(57)【要約】      （修正有）【課題】自己舌組織から、拍動する心筋細胞を創生するための細胞、細胞の培養、分化誘導法の提供。再生医学に多大な貢献をする。【解決手段】バイオプシーによってヒトからも採取可能な組織、特に自己舌組織幹細胞から、ＳＣＡ１陽性でＣＤ３４の細胞を採取し、脱メチル化剤を用いずに、血小板由来増殖因子や上皮細胞増殖因子のような成長因子を含む培地の使用と、培養における細胞外環境因子として遠心負荷をかける方法によって、拍動する心筋細胞を誘導する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
舌組織から単離された、自動拍動する心筋細胞に分化する能力を有する細胞。
【請求項２】
電気的細胞間連絡を形成する心筋細胞に分化しうる細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
細胞が、少なくとも心筋細胞、骨格筋細胞に分化する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項４】
細胞が、ＳＣＡ１陽性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細  胞。
【請求項５】
細胞が、ＣＤ３４陰性である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
細胞が、ＣＤ３８陰性もしくは陽性である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、さらにＣＤ３１陰性もしくは陽性である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞から誘導される心筋細胞に特異的に分化誘導される心筋前駆細胞。
【請求項９】
心室筋細胞に分化する能力を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
洞結節細胞に分化する能力を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
舌組織がほ乳動物由来のものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
ほ乳動物がマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サルおよびヒトから選ばれる１種である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
染色体ＤＮＡの脱メチル化薬を必要とせず心筋細胞に分化する能力を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１４】
圧負荷培養によって拍動する細胞の頻度を増加させることができる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１５】
培養に使用するサイトカインが血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１６】
培養に使用する接着分子がゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１5記載の細胞。
【請求項１７】
心筋細胞への分化を確認する転写因子の発現が、Ｎｋｘ２．５、ＧＡ  ＴＡ４、ＭＥＦ−２Ｃ、ＡＮＰ，ＢＮＰ、Ｃｘ４３、α-myosin heavy chain, MLC2a,   MLC2v、troponin Iからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１８】
心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として細胞外カルシウム濃度に依存する因子、細胞内カルシウム濃度に依存する因子、から選ばれる少なくとも１種である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１９】
心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として細胞内カルシウム濃度に依存する因子として、カルシウム−カルモデュリンキナーゼを介する請求項１８記載の細胞。
【請求項２０】
心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として細胞内カルシウム濃度を調節する因子として、Ｗｎｔからのシグナルを介する請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
心臓に移植することにより心筋細胞に分化する能力を有する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として圧負荷をかけ培養する方法。
【請求項２３】
心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として遠心負荷をかける培養方法。
【請求項２４】
拍動する心筋をfluo3、Fura2などの蛍光色素を用いて細胞内カルシウム動態、カルシウムトランジエントを測定する方法。
【請求項２５】
拍動する心筋細胞間の電気的な結合をfluo3蛍光色素を用いて確認する方法。
【請求項２６】
