を第１注入管路７及び第２注入管路１７のいずれに供給するかを切り換える図示していない切換バルブ、管路７１、７３、７５に吸引した溶液を第１注入管路７及び第２注入管路１７に送る図示していないポンプなどを有している。
【００６０】
そして、ユニット５７がインキュベータ４９の所定の位置に設置されると、第１注入管路７及び第２注入管路１７の連結部７ｂ、１７ｂとこれに対応する制御部６３の図示していない管路の連結部とが連結され、また、コック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａが制御部６３とコネクタ４５を介して電気的に接続される。
【００６１】
本実施形態の第１細胞分離室１の付着部５９及び第２細胞分離室３の付着部６１は、温度感受性の細胞接着性材料として、例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドつまりＮ−ＰＡＭと略称される温度応答性高分子ポリマーを用い、これを共有結合により付着部５９、６１となる面に固定化している。Ｎ−ＰＡＭは、３２℃前後を境に細胞への接着性が変化することから、培養液の温度制御や、ペルチェ素子などの冷却手段による付着部５９、６１の冷却などで細胞への接着性を制御できる。
【００６２】
このような本実施形態の細胞分離装置では、例えば骨髄細胞からのＭＳＣの分離の場合、図４に示したように、概略的な分離操作の流れは第１の実施形態と同じである。しかし、ステップ１０６及びステップ１１２の付着した細胞の剥離において、各々、ペルチェ素子６０、６２による冷却を行なう。インキュベータ４９によって第１細胞分離室１や第２細胞分離室３の温度が３７℃に設定されているとき、各々の付着部５９、６１のＮ−ＰＡＭは疎水性または弱い親水性となっており細胞が付着している。
【００６３】
ステップ１０６では、第１細胞分離室１に設けられたペルチェ素子６０を駆動させることにより、付着部５９を３２℃以下、例えば３０℃程度に下げる。これにより、付着部５９のＮ−ＰＡＭは親水性となって接着性が低下し、付着部５９に付着していた細胞が剥離される。同様に、ステップ１１２では、第２細胞分離室３に設けられたペルチェ素子６２を駆動させることにより、付着部６１を３２℃以下、例えば３０℃程度に下げる。これにより、付着部６１のＮ−ＰＡＭは親水性となって接着性が低下し、付着部６１に付着していた細胞が剥離される。
【００６４】
このように、本実施形態の細胞分離装置でも、第１の実施形態と同様の効果が得られ、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００６５】
さらに、第１細胞分離室１の付着部５９及び第２細胞分離室３の付着部６１は、温度感受性の細胞接着性材料で形成されている。このため、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がなく、細胞の増殖能や分化能など細胞が有している能力の低下を抑制できる。したがって、分離後の培養によって得られる細胞の品質の低下を抑制できる。
【００６６】
また、本実施形態では、温度感受性の細胞接着性材料のみで付着部を形成しているが、温度感受性の細胞接着性材料と抗体や蛋白質やペプチドなどとを組み合わせて付着部を形成することもできる。
【００６７】
また、本実施形態では、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がない付着部として、温度感受性の細胞接着性材料で付着部を形成している。しかし、温度感受性の細胞接着性材料に代えて、細胞接着性物質とセルロースを含み、セルラーゼなどによって分解され細胞の剥離が可能なセルロースシート、コラーゲンを含むゲル状で、コラゲナーゼなどによって分解し、細胞の剥離が可能なコラーゲンゲル、キトサンとポリビニルアルコールを含み、キトサナーゼなどによって分解され細胞の剥離が可能なキトサンゲルなどで付着部を形成することでも、トリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がない付着部を形成できる。ただし、温度感受性の細胞接着性材料で付着部を形成すれば、細胞の剥離に薬剤を用いる必要がない。
【００６８】
