(57)【要約】      （修正有）【課題】  テロメア蛋白質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインとテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体構造とその機能を解析し、ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能を調節できる薬剤のスクリーニングを可能とし、ＴＲＦ２をターゲットにした創薬に貢献する。【解決手段】  以下の(a)又は(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体蛋白質又はその塩。(a)野生型hTRF2のDNA結合ドメインのアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニン、34位のアラニンからセリン、47位のアラニンからセリン及び59位のアルギニンからリシンへの置換のうち少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有する蛋白質。(b)(a)該アミノ酸配列において、10位、34位、47位及び59位以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列5’-TTAGGG-3’を含む二重らせんＤＮＡへの結合能が特定のアミノ酸配列を有する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインより高い蛋白質。【選択図】  図３（ｂ）
2005229957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、10位のアミノ酸、34位のアミノ酸、47位のアミノ酸及び59位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡへの結合能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインよりも高いタンパク質
【請求項２】
(a)のタンパク質が以下の(ia)〜(via)のいずれかのタンパク質である請求項１記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(ia)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iia)配列番号２のアミノ酸配列において、34位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iiia)配列番号２のアミノ酸配列において、47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iva)配列番号２のアミノ酸配列において、59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(va)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(via)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換及び47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項３記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を採取することを含むＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
【請求項８】
請求項１記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質又はその塩。
【請求項９】
請求項１又は８記載のタンパク質とＤＮＡとの複合体。
【請求項１０】
配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換、７番目のGからCへの置換及び9番目のTからGへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項１１】
以下の(ib)〜(iiib)のいずれかのＤＮＡである請求項１０記載のＤＮＡ。
(ib) 配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
(iib) 配列番号１７の塩基配列において、７番目のGからCへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
(iiib) 配列番号１７の塩基配列において、9番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質がテロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができると判定することを含む、テロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができる物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析する請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テロメアタンパク質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質、テロメアＤＮＡ変異体及びＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインと二重らせんＤＮＡとの複合体構造の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の染色体末端はテロメアと呼ばれGG配列に富んだ繰り返しDNAとタンパク質から構成されている。哺乳類のテロメア末端はテロメアDNA結合タンパク質TRF1及びTRF2とそれらと相互作用するタンパク質などで構成されており、2本鎖DNA損傷末端の監視機構からの認識を免れている（非特許文献１〜３）。最近、テロメアタンパク質TRF2が機能的テロメア構造を形成するうえで、重要な役割を担っていることを裏付ける報告が数多く提示されてきた。TRF2は全長500個のアミノ酸からなり、N末には420残基からなる２量体形成ドメイン、C末には60残基からなるDNA結合ドメインが存在する。相同性の高いテロメアDNA結合タンパク質TRF1は439アミノ酸からなり同様にN末側に2量体形成ドメイン、C末にDNA結合ドメインが存在し、各ドメインの相同性は非常に高いが、2量体形成ドメインの前の約50アミノ酸がTRF2では塩基性アミノ酸に富んでいるのに対し、TRF1では酸性アミノ酸に富んでいる（非特許文献２〜５）。このTRF1,TRF2のDNA結合ドメインは同じDNA配列(TTAGGGのタンデムなリピート配列)を認識する。しかし、in vitroでTRF1は2本鎖DNA配列を認識し、DNAを折り曲げるのに対し（非特許文献４、６及び７）、TRF2は2本鎖DNAと3’突出末端の接合部位に優先的に結合しt-loop構造をとらせる（非特許文献８）。t-loopとは3’突出末端が内側の2本鎖部分のテロメア配列に入り込んで、その反対側のテロメア配列と2本鎖を形成することによって、作られるループ構造でありt-loop内ではその接合部位にTRF2が結合している（非特許文献９）。このTRF2のテロメアDNAへの結合を阻害するだけで、染色体の不安定性ならびにp16/RB系を介した老化やATM/p53系を介したアポトーシスによる細胞死を誘導する（非特許文献１０〜１３）。つまりTRF1とTRF2へのDNA結合様式には大きな違いがあり、テロメア結合分子は単にテロメア配列に結合するのではなく、テロメア末端の3次元的な構造変化を引き起こすことによって機能的なテロメア構造を形成しているのではないかと考えられている（非特許文献９）。DNA結合タンパク質であるTRF1とTRF2のDNA結合ドメインの相同性は約60％と高く、同じ配列を認識している。その配列は癌原遺伝子産物c-Myb（非特許文献１４、１５）のDNA結合ドメインの3つの各リピート配列との相同性が高いことが知られている。C-MybのDNA結合ドメインはR1,R2,R3と呼ばれる53残基からなるリピート配列から成っており、各リピートは3本ヘリックスから形成されている。TRF1のDNA結合ドメインは以前報告され、c-Myb同様3つのヘリックスから成っており3番目のヘリックスがDNAの主溝に深く入ることでDNAに結合する（非特許文献１６）。TRF2のDNA結合ドメインの配列はTRF1でのDNAの認識に関わるアミノ酸はほとんど保存されており、TRF1同様のDNAへの結合様式を取ると考えられる。このTRF2とDNAとの複合体の構造やその性質を調べ、TRF1との違いを調べることはテロメアの染色体末端の保護機構を調べる上で大変に重要である。
【非特許文献１】Bilaud, T., Brun, C., Ancelin, K., Koering, C.E., Laroche, T. & Gilson, E. Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein. Nat. Genet. 17, 236-239. (1997)
【非特許文献２】Broccoli, D., Smogorzewska, A., Chong, L. & de Lange, T. Human telomeres contain two distinct Myb-related proteins, TRF1 and TRF2. Nat. Genet. 17, 231-235. (1997)
【非特許文献３】Chong, L., van Steensel, B., Broccoli, D., Erdjument-Bromage, H., Hanish, J., Tempst, P. & de Lange, T. Ahuman telomeric protein. Science 270, 1663-1667. (1995)
【非特許文献４】Bianchi, A., Smith, S., Chong, L., Elias, P. & de Lange, T. TRF1 is adimer and bends telomeric DNA. EMBO J. 16, 1785-1794. (1997)
【非特許文献５】Smith, S. & de Lange, T. TRF1, a mammalian telomeric protein. Trends Genet. 13, 21-26. (1997)
【非特許文献６】Bianchi, A.M., Stansel, R.M., Fairall, L.D., Griffith, J.D., Rhodes, D. & de Lange, T. TRF1 binds a bipartite telomeric site with extreme spatial flexibility. EMBO J. 18, 5735-5744.(1999)
【非特許文献７】Griffith, J., Bianchi, A. & de Lange, T. TRF1 promotes parallel pairing of telomeric tracts in vitro. J. Mol. Biol. 278, 79-88. (1998)
【非特許文献８】Stansel, R.M., de Lange, T. & Griffith, J.D. T-loop assembly in vitro involves binding of TRF2 near the 3’ telomeric overhang. EMBO J. 20, E5532-E5540. (2001)
