(57)【要約】【課題】  新規構造を有するインスリン関連タンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することを目的とする。【解決手段】  ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ  ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）由来の新規構造を有するインスリン関連タンパク質の前駆体及びその部分ポリペプチド、並びにそれらをコードするＤＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質。
【請求項２】
配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、請求項１記載のタンパク質の機能と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質。
【請求項３】
軟体動物二枚貝類由来である請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ  ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）由来である請求項１または請求項２に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の部分ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５に記載の部分ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号６〜１０のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡ。
【請求項９】
軟体動物二枚貝類由来である請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
ホタテ貝（Ｐａｔｉｎｏｐｅｃｔｅｎ  ｙｅｓｓｏｅｎｓｉｓ）由来である請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規タンパク質及び該タンパク質の遺伝子に関する。詳しくは、軟体動物二枚貝類由来であり、医薬もしくは農薬開発あるいは農水産業における飼育、養殖技術開発等に有用な新規の構造を有するインスリン関連タンパク質及び該タンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】  インスリンは、ジスルフィド結合により連結されたＢ鎖及びＡ鎖のヘテロ２本鎖から成る分子量６千程度のタンパク質であり、脊椎動物においては、構造の良く似たインスリン様成長因子（以下、ＩＧＦと略記することがある。）と共に、物質代謝、細胞増殖及び細胞分化の調節に重要な役割を果たしているペプチドホルモンである。インスリンの前駆体タンパク質は，アミノ末端から順にシグナル配列、Ｂ鎖領域、Ｃ鎖領域及びＡ鎖領域から構成されている。該前駆体は、翻訳された後、プロセッシングを受けて、上記のＢ鎖及びＡ鎖から成る成熟インスリン分子となる。【０００３】  一方、線虫類から節足動物に至る種々の無脊椎動物及び原索動物から前記インスリンに構造の類似したタンパク質（以下、インスリン関連タンパク質と略記することがある。）もしくはその遺伝子が単離されている（非特許文献１、非特許文献２等参照）。また、脊椎動物では、インスリン遺伝子座は、通常１ヶ所であるが、昆虫類や腹足類等においては、互いに構造の異なるインスリン関連タンパク質をコードする多重遺伝子ファミリーを形成している例が知られている（非特許文献１、非特許文献２等参照）。さらに、線虫類ではインスリン関連タンパク質と共にそのレセプタータンパク質の遺伝子が見出され、脊椎動物における前記インスリン及びＩＧＦの場合と同様なシグナル伝達経路の存在が示されている（非特許文献３参照）。【０００４】  これらの研究結果から、無脊椎動物においても、インスリン関連タンパク質は、代謝、細胞増殖、細胞分化及び個体の成長に関わる因子の一つとして機能していることは明らかである。さらに、無脊椎動物においては、インスリン関連タンパク質は、神経伝達物質としても機能していると推定されている（非特許文献４参照）。加えて、線虫のインスリン関連タンパク質のレセプター遺伝子（ｄａｆ−２）は、個体の寿命を規定する遺伝子として見出されたものである（非特許文献５参照）。【０００５】  インスリン及びインスリン関連タンパク質に関連する上記のような研究結果は、これらのタンパク質群の動物界における広範な分布を示し、即ち、動物種を問わず個体の生命維持及び成長等に深く関与している重要な因子であることを示すものである。このことにより、該ファミリータンパク質は、他の成長制御因子と同様に、医薬品開発はもとより、農薬開発や飼育、養殖技術開発等においても重要な標的分子の一つとなっており、新規の構造を有するインスリン関連タンパク質及びその遺伝子の提供が望まれている。【０００６】  無脊椎動物には産業的に重要な生物種が数多く含まれている。ホタテ貝、カキ、アコヤ貝等の二枚貝類はその代表的な例である。従来から、それらの飼育・養殖技術、細胞あるいは組織培養技術の開発や改良が常に望まれて来た。例えば、カキでは魚類由来成長ホルモンや哺乳類ＩＧＦによる生育促進が検討されており（非特許文献６、非特許文献７参照）、また、アコヤ貝でも、同様に魚類由来成長ホルモンや哺乳類ＩＧＦの利用による真珠生育の促進が報告されている（特許文献１参照）。二枚貝類に関わるこのような技術においても、同種生物由来の成長制御因子を用いることによって、より高い効果が期待できる。しかしなが��、二枚貝類における内在性成長制御因子に関する知見は非常に限られている現状にあり（非特許文献８参照）、特にインスリン関連タンパク質の構造に関する知見は報告されていない。【０００７】
【特許文献１】特開平５−５６７２９号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５９巻、９２６−９３７頁、１９９６年
【非特許文献２】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９巻、６９９−７０３頁，１９９１年
