(57)【要約】      （修正有）【課題】増殖曲線を的確に特徴付けることにより、試料中の標的核酸の量を測定する方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程；標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する工程を含む。【選択図】図１
2005172797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
更に、標的シグナル値または標準シグナル値をディップ、スパイク、ドリフトまたはステップについて調べ、標的シグナル値または標準シグナル値をそれぞれ調整する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準シグナル値のサブセットまたは標的増殖曲線値のサブセットをそれぞれ使用して、標準または標的増殖曲線のベースラインを定義する工程；ならびに
対応するシグナルデータを、該ベースラインに関して標準化する工程
を含む、請求項１〜２いずれか記載の方法。
【請求項４】
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準または標的増幅それぞれのエルボー領域中の標準または標的増幅それぞれのサイクルを表す、標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程
を含む、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程が、標準または標的シグナルが予め定義したシグナル値を有する標準または標的増幅のサイクルを決定する工程を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程が、標準核酸に対する標準エルボー値および標的核酸に対する標的エルボー値を決定する工程を含む、請求項４〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
エルボー値を決定する工程が、標準または標的増殖曲線のそれぞれからエルボー値を決定する工程を含む、請求項４〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
エルボー値を決定する工程が、標準または標的シグナルがそれぞれ予め定義したシグナル値未満であるサイクル数と、標準または標的シグナルがそれぞれ予め定義したシグナル値より大きいサイクル数との間を補間する工程を含む、請求項４〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
エルボー値が分数サイクル数である、請求項４〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
ベースラインを定義する工程が、
シグナルデータ中の１以上のディップまたはスパイクを同定する工程；ならびに
ベースラインを定義するために使用されるデータのセットから、１以上のディップまたはスパイクに対応する１以上のデータ値を排除する工程
を含む、請求項３〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
１以上のスパイクを同定する工程が、
隣接するデータ点間の一次階差および隣接するデータ点の２以上の二次階差を同定する工程；ならびに
予め定義したSPAMP値より大きい一次階差があり、かつ二次階差の符号に変化がある場合にスパイクを確認する工程
を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
較正方程式が、既知量の標的核酸および既知量の標準核酸に対して実施される一連の増幅実験による標的増殖曲線値および標準増殖曲線値から得られる、請求項１〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
較正方程式が、標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸の初期量を既知量の標準核酸に関連付ける、請求項１〜１２いずれか記載の方法。
【請求項１４】
較正方程式が、
既知量の標準核酸と標的および標準増殖曲線値との関数に対して標的核酸の初期量の相関をプロットし、較正プロットを得る工程；ならびに
曲線を較正プロットに適合させる工程
により定義される、請求項１〜１３いずれか記載の方法。
【請求項１５】
既知量の標準核酸と標的および標準増殖曲線値の関数が、標的および標準増殖曲線値間の差の関数である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
曲線を較正プロットに適合させる工程が、二次階非線形曲線を較正プロットに適合させる工程を含む、請求項１４〜１５いずれか記載の方法。
【請求項１７】
非線形曲線が、式：
【数１】
2005172797.tif 000030
式中、TOは標的核酸の初期量であり、QOは標準核酸の初期量であり、nQは標準核酸の量がQであるサイクル数であり、nTは標準の量がTであるサイクル数である
により定義される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程が、データが標的核酸の初期量を算出するためには不適切であることを報告する工程を含む、請求項２〜１７いずれか記載の方法。
【請求項１９】
標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程がディップ、スパイク、ドリフトまたはステップに対応するデータ値を削除する工程を含む、請求項２〜１８いずれか記載の方法。
【請求項２０】
試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
連続したサイクルの標準増幅および標的増幅において既知量の標準核酸および標的核酸試料をそれぞれ増幅する工程；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングし、標準増殖データおよび標的増殖データを得る工程；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義する工程；
非線形較正方程式ならびに標的値および標準値を使用して標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメーターを使用して、標的核酸の量を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
既知量の標準核酸および標的核酸試料を増幅する工程が、
既知量の標準核酸と標的核酸試料とを混合して混合物を形成する工程；ならびに
混合物中で標準核酸と標的核酸とを同時増幅させる工程
を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
標準核酸および標的核酸を同時増幅させる工程が、共通のプライマー対を使用する工程を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
標準シグナルが第１蛍光シグナルであり、標的シグナルが第２蛍光シグナルである、請求項２０〜２２いずれか記載の方法。
【請求項２４】
標準シグナルまたは標的シグナルをモニタリングする工程が、蛍光色素対の一方に由来する蛍光シグナルをモニタリングする工程を含む、請求項２０〜２３いずれか記載の方法。
【請求項２５】
標準または標的シグナルをモニタリングする工程が、標準または標的核酸それぞれの内部へのオリゴヌクレオチドプローブのアニーリングをモニタリングする工程を含む、請求項２０〜２４いずれか記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸に関する較正方程式を定義する方法であって、
それぞれの増幅実験に既知量の標的核酸および既知量の標準核酸を使用して、一連の増幅実験を実施する工程、
複数サイクルについて、シグナル増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程、ならびに
標的シグナル値を使用する標的増殖曲線値、標準シグナル値を使用する標準増殖曲線値、および標的核酸の初期量を含む増幅実験の増幅データを定義する工程；ならびに
増幅実験における標的核酸の初期量を、増幅実験の増幅データを使用して、増幅実験の標的および標準増殖曲線値の関数として表す非線形較正方程式を定義する工程
を含む、方法。
【請求項２７】
試料中の標的核酸を評価する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受ける工程；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整する工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
異常がディップ、スパイク、ステップまたはドリフトである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
試料中の標的核酸量を決定するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標準核酸の初期量ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項３０】
試料中の標的核酸を評価するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整すること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項３１】
試料中の標的核酸の量を測定するためのコンピュータ実行システムであって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る手段；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する手段；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する手段
を含む、コンピューター実行システム。
【請求項３２】
試料中の標的核酸の量を測定するキットであって、
標的核酸との連続したサイクルの同時増幅での使用のための既知量の標準核酸；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングして、標準増殖データおよび標的増殖データを作製するのに使用するハイブリダイゼーションプローブ；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を定義し、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義するためのコンピュータープログラム製品；ならびに
非線形較正方程式を使用して標的核酸の量を測定するための、標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメータを含む較正データ
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸の定量分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、核酸配列を増幅するための、強力であり、広く用いられる技術である。PCRは、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（Taq）ポリメラーゼなどのポリメラーゼを用いて核酸の特定のセグメントのコピーを複製または増幅する。核酸のコピー数は、少なくとも最初は指数関数的に増加し、次いで、この増加は、反応物質が制限的なものとなるか、そうでなければ複製を干渉するので、次第に衰える。
【０００３】
従来のPCRアッセイは、例えば、比較的多量の材料を必要とする遺伝子型同定などの分析に用いるためのサンプル中の核酸を増幅するために用いられる。従来のPCRアッセイはまた、細胞または組織サンプル中の特定の病原体またはタンパク質の存在を検出するために、例えば、正常な細胞のバックグラウンド中の異常な細胞から特有のmRNA転写産物を検出するために臨床適用に用いることもできる。
【０００４】
多くの疾患にとって、病原体が通常存在している場合、遺伝子が通常低レベルで発現されている場合、またはウイルスが健常な細胞または組織に内因的に維持されている場合などは、適切な診断を下すために定量的測定が必要である。正確な定量的測定は、例えば特定の感染病、癌および自己免疫疾患を診断するために必要であり、治療に対する疾病の応答を評価し、回復を予知するのに治療上有用であり得る。正確な定量的測定はまた、サンプルに何らかの汚染がある場合に生じ得る偽陽性を検出する助けともなり得る。
【０００５】
しかしながら、通常、別々の実験または増幅からのデータが比較できるものではないために、任意の特定のPCRの結果を定量することは困難であり得る。増幅は指数関数的プロセスであり、プライマー対の長さおよび配列、鋳型およびヌクレオシドなどの反応物質の濃度、および反応条件をはじめとする、反応率に影響を及ぼすいずれかの変数のわずかな相違が、増幅およびPCR産物の最終的な収率に著しい相違をもたらし得る。要するに、PCR毎に異なる反応力学を有する。
