(57)【要約】【課題】  タンパク質処理に必要な合成、精製、染色、電気泳動、検出を、必要に応じた種々の組み合わせで実施できるマイクロフルイディクス型チップを提供する。【解決手段】  基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面に、無細胞タンパク質合成部位、アフィニティークロマトグラフィーカラム、タンパク質反応槽、あるいは濃縮機の少なくとも１つが形成されたマイクロフルイディクス型チップであって、キャピラリー電気泳動部、あるいは検出部の少なくともいずれか一つが形成されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とするタンパク質処理チップである。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロフルイディクス型チップであって、キレートカラムを有することを特徴とするタンパク質処理チップ。
【請求項２】
キレートカラムが充填型であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質処理チップ。
【請求項３】
充填剤を堰き止めるための構造が、流路幅を減ずる形状であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質処理チップ。
【請求項４】
マイクロフルイディクス型チップであって、圧力送液方式のタンパク質染色部を有することを特徴とするタンパク質処理チップ。
【請求項５】
染色されるタンパク質と染色剤とが別の流路からタンパク質染色部に送液されることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質処理チップ。
【請求項６】
基板上にタンパク質合成槽を有する無細胞タンパク質合成を行うマイクロフルイディクス型チップであって、該基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にアフィニティークロマトグラフィーカラム、タンパク質反応槽、あるいは濃縮機の少なくともいずれか一つが形成されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とするタンパク質処理チップ。
【請求項７】
キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にキャピラリー電気泳動部を有する請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質処理チップ。
【請求項８】
キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にタンパク質合成槽、タンパク質反応槽、濃縮機、あるいは検出部の任意の組み合わせが設置されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質処理チップ。
【請求項９】
タンパク質処理部位が、同一の、あるいは積層された一体の基板上に、３つ以上１００００個以下形成されていることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のタンパク質処理チップ。
【請求項１０】
タンパク質処理チップの接液面の一部、または全部に対しタンパク質吸着抑制処理を行った、請求項１から９のいずれかに記載のタンパク質処理チップ。
【請求項１１】
試料、移送液、溶離液、および染色液の少なくともいずれか一つにタンパク質吸着抑制成分が含まれていることを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載のタンパク質処理チップを用いるタンパク質処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質を取り扱うマイクロ化学チップに関し、特にタンパク質合成、粗精製、染色、電気泳動、検出などの一連の操作を行うタンパク質処理チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ化学チップは化学、生化学における分析、生産、制御のための種々の単位操作や反応を微細加工されたチップや配管材料などによるマイクロフルイディクスを用いて行うものである。とくに分析分野では開発が進んでおり、典型的には１０センチから数センチ角程度以下のガラス、シリコン、あるいは樹脂製のチップ表面に溝を刻んで、その溝中に試薬溶液や検体を流して、分離、反応を行って、微量試料の分析を行っている。一つのチップに一つ、あるいは複数の処理部位が形成されることによって、これらの操作や工程を実現している。
【０００３】
種々の応用分野の中でもバイオ応用は非常に高い関心が持たれ、取り扱うべき成分としてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸と並び、タンパク質は非常に高い注目を集めている。生化学分野では現状でも試料の取り扱いを手作業で行われる場合が多く、非効率な単純作業の占める割合が大きいからである。この解決策の一つはピペッティングを行う自動化装置を開発することであるが、大型の装置になりがちであり、全面的な解決策とはなり得ない。そこでマイクロフルイディクス型のチップを用いた流体制御によるピペッティング操作そのものの減少が提案されている。種々の処理部位を一連の流路で結ぶことにより試薬や試料を取り扱えるようになるので、処理部位間で発生していたピペッティング操作が不要になるのである。核酸の取り扱いについてはヒトゲノム計画と相まって、オンチップキャピラリー電気泳動装置を中心に遺伝子抽出やＰＣＲ反応など広範囲な研究が進んだ。しかし現状では、タンパク質の取り扱いについては立ち後れており、種々の処理部位の開発が求められている。
【０００４】
タンパク質の取り扱いの第一段階としてタンパク質を取得する手段には、通常、微生物から単離する方法が幅広く行われているが、夾雑物が多く、チップ上での実現には困難が伴う。一方、無細胞タンパク質合成法は定温で反応を進行させることができ、かつ、目的タンパク質のみの生産が可能であるため、より単純な反応であることが好ましいチップ上の反応としては至適である。すでに微細流路を用いた無細胞タンパク質合成を行う装置としては特許文献１、２、３などがある。しかしこれらは合成そのものに留まり、他の機能との一体化には至っていない。特許文献３ではオンチップキャピラリー電気泳動装置との一体化が行われている。
【０００５】
無細胞タンパク質合成を行わないタンパク質処理チップでは、特許文献４でチップ上で電気泳動を行う前に夾雑物を精製する方法が開示されている。また非特許文献１ではチップ上で電気泳動を行いながらタンパク質を染色する方法が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−３３７１７３号公報  （実施例）
【特許文献２】特開２００２−０８５９６１号公報  （実施例）
【特許文献３】特開２００３−３３４０５６号公報  （特許請求の範囲）
【特許文献４】特開平８−３２７５９４  （特許請求の範囲）
【非特許文献１】アナリティカルケミストリー(Analytical Chemistry)」、（アメリカ合衆国）、アメリカ化学会、２０００年、第７２巻、ｐｐ．４６０８−４６１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