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７巻、９４２−９４６頁、１９９７年
【非特許文献４】Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９巻、７７３２−７７４１頁、１９９９年
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９巻、１３４６−１３５１頁、２００３年
【非特許文献６】Ｂｉｏｌ．Ｂｕｌｌ．、１８１巻、４５９−４６２頁、１９９１年
【非特許文献７】Ｇｅｎ．  Ｃｏｍｐ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１３４巻、４４−５６頁、２００３年
【非特許文献８】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６７巻、３９８６−３９９３頁，２０００年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明の目的は、医薬もしくは農薬開発、あるいは、無脊椎動物，特には貝類の養殖技術の開発等に有益な新規の構造を有するインスリン関連タンパク質及び該タンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ホタテ貝において、新規構造を有するインスリン関連タンパク質をコードするｍＲＮＡを見出した。そのｃＤＮＡの塩基配列分析の結果、５種類のインスリン関連タンパク質前駆体のオープンリーディングフレームの塩基配列（配列番号６〜１０）及びアミノ酸配列（配列番号１〜５）を明らかにし、本発明を完成させるに至った。本発明は、これらの新規に見出されたインスリン関連タンパク質及びその遺伝子等に関するものである。【００１０】  即ち、請求項１に記載の本発明は、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質に関する。請求項２に記載の本発明は、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において、１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、請求項１記載のタンパク質の機能と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質に関する。請求項３に記載の本発明は，軟体動物二枚貝類由来である請求項１または請求項２に記載のタンパク質に関する。請求項４に記載の本発明は、ホタテ貝由来である請求項１または請求項２に記載のタンパク質に関する。請求項５に記載の本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の部分ポリペプチドに関する。請求項６に記載の本発明は、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡに関する。請求項７に記載の本発明は、請求項５に記載の部分ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡに関する。請求項８に記載の本発明は、配列番号６〜１０のいずれか一つで表される塩基配列から成るＤＮＡに関する。請求項９に記載の本発明は、軟体動物二枚貝類由来である請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡに関する。請求項１０に記載の本発明は、ホタテ貝由来である請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡに関する。
【発明の効果】
【００１１】  本発明は、二枚貝類由来の新規構造を有するインスリン関連タンパク質の前駆体、その部分ポリペプチド並びにそれらをコードするＤＮＡを提供する。これらは、さらに、該タンパク質の抗体、阻害剤、賦活剤等の開発及び製造や、該タンパク質のシグナル伝達に関わるタンパク質等（レセプター等）の単離及び利用をも促す。即ち、本発明による新規タンパク質及びＤＮＡ等は、医薬及び農薬開発の他、農水産物、特には二枚貝類の養殖技術、成育状態の検査技術及び飼料等の開発や、あるいは二枚貝類の細胞もしくは組織培養技術等において有用な新たな手段を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明による、配列番号１〜５のアミノ酸配列から成る全長１９８アミノ酸残基の５種類のタンパク質は、既知の脊椎動物インスリン及び無脊椎動物インスリン関連タンパク質の前駆体との構造比較により、いずれも新規の構造を有するインスリン関連タンパク質の前駆体であることが明らかとなったものである。【００１３】  即ち、本発明による配列番号１〜５のアミノ酸配列から成る該前駆体については、シグナル配列予測プログラム（ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１）により予測されたシグナル配列、既知の軟体動物インスリン関連タンパク質において保存性の高いアミノ酸残基及びその位置、インスリン関連タンパク質前駆体から成熟インスリン関連タンパク質になる際のプロセッシング部位（Ｌｙｓ−Ａｒｇの２残基から成る配列）の位置等によって、アミノ末端側から、シグナル配列（アミノ酸残基番号１−２４）、Ｂ鎖領域（アミノ酸残基番号２５−５９）、Ｃ鎖領域（アミノ酸残基番号６０−１３２）、Ａ鎖領域（アミノ酸残基番号１３３−１６８）及びＤ鎖領域（アミノ酸残基番号１６９−１９８）の各領域を特定することができる。さらに、既知の軟体動物由来インスリン関連タンパク質において特徴的に保存されているアミノ酸残基が保持されている（配列番号１〜５のアミノ酸配列のアミノ酸残基番号３０、４３、５５、１４２、１４４、１４５、１４９及び１５８のＣｙｓ、３９のＰｒｏ、４０のＡｒｇ、４１及び４４のＧｌｙ、４７のＬｅｕ、１４３のＧｌｕ及び１５７のＴｙｒ）。【００１４】  また、本発明による配列番号１〜５のアミノ酸配列から成るインスリン関連タンパク質前駆体は次のような構造上の特徴を有する。