(57)【要約】【課題】ヘテロジニアス法で要求されるB-F分離の工程が不要で、より簡便に、同じ病原体に関する抗原と抗体を同時に検査する方法、装置及び試薬を提供すること。【解決手段】本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、検体と、を混和して測定用試料を調製する工程と、前記工程にて調製された測定用試料から第一、第二の光学的情報を検出する工程と、前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度を求める工程と、前記工程にて求められた第一の担体粒子の凝集度に基づき第一の抗原を検出し、第二の担体粒子の凝集度に基づき第二の抗原に対する抗体を検出する工程と、を有する免疫測定方法を提供する。【選択図】図６
2005172546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、検体と、を混和して測定用試料を調製する工程と、
前記工程にて調製された測定用試料から第一、第二の光学的情報を検出する工程と、前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度を求める工程と、
前記工程にて求められた第一の担体粒子の凝集度に基づき第一の抗原を検出し、第二の担体粒子の凝集度に基づき第二の抗原に対する抗体を検出する工程と、を有する免疫測定方法。
【請求項２】
前記第一の光学的情報は蛍光強度である、請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】
前記第二の光学的情報は前方散乱光強度である、請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項４】
前記病原体は、B型肝炎ウィルスである、請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項５】
前記第一の抗原は、HBs抗原である、請求項４に記載の免疫測定方法。
【請求項６】
前記第二の抗原に対する抗体は、抗HBc抗体である、請求項４に記載の免疫測定方法。
【請求項７】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、検体と、を混和して測定用試料を調製する測定用試料調製部と、
調製された測定用試料から第一、第二の光学的情報を検出する光検出部と、
光検出部が検出した光学的情報を解析する解析部と、を有する免疫測定装置であり、  
解析部は、光検出部が検出した第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、光検出部が検出した第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度と第二の担体粒子の凝集度とを求める、免疫測定装置。
【請求項８】
前記第一の光学的情報は蛍光強度である、請求項７に記載の免疫測定装置。
【請求項９】
前記第二の光学的情報は前方散乱光強度である、請求項７に記載の免疫測定装置。
【請求項１０】
前記病原体は、Ｂ型肝炎ウィルスである、請求項７に記載の免疫測定装置。
【請求項１１】
前記第一の抗原は、HBs抗原である、請求項１０に記載の免疫測定装置。
【請求項１２】
前記第二の抗原に対する抗体は、抗HBc抗体である、請求項１０に記載の免疫測定装置。
【請求項１３】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、
前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、を含む免疫測定用試薬であって、
第一の担体粒子と第二の担体粒子は蛍光色素の含有状態が互いに異なる、免疫測定用試薬。
【請求項１４】
前記第一の担体粒子と第二の担体粒子は粒径が同じである、請求項１３に記載の免疫測定用試薬。
【請求項１５】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作され、前記第一の抗原の存在下で凝集する第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作され、該第二の抗原に対する抗体の存在下で凝集する第二の担体粒子と、検体と、を混和して試料を調製する試料調製工程と、
前記試料調製工程にて調製された試料中の各粒子の物理特性を検出する物理特性検出工程と、前記試料調製工程にて調製された試料中の各担体粒子の凝集度を検出する凝集度検出工程と、
検出された担体粒子の物理特性と凝集度に基づき、前記第一の抗原の存在と前記第二の抗原に対する抗体の存在を検出する分析工程と、を有する免疫測定方法であって、
前記第一及び第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定方法。
【請求項１６】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作され、前記第一の抗原の存在下で凝集する第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作され、該第二の抗原に対する抗体の存在下で凝集する第二の担体粒子と、検体と、を混和して試料を調製する試料調製手段と、
前記試料調製手段にて調製された試料中の各粒子の物理特性を検出する物理特性検出手段と、前記試料調製手段にて調製された試料中の各担体粒子の凝集度を検出する凝集度検出手段と、
検出された担体粒子の物理特性と凝集度に基づき、前記第一の抗原の存在と前記第二の抗原に対する抗体の存在を検出する分析手段と、を有する免疫測定装置であって、
前記第一及び第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定装置。
【請求項１７】
病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、