【非特許文献９】Griffith, J.D., Comenau, L., Rosenfield, S., Stansel, R.M., Bianch, A., Moss, H. & de Lange, T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97, 503-514. (1999)
【非特許文献１０】Karlseder, J., Smogorzewska, A. & de Lange, T. Senesecence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science 295, 2446-2449. (2002)
【非特許文献１１】van Steensel, B., Smogorzewska, A. & de Lange, T. TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusion. Cell 92, 401-413. (1998)
【非特許文献１２】Smogorzewska, A. & de Lange, T. Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells, EMBO J. 21, 4338-4348. (2002)
【非特許文献１３】Kalseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S. & de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science 283, 1321-1325. (1999)
【非特許文献１４】Gonda, T.J., Gough, N.M., Dunn, A.R. & de Blaquiere, J. Nucleotide sequence of cDNA clones of the murine myb proto-oncogene. EMBO J. 4, 2003-2008. (1985)
【非特許文献１５】Klempnauer, K.H. & Sippel, A.E. The highly conserved amino-terminal region of the protein encoded by the v-myb oncogene functions as a DNA-binding domain. EMBO J. 6, 2719-2725. (1987)
【非特許文献１６】Nishikawa, T., Okamura, H., Nagadoi, A., Konig, P., Rhodes, D. & Nishimura, Y. Solution structure of a telomere DNA complex of human TRF1. Strucure 9, 1237-1251. (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、テロメアタンパク質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインとテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体構造とその機能を解析することを目的とする。
【０００４】
また、本発明は、これらの解析結果により、ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能を調節できる薬剤のスクリーニングを可能とし、ＴＲＦ２をターゲットにした創薬に貢献することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、テロメアタンパク質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインとテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体構造をNMR法で決定した。以前に報告されているテロメアタンパク質ＴＲＦ１とテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体の構造（Nishikawa, T., Okamura, H., Nagadoi, A., Konig, P., Rhodes, D. & Nishimura, Y. Solution structure of a telomere DNA complex of human TRF1. Strucure 9, 1237-1251. (2001)）と比較して、ＴＲＦ２とＴＲＦ１の二重鎖ＤＮＡに対する認識様式を比較した。ＴＲＦ１とＴＲＦ２のアミノ酸は約40%(TRF1とTRF2の相同性はidentityで約60％ある。)異なっているが、構造比較の結果、ＴＲＦ２の４個のアミノ酸のみをＴＲＦ１型に置換することによって、ＴＲＦ２のＤＮＡ結合能をＴＲＦ１型に変換することに成功した。すなわち、ＴＲＦ２のテロメア二重らせんＤＮＡ結合能が野生型より非常に強い変異体を作製することができた。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００６】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  以下の(a)又は(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、10位のアミノ酸、34位のアミノ酸、47位のアミノ酸及び59位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡへの結合能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインよりも高いタンパク質
（２）  (a)のタンパク質が以下の(ia)〜(via)のいずれかのタンパク質である（１）記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩。
(ia)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iia)配列番号２のアミノ酸配列において、34位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iiia)配列番号２のアミノ酸配列において、47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(iva)配列番号２のアミノ酸配列において、59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(va)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(via)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換及び47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
（３）  （１）記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）  （３）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
（５）  （４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）  （３）記載のＤＮＡで形質転換した宿主を培養し、培養物からＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を採取することを含むＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質の製造方法。
（７）  （１）記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
（８）  （１）記載のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質又はその塩。
（９）  （１）又は（８）記載のタンパク質とＤＮＡとの複合体。
（１０）  配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換、７番目のGからCへの置換及び9番目のTからGへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ。
（１１）  以下の(ib)〜(iiib)のいずれかのＤＮＡである（１０）記載のＤＮＡ。
(ib) 配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
(iib) 配列番号１７の塩基配列において、７番目のGからCへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
(iiib) 配列番号１７の塩基配列において、9番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ
（１２）  配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質がテロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができると判定することを含む、テロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができる物質をスクリーニングする方法。
（１３）  5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析する（１２）記載の方法。
【０００７】
本明細書において、「ＴＲＦ２」とは、哺乳類のテロメア’TTAGGG’繰り返し配列に特異的に結合する500アミノ酸からなるタンパク質であり、N末端に塩基性領域、中央部に2量体形成ドメイン、C末端にDNA結合ドメインから構成されているものをいう。
【０００８】
「ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン」とは、TRF2のC末端部位にある約60アミノ酸からなる領域をいう。その領域のみでDNAへの結合が可能である。
【０００９】
「変異体タンパク質」とは、基準となるタンパク質と異なるが、基準となるタンパク質の不可欠な性質を保持しているタンパク質を意味する。典型的な変異体タンパク質は、基準となるタンパク質とアミノ酸配列が相違する。
【００１０】
5’-TTAGGG-3’は、哺乳類のテロメアDNAの二重鎖DNAの繰り返し配列であり、ここに特異的なタンパク質（例えば、出芽酵母のRap1、分裂酵母のTaz1p、コメのRTBP1、哺乳類で見つかっているTRF1およびTRF2）が結合する。5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡとしては、以下の配列を有するDNAを例示することができる。
tr13: 5’-GTTAGGGTTAGGG-3’（配列番号１７）／5’‐CCCATTCCCATTC‐3’（配列番号１８）
【００１１】
ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又はその変異体タンパク質の5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡへの結合能は、後述の実施例に示すような表面プラズマ共鳴により測定することができる。
【００１２】
「テロメアＤＮＡ」とは、脊椎動物の染色体末端のDNAはGに富んだ繰り返し配列とそのDNAに結合するタンパク質で構成されているテロメアと呼ばれる領域があるが、この繰り返しDNA配列がテロメアDNAである。
