(57)【要約】【課題】  抗生物質イチュリンＡを高い収量にて生産可能な枯草菌の培地を提供する。【解決手段】  枯草菌の培地（培養液）は、植物性有機物と、無機塩と、糖類とを含有する。前記植物性有機物は植物性ペプトンからなり、前記無機塩は燐酸ニ水素カリウム及び硫酸マグネシウムからなり、前記糖類はグルコースを含む。この培養液を用いれば、枯草菌は抗生物質イチュリンＡを高い収量で生産し、そして、このようにして生産した抗生物質イチュリンＡを付与した土壌にて植物を育成すれば、その罹病率を安価且つ有効に抑制することができる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性有機物と、無機塩と、糖類とを含有したことを特徴とする枯草菌の培地。
【請求項２】
前記植物性有機物は植物性ペプトンからなり、
前記無機塩は燐酸ニ水素カリウム及び硫酸マグネシウムからなり、
前記糖類はグルコースを含む
ことを特徴とする請求項１記載の枯草菌の培地。
【請求項３】
前記植物有機物は大豆からなり、
前記無機塩は、燐酸水素ニカリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及び塩化カルシウムからなり、
前記糖類は、マルトース、廃糖蜜、グルコース及びスクロースよりなる群から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１記載の枯草菌の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、枯草菌の培地に関し、より詳しくは、抗生物質の生産に好適した枯草菌の培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、農作物等の植物の土壌病害は、化学農薬の土壌への投与により防止されてきた。しかし近年、化学農薬の過剰な投与による土壌汚染やそれに伴う人体への健康被害が危惧され、化学農薬に頼らずに土壌病害を生物学的に抑制する手段が研究・開発されている。
例えば、非特許文献１は、土壌、枯草、塵埃中などの自然界に広範囲に分布するグラム陽性の桿菌である枯草菌（Bacillus subtilis）が抗生物質イチュリンＡを生産し、この抗生物質インチュリンＡにより植物の土壌病害が抑制できることを開示している。より詳しくは、非特許文献１では、枯草菌の一種としてＲＢ１４株（Bacillus subtilis RB14）が挙げられており、ガゼイン製ペプトン（商品名ポリペプトン：日本製薬株式会社製）を含有する培地にてＲＢ１４株が培養され、この際、イチュリンＡが生産される（非特許文献１の4081頁）。
【非特許文献１】Orie Asaka and Makoto Shoda, Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, p.4081-4085
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、イチュリンＡを用いたバイオ系薬品の開発・実用化にあたっては、イチュリンＡの収量の増大が望まれる。
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、抗生物質イチュリンＡを高い収量にて生産可能な枯草菌の培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、上記目的を達成すべく種々検討を重ねた結果、本発明に想到した。
本発明によれば、植物性有機物と、無機塩と、糖類とを含有したことを特徴とする枯草菌の培地が提供される（請求項１）。
上記した構成の好適な態様として、前記植物性有機物は植物性ペプトンからなり、前記無機塩は燐酸ニ水素カリウム及び硫酸マグネシウムからなり、前記糖類はグルコースを含んでいる（請求項２）。
【０００５】
また、上記した構成の好適な態様として、前記植物有機物は大豆（大豆粉）であってよく、この場合、前記無機塩は、燐酸水素ニカリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及び塩化カルシウムからなり、前記糖類は、マルトース、廃糖蜜、グルコース及びスクロースよりなる群から選択される少なくとも１種を含む（請求項３）。
【発明の作用及び効果】
【０００６】
以上説明したように、本発明の枯草菌の培地は従来の動物性のガゼイン製ペプトンに代えて植物性有機物を含有しているので、枯草菌を培養する際、イチュリンＡの収量を増大させることができる。この結果、抗生物質イチュリンＡを用いたバイオ系薬品の実現を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る一実施形態の培地について説明する。
一実施形態の培地は、蒸留水に植物性有機物、無機塩及び糖類を含ませてなる培養液であるが、必要に応じて寒天等で固めても良い。
