(57)【要約】【課題】操作が簡便で、しかも遺伝子発現抑制効率が高い新規遺伝子発現抑制法およびその利用方法を提供する。【解決手段】本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、またはその遺伝子断片とＲＮＡポリメラーゼとを、宿主細胞に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制するものである。これによれば、従来のＲＮＡ干渉のように、ベクターの構築が不要であるため、簡便で、しかも短時間に、遺伝子の機能解析を行うことができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制法。
【請求項２】
標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片と、ＲＮＡポリメラーゼとを、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制法。
【請求項３】
上記遺伝子断片は、５’末端にプロモーター配列を有する請求項１または２に記載の遺伝子発現抑制法。
【請求項４】
上記遺伝子断片は、２本鎖である請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法。
【請求項５】
上記遺伝子断片は、ＤＮＡである請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法。
【請求項６】
上記遺伝子断片は、少なくとも２１塩基または塩基対からなる請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法を用いて作製された、標的遺伝子の発現が抑制された形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法を用い、標的遺伝子の機能を解析する遺伝子の機能解析法。
【請求項９】
上記標的遺伝子は、既知の塩基配列からなる機能未知遺伝子であり、
標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を宿主に導入する工程と、
当該遺伝子断片の導入前後の宿主の機能を比較する工程とを含むことを特徴とする請求項８に記載の遺伝子の機能解析法。
【請求項１０】
標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を含み、標的遺伝子の発現を抑制する遺伝子発現抑制剤。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子の機能解析法によって機能が明らかとなった遺伝子、または請求項１０に記載の遺伝子発現抑制剤を有効成分とする遺伝子疾患治療薬。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制法、または、請求項８または９に記載の遺伝子の機能解析法に用いるキットであって、
標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、請求項１０に記載の遺伝子発現抑制剤、または、請求項１１に記載の遺伝子疾患治療薬のいずれかを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規遺伝子発現抑制法およびその利用に関し、より詳細には、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片の宿主細胞内への導入によって、その標的遺伝子の発現を抑制する新規遺伝子発現抑制法、および、その利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アンチセンスＲＮＡとは、ＤＮＡより転写されるｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）に対し、その遺伝情報が裏返しとなった転写物のことを意味する。このアンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子からつくられるｍＲＮＡと構造的に相補性を有しているので、両者は互いに結合してＲＮＡ二重鎖（二本鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡとも称する）を形成する。このように、言わば“フタ”をかぶされたｍＲＮＡは、特異的ＲＮＡ分解酵素によって分解され、タンパク質合成の場への移行ができなくなり、本来の遺伝子の機能が抑制される。
【０００３】
また、アンチセンスＲＮＡのみならず、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとが互いに結合して形成された上述のｄｓＲＮＡも、細胞内へ導入することによって、当該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡが分解され、遺伝子の発現を抑制するという現象を引き起こす。このｄｓＲＮＡの導入によって遺伝子の発現が抑制される現象は、ＲＮＡ干渉（或いは、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる（例えば、非特許文献１〜４）。
【０００４】
このような、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞内への導入によって、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であるＲＮＡ干渉は、１９９８年に線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）で初めて発見された。そして、ＲＮＡ干渉は、極めて高い配列特異性を持つことから、近年、逆遺伝学の有効な手法として、線虫を中心に広く利用されている。また、それにとどまらず、上記ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡを標的とした医薬品、農薬品、品種改良、微生物工業、バイオリアクターの開発などに幅広く利用できる可能性を有している。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｆｉｒｅ，  Ａ．，  Ｘｕ，  Ｓ．，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｋｏｓｔａｓ，  Ｓ．Ａ．，  Ｄｒｉｖｅｒ，  Ｓ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｏ，Ｃ．Ｃ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１，  ８０６−８１１．
【０００６】
【非特許文献２】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄＴｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８．
【０００７】
【非特許文献３】
Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ，  Ｒ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，５５０−５５３．
【０００８】
【非特許文献４】
Ｐａｄｄｉｓｏｎ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｃａｕｄｙ，  Ａ．Ａ．，  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．，  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｏｎｋｌｉｎ，  Ｄ．Ｓ．（２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １６，  ９４８−９５８．
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記ｄｓＲＮＡの細胞内への導入方法として、線虫などではマイクロインジェクションによる直接注入方法が頻繁に用いられている。一方、植物では、セルロースやペクチン質からなる強固な細胞壁が存在するため、ｄｓＲＮＡを細胞内へ直接導入することが極めて難しい。そのため、植物では転写後にｄｓＲＮＡが形成されることを期待した逆方向反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の構造を持つベクターで形質転換する方法が専ら利用されている（非特許文献３、４など）。
【００１０】
しかしながら、このようなベクターの構築は困難であるため、ベクターの作製にはかなりの時間を要し、その上、必ずしも遺伝子発現抑制効率が高くないという問題点を有している。その上、従来の遺伝子発現抑制法は、逆遺伝学の研究で要求されるハイスループットスクリーニングには不適であった。
【００１１】
このように、ベクターの作製は煩雑であるため、逆遺伝学の研究で要求されるハイスループットスクリーニングに適した遺伝子発現抑制法は、未だ開発されていないのが現状である。
【００１２】
そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便で、しかも効率的に標的遺伝子の発現を抑制する、新規遺伝子発現抑制法およびその利用方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために、操作が簡便で、しかも高い遺伝子発現抑制効率を示す遺伝子発現抑制法について、鋭意に検討した。その結果、従来のＲＮＡ干渉法のように、ｄｓＲＮＡまたはそれを発現するベクターではなく、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、ＲＮＡ干渉と略同等の抑制効率を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制することを特徴としている。
【００１５】
また、本発明の別の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片と、ＲＮＡポリメラーゼとを、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制することを特徴としている。
【００１６】
本発明の遺伝子発現抑制法において、上記遺伝子断片は、５’末端にプロモーター配列を有するものであってもよい。また、上記遺伝子断片は、２本鎖であることが好ましい。上記遺伝子断片は、ＤＮＡであることが好ましい。上記遺伝子断片は、少なくとも２１塩基または塩基対からなるものであってもよい。
【００１７】
上記の発明によれば、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、またはその遺伝子断片とＲＮＡポリメラーゼとを、宿主に導入するだけで、標的遺伝子の発現を抑制できる。つまり、従来のＲＮＡ干渉法には必要不可欠であり、多大な時間を要していた、ｄｓＲＮＡ発現ベクターの構築や、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡ作製が不要となる。しかも、本発明の遺伝子発現抑制法は、ｄｓＲＮＡによる従来のＲＮＡ干渉と略同程度の抑制効率を示す。したがって、従来よりも飛躍的に操作が簡便であり、しかも、大幅な時間短縮が可能であり、さらに、ＲＮＡ干渉法に匹敵する遺伝子発現抑制効果を得ることが可能となる。
【００１８】
さらに、上記の発明によれば、上記遺伝子断片を作製するのみの実験系であるので、大量のサンプルを、短時間で網羅的に解析することが可能となる。すなわち、本発明の遺伝子発現抑制法は、ハイスループットスクリーニングに適用可能である。
【００１９】
本発明の形質転換体は、上記遺伝子発現抑制法を用いて作製された、標的遺伝子の発現が抑制された形質転換体である。この形質転換体は、標的遺伝子の発現が抑制されているので、その遺伝子の機能の一部（または全て）を欠失した疾患モデル動物や、品種改良された植物として利用できる。
【００２０】
本発明の遺伝子の機能解析法は、上記いずれかの遺伝子発現抑制法を用い、標的遺伝子の機能を解析する方法であり、好ましくは、上記標的遺伝子は、既知の塩基配列からなる機能未知遺伝子であり、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を宿主に導入する工程と、当該遺伝子断片の導入前後の宿主の機能を比較する工程とを含む方法である。
【００２１】
言い換えると、本発明の遺伝子の機能解析法は、塩基配列が明らかな機能未知遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、機能未知遺伝子の機能を抑制し、機能未知遺伝子の機能を解析することが好ましい。
【００２２】
上記の発明によれば、標的遺伝子（好ましくは機能未知遺伝子）の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、その遺伝子の機能が抑制される。そして、その遺伝子断片を導入した前後の、宿主の機能を解析することによって、標的遺伝子（好ましくは機能未知遺伝子）の機能を明らかにすることができる。すなわち、機能未知遺伝子は、その遺伝子の発現を抑制することによって、抑制された機能を有していると同定できる。
【００２３】
このようにして、機能未知遺伝子の機能（生理的役割）が、明らかとなれば、その遺伝子は、医薬品、農薬品、品種改良、微生物工業、バイオリアクターに応用できる。
【００２４】
前述のように、本発明の遺伝子発現抑制法は、ベクターの構築が不要であるため、簡便で、しかも短時間で行うことが可能である。本発明の遺伝子の機能解析法においても、遺伝子断片を増幅するのみの実験系であるので、大量の機能未知遺伝子サンプルを、短時間で網羅的に解析することが可能となる。つまり、本発明の遺伝子の機能解析法は、大量の機能未知遺伝子の機能を解明し、その遺伝子から目的とする機能を有する遺伝子を選抜するハイスループットスクリーニングに好適である。
【００２５】
本発明の遺伝子発現抑制剤は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を含み、標的遺伝子の発現を抑制するものである。また、本発明の遺伝子疾患治療薬は、上記遺伝子の機能解析法によって機能が明らかとなった遺伝子、または上記遺伝子発現抑制剤を有効成分とするものである。これにより、標的遺伝子の発現を抑制することが可能な、新規遺伝子発現抑制剤および遺伝子疾患治療薬を提供することができる。
