(57)【要約】      （修正有）【課題】微量生体試料であるタンパク質、ペプチド、脂質、糖質及びＤＮＡの反応に於いて、サンプルを低損失で化学反応処理し、化学反応する分子同士の衝突回数を増加させる化学反応方法及び化学反応装置の提供。【解決手段】化学物質が固定化された反応部は、サンプル液で満たされ、サンプル液の両端はバッファー液との混合を防止するためのエアで挟まれる。サンプル液は、サンプル導入部等を利用して設置される。【選択図】図１（ａ）
2005318834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に生体分子が固定された担体を収める反応部を含む試料流通路に、第1の液体を導入する工程と、
前記試料流通路に、前記第1の液体に対して気体層を介して配置される第２の液体を導入する工程と、
前記気体層に、試料を導入する工程と、
前記担体に対して前記試料が相対的に移動するように、前記第1の溶液と前記試料と前記第2の溶液とを移動させる工程とを有することを特徴とする化学反応方法。
【請求項２】
前記第1の溶液と前記試料との間には第１の気体層があり、前記第２の溶液と前記試料との間には第２の気体層があることを特徴とする請求項１に記載の化学反応方法。
【請求項３】
前記第１の気体層の体積と前記第２の気体層の体積とは、各々０．１〜２μLの範囲であることを特徴とする請求項２に記載の化学反応方法。
【請求項４】
前記試料を導入する工程では、導入される前記試料の体積は、0.1μL以上100μL以下であることを特徴とする請求項１に記載の化学反応方法。
【請求項５】
前記担体は複数の微粒子であり、前記反応部はキャピラリ-であることを特徴とする請求項１に記載の化学反応方法。
【請求項６】
前記担体は前記反応部に設けられる構造物であり、前記反応部はキャピラリーであることを特徴とする請求項１に記載の化学反応方法。
【請求項７】
複数の微粒子を収める反応部と、
前記反応部の一方の端部、他方の端部とに各々繋がる第1の管、第2の管と、
前記第1の管につながりかつ試料を導入する試料導入手段と、
前記反応部の内部での試料の移動を制御するための第1のポンプと第2のポンプとを有することを特徴とする化学反応装置。
【請求項８】
前記試料の前記移動は、往復移動であることを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項９】
前記試料導入手段は少なくとも第１流路と第２流路とを有し、前記試料導入手段は、回転によって前記第１流路と前記試料が導入された前記第２流路との配置を切り替えられ、前記第２流路に導入された前記試料を前記反応部へ導入することを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項１０】
前記試料導入手段は試料保持部を有し、前記試料保持部に導入された前記試料を、前記試料保持部に次いで導入された気体もしくは液体によって押し出して、前記反応部へ導入することを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項１１】
恒温槽を更に有し、前記試料導入手段と前記反応部とは前記恒温槽の内部に設置されることを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項１２】
恒温槽を更に有し、前記反応部は前記恒温槽の内部に設置されることを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項１３】
前記反応部の温度を調整する温度調整器をさらに有することを特徴とする請求項７に記載の化学反応装置。
【請求項１４】
第１流路と、
複数の微粒子を収める反応部を具備する第２流路と、
前記第１流路と前記第２流路との配置を切り替える部材と、
前記第１流路若しくは前記第２流路の一方の端部に繋がる第1の管と、
前記第１流路若しくは前記第２流路の他方の端部に繋がる第2の管と、
前記第１の管に繋がる第1のポンプと、
前記第2の管に繋がる第2のポンプとを有することを特徴とする化学反応装置。
【請求項１５】
複数の微粒子を収める反応部と、前記反応部の一方の端部、他方の端部とに各々繋がる第1の管、第2の管と、前記第1の管につながりかつ試料を導入する試料導入手段と、前記反応部の内部での試料の移動を制御するための第1のポンプと第2のポンプとを具備する化学反応装置とを有し、
前記化学反応装置から導出される試料を輸送する輸送パイプと、
前記輸送パイプにつながる液体クロマトグラフ部と、
前記液体クロマトグラフ部で分離された試料が導入される質量分析装置と、
前記質量分析装置の出力を得る手段とを有することを特徴とする解析システム。
【請求項１６】
複数の前記化学反応装置を有し、各々の前記化学反応装置は、具備する前記微粒子に各々酵素が固定されるものであることを特徴とする請求項１５に記載の解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微量の試料溶液の化学反応に関わる。特に、本発明は微量生体試料、すなわちタンパク質、ペプチド、脂質、糖質、およびＤＮＡの反応に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素反応における酵素の活性向上やオンライン化によるサンプル損失低減を目指した技術が幾つか開発されている。例えば特許文献１には、酵素を固定化したキトサンビーズ（直径0.5〜3ｍｍ）を用いた酵素反応方法に関する記述がある（特許文献１）。この技術では、酵素固定化ビーズをサンプル液に添加し、振とうなどの方法を用いて、サンプル液に固定化酵素を分散させながら反応を促進させる。酵素を固定化する結果、酵素活性を実質的に高めることができるが、反応時間は1〜50時間程度必要とされる。また、例えば特許文献２には、サンプル損失低減を目指したオンライン酵素反応技術に関する記述がある（特許文献２）。この技術では、カラムに酵素固定化担体ゲルを充填し、サンプル溶液をポンプでカラム送液する。この方法を用いるとシステムの自動化が可能だが、反応時間は数時間程度必要と見積もられる。また、酵素反応とは異なるが、キャピラリーの中に、プローブなどの化学物質を表面に結合させたビーズなどの粒子を並べるプローブアレーに関する記述が例えば特許文献３にある（特許文献３）。この例では、サンプル液をプローブアレーに導入することにより、サンプル物質が化学物質と特異的に結合し、そのことを光学検出することができる。粒子毎に結合させる化学物質を変えることができるが、反応効率最適化に関する情報は明らかにされていない。
【０００３】