前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、を含む免疫測定用試薬であって、
第一の担体粒子と第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液、尿、腹水などの検体に含まれる物質を、抗原抗体反応を利用して検出する技術に関し、更に詳しくは、同じ病原体に関する抗原と抗体を同時に検査する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用して、血液等の検体から特定の抗原や抗体を検出する免疫測定方法が、臨床検査の分野で広く用いられている。そのような方法としては、ラジオイムノアッセイ（RIA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、フルオロイムノアッセイ（FIA）、粒子凝集法、等の様々な方法が知られている。粒子凝集法では、測定対象物である抗原又は抗体を含むと思われる検体と、測定対象物に対応する抗体又は抗原を感作した担体粒子とを混和する。検体中に測定対象物が存在すると、抗原抗体反応により担体粒子が凝集するので、その凝集を光学的に検出する。
【０００３】
B型肝炎ウィルス（HBV）やC型肝炎ウィルス（HCV）、エイズウイルス（HIV）など、感染症の原因となる病原体が数多く知られている。患者に対してある病原体の感染が疑われる場合、この病原体に由来する抗原、或いはこの病原体に対して患者の体内で産生された抗体を、患者から採取した血液や尿などの検体から検出することにより、病原体による感染の有無を検査する。感染からの時間の経過度合や、病原体の種類によっては、感染後の患者から抗原と抗体の両方が必ずしも検出されるわけではない。そこで、病原体による感染を確実に検出するためには、抗原の検査と抗体の検査の両方を行う必要がある。また、患者から採取した検体中に含まれる抗原及び抗体の量を経時的に捉え、感染症患者の治療の経過を観察するためにも、抗原の検査と抗体の検査の両方を行う必要がある。
【０００４】
一つの病原体による感染に関して複数の検査を行うことは煩雑であるため、一つの試料に対し同じ病原体に関する抗原の検査と抗体の検査を同時に行う方法が望まれていた。そのような方法としては、特許文献１に記載の方法のように、B-F分離が必要であるヘテロジニアス法の原理に基づいた方法が知られている。
【特許文献１】特開平６−２６５５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の解決課題は、ヘテロジニアス法で要求されるB-F分離の工程が不要で、より簡便に、同じ病原体に関する抗原と抗体を同時に検査する方法、装置及び試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題に鑑み本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、検体と、を混和して測定用試料を調製する工程と、前記工程にて調製された測定用試料から第一、第二の光学的情報を検出する工程と、前記工程にて検出された第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度及び第二の担体粒子の凝集度を求める工程と、前記工程にて求められた第一の担体粒子の凝集度に基づき第一の抗原を検出し、第二の担体粒子の凝集度に基づき第二の抗原に対する抗体を検出する工程と、を有する免疫測定方法を提供する。
【０００７】
また本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、検体と、を混和して測定用試料を調製する測定用試料調製部と、調製された測定用試料から第一、第二の光学的情報を検出する光検出部と、光検出部が検出した光学的情報を解析する解析部と、を有する免疫測定装置であり、解析部は、光検出部が検出した第一の光学的情報に基づき第一の担体粒子と第二の担体粒子とを弁別し、光検出部が検出した第二の光学的情報に基づき第一の担体粒子の凝集度と第二の担体粒子の凝集度とを求めることを特徴とする、免疫測定装置を提供する。
【０００８】
また本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、を含む免疫測定用試薬であって、第一の担体粒子と第二の担体粒子は蛍光色素の含有状態が互いに異なる、免疫測定用試薬を提供する。
【０００９】
また本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作され、前記第一の抗原の存在下で凝集する第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作され、該第二の抗原に対する抗体の存在下で凝集する第二の担体粒子と、検体と、を混和して試料を調製する試料調製工程と、前記試料調製工程にて調製された試料中の各粒子の物理特性を検出する物理特性検出工程と、前記試料調製工程にて調製された試料中の各担体粒子の凝集度を検出する凝集度検出工程と、検出された担体粒子の物理特性と凝集度に基づき、前記第一の抗原の存在と前記第二の抗原に対する抗体の存在を検出する分析工程と、を有する免疫測定方法であって、前記第一及び第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定方法を提供する。
【００１０】
また本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作され、前記第一の抗原の存在下で凝集する第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作され、該第二の抗原に対する抗体の存在下で凝集する第二の担体粒子と、検体と、を混和して試料を調製する試料調製手段と、前記試料調製手段にて調製された試料中の各粒子の物理特性を検出する物理特性検出手段と、前記試料調製手段にて調製された試料中の各担体粒子の凝集度を検出する凝集度検出手段と、検出された担体粒子の物理特性と凝集度に基づき、前記第一の抗原の存在と前記第二の抗原に対する抗体の存在を検出する分析手段と、を有する免疫測定装置であって、前記第一及び第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定装置を提供する。
