(57)【要約】      （修正有）【課題】β−アガラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列等を明らかにし、これらを利用してβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させ、ネオアガロビオースの選択的製造方法に利用すること。【解決手段】  寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドの特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびこれらを利用したβ−アガラーゼの製造方法ならびにネオアガロビオースの製造方法。【選択図】図２
2005229889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドのアミノ酸配列をコードする以下の（ａ）〜（ｇ）に示すポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列により
表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番において１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１記載のヌクレオチド配列により表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１記載のヌクレオチド配列の９４〜２３９４番により表されるポリヌク
レオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ
するポリヌクレオチド
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターを導入した形質転換体。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列により表されるポリペプチド。
【請求項５】
以下の性質を有するポリペプチド。
（１）作用： 
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖のβ−１,４結合を加水
分解して、ネオアガロビオースを生成する。
（２）基質特異性： 
アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースに作用し、速や
かにネオアガロビオースに分解する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース        （乳糖）には作用しない。
（３）至適温度： 
４０℃
安定温度：
４０℃以下
（４）分子量： 
約１８０ｋＤａ（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約８２ｋＤａ（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる）の２量体
【請求項６】
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖に、請求項４記載のポリペプチドを作用させて選択的にネオアガロビオースを得ることを特徴とするネオアガロビオースの製造方法。
【請求項７】
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖に、請求項３記載の形質転換体を培養することにより得られるポリペプチドを作用させて選択的にネオアガロビオースを得ることを特徴とするネオアガロビオースの製造方法。
【請求項８】
請求項３記載の形質転換体を培養し、当該培養物中から請求項第４項記載のポリペプチドを採取することを特徴とする寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドを利用したネオアガロビオースの製造方法に関する。さらに詳しくは、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖のβ−１,４結合を選択的に加水分解する特異的なβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び当該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体により生産されたβ−アガラーゼを利用する選択的なネオアガロビオースの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紅藻類、テングサ等に存在する寒天は便秘改善、腸内コレステロール吸収阻害、ダイオキシン等の有害物質の排出作用等様々な効用を有することが知られている。この寒天はアガロースとアガロペクチンと名づけられた多糖からなり、その比率は約７：３である。この寒天の主成分であるアガロースは、ガラクトースと３,６−アンヒドロガラクトースとが交互にそれぞれβ−１,４結合、α−１,３結合で直鎖状に並んだ構造を持っている。アガロースを酸によって分解するとα−１,３結合が切断され様々な長さを有するアガロオリゴ糖が生成する。一方、土壌や海洋生物に見出される寒天分解酵素（β−アガラーゼ）は、β−１,４結合を特異的に加水分解するため、ネオアガロビオースを構成成分とするネオアガロオリゴ糖を生成する。
【０００３】
上記ネオアガロビオースは他のネオアガロオリゴ糖成分と異なり、高い保湿性と美白作用を兼ね備えていることが報告されており、化粧品素材として有用であることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００４】
従来から、微生物による酵素反応を利用し、アガロースからネオアガロオリゴ糖を製造する方法は数多く報告されており、例えば、アガロースからのネオアガロビオースの製造にビブリオ（Vibrio）属が有するβ−アガラーゼ遺伝子を利用することが報告されている（特許文献２、非特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、これらの既存のβ−アガラーゼの特異性は、例えば、ネオアガロヘキサオース（６糖）やネオアガロテトラオース（４糖）、アガロヘキサオース（６糖）、アガロテトラオース（４糖）等の低分子のものにおいて低く、生成物は必ず２種以上のネオアガロオリゴ糖の混合物としてのみ得られてしまうという欠点がある。
【０００６】
一方、本発明者らは現在までに寒天やアガロースあるいは４糖以上のネオアガロオリゴ糖からネオアガロビオースを選択的に生産する菌体内β−アガラーゼを有する微生物としてアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株を取得し、これを用いたネオアガロビオースの製造法を報告している（特許文献３）。
【０００７】
しかしながら、上記報告ではアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株の休止菌体若しくはアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株から精製される寒天分解酵素を用いているため、培養条件等を改良しても生産量に限りがあり、未だ工業生産レベルへ増加させるまでには至っていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平０８−３１０９３７号公報
