(57)【要約】【課題】  由来する組織に関係なく、各種ＤＮＡに対して普遍的に適用することができる手段で、細胞質局在化を実現した修飾ＤＮＡを提供する。【解決手段】  核外移行シグナルペプチドで修飾された細胞質局在化ＤＮＡであって、固相担体上において、ＤＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ核外移行シグナルペプチドを縮合させたのち、固相担体から脱離させることにより製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核外移行シグナルペプチドで修飾された細胞質局在化ＤＮＡ
【請求項２】
５´末端又は３´末端で核外移行シグナルペプチドにより修飾されている請求項１記載の細胞質局在化ＤＮＡ。
【請求項３】
核外移行シグナルペプチドが、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（配列表配列番号１）、ＰＫＩα（配列表配列番号２）、ＤＳｋ−１（配列表配列番号３）又はＭＡＰＫＫ（配列表配列番号４）である請求項１又は２記載の細胞質局在化ＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡが遺伝子医薬作用を示すオリゴＤＮＡである請求項１ないし３記載の細胞質局在化ＤＮＡ。
【請求項５】
固相担体上において、ＤＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ核外移行シグナルペプチドを縮合させたのち、固相担体から脱離させることを特徴とする細胞質局在化ＤＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡに各種タンパク質由来の核外移行シグナルペプチドを共有結合により導入することにより、その細胞質透過性を向上させ、かつ選択的に細胞質内に局在化させることを可能にした新規な細胞質局在化ＤＮＡ及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物の核内で作用するタンパク質には、細胞質から核へ運搬されるための標識となる部分、すなわち核局在化シグナルが存在しており、この核局在化シグナルは各種核タンパク質それぞれに特有のものである。そして、そのシグナルを認識して核タンパク質を細胞質から核まで輸送する因子が多数存在し、これによって生命維持のためのタンパク質の供給が行われている。
【０００３】
一方、核外移行シグナル（以下ＮＥＳと示す）と称される特異なアミノ酸配列を有するタンパク質は、輸送タンパク質と結合して核内から細胞質へ移行する。
このようにして、遺伝子を保管し、遺伝情報の発信を行っている核とタンパク質の合成を行い、かつ細胞外からの刺激を受け取る場となっている細胞質において常に情報交換することにより生物細胞は生命活動を継続している。
【０００４】
ところで、最近、遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接作用して病気の原因となっている遺伝子発現を抑制して疾病を治療する医薬、いわゆる遺伝子医薬が遺伝子情報の源流であるＤＮＡやＲＮＡに直接作用して疾病を根本的に治療し得るという点で注目を浴びるようになり、このようなものとして例えば肝細胞に特異的に遺伝子導入可能な糖修飾ペプチド誘導体を含むベクターとＤＮＡ又はアンチセンスＤＮＡとからなる肝細胞特異的遺伝子医薬が提案されている（特許文献１参照）。
【０００５】
この遺伝子医薬は、３２６１５個という厖大な数の遺伝子のうちのただ１個を標的として作用する必要があるが、そのために３０．７億対からなるヒトゲノム配列のただ１個所に選択的に結合する分子が必要であり、その機能をもつ短鎖ＤＮＡ又はＲＮＡいわゆるオリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡの医薬への利用が研究されるようになった。
【０００６】
その結果、これまでに、ＤＮＡを標的とするアンチジーン法、ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス法、ＲＮＡを分解する機能をもつＤＮＡを用いＲＮＡを標的とするＤＮＡ酵素法、二本鎖ＲＮＡによるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用したＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ法などが既に開発されている。そして、これらの方法は、いずれも医薬としての特性をもつオリゴＤＮＡ又はオリゴＲＮＡ分子の創製が重要な課題となっている。
【０００７】
