(57)【要約】【課題】検体を変性又は破壊しない低温で凝集を解くことができ、検体の変性又は破壊を防止可能な磁気ビーズと、これを用いた検体の分離方法を提供する。【解決手段】複数種の検体１１，１２，１３を含む試料１４中に、それぞれ異なる温度範囲に補償温度をもつフェリ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体と特異的に結合又は反応する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を混合する。各検体と各磁気ビーズとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけて全ての超常磁性磁気ビーズを外磁場に凝集させる。次いで、試料と磁気ビーズとの混合体の温度を１の磁気ビーズの補償温度に調整し、当該１の磁気ビーズの凝集を解く。そして、この状態で当該１の磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体を取り出す。以下、この過程を必要回数繰り返す。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性粒子と当該磁性粒子の表面に被覆された非磁性の被覆層とからなる磁気ビーズであって、前記磁性粒子が補償温度をもつフェリ磁性体からなることを特徴とする磁気ビーズ。
【請求項２】
前記フェリ磁性体が、少なくとも希土類元素と遷移金属元素とを含む合金からなることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項３】
前記被覆層が、シリカ、アルミナ、アパタイト及びキトサンより選択されるいずれか１種の物質からなることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項４】
前記被覆層の表面に、特定の検体と特異的に結合又は反応するプローブを備えていることを特徴とする請求項１に記載の磁気ビーズ。
【請求項５】
前記プローブが、特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素より選択されるいずれか１種の物質からなることを特徴とする請求項４に記載の磁気ビーズ。
【請求項６】
複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる補償温度をもつフェリ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズの被覆層とをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけて全ての前記磁気ビーズを外磁場に凝集させ、次いで、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の磁性粒子の補償温度に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の補償温度に達するごとに、当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すことを特徴とする検体の分離方法。
【請求項７】
複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる補償温度をもつフェリ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応するプローブを有する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズのプローブとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけて全ての前記磁気ビーズを外磁場に凝集させ、次いで、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の磁性粒子の補償温度に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の補償温度に達するごとに、当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すことを特徴とする検体の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、蛋白質、核酸等の検体の定量、分離、精製及び分析等に有用な磁気ビーズとそれを用いた検体の分離方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の検体を定量、分析又は分画するためには、目的とする検体を他の物質から分離して取り出す必要がある。従来より、目的とする検体を他の物質から分離する手段としては、遠心分離法、カラム分離法及び電気泳動法などが広く用いられているが、これらの手段はいずれも大量の検体を必要とし、かつ目的とする検体の分離に長時間を要するばかりでなく、検体の環境条件を極端に変化させるために検体が変性しやすいという不都合がある。
