(57)【要約】【課題】        抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の生産菌の培養液に含まれる類縁物質を除去し、精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の工業的生産方法の確立。【解決手段】    抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液又はその処理液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。好ましくは抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液又はその処理液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、その後強酸を加えてｐＨ１〜３に調整する工程、次いで強塩基を加えて再度ｐＨ１２〜１３に調整する工程、更に塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、請求項１記載の精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液又はその処理液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。
【請求項２】
抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液又はその処理液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、その後強酸を加えてｐＨ１〜３に調整する工程、次いで強塩基を加えて再度ｐＨ１２〜１３に調整する工程、更に塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、請求項１記載の精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。
【請求項３】
培養液中の菌体を分離する工程を含まない、請求項１又は２記載の精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。
【請求項４】
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を陰イオン交換型樹脂に直接吸着させて、不溶性の類縁物質と分離する工程を含む請求項１乃至３記載の精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。
【請求項５】
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を多孔性吸着樹脂を充填したカラムに通液、吸着させて、溶出することにより、類縁物質と分離する工程を含む請求項１乃至４記載の精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製された抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の新規製造方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質は、化学名１−ヒドロキシ−２−（２−ｔｒａｎｓ−ノネニル）−３−メチル−４（１Ｈ）−キノロンであり、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌やヘリコバクター・ピロリ菌に対する抗菌活性が知られている有用な医薬化合物である（例えば、特許文献１、２参照）。
精製された抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法として特許文献１の実施例１には、生産菌株であるアルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株（国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２６）の培養液を遠心分離して得た上清液（ｐＨ７）に酢酸エチルを加えて振盪して目的物質を抽出し、得られた粗抽出物をシリカゲル薄層プレートを用いて精製する方法が記載されている。また、特許文献１の実施例２及び非特許文献１には、この粗抽出物をシリカゲルクロマトグラフィーとＯＤＳ−ＨＰＣＬで精製する方法が記載されている。
一方、特許文献３には、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質とは異なる１−ヒドロキシ−３−メチル−４（１Ｈ）−キノロン誘導体を生産するアルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株の変異株ＸＩ−５１１株の培養液を、硫酸でｐＨ２．０に調整して滅菌した後、水酸化ナトリウムを加えてｐＨ９．０に調整してダイヤイオンＨＰ２１に吸着にさせた後、ＨＰ２１をカラムに移してメタノール溶出し、これを繰り返して目的物質を精製する方法が記載されている。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−１８９号公報
【特許文献２】特開平１１−２９４７９号公報
【特許文献３】特開２００１−２２６３５５号公報
【非特許文献１】上桐、「ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオティクス」１９９６年、第４９巻、第８号、ｐ．８２３−８２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の工業生産方法を検討する過程で、アルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株及びその変異株の培養液中に２−（２−ｔｒａｎｓ−ノネニル）−３−メチル−４（１Ｈ）−キノリン（以下「ＮＨ体」と称する）や１−ヒドロキシ−２−（２−ｔｒａｎｓ−ノネニル）−４（１Ｈ）−キノロン（以下「ＤＭ体」と称する）等の類縁物質が存在すること、及び、精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質を得るためにはこれらの類縁物質の除去が必要であり、特に培養液中にＹＬ−０２７２９Ｓ物質に次いで多量に存在するＮＨ体の除去が必要であることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質がｐＨ１２〜１３の強塩基性環境において最も溶解性が高く（溶解度２ｍｇ／ｍｌ）しかも安定であること、強塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質は類縁物質と分離し易く、特にＮＨ体など強塩基性環境において不溶な類縁物質とは容易に分離できることを見出して発明を完成させた。