具体的には、培養液の植物性有機物としては、植物性ペプトン又は大豆（大豆粉）を用いることができる。植物性有機物として植物性ペプトンを用いた場合、無機塩として燐酸ニ水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）を用いることができ、糖類としてグルコースを用いることができる。そして、この場合、培養液における植物性ペプトン、燐酸ニ水素カリウム、硫酸マグネシウム及びグルコースの濃度は、それぞれ１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ及び１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌの範囲内にあることが好ましく、培養液のｐＨは６〜８の範囲内にあることが好ましい。なお、植物性ペプトンは、脱脂大豆を酵素分解後精製し、乾燥させたものである。ただし、硫酸マグネシウムの濃度は、培養液１Ｌに添加される硫酸マグネシウムの７水和物の重量に相当する。
【０００８】
また、植物性有機物として大豆（大豆粉）を用いた場合、無機塩として燐酸水素ニカリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）、硫酸鉄（ＦｅＳＯ4）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ4）及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）を用いることができ、糖類としては、マルトース、廃糖蜜、グルコース及びスクロースよりなる群から選択されるいずれか１種又は２種以上を用いることができる。そして、この場合、培養液における大豆（大豆粉）、燐酸水素ニカリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム及び糖類の濃度は、それぞれ８０ｇ／Ｌ〜１６０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、０．０２５ｇ／Ｌ〜０．２５ｇ／Ｌ、０．０２２ｇ／Ｌ〜０．２ｇ／Ｌ、０．１５ｇ／Ｌ〜０．８ｇ／Ｌ及び６０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌの範囲内にあることが好ましく、培養液のｐＨは６〜８の範囲内にあることが好ましい。ただし、硫酸マグネシウム、硫酸鉄及び硫酸マンガンの濃度は、培養液１Ｌに添加される硫酸マグネシウムの７水和物、硫酸鉄の７水和物及び硫酸マンガンの５水和物の重量にそれぞれ相当する。
【０００９】
上述した培地にて、枯草菌（Bacillus subtilis）として、特に、枯草菌のＲＢ１４株や、ＲＢ１４株のストレプトマイシン耐性変異株であるＲＢ１４−Ｃ株等を培養すると、これらＲＢ１４株及びＲＢ１４−Ｃ株は、植物の土壌病害を抑制可能な抗生物質イチュリンＡを高い収量にて生産する。なお、これらＲＢ１４株及びＲＢ１４−Ｃ株は、表１に示した同一の菌学的性質を有する。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
また、イチュリンＡは、７つのα−アミノ酸と長いアルキル側鎖Ｒを有する脂溶性β−アミノ酸とからなる環状リポペプチド構造を有し、アルキル側鎖Ｒとしては、ＣＨ3（ＣＨ2）10、ＣＨ3ＣＨ2（ＣＨ3）ＣＨ（ＣＨ2）8、（ＣＨ3）2ＣＨ（ＣＨ2）9、ＣＨ3（ＣＨ2）12及び（ＣＨ3）2ＣＨ（ＣＨ2）10を挙げることができる（化１参照）。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
具体的な抗生物質イチュリンＡの生産は、上記した培養液を、別に用意したＲＢ１４株又はＲＢ１４−Ｃ株を含む少量の公知の培養液とともに三角フラスコに入れて、温度２５〜３５℃にて数日間振盪培養し、この後、酸による沈殿法、有機溶媒による抽出法及びクロマトグラフィ等の公知の方法を適宜組み合わせ、培養液からイチュリンＡを分離すればよい。
【００１４】
なお、本発明は上述の一実施形態に制約されるものではなく、種々の変形が可能であり、例えば、イチュリンＡの生産を阻害しない範囲内において、培養液は他の化合物を含有していてもよい。
【実施例】
【００１５】
実施例１，２及び比較例１
１．枯草菌Bacillus subtilisの採取・分離
（１）枯草菌Bacillus subtilis R14
農家で使用されているコンポスト（堆肥）を採取するとともに、神奈川県農業総合研究所から譲り受けた植物病原菌Rhizoctonia solani（番号Ｋ１）を市販のポテト−デキストロース培地（栄研化学株式会社製ＰＤ培地）にて培養する。
【００１６】
次に、市販のポテト−デキストロース寒天培地（栄研化学株式会社製ＰＤＡ培地）をプレートに入れてから、このプレート（以下、ＰＤＡプレートともいう）に培養した病原菌Rhizoctonia solaniを均一に塗付し、更に、その直後にこのプレートの真中に、採取したコンポストの塊を１つ置く。
