(57)【要約】【課題】  SM合成酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列、並びに、それらの新たな用途を提供する。【解決手段】  本発明者は、SM合成が欠如しているマウスの白血病細胞変異体（WR19L/Fas(-))を用いた発現クローニング法により、SM合成酵素活性に対応するヒトcDNA(SMS-1)を単離した。WR19L/Fas-SM(-)細胞はSMを発現していないが、SMS-1 cDNA発現細胞は、WR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度にSMを発現しており、またSMの発現にセラミド及びフォスファチジルコリンを要求することから、SM合成酵素をコードしている。またSMS-1 cDNA がコードするSM合成酵素は細胞増殖に必須である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)又は(2)のポリペプチド。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2)  配列番号１において１又は２以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項４】
以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチド。
(3)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
【請求項６】
請求項４に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項７】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養する工程と；培養物から請求項１に記載のポリペプチドを回収する工程とを含む請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
以下の(5)又は(6)のアンチセンスポリヌクレオチド。
(5)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも１８塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも１８塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
【請求項１２】
請求項１０に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項１３】
以下の(7)又は(8)のsiRNA。
(7)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも２１塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも２１塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２本鎖RNAからなるsiRNA。
【請求項１４】
請求項１３に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
【請求項１５】
請求項１３に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項１６】
以下の(9)又は(10)のリボザイム。
(9)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも２０塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、請求項４のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも２０塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、請求項４のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
【請求項１７】
請求項１６に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
【請求項１８】
請求項１６に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項１９】
請求項１に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の抗体を有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
【請求項２１】
請求項１９に記載の抗体を有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
【請求項２２】
(a)  被験物質と請求項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２３】
(a)  被験物質と請求項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
【請求項２４】
(a)  被験物質と請求項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
【請求項２５】
(a)  被験物質と請求項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素遺伝子及びその新たな用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアシルグリセロール(DAG)、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジン酸のような多様なグリセロリン脂質が、細胞増殖及び生存についての生理活性分子と考えられている。また、スフィンゴ脂質は、細胞膜の構成成分であるとともに、細胞増殖、細胞分化及び細胞死などを調節することが知られるようになってきた。
【０００３】
近年、スフィンゴ脂質の一種であるセラミドはアポトーシス、細胞分化、分泌のシグナルメディエーターと考えられるようになってきた。紫外線、放射線、ヒートショック、酸素欠乏のような種々のストレス；TNF-α、INF-γ及びFas抗体のような生物学的因子は、アポトーシスにセラミドの生成を要求する(Cell Signal 10,685-692(1998))。このことは、セラミドがアポトーシスを誘導するシグナルとして機能していることを示唆している。
【０００４】
セラミドの代謝には多くの酵素が関わっているが、その一つであるスフィンゴミエリン（以下、「SM」と略称する）合成酵素は、フォスファチジルコリンのリン酸コリン部分をセラミドに転移してスフィンゴミエリンを生成するとともに、ジアシルグリセロールを生成する。
【０００５】
SM合成酵素の活性化により、アポトーシス誘導シグナルとされているセラミドレベルが低下し、続いてジアシルグリセロールのレベルが向上することが報告されている(Biochemistry 21,2753-2759)。またジアシルグリセロールは、プロテインキナーゼC(PKC)活性化を介した細胞増殖のための重要なシグナル因子であり(Science 246,1050)、セラミドに誘導されるアポトーシスに対して競合的に作用する(Cell Signal 10,685-692)。
【０００６】
セラミドと疾患との関係については、抗癌剤に耐性化した細胞ではセラミド量が低下していること、及び、抗癌剤耐性白血病患者から採種した白血病細胞では、抗癌剤感受性患者の献体に較べて、抗癌剤処理により認められるセラミドの増加が少ないことが知られている。このことは、アポトーシス誘導シグナルであるセラミドの細胞内量を増加させない仕組みが新たな薬剤耐性機構の一つであることを示唆している（タンパク質・核酸・酵素,Vol.47,No.4(2002))。
【０００７】
さらに、スフィンゴミエリンがデオキシコール酸が誘導するアポトーシスを容量依存的に阻害し、続いて結腸上皮細胞の過剰増殖が起こり、以上結腸陰窩の数が減少することが報告されている（Dig Dis Sci 48,1094-1101(2003))。
【０００８】
このように、セラミドがアポトーシスのシグナルメディエーターとして機能すること、スフィンゴミエリンがアポトーシスを阻害することが明らかにされつつある。しかし、スフィンゴミエリン合成酵素の具体的な役割は明瞭になっていないため、スフィンゴミエリン合成酵素の有用性は確定していなかった。
