(57)【要約】【課題】  結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブ、プローブが固定化されているマイクロアレイ及びプローブを設計する方法を提供する。【解決手段】  標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差値が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブ。【選択図】図３Ａ
2005318895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドプローブの長さは、１５ないし５０ｂｐである請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプローブが固定化されているマイクロアレイ。
【請求項４】
野生型標的核酸に完全マッチするように結合する野生型プローブ（ｗｐ）及びその相補的配列の融解温度（Ｔｍ）と、突然変異型標的核酸に完全マッチするように結合する突然変異型プローブ（ｍｐ）及びその相補的配列の融解温度との差が０℃ないし７℃である請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算して、その差が０℃ないし７℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸との結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「ポリヌクレオチドマイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度で固定化されているものであり、前記ポリヌクレオチドグループは、それぞれ一定の領域に固定化されているマイクロアレイを意味する。このようなマイクロアレイは当業界で周知のものである。マイクロアレイについては、例えば、特許文献１及び２に開示されている。基板上に固定化されているポリヌクレオチドは、一般的に分析しようとする核酸と特異的結合、例えば、ハイブリダイゼーション結合を行い、このような特異的結合を通じて標的核酸を分析する。基板上に固定化されており、標的核酸とハイブリダイゼーション結合を行えるポリヌクレオチドを、プローブポリヌクレオチド（または、オリゴヌクレオチド）という。
【０００３】
従来ポリヌクレオチドプローブの設計は、一般的に、標的核酸との融解温度を含む熱力学的変数、長さ、分子内のホモダイマーの形成如何、他のポリヌクレオチドプローブとの配列相同性の存否及び標的部位の位置などを考慮して設計された。それらのうち、熱力学的変数は、プローブ配列と標的核酸との混成化エネルギーを考慮するものであり、一定の範囲の融解温度を持つプローブを選択した。このような融解温度が高い場合には、特異的結合が増加し、低い場合には、非特異的結合が増加する傾向がある。したがって、従来のプローブ設計過程では、適当な範囲の融解温度を任意的に選択した。プローブの長さは、一般的に１５ないし５０ｂｐの長さが使われるが、これに限定されるものではない。プローブ分子内のホモダイマー形成や他のプローブとの配列相同性が存在する場合には望ましくなく、これを回避できる配列を持つことが望ましい。また、標的部位の位置は、一般的に立体的効果などを考慮してプローブの中央に対応するように位置させることが望ましい。
【０００４】
しかし、従来のポリヌクレオチドプローブの選択方法によれば、融解温度は、プローブ全体についてのみ考慮されたため、融解温度が同一または類似していても、標的部位に対応するヌクレオチドを基準として５’及び３’末端側のオリゴヌクレオチドの融解温度が顕著に異なる場合には、非特異的結合が発生する可能性があった。
【０００５】
本発明者らは、このような従来技術の問題点を解決するために集中的に研究していたところ、標的部位に対応するヌクレオチドから５’側に、最初のヌクレオチドから５’末端までのヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列、または３’側に、最初のヌクレオチドから５’末端までのヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列の標的核酸との融解温度が類似しているか、または同じ場合には、非特異的結合を顕著に減少させることができるということを見出して、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７４４，３０５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、前記プローブが基板上に固定化されているマイクロアレイを提供することである。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一形態によれば、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００１０】
本発明の他の形態によれば、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算して、その差が０℃ないし７℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブによれば、標的核酸とのハイブリダイゼーション反応で非特異的反応が起きることを減少できる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイの基板に固定化されて使われる。
【００１２】
