(57)【要約】      （修正有）【課題】  生体内に発現するタンパク質の機能、役割を解明すること。【解決手段】  インスリン刺激によるグルコース取り込みに重要で、糖代謝の重要な制御因子であり、肥満症や糖尿病の発症に係わるタンパク質であるポンシンと、Ｎ-ＷＡＳＰ（特定の配列からなるタンパク質）、ＥＮＡＨ（特定の配列からなるタンパク質）、ＷＩＲＥ（特定の配列からなるタンパク質）のそれぞれとの間に、相互作用があることを新規に見出した。従って、これらのタンパク質の新規な機能及びこれらのタンパク質間の新規な相互作用、並びにこれらを利用した肥満・糖尿病治療剤又は肥満・糖尿病に係わるスクリーニング方法などを提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポンシンと相互作用する配列番号１からなるタンパク質。
【請求項２】
ポンシンと相互作用する配列番号２からなるタンパク質。
【請求項３】
ポンシンと相互作用する配列番号３からなるタンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質の発現又は機能を抑制することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤。
【請求項５】
請求項２記載のタンパク質の発現又は機能を抑制することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤。
【請求項６】
請求項３記載のタンパク質の発現又は機能を抑制することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤。
【請求項７】
ポンシンと配列番号１からなるタンパク質との相互作用。
【請求項８】
ポンシンと配列番号２からなるタンパク質との相互作用。
【請求項９】
ポンシンと配列番号３からなるタンパク質との相互作用。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載された相互作用の少なくとも一つを抑制又は増強することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤。
【請求項１１】
肥満・糖尿病治療剤製造のための、請求項７から９のいずれか一項に記載された相互作用の使用。
【請求項１２】
請求項７から９のいずれか一項に記載された相互作用を利用することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項７から９のいずれか一項に記載された相互作用を利用することを特徴とする肥満・糖尿病の疾病診断用マーカー。
【請求項１４】
請求項７から９のいずれか一項に記載された相互作用を利用することを特徴とする肥満・糖尿病の発症リスク評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の新規な機能及びタンパク質間の新規な相互作用に関する。より詳しくは、新規機能を有するタンパク質の発現抑制又は機能抑制、あるいは、タンパク質間の新規な相互作用に係わる肥満・糖尿病治療剤、肥満・糖尿病治療剤のスクリーニング方法、製造、疾病診断用マーカー、発症リスク評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム（全遺伝情報）のＤＮＡ塩基配列の解析がほぼ終了し、今後の研究課題は、ＤＮＡにコードされる遺伝子の機能を解明するという方向に移ってきている。ＤＮＡにコードされる遺伝情報の多くは、タンパク質に関するものであり、タンパク質の構造、機能、役割等を明らかにすることにより、遺伝子の機能を解明しようとする研究が、各研究機関で行われている。
【０００３】
生体内では、遺伝情報に基づいて、多くのタンパク質が発現し、それらのタンパク質が相互作用を起こすことにより、生命活動が維持されている。例えば、細胞内の代表的な代謝経路であるクエン酸回路は、複数の酵素（タンパク質）が相互作用することにより、ピルビン酸を分解し、ＡＴＰ産生のためのエネルギーを供給する。
【０００４】
また、生体に引き起こされる疾患の多くは、細胞内のタンパク質間相互作用の異常に起因して、発生すると考えられる。例えば、遺伝性疾患の場合、正常なタンパク質が発現しないため、必要なタンパク質間相互作用が欠損したり、タンパク質間相互作用に異常が生じたりして、代謝異常が起こり、疾患が発生する。
【０００５】
従って、生体内で発現する各種タンパク質について、タンパク質間の相互作用を明らかにすることは、細胞内の反応経路を解明したり、各タンパク質の機能や役割それ自体を明らかにしたりする上で、重要である。また、タンパク質間の相互作用を明らかにすることにより、各種疾患の発症機序を解明したり、治療剤を開発したりする上において役立つ有用な情報を提供することができる。