【０００６】
2つの一般的なアプローチにより、PCR間のばらつきの多くを制御し、核酸の定量的または少なくとも半定量的データを得ることが可能になった:（1）同時増幅または「競合」PCRおよび（2）PCR増幅または「増殖曲線」のモデリング。
【０００７】
同時増幅とは、2種の核酸、例えば、標的核酸（「標的」）および標準核酸（「標準」）の同一混合物の増幅である。標的および標準のPCRを、同一条件下で同時に実施することによって、標的および標準が同一処理を受け、同一条件を経るために、前記のものなどの変数の作用を制御することができる。理想的には、標的および標準を増幅するのに同一プライマーを用い、それによってプライマーのアニーリングの相違による効率の相違を制御する。
【０００８】
2種の核酸の相対量は、例えば、アガロースゲル電気泳動、ノーザンブロット解析またはディファレンシャルディスプレイなどの異種の方法を用いて測定することができる。同時増幅アッセイでは、未知の量の標的を含むサンプルに、既知の濃度およびひいては既知の量または総量の標準を加えて混合物を形成し、2種の核酸を増幅することができる。次いで、種々の濃度のサンプルについて標的と標準の量を比較することによって標的の量を概算することができる。増幅後に同様の量の標的および標準産物が存在する標準の濃度から、標的の初期量の推定値が提供される。
【０００９】
種々のプローブの開発により、同種の方法でリアルタイムに、すなわち、反応が進行すると同時にPCR産物を解析することが可能となった。例えば、いくつかの既存の技術は、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて、蛍光発光を測定することによって各PCRサイクルで産物を検出する。蛍光の測定値は、核酸のコピー数に対応する。例えば、TaqMan（登録商標）プローブは、エネルギー転移蛍光法を利用し、これでは、プローブは、PCRヌクレアーゼアッセイの際に切断されるまで自己消光されている。PCRのリアルタイムサンプリングを用いることで、増殖曲線を種々のサイクルでの核酸の相対量の尺度に適合させることができる。次いで、既知量の核酸の増幅により作製した較正曲線を用いて核酸の初期量を定量することができる。特許文献１「Method for quantification of an analyte」を参照のこと。
【００１０】
蛍光色素の種々の組み合わせを使用して、核酸の同時増幅をリアルタイムに同時にモニターすることができ、次いで、標準核酸の標準曲線を作製することによって標的の絶対量を測定することができる。標準曲線は、例えば、増幅前に存在する、変動するが既知の量に対して、PCRのいくつかのサイクルによって生じた標準の量をプロットすることによって作製することができる。特許文献２「Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction」を参照のこと。
【００１１】
核酸の同時増幅により、PCRの際の種々の産物の直接比較およびモニタリングが可能となり、それによって定量に用いるためのデータが提供されるが、特定の人為的要素がデータに導入されることもある。例えば、競合作用は、直線較正が正確でないことを意味し得る。非競合法であっても、PCRの際のアニーリング温度の変化は、蛍光シグナルの変化、ひいてはベースラインのシフトを引き起こすことがあり、任意の作用、例えばサンプル中の泡が出力データにスパイクを引き起こすこともある。これらの人為的要素およびデータの異常特性を同定し、除去するか補正できないと、PCRの誤った解釈につながり得る。特に、異常を補正できないと偽陽性をもたらすことがあり、同時増幅の人為的要素を明らかにすることができないと、同時増幅PCRデータに基づいた定量の正確度および的確度が大幅に低下する。
【特許文献１】米国特許第6,503,720号明細書
【特許文献２】米国特許第5,476,774号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、以下の利点のうち1以上を提供することである。増殖曲線を的確に特徴付けることにより、増幅前のサンプル中の標的核酸量を的確および正確に確立することが可能となる。標的核酸の定量は自動化できる。定量には不十分であるデータを同定できる。PCR増殖曲線は、スパイクおよびベースラインシフトなどの異常について調べることができる。スペイクおよびベースラインシフトなどの異常は補正できる。PCRの指数増殖期のデータは、標的核酸を定量するために効果的に使用できる。アルゴリズムモジュールは、同時増幅PCRの定量分析のデータを用いるが、遺伝子型同定および定性試験などの他の状況に適用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は以下である：
[１]  試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する工程
を含む、方法。
[２]  更に、標的シグナル値または標準シグナル値をディップ、スパイク、ドリフトまたはステップについて調べ、標的シグナル値または標準シグナル値をそれぞれ調整する工程を含む、[１]記載の方法。
[３]  標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準シグナル値のサブセットまたは標的増殖曲線値のサブセットをそれぞれ使用して、標準または標的増殖曲線のベースラインを定義する工程；ならびに
対応するシグナルデータを、該ベースラインに関して標準化する工程
を含む、[１]〜[２]いずれか記載の方法。
[４]  標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準または標的増幅それぞれのエルボー領域中の標準または標的増幅それぞれのサイクルを表す、標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程
を含む、[１]〜[３]いずれか記載の方法。
[５]  標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程が、標準または標的シグナルが予め定義したシグナル値を有する標準または標的増幅のサイクルを決定する工程を含む、[４]記載の方法。
[６]  標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程が、標準核酸に対する標準エルボー値および標的核酸に対する標的エルボー値を決定する工程を含む、[４]〜[５]いずれか記載の方法。
[７]  エルボー値を決定する工程が、標準または標的増殖曲線のそれぞれからエルボー値を決定する工程を含む、[４]〜[６]いずれか記載の方法。
[８]  エルボー値を決定する工程が、標準または標的シグナルがそれぞれ予め定義したシグナル値未満であるサイクル数と、標準または標的シグナルがそれぞれ予め定義したシグナル値より大きいサイクル数との間を補間する工程を含む、[４]〜[７]いずれか記載の方法。
[９]  エルボー値が分数サイクル数である、[４]〜[８]いずれか記載の方法。
[１０]  ベースラインを定義する工程が、
シグナルデータ中の１以上のディップまたはスパイクを同定する工程；ならびに
ベースラインを定義するために使用されるデータのセットから、１以上のディップまたはスパイクに対応する１以上のデータ値を排除する工程
を含む、[３]〜[９]いずれか記載の方法。
[１１]  １以上のスパイクを同定する工程が、
隣接するデータ点間の一次階差および隣接するデータ点の２以上の二次階差を同定する工程；ならびに
予め定義したSPAMP値より大きい一次階差があり、かつ二次階差の符号に変化がある場合にスパイクを確認する工程
を含む、[１０]記載の方法。
[１２]  較正方程式が、既知量の標的核酸および既知量の標準核酸に対して実施される一連の増幅実験による標的増殖曲線値および標準増殖曲線値から得られる、[１]〜[１１]いずれか記載の方法。
[１３]  較正方程式が、標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸の初期量を既知量の標準核酸に関連付ける、[１]〜[１２]いずれか記載の方法。
[１４]  較正方程式が、
既知量の標準核酸と標的および標準増殖曲線値との関数に対して標的核酸の初期量の相関をプロットし、較正プロットを得る工程；ならびに
曲線を較正プロットに適合させる工程
により定義される、[１]〜[１３]いずれか記載の方法。
[１５]  既知量の標準核酸と標的および標準増殖曲線値の関数が、標的および標準増殖曲線値間の差の関数である、[１４]記載の方法。
[１６]  曲線を較正プロットに適合させる工程が、二次階非線形曲線を較正プロットに適合させる工程を含む、[１４]〜[１５]いずれか記載の方法。
[１７]  非線形曲線が、式：
【００１４】
【数１】
2005172797.tif 000003
【００１５】
式中、TOは標的核酸の初期量であり、QOは標準核酸の初期量であり、nQは標準核酸の量がQであるサイクル数であり、nTは標準の量がTであるサイクル数である
により定義される、[１６]記載の方法。
[１８]  標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程が、データが標的核酸の初期量を算出するためには不適切であることを報告する工程を含む、[２]〜[１７]いずれか記載の方法。
[１９]  標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程がディップ、スパイク、ドリフトまたはステップに対応するデータ値を削除する工程を含む、請求項[２]〜[１８]いずれか記載の方法。
[２０]  試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
連続したサイクルの標準増幅および標的増幅において既知量の標準核酸および標的核酸試料をそれぞれ増幅する工程；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングし、標準増殖データおよび標的増殖データを得る工程；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義する工程；
非線形較正方程式ならびに標的値および標準値を使用して標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメーターを使用して、標的核酸の量を測定する工程
を含む、方法。
[２１]  既知量の標準核酸および標的核酸試料を増幅する工程が、
既知量の標準核酸と標的核酸試料とを混合して混合物を形成する工程；ならびに
混合物中で標準核酸と標的核酸とを同時増幅させる工程
を含む、[２０]記載の方法。
[２２]  標準核酸および標的核酸を同時増幅させる工程が、共通のプライマー対を使用する工程を含む、[２１]記載の方法。
[２３]  標準シグナルが第１蛍光シグナルであり、標的シグナルが第２蛍光シグナルである、[２０]〜[２２]いずれか記載の方法。
[２４]  標準シグナルまたは標的シグナルをモニタリングする工程が、蛍光色素対の一方に由来する蛍光シグナルをモニタリングする工程を含む、[２０]〜[２３]いずれか記載の方法。
[２５]  標準または標的シグナルをモニタリングする工程が、標準または標的核酸それぞれの内部へのオリゴヌクレオチドプローブのアニーリングをモニタリングする工程を含む、[２０]〜[２４]いずれか記載の方法。
[２６]  標的核酸に関する較正方程式を定義する方法であって、
それぞれの増幅実験に既知量の標的核酸および既知量の標準核酸を使用して、一連の増幅実験を実施する工程、
複数サイクルについて、シグナル増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程、ならびに
標的シグナル値を使用する標的増殖曲線値、標準シグナル値を使用する標準増殖曲線値、および標的核酸の初期量を含む増幅実験の増幅データを定義する工程；ならびに
増幅実験における標的核酸の初期量を、増幅実験の増幅データを使用して、増幅実験の標的および標準増殖曲線値の関数として表す非線形較正方程式を定義する工程
を含む、方法。
[２７]  試料中の標的核酸を評価する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受ける工程；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整する工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価する工程
を含む、方法。
[２８]  異常がディップ、スパイク、ステップまたはドリフトである、[２７]記載の方法。
[２９]  試料中の標的核酸量を決定するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標準核酸の初期量ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
[３０]  試料中の標的核酸を評価するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整すること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
