(57)【要約】【課題】任意のタンパク質をよりミクロなレベルで配列させる技術を提供する。【解決手段】融合タンパク質２は、自己会合ドメイン４と任意の生理活性を有するタンパク質に相当する他のドメイン６とを備えている。自己会合ドメイン４が自己会合することを利用して、融合タンパク質２に一定の会合状態を付与した会合体１０を形成させることで、融合タンパク質２中の他のドメイン６にも一定の配列を付与することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己会合ドメインと、
該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、
を備える、融合タンパク質。
【請求項２】
前記自己会合ドメインはアミロイドタンパク質の自己会合ドメインの少なくとも一部を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記自己会合ドメインは配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記自己会合ドメインは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
タンパク質の会合体であって、
１種あるいは２種以上の融合タンパク質が会合されており、
各該融合タンパク質は、
自己会合ドメインと、
該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、
を備えている、会合体。
【請求項６】
前記自己会合ドメインはアミロイドタンパク質の自己会合ドメインの少なくとも一部を有する、請求項５に記載の会合体。
【請求項７】
前記自己会合ドメインは配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の会合体。
【請求項８】
前記自己会合ドメインは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の会合体。
【請求項９】
前記会合体は繊維状である、請求項５〜８のいずれかに記載の会合体。
【請求項１０】
タンパク質会合体の製造方法であって、
自己会合ドメインと、該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、を備えている１種あるいは２種以上の融合タンパク質を含有する溶液に対して、該融合タンパク質が会合する程度に外力を付与する工程と、
前記溶液中の前記融合タンパク質の会合体を回収する工程と、
を備える、製造方法。
【請求項１１】
前記外力付与工程は、前記１種あるいは２種以上の融合タンパク質を含有する溶液を充填した容器を所定の軌道で回転させる工程である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
タンパク質複合材料であって、
請求項５〜９のいずれかに記載の会合体を有する、複合材料。
【請求項１３】
前記会合体は、担体材料に保持されている、請求項１２記載の複合材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合タンパク質及びその会合体、並びにタンパク質会合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、特に、酵素は生体内の化学反応を触媒する機能分子であるが、基質に対する特異性により効率的な化学反応を担っている。この酵素を工業的に利用する試みは古くから行われ、実用化された例もある。しかしながら、これまでの試みは、各酵素あるいはタンパク質を単独で利用するものであって、複数の酵素を同時に利用する試みは多くはない。一方、生体内では複数の関連ある酵素あるいはタンパク質が複合体を形成することにより、それぞれが単独で機能するよりも効率的にあるいは新たな機能を発現していることが知られている。
【０００３】
複数の酵素を遺伝子工学的に連結して、複数の機能を有する巨大タンパク質を一つのポリペプチドとして生産する試みがある（特許文献１）。この手法によると、タンパク質の巨大化が避けられず、しかも巨大タンパク質の生産が困難であることから、有効に機能するタンパク質を生産するのは困難であった。また、個々の酵素を担体に固定化し、これら担体をカラムに対して合目的的に充填して個々の酵素に基づく複数の機能を単一のカラム内で発現させるリアクターを構築し、生体内におけるのと同等の機能を発現させようとの試みがある（非特許文献１、２，３）。この手法では、個々のタンパク質を担体に担持させて配置するものであるため、生体内のタンパク質の配置を極めてマクロなレベルで近似しているに過ぎず、生体機能に到底到達していない。
【特許文献１】特開２００４−１６１１７号
【非特許文献１】Stempfer G, Holl-NeugebauerB, Rudolph R. Improved refolding of an immobilized fusion protein.NatBiotechnol.1996 Mar;14(3):329-34.
【非特許文献２】Altamirano MM, GolbikR, Zahn R, Buckle AM, FershtAR.Related Articles,LinksRefolding chromatography with immobilized mini-chaperones.Proc Natl Acad Sci USA,1997 Apr 15;94(8):3576-8.