【０００３】
近年、かかる従来法の短所を克服し得る手法として、超常磁性磁気ビーズを用いる方法が開発され、細胞、蛋白質、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の検体の分離及び分析等に利用されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
超常磁性磁気ビーズは、永久磁性を維持するのに必要な磁区の大きさよりも微細な粒子にした酸化鉄等の磁性体を特定の検体と特異的に結合又は反応する非磁性のビーズ中に分散したもので、外磁場がかかったときのみ強磁性を示す性質を有している。したがって、この超常磁性磁気ビーズを外磁場をかけない状態で目的の検体を含む試料中に投入し、ビーズの表面に目的とする検体を結合させ、しかる後に外磁場を印加して超常磁性磁気ビーズを凝集させることにより、目的とする検体を超常磁性磁気ビーズと共に回収することができる。
【０００５】
また、試料中に含まれる複数の検体を個別に分離する方法として、磁性体のキュリー温度と磁気ビーズの表面に修飾された特定の検体と特異的に結合又は反応する結合パートナーとの組合せが異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入し、各超常磁性磁気ビーズの表面に目的とする検体を個別に結合させた後、外磁場をかけて全ての超常磁性磁気ビーズを外磁場に凝集させ、しかる後に、試料の温度を１の超常磁性磁気ビーズに含まれる磁性体のキュリー温度に昇温して当該１の超常磁性磁気ビーズの凝集を選択的に解き、当該凝集が解除された１の超常磁性磁気ビーズをこれに結合された検体と共に回収するという過程を必要回数だけ繰り返す方法も提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
この方法によると、試料の温度を各超常磁性磁気ビーズに含まれる磁性体のキュリー温度に段階的に昇温することにより、１の試料中に含まれる複数の検体を順次個別に分離することができるので、１の試料からの目的とする複数の検体の分離を効率的に行うことができる。
【特許文献１】特表平４−５０１９５６号公報
【特許文献２】特開平６−３００７５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかるに、現在知られている磁性体は、いずれもキュリー温度が１００℃以上の高温であるので、例えばある種の抗体については分離の過程でその機能が破壊されてしまうことがあり、適用可能な検体の種類が限定されるという問題点がある。
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の不備を解決するためになされたものであり、その目的は、検体を変性又は破壊しない温度で凝集を解くことができる磁気ビーズと、これを用いた検体の分離方法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記の課題を解決するため、磁気ビーズについては、磁性粒子と当該磁性粒子の表面に被覆された非磁性の被覆層とからなる磁気ビーズであって、前記磁性粒子が補償温度をもつフェリ磁性体からなるという構成にした。
【００１０】
前記フェリ磁性体としては、補償温度を磁性体の組成によって制御しやすいことから、希土類元素−遷移金属元素系の合金を用いることが特に好ましい。また、前記被覆層としては、磁性体の凝集を防止する機能が高く、かつ特定の検体と特異的に結合又は反応する結合パートナー（プローブ）の選択的な結合が可能であることから、シリカ、アルミナ、アパタイト及びキトサンより選択されるいずれか１種の物質からなるものを用いることが特に好ましい。さらに、前記被覆層の表面には、より多くの検体を特異的に結合又は反応できるようにするため、検体が有する官能基と特異的に結合する官能基等よりなるプローブを備えることもできる。前記プローブとしては、例えば特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素などを挙げることができる。
【００１１】
一方、磁気ビーズを用いた検体の分離方法としては、第１に、複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる補償温度をもつフェリ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズの被覆層とをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけて全ての前記磁気ビーズを外磁場に凝集させ、次いで、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の磁性粒子の補償温度に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の補償温度に達するごとに、当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すという構成にした。
