(57)【要約】【課題】細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置で、細胞吸着用基板の沈下を補正して正確に細胞に物質を注入すること。【解決手段】Ｓｉチップ１２（細胞吸着用基板）の表面に高さ検知マーク１３を設置し、その画像を観測することによりビジビリティを算出し、算出したビジビリティとＳｉチップ１２の高さとの対応関係を用いてＳｉチップ１２の沈下量を求め、沈下量に基づいてＸＹＺテーブル１４を上下方向に移動する。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測手段と、
前記画像計測手段により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出手段と、
前記基板高算出手段により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御手段と、
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【請求項２】
前記画像計測領域は、細胞吸着用基板の高さに応じて画像の信号強度が変化する互いに平行なラインパターンを形成する領域であり、
前記画像計測手段は、前記ラインパターンの画像を計測し、
前記位置制御手段は、前記画像計測手段により計測されたラインパターン画像の信号強度の変化を用いて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高さ算出手段と、前記基板高さ算出手段により算出された基板高さに基づいてインジェクション位置の補正量を算出する補正量算出手段と、前記補正量算出手段により算出された補正量に基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置補正手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項３】
前記画像計測領域は、光を反射する反射領域であり、
前記画像計測手段は、前記反射領域に映し出された前記微細な針の針先の鏡像および該針先の実像を計測し、
前記位置制御手段は、前記画像計測手段により計測された針先の鏡像および実像を用いて前記針先と細胞吸着用基板との距離を算出する距離算出手段と、細胞吸着用基板と微細な針とが相対的に水平方向に移動する際に、前記距離算出手段により算出された距離に基づいて前記針先と細胞吸着用基板との距離を一定に保つようにインジェクション位置制御機構を制御する位置補正手段と、
を備えたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項４】
前記画像計測手段は、前記針先の鏡像および実像を計測する光学系の光軸と該針先とを水平方向にずらすことにより該鏡像と実像とを同時に計測することを特徴とする請求項３に記載のマイクロインジェクション装置。
【請求項５】
細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション方法であって、
細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測工程と、
前記画像計測工程により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出工程と、
前記基板高算出工程により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御工程と、
を含んだことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法に関し、特に、インジェクション位置を高精度で制御し、確実に細胞に物質を注入することができるマイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞内に遺伝子を注入することにより細胞の性質改変を行うことは遺伝的な原因による病気を治療する方式として研究が進んでいる。この研究の成果として、遺伝子の役目を解明することができるとともに、個人の遺伝的特性にあった遺伝子治療を行うテーラメード医療が可能となる。
【０００３】
遺伝子を細胞に注入する方式には、電気的な方法（エレクトロポレーション）、化学的な方法（リポフェクション）、生物的な方法（ベクター法）、機械的な方法（マイクロインジェクション）、光学的な方法（レーザインジェクション）などが提案されてきている。
【０００４】
しかし、電気的な方法は細胞にダメジが大きい、化学的な方法は導入効率が悪い、生物的な方法は全ての材料を導入できないなどの欠点がある。このなかでは機械的な方法が最も安全で効率が高い方法として注目されている。
