(57)【要約】【課題】本発明は水溶液中試料物質の結合を制御および観測する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の装置は、強磁場を試料に印加する装置とテラヘルツ領域の電磁波を試料に照射する発振部を有する。また試料に核磁気共鳴を生じさせ検出することが可能なプローブおよび観測装置を配置させる。このテラヘルツ発振部に電気信号を送り試料の持つ不対電子スピンの共鳴周波数を持った電磁波を試料に照射し、核磁気共鳴の電気的性質を検出して、試料に生じる結合変化を観測する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁場を試料に印加する工程と、パルス状若しくは連続波状の電磁波を前記試料に照射する工程、試料の核磁気共鳴を検出する工程からなり、前記試料での特定部分の結合の変化を前記試料の核磁気共鳴信号の変化より観測することを特徴とする複合分光方法。
【請求項２】
前記照射する工程が、試料内の蛋白質が含む残基側鎖に存在する不対スピンの磁場中での共鳴周波数に対応するパルス状若しくは連続波状の電磁波を照射することを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項３】
前記照射する工程が、核磁気共鳴計測を検出する核スピン励起工程を実施する前、実施中、あるいは実施後のいずれかに行うことを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項４】
使用者があらかじめ設定した時間から、あらかじめ設定した時間間隔だけのパルス状若しくは連続波状の電磁波を単一もしくは複数回照射することを特徴とする請求項３記載の複合分光方法。
【請求項５】
前記パルス状若しくは連続波状の電磁波がテラヘルツ領域の周波数であることを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項６】
試料の核磁気共鳴信号を検出する工程において、試料に対してパルス状若しくは連続波状の電磁波が照射されることを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項７】
前記試料としては、蛋白質、蛋白質−リガンド複合体、蛋白質−蛋白質複合体のいずれかを対象として、核磁気共鳴検出工程により得られたスペクトルの比較より、これらの試料における特定の結合変化を観測することを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項８】
前記試料での特定部分の結合変化を観測する工程が、前記試料の核磁気共鳴スペクトル変化より、使用者がパルス状若しくは連続波状の電磁波の照射条件を調整することを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項９】
試料内に存在する蛋白質に含まれるアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基またはこれ以外の天然アミノ酸残基いずれか１つ、もしくは任意の組み合わせのアミノ酸残基が水素、炭素、窒素のいずれか１つもしくは任意の組み合わせにおいて同位体標識されていることを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項１０】
パルス状もしくは連続波状の電磁波を試料に照射する工程において、該電磁波の周波数が前もって定められた周波数、もしくは前もって定められた周波数範囲に渡り、連続的もしくは間欠的に変調されることを特徴とする請求項１記載の複合分光方法。
【請求項１１】
磁場を試料に印加する手段と、パルス状若しくは連続波状の電磁波を前記試料に照射する手段、前記試料の核磁気共鳴信号を検出する観測、比較する手段からなり、前記試料での特定部分の結合の変化を該核磁気共鳴信号の観測、比較手段により観測することを特徴とする複合分光装置。
【請求項１２】
前記パルス状若しくは連続波状の電磁波がテラヘルツ領域の周波数であることを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項１３】
前記電磁波照射手段により照射される電磁波は試料内に存在する蛋白質の残基側鎖に存在する不対スピンの印加された磁場に対応する共鳴周波数を持つパルス状若しくは連続波状の電磁波であることを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項１４】
前記電磁波照射手段により照射される電磁波は試料に対して連続的に電磁波を照射する機能を有し、該電磁波による核磁気共鳴計測手段は電磁波の照射時に動作することを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項１５】
前記電磁波照射手段が、核磁気共鳴計測を実施する前、実施中、あるいは実施後に動作するものであることを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項１６】