無細胞タンパク質合成は目的タンパク質のみを合成する手段ではあるが、反応後の反応液には合成させる側の酵素などのタンパク質や核酸など、種々の夾雑物が含まれるためアフィニティークロマトグラフィー法を適用して精製することが一般的である。しかし、マイクロフルイディクス型チップとして無細胞タンパク質合成と組み合わせたタンパク質のアフィニティークロマトグラフィー法を実施可能なチップは報告されていない。すなわち、第一の課題はマイクロフルイディクス型チップとして、公知である無細胞タンパク質合成部位やキャピラリー電気泳動部位に種々の有用な処理部位を連結することである。
【０００７】
アフィニティークロマトグラフィー法に用いるカラムの一種であるキレートカラムは、無細胞タンパク質合成法との関係のみならず、タグを利用した組み換えタンパク質の精製法として簡便かつ重要な手法であるが、マイクロフルイディクス型チップとしてのキレートカラムは報告例がない。すなわち第二の課題はマイクロフルイディクス型チップとしてキレートカラム法を提供することである。
【０００８】
また、オンチップキャピラリー電気泳動法での検出法のみならず、タンパク質を染色しておくことは、チップ内でのタンパク質の挙動を知る上で非常に重要な方法である。しかし、マイクロフルイディクス型チップ内でタンパク質を染色した例は電気泳動前後の電気泳動的、あるいは電気浸透流を利用した移送に限定されている。しかしこれらの移送法は移送中に電気泳動的な分離を誘起し、複数種類の成分を有する試料の移送には適さない。このため電気泳動的な分離を目的としない処理部位中、および該処理部位間の移送には圧力送液方式が好ましい。すなわち第三の課題は、マイクロフルイディクス型チップで圧力送液方式のタンパク質染色部位を提供することである。
【０００９】
第四の課題は、これらの処理部位のスループットを高めることである。スループットの向上によってチップ１枚あたりの生産性やコスト競争力を高めることができるからである。
【００１０】
第五の課題は、タンパク質吸着を抑制することである。タンパク質を取り扱うマイクロフルイディクス型チップが立ち後れている大きな要因が、比表面積が大きいことが特徴であるマイクロフルイディクス型チップにおいて、吸着問題が顕著となることだからであり、タンパク質を取り扱うチップにおいて特に重要な課題だからである。
【００１１】
第六の課題は、これらのチップを作製するにあたって、より作製コストを下げることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、まず第二の課題に対し、キレートカラムをチップ上に形成することによって、解決可能であることを見出した。さらに該キレートカラムは充填型であることが好ましいことを見出した。充填用の基材形成において必要になる堰き止め構造について、流路幅を減ずることによって堰き止めることが第六の課題解決につながることを見出した。
【００１３】
さらに第三の課題に対し、染色部位をチップ上に形成することによって解決可能であることを見出した。さらに該染色部位へは、染色されるタンパク質と染色剤とを別の流路から導入することが好ましいことを見出した。
【００１４】
さらに第一の課題に対し、アフィニティークロマトグラフィー用のカラム、タンパク質の反応槽、あるいは濃縮機が、無細胞タンパク質合成、あるいは電気泳動を行う部位と流路によって連結されることによって、解決できることを見出した。
【００１５】
さらに第四の課題に対し、マイクロフルイディクス型チップ中に該処理部位を複数形成することによって、解決できることを見出した。
【００１６】
さらに第五の課題に対し、チップの接液面の表面にタンパク質吸着抑制処理を施すことで解決できることを見出した。またさらに、通液される液体に適切な吸着抑制成分を添加することによっても解決可能であることを見出した。
【００１７】
さらに第六の課題に対しては、これらの処理部位を一体成形可能なように設計・作製することや、一枚のチップに並列して複数の一連の処理部位群を形成することや、先に述べたように充填部堰き止め構造を狭隘な構造によって実現するなどで解決可能であることを見出した。
【００１８】
即ち、本発明は以下のような構成をとる。
【００１９】
（１）マイクロフルイディクス型チップであって、キレートカラムを有することを特徴とするタンパク質処理チップ。
【００２０】
（２）キレートカラムが充填型であることを特徴とする（１）記載のタンパク質処理チップ。
【００２１】
（３）充填剤を堰き止めるための構造が、流路幅を減ずる形状であることを特徴とする（２）記載のタンパク質処理チップ。
【００２２】
（４）マイクロフルイディクス型チップであって、圧力送液方式のタンパク質染色部を有することを特徴とするタンパク質処理チップ。
【００２３】
（５）染色されるタンパク質と染色剤とが別の流路からタンパク質染色部に送液されることを特徴とする（４）記載のタンパク質処理チップ。
【００２４】
（６）基板上にタンパク質合成槽を有する無細胞タンパク質合成を行うマイクロフルイディクス型チップであって、該基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にアフィニティークロマトグラフィーカラム、タンパク質反応槽、あるいは濃縮機の少なくともいずれか一つが形成されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とするタンパク質処理チップ。
【００２５】
（７）キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にキャピラリー電気泳動部を有することを特徴とする（１）〜（３）記載のタンパク質処理チップ。
【００２６】
（８）キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にタンパク質合成槽、タンパク質反応槽、濃縮機、あるいは検出部の任意の組み合わせが設置されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とする（７）記載のタンパク質処理チップ。
【００２７】
（９）タンパク質処理部位が、同一の、あるいは積層された一体の基板上に、３つ以上１００００個以下形成されていることを特徴とする（１）〜（８）記載のタンパク質処理チップ。
【００２８】
（１０）タンパク質処理チップの接液面の一部、または全部に対しタンパク質吸着抑制処理を行った（１）〜（９）記載のタンパク質処理チップ。
【００２９】
（１１）試料、移送液、溶離液、および染色液の少なくともいずれか一つにタンパク質吸着抑制成分が含まれていることを特徴とする（１）〜（１０）記載のタンパク質処理チップを用いるタンパク質処理方法。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のキレートカラムを有するタンパク質処理チップにより、キレート現象を利用したタンパク質精製を行うことができる。特に組み換えタンパク質の解析においてタグを用いる場合に有効である。
【００３１】
さらに充填型の方式を採用することによって、簡便かつ、他処理部位に反応試薬の負担をかけることなくキレートカラム構造形成が可能となる。
【００３２】
また、さらに堰き止め型構造に流路幅を減ずる形状を採用することによって、平面デザインからの一回の転写過程で鋳型を形成することができ、コスト低減に寄与する。
【００３３】
一方、タンパク質染色部を有するタンパク質処理チップにより、タンパク質をチップ上で行われる一連の過程の中で染色することができる。ここで送液方法を圧力送液とすることで、移送中の成分分離を抑制することができる。また、前後で圧力送液法を用いている場合は、同じ送液系を活用することができ、チップ外のシステムの簡略化につながる。