【００１３】
「抗体」とは、抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に誘導されるタンパク質で、免疫原（抗原）と特異的に結合する活性を有するものを意味し、これには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらには、Fab又はFabフラグメントなどが含まれる。
【００１４】
「相互作用」とは、２つ以上の物体（例えば、原子、分子）の間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などを例示することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ＴＲＦ２のテロメア二重らせんＤＮＡ結合能が野生型より非常に強い変異体が提供された。
【００１６】
また、本発明により、テロメアタンパク質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインとテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体構造とその機能が解析され、ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能を調節できる薬剤のスクリーニングが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質
本発明は、以下の(a)又は(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩を提供する。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、10位のアミノ酸、34位のアミノ酸、47位のアミノ酸及び59位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡへの結合能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインよりも高いタンパク質
(a)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質としては、以下の(ia)〜(via)のタンパク質を例示することができる。
(ia)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(iia)配列番号２のアミノ酸配列において、34位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(iiia)配列番号２のアミノ酸配列において、47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(iva)配列番号２のアミノ酸配列において、59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(va)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(via)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換及び47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１８】
(ia)のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１９】
(iia) のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２０】
(iiia) のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００２１】
(iva) のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００２２】
(va) のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００２３】
(via) のタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
【００２４】
(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質としては、ヒト以外の生物（例えば、酵母、コメ、脊椎動物など）に由来する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインの変異体、配列番号４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列のN末端（すなわち、1位）にメチオニンが付加したアミノ酸配列を有するタンパク質などを例示することができる。
【００２５】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質は、ヒト由来の野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインの変異体であっても、ヒト以外の生物（例えば、酵母、コメ、脊椎動物など）由来の野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインの変異体であってもよい。
【００２６】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、公知の方法によって製造することができる。例えば、後述の２に記載のようにして、ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００２７】
あるいはまた、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００２８】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質は公知の方法により塩の形で得ることもできる。
【００２９】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質の塩は、薬理学的に許容される塩であるとよく、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。
【００３０】
２．ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡ
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号３、５、７、９、１１又は１３のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡを例示することができる。
【００３１】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下のようにして製造することができる。
【００３２】
健常なヒトのHela細胞からmRNAを抽出し、逆転写酵素およびオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成する。ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインを含む領域（63残基）をPCRによって増幅する。得られたPCR産物が野生型hTRF2のDNA結合ドメインを含む領域をコードするＤＮＡである。野生型hTRF2のDNA結合ドメインを含む領域のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配の一例をそれぞれ配列番号２及び１に示す。
【００３３】
hTRF2のDNA結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡは、hTRF2のDNA結合ドメインのコード領域（63残基）を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させたhTRF2のDNA結合ドメインのコード領域（63残基）をPCRによって増幅する。得られたPCR産物がhTRF2のDNA結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡである。配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号３に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、34位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号５に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号７に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号９に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１１に示す。配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換及び47位のアラニンからセリンへの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例を配列番号１３に示す。
【００３４】
３．組換えベクター
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターは、公知の方法（例えば、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入することにより得られる。
【００３５】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫病原ウイルスなどを用いることができる。
【００３６】
発現ベクターには、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
【００３７】
また、発現ベクターは、融合タンパク質発現ベクターであってもよい。種々の融合タンパク質発現ベクターが市販されており、pGEXシリーズ（アマシャムファルマシアバイオテク社）、pET CBD Fusion System 34b-38b（Novagen社）、pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b（Novagen社）、pET GST Fusion System 41 and 42（Novagen社）などを例示することができる。
【００３８】
４．形質転換体
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
【００３９】
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、真菌細胞（例えば、酵母、アスペルギルスなど）、昆虫細胞（例えば、S2細胞、Sf細胞など）、動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
【００４０】
組換えベクターを宿主に導入するには、Molecular Cloning２nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、トランスベクション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクロトポレーション法、形質導入法、スクレープローディング法、ショットガン法など）または感染により行うことができる。
【００４１】