即ち、本発明は、抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液又はその処理液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、精製された抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法に関する。
【０００６】
更に、この培養液を強塩基性にした際に菌体の殺菌・分解により高粘性となるが、一旦ｐＨ１〜３に調整することで粘度が低下すること、更に再度ｐＨ１２〜１３とすることで低粘性のまま抗生物質ＹＬ−２７２９Ｓ物質の溶解液を得ることができるので、菌体を分離する為の遠心分離やろ過等の操作が不要であることを見出し、発明を完成させた。
即ち、本発明は、抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物の培養液に、強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整する工程と、その後強酸を加えてｐＨ１〜３に調整する工程、次いで強塩基を加えて再度ｐＨ１２〜１３に調整する工程、更に塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程を含む、精製された抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の製造方法に関する。工業的製造方法として好ましくは、遠心分離やろ過等の培養液中の菌体を分離する工程を含まない。
【０００７】
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程としては、例えば陰イオン交換型樹脂や多孔性吸着樹脂を用いる方法が挙げられる。陰イオン交換型樹脂は、溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を直接吸着させてＮＨ体など不溶性の類縁物質の除去に適している。多孔性吸着樹脂は、バッチ吸着のみならず、多孔性吸着樹脂を充填したカラムにＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶解液を通液することにより吸着させることができ、溶出条件によりＤＭ体など溶解性の類縁物質の除去に用いることができる。従って、陰イオン交換型樹脂と多孔性吸着樹脂を組み合わせて用いることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
培養液中のＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶解により、多孔性吸着樹脂やイオン交換樹脂を用いて容易に類縁物質を除去することができる。また、菌体を分離する為の遠心分離やろ過操作を必要としない点でも工業的生産方法として優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の各工程につき詳述する。
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を生産する能力を有する微生物として好適なものとしては、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されているアルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６３２６号）及びＸＩ−５１１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０５号）等その変異株が挙げられるが、これらに限らず、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の生産菌であればよい。ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の生産菌の培養は特許文献１、特許文献３、非特許文献１に記載された方法、又は一般微生物の培養方法に準じて行うことができる。
即ち、生産菌の栄養源を含有する培地に接種し、好気的に発育させることにより、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を含む培養物が得られる。培養法としては、静置培養、振盪培養等の液体培養が用いられるが、工業的生産には特に通気攪拌培養が好ましい。培養温度は１５℃〜３７℃の範囲、培地のｐＨは４〜９の範囲、培養時間は通常１０時間〜１６８時間の範囲で各々適宜変更できる。アルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株の場合に好ましいのは、培養温度は約２８〜３２℃、培地のｐＨは６〜８、培養時間は２４時間〜９６時間の範囲である。
【００１０】
こうして得られた培養液又はその処理液に強塩基を加えてｐＨ１２〜１３に調整してＹＬ−０２７２９Ｓ物質を溶解する。強塩基としては、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムが用いられる。培養液を直接強塩基性環境にして３０分〜２時間程度攪拌する操作によって、菌体を死滅、分解することができる。
この操作によって培養液の粘度が上昇するので、強酸を添加してｐＨ１〜３付近に調整し、３０分〜２時間程度攪拌する操作によって粘度を低下させることが望ましい。強酸としては、塩酸、硫酸又は硝酸が用いられる。その後強塩基を添加して再度ｐＨ１２〜１３に調整することにより、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を溶解する。こうして得られたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶解液は低粘度であり、類縁物質との分離工程の前に遠心分離やろ過操作は不要である。
【００１１】
類縁物質とは、培養液中に存在するＹＬ−０２７２９Ｓ物質以外のキノロン骨格を有する化合物である。代表的にはＮＨ体とＤＭ体であるが、その他に含まれる類縁物質は生産菌によって異なる。例えば、ＸＩ−５１１株の培養液には特許文献３に記載された１−ヒドロキシ−３−メチル−４（１Ｈ）−キノロン誘導体が含まれる。