【０００９】
ここで、非特許文献１は、酵母細胞でSM合成及びその逆反応を触媒するポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を開示している。また、同文献には、ノーザンブロット法によりこのポリヌクレオチドがヒトの種々の組織で発現していること、及び、このポリペプチドがヒト細胞のゴルジ装置に局在していることが記載されている。
【００１０】
しかし、非特許文献１には、このポリペプチドの機能については、酵母細胞でSM合成及びその逆反応を触媒することしか記載されておらず、実際の哺乳類の細胞中での役割は明らかになっていない。
【非特許文献１】EMBO J. 2004,1-12(2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、SM合成酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を提供することを第１の課題とする。また本発明は、このアミノ酸配列を有するポリペプチドの哺乳類での細胞増殖における役割を解明することにより、その新たな用途を提供することを第２の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(1)    SM合成が欠如しているマウスの白血病細胞変異体（WR19L/Fas(-))を用いた発現クローニング法により、SM合成酵素活性に対応するヒトcDNAを単離した。このcDNAクローンは、413アミノ酸をコードしており、SMS-1と命名した。
(2)  WR19L/Fas-SM(-)細胞はSMを発現していないが、SMS-1 cDNA発現細胞（WR19L/Fas-SMS-1）は、WR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度にSMを発現している。
(3)  SMS-1発現細胞（WR19L/Fas-SMS-1）は、SMの発現にセラミド及びフォスファチジルコリンを要求することから、SMS-1 cDNAはSM合成酵素をコードしていると考えられる。
(4)  WR19L/Fas-SM(-)細胞は増殖が抑制されているが、SMS-1 cDNA発現細胞（WR19L/Fas-SMS-1）は、WR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度に増殖する。このことから、SMS-1 cDNA がコードするSM合成酵素は細胞増殖に必須である。
【００１３】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のポリヌクレオチドなどを提供する。
項１．  以下の(1)又は(2)のポリペプチド。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2)  配列番号１において１又は２以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。
項２．  項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
項３．  項１に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項４．  以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチド。
(3)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項５．  項４に記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖促進剤。
項６．  項４に記載のポリペプチドを有効成分として含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項７．  項４に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
項８．  項７に記載の組み換えベクターを保持する形質転換体。
項９．  項８に記載の形質転換体を培養する工程と；培養物から項１に記載のポリペプチドを回収する工程とを含む項１に記載のポリペプチドの製造方法。
項１０．  以下の(5)又は(6)のアンチセンスポリヌクレオチド。
(5)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも１８塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも１８塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
項１１．  項１０に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項１２．  項１０に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項１３．  以下の(7)又は(8)のsiRNA。
(7)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも２１塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも２１塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２本鎖RNAからなるsiRNA。
項１４．  項１３に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項１５．  項１３に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項１６．  以下の(9)又は(10)のリボザイム。
(9)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも２０塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、項４のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の中の連続する少なくとも２０塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、項４のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
項１７．  項１６に記載のsiRNAを有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項１８．  項１６に記載のsiRNAを有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項１９．  項１に記載のポリペプチドを特異的に認識する抗体。
項２０．  項１９に記載の抗体を有効成分として含む細胞増殖阻害剤。
項２１．  項１９に記載の抗体を有効成分として含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤。
項２２．  (a)  被験物質と項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖阻害剤のスクリーニング方法。
項２３．  (a)  被験物質と項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む、白血病、癌、自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
項２４．  (a)  被験物質と項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む細胞増殖促進剤のスクリーニング方法。
項２５．  (a)  被験物質と項７に記載の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるスフィンゴミエリン合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  スフィンゴミエリン合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療又は改善剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、SM合成活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列が提供され、この塩基配列を有するポリヌクレオチドが細胞増殖に必須であることが初めて確認された。