使用者があらかじめ設定した時間から、あらかじめ設定した時間間隔にわたり、パルス状若しくは連続波状の前記電磁波を単一もしくは複数回照射するスキームを設定、実行できる機能を有する電磁波照射装置を備えることを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置電磁波照射装置。
【請求項１７】
前記電磁波照射手段が、その周波数が前もって設定された値、若しくは前もって設定された周波数範囲に渡り連続的あるいは間欠的に変調されたパルス状もしくは連続波状の電磁波を照射することを特徴とする請求項１６記載の複合分光装置。
【請求項１８】
該核磁気共鳴信号を検出する装置において、電磁波照射装置と試料の間に位置する部位が該電磁波を透過することを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項１９】
試料の特定部分の結合変化を観測する装置が、パルス状若しくは連続波状の電磁波の照射条件が異なる核磁気共鳴観測データを複数記録する機能を有し、各観測データに対する加算、差分などのデータ操作を行う機能を有することを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【請求項２０】
磁場印加装置が、電磁波発振部から試料までの間に電磁波導波路を設置可能な開放空間を持てる構造を有することを特徴とする請求項１１記載の複合分光装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子の機能および結合の強さの判定に関し、特に蛋白質−リガンド複合体、蛋白質−蛋白質複合体の相互作用を判定する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの応用において、試料中物質同士の相互作用検出が望まれている。例えば、蛋白質とリガンドあるいは蛋白質と糖鎖や蛋白質同士の相互作用の検出は疾病の診断、生物工学研究、農業、医薬品の開発に極めて有効である。
【０００３】
分子の相互作用を検出するために多くの方法が開発されてきた。蛋白質の相互作用検出においては、ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲやＡｆｆｉｎｉｔｙ−ＮＭＲが用いられている。ＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲは１５Ｎ同位体標識を行った標的蛋白質の化学シフトの変化からリガンドとの相互作用を検出し、より相互作用の強いリガンドの分子設計を進める方法である（例えば、特許文献１：特表２００２−５１０３８４号公報、非特許文献１：山口芳樹、嶋田一夫、“核磁気共鳴を用いた創薬研究の新しいアプローチ”，蛋白質  核酸  酵素，４５（２０００）８９５．。Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ＮＭＲは低分子のリガンドが標的蛋白質に結合した際の並進運動の変化から生じるシグナルの緩和時間の変動を利用した検出方法である。
【０００４】
核磁気共鳴単独による相互作用計測には幾つかの欠点が伴う。第一にＳＡＲ−ｂｙ−ＮＭＲでは標識蛋白質の立体構造を解析する必要があるので解析可能な蛋白質分子量に上限があること（４０ＫＤ以下）。また、大量の同位体標識蛋白質が必要なため、標的蛋白質の溶解性などの制約があり測定可能な蛋白質の種類が制限されること。さらに大量の同位体標識試料は非常に高価であることが挙げられる。
【０００５】
第二にＡｆｆｉｎｉｔｙ−ＮＭＲでは大量の同位体標識蛋白質は不要なため、測定が比較的安価であるが、リガンドとの結合の強さしか検出できないので、活性部位や結合部位の位置や標的蛋白質の構造は分からない。このため、より優れたリガンドを開発するための指針となる構造情報を得ることは困難である。
【０００６】
さらに、蛋白質―蛋白質（糖鎖）複合体や巨大な蛋白質に対しては特定のアミノ酸を同位体標識した培地を利用して蛋白質合成を行う選択的同位体標識と核磁気共鳴を組み合わせることで計測が行われている（非特許文献２：J. Wigelt, M. Wikstrom, J. Schultz, M. J. P. van Dongen, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 5 (2002) 623.参照）。この選択的同位体標識を施した試料では特定アミノ酸残基上の原子からの共鳴シグナルだけを観測することで、分子量の大きい蛋白質の残基の帰属を可能とする。
【０００７】
しかし、選択的同位体標識を行うためには、特定アミノ酸のみを同位体標識した培地を用意し、高度な技術を用いた蛋白質合成をおこなうので、試料作成者の経験や技術の違いが大きく影響し、試料作成のコストが高くなってしまう。
【０００８】
また、従来の核磁気共鳴を利用した分子間の結合を検出する方法では、標的分子の結合する前と結合後の計測結果を比較する方法がほとんどであり、相互作用の過程の計測は極めて困難である。
【０００９】