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を類縁物質と分離する工程には、例えば多孔性吸着樹脂を用いる工程（以下「ＨＰ工程」と称する）と陰イオン性交換樹脂を用いる工程（以下「ＳＡ工程」と称する）が挙げられる。ＳＡ工程によって主としてＮＨ体等の塩基性環境で不溶性類縁物質を除去することができ、ＨＰ工程によって主としてＤＭ体等の塩基性環境で溶解性の類縁物質を除去することができる。
【００１２】
（ＨＰ工程）
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を多孔性吸着樹脂に吸着させて、含水有機溶媒の濃度差によってＹＬ−０２７２９Ｓ物質と類縁物質を分離する工程である。多孔性吸着樹脂としては、スチレン系吸着型樹脂として市販されているものを用いることが可能であり、このような市販品としてダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２１、ダイヤイオンＳＰ２０７、ダイヤイオンＳＰ８５０、ダイヤイオンＳＰ９００（いずれも商品名、三菱化学）やアンバーライトＸＡＤ−２（商品名、ローム・アンド・ハース）等が用いられる。タンク中で多孔性吸着樹脂とＹＬ−０２７２９Ｓ物質溶解液を１〜１０時間攪拌するバッチ吸着でもよいが、多孔性吸着樹脂を充填したカラムにＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶解液をＳＶ＝１〜５（ＳＶ：空間速度、１時間当たりの通液量をレジン量で除した値）の速度で通液することにより、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を多孔性吸着樹脂に吸着することができる。その後、水や４０〜５０％のアセトン水（硫酸酸性：ｐＨ２）をＳＶ＝２〜１０の速度でカラムに通液する操作により洗浄を行い不純物を流去する。ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶出は、含水有機溶媒が好適であり、その有機溶媒濃度を設定することにより、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質が溶離可能なものであればよい。このような水に可溶な有機溶媒としては、アセトン等のケトン類、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類が挙げられる。中でもアセトン、メタノール、水の混合溶媒が好適に用いられる。ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶出条件は、類縁体の分離条件を適宜選択設定して行うが、例えば、５０〜８０％アセトン水（アセトン／メタノール／水＝５０〜８０／４５〜１５／５）を用いる場合はＳＶ＝２〜３の速度で溶出するのが好適である。
【００１３】
（ＳＡ工程）
塩基性環境で溶解したＹＬ−０２７２９Ｓ物質を陰イオン性交換樹脂に吸着させて、樹脂に吸着しない類縁物質を分離した後、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を溶出する工程である。陰イオン性交換樹脂としては、市販されているＳＡ１２Ａ、ＳＡ１０Ａ，ＳＡ１１Ａ，ＳＡ２０Ａ，ＳＡ２１Ａ、ＰＡ３１６、ＰＡ４１８、ＰＡ３０６、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１８、ＰＡ４０６，ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１６等が挙げられる。カラム吸着も可能であるが、通常、陰イオン性交換樹脂にＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶解液を接触させ、１〜１０時間攪拌することにより、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を陰イオン性交換樹脂に吸着させるバッチ吸着が用いられる。その後、陰イオン性交換樹脂を水で洗浄する。ＹＬ−０２７２９Ｓ物質はアセトン、メタノール又はエタノールの２０〜８０％水溶液にＮａＣｌを１〜５％添加した溶媒により溶出することができ、溶出条件を適宜選択設定して行う。例えば、陰イオン性交換樹脂としてＳＡ１２Ａを用いる場合は８０〜９０％メタノール水（３．８％ＮａＣｌ）で溶出するのが好適である。
【００１４】
こうして得られたＹＬ−０２７２９Ｓ物質の溶出液は濃縮、結晶化、乾燥することにより、精製されたＹＬ−０２７２９Ｓ物質を高純度高収率で取得することができる。また、加熱や強塩基性条件での分液抽出等の常法により更に純粋に精製することもできる。
【実施例】
【００１５】
以下に実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。以下の実施例等において、「ＮＨ体」とは２−（２−ｔｒａｎｓ−ノネニル）−３−メチル−４（１Ｈ）−キノリンを意味し、「ＤＭ体」とは（１−ヒドロキシ−２−（２−ｔｒａｎｓ−ノネニル）−４（１Ｈ）−キノロンを意味する。
【００１６】
実施例１
特開２００１−２２６３５５号の実施例１と同様の方法で得られた培養液４８００Ｌに２５％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ＝１３に調整した後、１時間攪拌した。得られた処理液の品質は以下の通りであった。
（ｐＨ１３ブロス処理液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  １９２３ｇ
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝１９．４％、ＤＭ体＝１１．８％
【００１７】
上記ブロス処理液に１２００Ｌの水を加え希釈し、３５％硫酸溶液を用いてｐＨ２．０に調整した後、１時間攪拌した。次に２５％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ＝１３に調整した後、水を加えて７０００Ｌとした。
得られた培養液の処理液を、レジンＨＰ２１（２５０Ｌ）を充填したをカラムに、０．２５ｍ3〜０．７５ｍ3／ｈｒで通液し、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を吸着した。次に、２５００Ｌの水を用いて、０．５〜２．０ｍ3／ｈｒで水洗した。次に４０％アセトン水（硫酸酸性：ｐＨ２）７５０Ｌを用いて、０．５〜０．７５ｍ3／ｈｒで洗浄した。次に、１２５０Ｌの水を用いて、０．５〜２．０ｍ3／ｈｒで水洗した。次に、８０％アセトン水（アセトン／メタノール／水＝８０／１５／５）５００Ｌを用いて、０．５ｍ3／ｈｒで溶出し、主留分２００〜４００Ｌを分取した。得られた溶出液の品質及び収率は以下の様になった。