【０００６】
ここで、本発明に関連する知見、並びに本発明に係る四つのタンパク質、（１）ポンシン、（２）Ｎ−ＷＡＳＰ、（３）ＥＮＡＨ、（４）ＷＩＲＥ、それぞれについての公知の知見を説明する。
【０００７】
まず、細胞がグルコースを取り込む際には、ＧＬＵＴ４と呼ばれるタンパク質を含む小胞が、細胞膜表面直下へ運ばれることが明らかにされている（非特許文献１）。
【０００８】
このＧＬＵＴ４小胞は、定常時には細胞内に存在しているが、インスリン刺激に応答して細胞膜直下へ移動し、この小胞が細胞膜に融合するとグルコース取り込みのゲート（glucose transporters）を形成し、このゲートからグルコースを細胞内に取り込むことが知られている（非特許文献２）。
【０００９】
ポンシンは、ＣＡＰ(c-Cbl-associated protein)とも呼ばれるタンパク質であり、脂肪細胞や筋肉細胞のようなインスリン応答性の細胞に多く発現していることが知られている（非特許文献３）。また、このポンシンは、インスリン受容体を含む細胞増殖因子受容体結合タンパク質と相互作用し、インスリンをはじめとする細胞増殖因子の刺激に応答して活性化した受容体の下流で働くことが報告されている（非特許文献４）。
【００１０】
ポンシンの機能として、インスリン受容体からのシグナルをＴＣ１０と呼ばれる低分子ＧＴＰ結合タンパク質に伝達することがわかっている。このＴＣ１０は、ＧＬＵＴ４小胞が細胞膜直下に移動してグルコースの取り込みが行われるのに必須のタンパク質であるので、ポンシンはインスリン刺激によるグルコース取り込みに重要であると結論付けられる（非特許文献５）。
【００１１】
また、ポンシンの変異により、肥満症と糖尿病のリスクが下がることが知られている（非特許文献６）。即ち、ポンシンは、糖代謝の重要な制御因子であり、肥満症や糖尿病の発症に係わるタンパク質であることは確実である。
【００１２】
次に、Ｎ−ＷＡＳＰは、アクチンの重合起点を形成し、細胞内の様々な小胞の輸送の手助けを行うタンパク質であり、このＮ−ＷＡＳＰが輸送するものとしては、サイトカインやホルモンの分泌小胞などが知られている（非特許文献７）。
【００１３】
さらに最近の知見では、ＧＬＵＴ４小胞は、このＮ−ＷＡＳＰが関与して、アクチンによって細胞膜表面直下へ運ばれることが明らかにされた（非特許文献８）。先に述べたように、ＧＬＵＴ４小胞が膜に移動して細胞へグルコースが取り込まれるが、このグルコース取り込み過程が、Ｎ−ＷＡＳＰとアクチンの働きにより調節され、血糖値が正常に保たれているものと予想される。
【００１４】
ＥＮＡＨは、ＥＶＨ１ドメインを有する細胞質性タンパク質であり、このドメインは、アクチン重合に深く関わっている（非特許文献９）。従って、ＧＬＵＴ４小胞の移動に関しても、上記Ｎ-ＷＡＳＰ同様に重要な役割を果たしていることが予想される。
【００１５】
ＷＩＲＥ自体の機能は、これまで充分に明らかになっていないが、これと近縁のタンパク質であるＷＩＰが、免疫系の細胞において上記Ｎ-ＷＡＳＰの近縁タンパク質であるＷＡＳＰと共に働いて、アクチンの重合を司っていることが明らかとなっている（非特許文献１０）。この事実から類推すると、ＷＩＲＥは、脂肪細胞においてＮ−ＷＡＳＰと共に働いて、アクチンの重合を司っている可能性が高いと考えられる。
【非特許文献１】Slot, J. W., et al., J. CellBiol. 113, 123-135 (1991).
【非特許文献２】Ribon, V., et al., Mol. Cell. Biol. 18, 872-879(1998).
【非特許文献３】Ribon, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,14751-14756 (1998).
【非特許文献４】Baumann, C. A., et al. Nature 407, 202-207 (2000).
【非特許文献５】Chiang S.-H., et al., Nature 410, 944-948 (2001).
【非特許文献６】Lin, W. H., et al., Hum. Mol. Genet. 10, 1753-1760(2001).
【非特許文献７】Ma, L., et al., J. Cell Biol. 140, 1125-1136(1998).
【非特許文献８】Kanzaki, M., et al., J. Biol. Chem. 276,49331-49336 (2001).
【非特許文献９】Gertler，F. B., et al., Cell 87, 227-239 (1996).
