(57)【要約】【課題】  細胞に所望の遺伝子を導入するに際して核内移行を促進して効率的なトランスフェクションが確保できる新しい手法を提供する。【解決手段】  細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と、核膜孔を通過する機能を持ち核内輸送に関わるインポーティンタンパク（好ましくはインポーティンβ）とが、共有結合または非共有結合性の特異的相互作用を介して結合されて成る核内移行性核酸構造体による。好ましくは、核酸物質としてプラスミドＤＮＡを用い、ビオチン−アビジン相互作用により核酸物質とインポーティンタンパクが結合されている。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と、核膜孔を通過する機能を持ち核内輸送に関わるインポーティンタンパクとが、共有結合または非共有結合性の特異的相互作用を介して結合されて成ることを特徴とする核内移行性核酸構造体。
【請求項２】
インポーティンタンパクがインポーティンβ、インポーティン７、トランスポーティン、トランスポーティンＳＲまたはＣＡＳタンパクの中から選ばれたタンパクであることを特徴とする請求項１に記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項３】
インポーティンタンパクがインポーティンβであることを特徴とする請求項２に記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項４】
核酸物質とインポーティンタンパクとが非共有結合性の特異的相互作用を介して結合されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項５】
非共有結合性の特異的相互作用がビオチン-アビジン相互作用であることを特徴とする請求項４に記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項６】
核酸物質がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項７】
プラスミドＤＮＡがビオチンラベル化されており、ストレプトアビジン融合インポーティンタンパクと結合されていることを特徴とする請求項６に記載の核内移行性核酸構造体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の核内移行性核酸構造体を細胞と接触させる工程を含むことを特徴とする細胞に遺伝子を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスフェクションに際して細胞の核内移行を促進しトランスフェクション効率を向上させる非ウィルスベクターとして機能する核酸構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に特定の外部遺伝子を導入するトランスフェクションは、その遺伝子の関与する作用機序を解析して疾病の治療や薬剤の開発などに有用な情報を得るために不可欠な手段であるが、最近は、生体への悪影響を回避するためトランスフェクションに非ウィルスベクターを使用することが試みられている。従来より非ウイルスベクターのトランスフェクション効率を向上させる際に大きな障壁となっている一つに外部遺伝子の核内移行が挙げられる。この問題点を解決するためにこれまでに真核細胞内における核タンパクの核内移行システム利用が活発に取り組まれてきた。
【０００３】
核タンパクは一般に核内移行シグナル（ＮＬＳ）という荷札を有しており、ＮＬＳペプチドに輸送体との仲介役としてのインポーティンαが結合し、最終的に輸送担体本体のインポーティンβとの三元複合体が形成され、核膜に存在する核膜孔をエネルギー依存的かつ選択的に輸送される。
【非特許文献１】Gorlich, D., Vogel, F., Mills, A. D.,Hartmann, E.,およびLaskey, R. A., Nature,377, 246-248, (1995)。
【非特許文献２】Rexach, M.,およびBlobel, G., Cell 83,683-692, (1995)。
【非特許文献３】Yoneda, Y., J. Biochem. Tokyo 121,811-817 (1996)。
【０００４】