オンライン酵素反応の促進には、固定化酵素の表面積を増加させることも有効である。例えば非特許文献1には、シリコン基板に32本の微細流路（幅50μｍ、深さ250μｍ、長さ11ｍｍ）を形成させ、流路表面に酵素を固定化させる技術が記載されている（[非特許文献１]）。酵素を固定化する表面積を大きくすることができるため、酵素反応時間は短時間で完了させることができる。ただ、微細流路に一定流量でサンプルを導入するため、サンプルを導入する水圧が非常に高くなり、反応効率に影響を及ぼす。さらに、キャピラリーに多孔質のモノリスカラムを形成し、モノリス表面に酵素を固定化する酵素固定化モノリスカラムに関する記述が、例えば非特許文献２に記載されている（[非特許文献２]）。酵素を固定化する表面積を非常に大きくすることができるため、酵素反応時間は短時間となり、スループットは向上する。そのうえ、モノリスカラムは多孔質なので、比較的低い水圧でサンプルを導入することができる。しかし、モノリスカラムの製作は煩雑であり、かつ製作コストが高くなる。
【０００４】
【特許文献１】特開平9-313196号公報
【０００５】
【特許文献２】特開平11-196897号公報
【特許文献３】特開平11-243997号公報
【非特許文献１】Analytical Chemistry Vol. 72 (2000) p.286-293（アナリティカル  ケミストリー誌、第72巻、2000年、第286項から第293項）
【非特許文献２】Analytical Chemistry Vol. 74 (2002) p.4081-4088（アナリティカル  ケミストリー誌、第74巻、2002年、第4081項から第4088項）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
酵素反応は従来バッチ処理でチューブ容器を用いた溶液反応を行うことが多かったが、バッチ処理ではサンプルの損失が無視できない。さらに、酵素活性が低下することもある。従って、微量生体サンプルの化学反応においては、バッチ処理は不利となりがちである。
一方、サンプル損失低減を目指した従来の技術においては、上記の通り反応時間は数時間から数十時間程度必要とされ、反応には長時間費やさざるを得ない。また、ビーズを用いた反応方法についても、反応効率最適化に関する情報は明らかにされていなかった。
【０００７】
これらの問題を解決するためには、微量生体サンプルを低損失で化学反応処理する化学反応方法、及び、化学反応装置が必要である。
さらに、サンプル損失低減を目指し、かつ短時間で処理するためには、化学反応する分子同士の衝突回数を増加させる化学反応方法、及び、化学反応装置が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
試料についての化学反応を行うに当たり、化学反応方法について、表面に生体分子が固定された担体を収める反応部を含む試料流通路に、第1の液体を導入する工程と、試料流通路に、第1の液体に対して気体層を介して配置される第２の液体を導入する工程と、気体層に、試料を導入する工程と、担体に対して試料が相対的に移動するように、第1の溶液と試料と第2の溶液とを移動させる工程とを有することを特徴とする。表面に生体分子が固定された担体を用い、微量の試料の化学反応を行う場合、キャリア液となるバッファー等(上記の第1の液体、第2の液体)と試料が接していると、流路中での拡散による試料の損失が無視できないという問題がある。しかし、上記の構成を取ることにより、流路中での拡散による試料の損失を回避することができる。また、試料が微量である場合には、試料を反応部へ輸送する際に試料が損失してしまうと試料の回収率が下がるという問題がある。しかし、上記の構成を取ることにより、試料の輸送に伴う試料の損失を回避することができる。
【０００９】
ここで、第1の溶液と試料との間には第１の気体層があり、第２の溶液と試料との間には第２の気体層があってもよい。また、担体は複数の微粒子であり、反応部はキャピラリ-であってもよい。また、担体は反応部に設けられる構造物であり、反応部はキャピラリーであってもよい。
【００１０】
化学反応装置の一構成例は、複数の微粒子を収める反応部と、反応部の一方の端部、他方の端部とに各々繋がる第1の管、第2の管と、第1の管につながりかつ試料を導入する試料導入手段と、反応部の内部での試料の移動を制御するための第1のポンプと第2のポンプとを有することを特徴とする。ここで、試料導入手段は少なくとも第１流路と第２流路とを有し、試料導入手段は、回転によって第１流路と試料が導入された第２流路との配置を切り替えられ、第２流路の導入された試料を反応部へ導入してもよい。また、試料導入手段は試料保持部を有し、試料保持部の導入された試料を、試料保持部に次いで導入された気体もしくは液体によって押し出して、導出させることによって反応部へ導入してもよい。また、恒温槽を更に有し、試料導入手段と反応部とは恒温槽の内部に設置されてもよい。また、恒温槽を更に有し、反応部は恒温槽の内部に設置されてもよい。
【００１１】
化学反応装置の他の構成例は、第１流路と、複数の微粒子を収める反応部を具備する第２流路と、第１流路と第２流路との配置を切り替える部材と、第１流路若しくは第２流路の一方の端部に繋がる第1の管と、第１流路若しくは第２流路の他方の端部に繋がる第2の管と、第１の管に繋がる第1のポンプと、第2の管に繋がる第2のポンプとを有することを特徴とする。
上記化学反応装置は単独で用いられても良く、オンライン化された化学反応システム、質量分析システム等に組み込まれて用いられても良い。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化学反応装置化学反応装置を用いることにより、サンプル吸引にかかる時間を減少させることができる。また、吸引すべき量として設定した体積を確実に吸引することができ、試料のロスを防止することができる。その上で、化学物質を固定化した担体を収めた試料流通路において、試料の乱流や遷移流を生じさせ、試料流通路内における化学反応の効率を高めることができる。また、担体に固定化した化学物質と溶液中のサンプル分子との衝突回数を増加し、両者間の反応効率を高めることができる。このように反応効率を高めることにより、短時間で処理が完了することができるとともに、微量生体サンプルを低損失で化学反応処理することができる。
