(57)【要約】【課題】  優れた感度と信頼性を有する、新規の抗原濃度測定方法を提供することを可能とする。【解決手段】  １つの抗原に対して特異的に結合するＶＬ領域ポリペプチド１とＶＨ領域ポリペプチド３を両方、あるいはどちらか一方を粒子２を介して結合することで、多価の抗体フラグメント構造体を作製し、これらを抗原４と結合できる組み合わせで混合して用いることにより、そのエピトープの数に関わらず、抗原４と抗体フラグメント構造体による多結合を介した免疫複合体を形成する。また、この抗体フラグメント構造体において粒径1μm以下の粒子を用いることにより、イムノアッセイに用いられるような緩衝液中において単分散を形成し、均一系による測定においても良好な測定感度を有し、検出する。【選択図】  図１
2005145907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの抗原に対して特異的に結合する同一のＶＬ領域ポリペプチドを複数有するとともに、前記複数のＶＬ領域ポリペプチドは粒子を介して結合していることを特徴とする抗体フラグメント構造体。
【請求項２】
１つの抗原に対して特異的に結合する同一のＶＨ領域ポリペプチドを複数有するとともに、前記複数のＶＨ領域ポリペプチドは粒子を介して結合していることを特徴とする抗体フラグメント構造体。
【請求項３】
１つの抗原に対して特異的に結合するＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドをそれぞれ複数有するとともに、前記ＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドは粒子を介して結合した抗体フラグメント構造体であって、該抗体フラグメント構造体は単一では抗原と複合体を形成できず、複数存在することによって抗原と結合可能としたことを特徴とする抗体フラグメント構造体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の抗体フラグメント構造体において、前記粒子は粒径1μm以下であることを特徴とする抗体フラグメント構造体。
【請求項５】
請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体と抗原とからなる免疫複合体。
【請求項６】
請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体のいずれかひとつと請求項３の抗体フラグメント構造体と抗原とからなる免疫複合体。
【請求項７】
複数の、請求項３の抗体フラグメント構造体と、抗原とからなる免疫複合体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載の免疫複合体において、前記抗原は分子量１０００以下であることを特徴とする免疫複合体。
【請求項９】
請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体と抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、その免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１０】
請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体のいずれかひとつと請求項３の抗体フラグメント構造体と抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、その免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１１】
複数の、請求項３の抗体フラグメント構造体と、抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、その免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイ。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれかに記載のイムノアッセイにおいて、前記免疫複合体の存在を蛍光偏光測定法により検出することを特徴とするイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原濃度測定法に関するものである。この測定方法は、例えば蛍光偏光測定法などとして実施することができ、様々な測定対象抗原を検出する研究用あるいは工業用センサーとして、幅広く応用が可能な方法である。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ある測定対象物質を非常に特異的にかつ正確に測定することができる測定方法として、各種のイムノアッセイが知られている。