(57)【要約】【課題】  宿主細胞に悪影響を与えることなく、宿主ＤＮＡの所定の位置に１コピーの目的遺伝子を高頻度で導入するためのベクター及び方法、並びに、宿主細胞に悪影響を与えることなく、交配過程を経ずに宿主ＤＮＡを所定の位置において欠失又は逆位させるためのベクター及び方法を提供する【解決手段】  二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、これらの認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有し、かつ、該組換え酵素遺伝子が導入カセット外側に配されているベクターを用い、これを、一つ又は二つの部位特異的組換え酵素認識配列が存在するＤＮＡを保持する宿主細胞に導入する。部位特異的組換え酵素遺伝子と共に、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を導入カセット外側に配することにより、目的とする組換え体を効率良く取得することができるようになる。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターであって、部位特異的組換え酵素遺伝子を導入カセット外側に配したことを特徴とするベクター。
【請求項２】
導入カセット及び部位特異的組換え酵素遺伝子を脱離可能に配したことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
さらに、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を導入カセット外側に配したことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
導入カセット、部位特異的組換え酵素遺伝子、及び、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を脱離可能に配したことを特徴とする、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
形態異常誘導遺伝子が植物ホルモン関連遺伝子であることを特徴とする、請求項３に記載のベクター。
【請求項６】
植物ホルモン関連遺伝子がサイトカイニン合成遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
目的遺伝子を導入カセット内側に配したことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
選抜マーカー遺伝子の一部又は全部を導入カセット内側に配したことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
選抜マーカー遺伝子のうち、少なくともプロモーター部分を導入カセット内側に配したことを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
選抜マーカー遺伝子のうち、少なくとも構造遺伝子部分を導入カセット内側に配したことを特徴とする、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、その導入カセットの外側に配された、前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、一つの部位特異的組換え酵素認識配列が存在するＤＮＡを有する宿主細胞に導入し、ベクターの導入カセット部分と、宿主ＤＮＡ上の一つの部位特異的組換え酵素認識配列との間で起こる部位特異的組換えにより、宿主ＤＮＡ上に導入カセットを導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
【請求項１２】
宿主として植物を用いることを特徴とする、請求項１１に記載の植物への遺伝子導入方法。
【請求項１３】
二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、その導入カセットの外側に配された、前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分が存在するＤＮＡを有する宿主細胞に導入し、ベクターの導入カセット部分と、宿主ＤＮＡ上の二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分との間で起こる部位特異的組換えにより、宿主ＤＮＡ上に導入カセットを導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
【請求項１４】
宿主として植物を用いることを特徴とする、請求項１３に記載の植物への遺伝子導入方法。
【請求項１５】
以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、目的遺伝子が導入された植物組織又は植物個体の作成方法。
（Ａ）二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセットを有し、その導入カセットの内側に目的遺伝子、その導入カセットの外側に前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、一つの部位特異的組換え酵素認識配列が存在するＤＮＡ、又は、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分が存在するＤＮＡを有する植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、培養中に観察される特定形質の発現又は特定形質の消失を指標として、ＤＮＡ中の標的位置に目的遺伝子が導入された植物細胞を選抜する過程
（Ｃ）（Ｂ）で選抜された植物細胞を培養し、植物組織又は植物個体を再分化する過程
【請求項１６】
二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、その導入カセットの外側に配された、前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、一つの部位特異的組換え酵素認識配列が存在するＤＮＡを有する宿主細胞に導入し、ベクターの導入カセット部分と、宿主ＤＮＡ上の一つの部位特異的組換え酵素認識配列との間で起こる部位特異的組換えにより、宿主ＤＮＡの一部を欠失又は逆位させることを特徴とする、ＤＮＡの改変方法。
【請求項１７】
宿主として植物を用いることを特徴とする、請求項１６に記載の植物への遺伝子導入方法。
【請求項１８】
二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、その導入カセットの外側に配された、前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分が存在するＤＮＡを有する宿主細胞に導入し、ベクターの導入カセット部分と、宿主ＤＮＡ上の二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分との間で起こる部位特異的組換えにより、宿主ＤＮＡの一部を欠失又は逆位させることを特徴とする、ＤＮＡの改変方法。
【請求項１９】
宿主として植物を用いることを特徴とする、請求項１８に記載の植物ＤＮＡの改変方法。
【請求項２０】
以下の過程（Ａ）〜（Ｃ）を経ることを特徴とする、一部のＤＮＡが欠失又は逆位した植物組織又は植物個体の作成方法。
（Ａ）二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、その導入カセットの外側に配された、前記部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターを、一つの部位特異的組換え酵素認識配列が存在するＤＮＡ、又は、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた部分が存在するＤＮＡを有する植物細胞に導入する過程
（Ｂ）（Ａ）でベクターが導入された植物細胞を培養し、培養中に観察される特定形質の発現又は特定形質の消失を指標として、標的位置のＤＮＡが欠失又は逆位した植物細胞を選抜する過程
（Ｃ）（Ｂ）で選抜された植物細胞を培養し、植物組織又は植物個体を再分化する過程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は植物、動物、真菌類の所定の遺伝子を改変するためのベクターの発明に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、遺伝子組換え技術の進歩は目覚しく、遺伝子導入方法が種々開発され、実用化されており、その成果を活用することで、例えば、農業の分野では、従来不可能であった新規な形質を付与した組換え農作物等が作出され、野外で大規模に栽培されるようになっている。【０００３】  しかしながら、現在実用化されている遺伝子導入方法では、目的遺伝子の全長が導入されず、その一部が千切れた状態で宿主ＤＮＡ（宿主細胞のＤＮＡ）上に導入されることが多い。しかも、複数個の目的遺伝子が宿主ＤＮＡ上のランダムな位置に導入される。ところが、同じＤＮＡ上に、同じ遺伝子が複数個存在すると（それらのうちあるものは完全長ではなくとも）、導入遺伝子の発現抑制（ジーンサイレンシング）を引き起こす（Ｍｕｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４３：２４３−２６０、２０００、Ｍａｔｚｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４３：４０１−４１５、２０００）。また、遺伝子の発現は、遺伝子が導入された宿主ＤＮＡ上の位置に大きく左右される（Ｍｅｙｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４３：２２１−２３４、２０００）。このため、現在実用化されている方法により導入された目的遺伝子の発現パターンや発現量は、同じ遺伝子導入処理組織から作出され、ＤＮＡ解析等により目的遺伝子の導入が確認された組換え体であっても、それぞれが大きく異なってしまう。【０００４】  従って、従来の遺伝子導入方法により、目的とする遺伝子の発現パターンを示し、その発現量も高く、安定している組換え体を得るには、通常、目的遺伝子１個あたり多数の組換え体を作出し、これらをクローン増殖させて得られる各系統につき詳細なＤＮＡ分析を行って、染色体上にランダムに遺伝子が導入された組換え体のうち、１コピーの遺伝子が発現量の高い位置に導入されている組換え体を選抜しなければならない。実際、目的遺伝子を導入して新規な実用形質を付与した組換え農作物を作出するにあたっては、数百の独立した組換え体の系統が作成され、スクリーニングが行われている。【０００５】  そこで、宿主ＤＮＡの所定の位置に１コピーの目的遺伝子を導入する方法として、部位特異的組換え系の利用が検討されている。即ち、そのＤＮＡに部位特異的組換え酵素認識配列（以下、単に認識配列とも言う。）が予め導入されている宿主細胞に、ベクターとして、目的遺伝子と認識配列一つを有する環状ＤＮＡを導入することにより、これらの認識配列を認識して働く部位特異的組換え酵素（以下、単に組換え酵素とも言う。）の存在下、宿主ＤＮＡ上の認識配列とベクター上の認識配列との間で起こる部位特異的組換え反応を利用し、宿主ＤＮＡ上にあった認識配列の隣接部に目的遺伝子を組込む方法である（図３２）。【０００６】  この部位特異的組み換え系を用いる方法では、組換え酵素の発現制御が大きな問題となる。なぜなら、部位特異的組換え反応は、組換え酵素によって、目的遺伝子の組込み方向にも、切出し切出し方向にも触媒されるため、目的遺伝子の組込み状態が安定せず、目的の組換え体を得ることが非常に困難だからである。従って、目的遺伝子の組込みに十分な組換え酵素の発現と、組込み後の組換え酵素の発現遮断とを適切に制御する手法の開発が、この方法の実用化には必須となる。【０００７】  かかる問題を解決するため、現在までに、目的遺伝子及び認識配列を有するベクターと、組換え酵素を有するベクターとを別個に作成し、これら二つのベクターを宿主細胞に導入して行うトランジェント法や、宿主細胞で恒常的に組換え酵素を発現させると共に、目的遺伝子が標的位置に導入されることで組換え酵素の発現を遮断するようにしたＶｅｒｇｕｎｓｔらの方法が提案されており（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２６：２７２９−２７３４、１９９８）、これらの手法によって、ファージやイーストの部位特異的組み換え系（Ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ−ＦＲＴ）を用い、目的遺伝子を植物の染色体上の標的位置に組み込むことに成功した例も報告されている（総説：Ｏｗ、Ｃｕｒｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７：１８１−１８６、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：１８３−２００、２００２）。