(57)【要約】【課題】免疫増強剤有効成分、化粧品素材成分、健康食品成分、食品添加物として用いられ、簡便に大量な製造が可能でかつ安全な、海洋資源由来の細胞活性化物質含有海藻抽出物を提供する。【解決手段】海藻抽出物は、海藻の脂質成分であり、細胞活性化物質を含有している。細胞活性化物質は、好酸球活性化物質であることが好ましい。好酸球活性化物質は、４，７，１０，１３−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、およびそれらの類縁体の少なくともいずれかのｎ−３系不飽和脂肪酸類である。【選択図】          なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
海藻の脂質成分である細胞活性化物質を含有していることを特徴とする海藻抽出物。
【請求項２】
前記細胞活性化物質が、好酸球活性化物質であることを特徴とする請求項１に記載の海藻抽出物。
【請求項３】
前記好酸球活性化物質が、４，７，１０，１３−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸、およびそれらの類縁体の少なくともいずれかのｎ−３系不飽和脂肪酸類であることを特徴とする請求項２に記載の海藻抽出物。
【請求項４】
海藻を、有機溶媒に浸漬した後、濾過した濾液から有機溶媒を留去することを特徴とする細胞活性化物質を含有する海藻抽出物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の海藻抽出物、その精製物、またはｎ−３系不飽和脂肪酸類が含まれていることを特徴とする細胞活性化物質を含有する組成物。
【請求項６】
食用海藻由来のポリフェノール類、カロチン類、薬用植物由来のフェノール性成分、およびトコフェロール類、アスコルビン酸の天然ビタミン類の少なくともいずれかの酸化防止剤を含んでいることを特徴とする請求項５に記載の細胞活性化物質を含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫増強剤、アルゴテラピー用素材、化粧品、食品の成分として用いられるもので、細胞活性化物質を含有する海藻抽出物、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
住環境の悪化、食生活の変化に伴い、アトピー性皮膚炎・花粉症・喘息等のアレルギー性炎症疾患の患者が増加している。
【０００３】
白血球のうちの顆粒球の一種である好酸球は、アレルギー性炎症疾患の中心的なエフェクター細胞のひとつである。好酸球は、アレルギー性炎症疾患等で増加し活性化され、病原体等の異物に接触しあるいは取り込んで、産生した活性酸素種あるいは脱顆粒により攻撃して排除する顆粒球細胞である。好酸球が環境に応じて過剰に活性酸素種を産生すると、かえって組織や臓器の重篤な障害を惹き起してしまう。そのためアレルギー性炎症疾患の患者に対して、好酸球を適度に活性化させる必要がある。
【０００４】
このような好酸球活性化物質として、特許文献１に、海洋深層水由来の極性溶媒可溶性成分が開示されているが、その含有量は極僅かである。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−５５２３６号公報
【０００６】
アレルギー性炎症疾患を始めとした免疫応答を調節するため、化粧品や食品としても安全に用いることができ、しかも豊富な海洋資源から大量に得ることができる好酸球等の細胞の活性化物質の供給が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、免疫応答増強有効成分、化粧品素材成分、健康食品成分、食品添加物として用いられ、安全である海洋資源由来の細胞活性化物質含有抽出物、およびそれの簡便で大量な製造が可能な製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するためになされた本発明の抽出物は、海藻に由来するものである。この海藻抽出物は、海藻の脂質成分であって、細胞活性化物質を含有している。
【０００９】
海藻として、緑藻・褐藻・紅藻等の藻類が挙げられる。中でもスジアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）で例示される緑藻類アオサ目アオノリ属の海藻の総称であるアオノリ、または緑藻類アオサ目アオサ属の海藻の総称であるアオサであると、細胞活性化物質の含有量が多いので、一層好ましい。アオノリであるとなお一層好ましい。
【００１０】
海藻抽出物に含まれている細胞活性化物質は、アレルギー性炎症疾患患者に対して、生体防御の役割を担っている白血球のような細胞を活性化して自然免疫力を高揚させるものである。細胞活性化物質が、好酸球活性化物質であると好ましい。
【００１１】