また、この化学反応装置を組み込んだ解析システムによれば、化学反応装置の高い反応効率によりスループットを大幅に向上させることができる。また、微量のサンプルをオンラインで処理できるため、サンプルの損失を防止し、システム全体の高感度化が達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１(a)に、本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）を示す。管状に形成された反応部１には、化学物質が固定化されている。そして、バッファー液がバルブ２や反応部１などに充填される。先ず、エア導入口３より所定の体積のエアが所定の体積だけ第二のポンプ４により吸引される。次に、バルブ２が切り替わり、第一のポンプ６、及び、第二のポンプ４によりエアが試料導入部２８に導入されるが、エアの両端は、サンプル導入部２８の両端を跨ぐ状態となる。サンプル液は（図の黒い部分）サンプル導入部２８にあるサンプル導入口５に導入される。サンプル導入部２８では、サンプル導入部２８が回転するなどして、サンプルが導入される流路２９とエアが導入される流路３０とが入れ替わる。その結果、サンプル液の両端はエアに挟まれた状態となり、バッファーとの混合が防止される。第一のポンプ６、及び、第二のポンプ４により、両端がエアに挟まれたサンプル液は、反応部１に導入される。
【００１４】
反応部１は恒温部７で例えば３７℃程度の所定の温度に保たれる。サンプル液は第一のポンプ６、及び、第二のポンプ４により、反応部１を所定の流速で一定体積だけ往復運動する。ポンプ４、６により、一方から液を吸引すると同時に反対側から加圧することで、サンプル液の移動における遅延が抑制される。所定の時間だけ往復運動を繰り返すことにより、反応部１において化学反応が完了する。化学反応を起こしたサンプル（反応産物）は、バルブ２を通って、排出口８より排出される。その後、クリーニングのために、バッファー導入口９より導入されるバッファー液により、反応部１やバルブ２は洗浄される。そして、クリーニングに用いられたバッファー液（廃液）は、バッファー排出口３１より排出される。また、サンプルが導入されない保管時には、反応部１の温度は４℃程度に変更され、固定化化学物質の変化を防止する。このようにすると、反応部１は繰返し１ヶ月以上は使用することができる。
【００１５】
図１（ｃ）に、試料導入部２８の模式図を示す。試料導入部２８は、図中の点線を軸として回転手段（図示せず）によって回転され、流路の配置の切り替えを行う。ここに示した試料導入部２８は、少なくとも２つの流路を有するものであり、少なくとも１の流路にサンプル液(試料)を導入させて、気体もしくは液体を収める他の流路と切り替えられることによって、反応部１へとサンプル液(試料)を導入させるものである。
【００１６】
両端がエアに挟まれたサンプル液を速やかに移動させるために、サンプルが導入される流路２９、反応部１、バルブ２、排出口８を結合する管（石英キャピラリーなど）の内径は７０ミクロン以上であることが望ましい。この内径範囲であれば、管のコンダクタンスを低減させ、エアで挟まれたサンプル液の移動を高精度で制御できるためである。また、これらの内容積はサンプル体積の３〜５倍程度の範囲にあることが望ましい。この容積範囲であれば、サンプルの移送時間を反応時間より短くすることができるためである。また、サンプル液を挟むエアの体積は各々０．１〜２μLの範囲にあることが望ましい。サンプル液とバッファー液とが混合しないようにするためにはエアが0.1μL以上必要だが、多すぎると管内径が70ミクロン以上でもサンプル液の移動制御に支障が生じる。つまり、エアの体積は各々０．１〜２μLの範囲であれば、サンプル液の移動制御が適切に行うことができる。
【００１７】
サンプル導入部２８と反応部１との距離は短い方が、エアを両端に挟まれたサンプルの移動距離が短くなるため、高速化の観点からは望ましい。そのため、図１（ｂ）に示すように、サンプル導入部２８が恒温槽７の内部に設置されていても構わない。
化学反応装置（全体）としては、図２に示すように、第一ポンプ６、第一のバルブ２、サンプル導入部２８、恒温部７、第二のバルブ２、第二のポンプ４に、各々駆動するための電源が必要である。さらに、それらの電源を統括して制御するシステム制御部が必要である。このようなシステムにおいて、自動で微量サンプルのオンライン処理が実現させることができる。
【００１８】
本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコルを図３に模式的に示す。反応部１の内容積は２μLであり、サンプル体積は５μLとする。サンプル体積は、本実施例及び他の実施例において、0.1μL以上100μL以下の範囲で導入することができる。そして、反応部１や流路３０、ポンプ４や６に結合する管（内径７５μｍの石英キャピラリー）には、予め濃度10mM のTris-HCl溶液（pH8.0）などのバッファー液が満たされている。なお、本実施例におけるバルブ２は、内部ループ型インジェクションバルブを示すが、他のタイプでもよい。（ａ）バッファー液が満たされたバルブ２はエア導入口３に結合され、ポンプ４によりエアを７μL程度だけ吸引する。次に、バルブ２はシステム制御部の指示によりアクチュエーターなどにより回転し、流路はポンプ６への流路に結合する。
【００１９】
（ｂ）ポンプ４とポンプ６が実質的に同時に流量５μL／分でそれぞれ吸引、押し出しをすることにより、エアはサンプル導入部２８の流路３０に導入される。サンプル導入部２８の両端からエアが各々１μL程度づつはみ出した状態となった時点でポンプ４と６は停止する。（ｃ）サンプル導入口５よりサンプル（図では黒で表示）を流路２９（内容積５μL）に、吸引または押し出しにより導入される。（ｄ）サンプル導入部２８では、サンプル導入部２８が回転し、サンプルが導入されている流路２９とエアが導入されている流路３０とが入れ替わる。その結果、サンプル（５μL程度）の両端には各々１μL程度のエアが配置され、バッファー液との接触・混合が防止される。（ｅ）第一のポンプ６、及び、第二のポンプ４により、両端がエアに挟まれたサンプル液は、反応部１に流量５μL／分で導入される。そして、右側のエアが反応部１から出た状態でサンプル液の導入が停止する。この時、反応部１に導入されていないサンプルの体積は３μL程度である。反応部１は恒温部７にあるペルチェ素子により３７℃程度に制御される。
【００２０】
（ｆ）サンプルが右方に向かって移動するように、第二のポンプ４と第一のポンプ６は流量５μL/分で同時に０．６分間だけ吸引、押し出しを行う。その後、約４秒間（待ち時間）だけポンプ４、６の動作停止の結果、右側のエアは、反応部１に接する位置で停止する。次に、第二のポンプ４と第一のポンプ６によりサンプルが左方に向かって流量５μL/分で０．６分間だけ移動し、約４秒間（待ち時間）だけポンプ４と６は停止する。上記の往復運動を所定の時間（回数）だけを繰り返すことにより、化学反応は促進される。トリプシンを用いたタンパク質の酵素消化反応の場合には、１０分ほどでタンパク質はペプチド化する。この時間設定は反応部に固定された化学物質の種類やサンプルの種類に応じて、設定することができる。（ｇ）バルブ２は回転し、流路はサンプル排出口８に結合する。そして、第二のポンプ４により、反応サンプルはサンプル排出口８から流量５μL/分で外部に排出される。（ｈ）バルブ３２によりバッファー導入口９と第一のポンプ６への流路が結合し、第一のポンプ６は新しいバッファー液を吸引する。
