(57)【要約】  【課題】  大豆ホエーを特定濃度に濃縮すれば塩を添加しなくてもトリプシンインヒビター画分を沈殿画分として得る発明をした（特願2002-223228号、特願2003-094128号、特願2003-284120号）。  しかし、工業的に生産するとなると濃縮にコストがかかり、いかに生産コストを下げることが出来るかが問題となった。  【解決手段】  大豆ホエーを固形分濃度１０重量％〜３０重量％に濃縮し、濃縮大豆ホエーに対し、３重量％以上の加塩を行い、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する、大豆トリプシンインヒビター濃縮物の製造法。  【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆ホエーを固形分濃度１０重量％〜３０重量％に濃縮し、濃縮大豆ホエーに対し、３重量％以上の加塩を行い、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する、大豆トリプシンインヒビター濃縮物の製造法。
【請求項２】
濃縮液に対し、（３１％−固形分濃度％）／３の式で算出される数字以上の塩を加える、請求項１の製造法。
【請求項３】
用いる塩が、硝酸イオン，硫酸イオン及び塩化物イオンからなる群より選ばれる１又は２以上の陰イオンと、ナトリウム，カリウム及びアンモニウムからなる群より選ばれる１又は２以上の陽イオンからなる、請求項１又は請求項２の製造法。
【請求項４】
凝集沈殿物へ加水してｐＨ２．０〜４．８の範囲で部分的再溶解を行い、これを固液分離し、固液分離で得られる液体画分がBBI型トリプシンインヒビター濃縮物であり、固体画分がKunitz型トリプシンインヒビター濃縮物である請求項１〜請求項３のいずれかの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大豆に含まれる、生理活性を有するトリプシンインヒビター等の有用な濃縮物を簡単かつ安価に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆に含まれる生理活性物質の一つであるトリプシンインヒビターは、分子量約２０，０００、等電点４．５のKunitz型及び分子量約８，０００、等電点４．２のBBI型が知られており、生理作用として癌性胸・腹水貯留抑制剤（特許文献１）、炎症性浮腫亢進抑制剤（特許文献２）、酵素インヒビターを含有するスキンケア組成物を有する使い捨て吸収性製品（特許文献３）等が報告されている。
【０００３】
大豆トリプシンインヒビターの分画方法として実験室レベルでは等電点沈殿、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の組み合わせにより種々の精製法が提案されている。工業的な方法として限外濾過膜とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた特許文献４、トリプシンインヒビター抽出法とイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた特許文献５等がある。
トリプシンインヒビター同様、大豆の有効成分であるβ−アミラーゼの分画方法としては、限外濾過膜を利用した特許文献６や特許文献７、吸着剤として合成ケイ酸アルミニウムを利用した特許文献８等がある。
【０００４】
これら大豆トリプシンインヒビター、大豆β―アミラーゼは有用な物質であり工業化へ通じる簡単な分離技術が確立できれば社会的な貢献は大きい。
一方、従来技術の大豆トリプシンインヒビターの分画法、大豆β−アミラーゼの分画法の例を挙げてきたが、これらは現実には工業化出来ない特殊な手法であったり、多成分の有効利用という概念に欠けたものだった。
【０００５】
【特許文献１】特公平６−２３１１３号公報
【特許文献２】特開平７−１０７７２号公報
【特許文献３】特表２００２−５０５９１６号公報
【特許文献４】特開平６−１４５１９８号公報
【特許文献５】特開平１０−０６６５７２号公報
