(57)【要約】【課題】細胞外からその脂肪細胞分化を制御することができる脂肪前駆細胞、および上述の細胞を使用して脂肪細胞分化を調節することができる化合物を検索するためのスクリーニング方法を提供することを課題とする。【課題を解決するための手段】ドキシサイクリンにより誘導可能なプロモーター領域の下流にStat5遺伝子を発現可能に連結したDNA構造を有する、株化脂肪前駆細胞を樹立した。脂肪前駆細胞において脂肪細胞分化を誘導し；脂肪細胞分化を誘導した上述の細胞を、被検化合物と接触させ；被検化合物と接触させた上述の細胞の脂肪細胞分化の程度を測定し；上述した細胞の脂肪細胞分化の程度と対照細胞の脂肪細胞分化の程度とを比較して、被検化合物の脂肪細胞分化誘導調節活性を判定すること；を含む、脂肪細胞分化誘導調節活性を有する化合物のスクリーニング方法を確立した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドキシサイクリンにより誘導可能なプロモーター領域の下流にStat5遺伝子を発現可能に連結したDNA構造を有する、株化脂肪前駆細胞。
【請求項２】
Stat5遺伝子が野生型Stat5をコードする遺伝子である、請求項１に記載の株化脂肪前駆細胞。
【請求項３】
Stat5遺伝子がドミナントネガティブ型Stat5をコードする遺伝子である、請求項１に記載の株化脂肪前駆細胞。
【請求項４】
細胞外からドキシサイクリンを添加することによりStat5を誘導し、PPARγの活性を調節することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の株化脂肪前駆細胞。
【請求項５】
株化脂肪前駆細胞が、脂肪前駆細胞株3T3-L1細胞（NIHS細胞バンク、カタログ番号：JCRB9014）に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の株化脂肪前駆細胞。
【請求項６】
以下の工程：
i)  請求項１〜５のいずれか１項に記載の株化脂肪前駆細胞において脂肪細胞分化を誘導する工程；
ii)  脂肪細胞分化を誘導した上述の細胞を、被検化合物と接触させる工程；
iii）  被検化合物と接触させた上述の細胞の脂肪細胞分化の程度を測定する工程；
iv）  上述した細胞の脂肪細胞分化の程度と対照細胞の脂肪細胞分化の程度とを比較して、被検化合物の脂肪細胞分化誘導調節活性を判定する工程；
を含む、脂肪細胞分化誘導調節活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、工程i）およびii）はいずれを先に行ってもあるいは同時に行ってもよく、その後工程iii）および工程iv）を行う、前記スクリーニング方法。
【請求項７】
脂肪細胞分化誘導調節活性が、脂肪細胞分化誘導抑制活性である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
脂肪細胞分化誘導調節活性が、脂肪細胞分化誘導亢進活性である、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
脂肪細胞分化の程度をルシフェラーゼを用いたリポーター遺伝子アッセイにより決定する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
脂肪細胞分化の程度をStat5のリン酸化を測定することにより決定する、請求項６〜８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
脂肪細胞分化の程度を細胞を脂肪染色することにより決定する、請求項６〜９のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
脂肪細胞分化をドキシサイクリン処理の後、脂肪細胞分化誘導カクテルにより誘導する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
脂肪細胞分化誘導カクテルが、ウシ胎児血清（FBS）、デキサメタゾン（DEX）、メチルイソブチルキサンチン（MIX）、およびインスリンからなる、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により得られた、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を抑制することができる化合物。
【請求項１５】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法により得られた、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を亢進することができる化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞外からStat5を誘導し、PPARγの活性を調節することができる、株化脂肪前駆細胞を提供することに関する。本発明はさらに、前記株化脂肪前駆細胞を用いる、肥満抑制活性を有する化合物のスクリーニング方法を提供することに関する。本発明はさらに、当該スクリーニング方法により得られた、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を調節することができる化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脂肪細胞は、栄養性エネルギーの合成、貯蔵および加水分解において重要な働きをしている。脂肪細胞は、カロリー過剰な期間はトリグリセリドを貯蔵し、しかしカロリー不十分な期間はこの蓄えを流通させる。発生の間、脂肪細胞は酵素および付属タンパク質の完全な補足物を獲得し、de novo脂質生成、リポタンパク質加水分解、細胞内脂肪酸輸送、および脂肪分解を行う（Cornelius, P., et al., 1994. Annu Rev Nutr. 14:99-129）。
【０００３】
脂質の貯蔵に加えて、脂肪細胞は、レプチン（leptin）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、レジスチン（resistin）、およびアディポネクチン（adiponectin）などの多数の生理活性物質を分泌する（Steppan, C.M., et al., 2001. Nature. 409:307-312；Gregoire, F.M., et al., 1998. Physiol Rev. 78:783-809；Maeda, K., et al., 1996. Biochem Biophys Res Commun. 221:286-289）。これらの中で、レプチンはエネルギー代謝の制御において摂食抑制シグナルを媒介し、一方TNF-αおよびレジスチンは肥満におけるインスリン抵抗性に関与している（Kahn, B.B., and J.S. Flier. 2000. J Clin Invest. 106:473-481；Hotamisligil, G.S. 1999. J Intern Med. 245:621-625；Steppan, C.M., et al., 2001. Nature. 409:307-312）。
【０００４】
脂肪細胞はまた、肝臓グルコース代謝および末梢グルコース代謝の制御に寄与するグリセロールおよび遊離脂肪酸を取り込みそして放出する。グルコース恒常性に関して、脂肪組織は、心筋および骨格筋とともに、これらの細胞中へのそして食後の循環からのグルコースの取り込みを促進する、インスリン-依存性グルコーストランスポーター4（GLUT4）を発現しそして制御することが知られる数少ない組織である（Kahn, B.B. 1996. Lilly lecture 1995. Diabetes. 45:1644-1654）。したがって、脂肪細胞分化プログラムは、細胞形態、トリグリセリドの貯蔵および放出、グルコース代謝、そしてエネルギー恒常性などの分子的イベントのすべての側面に関与する遺伝子の制御を含む。
【０００５】
脂肪組織の過剰な蓄積により特徴付けられる肥満は、西欧諸国に影響を与えており、そしてインスリン抵抗性の主要な危険因子でありそして糖尿病、高血圧、、心臓血管疾患などの病理学的状態に寄与する。それゆえ、脂肪細胞分化の分子的基礎をよりよく理解することは、治療的関与の開発に扉を開く。
【０００６】
脂肪細胞分化誘導は、環境的因子および細胞内因子の両方から発せられるシグナルの相互作用により調節される複雑なプロセスである（MacDougald, O.A., and M.D. Lane. 1995. Annu Rev Biochem. 64:345-373；Fajas, L., et al., 1998. Curr Opin Cell Biol. 10:165-173；Rosen, E.D., et al., 2000. Genes Dev. 14:1293-1307）。3T3-L1や3T3-F422Aなどの脂肪前駆細胞株は、in vitroモデルとして供され、分化プロセスの間の転写を介した複雑なカスケードを詳細に描写する。直接的に脂肪細胞の発生に影響を及ぼす転写因子の3つの型が同定された。これらには、CCAAT-エンハンサー結合タンパク質（C/EBPs）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（PPARγ）および脂肪細胞決定分化因子1／ステロール応答配列結合タンパク質-1c（ADD1/SREBP-1c）が含まれる（Morrison, R.F., and S.R. Farmer. 1999. J Cell Biochem. Suppl:59-67；Rosen, E.D., et al., 2000. Genes Dev. 14:1293-1307；MacDougald, O.A., and M.D. Lane. 1995. Annu Rev Biochem. 64:345-373；Fajas, L., et al., 1998. Curr Opin Cell Biol.
