(57)【要約】【課題】  亜硝酸酸化細菌が有する亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢを検出・定量するためのＰＣＲプライマーセットを提供することを目的とする。【解決手段】  Nitrobacter hamburgensisの有する亜硝酸酸化還元酵素遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを作成した。２種類のプライマーからなるプライマーセット１及び２を用いて活性汚泥のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれに最適なＰＣＲ条件を求めた。ＰＣＲ産物を精製後、プラスミドベクターに連結し、大腸菌を形質転換し、クローンを得た。BLAST検索の結果、いずれのプライマーセットから得られたクローンもNitrobacter hamburgensisのｎｏｒＢ遺伝子と高い相同性を示した。Ｃ−ＰＣＲ法を用いることにより、ｎｏｒＢ遺伝子コピー数の定量も可能となった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜硝酸酸化還元酵素遺伝子(nitrite oxidoreductase β-subunit)ｎｏｒＢに特異的な一対のＰＣＲ用プライマーであって、当該プライマーが配列番号：１及び２に記載の塩基配列から構成されることを特徴とするプライマー。
【請求項２】
亜硝酸酸化還元酵素遺伝子(nitrite oxidoreductase β-subunit)ｎｏｒＢに特異的な一対のＰＣＲ用プライマーであって、当該プライマーが配列番号：３及び４に記載の塩基配列から構成されることを特徴とするプライマー。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢをＰＣＲ法によって検出する方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢコピー数をＰＣＲ法によって定量する方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ法がＣ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＭＰＮ−ＰＣＲ法又はＲＬＤ−ＰＣＲ法のいずれかである請求項４に記載の定量方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢをＰＣＲ法によって検出し、そのコピー数をＰＣＲ法によって定量しながら運転することを特徴とする生物学的排水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜硝酸酸化還元酵素（nitrite oxidoreductase：ＮＯＲ）遺伝子を検出するためのＰＣＲ（polymerase chain reaction）プライマーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いる排水の生物学的窒素除去は、化学式１に示される亜硝酸型硝化脱窒反応及び化学式２に示される硝酸型硝化脱窒反応の２種類の反応がある。
【化１】
2005229929.tif 000002
【０００３】
【化２】
2005229929.tif 000003
【０００４】
亜硝酸型硝化脱窒法は、硝化反応において、硝酸型硝化脱窒法と比較して必要な酸素量が25％少ないため、曝気量を25％削減することが可能であり、曝気にかかる電力を節約することが可能である。また、脱窒反応においても、硝酸型硝化脱窒法と比較して水素供与体として必要なメタノールを40％削減することが可能であり、排水処理コストを削減することが可能である。このため、近年、新しい省エネルギー型の窒素除去方法として、亜硝酸から脱窒する亜硝酸型硝化脱窒法が注目されている（非特許文献１）。
【０００５】
アンモニアの硝化に関与する酵素群（化学式３）のうち、アンモニア酸化酵素（ＡＭＯ）とヒドロキシルアミン酸化酵素（ＨＡＯ）をコードする遺伝子については、各種排水処理装置や自然界から多くの遺伝子がＰＣＲ法等により検出され、排水処理装置の処理特性との関連性についての報告もなされている。
【化３】
2005229929.tif 000004
【０００６】
この亜硝酸型硝化脱窒法を確立するためには、排水中のアンモニアの一部又は全ての酸化を亜硝酸で停止させ、硝酸が生成しない硝化プロセスが必要となる。すなわち、排水処理装置において亜硝酸酸化細菌の増殖を抑制するか、又は亜硝酸酸化細菌の亜硝酸酸化還元酵素（ＮＯＲ）をコードする遺伝子（nitrite oxidoreductase beta subunit：ｎｏｒＢ）の発現を抑制し、亜硝酸から硝酸が生成されるステップを抑制する運転を行うことが必要となる。
【０００７】
ここで、亜硝酸酸化細菌数を定量する方法としては、最確数法（most probable number method：ＭＰＮ法）が多く用いられてきた（非特許文献２）。また、亜硝酸酸化細菌の迅速な検出・定量方法として、16SrＲＮＡ遺伝子をターゲットとするＰＣＲ法による方法が報告されている（非特許文献３、４）。
【０００８】
一方、ＮＯＲをコードする遺伝子の研究例は極めて少なく、亜硝酸酸化細菌として、Nitrobacter hamburgensis 由来の遺伝子が唯一クローニングされているにすぎず、その遺伝子配列が決定されているだけである（非特許文献５）。また、この遺伝子をＰＣＲ法により検出、定量した例も見当たらない。
【非特許文献１】R. van Kempen et al., Wat. Sci. Technol., 44, p145-152 (2001).
