(57)【要約】【課題】  極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジを提供する。【解決手段】  架橋されたゼラチンからなる多数の微細小孔を有するゼラチンスポンジであって、ＪＩＳ  Ｋ  ７２２０に準拠した方法により測定した圧縮弾性率が０．０１〜１０ＭＰａであるゼラチンスポンジ。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたゼラチンからなる多数の微細小孔を有するゼラチンスポンジであって、ＪＩＳ  Ｋ  ７２２０に準拠した方法により測定した圧縮弾性率が０．０１〜１０ＭＰａであることを特徴とするゼラチンスポンジ。
【請求項２】
架橋されたゼラチンは、架橋剤により架橋されていることを特徴とする請求項１記載のゼラチンスポンジ。
【請求項３】
架橋されたゼラチンは、含水率が９０〜９９．８％であることを特徴とする請求項１又は２記載のゼラチンスポンジ。
【請求項４】
酸処理又はアルカリ処理されたゼラチンからなることを特徴とする請求項１、２又は３記載のゼラチンスポンジ。
【請求項５】
微細小孔の平均孔径が１０〜５００μｍであることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のゼラチンスポンジ。
【請求項６】
架橋剤を含有し、ゼラチン濃度が３重量％以下であるゼラチン水溶液を調製する工程と、前記ゼラチン水溶液を、ホモジナイザーを用いて３０００〜１００００ｒｐｍの回転数で攪拌して発泡させる工程と、前記発泡ゼラチン水溶液を凍結する工程と、前記凍結した発泡ゼラチン水溶液を凍結乾燥してスポンジ状成形体を得る工程とを有することを特徴とするゼラチンスポンジの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、組織又は器官の再生の足場になる基材を患者に移植することが行われている。このような基材としては、例えば、特許文献１に、コラーゲン単糸からなる移植用基材が開示されている。
【０００３】
近年、再生医療用の基材として、生体内吸収性高分子材料からなるものが注目されている。生体内吸収性高分子材料は、生体内の酵素等によって分解してその形状を失う性質を有する。生体内吸収性高分子材料からなる基材を再生医療用の足場材として移植すると、予め基材内に播種しておいた細胞、又は、周りの組織、器官から遊走して基材内に侵入してきた細胞が、分化、増殖するとともに、これらの細胞が細胞間物質を産生して組織又は器官を再構築していく。一方、足場材としての役割を終えた基材は、生体内の酵素等によりゆっくりと分解していく。従って、いったん移植した基材は、再手術により取り出す必要がなく、患者への負担を大幅に減ずることができる。
【０００４】
このような生体内吸収性高分子材料としては、例えば、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子が挙げられる。
【０００５】
なかでもゼラチンは、自然界に極めて広く分布しており、安易かつ容易に入手することができることから、ゼラチンスポンジを再生医療用基材として用いることが検討されている。このようなゼラチンを用いた再生医療用基材は、例えば、特許文献２や特許文献３等に開示されている。しかし、ゼラチンは、水溶性が極めて高く、これをそのまま生体内に移植しても急速にその形状を失ってしまう。従って、生体に移植して足場材としての役割を果たすためには、何らかの架橋を施して耐水性を高める必要があり、特許文献２、特許文献３等に記載されたゼラチンスポンジでも、架橋が施されている
しかしながら、このように架橋されたゼラチンスポンジは、柔軟性に欠けることから成形性に劣り、また、皮膚等の軟組織の再生に用いることが困難であったり、移植時に患部によく密着させることができなかったりする等の問題点があった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−１９３３２８号公報
【特許文献２】特開平９−１７３３６２号公報