[３１]  試料中の標的核酸の量を測定するためのコンピュータ実行システムであって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る手段；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する手段；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する手段
を含む、コンピューター実行システム。
[３２]
試料中の標的核酸の量を測定するキットであって、
標的核酸との連続したサイクルの同時増幅での使用のための既知量の標準核酸；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングして、標準増殖データおよび標的増殖データを作製するのに使用するハイブリダイゼーションプローブ；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を定義し、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義するためのコンピュータープログラム製品；ならびに
非線形較正方程式を使用して標的核酸の量を測定するための、標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメータを含む較正データ
を含む、キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、以下の利点のうち1以上を提供するように実施できる。増殖曲線を的確に特徴付けることにより、増幅前のサンプル中の標的核酸量を的確および正確に確立することが可能となる。標的核酸の定量は自動化できる。定量には不十分であるデータを同定できる。PCR増殖曲線は、スパイクおよびベースラインシフトなどの異常について調べることができる。スペイクおよびベースラインシフトなどの異常は補正できる。PCRの指数増殖期のデータは、標的核酸を定量するために効果的に使用できる。アルゴリズムモジュールは、同時増幅PCRの定量分析のデータを用いるが、遺伝子型同定および定性試験などの他の状況に適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
要約
本発明は、既知の初期濃度の標的核酸および標準核酸のPCR増殖曲線に基づいて標的核酸を定量する技術を提供する。
【００１８】
概して、一態様では、本発明は、コンピュータプログラム製品を含む方法および装置を提供し、これによりサンプル中の標的核酸量を測定するための技術を実施する。本技術は、標的核酸および標準核酸に対して実施された複数のサイクルの増幅実験のシグナルデータを受け取ること含む。シグナルデータは、シグナル増幅のサイクルの際に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクルの際に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む。標的増殖曲線値は、標的シグナル値を用いて定義し、標準増殖曲線値は、標準シグナル値を用いて定義する。標的核酸の初期量は、標準核酸の初期量ならびに標的および標準増殖曲線値を用いて、非線形方程式である較正方程式にしたがって算出する。
【００１９】
有利な実施は、以下の特徴のうちの1以上を含み得る。標的増殖曲線値および標準増殖曲線値はそれぞれ、標準シグナル値のサブセットまたは標的増殖曲線値のサブセットを用いて標準または標的増殖曲線のベースラインを定義し、対応するシグナルデータをベースラインに対して標準化することによって定義できる。ベースラインを定義することは、シグナルデータ中の1以上のディップまたはスパイクを同定し、1以上のディップまたはスパイクに対応する1以上のデータ値を、ベースラインを定義するのに用いられるデータセットから排除することを含み得る。1以上のスパイクを同定することは、隣接するデータ点間の一次階差および隣接するデータ点の2以上の二次階差を同定し、予め定義されたSPAMP値よりも大きな一次階差および二次階差の符号の変化がある場合に、スパイクを確認することを含み得る。
【００２０】
標的増殖曲線値および標準増殖曲線値を定義することは、標準核酸または標的核酸のエルボー（elbow）値を決定することを含み得、エルボー値は、それぞれ標準または標的増幅のエルボー領域における、それぞれ標準または標的増幅のサイクルに相当する。標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定することは、標準または標的シグナルが予め定義されたシグナル値を有する、標準または標的増幅のサイクルを決定すること；標準核酸の標準エルボー値および標的核酸の標的エルボー値を決定すること；標準または標的増殖曲線それぞれからエルボー値を決定すること；および標準または標的シグナルがそれぞれ、予め定義されたシグナル値未満であるサイクル数と、標準または標的シグナルがそれぞれ、予め定義されたシグナル値よりも大きいサイクル数の間を補間することを含み得る。エルボー値は分数サイクル数であり得る。
【００２１】
較正方程式は、既知量の標的核酸および既知量の標準核酸について実施した一連の増幅実験による標的増殖曲線値および標準増殖曲線値から得ることができる。較正方程式によって、標的および標準増殖曲線値を用いて標的核酸の初期量を既知量の標準核酸に関連付けることができる。較正方程式は、標的核酸の初期量の相関を、既知量の標準核酸ならびに標的および標準増殖曲線値の関数に対してプロットして較正プロットを得、曲線を較正プロットに適合させることによって定義することができる。既知量の標準核酸ならびに標的および標準増殖曲線値の関数は、標的および標準増殖曲線値間の差の関数であり得る。曲線を較正プロットに適合させることは、二次非線形曲線を較正プロットに適合させることを含み得る。非線形性は、式：
【００２２】
【数２】
2005172797.tif 000004
【００２３】
(式中、Ｔ0は標的核酸の初期量であり、Q0は標準核酸の初期量であり、nQは標準核酸の量がQであるサイクル数であり、nTは標準の量がTであるサイクル数である) によって定義することができる。
【００２４】
この技術は、標的シグナル値または標準シグナル値を、ディップ、スパイク、ドリフトまたはステップについて調べ、標的シグナル値または標準シグナル値をそれぞれ調節することを含み得る。標的シグナル値または標準シグナル値を調節することは、データが標的核酸の初期量を算出するには不適切であることを報告することを含み得る。標的シグナル値または標準シグナル値を調節することは、ディップ、スパイク、ドリフトまたはステップに相当するデータ値を削除することを含み得る。
【００２５】
概して、別の態様では、本発明は、コンピュータプログラム製品を含む、方法および装置を提供し、サンプル中の標的核酸量を測定するための技術を実施する。本技術は、既知量の標準核酸および標的核酸のサンプルをそれぞれ連続サイクルの標準増幅および標的増幅において増幅すること、標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニターして標準増殖データおよび標的増殖データを得ること、標準増幅を特性決定する標準増殖データから標準値を、および標的増幅を特性決定する標的増殖データから標的値を定義すること、ならびに、非線形較正方程式ならびに標的および標準値を用いて標的核酸量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメータを用いて標的核酸量を決定することを含む。
【００２６】
有利な実施は、以下の特徴のうち1以上を含み得る。既知量の標準核酸および標的核酸のサンプルを増幅することは、既知量の標準核酸と標的核酸のサンプルとを混合して混合物を形成すること；および混合物中の標準核酸と標的核酸を同時増幅することを含み得る。標準核酸と標的核酸を同時増幅することは、共通のプライマー対を用いることを含み得る。標準シグナルは第1の蛍光シグナルであり得、標的シグナルは、第2の蛍光シグナルであり得る。標準シグナルまたは標的シグナルのモニタリングは、蛍光色素対の一方に由来する蛍光シグナルのモニタリングを含み得る。標準または標的シグナルのモニタリングは、オリゴヌクレオチドプローブの、標準または標的核酸のそれぞれの内部へのアニーリングのモニタリングを含み得る。
【００２７】
概して、別の態様では、本発明は、コンピュータプログラム製品を含む、方法および装置を提供し、標的核酸の較正方程式を定義するための技術を実施する。この技術は、既知量の標的核酸および既知量の標準核酸を用いて一連の増幅実験を実施すること、ならびに各増幅実験について、複数のサイクルのシグナルデータを受け取ることを含む。シグナルデータは、シグナル増幅のサイクルの際に存在する標準核酸量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクルの際に存在する標的核酸量を示す一連の標的シグナル値を含み得る。標的増殖曲線値を含む増幅実験の増幅データは、標的シグナル値を用いて定義する。標準増殖曲線値は、標準シグナル値および標的核酸の初期量を用いて定義する。増幅実験における標的核酸の初期量を、増幅実験の増幅データを用いて増幅実験の標的および標準増殖曲線値の関数として表す、非線形較正方程式を定義する。
【００２８】
概して、別の態様では、本発明は、コンピュータプログラム製品を含む、方法および装置を提供し、サンプル中の標的核酸を評価する技術を実施する。この技術は、標的核酸および標準核酸について実施した増幅実験の複数のサイクルのシグナルデータを受け取ることを含む。シグナルデータは、シグナル増幅のサイクルの際に存在する標準核酸量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクルの際に存在する標的核酸量を示す一連の標的シグナル値を含む。標的シグナル値および標準シグナル値を、異常について調べ、標的シグナル値および標準シグナル値を、異常を明らかにするよう調節する。標的増殖曲線値を、標的シグナル値を用いて定義し、標準増殖曲線値を、標準シグナル値を用いて定義する。標的核酸を、標的および標準増殖曲線値を用いて評価する。異常はディップ、スパイク、ステップまたはドリフトであり得る。
【００２９】
概して、別の態様では、本発明は、サンプル中の標的核酸量を測定するキットを提供する。このキットは、標的核酸との同時増幅の連続サイクルに用いるための既知量の標準核酸と、標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルのモニタリングに用いて標準増殖データおよび標的増殖データを得るためのハイブリダイゼーションプローブとを含む。このキットはまた、標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を、および標的増殖を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義するためのコンピュータプログラム製品を含む。このキットはまた、非線形較正方程式を用いて標的核酸量を決定するための較正データを含み、この較正データは、標的核酸量を既知量の標準核酸と関連付ける較正方程式のパラメーターを含む。
【００３０】
本発明は、以下の利点のうち1以上を提供するように実施できる。増殖曲線を的確に特徴付けることにより、増幅前のサンプル中の標的核酸量を的確および正確に確立することが可能となる。標的核酸の定量は自動化できる。定量には不十分であるデータを同定できる。PCR増殖曲線は、スパイクおよびベースラインシフトなどの異常について調べることができる。スペイクおよびベースラインシフトなどの異常は補正できる。PCRの指数増殖期のデータは、標的核酸を定量するために効果的に使用できる。アルゴリズムモジュールは、同時増幅PCRの定量分析のデータを用いるが、遺伝子型同定および定性試験などの他の状況に適用できる。
【００３１】
本発明の1以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載で示す。特に規定のない限り、本明細書に用いたすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書に記載された、すべての出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。対立する場合には、定義を含む本明細書が支配する。本発明の他の特徴および利点は、説明、図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００３２】
発明の詳細な説明
本明細書に記載された方法および装置は、核酸の増殖曲線または増殖曲線値の的確かつ正確な特徴付けを提供する。本方法および装置はまた、既知の初期濃度の標的および標準核酸（「標準」）のPCR増殖曲線または増殖曲線値を特徴付けすることによって標的核酸（「標的」）の定量を提供し、また、既知の濃度の標的および標準の増殖曲線からの情報を用いて標準の濃度に対して較正される標的の濃度の測定値を提供する。
【００３３】