【特許文献６】特公昭５７−１１６３６号公報
【特許文献７】特開平７−１０７９７４号公報
【特許文献８】特公昭５７−５２３８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
大豆ホエーにはトリプシンインヒビターやβ-アミラーゼを始め、各種の有効成分が含まれている。また蛋白性の有効成分同士を効率的に分離する手法のひとつに、塩析があげられる。しかし、希薄な濃度のホエーを原料に塩析を行なうには、例えば３重量％濃度のホエーに１４重量％もの加塩が必要であり、現実性的方法でない。
本発明者らは、分離大豆蛋白の製造工程等で副産される大豆ホエーを濃縮した後、ｐＨを特定範囲に調整し、更に適切な加塩を行なう事により大豆ホエーに存在するトリプシンインヒビターを沈殿として効率的に回収できる知見を得た。
即ち本発明者らは先に、大豆ホエーを特定濃度に濃縮すれば塩を添加しなくてもトリプシンインヒビター画分を沈殿画分として得られる発明をした（特願２００２−２２３２２８号、特願２００３−０９４１２８号、特願２００３−２８４１２０号）が、工業的に生産する上で、より生産コストを下げることが可能となった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等が鋭意研究した結果、特定割合の塩を添加し、濃縮の程度を下げることにより生産コストを下げ得ることを見出し本発明を完成するに到った。
即ち、本発明者らは、分離大豆蛋白の製造工程等で副産される大豆ホエーを特定濃度まで濃縮した後、塩を加え、更にｐＨを特定範囲に調整することにより大豆ホエーに存在するトリプシンインヒビターを沈殿画分として回収できる知見を得た。
【０００８】
即ち、本発明は、大豆ホエーを固形分濃度１０重量％〜３０重量％に濃縮し、濃縮大豆ホエーに対し、３重量％以上の加塩を行い、酸性条件下で析出する凝集沈殿物を回収する、大豆トリプシンインヒビター濃縮物の製造法である。該加塩量は好ましくは濃縮液に対し、（３１％−固形分濃度％）／３の式で算出される数字以上の塩を加える製造法であり、また、用いる塩が、硝酸イオン，硫酸イオン，塩化物イオンから選ばれる陰イオンと、ナトリウム，カリウム及びアンモニウムからなる群より選ばれる１又は２以上の陽イオンからなるものが使用できる。更に、凝集沈殿物へ加水してｐＨ２．０〜４．８の範囲で部分的再溶解を行い、これを固液分離し、固液分離で得られる液体画分がBBI型トリプシンインヒビター濃縮物であり、固体画分がKunitz型トリプシンインヒビター濃縮物である大豆トリプシンインヒビター濃縮物を得ることができる。
【発明の効果】
【０００９】
大豆ホエーを、一定濃度にまで濃縮をした後に濃縮液に加塩することで、自身の濃縮のみによる塩析を行なう方法に比べ、濃縮コストを抑えつつ、効率よく大豆トリプシンインヒビター濃縮物を得ること、及び副次的にも効率よく大豆β−アミラーゼ濃縮物を得ることが可能になったものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いる大豆ホエーは、大豆トリプシンインヒビターを含む大豆ホエーが使用できる。すなわち、それが生じる過程で大豆トリプシンインヒビターが失活するほどの熱履歴を受けていないものが好ましい。
大豆ホエーは、大豆から分離大豆蛋白、あるいは濃縮大豆蛋白を製造する過程等で副生する。熱履歴の少ない大豆ホエーは、例えば、低変性脱脂大豆を水によって中性付近で抽出後オカラ成分を除去した脱脂豆乳を、等電点付近（例えばｐＨ４．５付近）で大豆蛋白質を凝集沈殿させて除いた溶液として得ることができる。
【００１１】
工業的に分離大豆蛋白を製造する過程で副産される大豆ホエーは、多量に品質の安定した原料として利用することができるので好都合であり、通常このホエーは典型的には、固形分が約３％程度で、その固形分組成（以下において「ｄｒｙ％」ともいう）は粗蛋白質２０％、灰分２０％、糖質６０％程度で構成されており、脱脂大豆からの水抽出倍率が変わっても大豆ホエーの固形分組成の変動は殆ど無い傾向にある。そして、固形分が３％程度であれば、大豆トリプシンインヒビターが活性として５ｕｎｉｔ／ｍｌ程度含まれており、本発明に好適に用いることができる。
