(57)【要約】【課題】柑橘系生薬から副作用が少ないＰ−糖蛋白質（ＭＤＲ１）阻害剤、引いては、抗癌剤と併用可能な耐性克服剤や化学療法増強剤（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を提供すること。【解決手段】枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏、山椒およびそれらの抽出物からなる群より選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とするＰ−糖蛋白質阻害剤、抗癌薬の耐性克服剤または化学療法増強剤。シトロネラール、シトロネロール、ゲラニオール又はシネオール若しくはそれらの生理学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含むＰ−糖蛋白質阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏、山椒およびそれらの抽出物からなる群より選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とするＰ−糖蛋白質阻害剤。
【請求項２】
枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏、山椒およびそれらの抽出物からなる群より選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とする抗癌薬の耐性克服剤または化学療法増強剤。
【請求項３】
シトロネラール、シトロネロール、ゲラニオール又はシネオール若しくはそれらの生理学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含むＰ−糖蛋白質阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｐ−糖蛋白質（ＭＤＲ１）阻害剤および抗癌薬の耐性克服剤又は化学療法増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  急性白血病などの腫瘍に対する治療成績は近年急速に向上したが、残存した腫瘍細胞が抗癌剤に対する薬剤耐性を獲得することによる再発が更なる問題となっている。Ｐ−糖蛋白質（Ｐ−ｇｐｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＤＲ１）は、癌細胞が抗癌剤に対して耐性を示す一つの原因となる膜蛋白質として発見された輸送担体（トランスポーター、ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）である（非特許文献１）。Ｐ−糖蛋白質は、癌細胞内に到達した抗癌剤を細胞外に汲み出すことでその作用を減弱し、癌細胞における防御機構として機能している（非特許文献２）。癌細胞膜上に存在するＰ−糖蛋白質を阻害することで抗癌剤に対する耐性を克服することが考えられ（非特許文献３）、臨床試験も行われている（非特許文献４）。しかし、Ｐ−糖蛋白質阻害作用を有している既存の治療薬やその誘導体を利用したこれらの試みでは抗癌剤の主作用のみならず副作用も増強し、その主な副作用機序は、既存の治療薬は投与後に循環血液中に効率良く移行してしまうために、抗癌剤の循環血中からの消失過程も抑制してしまうためであった（非特許文献５）。【０００３】  柑橘系食品であるグレープフルーツジュースはＰ−糖蛋白質を阻害することが報告されている（非特許文献６）。臨床においては、漢方薬として種々柑橘系（ミカン科：Ｒｕｔａｃｅａｅ）生薬が臨床で使用されている。しかし、漢方薬と医薬品との併用時の相互作用に関する情報は少なく、特に柑橘系生薬およびその含有成分がＰ−糖蛋白質の阻害作用を有しているか否かの検討については全く報告がない。【０００４】
【非特許文献１】Ｊｕｌｉａｎｏ  ＲＬ，Ｌｉｎｇ  Ｖ．  Ａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｄｒｕｇｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｍｕｔａｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９７６；４５５：１５２−６２
【非特許文献２】Ｉｎａｂａ  Ｍ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，Ｓａｋｕｒａｉ  Ｙ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＫ．Ａｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｏｆ  ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｕｂｌｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｐ３８８  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９７９；３９：２２００−３
【非特許文献３】Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ，Ｉｉｄａ  Ｈ，Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ  Ｓ，Ｓａｋｕｒａｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐ３８８  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１９８２；４２：４７０３−３３．
【非特許文献４】Ｋｏｒｎｂａｕ  ＳＭ，Ｅｓｔｅｙ  Ｅ，Ｍａｄｄｅｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅｐｌｕｓ  ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｂｙ  ＳＤＺ  ＰＳＣ８３３  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９７；１５：１７９６−１８０２．
【非特許文献５】Ｒｅｌｌｉｎｇ  ＭＶ．  Ａｒｅ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｄｕｅｔｏ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ？．  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ  １９９６；１８：３５０−３５６．
【非特許文献６】Ｔａｋａｎａｇａ  Ｈ，Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ａ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｈ，Ｓａｗａｄａ  Ｙ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅｅｆｆｌｕｘ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ  ｊｕｉｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｃｏ−２  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  １９９８；２１：１０６２−６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、柑橘系生薬からＰ−糖蛋白質（ＭＤＲ１）阻害剤を見出すことを主目的としている。Ｐ−糖蛋白質に対する阻害作用を有する生薬を探索し、その天然成分の中から副作用が少ないＰ−糖蛋白質阻害剤、引いては、抗癌剤と併用可能な耐性克服剤や化学療法増強剤（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者らは、種々の柑橘系生薬の抽出エキスを用いてＰ−糖蛋白質阻害活性を探索した結果、山椒をはじめ数種の柑橘系生薬エキスがその作用を有することを見出した。そして、食品としても用いられている山椒の抽出エキスから精製単離したモノテルペノイド（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ）の化合物がＰ−糖蛋白質に対する阻害作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】  即ち、本発明は、枳殻（Ａｕｒａｎｔｉｉ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）、枳実（Ａｕｒａｎｔｉｉ  Ｆｒｕｃｔｕｓ  Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ）、呉茱萸（Ｅｖｏｄｉａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）、陳皮（Ａｕｒａｎｔｉｉ  Ｎｏｂｉｌｉｓ  Ｐｅｒｉｃａｒｐｉｕｍ）、黄柏（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｉ  Ｃｏｒｔｅｘ）、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｉ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）およびそれらの抽出物からなる群より選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とするＰ−糖蛋白質阻害剤である。
