(57)【要約】【課題】抗癌剤の製造のためのガンボージ樹脂由来の生理活性抽出物の調製。【解決手段】ガンボージ樹脂から得られるアセトン抽出生成物及びこのアセトン抽出生成物からさらに精製された化合物（フォルモキサントンＡと呼ぶ新規化合物を含む）が本明細書中に開示される。アセトン抽出生成物及びさらに精製した化合物は、腫瘍／癌細胞の増殖の抑制における活性を有することが実証された。また、このさらに精製した化合物を得るためのプロセス、ならびに腫瘍／癌細胞の増殖を抑制するための薬学的組成物の調製における、アセトン抽出生成物及びさらに精製した化合物の使用も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2005330261.tif 000033
の化合物。
【請求項２】
治療有効量の以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物
（ｉｉ）請求項１に記載の化合物；ならびに
（ｉｉｉ）請求項１に記載の化合物、ならびにベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、
のいずれかを含む薬学的組成物。
【請求項３】
ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物を含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、ベツリン及びベツリニックアシッドを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、８％のモレリックアシッド、８％のイソモレリックアシッド、１８％のガンボジックアシッド、１５％のイソガンボジックアシッド、２％のイソモレリノール、４％のデスオキシモレリン、８％のベツリン、及び８％のベツリニックアシッドを含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物、ベツリニックアシッド、ならびに以下のいずれかの組み合わせ：
（１）イソガンボジックアシッド、ガンボジックアシッド、及びデスオキシモレリン；
（２）イソモレリックアシッド、モレリックアシッド、及びイソモレリノール；
（３）ガンボジックアシッド、モレリックアシッド、及びデスオキシモレリン；ならびに
（４）イソガンボジックアシッド、イソモレリックアシッド、及びイソモレリノール、
を含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソガンボジックアシッド、５０％のガンボジックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソモレリックアシッド、５０％のモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のガンボジックアシッド、３０％のモレリックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のイソガンボジックアシッド、３０％のイソモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が以下の薬剤の１つ以上を含む：賦形剤、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、及びリポソーム。
【請求項１３】
請求項１１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が賦形剤であり、そしてスクロース、ブラウンシュガー、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、及び結晶セルロースから選択される少なくとも１つのサッカライド化合物を含む。
【請求項１４】
経口投与に適する形態に製造された、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
乳癌、結腸癌、白血病、肝癌、肺癌及びリンパ腫からなる群より選択される少なくとも１つの癌／腫瘍の処置において用いられ得る、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
乳癌、結腸癌、白血病、肝癌、肺癌及びリンパ腫からなる群より選択される少なくとも１つの癌／腫瘍の処置のための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物
（ｉｉ）請求項１に記載の化合物；ならびに
（ｉｉｉ）請求項１に記載の化合物、及びベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、
のいずれかを含む。
【請求項１７】
ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物を含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の化合物、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、ベツリン及びベツリニックアシッドを含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
活性成分として、前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、８％のモレリックアシッド、８％のイソモレリックアシッド、１８％のガンボジックアシッド、１５％のイソガンボジックアシッド、２％のイソモレリノール、４％のデスオキシモレリン、８％のベツリン、及び８％のベツリニックアシッドを含む、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物、ベツリニックアシッド、ならびに以下のいずれかの組み合わせ：
（１）イソガンボジックアシッド、ガンボジックアシッド、及びデスオキシモレリン；
（２）イソモレリックアシッド、モレリックアシッド、及びイソモレリノール；
（３）ガンボジックアシッド、モレリックアシッド、及びデスオキシモレリン；ならびに
（４）イソガンボジックアシッド、イソモレリックアシッド、及びイソモレリノール、
を含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソガンボジックアシッド、５０％のガンボジックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソモレリックアシッド、５０％のモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のガンボジックアシッド、３０％のモレリックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記組成物の重量に基づき、５％の請求項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のイソガンボジックアシッド、３０％のイソモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が以下の薬剤の１つ以上を含む：賦形剤、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、及びリポソーム。
【請求項２７】
請求項２６に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が賦形剤であり、そしてスクロース、ブラウンシュガー、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、及び結晶セルロースから選択される少なくとも１つのサッカライド化合物を含む。
【請求項２８】
経口投与に適する形態に製造された、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
アセトンを用いるガンボージ樹脂の抽出により得られる製品であって、該製品は、図１に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを有し、そして請求項１に記載の化合物、ベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、台湾出願番号第０９３１１４３５１号（２００４年５月２１日出願）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、ガンボージ樹脂から得られるアセトン抽出生成物及びこのアセトン抽出生成物をさらに精製した化合物（フォルモキサントンＡ（ｆｏｒｍｏｘａｎｔｈｏｎｅ  Ａ）と呼ばれる新規化合物を含む）に関する。このアセトン抽出生成物及びさらに精製した化合物が、腫瘍／癌細胞の増殖を抑制する活性を有することが実証された。本発明はまた、このさらに精製された化合物を得るためのプロセス、ならびに腫瘍／癌細胞の増殖を抑制するための薬学的組成物の調製におけるこのアセトン抽出生成物及びさらに精製した化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
ガンボージ樹脂は、オトギリソウ科のＧａｒｃｉｎｉａ植物により分泌されるＧａｒｃｉｎｉａ種のガンボージである。それは、従来より、植物性色素及び顔料の供給源として用いられてきた。それは、いくつかの地域（例えば、インド及びタイ）における、民間療法においても用いられてきた。一般的にガンボージとして知られているＧａｒｃｉｎｉａ（ピン音でＴＥＮＧＨＵＡＮＧ）は、熱帯地方に生える常緑樹の一種である。インドに生える主な種は、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍｏｒｅｌｌａ  Ｄｅｓｖであり、一方、タイに生える主な種は、Ｇ．ｈａｒｂｕｒｙｉ  Ｈｏｏｋである。開花時期の前に、この木の樹皮を、地面から約２メートルらせん状に切断して開き、そのにじみ出る樹脂を回収する。次いで、この樹脂を、加熱乾燥に供して、凝固したガンボージ樹脂を得る。
【０００４】
伝統的な漢方（ＴＣＭ）によれば、ガンボージは、炎症の治療、毒素の除去、止血、及び殺虫に有効である。１９３４年以来、ガンボージ樹脂の成分についての多数の報告がされてきた。現在、多くの化合物がガンボージ樹脂の抽出物から単離され得ることが知られており、これらの化合物としては、：モレリン（ｍｏｒｅｌｌｉｎ）、モレリックアシッド（ｍｏｒｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ガンボジックアシッド（ｇａｍｂｏｇｉｃ  ａｃｉｄ）、モレリノール（ｍｏｒｅｌｌｉｎｏｌ）、イソモレリン（ｉｓｏｍｏｒｅｌｌｉｎ）、イソモレリックアシッド（ｉｓｏｍｏｒｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ）、イソガンボジックアシッド（ｉｓｏｇａｍｂｏｇｉｃ  ａｃｉｄ）、イソモレリノール（ｉｓｏｍｏｒｅｌｌｉｎｏｌ）、ネオガンボジックアシッド（ｎｅｏｇａｍｂｏｇｉｃ  ａｃｉｄ）、デスオキシモレリン（ｄｅｓｏｘｙｍｏｒｅｌｌｉｎ）、ジヒドロイソモレリン（ｄｉｈｙｄｒｏｉｓｏｍｏｒｅｌｌｉｎ）、α−グティフェリン（α−ｇｕｔｔｉｆｅｒｉｎ）、及びβ−グティフェリン（β−ｇｕｔｔｉｆｅｒｉｎ）等が挙げられる。
【０００５】
いくつかの研究が、ヒト肺癌細胞（ＨＥＬ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ細胞）、及びヒト鼻咽頭癌細胞（ＫＢ細胞）に対するガンボージ樹脂の特定成分の細胞毒活性を報告している［非特許文献１；非特許文献２］。
【０００６】
ある報告において、Ａｎｅｍｏｎｅ  ｒａｄｄｅａｎａの根が、中国の民間療法において、リウマチ及び神経痛を治療するために用いられること、ならびにベツリン及びベツリニックアシッドがＡｎｅｍｏｎｅ  ｒａｄｄｅａｎａの根のエタノール抽出物から単離され得ることが指摘されている。ベツリンは、ヒト好中球においてタンパク質のチロシンリン酸化を妨げ、それによって、スーパーオキサイドの発生を抑制することが出来ることが証明されている［非特許文献３］。
【０００７】
非特許文献４におけるＤａｒｒｉｃｋ  Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｋｉｍらによる報告において、ベツリニックアシッドの親の構造の単純な改変により、強力な抗癌剤として開発され得る誘導体を産生し得ることが実証されている。ベツリニックアシッドがミトコンドリアに対する直接的な効果によってアポトーシスを誘発し得ること［非特許文献５］及び腫瘍細胞に対する選択的な細胞毒性を有すること［非特許文献６］を指摘する報告が存在する。
【０００８】
本出願人の知る範囲で、ガンボージ樹脂からのベツリン及びベツリニックアシッドの単離を開示する報告も特許も存在していない。
【０００９】
特許文献１は、以下の式Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩによって表される、ガンボジックアシッド、そのアナログ、及び誘導体を開示し：
【００１０】
【化１】
2005330261.tif 000002
ここで、Ｒ1〜Ｒ5は、特許文献１において規定されるとおりである。
【００１１】
前述の式Ｉ〜ＩＩＩのうちの１つを有する化合物が、カスパーゼのアクチベータ及びアポトーシスの誘導物質であり得ることが開示されている。
【００１２】
特許文献２は、Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｍｏｒｅｌｌａ  Ｄｅｓｖの樹脂から細胞溶解毒素を精製するプロセスを開示し、エタノール抽出、クロロホルム抽出、及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により得られるＧＭＤ１６３０という名前により識別される生成物に関する。しかし、この特許は、ＧＭＤ１６３０生成物が単一の化合物であるか類似の特性を有する化合物の混合物であるか否かを開示していない。