【００１２】
本明細書における大豆トリプシンインヒビター活性の測定法はA.O.C.S.の公定法に基づいたBAPA法を用いて定量する。
【００１３】
本発明に於ける大豆ホエーの濃縮は添加する塩の量と負の相関がある。まずはホエーを固形分１０重量％〜３０重量％、好ましくは１５重量％〜２５重量％の範囲にまで濃縮することが適当である。１０重量％未満では大量の塩を加えないと塩析が起きないし、３０重量％以上では、蒸留濃縮のコスト削減になりにくい。
【００１４】
濃縮手段は公知の手段を利用できるが、減圧下で濃縮すると温度上昇を防ぎ効率良く濃縮できる。
その際のｐＨは酸性条件下が好ましく、より好ましくはｐＨ３．５〜８．５、更に好ましくはｐＨ４．５〜７．０である。その際の溶液温度（品温）も特に制限は設けないが、種々のホエー有効成分を高活性に取るならば低い事が好ましく、２０℃〜８０℃更に好ましくは２０℃〜６５℃で行い、引き続き、濃縮液に３重量％以上、より好ましくは３重量％以上１０重量％未満の加塩を行なう。加塩に用いる塩は、硝酸イオン，硫酸イオン，塩化物イオンからなる群より選ばれる１又は２以上の陰イオンと、ナトリウム，カリウム，アンモニウムからなる群より選ばれる１又は２以上の陽イオンからなる塩を用いることができる。価格や入手方法を考えればナトリウム塩が好ましく、特に塩化ナトリウムが好ましい。
これら塩の最適添加量は、塩の種類によっても異なるが、３重量％以上１０重量％未満であり、更に濃縮液１００部に対し、（３１％−固形分濃度％）／３、好ましくは、（３９％−固形分濃度％）／３の式で算出される数字以上の塩を加える。つまり、例えば固形分濃度１９重量％の濃縮液に対しては４重量％以上、好ましくは６.７重量％以上の塩の添加が必要である。但し、加える塩の濃度が３重量％未満では効果に薄く、また１０重量％を超えると、溶液の比重が重くなり、析出した沈殿の分離性が悪くなる。
【００１５】
上記のように濃縮した大豆ホエーは、酸性条件下、好ましくはｐＨ１．７〜５．２、より好ましくは２．７〜４．８の範囲に調整し、析出する凝集沈殿物と上清を分画する。この凝集沈殿物には大豆トリプシンインヒビターが濃縮されている。他方、上清画分にはβ−アミラーゼが濃縮されている。β−アミラーゼも失活させずに分画したい場合には、酸性条件下で２０℃以下で行う等の処理を行なえばよい。
【００１６】
なお、トリプシンインヒビターのKunitz型はｐＨ４．５の等電点を、BBI型はｐＨ４．２の等電点を、β−アミラーゼはｐＨ５．５の等電点を有するが、大豆ホエーをそのまま夫々の等電点でｐＨを調整して等電点沈殿を試みても目的物質の凝集沈殿は生じない、或いは極めて微量である。
【００１７】
このようにして得る凝集沈殿物は大豆トリプシンインヒビター濃縮物であり、加水してｐＨ２．０〜４．８好ましくはｐＨ３．０〜ｐＨ４．４の範囲で一部溶解を行い更に固液分離することができる。この固液分離により得られる液体画分を「BBI型トリプシンインヒビター濃縮物」、固体画分を「Kunitz型トリプシンインヒビター濃縮物」とすることができる。これは加水により塩濃度が、濃縮ホエーの塩濃度より低くなるため、BBI型トリプシンインヒビターは再溶解してくるのに対して、Kunitz型トリプシンインヒビターは溶解せず、両者を上清と沈殿とに分画することができるのである。
【００１８】
加水の程度は凝集沈殿物（含水物）に対し１．５倍以上、好ましくは２〜１０倍、もっとも好ましくは２．５〜４倍が好ましい。
【００１９】
固液分離の手段としては公知の固液分離装置、例えば遠心分離装置、膜分離装置などを利用することができる。
【００２０】
以上の工程により大豆ホエーから効率よく大豆トリプシンインヒビター、さらにはBBI型トリプシンインヒビターとKunitz型トリプシンインヒビターを濃縮することができる。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を示し本発明の具体的な実施態様を説明する。
【００２２】
製造例１
