(57)【要約】【課題】本発明は、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析に必要な修飾ＤＮＡ類の酵素合成可能なＣ５位置換デオキシシチジン誘導体又はＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を提供することにある。【解決手段】本発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、【化１】2005060240.tif 000039（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式、
【化１】
2005060240.tif 000027
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されるＣ５位置換デオキシシチジン誘導体。
【請求項２】
一般式、
【化２】
2005060240.tif 000028
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されるＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体。
【請求項３】
前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜３項のいずれか１項に記載の誘導体。
【請求項４】
基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡおよびプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、請求項１〜３項のいずれか１項に記載の誘導体を、基質として用いる核酸の合成方
法。
【請求項５】
さらに、既存のデオキシウリジン誘導体又は既存のデオキシアデノシンを請求項１〜３項のいずれか１項に記載のデオキシシチジン又はアデノシン誘導体と共に基質として用いる請求項４記載の核酸の合成方法。
【請求項６】
前記既存のデオキシウリジン誘導体が、式、
【化３】
2005060240.tif 000029
【化４】
2005060240.tif 000030
【化５】
2005060240.tif 000031
【化６】
2005060240.tif 000032
【化７】
2005060240.tif 000033
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種である請求項４又は５記載の核酸の合成方法。
【請求項７】
前記既存のデオキシアデノシン誘導体が、式、
【化８】
2005060240.tif 000034
【化９】
2005060240.tif 000035
【化１０】
2005060240.tif 000036
【化１１】
2005060240.tif 000037
【化１２】
2005060240.tif 000038
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種である請求項４又は５記載の核酸の合成方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ合成酵素が、ファミリー  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼである請求項４〜７項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
鋳型ＤＮＡが天然のＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡである請求項４〜８項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＣ５位置換デオキシシチジン誘導体と新規なＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法に関し、特に、有用な標識を導入することが可能な新規なＣ５位置換デオキシシチジン誘導体と新規なＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
標識機能物質が結合したオリゴヌクレオチド類は特定の配列を持った核酸の検出を行なう上で必要不可欠なものであり、それ故、このようなオリゴヌクレオチド類に関して、多くの研究がなされ、またその応用が検討されてきた。標識機能物質が結合したオリゴヌクレオチド類として、当初は、放射性物質である３２Ｐ−リン酸を酵素的に結合させたオリゴヌクレオチド類が用いられたが、この場合、放射性物質を扱うための施設の確保及び維持、放射性物質を扱う上での安全性、３２Ｐの半減期が２週間と短いため保存が困難である等、種々の問題点があった。
このため非放射性物質である蛍光物質、発光物質、ビオチン等の標識化物質をオリゴヌクレオチドに結合させた核酸類の化学合成の開発及びその応用研究がなされている。特に自動合成機械による核酸の化学合成法が確立して長いオリゴヌクレオチドの化学合成が容易になって以来、標識化物質を結合させたオリゴヌクレオチド類の化学合成の開発がなされ、ＤＮＡプローブとして利用されてきた。しかし、ＤＮＡチップを用いたマイクロアレイＤＮＡ解析では、天然から得られた特定のＤＮＡ又はＲＮＡを基に酵素的に標識化物質を導入した修飾ＤＮＡをＤＮＡプローブとして用いる必要がある。
【０００３】
核酸塩基部に標識化合物を導入したオリゴヌクレオチドは検出の対象となる核酸と安定な相補的塩基対結合を造らなければならない。このためには立体的な障害が少なく且つ相補的塩基対結合に関係の無いピリミジン環の５位にリンカーを介して標識化合物を結合する方法が最も優れている。このようなピリミジン環の５位の部分に標識化合物を導入したオリゴヌクレオチドの化学合成には、基質としてＣ５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体が必要である。このため、従来は天然から得られるウリジンを出発原料にして、標識化合物を結合させることが可能なＣ５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を合成する方法が行われている。この合成法では、出発原料である５−クロロ水銀化−２’−デオキシウリジン又は触媒のパラジウム錯体が高価であり、有害な水銀化合物を扱うという難点がある。
【０００４】
前記Ｃ５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を基質に用いてオリゴヌクレオチドを化学合成し、更に標識物質をこのオリゴヌクレオチドに導入する方法が文献に報告され、また特許出願されている［Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｐ２５５−２８２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，  米国特許Ｎｏ４９４８８８２；特開平３−８６８９７号公報参照］。また、これらの５−位置換２’−デオキシウリジン誘導体のある種のものは５’−三リン酸化体に導くと、大腸菌のＤＮＡ合成酵素であるクレノー断片又はある種の好熱菌のＤＮＡ合成酵素であるＴａｑ又はＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの基質となるので、これらから修飾ＤＮＡを酵素的に合成する方法が知られている［Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｇｅｒ，Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐ，Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６３３（１９８１）；Ｃ．Ｒ．Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ．ａｌ，．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２，４４１，（１９９１）；Ｊ．Ａ．Ｌａｔａｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２８１７（１９９４）；Ｋ．Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆ．Ｂａｒａｂａｓ  ＩＩＩ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，３７，２８７２（１９９８）参照］。
