(57)【要約】【課題】薬物代謝と薬物代謝酵素誘導のいずれも感度良く評価するための組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いる評価方法の提供。【解決手段】  ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価のための組換えヒト細胞であって、ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるベクターにより形質転換された組換えヒト細胞により前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価のための組換えヒト細胞であって、
ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるベクターにより形質転換された組換えヒト細胞。
【請求項２】
前記ヒト薬物代謝酵素が、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素およびグルコース転移酵素からなる群から選択される１以上である請求項１に記載の組換えヒト細胞。
【請求項３】
由来が、肝臓細胞、肺臓細胞、腎臓細胞、鼻粘膜細胞、消化管細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、小腸細胞および咽頭細胞からなる群から選択される１以上の細胞である請求項１または２に記載の組換えヒト細胞。
【請求項４】
前記レポータータンパク質が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される１以上であるである請求項１〜３のいずれかに記載の組換えヒト細胞。
【請求項５】
前記バイシストロニック性制御配列が、インターナル・リボゾーム・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ）配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されている請求項１〜４のいずれかに記載の組換えヒト細胞。
【請求項６】
前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ＩＲＥＳ配列と、前記レポータータンパク質コード配列とがこの順序で配置された請求項５に記載の組換えヒト細胞。
【請求項７】
前記ヒトチトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１およびＣＹＰ２１からなる群から選択される１以上である請求項２〜６のいずれかに記載の組換えヒト細胞。
【請求項８】
前記ＣＹＰ３Ａ４が、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質である請求項７に記載の組換えヒト細胞。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ塩基配列の１から数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質。
【請求項９】
前記ＣＹＰ３Ａ４のプロモータ配列が、下記（ｃ）または（ｄ）の配列である請求項７または８に記載の組換えヒト細胞。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相同性が５０％以上の塩基配列からなり、かつＣＹＰ３Ａ４の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列。
【請求項１０】
ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価のための組換えヒト細胞のためのベクターであって、
ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるベクター。
【請求項１１】
前記ヒト薬物代謝酵素が、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素およびグルコース転移酵素からなる群から選択される１以上である請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記レポータータンパク質が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される１以上である請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されている請求項１０〜１２のいずれかに記載のベクター。
【請求項１４】
前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ＩＲＥＳ配列と、前記レポータータンパク質コード配列とがこの順序で配置された請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ヒトチトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１およびＣＹＰ２１からなる群から選択される１以上である請求項１１〜１４のいずれかに記載のベクター。
【請求項１６】
前記ＣＹＰ３Ａ４が、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質である請求項１５に記載のベクター。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ塩基配列の１から数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
前記ＣＹＰ３Ａ４のプロモータ配列が、下記（ｃ）または（ｄ）の配列である請求項１５または１６に記載のベクター。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相同性が５０％以上の塩基配列からなり、かつＣＹＰ３Ａ４の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列。
【請求項１８】
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６８５のベクターである請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の組換えヒト細胞に被験物を接触させ、前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法。
【請求項２０】
前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価が、前記被験物の代謝産物を直接的または間接的に分析することによる請求項１９に記載のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法。
【請求項２１】
前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価が、前記レポータータンパク質を直接的または間接的に分析することによる請求項１９または２０に記載のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法。
【請求項２２】
前記ヒト薬物代謝酵素が、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素およびグルコース転移酵素からなる群から選択される１以上である請求項１９〜２１のいずれかに記載のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法。
【請求項２３】
ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する評価用キットであって、請求項１〜９のいずれかに記載の組換えヒト細胞を含む評価用キット。
【請求項２４】
ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する評価用バイオチップであって、基盤上に請求項１〜９のいずれかに記載の組換えヒト細胞が配置された評価用バイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
薬物が生体に摂取されると、生体内の臓器、主に肝臓において、代謝酵素によって生体外へ排泄しやすい形に代謝される。また、薬物によっては代謝酵素を増やす作用（誘導作用）を有し、その場合には薬物代謝は亢進される。このような薬物代謝により、生体におけるその薬物の効き目や毒性が左右されるため、薬物代謝および薬物代謝酵素誘導を評価することは医薬品開発において重要な点の一つである。
【０００３】
この薬物代謝および薬物代謝酵素誘導は、従来から動物を用いて評価されていた。しかし、動物を用いる実験は、時間がかかったり、多数の動物を扱うのは労力を要するなど、負担が大きかった。さらに、実験動物はヒトと種が異なるため、実験動物で得られた薬物代謝および薬物代謝酵素誘導の結果が、ヒトのものと異なる場合もあった。
【０００４】
負担を軽減し、かつ種の違いによる結果の相違をなくすため、ヒト細胞を用いる薬物代謝および薬物代謝酵素誘導の評価方法が近年開発されてきている。例えば、電極上で培養させたヒト肝臓細胞に薬物を投与し、薬物の代表的代謝酵素であるヒトチトクロムＰ４５０が活性を発現するときに使用する電子を電流計で測定することにより、その細胞の薬物代謝を電気化学的に測定する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、入手できるヒト肝臓由来の樹立細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ、ＦＬＣ等）は、初代肝臓細胞の数百分の１と活性が弱く、感度よく測定するには問題があった。
【０００５】
一方、前記ヒトチトクロムＰ４５０を安定に発現するヒト肝臓癌細胞由来の培養細胞株と、その細胞株を用いて薬物代謝を評価する方法も知られている（例えば、特許文献２参照）。しかし、この細胞は常にヒトチトクロムＰ４５０を産生するため、薬物代謝酵素誘導を評価することはできないという問題があった。
【特許文献１】特開２００２−２１８９７２号公報
【特許文献２】特開２００１−００８６８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、薬物代謝と薬物代謝酵素誘導の両方を感度良く評価するための組換えヒト細胞、ならびにその組換えヒト細胞を用いてヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価のための組換えヒト細胞であって、ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるベクターにより形質転換された組換えヒト細胞である。
【０００８】
また、本発明は、ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法であって、本発明の組換えヒト細胞に被験物を接触させ、前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法である。
【０００９】
前記組換えヒト細胞に被験物、例えば薬物と接触させ、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータの転写が活性化されれば、前記ヒト薬物代謝酵素が発現される。その結果、前記薬物は前記ヒト薬物代謝酵素で代謝され、代謝産物が生じる。この代謝産物を測定することにより薬物代謝を評価でき、かつ薬物代謝酵素の誘導を評価することができる。また、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータの転写が活性化されれば、前記レポータータンパク質も発現されるので、その発現量を測定することにより薬物代謝酵素誘導を評価できる。従って、例えば創薬過程において、薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝について必要な情報を簡便に得ることができるので、医薬品開発においても有用である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組換えヒト細胞は、薬物代謝と薬物代謝酵素誘導のいずれも感度良く評価するのに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ヒト薬物代謝酵素は、限定されないが、例えば、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素、グルコース転移酵素等が挙げられる。中でも、薬物の約８０％の代謝反応に関与するヒトチトクロムＰ４５０が、好ましい。
【００１２】