【特許文献２】特開平０６−２８４８８８号公報
【特許文献３】特開平０８−１４９９７９号公報
【非特許文献１】Usami, S. et al., Biosci.Biotech. Biochem. 61(1):162-163 (1997)
【非特許文献２】Sugano, Y. et al., Appl. Environ.Microbiol. 59 (11), 3750-3756 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の解決すべき課題は、上記の微生物の有するβ−アガラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド配列等を明らかにし、これを利用してβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを大量に発現させ、ネオアガロビオースを大量に選択的に製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株から、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的にネオアガロビオースとするβ−アガラーゼをコードする遺伝子を単離し、そのヌクレオチド配列を明らかにした。また、アルテロモナス・エスピーＥ−１株で実際に生産されるβ−アガラーゼをコードするヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列を有する遺伝子全長に相当するものではなく、その一部分に相当するものであることを明らかにした。そして、前記ヌクレオチド配列をアルテロモナス・エスピーＥ−１株と異なる微生物に導入することにより、β−アガラーゼ生産能が賦与された新規な微生物を創製し、これを用いることで効率よくβ−アガラーゼを製造できることを見出した。更に、このようにして得られた新規微生物を、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖に作用させることにより、効率的かつ選択的にネオアガロビオースを製造できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドのアミノ酸配列をコードする以下の（ａ）〜（ｇ）に示すポリヌクレオチドを提供するものである。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列により
表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番において１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１記載のヌクレオチド配列により表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１記載のヌクレオチド配列の９４〜２３９４番により表されるポリヌク
レオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ
するポリヌクレオチド
【００１２】
また、本発明は、前記ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列により表されるポリペプチドを提供するものである。
【００１３】
更に、本発明は、以下の性質を有するポリペプチドを提供するものである。
（１）作用： 
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖のβ−１,４結合を加水
分解して、ネオアガロビオースを生成する。
（２）基質特異性： 
アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースに作用し、速や
かにネオアガロビオースに分解する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース        （乳糖）には作用しない。
（３）至適温度： 
４０℃
安定温度：
４０℃以下
（４）分子量： 
約１８０ｋＤａ（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約８２ｋＤａ（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる）の２量体
【００１４】
また更に、本発明は、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖に、前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを含有するプラスミドを導入した形質転換体を培養することにより得られるポリペプチドを作用させて選択的にネオアガロビオースを得ることを特徴とするネオアガロビオースの製造方法を提供するものである。
【００１５】
更にまた、本発明は、前記ポリペプチドまたは前記ポリヌクレオチドを含有するプラスミドを導入した形質転換体を培養し、当該培養物中から採取することを特徴とする寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のポリヌクレオチドはβ−アガラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするものであるため、これを利用することにより種々の微生物等において当該ポリペプチドを効率よく製造することができる。
【００１７】
また、このβ−アガラーゼは常温、常圧の穏和な反応条件で寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的にネオアガロビオースとすることができるので、高収率でネオアガロビオースを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするβ−アガラーゼ（以下、「ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼ」という）をコードするものである。
【００２０】
このネオアガロビオース生産型β−アガラーゼは、例えば、本発明者らが先に報告したアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株から得ることができる。このアルテロモナス・エスピー Ｅ−１株は、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６４として平成６年１１月２５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託したものであり、この株は、１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列の決定より、セルビブリオ・エスピー（Cellvibrio sp.）に近いことが明らかになっている。
【００２１】
上記アルテロモナス・エスピー Ｅ−１株より得られるネオアガロビオース生産型β−アガラーゼは以下の性質を有するものである。
（１）作用： 
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖のβ−１,４結合を加水
分解して、ネオアガロビオースを生成する。
（２）基質特異性： 
アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースに作用し、速や
