(57)【要約】【課題】血管新生阻害作用を有する物質の提供【解決手段】 タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）の植物あるいはその植物の抽出物、又はサリシンあるいはサリシンを含有する植物の抽出物を有効成分とする血管新生阻害用組成物。【選択図】        図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）の植物、植物から抽出した成分から選ばれる１種以上を含有することを特徴とする血管新生阻害用組成物。
【請求項２】
サリシンあるいはサリシンを含有する植物又はサリシンを含有する植物から抽出した成分を含有することを特徴とする血管新生阻害用組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の血管新生阻害用組成物を含むことを特徴とする抗リウマチ用組成物。
【請求項４】
キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、ヤナギ樹皮（Salix spp.）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチドから選ばれる少なくとも１つ以上を添加したことを特徴とする請求項３記載の抗リウマチ用組成物。
【請求項５】
請求項１又は２記載の血管新生阻害用成分を含むことを特徴とする抗腫瘍用組成物。
【請求項６】
アガリクス（Agaricus blazei）、メシマコブ（Pellinus yucatensis）、マイタケ（Grifola frondose）、プロポリス、ビタミンE、βカロチン、カテキン類から選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする請求項５記載の抗腫瘍組成物。
【請求項７】
キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、ヤナギ樹皮（Salix spp.）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリンから選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする請求項５又は６に記載の抗腫瘍組成物。
【請求項８】
血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患の予防または治療用である請求項１又は２記載の血管新生阻害用組成物。
【請求項９】
血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患が糖尿病性網膜症、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障または炎症であることを特徴とする請求項８記載の血管新生阻害用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）、サリシンを有効成分とする血管新生阻害用組成物に関する。
また、その血管新生阻害用組成物を利用した抗リウマチ用組成物、抗腫瘍組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは元々ある血管から新しい血管が形成されることを指す。血管形成を指す用語として脈管形成があるが、脈管形成は胚形成期の初期の段階にみられる最初の血管形成の過程を指し、既存の血管から発生するものではなく中胚葉性の胎生細胞である血管芽細胞の分化によって発生するものである。
これに対して、血管新生は成人の正常な人体にみられる生理的な現象や、特定の疾患にみられる「新しい血管が形成されるプロセス」である。血管新生には、種々の分子や細胞のメカニズムによる、複雑なプロセスがあって、解剖学的にいうと、血管は、典型的な血管の外包膜（基底膜と呼ばれ主にコラーゲン繊維で構成されている）の内側にある内皮細胞（血管の主な細胞構成要素）がひとつの層をなしている。血管内には赤血球や炎症細胞（白血球）、さらにさまざまな可溶性の栄養が循環している。
【０００３】
血管は、外傷などにより損傷を受けると、新しく血管を形成することによって修復される。したがって、血管新生自体は、生体維持には必要不可欠である。血管新生の形成は血管新生因子（VEGF：血管内皮増殖因子やｂFGF：塩基性線維芽細胞増殖因子等）によって血管新生のスイッチがオンにされるとプロテアーゼ（プラスミノーゲンやマトリックスメタロプロテアーゼ等）によって基底膜の消化が起き、そこに内皮細胞が遊走・定着・増殖し、増殖した内皮細胞が管腔を形成し、最終的に毛細管網を形成することによって完了する。
【０００４】
血管新生のプロセスを概略すると次のような例が挙げられる。
(1)ステップ１
酸欠などの低酸素状態の間、血管の形成を促進する血管新生促進因子（成長因子、サイトカイン）が最寄りの血管にそのシグナルを送る。
(2)ステップ２
血管新生のプロセスでそのシグナルの発生源に向かって炎症細胞が血管外遊走して移動する最初の細胞現象がここでみられる。さらに血管新生促進因子が分泌されて炎症細胞がシグナル発生源に向かって増殖してゆく。  
(3)ステップ３
内皮細胞の反応により、血管の基底膜を形成するコラーゲン繊維を消化するマトリクスメタロプロテナーゼという特別な酵素の分泌が促進される。増殖する内皮細胞がシグナル発生源に向かって移動し、ブリーチを形成する。
(4)ステップ４
このブリーチに沿って内皮細胞が細胞外マトリクスを作り、その細胞外マトリクスと基底膜とで構成された、機能的な新しい血管を完成させる。
【０００５】
このような血管新生が生体にとって不適切になされると、身体の障害の発生や病気の原因となると考えられており、血管新生の制御に関心が大きくなっている。腫瘍化した組織においてこの血管新生のプロセスが進むと、腫瘍に新生血管を形成させ、腫瘍のさらなる成長を促してしまうのである。専門雑誌のメディカルレポートで、ガンやリウマチ様関節炎に血管新生の関連が報告されており、現在血管新生依存症疾患として、固形腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、歯周病、強皮症、緑内障、尋常性乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患等、多数の疾病が確認されている。