本発明の組換えヒト細胞の宿主細胞としては、一般に遺伝子組換え技術が適用できるものが好ましく、さらに好ましくは保存、増殖等の取扱いが容易な細胞である。このような宿主細胞としては、例えば、肝臓細胞、肺臓細胞、腎臓細胞、鼻粘膜細胞、消化管細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、小腸細胞、咽頭細胞等が挙げられる。中でも、薬物代謝酵素の大半が存在する肝臓細胞が好ましい。ヒト肝臓由来の細胞株としては、例えばＨｅｐＧ２細胞が挙げられる。このような細胞は、各種公的機関（細胞バンク）等から入手可能であるし、直接人体から採取して入手することもできる。
【００１３】
本発明の組換えヒト細胞において、前記レポータータンパク質は、蛍光を発するタンパク質等、限定されないが、例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。中でも、ｄ２ＥＧＦＰが好ましい。ｄ２ＥＧＦＰは、一定時間蛍光を発すると分解して蛍光が消える。従って、本発明の組換えヒト細胞を用いて評価する際、一度被験物と接触させてｄ２ＥＧＦＰの蛍光を用いて薬物代謝酵素の誘導等を評価した後、その蛍光が消えるので、その組換えヒト細胞に別の被験物を接触させて新たにｄ２ＥＧＦＰの蛍光を用いて薬物代謝酵素の誘導等を評価でき、同じ組換えヒト細胞を用いて数種類の被験物について評価できるからである。
【００１４】
本発明の組換えヒト細胞において、前記バイシストロニック性制御配列とは、バイシストロニック性を実現する制御配列を意味し、例えばインターナル・リボゾーム・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ）配列が挙げられる。なお、バイシストロニック性とは、２つの機能遺伝子が発現されることを意味する。本発明の組換えヒト細胞において、前記バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されているのが好ましい。
【００１５】
前記バイシストロニック性制御配列がＩＲＥＳ配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されている本発明の組換えヒト細胞において、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置する、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ＩＲＥＳ配列と、前記レポータータンパク質コード配列は、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置される限り順序は限定されない。例えば、上流側に前記ヒト薬物代謝酵素コード配列が、下流側に前記レポータータンパク質コード配列が配置されていてもよいし、下流側に前記ヒト薬物代謝酵素コード配列が、上流側に前記レポータータンパク質コード配列が配置されていてもよい。中でも、上流側に前記ヒト薬物代謝酵素コード配列が、下流側に前記レポータータンパク質コード配列が配置されている場合、すなわち、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ＩＲＥＳ配列と、前記レポータータンパク質コード配列とがこの順序で配置されたのが好ましい。前記ＩＲＥＳ配列は、転写を続行させる機能を有しているので、この順序で配置されていれば、前記ヒト薬物代謝酵素の発現後、前記レポータータンパク質も引き続き発現されるからである。
【００１６】
なお、前記「ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列」とは、ヒト薬物代謝酵素の遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモータの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第一エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウェアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することができる。推定プロモータ領域は構造遺伝子に応じて変動するが、通常構造遺伝子の上流にある。しかし、推定プロモータ領域はこれらに限定されず、構造遺伝子の下流にある場合もあり得る。好ましくは、推定プロモータ領域は、第１エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在しうる。前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列は、例えば公知のデータベースに記載の配列を参照することができる。その際、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列は、公知の配列と相同性が例えば５０％以上、好ましくは７０％以上であり、かつ前記ヒト薬物代謝酵素の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列も全て含まれる。
【００１７】
前記ヒト薬物代謝酵素コード配列は、前記ヒト薬物代謝酵素の活性を示すものであれば限定されない。前記配列としては、例えば、公知のものを全て利用することができる。また、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列についても同様で、例えば公知のデータベースに記載の配列を参照することができる。その際、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列には、公知の配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数が、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２であり、かつ前記ヒト薬物代謝酵素をとしての活性を有するタンパク質も含む。また、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列には、公知の配列との相同性が、例えば８０％以上であって、好ましくは８８％以上であり、より好ましくは９４％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、かつ前記ヒト薬物代謝酵素をとしての活性を有するタンパク質も含む。
【００１８】
前記ＩＲＥＳ配列は米国特許第４，９３７，１９０号、特表２００２−５１４０８６（Ｐ２００２−５１４０８６Ａ）号公報、特表２００１−５０００２１（Ｐ２００１−５０００２１Ａ）号公報に記載されており、具体的には配列番号３に記載の塩基配列を有する。また、前記レポータータンパク質コード配列としては、前記レポータータンパク質、例えば公知のＧＦＰ（Prasher,D.C., Eckenrode,V.K., Ward,W.W., Prendergast,F.G. Cormier,M.J. "Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein" Gene 111 (2), 229-233 (1992)参照）、ＥＧＦＰ（配列番号４参照）、ｄ２ＥＧＦＰ（配列番号５参照）、ルシフェラーゼ（Lorenz,W.W., McCann,R.O., Longiaru,M. and Cormier,M.J. "Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4438-4442 (1991)参照）、β−ガラクトシダーゼ（Oshima,A., Tsuji,A., Nagao,Y., Sakuraba,H. and Suzuki,Y. "Cloning, sequencing, and expression of cDNA for human beta-galactosidase"  Biochem. Biophys. Res. Commun. 157 (1), 238-244 (1988)参照）などをコードする配列が挙げられる。
【００１９】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ヒトチトクロムＰ４５０は、例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等が挙げられる。中でも、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４が好ましい。これらが前記ヒトチトクロムＰ４５０全体の大半を占めるからである。さらに、ＣＹＰ３Ａ４が好ましい。ＣＹＰ３Ａ４は、ヒトチトクロムＰ４５０全体の約３０％を占めるからである。
【００２０】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等は、公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列は例えば下記の文献を参照できる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等のタンパク質には、多数の多型が知られており、例えばＣＹＰ３Ａ４の多型については下記表１〜３に記載のもの、ＣＹＰ２Ｄ６については下記表４〜６に記載のもの、ＣＹＰ２Ｃ１９については下記表７に記載のものが挙げられる。他にも、前記ＣＹＰ１Ａ１等のタンパク質をコードするアミノ酸配列として、前記公知の配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数が、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２であり、かつ前記ＣＹＰ１Ａ１等としての活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列も含む。
【００２１】
ＣＹＰ１Ａ１については、Jaiswal AK, Gonzalez FJ, Nebert DW. Human dioxin-inducible cytochrome P1-450: complementary DNA and amino acid sequence. Science. 1985 Apr 5;228(4695):80-3.または登録番号ＮＭ ０００４９９（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ１Ａ２についてはQuattrochi LC, Tukey RH.The human cytochrome Cyp1A2 gene contains regulatory elements responsive to 3-methylcholanthrene.Mol Pharmacol. 1989 Jul;36(1):66-71.もしくはHuman CYP1A2: sequence, gene structure, comparison with the mouse and rat orthologous gene, and differences in liver 1A2 mRNA expression.Ikeya K, Jaiswal AK, Owens RA, Jones JE, Nebert DW, Kimura S. Mol Endocrinol. 1989 Sep;3(9):1399-408. または登録番号ＮＭ ０００７６１（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ１Ｂ１については、Tang YM, Wo YY, Stewart J, Hawkins AL, Griffin CA, Sutter TR, Greenlee WF. Isolation and characterization of the human cytochrome P450 CYP1B1 gene. J Biol Chem. 1996 Nov 8;271(45):28324-30. または登録番号Ｕ５６４３８（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２Ａ６については、Yamano S, Tatsuno J, Gonzalez FJ.Biochemistry. 1990 Feb 6;29(5):1322-9. The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human liver microsomes. または登録番号ＮＭ ０００７６２（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００２２】