【０００８】  しかしながら、トランジェント法においても、目的とする組換え体の得られる確率は相当に低く、高頻度に組換え体を得たという報告もあるものの、その実証はまだ十分ではない。一方、Ｖｅｒｇｕｎｓｔらの方法において組換え酵素は、目的遺伝子が標的位置に導入されるまで恒常的に発現し続けるため、宿主ＤＮＡの意図しない組換え反応が起こり、染色体が不安定化するおそれがある（Ｔｈｙａｇａｒａｙａｎ  ｅｔ．ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：３９２６−３９３４、２００１、Ｃｏｐｐｏｏｌｓｅ  ｅｔ．ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：３９２６−３９３４、２００１）。【０００９】  また、遺伝子組換え技術には、上記してきたような宿主ＤＮＡ上に目的遺伝子を導入する技術の他、宿主ＤＮＡの遺伝子を欠失させたり逆位させたりする技術も含まれる。宿主ＤＮＡの所定の遺伝子を欠失・逆位させる方法としては、部位特異的組換え系とトランスポゾンとを組合せて用いる方法が報告されているが（Ｖａｎ  Ｈａａｒｅｎ  ＭＪＪ、ＯＷ  ＤＷ．、Ｐｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３：５２５−５３３、１９９３）、この方法で、所定の遺伝子が欠失又は逆位した組換え体を得るには、交配過程を経て、次世代の個体を作出する必要があり、しかも、目的とする組換え体が得られる確率は非常に低い。また、この方法においても、染色体の不安定化や組換え体の奇形を引起こすおそれがある。【００１０】
【非特許文献１】            ヴェルグント（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ）ら、“核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）”（英国）、１９９８年、第２６巻、ｐ２７２９−２７３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  従って、本発明の目的は、宿主細胞に悪影響を与えることなく、宿主ＤＮＡの所定の位置に１コピーの目的遺伝子を高頻度で導入することができ、しかも、宿主細胞に悪影響を与えることなく、交配過程を経ずに、宿主ＤＮＡを所定の位置において欠失又は逆位させることができるベクターを提供することにある。また、本発明の目的は、このベクター用いて行う、宿主細胞に悪影響を与えることなく、宿主ＤＮＡの所定の位置に１コピーの目的遺伝子を高頻度で導入する方法、及び、宿主細胞に悪影響を与えることなく、交配過程を経ずに、宿主ＤＮＡを所定の位置において欠失又は逆位させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明者らは、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセットと、この導入カセットの外側に配した部位特異的組換え酵素遺伝子とを有するベクターにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成した。【００１３】  即ち、本発明は、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、及び、該部位特異的組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子を有するベクターであって、部位特異的組換え酵素遺伝子を導入カセット外側に配したことを特徴とするＤＮＡ改変用ベクター、又は、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセット、該組換え酵素認識配列を認識する部位特異的組換え酵素遺伝子、及び、致死誘導遺伝子もしくは形態異常誘導遺伝子を有するベクターであって、部位特異的組換え酵素遺伝子、及び、致死誘導遺伝子もしくは形態異常誘導遺伝子を導入カセット外側に配したことを特徴とするＤＮＡ改変用ベクター、並びに、これらのＤＮＡ改変用ベクターを用いて行う遺伝子導入方法又はＤＮＡ改変方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】  本発明によれば、宿主細胞に悪影響を与えることなく、宿主ＤＮＡの所定の位置に１コピーの目的遺伝子を高頻度で導入することができる。また、宿主細胞に悪影響を与えることなく、交配過程を経ずに、宿主ＤＮＡを所定の位置において高頻度で欠失又は逆位させることもできる。【００１５】  従って、本発明によれば、目的とする遺伝子の発現パターンを示し、その発現量も高く、安定している組換え体を効率良く得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下、本発明について詳細に説明する。【００１７】  部位特異的組換え酵素認識配列及び部位特異的組換え酵素遺伝子は、部位特異的組換え系の構成要素である。部位特異的組換え系は、例えば、ファージ、細菌（例えば大腸菌）、酵母等の微生物から分離されたＣｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系、ＦＬＰ／ＦＲＴ系、ｃｅｒ系、ｆｉｍ系等が知られているが（総説として、Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．ｒｅｖ．ｇｅｎｅｔ．、２２：１７、１９８８）、高等生物ではまだその存在を知られていない。しかし、これらの微生物から分離された部位特異的組換え系も、その由来する生物種と異なる生物種、即ち、植物や動物に導入された場合でも、そのそもそもの生物内における挙動と同一の挙動をとることが明らかとなっている。【００１８】  本発明において用いる認識配列及び組換え酵素遺伝子は、こうした部位特異的組換え系を構成する認識配列及び組換え酵素遺伝子の組合せより自由に選択して使用することができる。中でも、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系、Ｒ／ＲＳ系は、動物、植物等で広く用いられており、組換え効率も高いので、本発明において用いる部位特異的組換え系として好ましい。もっとも、認識配列は、野生型認識配列のＤＮＡ配列が人工的に又は天然に一部改変された、変異型を用いても構わない。但し、この場合において変異型認識配列は、これと共に本発明のベクター上に存在する、組換え酵素遺伝子のコードする組換え酵素により認識され得るものであることを要する。【００１９】  本発明のベクターにおいて導入カセットとは、二つの認識配列に挟まれた、組換え酵素遺伝子が存在しない部位をいう。この導入カセットを挟む二つの認識配列の向きは、互いに同方向でも逆方向でも構わない。また、二つの認識配列のうちのどちらか一方又は両方の認識配列として、変異型認識配列を用いても構わない（図１）。【００２０】  二つの野生型認識配列又は二つの変異型認識配列が互いに同種類であって、同方向を向いているときは、これらの認識配列を認識して働く組換え酵素の存在によって、この導入カセットはベクターから脱離する。また、二つの野生型認識配列もしくは二つの変異型認識配列が互いに同種類であっても逆方向を向いているとき、又は、二つの認識配列同士が異なるとき（一方が野生型認識配列で他方が変異型認識配列の場合や、異なる種類の野生型認識配列同士もしくは変異型認識配列同士である場合）は、これらの認識配列を認識して働く組換え酵素が存在しても、この導入カセットはベクターから脱離しない。しかし、いずれの場合でも、本発明のベクターを構成する認識配列として使用することができる。【００２１】  なお、本発明において用いる部位特異的組換え系は、組換えを起こす部位の長さに関係なく機能することが知られており、この部位特異的組換え系を用いて、染色体の長さに匹敵する２３０ｋｂのＤＮＡが導入された例や、酵母においてはＭｂレベルのＤＮＡ操作が行われた例も報告されている。従って本発明においても、導入カセットの長さに制限はない。また、この導入カセットに対する組換え酵素遺伝子の位置にも特に制限はない。本発明の目的は、二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれた導入カセットと、この認識配列を認識して働く部位特異的組換え酵素をコードする部位特異的組換え酵素遺伝子とを有し、この組換え酵素遺伝子を導入カセットの外側に配したベクターを使用する限り、達成することができる。【００２２】  本発明のベクターは、組換え酵素遺伝子と共に、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を、導入カセットの外側に配することで、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体、又は、宿主ＤＮＡが所定の位置で欠失もしくは逆位した組換え体をより確実に取得することができる。【００２３】  ここで、致死誘導遺伝子とは、細胞の機能を損ない、その細胞を死に至らしめるタンパクをコードする遺伝子全般を意味する。かかる致死誘導遺伝子としては、例えば、ＲＮＡｓｅ、ＤＡＭメチラーゼ、シトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）、ジフテリアトキシン、Ｂａｘ等をコードする遺伝子が一般に知られている。もっとも、本発明においては、致死誘導遺伝子であれば、これら以外の遺伝子であっても、その種類を問わず使用することができる。【００２４】  また、形態異常誘導遺伝子とは、その発現によって、宿主細胞の増殖・分化の方向を狂わせ、通常とは異なる形態分化を引起こす遺伝子全般を意味する。かかる形態異常誘導遺伝子としては、例えば植物の場合では、宿主植物に矮化、頂芽優勢の崩壊、色素の変化、根頭癌腫、毛状根、葉の波打ち等を引起こす、植物ホルモン合成系遺伝子や植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子など、植物ホルモン関連遺伝子を使用することができる。【００２５】  ここで、植物ホルモン合成系遺伝子とは、植物ホルモンの合成に関与するタンパク等をコードする遺伝子を意味し、例えば、植物病原菌であるアグロバクテリウム等に存在するｉｐｔ（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｏｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｃ．Ｓｍｉｇｏｃｋｉ、Ｌ．Ｄ．Ｏｗｅｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５１３１、１９８８）、ｉａａＭ（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｈ．Ｊ．Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ、１：８６、１９８７）、ｇｅｎｅ５遺伝子（Ｈ．ｋｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１０：３９８３、１９９１）、ｇｅｎｅ６ｂ遺伝子（Ｐ．Ｊ．Ｊ．Ｈｏｏｙａａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：７９１、１９８８）、及びｒｏｌＡ〜Ｄのｒｏｌ遺伝子群（Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６４：３３、１９８５）等を始め、シュードモナス・シリンガエの亜種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）に存在するｉａａＬ（ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子（Ａ．Ｓｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２７：２０５、１９９１）、更には、種々の植物のホメオボックス遺伝子やフィトクローム遺伝子等が知られている。