【０００６】
現在、上記列挙した疾病の予防や治療のために、血管新生を阻害する物質の探索研究が活発に推進されている。
例えば、これまで見出されてきた薬剤には、内皮細胞の増殖阻害を示す微生物代謝産物のフマギリン類縁体、コラゲナーゼ活性阻害作用を有するテトラサイクリン系抗生物質、ヘパリン結合性血管新生因子の受容体への結合抑制作用を有する微生物由来D−グルコ−ガラクタン硫酸等が知られている。また、既に広く用いられているアスピリン等の非ステロイド抗炎症剤が腫瘍発生のリスクを軽減することが知られていたが、その作用がインテグリンを介した内皮細胞の拡散と移動に関与し、線維芽細胞増殖因子−２（FGF−２）による血管新生誘導を阻害することが最近新たに解明された（非特許文献１：Nature Medicine２００１, Vol７,1041-1047）。しかし、こうした薬剤候補もヒト臨床試験において効果が認められなかったり、副作用により実用化が難しいと言った諸問題を抱えているのも事実である。
【０００７】
特許文献１（特開２００３−９６０７８号公報）には、血管内皮細胞の走化性を阻害することにより血管新生阻害活性、抗腫瘍活性、及び転移抑制活性を発揮する新規化合物として、次の式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び該化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む血管新生阻害剤や抗腫瘍剤などの医薬が提案されている。
【化１】
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【０００８】
特許文献２（特開２００３−３８１８８号公報）には、血管新生阻害活性を有し、抗癌剤、リウマチ性関節炎、及び網膜症治療剤等として有用な新規ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離・同定し、前記ポリペプチドの簡便な生産系を構築し、組換えタンパク質を提供するために、新規のＡＤＡＭＴＳポリペプチドであるとして、「配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２４５番〜第１１１７番のアミノ酸配列を含み、しかも、血管新生阻害活性を有するポリペプチド、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第２４５番〜第１１１７番のアミノ酸配列の１又は数個の箇所において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、血管新生阻害活性を有するポリペプチド」を提案している。
【０００９】
特許文献３（特開２００２−３０８７７７号公報）には、血管新生阻害作用を有する組成物として、「エルゴステロールとサイクロデキストリンを含有しており、エルゴステロールが椎茸、ヒラタケ、ナメコ、マイタケ、エノキタケ、ブナシメジ、ハタケシメジ、アガリクス茸、メシマコブ茸、マンネン茸（霊芝）、松茸、カワラ茸およびチヨレイマイ茸よりなる群から選ばれた少なくとも１種の茸に由来するものであって、サイクロデキストリンがβ−サイクロデキストリン、マルトシル−β−サイクロデキストリンまたはこれらを含む混合物」が提案されている。
【００１０】
特許文献４（特開２００１−３３５５７５号公報）には、ＭＭＰ酵素阻害剤は、癌や炎症性疾患の治療または予防に用いられる血管新生阻害剤、制癌剤、癌浸潤抑制剤、癌転移抑制剤；慢性関節リウマチ、変形性関節症やリウマチ様関節炎などの関節炎の治療・予防剤；歯肉炎、糸球体腎炎、間質性腎炎、脳脊髄炎、動脈硬化、肝硬変、血管再閉塞・再狭窄、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内障、角膜潰瘍、表皮水泡症、椎間板ヘルニア、骨粗鬆症等の骨吸収疾患、多発性硬化症、気管支喘息、アルツハイマー型痴呆症、自己免疫疾患（クローン病、シェグレン病等）などの各種疾患の治療・予防剤として、ニトロエテンアミン誘導体またはその塩、ならびにそれらを含有する医薬組成物が提案されている。
【００１１】
本研究者は血管新生阻害剤について、鋭意研究を続けており、本出願前に、ミカン属に属する植物から抽出した成分を有効成分とする血管新生阻害用組成物を特願２００３−１２９５１８号として特許出願した。本発明は、さらに研究開発を続けた結果、新たに血管新生阻害作用を奏する組成物を開発したものである。
【非特許文献１】Nature Medicine２００１, Vol７,1041-1047
【特許文献１】特開２００３−９６０７８号公報
【特許文献２】特開２００３−３８１８８号公報
【特許文献３】特開２００２−３０８７７７号公報
【特許文献４】特開２００１−３３５５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、このような様々な病気や症状の原因となる血管新生を抑制する新規な血管新生阻害用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記諸目的を解決すべく鋭意検討した結果、タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）、サリシンに管腔形成及び血管新生を阻害する作用を見出し、血管新生阻害用組成物として極めて有用であるという知見から本発明を完成するに至った。
すなわち、ここで提案する解決手段は、次の構成をとる。
１．タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）の植物、植物から抽出した成分からなることを特徴とする血管新生阻害用組成物。
２． サリシンあるいはサリシンを含有する植物又はサリシンを含有する植物から抽出した成分を含有することを特徴とする血管新生阻害用組成物。３．１．又は２．記載の血管新生阻害用組成物を含むことを特徴とする抗リウマチ用組成物。