【００２６】
本発明のキットは、上記いずれかの遺伝子発現抑制法、または、上記遺伝子の機能解析法に用いるキットであって、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、上記遺伝子発現抑制剤、または、上記遺伝子疾患治療薬のいずれかを含むものである。これにより、本発明の遺伝子発現抑制法および遺伝子の解析法を、より簡便に行うことができ、本発明の汎用性を向上できる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下により詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００２８】
（１）本発明の遺伝子発現抑制法
本発明の遺伝子発現抑制法は、以下の（ａ）または（ｂ）に示す方法である。
（ａ）標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
（ｂ）標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片と、ＲＮＡポリメラーゼとを、宿主に導入することによって、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【００２９】
すなわち、上記（ａ）は、宿主細胞に、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片のみを導入する方法である。また、上記（ｂ）は、宿主細胞に、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片に加えて、ＲＮＡポリメラーゼも導入する方法である。
【００３０】
本発明において、上記「標的遺伝子」とは、その遺伝子の機能を抑制すべき遺伝子のことを示し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなども含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。さらに、上記「標的遺伝子」は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列を含むものであってもよい。また、上記標的遺伝子は、機能が未知のもの、あるいは既知のもの、他生物の個体や細胞、または細胞においての機能は既知であるが、導入する細胞においては未知であるもの、また複数種が組合わさった機能が未知のもの等が挙げられる。また、細胞内在性のもの、外来性のもの、あるいは染色体性、非染色体性のもの等いずれのものでもよく、その由来は特に限定されるものではない。
【００３１】
また、上記「遺伝子断片」は、上記標的遺伝子の部分配列を少なくとも含むポリヌクレオチドであり、標的遺伝子の部分配列を少なくとも含んでいても、標的遺伝子の全てを含んでいてもよい。言い換えると、上記遺伝子断片は、標的遺伝子のうち少なくとも一部の領域の塩基配列が連続してなるものであれば特に限定されるものではない。なお、遺伝子断片の詳細については、後述する。
【００３２】
上記「宿主」は、上記遺伝子断片が導入される生物（個体）または細胞である。上記宿主は、例えば、単細胞、多細胞、植物、動物などを挙げることができ、後述の形質転換体と同様に、上記遺伝子断片を導入することができれば、特に限定されるものではない。
【００３３】
上記「標的遺伝子の発現を抑制」とは、上記遺伝子断片の導入によって、少なくとも一部の標的遺伝子の機能レベルの減少を示し、標的遺伝子の機能が欠失するものであってもよい。具体的には、例えば、標的遺伝子に由来するタンパク質及び／又はｍＲＮＡの消失、標的遺伝子からｍＲＮＡの転写阻害、又はそれらのレベルの減少を示す。
【００３４】
本発明の遺伝子発現抑制法の１つのメカニズムを、宿主として植物細胞を用いた図１を参照して説明する。すなわち、図１に示すメカニズムは、植物細胞に、遺伝子断片を導入することによって、標的遺伝子の発現を、転写後段階で抑制するものである。
【００３５】
具体的には、まず、抑制したい標的遺伝子の部分配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７プロモーターを付加したプライマーを用いたＰＣＲ法によって、標的遺伝子の部分配列を含む２本鎖ＤＮＡ断片を増幅する。これにより、Ｔ７プロモーター配列を両端に有する２本鎖ＤＮＡ断片が調製される。そして、このＤＮＡ断片を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともに、植物細胞に導入すると、ポリメラーゼが作用して、植物細胞内で、導入されたＤＮＡ断片の配列に対応した２本鎖ＲＮＡが形成される。その結果、この２本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することよって、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００３６】
このように、図１のメカニズムは、Ｔ７プロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡ断片を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとともに、植物細胞に導入することにより、植物細胞内で、ＲＮＡ干渉を引き起こすものである。
【００３７】
ただし、後述の実施例にも示すように、２本鎖ＤＮＡ断片のみを、宿主細胞に導入した場合も、同様に、標的遺伝子の発現を抑制することから、上記以外のメカニズムも考えられる。例えば、ＤＮＡ断片自体が標的遺伝子の発現を抑制するというメカニズムも否定できず、メカニズムの詳細は、今のところ明らかではない。
【００３８】
しかしながら、少なくとも標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を、宿主細胞に導入することによって、標的遺伝子の発現は、確実に抑制される。本発明の遺伝子発現抑制法は、これまでのＲＮＡ干渉のように、ベクターの構築、または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｄｓＲＮＡの作製などの煩雑な操作が不要である。それゆえ、従来のＲＮＡ干渉法よりも、極めて簡便で、しかも大幅な時間短縮が可能であり、しかも従来のＲＮＡ干渉法に匹敵するほどの遺伝子抑制効率で、標的遺伝子の発現を抑制できる、遺伝子発現抑制法を提供できる。
【００３９】
本発明の遺伝子発現抑制法では、上記遺伝子断片の５’末端にプロモーター配列を連結してもよい。これにより、後述する実施例に示すように、標的遺伝子の抑制効率を高くすることができる。
【００４０】
また、上記遺伝子断片がプロモーター配列を有していれば、上記遺伝子断片のＲＮＡへの転写効率の向上が可能である。そのため、前述した図１のメカニズムのように、上記遺伝子断片から転写されたｄｓＲＮＡが、標的遺伝子の発現を抑制するのであれば、プロモーター配列を有さない場合よりも、短時間で、標的遺伝子の発現を抑制できる。
