(57)【要約】    【課題】プロテインアレイのスポットを形成するのに、接触ピンを用いる方法では、滴下を１回で行うためにスポットの大きさや形状の制御が難しかった。インクジェット法を用いる方法では、微細なスポットを形成することが可能であるが、スポットの位置を特定することが非常に難しく、容易に目的のスポットが認識できる方法が望まれていた。    【解決手段】固相表面上に形成されるたんぱく質を含むプローブからなるスポットの形状を少なくとも1つ非円形にする。非円形の形状としては、記号、二元符号、文字、数字を用いることができ、位置情報等を持たせることも可能である。また、プロテインアレイをインクジェット方式で形成すれば、非円形のたんぱく質を含むスポットが任意の場所に任意の形状で容易に形成できる。【選択図】図３ 
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、前記固相基板上にプローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットが配列されたプロテインアレイであって、前記スポットが少なくとも1つの非円形スポットを含む、前記プロテインアレイ。
【請求項２】
前記液滴がインクジェット法により供給される、請求項１に記載のプロテインアレイ。
【請求項３】
前記非円形のスポットが、楕円形のスポットである、請求項１又は２に記載のプロテインアレイ。
【請求項４】
前記楕円形のスポットの長軸方向が、固相基板の特定方向と一致した請求項３に記載のプロテインアレイ。
【請求項５】
前記非円形のスポットのうち、少なくとも1つが記号又は文字である、請求項１又は２に記載のプロテインアレイ。
【請求項６】
前記記号が二元符号である、請求項５に記載のプロテインアレイ。
【請求項７】
前記記号が数字である、請求項５に記載のプロテインアレイ。
【請求項８】
前記固相基板がガラス、ポリマー樹脂及び金属のうち少なくとも1つの材料を含む単層または多層基板である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロテインアレイ。
【請求項９】
前記タンパク質がペプチド、抗体又は発現タンパク質である請求項１又は２に記載のプロテインアレイ。
【請求項１０】
前記液滴が、前記タンパク質を細胞表面に発現した生細胞を含む液滴である、請求項１又は２記載のプロテインアレイ。
【請求項１１】
インクジェット法により、タンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、前記固相基板上にプローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットが配列されたプロテインアレイの製造方法であって、前記スポットが少なくとも1つの非円形のスポットを含む、前記製造方法。
【請求項１２】
前記非円形のスポットが、楕円形のスポットである、請求項１１に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１３】
前記楕円形のスポットの長軸方向が、固相基板の特定方向と一致した請求項１２に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１４】
前記非円形のスポットのうち、少なくとも1つが記号又は文字である、請求項１１に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１５】
前記記号が二元符号である、請求項１４に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１６】
前記記号が数字である、請求項１４に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１７】
温度２５℃〜４０℃でインキュベートすることを含む、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記固相基板がガラス、ポリマー樹脂及び金属のうち少なくとも1つの材料を含む単層または多層基板である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項１９】
前記タンパク質がペプチド、抗体又は発現タンパク質である請求項１１に記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項２０】
前記液滴が、前記タンパク質を細胞表面に発現した生細胞を含む液滴である、請求項１１記載のプロテインアレイの製造方法。
【請求項２１】