【非特許文献１０】Ramesh, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,14671-14676 (1997).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
生体内に発現するタンパク質の多くは、どのタンパク質と相互作用するのか、どのような機能、役割を担っているのか、未解明なままである。
【００１７】
そこで、本発明は、タンパク質間相互作用の網羅的な解析を行うことによって、タンパク質の新規な機能及びタンパク質間の新規な相互作用、並びにこれらを利用した肥満・糖尿病治療剤又は肥満・糖尿病に係わる方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本願発明者らは、タンパク質間相互作用の網羅的な解析を鋭意行ったところ、インスリン刺激によるグルコース取り込みに重要で、糖代謝の重要な制御因子であり、肥満症や糖尿病の発症に係わるタンパク質であるポンシン（配列番号４からなるタンパク質）と、Ｎ-ＷＡＳＰ（配列番号１からなるタンパク質）、ＥＮＡＨ（配列番号２からなるタンパク質）、ＷＩＲＥ（配列番号３からなるタンパク質）のそれぞれとの間に、相互作用があることを全く新規に見出した。
【００１９】
また、本願発明者らは、ＧＬＵＴ４小胞によるグルコース取り込み過程に関与するＮ−ＷＡＳＰが、ＥＮＡＨやＷＩＲＥと相互作用し、さらには、ＥＮＡＨとＷＩＲＥとの間でも相互作用があることを突き止めた。
【００２０】
即ち、本願発明者らが新規に見出したタンパク質間の相互作用を簡潔に記載すれば、（１）ポンシン−Ｎ-ＷＡＳＰ、（２）ポンシン−ＥＮＡＨ、（３）ポンシン−ＷＩＲＥ、以上計３通りの相互作用である。
【００２１】
既述した現在公知の知見を総合的に勘案すれば、前掲の相互作用が関与することによって、細胞増殖因子のシグナルが細胞内のアクチンに伝えられると、該アクチンによって細胞内のＧＬＵＴ４小胞が細胞膜直下へ運ばれ、その結果、グルコースが該ＧＬＵＴ４小胞のゲートから細胞内へ取り込まれてエネルギー代謝に利用されるとともに、血中のグルコース濃度を正常に保つという機構を導くことができる。
【００２２】
また、ポンシンと、アクチン重合に係わっているＮ-ＷＡＳＰ、ＷＩＲＥ、ＥＮＡＨのそれぞれが相互作用することを突き止めたことによって、このポンシンが、Ｎ-ＷＡＳＰ、ＷＩＲＥ、ＥＮＡＨを通して、あるいはこれらの４つのタンパク質のいずれか又はすべてが協働して、アクチンに働きかけるという機構を導くことができる。
【００２３】
以上のように、本願発明者らは、インスリン受容体と細胞骨格系、アクチン重合が係わるＧＬＵＴ４小胞トランスロケーションを繋ぐキーとなるタンパク質、並びにタンパク質間相互作用を新規に見出した。
【００２４】
従って、これらのタンパク質の発現又は機能を抑制したり、これらタンパク質間の相互作用を抑制あるいは増強させたり、あるいは、このタンパク質間相互作用の結合特性を変化させたり等を行うことによって、血糖値を正常に保ち、肥満症と糖尿病の増悪を阻止できると考える。
【００２５】
そこで、本発明は、ポンシンと相互作用する配列番号１からなるタンパク質（Ｎ-ＷＡＳＰ）、ポンシンと相互作用する配列番号２からなるタンパク質（ＥＮＡＨ）、ポンシンと相互作用する配列番号３からなるタンパク質（ＷＩＲＥ）を提供し、また、これらのタンパク質の発現又は機能を抑制することを特徴とする肥満・糖尿病治療剤を提供することにする。
【００２６】
なお、本発明に係る配列表の配列番号１、２、３に示されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、当該配列それ自体に狭く限定する趣旨ではなく、ポンシンと相互作用する生理的機能を少なくとも備えるものであれば、前記アミノ酸配配列の一部アミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されているタンパク質も含まれる。
【００２７】
また、ポンシンは、実施例で用いた配列番号４の配列それ自体に狭く限定する趣旨ではなく、Ｎ-ＷＡＳＰ、ＥＮＡＨ、ＷＩＲＥと相互作用する生理的機能を少なくとも備えるものであれば、前記アミノ酸配配列の一部アミノ酸が欠失、置換、付加あるいは挿入されているタンパク質も含まれる。
【００２８】
また、本発明では、ポンシンと配列番号１からなるタンパク質（Ｎ-ＷＡＳＰ）との相互作用、ポンシンと配列番号２からなるタンパク質（ＥＮＡＨ）との相互作用、ポンシンと配列番号３からなるタンパク質（ＷＩＲＥ）との相互作用を提供する。
【００２９】