【００１５】
これにより、このポリヌクレオチドの発現阻害剤、このポリペプチドの活性阻害剤、アンチセンス、siRNA、リボザイム及び抗体などが、細胞増殖抑制を必要とする癌等の治療に有用であることが明らかになった。また、このポリヌクレオチド、これがコードするポリペプチド、このポリヌクレオチドの発現促進剤、及び、このポリペプチドの活性促進剤が、細胞増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制等の治療に有用であることが明らかになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ポリペプチド
本発明のポリペプチドは、以下の(1)又は(2)のポリペプチドである。
(1)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(2)  配列番号１において１又は２以上のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチド。
【００１７】
本発明において、ポリペプチドには、そのポリペプチドの他に生物学的活性を損なわない範囲で、その塩及び誘導体が含まれる。誘導体としては、例えば、グリコシル化、アミド化、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸化、ホルミル化、アシル化等されたものが挙げられる。また、塩としては酸付加塩が好ましい。酸付加塩としては、塩酸、リン酸、硫酸等の無機酸との塩；蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酒席酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００１８】
(2)の改変されたポリペプチドとしては、例えば、配列番号１のヒトのポリペプチドに対応する他生物種のポリペプチドが挙げられる。他生物種の対応ポリペプチドは、例えば後述するNCBIのBlastサーチにより選抜された他生物種の対応遺伝子から演繹的に同定することができる。
【００１９】
(1)のポリペプチドのアミノ酸の置換により(2)のポリペプチドを得る場合は、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００２０】
(2)の変異体ポリペプチドは、SM合成酵素活性を有していればよくそれには制限されないが、配列番号１のアミノ酸配列において、好ましくは３個以下、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、付加又は置換したものであればよい。
（ＩＩ）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、以下の(3)又は(4)のポリヌクレオチドである。
(3)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(4)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明において、ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）には、特に言及しない限り、DNA及びRNAの双方が含まれる。また、DNAには、特に言及しない限り、cDNA、ゲノムDNA及び合成DNAが含まれる。RNAには、特に言及しない限り、totalRNA、mRNA、rRNA、tRNA及び合成RNAが含まれる。
【００２２】
(3)のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得ることができる。また、ヒトcDNAライブラリーをPCRの鋳型として用い、例えば配列番号２のの塩基番号338〜1576の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、常法に従いPCRを行うことによっても得ることができる。また、化学合成によっても得ることができる。
【００２３】
(4)のポリヌクレオチドは、配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。「あるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年)等に記載の方法によって得ることができる。
【００２４】
本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、６×SSC、0.5% SDS及び50%ホルムアミドの溶液中で42℃で加温した後、0.1×SSC、0.5% SDSの溶液中で68℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件が挙げられる。
【００２５】
(4)のポリヌクレオチドには、例えば、配列番号２の塩基番号338〜1576のヒトのポリヌクレオチドに対応するマウスやラットのような他生物種のポリヌクレオチドや、天然又は非天然のアレル変異体などが含まれる。
【００２６】
他生物種のポリヌクレオチドは、例えばNCBIのblastサーチ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により選抜することができる。具体的には、例えば配列番号２の塩基番号338〜1576の一部の塩基配列をNCBIのblastサーチにかけて、他の生物種の塩基配列データベース及びESTデータベースより相同性の高い配列を検索する。検索により選択された配列の当該一部配列に相当する領域の相同性が例えば90％以上の塩基配列を選抜することにより、対応する他の生物種の対応遺伝子を選抜することができる。
【００２７】
(3)のポリヌクレオチドのヌクレオチドを置換して(4)のポリヌクレオチドを定めるに当たっては、翻訳後に得られるアミノ酸が、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性などの点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するような塩基の置換を行うことができる。また、一つのアミノ酸が数個の翻訳コドンを有する場合、この翻訳コドン内での塩基の置換も勿論可能である。
（ＩＩＩ）組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明のポリヌクレオチド（ここではDNA)を含むベクターであり、本発明のポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに組み込むことにより得られる。
ベクターDNAは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクターDNAは、天然に存在するDNAであってもよく、天然DNAから増殖に必要な部分以外のDNA部分が一部欠落しているものでもよい。ベクターDNAとしては、例えば、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウィルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等）等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミドおよびファージミド等）が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドの製造のためには、発現ベクター又はクローニングベクター等を用いればよい。
（ＩＶ）形質転換体
本発明のポリヌクレオチドが組み込まれた組み換えベクターを、公知の宿主、例えば大腸菌（例えばK12）、バチルス属細菌（例えばMI114）のような細菌、酵母（例えばAH22）、昆虫細胞（例えばSf細胞）又は動物細胞（例えばCOS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）等に公知の方法で導入することにより本発明の形質転換体が得られる。