その反応系により、測定が終始溶液状態で行われる均一系による測定と、固相化された抗体などを用いて反応、洗浄が行われる不均一系による測定に分類される。これらのイムノアッセイのうち、例えば不均一系による測定においては、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法（あるいはサンドイッチＲＩＡ法）が有用な方法のひとつとしてあるが、この方法は、ある抗原蛋白質を測定する際に、認識するエピトープが各々異なる２種類のモノクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて測定を行うことを特徴としている。すなわち第一段階として一次抗体と呼ばれるモノ／ポリクローナル抗体を吸着させた測定用プレートに抗原を含む検体を注ぎ一定時間おく。この間に抗体に結合した抗原以外の夾雑物を、第二段階として洗浄液で洗浄して取り除く。次に第三段階として、予め酵素あるいはラジオアイソトープなどのレポーター分子を結合した標識抗体溶液を注ぎ一定時間おく。この間に一次抗体によって補足された抗原に標識抗体が結合するので次に洗浄液で余分の標識抗体を充分洗い流した後に、測定用プレートに残ったレポーター分子の量を酵素活性あるいは液体シンチレーションカウンターなどで測定することにより検体中の抗原量を推定している。以上のような操作手順からなる従来のサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、必要な抗体さえ得られれば様々な抗原を測定できるというメリットはあるが、一方で、最低二回ずつの反応と洗浄を必要とするその測定手順は煩雑であり、そのため測定に時間がかかり自動化のための設備も高価になるという欠点があった。また、低分子量の物質においては、単エピトープであるため抗体がひとつの抗原に対してひとつしか結合できず、このサンドイッチＥＬＩＳＡ法をそのまま適用することはできなかった。
【０００３】
そこで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法をさらに発展させ、測定手順を簡便かつ迅速化することのできる改良された抗原濃度測定法として、測定対象物質としての抗原を特異的に認識する単一抗体のＶＨ領域ポリペプチドおよびＶＬ領域ポリペプチドを用いて、抗原との結合を検出することを特徴としている方法がある（例えば、特許文献１参照）。ＶＨ領域ポリペプチドおよびＶＬ領域ポリペプチドのうちいずれか一方のポリペプチドをレポーター分子で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドを固相に固定して固定化ポリペプチドとし、抗原含有試料および標識化ポリペプチドを固相に接触させ、固定化ポリペプチドに結合した標識化ポリペプチドのレポーター分子の量を測定している。このような場合、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法に比べ、測定手順を簡便かつ迅速にできるというメリットがある。また、抗原のエピトープ数に関わらず測定可能であるというメリットがある。
【特許文献１】特開平１０−７８４３６号公報（第９頁、第１図）
【０００４】
均一系による測定においては、例えば蛍光偏光度測定法が有用な方法として知られている。蛍光偏光度測定法は、固定化や、反応後の抽出分離、洗浄操作を必要としない均一な測定系で、蛍光標識した分子と溶液中で反応させるだけで、より天然に近い環境下で解析できる。そのためイムノアッセイにおいて、非常に簡便で優れた測定法である。液体中の蛍光性分子が平面偏光により励起されると、蛍光性分子中のフルオロフォア（蛍光団）が励起状態で、かつ、蛍光性分子が定常状態を維持している時、同一平面に偏光蛍光を発するが、フルオロフォアの励起状態中に蛍光性分子がブラウン運動により回転すると、励起平面と異なる平面へ蛍光を放射し蛍光偏光が解消される。偏光度（Ｐ）は、分子の回転緩和時間に比例し、分子の粘度（η）、絶対温度（Ｔ）、分子容（Ｖ）、および気体定数（Ｒ）と、以下の式で表わされるような関係が見られる。もし温度と粘度を一定にすれば、偏光度は分子容（分子サイズ）と直接的な関係を示す。
Ｐ値 ∝ 回転緩和時間 ＝ ３ηＶ／ＲＴ