10:165-173）。
【０００７】
これらの中で、C/EBPβおよびδは、脂肪細胞分化誘導の初期段階で誘導され、そしてそれに引き続く脂肪細胞分化プログラムの完了に必要とされる（Cao, Z., et al., 1991. Genes Dev. 5:1538-1552；Wu, Z., et al., 1995. Genes Dev. 9:2350-2363；Yeh, W.C., et al., 1995. Genes Dev. 9:168-181）。in vitroの研究により、C/EBPβの過剰発現および程度は低いもののC/EBPδの過剰発現が、脂肪前駆細胞またはNIH-3T3細胞の脂肪細胞への転化を導く（Yeh, W.C., et al., 1995. Genes Dev. 9:168-181；Wu, Z., et al., 1995. Genes Dev. 9:2350-2363）。
【０００８】
遺伝子ノックアウト実験により、C/EBPβまたはδを欠損させることにより、結果として胎仔線維芽細胞の脂肪細胞分化の潜在性が若干減少し、その一方で両方の欠損により重度の障害が導かれることが示された（Tanaka, T., et al., 1997. Embo J. 16:7432-7443）。C/EBPαは、分化の比較的後期、すなわちPPARγの誘導の後であるが完全に分化した細胞に特徴的な多くの酵素およびタンパク質の合成の前に、誘導される（Fajas, L., et al., 1998. Curr Opin Cell Biol. 10:165-173）。C/EBPβの場合と同様に、線維芽細胞におけるC/EBPαの過剰発現は、その細胞が脂肪細胞に転化するために十分である（Lin, F.T., and M.D. Lane. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A. 91:8757-8761；Freytag, S.O., et al., 1994. Genes Dev. 8:1654-1663）。さらに、C/EBPαノックアウトマウスは、白色脂肪組織（WAT）および褐色脂肪組織（BAT）における脂肪蓄積の劇的な減少を示す（Wang, N.D., et al., 1995. Science. 269:1108-1112）。これらの知見から、これらのC/EBPは、脂肪細胞発生においてきわめて重大な役割を果たしていることが示される。
【０００９】
現在のところ、C/EBPβおよびδの誘導は、引き続いて起こるPPARγの発現に欠くことができないものであると考えられている（Wu, Z., et al., 1996. Mol Cell Biol. 16:4128-4136）。機能獲得（gain of function）実験により、PPARγのアゴニストの存在下においてPPARγを過剰発現させることが、線維芽細胞および筋芽細胞を含む様々な細胞型において脂肪細胞分化を誘導させるために十分なものであることが示された（Tontonoz, P., et al., 1994. Cell. 79:1147-1156；Hu, E., et al., 1995. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9856-9860）。補充的には、遺伝子欠損実験により、脂肪細胞分化誘導にPPARγが必須の働きを示すことが示された（Rosen, E.D., et al., 1999. Mol Cell. 4:611-617；Kubota, N., et al., 1999. Mol Cell. 4:597-609；Barak, Y., et al., 1999. Mol Cell. 4:585-595）。
【００１０】
ADD1/SREBP-1cは、脂肪細胞分化に関連する第3の転写因子である（Tontonoz, P., et al., 1993. Mol Cell Biol. 13:4753-4759）。線維芽細胞におけるADD1の過剰発現により、PPARγアゴニストの存在下における線維芽細胞の脂肪細胞への転化を導く（Kim, J.B., and B.M. Spiegelman. 1996. Genes Dev. 10:1096-1107）。最近の研究では、ADD1/SREBP-1cがPPARγの発現を直接的にまたは内在性のリガンドの産生を介して活性化し、その結果細胞が脂肪細胞へ分化できるようになると考えられている（Fajas, L., et al., 1999. Mol Cell Biol. 19:5495-5503；Kim, J.B., et al., 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95:4333-4337）。
【００１１】
現在、これらの因子が脂肪細胞分化において脂肪細胞分化誘導促進因子（proadipogenic factors）として機能することは明らかである。しかしながら、これらのすべての因子が、分化の前には、検出できないかあるいは非常に低レベルでしか発現されず、そしてそれらの発現は脂肪細胞分化の誘導後にのみ増大することを確認すべきである。したがって、これらの因子の発現は、脂肪細胞分化誘導刺激の前に存在する（1または複数の）タンパク質により調節されると、考えられる。C/EBPβおよびδは、PPARγの誘導に必要であると考えられているが、C/EBPβおよびδの二重ノックアウトマウスの実験から得られたin vivoのデータから、C/EBPβ-非依存性経路およびδ-非依存性経路がPPARγおよびC/EBPα発現を引き起こしているに違いないと示された（Tanaka, T., et al., 1997. Embo J. 16:7432-7443）。
【００１２】
3T3-L1細胞は、メチルイソブチルキサンチン（MIX）、デキサメタゾン（DEX）、インスリン、およびウシ胎児血清（FBS）を含有する脂肪細胞分化誘導カクテルによりチャレンジすると、分化を行う。MIXおよびDEXはそれぞれ、C/EBPβおよびδの直接的な誘導物質であるため（Cao, Z., et al., 1991. Genes Dev. 5:1538-1552）、FBSにより翻訳後修飾的に活性化される因子がC/EBPβおよびδとともに脂肪細胞分化誘導における役割を果たしている可能性があると予想した。脂肪細胞は、成長ホルモン受容体およびプロラクチン受容体などのいくつかのサイトカイン受容体を含有するため（McAveney, K.M., et al., 1996. Endocrinology. 137:5723-5726；Zou, L., et al., 1997. Metabolism. 46:114-118）、これらの受容体の機能を支持する（1または複数の）下流分子が、（1または複数の）候補分子である可能性があると考えられるが、これまでに脂肪細胞の分化を制御できるこのような分子は知られていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞外からその脂肪細胞分化を制御することができる脂肪前駆細胞を提供することを課題とする。本発明はまた、上述した細胞を使用して、脂肪細胞分化を調節することができる化合物を検索するためのスクリーニング方法を提供することも課題とする。本発明はまた、上述したスクリーニング方法により得られた、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を調節することができる化合物を提供することも課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の発明者らは、ドキシサイクリンにより誘導可能なプロモーター領域の下流にStat5遺伝子を発現可能に連結したDNA構造を有する、株化脂肪前駆細胞を樹立することにより、上記課題を解決することができることを示した。
【００１５】
本発明において、「株化脂肪前駆細胞」は、細胞外から誘導可能なように組み込まれたStat5を細胞外から誘導することにより、PPARγの活性を調節し、その結果として脂肪細胞分化を誘導することができる株化細胞のことをいい、好ましくは、上記の細胞外からの誘導を、ドキシサイクリンを細胞外から投与することにより行うことができる、株化細胞をいう。
【００１６】
前述したように、脂肪前駆細胞においては、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ（PPARγ；核酸配列としてSEQ ID NO: 5、アミノ酸配列としてSEQ ID NO: 6）が、脂肪細胞分化のマスターレギュレーター分子として機能していることが知られている（Tontonoz, P., et al., 1994. Cell. 79:1147-1156；Hu, E., et al., 1995. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9856-9860；Rosen, E.D., et al., 1999. Mol Cell. 4:611-617；Kubota, N., et al., 1999. Mol Cell. 4:597-609；Barak, Y., et al., 1999. Mol Cell. 4:585-595）。そしてPPARγの誘導の後、分化の比較的後期にC/EBPαが誘導されることも知られている（Fajas, L., et al., 1998. Curr Opin Cell Biol. 10:165-173）。C/EBPβまたはC/EBPδの誘導は、引き続いて起こるPPARγの発現に欠くことができないものであると考えられている（Wu, Z., et al., 1996. Mol Cell Biol. 16:4128-4136）。また、ADD1/SREBP-1cも脂肪細胞分化に関与しているが、PPARγの発現を直接的にまたは内在性のリガンドの産生を介して活性化していると考えられている（Fajas, L., et al., 1999. Mol Cell Biol. 19:5495-5503；Kim, J.B., et al., 1998. Proc Natl Acad Sci U S A. 95:4333-4337）。これらの事実、およびこれらのすべての因子が、分化の前には検出できないかあるいは非常に低レベルでしか発現されず、そしてそれらの発現は脂肪細胞分化の誘導後にのみ増大することを考え合わせた結果、C/EBPβ-非依存性経路およびδ-非依存性経路がPPARγおよびC/EBPα発現を引き起こしているに違いないと予想した（Tanaka, T., et al., 1997. Embo J. 16:7432-7443）。
