(57)【要約】【課題】  全身性炎症反応症候群あるいは感染症の判定に利用可能な新規物質及びその取得方法の提供。【解決手段】  下記条件下で、ODS（オクタデシルシリル化シリカゲル）カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに付した際に、そのメインピークが溶出開始から約13分後に出現する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が490である物質、及び当該物質の取得方法並びに当該物質の定量方法。          流速：1.0ml／分          カラム温度：４０℃          溶離液と溶出条件：              ０〜10分：60％  アセトニトリル水溶液、イソクラティック              10〜15分：60→72.5％  アセトニトリル水溶液、リニアグラジェント              15分以後：100％  アセトニトリル、イソクラティック【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記条件下で、ODS（オクタデシルシリル化シリカゲル）カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに付した際に、そのメインピークが溶出開始から約13分後に出現する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析により測定した分子量が490である物質。
流速：1.0ml／分
カラム温度：４０℃
溶離液と溶出条件：
０〜10分：60％  アセトニトリル水溶液、イソクラティック
10〜15分：60→72.5％  アセトニトリル水溶液、リニアグラジェント
15分以後：100％  アセトニトリル、イソクラティック
【請求項２】
請求項１記載の物質を含有する試料を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、当該物質が溶出した画分を分取することを特徴とする、請求項１記載の物質の取得方法。
【請求項３】
ODSカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに付すことを特徴とする、請求項２記載の取得方法。
【請求項４】
試料を固相抽出法で前処理する、請求項２又は３記載の取得方法。
【請求項５】
請求項１記載の物質を蛍光標識処理した後、逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、得られたピークの蛍光強度を測定することによる、請求項１記載の物質の定量方法。
【請求項６】
逆相高速液体クロマトグラフィーが、ODSカラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィーである、請求項５記載の定量方法。
【請求項７】
蛍光強度の測定が、得られたピークの総面積を測定することである、請求項５又は６記載の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性炎症反応症候群（Systemic Inflammatory response syndrome、以下、SIRSと略記する。）あるいは感染症の判定に利用可能な新規物質及びその取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症に代表される全身性炎症反応症候群等の細菌感染症は、強い発熱やエンドトキシンショック等の重篤な症状を引き起こすことから、感染症の早期且つ確実な診断が求められている。しかしながら、これまでエンドトキシンショックのメディエーターとして非常に多くの物質が注目されているが、最も重要なメディエーターが何であるのかは明らかになっていない。
【０００３】
一方、N-アラキドニルエタノールアミン（N-Arachidonylethanolamide、anandamide、一般にはアナンダミド又はアナンダマイドと呼ばれる。以下ANAと略記する）は、アラキドン酸とエタノールアミンが酸アミド結合した構造を有し（Science, 258, 1946-1949, 1992）、2-アラキドノイルグリセロールと並んでマリファナの受容体であるカンナビノイド受容体の内在性リガンドである。最近、敗血症患者において、患者の血中にANAが出現することが報告され（Wagner,J.A. et al., J.Mol.Med., 76, 824(1998)、Wang, Y., et al., Anal. Biochem., 294, 73(2001)）、ANAがエンドトキシンショックのメディエーター候補として注目されている。しかし、ANAと病態との関連は未だ十分に検討されていないのが現状である。そのため、エンドトキシンショックの真のメディエーターの解明、ひいてはSIRSの診断用として有用なマーカーの発見が望まれている。