４．キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、ヤナギ樹皮（Salix spp.）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチドから選ばれる少なくとも１つ以上を添加したことを特徴とする３．記載の抗リウマチ用組成物。
５．１．又は２．記載の血管新生阻害用成分を含むことを特徴とする抗腫瘍用組成物。
６．アガリクス（Agaricus blazei）、メシマコブ（Pellinus yucatensis）、マイタケ（Grifola frondose）、プロポリス、ビタミンE、βカロチン、カテキン類から選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする５．記載の抗腫瘍組成物。
７．キャッツクロー（Uncaria tomentosa）、ヤナギ樹皮（Salix spp.）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリンから選ばれる少なくとも１つ以上添加したことを特徴とする５．又は６．に記載の抗腫瘍組成物。
８．血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患の予防または治療用である１．又は２．記載の血管新生阻害用組成物。
９．血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患が糖尿病性網膜症、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障または炎症であることを特徴とする８．記載の血管新生阻害用組成物。
である。
【発明の効果】
【００１４】
タイム、タラゴン、ナツメグ、メースの各植物体及びそれらの抽出物は、内皮細胞を用いた管腔形成モデル及びマウスを用いた血管新生モデルにおいて顕著に管腔の形成と血管の新生を阻害することを確認した。また、ナツメグ、メースの各植物体及びそれらの抽出物は、内皮細胞及び線維芽細胞の増殖阻害試験における比較から、特異的に内皮細胞の増殖を阻害することが確認できた。
サリシン、サリシン含有植物体及びその植物の抽出物は、マウスを用いた血管新生モデルにおいて顕著に血管新生阻害作用を奏することが確認できた。
本発明は、血管新生を発生の起因とする疾病、例えば、リウマチや腫瘍の予防や治療に有用なものである。その使用法としては、経口用、皮膚外用、注射、化粧品、医薬があげられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明の植物には、タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）が使用可能である。これら植物は、通常食用として提供されているものも使用できる。また、サリシン及びそれを含有する植物を使用することもできる。
【００１６】
以下、本発明の詳細を説明する。
タイム（Thymus vulgaris）は、シソ科イブキジャコウソウ属に属し、ヨーロッパ南部の地中海沿岸地方の原産で、各地に香料用などに栽培される常緑小低木である。タチジャコウソウとも呼ばれる。５月から６月に全草を採集し、水洗い後そのまま使用するか、日干しにしたものを鎮咳、鎮痙、駆風、駆虫薬として急性気管支炎、百日咳、鈎虫症、咽喉炎などに用いられてきたものである。
【００１７】
タラゴン（Artemisia dracunculus）は、キク科ヨモギ属の多年草で、原産地は西シベリアから南米にかけての地域と見られている。フランスではエストラゴンと呼ばれ、肉や魚料理の香料として古くから用いられてきたものである。
【００１８】
ナツメグ（Myristica fragrans）は、ニグスク科ニグスク属の常緑高木で、インド洋のモルッカ島を原産とする。ナツメグは種子を指し、ニグスクともいわれている。カレー、クッキー、ケーキ、ドーナツなどの香辛料 として用いられてきたものである。
【００１９】
メース（Myristica fragrans）は、ナツメグと同一植物で、種子をナツメグというのに対し、メースは仮種子を指す。メースとナツメグはともに甘い刺激性の香りがあるが、メースの方が香りが穏やかであると言われている。香辛料としてはボロニャソセージやフランクフルトソセージに良く用いられてきたものである。
【００２０】
サリシンは、解熱・鎮痛剤であるアスピリンのリード化合物として良く知られている。アスピリンより胃腸障害が少ないという利点があり、サリシンを含有するヤナギ樹皮は、ヨーロッパを中心に、その価値が再度見直されているものである。サリシンは下記化学式で示される。
【化２】
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サリシンを含む植物として、ヤナギ樹皮以外にはスィートバーチ（Betula lenta）、ホワイトバーチ（Betula pendula）、セイヨウナツユキソウ（Filipendula ulmaria）、ウィンターグリーン（Gaultheria procumbens）、バルサムポプラ（Populus balsamifera）、などが挙げられる。
【００２１】
上記列挙した植物は、葉、茎、芽、花、木質部、木皮部（樹皮）等の地上部、及び、根、塊茎等の地下部、種子、樹脂等すべての部位が使用可能である。
上記列挙した植物は、そのまま、抽出物、抽出物の加水分解物、又は植物の加水分解物として使用可能である。
本発明の組成物を植物から得るための抽出方法としては、例えば、タイムの全草を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、タイムの全草を圧搾して得られる搾汁等を適当な溶媒で抽出し、場合によっては加水分解処理を施し、不溶部分を濾過等で取り除きこの液から溶媒を除去した後にカラムクロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いて目的物を得る方法が挙げられる。その際、バイオアッセイを並行して行い、管腔形成の阻害を指標として精製を進めることが望ましい。