ところで電子スピンの状態を変化させて共鳴信号を検出する実験手段としてはＥＳＲが広く知られている。このＥＳＲは数１００ＭＨｚから数１０ＧＨｚまでの広い周波数帯を利用している。この帯域のＥＳＲで不対電子に与えるエネルギーは化学結合や水素結合、ファンデルワールス力に比べて著しく小さく、長時間パルスを試料に与えてもその性質は変化しない。この点でＥＳＲは非破壊な測定法であると言える。
【００１０】
これに対して、紫外ラマン分光といった高エネルギーのパルスレーザーを利用して試料の応答を観測する観測では、パルスレーザーの出力が強すぎると試料蛋白質の変性を引き起こす場合がある。このように赤外よりも高周波のレーザーを照射することで蛋白質の構造変化を生じさせることが可能であるが、照射エネルギーが蛋白質を構成する原子同士の結合エネルギーや原子団の回転エネルギーに近いために、特定の部分だけに選択的にエネルギーを供給することは出来ない。しかもラマン分光等の入射光に対する試料全体の応答を解析する実験方法では特定部分だけの選択的な観測も困難である。
【００１１】
このように、蛋白質の機能および構造解析はより高分子量の蛋白質を対象にしたり、リガンドや蛋白質との複合体を解析するニーズが高まってきている中、蛋白質中の特定部分のみを変化させたり、特定部分のみを観測する技術が未だ確立されていない。
【００１２】
【特許文献１】特表２００２−５１０３８４号公報
【００１３】
【非特許文献１】山口芳樹、嶋田一夫、“核磁気共鳴を用いた創薬研究の新しいアプローチ”，蛋白質  核酸  酵素，４５（２０００）８９５．
【非特許文献２】J. Wigelt, M. Wikstrom, J. Schultz, M. J. P. van Dongen, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 5 (2002) 623.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、標的蛋白質とリガンド間の結合や蛋白質同士の相互作用を検出するために、混合試料内の標的蛋白質での結合に寄与する特定残基へ選択的にエネルギーを供給し状態を制御して蛋白質の結合部分のみを変化させる技術と、結合の有無や相互作用の過程を計測する技術が重要である。
【００１５】
本発明は、混合試料内の蛋白質での相互作用の制御、検出、さらには相互作用の過程の計測を可能とする方法および装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明においては、試料に均一な静磁場を与える装置、テラヘルツ領域の電磁波を試料に照射する発振部および核磁気共鳴の信号を検出することが可能なプローブおよび観測装置を配置する。
【００１７】
図１、図２および図３は、本発明を実施するに好適な核磁気共鳴装置（以下、ＮＭＲと略すこともある）の各構成要素の配置を模式的に示す図である。図１、図２は二つに分割された静磁場発生用磁石６，６の間に試料溶液４および核磁気共鳴プローブコイル５を配置する例であり、図３は電磁石６のボア７の中に試料溶液４を配置する例である。それぞれの図において、１はテラヘルツ電磁波の発振部、２はテラヘルツ電磁波検出部、３は試料保持管、４は試料溶液、７は磁石6のボア、８は核磁気共鳴プローブコイル５の引き出し線、９は試料保持管３の導入用のガイドである。テラヘルツ電磁波の発振部１およびテラヘルツ電磁波検出部２も引き出し線があるが表示は省略した。核磁気共鳴プローブコイル５は、図１および図２では、ソレノイド型のコイルとし、図３では、鞍型のコイルとした。また、図１、図３では、テラヘルツ電磁波の発振部１およびテラヘルツ電磁波検出部２を備える構成としたが、図２ではテラヘルツ電磁波の発振部１のみとした。
【００１８】
核磁気共鳴装置ではテラヘルツ発振部１に電気信号を送り電磁波を試料溶液４に照射し、試料の核磁気共鳴信号を核磁気共鳴プローブコイル５で検出して、標的蛋白質での結合変化を観測する。核磁気共鳴プローブコイル５を核磁気共鳴用電磁波の送信コイルとしても良い。テラヘルツ発振部１から照射される電磁波は、核磁気共鳴プローブコイル５と試料保持管３を透過して試料溶液４に到達する。
【００１９】
テラヘルツ電磁波により試料に生じた核磁気共鳴信号の変化を観測する為にＮＭＲのプローブコイル５の最大感度領域とテラヘルツ電磁波が到達する領域をほぼ同じ領域にする。このために、図１−図３では図示しなかったが、核磁気共鳴プローブコイル５、試料保持管３およびガイド９を保持するための機構部の内、核磁気共鳴プローブコイル５の周辺部にはガードのための保護構造が設けられる。この保護構造の上記領域に対応する部分にテラヘルツ電磁波透過窓を設ける。
【００２０】