【００２１】
次に、バルブ３２、及び、バルブ２が回転し、第一のポンプ６とバルブ２との流路が結合する。そして、第一のポンプ６が流量５μL/分でバッファー液を押し出すことにより、試料導入部の流路２９，３０や反応部１がクリーニングされる。このとき、第一のポンプ６及び、第二のポンプ４を用いて、バッファー液を往復運動させてもよい。クリーニングに用いられたバッファー液は排出口３１から外部に排出される。その後、上記（ａ）に戻り、次のサンプルを反応させることができる。一方、反応を終了させる場合には、恒温部７により反応部１の温度は４℃に保たれ、反応部１に固定された化学物質の機能低下を防止する。反応部１は繰返し使用できるが、機能が低下した場合には交換が必要である。また、反応部の反応効率が充分に高い場合には、サンプルを反応部１に一回通過させるだけで反応が完了する。この場合には、上記（ｆ）に記載のような、往復運動は必ずしも必要ではない。
【００２２】
図４には、一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）を示す。この例では、外部ループ型インジェクションバルブ（６方バルブ）を用いている。図４（ｄ）にインジェクションバルブの模式図を示す。流路３３が形成されたローター部２８がおよそ１/６回転することにより、流路を切り替えることができる。サンプルが導入される流路２９が定められた内容積を有するサンプルループに対応し、インジェクションバルブのローター部２８を回転させることにより、流路２９はバルブ２や反応部１へ繋がることができる。
【００２３】
反応に関わる送液シーケンスは図３の説明に準じるが、以下に概略を示す。（ａ）バッファー液が満たされたバルブ２はエア導入口３に結合され、エア導入口３よりエアを所定体積だけ第二のポンプ４により吸引される。次に、バルブ２はシステム制御部の指示により空気圧などにより回転し、流路は第一のポンプ６への流路に結合する。（ｂ）第一のポンプ６と第二のポンプ４が同時に流量５μL/分でそれぞれ吸引、押しだしをすることにより、エアはサンプル導入部２８の流路３０に導入され、流路３３の両端に１μLづつはみ出した状態となった時点でポンプ４と６は停止する。一方、サンプル導入口５よりサンプル（図では黒で表示）を流路２９（内容積５μL）に、吸引または押し出しにより導入される。（ｃ）サンプル導入部２８では流路３３が１/６回転し、サンプルが導入されている流路２９とエアが導入されている流路３３とが入れ替わる。
【００２４】
その結果、サンプル（５μL程度）の両端には各々１μL程度のエアが配置され、バッファー液との接触・混合が防止される。そして、第一のポンプ６、及び、第二のポンプ４により、両端がエアに挟まれたサンプル液は、反応部１に流量５μL／分で導入される。そして、右側のエアが反応部１から出た状態でサンプル液の導入が停止する。この時、反応部１に導入されていないサンプルの体積は３μL程度である。反応部１は恒温部７にあるペルチェ素子により３７℃程度に制御される。サンプルが右方に向かって移動するように、第二のポンプ４と第一のポンプ６は流量５μL/分で同時に０．６分間だけ吸引、押し出しを行う。その後、約４秒間（待ち時間）だけポンプ４、６の動作停止の結果、右側のエアは、反応部１に接する位置で停止する。次に、第二のポンプ４と第一のポンプ６によりサンプルが左方に向かって流量５μL/分で０．６分間だけ移動し、約４秒間（待ち時間）だけポンプ４と６は停止する。
【００２５】
上記の往復運動を所定の時間（回数）だけを繰り返すことにより、化学反応は促進される。ここでは、流路３３を３つ有するインジェクションバルブを示したが、この流路の数は３つに限らない。ここでのインジェンクションバルブ（試料導入部）は、サンプル液(試料)を保持するための試料保持部、つまりサンプルループを有し、そのサンプルループに試料を導入させ、次いで気体もしくは液体をサンプルループに導入させて先に導入していた試料をサンプルループから導出させることにより、反応部１へ試料を導入させるものである。サンプルループの内容積は導入するサンプルの体積に対応し、２μLあるいは５μL程度のものを目的に応じて使用する。図３に示す実施例と比較し、最初に吸引するエアの体積は、サンプル体積に依存せずに２μL程度でよく、図３に示す例より小さいのでエア吸引時間が短縮できる。インジェクションバルブ内の回転する流路３３における内容積は微小であり、流路３３に導入されるエアの体積は１μLより充分に少ないことが多いからである。
【００２６】
図５に、一実施例に基づく化学反応装置の構成図を示す。この例では、サンプル導入部２８にサンプルが導入される流路２９と反応部１が組み込まれている。図３に示す実施例との対比では、インジェクションバルブ（６方バルブ）のサンプルループに反応部１を追加した構成であり、反応部１の一端はバルブの切替面に接するように配置される点が特徴である。エアが導入される流路３０と、サンプルが導入された流路２９及び反応部１とが、切り替えられることにより、サンプルの両端がエアに挟まれた構成をとることができる。そのため、サンプルを反応部１に移動させるプロセスが不要となり、処理の高速化が実現する。サンプル導入部２８は恒温部７に設置されるため、特にサンプル体積が大きい場合には、反応温度の制御が容易である。
【００２７】
図６に、一実施例に基づく化学反応装置の構成図を示す。この例では、サンプル導入部２８と反応部１との間にバルブ２が配置されている。送液シーケンスは以下の通りである。（ａ）バッファー液が満たされたバルブ２はエア導入口３に結合され、ポンプ４によりエアを所定の体積だけ吸引する。次に、バルブ２は回転し、流路はサンプル導入部２８への流路に結合する。（ｂ）ポンプ４が流量５μL／分で押し出しをすることによりエアは移動するが、サンプル導入部２８にある流路２９の両端からエアが各々１μL程度づつはみ出した状態でポンプ４は停止する。一方、流路２９には、サンプル導入口５よりサンプル（図では黒で表示）が吸引または押し出しにより導入される。（ｃ）サンプル導入部２８では、サンプル導入部２８が回転し、サンプルが導入されている流路２９とエアが導入されている流路３０との位置が入れ替わる。その結果、サンプルの両端には各々１μL程度のエアが配置され、バッファー液との接触・混合が防止される。（ｄ）両端がエアに挟まれたサンプルはポンプ４により吸引され、反応部１に移動する。そして、（ｅ）右側のエアが反応部１から出た状態で停止する。バルブ２は回転し、ポンプ６に結合する。