図1に示されるように、本方法は、標的核酸の濃度を決定するために分析される材料を用いて開始する（ステップ102）。サンプル中の標的核酸の存在または量は通常未知である。通常、材料は生物学的サンプル、例えば、血液または組織サンプルに由来する。従来技術を用いて、材料を分析のために準備する。例えば、サンプル材料から手作業で、またはサンプル調整用に構築された機器によって標的核酸を抽出することができる。1以上の標的核酸を同定することができる。
【００３４】
標準核酸を選択する（ステップ104）。標準核酸は通常、標的核酸を増幅するために用いるものと同一のプライマー対を用いて増幅できるよう選択する。標準核酸は通常、DNA配列を設計するための種々の従来法のうちのいずれかを用いて合成する。標準は、天然に存在するものではないか、またはそうでなければ従来のものではない核酸であり得る。例えば、標準は、天然に存在する核酸の改変型であってもよい。標準はその融解温度を調節するために、例えば、TM修飾因子配列を挿入することによって改変できる。標準はまた、炭水化物部分を除去するために、例えば、別の方法でグリコシル化シグナルを生じるヌクレオチドを変更することによって改変できる。標準核酸の濃度は既知であるか、そうでなければ標準核酸量を決定することができる。
【００３５】
標準および標的核酸は、DNA（ゲノムまたはウイルスDNAを含む）またはRNA（ウイルスRNAまたはmRNAを含む）であり得る。DNAである標的または標準は、様々な従来のPCR法のうち任意のものを用いて増幅または同時増幅することができる。RNAである標的または標準は、RNAが逆転写酵素を用いてまずDNAに変換され、次いでDNAを増幅するためにPCRが用いられる、逆転写PCR（RT-PCR）を用いて増幅または同時増幅することができる。McPherson, M.J.およびS.G. Moller、PCR:The Basics from Background to Bench、第8章:Analysis of Gene Expression（2000）参照。RT-PCRにより、mRNAをサンプリングしてHIVなどのレトロウイルスを検出するために遺伝子発現を測定することが可能となる。標準核酸は、標的核酸について分析される材料のサンプル（標的のサンプル）と混合することができ、得られた標準および標的サンプルの組合せを同時増幅することができる（ステップ112）。あるいは、各増幅を、できる限り類似の条件下で個別に行うことができる。
【００３６】
各核酸の増幅は、核酸の濃度または量を示すシグナルを測定することによってモニターする（ステップ114）。したがって、シグナル測定値は測定時のPCR中に存在する核酸の濃度または量に対応する。シグナル測定値はPCRの間の2以上の時点で取る。熱サイクルが、サンプルのセット（バッチ）のPCR条件を支配し、通常、温度および温度変化の時間はPCRプロフィールに指定されている。このようなプロフィールはまた、PCRのモニタリングを制御するために使用できる。例えば、各サイクルで、例えば、変性後または増幅の間に、あるいはPCRの際の合間に測定値を取ることができる。
【００３７】
標的核酸を標準と同時増幅する場合には、ステップ114において増幅が進行する共に、両PCRの産物を同時にモニターすることができる。2以上の増幅産物のこのような「オンライン」または「リアルタイム」検出は、COBAS TaqMan（登録商標）システムのいずれかなどのシステムを用いて可能であり、以下により詳細に記載する。
【００３８】
一実施では、各サイクルで、指定の条件下で、例えば、PCR産物と結合すると、またはPCR産物がコピーされるまで蛍光を発する標識されたオリゴヌクレオチドプローブの蛍光を測定することによってPCRをモニターする。蛍光の測定値は、通常、フィルター処理した光でサンプルを一時的に照射した後に取る（「光」読み取り）。バックグラウンド作用および機器の感度の揺らぎなどの混乱による変動を制御するために、光源の強度を参照（「参照」）として測定することができ、データを集めて蛍光のバックグラウンド（「暗」）レベルを特徴付けすることができる。バックグラウンドは、照射せずに、例えば、サンプルに照射する直前に測定する。理想的には、蛍光のバックグラウンド（「暗」）レベルを各蛍光（「光」）読み取りについて決定する。蛍光のバックグラウンドレベルは、複数の測定値の平均として特性決定することができ、それらの読み取り値の何らかのドリフトまたは変動を考慮に入れることができる。補正した蛍光シグナル、Fは、次いで、以下のように決定することができる:
【００３９】
【数３】
2005172797.tif 000005
【００４０】
本明細書では本発明は、蛍光の測定値を用いて記載されるが、他のシグナルの測定値を用いてもよい。PCR産物の濃度を示すかまたはそれに対応するシグナルが好ましい。シグナルは繰り返して、サンプルにとって破壊的ではなく測定でき、それによって、PCRが進行するにつれてサンプルのPCRをモニターすることが可能となることが理想的である。
【００４１】
標的核酸の濃度を示すシグナルのモニタリングにより、標的のシグナルデータのセット（120）が得られ、標準核酸の濃度を示すシグナルのモニタリングにより、標準のシグナルデータのセット（130）が得られる。標的データおよび標準データは、例えば、データベースに保存することができる。
【００４２】
シグナルデータの各セット（120、130）は、核酸の増幅の増殖曲線を表すことができ、個別にではあるが同様に、以下により詳細に記載するように処理する（ステップ122、124;132、134）。手短には、ステップ122および132では、標的およびシグナルデータそれぞれを、スパイク、ディップ、ステップおよびベースラインシフトなどの異常について調べる。このような異常が存在する場合には、それらを補正することができる。ステップ124および134では、補正された標的およびシグナルデータを、以下により詳細に説明するように、増幅が増幅または増殖曲線のエルボー領域にある、サイクル数またはサイクルの分数である「エルボー値」などの増殖曲線値を決定するために各々見積もる。エルボー値は、例えば、増幅が、予め定義された値に最も近い核酸量の指標を生じるサイクルであり得る。エルボー値は、増殖曲線の形を反映する尺度または計算から、または以下により詳細に説明するように、観察された値の間の補間から決定することができる。
【００４３】
シグナルデータ120、130を、増幅サイクル数の関数としてプロットし、増殖曲線を作製することができる。PCRによる核酸の増幅は指数関数的プロセスであり、そのため、PCR増殖曲線は典型的には、および概して、少なくともPCRの初期段階の間は指数関数的な形である。図2A〜Jは、図1の方法によるPCR実験で得ることのできる増殖曲線の例を示す。図2A〜DおよびHは、概して指数関数的な形である増殖曲線を示す。この曲線は、図2Dに示されるように、高率の増幅を、または図2Eに示されるように、低率の増幅を特徴とし得る。高率の増幅を有するPCRは、短いベースライン（またはベースラインがない）と急激に上昇する増殖曲線を有する傾向がある。低率の増幅を有するPCRは、長いベースラインとゆっくりと上昇する増殖曲線を有する傾向がある。後者の場合には、増殖は直線的であるように見えることもある。
【００４４】
増殖曲線は、図2F、G、Jに示されるように、一定期間指数関数的に増加した後、次第に衰えることもある。しかしながら、各増殖曲線は、図2A〜H、Jに示されるように、典型的には、たとえ、産物の濃度または量がゆっくりとしか増えなくとも、絶対的なベースラインレベルは有する。各増殖曲線はまた、例えば、同様に図2A〜H、Jに示されるように、典型的には、「エルボー」、産物の濃度または量が急激に増加しはじめる領域を有する。
【００４５】
増殖曲線は、通常、なだらかであり増加しているが、図2Fに示されるように、周期的またはランダムなシグナル変化がシグナルデータに重ね合わさり、「ノイズのある」曲線を生じることもある。完全な系ができないと、図2Iに示されるように、「フラットライン」曲線を生じ得る。あるいは、PCRが進行した時点で、増殖曲線に認識可能な異常が表れることがある。このような異常は、例えば、方法論の人為的結果、機器の挙動、またはランダムエラーの結果として生じ得る。それらとしては、例えば、ベースラインディップ、ベースラインドリフト、シグナルスパイクおよびシグナルステップが挙げられる。
【００４６】
図2Aは、典型的には、たとえ、最初の5〜10増幅サイクルの間であっても生じるベースラインディップを示す。ベースラインディップとは、シグナルの異常な上昇または落ち込みはいずれも含む。例えば、ベースラインディップは、図2Aに示されるように、シグナルが低下し、次いで、上昇するために「U」様であり得る。例えば、ベースラインディップは上昇とそれに続く低下、または何らかの一連の上昇および低下であり得る。ベースラインディップは、サンプルの不均質性（例えば、調製の際の不完全な混合）に起因し得る。
【００４７】
図2Bはベースラインドリフト-典型的には、シグナルの任意の著しい増加の前に生じる、増殖曲線の緩徐な上方への（示されるような）または下方への傾斜を示す。ベースラインドリフトは、連続PCRサイクルの間のサンプルの変化または変性によって引き起こされ得る。
【００４８】
図2Cは、シグナルスパイクを示し、これは、PCRの間、いつでも起こり得、これでは、シグナルが急上昇または急降下して、突然、劇的に変化する。シグナルスパイクは、サンプルの不均質性（例えば、泡形成）または機器もしくはシグナルの干渉（例えば、検出器に対する宇宙線）によって引き起こされ得る。図2Jは、増殖曲線が、示されるようにシフトアップするか、シフトダウンするようにシグナルを変更する、シグナルステップを示す。シグナルステップ（シフト）は、PCRの間、いつでも起こり得るが、通常、アニーリング温度の変化と関連している。例えば、蛍光シグナルは温度に対して敏感であり得、その結果、蛍光強度がアニーリング温度の変化に伴って変化する。
【００４９】
ステップ122および132では、標的および標準データをそれぞれ、異常について調べ、異常を補正することができる。シグナル異常を同定および除去または補正することができないと、定量の誤りおよび不正確な結果をもたらし得る。スパイク、ディップ、またはドリフトは同定され、論理的に誤ったデータが除去されるか、なだらかな増殖と一致するデータと置き換えられるのが理想的である。また、ベースラインステップが同定され、シフトを説明するためにデータが調節されるのも理想的である。データはまた、品質管理標準に対して調べることができる。例えば、方法の失敗を反映するか、過度のノイズまたはベースライン傾斜を含むデータを、分析から排除することができる。核酸の同時増幅は、PCR増殖曲線データに異常を観察する尤度を高めることがあり、使用可能なデータの範囲を制限し得る。例えば、不均質性は、増殖曲線にスパイクを引き起こし得る。したがって、標的核酸の濃度または量を定量するために同時増幅データを用いる場合には、異常を制御し、明らかにすることは特に重要である。
【００５０】
ステップ124および134では、標的および標準データそれぞれについて「エルボー値」などの増殖曲線値を決定する。増殖曲線値は、通常、標的またはシグナルデータに基づいており、典型的には、それらのデータによって表される増殖曲線に対して特定される。例えば、増殖曲線値は、増殖曲線によって表されるシグナルが、予め決定されたシグナル値とほぼ等しいサイクル数の尺度であり得る。このような増殖曲線値は、整数サイクル数よりも大きな正確さを有すること、例えば、分数サイクル数が好ましい。予め決定されたシグナル値は、多数の値が可能であり、同様に適している可能性があるため、本明細書では「任意の」シグナル値または「ASV」と呼ぶ。
【００５１】
ASVは、分析されている増殖曲線の各々が、そのエルボー領域においてASVと交差し、その場合に増殖曲線値がエルボー値と呼ばれるよう定義されることが好ましい。先に論じたように、PCR増殖曲線は典型的には、および概して、少なくともPCRの初期段階の間は指数関数的な形であり、非常に緩徐な増加を特徴とする初期領域と産物の濃度または量が急速に増加する後期領域を有する傾向がある。エルボー領域は、産物の濃度または量がちょうど急速に増加しはじめる、初期領域から後期領域への移行時にある。PCRの数学は、典型的には、エルボー領域では、曲線のその他の領域、例えば、競合作用が増幅または増殖の速度を低下させるPCRの後期では単純である。さらに、増殖は、あるサイクルから次への産物の濃度の変化が最大である、エルボー領域の測定値を用いることでかなり正確にモニターされる。
【００５２】
所与の増殖曲線のエルボー値を決定するためには、まず増殖曲線を、シグナルデータが、例えば、1または0という値ではじまるよう、定義されたベースラインにしたがって標準化する。次いで、任意のシグナル値に近い増殖曲線のデータ点を同定し、そのデータ点と関連しているサイクル数の間を補間することによってエルボー値を決定する。
【００５３】
より正確には、図3に示したように、エルボー値を決定することは、増殖曲線のベースラインを決定すること（ステップ302）によってはじまる。固定範囲のサイクル、例えば、BLstart〜BLstopを使用できる。あるいは、使用されるサイクルの範囲は、以下により詳細に説明するようにデータに基づいて選択できる。
【００５４】