形質転換体を培地で培養し、培養物からＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を採取することができる。ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回収し、その培地からＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を溶解し、その溶解物からＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。
【００４２】
ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タンパク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、FactorXaや酵素（エンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目的とするＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を得ることができる。
【００４３】
ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００４４】
５．抗体
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩の検出及び／又は定量に利用することができる。
【００４５】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩またはそのエピトープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
【００４６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体のいずれであってもよい。
【００４７】
ポリクローナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、動物に投与（免疫）を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法（例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
【００４８】
モノクローナル抗体は、Nature (1975) 256: 495、Science (1980) 208: 692-に記載されている、G. Koehler及びC. Milsteinのハイブリドーマ法により作製することができる。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。さらに、インターロイキン−１８変異体タンパク質又はその塩と特異的に反応するが、他の抗原タンパク質とは実質的に交差反応しない抗体を産生する細胞系を単離するとよい。この細胞系を培養し、培養物から所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクローナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４９】
一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第4,946,778号に記載されている。
【００５０】
ヒト化抗体を作製する技法は、Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 169-, 1992に記載されている。
【００５１】
６．ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩の用途
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、ＴＲＦ２が関与する事象（例えば、癌、老化、アポトーシスなど）の制御に利用することができる。ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能をなくすと、老化やアポトーシスが起こることがわかっているKarlseder, J., Smogorzewska, A. & de Lange, T. Senesecence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science 295, 2446-2449. (2002); Smogorzewska, A. & de Lange, T. Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells, EMBO J. 21, 4338-4348. (2002); Kalseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S. & de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science 283, 1321-1325. (1999))ので、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩を利用して、老化やアポトーシスを防止できると考えられる。
【００５２】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩を被験体に投与する場合には、ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又はその塩を、単独で、あるいは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに、適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００５３】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質及びその塩は、疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、実験用の試薬として利用することができる。
【００５４】
７．ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質
また、本発明は、上記のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩を提供する。ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質としては、野生型ＴＲＦ２において、ＤＮＡ結合ドメイン領域が本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質に置換されたものを例示することができる。野生型ヒトＴＲＦ２の塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５及び１６に示す。配列番号１６のアミノ酸配列において、1位から45位までがＮ末の塩基性ドメイン、46位から245位までが中央のTRF特異的／二量化ドメイン、438位から500位までがＤＮＡ結合ドメインである。配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１６のアミノ酸配列における438位のグルタミン酸から500位のアスパラギンまでの断片である。配列番号２のアミノ酸配列における10,34,47及び59位のアミノ酸部位は、それぞれ、配列番号１６のアミノ酸配列における447,471,484及び496位のアミノ酸部位に相当する。
【００５５】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩は、公知の方法によって製造することができる。例えば、ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質をコードするＤＮＡを得、得られたＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質を製造することができる（例えば、西郷薫、佐野弓子共訳、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳコンパクト版、分子生物学実験プロトコール、Ｉ、II、III、丸善株式会社：原著、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００５６】
あるいはまた、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
【００５７】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質は公知の方法により塩の形で得ることもできる。
【００５８】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質の塩は、薬理学的に許容される塩であるとよく、特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例示することができる。
【００５９】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩は、ＴＲＦ２が関与する事象（例えば、癌、老化、アポトーシスなど）の制御に利用することができる。ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能をなくすと、老化やアポトーシスが起こることがわかっているKarlseder, J., Smogorzewska, A. & de Lange, T. Senesecence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science 295, 2446-2449. (2002); Smogorzewska, A. & de Lange, T. Different telomere damage signaling pathways in human and mouse cells, EMBO J. 21, 4338-4348. (2002); Kalseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S. & de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. Science 283, 1321-1325. (1999))ので、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩を利用して、老化やアポトーシスを防止できると考えられる。
【００６０】
タンパク質の投与法は上記の通りである。
【００６１】
本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質及びその塩は、疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、実験用の試薬として利用することができる。
【００６２】
８．テロメアＤＮＡ変異体
本発明は、配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換、７番目のGからCへの置換及び9番目のTからGへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ（以下、「テロメアＤＮＡ変異体」と記すこともある。）を提供する。
【００６３】
本発明のテロメアＤＮＡ変異体としては、以下の(ib)〜(iiib)のＤＮＡを例示することができる。
(ib) 配列番号１７の塩基配列において、3番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ。