【００１２】
また、第２に、複数種の検体を含む試料中に、それぞれ異なる補償温度をもつフェリ磁性体からなる磁性粒子の表面にそれぞれ前記複数種の検体の１つと特異的に結合又は反応するプローブを有する非磁性の被覆層を被覆してなる複数種の磁気ビーズを混合し、前記複数種の検体と前記複数種の磁気ビーズのプローブとをそれぞれ特異的に結合又は反応させた後、外磁場をかけて全ての前記磁気ビーズを外磁場に凝集させ、次いで、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度を前記複数種の磁性粒子の補償温度に段階的に調整し、前記試料と前記磁気ビーズとの混合体の温度が１種類の磁性粒子の補償温度に達するごとに、当該１種類の磁性粒子を有する前記磁気ビーズとこれに特異的に結合又は反応した前記検体とを選択的に取り出すという構成にした。
【００１３】
フェリ磁性体は、磁性原子が２組以上の結晶の副格子上にあり、図５に示すように、各磁性原子の磁気モーメントＡ，Ｂが互いに逆向きになっているとき、外部にはこれらの各磁気モーメントＡ，Ｂの差に相当する自発磁化が生じる。この自発磁化は温度依存性を有し、組成によっては、図６に示すように、キュリー温度Ｔｃよりも低温のある温度Ｔｃｏｍｐで自発磁化を発現しないフェリ磁性体もある。この自発磁化を発現しない温度Ｔｃｏｍｐは「補償温度」と呼ばれ、補償温度より高い温度又は低い温度では自発磁化を持つ。このため、補償温度が異なる複数種の磁気ビーズを試料中に混合した場合、試料の温度がいずれの磁気ビーズの補償温度でもないときには、外磁場をかけることにより、全ての磁気ビーズを外磁場に凝集させることができ、試料の温度を１の磁気ビーズの補償温度に調整したときには、当該１の磁気ビーズの外磁場による凝集を解除することができる。
【００１４】
したがって、磁性体の補償温度と非磁性体が特異的に結合又は反応する検体との組合せが異なる複数種の磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入し、各磁気ビーズに目的とする検体を個別に結合させた後、試料の温度を１の磁気ビーズを構成する磁性体の補償温度に昇温して当該１の磁気ビーズの凝集を解き、凝集が解かれた磁気ビーズをそれに結合されている検体と共に回収するという過程を必要回数だけ繰り返すことにより、キュリー温度が異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを用いる場合に比べて低温で１の試料から複数の目的とする検体を個別に分離することができる。よって、検体に変性や破壊等の不都合が生じにくく、目的の検体を高能率に分離できると共に、磁気ビーズの適用範囲を拡張することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、磁性粒子が補償温度をもつフェリ磁性体からなるので、１の試料中から複数の目的とする検体を個別に分離する際に、補償温度と特異的に結合又は反応する検体との組合せが異なる複数種の磁気ビーズを複数の検体を含む試料中に投入することにより、キュリー温度が異なる複数種の超常磁性磁気ビーズを用いる場合に比べて低温で１の試料から複数の目的とする検体を個別に分離することができ、検体分離の高能率化と磁気ビーズの適用範囲の拡張とを図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明に係る磁気ビーズの実施形態を図１及び図２に基づいて説明する。図１は本発明に係る磁気ビーズの第１例を示す断面図、図２は本発明に係る磁気ビーズの第２例を示す断面図、図３は本発明に係る磁気ビーズに適用可能な各種のフェリ磁性体とその補償温度とを示す表図である。
【００１７】
第１例に係る磁気ビーズ１Ａは、図１に示すように、磁性粒子２と当該磁性粒子２の表面に被覆された非磁性の被覆層３とからなる。
【００１８】
前記磁性粒子２は、補償温度をもつフェリ磁性体をもって形成される。フェリ磁性体としては、補償温度をもつものであれば公知に属する任意のものを用いることができるが、補償温度が比較的室温に近いことから、希土類元素−遷移金属元素系の合金を用いることが特に好ましい。図３に磁性粒子２として適用可能な各種のフェリ磁性体とその補償温度とを示す。この図から明らかなように、３Ｄｙ２Ｏ３・５Ｆｅ２Ｏ３の補償温度は−４０℃、３Ｔｂ２Ｏ３・５Ｆｅ２Ｏ３の補償温度は−３０℃、３Ｇｄ２Ｏ３・５Ｆｅ２Ｏ３の補償温度は０℃、Ｙ３Ｇａ２Ｆｅ３Ｏ１２の補償温度は−１３０℃、ＬｉＣｒフェライトの補償温度は室温〜＋１００℃、ＧｄＦｅ，ＧｄＴｂＦｅ，ＧｄＤｙＦｅの補償温度はそれぞれ−１００℃〜＋１００℃である。
【００１９】
前記被覆層３は、特定の検体を特異的に結合又は反応する非磁性体や、リンカー端にあるエポキシ基が特定の官能基、例えばアミノ基やチオール基を有する化学物質を固定するトシル基、水酸基を有する化学物質を固定する活性化カルボキシル基、カルボキシル基を有する化学物質を固定するアミノ基、プロモアセトアミド基を有する化学物質を固定するチオール基に置換された非磁性体をもって形成される。前記特定の検体を特異的に結合又は反応する非磁性体としては、磁性体の凝集を防止する機能が高く、かつプローブの選択的な結合が可能であることから、シリカ、アルミナ、アパタイト又はキトサンなどを用いることができる。
