(57)【要約】【課題】  コラーゲン上の蛋白質結合部位をマッピングする新規な方法を提供すること。【解決手段】  コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識する方法であって、ａ）  蛋白質のコラーゲン結合部位にシステイン残基を導入し；ｂ）  前記システイン残基の−ＳＨ基に、光反応性基とジスルフィド結合とを有する光反応性架橋剤を導入し；ｃ）  コラーゲンと蛋白質とを接触させ；ｄ）  光を照射して前記光反応性架橋剤により蛋白質とコラーゲンとを架橋し；ｅ）  架橋を切断してコラーゲン上に−ＳＨ基を生成し；そしてｆ）  −ＳＨ基に標識を導入する、の各工程を含む方法。【選択図】図１
2005172786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識する方法であって、
ａ）  蛋白質のコラーゲン結合部位にシステイン残基を導入し；
ｂ）  前記システイン残基の−ＳＨ基に、光反応性基とジスルフィド結合とを有する光反応性架橋剤を導入し；
ｃ）  コラーゲンと蛋白質とを接触させ；
ｄ）  光を照射して前記光反応性架橋剤により蛋白質とコラーゲンとを架橋し；
ｅ）  架橋を切断してコラーゲン上に−ＳＨ基を生成し；そして
ｆ）  −ＳＨ基に標識を導入する、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法により得られる、蛋白質結合部位が標識されたコラーゲン。
【請求項３】
光反応性基とジスルフィド結合とを有する光反応性架橋剤を含む、コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、長い三重らせん構造を特徴とし、細胞外マトリクスを構成する最も主要な蛋白質成分である（Kadler, et al., Biochem. J. 1995, 316, 1-11）。コラーゲンは、細胞表面上のレセプターに結合することにより、および成長因子またはサイトカイン等の蛋白質と相互作用することにより、細胞の機能を調節する（Heino, J.; Matrix Biol. 2000, 19, 319-323; Vogel, et al., Mol. Cell 1997, 1, 13-23; Somasundaram, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 38170-38175; Taipale, et al., FASEB. J. 1997, 11, 51-59）。これまでに、種々の蛋白質がコラーゲンに特異的に結合することが報告されている。コラーゲンとこれらの蛋白質との相互作用のメカニズムおよびこの相互作用が細胞に与える機能を解明するためには、コラーゲン結合蛋白質の結合部位をコラーゲン上にマッピングすることが必要である。しかし、コラーゲンの溶解度が低いこと、およびその独特の三重らせん構造のため、他の蛋白質において用いられている種々のマッピング方法を適用することができなかった。これまで、コラーゲン上における蛋白質結合部位の決定には、ロータリー・シャドウイング電子顕微鏡による観察、ＣＮＢｒフラグメント法、コラーゲン模倣ペプチド法などが用いられてきたが（Keene, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 21801-21804; Xu, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 38981-38989; Beher, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 1613-1620）、いずれの方法によっても、コラーゲン上に蛋白質結合部位をアミノ酸配列レベルで決定することは困難である。
【非特許文献１】Keene, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 21801-21804
【非特許文献２】Xu, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 38981-38989
【非特許文献３】Beher, et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 1613-1620
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、コラーゲン上の蛋白質結合部位をマッピングする新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識する方法であって、
ａ）  蛋白質のコラーゲン結合部位にシステイン残基を導入し；
ｂ）  前記システイン残基の−ＳＨ基に、光反応性基とジスルフィド結合とを有する光反応性架橋剤を導入し；
ｃ）  コラーゲンと蛋白質とを接触させ；
ｄ）  光を照射して前記光反応性架橋剤により蛋白質とコラーゲンとを架橋し；
ｅ）  架橋を切断してコラーゲン上に−ＳＨ基を生成し；そして
ｆ）  −ＳＨ基に標識を導入する、
の各工程を含む方法を提供する。
【０００５】
別の態様においては、本発明は、上述の標識方法により得られる、蛋白質結合部位が標識されたコラーゲンを提供する。
【０００６】