拍動する心筋細胞間の電気的な結合をＣｘ４３の免疫染色を用いて確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己舌組織から拍動する心筋細胞を創生するための細胞、および細胞の単離、精製、培養、分化誘導法に関する。また本発明は、各種サイトカイン、接着因子などを用いた、心筋細胞への分化能を有する細胞の増殖方法および心筋細胞への分化を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全の原因として、心筋梗塞、心筋炎、拡張型心筋症、二次性心筋症、高血圧性などがあり、特に近年、生活習慣の欧米化によって心筋梗塞によるものが増えている。心不全の治療法としては、強心薬、アンギオテンシン変換酵素阻害薬、アンギオテンシン受容体拮抗薬、β遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬などを用いた薬物療法が中心であるが、失われた心筋量が多い場合や、心筋そのものの変性が著しい場合には心臓移植しか有効な治療法がない。しかし、心臓移植はわが国では特に心臓提供者が得られにくく、心臓移植が施行されて数年になるが、いまだに１０数例の治療例しかないのが現状である。そこで、胚性幹細胞や自己組織幹細胞、中でも自己骨髄中の幹細胞による心筋細胞の分化誘導が試みられているが、心筋細胞への誘導効率が極めて低く、再現性に乏しいことや、移植しても、自己の心筋細胞と電気的な結合を形成せず、不整脈の原因になったり、また、細胞のソースとして胎児や新生児の心筋細胞を用いるために倫理的な反対が続出しており、新たな、細胞ソースが求められているがいまだに、画期的な細胞ソースは見出されていない。近年、マウス成体の骨髄から、心筋細胞に分化する能力を有する細胞を得たという報告がある（非特許文献１および非特許文献２）。また、生体組織とくに骨髄から単離された少なくとも心筋細胞に分化する能力を有する細胞に関する特許が出願されている（特許文献１）。しかし、前述の発明は、心筋細胞に分化する細胞を得るために脱メチル化剤を用いなければならないため、染色体ＤＮＡに損傷を受けた変異細胞となっている可能性があり、臨床応用には耐えない方法と考えられる。また、心筋から組織幹細胞を分離し、心筋梗塞マウスで心筋への分化を認めた方法も報告されているが、（非特許文献３）、心臓からそのような細胞を得ることは実際の臨床においては不可能であると考えられる。また、骨格筋から骨格筋の前駆細胞を分離し、心筋に移植する実験が行われているが、骨格筋からの細胞は心筋と電気的結合ができず、不整脈の原因になる可能性が示されており、この方法も限界があると考えられる（非特許文献４）。
【０００３】
また、成体マウス筋肉由来の細胞を、脱メチル化剤等の分化誘導剤を用いずに培養することにより拍動する心筋様細胞に分化することを見出し、この心筋様細胞を（１）心筋分化・再生に関わる遺伝子の同定および評価、（２）心不全・心筋梗塞など心疾患をはじめとする種々の疾患の細胞移植、（３）心筋分化を促進する化合物の探索および評価、（４）細胞移植効率を上昇させる薬剤（移植細胞の生体組織への定着・機能促進）の探索および評価、（５）心不全治療剤を開発するためのモデル動物作成などに用いることを請求している特許がある（特許文献２）。
【特許文献１】特願２００１−５４８６６４
【特許文献２】特願２００３−５９２９７
【非特許文献１】J. Clinical Investigation, 103, 10-18(1999)
【非特許文献２】Cell，114:763-776,(2003)
【非特許文献３】PNAS, 100:12313-12318,2003
【非特許文献４】Circulation，107:3088-3092, (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、心筋細胞への分化能を有する舌組織由来の細胞およびその用途等に関するものであり、自己の舌組織を用いる場合には、ヒトの心疾患の治療にも用いることができる。また、心筋細胞への分化能を有する舌組織由来の拍動する心筋細胞を移植された移植動物（ヒトを除く）は、心疾患の予防・治療剤となりうる化合物を探索するためのスクリーニング等にも利用できる。
【０００５】
世界で始めて自己舌組織幹細胞から、脱メチル化剤を用いずに、成長因子と圧負荷によって拍動する心筋細胞を誘導させることに成功した。特に、舌組織というバイオプシーによって採取可能な組織から誘導できたことは非常に有用で、再生医学に多大な貢献をし得る発明と考えられる。
【０００６】
本発明では、変異原性のある薬物を使用しないで分化を誘導できること、再現性を  持って、自己拍動する心筋細胞を得ることができること、電気的接合を形成し協調して拍動すること、細胞内カルシウムトランジエントを測定することができるまったく新規な細胞ソースとその分化誘導法を考案したのでここに特許申請する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これまで心筋細胞を自己の組織幹細胞から誘導できると報告されたものは、骨髄中の幹細胞に脱メチル化剤を投与し、頻回の培養を繰り返しているうちに、たまたま出現した拍動する細胞を採取してcell line化する方法(CMG cell)であるが、再現性がほとんどなく、新規に骨髄よりこのような細胞を繰り返して分離することは困難である。また胚性幹細胞(ES細胞)から拍動する心筋細胞が比較的簡単に誘導できるが、これは自己の細胞ではなく免疫学的な問題や、倫理的問題が大きく、現時点では臨床的には使用できない。発明者らは、今回、拍動する心筋細胞を初回培養で、高率に、再現性を持って、しかも変異原性のある脱メチル化剤を使用せずに分化誘導できる方法を発明した。
【０００８】