【００４１】
本発明の遺伝子発現抑制法では、上記遺伝子断片は、１本鎖でも２本鎖でもよい。通常のＲＮＡ干渉と同様に、標的遺伝子の発現を効率的に抑制するためには、上記遺伝子断片が２本鎖であることが好ましい。また、上記遺伝子断片が２本鎖であれば、１本鎖の場合よりも低濃度で、標的遺伝子の発現を抑制できる。さらに、上記遺伝子断片が２本鎖であることは、１本鎖の場合よりも細胞内のヌクレアーゼに対する分解を抑制できるため好ましい。
【００４２】
本発明の遺伝子発現抑制法では、上記遺伝子断片は、標的遺伝子の部分配列からなるものである。本発明において、標的遺伝子と遺伝子断片との核酸の種類は、必ずしも同じである必要はなく、異なっていてもよい。例えば、標的遺伝子がＤＮＡの場合、遺伝子断片はＤＮＡ断片でもＲＮＡ断片でもよい。すなわち、「標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片」とは、少なくとも、標的遺伝子の部分配列からなるＤＮＡ断片、または、その部分配列に対応するＲＮＡ断片を示すこととなる。上記遺伝子断片の安定性を考慮すると、上記遺伝子断片は、ＤＮＡであることが好ましい。これにより、標的遺伝子の発現を持続的に抑制することが可能となる。
【００４３】
上記遺伝子断片となる標的遺伝子の部分配列は、特に限定されるものではない。例えば、塩基配列が非常に類似した遺伝子ファミリー中のある特定の遺伝子のみを標的遺伝子としたい場合、上記遺伝子断片は、その標的遺伝子の部分配列として、３’−ＵＴＲなどの非翻訳領域を含むことすることが好ましい。この領域は、遺伝子ファミリー間であっても、配列の相同性が低いので、上記遺伝子ファミリーの中から、標的遺伝子のみの発現を特異的に抑制することができる。
【００４４】
なお、本発明の遺伝子発現抑制法のメカニズムが、ｄｓＲＮＡの形成を必要とするとすれば、上記遺伝子断片は、標的遺伝子の部分配列として、エクソン部分を含むことが好ましく、ＯＲＦ部分を含むことがより好ましい。標的遺伝子のエクソン部分を含む遺伝子断片から転写されたｄｓＲＮＡ断片は、標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡと相同であるため、ｄｓＲＮＡがｄｉｃｅｒによって分解されて生じるｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする。その結果、標的ｍＲＮＡが分解されるので、標的遺伝子の発現を抑制できる。
【００４５】
上記遺伝子断片は、標的遺伝子の部分配列からなり、かつ、宿主に導入することによって標的遺伝子の発現を抑制できれば、その塩基配列の長さ（数）は、特に限定されるものではない。一般に、ＲＮＡ干渉で用いられるｄｓＲＮＡの長さは、２００塩基程度のポリヌクレオチドである。したがって、上記遺伝子断片も、２００塩基程度のポリヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
また、ＲＮＡ干渉では、２００塩基程度のｄｓＲＮＡから分解された２０〜３０塩基程度の短鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、標的遺伝子の発現を抑制するとされている。
【００４７】
したがって、上記遺伝子断片は、標的遺伝子のうち少なくとも２１塩基の部分配列からなるものであればよい。これにより、効率的に標的遺伝子の発現を抑制できる。
【００４８】
なお、上記遺伝子断片は、標的遺伝子の発現を抑制する限り、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えた改変体であってもよい。ただし、本発明において、上記遺伝子断片と標的遺伝子との相同性は、非常に重要な要素となる。このため、上記遺伝子断片として上記改変体を用いた場合、標的遺伝子の発現抑制効率が低下することもある。
【００４９】
このような改変体は、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入する方法などを用いて、上記標的遺伝子の塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。
【００５０】
また、上記遺伝子断片は、標的遺伝子の発現抑制を容易に確認するために、標識化するなど、化学的に修飾されていてもよい。ただし、上記遺伝子断片を化学修飾する場合には、注意が必要となる。なぜなら、従来のＲＮＡｉの場合、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖側の３’末端への化学修飾は、遺伝子発現抑制効果に影響を及ぼさないのに対して、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖側の５’末端を化学修飾すると、遺伝子発現抑制効果を失う場合があるからである。なお、ｄｓＲＮＡのセンス鎖側の化学修飾は、５’、３’ともに、遺伝子発現抑制効果に影響を及ぼさない。
【００５１】
本発明に係る遺伝子断片を取得する方法は、特に限定されるものではなく、標的遺伝子の配列情報等に基づいて種々の方法により、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を取得することができる。
【００５２】
例えば、上記遺伝子断片は、標的遺伝子の部分配列をプライマーとしたＰＣＲ法（またはその改変法）によって、容易に合成できる。例えば、標的遺伝子の塩基配列のうち、５’側および３’側の配列の中からそれぞれプライマーを調製し、これらのプライマーを用いて、増幅すべき標的遺伝子の部分配列を含む遺伝子（例えば、標的遺伝子を有するゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）、またはその断片）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することによって、本発明に係る遺伝子断片を大量に取得できる。
【００５３】
言い換えると、上記遺伝子断片を取得するための出発原料は、標的遺伝子の部分配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡであれば、必ずしも２本鎖である必要はなく、１本鎖であってもよい。その理由は、この１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として、２本鎖ＤＮＡ（遺伝子断片）を増幅することができるためである。なお、鋳型がＲＮＡの場合、ＤＮＡに逆転写した後、ＰＣＲを行えばよい（いわゆるＲＴ−ＰＣＲ）。
【００５４】
なお、上記プライマーの５’末端に、プロモーター配列を連結することによって、５’末端にプロモーター配列を有する遺伝子断片を取得できる。後述する実施例のように、上記遺伝子断片がプロモーター配列を有する場合、上記遺伝子断片とともに、ＲＮＡポリメラーゼを、宿主に導入することによって、標的遺伝子の抑制効率の向上が可能である。ここで、「ＲＮＡポリメラーゼ」は、特に限定されるものではなく、後述する実施例で用いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをはじめ、種々のポリメラーゼを利用できる。
【００５５】