さらに別の態様においては、本発明は、光反応性基とジスルフィド結合とを有する光反応性架橋剤を含む、コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識するためのキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、光反応性性架橋剤を用いて、コラーゲン上の蛋白質結合部位を標識する方法を提供する。本発明において用いられる光反応性性架橋剤は、特定の波長の光により活性化されて蛋白質と共有結合を形成することができる光反応性基と、蛋白質上のチオール基と反応してジスルフィド結合を導入することができるジスルフィド基とを有する。光反応性基とジスルフィド基との間には所望の長さのスペーサー基を設けることができる。このような光反応性架橋剤の例としては、市販品として、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ；図１ａ；スペーサーアーム長さ２１Å）およびＮ−［（２−ピリジルジチオ）エチル］−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ；図４；スペーサーアーム長さ１４Å）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、適切な光反応性および適切な長さのスペーサー基を有する光反応性架橋剤を容易に設計し製造することができる。
【０００８】
本発明の方法により蛋白質結合部位をマッピングすることができるコラーゲンとしては、単品として精製可能であり、長い３本らせん領域を有するするものであれば、いずれのタイプのコラーゲンを用いてもよく、例えば、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＩＶ、ＶＩＩコラーゲンを用いることができる。また、コラーゲンに結合することが知られている蛋白質の例としては、色素上皮由来因子、ａＶｂ３インテグリン、抗血小板蛋白質(Haementeria officinalis)、ビグリカン、ビリルビン、ＢＭ４０／ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、カルシウム結合蛋白質ＭＲＰ８およびＭＲＰ１４、カリン(Hirudo medicinalis)、コラーゲン付随角膜分子、ＤＤＲ１ (ジスコイジンドメインレセプター1)、Entamoeba histolytica コラーゲン結合蛋白質、フィブロモジュリン、Ｇｌａ蛋白質、糖蛋白質ＶＩ、ルミカン、リンパ球膜分子、ミエリン付随糖蛋白質、神経細胞接着分子、プロマスチゴート、Staphylococcus aureus 細胞表面分子、Staphylococcus aureus マトリクス結合蛋白質、Streptococcus cricetus 結合分子、Streptococcus rattus 結合分子、テネシン−Ｃ、ビトロネクチン、フォンヴイルブランド因子、および抗コラーゲンモノクローナル抗体およびそのフラグメント等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの蛋白質のいずれについても、本発明の方法を用いることにより、コラーゲン上の蛋白質結合部位を同定することができる。
【０００９】
以下に、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（Kozaki, et al., J. Biol. Chem. 1997, 273, 15125-15130）をコラーゲン結合蛋白質のモデルとして、図１を参照しながら、本発明の方法によるコラーゲンの標識を説明する。ＰＥＤＦは、抗血管新生／神経栄養因子として知られており（Charder, G. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2001, 98, 2122-2124）、そのコラーゲン結合部位は同定されている（Yasui, et al., Biochemistry, 2003, 42, 3160-3167）。まず、部位特異的突然変異により、コラーゲン結合蛋白質のコラーゲン結合部位にシステイン残基を導入した変異体蛋白質を生成する（図１ｂ，工程ａ）。ここで、コラーゲン結合部位とは、コラーゲン結合蛋白質のコラーゲンに結合する領域またはその近傍に存在するアミノ酸残基をいう。適切に設計したプライマーを用いてＰＣＲ増幅反応を行うことにより、所望の位置に容易に変異を導入することができる。このような部位特異的突然変異法ならびに組換え変異体蛋白質を製造する方法は当該技術分野においてよく知られている。次に、光反応性架橋剤、例えばＡＰＤＰ（図１ａ）を蛋白質上のシステイン残基の−ＳＨ基に導入する（工程ｂ）。ＡＰＤＰ修飾蛋白質とコラーゲンとを接触させることによりこれらの複合体を形成させ（工程ｃ）、これに紫外線（ＵＶ）を照射することによりコラーゲンとコラーゲン結合蛋白質とを光反応性架橋剤により架橋する（工程ｄ）。このことにより、ＡＰＤＰ修飾蛋白質とコラーゲン上の蛋白質結合部位またはその近傍との間に共有結合による架橋が形成される。次に、この架橋のジスルフィド結合を還元により切断し、コラーゲン上に−ＳＨ基を新たに生成させる（工程ｅ）。一般にコラーゲン性三重らせんのほとんどはシステイン残基を有しないため、光架橋生成物中のジスルフィド結合を切断することにより、コラーゲン分子中にユニークな−ＳＨ基を導入することができる。この−ＳＨ基に標識を導入することにより、コラーゲン上の蛋白質結合部位またはその近傍を検出可能なように標識する（工程ｆ）。このような標識としては、−ＳＨ基と反応して検出可能な信号を発生することができるものであればいずれの標識を用いてもよい。例えば、蛍光標識する場合には、フルオレセイン−５−マレイミド（ＦＭ）などのマレイミド誘導体、Ｎ−［ヨードアセチルアミノエチル］−５−ナフチルアミン−１−スルホン酸などのヨードアセトアミド誘導体、アジリジン誘導体、水銀誘導体、ジスルフィド誘導体、ハロゲノベンゾフラザン誘導体等の各種の蛍光標識試薬を用いることができる。あるいは、放射性同位体を用いて放射性標識してもよく、Ｎ−ビオチノイル−Ｎ’−（６−マレイミドヘキサノイル）ヒドラジドなどを用いてビオチン標識してもよい。