【０００４】
【非特許文献１】Wagner,J.A. et al., J.Mol.Med., 76, 824(1998)
【非特許文献２】Wang, Y., et al., Anal. Biochem., 294, 73(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、SIRSあるいは感染症の判定に用いることの出来る新規物質を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
（１）下記条件下で、ODS（オクタデシルシリル化シリカゲル）カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（以下、逆相HPLCと略記する。）に付した際に、そのメインピークが溶出開始から約13分後に出現する物質であって、液体クロマトグラフ質量分析（以下、LC/MSと略記する。）により測定した分子量が490である物質（以下、「本発明の物質」と記載する。）。
流速：1.0ml／分
カラム温度：４０℃
溶離液と溶出条件：
０〜10分：60％ アセトニトリル（以下、AcCNと略記する。）水溶液、
イソクラティック
10〜15分：60→72.5％  アセトニトリル水溶液、リニアグラジェント
15分以後：100％  アセトニトリル、イソクラティック
【０００７】
（２）本発明の物質を含有する試料を逆相HPLCに付し、本発明の物質が溶出した画分を分取することを特徴とする、本発明の物質の取得方法。
（３）本発明の物質を蛍光標識処理した後、逆相HPLCに付し、得られたピークの蛍光強度を測定することによる、本発明の物質の定量方法。
【０００８】
即ち、本発明者等は、敗血症患者の血漿中に含まれる成分について詳細に検討を行うべく、逆相HPLCによる分析を行ったところ、未知のピークを検出した。このピークはANAの溶出位置の後にメインピークが出現することから、ANAとは異なる新規な物質であると考えられた。また、このピークは正常なヒトの血漿中からは検出されないことが確認され、更に鋭意研究の結果、この新規物質は敗血症を含むSIRS患者の血液中に存在すること、またこの新規物質を検出することにより、SIRSの判定に用いることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
発明の物質とは、下記条件下で、ODSカラムを用いた逆相HPLCに付した際に、そのメインピークが溶出開始から約13分後に出現する物質であって、エレクトロスプレー−イオン化（electrospray ionization, ESI）法によるLC/MSにより測定した分子量が490の物質である。
流速  1.0ml／分
カラム温度：４０℃
溶離液と溶出条件
０〜10分：60％ アセトニトリル水溶液、イソクラティック
10〜15分：60→72.5％  アセトニトリル水溶液、リニアグラジェント
15分以後：100％  アセトニトリル、イソクラティック
【００１０】
また、コーン電圧40Vでのフラグメンテーションによる分析によると、本発明の物質は分子量211と分子量277の二つのフラグメントに解離することが確認されている。
【００１１】
本発明の物質の取得方法は、本発明の物質を含有する試料を逆相HPLCに付し、本発明の物質が溶出した画分を分取する方法である。
【００１２】
逆相HPLCに於いて用いられるHPLC用装置としては、通常この分野に於いて用いられているものであれば、特に限定されることなく挙げることができる。
【００１３】
また、該装置に装着されるカラムの充填剤は、通常の逆相HPLCに用いられるODS（オクタデシルシリル化シリカ）ゲルの他に、C8基，C4基，C3基，C22基，C30基等が結合したシリカゲル、フェニル基，シアノプロピル基等が結合したシリカゲル等、ポリマーゲルにオクタデシル基を結合させたODPカラム等のポリマーカラム等が挙げられるが、最も一般的に用いられているODSゲルを用いればよい。WakosilTM-II 5C18 AR，WakosilTM-II 5C18 HG，WakosilTM-II 5C18 RS，Navi C30-5等の市販品（いずれも和光純薬工業(株)製）も用いることが出来る。
【００１４】
逆相HPLCに用いられるカラムの大きさは特に限定されず、この分野で通常用いられているHPLC用カラムを用いればよい。上記充填剤を予め充填したHPLC用カラム等が市販されているので、それを用いても良い。
【００１５】