【０００５】
従来の機械的な方法の例として、キャピラリ（インジェクション針）を用いてマイクロインジェクションを行う方法が特許文献１に記載されている。この方式を図２２に示す。この方式では、Ｓｉチップ１２に孔をあけ、細胞を入れた培養液（培地ともいう）を下部から吸着している。なお、以降の説明図では特に図示しないが全て培養液を満たした中でインジェクション（注入）を行うこととする。
【０００６】
図２２において、Ｓｉチップ（Ｓｉ基板ともいう）１２に開けた孔の直径は数μｍと細胞（直径１０−１５μｍ）に比べ小さいので細胞は孔の表面に留まる。そこで、孔に吸着された細胞に対してインジェクション針１１を用いて薬液を注入する。この動作を吸着された細胞に順次適用することにより多数の細胞にインジェクションを行うことができる。
【０００７】
【特許文献１】特許第２６２４７１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
マイクロインジェクションでは、細胞の大きさが直径１０−１５μｍであることから、インジェクション針１１の先端位置は細胞の中心点に対し±２−３μｍ以内の精度で突き出す必要がある。しかしながら、マイクロインジェクションシステムには、さまざまな変動要因があるため、このような精度で針の位置を制御することができないという問題がある。
【０００９】
ここで、変動要因としては、インジェクション針位置の変動、細胞の形状・位置の変動、孔のあいたＳｉチップ１２の高さ位置変動などがある。図２３は、これら従来のマイクロインジェクションの変動要因を示す図である。
【００１０】
インジェクション針１１の位置変動としては、針の保持機構の熱的形状変動によるものが大きい（主にｙ方向）。また、図２３には記入していないが、Ｓｉチップ１２を移動するＸＹＺテーブルには数ミクロンの位置設定誤差（ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向）がある。また、シリコン基板の製作誤差（数μｍ）、Ｓｉチップ１２とシャーレとの位置合わせ誤差などがある。
【００１１】
細胞の形状・位置の変動としては、細胞サイズの変動、吸着孔と細胞中心位置との誤差などがある。細胞は生き物であるので、個別に大きさが異なるし、完全な球形ではないことも変動要因である。
【００１２】
図２４は、高さ方向（ｚ方向）の変動と、細胞の大きさ変動を例として、インジェクションへの影響を説明するための説明図である。同図に示すように、大きな細胞の場合には、Ｓｉチップ表面が沈下するため、インジェクション針１１の移動方向が膜面と平行に近くなり、針先が細胞膜を破ることができなくなる。一方、小さな細胞の場合には、インジェクション針１１は細胞に届かなくなるため、インジェクションは不可能となる。
【００１３】
Ｓｉチップ１２を加工して孔をあける場合、この加工部分のＳｉチップ１２の厚みは１０−２０μｍである。したがって、たくさんの細胞にインジェクションを行おうとし、孔をあける面積を広くすると、この部分の機械的強度が低下するため、下部から吸引時には、この部分の高さが大きく変化することになる。ここで、吸引と変形との関係は細胞の吸着数によって変化する。
【００１４】
図２５−１は、吸着細胞数が少ない場合の基板変形を示す図である。この場合には、孔を通って培養液が十分流れるので、吸引孔周辺の変形は小さい。一方、図２５−２に示すように、細胞が多数吸着した場合には、液体が通過する吸引孔の数が少ないため、一定の速度で吸引を続けると吸引部の圧力が下がり吸引部周辺の高さ変動（沈下）をもたらす。このような変動のうち、吸引領域中央部で、変形量が最も大きな場所の変動量を沈下量として定義する（図２６−１）。
【００１５】
図２６−２は、吸着率をパラメータとした吸引量と沈下量との関係を示す図である。細胞が吸着しない場合でも、ある程度の沈下は起こる。しかし、細胞が吸着し始めると沈下量も増加するため沈下量が一定になるような吸引方法が必要である。
【００１６】
この発明は、上述した従来技術による問題点を解消するためになされたものであり、インジェクション位置を高精度で制御し、確実に細胞に物質を注入することができるマイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、本発明は、細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測手段と、前記画像計測手段により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出手段と、前記基板高算出手段により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１８】
