(57)【要約】【課題】ポリマー吸着剤、ならびに調製および使用方法の提供。【解決手段】中圧および高圧逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰＣ」）に使用すると好適な剛性ポリマーマトリックスを提供する選択された細孔率および浸透性特性を有する新規なマクロポーラスポリマーが開示される。当該ポリマーの調製方法も提供される。当該ポリマーは、大規模クロマトグラフィーカラム中の固定相として特に有用であり、長期間の使用中に圧力が増加することがなく、インスリンなどのターゲット生体分子に対して良好なクロマトグラフィー性能を維持する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）５０〜１００重量％の１種類以上のポリビニル芳香族モノマー、および
（ｂ）０〜５０重量％の１種類以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー
の重合モノマー単位を含むマクロポーラスポリマーであって；
当該マクロポーラスポリマーが
（ｉ）０．７〜２ｃｍ３／ｇの全細孔率；
（ｉｉ）０．７〜１．９ｃｍ３／ｇの使用可能なメソ細孔率；
（ｉｉｉ）５〜５０ミクロンの平均粒子サイズ直径；
（ｉｖ）２００〜１５００ｍ２／ｇの表面積；
（ｖ）１００ｂａｒの圧力において２，０００未満の流動抵抗値；
（ｖｉ）インスリン６０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの全インスリンキャパシティ、およびインスリン５０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの動的インスリンキャパシティを有し、
当該マクロポーラスポリマーが、７０〜９９．９％の範囲のインスリンまたはインスリン様分子の収率、および任意に９５〜１００％の範囲の前記インスリンまたはインスリン様分子の純度を達成することができ、さらに
当該マクロポーラスポリマーがシード拡張ポリマーである、マクロポーラスポリマー。
【請求項２】
ポリビニル芳香族モノマーが、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン、およびジビニルキシレンの１種類以上から選択される請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
モノ不飽和ビニル芳香族モノマーが、スチレンおよび（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル置換スチレンの１種類以上から選択される請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
ポリマーが：
（ａ）４００〜１０００ｍ２／ｇの表面積；
（ｂ）０．９〜１．４ｃｍ３／ｇの使用可能なメソ細孔率；
（ｃ）５〜２０ミクロンの平均粒子サイズ直径；
（ｄ）１００ｂａｒの圧力において２，０００未満の流動抵抗値；
（ｅ）インスリン６０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの全インスリンキャパシティ、およびインスリン５０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの動的インスリンキャパシティ、
を有する請求項１に記載のポリマー。
【請求項５】
（ａ）７５〜１００重量％の１種類以上のポリビニル芳香族モノマー、および
（ｂ）０〜２５重量％の１種類以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー
の重合モノマー単位を含む請求項１に記載のポリマー。
【請求項６】
ポリマーが、ジビニルベンゼンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンコポリマー、およびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーの１種類以上から選択される請求項１に記載のポリマー。
【請求項７】
混合された生体分子の水性溶液の精製または最終精錬を行う方法であって、水性溶液を、内径２〜１００ｃｍの液体クロマトグラフィーカラム中の請求項１記載のマクロポーラスポリマーと接触させることを含み、カラムが１００ｂａｒまでの圧力で操作される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中圧および高圧逆相液体クロマトグラフィー（「ＲＰＣ」）への使用に好適な剛性高性能ポリマー充填剤を提供する選択された細孔率および浸透性特性を有する新規なマクロポーラスポリマー、ならびにこれが使用されるカラムに関する。本明細書に開示されるポリマーは、インスリンおよびインスリン様化合物などの生体分子のクロマトグラフィー分離、または精錬に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明のポリマー樹脂は、現行技術の重大な欠点を克服する。インスリンおよびインスリン様分子の最終精錬（すなわち、最終精製段階における少量不純物の除去）は、従来的に、高圧条件下で操作されるＲＰＣシリカゲル充填剤を使用して実施されている。たとえば、Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）シリカ（Ｅｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＳＥ−４４５  ８０  Ｂｏｈｕｓ、Ｓｗｅｄｅｎにより市販されている）などのシリカ充填剤が、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法において分析規模から生産規模まで使用されている。用語「ＲＰＣシリカゲル」は、ゲル表面と生体分子との間の疎水性相互作用を促進するために疎水性リガンドで表面改質されている多孔質シリカ粒子を意味することを理解されたい。有用な疎水性リガンドの例としては、３〜２０個の炭素原子、最も典型的には４〜１８個の炭素原子のアルカンが挙げられるが、その他の疎水性リガンドも可能である。充填剤の細孔径は、生体分子が制限なしに拡散して材料を出入りすることができるために適切でなければならない。インスリンなどの生体分子の精製に有用な細孔径は、最も典型的には５０〜３００オングストロームである。
【０００３】
大規模精錬に有用な充填剤の粒子サイズは、混合物からの高純度生成物の回収が、最も高い可能収率、最も短いサイクル時間で可能となるために十分小さい必要がある。しかし、粒子サイズは、極度の圧力低下がクロマトグラフィーカラム中に発生するほど小さくなってはならない。ＲＰＣ製造クロマトグラフィーにおけるこれらの要求を満たす粒子サイズは、典型的には５〜５０ミクロンの範囲であり、最も典型的には１０〜２０ミクロンの範囲である。
【０００４】
重要なことは、製造プロセスにおいて遭遇する条件下で有用となるために、ＲＰＣ充填剤は、典型的には２〜１００ｃｍの内径を有するクロマトグラフィーカラムで発生する高い作業圧力に耐えるよう機械的に剛性である必要があることである。カラムは、２０ｂａｒ〜１００ｂａｒの圧力で一般に操作され、高い背圧は、クロマトグラフィー法で使用される小さい粒子サイズ、速い流速、および粘稠有機溶媒の組み合わせによるものである。工業用高圧液体クロマトグラフィーでは、樹脂上に直接動的な力を作用させるピストンを備えたカラムが一般に使用される。クロマトグラフィーカラム中の流体力学的圧力以上の力（圧力）が作用するように、ピストンが能動的に維持されることが好ましい。たとえば、Ｎｏｖａｓｅｐ製造のダイナミック・アキシャル・コンプレッション（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｘｉａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＤＡＣ）カラム（Ｎｏｖａｓｅｐ、ＢＰ−５０  ５４３４０  Ｐｏｍｐｅｙ，Ｆｒａｎｃｅにより市販されている）が大規模高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）法で使用されている。
【０００５】