好酸球の産出する活性酸素種の量を指標として、海藻抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分離精製した好酸球活性化物質のうちの幾つかは、４，７，１０，１３−ヘキサデカテトラエン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸および９，１２，１５−オクタデカトリエン酸で例示されるｎ−３系不飽和脂肪酸である。その不飽和基は全てｃｉｓ体である。また、好酸球活性化物質は、このｎ−３系不飽和脂肪酸と低級アルコールとのエステル、ｎ−３系不飽和脂肪酸のアミド、ｎ−３系不飽和脂肪酸のグリセリド、ｎ−３系不飽和脂肪酸の糖脂質で例示されるｎ−３系不飽和脂肪酸の類縁体であってもよい。好酸球活性化物質であるこれらの脂肪酸類は、海藻抽出物中に、単独または複数含まれている。これらのｎ−３系不飽和脂肪酸類は、過剰とならない適量の活性酸素種を、好酸球から産生させるものである。さらにｎ−３系不飽和脂肪酸類は、魚油に多く含まれる別なｎ−３系不飽和脂肪酸であるドデカペンタエン酸（ＤＨＡ）が有する抗アレルギー作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用、抗動脈硬化作用と同様な生理活性も、有している。
【００１２】
本発明の細胞活性化物質を含有する海藻抽出物の製造方法は、海藻を、有機溶媒に浸漬した後、濾過した濾液から有機溶媒を留去するという簡便なものである。有機溶媒は、例えばヘキサン、酢酸エチル、エタノールが挙げられる。海藻は、乾燥し粉末化したものであってもよい。
【００１３】
本発明の細胞活性化物質含有組成物は、前記海藻抽出物、この抽出物を脱色・脱臭した精製物、またはカラムクロマトグラフィーで例示される方法により精製された好酸球活性化物質含有精製物が、含まれていることが好ましい。細胞活性化物質含有組成物は、タラソテラピー・アルゴテラピーの素材や、皮膚病治療・肌の老化防止の民間薬として古くから用いられている海藻に由来する抽出物やその精製物を含むものであるから、安全性が高い。
【００１４】
細胞活性化物質含有組成物は、別な天然資源由来または化学合成した前記のｎ−３系不飽和脂肪酸類が含まれていてもよい。
【００１５】
細胞活性化物質含有組成物は、酸化防止剤を含んでいてもよい。酸化防止剤は、食用海藻由来のポリフェノール類、カロチン類、薬用植物由来のフェノール性成分、およびトコフェロール類、アスコルビン酸の天然ビタミン類の少なくともいずれかの酸化防止剤であることが好ましい。この酸化防止剤は、細胞活性化物質であるｎ−３系不飽和脂肪酸類の分子中の不飽和基が速やかに酸化してしまうのを防止するものである。不飽和基の酸化は、高度不飽和脂肪酸の不活性化を引き起こすだけでなく、毒性発現をもたらす。具体的には、ポリフェノール類としてタンニン、フロログリシノールとそのオリゴマーやポリマーであるフロロタンニン類、カロチン類としてフコキサンチンなどのキサントフィル、フェノール性成分としてフラボノイド類、リグナン類、クルクミン類、アントラキノン類が挙げられる。
酸化防止剤は、アカモク、ヒジキ、カジメ、クロメなどで例示される食用海洋由来のポリフェノール類およびカロチン類；ウコン、ギシギシ、ヤマモモなどで示される薬用植物由来のフェノール性成分；天然のビタミン類を含んでいる抽出物であると、食材等に用いられる海藻や植物に由来するものであるから安全性が高いので、なお好ましい。細胞活性化物質含有組成物中、酸化防止剤は、ｎ−３系不飽和脂肪酸類１００重量部に対し０．０１〜０．１重量部含まれることが好ましい。
【００１６】
細胞活性化物質含有組成物は、アレルギー性炎症疾患治療薬有効成分、化粧品素材成分、健康食品成分、食品添加物として好適である。細胞活性化物質含有組成物中、海藻抽出物、その精製物、またはｎ−３系不飽和脂肪酸類が、治療薬・化粧品・食品の使用態様に応じ任意の割合で含まれ、好ましくは０．００００１〜１０．０重量％、一層好ましくは０．０００１〜１．０重量％含まれる。細胞活性化物質含有組成物には、賦形剤で例示される添加剤が含まれていてもよい。この組成物を、錠剤、顆粒剤、液剤で例示される製剤にしてもよい。
【００１７】
細胞活性化物質含有組成物は、免疫力を高揚させ、副作用が殆どないので、医療、美容、飲食物のために安心して使用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明の細胞活性化物質を含有する海藻抽出物、および細胞活性化物質を含有する組成物の実施例について詳細に説明する。
【００１９】
海藻抽出物の調製およびその精製に先立ち、海藻抽出物およびその精製物の好酸球活性化度の測定試験方法について説明する。
【００２０】
（海藻抽出物およびその精製物の好酸球活性化度の測定試験方法）
海藻抽出物やその精製物を被検体としたときの好酸球活性化度は、被検体によって好酸球が産生するスーパーオキサイド（Ｏ２−）から派生した過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を主な分子とする活性酸素種の量を指標にして、以下のようにして測定した。
【００２１】
好酸球の調製