第一に、インスリンとしては例外的にＩＧＦにおけるＤ鎖領域と見なすことができる配列領域が存在する（アミノ酸残基番号１６９−１９８）。第二に、特に長いＣ鎖領域に加えて上記Ｄ鎖領域が付加されていることにより、全長が１９８アミノ酸残基に達し、既知の脊椎動物インスリン及び無脊椎動物インスリン関連タンパク質の中では例外的に大きい前駆体である。第三に、該前駆体５種は、６ヶ所においてアミノ酸変異が認められるものである。即ち、配列番号１のアミノ酸配列に対して、配列番号２では、１０８番目ＨｉｓがＡｓｎに置換されている。配列番号３では、７１番目ＬｙｓがＩｌｅ、９９番目ＬｅｕがＰｈｅ、１１３番目ＩｌｅがＶａｌ、１１６番目ＧｌｙがＳｅｒ、１７１番目ＴｈｒがＳｅｒにそれぞれ置換されている。配列番号４では，７１番目ＬｙｓがＩｌｅ、９９番目ＬｅｕがＰｈｅ、１１３番目ＩｌｅがＶａｌ、１１６番目ＧｌｙがＳｅｒにそれぞれ置換されている。配列番号５では１１６番目ＧｌｙがＰｒｏに置換されている。【００１５】  本発明による配列番号１〜５のアミノ酸配列から成る５種類のインスリン関連タンパク質前駆体は、そのアミノ酸配列の相同性が９７％以上であることから、同一の遺伝子座における多型性によるものと考えられる。また、アミノ酸置換位置は、前記Ｃ鎖領域において５ヶ所、Ｄ鎖領域において１ヶ所存在しており、Ｂ鎖領域及びＡ鎖領域にアミノ酸置換は認められない。このことは翻訳後のプロセッシングによって成熟タンパク質の構成鎖となるＢ鎖領域及びＡ鎖領域を保存する分子��化上の選択圧を推測させるものである。これらの観察から、本発明による５種類のインスリン関連タンパク質前駆体の遺伝子座由来のものに限ってみても、特にＣ鎖領域及びＤ鎖領域において、１〜１０個程度のアミノ酸変異を有する他の変異体タンパク質が存在することは容易に推測できる。【００１６】  本発明による、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質、またはこれらのタンパク質の部分ポリペプチドは、その由来は特に限定されない。生物起源のものの他、当業者に周知の手法、例えば化学合成によって製造されるものや、該タンパク質の遺伝子を導入された形質転換体等を作製して生産されるもの等も全て包含される。天然の生物起源の上記タンパク質としては、軟体動物二枚貝類由来のもの、好ましくはホタテ貝由来のものが例示される。【００１７】  生物からの配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質の製造には、公知の生体物質の精製法、例えば、硫安沈澱法等の塩析法、各種クロマトグラフィー法、電気泳動法、あるいは限外ろ過法等を適宜組合わせて精製する方法を用いることができる。これらの分離精製過程においては、該タンパク質は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離してクマシーブリリアントブルー等により染色することで検出するか、あるいは、該タンパク質の一部あるいは全部を抗原として用いることによって作製される抗体を用いることにより検出することができる。【００１８】  あるいは、本発明による配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質の製造には、遺伝子操作に関わる公知の各種手法を用いることもできる。例えば、本発明による配列番号６〜１０のいずれかの塩基配列を含有するＤＮＡ等の該タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、適当な発現ベクターのプロモーター下流に連結し、これを微生物等の細胞に導入して形質転換体を得、その培養物から採取する方法が好ましく用いられる。発現ベクターとしては、形質転換体において該タンパク質が発現されるものであれば特に制限はなく、簡便には該形質転換体に適合した市販の各種タンパク質発現用ベクターを用いることができる。発現されたタンパク質の分離精製には、例えば、前記の生体物質の精製方法が適宜用いられる。【００１９】  また、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質の部分ポリペプチドとは、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列中の連続した４個以上のアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列で表されるポリペプチドの他、それらのポリペプチドがジスルフィド結合等の共有結合により連結されて成るポリペプチド、例えば、該タンパク質から翻訳後のプロセッシングによって生じる該タンパク質由来の成熟ポリペプチド等を意味する。該部分ポリペプチドの製造にも上記の生体物質の精製法や遺伝子操作技術等の公知の手法を用いることができるが、短鎖ポリペプチドであれば、化学合成法が好ましく用いられる。【００２０】  本発明による、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質とは、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列において、好ましくは２０個以下のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、しかも配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質を意味する。