【特許文献１】米国特許第６，４６２，０４１号
【特許文献２】欧州特許出願第０  ４２８  ８１５号
【非特許文献１】Ｍ．Ｔａｄａら、（１９９６）、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１、８１５〜９２０
【非特許文献２】Ｇ．Ａ．Ｃｏｒｄｅｌｌら、（１９９３）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、３４０〜３４７
【非特許文献３】Ｋ．Ｙａｍａｓｈｉｔａら、（２００２）、Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３２５、９１〜９６
【非特許文献４】Ｄａｒｒｉｃｋ  Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｋｉｍら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、（１９９８）、８、１７０７〜１７１２
【非特許文献５】Ｓｉｍｏｎｅ  Ｆｕｌｄａら、（１９９８）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７８、３３９４２〜３３９４８
【非特許文献６】Ｖａｌｅｎｔｉｎａ  Ｚｕｃｏら、（２００２）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７５、１７〜２５
【非特許文献７】Ｓ．Ａ．Ａｈｍａｄら、（１９６６）、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｃ）、７７２〜７７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の点から、薬物（例えば、抗癌剤）の製造のためのガンボージ樹脂由来の生理活性抽出物または精製化合物の調製は、さらに研究及び調査をする利点があるはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の要旨
本発明は、以下の項を含む：
項１．下記式：
【００１５】
【化２】
2005330261.tif 000003
の化合物；
項２．治療有効量の以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物
（ｉｉ）項１に記載の化合物；ならびに
（ｉｉｉ）項１に記載の化合物、ならびにベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、
のいずれかを含む薬学的組成物；
項３．ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物を含む、項２に記載の薬学的組成物；
項４．項１に記載の化合物、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、ベツリン、及びベツリニックアシッドを含む、項２に記載の薬学的組成物；
項５．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、８％のモレリックアシッド、８％のイソモレリックアシッド、１８％のガンボジックアシッド、１５％のイソガンボジックアシッド、２％のイソモレリノール、４％のデスオキシモレリン、８％のベツリン、及び８％のベツリニックアシッドを含む、項４に記載の薬学的組成物；
項６．項１に記載の化合物、ベツリニックアシッド、ならびに以下のいずれかの組み合わせ：
（１）イソガンボジックアシッド、ガンボジックアシッド、及びデスオキシモレリン；
（２）イソモレリックアシッド、モレリックアシッド、及びイソモレリノール；
（３）ガンボジックアシッド、モレリックアシッド、及びデスオキシモレリン；ならびに
（４）イソガンボジックアシッド、イソモレリックアシッド、及びイソモレリノール、
を含む、項２に記載の薬学的組成物；
項７．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソガンボジックアシッド、５０％のガンボジックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、項６に記載の薬学的組成物；
項８．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソモレリックアシッド、５０％のモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、項６に記載の薬学的組成物；
項９．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のガンボジックアシッド、３０％のモレリックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、項６に記載の薬学的組成物；
項１０．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のイソガンボジックアシッド、３０％のイソモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、項６に記載の薬学的組成物；
項１１．薬学的に許容される担体をさらに含む、項２に記載の薬学的組成物；
項１２．項１１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が以下の薬剤の１つ以上を含む：賦形剤、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、及びリポソーム；
項１３．項１１に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が賦形剤であり、そしてスクロース、ブラウンシュガー、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、及び結晶セルロースから選択される少なくとも１つのサッカライド化合物を含む；
項１４．経口投与に適する形態に製造された、項２に記載の薬学的組成物；
項１５．乳癌、結腸癌、白血病、肝癌、肺癌及びリンパ腫からなる群より選択される少なくとも１つの癌／腫瘍の処置において用いられ得る、項２に記載の薬学的組成物；
項１６．乳癌、結腸癌、白血病、肝癌、肺癌及びリンパ腫からなる群より選択される少なくとも１つの癌／腫瘍の処置のための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物
（ｉｉ）項１に記載の化合物；ならびに
（ｉｉｉ）項１に記載の化合物、及びベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物、
のいずれかを含む；
項１７．ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物を含む、項１６に記載の薬学的組成物；
項１８．項１に記載の化合物、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、ベツリン及びベツリニックアシッドを含む、項１６に記載の薬学的組成物；
項１９．活性成分として、前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、８％のモレリックアシッド、８％のイソモレリックアシッド、１８％のガンボジックアシッド、１５％のイソガンボジックアシッド、２％のイソモレリノール、４％のデスオキシモレリン、８％のベツリン、及び８％のベツリニックアシッドを含む、項１８に記載の薬学的組成物；
項２０．項１に記載の化合物、ベツリニックアシッド、ならびに以下のいずれかの組み合わせ：
（１）イソガンボジックアシッド、ガンボジックアシッド、及びデスオキシモレリン；
（２）イソモレリックアシッド、モレリックアシッド、及びイソモレリノール；
（３）ガンボジックアシッド、モレリックアシッド、及びデスオキシモレリン；ならびに
（４）イソガンボジックアシッド、イソモレリックアシッド、及びイソモレリノール、
を含む、項１６に記載の薬学的組成物；
項２１．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソガンボジックアシッド、５０％のガンボジックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、項２０に記載の薬学的組成物；
項２２．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソモレリックアシッド、５０％のモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、項６に記載の薬学的組成物；
項２３．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のガンボジックアシッド、３０％のモレリックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、項２０に記載の薬学的組成物；
項２４．前記組成物の重量に基づき、５％の項１に記載の化合物、１０％のベツリニックアシッド、４０％のイソガンボジックアシッド、３０％のイソモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、項２０に記載の薬学的組成物；
項２５．薬学的に許容される担体をさらに含む、項１６に記載の薬学的組成物；
項２６．項２５に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が以下の薬剤の１つ以上を含む：賦形剤、溶媒、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、及びリポソーム；
項２７．項２６に記載の薬学的組成物であって、ここで、前記薬学的に許容される担体が賦形剤であり、そしてスクロース、ブラウンシュガー、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、及び結晶セルロースから選択される少なくとも１つのサッカライド化合物を含む；
項２８．経口投与に適する形態に製造された、項１６に記載の薬学的組成物；
項２９．アセトンを用いるガンボージ樹脂の抽出により得られる製品であって、該製品は、図１に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを有し、そして項１に記載の化合物、ベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンを含む。
【００１６】
本発明は、ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物、ならびにこのアセトン抽出生成物からさらに精製した９種類の化合物：ベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、及びフォルモキサントンＡとして識別される新規化合物、を提供する。
【００１７】
本発明に従うガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物及びそれからさらに精製された化合物が効果的に腫瘍／癌細胞の増殖を抑制することが出来ることが実証されている。従って、本発明はさらに、治療有効量の以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物；
（ｉｉ）フォルモキサントンＡ；ならびに
（ｉｉｉ）フォルモキサントンＡ及び以下の化合物から選択される少なくとも１つの化合物：ベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリン、
のいずれかを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、以下の好ましい実施形態の詳細な説明において明らかになる。
【００１９】
好ましい実施形態の詳細な説明
抽出溶媒中へのガンボージ樹脂粉末の溶解度、並びに抽出溶媒の沸点及び安全性を考慮すると、アセトンが最良の選択であるようである。従って、本出願人は、アセトンを用いてガンボージ樹脂を抽出し、次いでアセトンを除去して、アセトン抽出生成物（ＴＳＢ−１４として識別した）を得ることを試みた。
【００２０】
このアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４のさらなる成分分離を、主に、カラムクロマトグラフィーを用いて実施した。適切なカラム充填剤の好ましい選択としては、一般的に用いられるシリカゲル及びＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０が挙げられる。前者は、吸着マトリクスであり、一方で、後者は、サイズ排除クロマトグラフィーのためのカラム充填剤である。
【００２１】
アセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４を、最初に、シリカゲルカラムを用いる吸着クロマトグラフィーに供し、そしてｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配（１００／０→４／１）で溶出した。すなわち、溶出は、最初に、ｎ−ヘキサンを用いて実施した。次いで、酢酸エチル勾配を徐々に増加して、３種類の画分（すなわち、ＧＭＥ１、ＧＭＥ２及びＧＭＥ３）を得た。ここで、以下の実施例２に関連して記載されるように、ＧＭＥ１は、１００／０→１０／１の溶出部分であり；ＧＭＥ２は、１０／１→４／１の溶出部分であり；そしてＧＭＥ３は、４／１→１／１の溶出部分であった。
【００２２】
前述のＧＭＥ１、ＧＭＥ２、及びＧＭＥ３の画分において用いられる溶出溶媒を、バキュームロータリーエバポレーターを用いて除去した。