【非特許文献３】Tsumoto K, UmetsuM, Yamada H, Ito T, Misawa S, Kumagai I.Immobilized oxidoreductase as an additive for refolding inclusion bodies:applicationto antibody fragments. Protein Eng.2003 Jul;16(7):535-41.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、これまでタンパク質を目的に集合させて、生体機能を近似させる試みは行われているものの、十分な結果は得られていない。また、タンパク質を機能的に配置する新たな手法も確立されていない。
【０００５】
そこで、本発明は、任意のタンパク質をよりミクロなレベルで配列させる技術を提供することを目的とする。具体的には、自己会合可能な融合タンパク質および自己会合よって会合されたタンパク質会合体並びにその会合体の製造方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明の他の一つの目的は、自己会合したタンパク質会合体を有する複合材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、生体内で自己会合して線維状等に集積するタンパク質であるアミロイドタンパク質に着目し、あるアミロイドタンパク質をインビトロで人工的に会合させ線維状に集積させる手法に関する知見を得、さらに、この自己会合に着目してアミロイドタンパク質の自己会合部位を配列制御部位として使用して、この自己会合部位と他の機能あるタンパク質とを結合することにより、この他のタンパク質を自己会合部位によって構築される会合ないしは集積状態に基づいて配列させることができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明は、自己会合ドメインと、該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、を備える、融合タンパク質を提供する。この発明の好ましい態様によれば、上記自己会合ドメインはアミロイドタンパク質の自己会合ドメインの少なくとも一部を有する融合タンパク質が提供される。さらに、他の好ましい態様によれば、上記自己会合ドメインは配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する融合タンパク質が提供され、さらにまた、自己会合ドメインは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質も提供される。
【０００８】
また、本発明は、タンパク質の会合体であって、１種あるいは２種以上の融合タンパク質が会合されており、各該融合タンパク質は、自己会合ドメインと、該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、を備えている、会合体を提供する。この発明の好ましい態様によれば、上記自己会合ドメインはアミロイドタンパク質の自己会合ドメインの少なくとも一部を有する、会合体が提供される。また、他の態様によれば、上記自己会合ドメインは配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する、会合体が提供され、さらにまた、上記自己会合ドメインは配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する、会合体が提供される。さらに、これらの会合体において、繊維状である会合体も提供される。
【０００９】
さらに、本発明は、タンパク質会合体の製造方法であって、自己会合ドメインと、該自己会合ドメイン以外の他のドメインと、を備えている１種あるいは２種以上の融合タンパク質を含有する溶液に対して、該融合タンパク質が会合する程度に外力を付与する工程と、前記溶液中の前記融合タンパク質の会合体を回収する工程と、を備える、製造方法が提供される。この発明の好ましい態様によれば、上記外力付与工程は、前記１種あるいは２種以上の融合タンパク質を含有する溶液を充填した容器を所定の軌道で回転させる工程である、製造方法が提供される。
【００１０】
さらにまた、本発明によれば、タンパク質複合材料であって、上記したいずれかのタンパク質会合体を有する複合材料が提供される。この発明の好ましい態様によれば、上記会合体は、担体材料に保持されている、複合材料が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施する形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の融合タンパク質２は、図１に例示するように、自己会合ドメイン４と任意の生理活性を有するタンパク質に相当する他のドメイン６とを備えている。自己会合ドメイン４が自己会合することを利用して、融合タンパク質２に一定の会合状態を付与した会合体１０を形成させることで、融合タンパク質２中の他のドメイン６にも一定の配列を付与することができるようになる。同時に、他のドメイン６に相当する任意のタンパク質を、従来よりも小さいスケールレベルで配列させることが可能となる。また、配列させることで従来にない新たな機能の発現や相乗的機能の発現が期待される。
【００１３】
また、この手法によれば、従来タンパク質を固定していたビーズや繊維などの担体を要することもなく、ナノサイズのタンパク質の機能性ユニット（粒子）を構築することが可能となる。ナノサイズレベルでタンパク質分子が配列されているため、他のナノサイズ材料との複合化も容易になる。さらにまた、このユニットは、生体成分、すなわち、アミノ酸で構築されるため、易分解性ももたらされる。さらに、この機能性ユニットは、自己会合ドメインが共有結合以外の分子間相互作用によって会合されて形成されているため、非共有結合性の会合体であるため、会合及び脱会合を人為的に制御等することが容易となっている。
【００１４】