また、本発明は、細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション方法であって、細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測工程と、前記画像計測工程により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出工程と、前記基板高算出工程により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御工程と、を含んだことを特徴とする。
【００１９】
かかる発明によれば、細胞吸着用基板に設置され、細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測し、計測した画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出し、算出した細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御するよう構成したので、インジェクション位置を高精度で制御することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、インジェクション位置を高精度で制御するので、確実に細胞に物質を注入することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に添付図面を参照して、この発明に係るマイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法の好適な実施例を詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
まず、基板高さの変動に対して針位置を調整することができるマイクロインジェクション装置について説明する。図１は、本実施例１に係るマイクロインジェクション装置が基板高さの変動に対する針位置の調整のために使用する高さ検知マーク１３を示す図である。
【００２３】
同図に示すように、このマイクロインジェクション装置では、Ｓｉチップ表面に平行な複数の細線パターンを複数箇所に作成する。ここで、平行パターンの作成箇所は孔形成領域の中心、その周辺部、さらに、孔が形成されていない領域などとする。
【００２４】
本実施例１に係るマイクロインジェクション装置は、これらの平行パターンのそれぞれについて高さを計測することにより、Ｓｉチップ１２の姿勢と孔形成領域のたわみを計測することができる。
【００２５】
図２は、本実施例１に係るマイクロインジェクション装置の基板高さ計測光学系の構成を示す図である。同図に示すように、基板高さ計測光学系は、Ｓｉチップ表面の平行パターンを水浸対物レンズを用いて拡大し、ＣＣＤカメラで観測する。ここで、Ｓｉチップ１２は孔のあいたシャーレに接着されている。
【００２６】
また、シャーレの孔あき部を吸引するための吸引孔がシャーレ保持基盤にあけられている。吸引孔は図示しない吸引ポンプにチューブでつながっており、吸引ポンプが培養液（液体）を吸引している。なお、吸引ポンプの吸引速度は変化させることが可能である。また、これらの装置はＸＹＺテーブル１４上に設置されている。
【００２７】
図３−１は、図１に示した高さ検知マーク１３をＣＣＤカメラで観測した画像を示す図である。同図に示すように、ＣＣＤカメラで観測する場合には、観測画像の中央に細線パターンの中心が来るように調整する。（観測線は、ＣＣＤカメラの画素走査方向と一致させる。この方向のほうが計測誤差が少ない計測が可能である。）
【００２８】
図３−２は、高さ計測信号の例を示す図である。パターン表面に焦点が合った場合には、信号強度の振幅が大きくビジビリティの大きな信号となる。ここで、ビジビリティは、最大強度と最小強度の観測値から図３−２に示すように、ビジビリティ＝（ｂ−ａ）／（ａ＋ｂ）で計算できる。このビジビリティは、焦点がずれると低下するので、これを計測することにより基板高さと対物レンズとの関係を計測でき、基板の沈下量を算出することができる。
【００２９】
図４は、ビジビリティを用いた基板高さ調整方式を説明するための説明図である。同図において、横軸はＳｉチップ１２の表面高さで、合焦点高さを0とした。また、縦軸はビジビリティである。
【００３０】
開始時点では、細胞が吸着していないので、わずかに沈下した状態にある（１）。細胞が吸着し始めるとビジビリティが小さくなる（２）。これは、沈下量が大きくなったためであるので（３）、ＸＹＺテーブル１４を移動（または対物レンズを移動）させて、当初の差分位置に戻す（４）。
【００３１】