ポリヌクレオチド導入方法は、公知の方法を制限なく使用できる。このような公知のポリヌクレオチド導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法及び感染等を例示できる。
（Ｖ）ポリペプチドの製造方法
本発明のポリペプチドは公知のペプチド合成法により合成することができる。このようなペプチド合成法としては、例えば「ペプチド合成」（丸善；１９７５年発行）に記載の方法が例示される。また、例えばアプライドバイオシステムズ社のペプチド合成装置のような公知の化学合成装置を用いて製造することもできる。
また本発明のポリペプチドは、上記説明した本発明の形質転換体を培養する工程と、この培養物から本発明のポリペプチドを回収する工程とを含む方法により製造することもできる。
【００２８】
培養物から本発明のポリペプチドを回収し、さらにこれを精製することが好ましい。精製は、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー等を組み合わせた公知の方法により行えばよい。
また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき製造された、このアミノ酸配列に特異的なポリクローナル抗体又はモノクロ−ナル抗体を用いて、培養物中の本発明のポリペプチドを特異的に吸着回収することもできる。
（ＶＩ）アンチセンス
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の(5)又は(6)のポリヌクレオチドである。
(5)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(6)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも18塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００２９】
本発明のアンチセンスは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAとハイブリダイズしてmRNAからポリペプチドへの翻訳を阻害すること、又は、ｍRNAを分解することにより、このポリペプチドの発現を阻害する。
【００３０】
(5)のアンチセンスは、配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、連続する少なくとも２０塩基に相補的な塩基配列を含むことが好ましい。(6)のアンチセンスも、配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、少なくとも２０塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００３１】
アンチセンスの塩基数の上限は特に限定されないが、通常３０塩基程度もあれば十分に目的を達成できる。選択した配列が目的mRNAの発現のみを阻害するか否かは、例えばBLASTサーチで確認すればよい。
【００３２】
配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列中の、(5)及び(6)のポリヌクレオチドがハイブリダイズする領域は、配列番号２の塩基番号338〜1576の5'末端に近いほど好ましい。
【００３３】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、１本鎖DNA、１本鎖RNA、２本鎖DNA又はDNA・RNAハイブリッドのいずれであってもよい。なお、２本鎖RNAは後述するsiRNAに該当する。
【００３４】
また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの発現を阻害する限り、これらのヌクレオチドの誘導体であってもよい。誘導体としては、ホスホロチオエートDNA、H-ホスホネートDNAなどを例示できる。
【００３５】
本発明のアンチセンスによる本発明のポリペプチドの発現の阻害は、例えば以下の方法で確認できる。ヒトの白血病由来の細胞に、２０〜５０μg/ml程度のアンチセンスを、必要に応じてリポフェクション試薬、リポフェクタミン試薬、リポソーム等の公知の細胞内導入試薬とともに加える。次いで、この細胞から細胞抽出液を公知の方法で調製し、後述する本発明の抗体を用いて、ELISAやウェスタンブロット等の公知の方法で本発明のポリペプチドの発現量を測定すればよい。この発現量をアンチセンス非添加の場合と比較する。
【００３６】
本発明のアンチセンスは、公知の化学合成法により製造できる。
（ＶＩＩ）ｓｉＲＮＡ
本発明のsiRNAは、以下の(7)又は(8)のsiRNAである。
(7)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列の連続する少なくとも21塩基に相補的なRNA鎖とこれに相補的なRNA鎖との対を含むsiRNA。
(8)  配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも21塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２本鎖RNAからなるsiRNA。
【００３７】
本発明のsiRNAの作用機作は必ずしも明らかではないが、本発明のポリペプチドをコードするmRNAとハイブリダイズしてmRNAからポリペプチドへの翻訳を阻害すること、又は、ｍRNAを分解することにより、このポリペプチドの発現を阻害すると考えられる。
【００３８】
(7)のsiRNAは、配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、連続する少なくとも23塩基に相補的な塩基配列を含むことが好ましい。(6)のsiRNAも、配列番号２に記載の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の、少なくとも23塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００３９】
siRNAの塩基数の上限は特に限定されないが、通常30塩基程度もあれば十分に目的を達成できる。選択した配列が目的mRNAのみ発現阻害するか否かは、例えばBLASTサーチで確認すればよい。
【００４０】
また、配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列中の(7)及び(8)のsiRNAがハイブリダイズする領域は、開始コドンの下流50〜100塩基程度の領域を含むことが好ましく、この領域に含まれることがより好ましい。
【００４１】
本発明のsiRNAによる本発明のポリペプチドの発現の阻害の確認は、アンチセンスの場合と同様にして行えばよい。
【００４２】
本発明のsiRNAは、公知の化学合成法により製造できる。
（ＶＩＩＩ）リボザイム
本発明のリボザイムは、以下の(9)又は(10)のリボザイムである。
(9)  配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列中の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれ相補的な二つの塩基配列部分を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
(10)  配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列の連続する少なくとも20塩基からなる二つの領域にそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズする二つの塩基配列を有し、かつ、本発明のポリヌクレオチドを分解する活性を有するリボザイム。
【００４３】
本発明のリボザイムの塩基数の上限は特に限定されないが、通常１００塩基程度とすればよい。
【００４４】
配列番号２の塩基番号338〜1576の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列中の二つの領域は、隣接していても離れていてもよいが、それらの領域間には2〜6塩基程度の塩基が存在することが好ましい。例えばハンマーヘッド型リボザイムでは、２塩基が存在する場合が挙げられ、ヘアピン型リボザイムでは6塩基が存在する場合が挙げられる。
【００４５】
リボザイムは、RNAの特定の部位を認識するアンチセンス配列を含むRNA分子であり、かつ、RNA切断酵素活性を有する。これによりリボザイムは、標的RNAを識別し、RNAの特定部位を特異的に切断する。