高性能ＲＰＣシリカゲル充填剤は、典型的なプロセス条件下で遭遇する圧力に耐える機械的強度を有する。さらに、これらの材料を所望の粒子サイズおよび細孔サイズ特性を有するように構築して、最終精錬プロセスにおいてクロマトグラフィー性能（分解能、サイクル時間など）を得ることができる。しかし、これらの充填剤は、高ｐＨ条件下で操作することができず、そのため広範囲の生体分子分離における使用は厳しく限定される。製造プロセスの通常の部分として、クロマトグラフィーカラムに定位置でアルカリ溶液を使用する定置洗浄または定置消毒（それぞれ「ＣＩＰ」および「ＳＩＰ」）が望まれる。シリカゲル充填剤は、これらの条件下では長期間安定性を有さず、インスリン製造プロセスにおいて頻繁に交換する必要があり、結果として全体の経済性が低くなっている。シリカベースの材料のさらなる欠点は、シリカベースのマトリックス、またはこれに結合したリガンドの、ターゲット分子を含有する溶離液中への漏出である。交換の頻度が減少し、現在の生物医薬品プロセスにおいて望まれる洗浄プロトコルに耐えることができるために十分な、化学的耐久性および機械的耐久性の両方を有するクロマトグラフィー精錬用樹脂が必要とされている。
【０００６】
合成ポリマーをベースとするクロマトグラフィー充填剤は、強アルカリ条件による化学的な影響を受けない。これらの材料は典型的には、広範囲のｐＨ条件にわたって操作可能であり、生体分子の分離においてはシリカベースの材料よりも有用性が高い。ポリマー樹脂は、高ｐＨ溶液を使用して積極的に洗浄することができ、そのためカラム寿命が改善され、その結果、生物医薬品製造プロセス全体の経済性が改善される。さらに、シリカベースの充填剤を用いては不可能な方法において、ポリマー充填剤を用いて高ｐＨの移動相を使用することができるので、開発科学者は、効率的な生物医薬品製造プロセスを設計するに際して、用いるツールが増えることとなる。ある種の分子は高ｐＨ条件下で溶解性が改善され、プロセス中のカラム容量およびクロマトグラフィー選択性も改善される。
【０００７】
しかし、既存のポリマー材料の欠点は、最新式のＲＰＣシリカゲルによって得られる優れたクロマトグラフィー性能および圧力安定性の組み合わせを同時には有さないことである。「優れたクロマトグラフィー性能」とは、高い収率−純度を、高スループットで、最小限のサイクル時間において得ることを意味する。「圧力安定性」とは、プロセス中に遭遇する高圧条件下での顕著な変形に耐える充填材の能力を意味する。ゲル粒子が顕著に変形すると、充填床の空隙体積（したがって媒体の浸透性）が減少して、それによって、背圧が増加し、カラムを通過する溶媒の許容される流速が低下する。これによってプロセス中のサイクル時間および処理能力が低下する。
【０００８】
インスリンなどの化合物の最終精錬のためのクロマトグラフィー性能は、高収率、高純度、速いサイクル時間、および高スループット（スループットは収率、カラム容量、およびサイクル時間の組み合わせである）を表す４つの頂点を有する四面体で視覚化されて説明されることが多い。本発明が対処する問題は、上記４つの基準に適合し、一方１００ｂａｒまでの圧力にさらされた場合に顕著な変形に抵抗することができる能力を同時に示すことによって、最終精錬ステップにおけるクロマトグラフィー性能を実現するポリマー樹脂を提供することである。
【０００９】
高圧下で使用されるＲＰＣポリマーは、Ｌｌｏｙｄ，Ｌ．Ｌ．およびＷａｒｎｅｒ，Ｆ．Ｐ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、Ｖｏｌ．５１２、ｐｐ３６５−３７６（１９９０）、およびＬｌｏｙｄ，Ｌ．Ｌ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、Ｖｏｌ．５４４、ｐｐ２０１−２１７（１９９１）に記載されている。これらの参考文献には、壁効果がないことによるポリマーの圧密性によってさらなる大きな圧力の蓄積が予想される大規模の高圧ＤＡＣクロマトグラフィーカラムにおける操作は開示されていない。
【００１０】
インスリン精錬に使用される逆相ポリマー材料が、米国特許第６，７１０，１６７号に記載されている（以後、特許文献１）。この特許は、８０ｂａｒもの高圧における逆相ポリマー材料の使用に関するが、４０ｂａｒを超える圧力におけるポリマー材料に関する実現可能な開示を提供していない。特許文献１に示される８０ｂａｒにおける圧力安定性データは、シリカベースの材料についてのみであり、ポリマー材料については示されておらず、これが本発明の主題である。さらに、インスリン分離においてシリカ対照標準のクロマトグラフィー性能に見合う、または超える可能性が示されている唯一のポリマー樹脂は、４０ｂａｒの圧力でさえも顕著に変形性であった。後述の実施例の１つでは特許文献１中のポリマー材料が１００ｂａｒの圧力で実質的に変形性であることを示している。
【００１１】
特許文献１に記載される逆相ポリマー材料のさらなる欠点は、開示される最高カラム負荷レベルが、媒体１リットル当たり６ｇのインスリンであることである。より高い負荷キャパシティのポリマー材料が当技術分野において必要とされている。高い負荷キャパシティは、より高いスループット、および製造コストの削減につながる。
【００１２】
逆相ポリマー材料は、米国特許第６，３８７，９７４号（以後、特許文献２）にも開示されている。この特許に、８０〜１００ｂａｒもの高圧でのプロセスにおける逆相ポリマー材料が挙げられているが、６０ｂａｒを超える圧力における実現可能な開示を提供していない。本発明の一実施例においては、特許文献２によって得ることができる市販材料が、１００ｂａｒの圧力で実質的に変形性であることを示している。
【００１３】
特許文献２のさらなる欠点は、インスリンの最終精錬／精製に対する実現可能な開示を提供していないことである。本明細書における一実施例では、特許文献２に記載の市販材料が収率−純度性能で所望のレベルが実現されないことを示している。
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，７１０，１６７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３８７，９７４号明細書
【特許文献３】米国特許第４，３３６，１７３号明細書
【非特許文献１】Ｌｌｏｙｄ，Ｌ．Ｌ．およびＷａｒｎｅｒ，Ｆ．Ｐ．、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．」、Ｖｏｌ．５１２、ｐｐ３６５−３７６（１９９０）
【非特許文献２】Ｌｌｏｙｄ，Ｌ．Ｌ．、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．」、Ｖｏｌ．５４４、ｐｐ２０１−２１７（１９９１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、またインスリンおよびインスリン様化合物などの生体分子の最終精錬に好適なマクロポーラスポリマー充填剤を提供する。この充填剤によって１００ｂａｒまでの圧力に曝露した場合の圧力安定性および低い変形性；高分解能のための小さな粒子サイズ、および最小限の圧力低下のための均一な粒子サイズ分布；ターゲット分子の高い負荷能；および最小限のサイクル時間でターゲット分子を高収率−純度で得る能力を同時に提供する。高収率−高純度を実現するために必要な小さな粒子サイズの充填剤は本質的に高い背圧を発生させるので、１００ｂａｒまでの圧力安定性が、小さく均一な粒子サイズの充填剤についても提供される。
【００１６】
一態様において、本発明は、本明細書に記載の逆相ポリマー樹脂上でのインスリンまたはインスリン様分子の精製方法を提供する。この方法は、逆相ポリマー樹脂の単独使用、またはシリカとの併用を含む。本発明の一態様において、ポリマー樹脂は単分散性ポリマー樹脂である。単分散性樹脂は、ふるい分け、ジェッティング、およびシード拡張（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）技術などの当技術分野の種々の方法によって作製される。一態様において、樹脂の細孔サイズは２００〜８００オングストロームであり、細孔容積は０．８〜２．４ｃｃ／ｃｃである。充填床の「流動抵抗」によって測定される樹脂の圧力安定性は、１００ｂａｒの圧力で２，０００以下である（用語「流動抵抗」は媒体浸透性の逆数であり、後の段落で定義される）。
【００１７】