【００２８】
反応部１は恒温部７にあるペルチェ素子により３７℃程度に制御される。（ｆ）サンプルが右方に向かって移動するように、第二のポンプ４と第一のポンプ６は流量５μL/分で所定の時間だけ同時に吸引、押し出しを行う。その後、約４秒間（待ち時間）だけポンプ動作を停止させる結果、右側のエアは、反応部１に接する位置で停止する。次に、第二のポンプ４と第一のポンプ６によりサンプルが左方に向かって流量５μL/分で所定の時間だけ移動し、約４秒間（待ち時間）だけポンプ４と６は停止する。上記の往復運動を所定の時間（回数）だけを繰り返すことにより、化学反応は促進される。以下のサンプル排出、及び、クリーニングにおける送液プロトコルは、図２に示すプロトコルに準じる。この例では、サンプル導入部２８を反応部１から離れた位置に配置できるため、反応部１の温度制御が容易となる。
【００２９】
図７に、本発明の一実施例に基づく送液プロトコルに従った化学反応装置の動作シーケンスを示す。化学反応装置は反応部１、バルブ２、エア導入口３、サンプル導入口５、バッファー導入口９、恒温部７、第一のポンプ６、第二のポンプ４、及び、排出口８から構成される。反応動作の開始前には、反応部１はバッファー液で満たされ、第一のポンプ６や第二のポンプ４に繋がる配管もバッファー液などの液体で満たされる。また、ペルチェ素子などからなる恒温部７により反応部１は予め定められた温度に制御される。（a）バルブ２が第二のポンプ４とエア導入口３とを接続し、第二のポンプ４により所定の体積のエアがバルブ４より第二のポンプに結合された配管に向けて導入される。（b）次に、バルブ２が回転し、サンプル導入口５と第二のポンプ４とを接続し、第二のポンプ４により所定の体積のサンプルがバルブ２より第二のポンプ４に結合された配管に向けて導入される。（c）再度バルブ２が回転し、第二のポンプ４とエア導入口３とを接続し、第二のポンプ４により所定の体積のエアがバルブ２より第二のポンプ４に結合された配管に向けて導入される。
【００３０】
図３（c）の状態に対応する。（d）バルブ２が回転し、バルブ２より第二のポンプ４に結合された配管に向けて導入されたエア/サンプル/エアは反応部１の入口に接続される。第一のポンプ６と第二のポンプ４により、サンプルは反応部１を満たすまで第一のポンプ６方向に移動する。（e）所定の時間だけ、サンプルは反応部１の中を往復運動する。トリプシンを用いたタンパク質の酵素消化反応の場合には１０分ほどで、タンパク質はペプチド化する。この時間設定は反応部に固定された化学物質の種類やサンプルの種類に応じて、設定することができる。（f）バルブ１４によりバルブ２と排出口８とが接続される。第一のポンプ６により、サンプルは反応部１から排出され排出口８方向に移動し外部に排出される。（g）バルブ１４が動作し、第二のポンプ４に向けた配管とバルブ２とを接続する。次に、バルブ２が回転し、バッファー導入口９と第二のポンプ４に向けた配管を接続する。そして、バッファー導入口９より新しいバッファー液を導入する。（h）バルブ２が回転し、第二のポンプ４に結合された配管は反応部１に接続され、新しいバッファー液が反応部１に導入される。新しいバッファー液は反応部１を往復運動するなどして反応部１などを洗浄する。
【００３１】
その後、バルブ１５が動作し、排出口１６と反応部１とが接続され、第二のポンプ４により排出口１６よりバッファー液が排出される。引き続き反応過程を行う場合には、上記＜エア吸引＞のプロセスに戻る。一方、反応過程を終了する場合には、恒温部７により反応部１の温度は４℃に低下され、反応部１の機能低下を防止する。反応部１は繰返し使用できるが、機能が低下した場合には交換が必要である。図８（b）に示すように、セルのキャピラリー１０をアルミなどの熱伝導性の高い材質の容器２８に固定し、キャピラリー１０の両端にフィッティング２９を装着できるようにしておくと、反応部１の交換が容易となる。ここでは、バルブ２を恒温槽の内部に設置したが、バルブは高温そうの外部に設置してもよい。なお、図７では省略したが、試料導入部は、図1(a)、図３、図４、図６のように恒温部の外に設けてもよく、また図1(b)、図５のように恒温部の内部に設けてもよい本実施例では、サンプル導入口５からサンプルを吸引するため、サンプルがチューブなどの容器で供給されることが望ましい。この場合、バルブ２の流路の内径が充分に大きければ、（a）、（b）、（c）でエアやサンプル吸引を実施する際に、吸引の流量を５μL程度に高く設定しても高精度で液体を移動させることができる。そのため、図1に示す実施例と同程度の時間で処理を実現することができる。
【００３２】
本発明の一実施例に基づく化学反応装置における反応部１の構造を、図８（a）に示す。長さ２００ｍｍのキャピラリー１０（内径１５０μｍ、外径３６０μｍ）には、トリプシン酵素を固定化したガラスビーズ１１（直径１０３μｍ）が約２８００個導入される。キャピラリー１０の両端部には、ガラスビーズ１１を固定するために、別の石英キャピラリー１２（内径５０μｍ、外径１５０μｍ、長さ５ｍｍ）が挿入される。キャピラリー１０、１２の内面には、サンプルの吸着を防止するためのコーティングを施すことが有効だが、ガラスビーズ１１と同様の化学物質を固定化しても構わない。このような構造の反応部では、反応部体積が約２μLとなる。
【００３３】
一例として、トリプシン固定化ガラスビーズの作製方法について述べる。表面がアミノ基で修飾されたガラスビーズ１１へのトリプシン固定化は、以下の手順で行うことができる。
１．  ＜ビーズ表面アミノ基をカルボキシル基に置換＞ポリプロピレン製チューブ（２ｍＬ容器）にアミノ基修飾ガラスビーズ（100ｍｇ）を入れ、そこに濃度480mＭの無水コハク酸溶液（溶媒：１-メチル-２-ピロリドン）を500μＬだけ添加する。
２．  上記チューブごと、無水コハク酸溶液とビーズを50℃で60分間攪拌する。
３．  濃度0.1Ｍのホウ酸バッファー（ｐＨ8.0）を500μＬだけ上記チューブに加え、20℃で10分間放置する。
４．  1ｍＬの純水でチューブ内のビーズを洗浄する。この洗浄プロセスは６回繰り返す。
５．  ＜カルボキシル基の活性化＞20ｍＭのＮ-ヒドロキシスクシンイミドと0.1ＭのＮ-エチル-N'-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドの混合溶液（1ｍＬ、溶媒：濃度0.1Ｍのホウ酸バッファー(pH6.2)）でビーズを１回洗浄する。