そこでこれまで、外部遺伝子とＮＬＳペプチドを複合化することで、核内移行を促進し、ひいては発現効率をも向上させるべく多くの研究がなされてきた。しかし、ＮＬＳの効果が確認されたケースも有れば、発現効率に対する有意義な効果が否定された報告もあり、現在のところ方法論は確立していない。この原因の一つとして三元複合体を形成させることが二段階の反応であり効率を低下させている可能性がある。
【非特許文献４】Zanta, M. A., Belguise-Valladier, P.,およびBehr, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.96, 91-96 (1999)。
【非特許文献５】Collas, P.,およびAlestrom, P., Biochem. Cell. Biol., 75,633-640（1997）。
【特許文献１】特表平11-506935
【特許文献２】特表2002-514892
【特許文献３】特表2002-533088
【非特許文献６】Nagasaki, T., Myohoji,T., Tachibana, T.,およびTamagaki, S., Bioconjugate Chem., 14, 282-286 (2003)。
【非特許文献７】Tanimoto, M., Kamiya, H., Minakawa, N., Matsuda,A.,およびHarashima, H., Bioconjugate Chem.,14,1197-1202 (2003)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞に所望の遺伝子を導入するに際して核内移行を促進して効率的なトランスフェクションが確保できる新しい手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
最近、核内で機能する物質の核内移行メカニズムには三元複合体形成を必要とせず、直接輸送担体本体であるインポーティンβと複合体を形成することで多くの物質（タンパク質）が核内に輸送されていることが明らかとなってきた。
【非特許文献８】Jakel, S.,およびGorlich, D., EMBOJ., 17, 4491（1998）。
【非特許文献９】Truant, R.,およびCullen, B. R., Mol. Cell Biol., 19,1210（1999）。
【非特許文献１０】Nagoshi, E., Imamoto, N., Sato, R.,およびYoneda, Y., Mol. Biol. Cell, 10, 2221 (1999)。
【０００７】
本発明者は、これらの現象に留意し、核タンパク質輸送に関わる特定の細胞内因子に被導入遺伝子を結合させる手段を案出することにより上記の目的を達成したものである。
かくして、本発明に従えば、細胞の核内に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質と、核膜孔を通過する機能を持ち核内輸送に関わるインポーティンタンパクとが、共有結合または非共有結合性の特異的相互作用を介して結合されて成ることを特徴とする核内移行性核酸構造体が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
被導入遺伝子が輸送因子であるインポーティンタンパクと結合して複合体（コンジュゲート体）を形成している本発明の核酸構造体は、所定の細胞に接触させられると該細胞の核内に確実に移行するので、その遺伝子を効率よく細胞内に導入することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、細胞の核内に導入すべき遺伝子を含む核酸物質と結合してコンジュゲート体を形成するインポーティンタンパクとしては、核膜孔を通過する機能を持ち且つ核内輸送に関わるタンパクで有ればいずれも使用することが可能である。具体的にはインポーティンβ、インポーティン７、トランスポーティン、トランスポーティンＳＲ、ＣＡＳタンパク等を挙げることができるが、なかでもインポーティンβが好ましいものとして例示される。
【００１０】
これらのインポーティンタンパクのアミノ酸配列（塩基配列）やその作用などについては、例えば、下記の文献から知ることができる。
【非特許文献８】Jakel, S.,およびGorlich, D., EMBOJ., 17, 4491（1998）。
【非特許文献１１】Imamoto,N., Shimamoto,T., Kose,S.,Takao,T., Tachibana,T., Matsubae,M., Sekimoto,T., Shimonishi,Y.,およびYoneda,Y. FEBS Lett. 368 , 415(1995)。