逆相HPLCに用いられる溶離液としては、通常この分野で用いられている適当な溶媒を単独若しくは適宜組み合わせて用いればよい。溶媒の具体例としては、例えばリン酸緩衝液、水、及びAcCN，メタノール，エタノール，プロパノール，イソプロパノール，1-ブタノール，アセトン，ギ酸，酢酸，ジクロロメタン，酢酸エチル，ジオキサン，テトラヒドロフラン，ジメチルスルホキシド等の有機溶媒等が挙げられるが、有機溶媒としては中でもAcCN、メタノール等が好ましい。また、水とAcCN、水とメタノール等の極性混合溶媒でも良い。尚、グラジエント操作を行うことにより有機溶媒の濃度を順次変えることも任意である。
【００１６】
逆相HPLC時に於ける流速は、用いられるカラムの直径に応じて通常、0.1〜５ml/分、好ましくは0.5〜2ml/分の範囲から適宜選択されるが特にこれに限定されない。
【００１７】
カラム温度は、通常、０〜60℃、好ましくは20〜50℃の範囲から適宜選択される。
【００１８】
本発明の物質の検出は、紫外分光光度計等の検出装置を用いて、紫外波長，例えば210nmあるいは214nmに於ける吸収を測定すればよい。
【００１９】
上記した如き条件下で分析を行うことにより、本発明の物質は、溶離液中の有機溶媒の濃度が６０〜７５％程度になったときに溶出されてくる。
【００２０】
本発明の物質を含有する画分を分取する方法としては、例えば下記の方法がある。
（１）特定の逆相HPLC条件で行う方法
下記の条件で逆相HPLCを行えば、本発明の物質はそのメインピークが溶出開始から約13分後に出現するので、そのメインピークを含む画分を分取すればよい。
カラム：ODSカラム
流速：1.0ml／分
カラム温度：４０℃
溶離液と溶出条件：
０〜10分：60％ AcCN水溶液、イソクラティック
10〜15分：60→72.5％  AcCN水溶液、リニアグラジェント
15分以後：100％  AcCN、イソクラティック
【００２１】
（２）ANAのメインピーク位置を確認することによる方法
本発明の物質のメインピークは、同じ条件で逆相HPLCを行った際、ANAのメインピークの溶出位置の後に出現してくるので、ANAのメインピークの溶出位置を確認することによって、本発明の物質のピークを特定し、その画分を分取する方法である。
【００２２】
当該方法においてANAのピーク位置を確認する方法としては、(i)例えば市販されているANA標準を、本発明の物質を含有する試料とは別に、試料と同様の条件で逆相HPLCに付し、ANA標準のピーク溶出位置を確認する方法、(ii)本発明の物質を含有する試料と一緒にANA標準を逆相HPLCに付し、ANA標準のピーク溶出位置の確認と本発明の物質の分離及び溶出位置の確認を同時に行う方法、等が挙げられる。
【００２３】
上記(i)の方法によりANAのメインピーク位置を確認して本発明の物質画分を得る、より具体的な一例を示せば、例えば以下の如くである。
即ち、上記した如きODSを充填したカラムを装着したHPLC装置に、ヒト血漿等の本発明の物質を含有する試料をアプライした後、20〜50℃で通常0.1〜５ml/分、好ましくは0.5〜２ml/分の流速で、AcCN水溶液等の溶離液をリニアグラジェントな条件で流して有機溶媒(AcCN等)濃度を順次増加させ、順次溶出される画分について、紫外分光光度計等の検出装置により210nmの吸収を検出する。予め同じ条件でANA標準について逆相HPLCを行って確認しておいたANA標準のメインピークの溶出位置の後にメインピークが出現したピーク画分を分取すれば、本発明の物質を含有する画分が得られる。
【００２４】
また、上記(ii)の方法によりANAのメインピーク位置を確認して本発明の物質画分を得る方法についてより具体的な一例を示せば、例えば以下の如くである。
即ち、上記した如きODSを充填したカラムを装着したHPLC装置に、ヒト血漿等の本発明の物質を含有する試料とANA標準を混合したものをアプライする。上記(i)と同様の条件で逆相HPLCを行い、210nmの吸収を検出する。先に出現したメインピークがANA標準のメインピークであり、後に出現したメインピークが本発明の物質のメインピークと決定する。本発明の物質のピークは、ANAのメインピークが出現する位置より前約１分以内から溶出し始めANAのメインピークの溶出位置の後約１分以内の間に出現し、そのメインピークの溶出位置は、ANAのメインピークの溶出位置の0.1〜1.0分後である。
【００２５】
尚、本発明の取得方法に於いて、本発明の物質を含有する試料をそのまま逆相HPLCに付してもよいが、HPLC分析の前処理として一般に行われている固相抽出法による前処理を行っても良い。前処理を行った方が、逆相HPLCのカラムライフを維持できるので好ましい。
【００２６】
固相抽出法の例としては、例えば、下記に説明するような(1)試料を固相抽出用のカラムで処理する方法、(2)試料を薄層クロマトグラフィー(以下、TLCと略記する。)に付す方法等があるが、これらに限定されない。
【００２７】
(1)試料を固相抽出用のカラムで処理する方法