【非特許文献２】下水試験方法上巻（1997年版）：社団法人日本下水道協会、p608-611．
【非特許文献３】Hebe M. Dionisi et al., 2003  Appl. Environ. Microbiol., 69, p6597-6604.
【非特許文献４】Hebe M. Dionisi et al. 2002  Appl., Environ. Microbiol., 68, p245-253.
【非特許文献５】K. Kirstein and E. Bock, Arch. Microbiol., 160, P447-453 (1993).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
生物学的排水処理装置における亜硝酸酸化細菌の定量方法として、ＭＰＮ法は、結果が出るまでに約１〜２ヶ月もの期間を必要とするため、排水処理装置の運転管理への適応は不可能であった。また、16SrＲＮＡ遺伝子をターゲットとするＰＣＲ法も、２〜３日以内に遺伝子数（∝亜硝酸酸化細菌数）を定量することが可能であるが、ＮＯＲ遺伝子を対象とした定量法ではないために排水処理装置の処理性能に直結した解析は不可能であった。
【００１０】
本発明は、排水処理装置中のＮＯＲコード遺伝子であるｎｏｒＢのコピー数を、ＰＣＲ法を用いて迅速に定量するためのプライマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、排水処理装置中の亜硝酸酸化細菌が有するｎｏｒＢを、ＰＣＲ法を用いて増幅・検出するためのプライマーに関する。また、本発明は、ＰＣＲ法を用いて排水処理装置中のｎｏｒＢコピー数を定量する方法に関する。
【００１２】
具体的に、本発明は、
（１） 亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢに特異的な一対のＰＣＲ用プライマーであって、当該プライマーが配列番号：１及び２に記載の塩基配列から構成されることを特徴とするプライマー；
（２） 亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢに特異的な一対のＰＣＲ用プライマーであって、当該プライマーが配列番号：３及び４に記載の塩基配列から構成されることを特徴とするプライマー；
（３）上記（１）又は（２）に記載のＰＣＲプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢをＰＣＲ法によって検出する方法;
（４）上記（１）又は（２）に記載のＰＣＲプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢコピー数をＰＣＲ法によって定量する方法；
（５）前記ＰＣＲ法がＣ−ＰＣＲ法（competitive PCR法）法、リアルタイムＰＣＲ法（real time PCR法）法、ＭＰＮ−ＰＣＲ法（most probable number PCR法）又はＲＬＤ−ＰＣＲ法（replicative limiting dilution PCR法）のいずれかである上記（４）に記載の定量方法、
（６）上記（１）又は（２）に記載のプライマーを用いて、排水処理装置中の亜硝酸酸化還元酵素遺伝子ｎｏｒＢをＰＣＲ法によって検出し、そのコピー数をＰＣＲ法によって定量しながら運転することを特徴とする生物学的排水処理方法、に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のプライマーセットを用いることにより、排水処理装置中のｎｏｒＢ遺伝子数を、ＰＣＲ法によって迅速に検出することが可能となる。また、ｎｏｒＢ遺伝子のコピー数を、ＰＣＲ法によって迅速に定量することが可能となる。それにより、排水処理装置において亜硝酸酸化細菌の増殖を抑制し、又は亜硝酸酸化細菌のｎｏｒＢ遺伝子の発現を抑制し、亜硝酸から硝酸が生成されるステップを抑制する運転を行うことが可能となる。さらに、排水処理装置において亜硝酸型硝化脱窒法を安定して実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り下記に限定されるものではない。
（プライマーの設計）
データベース上に唯一登録されている Nitrobacter hamburgensis のｎｏｒＢのＤＮＡ配列を基に、下記プライマーセットを設計した。
【００１５】
プライマーセット１
norB269f： 5’- actggaacaacgtggagacc − 3’（配列番号１）
norB443r： 5’- gtcggcagataggggttgta − 3’（配列番号２）
プライマーセット２
norB155f： 5’- acatccgagctcaagtttcg − 3’（配列番号３）
norB557r： 5’- atgtacttgcccgtcaccat − 3’（配列番号４）
（ＰＣＲ産物のクローニング）
活性汚泥からのＤＮＡの抽出と精製
民間工場の排水処理設備から採取した活性汚泥に含まれるＤＮＡを鋳型として、プライマーセット１を用いてＰＣＲを行った。活性汚泥からのＤＮＡ抽出は、ISOPLANT II（株式会社ニッポンジーン製）を用い、製造業者の推奨する方法に従って実施した。抽出したＤＮＡに、20μg/mLの濃度になるようRNase（株式会社ニッポンジーン製）を添加し、37℃で30分間処理して混在するＲＮＡを分解した後、製造業者の推奨する方法に従ってBIOSPINカラム（日本バイオラッドラボラトリー株式会社製）を用いてＤＮＡを精製した。この精製したＤＮＡをＰＣＲの鋳型として使用した。