また、第１の実施形態及び第２の実施形態では、微細な複数の突起または温度感受性の細胞接着性材料などによってトリプシンなどの動物細胞由来の蛋白質分解酵素を用いて細胞を剥離する必要がない付着部を形成している。しかし、目的とする細胞が付着する細胞でない場合、トリプシンを使用しても品質が低下し難い場合などは、細胞との接着性を有する材料であるポリスチレンなどで細胞分離室の壁面を形成したり、付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などの表面処理を行なったポリスチレンなどの壁面で細胞分離室を画成したりする構成とすることもできる。
【００６９】
このように、細胞分離室に設ける付着部は、化学的接着性や免疫抗体反応、それらの組み合わせなどを適宜利用して形成することができる。したがって、付着を利用した細胞の分離は、骨髄液からのＭＳＣに代表されるような付着性を有する細胞のみでなく、血球系などの浮遊細胞も含めた複数種の細胞の分離精製に用いることが可能である。
【００７０】
また、第１の実施形態及び第２の実施形態では、制御部によって操作手順にしたがって自動的に各流路開閉手段となるコック５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａを開閉する構成を示している。しかし、流路開閉手段は、各流路内の液体の通流及び遮断を制御できるものであればよく、電磁弁などを用いることもできる。さらに、流路開閉手段として、操作手順にしたがって手作業で操作する流路開閉手段を用いた構成にすることもでき、この場合、流路開閉手段として、外側からチューブを挟み込むピンチコックやローラ式コック、活栓など手動で操作するコックなどの様々な流路開閉手段を用いることができる。
【００７１】
また、第１の実施形態及び第２の実施形態では、第１細胞分離室１や第２細胞分離室３などを一体的にユニット４３、５７とした構成を示しているが、ユニット４３、５７のように第１細胞分離室１や第２細胞分離室３などの各要素を一体的にユニット化していない構成とすることもできる。
【００７２】
（第３の実施形態）
以下、本発明を適用してなる細胞分離装置の第３の実施形態について図８乃至図１０を参照して説明する。図８は、本発明を適用してなる細胞分離装置の概略構成を模式的に示す平面図である。図９は、本発明を適用してなる細胞分離装置を用いた細胞の分離操作を示すフロー図である。図１０は、本発明を適用してなる細胞分離装置を用いた細胞の別の分離操作を示すフロー図である。なお、本実施形態では、第１及び第２の実施形態と同一の構成などには同じ符号を付して説明を省略し、第１及び第２の実施形態と相違する構成や特徴部などについて説明する。
【００７３】
本実施形態の細胞分離装置が第１及び第２の実施形態と相違する点は、細部分離室に一時的に細胞を収容する細胞収容室を、移動流路を介して連結したことにある。すなわち、本実施形態の細胞分離装置は、３種類以上の異なる種類の細胞を含む細胞含有液から各細胞を分離するための細胞の細胞分離室７７、そして、細胞分離室７７で分離した細胞を一時的に収容する細胞収容室７９を備えている。細胞分離室７７と細胞収容室７９との間は、細胞分離室７７で分離した細胞を移動させるための移動管路８１によって連結されている。さらに、移動管路８１には、移動管路８１内の流路を開閉する移動流路開閉手段となるコック８１ａが設けられている。したがって、細胞分離室７７と細胞収容室７９とは、移動管路８１によって連通可能な状態となっている。
【００７４】
細胞分離室７７には、細胞分離室７７内へ洗浄液や細胞含有液などを注入するための注入管路８３、そして、細胞分離室７７内の液体を導出する３つの導出管路、つまり第１導出管路８５、第２導出管路８７、第３導出管路８９が連結されている。注入管路８３には、注入管路８３内の流路を開閉する注入流路開閉手段となるコック８３ａが設けられている。そして、第１導出管路８５には、第１導出管路８５を開閉する導出流路開閉手段となるコック８５ａが、第２導出管路８７には、第２導出管路８７を開閉する導出流路開閉手段となるコック８７ａが、第３導出管路８９には、第３導出管路８９を開閉する導出流路開閉手段となるコック８９ａが各々設けられている。なお、第１導出管路８５、第２導出管路８７、第３導出管路８９には、各々の端部に、分離した細胞を回収するための回収容器９１、９３、９５が適宜連結される。
【００７５】