【００２３】
分画のプロセスの間、各々の画分の検出を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び展開試薬を用いて実施し、そして各々の画分の成分分離を一般的に用いられる手順を参照して検出した。
【００２４】
画分ＧＭＥ２を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０で充填したカラムを用いる分子ふるいクロマトグラフィーに供した。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（２：１：１）を用いる溶出の後、ＴＬＣ検出に従い、分子ふるいクロマトグラフィー（２：１：１のｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール）及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノールを用いる勾配溶出（１：１：０→０：１：０→０：１０：１））を、２３番目のチューブについて繰り返した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる溶出の間、２つの無色の針状様結晶生成物を得、これらを、ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１として識別した。さらに、４６番目のチューブを、薄層クロマトグラフィーに供した。ＴＬＣシート上に噴霧試薬により検出された桃色のスポット（本明細書中以下の実施例２及び表１を参照のこと）に対応する分離した部分を回収し、そして分子ふるいクロマトグラフィー及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返した。最後に、分取薄層クロマトグラフィーを実施して、２種類の生成物（夫々、ＴＳＢ−６及びＴＳＢ−７として識別した）を得た。さらに、４７番目のチューブを薄層クロマトグラフィーに供した。ＴＬＣシート上に噴霧試薬により検出された桃色のスポット（本明細書中以下の実施例２及び表１を参照のこと）に対応する分離した部分を回収し、そして分子ふるいクロマトグラフィー及びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返した。最後に、分子ふるいクロマトグラフィー及び再結晶を実施して、橙色のフレーク状結晶（ＴＳＢ−２として識別した）を得た。さらに、６３番目のチューブを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、そしてジクロロメタン／メタノール（３０：１）を用いて溶出し、引き続き分取薄層クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル、２：１）及び再結晶を行って、黄色の針状様生成物（ＴＳＢ−４として識別した）を得た。
【００２５】
画分ＧＭＥ１を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、そしてｎ−ヘキサン／アセトン（５：１）で溶出した。２６番目のチューブを、分子ふるいクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、２：１：１）、次いで、分取薄層クロマトグラフィーに供して２種類の生成物（夫々、ＴＳＢ−５及びＴＳＢ−３として識別した）を得た。さらに、２３番目のチューブ及び５１番目のチューブを、夫々、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。前者をｎ−ヘキサン／ジクロロメタン（１：１）を用いて溶出した。後者を、ｎ−ヘキサン及びｎ−ヘキサン／酢酸エチル（７：１）の勾配を用いて溶出した。その後、ＴＣＬを実施した。ＴＬＣシート上に示された桃色のスポットに対応し、そして等価のＲｆ値を有する分離した部分を合わせて、シリカゲルクロマトグラフィーに供し、そしてジクロロメタンを用いて溶出した。次いで、ＴＬＣを実施し、そしてＴＬＣシート上に桃色のスポットとして示される分離した部分を回収し、引き続いてクロマトグラフィー（シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び分子ふるいクロマトグラフィーを含む）をした。最後に、分取薄層クロマトグラフィー及び再結晶を実施して橙色の針状様生成物（ＴＳＢ−８として識別した）を得た。
【００２６】
従って、本明細書中上記において得た９種類の精製した生成物を、スペクトル分析（赤外線分光法、核磁気共鳴分光法（1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲ）、質量分析法などを含む）に供した。
【００２７】
化学構造解析によって、生成物ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１が、２種類の公知のベツリニックアシッド誘導体（すなわち、夫々、以下の化学構造：
【００２８】
【化３】
2005330261.tif 000004
を有する、ベツリン及びベツリニックアシッド）であることを確認した。
【００２９】
化学構造解析によって、生成物ＴＳＢ−７及びＴＳＢ−２が、２種類の公知のモレリックアシッド立体異性体（すなわち、夫々、以下の化学構造：
【００３０】
【化４】
2005330261.tif 000005
を有する、モレリックアシッド及びイソモレリックアシッド）であることを確認した。
【００３１】
化学構造解析によって、生成物ＴＳＢ−５及びＴＳＢ−３が、２種類の公知のモレリックアシッド立体異性体（すなわち、夫々、以下の化学構造：
【００３２】
【化５】
2005330261.tif 000006
を有する、ガンボジックアシッド及びイソガンボジックアシッド）であることを確認した。
【００３３】
化学構造解析によって、生成物ＴＳＢ−６が、以下の化学構造：
【００３４】
【化６】
2005330261.tif 000007
を有する、イソモレリノールであることを確認した。
【００３５】
化学構造解析によって、生成物ＴＳＢ−８が、以下の化学構造：
【００３６】
【化７】
2005330261.tif 000008
を有する、デスオキシモレリンであることを確認した。
【００３７】
化学構造解析の結果及び既知の化合物の分光学的データとの比較によって、ＴＳＢ−４が今までのところ報告されていない新規の化合物であることを確認した。本明細書中において、それは、フォルモキサントンＡと名付けられ、そして以下の構造を有する：
【００３８】
【化８】
2005330261.tif 000009
本発明に従いガンボージ樹脂から得た生成物ＴＳＢ−４（フォルモキサントンＡ）は、キサントン骨格中に、以下を有する：（１）夫々、Ｃ−１位、Ｃ−３位、及びＣ−５位に３つのヒドロキシル基；（２）Ｃ−４位に１つのγ，γ−ジメチルアリル鎖；（３）Ｃ−６位及びＣ−７位に位置する１つの２，２−ジメチルピラン環；ならびに（４）Ｃ−１１位とＣ−１２位との間の１つの二置換二重結合及びＣ−１７位とＣ−１８位との間の１つの三置換二重結合。
【００３９】
前述の化学構造によれば、以下の一般式を有するフォルムキサントンＡ誘導体が、化学反応によって調製され得：
【００４０】
【化９】
2005330261.tif 000010
ここで、Ｒは、独立して水素；好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、必要に応じて置換された低級アルキル；３〜２０個の炭素原子を有する、必要に応じて置換されたアリール（好ましくはＣ5〜Ｃ12アリール；３〜３０個の炭素原子を有する必要に応じて置換されたアラルキル（好ましくは（Ｃ5〜Ｃ12）アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、より好ましくは、（Ｃ6）アリール（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル；または化学式Ｒａ−ＣＯにより表されるアシルを表し、ここで、Ｒａは：好ましくは１〜６個の炭素原子を有する、必要に応じて置換された低級アルキル；３〜２０個の炭素原子を有する必要に応じて置換されたアリール（好ましくはＣ5〜Ｃ12アリール）；３〜３０個の炭素原子を有する必要に応じて置換されたアラルキル（好ましくは（Ｃ5〜Ｃ12）アリール（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、そしてより好ましくは（Ｃ6）アリール（Ｃ1〜Ｃ3）アルキル）である。
【００４１】
例えば、前述のヒドロキシル基が芳香族環上に位置するので、メトキシ誘導体をメチル化によって得ることが出来るか、またはアセチル誘導体をアセチル化によって得ることが出来る。さらに、二重結合がキサントン環の外側に位置するので、これらの二重結合を水素化によって処理して、水素化誘導体を産生することが出来るか、または他の付加反応（例えば、水和）によってヒドロキシル誘導体を産生することが出来る。一方、過酸化を用いてエポキシド誘導体（例えば、以下の化学構造：
【００４２】
【化１０】
2005330261.tif 000011
を有するエポキシド誘導体）を産生することが出来る。
【００４３】
本出願人は、さらに、本発明に従いガンボージ樹脂から得られるアセトン抽出生成物、このアセトン抽出生成物をさらに精製することによって得られる９種類の生成物（ＴＳＢ−０〜ＴＳＢ−８）、及びこれらの精製した生成物からなる混合物の生理活性を調査し、そしてこのアセトン抽出生成物、生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８、及び前述の生成物からなる混合物が腫瘍／癌細胞（例えば、肝癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、白血病細胞、リンパ腫癌細胞等）の増殖の抑制において有効であることを発見した。腫瘍／癌細胞の増殖の抑制において、生成物ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１は生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８ほど有効ではないようであるが、本出願人は、これらが、他の生成物と組み合わせて用いられる場合に、生成物ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１は、他の生成物を活性化する効果を有するようであることを発見した。従って、生成物ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１は、生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８の少なくとも１つを含む薬学的組成物においてアクチベータとして用いられることが企図される。
【００４４】
刊行物によれば、トリテルペンのベツリン及びベツリニックアシッドは、複合的な薬理学的活性（インビトロ及びインビボでの黒色腫細胞に対する有効性を含む）を有する。さらに、これらは、全く安全である。従って、キサントン化合物である生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８と組み合わせて用いられる場合、トリテルペンであるこれらの２種類の生成物（ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１）は、補助的または相乗的な効果を示すことが出来るはずである。
【００４５】
従って、本発明は、治療有効量の以下：
（ｉ）ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物；
（ｉｉ）フォルモキサントンＡ；ならびに
（ｉｉｉ）フォルモキサントンＡならびにベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物、
のいずれかを含む、薬学的組成物を提供する。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物を含む、薬学的組成物を提供する。
【００４７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、フォルモキサントンＡならびにベツリン、ベツリニックアシッド、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、及びデスオキシモレリンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００４８】
より好ましい実施形態において、本発明は、フォルモキサントンＡ、モレリックアシッド、イソモレリックアシッド、ガンボジックアシッド、イソガンボジックアシッド、イソモレリノール、デスオキシモレリン、ベツリン、及びベツリニックアシッドを含む、薬学的組成物を提供する。別のより好ましい実施形態において、本発明は、活性成分として組成物の重量に基づき、５％のフォルモキサントンＡ、８％のモレリックアシッド、８％のイソモレリックアシッド、１８％のガンボジックアシッド、１５％のイソガンボジックアシッド、２％のイソモレリノール、４％のデスオキシモレリン、８％のベツリン及び８％のベツリニックアシッドを含む、薬学的組成物を提供する。
【００４９】
本発明に従いガンボージ樹脂から分離及び精製される９種類の生成物としては、モレリノール、デスオキシモレリン、２種類のベツリニックアシッド誘導体（すなわち、ベツリン及びベツリニックアシッド）及び２組の立体異性体（すなわち、モレリックアシッド及びイソモレリックアシッド、ならびにガンボジックアシッド及びイソガンボジックアシッド）が挙げられる。さらに、抽出及び分離の実験結果によれば、ガンボジックアシッド及びイソガンボジックアシッドの２つの立体異性体が、最も高い含量を有し、次いで、モレリックアシッド及びイソモレリックアシッドの２つの立体異性体が高い含量を有する。