図４Ａおよび図４Ｂは保護構造の一例を示す図であり、図４Ａは断面図を、図４Ｂは斜視図の形で示す図である。また、図４Ａおよび図４Ｂはプローブコイル５が常温で使用されるときの例である。１０は保護構造のシールド部、１３，１３’はテラヘルツ電磁波入射、出射窓、５はプローブコイル、１２，１２’は試料保持管３の導入用のガイド９の接続孔である。ここで、プローブコイル５は直列または並列または直並列に接続され、引き出し線８（図１−図３）で外部に引き出されるが、図示は省略した。また、プローブコイル５は図に示すようなソレノイド型でも良いし、図３に示すような鞍型でも良い。試料保持管３の導入用のガイド９は接続孔１２，１２’に結合されて、試料保持管３はガイド９および接続孔１２を介してプローブコイル５の中に導入される。シールド部１０にはテラヘルツ電磁波入射、出射窓１３，１３’が設けられる。図１，３のように、テラヘルツ電磁波の発振部１、テラヘルツ電磁波検出部２が設けられるときは、入射、出射窓１３，１３’が設けられるが、図２のように、テラヘルツ電磁波の発振部１のみが設けられるときは入射窓１３のみでよいことは言うまでもない。
【００２１】
プローブコイル５が常温で使用されるときはプローブを断熱の為に密閉する必要が無いので、図４Ａ，Ｂに示すように、シールド部１０の一部分にテラヘルツ電磁波透過用の窓１３，１３’を開けておくだけで良い。図４Ａ，Ｂで示した例はテラヘルツ電磁波の入射窓１３の反対側に透過したテラヘルツ電磁波を観測することが可能な窓１３’を設置し、ＮＭＲ計測とテラヘルツ分光を同時に行えるような構成である。特別な条件がない限り入射窓１３，１３’は真空ないし空気のみであることが望ましい。
【００２２】
プローブコイル５が極低温で動作させるものであるときは、図示は省略するが、シールド部１０内は極低温になるような構造とされる。したがって、テラヘルツ電磁波透過用の窓１３，１３’を閉じた構造として断熱を行うとともに、テラヘルツ電磁波を透過できるようにする必要がある。この場合には、図４Ａ、Ｂに示した開口１３，１３’をシリコン結晶の薄板で塞ぐのが良い。例えば、American Institute of Physics Handbook, 3rd Edition ed. D. E. Gray (McGraw-Hill, 1972)などの文献に記載されたデータからも分かるように、シリコン結晶（シリコン薄板）がテラヘルツ領域の電磁波を透過させるのに最適である。
【００２３】
テラヘルツ領域は電磁波と光の境界領域であり、試料のフォノンの共鳴・吸収が多く存在する周波数帯である。試料が均一な静磁場下に置かれると試料が不対スピンを持つ場合ではゼーマン効果により、不対スピンの向きに対応したエネルギー準位を持つ。この準位差に共鳴する周波数を持った電磁波を入射すると不対スピンの準位間での遷移が生じる。この周波数がテラヘルツ領域に達する高磁場下では、共鳴周波数近傍に存在するフォノンモードへとエネルギーが散逸していく。散逸するエネルギーは格子系のプロセスを経て不対スピン近傍残基での熱エネルギーとなり、試料の特定部分のみにエネルギーを供給する。
【００２４】
この供給されたエネルギーが十分であれば、特定残基部分での構造変化が生じる。この変化は断熱的な電子系の変化とは異なり、一定のエネルギーの供給が続けば準定常的な構造変化となる。したがって、連続的なテラヘルツ電磁波の照射を行うことで、ＮＭＲ計測でこの構造変化から派生する化学シフト変動等を観測可能となる。
【００２５】
更に、リガンドとの結合あるいは解離により特定残基での電子状態が変化し、不対スピンが消滅（あるいは生成）すると特定残基へのエネルギー供給が無くなる（あるいは生じる）為に、ＮＭＲ計測による化学シフト等の信号変化の消失（あるいは出現）により相互作用の検出や観測が可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、カルボニル基等の結合活性の高い基を側鎖に持つ特定アミノ残基での相互作用や結合を選択的に変化させ、分子量の大きい蛋白質でのリガントとの結合や、蛋白質同士の相互作用を核磁気共鳴シグナルで観測することを可能とする。さらに波長可変なテラヘルツ発振機を用いるため、蛋白質全体の共鳴振動や特定構造での共鳴を与えて、その分子構造的、化学的変化を核磁気共鳴で観測することを可能とする。さらに照射するテラヘルツ電磁波のエネルギーは周波数が１ＴＨｚの場合０．４ｋＪ／ｍｏｌと低く、ラマン分光等の赤外線以上の光を用いる実験では考慮する必要がある蛋白質の変性の問題を抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、図１−図４Ａ、図４Ｂで説明した本発明の好ましい構成例の下で、標的蛋白質とリガンド間の結合や蛋白質同士の相互作用を検出するために、混合試料内の標的蛋白質での結合に寄与する特定残基へ選択的にエネルギーを供給し状態を制御して蛋白質の結合部分のみを変化させ、結合の有無や相互作用の過程を計測する具体的な手法について説明する。
【００２８】
（実施例１）
まず、テラヘルツ電磁波照射とＮＭＲ計測の複合計測による蛋白質解析について詳細に説明する。
【００２９】
試料溶液４に含まれる蛋白質は約２０種類のアミノ酸残基から構成されており、これがペプチド結合によって結ばれている。この残基の中に側鎖と呼ばれるペプチド結合に寄与しない部分にカルボニル基を有するものが存在する。この側鎖カルボニル基は水溶液条件によってはプロトンが電離し、酸素原子近傍に１つの不対スピンを持った２重項状態を持つ。図５にはプロトンが電離したカルボニル基の構造式を示す。このとき矢印に示すような、試料全体を強い一様な静磁場下に置くと側鎖カルボニル基の不対電子スピンは磁場に対して平行になるように揃う。