【００４６】
本発明のリボザイムは、ハンマーヘッド型及びヘアピン型のいずれであってもよい。ハンマーヘッド型は、通常NUX（NはG、U、C又はAであり、XはC、U又はAである）を認識し、Xの3'側の位置でRNA（通常mRNA）を切断する。また、ヘアピン型は、通常NNNG/CN*GUCNNNNNNNN（NはG、U、C又はA）を認識し、N*G間でRNA（通常mRNA）を切断する。
【００４７】
また本発明のリボザイムは、ヘリカーゼと相互作用するモチーフを有することが好ましく、これにより、RNA切断活性が向上する。
【００４８】
本発明のリボザイムは、通常RNAからなるが、デオキシリボヌクレオチドを含むものや、生体内で分解され難いホスホチオエート修飾されたもの等の誘導体も本発明のリボザイムに含まれる。
【００４９】
本発明のリボザイムは、周知の化学合成法等により製造できる。
（ＩＸ）抗体
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体である。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。また本発明の抗体には、本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸配列の連続す20アミノ酸、好ましくは30アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も含まれる。さらに、これらの抗体の誘導体（キメラ抗体等）やペルオキシダーゼのような酵素で標識したものも本発明の抗体に含まれる。
抗体の製造方法
これらの抗体は、周知の製造方法（例えばCurrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）に従って製造することができる。
【００５０】
具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、本発明のポリペプチドを用いて家兎等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の血清から常法に従って得ることができる。また本発明の抗体がモノクローナル抗体である場合には、例えば、本発明のポリペプチド又はその部分配列を有するポリペプチドを用いてマウス等の非ヒト動物を免疫し、この免疫動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより得られたハイブリドーマから得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
（Ｘ）医薬
ポリペプチド
後掲の実施例に示されるように、本発明のポリペプチドはSM合成酵素活性を有し、細胞増殖に必須であることから、細胞増殖を必要とする疾患、例えば再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、リンパ球の増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制に好適に使用できる。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、薬学的に許容される各種担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる）と配合し、製剤とされる。製剤は慣用の添加剤を含んでいてよい。
【００５２】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。
【００５３】
製剤中の本発明のポリペプチドの含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリペプチドの１日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。
ポリヌクレオチド
本発明のポリペプチドがSM合成酵素活性を有し、細胞増殖に必須であることから、これをコードするポリヌクレオチドも、例えば再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、リンパ球の増殖を必要とする骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制に好適に使用できる。
これらの疾患の治療又は改善に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをベクターに担持させ、直接体内に導入してもよく、又ヒトから細胞を採取してベクターを導入した後体内に戻すこともできる。ベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等の遺伝子治療に使用できることが知られているものを制限なく使用できるが、レトロウイルスが推奨される。
また、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに封入して送達するマイクロインジェクションなどを使用して細胞に導入することもできる。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドの投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリヌクレオチド量として、血中濃度が10〜100ng/ml程度、好ましくは20〜50 ng/ml程度程度になるように投与すればよい。
アンチセンス・ｓｉＲＮＡ
本発明のアンチセンス及びsiRNAは、SM合成酵素遺伝子の発現を阻害することから、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば白血病、各種癌、自己免疫疾患などの治療又は改善に好適に使用できる。中でも、白血病又は癌の治療又は改善に好適に使用できる。
これらの疾患の治療又は改善に当たっては、本発明のポリヌクレオチドをリポソームに封入して送達するマイクロインジェクションなどを使用して細胞に導入したり、細胞に直接注入もしくは経静脈的に投与すればよい。
【００５５】
アンチセンス及びsiRNAの投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、アンチセンス及びsiRNA量として、血中濃度が10〜100ng/ml程度、好ましくは20〜50 ng/ml程度程度になるように投与すればよい。
抗体
本発明の抗体は、SM合成酵素に結合することによりその活性を阻害することから、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば白血病、各種癌、自己免疫疾患などの治療又は改善に好適に使用できる。
【００５６】
本発明の抗体は、通常、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射などの注射剤とすればよい。注射剤には、必要に応じて、食塩、湿潤剤、乳化剤などの慣用の添加剤が含まれていてよい。
【００５７】
製剤中の抗体の含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、抗体の１日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500ｍｇ程度になる量とすればよい。
（ＸＩ）医薬のスクリーニング方法
本発明の細胞増殖抑制剤、又は、白血病、癌及び自己免疫疾患からなる群より選ばれる疾患の治療若しくは改善剤のスクリーニング方法（第１の方法）は、
(a)  被験物質と本発明の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  SM合成酵素活性を低減させる被験物質を選択する工程と
を含む方法である。
【００５８】
また本発明の細胞増殖促進剤、又は、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制、肝硬変、心筋梗塞、脳梗塞、創傷からなる群より選ばれる疾患の治療若しくは改善剤のスクリーニング方法（第２の方法）は、
(a)  被験物質と本発明の組み換えベクターを保持する試験細胞とを接触させる工程と、
(b)  試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値を、被験物質を接触させていない試験細胞におけるSM合成酵素活性又はその指標値と比較する工程と