ＣＹＰ２Ａ１３については、Fernandez-Salguero P, Hoffman SM, Cholerton S, Mohrenweiser H, Raunio H, Rautio A, Pelkonen O, Huang JD, Evans WE, Idle JR, et al.A genetic polymorphism in coumarin 7-hydroxylation: sequence of the human CYP2A genes and identification of variant CYP2A6 alleles. Am J Hum Genet. 1995 Sep;57(3):651-60. または登録番号ＮＭ ０００７６６（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２Ｂ６については、Yamano S, Nhamburo PT, Aoyama T, Meyer UA, Inaba T, Kalow W, Gelboin HV, McBride OW, Gonzalez FJ. cDNA cloning and sequence and cDNA-directed expression of human P450 IIB1: identification of a normal and two variant cDNAs derived from the CYP2B locus on chromosome 19 and differential expression of the IIB mRNAs in human liver. Biochemistry. 1989 Sep 5;28(18):7340-8. または登録番号ＮＭ ０００７６７（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２Ｃ８については、Klose TS, Blaisdell JA, Goldstein JA. Gene structure of CYP2C8 and extrahepatic distribution of the human CYP2Cs. J Biochem Mol Toxicol. 1999;13(6):289-95. または登録番号ＡＹ５１４４９０（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００２３】
ＣＹＰ２Ｃ９については、 Romkes M, Faletto MB, Blaisdell JA, Raucy JL, Goldstein JA. Cloning and expression of complementary DNAs for multiple members of the human cytochrome P450IIC subfamily. Biochemistry. 1991 Apr 2;30(13):3247-55. または登録番号Ｍ６１８５７  Ｊ０５３２６（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２Ｃ１９については、  Romkes M, Faletto MB, Blaisdell JA, Raucy JL, Goldstein JA.Cloning and expression of complementary DNAs for multiple members of the human cytochrome P450IIC subfamily. Biochemistry. 1991 Apr 2;30(13):3247-55.、登録番号Ｍ６１８５４  Ｊ０５３２６（GenBank/EMBL/DDBJ）または配列番号６に示すアミノ酸配列、ＣＹＰ２Ｄ６については、Kimura S, Umeno M, Skoda RC, Meyer UA, Gonzalez FJ. The human debrisoquine 4-hydroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic CYP2D6 gene, a related gene, and a pseudogene. Am J Hum Genet. 1989 Dec;45(6):889-904. 、登録番号ＮＭ ０００１０６（GenBank/EMBL/DDBJ）または配列番号７に示すアミノ酸配列、ＣＹＰ２Ｅ１については、Umeno M, McBride OW, Yang CS, Gelboin HV, Gonzalez FJ. Human ethanol-inducible P450IIE1: complete gene sequence, promoter characterization, chromosome mapping, and cDNA-directed expression. Biochemistry. 1988 Dec 13;27(25):9006-13. または登録番号ＮＭ ０００７７３またはＪ０２８４３（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２Ｊ２については、King LM, Ma J, Srettabunjong S, Graves J, Bradbury JA, Li L, Spiecker M, Liao JK, Mohrenweiser H, Zeldin DC. Cloning of CYP2J2 gene and identification of functional polymorphisms. Mol Pharmacol. 2002 Apr;61(4):840-52. または登録番号ＡＦ２７２１４２（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００２４】
ＣＹＰ３Ａ５については、 Aoyama T, Yamano S, Waxman DJ, Lapenson DP, Meyer UA, Fischer V, Tyndale R, Inaba T, Kalow W, Gelboin HV, et al. Cytochrome P-450 hPCN3, a novel cytochrome P-450 IIIA gene product that is differentially expressed in adult human liver. cDNA and deduced amino acid sequence and distinct specificities of cDNA-expressed hPCN1 and hPCN3 for the metabolism of steroid hormones and cyclosporine.  J Biol Chem. 1989 Jun 25;264(18):10388-95. または登録番号ＮＭ ０００７７７（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ３Ａ７については、Komori M, Nishio K, Ohi H, Kitada M, Kamataki T. Molecular cloning and sequence analysis of cDNA containing the entire coding region for human fetal liver cytochrome P-450.  J Biochem (Tokyo). 1989 Feb;105(2):161-3. または登録番号ＮＭ ０００７６５（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００２５】
ＣＹＰ５Ａ１については、Miyata A, Yokoyama C, Ihara H, Bandoh S, Takeda O, Takahashi E, Tanabe T. Characterization of the human gene (TBXAS1) encoding thromboxane synthase. Eur J Biochem. 1994 Sep 1;224(2):273-9. もしくは Strausberg,R.L.,et al., Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)または登録番号ＢＣ０１４１１７、ＮＰ ００１０５２（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ８Ａ１については、Yokoyama C, Yabuki T, Inoue H, Tone Y, Hara S, Hatae T, Nagata M, Takahashi EI, Tanabe T. Human gene encoding prostacyclin synthase (PTGIS): genomic organization, chromosomal localization, and promoter activity. Genomics. 1996 Sep 1;36(2):296-304. または登録番号ＮＭ ０００９６１（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２１については、Higashi Y, Yoshioka H, Yamane M, Gotoh O, Fujii-Kuriyama Y.Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 May;83(9):2841-5. または登録番号ＮＭ ０００５００（GenBank/EMBL/DDBJ）を参照できる。
【００２６】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ＣＹＰ３Ａ４は、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質であるのが好ましい。なお、下記配列番号１のアミノ酸配列は公知であり、例えばGonzalez FJ, Schmid BJ, Umeno M, Mcbride OW, Hardwick JP, Meyer UA, Gelboin HV, Idle JR. Human P450PCN1: sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA. 1988 Mar;7(2):79-86または登録番号Ｍ１８９０７、ＮＭ ０１７４６０  ＮＭ＿０００７７６（GenBank/EMBL/DDBJ））を参照できる。下記（ｂ）のタンパク質は、下記（ａ）のタンパク質との相同性が、例えば９４％以上であって、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。また、下記（ｂ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ塩基配列の１から数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質。
【００２７】
前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等をコードする配列は、例えば前記文献をそれぞれ参照できる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等をコードする配列は、多数のAlleleが知られており、例えばＣＹＰ３Ａ４のAlleleについては下記表１〜３に記載のもの、ＣＹＰ２Ｄ６については下記表４〜６に記載のもの、ＣＹＰ２Ｃ１９については下記表７に記載のものが挙げられる。他にも、前記ＣＹＰ１Ａ１等をコードする配列として、公知の配列と相同性が例えば５０％以上、好ましくは７０％以上であり、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質をコードする配列も全て含まれる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等をコードする配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２である。
【００２８】
【表１】
2005229967.tif 000002
【００２９】
【表２】
2005229967.tif 000003
【００３０】
【表３】
2005229967.tif 000004
【００３１】
【表４】
2005229967.tif 000005
【００３２】
【表５】
2005229967.tif 000006
【００３３】
【表６】
2005229967.tif 000007
【００３４】
【表７】
2005229967.tif 000008
【００３５】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ＣＹＰ３Ａ４をコードする配列は、下記（ｅ）または（ｆ）の配列であるのが好ましい。なお、下記配列番号８の塩基配列は公知であり、例えばGonzalez FJ, Schmid BJ, Umeno M, Mcbride OW, Hardwick JP, Meyer UA, Gelboin HV, Idle JR. Human P450PCN1: sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA. 1988 Mar;7(2):79-86.または登録番号Ｍ１８９０７，ＮＭ ０１７４６０  ＮＭ ０００７７６（GenBank/EMBL/DDBJ））を参照できる。下記（ｆ）の配列は、下記（ｅ）の配列との相同性が、例えば９４％以上であって、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。下記（ｆ）の配列は、例えば、前記表１〜３に記載のものであってもよい。
