(57)【要約】【課題】S/N比の向上、検出感度の向上、検出時間の短縮を図った抗原抗体反応利用の生体高分子検出方法およびバイオチップを実現する。【解決手段】ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、  蛍光標識したターゲット生体高分子と、プローブ生体高分子およびビーズのID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを表面に固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、
蛍光標識したターゲット生体高分子と、プローブ生体高分子およびビーズのID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを表面に固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする生体高分子検出方法。
【請求項２】
前記ターゲット生体高分子とビーズをバッファ溶液と共に容器中に入れ、物理的もしくは電気的もしくは化学的手段により攪拌することを特徴とする請求項１に記載の生体高分子検出方法。
【請求項３】
前記ビーズとして磁気ビーズもしくは金属またはプラスチックを用いたビーズを使用したことを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の生体高分子検出方法。
【請求項４】
前記ターゲット生体高分子は、DNAからの転写産物であるRNA、またはcDNA、またはタンパク質であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の生体高分子検出方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーション法によりターゲット生体高分子と結合するプローブ生体高分子と共にビーズ表面に固定されたID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを、抗原・抗体反応により捕捉することのできるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体を基板上に固定したバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAやRNA（RNAはDNAからの転写産物、すなわちmRNAまたはｒRNAまたはｔRNAまたは低分子RNAなどである）、タンパク質などの生体高分子を検出する方法およびそれに用いられるバイオチップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、マイクロアレイチップを用いて生体高分子（以下DNAを例にとる）を解読する技術はよく知られている（例えば、特許文献１参照）。そして、この種のDNAのマイクロアレイチップは通常次のように形成され、DNAを解読することができるようになっている。
【０００３】
ガラス（あるいはプラスチック）基板上に、ターゲットとなるmRNA（cDNA）と相補的配列をもつプローブDNAをアレイ状にスポッティングして固定する。その上に、ターゲットとなるmRNA（cDNA）に蛍光ラベルを付けたものを滴下する。このとき、相補的配列同士のプローブとターゲットはハイブリダイズして結合するが、そうでないものは結合しない。
【０００４】
十分ハイブリダイゼーションが進行した後、基板上をウォッシングバッファ液で洗浄し、ハイブリダイズしなかったターゲットを洗い流す。次に、読取装置で光学的に蛍光ラベルの位置および光量を読み取ることにより、ターゲットとなるmRNA（cDNA）の有無およびその量を測定することができる（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１３１２３７号公報（第２頁、図１−３）
【特許文献２】特開２０００−２３５０３５号公報（第２頁、図７−９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のDNAマイクロアレイは上記のような一連のプロトコルにより目的とするデータが得られるが、実際には各段階のプロトコル上で色々な問題点を抱えている。その結果、得られたデータには確かさ、再現性、繰り返し特性、感度などの課題が多く、それゆえ実験データの標準化が進まず、更にはコンテンツ面での問題点と相俟って臨床現場でDNAマイクロアレイが普及するには至っていない。
色々な問題点のうち特に問題となる項目は、S/N比、検出感度、検出時間、確からしさ、再現性である。
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するもので、S/N比の向上、検出感度の向上、検出時間の短縮を図った抗原抗体反応利用の生体高分子検出方法およびその方法に用いられるバイオチップを実現することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような課題を達成するために、本発明では、
ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、
蛍光標識したターゲット生体高分子と、プローブ生体高分子およびビーズのID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを表面に固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする。
【０００９】
本発明ではビーズを使用しているため、ビーズの表面積は従来のDNAチップの表面積に比べ格段に大きくなり、そのビーズ表面に沢山のプローブ生体高分子を固定することができ、これによりビーズ上のプローブ生体高分子と溶液中のターゲット生体高分子とが邂逅する機会が格段に高まり、ターゲット生体高分子を極めて高い感度で捕捉することができる。一般にDNAアレイの約１０００倍以上の感度である。
ビーズには、さらにID認識用のアドレスリンカーが固定されている。アドレスリンカーとしては、ポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子が使用される。
【００１０】
一方、基板上のサイトには前記アドレスリンカーと抗原・抗体の関係にある（DNAとDNAのハイブリダイゼーションに比較して格段に強力な結合力がある）アドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体が固定されている。基板に前記ビーズを注ぐと、抗原・抗体反応によりアドレスリンカーはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体に強力な結合力で捕捉される。
このようにして、高S/N比、高検出感度でターゲット生体高分子を基板上に捕捉することができる。
【００１１】