なお、上記遺伝子断片は、ＰＣＲによって化学的に合成して取得する以外にも、生物の細胞や組織から精製したゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡを酵素処理によって断片化しても取得できる。
【００５６】
上記遺伝子断片を、宿主細胞に導入する方法は、特に限定されるものではなく、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主細胞内に導入することができる。具体的には、例えば、ＲＮＡ干渉法に用いられる、リポソーム法、電子穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション、パーティクルガン、アグロバクテリウムなどによって行うことができる。
【００５７】
なお、例えば、宿主が線虫であれば、餌に上記遺伝子断片を混ぜたり、上記遺伝子断片を含む溶液に線虫を浸したりすることによっても、上記遺伝子断片を導入することができる。
【００５８】
上記遺伝子断片を導入することによって、標的遺伝子の発現抑制を確認する方法は、特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、化学発光（ルシフェラーゼ）に関与する遺伝子を抑制する場合には、上記遺伝子断片の導入前後のルシフェラーゼ活性を比較することによって、確認できる。その他にも、例えば、宿主細胞の形態、細胞体内物質量、細胞が分泌する物質量、細胞体内物質の動態、細胞間接着、細胞運動、あるいは細胞寿命等の細胞行動等によっても確認することが可能である。なお、標的遺伝子の機能が他細胞において既知の場合は、その機能に関連する形質について、行うことが好ましい。形質の変化を解析する方法としては、例えば、細胞の形質の変化を解析する場合には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法を用いることができる。また、確認する物質が、遺伝子の場合には、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ解析やＰＣＲ、あるいはＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ等によって確認することができ、タンパク質の場合には、抗体との反応性や酵素活性を測定する方法等が挙げられる。
【００５９】
以上のように、本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、または、その遺伝子断片とＲＮＡポリメラーゼとを、宿主細胞に導入するものである。
【００６０】
これに対し、従来のＲＮＡ干渉は、２本鎖ＲＮＡを導入またはベクターを導入し宿主細胞内で２本鎖ＲＮＡを発現させることによって、そのＲＮＡ配列に相同なｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子の発現を抑制するものである。すなわち、従来のＲＮＡ干渉は、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡに相同な、２本鎖ＲＮＡを、宿主細胞に導入またはベクターから発現させるものである。
【００６１】
したがって、本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を用いる点で、従来のＲＮＡ干渉法とは全く異なる。本発明の遺伝子発現抑制法は、ベクターの構築が不要であるので、従来のＲＮＡ干渉法に代わる極めて簡便な遺伝子発現抑制法である。
【００６２】
（２）本発明の遺伝子発現法の利用
▲１▼本発明の形質転換体
本発明の形質転換体は、上記遺伝子発現抑制法によって、標的遺伝子の発現が抑制された形質転換体である。すなわち、本発明の遺伝子発現抑制法は、本発明の形質転換体の作製方法ということもできる。本発明の形質転換体は、本発明にかかる遺伝子断片が導入されることによって、標的遺伝子の機能の少なくとも一部が抑制されている。
【００６３】
ここで、上記「形質転換体」とは、上記遺伝子断片が導入された細胞・組織・器官のみならず、動物・植物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどのヒトを含む哺乳動物が例示される。また、上記個体には、その子孫およびクローン、ならびに、その子孫およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００６４】
特に、ヒトを形質転換の対象とすれば、遺伝子の過剰発現や、遺伝子中の変異など、遺伝子の異常が原因となる各種疾患患者に対して、その遺伝子を標的遺伝子とした遺伝子断片を投与することによって、それらの疾患の治療が可能となる。より具体的には、上記遺伝子断片は、標的遺伝子（特定の遺伝子）のみの発現を抑制できるので、例えば、ウイルスの増殖阻害、持続感染しているウイルス治療、遺伝子の点変異で生じた疾患（例えば、ガン抑制遺伝子の異常）の治療、などの医療応用も可能である。
【００６５】
また、ヒト以外の動物を対象とすれば、標的遺伝子の発現が抑制された、実験動物・病態動物を作製できる。マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられ、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、標的遺伝子やそのホモログの更なる機能解析、これらの標的遺伝子が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
【００６６】
なお、後述する実施例では、シロイヌナズナの葉肉細胞のプロトプラストを宿主として、ポリエチレングリコール法によって上記遺伝子断片を導入した形質転換体を作製している。上記形質転換体に導入される遺伝子断片は、ターゲット配列としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子の部分配列である（配列番号１に示すホタルルシフェラーゼのＯＲＦにおける９３番目〜５９７番目（開始コドンの下流９３〜５９７番目の５０５ｂｐ））。そして、上記形質転換体は、上記遺伝子断片とともに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ホタルルシフェラーゼの全長遺伝子の発現ベクターが導入されており、コントロールと比較してルシフェラーゼの活性が有意に高効率に抑制されることが確認されている。この結果は、上記遺伝子断片が導入された上記形質転換体は、標的遺伝子の発現を高効率に抑制できることを示している。
【００６７】
なお、上記植物の範疇には、完全な植物のみならず、その一部、例えば、葉、種子、塊茎、挿木等も含まれるものとする。さらに、上記植物には、予め形質転換された遺伝子組み換え植物やその子孫を起源とする植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの増殖可能な植物材料；花、茎、実、葉、根などを含む植物の一部；懸濁培養細胞；等も含まれるものとする。
【００６８】