（ｅ）配列番号８に記載の塩基配列。
（ｆ）配列番号８に記載の塩基と相同性が９４％以上の塩基配列からなり、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質をコードする配列。
【００３６】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等のプロモータ配列は、例えば下記の文献を参照できる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等のプロモータ配列には、Allele、例えば公知のプロモータ配列と相同性が例えば５０％以上、好ましくは７０％以上であり、かつＣＹＰ１Ａ１等の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列も全て含まれる。
【００３７】
ＣＹＰ３Ａ４については、Furukawa M, Okubo T, Ogino M, Yamazaki T, Shimada M, Nagata K, Yamazoe Y. "Adenovirus vector-mediated reporter system for in vivo analyses of human CYP3A4 gene activation" J Biochem (Tokyo). 2002 Jan;131(1):71-8. ；Ogg MS, Gray TJ, Gibson GG. Related Articles, Links 
"Development of an in vitro reporter gene assay to assess xenobiotic induction of the human CYP3A4 gene." Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 1997 Oct-Dec;22(4):311-3. ；El-Sankary W, Bombail V, Gibson GG, Plant N. "Glucocorticoid-mediated induction of CYP3A4 is decreased by disruption of a protein: DNA interaction distinct from the pregnane X receptor response element" Drug Metab Dispos. 2002 Sep;30(9):1029-34.または登録番号ＡＦ１８５５８９、ＡＦ１８１１０５（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００３８】
ＣＹＰ２Ｄ６については、Cairns W, Smith CA, McLaren AW, Wolf CR. "Characterization of the human cytochrome P4502D6 promoter. A potential role for antagonistic interactions between members of the nuclear receptor family" J Biol Chem. 1996 Oct 11;271(41):25269-76. もしくはRaimundo,S. and Zanger,U. Polymorphisms in the human cyp2d6 gene promoter region and their use in diagnostic and therapeutic applications Patent: WO 0155432-A 10 02-AUG-2001 または登録番号ＡＸ２０７２２４〜ＡＸ２０７２３３（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ１Ａ１については、Vecchini F, Lenoir-Viale MC, Cathelineau C, Magdalou J, Bernard BA, Shroot B."Presence of a retinoid responsive element in the promoter region of the human cytochrome P4501A1 gene." Biochem Biophys Res Commun. 1994 Jun 30;201(3):1205-12.、ＣＹＰ１Ａ２については、Chung I, Bresnick E. "Identification of positive and negative regulatory elements of the human cytochrome P4501A2 (CYP1A2) gene."Arch Biochem Biophys. 1997 Feb 15;338(2):220-6. ；Quattrochi LC, Vu T, Tukey RH. "The human CYP1A2 gene and induction by 3-methylcholanthrene. A region of DNA that supports AH-receptor binding and promoter-specific induction. "J Biol Chem. 1994 Mar 4;269(9):6949-54.、ＣＹＰ１Ｂ１については、Wo YY, Stewart J, Greenlee WF. "Functional analysis of the promoter for the human CYP1B1 gene." J Biol Chem. 1997 Oct 17;272(42):26702-7、ＣＹＰ２Ｃ１９については、Arefayene M, Skaar TC, Zhao X, Rae JM, Tanus-Santos JE, Brinkmann U, Brehm I, Salat U, Nguyen A, Desta Z, Flockhart DA. "Sequence diversity and functional characterization of the 5'-regulatory region of human CYP2C19." Pharmacogenetics. 2003 Apr;13(4):199-206. ； de Morais SM, Schweikl H, Blaisdell J, Goldstein JA. "Gene structure and upstream regulatory regions of human CYP2C9 and CYP2C18." Biochem Biophys Res Commun. 1993 Jul 15;194(1):194-201. もしくは、M., Skaar,T.C., Zhao,X., Rae,J.M., Tanus-Santos,J.E., Brinkmann,U., Brehm,I., Salat,U., Nguyen,A., Desta,Z. and Flockhart,D.A. Sequence diversity and functional characterization of the 5'-regulatory region of human CYP2C19 Pharmacogenetics 13 (4), 199-206 (2003) もしくはde Morais SM, Schweikl H, Blaisdell J, Goldstein JA. Related Articles, Links  Gene structure and upstream regulatory regions of human CYP2C9 and CYP2C18. Biochem Biophys Res Commun. 1993 Jul 15;194(1):194-201.または登録番号ＡＦ３５４１８１、Ｌ１６８７７、ＡＪ２９３３４５（GenBank/EMBL/DDBJ）、
【００３９】
ＣＹＰ３Ａ５については、  Schuetz JD, Schuetz EG, Thottassery JV, Guzelian PS, Strom S, Sun D. " Identification of a novel dexamethasone responsive enhancer in the human CYP3A5 gene and its activation in human and rat liver cells." Mol Pharmacol. 1996 Jan;49(1):63-72. または登録番号Ｌ３５９１２（GenBank/EMBL/DDBJ）、ＣＹＰ２１については、 Wijesuriya SD, Zhang G, Dardis A, Miller WL. "Transcriptional regulatory elements of the human gene for cytochrome P450c21 (steroid 21-hydroxylase) lie within intron 35 of the linked C4B gene."J Biol Chem. 1999 Dec 31;274(53):38097-106. または登録番号Ｍ９４０７０（GenBank/EMBL/DDBJ）を参照できる。
【００４０】
本発明の組換えヒト細胞において、前記ＣＹＰ３Ａ４のプロモータ配列は、下記（ｃ）または（ｄ）の配列であるのが好ましい。なお、下記配列番号２の塩基配列は、公知の塩基配列、例えば登録番号ＡＦ１８５５８９（GenBank/EMBL/DDBJ）を基にし、下記配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いて、前記登録番号ＡＦ１８５５８９（GenBank/EMBL/DDBJ）の１１３７４個の塩基配列から、１０１２１〜１０５６４番目の塩基配列を調製して、得ることができる。下記（ｄ）の塩基配列は、下記（ｃ）の塩基配列との相同性が、例えば５０％以上であって、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相同性が５０％以上の塩基配列からなり、かつＣＹＰ３Ａ４の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列。
【００４１】
前記ヒト宿主細胞を、ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるであるベクターにより形質転換する方法としては、特に限定されず、前記宿主細胞に適した従来公知の形質転換の方法により行うことができる。例えば、当業者に公知の任意のベクターを用いて、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを所望の順番に導入し、次いで、そのベクターによりヒト宿主細胞を形質転換させることにより製造することができる。前記ベクターへの各配列の導入、ベクターによる細胞の形質転換等の操作は、当該技術分野で公知の任意の方法および手段により容易に行うことができる。また、後記する本発明の受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６８５のベクター（ｐ３Ａ４ｃｐ−ｄ２ＥＧＦＰ）を用いてヒト宿主細胞を形質転換させれば、本発明の組換えヒト細胞の一例を容易に得ることができる。
【００４２】
また、本発明のベクターは、ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価のための組換えヒト細胞のためのベクターであって、ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、バイシストロニック性制御配列とを含み、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記バイシストロニック性制御配列と、前記レポータータンパク質コード配列とが、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に位置し、かつ前記プロモータの転写活性により前記ヒト薬物代謝酵素および前記レポータータンパク質がバイシストロニック性に発現可能であるベクターである。
【００４３】
また、本発明のベクターにおいて、前記組換えヒト細胞と同様、前記ヒト薬物代謝酵素は、例えば、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素、グルコース転移酵素等が挙げられる。中でもヒトチトクロムＰ４５０が好ましい。
【００４４】
また、本発明のベクターにおいて、前記レポータータンパク質は、蛍光を発するタンパク質等、限定されないが、例えばＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。中でもｄ２ＥＧＦＰが好ましい。
【００４５】
本発明の組換えヒト細胞において、前記バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されているのが好ましい。
【００４６】