本発明は、このような融合タンパク質、その会合体、さらにこれら会合体を含むタンパク質複合材料、ならびにこれらの製造方法も併せて提供する。以下、順にこれらを説明する。
【００１５】
（融合タンパク質）
（第１のドメイン−会合ドメイン）
本明細書において、「自己会合」とは、少なくとも互いに会合する部位を有する２分子以上が共有結合以外の分子間相互作用によって結合し、１個の分子のように行動することを意味している。共有結合以外の分子間相互作用（以下、非共有結合性分子間相互作用という。）とは、例えば、水素結合、疎水結合、イオン結合等が挙げられる。また、「自己会合」とは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるものとインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）におけるものとの双方を含む。
【００１６】
自己会合ドメインは、少なくともインビトロにおいては、人為的に何らかの作用を付与することで会合可能なドメインである。自己会合ドメインは、例えば、生体内において、当該自己会合ドメインが含まれるタンパク質分子の自己会合を担っているとされるドメインである。かかる自己会合ドメインとしては、生体内においてアミロイドとして蓄積するアミロイドタンパク質の自己会合ドメインを用いることができる。かかるアミロイドタンパク質としては、メディン（ｍｅｄｉｎ）（配列番号１）、アミロイドＡβ４０（配列番号２）、アミロイドＡβ４２（配列番号３）、ＣｏｌｄｓｈｏｃｋＢ由来ペプチド（配列番号４、５および６）、トランスサイレチン由来タンパク質（配列番号７）、トランスサイレチン由来ペプチド（配列番号８および９）、β２ミクログロブリン由来ペプチド（配列番号１０および１１）、プリオン由来のペプチド（配列番号１２、１３および１４）を挙げることができる。これらのアミロイドタンパク質はいずれもそのＣ末端側に自己会合ドメインを有している。アミロイドタンパク質は、剛直で枝分かれのない繊維であるため、アミロイドタンパク質の自己会合部位を本発明の自己会合ドメインとして用いることにより、他のドメインを連結しても、互いの会合形成に影響せずに本来の会合状態を形成できる。この結果、他のドメインに相当するタンパク質は有効に機能を発現できる。
【００１７】
なかでも、自己会合ドメインとしては、ｍｅｄｉｎのＣ末端側ドメインを用いることが好ましい。具体的には、少なくとも配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるドメインとすることが好ましい。また、インビトロにて会合可能である限り、この配列において、１あるいは２以上のアミノ酸が付加、欠失、挿入、及び／又は置換されていてもよい。より好ましくは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、他のアミノ酸が付加された形態である。好適な会合ドメインのアミノ酸配列の一例として、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を挙げることができる。なお、自己会合ドメインには、自己会合に必須のアミノ酸配列の他、当該必須アミノ酸配列に対して会合可能な立体構造を付与しあるいはそのような立体構造の形成を阻害しない他のアミノ酸配列を含めることができる。
【００１８】
自己会合ドメインは、種類にもよるが、本融合タンパク質のＮ末端側あるいはＣ末端側に備えられていることが好ましい。生体内にあって会合状態にある分子における自己会合部位がＣ末端側に存在しており、本融合タンパク質が、このような自己会合部位に基づく自己会合ドメインを備える場合であっても、当該自己会合ドメインをＮ末端側に備えることができる。なお、自己会合ドメインは、単一の融合タンパク質においては必ずしも一つである必要はなく、二つ以上の会合ドメインを有することもできる。二つ以上の会合ドメインが存在する場合には、同時に二つ以上の会合ドメインが機能する必要はない。
（第２のドメイン−他のドメイン）
本発明の融合タンパク質は、会合ドメインと他のドメインとを有している。当該他のドメインは、特に限定しないが任意の活性を有するタンパク質あるいはその一部（活性部位）とすることができる。他のドメインに相当するタンパク質としては、抗体、ホルモン、サイトカイン、成長因子、阻害因子、酵素、蛍光などの発色体、抗菌剤、膜タンパク質、各種化合物の受容体、吸着活性体、などの各種の活性を備えるタンパク質を包含している。これらのタンパク質は、工業用、治療用、診断用、医薬用、農業材料に適用されうる。これらのタンパク質の由来は特に限定されないで、天然由来のアミノ酸配列からなるものの他、これらに対し人為的に挿入、欠失、置換等が行われたものであってもよいし、非天然アミノ酸を含むこともできるし、適宜修飾がおこなわれていてもよい。
【００１９】
なお、他のドメインは、単一の融合タンパク質においては必ずしも一つである必要はなく、二つ以上の他のドメインを有することもできる。これらは直接にあるいはリンカーを会して結合させることもできるし、二つ以上の会合ドメインと組み合わせて、会合ドメイン−他のドメイン−会合ドメイン−他のドメイン等のように両ドメインを交互に組み合わせることも可能である。二つ以上の他のドメインが存在する場合には、同時に二つ以上の他のドメインが機能する必要はない。
【００２０】
当該他のドメインは、会合ドメインに対してリンカーを介して接続されていてもよい。適切なリンカーが会合ドメインと他のドメインとの間に存在されることで、これら２個のドメインが互いに他のドメインの機能を損なわないように構成することができる。このようなリンカーとしては、融合タンパク質を作製するのに一般的に用いられる従来公知の各種のリンカーを用いることができる。また、プロテアーゼによる分解部位を備えるリンカーを用いることもできる。例えば、配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるリンカーは好適な一例である。このリンカーにおいては、適度な長さを備える他、ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（エンテロキナーゼ）による切断部位を有するため、会合させて得られた融合タンパク質の会合体をエンテロキナーゼで処理して、会合ドメインから他ドメインを分離することができる。リンカーが選択的切断部位を備えることで、一体構築した会合体の形態を変化させることができる他、会合ドメインと他のドメインとを互いに分離精製することも可能となる。