インクジェット法によりタンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、プローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットを、少なくとも1つのスポットが非円形になるように前記固相基板上に配列させることにより製造された、プロテインアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ、特にプローブとしてのタンパク質を含むスポットが多数配列されたプロテインアレイ、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子やタンパク質の解析技術はめざましいものがあり、特定の病気やガンに関与する機構も明らかになってきている。マイクロアレイはこれらの知識をもとに疾病の診断・体質検査等を迅速に行うために用いられている。マイクロアレイには、ＤＮＡアレイやプロテインアレイがある。
【０００３】
ＤＮＡアレイは、予め配列のわかっている塩基配列を持つ核酸プローブを含むスポットを多数並べたもので、相補核酸鎖の相互作用（ハイブリダイゼーション）を利用して、標的となる核酸を捕捉し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や蛍光分子標識により標的となる核酸を検出する。標的となる核酸の検出されたスポットの核酸プローブの塩基配列は予めわかっているため、調べたい遺伝子の含まれた試料のＤＮＡの塩基配列を特定することができる。
【０００４】
プロテインアレイは、血清、尿、髄液、関節液、唾液、組織ホモジネートなどの生体サンプルや細胞培養上清、培養細胞破砕液など、タンパク質を含有する多様なサンプルの中から、プローブとしてタンパク質を含むポット表面に対する親和性を利用して目的タンパク質を捕捉するのに用いられる。
【０００５】
前記マイクロアレイの製造において、プローブを含む溶液でスポットを形成する方法として、接触ピン又はインクジェットを用いる方法がとられている。接触ピンを用いる方法としては、ピンを基板に接触させてプローブを含む溶液を滴下する報告がある。（例えば、特許文献１参照）インクジェット方式を用いる方法としては、同一スポットに複数回ＤＮＡプローブを含む溶液を滴下する方法の報告がある。（例えば、特許文献２参照）
【０００６】
また、スポットの位置を知るための方法として、マーカー物質を基板上に配置して、マーカー物質の位置をもとに、それぞれのスポット位置を特定する方法が報告されている。（例えば、特許文献３参照）
【特許文献１】特許３２９９２１２
【特許文献２】特開２００１−１８６８８０
【特許文献３】特開２０００−２７０８７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、接触ピンを用いる方法では、ピンの数が少ないため、基板と、プローブを含む溶液を収容するウェルプレートとの間で頻繁にピンを移動させる必要があった。また、滴下を１回で行うためにスポットの大きさや形状の制御が難しかった。
【０００８】
インクジェット法を用いる方法では、微細なスポットを高密度で形成することが可能である。しかし、どの位置にどのプローブを含むスポットを配置したかを特定することが非常に難しく、容易に目的のスポットが認識できる方法が望まれている。
【０００９】
即ち、本発明の目的は、これらの問題を解消し、プローブを含むスポットの位置が容易に認識できるプロテインアレイと、その製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
即ち、本発明は、[１]固相基板上に、タンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、前記固相基板上にプローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットが配列されたプロテインアレイであって、前記スポットが少なくとも1つの非円形スポットを含む、前記プロテインアレイ；[２]前記液滴がインクジェット法により供給される、[１]に記載のプロテインアレイ；[３]前記非円形のスポットが、楕円形のスポットである、[１]又は[２]に記載のプロテインアレイ；[４]前記楕円形のスポットの長軸方向が、固相基板の特定方向と一致した[３]に記載のプロテインアレイ；[５]前記非円形のスポットのうち、少なくとも1つが記号又は文字である、[１]又は[２]に記載のプロテインアレイ；[６]前記記号が二元符号である、[５]に記載のプロテインアレイ；[７]前記記号が数字である、[５]に記載のプロテインアレイ；[８]前記固相基板がガラス、ポリマー樹脂及び金属のうち少なくとも1つの材料を含む単層または多層基板である、[１]〜[７]のいずれか１項に記載のプロテインアレイ；[９]前記タンパク質がペプチド、抗体又は発現タンパク質である[１]又は[２]に記載のプロテインアレイ；[１０]前記液滴が、前記タンパク質を細胞表面に発現した生細胞を含む液滴である、[１]又は[２]記載のプロテインアレイ；[１１]インクジェット法により、タンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、前記固相基板上にプローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットが配列されたプロテインアレイの製造方法であって、前記スポットが少なくとも1つの非円形のスポットを含む、前記製造方法；[１２]前記非円形のスポットが、楕円形のスポットである、[１１]に記載のプロテインアレイの製造方法；[１３]前記楕円形のスポットの長軸方向が、固相基板の特定方向と一致した[１２]に記載のプロテインアレイの製造方法；[１４]前記非円形のスポットのうち、少なくとも1つが記号又は文字である、[１１]に記載のプロテインアレイの製造方法；[１５]前記記号が二元符号である、[１４]に記載のプロテインアレイの製造方法；[１６]前記記号が数字である、[１４]に記載のプロテインアレイの製造方法；[１７]温度２５℃〜４０℃でインキュベートすることを含む、[１１]に記載の製造方法；[１８]前記固相基板がガラス、ポリマー樹脂及び金属のうち少なくとも1つの材料を含む単層または多層基板である、[１１]〜[１７]のいずれか１項に記載のプロテインアレイの製造方法；[１９]前記タンパク質がペプチド、抗体又は発現タンパク質である[１１]に記載のプロテインアレイの製造方法；[２０]前記液滴が、前記タンパク質を細胞表面に発現した生細胞を含む液滴である、[１１]記載のプロテインアレイの製造方法；[２１]インクジェット法によりタンパク質を含む液滴を固相基板上に供給して、プローブとしてのタンパク質を含む複数のスポットを、少なくとも1つのスポットが非円形になるように前記固相基板上に配列させることにより製造された、プロテインアレイ、に関する。
【００１１】
本発明でいうプローブは、標的となるタンパク質試料と特異的に結合するタンパク質を含む。タンパク質は、生物細胞に不可欠の主要成分として、２０種のＬ−アミノ酸がペプチド結合することで合成される高分子ポリペプチドの総称であり、様々な分子量、構造、機能を持った生体高分子である。例えば、標的となるタンパク質を捕捉するプローブとしてのタンパク質として、ペプチド、抗体、発現タンパク質を用いることができる。
【００１２】
プローブとしてのタンパク質を含む液体は、インクジェット法により、液滴として固相基板に供給されスポットを形成する。供給される液滴に、プローブとしてのタンパク質を細胞表面に発現した生細胞を含ませることも可能である。
【００１３】
タンパク質は、必要に応じて試料と結合したことを検出するための標識が結合していても良い。前記検出のための標識としては、好適には蛍光色素のような光学的ラベルを用いることができ、光学シグナルの変化として検出することができる。
【００１４】
本発明において用いる固相基板とは、プローブとしてのタンパク質が、固相基板表面でのインキュベートを妨げない限りにおいて限定されず、いかなる固相基板をも用いることができる。基板材料として好適な例をあげると、ガラス基板、シリコン基板、金属基板（例えば金、銀、銅、アルミニユウム、白金等）、金属酸化物基板（例えばＳｒＴｉＯ３、ＬａＡｌＯ３、ＮｄＧａＯ３、ＺｒＯ２、酸化ケイ素等）、樹脂基板（例えばポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート）、等から選ばれる材料である。
【００１５】
本発明において用いる固相基板は、前記材料のうち単一に材料からなる基盤基板であっても良いし、材料のうち少なくとも1つを含む単層または多層基板であってもよいし、これらの基板は適当な表面処理を施して用いても良い。
【００１６】
当該固相基板の材料、層の数と種類及びそれらの厚さの選択は、タンパク質の種類、検出のために採用するシグナル検出手段等に依存して、当業者が最適な条件を選択することが可能である。
【００１７】
その中で、ガラス基板は入手の容易さ、コストの点で好ましく用いることができる。ガラス基板は、各種の官能基が結合したシランカップリング剤で処理することが可能である。官能基としては、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、クロライド基、エポキシ基等がある。官能基を適切に選択することにより、プローブであるタンパク質が容易に結合可能な基板を得ることができる。
【００１８】
