(57)【要約】  【課題】ブラックコホシュ、シミシフガ・ラセモサ（Cimicifuga racemosa）の活性成分であるアクテイン（Actein）を、安全で簡便に操作できる示差屈折計（ＲＩ）を用いる検出により高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）定量分析を行うことを課題とする。  【解決手段】アクティンを含有する試料溶液を調製する工程が（１）アクテインを含有する試料を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる工程、（２）（１）で得た溶液をアルキル基が結合したシリカゲル担体に供し、アクテインを該担体に保持させる工程、（３）該担体を洗浄する工程、（４）該担体からアクテインを溶出させる工程、（５）（４）で得た溶出液をイオン交換樹脂に供し、素通り液を高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液とする工程からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクテインを含有する試料を高速液体クロマトグラフィーにより分析する方法において、高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液の調製工程が、（１）アクテインを含有する試料を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる工程、（２）（１）で得た溶液をアルキル基が結合したシリカゲル担体に供し、アクテインを該担体に保持させる工程、（３）該担体を洗浄する工程、（４）該担体からアクテインを溶出させる工程、（５）（４）で得た溶出液をイオン交換樹脂に供し、素通り液を高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液とする工程からなることを特徴とするアクテインの分析方法。
【請求項２】
高速液体クロマトグラフィーにおけるアクテインの検出を示差屈性率検出により行うことを特徴とする請求項１記載のアクテインの分析方法。
【請求項３】
アルキル基がオクタデシル基である請求項１または２記載のアクテインの分析方法。
【請求項４】
イオン交換樹脂がスルホプロピル系陽イオン交換樹脂である請求項１、２または３記載のアクテインの分析方法。
【請求項５】
アルキル基が結合したシリカゲル担体及びイオン交換樹脂がカートリッジカラムに充填されていることを特徴とする請求項１または２に記載のアクテインの分析方法。
【請求項６】
アクテインを含有する試料を高速液体クロマトグラフィーにより定量する方法において、高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液の調製工程が、（１）アクテインを含有する試料を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる工程、（２）（１）で得た溶液をアルキル基が結合したシリカゲル担体に供し、アクテインを該担体に保持させる工程、（３）該担体を洗浄する工程、（４）該担体からアクテインを溶出させる工程、（５）（４）で得た溶出液をイオン交換樹脂に供し、素通り液を高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液とする工程からなることを特徴とするアクテインの定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ブラックコホシュの活性成分であるアクテイン（Actein）の分析及び定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブラックコホシュ（Cimicifuga rasemoasa Nutt.の根および根茎）は、更年期障害の改善、月経障害の改善、沈静、鎮痛、解熱に用いられるハーブの一種である。その活性成分としてトリテルペンサポニンであるアクテイン（Actein）がある。
アクテインはトリテルペンサポニンの一種であるが、各種溶媒に対する溶解性が悪いこと、アセタール構造を有するため２６Ｒ体−２６Ｓ体（１：２）の平衡状態で存在すること、紫外吸収（ＵＶ）での検出が困難であること、ブラックコホシュ中に類似のサポニンが多数含まれていることなどの理由から、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという）を用いた定量法の確立は困難とされていた。