【００２１】
（融合タンパク質の作製）
このような融合タンパク質は、従来公知の各種方法により作製することができ、化学合成によっても取得可能であるが、好ましくは、遺伝子操作によって得られるタンパク質産生細胞を培養することにより取得する。融合タンパク質の構成要素（自己会合ドメイン及び他のドメイン）をそれぞれ培養生産した後に、化学合成的にこれらを結合することも可能ではあるが、融合タンパク質の全長をコードするＤＮＡを、当該ＤＮＡを発現可能に保持するベクター等の遺伝子導入用ＤＮＡ構築物を適当な細胞に導入し、形質転換して、培養することにより、産生させることが好ましい。
【００２２】
融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物としては、自己会合ドメイン及び他のドメインとをコードするＤＮＡ配列を有し、必要に応じて、これらのドメインを連結するリンカーをコードするＤＮＡ配列やその他のＤＮＡ配列を有することができる。さらに、このＤＮＡ構築物には、融合タンパク質の構成要素に対応するＤＮＡ配列に加えて、ホスト細胞の種類に応じた分泌シグナル遺伝子を備えることもできる。また、ＤＮＡ構築物それ自体が発現ベクターである場合には、融合タンパク質をコードするＤＮＡをホスト細胞内で有効に発現させるためのＤＮＡ配列を同時に備えることもできる。具体的には、ポリペプチドをコードする配列の上流に配置されるプロモーター配列、コード配列の下流に配置されるターミネション配列、ポリアデニレーションシグナルである。プロモーター配列としては、特に限定しないで、ホスト細胞で当該コード配列を発現可能なものを使用すればよいが、必要に応じて各種プロモーター配列を使用しうる。さらに、エンハンサーも含めることもできる。さらに、当該ＤＮＡ配列を保有する細胞を選択するためのマーカー遺伝子も同時に導入されることが好ましい。選択マーカー遺伝子のＤＮＡ配列はこのＤＮＡ構築物に直接連結してもよいし、同時トランスフェクションによってホスト細胞に導入してもよい。
【００２３】
このようなＤＮＡ構築物は、用いようとするホスト細胞に適した各種ベクターに組み込まれて保持されていてもよい。かかるベクターは、ＤＮＡ構築物の好ましい形態であり、本融合タンパク質のための発現ベクターを構成する。ベクターは、ホスト細胞や遺伝子導入法の種類に応じて適切なものが選択される。一般的には、各種プラスミドベクター、ウイルス性ベクター、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＭＡＣ等を使用できる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
【００２４】
一旦、ＤＮＡ構築物あるいはベクターが構築されたら、適当なホスト細胞に、トランスフォーメーションや、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物を導入後、そのホスト細胞は、選択培地で培養され、さらに選択された形質転換細胞を培養し増殖させて、培養液および／または菌体から本融合タンパク質を分離精製する。
【００２５】
（融合タンパク質の会合体）
本融合タンパク質は、所定条件を付与することで会合して会合体を構成する。会合体は、通常、多数の融合タンパク質が会合することで、会合ドメインの有する会合形式に依存した特有の形態を示すようになる。例えば、自己会合ドメインが生体内タンパク質の自己会合部位であって当該生体内タンパク質が生体内で会合するときの形態が繊維状であるならば、繊維状となる。したがって、会合体の形態は、線維状、球状、針状等の各種の形態を採ることができる。会合体の大きさは、通常、最大寸法で１０ｎｍ以上１０μｍｎｍ以下であることが好ましく、好ましくは１００ｎｍ以上６００ｎｍ以下である。
【００２６】
会合体においては、自己会合ドメインは、非共有結合性分子間相互作用により結合している。他のドメインについて、そのような非共有結合性分子間相互作用を意図する必要はないが、非共有結合性分子間相互作用の存在を否定するものではない。会合ドメインによって会合体が構成され、他のドメインが相互に近接することで他のドメイン間に非共有結合性の分子間相互作用が生じることもある。
【００２７】
会合体を構成する個々の融合タンパク質は、その会合ドメインが互いに会合可能である限り同一である必要はない。単一の会合形態を構成可能な同一あるいは類似の会合ドメインを用いることもできるし、２種類以上の会合ドメインをそれぞれの融合タンパク質に用いて、最終的に得られる会合形態を設計することも可能である。また、個々の融合タンパク質における他のドメインも同一である必要はない。２種類以上の他のドメインを組み合わせることも可能である。異なる他のドメインが直接会合する一対の会合ドメインにより隣接されることにより、あるいは複数の会合ドメイン対を介して近接されることにより、新たな機能の発現や相乗的な機能の発現が期待される。また、酵素機能を発現する会合体を構築する場合において、会合体の形態確認のために、蛍光タンパク質を他のドメインとして備える融合タンパク質をマーカーとして用いることもできる。
【００２８】
また、会合体を構成する個々の融合タンパク質は、会合ドメインと他のドメインとの間に介在されるリンカーを含んでいてもいなくてもよいが、当該リンカーを備える場合、リンカーの種類を選択することで、会合体を構築後において、会合体を改変することが可能となる。例えば、酵素等によって選択的に切断可能なリンカーを１種類あるいは２種類以上を組み合わせて用いることで、必要に応じ、適時にかつ所望の他のドメインを会合体から分離させることができる。こうすることで、会合体の形態の他、分子量、他のドメインの組成や含有量、配列間隔等も改変できるようになる。一方、他のドメインを回収することも可能となる。