【００５０】
本出願人は、化合物の構造的特性に従い、これらの９種類の生成物の種々の組み合わせを作製し、そしてこれらの９種類の生成物の全ての組み合わせが、癌細胞の増殖抑制において顕著な効果を示したことを証明した。従って、薬理学的実験結果を参照し、前述の９種類の生成物の産業への適用を考慮して、前述の９種類の生成物は、意図される効果に従い異なる活性成分及び組成の割合を有する薬学的組成物へと処方され得る。
【００５１】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、フォルモキサントンＡ、ベツリニックアシッド、ならびに以下の化合物の組み合わせ：
（１）イソガンボジックアシッド、ガンボジックアシッド、及びデスオキシモレリン；
（２）イソモレリックアシッド、モレリックアシッド、及びイソモレリノール；
（３）ガンボジックアシッド、モレリックアシッド、及びデスオキシモレリン；ならびに
（４）イソガンボジックアシッド、イソモレリックアシッド、及びイソモレリノール、
のいずれか１つを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明は、活性成分として、組成物の重量に基づき、５％のフォルモキサントンＡ、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソガンボジックアシッド、５０％のガンボジックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、活性成分として、組成物の重量に基づき、５％のフォルモキサントンＡ、１０％のベツリニックアシッド、２０％のイソモレリックアシッド、５０％のモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５４】
なお別の好ましい実施形態において、本発明は、活性成分として、組成物の重量に基づき、５％のフォルモキサントンＡ、１０％のベツリニックアシッド、４０％のガンボジックアシッド、３０％のモレリックアシッド、及び５％のデスオキシモレリンを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５５】
なお別の好ましい実施形態において、本発明は、活性成分として、組成物の重量に基づき、５％のフォルモキサントンＡ、１０％のベツリニックアシッド、４０％のイソガンボジックアシッド、３０％のイソモレリックアシッド、及び５％のイソモレリノールを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５６】
本発明に従う薬学的組成物は、当業者に周知の技術を用いて非経口投与、局所投与、または経口投与に適する投薬形態へと処方され得、これらの投薬形態としては、注射（例えば、滅菌水溶液または分散液）、滅菌散剤、錠剤、ロゼンジ、丸剤、カプセル剤等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明に従う生物学的に活性な成分は、制御放出（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）薬物及び処方薬へと組み込まれ得る。
【００５７】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、さらに、薬品製造の分野において広く用いられる薬学的に許容される担体を含み得る。例えば、この薬学的に許容される担体としては、以下の薬剤：溶媒（例えば、水、通常生理食塩水、緩衝液、グリセリン、有機溶媒）、乳化剤、懸濁化剤、崩壊剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、保存剤、滑沢剤、吸収遅延剤、リポソーム等、のうち１つ以上が挙げられ得る。
【００５８】
経口固体調製物を作製するために、賦形剤及び、必要であれば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤等が、本発明に従うガンボージ樹脂由来の抽出生成物と混合され得る。次いで、得られた混合物が、当該分野においてそれ自身公知の方法によって、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などへと形成され得る。そのような添加剤は、本発明の分野において一般的に使用される添加剤であり得、これらの添加剤としては、賦形剤：サッカライド化合物［例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、ブラウンシュガー、ソルビトール、マンニトール、スターチ］、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、及び珪酸；結合剤：水、エタノール、プロパノール、スクロース溶液、グルコース溶液、澱粉溶液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、セラック、リン酸カルシウム、及びポリビニルピロリドン；崩壊剤：ドライスターチ、アルギン酸ナトリウム、粉末寒天、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、モノグリセロールステアレート、及びラクトース；滑沢剤：精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、及びポリエチレングリコール；ならびに矯正剤：スクロース、ビターオレンジピール、クエン酸、及び酒石酸が挙げられる。
【００５９】
本発明に従う好ましい実施形態において、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。この賦形剤としては、以下の群：スクロース、ブラウンシュガー、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、コーンスターチ、及び結晶セルロースから選択される少なくとも１つのサッカライド化合物が挙げられる。サッカライド化合物が賦形剤として用いられる場合、これらは、粉末形態の薬学的化合物の特性を増強し得、そして溶解を促進する効果を有する。
【００６０】
経口液体調製物を作製するために、矯味矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等が、本発明に従うガンボージ樹脂由来の抽出生成物と混合され得る。次いで、得られた混合物は、当該分野においてそれ自身公知の方法によって、内服溶液、シロップ剤、エリキシル剤等へと形成され得る。この場合、矯味矯臭剤は、上記のものと同じであり得る。緩衝剤の例は、クエン酸ナトリウムであり、一方、安定化剤の例は、トラガント、アラビアガム、及びゼラチンである。
【００６１】
注射溶液を調製するために、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、等張液などが、本発明に従うガンボージ樹脂由来の抽出生成物と混合され得る。次いで、得られた混合物が、当該分野においてそれ自身が公知である方法によって、皮下注射用液、筋内注射用液、または静脈注射用液へと形成され得る。ｐＨ調整剤及び緩衝剤の例としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びリン酸ナトリウムが挙げられる。安定化剤の例は、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、及びチオ乳酸である。等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、及びグルコースが挙げられる。
【００６２】
本明細書中で用いられる用語「有効量」とは、本発明に従う薬学的組成物を必要とする処置される被験体に投与する場合に、標的としない組織または器官に対して所望されない重篤な損傷を引き起こすことなく、所望とされる治療効果を提供するのに十分な、その組成物の量を示す。治療有効量は、種々の因子に依存して変化する。これらの因子としては、例えば、疾患の型、体重、年齢、身体的な状態、及び処置される被験体の応答、及び投与経路等が挙げられる。この治療有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００６３】
本発明に従う薬学的組成物の投与の投薬量及び頻度は、以下の因子：処置される疾患の重篤度、投与の経路、ならびに処置される被験体の応答、体重、年齢及び身体的状態に依存して変化する。例えば、本発明に従う薬学的組成物の一日当りの投薬量は、体重１キログラム当り２．１〜３．０ｍｇであり得、そして単回用量または複数回用量で投与され得る。例えば、３回に分割した用量で投与される場合、各々の投薬量は、体重１キログラム当り０．７〜１．０ｍｇである。
【００６４】
本発明に従う薬学的組成物は、単独で、または腫瘍もしくは癌の処置において用いられる他の治療方法もしくは治療薬と組み合わせて投与され得る。そのような治療方法としては、化学療法及び外部ビーム放射療法が挙げられる。そのような治療薬としては、パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、サイクロホスファミド、及びドキソルビシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明は、以下の実施例を参照にしてより詳細に記載され、以下の実施例は、例示目的のためのみに提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。
［実施例］
【００６６】
一般的手順：
赤外スペクトルを、ＫＢｒディスクとしてのＪＡＳＣＯ  ＦＴ−ＩＲ  ５３００分光計に記録した。
【００６７】
紫外スペクトルを、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｕ−３０００分光計で測定した。
【００６８】
ＥＩＭＳスペクトルを、ＪＥＯＬ  ＨＸ１１０またはＪＥＯＬ  ＳＸ−１０２Ａ質量分析機で記録した。
【００６９】
プロトン及び炭素−１３核磁気共鳴スペクトルを、ＢＲＵＫＥＲ  ＡＭ４００、ＶＡＲＩＡＮ  ＧＥＭＩＮＩ−４００またはＢＲＵＫＥＲ  ＡＤＶＡＮＣＥ  ＤＭＸ−６００分光計で得た。
【００７０】
カラムクロマトグラフィーとしては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いる分子ふるいカラムクロマトグラフィー、及びＭｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｇｅｌ  ６０（７０−２３０メッシュＡＳＴＭ）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーが挙げられる。
【００７１】
ＴＬＣシートについては、０．２５ｍｍの層厚を有し、適切なサイズに切断可能であるＭｅｒｃｋ  シリカゲル６０Ｆ254ガラスシート（２０×２０ｃｍ）を用いた。
【００７２】
分取層クロマトグラフィー（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＬＣ）シートについては、０．５ｍｍまたは１ｍｍの層厚を有するＭｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ254ガラスシート（２０×２０ｃｍ）を用いた。
【００７３】
ＴＬＣ検出について、以下の噴霧試薬処方物：（ａ）Ｃｅ（ＳＯ4）2・４Ｈ2Ｏ（０．８ｇ）；（ｂ）（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ（２０．０ｇ）；（ｃ）濃硫酸（２３ｍＬ）；及び（ｄ）蒸留水（３７７ｍＬ）を用いた。
【００７４】
展開応答を、照射のためにＵＶランプを用い、そして短波長（２５４ｎｍ）及び長波長（３６５ｎｍ）で検出した。
【００７５】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、Ｒａｉｎｉｎ、ｍｏｄｅｌ  ＳＤ−２００を用いて実施した。ＵＶ検出器の検出を、３６０ｎｍの固定した波長を用いて実施した。ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００ＲＰ−１８ｅ  ５μｍ（Ｍｅｒｃｋ）を分析カラムとして用いた。移動相：９０％アセトニトリル及び０．０５％のＴＦＡでスパイク（ｓｐｉｋｅ）した１０％脱イオン水（ｖ／ｖ）；流速は１．０ｍｌ／分；分析条件：サンプルをアセトンで溶解して適切に希釈した溶液を形成し、ＨＰＬＣ装置に注入した。
【実施例１】
【００７６】
実施例１．ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物の調製
抽出手順：
地方の漢方薬局から購入したガンボージ樹脂を、粉砕して粉末にし、そして１００ｇの粉末を室温でアセトン（６×５００ｍＬ）に浸漬して抽出を実施し、夫々、２４時間放置した。合わせた抽出溶液を、通常の室内条件でろ紙を用いてろ過した。ろ過した溶液から、バキュームロータリーエバポレーターを用いてアセトンを除去して、黄褐色のゲル状固体を得た（６５ｇ）（非特許文献７）。
【００７７】
このように得られたアセトン抽出生成物を、ＴＳＢ−１４として識別した。この生成物ＴＳＢ−１４の主成分の分布を理解するために、前述の一般的手順に従って、生成物ＴＳＢ−１４に対するＨＰＬＣ分析を実施し、そして図１に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを得た。
【００７８】
実施例２．ガンボージ樹脂から精製された化合物の調製
実験手順：
本明細書中、上記したカラム分析を、前述の一般的手順に従って実施した。
【００７９】
