(57)【要約】      （修正有）【課題】眼局所移植における拒絶反応抑制ならびに緑内障、眼アレルギー炎症抑制に有効な結膜下投与に特定された新しい眼科用医薬品を提供する。【解決手段】Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する化合物からなる。【効果】細胞性免疫のＴｈ１応答と考えられるアロ移植片の拒絶反応の抑制ならびにＴｈ２応答と考えられる眼アレルギー、眼炎症を抑制する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する眼科用医薬品。
【請求項２】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する結膜下投与用眼科用医薬品。
【請求項３】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する、眼局所移植における拒絶反応抑制剤である結膜下投与用眼科用医薬品。
【請求項４】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する、移植される臓器が角膜、角膜内皮、角膜幹細胞などである請求項３に記載の移植拒絶反応抑制剤。
【請求項５】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する、緑内障、眼アレルギー炎症抑制剤である請求項１に記載の眼科用医薬品。
【請求項６】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する、緑内障、眼アレルギー炎症抑制剤である請求項２に記載の結膜下投与用眼科用医薬品。
【請求項７】
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンおよびそのエステルよりなる群から選択される少なくとも一種を含有する、アレルギー性結膜炎、急性結膜炎、慢性結膜炎、角膜フリクテン、点状角膜上皮症、強膜炎、ぶどう膜炎、網脈絡膜炎、虹彩炎などの眼アレルギー炎症抑制剤である請求項２に記載の結膜下投与用眼科用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新しい眼科用医薬品に関し、特に、結膜下投与による眼組織移植拒絶反応抑制剤ならびに眼アレルギー、眼炎症抑制剤からなる医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】  免疫系は、ウイルス、細菌等の外部からの感染、又は自己由来細胞が異常を来たすことで生成する細胞（癌細胞など）による生体侵襲から自己を防衛するためのシステムである。しかしながら、この免疫系が異常を来たし、過剰に働いたり、自己成分を排除する方向に免疫系が働いたりするとともに、逆に、排除機能が不全状態に陥ることがある。このような状態を惹起する疾患は総称して免疫性疾患と呼ばれる。例えばアトピー性皮膚炎、花粉症、喘息、ザルコイドーシスなどの急性並びに慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、慢性関節リウマチ、糖尿病（ＩＤＤＭ）、ＳＬＥ、慢性疲労性症候群などの自己免疫疾患や、肝炎、肝硬変、潰瘍性大腸炎、クローン病など消化管炎症（ＩＢＤ）、がん悪液質状態等数多くの疾患が含まれる。これら免疫性疾患の原因は様々であり、単純に免疫抑制、免疫増強と言う考えかたでは疾患に真に有用な医薬品を創製することは不可能である。一方、腎臓、肝臓、心臓、肺臓、皮膚、角膜など種々の臓器移植反応に際しては生体の有する免疫応答反応により移植片が拒絶され、脱落することが良く知られている。アロ移植拒絶反応と総称されるがその免疫学的機作も全く明らかにされていない。免疫応答を非選択的に抑制することで拒絶反応を抑制することは判明しているが、作用標的細胞への選択性が欠如するものが殆どで、発がん率の上昇、感染機会の増大など重篤な副作用を伴うことが多い。【０００３】  免疫を担当する細胞としてはＴリンパ球、Ｂリンパ球が良く知られ、各々細胞性免疫、液性免疫の担い手として多彩な機能を発揮する。一方、マクロファージ／単球（樹状細胞、ランゲルハンス細胞を含む）は細胞性免疫及び液性免疫に深く関与する細胞で、アレルギー、リウマチ等の免疫性疾患、癌、細菌感染、移植組織等の非自己である異物排除に深く関わっている。上述のような炎症性、アレルギー性、免疫性疾患の発症や臓器移植後の拒絶反応の病態進展に、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球やマクロファージ／単球は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、各々の細胞特異的機能を想定してのヒトの疾患の治療、改善、予防、移植分野への応用は依然として試行錯誤の状態にある。【０００４】  近年、末梢血中のヘルパーＴ細胞亜集団のタイプの片寄りが疾患と対応づけられつつあり、Ｔリンパ球中の亜集団であるヘルパーＴリンパ球が更に２つの亜集団Ｔｈ１とＴｈ２に分類され、その２種の存在比が生体の免疫機能の重要な指標になることが立証されつつある。本指標をもとに疾患の病態を診断したり、その存在比を改善することにより、より適切な治療法を樹立しようとの試みがなされつつある。すなわち、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を引き起こすＴｈ２がＴｈ１より多い場合（Ｔｈ１＜Ｔｈ２）、アレルギー性疾患が悪化するとされ、Ｔｈ１／Ｔｈ２を測定することにより、免疫の状態を検定したり、Ｔｈ１＞Ｔｈ２にすることによりアレルギーを抑制しようとする試みがなされつつある。逆に、Ｔｈ１が支配的な状況で引き起こされる疾患、生体反応の存在も慢性関節リウマチや移植拒絶反応などが上げられている。しかしながらこうした単純な考え方が全くの誤謬であることが近年明らかにされつつある。【０００５】  シスチン誘導体が免疫調整���（特許文献１）、炎症因子活性化抑制剤（特許文献２）として有用であることが開示されている。しかし。結膜下に投与することにより、眼局所移植における拒絶反応および眼アレルギー炎症を抑制することは知られていない。
【特許文献１】特開平１１−２４６４３５号公報
【特許文献２】特開２００２−２２６４５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルがＴｈ１応答で代表される細胞性免疫応答を抑制するか否かを明らかにし、同時に眼局所においてアロ移植時に認められるＴｈ２応答たるアレルギー性炎症応答を悪化させる可能性があるか否かを検討し、眼局所へのアロ移植における拒絶反応の新しい抑制剤、抑制方法を提供し、視力不全患者の視力回復に不可欠のアロ移植と言う医療行為が広汎に安全に行われるための技術を提供することを課題とする。即ち免疫学的拒絶反応（細胞性免疫が関与すると考えられていうる）と同時にアレルギー性炎症応答（液性免疫が関与すると考えられている）も抑制しうる新たな眼科用医薬品の開発が出来ないかどうか、その効能の発現には如何なる投与形態が望ましいかを明らかにすることを課題にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステル体はＴｈ１応答を抑制するのではないかと考え本発明者らは鋭意医研究を進め、医薬品化を目指した。ヒト角膜上皮細胞や結膜由来の線維芽細胞からのケモカイン産生を抑制することで、予期に反してＴｈ２応答を抑制することを新たに見い出した。また、結膜下に投与することで効率的にかつ局所的にＴｈ２応答と考えられる眼アレルギー炎症を抑制するとともに、Ｔｈ１応答と考えられるアロ移植片の拒絶反応を抑制することを見い出した。アロ移植に随伴する拒絶反応を抑制すると共に、拒絶反応時に認められる有害な炎症応答も抑制できることを見い出し、本発明の完成に至った。
