(57)【要約】  【課題】  反応領域に二対の対向電極を設け、これに所定の電界を印加することによって、物質の高次構造調整、移動、固定化等を自在に行うこと。  【解決手段】  物質間の相互作用の場を提供する反応領域Ｒと、該反応領域Ｒに臨むように設けられた第１電極Ｅ１１と、を少なくとも備える検出部Ｘが設けられた第１基板１１と、前記第１電極Ｅ１１との間で前記反応領域Ｒに電界印加可能な第２電極Ｅ１２が少なくとも設けられた第２基板１２と、を用いて、これら二枚の基板１１，１２を、前記第１電極Ｅ１１と前記第２電極Ｅ１２とが対向するように重ね合わせたバイオアッセイ用基板１と該基板１の製造方法を提供する。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相中での物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように配置された第１電極と、を少なくとも備える第１基板と、
該第１対向電極の対向するように形成された第２電極を少なくも備える第２基板と、が重ね合わされたことを特徴とするバイオアッセイ用基板。
【請求項２】
前記第１電極と前記第２電極の対向軸が、前記反応領域底面に対して垂直であることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項３】
前記第１電極部位に光源が設けられ、前記第２電極部位に受光部が設けられていることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項４】
前記第１電極部位に受光部が設けられ、前記第２電極部位に光源が設けられていることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ用基板。
【請求項５】
物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように設けられた第１電極と、を少なくとも備える検出部が設けられた第１基板と、
前記第１電極との間で前記反応領域に電界印加可能な第２電極が少なくとも設けられた第２基板と、を用いて、
これら二枚の基板を、前記第１電極と前記第２電極とが対向するように重ね合わせるバイオアッセイ用基板の製造方法。
【請求項６】
複数個の前記検出部が配列された前記第１基板と、複数個一組の前記検出部のそれぞれに配置されている前記第１電極との間で対向電極の関係を形成する共通第２電極が設けられた前記第２基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
【請求項７】
複数の前記検出部が基板中央から放射状列をなして配設された円盤状の前記第１基板と、一つの放射状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第２電極が形成された前記第２基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
【請求項８】
複数の前記検出部が同心円状列をなして配設された円盤状の前記第１基板と、一つの同心円状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第２電極が形成された前記第２基板と、を重ね合わせることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
【請求項９】
複数の前記検出部がスパイラル状列をなして配設された円盤状の前記第１基板と、一つのスパイラル状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第２電極が形成された前記第２基板と、を用いることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
【請求項１０】
前記第１電極と前記第２電極の対向軸は、前記反応領域底面に対して垂直であることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ用基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップその他のバイオアッセイ用基板に係わる技術に関する。より詳しくは、電極を有する二枚の基板を位置合わせして重ね合わせることによって対向電極が形成されたバイオアッセイ用基板並びに該バイオアッセイ用基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明に関する主たる背景技術を説明する。まず、第一の背景技術（従来技術）は、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板に関する技術である（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
このＤＮＡチップ技術は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。このためＤＮＡチップは、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。ＤＮＡチップ以外にも、基板上にタンパク質を固定したプロテインチップや種々の物質間の相互作用を解析するためのバイオセンサーチップなども開発されている。