低変性脱脂大豆に１０倍量の温水を加え、ｐＨを７.０に維持しつつ１時間撹拌下で抽出を行なった。デカンターにて不溶成分であるオカラを除去し、脱脂豆乳液を得た。脱脂豆乳液に濃塩酸を加えｐＨを４.５とし、析出した大豆蛋白質の沈殿を分離し、大豆ホエーを得た。
【００２３】
実施例１
上記製造例１で得られた大豆ホエー（固形分３重量％、ｐＨ４.５）を薄膜式フラッシュエバポレーター（東京理科器械製）にて、真空度40Torr，加熱温度60℃，蒸発温度35℃にて減圧濃縮し、固形分濃度７％，１２％，１６％，２７％の時点で抜き出した。得られた各濃度の濃縮ホエーに硫酸ナトリウムを濃縮ホエーに対し０.５％，３％，６％，９％、１４％を加え、更にリン酸にてｐＨ４に調整し、冷蔵にて一晩放置した。
それぞれの試料を3,000rpmで５分間遠心分離し、上澄をSDS電気泳動にアプライし、Kunitz型トリプシンインヒビター（以下、ＫＳＴＩと称する。）に相当する20kDaのバンドの濃度を定量し、原ホエーと比較した。
【００２４】
実施例２（ホエー濃度２８％の例）
実施例１と同様に、大豆ホエーを薄膜式フラッシュエバポレーターにて減圧濃縮し、固形分濃度２８％とした。濃縮ホエーに硫酸ナトリウムを濃縮ホエーに対し３％又は６％を加え、更にリン酸にてｐＨ４に調整し、冷蔵にて一晩放置した。
それぞれの試料を3,000rpmで５分間遠心分離し、上澄をSDS電気泳動にアプライし、ＫＳＴＩに相当する20kDaのバンドの濃度を定量し、原ホエーと比較した。
【００２５】
実施例３（ホエー濃度１３％の例）
実施例１と同様に、大豆ホエーを薄膜式フラッシュエバポレーターにて減圧濃縮し、固形分濃度１３％とした。濃縮ホエーに硫酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを濃縮ホエーに対し０.５％，３％，６％，９％，１４％を加え、更にリン酸にてｐＨ４に調整し、冷蔵にて一晩放置した。
それぞれの試料を3,000rpmで５分間遠心分離し、上澄をSDS電気泳動にアプライし、ＫＳＴＩに相当する20kDaのバンドの濃度を定量し、原ホエーと比較した。
【００２６】
比較例１
実施例１と同様に、大豆ホエーを薄膜式フラッシュエバポレーターにて減圧濃縮し、固形分濃度３２％，３５％，３８％，４１％，４４％，４７％，５１％の時点で抜き出した。得られた各濃度の濃縮ホエーにをリン酸にてｐＨ４に調整し、冷蔵にて一晩放置した。
それぞれの試料を3,000rpmで５分間遠心分離し、上澄をSDS電気泳動にアプライし、ＫＳＴＩに相当する20kDaのバンドの濃度を定量し、原ホエーと比較した。
【００２７】
（表１）各固形分濃度，塩濃度での、上澄のＫＳＴＩ分子残存量
──────────────────────────────────────
固形分  添加塩        各塩濃度におけるＫＳＴＩ分子残存量（%）
濃度(%)         ─────────────────────────
0(%)   0.5(%)   3(%)    6(%)    9(%)    14(%)
──────────────────────────────────────
実施例１   3    Na2SO4     99 ×  103 ×  101 ×   97 ×   80 ×   26 ○
7    Na2SO4    105 ×  113 ×  109 ×  102 ×   60 △   15 ○
12    Na2SO4    110 ×  111 ×  109 ×   83 ×   32 ○    0 ○
16    Na2SO4    104 ×  117 ×  103 ×   64 △   24 ○    2 ○
27    Na2SO4    102 ×   86 ×   84 ×   30 ○   15 ○   76 ×
実施例２  28    Na2SO4     89 ×    −     58 △   29 ○     −     −
実施例３  13    Na2SO4    104 ×   95 ×   98 ×   65 △   26 ○    8 ○