この動作を一定時間ごとにくりかえすと沈下量を一定に保つことができる。また、細胞が吸着した後に、余分な細胞を除去すれば、この状態は安定する。なお、ビジビリティと沈下量の関係は前もって調査し、圧力とたわみの関係を計測しておく。
【００３２】
上述してきたように、本実施例１では、Ｓｉチップ１２の表面に高さ検知マーク１３を設置し、その画像を観測することによりビジビリティを算出し、算出したビジビリティとＳｉチップ１２の高さとの対応関係を用いてＳｉチップ１２の沈下量を求め、沈下量に基づいてＸＹＺテーブル１４を移動するので、Ｓｉチップ１２の沈下を精度良く補正することができる。なお、高さ検知マークとしては、細胞捕捉用の吸引孔の外周を高さ検知マークとして用いることもできる。
【実施例２】
【００３３】
次に、ＸＹＺテーブル１４の水平方向の移動に伴ってインジェクション針１１の高さを調整することができるマイクロインジェクション装置について説明する。まず、インジェクション針１１の高さ調整の必要性について説明する。
【００３４】
図５は、インジェクション針１１の高さ調整の必要性を説明するための説明図である。同図に示すように、ＸＹＺテーブル１４は完全な水平ではなく一定の傾きを持っている。また、インジェクション針１１は細胞の中心をめがけて突き出すため、その先端はＳｉチップ表面から５μｍ近くまでに接近する。したがって、ＸＹＺテーブル１４が水平方向に移動する場合に、Ｓｉチップ１２の上に捕捉された細胞にインジェクションが不可能となる。さらに、インジェクション針１１がＳｉチップ１２に衝突し破損する場合がある。
【００３５】
また、孔の数が多くなると、孔をあけた領域の範囲が広くなり、チップ高さ変動の増大、たわみ量の増大などをもたらすことになる。その結果、ＸＹＺテーブル１４の移動によって、インジェクション針１１がＳｉチップ１２に衝突し破損する事態が発生する場合がある。
【００３６】
そこで、本実施例２に係るマイクロインジェクション装置は、細胞の中心をめがけてインジェクション針１１がくりだされるように、また、Ｓｉチップ１２への衝突によるインジェクション針１１の破損をなくすために、針先とＳｉチップ表面との距離（高さ）を計測し、常に同じ距離を保つようにする。
【００３７】
図６は、Ｓｉチップ表面と針先との距離を計測する方式を説明するための説明図である。同図に示すように、Ｓｉチップ１２の表面に光を反射する一定の大きさの（１０−２０μｍ角）平坦な領域（あるいは金属パターン）を高さ合わせマーク１５として設置する。この平面は、よく研磨したシリコン表面でも良い。また、金属の表面の場合には、直接培養液と接触しないようにSiO2で保護することが望ましい。
【００３８】
本実施例２に係るマイクロインジェクション装置は、インジェクション針１１をこの高さ合わせマーク１５の中央付近に置き、その実像と鏡像を計測する。ここで、観測には対物レンズとＣＣＤカメラを用いる。
【００３９】
図７−１は、実像の結像を示す断面図であり、図７−２は、鏡像の結像を示す断面図である。本実施例２に係るマイクロインジェクション装置は、これら実像と鏡像の相互の高さ方向の位置ずれΔｚを求め、その値を１／２にすることによって針の高さを計測する。
【００４０】
図８−１は、他の針高さ計測方式を説明するための説明図である。ここでは、針の位置を対物レンズの光軸からわずかに水平方向にずらす。図８−２は、図８−１に示した針高さ計測方式で得られる画像を示す図である。
【００４１】
同図に示すように、顕微鏡の対物レンズはレンズの中心からの見込み角度（θ）が異なると違う位置に結像するように結像されるので、鏡像と実像はそれぞれ同一画面内で少し異なる位置に結像する。
【００４２】
今、相互の距離を計測し、Δｙとすると、観測角θなどから針高さが
ｈ＝Δｙ/（２sinθ）
と計算できる。ここで、観測角θは、二つの像の中心と観測中心の距離をΔｄとすると
θ＝Δｄ／ｆ
であるので（ｆは対物レンズの焦点距離）
ｈ＝Δｙｆ／２Δｄ
で計算できる。ここで、θ＜＜１とした。
【００４３】
上述してきたように、本実施例２では、Ｓｉチップ１２の表面に設置した高さ合わせマーク１５を用いてインジェクション針１１の実像と鏡像を計測し、実像と鏡像の相互の高さ方向の位置ずれからインジェクション針１１の高さを計測することとしたので、計測した高さに基づいてＸＹＺテーブル１４を上下してインジェクション針１１とＳｉチップ１２の距離を所定の値に保つことができる。
【００４４】
また、ＸＹＺテーブル１４が水平方向に移動した場合には、移動方向、移動距離およびＸＹＺテーブル１４の傾きを用いてＸＹＺテーブル１４の上下動を算出し、算出した上下動を補正するようにＸＹＺテーブル１４の高さを制御することによって、インジェクション針１１とＳｉチップ表面を常に同じ距離に保つことができる。