【００２２】
抽出に用いる溶媒としてはメタノール、エタノール、プロパノール、１,３ブチレングリコール等のアルコール類、エーテル、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒、水等が挙げられる。これら溶媒は単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。抽出条件は、特に限定されないが、例えば、温度は５〜９５℃、好ましくは１５〜８５℃で常温でも好適に抽出することが出来る。
圧力は常圧、加圧、減圧の何れでも良い。
抽出時間は選定した溶媒によっても異なるが数分〜数時間であり、反復抽出、振とう抽出、抽出時間の延長等により抽出効率を高めることができる。
【００２３】
また、加水分解を行う場合、グリコシダーゼやエステラーゼのような酵素による分解や、乳酸菌や酵母等の微生物による分解、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸等の酸による分解、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリによる分解等が挙げられる。加水分解の条件は、特に限定されないが酵素や微生物を用いる場合は使用する酵素や微生物の至適温度、ｐHに合わせ、通常、１０〜５５℃、ｐH３〜８、５〜２４時間程度、加水分解を行う。酸やアルカリを用いて加水分解を行う場合、通常、２〜１５重量％の濃度で常温〜６０℃にて０．５〜２４時間程度、加水分解を行う。
これら抽出物や抽出加水分解物は、必要に応じてｐH調整を行った後、凍結乾燥、減圧蒸留、減圧・真空乾燥、スプレードライ等の公知の方法で濃縮乾燥物を得ことが出来る。精製処理の方法については特に限定されないが、例えば、順相及び逆相クロマトグラフィーによる精製、再結晶、再沈殿、脱色処理、脱臭処理等を組み合わせて精製することができる。
【００２４】
上記方法より抽出された、タイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）の抽出物あるいはサリシン及びサリシンを含有する植物はヒト血管内皮細胞を用いた管腔形成モデル及びマウスを用いた血管新生阻害作用確認試験において、強い阻害活性を示した。このことから、本発明の組成物は、リウマチや腫瘍をはじめとする血管新生に関わる疾患の予防及び治療に極めて有用な血管新生阻害用組成物である。
【００２５】
更に、リウマチに対してはキャッツクロー（Uncaria tomentosa）、ヤナギ樹皮（Salix spp.）、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン等の抗炎症剤や、グルコサミン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンあるいはそのペプチド等と併用することにより、更に優れた効果を発揮し、抗リウマチ用組成物として利用可能である。本発明における「リウマチ」とは、慢性関節リウマチ、変形性関節症などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
また、腫瘍に対しては既に抗腫瘍活性が知られているアガリクス（Agaricus blazei）、メシマコブ（Pellinus yucatensis）、マイタケ（Grifola frondose）、プロポリス、ビタミンE、βカロチン、カテキン類等に加え、キャッツクロー、ヤナギ樹皮、アスピリン、サリチル酸、インドメタシン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、エテンザミド、イソプロピルアンチピリン等の抗炎症剤と併用することにより、更に優れた効果を発揮し、抗腫瘍用組成物として利用可能である。
【００２６】
本発明における「腫瘍」とは、良性及び悪性腫瘍を含み、例えば、胃癌、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌、脳腫瘍、神経鞘腫、直腸癌、結腸癌、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、胆管癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、大腸癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、骨腫瘍、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、小児固形癌、カボジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組識球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、白血病などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
本発明における「血管内皮細胞の増殖、遊走、又は血管の新生に起因する疾患」とは、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、網膜中心動脈閉塞症、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、角膜汚濁、動脈硬化症、歯周病、強皮症、乾癬、加齢黄斑変性症、皮膚疾患、緑内障、肥厚性瘢痕、虚血を来たす病態、粥状動脈降下巣外膜の異常毛細血管網、アレルギー性炎症、気道性炎症、腎炎、慢性炎症などを挙げることができるがこれらに限定されるわけではない。
本発明の組成物は、食品、医薬品等として使用できる。栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として使用しても良い。投与に関しては、有効成分を経口投与、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体として混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル、等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。上記の医薬品用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。また、食品としては、ジュースのような飲料に配合することもできる。