【００１１】
また本発明は、病原体に由来する第一の抗原に対する抗体が感作された第一の担体粒子と、前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原が感作された第二の担体粒子と、を含む免疫測定用試薬であって、第一の担体粒子と第二の担体粒子は、それぞれ異なる物理特性を有する、免疫測定用試薬を提供する。 
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、B-F分離の工程を必要とせず、容易かつ簡便に、同じ病原体に関する抗原と抗体を同時に検査することができる。またそれにより、患者が病原体に感染していることをより確実に捉えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態の一例である免疫測定装置及び免疫測定用試薬を用いての測定につき説明する。しかし本発明がこの実施形態に限定されるわけではない。
【００１４】
概要
以下に説明する測定は、B型肝炎ウィルスの感染を検査することを目的としている。本実施形態は粒子凝集法の原理を応用したものであり、HBs抗原及び抗HBc抗体の二項目につき同時に検出を行うものである。HBs抗原はＢ型肝炎ウィルスに由来する抗原である。抗HBc抗体は、HBc抗原（B型肝炎ウィルスに由来するがHBs抗原とは異なる抗原である）に対応する抗体である。
【００１５】
試薬
以下に説明するラテックス試薬と反応緩衝液を用いる。
１．ラテックス試薬
HBs抗原を検出するために抗HBs抗体を感作したラテックス粒子（以下、「第一のラテックス粒子」という）、及び抗HBc抗体を検出するためにHBc抗原を感作したラテックス粒子（以下、「第二のラテックス粒子」という）を担体粒子として液体に懸濁したものである。
第一のラテックス粒子は、粒子径0.78μmで、赤色蛍光色素（波長640nmのレーザ光で励起可能）を濃度1％(w/v)含有しているポリスチレンラテックスの粒子（以下、「蛍光ラテックス粒子」という）に、抗HBs抗体を感作したものであり、HBs抗原の存在下で凝集する性質を有している。
また第二のラテックス粒子は、粒子径0.78μmのポリスチレンラテックスの粒子に、HBc抗原を感作したものであり、抗HBc抗体の存在下で凝集する性質を有している。第二のラテックス粒子は、蛍光色素を含有していない。
【００１６】
上記第一、第二のラテックス粒子を含むラテックス試薬は、以下の通りに調製した。まず抗HBs抗体（マウスモノクローナル抗体、市販品）60μgを含むGTA緩衝液（0.53mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、0.4mg/mL トリス、0.35mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、pH4.6）950μlに、前記蛍光ラテックス粒子10%(w/v)懸濁液50μlを加え、20℃で2時間静置した。これを10000×g, 10分間遠心し、上清を捨て、沈殿に1%(w/v) 牛血清アルブミン（市販品）を含むGTA緩衝液を1mL加えて、超音波処理し、分散させた。この遠心から分散までの工程を数回繰り返し、最後に遠心して上清を捨て、沈殿に220mg/mL グリセリン、0.3%(w/v) 牛血清アルブミンを含むGTA緩衝液（pH6.2）1mLを加えて、超音波処理し、分散させた。これを第一のラテックス粒子懸濁液とした。第一のラテックス粒子懸濁液は、抗HBs抗体を感作したラテックス粒子を5mg/mL含有している。
【００１７】
また第二のラテックス粒子懸濁液として、シスメックス株式会社製ランリームHBcＡｂ試薬キットに含まれるHBcAbラテックス試薬を用意した。これは、ポリスチレンラテックスの粒子（粒子径0.78μm）にHBc抗原を感作したものを含む懸濁液である。第二のラテックス粒子懸濁液は、HBc抗原を感作したラテックス粒子を5mg/mL含有している。
【００１８】
そして第一のラテックス粒子懸濁液と第二のラテックス粒子懸濁液を体積比１：１の割合で混合し、本実施形態で使用するラテックス試薬とした。
【００１９】
２．反応緩衝液
反応緩衝液は、ラテックス試薬と共に検体に添加し、抗原抗体反応を生じさせる環境を整えるためのものである。これは、1.6mg/mL 3,3-ジメチルグルタル酸、1.1mg/mL 2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール、18.18mg/mL トリス、5%(w/v) 牛血清アルブミン、0.6%(w/v) デキストラン（市販品）、15％(w/v)加熱処理牛血清アルブミン、40％(w/v)ペプシン処理牛血清アルブミン、0.4％(w/v)PVA(市販品) 0.15％（w/v）塩化ナトリウム、0.045％(w/v)アジ化ナトリウム、pH6.0を調製し、ラテックス試薬と共に測定対象となる検体へ添加するための反応緩衝液とした。
【００２０】
自動免疫測定装置
以下、本実施形態に用いる自動免疫測定装置につき説明する。
【００２１】
１．装置構成
図１は自動免疫測定装置１００の外観を示したものである。装置の前面には、各種設定入力を行ったり、また測定結果を表示出力するための液晶タッチパネル１０１、後述する試料調製部２００を覆うカバー１０２、スタートスイッチ１０３を備えている。図２は自動免疫測定装置１００の内部構成を示したものである。装置の右側のスペースには、装置の動作や解析処理を司る制御部４００が備えられている。装置の左下のスペースには、試料液から信号を検出するための光検出部３００が備えられている。また残りのスペースに、試料液を調製するための試料調製部２００が備えられている。  
【００２２】
以下、試料調製部２００、光検出部３００、制御部４００の各部について説明する。