即ち免疫学的拒絶反応（細胞性免疫が関与すると考えられていうる）と同時にアレルギー性炎症応答（液性免疫が関与すると考えられている）も抑制しうる新たな眼科用医薬品の開発に成功し、その効能は結膜下投与と言う特定化された具体的手法でさらに強く発揮されることを明確にすることで本発明を完成するに至ったのである。【０００８】  現在、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＩＬ−６、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−４とＩＬ−１２、ＩＬ−１８が生体内でどのような割合で産生されるかによって規定されるとされている。前３者によって液性免疫に関与するＴｈ２が、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８によって細胞性免疫に関与するＴｈ１が誘導されることが既に知られている。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８はマクロフアージから産生されることは判明しているが、同一のマクロフアージ細胞がＩＬ−６もＩＬ−１０もＩＬ−１２もＩＬ−１８も産生するとすると、Ｔｈ１誘導にもＴｈ２誘導にも関与する１種のマクロフアージが存在することとなり、生体の免疫応答を考えるに当り大きな矛盾にぶつかる。本発明者らはＧＳＨ含量の高い還元型マクロフアージによってのみＩＬ−１２が産生され、Ｔｈ１偏位が起こり、酸化型マクロフアージによってはＩＬ−６、ＩＬ−１０の産生が亢進し、Ｔｈ２偏位が誘導されることを見出した。また、Ｔｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγが産生されてもマクロフアージが酸化型に傾斜していると、ＩＦＮγの作用でＴｈ２を誘導するＩＬ−６が大量に産生されることも見出された。逆に、還元型マクロファージが存在するとＴｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγによってマクロフアージの還元型形質が一層増強されることも判明した。酸化型マクロフアージが誘導されているところにＴｈ２サイトカインの代表であるＩＬ−４が作用すると酸化型マクロフアージの形質が益々増強される。これらの知見は液性免疫と細胞性免疫という対局にある免疫応答がマクロフアージの酸化還元状態によって一義的に規定されていることを示すもので、免疫学の根幹に関わる重要な知見である。本発明者らはＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルが酸化型マクロフアージを誘導することを明らかにしている。即ち、この考えに従えばＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルはＴｈ２応答を増強すると予期される。
しかしながら、本発明において本発明者らの予期に反して、また、本発明完成時の当該業者の予期とは全く異なり、実際にはＴｈ２応答と考えられるアレルギー性炎症応答を抑制したのである。【０００９】  アロ移植片の拒絶反応においては、ＣＤ８０／８６−ＣＤ２８、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの２種のｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎが中心的働きをしている。これに対して、Ｔｈ１／Ｔｈ２パラダイムに基づいて想定されるＴｈ２サイトカインＩＬ４、ＩＬ１０の生体内における免疫抑制性作用には疑問点が多い。Ｔｈ２型のＣＤ４＋Ｔリンパ球のＳＣＩＤマウスへの養子移入によって皮膚移植片が早く拒絶されるとの知見もあり、ＩＬ−４−／−やＩＬ−１０−／−マウスにおける知見でも細胞性免疫応答が逆に抑制されるとの報告が多い。上述の考え方と真っ向対立する考え方で、最近ではＴｈ１よりもＴＧＦβを産生するＴｒ−１と呼ばれるＴリンパ球亜集団が免疫制御において中心的働きを担うと考えられている。典型的Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γやＩＬ−２は上述の考えに従えば、細胞性免疫を増強することとなる。最近の知見ではＩＦＮ一γやＩＬ−２を欠損したマウスでは細胞性免疫が逆に増強されるとの報告が多く見られる。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ投与によるＴリンパ球増殖の抑制は野生型マウスでは認められるが、ＩＦＮ−γ−／−マウスでは起こらない。ＩＦＮ−γが生体内では免疫抑制作用を有することを示す。この状況は、ＩＬ−２についても同様である。ＩＬ−２の免疫抑制作用はＴリンパ球の活性化を介するアポト−シスの誘起に起因する。ＩＬ−２−／−や高親和性ＩＬ−２Ｒを欠損するマウスではＴリンパ球の過増殖やＩＢＤを始めとする自己免疫疾患が高頻発する。Ｔｈ１サイトカインを欠如するマウスで自己免疫が高頻発すると言う事実が明らかになったのである。【００１０】  こうしたマウスではＦａｓ経由のＡＩＣＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）と呼ばれるアポトーシスの誘導が重篤に障害されている。ＩＬ−２が抗原により活性化されたＴリンパ球にアポトーシスを誘起するのは、Ｔリンパ球上にＦａｓＬ発現を増強する作用とＦａｓ／ＦａｓＬ系に抑制的に働く蛋白質であるＦＬＩＰの発現が抑制されることが重復して生じるためである。その結果、ＩＬ−２が免疫抑制的に働くことになる。また、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２Ｒβの機能を中和するとＡＩＣＤは抑制されるが、ＩＬ−２Ｒγの機能を中和するとＢｃｌ−２の発現が抑制されてＡＩＣＤが増強される。ＩＬ−２がＦａｓＬの発現を増強すること、ならびに、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のγ鎖発現をｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅするという２つの機構を介して、ＣＤ８＋Ｔリンパ球のＡＩＣＤを促進している訳である。なお、γ鎖を共有するＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５はＦａｓＬの発現にもγ鎖発現にも影響を与えず、ＡＩＣＤを促進する作用は無い。【００１１】  還元型マクロフアージを誘導するＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）はＴｈ１免疫応答を誘導することでＴｈ２免疫応答を抑制し、アレルギー反応を抑制することが知られている。従って、細胞内のグルタチオン量を減らし酸化型マクロフアージを誘導する本発明に係わるＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンまた��そのエステルはアレルギー反応を増強すると想定される。【００１２】  他の部位の炎症と同様、眼局所でのケモカイン発現はアレルギー性結膜炎、角膜移植拒絶反応、アルカリ外傷、ぶどう膜炎、緑内障などの発症、維持に深く関与している。