【００２７】
本発明により選定されたタイム（Thymus vulgaris）、タラゴン（Artemisia dracunculus）、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）の乾燥物、抽出物、抽出加水分解物あるいはサリシンの有効投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の活性の強さ等により、適宜選択決定されるが、例えば、経口用の場合、タイム抽出物の投与量は、1日あたり１〜５００００mgが好ましく、特に好ましくは１０〜１００００mgである。タラゴン抽出物の投与量は、1日あたり１〜５００００mgが好ましく、特に好ましくは１０〜１００００mgである。ナツメグ抽出物の投与量は、1日あたり１〜５００００mgが好ましく、特に好ましくは１０〜１００００mgである。メース抽出物の投与量は、1日あたり１〜５００００mgが好ましく、特に好ましくは１０〜１００００mgである。サリシンの投与量は、1日あたり１〜２０００mgが好ましく、特に好ましくは２０〜５００mgである。抗リウマチ用組成物としては、例えば、併用がヤナギ樹皮抽出物の場合、１日あたり５〜５０００mgが好ましく、特に好ましくは、５０〜１６００mgである。また、抗腫瘍用組成物としては、例えば、併用がアガリクス抽出物の場合、1日あたり１００〜５０００mgが好ましく、特に好ましくは５００〜２０００mgである。これらは、1日に数回に分けて投与しても良い。
【００２８】
また、本発明の組成物は皮膚外用として、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
本発明の組成物の皮膚外用における含有量は、症状の違いにより適宜選択されるが、例えば、タイム抽出物の場合、全重量の０．００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％である。タラゴン抽出物の場合、全重量の０．００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％である。ナツメグ抽出物の場合、全重量の０．００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％である。メース抽出物の場合、全重量の０．００１〜５０重量％程度、好ましくは０．０１〜１０重量％である。サリシンの場合、全重量の０．０１〜２０重量％程度、好ましくは０．０２〜２重量％である。また、抗炎症剤を併用する場合、例えばインドメタシンでは、含有量は０．００１〜２０重量％が好ましく、特に好ましくは、０．１〜１重量％である。これを１〜４回／日に分けて塗布することももちろん差し支えない。
【００２９】
以下に実施例を挙げて、具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
実施例１（植物の抽出）
タイム（Thymus vulgaris）全草、タラゴン（Artemisia dracunculus）の葉、ナツメグ（Myristica fragrans）、メース（Myristica fragrans）についてそれぞれの乾燥物１０００ｇに９０％エタノール液１２Ｌ（リットル）を加え、４０℃、５時間攪拌し、ろ紙によりろ液を回収した。この操作を２回繰り返し、ろ液をエバポレーターにて減圧濃縮し、エタノール溶媒を取り除いた。その結果、それぞれの植物からの抽出物の乾燥重量１９７．３ｇ、２６８．２ｇ、８６．４ｇ、１９０．８gを得た。
【実施例２】
【００３１】
実施例2（細胞増殖阻害試験）
ヒト内皮細胞増殖阻害試験にはKT４−T１正常ヒト臍帯由来静脈内皮細胞（HUVEC）を用いた。ゼラチンをコートした24マルチウェルプレート（ファルコン社）にKT４−T１を５×１０３ cells／cm２に播種し、10％のウシ胎児血清（以下、FBSと略す）含有MCDB104培地に成長因子カクテル（EEP；ECGF１００ng／ml＋EGF１０ng／ml＋ヘパリン１００μg／ml）を添加した条件にて２４時間培養した。その後、実施例１の抽出物を最終濃度５０μg／mlとなるよう添加し７２時間培養後、コルターカウンター（ベックマン・コルター社）にて生存する細胞数を計測し、増殖阻害率を求めた。増殖阻害率は、エタノール溶媒を添加した対照群との比較によって次式により算出した。
増殖阻害率＝（１−抽出物添加群の生存細胞数／対照群の生存細胞数）×１００
【００３２】
また、内皮細胞増殖阻害活性の特異性を検証するため、線維芽細胞の増殖阻害試験と比較検討した。線維芽細胞増殖阻害試験にはASF４−1（正常ヒト上腕内側部由来線維芽細胞）を用いた。24マルチウェルプレート（ファルコン社）にASF４−１を５×１０３ cells／cm２播種し、10％ FBS含有MEM（Minimum essential medium）培地にて２４時間培養した。その後、実施例１の抽出物を最終濃度５０μg／mlとなるよう添加し７２時間培養後、コルターカウンター（ベックマン・コルター社）にて生存する細胞数を計測し増殖阻害率を求めた。増殖阻害率は、エタノール溶媒を添加した対照群との比較によって次式により算出した。
増殖阻害率＝（１−抽出物添加群の生存細胞数／対照群の生存細胞数）×１００
血管新生阻害作用を目的として、植物抽出物をスクリーニングする際には、生体に目的外の影響を及ぼさないために、内皮細胞の増殖を特異的に阻害するものを選択することが必要である。そこで、線維芽細胞増殖阻害率５０％以下を目安として、抽出物を選択している。結果を表１に示す。また、図１及び２では、評価した内皮細胞（図１内皮細胞増殖試験結果（実測値）参照）及び線維芽細胞の生細胞数（図２ 線維芽細胞増殖試験結果（実測値）参照）を実数値で示す。