これらのタンパク質の起源は、特に限定されるものではないが、例えば、ホタテ貝由来のものでは、前述のように、本発明による配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列から成るタンパク質の遺伝子座の多型性に基づく変異体タンパク質や、該遺伝子座と異なる遺伝子由来のインスリン関連タンパク質が挙げられる。【００２１】  天然の生物由来の上記のような変異体タンパク質等の取得にも、前記の公知の生体物質の精製方法を用いることができる。また、前記のように、当業者に周知の方法により、該タンパク質をコードするＤＮＡを導入された形質転換体を作成し、その培養物から採取する方法も用いることができる。該タンパク質等をコードするＤＮＡの取得には、例えば、対象とする生物のゲノムもしくはｃＤＮＡのライブラリーを構築した後、本発明による配列番号６〜１０のいずれかの配列またはその一部の配列から成るＤＮＡをプローブとして選抜する方法や、部位特異的変異導入法、Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（以下、ＲＡＣＥと略記することがある。）法、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲと略記することがある。）法、化学合成法等の公知の手法を適宜組み合わせて用いることができる。【００２２】  また、上記の変異体タンパク質等の部分ポリペプチドとは、これらのタンパク質のアミノ酸配列中の連続した４個以上のアミノ酸残基から成る部分アミノ酸配列で表されるポリペプチドの他、それらのポリペプチドが共有結合により連結されて成るポリペプチド、例えば、該タンパク質から翻訳後のプロセッシングによって生じる成熟ポリペプチド等を意味する。これらの部分ポリペプチドの製造にも上記の公知手法を適宜用いることができるが、短鎖ポリペプチドであれば、化学合成法が好ましく用いられる。【００２３】  配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列において１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、配列番号１〜５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質、またはこれらのタンパク質の部分ポリペプチドのいずれかをコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、その由来もしくはその製法は特に限定されない。生物起源のものの他、当業者に周知の手法、例えば化学合成法や遺伝子操作技術またはそれらを適宜組み合わせた手法によって取得されるもの等も全て包含される。また、該ＤＮＡは、上記のタンパク質あるいは部分ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであれば、いかなる塩基配列から成るものであっても良い。生物起源の該ＤＮＡとしては、軟体動物二枚貝類由来のもの、好ましくはホタテ貝由来のものが例示される。また、ホタテ貝由来のものとしては、本発明による、配列番号６〜１０のいずれかの塩基配列から成る５種類のＤＮＡが例示される。尚、配列番号６、７、８、９、１０の塩基配列は、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５のアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものである。【００２４】  本発明による、配列番号１〜５のいずれか一つで表される���ミノ酸配列から成るタンパク質またはそれらの部分ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、前記のような、当業者に周知の遺伝子操作技術、例えば、対象とする生物のゲノムもしくはｃＤＮＡのライブラリーを構築した後、本発明による配列番号６〜１０のいずれかの配列の一部の配列から成るＤＮＡをプローブとして選抜する方法、ＲＡＣＥ法、化学合成法、ＰＣＲ法、部位特異的変異導入法等によって取得できる。例えば、ホタテ貝からは、以下のようにＲＡＣＥ法を適用することによっても取得できる。【００２５】  まず、ホタテ貝からｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製し、このｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として市販の反応キットを用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成する。例えば、ＳＭＡＲＴＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いた場合には、第一鎖ｃＤＮＡの３’末端にユニバーサルプライマーの配列に対する相補配列が付加された５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ、及び５’末端にユニバーサルプライマー配列が付加された３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡをそれぞれ取得できる。次に、配列番号６〜１０のいずれかの塩基配列の一部の配列から成るセンスプライマー、もしくは軟体動物腹足類のインスリン関連タンパク質の遺伝子において良く保存されているアミノ酸配列を基にして設計されるセンスプライマー（混合塩基を含むＤＮＡであっても良い）のいずれかとユニバーサルプライマーを用い、３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。これによって増幅される該タンパク質ｃＤＮＡの下流側の断片をクローニングし、その塩基配列を分析する。続いて、このクローニングされた増幅断片の配列からアンチセンスプライマーを設計し、このプライマーとユニバーサルプライマーを用いて５’ＲＡＣＥを行う。これによって増幅される該タンパク質ｃＤＮＡの上流側断片をクローニングし、塩基配列を分析する。以上のＲＡＣＥの結果から、該タンパク質のｃＤＮＡの塩基配列が明らかとなる。該タンパク質をコードする全長ｃＤＮＡは、例えば、この塩基配列を基に設計される上流センスプライマーとユニバーサルプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ等によって取得できる。このＰＣＲには、正確性の高いＤＮＡポリメラーゼ（例えば、商品名ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴＯＹＯＢＯ社製等）を用いることが好ましい。以上の手法を複数のホタテ貝個体由来のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに適用することにより、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列を含有するＤＮＡが取得された。