【００２９】
会合体には、融合タンパク質以外の他のポリペプチドを含むことができる。例えば、会合ドメインを備えるが、他の機能性タンパク質を構成する他のドメインを有していないポリペプチドを含んでいてもよい。このようなポリペプチドを用いることで、会合体における融合タンパク質の含有量、換言すれば他のドメインの含有量を調整することができる。また、会合体における他のドメインの配列間隔や分布も調整することができる。なお、このような調整的ポリペプチドとしては、既に述べたように、会合体形成後に選択的に切断可能なリンカーを介して他のドメインを有する融合タンパク質を用いることもできるし、他のドメインの機能を妨げない限り（例えば、立体障害などが少ない）、他のペプチド鎖を備えるものを用いることができる。さらにまた、立体障害の大きな他のペプチド鎖を備えるものを用いることで、会合ドメインの会合を阻止するブロック剤として機能させ、会合体の大きさ等を調整することもできる。
【００３０】
このような会合体は、構成要素である融合タンパク質が備える他のドメインの機能に応じ、各種の機能を発現するユニット（粒子）を構成する。したがって、例えば、会合体は、１種あるいは２種以上の他のドメインタンパク質を備えるユニットとして、触媒機能を発現する酵素ユニット、抗菌性などを発現する薬剤ユニット、膜タンパク質ユニット、抗体ユニット等として機能する。会合体は、会合ドメインの種類により繊維状、球状等の各種の形態を備えることができるため、会合ドメインの選択により所望の形態を付与させることができる。会合体に対しては、酵素あるいは化学的手段により、部分的にペプチド鎖を除去したり、あるいは付加したりすることが可能であり、官能基や化合物による修飾も可能である。また、１種あるいは２種以上の会合体をさらに会合させることにより、高次の会合体を得ることができる。なお、この場合、必ずしも明確に一定形状を呈するまでには至っていない小さい会合体を、高次会合体を得るための要素として用いることができる。
【００３１】
例えば、ｍｅｄｉｎのＣ末端側の会合ドメインあるいは配列番号１５（好ましくは配列番号１６）に記載のアミノ酸配列を有するペプチド鎖を自己会合ドメインとして備え、アミノ酸残基数が５０〜１００程度の他のドメインとを備える融合タンパク質を構成要素とする会合体は、直鎖繊維状形態を有し、直径は通常、約５ｎｍ以上約２０ｎｍ以下であり、好ましくは、５ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。長さは、通常、１０ｎｍ以上１０μｍ以下であり、好ましくは１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、この会合体は、アミノ酸残基数が１０〜１００程度のリンカーを備えることができる。
（会合体の作製方法）
本発明の会合体は、融合タンパク質を含む溶液に所定条件下において会合を生じさせることによって当該会合系中に生成させることができる。さらに、かかる会合系から会合体を回収することにより本発明の会合体を得ることができる。
【００３２】
本発明の会合体は、融合タンパク質、あるいは融合タンパク質と上記したその他の構成要素を所定の溶媒に溶解した溶液を調製し、この溶液に対して、会合を誘起させることにより行われる。融合タンパク質溶液における条件は、会合ドメインの種類等によって相違する。例えば、融合タンパク質の濃度条件、溶媒の種類、ｐＨ、塩濃度などの液性条件、温度条件が考慮される。例えば、融合タンパク質の濃度は、当該タンパク質が溶解していればよいが、約０．１ｍｇ／ｍｌ以上約２０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。０．１ｍｇ／ｍｌ未満であると会合体形成にかかる時間が長くなり現実的ではなく、２０ｍｇ／ｍｌを超えると非特異的な凝集体が形成されやすくなりまた塩析によって析出されやすくなるからである。より好ましくは、約１．５ｍｇ／ｍｌ以上約５ｍｇ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌである。
【００３３】
また、溶媒としては、融合タンパク質が付加逆的に変性せず溶解可能なものを用いることができるが、水を主体とすることが好ましく、より好ましくは水のみを用いる。ｐＨも、付加逆的変性を生じない範囲であって、ｐＨ約２〜約１１とすることができるが、約４〜約９であることが好ましい。より好ましくは約４以上約７以下である。塩濃度は、１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下とすることが好ましい。１０ｍＭ未満であるとタンパク質が不安定となり、１００ｍＭを超えると非特異的な結合が形成されやすくなり、また塩析によって析出されやすくなるからである。
【００３４】
温度条件は、４℃以上５０℃以下とすることが好ましい。４℃未満であるとタンパク質が凍結する可能性があり、５０℃を超えるとタンパク質が熱変性するからである。溶解の方法は融合タンパク質が適当な量の溶媒に完全に溶解する方法であれば特に制限はない。
【００３５】
このような融合タンパク質含有溶液に対して会合を誘起させる方法は、特に限定しないが、例えば、融合タンパク質溶液に対して外力を付与して、溶液自体やその内部において変位や対流を生じさせることにより、会合を誘起させることができる。外力付与手法としては、特に限定しないが、融合タンパク質溶液が注入された容器を一定の軌道を回転（周回）させたり、自転させたり、振とう、揺動させたりなどのように動かすことの他、容器中の融合タンパク質溶液を攪拌子や超音波などによって攪拌してもよい。装置としては、例えば、回転培養機や振とう機、攪拌機を用いることができる。容器を、融合タンパク質溶液が強制的に循環可能な形態とすることにより融合タンパク質溶液を攪拌することもできる。
【００３６】