本発明の他の態様において、本明細書に記載の逆相ポリマー樹脂を使用する、少なくとも９０％の純度インスリンまたはインスリン様分子を得る方法が提供される。この樹脂によって、８５％以上の収率のインスリンまたはインスリン様分子が提供される。本発明の他の態様において、小さな単分散性ポリマー樹脂を使用して、ある純度のインスリンまたはインスリン様分子を得る方法が提供される。この態様では、単分散性ポリマー樹脂は、７５％を超える前記インスリンまたはインスリン様分子の収率、および少なくとも９８％の純度を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の態様において、シード拡張法によって製造された小さく均一な粒子サイズの圧力安定性逆相ポリマー樹脂を使用してクロマトグラフィーが行われる。シード拡張法は、０．５ミクロンから２００ミクロン超までの均一なポリマービーズを作製するために使用される。最終精錬には、粒子は５〜５０ミクロンのサイズのものが特に有用であり、５〜２０ミクロンのサイズの粒子が最も有用である。カラムクロマトグラフィー用途では、狭い粒子サイズのビーズによってカラム分解能（すなわち収率−純度）が劇的に改善される。単分散性の粒子サイズに関連する他の利点としては、カラムの効率的な充填、均一な流れ、および低い背圧が挙げられる。粒子形状、細孔サイズ、および表面積は、本明細書に記載の技術を使用して有利に制御される重要な別の一群の物理的性質である。これらの技術によって、最終精錬ステップにおける優れたクロマトグラフィー分離能、高圧条件下での変形に対する抵抗性、ならびに低い背圧および高分解能のための均一な粒子サイズを有するポリマー樹脂の形成が可能となる。
【００１９】
シード添加拡張重合方法では、最初に膨潤性単分散性シードを、安定剤と共に連続水性相中に懸濁させる。モノマー含有開始剤（通常はエマルジョンの形態）を次いで加えて、シードをより大きなサイズに膨潤させる。シードはサイズが均一であり同一組成を有するので、これらのシードは、同じ膨潤能力を有し、それぞれ個々のシードについて同量のモノマーを熱力学的に吸収する。したがって、均一なモノマー液滴が得られる。加熱温度で懸濁重合を行うと、均一なポリマー粒子が形成される。
【００２０】
シードは、テンプレートとして機能し、モノマーを容易に吸収することができるポリマーおよび／またはオリゴマーを含有する均一な粒子である。結果として得られる最終ポリマーの粒子サイズは、初期シードのサイズ、サイズ分布、および膨潤性などの特性によって主に決定される。シード粒子に関しては多数の要求事項が存在する。第１に、シードがテンプレートとして使用されるので、そのサイズ分布が均一であり、それによって、最終的に伸張されたポリマー粒子の粒子サイズ分布が同様に均一とならなければならない。第２に、シードは、溶媒（ポロゲン）をも含有するモノマーを迅速かつ均一に吸収することができるべきである。全体のポリマープロセスにおいて膨潤プロセスが最も時間を消費するステップであることが多いので、迅速な膨潤が特に望まれる。第３に、シードは、吸収するモノマーおよび最終ポリマーの両方に対して化学的に混和性となるべきであり、さもないと、シードが重合中に放出されて、最終生成物中に穴が残る場合がある。最後に、シードは、最終ポリマー樹脂製品の化学的、物理的、または性能の特性に対して悪影響を生じてはならない。本発明の一態様において、シードは、単分散であり、組成がオリゴマーであり、最適なサイズおよび高い膨潤能力も有するシードであって、最小回数の拡張で目標ポリマー樹脂生成物のサイズに適合することができる。本発明の他の態様において、本発明に使用される樹脂の製造方法は、連鎖移動剤としてのチオール類の使用を含む。
【００２１】
ポリマー粒子を生成するための数種類のシード添加拡張重合方法が存在し、それらのそれぞれを本明細書に開示される本発明と組み合わせて使用することができる。そのような方法の１つは、２段階「活性化」シード添加拡張重合（「ウゲルスタッド（Ｕｇｅｌｓｔａｄ）法」）と呼ばれている。米国特許第４，３３６，１７３号。この方法は、組成がポリマーであるシードで出発する。このポリマーシードは、最初に、全体の膨潤能力を増大させるために、高い水不溶性の有機化合物または膨潤剤を使用して「軟化」すなわち予備膨潤させる必要がある。これにより、得られたシード（膨潤剤を含有する）は、次いで純粋なポリマーシード自体よりも大きな体積のモノマーを吸収することができる。
【００２２】
本発明の他の態様において、改良された１段階膨潤／重合方法を使用し、組成がオリゴマーであるシードを使用して、樹脂が製造される。オリゴマーシードが、本発明による教示のように容易に入手可能であれば、膨潤過程がより容易になり、サイクル時間がウゲルスタッドの２段階膨潤方法よりもはるかに短縮される。オリゴマーシードを使用する本発明の１段階膨潤／重合方法は、前述の性能特性を有する最終精錬に好適な逆相ポリマー粒子を合成するための重要な手段である。
【００２３】
これらの技術は、最終精錬精製に好適なマクロポーラス逆相ポリマー樹脂を提供することにより本発明により対処される問題の解決に使用される。このポリマー樹脂によって、最終精錬ステップにおいて、高品質ＲＰＣシリカゲルと同等の性能特性を有するクロマトグラフィー性能が実現され、同時に１００ｂａｒまでの圧力に曝露した場合にＤＡＣカラム中での顕著な変形に抵抗する能力が示される。
【００２４】
これに関して、本発明は、（ａ）５０〜１００重量％の１種類以上のポリビニル芳香族モノマー、および（ｂ）０〜５０重量％の１種類以上のモノ不飽和ビニル芳香族モノマーの重合モノマー単位を含むマクロポーラスポリマーであって；前記ポリマーが、（ｉ）０．７〜２ｃｍ３／ｇの全細孔率；（ｉｉ）０．７〜１．９ｃｍ３／ｇの使用可能なメソ細孔率；（ｉｉｉ）２〜５０ミクロンの平均粒子サイズ直径、（ｉｖ）２００〜１５００ｍ２／ｇの表面積；（ｖ）１００ｂａｒの圧力において２，０００未満の流動抵抗値；（ｖｉ）インスリン５０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの全インスリンキャパシティ、およびインスリン５０〜１５０ｇ／ポリマー１リットルの動的インスリンキャパシティ；ならびに（ｖｉｉ）７０〜９９．９％の範囲のインスリンまたはインスリン様分子の収率、および任意に９５〜１００％の範囲の前記インスリンまたはインスリン様分子の純度；を得る能力を有する、ポリマーを提供する（異なる供給元からのインスリン混合物は、異なる不純物特性を有し、それ自体で収率−純度の差が生じることがあり、そのため本発明との比較として高品質シリカゲルが対照標準として示されていることを理解されたい）。
【００２５】
本発明は、また０〜５０％のモノビニル芳香族モノマー、および５０〜１００％のポリビニル芳香族モノマーとから、４０〜１００％のポロゲン、および０．５〜１０％のフリーラジカル重合開始剤の存在下、水性懸濁液中で重合するステップを含むマクロポーラスポリマーを調製するためのシード添加拡張重合方法を提供し、ここですべての％量はモノマーの全重量を基準としている。
【００２６】
本発明は、インスリンまたはインスリン様分子などの生体分子混合物の水性溶液の最終精錬方法であって、前記水性溶液を、前述のマクロポーラスポリマーと、２〜１００センチメートルの内径を有する液体クロマトグラフィーカラム中で接触させるステップを含み、前記カラムが１０〜１００ｂａｒの圧力で操作される方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本明細書全体で使用される場合、他に明記しない限り、以下の用語は以下の意味を有するものとする。
【００２８】
用語「アルキル（メタ）アクリレート」は、対応するアクリレートエステルまたはメタクリレートエステルのいずれかを意味し；同様に、用語「（メタ）アクリル」は、アクリル酸またはメタクリル酸のいずれか、および対応する誘導体、たとえばエステルまたはアミドを意味する。他に明記しない限り、記載のすべての％値は、問題となるポリマーまたは組成物の全重量を基準にした重量パーセント（％）の単位で表される。用語「コポリマー」は、位置異性体を含めた２種類以上の異なるモノマーの単位を含むポリマー組成物を意味する。本明細書では次のような略語が使用される：ｇ＝グラム；ｐｐｍ＝重量／体積による百万分率、ｃｍ＝センチメートル、ｍｍ＝ミリメートル、ｍｌ＝ミリリットル、Ｌ＝リットル。他に明記しない限り、挙げられている範囲は両端の値を含み、組み合わせることが可能であると見るべきであり、温度の単位は摂氏温度（℃）である。
【００２９】
高性能逆相液体クロマトグラフィーによる（たとえば直径２〜１００ｃｍのカラム中における）生体分子の最終精錬に有用な本発明のポリマーは、典型的には平均粒子サイズが２〜１５０、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜７５、最も好ましくは５〜２０μｍである。