【００１０】
以上のようにして標識されたコラーゲンは、例えば、２次元（２Ｄ）対角線電気泳動を用いることにより検出することができる。図３ａに、コラーゲンの標識された部位を蛍光スポットとして検出するための２次元対角線電気泳動システムの概略図を示す。光架橋生成物を非還元条件下で１次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、次にゲル中でＤＴＴによる還元を行う。蛋白質上の−ＳＨ基を蛍光標識した後、還元条件下で２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。このシステムを用いて、光架橋された結合パートナーをＵＶ光下でゲル上の蛍光スポットとして検出することができる。
【００１１】
さらに、適当な手段によりコラーゲンをフラグメント化した後に標識を検出することにより、コラーゲン上の蛋白質結合部位をさらに詳細にマッピングすることができる。また、ビオチンで標識した場合には、標識コラーゲンを断片化した後に、ストレプトアビジンビーズ等を用いた標識フラグメントのアフィニティー精製も可能である。コラーゲンをフラグメント化するためには、例えば、ＭＭＰ−１を用いることができる。ＭＭＰ−１はＮ−末端から３／４の距離の部位でコラーゲンＩを切断して、３／４長さのフラグメントと１／４長さのフラグメントとを生ずる。これらはそれぞれＴＣAおよびＴＣBと称される（Gross, J.; Nagai, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1965, 54, 1197-1204）。また、細菌コラゲナーゼを用いてコラーゲンのより小さいフラグメントを生成し、これを質量スペクトルおよび／またはエドマン分解法により分析することにより、コラーゲン上の蛋白質結合部位をアミノ酸配列のレベルで同定することができる。あるいは、ＣＮＢｒ分解や、他の蛋白質分解酵素を用いてコラーゲンをフラグメント化してもよい。
【００１２】
本発明にしたがえば、光反応性架橋剤を用いてコラーゲン中の蛋白質結合部位またはその近傍に−ＳＨ基を導入し、これを標識して検出することにより、コラーゲン中の蛋白質結合部位を容易にマッピングすることができる。本発明は、コラーゲンの機能ならびにコラーゲンと蛋白質との相互作用の解明に有用なツールを提供するものである。
【００１３】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】
突然変異誘発ＰＥＤＦ変異体の調製
色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）のコラーゲン結合部位が存在する部位（Ｆ３８３）、およびその部位の反対側の表面（Ｙ２１１）に部位特異的突然変異によりシステイン置換を導入した（図２ａ）。
【００１５】
先に記載されるように（Yasui, et al., Biochemistry, 2003, 42, 3160-3167）、ＰＥＤＦ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１をテンプレートとして、５’−および３’−ｐＧＥＸプライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＰＣＲによりマウスＰＥＤＦ遺伝子（受託番号ＡＦ０１７０５７）に部位特異的突然変異を導入した。この実験において用いた変異原プライマーは表１に示される。アミノ酸の番号付けは前駆体ポリペプチド配列に基づく。増幅したフラグメントを適当な制限酵素で消化し、ＰＥＤＦ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１の対応する部位に挿入した。すべての構築物は自動化ＤＮＡシークエンサー（モデルＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ  ３７７，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によりシークエンスして、リーディングフレームおよび変異が正しいことを確認した。ＰＥＤＦＤ２９９Ｎ／Ｆ３８３Ｃ変異体を作成するためには、ＰＥＤＦＦ３８３Ｃ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１をＢｐｕ１１０２ＩおよびＳａｌＩで消化し、ＰＥＤＦＤ２９９Ｎ／ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Yasui, et al., Biochemistry, 2003, 42, 3160-3167）の対応する部位の間に挿入した。
【００１６】
表１．変異原プライマーの配列
【表１】
2005172786.tif 000003
【実施例２】
【００１７】
