(57)【要約】      （修正有）【課題】  若年発症成人型糖尿病および永続的新生児糖尿病などの糖尿病のモデル動物を提供する。【解決手段】  以下の（A）、（B）のいずれかの塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する非ヒト哺乳動物を提供する。  （A）エクソン１Aの直後のイントロンの１番目のグアニン、エクソン３の直前のイントロンの３’側から３番目のシトシンおよびエクソン８の直後のイントロンの２番目のチミンの他の塩基への置換、（B）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の２２４番目のメチオニンをアルギニンに、２２０番目のシステインをチロシンに、１８２番目のバリンをメチオニンに、２７３番目のチロシンおよび３４５番目のアルギニンを終始コドンに、２２８番目のスレオニンをアラニンに、４１９番目のフェニルアラニンをロイシンに、２０６番目のスレオニンをメチオニンに、１２７番目のセリンをプロリンに置換。【選択図】図１
2005318892.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（A）〜（L）のいずれかの塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する非ヒト哺乳動物、
（A）エクソン１Aの直後のイントロンの第１番目のグアニンの他の塩基への置換、
（B）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２４番目のメチオニンをアルギニンに変換する塩基置換、
（C）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２０番目のシステインをチロシンに変換する塩基置換、
（D）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１８２番目のバリンをメチオニンに変換する塩基置換、
（E）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２７３番目のチロシンを終始コドンに変換する塩基置換、
（F）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第３４５番目のアルギニンを終始コドンに変換する塩基置換、
（G）エクソン３の直前のイントロンの３’側から第３番目のシトシンの他の塩基への置換、
（H）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２８番目のスレオニンをアラニンに変換する塩基置換、
（I）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第４１９番目のフェニルアラニンをロイシンに変換する塩基置換、
（J）エクソン８の直後のイントロンの第２番目のチミンの他の塩基への置換、
（K）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２０６番目のスレオニンをメチオニンに変換する塩基置換。
（L）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１２７番目のセリンをプロリンに変換する塩基置換。
【請求項２】
以下の（a）〜（l）のいずれかの塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する請求項１に記載の非ヒト哺乳動物、
（a）エクソン１Aの直後のイントロンの第１番目のグリシンのチミンへの置換、
（b）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２４番目のアミノ酸に対応するコドンをatgからaggに変換する塩基置換、
（c）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２０番目のアミノ酸に対応するコドンをtgtからtatに変換する塩基置換、
（d）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１８２番目のアミノ酸に対応するコドンをgtgからatgに変換する塩基置換、
（e）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２７３番目のアミノ酸に対応するコドンをtacからtaaに変換する塩基置換、
（f）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第３４５番目のアミノ酸に対応するコドンをcgaからtgaに変換する塩基置換、
（g）エクソン３の直前のイントロンの３’側から第３番目のシトシンのアデニンへの置換、
（h）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２８番目のアミノ酸に対応するコドンをaccからgccに変換する塩基置換、
（i）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第４１９番目のアミノ酸に対応するコドンをttcからttaに変換する塩基置換、
（j）エクソン８の直後のイントロンの第２番目のチミンのシトシンへの置換、
（k）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２０６番目のアミノ酸に対応するコドンをacgからatgに変換する塩基置換。
（l）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１２７番目のアミノ酸に対応するコドンをtctからcctに変換する塩基置換。
【請求項３】