【００３０】
本発明のマクロポーラスポリマーは、典型的にはシード添加拡張重合によって生成され、２００〜１５００、好ましくは３００〜１２００、より好ましくは４００〜１０００平方メートル／グラム（ｍ２／ｇ）の表面積を有する。このマクロポーラスポリマーは好ましくは、たとえば、米国特許第４，３８２，１２４号に開示される種類のものであり、たとえばこれによると、モノマーにとって溶媒であるがポリマーにとっては非溶媒であるポロゲン（「相エキステンダー」または「沈殿剤」とも呼ばれる）の存在によってポリマービーズ中に細孔が導入される。米国特許第４，３８２，１２４号により調製されるような従来のマクロポーラスポリマーは、典型的には広範囲のポロゲンの種類、モノマー相に対するポロゲン濃度、モノマーの種類、架橋性モノマーの種類、架橋剤レベル、重合開始剤、および開始剤濃度の使用を伴う。しかし、以下のシード添加拡張重合技術に、ある選択されたポロゲンの種類、およびモノマー相に対する濃度、特定のモノマーおよび選択されたレベルの架橋剤、ならびに選択された重合開始剤濃度を併用することで調製されたマクロポーラスポリマーが、予期せぬ剛性ポリマー構造を有し、高性能逆相液体クロマトグラフィーによる生体分子の分離および精製における改善された性能に帰着するという発見に、本発明は基づいている。
【００３１】
本発明に有用なマクロポーラスポリマーの調製に使用することができる好適なポリビニル芳香族モノマーとしては、たとえば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルナフタレン、ジビニルアントラセン、およびジビニルキシレンから選択される１種類以上のモノマーが挙げられ；上記架橋剤のそれぞれの種々の位置異性体がいずれも好適であると理解され；好ましくはポリビニル芳香族モノマーはジビニルベンゼンである。典型的にはマクロポーラスポリマーは、５０〜１００％、好ましくは６５〜１００％、より好ましくは７５〜１００％のポリビニル芳香族モノマー単位を含む。
【００３２】
任意に、脂肪族架橋性モノマー、たとえばエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、グリシジルメタクリレート、ジエチレングリコールジビニルエーテル、およびトリビニルシクロヘキサンも、ポリビニル芳香族架橋剤に加えて使用することができる。使用される場合、これらの脂肪族の架橋性モノマーは、典型的には、重合単位として、マクロポーラスコポリマーを生成するために使用される全モノマー重量を基準にして、マクロポーラスポリマーの０〜２０％、好ましくは０〜１０％、より好ましくは０〜５％を構成する。
【００３３】
本発明に有用なマクロポーラスコポリマーの調製に使用することができる好適なモノ不飽和ビニル芳香族モノマーとしては、たとえば、スチレン、α−メチルスチレン、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−置換スチレン、ハロ置換スチレン（たとえば、ジブロモスチレンおよびトリブロモスチレン）、ビニルナフタレン、およびビニルアントラセンが挙げられ；好ましくはモノ不飽和ビニル芳香族モノマーはスチレンおよび（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−置換スチレンの１種類以上から選択される。好適な（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−置換スチレンとしては、たとえば、エチルビニルベンゼン、ビニルトルエン、ジエチルスチレン、エチルメチルスチレン、およびジメチルスチレンが挙げられ；前述のビニル芳香族モノマーのそれぞれの種々の位置異性体がいずれも好適であると理解され；好ましくはモノ不飽和ビニル芳香族モノマーはエチルビニルベンゼンである。典型的には、マクロポーラスポリマーは、０〜５０％、好ましくは０〜３５％、より好ましくは０〜２５％のモノ不飽和ビニル芳香族モノマー単位を含む。
【００３４】
任意に、非芳香族ビニルモノマー、たとえば脂肪族不飽和モノマー、たとえば、塩化ビニル、アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸、および（メタ）アクリル酸のアルキルエステル（アルキル（メタ）アクリレート）も、ビニル芳香族モノマーに加えて使用することができる。使用される場合、非芳香族ビニルモノマーは、典型的には、重合単位として、マクロポーラスコポリマーを形成するために使用される全モノマー重量を基準にして、マクロポーラスコポリマーの０〜２０％、好ましくは０〜１０％、より好ましくは０〜５％を構成する。
【００３５】
好ましいマクロポーラスポリマーは、ジビニルベンゼンコポリマー、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンコポリマー、およびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーの１種類以上から選択され；より好ましくはジビニルベンゼン−エチルビニルベンゼンおよびスチレン−エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンポリマーである。
【００３６】
本発明のマクロポーラスポリマーの調製に有用なポロゲンとしては、疎水性ポロゲン、たとえば（Ｃ７〜Ｃ１０）芳香族炭化水素および（Ｃ６〜Ｃ１２）飽和炭化水素；ならびに親水性ポロゲン、たとえば（Ｃ４〜Ｃ１０）アルカノールおよびポリアルキレングリコールが挙げられる。単一のポロゲン系または混合したポロゲン系のいずれをも使用することができる。好適な（Ｃ７〜Ｃ１０）芳香族炭化水素としては、たとえば、トルエン、エチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、およびｐ−キシレンの１種類以上が挙げられ；上記炭化水素のそれぞれの種々の位置異性体がいずれも好適であると理解される。好ましくは芳香族炭化水素は、トルエンまたはキシレン、あるいはキシレン類の混合物、またはトルエンとキシレンとの混合物である。好適な（Ｃ６〜Ｃ１２）飽和炭化水素としては、たとえば、ヘキサン、ヘプタン、およびイソオクタンの１種類以上が挙げられ；好ましくは、飽和炭化水素はイソオクタンである。好適な（Ｃ４〜Ｃ１０）アルカノールとしては、たとえば、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、ｎ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、メチルイソブチルカルビノール（４−メチル−２−ペンタノール）、ヘキサノール、およびオクタノールの１種類以上が挙げられ；好ましくは、アルカノールは１種類以上の（Ｃ５〜Ｃ８）アルカノールから選択され、たとえばメチルイソブチルカルビノールおよびオクタノールから選択される。好ましくは、ポロゲン混合物は、（Ｃ５〜Ｃ８）アルカノールの１種類以上から選択される親水性ポロゲンと、（Ｃ７〜Ｃ１０）芳香族炭化水素の１種類以上から選択される疎水性ポロゲンとを含む。
【００３７】
典型的には、本明細書に記載の技術を使用すると、本発明のポリマーの調製に使用されるポロゲンの総量は、モノマー重量を基準にして、最も好ましくは４５〜１００％である。ポロゲンレベルが１００％を超えると、ＤＡＣカラム中の高圧条件（１００ｂａｒのピストン圧）でポリマーは低い流動抵抗値（高い変形性）を有する。これはポロゲンレベルが４５％未満から確認することができ、そのポリマーは、ウシインスリン結合試験（表１参照）によって測定されるクロマトグラフィー特性が低い。
【００３８】