【００１７】
本発明においてはまず、マウス個体の脂肪組織を含む種々の組織からmRNAを抽出し、ノザンブロットハイブリダイゼーションを行った。その結果、肝臓由来のmRNAにおけるStat5の発現レベルと比較して、白色脂肪細胞（WAT）由来のmRNAにおけるStat5の発現レベルが高いことが見出された。この結果、個体のWAT組織において、Stat5が何らかの役割を担うことが予想された。
【００１８】
これらの考察およびプロラクチンがNIH3T3の脂肪細胞分化誘導を刺激するという、発明者らの以前の報告に基づき（Nanbu-Wakao, R., et al., 2000. Mol Endocrinol. 14:307-316）、本発明の発明者らは、プロラクチン／成長ホルモン-シグナル伝達媒介物質であるStat5が、脂肪細胞分化において役割を果たしている可能性があると考えた。
【００１９】
Stat5は、2種類の非常に相同な遺伝子、Stat5A（Accession No.Z48538；核酸配列としてSEQ ID NO: 1、アミノ酸配列としてSEQ ID NO: 2）およびStat5B（Accession No.Z48539；核酸配列としてSEQ ID NO:3、アミノ酸配列としてSEQ ID NO: 4）、から構成されており、そして様々なサイトカインや成長因子のシグナル伝達トランスデューサーとして機能している。Stat5およびStat1タンパク質が、3T3-L1細胞またはNIH-3T3β／δ細胞の脂肪細胞分化の間、亢進調節されるが、一方Stat3およびStat6の発現は定常的なままであることも示された（Stephens, J.M., et al., 1996. J Biol Chem. 271:10441-10444；Stephens, J.M., et al., 1999. Biochem Biophys Res Commun. 262:216-222）。これらの知見から、Stat5が脂肪細胞発生に関与していることが示唆された。しかしながら、Stat5の発現が増加することと、脂肪細胞分化におけるPPARγの活性化との間にどのような関係があるかについては全く調べられていなかった。
【００２０】
本発明において、株化脂肪前駆細胞を作成するためには、適切なホルモンからなる脂肪細胞分化誘導処理をした場合に、脂肪細胞に転化する潜在性を有する細胞を使用することができる。具体的には、マウス胚線維芽細胞に由来する3T3-L1細胞、マウス胚由来の線維芽細胞様細胞であるNIH-3T3細胞、3T3-F422A、などを、起源細胞として使用することができるが、これらのものには限定されない。より好ましくは、3T3-L1細胞を使用する。これらの細胞に対する脂肪細胞分化誘導処理としては、例えば3T3-L1細胞の場合には、メチルイソブチルキサンチン（MIX）、デキサメタゾン（DEX）、インスリン、およびウシ胎児血清（FBS）を含有する脂肪細胞分化誘導カクテルによる処理が、またたとえばPPARγまたはADD1を過剰発現させたNIH-3T3細胞の場合には、FBS、MIX、DEX、およびインスリンの処理の48時間の後に、FBS、インスリンさらにPPARγのリガンドを添加する処理が知られている。
【００２１】
例えば起源細胞として使用することができる3T3-L1細胞は、ウシ血清（Calf Serum）中で培養を行う場合、線維芽細胞様の形態を示しているが、この細胞をコンフルエントな状態にして増殖を一旦停止した後、FBS、MIX、DEX、インスリンからなる脂肪細胞分化誘導カクテルを作用させ、分化培養を行うと、およそ8日間かけて細胞内部に脂肪滴を蓄積する脂肪細胞へと分化することが知られている。
【００２２】
本発明においては、これらの細胞に対して、細胞外から誘導可能なStat5遺伝子の発現系を組み込むことにより、株化脂肪前駆細胞を作成する。より具体的には、ドキシサイクリンを添加することにより細胞内部でのStat5遺伝子の発現を細胞外から誘導することができるStat5遺伝子発現系を組み込む方法、Lac Switch IIシステム（Stratagene）によりStat5遺伝子の発現を誘導することができるStat5遺伝子発現系を組み込む方法、などの、当該技術分野において既知の方法を改変するすることにより、目的とする株化脂肪前駆細胞を作成することができる。本発明においては、細胞外からドキシサイクリンを添加することにより細胞内部でのStat5遺伝子の発現を誘導することができるStat5遺伝子発現系を組み込む方法により、目的とする株化脂肪前駆細胞を作成することが好ましい。
【００２３】
ドキシサイクリンを添加することにより細胞外から目的遺伝子の発現を誘導することができる遺伝子発現系は、標的遺伝子の転写を、ドキシサイクリン（Dox）処理により開始することができる、リバース・テトラサイクリン-誘導トランス活性化因子（rtTA）系（Gossen, M., et al., 1995. Science. 268:1766-1769）を使用して作成することができる。この発現系は、生体に対して無毒性の化合物であるDoxが細胞膜を容易に通過すること、テトラサイクリンオペレーター（tetO）を高い特異性で認識するTetR（大腸菌由来のTn10テトラサイクリン（Tc）耐性オペロンのリプレッサー）の変異体であるリバースTetRがTetRとは逆の表現型、すなわちリバースTetRがtetOに結合することによりその下流に位置する目的遺伝子の発現を亢進するという表現型を示すこと、rtTAがDoxあるいは無水テトラサイクリンにより処理されるとプロモーターPtetを活性化すること、に基づいて作成されたものである。したがって、rtTA系の発現系を作成するためには、まずrtTAであるリバースTetRを細胞に安定的にトランスフェクトし、その後所望の目的遺伝子をプロモーターPtetの下流に発現可能に連結したテトラサイクリンオペロンの構造物をさらに安定的にトランスフェクトすることにより作成することができる。
【００２４】
本発明においては、Stat5遺伝子の発現を活性化させるため、プロモーターの下流に挿入する目的遺伝子として、Stat5遺伝子を挿入する。Stat5遺伝子には、Stat5AおよびStat5Bの2種類の異性体が存在しており、本発明においてはそのいずれを目的遺伝子として挿入してもよい。さらには、Stat5遺伝子を過剰発現した際の脂肪細胞分化に対する影響を確認するため、Stat5遺伝子の野生型（wt-Stat5）を使用する場合の他、ドミナントネガティブ型（dn-Stat5）を使用することもできる。ドミナントネガティブ型としては、Stat5のチロシンリン酸化を妨げる様なアミノ酸変異を起こしたStat5を使用することができ、例えばマウスStat5Aの694番アミノ酸であるチロシン（Yamashita, H., et al., J. Biol. Chem., 1998, 273:30218-30224）をフェニルアラニンに置換したStat5、マウスStat5Bの699番アミノ酸であるチロシン（Yamashita, H., et al., J. Biol. Chem., 1998, 273:30218-30224）をフェニルアラニンに置換したStat5、ヒツジStat5の694番アミノ酸であるチロシン（Gouilleux, F., et al., EMBO J., 1994, 13: 4361-4369）をフェニルアラニンに置換したStat5、Stat5のC末端欠損、などを使用することができ、より好ましくは、ヒツジStat5の694番アミノ酸であるチロシンをフェニルアラニンに置換したStat5（dn-Stat5 Y694F）を使用することができる。
【００２５】
本発明において、野生型Stat5（wt-Stat5）遺伝子を外部から発現可能に連結したDNA構造を有する株化脂肪前駆細胞を誘導して外部からwt-Stat5遺伝子の発現を増大させた後に、脂肪細胞分化誘導ホルモンチャレンジを行うと、当該細胞は脂肪細胞分化促進を起こす。これに対して、ドミナントネガティブ型Stat5（dn-Stat5）遺伝子を外部から発現可能に連結したDNA構造を有する株化脂肪前駆細胞を誘導して、外部からdn-Stat5遺伝子の発現を増大させることにより、脂肪細胞分化誘導ホルモンチャレンジを行った場合であっても当該細胞の脂肪細胞分化は抑制されることを見出した。
【００２６】
これらの脂肪細胞分化誘導処理に際して、どのような作用機序に基づいて脂肪細胞分化が行われるのかを、外部から誘導可能なプロモーター領域の支配下でwt-Stat5遺伝子を発現可能に連結したDNA構造を有する株化脂肪前駆細胞（WT細胞）またはdn-Stat5遺伝子を発現可能に連結したDNA構造を有する株化脂肪前駆細胞（DN細胞）を用いて調べた。この結果、wt-Stat5遺伝子が発現することにより、wt-Stat5遺伝子を発現しない場合と比較して、顕著にPPARγ mRNAの発現を誘導できることを見出した。
【００２７】