３５ｇの実施例１で得られた生成物ＴＳＢ−１４を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し［カラム：１０ｃｍ（直径）×８０ｃｍ（長さ）］、そして溶出し（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配）（１００／０→４／１）、バキュームロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、そして３つの画分（ＧＭＥ１（１０ｇ）、ＧＭＥ２（１４ｇ）、及びＧＭＥ３（８ｇ））に分離した。
【００８０】
ＧＭＥ１は、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出が１００／０→１００／１０までで溶出される時に回収される画分であり、ＴＬＣ（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）を用いる検出によって、主成分としてＴＳＢ−５（下記参照のこと）、及びＲｆ値＞ＴＳＢ−５であるＲｆ値を有する他の成分を含有することが見出された。
【００８１】
ＧＭＥ２は、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出が１０／１→４／１までで溶出される時に回収される画分であり、ＴＬＣ（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）を用いる検出によって、主成分としてＴＳＢ−５、ならびにＴＳＢ−５のＲｆ値より僅かに小さいＲｆ値を有する成分ＴＳＢ−７、ＴＳＢ−６、及びＴＳＢ−２を含有することが見出された。
【００８２】
ＧＭＥ３は、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配溶出が４／１→１／１までで溶出される時に回収される画分であり、ＴＬＣ（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）を用いて検出した際、ＴＳＢ−５を含有することが見出されなかった。それは、ＴＳＢ−５より強い極性及びＴＳＢ−５より小さいＲｆ値を有する他の成分を含有し、そしてそれは、テーリング現象を示した。
【００８３】
１０ｇの画分ＧＭＥ２を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０を用いるカラムクロマトグラフィー（カラム：５ｃｍ×８０ｃｍ）（本明細書中、以降でカラムＡとして示す）を実施した。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（２：１：１）を用いる溶出の後（画分サイズ：１００ｍＬ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／クロロホルム／メタノール、２：１：１０）を、２３番目のチューブの画分について繰り返した（これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／クロロホルム／メタノール勾配、１：１：０→０：１：０→０：１０：１）にも供した）。無色の針状様結晶の形態の２種類の生成物（ＴＳＢ−０（３２０ｍｇ）及びＴＳＢ−１（４５０ｍｇ））を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いる溶出の間に順次得た。
【００８４】
さらに、カラムＡを溶出することによって得られる４６番目のチューブの画分を用いて、ＴＬＣを実施し（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）、そして噴霧試薬によってＴＬＣシート上で検出された桃色のスポットに対応する分離した部分を回収し、そして分子ふるいクロマトグラフィー（ｎ−へキサン／酢酸エチル／メタノール、２：２：１）及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−へキサン／酢酸エチル、４：１）を繰り返した。最後に、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、１００：１）を実施して、橙色粉末の形態の生成物ＴＳＢ−６（４４ｍｇ）及び生成物ＴＳＢ−７（２２０ｍｇ）を得た。
【００８５】
さらに、カラムＡを溶出することによって得られる４７番目のチューブの画分を用いて、ＴＬＣを実施し（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）、そして噴霧試薬によってＴＬＣシート上で検出された桃色のスポットに対応する分離した部分を回収し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−へキサン／酢酸エチル／メタノール、２：２：１）を実施した。溶出溶媒をバキュームエバポレーター中で除去し、そして残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−へキサン／酢酸エチル、４：１；    ｎ−ヘキサン／酢酸エチル１：０→１０：１、勾配溶出；    ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、２０：３０：１）に供した。最後に、分子ふるいカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、２：２：１）を実施した。バキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を除去し、そして残渣を再結晶してオレンジイエロー（ｏｒａｎｇｅ  ｙｅｌｌｏｗ）のフレーク状結晶の形態の生成物ＴＳＢ−２（８１５ｍｇ）を得た。
【００８６】
さらに、カラムＡから溶出することによって得られる６３番目のチューブの画分を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン／メタノール、３０：１）を実施し、引き続きＴＬＣを実施して、噴霧試薬（この噴霧試薬を噴霧した後、加熱を実施した；一般的操作手順及び表１を参照のこと）によってＴＬＣシート上（展開溶媒：ジクロロメタン／メタノール、２０：１）で検出された黄色のスポットに対応する分離した部分を得た。分離した部分を合わせ、そしてバキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を除去した。残渣を、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル、２：１）に供して、黄色がかった針状様結晶の形態の生成物ＴＳＢ−４（５２ｍｇ）を得た。
【００８７】
さらに、画分ＧＭＥ１（８ｇ）を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム：６ｃｍ×８０ｃｍ）（本明細書中、以降で、カラムＢとして示す）に供した。ｎ−ヘキサン／アセトン（５：１）を用いる溶出の後（画分サイズ：１００ｍＬ）、２６番目のチューブを用いて、分子ふるいカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、２：２：１）を実施し、そしてバキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を除去した。残渣を、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル、４：１）に供して、橙色粉末の形態の生成物ＴＳＢ−５（１０５０ｍｇ）及び暗黄色粉末の形態の生成物ＴＳＢ−３（８５０ｍｇ）を得た。
【００８８】
さらに、カラムＢからの溶出の後に得られる２３番目のチューブ及び５１番目のチューブの画分を、夫々、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。前者を、ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン（１：１）を用いて溶出した。後者を、勾配溶出（ｎ−ヘキサン→ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（１：０→７：１））に供した。ＴＬＣを実施して、噴霧試薬によってＴＬＣシート（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／アセトン、６：１）上で検出される桃色のスポットに対応し、そして同一のＲｆ値を有する分離した部分を回収した。回収した分離部分を合わせ、そしてバキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を除去した。残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン）によって溶出した。次いで、ＴＬＣを実施して、ＴＬＣシート（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／アセトン、６：１）上に展開された桃色のスポットに対応する分離部分を回収し、そして合わせた。バキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を除去し、一方で、残渣を分子ふるいカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、２：２：１）に供した。バキュームエバポレーターを用いて溶出溶媒を、除去した。最後に、残渣を、分取薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン、２：１）及び再結晶に供して、橙色の針状様結晶の形態の生成物ＴＳＢ−８（６０ｍｇ）を得た。
【００８９】
実施例３．ガンボージ樹脂から精製された化合物の同定及び特徴付け
（実験手順）：
実施例２においてガンボージ樹脂から得られた９種類の生成物の物理的及び化学的特性を、前述の一般的手順（赤外分光法（ＩＲ）、核磁気共鳴分光法（1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲ）、質量分析法（ＥＩＭＳ）、及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を含む）に従って分析した。
【００９０】
結果：
ＴＬＣシート上の実施例２において得られた９種類の生成物（ＴＳＢ−０〜ＴＳＢ−８）の展開の結果を、表１に示す。ここで、実施した全ての試験において、生成物ＴＳＢ−４が黄色を示したことが示される。
【００９１】
表１．ＴＬＣシート上の、ガンボージ樹脂から得られた生成物の展開結果
【００９２】
【表１−１】
2005330261.tif 000012
観察されるＴＬＣ展開挙動ならびに物理的及び化学的特性から、生成物ＴＳＢ−４が、いずれの文献の刊行物にも記載されていない、新規化合物であると予備的に決定された。
【００９３】
これらの９種類の生成物を、種々の分光分析を使用することによって測定した。このようにして得られた実験データを、以下の通り示す：
１．生成物ＴＳＢ−０：
生成物ＴＳＢ−０が、以下の特徴（特性）を有することを測定した：
無色針状晶、融点、２５７〜２５９℃
ＩＲνmaxｃｍ−１（ＫＢｒ）：３４００、３０９０、２９７０、１６４０、１４６０、１３８０、１０４０、１０２０、８８０。
【００９４】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ４．６５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、４．５５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）、３．７７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ）、３．３１（１Ｈ、ｂｒ  ｄ、Ｊ＝１０．９Ｈｚ）、３．１６（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．２、５．０Ｈｚ）、１．６６（３Ｈ、ｓ）、１．０１、１．００、０．９５、０．８０、０．７４（各々、３Ｈ、ｓ）。
【００９５】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ１５０．６２、１０９．７４、７９．１４、６０．８０、５５．５７、５０．６７、４９．０５、４７．９６、４２．９２、４１．１６、３８．９９、３８．９３、３７．５６、３７．３６、３４．４８、３４．１０、３０．０２、２９．４２、２８．０９、２７．５８、２７．２７、２５．４８、２１．０１、１９．１９、１８．４４、１６．１３、１５．３７、１４．８７。
【００９６】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：４４２［Ｍ］+（７６）、４２７（１１）、４２４（１６）、４１１（７７）、３９９（１２）、３８５（１４）、２８８（１５）、２７３（６）、２７１（５）、２５７（９）、２４７（１０）、２４５（１０）、２３４（５６）、２２０（３０）、２０７（９０）、２０３（８０）、１８９（１００）。
【００９７】
分析した分光データに従い、生成物ＴＳＢ−０が、以下の化学構造：
【００９８】
【化１１】
2005330261.tif 000013
を有する既知の化合物（すなわち、ベツリン）であることを同定した。
【００９９】
２．生成物ＴＳＢ−１：
生成物ＴＳＢ−１が、以下の特性を有することを測定した：
無色針状晶、融点２９０〜２９２℃。
【０１００】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３６００−２４００、３０７０、２９５０、１６９０、１６４０、１２４０、１０４０、８８０。
【０１０１】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ3ＯＤ）：δ０．７５、０．８６、０．９５、０．９７、１．００、１．７０（各々３Ｈ、ｓ）、２．２３（１Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１２．４、２．８Ｈｚ）、２．３０（１Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１２．８、３．６Ｈｚ）、３．０２（１Ｈ、ｄｔ、Ｊ＝１０．４、４．８Ｈｚ）、３．１２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１１．２、５．２Ｈｚ）、４．５９、４．７１（各々１Ｈ、ｂｒｓ）。