【００３０】
このようにカルボニル基に発生した不対スピンを強い静磁場下に置くと磁場の平行方向に向いた状態と反並行に向いた状態ではエネルギーが異なり、スピン状態が分裂して縮退が解ける。この状態間のエネルギー差に等しいエネルギーを不対スピンに供給すると、２つの状態の間で遷移が起こり、スピン反転が起こる。スピンが反転した状態はエネルギーが高い。このスピンが反転した状態はそのまま保持されず、電子系と格子系の相互作用を介してエネルギーが緩和され、元の平行スピン状態へと戻っていく。分子振動や分子構造変化がこの電子スピン状態に大きな影響を与えるので、この状態緩和は試料の温度の影響を受ける。
【００３１】
蛋白質での特定部位からのエネルギー移動に関してはピコ秒パルスレーザー光を用いたアンチストークスラマン線の時間変化の観測により確かめられている。Y. Mizutani & T. Kitagawa, Science 278 (1997) 443 によるとミオグロビンから一酸化炭素を光解離させると、一瞬ヘムが高温となり、それが時定数１．９ピコ秒で冷えていく。それに伴い蛋白質の構造変化が〜１００ピコ秒で生じることも明らかになっている。
【００３２】
このように蛋白質の特定部分に与えたエネルギーは近傍の原子へと移動していき、それに伴って構造変化が生じる。特定の電子スピンに与えたエネルギーが結合の活性化エネルギー以上の場合にはリガンド−蛋白質、もしくは蛋白質−蛋白質の結合を変化させることが可能となる。
【００３３】
蛋白質とリガンドもしくは蛋白質同士の結合に目を向けると、結合に関与する領域は側鎖が酸性もしくは塩基性を呈する残基であることが多い。具体例としては、ＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ蛋白質が挙げられる。この蛋白質はＨＩＶ−１ウイルスの前駆体蛋白質からプロテアーゼ自身、逆転写酵素、インテクラーゼを生成する機能を持つ。このプロテアーゼ活性を示す部分はこの蛋白質の２５番目に位置するアスパラギン酸であることが知られており、このアスパラギン酸は側鎖にカルボニル基を有し、このカルボニル基は不対スピンを持つと共に、阻害剤などの分子と水素結合を介して結合することが知られている。
【００３４】
近年の核磁気共鳴装置の静磁場は分解能を上げるために高磁場になってきており、プロトン核の共鳴周波数１ＧＨｚ程度に対応する磁場は約２１Ｔ（テスラ）にもなる。このときに不対電子スピンを反転させるのに必要なパルス電磁波の共鳴周波数はゼーマン分裂のエネルギー準位を示す式（１）で求まる。
【００３５】
【数１】
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【００３６】
ここで、ｇは電子のｇ値、βは微細構造定数（９．２７４×１０−２４ＪＴ−１）、Ｈは外部磁場強度を表す。例えば、外部磁場強度２１Ｔに対応する不対スピンの共鳴周波数は約５００ＧＨｚとなり、テラヘルツ領域に近づく。
【００３７】
この５００ＧＨｚは１．０９ｃａｌ／ｍｏｌに相当する。この電磁波をカルボニル基に生じた不対スピンに照射し、不対スピンで共鳴が生じ、電磁波のエネルギーが不対スピン近傍に緩和されるとすると、残基部分に２０Ｋ程度のエネルギーを与えることを示しており、水溶液中のファンデルワールス力の１００分の１程度に相当する。このように１回の照射で与えるエネルギーはファンデルワールス力の１００分の１程度と微弱なため、従来から構造・機能解析に幅広く用いられているラマン分光など、赤外光以下の波長の電磁波を利用する分光技術で危惧される蛋白質の変性といった問題が生じる可能性が極めて低い。
【００３８】
また、静磁場下で不対電子スピンの共鳴周波数に対応したテラヘルツ領域電磁波を様々なパルスの組み合わせで標的蛋白質に照射すると、不対電子スピン部分の磁気共鳴による特異的な吸収が生じ、不対電子スピンを持った特定残基にエネルギーを供給することが可能である。そのエネルギーは数ピコ秒で緩和され、蛋白質を変性させること無く特定の残基部分での結合・解離反応を促進させることができる。
【００３９】
（実施例２）
更に電磁波照射と核磁気共鳴計測を組み合わせることで、様々な試料の状態変化を観測することが可能である。この状態変化は蛋白質全体で生じる変化だけでなく、特定残基を中心とした選択的な変化も含まれる。以下に電磁波照射により生じた蛋白質構造の変化に関する観測について詳細に示す。
【００４０】
図６はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸を活性中心に持つ蛋白質１０１に対してアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のみの同位体標識１０２を施した標的蛋白質試料１０３を示す。
【００４１】
次に、観測したい核スピン間の繋がりを決定する。たとえばＨＮ原子とＮ原子の化学シフトの変動を比較する場合には１Ｈ−１５Ｎ−ＨＭＱＣスペクトルなどを用いる。水素原子間の相互作用の強さ（すなわち原子間距離）を調べたい場合にはＮＯＥＳＹスペクトルを用いる。