これらの外力付与手法を用いたときの条件は、例えば、周回軌道の大きさ、周回速度、自転速度、振とう時間（回数）や振とう強度、攪拌回数（時間）や攪拌強度等は、融合タンパク質が会合する限り特に制限しない。好ましい外力付与手法としては、融合タンパク質溶液の入った容器を、一定の軌道で回転（周回）させる方法である。この方法を用いる場合、所定の大きさの円盤などの回転体の一部に融合タンパク質溶液が注入された容器を取り付けて、当該円盤を一定の回転数で回転させることなどが挙げられる。この軌道は、半径が５ｃｍ〜３０ｃｍ程度の円形軌道であることが好ましく、回転数を２ｒｐｍ〜１００ｒｐｍとすることが好ましい。
【００３７】
この他、融合タンパク質を会合させるには、一般的にタンパク質の結晶化を誘起する物質を添加することによっても可能である。例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、ギ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウムセチルトリメチルアンモニウム塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機塩類；ＰＥＧ１００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ１００００などのポリエチレングリコール類；アセトニトリル、アセトン、イソプロパノール、エタノール、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ブタノール、１，３-ブチロラクトン、１，３-プロパンジオール、２，５-ヘキサンジオール、メタノール、２-メチル-２，４-ペンタンジオール等の有機溶媒を挙げることができる。凝集媒体の添加方法としては、一般的にタンパク質の結晶化に用いられる添加方法を採用することができる。
【００３８】
融合タンパク質含有溶液中において生成した会合体は、通常、当該溶液の溶媒に不溶となり不溶画分を構成する。したがって、会合体は溶液から不溶画分を分取・回収する従来公知の方法により分画することができる。分画の方法としては、遠心分離法、クロマトグラフィー法、フィルター濾過法等を用いることができる。本発明においては、未会合の遊離の融合タンパク質やその他のポリペプチドを除去できる方法を採用することが好ましい。これらの未会合成分は、会合系の可溶性画分に存在するため、所定の分画後、不溶画分を水等により洗浄することで容易に除去することができる。必要に応じて、クロマトグラフィーや電気泳動等により精製することも可能である。
【００３９】
会合体が作製されたか否かの確認は、例えば、原子間力顕微鏡などの顕微鏡観察、円偏光二色性分析などの偏光分析等にて確認することができる。あるいは、会合体の形成を他のドメインの少なくとも一部に蛍光発色性のタンパク質を用いることで容易に視認できる。会合体のサイズ、サイズ分布、電気泳動度、立体構造等は必要に応じて測定することができる。
【００４０】
（タンパク質複合材料）
このように形成された１種あるいは２種以上の会合体を備える複合材料とすることもできる。複合材料には、１種あるいは２種以上の会合体を用いることができる。複合材料は、例えば、会合体を他の材料と混合した混合形態、他の材料と混合して成形された形態、あるいは従来公知の担体材料と混合した形態、又は当該担体に吸着等により保持させた形態を備えることができる。会合体の形態にもよるが、例えば、会合体を他のタンパク質と混合した混合粉末、会合体を糖類などとともに顆粒状あるいは粒状に成形した複合体、あるいは、繊維と複合化したメッシュ状等のシート状体、高分子材料や多孔質無機材料の表面や細孔に会合体を吸着あるいは充填等した形態を採ることができる。このような複合材料は、機能を発現するタンパク質が分子レベルで配列されているため、従来にない新たな機能や高効率での機能実現が期待される。
【００４１】
以下、本発明の実施例について具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００４２】
本実施例では、アミロイド形成タンパク質の一つであるヒトｍｅｄｉｎタンパク質のＣ末端領域とＹＦＰとを連結した融合タンパク質を大量調製した。
（１）Ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ融合タンパク質の調製
Ｍｅｄｉｎの自己会合ドメインを含む領域のアミノ酸配列（配列番号１７、対応するＤＮＡ配列は配列番号１８である）と、リンカーのアミノ酸配列（配列番号１９、対応するＤＮＡ配列は配列番号２０である）と、ＹＦＰのアミノ酸配列（配列番号２１、対応するＤＮＡ配列は配列番号２２である）とを有する融合タンパク質（配列番号２３）をコードするＤＮＡ（配列番号２４）を合成した（なお、発現産物としての融合タンパク質においては、Ｎ末端のメチオニン残基は外れる。）。この合成ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２２ｂ（+）ベクターのＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩサイト間に挿入してｐＥＴ−Ｆ２Ｌ−ＹＦＰとした。ｐＥＴ−Ｆ２Ｌ−ＹＦＰベクターを、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）を形質転換した。ＬＢ−アンピシリンプレートから単コロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ液体培地にて３７℃で１６時間培養した。前培養の全量を１ＬのＬＢ液体培地に植菌して３７℃で２時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えて１６℃で１６時間培養した。培養菌体を８０００ｇで１５分間遠心し、得られた沈殿に１００ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて超音波破砕した。破砕液を２００００ｇで３０分間遠心し、上清を分取した。