【００３４】
さらに染色されるタンパク質と染色剤とを別の流路からタンパク質染色部に送液する事によって、流れの安定化、不要な反応の低減を図ることができる。
【００３５】
本発明の、基板上にタンパク質合成槽を有する無細胞タンパク質合成を行うマイクロフルイディクス型チップであって、該基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にアフィニティークロマトグラフィーカラム、タンパク質反応槽、あるいは濃縮機の少なくともいずれか一つが形成されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とするタンパク質処理チップを採用すること、あるいは、キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にキャピラリー電気泳動部を有することを特徴とするタンパク質処理チップを採用すること、あるいは、キレートカラムを有する基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にタンパク質合成槽、タンパク質反応槽、濃縮機、あるいは検出部の任意の組み合わせが設置されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とするタンパク質処理チップを採用することにより、合成、精製、反応、染色、電気泳動、検出を、必要に応じた種々の組み合わせで実施できる。たとえば、特許文献３には合成と電気泳動の組み合わせが開示されている。本発明のタンパク質合成槽とアフィニティークロマトグラフィーカラムが連結したタンパク質処理チップでは、合成されたタンパク質をチップ上あるいはチップ外で用いる上でその反応液の純度を高めて利用できることから、電気泳動とは無関係に有用である。また、タンパク質合成槽とキレートカラムの組み合わせは、合成系の酵素群がすべてタグ付与されたタンパク質合成系を用いれば、溶出操作なしにタグのない産物を得ることができるので有用である。本発明のタンパク質合成槽とタンパク質反応槽が連結したタンパク質処理チップでは、合成されたタンパク質である酵素による反応を同一チップ上で行うことできるので、電気泳動とは無関係に有用である。いずれの場合も、またタンパク質合成槽と濃縮機との組み合わせの場合も、目的タンパク質を濃縮して提供できるので有用である。同様にキャピラリー電気泳動部とキレートカラムの組み合わせでは、内部、あるいは外部から供給される夾雑物を含んだ試料の純度を高めることができることで夾雑物によるキャピラリー電気泳動の電場の乱れを抑制することができる。新規な組み換えタンパク質の解析では該タンパク質に対する抗体を入手することが困難な場合があるが、アフィニティークロマトグラフィーの中でもタグを利用するキレートカラムを用いることで確実に精製を進めることができる。キャピラリー電気泳動部は染色部位との組み合わせにより分離後の成分を光学的に検出することができるようになる。
【００３６】
本発明の、該タンパク質処理部位が、同一の、あるいは積層された一体の基板上に、３つ以上１００００個以下形成されていることを特徴とするタンパク質処理チップを採用することにより、当該チップのスループットを高めることができる。
【００３７】
本発明の、該タンパク質処理チップの接液面の一部、または全部に対しタンパク質吸着抑制処理を行ったタンパク質処理チップ、あるいは、試料、移送液、溶離液、および染色液の少なくともいずれか一つにタンパク質吸着抑制成分が含まれていることを特徴とするタンパク質処理チップの利用法を採用することにより、目的タンパク質を吸着によって失うことなく、下流の処理部位へ移送して利用していくことができる。
【００３８】
このように本発明によって、タンパク質処理に必要な種々の機能を有する多機能型のタンパク質処理チップを提供できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明について、以下具体的に説明する。
【００４０】
本発明はマイクロフルイディクス型チップに関するものである。
【００４１】
マイクロフルイディクス型チップとは凹部を形成した基材を別基材と接合して流体を保持可能な微小空間を有するように作製されたものである。あるいは貫通したスリット形状を有する薄膜とこれを挟み込む少なくとも２つの基材によって作製された流体を保持可能な微小空間を有するものである。基材はシート状、板状、フィルム状、棒状、管状、塗膜状、円筒状、その他複雑な形状の成形物をとりうるが、これに限定されるものではない。しかし加工性および取り扱いの容易さから、好ましくはシート状、板状、フィルム状である。基材には、ガラス、セラミックス、樹脂、金属、半導体およびこれらの組み合わせが考えられるが、これに限定されるものではない。光学的検出を行うチップにあっては、少なくとも基材の一部が染色の波長域で透明な材料であることが好ましい。基板の一方から蛍光検出を行うチップにあっては、検出を行わない側の基材が該波長域で不透明であり、反射性が低いことが好ましい。送液に電気浸透流を利用する方式、あるいはオンチップキャピラリー電気泳動を行う方式にあっては、絶縁性の材料でかつ、その絶縁破壊強度が実施時の印加電圧に耐えられるものであることが好ましい。
【００４２】
凹部、あるいは貫通穴形状を得るには、射出成形、ホットエンボシング、溶剤キャスト法、切削、旋削、研削、エッチング、打ち抜き、フォトリソグラフィー、リフトオフ、蒸着、およびこれらの組み合わせなどを手段とできるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
マイクロフルイディクス型チップの典型的な、接合後流体を導入することになる空間を形成する凹部は、好ましくは基材に垂直な方向から見て幅１から５００マイクロメートルの線形状と、１００平方センチメートル以下の幾何学形状の組み合わせで、深さ１から５００マイクロメートルであるが、これに限定されるものではない。典型的に線形状は接合後、管形状となり、流路として用いられ、その他の幾何学形状は特定の機能付与のため空間や別部材導入の空間に用いられる。流路として用いる部分については幅あるいは深さが１マイクロメートルを下回ると流路としての圧力損失が大きくなるため不適当で、深さや幅が５００マイクロメートルを上回る場合および、部分的な幾何学形状が１００平方センチメートルを上回る場合は、微小デバイスとしての全体のサイズに不適当であるからである。また、凹部形成のための貫通穴形状を有する基材は、少なくとも貫通穴周辺部で厚さが５００マイクロメートル以下であることが好ましい。貫通穴を有する基材の厚みが、接合後流体を導入することになる空間の深さ方向寸法を規定することとなるためである。ただし、これらの寸法は接合面で面方向に流す流路以外の空間の寸法を規定するものではない。たとえば典型的な試料導入穴は、５００マイクロメートルを上回る板厚に貫通穴が形成される形で形成され、反応槽や電気泳動槽などにあっては幅が１０ミリメートルを上回って形成されてもよい。
【００４４】
本発明における接合とは、複数の基材を重ね合わせ、必要であれば凹部から流体の漏れを起こさないようにする手法を指す。より具体的には、単純な重ね合わせ、プラズマ処理などによる表面活性化、加熱を伴う方法、圧力を印加する方法、電場を印加する方法、接着剤を用いる方法、溶剤を用いる方法、およびこれらの組み合わせがある。タンパク質合成部位で膜を挟み込む方式にあっては、好ましくは、膜の耐熱温度より３０℃を上回らない温度で実施する。耐熱温度より３０℃以上加熱すると、輻射熱や接合面から伝熱により膜が耐熱温度以上になり膜の機能を失うからである。不可逆に接合するだけでなく、使用時に治具により押さえつける加圧方式によって接合を行うこともできる。接合される枚数は、マイクロ化学チップではすでに２〜１０枚程度の積層によるデバイスが報告され、数百から数千枚の組み合わせによるスループット向上が提唱されている。組み込まれる膜との一方の接合面部分で面方向に複数の基材を組み合わせることができるが、構造の簡略化や漏れの抑制の観点からそれぞれ一つの基材で構成されていることが好ましい。このため少なくとも２つの基材が必要である。