また、前記バイシストロニック性制御配列が、ＩＲＥＳ配列であり、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記レポータータンパク質コード配列との間に前記ＩＲＥＳ配列が配置されている本発明のベクターにおいて、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列の下流に、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ＩＲＥＳ配列と、前記レポータータンパク質コード配列とがこの順序で配置されたポリヌクレオチドが導入されるのが好ましい。
【００４７】
また、本発明のベクターにおいて、前記ヒトチトクロムＰ４５０は、例えば、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等が挙げられる。中でも、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４が好ましく、ＣＹＰ３Ａ４がより好ましい。
【００４８】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等は、公知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列は例えば前記本発明の組換えヒト細胞において列挙した前記文献をそれぞれ参照できる。
【００４９】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ３Ａ４は、下記（ａ）または（ｂ）のタンパク質であるのが好ましい。なお、下記配列番号１のアミノ酸配列は公知であり、例えばGonzalez FJ, Schmid BJ, Umeno M, Mcbride OW, Hardwick JP, Meyer UA, Gelboin HV, Idle JR. Human P450PCN1: sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA. 1988 Mar;7(2):79-86または登録番号Ｍ１８９０７、ＮＭ ０１７４６０  ＮＭ ０００７７６（GenBank/EMBL/DDBJ））を参照できる。下記（ｂ）のタンパク質は、下記（ａ）のタンパク質との相同性が、例えば９４％以上であって、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。また、下記（ｂ）のタンパク質において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ塩基配列の１から数個のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質。
【００５０】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等をコードする配列は、例えば前記本発明の組換えヒト細胞において列挙した前記文献をそれぞれ参照できる。その際、前記ＣＹＰ１Ａ１等をコードする配列には、公知の配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数が、例えば１〜１０であって、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１〜２であり、かつ前記ＣＹＰ１Ａ１等の酵素をとしての活性を有するタンパク質も含む。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等をコードする配列には、公知の配列との相同性が、例えば８０％以上であって、好ましくは８８％以上であり、より好ましくは９４％以上であり、さらに好ましくは９６％以上であり、かつ前記ＣＹＰ１Ａ１等の酵素をとしての活性を有するタンパク質も含む。
【００５１】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ３Ａ４をコードする配列は、下記（ｅ）または（ｆ）の配列であるのが好ましい。なお、下記配列番号８の塩基配列は公知であり、例えばGonzalez FJ, Schmid BJ, Umeno M, Mcbride OW, Hardwick JP, Meyer UA, Gelboin HV, Idle JR. Human P450PCN1: sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA. 1988 Mar;7(2):79-86.または登録番号Ｍ１８９０７，ＮＭ ０１７４６０  ＮＭ ０００７７６（GenBank/EMBL/DDBJ））を参照できる。下記（ｆ）の配列は、下記（ｅ）の配列との相同性が、例えば９４％以上であって、好ましくは９６％以上であり、より好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。下記（ｆ）の配列は、例えば、前記表１〜３に記載のものであってもよい。
（ｅ）配列番号８に記載の塩基配列。
（ｆ）配列番号８に記載の塩基と相同性が９４％以上の塩基配列からなり、かつヒトチトクロムＰ４５０として酵素活性を有するタンパク質をコードする配列。
【００５２】
本発明のベクターにおける前記ヒト薬物代謝酵素コード配列は、前記の本発明における前記ヒト薬物代謝酵素コード配列を参照できる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１およびＣＹＰ２１をコードする配列は、前記文献をそれぞれ参照できる。さらに、ＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ２Ｄ６は、配列番号９および配列番号１０の塩基配列をそれぞれ参照できる。
【００５３】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ２１等のプロモータ配列は、例えば前記本発明の組換えヒト細胞において列挙した前記文献をそれぞれ参照できる。また、前記ＣＹＰ１Ａ１等のプロモータ配列には、Allele、例えば公知のプロモータ配列と相同性が例えば５０％以上、好ましくは７０％以上であり、かつＣＹＰ１Ａ１等の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列も全て含まれる。
【００５４】
本発明のベクターにおいて、前記ＣＹＰ３Ａ４のプロモータ配列は、下記（ｃ）または（ｄ）の配列であるのが好ましい。なお、下記配列番号２の塩基配列は、公知の塩基配列、例えば登録番号ＡＦ１８５５８９（GenBank/EMBL/DDBJ）を基にし、下記配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いて、前記登録番号ＡＦ１８５５８９（GenBank/EMBL/DDBJ）の１１３７４個の塩基配列から、１０１２１〜１０５６４番目の塩基配列を調製して、得ることができる。下記（ｄ）の塩基配列は、下記（ｃ）の塩基配列との相同性が、例えば５０％以上であって、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列と相同性が５０％以上の塩基配列からなり、かつＣＹＰ３Ａ４の転写調節を行うプロモータ活性を有する配列。
【００５５】
本発明のベクターは、例えば、当該分野に公知のベクターを使用し、前記ヒト薬物代謝酵素コード配列と、前記ヒト薬物代謝酵素のプロモータ配列と、レポータータンパク質コード配列と、ＩＲＥＳ配列とを、所望の順番で導入することにより製造することができる。前記ベクターへの各配列の導入等の操作は、当該技術分野で公知の任意の方法および手段、例えば制限酵素を用いる方法、部位特異的遺伝子組み換え等により容易に行うことができる。
【００５６】
本発明で用いる当該分野に公知のベクターとしては、限定されず、例えば、プラスミド、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドの例としては、pMSG、pSVL、pSVK3、pMAM-neo、pTX、pBPV、pHβAPr-1-neo、pSV2-dhfr、（細胞工学実験操作入門、石田功、三沢典彦  講談社サイエンティフィック1992年）、pCDNA系ベクター（インビトロジェン社）、pEF系ベクター（インビトロジェン社）等が挙げられる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、レンチウイルス、EBウイルス、BKウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス等が挙げられる。
【００５７】
本発明の受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９６８５のベクター（ｐ３Ａ４ｃｐ−ｄ２ＥＧＦＰ）には、上流からこの順序で、配列番号２に記載のＣＹＰ３Ａプロモータ配列と、配列番号８に記載のＣＹＰ３Ａ４をコードする配列と、配列番号３に記載のＩＲＥＳ配列と、配列番号５に記載のｄ２ＥＧＦＰをコードする配列が含まれているので、このベクターを利用すれば、容易に本発明のベクターの一例をクローニングすることができる。
【００５８】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法は、前記のように、本発明の組換えヒト細胞に被験物を接触させ、前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法である。前記被験物としては、特に限定されないが、新規または公知の薬物、毒物、漢方薬や、健康食品、アルコール等が挙げられる。また、前記被験物を本発明の組換えヒト細胞に接触させる方法としては、例えば、本発明の組換えヒト細胞と混合する方法や、または、前記細胞を含む培養液を被験物と混合する方法や、前記細胞が固定されたウェル中に、前記被験物の溶液を入れて一定時間放置する方法等が挙げられる。
【００５９】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法において、前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価が、前記被験物の代謝産物を直接的または間接的に分析することによるのが好ましい。前記被験物の代謝産物を直接的に分析する方法としては、前記代謝産物が蛍光を有する場合には、その蛍光強度を直接測定する方法が挙げられる。また、前記被験物の代謝産物を間接的に分析する方法としては、被験物に蛍光色素で標識した抗体と結合させ、その蛍光色素の蛍光強度を間接的に測定する方法が挙げられる。
【００６０】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法において、前記被験物によるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価が、前記レポータータンパク質を直接的または間接的に分析することによるのが好ましい。前記レポータータンパク質を直接的に分析する方法としては、前記代謝産物が蛍光を有する場合には、その蛍光強度を直接測定する方法が挙げられる。また、前記レポータータンパク質を間接的に分析する方法としては、レポータータンパク質に蛍光色素で標識した抗体と結合させ、その蛍光色素の蛍光強度を間接的に測定する方法が挙げられる。例えば、前記レポータータンパク質がβ−ガラクトシダーゼである場合、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド）等の発色試薬を作用させ、その吸光度を測定する。この測定において、標準物質を用いて測定し、検量線を作成しておくことが好ましい。このような測定方法であれば、吸光度を測定するだけで、前記レポータータンパク質を簡便かつ迅速に間接的に分析することができる。
【００６１】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する方法において、前記ヒト薬物代謝酵素は、例えば、ヒトチトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミンオキシダーゼ、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、エステラーゼ、エポキシヒドロラーゼ、β−グルクロニダーゼ、スルファターゼ、ＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素、グルタチオンＳ−転移酵素、Ｎ−アセチル転移酵素、硫酸転移酵素、グリシン抱合酵素、メチル化酵素、グルコース転移酵素が挙げられる。
【００６２】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する評価用キットは、本発明の組換えヒト細胞を含む評価用キットである。このようなキットは、例えば、各ウェルに前記組換えヒト細胞が固定されたプレート、ディッシュ、ファイバー、流体チップ、セラミックの固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記組換えヒト細胞の他に、例えば、培養組成物、培地、培養組成物、培地以外には代謝薬物や、反応して発色する発色用基質、検出を容易にする感度補助剤等を含んでいてもよい。