ゲノム内に上記遺伝子断片が導入された形質転換植物がいったん得られれば、その形質転換植物から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、形質転換植物やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に形質転換植物を量産することも可能である。
【００６９】
このようにして、野生型植物体と比較して、標的遺伝子の発現が顕著に抑制された形質転換植物体を作出することができる。
【００７０】
なお、上記形質転換体を作製する手法については、前述の遺伝子断片を導入する方法に示したように、従来公知の種々の形質転換法を用いることができる。例えば、リポソーム法、ポリエチレングリコール法、電子穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション、パーティクルガン、アグロバクテリウムを介した方法、弾道粒子加速法、およびプロトプラスト形質転換／再生法、などが利用できる。これらの形質転換方法は、宿主の種類に応じて適宜選択することが好ましい。
【００７１】
なお、上記形質転換体は、標的遺伝子の発現が抑制され、かつ、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を含有している。これに対し、従来のＲＮＡ干渉法によって作製される形質転換体には、上記遺伝子断片は存在しない。したがって、それぞれの形質転換体は、上記遺伝子断片の有無を確認することによって、区別できる。
【００７２】
▲２▼本発明の遺伝子発現抑制剤および遺伝子疾患治療薬
前述のように、本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の発現を抑制させた形質転換体の作製に利用できる。言い換えれば、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片は、標的遺伝子の発現を抑制するための遺伝子発現抑制剤である。この遺伝子発現抑制剤は、少なくとも上記遺伝子断片を含んでいればよい。
【００７３】
上記遺伝子発現抑制剤を、ヒト・マウス・ラットの細胞、組織、および個体に投与して、それらを形質転換させれば、標的遺伝子の関与する疾患の診断や治療法の開発に有効である。
【００７４】
また、上記遺伝子発現抑制剤を有効成分とする薬剤は、遺伝子疾患治療薬として利用できる。上記▲１▼で説明したように、遺伝子異常を生じた患者に対して、この遺伝子疾患治療薬を投与すれば、その遺伝子の発現を抑制できる。例えば、環境要因に対して高い感受性を示す遺伝子や、変異の生じたガン抑制遺伝子の発現を抑制することができる。それゆえ、アレルギー性疾患やガンなど、遺伝子異常による疾患の新規治療薬（医薬品）として、有効である。なお、医薬品として利用する場合の投与方法は、経口、静注など、特に限定されるものではない。
【００７５】
▲３▼本発明の遺伝子の機能解析法
本発明の遺伝子の機能解析法は、前述した本発明の遺伝子発現抑制法を利用して、標的遺伝子の機能を解析する方法である。
【００７６】
生体高分子であるタンパク質とＲＮＡとはともにＤＮＡの最終産物として生命活動における様々な機能を担っている。ゲノム解析によってヒトの遺伝子は、約４万種類存在すると言われているものの、機能が明らかとなっているのは、そのうちの半分にも満たず、多数の遺伝子が機能未知遺伝子である。
【００７７】
したがって、このような機能未知遺伝子の機能を明らかにすることは、生命活動の原理を理解するためにも、その遺伝子と疾患との関係を解明するためにも、重要である。
【００７８】
前述のように、上記遺伝子断片を細胞内に導入すれば、標的遺伝子の発現が抑制される。それゆえ、標的遺伝子として、塩基配列が既知であるが、その機能が未知の遺伝子を用いて遺伝子断片の作製を行い、それを適当な宿主細胞に導入すれば、その遺伝子の発現のみが人為的に抑制された形質転換体を作製することができる。これにより、機能未知遺伝子の機能の同定が可能となる。
【００７９】
すなわち、本発明の遺伝子の機能解析法は、特に、このような機能未知遺伝子の機能解析を行うために有効である。本発明の遺伝子の機能解析法は、本発明の遺伝子発現抑制法を用いているので、簡便、かつ短時間で行うことができる。このため、機能未知遺伝子を、迅速、かつ網羅的に解析するハイスループットスクリーニングにも適している。それゆえ、本発明の遺伝子の機能解析法は、生命を理解する上での効果的なアプローチとなる。
【００８０】
以下、塩基配列が既知である機能未知遺伝子の機能解析法を例に挙げて、本発明の遺伝子の機能解析法について説明する。
【００８１】
本発明の遺伝子の機能解析法は、機能未知遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片を宿主に導入する工程（遺伝子断片導入工程）と、当該遺伝子断片の導入前後の宿主の機能を比較する工程（比較工程）とを含んでいる。
【００８２】
上記遺伝子断片導入工程は、前述と同様にして、宿主に、遺伝子断片を導入する工程である。これにより、宿主は、機能未知遺伝子の機能が抑制される。遺伝子断片導入工程では、機能未知遺伝子の機能をできる限り抑制することが好ましく、その機能を完全に欠失させることがより好ましい。例えば、上記遺伝子断片としては、これにより、後続する比較工程における、機能未知遺伝子の機能の推定が容易となる。
【００８３】
続いて、上記比較工程は、上記遺伝子断片を、宿主に導入する前後の標的遺伝子の発現抑制の程度を比較する工程である。すなわち、比較工程は、機能未知遺伝子の機能を同定する工程である。
【００８４】
上記遺伝子断片導入工程にて、上記遺伝子断片が導入されると、宿主における機能未知遺伝子の機能は抑制される。したがって、上記遺伝子断片導入工程後、前述の本発明の遺伝発現抑制法における、標的遺伝子の発現抑制を確認する方法と同様にして、分子生物学的または生化学的手法により機能未知遺伝子の発現抑制を確認することによって、機能未知遺伝子の機能を同定することができる。すなわち、機能未知遺伝子の遺伝子断片が導入された宿主にのみ現れる形質は、機能未知遺伝子（標的遺伝子）の発現抑制に付随することから、標的遺伝子の機能を同定することができる。
【００８５】
本発明の遺伝子解析法を、塩基配列のみが決定された機能未知遺伝子のライブラリー、例えば、ゲノムＤＮＡに含まれるＯＲＦを持つエクソン断片からなるライブラリー、特定組織由来のｃＤＮＡライブラリー、またはそれらの混合物に適用することによって、そのような機能未知遺伝子の全てを網羅的に解析するハイスループットスクリーニングを行うことができる。これにより、多数の機能未知遺伝子から、目的とする機能を有する遺伝子を選抜することができる。さらに、機能未知遺伝子の機能を、同定することもできる。
【００８６】
このようにして、機能を同定した機能未知遺伝子は、新規遺伝子であり、前述の遺伝子発現抑制剤や遺伝子疾患治療薬として、利用できる可能性がある。本発明には、本発明の機能解析法によって、新たに機能が明らかとなった、遺伝子も含まれる。機能が明らかとなった遺伝子は、その遺伝子の関与する疾病の診断や治療に有効である。
【００８７】
▲４▼本発明のキット