【００４５】
マイクロフルイディクス型チップの送液方法には、圧力、濃度、電場、磁場の差、あるいは勾配を利用する方法、表面力を利用する方法、慣性力を利用する方法およびこれらの組み合わせがあるがこれに限定されるものではない。圧力では加圧と減圧があり、ポンプやガスボンベ、加圧器、減圧器、落差などを組み合わせて流体を移動させることができる。電場には直流電場、交流電場、あるいは任意波形の電場を用いることができる。直流電場では電気浸透流、電気泳動を、交流電場では誘電泳動などの原理によって流体、あるいは流体の成分を移動させることができ、任意波形ではこれらの現象の組み合わせにより移動させることができる。磁場、あるいは電場によって流体にけん濁させた粒子を移動させ、その結果として流体を移動させることができる。表面力には毛管現象がある。流体と接する面を改質、加工するなどで表面力の差、あるいは勾配を形成し、流体の移動を制御することができる。慣性力を利用する場合には、チップ全体を遠心器に配置して利用する方法や、チップに一時的な加速度を与える方法がある。これらの組み合わせには、複数の手法を同時に行うものと、処理部位ごとにそれぞれ個別の移動方法を行うことができる。
【００４６】
本発明は、キレートカラムを有することを特徴とする。
【００４７】
本発明におけるキレートカラムとは、アフィニティークロマトグラフィーの一種である金属イオンと、タンパク質表面に局在しているヒスチジン、システイン、トリプトファンなどにより金属イオン親和性を示すタンパク質とがキレート形成する現象を利用した精製を行うカラムである。好ましくは、目的タンパク質が、あらかじめヒスチジンタグを持つように発現させてあり、目的タンパク質の該ヒスチジンタグと固定相の金属イオンとでキレート形成させる方法である。金属イオンには銅、亜鉛、ニッケル、カルシウム、コバルト、マグネシウムそれぞれのイオンを用いることができるが、これに限定されるものではない。キレート形成により親和性を示すタンパク質をカラム中に保持し、親和性を示さない夾雑物と分離した後、溶離液を導入することで保持されていたタンパク質を下流へ流すことができる。溶離液には競合試薬あるいはキレート剤を含むか、低ｐＨの緩衝液などであり、好ましくは、イミダゾール、尿素、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、塩酸である。
【００４８】
本発明におけるヒスチジンタグは、産物であるタンパク質にある場合と、無細胞合成に関与するすべてのタンパク質にある場合とがある。前者には一般の無細胞タンパク質合成試薬を、後者にはポストゲノム研究所のピュアシステムを用いることができる。産物にヒスチジンタグがあっても良い場合は、収量の高い前者を、タグがあることが良くない場合は後者を選択することが好ましい。
【００４９】
キレートカラムのための金属イオンを固相化するには、好ましくは末端窒素原子に２つあるいは３つの有機酸官能基が結合した基が固定化され、該基によって金属イオンとイオン結合、あるいは配位結合する。該基を固定化するには、チップの加工中、あるいは加工後に化学的に表面処理するか、あらかじめ該基が導入された充填剤を充填する方式がある。
【００５０】
キレート形成のための金属イオンを固相化する官能基が、化学的な表面処理は複数種類の処理部位が流路で結ばれたチップにおいて、反応試薬が他処理部位に流れ込むなどの問題を引き起こしやすく、またその固定化処理がチップ内反応に限定されるため種々の困難を伴いがちである。このため好ましくは充填型である。金属イオンはあらかじめ固相化されている場合と、使用時に固相化される場合とがある。
【００５１】
マイクロフルイディクス型のタンパク質処理チップにおいてキレートカラムを構築することによって、他の精製方式よりも容易に精製系を構築し、実施できるようになる。キレートカラムでは組み換えタンパク質にタグを付与するだけで精製を進めることができるので、新規なタンパク質毎に抗体を開発する必要がないからであり、タグを有するタンパク質のみを特異的に吸着するので、１段階で非常に高い精製効率が期待されるからである。
【００５２】
本発明は、充填型であることを特徴とする。
【００５３】
本発明における充填型キレートカラムとは、キレートカラム用の充填剤をマイクロ流路中に充填したものである。試料の流れ方向分散を抑制するためには充填率は該マイクロ流路中に理論的に最密充填された状態に近いことが好ましいが、タンパク質の分取目的では流れ方向分散抑制の要請度は低いことが多く、充填部に充填剤が部分的に欠損してもよい。
【００５４】
本発明におけるキレートカラム用の充填剤とは、大きさ１０ｎｍ以上で、管の断面以下の断面形状を有する粒子状の部材であって、キレート形成可能な金属イオンが固定化されているか、金属イオンの通液操作によって金属イオンをキレート形成可能な状態で固定化させる官能基が表面に固定化されたものである。より好ましくは大きさが５０ｎｍ以上で１００マイクロメートル以下である。小さすぎる場合、充填剤が下流に流れ出ない構造にすることが困難であり、大きすぎる場合、表面の接触効率が低下するからである。市販のキレートカラムのための充填剤をそのまま用いることができる。
【００５５】
キレートカラムの固定層を充填方式によって実現することは、固定層の化学処理が基板接合時の加熱処理などの影響を受けることなく接合後に充填できるようになるため好ましい。また、既成の充填剤を転用できるため好ましい。さらにチップ構造上の制約を受けることなく、チップ外で充填剤を作製できるので好ましい。
【００５６】
本発明における充填剤を堰き止めるための構造は、充填剤の粒径よりも、流路深さが浅くなるか、流路幅が狭くなるか、あるいはこれらの組み合わせによって実現される。このために形成される流路を構成する基材自体が狭隘な構造をとる場合と、別部材の導入によって狭隘な構造とする場合、あるいはこれらの組み合わせを行うことができる。しかし、別部材の導入は作製工程を煩雑にするため、製作コストの観点から基材自体を狭隘な形状に加工することが好ましい。マイクロフルイディクス型チップの作製法にあっては、平面パターンから深さを持つように転写、加工する方式をとることが多い。このため部分的に流路深さを浅くするには２段階の平面パターンを転写する工程を必要とする。よって、作製コストの観点から、流路幅を狭くする加工法とすることが好ましい。堰き止め構造部の狭隘な流路は、１つの堰き止め構造部あたり１つであればよいが、該構造部での圧力損失低減のためには、並列した複数の狭隘な流路があるのでも良い。図２に堰き止め構造部での狭隘な流路の例を示す。矢印は送液方向を示す。
【００５７】
堰き止め構造が流路幅を減ずる形状であることは、リソグラフィー法を用いて開発されるチップにあってはマスク数を抑制することができるため作製コストの面から好ましい。機械加工方式であっても深さが一定になり、複雑なZ軸制御を必要としないので好ましい。
【００５８】
本発明は、タンパク質染色部を有することを特徴とする。
【００５９】