かにネオアガロビオースに分解する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース
（乳糖）には作用しない。
（３）至適温度： 
４０℃
安定温度：
４０℃以下
（４）分子量： 
約１８０ｋＤａ（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）、かつ約８２ｋＤａ（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる）の２量体
【００２２】
本明細書において、ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼの「至適温度」とは、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ７.５）において酵素活性を測定したときに、最も高い活性レベルを示す温度を指す。
【００２３】
また、本明細書において、ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼの「安定温度」とは、該酵素溶液を種々の温度に一定時間（例えば、３０分間）放置した後、特定の温度（例えば、４０℃）に再調整し、特定のｐＨ（例えば、ｐＨ７.５）において残存する酵素活性を測定したときに、最も高い活性レベルを１００％として、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上の活性レベルを示す温度範囲を指す。
【００２４】
上記のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼは、以下の（１）〜（４）のアミノ酸配列により表されるポリペプチドであり、好ましくは（１）または（３）のアミノ酸配列により表されるポリペプチドである。
（１）配列番号２記載のアミノ酸配列
（２）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
（３）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列
（４）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番において１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列
【００２５】
上記のアミノ酸配列のうち、例えば配列番号２記載のアミノ酸配列は、スガノらが報告（Sugano, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 59（11）, 3750-3756（1993））しているビブリオ・エスピー（Vibrio sp.）ＪＴ０１０７株由来のβ−アガラーゼであるＡｇａＢ及びＡｇａＡのアミノ酸配列とそれぞれ４０％、３２％の相同性を示す。しかしながら、ＡｇａＢがコードするタンパク質はアガロース加水分解活性は示すがネオアガロビオースにまでは分解できず、また、ＡｇａＡがコードするタンパク質はネオアガロビオースの他に４糖のネオアガロオリゴ糖であるネオアガロテトラオースが生成するものであり、本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼとはその性質において異なる。さらに、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴプログラムによりデータベース検索を行ったが、上記アミノ酸配列と４０％以上の相同性を示すものは検出されなかった。
【００２６】
本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上記（１）〜（４）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられ、具体的には、以下の（ａ）〜（ｇ）に示すものが挙げられる。
【００２７】
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置
換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列により
表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番において１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１記載のヌクレオチド配列により表されるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１記載のヌクレオチド配列の９４〜２３９４番により表されるポリヌク
レオチド
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズ
するポリヌクレオチド
【００２８】
上記ポリヌクレオチドは、例えば、アルテロモナス・エスピー Ｅ−１株等のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを産生する微生物から、後述する実施例１、実施例２及び実施例３に記載された方法により得ることができる。
【００２９】
具体的には、配列番号２記載のアミノ酸配列または配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を基にＰＣＲプライマーを作成し、これを用いてアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株から調製されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００３０】
このようにして得られるヌクレオチド配列としては配列番号１記載のポリヌクレオチドまたは配列番号１記載のヌクレオチド配列の９４〜２３９４番により表されるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
また、配列番号２記載のアミノ酸配列または配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９４番に表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列でネオアガロビオース生産型β−アガラーゼ活性を有するポリペプチド（以下、「欠失型ポリペプチド」という）をコードするポリヌクレオチドを利用しても、ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを産生する微生物からこの欠失型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
【００３２】
このポリペプチドを得るに当たっては、公知の技術、例えば、ゾラーらが報告（Zoller
et al., Nucleic Acids Res.10 6487-6500, (1982)）している部位特異的変異誘発法により配列番号２記載のアミノ酸配列または配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを改変することにより得ても良い。
【００３３】