重症のアレルギー性結膜炎の発症や進展には、好酸球による組織障害作用の関与が示唆されており、本疾患における好酸球の遊走因子として、エオタキシンが重要な役割をしていることがわかってきた。従って、エオタキシン抑制によりアレルギー性結膜炎の重症化を防ぐことができる。
角膜移植拒絶反応の発症には、ランゲルハンス細胞遊走による抗原提示・Ｔ細胞やマクロファージ、好中球遊走による遅延型過敏反応の成立に関して、さまざまなサイトカインが関連していることが明らかである。特に、所属リンパ節においてはＩＰ−１０が関与していることもわかっている。
アルカリ外傷は最も重傷で失明に至る眼外傷であるが、発症には局所におけるＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳの産生が密接に関係している。実験的には、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト点眼によってＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ産生を抑制させ、アルカリ外傷後の角膜混濁や炎症を抑制できている。
ぶどう膜炎に関して、Ｖｅｒｍａらは前部ぶどう膜炎患者の前房水中から高濃度のＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１βを検出し、その濃度が病態と相関することを示した。さらにケモカインは炎症細胞を局所に呼び寄せるのみでなく、Ｔリンパ球の分化にも関与することが知られている。たとえば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αはＴｈ１細胞、ＭＣＰ−１はＴｈ２細胞分化に関与する。眼球内に浸潤したＴリンパ球は、その後も様々なケモカインの影響下に眼内抗原提示細胞からの刺激を受け、病態を修飾していくことになる。ラットにおける検討では、抗ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β抗体の投与により、おのおのｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｖｅｉｔｉｓ抑制効果を持っていた。Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ（ＬＰＳ）投与による実験的ぶどう膜炎であるｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｖｅｉｔｉｓでは前房内にＩＬ−８、ＧＲＯ、ＭＣＰ−１の産生が確認されている。抗ＩＬ−８抗体投与で好中球、抗ＭＣＰ−１抗体の投与で単核球の眼内浸潤が抑制されることがわかっている。
緑内障においては眼瞼癒着が眼圧上昇の大きな原因であるが、本癒着がＩＬ−８やＭＣＰ−１と言ったケモカイン産生に連関して起こる局所炎症によりフイブロネクチンやコラーゲンなどの細胞外マトリックスの異常生産と分解異常に起因することを本発明者らは明らかにしている。
このように眼局所でのケモカイン発現はアレルギー性結膜炎、角膜移植拒絶反応、アルカリ外傷、ぶどう膜炎、緑内障などの発症、維持に深く関与していることが明らかにされつつあるが、眼科領域においてケモカイン産生を抑制する薬剤は未だに提供されていない。【００１３】  薬剤の全身投与による眼疾患の治療には大量の薬剤が必要であり、副作用が無視できない。これに比較して、結膜下注射による局所投与では眼局所を少量の高濃度の薬剤で効率的に治療できる利点がある。さらに、結膜上皮のバリアーを無視できるため、点眼薬より効果的に眼内へ移行する。また、結膜下に貯留した薬剤は徐々に涙液中に流出するため、持続点眼の効果も併せ持つ。角膜移植の場合、新生血管がドナー角膜に到達するまで、ドナー角膜への血流は皆無であるため、全身投与によるドナー角膜への効果は涙液を介する経路以外に存在しない。従って、局所に依存した炎症、拒絶反応、抗原提示などを抑制するための最も有効な投与方法といえる。【００１４】  以上の背景のもと、本発明者らは鋭意研究を行い、酸化型マクロフアージを誘導することを明らかにしているＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルはＴｈ２応答を増強すると予期されるにも拘らず、全く異なった薬理効果を示すことを見い出した。本発明において本発明者らの予期に反して、また、本発明完成時の当該業者の予期とは全く異なり、実際にはＴｈ２応答と考えられるアレルギー性炎症応答を抑制したのである。【００１５】  本発明のＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンとしては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンが、Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンのエステルとしては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジエチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンイソプロピルエステル、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステルなどが挙げられる。好ましいのは、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルである。
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステル単独で投与しても、これらの混合物を投与してもよい。【００１６】  本発明の結膜下投与用医薬品は注入、埋め込み等の形態で用いられ、その剤形としては注射剤などの液剤、ゲル剤、軟膏剤、固形剤などが挙げられる。
【発明の効果】
【００１７】  即ち、本発明はつぎの通りである。
Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルを結膜下に投与することで、安全且つ効率的に局所Ｔｈ２応答と考えられる眼アレルギー、眼炎症を抑制するとともに、Ｔｈ１応答と考えられるアロ移植片の拒絶反応を抑制する眼科用医薬品の提供である。アロ移植に随伴する拒絶反応を抑制すると共に、拒絶反応時に認められる有害な炎症応答も抑制できる眼科用医薬品の提供である。
即ち免疫学的拒絶反応（細胞性免疫が関与すると考えられていうる）と同時にアレルギー性炎症応答（液性免疫が関与すると考えられている）も抑制しうる新たな眼科用医薬品の開発に成功し、その効能は結膜下投与と言う特定化された具体的手法で発揮されることを明確にすることでＮ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルを結膜下投与用眼科用医薬品として提供し、移植される臓器が角膜、角膜内皮、角膜幹細胞などである眼局所移植における拒絶反応抑制剤である結膜下投与用眼科用医薬品ならびに眼アレルギー、眼炎症抑制剤である結膜下投与用眼科用医薬品を提供することを骨子とする発明である。【００１８】  以下に臓器移植拒絶反応抑制における本発明の有用性、進歩性、新規性につき説明する。様々な免疫性疾患と異なり、臓器移植においては移植術を行う時点がドナー抗原に対する最初の暴露であり、免疫学的操作が簡単に行える。臓器移植を行う場合には、拒絶反応抑制のために、免疫抑制剤を使用しているのが臨床における現状であるが、この治療では抗原非特異的にすべての免疫系が抑制されることや、易感染性などの副作用の問題がある。したがって、ドナー抗原に対する免疫反応のみを選択的に抑制する方法の確立が重要であり、最も理想的な治療である。本発明者らは、ドナー抗原に対する免疫寛容の誘導を目的とし、自己移植と同様の恒久的な生着が得られ、免疫抑制剤を必要としな治療方法の開発を鋭意検討しここに本発明を完成した。この方法の開発は、２１世紀の治療と呼ぶにふさわしいと確信する。本発明になる治療のメリットは、移植臓器抗原に対する反応のみを抑制し（抗原特異性）、この細胞が出現した後には、抗原に暴露されるほど抑制機構も強くなり抗原提示が敏速に行われ拒絶反応の生じやすいハイリスク眼への角膜移植に応用可能なことである。【００１９】  本発明者らは、Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルを結膜下に投与することで、安全且つ効率的に局所Ｔｈ２応答と考えられる眼アレルギー炎症を抑制するとともに、Ｔｈ１応答と考えられるアロ移植片の拒絶反応をを同時に抑制する眼科用医薬品を見い出した。アロ移植に随伴する拒絶反応を抑制すると共に、拒絶反応時に認められる有害な炎症応答も抑制できる眼科用医薬品である。【００２０】  現在までのＴｈ２偏位によるドナー抗原特異的拒絶反応抑制に関しては、ＩＬ−４やＩＬ−１０を大量投与したり、遺伝子導入したりする試みが多々なされているが、実際に抗原提示される場である局所リンパ節での反応に影響しにくい。なぜなら、サイトカイン自体は体内においてエンドクリン作用はもたず、細胞同士の近傍においてのパラクリンもしくはオートクリン作用が主だからである。しかも、長期継続投与には大量の費用と労力が必要である。本発明は、移植臓器を移植されたレシピエントの局所に薬剤を投与する方法であり、全身性の副作用が少ない。さらに、ドナーに対する反応が拒絶反応を抑制する反応に偏位するため、拒絶反応を常に上回る抑制が生じる。現在のところ、臓器移植においてこの方法を確立しているのは本発明者らのみである。この方法の最大のメリットは、生体内の免疫バランスを壊すことなく、安価、簡便、安全に実現できる事も特徴的である。【００２１】  角膜移植は他の臓器移植と比較して生着率が高く、安全な移植であり、アメリカで年間５００００件、日本で年間２０００件の手術が行われているのが現状である。さらに、近年、角膜上皮細胞Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌの存在部位が明らかになり、細胞生物学的な立場から新しい術式が確立され、これまで適応とならなかった疾患群に対して外科的治療を行うことが可能となった。こうした中で、現在最大の問題となっているのは移植片に対する拒絶反応であり、これらに対する臨床的な対応として大量のステロイドやサイクロスポリンの局所ならびに全身投与が行われているに過ぎず、これらの副作用が問題となっている。
また、適応疾患の拡大としてハイリスク眼への移植技術の確立が大きな課題とされる。新生血管が侵入している角膜への移植は抗原感作が早くなされ、また、ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌがドナー角膜へ到達しやすい。炎症後にランゲルハンス細胞が遊走している角膜への移植は抗原感作が早期に行われる。
更に、術式の拡大における課題として、角膜輪部移植や上皮移植がある。角膜輪部移植はドナーのランゲルハンス細胞を持ち込むため、抗原提示されやすい。また、輪部移植、七皮移植ともに、移植部位が角膜輪部であり、血管組織が豊富であるため、拒絶されやすい。また、角膜上皮は抗原性が高い。従来用いられている抗原非特異的免疫抑制法には全身的副作用の問題として易感染性、糖尿病、消化管潰瘍、神経症状、肥満、腎機能不全が局所的副作用の問題としてステロイド緑内障、ステロイド白内障、易感染性などが指摘されており本課題も本発明を実施することで解決される。【００２２】  レシピエントの角膜に新生血管の存在するｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ眼は移植拒絶反応が生じやすく、ステロイドや免疫抑制剤が用いられるが、いまだ問題点が多い。角膜移植拒絶における報告では、ＭＨＣ（主要組織適合性抗原）適合は拒絶反応の低下には効果なく、ＭＨＣ以外のｍｉｎｏｒ抗原の適合が拒絶反応を有意に減少させる事が知られている。これは角膜がＩｍｍｕｎｅ  ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ  ｓｉｔｅと呼ばれる免疫的に特殊な環境を有するためであり、（１）角膜組織においてはＭＨＣの発現が低い、（２）血管やリンパ管が存在しない、（３）角膜組織には抗原提示細胞が存在しないことなどが関与している。これらの特殊環境により、角膜移植におけるドナー抗原は、主にレシピエントの抗原提示細胞によって、レシピエントのＴ細胞に抗原提示されると考えられる（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）。この機序でレシピエントは感作され、抗原提示を受けたＣＤ４＋Ｔ細胞がドナー抗原に対する遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を生じて拒絶反応を惹起する。角膜移植においては、角膜がｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｉｖｉｌｅｇｅ  ｓｉｔｅであるという点で、これらの操作をより簡単にしていると考えられる。