６．  ビーズに20ｍＭのＮヒドロキシツクシイミドと0.1ＭのＮ-エチル-Ｎ-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドの混合溶液（1ｍＬ、溶媒：濃度0.1Ｍのホウ酸バッファー(pH6.2)）を添加する。チューブごとビーズを氷上で30分間放置（時々攪拌）し、ビーズのみ回収する。
７．  ビーズを200μＬの濃度0.1Ｍホウ酸バッファー(pH6.2)で洗浄する。
８．  ＜トリプシン固定化＞40ｍｇトリプシンを800μＬの濃度0.1Ｍホウ酸バッファー(pH6.2)に溶解させ、ビーズに添加する。４℃で一昼夜（16時間）放置する。
９．  ビーズを2ｍＬの濃度10ｍＭ Tris-HCl溶液（pH8.0）で洗浄する。この洗浄プロセスを６回繰り返す。
１０．ビーズを濃度10mM のTris-HCl溶液（pH8.0）に浸し、４℃で保存する。
【００３４】
これまで述べた化学物質固定化法は、必ずしもトリプシンのみの固定化に適用が限定される訳ではない。得られた酵素固定化ガラスビーズ１１をバッファー液とともにキャピラリー１０にポンプなどを使用して吸引することにより、図８に示すようにキャピラリー１０に充填することができる。ビーズの充填具合を観測するために、キャピラリー１０の材質は実質的に透明であることが望ましい。この酵素固定化ガラスビーズ１１は、乾燥すると酵素活性が低下する傾向がある。そこで、一旦製作された反応部１にはバッファー液を充填し、蓋をするなどして乾燥を防止し、４℃で保存することが望ましい。以上のような取り扱いにより、反応部１を繰返し使用しても、反応部１の酵素活性は保持される。また、図８（b）に示すように、セルのキャピラリー１０をアルミなどの熱伝導性の高い材質の容器３８に固定し、キャピラリー１０の両端にフィッティング３９を装着できるようにしておくと、反応部１の交換が容易となる。
【００３５】
また、図８ではガラスビーズに酵素を固定化し、ガラスビーズをキャピラリー内にほぼ一列並べる例を示したが、酵素を固定化した硬質微粒子（あるいは構造物）を流路に配置して先述の条件で動作させてもよい。例えば、図９に示すように、シリコン基板４０に流路４１、及び、乱流を生じさせるための構造物４２を配置したセルであってもよい。ガラス基板４３に穴４４をあけ、シリコン基板４０に接合することにより、セルを形成することができる。後述のように、乱流を生じさせるための微粒子（あるいは構造物）はガラスのように硬質であることが望ましいが、ゲルのような軟質でなければなく、材質がＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの樹脂でも構わない。
【００３６】
反応部１におけるサンプルの送液条件は、化学反応の効率に強く関係する。例えば、流量（流速）が充分に低い場合には、液体の流れは層流となる。この場合、サンプル分子の流れに対する垂直な運動成分が熱拡散により生じ、この熱拡散が化学物質の固定された壁面との衝突を支配する。衝突過程のなかで、一定の確率で化学反応は進められる。サンプル分子がタンパク質の場合には、拡散速度は１０μｍ/秒程度であり、壁面近傍のサンプル分子のみが化学反応を起こすが、流れの中心部にある大半のサンプル分子は壁面近傍に移動するには充分な時間が必要である。即ち、サンプル分子全体の化学反応は充分な時間を掛けないと困難である。一方、流量（流速）が充分に高い場合には、液体の流れは乱流となる。この場合、乱流拡散が反応効率の向上に本質的な役割を果たすため、全てのサンプル分子が壁面に衝突し易くなり、全体の化学反応効率は向上する。完全な乱流でなくても、部分的な乱流が生じる遷移流であれば、層流の場合に比較して化学反応効率は増加するため、有効である。
【００３７】
一般に、円管に対する抵抗係数Cがレイノルズ数Reの−１乗に比例する場合には、層流が形成されることが知られる。一方、乱流の場合には、抵抗係数Cはレイノルズ数Reの０乗に比例し、部分的に乱流が発生する遷移域の流れに対してはレイノルズ数Reの約−1/2乗に比例するといった中間的な依存性を示すとされる。乱流拡散が有効なのは遷移流、及び、乱流であるため、抵抗係数Cはレイノルズ数Reの０乗から−１乗の範囲のべき乗に比例する場合に相当する。抵抗係数Cは流量Qの−２乗に比例し、背圧△Pの１乗に比例する。また、レイノルズ数Reは流量Qに比例する。以上より、乱流拡散が有効であるのは、以下の条件との結論が得られる。
【００３８】
【数１】
2005318834.tif 000003
上式において、△PがQに比例する場合が層流に相当し、Qの２乗に比例する場合が完全な乱流に相当する。実際には、完全な乱流を実現することは物理的に困難な場合が多く、層流でなければ乱流拡散は有効である。即ち、△PはQの（１．５±０．４）乗に比例する条件であれば、充分な効果が得られる。
【００３９】
実際には、上記条件を満たすように、予め送液条件（流量）を設定しておくことが現実的である。例えば、液体クロマトグラフ用ポンプを使用すると、反応部１に対する液体流量Qと背圧△Pの関係を調べることができる。これより、上式のような非線型関係を満たす適当な流量を決定すれば、乱流拡散を用いた化学反応を実現させることができる。図１０に、酵素消化反応結果を示す。用いたサンプルはチトクロムCタンパク質であり、反応部１にはトリプシン酵素を固定化した。また、流量が５μL/分の場合、背圧△PはQの約１．６乗に比例し、上記条件が満たされることを確認した。図中、縦軸は残存するタンパク質の量（相対値）であり、横軸は反応時間である。層流の場合には、反応は流量には依存せず反応時間に依存するはずである。図１０において流量が５μL/分の場合と２．５μL/分の場合を比較すると、流量が半分になると、反応時間は同一であるにも関わらず、反応効率は低下することが示される。このことは、乱流や遷移流の特徴である。より高い液体流量で反応を行えば、反応効率はさらに向上すると期待されるが、背圧△Pも顕著に増大する。そのため、配管やキャピラリーの接続部では液体リークが発生しないように注意する必要がある。
【００４０】
両端を空気で挟まれた試料溶液を反応部内で往復させる時に、空気が反応部に何度も入ると、溶液に細かい気泡が混入するとともに、サンプル溶液がバッファー液で希釈されるという問題が発生することがある。その場合には、試料の損失にもつながり得る。そこで、試料溶液を反応部内で往復させる時には、試料溶液の両端にある空気が反応部の内部の化学物質を固定化した領域に接触しないようにする要がある。そのために、最初に吸引する試料溶液は設定通りの体積であることが必要である。ところが、サンプルを導入する際、図７に示すようにキャピラリー内をエアで挟まれた液体を吸引すると、液体の粘性および空気層の体積変化により、細管内に所定量の液体が導入されない場合もある。
【００４１】