【０００５】
このようにして酵素的に合成され且つ蛍光物質を導入した修飾ＤＮＡは、ＤＮＡプローブとして、特定のＤＮＡの検出に用いられている［Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，”ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ１０５−１４８，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｄｅｎｎｙ，”ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，ｐ４３−５９，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，”Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １”，  Ｅｄ．ｂｙ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｐ９３−１４４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）  参照］。また、アミノ基又はイミダゾール基を導入した修飾ＤＮＡの酵素を用いる合成、増幅法（ＰＣＲ法）と試験管内選択法を併用することで、特定の反応を触媒する触媒ＤＮＡ、又は特定の分子に結合するＤＮＡアプタマーとして応用されている［Ｔ．Ｒ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａ１．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，９７８１（１９９９）；  Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ．ａ１．，１２２，２４３３（２０００）参照］。しかし、  従来の修飾ＤＮＡの酵素合成法、ＰＣＲ法による大量合成法では酵素の基質特異性が高いため、用いることのできるＤＮＡ合成酵素の種類や基質となるＣ５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチド誘導体に大きな制約があった。
【０００６】
前記以外の従来技術としては、例えば、アラビノースとシアンアミドから容易に得られるアラビノアミノオキサゾリンとα−ブロモメチルフマル酸誘導体とを反応させることにより、標識物質などの機能性物質を結合することが可能な新規なＣ５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチド類を得る合成法が挙げられる。
更にこのＣ５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチドを基質に用いてオリゴヌクレオチドを化学合成し、このオリゴヌクレオチドに蛍光物質を導入した修飾ＤＮＡを化学合成する方法が特許出願された［沢井ら、特開平７−１６５７８６号公報参照］。また、この修飾ＤＮＡにポリアミン類を導入した化合物は、特定のＲＮＡを切断するＲＮＡ制限酵素として特許出願された［篠塚ら、特開平８−２４２８６２号公報参照］。
【０００７】
【（非）特許文献１】
Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｐ２５５−２８２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，
【（非）特許文献２】
米国特許Ｎｏ４９４８８８２号
【（非）特許文献３】
特開平３−８６８９７号公報
【（非）特許文献４】
．Ｐ．Ｌａｎｇｅｒ，Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐ，Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６３３（１９８１）；Ｃ．Ｒ．Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ．ａｌ，．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２，４４１，（１９９１）；Ｊ．Ａ．Ｌａｔａｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２８１７（１９９４）；  Ｋ．Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆ．Ｂａｒａｂａｓ  ＩＩＩ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，３７，２８７２（１９９８）
【（非）特許文献５】
Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，”ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ１０５−１４８，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｄｅｎｎｙ，”ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，ｐ４３−５９，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，”Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｐ９３−１４４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）
【（非）特許文献６】
Ｔ．Ｒ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａ１．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，９７８１（１９９９）；Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ．ａ１．，１２２，２４３３  （２０００）
【（非）特許文献７】
特開平７−１６５７８６号公報
【（非）特許文献８】
特開平８−２４２８６２号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来技術の方法では、Ｃ５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を導入した修飾ＤＮＡ類の合成は化学合成法に限られており、  前記修飾ＤＮＡ類の酵素合成は不可能である。多くの研究分野において、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析などでは、特定の天然の核酸を鋳型としたＤＮＡプローブの酵素合成、とりわけＰＣＲ法による合成が必要となるので、修飾ＤＮＡ類の酵素合成に関する大きな要求がある。