角膜移植は臓器移植の中で最も生着率のよい安全な移植であり、従来から世界で多数行われてきた。しかし近年、移植に対するコンセプトが発達し、移植術を施行する適応症や移植方法が拡大したため、拒絶反応の生じやすい角膜移植が増加している。【００２３】  本発明の意義を角膜移植を例に述べる。結膜下投与により、Ｔｈ１反応の抑制と、アレルギー性炎症応答を同じに抑制することで、（１）角膜移植抗原に対する反応のみを抑制出来る（抗原特異性）、（２）ドナー抗原に対して拒絶反応を常に上回る抑制反応を生じさせることが出来る、（３）抗原提示が敏速で拒絶反応を高率に生じるハイリスク眼においても応用可能であるなどである。臓器移植においては臓器の機能的な役割を保つことも考慮に入れなければならない。角膜移植は、移植片の形状や機能がシンプルであり、また、ドナーの抗原提示細胞が存在しないため、マイナー抗原に対する拒絶反応のモデルとしてもっとも適した移植である。本発明の構成要素の一つである角膜移植拒絶反応抑制と移植片定着に関わる新規性は（１）抗原提示細胞を操作し、免疫反応を変化させるというこれまでまったく見られなかった治療法であること、（２）従来からの方法としては抗原非特異的な免疫抑制以外になかった点を打破したこと、（３）研究レベルでは抗体などによるトレランスの誘導が用いられていたが、実用にならない点を打破したこと、（４）結膜下投与により、Ｔｈ１反応の抑制と、アレルギー性炎症応答を同じに抑制することができる点が上げられる。進歩性としては（１）従来の非特異的な免疫抑制法から抗原特異的な免疫抑制が行える可能性があること、（２）従来の全身投与の副作用の強い免疫抑制剤の使用を制限できる点が挙げられる。有用性としては、（１）抗原特異的に抑制できる点、（２）安価で達成できる点、（３）本発明になる治療の後には抗原に暴露されるほど抑制機構も強くなる点、（４）抗原提示が敏速に行われ拒絶反応を生じやすいハイリスク眼においても応用可能な点などが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】  本発明の実施の形態を説明する。
本発明は、Ｎ，Ｎ’−ジアシルシスチンまたはそのエステルを、眼局所なかんずく結膜下に投与することで、安全且つ効率的に局所Ｔｈ２応答と考えられる眼アレルギー炎症を抑制するとともに、Ｔｈ１応答と考えられるアロ移植片の拒絶反応をを同時に抑制する眼科用医薬品として適用する。アロ移植に随伴する拒絶反応を抑制すると共に、拒絶反応時に認められる有害な炎症応答も抑制できる眼科用医薬品である。これらの薬剤は単独若しくはそれらの混合物として用いることが出来る。【００２５】  対象として用いることの出来る病態としては、眼アレルギー性疾患、眼炎症ならば全て含まれるが、なかんずく、眼局所でのケモカイン発現が病態に係わるアレルギー性結膜炎、急性結膜炎、慢性結膜炎、角膜フリクテン、点状角膜上皮症、強膜炎、ぶどう膜炎、網脈絡膜炎、虹彩炎、アルカリ外傷、緑内障を含む。また、移植拒絶反応の抑制剤として用いる場合の移植される臓器の代表としては、角膜、角膜内皮、網膜、角膜幹細胞、網膜幹細胞など、古典的な眼組織の移植、さらに、再生医療としての細胞移植、人工臓器移植も含まれる。
拒絶反応に随伴する炎症病態についても広範に本発明を適用することができることは明白である。【００２６】  本発明で取り扱う眼科用医薬品は実際の医療現場では単独で投与することもできるが、本発明に含まれる眼科用医薬品に加え、例えば、ステロイド性化合物や、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βを代表とするサイトカインなど生体外由来並びに生体内由来の物質と混合若しくは併用することもできる。また、本発明で取り扱う眼科用医薬品は単独もしくは眼科領域で扱われる他の薬剤との合剤として用いることも可能である。【００２７】  本発明の実施態様の骨子を角膜移植について述べる。
同種異型角膜移植における角膜生着の誘導を判定するには、８から１０週令のマウスを使用しレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用する。高率に、そして早期に拒絶反応が生じやすいハイリスク眼である角膜新生血管をレシピエントに誘導するには１１−０のナイロン糸を３糸、角膜実質に縫着し、１４日間留置し、本ナイロン糸は角膜移植時に抜去する。
角膜移植は以下のように行う。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行う。ドナーマウスの角膜中央部を円状に直径２ｍｍ切除し、移植片を作成する。ホストマウスの角膜中央部を直径２ｍｍ切除し、ドナー角膜を１１−０ナイロンを使用して８糸端々縫合する。術後は抗生剤の軟膏を塗布し、８−０ナイロンを使用して眼瞼縫合を行う。眼瞼縫合は術後７２時間後に抜去し、角膜縫合は移植後７日に抜去する。【００２８】  角膜拒絶反応の判定にはスリットランプ顕微鏡を用い、週に２回観察する。角膜混濁を６段階にスコア化することにより拒絶反応を判定する。判定可能時期は移植後１４日以降で、スコア３以上、２１日以降でスコア２以上を拒絶反応と判定する。（スコア  ０：透明生着、１：軽度角膜表層混濁及び虹彩血管・虹彩紋理明暸透見可、２：軽度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見可、３：中等度角膜実質混濁及び虹彩血管・虹彩紋理透見不可、４：高度角膜実質混濁及び虹彩縁透見不可、５：完全角膜混濁及び前房透見不可）。【００２９】  薬剤の投与法；一回の投与法は薬剤をＰＢＳに所定濃度に溶解もしくは懸濁させたのち、マウス腹腔内もしくは結膜下に注入する。注入時期は角膜移植を行う７日前、４日前、１時間前の３回である。対照マウスには同時期にＰＢＳを注入する。角膜移植の生着率の有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｕｒｖｅｓを用い、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔによって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とする。【００３０】  角膜上皮移植は以下のように実施する。角膜は５層からなり、外側から、角膜上皮、ボウマン膜、角膜実質、Ｄｅｓｃｅｍｅｔ膜、角膜内皮である。角膜上皮は増殖能が高く、角膜輪部にあるｓｔｅｍ  ｃｅｌｌから細胞が供給されている。従って、角膜中央部の移植である全層角膜移植や表層角膜移植術を用いても角膜上皮は数ヶ月でホストの角膜上皮に置き換わる。また、この５層構造のうち、角膜上皮が最も抗原性が高く、移植後早期の拒絶反応のターゲットとなりやすい。最後に、角膜上皮は炎症や拒絶反応によって非常に脱落しやすい層で、ドナー上皮の維持は非常に難しい。現在、健常組織に置き換える、もしくは欠損した組織を補う意味で角膜移植術が用いられている。角膜移植を行う意義としては（１）混濁した角膜を透明にすることにより視力改善をはかる（主に角膜全層移植、角膜表層移植によって治療）、（２）増殖しない角膜内皮細胞が、手術侵襲や疾患によって減少し、水疱性角膜症を生じた角膜に対し、内皮細胞を補う目的で視力改善や疼痛解除をはかる（主に角膜全層移植によって治療）、（３）角膜上皮がｓｔｅｍ  ｃｅｌｌを含めて障害を受けた角膜に対し、結膜上皮細胞の侵入を阻止し、透明な角膜上皮細胞で被覆させる、がある。角膜上皮移植は主に（３）の目的で使用されるが、角膜混濁を伴う症例が多く、（１）の意味合いを持つことが多い。