(c)  SM合成酵素活性を増大させる被験物質を選択する工程と
を含む方法である。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法によれば、細胞膜受容体等を介して間接的に本発明のポリヌクレオチドの発現又は本発明のポリペプチドの活性に影響を与える物質、細胞内に取り込まれて直接本発明のポリヌクレオチドに結合することによりその発現に影響を与える物質又は直接本発明のポリペプチドに結合することによりその活性に影響を与える物質、細胞内に取り込まれて他の細胞内タンパク質に作用することにより間接的に本発明のポリヌクレオチドの発現又は本発明のポリペプチドの活性に影響を与える物質等が選択される。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドの発現を阻害又は本発明のポリペプチドの活性を低減させる物質は、細胞増殖抑制剤として有用である。また、本発明のポリヌクレオチドの発現を促進又は本発明のポリペプチドの活性を増大させる物質は、細胞増殖促進剤として有用である。
試験細胞
本発明の組み換えベクターを保持させる試験細胞としては、それには限定されないが、哺乳動物細胞又は昆虫細胞などを用いることができる。
【００６１】
哺乳動物細胞としては、例えばベロ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＶ１細胞、ナマルバ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＨＯ細胞等の公知の細胞を使用できる。また、ヒト骨肉腫細胞株Saos-2（ATCC、HTB85）、大腸癌細胞株のDLD-1、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７(国立医薬品食品衛生研究所 細胞バンク、ＪＣＲＢ０１３４)、ヒト腎上皮細胞株293（ATCC、CRL1573）、赤白血球病細胞株K562（ATCC、CCL243）等の癌細胞を使用することもできる。継代培養が容易であり、正常細胞の多くの性質を有していることから、一次スクリーニングの段階では癌細胞を用いてもよい。
【００６２】
昆虫細胞としては、例えばSf細胞、MG1細胞、High FiveTM細胞等の公知の細胞を使用できる。
SM合成活性の評価
SM合成酵素活性の低減又は増大の確認方法は特に限定されないが、例えば、実施例６に示すように、ラジオラベルしたアミノ酸とともに細胞をインキュベートした後、抽出した脂質をTLCに供し、SMに相当するバンドの放射活性を比較する方法、蛍光基質ＮＢＤ？セラミドのＮＢＤ？ＳＭへの変化をＴＬＣ上でＢＡＳ？２０００イメージアナライザー又は公知の蛍光量測定装置で測定する方法等を使用できる。
【００６３】
またSM合成酵素活性の指標値としては、例えばlysenin結合能等が挙げられる。非毒性の変異体lyseninを用いる場合は、実施例２に示すように、マルトース結合タンパク質(MBP)に融合させたlyseninとしてMBPに対する抗体を用いてlysenin結合能を測定すればよい。また天然型のlyseninを用いる場合は、実施例２に示すようにlyseninによる細胞死を測定することによりlysenin結合能を評価すればよい。
被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物（ヌクレオチド、アミン、糖質、脂質等）、有機低分子化合物、無機低分子化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
接触・判定
試験細胞と被験物質との接触は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち、ベクターを保持する細胞は、その細胞に適した培地を用いて継代し、対数増殖期の状態になるように培養しておく。被験物質を接触させる際には、細胞を５ｘ１０5／ｍｌ程度の細胞密度になるように播き、24時間程度培養する。次いで、被験物質を、その種類によって異なるが例えば１０〜１０００ｎＭ程度の濃度になるように細胞培養に添加する。次いで、37℃程度で、12〜48時間程度インキュベートする。なお、被験物質によりアポトーシスが誘導されてしまうのを防ぐために、アポトーシス阻害剤ＤＥＶＤ−ＣＨＯを２００ｍＭ前後の濃度で添加することが好ましい。
【００６４】
この後、被験物質を接触させた試験細胞におけるSM合成酵素活性とと被験物質を接触させない試験細胞のSM合成酵素活性を比較する。比較は、両細胞のSM合成酵素活性を測定した後比較することもでき、又は、SM合成酵素活性を目視等により直接比較することにより定性的に確認することもできる。
【００６５】
被験物質を接触させることにより、SM合成酵素活性が被験物質を接触させない対照の例えば75％以下、好ましくは50％以下になる場合には、SM合成酵素活性が低減したと判定すればよい。また、SM合成酵素活性が対照の例えば125％以上、好ましく150%以上になる場合には、SM合成酵素活性が増大したと判定すればよい。
（ＸＩＩ）実施例
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
細胞培養
各実施例において細胞は以下のようにして入手し、維持したものを用いた。
【００６６】
WR19L/Fas細胞は、京都大学ウィルス研究所の米原博士から入手した。WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SM(+)細胞は、天然型のWR19L/Fas細胞から限界希釈法により単離した。
【００６７】
細胞は、常法に従い、10%牛胎児血清(FBS)、50μMの2-メルカプトエタノール及び75μg/mlのカナマイシンを添加したRPMI-1640培地中で5%CO2及び100%湿度の下37℃で維持した。
【００６８】
血清フリー培地の培養のためには、細胞を洗浄し、１×105cells/mlで再播種し、５μg/mlのヒトインスィン及びウシholoタイプトランスフェリンを含むRPMI-1640培地中で5%CO2の下37℃で培養した。48時間の培養の後、0.25%トリパンブルーを用いたdye exclusion法により細胞数を測定した。
【実施例１】
【００６９】
各細胞のSM産生の有無の確認
（１）  WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SM(+)細胞を、それぞれ2%FBS及びL-[14C]セリン（比活性;155mCi/mmol)を含むRPMI-1640培地中に、５×105cells/mlの密度になるように播種した。細胞を37℃の下5%CO2中で２時間培養することによりラベルした。
【００７０】
WR19L/Fas 細胞は、Fas抗原を過剰発現しているリンパ球細胞であり、WR19L/Fas-SM(+)細胞は、SMを発現している天然型WR19L/Fas細胞であり、WR19L/Fas-SM(-)細胞はそのSM欠損変異体である。
【００７１】
両細胞の細胞脂質をBligh&Dyerの方法（J.Biol.Chem.264,19076-19080(1989)）により抽出し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート（Whatman Maidstone,UK)にアプライし、酢酸メチル／プロパノール／クロロフォルム／メタノール／0.25%KCl（25：25：25：10：9)で展開した。放射線活性を有するスポットが可視化されるため、この放射活性をBAS2000イメージアナライザー（Fuji Photo Film)を用いて定量した。
【００７２】
TLCの結果を図1Aに示す。図1A中、Cerはセラミドを示し、GCはグリコシルセラミドを示し、PEはフォスファチジルエタノールアミンを示し、PSはフォスファチジルセリンを示す。
【００７３】
WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SM(+)細胞において検出される[14C]セリンでラベルしたSMが検出されず、[14C]セリンでラベルしたSMを合成していないことが分かる。
（２）  上記各細胞の５０μgのlysateを５０μgのC6-NBD-セラミド及び５００μgのフォスファチジルコリンの存在下で、20mM Tris/Hcl(Ph.7.5)反応液中で最終液量１００μlとして、３７℃にて３０分間インキュベートし、上記と同様にしてTLCを行った。