【０００９】
本発明は前記従来技術の問題点を解決するためのものである。本発明者らは前記実情に鑑み、有用なＣ５位置換デオキシシチジン誘導体とＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体、及びそれらを用いた核酸の合成方法を確立した。
【００１０】
すなわち、本発明は、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析に必要な修飾ＤＮＡ類の酵素合成可能なＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、基質、ＤＮＡ合成酵素について種々のスクリーニングを行なった結果、本発明の誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を見出すに至った。
【００１２】
すなわち、本願発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００１３】
【化１３】
2005060240.tif 000002
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００１４】
また、本願発明のＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体は、一般式、
【００１５】
【化１４】
2005060240.tif 000003
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００１６】
また、本願発明のＣ５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体又はＮ６位置換プリンデオキシヌクレオチド誘導体の好ましい実施態様において、前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１７】
また、本願発明のＣ５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体又はＮ６位置換プリンデオキシヌクレオチド誘導体を用いた核酸の合成方法は、前記基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、請求項１〜５項に記載の誘導体を、基質として用いることを特徴とする。
【００１８】
また、本願発明のＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、さらに、既存のデオキシウリジン誘導体と共に基質として用いることが可能であることを特徴とする。
【００１９】
また、本願発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体又はＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、前記既存のデオキシウリジン誘導体が、式、
【００２０】
【化１５】
2005060240.tif 000004
【００２１】
【化１６】
2005060240.tif 000005
【００２２】
【化１７】
2005060240.tif 000006
【００２３】
【化１８】
2005060240.tif 000007
【００２４】
【化１９】
2005060240.tif 000008
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００２５】
また、本願発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体又はＮ６位置換デオキシアデノシンを用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、前記既存のデオキシアデノシン誘導体が、式、
【００２６】
【化２０】
2005060240.tif 000009
【００２７】
【化２１】
2005060240.tif 000010
【００２８】
【化２２】
2005060240.tif 000011
【００２９】
【化２３】
2005060240.tif 000012
【００３０】
【化２４】
2005060240.tif 000013
但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００３１】
また、本願発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体又はＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、前記ＤＮＡ合成酵素が、ファミリー  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
【００３２】
また、本願発明のＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、鋳型ＤＮＡが、天然のＤＮＡ，化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡであることを特徴とする。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本願発明のＣ５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００３４】
【化２５】
2005060240.tif 000014
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３５】
本願発明のＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体は、一般式、
【００３６】
【化２６】
2005060240.tif 000015
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３７】
ここで、ＤＮＡ分子への新しい機能の付与という観点から、Ｘとしては、修飾ＤＮＡアプタマーを創製する際には静電的結合や疎水結合または水素結合を形成するような官能基、また、修飾ＤＮＡ触媒を創製する際にはルイス酸・塩基またはそれらのリガンドとなる分子を用いることが好ましい。
【００３８】
上記本発明の誘導体は、単独又は複数で用いても、容易に修飾ＤＮＡを導入することができる。また、後述するように、これら本発明の誘導体と、従来からある既存の誘導体とを組み合わせても、容易に修飾ＤＮＡを導入することができる。
【００３９】
本願発明のＣ５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体又はＮ６位置換デオキシアデノシン誘導体の好ましい実施態様において、前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種である。これらはタンパク質に含まれる機能性残基という観点から、特に好ましく用いることができる。
【００４０】
次に、核酸の合成方法について説明する。本願発明のＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法は、前記基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、上記本発明の誘導体を、基質として用いる。