【００２６】  一方、植物ホルモンシグナルトランスダクション系遺伝子とは、ジベレリン、エチレン、オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモンの存在を認識するセンサー機能を持つタンパクや、そのセンサーからの情報を伝��していく、一連の情報伝達経路に関わるタンパク等をコードする遺伝子を意味し、例えば、エチレン受容体遺伝子であるＥＴＲ１遺伝子（Ｃ．Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：５３９、１９９３）、サイトカイニン受容体遺伝子であると考えられているＣＫＩ１遺伝子（Ｔ．Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９８２、１９９６）とその変異体（ｅｘ．ＣＫＩ２遺伝子）及びＧＣＲ１遺伝子（Ｓ．Ｐｌａｋｉｄｏｕ−Ｄｙｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、８：３１５、１９９８）の他、ＩＢＣ６遺伝子及びＩＢＣ７遺伝子（Ｉ．Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｅｂｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１０：１００９、１９９８）等が知られている。【００２７】  本発明を植物に適用する場合においては、これらの形態異常誘導遺伝子をいずれも使用することができるが、中でも特に、頂芽優勢の崩壊を引き起こすｉｐｔ遺伝子や、毛状根の形成、及び毛状根から再生した植物の矮化や葉の波打ち等を引き起こすｒｏｌ遺伝子群は、特徴的な形態の異常を引き起こし、植物個体の再分化を妨げることから、本発明を植物に適用する場合の形態異常誘導遺伝子として好ましい。【００２８】  さらに、本発明のベクターにおいては、導入カセット及び組換え酵素遺伝子、又は、導入カセット、組換え酵素遺伝子及び致死遺伝子もしくは形態異常誘導遺伝子を脱離可能に配してもよい（以下、このようなタイプの本発明のベクターを、脱離型ベクターと呼ぶ。）。これは、例えば、導入カセットを挟む二つの認識配列のうちのどちらか一方の認識配列と、これと同種類・同方向の認識配列とで、導入カセット及び組換え酵素遺伝子等を更に挟んだり（図２）、導入カセットを挟む認識配列とは異なる種類の認識配列を用い、この二つの同方向を向いた認識配列で、導入カセット、導入カセットを挟む認識配列を認識する組換え酵素遺伝子等と共に、これら異なる種類の認識配列を認識する組換え酵素遺伝子を挟む（図３）ことでも実現することができる。脱離型ベクターは、非特異的な組込みが起こりやすい、バイナリ−ベクターを用いたアグロバクテリウム法により、植物細胞に遺伝子導入処理を行う場合に特に有効である。なお、上記した場合において用いる認識配列としても、野生型、変異型のいずれでも用いることができる。【００２９】  本発明のベクターにおいて、導入カセット内側に目的遺伝子１コピーを配すれば、宿主ＤＮＡの所定の位置に、１コピーの目的遺伝子を、高い頻度で導入することができる。ここで、目的遺伝子としては、宿主生物に優れた形質を付与できる遺伝子、宿主生物に優れた形質を付与するとは限らないが、遺伝子発現機構の研究に必要とされる遺伝子等、目的に応じて種々選択することができる。【００３０】  また、本発明において選抜マーカー遺伝子を使用すれば、その発現又はその発現の消失を指標として、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体、及び、宿主ＤＮＡが所定の位置で欠失又は逆位した組換え体を効率的に選抜することができる。使用する選抜マーカー遺伝子の配置及び数は特に限定されない。例えば、選抜マーカー遺伝子は、導入カセットの内側に配しても外側に配してもよい。���た、宿主ＤＮＡの目的遺伝子を導入しようとする位置、又は、宿主ＤＮＡにおいて欠失もしくは逆位させようとする位置（標的位置とも言う。）に配してもよい。更に、選抜マーカー遺伝子のプロモーター部分とその他の部分（構造遺伝子、ターミネーター等）を導入カセットの内側と、宿主ＤＮＡの標的位置とに分けて配してもよい。  なお、選抜マーカー遺伝子としては、本発明のベクター又は宿主ＤＮＡに組込むことができ、宿主細胞において発現し、その発現、又はその発現の消失が容易に検出できるものであれば、何であれ使用することができる。例えば、宿主が植物である場合には、かかる選抜マーカー遺伝子の代表的な例として、カナマイシン耐性（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子や、ビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等の除草剤耐性遺伝子などを挙げることができる。本発明においては、こうした選抜マーカー遺伝子を１以上使用することもできる。【００３１】  本発明のベクターを用いて、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子を導入する場合は、まず、予め、宿主ＤＮＡの標的位置に、用いるベクターの導入カセットを挟んでいる認識配列と同種類の認識配列を一つ又は二つ組込んでおき、次いで、公知の遺伝子導入法を用い、このＤＮＡを保持する宿主細胞に本発明のベクターを導入すればよい。一方、宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失・逆位させる場合は、標的位置の隣接部位に、用いるベクターの導入カセットを挟んでいる認識配列と同種類の認識配列を一つ又は二つ組込んでおく。それ以外は、目的遺伝子を導入する場合と同様にして、このＤＮＡを保持する宿主細胞に本発明のベクターを導入すればよい。【００３２】  宿主ＤＮＡ中への認識配列の組込みは、定法に従って行うことができる。この場合、認識配列は、宿主ＤＮＡ中にランダムに組込まれるが、公知の手法によってＤＮＡ解析を行い、標的位置又は標的位置の隣接部位に所定の数の認識配列が組込まれている宿主細胞を選抜し、本発明のベクターを導入すればよい。【００３３】  本発明のベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックベネトレーション法等の物理的・化学的手法を、植物又は動物細胞への直接導入法として使用することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。また、植物細胞に対しては、植物に感染するウイルスや細菌を介して行う、間接導入法も使用することができる（Ｉ．Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２：２０５、１９９１）。この場合、ウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルス等が使用でき、細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（以下、Ａ．ツメファシエンスと略す。）、アグロバクテリウム・リゾジェネス等が使用できる。【００３４】  宿主細胞に導入された本発明のベクターは、下記＜作用＞の項に詳説する機構により宿主ＤＮＡとの間で組換えを起こして、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子を導入し、あるいは、宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失・逆位させる。このようにＤＮＡが改変された宿主細胞から組換え組織又は組換え個体を得るには、本発明のベクターを用いて遺伝子導入処理を行った細胞を、適宜、目的遺伝子や選抜マーカー遺伝子による特定形質の発現、遺伝子の欠失等による特定形質の消失などを指標として選抜を行いつつ、定法によって増殖させ、再分化させればよい。【００３５】    ＜作用＞
本発明のベクターを用いれば、宿主ＤＮＡ上の所定の位置に目的遺伝子を導入することができ、また、宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失・逆位させることができる。以下に、宿主細胞に導入された本発明のベクターと宿主ＤＮＡとの間で組換えが起こり、所定の位置に遺伝子が導入される機構、及び、所定の位置で欠失・逆位が起こる機構を、図４〜１４に示した例により説明する。但し、本発明のベクターによる遺伝子導入機構及びＤＮＡ改変機構は、これらの例に限定されるものではない。【００３６】  まず、導入カセットが二つの部位特異的組換え酵素認識配列に挟まれ、脱離可能に配されており、この導入カセットの内側に目的遺伝子が、外側にこの認識配列を認識して働く部位特異的組換え酵素をコードする組換え酵素遺伝子が組込まれている、図４のような構成のベクターの場合、これが宿主細胞に導入されると、このベクターに組込まれた組換え酵素遺伝子から発現する組換え酵素の働きにより、導入カセット部分が脱離して環状に切出される。このとき、宿主細胞の保持するＤＮＡに、この導入カセットを挟んでいた認識配列と同種類の認識配列が一つ組込まれていると、再び上記ベクター由来の組換え酵素が働いて、環状化した導入カセット部分と、宿主ＤＮＡ上の認識配列とが部位特異的組換えを起こし、認識配列が組込まれていた宿主ＤＮＡの位置に、目的遺伝子が導入される（図４）。【００３７】  一方、組換え酵素遺伝子及び目的遺伝子に関する構成は図４のベクターと同様であるが、導入カセットが脱離不能に配されている図５、６のようなベクターを宿主細胞に導入した場合、宿主細胞の保持するＤＮＡに、この導入カセットを挟む二つの認識配列のそれぞれと同種類・同方向の二つの認識配列で挟まれた部位が存在すると、ベクターに組込まれた組換え酵素遺伝子から発現する組換え酵素の働きにより、導入カセットとこの部位との間で部位特異的組換えが起こり、宿主ＤＮＡの認識配列で挟まれていた部位に目的遺伝子が導入される（図５、６）。【００３８】  なお、図５、６に示したベクターを、その導入カセットを挟んでいる認識配列と同種類の認識配列が一つ以上組込まれているＤＮＡを保持する宿主細胞に導入した場合は、一定の確率で、ベクターの導入カセット及び組換え酵素遺伝子が当該ＤＮＡ上に非特異的に組込まれ、この組換え酵素遺伝子から発現する組換え酵素が働いて、導入カセットを挟んでいた認識配列と宿主細胞に組み込まれていた認識配列との間が脱離するという現象が起こる。従って、宿主ＤＮＡにおいて、標的位置の隣接部位に、導入カセットを挟んでいる認識配列と同種類の認識配列を一つ以上組込めば、標的位置にあるＤＮＡを欠失させることができる（図７）。この場合において、導入カセットの内側には目的遺伝子を配する必要はない。【００３９】  また、上記した宿主ＤＮＡへの非特異的組込みは、導入カセットを脱離可能に配した図４のようなベクターでも、わずかながら起こる。従って、この場合も、宿主ＤＮＡ中に、導入カセットを挟んでいる認識配列と同種類の認識配列一つが存在すると、その隣接部位に存在するＤＮＡが欠失する可能性がある（図８）。しかし、その頻度は非常に低いと考えられる。【００４０】  図４〜図８に示す場��において、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子を導入しようとする際、又は宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失させようとする際、宿主細胞に導入された本発明のベクターが、標的位置が存在するＤＮＡとは異なるＤＮＡと非特異的組換えを起こし、組換え酵素遺伝子が標的位置が存在するＤＮＡとは異なるＤＮＡに組込まれる場合がある。さらに、宿主ＤＮＡと複数のベクターとの間で組換えが起こり、所定の位置に目的遺伝子を導入させ、又は、所定の位置で欠失を起こさせることができたとしても、同時に、上記したような意図しない組換え酵素遺伝子の組込みが起こる場合もある。かかる場合には、組換え酵素遺伝子は宿主ＤＮＡから脱離せず、発現し続けるので、その宿主ＤＮＡは不安定化する。【００４１】  図９、１０は、本発明のベクターにおいて、導入カセット外側に、組換え酵素遺伝子と共に、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を配した例を示している。この図のように、導入カセット外側に、組換え酵素遺伝子と共に致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子を配すると、意図しない組込みにより、組換え酵素遺伝子が宿主ＤＮＡ上から脱離せず、発現し続けるように組込まれた場合は、この致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子も発現し続けるので、このような組込みが起こったＤＮＡを保持する宿主細胞は死に到るか、形態異常を起こして正常な組換え体が得られないこととなる。