【実施例３】
【００４５】
次に、インジェクション針先端の位置変動に対して針位置を調整することができるマイクロインジェクション装置について説明する。まず、インジェクション針先端の位置変動について説明する。図９は、インジェクション針先端の位置変動を説明するための説明図である。
【００４６】
同図は、インジェクション針１１が水平面内でｘ、ｙ方向に変動することを示し、その結果インジェクションが不可能となることを示している。この変動は、インジェクション針１１の周辺の温度変化により針の保持機構が変形したため、あるいは針自体が変形したために発生する。なお、針の構造上、ｙ方向の変動が大きく、ｘ方向の変動は小さい。
【００４７】
図１０は、インジェクション針１１の変動による影響を示す図である。細胞吸着時には孔以外にも細胞がある場合があるため、針の移動した先に細胞があるとこの部分で針先の画像のコントラストが低下しその先端位置を正確に計測しにくくなる。
【００４８】
そこで、本実施例３に係るマイクロインジェクション装置では、細胞を含む画像の中から細胞の無い領域を探し、先端位置を正確に計測できるようにする。図１１−１は、細胞なし領域の探索手法を説明するための説明図である。
【００４９】
同図に示すように、細胞より少し大きな領域（約φ２０μｍ）をテンペレートとして画像の中を走査して、細胞がない領域を探索する。図１１−１では、探索された細胞なし領域をハッチングして示している。ここで、細胞なし領域とは探索テンペレートの中心の軌跡で定義する。
【００５０】
そして、それらの細胞なし領域のうち最も大きな領域の中心位置を求める。図１１−１では、クロスで示した点が最も大きな細胞なし領域の中心位置である。そして、針中心のｙ座標を求めて、クロスで示した中心位置のｙ座標が針中心のｙ座標に一致するようＸＹＺテーブル１４を移動させる（図１１−２）。ここで、ｙ座標としたのは、針はｘ方向にほとんどドリフトしないためである。
【００５１】
以上の移動の結果、図１１−２に示すように、針の下に細胞が無い画像を得ることができる。そいて、この画像から針の先端位置を計測する。先端位置は、画像の合焦状態を検知し、その先端位置から求める。
【００５２】
上述してきたように、本実施例３では、細胞の無い領域を探し、インジェクション針１１の先端位置が細胞の無い領域にくるようにＸＹＺテーブル１４を移動することとしたので、インジェクション針１１の先端位置を正確に計測することができる。
【実施例４】
【００５３】
次に、細胞の付着位置変動に対して針位置を調整することができるマイクロインジェクション装置について説明する。まず、細胞の付着位置変動について説明する。図１２−１は、細胞の付着位置変動を示す図である。
【００５４】
同図に示すように、細胞はさまざまな形をしているため吸着孔の中心と細胞の中心とが一致しないことが起こりうる。その場合、細胞が吸着孔に対し、それぞれΔｘ、Δｙだけずれている。そこで、本実施例４に係るマイクロインジェクション装置は、図１２−２に示すように、ＸＹＺテーブル１４を移動させて、針の進行方向と細胞位置との調整を行う。
【００５５】
ただし、ｙ方向の変動量Δｙc分だけ補正を行うと、細胞にモーメントが掛かるため、細胞がはずれてしまう可能性がある。そこで、本実施例４に係るマイクロインジェクション装置は、吸着力と、細胞の液体中での抵抗を考慮し、細胞中心と吸着孔中心の中間地点（図１２−２ではεだけずれた位置）にインジェクションする（図１２−２にεを図示する）。
【００５６】
なお、吸引孔の位置はあらかじめ分かっているので、細胞中心を計測することによって、細胞中心のずれを求めることができる。また、細胞中心が一定距離以上はずれた場合には、インジェクションを実行しないようにする。
【００５７】
図１３は、細胞中心の計測手法の一例を示す図である。細胞は、ほぼ円形であることを利用し、細胞の輪郭と近似した円形を求める。そして、両者の面積の差が最も小さな円を選び、その大きさと中心位置とを、細胞位置とする。
【００５８】
上述してきたように、本実施例４では、細胞の中心位置を測定し、吸引孔の位置との差を求めることによって細胞中心のずれを求めることとしたので、求めたずれに基づいてＸＹＺテーブル１４の位置を調整し、細胞に正確にインジェクションを行うことができる。
【実施例５】
【００５９】
次に、細胞の大きさの変動に対して針位置を調整することができるマイクロインジェクション装置について説明する。まず、細胞サイズの変動に対するインジェクション位置補正について説明する。
【００６０】
図１４は、細胞サイズの変動に対するインジェクション位置補正を説明するための説明図である。細胞の大きさはそれぞれ異なっているので、それぞれの大きさに応じてインジェクション位置を変化させる必要がある。図１４は、大きな細胞Ａ（実線）および小さな細胞Ｂ（破線）にインジェクションする場合の平面図と断面図を示している。