【非特許文献１２】Pollard,V.W., Michael,W.M., Nakielny,S.,Siomi,M.C., Wang,F.,およびDreyfuss,G., Cell 86 , 985 (1996)。
【非特許文献１３】Nagoshi, E., Imamoto, N., Sato, R.,およびYoneda, Y., Mol. Biol. Cell, 10, 2221 (1999)。
【非特許文献１４】Kutay,U., Bischoff,F.R., Kostka,S.,Kraft,R.,およびGorlich,D., Cell 90,1061 (1997)。
【００１１】
遺伝子を含む核酸物質と上述のインポーティンタンパク質との結合は、共有結合または非共有結合性の特異的相互作用を介して行なわれる。
共有結合を用いる具体例としては、化学修飾により遺伝子にアミノ基を導入後、二官能性のε−マレイミドカルボン酸活性エステルを用い、マレイミド基を導入し、更にインポーティンタンパクのシステイン残基と反応させ連結させることによりコンジュゲート体とすることなどが挙げられる。しかし、多くの遺伝子にインポーティンタンパクをコンジュゲートすることを考えた場合、遺伝子の化学修飾による方法は二段階反応となる点が難点である。
【００１２】
これに対して、非結合性の特異的相互作用に基づく場合は、生化学の分野で従来より多用されている反応系を利用することができるので、共有結合による場合よりも好ましい。具体的にはＧＳＴタンパク-グルタチオン、ヒスチジンタグ−ニッケル錯体、ビオチン−アビジン等を挙げることができる。これらの反応系を利用すれば、例えば、遺伝子を含む核酸物質をＧＳＴタンパク、ヒスチジンタグまたはビオチンで修飾するとともに、インポーティンタンパクをグルタチオン、ニッケル錯体またはアビジンと融合させることにより、それぞれの反応系の特異的相互作用を介して核酸物質−インポーティンタンパクコンジュゲート体（複合体）から成る本発明の核酸移行性核酸構造体が得られる。
【００１３】
非共有結合性の特異的相互作用を発揮するものとして以上に例示した反応系の中でも、その結合力が特に大きいビオチン−アビジンが好ましい。核酸のビオチン化はそのためのキットも市販されており、容易に修飾可能であり、種々の遺伝子を含む核酸物質を簡便にビオチン化することができる。アビジンとしては一般にストレプトアビジンが好ましく用いられ、ストレプトアビジン融合インポーティンタンパクを利用すれば、ビオチンーストレプトアビジンの非常に安定な非共有結合性特異的相互作用（解離定数：＜10-15）に因り容易に種々の遺伝子を含む核酸物質にインポーティンタンパクを結合させたコンジュゲート体から成る本発明の核酸構造体を得ることが可能である。
【００１４】
本発明において、核酸物質とは、細胞内に導入されるべき遺伝子自体または該遺伝子を含む核酸類であり、既述のような手段によりインポーティンと結合されるものであればどのような形態でも良く、ＲＮＡ、オリゴＤＮＡ、１本鎖核酸、２本鎖核酸、プラスミドＤＮＡなどが包含されるが、実用的見地から特に好適な核酸物質はプラスミドＤＮＡである。ここで、プラスミドＤＮＡとは、発現ベクター、すなわち、発現するタンパクをプロモーターの下流にコードするものという意味で用いており、その具体的な塩基配列については目的タンパクによって異なる。
【００１５】
かくして、本発明の核内移行性核酸構造体の特に好ましい態様は、細胞に導入すべき遺伝子を含む核酸物質がプラスミドＤＮＡであり、該プラスミドＤＮＡがビオチンラベル化されており、ストレプトアビジン融合インポーティンタンパク（好ましくはインポーティンβ）と結合されているものである。
【００１６】
このような場合、ビオチン（ラベル）化プラスミドとしては、プラスミドＤＮＡとビオチン間に充分な距離を与える分子量3000〜5000のポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）を有する化合物を用いることが好適である。また、プラスミドＤＮＡのビオチン化はジアゾカップリングによる化学修飾により行うが、１分子あたりのビオチンの導入数は5〜20が好ましく、5〜10がより好適である。
【００１７】