【００４２】
図７はテラヘルツ電磁波照射による蛋白質の構造変化を観測する手順を示す。
【００４３】
（１）まず、蛋白質試料１０３が含まれる試料溶液４を準備する。
【００４４】
（２）次に、試料溶液４に対してテラヘルツ電磁波照射を全く行わない状態でＮＭＲ計測を実施しＮＭＲスペクトルを取得する（計測１）。計測１では、蛋白質試料１０３が含まれる試料溶液４を収納した試料保持管３を核磁気共鳴プローブコイル５内に挿入して通常のＮＭＲの計測手順に従って、ＮＭＲ計測を実施する。このときの計測結果を処理（データ処理１）して横軸に化学シフト（Ｆ１）、縦軸に化学シフト（Ｆ２）をとった計測結果１２４−１を得る。計測結果１２４−１は図６に示した試料がテラヘルツ電磁波照射を受けていない時の蛋白質試料の構造に基づいたスペクトルである。ここで、ピーク１２０は活性中心アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のピークである。
【００４５】
（３）次に、試料溶液４に対してテラヘルツ電磁波照射を行いながらＮＭＲ計測を実施しＮＭＲスペクトルを取得する（計測２）。上段に示した計測１と比較して分かるように、核磁気共鳴プローブコイル５内に挿入された試料保持管３は通常のＮＭＲの計測手順に加えて、テラヘルツ電磁波１１０を入射されて、ＮＭＲ計測を実施する。テラヘルツ電磁波１１０を入射すると数百ピコ秒で試料の構造変化が発生するので、テラヘルツ電磁波入射から試料の変化にいたる時間は核磁気共鳴の１回の計測時間よりも十分短い。よって、テラヘルツ電磁波を照射してその後に数百ピコ秒の緩和時間を置くという一連の組み合わせを１回以上の複数回行い、その間あるいはその後にＮＭＲのパルスを照射する一連の計測を行い、核磁気共鳴信号が十分観測できるだけの積算回数分行う。
【００４６】
このときの計測結果を処理（データ処理２）して横軸に化学シフト（Ｆ１）、縦軸に化学シフト（Ｆ２）をとった計測結果１２４−２を得る。計測結果１２４−２は図６に示した試料がテラヘルツ電磁波照射を受けた時の蛋白質試料の構造に基づいたスペクトルである。ここで、ピーク１２１はテラヘルツ電磁波照射時での活性中心アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のピークである。このように、テラヘルツ電磁波を共鳴吸収する基に近接する原子からのスペクトルはテラヘルツ電磁波の吸収量に対応して変動する。
【００４７】
なお蛋白質試料上の変化を観測する原子種、核スピンの結合関係などが異なると使用するＮＭＲパルスが異なる。照射するテラヘルツ電磁波はＮＭＲパルスと組み合わせて用いるので、用いるＮＭＲパルスに合わせて（i）テラヘルツ電磁波が先に照射されてその後のＮＭＲパルスシーケンスを実施する場合、（ii）ＮＭＲパルスの間にテラヘルツ電磁波を挿入する場合、（iii）ＮＭＲパルスと同時にテラヘルツ電磁波を照射する場合、（iv）ＮＭＲパルスを入射後のＦＩＤ（自由誘導減衰信号）を検出する間にテラヘルツ電磁波を照射する場合、（v）ＮＭＲパルスシーケンス実施中の間テラヘルツ電磁波を連続的に照射する場合、（vi）上記（i）−（v）を複数組み合わせて用いる場合がある。
【００４８】
（４）次に、データ処理１およびデータ処理２で得られたＮＯＥＳＹ等のスペクトル１２４−１，１２４−２の比較を行い、テラヘルツ電磁波照射前後での得られたピーク１２０および１２１間の変化を決定する。この変化は化学シフト値の変動ΔＣだけでなく、ピークの強度（ピークでの等高線の数）ΔＳにも現れる。この変動から水素原子間距離の変化を推定する。
【００４９】
図８は、図７で説明したテラヘルツ電磁波照射による計測結果から、試料蛋白質の構造変化（水素原子間距離の変化）を推定する模式図である。上段に示す計測結果に応じて、試料蛋白質の同位体標識１０２の水素原子間の距離が、矢印に示されるように変化したものと推定される。この大きさは、ΔＣ，ΔＳに対応する。このように、テラヘルツ照射によって生じた蛋白質試料の活性中心近傍での構造変化の情報が本発明の複合分光方法で得られることが分かる。更に、これらの情報と帰属が既知の水素原子の情報を組み合わせることで、立体的な構造変化や、静電ポテンシャル等の化学的性質の変化も解析可能となる。
【００５０】
（実施例３）
以下にテラヘルツ電磁波照射を用いた蛋白質−リガンド相互作用に関する観測例について詳細に示す。
【００５１】
図９はアスパラギン酸もしくはグルタミン酸を活性中心に持つ蛋白質１０１に対してアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のみの同位体標識１０２を施した試料蛋白質に、さらに、リガンド１０４を結合させた標的蛋白質試料１０５を示す。このように、試料蛋白質に対して選択的な同位体標識を行うとともにリガンド１０４を結合させる試料調整を行う。
【００５２】
図１０に蛋白質−リガンド相互作用を観測する手順を示す。
【００５３】