細胞分離室７７には、細胞分離室７７内に収容される細胞含有液に含まれる細胞を付着させるための付着部９７が設けられている。付着部９７は、例えば細胞分離室７７を形成する壁の底面となる部分に設けられている。本実施形態の細胞分離室７７は、少なくとも付着部９７となる面を有する壁が、細胞の接着性が他の材料に比べて高いポリスチレンで形成されており、さらに、付着部９７には、細胞の付着を促進する表面処理、例えば細胞の付着を促進する物質のコーティング処理やプラズマ処理などが行われている。一方、細胞収容室７９は、細胞収容室７９を画成する全ての面が、細胞が付着し難いように撥水処理を行ったプラスッチク製の壁で形成されている。
【００７６】
本実施形態では、細胞分離室７７や細胞収容室７９は、各々別個の容器で形成され、これらを移動管路８１、注入管路８３、第１導出管路８５、第２導出管路８７、第３導出管路８９となるチューブに各々コック８１ａ、８３ａ、８５ａ、８７ａ、８９ａとなるコックを設けることで形成している。しかし、第１及び第２の実施形態のように、細胞分離室７７や細胞収容室７９、移動管路８１、注入管路８３、第１導出管路８５、第２導出管路８７、第３導出管路８９、コック８１ａ、８３ａ、８５ａ、８７ａ、８９ａなどを一体的なユニット化した構成にすることもできる。また、コック８１ａ、８３ａ、８５ａ、８７ａ、８９ａは、電動で開閉が可能なコックを用い、自動的に開閉を制御する構成にすることもできる。
【００７７】
このような構成の細胞分離装置による分離操作について説明する。ここでは、このような構成の細胞分離装置を用いて、骨髄細胞から付着性細胞である間葉系幹細胞つまりＭＳＣを分離、抽出するプロセスの中で、細胞の付着性の有無及びその程度の大小により３種類の細胞に分離する場合を例示する。また、分離操作を開始する時、コック８１ａ、８３ａ、８５ａ、８７ａ、８９ａは閉じられた状態になっている。
【００７８】
細胞分離室７７や細胞収容室７９、移動管路８１、注入管路８３、第１導出管路８５、第２導出管路８７、第３導出管路８９、コック８１ａ、８３ａ、８５ａ、８７ａ、８９ａなどを組み立てて細胞分離装置とし、オートクレーブ滅菌やγ線滅菌などによって滅菌した後、細胞分離室７７に、図８及び図９に示すように、注入管路８３のコック８３ａを開き、骨髄細胞を含む細胞含有液を注入管路８３から注入することで細胞を播種する（ステップ２０１）。そして、注入管路８３のコック８３ａを閉じた細胞分離装置を図示していないインキュベータ内に設置し、細胞が成育できる条件化で一定時間経過すると、播種した３種類の細胞のうち、付着性が最も強い細胞が細胞分離室７７の付着部９７に付着する（ステップ２０２）。
【００７９】
ステップ２０２で１種の細胞が細胞分離室７７の付着部９７に付着したら、注入管路８３のコック８３ａ及び移動管路８１のコック８１ａを開き、注入管路８３から洗浄液を細胞分離室７７内に注入する（ステップ２０３）。このとき本実施形態では洗浄液としてヒト間葉系幹細胞専用培地を用いるが、洗浄液は、他の培地やＰＢＳ（−）などの緩衝液などであっても構わない。これにより、細胞分離室７７内で浮遊している２種の細胞が、移動管路８１を介して、洗浄液によって細胞収容室７９に移送される（ステップ２０４、２０５）。ステップ２０３からステップ２０５で細胞移送終了後、注入管路８３のコック８３ａ及び移動管路８１のコック８１ａを閉じる。
【００８０】
その後、注入管路８３のコック８３ａを再び開け、注入管路８３から細胞剥離剤である０.０５重量％トリプシン−０.５３ｍＭＥＤＴＡ液を細胞分離室７７に注入し、細胞剥離剤注入後、注入管路８３のコック８３ａを閉じて反応させ、細胞分離室７７の付着部９７に付着している細胞の剥離を行う（ステップ２０６）。ステップ２０６の後、細胞の剥離を確認した時点で、注入管路８３のコック８３ａ及び適宜の導出管路のコック、例えば第１導出管路８５のコック８５ａを開き、注入管路８３から１０％子ウシ胎仔血清含有の培養液を細胞分離室７７に注入する。これにより、血清によりトリプシン活性が失活され、また、剥離した付着性の最も強い細胞が第１導出管路８５を介して回収容器９１に回収される（ステップ２０７）。ステップ２０７の後、注入管路８３のコック８３ａ及び第１導出管路８５のコック８５ａを閉じる。
【００８１】