この測定試験に使用する好酸球は、好酸球に選択的な増殖分化因子であるＩＬ−５を恒常的に産生するトランスジェニック（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ−ＴｇＮ（ＩＬ−５）−Ｉｍｅｇ、以下ＩＬ−５ＴＧマウスと略す）の末梢血から分離した好酸球である。末梢血を終濃度０．２２％のクエン酸を含むＣａ（ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ：  ＋＋）フリー、Ｋｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒリン酸緩衝液（以下ＫＲＰと略す）（０．９％ＮａＣｌ、６  ｍＭ  ＫＣｌ、１  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０  ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４））中に採血し、赤血球および単球を除去する目的で、Ｐｅｒｃｏｌｌ不連続密度勾配遠心法を行った。Ｐｅｒｃｏｌｌ原液に対し、１０倍濃度のＫＲＰを１／１０量添加したものを１００％Ｐｅｒｃｏｌｌと定義し、細胞混濁液の下に６０、７０、８０％Ｐｅｒｃｏｌｌを重層し、３５０  ｇ、室温で２０分間遠心した後、７０、８０％Ｐｅｒｃｏｌｌ層を回収した。回収した細胞集団を分離用緩衝液（５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、１０  ｍＭ  Ｎａ−Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．２））に再懸濁（１×１０７  ｃｅｌｌｓ／５０μｌ）し、抗Ｔｈｙ１．２抗体結合磁気ビーズ（１×１０７  ｂｅａｄｓ／２５μｌ）と抗Ｂ２２０抗体結合磁気ビーズ（１×１０７  ｂｅａｄｓ／２５μｌ）を添加し、４℃で２０分間反応させた後、永久磁石を用いたネガティブセレクションでＴ、Ｂリンパ球をさらに除去し、採取された細胞集団を好酸球集団として実験に供した。なお、分離後の細胞集団の純度はフローサイトメーター（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で解析し、リンパ球の混入は５％以下であった。また、７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（終濃度２  μｇ／ｍｌ）で染色される細胞は死細胞として解析した。最終的に、好酸球は２５％ホルマリン／４５％アセトン／３０％蒸留水で３０秒間室温で固定し、２  ｍＭ  ３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＤＢＡ；Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、８  ｍＭ  ＮａＣＮと０．００９％過酸化水素を含む０．１  Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で１５分間室温染色し、茶色に染色された顆粒を持つ細胞として同定した。すべての実験で、９０〜９５％が好酸球であった。
【００２２】
なお、この好酸球の調製には、文献  Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：  ４２９−４３７，１９９１およびＷａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，  Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：  １８９−２０２，２００１を参考にした。
【００２３】
活性酸素種量の測定
好酸球（１×１０６ｃｅｌｌ  ｓ／ｍｌ）１  ｍｌの細胞溶液を無蛍光物質である５  ｍＭ  ２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  （ＤＣＦＨ−ＤＡ、最終濃度２５  ｎＭ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  （５  ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（以下ＰＢＳｇと略す）中で３７℃、１５分間インキュベートした後、海藻抽出物やその精製物等の被検体（１  ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）を最終濃度３０、１０、１μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃、３０分間インキュベートした。同様に、ポジティブコントロールとしてＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ，１２−ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）を最終濃度５０  ｎｇ／ｍｌになるように添加した。反応後、ＰＢＳｇで２度細胞を洗浄し、フローサイトメーターで解析を行った。具体的には、アルゴンレーザー４８８ｎｍで励起し、５３０ｎｍの蛍光を測定した。
【００２４】
このようにして得られたＭｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙの値から、ポジティブコントロールを１とするＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘを求めることにより、好酸球の産生する過酸化水素をはじめとした活性酸素種の量が推定可能となることから、好酸球活性化度の程度が判定できる。