従って、意図した組込みが起こり、所定の位置にのみ目的遺伝子が導入されたＤＮＡ、又は、所定の位置でのみ欠失・逆位が起こったＤＮＡを保持する宿主細胞に由来する組換え体を優先的に取得できるようになる。なお、この場合において、意図した組込みが起こり、所定の位置に目的遺伝子が導入されたＤＮＡ、又は、所定の位置で欠失・逆位が起こったＤＮＡにおいては、致死誘導遺伝子又は形態異常誘導遺伝子は宿主ＤＮＡ上に組込まれず、組込まれても脱離してしまっている（例えば、図１１）ので、これらのＤＮＡを保持する宿主細胞に悪影響を与えることはない。【００４２】  図１２は、脱離型ベクターにより、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子を導入する例を示した図である。脱離型ベクターが宿主細胞に導入されると、いったん、導入カセット及び組換え酵素遺伝子等がベクターから脱離して、この脱離した部分と宿主ＤＮＡとの間で組換えが起こり、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入されたり、所定の位置で欠失・逆位が起こることとなる。導入カセット及び組換え酵素遺伝子等が脱離してから、これらが宿主ＤＮＡと組換えを起すまでの機構は、これまでに説明した機構と同様である。【００４３】  図１３は、導入カセットが脱離不能に配されているベクターを用いて、宿主ＤＮＡの標的位置に目的遺伝子を導入する例であるが、ここで、導入カセット内側には、目的遺伝子と選抜マーカー遺伝子のプロモーター部分とが組込まれており、かかる導入カセットを有するベクターを、標的位置の隣接部に、予め，上記選抜マーカー遺伝子の構造遺伝子とターミネーター部分が組込まれた宿主ＤＮＡに対して使用している。このような導入カセットを有するベクターと宿主ＤＮＡとの組合せにより目的遺伝子の導入を行った場合、導入カセットと宿主ＤＮＡの標的位置との間で部位��異的組換えが起こって目的遺伝子がこの標的位置に導入されれば、選抜マーカー遺伝子が発現するので、目的とする組換えが起こったＤＮＡを保持する宿主細胞に由来する組織を、効率的に選抜することができる。なお、図１３の例とは逆に、選抜マーカー遺伝子の構造遺伝子とターミネーター部分を導入カセット内側に、プロモーター部分を宿主ＤＮＡの標的位置隣接部に配しても、もちろん構わない。【００４４】  図１４は、本発明の実施例１又は３における、目的遺伝子導入機構を示す図である。実施例１又は３では、本発明のベクターとして、導入カセットの内側には目的遺伝子と選抜マーカー遺伝子１、外側には組換え酵素遺伝子と形態異常誘導遺伝子を組込み、導入カセット自体は脱離不能に、この導入カセット、組換え酵素遺伝子及び形態異常誘導遺伝子は脱離可能に配したものを用い、これを、標的位置に選抜マーカー遺伝子２（選抜マーカー遺伝子１とは異なる発現を示す遺伝子）を配したＤＮＡを保持する宿主細胞に導入して組換えを行った。この場合、目的遺伝子が宿主ＤＮＡの標的位置に組込まれると、選抜マーカー遺伝子１も宿主ＤＮＡの標的位置に組込まれて発現する。一方、選抜マーカー遺伝子２は宿主ＤＮＡ上から脱離して、その機能を失ってしまうので、選抜マーカー遺伝子１の発現及び／又は選抜マーカー遺伝子２の発現の消失を指標として遺伝子導入処理後の細胞を選抜することにより、目的とする組換えが起こって目的遺伝子が所定の位置に組込まれた組換え体を効率的に選抜することができる。
【実施例】
【００４５】  以下、実施例に従って発明の詳細を説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、更に詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）、又は製造業者の取り扱い説明書に従い行った。【００４６】  ［実施例１］
Ｉ．宿主ＤＮＡへの認識配列導入用ベクターの構築
ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター（Ｎｏｓ−Ｐ）及びノパリンシンターゼ遺伝子のポリアデニル化シグナル（以下、ポリアデニル化シグナルは全てノパリンシンターゼ由来のものを用いた。）を連結したＮＰＴＩＩ構造遺伝子、３５Ｓプロモーター（３５Ｓ−Ｐ）及びポリアデニル化シグナルを連結したＣｏｄＡ構造遺伝子、並びに、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子がこの順で連結され、かつ、これらが互いに逆方向を向いた部位特異的組換え酵素認識配列ＲＳで挟まれた構造を有するプラスミドｐＣＡｍｐＣｏｄＮを構築した（図１５Ａ）。ここで、ｃｏｄＡ構造遺伝子は、大腸菌（ＤＨ５α、東洋紡（株）より購入）のゲノムＤＮＡをテンプレートに、配列番号１に示すプライマーα（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｃａｔｇｔｇｇａｇｇｃｔａａｃａｇｔｇ−３’）と配列番号２に示すプライマーβ（５’−ｇｃｇａｇｃｔｃｔｃａｇｔｇｃｔｃｔａｃｇｔａｇｇｃｃｇ−３’）を用いてＰＣＲ法により取得した。なお、図中、四角形の枠で囲まれた網掛けの三角形はＲＳ及びその配列の方向を、Ｔはポリアデニル化シグナルを示す（以下同じ。）。【００４７】  一方、プラスミドｐＴＬ７（特願２００３−９２８２７）の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｓｅ８３８７０１（以下、ＳｓｅＩと略記する。）部位間にプロモーター配列を除いたＧＵＳ遺伝子を連結して、プラスミドｐＴＬＧＵＳを作成し（図１５Ｂ）、このｐＴＬＧＵＳの制限酵素ＳｓｅＩ部位に、上記ｐＣＡｍｐＣｏｄＮから制限酵素ＳｓｅＩにより切出した、逆方向を向いた二つのＲＳ及びこれらに挟まれた領域を挿入して、宿主ＤＮＡへの認識配列導入用ベクタープラスミドｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮを作成した（図１５Ｃ）。このベクターを植物細胞に導入した場合、図中、小さな黒三角形で示した、Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー（ＲＢ）とレフトボーダー（ＬＢ）間が、植物ＤＮＡ中に組込まれることとなる。【００４８】ＩＩ．本発明のベクター（ｐ２ｎｄ１）の構築
図１６Ａに示す構造を有するプラスミドｐＣＳ３５ｈｙｇ３５を構築した。ここで、逆向きのＲＳに挟まれた部分が導入カセットとなる。なお、図中、Ｈｙｇは、ハイグロマイシン耐性構造遺伝子を示す。【００４９】  一方、ｐＴＬ７（Ｈ．Ｅｂｉｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、２２：９５、２００２）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩ１部位に、Ｎｏｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結したクラゲ蛍光タンパク（ＧＦＰ）構造遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ部位間にＲｕｂｉｓｃｏプロモーター（Ｒｕｂ−Ｐ）に連結したｉｐｔ構造遺伝子（ｉｐｔ遺伝子自身のターミネーター配列を含む。）を、ＥｃｏＲＩ部位に３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルに連結した部位特異的組換え酵素（Ｒ）構造遺伝子を、更に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩ部位間にＲＳ配列を導入し、プラスミドｐＴＬＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒを構築した（図１６Ｂ）。ここで、Ｒ遺伝子は、ＲＳを認識して部位特異的組換え反応を触媒する、部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子である。【００５０】  次いで、ｐＣＳ３５ｈｙｇ３５の導入カセット部分を、これを挟むＲＳ配列ごと、制限酵素ＳｓｅＩにより切出し、ｐＴＬＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒの制限酵素ＳｓｅＩ部位に連結して、本発明のベクタープラスミドｐ２ｎｄ１を作成し（図１６Ｃ）、これを国際寄託に付した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８７）。【００５１】  このベクターは、導入カセット内側に、目的遺伝子のモデルとして３５Ｓ−Ｐ、選抜マーカー遺伝子としてハイグロマイシン（Ｈｙｇ）遺伝子が配され、外側に組換え酵素遺伝子と形態異常誘導遺伝子が配された脱離型ベクターであって、上記ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡとの間で部位特異的組換えが起こり、標的位置に目的遺伝子である３５Ｓ−Ｐが導入されると、ＧＵＳ遺伝子が発現するようになっている（図１７）。また、非特異的組換えによって、認識配列が導入されたＤＮＡと同一のＤＮＡ上に組込まれた場合には、宿主ＤＮＡの一部を欠失させるようになっている。【００５２】ＩＩＩ．アグロバクテリウムへのベクターの導入
Ａ．ツメファシエンス４４０４株を、１０ｍｌのＹＥＢ液体培地（ビーフエキス５ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、ペプトン１ｇ／ｌ、ショ糖５ｇ／ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２２℃でのｐＨ７．２（以下、特に示さない場合、２２℃でのｐＨとする。））に接種し、ＯＤ６３０が０．４から０．６の範囲に至るまで，２８℃で培養した。培養液を、６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌した後、菌体を２０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁して、再度６９００×ｇ、４℃、１０分間遠心して集菌し、得られた菌体を２００μｌのＹＥＢ液体培地に懸濁して、これをプラスミド導入用菌液とした。【００５３】  次いで、プラスミド導入用菌液５０μｌと、Ｉ及びＩＩで作成したｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ及びｐ２ｎｄ１各３μｌを０．５ｍｌチューブ内で混合し、エレクトロポレーション（ジーンパルサーＩＩシステム［ＢＩＯＲＡＤ社］を使用。）を行うことにより、Ａ．ツメファシエンス４４０４株にこれらのベクターを導入した。エレクトロポレーション後の菌体は、２００μｌのＹＥＢ液体培地を加えて２５℃で１時間振とう培養してから、５０ｍｇ／ｌカナマイシン添加ＹＥＢ寒天培地（寒天１．５ｗ／ｖ％、他の組成は上記に同じ。）に播種して、２８℃で２日間培養を行った。【００５４】  この培養の結果、菌コロニーを形成した菌について、更にＹＥＢ液体培地に移植して培養した後、アルカリ法でプラスミドを抽出し、これをＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで分解してポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、制限酵素分解物の長さを解析することにより、Ａ．ツメファシエンス４４０４株へのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ又はｐ２ｎｄ１の導入を確認した。ここで、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮの導入が確認された菌をＬＢＡ４４０４（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）、ｐ２ｎｄ１の導入が確認された菌をＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄ１）とした。【００５５】ＩＶ．タバコへの認識配列導入用ベクター（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）の導入
ＩＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）をタバコに感染させることにより、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮをタバコに導入した。ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ導入用の材料としては、培養容器内で成育させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＳＲｌ、特に記載する場合を除き、以下同じ。）の葉から、中脈を取り除いて約８ｍｍ角となるようにカットして得られた葉片を用いた。【００５６】  即ち、上記のようにして得られた葉片３６片を、ＬＢＡ４４０４（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）の菌液（ＯＤ６３０＝０．２５、ＹＥＢ液体培地にて一夜培養後、滅菌水で稀釈して菌体濃度を調整。）に約１分間浸した後、滅菌した濾紙の上に置いて余分な菌液を除いてから、アセトシリンゴン５０ｍｇ／ｌを添加した植物ホルモンを含まない（ホルモンフリー）ＭＳ寒天培地（Ｔ．Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５：４７３、１９６２、但し、寒天０．８ｗ／ｖ％を添加。）に、葉の裏が上になるように置床して、２５℃、全明（特に記載されない限り、外植片及び植物組織・植物体の培養はこの条件で行った。）で３日間培養することで、これらの葉片にＬＢＡ４４０４（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）を感染させた。【００５７】  上記感染処理後の葉片は、６−ベンジルアミノプリン１ｍｇ／ｌ、ナフタレン酢酸０．１ｍｇ／ｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシン２００ｍｇ／ｌを添加したＭＳ寒天培地に移植して培養を行うことにより、不定芽を再分化させた。再分化してきた不定芽は分離して、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びカナマイシンン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に移植して培養することにより発根させた。こうして、１０個の不定芽にそれぞれ由来する、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮが導入されたカナマイシン耐性組換え体１０系統を得ることができた。また、得られたカナマイシン耐性組換え体１０系統のうち６系統については、更に、順化後の発根個体より種子を採取して、カナマイシン２００ｍｇ／ｌを含むホルモンフリーＭＳ寒天培地に播種し、カナマイシン耐性を示して発芽し、生育した苗を１系統あたり２株づつ選抜した。【００５８】Ｖ．認識配列導入用ベクター（ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ）が導入されたタバコの分析
Ａ．サザン分析
ＩＶで得られたカナマイシン耐性組換え体６系統の植物体１２株（Ｎｏ．２−１、２−２、４−１、４−２、５−１、５−２、６−１、６−２、７−１、７−２、１０−１、１０−２）より、ＣＴＡＢ法を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、これを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断して、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のアガロースゲルは、アルカリ・酸処理の後、その電気泳動面をナイロンメンブランに転写し、このナイロンメンブランについて、ＤＩＧ  ＰＣＲ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より購入）にて予めラベリングしておいた、Ａｍｐ遺伝子と相同性を有するプローブＰ１を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、ＤＩＧ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より購入）により化学発光検出を行ったところ、サザン分析に供した１系統２株（Ｎｏ．２−１、２−２）において、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮが導入されていることが確認された。【００５９】Ｂ．ＩＰＣＲ分析
上記Ａにて、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ導入が確認された２−２株につき、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮのＡｍｐ遺伝子と相同性を有する配列番号３に示すプライマーＡ（５’−ｔｇａａｃｇａａａｔａｇａｃａｇａｔｃｇ−３’）、及び、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮのレフトボーダー付近のＴ−ＤＮＡ領域と相同性を有する配列番号４に示すプライマーＬｚｓ７（５’−ａｔｔｃｇｃａｇｇｇｇａｔａａｃｇｃａｇｇａａａ−３’）を用い、以下のようにしてＩＰＣＲ分析を行った（図１８）。サザン分析の結果が示すように、この組換え体に１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮが導入されている場合は、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダーの外側のＤＮＡ、約６００ｂｐが、ＰＣＲ反応により増幅されることとなる。【００６０】  まず、この２−２株より、ＣＴＡＢ法を用いて染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断してエタノール沈殿処理後、Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅにて環状化した。環状化したＤＮＡ１μｇは、プライマーＡ及びＬｚｓ７各０．２μＭを含む、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｗ／ｖ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰ、並びに１．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＣＥＴＵＳ社より購入）を混合したＰＣＲ緩衝液５０μｌ中に溶解し、この混合液について、９４℃で１分３０秒間加温した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の加温サイクルを３０回繰り返すことによりＰＣＲ反応をい、得られたＰＣＲ反応物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。【００６１】  上記アガロースゲル電気泳動の結果、約６００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出され、組換え体２−２株に、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮが導入されていることを、ＩＰＣＲ分析においても確認することができた。なお、ここで増幅されたＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ−ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）を用いてサブクローニングし、ＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡ配列を決定したところ、この組換え体のＤＮＡには、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮのＴ−ＤＮＡ領域が、そのレフトボーダー約２００ｂｐを欠落させた状態で組込まれていることが明らかになった。【００６２】ＶＩ．認識配列導入タバコへの本発明のベクター（ｐ２ｎｄ１）の導入
ＩＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄ１）を、Ｖにおいて、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ導入が確認された組換え体２−２株に感染させることにより、本発明のベクターｐ２ｎｄ１をこの認識配列導入タバコに導入した。感染処理はＩＶと同様にして行った。【００６３】  感染処理後のタバコ葉片は、ナフタレン酢酸１ｍｇ／ｍｌ、ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｍｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｍｌ及びハイグロマイシン２０ｍｇ／ｍｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、３２の葉片より２６個のカルスが得られ、この２６個のカルスを同組成の培地に移植して４週間培養を続けることにより、６０個の不定芽が得られた。これらの不定芽をホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続け、４９個の発根個体を得ることができた。【００６４】ＶＩＩ．認識配列及び本発明のベクター（ｐ２ｎｄ１）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＶＩにおいて得られた４９個の発根個体について、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、Ｈｙｇ遺伝子に結合する配列番号５に示すプライマーＨ１（５’−ｃｇｔｃｔｇｔｃｇａｇａａｇｔｔｔｃｔｇ−３’）及び配列番号６に示すプライマーＨ２（５’−ｃｔａｔｃｇｇｃｇａｇｔａｃｔｔｃｔａｃ−３’）、３５Ｓ−Ｐに結合する配列番号７に示すプライマーＳ（５’−ａｃａａｔｃｃｃａｃｔａｔｃｃｔｔｃｇｃ−３’）及びＧＵＳ遺伝子に結合する配列番号８に示すプライマーＧ（５’−ｔｇｃａｔｃｇｇｃｇａａｃｔｇａｔｃｇｔ−３’）、更に、Ｖ−Ｂで行ったＩＰＣＲ法によりＤＮＡ配列が決定された、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダーの外側のＤＮＡに結合する配列番号９に示すプライマーＧＥ（５’−ｃａｇｃａｇｇｇｇａａｇｇｇｇａｔａｇ−３’）及び上記Ｓを用い、Ｖ−Ｂと同様の条件でＰＣＲ分析を行った。【００６５】  この場合において、分析したＤＮＡ上に、ｐ２ｎｄ１の導入カセット内側に存在していたＨｙｇ構造遺伝子が組込まれているときには、約９００ｂｐ（Ｈ１−Ｈ２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。また、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、タバコ染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、部位特異的組換えの結果、ｐ２ｎｄ１の導入カセットに置換されたときには、約１ｋｂｐ（Ｓ−Ｇ）及び約５００ｂｐ（ＧＥ−Ｓ）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。さらに、約１ｋｂｐ（Ｓ−Ｇ）又は約５００ｂｐ（ＧＥ−Ｓ）のどちらかの増幅しか検出されない場合は、その個体の一部のＤＮＡが欠失又は逆位しているものと考えられる（図１９）。【００６６】  ＰＣＲ分析の結果、分析に供した４９個体全てにおいて、約９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出された。また、１ｋｂｐの増幅が検出されたのは１０個体、５００ｂｐの増幅が検出されたのは１２個体、１ｋｂｐ及び５００ｂｐの増幅が検出されたのは５個体（２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８、２−２−２９）であり、１ｋｂｐ及び５００ｂｐの増幅が検出されたこれら５個体を、そのＤＮＡ上の所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体として選抜した。【００６７】Ｂ．サザン分析