本発明のマイクロアレイによれば、基板上に固定化されているオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドから、５’末端側配列及びそれと相補的な配列の融解温度と、３’末端側配列及びその相補的配列の融解温度との差が小さいために、マイクロアレイを利用する分析方法で、強いハイブリダイゼーション信号を得ることができる。
【００１３】
また、本発明の標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法によれば、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを製作できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、添付した図面を参照して本発明の望ましい実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明の一形態は、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。
【００１６】
本発明において、オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション反応を行い、得られるハイブリダイゼーション反応の程度を利用して標的核酸の遺伝子型を分析するのに使われるハイブリダイゼーションプローブを意味する。本発明において、標的核酸とは、分析しようとする標的部位を持っている核酸または核酸試料を意味する。「標的部位」とは、ヌクレオチドの変異が見つけられる標的核酸中の特定のヌクレオチド位置をいう。前記変異には、対立形質変異、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）などが含まれるが、それらの例に限定されるものではない。また、変異を誘発させる原因には天然及び人工的な突然変異が含まれ、本発明で使われる変異は、それを誘発する原因によって特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明において、融解温度（Ｔｍ）とは、２本のポリヌクレオチドがアニーリングによってハイブリダイゼーションされる場合、得られる２本鎖ポリヌクレオチドの最大値の半分に相当する２本のポリヌクレオチドが得られる温度、または２本のポリヌクレオチドが熱によって解離される場合、前記２本鎖ポリヌクレオチドの半分が解離する温度を意味する。融解温度は、ポリヌクレオチド中の塩基含有量、長さ、及び溶液中の塩の濃度によって変わることがある。本発明における融解温度（Ｔｍ）は、当業界で一般的に使われている溶液条件における融解温度を意味する。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドを除外した５’末端側のオリゴヌクレオチド配列及びこれに対応する標的核酸の融解温度と、標的部位に対応するヌクレオチドを除外した３’末端側のオリゴヌクレオチド配列及びこれに対応する標的核酸の融解温度とが、互いに類似している。このような融解温度の差は、望ましくは０℃ないし７℃、さらに望ましくは０℃ないし５℃である。融解温度の差が前記条件を満足する限り、前記５’末端側のオリゴヌクレオチドと、前記３’末端側のオリゴヌクレオチドとの長さは同じであっても、異なってもよい。しかし、一般的に立体的効果などを考慮して、標的部位がオリゴヌクレオチドの中央部位近くに対応するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブが使われる。したがって、望ましくは、前記５’末端側のオリゴヌクレオチドと前記３’末端側のオリゴヌクレオチドとの長さは、類似または同一である。
【００１９】
本発明において、オリゴヌクレオチドプローブの長さは、当業界で一般的に使われている範囲の長さが使われ、特別に限定されるものではない。例えば、１５ｂｐないし５０ｂｐ、さらに望ましくは１５ｂｐないし４０ｂｐ、最も望ましくは２０ｂｐないし３０ｂｐである。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定化されて、標的核酸の分析に効果的に利用される。望ましくは、前記ＤＮＡマイクロアレイ基板上に固定化される本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ相互間にも類似した融解温度を持っており、それにより、前記マイクロアレイを利用して得られるハイブリダイゼーション反応の結果の品質を改善させることができる。
【００２１】
したがって、本発明のさらに他の形態は、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブが固定化されているマイクロアレイを提供する。すなわち、本発明のマイクロアレイに固定化されるオリゴヌクレオチドプローブは、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差が０℃ないし７℃であることが望ましく、より望ましくは０℃ないし５℃である。本発明のマイクロアレイに固定化される前記プローブは、野生型標的核酸に完全マッチするように結合する野生型プローブ（ｗｐ）及びその相補的配列との融解温度と、突然変異型標的核酸に完全マッチするように結合する突然変異型プローブ（ｍｐ）及びその相補的配列との融解温度の差も、０℃ないし７℃であることが望ましく、より望ましくは０℃ないし５℃である。
【００２２】
