(57)【要約】【課題】遺伝子組換えインフルエンザウイルスを用いて、感染防御能を有する結核菌のＴ細胞あるいはＢ細胞エピトープを上気道粘膜細胞で発現し、粘膜免疫を誘導することにより、結核菌の感染を有効に阻止できる結核ワクチンの提供を目的とする。  【解決手段】クローン化遺伝子から感染性ウイルスを作製するリバースジェネティクスの手法を用いてインフルエンザウイルスの第８RNA分節NS1遺伝子の内部に結核菌由来のＴ細胞エピトープを含む配列を導入し、上気道粘膜免疫をターゲットとした結核菌ワクチン株を作製したＮＳ１の遺伝子を改変し結核菌エピトープを挿入した遺伝子組換えインフルエンザウイルスを作製した。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌遺伝子の一部あるいはこれと相同のアミノ酸配列をコードする塩基配列をゲノム内に有することを特徴とする遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項２】
前記結核菌遺伝子が、Ag85Aであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項３】
コードするアミノ酸配列が、ヒトあるいは動物に対する結核菌由来Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープを含むことを特徴とする請求項１又は請求項２記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項４】
コードするアミノ酸配列が、ヒトあるいは動物に対し抗結核菌免疫応答を誘導することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項５】
塩基配列がコードするアミノ酸配列が、下記記載の配列番号１からなるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
配列番号１：Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln    Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala    Ser Asp Met Trp
【請求項６】
前記塩基配列をコードするインフルエンザウイルスのゲノムが第８ＲＮＡ分節であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記塩基配列をコードするインフルエンザウイルスが、ＮＳ１蛋白あるいはＮＳ１蛋白のＮ端側の一部とのポリプロテインとして発現することを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルス。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の遺伝子組換えインフルエンザウイルスより製造されるワクチン。
【請求項９】
請求項８記載のワクチンが、生ワクチン、不活化ワクチン、またはサブユニットワクチンのいずれかであることを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載のワクチンを含むことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えインフルエンザウイルスを用いた結核ワクチンに関する。
より詳細には、結核菌の抗原Ag85aのＴ細胞エピトープを第８ＲＮＡ分節内に持ち、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質との融合タンパクとして発現する遺伝子組換えインフルエンザウイルス、およびそれを用いた結核ワクチンに係る。
【背景技術】
【０００２】
結核は今日もなお世界中で多くの感染者が発症する重要な感染症である。
また、結核の病因菌である結核菌はヒト以外に豚等の動物にも感染し、人畜共通感染症である。
我が国では結核ワクチンとして結核菌とは異なるが同じ抗原性を持ち病原性の弱いBCGワクチンが用いられてきたが、有効性は低く、結核感染を有効に予防できるワクチンの開発が必要とされている。
【０００３】
結核菌感染防御を誘導する抗原の解析が進められているが、結核菌とBCG菌に共通の主たる分泌蛋白であるフィブロネクチン結合85抗原複合体（Ag85A、Ag85B、Ag85C）のうち、Ag85Aはマウスモデル実験から強力なＴ細胞応答と防御免疫を誘導する事が示されている。さらにDNAワクチンの手法によりＴ細胞エピトープの詳細な解析がなされている（文献１）。そこで、これらのエピトープを上気道の細胞で発現し呼吸器系粘膜免疫を直接活性化することにより、結核菌の感染を高効率で防御することが期待される。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、ヒトに加えトリや豚その他の多くの動物の上気道に急性感染するウイルスであるが、すでに不活化インフルエンザワクチンや弱毒生インフルエンザワクチンが使用されてきた実績がある。
榎並らは、インフルエンザウイルス第８ＲＮＡ分節にCAT（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）レポーター遺伝子を挿入し、NS1タンパク質との融合タンパクとして発現する遺伝子組換えインフルエンザウイルスを作成し、さらに、マウスに経鼻接種すると、レポーター遺伝子に対する防御免疫を誘導することを見いだした（非特許文献２、３）。
【０００５】
【非特許文献１】O. Denis, et al., Infection and Immunity, 66:1527-1533, 1998.