この方法に用いられるカラムとしては、市販されている固相抽出用カラムを用いればよい。例えばカートリッジタイプやシリンジタイプのものが市販されている。充填剤も、ODSゲルのほか各種シリカゲルを充填したカラムがあるので、適宜選択して用いればよい。市販されている固相抽出用カラムとしては、例えばODSを充填したスピーディスク SPETM（SpeediskTMSPE）カラム（J.T.Baker製）、プレセップTM-C（Presep-C）C18カラム(和光純薬製)、プレセップTMRPP（PresepTM RPP）カラム（和光純薬工業(株)製）等が挙げられる。
【００２８】
溶離液としては、上記した逆相HPLCに用いられる溶離液と同じものを用いることが出来る。溶出方法は、溶離液中の有機溶媒の濃度をステップワイズな条件で段階的に高くして、若しくは溶離液中の有機溶媒の濃度をリニアに徐々に高くして、溶出処理を行えばよい。
【００２９】
また、市販されている固相抽出用カラムを用いて固相抽出を行う場合は、その取扱説明書に従って行えばよい。試料を固相抽出用カラムにアプライする前にカラムを蒸留水や有機溶媒で洗浄してゲルを活性化処理したり、カラムに減圧システムを取り付けて抽出を行う等は任意である。
【００３０】
ODSを充填した固相抽出用カラムを用いた固相抽出方法の一例を示すと、下記の通りである。
即ち、メタノール，AcCN等の有機溶媒、又はメタノールあるいはAcCNと蒸留水の混合溶媒(4:6)等の混合溶媒に溶解した本発明の物質を含有する試料を、メタノール、エタノール等の有機溶媒で活性化した後、蒸留水で平衡化した市販の固相抽出用カラムにアプライする。蒸留水、10v/v％有機溶媒溶液、70v/v％有機溶媒溶液をカラム１容に対して１容の割合で順次通液してカラムを洗浄し、次いで100％有機溶媒で本発明の物質を溶出させ、本発明の物質を含有する画分を回収する。続いて、得られた画分について、前記した如き本発明に係る本発明の物質の取得方法を行えばよい。
【００３１】
尚、溶媒に溶解した本発明の物質を含有する試料に不溶物が混在するときは、固相抽出処理する前に遠心分離等の不溶物を除く処理を行ってもよい。
【００３２】
（２）試料をTLCに付す方法
本発明の物質を含有する試料を適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）、又はクロロホルム：メタノール：水（8:4:3 v/v/v）の混合溶媒等と混合、攪拌した(有機溶媒抽出)後、有機溶媒相を回収、乾固する。乾固した試料を、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）又は、例えばクロロホルム：メタノール（85:15 v/v）等の混合溶媒に溶解し、適当なシリカゲルを塗布したTLC用プレートにアプライし、適当な展開溶媒で展開する。本発明の物質を含有するスポットをUV照射によって検出し、シリカゲルをかき取るか、もしくはあらかじめ標準ANAを同一条件で展開した場合のANA移動度を確認しておき、本発明の物質を含有する試料から抽出した試料のANAの移動度に相当する付近のシリカゲルをかき取り、これを適当な溶媒に溶解し、遠心処理すれば、本発明の物質を含有する上清を得ることが出来る。続いて、得られた上清について、前記した如き本発明に係る本発明の物質の取得方法を行えばよい。
TLC用プレートは用時調製してもよいが、市販されている適当なTLC用プレートを用いてもよい。
【００３３】
本発明に係る本発明の物質の定量方法は、本発明の物質を蛍光標識処理した後、逆相HPLCに付し、得られたピークの蛍光強度を測定することによる方法である。
即ち、本発明に係る方法で本発明の物質を含有する試料から得られた本発明の物質を、適当な蛍光標識試薬を用いて蛍光標識し、逆相HPLCに付した後、得られた本発明の物質のピークの蛍光を適当な化学発光検出器で検出する、いわゆるポストカラム法により検出を行えば良い。
【００３４】
本発明の物質の蛍光標識に用いられる蛍光標識試薬としては、4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(N-chloroformylmethyl-N-methylamino)-2,1,3-benzoxadiazole（略称DBD-COCl）、6,7-Dimethoxy-1-methoxy-1-methyl-2(1H)-quinoxalinone-3-carbonyl-Cl（略称DMEQ-COCl）、2-(5-Chlorocarbonyl-2-oxazolyl)-5,6-methylenedioxybenzofuran（略称OMB-COCl）、1-Anthroyl cyanide、9-anthroylnitrile、7-Hydroxycoumarin-3-carboxylic acid、7-Chloro-4-nitrobenzoxadiazole（略称NBD-Cl）、Pyrene-1-carbonyl cyanide等の水酸基標識用蛍光標識試薬、好ましくはDBD-COCl、DMEQ-COCl、OMB-COClを用いることが出来る。これらの蛍光標識試薬を用いて、夫々の蛍光標識試薬毎に通常行われている条件で、水酸基を蛍光標識する常法に従い、本発明の物質を蛍光標識すればよい。