角膜上皮が欠損し、結膜上皮で覆われ、混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療とし、角膜上皮移植術が行われている。角膜上皮移植術とは、ドナー角膜から角膜輪部上皮と浅層実質のみを切除し、ホスト輪部に移植する方法であり、移植片の角膜上皮が恒常釣に増殖を繰り返し、ホスト角膜上皮を維持することを目的としているものである。しかし、その中でも、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患においては、その予後は極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることがあげられる。また、移植部位が血管組織やランゲルハンス細胞の多い角膜輪部であるため、ドナー抗原に対する抗原感作や拒絶反応が生じやすいことがあげられる。さらに、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身、および局所投与することによって生じる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。ステロイドの副作用としては全身性に、易感染性、糖尿病、消化管潰瘍、神経症状、肥満があり、眼局所的にもステロイド緑内障、ステロイド白内障、易感染性などがある。従って、ドナー抗原に対する免疫反応のみを選択的に抑制させる本発明になる方法が理想と考えられる。このことは、現在積極的に治療を行われていない難治性角結膜疾患に対し、新しい安全な治療法を提供できることとなり、その社会的貢献度は極めて高いと考えられる。【００３１】  角膜幹細胞（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）移植について記す。Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食などの疾患ではＳｔｅｍ  ｃｅｌｌを含めた角膜上皮が脱落し、血管を伴った不透明な結膜上皮の侵入をきたす。また、膠様滴状角膜変性症などは角膜上皮に遺伝的に異常がある疾患ではＳｔｅｍ  ｃｅｌｌ自体に異常がある。これらを治療する方法としては正常眼の輪部にある健全な角膜上皮Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌを移植し、正常角膜細胞を常に供給させる以外に方法がない。しかし、異系角膜上皮移植は拒絶されやすく、維持が難しい。従って、本発明になる方法を用いて拒絶反応を抑制することがこれらの疾患の治療に転機を生む。【００３２】  以上のように本発明になる臓器移植拒絶反応抑制剤の医療現場における有用な効能は、その斬新な作用機序からして自明であり、疾拒絶反応の急性期、慢性期の何れにも有用である。なかんずく眼組織の移植における結膜下投与が有効である。眼アレルギー性疾患、眼炎症などのＴｈ２偏位に依る病態にたいしても広範に適用することが出来る。【００３３】  以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００３４】  実施例１．結膜下投与による眼表面の酸化型マクロファージ誘導
方法
（１）材料
マウス：８から１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。
薬剤：４０００μｇ／ｍｌに調整した薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルをヒア
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を作成した。
（２）結膜下投与方法
３０Ｇ注射針を用い、０時、３時、６時、９時方向のマウス結膜下に５μｌずつ、計２０μｌ（８μｇ）の薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル溶液を注入した。注入頻度は計３回、０日、３日、７日に投与した。
（３）酸化型マクロファージ同定方法
角膜および結膜組織を凍結し、５μｍに薄切した。Ｐｏｌｙ−ｌｙｓｉｎｅでコーティングしたスライド上で空気乾燥し、アセトン固定を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的抗体結合部位を阻害したのち、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣで染色を行った。洗浄後、１０μＭのＭｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉａｍｉｎｅ（以下、ＭＣＢ）を３０分作用させ、洗浄後蛍光顕微鏡で螢光強度を判定した。結果、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル結膜下投与群では、角膜および結膜におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞だけでなく、その他の細胞もＭＣＢによる螢光減弱がみられ、細胞内グルタチオン濃度が低下していることが明らかとなった。【００３５】  実施例２．ドナーおよびレシピエント結膜下投与による角膜輪部移植の拒絶反応抑制効果
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。ドナー眼球から、強膜、角膜を含む強角膜片を切除した。角膜内皮を擦過除去後、角膜輪部を幅０．５ｍｍのドーナツ状に切除し、ドナー移植片を作成した。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行った。レシピエントマウスの角膜上皮を擦過除去した後、上記ドナー移植片を角膜輪部に１１−０ナイロン糸を用いて端々縫合にて移植し、眼瞼縫合して術式を終了した。眼瞼縫合は３日後に除去し、その後は拒絶反応を毎日観察した。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルは一回当たり４００μｇ／ｍｌ溶液を５μｌずつ、計２０μｌ、Ｂ１０．Ｄ２ドナー眼球およびＢＡＬＢ／ｃレシピエント眼球の０時、３時、６時、９時方向の結膜下へ注入した。ドナーへの注入は移植を行う７日前、４日前、１日前、レシピエントへの注入は移植を行う７日前、４日前、１時間前の３回実施した。コントロールとして結膜下にＰＢＳ基剤を注入した。輪部移植の生着率の有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｕｒｖｅｓを用い、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔによって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。