本発明におけるタンパク質染色部とは、対象とするタンパク質液と染色液との２つ、あるいはそれ以上の液を接触させ、タンパク質分子と染色剤分子とを接触させる機能を有する部位を指す。タンパク質と染色剤とを混合するには、別の流路から合流させる方法と、同じ流路の流れの別セグメントに置かれたそれぞれの液を流れ方向の拡散あるいは分散によって混合する方法とがある。多種類の処理部位が直列に配置されるチップにあっては同じ流路上の流れの別セグメントにタンパク質と染色剤とを配置することが困難であり、染色部よりも上流側にある処理部位に対し染色剤による負担をかけることになり、流れ方向の拡散あるいは分散により試料セグメント長を不必要に長くしてしまうため、好ましくは別の流路から合流させる方法である。
【００６０】
本発明における染色剤には、紫外域、あるいは可視域における吸光団、あるいは蛍光団を有する原子、分子、あるいは大きさが１００ｎｍ以下の粒子を用いることができるがこれに限定されるものではない。その結合様式は、タンパク質との共有結合や抗原抗体のように強い結合を形成するものから、イオン性結合、配位結合、スタッキング、ミセル形成などの弱い相互作用や、タンパク質と相互作用する分子中で発色するもの、あるいは活性染色のように間接的な染色であってもよい。流れの全体における目的タンパク質の局在を確認できることが重要であるからである。３００ｎｍ以下ではタンパク質がもともと吸収を有し、かつ、３００ｎｍ以下で透明な基材が石英に限定されることから、波長域は３００ｎｍ以上であることが好ましい。検出感度の高さから蛍光染色が好ましい。特定のタンパク質のみを対象としたい場合は目的タンパク質を抗原とする抗体に直接、あるいは間接的に染色されていることが好ましい。種々のタンパク質を検出する場合にはタンパク質によらず染色が可能な色素であり、たとえばフルオレセインイソチオシアネート、あるいはローダミンイソチオシアネートである。しかし、タンパク質のアミノ基と反応するイソチオシアネートによる染色はタンパク質ごとに染色度合いが異なるため、より好ましくはタンパク質によらず染色が可能なＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｒシリーズ（インビトロジェン社）、あるいはＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅなどであり、より好ましくは室温の混合だけで迅速な染色が可能なＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅである。
【００６１】
タンパク質染色部を圧力送液方式によって実現することは、電場による送液での電気泳動的な分離を誘起しないので好ましい。また前後で圧力送液方式の処理部位を有する場合、送液方式を共有できるので好ましい。また、簡易な背圧、あるいは吸引を行う外部のポンプによって簡単に送液を実現できるので好ましい。
【００６２】
染色剤が、試料と別の入り口からチップ内に導入されることは、移送経路上での不用意な混合を避けることができるので好ましい。また、試料と染色液が別の送液方式によって移送されるためには好ましい。さらに、合流方式は攪拌や対流を誘起することなく速やかな混合が期待されるので乱流条件を成立されることが困難な微小空間では好ましい。
【００６３】
本発明は、基板上にタンパク質合成槽を有する無細胞タンパク質合成を行うマイクロフルイディクス型チップであって、該基板上、あるいは積層された別基板上のいずれかの面にアフィニティークロマトグラフィーカラム、タンパク質反応槽、あるいは濃縮機の少なくともいずれか一つが形成されており、おのおのが試料運搬用流路で結ばれていることを特徴とする。
【００６４】
本発明における、タンパク質合成槽、およびキャピラリー電気泳動部、検出部については特許文献３に開示されているとおりである。
【００６５】
本チップのタンパク質合成槽にて無細胞タンパク質合成を行う上で、無細胞タンパク質合成用反応液の接液面からＲＮＡ分解酵素除去されているか、該ＲＮＡ分解酵素の濃度が非常に低いことが好ましい。作製工程のあらゆる段階でＲＮＡ分解酵素の混入を防ぐように措置されていることが好ましく、さらに作製後、乾熱滅菌処理を行うか、ＲＮＡ分解酵素を取り除いた水で洗浄することが好ましい。
【００６６】
タンパク質合成槽において用いられる膜は、乾熱滅菌処理に耐えられず、また水洗後、そのまま乾燥させると壊れることが多いので、乾燥が必要であれば、ＲＮＡ分解酵素除去水での水洗後、ＲＮＡ分解酵素を含まないように処理したポリエチレングリコールの水溶液を浸して、完全な乾燥から守ることが好ましい。
【００６７】
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィー法には、金属イオンとのキレート現象を利用した方法以外に、抗原、抗体、ヘパリン、ストレプトアビジン、ベンザミジン、グルタチオン、アルギニン、カルモジュリン、ゼラチン、リジン、マンノース、ＤＮＡ、２’５’アデノシン２リン酸、核酸、酵素基質、酵素阻害剤などが固相化されたカラムを用いることができるが、これに限定されるものではない。ただし特異性の低い相互作用を利用した固相吸着・固相抽出法は含まれない。
【００６８】
アフィニティーカラムを作製するには、基質や阻害剤、抗体、あるいは金属イオンなどを固定相に配置する。このためチップのマイクロ流路内壁表面に物理・化学修飾による固定化を行うか、流路径よりも小さな寸法を有する粒子に固相化した後、該粒子を充填するかによって実現することができる。一般のアフィニティークロマトグラフィー法で用いられている充填剤、あるいはそれに類するものを充填すれば、容易に実施できるので好ましい。
【００６９】
本発明におけるタンパク質反応槽とは、取り扱われるべきタンパク質と、反応槽に供給、あるいは固定化された成分との反応を起こすための、チップ内に設けられた部位を指す。この反応には、チップ上で合成された、あるいは外部から導入されたタンパク質である抗体、受容体、あるいは酵素などの反応性のタンパク質による会合体の形成や共有結合の開裂をふくむ化学反応などの反応や、共有結合的、あるいは会合的なタンパク質の染色反応などがあるがこれに限定されるものではない。連結した下流側のすべての処理部位でタンパク質以外を取り扱うことを目的として、外部からタンパク質を加えて起こす反応は対象としない。例えば処理対象となるタンパク質が酵素であって、その酵素反応精製物を分離、検出、定量するシステムにおける酵素反応槽は含まれるが、処理対象がＤＮＡであって、その切断や増幅のために酵素が添加されて反応を起こし、連結した下流側のすべての処理部位でＤＮＡを対象として処理する方式は本タンパク質反応槽に含まれない。
【００７０】
本発明において濃縮機とは、タンパク質を該処理部位への導入時の濃度よりも高めることができる処理部位を指す。アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー法、膜分離法、あるいは等電点電気泳動やスイーピング、スタッキングなどの電気泳動的手法をチップ上に構成することによって実施できるがこれに限定されるものではない。
【００７１】
本発明における試料運搬用流路とは、処理部位間、あるいはチップと外部とを結ぶ細管である。好ましくは基材面上に加工された幅１０マイクロメートル以上、２００マイクロメートル以下の、等幅で一様な深さの流路であるか、基材を貫通するように加工された直径１０マイクロメートル以上、１ミリメートル以下の管形状であるが、これに限定されるものではない。試料運搬用流路は、設計上、直接連結させることのできない２つあるいは２つ以上の処理部位、あるいはチップと外部とを結ぶ。連結以外の機能が期待されない流路にあっては、圧力損失が小さく、試料セグメントの流れ方向拡散を抑制する構造で、デッドボリュームが小さいことが求められるからである。