単純で標準的なモデルでは、的確である場合もそうでない場合もあるが、ベースラインの傾きは０であると仮定する。ベースラインの切片（BLint）は、増殖曲線がy軸と交差するシグナル値である。それは、選択した範囲内の、例えば、BLstart〜BLstopを含めたサイクルの各サイクル、のシグナルの平均（BLavg）として算出できる。生シグナルデータの例が図4Aに示されている。増殖曲線はシグナル値約30でy軸を横切る。ベースラインは以下として定義される:
【００５５】
【数４】
2005172797.tif 000006
【００５６】
シグナルデータを、算出したベースラインを用いて標準化する（ステップ304）。例えば、以下の方程式にしたがって、図4Bに示したように生シグナルデータを、増殖曲線が約1.0でy軸を横切るよう標準化することができる。
【００５７】
【数５】
2005172797.tif 000007
【００５８】
より実際的なモデルでは、ベースラインの切片および傾き（BLslope）を、例えば、直線回帰を用いてシグナルデータから推定することができる。この新しいモデルは、ベースラインの直線ドリフトを説明することができる。このモデルでは、シグナルS、およびサイクル数C、ベースラインが、ステップ302で以下のように定義される:
【００５９】
【数６】
2005172797.tif 000008
【００６０】
標準化ステップ304では、図4Cに示されるように、次いで、以下のようにシグナルデータを標準化することができる:
【００６１】
【数７】
2005172797.tif 000009
【００６２】
方程式（4）および（5）のモデルにしたがって標準化したデータのベースライン切片は、ベースライン切片0.00を有し、一方、方程式（2）および（3）のより単純なモデルにしたがって標準化したデータのベースライン切片は1.00である。また、両モデルを、ベースラインディップまたはデータスパイク、等間隔でないデータ、ベースラインステップを含むデータを含む増殖曲線に使用することができるが、得られるパラメータ値は、このような論理的に誤ったデータから悪影響を受け得る。例えば、上方へのスパイクの存在は、適当なものよりも大きな切片値をもたらし得る。
【００６３】
算出したベースラインにしたがってデータを標準化した後、データを調べて標準化された増殖曲線が任意のシグナル値、ASV（nASV）と交差するかどうかを決定する（ステップ306）。オフセットサイクル数を用いて、ASV付近のデータを調べ始める時点でのサイクル数を示すことができる。この場合には、エルボー値は、有効であるオフセットサイクル数より大きくなくてはならない。このようなデータがない場合には（「いいえ」の分岐、307）、陰性サンプルを示す値を戻すことができ、またはエルボー値を最大サイクル数に等しく設定することができる（ステップ308）。増殖曲線がASVと交差する場合には（「はい」分岐、309）、エルボー値をシグナルデータから算出する（ステップ310）。
【００６４】
エルボー値は、ASVに近いシグナル値の間を補間し、シグナル値がASVとほぼ等しいサイクル数を見出すことによって算出することができる。例えば、ASV、nASVに近く、これを上回るシグナル値Yhiのサイクル数、nhi、およびASVに近く、これを下回るシグナル値Yloのサイクル数nloについては、以下のように2点直線補間によってエルボー値を算出することができる:
【００６５】
【数８】
2005172797.tif 000010
【００６６】
あるいは、エルボー値は、以下のように2点対数補間によって算出することができる:
【００６７】
【数９】
2005172797.tif 000011
【００６８】
エルボー値をコンピュータで計算した後、定量が可能である場合には、値が計算を反映するかどうか、または定量が不適当である場合には陰性サンプルを示す値を示すようフラグ（flag）を設定することができる（ステップ312）。
【００６９】
図5Aに示されるように、標的核酸の増殖曲線値および標準核酸の増殖曲線値を使用して、標的核酸量を定量することができる。ステップ525、535では、本方法により標的核酸の増殖曲線値および標準の増殖曲線値をそれぞれ得る。例えば、ステップ124および134に記載したように、本方法により標的のエルボー値および標準のエルボー値をそれぞれ得る。ステップ545では、本方法により、選択した標準および標的の較正曲線または方程式を定義する情報を得る。較正曲線は、例えば、以下により詳細に説明するように、既知の濃度の標的核酸および標準核酸の増殖曲線からの情報を用いて標的核酸量を標準核酸の濃度の関数として表すことができる。最後に、ステップ550で、較正方程式を用いてサンプル中の標的核酸量を求める。
【００７０】
増殖曲線値を用いて標的核酸および標準核酸の較正曲線を決定する方法は図5Bに示されている。較正曲線は、標的および標準の滴定についての増殖曲線値などの情報を用いて定義することができる。例えば、較正曲線を、濃度が異なる、その各々を、例えば、既知量の標準と同時増幅した、複数の標的サンプルからの情報を用いて定義する。
【００７１】
標的および標準核酸の較正方法は、標的核酸および標準核酸を同定することによってはじめる（ステップ502、504）。標的核酸は、例えば、疾病の診断において特に重要であり得る。例えば、標的はヒト免疫不全ウイルス（HIV）、A型肝炎ウイルス（HAV）またはB型肝炎ウイルス（HBV）であり得る。標準核酸は、先に論じたように、通常、標的核酸を増幅するために用いられるものと同一のプライマー対を用いて増幅できるよう選択する。先に論じたように、較正曲線を決定するために用いられる標的および標準核酸は、標的を定量するために用いられる標的および標準核酸と同一である。
【００７２】
標準は、既知の初期濃度を有するよう調製することができ（ステップ505）、標的は、通常、種々の既知の初期濃度を有するよう調製する（ステップ503）。例えば、標準と同一濃度または量を有する、標準の複数のサンプルがあり得、濃度または量を増したまたは減らしたサンプルを含む、標的の段階希釈物があり得る。標的の各濃度について（ステップ508）、例えば、先に記載したように、標的および標準核酸のサンプルを次いで増幅し（ステップ512）、各増幅をモニターし（ステップ514）、標的の増殖曲線値を決定し（ステップ524）、標準の増殖曲線値を決定する（ステップ534）。より一般には、1以上の濃度の標的を、1以上の濃度の標準と組合せ、各組合せについて、例えば、先に記載したように、標的および標準を増幅し（ステップ512）、モニターし（ステップ514）、標的の増殖曲線値を決定し（ステップ524）、標準の増殖曲線値を決定することができる（ステップ534）。
【００７３】
ステップ540では、既知濃度または量の標準および標的の組合せについて、決定した増殖曲線値を用いて較正曲線を決定する。例えば、以下により詳細に記載するように、標的および標準の相対濃度または量の尺度を、二次多項式（二次方程式）を用いて増殖曲線値の差と関連付けることができる。
【００７４】
較正は指数関数的増殖の根本的なモデルに依存し得る。先に記載したように、PCRによる核酸の増幅は、一般に、その初期段階の間は指数関数的プロセスである。数サイクル、nN後の増幅度（C）は、例えば、以下の方程式によって示すことができる:
【００７５】
【数１０】
2005172797.tif 000012
【００７６】
式中、C0は物質の初期量であり、Eは増幅効率である。したがって、数サイクル、nQおよびnT後の標準の濃度Qおよび標的の濃度Tはそれぞれ、以下のように定義することができる：
【００７７】
【数１１】
2005172797.tif 000013
【００７８】
【数１２】
2005172797.tif 000014
【００７９】
以下に示すように、方程式（9）および（10）を用い、EQ=ETと仮定することによって、標的および標準の初期濃度の比例測定値または較正方程式を定義することができる:
【００８０】
【数１３】
2005172797.tif 000015
【００８１】
すなわち、以下としてはじめると
【００８２】
【数１４】
2005172797.tif 000016
【００８３】
fを、方程式（9）および（10）を用いて以下のように書き換えることができる。
【００８４】
【数１５】
2005172797.tif 000017
【００８５】
次いで、εQ=εTと仮定すると（標的および標準を増幅するために同一プライマーを用いる場合には合理的な仮定）、以下を得、
【００８６】
【数１６】
2005172797.tif 000018
【００８７】
以下のように書き換えることができる
【００８８】
【数１７】
2005172797.tif 000019
【００８９】
方程式（11）は直線の形、y=b+xmのものである。したがって、標的および標準の初期濃度比のlogであるlog（T0/Q0）は、サイクル数の差、（nQ-nT）と関連しているはずである。すなわち、標的および標準増殖曲線の水平位置のずれの関数であるはずである。この方程式によって、標的および核酸の濃度の種々の組合せの増殖曲線データの較正プロット、詳しくは、log（T0/Q0）対（nQ-nT）のプロットは直線となるはずである。
【００９０】
しかしながら、図6に示したように、実際のlog（T0/Q0）の濃度を（nQ-nT）の測定値に対してプロットすると、通常、直線を示さない。むしろ、その同時増幅から決定したエルボー値などの増殖曲線値に対する、標的および標準の実際の濃度のプロットは、曲線を示す。
【００９１】
理論に拘束されようとするものではないが、曲線型の較正プロットは、幾分かは、標的および標準核酸の同時増幅における競合作用による、すなわち、2種のPCRが互いに干渉し、その結果その増幅が予想されたようには、または互いに単離されているようには進行しないということが考えられる。このような競合作用としては、酵素の基質飽和、生成物による酵素の阻害、不完全な生成物である鎖の分離および生成物鎖の再アニーリングが挙げられる。また、PCR中に存在する化学物質が、増幅に対して阻害剤として作用することもあり得、標的および標準に対して異なる作用を有し、その結果、非線形性がもたらされたこともあり得る。さらに、データは、実際の濃度ではなく、シグナルのデータから作製され、シグナルデータが実際の濃度と直線関係にはないこともあり得る。濃度の測定値におけるこのように間接性も、較正プロットに非線形性を導入し得る。
【００９２】
したがって、較正プロットのデータは、より高次の較正方程式、例えば、以下のような放物線の形y=aX2+bx+cの方程式によってより近似値を求めることができる:
【００９３】
【数１８】
2005172797.tif 000020
【００９４】
較正方程式（15）は、標準核酸の初期濃度、標的の増殖曲線値nT、標準の増殖曲線値nQ、任意の較正係数を仮定すると、標的核酸の初期濃度の表現として書き換えることができる。詳しくは、標的核酸の初期量、T0を解くことによって、以下の方程式が得られる:
【００９５】
【数１９】
2005172797.tif 000021
【００９６】
この定量方程式の二次の形は、標的および標準増殖曲線間の観察された関係を適切、かつ、的確に表し、アッセイのダイナミックレンジを現在達成可能なものよりも3〜4桁大きく広げることができる。
【００９７】
記載した技術を用いて、特定の核酸の最も信頼性のある較正を得るためには、標準および標的核酸の初期濃度の範囲、ならびに増幅サイクル数が、反応が指数関数期の増殖にとどまるのままであるようでなくてはならない。初期濃度は典型的には、ポワソン分析またはWHO標準を用いる分析によって決定する。さらに、標的核酸の最も信頼性のある定量的評価を得るためには、較正方程式を定義するために用いられる標的の初期濃度の範囲が、定量されるサンプル中の標的の実際の濃度を含まなければならない。
【００９８】
前記の方法は、一連のアルゴリズムモジュールを用いて、実施し、自動化することができる。例えば、本明細書に記載した技術を実施するコンピュータプログラム適用は、増殖曲線の異常を調べ、補正し（ステップ122、132）、エルボー値を算出し（ステップ124、134）、定量を実施する（ステップ550）モジュールを含み得る。これらの技術を実施し、有効な結果（標的は検出されず、ダイナミックレンジよりも低い濃度、レンジ内の濃度またはダイナミックレンジより高い濃度）か、有効でない結果（定量を実施できない）のいずれかを出すためのソフトウェアを作製することができる。
【００９９】
増殖曲線の異常を調べ、補正するモジュール（例えば、ステップ122、132）は、ベースラインの適切な範囲でノイズおよびドリフトを同定する、一連の事前チェックを実施することができる事前チェックモジュール、スパイクを同定し、補正または除去する、スパイク検出器モジュールおよびベースラインのシフトを補正する、ベースラインステップ補正モジュールを含み得る。図7A〜Bに示されるように、これらのモジュール、ならびにさらなるもっともらしさ（plausibility）および範囲チェックと、標的のエルボー値の測定（例えば、ステップ124、134）および定量（ステップ550）を定量法700にまとめることができる。
【０１００】