これは例えば、二分子間の結合や解離、分解や構造変化などが、その見かけの分子サイズの変化に応じて偏光度も変化するということである。この測定法を用いて免疫反応を解析する際、分子量が小さく、回転運動が大きい抗原側を蛍光標識するのが一般的である。この抗原が、高分子量である場合はエピトープが複数存在し、抗体の結合部位が増えるために、みかけの分子サイズが大きくなり、より大きな蛍光偏光度の変化を捉えることができる。一方で、抗原が低分子量である場合は単エピトープであるため、一つの抗原分子に対して一つの抗体のみしか結合できない。ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いて測定する場合は、このエピトープ数によって測定感度の向上がそれ以上望めない。先に挙げた、測定対象物質としての抗原を特異的に認識する単一抗体のＶＨ領域ポリペプチドおよびＶＬ領域ポリペプチドを用いて、抗原との結合を検出することを特徴としている方法をこの蛍光偏光度測定法に適用した場合、抗原に対する結合分子の大きさが、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いたときに比べて小さく、より大きな分子容の変化が見られない、すなわち特に蛍光偏光度法においてはより高い感度を得ることはできないという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題を解決するためになされたもので、特に均一系による測定においても抗原のエピトープ数に関わらず良好な測定感度を有し、検出することができる抗体フラグメント構造体およびその免疫複合体とその免疫複合体を用いたイムノアッセイを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために請求項１記載の発明によれば、１つの抗原に対して特異的に結合する同一のＶＬ領域ポリペプチドを複数有するとともに、前記複数のＶＬ領域ポリペプチドは粒子を介して結合していることを特徴とする抗体フラグメント構造体とすることにより、抗原に対して多結合を形成することを可能とした。
【０００７】
また、請求項２記載の発明によれば、１つの抗原に対して特異的に結合する同一のＶＨ領域ポリペプチドを複数有するとともに、前記複数のＶＨ領域ポリペプチドは粒子を介して結合していることを特徴とする抗体フラグメント構造体とすることにより、抗原に対して多結合を形成することを可能とした。
【０００８】
また、請求項３記載の発明によれば、１つの抗原に対して特異的に結合するＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドをそれぞれ複数有するとともに、前記ＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドは粒子を介して結合している抗体フラグメント構造体であって、該抗体フラグメント構造体は単一では抗原と複合体を形成できず、複数存在することによって抗原と結合可能としたことを特徴とする抗体フラグメント構造体とすることにより、抗原に対して多結合を形成することを可能とした。
【０００９】
また、請求項４記載の発明によれば、請求項１〜３記載の抗体フラグメント構造体において、前記粒子は粒径1μm以下であることを特徴とする抗体フラグメント構造体とすることによって、通常、免疫測定に用いられるような緩衝液中においてその抗体フラグメント構造体が単分散を形成し、それにより均一系による測定を可能とした。
【００１０】
また、請求項５記載の発明によれば、請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体と抗原とからなる免疫複合体とすることにより、一つの抗原に対して複数の結合部位を有しているため、三次元的な多結合を形成することができ、特に測定対象抗原が低分子量である場合においても良好な測定感度を有し、検出することを可能とした。
【００１１】
また、請求項６記載の発明によれば、請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体のいずれかひとつと請求項３の抗体フラグメント構造体と抗原とからなる免疫複合体とすることにより、一つの抗原に対して複数の結合部位を有しているため、三次元的な多結合を形成することができ、特に測定対象抗原が低分子量である場合においても良好な測定感度を有し、検出することを可能とした。
【００１２】
また、請求項７記載の発明によれば、複数の、請求項３の抗体フラグメント構造体と、抗原とからなる免疫複合体とすることにより、一つの抗原に対して複数の結合部位を有しているため、三次元的な多結合を形成することができ、特に測定対象抗原が低分子量である場合においても良好な測定感度を有し、検出することを可能とした。
【００１３】
また、請求項９記載の発明によれば、請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体と抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、それによりその免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイを提供することを可能とした。
【００１４】