そして、これらの相互作用の少なくとも一つを抑制又は増強する肥満・糖尿病治療剤、肥満・糖尿病治療剤製造のための、これらの相互作用の使用、さらには、これらの相互作用のいずれかを利用する肥満・糖尿病治療剤のスクリーニング方法、肥満・糖尿病の疾病診断用マーカー、肥満・糖尿病の発症リスク評価方法を提供する。
【００３０】
ここで、本発明に係る「肥満・糖尿病製造のための相互作用の使用」とは、例えば、肥満・糖尿病製造の過程において前記相互作用が直接的又は間接的に用いられる手段を意味する。一例を挙げれば、該相互作用を利用するスクリーニング過程を経て目的の物質を選別し、この物質を肥満・糖尿病の製造に利用する場合を挙げることができる。あるいは、肥満・糖尿病の候補となる物質が正しく活性を持っているか否かを検査（品質検査）する場合に、前記相互作用を利用する場合を挙げることができる。
【００３１】
本発明に係る「スクリーニング方法」では、例えば、対象とするタンパク質間の相互作用の結合特性を変化（阻害又は増進）させ得る化合物のスクリーニングを実施することができる。
【００３２】
前記化合物は、対象とするタンパク質間の相互作用が関連する肥満・糖尿病治療剤に対する治療薬又は予防薬の候補となり得る。このようなスクリーニングには、上記相互作用を検出可能な反応系に候補化合物を適切な濃度で添加して、相互作用に対する影響を調べる手法が含まれる。
【００３３】
この手法は、従来の酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）と同様の手法が可能である。そして、固相表面に相互作用の相手となるタンパク質（パートナータンパク質）を結合固定化し、そこに、スクリーニング対象分子を添加し、標識抗体、基質の順で反応させ、スクリーニング対象物質の存在下でどのくらいタンパク質間の相互作用の程度が変化するかを調べることができる。基質の発色が強い方が両者の結合は強いということになる。
【００３４】
なお、薬物のスクリーニングは、ＮＭＲ分光学やＸ線結晶解析や電子顕微鏡等による一分子直接観察によっても可能である。また、表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲ）や水晶発振子などの検出原理を用いても効率よくスクリーニング可能である。相互作用するタンパク質のいずれかをセンサーチップなどの固相表面に固定し、スクリーニング対象分子を添加した状態で固定化されていない側のパートナータンパク質をセンサーチップ上に送液する。両者の結合は、例えば、表面プラズモン共鳴などによりリアルタイムに結合曲線が観察され、両者の結合が強まれば結合曲線は増高して、弱まれば減弱あるいは消失する。
【００３５】
本発明に係る「肥満・糖尿病の疾病診断用マーカー」や「肥満・糖尿病の発症リスク評価方法」に関しては、例えば、本発明に係わるタンパク質の発現状態や該タンパク質をコードする遺伝子の変異あるいは一塩基多型等を調べることによって、肥満・糖尿病の創薬技術、診断技術、検査技術、発症リスクの評価技術等に役立てることができる。
（作用機序）
【００３６】
以下、本発明の理解に資するために、添付図面を用いることによって、本発明の係わる作用機序について例示的に説明する。図１は、ＧＬＵＴ４小胞が介在するグルコース取り込み機構の概念を模式的に説明するための図、図２は、ＧＬＵＴ４小胞と本発明に係るタンパク質の相互作用関係の例示的に示す図、図３は、本発明に係るタンパク質の相互作用の全てを模式的に示す図である。
【００３７】
まず、図１に符号Ｉで示されたインスリンが、細胞膜Ｍに結合する細胞増殖因子受容体Ｒに作用すると、この受容体Ｒの下流側において、タンパク質の相互作用を少なくとも介したシグナル伝達（符合Ｓ）が行なわれると考える。
【００３８】
このシグナル伝達Ｓによって、細胞内に存在しているＧＬＵＴ４小胞においてアクチン重合が起こる（符合Ａはアクチン重合体を示す）。このアクチン重合が駆動力となってＧＬＵＴ４小胞が細胞膜Ｍの直下に向けて移動して、細胞膜Ｍに融合したＧＬＵＴ４小胞のゲート（符合Ｇ）から、グルコースが取り込まれる。本発明に係るタンパク質群が関与するのは、前記シグナル伝達Ｓの部分及びアクチン重合の部分と考えられる。
【００３９】
本発明に係る計４つのタンパク質、ポンシン（符号Ｐ）、Ｎ−ＷＡＳＰ（符号Ｐ１）、ＥＮＡＨ（符号Ｐ２）、ＷＩＲＥ（符合Ｐ３）は、互いに相互作用する関係にあり、例えば、図２に示されるような相互作用状態で、ＧＬＵＴ４小胞に相互作用する関係かも知れない。あるいは、図２のような相互作用状態とは異なる状態でＧＬＵＴ４へシグナル伝達するのかもしれない。
【００４０】