定量法700は、標的および標準核酸の生シグナルデータ702を用いる。各核酸の生シグナルデータ702は、例えば、先に論じたように、蛍光の2つのフィルター測定値を含み得る。各核酸の一対のフィルター測定値がある場合には、フィルター測定値の各対を、多成分法（以下により詳細に記載）を用いて解析し（ステップ704）、シグナルのまとめシグナル値すなわち「色素濃度」を得る（706）。次いで、各核酸のすべてのまとめシグナル値を、シグナルデータを必要とするさらなる解析に用いる。
【０１０１】
次のステップ（710〜743）では、シグナルデータの各セット702を、同様に処理する。標準核酸のシグナルデータを、標的核酸のシグナルデータを処理する前に処理することが好ましい。したがって、ステップ710〜713は、標準シグナルデータを用いて実施し、類似のステップ720〜723は標的シグナルデータを用いて実施する。同様に、ステップ730〜733は、ステップ713からの標準シグナルデータではじめて実施し、類似のステップ740〜743はステップ723からの標的シグナルデータではじめて実施する。類似のステップの各対、例えば、標準のステップ710と標的のステップ720を、以下で合わせて論じる。
【０１０２】
（標準および標的それぞれについての）シグナルデータを調べ、補正すること（ステップ122、132、図1）は、基本的な事前チェックではじまる（ステップ710、720）。例えば、データを調べて、適切な増幅サイクル数のシグナルデータ値があることを確認する。各々、以下により詳細に説明する次の2つのステップでは、シグナルデータの各セットを、ベースラインシフト（ステップ711、721）およびシグナルスパイク（ステップ712、722）について調べる。ベースラインシフトがある場合には、それらを特性決定し、補正する。スパイクが存在する場合には、それらを補正または除去してもしなくともよい。ベースラインシフトについて、および場合によりスパイクについてデータを補正した後、一連の事前チェックを実施する（ステップ713、723）。事前チェックは、エルボー値が決定されるべきかどうかを評価する。例えば、事前チェックでは、データがもっともらしさの特定の制限内に入るかどうかを評価する。
【０１０３】
ステップ713、723で、データが適しているとわかれば、例えば、先に記載したように、エルボー値などの増殖曲線値を決定する（ステップ730〜733、740〜743）。このプロセスでは、ベースラインを定義し（ステップ730、740）、シグナルデータを標準化し（ステップ731、741）、例えば、標準化したデータ点間の補間によってエルボー値を算出する（ステップ732、742）。このプロセスの最終ステップは、例えば、もっともらしさの定義された制限に対して値を比較することによる、エルボー値のもっともらしさのチェックである（ステップ733、743）。
【０１０４】
エルボー値がもっともらしいとわかれば、それらを用いて、例えば、先に記載したように標的を定量する（ステップ750）。次いで、例えば、それをもっともらしさの制限に対して比較することによって標的量の値を調べて（ステップ752）そのもっともらしさを確認し、結果がどのように報告されるべきかを決定する。もっともらしさの制限は、例えば、定量のための較正方程式を求めるために用いた標的の濃度の範囲によって定義することができる。一実施では、この範囲チェックにより、許容される値の特定の範囲、最少〜最大に応じて、5つの可能性ある結果のうち１つが得られる：
1.有効でない    定量法の失敗または中止
2.＞最大        エルボー値を求めたが、量が最大より多い。
3.定量          エルボー値を求め、量が範囲内である。
4.＜最小        エルボー値を求めたが、量が最少未満である。
5.検出されず    エルボー値が判明せず
【０１０５】
複数の範囲を設定することができる。例えば、許容される範囲を設定することができ、次いで、許容される範囲内に、低、中、高などの精密範囲を設定することができ、高精密範囲は最も狭い範囲である。低陽性対照は、いくつかのアッセイのヒット率対照として用いることができ、その結果、「標的が検出されず」の結果とは明らかに区別される場合には、この制限より少ない量が有効であり得る。最後に、標的の量の値−滴定量−を求める（ステップ754）。例えば、定義された範囲の各々について、5つの可能性ある結果のうち１つを報告することができる。
【０１０６】
方法700の各ステップで、チェックまたは解析の結果を示すためにフラグを設定することができる。例えば、データがベースラインシフトまたはスパイクを示したことを示すために、特定の制限に対してデータがどこにあるかを説明するために、または変わったデータ、数理的エラーまたはシステム失敗の証拠を残すためにフラグを作製することができる。
【０１０７】
定量法700は、特定のパラメータ760が定義されることを必要とし得る。このようなパラメータを定義し、試験ファイルに保存し、方法700によって必要に応じてアクセスすることができる。例えば、事前チェック（ステップ713、723、前記）およびもっともらしさチェック（ステップ733、743、前記）は、もっともらしさ値の範囲が、例えば、最少（min）および最大（max）値によって定義されることを必要とする。エルボー値の決定には、例えば、任意のシグナル値（ASV）の定義をはじめとする、パラメータの定義が必要である。試験ファイルパラメータは通常、用いられているアッセイに特異的である。しかしながら、標的および標準データの類似のパラメータは異なることがあり、これは、核酸とそれらを検出するために用いた機構（例えば、蛍光色素）が異なる挙動を有することがあるからである。
【０１０８】
定量法700はまた、標的および標準核酸のPCRに関する情報が必要であり得る。例えば、基本的な事前チェック（ステップ710、720、前記）には、PCRに用いたサイクル770、780の数をはじめとするインプットが必要であり得る。このような情報は、PCRデータファイルに保存され、方法700によって必要に応じて読み出すことができる。
【０１０９】
また、定量法700には、通常、例えば、定量するための方法の特定の適用または使用に関する情報が必要である。定量を実施するには、例えば、「オーダー」ファイル765に明記されるように、較正方程式に関する情報を定量法に提供する。較正方程式に関する情報は、先に論じたように、標的および標準、較正方程式の形、および較正係数の値を定義する情報を含み得る。標的の適切な範囲に関する情報も提供することができる。例えば、先に論じたように、許容性の1以上の範囲を定義するために、「低」および「高」値を提供することができる。
【０１１０】
本方法の特定の適用または使用に関する情報は、バーコードシートから読み取るか、または手動で入力することができる。
【０１１１】
図7A〜Bに示されるように、定量法700の機能性のうちのいくつかは、ダイナミックリンクライブラリー（DLL）で実施できる。例えば、DLLを使用してベースラインステップ補正モジュール771、781；スパイク検出モジュール772、782；事前チェックモジュール773、783；およびエルボーモジュール790〜796を実施できる。DLLは、異なる環境で実施されるソフトウェア間で共有することができる。DLLの使用により、算出モジュールがソフトウェアの独立した要素によって確認され、全ソフトウェアシステムを再構築しなくとも方法論の実施の変更が可能となる。例えば、DLLを変更することができ、そのDLLを必要とするか参照する実行ファイルを再編集する必要はない。
【０１１２】
ベースラインステップ補正を実施する例示的方法は以下の通りである。
【０１１３】
図8A〜Bに示されるように、ベースラインステップまたはシフトは、増殖曲線のすべてのその後の点をシフトダウン（図8Aに示されるように）またはシフトアップ（図8Bに示されるように）させる。ベースラインステップは、通常、アニーリング温度に変化がある場合に起こるが、これは測定される蛍光シグナルが温度に応じて変わり得るためである。通常、蛍光強度は温度に比例する。
【０１１４】
アニーリング変化のサイクルはCACと表される。図8A〜Bに示される例では、アニーリング温度は、サイクル15で60℃から45℃まで変化する。変化の方向は、核酸を検出するために用いられる蛍光色素に依存し得る。図8では、第1図に標準増殖曲線が示されており、標的曲線が第2図に示されている；標準および標的核酸は異なる蛍光色素を用いて検出される。
【０１１５】
増殖曲線を構成するシグナルの上方へのまたは下方へのシフト量は、ベースラインシフト、ΔF（n）として表される。ΔF（n）は以下のように定義される:
【０１１６】
【数２０】
2005172797.tif 000022
【０１１７】
[式中、YCAC+1は、アニーリング温度の変化後のそのサイクルでのシグナル値であり、YCACは、アニーリング温度の変化が生じたサイクルでのシグナル値である（すなわち、新しい温度での最初のサイクル）]。
【０１１８】
ベースラインステップは、増殖曲線のベースラインに生じる場合には最も注目すべきものである（図8A、8Bに示されるように）。ベースラインステップは、迅速な増幅の間に生じる場合（図8Bの一番左の曲線について示されるように）には、増幅による変化が温度による変化よりもかなり大きいために、わずかなものであり得る。アニーリング温度の変化によるシグナル変化は、それより上の変化が単に増幅によるものである閾値DFDTを設けることによって増幅による変化と区別できる。
【０１１９】
図9は、ベースラインシフトを評価するステップを示す。CACおよび閾値シフト値、DFDTを入力する（ステップ902）。CACを0と比較する（ステップ904）。CACが0よりも大きければ（ステップ904の「はい」の枝）、ベースラインシフトの程度および方向、ΔF（n）を求める（ステップ906）。ΔF（n）の絶対値を閾値DFDTと比較する（ステップ908）。ΔF（n）の絶対値が閾値を越えれば（ステップ908のはいの枝）、データを補正し（ステップ910）、フラグをベースラインシフト補正が完了したことを示すように設定することができる（ステップ912）。ΔF（n）の絶対値が閾値を超えない場合には（ステップ910のいいえの枝）、データを補正せず、フラグを補正が中止されたことを示すように設定することができる（ステップ912）。
【０１２０】
CACが0よりも大きくない場合には（ステップ904の「いいえ」の枝）、アルゴリズムを飛び越えて進むことができる。この場合には、ベースラインシフト補正を実施しなかったことを示すように算出フラグを設定することができる（ステップ912）。
【０１２１】
最初のサイクルからアニーリング温度の変化のサイクルまで、すなわち、i=1からCACまでのデータを、方程式15にしたがって補正する:
【０１２２】
【数２１】
2005172797.tif 000023
【０１２３】
図10A〜Cは、ベースラインシフト補正を示す。図10Aは、サイクル15でアニーリング変化があった増幅の生データを示す。図10Bの拡大図は、ベースラインシフトを示す。図10Cでは、同様に拡大された図により、上記のように補正されたデータを示す。
【０１２４】
スパイク検出を実施する例示的方法は以下の通りである。
【０１２５】
スパイク検出は少なくとも2つのパラメータに依存している。SPMAXパラメータは、シグナルスパイクを構成し得る点の最大数を定義し、通常、1と4の間である。SPAMPパラメータは、スパイクが有し得る最少振幅を定義する。本方法は、SPMAX+1データ点のブロックに隣接するデータ点間の差を得、可能性あるスパイク点の位置を決定するものである。一次階差のいずれかが値SPAMPより大きく、異なる符号を有する場合には、スパイクがあり得る。スパイクは、二次階差の符号に変化がある場合にも確認される。
【０１２６】
例えば、図11Aのフローチャートに示されるように、SPMAXが2であるスパイク検出法は、PCR増幅において、SPAMPを定義し（ステップ1101）、サイクル数、n0を同定することによってはじまる。サイクル数nをn0と設定する（ステップ1102）。サイクルnでのシグナル値とサイクルn+1でのシグナル値の間の差D1を求める（ステップ1104）。SPMAXが2よりも大きい場合には、複数の値を用いて一次または二次の差を定義することができる。D1がSPAMPよりも大きくない場合には（ステップ1106のいいえの枝）、本方法を停止する；スパイクはない。D1がSPAMPよりも大きい場合には（ステップ1106のはいの枝）、サイクルn+1でのシグナル値とサイクルn+2でのシグナル値間の差、D2を求める（ステップ1114）。D2がSPAMPよりも大きくない場合には（ステップ1116のいいえの枝）、本方法を停止する；スパイクはない。しかしながら、D2がSPAMPよりも大きい場合には（ステップ1116のはいの枝）、可能性あるスパイクが存在する。SPMAXが2である場合には、サイクルn+2でのシグナル値とサイクルn+3でのシグナル値間の差D3を求め（ステップ1124）、二次階差C1を、D1とD2間の差として求め、二次階差C2をD2とD3間の差として求める（ステップ1130）。SPMAXが2より大きい場合には、複数の値を用いて二次階差を定義することができる。二次階差C1およびC2の符号が異なる場合には（ステップ1132のはいの枝）、本方法を停止し、スパイクが確認される（ステップ1136）。二次階差の符号が異ならない場合には（ステップ132のいいえの枝）、本方法を停止する；スパイクはない。
【０１２７】