本発明における非円形のスポットの非円形とは、基板の鉛直方向から見た場合のスポットの形状である。従来の例では、ピンを用いる方法、インクジェットを用いる方法、いずれの場合でもスポットは円形で形成されていた。本発明では、従来の円形のスポットを基本単位として、それらを組合せ、全体として非円形のスポットを形成する。また、非円形のスポットの配置に関しては、固相基板上に配列された多数のスポットをすべて非円形のスポットで形成しても良いし、多数の円形スポットの配列中に、少なくとも１つの非円形のスポットが配置されても良い。
【００１９】
非円形のスポットの具体的な形状は、２つ以上の円から構成することができる。複数の円形のスポットを一方向に重なるように連続して形成すれば、楕円形のスポットを構成することができ、基板の特定方向に楕円形のスポットの長軸方向を一致させて配置すれば、アレイの配列方向を特定することも可能である。
【００２０】
インクジェット方式によれば、非円形のスポットに意味をもたす形状で形成することも可能である。例えば、スポットの形状に十字型、記号、数字、などを用いてスポット自体を位置標識とすることができる。予め決められた場所に位置を示す非円形のスポットを配置しておけば、非円形のスポットの形状を画像処理技術により自動認識することにより、非円形スポットの位置から全スポットの位置を割り出して、自動読み取り解析することが可能である。
【００２１】
また、スポット自体の形を、陽性/陰性や発現量を表す記号、文字形状に形成し、検査、解析の結果を直接その形状から判るようにすることもできる。例えば、二元符号を用いて、陽性の場合は＋が、陰性の場合は−が認識できるようにできる。発現量を表示するには、スポットのプローブの許容反応量を数字で表現して、ある一定量反応するとその量に対応した数字を認識させることも可能である。
【００２２】
本発明では、インクジェット法を用いて、固相基板上にプローブとしてタンパク質を含む液滴を非円形に供給し、インキュベートすることにより少なくとも１つの非円形スポットを形成する。供給に際しては、大部分のスポットを円形のスポットで形成して、位置標識となる非円形のスポットを配置してスポット群を形成しても良いし、スポット群全体が非円形のスポットからなってもよい。
【００２３】
インクジェット法には、液滴を吐出する手段として、ピエゾ素子を用いたピエゾジェット法、サーマル素子を用いたサーマルジェット法、振動板と電極間の静電容量の変化を利用した静電アクチュエータ法がある。いずれを用いても良いが、たんぱく質のように熱によって失活する物質を吐出するには、機械的に液滴を吐出するピエゾジェト法や静電アクチュエータ法を用いるのが好ましい。
【００２４】
プローブを含む液滴の供給位置は、吐出ヘッドを搭載したキャリッジのＸ軸方向の動きと、Ｘ軸に直交するＹ軸方向への基板の乗ったテーブルの動きと、吐出のタイミングを制御することによって決定することができる。この方法は、制御も容易で、装置の構成もコンパクトにすることが可能で好ましく用いることができる。
【００２５】
非円形のスポットの形状に情報を与え、形状を制御するには一回に吐出する液滴の量は、数ｐｌ〜百数十ｐｌであるのが望ましい。これらの液滴は、固相基板上供給されると、直径数十〜数百μの円形のスポットを形成する。本発明では、この円形のスポットを組み合わせて、種々の非円形スポットを形成することができる。
【００２６】
本発明において用いるプローブであるタンパク質は、市販の商品として入手可能であるか、自体公知またはそれに準じた方法により容易に製造できる。例えば、市販の商品として入手する場合は、通常、固体粉末で購入入手することができる。
【００２７】
プローブであるタンパク質は、水や塩化ナトリウムを含む緩衝液やポリマーを含む水溶液で希釈して用いルことができる。また、添加物により、インクジェット法に適した粘度、表面張力に調整することが好ましい。粘度は、２０cp以下、表面張力は２０〜４０ｄｙｎ/ｃｍが好ましい。さらに、プローブであるタンパク質を希釈した溶液は、予め脱気操作を通して溶液中の溶存気体を取り除いたものを使用することが好ましい。
【００２８】
固相基板表面に供給されたプローブであるタンパク質のインキュベートの方法としては、基板を加熱する方法か、供給されたプローブを含む溶液を加熱する方法を用いることができる。加熱の方法としては、ヒータ、レーザー光、赤外線、電磁波等を用いることができる。吐出直後に加熱する場合は、吐出ヘッドに直接熱のかからない方法が好ましい。
【００２９】
前記インキュベートの温度は、通常０℃〜４０℃付近であり、好適には２５〜４０℃である。インキュベートの時間も特に限定されないが、通常、３０分から２４時間で十分であり、好適には１時間〜１２時間である。
【００３０】
本願明細書において用いる語句の意義、並びに本発明の詳細な説明は以上の通りであるが、本発明への理解を更に容易にすべく、本発明の特徴を以下に記す。