(iib) 配列番号１７の塩基配列において、７番目のGからCへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ。
(iiib) 配列番号１７の塩基配列において、9番目のTからGへの置換がなされている塩基配列を有するＤＮＡ。
【００６４】
(ib)のＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に示す。
【００６５】
(iib)のＤＮＡの塩基配列を配列番号２０に示す。
【００６６】
(iiib)のＤＮＡの塩基配列を配列番号２１に示す。
【００６７】
本発明のテロメアＤＮＡ変異体は、一本鎖であっても、二本鎖であっても、一部が一本鎖で残りの部分が二本鎖であるものであってもよいが、テロメアDNAの二重鎖DNAの繰り返し配列に特異的なタンパク質（すなわち、テロメアタンパク質）との結合性の点からは、二本鎖であることが好ましい。
【００６８】
本発明のテロメアＤＮＡ変異体は公知の方法で合成することができる。例えば、市販のＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。
【００６９】
本発明のテロメアＤＮＡ変異体は、後述の実施例に示すように、テロメアタンパク質（例えば、TRF1、TRF2など)の機能解析に利用することができる。また、本発明のテロメアＤＮＡ変異体は、テロメアタンパク質（例えば、TRF1、TRF2など）が関与する事象（例えば、癌、老化、アポトーシスなど）の制御に利用することができると考えられる。
【００７０】
本発明のテロメアＤＮＡ変異体は、疾患の予防及び／又は治療を目的とする医薬品として、あるいは、実験用の試薬として利用することができる。
【００７１】
９．ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又は該変異体タンパク質を含むタンパク質とＤＮＡとの複合体
本発明は、上記のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又は該変異体タンパク質を含むタンパク質とＤＮＡとの複合体を提供する。
【００７２】
本発明の複合体を形成するタンパク質は、以下の(a)若しくは(b)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又は該変異体タンパク質を含むタンパク質である。
(a)配列番号２のアミノ酸配列において、10位のリシンからアルギニンへの置換、34位のアラニンからセリンへの置換、47位のアラニンからセリンへの置換及び59位のアルギニンからリシンへの置換からなる群より選択される少なくとも１つの置換がなされているアミノ酸配列を有するタンパク質。
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、10位のアミノ酸、34位のアミノ酸、47位のアミノ酸及び59位のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡへの結合能が配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインよりも高いタンパク質。
【００７３】
(a)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質としては、配列番号４、６、８、１０、１２及び１４のアミノ酸配列を有するタンパク質を例示することができる。
【００７４】
(a)のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質を含むタンパク質としては、野生型ＴＲＦ２において、ＤＮＡ結合ドメイン領域が配列番号４、６、８、１０、１２又は１４のアミノ酸配列を有するタンパク質に置換されたものを例示することができる。野生型ヒトＴＲＦ２のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。配列番号１６のアミノ酸配列において、Glu438からAsn500までがＤＮＡ結合ドメイン領域である。
【００７５】
本発明の複合体を形成するＤＮＡとしては、5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡを挙げることができる。5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡとしては、以下の配列を有するDNAを例示することができる。
tr13: 5’-GTTAGGGTTAGGG-3’（配列番号１７）／5’‐CCCATTCCCATTC‐3’（配列番号１８）
【００７６】
本発明の複合体を形成するには以下のようにするとよい。
DNA及びタンパク質は50mM以上の塩濃度、pH6.0〜8.0の溶液中で30℃以下の温度で混合する。混合においてDNAに対しタンパク質を加えるようにし、タンパク質のモル比がDNAのモル比を超えないようにする。また、塩濃度を落としたいときは上記の条件で複合体を形成させたのち透析で溶液の交換をする。
【００７７】
複合体の形成はBiacore(Biamolecular Interaction Analysis Core technology)装置（Biacore社）により確認することができる。例えば、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又は該変異体タンパク質を含むタンパク質をセンサーチップ上に固定した後に、このセンサーチップ上で、ＤＮＡと接触させるとよい。あるいは、ＤＮＡをセンサーチップ上に固定した後に、このセンサーチップ上で、本発明のＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン変異体タンパク質又は該変異体タンパク質を含むタンパク質と接触させてもよい。２分子間の結合、解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化をSPR(Surface Plasmon Resonance)シグナルとして検出し、このシグナルの経時変化をSensorgramと呼ぶグラフとして表示させ、これを解析ソフトで解析することにより、ＫＤ値を求めることができる。ＫＤ値が、１０−４以下、好ましくは１０−５以下、より好ましくは１０−６以下であれば、タンパク質とＤＮＡが特異的な結合をしている、すなわち、複合体を形成していると言える。
【００７８】
１０．スクリーニング方法
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析し、相互作用する場合には、被験物質がテロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができると判定することを含む、テロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができる物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法において、5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡの存在下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析してもよい。5’-TTAGGG-3’で表される配列を含む二重らせんＤＮＡとしては、以下の配列を有するDNAを例示することができる。
tr13: 5’-GTTAGGGTTAGGG-3’（配列番号１７）／5’‐CCCATTCCCATTC‐3’（配列番号１８）
【００７９】
配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメイン又は該ドメインを含むタンパク質が、10位のリシン、34位のアラニン、47位のアラニン及び59位のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸部位で、被験物質と相互作用するか否かを解析するには、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複合体の形状を観察する方法やｍ配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインの立体構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシュミレートするドッキングスタディなどの手法、本発明者らがこの明細書において開示するヒトＴＲＦ２の立体構造との類似性に基づく判断を用いることができる。
【００８０】
テロメアＤＮＡとＴＲＦ２の結合を制御することができる物質は、細胞の老化を進めたりあるいは逆に遅らせたりする活性、細胞のがん化を遅らせる活性、がん細胞の細胞死を進めるような生理活性を持ちうる。従って、本発明のスクリーニング方法により、テロメアＤＮＡとＴＲＦ２との結合を制御することができると判定された物質は、抗がん剤、細胞老化抑制剤、細胞老化促進剤等に利用することができる。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８２】
『結果及び考察』
構造計算
hTRF2のDNA結合ドメインを含む領域 （hTRF2DBD：N末端にMetが付加したGlu438からAsn500）とDNAとの複合体の構造をNMRを用いて決定した。目的タンパク質hTRF2DBDは大腸菌大量発現系により15Nまたは15N/13Cラベルしたサンプルを作成した。また、複合体に用いたDNAは以前報告されているhTRF1とDNAとの複合体の構造決定に用いられた配列tr13：5’-GTTAGGGTTAGGG-3’を用いた。フリーと複合体の構造ではそれぞれ910と1412のNOEsを強度により4つの範囲(1.8-3.0、2.3-4.0、2.3-5.0、2.3-6.0)にそれぞれ分けた。角度制限は3JHNα＜5.5Hzに対して-90°＜φ＜-40°、3JHNα＞8.5Hzに対して-160°＜φ＜‐80°にした。フリーの構造は距離制限が0.3 オングストローム以下、角度制限が5°以下を満たし、構造的に矛盾のない構造からもっともエネルギーの低い25個の構造を選んだ。また、複合体の計算ではDNAの制限としてWatson‐Crickの塩基間の水素結合の制限がGC塩基間でrG(N1)-C(N3) = 2.95±0.2オングストローム, rG(N2)-C(O2) = 2.86±0.2オングストローム, rG(O6)-C(N4) = 2.91±0.2オングストローム及びTA塩基間でrA(N6)-T(O4) = 2.95±0.2オングストローム, and rA(N1)-T(N3) = 2.82±0.2オングストロームにし、角度制限としてA型及びB型のDNAを満たす範囲でα = -65±50°, β = 180±50°, γ = 60±50°, ε = 180±50°, ζ = -85±50°にした。以上の条件を用いてCNS(crystallography and NMR system;Yale University)で構造計算を行なった。複合体の計算では最初にhTRF2DBDだけのNOEを用いて計算を行い、条件を満たす200個の構造を決定した。次に200個の構造に対し、典型的なB型DNAをタンパクから50 オングストロームの距離に異なった方向に置き、全ての制限を用いて計算を行った。最後に距離制限が0.3 オングストローム以下、角度制限が5°以下を満たし、構造的に矛盾のない構造を20個選んだ。
【００８３】
hTRF2のDNA結合ドメインの構造