なお、上記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも、上記ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼのアミノ酸配列をコードするものとして使用することができる。ここにおいて、ハイブリダイズさせるためのストリンジェントな条件としては、目的の遺伝子を含まれるポリヌクレオチドをプローブとして用いて、６８℃で１８時間でサザンハイブリダイゼーションの反応を行うといった条件が挙げられる。
【００３４】
斯くして得られる本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、「ａｇａＩ」ということもある）は、例えば、前記ビブリオ・エスピー（Vibrio sp.）ＪＴ０１０７株由来のβ−アガラーゼであるＡｇａＢ及びＡｇａＡのヌクレオチド配列とそれぞれ５３％、４９％の相同性を示す。しかし、ＡｇａＢがコードするタンパク質はアガロース加水分解活性を示すがネオアガロビオースにまでは分解できず、また、ＡｇａＡがコードするタンパク質はネオアガロビオースの他に副生成物として４糖のネオアガロオリゴ糖であるネオアガロテトラオースの生成が避けられないので、本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼとはその性質において異なる。
【００３５】
さらに、ａｇａＩについてＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴプログラムによりデータベース検索を行ったが、上記ａｇａＩと４０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列は検出されなかった。
【００３６】
本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを効率的に産生させるためには、このβ−アガラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターを利用することが好ましい。
【００３７】
このベクターは、上記のようにして得られたネオアガロビオース生産型β−アガラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を作製し、これを公知の方法で適切なベクターに挿入することにより作製することができる。
【００３８】
ＤＮＡ断片を挿入するベクターは、形質転換する宿主に応じて決めればよく、例えば、プラスミドベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター及び酵母ベクター等が挙げられる。これらのベクターの中でも宿主として大腸菌を使用するのであれば、強力なプロモーターである、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、λｐＬ、Ｔ７、ｒｒｎＢ等を含むｐＵＲ系、ｐＧＥＸ系、ｐＵＣ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系等のベクターを使用するのが好ましい。
【００３９】
上記のようにして得られたベクターは、これを適切な宿主に導入し、得られた形質転換体（形質導入体）を培養することにより、目的とするネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを効率的に得ることができる。
【００４０】
宿主細胞にベクターを導入し、形質転換体とするには、上記のようにして得られたベクターを電気パルス法、コンピテントセル法、接合伝達法、プロトプラスト法等当技術分野において公知の技術を用いれば良い。これらの方法は、例えば、サムブルック（Sambrook）らの成書（Molecular Cloning Laboratory Mannual 2nd ed.）に記載されている。
【００４１】
また、上記ベクターを導入する宿主としては、植物細胞や動物細胞等であってもよいが、大腸菌等の微生物が好ましい。代表的な菌株としては、サムブルック（Sambrook）らの成書（Molecular Cloning Laboratory Mannual 2nd ed.）に記載されている、７１／１８、ＢＢ４、ＢＨＢ２６６８、ＢＨＢ２６９０、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＮＮｌ０２（Ｃ６００ｈｆｌＡ）、Ｃ−１ａ、Ｃ６００（ＢＮＮ９３）、ＣＥＳ２００、ＣＥＳ２０１、ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５α、ＤＰ５０ｓｕｐＦ、ＥＤ８６５４、ＥＤ８７６７、ＨＢ１０１、ＨＭＳ１７４、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ８０２、ＫＫ２１８６、ＬＥ３９２、ＬＧ９０、Ｍ５２１９、ＭＢＭ７０１４.５、ＭＣ１０６１、ＭＭ２９４、ＭＶ１１８４、ＭＶ１１９３、ＭＺ−１、ＮＭ５３１、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９、Ｑ３５８、Ｑ３５９、Ｒ５９４、ＲＢ７９１、ＲＲ１、ＳＭＲ１０、ＴＡＰ９０、ＴＧ１、ＴＧ２、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＳ１０１、ＸＳ１２７、Ｙ１０８９、Ｙ１０９０ｈｓｄＲ、ＹＫ５３７等が挙げられる。
【００４２】
なお、上記した形質転換体からネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを製造するには、当該形質転換体を、その生育に最適な培地、条件で培養した後、当該培養物中から、常法に従ってネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを分離、採取すれば良い。
【００４３】
具体的な培養例としては、ｐＥＴ系ベクターと大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いてアンピシリンおよびイソプロピルチオガラクトシドを含んだＬＢ培地で１８時間培養するものがあり、また、分離、精製例としては大腸菌を遠心分離して集め、超音波破砕（０℃、２０ＫＨｚ、３０分）したのち得られる無細胞抽出液を陰イオンカラムクロマトグラフィーおよびゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分離するといった方法が挙げられる。
【００４４】
また、上記ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを用いたネオアガロビオースの製造は、例えば、これを寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を含有する溶液中に加え、適切な条件で保持することにより行われる。
【００４５】
より具体的に、寒天等に上記ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを作用させてネオアガロビオースを製造するには、寒天等を溶解させ、ｐＨを８.０に調整したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に上記ネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを添加し、振とうを加えながら４０℃で保持すればよい。
【００４６】