一方、細胞収容室７９に収容された２種の細胞は、ステップ２０６からステップ２０７の操作の間、細胞収容室７９内に収容された状態に保持されている（ステップ２０８）。ステップ２０８の後、つまり、ステップ２０７が終了して注入管路８３のコック８３ａ及び第１導出管路８５のコック８５ａを閉じられた後、移動管路８１のコック８１ａを開いて、移動管路８１を介して、細胞収容室７９内に一時的に収容されていた細胞を再び細胞分離室７７に戻す（ステップ２０９）。このとき、細胞収容室７９が細胞分離室７７よりも上になるように傾けることで細胞を移送することもできるし、細胞収容室７９に注入管路を設け、この注入管路から培養液や緩衝液などを注入することで細胞を移送することなどもできる。
【００８２】
ステップ２０９の後、移動管路８１のコック８１ａを閉じ、細胞が成育できる条件化で一定時間経過すると、播種した３種類の細胞のうち、付着性を有する細胞が細胞分離室７７の付着部９７に付着する（ステップ２１０）。ステップ２１０で１方の細胞が細胞分離室７７の付着部９７に付着したら、注入管路８３のコック８３ａ及び適宜の導出管路のコック、例えば第２導出管路８７のコック８７ａを開き、注入管路８３から洗浄液を細胞分離室７７内に注入する（ステップ２１１）。このとき本実施形態では洗浄液としてヒト間葉系幹細胞専用培地を用いるが、洗浄液は、他の培地やＰＢＳ（−）などの緩衝液などであっても構わない。これにより、細胞分離室７７内で浮遊している細胞、本実施形態の場合主に血球系の浮遊細胞が、第２導出管路８７を介して、洗浄液によって回収容器９３に回収される（ステップ２１２、２１３）。ステップ２１３の後、注入管路８３のコック８３ａ及び第２導出管路８７のコック８７ａを閉じる。
【００８３】
その後、注入管路８３のコック８３ａを再び開け、注入管路８３から細胞剥離剤である０.０５重量％トリプシン−０.５３ｍＭＥＤＴＡ液を細胞分離室７７に注入し、細胞剥離剤注入後、注入管路８３のコック８３ａを閉じて反応させ、細胞分離室７７の付着部９７に付着している細胞の剥離を行う（ステップ２１４）。ステップ２１４の後、細胞の剥離を確認した時点で、注入管路８３のコック８３ａ及び適宜の導出管路のコック、例えば第３導出管路８９のコック８９ａを開き、注入管路８３から１０％子ウシ胎仔血清含有の培養液を細胞分離室７７に注入する。これにより、血清によりトリプシン活性が失活され、また、剥離した細胞、つまり、ステップ２０７で回収容器９１に回収した細胞よりも付着性が弱い細胞が第３導出管路８９を介して回収容器９５に回収される（ステップ２１５）。
【００８４】
このように、本実施形態の細胞分離装置では、細胞の付着性の有無または付着性の程度に応じて細胞分離室７７内の付着部９７に付着した細胞と付着部９７に付着していない細胞とに分離することができる。さらに、付着部９７に付着していない細胞を細胞収容室７９に移動管路８１を介して移動し、付着部９７に付着した細胞を剥離して回収した後、移動管路８１を介して細胞収容室７９内の細胞を細胞分離室７７に戻すことで、再度、細胞の付着性の有無または付着性の程度に応じて付着部９７に付着した細胞と付着部９７に付着していない細胞とに分離することができる。加えて、細胞分離室７７への洗浄液の注入や細胞収容室７９への細胞含有液の移動などは、移動管路８１、注入管路８３及び各導出管路８５、８７、８９などによって隔離された空間内で行なうことができる。このため、複数回の分離操作を、作業者がピペットなどを用いて手作業で行なうことなく、外部から隔離された一貫した空間の中で行なうことができる。したがって、本実施形態のような構成の細胞分離装置でも、第１及び第２の実施形態と同様の効果が得られ、複数回行なわれる分離操作におけるコンタミネーションの発生を抑制できる。
【００８５】
また、本実施形態では、１組の細胞分離室７７と細胞収容室７９を備えた構成を示したが、細胞分離室７７と細胞収容室７９との組を、必要に応じ２組以上連結した構成にすることもできる。
【００８６】
また、本実施形態では、３種類の付着性が異なる細胞を分離する操作を例示したが、本実施形態の構成で４種類の付着性が異なる細胞を分離することもできる。この場合、図１０に例示したような操作を行ない、また、細胞分離室に第４導出管路を追加しておくことがクロスコンタミネーションを防ぐ上で望ましい。なお、図１０において図９と同じ操作を行なうステップは、図９と同じ符号を付している。