また、請求項１０記載の発明によれば、請求項１の抗体フラグメント構造体と請求項２の抗体フラグメント構造体のいずれかひとつと請求項３の抗体フラグメント構造体と抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、それによりその免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイを提供することを可能とした。
【００１５】
また、請求項１１記載の発明によれば、複数の、請求項３の抗体フラグメント構造体と、抗原とを混合することにより免疫複合体を形成し、それによりその免疫複合体の存在を検出することを特徴とするイムノアッセイを提供することを可能とした。
【００１６】
また、請求項１２記載の発明によれば、請求項９〜１１のいずれかに記載のイムノアッセイにおいて、前記免疫複合体の存在を、例えば抗原を適切な方法で蛍光標識することにより、蛍光偏光測定法により検出することを可能とした。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、１つの抗原に対して特異的に結合するＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドを両方、あるいはどちらか一方を粒子を介して結合することで、多価の抗体フラグメント構造体を作製し、これらを抗原と結合できる組み合わせで混合して用いることにより、そのエピトープの数に関わらず、抗原と抗体フラグメント構造体による多結合を介した免疫複合体を形成できるという効果がある。また、この抗体フラグメント構造体において粒径1μm以下の粒子を用いることにより、イムノアッセイに用いられるような緩衝液中において単分散を形成し、均一系による測定においても良好な測定感度を有し、検出することができるという効果がある。
【００１８】
以下、本発明についてそれを実施するための最良の形態をさらに詳しく説明するが、以下の説明においては、ＶＨ領域ポリペプチドをＶＨと記載し、ＶＬ領域ポリペプチドをＶＬと記載することがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の実施の形態を図面に基づいて具体的に説明する。図１〜４は本発明の抗体フラグメント構造体およびその免疫複合体を示す模式図である。この抗体フラグメント構造体の構成は、図中の符号１および３で示されるような抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域のポリペプチド断片と、符号２で示されるようなそれらを結合するための粒子からなる。ポリペプチド断片１，３と粒子２のハイブリッド分子として設計することで、抗体フラグメント構造体として、図４中の符号４で示されるような抗原と、そのエピトープの数に関わらず多結合を介した免疫複合体を形成できるということを特徴とした構造をもつ。また、この粒子に関しては以下のような特徴をもつ。
【００２０】
すなわち、本発明で用いる粒子としては、ＶＨおよび／またはＶＬ領域ポリペプチドを結合し、多価の抗体フラグメント構造体を形成できる分子であればよい。例えば粒子として球状粒子を用いる場合は、金属単体および金属化合物、セラミック単体またはそれらの複合体等が利用できる。具体的には、金、銀、鉄、硫化カドミウム、硫化亜鉛、シリカ、酸化アルミ、酸化チタン等がある。また、その他に、上述した球状粒子以外にも粒子として様々な化合物が利用できる。例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ領域ポリペプチドにビオチンを修飾し、ビオチンとアビジンの相互作用を利用して結合し、多価の抗体フラグメント構造体を形成することが可能である。また、ポリペプチドの化学組成から、粒子が適切な修飾により、あるいはもともとの化学組成としてカルボキシル基を有していれば、ポリペプチドのアミノ基やチオール基などカルボキシル基と反応性のある官能基を結合の際の標的官能基にすることが可能である。ポリペプチドのアミノ基を用いる場合は、粒子のカルボキシル基にＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）のようなエステルを導入し、求核置換反応により共有結合させることが可能である。ポリペプチドのチオール基を用いる場合は、カルボキシル基にＮＨＳを反応させた後に、２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミンを用いることにより結合させることが可能である。このように適宜、試薬、修飾の方法を選択すれば、様々な粒子を用いて、ＶＨおよび／またはＶＬ領域ポリペプチドを結合し、多価の抗体フラグメント構造体を形成することが可能である。
【００２１】
また、本発明で用いる粒子としては、分散粒径が1μm以下、好ましくは500nm以下、最も好ましくは200nm以下である。この粒径にすることによって、確実に均一系による測定を行うことが可能である。
【００２２】