【０００４】
第二の背景技術は、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術である。具体的には、ヌクレオチド鎖（核酸分子）は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られており、その原理は、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン雲を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は電気力線が集中する部位に向かって移動する（非特許文献１参照）。この移動は「誘電泳動」と呼ばれる。例えば、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、「誘電泳動」と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定されることが知られている（非特許文献２参照）。
【特許文献１】特開表４−５０５７６３号公報。
【特許文献２】特表平１０−５０３８４１号公報。
【非特許文献１】Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:“Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy”,IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。
【非特許文献２】鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報  Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．７６（２０００年１月）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したＤＮＡチップ技術は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域を基板に予め設定しておき、この反応領域中にプローブＤＮＡ等の検出用ヌクレオチド鎖を固定しておくことによって、この検出用ヌクレオチド鎖と相補的な標的ヌクレオチド鎖との間の相互作用であるハイブリダイゼーションを解析する技術であるが、ハイブリダイゼーションの効率が悪いため、同反応に長時間を要する点や、擬陽性や偽陰性の発生するため検出精度が低い点などが重要な技術的課題となっている。
【０００６】
このＤＮＡチップ技術を実施する場合において、前記反応領域中にその末端部位が固定されて存在する検出用ヌクレオチド鎖を伸長状態に調整することができれば、ランダムコイル状の分子高次構造に起因する立体障害や前記検出用ヌクレオチド鎖と周辺表面との干渉（例えば、付着や接触）による障害を排除することが可能となり、その結果、ハイブリダイゼーションの効率が向上すると考えられる。
【０００７】
そこで、本発明は、反応領域に対向電極を設けておき、これに所定の電界を印加することによって、物質の高次構造調整、移動、固定化等を自在に行うことができるバイオアッセイ用基板の提供並びにその製造方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明で提供するバイオアッセイ用基板の基本構成は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように配置された第１電極と、を少なくとも備える「第１基板」と、該第１対向電極の対向するように形成された第２電極を少なくも備える「第２基板」と、が重ね合わされた形態のものであり、また、第１電極と第２電極の対向軸が反応領域の底面に対して垂直となるものである。
【０００９】
そして、第１基板側の第１電極部位に光源を設け、第２基板側の第２電極部位に受光部を設けた構成、あるいは、前記第１電極部位に受光部が設けられ、前記第２電極部位に光源が設けられた構成のバイオアッセイ用基板も提供できる。
【００１０】
次に、本発明では、物質間の相互作用の場を提供する反応領域と、該反応領域に臨むように設けられた第１電極と、を少なくとも備える検出部が設けられた「第１基板」と、前記第１電極との間で前記反応領域に電界印加可能な第２電極が少なくとも設けられた「第２基板」と、を用いて、これら二枚の基板を、前記第１電極と前記第２電極とが対向するように重ね合わせるバイオアッセイ用基板の製造方法を提供する。
【００１１】
また、複数個の前記検出部が配列された「第１基板」と、複数個一組の前記検出部のそれぞれに配置されている前記第１電極との間で対向電極の関係を形成する共通第２電極が設けられた「第２基板」と、を重ね合わせる製造方法を提供する。この「共通第２電極」は、複数の第１電極との間で対向電極を形成できるので、電極構成を簡易化できる。
【００１２】
さらに、円盤状の形態をなす二枚の基板を重ね合わせる場合では、複数の前記検出部が基板中央から放射状列、同心円状列、スパイラル状列のいずれかの形状をなして配設された円盤状の「第１基板」と、一つの前記形状列に属する一部又は全部の検出部にまたがる帯状又は線状の前記共通第２電極が形成された「第２基板」と、を重ね合わせる製造方法も提供する。