【００２０】
一方、第２例に係る磁気ビーズ１Ｂは、図２に示すように、磁性粒子２と当該磁性粒子２の表面に被覆された非磁性の被覆層３と、当該非磁性の被覆層３に結合されたプローブ４とからなる。プローブ４としては、例えば特定の抗原と特異的に結合又は反応する特異的抗原、特定のホルモンと特異的に結合又は反応するホルモン受容体、特定のハプテンと特異的に結合又は反応する抗ハプテン、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応する相補的ポリヌクレオリド、特定のポリヌクレオチドと特異的に結合又は反応するポリヌクレオリド結合蛋白、特定のビオチンと特異的に結合又は反応するアビジン又はストレプトアビジン、特定の酵素と特異的に結合又は反応する酵素補因子、及び特定のレクチンと特異的に結合又は反応する特異的炭化水素などを挙げることができる。その他については、第１例に係る磁気ビーズ１Ａと同じであるので、説明を省略する。
【００２１】
次に、第２例に係る磁気ビーズ１Ｂを用いる場合を例にとり、１の試料中から複数の目的とする検体を個別に分離する方法を図４に基づいて説明する。図４は本発明に係る検体の分離方法の一例を示す説明図である。
【００２２】
まず、図４（ａ）に示すように、補償温度がＴ１の磁性粒子２ａと第１のプローブ４ａとを有する磁気ビーズ１Ｂ１と、補償温度がＴ２の磁性粒子２ｂと第２のプローブ４ｂとを有する磁気ビーズ１Ｂ２と、補償温度がＴ３の磁性粒子２ｃと第３のプローブ４ｃとを有する磁気ビーズ１Ｂ３とを用意する。
【００２３】
次に、図４（ｂ）に示すように、これらの磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を、少なくとも３種の検体１１，１２，１３が含まれる試料１４中に投入し、良く攪拌して第１乃至第３のプローブ４ａ，４ｂ，４ｃのそれぞれに各検体１１，１２，１３を個別に結合させる。検体１１，１２，１３としては、細胞、蛋白質、核酸その他の化学物質を当てることができる。また、試料１４は、液相、気相及び気相流体のいずれでも良い。
【００２４】
次に、図４（ｃ）に示すように、磁石１５を用いて試料１４に外磁場をかけつつ、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ａの補償温度であるＴ１に調整する。これにより、自発磁化が発現しない磁気ビーズ１Ｂ１のみが選択的に試料１４の底に沈殿し、自発磁化が発現している磁気ビーズ１Ｂ２，１Ｂ３は磁石１５に凝集される。なお、前記磁石１５としては、電磁石を用いることもできるし、永久磁石を用いることもできる。また、前記調温器１６としては、ペルチェ素子などを用いることができる。
【００２５】
したがって、図４（ｄ）に示すように、試料１４を入れた容器の底より磁気ビーズ１Ｂ１を抜き取り、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ１とこれに結合された検体１１とを単独で取り出すことができる。
【００２６】
次いで、図４（ｅ）に示すように、磁石１５を用いて試料１４に外磁場をかけつつ、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ｂの補償温度であるＴ２に調整する。これにより、自発磁化が発現しない磁気ビーズ１Ｂ２のみが選択的に試料１４の底に沈殿し、自発磁化が発現している磁気ビーズ１Ｂ３は磁石１５に凝集される。
【００２７】
したがって、図４（ｆ）に示すように、試料１４を入れた容器の底より磁気ビーズ１Ｂ２を抜き取り、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ２とこれに結合された検体１２とを単独で取り出すことができる。
【００２８】
最後に、図４（ｇ）に示すように、調温器１６を用いて試料１４の温度を磁性粒子２ｃの補償温度であるＴ３に調整する。これにより、自発磁化が発現しない磁気ビーズ１Ｂ３が試料１４の底に沈殿する。
【００２９】
したがって、図４（ｈ）に示すように、試料１４を入れた容器の底より磁気ビーズ１Ｂ３を抜き取り、別の容器に収納することによって、磁気ビーズ１Ｂ３とこれに結合された検体１３とを単独で取り出すことができる。
【００３０】
前記したように、フェリ磁性体の補償温度は、キュリー温度に比べて格段に低温であるので、本発明に係る磁気ビーズ１Ｂを用い、上記の方法で１の試料から複数の検体を個別に分離すると、検体に変性や破壊等の不都合が生じにくく、目的の検体を高能率に分離できると共に、磁気ビーズの適用範囲を拡張することができる。
【００３１】