【００７４】
蛍光脂質はFluorImager SI システム（Molecular Dynamics, Sunnyvale,U.S.A.）により励起波長475nm、発光波長525nmで可視化した。
【００７５】
図1Bに示すように、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SM(+)細胞において検出されるC6-NBDを基質として蛍光ラベルしたC6-NBD-SMが検出されず、SMを合成せず、ＳＭ合成酵素活性のないことが分かる。
【実施例２】
【００７６】
FACS分析による形質膜の細胞表面側におけるSMの存在の有無の確認
（１）  lyseninは、ミミズから単離されたSM特異的な細胞溶解性抗体であり、SMに結合することにより、形質膜に孔を空けて、細胞を死滅させることが知られている（J.Biol.Chem.273,33787-33794(1998))。
【００７７】
また、形質膜の外側にSMを発現しているCHO細胞は、lysenin誘導性細胞死に感受性であること、及び、細胞表面のSM量が低減しているCHO細胞変異体LY-A及びLY-Bは、lyseninに耐性であることが報告されている（J.Biol.Chem.273,33787-33794(1998))。
【００７８】
本実施例（１）では、細胞死を誘導することなくSMに特異的に結合する変異体（非毒性）lysenin（J.Biol.Chem 278,22762-22770(2003)）を用いて、以下のようにして形質膜の細胞表面側の単分子層に局在するSMの存在を確認した。
【００７９】
両細胞を、100ng/mlのマルトース結合タンパク質に融合した非毒性lysenin(MBP-lysenin；RIKENの小林氏から供与)とともに氷上で30分間インキュベートした。
【００８０】
次いで、細胞を、1%FCS及び0.1%NaN3を添加した氷冷phosphate buffer saline(PBS)で洗浄し、ウサギ抗MBP抗血清（New England BioLabs,Berly,U.K.)とともに氷上で30分間インキュベートした。
【００８１】
細胞を再度洗浄した後、細胞をphycoerythrin(PE)-複合抗ウサギIgG（Sigma-Aldrich)とともに30分間インキュベートし、fluorescence-activating cell-sorter(FACS)calibur（BD Bioscience,San Jose,U.S.A.)を用いたFACS分析に供した。データ分析は、Cell Quest software(Becton Dickinson)により行った。
【００８２】
結果を図１Cに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理しない場合とlysenin処理した場合とで蛍光強度に差は認められなかった。一方、WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、蛍光強度が強くなった。このことから、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、形質膜の細胞表面側のSM量が著しく低減していることが分かる。
（２）  細胞を、20μg/ml propidium iodide(PI; Molecular Probes,Eugene,U.S.A.)の存在下で、500ng/mlのlyseninとともに室温で15分間インキュベートし、FACScalibur（BD Bioscience,San Jose,U.S.A.)を用いたFACS分析に供した。
【００８３】
なお、propidium iodideは、形質膜に孔が空いた死細胞に取り込まれることにより、これを染色する試薬である。
【００８４】
結果を図1Dに示す。WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、controlに較べてPIの取り込み量が増大した。一方、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理しても、PIの取り込み量はcontrolと同程度であった。このように、R19L/Fas-SM(-)細胞は、lyseninに耐性であることから、形質膜の細胞表面側のSM量が著しく低減していることが分かる。
【実施例３】
【００８５】
共焦点顕微鏡観察による形質膜の細胞表面側におけるSMの存在の有無の確認
形質膜の細胞表面側の単分子層に局在したSMを可視化するため、両細胞をpoly-L-lysineをコートしたスライドグラスの上に載せ、4%フォルムアミドで固定し、lysenine-MBPで４℃で45分間、次いで抗MBP抗体で処理した。さらにPE複合抗ウサギIgGモノクローナル抗体で染色した後、Zeiss LSM-5Pascalレーザースキャン共焦点顕微鏡（Carl Zeiss、ドイツ）を用いて細胞を観察した。
【００８６】
顕微鏡写真を図１Cに示す。WR19L/Fas-SM(+)細胞では、lysenin処理することにより、蛍光が観察された。このことから、WR19L/Fas-SM(+)細胞では、形質膜の細胞表面側にSMが存在していることが分かる。これに対して、WR19L/Fas-SM(-)細胞では、lysenin処理の有無に関わらず蛍光は観察されず、細胞表面のSM量が著しく低減していることが分かる。
【実施例４】
【００８７】
SMS-1 cDNAの発現クローニング
（１）  SMは、生体膜及びモデル膜中のコレステロールと強く相互作用すること、及び、SMは、細胞死及び細胞増殖のような細胞機能に関連した膜マイクロドメイン（lipid rafts)の形成に必要とされることが報告されている。また、SMレベルが低減したLY-A細胞はメチル−β−シクロデキストリン（MβCD)誘導性細胞死に感受性であることも報告されている（以上、J.Biol.Chem 275,34028-34034(2000)等)。
【００８８】
このように、SMは形質膜のコレステロールと強く結合しているため、MβCD誘導性細胞死に対して耐性を与えると考えられる。
【００８９】
本実施例では、以下のようにして、pantropic レトロヴィールストランスフェクションシステムを用いて、WR19L/SM(-)細胞をヒトHela細胞のcDNAライブラリーをトランスフェクトし、MβCD耐性の変異体を選択した。
【００９０】
即ち、vesicular stomatitis virus(VSV-G)のG 糖タンパク質を含むpantropic レトロヴィールス粒子を、ヒトHela cDNAレトロヴィールス発現ライブラリーキット及びGP2-293パッケージング細胞(BDBiosciences Clontech)を用いて調製した。
【００９１】
感染24時間後、WR19L/Fas-SM(-)細胞を、2%FBSを含むRPMI-1640培地中で終夜培養した。血清フリーRPMI-1640培地を用いて細胞を洗浄した後、細胞を1.5mM MβCDを含むRPMI-1640培地中で37℃で５分間インキュベートし、FBS濃度が最終5%になるように普通培地を補充し、次いで37℃で60時間培養した。
【００９２】
細胞を2%FBSを含むRPMI-1640培地に再播種して終夜培養し、適当濃度のMβCDで再び処理した。1.5mMのMβCD処理を２回、3mMのMβCD処理を２回、5mMのMβCD処理を２回行うことにより、WR19L/SM(-)細胞のMβCD耐性変異体を限界希釈により単離した。
【００９３】
pLIB発現ベクター特異的なプライマー（5'及び3'pLIBプライマー、BD Biosciences Clontech)を用いたPCRにより、MβCD耐性細胞のゲノム中に挿入された2.0kbのcDNAを増幅し、pGEM-T easy vector（Promega,Madison,WI,U.S.A.）にクローニングした。
【００９４】
MβCD耐性細胞（WR19L/Fas-SMS-1細胞）の上記2.0kbのcDNA中のSM合成酵素をコードしていると考えられる領域の塩基配列をＤＮＡシークエンサーを用いて決定し、それがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。
【００９５】
塩基配列及びアミノ酸配列を図2Aに示す。MβCD耐性細胞は、413アミノ酸をコードする1967bpのヒトcDNAをゲノム中に取り込んでいた。また、図2A中に示したstrile alpha モチーフ（SAM)領域配列及び膜貫通(TM)領域配列は、それぞれBLASTアルゴリズム及びSOSUIプログラムを用いて予測したものである。