本発明のキットは、上記（１）あるいは（２）の▲１▼または▲３▼に記載した方法を行うためのキットであり、少なくとも、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片、上記遺伝子発現抑制剤、または上記遺伝子疾患治療薬のいずれか、またはこれらの混合物を含んでいればよい。このようなキットは、遺伝子発現抑制法、遺伝子疾患の診断、遺伝子疾患治療薬の治療効果の予測などを簡便に行うために利用することができる。それゆえ、キット化することによって、本発明の汎用性が向上する。
【００８８】
なお、上記キットには、さらに、培養細胞、培地、酵素、プライマー、バッファー等の試薬類、形質転換のための試薬類、選択薬剤、及び細胞から導入した核酸を回収し塩基配列を決定するためのプライマーや試薬等を含んでいてもよい。
【００８９】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９０】
【実施例】
以下の実施例は、２本鎖ＤＮＡ断片を用いて、標的遺伝子の発現を効果的に抑制する方法の一例として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、または、ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）遺伝子の部分配列をＰＣＲにより増幅し、ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（レポーター）、ウミシイタケルシフェラーゼ（内部標準）、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、宿主であるシロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストに、ＰＥＧ法により導入し、Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙにより、遺伝子発現抑制効果を観測したものである。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
１．植物材料
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）（ハイトカルチャ株式会社から購入）を２２℃、湿度６０％の人工気象器（明期１２時間，暗期１２時間）で栽培したものを用いた。
【００９２】
２．ＤＮＡ断片の調製
約５００  ｂｐの標的配列を含むＤＮＡ断片は，５’末端にＴ７プロモーターを付加したプライマーを用いたＰＣＲにより調製した．使用したプライマーを下記に示す（下線部：Ｔ７プロモーター）．
ターゲット：ホタルルシフェラーゼ（配列番号１に示すホタルルシフェラーゼのＯＲＦの塩基配列中の、開始コドンの下流９３〜５９７：  ５０５  ｂｐ）
フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号３）
リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧ−３’（配列番号４）
ターゲット：ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）（配列番号２に示すｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のＯＲＦの塩基配列中の、開始コドンの下流１１３〜６１４：  ５０２  ｂｐ）
フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣ−３’（配列番号５）
リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴ−３’（配列番号６）
配列番号３〜６に示すプライマー配列において、５’末端のＴ（チミンから）２０番目のＧ（グアニン）までが、Ｔ７プロモーター配列に相当する。
【００９３】
ＰＣＲの条件は、９４°Ｃで１  ｍｉｎ，５２°Ｃで１  ｍｉｎ，７２°Ｃで１  ｍｉｎを１サイクルとして、３０サイクル行った。次に、１．５％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物の長さを確認したのち、フェノールとクロロホルムを用いて精製した。
【００９４】
３．ｄｓＲＮＡの調製
上記ＤＮＡ断片を鋳型として，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりｄｓＲＮＡを調製した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎは、ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｔ７  （Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＴ７  ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  を用いてマニュアルの指示に従って行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによって得られたＲＮＡはフェノールとクロロホルムを用いて精製したのち、１．５％アガロースゲル電気泳動で長さを確認した。
【００９５】
４．葉肉細胞プロトプラストの調製
葉肉細胞プロトプラストの調製は，Ｓｈｅｅｎが開発した方法［Ｓｈｅｅｎ，  ２００２  ＃５１１］に従って行った。すなわち、発芽３−４週間後のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのロゼット葉（１−２  ｃｍ：  １０〜２０枚）を０．５〜１  ｍｍぐらいの幅にメスの刃で切り刻み、１０  ｍｌの酵素液（１．５％  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０，  ０．４％  Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ１０，  ０．４  Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ，  ２０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １０  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ０．１％  ＢＳＡ，  ２０  ｍＭ  ＭＥＳ，  ｐＨ  ５．７）を加えた。デシケーター内で１５分間減圧脱気を行ったのち、２３°Ｃ、  ５０  ｒｐｍで９０分間ゆるやかに振とうした。顕微鏡でプロトプラストが出来ていることを確認したのち、ナイロンメッシュでプロトプラスト溶液をろ過し、ろ液を５０  ｍｌの遠心チューブに回収した。１００×ｇ、室温で３  分間遠心し、上清を除いた。氷冷Ｗ５溶液（１５４  ｍＭ  ＮａＣｌ，  １２５  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  ５  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２  ｍＭ  ＭＥＳ，  ｐＨ  ５．７）を１０  ｍｌ加えて緩やかに混合したのち、再度上記条件で遠心し上清を除いた。適量の氷冷Ｗ５溶液を加えて緩やかに混合したのち、血球計算版で細胞密度を算出し、２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように氷冷Ｗ５溶液で希釈した．このプロトプラスト溶液を氷中で３０分間インキュベーションしたのち，１００×ｇ，室温で３  分間遠心した．上清を除いたのち，細胞密度が２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように氷冷ＭＭｇ溶液（０．４  Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ，  １５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ４  ｍＭ  ＭＥＳ，  ｐＨ  ５．７）に懸濁した。