本発明のポリマーの調製に有用な重合開始剤としては、モノマー可溶性開始剤、たとえば過酸化物、ヒドロペルオキシド、および関連する開始剤が挙げられ；たとえば、過酸化ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、クメンペルオキシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシド、カプロイルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエート（ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエートとも呼ばれる）、ｔｅｒｔ−アミルペルオクトエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルジペルフタレート、ジシクロヘキシルペルオキシジカーボネート、ジ（４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）ペルオキシジカーボネート、およびメチルエチルケトンペルオキシドが挙げられる。アゾ開始剤、たとえば、アゾジイソブチロニトリル、アゾジイソブチルアミド、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、アゾ−ビス（α−メチル−ブチロニトリル）、およびジメチル−、ジエチル−、またはジブチルアゾ−ビス（メチルバレレート）も有用である。好ましい過酸化物開始剤は、ジアシルペルオキシド、たとえば過酸化ベンゾイル、ならびにペルオキシエステル、たとえばｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートおよびｔｅｒｔ−ブチルペルベンゾエートであり；より好ましくは、開始剤は過酸化ベンゾイルである。過酸化物開始剤の好適な使用レベルは、ビニルモノマーの全重量を基準にして、０．５％〜１０％、好ましくは１〜９％、より好ましくは２〜７％、最も好ましくは３〜５％である。最も好ましくは、フリーラジカル開始剤が、モノマーの全重量を基準にして２〜７％で存在し、１種類以上のジアシルペルオキシドおよびペルオキシエステルから選択される。
【００３９】
本発明のマクロポーラスポリマーの調製に有用な分散剤および懸濁剤は、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖と、１〜２４個の炭素原子を含有する疎水性アルキル側鎖と、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖の各繰り返し単位を置換する平均で１〜８個、好ましくは１〜５個のエチレンオキシド基とを有し、アルキル側鎖が、ヒドロキシアルキルセルロース主鎖中の１００個の繰り返し単位当たり０．１〜１０個のアルキル基のレベルで存在する、非イオン界面活性剤である。ヒドロキシアルキルセルロース中のアルキル基は、１〜２４個の炭素を含有することができ、線状、分岐、または環状であってよい。より好ましくは、無水グルコース単位１００個当たり０．１〜１０個の（Ｃ１６）アルキル側鎖と、各無水グルコース単位を置換する約２．５〜４個のエチレンオキシド基とを含むヒドロキシエチルセルロースである。分散剤の典型的な使用レベルは、水相の全重量を基準にして約０．０１〜約４％である。
【００４０】
本発明のマクロポーラスポリマーの製造に有用な他の分散剤および懸濁剤は、親水性主鎖を含有するポリマーであって、２つの相の界面でそれらの親油性部分をモノマー相に向け、それらの親水性部分を水相に向けることができるポリマーである。このようなポリマー分散剤としては、セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デンプンなどが挙げられる。分散剤の混合物を使用することもできる。これらの他の分散剤は、ある程度多量の凝集物質またはその他の望ましくない物質を生成する傾向にあるため、あまり好ましくない。
【００４１】
任意に、マクロポーラスポリマーは、コーティングすることができ、あるいは公知の方法、たとえば従来のスルホン化、クロロメチル化、およびアミノ化によって種々の従来のイオン化可能官能基（弱酸官能基、たとばカルボン酸基；弱塩基官能基、たとえば第１級、第２級、または第３級アミン官能基；強酸官能基、たとえばスルホン酸基；強塩基官能基、たとえば第４級アンモニウムクロリド基またはヒドロキシド基）で後官能化することができる。
【００４２】
本発明のマクロポーラスポリマーは、向上した剛性ポリマー構造、および重合中にポリマー中に導入される選択された細孔率の結果である改善された浸透性（低流動抵抗）を特徴とする。浸透性（Ｋ）は、ダルシー（Ｄａｒｃｙ）の法則（式１）によりカラム中に発生する背圧と関連する：
ΔＰ／Ｌ＝μＶ／［Ｋ（ｄｐ）２］    式１
式中：
μ＝粘度（ミリパスカル・秒またはセンチポアズ）
Ｖ＝線速度（ｃｍ／時）
ΔＰ＝圧力低下（ｂａｒ）
Ｌ＝床高さ（ｃｍ）
ｄｐ＝ポリマーの平均粒子サイズ（μｍ）
【００４３】
上記変量の単位は、一般的な形態で表され、式１を無次元にするためには単位変換が必要であることが理解できるであろう。ポリマーの剛性が高いほど（すなわち圧密性が低いほど）、ポリマーの浸透性が高くなり、このため溶媒粘度、線速度、および粒子サイズのあらゆる所与の組み合わせで背圧が低くなる。クロマトグラフィー分離および精製の用途では典型的な層流条件下では、カラム中の背圧はカルマン（Ｃａｒｍａｎ）−コゼニーの式（式２）によって表現することもできる：
ΔＰ／Ｌ＝１５０・［（１−ε）２／ε３］・μＶ／（ｄｐ）２    式２
式中：ε＝粒子間空隙体積（ｃｍ３／ｃｍ３）
【００４４】
たとえば、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｇ．Ｇｕｉｏｃｈｏｎ、Ｓ．Ｇｏｓｈａｎ  Ｓｈｉｒａｚｉ、およびＡ．Ｋａｔｔｉ、アカデミック・プレス（１９９４）；および「Ｕｎｉｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｗ．Ｌ．ＭｃＣａｂｅ、Ｊ．Ｃ．ＳｍｉｔｈおよびＰ．Ｈａｒｒｉｏｔｔ、マグローヒル（１９８５）の参考文献は、ダルシーの法則およびカルマン−コゼニーの式（式１および２）に関するさらなる一般的および具体的詳細を知ることができる。
【００４５】
式１および式２を組み合わせると、クロマトグラフィーカラム中の浸透性（または流動抵抗）をポリマー樹脂床の粒子間空隙体積（すなわちポリマー粒子間の体積）と関係づけるできることが理解され；εはポリマー床の単位体積当たりの空隙体積として表される。この関係は式３で表される：
１／Ｋ＝１５０・［（１−ε）２／ε３］    式３
【００４６】
本発明の目的のため、ポリマーの特性「流動抵抗」値が浸透性の逆数になると定義する。この特性「流動抵抗」値は、中圧から高圧の条件下でポリマーがいかによく機能するかを示す指標であり：低い流動抵抗値は低い圧密性を示しており、高い流動抵抗値は圧密性が劣ることを示している。
【００４７】
さらに、ダルシーの法則によると、浸透性または流動抵抗のいずれかの式は一般に、粒子サイズの影響（式１におけるｄｐ）を含んでいる。本発明の目的の１つは、粒子サイズの影響とは無関係に、ポリマー剛性の増加によって改善された流動抵抗を提供することである。式１および２から求められるように、粒子サイズのみが減少すると、所与のポリマーにおいて、より高い背圧が発生すると理解される。
【００４８】
典型的には、本発明のマクロポーラスポリマーは、流動抵抗値（すなわち１／Ｋ）が、作業圧力１０ｂａｒ（中圧）において、７００から１，８００未満まで、好ましくは７００から１，５００未満まで、より好ましくは１，３００未満である。より高い圧力操作（たとえば６０ｂａｒ）では、マクロポーラスポリマーは、流動抵抗値が１，５００から７，０００未満まで、好ましくは１，５００から５，０００未満まで、より好ましくは４，５００未満となる。最高圧力操作（たとえば１００ｂａｒ）では、マクロポーラスポリマーは、流動抵抗値が１，５００から７，０００未満まで、好ましくは１，５００から５，０００未満まで、より好ましくは４，５００未満となる。ＲＰＣに使用するのに好適なマクロポーラスポリマーは、流動抵抗値が（ｉ）１０ｂａｒ圧の圧力で１，８００未満であり、（ｉｉ）６０ｂａｒの圧力で７，０００未満である。上記限度よりも大きな流動抵抗値を有するポリマーは、市販のＲＰＣカラムで見られるような中圧から高圧で十分な圧縮抵抗性が得られず、そのためスループットが低下し、操作中にカラムの圧力が上昇する。
【００４９】
本発明のマクロポーラスポリマーは、ポリマーの調製に使用されたポロゲンの種類および比率によって得られる選択された細孔率および孔径分布を特徴とする。細孔率は、マイクロメレティクス（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｅｔｉｃｓ）（商標）ＡＳＡＰ−２４００窒素ポロシメーター（Ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）を使用して測定される。ＩＵＰＡＣによる細孔の用語は以下の通りである：