【００３５】
例えば蛍光標識試薬としてDBD-COClを用いる場合は、本発明の物質をDBD-COClの適当な有機溶媒溶液（例えばベンゼン溶液等）に溶解させ、50〜60℃で40〜50分反応させれば、本発明の物質をDBD-COClで蛍光標識することができる。
次いで、上記方法によって蛍光標識した本発明の物質を逆相HPLCに付し、順次溶出される本発明の物質のピークを例えば蛍光強度計等の検出装置により検出し、蛍光強度のピーク面積を得る。蛍光標識した本発明の物質を逆相HPLCに付す方法、試薬、装置等は本発明の物質の取得方法に準じて行えばよい。
【００３６】
得られた本発明の物質のピーク面積をもとに本発明の物質の定量を行うが、本発明の物質は、逆相HPLCに付した際にANAの溶出位置の近辺に溶出すること、及び本発明の物質が新規物質なのでこれを標準に用いるほど多量に得られていないことから、以下ではANA標準を用い、本発明の物質をANAの量に換算して定量する方法を説明する。尚、当然のことながら、ANA標準の代わりに本発明の物質の精製物を用いれば、本発明の物質そのものを定量することができる。
【００３７】
即ち、上記と同じ方法で蛍光標識した濃度既知の蛍光標識ANA標準を、蛍光標識した本発明の物質の場合と同じ条件で別途逆相HPLCに付し、ANA標準の蛍光強度のピーク面積を求める。先に得られた本発明の物質のピーク面積をANA標準のそれと比較すれば、逆相HPLCに付した本発明の物質の濃度をANA量に換算して定量することができる。
【００３８】
また、本発明の物質を含有する試料としてヒト血漿等の不純物を含有する試料を用いる場合には、ANA添加回収率を考慮して、本発明の物質の濃度を換算定量すればよい。
即ち、濃度既知のANA標準を蛍光標識したものを試料とし、これを逆相HPLCに付して蛍光強度の測定を行い、標識済みANA標準のピーク面積を測定する（面積aとする。）。別に、本発明の物質を含有しないことが明らかなヒト血漿等の試料に既知濃度のANA標準を添加したものを用意し、上記と同様に固相抽出、逆相HPLC精製、蛍光標識、逆相HPLC及び蛍光強度の測定を行い、ANA標準のピーク面積を測定する(面積bとする。)。面積aに対する面積bの割合を計算して、ANA添加回収率を求める。別途得られた本発明の物質のピーク面積値をANA添加回収率で除することによって、不純物を含有する試料中の本発明の物質濃度（但し、ANA換算値として）を得ることが出来る。
【００３９】
本発明に係る本発明の物質を含有する試料としては、血漿、血清、髄液、臓器抽出液等が挙げられるが、通常は血漿が用いられる。
【００４０】
また、上記試料の由来としては、SIRSあるいは感染症に罹患したヒトのほか、ウサギ、ウシ等が挙げられる。
【００４１】
尚、ヒト以外のこれらの動物から得られた血液成分について逆相HPLC分析を行ったところ、何れもヒトの本発明の物質と同じ位置にピークが出現することから、ヒトの本発明の物質と、その他の動物を試料として用いて同様の方法で精製して得られる物質は同じものであると考えられる。
【発明の効果】
【００４２】
以上述べた如く、本発明は、SIRSあるいは感染症を判定するためのマーカーとしての利用が期待できる新規物質、該物質の取得方法及び精度の高い定量方法を提供するものであり、斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。
【００４３】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約を受けるものではない。
【実施例１】
【００４４】
《本発明の物質の分離》
（１）試料の前処理
i）試料
血液培養試験により敗血症と診断された患者のヒト血漿を用いた。
Ii）前処理
試料1mlにメタノール0.4ml及び蒸留水0.6mlを混合した後、3000rpmで10分間遠心処理し、得られた上清を、減圧システムを取り付けたスピーディスク SPE（SpeediskTM SPE）カラム(充填剤：粒子径10μmのオクタデシルC18、20mg、カラム容積１ml、J.T.Baker製) にアプライした。カラムを蒸留水１ml、10v/v％メタノール水溶液 １ml、70v/v%メタノール水溶液 1 mlで順次洗浄した。次いで100%メタノールを通液して、溶出画分を回収した。
【００４５】
（２）本発明の物質の分離と定量
i）逆相HPLC
上記前処理で得られた溶出画分を乾固し、25μlの100％ メタノールに溶解し、HPLC用試料とした。うち20μlについて、下記条件下で逆相HPLCを行った。
・装置：LC-10A 高速液体クロマトグラフシステム（(株)島津製作所製）。
・カラム：