ところで、これらの遺伝子医薬の多くは、細胞内の細胞核よりも細胞質において、より高い効力を発揮することが知られているので、その細胞質における遺伝子医薬の局在化を実現することができれば、優れた遺伝子医薬が得られることになる筈であるが、これまでこのような遺伝子医薬は知られていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２９００７３号（特許請求の範囲その他）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、由来する組織に関係なく、各種ＤＮＡに対して普遍的に適用することができる手段で、細胞質局在化を実現した修飾ＤＮＡを提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、細胞質内に局在化可能なＤＮＡを得るために種々研究を重ねた結果、細胞内に存在するタンパク質とＲａｎＧＴＰとコンプレックスを形成し、これを核から細胞質へ移行させるＮＥＳペプチドでＤＮＡ特にオリゴＤＮＡを修飾すれば、ＤＮＡを細胞質に局在化し得ること、したがって、これを利用して遺伝子医薬例えばオリゴヌクレオチドとのコンジュゲート体を形成させれば、所望の遺伝子医薬を細胞質へ局在化させ効力を向上させ得ることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、核外移行シグナルペプチド（以下ＮＥＳペプチドと略記する）で修飾された細胞質局在化ＤＮＡ、及び固相担体上において、ＤＮＡのフラグメントを活性水素含有基で修飾し、これに二官能性リンカーを介して活性水素含有基をもつ核外移行シグナルペプチドを縮合させたのち、固相担体から脱離させることを特徴とする細胞質局在化ＤＮＡの製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明において、ＮＥＳペプチドにより修飾されるべきＤＮＡは、どのような由来のものでもよく、生体内の種々の組織から採取されたものの中から使用目的に応じて任意に選ぶことができるが、塩基配列数１０〜３０程度のオリゴＤＮＡが好ましい。
【００１３】
次にＮＥＳペプチドとしては、例えばＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（配列表配列番号１）、ＰＫＩα（配列表配列番号２）、ＤＳｋ−１（配列表配列番号３）、ＭＡＰＫＫ（配列表配列番号４）などが挙げられるが、それ以外のＮＥＳペプチドも用いることができる。
【００１４】
このようなＮＥＳペプチドでＤＮＡを修飾する方法としては、液相中でγ‐マレインイミドブチルオキシサクシンイミドをリンカーとして用いて縮合させる方法、液相中でヨードアセトキシサクシンイミドをリンカーとして用いて縮合させる方法、液相中でコンジュゲートする方法などが知られており、これらの中のいずれの方法を用いてもよいが、特に好適なのは、固相フラグメント縮合法である。
【００１５】
この方法は、多孔性ガラス、制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）、ポリエチレングリコール／ポリスチレンのような固相担体上においてＤＮＡのフラグメントの活性水素含有基、例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基に二官能性リンカーを反応させたのち、ＮＥＳペプチドを縮合させることによって製造することができる。
【００１６】
この際に用いる二官能性リンカーとしては、活性水素含有基と反応して安定な結合を形成しうる官能基２個を有する化合物が用いられる。
このような化合物としては、例えば以下の（イ）ないし（チ）に示す化合物が挙げられる。
（イ）Ｓ‐（２‐ピリジルジチオ）システアミン
【化１】
2005229946.tif 000002
（ロ）Ｎ‐スクシンイミジル＝３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピナート
【化２】
2005229946.tif 000003
（ハ）ヨードアセトキシスクシンイミド
【化３】
2005229946.tif 000004
（ニ）ジチオイソシアナトアルカン
ＳＮＣ−（ＣＨ2）n−ＮＣＳ
（ホ）ジイソシアナトアルカン
ＯＮＣ−（ＣＨ2）n−ＮＣＯ
（ただしｎは１〜１０の整数）
（ヘ）２‐（２‐ピリジルジチオ）エチルイソシアネート
【化４】
2005229946.tif 000005
（ト）Ｎ‐（４‐マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド
【化５】
2005229946.tif 000006
（チ）Ｎ‐４‐マレイミド酪酸
【化６】
2005229946.tif 000007
【００１７】
このＤＮＡのフラグメントと二官能性リンカーとの反応は、前記の固相担体上でＤＮＡのフラグメントに、上記の二官能性リンカーを、例えばアセトニトリルやジメチルホルムアミドのような溶液に溶かして加え、１０〜４０℃において２〜１０時間かきまぜる。この際の溶液中の二官能性リンカーの濃度としては、０．１〜１モル／リットルが好ましい。反応終了後、上記の溶剤でよく洗浄して不純物を除去する。
【００１８】
次に、このようにして得たＤＮＡのフラグメントと二官能性リンカーとの縮合生成物を固相担体上に担持したまま、これにＮＥＳペプチドを有機溶剤、例えばアセトニトリルやジメチルホルムアミドなどに溶解して加え、１０〜４０℃において２〜１０時間かきまぜることによって反応させる。反応終了後、同じ溶剤で洗浄し、不純物を除くと固相担体に結合したＤＮＡコンジュゲートが得られる。
次いで、アルカリで処理し固相担体から脱離させ、クロマトグラフなどにより精製すれば、所望の細胞質局在化ＤＮＡが２〜５０％の収率で得られる。