前記グルコキナーゼ遺伝子が内因性のグルコキナーゼ遺伝子である、請
求項１又は２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記グルコキナーゼ遺伝子がマウスのグルコキナーゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
マウスである請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト哺乳動物に抗糖尿病薬候補物質を投与し、該非ヒト哺乳動物の、血糖値、インスリン値、糖化ヘモグロビン値からなる群より選ばれる1又は2以上のパラメーターを測定することを特徴とする、抗糖尿病薬候補物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は若年発症成人型糖尿病及び永続的新生児糖尿病などの糖尿病のモデルとして有用な非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
若年発症成人型糖尿病（Maturity-onset diabetes of the young: 以下MODYとも呼ぶ）は単一の遺伝子異常により常染色体優性遺伝し，若年（多くの場合25歳前後）で発症する糖尿病で，主にインスリン分泌能の低下により起こる。現在までに6種の原因遺伝子が報告されており，原因遺伝子別にMODY1~6と 呼ばれている。MODY2の原因遺伝子であるグルコキナーゼ（glucokinase: 以下GKとも呼ぶ）は膵臓ランゲルハンス島のβ細胞と肝細胞に主な発現がみられ，解糖系の初期のステップであるグルコースからグルコース6リン酸への変換を触媒する酵素である。β細胞ではインスリン分泌は細胞内でのグルコース代謝量に比例するため，GKの遺伝子異常により機能が低下すると血中グルコースのインスリン分泌閾値が上昇することにより，インスリン分泌が低下し，高血糖を来たす。逆に機能亢進型の変異が起これば，低血糖症の原因となる。現在までに報告されたヒトGK遺伝子変異のパターンは約190箇所に及ぶが，その大部分は機能喪失型変異をヘテロ接合体で有するMODY2患者で報告されたものである（非特許文献１参照）。機能喪失型の変異のホモ接合体は現在までに4例，コンパウンドへテロ接合体は１例が報告されており５例とも永続的新生児糖尿病（Permanent neonatal diabetes mellitus:以下PNDMとも呼ぶ）を発症し，出生直後から著しい高血糖を呈し，インスリン治療を必要とする（非特許文献2または３参照）。
【０００３】
このようにヒトではGK遺伝子に塩基置換を有する糖尿病患者が知られていたが、マウスなどの実験動物モデルでは、そのようなGK遺伝子に塩基置換を有する遺伝性糖尿病動物やトランスジェニック動物は知られていなかった。一方で、GK遺伝子破壊（gene knockout:
以下KOとも呼ぶ）によって作製されたマウス6系統が存在する（例えば、非特許文献４~７参照）。これらKOマウスはすべて、GK遺伝子の11あるエクソンのうち，1あるいは複数個が欠損している。しかし、このような大幅な遺伝子構造の変化はヒト患者では報告が少なく，これらのKOマウスが厳密にヒトMODY2患者すべての病態を再現しているとは言えない。また，ヒトMODY2患者において報告されている多様なミスセンス変異を含むリコンビナントGKタンパク質の解析より，変異の箇所や置換するアミノ酸の種類によりGKの酵素活性やタンパクの安定性などに及ぼす影響が異なることが報告されている。したがって、ヒトMODY2患者にみられるような微細な変異によって影響を受けたGKが表現型に及ぼす影響についての詳細な解析は、KOマウスでは不可能であった。また，KOマウスのうち１系統ではホモ欠損個体は胎生致死であり，ヒトMODY2やPNDMのモデルとはなり得なかった。
【非特許文献１】Hum Mutat., 2003, vol. 22, p353-362.
【非特許文献２】N. Engl. J. Med., 2001, vol. 344, p1588-1592
【非特許文献３】Diabetes, 2003, vol. 52, p2854-2860.
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, p30253-30256.
【非特許文献５】J Biol Chem., 1995, vol. 270, p21464-21467.
【非特許文献６】Cell, 1995, vol. 83, p69-78.
【非特許文献７】J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, p305-315.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、若年発症成人型糖尿病および永続的新生児糖尿病などの糖尿病のモデル動物
を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果，化学変異原ENU誘発突然変異を用いてマウスに変異を導入することにより，GK遺伝子に塩基置換を有する変異マウス系統を１２系統見出した。これらのマウスが糖尿病の症状を呈することを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  以下の（A）〜（L）のいずれかの塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する非ヒト哺乳動物、
（A）エクソン１Aの直後のイントロンの第１番目のグアニンの他の塩基への置換、
（B）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２４番目のメチオニンをアルギニンに変換する塩基置換、