上記のネオアガロビオースの製造方法によれば、選択的にネオアガロビオースを製造できるため、従来のネオアガロビオースの製造方法に比べ、経済性が高いものである。すなわち、従来の方法では副生成物の生成が不可避で、最終的に生成物中から副生生物を分離する必要があったが、本発明の製造方法によれば、副生成物とオアガロビオースを分離する必要がなく、製造工程を簡略化できる。さらに、形質転換体を利用することにより該酵素の大量利用が可能となり、高選択的かつ高収率でネオアガロビオースを製造することが可能とすることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例中の遺伝子操作に関連した実験は、主に前記したサムブルックらの成書に詳述されている方法に従って行った。
【００４８】
実 施 例  １
アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株のＤＮＡの抽出：
アルテロモナス・エスピー Ｅ−１株（以下、単に「Ｅ−１株」という）（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６６４）のＤＮＡ抽出は以下のように行った。まず、表１に示した組成の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量のエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌を行った。これに表２に示した組成の培地に１.５％の寒天を加えた培地中で維持されているＥ−１株を１白金耳で接種し、これを３０℃の恒温室にて１２０ｒｐｍで２４時間振とう培養を行い、菌体を増殖させた。培養終了後、培養液を４,０００×ｇで５分間遠心分離を行い、菌体を回収した。この回収した菌体を６ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に懸濁し、１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を２０μｌ及び２０％ＳＤＳ溶液を２００μｌ加えて溶菌を行った。さらに遠心分離を行って、上清を得た。次いでこの溶液に２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を４５μｌ添加し、３７℃で１０分間反応させた後、ＲＮａｓｅＡ処理を行い、更にフェノール・クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを抽出した。
【００４９】
【表１】
2005229889.tif 000003
【００５０】
【表２】
2005229889.tif 000004
【００５１】
実 施 例  ２
全ＤＮＡライブラリーの作製：
Ｅ−１株の全ＤＮＡライブラリーは以下のようにして作製した。まず、ベクターとして用いるファージ（ＬＡＭＢＤＡ  ＤＡＳＨ  ＩＩ；ストラタジーン製）のＤＮＡを、ＳＤＳを加えて溶菌させ、プロテアーゼ、次いで ＲＮａｓｅＡ で処理した後、フェノール・クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。次いで、実施例１で抽出したＥ−１株からのＤＮＡ約０.２μｇを、ファージ（ＬＡＭＢＤＡ  ＤＡＳＨ  ＩＩ／ＢａｍＨＩアーム；ストラタジーン製）約２μｇ と２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ存在下、４℃で１８時間反応させた。この反応混合物を、ギガパック ＩＩＸＬ パッケージング エクストラクト（ Gigapack IIXL packaging Extract；ストラタジーン製）と反応させることにより、インビトロ（in vitro）パッケージングを行い、ファージライブラリーを作製した。さらにこれを制限酵素 Ｓａｕ３ＡＩで消化し、精製を行った後、制限酵素ＢａｍＨＩで消化したファージＤＮＡに連結し、パッケージングを行った。得られたファージを、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｘｌｉ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＡ（Ｐ２）（ストラタジーン製）に感染させることにより全ＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５２】
実 施 例  ３
全ＤＮＡライブラリーのスクリーニング：
（１）プローブの作製
β−アガラーゼをコードする遺伝子を取得するためのファージライブラリーのスクリーニングに用いるＤＮＡプローブとしては、化学合成したジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識オリゴヌクレオチドプローブ（ADDP-DIG）及びＰＣＲにより得られた約０.６ｋｂｐの ＰｓｔＩ断片を鋳型として用いてランダムプライム法（マルチプライム法）により作製したＤＩＧ標識プローブ（DIG-11-dUTP）を使用した。ランダムプライム法によるＤＩＧ標識プローブの調製法は、製造元であるベーリンガーマンハイム社のプロトコールに従った。
【００５３】
ＤＩＧ 標識プローブは、以下のようにして調製した。すなわち、まず、Ｅ−１株を培養し、常法に従ってネオアガロビオース生産型β−アガラーゼを精製した。この精製されたβ−アガラーゼのアミノ酸末端及び内部のアミノ酸配列を決定した。それらの配列を以下に示す。
【００５４】
アミノ酸末端：  ＮＨ２―ＱＥＥＡＡＤＫ―ＣＯＯＨ
内部アミノ酸配列：  ＮＨ２―ＦＩＧＡＨＷＦ―ＣＯＯＨ
【００５５】
上記のアミノ酸配列をもとに以下に示すようなＰＣＲ用プライマーを作成した。
【００５６】
センスプライマー：
５'−ＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＡ−３' 
アンチセンスプライマー：
５'−ＧＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡ−３'
【００５７】
上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、実施例１に記載の方法により調製したＥ−１株のＤＮＡ を鋳型として用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
【００５８】
＜ＰＣＲサイクル＞
９５℃    １ｍｉｎ    １回
９５℃    １ｍｉｎ      ↓
５８℃    １ｍｉｎ    この間を２５回繰り返す
７２℃    ２ｍｉｎ      ↑
７２℃    ５ｍｉｎ    １回
【００５９】
上記の条件でＰＣＲを行った結果、約２ｋｂの増幅フラグメントを与えることが確認された。このフラグメントをβ−アガラーゼをコードする遺伝子の一部分であると考え、次にこのフラグメントを用いて以下の手順でＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブを作製した。
【００６０】