【００６３】
本発明のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価する評価用バイオチップは、基盤上に本発明の組換えヒト細胞が配置された評価用バイオチップである。前記評価用バイオチップは、ヒト体内での薬物代謝システムを模倣したため、より実際のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価することが可能である。例えば、ヒト体内の肝臓での薬物代謝に着目すると、これまで、初代ヒト肝臓細胞を用いた薬物代謝評価においては、細胞培養用ウェルに培養液存在下に前記細胞を播種し、これに被験薬物を入れて、静置して反応させ、培養液上清中の反応物を測定するという手法が用いられていた。しかし、実際のヒト肝臓においては、小腸より吸収された薬物が、血流にのって肝臓内の肝小葉に流れ込むため、被代謝薬物が次々に連続的に供給されるシステムによって代謝されている。そのため、肝臓ゾネーション（liver zonation）と呼ばれる、肝臓内血流に沿ったヒト薬物代謝細胞の分布、代謝分布が見られ、この分布に沿ったヒト薬物誘導および代謝が生体内にて行われている（Jungermann K, Kietzmann T. Oxygen: modulator of metabolic zonation and disease of the liver. Hepatology. 2000 Feb;31(2):255-60. Review. No abstract available.； Lindros KO. Zonation of cytochrome P450 expression, drug metabolism and toxicity in liver. Gen Pharmacol. 1997 Feb;28(2):191-6.； Jungermann K, Kietzmann T. Zonation of parenchymal and nonparenchymal metabolism in liver. Annu Rev Nutr. 1996;16:179-203.；またはAllen JW, Bhatia SN. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol Bioeng. 2003 May 5;82(3):253-62.参照）。前記評価用バイオチップは、このようなシステムを模倣しているため、例えばヒト肝臓細胞におけるヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価することが可能である。
【００６４】
前記評価用バイオチップは、基盤上に本発明の組換えヒト細胞が配置された評価用チップである。前記バイオチップは、例えば、肝小葉を模した細い溝状の流路内(幅数十から数百μｍ)に前記細胞を配置する。そして、流路の片側より、被験物、例えば薬物溶液を連続的に流し込み、その結果得られる薬物代謝誘導を蛍光により評価し、さらに流路から排出される反応液を分析することにより薬物代謝物を評価することができる。前記流路の幅がμｍオーダーの細い流路であるため、レイノルズ数２０００以下の層流条件となり、肝小葉における流れ場とほぼ同じ条件が実現可能となる。層流条件下では、流れ方向の薬物溶液の混合が起こらず、被験物である薬物溶液と、この代謝に影響を及ぼす可能性がある別の薬物溶液を交互に流して、薬物同士の相互作用を評価することが可能である。また、層状にて流すことにより、同一細胞の一部分に対して薬物を供給した場合のヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方を評価することができる。
【００６５】
前記評価用バイオチップは、例えば以下のようにして製造することができる。バイオチップ上にフィブロネクチン滅菌水溶液を撒き、数時間静置する。その後、フィブロネクチンを吸い出してＰＢＳで数回洗浄し、ＰＢＳ除去後、本発明の組換えヒト細胞を播種する。培地をガラスチップの入ったシャーレ内に加えて、チップ全体が培地に浸されるようにし、３７℃でインキュベートする。このようにして、例えば、本発明の組換えヒト細胞を含む評価用バイオチップを製造することができる。
【００６６】
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
（動物細胞培養法）
（１）使用した宿主動物細胞
ＨｅｐＧ２  （理化学研究所細胞バンク  ＲＣＢ０４５９）
由来     ヒト肝細胞癌
増殖形態  上皮性
使用動物細胞
ＨｅｐＧ２  （上記由来）
ＣＹＰ３Ａ４−ＧＳ−ＨｅｐＧ２  （特開２００３−２７４９６３参照）
【００６８】
（２）使用した動物細胞培養培地
各培地は０．２２μｍメンブレンフィルター（７１０５；Ｆａｌｃｏｎ）を用い、ろ過滅菌した後、使用した。
［ＲＤＦ培地組成］
RDF(HO)粉末(日本製薬;010406特注)                8.44g
ク゛ルコース(ナカライテスク;M7T4154)            2.58g
NaHCO3(和光純薬;CKN3650)                        2.0 g
ク゛ルタミン(ナカライテスク;M1H9105 16919-42)   0.333g
ヘ゜ニシリンG(SIGMA 17H1214 EECNS 200-710-2)    58.8mg
ストレフ゜トマイシン(和光純薬; DWL2287)         120mg
超純水（ミリ-Q H2O）                            全量を1Lにするまで加える。
注１）  ＲＤＦ（ＨＯ）は通常のＲＤＦ培地からグルコース、グルタミンを抜いたものである。
注２）  使用時には牛胎児血清（fetal bovine serum （ＦＢＳ）；Ｇｉｂｃｏ）を培地容量の１０％（ｖｏｌ．％）相当量加えた。
注３）  ＣＹＰ３Ａ４−ＧＳ−ＨｅｐＧ２細胞株の継代時にゼオシン（インビトロジェン（invitrogen）株式会社；Ｒ２５０−０１）を２００μｍ／ｍＬとなるように添加した。
【００６９】
［ＤＭＥＭ培地］
ＤＭＥＭ（ナカライテスク；１４２４７−１５）    500ｍＬ
ヘ゜ニシリンG(SIGMA 17H1214 EECNS 200-710-2)          58.8mg
ストレフ゜トマイシン(和光純薬; DWL2287)                   120mg
【００７０】
（細胞培養容器）
細胞培養容器として５０ｍＬのＴ−フラスコ（住友ベークライト製ＭＳ−２００５０；底面積２５ｃｍ2，容量５０ｍＬ）（以下、小Ｔ−フラスコ）および１００ｍｍシャーレ、６ウェルプレートを用いた。小Ｔ−フラスコと１００ｍｍシャーレには通常１０ｍＬ、６ウェルプレートには３ｍＬの培地を用いた。通常の細胞株継代には小Ｔ−フラスコを用いた。
【００７１】
（細胞の継代）
［方法１］
（１）  培地をピペットで抜き取り、以下に示す０．２５％のトリプシン液を加えた。Ｔ−フラスコの場合は、５ｍＬ用いた。
（２）  ３７℃で１０分間インキュベートした。
（３）  細胞集団が剥がれだし始めると、トリプシンと等量の新しい培地を加えてトリプシンの反応を止め、ピペッティングにより懸濁させた。
（４）  細胞懸濁液を遠心管に移し、８０×ｇ．で１０分間遠心分離した後、上澄みをピペットで除去した。
（５）  遠心管に新しい培地を加えて細胞を再び懸濁させ、新しいＴ−フラスコに適当量播種した。
【００７２】
０．２５％トリプシン液の組成
ＮａＣｌ                                              ８．０ｇ
ＫＣｌ                                                ０．２ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ                              ２．９ｇ
ＫＨ2ＰＯ4                                           ０．２ｇ
トリプシン  （Ｄｉｆｃｏ  １：２５０）                ２．５ｇ
ｄＨ2Ｏ                                              １Ｌ
【００７３】
［方法２］
（１）  培地をアスピレーターで抜き取り、ＰＢＳ  １ｍＬで洗浄後、前記０．２５％−トリプシン液を加えた。Ｔ−フラスコの場合は５ｍＬ用いた．
（２）  ３７℃で５分間インキュベートした。
（３）  細胞集団が剥がれだし始めると、トリプシン液と等量の新しい培地を加えてトリプシンの反応を止め、ピペッティングにより懸濁させた。
（４）  細胞懸濁液を遠心管に移し、２００×ｇ．で３分間遠心分離した後、上澄みをアスピレーターで除去した。
（５）  遠心管に新しい培地を加えて細胞を再び懸濁し、新しいＴ−フラスコに適当量播種した。
【００７４】
（細胞の凍結保存法）
培地に１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた液で細胞を懸濁し、セラムチューブに分注してＢＩＣＥＬＬ（Nihon Freezer）に入れ、−８０℃で一晩凍結させた後、液体窒素中に保存した。
【００７５】
解凍は３７℃の温水中にて行い、培地１０ｍＬを入れた遠心管に細胞懸濁液を移し、８０×ｇ．で１０分間遠心分離し、細胞を新しいＴ−フラスコに播種した。
【００７６】
（細胞濃度測定法）
［方法１］
細胞計測はトリパンブルーを用いた色素排除法にて測定した。０．２％トリパンブルー水溶液（ｗ／ｖ）と、４．２５％ＮａＣｌ水溶液（ｗ／ｖ）を４：１の割合で混合させた水溶液を用い、この水溶液と細胞浮遊液を等量混合させＢｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算板（ＥＲＭＡ４２９６）に一滴（約１５Ｌ）加えて検鏡し、生細胞濃度および全細胞濃度を計測した。血球計算板では右側および下側の二辺にかかる細胞について計測時に省いた。ここで血球計算板付属の検定地に従い、血球計算板の深さを補正および体積を計算して細胞濃度を算出した。
［方法２］
細胞計測はトリパンブルーを用いた色素排除法にて測定した。０．２％トリパンブルー水溶液（ｗ／ｖ）と、４．２５％ＮａＣｌ水溶液（ｗ／ｖ）を４：１の割合で混合させた水溶液を用い、この水溶液と細胞浮遊液を等量混合させＢｕｒｋｅｒ−Ｔｕｒｋ型血球計算板に一滴（約１５Ｌ）加えて検鏡し、生細胞濃度および全細胞濃度を計測した。
【００７７】
計測には以下の計算式を用いた。
【００７８】
【数１】
2005229967.tif 000009
【００７９】
（ベクターの製造）
使用菌株および培地
菌株
大腸菌  ＤＨ５      （ＴＯＹＯＢＯ；  ＤＮＡ−９０１）
ＤＨ５      （ＴＯＹＯＢＯ；  ＤＮＡ−９０１）
培地
Agerを超純水（ミリ-Q水）で溶解し、オートクレーブした。プレートにする場合は60 g/LのAgarまたはSuper Brothを加えた。オートクレーブ後に約55℃程度にまで冷却させ、抗生物質（カナマイシンまたはアンピシリン）添加の場合は50mg/ mLになるように加えた。
【００８０】
（使用プラスミド）
P450発現ベクター構築用プラスミドとしては、pIRES2-EGFP (clontech;６３２３０６)（図１参照）と、pd2-EGFP-N1(clontech;６３２３３４)（図２参照）を、TAクローニング用プラスミドとしてはpCR 2.1 (invitrogen;ＴＡクローニング試薬４５−００４６に含有されるベクター)（図３参照）を用いた。
【００８１】
（遺伝子工学実験操作）
アガロース電気泳動
１×ＴＢＥ緩衝液およびゲル１５ｍＬ当たり１μＬとなるよう臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を添加した１％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＯ３；ＴＡＫＡＲＡ）を調製し、小型電気泳動槽（ｉ−Ｍｕｐｉｄ−Ｊ；コスモバイオ）を用いて電気泳動を行った。試料はＤＮＡ  ｓｏｌｎ．が×２〜×３となるよう泳動用染色液を加えて作製し、トランスイルミネーター（ＦＡＳ−III；ＴＯＹＯＢＯ）でＤＮＡバンドを観察した。
【００８２】
エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液にＥｔｈａｃｈｉｎｍａｔｅ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）１μＬ、３Ｍ−酢酸ナトリウム（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）を１００μＭになるように加えた。この溶液に９９％エタノールを１００μＬ程度加え２０４００×ｇ．１０分遠心しＤＮＡを析出させた。
【００８３】
上清を除去し、７０％エタノール１００〜２００μＬを加え、２０４００×ｇ．５分遠心しＤＮＡを析出させ、上清除去後乾固させた。
【００８４】
フェノール−クロロホルム抽出