【００１３】
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。まず、本発明において用いられる「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーションを含む。
【００１４】
次に、「対向電極」は、電極面が向かい合った状態で配置される少なくとも一対の電極を意味する。「対向軸」とは、対向する二つの電極面の中心同士を結ぶ直線によって形成される軸を意味する。
【００１５】
ここで、本願において「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００１６】
「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味し、本発明では、しばしば「ミスハイブリ」と略称する。
【００１７】
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどを貯留できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。例えば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。
【００１８】
「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（本願では、ハイブリダイゼーション）が起こりにくくなる現象を意味する。
【００１９】
「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林  輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。
【００２０】
「バイオアッセイ用基板」は、生物化学的、あるいは分子生物的な分析や解析を目的に使用される情報集積基板を意味し、いわゆるＤＮＡチップを含む。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、現在普及している確立された光ディスクの製造技術を用いて、対向電極を備えるバイオアッセイ用基板を低コストで、かつ容易に製造することができる。バイオアッセイ用基板の対向電極に所定の電界を所定のタイミングで印加することによって、前記反応領域中に存在する核酸等の物質の高次構造調整、電界に沿って物質の移動、物質の末端部位の電極表面への固定化等を自在に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明に係るバイオアッセイ用基板の製造方法の好適な実施方法及び同バイオアッセイ用基板の好適な実施形態について、添付図面を参照しながら説明する。
【００２３】
まず、図１は、本発明に係るバイオアッセイ用基板の基本構成の一例と該バイオアッセイ用基板の基本的な製造方法を説明するための図であり、図２は、図１中のＩ−Ｉ線矢視断面図である。これら図１、図２に示された符号１は、本発明に係るバイオアッセイ用基板を表している。
【００２４】
このバイオアッセイ用基板１は、符号１１で示す下側の第１基板と、符号１２で示す上側の第２基板と、から構成されている。バイオアッセイ用基板１は、これら二枚の基板１１と１２とを正確に位置合わせして重ね合わせることによって製造される。
【００２５】
第１基板１１や第２基板１２は、ガラスや合成樹脂で形成されており、少なくとも、ハイブリダイゼーションなどの相互作用を検出するために用いる励起光が照射される側の基板は、該励起光の所定波長域で透明な部材で形成するのが望ましい。本実施形態では、第１基板１１が透明樹脂で形成されている。
【００２６】
下側の第１基板１１の所定位置（例えば、中央位置）には、少なくとも一つの検出部Ｘが設けられている。この検出部Ｘには、上方に開口する所定容積のウエル（凹部）である反応領域Ｒと、この反応領域Ｒの底面中央に配置された、金やアルミニウム等の金属や光透過性のＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）などの導電性材料から形成された第１電極Ｅ１１と、が設けられている。
【００２７】
反応領域Ｒは、相互作用の場となる溶液を貯留したり、ゲルなどを保持したりできる領域又は空間として機能する。この反応領域Ｒに設けられた第１電極Ｅ１１は、第２基板１２が第１基板１１上に正確に位置合わせされて重ね合わされたときに、前記第２基板１２の所定位置に設けられた第２基板Ｅ１２との間で、反応領域Ｒの底面に対して垂直方向の対抗軸を備える対向電極を形成する。両電極Ｅ１１−Ｅ１２間に電圧が印加されたときに、反応領域Ｒ中の媒質に電界を形成する役割を果たす。なお、対向電極間の距離は、1μｍ〜1ｍｍ程度である。
【００２８】
また、この第１電極Ｅ１１は、ＤＮＡプローブに代表される検出用物質Ｄを固定化するための検出表面として機能させることも可能である。この場合において第１電極Ｅ１は、予めプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄの末端を固定化できる表面処理を施しておく。なお、前記第２電極Ｅ１２を固定化の検出表面として用いることも可能である。
【００２９】