試料調製部２００の構成
図３は試料調製部２００を示す説明図である。試料調製部２００は、手前右側に検体セット部２２１、手前左側に試薬セット部２２２、奥側にインキュベータ２２３、を備えている。また上下左右に移動可能な分注装置２２４を備えている。前記図１のカバー１０２を開けることにより、図３に示した試料調製部２００が現れ、操作者は以下に説明する各種容器をセットするよう構成されている。検体セット部２２１には、検体の入った検体容器２２５を、インキュベータ２２３に反応容器２２６をセットするよう構成されている。また試薬セット部２２２には、ラテックス試薬の入った試薬容器２２７、反応緩衝液が入った試薬容器２３１をセットするよう構成されている。インキュベータ２２３は、セットされた反応容器２２６の中の液体を、所定の温度に保ちながら振盪撹拌するよう構成されている。分注装置２２４は、その先端から所定量の液体を吸引・吐出するようになっており、また図示しない駆動装置によって上下左右に移動可能に構成されている。試料容器２３３は、後述する光検出部３００のフローセル３０１と接続されている。
【００２３】
光検出部３００の構成
図４は光検出部３００の構成を示す説明図である。光検出部３００は、試料液を流すためのフローセル３０１を有する。フローセル３０１は、レーザ光が照射される部分であり内部流路が細く絞られているオリフィス部３０２、試料液をオリフィス部に向かって上方へ噴射するノズル３０３、シース液供給口３０４、排液口３０５を有する。また光検出部３００は、レーザ光を照射するためのレーザ光源３０６（波長６３５ｎｍのレーザ光を出射する赤色半導体レーザ光源である）、レーザ光源から照射されたレーザ光をシースフローセルへ集光するコンデンサレンズ３０７、粒子が発する前方散乱光を受光して電気信号に変換するフォトダイオード３０８、フォトダイオードへ前方散乱光を集光するためのコレクタレンズ３０９とピンホール３１０、蛍光を受光して電気信号に変換するフォトマルチプライヤチューブ３１１、フォトマルチプライヤチューブへ蛍光を集光するためのコレクタレンズ３１２、フィルタ３１３、ピンホール３１４、フォトダイオード３０８やフォトマルチプライヤチューブ３１１から出力された電気信号を増幅して制御部４００へ出力するアンプ３１５、３１６を有する。
【００２４】
制御部４００の構成
図５は制御部４００の構成、及び制御部４００と装置各部との関係を示すブロック図である。制御部４００は、中央演算装置（ＣＰＵ）やＲＯＭ・ＲＡＭ等の記憶装置を有するマイクロコンピュータ、光検出部３００から送られた信号を処理する回路などを有する。制御部４００は、記憶部４４１、解析部４４２、動作制御部４４３としての機能を果たす。記憶部４４１は、試料中の粒子から得た信号の解析に関する解析プログラムや、装置各部の動作を制御する制御プログラムを記憶している。また光検出部３００で検出された信号のデータや、解析プログラムによる処理結果を記憶する。解析部４４２は、試料液を測定して光検出部３００で検出された信号を処理し、処理後の信号を解析する。解析部４４２での解析結果は、液晶タッチパネル１０１に出力される。動作制御部４４３は、記憶部４４１に記憶されている制御プログラムに基づき、装置各部の動作を制御する。
【００２５】
２．自動免疫測定装置１００の動作概要及び測定原理
この自動免疫測定装置１００の動作は、試料調製部２００による試料調製工程、光検出部３００による検出工程、及び解析部４４２による解析工程からなる。
検出工程では、検体（血清）に、反応緩衝液と、上記第一及び第二のラテックス粒子を含むラテックス試薬と、を混合して測定用試料液を調製する。
検出工程では、測定用試料液にレーザ光を照射し、レーザ光を照射された試料液から発せられた前方散乱光及び蛍光を検出する。
解析工程では、検出工程で検出した蛍光の強度に基づき、測定用試料液中の第一のラテックス粒子と第二のラテックス粒子を弁別する。次に第一のラテックス粒子と第二のラテックス粒子それぞれにつき、凝集度を算出する。ここでラテックス粒子の凝集度とは、抗原抗体反応に基づく粒子凝集の度合いをいう。そして第一のラテックス粒子の凝集度に基づいてHBs抗原を検出し、第二のラテックス粒子の凝集度に基づいて抗HBc抗体を検出する。一般に、測定対象である抗原（または抗体）の濃度が高くなるほど、ラテックス粒子の凝集度も高くなる。そこで、凝集度と抗原（または抗体）の濃度を対応させた検量線を作成し、その検量線に基づき濃度換算することで、検体を測定して測定対象である抗原（または抗体）の定量や定性が可能となる。
【００２６】
本実施形態における凝集度の算出につき以下に説明する。図６は、検出工程で各粒子から得られた蛍光強度を縦軸に、前方散乱光強度を横軸にとって作成した二次元スキャッタグラムを模式的に示すものである。第一のラテックス粒子は蛍光色素を含有しているため検出される蛍光強度が大きく、二次元スキャッタグラム上で蛍光強度の大きい位置に出現する。一方、第二のラテックス粒子は蛍光色素を含有していないため、検出される蛍光強度が小さく、二次元スキャッタグラム上で蛍光強度の小さい位置に出現する。このため、第一のラテックス粒子と第二のラテックス粒子を二次元スキャッタグラム上で弁別することができる。図中、Ｒ１は第一のラテックス粒子に対応するプロットが出現する領域として設定されたものである。またＲ２は第二のラテックス粒子に対応するプロットが出現する領域として設定されたものである。領域Ｒ１は、領域Ｒ２に比べ蛍光強度の大きい位置に設定されている。
【００２７】
領域Ｒ１・Ｒ２により弁別された各ラテックス粒子については、前方散乱光強度に基づき、ヒストグラムを作成する。前方散乱光強度は粒子の大きさを反映する情報であるため、未凝集の単独粒子、二個のラテックス粒子が凝集して生じた二個凝集粒子、三個のラテックス粒子が凝集して生じた三個凝集粒子が、前方散乱光強度の違いに応じてヒストグラム上でピークを形成する。なお、検体中に測定対象となる抗原（又は抗体）が存在しない場合は、抗原抗体反応によるラテックス粒子の凝集が生じないため、二個凝集粒子や三個凝集粒子が生じない。
【００２８】