【００７２】
無細胞タンパク質合成とアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせることは、複雑な混合溶液である無細胞タンパク質合成液を効率よく処理して目的のタンパク質を得ることができるようになるので好ましい。
【００７３】
無細胞タンパク質合成とタンパク質反応槽を組み合わせることは、不安定なタンパク質を合成後すみやかに利用できるようになるので好ましい。また、ピペッティングなどに起因する試料や時間のロスなどを起こさずに処理を実施できるようになるので好ましい。
【００７４】
無細胞タンパク質合成と濃縮機を組み合わせることは、産物であるタンパク質の濃度を高めて、下流側での検出や反応などの利用時の効率を向上させることができるようになるので好ましい。特にタンパク質合成の液量は、他のタンパク質処理部位が必要とする液量よりも多くの液量を有することがあり、利用可能な体積に目的成分を濃縮することは好ましい。
【００７５】
電気泳動を実施する前にキレートカラムによる精製を実施することによって、目的以外の成分を除去することができるので好ましい。電気泳動はイオン性物質やその他の高濃度目的外成分を除去することによってより鋭く安定なバンドを得ることができるからである。
【００７６】
また、キレートカラム精製後、その精製成分を電気泳動によって確認することは、対象成分が、タグ部分を有する不完全な長さのタンパク質であったり、非特異的な吸着によりカラム部分にとどまった成分でないことを確認できるため好ましい。
【００７７】
このようなキレートカラムとキャピラリー電気泳動の組み合わせにおいて、検出部を含まなくても、電気泳動的を分取法として利用することができる。しかし、検出部を有することによってその分離状況を確認することができ好ましい。分析目的で検出部は大変重要な機構である。
【００７８】
また、このようなキレートカラムとキャピラリー電気泳動の組み合わせにおいて濃縮機構を加えると、分析の感度を向上させることができるので好ましい。多くの場合キレートカラムのでタンパク質処理量と、キャピラリー電気泳動に供される試料量を比較すると、キャピラリー電気泳動の試料量が極めて少ない。濃縮機構の採用によってよりキレートカラムからの試料の利用度を高めることができ、それにより感度の向上につながるからである。
【００７９】
また、キレートカラムとキャピラリー電気泳動の組み合わせにおいて、反応機構を加えると、染色反応や酵素反応などによって、そのままでは検出が困難なタンパク質試料を、電気泳動後に検出可能な試料に変換することができるので好ましい。また、得られたタンパク質を利用した産物を得る方式では、その一部を電気泳動により確認することができるので好ましい。
【００８０】
本発明におけるタンパク質処理部位とは、タンパク質処理チップ上に形成された、タンパク質合成槽、アフィニティークロマトグラフィーカラム、キレートカラム、タンパク質反応槽、タンパク質染色部、濃縮機、キャピラリー電気泳動部、および検出部のうちの一つ、あるいは任意の組み合わせである。
【００８１】
タンパク質処理部位が複数形成されているとは、まったく同じ設計の処理部位が、チップ上の異なる場所に形成される場合と、少し異なる設計の処理部位がチップ上の異なる場所に形成される場合とがある。また、一連の処理部位のうち、一部の処理部位が複数並列して形成されており、他の処理部位がそれよりも少ない数で形成される場合がある。たとえば、所要時間の長い処理部位であるタンパク質合成槽が複数形成され、その下流にその他、アフィニティークロマトグラフィーカラム、染色部位、脱塩部位、濃縮部位、キャピラリー電気泳動部位が１つだけ形成され、タンパク質合成槽を切り換えながら利用することで、各機能部位の利用効率を高めることができる。
【００８２】
このような機能を並列して配置すると、処理量を向上させることができるので好ましい。
【００８３】
本発明は、タンパク質吸着抑制処理を行ったことを特徴とする。
【００８４】
本発明におけるタンパク質吸着抑制処理とは、高分子や無機材料を流路や膜の表面にコーティングして、流路内壁および膜表面を改質することである。好ましくは基板材料よりも水との親和性が高い物質でコーティングすることである。例えば、流路表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーを塗布したり吸着させたりすることが特に好ましい。ここで、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーとは、ＭＰＣのホモポリマーでも良いし、ＭＰＣと、例えば、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリレート、スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ核置換スチレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、ジエチルイタコネート、ジ−ｎ−ブチルイタコネート等との共重合体でも良い。その他の方法としては、シリコーン樹脂を壁面に塗布することも効果的であり好ましい。
【００８５】
本発明におけるタンパク質吸着抑制成分とは、塩類、タンパク質、界面活性剤、親水性高分子、あるいはこれらの組み合わせである。いずれも一定以上の濃度、あるいは量がなければ有効な機能が見られない。しかし、タンパク質の機能を活用するチップにあっては、それぞれの濃度が高すぎるとタンパク質が機能を失うので、利用にあってはあらかじめ実験的に確認する必要がある。好ましくは、塩類であれば、塩化ナトリウムなどの無機塩類を１０ｍＭから１Ｍの濃度で用い、タンパク質であれば、ウシ血清アルブミンを、接液面を覆うのに十分な量以上目的タンパクに先行して流すか、目的タンパク質と競争的に十分優先して表面吸着できるように目的タンパク質と混合して流し、界面活性剤であればＴｗｅｅｎ２０あるいはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．００１％からミセル臨界濃度以下で、親水性高分子であればポリエチレングリコールを０．１％以上５％以下で用いるか、これらの組み合わせである。
【００８６】
接液部にタンパク質吸着抑制処理を行うか、通液される溶液にタンパク質の吸着抑制成分を添加することにより、タンパク質の吸着を抑制することは、処理の高収量化、分析の高感度化につながり好ましい。微小空間では比表面積が大きいため吸着現象は他の系よりも顕著に表れる。タンパク質を取り扱うチップで目的タンパク質が内壁面に吸着すると、反応が進行しなかったり、下流で産物として回収できなかったり、検知部まで届かないことにより感度を下げたり、吸着で表面状態を変えて流れを乱してしまったりするおそれがあるが、これらの問題を解消できるからである。
【実施例】
【００８７】
以下に、実施例を用いて本発明の効果をさらに具体的に説明する。
（実施例１）