Kan Heらは、ブラックコホシュ中のトリテルペン誘導体、アクテイン、２７−デオキシアクテイン、シミシフゴシドをＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィ／(+)常圧化学イオン化マススペクトル）により分析した例を開示している。サンプル調製は0.5％ＮａＯＨにブラックコホシュエキスを溶解し、ジクロロメタンで振とう抽出して行い、以下、ＨＰＬＣは逆相アセトニトリル−水系のグラジエントにて実施する。（非特許文献１参照）。
【０００３】
L. Kong らは、Cimicifuga Foetida L.中のトリテルペン誘導体、アクテイン、２７−デオキシアクテイン、シミシフゴシドをアクテインをＬＣ／ＥＬＳＤ（液体クロマトグラフィ／蒸発光散乱検出）により分析した例を開示している。サンプル調製はシミシフガ（
Cimicifuga Foetida L.）を破砕後、メタノール：水＝８０：２０にて超音波抽出して行い、ＨＰＬＣは逆相メタノール−水系のグラジエントにて実施する。（非特許文献２参照）。
蒸発光散乱検出というのは、移動相を移動中に蒸発させることにより目的化合物を微粒化し、その散乱光を測定する方法であり、ＵＶ検出できない化合物（炭水化物、アルコール、脂質、テルペンなど）を検出でき、グラジエント分析が可能であり、溶媒ピークを除去できるなどの利点がある。
【非特許文献１】Kan He et al.「Direct Analysis and Identification of TriterpeneGlycosides by LC/MS in Blach Cohosh,Cimicifuga racemosa, and in SeveralComercially Available Black Cohosh Product」Planta Medica 66(2000),635-640
【非特許文献２】L. Kong et al.「Analysis of terpene compounds in Cimicifuga Foetida L.by reversed-phase high-performance liquid chromatoghraphy with evaporativelight scattering detection」J.of Chromatography,A, 936(2001)111-118
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、一般的に使用され、コストが安い検出法であり、ＵＶ検出できない化合物（炭水化物、アルコール、脂質、テルペンなど）を検出できる示差屈折率計（ＲＩ）を用いた検出法を用いたＨＰＬＣによるアクテインの分析法は開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者らは鋭意研究の結果、本発明は簡便な操作で安全にでき、ＲＩ検出に適した試料の調製法を開発し、ＲＩ検出によるＨＰＬＣによる定量分析が可能となり、本発明を完成した。
本発明の第１は、アクテインを含有する試料を高速液体クロマトグラフィーにより分析する方法において、高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液の調製工程が、（１）アクテインを含有する試料を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる工程、（２）（１）で得た溶液をアルキル基が結合したシリカゲル担体に供し、アクテインを該担体に保持させる工程、（３）該担体を洗浄する工程、（４）該担体からアクテインを溶出させる工程、（５）（４）で得た溶出液をイオン交換樹脂に供し、素通り液を高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液とする工程からなることを特徴とするアクテインの分析方法を提供することである。
本発明の第２は、高速液体クロマトグラフィーにおけるアクテインの検出を示差屈性率検出により行うことを特徴とする第１の発明に記載のアクテインの分析方法を提供することである。
本発明の第３は、アルキル基がオクタデシル基である第１または第２の発明に記載のアクテインの分析方法を提供することである。
本発明の第４は、イオン交換樹脂がスルホプロピル系陽イオン交換樹脂である第１、第２または第３の発明に記載のアクテインの分析方法を提供することである。
本発明の第５は、アルキル基が結合したシリカゲル担体及びイオン交換樹脂がカートリッジカラムに充填されていることを特徴とする第１または第２の発明に記載のアクテインの分析方法を提供することである。