本発明のさらに他の形態は、標的部位に対応するヌクレオチドから５’末端側に、最初のヌクレオチドから５’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）と、標的部位に対応するヌクレオチドから３’末端側に、最初のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列、及びそれと相補的なオリゴヌクレオチド配列との融解温度（Ｔｍ）との差を計算し、その差が０℃ないし７℃、望ましくは０℃ないし５℃となるオリゴヌクレオチドプローブを選択する段階を含む、標的部位に対する結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法を提供する。
【００２３】
本発明において、配列が知られたオリゴヌクレオチドの融解温度の計算方法は、当業界で周知のものである。このような融解温度の計算方法の例としては、サンタルチア（Ｊｏｈｎ  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ．）が、１９９６年以後持続的にヌクレオチドの反応実験の結果を発表しており、それら各場合による融解温度（Ｔｍ）などが広く使われている。また、このような融解温度の計算のために、商業的に利用可能なプログラムであるビジュアルＯＭＰ（ＤＮＡ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．製、米国）または公衆ウェブサイトに開放されているＭＥＬＴＳＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｍｅｌｔｓｉｍ／）などを使用できる。
【００２４】
本発明の方法において、前記融解温度の差と共に、従来のプローブ設計において一般的に考慮される事項が考慮される。このような考慮事項には、標的核酸との融解温度を含む熱力学的変数、長さ、分子内のホモダイマー形成如何、他のポリヌクレオチドプローブとの配列相同性の存否及び標的部位の位置などが含まれる。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
比較例：従来方法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計
本比較例では、従来のオリゴヌクレオチドプローブの設計方法によってオリゴヌクレオチドを設計した。
【００２７】
プローブ設計に考慮された事項は、融解温度を含むオリゴヌクレオチド全配列に対する熱力学的変数、標的部位はプローブの中央に対応させること、及びハイブリダイゼーション検索を通じて非特異的結合を最小化することなどが考慮された。
【００２８】
まず、分析しようとする突然変異部位を含む長さ１８ｂｐ〜２８ｂｐのプローブ候補配列を選択した。次いで、全体プローブと標的試料とのハイブリダイゼーションシミュレーションを実施して、Ｔｍが６５℃〜８０℃であるプローブを選択した。選択されたプローブを、選定された領域ではない他の標的配列部位に対してハイブリダイゼーションシミュレーションを実施して、相同性が５０％以上であるものを除外した。また、それらプローブに対しプローブ分子内のホモダイマーを形成する可能性があるかどうかを、シミュレーションを実施して確認し、ホモダイマー形成の可能性があるものは除外した。それらのうち、ＧＣ含有量が２０％〜８０％であるものを選択した。配列が完全に相補的な配列とのハイブリダイゼーション結果（完全マッチ）によるＴｍと、標的部位が相補的でない配列とのハイブリダイゼーション結果（ミスマッチ）によるＴｍとの差が３℃以上であるものを選択した。以上のように選択されたプローブのうち、完全マッチＴｍとミスマッチＴｍとの差が最も大きいものを選択した。
【００２９】
その結果、標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ１：配列番号１）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ１：配列番号２）とを得た。ＷＰ１及びＭＰ１の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は８．３℃であった（図１Ａ参照）。また、標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ３：配列番号５）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ３：配列番号６）とを得た。ＷＰ３及びＭＰ３の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は７．０℃であった（図２Ａ参照）。
【００３０】
ＷＰ１及びＭＰ１の全体Ｔｍは１．５℃しか差がないが、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は８．３℃で、相対的に大きい差が発生するために、非特異的結合が発生する可能性がある。ＷＰ３及びＭＰ３もまた全体Ｔｍは１．６℃しか差がないが、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は７．０℃で、相対的に大きい差が発生するために、非特異的結合が発生する可能性がある。このような非特異的結合は、特異的結合に比べて結合力は低いために、ハイブリダイゼーションの結果測定される蛍光強度を低める。また、非特異的結合が発生する場合、標的核酸との特異的結合が妨害されるという問題も発生する。
【００３１】
したがって、このような従来方法によるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法によれば、結合特異性が低いという短所がある。
【００３２】
実施例１：本発明によるオリゴヌクレオチドプローブの設計