ミクロ細孔＝２０オングストローム単位未満の細孔
メソ細孔＝２０〜５００オングストローム単位の細孔
マクロ細孔＝５００オングストローム単位を超える細孔
【００５０】
本発明の目的については、「使用可能な」ミクロ細孔は、５０オングストローム単位未満の直径の細孔として定義され、「使用可能な」メソ細孔は、５０〜５００オングストローム単位の直径を有する細孔として定義される。本明細書で使用される「使用可能な」細孔と、ＩＵＰＡＣ用語による細孔の定義との間のわずかな差は、本発明のマクロポーラスポリマーにおける対象となる生体分子の収着に対応するためには、５０オングストローム単位が（２０オングストローム単位と比較して）より好適で適切な区切れ目となるからである。
【００５１】
本発明のマクロポーラスポリマーは、典型的には全細孔率が０．７〜２、好ましくは０．９〜１．８、およびより好ましくは１．０〜１．７ｃｍ３／ｇである。典型的には、マクロポーラスポリマーは、使用可能なメソ細孔率が０．７〜１．９、好ましくは０．８〜１．７、およびより好ましくは０．９〜１．４ｃｍ３／ｇである。典型的には、マクロポーラスポリマーは、使用可能なミクロ細孔率が０〜０．５、好ましくは０〜０．３、より好ましくは０〜０．２、最も好ましくは０〜０．１ｃｍ３／ｇ未満である。典型的には、マクロポーラスポリマーは、マクロ細孔率が０〜０．６、好ましくは０〜０．５、より好ましくは０〜０．３ｃｍ３／ｇである。マクロ細孔率の値が０．６ｃｍ３／ｇを超えると、全キャパシティという点において、ターゲットとされた分子のサイズおよび形状を有する生体分子についてのポリマーの作用キャパシティが減少する。
【００５２】
インスリン精製能力は、類似のサイズおよび分子構造の生体分子についての大規模分離および精製に好適な媒体としてのポリマーマトリックスの能力の指標となる。
【００５３】
本明細書に実施例を提供する。すべての比率、部、およびパーセント値は、他に明記しない限り重量を基準にして表され、使用されるすべての試薬は、他に明記しない限り良好な工業品質のものである。実施例および表において使用される略語を、対応する説明と共に以下に示す：
ＭＩＢＣ＝メチルイソブチルカルビノール（４−メチル−２−ペンタノール）
ＤＶＢ＝ジビニルベンゼン（メタ／パラ異性体の混合物）
ＥＶＢ＝エチルビニルベンゼン（メタ／パラ異性体の混合物）
ＢＰＯ＝過酸化ベンゾイル
ｒｐｍ＝回転／分
ｖ／ｖ＝体積／体積
ｗ／ｖ＝重量／体積
μｍ＝ミクロン
ｎｍ＝ナノメートル
ｇ／Ｌ＝グラム／リットル
ｃｍ３／ｇ＝立方センチメートル／グラム
μｌ＝マイクロリットル
ＮＡ＝分析せず
【実施例１】
【００５４】
以下の代表的手順を使用して、本発明で使用する、単一サイズでサブミクロンのポリスチレン粒子、および単一サイズの３．０ミクロンのオリゴマーシードを生成する。Ｆｒａｚｚａら（米国特許第５，１４７，９３７号）が開発した乳化重合方法を使用して０．２５ミクロンのポリスチレン粒子を合成した。この方法は、界面活性剤のＡＥＲＯＳＯＬ  ＭＡ−８０（ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウム）を、ミセルおよび水溶性開始剤（過硫酸アンモニウム）の安定化のために使用することを含む。この反応は、不活性雰囲気下で行われ、モノマーおよび開始剤の全装填物が反応開始時にケトルに入れられる。ジヘキシルスルホコハク酸ナトリウムは水への溶解性が限られているが、水性相によく分散し、その結果、１％に満たない濃度でわずかに不透明な水性混合物が得られる。重合後に、０．２５ミクロンの粒子サイズの、安定で青みがかったラテックスがほぼ１００％の収率で得られる。粒子サイズは、ＢＩ−９０またはＢＩ−９０プラスまたはＣＨＤＦ−２０００（キャピラリー流体力学的分別（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ））によって測定した。
【００５５】
（０．６ミクロンのオリゴマーシードの合成）
０．５ミクロンのオリゴマーシードを、０．２５ミクロンのポリマーシードから、シード乳化重合（米国特許第５，８４６，６５７号）に基づいて合成した。
【００５６】
【表１】
2005329401.tif 000002
【００５７】
混合物Ａをリアクターに加え、撹拌しながら８８℃に加熱した。撹拌しながら混合物Ｂ、Ｃ、およびＤをリアクターに３時間かけて加え、その後温度を８８℃で維持し、９０分間撹拌した。リアクターの内容物を６５℃まで冷却し、１時間撹拌し、その後リアクターの内容物を室温まで冷却した。得られたエマルジョンポリマー粒子は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＢＩ−９０によって測定した直径が０．５ミクロンであった。
【００５８】
以下の例のようにして３ミクロンのオリゴマーシードの合成を行うことができる：
混合物Ａを撹拌しながらリアクターに装填した。混合物Ｂを均一化して、上記リアクターに装填した。ヘキサンチオールがオリゴマーシードに完全に吸収されてから、エマルジョンＣをリアクターに装填した。次いでリアクターを室温で２０時間撹拌し、次いで８５℃に１時間加熱し、次いで９５℃にもう１時間加熱した。室温に冷却すると、３ミクロンの粒子サイズの均一なオリゴマー粒子が得られた。
【００５９】
【表２】
2005329401.tif 000003
【実施例２】
【００６０】
以下の実施例は、本発明の逆相ポリマー樹脂の調製を示しており、この樹脂は生体分子の分離および最終精錬における充填剤として使用される。
【００６１】
シード装填物を、５００ｍｌビーカー中で、以下の成分を混合することによって調製した：２１．３ｇの実施例１の固形分３０．１％の３．０ミクロンオリゴマーシード、８．５ｇの１％ソルゾル（ｓｏｌｕｓｏｌ）溶液、および１０５．５ｇの脱イオン水。
シード溶液を、メカニカルスターラーおよび熱電対を取り付けた１．８リットルのＢｕｃｈｉステンレス鋼反応フラスコ（「リアクター」）に装填した。これに続いて、４６．４ｇの脱イオン水でトランスファーラインを洗浄した。スターラーは１５０ｒｐｍに設定した。
【００６２】
モノマー／ポロゲンエマルジョンを、５００ビーカー中で以下の成分を加えることによって調製した：１１６．１ｇのジビニルベンゼン（８０％ＤＶＢ／２０％ＥＶＥ）、６９．７ｇのＭＩＢＣ、１４２．０ｇの脱イオン水、および１．４９ｇの７５重量％ソルゾル（Ｓｏｌｕｓｏｌ）水溶液。
これらの成分をビーカー中で混合して、エマルジョンを得た。このエマルジョンを次いで、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  ＩＬＥ乳化機（５０％出力に設定）によって４０分間かけて、ビーカーからリアクターに圧送した。
【００６３】
リアクターを１時間かけて６０℃に加熱し、この温度で２時間維持して、オリゴマーシードを、モノマーおよびポロゲンエマルジョンで膨潤させた。
【００６４】
６０℃で２時間維持した後に、乳化させた開始剤溶液を加えた。このエマルジョンは、５０ｍｌのビーカー中で、１．２９ｇのｔｅｒｔ−ブチルペルオクトエートを１８．７ｇの１％ソルゾル溶液に加えることによって調製した。これらの成分を均一化してエマルジョンを形成し、ビーカーからリアクターに１回で移した。この後、２４．１ｇの脱イオン水を使用してトランスファーラインを洗浄した。リアクターを６０℃でさらに２時間維持した。
【００６５】
２．４ｇのＫ４ＭＰ（メチルヒドロキシエチルセルロース、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能）を３３４．９ｇの脱イオン水と混合することによって水性溶液を調製した。２時間維持した後、この水性溶液をリアクターに移し、続いて１５．８ｇの脱イオン水でトランスファーラインを洗浄した。
【００６６】
この反応混合物（有機相および水性相の混合）を１２０ｒｐｍで６０℃の温度で３０分間撹拌した後、８０℃まで６０分かけて加熱した。この反応混合物を８０℃で１２時間維持して反応物を重合させた。
【００６７】
重合反応の終了後、混合しながら反応混合物の温度を５０℃に調整した。最終ｐＨに到達するまで１０％硫酸を水性相にゆっくり加えることによって、水性／ポリマー混合物の水性相のｐＨを５．０に調整した。
【００６８】