【００３１】
まず、本発明の第1の特徴は、プロテインアレイの固相表面上に形成されるたんぱく質を含むプローブからなるスポットの形状が非円形であることである。固相基板上のスポットはすべて非円形のスポットであっても良いし、円形のスポット群に非円形のスポットが混ざっていても良い。非円形の形状としては、記号、二元符号、文字、数字を用いることができる。
【００３２】
本発明の第2の特徴は、前記プロテインアレイをインクジェット方式で形成する製造方法にある。当該製造方法によれば、非円形のたんぱく質を含むスポットが任意の場所に任意の形状で容易に形成できる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、インクジェット法を用いて任意の形状のスポットを得ることができ、スポットの形状によって位置の認識が可能になり、自動計測が可能となった。また、目的のスポットの情報が直接認識できるプロテインアレイを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下に示す本発明の参考例、実施例及び試験例は例示的なものであり、本発明は以下の具体例に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。
【実施例１】
【００３５】
図１は、本実施例で用いたマイクロアレイ製造装置の概要を示す斜視図である。マイクロアレイ製造装置１０は、基台１１上に、Ｘ軸上に往復移動するカートリッジホルダー（キャリッジ）１２と、Ｘ軸に直交するＹ軸方向に往復移動するテーブル１３と、カートリッジホルダー１２のホームポジション（テーブル１３の可動領域以外の領域における格納位置）に吐出液充填用の吸引ユニット１４と、キャリッジ及びテーブル駆動部１５を備えている。駆動部１５で、タイミングベルト機構やボールネジ機構等を用いて、カートリッジホルダー１２及びテーブル１３を数値制御方式等で移動し、マイクロアレイ基板１６への吐出液供給位置を決めることができる。カートリッジホルダーには吐出ヘッド（図示せず）が搭載されている。
【００３６】
本実施例では、静電アクチュエータを用いた吐出ヘッドを用いて、タンパク質を緩衝液に溶解したプローブを含む液滴を数種類吐出して、ヒータにより３０℃、２時間インキュベートした。基板への供給は、駆動周波数１６ｋＨｚ、１ドットあたりの２０ｐｌの条件で行い、テーブルと、吐出ヘッドが搭載されたキャリッジを連動させて、ガラスのマイクロアレイ用基板に図２に示す細長いスポット群を形成した。
【実施例２】
【００３７】
実施例１で用いたマイクロアレイ製造装置、プローブとして蛍光分子標識を持つタンパク質を含む溶液を用いて、図３に示すように、規則正しく配置された円形状のスポット群の四隅と中央に十字型のスポットを形成した。
【実施例３】
【００３８】
実施例１で用いたマイクロアレイ製造装置、プローブとしてタンパク質を含む溶液を用いて、図４に示すように、規則正しく配置された円形状のスポット群の外側に、縦方向、横方向のスポットの番地がわかるように数字のスポットを形成した。
【実施例４】
【００３９】
実施例１で用いたマイクロアレイ製造装置、プローブとしてタンパク質を含む溶液を用いて、図５に示すように、それぞれのスポットに対応して、陽性を示すプラス型のスポット形状、陰性を示すマイナスのスポット形状、反応量を表す数字のスポットを形成した。また、図６に示すように、スポット自体をプラス型、マイナス型、数字で形成した。
【００４０】
実施例２、３に関しては、画像解析用ＣＣＤカメラ１７を用いて、位置標識である非円形スポットを認識し、その位置から配列された円形のスポットの位置を割り出し、解析を行った結果、全スポットの認識が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明で用いたマイクロアレイ製造装置
【図２】実施例１で形成したスポットの形状及びパターン図
【図３】実施例２で形成したスポットの形状及びパターン図
【図４】実施例３で形成したスポットの形状及びパターン図
【図５】実施例４で形成したスポットの形状及びパターン図
【図６】実施例４で形成したスポットの形状及びパターン図
【符号の説明】
【００４２】
１０  粒子アレイ製造装置
１１  基体
１２  キャリッジ
１３  テーブル
１４  吸引ユニット
１５  キャリッジ及びテーブル駆動部
１６  マイクロアレイ基板
１７  画像処理用ＣＣＤカメラ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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