【０１０２】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ−ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ１７８．９３、１５０．５１、１０９．１６、７８．５３、５５．９８、５５．１４、５０．３１、４６．７５、４２．１７、４０．４１、３８．５３、３８．０６、３６．８８、３４．０８、３２．０１、３０．３２、２９．３９、２７．５６、２６．６６、２５．２９、２０．６２、１８．９４、１８．０２、１５．７６、１５．５６、１５．０３、１４．３４。
【０１０３】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：４５６［Ｍ］+（７０）、４３８（３５）、４２３（２５）、４１０（２０）、３９５（１５）、３１６（１５）、３０２（１８）、２５９（３０）、２４８（８０）、２３４（５５）、２２０（６０）、２０７（８０）、２０３（６０）、１８９（１００）。
【０１０４】
分析した分光データに従い、生成物ＴＳＢ−１が以下の化学構造：
【０１０５】
【化１２】
2005330261.tif 000014
を有する既知の化合物（すなわち、ベツリニックアシッド）であることを同定した。
【０１０６】
３．生成物ＴＳＢ−２：
生成物ＴＳＢ−２が以下の特性を有することを同定した：
黄色フレーク、融点２０４〜２０９℃。
【０１０７】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３５００−２４００、２９６０、１７３５、１６８０、１６５０、１５９０、１４３０、１３８０、１３２５、１１３０、１０４０、９６０、８７０。
【０１０８】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ７．５６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、６．６３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．５１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．１２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．６、６．８Ｈｚ）、３．５２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．２、４．７Ｈｚ）、３．２６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、２．６６（１Ｈ、ｍ）、２．５５（２Ｈ、ｍ）、２．３５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．４、４．６Ｈｚ）、１．７５（３Ｈ、ｓ）、１．７２（３Ｈ、ｓ）、１．６５（３Ｈ、ｓ）、１．４４（３Ｈ、ｓ）、１．４３（３Ｈ、ｓ）、１．３５（３Ｈ、ｓ）、１．３０（３Ｈ、ｓ）。
【０１０９】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ２００．９３、１７８．９１、１７１．８６、１６１．１０、１５７．６４、１５７．２８、１３６．９７、１３５．３９、１３３．３５、１３１．７０、１２８．６３、１２６．１８、１２２．１２、１１５．４４、１０８．２７、１０３．１８、１００．４９、９０．７１、８３．７１、８３．６４、７８．６５、４９．０６、４６．８８、２９．９５、２８．９３、２８．３３、２５．７１、２５．３１、２１．６２、１８．０９、１１．３４。
【０１１０】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：５６０［Ｍ］+（１００）、５４５（４７）、５３２（２２）、５１７（３６）、４０５（４４）、３８９（１１）、３６３（２４）、３４９（１７）、３０７（１２）、２８７（２２）、２８５（１６）、２４５（１５）、２１５（１２）、１８９（５）。
【０１１１】
分析した分光データに従い、生成物ＴＳＢ−２が以下の化学構造：
【０１１２】
【化１３】
2005330261.tif 000015
を有する既知の化合物（すなわち、イソモレリックアシッド）であることを同定した。
【０１１３】
４．生成物ＴＳＢ−３：
生成物ＴＳＢ−３が以下の特性を有することを測定した：
暗黄色アモルフォス粉末、融点１１０〜１１２℃。
【０１１４】
ＩＲνmaxｃｍ-1  （ＫＢｒ）：３５００−２４００、２９６０、２９２０、１７３５、１６８５、１６４０、１５９０、１４３５、１４００、１３８０、１３３０、１１７５、１１４０、１０４５、９６０、８０５、７６０。
【０１１５】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１２．７０、１２．６９（１Ｈ、ｓ）、７．４８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、６．５９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ）、６．４７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．３８、５．３６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、５．０３（２Ｈ、ｍ）、３．４４（１Ｈ、ｍ）、３．２１（１Ｈ、ｍ）、３．１７（１Ｈ、ｍ）、２．５６（１Ｈ、ｍ）、２．４５（１Ｈ、ｍ）、２．２７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１２．０、４．４Ｈｚ）、１．９７（２Ｈ、ｍ）、１．６７、１．６４、１．５７、１．５４、１．５２、１．４７、１．３２、１．２７（各々３Ｈ、ｓ）。
【０１１６】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ２０２．９５、２０２．８８、１７８．７６、１７８．７１、１７２．３８、１７２．２４、１６１．３４、１６１．２１、１５７．５２、１５７．２７、１３７．０７、１３６．８２、１３５．３２、１３３．２３、１３３．１８、１３１．７７、１３１．７０、１３１．６４、１２８．８６、１２８．４９、１２４．６７、１２３．７６、１２３．６９、１２２．０９、１１５．８６、１０７．８２、１０２．８１、１０２．７０、１００．３８、１００．２７、９０．６６、９０．５５、８３．６８、８３．５５、８３．５１、８１．２３、８１．１９、４８．９５、４６．８７、４６．７８、４１．８３、２９．９４、２９．８３、２８．９７、２８．８６、２７．４２、２７．２７、２５．６１、２５．５７、２５．３７、２５．２２、２２．６８、２１．５５、１８．０７、１８．００、１７．５３、１１．２６。
【０１１７】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：６２８［Ｍ］+（７８）、６１３（１１）、６００（１２）、５４６（６８）、５４５（１００）、５１７（２６）、４７３（１５）、３８９（８）、３５５（１１）、２７１（５）、２４５（１２）、２１４（１９）、１８９（８）。
【０１１８】
分析された分光データに従い、生成物ＴＳＢ−３が以下の化学構造：
【０１１９】
【化１４】
2005330261.tif 000016
を有する既知の化合物（すなわち、イソガンボジックアシッド）であることを同定した。
【０１２０】
５．生成物ＴＳＢ−５：
生成物ＴＳＢ−５が以下の特性を有することを検出した：
橙色粉末；融点９６〜９９℃。
【０１２１】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３６００−２４００、２９５０、２９１０、１７３５、１６８０、１６２５、１５８５、１４５０、１４３０、１４００、１３８０、１３２５、１２５５、１１７０、１１３５、１０４０、９５０、８８０、８００、７５５。
【０１２２】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１２．７２、１２．７０（１Ｈ、ｓ）、７．５１、７．５０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、６．５２、６．５１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、６．１７、６．０７（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、５．３４、５．３０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、５．０２（２Ｈ、ｍ）、３．４４（１Ｈ、ｍ）、３．２６（１Ｈ、ｍ）、３．１０（１Ｈ、ｍ）、２．９７（１Ｈ、ｍ）、２．８８（１Ｈ、ｍ）、２．４７（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝９．２、２．５Ｈｚ）、１．９９（２Ｈ、ｍ）、１．７１、１．７０、１．６９、１．６６、１．５４、１．５０、１．２９、１．２２（各々３Ｈ、ｓ）。
【０１２３】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ２０３．２６、１７８．８２、１７８．７８、１７１．８９、１７１．７０、１６１．３５、１６１．２０、１５７．５１、１５７．４５、１５７．２４、１３８．５１、１３５．５２、１３５．２６、１３３．２６、１３３．１１、１３１．７７、１３１．６１、１３１．２９、１３１．２５、１２７．３８、１２７．３４、１２４．６２、１２４．３０、１２３．７９、１２２．２１、１１５．８０、１０７．６４、１０７．４６、１０２．７７、１０２．６０、１００．４１、１００．３３、９０．９７、９０．８７、８３．７０、８３．５８、８１．１５、８０．９３、４８．９２、４６．７２、４１．８９、４１．５９、２９．８４、２９．７８、２９．１５、２８．７７、２８．７１、２７．５５、２６．８１、２５．６１、２５．５５、２５．１１、２２．６５、２１．５２、２０．６０、１８．０５、１７．９７、１７．５１。
【０１２４】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：６２８［Ｍ］+（４６）、６１３（７）、６００（１２）、５４６（４８）、５４５（１００）、５１７（２４）、４７４（１３）、３９１（７）、３５５（７）、２８７（６）、２４５（９）、２１４（１３）、１８９（５）。
【０１２５】
分析された分光データに従い、生成物ＴＳＢ−５が以下の化学構造：
【０１２６】
【化１５】
2005330261.tif 000017
を有する既知の化合物（すなわち、ガンボジックアシッド）であることを測定した。
【０１２７】
６．生成物ＴＳＢ−６：
生成物ＴＳＢ−６が以下の特性を有することを測定した：
橙色粉末；融点１３７〜１３９℃。
【０１２８】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３４６０、２９７０、２９２５、１７３５、１６４５、１６３０、１５９０、１４６０、１４３５、１４００、１３８５、１３３０、１３００、１２５０、１２１０、１１８５、１１６５、１１４０、１０４５、９６０、８８０、８１０。
【０１２９】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１２．６８（１Ｈ、ｓ）、７．４１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、６．５９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、５．４９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、５．１９（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、４．７３（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、３．６１（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝１０．２Ｈｚ）、３．４９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．７Ｈｚ）、３．４７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝４．７Ｈｚ）、３．３２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．５、６．８Ｈｚ）、３．２４（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１４．３、７．７Ｈｚ）、２．６０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ）、２．４８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．４Ｈｚ）、２．３１（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．５、４．７Ｈｚ）、１．７４、１．６８、１．６４、１．２５、１．０１（各々３Ｈ、ｓ）、１．４１（６Ｈ、ｓ）。