ＡＰＤＰのコンジュゲーション
ＰＥＤＦ変異体に導入したシステインの−ＳＨ基をＮ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ）で官能化した。組換え大腸菌からのＰＥＤＦ変異体の精製は先に記載されるようにして行った（Yasui, et al., Biochemistry, 2003, 42, 3160-3167）。簡単には、ＧＳＴ融合ＰＥＤＦ蛋白質（ＧＳＴ−ＰＥＤＦ）をグルタチオン（ＧＳＨ）−セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、次にビーズ上のＧＳＴ−ＰＥＤＦを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，および１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むバッファー中でＦａｃｔｏｒ  Ｘａで処理した。必要な場合には、ＧＳＴ切断型のＰＥＤＦを含む画分をイオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ−２５カラムに画分を負荷し、次にフロースルー画分を回収した。精製した蛋白質は使用するまで−８０℃で保存した。
【００１８】
ＡＰＤＰによるＰＥＤＦ変異体の修飾は、以下のとおり行った。最初に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ2，５ｍＭ  ＥＤＴＡ中の６．７−１１．１μＭ（０．３−０．５ｍｇ／ｍｌ）のＰＥＤＦ蛋白質を、蛋白質の３０倍モル過剰のＡＰＤＰで暗所で３時間処理した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃、１５分間）した後、上清をＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化したセファデックスＧ−２５ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に負荷して未反応ＡＰＤＰを除去した。蛋白質濃度はブラッドフォードアッセイにより測定した。修飾蛋白質は使用するまで−８０℃で保存した。
【実施例３】
【００１９】
コラーゲン結合アッセイ
ＡＰＤＰ修飾ＰＥＤＦ（ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦ）の固定化コラーゲンＩへの結合を試験した。コラーゲンＩ（ＫＯＫＥＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）への固定化は、先に記載されているようにして行った（Koide, et al., J. Biol. Chem., 1999, 274, 34523-34526）。ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦのコラーゲンＩへの結合は、先に詳細に記載されているようにして調べた（Yasui, et al., Biochemistry, 2003, 42, 3160-3167）。簡単には、４μｇのＡＰＤＰ−ＰＥＤＦをバッファーおよび３０μｌのコラーゲンビーズと穏やかに混合した。次に、ビーズをバッファーで洗浄し、ビーズ中に保持された蛋白質を２ＸＳＤＳサンプルバッファーで溶出し、次にこれを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【００２０】
ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦＦ３８３Ｃ（ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃ）およびＡＰＤＰ−ＰＥＤＦＹ２１１Ｃ（ＡＰＤＰ−Ｙ２１１Ｃ）はコラーゲンＩに結合したが、コラーゲン結合部位における変異を有するＡＰＤＰ−ＰＥＤＦＤ２９９Ｎ／Ｆ３８３Ｃ（ＡＰＤＰ−Ｄ２９９Ｎ／Ｆ３８３Ｃ）は結合しなかった（図２ｂ）。
【実施例４】
【００２１】
光誘導性架橋
ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦ蛋白質をコラーゲンＩと混合し、ＵＶ照射を用いて光誘導性架橋反応を行った。架橋反応は、１μｇのコラーゲンＩ（ＫＯＫＥＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）および２μｇのＡＰＤＰ修飾ＰＥＤＦ変異体（ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦ）を含む２０μｌのＨＢＳ中で行った。反応溶液をカバーガラスの上に置き、氷上に置くことにより予冷した。必要な場合には、反応中の蛋白質量を１２μｇのコラーゲンＩおよび２．５μｇのＡＰＤＰ−ＰＥＤＦに変更した。ＵＶランプ（Ｍｏｄｅｌ  Ｌ２８５９−０１，ＨＡＭＡＭＡＴＳＵ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いて氷上で３．５ｃｍの距離で溶液にＵＶ光（波長３６５ｎｍ）を５秒間照射した。
【００２２】