【００１９】
この際用いるアルカリとしては、濃アンモニア水又は０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
【００２０】
次に、ＤＮＡの５´‐位置をＮＥＳペプチドで修飾する方法の１例の反応式を示す。
【化７】
2005229946.tif 000008
（ただし式中のＣＰＧは制御多孔性ガラスである）
この例ではオリゴペプチドの５´‐位置を修飾したが、ＤＮＡフラグメントの５´‐位置で固相担体に結合させれば同様にして３´‐位置の修飾も行うことができる。
【００２１】
このようにして得た細胞質局在化ＤＮＡの細胞導入性は、オリゴペプチドのＮ末端にフルオレセインイソチオシアネートなどを用いて蛍光ラベル化したのち、所定の細胞に導入し、培養し、フローサイトメトリー及び共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて確認することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の細胞質局在化ＤＮＡは、従来の修飾ＤＮＡに比べ、細胞導入性や細胞質局在化が優れているほか、分解酵素耐性、テロメラーゼ活性阻害及びチロシンキナーゼ活性阻害も天然ペプチドに比べて高いという利点がある。この結果、細胞質に存在するチロシンキナーゼに対するアンチセンス効果が細胞内での細胞質局在化性と高い相互関係を有することが示唆された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
次に、実施例により本発明を実施するための最良の形態を説明する。
なお、各例中の細胞質局在化性、酵素分解耐性、血清中分解耐性、テロメラーゼ阻害活性及びチロシンキナーゼ活性阻害は次のようにして評価したものである。
【００２４】
（１）細胞質局在化性；
蛍光ラベル化した修飾ＤＮＡを、生理食塩水に１μＭの濃度に懸濁させて試料を調製する。別に白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、標準栄養培地中に１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度で加え、上記の修飾ＤＮＡ懸濁液を添加したのち、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で２４時間培養した。培養後、細胞を遠心分離し、ＰＢＳ（−）緩衝液で３回洗浄したものについてフローサイトメトリー［ベックマンコールター（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）社製、製品記号「エピクス（Ｅｐｉｃｓ）ＸＬ」］及び共焦点レーザー蛍光顕微鏡［バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）社製、製品記号「ラディアンス（Ｒａｄｉａｎｃｅ）２０００」］を用いて評価した。
【００２５】
（２）酵素分解耐性；
修飾ＤＮＡを濃度１μＭで含む栄養培地に、酸素（ＤＮａｓｅ１）１００ｕｎｉｔを添加し、３７℃において１０分間培養後、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析し、修飾ＤＮＡの分解率を求めた。
【００２６】
（３）血清中分解耐性；
栄養培地中に１μＭ濃度の修飾ＤＮＡと、１０％濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加え、３７℃において、２時間培養後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、修飾ＤＮＡの分解率を求めた。
【００２７】
（４）テロメラーゼ阻害活性；
白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ濃度で含むＲＰＭＩ培地中に修飾ＤＮＡを１μＭ濃度で加え、５％ＣＯ2、３７℃の条件下、３７℃において４８時間培養したのち、ＴＲＡＰアッセイ法によりテロメラーゼ活性阻害性をＩＣ50（ｎＭ）として求めた。
【００２８】
（５）チロシンキナーゼ活性阻害；
白血病細胞Ｋ−５６２を用い、プロテインチロシンキナーゼアッセイ法により細胞濃度１×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ中に試料を５μＭの濃度で加え、５％ＣＯ2、３７℃の条件下で４８時間培養したのち、その阻害率を求めた。
【実施例１】
【００２９】
ＤＮＡ自動合成機（クルアケム社製、製品名「ＰＳ２５０」）を用い、常法に従いＣＰＧ担体上でオリゴヌクレオチドＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（５´‐ＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ‐３´）の５´末端をＯ‐アミノエトキシエチル‐Ｏ´‐シアノエチルリン酸エステル残基で化学修飾した。
【００３０】