いずれにしても、これらタンパク質間の相互作用のいずれかが別個独立に、あるいは、これらの相互作用のいずれかの組合せやすべての組合せによる協働が起点となって、ＧＬＵＴ４小胞においてアクチン重合が発生し、これが駆動力となって、ＧＬＵＴ４小胞が細胞膜Ｍの直下に向けて移動すると考えられる。なお、現在検証作業中であるが、Ｎ-ＷＡＳＰ−ＥＮＡＨ、Ｎ-ＷＡＳＰ−ＷＩＲＥ、ＥＮＡＨ−ＷＩＲＥのそれぞれの間においても、相互作用する関係があることも予測される。
【００４１】
図３には、本発明に係る、（１）ポンシン−Ｎ-ＷＡＳＰ、（２）ポンシン−ＥＮＡＨ、（３）ポンシン−ＷＩＲＥ、以上計３通りのタンパク質間の新規な相互作用を模式的に示したものである。
【００４２】
この図３に示されたこれらの相互作用の少なくとも一つを抑制又は増強することができる物質は、ＧＬＵＴ４小胞への上記シグナル伝達Ｓに対して、正又は負の影響を及ぼす標的物質となる。
【００４３】
公知の知見に基づいて、ポンシンは、糖代謝の重要な制御因子であり、肥満症や糖尿病の発症に係わるタンパク質であることが確実であること、このポンシンはインスリン刺激によるグルコース取り込みに重要であること、ＧＬＵＴ４小胞は、ポンシンと相互作用するＮ−ＷＡＳＰが関与して、アクチンによって細胞膜Ｍの表面直下へ運ばれること、Ｎ−ＷＡＳＰは、アクチンの重合起点を形成し、細胞内の様々な小胞の輸送の手助けを行うタンパク質であること、ポンシンと相互作用するＷＩＲＥは、脂肪細胞においてＮ−ＷＡＳＰと共に働いて、アクチンの重合を司っている可能性が高いこと、ポンシンと相互作用するＥＮＡＨのドメインがアクチン重合に深く関わっていること等を総合的に考えれば、上記標的物質は、肥満・糖尿病治療剤となり得る。
【発明の効果】
【００４４】
本発明では、タンパク質間相互作用の網羅的な解析を行った結果により、（１）ポンシン、（２）Ｎ−ＷＡＳＰ、（３）ＥＮＡＨ、（４）ＷＩＲＥ、これら計四つのタンパク質の新規な機能を解明することができた。
【００４５】
また、（１）ポンシン−Ｎ-ＷＡＳＰ、（２）ポンシン−ＥＮＡＨ、（３）ポンシン−ＷＩＲＥ、以上計３通りのタンパク質間の新規な相互作用、並びにこれらの相互作用に関連する肥満・糖尿病治療剤又は肥満・糖尿病に係わる方法を提供することができる。
【実施例】
【００４６】
本願発明者らは、ポンシンを認識して、相互作用を示す「パートナータンパク質」を、以下の方法によって効率的に探索した。
【００４７】
まず、  Marathon-Ready
cDNA（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）を用いて、ｃＤＮＡから、ポンシンをコードするｃＤＮＡを得るため、Ｆｏｒｗａｒｄが、塩基配列：ATGAGTTCTGAATGTGATGGTGGTTCCAAAGCTであり、Ｒｅｖｅｒｓｅが、塩基配列：TAGATACAAAGGTTTTACATAGTTGCCTGGAAAAGTACのプライマーをデザインし、Ｎａｔｉｖｅ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を用いて、ＰＣＲ法で目的のｃＤＮＡを増幅した。そして、アガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出して、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）で、ポンシンをコードするｃＤＮＡを精製した。
【００４８】
次に、pDONR201ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に、精製したｃＤＮＡを挿入した。そして、さらに、この組換えｐＤＯＮＲベクターを用いて、ＦＬＡＧタグをポンシンのＣ末端側に付加し、ＣＭＶプロモーターを持った、動物細胞発現用ベクターを作製した。
【００４９】
次に、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて、作製した動物細胞発現用ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎由来培養細胞）に導入し（トランスフェクション）、３７℃、２４時間、培養した。
【００５０】
トランスフェクションした培養細胞内では、タグが融合した組み換えタンパク質が発現する。そして、発現した一部組換えポンシンは、細胞内に存在する未知のパートナータンパク質と相互作用し複合体を形成する。そして、ポンシンと未知パートナータンパク質との複合体を、ポンシンに付したタグに対する抗体を用いた公知の「免疫沈降法」によって、細胞内から抽出した。
【００５１】