タイム抽出物の内皮細胞及び線維芽細胞増殖阻害率は、それぞれ６４．０％と４９．５％で、やや特異性は低いものの内皮細胞の増殖阻害活性が観察された（表１及び図１，２）。
タラゴン抽出物の内皮細胞及び線維芽細胞増殖阻害率は、それぞれ３３．３％と４１．０％であり、内皮細胞、線維芽細胞どちらも増殖があまり阻害されなかった（表１及び図１、２）。但し、後に示す実施例３のスクリーニングでは管腔形成阻害作用が認められている。
ナツメグ抽出物の内皮細胞及び線維芽細胞増殖阻害率は、それぞれ８３．８％と３９．９％であり、内皮細胞増殖を選択的に強く阻害し血管新生阻害効果が推測された（表１及び図１、２）。
メース抽出物の内皮細胞及び線維芽細胞増殖阻害率は、それぞれ８８．２％と４８．３％であり、内皮細胞増殖を選択的に強く阻害し血管新生阻害効果が推測された（表１及び図１、２）。
【００３３】
【表１】
2005206533.tif 000005
【実施例３】
【００３４】
実施例３（管腔形成阻害試験）
０．２１％コラーゲンゲル（高研社）を２４マルチプレートに下層２００μl／well、上層１５０μl／well添加し、その間にKT４−T１（正常ヒト臍帯由来静脈内皮細胞）を１．２×１０５cells/well播種してサンドイッチした。これに、１０ng／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂFGF）と８nMのホルボールミリステートアセテート（PMA）を添加した培養液を加えて管腔形成を誘導し、更に同時に実施例１の抽出物を最終濃度３．１２５μg／ｍｌ、１２．５μg／ｍｌ、５０μg／ｍｌとなるよう添加し、４８時間後に顕微鏡下においてその阻害活性を観察した。
【００３５】
培養血管内皮細胞における管腔形成は、細胞が細長く伸長し、互いに融合し合って個々の細胞の境界が判別できないような網目状のネットワークを形成した状態として観察することができる。この複雑な網目状のネットワークが維持されていれば管腔形成が充分に行われており、ネットワークが細くなったり途切れたりしていれば管腔形成が弱く阻害され、個々の細胞が融合せずに丸くなって一個一個区別できれば、管腔形成が強く阻害されていることになる。そこで、管腔形成の阻害評価は、網目状ネットワークの維持や細胞の伸展の程度、個々の細胞が区別できるか等の基準から、（１）全く阻害しない、（２）低度に阻害する、（３）中度に阻害する、（４）高度に阻害する、の４段階で評価した。その結果を表２に示し、実際の阻害活性の様子を図３〜１５に示す。
【００３６】
図３は対照群、タイム抽出物は図４〜６、タラゴン抽出物は図７〜９、ナツメグ抽出物は図１０〜１２、メース抽出物は図１３〜１５にそれぞれ３．１２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの添加濃度の結果が写真で示されている。
それぞれの活性は、次のとおりである。
図３は実施例１の抽出物を添加していない対照群の管腔形成の写真であり、ＫＴ４−Ｔ１細胞（正常ヒト臍帯由来静脈内皮細胞）が細長く伸長し、互いに融合し合って個々の細胞の境界が判別できないような網目状のネットワークを形成している。
【００３７】
図４〜６はタイム抽出物を添加したときの管腔形成阻害の様子である。タイム抽出物を３．１２５μｇ／ｍｌ添加したものは管腔形成を全く阻害していないが（図４）、１２．５μｇ／ｍｌの添加で管腔形成が減少し、網目が細くなり、途切れており、低度に管腔形成が阻害された（図５）。さらに５０μｇ／ｍｌ添加することにより、個々の細胞が融合せずに丸くなり管腔形成が高度に阻害された（図６）。
図７〜９はタラゴン抽出物を添加したときの管腔形成阻害の様子である。タラゴン抽出物を３．１２５μｇ／ｍｌ添加したものは管腔形成を全く阻害していないが（図７）、１２．５μｇ／ｍｌの添加で管腔形成が減少し、網目が細くなり、途切れており、低度に管腔形成が阻害された（図８）。さらに５０μｇ／ｍｌ添加することにより、一部の細胞が細く伸び、一部細胞の融合が認められるが、網目状のネットワークは殆ど認められず、管腔形成が中度に阻害された（図９）。
【００３８】
図１０〜１２はナツメグ抽出物を添加したときの管腔形成阻害の様子である。ナツメグ抽出物を３．１２５μｇ／ｍｌ添加したものは管腔形成を全く阻害していないが（図１０）、１２．５μｇ／ｍｌの添加で一部の細胞が細く伸びているが、細胞の融合、網目状のネットワークが全く認められず、管腔形成が高度に阻害された（図１１）。さらに５０μｇ／ｍｌ添加することにより、個々の細胞が融合せずに丸くなり管腔形成が高度に阻害された（図１２）。
【００３９】
図１３〜１５はメース抽出物を添加したときの管腔形成阻害の様子である。メース抽出物を３．１２５μｇ／ｍｌ添加したものは網目状のネットワークを形成するものの、細胞が細くなっており低度に管腔形成が阻害された（図１３）、１２．５μｇ／ｍｌの添加で一部の細胞が細く伸びているが、細胞の融合、網目状のネットワークが全く認められず、管腔形成が高度に阻害された（図１４）。さらに５０μｇ／ｍｌ添加することにより、個々の細胞が融合せずに丸くなり管腔形成が高度に阻害された（図１５）。
【００４０】
これらの結果より、実施例１より抽出したタイム抽出物、タラゴン抽出物、ナツメグ抽出物、メース抽出物は濃度依存的に血管内皮細胞の管腔形成を阻害した。実施例２ではタイム抽出物の内皮細胞増殖阻害率がやや低く、また、タラゴン抽出物の内皮細胞増殖阻害はわずかしか認められなかったが、管腔形成阻害活性はタイム抽出物、タラゴン抽出物、ナツメグ抽出物、メース抽出物全てほぼ同等の効果を示す。従って、内皮細胞の増殖抑制に起因する作用機序以外に、管腔形成に特異的に作用する機序があることが考えられた。
【００４１】
【表２】
2005206533.tif 000006
【実施例４】
【００４２】
実施例４（マウス背部皮下法を用いた血管新生阻害作用の評価）