（C）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２０番目のシステインをチロシンに変換する塩基置換、
（D）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１８２番目のバリンをメチオニンに変換する塩基置換、
（E）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２７３番目のチロシンを終始コドンに変換する塩基置換、
（F）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第３４５番目のアルギニンを終始コドンに変換する塩基置換、
（G）エクソン３の直前のイントロンの３’側から第３番目のシトシンの他の塩基への置換、
（H）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２８番目のスレオニンをアラニンに変換する塩基置換、
（I）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第４１９番目のフェニルアラニンをロイシンに変換する塩基置換、
（J）エクソン８の直後のイントロンの第２番目のチミンの他の塩基への置換、
（K）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２０６番目のスレオニンをメチオニンに変換する塩基置換。
（L）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１２７番目のセリンをプロリンに変換する塩基置換。
（２）  以下の（a）〜（l）のいずれかの塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する（１）の非ヒト哺乳動物、
（a）エクソン１Aの直後のイントロンの第１番目のグリシンのチミンへの置換、
（b）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２４番目のアミノ酸に対応するコドンをatgからaggに変換する塩基置換、
（c）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２０番目のアミノ酸に対応するコドンをtgtからtatに変換する塩基置換、
（d）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１８２番目のアミノ酸に対応するコドンをgtgからatgに変換する塩基置換、
（e）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２７３番目のアミノ酸に対応するコドンをtacからtaaに変換する塩基置換、
（f）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第３４５番目のアミノ酸に対応するコドンをcgaからtgaに変換する塩基置換、
（g）エクソン３の直前のイントロンの３’側から第３番目のシトシンのアデニンへの置換、
（h）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２２８番
目のアミノ酸に対応するコドンをaccからgccに変換する塩基置換、
（i）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第４１９番目のアミノ酸に対応するコドンをttcからttaに変換する塩基置換、
（j）エクソン８の直後のイントロンの第２番目のチミンのシトシンへの置換、
（k）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第２０６番目のアミノ酸に対応するコドンをacgからatgに変換する塩基置換。
（l）グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の第１２７番目のアミノ酸に対応するコドンをtctからcctに変換する塩基置換。
（３）  前記グルコキナーゼ遺伝子が内因性のグルコキナーゼ遺伝子である、（１）又は（２）の非ヒト哺乳動物。
（４）  前記グルコキナーゼ遺伝子がマウスのグルコキナーゼ遺伝子である、（１）〜（３）のいずれかの非ヒト哺乳動物。
（５）  マウスである（１）〜（４）のいずれかの非ヒト哺乳動物。
（６）  （１）〜（５）のいずれかの非ヒト哺乳動物に抗糖尿病薬候補物質を投与し、該非ヒト哺乳動物の血糖値、インスリン値、糖化ヘモグロビン値からなる群より選ばれる1又は2以上のパラメーターを測定することを特徴とする、抗糖尿病薬候補物質の評価方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の非ヒト哺乳動物は、ヒトMODY2ならびにPNDMの詳細な病因／病態の解析や治療薬の開発のためのモデル動物として有用である。
また，MODYなど単一の遺伝素因で発症する糖尿病以外ではインスリン分泌不全あるいはインスリン抵抗性を誘発する複数の遺伝的素因ならびにそれら遺伝素因に環境要因が加わって発症することが知られている。本発明のGK遺伝子に塩基置換を有する非ヒト哺乳動物はヘテロ個体においては概して穏やかな表現型を呈し，維持，繁殖も容易なことから，これらの個体に他の遺伝的要因（インスリン抵抗性など）を有する非ヒト哺乳動物を交配した場合や、高脂肪食などの環境の負荷をかけた場合の糖尿病の発症／病態の解析により，MODY2に限らず広く糖尿病の病態の基礎にあるメカニズムを解明するために有用なモデルとして利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の非ヒト哺乳動物は、糖尿病を引き起こす塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を保持する非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギなどが挙げられるが、マウスが好ましい。