【００６１】
断面図に示すように、細胞の中心を目指してインジェクションを行おうとする場合、細胞Ｂでは細胞Ａより少し低いところ（Δz’）にインジェクション針１１を移動させる必要がある。また、ｘ方向についても、小さな細胞（細胞Ｂ）では細胞Ａよりやや前方（Δｘ’）に突き出す必要がある。したがって、本実施例５に係るマイクロインジェクション装置は、細胞の大きさを計測し、細胞の大きさに基づいてＸＹＺテーブル１４の位置を調整する。
【００６２】
ここで、図１５に示すように、あまり細胞が小さい場合には、インジェクションができないのでインジェクション中止とし、大きすぎる場合にも、やはり細胞が異常であるとしてインジェクションを行わないようにする。
【００６３】
上述してきたように、本実施例５では、細胞の大きさを計測し、細胞の大きさに基づいてＸＹＺテーブル１４の位置を調整することとしたので、細胞の大きさが変動する場合にも正確にインジェクションを行うことができる。
【実施例６】
【００６４】
次に、インジェクション時の細胞の移動を抑えることができるマイクロインジェクション装置について説明する。まず、インジェクション時の細胞移動について説明する。図１６は、インジェクション時の細胞移動を説明するための説明図である。
【００６５】
マイクロインジェクション装置は、Ｓｉ基板に孔をあけ、下から培養液を吸引することにより細胞を捕捉するが、孔の大きさが細胞の１／３程度になると細胞は、孔を通過してしまう。一方、孔の大きさを小さくすると捕捉は可能であるがインジェクション時に細胞の位置が一定せずに、図１６のように細胞位置が移動し針が細胞膜を突き破れなくなる。
【００６６】
そこで、本実施例６に係るマイクロインジェクション装置では、吸引孔の直径を小さくして（細胞直径の１／１０程度）、細胞が孔を通過できないようにするとともに、吸引孔の周りに細胞直径の８０％程度の大きさで一段低くなった領域を作成する（図１７−１）。これにより細胞の移動を防ぐことができる。
【００６７】
また、図１７−２は、このようにして補足した細胞にインジェクション針を突出させた場合の図である。細胞は多少変形するが位置の移動は無くインジェクションが可能である。図１８は、細胞直径と凹み部の大きさとの関係を示した。細胞がへこみの底の吸引孔と接したとき、凹みのふちと細胞膜とが接触する関係のとき、細胞を最もよく捕捉できる。
【００６８】
また、捕捉可能な細胞の大きさの範囲は、図示した細胞の大きさの±３０％までである。このパターンを上部から顕微鏡で観測すると、図１９のような形状が観測できる。この形状は、基板高さの計測に使用可能である。
【００６９】
上述してきたように、本実施例６では、細胞吸引孔の直径を細胞直径の１／１０程度にするとともに、吸引孔を中心として細胞直径の８０％程度の領域を凹ませることとしたので、インジェクション時の細胞移動を防ぐことができる。
【００７０】
図２０は、本実施例１および２で説明した調整マーク（高さ検知マーク１３および高さ合わせマーク１５）と位置合わせマークとを搭載したＳｉチップ１２の表面の一例を示す図である。
【００７１】
同図に示すように、このＳｉチップ１２は、位置合わせマークとして、大きな方向を示すシェブロンマークと十字マークを周辺に持ち、調整マークとして、高さ検知マーク１３と高さ合わせマーク１５を吸着孔周辺に持つ。なお、吸着孔領域の中心は最も沈下量の変化が大きいので、高さ検知マーク１３と高さ合わせマーク１５を設置する。
【００７２】
図２１は、本実施例１〜６に係るインジェクション位置調整システムの構成を示す図である。同図に示すように、このインジェクション位置調整システムは、ＣＣＤカメラを用いて画像を入力し、細胞位置、インジェクション針１１の位置などを計測する。
【００７３】
また、計測した情報にもとづき、吸引ポンプ１７の吸引量、ＸＹＺテーブル１４、検知光学系の上下動、インジェクタの位置調整などの制御を行う。そして、インジェクション位置調整後に、インジェクション針１１の突き出し、薬液噴出などの動作を行う。なお、これらの動作はコントローラ１６で制御する。
【００７４】
（付記１）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測手段と、
前記画像計測手段により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出手段と、
前記基板高算出手段により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御手段と、
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【００７５】