ＤＮＡ  ｓｏｌｎ．にフェノール‐クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）（フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール；Ｗａｋｏ；３１１−９０１５１）を１：１の割合で加えた。転倒混和後、１２０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上層を新しいサンプルチューブに移した。
【００８５】
ＤＮＡ定量
実験に用いる微量のＤＮＡを測定する場合は、電気泳動によるバンドマーカーとの比較で計算し、プラスミド調整時等のＤＮＡ量測定は吸光光度計にて測定した。
【００８６】
（ＰＣＲ法による遺伝子調整）
Ｐ４５０  ３Ａ４  プロモータ遺伝子の調整
目的に応じた制限酵素サイトを付加させたＰＣＲプライマーを用い、ゲノムＰＣＲでゲノム配列より目的のプロモータ領域を増幅後、ＴＡベクター内にクローニングすることで獲得した。ＴＡクローニング後シークエンスを行い、配列が正しく増幅されているか確認した。
【００８７】
Ｐ４５０  ３Ａ４発現遺伝子の調整
生物化学工学領域作製のＣＹＰ３Ａ４−ＧＳ−ＨｅｐＧ２細胞に用いられたＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡ配列をテンプレートに、目的に応じた制限酵素サイトを付加させたＰＣＲプライマーを用い、ＰＣＲにて増幅し、ＴＡベクター内にクローニングすることで獲得した。ＴＡクローニング後シークエンスを行い、ｃＤＮＡ配列が正しく増幅されているか確認した。
【００８８】
ＰＣＲ法
ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマーは、プロモータ獲得用には配列番号１１のプライマーおよび配列番号１２のプライマーを、プラスミド挿入用プライマーには配列番号１３のプライマー、配列番号１４のプライマーおよび配列番号１５のプライマーを、ＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡ用プライマーには配列番号１６のプライマーおよび配列番号１７のプライマーを、用いた。ゲノムＰＣＲ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）  ＧＣゲノムＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、付属のゲノムＤＮＡよりＣＹＰ３Ａ４プロモータを獲得した。
【００８９】
（制限酵素処理）
ｄＨ2Ｏで溶解させたＤＮＡに制限酵素（ＴＡＫＡＲＡ，ＴＯＹＯＢＯ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ）および付属緩衝液を加え、各酵素の至適温度で１時間〜Ｏ／Ｎ反応させた。
【００９０】
（ゲル抽出によるＤＮＡ断片回収）
７０％ＥｔＯＨで消毒した手術用レザーブレードを用いてゲルを切り出し、ゲル断片をエッペンに入れて断片の重さを量った。ゲル抽出キットを用いて、抽出を行った。
１）  ゲル断片の重さに対して３倍×１０００μＬのＱＸ１およびＱＩＡＥＸII懸濁液２０μＬを加えた。
２）  ５０℃でインキュベートし、２分おきにボルテックスをかける操作を１０分間行い、ゲルを溶解させＤＮＡをガラスビーズに吸着させた。
３）  １２０００ｒｐｍ、３０秒、室温で遠心分離（ＤＩＳＫＢＯＹ；ＫＵＲＡＢＯ；ＦＢ−８０００）を行った。
４）  上清除去後、ＱＸ１を５００μＬ加え洗浄した。
５）  ボルテックスをかけ、再び３）の条件で遠心分離を行った。
６）  ＱＸ１除去後、遠心して残りの溶液を除去した。
７）  ＰＥ緩衝液５００μＬを加えて洗浄した。
８）  ボルテックス後、１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。
９）  ＰＥ緩衝液を抜き取り、軽く遠心して残りの緩衝液を除去した。
１０）  白く乾燥するまで２０〜３０分自然乾燥させ、ｄＨ2Ｏ ２０μＬを加えて溶解するまでボルテックスし、５分間静置させてＤＮＡを溶出させた。
１１）  ボルテックス後、１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、上清を得ることでＤＮＡを回収した。
【００９１】
（ライゲーション）
ライゲーションには、ＤＮＡライゲーション・キットＶｅｒ．２（ＴａＫａＲａ；６０２２）を用いた。このキットは、ポリエチレングリコールを用いたＴａＫａＲａ独自の緩衝液系により、ＤＮＡの末端形状による影響を受けず、ライゲーション反応を迅速に終了させることができる。
【００９２】
環状ライゲーション（circular ligation）
１）直鎖状プラスミドベクター０．０３ｐｍｏｌおよびインサートＤＮＡ（０．１〜０．３ｐｍｏｌ）を含むＤＮＡ溶液５〜１０μＬに、ＤＮＡ溶液と等量のI液（５〜１０μＬ）を添加し、よく攪拌した。
２）１６℃で１時間〜Ｏ／Ｎで保温した。
【００９３】
線状ライゲーション（linear ligation）
１）目的に応じたフラグメントを混合したＤＮＡ溶液５〜１０μＬに対し、ＤＮＡ溶液の２倍量のI液とＤＮＡ溶液と等量のII液（５〜１０μＬ）を加
えてよく混合した。
２）  １６℃で１時間〜Ｏ／Ｎで保温した。
【００９４】
平滑末端ライゲーション
ＣＭＶプロモータを外したプラスミドを作製するため、平滑末端ライゲーションを行った。操作にはＤＮＡ Bluntingキット（ＴａＫａＲａ）を用いた。
１）  ０．１ｐｍｏｌ以上１０ｐｍｏｌ程度までのＤＮＡ量に調整した。突出末端を有する精製直鎖上ＤＮＡに１０×緩衝液１μＬを加え、１０μＬにまでメスアップした。
２）  ＤＮＡ末端のアニーリングを防ぐため、７０℃で５分間保温後、３７℃に保温した。
３）  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、ピペッティングにより穏やかに混和後、３７℃で５分間保温した。
４）  環状ライゲーションと同様の方法で、ライゲーション反応を行った。
【００９５】
ＴＡ  クローニング
Ｔａｑ  ポリメラーゼでＰＣＲ増幅させたインサートＤＮＡに対し、ｐＣＲ  ２．１ベクターを用いてクローニングした。乾固後のインサートＤＮＡを、４μＬｄＨ2Ｏに溶解させ、その２μＬにベクター溶液を１μＬ、ＴａＫａＲａライゲーション溶液I３μＬ加えてライゲーション反応させた。ま
たｐＣＲ  ２．１ベクターは、blue-white selection によるコロニーの判別が可能であるため、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを用いてblue-white selectionを併用した。
【００９６】
（形質転換）
１）  コンピテントセルを氷中で溶解させた。
２）  コンピテントセルの入った容器にライゲーション溶液を加え、氷中で３０分以上保温させた。
３）  ４２℃の恒温槽で４０秒ヒートショックさせた。
４）  氷中に２分保温させた。
５）  実験手法によりＳＯＣをＤＮＡ溶液に対して１：３〜１：９加え、３７℃シェーカーで１時間インキュベーションした。
６）  ＬＢプレート１枚あたり２００μＬまでの溶液を播種した。
【００９７】
（大腸菌からのプラスミドDNA調整）
Mini prep
Wizard plus SV Mini prep kit (プロメガ株式会社（Promega）;Ａ１３３０) を用い、アルカリ抽出法にてMini prep を行った。
１）アンピシリンまたはカナマイシン加えたＬＢ培地３ｍＬ中で、大腸菌を３７℃で２００ｒｐｍで２４時間培養した。
２）エッペンドルフチューブに培養液を入れて９１００×ｇ．で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
３）Ｒｅ懸濁液溶液２５０μＬを加え、ボルテックスを行い懸濁した。
４）細胞溶解溶液２５０μＬおよびアルカリを１０μＬ加えて転倒混和後５分間静置し、細胞および染色体を破砕した。
５）Nutorizaton 溶液３５０μＬを加えて中和し、２０４００×ｇ．で１０分間遠心分離した。
６）遠心後閉環状プラスミドＤＮＡの含まれた上清を抜き取り、廃液入れを備え付けたカラムチューブに加えて１７８００×ｇ．で１分間遠心分離してＤＮＡをカラムに吸着させた。
７）廃液を除去して廃液入れを再びカラムチューブに備え付け、７０％ＥｔＯＨを加えた。７００μＬを加えて１７８００×ｇ．で１分間遠心分離し、エタノール溶出およびカラム洗浄を行った。
８）廃液を除去して廃液入れを再びカラムチューブに備え付け、カラム洗浄液を２５０μＬ加えて１７８００×ｇ．で２分間遠心分離し、再びカラムを洗浄した。
９）エッペンドルフチューブにカラムチューブを備え付け、Ｈ2Ｏ  １０μＬ加えて１７８００×ｇ．で１分間遠心分離し、カラムからＤＮＡを溶出させた。
【００９８】
Large prep
エンド・フリー・プラスミドＭａｘｉ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用い、アルカリ抽出法にてLarge prep を行った。
１）  ２００ｍＬ  ＬＢ培溶液を５０ｍＬ入りディスポーサブルチューブ４本に均等に分注した。
２）  ４℃で３０００×ｇ．で１０分間遠心分離を行った。
３）  上清を廃棄し、緩衝液１を２．５ｍＬずつ加えて懸濁し、懸濁液を１本にまとめた。
４）  緩衝液Ｐ２ １０ｍＬを加え、４〜６回転倒混和して５分間静置し、細胞および染色体を破砕した。
５）  緩衝液Ｐ３ １０ｍＬを加えて４〜６回転倒混和し、抽出口をキャップで閉じた抽出用シリンジに液を入れ、１０分間室温にて中和させた。
６）  キャップを外し、新しい５０ｍＬディスポーサブルチューブに液を抽出し、氷中にて３０分静置させた。
７）  ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００を廃液入れにセッティングし、緩衝液ＱＢＴ １０ｍＬを加えて自然落下させた。
８）  自然落下終了後、ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００にクリアライセートを加え、カラムにＤＮＡを吸着させた。
９）  自然落下後、緩衝液ＱＣ  ３０ｍＬを２回加え、カラムを洗浄した。
１０）  新しい５０ｍＬディスポーサブルチューブにＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００をセッティングし、緩衝液ＱＮ  １５ｍＬを加えてＤＮＡを洗い出した。
１１）  １５ｍＬ溶液を７．５ｍＬずつ分注した。
１２）  各々のチューブにイソプロパノール５．２５ｍＬずつ加え、転倒混和した。
１３）  ４℃で、６０００×ｇ．で３０分間遠心分離した。
１４）  上清廃棄後、エンドトキシン−フリー（７０％エタノール添加）を１ｍＬずつ加え、壁面のＤＮＡをピペッティングではがしてエッペンドルフチューブに加えた。
１５）  ４℃で、１５０００×ｇ．で１０分間遠心分離後、上清を除去して乾固させた。
１６）  ＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏをそれぞれ１００μＬと２００μＬ加えた。
【００９９】
（シークエンス）
３１００シークエンシング（Applied Biosystems）にてシークエンスを行った。
シークエンスプライマーの調整
シークエンスに関して用いたプライマーは、ＰＣＲに用いたものに加え以下のプライマーを注文した。製造は株式会社ジーンデザインに注文した。以下にプライマーを示す。ＣＹＰ３Ａ４プロモータとしては配列番号１１〜１７のプライマーを、ＣＹＰ３Ａ４  ｃＤＮＡには、配列番号１８〜２０のプライマーを、ＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰ確認用プライマーには、５’側にｄ１ＥＧＦＰ増幅用ＰＣＲプライマーとして配列番号２１のプライマーを、３’側にシークエンス用プライマーとして配列番号２２のプライマーを用いた。
【０１００】
ゲルろ過によるサンプル調整
ゲルろ過の前にサンプルのＰＣＲを行った。以下に示す試薬を用いて、ＰＣＲを行った。
プライマー（３．２  μＭ）                １μＬ
テンプレート                              ２μＬ
プレミックス                              ８μＬ
ｄＨ2Ｏ                                  ９μＬ
全量                                  ２０μＬ
９６          ”１０
５０          ”５
６０          ’４
以上をそれぞれ２５倍にした。
４          ∞
【０１０１】
ＣｅｎｔｒｉＳｅｐ  スピンカラムを用いてサンプルのゲルろ過調整を行った。
１）  カラム内へ滅菌水８００μＬを加えた。
２）  カラムの上のふたを閉め、ボルテックス後にカラムに気泡がないことを確認してから室温で２時間以上放置した。気泡が混入している場合は指でカラムを弾いて除去した。