本発明の核内移行性核酸構造体は所定の細胞と接触させることにより、細胞に特定の遺伝子を注入したり、その遺伝子をクローニングしたり、または該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるために用いることができるが、対象とされる細胞は限定されるものではなく、本発明の原理はあらゆる種類の真核細胞、特に動物細胞に適用することができる。ただし、使用するインポーティンタンパクの由来は対象とする細胞の種と一致することが好適である。
【００１８】
以下、本発明の特徴をさらに具体的に示すため、本発明に従う核酸構造体であるプラスミドＤＮＡ−インポーティンタンパクコンジュゲート体の調製、およびそれを用いるインビトロ試験における核内移行促進評価とタンパク発現に関する実施例を記すが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
ビオチンラベル化プラスミドの調製  プラスミドDNAとしてpDsRed（赤色蛍光タンパクをコードするプラスミドDNA、4700bp、Clontech社製）を使用した。まず、図１に示されるスキームにより合成されたポリエチレングリコール鎖を有するビオチン修飾アニリン誘導体（図１中の(I)、以下、biotin-PEG修飾アニリン誘導体と記す）5.17mgを4℃に冷やした0.5M HCl(116μL)に溶かし、よく撹拌しながら4℃に冷やした10mg/ml NaNO253μLを加え、4℃で5分間撹拌した。
その後1M NaOH(57.8μL)を加え反応を終了した。この溶液を0.13μg/μLのpDsRed(0.1Mホウ酸緩衝液中(pH＝9.0))溶液752μLに加え、室温で15分間撹拌した。Ultrafree-MC(MW：10000)の分子ふるいフィルターにのせ、4℃、14000gで遠心し、未反応のbiotin−PEG修飾アニリン誘導体を除去した。さらに70%エタノール400μLを加え4℃、14000gで遠心し洗浄した。乾燥後、合成したビオチンラベル化プラスミド（図１中の(II)、以下、biotin−PEG−pDsRedと記す）(91μg)をPBS(−)60μLに溶かして−20℃で保存した。
【００２０】
ビオチン導入数の決定  合成したbiotin-PEG-pDsRed(2μg)、テキサスレッドラベル化ストレプトアビジン（texas
red labeled streptavidin）(TR−S、5μg)をPBS(20μL)中で混合し、コンジュゲート体を調製した。1.5M NaI(200μL)を加え、非特異的に結合したテキサスレッドラベル化ストレプトアビジンを解離させ、限外濾過膜(Microcon YM−100、NMWL：100,000)を用いて遊離したテキサスレッドラベル化ストレプトアビジンを除去した。PBS(200μL)で洗浄後、テキサスレッドラベル化pDsRed(以下pDsRed−biotin−(TR−S)4と記す)を得た。
次に、DNA濃度を決定するためにPBS(2mL)に1mg/mLヘキスト溶液を5μL加え、さらにpDsRed−biotin−(TR−S)4溶液を5、10、15、20μLとなるように徐々に加えていきヘキストの蛍光強度を測定した。この際、既知濃度のDNA溶液でヘキスト蛍光強度の検量線を作成しておき、pDsRed−biotin−(TR−S)4溶液のDNA濃度を決定した。一方、TR−Sの蛍光強度と濃度の検量線を元に、PBS(2mL)にpDsRed−biotin−(TR−S)4溶液を5、10、15、20μLとなるように徐々に加えて、テキサスレッドの濃度を決定した。このDNA濃度とテキサスレッド濃度より算出し、プラスミドDNA１個あたりのビオチンラベル数を9.4と決定した。
【実施例２】
【００２１】
ストレプトアビジン融合インポーティンβタンパクの調製  インポーティンβ（importinβ）およびGFP（緑色蛍光タンパク）をコードするpGEX2T−GFP−impβプラスミドベクター（非特許文献１５）のインポーティンβをコードする領域EcoRIとHindIIIサイトに同じ制限酵素サイトをもつストレプトアビジン（Streptavidin）遺伝子を挿入し図２に示すGFP−インポーティンβ−ストレプトアビジン融合タンパク(以下GβSと記す)発現ベクターpGβS（配列番号１）を構築した。pGEX2T−GFP−impβにコードされたインポーティンβはマウス由来である。