【非特許文献２】榎並正芳、インフルエンザウイルスベクター、「第２版微生物学実習提要、東京大学医科学研究所学友会編」丸善、pp194-196, 1998.
【非特許文献３】N. Takasuka, et al., Vaccine 20: 1579-1585, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
結核ワクチンとしては、結核菌とは異なるが同じ抗原性を持ち病原性の弱いBCGワクチンが用いられてきたが、有効性は低い。
その理由としては、結核菌とは異なるBCG菌を、感染経路である上気道ではなく皮下に接種しているために、結核菌の初感染経路である上気道粘膜に有効な免疫が誘導されないためであると考えられる。
【０００７】
そこで、本発明は、遺伝子組換えインフルエンザウイルスを用いて、感染防御能を有する結核菌のＴ細胞あるいはＢ細胞エピトープを上気道粘膜細胞で発現し、粘膜免疫を誘導することにより、結核菌の感染を有効に阻止できる結核ワクチンの提供を目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するための、本発明における技術的要旨は、クローン化遺伝子から感染性ウイルスを作製するリバースジェネティクスの手法を用いてインフルエンザウイルスの第８RNA分節NS1遺伝子の内部に結核菌由来のＴ細胞エピトープを含む配列を導入し、上気道粘膜免疫をターゲットとした結核菌ワクチン株を作製した点にある。
【０００９】
具体的には、遺伝子組換えインフルエンザウイルスは、結核菌遺伝子の一部あるいはこれと相同のアミノ酸配列をコードする塩基配列をゲノム内に有することを特徴とする。
前記結核菌遺伝子は、Ag85Aが好ましい。
コードするアミノ酸配列は、ヒトあるいは動物に対する結核菌由来Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープを含むのがよく、ヒトあるいは動物に対し抗結核菌免疫応答を誘導する。
塩基配列がコードするアミノ酸配列が、下記記載の配列番号１からなるアミノ酸配列であって良い。
配列番号１：Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln    Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala    Ser Asp Met Trp
前記塩基配列をコードするインフルエンザウイルスのゲノムが第８RNA分節であって良い。
また、前記塩基配列をコードするインフルエンザウイルスは、NS1蛋白あるいはNS1蛋白のＮ端側の一部とのポリプロテインとして発現する。
このような、遺伝子組換えインフルエンザウイルスを用いて結核ワクチンを製造する。
なお、ワクチンは、生ワクチン、不活化ワクチン、またはサブユニットワクチン等、特に限定されない。
また、ワクチンを含む医薬組成物とすることも可能である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明における遺伝子組換えインフルエンザウイルスは、結核菌感染防御免疫を誘導するエピトープを発現する塩基配列をゲノム内に有している。
本発明の遺伝子組換えインフルエンザウイルスは、持続感染や結核を発症する事もなく病原性も低い。
したがって結核感染を阻止する上気道粘膜免疫を誘導する優れたワクチン株として利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
インフルエンザウイルスのゲノム、例えばA/WSN/33 (H1N1)株第8RNA分節NS1遺伝子のN端側151残基をコードする塩基配列の下流に、必要に応じて自己切断活性を持つ2Aプロテアーゼ配列（配列番号２：Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro  ）をコードする塩基配列を挟んで、強力な防御免疫を誘導するＢ細胞またはＴ細胞エピトープ、例えばAg85A由来Ｔ細胞エピトープを含む下記、配列番号１をコードする塩基配列を挿入する。
配列番号１：Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln    Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala    Ser Asp Met Trp