決定されたhTRF2のDNA結合ドメインを含むN末端にMetが付加したGlu438からAsn500まで(hTRF2DBD)の25個の構造をFig2(a)に示した。hTRF2DBDの平均座標に対する個々のrmsdはbackboneで0.34±0.05オングストローム、 All heavy atomsで0.82±0.06オングストローム、だった。hTRF1の構造とはヘリックス間のループに若干の違いが見られるだけで基本構造はほとんど同じであり、Trp450、Val458、Leu462、Trp470、Leu474、Phe479、Ile487、Trp491、Met494が主な分子内に疎水性のコアをつくりタンパク質の構造を安定化していた。また、疎水性のコアのほかにGlu453とArg482、Ser454とArg490が架橋をつくり構造の安定化に寄与している。この構造は今まで知られている典型的なMyb構造である。
【００８４】
hTRF2DBDとDNAの複合体の構造
複合体の構造解析に用いたDNAは以前報告されたhTRF1とDNAとの複合体の構造に使用されたtr13：5’‐GTTAGGGTTAGGG‐3’／5’‐CCCATTCCCATTC‐3’を使用した。まず、hTRF1同様tr13にhTRF2が結合できるか確認するためNMRによる滴定実験を行なった。DNAに対してタンパクを加えていったところhTRF1同様1:1でhTRF2DBDが結合することがわかった。そこでDNAとタンパクの比を1:1になるように試料を調整しNMRにより、20個の複合体の構造を決定した(Fig2(b))。hTRF2DBDとtr13の複合体の構造は平均座標に対する個々の構造のrmsdはbackboneで0.51±0.11 オングストローム 、All heavy atoms で0.68±0..09であった。複合体内のタンパクの構造はフリーの構造に対して構造変化はなく、またDNAもbendingなどの変化はなかった。
【００８５】
複合体におけるDNAの認識
複合体におけるhTRF2DBDのDNAの認識の模式図はFig3(a)に示した。hTRF2DBDはDNAに主溝に対し三番目のヘリックスが深くはまり、Asp489がC7’、C8’をLys488がA4またはG5を認識している。また、Ala484、Val485とT3のメチル基が疎水的な相互作用をしている。またMet486とVal485のメチル基がArg489のメチレン基とC7’、C8’の塩基とC7’の糖鎖で疎水性の相互作用がある。その他にThr493のメチル基がA5’の糖鎖と疎水的な相互作用も確認できた。副溝においてはLys447がT9またはA6’を認識している。また、塩基への直接的な認識の他にTrp450、Trp470、Ala471、Lys488、Arg490、Arg492がDNAのリン酸骨格を認識することでDNAとの相互作用を可能にしている。このようなDNAへの認識機構は今まで報告されているホメオドメインやhTRF1との複合体などで見られる。特にhTRF1とは同様のDNA配列を認識し、またDNA結合ドメインの構造もほとんどかわらず、その結合様式が同じであることが確認できた(Fig3(b))。
【００８６】
hTRF1とhTRF2のDNAへの認識の違い。
hTRF1(Arg378−Leu430)とhTRF2(Thr445‐Leu497)のDNA結合ドメイン領域での相同性はidentityで約59％,similarityで約70％で大変に高い。また、決定された   hTRF1及びhTRF2のDNAへの複合体から、DNAへの認識に関与しているアミノ酸はわずか４残基であり、hTRF2においてLys447、Ala471、Ala484、Arg496である。しかし、この４残基の違いによって、DNAへの主な認識様式の変化はなく、この4残基以外のアミノ酸のDNAへの認識はhTRF1と全く同じであった。この4残基はhTRF1ではそれぞれArg380、Ser404、Ser417、Lys429である。hTRF2ではLys447はDNAの副溝に入りT9を認識している。hTRF1のArg380も同様にT9を認識しているが、他にA6’も同時に認識している。また、hTRF2のAla471の主鎖のNHはT3のリン酸を認識している。またAla484の側鎖のメチル基はT3のメチル基と疎水性の相互作用をしている。hTRF1ではこの2つの残基はSerに変わっており、Ala471に相当するSer404の主鎖の認識は同じであるが、側鎖もリン酸基への認識をしており、Ser417でもAla484同様に疎水性の相互作用のほかにリン酸基への認識が確認できた(Fig.5)。また、Arg496はhTRF2ではDNAへの相互作用に関与しておらず、hTRF1のLys429はT4’のリン酸基を認識しているが、認識している構造は半分にも満たないことからDNAの認識ほとんど寄与してないのではないかと考えられる。hTRF2はhTRF1と4つのアミノ酸に違いがあることで若干、水素結合の数が少ない。このことからhTRF2はhTRF1よりも親和性が弱いことが予想される。
【００８７】
DNAへのaffinity解析
DNA認識においてhTRF1と違う4つのアミノ酸に対してhTRF1と同じになるように変異体を作成し、wild typeとの違いを調べた。変異体はK447R、A471S、A484S、K496R、qm(K447R、A471S、A484S、K496R)、dm(A471S、A484S)の6つを作成した。まず、この変異体に対しNMRでtr13に対する滴定実験を行なった。各変異体に対する滴定実験のDNAのイミドプロトンのスペクトルの結果とwild typeとの化学シフトの差をFig6に示した。K447RではG7,T8,T9に大きな変化が見られた。このことから、副溝に入るLys447をArgに変えることでT9以外にもA6’も認識していると考えらる。この違いが実際DNAへの親和性にどのような違いがあるか調べるためにaffinity実験を表面プラズマ共鳴(Surface plasmon resonance;SPR)を使って行なった。
まず、hTRF2WTのtr13(5’-GTTAGGGTTAGGG-3’)への解離定数(KD)は10mM  HEPES-KOH pH6.8,3mMEDTA,180mMKCl,0.003%(v/v)X-100の条件ではKD=(7.48±0.21)×10-7Mであった。次に特異的認識に使われている塩基を変えた３つのDNA；T3→G3(T3G)、G7→C7(G7C)、T9→G9(T9G)についても同様の実験を行なった。その結果T3G；KD=(5.94±0.24)×10-6M、G7C；KD＝(5.33±0.88)×10-5M、T9G；KD=(1.10±0.06)×10-4Mであった(表２)。T9GのKD値がtr13に比べ100倍以上、大きいことから、特に重要な塩基であることがわかる。また同様の実験をhTRF2の各変異体を使って同条件で行なったところ、R496Kを除く変異体はWTに比べ親和性が上がった。特に4つの変異を入れたqmはWTに比べ約4倍(qm；KD=(1.96±0.09)×10-7M)も親和性が高い。また各変異体ではK447R；KD＝(2.97±0.18)×10-7M、A471S；KD=(4.82±0.20)×10-7M、A484S；KD＝(5.50±0.17)×10-7M、R496K；KD＝(7.64±0.21)×10-7Mであり、T9を認識するK447Rの親和性が他の変異体に比べて高いことがわかる。このことからN末端の副溝に対する認識がDNA結合ドメインのDNAへの親和性に大きく寄与しており、hTRF2がLysで認識していることでhTRF1よりもDNAへの親和性が低いことがわかる。また、T3G、G7C、T9Gに対しても同様な実験を行なったところT3Gはtr13に比べ相対的にKDが約7倍、T9Gは約100倍高くなっている。しかし、G7Cではqmに比べK447Rの方がKD値が低くなるなど、T3GやT9Gと各変異体との親和性の傾向が異なっている。G7CではC7’がGに変わっており、C7’を認識するAsp489がDNAを認識できなくなっているため主溝内での特異的な認識ができなくなっており、DNAへの認識が非特異的になっていると思われる。T9Gへの親和性はG7Cに比べ10倍も弱いが各変異とDNAのKD値の違いはtr13、T3Gと相対的に同じ傾向を示しており、主溝と認識ヘリックスとの結合様式は変わらず、単純に親和性だけが極めて大きく落ちていると思われる。このことからもN末端の副溝への認識がDNAへの親和性に大きな影響を与えていることが示された。
また同様の実験をhTRF1についても同条件でおこなった。hTRF1はtr13への解離定数はKD=(1.86±0.06)×10-7Mで、ほとんどqmと同じ値を示した。
【００８８】
ホメオドメインとの比較
ホメオドメインはMybドメイン同様3本のヘリックスからなっており、第2、第3ヘリックスがヘリックス・ターン・ヘリックス(HTH)を形成し、三番目のヘリックスが認識ヘリックスとしてDNAの主溝に深く入って塩基を認識する。一般的に1つのDNA結合モチーフが認識できる配列は約4~5塩基対であるが、c-MybやscRap1pのように認識モチーフをもったサブドメインが複数存在し、それらが強調してDNAを認識するものや、分子間でホモダイマーやヘテロダイマーを形成してDNAを認識することで、識別できる塩基配列の長さが広がり、その結果タンパク質がDNAと相互作用できる範囲が大きくなりDNAに対する親和性が増加すると同時に塩基配列の選択性がより高くなる。しかし、ホメオドメインのいくつかはHTHモチーフのほかにN末端やC末端のアームも塩基の認識に関与しているため、認識範囲が約7〜10塩基対にわたり、DNAとの接触面も広く、1つのドメインのみでDNAに結合できる。hTRF1やhTRF2はダイマーでDNAに結合するが、DNA結合タンパク質間の相互作用はなく1つのDNA結合ドメイン単独でDNAに結合できる。これはホメオドメイン同様にN末端のアームがDNAの副溝を認識することで可能になっている。DNAとの複合体で構造が決定されているホメオドメインは、ほとんどの場合Argが副溝のTA塩基を認識している。MATa1ではLysが認識しているが、MATa1とMATα2はDNAとヘテロダイマーを形成し、DNAの同じ側から隣り合った主溝に、認識ヘリックスが同じ方向を向くように結合することから、1つのDNA結合モチーフ単独での結合ではない。Lysに比べArgが副溝のATに富んだ配列に対して認識すると、その近辺の塩基やリン酸基も同時に認識できるので高い親和性でDNAを認識できる。また、複合体での構造解析がなされていないホメオドメインでも5番目のArgはよく保存されていることから、副溝への認識にArgが使われるのがLysよりも優位だと考えられる。NMRやSPRの結果からhTRF2は副溝をLysで認識するためにhTRF1よりもDNAに対して親和性が弱いことがわかる。それに加えてAla471やAla484での相互作用はhTRF1に比べて水素結合の数も少ないので、hTRF1よりもDNAに対して解離しやすくなっている。
【００８９】
Biological  Implication
hTRF1とhTRF2はC末端にMybドメインが存在し、ホモ2量体でDNAに結合する。しかし、Mybドメイン同士が協同的に結合するのではなく、１つのMybドメイン単独で結合する。そのhTRF1とhTRF2のMybドメインの相同性は非常に高く、今回の構造解析の結果hTRF1とhTRF2のDNAへの認識はほとんど変わらないことがわかった。しかし、ホモ2量体のhTRF1の2つのＭｙｂドメインは近隣のテロメア配列に結合するだけではなく、離れたテロメア配列に結合しＤＮＡを曲げることがin  vitoroで報告されている。hTRF2にはそのような結合様式はない。hTRF2は3’突出末端の1番最初にTTAGGGの配列が1つでもあれば2本鎖と1本鎖の結合部位にある2本鎖側に結合しやすくなることが報告されている。また、t-loop構造内ではD-loopにTRF2は結合することも報告されている。hTRF2のMybドメインは今回の解析の結果、hTRF1同様に3’突出末端の近傍以外の大部分を占める2本鎖のテロメア配列に結合できるはずである。しかし、hTRF2の結合部位が3’突出末端に偏っていることから、1度、hTRF1同様に2本鎖テロメア配列に結合したhTRF2はhRap1やMre11  complexなどのhTRF2に相互作用する他のタンパク質や、または1本鎖DNAの影響で、3’突出末端近傍に集められ、その後t-loopの形成など機能するのではないかと考えられる。そのためにはhTRF1のように強い親和性でDNAに結合するのではなく、弱い親和性でDNAに結合したほうが、テロメア配列間を動くのに有利に働くのではないかと思える。