検出用物質ＤがプローブＤＮＡである場合を例に挙げると、その固定方法としては、電極Ｅ１表面とプローブＤＮＡの末端がカップリング反応等の反応によって固定されるようにしても良い。例えば、ストレプトアビジンによって表面処理された電極表面の場合には、ビオチン化されたプローブＤＮＡ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された電極表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
【００３０】
なお、第１基板１１の第１電極Ｅ１１や第２基板１２の第２電極Ｅ１２の各表面は、ＳｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＳｉＣ、ＴｉＯ２のいずれか一つから選択される材料によって形成した絶縁層（図示せず。）で覆うことが望ましい（後述する他形態の検出部でも同様。以下説明割愛）。これは、反応領域Ｒ中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止するためである。
【００３１】
続いて、図３は、本発明に係るバイオアッセイ用基板の第二の基本構成の一例と該バイオアッセイ用基板の基本的な製造方法を説明するための図であり、図４は、図３中のＩＩ−ＩＩ線矢視断面図である。
【００３２】
図３、図４において符号２で示されたバイオアッセイ用基板は、上記したバイオアッセイ用基板１の場合と同様に、二枚の基板が重ね合わされて製造される。即ち、符号２１で示された第１基板と符号２２で示された第２基板とが重ね合わされることにより製造される。
【００３３】
このバイオアッセイ用基板２を構成する下側の第１基板２１には、計５個（５個に限定しない。）の検出部Ｘが所定間隔で並設されており、これら各検出部Ｘの各反応領域Ｒのそれぞれの底面には第１電極Ｅ２１が配置されている。一方の第２基板２２には、該基板長手方向に延びる線状又は帯状の第２電極Ｅ２２が設けられている。なお、前記第１電極Ｅ２１は、図示されたような別個独立の電極とするのではなく、第２電極Ｅ２２と同様に、線状又は帯状の一体の電極であってもよい。
【００３４】
線状又は帯状をなす第２電極Ｅ２２は、第１基板２１の上に第２基板２２が重ね合わされたときに、すべての第１電極Ｅ２１を相手にして対向する共通電極として機能する。即ち、スイッチＳをオンにすると、電源Ｖを介して、各反応領域Ｒ中の媒質に対して同時に電界が形成される構成となっている（図４参照）。
【００３５】
続いて、図５は、本発明に係るバイオアッセイ用基板の第三の基本構成を説明する図であって、該バイオアッセイ用基板を構成する円盤状の第１基板の構成を示す図である。図６は、同バイオアッセイ用基板を構成する円盤状の第２基板の構成を示す図である。図７は、第１基板と第２基板が重ね合わされた状態の同バイオアッセイ用基板の断面図である。
【００３６】
まず、図５に示す円盤状の第１基板３１は、その中心部に円形の孔３１１が形成されており、かつ該第１基板３１の上面には放射状あるいは同心円状をなすように配設された計８列の検出部Ｘ群が設けられている。各検出部Ｘ（の反応領域Ｒ）には、第１電極Ｅ３１がそれぞれ配置されている。この第１電極Ｅ３１群は、孔３１１の周囲に形成されたリング状の第１通電部３１２に接続状態で導出する配線３１３に接続されている。なお、第１通電部３１２は、孔３１１の周壁面に露出している。
【００３７】
図６に示されている、前記第１基板３１と同口径の円盤状の第２基板３２は、その中心部に前記孔３１１と同口径の孔３２１が形成されており、該第２基板３２の下面には、放射状をなすように配設された線状又は帯状をなす計８条（８条に限定しない。）の共通電極Ｅ３２が形成されている。各共通電極Ｅ３２は、孔３２１の周囲に形成されたリング状の第２通電部３２２に接続されている。なお、第２通電部３２２は、孔３２１の周壁面に露出している。
【００３８】
これらの第１基板３１と第２基板３２とを正確に所定の位置決めを行い、公知の光ディスク貼り合わせ技術等を応用して重ね合わせし、バイオアッセイ用基板３を形成すると、第２基板３２の各共通電極Ｅ３２は、下側の第１電極Ｅ３１の各列の真上に、反応領域Ｒを横断又は縦断するように正確に配置されることになる。これにより各共通電極Ｅ３２と対向電極を形成する（図７参照）。
【００３９】
このとき、第１通電部３１２と第２通電部３２２とは一体化し、図７中に符号３４で示されたような一つの通電部を形成することになる。この通電部３４は、孔３５に挿着される通電治具３６と接触して通電され、これにより対向電極Ｅ３２−Ｅ３２に電圧が印加される。なお、通電の方法はこれに限定されず、対向電極Ｅ３２−Ｅ３２に電圧が印加できれば採用可能である。また、前記孔３５には、バイオアッセイ用基板３を保持又は回転させるための図示しないチャッキング機構も挿入される。
【００４０】
図８は、本発明に係るバイオアッセイ用基板で採用可能な円盤状の第１基板の変形例の構成を示す図である。図示された変形例である第１基板４１には、上方視スパイラル状に配列された多数の検出部Ｘ群が設けられている。なお、各検出部Ｘには、符号Ｅ４１で示す第１電極が設けられている（図８参照）。
【００４１】