図11B〜Cに、SPMAX=2およびSPAMP=15について、図による例が示されている。本方法は、一次階差がSPAMPを越え、符合が変わるデータ点を探すものである。これらの基準は、サイクル数25、26、27および28のデータ点について満たされている。しかしながら、サイクル数26、27および28のデータ点のみが符号の変わる二次階差を有するので、スパイクはこれら3データ点の間に存在する。スパイクは2点の最大値（SPMAX=2）のみからなり得るので、これら3点のうち1点は曲線状の本物の点でなくてはならない。
【０１２８】
どの点が本物であるかを調べるには、二次多項式をスパイク点の前の5つのデータ点に当てはめ、それから各スパイク点の距離を求める。この実施例では、3つのスパイク点のうち、サイクル数28のデータ点が本物の点であると考えられ、他の2点はスパイクであると考えられる。スパイクは、本物の点を含む別の放物線を求め、それを用いてスパイク点に対して許容されるデータ値を求めることによって補正することができる。
【０１２９】
図12Aは、2つのスパイクを有すると決定された増殖曲線を示す。図12Cに示されるように、スパイクは、論理的に誤ったデータ値をデータなしと置き換えることによって除去することができる。あるいは、図12Bに示されるように、スパイクは補正することができる。各サイクルで取られたシグナル読み取り値を、等間隔であると仮定する。理想的には、データの間隔が保存されるようにスパイクが検出され、補正される。スパイクが検出されるが補正されない場合には、その存在がエルボー値の決定に誤りをもたらし得る。スパイクデータが検出され除去される場合には、データセットは、予想されるよりも少ない、不適切な間隔のデータ値を有することとなり、このこともまた、エルボー値の決定に誤りをもたらし得る。
【０１３０】
スパイクを同定し、除去するか補正することによって、定量法の信頼性が補償される。一実施では、ベースラインステップを補正し、その後、データ点が等間隔であり、連続していることを確実にするようスパイク検出法を実施する。
【０１３１】
図13A〜Bは、先に論じた事前チェックの一実施において実施されるべきいくつかの可能性ある方法を示す。
【０１３２】
BLstart〜BLstopまでのデータ点の傾斜は、線形回帰を用いて算出することができる。ベースラインの算出された傾斜は、BLslope=0〜maxBLslopeの範囲にあることを確かめるために調べることができる。ベースライン傾斜がこの範囲の外側である場合には、定量は中止しなくてはならない。
【０１３３】
データのノイズ（BLnoise）は、図13Aに示されるように、BLstart〜BLstopまでのデータの線形回帰によって求められる、シグナル値y（x）のエラーを調べることによって調べることができる。図13Bにより詳細に示されるように、この線形回帰のエラーはノイズの閾値BLnoiseよりも小さくなくてはならない。エラーがこの閾値を越える場合には、定量を中止しなくてはならない。
【０１３４】
サンプル処理エラーは、BLstart〜BLstopまでのデータ点の線形回帰の切片を調べることによって検出することができる。ベースラインの切片は、BLminとBLmaxによって定義されるような指定の範囲内になくてはならない。高すぎるか低すぎる切片は、空のウェル、試薬の欠如またはサンプルの欠如を示す可能性がある。いずれの場合にも定量は中止しなくてはならない。
【０１３５】
増幅度、RFIは、PCRの後期に観察される、例えば、PLstart〜PLstopまでのデータ点についての、シグナルの平均を算出し、PCRの初期の、例えば、BLstartとBLstopの間のシグナルの平均で除することによって評価することができる。RFIは1.0よりも大きくなくてはならない。そうでなければ定量は中止しなくてはならない。
【０１３６】
スパイクが補正または除去されない場合には、エルボー値が誤って検出される可能性がある。したがって、スパイクについてのさらなるチェックが有用であり得る。例えば、標準化された蛍光強度がASVを通る、1より多くの点があるかどうか調べるためのチェックを行うことができる。あるいは、ASVまたはエルボー値周辺の臨界範囲を定義することによって、増殖曲線とASVの交差点が既知のスパイクに近いかどうかを調べるためのチェックを行うことができる。スパイクがこの臨界範囲内に検出される場合には、さらなるデータ処理を停止しなければならない。
【０１３７】
エルボー値算出を実施するための一方法は先に記載した。ベースライン傾斜を調べる、エルボー値算出を実施するための代替法は以下の通りである。
【０１３８】
代替法では、ベースライン基準セットに適合する点の数を動的に予測し、ベースライン傾斜を補正する。2点補間（直線またはlogのいずれか）を用いて、先に論じたように、増殖曲線がAFLと交差するサイクルを決定する。2より多い点間の補間を用いることもできる。一実施では、存在する場合、ベースラインステップを補正し、その後この方法を用いる。
【０１３９】
図14に示されるように、エルボー値算出を実施するための代替法では、動きのある5点のブロックを用いる。隣接する点の間の傾斜（a〜dと表示）およびブロックの最初の点と5番目の点の間の傾斜（eと表示）を算出する。
【０１４０】
隣接する点の間の傾斜（点iで表される）は、以下の方程式を用いて算出する:
【０１４１】
【数２２】
2005172797.tif 000024
【０１４２】
最初の点と5番目の点の間の傾斜（点iで表される）は、以下の方程式を用いて算出する:
【０１４３】
【数２３】
2005172797.tif 000025
【０１４４】
ベースライン点と考えられる5点すべてについて、2つの条件が満たされなくてはならない:（1）a〜dの各傾斜の絶対値はノイズインプットパラメータよりも小さくなくてはならない、および（2）傾斜eの値は、特定の範囲内、例えば、-0.1などの閾値よりも大きく、ノイズインプットパラメータの産物およびデータの変動の尺度などのエラー値よりも小さくなくてはならない。いずれかの条件が満たされない場合には、5点の最後はベースラインの一部と考えない。
【０１４５】
a〜eの傾斜を算出した後、例えば、一サイクル分ブロックを右側に移動し、算出を繰り返す。ある5点ブロックに対しては条件が満たされるが、次では満たされないことがあり得る。したがって、このスライディングウィンドウ法によって、悪いベースライン点（ベースラインスパイクの間に生じるようなもの）を省くデータセットが得られる。
【０１４６】
図15AおよびBは、許容されるベースライン点を含む2つの増殖曲線を四角で示す。図15Aの曲線については、2つの別個のスパイクを形成する5点（サイクル9〜11および17〜18）が、ベースラインを算出するために用いられる点のセットから除かれている；図15Bの曲線については、8個の最初の点（サイクル3〜10）が除かれている。解析に含められるべきデータは末端を切断することもできる。例えば、指定のサイクル数を超えるデータを除くことができ、または有効なベースライン点の特定の総数が同定されたらすぐにデータを除くことができる。
【０１４７】
有効なベースライン点に対して線形回帰を実施する。先に記載したように、方程式（4〜5）の場合、回帰によりBLslopeおよびBLinterceptが得られ、これを用いてデータを標準化することができる。標準化された増殖曲線は、約0.0ではじまり、次いで増加するベースラインを有する。
【０１４８】
標準化された増殖曲線がと交差する点（ASV-1）がエルボー値である。エルボー値は、例えば、先に示したように、2点線形補間を用いて、または以下のように定義される2点対数補間を用いて算出することができる:
【０１４９】
【数２４】
2005172797.tif 000026
【０１５０】
多成分分析（ステップ704、前記）を実施するための例示的方法は以下の通りである。
【０１５１】
各核酸を検出するために用いられる蛍光色素の対は、フィルターシステムと蛍光色素が完全対応しないために、少なくとも一部が重複するスペクトル（励起/発光）を有し得る。このスペクトルの重複は、「クロストーク」として特性決定される。通常、4つ、標的核酸用の2つと標準用の2つの色素がある。多成分分析は、潜在的に重複している測定値から信頼性のあるシグナル尺度を抽出することができる。
【０１５２】
例えば、m個の方程式とn個の未知の色素濃度について、m≧nと仮定すると、シグナルまたは濃度は以下の通りとなる:
【０１５３】
【数２５】
2005172797.tif 000027
【０１５４】
[式中、Aは試験ファイルから得られるアッセイ特異的クロストークマトリックス（m×nマトリックス）であり、fは、4種のフィルターの組合せの各々からのデータ獲得の際に得られる4つの蛍光読み取り値（1×4ベクトル）を含み、bはブランク（1×4ベクトル）であり、cはクロストーク補正シグナルデータまたは色素濃度（1×mベクトル）である]。クロストークマトリックスAは通常、少なくとも4×4マトリックスとなる。マトリックスの大きさは、用いられるフィルター組合せの数によって決まり、より多くのフィルター組合せを用いる場合にはより大きくなる。
【０１５５】
多成分分析は各サイクル後に行われる必要があるので、多成分分析のコストは最少でなければならない。例えば、マトリックスBは事前に算出することができ:
【０１５６】
【数２６】
2005172797.tif 000028
【０１５７】
次いで、方程式
【０１５８】
【数２７】
2005172797.tif 000029
【０１５９】
を各ステップに用いて色素濃度を求めることができる。
【０１６０】
本発明は、デジタル電子回路で、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェアで、またはその組合せで実施することができる。本発明の装置は、プログラム可能なプロセッサーによって実行するために機械読取可能記憶デバイスで実体的に具体化されたコンピュータプログラム製品中で実施することができ；本発明の方法ステップは、命令のプログラムを実施するプログラム可能なプロセッサーによって実施され、インプットデータに基づいて作動し、アウトプットを作製することによって、本発明の機能を実施することができる。本発明は、データ記憶システム、少なくとも１つのインプットデバイスおよび少なくとも１つのアウトプットデバイスからデータおよび命令を受け取り、それらにデータおよび命令を送信するよう連結されている、少なくとも１つのプログラム可能なプロセッサーを含む、プログラム可能なシステムで実行可能な1以上のコンピュータプログラムで実施できることが有利である。各コンピュータプログラムは、所望の場合、高レベル手続きの、またはオブジェクト指向プログラミング言語で、あるいはアセンブリ言語または機械言語で実施でき；また、いずれの場合でも、言語は、コンパイラ型言語またはインタープリタ型言語であり得る。適したプロセッサーとしては、例として、汎用および特殊目的マイクロプロセッサーの双方が挙げられる。一般に、プロセッサーは、命令およびデータを読出し専用メモリおよび/またはランダムアクセスメモリから受け取る。コンピュータの必須要素は、命令を実行するためのプロセッサーとメモリである。一般に、コンピュータは、データファイルを格納するための1以上の大容量記憶デバイスを含み、このようなデバイスとしては、磁気ディスク、例えば、内蔵されたハードディスクおよび取り外し可能なディスク、光磁気ディスクおよび光ディスクが挙げられる。コンピュータプログラム命令およびデータを実体的に具体化するのに適した記憶デバイスとしては、例として、EPROM、EEPROMおよびフラッシュメモリデバイスなどの半導体メモリデバイス、、内蔵されたハードディスクおよび取り外し可能なディスクなどの磁気ディスク、光磁気ディスクおよびCD-ROMディスクを含む、不揮発性メモリのすべての形が挙げられる。前記のいずれもASIC（特定用途向け集積回路）によって補完され得るか、またはそれに組み込まれ得る。
【０１６１】
ユーザーとの対話を提供するために、本発明は、ユーザーに情報を表示するためのモニターまたはLCDスクリーンなどのディスプレイデバイスおよびキーボードおよびマウスまたはトラックボールなどの、それによってユーザーがコンピュータシステムにインプットを提供できる、ポインディングデバイスを有するコンピュータシステムで実施することができる。コンピュータシステムは、それによってコンピュータプログラムがユーザーと相互作用する、グラフィカルユーザーインターフェースを提供するようプログラムすることができる。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変をなすことができるということは理解されよう。例えば、シグナルデータからの増殖曲線の作製をはじめとするような技術が記載されているが、本発明の技術を実施するために増殖曲線を実際にプロットすることは必要でないこともある。個別の増幅を使用することができる。増殖曲線値を同定するための他のアルゴリズムを用いて、核酸を較正し、標的核酸を定量するために用いられるデータを作製することもできる。異なる形およびパラメータを有する較正方程式を使用することもできる。したがって、他の態様は以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、本発明の一態様にしたがって、増殖曲線を特徴付けし、標的核酸の増殖曲線値および標準核酸の増殖曲線値を決定する方法を示すフローダイヤグラムである。