【００４３】
（２）Ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰタンパク質の精製
上記（１）で分取した上清を、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析した。その後、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ベッドボリューム１５ｍｌ）のオープンカラムに供し、非吸着画分を分取した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析した。同緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＳＰ（ファルマシア製、べッドボリューム５ｍｌ）に供した。塩緩衝液（Ａ液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、Ｂ液：１．５Ｍの塩化ナトリウムを加えたもの）でグラジエント溶出した。Ｂ液０−１００％（０−１．５Ｍ塩化ナトリウム濃度）で溶出された一部の吸着画分（３８０ｎｍ吸収極大部分）を精製Ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰとした（図２）。精製純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、図３の右側のレーンに示すように、太い単一のバンドを有しており、高度に精製されたことが確認できた。
【００４４】
（３）ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰの線維化
１ｍｇ／ｍｌ ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰの１００ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．０）となるように調製したタンパク質溶液を準備し、このタンパク質溶液１ｍｌを１．５ｍｌのマイクロチューブに入れたものを１２本準備した。半径２０ｃｍの円盤の外周にほぼ垂直にマイクロチューブを固定し、３７℃、８ｒｐｍで回転させた。回転開始後０時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間後にタンパク質溶液を回収し、原子間力顕微鏡測定用試料及び円偏光二色性分析用試料とした。同時に、ネガティブコントロールとして回転せずに３７℃で静置したタンパク質溶液についても上記と同様の経過時間においてタンパク質溶液を回収した。タンパク質溶液は、当初、溶液全体が黄色く発色する透明の液体の状態を呈していたが、回転したタンパク質溶液は６時間経過後には黄色く発色する凝集体が沈殿し（図４（ａ）、静置したコントロール溶液の外観に変化はなく、２４時間経過後においても、溶液全体が黄色く発色する透明の液体の状態であった（図４（ｂ）。なお、回転したタンパク質溶液及びコントロールのタンパク質溶液の各経過時間サンプルについて、原子間力顕微鏡測定及び円偏光二色性分析のための試料調製に供した。
【００４５】
（４）原子間力顕微鏡分析
上記（３）で調製した各時間経過後のタンパク質溶液１０μｌを水で１００倍希釈し、マイカ基板上に希釈液５μｌを載せ、陰圧にしたデシケーター内でサンプルを乾燥させた後、２０μｌの水をマイカ基板上に添加し、キムワイプ（商品名）で水を吸い取った。同様の操作を３回繰り返した後、陰圧デシケータ内でサンプルを乾燥して原子間力顕微鏡測定用試料とした。原子間力顕微鏡はセイコ−インスツルーメント社製 ＳＰＡ４００を用い、タッピングモードで測定した。結果を図５に示す。図５に示すように、回転サンプルにおいては、３時間経過後に短い線維が観察され、６時間経過後以降には明らかに多数のアミロイド様線維が観察された。画像解析により、当該線維は、直径約８ｎｍの分岐のない直鎖状の線維であることがわかった。一方、コントロールにおいては、いずれの経過時間においても線維は観察されなかった。これらの結果は、上記（３）における目視による外観変化が融合タンパク質の会合及び線維化に起因するものであることを支持している。
【００４６】
（５）円偏光二色性分析
上記（３）において回転サンプル及びコントロールの各サンプル４５０μｌを光路２ｍｍの石英セルにいれ、２５０ｎｍ−２００ｎｍの円偏光二色性（ＣＤ）を測定した。結果を図６に示す。図６（ａ）は、回転サンプルであり、図６（ｂ）は、コントロールである。図６（ａ）に示すように、回転サンプルにおいては、０時間サンプルでのＣＤスペクトルは、２１５ｎｍにおいて大きな負の吸収極大を有するＹＦＰそのもののＣＤスペクトルを示したが、６時間経過後以降のＣＤスペクトルは、２１８ｎｍに吸収極大を有するβシート構造に特有の構造に変化したことを示していた。これに対し、図６（ｂ）に示すように、コントロールのＣＤスペクトルは、０時間コントロールと同一のＣＤスペクトルを呈した。以上のことから、回転サンプルにおいては、回転開始後６時間経過後時点の近傍において、均一溶液状態からβシート構造への転換が生じたことが明らかであった。これらの結果は、上記（３）における目視による外観変化が融合タンパク質の会合及び線維化に起因するものであることを支持している。
【００４７】
（６）蛍光スペクトル分析 ［１］
上記（３）の回転サンプルのうち線維が観察されたサンプルを遠心分離し、上清を捨てさらに可溶性画分が残留しないように３回洗浄することにより、可溶性のｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ又は切断されたＹＦＰ断片を除去した線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰを回収した。この線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１．５ｍｌを加えた線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ液及びコントロール各１００μｌを光路長１ｃｍの石英セルに入れ、ＹＦＰの励起波長である５１２ｎｍで２５０ｎｍ−７００ｎｍの蛍光を測定した。結果を図７に示す。図７に示すように、線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ（図６において実線で示す。）及びコントロール（図７において点線で示す。）は、いずれも、ＹＦＰに特徴的な５３０ｎｍ付近での極大を有する蛍光スペクトルを示した。このことは、ＹＦＰが線維化した状態においても、ＹＦＰ本来の構造を維持していることを支持している。