第１基板４１のような配列構成からなる検出部Ｘ群の場合でも、これと同軌道のスパイラル状に延設された共通第２電極を備える第２基板（図示せず。）を重ね合わせたり、あるいは前記検出部Ｘ群をスパイラル状で、かつ放射列状に配列しておくことによって、例えば、上記したような第２基板３２などを重ね合わせたりすることで、対向電極を形成することができる。
【００４２】
図９は、本発明に係るバイオアッセイ用基板に対向電極を形成するために採用できる他の実施形態を示す図である。下側の第１基板には、検出部Ｘを横断（又は縦断）する給電配線（又は帯状の電極）Ｈ１を延設しておき、一方の上方側の第２基板には、検出部Ｘを縦断（又は横断）する給電配線（又は帯状の電極）Ｈ２を延設しておくようにする。このような構成では、給電配線（又は帯状の電極）Ｈ１と同Ｈ２が交差する領域Ｙにおいて、対向電極を簡単に形成することができる。
【００４３】
次に、図１０は、本発明に係るバイオアッセイ用基板の発展形態の例を説明するための図である。この実施形態を既述したバイオアッセイ用基板１に適用した場合で説明する。
【００４４】
まず、対向電極を構成する一方の電極Ｅ１１又は（電極Ｅ１２）に微小サイズの光源（例えば、発光ダイオードや半導体レーザ）Ｐを設け、かつ第１基板１１に光源Ｐと光ファイバで結ばれた導波路構造を設けておき、他方の電極Ｅ１２（又は電極Ｅ１１）には、前記光源Ｐからの出射光により発生した蛍光（例えば、蛍光インターカーレータからの蛍光）を捕捉する受光部である光ディテクターＱを一体化して設けておく。
【００４５】
この場合、各電極Ｅ１１又は電極Ｅ１２は、ＩＴＯなどの透明な導電体で形成しておけば、光源（例えば、発光ダイオードや半導体レーザ）Ｐや光ディテクターＱを電極Ｅ１１，電極Ｅ１２の内部や反応領域Ｒに臨んでいない面側に設けることができる。なお、図１０の符号Ｕは、光ディテクターＱに接続する解析部を示している。
【００４６】
続いて、図１１〜図１３を用いて、本発明に係るバイオアッセイ用基板をＤＮＡチップとして用いる場合のバイオアッセイ方法の一例を説明する。なお、以下の前記方法に係わる説明は、既述した符号１のバイオアッセイ用基板を代表例として採用する。図１１は、バイオアッセイ用基板１の要部外観斜視図、図１２、図１３は、同要部の縦断面図である。
【００４７】
（検出用物質Ｄの伸長及び固定化）
ＤＮＡプローブに代表される検出用物質Ｄを含むサンプル溶液を、開口状態にある反応領域Ｒに対して、図示しないインクジェットノズルやディスペンサー等を用いて所定容量滴下する。
【００４８】
その後、第１基板１１に第２基板１２を位置決めして正確に重ね合わせた後、スイッチＳをオンにし、電源Ｖを介して、対向電極Ｅ１１−Ｅ１２間に高周波交流電界を印加する。なお、この際、対向電極Ｅ１１−Ｅ１２の間に印加される前記電界の条件は、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚの高周波高電圧の電界が好適である（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００４９】
なお、反応領域Ｒに対するサンプル溶液の滴下は、第２基板１２の反応領域Ｒに臨む部分に所定の孔を形成しておき（図示せず）、この孔から滴下するようにしてもよい。このような構成では、サンプル溶液を滴下する場合において、その都度、第２基板１２を第１基板１１上から取りはずして反応領域Ｒを開口させる必要がなくなる。
【００５０】
ここで、反応領域Ｒに対して前記高周波交流電界が形成されると、この反応領域Ｒには、電極Ｅ１２よりも狭小な表面面積に形成された電極Ｅ１１（図１１参照）の表面付近あるいはこの電極１１のエッジ付近に電気力線が集中して、不均一電界が形成される。
【００５１】
この不均一電界の作用によって、前記反応領域Ｒ中にランダムに分散して存在している検出用物質ＤであるＤＮＡプローブが前記不均一電界に沿った方向に伸長し、直鎖状の高次構造に調製されながら誘電泳動の作用で電極Ｅ１１に向けて移動し、最終的には、検出用物質Ｄの末端部位が電極Ｅ１１の表面に、特異的なカップリング反応等によって固定化される（図１１参照）。その後、反応領域Ｒの所定のバッファー溶液を投入して洗浄作業を行い、余剰のＤＮＡプローブを除去したり、乾燥させたりしてもよい。
【００５２】
なお、特に、検出用物質Ｄが固定化される検出表面として利用する第１電極Ｅ１１の表面を、凹凸や突起のある粗面状に加工しておいてもよい。例えば、凹凸が島状になるようにパターニング形成しておくことによって、電気力線が、第１電極Ｅ１１の表面の凸部位（山状部位）に集中し易くなって、不均一電界がより形成され易くなり、また、ＤＮＡプローブＤを整列固定化し易くなる。第１電極Ｅ１１の粗面形態は限定されない。また、電極表面を粗面加工する方法は、例えば、公知のスパッタリング技術及びエッチング技術等を用いて実施することができるが、該方法も特に限定されない。
【００５３】
（標的物質Ｔの滴下及び伸長移動）
次に、固定化された前記ＤＮＡプローブＤと相補的な塩基配列を有する標的ＤＮＡ（符号Ｔ）を含むサンプル溶液を、第２基板１２が取り外されて再び開口状態とされた反応領域Ｒに滴下し（又は第２基板１２に設けられた図示しない孔から滴下し）、その後、スイッチＳをオンにし、電源Ｖを介して、対向電極Ｅ１１−Ｅ１２間に高周波交流電界を印加する。なお、この際、対向電極Ｅ１１−Ｅ１２の間に印加される前記電界の条件は、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚの高周波高電圧の電界が好適である（Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。