ワコーシルTM−II 5C18 AR (WakosilTM−II 5C18AR)カラム（φ4.6 X 150 
mm、和光純薬工業(株)製）+ ガードカラム (充填剤 WakosilTM-II 5C18AR、
φ4.6 X 10 mm、和光純薬工業(株)製)
・溶離液および溶出条件
０〜１０分：60%  AcCN (HPLC用,和光純薬工業(株)製)、イソクラティック
１０〜１５分： 60%→72.5%  AcCN、リニアグラジエント
１５分〜    ：100%  AcCN、イソクラティック
・流速：1.0 ml/分
・カラム温度：４０℃
・検出：210nm の吸収を測定した。
【００４６】
ii）本発明の物質画分の取得
HPLC用試料について逆相HPLCを行ったところ、溶出開始後12.25分〜13.25分の位置に溶出し、メインピークが13.1分の位置に出現するピークが現れた。これまで敗血症患者の血漿の分析では、このピークは検出されていない。また、ANA標準品（和光純薬工業(株)製）を用いて、上記と同様の条件で逆相HPLCを行い、ANAのピーク位置を確認したところ、ANA標準のメインピークは12.5分の位置に溶出した。即ち、HPLC用試料中の当該物質のメインピークの位置は、ANA標準のメインピークの溶出位置より少し遅れた位置に出現することが判った。従って、当該物質はANAとも異なる新規物質であることが推定された。
得られた12.25分〜13.25分の溶出画分を分取し、当該画分に溶出された物質を本発明の物質とした。
【実施例２】
【００４７】
《本発明の物質の定量》
（１）蛍光標識
実施例１で分取した溶出画分を乾固させた後、4.17mM 4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(N-chloroformylmethyl-N-methylamino)-2,1,3-benzoxadiazole（DBD-COCl、東京化成工業（株）製）ベンゼン溶液30μlに溶解し、60℃で40分間反応を行い、溶出画分を蛍光標識した。
【００４８】
（２）逆相HPLC
上記(1)で得られた、蛍光標識した溶出画分を乾固した後、AcCN 80μlに溶解し、そのうち10μlを下記測定条件で逆相HPLCに付し、蛍光強度を測定し、本発明の物質の溶出ピークの面積を求めた。
・装置：LC-10A 高速液体クロマトグラフシステム（(株)島津製作所製）
・カラム：
ワコーシルTM−II 5C18 AR (WakosilTM−II 5C18AR)カラム（φ4.6 X 150 
mm、和光純薬工業(株)製）+ ガードカラム (充填剤 WakosilTM-II 5C18AR、
φ4.6 X 10 mm、和光純薬工業(株)製)
・溶離液および溶出条件
０〜１５分： 70%  AcCN、イソクラティック
１５分〜  ：100%  AcCN、イソクラティック
・流速：1.0 ml/分
・カラム温度：４０℃
・検出：励起波長：450nm及び測定波長：560nmによる蛍光検出により行った。
【００４９】
（３）本発明の物質の定量
i）予め上記(1)と同様の方法で蛍光標識したANA標準10ngについて、上記(2)と同様の条件で逆相HPLCを行い、蛍光強度を測定してANA標準の溶出ピークの面積を求めた（面積aとした）。
ii）健常人ヒト血漿１mlにANA標準10ngを混合したものを試料とし、実施例１及び上記(1)及び(2)と同様の方法で固相抽出、逆相HPLC精製、蛍光標識、逆相HPLC及び蛍光強度の測定を行い、ANA標準の溶出ピークの面積を求めた（面積bとした）。面積bの面積aに対する割合を算出して、ANA添加回収率（％）とした。
ANA添加回収率（％）＝面積b／面積a×100
ANA添加回収率は36.2％であった。
iii）次いで、上記(2)で得られた本発明の物質のピーク面積から、下記の方法で試料（ヒト血漿）中の本発明の物質濃度を定量した。
本発明の物質濃度(ng/ml)
＝本発明の物質のピーク面積／ANA標準10ngのピーク面積(面積a)
×(25／20)×10÷ANA添加回収率
定量の結果、試料としたヒト血漿中の本発明の物質の濃度は、56.9ng/ml（ANA換算）であった。
【実施例３】
【００５０】
《本発明の物質（ヒト）の解析》
（１）試料
実施例１と同様の方法により精製して得られた、ヒト血漿中の本発明の物質精製品４μgの凍結乾燥品を200μlのメタノールに溶解し、試料とした。
（２）液体クロマトグラフ質量分析（LC/MS）
装置としてHP1100 (アジレント社製)を用い、下記の条件でLC/MS分析を行った。
i）LC条件
HPLCカラム：Cosmosil 5C18-MS (φ4.6 X 150 mm、ナカライテスク製)
流速：1.0 ml/分、
溶出：0分→2 分   ：60% AcCNイソクラティック、
2 分→15 分 ：92.5% AcCNまでリニアグラジエント、
15 分→16 分：100% AcCN までリニアグラジエント、