【００４１】
これら本発明の誘導体を基質として用いて合成した核酸は、種々の蛍光標識を容易に結合させることが可能であり、蛍光標識を結合させた核酸は、有用なプローブ等となり得る。このような蛍光標識としては、従来のものを挙げることができ特に限定されない。例えば、蛍光標識として、フルオレスセイン，Ｃｙ５，テトラメチルカルボキシローダミン，ピレンなどを挙げることができる。
【００４２】
なお、蛍光標識を予め結合させた本発明の誘導体を用いて核酸を合成することも可能である。
【００４３】
さらに、蛍光標識以外に、種々の機能性物質を結合させた機能性修飾ＤＮＡ，例えば触媒、アプタマーなどを合成することもできる。また、蛍光標識ではなく、阻害剤を結合させることも可能である。
【００４４】
また、本願発明のＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法は、さらに、既存のデオキシウリジン誘導体又は既存のデオキシアデノシン誘導体と共に基質として用いることができる。既存のデオキシウリジン又はアデノシン誘導体を用いることにより、より多くの物質（蛍光標識等）を結合させることができる。前記既存のデオキシウリジン誘導体としては、ＤＮＡポリメラーゼによって効率よく修飾ＤＮＡを生成するという観点から、式、
【００４５】
【化２７】
2005060240.tif 000016
【００４６】
【化２８】
2005060240.tif 000017
【００４７】
【化２９】
2005060240.tif 000018
【００４８】
【化３０】
2005060240.tif 000019
【００４９】
【化３１】
2005060240.tif 000020
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種を好ましく用いることができる。
【００５０】
前記既存のデオキシアデノシン誘導体としては、ＤＮＡポリメラーゼによって効率よく修飾ＤＮＡを生成するという観点から、式、
【００５１】
【化３２】
2005060240.tif 000021
【００５２】
【化３３】
2005060240.tif 000022
【００５３】
【化３４】
2005060240.tif 000023
【００５４】
【化３５】
2005060240.tif 000024
【００５５】
【化３６】
2005060240.tif 000025
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種を好ましく用いることができる。
【００５６】
本願発明のＣ５位置換シチジン誘導体又はＮ６位置換アデノシン誘導体を用いた核酸の合成方法では、ＤＮＡ合成酵素として、ファミリー  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。これらのポリメラーゼ用いることにより、効率よく修飾ヌクレオチドをＤＮＡに導入できるという利点がある。
【００５７】
鋳型ＤＮＡとしては、天然のＤＮＡ，化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡのものを挙げることができる。
【００５８】
【実施例】
以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１
本実施例では、Ｃ５位に［（６−アミノヘキシル）カルバミルメチル］基を持つ修飾２’−デオキシシチジン三リン酸とＮ６位に４−アミノブチル基を持つ修飾２’−デオキシ−２，６−ジアミノプリンヌクレオシド三リン酸（５ｃ，３ａ）の合成とそれらのＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する基質特性について調べた。
【００６０】
まず、用いた試薬等について説明すれば以下の通りである。
【００６１】
＜用いた試薬と方法＞
１．  試薬
５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （３ｕ），  ５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸  （３ｃ）  ，  ２−アミノ−２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸（１ａ），  Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸（２ａ）はＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。  ５−アミノプロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸  （２ｃ）  はＪＥＮＡ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社から購入した。５−アミノアリル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （１ｕ），  ５−アミノプロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （２ｕ），  ５−アミノアリル−２’−デオキシチジン−５’−三リン酸  （１ｃ）は、ＧＥＮＥ  ＡＣＴ社から提供された。５−（７−アミノ−２，５−ジオキサヘプチル）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （４ｕ），  ５−［（６−アミノヘキシル）カルバミルメチル］−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （５ｕ），  ５−（７−アミノ−２，５−ジオキサヘプチル）−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸  （４ｃ）は、既知の方法に従って合成された。天然型の２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸  （ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ  及び  ＴＴＰ）  はＲｏｃｈｅ社から購入した。次のＤＮＡ  ポリメラーゼが実験に使われた。Ｔａｑ（タカラバイオケミカルズ社），  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社），  ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  （東洋紡株式会社）。プライマーオリゴヌクレオチドは北海道システムサイエンスから、  ｐＵＣ１８  鋳型ＤＮＡ  はタカラバイオケミカルズ社から購入した。他のすべての試薬は特級試薬をそのまま用いた。
【００６２】
２．  分析方法とゲル電気泳動
ＮＭＲはＪＥＯＬ社の  ＪＮＭ−ＡＬ３００で測定した。ＥＳＩ−マススペクトルはアプライドバイオシステム社のＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−１００で測定した。ＵＶスペクトルは島津製作所のＵＶ−１２００分光光度計で測定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はＯＤＳ−シリカゲルカラム（２０  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．  ×  ２５０  ｍｍ  Ｌ）を用い、５０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）の緩衝溶液中、５〜１５％のアセトニトリルの濃度勾配を用いて、流速８ｍＬ／分で溶出させた。ゲル電気泳動は２％アガロースゲル（１００  Ｖ，  ４０分）でおこなった。ＰＣＲ産物は２％のアガロース電気泳動によって分離し臭化エチジウム着色によって可視化し、ゲルイメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオ・ラド社）で記録した。