グルコキナーゼ遺伝子としては、上記哺乳動物のグルコキナーゼ遺伝子が挙げられるが、マウスのグルコキナーゼ遺伝子がより好ましい。例えば、マウス染色体上のグルコキナーゼ遺伝子として、データベース「Ensembl」に、「ENSMUSG00000041798」として登録されている遺伝子を挙げることができる（http://www.ensembl.org/Mus_musculus/geneview?gene=ENSMUSG00000041798）。このURLの「Exon Information」を参照することによって塩基配列情報を入手することができる。また、マウスグルコキナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列としては、配列番号1に記載の塩基配列を挙げることができる。ただし、グルコキナーゼ遺伝子は種によってバリエーションがある可能性があるため、これらに限定されるものではない。糖尿病を引き起こすグルコキナーゼ遺伝子上の塩基置換としては、以下の（A）〜（L）のいずれかの塩基置換を挙げることができる。
【０００９】
（A）として、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子のエクソン１Aの直後のイントロンの第１番目のグアニン（ｇ）の他の塩基への置換が挙げられる。ここで、エクソン１Aの配列としては、配列番号３の１〜４５番目の配列が挙げられ、その直後のイントロンの第１番目のｇとしては、配列番号３の４６番目のｇが挙げられる。このｇはチミン（ｔ）に置換
されていることが好ましい。
【００１０】
（B）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の２２４番目のメチオニンをアルギニンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このメチオニンに対応するコドンatgをアルギニンに対応するコドンaga、agg、cga、cgc、cgg又はcgtに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の６７１番目のｔに対応するｔをｇにする塩基置換が好ましい。
【００１１】
（C）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の２２０番目のシステインをチロシンに変換する塩基置換を挙げることができる。具体的には、このシステインに対応するコドンtgtをチロシンに対応するコドンtat又はtacに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の６５９番目のｇに対応するｇをａにする塩基置換が好ましい。
【００１２】
（D）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の１８２番目のバリンをメチオニンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このバリンに対応するコドンgtgをメチオニンに対応するコドンatgに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の５４４番目のｇに対応するｇをａにする塩基置換が好ましい。
【００１３】
（E）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の２７３番目のチロシンを終始コドンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このチロシンに対応するコドンtacを終始コドンtaa、tag又はtgaに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の８１９番目のｃに対応するｃをａにする塩基置換が好ましい。
【００１４】
（F）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の３４５番目のアルギニンを終始コドンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このアルギニンに対応するコドンcgaを終始コドンtaa、tag又はtgaに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の１０３３番目のｃに対応するｃをｔにする塩基置換が好ましい。
【００１５】
（G）として、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子のエクソン３の直前のイントロンの３’側から第３番目のシトシン（ｃ）の他の塩基への置換が挙げられる。ここで、エクソン３の配列としては、配列番号４の１１〜１６６番目の配列が挙げられ、その直前のイントロンの３’側から第３番目のｃとしては、配列番号４の９番目のｃが挙げられる。このｃはアデニン（ａ）に置換されていることが好ましい。
【００１６】
（H）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の２２８番目のスレオニンをアラニンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このスレオニンに対応するコドンaccをアラニンに対応するコドンgca、gcc、gct又はgcgに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の６８２番目のａに対応するａをｇにする塩基置換が好ましい。
【００１７】