なお、前記においては、プローブ４ａ，４ｂ，４ｃを有する磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を用いたが、プローブ４ａ，４ｂ，４ｃを有しない磁気ビーズ１Ａを用いた場合にも、同様の方法で検体の分離を行うことができる。シリカが表面に被覆された磁気ビーズを用いてＤＮＡ又はＲＮＡの分離を行う場合には、シリカの表面にある特異なＤＮＡプローブ或いはＲＮＡプローブを修飾し、ハイブリダイゼーションに用いても良い。また、ｍＲＮＡを単離、精製する場合には、２０個から３０個のデオキシチミジル酸を５′リンカーを介して磁気ビーズの表面に共有結合させたものを用いることができる。
【００３２】
また、前記においては、磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３を検体の分離に用いたが、プライマーを磁気ビーズ１Ｂ１，１Ｂ２，１Ｂ３と結合させることで、効果的かつ効率的にＰＣＲを行い分離することも可能である。
【００３３】
以下、本発明に係る磁気ビーズの他の例を列挙する。
【００３４】
（１）検体である抗原の結合パートナーをモノクロラール抗体とする。
【００３５】
（２）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチド分子が１個以上のものとする。
【００３６】
（３）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが５′−アミノ基を介して磁性ビーズに共有結合しているものとする。
【００３７】
（４）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが１２〜２００塩基の範囲の鎖長を有しているものとする。
【００３８】
（５）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドがぽりｄＴであるものとする。
【００３９】
（６）検体である抗原の結合パートナーをオリゴヌクレオチドが標的核酸のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的に結合するものとする。
【００４０】
（７）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ結合を行えるアミノ基を有するものとする。
【００４１】
（８）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ基を与えるためにアミノアルキル化ポリマーよりなるものとする。
【００４２】
（９）検体である抗原の結合パートナーを表面にアミノ結合を行えるカルボキシル基を有するものとする。
【００４３】
（１０）検体である抗原の結合パートナーを表面にカルボキシル基を与えるためにアクリル酸のポリマー或いはコポリマーよりなるものとする。
【００４４】
（１１）検体である抗原の結合パートナーを表面にカルボキシル基を与えるためにメタクリル酸のポリマー或いはコポリマーよりなるものとする。
【００４５】
（１２）検体である抗原の結合パートナーをアミノ結合を行えるアルデヒド基を有するものとする。
【００４６】
（１３）検体である抗原の結合パートナーを表面に共有結合を行えるヒドロキシル基を有するものとする。
【００４７】
（１４）検体である抗原の結合パートナーを表面にヒドロキシル基を与えるためにポリグリコールを伴うポリウレタンよりなるものとする。
【００４８】
（１５）検体である抗原の結合パートナーを表面にヒドロキシル基を与えるためにセルロース誘導体よりなるものとする。
【００４９】
（１６）検体である抗原の結合パートナーを表面にシラン結合を行えるシラン基を有するものとする。
【００５０】
その他、前記検体の分離方法においては、複数種の磁気ビーズを試料中に投入する方法について説明したが、本発明に係る磁気ビーズは、かかる使用方法に限定されるものではなく、従来の超常磁性磁気ビーズと同様に、単独で検体の分離に適用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明に係る磁気ビーズの第１例を示す断面図である。
【図２】本発明に係る磁気ビーズの第２例を示す断面図である。
【図３】本発明に係る磁気ビーズに適用可能な各種のフェリ磁性体とその補償温度とを示す表図である。
【図４】本発明に係る検体の分離方法の一例を示す説明図である。
【図５】フェリ磁性体の磁気モーメントを示す説明図である。
【図６】フェリ磁性体の自発磁化の温度依存性を示すグラフ図である。
【符号の説明】
【００５２】
１Ａ，１Ｂ    磁気ビーズ
２    磁性粒子
３    被覆層
４    プローブ
１１，１２，１３    検体
１４    試料
１５    磁石（外磁場）
１６    調温器
【図１】
2005295868.tif 000003
【図２】
2005295868.tif 000004
【図３】
2005295868.tif 000005
【図４】
2005295868.tif 000006
【図５】
2005295868.tif 000007
【図６】
2005295868.tif 000008