抽出方法は、次の通りである。遺伝子導入した細胞を可溶化バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．５,１５０ｍＭＮａＣｌ,５０ｍＭＮａＦ,１ｍＭＮａ3ＶＯ4,１ｍＭＰＭＳＦ,０．００５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を用いて可溶化した。この可溶化バッファーを加えたのち細胞を掻き取り、遠心管に回収し超遠心（５５，０００回転，４℃，２０分）した。
【００５２】
遠心後の細胞抽出液（上清）にＦＬＡＧペプチド抗体を固定化したアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社から購入）を加え４℃で３時間撹拌した。撹拌後のビーズを遠心（1，０００回転，４℃，１分）して集め可溶化バッファーで洗浄後，ＦＬＡＧペプチドを含むバッファーを加えることによりビーズに結合したポンシンを溶出し、ポンシンと目的のパートナータンパク質が結合したタンパク質複合体を回収した。
【００５３】
タンパク質複合体の回収後は、相互作用の相手となるたんぱく質を、公知のタンデム質量計(ＭＳ／ＭＳ)を用いる「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析法」、磯辺俊明、高橋信弘編、Ｐ１２９〜Ｐ１４２）によって同定した。具体的な手順は以下の通りである。
【００５４】
まず、回収したサンプルを、遠心濃縮後、酵素反応用バッファー（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ,ｐＨ８．８）に溶解した。次に、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」あるいは「リジルエンドペプチダーゼ」により消化分解した。なお、本実験では、リジルエンドペプチダーゼを用いた。酵素基質比（重量比）が１／１００から１／５０になるようにリジルエンドペプチダーゼを加え３７℃で１２時間反応させ、消化物を得た。そして、その消化物をタンデム質量計で測定し、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報を得た。
【００５５】
酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上から候補アミノ酸シークエンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメント化したときの質量値セットを計算した。
【００５６】
なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ」（インターネットアドレス：ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/sp_tr_nrdb/fasta/sprot.fas.Z）と核酸データベースである「ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ」（インターネットアドレス：ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/hs.faa.gz）を使用した。
【００５７】
この計算値と実測のフラグメントイオン（MS/MSスペクトラム）を比較することによって、配列番号４のポンシンのパートナータンパク質を同定したところ、Ｎ−ＷＡＳＰ（配列番号１）、ＥＮＡＨ（配列番号２）、ＷＩＲＥ（配列番号３）を新規に同定した。これにより、配列番号４のポンシンとＮ−ＷＡＳＰ（配列番号１）、ＥＮＡＨ（配列番号２）、ＷＩＲＥ（配列番号３）のそれぞれが相互作用を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
肥満・糖尿病の発症機序の解明や肥満・糖尿病の治療剤のスクリーニング、開発、製造、肥満・糖尿病の発症リスク評価などに特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＧＬＵＴ４小胞が介在するグルコース取り込み機構の概念を模式的に説明するための図である。
【図２】ＧＬＵＴ４小胞と本発明に係るタンパク質の相互作用関係の一例を示す図である。
【図３】本発明に係るタンパク質の相互作用を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００６０】
Ａ  アクチン重合体
Ｇ  ＧＬＵＴ４のゲート
Ｉ  インスリン
Ｐ  ポンシン
Ｐ１  Ｎ−ＷＡＳＰ
Ｐ２  ＥＮＡＨ
Ｐ３  ＷＩＲＥ
Ｒ  受容体
Ｓ  シグナル伝達部
【図１】
2005314340.tif 000003
【図２】
2005314340.tif 000004
【図３】
2005314340.tif 000005
【配列表】
2005314340000001.app