図１１に、内径１５０ μｍの石英キャピラリーを用いて空気を１μＬ吸引し、次にサンプル溶液を５ μＬ吸引した際の、吸引試料の不足体積測定結果例を示す。このデータは、バッファー溶液が満たされたキャピラリーをバッファー溶液が満たされたシリンジに結合し、チューブに入れられたサンプル溶液をプログラミング可能なシリンジポンプにより吸引して得られたものである。実際のタンパク質溶液は粘性が高いことがあるので、サンプル溶液としてポリエチレングリコール水溶液（分子量1,000,000、５０ g/L）を使用した。また、図中の所要時間は、空気を吸引する時間と、試料溶液を吸引する時間と、待ち時間（図中の数字（分））との和である。実際には、待ち時間とは空気の吸引の後に一定時間吸引を停止させる時間を指し、待ち時間を設定しない限り、試料吸引量が不足することがあり得る。そこで、吸引時の流量に対し、吸引を停止する待ち時間を変化させ、最終的に吸引された試料の不足体積を測定した。
【００４２】
図１１に示す測定結果では、吸引の流量が低いほど、また待ち時間が長いほど、吸引量の不足は減少する傾向が示される。そして、吸引される試料溶液体積の不足を５％以内（0.25μＬ以下）に収めようとする際には、所要時間が７分以上必要になることが示される。反応時間が１０分程度であるため、処理を高速化するためにはこの所要時間はより短いことが望ましい。
【００４３】
これに対し、ここで開示した図３から６に示すような試料導入部を用いて試料を導入する方法では、試料を５μＬ/分もの速さで試料吸引量をほとんど不足させることなく移動させることが可能である。あらかじめ空気を導入しておけば、試料が５μｌの場合、導入に要する時間は１分程度（図中の領域58）に抑えることができ、定量的かつ高速の処理が可能となる。また試料導入時間を考慮しなくても良い場合には、吸引の流速を低く設定すればよい。
【００４４】
図１２に、液体クロマトグラフ/質量分析装置（ＬＣ/ＭＳ）を用いたタンパク質の解析プロトコル、及び、本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システム（ショットガン解析システム）の構成図との関係を示す。図中、点線で囲った部分が本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システムである。生体から得られる生体サンプルは、液体クロマトグラフやアフィニティーカラムなどにより分離・精製される。分離・精製により得られるサンプル（タンパク質混合液）は、化学反応装置において、固定化されたトリプシンなどの消化酵素によりペプチド化される。そして、ペプチド混合液は、逆相カラムによる液体クロマトグラフ（1D-HPLC）またはイオン交換カラムと逆相カラムによる液体クロマトグラフ（2D-HPLC）により分離され、分離ペプチドは質量分析装置でタンデム質量分析（MSｎ）される。得られた質量分析結果は、情報処理装置に送られ、データベース検索される。
【００４５】
検索結果より、もともと存在したタンパク質が同定される。化学反応装置の部分が、従来のバッチ処理で行うと８〜１６時間要する。2D-HPLCでは半日、1D-HPLCでは１時間程度必要であり、化学反応過程を含めると、従来では２日は必要だった。しかし、本発明の化学反応装置を用いると、半日程度で結果が得られることになり、スループットが大幅に向上する。また、生体から得られる生体サンプルはできるだけ微量であることが望ましく、そのためにはバッチ処理による損失が課題である。サンプルを希釈すると、サンプル液体の表面積が増大するため、容器やなどでの吸着による損失が無視されない。本発明の化学版の装置では、微量サンプルをできるだけ希釈せず、オンライン処理できるため、サンプルの損失を防止でき、システム全体の高感度化が実現する。この解析システムで用いられるデータベースは、入力操作により予め構築しておいたものでもよく、また外部データベースを利用し、サーバーを介して更新データにアクセスしてバージョンアップする形式のものであっても良い。
【００４６】
図１３に、2D-HPLCの部分の詳細図を示す。化学反応装置の排出口８が2D-HPLCのインジェクションバルブまたはトラップカラムにオンラインで接続されることが示される。一次元目の分離カラム４７（イオン交換カラムなど）には、組成の異なる溶媒が液体リザーバー４８よりポンプ４９、及び、ミキサー５０によりバルブ５１を経て導入される。一次元目の分離カラム４７で分離されたサンプルは、六方バルブ５２に接続されたトラップカラム５３に一旦吸着される。次に、二次元目の分離カラム５４（逆相カラムなど）に向けて、組成の異なる溶媒が液体リザーバー５５よりポンプ５６、及び、ミキサー５７によりバルブ５２を経て導入される。二次元目の分離カラム５４で分離されたサンプルは質量分析装置（ＭＳ）に導入され、質量分離される。ＭＳの出力は出力表示部で表示される。1D-HPLCを用いる場合にも同様に化学反応装置がオンラインで接続される。このようなシステムにおいても、化学反応装置における処理時間は実際の反応時間と大差ないことが望ましく、図３から６に示すような試料導入部を用いて試料を導入する方法は有効である。
【００４７】
図１４に、質量分析装置を用いた糖鎖の構造解析（糖鎖シーケンス解析）プロトコル、及び、本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システムの構成図との関係を示す。図中、点線で囲った部分が、本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システムである。この場合には３種類の化学反応（タンパク質消化、糖鎖脱離、糖鎖消化）が必要であり、図に示すように３種類の化学反応装置が用いられる。固定化される酵素の種類、及び、反応部１の構造や反応時間、温度などが異なるだけである。従来は３種類の化学反応をバッチで処理するだけで２日程度は必要だったが、本発明の化学反応装置を用いることにより１時間程度に短縮することが可能である。ここでも、化学反応装置における処理時間は実際の反応時間と大差ないことが望ましく、図３から６に示すような試料導入部を用いて試料を導入する方法は有効である。
【００４８】
また、1D-HPLC/ＭＳnシステムにおいて、短時間で液体クロマトグラフが完了する場合には、図１５に示すように複数の化学反応装置を並列で動作させることができる。このような高スループット解析では、液体クロマトグラフでの分離に要する時間との兼ね合いで、化学反応装置の数を最適化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１（ａ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構造図。