【図２】図２Ａ〜Ｊは、例示的なPCR増殖曲線を示すプロットである。
【図３】図３は、本発明の一態様にしたがって、エルボー値を算出する方法を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、それぞれ、生シグナルデータ、傾斜なしと仮定する方法を用いて標準化した後のデータ、ベースラインスロープを考慮する方法を用いて標準化した後のデータによって表される増殖曲線を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の一態様にしたがって、標的核酸の増殖曲線値および標準核酸の増殖曲線値を用いて標的核酸を定量する方法を示すフローダイヤグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の一態様にしたがって、増殖曲線値を用いて標的核酸および標準核酸の較正曲線を決定する方法を示すフローダイヤグラムである。
【図６】図６は、種々の初期濃度比を用いた2種の核酸の同時増殖による増殖曲線データの2つの較正曲線を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の一態様に従って、増殖曲線を用いて標的核酸定量方法の一例を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の一態様に従って、増殖曲線を用いて標的核酸定量方法の一例を示す。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、ベースラインシフトを有する増殖曲線を示す。
【図９】図９は、本発明の一態様に従って、ベースラインシフトを同定する方法を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃはそれぞれ、ベースラインシフトを有する増殖曲線、ベースラインシフトの拡大図、補正版のデータを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、スパイクを同定する方法を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、スパイクを同定する方法を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、スパイクを同定する方法を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｃはそれぞれ、2つのスパイクを有する増殖曲線、スパイクを補正した増殖曲線、およびスパイクを除去した増殖曲線を示す。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、増殖曲線のいくつかの可能な事前チェックを示す。
【図１４】図１４は、本発明の一態様にしたがって、ベースライン傾斜異常を同定し、一方で、エルボー値を決定する方法を示す。
【図１５】図１５Ａ〜Ｂはベースライン傾斜異常を有する増殖曲線を示し、エルボー値の算出のためにベースラインを決定するのに用いられる四角で囲まれたデータ点を示す。  いくつかの図面中の参照記号のようなものは、構成要素などを示す。
【図１】
2005172797.tif 000031
【図２】
2005172797.tif 000032
【図３】
2005172797.tif 000033
【図４】
2005172797.tif 000034
【図５Ａ】
2005172797.tif 000035
【図５Ｂ】
2005172797.tif 000036
【図６】
2005172797.tif 000037
【図７Ａ】
2005172797.tif 000038
【図７Ｂ】
2005172797.tif 000039
【図８】
2005172797.tif 000040
【図９】
2005172797.tif 000041
【図１０】
2005172797.tif 000042
【図１１Ａ】
2005172797.tif 000043
【図１１Ｂ】
2005172797.tif 000044
【図１１Ｃ】
2005172797.tif 000045
【図１２】
2005172797.tif 000046
【図１３】
2005172797.tif 000047
【図１４】
2005172797.tif 000048
【図１５】
2005172797.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月17日(2004.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
更に、標的シグナル値または標準シグナル値をディップ、スパイク、ドリフトまたはステップについて調べ、標的シグナル値または標準シグナル値をそれぞれ調整する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準シグナル値のサブセットまたは標的増殖曲線値のサブセットをそれぞれ使用して、標準または標的増殖曲線のベースラインを定義する工程；ならびに
対応するシグナルデータを、該ベースラインに関して標準化する工程
を含む、請求項１〜２いずれか記載の方法。
【請求項４】
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程が、
標準または標的増幅それぞれのエルボー領域中の標準または標的増幅それぞれのサイクルを表す、標準核酸または標的核酸のエルボー値を決定する工程
を含む、請求項１〜３いずれか記載の方法。 
【請求項５】
ベースラインを定義する工程が、
シグナルデータ中の１以上のディップまたはスパイクを同定する工程；ならびに
ベースラインを定義するために使用されるデータのセットから、１以上のディップまたはスパイクに対応する１以上のデータ値を排除する工程
を含む、請求項３〜４いずれか記載の方法。 
【請求項６】
較正方程式が、既知量の標的核酸および既知量の標準核酸に対して実施される一連の増幅実験による標的増殖曲線値および標準増殖曲線値から得られる、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
較正方程式が、標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸の初期量を既知量の標準核酸に関連付ける、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
較正方程式が、
既知量の標準核酸と標的および標準増殖曲線値との関数に対して標的核酸の初期量の相関をプロットし、較正プロットを得る工程；ならびに
曲線を較正プロットに適合させる工程
により定義される、請求項１〜７いずれか記載の方法。 
【請求項９】
曲線を較正プロットに適合させる工程が、二次階非線形曲線を較正プロットに適合させる工程を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
非線形曲線が、式：
【数１】
2005172797.tif 000050
式中、TOは標的核酸の初期量であり、QOは標準核酸の初期量であり、nQは標準核酸の量がQであるサイクル数であり、nTは標準の量がTであるサイクル数である
により定義される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程が、データが標的核酸の初期量を算出するためには不適切であることを報告する工程を含む、請求項２〜１０いずれか記載の方法。
【請求項１２】
標的シグナル値または標準シグナル値を調整する工程がディップ、スパイク、ドリフトまたはステップに対応するデータ値を削除する工程を含む、請求項２〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
試料中の標的核酸の量を測定する方法であって、
連続したサイクルの標準増幅および標的増幅において既知量の標準核酸および標的核酸試料をそれぞれ増幅する工程；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングし、標準増殖データおよび標的増殖データを得る工程；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義する工程；
非線形較正方程式ならびに標的値および標準値を使用して標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメーターを使用して、標的核酸の量を測定する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
既知量の標準核酸および標的核酸試料を増幅する工程が、
既知量の標準核酸と標的核酸試料とを混合して混合物を形成する工程；ならびに
混合物中で標準核酸と標的核酸とを同時増幅させる工程
を含む、請求項１３記載の方法。 
【請求項１５】
標準シグナルまたは標的シグナルをモニタリングする工程が、蛍光色素対の一方に由来する蛍光シグナルをモニタリングする工程を含む、請求項１３〜１４いずれか記載の方法。 
【請求項１６】
標的核酸に関する較正方程式を定義する方法であって、
それぞれの増幅実験に既知量の標的核酸および既知量の標準核酸を使用して、一連の増幅実験を実施する工程、
複数サイクルについて、シグナル増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る工程、ならびに
標的シグナル値を使用する標的増殖曲線値、標準シグナル値を使用する標準増殖曲線値、および標的核酸の初期量を含む増幅実験の増幅データを定義する工程；ならびに
増幅実験における標的核酸の初期量を、増幅実験の増幅データを使用して、増幅実験の標的および標準増殖曲線値の関数として表す非線形較正方程式を定義する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
試料中の標的核酸を評価する方法であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受ける工程；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整する工程；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する工程；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価する工程
を含む、方法。 
【請求項１８】
試料中の標的核酸量を決定するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標準核酸の初期量ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１９】
試料中の標的核酸を評価するためにコンピュータ読み込み可能媒体上に実体的に保存されたコンピュータプログラム製品であって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含む、シグナルデータを受け取ること；
標的シグナル値および標準シグナル値を異常について調べ、異常の原因である標的シグナル値および標準シグナル値を調整すること；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義すること；ならびに
標的および標準増殖曲線値を使用して標的核酸を評価すること
をプログラム実行可能な処理装置に行わせるように操作可能な指示を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２０】
試料中の標的核酸の量を測定するためのコンピュータ実行システムであって、
標的核酸および標準核酸に対して実施される複数サイクルの増幅実験について、標準増幅のサイクル中に存在する標準核酸の量を示す一連の標準シグナル値、および標的増幅のサイクル中に存在する標的核酸の量を示す一連の標的シグナル値を含むシグナルデータを受け取る手段；
標的シグナル値を使用して標的増殖曲線値を定義し、標準シグナル値を使用して標準増殖曲線値を定義する手段；ならびに
標準核酸の初期量、ならびに標的および標準増殖曲線値を使用して、非線形方程式である較正方程式に従って標的核酸の初期量を算出する手段
を含む、コンピューター実行システム。
【請求項２１】
試料中の標的核酸の量を測定するキットであって、
標的核酸との連続したサイクルの同時増幅での使用のための既知量の標準核酸；
標準核酸量を示す標準シグナルおよび標的核酸量を示す標的シグナルをモニタリングして、標準増殖データおよび標的増殖データを作製するのに使用するハイブリダイゼーションプローブ；
標準増幅を特徴付ける標準増殖データから標準値を定義し、標的増幅を特徴付ける標的増殖データから標的値を定義するためのコンピュータープログラム製品；ならびに
非線形較正方程式を使用して標的核酸の量を測定するための、標的核酸の量を既知量の標準核酸に関連付ける較正方程式のパラメータを含む較正データ
を含む、キット。
【外国語明細書】
2005172797000001.pdf
2005172797000002.pdf
2005172797000003.pdf
2005172797000004.pdf