【００６３】
３．  ５−シアノメチル−３’５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシシチジン（２）の合成
５−シアノメチル−３’５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシウリジン  （１）  （１．５３  ｇ，  ４  ｍｍｏｌ）を溶かした乾燥ピリジン溶液（６１  ｍＬ）にオキシ塩化リン（０．８１  ｍＬ，  ８  ｍｍｏｌ）を室温で撹拌しながら滴下した。４時間後、反応液に氷水（２  ｍＬ）を０℃で加え、さらに０．５時間撹拌した。続いて濃アンモニア水（８  ｍＬ）を加え５０℃で２時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を１−１０％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、赤褐色オイル状の目的物（２）を収率４４％で０．６７２  ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ７．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２０  （ｄｄ，  １Ｈ），  ５．２０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０−４．２８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．５９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．６３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０９  （ｓ，  ３Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ３７２．９  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］，  ７２３．４  ［（２Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００６４】
４．  ５−カルボキシメチル−２’−デオキシシチジン（３）の合成
ヌクレオシド（２）  （０．５４  ｇ，  １．５  ｍｍｏｌ）を１Ｎ  ＫＯＨ水溶液（６．６  ｍＬ）に溶かし８５℃で２時間反応させた。反応液を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で中和した後、減圧留去した。続いて、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液−アセトニトリル混合液を溶出溶媒に用いて、残渣を中圧カラム（Ｗａｋｏｓｉｌ  ４０Ｃ１８）によって精製した。黄白色粉末状の目的物３を収率８５％で０．３７ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  ７．５９  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１６  （ｔ，  １Ｈ），  ４．３２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｄｄｄ，  ２Ｈ），  ３．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．３３−２．１８  （ｍ，
２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ２８４．１  ［（Ｍ−Ｈ）−］。
【００６５】
５．  ５−メトキシカルボニルメチル−２’−デオキシシチジン（４）の合成
ヌクレオシド（３）  （０．３４  ｇ，  １．２  ｍｍｏｌ）をメタノール（５０  ｍＬ）に溶かし、これにクロロトリメチルシラン（０．５７  ｍＬ）を加え３０℃で１．５時間反応させた。反応液を減圧留去した後、１０−２０％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、黄白色粉末状の目的物４を収率８２％で０．３０ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ  ８．３８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１９  （ｔ，  １Ｈ），  ４．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８５  （ｄｄｄ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．５９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．４４−２．２１  （ｍ，  ２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ３２２．３  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００６６】
５．  ５−（６−トリフルオロアセチルアミノ−ヘキシル）カルバミルメチル−２’−デオキシシチジン（５）の合成
ヌクレオシド  ４  （０．１５  ｇ，  ０．５０  ｍｍｏｌ）  をメタノール（３  ｍＬ）に溶かし、ヘキサメチレンジアミン（０．２２  ｇ，  １．９  ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で３時間反応させた。反応終了後、室温に戻しトリフルオロ酢酸エチルエステル（２  ｍＬ，  １７  ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．２  ｍＬ，  １．４  ｍｍｏｌ）を加え、２時間反応させた。溶媒を減圧留去した後、残渣を水に溶かしジエチルエーテル洗浄した。水相を減圧留去した後、１０−２０％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、黄白色粉末状の目的物５を収率５２％で０．１３ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  ７．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１０  （ｔ，  １Ｈ），  ４．２７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９０  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６５  （ｄｄｄ，  ２Ｈ），  ３．２３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２０−３．０２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．３１−２．０９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４０−１．３５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１５−１．１１  （ｍ，  ４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ５０２．４  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００６７】
６．  ５−［（６−アミノヘキシル）カルバミルメチル］−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸（５ｃ）の合成
ヌクレオシド５  （０．２４  ｇ，  ０．５０  ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン  （Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（Ｒ），  ０．１６ｇ，  ０．７６  ｍｍｏｌ）を一晩減圧乾燥させた。これにリン酸トリメチル（３  ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で加えて溶かした後、０°Ｃに冷却した。蒸留したオキシ塩化リン（０．０９９  ｍＬ，  １．０５  ｍｍｏｌ，  ２．１  ｅｑ）をマイクロシリンジで滴下し０°Ｃのまま撹拌した。さらに４５分後トリブチルアミン（０．４１  ｍＬ，  １．７  ｍｍｏｌ）と０．５  Ｍピロリン酸トリブチルアンモニウムのＤＭＦ溶液（５．３  ｍＬ）を０°Ｃで加え、反応液を室温に戻し１時間反応させた。１．０  Ｍ  炭酸水素トリブチルアンモニウム水溶液（４  ｍＬ）を加えて反応を止め反応液を減圧濃縮した。濃縮液を水（５  ｍＬ）で薄めた液を、セファデックスＤＥＡＥＡ−２５カラムを用いて、炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ  ８．０）の塩濃度勾配（０．０５〜１．０Ｍ）緩衝液により溶出した。精製したＮ−保護ヌクレオシド三リン酸を含むフラクション中の過剰のピロリン酸を取り除くため、さらに、これを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、５−（６−トリフルオロアセチルアミノ−ヘキシル）カルバミルメチル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸を収率２５％で９２５  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ７１８．１  ［（Ｍ−Ｈ）−］。このＮ−保護ヌクレオシド三リン酸（６４  ＯＤ，  ８．６  μｍｏｌ）を２Ｎ  アンモニア水（４．０  ｍＬ）に溶かし室温で２時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、目的物５ｃを収率６９％で４４  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ６２２．１  ［（Ｍ−Ｈ）−］。
【００６８】
７．  ３’，５’−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ６−（４−トリフルオロアセチルアミノ−ブチル）−２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（８）の合成
乾燥アセトニトリル（１２  ｍＬ）に懸濁させたヌクレオシド７（５５８ｍｇ，  ０．８６  ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（０．１２  ｍＬ，  ０．８６  ｍｍｏｌ）と１，４−ジアミノブタン（２６０  ｍｇ，  ２．９  ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（４  ｍＬ）溶液を室温で加え、５０．５℃で７時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣をメタノール（２０  ｍＬ）に懸濁させ、これにトリフルオロ酢酸エチル（１．４  ｍＬ，  １２  ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．４９  ｍＬ，  ３．５  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１４．５時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を酢酸エチルに溶かし、水で洗浄後、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過し、ろ液を減圧留去しオイル状の粗生成物を得た。０−２％メタノールークロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、無色オイル状の目的物８を収率９８％で０．５６  ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ７．７８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．１２  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７），  ４．５０（ｍ，  １Ｈ），  ３．８０  （ｑ，  １Ｈ，  Ｊ＝４），  ３．６７  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２５  （ｍ，  １Ｈ），  １．５４  （ｍ，  ４Ｈ），  ０．８０  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．７８  （ｓ，  ９Ｈ），  −０．０４  （ｓ，  ６Ｈ），  −０．０６  （ｓ，  ６Ｈ）。  ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  帰属  ６６２．５  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］，  ６８４．４  ［（Ｍ＋Ｎａ）  ＋］
【００６９】
８．  Ｎ６−（４−トリフルオロアセチルアミノ−ブチル）−２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（９）の合成
ヌクレオシド８  （０．５３２  ｇ，  ０．８０  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶かし、トリエチルアミントリハイドロフロライド（ＴＲＥＡＴ・ＨＦ，  ０．８  ｍＬ，  ４．９  ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で２４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、２−８％メタノールークロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、無色オイル状の発泡した化合物９を収率４６％で０．１５８ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ７．８６  （ｓ，１Ｈ），  ６．２４  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７），  ４．５４  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝５），  ４．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７８  （ｍ，２Ｈ），  ２．７８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２９  （ｍ，  １Ｈ），  １．６７  （ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ４３４．４  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］，  ４５６．２  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］