本発明においては、さらに、分子的なStat5とPPARγとの関係を調べるために、PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域の解析を行った。PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域のヌクレオチド配列の一部を、SEQ ID NO: 7として示す。この配列は、PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域のヌクレオチド配列のヌクレオチド-1184〜-1をその順番に、1〜1184として示す。PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域においてStat5結合モチーフであるTTCNNNGAA（SEQ ID NO: 8）の配列についてモチーフ検索を行った。PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域の-1030〜-1038に該当する配列、TTCAGGGAA、が存在する。
【００２８】
発明者らは、この配列、TTCAGGGAAが現実にStat5の結合モチーフとして機能しているか否かについて確認するため、PPARγ遺伝子のプロモーター領域中の上記配列、TTCAGGGAAの有無により2種類の発現ベクターを、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)を参照）に従って作成し、これらの発現ベクターを、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)を参照）に従って、上述のNIH-3T3細胞にトランスフェクトした。このような系に基づいてStat5を過剰発現させたところ、Stat5の結合モチーフを有する場合には、有意にルシフェラーゼの活性が亢進されることが見出された。
【００２９】
以上の知見から、本発明は：脂肪前駆細胞が、外部からの脂肪細胞分化誘導処理または脂肪細胞分化刺激に反応して、細胞内部でのStat5のリン酸化を生じ；このリン酸化したStat5が二量体を形成した後核内に移行し；PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域に結合することによりPPARγ遺伝子の発現を活性化し；そしてPPARγの働きにより脂肪細胞分化を行う；という、これまで知られていなかった脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化の作用機序を初めて明らかにした。
【００３０】
本発明の一態様において、i）明細書の上記に説明した株化脂肪前駆細胞において脂肪細胞分化を誘導する工程；ii)脂肪細胞分化を誘導した上述の細胞を、被検化合物と接触させる工程；iii）被検化合物と接触させた上述の細胞の脂肪細胞分化の程度を測定する工程；iv）上述した細胞の脂肪細胞分化の程度と対照細胞の脂肪細胞分化の程度とを比較して、被検化合物の脂肪細胞分化誘導調節活性を判定する工程；を含む、脂肪細胞分化誘導調節活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、工程i）およびii）はいずれを先に行ってもあるいは同時に行ってもよく、その後工程iii）および工程iv）を行う、前記スクリーニング方法を確立することにより、上記課題を解決することができることを示した。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法においては、上記に説明した細胞外から野生型Stat5の発現を誘導し、PPARγの活性を調節することができる上述した株化脂肪前駆細胞を使用する。本発明のスクリーニング方法においては、上述した株化脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を誘導するため、ドキシサイクリンおよび脂肪細胞分化誘導カクテル（メチルイソブチルキサンチン（MIX）、デキサメタゾン（DEX）、インスリン、およびウシ胎児血清（FBS））を細胞培養液中に添加することにより、当該脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を誘導する。この場合、ドキシサイクリンを添加した後脂肪細胞分化誘導カクテルを添加するか、あるいはドキシサイクリンと脂肪細胞分化誘導カクテルを同時に添加する。好ましくは、ドキシサイクリンを先に添加する。
【００３２】
その後、細胞培養液中に被検化合物を添加することにより、これらの脂肪細胞分化を誘導した細胞を当該被検化合物と接触させる。被検化合物は、既知の化合物を使用することができ、またはコンビナトリアルケミストリーの手法を用いてライブラリーとして合成された化合物群を用いることもできる。脂肪細胞分化を誘導させた細胞と被検化合物とを接触させる場合、脂肪前駆細胞を96穴培養プレートの各ウェル中にて、細胞をコンフルエントになるまで培養し（1×104ずつ）、脂肪細胞分化を誘導した後、そこに化合物を様々な濃度、例えば1 ng/ml〜100μg/ml、で添加することにより反応させる。
【００３３】
ついで、脂肪細胞分化を誘導した後、被検化合物を接触させた細胞の脂肪細胞分化の程度と、脂肪細胞分化を誘導したが被検化合物を接触させなかった細胞の脂肪細胞分化の程度とをそれぞれ測定し、それらを比較する。脂肪細胞分化の程度は、脂肪細胞分化に関わるStat5の活性を測定する方法、PPARγ遺伝子の発現の程度をmRNAレベルで測定する方法、細胞中に蓄積されたトリグリセリドの量を定量する方法、細胞中の脂肪滴を染色して細胞中の脂肪滴の蓄積を調べる方法、α-グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）活性を定量する方法、などにより測定することができる。
【００３４】
脂肪細胞分化の程度を測定するための脂肪細胞分化に関わるStat5の活性を測定する方法には、ルシフェラーゼ遺伝子リポーターアッセイにより調べる方法、細胞内でのStat5のリン酸化を測定することにより調べる方法などがある。
【００３５】
ルシフェラーゼ遺伝子リポーターアッセイを使用する方法においては、上述した株化脂肪前駆細胞として、PPARγ遺伝子のプロモーター領域の下流に発現可能にルシフェラーゼ遺伝子を連結した発現ベクターを、安定にまたは一過性にトランスフェクトした細胞を用いてスクリーニングを行うことにより、脂肪細胞分化の程度を調べることができる。この場合、上述した株化脂肪前駆細胞にトランスフェクトする発現ベクターは、Stat5反応性発現ベクターとして、PPARγ遺伝子のプロモーター領域のうち、少なくとも-1047〜0までを有し、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を発現可能に連結したものを用いる。この場合、PPARγ遺伝子のプロモーター領域の-1030〜-1038に位置するTTCAGGGAAというヌクレオチド配列が、Stat5の結合モチーフであるTTCNNNGAAに相当する。また、対照ベクターとして、このStat5の結合モチーフを含まない、PPARγ遺伝子のプロモーター領域のうち、-1029〜0までを有し、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を発現可能に連結したものを用いる。これらのベクターの構築、トランスフェクト、遺伝子の発現などの方法は、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)を参照）に基づいて、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３６】
細胞内でのStat5のリン酸化を測定する方法においては、被検化合物により処理した細胞の細胞溶解物を調製し、細胞溶解物を抗リン酸化Stat5抗体（Cell Signaling Technology社）を用いるウェスタンブロットに供することにより、脂肪細胞分化の程度を測定することができる。
【００３７】
脂肪細胞分化の程度はさらに、PPARγ遺伝子の発現の程度をmRNAレベルで測定して調べることができる。この方法においては、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)に記載された方法）を用いて、ノザンブロッティング法、RT-PCR法、RNaseプロテクションなどの方法により、脂肪細胞分化の程度を調べることができる。
【００３８】
脂肪細胞分化の程度はさらに、細胞中に蓄積されたトリグリセリドの量を定量することにより調べることができる。この方法においては、アセチルアセトン法を行うことにより、脂肪細胞分化の程度を調べることができる。
【００３９】
脂肪細胞分化の程度はさらに、細胞中の脂肪滴を染色することにより調べることができる。脂肪の蓄積は、脂肪細胞をパラフィンもしくはグルタルアルデヒドにより固定し、Oil-Red-O染色などの既知の脂肪染色により染色することにより調べることができる。
【００４０】
本発明において、脂肪細胞分化誘導調節活性とは、脂肪細胞分化誘導抑制活性および脂肪細胞分化亢進活性の両方を意味する。したがって、対照細胞における脂肪細胞分化の程度と比較して、被検化合物と接触させた細胞における脂肪細胞分化の程度が低い場合、スクリーニングした被検化合物は脂肪細胞分化を抑制する効果を有する化合物である。一方、対照細胞における脂肪細胞分化の程度と比較して、被検化合物と接触させた細胞における脂肪細胞分化の程度が高い場合、スクリーニングした被検化合物は脂肪細胞分化を促進する効果を有する化合物である。
【００４１】
したがって、本発明の別の態様においては、上述したスクリーニング方法により得られた化合物を提供することもできる。被検化合物と接触させた細胞における脂肪細胞分化の程度が低い場合、当該被検化合物は抗肥満薬として使用することができる。一方、PPARγのリガンドとして知られているチアゾリジン誘導体がPPARγに結合することにより、脂肪細胞分化を促進することが知られていることから（Lehmann, J.M., et al., J. Biol. Chem., 270: 12953-12956, 1995）、被検化合物と接触させた細胞における脂肪細胞分化の程度が高い場合、当該被検化合物は抗糖尿病薬として使用することができる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様において、本発明のスクリーニング方法により得られた脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化を調節する活性を有する化合物を治療的有効量で含む医薬組成物を提供することができる。このような医薬組成物は、脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化、または脂肪細胞における脂肪細胞分化誘導と関連する疾患を治療するために用いることができる。