非上皮性組織由来の悪性腫瘍Sarcoma 180（S-180）の細胞懸濁液（ＰＢＳに懸濁）を１．０×１０６ cells/０．１５ mlずつ入れたメンブレンチャンバーを作製し、これをマウス背部皮下に挿入して５日間血管新生を誘導した。実施例１の抽出物及び合成品であるサリシンを被験剤とし、皮下移植１週間前よりそれぞれの濃度の混餌食を与えた。誘導開始から５日後、背部標的皮膚組織の摘出を行い、実態顕微鏡で観察して新生血管の本数を測定し、その本数をＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｅｘとして評価した。血管新生を誘導していない陰性対照群にはＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）を、血管新生を誘導した陽性対照群はＳ−１８０を移植した新生血管とした。
【００４３】
その結果を図１６〜２９に示す。図１７〜２５は代表的な写真を示しており、各条件で５検体を観察し、観察視野における新生血管の本数を平均化したものを図１６マウス背部皮下法における血管新生阻害試験結果（実施例１の抽出物）のグラフに示す。
図１７はメンブレンチャンバーに細胞フリーのPBSを添加した陰性対照群の血管の写真である。太い既存血管と少量の細い血管が認められるが血管の新生はほとんど認められない。
図１８はメンブレンチャンバーにＳ−１８０・ＰＢＳ液を添加した陽性対照群の血管の写真である。陰性対照群にも存在する太い既存血管、細い血管に加えて、くねくねと細かく波打った血管が明確に新生している。新生された血管数は平均８．７５±２．５（±は標準偏差を示す）であった（図１６）。
ナツメグ抽出物を０．２５％（図２１）、０．５％（図２２）、１％（図２３）の混餌食を与えたマウス、メース抽出物を１％（図２４）、１．５％（図２５）の混餌食を与えたマウスにおいて、その新生血管の本数は、それぞれ６±２．３、４±０．９、４．５±１．２、４．５±１．５、３．７±２．５であった（図１６）。
【００４４】
これらの結果は、陽性対照群の新生血管に対して約半数であり、ナツメグ及びメース抽出物は濃度依存的に血管新生を阻害したことを示している。タイム抽出物は１０％混餌食としてマウスに与え、濃度が高いながらも新生血管の本数が４±０．６と陽性対照群の半数以下に抑えられた（図１６、図１９参照）。タラゴン抽出物も同様に１０％混餌食として与えたが、他の抽出物と比較して弱いながらも血管新生の阻害作用（６．４±１．２）を示した（図１６、図２０参照）。
【００４５】
サリシンの血管新生阻害試験結果を図２７〜２９に示す。
図２７、２８は図１７、１８と同様にそれぞれ陰性対照群、陽性対照群の血管の写真である。図２６は、サリシンの血管新生阻害試験結果のグラフを示す。図２６のグラフで陰性対照群のＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｅｘが１．６±０．９本であるが、これは、マウス背部皮下にメンブレンチャンバーを挿入した際の、創傷治癒に基づく新生血管である。陰性対照群であっても、血管の新生が観察されることがあり、ベースラインとして計測した。陽性対照群の新生血管数は６．７±１．１（図２６）であった。尚、図２６に示した値は５検体の平均値である。
図２９は非ステロイド型の抗炎症剤であるサリシンを１％配合した混餌食を与えた結果である。新生血管の本数は３．５±０．５（図２６）であり、陰性対照群で観察された新生血管の本数（ベースライン）を差し引いて比較すると、新生血管の本数が陽性対照群の約半数に抑えられ、サリシンの強い血管新生阻害作用が認められた。
【００４６】
以上の結果より、実施例１の植物抽出物及びサリシンは血管新生を発生の起因とする疾病、例えばリウマチや腫瘍の予防や治療に対して有用性を示すものである。
【００４７】
処方例1
[錠剤の製造]
実施例1で得たタイム（Thymus vulgaris）全草のエタノール抽出物とヤナギ樹皮（Salix spp.）抽出物を用いて常法に従って、下記組成の錠剤を製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
タイム抽出物                                 30
ヤナギ樹皮抽出物                             25
乳糖                                         32
コーンスターチ                               12
グァーガム                                    1
【００４８】
処方例2
[ジュースの製造]
実施例1で得たタイム（Thymus vulgaris）全草のエタノール抽出物を用いて常法に従って、下記組成のジュースを製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
果糖ブトウ糖液糖                             5.00
クエン酸                                    10.40
L−アスコルビン酸                            0.50
香料                                         0.02
色素                                         0.10
タイム抽出物                                 2.00
精製水                                       8.98
【００４９】
処方例3
[軟膏の製造]
実施例1で得たタイム（Thymus vulgaris）全草のエタノール抽出物とインドメタシンを用いて常法に従って、下記組成の軟膏を製造した。
（組成）                               （配合；重量％）
白色ワセリン                                 24.00
プロピレングリコール                         12.00
ステアリルアルコール                         20.00
パラオキシ安息香酸メチル                      0.05
タイム抽出物                                  4.00