ＰＢＳ投与群（Ｎ＝７）では移植５日ですべてのドナー角膜が拒絶されたのと比較し、薬剤投与群（Ｎ＝１４）では移植後２２日においても１４眼中１２眼でドナー角膜が生着しており、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０００１）。【００３６】  実施例３．レシピエントのみの結膜下投与による角膜輪部移植の拒絶反応抑制効果
角膜輪部移植を上記方法によって施行した。薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルを上記方法を用いてＢＡＬＢ／ｃレシピエント眼球の結膜下へのみ注入し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。
薬剤投与群（Ｎ＝１１）では、移植後１４日においても５眼が生着しており、上記コントロール群と比較して、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０５）。【００３７】  実施例４．ドナーのみの結膜下投与による角膜輪部移植の拒絶反応抑制効果
角膜輪部移植を上記方法によって施行した。薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルを上記方法を用いてＢ１０．Ｄ２ドナー眼球の結膜下へのみ注入し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。
薬剤投与群（Ｎ＝１２）では、移植後１４日においても４眼が生着しており、上記コントロール群と比較して、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０５）。【００３８】  実施例５．ＭＨＣの異なるドナーに対する角膜輪部移植の拒絶反応抑制効果
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてＭＨＣおよびマイナー抗原の異なるＣ５７ＢＬ／１０（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。移植方法および拒絶反応の判定は上記を用いた。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルをＣ５７ＢＬ／１０ドナー眼球およびＢＡＬＢ／ｃレシピエント眼球に上記方法で注入し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。
薬剤投与群（Ｎ＝１３、ＭＳＴ＝７．５±０．８日）はＰＢＳ投与コントロール群（Ｎ＝７、ＭＳＴ＝４．１±０．１日）に比べ、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．００２）。【００３９】  実施例６．薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルを添加した保存液を用いたドナー角膜保存法
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。ドナー移植片を上記方法で作成した。薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル４００μｇ／ｍｌを添
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状態を検討した。ドナー移植片を凍結し、５μｍに薄切した。Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅでコーティングしたスライド上で空気乾燥し、アセトン固定を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的抗体結合部位を阻害したのち、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣで染色を行った。洗浄後、１０μＭのＭＣＢを３０分作用させ、洗浄後蛍光顕微鏡で螢光強度を判定した。結果、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルを添加保存液中で保存した移植片では、基剤であるオプチゾール保存液と比較して、ＣＤ１１ｂ陽性細胞だけでなく、その他の細胞もＭＣＢによる螢光減弱がみられ、細胞内グルタチオン濃度が低下していることが明らかとなった。
また、この保存角膜を上記方法によりレシピエントマウスに移植し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。薬剤投与群（Ｎ＝１３、ＭＳＴ＝６．５±０．８日）は上記コントロールと比較して有意な差が認められなかったが、拒絶反応は促進されなかった。【００４０】  実施例７．ドナーおよびレシピエント結膜下投与による全層角膜移植の拒絶反応抑制効果
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてマイナー抗原のみ異なるＢ１０．Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。ドナー角膜中央部から、直径２ｍｍの全層角膜を切除し、ドナー移植片を作成した。レシピエントには１１−０ナイロンを移植１４日前に角膜実質に縫着し、角膜新生血管を誘導したハイリスク眼を用いた。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行った。レシピエントマウスの角膜中央部２ｍｍ弱を切除し、上記ドナー移植片を１１−０ナイロン糸を用いて端々縫合にて移植し、眼瞼縫合して術式を終了した。眼瞼縫合は３日後に除去し、その後は拒絶反応を週に２回、観察した。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルは一回当たり４００μｇ／ｍｌ溶液を５μｌずつ、計２０μｌ、Ｂ１０．Ｄ２ドナー眼球およびＢＡＬ／ｃレシピエント眼球の０時、３時、６時、９時方向の結膜下へ注入した。ドナーへの注入は移植を行う７日前、４日前、１日前、レシピエントへの注入は移植を行う７日前、４日前、１時間前の３回実施した。コントロールとして結膜下にＰＢＳ基剤を注入した。全層角膜移植の生着率の有意差検定にはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｕｒｖｅｓを用い、Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｇｅｈａｎ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔによって比較した。Ｐ値が０．０５未満を有意とした。