【特許文献３】特開２００２−７１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、架橋されたゼラチンからなる多数の微細小孔を有するゼラチンスポンジであって、ＪＩＳ  Ｋ  ７２２０に準拠した方法により測定した圧縮弾性率が０．０１〜１０ＭＰａであるゼラチンスポンジである。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明のゼラチンスポンジは、架橋されたゼラチン（以下、架橋ゼラチンともいう）からなる。
上記ゼラチンとしては特に限定されないが、牛、豚、鶏、鮭等の骨、腱、皮等に由来するものを用いることができる。
【００１０】
上記ゼラチンは、酸処理又はアルカリ処理されていることが好ましい。酸処理されたゼラチンは正電荷に、アルカリ処理されたゼラチンは負電荷に帯電することから、この電荷を利用すれば、本発明のゼラチンスポンジに、静電結合により各種の生理活性物質を変性させることなく結合することが可能となる。このような生理活性物質が結合したゼラチンスポンジを再生医療用基材として用いれば、ゼラチンスポンジの分解にあわせて生理活性物質が徐放され、極めて高い治療効果を得ることができる。
上記静電結合により本発明のゼラチンスポンジに結合できる生理活性物質としては、生理的条件下において正又は負に帯電しているものであれば特に限定されず、例えば、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２等のサイトカイン；ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＭＭＰＩ、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）等が挙げられる。
【００１１】
上記ゼラチンを酸処理する方法としては特に限定されず、例えば、塩酸、硫酸等の酸溶液中にゼラチンを溶解して１０〜２４時間程度処理した後、水洗して、酸性水で抽出する方法等が挙げられる。
上記ゼラチンをアルカリ処理する方法としては特に限定されず、例えば、ゼラチンを水酸化カルシウム水溶液中に２０℃、３０〜１００日間浸漬した後、水洗して、中性水で抽出する方法等が挙げられる。
なお、ゼラチン及びゼラチンの酸処理方法並びにアルカリ処理方法は、ゼラチンの由来によって適宜選択することが好ましい。例えば、牛骨由来のゼラチンはアルカリ処理を施すのに適しており、また、豚皮由来のゼラチンは、酸処理とアルカリ処理のいずれを施すにも適している。
【００１２】
上記架橋ゼラチンは、上記ゼラチンを架橋することにより得ることができる。架橋の方法としては特に限定されず、例えば、真空熱脱水法、乾熱法、γ線照射法、紫外線照射法、電子線照射法、Ｘ線照射法、架橋剤を用いる方法等が挙げられる。なかでも、ゼラチンスポンジの全体が均一の架橋度となるように架橋できることから架橋剤を用いる方法が好適である。
【００１３】
上記架橋剤としては特に限定されず、例えば、グルタルアルデヒド、ホルマリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。
【００１４】
上記架橋ゼラチンの含水率の好ましい下限は９０％、好ましい上限は９９．８％である。架橋ゼラチンの含水率は、ゼラチンの架橋度に対応しており、架橋度が高いほど含水率は低くなる。
含水率が９０％未満であると、得られるゼラチンスポンジを再生医療用基材として用いる場合に、移植に適する柔軟性を有しないことがあり、９９．８％を超えると、得られるゼラチンスポンジが培養液やバッファー中で強度を保つことができないことがある。より好ましい下限は９５％、より好ましい上限は９８％である。
【００１５】
本発明のゼラチンスポンジは、上記架橋ゼラチンからなるものであって、多数の微細小孔を有するものである。多数の微細小孔を有する構造であることにより、本発明のゼラチンスポンジを再生医療用基材として用いる場合に、細胞を播種したときには細胞が微細小孔内に浸入して接着し、三次元的に伸展することが可能となり、また、細胞を播種することなく移植した場合にも、周辺の細胞が容易に侵入することができる。更に、接着した細胞へ充分な栄養を供給することが可能となり、細胞を正常に増殖、分化させることができる。
【００１６】