本発明の第６は、アクテインを含有する試料を高速液体クロマトグラフィーにより定量する方法において、高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液の調製工程が、（１）アクテインを含有する試料を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる工程、（２）（１）で得た溶液をアルキル基が結合したシリカゲル担体に供し、アクテインを該担体に保持させる工程、（３）該担体を洗浄する工程、（４）該担体からアクテインを溶出させる工程、（５）（４）で得た溶出液をイオン交換樹脂に供し、素通り液を高速液体クロマトグラフィー分析用試料溶液とする工程からなることを特徴とするアクテインの定量方法を提供することである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、ブラックコホシュをはじめとするアクテインを含有する植物試料またはそのエキス中の定量が可能となり、これらの品質管理に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の方法において、アクテインを含有する試料としては特に制限は無いが、アクテインを比較的多く含有するブラックコホシュ（Cimicifuga
rasemoasa Nutt.の根および根茎）、Cimicifuga Foetida L.等のアクテインが用いられる。また、その形態は植物の乾燥物、粉砕物または抽出物（エキス）などの形態をとることができる。
ＨＰＬＣに供する試料の調製は次のように行う。まず、植物の乾燥物、粉砕物または抽出物（エキス）などを有機溶媒−水系の振とう抽出法で試料を調製することもできるが、労力が多大にかかることから、容易に入手でき、簡便な操作でおこなえる、担体を充填したカートリッジカラムを利用するのが好ましい。
【０００８】
アクテインはトリテルペンサポニンの一種であり、中性物質であり、極性が小さな疎水性物質であることから、第１の工程として、試料内容物から糖類、アミノ酸、タンパク、ミネラル等の親水性物質を除く必要があり、担体にアクテインを吸着させ、親水性物質を洗い流す作業を行う。ブラックコホシュの乾燥物または抽出物を有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させる。有機溶媒にはメタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトニトリル、アセトンなどが使用できるが、安全性の面からエタノール、メタノールが良い。アルコールと水の混合比はアルコール：水＝１０〜５０：９０〜１０が好ましい。アルコール濃度が高いと次工程の担体への保持が困難となり、１０％以下ではアクテインを含む試料が十分溶解しない。
【０００９】
次に、完全に試料を溶解させた溶液を担体を充填したカートリッジカラムに通し、アクテインを担体に保持させる。充填剤としては、シリカゲルにアルキル基を化学結合させたシリカゲル充填剤がよい。アルキル基としては、炭素数が１８，８，４，２のものが利用できるが、疎水性物質の吸着保持に最も優れる炭素数が１８（Ｃ18）の、いわゆるＯＤＳが良い。また、試料液の量や試料の濃度などから、カートリッジカラムを１個だけでなく、複数個を連結して使用しても良い。    
次いで、充填剤を上記のアクテインを含有する試料を溶解させた溶媒と同じ組成のアルコール水溶液で数度洗浄し、親水性物質を除去する。
【００１０】
第２の工程として、保持されたアクテインを極性の小さい溶媒、具体的には８０〜１００％のエタノール、メタノールを上記アルキル系シリカゲル担体に通して、アクテインを溶出させる。さらに、溶出液に含まれる類似の多数のサポニン誘導体や酸性もしくは塩基性物質を除去するため、上記のアルキルシリカゲルカートリッジカラムにイオン交換樹脂を充填したカートリッジカラムを連結することにより、上記の夾雑物をイオン交換樹脂上に吸着させ、素通り画分をＨＰＬＣ分析用の試料溶液とする。イオン交換樹脂としては、実施例にはスルホプロピル陽イオン交換樹脂が記載されているが、陽イオン交換樹脂でも陰イオン交換樹脂でも良い。
【００１１】
ＨＰＬＣによる分析の条件としては、アクテインがＵＶ吸収基を持たない構造であるため、示差屈折率検出法を用いるのが望ましい。なお、より高価ではあるがグラジエント分析もできる蒸発光散乱検出法を用いることもできる。分析カラムとしては極性基をもたないアクテインの場合はＣ18のＯＤＳカラムを使用するのがもっとも好ましい。移動相（溶離液）には、メタノールまたはアセトニトリルの水の混合溶媒がよい。実施例ではメタノール：水＝９：４を使用したが、その混合比は適宜変更できる。また、移動相に少量の酸またはアルカリを添加できる。酸としては有機酸、特に酢酸がよく、アルカリとしては有機アミンやアンモニアが使用できる。
以下、本発明を実施例により説明するが、これに限定するものではない。
【実施例１】
【００１２】
(試料の調製)