Ａで選抜された組換え体（２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８、２−２−２９）について、Ｖ−Ａと同様にしてサザン分析を行った。但し、ここでは、染色体ＤＮＡの切断を制限酵素ＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで行い、プローブとしては、ＧＵＳ遺伝子に相同性のあるプローブＰ２（染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合）又はＨｙｇ遺伝子に相同性のあるプローブＰ３（染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した場合）を用いて行った。【００６８】  図２０Ａは、上記各組換え体の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、プローブとしてＧＵＳ遺伝子と相同性を有するプローブＰ２を用いたときの結果を示したものである。２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８及び２−２−２９株においては、いずれも、４．６ｋｂｐのバンドが確認された。これは、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、これらの染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、部位特異的組換えの結果、ｐ２ｎｄ１の導入カセットに置換された場合に予測される、ＥｃｏＲＩ断片の長さに一致する（図１９）。一方、ｐ２ｎｄ１導入前の組換え体２−２株においては、６．７ｋｂｐのバンドが確認されたが、これも、その染色体ＤＮＡ上にｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによる構成のみが導入されている場合に予測される、ＥｃｏＲＩ断片の長さに一致する（図１８）。【００６９】  また、図２０Ｂは、これらの染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プローブとしてＨｙｇ遺伝子と相同性を有するプローブＰ３を用いたときの結果を示したものである。２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８及び２−２−２９株においては、いずれも、６．２ｋｂｐのバンドが確認された。これも、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、これらの染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、ｐ２ｎｄ１の導入カセットに置換された場合に予測される、ＨｉｎｄＩＩＩ断片の長さに一致する（図１９）。また、このサザン分析の結果、２−２−２７株を除く４個体で、Ｈｙｇ遺伝子が１コピー導入されていることが確認された。【００７０】Ｃ．ＩＰＣＲ分析
Ａで選抜された組換え体（２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８、２−２−２９）について、プライマーＬｚｓ７及びＨｙｇ遺伝子に相同性のあるプライマーＨ１を用い、Ｖ−Ｂと同様にしてＩＰＣＲ分析を行った（図１９）。上記Ｂで行ったサザン分析の結果が示すように、これら組換え体のＤＮＡにおいて、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された構成のうち、認識配列に挟まれた部分と、ｐ２ｎｄ１の導入カセットとの間で置換が起こっているのであれば、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダー領域及びその外側のＤＮＡ配列は、これらの組換え体とｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによる構成のみが導入されている組換え体との間に相違はなく、この場合も、ＰＣＲ反応により約６００ｂｐのＤＮＡが増幅されるはずである。【００７１】  ＩＰＣＲ分析の結果、Ａで選抜された組換え体（２−２−１４、２−２−２０、２−２−２７、２−２−２８、２−２−２９）の染色体ＤＮＡは、いずれも約６００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を示し、また、これらのＤＮＡ断片について、やはりＶ−Ｂと同様にしてＤＮＡ配列を解析したところ、そのＴ−ＤＮＡレフトボーダー領域及び外側のＤＮＡ配列は、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによる構成のみが導入されている組換え体のＤＮＡ配列と一致していた。従って、このＩＰＣＲ分析の結果は、サザン分析の結果を支持するものと考えられる。【００７２】  以上のＰＣＲ分析、サザン分析及びＩＰＣＲ分析の結果、組換え体２−２−１４株、２−２−２０株、２−２−２７株、２−２−２８株及び２−２−２９株においては、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによってそのＤＮＡ上に導入されていた、互いに逆方向を向いたＲＳ配列間のＮＰＴＩＩ遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子及びＡｍｐ遺伝子が、ｐ２ｎｄ１の導入カセットに置換されていることが確認された。即ち、本発明においては、３２切片を材料として、染色体ＤＮＡの所定の位置に遺伝子が導入された組換え体５個体を得ることができ、その効率は１．６×１０−１であった。これは前記した、トランジェント法により得られる結果（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）の１００倍以上の効率であり、組換え酵素の発現を、標的位置への目的遺伝子の導入によって遮断する方法により得られる結果（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）と比較しても１０倍以上の効率である。【００７３】  また、以上の結果より、このベクターｐ２ｎｄ１によって、交配過程を経ずに、効率良く、宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失又は逆位させ得ることも明らかとなった。即ち、上記Ａで行ったＰＣＲ分析の結果、１ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅のみが検出された個体、及び、５００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅のみが検出された個体は、このようなＤＮＡの欠失又は逆位が起こった組換え体であると考えられる。【００７４】  ［実施例２］
Ｉ．本発明のベクター（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）の構築
ｐＴＬ７（特願２００３−９２８２７）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位に、Ｎｏｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結したＧＦＰ構造遺伝子を、ＥｃｏＲＩ部位に３５Ｓ−Ｐ及びポリアデニル化シグナルを連結したＲ構造遺伝子を導入し、プラスミドｐＴＬＧＦＰ３５Ｒを構築した（図２１Ｂ）。【００７５】  次いで、実施例１のＩＩで構築したｐＣＳ３５ｈｙｇ３５の導入カセット部分を、これを挟むＲＳ配列ごと、制限酵素ＳｓｅＩにより切出し、ｐＴＬＧＦＰ３５Ｒの制限酵素ＳｓｅＩ部位に連結して、本発明のベクタープラスミドｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔを作成し（図２１Ｃ）、これを国際寄託に付した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８５６０）。【００７６】  このベクターは、導入カセット内側に、目的遺伝子のモデルとして３５Ｓ−Ｐ、選抜マーカー遺伝子としてＨｙｇ遺伝子が配され、外側に組換え酵素遺伝子が配されたベクターであって、前記ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡとの間で部位特異的組換えが起こり、標的位置に目的遺伝子である３５Ｓ−Ｐが導入されると、ＧＵＳ遺伝子が発現するようになっている。（図２２）【００７７】ＩＩ．アグロバクテリウムへの本発明のベクター（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）の導入
実施例１のＩＩＩと同様にして、上記Ｉにて作成したｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔをＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、ＤＮＡ解析によりこれを確認して、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）とした。【００７８】ＩＩＩ．認識配列導入タバコへの本発明のベクター（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）の導入
ＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）を、実施例１のＶにおいて、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ導入が確認された組換え体２−２株に感染させることにより、本発明のベクターｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔをこの認識配列導入タバコに導入した。感染処理は、実施例１のＩＶと同様にして行った。【００７９】  感染処理後のタバコ葉片は、ナフタレン酢酸１ｍｇ／ｍｌ、ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｍｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｍｌ及びハイグロマイシン２０ｍｇ／ｍｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、３２の葉片より６３個のカルスが得られ、この６３個のカルスを同組成の培地に移植して４週間培養を続けることにより、２３９個の不定芽が得られた。これらの不定芽をホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続け、５３個の発根個体を得た。【００８０】ＩＶ．認識配列及び本発明のベクター（ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔ）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた５３個の発根個体について、実施例１のＶＩＩ−Ａと同様のプライマー及び条件を用いてＰＣＲ分析を行った。【００８１】  この場合においても、分析したＤＮＡ上に、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの導入カセット内側に存在していたＨｙｇ構造遺伝子が組込まれているときには、約９００ｂｐ（Ｈ１−Ｈ２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。また、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、タバコ染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの導入カセットに置換されたときには、約１ｋｂｐ（Ｓ−Ｇ）及び約５００ｂｐ（ＧＥ−Ｓ）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。さらに、約１ｋｂｐ（Ｓ−Ｇ）又は約５００ｂｐ（ＧＥ−Ｓ）のどちらかの増幅しか検出されない場合は、その個体の一部のＤＮＡに欠失又は逆位が起こっているものと考えられる（図２３）。【００８２】  ＰＣＲ分析の結果、分析に供した５３個体全てにおいて、約９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出された。また、１ｋｂｐの増幅が検出されたのは３個体、５００ｂｐの増幅が検出されたのは２個体、１ｋｂｐ及び５００ｂｐの増幅が検出されたのは２個体（３０−１、９１−１）であり、１ｋｂｐ及び５００ｂｐの増幅が検出されたこれら２個体を、そのＤＮＡ上の所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体として選抜した。【００８３】Ｂ．サザン分析