次いで、ヘキサメチレンジイソシアナートをアセトニトリルに溶かして調製した０．５モル濃度溶液を加え、２０℃において５時間反応させたのち、アミノ酸側鎖を保護したフリーのＮ末端アミノ基をもつペプチドフラグメントＨＩＶ−１  Ｒｅｖ（配列表配列番号１）を反応させることにより、オリゴヌクレオチドの５´末端にヘキサメチレンジイソシアナートを介してＮＥＳペプチドを結合させた。
【００３１】
次に、この反応生成物に２８％濃度のアンモニア水を加え、５５℃において５時間かきまぜることにより、固相担体からの生成コンジュゲートの切り出しと同時にペプチドからの保護基の脱離を行った。
【００３２】
このようにして、式
【化８】
2005229946.tif 000009
で表わされる細胞質局在化ＤＮＡが収率１０．７％で得られた。
【００３３】
このようにして得た細胞質局在化ＤＮＡの酵素分解耐性は２９．１％、血清中分解耐性は４２．３％、テロメラーゼ阻害活性は１２０ｎＭ、チロシンキナーゼ活性阻害は約５０％であった。また対照の原料ＤＮＡの酵素分解耐性は４９．２％、血清中分解耐性は５６．９％、テロメラーゼ阻害活性は４０ｎＭ、チロシンキナーゼ活性阻害は約２５％であった。また、細胞質局在化ＤＮＡと相補的なＤＮＡ又はＲＮＡとの間の融解熱は、対照の原料ＤＮＡの融解点とほぼ同じであった。
【００３４】
次に、このようにして得た細胞質局在化ＤＮＡをアセトニトリルに溶かし、同モル量のフルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を加え、反応させることにより、蛍光ラベル化した。
この蛍光ラベル化した細胞質局在化ＤＮＡの細胞質局在化性を示す顕微鏡写真（Ａ）を、対照の蛍光ラベル化した原料ＤＮＡの顕微鏡写真（Ｂ）と共に図１に示す。
【実施例２】
【００３５】
ＤＮＡとして５´‐ＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ−３´を用い、リンカーとして式
【化９】
2005229946.tif 000010
で表わされる残基を介してＮＥＳペプチドを導入した以外は実施例１と同様にして、式
【化１０】
2005229946.tif 000011
で表わされる細胞質局在化ＤＮＡを２．７％の収率で得た。このものの酵素分解耐性は２９．１％、血清中分解特性は４２．３％、テロメラーゼ阻害活性は細胞溶解液を用いた系で１２０ｎＭであった。また細胞系においては、約１２％のテロメラーゼ活性阻害が確認された。
【００３６】
対照の原料ＤＮＡの非細胞系でのテロメラーゼ阻害活性は４００ｎＭ以上であり、細胞系では０％のテロメラーゼ活性阻害が認められた。
次にこれを実施例１と同様にして蛍光ラベル化して、細胞質局在化性を調べた。その結果を図２に示す。
【実施例３】
【００３７】
ＤＮＡとして５´‐ＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＴＣ−３´を用い、ＮＥＳペプチドとしてＭＡＰＫＫ（配列表配列番号４）を用いること以外は実施例２と同様にして式
【化１１】
2005229946.tif 000012
で表わされる細胞質内局在化ＮＥＳペプチド修飾ＤＮＡを得た。
【００３８】
このものの酵素分解耐性は３４．２％、血清中分解耐性は４１．４％、チロシンキナーゼ活性阻害は約４６．２％であった。なお対照の原料ＤＮＡの酵素分解耐性は４９．２％、血清中分解耐性は５６．９％、チロシンキナーゼ活性阻害は約２１．８％であった。
【００３９】
次に、この細胞質局在化ＮＥＳペプチド修飾ＤＮＡを実施例１と同様にして蛍光ラベル化し、その細胞質局在化性を調べた結果を図３（Ａ）に示す。また比較のために原料ＤＮＡの細胞質局在化性を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。
これらを対比することにより本発明のＮＥＳペプチド修飾ＤＮＡは、細胞質局在化性を示し、また原料ＤＮＡよりも優れた酵素分解耐性、血清中分解耐性及びテロメラーゼ阻害活性を有することが分る。
【００４０】
比較例
実施例１におけるＮＥＳペプチドＨＩＶ−１  Ｒｅｖの代わりにＮＬＳペプチドＳＶ４０Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ（配列表配列番号５）を用いて、同様に操作して修飾したＤＮＡを蛍光ラベル化し、その細胞質局在化性を調べたところ、その顕微鏡写真は原料ＤＮＡのそれと全く同じであり、細胞質局在化性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、遺伝子医薬の効力を向上させることができるので、医薬分野においての利用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例１において蛍光ラベル化した細胞質局在化ＤＮＡの細胞質局在化性を示す顕微鏡写真及び原料ＤＮＡの顕微鏡写真。
【図２】実施例２において蛍光ラベル化した細胞質局在化ＤＮＡの細胞質局在化性を示す顕微鏡写真及び原料ＤＮＡの顕微鏡写真。
【図３】実施例３において蛍光ラベル化した細胞質内局在化ＮＥＳペプチド修飾ＤＮＡの細胞質局在化性を示す顕微鏡写真及び原料ＤＮＡの顕微鏡写真。
【図１】
2005229946.tif 000013
【図２】
2005229946.tif 000014
【図３】
2005229946.tif 000015
【配列表】
2005229946000001.app