【図１（ｂ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構造図。
【図１（ｃ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構造図。
【図２】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の制御系統図。
【図３（ａ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｂ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｃ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｄ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｅ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｆ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｇ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図３（ｈ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における典型的な送液プロトコル。
【図４（ａ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図４（ｂ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図４（ｃ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図４（ｄ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図５】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ａ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ｂ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ｃ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ｄ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ｅ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図６（ｆ）】本発明の一実施例に基づく化学反応装置の構成図（概略）。
【図７】本発明の一実施例に基づく送液プロトコルに従った化学反応装置の動作シーケンス。
【図８】本発明の一実施例に基づく化学反応装置における反応部１の構造。
【図９】サンプル吸引に要する時間と不足体積との関係図。
【図１０】本発明の一実施例に基づく構造物を流路に配置する化学反応装置の模式図。
【図１１】本発明の一実施例に基づくタンパク質の酵素消化反応結果。
【図１２】質量分析装置を用いたタンパク質の解析プロトコル、及び、本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システム（ショットガン解析システム）の構成図。
【図１３】2D-HPLCの部分の詳細図。
【図１４】質量分析装置を用いた糖鎖の構造解析（糖鎖シーケンス解析）プロトコル、及び、本発明の一実施例に基づく化学反応装置を組み込んだ解析システムの構成図。
【図１５】複数の化学反応装置を並列で動作させる解析システムの構成図。
【符号の説明】
【００５０】
１：反応部１、２：バルブ、３：エア導入口、４：第二のポンプ、５：サンプル導入口、６：第一のポンプ、７：恒温部、８：排出口、９：バッファー導入口、１０：キャピラリー、１１：ガラスビーズ１１，１２：別の石英キャピラリー、１３：キャピラリー、１４：別のキャピラリー、１５：バルブ、１６：排出口、２８：サンプル導入部、２９：流路、３０：流路、３１：バッファー排出口、３２：バルブ、４０：シリコン基板、４１：流路、４２：構造物、４３：ガラス基板、４４：穴、４７：一次元目の分離カラム、４８：液体リザーバー、４９：ポンプ、５０：ミキサー、５１：バルブ、５２：六方バルブ、５３：トラップカラム、５４：二次元目の分離カラム、５５：液体リザーバー、５６：ポンプ、５７：ミキサー、５８：領域。
【図１（ａ）】
2005318834.tif 000004
【図１（ｂ）】
2005318834.tif 000005
【図１（ｃ）】
2005318834.tif 000006
【図２】
2005318834.tif 000007
【図３（ａ）】
2005318834.tif 000008
【図３（ｂ）】
2005318834.tif 000009
【図３（ｃ）】
2005318834.tif 000010
【図３（ｄ）】
2005318834.tif 000011
【図３（ｅ）】
2005318834.tif 000012
【図３（ｆ）】
2005318834.tif 000013
【図３（ｇ）】
2005318834.tif 000014
【図３（ｈ）】
2005318834.tif 000015
【図４（ａ）】
2005318834.tif 000016
【図４（ｂ）】
2005318834.tif 000017
【図４（ｃ）】
2005318834.tif 000018
【図４（ｄ）】
2005318834.tif 000019
【図５】
2005318834.tif 000020
【図６（ａ）】
2005318834.tif 000021
【図６（ｂ）】
2005318834.tif 000022
【図６（ｃ）】
2005318834.tif 000023
【図６（ｄ）】
2005318834.tif 000024
【図６（ｅ）】
2005318834.tif 000025
【図６（ｆ）】
2005318834.tif 000026
【図７】
2005318834.tif 000027
【図８】
2005318834.tif 000028
【図９】
2005318834.tif 000029
【図１０】
2005318834.tif 000030
【図１１】
2005318834.tif 000031
【図１２】
2005318834.tif 000032
【図１３】
2005318834.tif 000033
【図１４】
2005318834.tif 000034
【図１５】
2005318834.tif 000035