【実施例１】
【００１６】
１）プライマーセット１を用いるＰＣＲ条件の検討
ＤＮＡ 10 ng、ＤＮＡポリメラーゼとしてKOD-Plus-（東洋紡績株式会社製）0.5 unit、1×PCR Buffer（東洋紡績株式会社製）、0.2 mM dNTP（東洋紡績株式会社製）、1 mM MgSO4、及び0.5μM 各プライマーからなる反応液を用いて、表１の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００１７】
【表１】
2005229929.tif 000005
ＰＣＲ産物は、常法に従い、３％アガロースゲル電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で観察した。全てのアニーリング条件で、目的とする約175bpの単一バンドが増幅された（図１）。
【００１８】
次に、このバンドがｎｏｒＢ遺伝子であるか否かを確認するため、60.0℃、62.2℃、及び63.7℃のアニーリング温度で得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定し、既知の遺伝子配列との相同性を比較した。ＰＣＲ産物は、MinElute PCR Purification Kit（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、Zero Blunt TOPO PCR Purification Kit（インビトロジェン株式会社製）を用いてクローニングし、大腸菌を形質転換した。任意に選出した形質転換体24ケからプラスミドを精製した後、プライマーセット１を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は、上記精製キットを用いて精製した。このＰＣＲ産物を、制限酵素HaeIII、HhaI、及びHpaIIで別々に切断した後、その一部をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、その泳動パターンを比較した。泳動パターンの異なるクローンを選出し、塩基配列を決定した。
２）BLAST相同性検索
プライマーセット１によって得られたＰＣＲ産物の塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、既知の遺伝子及び蛋白質との相同性検索は、BLASTホモロジー検索（http://www.ncbi.nlm.gov/）により実施した。表２にプライマーセット１を用いたときに得られたＰＣＲ産物のBLASTホモロジー検索の結果を示す。
【００１９】
【表２】
2005229929.tif 000006
プライマーセット１を用いた場合、60.0℃及び62.2℃のアニーリング温度において、それぞれ４種類のクローンが得られた。それらのうち、クローン１〜３は、Nitrobacter hambuergensisのｎｏｒＢ遺伝子と塩基配列で、それぞれ88％、86％及び93％の相同性を示した。また、アミノ酸レベルでは、それぞれ95％、96％及び96％の相同性を示した。クローン４は、ｎｏｒＢ遺伝子とは全く関連性が見られない遺伝子であったことから、プライマーのミスマッチにより増幅されたものと推測された。63.7℃のアニーリング温度において３種類のクローンが得られ、全てｎｏｒＢ遺伝子と高い相同性を示した。以上の結果から、プライマーセット１のＰＣＲ条件として、ＤＮＡポリメラーゼとしてKOD-Plus-を用いた場合、MgSO4 濃度1 mM、アニーリング温度63.7℃において目的とするｎｏｒＢ遺伝子のみが増幅され、最適なＰＣＲ条件であることが示された。なお、クローン１〜３の塩基配列は、配列表の配列番号：５〜７に示した。
【実施例２】
【００２０】
１）プライマーセット２を用いるＰＣＲ条件の検討
ＤＮＡ 10 ng、ＤＮＡポリメラーゼとしてAmpliTaq Gold（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）1.25 unit、1×PCR Buffer（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）、0.2 mM dNTP（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）、2.5 mM MgSO4、及び0.5μM 各プライマーからなる反応液を用いて、表３の条件でＰＣＲ反応を行った。
【００２１】
【表３】
2005229929.tif 000007
ＰＣＲ産物は、常法に従い、３％アガロースゲル電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で観察した。アニーリング温度53.5℃以下で、目的とする約400bpの単一バンドが増幅された（図２）。
【００２２】
次に、このバンドがｎｏｒＢ遺伝子であるか否かを確認するため、実施例１と同様にして、48.6℃のアニーリング温度で得られたＰＣＲ産物の遺伝子配列を決定し、既知の遺伝子配列との相同性を比較した。