【００４３】
上述した化合物を含む医薬組成物は、皮下投与及び非経口投与を含むいずれかの適当な投与経路から投与することができる。経口投与には舌下投与、胃内投与、小腸内投与などが含まれる。非経口投与の例には静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与および腹腔内投与などが含まれる。本発明においては、静脈内投与および腹腔内投与が好ましい。医薬組成物中で投与する1回当たりの化合物量は、0.01〜100 mg、好ましくは0.1〜50 mgであり、1日当たり1回〜3回投与することが好ましい。しかしながら投与量および投与方法は、投与すべき化合物の種類、化合物を含む医薬組成物の用途、治療すべき患者の年齢、体重、および患者の症状等を含む状況を考慮して医師により決定されるものであり、これらには限定されない。
【００４４】
【発明の実施の形態】
プラスミドおよびcDNA
C/EBPα（Accession No. NM#007678）、C/EBPβ（Accession No. NM#009883.1）、C/EBPδ（Accession No. NM#007679）、PPARγ（Accession No. U09138；核酸配列についてSEQ ID NO: 5、アミノ酸配列についてSEQ ID NO: 6）、aP2（Accession No. K012109）、GLUT4（Accession No. NM#009204.1）、およびアディプシン（Accession No. NM#013459.1）についてのcDNAは、SuperScriptIIラムダシステム（Life Technologies, Rockville, USA）を使用することにより、分化の誘導の9日後に構築したpZL1中の3T3-L1脂肪前駆細胞cDNAライブラリーから単離された。
【００４５】
その他のcDNAは、以下のようにRT-PCRにより調製した。ファースト・ストランドcDNAは、RNA PCR（AMV）バージョン2.1キット（Takara, Ohtsu, Japan）を使用することにより、3T3-L1の全RNAから調製した。その後、cDNAをPCR反応における鋳型として、指定したプライマーセットとともに使用した。得られたPCR産物をpGEM-7Zf（+)ベクター（Promega, Madison, USA）中にサブクローニングした。
【００４６】
本研究において使用したその他のcDNAについてのプライマー配列は以下の通りである：
ADD1/SREBP-1c
5'-AAAGAATTCG ACCCTGGTGA GTGGNGGAAC-3'（センス：SEQ ID NO: 9）、
5'-AAAGGATCCG AGGCCAANGG GTTGCAGGNC-3'（アンチセンス：SEQ ID NO: 10）；
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）
5'-AAAGAATTCC TGTGGGAAGA CTAACTTGGC-3'（センス：SEQ ID NO: 11）、
5'-AAAGGATCCG CTGATTCTCT GTTTCAGGGC-3'（アンチセンス：SEQ ID NO: 12）；
である。cDNA配列のすべては、DNA配列決定により確認した（ABI 377 DNAシークエンサー）。
【００４７】
細胞培養および分化の誘導
3T3-L1脂肪前駆細胞（NIHS cell bank, Japan, catalogue number JCRB9014）を、10％の正常ウシ血清（CS、GIBCO BRL, Grand Island, NY）を含有する、Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）（Nisseiken, Kyoto, Japan）からなる増殖培地中で維持した。3T3-L1細胞を分化させるため、細胞を10 cmディッシュ（Corning）中でコンフルエントになるまで増殖させ、そして2日間そのままにした。その後、DMEM、10％ウシ胎児血清（FBS、GIBCO BRL）、1μMデキサメタゾン（DEX；Sigma, St. Louis, USA）、0.5 mMメチルイソブチルキサンチン（MIX；Wako Chemical Co, Osaka, Japan）、および10μg/mlのインスリン（Sigma, St. Louis, USA）からなる新鮮な分化培地に、細胞を48時間曝露した。その後、細胞を10％FBSおよび2.5μg/mlのインスリンを含有するDMEMにより、一日おきに培養液を交換した。分化は、脂肪滴の蓄積をOil-Red-O染色することにより確認した。分化した細胞に由来するトリグリセリドは、イソプロパノールを使用して抽出し、そしてトリグリセライドテストワコー（Wako Chemical Co, Osaka, Japan）を使用して定量した。細胞は、血球解析器CDA-500（Sysmex, Kobe, Japan）を使用して計数した。
【００４８】
STAT5についてのDox-誘導可能発現系の構築
誘導可能Stat5発現細胞株を確立するために、標的遺伝子の転写を、ドキシサイクリン（Dox）処理により開始する、リバース・テトラサイクリン-誘導トランス活性化因子（rtTA）系を使用した（Gossen, M., et al., 1995. Science. 268:1766-1769）。まず、3T3-L1細胞をpUD172-2neo（rtTA；Gossen, M., et al., 1995. Science. 268:1766-1769）を用いてトランスフェクトし、そしてクローンを0.4 mg/mlのG418（GIBCO BRL）の存在下において選択した。G418-耐性クローンを、TetOプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したpUHC13-3（Gossen, M., et al., 1995. Science. 268:1766-1769）をDox存在下とDox非存在下、一過性にスーパートランスフェクトすることにより、そのrtTA-依存性リポーター遺伝子発現について評価した。
【００４９】
最大のDox-依存性ルシフェラーゼ活性を示したクローンを単離し、親細胞と名付け、そしてさらなる構築に使用した。野生型Stat5の発現ベクターおよびドミナントネガティブStat5（Y694F）の発現ベクターを、マウスStat5Aに相当するヒツジStat5またはStat5（Y694F）を含有するEcoRI-NotI断片を、pUHD10-3（Dr. Bujardより譲渡）の改変したマルチクローニングサイト中にライゲーションすることにより構築した。これらのベクターをpPUR（CLONTECH, Palo Alto, USA）とともに親細胞中にトランスフェクトした。3μg/mlのピューロマイシン（CLONTECH）の存在下、クローンを選択し、そしてそれらのDox-依存的なStat5の誘導を、ウェスタンブロット解析によりモニターした。
【００５０】
RNA解析
ChomczynskiとSacchiの方法（Chomczynski, P., and N. Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156-159）に従って単離した全RNAをNorthern Max-Glyキット（Ambion, Austin, USA）を用いて、1％アガロースゲル（BMA, Rockland, ME, USA）上で分離し、そしてナイロンメンブレン（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）に転写した。rRNAをフィルター上で、メチレンブルーを使用して染色し、RNAのロード効率と転写効率を評価した。DIG-標識したアンチセンスRNAプローブを直線化プラスミドからSP6/T7 RNAポリメラーゼ（Roche Diagnostics）を使用して合成した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、発売元（Roche Diagnostics）により提供されたプロトコールにしたがって行った。
【００５１】
ノザンブロット解析において用いたプローブとして、それぞれの遺伝子について上述の方法により採取した全長cDNAを用いた。
免疫沈降および免疫ブロッティング
3T3-L1細胞由来の全細胞抽出物を調製した。溶解バッファー（50 mM Hepes-NaOH pH 7.8、150 mM NaCl、1％Triton-X 100、50 mM NaF、1mM Na3VO4、30 mMピロリン酸ナトリウム、1 mMペファブロック（Pefablock；Roche Diagnostics）、0.1 mg/mlロイペプチン（Wako Pure Chemicals Co., Osaka, Japan））を使用して、指定した時間点において調製した。細胞を氷上で60分間溶解し、そして不溶性物質を遠心分離によりペレット化した。タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（PIERCE, Rockford, USA）を用いて測定した。清澄にした溶解物をStat5Aタンパク質およびStat5Bタンパク質に対する抗血清とともにインキュベートした。プロテインA-結合ビーズ（Pierce, Rockford, USA）とともに一晩インキュベートした後、免疫沈降物を10％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてPVDFメンブレン（Hybond-P；Amersham Pharmacia）に転写した。免疫沈降したタンパク質を4G10（Upstate, Lake Placid, USA）を用いてブロットし、ついでそれぞれの抗体を用いて再ブロットした。抗-Stat5A（L-20）およびStat5B（C-17）は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, USA）から入手した。