例えば榎並らの方法（J.Virol. 74, 5556-5561, 2000）を用いて、遺伝子組換えウイルスを回収する。2回免疫を目的として、異なる表面抗原を持つUdorn (H3N2)株等由来のウイルスも作成する。
【実施例】
【００１２】
１、遺伝子組み換えウイルスの作成
pUC19にクローン化した、T7プロモーターとHgaI制限酵素切断部位を持つインフルエンザウイルスA/WSN/33 (H1N1)株NS1遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されているものを用いた（J. Virol. 63, 5142-5152）。
常法に従い、合成ＤＮＡプライマーを用いＰＣＲ法によりNS1タンパクＮ端151残基の下流に２Ａプロテアーゼ配列（配列番号２）とＴ細胞エピトープを含む配列（配列番号１）をコードする塩基配列を導入した（図１）。
次に、榎並らの方法（J.Viro. 74, 5556-5561, 2000）を用い、上記遺伝子組換えNS遺伝子を持つ遺伝子組換えインフルエンザウイルスNSAg85A を得た。
ウイルスはMDBK細胞を用いてプラーク単離と増殖を行った。
【００１３】
１、感染細胞内での融合タンパクの発現。
NSAg85Aウイルスと対照としてNSCATウイルスをmoi（細胞当たり感染価）１でMDBK細胞に感染した。6時間目に35S-Metで１時間標識後、細胞破砕液を抗NS1抗体で免疫沈降し、10-20％PAGEでタンパク質を分離、フルオログラフィーで解析した。融合タンパク質の効率的な発現と２Ａプロテアーゼによる自己切断（成熟）を確認した（図２）
【００１４】
２、マウスでの免疫原生の検証
NSAg85Aウイルスと対照としてNSCATウイルスを、雄６週齢BALB/cマウスに、１匹当たり1ｘ106pfuを経鼻接種した。12日後にリンパ節細胞より、Ｔ細胞を単離精製した。刺激剤として、精製インフルエンザウイルス全粒子タンパク質、ＢＣＧ菌タンパク質（ツベルクリン）、又は遺伝子組換え精製Ag85Aタンパク質を用いた。インターフェロンγの産生をELISAで定量した。
ウイルスタンパク質とAg85Aタンパク質に対する特異的免疫誘導が確認された（図３）。
【００１５】
NSAg85A、第８RNA分節の全塩基配列1060塩基を下記配列番号４に示す。
27番目 Aから656番目Gまで、融合タンパク質210残基をコードする。
27番目Aから479番目Cまで、WSN株NS1タンパク質のＮ端151残基のアミノ酸配列をコードする。
480番目Cから485番目Gまで、Xho I制限酵素認識配列。
486番目Aから536番目Tまで、2Aプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする。
537番目Cから656番目Gまで、結核菌Ag85Aタンパク質の141から180番目のアミノ酸配列をコードする。
配列番号４
ａｇｃａａａａｇｃａｇｇｇｔｇａｃａａａｇａｃａｔａａｔｇｇａｔｃｃａａａｃａｃｔｇｔｇｔｃａａｇｃｔｔｔｃａｇｇｔａｇａｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｔｇｇｃａｔｇｔｃｃｇｃａａａａｇａｇｔｔｇｃａｇａｃｃａａｇａａｃｔａｇｇｔｇａｔｇｃｃｃｃａｔｔｃｃｔｔｇａｔｃｇｇｃｔｔｃｇｃｃｇａｇａｔｃａｇａａｇｔｃｃｃｔａａｇａｇｇａａｇａｇｇｃａｇｃａｃｔｃｔｃｇｇｔｃｔｇｇａｃａｔｃｇａａａｃａｇｃｃａｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａａａｇｃａａａｔａｇｔｇｇａｇｃｇｇａｔｔｃｔｇａａｇｇａａｇａａｔｃｔｇａｔｇａｇｇｃａｃｔｃａａａａｔｇａｃｃａｔｇｇｃｃｔｃｔｇｔａｃｃｔｇｃａｔｃｇｃｇｃｔａｃｃｔａａｃｔｇａｃａｔｇａｃｔｃｔｔｇａｇｇａａａｔｇｔｃａａｇｇｃａｃｔｇｇｔｔｃａｔｇｃｔｃａｔｇｃｃｃａａｇｃａｇａａａｇｔｇｇｃａｇｇｃｃｃｔｃｔｔｔｇｔａｔｃａｇａａｔｇｇａｃｃａｇｇｃｇａｔｃａｔｇｇａｔａａｇａａｃａｔｃａｔａｃｔｇａａａｇｃｇａａｃｔｔｃａｇｔｇｔｇａｔｔｔｔｔｇａｃｃｇｇｃｔｇｇａｇａｃｔｃｔａａｔａｔｔａｃｔａａｇｇｇｃｃｔｔｃａｃｃｃｔｃｇａｇａａｔｔｔｔｇａｔｔｔａｔｔａａａｇｃｔａｇｃｔｇｇｔｇａｔｇｔｔｇａａｔｃｔａａｔｃｃｔｇｇｔｃｃｔｃａａｃａａｔｔｔｇｔａｔａｔｇｃａｇｇｔｇｃａａｔｇｔｃａｇｇａｔｔａｔｔａｇａｔｃｃａｔｃｔｃａａｇｃｔａｔｇｇｇｔｃｃａａｃｔｔｔａａｔｔｇｇａｔｔａｇｃｔａｔｇｇｇａｇａｔｇｃｔｇｇａｇｇｔｔａｔａａａｇｃｔｔｃａｇａｔａｔｇｔｇｇｔａａｃａａｔｔｇｔｔｇｇｃｇａａａｔｔｔｃａｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃａｇｇａｃａｔａｃｔｇａｔｇａｇｇａｔｇｔｃａａａａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｇｇｔｃｃｔｃａｔｃｇｇａｇｇａｃｔｔｇａａｔｇｇａａｔａａｔａａｃａｃａｇｔｔｃｇａｇｔｃｔｃｔｇａａａｃｔｃｔａｃａｇａｇａｔｔｃｇｃｔｔｇｇａｇａａｇｃａｇｔａａｔｇａｇａａｔｇｇｇａｇａｃｃｔｃｃａｃｔｃａｃｔｃｃａａａａｃａｇａａａｃｇｇａａａａｔｇｇｃｇｇｇａａｃａａｔｔａｇｇｔｃａｇａａｇｔｔｔｇａａｇａａａｔａａｇａｔｇｇｔｔｇａｔｔｇａａｇａａｇｔｇａｇａｃａｃａｇａｃｔｇａａｇａｔａａｃａｇａｇａａｔａｇｔｔｔｔｇａｇｃａａａｔａａｃａｔｔｔａｔｇｃａａｇｃｃｔｔａｃａａｃｔａｔｔｇｃｔｔｇａａｇｔｇｇａｇｃａａｇａｇａｔａａｇａａｃｔｔｔｃｔｃｇｔｔｔｃａｇｃｔｔａｔｔｔａａｔａａｔａａａａａａｃａｃｃｃｔｔｇｔｔｔｃｔａｃｔ
【００１６】
NSAg85A、融合タンパク質の全アミノ酸配列210残基を下記、配列番号３に示す。
1から151番目まで、WSN株NS1タンパク質のＮ端151残基のアミノ酸配列。
152から153番目まで、Xho I制限酵素認識配列由来。
154から170番目まで、2Aプロテアーゼ配列。
171番目から210番目まで、結核菌Ag85Aタンパク質の141から180番目のアミノ酸配列。
配列番号３
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys  Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg  Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg His Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala Gly Pro Leu Cys Ile Arg  Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Leu Glu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met Trp
【００１７】
本発明は、結核菌遺伝子の一部あるいはこれと相同のアミノ酸配列をコードする塩基配列をゲノム内に有することを特徴とする遺伝子組換えインフルエンザウイルスを用いる限り、上記実施例によって限定されるものではない。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明の遺伝子組換えインフルエンザウイルスは、上気道粘膜免疫をターゲットした結核菌ワクチンとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の組換えインフルエンザウイルスの遺伝子改変部位の模式図である。HgaIは制限酵素切断部位を、T7はT7プロモーター部位を示す。
【図２】遺伝子組み換えインフルエンザウイルス感染MDBK細胞での融合タンパク質の発現を示す。
【図３】遺伝子組み換えインフルエンザウイルスを経鼻接種したマウスから単離したＴ細胞を用い、インフルエンザウイルスタンパク質とBCG菌タンパク質（ツベルクリン）又は遺伝子組み換え精製Ag85Aタンパク質により活性化した時のγ-インターフェロン産生を示す。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【配列表】
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