16 分→20 分：100% AcCN洗浄、
20 分→29 分：60% AcCN平衡化。
カラム温度：40℃
検出：210 nmの吸収を測定した。
注入量：10μl
ii）ESI-MS条件
イオン化法：エレクトロスプレー−イオン化法（electrospray ionization法、ESI)
測定イオン：負イオン
スプレー電圧：3000V
コーン電圧：30V, 40V（フラグメンテーション測定時）
RFレンズ：200unit
デソルベーションガス：窒素（700L/hr）
イオン源温度：150 ℃
デソルベーション部温度：250 ℃
走査範囲：m/z 100 〜 1,000
【００５１】
（３）結果
i）LC/ESI-MS測定結果
LC/ESI-MS 測定時におけるHPLCクロマトグラムを図１に示す。図１に於いて、溶出時間9.14 分に出現したピークが本発明の物質のピークに相当する。
また、図１の本発明の物質画分についてESI-MS 分析をおこなった際のマススペクトルを図２に示す。図２においていくつかのシグナルが観察されたが、親イオンはm/z 489 と考えられた。このイオンは脱プロトン化分子（(M-H)-）であり、従って、本発明の物質は分子量490 であると推定された。ANAの分子量は347.53なので、本発明の物質はANAよりも100程度分子量の大きい化合物であることが明らかになった。
ii）フラグメントイオンの測定
さらに、コーン電圧を40V として本発明の物質のフラグメントイオンを観察した。図３にマススペクトルを示す。m/z 133,151,155,211,277,395,411 などのフラグメントイオンが観察された。また、図３より明らかな如く、本発明の物質は、フラグメンテーションにより、大きく２つのイオンに解裂して、m/z 211, 277 が観測されている。更に、m/z 411 (489-78), m/z 133 (211-78)のイオンが観測されたことから、目的成分は質量78となる部分構造を持ち、m/z 211を示すフラグメントイオンにその構造が保持されていると推定された（m/z 277 のフラグメントイオンから78 Da脱離は観測されていない）。
以上、観測されたフラグメントイオンの結果から予想される、部分構造の分子量を図４に示す。  
【００５２】
尚、図３において151 (211-60)のフラグメントイオンが観察されている。これは211のフラグメントイオンから、脱プロトン化したエタノールアミン(-HNCH2CH2OH、分子量６０)が開裂したものと推定され、エタノールアミンが本発明の物質構造中に含まれる可能性が示唆された。またMSマススペクトル（図３）によると同位体比が高いことから、本発明の物質は酸素あるいは窒素を含む化合物である可能性が考えられた。
【００５３】
（４）分子量490 の化合物の検索
分子量490 の化合物について ChemFinder.Com のデータベース上で検索をおこなった。その結果、下記17件の化合物がヒットした。
1: Kepone, 
2: 5-oxo-prolyl-1-(hexyloxycarbonyl)-histidyl-prolinamide, 
3:Cholesteryl benzoate, 
4:Tetraheptylammonium bromide, 
5: Rhodamine 101 inner salt, 
6:Panose, 
7:1,1'-Carbonylbis(3-methylimidazolium)Triflate, 
8:Bis(3-nitro-2,4-pentanedionate-O2,O4)-(2,4-pentanedionato-O,O')rhodium, 
9:Glimepiride, 
10:Bentiamine, 
11:Mobenzoxamine, 
12:Niludipine, 
13:Salprotoside, 
14:Trimethidinium methosulfate, 
15:11-(Perfluoro-n-hexyl)undecanol, 
16:Perfluorosebacic acid,
17:Calcium hexafluoroacetylacetonate dihydrate の17件にヒットした。
しかしながら、図４に示したようなフラグメントが現れる可能性のある化合物は存在しなかった。従って、本発明の物質は新規物質であると考えられた。
【実施例４】
【００５４】
《本発明の物質（ウサギ）の解析》
ウサギ血漿を用いて実施例１と同様の方法で逆相HPLC分析を行ったところ、ヒト敗血症患者の血漿を用いた場合と同じ位置に、同様の挙動を示すピークが得られた。従って、ウサギ血漿中にもヒト敗血症患者の血漿中に存在するのと同じ本発明に係る物質が存在することが確認された。そこで、ヒト敗血症患者の血漿を多量に入手することが困難なことから、以下の本発明に係る物質の構造解析は、ウサギ血漿を試料として用いて行った。