次に、得られた架橋生成物を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色およびウエスタンブロッティングにより分析した。サンプルを０．２倍容量の５ＸＳＤＳ−サンプルバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ６．７，１０％ＳＤＳ，５０％グリセロール，０．０１％ブロモフェノールブルー）と混合し、次に９５℃で５分間加熱した。サンプルを８または９％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により非還元条件下で分離した。還元条件下で分析する場合には、ＤＴＴを０．１Ｍでサンプルに加えた。
【００２３】
抗ＰＥＤＦマウスモノクローナル抗体は森田育夫博士（Ｔｏｋｙｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した。光架橋生成物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜をＰＢＳ（−）中５％無脂ドライミルクで室温で６０分間ブロッキングし、次に２．５％無脂ドライミルク中１：３０００希釈の抗ＰＥＤＦ抗体とともに室温で６０分間インキュベートした。膜をＰＢＳ（−）で洗浄した後、１：２０００希釈のアルカリホスファターゼコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＩＯＲＡＤ）とともにインキュベートし、ＰＢＳ（−）で２回、ＰＢＳ（−）／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１回洗浄した。ＰＢＳ（−）ですすいだ後、アルカリホスファターゼコンジュゲート基質キット（ＢＩＯ  ＲＡＤ）でシグナルを発色させた。
【００２４】
ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃを用いる光架橋反応により、ＵＶ照射に依存して架橋生成物に対応するバンドが検出された（図２ｃ）。一方、ＡＰＤＰ−Ｙ２１１ＣおよびＡＰＤＰ−Ｄ２９９Ｎ／Ｆ３８３Ｃはいずれも、コラーゲンＩと架橋しなかった（図２ｃ）。これらの結果は、ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦがコラーゲン結合活性を有し、かつ光架橋剤が構造的に近接している場合にのみ架橋が導入されたことを示す。光架橋生成物をＤＴＴで処理すると、対応するバンドが消失し、このことにより完全なジスルフィド結合の存在が示された（図２ｄ）。図中、矢印は光架橋生成物に対応するバンドを示す。
【実施例５】
【００２５】
フルオレセイン−５−マレイミド（ＦＭ）標識および２次元対角線電気泳動
フルオレセイン−５−マレイミド（ＦＭ）修飾（図１ｂ，工程ｆ）と２次元（２Ｄ）対角線電気泳動（図３ａ）との組み合わせを用いて、架橋生成物を分析した。
【００２６】
１次元目の電気泳動として、架橋生成物を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ｍｍ厚さのゲル）で非還元条件下で分離した。レーンをゲルから切り出し、０．１ＭＤＴＴを含む１ＸＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ６．７，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，０．００２％ブロモフェノールブルー）に穏やかに振盪しながら２０分間２回浸漬した。過剰のＤＴＴを除去するために、ゲルをＴＥＳバッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ）で穏やかに振盪しながら２０分間４回洗浄した。次にゲルを暗所でＴＥＳ中０．１ｍＭフルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ）中に６０分間浸漬して、蛋白質上のＳＨ基を標識した。過剰のＦＭを除去するために、ゲルを暗所でＴＥＳバッファー中１０ｍＭ  ＤＴＴで２０分間３回処理した。最後に、１０ｍＭ  ＤＴＴを含む１ＸＳＤＳサンプルバッファーでゲルを平衡化した。
【００２７】
２次元目の電気泳動は、上述のように還元しＦＭで処理したゲルを、別のゲル（２ｍｍ厚さ、ゲルの濃度は１次元目と同じ）に水平に適用して行った。サンプルが分離ゲル中に入った後、１次元目のゲルをウエルから除去した。電気泳動は暗所で行った。泳動後、バンドをＵＶ光下で蛍光により検出し、次にゲルをＣＢＢで染色した。
【００２８】
図３ｂに示されるように、ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃの架橋されたパートナーは蛍光スポットとして検出され（右パネル）、続いてゲルをＣＢＢ染色することにより、このスポットがコラーゲンＩのα２鎖に由来すると判定された（左）。
【実施例６】
【００２９】
光架橋生成物のＭＭＰ−１消化
光架橋生成物をＭＭＰ−１で処理して、コラーゲンＩ中の架橋部位をマッピングした。ＭＭＰ−１はＮ−末端から３／４の距離の部位でコラーゲンＩを切断して、３／４長さのフラグメントと１／４長さのフラグメントとを生ずる。これらはそれぞれＴＣAおよびＴＣBと称される（Gross, J.; Nagai, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1965, 54, 1197-1204）。１２μｇのコラーゲンＩおよび２．５μｇのＡＰＤＰ修飾ＰＥＤＦＦ３８３Ｃを２０μｌのＨＢＳ中に含む反応混合物を調製し、上述したように光架橋を行った。光架橋生成物を２４μｌの０．７Ｕ／ｍｌＭＭＰ−１と混合し、２５℃で１２時間インキュベートした。ＥＤＴＡを５ｍＭで加えることにより切断反応を停止させた。次にサンプルを０．２倍容量の５ＸＳＤＳ−サンプルバッファーと混合し、９５℃で５分間加熱した。１２％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、バンドをＵＶ光下で蛍光により検出し、次にゲルを銀で染色した。