（１）まずは標的蛋白質のみの試料１０３でＮＭＲ計測を行い、１Ｈ−１５Ｎ−ＨＭＱＣ等のスペクトル１２４−１を取得する。この計測は、実施例２で説明した計測１と同じである。このスペクトルは標的蛋白質１０３に何も結合していない状態でのスペクトルであり、以下の解析の基準となるスペクトルである。特に活性中心アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のピーク１２０は重要な値である。
【００５４】
（２）次に、図９で説明したように、標的蛋白質１０１とリガンド１０４とを結合させた標的蛋白質試料１０５を含む試料溶液４のＮＭＲ計測（計測３）を行う。この計測手順は計測１と同じである。この計測結果を処理（データ処理３）して横軸に化学シフト（Ｆ１）、縦軸に化学シフト（Ｆ２）をとった計測結果１２４−３を得る。１Ｈ−１５Ｎ−ＨＭＱＣ等のスペクトル１２４−３において活性中心アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のピーク１２４が観測される。このピークは計測１のピーク１２０と比較して、変動しており、このピーク値の変動はリガンド１０４と標的蛋白質１０１が結合状態を形成した為に生じている。
【００５５】
（３）次に、標的蛋白質１０１とリガンド１０４とを結合させた試料溶液４のＮＭＲ計測（計測４）を行う。この計測４では、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボニル基の不対電子スピンが共鳴するテラヘルツ電磁波１１０を数回に分けて照射し、結合部位のアスパラギン酸もしくはグルタミン酸を中心にエネルギーを供給する。テラヘルツ電磁波１１０による構造変化は数百ピコ秒で発生するので、テラヘルツ電磁波入射から試料の変化に至る時間は核磁気共鳴の１回の計測時間よりも十分短い。よって、テラヘルツ電磁波を照射してその後に数百ピコ秒の緩和時間を置くという一連の組み合わせを１回以上の複数回行い、その間あるいはその後にＮＭＲのパルスを照射する一連の計測を行い、ＮＭＲシグナルが十分観測できるだけの積算回数分行う。この計測結果を処理（データ処理４）して横軸に化学シフト（Ｆ１）、縦軸に化学シフト（Ｆ２）をとった計測結果１２４−４を得る。計測結果１２４−４は図９に示した試料がテラヘルツ電磁波照射を受けた時の蛋白質試料の構造に基づいたスペクトルである。ここで、ピーク１２５はテラヘルツ電磁波照射を受けた活性中心アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のピークである。
【００５６】
なお、測定に用いるＮＭＲパルスに合わせて、テラヘルツ電磁波の照射とＮＭＲパルスの組み合わせは前述した組み合わせをとる。
【００５７】
テラヘルツ電磁波１１０が与えたエネルギーは不対スピンからアスパラギン酸もしくはグルタミン酸残基に供給される。このエネルギーはテラヘルツ電磁波のパルス幅、パルスの回数を変えることでコントロールできる。照射量が少ないとリガンドとの結合部分に供給するエネルギーは活性化エネルギーよりも小さいためにリガンドとの結合は解離せず、ＮＭＲスペクトルの変動は生じない。パルス回数、パルス幅を調節することで、試料に供給するエネルギーを増加させていき、結合の活性化エネルギーと同程度のエネルギーを結合部位に供給できる状況になると、ＮＭＲスペクトルの変動がピーク１２５に現れ始める。
【００５８】
計測１で得られた、基準となる、標的蛋白質のみの試料１０３での結合部位でのピーク１２０と、リガンドを含ませた試料１０５にテラヘルツ電磁波１１０を入射させて得られたピーク１２５を同じ座標で比較すると図９に示した試料でのテラヘルツ電磁波の照射により生じた化学シフト変動値ΔＣが得られる。
【００５９】
図１１は、図１０で説明したテラヘルツ電磁波照射による計測結果から、試料蛋白質とリガンドの結合の強さを推定する模式図である。結合の強さを推定するために、試料蛋白質とリガンドを結合させた状態から結合が切れる（解離する）に十分な状態までに変化するのに必要なテラヘルツ電磁波の照射量を求める。照射量が不十分で結合が切れない状態では図１０でのピーク１２５はピーク１２４とほぼ同一であり、照射量を増加させて結合が切れた状態ではピーク１２５はピーク１２０に近づく。このように化学シフト変動値ΔＣは結合部位とリガンドの結合の強さに密接に関連している。
【００６０】
具体的には、様々な照射量の下で計測した化学シフト変動値ΔＣをプロットすると図１２Ｂに示すテラヘルツ電磁波照射量-化学シフト変動量曲線１３３を得る。図１２Ａは、この曲線１３３の振る舞いを説明するための蛋白質リガンド複合体のエネルギー曲線１３１を示す。テラヘルツ電磁波の照射量がリガンドの解離エネルギー（Ｅｄ）１３２よりも小さい場合にはリガンドと蛋白質は解離できないので化学シフト変動量は小さいまたは変化が生じない。これに対してテラヘルツ電磁波の照射量を増加させて、解離エネルギー１３２よりも十分に大きな照射量を与えられると、リガンド１０４は標的蛋白質１０１から離れ、化学シフトの変動値が増大する。この化学シフトが増大した時点でのテラヘルツ電磁波照射量がリガンドの解離エネルギー１３２に対応している。
【００６１】