抗体フラグメント構造体において、抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のポリペプチド断片については別々に調製する。本発明においては、測定対象となる任意の抗原に特異的に結合する抗体を使用する。このような抗体は、例えば、ハイブリドーマ技術により作成されたモノクローナル抗体から選択することができる。次に、このような抗体からＶＨ領域とＶＬ領域のポリペプチド断片を別々に調製するが、各々のポリペプチドは、それらが対合した状態で対象抗原を結合することのできる長さであれば、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域よりも長くても短くてもよい。これらのポリペプチドは、あらゆる抗原を認識する抗体を対象として、例えば以下のようにして調製することができる。
【００２３】
すなわち、任意の抗原を特異的に結合するモノクローナル抗体を公知の方法(Kohler, G. and Milstein, C. Nature 256, 495-496, 1975)によって作成し、この抗体の可変領域をコードする遺伝子をｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションを用いる方法(Sambrook, Frisch, and Maniatis, Monecular Cloning2nd ed., 1989)、またはＰＣＲを用いる方法(larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1250-1256, 1989; Jones, S. and Bendig, M., Bio/Technology 9, 88-89, 1991)により特定し、この遺伝子をベクターにクローニングする。そして、この組換え体ベクターからＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする配列を得、この断片を発現ベクターにサブクローニングし、この遺伝子を宿主細胞内で発現させることにより、必要量のＶＨおよび／またはＶＬを得ることができる。抗体遺伝子からＶＨ／ＶＬコード配列を得るためには、所望の配列領域を制限酵素で切り出し、これをクローニングベクターで増幅させてもよく、あるいは所望の配列をＰＣＲ法で増幅してもよい。ＶＨおよび／またはＶＬは、抗体分子を蛋白質分解酵素によって分解することによっても得ることもできる。ただし、この発明においてはそれぞれのポリペプチドの調製はこれらの方法に特定されるものではなく、最終的な目的を達成できればどんな方法を用いても良い。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例に従って詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に制限されるものではない。
【００２５】
fliorescein succinimidyl ester（FS）により蛍光標識したウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（RNase A）濃度の測定
（ａ）RＮase Aに対する抗体３Ａ２１のＶＬ領域ポリペプチドおよびＶＨ領域ポリペプチドと、ビオチンと特異的に結合するＡｖｉＴａｇペプチドのキメラタンパク質発現ベクタープラスミドの構築
ビオチンと特異的に結合するＡｖｉＴａｇペプチドシーケンスをコードしたベクタープラスミドｐＡＣ４（Avidity）を250pg用いて鋳型とし、制限酵素Ｘｂａiのサイト付プライマーおよび制限酵素Ｓｔｕi、Ｓａｌiのサイト付プライマー（配列表の配列番号１および２）を終濃度200nMとなるよう用い、終濃度0.2mMのｄＮＴＰｓ、0.5 UのEx Taq polymerase（Takara Bio Inc.）、10μlの１０倍濃度反応液からなる100μlの反応液４つでＰＣＲにてＡｖｉＴａｇをコードする部分を増幅した。この結果得られた72bpのＤＮＡ断片を、8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲル中から切り出して精製し、制限酵素Ｘｂａi、Ｓｔｕiで消化を行い、同じく制限酵素Ｘｂａi、Ｓｔｕiで消化したベクタープラスミドｐＫＦ３（Takara Bio Inc.）の断片とライゲーションさせ、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いてインサート配列の確認を行った。これによりＡｖｉＴａｇ部位を制限酵素ＸｂａiおよびＳａｌiで消化するためのベクターを構築した。次に、このベクターより制限酵素Ｘｂａi、Ｓａｌiで消化を行い、８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲル中から切り出して精製し、ＡｖｉＴａｇをコードする部分のＤＮＡ断片を得た。