【００２６】  また、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列から成るタンパク質の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号６〜１０のいずれかの塩基配列を基に、目的の部分ポリペプチドをコードする塩基配列領域を挟むセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計し、これらを１対のプライマーとして用いて、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするＤＮＡもしくは前記の１本鎖ｃＤＮＡのいずれかを鋳型とするＰＣＲを行う方法等によって取得できる。【００２７】  配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列に���いて１あるいは数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列から成り、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列から成るタンパク質と実質的に同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、例えば、対象とする生物のゲノムもしくはｃＤＮＡのライブラリーを構築した後、本発明による配列番号６〜１０のいずれかの塩基配列またはその一部の配列を有するＤＮＡをプローブとして選抜する方法や、前記のようなＲＡＣＥ法、部位特異的変異導入法、ＰＣＲ法、化学合成法等の当業者周知の手法により取得できる。また、本発明において示されているように、ホタテ貝では、インスリン関連タンパク質の遺伝子に著しい多型性が認められた。即ち、前記のＲＡＣＥ法を多数のホタテ貝個体由来のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに適用することによっても、配列番号１〜５のアミノ酸配列において数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列から成る変異体タンパク質のｃＤＮＡを取得することができる。
さらに、該タンパク質の部分ポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、前記のように、目的の部分ポリペプチドをコードする塩基配列領域を挟むセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計し、これらを１対のプライマーとして用い、該タンパク質をコードするＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う方法等によって容易に取得できる。
【実施例】
【００２８】  以下に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００２９】実施例１（ホタテ貝ＲＮＡの調製）
ホタテ貝の稚貝（殻径約１〜４ｍｍ）を集めて液体窒素で凍結し、ＲＮＡの抽出に用いた。ホタテ貝全ＲＮＡの調製は、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法を用い、次のように行った。即ち、凍結した稚貝（２．６ｇ）に、２６ｍｌの細胞破砕用溶液（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）を加え、直ちにポリトロン（登録商標）ホモジナイザーにて破砕（１０秒間×３）した。懸濁液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間、室温）して不溶物を除去し、上清に２．６ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウ厶（ｐＨ４．０）を加えて撹拌した後、２６ｍｌの水飽和フェノールを加えて撹拌した。この混合液に５．２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：１、ｖ／ｖ）を加えて撹拌し、氷中に１５分間静置後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）した。水層を回収し、水層に２６ｍｌのイソプロパノールを加えて、−２０℃で３０分間静置した後、生じたＲＮＡの沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）により回収した。沈殿を１．４ｍｌの細胞破砕用溶液に溶解し、等量のイソプロパノールを加えて−２０℃に３０分間静置後、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールに懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、２０分間、４℃）によって再度沈殿を回収、風乾することにより、２．６ｍｇのＲＮＡが得られた。得られたＲＮＡから、オリゴｄＴセルロースによるｍＲＮＡ精製キット（商品名ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、アマシャムバイオテク社製）を用い、同社マニュアルに従って、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。【００３０】実施例２（ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡの調製）
実施例１で調製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥの鋳型として用いる１本鎖ｃＤＮＡを調製した。反応は、市販のＲＡＣＥ用キット（商品名ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、クロンテック社製）を用い、同社の添付資料の方法に従って以下のように行った。