また、本発明の他の態様は、枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏、山椒およびそれらの抽出物からなる群より選ばれる１種または２種以上を配合することを特徴とする抗癌薬の耐性克服剤または化学療法増強剤である。【０００８】  また、本発明の他の態様は、シトロネラール（ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ）、シトロネロール（ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ）、ゲラニオール（ｇｅｒａｎｉｏｌ）、シネオール（ｃｉｎｅｏｌｅ）若しくはそれらの生理学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含むＰ−糖蛋白質阻剤である。【０００９】  また、本発明の他の態様は、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、ｇｅｒａｎｉｏｌ、ｃｉｎｅｏｌｅ若しくはそれらの生理学的に許容される塩、またはそれらの水和物若しくは溶媒和物を有効成分として含む、抗癌薬の耐性克服剤または化学療法増強剤である。【００１０】  Ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、ｇｅｒａｎｉｏｌおよびｃｉｎｅｏｌｅは、それぞれ下記構造式で示すことができる。
2005330253.tif 000002
これらの化合物は、置換基の種類により１以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体などの立体異性体が存在する場合がある。本発明の医薬の有効成分としては、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いてもよい。
【発明の効果】
【００１１】  本発明に係る成分はＰ−糖蛋白質を介した膜輸送を阻害するために有用であり、それは抗癌薬の耐性克服剤または化学療法増強剤としても応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により限定されるものではない。【００１３】
【実施例】：Ｐ−糖蛋白質を介した膜輸送に対する阻害作用の評価
（１）生薬の抽出および水溶性画分と酢酸エチル画分の分離
枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏および山椒１００ｇをそれぞれ水６００ｍＬで１００℃、３０分間加熱抽出した。抽出液を分液ロートに移し、酢酸エチル２００ｍｌを加えて振り混ぜた。上層が透明になるまで静置した。水相、有機相をそれぞれ回収し、完全に分離しなかったものを中間相として回収した。この操作をさらに２回行った。水相は、突沸しなくなるまでエバポレーターにかけた後、凍結乾燥させ、これを水溶性画分ｐｏｗｄｅｒとした。有機相は、酢酸エチルがほとんどなくなるまでエバポレーターにかけた後、少量の水を加えて凍結乾燥させ、これを酢酸エチル画分ｐｏｗｄｅｒとした。【００１４】（２）山椒の酢酸エチル画分からのモノテルペノイドの単離
酢酸エチル画分ｐｏｗｄｅｒをクロロホルム／メタノールに溶解し、シリカゲルカラムにて、メタノールの濃度勾配により分画をおこなった。Ｐ−糖蛋白質阻害活性の強い画分を分取、濃縮後、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＴＬＣにて、さらに分画を実施した。各スポット位置を掻き取り、メタノールで抽出、回収した。Ｐ−糖蛋白質阻害活性のあるスポット抽出部分をｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＴＬＣを繰り返すことにより精製した。単離された４種類の活性成分は、ＵＶ吸収、ヨウ素発色、塩化第二鉄反応、Ｇｉｂｂｓ反応ならびに、１３Ｃ−ＮＭＲより、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、ｇｅｒａｎｉｏｌまたはｃｉｎｅｏｌｅと同定された。【００１５】（３）細胞培養
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞はヒューマンサイエンス振興財団より譲与された。ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞（ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９２；２６７：２４２４８−２４２５２）は理化学研究所細胞開発銀行より譲与された。ブタ腎由来であるＬＬＣ−ＰＫ１細胞と、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞のヒトＰ−ｇｐ過剰発現株ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞は、ｐｌａｓｔｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｌａｓｋで継代培養した。２−３日に一度、培地交換を行った。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は１０％ＦＢＳを含むＭｅｄｉｕｍ１９９培地で培養した。ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞は、Ｍｅｄｉｕｍ１９９に１５０ｎｇ／ｍｌ  ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅを添加した培地で培養した。培養は５％ＣＯ２、３７℃条件下で行った。【００１６】（４）細胞取込み実験
細胞膜上におけるＰ−糖蛋白質を介した輸送は、細胞へのＰ−糖蛋白質基質である［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込み実験により評価した（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ１９９２；２６３：８４０−８４５）。
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞とＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞は、２４ｗｅｌｌ  ｍｕｌｔｉ  ｄｉｓｈ（Ｎｕｎｃ）にそれぞれ１．５×１０５、２．０×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３日間５％ＣＯ２  ３７℃条件下で培養したものを実験に用いた。実験開始６時間前にｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ−ｆｒｅｅのｆｒｅｓｈ  ｍｅｄｉｕｍに培地を交換した。培養液を吸引し、細胞をＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）（１．２６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．８１ｍＭ  ＭｇＳＯ４および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む）１ｍＬで２回洗浄後、ＨＢＳＳを加えて１０分間インキュベートした。［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）または［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（５００ｎＭ）、１％  ＤＭＳＯ、Ｐ−糖蛋白質阻害作用を有するポジティブコントロール（５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３）または試験薬（生薬エキスまたはモノテルペノイド）を含むＨＢＳＳを反応液として２５０μＬ加え、取り込み実験を開始した。６０分後、ｉｃｅ−ｃｏｌｄＰＢＳで３回洗浄することにより取り込みを終了させた。その後、４ＭＮａＯＨ  ２５０μＬを加えて細胞を可溶化（２時間以上）し、２ＭＨＣｌ（５００μＬ）で中和したものを細胞溶解液とした。ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３の細胞内取り込み量は、分光蛍光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で蛍光強度（ｅｘ；５０４ｎｍ，ｅｍ；５２５ｎｍ）を測定することにより定量した。［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎおよび［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅの細胞内取り込み量は、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ５２００，Ａｌｏｋａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で放射活性を測定することにより定量した。ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を標準物質としてＢＣＡ法により蛋白定量を行った。得られた測定値から平均値（ｍｅａｎ）とその標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を算出した。統計解析では、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較を行い、統計的有意性の有無を危険率（ｐ）の５％および１％以下によって検定した。ＩＣ５０はｐｒｏｂｉｔ法を用いて算出した。【００１７】  結果（各実験について、ｎ＝３−４，平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）を図１から図５に示す。全てのグラフに、溶媒を添加したコントロール群およびＰ−糖蛋白質阻害作用を有するポジティブコントロールであるｖｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３の結果も合わせて示す。図４以外の全ての結果はＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取込み量に対する併用薬の効果であり、その蓄積量の上昇はＰ−糖蛋白質を介した［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの排出輸送の阻害を示す。図４はＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅの取込み量に対する併用薬の効果であり、その取込みは単純拡散による細胞膜透過過程によるものである。
図１は枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏および山椒の熱水抽出エキス２０ｍｇ／ｍＬ（パネルＡ）、水溶性画分２０ｍｇ／ｍＬ（パネルＢ）および酢酸エチル画分２５０μｇ／ｍＬ（パネルＣ）の効果（添加１時間後）、図２は山椒の酢酸エチル画分の効果に関する時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）、図３と４は山椒含有のモノテルペノイドである（１）ｇｅｒａｎｉｏｌ、（２）ｇｅｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、（３）（Ｒ）−（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅ、（Ｒ）−（＋）−ｌｉｎａｌｏｏｌ、（５）ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（６）（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（７）ＤＬ−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、（８）（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌおよび（９）ｃｉｎｅｏｌｅの効果（１ｍＭ、添加１時間後）、図５は（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌの効果に関する時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）、図６は（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌの効果に関する時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）である。【００１８】  図１の結果から分かるように、呉茱萸、陳皮、および山椒の熱水抽出エキス、山椒の水溶性画分、および用いた全ての生薬の酢酸エチル画分存在下で［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの細胞内取り込み量はｃｏｎｔｒｏｌに比べて有意に増加した。その作用は酢酸エチル画分（パネルＣ）においてより強い傾向が示され、特に山椒の酢酸エチル画分にはポジティブコントロールのＳＤＺ−ＰＳＣ８３３とほぼ同等の最も強いＰ−ｇｐ阻害活性が見られた。【００１９】  図２の結果から分かるように、山椒の酢酸エチル画分存在下で［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの細胞内取り込み量の時間推移を検討したところ、１２０分まで直線的な取り込み量の増加が見られた（パネルＡ）。また、その阻害作用は濃度依存的であり、ＩＣ５０は約１６６μｇ／ｍＬであった（パネルＢ）。【００２０】  図３の結果から分かるように、ｇｅｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、（Ｒ）−（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅおよび（Ｒ）−（＋）−ｌｉｎａｌｏｏｌは［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込み量に影響を及ぼさなかった。しかし、ｇｅｒａｎｉｏｌ、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、ＤＬ−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌおよびｃｉｎｅｏｌｅは、［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込み量を有意に増加させた。なかでも（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌと（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ存在下での［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ取り込み量は、Ｐ−糖蛋白質阻害作用を有するポジティブコントロールの５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３存在下と同等の取り込み量であった。一方、図４の結果から分かるように、実験に使用したポジティブコントロールのｖｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３および種々のモノテルペノイドは、Ｐ−糖蛋白質の基質ではない［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅの取込み量に影響は及ぼさなかった。【００２１】  図５と図６の結果から分かるように、図３で強い阻害作用を示した（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌと（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌは、１２０分まで直線的に取り込み量を増加させた。その阻害作用は濃度依存的であり、最大でポジティブコントロールである５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３とほぼ同等であった。（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌと（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌのＩＣ５０は、それぞれ約１６７μＭと約５０４μＭであった。【００２２】  上記した実施例の結果から、柑橘系生薬である枳殻、枳実、呉茱萸、陳皮、黄柏および山椒と、山椒含有のモノテルペノイドであるｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、ｇｅｒａｎｉｏｌおよびｃｉｎｅｏｌｅによりＰ−糖蛋白質を介した膜輸送を阻害できることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込みに対する６種の柑橘系生薬の効果を示す。  ［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μΜ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μΜ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３、生薬の熱水抽出エキス２０ｍｇ／ｍＬ（パネルＡ）、その水溶性画分２０ｍｇ／ｍＬ（パネルＢ）または酢酸エチル画分２５０μｇ／ｍＬ（パネルＣ）を含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。ＶｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３はポジティブコントロール。各生薬については、（１）枳殻；（２）枳実；（３）呉茱萸；（４）陳皮；（５）黄柏；（６）山椒。