図７は、前記領域Ｒ１内に出現した第一のラテックス粒子の前方散乱光強度をもとに作成したヒストグラムの一例であり、縦軸に度数（粒子の個数）を、横軸に前方散乱光強度をとったものである。なおこの実施形態例では、二個凝集粒子については、二個のラテックス粒子が凝集して形成された一つの凝集塊を、一つの粒子として計数している。また三個凝集粒子についても同様に、三個のラテックス粒子が凝集して形成された一つの凝集塊を、一つの粒子として計数している。単独粒子よりも二個凝集粒子の方が、二個凝集粒子よりも三個凝集粒子の方が大きな粒子として検出されるので、前方散乱光強度について閾値を設定することにより未凝集の単独粒子と、複数のラテックス粒子が凝集して生じた凝集粒子とを弁別し、単独粒子数(M)と凝集粒子数（P）を計数する。また、MとPの合計である総粒子数（T）を得る。そして凝集率P/Tを、ラテックス粒子の凝集度として算出する。
【００２９】
３．自動免疫測定装置１００の動作詳細
以下、自動免疫測定装置１００の動作の詳細につき説明する。図８は、制御プログラムによる自動免疫測定装置１００の全体制御を示すフローチャートである。操作者がスタートスイッチ１０３を押すと、制御プログラムが起動し、ステップＳ１（試料調製部制御）、ステップＳ２（光検出部制御）、ステップＳ３（解析部制御）が順次実行される。これにより、試料調製部２００、光検出部３００、解析部４４２が制御され、自動免疫測定装置１００の一連の動作が自動的に行われる。上記ステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３による装置各部の動作を以下に説明する。
【００３０】
ステップＳ１（試料調製部制御）
試料調製部制御による試料調製部２００の動作を、図３を用いて説明する。まず分注装置２２４が、試薬セット部２２２の試薬容器２３１から反応緩衝液を８０μＬ吸引し、次に検体セット部２２１にセットされている検体容器２２５から検体を１０μＬ吸引する。そして吸引した反応緩衝液と検体を、インキュベータ２２３にセットされている反応容器２２６に分注する。次に分注装置２２４は、試薬セット部２２２の試薬容器２２７からラテックス試薬を１０μＬ吸引し、反応容器２２６に分注する。この後インキュベータ２２３が、検体・ラテックス試薬・反応緩衝液が入った反応容器２２６を、温度４５℃に保ちながら１５分間振盪撹拌することでインキュベートし、試料液を調製する。インキュベート後の試料液を分注装置２２４が吸引し、試料容器２３３に分注する。試料容器２３３中に分注された試料液は、光検出部３００のフローセル３０１に流される。
【００３１】
ステップＳ２（光検出部制御）
光検出部制御による光検出部３００の動作を、図４を用いて説明する。前記の通り試料容器２３３に試料液が供給されると、図示しないポンプやバルブの動作により試料液がノズル３０３へ導かれる。そして試料液がノズル３０３からフローセル３０１に吐出される。それと同時にシース液が、図示しないシース液容器からシース液供給口３０４を介してフローセル３０１に供給される。これによって試料液は、フローセル３０１内でシース液に包まれ、更にオリフィス部３０２で細く絞られて流れる。試料液の流れを、粒子径と同程度まで絞り込むことにより、試料液に含まれた粒子を一列に整列させてオリフィス部３０２に流すことができる。オリフィス部３０２を流れる試料液に対し、レーザ光源３０６から出射されたレーザ光がコンデンサレンズ３０７で絞られて照射される。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた前方散乱光はコレクタレンズ３０９により集光される。そしてピンホール３１０を通過した前方散乱光は、フォトダイオード３０８で受光、光電変換されて前方散乱光信号となる。レーザ光を受けた試料液中の粒子から発せられた蛍光は、コレクタレンズ３１２により集光される。そしてフィルタ３１３、ピンホール３１４を通過した蛍光は、フォトマルチプライヤチューブ３１１で受光、光電変換されて蛍光信号となる。前方散乱光信号及び蛍光信号は、それぞれアンプ３１５・３１６で増幅された後に制御部４００へ送られ、粒子毎のデータとして記憶部４４１に記憶される。
【００３２】
ステップＳ３（解析部制御）
解析部制御の詳細について、図９のフローチャートを用いて説明する。フローチャートの各ステップは以下の通りである。
【００３３】
ステップＳ１１：前方散乱光信号及び蛍光信号のデータを、記憶部４４１から読み出す。続いてステップＳ１２へ進む。
ステップＳ１２：前方散乱光信号のピークレベルに基づき前方散乱光強度（Fsc）を、蛍光信号のピークレベルに基づき蛍光強度（Fl）を、粒子毎に算出する。続いてステップＳ１３へ進む。
ステップＳ１３：ステップＳ１２で算出した粒子毎のFsc・Flをパラメータとした二次元スキャッタグラムを作成する。このスキャッタグラムには、第一のラテックス粒子（HBs抗原検出用）と第二のラテックス粒子（抗HBc抗体検出用）がそれぞれ出現すると目される領域が予め設定されている。
ステップＳ１４：二次元スキャッタグラム上に予め設定されていた各領域内に出現した粒子のヒストグラムを作成し、粒度分布を得る。続いてステップＳ１５へ進む。
ステップＳ１５：粒度分布に基づき、各領域内の単独粒子数Mと凝集粒子数P及びその合計Tを得、各領域内に出現した粒子の凝集率P/Tを算出する。続いてステップＳ１６へ進む。
ステップＳ１６：前記作成された二次元スキャッタグラム、各領域のヒストグラム及び算出した凝集率P/Tを液晶タッチパネル１０１に出力して表示する。
【００３４】
図１０は、ステップＳ１３で作成された二次元スキャッタグラム、ステップＳ１４で作成されたヒストグラム、ステップＳ１５で算出された凝集率P/Tを表示している画面が、ステップＳ１６で液晶タッチパネル１０１に出力された様子を示す図である。
【００３５】
測定例