構築したpGβSは大腸菌BL21へトランスフォーメーションし、LB培地中で培養することで、組換え融合タンパクGβSを得た。GβSはGSTタンパク(26K Da)、GFP(27K Da)、全896base数のcDNAのうち核内移行能を残す5’側643base分のインポーティンβ(76K Da、全長97K Da)、ストレプトアビジン (16K Da)のフラグメントを含む組換えタンパクであり分子量は145K Daとなる。この組換えGβSタンパクのSDS−PAGEの結果を図３に示す。対応する分子量の位置に単一のバンドを示しており、GβSタンパクの発現、精製に成功したことが解る。
【非特許文献１５】Kose,S., Imamoto,N., Shimamoto,T., Tachibana,T., Shimamoto, T.,およびYoneda,Y. J. Cell Biol. 139 , 841 (1997)。
【実施例３】
【００２２】
マイクロインジェクション法による核内移行能評価  マイクロインジェクション法により細胞質に注入した後、一定時間培養後、細胞を5%HCHO溶液で固定化し、注入した物質の細胞内動態を観察した。もし、核内移行能を有する場合は、核が染色される。実施例１の方法で調製したbiotin−PEG−pDsRed（9.4）（プラスミドあたりのビオチン導入数：9.4）を用い、2.0μg/μL biotin−PEG−pDsRed（9.4）PBS溶液（30μL）と2.4μg/μLGβS PBS溶液（30μL）を混合し、すぐさまNIH3T3細胞の細胞質にマイクロインジェクションを行った。１時間後に固定化し、GFPの緑色蛍光を観察したのが、図４(a)である（便宜上、モノクロで示す）。また、スキムミルクで蛋白質の非特異的吸着をブロッキングした後にテキサスレッドラベル化ストレプトアビジンを細胞に添加し、ビオチンへの結合処理を行い、テキサスレッドの蛍光を観察した結果が図４(b)（便宜上、モノクロで示す）である。
上記の結果より、NIH3T3細胞において細胞質にマイクロインジェクションした融合タンパクおよびビオチンラベル化プラスミドは核内に局在しており、ビオチンラベル化プラスミドDNAとストレプトアビジンーインポーティンβ融合体の核内移行も促進していることが明らかとなった。
【実施例４】
【００２３】
マイクロインジェクションによるタンパク発現実験  組換え融合タンパクGβSはビオチンラベル化プラスミドDNAの核内移行を促進するので、細胞質に注入後核内にて効率よく転写され、タンパクの発現量が増強されると期待できる。そこで、プラスミド濃度0.5μg/μLとなるように、また融合タンパクGβSと複合化させる際には融合タンパクGβSの最終濃度が0.6μg/μLとなる溶液でNIH3T3細胞の細胞質に各50個の細胞にマイクロインジェクションし、24時間後における赤色蛍光タンパクの発現が確認できる細胞の割合を調べた。
その結果を図５に示す。ビオチン化学修飾したプラスミドDNA単独でマイクロインジェクションした場合（図５中、最下部）ではタンパク発現は全く観察されなかった。一方、プラスミドDNA−インポーティンβコンジュゲートから成る本発明の核酸構造体（図５中、中央部）はインタクトなプラスミドDNA（図５中、最上部）と比較しても発現効率の向上が認められ、プラスミドDNA−インポーティンβコンジュゲートがプラスミドDNAの核内移行促進によりタンパク発現を増強していることが解る。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明は、遺伝子治療をはじめとして種々の分野において細胞に所望の遺伝子を導入するための新しい非ウィルス性の技術として利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の核酸構造体を作製するのに用いられるビオチンラベル化プラスミドDNA合成スキームを示す（実施例１）。
【図２】本発明の核酸構造体を作製するのに用いられる組換え融合タンパクGβS発現ベクターのベクターマップを示す（実施例２）。
【図３】GβSタンパク発現のSDS−PAGEによる確認を示す（実施例２）。
【図４】本発明の核酸構造体の核内移行能を評価するためのNIH3T3細胞へのマイクロインジェクション法による蛍光観察結果を示す（実施例３）。
【図５】本発明の核酸構造体および比較サンプルについて行なったタンパク発現実験におけるマイクロインジェクション後の発現効率を示す（実施例４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【配列表】
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