【００２５】
なお、この活性酸素種量の測定は、文献  Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，  Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：  １８９−２０２，２００１を参考にした。
【００２６】
次に、海藻抽出物の調製およびその精製と同定とについて説明する。
【００２７】
（海藻抽出物の調製）
スジアオノリ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａ）を真空乾燥により乾燥し、粉砕して粉末とした。図１に示すように、このスジアオノリの粉末の１．５  ｋｇ（Ｅｎｔｅｒｏｍｏｒｐｈａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａ（１．５  ｋｇ  ｄｒｙ  ｗｔ．））を蒸留ｎ−ヘキサン８Ｌに室温下で１週間浸漬してから濾過する操作を２回繰り返し、濾液を併せてヘキサンを減圧下留去すると、海藻のヘキサン抽出物（Ｈｅｘａｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔ）６．５  ｇが得られた。次いで濾過残渣を蒸留酢酸エチル８Ｌに室温下で１週間浸漬してから濾過する操作を２回繰り返し、濾液を併せて酢酸エチルを減圧下留去すると、海藻の酢酸エチル抽出物（ＡｃＯＥｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）７．０  ｇが得られた。
【００２８】
得られた海藻のヘキサン抽出物および酢酸エチル抽出物について好酸球活性化度の測定試験を行なったところ、図２に示すようにヘキサン抽出物に極めて高い活性が認められた。
【００２９】
（海藻抽出物中の好酸球活性化物質の精製および好酸球活性化度測定試験）
そこで海藻のヘキサン抽出物について、充填剤としてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０の４００  ｇ、展開溶媒としてジクロロメタン／メタノール  １／１を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、所定量毎の流出分画を薄層クロマトグラフィーにより比較しながら、図３に示すように７つのフラクション（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．７）に集約した。この７つのフラクションに対して、好酸球活性化度測定試験を行ったところ、図４に示すようにフラクション６の８６４  ｍｇに高い活性が認められた。このフラクション６（Ｆｒ．６）について、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）を測定したところ、主に不飽和脂肪酸が含まれていることが分かった。
【００３０】
このフラクション６のうち８００  ｍｇについて、Ｌｏｂａｒカラム（ＯＤＳ）を用い、メタノール／水系混合溶媒を展開溶媒として、逆相クロマトグラフィーを行い精製した。所定量毎の流出分画を薄層クロマトグラフィーにより比較しながら、図５に示すように７つのフラクション（Ｆｒ．６−Ｉ〜Ｆｒ．６−ＶＩＩ）に集約した。
【００３１】
得られた７つのフラクション（Ｆｒ．６−Ｉ〜Ｆｒ．６−ＶＩＩ）について好酸球活性化度の測定試験を行なったところ、図６に示すように各々極めて高い活性が認められた。
【００３２】
薄層クロマトグラフィーによる比較の結果、Ｆｒ．６−ＩＩＩの１０３  ｍｇに化合物１、Ｆｒ．６−Ｖの１１８  ｍｇに化合物２、Ｆｒ．６−ＶＩＩの２１８  ｍｇに化合物４がそれぞれほぼ単一に含まれていた。また、Ｆｒ．６−ＶＩの１０  ｍｇには化合物３を主成分とする２成分が含まれていた。
【００３３】
各フラクションのＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ポジティブコントロールを１とする）は、１μｇ／ｍｌでＦｒ．６−ＩＩＩが０．０７、Ｆｒ．６−Ｖが０．５０、Ｆｒ．６−ＶＩが０．６１、Ｆｒ．６−ＶＩＩが０．９０であって、Ｆｒ．６−ＶＩＩが最も活性が高かった。
【００３４】
次に、Ｆｒ．６−ＶＩＩの好酸球活性に及ぼす酸化防止剤の影響を調べたところ、図７に示すように酸化防止剤ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）は濃度によらず、好酸球活性化度には何ら影響を与えないことがわかった。
【００３５】
（化合物１の同定）