即ち、５’ＲＡＣＥ用ｃＤＮＡの調製においては、４０ｎｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに１０ｐｍｏｌの該キット付属の５’ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ及び１０ｐｍｏｌの該キット付属のＳＭＡＲＴ  ＩＩＡ  Ｏｌｉｇｏを加えて全量５μｌの水溶液とした。一方、３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡの調製では、４０ｎｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡに１０ｐｍｏｌの該キット付属の３’ＲＡＣＥ  ＣＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａを加えて、全量５μｌの水溶液とした。混合液を７０℃で２分間加熱変性し、氷冷した後、それぞれの混合液に、終濃度で５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、７５ｍＭの塩化カリウム、６ｍＭの塩化マグネシウム、２ｍＭのジチオスレイトール、各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを加え、最後に１μｌの該キット付属の逆転写酵素を加えて総量１０μｌとし、４２℃で１．５時間保温した。逆転写反応後、それぞれの反応液に２０μｌの該キット付属のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ緩衝液を加え、７２℃で７分間加熱後、氷冷した。それぞれを、５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ及び３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡとして以後の実験に用いた。【００３１】実施例３（インスリン関連タンパク質のｃＤＮＡの検出）
軟体動物腹足類のインスリン関連タンパク質の遺伝子において比較的良く保存されているＡ鎖領域の部分アミノ酸配列を基にして設計した混合塩基を含むＤＮＡをセンスプライマー（プライマー１、配列番号１１）として用い、実施例２で調製した３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として３’ＲＡＣＥを行った。ＰＣＲは、反応キット（商品名ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ、クロンテック社製）を用いて行った。反応は、３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ溶液（１μｌ）、１００ｐｍｏｌのプライマー１、１０ｐｍｏｌのＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ付属）、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１μｌのＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及びＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ添付の反応緩衝液から成る総量５０μｌの反応液で行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間保持後、変性（９４℃、１０秒間）、アニーリング（５０℃、３０秒間）及び伸長（７２℃、１分間）を３０サイクル繰り返した後、７２℃で３分間保持して反応を終了した。増幅断片（約６００塩基対）を市販の大腸菌プラスミド（商品名ｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ、ノバジーン社製）にリガーゼ（商品名ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。増幅されたｃＤＮＡ断片のプラスミドクローンを保持した大腸菌形質転換株からアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドを調製し、塩基配列を分析した。
該ｃＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサー（型式ＳＱ−５５００、日立製作所製）を用いて分析した。反応は、サイクルシーケンシング反応キット（商品名Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ、日立計測器サービス社より購入）により、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識プライマー（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識Ｍ１３  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（−２１）またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識Ｍ１３  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（−２９）、日立計測器サービス社より購入）を用いて、同社の添付資料の方法に従って行った。その結果、プライマー１の配列に続いて、配列番号１〜５のアミノ酸配列のカルボキシル末端側（１４５残基目から１９８残基目）をコードする数種のｃＤＮＡ断片のクローンを得た。これらは、そのアミノ酸配列が既知のインスリンファミリーに属するタンパク質のＡ鎖部分において特徴的に保存されたアミノ酸残基を全て含んでいたことから、目的とするホタテ貝インスリン関連タンパク質のｃＤＮＡ断片のクローンであることが明らかとなった。【００３２】実施例４（インスリン関連タンパク質ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥ）