本実施例では、前記比較例で考慮された事項に、標的部位に対応するヌクレオチドの５’末端側と３’末端側とのオリゴヌクレオチドのＴｍを計算し、これを比較してその差ができるだけ小さなオリゴヌクレオチドプローブを選択した。具体的には、比較例のように、全体プローブと標的試料とのハイブリダイゼーションシミュレーションを実施してＴｍが６５℃〜８０℃であるプローブを選択した後、標的部位、例えば、突然変異部位を基点として右側と左側とのＴｍの差が５℃以下であるものを選択する過程をさらに含むことを除いては、比較例と同一である。
【００３３】
その結果、標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ２：配列番号３）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ２：配列番号４）とを得た。ＷＰ２及びＭＰ２の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は１．４℃であった（図１Ｂ参照）。また、標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、完全マッチする野生型プローブ（ＷＰ４：配列番号７）と、標的部位のみマッチしていない突然変異型プローブ（ＭＰ４：配列番号８）とを得た。ＷＰ４及びＭＰ４の標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差は０．８℃であった（図２Ｂ参照）。
【００３４】
ＷＰ２及びＭＰ２の全体Ｔｍは、１．６℃しか差がないと同時に、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差もやはり１．４℃で、差が相対的に小さいために、非特異的結合が発生する可能性が少ない。ＷＰ４及びＭＰ４もまた全体Ｔｍは１．７しか差がないと同時に、標的部位に対応する部位のヌクレオチドを基準に、５’側配列と３’側配列とのＴｍの差も０．８℃で、差が相対的に小さいために、非特異的結合が発生する可能性が少ない。非特異的結合の比率が相対的に低くなるために、ハイブリダイゼーションの結果測定される蛍光強度が、従来方法によって設計されたプローブに比べて増加すると推定される。
【００３５】
実施例２：本発明のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーション結果に及ぼす影響
本実施例では、前記比較例及び実施例１で製作されたオリゴヌクレオチドプローブ、すなわち、野生型標的核酸に相補的なプローブＷＰ１、ＷＰ２、ＷＰ３及びＷＰ４と、突然変異型標的核酸に相補的なプローブＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３及びＭＰ４とをマイクロアレイで固定化し、ハイブリダイゼーション反応を行った後、その結果を分析した。
【００３６】
まず、標的核酸（Ｅ０１−１１またはＥ０２−２２）に対するプローブとして、前記プローブを基板上に固定化してマイクロアレイを完成した。対照群マイクロアレイには、ＷＰ１とＭＰ１、及びＷＰ３とＭＰ３プローブを同じ方法によって固定化した。マイクロアレイは、アミン基を持つＷＰ２とＭＰ２、及びＷＰ４とＭＰ４を、エポキシ基を持つポリエチレングリコール（ＰｏｌｙＥｔｈｙｌｅｎＧｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）誘導体を利用したハイドロゲルと混合したスポッティング溶液を使用して製造した。アミン基を持つように表面処理されたガラス表面に、前記のように構成されたスポッティング溶液をバイオロボットプリンタ（モデルＰｉｘＳｙｓ  ５５００、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ、米国）を利用してスポッティングした後、３７℃で４時間湿潤しているインキュベータに放置した。次いで、背景ノイズの制御に必要な工程、すなわち、標的核酸をガラス表面に付着させないために、スポッティングされていない位置のガラス表面アミン基が負電荷を持つように、反応を行って乾燥器に保管した。
【００３７】
標的核酸には蛍光物質をラベル化した。本実施例では、蛍光物質としてＣｙ３−ｄＵＴＰを使用し、標的核酸の本体または両末端にラベル化した。
【００３８】
標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション条件は、０．１％  ６×ＳＳＰＥＴ溶媒（０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＳａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ）に溶解させた２０ｎＭ濃度の標的核酸及びマイクロアレイを、３７℃で１６時間反応させた後、マイクロアレイを０．０５％  ６×ＳＳＰＥＴ及び０．０５％  ３×ＳＳＰＥＴで各５分ずつ常温にて洗浄し、５分間常温で乾燥させた後、スキャニングした。この時、スキャニングは、アクソンスキャナー（モデルＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，ＣＡ、米国）を利用し、スキャニングデータを解析するプログラムとして同社のＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ３．０プログラムを使用して比率成分及び強度成分を計算した。その結果を図３及び図４のＭＡグラフで図示した。各データは、正常型標的核酸とは約１００枚のチップとのハイブリダイゼーションを通じて、突然変異標的核酸とは約３０枚のチップとのハイブリダイゼーションを通じて得たものである。