（I）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の４１９番目のフェニルアラニンをロイシンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このフェニルアラニンに対応するコドンttcをロイシンに対応するコドンtta、ttg、cta、ctc、ctt又はctgに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の１２５７番目のｃに対応するｃをａにする塩基置換が好ましい。
【００１８】
（J）として、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子のエクソン８の直後のイントロンの第２番目のチミン（ｔ）の他の塩基への置換が挙げられる。ここで、エクソン８の配列としては、配列番号５の１〜１５６番目の配列が挙げられ、その直後のイントロンの第２番目のｔとしては、配列番号５の１５８番目のｔが挙げられる。このｔはシトシン（ｃ）に置換されていることが好ましい。
【００１９】
（K）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の２０６番目のスレオニンをメチオニンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このスレオニンに対応するコドンacgをメチオニンに対応するコドンatgに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の６１７番目のｃに対応するｃをｔにする塩基置換が好ましい。
【００２０】
（L）として、グルコキナーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の１２７番目のセリンをプロリンに変換する塩基置換が挙げられる。具体的には、このセリンに対応するコドンtctをプロリンに対応するコドンcct, cca, ccg又は
cccに変換する置換が挙げられる。配列番号１にグルコキナーゼ遺伝子のcDNAの配列を示すが、染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子において、配列番号１の３７９番目のｔに対応するｔをｃにする塩基置換が好ましい。
【００２１】
本発明の非ヒト糖尿病モデル動物としては、上記のような塩基置換を内因性のグルコキナーゼ遺伝子上に有する非ヒト哺乳動物が好ましい。このような非ヒト哺乳動物は、例えば、以下のようにして得ることができる。すなわち、まず、ENU （N-ethyl-N-nitrosourea）などの変異剤でオスの非ヒト哺乳動物を変異処理し、変異処理されたオスの非ヒト哺乳動物をメスの非ヒト哺乳動物と交配させてその産仔を得る。次に、産仔の中から高血糖（例えば、血糖値200 mg/dl以上）などの糖尿病の症状を呈する個体を選択する。このようにして得られる糖尿病非ヒト哺乳動物から染色体DNAを取得し、これを鋳型にし、「ENSMUSG00000041798」や配列番号１などの塩基配列に基いて上記変異箇所の近傍に設定したプライマーを用いて染色体DNA上のグルコキナーゼ遺伝子の塩基配列を決定することによって、目的箇所に変異が導入されているかを確認する。目的箇所に変異が導入されているものを、本発明の糖尿病非ヒト哺乳動物として選択することができる。なお、このようにして得られる非ヒト哺乳動物は、より表現型を均一にするために戻し交配をすることが好ましい。このようにして本発明の非ヒト哺乳動物が得られた後は、交配を繰り返すことによって、繁殖、維持することができる。
【００２２】
本発明の非ヒト哺乳動物は前記のような塩基置換をヘテロで有するものであってもよいし、ホモで有するものであってもよい。ホモ個体及びヘテロ個体ともに、高血糖、高HbA1c、耐糖能異常、糖負荷に対するインスリン分泌能の低下などの糖尿病の症状を示すが、ホモ個体のほうがその程度は重篤で、出生後まもなく300mg/dl以上の高血糖ならびに尿糖陽性を呈する。さらに、ホモ個体においては顕著な脂肪肝や肝臓におけるグリコーゲンの減少などの症状も見られる。ホモ個体の表現型はヒトの永続的新生児糖尿病（PNDM）の症状に類似しているため、PNDMのモデル動物として有用である。一方、ヘテロ個体はヒトのＭＯＤＹ２の症状に類似した表現型を示すため、ＭＯＤＹ２のモデル動物として有用であ
る。また、ヘテロ個体に高脂肪食を負荷することによって肥満やインスリン抵抗性などのモデルとして使用することもできる。
【００２３】
本発明のモデル動物は、上記塩基置換を有する動物を、他の糖尿病モデル動物と交配させることによって得られる動物であってもよい。交配させる動物としては、例えば、ＫＫＡyマウスやｄｂ／ｄｂマウス、ｏｂ／ｏｂマウスなどが例示される。
【００２４】
本発明の動物はまた、上記の塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物であってもよい。トランスジェニック 非ヒト哺乳動物は、例えばマウス等の非ヒト哺乳動物の受精卵に、上記のような塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を哺乳動物で機能しうるプロモーター（例えば、β−アクチンプロモーター）の下流に連結した遺伝子を導入し、該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、該非ヒト哺乳動物から変異型グルコキナーゼ遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより創製することができる。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物を例示することができるが、創製、育成、使用の簡便さ等からしてマウスが好ましい。