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびｍａｌＥシグナルペプチドシーケンスをコードするベクターｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ（New England Biolabs Inc.）を制限酵素Ｘｂａi、Ｓａｌiで消化し、先のＡｖｉＴａｇをコードする部分のＤＮＡ断片とライゲーションさせ、同様にインサート配列の確認を行い、ｐＡＶと名付けた。次に、抗体３Ａ２１のＶＨ鎖とＶＬ鎖の構造遺伝子がベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Pharmacia）に組み込まれたＤＮＡ（Katakura, Y. et al., J. Ferm. Bioeng. 82, 312-314, 1996）250pgを用いて鋳型とし、制限酵素Ｓａｌiのサイト付プライマーおよび制限酵素Ｈｉｎｄiiiのサイト付プライマー（配列表の配列番号３および４）を終濃度200nMとなるよう用い、終濃度0.2mMのｄＮＴＰｓ、0.5 UのEx Taq polymerase（Takara Bio Inc.）、10μlの１０倍濃度反応液からなる100μlの反応液４つでＰＣＲにてＶＨ構造遺伝子をコードする部分を増幅した。同様にＶＬ構造遺伝子をコードする部分を制限酵素ＥｃｏＲiのサイト付プライマーおよび制限酵素Ｘｂａiのサイト付プライマー（配列表の配列番号５および６）を用いてＰＣＲにて増幅した。この結果得られた361bpおよび336bpのＤＮＡ断片を、8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動後、ゲル中から切り出して精製し、ＶＨ構造遺伝子およびＶＬ構造遺伝子それぞれのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をそれぞれ、ＶＨ構造遺伝子に関しては、制限酵素Ｓａｌiおよび制限酵素Ｈｉｎｄiiiにて消化し、同じく制限酵素Ｓａｌiおよび制限酵素Ｈｉｎｄiiiにて消化したｐＡＶとライゲーションさせ、同様にインサート配列の確認を行い、ＡｖｉＴａｇの下流にＶＨ構造遺伝子をもつＡｖｉＴａｇ−ＶＨ（ＡＶ−ＶＨ）発現プラスミドを構築し、これをｐＡＶＶＨと名付けた。また、ＶＬ構造遺伝子に関しては、制限酵素ＥｃｏＲiおよび制限酵素Ｘｂａiにて消化し、同じく制限酵素ＥｃｏＲiおよび制限酵素Ｘｂａiにて消化したｐＡＶとライゲーションさせ、同様にインサート配列の確認を行い、ＡｖｉＴａｇの上流にＶＬ構造遺伝子をもつＶＬ−ＡｖｉＴａｇ（ＶＬ−ＡＶ）発現プラスミドを構築し、これをｐＶＬＡＶと名付けた。
【００２６】
（ｂ）ＡＶ−ＶＨタンパク質およびＶＬ−ＡＶタンパク質の大腸菌での発現と精製
ＡｖｉＴａｇペプチドのリジン残基にビオチンを結合する、ビオチン・リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードしたベクタープラスミドを保持する大腸菌ＡＶＢ−１０１（Avidity）を、塩化カルシウム法によりｐＡＶＶＨおよびｐＶＬＡＶで形質転換し、抗生物質（50mg/l アンピシリン、34mg/lクロラムフェニコール）を含む1.5%寒天入りＬＢ培地で３７℃１夜培養してコロニーを形成させた。このコロニーを、抗生物質（50mg/l アンピシリン、34mg/lクロラムフェニコール）を加えた5ml のＬＢ培地に移し、３７℃で更に１夜培養した。飽和菌体濃度に達した菌体を遠心で集め、抗生物質（50mg/l アンピシリ、34mg/lクロラムフェニコール）を含む新鮮なＬＢ培地50mlに懸濁した後、更に３７℃で３−４時間培養し、培地を1 lにスケールアップした。菌体濃度がOD600=0.3-0.4に達したところでIPTG0.1mMにより誘導して、ＡＶ−ＶＨタンパク質およびＶＬ−ＡＶタンパク質とＢｉｒＡを発現させた。また、同時にビオチン50μMを加え、ＡｖｉＴａｇペプチドをビオチン化させた。一夜培養し、培養液20μlをそのまま用いてSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により目的タンパク質の発現を確認した後、菌体を遠心で集め、培養上清と菌体とを分離した。菌体から浸透圧ショック法によりタンパク質溶液を回収し、amirose resin（New England Biolabs Inc.）のカラムにそのタンパク質溶液を流して目的のタンパク質を吸着させ、10mMマルトースで溶出して画分を回収し、更にSephadex G-25（Amersham Biosciences）にてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、PBS buffer（pH 7.4）3.5mlに溶出した。精製したタンパク質はSDS-PAGEによって確認を行い、９５％以上の純度のＡＶ−ＶＨタンパク質およびＶＬ−ＡＶタンパク質を得た。ビオチン化についてはペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを用いてウェスタンブロッティングをすることにより９０％以上のビオチン化を確認した。得られたタンパク質は、BCAプロテインアッセイ（Pierce）を用いて濃度を測定した後、測定に使用するまで４℃で保存した。