本発明の細胞は、舌組織から単離された、自動拍動する心筋細胞に分化する能力を有する細胞である。また、この細胞は、電気的細胞間連絡を形成する心筋細胞に分化しうる細胞であり、少なくとも心筋細胞、骨格筋細胞に分化しうる細胞である。これらの細胞は、幹細胞に特異的な細胞表面マーカー（たとえばＳＣＡ１）が陽性である細胞、ＣＤ３８陰性もしくは陽性である細胞、さらにＣＤ３１陰性もしくは陽性である細胞が含まれる。また、これらの細胞から誘導される、心筋細胞に特異的に分化誘導される心筋前駆細胞、心室筋細胞に分化する能力を有する細胞、洞結節細胞に分化する能力を有する細胞も含まれる。舌組織は、ほ乳動物由来のものであり、具体的にはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サルおよびヒトから選択できる。
【０００９】
染色体ＤＮＡの脱メチル化薬を必要とせず心筋細胞に分化する能力を有する細胞は、圧負荷培養によって拍動する細胞の頻度を増加させることができる。また、培養に使用するサイトカインは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）および骨形成因子２、４（ＢＭＰ−２、４）、Ｗｎｔからなる群から選ばれる少なくとも１種である。また培養に使用する接着分子は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも１種である。心筋細胞への分化を確認する転写因子の発現は、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ｃ、ＡＮＰ，ＢＮＰ、Ｃｘ４３、α-myosin heavy chain, MLC2a, MLC2v、troponin I からなる群から選ばれる少なくとも１種である。心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子としては、細胞外カルシウム濃度に依存する因子、細胞内カルシウム濃度に依存する因子、から選ばれる少なくとも１種である。また、心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として細胞内カルシウム濃度に依存する因子として、カルシウム−カルモデュリンキナーゼを介する細胞である。さらに、心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として細胞内カルシウム濃度を調節する因子として、Ｗｎｔからのシグナルを介する細胞である。さらに、心臓に移植することにより心筋細胞に分化する能力を有する細胞である。
【００１０】
本発明の細胞の培養方法は、心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として圧負荷をかけ培養する方法、心筋細胞への分化を促進する細胞外環境因子として遠心負荷をかける培養方法を用いる。
【００１１】
本発明により得られる拍動する心筋を、fluo3やFura2などの蛍光色素を用いて細胞内カルシウム動態やカルシウムトランジエントを測定する方法、拍動する心筋細胞間の電気的な結合をfluo3蛍光色素を用いて確認する方法、拍動する心筋細胞間の電気的な結合をＣｘ４３の免疫染色を用いて確認する方法も、本発明に含まれている。
【００１２】
成獣の舌組織を、コラゲナーゼ等により酵素処理して単離細胞にし、幹細胞マーカーを認識する抗体で標識し、二次抗体として磁気ビーズで標識したものを用い、陽性細胞を分離する。これを１０％ＦＣＳを加えた  DMEM培地にLIF, EGF, PDGFbb等を加え、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養する。このとき、特殊な培養器を用いる。すなわち、培養器内に高圧をかけることのできる耐圧の培養器内で培養する。培養後に棒状及び球状の細胞塊が出現し、これらの細胞は互いに融合し、電気刺激なしに一定の自動拍動を起こし、横紋も観察され、心筋細胞に特異的に分化することが確認された。さらに、これらの細胞は免疫組織学的検討、およびRT-PCRによる遺伝子発現により、心筋特異的遺伝子であるNKX2.5, ANP, connexin 43の遺伝子を発現することを確認した。また、myosin, Cx 34, troponin Iによる免疫染色により、心筋に分化していることを確認するとともに、これらの細胞はgap junctionを介して結合し、各細胞が同期して拍動しうることを確認した。さらに、細胞内カルシウムトランジエントをカルシウム感受性蛍光色素Fluo3を負荷し、レーザー共焦点顕微鏡で観察したところ、心筋細胞に見られるものと同様の細胞内カルシウムトランジエントを観察した。これらの細胞は２週間培養を続けると、シート状になり、シート全体が同期して拍動するのが観察された。以上より、舌由来幹細胞は特異的に心筋細胞に分化し、自己拍動する能力を有し、細胞間結合を介して同期して拍動、および電気現象をおこすことが証明された。さらに、この心筋細胞分化には、変異原性を有する有害な薬物を用いることなく、再現性を持って分化誘導することができることを証明した。このような自己拍動する細胞を得ることができ、また拍動する心筋シートをこの細胞から作製することも可能であり、移植に使用可能な幹細胞ソースとして非常に有用であると考えられる。
【発明の効果】
【００１３】
自己組織幹細胞から拍動する心筋細胞を、脱メチル化剤を用いずに、成長因子と圧負荷によって誘導させることに成功した。特に舌組織というバイオプシーによってヒトからも採取可能な組織から誘導できたことは非常に有用で、再生医学に多大な貢献をし得る発明と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の実施の形態を、実施例にもとづき図面を参照して説明する。
【実施例】