【００９６】
５．ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を用いた葉肉細胞プロトプラストへの遺伝子導入
ＰＥＧを用いた葉肉細胞プロトプラストへの遺伝子の導入は、Ｓｈｅｅｎが開発した方法［Ｓｈｅｅｎ，  ２００２  ＃５１１］に従って行った。まず、０．５  μｇのホタルルシフェラーゼ発現ベクター（レポーター）（配列番号７）および０．５μｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（内部標準）（配列番号８）を１．５  ｍｌの微量遠心チューブに加えた。続いて５μｇのｄｓＲＮＡ，または５μｇのＤＮＡ断片を加えた．ＤＮＡ断片を加えたサンプルは２つ用意し、片方にはさらに１００ユニットのＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  を加えた。これらのチューブにプロトプラスト溶液を２００  μＬづつ加え、さらにＰＥＧ溶液（４０％  ＰＥＧ４０００，  ０．２  Ｍ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ，  １００  ｍＭ  ＣａＣｌ２）を２２０μＬ加え、緩やかなピペッティングでよく混合した。２３°Ｃで３０分間インキュベーションしたのち、Ｗ５溶液を８００  μＬ加え、ゆるやかに転倒混合した。１００×ｇ、室温で３分間遠心したのち、上清を除いた。１００  μＬのＷ５溶液を加えて緩やかなピペッティングでよく混合したのち，あらかじめ１  ｍｌのＷ５溶液を分注しておいた２４穴プレートに移し、緩やかに混合した。アルミホイルで包み、２２°Ｃで１２〜１５時間インキュベーションした。
【００９７】
なお、配列番号７に示すホタルルシフェラーゼ発現ベクター配列において、２４３３〜２８７８番目がＣａＭＶプロモーター、２９１４〜４５６６番目がホタルルシフェラーゼ、４６５６〜４９３０番目がＮＯＳターミネーター、２４０１〜２４０６番目がＨｉｎｄＩＩＩ、２４２７〜２４３２がＢａｍＨ  Ｉ、２８７９〜２８８４番目がＳａｌ  Ｉ、４６３７〜４６４４番目がＮｏｔ  Ｉ、４９３１〜４９３６番目がＥｃｏＲ  Ｉの配列に相当する。
【００９８】
また、配列番号８に示すウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターにおいて、２４３３〜２８７８番目がＣａＭＶプロモーター、２８９６〜３８３１番目がウミシイタケルシフェラーゼ、３８５８〜４１３２番目がＮＯＳターミネーター、２４０１〜２４０６番目がＨｉｎｄＩＩＩ、２４２７〜２４３２がＢａｍＨ  Ｉ、２８７９〜２８８４番目がＳａｌ  Ｉ、３８３９〜３８４６番目がＮｏｔ  Ｉ、４１３３〜４１３８番目がＥｃｏＲ  Ｉの配列に相当する。
【００９９】
６．Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ
プロトプラスト溶液を１．５  ｍｌ微量遠心チューブに移し、１００×ｇ、室温で３分間遠心した。上清を除いたのち、１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  を１００  ｍｌ加えた。緩やかなボルテックスにより細胞を溶解させ、そのまま室温で５分間放置した。この細胞溶解液１０  ｍｌをルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）にセットし、ホタルおよびウミシイタケの各ルシフェラーゼ活性を測定した。各アッセイにおけるプラスミドの導入効率は、ホタルルシフェラーゼの活性値をウミシイタケルシフェラーゼの活性値で割ることで標準化した。
【０１００】
７．実験結果
まず、本アッセイ系でＲＮＡｉが観測できることを確認するために、約５００  ｂｐのｄｓＲＮＡを導入した。その結果、８０％以上の発現抑制効果が見られた（図２）。この結果から、本アッセイ系はＲＮＡｉの観測に適用可能であることが示された。
【０１０１】
次に、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片とＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを同時に導入したところ、約８０％の発現抑制効果が見られた（図３）。
【０１０２】
一方、ＤＮＡ断片のみ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ無し）の場合においても約７０％の抑制効果が見られた（図４）。これらの結果から、  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのサイレンシングへの寄与率は、約１０％と、当初の期待よりもかなり小さいことが判明したが、一方でＤＮＡ断片のみで標的遺伝子の発現を大幅に（約７０％）抑制できることが示された。
【０１０３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の遺伝子発現抑制法は、標的遺伝子の部分配列からなる遺伝子断片のみ、または、その遺伝子断片とＲＮＡポリメラーゼとを、宿主細胞に導入することによって、従来のＲＮＡ干渉法に匹敵する遺伝子発現抑制効果を示すことを特徴とするものである。
【０１０４】
本方法は、操作の簡便さと高い抑制効率から、従来の方法に代わる逆遺伝学の手法として、例えば、機能未知遺伝子のハイスループットスクリーニングなどに応用可能であり、実用上極めて有用な方法である。
【０１０５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子発現抑制法のメカニズムの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の実施例において、ｄｓＲＮＡをプロトプラストに導入した場合の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例において、ＤＮＡ断片とＴ７ＲＮＡポリメラーゼとを同時にプロトプラストに導入した場合の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例において、ＤＮＡ断片のみをプロトプラストに導入した場合のルシフェラーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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