【００５２】
ドキシサイクリン（Dox）-依存性転写活性化アッセイ
トランスフェクションの48時間前に、WT細胞またはDN細胞をDoxで処理しまたは未処理のままにした。50〜60％コンフルエントの時に、細胞を、renillaルシフェラーゼ発現ベクター（pRL-CMV；Promega）とともにStat5-リポータープラスミドによりトランスフェクトし、トランスフェクション効率を調節した（Promega, Madison, USA）（Matsumura, I., et al., 1998. Mol Cell Biol. 18:4282-4290）。DNA除去の後、細胞をOPTIMEM（Life Technologies, Rockville, USA）中で16時間血清除去し、その後非処理のままにしておくかまたはプロラクチン（Sigma）またはFBSにより処理した。細胞を溶解し、そしてホタルルシフェラーゼおよびrenillaルシフェラーゼの両方の活性を測定した。
【００５３】
【実施例】
以下に実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するために記載するものであり、本発明の技術的範囲を限定するために記載するものではない。
【００５４】
実施例1：3T3-L1細胞分化の間のStat5AおよびStat5Bの活性化
実施例1においては、Stat5が脂肪細胞分化誘導に関与しているかどうかを調べるため、まず脂肪細胞分化過程におけるこれらのタンパク質の活性化を、免疫沈降した後に4G10によるブロッティングをすることにより調べた。
【００５５】
3T3-L1脂肪前駆細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、そして2日間そのままにした後、10％FBS、インスリン、デキサメタゾン（DEX)、およびメチルイソブチルキサンチン（MIX)を用いる脂肪細胞分化ホルモンチャレンジを行った。その後、細胞を10％FBSおよび2.5μg/mlのインスリンを含有する培養液を用いて、1日おきに培地交換を行う。細胞溶解物を指定した時間点で調製し、そして2 mgのタンパク質を抗-Stat5A（L-20）抗体または抗-Stat5B（C-17）抗体による免疫沈降のために用いる。L-20はStat5Aと反応するが、C-17はStat5AおよびStat5Bの両方を認識することに注意すべきである。沈降させたタンパク質を、抗-リン酸化チロシン抗体4G10を用いてブロッティングした。ストリップした後、メンブレンをそれぞれの抗体によりブロッティングした。
【００５６】
Stat5AおよびStat5Bは、分化誘導の前および分化の間ずっと、3T3-L1細胞中に存在した（図1）。Stat5Aは、ホルモン処理の1時間後に強力にチロシンリン酸化され、そしてこの高レベルの活性化は3時間まで持続した（図1、レーン2および3、上パネル）。しかしながら、24時間までに、リン酸化の程度は若干減弱した（図1、レーン4、上パネル）。その後は、チロシンリン酸化のわずかな増大が120時間まで観察された（レーン5〜7、上パネル）。192時間においても、3時間の時点よりもその程度はかなり低下していたものの、Stat5Aはチロシンリン酸化されていた（図1、レーン8、上パネル）。下パネルでは、Stat5が95 kDaおよび92 kDaの一対として泳動されることが示されており、それぞれがStat5AおよびStat5Bに対応していた。Stat5AおよびStat5Bの両方とも、ホルモン処理の1時間後に強力にチロシンリン酸化を引き起こし、そしてこの高レベルの活性化は3時間まで持続した（図1、レーン2および3、下パネル）。その後、チロシンリン酸化された92 kDaのバンド（Stat5B）は、徐々に消失していき、これに対して95 kDaのバンド（Stat5A）は、弱いもののチロシンリン酸化の状態を維持した。興味深いことに、ウェスタンブロット解析の結果、Stat5AおよびStat5Bの発現が、脂肪細胞分化チャレンジの48時間後から分化の終了に向けて増強されることが示されたが、これらの知見は過去の報告と調和していた（図1、レーン5〜8、上パネルおよび下パネル）（Stephens, J.M., et al., 1996. J Biol Chem. 271:10441-10444）。免疫沈降を行った後は、細胞溶解物中にStat5AおよびStat5Bは残されていなかったことも、われわれは確認した（データは示していない）。チロシンリン酸化されたStat5とリン酸化されていないStat5の比率は、細胞が脂肪細胞に分化するにつれて減少した（図1、レーン2〜8、上パネルおよび下パネル）。Stat1およびStat3などのその他のStatは、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化誘導の間、活性化されなかった（データは示していない）。これらの結果から、Stat5AおよびStat5Bは、脂肪細胞分化ホルモン刺激を受けると活性化され、そしてStat5Aの活性化は3T3-L1細胞の脂肪細胞分化誘導の間持続されることが示された。
【００５７】
実施例2：3T3-L1脂肪前駆細胞におけるリバース・テトラサイクリン-誘導Stat5発現系の確立および特性決定
実施例2においては、3T3-L1分化の間のStat5活性化により、Stat5が脂肪細胞分化誘導において何らかの役割を果たしていることがさらに示唆された。Stat5が脂肪細胞分化誘導に関与するかどうかを直接的に評価するため、3T3-L1細胞を操作して、リバース・テトラサイクリン-誘導トランス活性化因子を用いてStat5タンパク質を発現させた（Gossen, M., et al., 1995. Science. 268:1766-1769）。この系により、誘導物質の存在下において、所望のタンパク質を比較的厳密に誘導することが可能になる。われわれは、ドキシサイクリン（Dox）を添加すると誘導可能に野生型（wt）-Stat5（Wakao, H., et al., 1994. Embo J. 13:2182-2191）あるいはドミナントネガティブ（Y694F）（dn）-Stat5（Matsumura, I., et al., 1999. Embo J. 18:1367-1377）を発現する、多数の3T3-L1細胞株を作成した。いくつかの独立したクローンを解析し、親細胞と同様の分化能力を維持しているクローンをさらなる解析に使用した。wt-Stat5およびdn-Stat5を発現する細胞についての代表的なクローン、それぞれWT細胞およびDN細胞、を使用した実験を示す。
【００５８】
ウェスタンブロット解析は、Dox（1μg/ml)の非存在下（-）または存在下（+）において48時間培養したWT細胞およびDN細胞から調製した全細胞抽出物を用いて、上述したように行った。4μgのタンパク質を、Stat5のウェスタンブロット解析のために使用した。
【００５９】
外来性Stat5のWT細胞およびDN細胞における発現を、ウェスタンブロット解析により決定した（図2）。Dox処理の結果、wt-Stat5およびdn-Stat5については4倍の増加が見られた（図2）。wt-Stat5タンパク質およびdn-Stat5タンパク質の両方とも、最大の誘導は48〜72時間持続することが見出された。その後は、wt-Stat5およびdn-Stat5の発現とも、Doxが継続的に存在している場合であっても徐々に消失した（データは示していない）。Doxは、rtTAを単独で安定にトランスフェクトした対照クローン（親細胞という）におけるStat5タンパク質発現に対して何ら影響を及ぼさなかった（データは示していない）。
【００６０】
WT細胞およびDN細胞を確立したので、Stat5-依存性リポーター遺伝子アッセイを行い、外来性Stat5の過剰発現が内在性Stat5のシグナル伝達経路を阻害するかどうかを調べた。
【００６１】
親細胞、WT細胞およびDN細胞を、Stat5-依存的に転写活性化を受けるホタル・ルシフェラーゼ・リポーター遺伝子により一過性にトランスフェクトした（Matsumura, I., et al., 1998. Mol Cell Biol. 18:4282-4290）。WT細胞、DN細胞、および親細胞を、ドキシサイクリン（Dox）の存在下（+）または非存在下（-）において2日間培養し、その後Stat5-リポーター遺伝子によりトランスフェクトした。血清を除去した後、細胞を非処理のままにするか、あるいは10％FBSまたはプロラクチン（1μg/m）を含有するOPTIMEMによりチャレンジした。Doxの存在下（+）または非存在下（-）にて、さらに6時間インキュベートした。比ルシフェラーゼ活性および標準偏差を示す。トランスフェクトは、3重にして行い、そして4回繰り返した。
【００６２】
Doxの非存在下において、親細胞においては、プロラクチンまたはFBSによるチャレンジにより、それぞれ7.0倍および5.3倍にルシフェラーゼ活性が刺激された（図3、親細胞、Dox〔-〕、プロラクチンおよびFBS）。同様に、WT細胞においては、プロラクチンまたはFBSによるチャレンジにより、それぞれ5.2倍および4.4倍にルシフェラーゼ活性が刺激された（図3、WT細胞、Dox〔-〕、プロラクチンおよびFBS）。同様に、DN細胞においては、プロラクチンまたはFBSにより、それぞれ7.1倍および5.6倍にルシフェラーゼ活性が刺激された（図3、DN細胞、Dox〔-〕、プロラクチンおよびFBS）。Doxの添加により、親細胞においては、プロラクチン-誘導性転写活性およびFBS-誘導性転写活性は影響を受けなかった（図3、親細胞、Dox〔+〕、プロラクチンおよびFBS）。wt-Stat5の発現を誘導した場合、プロラクチン-依存性ルシフェラーゼ活性およびFBS-依存性ルシフェラーゼ活性の両方とも、結果としてさらに2.0倍増大した（図3、WT細胞、Dox〔+〕、プロラクチンおよびFBS）。WT細胞では、Doxにより基底ルシフェラーゼ活性が3倍増大したことが見出された（図3、WT細胞、Dox〔-〕およびDox〔+〕、なし）。これに対して、dn-Stat5を誘導した場合には、プロラクチン-刺激性ルシフェラーゼ活性およびFBS-刺激性ルシフェラーゼ活性の両方とも、それぞれ、それらの対照値の44％および67％に抑制された（図3、DN細胞、Dox〔-〕およびDox〔+〕の対比、プロラクチンおよびFBS）。これらの結果から、外来性のStat5は、内在性Stat5シグナル伝達経路に対して現実に影響を及ぼしており、したがってこの系の妥当性を支持している。
【００６３】
Stat5は、いくつかのサイトカインに依存する細胞増殖の原因となることが示され、したがってStat5が脂肪細胞分化誘導に影響を与える可能性のある機構として、クローナル・エクスパンジョンの間の細胞増殖を促進することまたは阻害することによるものがありうる（Damen, J.E., et al., 1995. et al.,Embo J. 14:5557-5568；Mui, A.L., et al., 1996. Embo J. 15:2425-2433）。この可能性を評価するため、WT細胞およびDN細胞においてDoxの存在下または非存在下において、分化刺激の前後（day 0-4）で細胞数を比較した。
【００６４】
WT細胞およびDN細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、Doxの存在下または非存在下において48時間インキュベートした後、脂肪細胞分化ホルモン処理を行った。その後、細胞を実施例1に記載するように、Doxの存在下または非存在下において分化培地に交換した。細胞数を毎日計数した。データは、比細胞数を示し、そして3重で行った3つの独立した実験の平均として示す。標準偏差をエラーバーとして示す。
【００６５】
図4に示すように、脂肪細胞分化チャレンジにより細胞数が約3倍に増大したが、これは脂肪前駆細胞のクローナル・エクスパンジョンによる細胞増殖の間に正常に観察される（図4、day 0およびday 3を比較）（Lyle, R.E., et al., 1998. Biochem Biophys Res Commun. 247:373-378）。WT細胞およびDN細胞の増殖は、Doxの存在に関わらず、顕著に影響を受けなかった（図4）。DN細胞の倍増にかかる時間は、WT細胞の場合と比較して若干遅かった（図4）が、Doxの明らかな影響は観察されないことを見出した。増殖期における細胞数を比較した場合、Doxの存在にかかわらず、細胞数に変化は見られなかった（データは示していない）。Stat5は造血細胞中での細胞周期の進行に必要ないくつかの遺伝子の発現を調節することから（Mui, A.L., et al., 1996. Embo J. 15:2425-2433；Matsumura, I., et al., 1999. Embo J. 18:1367-1377）、wt-Stat5またはdn-Stat5がこれらの遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかについて評価した。ノザンブロット解析の結果、c-fos、サイクリンA、B、D1、E、p21、およびp27の発現レベルは、wt-Stat5またはdn-Stat5のいずれによっても影響を受けなかった（データは示していない）。これらのデータから、Stat5の活性化は、3T3-L1細胞の細胞増殖には関係がないことが示唆される。
【００６６】
実施例3：脂肪細胞分化誘導初期におけるStat5による刺激
実施例3においては、野生型Stat5の発現が脂肪細胞分化を促進し、一方でdn-Stat5は分化を阻害するとの仮説を立て、検証した。この仮説は、トリグリセリドの貯蔵を脂肪細胞分化の指標としてOil-Red-O染色によりモニターする実験においてまず試験した（図5）。
【００６７】
WT細胞およびDN細胞を、コンフルエントに達した後、Doxの存在下（+）または非存在下（-）において、48時間培養した。細胞を、実施例1において示したように、脂肪細胞分化誘導カクテルを用いてチャレンジした。培養9日後に、細胞Oil-Red-Oで染色し、脂肪滴を可視化した。
【００６８】
Doxの非存在下において、WT細胞およびDN細胞では、脂肪細胞分化誘導カクテルに曝露した9日後にトリグリセリドの蓄積が見られ、大型で丸型の形状を示した。したがって、それぞれの細胞株は、正常の分化特性を有していた。WT細胞において、トリグリセリドを蓄積する細胞の割合は、Doxで処理した後に脂肪細胞分化誘導カクテルに曝露した場合に増大した（図5、上パネル、+）。これに対して、dn-Stat5の過剰発現により、脂肪細胞分化誘導を行う細胞集団は減少した（図5、下パネル、+）。Doxの存在に関わらず、親細胞の分化能力に何の相違も見られなかった（データは示していない）。これらの知見から、Stat5は脂肪細胞分化を変調することが示唆される。
【００６９】
Stat5は分化の初期段階において強力に活性化されることから（実施例1）、ついでStat5が脂肪細胞分化に対して影響を及ぼす時間領域を決定することを試みた。WT細胞、DN細胞、および親細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、そして実施例1に記載するように、誘導して分化させた。Doxによる処理を、指定した日に開始し、結果としてStat5発現の増加の異なるパルスを得た（図6、上パネル）。9日後に、トリグリセリドを細胞から抽出し、そして上述したように定量した。結果は、3重にして行った5回の実験の平均値を、標準偏差エラーバーとともに示す。対照に対する比トリグリセリド含量（Doxの非存在下における）を示す（図6、下パネル）。
【００７０】
脂肪細胞分化処理の間、wt-Stat5の発現を、様々な時間点で誘導することにより、得られたトリグリセリド含量を比較した（図6、下左パネル）。外来性のStat5をDoxにより最大に誘導するためには48時間がかかることに注目すべきである。Doxを脂肪細胞分化ホルモンチャレンジの48時間前に添加すれば、トリグリセリドの相対量はWT細胞の対照と比較して1.8倍に増大した（図6、下左パネル、-および-2 daysを対比）。脂肪細胞分化ホルモン処理と同日にDoxを添加すると、対照と比較してトリグリセリド含量が30％増大した（図6、下左パネル、-および0 dayを対比）。対照的に、脂肪細胞分化誘導がDox処理の2日前に行われた場合には、トリグリセリドの蓄積の増大はほとんど観察されなかった（図6、下左パネル、-および+2 daysを対比）。同様のプロトコルにより、細胞中のトリグリセリドの増量に対するdn-Stat5の影響についても評価した（図6、下中パネル）。Doxを脂肪細胞分化ホルモンチャレンジの48時間前に添加した場合、トリグリセリドの相対量は対照と比較して67％に減少した（図6、下中パネル、-および-2 daysを対比）。Doxを脂肪細胞分化ホルモン処理と同日に添加すると、対照と比較してトリグリセリド含量が21％減少した（図6、下中パネル、-および0 dayを対比）。対照的に、脂肪細胞分化誘導をDox処理の2日前に行った場合、トリグリセリド蓄積の減少はほとんど観察されなかった（図6、下中パネル、-および+2 daysを対比）。Doxを親細胞に添加しても、トリグリセリド含量に変動はなかったことから、Dox単独では分化に対して影響がないことが示された（図6、下右パネル）。これらのデータから、Stat5は分化の初期の間、脂肪細胞分化促進作用を発揮し、この期間はStat5の活性が強力である期間とよく相関している（図1および図6）。
【００７１】
実施例4：脂肪細胞分化調節転写因子および脂肪細胞特異的遺伝子の発現の、Stat5による制御
実施例4においては、Stat5は脂肪細胞分化誘導にどのように関与しているのかについて調べた。最も可能性があるのは、このプロセスが、クローナル・エクスパンジョンおよび／または脂肪細胞分化プログラムを駆動して脂肪細胞特異的遺伝子群の発現を引き起こす遺伝子の活性化を通じて起こる。分子メカニズムに対する洞察を得るため、分化の初期の間のwt-Stat5あるいはdn-Stat5の過剰発現が脂肪細胞分化調節に働く転写因子の発現を変更させるかどうかを解析した。
【００７２】
WT細胞およびDN細胞をコンフルエントになるまで培養し、そしてDoxをホルモンチャレンジの前48時間の時点で添加したこと以外は実施例1に記載したように、Doxの存在下（+）または非存在下（-）において誘導して分化させた。全RNAを指定した時間で抽出し、そしてそれぞれ2μgのサンプルをそれぞれの遺伝子に対応するリボプローブを用いるノザンブロット解析に供した。3種の独立した実験を2重で行った。さらに、親細胞を培養し、そして上述したように、Doxの存在下（+）または非存在下（-）において誘導して分化させた。9日後に、全RNA（2μg）を脂肪細胞分化調節因子の発現について解析した。
【００７３】