Ａで選抜された組換え体（３０−１、９１−１）について、実施例１のＶ−Ａと同様にしてサザン分析を行った。但し、ここでは、染色体ＤＮＡの切断を制限酵素ＥｃｏＲＩで行い、プローブとしては、Ｈｙｇ遺伝子に相同性のあるプローブＰ４、又は、同じくＨｙｇ遺伝子に相同性のあるプローブＰ５を用いて行った。【００８４】  図２４Ａは、組換え体９１−１株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、プローブとしてプローブＰ４を用いたときの結果を示したものである。この図２４Ａより明らかなように、サザン分析の結果、この場合は４．５ｋｂｐのバンドが確認された。また、図２４Ｂは、やはり組換え体９１−１株の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、プローブとしてプローブＰ５を用いたときの結果を示したものである。この図２４Ｂより明らかなように、この場合は、３．０ｋｂｐのバンドが確認された。これらのバンドは、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、これらの染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、部位特異的組換えの結果、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの導入カセットに置換された場合に予測されるＥｃｏＲＩ断片の長さに一致する（図２３）。また、このサザン分析の結果、９１−１株はＨｙｇ遺伝子が１コピー導入されていることが確認された。さらに、組換え体３０−１株においても、この９０−１株と同様の結果を得ることができた。【００８５】Ｃ．ＩＰＣＲ分析
Ａで選抜された組換え体（９１−１）について、プライマーＬｚｓ７及びＨｙｇ遺伝子に相同性のある配列番号１０に示すプライマーＨ３（５’−ｇａｔｇｃａａｔａｇｇｔｃａｇｃｔｃｔ−３’）を用い、実施例１のＶ−Ｂと同様にしてＩＰＣＲ分析を行った。実施例１のＶＩＩ−Ｃと同様、上記Ｂで行ったサザン分析の結果が示すように、これら組換え体のＤＮＡにおいて、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された構成のうち、認識配列に挟まれた部分と、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの導入カセットとの間で置換が起こっているのであれば、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダー領域及びその外側のＤＮＡ配列は、これらの組換え体とｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによる構成のみが導入されている組換え体との間に相違はなく、この場合も、ＰＣＲ反応により約６００ｂｐのＤＮＡが増幅されるはずである。【００８６】  ＩＰＣＲ分析の結果、組換え体９１−１株の染色体ＤＮＡは、約６００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅を示し、また、これらのＤＮＡ断片について、やはり実施例１のＶ−Ｂと同様にしてＤＮＡ配列を解析したところ、そのＴ−ＤＮＡレフトボーダー領域及び外側のＤＮＡ配列は、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによる構成のみが導入されている組換え体の−ＤＮＡ配列と一致することが明らかとなった。従って、このＩＰＣＲ分析の結果は、サザン分析の結果を支持するものと考えられる。【００８７】  以上のＰＣＲ分析、サザン分析及びＩＰＣＲ分析の結果、組換え体３０−１株及び９１−１株においては、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによってそのＤＮＡ上に導入されていた、互いに逆方向を向いたＲＳ配列間のＮＰＴＩＩ遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子及びＡｍｐ遺伝子が、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの導入カセットに置換されていることが確認された。即ち、本発明においては、３２切片を材料として、染色体ＤＮＡの所定の位置に遺伝子が導入された組換え体を２個体得ることができ、その効率は６．３×１０−２であった。この効率も、前記した、トランジェント法による結果（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）の１００倍以上の効率である。【００８８】  また、このベクターｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔによっても、交配過程を経ずに、効率良く、宿主ＤＮＡを所定の位置で欠失又は逆位させ得ることも明らかとなった。即ち、上記Ａで行ったＰＣＲ分析の結果、１ｋｂｐのＤＮＡ断片の増幅のみが検出された個体に関しては、このようなＤＮＡの欠失又は逆位が起こった組換え体であると考えられる。【００８９】  ［実施例３］
Ｉ．本発明のベクター（ｐ２ｎｄ２０）の構築
図２５Ａに示す構造を有するプラスミドｐＣＲＳＨｙｇＬｕｃを構築した。実施例１と同様、この場合も、逆向きのＲＳに挟まれた部分が導入カセットとなる。なお、図中、Ｌｕｃはルシフェラーゼ構造遺伝子を示す。【００９０】  次いで、このｐＣＲＳＨｙｇＬｕｃの導入カセット部分を、これを挟むＲＳ配列ごと、制限酵素ＳｓｅＩにより切出して、実施例１のＩＩで構築したプラスミドｐＴＬＲＳｒｕｂｉｐｔ３５Ｒ（図２５Ｂ）の制限酵素ＳｓｅＩ部位に連結し、本発明のベクタープラスミドｐ２ｎｄ２０を作成し（図２５Ｃ）、これを国際寄託に付した（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８５６１）。【００９１】  このベクターは、導入カセット内側に、目的遺伝子のモデルとしてルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子、選抜マーカー遺伝子としてＨｙｇ遺伝子が配され、外側に組換え酵素遺伝子と形態異常誘導遺伝子が配された脱離型ベクターであって、前記ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡとの間で部位特異的組換えが起こると、標的位置に目的遺伝子であるＬｕｃ遺伝子が導入される（図２６）。また、非特異的組換えによって、認識配列が導入された染色体と同一の染色体上に組込まれた場合には、図２７に示す機構によって、標的位置への目的遺伝子の導入と、所定の位置での宿主ＤＮＡの欠失とが共に起こるようになっている。【００９２】ＩＩ．アグロバクテリウムへの本発明のベクター（ｐ２ｎｄ２０）の導入
実施例１のＩＩＩと同様にして、上記Ｉにて作成したｐ２ｎｄ２０をＡ．ツメファシエンス４４０４株に導入し、ＤＮＡ解析によりこれを確認して、この菌をＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄ２０）とした。【００９３】ＩＩＩ．認識配列導入タバコへの本発明のベクター（ｐ２ｎｄ２０）の導入
ＩＩで得られたＬＢＡ４４０４（ｐ２ｎｄ２０）を、実施例１のＶにおいて、１コピーのｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮ導入が確認された組換え体２−１株に感染させることにより、本発明のベクターｐ２ｎｄ２０をこの認識配列導入タバコに導入した。感染処理は、実施例１のＩＶと同様にして行った。【００９４】  感染処理後のタバコ葉片は、ナフタレン酢酸１ｍｇ／ｍｌ、ベンジルアデニン０．１ｍｇ／ｍｌ、カルベニシリン５００ｍｇ／ｍｌ及びハイグロマイシン２０ｍｇ／ｍｌを含むＭＳ寒天培地に移植して培養を続けたところ、６４の葉片より６０個のカルスが得られ、この６０個のカルスを同組成の培地に移植して４週間培養を続けることにより、３４個のカルスから６４個の不定芽が得られた。これらの不定芽をホルモンフリーＭＳ寒天培地にて継代培養を続け、２１個のカルスにそれぞれ由来する２１系統の不定芽から、合わせて３１個の発根個体を得た。【００９５】ＩＶ．認識配列及び本発明のベクター（ｐ２ｎｄ２０）が導入されたタバコの分析
Ａ．ＰＣＲ分析
ＩＩＩにおいて得られた３１個の発根個体について、染色体ＤＮＡをＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＢＩ０  １０１  Ｉｎｃ．）により抽出し、Ｈｙｇ遺伝子に結合するプライマーＨ１及びＨ２、Ｌｕｃ構造遺伝子に結合する配列番号１１に示すプライマーＬ３（５’−ｃｇｔｔｃｇｇｔｔｇｇｃａｇａａｇｃｔａｔｇａａａ−３’）及びＧＵＳ遺伝子に結合するプライマーＧ、Ｈｙｇ構造遺伝子に結合する配列番号１２に示すプライマーＨＲ１（５’−ｃａｇａａａｃｔｔｃｔｃｇａｃａｇａｃｇ−３’）及び上記Ｇ、更に、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダーの外側のＤＮＡに結合するプライマーＧＥ及び上記Ｌ３又は上記ＨＲ１を用い、実施例１のＶ−Ｂと同様の条件でＰＣＲ分析を行った。【００９６】  この場合において、分析したＤＮＡ上に、ｐ２ｎｄ２０の導入カセット内側に存在していたＨｙｇ構造遺伝子が組込まれているときには、約９００ｂｐ（Ｈ１−Ｈ２）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。また、図２８Ａに示すようにして部位特異的組換えが起こり、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮにより導入された、タバコ染色体ＤＮＡ上の認識配列に挟まれた部分が、ｐ２ｎｄ２０に置換されたときには、約２．４ｋｂｐ（Ｇ−Ｌ３）及び約１．６５ｋｂｐ（ＧＥ−ＨＲ１）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。一方、図２８Ｂに示すようにして部位特異的組換えが起こった場合は、約１．５ｋｂｐ（Ｇ−ＨＲ１）及び約２．４ｋｂｐ（ＧＥ−Ｌ３）のＤＮＡ断片が増幅されることとなる。【００９７】  ＰＣＲ分析の結果、分析に供した３１個体全てにおいて、約９００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が検出された。そのうち、約２．４ｋｂｐ（Ｇ−Ｌ３）及び約１．６５ｋｂｐ（ＧＥ−ＨＲ１）のＤＮＡ断片が増幅されたのは２個体（１２−２、３７−１）、約１．５ｋｂｐ（Ｇ−ＨＲ１）及び約２．４ｋｂｐ（ＧＥ−Ｌ３）のＤＮＡ断片が増幅されたのは４個体（１２−１、２２−１、２２−２、４３−１）であり、これらをＤＮＡ上の所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体として選抜した。【００９８】  また、ＰＣＲ分析の結果、約２．４ｋｂｐ（Ｇ−Ｌ３）又は約１．５ｋｂｐ（Ｇ−ＨＲ１）のＤＮＡ断片の増幅しか検出されなかったものも合わせて４個体（７−１、１１−１、１７−３、４０−１）あった。そこで、これらについて、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダー付近の領域と相同性を有するプライマーＬｚｓ７及び上記ＧＥを用いて、上記で選抜した所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体と共にＰＣＲ分析を行ったところ、これらの個体でのみ約２００ｂｐの断片が増幅されず、これらの個体７−１株、１１−１株、１７−３株、４０−１株は、いずれも一定の部位のＤＮＡが欠失している個体（以下、単に、遺伝子欠失個体とも言う。）であることが明らかとなった（図２８Ａ及びＢ）。【００９９】Ｂ．サザン分析