【００１５】
マウスの舌組織を０．２％コラゲナーゼで３０分間酵素処理して単離細胞にし、幹細胞マーカーの一種としてよく知られているSCA-1に対するモノクローナル抗体で標識し、二次抗体として磁気ビーズで標識したものを用い、陽性細胞を分離した（Miltenyi社製の市販のキットを使用）。次に、１０％ＦＣＳを加えた DMEM培地にLIF、EGF、PDGFbbを加え、分離したSCA-1陽性細胞を、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。このとき、特殊な培養器を用い、培養器内に１１０ｍｍＨｇの圧をかけ培養した。７日後に棒状の細胞と球状の細胞塊（cardiosphere）が多数出現し、これらは細胞融合し、電気刺激なしに一定の自動拍動を起こし、横紋も観察され、心筋細胞に特異的に分化することが確認された。さらに、これらの細胞は免疫組織学的検討によりmyosin, Cx 43, troponin I を発現し、RT-PCRによる遺伝子発現の解析により、心筋特異的遺伝子であるNKX2.5、ANP、connexin 43の遺伝子を発現することを確認した。これらの細胞はgap junctionを介して結合し、各細胞が同期して拍動することを確認した。さらに細胞内カルシウムトランジエントを、カルシウム感受性蛍光色素Fluo3を負荷し、レーザー共焦点顕微鏡で観察したところ、心筋細胞に一致する細胞内カルシウムトランジエントを観察した。これらの細胞は、２週間培養を続けるとシート状になり、シート全体が同期して拍動するのが観察された。以上より、舌由来幹細胞は特異的に心筋細胞に分化しうる能力を有することが証明された。また、有害な薬物を用いることなく、再現性を持って心筋細胞に分化誘導することができることを証明できた。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】舌組織由来幹細胞（ＴＤＳ）から分化した心筋様細胞の免疫染色（Myosin：赤色、connexin 43：黄色、DAPI：青色) の一例。融合したmyosin陽性細胞にconnex  in 43が発現していることを示す図である。
【図２】舌組織由来幹細胞（ＴＤＳ）から分化した心筋様細胞の免疫染色（Myosin：赤色、connexin 43：黄色、DAPI：青色) の一例。融合したmyosin陽性細胞にconnex  in 43が発現していることを示す図である。
【図３】舌組織由来幹細胞（ＴＤＳ）の培養２週間目にカルシウム感受性蛍光色素Fluo3を負荷し、レーザー共焦点顕微鏡でカルシウムトランジエントを観察した結果で  あり、左の図は測定部位を示し、右の図はカルシウムトランジエントを示している図で  ある。
【図４】舌組織由来幹細胞（ＴＤＳ）の培養２週間目にカルシウム感受性蛍光色素  Fluo3を負荷し、レーザー共焦点顕微鏡でカルシウムトランジエントを観察した結果であり、隣接する２つの細胞のカルシウムトランジエントを測定し、これらが同期していることを示すために、左の図は測定部位を示し、右の図はカルシウムトランジエントを示している図である。図A, 図Bはそれぞれの細胞のトランジエントを示し、図Cは２つの細胞を合わせてトランジエントを記録したものである。同期していなければ、図Cにおいて図AおよびBと同様な波形は認められないはずであり、２つの細胞は同期していることを示す図である。
【図５】舌組織由来幹細胞（ＴＤＳ）から分化誘導した拍動細胞（１週間、２週間  ）の遺伝子発現をRT-PCRで検討した結果を示す図であり、対照としてadult heart, 水および大腿筋、を用いて、NKX2.5, ANP, connexin 43といった心筋細胞でのみ見られる遺伝子発現を、TDS細胞を１週間および２週間培養したもののいずれにも認めたことを示す図である（一方、大腿筋にはこれらの遺伝子発現は認められない）。
【図６】舌組織からcollagenaseによって単離した細胞をSCA1 monoclonal 抗体で標識し、磁気ビーズを結合した二次抗体を結合させ、磁気分離カラムによる分離を２回行った後の細胞（ＴＤＳＣ）を、PE conjugated SCA-1抗体と反応させ、Fluorescent   activated cell sorter(FACS)により、細胞の大きさ、ＳＣＡ−１陽性率について解析した結果を示す図である.A. side scatter(縦軸)、forward scatter(縦軸)による細胞分布を示す。B.  SCA-1抗原のヒストグラムを示す。黒はTDSCを、grayはnegative c  ontrolを示す。C. SCA-1についてnegative controlの分布を示す。D. ＴＤＳＣのSCA-  1陽性細胞の分布を示す（SCA-1 陽性率は８６％まで濃縮された）。
【図７】TDS細胞を５日間培養することにより自己拍動する球形の細胞塊が見られるが、これをCardiosphereと命名した。Cardiosphereは、自己拍動することを確認するとともに、Fluo3負荷による細胞内カルシウムトランジエントも存在することを確認し、また、これらの細胞は棒状の細胞（myotube）とfusionをおこし、自己拍動することを示した図である。
【図８】Cardiosphereとmyotubetはfusionをおこし（図A,B,C）、完全にfusionしたcardiosphereとmyotubeは幅の広い紡錘状の細胞となり自己拍動する(図D)ことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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