受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなく、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等を例示することができる。マウスを使用する場合、マウスの受精卵としては、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ等に由来するマウスの交配により得られる受精卵を使用することができる。注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり１００〜３０００分子が適当である。なお、目的遺伝子の導入されたマウスの選択は、マウスの尻尾等より染色体ＤＮＡを抽出し、導入したグルコキナーゼ遺伝子の一部をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００２５】
上記塩基置換を有するグルコキナーゼ遺伝子を有するトランスジェニック動物を作製する場合、ナンセンス変異(上記Ｅ又はＦ)，あるいはスプライスドナー＆アクセプター部位の変異(上記Ａ，Ｇ又はＪ)などは、導入遺伝子産物が発現しない可能性があるため，本発明のトランスジェニック動物はミスセンス変異（上記Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｋ又はＬ）を有するグルコキナーゼ遺伝子が導入されたものが好ましく、B,C,Iの変異を有するグルコキナーゼ遺伝子が導入されたものがより好ましい。トランスジェニック動物において、塩基置換型グルコキナーゼ遺伝子が導入される染色体上の位置は特に制限されないが、染色体上のグルコキナーゼ遺伝子を置換する形で導入されることが好ましい。
【００２６】
本発明の非ヒト哺乳動物は、抗糖尿病薬候補物質の薬効評価に使用することができる。例えば、抗糖尿病薬候補物質を本発明の動物に投与し、血糖値、インスリン値、糖化ヘモグロビン（HbA1c）などのパラメーターを測定し、非投与群と比較することによって薬効を評価することができる。また、投与動物の肝臓、膵臓、脂肪組織などを免疫学的手法などによって組織学的に解析することにより、薬効を評価することもできる。なお、評価対象の抗糖尿病薬候補物質は、低分子化合物であってもよいし、ペプチドやタンパク質などであってもよい。また、本発明の非ヒト哺乳動物を糖尿病の病態メカニズムを解明するための研究に使用することもできる。
【実施例】
【００２７】
（１）ENU （N-ethyl-N-nitrosourea）誘発変異マウスの作成および高血糖個体の検出
8週齢C56BL/6J♂個体に85，あるいは100 mg/kg体重 のENUを１週間間隔で2回投与し，精子に変異を誘発した。ENU被投与個体は投与後約10〜11週間は不妊となるが，回復後DBA/2J♀個体と交配させ，次世代のDBF1個体を得た。F1個体が11週齢時に血液生化学スクリーニングを行った。測定は随時血の血清を用い，自動血液生化学分析機JCA-BM2250（日本電子）により行った。血糖値が200 mg/dl以上の個体を選抜し，DBA/2Jと交配し，N2産仔において遺伝性を確認し，高血糖個体が得られた場合に変異個体とした。また高血糖が確
認された個体では，血餅サンプルを用い，糖化ヘモグロビン(HbA1c)濃度を測定した。HbA1cは過去3-4週間の血糖値を反映する値である。
【００２８】
（２）原因遺伝子のマッピングならびにＧＫ遺伝子変異の同定
マッピングにはN2産仔のゲノムDNAを用いた。マーカーは全染色体を約10cM間隔でカバーできるよう，MITデータベース(http://www-genome.wi.mit.edu/SNP /mouse/)を用い，C57BL/6JとDBA/2Jの間に多型のあるSNPマーカー76個を選出した。プライマーの塩基配列とPCRの条件設定に関する情報もMITデータベースから得た。アレル判定のためには、TaqMan
MGBプローブ(Applied Biosystems, USA)を使用した。遺伝性が確認された高血糖変異系統のうち，８系統がグルコキナーゼ（ＧＫ）遺伝子座が存在する11番染色体のproxymal regionにマップされたため，ＧＫ遺伝子の全エクソンをdirect sequencingしたところ，それぞれ異なる変異が検出された。表現型が類似していた他の4系統についても同様にsequencingしたところ，ＧＫ遺伝子上に変異が検出され，合計１２系統のＧＫ遺伝子異常が同定された。全ラインの変異および遺伝性データについての詳細は表1に示す。なお、表１において、Fはメスを、Mはオスを示している。
表１によると、すべての系統において，雌雄ともに高血糖産仔が得られた。また，Genotypingの結果，浸透度は77〜100％と非常に高かった。IVS1A＋1G→Tは配列番号３の４６番目のｇのｔへの置換を、IVS3-3C→Aは配列番号４の９番目のｃのaへの置換を、IVS8＋2T→Cは配列番号５の１５８番目のｔのｃへの置換をそれぞれ示している。変異の箇所はexon 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10と，ほぼ遺伝子全域にわたっており，１２系統のうち，2系統はスプライシングドナーサイトに，また，１系統はスプライシングアクセプターサイトに変異が誘発されていた。またアミノ酸レベルではミスセンス変異が７系統，ナンセンス変異が2系統で誘発されていた。このうちスプライシングドナーサイトに変異をもつ１系統（Ｍ−２１０）とミスセンス変異をもつ３系統（Ｍ−３９２、Ｍ−２３６、Ｍ−７３５）はヒトMODY2患者と同じ変異であり，これら変異マウスではヒトMODY2患者の病態を正確に再現していると考えられた。また、Ｍ−５５３はヒトＰＮＤＭ患者と同じ箇所の変異であり，この変異マウスではヒトＰＮＤＭ患者の病態を正確に再現していると考えられた。