【００３０】
２Ｄ電気泳動の結果、主としてα２鎖のＴＣBフラグメントに架橋が存在することが示された（図３ｃ）。この結果は、ＰＥＤＦがコラーゲンＩのＣ末端１／４に結合することを示す。
【実施例７】
【００３１】
ＰＥＡＳ（短鎖光反応性架橋剤）の使用
Ｎ−［（２−ピリジルジチオ）エチル］−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ）（Chen, et al., Science, 1994, 265, 90-92）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。ＰＥＡＳの分子構造を図４に示す。ＰＥＤＦ変異体のＰＥＡＳによる修飾、光誘導性架橋、ＦＭ標識および２Ｄ電気泳動はＡＰＤＰの場合と同様に行った。
【００３２】
図４に示されるように、ＵＶ照射によりＰＥＡＳ−ＰＥＤＦＦ３８３Ｃの架橋生成物に対するバンドを検出した（矢印で示される）。架橋生成物をＤＴＴで処理すると、シフトしたバンドが消失し、このことは、完全なジスルフィド結合が存在することを示す。図５は、２Ｄ電気泳動により分離した架橋生成物のＭＭＰ−１消化産物の蛍光スポットの検出を示す。矢印は、ＰＥＡＳ−ＰＥＤＦＦ３８３Ｃの光架橋されたパートナー（コラーゲンＩのＴＣBフラグメント）に対応するスポットを示す。この結果から、ＰＥＡＳ修飾ＰＥＤＦの架橋されたパートナーはＴＣBフラグメントであることがわかる。すなわち、より短いスペーサーアームを有するＰＥＡＳもＡＰＤＰと同じ条件下で用いることができることがわかった。
【実施例８】
【００３３】
非特異的架橋の可能性の考察
この実施例においては、望ましくない分子間および分子内架橋の可能性について調べた。そのような非特異的架橋が生ずるか否かを判定するために、種々の量のコラーゲンＩおよび５μｇのＡＰＤＰ−ＰＥＤＦＦ３８３Ｃ（ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃ）を用いて光架橋反応を行った。ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃのみを含む反応混合物をＵＶで照射したとき（すなわち、コラーゲンＩの量は０）、ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃの分子間架橋（すなわち、ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃ分子の間の架橋）により生ずるオリゴマーに対応するバンドはＣＢＢ染色では検出されなかった（図６）。種々の量のコラーゲンＩを用いた場合にも同様の結果が得られた。これらの結果は、この実験系ではＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃの分子間架橋は検出可能なほど生じなかったことを示す。
【００３４】
一方、図６において＊で示されるバンドがＵＶ照射により検出された。このバンドは、ゲル上でＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃよりわずかに速く移動し（図６）、ＤＴＴ処理により消失した（データ示さず）。したがって、このバンドは、分子内架橋（すなわち、ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃ分子のそれ自身への架橋）により生じたようである。しかし、特異的光架橋生成物の量は、反応で用いたコラーゲンＩの量に応じて増加した（図６）。このことは、主としてＡＰＤＰ−Ｆ３８３ＣのコラーゲンＩへの架橋が生じたことを示す。
【実施例９】
【００３５】
架橋の定量的測定
ＡＰＤＰ−Ｆ３８３ＣのコラーゲンＩへの架橋の効率を評価するために、ＳｃｉｏｎＩｍａｇｅソフトウエアを用いて２Ｄ−ＰＡＧＥにより分離したゲル上の蛋白質スポットの密度計分析を行った。ＡＰＤＰ−Ｆ３８３Ｃの約８％がコラーゲンＩのα２鎖と架橋していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ＡＰＤＰの構造およびコラーゲン中の架橋された部位の光架橋および蛍光標識の工程を示す。
【図２】図２は、ＰＥＤＦの構造、ＡＰＤＰで修飾したＰＥＤＦ変異体（ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦ）の結合プロファイル、ＡＰＤＰ−ＰＥＤＦのコラーゲンＩへの光架橋、ならびにＤＴＴによる架橋生成物の還元を示す。
【図３】図３は、２次元（２Ｄ）対角線電気泳動システムの概略図ならびにこれを用いる架橋生成物の分析結果を示す。
【図４】図４は、ＰＥＡＳ修飾ＰＥＤＦのコラーゲンＩへの光架橋を示す。
【図５】図５は、ＰＥＡＳ−ＰＥＤＦＦ３８３Ｃの架橋されたパートナーの２Ｄ電気泳動による検出を示す。
【図６】図６は、種々の量のコラーゲンＩを用いる光架橋を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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