１４．４グラムのβ−１，４−グルカン−４−グルカンヒドロラーゼ酵素混合物（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ（登録商標）４０００、Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．より入手可能）を１３４．５ｇの脱イオン水と混合し、続いてリアクターに装填した。その温度を５０℃で１２時間維持した。水性／ポリマー混合物の水性相のｐＨを、５０％水性水酸化ナトリウム溶液で１２．０に調整し、リアクター中の温度を９０℃まで上昇させた。リアクターをこの温度で５時間維持した。
【００６９】
この水性／ポリマー混合物を室温まで冷却し、リアクターから取り出して、１リットルのクロマトグラフィーカラムに入れた。この水性相をポリマーから濾過し、次いでポリマーの充填床を、２リットルの脱イオン水、次いで３．５リットルのアセトン、最後に３．５リットルのメタノールで洗浄した。この濡れたポリマーを、温度１００℃において、２．５ｍｍ（０．１インチ）Ｈｇの減圧下で１６時間乾燥させた。
【実施例３】
【００７０】
この実施例では、本発明のマクロポーラスポリマーのインスリン結合キャパシティを評価する。体積約５ｍｌの試料を小規模試験カラム（内径１．０ｃｍ×長さ６．３ｃｍ）に入れ、水性溶液からのウシインスリンの前端吸着を評価した；典型的な使用条件下で、ポリマーマトリックスが迅速で効率的な物質移動と、ターゲットプローブ分子（ウシインスリン）に対する高いキャパシティとが得られるかどうかを調べるためにこの試験が設計された。
【００７１】
５ｇの乾燥ポリマー樹脂（他に明記しない限り実施例２により調製した）を３５ｍｌの２０％エタノール／水（ｖ／ｖ）と混合し、周囲温度で少なくとも２時間静置した。次いで、２０％ｖ／ｖエタノール／水溶液中の充填剤を、線速度１６０ｃｍ／時で流すことによって、ポリマースラリーをステンレス鋼カラム（サイズ：内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ、Ａｌｌｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．より入手可能）に充填した。５０μＬのパルスの１％塩化ナトリウム脱イオン水溶液をカラムに注入し、同時に２０％ｖ／ｖのエタノール／水溶離液を線速度４０ｃｍ／時で流すことによって、カラム充填剤の品質を確認した。Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ソフトウエアを使用して、カラムの効率（段／メートル）および非対称性を計算した。許容されるカラム充填剤のパラメーターの目標値は、最小５，０００段／メートルの効率で非対称性が０．８〜１．８であった。
【００７２】
５グラム／水１リットルの濃度のウシインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏより入手可能）の溶液を調製した。この溶液の合計２００ｍｌを、カラム中に線速度１５０ｃｍ／時で圧送し、波長２９１ｎｍに設定したＵＶ分光光度検出器Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｏｗ（登録商標）７８３、ＡＢＩ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｋｒａｔｏｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎより入手可能）を使用して、溶出物中のウシインスリンを監視した。
【００７３】
ＵＶ応答曲線における１％（ポリマー樹脂上に収着したインスリン総量に対して）インスリン破過点における、ポリマー樹脂上に収着したインスリン量を記録することによって、ポリマー樹脂の動的キャパシティ（ｇ／Ｌ）を求めた。樹脂のトータルキャパシティ（ｇ／Ｌ）は、流入物および溶出物溶液のインスリン濃度をＵＶ分光分析によって測定し、次いで物質収支を求めることで決定した。
【００７４】
ウシインスリン結合キャパシティは、使用時の性能を測定するスクリーニングテストとして使用される。このキャパシティ試験の結果を表１に示す。実施例２の樹脂はこの表の試料番号１−３で表され、試料番号１−１、１−２、１−４、および１−５は配合物中のポロゲンレベルが異なるものを表している。製品性能を最大限にするため、最小限のポロゲンレベルで高い結合キャパシティとなることが望ましい。
【００７５】
試料番号１−６、１−７、および１−８は、米国特許第６，３８７，９７４号に開示される技術で調製した樹脂を表している。米国特許第６，３８７，９７４号で調製した樹脂と比較すると、本明細書に記載の技術で調製した試料は、はるかに低いポロゲンレベルで高いインスリン結合キャパシティを有するという予想外の結果を示している。以下の実施例で示されるように、このことは、所望の最終精錬性能を有しながら１００ｂａｒにおいて圧力安定性となる逆相ポリマー樹脂を製造するために重要な成功因子である。
【実施例４】
【００７６】
次の実施例は、実施例２のポリマー樹脂を使用したウシインスリンの最終精錬を示す。実施例２の樹脂を、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍの寸法のステンレス鋼クロマトグラフィーカラムに充填した。この実施例では以下の移動相を使用した：「緩衝液Ａ」＝脱イオン水中の１００ｍＭグリシン（ｐＨ４．０）；「緩衝液Ｂ」＝１００％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル。
【００７７】
この実施例で使用したインスリンは、９２％の粗製純度のウシインスリンであった（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙより購入した）。脱イオン水中の１０％ｖ／ｖアセトニトリル中０．１％グリシンを含有し、３０ｍＬのＴＦＡでｐＨ２に調整された「ロード用緩衝液」１２．５ｍＬに全量７５ｍｇのこのインスリンを溶解することによって、ウシインスリン溶液を調製した。１８ｍｇインスリン／ｍＬカラムのカラム濃度を得るために十分なインスリン溶液を０．２７ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）の速度でカラム上にロードした。
【００７８】
ロード後、１カラム体積（４．１５ｍＬ）のロード用緩衝液を使用して、同じく０．２７ｍｌ／分の流速で、カラムを洗浄した。１７．５％から３０％の緩衝液Ｂの直線グラジエントを、３２．５カラム体積（１３５ｍＬ）の溶媒に対して使用してインスリンをカラムから溶出させた。溶出中の溶媒の流速は０．２７ｍＬ／分であった。溶出物を２８０ｎｍのＵＶで監視し、２分ごとに１つの割合でフラクションを回収した。
【００７９】
Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８，３００Ａ，５ミクロン樹脂を充填したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの逆相ＨＰＬＣカラム（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用してフラクションを分析した。フラクション分析において次の溶媒条件を使用した：緩衝液Ａ：ＨＰＬＣグレードの水中の０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中の０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣを分析に使用し、これをカラム温度２５℃および流速０．８ｍｌ／分で使用した。溶出条件は、２５％緩衝液Ｂを３分間維持した後、２５％から３５％の緩衝液Ｂのグラジエントを３０分間であった。
【００８０】
ウシインスリンの調製精製の結果を表２に示す。実施例２の樹脂は、この表に試料番号１−３で表されている。他の市販のポリマー樹脂は比較のため示されており、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許第６，３８７，９７４号によって実現された市販材料）を含んでいる。試料１−１１は、高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販される）を表しており、これは性能の対照標準として示している。表２の結果は、本発明の逆相ポリマー樹脂のみが高品質逆相シリカに匹敵する最終精錬精製性能を提供することを示している。
【実施例５】
【００８１】