インドメタシン                                2.00
香料                                          0.10
精製水                                       42.85
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】内皮細胞増殖阻害試験結果（実測値）を示すグラフ
【図２】線維芽細胞増殖阻害試験結果（実測値）を示すグラフ
【図３】管腔形成阻害活性試験の写真（対照群の管腔形成）
【図４】管腔形成阻害活性試験の写真 （タイム抽出物の管腔形成阻害作用 濃度３．１２５μｇ／ｍｌ）
【図５】管腔形成阻害活性試験の写真（タイム抽出物の管腔形成阻害作用 濃度１２．５μｇ／ｍｌ）
【図６】管腔形成阻害活性試験の写真（タイム抽出物の管腔形成阻害作用 濃度５０μｇ／ｍｌ）
【図７】管腔形成阻害活性試験の写真（タラゴン抽出物の管腔形成阻害作用 濃度３．１２５μｇ／ｍｌ）
【図８】管腔形成阻害活性試験の写真（タラゴン抽出物の管腔形成阻害作用 濃度１２．５μｇ／ｍｌ）
【図９】管腔形成阻害活性試験の写真（タラゴン抽出物の管腔形成阻害作用 濃度５０μｇ／ｍｌ）
【図１０】管腔形成阻害活性試験の写真（ナツメグ抽出物の管腔形成阻害作用 濃度３．１２５μｇ／ｍｌ）
【図１１】管腔形成阻害活性試験の写真（ナツメグ抽出物の管腔形成阻害作用 濃度１２．５μｇ／ｍｌ）
【図１２】管腔形成阻害活性試験の写真（ナツメグ抽出物の管腔形成阻害作用 濃度５０μｇ／ｍｌ）
【図１３】管腔形成阻害活性試験の写真（メース抽出物の管腔形成阻害作用 濃度３．１２５μｇ／ｍｌ）
【図１４】管腔形成阻害活性試験の写真（メース抽出物の管腔形成阻害作用 濃度１２．５μｇ／ｍｌ）
【図１５】管腔形成阻害活性試験の写真（メース抽出物の管腔形成阻害作用 濃度５０μｇ／ｍｌ）
【図１６】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験結果（実施例１の抽出物）を示すグラフ
【図１７】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（陰性対照群（ＰＢＳ）の血管新生）
【図１８】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（陽性対照群（Ｓ-１８０移植）の血管新生）
【図１９】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（タイム抽出物の血管新生阻害作用 タイム抽出物１０％混餌食）
【図２０】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（タラゴン抽出物の血管新生阻害作用 タラゴン抽出物１０％混餌食）
【図２１】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（ナツメグ抽出物の血管新生阻害作用 ナツメグ抽出物０．２５％混餌食）
【図２２】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（ナツメグ抽出物の血管新生阻害作用 ナツメグ抽出物０．５％混餌食）
【図２３】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（ナツメグ抽出物の血管新生阻害作用 ナツメグ抽出物１％混餌食）
【図２４】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（メース抽出物の血管新生阻害作用 メース抽出物１％混餌食）
【図２５】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（メース抽出物の血管新生阻害作用 メース抽出物１．５％混餌食）
【図２６】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験結果（サリシン）を示すグラフ
【図２７】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（陰性対照群（ＰＢＳ）の血管新生）
【図２８】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（陽性対照群（Ｓ-１８０移植）の血管新生）
【図２９】マウス背部皮下法における血管新生阻害試験の写真（サリシンの血管新生阻害作用 サリシン１％混餌食）
【図１】
2005206533.tif 000007
【図２】
2005206533.tif 000008
【図３】
2005206533.tif 000009
【図４】
2005206533.tif 000010
【図５】
2005206533.tif 000011
【図６】
2005206533.tif 000012
【図７】
2005206533.tif 000013
【図８】
2005206533.tif 000014
【図９】
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【図１０】
2005206533.tif 000016
【図１１】
2005206533.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2005206533.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2005206533.tif 000022
【図１７】
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【図１８】
2005206533.tif 000024
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2005206533.tif 000031
【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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