（付記２）前記画像計測領域は、細胞吸着用基板の高さに応じて画像の信号強度が変化する互いに平行なラインパターンを形成する領域であり、
前記画像計測手段は、前記ラインパターンの画像を計測し、
前記位置制御手段は、前記画像計測手段により計測されたラインパターン画像の信号強度の変化を用いて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高さ算出手段と、前記基板高さ算出手段により算出された基板高さに基づいてインジェクション位置の補正量を算出する補正量算出手段と、前記補正量算出手段により算出された補正量に基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置補正手段と、
を備えたことを特徴とする付記１に記載のマイクロインジェクション装置。
【００７６】
（付記３）前記画像計測領域は、光を反射する反射領域であり、
前記画像計測手段は、前記反射領域に映し出された前記微細な針の針先の鏡像および該針先の実像を計測し、
前記位置制御手段は、前記画像計測手段により計測された針先の鏡像および実像を用いて前記針先と細胞吸着用基板との距離を算出する距離算出手段と、細胞吸着用基板と微細な針とが相対的に水平方向に移動する際に、前記距離算出手段により算出された距離に基づいて前記針先と細胞吸着用基板との距離を一定に保つようにインジェクション位置制御機構を制御する位置補正手段と、
を備えたことを特徴とする付記１に記載のマイクロインジェクション装置。
【００７７】
（付記４）前記画像計測手段は、前記針先の鏡像および実像を計測する光学系の光軸と該針先とを水平方向にずらすことにより該鏡像と実像とを同時に計測することを特徴とする付記３に記載のマイクロインジェクション装置。
【００７８】
（付記５）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
細胞吸着用基板上に細胞が存在しない細胞無領域を探索する細胞無領域探索手段と、
前記細胞無領域探索手段により探索された細胞無領域の中心位置を算出する中心位置算出手段と、
前記中心位置算出手段により算出された中心位置に前記針の針先が近接するように制御する針先近接制御手段と、
前記針先近接制御手段により細胞無領域の中心位置に近接するように制御された針先の画像を用いて針先の位置を計測する針先位置計測手段と、
前記針先位置計測手段により計測された針先位置に基づいてインジェクション位置制御機構を制御するインジェクション位置制御手段と、
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【００７９】
（付記６）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
前記吸着した細胞の大きさを計測する細胞サイズ計測手段と、
前記細胞サイズ計測手段により計測された細胞の大きさに基づいてインジェクション位置制御機構を制御するインジェクション位置制御手段と、
を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【００８０】
（付記７）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション方法であって、
細胞吸着用基板に設置され、該細胞吸着用基板の高さに応じて画像特性が変化する画像計測領域の画像を計測する画像計測工程と、
前記画像計測工程により計測された画像に基づいて細胞吸着用基板の高さを算出する基板高算出工程と、
前記基板高算出工程により算出された細胞吸着用基板の高さに基づいてインジェクション位置制御機構を制御する位置制御工程と、
を含んだことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
【００８１】
（付記８）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション方法であって、
細胞吸着用基板上に細胞が存在しない細胞無領域を探索する細胞無領域探索工程と、
前記細胞無領域探索工程により探索された細胞無領域の中心位置を算出する中心位置算出工程と、
前記中心位置算出工程により算出された中心位置に前記針の針先が近接するように制御する針先近接制御工程と、
前記針先近接制御工程により細胞無領域の中心位置に近接するように制御された針先の画像を用いて針先の位置を計測する針先位置計測工程と、
前記針先位置計測工程により計測された針先位置に基づいてインジェクション位置制御機構を制御するインジェクション位置制御工程と、