（１）試料
実施例１と同様の方法により精製して得られた、ウサギ血漿中の本発明の物質精製品４μgの凍結乾燥品に200μlの重水素置換AcCNを添加し、vortex, sonicationをおこない溶解させたものを試料とした。
（２）LC/NMR 分析
装置としてUnity Inova 600 (Varian社製)を用い、下記の条件でLC/NMR 分析（Stop-flow 法）を行った。
i）ＬＣ条件
HPLCカラム：コスモシール 5C18-MS (φ4.6 X 150 mm、ナカライテスク(株)製)
移動相：A) 重水、B)重水素置換AcCN（いずれもHPLC用、和光純薬工業(株)製）
グラジエントプログラム（リニア）
0 分→2 分  ：A/B (40/60)イソクラティック
2 分→15 分 ：A/B (7/93) までリニアグラジエント 
15 分→16 分：A/B (0/100) までリニアグラジエント
16分→20 分 ：A/B (100/0) までリニアグラジエント
20 分→30 分：A/B (40/60) までリニアグラジエント
流速：1.0 ml/分、
検出：210 nm、カラムオーブンを40℃に設定
注入量：160 μl
ii）NMR条件
NMR測定核種：1H
観測周波数：599.6 MHz
化学シフト基準：AcCN(1.92 ppm)
NMR 測定温度：25℃
積算回数：9024回
パルスシークエンス：lc1d(WET 法による溶媒消去)
【００５５】
（３）LC/NMR 測定結果
LC/NMR 測定時におけるHPLCクロマトグラムを図５に示す。溶出時間9.6 分に目的の本発明の物質を含有するピークが観察された。
このピークについてLC/NMRを測定した。図６にNMRスペクトルを示す。移動相由来のシグナルが1.9ppm 付近（重水素置換AcCN）と3.7ppm 付近（重水）に観測される（シグナルはつぶされている）。
LC/NMRの結果より、本発明の物質の構造に関して以下の推察がされた。
１：1.2ppm付近および 1.5ppm 付近のシグナルは脂質の脂肪鎖(−CH2−)のプロトン    に由来する。
２：0.8ppmか0.9ppm 付近のシグナルは末端のメチル基のプロトンに由来する。
３：5.3ppm 付近のシグナルは糖のアノメリックプロトンか二重結合に由来する。
４：3.3〜4.2ppm付近のシグナルは糖かグリセライドなどに由来する。
５：2.7ppm 付近のシグナルは-N-CH2-のプロトンに由来する。
以上のことから、本物質は脂肪族系の化合物で、酸素か窒素を含む構造が推定された。
【００５６】
また、(1)逆相HPLCによる本発明の物質の溶出位置がANAのそれに近いこと、及び(2)MS分析により本発明の物質がエタノールアミンを含む可能性があることが判ったが、アナンダミドのMSフラグメントにおいてもエタノールアミン(-HNCH2CH2OH)のシグナルが観察される（Lipid Bank のデータベースより）こと、より、本発明の物質はANAと似た構造をもつと推定され、その場合、分子量の差から考えてアミノ酸あるいは糖とANA が結合したものではないかと推察された。
【実施例５】
【００５７】
（１）試料
SIRSと診断された患者のヒト血漿（59検体）、健常人血漿（8検体）
（２）本発明の物質の検出
各試料について実施例１と同様の方法で本発明の物質の検出を行った。
（３）結果
結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
表１より明らかな如く、SIRS患者の約66％の血漿中には本発明の物質が検出されたが、健常人の血漿からは本発明の物質は全く検出されなかった。
以上のことより、本発明の物質を検出することにより、SIRS患者用マーカーとしての有用性があることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例３に於いて得られた、本発明の物質のLC/ESI-MS測定時に於けるHPLCクロマトグラムを示す。
【図２】実施例３に於いて得られた、本発明の物質のESI-MS分析を行って得られたマススペクトルを示す。
【図３】実施例３に於いて得られた、本発明の物質についてフラグメンテーションを行って得られたマススペクトルを示す。
【図４】実施例３に於いて得られた、本発明の物質についてフラグメンテーションを行って得られた結果から予想される、本発明の物質の部分構造の分子量を示す。
【図５】実施例４に於いて得られた、本発明の物質のLC/NMR 測定時におけるHPLCクロマトグラムを示す。
【図６】実施例４に於いて得られた、本発明の物質のLC/NMR分析を行って得られたNMRスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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