図３は作製したキレートカラムのフォトマスクパターン、図４は該パターンの堰き止め構造部の拡大図である。このマスクのパターンを用いて、マイクロフルイディクス型チップのＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）チップ作製法として一般的な方法に従って、ＰＤＭＳチップを作製した。１回目のスピンコートの回転数については、あらかじめフォトレジストのデータシート、および種々の回転数での事前検討により、約６０マイクロメートル厚となる回転数を明らかにしておき実施した。ＰＤＭＳ厚が約２ｍｍとなるようにでパターンを転写した後、切り取り、試料および充填剤導入口、および排出位置に貫通穴を開けた。別途、平板ガラス上で形成した約１ｍｍ厚のＰＤＭＳ板作製した上板および下板の接合面を反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、サムコ・インターナショナル社）で１００Ｗ，３０秒間処理し、接合した。充填剤（ＨｉｓＴｒａｐ  ｋｉｔから取り出したもの：ゲルマトリックス６％高度架橋アガロース、平均粒子径３４μｍ、アマシャムバイオサイエンス社）を、０．１Ｍ硫酸ニッケル溶液（ＨｉｓＴｒａｐ  Ｋｉｔ、アマシャムバイオサイエンス社）に１時間浸漬し、超純水で３回洗浄した後、導入口からスラリー充填した。フローシステムは、上流から順に、シリンジポンプ（モデル２１０、１ｍＬシリンジ、ＫＤサイエンティフィック社）、ＰＥＥＫ製チューブ、溶離液導入用サンプルインジェクター（モデル７７２５、ループサイズ５μＬ、レオダイン社）、ＰＥＥＫ製チューブ、タンパク質導入用サンプルインジェクター（モデル７５２０、ループサイズ１μＬ、レオダイン社）、ＰＥＥＫ製チューブ、作製したチップ、テフロン（登録商標）製チューブ、廃液溜め、となるように接続した。作製したチップは倒立型蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、対物レンズ４倍、オリンパス社）上に置き、顕微鏡のサイドポートに接続した冷却ＣＣＤカメラシステム（ＣｏｏｌＰｉｘ、ＲＳイメージエクスプレス、ローパー社）によって動画を取得した。
【００８８】
移送液として、１０分間超純水を１０μＬ／ｍｉｎで送液したのち、１０ｍＭイミダゾール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、１０μＬ／ｍｉｎで送液した。試料として、ヒスチジンタグを有するＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）１５０ｎｇ／μＬ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製して用い、タンパク質導入用サンプルインジェクター（モデル７５２０）から導入した。溶離液として、５００ｍＭイミダゾール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製して用い、溶離液導入用タンパク質導入用サンプルインジェクター（モデル７７２５）から導入した。
【００８９】
カラムを明視野観察すると、充填剤がほぼ規則正しく密に充填されていることがわかった。蛍光顕微鏡で観察しながらタンパク質を導入すると充填剤位置が上流から次第に蛍光性を示すようになり、下流側堰き止め部位まで蛍光が確認されるようになった直後、蛍光性を有する溶液セグメントが下流側に流れ出た。これは充填剤でキレート形成できなかった過剰なＧＦＰが下流に流れていったためだと考えられる。つぎに溶離液を導入したところ、すみやかに上流側から順に蛍光性が失われていき、蛍光性セグメントが下流に流れていった。蛍光性セグメントの特に蛍光強度が強い部分は、充填剤なしで同じＧＦＰを導入したときよりも明るかった。このことからキレートカラムによる濃縮効果が確認された。
【００９０】
このタンパク質導入、溶離は、間に移送液を流すだけの措置で、顕著な変化なく３回繰り返すことができた。しかし、移送液、タンパク質液、溶離液のすべてをＴｗｅｅｎ  ２０を除き、それ以外を同一として調製した試薬群を用いると、繰り返すごとにカラムやカラム以外の流路のバックグランド蛍光が高くなった。すなわちそれぞれの液に界面活性剤を添加することで非特異的なタンパク質の吸着を抑制できることがわかった。
【００９１】
再びＴｗｅｅｎ  ２０を含む条件で、タンパク質濃度を５ｎｇ／μＬとして導入すると、カラムの上流側のみから蛍光が観察され、過剰なＧＦＰのセグメントが、溶離液導入前に流れ出る現象を見ることはできなかった。さらにヒスチジンタグのないＧＦＰを通液したところ、カラムでの吸着現象を観察することはできず、溶離液導入以前に、単純に下流に流れ出た。
【００９２】
さらに種々のＧＦＰ濃度で試したところ、１０−１００ｎｇ／μＬの濃度範囲で回収して、それぞれの蛍光強度を蛍光光度計によって測定したところ、図５に示すようにタンパク質液の蛍光強度と濃度との間に直線関係が認められた。
【００９３】
さらにウシ血清アルブミンをCY5で染色したものとヒスチジンタグの結合したＧＦＰの混合液の、それぞれ３０ｎｇ／μＬを注入し、１０分間通液し、溶離液を導入した。溶離液導入の前後に回収した溶液それぞれの蛍光強度を蛍光光度計によって測定し比較したところ、図６に示すようにウシ血清アルブミンは、約８５％が溶離液導入前に、約１５％が導入後に回収され、ＧＦＰは約２５％が溶離液導入前に、約７５％が導入後に回収され、混合液からヒスチジンタグの有無により特定成分のみを回収できることがわかった。
【００９４】
以上から作製したビーズ充填カラムがキレートカラムとして機能することを確認した。
（実施例２）
図７は作製した染色部位のフォトマスクパターンである。実施例１と同様の手法でＰＤＭＳチップを作製した。フローシステムは１台のシリンジポンプで２本のシリンジを押して送液し、染色側は染色液導入用サンプルインジェクター（モデル７７２５、ループサイズ２０μＬ、レオダイン社）、を経てチップの染色液導入口へ接続し、タンパク質側はタンパク質導入用サンプルインジェクター（モデル７５２０、ループサイズ１μＬ、レオダイン社）を経てチップのタンパク質導入口へ接続した。移送液として、染色液側もタンパク質液側も０．５％ＰＥＧ水溶液をそれぞれ１０μＬ／ｍｉｎで流し、染色液として、１００倍希釈のＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（バイオラッド社）と０．１％のＳＤＳを超純水で１００倍希釈したもの、タンパク質液としてＢＳＡ１０００ｎｇ／μＬを調製して用いた。
【００９５】
蛍光顕微鏡で観察しながら送液を開始し、流れが十分安定したところで染色剤を導入して、このセグメントと合流できるタイミングでタンパク質を導入したところ、合流した２液は出口までほぼ理想的な２相流を形成していたが、タンパク質セグメントは下流に移るにつれて染色液界面から順に蛍光性を示すようになった。この試験は３回繰り返すことができた。このように合流方式によって、オンラインでタンパク質を蛍光染色することができた。別途新規のチップで移送液にＰＥＧを含まない方式を試みたところ、一度目の通液以降、流路のタンパク質側が染色されたままになり再現性のある試験を実施することができなかった。この結果からＰＥＧの添加効果が確認された。
（実施例３）