【００９０】
『実験手順』
タンパク質及びDNAの調製
TRF2全長のDNAをコードするプラスミドに対し40塩基からなるTRF2-DBDをコードするDNAのプライマーを5’側、3’側を用意し、PCR方によりTRF2−DBD部位をコードするDNAを増幅した。増幅したDNAをNdeI、EcoRIで制限酵素処理し、pET23bベクターに対しライゲーションし、得られたベクターを大腸菌BL21（DE3）にトランスフォームした。
また、上記の2種類のプライマーのほかに変異体部位のアミノ酸をコードしたプライマーを5’側、3’側を用意した。変異体部位に対し5’側と3’側の2つを別々にPCR方で増幅した。得られた2本のDNAとTRF2-DBD部位の5’側と3’側のプライマーを混ぜPCRで増幅することで変異体をコードしたTRF2-DBD(変異体)のDNAが得られる。得られたDNAに対しTRF2-DBD同様に制限酵素、ライゲーション処理を行なって発現ベクターを得た。得られたベクターはBL21(DE3)にトランスフォームした。
変異体作成に使用したプライマーの配列を以下に示す。上段が5'側、下段が3'側である。K447Rは5'側のみ、R496Kは3'側のみである。
TRF2DBD
5’-ggtctcgcatatggaagacagtacaaccaatataac-3’（配列番号２２）
5'-gcgggaattctcagttcatgccaagtcttttc-3'（配列番号２３）
TRF2DBD(A471S)
5’-ggaaactggtctgccatttctaaaaat-3’ （配列番号２４）
5’-agaaatggcagaccagtttccttcccc-3’ （配列番号２５）
TRF2DBD(A483S)
5’-aaccgaacatctgtgatgattaaggat-3’ （配列番号２６）
5’-aatcatcacagatgttcggttaacaaa-3’ （配列番号２７）
TRF2DBD(K447R)
5’-ggtctcgcatatggaagacagtacaaccaatataacaaaaaggcagaagtgg-3’ （配列番号２８）
TRF2DBD(R496K)
5’-ggaattctcagttcatgccaagttttttcatggtccg-5’ （配列番号２９）
TRF2のDNA結合ドメイン（hTRF2-DBD：N末端にMetが付加したGlu438からAsn500までのアミノ酸配列）及び各変異体を大腸菌BL21(DE3)株(Novagen)においてpET23bベクターを用いて過剰発現させた。細胞を37℃で培養した。OD600が0.5〜0.6に達したとき、1mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG)を添加して、25℃でタンパク質発現を誘導した。さらに３時間培養した後、細胞を回収し、バッファー（50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、5mM EDTA、100mM NaCl）中に再懸濁した。同位体標識のため、15NH4Cl(0.15%)及び／又は[13C]-グルコース(0.2%)を含有するM9最小培地を用いた。TRF2-DBDを以下の精製手順で精製した。細胞を氷上で超音波処理にて溶解した後、遠心(39,000g)した。上清をバッファー（50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、5mM EDTA、100mM NaCl)で平衡化したリン酸セルロース(p11, Whatman)カラムにロードし、150mM、200mM及び250mM NaClで段階的に溶出した。目的のタンパク質を含有する画分を回収し、3kDaカットオフ膜を有するcentriprep (Amicon)又はVivaspin (VIVASCIENCE)を用いて濃縮し、体積を2mL以下にした。このサンプルをバッファー（50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、5mM EDTA、300mM KCl)で平衡化したゲル濾過カラム(Superdex 30; Pharmacia)にアプライした。サンプルの同定と純度はMALDI-TOF質量分析法及び電気泳動により行った。
本実施例で用いるオリゴヌクレオチドフラグメント(5’-GTTAGGGTTAGGG-3’)（配列番号１７）はBex Co. Ltd（日本）から購入した。二重らせんの各鎖はバッファー（50mMリン酸カリウム(pH7.0)、1mM EDTA、150mM KCl)中で当モル比で混合し、95℃から室温までゆっくりと冷却することによりアニールした。このサンプルをバッファー（50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、5mM EDTA、300mM KCl)で平衡化したゲル濾過カラム(Superdex 30; Pharmacia)にアプライした。
凝集を避けるために、タンパク質とDNAの両方を50mMリン酸カリウム(pH7.0)、150mMKClに溶解し、当モル比になるまで、タンパク質を徐々にDNA溶液に添加することにより複合体を形成した。サンプルを10%D2O(v/v)中で5mMリン酸カリウム(pH6.9)で透析した。
【００９１】
NMR分析法
10%(v/v)又は100%D2Oを含有する5mMリン酸カリウムバッファー（pH6.9）中の1.0-1.5mMのTRF2-DBD-DNA複合体をNMR実験に用いた。NMR実験は303KでBruker DMX-600及び-800上で行った。タンパク質の主鎖のアサイメントは3D HN(CO)CA, 3D HNCA, 3D HNCO (Grzesiek, S. & Bax, A. Improved three-dimensional triple resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J.Magn. Reson. 96, 432-440. (1992a))、3DHN（CA）CO，3D CBCANH及び3D CBCA(CO)NH (Grzesiek S and Bax A (1992b) Correlating backbone amide and side-chain resonances in larger proteins by multiple relayed triple resonance NMR. J. Am. Chem. Soc. 114, 6291-6293.）から得た。タンパク質側鎖のアサイメントは、3D HBHA(CO)NH(1992b), 3D HCCH-TOCSY（Kay LE, Xu G-Y, Singer AU, Muhandiram DR and Forman-Kay JD (1993) A gradient-enhanced HCCH-TOCSY experiment for recording side-chain 1H and 13C correlations in H2O sample of protein. J. Magn. Reson. B., 101, 333-337.）, 3D HCCH-COSY, 3D 15N-edited NOESY, 及び3D 15N-edite TOCSY 実験から得た。主鎖の二面角Φ制限に対する3JHNα結合定数は3D HNHA(Vuister GW and Bax A (1993) Quantitative J correlation: a new approach for measuring homonuclear three bond J-(HN-Hα) coupling constants in 15N-enriched protein. J. Am. Chem. Soc., 115, 7772-7777.)実験により測定した。
DNA共鳴のアサイメント及び分子内距離制限は2D NOESY, 2D TOCSY, 及び13C 又は13C/15N filtered pulse scheme付き2D DQF-COSY (Ogura K, Terasawa H and Inagaki F (1996) An improved double-tuned and isotope-filtered pulse scheme based on a pulse field gradient and a wide-band inversion shaped pulse. J. Biomol. NMR, 8, 492-498.)から得た。分子間距離制限は、3D 13C-edited(F1), 13C-filtered(F3) NOESY 実験及び3D 15N-edited(F2), 15N/13C-filtered(F3) NOESY 実験(Ogura K, Terasawa H and Inagaki F (1996) An improved double-tuned and isotope-filtered pulse scheme based on a pulse field gradient and a wide-band inversion shaped pulse. J. Biomol. NMR, 8, 492-498.)から得た。すべてのNMRスペクトルをNMRPipe (Delaglio F, Grzesiek S, Vuister GW, Zhu G, Pfeifer J and Bax A (1995) NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX PIPES. J. Biomol. NMR, 6, 277-293.)及びPIPP (Garret DS, Powers R, Gronenborm AM and Clore GM (1991) A common sense approach to peak picking in two-, three-, and four-dimentinal spectra using automatic computer analysis of contour diagrams. J. Magn. Reson., 99, 214-220.)ソフトウェアを用いて、処理及び解析した。
【００９２】
構造計算