【０１３０】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ２０３．３５、１８０．３３、１６１．０６、１５７．８０、１５７．４４、１３８．０１、１３４．４０、１３３．６３、１３１．８７、１２６．３１、１２１．９０、１１８．２０、１１５．５０、１０８．４４、１０３．００、１００．７２、９０．４８、８４．５０、８３．４１、７８．６６、６７．９２、４９．０９、４７．００、３０．０９、２８．９６、２８．２８、２８．２１、２５．７１、２５．２９、２１．５７、１８．１４、１２．４９。
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：５４６［Ｍ］+（１００）、５３１（１８）、５１８（４４）、５０３（４０）、４８５（９）、４３３（７）、４０５（３３）、３９１（１０）、３６３（１９）、３４９（１３）、３０７（１０）、２８７（２５）、２４５（８）、２３１（１８）、２１４（１２）、１８９（５）、１０５（６）。
【０１３１】
分析された分光データに従い、生成物ＴＳＢ−６が以下の化学構造：
【０１３２】
【化１６】
2005330261.tif 000018
を有する既知の化合物（すなわち、イソモレリノール）であることを同定した。
【０１３３】
７．生成物ＴＳＢ−７：
生成物ＴＳＢ−７が以下の特性を有することを測定した：
橙色粉末；融点１０６〜１０９℃。
【０１３４】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３５００−２４００、２９６０、２９２０、１７３５、１６８０、１６５０、１６２５、１５９０、１４３０、１３２５、１１２０、１０４０、８７０、７３５。
【０１３５】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１２．７１（１Ｈ、ｓ）、７．５１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、６．４９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、６．０５（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．０Ｈｚ）、５．３９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、４．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．４５（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝６．４、４．７Ｈｚ）、３．２７（１Ｈ、ｍ）、３．０８（１Ｈ、ｍ）、２．９７（２Ｈ、ｓｅｐｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、２．４９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、２．２８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１３．４、４．５Ｈｚ）、１．７０、１．６９、１．６７、１．６０、１．３６、１．３４、１．２６（各々３Ｈ、ｓ）。
【０１３６】
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、１００ＭＨｚ）：δ２０３．４７、１７９．０７、１７１．７４、１６１．２２、１５７．６５、１５７．３４、１３８．４６、１３５．３９、１３３．４２、１３１．４６、１２７．６４、１２６．００、１２２．２２、１１５．４４、１０８．０４、１０３．１６、１００．５５、９０．９３、８３．８２、７８．５５、４９．０１、４６．８０、２９．８７、２９．２６、２８．８２、２８．４０、２８．２０、２５．６８、２５．１４、２１．５７、２０．６３、１８．０６。
【０１３７】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：５６０［Ｍ］+（１００）、５４５（５６）、５３２（６３）、５１７（４８）、４８７（１２）、４３３（９）、４０５（８１）、３９１（２２）、３６３（３８）、３４９（２４）、３０７（１８）、２８７（６４）、２４５（４０）、２３１（２１）、２１５（２０）、１８９（１０）。
【０１３８】
分析された分光データに従い、生成物ＴＳＢ−７が以下の化学構造：
【０１３９】
【化１７】
2005330261.tif 000019
を有する既知の化合物（すなわち、モレリックアシッド）であると同定した。
【０１４０】
８．生成物ＴＳＢ−８：
生成物ＴＳＢ−８が以下の特性を有することを測定した：
橙色針状物；融点１０９〜１１０℃。
【０１４１】
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）：δ１２．８９（１Ｈ、ｓ）、７．４５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．２７（１Ｈ、ｓ）、６．６５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．４Ｈｚ）、５．５３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．３０（１Ｈ、ｂｒ  ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、４．４３（１Ｈ、ｂｒｓ）、３．４９（１Ｈ、ｍ）、３．３２（２Ｈ、ｍ）、２．５０（２Ｈ、ｍ）、２．３４（１Ｈ、ｍ）、１．７８、１．７１、１．６８、１．５９、１．３３、１．０３（各々３Ｈ、ｓ）、１．４５（６Ｈ、ｓ）。
【０１４２】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：５３０［Ｍ］+（１００）、５１５（２２）、５０２（９２）、４８８（３０）、４８７（８３）、４５９（１１）、４３３（２０）、４０５（４９）、３９１（１５）、３６３（２４）、３４９（１６）、３０７（１３）、２８７（２７）、２３１（１３）、２１５（３７）、１８９（６）。
【０１４３】
分析された分光データに従い、生成物ＴＳＢ−８が以下の化学構造：
【０１４４】
【化１８】
2005330261.tif 000020
を有する既知の化合物（すなわち、デスオキシモレリン）であると同定した。
【０１４５】
９．生成物ＴＳＢ−４：
生成物ＴＳＢ−４が以下の特性を有することを測定した：
黄色針状晶；融点１１５〜１１８℃。  ＦｅＣｌ3試験に供した際、結果は陽性だった。このことは、それがフェノール性化合物であることを示す。
【０１４６】
ＩＲνmaxｃｍ-1（ＫＢｒ）：３６４０、３４５０、３１５０、２９６０、２９００、１６３２、１６０２、１５７０、１５００、１４６０、１４２０、１３９５、１３４０、１２９５、１２３０、１１３０、１０５５、８７０、８２５、７９０。
【０１４７】
1Ｈ  ＮＭＲ（アセトン  −ｄ6、６００ＭＨｚ）：δ１３．０９（１Ｈ、ｓ、ＯＨ−１）、７．４０（１Ｈ、ｓ、Ｈ−８）、６．５５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、Ｈ−１１）、６．３２（１Ｈ、ｓ、Ｈ−２）、５．８７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．０Ｈｚ、Ｈ−１２）、５．３６（Ｈ、ｍ、Ｈ−１７）、３．５５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、Ｈ2−１６）、１．８４（３Ｈ、ｓ、Ｈ−２０）、１．６３（３Ｈ、ｓ、Ｈ−１９）、１．４８（６Ｈ、ｓ、Ｈ3−１４、Ｈ3−１５）。
【０１４８】
13Ｃ  ＮＭＲ（アセトン  −ｄ6、１２５ＭＨｚ）：δ１８１．２４（Ｃ＝Ｏ）、１６３．４１（Ｃ−３）、１６２．２６（Ｃ−１）、１５５．５６（Ｃ−４ａ）、１４６．９４（Ｃ−６）、１４６．４３（Ｃ−１０ａ）、１３４．４２（Ｃ−１８）、１３２．３０（Ｃ−１２）、１３１．７７（Ｃ−５）、１２３．３３（Ｃ−１７）、１２２．０８（Ｃ−１１）、１１９．０３（Ｃ−７）、１１５．２０（Ｃ−８ａ）、１１３．１５（Ｃ−８）、１０７．５４（Ｃ−４）、１０３．２６（Ｃ−９ａ）、９８．４０（Ｃ−２）、７８．８４（Ｃ−１３）、２８．２６（Ｃ−１４、１５）、２５．９３（Ｃ−１９）、２２．１６（Ｃ−１６）、１８．００（Ｃ−２０）。
【０１４９】
ＥＩＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：３９４［Ｍ］+（６６）、３９３（２３）、３７９（１００）、３３９（３０）、３２３（１６）、３１１（１３）、２９５（５）、２７８（１０）、２０３（４）、１６２（７）。
【０１５０】
生成物ＴＳＢ−４のＥＩＭＳデータは、ｍ／ｚ  ３９４で分子ピーク［Ｍ］+を示し、これは、分子式Ｃ23Ｈ22Ｏ6により表されるキサントンに対応する。
【０１５１】
生成物ＴＳＢ−４の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、それがキレート化ヒドロキシル基（δ１３．０９）、芳香族プロトンの２つのシングレット［δ６．３２（１Ｈ、ｓ）及びδ７．４０（１Ｈ、ｓ）］、２つのメチルプロトンのシングレット［δ１．４８（６Ｈ、ｓ）］及び互いにカップリングした２つのシス−オレフィンプロトン［δ５．８７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）及びδ６．５５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）］を有することを示す。これらのシグナルは、生成物ＴＳＢ−４の分子構造中にジメチルクロメン環が存在することを示す。
【０１５２】
さらに、生成物ＴＳＢ−４の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータから、２つのビニルメチルプロトン［δ１．６３（３Ｈ、ｓ）及びδ１．８４（３Ｈ、ｓ）］、メチレンプロトン［δ３．５５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）］、及びオレフィンプロトン［δ５．３６（１Ｈ、ｍ）］が存在することが分かる。このことは、生成物ＴＳＢ−４の分子構造がγ，γ−ジメチルアリル鎖を含むことを示す。
【０１５３】
上記データから、２，２−ジメチルピラン環及びγ，γ−ジメチルアリル鎖の置換基が、生成物ＴＳＢ−４のキサントン構造中に存在することが分かる。
【０１５４】
前述の1Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおけるカップリングを実証するために、２Ｄ−ＮＭＲ、同核相関分光法（Ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、1Ｈ−1Ｈ−ＣＯＳＹ）を用いる以外に、1Ｈ検出異核種多量子コヒーレンス（1Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＭＱＣ）（Ｊ＝１５０Ｈｚ）から、δ７．４０とδ１１３．１５とが相互に関連し；δ６．３２とδ９８．４０とが相互に関連し；δ６．５５とδ１２２．０８が相互に関連し；そしてδ５．８７とδ１３２．３０とが相互に関連することが見出される。このことは、ピラン環における２つの二置換オレフィン炭素の化学シフトが、δ１２２．０８及びδ１３２．３０であることを示す。さらに、三置換オレフィンプロトンのδ５．３６とδ１２３．３３が相互に関連し、そしてそれにカップリングしたメチレンプロトン（δ３．５５）は、δ２２．１６と相互に関連する。
【０１５５】
さらに、生成物ＴＳＢ−４の1Ｈ検出多重結合異核種多量子コヒーレンス（1Ｈ−Ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）（ＨＭＢＣ）（Ｊ＝８Ｈｚ）スペクトルデータから、キレート化された水酸基（δ１３．０９）及び２つの第四級炭素（δ１０３．２６及び１６２．２６）が相互に関連し、そして非置換芳香族環炭素（δ９８．４０）とさらに相互に関連することが見出された。このことは、キサントン骨格のＣ−２位が水酸基で置換されていないことを証明する。Ｃ−２プロトンシグナルδ６．３２及び２つの第四級炭素（δ１０３．２６、１０７．５４）が相互に関連し、そして２つの水酸基の結合した第四級炭素（δ１６３．４１、１６２．２６）とさらに相互に関連する。メチレンプロトン（δ３．５５）及び第四級炭素（δ１６３．４１、１５５．５６、１３４．４２、及びδ１０７．５４）が相互に関連し、そして第三級炭素（δ１２３．３３）と相互に関連する。このことは、γ，γ−ジメチルアリル鎖がＣ−４位に結合していることを証明する。従って、キサントン骨格中のＡ環は、［１，３−ジヒドロキシ−４−（γ，γ−ジメチルアリル）］によって置換されている。
【０１５６】
ＨＭＢＣスペクトルから、別の芳香族プロトン（δ７．４０）が、カルボニル炭素（δ１８１．２４）及び２つの酸素に結合した炭素（δ１４６．４３、δ１４６．９４）と相互に関連し、そしてピラン環中のオレフィン炭素の１つ（δ１２２．０８）と相互に関連していることが見出される。従って、プロトン（δ７．４０）がＣ−８（すなわち、カルボニル基のペリ位）に位置すること、そして結合するピラン環とキサントン骨格が直線状にカップリングしているはずであることが見出され得る。最後に残った水酸基は、Ｃ−５位にのみ結合することが出来、そしてその13Ｃ  ＮＭＲスペクトルの化学シフトは、δ１３１．７７である。
【０１５７】
上記のデータをかんがみ、生成物ＴＳＢ−４は、以下の化学構造：
【０１５８】
【化１９】
2005330261.tif 000021
を有する新規化合物であると同定される。
【０１５９】
生成物ＴＳＢ−４を、フォルモキサントンＡ｛ＩＵＰＡＣ命名法：［１，３，５−トリヒドロキシ−６’，６’−ジメチル−２Ｈ−ピラノ（２’，３’：６，７）−４−（３−メチルブト−２―エニル）キサントン］または［７，９，１２−トリヒドロキシ−２，２−ジメチル−１０−（３−メチル−ブト−２−エニル）−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｂ］キサンテン−６−オン］｝との名称によって識別する。