【００８７】
図１０に示す分離操作では、ステップ２０１からステップ２０６までに示すように、細胞分離室７７の付着部９７に最初に付着させた細胞の取扱は、図９の場合と同じである。しかし、ステップ２０６で付着部９７に付着した細胞を剥離し、トリプシン活性が失活させた後、再度、細胞が成育できる条件化で一定時間経過させ、剥離した細胞のうち、付着性のより強い細胞を細胞分離室７７の付着部９７に付着させる（ステップ２１６、２１７）。ステップ２１７で付着性を有する細胞が細胞分離室７７の付着部９７に付着したら、ステップ２０３と同様に、細胞分離室７７に洗浄液を注入し（ステップ２１８）、細胞分離室７７内で浮遊している付着性がより弱い方の細胞を適宜の導出管路、例えば第１導出管路８５から回収する（ステップ２１９、２２１）。そして、ステップ２１９の後、細胞分離室７７の付着部９７に付着している細胞をステップ２０６と同様の操作で剥離し（ステップ２２０）、そして、第２導出管路８７から最も付着性が強い細胞を適宜の導出管路、例えば第２導出管路８７から回収する（ステップ２２２）。
【００８８】
一方、細胞収容室７９に収容した細胞のその後の分離操作は、ステップ２０５からステップ２１５に示すように、図９の場合と同様であるが、ステップ２０８では、ステップ２０６、そして、ステップ２１６からステップ２２２を行なっている間、細胞を細胞収容室７９に保持しておく。ステップ２０５からステップ２１５の操作により、例えば付着生のない細胞と、付着性が最も弱い細胞とが分離され回収される。
【００８９】
また、本実施形態の細胞分離室７７の付着部９７は、ポリスチレンを用いることや、表面処理などを施すことで形成されているが、第１及び第２の実施形態のように、微細な複数の突起、温度感受性の細胞接着性材料、酵素などで分解可能なその他の細胞接着性材料などを用いて形成することもできる。さらに、本実施形態の細胞分離装置も、第１及び第２の実施形態のように、自動化した構成にすることもできる。
【００９０】
また、本発明は、第１乃至第３実施形態の構成や操作に限らず、複数の細胞分離室を備えているか、または、細胞分離室と細胞収容室の組を備えていれば、差様々な構成にすることができ、また、様々な操作で細胞を分離することができる。さらに、本発明は、第１乃至第３実施形態で例示したような種類の細胞に限らず、付着性が異なる様々な細胞の分離に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】本発明を適用してなる細胞分離装置の第１の実施形態の細胞分離を行なう細胞分離室を含むユニット部分の概略構成を模式的に示す平面図である。
【図２】本発明を適用してなる細胞分離装置の第１の実施形態の概略構成を模式的に示す斜視図である。
【図３】本発明を適用してなる細胞分離装置の第１の実施形態の細胞分離室に設けられた付着部の構造を模式的に示す断面図である。
【図４】本発明を適用してなる第１及び第２の実施形態の細胞分離装置を用いた細胞の分離操作を示すフロー図である。
【図５】本発明を適用してなる第１及び第２の実施形態の細胞分離装置を用いた細胞の別の分離操作を示すフロー図である。
【図６】本発明を適用してなる細胞分離装置の第２の実施形態の細胞分離を行なう細胞分離室を含むユニット部分の概略構成を模式的に示す平面図である。
【図７】本発明を適用してなる細胞分離装置の第２の実施形態の概略構成を模式的に示す斜視図である。
【図８】本発明を適用してなる細胞分離装置の第３の実施形態の細胞分離を行なう細胞分離室を含むユニット部分の概略構成を模式的に示す平面図である。
【図９】本発明を適用してなる第３の実施形態の細胞分離装置を用いた細胞の分離操作を示すフロー図である。
【図１０】本発明を適用してなる第３の実施形態の細胞分離装置を用いた細胞の別の分離操作を示すフロー図である。
【符号の説明】
【００９２】
１  第１細胞分離室
３  第２細胞分離室
５  移動管路
７  第１注入管路
９  第１導出管路
１７  第２注入管路
１９  第２導出管路
２１  第３導出管路
５ａ、７ａ、９ａ、１７ａ、１９ａ、２１ａ  コック
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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