次の実施例では、実施例２のポリマー樹脂を使用してインスリンまたはインスリン様分子の最終精錬を示す。実施例２の樹脂を、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍの寸法のステンレス鋼クロマトグラフィーカラムに充填した。この実施例では以下の移動相を使用した：「緩衝液Ａ」＝脱イオン水中の１００ｍＭグリシン（ｐＨ４．０）；「緩衝液Ｂ」＝１００％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル。
【００８２】
この実施例で使用したインスリンは、Ｓｉｇｍａから購入した純度９２％の組み換えヒトインスリンであった。脱イオン水中の１０％ｖ／ｖアセトニトリル中０．１％グリシンを含有し３０ｍＬのＴＦＡでｐＨ２に調整された「ロード用緩衝液」１２．５ｍＬに全量７５ｍｇのこのインスリンを溶解することによって、溶液を調製した。１８ｍｇインスリン／ｍＬカラムのカラム濃度を得るために十分なインスリン溶液を０．２７ｍｌ／分（１００ｃｍ／時）の速度でカラム上にロードした。ロード後、１カラム体積（４．１５ｍＬ）のロード用緩衝液を使用して、同じく０．２７ｍｌ／分の流速で、カラムを洗浄した。
【００８３】
１７．５％から３０％の緩衝液Ｂの直線グラジエントを、３２．５カラム体積（１３５ｍＬ）の溶媒にわたって使用してインスリンをカラムから溶出させた。溶出中の溶媒の流速は０．２７ｍＬ／分であった。溶出物を２８０ｎｍのＵＶで監視し、２分ごとに１つの割合でフラクションを回収した。
【００８４】
Ｚｏｒｂａｘ  ３００ＳＢ−Ｃ８，３００Ａ，５ミクロン樹脂を充填したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの逆相ＨＰＬＣカラム（内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）を使用してフラクションを分析した。フラクション分析において次の溶媒条件を使用した：緩衝液Ａ：ＨＰＬＣグレードの水中の０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中の０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ＨＰＬＣを分析に使用し、これをカラム温度２５℃および流速０．８ｍｌ／分で使用した。溶出条件は、２５％緩衝液Ｂを３分間維持した後、２５％から３５％の緩衝液Ｂのグラジエントを３０分間であった。
【００８５】
ヒトインスリンの調製精製の結果を表３に示す。実施例２の樹脂は、この表に試料番号１−３で表されている。他の市販のポリマー樹脂は比較のため示されており、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許第６，３８７，９７４号によって実現された市販材料）を含んでいる。試料１−１１は、高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販される）を表しており、これは性能の対照標準として示している。表３の結果は、本発明の逆相ポリマー樹脂のみが高品質逆相シリカに匹敵する最終精錬精製性能を提供することを示している。
【００８６】
この技術を使用すると、ヒトインスリンを不純物から非常に良好に分離することができる。インスリン７０％の収率が、９９．５％の純度で得られた。ロードしたインスリンの全体の回収率は＞９０であった。
【実施例６】
【００８７】
この実施例では、本発明のマクロポーラスポリマーの浸透性特性、すなわち圧縮に対する抵抗性をどのように評価したかを説明する。ポリマーは、それらの「流動抵抗」または１／Ｋ値（式３参照）によって特徴づけられる。
【００８８】
工業用高圧液体クロマトグラフィーでは、力（圧力）を直接樹脂上に作用させるピストンが備えられたカラムを使用するのが一般的である。クロマトグラフィーサイクル全体で予想される最大流動圧力以上の圧力で床を能動的に圧縮するようピストンが維持されることが好ましい。本発明のポリマーの浸透性特性を試験するために、ポリマー樹脂をＰｒｏＣｈｒｏｍ（商標）ダイナミック・アキシャル・コンプレッションカラム（モデルＬＣ．５０、Ｎｏｖａｓｅｐより市販される）に充填し、最初に１００ｂａｒの圧縮圧力に設定したピストンで圧縮した。この試験の目的は、各試料の浸透性特性（圧縮に対する抵抗性）の特性決定を行うことであった。以下に詳細に説明する。
【００８９】
一般に、ポリビニル芳香族ポリマー床の粒子間空隙体積（または浸透性）を測定するために、ポリビニル芳香族ポリマーの疎水性表面とプローブ分子との相互作用が移動相によって解消されるまたは軽減されるように、プローブ分子と相溶性である移動相が選択される。従来のプローブ分子、たとえば線状ポリスチレン、ブルーデキストラン、およびポリエチレングリコールを使用することができるが、非極性移動相（たとえばテトラヒドロフランおよびトルエン）の使用が必要である。しかし、後述の方法で使用されるプローブ分子は非極性溶媒の使用が不要であり、任意の水性−有機溶媒系、たとえば２０％エタノールで使用することができる。
【００９０】
カラム中の全空隙体積（粒子内と粒子間の両方）を求めるために、２ｍｌの１％塩化ナトリウム（ｗ／ｖ、２０％エタノール水溶液中）を系に注入した。この塩を導電率検出器によって検出した。粒子間空隙体積のみを求めるため、１％（ｗ／ｖ）の０．１〜０．９μｍのイオン帯電エマルジョンポリマーまたは微粉砕イオン帯電ポリマー（たとえばイオン化可能官能基、たとえば弱酸官能基（カルボキシレート基）、強酸官能基（スルホネート）、または第４級アンモニウムクロリド基を有する架橋ポリスチレン）を含有する２０％エタノール（水溶液）を、床を通過して流れる２０％エタノール（水溶液）の流れに注入した。粒子は、２８０ｎｍに設定したＵＶ検出器で検出した。イオン帯電ポリマープローブ粒子の大きさのため、粒子は本発明のポリマー樹脂の細孔を通過しなかった。イオン帯電ポリマープローブ粒子の表面の性質のため（これらの粒子は芳香族構造を有し、表面全体に分布した高濃度のイオノゲン基を有した）、本発明のポリマー樹脂への疎水性吸引／保持が妨害された。
【００９１】
ポリマー床の全空隙体積（塩プローブ溶出体積）を求め、ポリマー粒子外部の空隙体積（イオン帯電エマルジョンまたは粉砕ポリマーの溶出体積）と組合わせた。これらの値と、測定した床体積とを使用して、式２および３のεを計算した。
【００９２】
ウシインスリンの調製精製の結果を表４に示す。実施例２の樹脂は、この表に試料番号１−３で表されている。他の市販のポリマー樹脂は比較のため示されており、試料１−１０（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＣＧ３００Ｓ）、および試料１−９（Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（商標）ＸＴ２０、米国特許第６，３８７，９７４号によって実現された市販材料）、試料１−１２（Ｓｏｕｒｃｅ（商標）３０  ＲＰＣ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃより市販される）、および試料１−１３（ＰＬＲＰ（商標）１０−１５ミクロン、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓより市販される）を含んでいる。試料１−１１は、高品質逆相シリカ充填剤（Ｋｒｏｍａｓｉｌ（商標）１００Ａ、１３ミクロンシリカ、Ｅｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販される）を表しており、これは性能の対照標準として示している。表４の結果から、１００ｂａｒのピストン圧力で、本発明の逆相ポリマー樹脂のみが実質的に変形しておらず、他のすべての逆相ポリマー充填剤は実質的に変形し、流動抵抗が増加していることが分かる。
【００９３】
【表３】
2005329401.tif 000004
【００９４】
試料１−１から１−６は、実施例２に記載の本発明により調製された材料を表しており、試料１−７から１−９は米国特許第６，３８７，９７４号により調製した材料を表している。
【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【外国語明細書】
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