この場合、請求項２のように、ターゲット生体高分子とビーズをバッファ溶液と共に容器中に入れ、物理的もしくは電気的もしくは化学的手段により攪拌すると、従来方式が単にブラウン運動にて相補的プローブを探すことに比べ、本発明では他からのエネルギーを得て相補的プローブを探すことになるので、邂逅する機会が格段に高まり、その結果プローブ生体高分子とターゲット生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化することができる。
【００１２】
ビーズとしては、請求項３のように磁気ビーズ、もしくは金属またはプラスチックを用いたビーズを使用する。また、ターゲット生体高分子は、請求項４のようにDNAからの転写産物であるRNA（mRNAまたはrRNAまたはtRNAまたは低分子RNA）、またはcDNA、またはタンパク質である。
【００１３】
請求項５の発明は、ハイブリダイゼーション法によりターゲット生体高分子と結合するプローブ生体高分子と共にビーズ表面に固定されたID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを、抗原・抗体反応により捕捉することのできるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体を基板上に固定していることを特徴とするバイオチップである。
【発明の効果】
【００１４】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）ビーズは表面積が大きいため沢山のプローブDNAを結合でき、したがって溶液中の微量のターゲット生体高分子を極めて高い感度（一般のDNAアレイの約１０００倍以上の感度）で容易に捕捉することができる。
（２）１つのビーズに結合した沢山のプローブDNAにターゲットDNAをハイブリダイズさせ結合させ得るので、容易にS/N比を上げることができる。
【００１５】
（３）１つのビーズに沢山のプローブDNAを結合していることと、溶液を攪拌することにより、ターゲットDNAとプローブDNAとの邂逅の機会が多くなり、検出時間（主としてハイブリダイゼーションに要する時間）を容易に短縮することができると同時に、極めて高い感度でターゲットDNAとプローブDNAとをハイブリダイズさせることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明では、ビーズの良いところとDNAアレイの良いところを組合わせている。ビーズの良いところは、表面積が大きいためプローブDNAを沢山結合しておくことができ（平板状のサイトにプローブDNAを結合するのに比して格段に多い）、しかも溶液中を自由に移動することができるので、溶液中のターゲット生体高分子と邂逅する機会が飛躍的に向上し、その結果溶液中の微量のターゲットDNAを極めて高い感度で捕捉することができる（一般にDNAアレイの約１０００倍以上である）点である。
【００１７】
しかしながら、一方で、各ビーズのIDすなわちどのビーズにどのDNAが結合したかが分らないという欠点がある。このビーズのIDを認識するため、通常、カラービーズを使ったり、２色の光源で識別したりと色々な試みがなされているが、識別できる数が少ないという問題と、装置が複雑化、高額化、大型化し、そして取り扱いが難しくなるという問題がある。本発明ではビーズ上とアレイ上のタンパク質の抗原・抗体反応により識別できるようにして、この問題をうまく解決している。
【００１８】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１ないし図３は本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。なお、ここでは、生体高分子がDNAである場合について説明する。
図１ないし図３は本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。なお、ここでは、生体高分子がDNAである場合について説明する。
【００１９】
図１に示すように、ビーズ１の表面にプローブDNA２を固定する。ビーズとしては、磁気ビーズや金属もしくはプラスチックを用いたビーズなどが使用できる。
ビーズ１の表面には、それに加えてビーズの識別情報（ID）を認識するためのアドレスリンカー３を固定する。アドレスリンカー３としては、アドレス判定用抗原もしくはアドレス判定用抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）が使用される。
他方、ターゲットとなるRNAあるいはcDNAあるいはタンパク質（以下これらを代表してRNAという）４には、蛍光タグ５を付加（標識）する。
【００２０】
上記のようにして作成されたビーズ１とターゲットRNA４、そしてバッファ溶液６を共に容器７中に入れ、必要に応じて物理的もしくは電気的もしくは化学的手段によって攪拌する。その結果、ビーズ１表面のプローブDNA２には、これと相補的関係にあるターゲットRNA４が結合する。
【００２１】
次に、前記結合したビーズを図２に示すバイオチップ１０のアレイ状のサイト１１上に注ぐ。なお、同図（ａ）は側面図、同図（ｂ）は平面図である。
サイト１１上には、ビーズ１表面に固定されたID認識用アドレスリンカー３を抗原・抗体反応により捕捉するアドレスプローブタンパク質１２があらかじめ固定してある。なお、図３は図２の丸囲み部分Ａの拡大図である。
【００２２】
アドレスリンカー３とアドレスプローブタンパク質１２は抗原・抗体反応により結合する。ビーズ１がどのプローブサイト１１のアドレスプローブタンパク質１２に結合したかは蛍光ラベル５によって認識することができる。蛍光ラベルは蛍光読取装置（図示せず）により容易に検出できる。
このようにしてターゲットRNA４の存在およびその量を効率よく測定することができる。
【００２３】
なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
【００２４】
例えば、アドレスリンカーとしては、ポリクローナル抗体の他にアドレスプローブペプチドまたは生体高分子を用いることができる。この場合、これに対応して基板上にはアドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体のいずれかを固定する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。
【図２】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する他の説明図である。
【図３】本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する他の説明図である。
【符号の説明】
【００２６】
１  ビーズ
２  プローブタンパク
３  アドレスリンカー
４  ターゲットＲNA
５  蛍光タグ
６  溶液
７  容器
１０  基板
１１  サイト
１２  アドレスプローブタンパク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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