化合物１を含むＦｒ．６−ＩＩＩのうちの２３  ｍｇをメタノール１  ｍｌに溶解し、２．０  Ｍトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液１００  μｌによりメチル化した。その後、メタノール／水  ９９／１を展開溶媒として、逆相Ｌｏｂａｒカラムクロマトグラフィーを行い、１０余りのフラクションを分取した。各フラクションを薄層クロマトグラフィーで比較検討することにより、精製された化合物１のメチルエステルを得た。化合物１のメチルエステルは、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＨ０．９８（３Ｈ，ｔ，７．６）にメチル基のプロトン、δＨ２．０８（２Ｈ，ｍ）、２．３８（４Ｈ，ｍ）にメチレン基のプロトン、δＨ２．８０−２．８８（６Ｈ，ｍ）にオレフィン間のメチレンプロトン、δＨ３．６８（３Ｈ，ｓ）にメトキシ基のプロトン、δＨ５．２８−５．４５（８Ｈ，ｍ）にオレフィンプロトンに基づくシグナルが認められた。また、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＣ１４．２にメチル基、δＣ２０．５、２２．８、２５．５、２５．５、２５．６、３４．０に６個のメチレン炭素、δＣ５１．５にメトキシ炭素、δＣ１２７．０、１２７．８、１２７．９、１２８．３、１２８．５、１２９．３、１３１．９、１３６．７に８個のオレフィン炭素、δＣ１７３．５にカルボニル炭素に基づくシグナルが認められた。これらのことから、化合物１は炭素数１６で二重結合数が４の不飽和脂肪酸であることが示唆された。また、化合物１のメチルエステルは、ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ測定試験から、二重結合の位置がｎ−３系である不飽和脂肪酸類であることが判明した。続いて化合物１のメチルエステルのＧＣ−ＭＳによる分析を行いＭ＋が２６２であったことと、ＮＭＲスペクトルとを併せて検討した結果、化合物１のメチルエステルを、４，７，１０，１３−ヘキサデカテトラエン酸メチルエステルであると同定した。よって、化合物１は、４，７，１０，１３−ヘキサデカテトラエン酸であると同定された。
【００３６】
（化合物２の同定）
化合物２を含むＦｒ．６−Ｖのうちの２０  ｍｇを前記と同様な方法でメチル化および精製を行い、化合物２のメチルエステルを得た。化合物２のメチルエステルは、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＨ０．９８（３Ｈ，ｔ，７．６）にメチル基のプロトン、δＨ１．４０（２Ｈ，ｍ）、δＨ１．６６（２Ｈ，ｍ）、δＨ２．０８（２Ｈ，ｍ）、δＨ２．３２（２Ｈ，ｔ，７．４）にメチレン基のプロトン、δＨ２．８０−２．８８（６Ｈ，ｍ）にオレフィン間のメチレンプロトン、δＨ３．６７（３Ｈ，ｓ）にメトキシ基のプロトン、δＨ５．２８−５．４４（８Ｈ，ｍ）にオレフィンプロトンに基づくシグナルが認められた。また、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＣ１４．２にメチル基、δＣ２０．５、２４．６、２５．５、２５．６、２５．６、２６．８、２９．１、３３．９に８個のメチレン炭素、δＣ５１．４にメトキシ炭素、δＣ１２７．０、１２７．９、１２８．１、１２８．１、１２８．３、１２８．５、１２９．６、１３２．０に８個のオレフィン炭素、δＣ１７４．１にカルボニル炭素に基づくシグナルが認められた。これらのことから、化合物２は炭素数１８で二重結合数が４の不飽和脂肪酸であることが示唆された。また、化合物２のメチルエステルは、ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ測定試験から二重結合の位置がｎ−３系である不飽和脂肪酸類であることが判明した。続いて化合物２のメチルエステルのＧＣ−ＭＳによる分析を行いＭ＋が２９０であったことと、ＮＭＲスペクトルとを併せて検討した結果、化合物２のメチルエステルを、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸メチルエステルであると同定した。よって、化合物２は６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸であると同定された。
【００３７】
（化合物３の同定）
化合物３を含むＦｒ．６−ＶＩの９ｍｇを前記の方法でメチル化し、精製を試みたが単離は成功せず、化合物３のメチルエステルを主成分とする分画を得た。この分画について、ＧＣ−ＭＳによる分析を行ったところ、主成分のフラグメントパターンが５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸メチルエステルのそれと一致したことから、化合物３は５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸であると同定された。
【００３８】
（化合物４の同定）