【００５４】
この電界印加によって、反応領域Ｒで生じた不均一電界中において、符号Ｔで示す標的ＤＮＡを、誘電泳動の電気力学的効果によって、電界強度のより強い電極Ｅ１１の方へ、伸長させながら移動（泳動）させることができる（図１２参照）。
【００５５】
その結果、符号Ｄで示すプローブＤＮＡが予め固定された電極Ｅ１１表面上に符号Ｔで示す標的ＤＮＡが集まって濃度が高まり、ハイブリダイゼーションが進行し易い環境が形成され、ハイブリダイゼーション時間を短縮させることができる。
【００５６】
加えて、ＤＮＡプローブＤを、不均一電界の作用により、第１電極Ｅ１１表面に伸長状態で整列固定化させることができるので、前記検出用物質Ｄのランダムコイル状の高次構造が原因となる立体障害によるハイブリダイゼーションの阻害やミスハイブリダイゼーションを減少させることが可能となる。このため、ハイブリダイゼーションの効率と精度を向上させることができる。
【００５７】
（ハイブリダイゼーション）
ハイブリダイゼーションの際は、一旦スイッチＳをオフにすることによって反応領域Ｒ中における電界をゼロの状態とし、専ら自然なブラウン運動に委ねて行うようにする。図１３は、ＤＮＡプローブＤと符号Ｔで示す標的ＤＮＡとの間でのハイブリダイゼーションが進行して、その結果、二本鎖ＤＮＡが形成されている状態が模式的に示されている。
【００５８】
なお、反応領域Ｒにおいて、ハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖ＤＮＡには、予め符号Ｔで示された標的ＤＮＡと一緒に反応領域Ｒに投入された蛍光インターカーレータ、あるいは、ハイブリダイゼーション後に反応領域Ｒに投入された蛍光インターカーレータに対して、所定の励起光を照射すると蛍光を発するようになる。この蛍光強度を検出する光学的手段（分光手段）によって、ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。また、前記ハイブリダイゼーションの検出は、検出用物質ＤであるプローブＤＮＡに標識された蛍光物質が発する蛍光を検出する方法で行うこともできる。なお、本発明において、当該検出手段は特に限定されない。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、ハイブリダイゼーション等の相互作用の効率が良いので、該相互作用の時間も大幅に短縮することができ、かつ正確な相互作用が進行し易い環境を形成できるので、擬陽性や偽陰性の発生を少なく抑えることができる。このため、相互作用検出のためのアッセイ作業の効率に優れ、かつ検出精度が高いという特性を備えたＤＮＡチップ等のバイオアッセイ用基板及びその製造方法に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明に係るバイオアッセイ用基板の基本構成の一例と該バイオアッセイ用基板（１）の基本的な製造方法を説明するための図である。
【図２】図１中のＩ−Ｉ線矢視断面図（重ね合わされた状態）である。
【図３】本発明に係るバイオアッセイ用基板の第二の基本構成の一例と該バイオアッセイ用基板（２）の基本的な製造方法を説明するための図である。
【図４】図３中のＩＩ−ＩＩ線矢視断面図（重ね合わされた状態）である。
【図５】本発明に係るバイオアッセイ用基板の第三の基本構成を説明する図であって、該バイオアッセイ用基板（３）を構成する円盤状の第１基板（３１）の構成を示す図である。
【図６】同バイオアッセイ用基板（３）を構成する円盤状の第２基板（３２）の構成を示す図である。
【図７】第１基板（３１）と第２基板（３２）とが重ね合わされた状態の同バイオアッセイ用基板（３）の断面図である。
【図８】本発明に係るバイオアッセイ用基板で採用可能な円盤状の第１基板の変形例（４１）の構成を示す図である。
【図９】本発明に係るバイオアッセイ用基板に対向電極を形成するときに採用できる他の実施形態を示す図である。
【図１０】本発明に係るバイオアッセイ用基板（１）の発展形態の例を説明するための図である。
【図１１】バイオアッセイ用基板（１）の要部外観斜視図である。
【図１２】同要部の縦断面図であり、標的ＤＮＡ（Ｔ）が電界により伸長されながら移動している様子を模式的に示す図である。
【図１３】同要部の縦断面図であり、ＤＮＡプローブ（Ｄ）と標的ＤＮＡ（Ｔ）との間でのハイブリダイゼーションが進行して二本鎖ＤＮＡが形成されている状態を模式的にしている図である。
【符号の説明】
【００６１】
１，２，３  バイオアッセイ用基板
１１、２１，３１，４１  第１基板
１２，２２，３２  第２基板
Ｅ１１，Ｅ２１，Ｅ３１，Ｅ４１  第１電極
Ｅ１２，Ｅ２２，Ｅ３２  第２電極
Ｐ  光源（例、発光ダイオード）
Ｑ  受光部（光ディテクター）
Ｒ  反応領域
Ｘ  検出部
Ｄ  検出用物質（例、ＤＮＡプローブ）
Ｔ  標的物質（例、標的ＤＮＡ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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