Ａで選抜された所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体（１２−１、１２−２、２２−１、２２−２、３７−１、４３−１）及び遺伝子欠失個体（７−１、１１−１、１７−３、４０−１）について、実施例１のＶ−Ａと同様にしてサザン分析を行った。但し、ここでは、染色体ＤＮＡの切断を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＶで行い、プローブとしては、ＧＵＳ遺伝子に相同性のあるプローブＰ２（染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合）、Ｌｕｃ遺伝子に相同性のあるプローブＰ７（染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断した場合）、及び、同じくＬｕｃ遺伝子に相同性のあるプローブＰ６（染色体ＤＮＡをでＥｃｏＲＶで切断した場合）を用いて行った。【０１００】  サザン分析の結果、所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体（１２−１、１２−２、２２−１、２２−２、３７−１、４３−１）すべてにおいて、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによりそのＤＮＡ上に導入され、存在していたはずのＮＰＴＩＩ遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子及びＡｍｐ遺伝子が、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットに置換されていることが確認された。また同時に、このサザン分析の結果は、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットが、組換え体のＤＮＡ上に、図２８Ａ及びＢに示す２種の向きで導入されていることをも示し、ＰＣＲ分析結果を裏付けるものであった。【０１０１】  例として、組換え体１２−１株、１２−２株のサザン分析結果を示す。図２９Ａは、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、プローブＰ２を用いたときの結果を示したものであり、このとき、組換え体１２−１株においては３．７ｋｂｐ、組換え体１２−２株においては２．８ｋｂｐのバンドが検出された。これは、ＰＣＲ分析の結果と同様に、組換え体１２−１株では図２８Ｂに示す向きに、組換え体１２−２株では図２８Ａに示す向きに、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットが導入されたことを示すものである。【０１０２】  図２９Ｂは、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プローブとしてプローブＰ７を用いたときの結果を示したものであり、このとき、組換え体１２−１株においては６．９ｋｂｐ、組換え体１２−２株においては８．０ｋｂｐのバンドが検出された。これも、上記ＰＣＲ分析の結果と同様に、組換え体１２−１株では図２８Ｂに示す向きに、組換え体１２−２株では図２８Ａに示す向きに、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットが導入されたことを示すものである。【０１０３】  図２９Ｃは、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断し、プローブとしてプローブＰ６を用いたときの結果を示したものであり、このとき、組換え体１２−１株においては１２．０ｋｂｐ、組換え体１２−２株においては１．７ｋｂｐのバンドが検出された。これも、上記ＰＣＲ分析の結果と同様に、組換え体１２−１株では図２８Ｂに示す向きに、組換え体１２−２株では図２８Ａに示す向きに、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットが導入されたことを示すものである。【０１０４】  また、これらサザン分析の結果、組換え体１２−１株及び１２−２株は、Ｌｕｃ遺伝子が標的位置に１コピー導入されているものであることが確認された。【０１０５】  一方、サザン分析の結果は、遺伝子欠失個体（７−１、１１−１、１７−３、４０−１）すべてにおいて、前記２−１株では存在していた一定の部位のＤＮＡが欠失していることを示し、ＰＣＲ分析の結果を裏付けるものであった。【０１０６】  例として遺伝子欠失個体１１−１株の分析結果を図３０に示す。図３０より明らかなように、サザン分析の結果、この遺伝子欠失個体１１−１株は、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、プローブとしてプローブＰ２を用いた場合には、３．７ｋｂｐのバンドを、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、プローブとしてプローブＰ７を用いた場合には、６．９ｋｂｐのバンドを、また、染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＶで切断し、プローブとしてプローブＰ６を用いた場合には、１４．０ｋｂｐのバンドを示した。【０１０７】  これらはいずれも、この遺伝子欠失個体１１−１株では、図２７に示す機構によって、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットが標的位置に導入されると共に、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮに由来するＴ−ＤＮＡレフトボーダー外側の染色体ＤＮＡの一部が欠失したことを示すものである（図３１）。【０１０８】  以上のＰＣＲ分析及びサザン分析の結果、１２−１株、１２−２株、２２−１株、２２−２株、３７−１株及び４３−１株においては、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐＣｏｄＮによりそのＤＮＡ上に導入されていた、互いに逆方向を向いたＲＳ配列間のＮＰＴＩＩ遺伝子、ｃｏｄＡ遺伝子及びＡｍｐ遺伝子が、ｐ２ｎｄ２０の導入カセットに置換されており、これらは、その染色体ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入された組換え体であることが確認された。また、７−１株、１１−１株、１７−３株及び４０−１株は、一定の部位の染色体ＤＮＡが欠失している個体であることが確認された。【０１０９】  即ち、本発明においては、６４切片を材料として、染色体ＤＮＡの所定の位置に遺伝子が導入された組換え体６個体を得ることができ、その効率は９．４×１０−２であった。この効率も、前記した、トランジェント法による結果（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）の１００倍以上の効率である。また、一定の部位の染色体ＤＮＡが欠失している個体を、交配を経ることなく当世代で４個体得ることができ、その効率は６．３×１０−２であった。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】  本発明のベクターにおいて用いる導入カセットの例を示す図である。
【図２】  本発明のベクターのうち、脱離型ベクターの基本的構造とその機能の一例を示す説明図である。
【図３】  本発明のベクターのうち、脱離型ベクターの基本的構造とその機能の他の例を示す説明図である。
【図４】  本発明のベクターにより、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入される機構の一つを示す説明図である。
【図５】  本発明のベクターにより、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入される他の機構を示す説明図である。
【図６】  本発明のベクターにより、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入される他の機構示す説明図である。
【図７】  本発明のベクターが、宿主ＤＮＡを所定の位置において欠失させる機構の一つを示す説明図である。
【図８】  本発明のベクターが、宿主ＤＮＡを所定の位置において欠失させる他の機構を示す説明図である。
【図９】  本発明のベクターにおいて、致死誘導遺伝子による効果を示す説明図である。
【図１０】  本発明のベクターにおいて、形態異常誘導遺伝子の効果を示す説明図である。
【図１１】  本発明のベクターが、宿主ＤＮＡを所定位置において欠失させるように働く場合における、形態異常誘導遺伝子の挙動を示す説明図である。
【図１２】  本発明のベクターのうち、脱離型ベクターを用いた場合に、宿主ＤＮＡの所定の位置に目的遺伝子が導入される機構の一つを示す説明図である。
【図１３】  選抜マーカー遺伝子の一部を組込んだ本発明のベクターを用いて、宿主ＤＮＡの標的位置に目的遺伝子を導入した場合を示す説明図である。
【図１４】  本発明の実施例１又は３における目的遺伝子導入機構を示す説明図である。
【図１５】  認識配列導入用ベクターｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮの作成スキムを示す図である。
【図１６】  本発明のベクターｐ２ｎｄ１の作成スキムを示す図である。
【図１７】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡに対し、ｐ２ｎｄ１により目的遺伝子を導入した場合の遺伝子導入機構を示す図である。
【図１８】  本発明の実施例で用いたプローブ又はプライマーと、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮが導入された宿主ＤＮＡとの関係を示す図である。
【図１９】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより導入された認識配列とｐ２ｎｄ１との間の部位特異的組換えによって、目的遺伝子が導入される場合に想定される、本発明の実施例１で用いたプローブ又はプライマーと宿主ＤＮＡの関係を示す図である。
【図２０】  実施例１で得られた組換え体２−２−１４株、２−２−２０株、２−２−２７株、２−２−２８株及び２−２−２９株につき、サザン分析を行った結果を示す図である。
【図２１】  本発明のベクターｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔの作成スキムを示す図である。
【図２２】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡに対し、ｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔにより目的遺伝子を導入した場合の遺伝子導入機構を示す図である。
【図２３】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより導入された認識配列とｐ２ｎｄΔＲＳｉｐｔとの間の部位特異的組換えによって、目的遺伝子が導入される場合に想定される、本発明の実施例２で用いたプローブ又はプライマーと宿主ＤＮＡの関係を示す図である。
【図２４】  実施例２で得られた組換え体９１−１株につき、サザン分析を行った結果を示す図である。
【図２５】  本発明のベクターｐ２ｎｄ２０の作成スキムを示す図である。
【図２６】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡに対し、ｐ２ｎｄ２０により目的遺伝子を導入した場合の遺伝子導入機構を示す図である。
【図２７】  ｐ２ｎｄ２０を用い、ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより認識配列が導入された宿主ＤＮＡを、所定の位置において欠失させる場合の機構を示す図である。
【図２８】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより導入された認識配列とｐ２ｎｄ２０との間の部位特異的組換えによって、目的遺伝子が導入される場合に想定される、本発明の実施例３で用いたプローブ又はプライマーと宿主ＤＮＡの関係を示す図である。
【図２９】  実施例３で得られた組換え体１２−１株及び１２−２株につき、サザン分析を行った結果を示す図である。
【図３０】  実施例３で得られた遺伝子欠失個体１７−１株につき、サザン分析を行った結果を示す図である。
【図３１】  ｐＴＬＧＵＳＡｍｐｃｏｄＮにより導入された認識配列とｐ２ｎｄ２０との間の部位特異的組換えによって、ＤＮＡの一部が欠失する場合に想定される、本発明の実施例３で用いたプローブ又はプライマーと宿主ＤＮＡの関係を示す図である。
【図３２】  部位特異的組換え系を利用した、従来型ベクターによる遺伝子導入法を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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