得られたフラグメント１μｇ（５μｌ）を沸騰した熱湯中で１０分間熱変性させ、氷上で冷却した。得られた変性ＤＮＡ溶液に、１０μｌのヘキサヌクレオチド混合液（０.５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオエリスリオール（Dithioerythriol）、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、３.１４３ｍｇ／ｍｌのランダム・プライマー（Random Primer）を含むｐＨ７.２の溶液）、１０μｌのｄＮＴＰ標識混合液（１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、０.６５ｍＭのｄＴＴＰ、０.３５ｍＭのＤＩＧ−ｄＵＴＰを含むｐＨ７.５の溶液）、７０μｌの滅菌蒸留水及び５μｌ（１０ｕｎｉｔｓ）のクレノウ（Klenow）酵素を添加して、３７℃で１時間反応させた。反応液に、０.５ＭのＥＤＴＡ 溶液を５μl 添加して反応を停止させた。次に８ＭのＬｉＣｌ４を５μl及び２７５μｌの冷エタノール（−２０℃）を添加して、−８０℃で２０分間放置したのち、１４,０００×ｇで２０分間遠心を行い、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを冷７０％(ｗ／ｖ)エタノールで洗浄後、吸引乾燥したのち、５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解して、ＤＩＧ 標識プローブを調製した。
【００６１】
（２）ファージライブラリーからのスクリーニング
β−アガラーゼをコードする遺伝子のスクリーニングは上述の方法で調製したＤＩＧ標識プローブを用い、ハイボンド Ｎ＋（Hybond N+）メンブレン（バイオラッド製）に転写されたプラークに対するプラークハイブリダイゼーションにより行った。ハイブリダイズするクローンの検出にはＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ（ベーリンガーマンハイム製)を用いた。ゲノムライブラリーより約３,０００個のファージプラークを、プローブを用いてスクリーニングしたところ、５個の陽性プラークが検出された。検出された陽性プラークを用いてファージクローンを調製し、それらのクローンから、キアゲン・ラムダ（QIAGEN Lambda）キット（キアゲン製）を用いてファージＤＮＡを抽出した。さらに、これら５種のファージＤＮＡをＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩを用いて消化して得られたＤＮＡ断片についてプラークハイブリダイゼーションに用いたプローブを用いてサザーンプロット分析を行い制限酵素地図の作製を試みたところ、１クローンから制限酵素地図を作製することができた。これにより約７ｋｂのＳａｌＩ断片にハイブリダイズすることが確認された。一方、他の４クローンでは制限酵素地図が作成できなかった。
【００６２】
実 施 例  ４
ヌクレオチド配列の決定：
（１）組換えプラスミドの構築
β−アガラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列決定をおこなうため、プローブ陽性ファージクローンから抽出されたＤＮＡを用いて、ベクターをプラスミドｐＵＣ１９（ニッポンジーン製）、宿主を大腸菌ＪＭ１０９株（ニッポンジーン製）としてサブクローニングを行った。そして、プローブ陽性ファージクローンから調製したＤＮＡ、約０.２μｇをＳａｌＩを用いて制限消化し、得られたＤＮＡ断片の電気泳動を行い、約７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片を精製した。次いでこれを、ｐＵＣ１９をＳａｌＩで処理して得た制限消化物を脱リン酸化したものと連結させ、得られたハイブリッドＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して組換え大腸菌を得た。この組換え大腸菌からプラスミドを常法により抽出し、組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドに対し、実施例３記載の二つのプライマーによるＰＣＲ及びプラークハイブリダイゼーションに用いたプローブによるサザーンハイブリダイゼーションを行った結果、この組換えプラスミドがβ−アガラーゼをコードする遺伝子を保持していることを確認した。
【００６３】
（２）ヌクレオチド配列の決定
得られた組換えプラスミドを用いてβ−アガラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定を行った。まず、ヌクレオチド配列を読み進める際に明らかになった配列をもとにして新たなプライマーを設計し、これを化学合成法により作製した。このプライマーを用いて、組換えプラスミドを鋳型とするＰＣＲを行い、新たに明らかになった配列を基にしたプライマーを設計した。これを繰り返すことで遺伝子の全域のヌクレオチド配列を決定した。試料の精製は、オートセックＧ−５０（AutoSeqTM G-50；アマシャムバイオサイエンス製)を用いて行った。配列決定は、ＤＹエナミック ＥＴ ターミネーター サイクル シーケンシング キット（DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit；アマシャムバイオサイエンス製)を用いて行い、ＡＢＩプリズム ３１０（ABI Prism 310；アプライドバイオシステム製）によりヌクレオチド配列を決定した。得られたヌクレオチド配列データは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ／ＡＴＳＱ ｖ３.０（ゼネティックス製）及びＧＥＮＥＴＹＸ−Ｗｉｎ ｖ６.０（ゼネティックス製）を用いて解析した。
【００６４】
上記決定されたヌクレオチド配列中のＯＲＦを探索した結果、２,３９４ｂｐのＯＲＦが見つかった。このＯＲＦは７９８個のアミノ酸をコードし推定分子量は８３.５ｋＤａであった。このＯＲＦを含むヌクレオチド配列を配列番号１に、そのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００６５】
上記ＯＲＦのヌクレオチド配列の相同性検索の結果、この配列はビブリオ・エスピー（Vibrio sp.）ＪＴ０１０７株（Sugano, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol. 59 （11）, 3750-3756 （1993））由来のβ−アガラーゼＡｇａＢ及びＡｇａＡとアミノ酸配列で比較してそれぞれ４０％、３２％の低い相同性しか確認されなかった。また、数種のβ−アガラーゼとは局所的に１５％前後という非常に低い相同性しか確認されなかった。
【００６６】
実 施 例  ５
β−アガラーゼの大腸菌内での発現：
（１）組換え大腸菌の作成
β−アガラーゼを発現する大腸菌を作製するためにプラスミドの構築を行った。まず、実施例４で明らかになった配列番号１記載のヌクレオチド配列をもとに以下に示すようなＰＣＲ用プライマーを作製した。
【００６７】
センスプライマー：
５'−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＴ−３'  
アンチセンスプライマー：
５'−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＴＧ−３'
【００６８】
上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、実施例４で得られた組換えプラスミドを鋳型とするＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
【００６９】
＜ＰＣＲサイクル＞
９５℃    １ｍｉｎ    １回
９５℃    １ｍｉｎ      ↓
６０℃    １ｍｉｎ    この間を２５回繰り返す
７２℃    ２.５ｍｉｎ   ↑
７２℃    ５ｍｉｎ    １回