本発明のゼラチンスポンジの微細小孔の平均孔径としては、再生医療用基材として再生しようとする組織又は器官により最適な値を選択することができるが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５００μｍである。１０μｍ未満であると、ゼラチンスポンジの内部に細胞が侵入できず細胞接着性が極端に劣ったり、接着した細胞が三次元的に伸展できなかったりすることがあり、５００μｍを超えると、細胞の密度が低くなり組織又は器官を再生できないことがある。
【００１７】
本発明のゼラチンスポンジは、ＪＩＳ  Ｋ  ７２２０に準拠した方法により測定した圧縮弾性率の下限が０．０１ＭＰａ、上限が１０ＭＰａである。０．０１ＭＰａ未満であると、生体内に移植した場合に形状を維持することができず、１０ＭＰａを超えると、柔軟性に劣り、成形性に欠けるほか、皮膚等の軟組織の再生に用いることが困難であったり、移植時に患部によく密着させることができなかったりする。好ましい下限は０．０５ＭＰａ、好ましい上限は２ＭＰａである。
【００１８】
本発明のゼラチンスポンジは、横編地、縦編地、組紐、織地、不織布等の補強材により補強されていてもよい。補強材により補強することにより、強度が向上し、取扱い性等が向上する。上記補強材を構成する材料と本発明のゼラチンスポンジを構成する材料とは同一であってもよいし、異なっていてもよいが、生体内吸収性高分子材料からなることが好ましい。
上記上記生体内吸収性高分子材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン、乳酸−グリコール酸共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、乳酸−ε−カプロラクトン共重合体、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子；デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。
【００１９】
本発明のゼラチンスポンジは、セラミック等のフィラーを配合することにより、圧縮抵抗性等の機械的物性を向上させてもよい。
上記フィラーとしては、例えば、ハイドロキシアパタイト、トリリン酸カルシウム（α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ）、アルミニウム、ジルコニア等からなるもの等が挙げられる。
【００２０】
本発明のゼラチンスポンジを製造する方法としては、例えば、架橋剤を含有し、ゼラチン濃度が３重量％以下であるゼラチン水溶液を調製する工程と、上記ゼラチン水溶液を、ホモジナイザーを用いて３０００〜１００００ｒｐｍの回転数で攪拌して発泡させる工程と、上記発泡ゼラチン水溶液を凍結する工程と、上記凍結した発泡ゼラチン水溶液を凍結乾燥してスポンジ状成形体を得る工程とを有する方法が好適である。このような製造方法によれば、上述の圧縮弾性率を実現した極めて柔軟な本発明のゼラチンスポンジを製造することができる。
このようなゼラチンスポンジの製造方法もまた、本発明の１つである。
【００２１】
本発明のゼラチンスポンジの製造方法では、まず、架橋剤を含有し、ゼラチン濃度が３重量％以下であるゼラチン水溶液を調製する工程を行う。架橋剤を含有するゼラチン水溶液を用いることにより、後述する工程において、成形体の形成と同時にゼラチンの架橋反応を進めることができる。このように架橋剤を予めゼラチン水溶液中に含有させた状態で成形体の形成を行うことにより、従来から行われていたいったん未架橋の成形体を得てから架橋を行う方法に比べて、極めて柔軟性の高いゼラチンスポンジが得られる。
上記架橋剤の濃度としては特に限定されず、架橋剤の種類に応じて、得られるゼラチンスポンジの含水率が９０〜９９．８％の範囲内になるように選択する。
【００２２】
上記ゼラチン水溶液のゼラチン濃度も、得られるゼラチンスポンジの圧縮弾性に大きく影響する。ゼラチン濃度が３重量％未満であると、得られるゼラチンスポンジは、圧縮弾性率が高く、柔軟性に劣るものとなる。ゼラチン濃度の下限は特に限定されないが、０．１重量％未満であると、成形体が得られないことがある。
【００２３】
本発明のゼラチンスポンジの製造方法では、次いで、上記ゼラチン水溶液を、ホモジナイザーを用いて３０００〜１００００ｒｐｍの回転数で攪拌して発泡させる工程を行う。