ブラックコホシュエキスを100mgを100mlマイヤーに精密に量り、エタノール25mlを加え、超音波をかけて懸濁させる。さらに、水75mlを加え、超音波をかけて完全に溶解させる。この溶液をSep-Pak
C18 カートリッジ（Waters製、No.Wat 023635を２連結）に通し保持させる。さらに、25％エタノール（５ml×３）を上記Sep-Pak
C18 カートリッジに通し、洗浄した。その後上記Sep-Pak C18カートリッジの先にスルホプロピル系陽イオン交換樹脂Toyopak
SP-M カートリッジ（東ソー、No,08489）を連結させ、エタノール１mlずつを６回通す。最初の溶離液1.5mlを捨て、次の4.5mlの溶離液を５mlのメスフラスコに取る。エタノールを加え正確に５mlとしたものを試料溶液とした。
【００１３】
(アクテインの定量法)
上記試料溶液を下記のＨＰＬＣ条件で分析し、アクテイン（保持時間：約16分）に基づくピークのピーク面積を求めた。アクテイン希釈溶液より得られた検量線に基づき、ブラックコホシュエキス中のアクテイン量を算出した。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
東ソーＨＰＬＣシステム
ポンプ：CCPD
検出器：示差屈折率検出器RI-8010（感度  32×10-6RIU/FS）
インテグレーター：SIC Chromatocorder １２（システムインスツルメンツ）
カラム：Capcell Pak C18 AQ(5μm)、250mm×4.6mm i.d.（資生堂）
溶離液：メタノール−水−１０％アンモニア（9：4：0.013 v/v/v）
流速：1.0ml/mm（圧:140kg/cm2）
試料注入量：２０μｌ
【００１４】
（再現性の検討）
上述のＨＰＬＣ分析条件において、アクテイン標準溶液（450μｇ／ml）を3回注入し、そのばらつきについて検討した。表1にあるように、標準偏差、変動係数どちらも小さな値を示し、3回のピーク面積のばらつきがほとんど無いことが明らかとなり、良好な再現性が確認された。
【００１５】
表１
ピーク面積 平均 標準偏差 変動係数
29209  29626  29575    29470     227.5        0.8
（直線性の検討）
−希釈溶液の調製−
アクテイン4.80mgをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１mlに溶解、溶離液（前述のＨＰＬＣ分析条件に記載）を加え、正確に10mlとした（480μｇ／ml）。この溶液に溶離液を加え、２倍（240μｇ／ml）、４倍（120μｇ／ml）、８倍（60μｇ／ml）、16倍（30mg／ml）に希釈し、希釈溶液を調製した。
−検量線の作成−
調製した希釈溶液を、上述のＨＰＬＣ分析条件下20μｌずつ注入し、それぞれの濃度におけるクロマトグラムを得て、検量線を作成した。各濃度のピーク面積を表２に示し、グラフ化したものを図１に示す。
【００１６】
表２
濃度（μg/ml）    ピーク面積
480             31463
240             15923
120              7978
60              4047
30              1918
回帰方程式：ｙ＝65.51886ｘ＋79.29167
相関係数：ｒ＝0.9999
以上のことから、０〜480μｇ／mlの濃度において良好な直線性が確認された。
【００１７】
（添加回収試験の検討）
アクテインは溶媒への溶解性が悪いため、アクテインを溶液の状態で添加した。アクテイン11.79mgをＤＭＳＯ 3mlに溶解し、エタノールで正確に５mlとした。この溶液［170μｌ（0.40086mg）、330μｌ（0.77814mg）、500μｌ（1.179mg）をブラックコホシュエキス100mgに添加し、アクテインの回収率の検討を行った。結果を表３に示す。
【００１８】
表３
アクテイン添加量（mg）    回収率（％）    平均回収率（％）
0.40086            97.0  100.3   97.1      98.1
0.77814           102.2  103.5   97.0     100.9
1.179             102.5  102.8  103.5     102.9
いずれの添加量においても良好な回収率が認められた。この結果より、上述の試料の調製法によるアクテインの損失は、ほとんど無いことが明らかとなった。また、検量線の信頼性も確立された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】表２に示した希釈溶液の検量線における各濃度とピーク面積の関係を示すグラフである。
【図１】
2005114381.tif 000002