【００７０】
上記の条件でＰＣＲを行った結果、約２.４ｋｂの増幅フラグメントを与えることが確認された。このフラグメントを精製した後、これの約０.２μｇをＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて消化し、得られたＤＮＡ断片を精製した。この精製ＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１−ａ（＋）（ノバジェン製）を同様にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理して得た制限消化物を連結させ、得られたハイブリッドＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバジェン製）を形質転換して組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌のプラスミドｐＥＡｇａＩを抽出し、上記二つのプライマーによるＰＣＲ及びヌクレオチド配列解析を行った結果、得られた組換えプラスミドがβ−アガラーゼをコードするポリヌクレオチドを保持していることを確認した。
【００７１】
（２）無細胞抽出液の調製
上記で得られた組換え大腸菌がβ−アガラーゼを発現するかを確認するために、無細胞抽出液を以下の方法で調製した。まず、上記（１）で作製した組換え大腸菌の終夜培養液を５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ−Ａｍｐ培地）に接種して、ＯＤ６００が０.６となるまで３０℃で４時間培養した。次いでこの培養液にＩＰＴＧを終濃度０.８ｍＭとなるように加え、さらに１４時間培養して培養菌体を得た。この培養菌体を集菌・洗浄した後、２０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むｐＨ８．０の溶液)に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機により１０分間の処理を２回行い、さらに３０,０００×ｇで１０分遠心分離し、無細胞抽出液を調製した。
【００７２】
（３）無細胞抽出液の性質：
無細胞抽出液の反応は以下のようにして行った。まず、調製した無細胞抽出液０.２ｍｌを、０.１２５％（ｗ／ｖ）のアガロース、ネオアガロヘキサオース及びネオアガロテトラオースを含む０.８ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に加え、４０℃で往復振盪を行うことにより反応させた。次いで、得られた反応液を１００℃の熱湯中に５分間おくことで反応を停止させ、室温まで冷却後ＴＬＣもしくはＨＰＬＣにより反応生成物の分析を行った。
【００７３】
上記で得られた無細胞抽出液を用い、ネオアガロヘキサオースを基質として反応を行ったときの１分間あたりのネオアガロヘキサオースの分解活性を図１に示す。図１に示すように無細胞抽出液にはネオアガロヘキサオースを基質としてネオアガロビオースが生成する反応が４０℃において進行することが認められ、β−アガラーゼ活性を有することが確認された。無細胞抽出液のβ−アガラーゼ活性は、１.１２Ｕ／ｍｇと計算され、Ｅ−１株の無細胞抽出液の１７.６倍の比活性を示した。また、アガロースまたはネオアガロテトラオースを基質とした場合も同様にネオアガロビオースが選択的に生成した。これによりクローニングされたＥ−１株由来のβ−アガラーゼが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現し、ネオアガロビオース生産に利用可能であることが明らかになった。なお、ここで１ユニット（Ｕ）は１分間に１μｍｏｌのネオアガロビオースを生産する酵素量と定義する。
【００７４】
また、このβ−アガラーゼは、以下のような性質を有していた。
（１）酵素活性：
市販の寒天（和光純薬製）およびアガロース（ニッポンジーン製）は、０.５％濃度となるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）に加熱溶解した後に４０℃に保温し、また、ネオアガロヘキサオース（シグマ製）およびネオアガロテトラオース（シグマ製）は０.１％の濃度となるように２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.５）に常温で溶解して試験液を調製した。 各試験液に得られたβ−アガラーゼを添加して、４０℃で１時間攪拌しながら反応させたところ、いずれの試験液においてもネオアガロビオースのみが得られ、他のオリゴ糖や単糖は検出されなかった。
（２）ｐＨ安定性：
２０ｍＭ クエン酸−リン酸緩衝液および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用い、ｐＨ５.０〜９.５の範囲におけるβ−アガラーゼの安定性を調べた。この結果より、基質が存在しない条件下においては、ｐＨ６.０〜９.０の範囲で安定であることが示された。
また寒天を基質としたとき最適ｐＨは７.５であり、ｐＨ８.０においても高い活性（最高活性の９５％）を有することが示された。ｐＨ安定性や最適ｐＨは元株アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株由来のβ−アガラーゼと同一であった。
（３）熱安定性：
ｐＨ７.５の条件で、２０℃〜７０℃の範囲での精製酵素の安定性を調べた。寒天を基質とする反応において最適温度は４０℃であることが示された。また、熱安定性に関しては４０℃以下では安定であったが５０℃では約３％まで活性が低下した。熱安定は元株アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株由来のβ−アガラーゼと同一であった。
（４）分子量：
得られたβ−アガラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供したところ、一本の単一なバンドが検出され、分子量は約８２,０００ ｋＤａであった。さらに、この精製酵素について、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムバイオサイエンス製）を用いてゲル濾過法による分子量を測定したところ、約１８０,０００ ｋＤａであった。
【００７５】
実 施 例  ６
アガロースからのネオアガロビオースの選択的製造：
実施例５で得られたβ−アガラーゼ活性を有する無細胞抽出液の０.２ｍｌを、０.５％（ｗ／ｖ）のアガロースを含む０.８ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣl緩衝液に加え、４０℃で往復振盪を行うことにより反応を行ったときのネオアガロビオースの収率と反応時間の関係を図２に示す。図２に示すように、１２時間以内に９７％のアガロースがネオアガロビオースに分解されることが確認された。ＴＬＣにおいて他のネオアガロオリゴ糖の生成を測定したところ、ネオアガロビオース以外の生成物は認められなかった。
【００７６】
実 施 例  ７
成熟型β−アガラーゼを生産する組換え大腸菌の作製：