化合物４を含むＦｒ．６−ＶＩＩのうちの１０  ｍｇを前記と同様な方法で処理して、精製された化合物４のメチルエステルを得た。化合物４のメチルエステルは、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＨ０．９８（３Ｈ，ｔ，７．６）にメチル基のプロトン、δＨ１．２５−１．３６（８Ｈ，ｍ）、δＨ１．６２（２Ｈ，ｍ）、δＨ２．０６（２Ｈ，ｍ）、δＨ２．３０（２Ｈ，ｔ，７．８）にメチレン基のプロトン、δＨ２．７９−２．８５（４Ｈ，ｍ）にオレフィン間のメチレンプロトン、δＨ３．６７（３Ｈ，ｓ）にメトキシ基のプロトン、δＨ５．２８−５．４３（６Ｈ，ｍ）にオレフィンプロトンに基づくシグナルが認められた。また、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）において、δＣ１４．４にメチル基、δＣ２０．７、２５．１、２５．５、２５．７、２５．７、２７．４、２９．３、２９．３、２９．７、２９．８に１０個のメチレン炭素、δＣ５１．５にメトキシ炭素、δＣ１２７．３、１２７．９、１２８．４、１２８．５、１３０．４、１３２．１に６個のオレフィン炭素、δＣ１７４．１にカルボニル炭素に基づくシグナルが認められた。これらのことから、化合物４は炭素数１８で二重結合数が３の不飽和脂肪酸であることが示唆された。また、化合物４のメチルエステルは、ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ測定試験から二重結合の位置がｎ−３系である不飽和脂肪酸類であることが判明した。続いて化合物４のメチルエステルのＧＣ−ＭＳによる分析を行いＭ＋が２９２であったことと、ＮＭＲスペクトルとを併せて検討した結果、化合物４のメチルエステルを、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸メチルエステルであると同定した。よって、化合物４は９，１２，１５−オクタデカトリエン酸であると同定された。
【００３９】
なお、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）および１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）のスペクトルの測定はＪＥＯＬ−ＧＸ−４００、ＧＣ−ＭＳスペクトルの測定はＡｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＧＣ−Ｓｙｓｔｅｍ，  Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７３  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒの各装置を用いて行なった。
【００４０】
なお、用いられる海藻は、海洋から採取したものであってもよく、採水した海洋表層水または海洋深層水で培養したものであってもよい。海藻が、水深約２００ｍ以深の深海を緩やかに流れ、無機栄養塩が豊富でミネラル類をバランスよく含み陸水由来の病原菌に汚染されていない海洋深層水中で培養したものであると、病原菌に汚染されておらず早く成長し安定して培養できるため、海藻抽出物が、歩留まりよく製造できる。
【００４１】
（細胞活性化物質含有組成物の調製）
細胞活性化物質である９，１２，１５−オクタデカトリエン酸１  ｍｇのヘキサン溶液に酸化防止剤  ＢＨＴ（ジブチルヒドロキシトルエン）の１  ％溶液を終濃度０．００１、０．０１、０．１％となるよう添加し、溶媒を留去することにより細胞活性化物質含有組成物を得た。
【００４２】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように本発明の海藻抽出物は、細胞活性化物質を高比率で含有している。この細胞活性化物質である好酸球活性化物質は、高い活性酸素種誘導能力を有しており、適量産生される活性酸素種の作用により優れた生体防御機能を発現させるとともに、免疫応答を増強させる。この細胞活性化物質は、副作用が著しく少なく、極めて安全性が高い。
【００４３】
海藻抽出物やその精製物は、免疫増強剤、アルゴテラピー用素材、化粧品、食品の成分として有用である。
【００４４】
この海藻抽出物の製造方法によれば、簡便かつ安価に大量に製造でき歩留まりがよい。
【００４５】
この細胞活性化物質を含有する組成物は、皮膚炎、花粉症、喘息等のアレルギー疾患の治療薬の有効成分として有用である。さらにこの細胞活性化物質含有組成物は、心疾患、脳血管障害、動脈硬化、高脂血症、高血圧、糖尿病、ガン等の疾病に効果が期待できる。また、肌の美容や肌の老化防止のための化粧品素材の成分、健康増進や成人病予防のための健康食品や食品添加物としても有用である。この組成物は、副作用が殆どないので反復して長期間使用しても安全である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用する海藻抽出物の調製方法を示す工程図である。
【図２】本発明を適用する海藻抽出物の好酸球活性化度を示す図である。
【図３】本発明を適用する海藻抽出物を精製する方法を示す工程図である。
【図４】本発明を適用する海藻抽出物の精製物の好酸球活性化度を示す図である。
【図５】本発明を適用する海藻抽出物をさらに精製する方法を示す工程図である。
【図６】本発明を適用する海藻抽出物のさらなる精製物の好酸球活性化度を示す図である。
【図７】本発明を適用する酸化防止剤を含有している海藻抽出物の好酸球活性化度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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