図３及び図４で、ｘ軸は強度成分（Ａ）を、ｙ軸は比率成分（Ｍ）を表す。比率成分（Ｍ）は、比率（ｒ）＝（野生型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＷＰ）／突然変異型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＭＰ））の値に自然対数を取った値である。突然変異型プローブとは、突然変異が含まれる核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであって、ＭＰ１（配列番号２）、ＭＰ２（配列番号４）、ＭＰ３（配列番号６）及びＭＰ４（配列番号８）が含まれる。野生型プローブは、野生型標的核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであって、ＷＰ１（配列番号１）、ＷＰ２（配列番号３）、ＷＰ３（配列番号５）とＷＰ４（配列番号７）が含まれる。強度成分（Ａ）は、野生型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＷＰ）及び突然変異型プローブのハイブリダイゼーション強度（ＭＰ）の最大値に、常用対数を取って得られる値である。
【００３９】
図３Ａは、従来方法によって設計されたプローブＷＰ１及びＭＰ１が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた結果を示すＭＡグラフである。図３Ｂは、本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ２及びＭＰ２が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。また、図４Ａは、従来方法によって設計されたプローブＷＰ３及びＭＰ３が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた結果を示すＭＡグラフである。図４Ｂは、本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ４及びＭＰ４が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。図３Ｂ及び図４Ｂで、Ｇ−ＤＮＡは、正常の人間から由来したゲノムＤＮＡ、Ｇ−ＭＩＭＩＣは合成されたＧ−ＤＮＡ、ヘテロ（Ｈｅｔｅｒｏ）及びホモ（Ｈｏｍｏ）は、それぞれ標的部位にヘテロ型またはホモ型突然変異を持つ人間由来のゲノムＤＮＡを、標的核酸として使用した場合の結果である。また、図３Ｂ及び図４Ｂに示すコントロール１及び２は、いずれもＧ−ＤＮＡと同一の実験条件下での再現性を確認するために行った反復実験の結果を示すプロットである。
【００４０】
図３Ａ及び図３Ｂ、並びに図４Ａ及び図４Ｂに示したように、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、蛍光強度はほぼ類似した値に維持しつつ、野生型プローブに対する突然変異型プローブの蛍光強度比が増加した。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、蛍光強度の差が増加して特異的検出が容易になった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、標的核酸との結合特異性が改善されたオリゴヌクレオチドプローブ、前記プローブが固定化されているマイクロアレイ及び前記プローブを設計する方法の技術分野に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、従来の方法によって設計された野生型及び突然変異型オリゴヌクレオチドプローブを示す図面である。
【図１Ｂ】標的試料Ｅ０１−１１（配列番号９）の３４２番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、本発明の方法によって設計された野生型及び突然変異型オリゴヌクレオチドプローブを示す図面である。
【図２Ａ】標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、従来の方法によって設計された野生型及び突然変異型オリゴヌクレオチドプローブを示す図面である。
【図２Ｂ】標的試料Ｅ０２−２２（配列番号１０）の１４７番目Ｃに相補的なヌクレオチド部位を標的部位とする場合の、本発明の方法によって設計された野生型及び突然変異型オリゴヌクレオチドプローブを示す図面である。
【図３Ａ】従来方法によって設計されたプローブＷＰ１及びＭＰ１が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションした結果を示すＭＡグラフである。
【図３Ｂ】本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ２及びＭＰ２が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。
【図４Ａ】従来方法によって設計されたプローブＷＰ３及びＭＰ３が固定化されている対照群マイクロアレイに、正常の人間由来のゲノムＤＮＡをハイブリダイゼーションした結果を示すＭＡグラフである。
【図４Ｂ】本発明の方法によって設計されたオリゴヌクレオチドプローブＷＰ４及びＭＰ４が固定化されたマイクロアレイに対する、標的核酸のハイブリダイゼーション結果を示すＭＡグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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