前記３’ＲＡＣＥの結果を基に、ホタテ貝インスリン関連タンパク質ｃＤＮＡに特異的なアンチセンスプライマー（プライマー２、配列番号１２）を設計し、これを用いてホタテ貝インスリン関連タンパク質ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥを行った。５’ＲＡＣＥは前記のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて行った。ＰＣＲは、実施例２で調製した５’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ（１μｌ）、１０ｐｍｏｌのプライマー２、５μｌの該キット付属の１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｉｍｅｒＡ  Ｍｉｘ、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１μｌの該キット付属のＤＮＡポリメラーゼ（５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ）及び該キット付属のＰＣＲ用緩衝液から成る総量５０μｌの反応液で行った。ＰＣＲは、変性（９４℃、５秒間）及びアニーリング／伸長（７２℃、２分間）を５サイクル繰り返した後、変性（９４℃、５秒間）、アニーリング（６８℃、１０秒間）及び伸長（７２℃、２分間）を５サイクル行い、最後に変性（９４℃、５秒間）、アニーリング（６５℃、１０秒間）及び伸長（７２℃、２分間）を３０サイクル繰り返して終了した。増幅されたＤＮＡ断片（約７００塩基対）を、前記実施例３に記載の方法によってクローニングし、塩基配列を分析した。その結果、プライマー２の配列に続いて、配列番号１〜５のアミノ酸配列のアミノ末端側（１残基目から１５５残基目）をコードする数種のｃＤＮＡ断片のクローンを得た。これらのアミノ酸配列が既知のインスリンファミリーに属するタンパク質において特徴的に保存されているアミノ酸残基を含んでいたことから、目的とするホタテ貝インスリン関連タンパク質のｃＤＮＡ断片のクローンであることが明らかとなった。【００３３】実施例５（インスリン関連タンパク質の全長ｃＤＮＡのクローニング）
３’ＲＡＣＥによりホタテ貝インスリン関連タンパク質の全長ｃＤＮＡのクローニングを行った。実施例４の５’ＲＡＣＥによって得られた結果を基に、該ｃＤＮＡに特異的なセンスプライマーとして、該ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の部分塩基配列から成るプライマー３（配列番号１３）を設計して反応に用いた。また、ＰＣＲには、正確性を高めるために、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。反応は、前記の３’ＲＡＣＥ用１本鎖ｃＤＮＡ（２μｌ）、１５ｐｍｏｌのプライマー３、７．５μｌの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、終濃度各０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、終濃度０．８ｍＭ硫酸マグネシウ厶、１ｕｌのＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及び該酵素に添付されたＰＣＲ用緩衝液から成る総量５０μｌの反応液で行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間保持後、変性（９４℃、５秒間）及びアニーリング／伸長（６８℃、３分間）を３５サイクル繰り返して終了した。約１１００塩基対の鎖長を有する増幅断片を２％アガロースゲル電気泳動によって精製した後、市販の平滑末端ＤＮＡクローニングキット（商品名Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ、ノバジーン社製）を用いて該キット付属のプラスミドｐＴ７  Ｂｌｕｅに連結し、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ株を形質転換した。形質転換株から増幅断片を含むプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法によって調製し、実施例３に記載の方法によって塩基配列を決定した。以上の結果、配列番号６〜１０のオープンリーディングフレームの塩基配列を含む５種類のｃＤＮＡクローンが取得された。これらのオープンリーディングフレームは５９７塩基対から成り、それぞれ配列番号１〜５のアミノ酸配列から成る５種類のホタテ貝インスリン関連タンパク質の前駆体をコードするものである。【００３４】  配列番号１〜５のアミノ酸配列について、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）によって提供されているＦＡＳＴＡ検索プログラムを利用して、相同性検索を行った結果、軟体動物インスリン関連タンパク質のアミノ酸配列の特徴が保持された新規のインスリン関連タンパク質の前駆体であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】  本発明は、二枚貝類由来の新規構造を有するインスリン関連タンパク質の前駆体、その部分ポリペプチド及びそれらをコードするＤＮＡを提供する。該新規タンパク質やＤＮＡ等は、これらを利用して得られる抗体、阻害剤等と共に、医薬及び農薬開発の他、農水産物、特には二枚貝類の養殖技術、成育状態の検査技術及び飼料等の開発や、あるいは二枚貝類の組織培養技術等において有用な新たな手段を提供するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（インスリン関連タンパク質ｃＤＮＡの３’ＲＡＣＥに用いた混合塩基を含むプライマー１の配列）、位置（９）及び（１５）は、ａ、ｃ、ｇまたはｔ。
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（インスリン関連タンパク質ｃＤＮＡの５’ＲＡＣＥに用いたプライマー２の配列）。
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ（インスリン関連タンパク質の全長ｃＤＮＡの増幅に用いたプライマー３の配列）。【００３７】
【配列表】
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