TRF2-DBDのプロトン間距離制限はNOESYスペクトルのクロスピーク強度から導き出した。NOEを、それぞれ、強い、中程度、弱い、非常に弱いNOEに相当する1.8-3.0、2.3-4.0、2.3-5.0及び2.3-6.0オングストロームの４つの距離レンジに分類した。さらに、ねじれ角制限を3JHNα結合定数から導き出した。制限角の範囲は、3JHNα<5.5Hzに対して-90°<φ<-40°、3JHNα>8.5Hz に対して-160°<φ<-80°にした。分子内DNAのNOEを、それぞれ、強い、中程度、弱い、非常に弱いNOEに相当する1.8-3.0、2.3-4.0、2.3-5.0及び2.3-6.0オングストロームの４つの距離レンジに分類した。偽原子補正を上限に対して適用した。DNA内の水素結合制限を用いて、塩基対を維持した。以下の水素結合制限により、ワトソン−クリック塩基対形成をDNA中に維持した。GC塩基対に対しては、rG(N1)-C(N3) = 2.95±0.2オングストローム, rG(N2)-C(O2) = 2.86±0.2オングストローム, 及びrG(O6)-C(N4) = 2.91±0.2オングストローム、TA塩基対に対しては、rA(N6)-T(O4) = 2.95±0.2オングストローム, 及びrA(N1)-T(N3) = 2.82±0.2オングストローム (Grpnenborn, A.M. & Clore, G.M. Three-dimentional structure of proteins in by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Protein Seq Date Anal. 2, 1-28. (1989))。このDNAに対するゆるいねじれ角制限を用いて、A形及びB形DNAの両方を満たす角度制限(α = -65±50°, β = 180±50°, γ = 60±50°, ε = 180±50°,及びζ = -85±50°)(Omichinski, J.G., Pedone, P.V., Felsenfeld, G., Gronenborn, A.M. & Clore, G.M. The solution structure of a specific GAGA factor-DNA complex reveals a modular binding mode. Nat. Struct. Biol. 4, 122-132. (1997); Wojciak, J.M., Connolly, K.M. & Clubb, R.T. NMR structure of the Tn916 integrase-DNA complex. Nat. Struct. Biol. 6, 366-373. (1999))にした。DNAに対するNOEのパターンはB形DNAに典型的なものであるので、DNAに対するこれらの水素結合及びねじれ角制限は正当なものと判断される (Wuthrich, K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. Wiley, New York. (1986).)。
最初に、crystallography and NMR System (CNS; Yale University)を用いて、タンパク質のみの200個の構造を計算した。次に、B形DNA及び計算した200個のhTRF2-DBDからスタートして、全てのNOEを用いてhTRF2-DNA複合体の構造をsimulated annealing protocols計算した。B形DNAは種々の配向でタンパク質から50オングストローム離れた位置に配置した。全部で、200個の構造のhTRF2-DNA複合体が計算された。これらのうち、52個が距離制限が0.3 オングストローム以下、角度制限が5°以下を満たしており、エネルギーが最も低い構造的に矛盾のない構造を20個選んだ。
【００９３】
表面プラズマ共鳴分析
affinity分析をBiacore3000装置を用いて行った。すべての実験は293Kで10mM HEPES-KOH, 3mM EDTA, 180mM KCl 及び0.003% Triton X-100 (v/v) (pH6.8)を含有するバッファーを用いて行った。SAストレプトアビジンセンサーチップのフローセルをビオチン化された13merのオリゴヌクレオチドでコートした。タンパク質とDNAの反応が平衡化するまで、タンパク質を3-5分間かけて10μL/分の流速でフローセルに注入した。２M KClで30秒間洗浄することにより、結合したタンパク質を除去した。平衡解離定数（KD)を各アナライト濃度でセンサーグラムの平衡領域におけるRU値のスキャッチャード分析から計算した。BIAevalution ver.3.2を用い、この親和性データを分析した。  
【００９４】
【表１】
2005229957.tif 000003
【００９５】
【表２】
2005229957.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明により、ＴＲＦ２のテロメア二重らせんＤＮＡ結合能が野生型より非常に強い変異体が提供された。本発明の変異体は、ＴＲＦ２が関与する事象（例えば、癌、老化、アポトーシスなど）の制御に利用することができる。例えば、本発明の変異体を利用して、老化やアポトーシスを防止できると考えられる。
【００９７】
また、本発明により、テロメアタンパク質ＴＲＦ２ＤＮＡ結合ドメインとテロメア二重らせんＤＮＡとの複合体構造とその機能が解析され、ＴＲＦ２のＤＮＡへの結合能を調節できる薬剤のスクリーニングが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１（ａ）】主なMybドメインを含むテロメアタンパク質とc-Mybのドメイン構造の概要図、basic：塩基性ドメイン、acidic：酸性ドメイン、TRFH：TRFホモロジードメイン、BRCT：BRCA1ホモロジードメイン、RCT：Rap1  C末端ホモロジードメイン、active：転写活性化ドメイン、negative regulation：転写抑制ドメイン、Myb：Mybホモロジードメイン、DNA binding:DNA結合能があるMyb領域
【図１（ｂ）】主なテロメアタンパク質のMybドメインとc-Mybの各リピート(R1、R2、R3)のアミノ酸配列。アンダーラインはヘリックス領域を示している。また点線は分子内の架橋を形成している残基を繋いだ。
【図２（ａ）】TRF2―DBDのステレオ図。上は25個の中で最もエネルギーの低い構造であり、下は25個の重ね書きである。
【図２（ｂ）】TRF2―DBDとDNAとの複合体のステレオ図。(a)は20個の中で最もエネルギーの低い構造であり、(b)は20個の重ね書きである。
【図３（ａ）】NMRで決定した構造から得られたTRF1とTRF2のDNAへの認識模式図。矢印は静電的な相互作用を示し、点線での矢印は疎水性の相互作用を示す。
【図３（ｂ）】TRF1とTRF2の静電分布図。青が正電荷、赤が負電荷を帯びている。表示したアミノ酸はDNAの認識に関わる残基で、赤で表示したのがTRF1とTRF2で異なるアミノ酸を示す。
【図４】TRF2の主溝の認識。点線の円で囲まれた部位はT3、Val485、Ala484で形成される疎水性の相互作用。Asp489とC7’,C8’を結ぶ線は水素結合を示す。
【図５（ａ）】TRF1とTRF2の副溝を認識する模式図。上の値はArg380のN1、N2とT9のO2、A6’のN3の距離(オングストローム)と、Lys447とT9のO2、A6’のN3の距離(オングストローム)を示している。また下の括弧内は得られた20個の構造のうちN-H・・D(O or N): H・・D distance<2.7オングストローム; N・・D distance<3.4 オングストローム; N-H-D angle>90°を満たす位置関係にある数を示した。
【図５（ｂ）】TRF1とTRF2のSer404/Ala471とSer417/Ala484とT3のリン酸骨格との相互作用を示した。線は水素結合を示している。
【図６（ａ）】TRF2の各DBDとtr13(5’-d(GTTAGGGTTAGGG))のモル濃度が1:1のときのDNAのイミノプロトン領域のシグナル。
【図６（ｂ）】図6(a)で得られた変異体のイミノプロトンの化学シフトの値から野生型を引いた値のグラフ
【図７】SPRで得られたTRF2、各DBDの解離定数(KD)をtr13、T3G、G7C、T9Gについてのグラフ
【図８】構造が登録されているホメオドメインのアミノ酸のアライメント。保存されている疎水性のアミノ酸を黄色、5番目のアミノ酸をシアンで囲った。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
＜配列番号１＞
配列番号１は、野生型hTRF2-DBDのDNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、野生型hTRF2-DBDのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、変異体K447RのDNA配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、変異体K447Rのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、変異体A471SのDNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、変異体A471Sのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、変異体A484SのDNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、変異体A484Sのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、変異体K496RのDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、変異体K496Rのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、変異体qmのDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、変異体qmのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１３＞
配列番号１３は、変異体dmのDNA配列を示す。
＜配列番号１４＞
配列番号１４は、変異体dmのアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１５＞
配列番号１５は、野生型hTRF2のDNA配列を示す。
＜配列番号１６＞
配列番号１６は、野生型hTRF2のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号１７＞
配列番号１７は、二重らせんDNAであるtr13の一方の鎖のDNA配列を示す。
＜配列番号１８＞
配列番号１８は、二重らせんDNAであるtr13の他方の鎖のDNA配列を示す。
＜配列番号１９＞
配列番号１９は、テロメアDNAの変異体であるT3GのDNA配列を示す。
＜配列番号２０＞
配列番号２０は、テロメアDNAの変異体であるG7CのDNA配列を示す。
＜配列番号２１＞
配列番号２１は、テロメアDNAの変異体であるT9GのDNA配列を示す。
＜配列番号２２＞
配列番号２２は、TRF2-DBD部位の5’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２３＞
配列番号２３は、TRF2-DBD部位の3’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２４＞
配列番号２４は、TRF2-DBD変異体A471S部位の5’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２５＞
配列番号２５は、TRF2-DBD変異体A471S部位の3’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２６＞
配列番号２６は、TRF2-DBD変異体A483S部位の5’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２７＞
配列番号２７は、TRF2-DBD変異体A483S部位の3’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２８＞
配列番号２８は、TRF2-DBD変異体K447R部位の5’側のプライマーの配列を示す。
＜配列番号２９＞
配列番号２９は、TRF2-DBD変異体R496K部位の3’側のプライマーの配列を示す。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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