【００２７】
（ｃ）抗体フラグメント構造体の作製
得られたビオチン化ＡＶ−ＶＨタンパク質およびＶＬ−ＡＶタンパク質に対して、それぞれ１／４モル量のストレプトアビジンを室温で混合し、30分間ゆるやかに撹拌することで、ＶＨ抗体フラグメント構造体およびＶＬ抗体フラグメント構造体を作製した。Superdex 75（Amersham Biosciences）にてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、未反応のストレプトアビジンと分離精製し、ＶＨ抗体フラグメント構造体およびＶＬ抗体フラグメント構造体を含む画分を回収した。
【００２８】
（ｄ）RNase Aの蛍光標識
RNase Aの蛍光標識にはFluorescein Amine Labeling Kit（PANVERA）を用いて製造者の手順書に基づき、fluorescein誘導体でアミノ基の修飾を行った。BIOSPEC-1600（Shimadzu）を用いてOD=280, 492を測定し、タンパク質における蛍光標識比を算出し、約７倍モル量の蛍光標識を確認した。
【００２９】
（ｅ）RNase A濃度の測定
測定溶液にはPBS buffer（pH 7.4）を用い、ＶＨ抗体フラグメント構造体およびＶＬ抗体フラグメント構造体を終濃度150nMから1nMとなるようにそれぞれ調整して、等量のＶＨ抗体フラグメント構造体およびＶＬ抗体フラグメント構造体をそれぞれ495μlずつ混合し３７℃で15min予熱する。そこに10nMおよび1nMの蛍光標識RNase A溶液をそれぞれの濃度で10μl加え、３７℃で30min静置し、平衡を達成した後にBEACON 2000（PANVERA）を用いて蛍光偏光度を測定した。同様に、抗体３Ａ２１を終濃度150nMから10nMとなるようにそれぞれ調整して、990μlの溶液を３７℃で15min予熱する。そこに10nMおよび1nMの蛍光標識RNase A溶液をそれぞれの濃度で10μl加え、３７℃で30min静置し、蛍光偏光度を測定した。
結果は図５〜６に示したとおりである。この図５〜６は、蛍光偏光度をRNase A溶液の各濃度において抗体および抗体フラグメント構造体の終濃度に対してプロットしたものであり、プロットした値は２回の測定値の平均である。この図からも明らかなように、この発明の方法によって抗体フラグメント構造体を用いたときは、抗原であるRNase Aの終濃度が10pMの場合においても高感度で測定できることが確認された。なお、この測定値は抗体を用いたときに比べて、より上回る感度を得ることができ、この発明の優位性が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明における同一のＶＬ領域ポリペプチドからなるＶＬ抗体フラグメント構造体を示す模式図である。
【図２】本発明における同一のＶＨ領域ポリペプチドからなるＶＨ抗体フラグメント構造体を示す模式図である。
【図３】本発明におけるＶＬ領域ポリペプチドとＶＨ領域ポリペプチドをそれぞれ複数有するＶＨ−ＶＬ抗体フラグメント構造体を示す模式図である。
【図４】本発明における抗体フラグメント構造体と抗原からなる免疫複合体を示す模式図である。図中の４で示す部分は抗原である。
【図５】蛍光標識した濃度100pMのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡに対する抗体および抗体フラグメント構造体の結合を示す蛍光偏光度を抗体および抗体フラグメント構造体の濃度毎にプロットしたグラフである。
【図６】蛍光標識した濃度10pMのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡに対する抗体および抗体フラグメント構造体の結合を示す蛍光偏光度を抗体および抗体フラグメント構造体の濃度毎にプロットしたグラフである。
【符号の説明】
【００３１】
１…ＶＬ領域ポリペプチド
２…粒子
３…ＶＨ領域ポリペプチド
４…抗原
【図１】
2005145907.tif 000003
【図２】
2005145907.tif 000004
【図３】
2005145907.tif 000005
【図４】
2005145907.tif 000006
【図５】
2005145907.tif 000007
【図６】
2005145907.tif 000008
【配列表】
2005145907000001.app