３）  上のキャップ、下のストッパーの順に外し、ウォッシャーチューブをセットしてカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた。落下しない場合は、上のキャップで少し押して水を押し出し、ねじりながらキャップを外した。
４）  ウォッシャーチューブ内の滅菌水を廃棄し、再びセットして７３０×ｇ．、２分間遠心分離した。
５）  遠心分離後、エッペンドルフチューブにカラムをセットしてＰＣＲ反応液を加え、７３０×ｇ．で２分間遠心分離した。
６）  エッペンドルフチューブを乾固させてサンプルを精製した。
【実施例２】
【０１０２】
新規プラスミド：ｐＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドの構築
組換えヒト細胞の一例を製造するために用いるプラスミドの一例の製造方法を示した（図４参照）。
１）  ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰのＭＣＳ内に含まれるＢａｍＨI配列を制限
酵素処理した。（図４中、矢印１で示す）
２）  制限酵素処理した直鎖上ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰについて、ＮｏｔI
またはＮｃｏI配列で制限酵素処理した２サンプルを用意した。（図４中、
矢印２で示す）
３）  ＢａｍＨI／ＮｏｔIで処理したサンプルからＩＲＥＳ＋ＥＧＦＰ配
列を除いた配列（Ａ）を、ＢａｍＨI／ＮｃｏIで処理したサンプルからＩ
ＲＥＳを含む配列（Ｂ）をゲル抽出より獲得した。
４）  ｐｄ２ＥＧＦＰ−Ｎ１よりＮｃｏI／ＮｏｔIで制限酵素処理して得
たｄ２ＥＧＦＰを含む配列（Ｃ）と、（Ｂ）の配列を線状ライゲーション反応させた。（図４中、矢印３で示す）
５）  線状ライゲーションにより獲得した配列をＢａｍＨI／ＮｏｔIで制
限酵素処理し、ＩＲＥＳ＋ｄ２ＥＧＦＰを含む配列（Ｄ）をゲル抽出より獲得した。（図４中、矢印４で示す）
６）  （Ａ）と（Ｄ）の配列を環状ライゲーションさせ、ｐＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドを獲得した。（図４中、矢印５で示す）（図５参照）
【実施例３】
【０１０３】
ｐ３Ａ４ｃｐ−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドの製造（図６参照）
１）実施例１で製造したｐＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドを、Ｓａｌ１／Ｓｍａ１配列で制限酵素処理したサンプルを用意した。
２）前記サンプルと、ＣＹＰ３Ａ４ｃＤＮＡ（配列番号８参照）を環状ライゲーション反応させて、ｐ３Ａ４ｃ−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドを得た。
３）得られたｐ３Ａ４ｃ−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドを、Ａｓｅ１／Ｎｈｅ１配列で制限処理し、その後、ＣＹＰ３Ａ４プロモータ（配列番号２参照）を環状ライゲーション反応させて、３Ａ４ｃｐ−ｄ２ＥＧＦＰプラスミドを得た。
【実施例４】
【０１０４】
形質移入はＴＥＲＣ仕様で記載した。Effectene（登録商標）形質移入キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。ＤＮＡとしては、実施例２および比較例１で得たプラスミドをそれぞれ用いた。
１）  ＨｅｐＧ２を６−ウェルプレートに３×１０4セル／ｍＬの条件で播種し、全量２ｍＬとなるようにＯ／Ｎした。
２）  １５ｍＬのコニカルチューブに培地を入れ、３７℃恒温槽で保温した。（３ｍＬ／ウェル）
３）  エッペンドルフチューブにＥＣ緩衝液７５μＬ／ウェル、ＤＮＡ０．５μｇ／ウェル、エンハンサー４μＬ／ウェルになるように加え、５分間インキュベートした。
４）  Effectene １５μＬ／ウェルになるように混合し、１０分間インキュベートした。
５）  培地にＤＮＡ溶液を加えた。
６）  ６−ウェルプレートの培地を抜き出し、ＤＮＡ溶液の混合された培地を３ｍＬ／ウェルずつ加え、３７℃のインキュベーター内にＯ／Ｎでインキュベートした。
【０１０５】
（薬物代謝酵素誘導の確認実験）
作製した一例の組換えヒト細胞の薬物代謝酵素の誘導を確認するため、薬物としてクロトリマゾール(SIGMA; C6019, M = 344.84)、デキサメタゾン(SIGMA; D8893, M = 392.46)、ラパマイシン(SIGMA; R8883, M = 822.95)およびフェニトイン[Aleviatin](WAKO; 166-12082, M = 252.27)を用いた。それぞれの化学構造式は図７参照。
（１）  前記薬物をコニカルチューブにそれぞれ１ｍＭになるようにして薬物試薬を調製し、−２０℃で保存した。溶媒にはＤＭＳＯを用いた。
（２）  形質転換させた細胞の培養されている６−ウェルプレートのウェル内の培地を抜き取り、ＰＢＳで２度洗浄した後、新しい培地を３ｍＬ加え、続けて前記薬物試薬が１０μＭになるように加えた。
（３）  １日〜７日間培地交換を行わずに培養を続け、必要に応じて蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＡＳ  ＤＰ７０）にて蛍光発現による誘導の度合いを確認した。クロトリマゾール、デキサメタゾン、ラパマイシンおよびフェニトインにより誘導された薬物代謝酵素を示す蛍光顕微鏡の写真を図９、図１０、図１１および図１２にそれぞれ示す。
【０１０６】
（薬物代謝酵素の測定）
Ｖｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スクリーニング・キット（Invitrogen；Ｐ２８５６）に付属のＶｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・フロー（Red Fluor）（Invitrogen；Ｐ２８６５）を代謝能測定用基質に、Ｖｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スタンダード（Invitrogen；Ｐ２８７４）を検量用試薬に用いた。Ｖｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・フローはＣＹＰ３Ａ４により代謝されることにより、赤色の蛍光を示す物質となる。この蛍光強度をＶｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スタンダードと比較することにより、実施例２で得られた組換えヒト細胞における薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の量を計測することができる。（図８参照）
【０１０７】
（１）  まず、Ｖｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・フロー（分子量３３３．３）の１．６６μｇ／μＬ溶液を調製した。調節後は実験に合わせた薬液量を投与した。
（２）  使用機器; AvroTM SX 1420 multilabel counter (Perkin Elmer Ltd.)、励起波長：420 nm、蛍光波長：535 nm、励起時間0.5秒で測定した（サンプルは分析まで−２０℃以下で保存）。Ｖｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スタンダードの調整は、始めにｄＨ2ＯとＶｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ４５０反応緩衝液I２×を等量ずつ混合した液を白色９６−ウ
ェルプレートに１９５μＬ、１００μＬ、１００μＬ、１００μＬ・・・（以下１００μＬ）と１０−ウェル加え、次に混合液１９５μＬの入ったウェルにＶｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スタンダードを５μＬ加えてよく撹拌した。さらに２００μＬとなった試薬入り混合液から１００μＬ取り出し、隣のウェルに加えてよく撹拌した。この希釈を９−ウェル目まで行うことで濃度を確定した。
（３）  既知量のＶｉｖｉｄ（登録商標）ＣＹＰ３Ａ４レッド・スタンダードから得られた検量線を元にサンプル中の試薬代謝物濃度を求めた。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の組換えヒト細胞は、ヒト薬物代謝酵素の誘導および薬物代謝の少なくとも一方の評価において有用であり、創薬開発においても適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ヒトチトクロムＰ４５０発現ベクター構築用プラスミドの一例を示した説明図である。
【図２】ヒトチトクロムＰ４５０発現ベクター構築用プラスミドの別の一例を示した説明図である。
【図３】ヒトチトクロムＰ４５０ ＴＡクローニング用プラスミドの一例を示した説明図である。
【図４】ｐＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰの製造工程の一例を示した説明図である。
【図５】ｐＩＲＥＳ２−ｄ２ＥＧＦＰの一例を示した説明図である。
【図６】３Ａ４ｃｐ−ｄ２ＥＧＦＰの製造工程の一例を示した説明図である。
【図７】薬物代謝酵素誘導の確認実験に用いた薬物の化学構造式を示した。
【図８】薬物代謝の確認実験に用いた蛍光物質の化学構造式を示した。
【図９】クロトリマゾールにより薬物誘導されたことを示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図１０】デキサメタゾンにより薬物誘導されたことを示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図１１】ラパマイシンにより薬物誘導されたことを示す蛍光顕微鏡の写真である。
【図１２】フェニトリンにより薬物誘導されたことを示す蛍光顕微鏡の写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１      ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２      ＣＹＰ３Ａ４プロモータ配列
配列番号３      ＩＲＥＳをコードする配列
配列番号４      ＥＧＦＰをコードする配列
配列番号５      ｄ２−ＥＧＦＰをコードする配列
配列番号６      ＣＹＰ２Ｃ１９タンパク質のアミノ酸配列
配列番号７      ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質のアミノ酸配列
配列番号８      ＣＹＰ３Ａ４タンパク質をコードする塩基配列
配列番号９      ＣＹＰ２Ｃ１９タンパク質をコードする塩基配列
配列番号１０    ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質をコードする塩基配列
配列番号１１    ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマー、プロモータ獲得用
配列番号１２    ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマー、プロモータ獲得用
配列番号１３    ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマー、プラスミド挿入用
配列番号１４    ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマー、プラスミド挿入用
配列番号１５    ＣＹＰ３Ａ４プロモータ用プライマー、プラスミド挿入用
配列番号１６    ＣＹＰ３Ａ４ ｃＤＮＡ用プライマー
配列番号１７    ＣＹＰ３Ａ４ ｃＤＮＡ用プライマー
配列番号１８    ＣＹＰ３Ａ４ ｃＤＮＡ用プライマー
配列番号１９    ＣＹＰ３Ａ４ ｃＤＮＡ用プライマー
配列番号２０    ＣＹＰ３Ａ４ ｃＤＮＡ用プライマー
配列番号２１    ＩＲＥＳ−ｄ２ＥＧＦＰ確認用プライマー
配列番号２２    ＩＲＥＳ−ｄ２ＥＧＦＰ確認用プライマー
【図１】
2005229967.tif 000010
【図２】
2005229967.tif 000011
【図３】
2005229967.tif 000012
【図４】
2005229967.tif 000013
【図５】
2005229967.tif 000014
【図６】
2005229967.tif 000015
【図７】
2005229967.tif 000016
【図８】
2005229967.tif 000017
【図９】
2005229967.tif 000018
【図１０】
2005229967.tif 000019
【図１１】
2005229967.tif 000020
【図１２】
2005229967.tif 000021
【配列表】
2005229967000001.app