【００４８】
蛍光スペクトル分析  ［２］
上記［１］と同様にして線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ液及びコントロールに対して、励起波長３１２ｎｍを照射したときの蛍光スペクトルを測定した。結果を図７に示す。線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ（図８において実線で示す）は、３１２ｎｍと５２０ｎｍと６２０ｎｍとに吸収極大を示した。３１２ｎｍにおける蛍光強度は、励起波長が散乱した際に生じたものであるが、ＹＦＰに特徴的な５３０ｎｍ付近の蛍光を示していた。さらに、線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰは７５０ｎｍ（赤から赤外線領域）にも蛍光を発することが判明した。このことは、ＹＦＰが近接して配列されたことによる共役系の延長効果であると推測された。
【００４９】
以上のことから、線維化したｍｅｄｉｎ−ＹＦＰには紫外線による励起によって２種類の励起状態があると推測された。一方、コントロール（図８において点線で示す。）は、３１２ｎｍと５２０ｎｍと６２０ｎｍとに吸収極大を示していた。以上のことから、線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ及びコントロールのスペクトルの特徴は一致しており、ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰは線維化してもＹＦＰの本来の構造を維持していることを支持していた。
【００５０】
なお、３１２ｎｍで照射したときの線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ液は、線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰが沈殿物として黄色く発色していたのに対し、コントロールでは溶液全体が黄色く発色していた。
【００５１】
以上説明したように、全ての結果は、回転サンプルにおいて融合タンパク質が自己集合し線維化したこと、及び線維化前後において同様にＹＦＰの蛍光発色機能が維持されていたことを示している。これらの結果より、本発明の融合タンパク質は、それ自体に備える機能性タンパク質の活性を損なうことなく、所定条件下において自己集積ドメインの自己集合機能に基づいて集合し、さらに一定形状を採ることができることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号１９：リンカーのアミノ酸配列
配列番号２０：リンカーのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号２１：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号２２：ＹＦＰのアミノ酸配列のＤＮＡ配列
配列番号２３：実施例の融合タンパク質の全ＡＡ配列
配列番号２４：融合タンパク質の全ＤＮＡ配列
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の融合タンパク質及び会合体の概念図である。
【図２】実施例におけるＨｉＴｒａｐ ＳＰによるｍｅｄｉｎ−ＹＦＰの溶出クトマトグラムを示す。
【図３】精製されたｍｅｄｉｎ−ＹＦＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。左側レーンが分子量マーカーであり、右側レーンがｍｅｄｉｎ−ＹＦＰである。
【図４】（ａ）はｍｅｄｉｎ−ＹＦＰの線維化状態を示す図であり、（ｂ）は、ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰが繊維化しないコントロールを示す図である。
【図５】回転サンプル及びコントロールの原子力間顕微鏡観察結果を示す図である。左列がサンプルであり、右列がコントロールであり、上から順にそれぞれ１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間経過後のサンプル及びコントロールの観察結果を示す。
【図６】（ａ）は回転サンプル（０、１、３、６、１２、２４時間経過後）ＣＤスペクトルであり、（ｂ）はコントロール（０、１、３、６、１２、２４時間経過後）のＣＤスペクトルを示す図である。
【図７】線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ液（実線）及びコントロール（点線）の５１６ｎｍ励起時の吸収スペクトルを示す。
【図８】線維化ｍｅｄｉｎ−ＹＦＰ液（実線）及びコントロール（点線）の３１２ｎｍ励起時の吸収スペクトルを示す。
【符号の説明】
【００５４】
２  融合タンパク質、４  自己会合ドメイン、６  他のドメイン、１０  会合体。
【図１】
2005314293.tif 000003
【図２】
2005314293.tif 000004
【図４】
2005314293.tif 000005
【図５】
2005314293.tif 000006
【図６】
2005314293.tif 000007
【図７】
2005314293.tif 000008
【図８】
2005314293.tif 000009
【図３】
2005314293.tif 000010
【配列表】
2005314293000001.app