を含んだことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
【００８２】
（付記９）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション方法であって、
前記吸着した細胞の大きさを計測する細胞サイズ計測工程と、
前記細胞サイズ計測工程により計測された細胞の大きさに基づいてインジェクション位置制御機構を制御するインジェクション位置制御工程と、
を含んだことを特徴とするマイクロインジェクション方法。
【００８３】
（付記１０）細胞吸着用基板にあけた複数の微細孔に細胞を吸着し、該吸着した細胞に微細な針を用いて物質を注入するマイクロインジェクション装置であって、
細胞吸着用基板に吸引孔を中心として所定の大きさの凹み領域を備えたことを特徴とするマイクロインジェクション装置。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上のように、本発明に係るマイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法は、細胞内に遺伝子などを注入する場合に有用であり、特に、針の位置を高精度に制御し、細胞に正確に注入する必要がある場合に適している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本実施例１に係るマイクロインジェクション装置が基板高さの変動に対する針位置の調整のために使用する高さ検知マークを示す図である。
【図２】本実施例１に係るマイクロインジェクション装置の基板高さ計測光学系の構成を示す図である。
【図３−１】図１に示した高さ検知マークをＣＣＤカメラで観測した画像を示す図である。
【図３−２】高さ計測信号の例を示す図である。
【図４】ビジビリティを用いた基板高さ調整方式を説明するための説明図である。
【図５】インジェクション針の高さ調整の必要性を説明するための説明図である。
【図６】Ｓｉチップ表面と針先との距離を計測する方式を説明するための説明図である。
【図７−１】実像の結像を示す断面図である。
【図７−２】鏡像の結像を示す断面図である。
【図８−１】他の針高さ計測方式を説明するための説明図である。
【図８−２】図８−１に示した針高さ計測方式で得られる画像を示す図である。
【図９】インジェクション針先端の位置変動を説明するための説明図である。
【図１０】インジェクション針の変動による影響を示す図である。
【図１１−１】細胞なし領域の探索手法を説明するための説明図である。
【図１１−２】ＸＹＺテーブル移動による細胞なし領域と針位置との一致を示す図である。
【図１２−１】細胞の付着位置変動を示す図である。
【図１２−２】細胞の付着位置変動補正後の画像を示す図である。
【図１３】細胞中心の計測手法の一例を示す図である。
【図１４】細胞サイズの変動に対するインジェクション位置補正を説明するための説明図である。
【図１５】細胞サイズと針位置補正量との関係を示す図である。
【図１６】インジェクション時の細胞移動を説明するための説明図である。
【図１７−１】吸引孔の周りの凹みを示す図である。
【図１７−２】インジェクション針を突出した場合の細胞の移動を示す図である。
【図１８】細胞直径と凹み部の大きさとの関係を示す図である。
【図１９】図１８に示した細胞捕捉時の観測形状を示す図である。
【図２０】本実施例１および２で説明した調整マークと位置合わせマークとを搭載したＳｉチップの表面の一例を示す図である。
【図２１】本実施例１〜６に係るインジェクション位置調整システムの構成を示す図である。
【図２２】従来のマイクロインジェクション方式を説明するための説明図である。
【図２３】従来のマイクロインジェクションの変動要因を示す図である。
【図２４】高さ方向（ｚ方向）の変動と、細胞の大きさ変動を例として、インジェクションへの影響を説明するための説明図である。
【図２５−１】吸着細胞数が少ない場合の基板変形を示す図である。
【図２５−２】吸着細胞数が多い場合の基板変形を示す図である。
【図２６−１】沈下量の定義を示す図である。
【図２６−２】吸着率をパラメータとした吸引量と沈下量との関係を示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
１１    インジェクション針
１２    Ｓｉチップ（Ｓｉ基板）
１３    高さ検知マーク
１４    ＸＹＺテーブル
１５    高さ合わせマーク
１６    コントローラ
１７    吸引ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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