【００２４】
【図２】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込みに対する山椒の酢酸エチル画分の阻害作用の時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）を示す。  （Ａ）［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μΜ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ（□）、５０μΜ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３（△）または山椒の酢酸エチル画分（●）を含有した３７℃のメディウム（コントロール：○）中でインキュベーションすることにより測定した。（Ｂ）［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μΜ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μΜ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３または山椒の酢酸エチル画分５−２５０μｇ／ｍＬを含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。ＶｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３はポジティブコントロール。
【００２５】
【図３】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込みに対する山椒含有の種々のモノテルペノイドの効果を示す。  ［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３、１ｍＭの（１）ｇｅｒａｎｉｏｌ、（２）ｇｅｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、（３）（Ｒ）−（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅ、（４）（Ｒ）−（＋）−ｌｉｎａｌｏｏｌ、（５）ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（６）（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（７）ＤＬ−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、（８）（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌまたは（９）ｃｉｎｅｏｌｅを含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。ＶｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３はポジティブコントロール。
【００２６】
【図４】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅの取り込みに対する山椒含有の種々のモノテルペノイドの効果を示す。  ［３Ｈ］３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（５００ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３、１ｍＭの（１）ｇｅｒａｎｉｏｌ、（２）ｇｅｒａｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ、（３）（Ｒ）−（＋）−ｌｉｍｏｎｅｎｅ、（４）（Ｒ）−（＋）−ｌｉｎａｌｏｏｌ、（５）ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（６）（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ、（７）ＤＬ−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ、（８）（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌまたは（９）ｃｉｎｅｏｌｅを含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。
【００２７】
【図５】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込みに対する（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌの阻害作用の時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）を示す。  （Ａ）［３Ｈ］ｄｉｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ（□）、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３（△）または１ｍＭ（Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌ（●）を含有した３７℃のメディウム（コントロール：○）中でインキュベーションすることにより測定した。（Ｂ）［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３または５０−１０００μＭ  （Ｒ）−（＋）−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌａｌを含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。ＶｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３はポジティブコントロール。
【００２８】
【図６】ＬＬＣ−ＧＡ５−ＣＯＬ１５０細胞における［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎの取り込みに対する（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌの阻害作用の時間依存性（パネルＡ）と濃度依存性（パネルＢ）を示す。  （Ａ）［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ（□）、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３（△）または１ｍＭ（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ（●）を含有した３７℃のメディウム（コントロール：○）中でインキュベーションすることにより測定した。（Ｂ）［３Ｈ］ｄｉｇｏｘｉｎ（３０ｎＭ）の蓄積量は、５００μＭ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ、５０μＭ  ＳＤＺ−ＰＳＣ８３３または５０−１０００μＭ（Ｓ）−（−）−β−ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌを含有した３７℃のメディウム中で１時間インキュベーションすることにより測定した。ＶｅｒａｐａｍｉｌとＳＤＺ−ＰＳＣ８３３はポジティブコントロール。
【図１】
2005330253.tif 000003
【図２】
2005330253.tif 000004
【図３】
2005330253.tif 000005
【図４】
2005330253.tif 000006
【図５】
2005330253.tif 000007
【図６】
2005330253.tif 000008