発泡時のホモジナイザーの回転数も、得られるゼラチンスポンジの圧縮弾性及び微細小孔の孔径に大きく影響する。回転数が３０００ｒｐｍ未満であると、ほとんど発泡せず、得られるゼラチンスポンジは、微細小孔の孔径が小さく、また、圧縮弾性率が高く柔軟性に劣るものとなる。１００００ｒｐｍを超えると、得られるゼラチンスポンジの微細小孔の孔径が小さくなることがある。
上記ホモジナイザーによる攪拌は、少なくとも１０秒間以上行うことが好ましい。１０秒間未満であると、均一な発泡状態を得ることができないことがある。より好ましくは３分間以上である。
【００２４】
本発明のゼラチンスポンジの製造方法では、次いで、上記発泡ゼラチン水溶液を凍結する工程を行う。具体的には、適当な大きさの型枠に流延して、この状態で凍結する。得られるゼラチンスポンジの大きさ、形状は、このときの型枠の形状によりほぼ決まる。上記凍結の温度としては特に限定されないが、発泡状態が変化しない程度の短時間で凍結させるために、−４０℃程度であることが好ましい。
【００２５】
本発明のゼラチンスポンジの製造方法では、次いで、上記凍結した発泡ゼラチン水溶液を凍結乾燥してスポンジ状成形体を得る工程を行う。上記凍結乾燥の条件としては特に限定されず、例えば、−４０℃、０．１Ｔｏｒｒの条件で凍結乾燥することが好ましい。
【００２６】
なお、得られたゼラチンスポンジは、架橋剤による架橋を行っていることから、架橋剤の反応末端を処理して毒性を除去することが好ましい。例えば、架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いた場合には、グリシン水溶液等を用いて洗浄することにより、反応末端を失活させて毒性を除去することができる。
【００２７】
本発明のゼラチンスポンジは、架橋されたゼラチンからなり、極めて柔軟であることから、再生医療用基材として用いた場合に、成形性に優れ、移植時に患部によく密着させることができる。また、皮膚等の軟組織の再生にも好適に用いることができる。更に、原料となるゼラチンに酸処理又はアルカリ処理を施して、正電荷又は負電荷に帯電させた場合には、各種の生理活性物質を結合させて徐放させることもできる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
ゼラチンとして、新田ゼラチン社製のアルカリ処理品（アルカリ処理ゼラチン）を用いた。
アルカリ処理ゼラチンを蒸留水に溶解して３重量％のゼラチン水溶液を調製した。得られたゼラチン水溶液６０ｍＬと、０．１６重量％グルタルアルデヒド水溶液０．４ｍＬとを混合し、ホモジナイザーを用いて５０００ｒｐｍ、３分間攪拌することにより発泡させた。発泡したゼラチン水溶液を１２ｃｍ×１２ｃｍの型枠に流延した後、−４０℃にて凍結し、０．１Ｔｏｒｒの条件下で凍結乾燥を行いゼラチンスポンジを得た。
得られたスポンジ体を、０．１Ｎグリシン水溶液を用いて１時間洗浄を３回行った後、更に水洗し、再度凍結乾燥してゼラチンスポンジを得た。
【００３１】
（比較例１）
ゼラチンとして、新田ゼラチン社製のアルカリ処理品（アルカリ処理ゼラチン）を用いた。
アルカリ処理ゼラチンを蒸留水に溶解して３重量％のゼラチン水溶液を調製した。得られたゼラチン水溶液６０ｍＬと、０．１６重量％グルタルアルデヒド水溶液０．４ｍＬとを混合し、発泡したゼラチン水溶液を１２ｃｍ×１２ｃｍの型枠に流延した後、−４０℃にて凍結し、０．１Ｔｏｒｒの条件下で凍結乾燥を行いゼラチンスポンジを得た。
得られたスポンジ体を、０．１Ｎグリシン水溶液を用いて１時間洗浄を３回行った後、更に水洗し、再度凍結乾燥してゼラチンスポンジを得た。
【００３２】
（評価）
実施例１及び比較例１で得られたゼラチンスポンジについて、以下の方法により評価を行った。
結果を表１に示した。
【００３３】
（１）微小細孔の孔径測定
画像解析法により平均孔径を測定した。
【００３４】
（２）含水率の測定
含水時及び乾燥時のゼラチンスポンジの重量を測定し、下記式により含水率を算出した。
含水率（％）＝（含水時重量−乾燥時重量）／含水時重量×１００
【００３５】
（３）圧縮弾性率の評価
ＪＩＳ  Ｋ  ７２２０に準拠した方法により圧縮弾性率を測定した。
【００３６】
【表１】
2005213449.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、極めて柔軟であり、再生医療用基材として好適に用いることができるゼラチンスポンジを提供できる。