２）BLAST相同性検索
プライマーセット２によって得られたＰＣＲ産物の塩基配列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列と、既知の遺伝子及び蛋白質との相同性検索は、実施例１と同様にBLASTホモロジー検索により実施した。表４にプライマーセット２を用いたときに得られたＰＣＲ産物のBLASTホモロジー検索の結果を示す。
【００２３】
【表４】
2005229929.tif 000008
プライマーセット２を用いた場合、48.6℃のアニーリング温度において、２種類のクローンが得られ、Nitrobacter hamburgensisのｎｏｒＢ遺伝子と塩基配列で、それぞれ90％及び91％の相同性を示した。また、アミノ酸レベルでは、それぞれ98％及び96％の相同性を示した。以上の結果から、プライマーセット２のＰＣＲ条件として、ＤＮＡポリメラーゼとしてAmpliTaq Goldを用いた場合、MgSO4 濃度2.5 mM、アニーリング温度48.6℃において目的とするｎｏｒＢ遺伝子のみが増幅され、最適なＰＣＲ条件であることが示された。なお、クローン５及び６の塩基配列は、配列表の配列番号：８及び９に示した。
【実施例３】
【００２４】
（ｎｏｒＢ遺伝子コピー数の定量）
プライマーセット１を用いて、活性汚泥中のｎｏｒＢ遺伝子コピー数の定量実験を行った。定量法として、この実施例ではＣ−ＰＣＲ法を採用した。
【００２５】
競合的ＤＮＡは、competitive DNA Construction Kit（宝バイオ株式会社製）を用いて製造業者の推奨する方法に従って作製した。標的ＤＮＡ 10 ng、1×PCR Buffer（東洋紡績株式会社製）、  0.2 mM dNTPs（東洋紡績株式会社製）、1 mM MgSO4、及び0.5μM 各プライマー、1×106〜1.56×104コピーの競合的ＤＮＡ、及びKOD-Plus-（東洋紡績株式会社製）0.5 unitからなる反応液を用いて、表５に示す条件でＣ−ＰＣＲを実施した。
【００２６】
【表５】
2005229929.tif 000009
ＰＣＲ産物は、常法に従い、３％アガロースゲル電気泳動を行い、電気泳動ゲル撮影／解析システムEDAS290（Kodak）により、ｎｏｒＢ遺伝子と競合ＤＮＡに相当するバンドの蛍光強度を測定した。本実施例では、図３（Ａ）に示した４つの競合ＤＮＡコピー数における、標的ＤＮＡと競合ＤＮＡの蛍光強度を測定した。ｎｏｒＢ遺伝子のコピー数は、図３（Ｂ）に示した両対数グラフにおいて、ｎｏｒＢ遺伝子に相当するバンドの蛍光強度が、競合ＤＮＡの蛍光強度と等しくなる点、すなわち、log(Fl. Target / Competitor = 0)であるときのｙ軸の値から算出した。本実施例では、10 ngの標的ＤＮＡあたり105.44コピーのｎｏｒＢ遺伝子が存在した。本実施例で用いた活性汚泥１mLから精製したＤＮＡは、3260 ngであったため、活性汚泥１mL中に含まれるｎｏｒＢ遺伝子は、
105.44 × 3260／10 = 107.95  コピーであると算出された。
【００２７】
本実施例のｎｏｒＢ遺伝子コピー数の定量法では、２日以内に操作が終了するため、ＭＰＮ法と比較して極めて短時間で定量を行うことが可能であった。なお、ｎｏｒＢ遺伝子の定量方法は、Ｃ−ＰＣＲ法に限らず、リアルタイムＰＣＲ法、ＭＰＮ−ＰＣＲ法又はＲＬＤ−ＰＣＲ法を用いても実施することが可能である。これらのうち、迅速に定量結果が得られるという点ではリアルタイムＰＣＲ法が最も好ましい。
【００２８】
また、本発明を適用しうる生物学的排水処理装置としては、微生物を装置内に浮遊させる活性汚泥処理装置、微生物を付着させた担体を用いる流動床式処理装置又は固定床式処理装置等が挙げられる。これら排水処理装置中のｎｏｒＢ遺伝子コピー数を、ＰＣＲ法を用いて迅速に定量することにより、定量結果に基づいて排水処理装置の運転条件を変化させて生物学的排水処理を効果的に継続することも可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
このように、本発明のプライマーセットを用いる定量法は、迅速かつ正確にｎｏｒＢ遺伝子を検出し、またそのコピー数を定量することができるため、排水処理装置において亜硝酸酸化細菌の増殖を抑制し、又は亜硝酸酸化細菌のｎｏｒＢ遺伝子の発現を抑制し、亜硝酸から硝酸が生成されるステップを抑制する運転を行うことが可能となる。また、排水処理装置において亜硝酸型硝化脱窒法を安定して実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プライマーセット１によるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動写真である。
【図２】プライマーセット２によるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動写真である。
【図３】（Ａ）Ｃ−ＰＣＲにおけるＰＣＲ産物のアガロース電気泳動写真である。          （Ｂ）Ｃ−ＰＣＲにおけるｎｏｒＢ遺伝子の検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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