実施例３で明らかになったアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株の生産するβ−アガラーゼのアミノ酸末端配列は、実施例４で決定したヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチドのアミノ酸末端配列よりも３０アミノ酸残基短いことが認められた。これによりＥ−１株が生産するβ−アガラーゼは成熟型であると推定された。そこで、Ｅ−１株が生産する成熟型β−アガラーゼと同一の組換えβ−アガラーゼを大腸菌内で発現させるため、実施例４で決定したヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチドのアミノ酸末端配列よりも３０アミノ酸残基短い配列（配列番号２記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番）に対応する配列番号１記載の９４〜２３９４に相当するポリヌクレオチド（ａｇａ１−ｍ）を保持したプラスミドｐＥＡＧＡＩ−Ｍを実施例５と同様に作製し、大腸菌において発現させた。
【００７７】
（１）組換え大腸菌の作製
成熟型β−アガラーゼを発現する大腸菌を作製するためにプラスミドの構築を行った。まず、実施例４で明らかになった配列番号１記載のヌクレオチド配列をもとに、それから上記ヌクレオチド配列を得るため、以下に示すようなＰＣＲ用プライマーを作製した。
【００７８】
センスプライマー：
５'−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡ−３'  
アンチセンスプライマー：
５'−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴＡＣＴＧ−３'
【００７９】
上記のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いて、実施例４で得られた組換えプラスミドを鋳型とするＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
【００８０】
＜ＰＣＲサイクル＞
９５℃    １ｍｉｎ    １回
９５℃    １ｍｉｎ      ↓
６０℃    １ｍｉｎ    この間を２５回繰り返す
７２℃    ２.５ｍｉｎ   ↑
７２℃    ５ｍｉｎ    １回
【００８１】
上記の条件でＰＣＲを行った結果、約２.４ｋｂの増幅フラグメントを与えることが確認された。このフラグメントを精製した後、これの約０.２μｇをＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて消化し、得られたＤＮＡ断片を精製した。この精製ＤＮＡ断片と、ｐＥＴ２１−ａ（＋）を同様にＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩで処理して得た制限消化物を連結させ、得られたハイブリッドＤＮＡを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換して組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌のプラスミドｐＥＡＧＡＩ−Ｍを抽出し、上記二つのプライマーによるＰＣＲ及びヌクレオチド配列解析を行った結果、得られた組換えプラスミドが成熟型β−アガラーゼをコードするポリヌクレオチド（ａｇａ１−ｍ）を保持していることを確認した。
【００８２】
（２）無細胞抽出液の調製
得られた組換えＡｇａＩの発現を確認するため大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＧＡＩ−Ｍ株の無細胞抽出液を以下の方法で調製した。まず、上記（１）で作製した組換え大腸菌の終夜培養液を５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ−Ａｍｐ培地）に接種して、ＯＤ６００が０.６となるまで３０℃で４時間培養した。次いでこの培養液にＩＰＴＧを終濃度０.８ｍＭとなるように加え、さらに１４時間培養して培養菌体を得た。この培養菌体を集菌・洗浄した後、２０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣl緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むｐＨ８.０の溶液)に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機により１０分間の処理を２回行い、さらに、３０,０００×ｇで１０分遠心分離し、無細胞抽出液を調製した。
【００８３】
（３）無細胞抽出液の性質
無細胞抽出液の反応は以下のようにして行った。まず、調製した無細胞抽出液０.２ｍｌを、０.１２５％（ｗ／ｖ）のアガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースを含む０.８ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣl緩衝液に加え、４０℃で往復振盪を行うことにより反応を行った。得られた反応液を１００℃の熱湯中に５分間おくことで反応を停止させ、室温まで冷却後ＴＬＣもしくはＨＰＬＣにより反応生成物の分析を行った。
【００８４】
上記で得られた無細胞抽出液を用い、ネオアガロヘキサオースを基質として反応を行ったときの１分間あたりのネオアガロヘキサオースの分解活性を図３に示す。図３に示すように無細胞抽出液にはネオアガロヘキサオースを基質としてネオアガロビオースが生成する反応が４０℃において進行することが認められ、β−アガラーゼ活性を有することが確認された。無細胞抽出液のβ−アガラーゼ活性は１８.７Ｕ／ｍｇと計算され、アルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株の無細胞抽出液の２９２倍の比活性を示した。アガロースまたはネオアガロテトラオースを基質とした場合も同様にネオアガロビオースが選択的に生成した。これによりクローニングされたアルテロモナス・エスピー（Alteromonas sp.）Ｅ−１株由来のネオアガロビオース生産を行う成熟型β−アガラーゼが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現し、ネオアガロビオース生産に利用可能であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のネオアガロビオース生産型β−アガラーゼをコードするポリヌクレオチドは、これを適当なベクターに組み込むことにより、上記β−アガラーゼを効率よく産生する形質転換体または形質導入体を作製することができる。
【００８６】
そして、得られるβ−アガラーゼは寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖をネオアガロビオースとする反応を触媒するので、これを利用することにより常温、常圧の環境調和型プロセス及び酸素存在下でかつ、高選択的かつ高収率でネオアガロビオースを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、β−アガラーゼを含む無細胞抽出液による１分間あたりのネオアガロヘキサオース分解活性を示す図面である。
【図２】図２は、アガロース分解の経時変化を示す図面である。
【図３】図３は、成熟型βアガラーゼを含む無細胞抽出液による１分間あたりのネオアガロヘキサオース分解活性を示す図面である。
【図１】
2005229889.tif 000005
【図２】
2005229889.tif 000006
【図３】
2005229889.tif 000007
【配列表】
2005229889000001.app