13    NaCl      104 ×  105 ×  104 ×   91 ×   78 ×   29 ○
比較例１  32      −       88 ×    −      −      −      −      −
35      −       82 ×    −      −      −      −      −
38      −       57 △    −      −      −      −      −
41      −       47 ○    −      −      −      −      −
44      −       45 ○    −      −      −      −      −
──────────────────────────────────────
※評価方法
・ＴＩ分子残存量55%未満  「分離良好：○」
・ＴＩ分子残存量70%未満  「多少分離：△」
・ＴＩ分子残存量70%以上  「分離不良：×」
【００２８】
実施例１〜３で示す、各固形分濃度の濃縮ホエーに対して加塩した際の、ＫＳＴＩ分子の残存量を比較すると、固形分濃度１２重量％〜２８重量％では、３重量％〜１４重量％の塩添加によりＫＳＴＩが沈殿し上澄に残存しない事が判る。特に、有効加塩量は（３１％−固形分濃度％）／３、好ましくは（３９％−固形分濃度％）／３の式によって算出される範囲が良好であった。
【００２９】
本発明は、比較例１で示した様な、固形分濃度が３０重量％を超える場合に必要な濃縮のためのエネルギーの量が減る。また固形分濃度１０重量％未満では、加塩量が大きくなり、塩に関わる費用が発生する上に、濃縮液の比重が上がり、分離性が悪化する。１０重量％以上３０重量％未満の限定した濃度で加塩を行なう本発明方法では、高くない濃度でもＫＳＴＩの沈殿が起こる為に、濃縮に必要なエネルギーの節約となり、より安価且つ効率的に大豆ホエーの分画が可能となる。
【００３０】
実施例４
分離大豆蛋白製造工程で得られた大豆ホエー７０ｋｇ（固形分２．９重量％、ｐＨ４．６、総トリプシンインヒビター活性357,000unit、粗蛋白質含有量２０．１dry％、灰分１９．７dry％、糖質６０．２dry％）を大川原製作所製エバポール（ＣＥＰ−Ｌ型）にて大豆ホエーの蒸発温度５０℃（加熱温度８０℃）の条件で減圧濃縮して固形分２０．０重量％、総トリプシンインヒビター活性333,000unitの濃縮ホエーを８ｋｇ得た。
濃縮ホエーに塩化ナトリウム５６０ｇを加え、１５℃に冷却してリン酸によりｐＨ４．０に調整して３時間静置した後遠心分離（1,500Ｇ×１０分）を行い上清と沈殿に分けた。
分離した上清は8,100ｇ得られ固形分は２６．０重量％、総トリプシンンインヒビター活性40,000unitとなり、沈殿は３２４ｇ得られ、固形分は５５．０重量％、総トリプシンインヒビター活性305,000unitであった。
従って両酵素活性の分配率は、トリプシンインヒビターは上清に１１．６％、沈殿に８８．４％、β−アミラーゼは上清に９２．１％、沈殿に７．９％の割合であった。
沈殿であるトリプシンインヒビター画分１００ｇへ水２００ｇを加え沈殿させたｐＨ４．０を維持しながらホモミキサーを用いて（4,000rpm×１５分）間攪拌し溶解させた後遠心分離（5,000Ｇ×１０分）して上清と沈殿に分けた。
上清は２７７ｇ得られ固形分１４．２％、総トリプシンインヒビター力価60,000unitで、沈殿は２３ｇ得られ固形分５５．８％総トリプシンインヒビター力価22,100unitとなった。
上清と沈殿のたん白をＳＤＳ電気泳動で分析したところ、上清にはBBI型トリプシンインヒビターが、沈殿にはKunitz型トリプシンインヒビターが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の製造法を利用すれば大豆ホエーから効率良く大豆トリプシンインヒビター、さらにはBBI型トリプシンインヒビターとKunitz型トリプシンインヒビター、大豆β−アミラーゼ、及び大豆少糖類を一連の工程で分離することができるものであり、大豆ホエーを総合的に利用することが可能になったものである。