以上に説明してきた試薬及び自動免疫測定装置１００を用いて検体を測定した結果を示す。まずHBs抗原の測定に用いる検量線を作成するために、シスメックス株式会社製ランリームHBsＡｇ試薬キットに含まれている検体希釈液及びキャリブレータを検体として測定した。検体希釈液は、HBs抗原を含有していない液体である。キャリブレータは、HBs抗原を含有する液体であり、抗原濃度が６段階に調整されている。そこで検体希釈液を検体１、キャリブレータを濃度の低い順に検体２〜７とし、計７段階の抗原濃度の検体を用意してそれぞれを自動免疫測定装置１００で測定し、検体毎に第一のラテックス粒子（HBs抗原検出用）の凝集率を得た。検体１〜７の各抗原濃度と、測定の結果得られた凝集率は表１の通りであった。
【００３６】
【表１】
2005172546.tif 000003
【００３７】
表１に示した結果より、第一のラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれるHBs抗原の濃度に依存して上昇していることがわかる。このことから、凝集率に基づき検量線を作成し、その検量線に基づき濃度換算することで、検体中の抗原濃度を得ることができるといえる。表１に基づき作成した検量線を図１１に示す。
【００３８】
次に、抗HBc抗体の測定に用いる検量線を作成するために、シスメックス株式会社製ランリームHBcAb試薬キットに含まれている検体希釈液及びキャリブレータを検体として測定した。検体希釈液は、抗HBc抗体を含有していない液体である。キャリブレータは、抗HBc抗体を含有する液体であり、抗体濃度が６段階に調整されている。そこで検体希釈液を検体１、キャリブレータを濃度の低い順に検体２〜７とし、計７段階の抗体濃度の検体を用意してそれぞれを自動免疫測定装置１００で測定し、検体毎に第二のラテックス粒子の凝集率を得た。検体１〜７の各抗体濃度と、測定の結果得られた凝集率は表２の通りであった。
【００３９】
【表２】
2005172546.tif 000004
【００４０】
表２に示した結果より、第二のラテックス粒子の凝集率は、検体に含まれる抗HBc抗体の濃度に依存して上昇していることがわかる。このことから、凝集率に基づき検量線を作成し、その検量線に基づき濃度換算することで、検体中の抗体濃度を得ることができるといえる。表２に基づき作成した検量線を図１２に示す。
【００４１】
以下、患者から採取した検体Ａ、検体Ｂ、検体Ｃ、及び検体Ｄの四検体（いずれも血清である）を前記自動免疫測定装置１００で測定し、HBs抗原及び抗HBc抗体の各測定項目につき陰性・陽性の判別を行った結果につき説明する。なお、陰性・陽性の判別は、前記図１１・図１２の各検量線に基づき行った。図１１の検量線においては、検体中のHBs抗原濃度０．５Ｕ／ｍＬ未満の場合を陰性、０．５Ｕ／ｍＬ以上の場合を陽性とした。また図１２の検量線においては、検体中の抗HBc抗体濃度１０ｍＵ／ｍＬ未満の場合を陰性、１０ｍＵ／ｍＬ以上の場合を陽性とした。
【００４２】
検体Ａ
検体Ａは、B型肝炎ウィルスに感染していない患者から採取した検体である。図１３は、前記自動免疫測定装置１００により得られた二次元スキャッタグラム、この二次元スキャッタグラム中で第一のラテックス粒子が出現する領域Ｒ１に対応するヒストグラム、及び第二のラテックス粒子が出現する領域Ｒ２に対応するヒストグラムを示すものである。二次元スキャッタグラムにおいて横軸は前方散乱光強度（Fsc）を、縦軸は蛍光強度（Fl）を表わす。またヒストグラムにおいて縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ１、Ｒ２、及びそれらに対応するヒストグラムにおいては、いずれも前方散乱光強度の小さな位置にほとんどの粒子が出現していることがわかる。これは、検出された粒子のほとんどが前方散乱光強度の小さな単独粒子であり、前方散乱光強度の大きな凝集粒子はほとんど存在しなかったことを示している。なお、検体Ａを測定して得られた第一のラテックス粒子の凝集率は0.69％、HBs抗原濃度は0U/mLであり、HBs抗原は陰性であると判定された。また、第二のラテックス粒子の凝集率は0.23％、抗HBc抗体濃度は0mU/mLであり、抗HBc抗体は陰性であると判定された。
【００４３】
検体Ｂ
検体Ｂは、B型肝炎ウィルス感染直後の患者から採取した検体である。図１４は、前記自動免疫測定装置１００により得られた二次元スキャッタグラム、この二次元スキャッタグラム中で第一のラテックス粒子が出現する領域Ｒ１に対応するヒストグラム、及び第二のラテックス粒子が出現する領域Ｒ２に対応するヒストグラムを示すものである。二次元スキャッタグラムにおいて横軸は前方散乱光強度（Fsc）を、縦軸は蛍光強度（Fl）を表わす。またヒストグラムにおいて縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ１、及びそれに対応するヒストグラムにおいては、前方散乱光強度の小さな位置に多くの粒子が出現しているが、やや前方散乱光強度の大きな位置にも粒子が出現しており、若干の凝集粒子も存在していることを示す。また二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ２、及びそれに対応するヒストグラムにおいては、前方散乱光強度の小さな位置のみならず、やや前方散乱光強度の大きな位置、更に前方散乱光強度の大きな位置にも粒子が出現しており、単独粒子の他に二個凝集粒子や三個凝集粒子が存在していることを示す。検体Ｂを測定して得られた第一のラテックス粒子の凝集率は1.49％、HBs抗原濃度は0.49U/mLであり、HBs抗原は陰性であると判定された。また、第二のラテックス粒子の凝集率は5.87％、抗HBc抗体濃度は90mU/mLであり、抗HBc抗体は陽性であると判定された。感染直後の患者体内においては、抗原が陽性として検出されるまでには増殖しておらず、本結果のように陰性と判定される場合がある。しかし体内に存在する微量の抗原に反応して生成された抗体を陽性として検出したことにより、この患者がＢ型肝炎ウィルスに感染していることを見逃さずに済む。
【００４４】
検体Ｃ