このＰＤＡプレートを２５℃の恒温槽内に１〜２日間放置すると、病原菌Rhizoctonia solaniがＰＤＡプレートの全面に亘り増殖するが、真中のコンポスト付近では病原菌が生育できない部分（阻止円）が形成されるので、この阻止円の周辺のコンポストを取り出す。
【００１７】
取り出したコンポストを、後述する比較例１と同じ組成を有する培地（表２参照。以下、Ｎｏ．３培地という）に懸濁し、３０℃の恒温槽内にこの培地（培養液）を１日放置する。
その後、放置した培養液を適当に希釈してから、寒天で固化させたＮｏ．３培地に塗付し、３０℃の恒温槽内にこの培地を１日放置する。この放置後に出現したコロニーを１つずつ取り出して、各コロニーをＮｏ．３培地で培養し、枯草菌Bacillus subtilis RB14が得られる。
【００１８】
なお、コロニーを培養した培養液を、病原菌の塗布されたＰＤＡプレートに付与し、このＰＤＡプレートを２５℃の恒温槽内に１〜２日間放置したときに、病原菌が生育できない阻止円が形成されることを確認し、更に、この培養液内の菌を同定することで、枯草菌Bacillus subtilis RB14が得られたことを確認することができる。
【００１９】
（２）枯草菌Bacillus subtilis R14-C
枯草菌Bacillus subtilis RB14を、ストレプトマイシンが100ppm添加されたＮｏ．３培地で培養し、生育した枯草菌にRB14-Cと命名した。これは枯草菌Bacillus subtilis RB14の自然突然変異株である。
【００２０】
２．ＲＢ１４株の培養及びイチュリンＡの生産
表２に示した組成及びｐＨを有する実施例１，２及び比較例１の培地（培養液）を調製し、各培養液１００ｍｌをそれぞれ別の三角フラスコに注液した。次に、上述のＲＢ１４株を含む培養液１ｍｌを各三角フラスコに注液し、その直後から三角フラスコを温度３０℃にて５日間に亘って振盪し、ＲＢ１４株の培養及びイチュリンＡの生産を行った。
【００２１】
３．ＲＢ１４株の菌数及びイチュリンＡの生産量の測定
上記培養の際、振盪開始直前及び振盪開始から１日経過する毎に培養液の一部を各三角フラスコから採取し、その中に含まれるイチュリンＡの生産量（単位：ｍｇ／リットル）及びＲＢ１４株の菌数（単位：ＣＦＵ／ｍＬ）をそれぞれ測定した。これらの測定結果を表３及び４に示す。
【００２２】
４．トマトの罹病率の測定
トマトの苗木の立ち枯れ病を引き起こすことで知られている上記の病原菌Rhizoctonia solani K-1を土壌に付与した。その後、この土壌１５０ｇに対して上記５日間振盪した実施例１及び２の培養液３０ｍｌを付与してから、これらの土壌を鉢に入れ、複数のトマトの苗木を各鉢に植えて植物育成室内で発育させた。このときの育成条件を表５に示す。そして、２週間後のトマトの苗木の罹病率（病害にかかった割合）を測定し、この結果を図１に示した。なお、図１中の比較例２は、病原菌のみ付与して実施例１，２の培養液を付与しなかった土壌で苗木を発育させた場合の結果を示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
【表３】
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【００２５】
【表４】
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【００２６】
【表５】
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【００２７】
５．結果
表３から、植物性有機物を含有する実施例１及び２の培養液を用いてＲＢ１４株を培養したときのイチュリンＡの生産量は、ガゼイン製ペプトンを含有する比較例１の培養液の場合に比べて増大することがわかる。特に、実施例２の培養液によれば、比較例１の培養液に比べ、イチュリンＡの収量を約４０倍と飛躍的に増大可能なことがわかる。
【００２８】
一方、表４から、培養液中のＲＢ１４株の菌数は、実施例２よりも実施例１の方が多いことがわかる。このことから、ＲＢ１４株の菌数とイチュリンＡの収量とは単純な比例関係にないことがわかる。
そして、図１から、実施例１及び２の培養液を土壌に付与すると、病原菌のみ付与した場合に比べてトマトの罹病率が低下することがわかる。特に、実施例２の培養液によれば、比較例１の培養液に比べ、苗木の罹病率を４分の１以下にまで減少させることができる。これは、実施例２の培養液が相対的に多くのイチュリンＡを含有し、イチュリンＡにより苗木の立ち枯れ病が有効に抑制されたためと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】病原菌を含む土壌にてトマトの苗木を発育させた場合の罹病率の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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