【００２９】
【表１】
2005318892.tif 000003
【００３０】
（３）表現型の解析
＜随時血糖の上昇＞
上記の１２系統のうち，各変異のタイプから代表して６系統についての11-12週齢時における随時血糖値の測定結果を表2に示した。統計的解析はunpaired two-tailed Student's t-testによって行い、＊は野生型に対してp<0.01水準で有意差があることを示している。各ラインの変異のタイプは以下のとおり；Ｍ-210：スプライシングドナーサイトの変異，M-272, M-341, M-392：ミスセンス変異，M-475, M-702：ナンセンス変異。その結果、すべての系統において，野生型（WT）個体よりも有意に随時血糖値ならびにHbA1cは高値であった。なお、他の6系統についても同様の表現型が観察された。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
＜耐糖能の低下＞
上記６系統において経口糖負荷試験（OGTT）を行った。検査実施前日夕方から16-18時間絶食し，1.5 mg/g B.W.のグルコースを経口投与した。投与後0, 15, 30, 60, 120分後の血糖値を測定した。測定は簡易血糖測定器グルコカード（Arkray）により行った。結果を別紙図1のＡおよびＢに示す。図1Ａより，全系統において糖負荷後15〜120分で明らかに変異個体で血糖値が高かった。また血糖値の曲線下面積(Area under the glucose curv
e: 以下AUC_glucose)を算出したところ，雌雄ともにすべての系統でWTよりも有意に高値を示した（図1Ｂ）。以上より，GK変異個体は明らかな耐糖能不良を呈していることが確認された。
【００３３】
＜糖負荷に対するインスリン分泌能の低下＞
OGTT時0, 15, 30分における血液サンプルより血清を分離し，マウスインスリン測定ELISA kit（シバヤギ）にて血中インスリン濃度を測定した。グルコース応答性インスリン分泌能を評価する指標となるInsulinogenic indexを以下の式により算出した。
Insulinogenic index＝｛（グルコース投与後15分のインスリン値）−（グルコース投与後0分のインスリン値)｝／｛（グルコース投与後15分の血糖値）−（グルコース投与後0分の血糖値)｝
図1Ｃに結果を示す。これらGK変異マウスではWTと比較してInsulinogenic indexが低く，グルコース応答性のインスリン分泌能が低下していることがわかった。
【００３４】
＜ホモ変異個体におけるPNDM様の重篤な表現型＞
スプライシングドナーサイトの変異を有するM-210，ナンセンス変異のM-702，ミスセンス変異のM-392, M-960についてホモ変異個体の解析をおこなった。その結果，４系統すべてにおいて，出生後2日目よりホモ仔体は300mg/dl以上の高血糖ならびに尿糖陽性を呈した。M-210, M-702では生後２日目以降，顕著な脂肪肝を呈し，生後約１週間以内に死亡した。また、Oil red-O染色により肝臓における脂肪滴の顕著な増加が観察され、PAS染色により肝臓におけるグリコーゲンの減少が観察された。M-392では顕著な高血糖ならびに尿糖陽性は同様に観察されたが，出生後５週間以上生存した。M-960においても，M-392と同様の生後2日齢からの顕著な高血糖とマクロ所見での正常な肝臓像を示したが，生存日数はM-392よりも短い傾向があった。
図2にM-210のホモ変異個体の解析結果を示した。M-210系統のホモ変異個体は、野生型, ヘテロと比較して顕著な発育不良を示した（図2A）。また、血糖値について、M-210系統のホモ変異個体は顕著な高血糖を呈した（図2B）。生後4日齢肝臓の肉眼的所見について、M-210系統のホモ変異個体の肝臓は白色化し，顕著な脂肪肝様の所見を呈した（図2C）。生後４日齢の肝臓の組織像について、PAS染色では（図2D上段）、M-210系統のホモ変異仔体ではグリコーゲン（PAS染色陽性：紫色）の減少が観察された。Oil red-Oによる脂肪滴の染色（図2D下段）では、M-210系統のホモ変異個体では脂肪滴（赤色に染色される）の顕著な増加が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のマウスは若年発症成人型糖尿病および永続的新生児糖尿病様の症状を示すため、これらを含む糖尿病の病因／病態の解析や治療薬の開発のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】経口糖負荷試験（OGTT）の結果を示すグラフ図。Aは血糖値を示す。BはグルコースのAUC(area under curve)を示す。Cはinsulinogenic indexを示す。B,Cにおいて統計解析はStudent's t-testにより行った。Bにおいて、*は野生型との検定において p<0.01 水準で有意差があることを示す。Cにおいて、*は野生型との検定においてp<0.05 水準で，**はp<0.01 水準で有意差があることを示す。
【図２】Gkホモ変異個体の解析結果（M-210）を示す図。Ａは体重変化、Ｂは血糖値を示すグラフ図であり、（×）はホモ個体、（○）は野生型、（△）はヘテロ個体である。Ｃは生後4日齢肝臓の肉眼的所見、Ｄは生後４日齢の肝臓の組織像を示す図（写真）である。Dの上段はPAS染色の結果を示す。下段はOil red-Oによる脂肪滴の染色像を示す。Barは50μｍを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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