検体Ｃは、B型肝炎ウィルスに感染した患者から採取した検体であり、感染後に経過した時間が前記検体Ｂに比べ長いものである。図１５は、前記自動免疫測定装置１００により得られた二次元スキャッタグラム、この二次元スキャッタグラム中で第一のラテックス粒子が出現する領域Ｒ１に対応するヒストグラム、及び第二のラテックス粒子が出現する領域Ｒ２に対応するヒストグラムを示すものである。二次元スキャッタグラムにおいて横軸は前方散乱光強度（Fsc）を、縦軸は蛍光強度（Fl）を表わす。またヒストグラムにおいて縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ１、Ｒ２、及びそれらに対応するヒストグラムにおいては、前方散乱光強度の小さな位置のみならず、やや前方散乱光強度の大きな位置、更に前方散乱光強度の大きな位置にも粒子が出現しており、単独粒子の他に二個凝集粒子や三個凝集粒子が存在していることを示す。検体Ｃを測定して得られた第一のラテックス粒子の凝集率は29.01％、HBs抗原濃度は20.5U/mLであり、HBs抗原は陽性であると判定された。また、第二のラテックス粒子の凝集率は17.90％、抗HBc抗体濃度は270mU/mLであり、抗HBc抗体も陽性であると判定された。
【００４５】
検体Ｄ
検体Ｄは、B型肝炎ウィルスに感染し、治療を行った患者から採取した検体である。図１６は、前記自動免疫測定装置１００により得られた二次元スキャッタグラム、この二次元スキャッタグラム中で第一のラテックス粒子が出現する領域Ｒ１に対応するヒストグラム、及び第二のラテックス粒子が出現する領域Ｒ２に対応するヒストグラムを示すものである。二次元スキャッタグラムにおいて横軸は前方散乱光強度（Fsc）を、縦軸は蛍光強度（Fl）を表わす。またヒストグラムにおいて縦軸は度数（粒子数）を、横軸は前方散乱光強度すなわち粒子の大きさを表わす。
二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ１、及びそれに対応するヒストグラムにおいては、前方散乱光強度の小さな位置にほとんどの粒子が出現しており、検出された粒子のほとんどが前方散乱光強度の小さな単独粒子であることを示す。また二次元スキャッタグラム上の領域Ｒ２、及びそれに対応するヒストグラムにおいては、前方散乱光強度の小さな位置のみならず、やや前方散乱光強度の大きな位置、更に前方散乱光強度の大きな位置にも粒子が出現しており、単独粒子の他に二個凝集粒子や三個凝集粒子が存在していることを示す。検体Ｄを測定して得られた第一のラテックス粒子の凝集率は0.69％、HBs抗原濃度は0U/mLであり、HBs抗原は陰性であると判定された。また、第二のラテックス粒子の凝集率は5.79％、抗HBc抗体濃度は88mU/mLであり、抗HBc抗体は陽性であると判定された。
【００４６】
上記の実施形態によれば、B-F分離の工程を必要としない。また二種類のラテックス粒子の種類の弁別を、ラテックス粒子自体の物理的特性（ここでは粒子に含有されている蛍光色素量に応じた蛍光強度）を検出して行うするため、別途標識抗体等を用いる必要がない。そのため、容易かつ簡便に、同じ病原体に関する抗原と抗体を同時に検査することができる。またそれにより、患者が病原体に感染していることをより確実に捉えることができる。また患者から採取した一つの検体に対して一度の測定で抗原検査と抗体検査の両方を行うことができるので、それぞれの検査を別々に実施する場合と比較すると、必要となる検体の量が少量でよい。
【００４７】
上記実施形態では、第一・第二のラテックス粒子から検出される蛍光強度に差を生じさせて両者を弁別している。このように粒子から検出される蛍光強度に基づき第一・第二のラテックス粒子を弁別する場合、上記実施形態のように第一のラテックス粒子には蛍光色素を含有するものを用い、第二のラテックス粒子には蛍光色素を含有しないものを用いてもよい。あるいは第一・第二いずれのラテックス粒子にも蛍光色素を含有するものを用い、且つ第一・第二のラテックス粒子間で含有される蛍光色素濃度を互いに異なるようにしてもよい。
【００４８】
上記の実施形態における免疫測定方法はいわゆる粒子凝集法を応用したものであり、担体粒子としてはポリスチレンラテックス粒子を用いたが、担体粒子としては粒子凝集法で一般的に用いられているもの、例えば磁性粒子、ガラス粒子などを用いることもできる。
【００４９】
上記実施形態では、担体粒子であるラテックス粒子から蛍光を検出し、検出した蛍光強度に基づき複数種類の担体粒子同士を弁別している。しかし担体粒子の弁別に用いることができる物理特性は蛍光強度に限られない。例えば側方散乱光強度や吸光度を用いることができる。その場合、粒子の表面状態や粒子の内部構造、粒子内部の密度などを変えることにより、粒子から検出される側方散乱光強度や吸光度に差を生じさせることができる。その他、化学発光、生物発光などの光学的情報について担体粒子同士で違いを持たせ、それらを担体粒子の種類を弁別するための物理的特性としてもよい。また、担体粒子の大きさを種類毎に異なったものとすれば、粒子の大きさ情報に基づき複数種類の担体粒子同士を弁別できる。第一の担体粒子と第二の担体粒子を弁別する場合、第一の担体粒子が凝集した凝集粒子の大きさと、第二の担体粒子の大きさが重ならないよう、担体粒子の大きさに充分な差を持たせることが好ましい。粒子の大きさ情報としては、前方散乱光強度や、電圧を印加した細孔を粒子が通過する際に得られる電気抵抗の変化などを用いることができる。これら粒子の物理的特性を検出するには、上記実施形態に示した自動免疫装置の光検出部を適宜変更し、検出すべき物理特性に応じた検出器を有する検出部とすればよい。なお上記に例示した粒子の物理特性は、標識抗体などにより粒子を二次的に標識して得るものではなく、粒子そのものから検出可能なものであることが好ましい。
【００５０】