【０１６０】
ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４の構成成分の同定
ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４の構成成分の分布をさらに理解するために、本明細書中、上記した一般的手順を参照して、ＨＰＬＣ分析を実施した。このようにして得られた結果を図１に示す。
【０１６１】
ＴＳＢ−０及びＴＳＢ−１はＵＶ光吸収の特徴を有さないので、７種類の精製した化合物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８を、ＨＰＬＣ分析のための標準化合物として用い、それによって図２に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイル（ここで、ピークの番号は、ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８の生成物の番号に対応する）を生じた。
【０１６２】
アセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４の溶出プロファイルにおける、生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８が夫々対応するピークを見出すために、アセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４のサンプルの濃度を増加させて、図３に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを得た。
【０１６３】
図１〜３における結果を比較することによって、ＴＳＢ−１４中のＴＳＢ−４及びＴＳＢ−８の含量は、明らかに、高くなく、そのため、ＨＰＬＣ溶出プロファイル中に見出される対応するピークが非常に低いことが見出される。ＴＳＢ−４及びＴＳＢ−８のピークの位置を確認するために、アセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４（上）及びＴＳＢ−４（５００μｌ）及びＴＳＢ−８（５００μｌ）を添加したアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４（下）を用いてＨＰＬＣを実施し、それによって、図４に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを得た。
【０１６４】
本発明に従う生成物ＴＳＢ−１４の溶出プロファイルにおける、本発明に従いガンボージ樹脂から精製された７種類の生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８に対応する位置を示すために、図５に示されるようなＨＰＬＣ溶出プロファイルを得た。
【０１６５】
従って、ＨＰＬＣの結果から、本発明に従いガンボージ樹脂から得られたアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４が、以下の９種類の化合物：ベツリン（ＴＳＢ−０）、ベツリニックアシッド（ＴＳＢ−１）、イソモレリックアシッド（ＴＳＢ−２）、イソガンボジックアシッド（ＴＳＢ−３）、フォルモキサントンＡ（ＴＳＢ−４）、ガンボジックアシッド（ＴＳＢ−５）、イソモレリノール（ＴＳＢ−６）、モレリックアシッド（ＴＳＢ−７）、及びデスオキシモレリン（ＴＳＢ−８）、を含むことを確認することが出来る。前述の９種類の精製した化合物に加え、アセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４は、約２５％の少量の構成成分（トリテルペン及びキサントン、ならびに他の同定されていない化合物を含む）をさらに含む。
【０１６６】
実施例４．ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物及び精製された化合物の薬理学的実験
本発明のアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４及びこの抽出物から精製された生成物ＴＳＢ−１〜ＴＳＢ−８の生物学的活性を測定するために、以下の薬理学的活性分析を実施した。
【０１６７】
薬理学的実験１．インビトロ抗癌試験
最初に、癌細胞増殖抑制試験を用いて、癌細胞増殖に対する候補薬物の効果を検出した。ここで関連する作業原理は、生きた細胞が、代謝反応を介して、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＵＳＡ）を、もとの非蛍光酸化状態から蛍光性を有する還元状態（蛍光、赤）に変化させる能力である。このようにして得られるａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬によって発生した蛍光データの結果に従い、生きた細胞の増殖及び細胞活性を、検出によって定量することが出来る。
【０１６８】
この実験において、候補薬物のアッセイ濃度を０．０１、０．１、１、１０及び１００μｇ／ｍｌに設定し、そして以下の細胞株を用いた：６種類のヒト癌細胞ＭＣＦ−７（乳癌）、ＨＴ−２９（結腸癌）、ＨＬ−６０（白血病）、ＨｅｐＧ２（肝癌）、Ａ５４９（肺癌）、及びＵ９３７（リンパ腫）、ならびに正常なヒト臍帯の静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）。さらに、ＤＭＳＯ（４０％）を陰性コントロールとして、そしてマイトマイシンを陽性コントロールとして用いた。
【０１６９】
上記の６種類のヒト癌細胞株及び１種類の正常なヒト細胞についての、本発明に従うアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４及びこの抽出物から精製した生成物ＴＳＢ−１〜ＴＳＢ−８のＩＣ50値（５０％細胞増殖抑制濃度）及びＬＣ50値（５０％細胞破壊致死濃度）を、夫々以下の表に示す。
【０１７０】
表１．癌細胞についての、ガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４のＩＣ50（μｇ／ｍｌ）及びＬＣ50（μｇ／ｍｌ）
【０１７１】
【表１−２】
2005330261.tif 000022
表２．癌細胞についての、ガンボージ樹脂から精製した生成物ＴＳＢ−１〜ＴＳＢ−８のＩＣ50（μｇ／ｍｌ）
【０１７２】
【表２】
2005330261.tif 000023
「−」は、「測定せず」を示す。
【０１７３】
表３．癌細胞についての、ガンボージ樹脂からさらに精製した生成物ＴＳＢ−１〜ＴＳＢ−８のＬＣ50（μｇ／ｍｌ）
【０１７４】
【表３】
2005330261.tif 000024
「−」は、「試験せず」を示す。
【０１７５】
表１〜３に示される結果から、本発明に従うアセトン抽出生成物ＴＳＢ−１４及びこの抽出物から精製した生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８が、明らかに、腫瘍細胞増殖を抑制する効果を有し、従って非常に見込みのある抗癌剤であることが分かる。
【０１７６】
薬理学的実験２．生成物ＴＳＢ−０〜ＴＳＢ−８を含む混合処方物のインビトロでの抗癌効果
本発明の生成物ＴＳＢ−０〜ＴＳＢ−８を組み合わせて用いた場合のこれらの生理活性をさらに理解するために、混合処方物ＴＳＢ−９、ＴＳＢ−１０、ＴＳＢ−１１、ＴＳＢ−１２、及びＴＳＢ−１３を、以下の表４に従い調製した。得られた結果を、夫々、表５〜９に示す。
【０１７７】
表４
【０１７８】
【表４】
2005330261.tif 000025
表５．癌細胞増殖の抑制に対する処方物ＴＳＢ−９の効果
【０１７９】
【表５】
2005330261.tif 000026
表６．癌細胞増殖の抑制に対する処方物ＴＳＢ−１０の効果
【０１８０】
【表６】
2005330261.tif 000027
表７．癌細胞増殖の抑制に対する処方物ＴＳＢ−１１の効果
【０１８１】
【表７】
2005330261.tif 000028
表８．癌細胞増殖の抑制に対する処方物ＴＳＢ−１２の効果
【０１８２】
【表８】
2005330261.tif 000029
表９．癌細胞増殖の抑制に対する処方物ＴＳＢ−１３の効果
【０１８３】
【表９】
2005330261.tif 000030
表５〜９に示される結果から、本発明に従いガンボージ樹脂から精製した生成物ＴＳＢ−１〜ＴＳＢ−８が、明らかに、種々の組み合わせの下で、腫瘍細胞増殖を抑制する効果を示し、従って、抗癌剤へと開発される高い潜在能力を有することを知ることが出来る。
【０１８４】
薬理学的実験３．混合処方物ＴＳＢ−９のインビボでの生物活性
混合処方物ＴＳＢ−９を、さらに、元々Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ起源であり重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を有する雌のマウス（６〜８週齢、体重２０〜２２グラム）を用いる動物試験に供した。
ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）（１×１０7細胞／０．２ｍｌ）を、これらのマウスの背側に皮下移植し、そして５０μｇ／マウスの安息香酸エストラジオール（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、毎週、合計４週間、サプリメントとして皮下注射した。腫瘍増殖が直径５ｍｍ以上に達したとき（まさにその日を１日目とした）、腫瘍保有ヌードマウスを、無作為に、４つの群（１群あたり６匹のマウス）に分けた。
【０１８５】
混合処方物ＴＳＢ−９を、１０％のＤＭＳＯに溶解し、そしてこれらのマウスに毎日、夫々４０ｍｇ／ｋｇ及び８０ｍｇ／ｋｇの２種類の投薬量で、合計連続２１日間、経口投与した。マウスに、マイトマイシンを、２ｍｇ／ｋｇの用量で、４日間隔で、合計５回用量、腹腔内投与した。この処理群は、陽性コントロールの役割を果たした。
【０１８６】
試験物質の投与の後、これらのマウスを、以下の項目について観察した：明白な毒性のサイン、体重、及び腫瘍サイズ。測定を、実験期間の間、４日毎に１回行い、そして記録した。得られた実験結果を、表１０及び表１１に示す。
【０１８７】
表１０．腫瘍増殖抑制における混合処方物ＴＳＢ−９のインビボでの効果
【０１８８】
【表１０】
2005330261.tif 000031
*：％Ｔ／Ｃが４２％以下の場合、それは、有意な抗腫瘍活性を示す。
【０１８９】
表１１．試験動物の体重に対する混合処方物ＴＳＢ−９の効果
【０１９０】
【表１１】
2005330261.tif 000032
*：実験群の体重の値は、解析として独立スチューデント検定を用いた場合、ビヒクルコントロール群と比較して有意な変化を示した（ｐ＜０．０５）。
【０１９１】
２９日の期間の間、賦形剤コントロール群と比較して、混合処方物ＴＳＢ−９は、８０ｍｇ／ｋｇの用量で、有意な腫瘍重量抑制効果を引き起こし、一方で、混合処方物ＴＳＢ−９は、４０ｍｇ／ｋｇの用量で、中程度の腫瘍重量抑制効果を引き起こした。
【０１９２】
本明細書中に引用される全ての特許及び参考文献は、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む、本明細書の記載を優先する。
【０１９３】
本発明は、上記の特定の実施形態を参照して記載されてきたが、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、多数の修正及び改変をすることが出来ることは明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって示されるとおりにのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】図１は、上記の記載においてＴＳＢ−１４として識別される、本発明に従うガンボージ樹脂由来のアセトン抽出生成物のＨＰＬＣ溶出プロファイルである。
【図２】図２は、ＨＰＬＣ溶出プロファイルであり、ここで、本発明に従いガンボージ樹脂から精製される７つの生成物（それぞれ、上記の記載において、夫々、ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８として識別される）が、ＨＰＬＣ分析を実施するために標準生成物として用いられ、そしてピークの番号が、夫々、生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８の番号に対応する。
【図３】図３は、ＴＳＢ−１４の溶出プロファイルにおけるピークのいずれに7種類の生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ−８が対応するかを例示するために、図１と図２との比較の結果を示すＨＰＬＣ溶出プロファイルであり、ここで、比較を容易にするために、生成物ＴＳＢ−１４のサンプル濃度を上方に調整した。
【図４】図４は、生成物ＴＳＢ−４及びＴＳＢ−８に対応する溶出ピークを同定するための、本発明に従う生成物ＴＳＢ−１４のＨＰＬＣの結果（上側）、ならびに各々５００μｌの生成物ＴＳＢ−４アセトン溶液及び生成物ＴＳＢ−８アセトン溶液を補充した生成物ＴＳＢ−１４のＨＰＬＣの結果（下側）を示すＨＰＬＣ溶出プロファイルである。
【図５】図５は、本発明に従う生成物ＴＳＢ−１４の溶出プロファイルにおける本発明に従うガンボージ樹脂から精製された７種類の生成物ＴＳＢ−２〜ＴＳＢ８の対応する位置を示す、ＨＰＬＣ溶出プロファイルである。
【図１】
2005330261.tif 000034
【図２】
2005330261.tif 000035
【図３】
2005330261.tif 000036
【図４】
2005330261.tif 000037
【図５】
2005330261.tif 000038