この化学シフト変動の計測を様々なリガンドに対して行うことで、各リガンドの相対的な解離エネルギーの大小を評価することが可能である。
【００６２】
このように活性中心の残基に注目し、磁場下での電磁波照射により選択的に活性中心の残基にエネルギーを供給することで、活性中心での相互作用、結合あるいは分子立体構造を変化させ、核磁気共鳴で測定することで、結合の強さ、活性中心での構造変化を観測することが可能となる。
【００６３】
（その他）
複合分光測定による蛋白質試料の計測を行う前に、照射テラヘルツ電磁波の周波数を特定する前処理を行う必要がある。ここで、テラヘルツ電磁波の周波数は可変であるので、テラヘルツ電磁波検出部２を用いテラヘルツ電磁波の透過量を測定しながら照射周波数を定める。こうすることで未知の試料蛋白質に対して磁場中で吸収する電磁波の周波数を設定することができる。この前処理は次の様に進める。
（１）磁場が存在しない状態で、蛋白質試料のテラヘルツ電磁波に対する吸収スペクトルを計測する。この時、試料は複合分光で用いるものと同等あるいは同一の試料管を用いることが望ましい。
（２）本発明の複合分光装置を用いて、磁場を印加した状態での吸収スペクトルを計測する。この時、ＮＭＲ測定は行わない。
（３）前記（１）および（２）の吸収スペクトルを比較し、（２）の測定にのみ出現しているスペクトルの周波数が、設定すべき周波数である。
【００６４】
以上より、ＮＭＲ測定装置にテラヘルツ電磁波を入射可能な開放スペースおよび、プローブ構造を設け、テラヘルツ電磁波を用いた複合分光測定による特定部位に選択的な観測することは、蛋白質−リガンド結合や蛋白質−蛋白質相互作用の観測に有効であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明を実施するに好適な核磁気共鳴装置の各構成要素の配置を模式的に示す図。
【図２】本発明を実施するに好適な他の核磁気共鳴装置の各構成要素の配置を模式的に示す図。
【図３】本発明を実施するに好適な他の核磁気共鳴装置の各構成要素の配置を模式的に示す図。
【図４Ａ】核磁気共鳴プローブコイルの周辺部に設けられる保護構造の一例を示す断面図。
【図４Ｂ】図４Ａに対応する斜視図。
【図５】プロトンが電離した溶液中でのカルボニル基の構造式を示す図。
【図６】アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を活性中心に持つ蛋白質に対してアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のみの同位体標識を施した標的蛋白質試料を示す模式図。
【図７】テラヘルツ電磁波照射による蛋白質の構造変化を観測する手順を示す図。
【図８】図７で説明したテラヘルツ電磁波照射による計測結果から、試料蛋白質の構造変化（水素原子間距離の変化）を推定する模式図。
【図９】アスパラギン酸もしくはグルタミン酸を活性中心に持つ蛋白質に対してアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のみの同位体標識を施した試料蛋白質に、さらに、リガンドを結合させた標的蛋白質試料を示す模式図。
【図１０】蛋白質−リガンド相互作用を観測する手順を示す図。
【図１１】図１０で説明したテラヘルツ電磁波照射による計測結果から、試料での蛋白質とリガンド間の結合の強さを推定する模式図。
【図１２Ａ】図１２Ｂに示すテラヘルツ電磁波照射量-化学シフト変動量曲線の振る舞いを説明するための蛋白質リガンド複合体のエネルギー曲線を示す図。
【図１２Ｂ】様々な照射量の下で計測した化学シフト変動値ΔＣをプロットしてテラヘルツ電磁波照射量-化学シフト変動量曲線を示した図。
【符号の説明】
【００６６】
１…テラヘルツ電磁波の発信部、２…テラヘルツ電磁波検出部、３…試料のサンプル管、４…試料溶液、５…核磁気共鳴プローブコイル、６…静磁場発生用マグネット、７…マグネットのボア、８…核磁気共鳴プローブコイルの引き出し線、９…試料保持管の導入用のガイド、１０…シールド部、１２，１２’…試料保持管の導入用のガイドの接続孔、１３，１３’…テラヘルツ電磁波入射窓、１４…残基に発生した不対スピン、１０１…標的蛋白質、１０２…同位体標識されたアスパラギン酸とグルタミン酸、１０３…標的蛋白質のみの試料、１０４…リガンド、１０５…標的蛋白質とリガンドを含んだ試料、１１０…テラヘルツ電磁波、１２０…標的蛋白質のみ試料で観測した結合部位のピーク信号、１２１…標的蛋白質のみ試料でテラヘルツ電磁波を入射して観測した結合部位のピーク信号、１２４…標的蛋白質とリガンドが結合した試料で観測した結合部位のピーク信号、１２５…標的蛋白質とリガンドが結合した試料でテラヘルツ電磁波を入射して観測した結合部位のピーク信号、１３１…蛋白質リガンド複合体のエネルギー曲線、１３２…リガンド蛋白質間の解離エネルギー、１３３…テラヘルツ電磁波照射量−化学シフト変動量曲線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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