また上記実施形態では、HBs抗原と抗HBc抗体が測定対象項目となっているが、測定対象項目は必ずしもこれらに限られる必要はない。病原体に由来する第一の抗原、及び前記病原体に由来するが前記第一の抗原とは異なる第二の抗原に対する抗体であれば測定対象項目とすることができる。例えばHIVコアp24抗原と抗HIVエンベロープ抗体を測定対象とすることができる。HIVコアp24抗原は、エイズウィルスの核に由来する抗原である。抗HIVエンベロープ抗体は、HIVエンベロープ抗原（エイズウィルスに由来するが、HIVコアp24抗原とは異なりエイズウイルスのエンベロープに由来する抗原である）に対応する抗体である。また、HCVコア抗原と抗HCVエンベロープ抗体を測定対象とすることができる。HCVコア抗原は、C型肝炎ウィルスの核に由来する抗原である。抗HCVエンベロープ抗体は、HCVエンベロープ抗原（C型肝炎ウィルスに由来するが、HCVコア抗原とは異なりC型肝炎ウイルスのエンベロープに由来する抗原である）に対応する抗体である。
【００５１】
上記実施形態において自動免疫測定装置にセットして使用したラテックス試薬は、測定対象の二項目に対応する第一・第二のラテックス粒子を、一液中に含有させたものであった。しかし、第一・第二のラテックス粒子を必ずしも一液中に含有させる必要はない。例えば第一のラテックス粒子を含有する第一のラテックス試薬と、第二のラテックス粒子を含有する第二のラテックス試薬を別々に用意し、一方で免疫測定装置を、測定項目に応じた複数種類のラテックス試薬をセットできるように構成してもよい。また例えば、HBs抗原を検出するためのラテックス試薬と、抗HBc抗体を検出するためのラテックス試薬を別々に用意し、それらを一纏まりとしたものをB型肝炎感染検出試薬キットとしてもよい。
【００５２】
また、上記実施形態では、担体粒子は第一・第二のラテックス粒子の二種類を用い、二項目の免疫測定を同時に測定しているが、同時に測定可能な項目は二項目には限られない。第一、第二の担体粒子と弁別することができる第三の担体粒子を用いることで、同時に三項目の免疫測定が可能である。上記実施形態に照らせば、蛍光色素を含有する第一のラテックス粒子、蛍光色素を含有しない第二のラテックス粒子に加え、第三のラテックス粒子を用い、この第三のラテックス粒子には、第一のラテックス粒子に含まれる蛍光色素と同種の蛍光色素を、第一のラテックス粒子よりも高濃度に含有させることで、同時に三項目の免疫測定が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の外観を説明する図である。
【図２】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の内部構成を説明する図である。
【図３】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の試料調製部を説明する図である。
【図４】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の光検出部を説明する図である。
【図５】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の制御部、及び制御部と装置各部との関係を説明する図である。
【図６】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により得られる二次元スキャッタグラムを模式的に示す図である。
【図７】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により得られるヒストグラムを模式的に示す図である。
【図８】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の全体制御を説明する図である。
【図９】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の解析部の制御を説明する図である。
【図１０】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置の液晶タッチパネルに表示された画面の一例を示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により得られた検量線を示す図である。
【図１２】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により得られた検量線を示す図である。
【図１３】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムとヒストグラムを示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムとヒストグラムを示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムとヒストグラムを示す図である。
【図１６】本発明の一実施形態である自動免疫測定装置により検体を測定して得られた二次元スキャッタグラムとヒストグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００５４】
１００  自動免疫測定装置
２００  試料調製部
３００  光検出部
４００  制御部
Ｒ１    第一のラテックス粒子が出現する領域
Ｒ２    第二のラテックス粒子が出現する領域
【図１】
2005172546.tif 000005
【図２】
2005172546.tif 000006
【図３】
2005172546.tif 000007
【図４】
2005172546.tif 000008
【図５】
2005172546.tif 000009
【図６】
2005172546.tif 000010
【図７】
2005172546.tif 000011
【図８】
2005172546.tif 000012
【図９】
2005172546.tif 000013
【図１０】
2005172546.tif 000014
【図１１】
2005172546.tif 000015
【図１２】
2005172546.tif 000016
【図１３】
2005172546.tif 000017
【図１４】
2005172546.tif 000018
【図１５】
2005172546.tif 000019
【図１６】
2005172546.tif 000020