図１は作製した集積型チップの接合前分解斜視図である。上板、下板ともに大きさ８０×２３ｍｍで厚さ１ｍｍである。下板は、このパターンでＬＩＧＡプロセスによるニッケル製鋳型を作製し射出成形を行うことで深さ４５μｍの無色透明なポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ）製チップを作製した。上板はブッシング加工による鋳型を作製し、射出成形を行うことで無色透明、あるいは黒色不透明のＰＭＭＡ製チップを作製した。透析膜（スペクトラ／ポー、スペクトラム社）を切り抜き、タンパク質合成部位に静置して、ホットプレスによって接合した。このチップに対し分子量５０００００、１０００ｐｐｍのポリエチレングリコール水溶液を充填、密封し、ガンマ線を照射した。ＲＮＡ除去水（ＲＮａｓｅ  ＡＷＡＹ、モレキュラーバイオプロダクツ社）で洗浄した後、実施例１と同様に充填剤を充填し、再びチップとフローシステム部材とをＲＮＡ除去水で洗浄した。チップ全体を該水で満たしたままにしておいた。無細胞タンパク質合成キット（プロテオマスター  Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｋｉｔ）およびヒスチジンタグ領域を持つＧＦＰのプラスミドを用いて取扱説明書に従って供給液と反応液を調製し、使用時まで、氷上で保存した。チップ全体を該水で満たしたままの状態から、ピペットを用いて供給槽部分を供給液で置換し、ポリカーボネート製のホルダーにセットした。移送液として、１分間超純水を１０μＬ／ｍｉｎで送液したのち、１０ｍＭイミダゾール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を、１０μＬ／ｍｉｎで送液した。このとき廃液は、キレートカラム直後の廃液用ポートから排出されるように、他の試料ポートそばに設置しておいたストップバルブを閉じておいた。反応液をサンプルインジェクター（モデル７５２０、ループサイズ１μＬ）から導入し、無細胞タンパク質合成部位で、該タンパク質反応液セグメントが静止するように送液を止め、室温で３０分静置した。導入時に用いた送液系を再び１０μＬ／ｍｉｎで駆動し、反応液をキレートカラムに流した。合成液がキレートカラムを十分通過したのちさらに１分間送液を続け、送液を停止し、導入部、排出部のストップバルブを閉じた。充填剤導入口から、図１の５ｂに示す夾雑物排出口へ送液するようにストップバルブを開け、溶離液兼染色液として５００ｍＭイミダゾール、０．１％ＳＤＳ、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１００倍希釈のＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（バイオラッド社）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を調製して、サンプルインジェクター（モデル７７２５、ループサイズ５μＬ）から導入した。溶出タンパク質セグメントが図１の８ｂへの分岐部から９ｂの間の位置で静止するようにポンプを止めた。高電圧シーケンサー（モデル  ＨＶＳ４８８  １５００Ｖ、ラボスミス社）を用いて、９ｂと１１ｂとの間に３００Ｖの電圧を１０秒間印加し、さらに１０ｂと１２ｂとの間に９００Ｖの電圧を３分間印加し、領域２２の種々の位置で、蛍光顕微鏡観察した。
【００９６】
蛍光顕微鏡で観察したところ、タンパク質合成部位ではＧＦＰに基づく蛍光を確認することはできなかった。しかし、溶離・染色工程以降ではＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅに基づく蛍光が観察されるようになり、かつ、充填剤に対し直接溶離剤を含む染色液を入れる方が混合が早く進んでいることを確認できた。キャピラリー電気泳動では、下流に移動するにつれピークが薄くなったが、有効分離長さとして２０ｍｍまでは有効に機能したことを確認した。
【００９７】
また、上板を黒色不透明、下板を無色透明チップとしたところ、それぞれの位置での蛍光観察においてバックグランドの低下が認められた。
【００９８】
このように１つのマイクロフルイディクス型チップにおいてタンパク質合成、精製、濃縮、染色、電気泳動、検出を行うことができた。
（実施例４）
同様のキレートカラム処理の後、染色剤であるＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅの代わりにＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）の基質を、５００ｍＭイミダゾール、０．１％ＳＤＳ、５００ｍＭ塩化ナトリウムとなるように該キット付属のバッファーで調製し、充填剤導入用穴４ａから導入し、キャピラリー電気泳動試料導入穴９ａに排出した。図１の領域１６における化学発光を実施例３と同じ倒立顕微鏡と冷却ＣＣＤカメラシステムで観察したところ、比較として行ったＧＦＰ合成の場合は顕著な発光が見られなかったのに対して、ルシフェラーゼを合成した場合にはその化学発光を観測することができた。これにより、無細胞タンパク質合成、キレートカラム精製、タンパク質反応槽の一体化が可能であることがわかった。
（実施例５）
実施例３の構造が３ｍｍのギャップを開けて同じ向きに４つ並んだデバイスを実施例１と同様のＰＤＭＳで作製した。酸素プラズマ処理によって活性化された表面に対し、膜を挟んだ接合と、ＰＥＧ溶液の通液の両方を行った。同じ手順に従ってポンプを切り替えながらタンパク質合成、生成・濃縮、染色、電気泳動・検出を行ったところ、ＰＤＭＳではタンパク質合成槽においてわずかながらＧＦＰ自身の蛍光を確認することができた。それ以降の挙動は実施例３と同等な結果が得られた。最終段階の評価として４レーンそれぞれの、十字流路（図１の２１）から２０ｍｍ下流までの電気泳動時間を評価したところ、２０％以内の誤差であった。このように１つのマイクロフルイディクス型チップにおいて多数の機能部位が並列したチップが開発できた。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】合成、精製、染色、濃縮、電気泳動、検出部位が集積化されたタンパク質処理チップの分解斜視図
【図２】堰き止め構造部での狭隘な流路の例
【図３】作製したキレートカラムのフォトマスクパターン
【図４】作製したキレートカラムの堰き止め構造拡大図
【図５】導入したタンパク質量と精製・回収できたタンパク質量との関係
【図６】キレートカラムによるモデル目的タンパク質とモデル不純物を含む試料の分離
【図７】作製した染色部位のフォトマスクパターン
【符号の説明】
【０１００】
１ａ…  反応液導入穴
１ｂ…  反応液導入位置
２…  供給液導入穴
３…  供給液排出穴
４ａ…  充填剤導入穴
４ｂ…  充填剤導入位置
５ａ…  夾雑物排出穴
５ｂ…  夾雑物排出位置
６ａ…  染色液導入穴
６ｂ…  染色液導入位置
７ａ…  染色予備穴
７ｂ…  染色予備穴位置
８ａ…  試料排出予備穴
８ｂ…  試料排出予備穴位置
９ａ…  キャピラリー電気泳動試料導入穴
９ｂ…  キャピラリー電気泳動試料導入位置
１０ａ…  キャピラリー電気泳動電圧印加穴
１０ｂ…  キャピラリー電気泳動電圧印加位置
１１ａ…  キャピラリー電気泳動試料排出穴
１１ｂ…  キャピラリー電気泳動試料排出位置
１２ａ…  排出穴
１２ｂ…  排出位置
１３…  上板
１４…  供給槽および膜保持用構造
１５…  キレートカラム部
１６…  タンパク質染色部
１７…  キャピラリー電気泳動部
１８…  下板
１９…  タンパク質合成槽
２０…  透析膜
２１…  クロスインジェクション部
２２…  蛍光観察領域
２３…  堰き止め構造における単独の狭隘な流路
２４…  堰き止め構造における複数の狭隘な流路
２５…  行き止まり構造
２６…  上流側堰き止め構造
２７…  下流側堰き止め構造
２８…  目的タンパク質排出口
２９…  充填剤導入口
３０…  夾雑タンパク質排出口
３１…  タンパク質液導入口
３２…  染色液導入口
３３…  排出口
【図１】
2005330272.tif 000003
【図２】
2005330272.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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