C/EBPβおよびδは、脂肪細胞分化誘導ホルモンチャレンジの際に転写レベルでに誘導される初期の因子であり、そしてPPARγ発現に必要であると考えられている（Cao, Z., et al., 1991. Genes Dev. 5:1538-1552；Wu, Z., et al., 1996. Mol Cell Biol. 16:4128-4136）。脂肪細胞分化誘導ホルモンの投与により、報告されたようにC/EBPβおよびδの迅速な転写活性化が引き起こされる（図7、レーン1、2およびレーン6、7、C/EBPβおよびC/EBPδ）（Cao, Z., et al., 1991. Genes Dev. 5:1538-1552）。C/EBPβおよびδのレベルの増大が2日まで維持され、その後WT細胞およびDN細胞の両方において4日までに減少する（図7、レーン3-5、C/EBPβおよびC/EBPδ）。Doxの添加により、両方の細胞におけるこれらの因子の発現レベルに何ら変化は引き起こされなかった（図7、レーン1-5およびレーン6-10を対比、C/EBPβおよびC/EBPδ）。これらのデータから、Stat5はC/EBPβおよびδの発現に対してほとんど影響を与えないことがはっきりと示された。PPARγ mRNAは、WT細胞およびDN細胞の両方の分化の間、非常に初期（分化誘導後1〜2日）に誘導された（図7、レーン1-5、PPARγ）。DoxをWT細胞に添加すると、day 1からday 9まで、PPARγレベルを強力に刺激した（図7、レーン2-5およびレーン7-10を対比）。対照的に、DoxをDN細胞に対する添加すると、day 1からday 9まで、PPARγは減少した（図7、レーン2-5およびレーン7-10を対比）。これらのデータは、分化の初期に由来するPPARγ mRNAの発現を制御する際のStat5の役割を明確に規定する。より高いC/EBPα mRNAのレベルが、WT細胞およびDN細胞の両方の分化の後期に検出された（図7、レーン5、C/EBPα）。wt-Stat5の誘導は、結果としてWT細胞におけるC/EBPαの亢進調節を引き起こしたが、一方でdn-Stat5の誘導は、day 9までにDN細胞におけるC/EBPαの発現を低下させた（図7、レーン5および10を対比）。SREBP1cは、WT細胞およびDN細胞の両方において非常に初期に誘導された（図7、レーン1-5、SREBP1c）。wt-Stat5あるいはdn-Stat5の過剰発現により、結果としてday 9に、それぞれSREBP1c mRNAの若干の増加あるいは低下を引き起こした（図7を対比、レーン5および10、SREBP1c）。Dox処理が、親細胞中でのC/EBPβ、δ、PPARγ、C/EBPαおよびSREBP1cのレベルに影響を及ぼすかどうかについても調べ、そしてDoxがこれらの転写因子の発現に対して何ら影響をもたないことを見出した（図8）。
【００７４】
PPARγは、aP2およびPEPCKなどの脂肪細胞特異的遺伝子の発現を制御する（Tontonoz, P., et al., 1994. Genes Dev. 8:1224-1234；Tontonoz, P., et al., 1995. Mol Cell Biol. 15:351-357）。C/EBPαは、aP2、Glut4、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）などのいくつかの脂肪細胞遺伝子のプロモーターに結合しそして転写を活性化する（Christy, R.J., et al., 1989. Genes Dev. 3:1323-1335；Kaestner, K.H., et al., 1990. Proc Natl Acad Sci U S A. 87:251-255；Ross, S.R., et al., 1990. Proc Natl Acad Sci U S A. 87:9590-9594；Park, E.A., et al., 1990. Mol Cell Biol. 10:6264-6272）。そこで、wt-Stat5あるいはdn-Stat5のいずれかがこれらの遺伝子の発現に影響を及ぼすかどうかについて調べた。
【００７５】
WT細胞、DN細胞、および親細胞をコンフルエントになるまで培養し、そしてDoxをホルモンチャレンジの48時間前に添加したこと以外は実施例1に記載したように、Doxの存在下（+）または非存在下（-）において誘導して分化させた。全RNAを9日目に抽出し、それぞれ2μgのサンプルを、それぞれの遺伝子に対応するリボプローブを用いるノザンブロット解析に供した。3つの独立した実験を3重で行い、本質的に同一の結果を得た。それぞれのバンドの強度を、CCDカメラを用いて光子計測したところ、結果は対照に対して強いものとして示される（倍数変化）。
【００７６】
wt-Stat5の発現は、結果としてaP2、Glut4、およびPEPCKをそれぞれ3.4倍、2.4倍、および2.5倍に増大させた（図9、レーン1-2、13-14、および19-20）。逆に、dn-Stat5の過剰発現は、aP2、Glut4、およびPEPCKを50％減少させた（図9、レーン3-4、15-16、および21-22）。これらのデータは、上述した遺伝子の発現にとってPPARγおよびC/EBPαの重要性について強調した。これらに加えて、脂肪細胞分化とともにアディプシン（adipsin）の発現が増大することが知られている（Cornelius, P., et al., 1994. Annu Rev Nutr. 14:99-129）。wt-Stat5の過剰発現は、アディプシンの2.8倍の増大を引き起こしたが、一方でdn-Stat5により50％の減少が観察された（図9、レーン7-8および9-10）。Doxの添加は、親細胞におけるaP2、アディプシン、Glut4、およびPEPCKの発現を変動させなかった（図9、レーン5-6、11-12、17-18、および23-24）。このように、Dox単独では、これらの脂肪細胞マーカー遺伝子の発現に対して、何ら影響をもたなかった。全体として、これらの結果から、Stat5が、3T3-L1細胞の脂肪細胞分化の間、少なくとも部分的に、PPARγ、C/EBPα、およびSREBP1cなどの脂肪細胞分化調節因子、並びに脂肪細胞マーカー遺伝子の発現を調節することが示された。
【００７７】
実施例5：PPARγ遺伝子のプロモーター領域の解析
実施例5においては、分子的なStat5とPPARγとの関係を調べるために、マウスPPARγ遺伝子の上流プロモーター領域の解析を行った（図10A）。
【００７８】
PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域のヌクレオチド配列の一部を、SEQ ID NO: 7として示す。この配列は、上述したように、PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域のヌクレオチド配列のヌクレオチド-1184〜-1をその順番に、1〜1184として示す。PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域においてStat5結合モチーフであるTTCNNNGAA（SEQ ID NO: 8）の配列についてモチーフ検索を行った。その結果、-1030〜-1038の領域に該当する配列、TTCAGGGAA、が存在することを見出した（図10A）。
【００７９】
発明者らは、この配列、TTCAGGGAAが現実にStat5の結合モチーフとして機能しているか否かについて確認するため、1）PPARγ遺伝子のプロモーター領域のうち少なくとも-1047〜0までを有し、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を発現可能に連結したStat5反応性発現ベクター、および2）PPARγ遺伝子のプロモーター領域のうち-1029〜0までを有し、その下流にルシフェラーゼ遺伝子を発現可能に連結した発現ベクター、の2種類の発現ベクターを、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)を参照）に従って、pGL3（Promega社）に連結し、これらの発現ベクターを、当該技術分野において既知の方法（例えば、Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001)を参照）に従って、Lipofectamine plus（Invitrogen社）を使用して、一過性に上述のNIH-3T3細胞にトランスフェクトした。
【００８０】
Stat5を過剰発現させたところ、Stat5の結合モチーフを有する場合には、有意にルシフェラーゼの活性が亢進されることが見出された（図10B）。
【００８１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図1は、脂肪細胞分化の間のStat5AおよびStat5B活性化を示す。
【図２】  図2は、WT細胞およびDN細胞における野生型Stat5およびドミナントネガティブ型Stat5の誘導可能な発現を示す。
【図３】  図3は、外来性Stat5のStat5-リポーター遺伝子転写に対する影響を示す。
【図４】  図4は、外来性Stat5の細胞増殖に対する影響について示す。
【図５】  図5は、トリグリセリド貯蔵により調べたところ、wt-Stat5の過剰発現が脂肪細胞分化誘導を刺激するが、一方dn-Stat5の過剰発現が脂肪細胞分化誘導を阻害することが示されたことを示す。
【図６】  図6は、Stat5は、脂肪細胞分化の初期において、トリグリセリド蓄積に対する効果を発揮することを示す。
【図７】  図7は外来性Stat5の過剰発現が、脂肪細胞分化調節に働く転写因子の発現に影響を及ぼすことを示し、WT細胞およびDN細胞において、Stat5の発現がそれぞれの遺伝子の発現に及ぼす影響について示す。
【図８】  図8は外来性Stat5の過剰発現が、脂肪細胞分化調節に働く転写因子の発現に影響を及ぼすことを示し、Doxが、親細胞における脂肪細胞分化調節因子の発現に対してはいかなる影響も有さないことを示す。
【図９】  図9は、外来性Stat5の過剰発現により、結果として脂肪細胞-関連遺伝子の発現の変動が得られることを示す。
【図１０】  図10は、PPARγ遺伝子の上流プロモーター領域の配列解析を行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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