ＰＢＳ投与群（Ｎ＝１５）では移植２１日ですべてのドナー角膜が拒絶されたのと比較し、薬剤投与群（Ｎ＝１４）では移植後５６日においても１４眼中１２眼でドナー角膜が生着しており、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．０００１）。【００４１】  実施例８．ＭＨＣの異なるドナーに対する全層角膜移植の拒絶反応抑制効果
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてＭＨＣおよびマイナー抗原の異なるＣ５７ＢＬ／１０（Ｈ−２ｂ）マウスを使用した。移植方法および拒絶反応の判定は上記を用いた。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルをＣ５７ＢＬ／１０ドナー眼球およびＢＡＬＢ／ｃレシピエント眼球に上記方法で注入し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。
ドナーおよびレシピエント結膜下薬剤投与群（Ｎ＝２５、ＭＳＴ＝４３．６±１．５日）はＰＢＳ投与コントロール群（Ｎ＝１０、ＭＳＴ＝１６．１±１．１日）に比べ、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０／００１）。また、レシピエント結膜下のみの薬剤投与群（Ｎ＝１０、ＭＳＴ＝３６．８±４．５日）においても有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．００１）。【００４２】  実施例９．ドナー・レシピエントのＦ１をドナーに用いた全層角膜移植の拒絶反応抑制効果
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス、ドナーとしてＢＡＬＢ／ｃとＣ５７ＢＬ／６のＦ１であるＣＢＦ１（Ｈ−２ｂ／ｄ）マウスを使用した。移植方法および拒絶反応の判定は上記を用いた。
薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルをＣ５７ＢＬ／１０ドナー眼球およびＢＡＬＢ／ｃレシピエント眼球に上記方法で注入し、拒絶反応抑制効果を生着率を検討することにより判定した。
ドナーおよびレシピエント結膜下薬剤投与群（Ｎ＝１５）はＰＢＳ投与コントロール群（Ｎ＝１０）に比べ、有意に生着率が上昇した（Ｐ＜０．００１）。【００４３】  実施例１０．ＩＮＦ−γノックアウトマウス、およびＩＬ−４ノックアウトマウスにおける拒絶反応の検討
８から１０週令のマウスを使用した。移植のレシピエントとしてＩＮＦ−γノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグランド（Ｈ−２ｂ））、ＩＬ−４ノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Ｈ−２ｂ））、およびＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス、ドナーとしてＭＨＣおよびマイナー抗原の異なるＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｂ）マウス、マイナー抗原のみ異なるＢＡＬＢ．Ｂ（Ｈ−２ｄ）マウスを使用した。ドナー角膜中央部から、直径２ｍｍの全層角膜を切除し、ドナー移植片を作成した。無処置のレシピエントに移植を行った。レシピエントマウスに３ｍｇのｋｅｔａｍｉｎｅと０．００７５ｍｇのｘｙｌａｚｉｎｅを腹腔内に投与して麻酔し移植を行った。レシピエントマウスの角膜中央部２ｍｍ弱を切除し、上記ドナー移植片を１１−０ナイロン糸を用いて端々縫合にて移植し、眼瞼縫合して術式を終了した。眼瞼縫合は３日後に除去し、その後は拒絶反応を週に２回、観察した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスをドナーに用いた場合、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｎ＝３０、ＭＳＴ＝３０．１±２．１）と比較してＩＮＦ−γノックアウトマウス（Ｎ＝１２、ＭＳＴ＝３４．９±２．６）もＩＬ−４ノックアウトマウス（Ｎ＝１０、ＭＳＴ＝２８．１±３．１）も有意な角膜生着は見られなかった。また、ＢＡＬＢ．Ｂマウスをドナーに用いた場合も同様、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｎ＝１０，ＭＳＴ＝２５．９±３．２）と比較してＩＮＦ−γノックアウトマウス（Ｎ＝１０、ＭＳＴ＝３５．６±４．０）もＩＬ−４ノックアウトマウス（Ｎ＝１０、ＭＳＴ＝２３．３±１．３）も有意な角膜生着は見られなかった。【００４４】  実施例１１．眼局所の細胞のチオールレドックス状態の修飾によるケモカイン産生抑制効果
マクロファージ、樹状細胞の細胞内チオールレドックス状態は局所組織炎症病態を制御する。ヒトテノン嚢線維芽細胞、および培養角膜上皮（ＨＣＥ）を用い、レドックス状態を酸化型に偏奇させる薬剤Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル（４００μｇ／ｍｌ）および還元型に偏倚させるｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｍｏｎｏｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（ＧＳＨ−ＯＥｔ）（１０ｍＭ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで８時間作用させた。次いで、ＩＬ−１α（１ｎｇ／ｍｌ）を添加、刺激した。１６時間後の培養上清中のＩＬ−８、ＭＣＰ−１をＥＬＩＳＡ法にて測定した。ＩＬ−１α添加２時間後の細胞から核蛋白を抽出し、ゲルシフトアッセイ法にてＮＦ−κＢ活性化を測定した。
その結果、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１産生は、それぞれ、コントロール（１４１０６±５５３ｐｇ／ｍｌ、１０３１１±８３４ｐｇ／ｍｌ、以下ｍｅａｎ±ＳＤ）に比べ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル（７０２８±５６９ｐｇ／ｍｌ、１９２９±４１ｐｇ／ｍｌ）では有意に抑制された（Ｐ＜０．０５）。還元型誘導剤であるＧＳＨ−Ｏｅｔ（１６１９９±６５０ｐｇ／ｍｌ、１００８２±４９１ｐｇ／ｍｌ）では有意な抑制がみられなかった。また、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルにより転写因子ＮＦ−κＢの活性化は抑制された。
これらのことより細胞内レドックス状態の修飾が好中球やマクロファージの遊走阻害を介し、抗炎症作用をもたらす事が明らかとなり、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルが炎症性疾患に対して抑制効果があることが明らかとなった。すなわち、アレルギー性結膜炎、急性結膜炎、慢性結膜炎、角膜フリクテン、点状角膜上皮症、強膜炎、ぶどう膜炎、網脈絡膜炎、虹彩炎に効果が期待できる。