【００９６】
また、Kyte&Doolittleの方法(J.Mol.Biol.157,105-132(1982))により解析されたSMS-1のアミノ酸配列のHydropathyプロットを図2Bに示す。SMS-1ペプチドは、推定48.6kDaの分子量を有している。また、BLASTアルゴリズム及びSOSUIプログラムから、SMS-1はN末端領域に1個のstrile alpha モチーフ（SAM)領域配列を有しており、4個の膜貫通(TM)領域配列を有することが分かる。
（２）  WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞から、それぞれ常法に従いDNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲル写真を図2Cに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞では、WR19L/Fas-SMS-1細胞に見られない２kbのバンドが検出されており、SMS-1 cDNAがWR19L/Fas-SM(-)細胞に導入されたことが確認された。
【実施例５】
【００９７】
MβCDに暴露された細胞の生存能力の測定
配列決定及びコンピューター分析の後、cDNAをpLIB発現ベクターにサブクローニングし、VSV-Gレトロヴィールス粒子を用いてWR19L/Fas-SA(-)細胞にトランスフェクトした。得られた細胞は、MβCD耐性細胞（WR19L/Fas-SMS-1細胞）を富化するために以下のようにして5mM MβCDで処理した。
【００９８】
即ち、1×106個のWR19L/Fas-SM(+)細胞、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞をそれぞれ洗浄し、血清フリーのRPMI-1640培地の1mlに懸濁し、適当濃度のMβCDで処理して、5%CO2中で37℃にて５分間インキュベートした。普通培養液を1ml添加した後、さらに細胞を12時間インキュベートした。細胞の生存数をWST-8を用いた細胞生存数キット（ナカライテスク）を用いて測定した。
【００９９】
結果を図2Dに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞にSMS-1 cDNAを導入したWR19L/Fas-SMS-1細胞では、MβCD誘導性細胞死に対する耐性を回復している。このことから、上記cDNAの導入によりSMが存在するようになったことが分かる。
【実施例６】
【０１００】
WR19L/Fas-SMS-1細胞のSM合成酵素活性測定
（１）  実施例１の（１）と同様にして、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞を、L-[14C]セリンとともにインキュベートした後、脂質を抽出してTLCに供した。結果を図3Aに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では [14 C]セリンでラベルしたSMが検出されており、SM合成が回復していることが分かる。
（２）  実施例１の（２）と同様にして、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞のlysateをC6-NBD-セラミド及びフォスファチジルコリンの存在下でインキュベートした後、TLCを行った。結果を図3Bに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では C6-NBD-SMが検出されており、SM合成が回復していることが分かる。
【０１０１】
以上の結果、SMS-1 cDNAは、哺乳動物細胞におけるSM合成に必須であることが分かる。
（３）  WR19L/Fas-SMS-1細胞を、20ｍM Tris HCl(pH7.4),2mM EDTA,10mM EGTA,1mM phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF)及び2.5μg/ml  leupeputinを含む氷冷バッファー中でホモジナイズした。細胞タンパク質の500μgを含むlysateを、10mM Tris HCl(pH7.5),1mM EDTA,20μM C6-NBD-セラミド、120μM の[N-メチル-14C]PC（比活性;57μCi/mmol)又は[メチル-14C]CDP-コリン（比活性;54μCi/mmol)を含む反応溶液に添加し、37℃で30分間インキュベートした。
【０１０２】
Bligh&Dyerの方法（J.Biol.Chem 264,19076-19080(1989)）で脂質を抽出し、TLCプレートにアプライし、クロロフォルム/メタノール/12mM MgCl2水溶液（65:25:4)を含む溶液で展開した。放射活性をBAS2000システムを用いて可視化した。
【０１０３】
結果を図3Cに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞では、セラミド及びPCの存在下でインキュベートした場合にSMが合成されており、フォスファチジルコリンのドナーとしてPCを用いることが分かる。
【０１０４】
Biochemistry 21,2753-2759(1982)によれば、SM合成酵素はフォスフォコリンのドナーとしてフォスファチジルコリンを用いることが記載されており、上記結果は、SMS-1 cDNAがSM合成酵素をコードするものであることを裏付けている。
【実施例７】
【０１０５】
WR19L/Fas-SMS-1細胞の生存に対するlyseninの影響
７×105個のWR19L/Fas-SMS-1細胞を洗浄し、プレウオームしたPBS中に再懸濁し、0,100,500及び1000ng/mlのlyseninで処理し、5%CO2の中で37℃で１時間インキュベートした。FBSの添加後、生細胞数を0.25%トリパンブルーを用いてdye exclusion法でカウントした。
【０１０６】
結果を図4Aに示す。WR19L/Fas-SMS-1細胞の生存数は、lysenin濃度依存的に減少している。このことから、SMS-1 cDNAの過剰発現により形質膜中のSM量が増大することが分かる。
【実施例８】
【０１０７】
SMS-1 cDNAの細胞生存に与える影響
WR19L/Fas-SM(+)細胞、WR19L/Fas-SM(-)細胞及びWR19L/Fas-SMS-1細胞をそれぞれ、血清フリーの培養液中で48時間培養した後、生細胞数を0.25%トリパンブルーを用いてdye exclusion法でカウントした。
【０１０８】
結果を図4Bに示す。WR19L/Fas-SM(-)細胞は増殖が抑制されているが、WR19L/Fas-SMS-1細胞はWR19L/Fas-SM(+)細胞と同程度に増殖している。このことから、SM合成酵素は細胞増殖に必須であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】A及びBは、WR19/Fas-SM(-)細胞及びWR19/Fas-SM(+)細胞の脂質のTLCパターンを示す図である。C及びDは、WR19/Fas-SM(-)細胞及びWR19/Fas-SM(+)細胞の表面のSMの有無を示す図である。
【図２】Aは、SMS-1 cDNAの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を示す図である。Bは、SMS-1ペプチドのHydropathyを示す図である。Cは、WR19/Fas-SM(-)細胞及びWR19/Fas-SMS-1細胞のゲノム中におけるSMS-1 cDNAの有無を示す図である。Dは、WR19/Fas-SMS-1細胞がMβCDに対する耐性を獲得したことを示す図である。
【図３】A及びBは、WR19/Fas-SMS-1細胞がSM合成活性を有することを示す図である。Cは、SMS-1 cDNAがフォスフォコリンのドナーとしてフォスファチジルコリンを用いていることを示す図である。
【図４】Aは、WR19/Fas-SMS-1細胞がSMを過剰発現していることを示す図である。Bは、WR19/Fas-SMS-1細胞がWR19/Fas-(+)細胞と同程度に増殖することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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