（ＨＰ２１溶出液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  １６８２ｇ（ブロス処理液からの収率＝８７．５％）
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝１７．５％、ＤＭ体＝１０．２％
【００１８】
得られたレジンＨＰ２１溶出液を４５〜５５℃で蒸留濃縮した後、濃縮残量と同容量のアセトニトリルを加え、１０時間以上攪拌し結晶を析出させた。次に、得られた結晶を遠心分離装置を用い回収した後、４０℃で１０時間乾燥した。結晶の品質及び収率は以下の様になった。
（結晶）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  １５９０ｇ（ブロス処理液からの収率＝８２．７％）
結晶純度  ７０．３％
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝１３．６％、ＤＭ体＝１１．３％
【００１９】
実施例２
実施例２−１
特開２００１−２２６３５５号の実施例１と同様の方法で得られた培養液４８００Ｌに２５％水酸化ナトリウムを加えｐＨ＝１３に調整した後、３０分間攪拌した。得られた処理液の品質は以下の通りであった。
（ｐＨ１３ブロス処理液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ４１６０ｇ
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝４１．４％、ＤＭ体＝１５．１％
【００２０】
上記ブロス処理液に３５％硫酸溶液を用いてｐＨ２．０に調整した後、３０分間攪拌した。次に、２５％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ＝１３に調整した。
次に、得られた培養液の処理液を、レジンＳＡ１２Ａ（６００Ｌ）を充填したタンクに入れ、３〜６時間攪拌しＹＬ−０２７２９Ｓ物質を吸着した。次に、培養液の処理液を排出した後、２５００Ｌの水を加え、１０分間攪拌しレジンを水洗した。この水洗操作を５回行った。次に、９０％メタノール水（３．８％ＮａＣｌ）１２００Ｌを用いて、３時間以上攪拌を行い、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を溶出した後、溶出液を分離する（溶出液(1)）。
次に８０％メタノール水（２．５％ＮａＣｌ）１２００Ｌを用いて、３時間以上攪拌を行いＹＬ−０２７２９Ｓ物質を溶出した後、溶出液を分離した（溶出液(2)）。溶出液(1)と溶出液(2)を合わせて得られた溶出液の品質及び収率は、以下の様になった。
（ＳＡ１２Ａ溶出液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ３３８０ｇ（ブロス処理液からの収率＝８１．３％）
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝４．５％、ＤＭ体＝２５．８％
【００２１】
得られた溶出液２４００Ｌに、水を加えて７２００Ｌに希釈した後、ＨＰ２１（２００Ｌ）を充填したカラムに、０．８〜１．２ｍ3／ｈｒで通液しＹＬ−０２７２９Ｓ物質を吸着した。次に、２０００Ｌの水を用いて、０．８〜２．０ｍ3／ｈｒで水洗した。次に、５０％メタノール水（硫酸酸性：ｐＨ２）４００Ｌを用いて、０．４〜０．６ｍ3／ｈｒで洗浄した。次に、１０００Lの水を用いて、０．４〜２．０ｍ3／ｈｒで水洗した。次に、５０％アセトン水（アセトン／メタノール／水＝５０／４５／５）１０００Ｌを用いて、０．４〜０．６ｍ3／ｈｒで溶出し、ＹＬ−０２７２９Ｓ物質の主留分８００Ｌを分取した。得られた溶出液の品質及び収率は以下の様になつた。
（ＨＰ２１溶出液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ２９４０ｇ（ブロス処理液からの収率＝７０．７％）
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝１１．３％、ＤＭ体＝２１．０％
【００２２】
実施例２−２
アルスロバクター  エスピー  ＹＬ−０２７２９Ｓ株を、特開２００１−２２６３５５号に記載の方法で培養し、得られた培養液１３ｍ3を、実施例１と同様に精製した。培養液、ＳＡ１２Ａ溶出液及びＨＰ２１の溶出液の品質と収率は以下の様になった。
（ｐＨ１３ブロス処理液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ６８５０ｇ
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝３２．７％、ＤＭ体＝１７．７％
（ＳＡ１２Ａ溶出液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ５６００ｇ（ブロス処理液からの収率＝８１．８％）
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝５．８％、ＤＭ体＝２４．９％
（ＨＰ２１溶出液）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ４６３０ｇ（ブロス処理液からの収率＝６７．６％）
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝１０．１％、ＤＭ体＝１９．４％
【００２３】
実施例２−３
実施例２−１と実施例２−２で得られたＨＰ２１溶出液を合わせ、４５〜５５℃で蒸留濃縮した後、濃縮残量と同容量のアセトニトリルを加え、１０時間以上攪拌し結晶を析出させた。次に、得られた結晶を遠心分離装置を用い回収した後、４０℃で１０時間乾燥した。結晶の品質及び収率は以下の様になった。
（結晶）
ＹＬ−０２７２９Ｓ物質  ７２６０ｇ（ブロス処理液からの収率＝６５．９％）
結晶純度＝６５．３％
不純物の含有量（液体クロマトグラフィー法面積百分率）
ＮＨ体＝５．５％、ＤＭ体＝１９．４％
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によれば、精製された抗生物質ＹＬ−０２７２９Ｓ物質を高純度、高収率で得ることができる。