【００７０】
９．  Ｎ６−（４−アミノブチル）−  ２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸（３ａ）の合成
ヌクレオシド９  （０．１３７  ｇ，  ０．３２  ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン（Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（登録商標），  ０．１０３  ｇ，  ０．４８  ｍｍｏｌ）を一晩乾燥させた。これにリン酸トリメチル（１．９  ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で加えて溶かした後、０℃に冷却した。オキシ塩化リン（０．０３６  ｍＬ，  ０．３８  ｍｍｏｌ）をマイクロシリンジで滴下し０℃のまま撹拌した。さらに４５分後トリブチルアミン（０．２６  ｍＬ，  １．１  ｍｍｏｌ  ）と０．５Ｍピロリン酸トリブチルアンモニウムのＤＭＦ溶液（３．４  ｍＬ）を０℃で加え、反応液を室温に戻し１時間反応させた。１．０Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ８．０，  ５ｍＬ）と水（５ｍＬ）を加えて反応を止め反応液を減圧留去した。続いて残渣を水に溶かしジエチルエーテルで洗浄した。水相をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムを用い、炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ８．０）の塩濃度勾配（０．０５￣１．０Ｍ）緩衝液により溶出した。精製したＮ−保護ヌクレオシド三リン酸を含むフラクション中の過剰のピロリン酸を取り除くため、さらに、これを中圧カラムによって精製し、Ｎ６−（４−トリフルオロアセチルアミノ−ブチル）−２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−５’−三リン酸を収率４４％で１２３０  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ６７２．２  ［（Ｍ−Ｈ）−］。このＮ−保護ヌクレオシド三リン酸（１１７５  ＯＤ，  ０．１３  ｍｍｏｌ）を４Ｎアンモニア水（３．４  ｍＬ）に溶かし室温で３時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し目的物３ａを収率８１％で９５０  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ５７６．２  ［（Ｍ−Ｈ）−］。
【００７１】
上記条件設定によって、具体的に種々の修飾アナログの合成を試みた。
修飾アナログ５ｃおよび３ａは、それぞれスキーム１およびスキーム２に従って合成された。図１は、種々の修飾アナログの合成スキームを示す。原料である５−シアノメチル−３’５’−ジ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシウリジン  （１）および３’，５’−ジ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−Ｏ６−ｐ−トルエンスルホニル−２’−デオキシグアノシン（７）は、それぞれチミジンおよび２’−デオキシグアノシンから既知の手法により容易に合成することができる。
【００７２】
修飾ヌクレオチド三リン酸を基質とし、特定のＤＮＡ合成酵素（ファミリー  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いたＰＣＲ法による修飾ＤＮＡの大量合成。
次に、合成された核酸の増幅を試みた。ｐＵＣｌ８鋳型ＤＮＡと１０８塩基長のＰＣＲ産物を与える適当なプライマーを使って、対応する天然型ヌクレオシド三リン酸（ＴＴＰかｄＣＴＰかｄＡＴＰ）の代わりに修飾アナログ（１ｕ−５ｕ，  １ｃ−５ｃ，  １ａ−３ａ）のＰＣＲにおける取り込みを検討した（図２−５）。図２，４は、本実施例において使用した修飾ヌクレオシド三リン酸を示す。図３は、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。電気泳動は、エチジウムブロミド染色した２％アガロースゲルでおこなった。全ての増幅を以下のようにおこなった。すなわち、ホットスタートを使用し（９４℃で１分間）、次いで２０サイクル増幅（９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、７４℃で１分間）、及び７４℃で５分間最終インキュベーションした。また、図５は、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。電気泳動は、エチジウムブロミド染色した２％アガロースゲルでおこなった。全ての増幅を以下のようにおこなった。すなわち、ホットスタートを使用し（９４℃で１分間）、次いで３０サイクル増幅（９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、７４℃で１分間）、及び７４℃で５分間最終インキュベーションした。
【００７３】
図３について説明すれば以下のとおりである。レーン１：  ４つの天然の三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰを含むＰＣＲ（正のコントロール）、レーン２：ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを含むＰＣＲ（負のコントロール）、レーン３−７：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び図２の修飾ｄＵＴＰを含むＰＣＲ、レーン８：  ４つの天然の三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＴＴＰを含むＰＣＲ（正のコントロール）、レーン９：ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含むＰＣＲ（負のコントロール）、レーン１０−１４：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ及び図２の修飾ｄＣＴＰを含むＰＣＲ。使用した熱安定ＤＮＡポリメラーゼ：（ａ）Ｔａｑ  （０．０５Ｕ／μＬ），（ｂ）  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）  （０．０２５Ｕ／μＬ），（ｃ）ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  （０．０２Ｕ／μＬ）。
【００７４】
図５について説明すれば以下のとおりである。レーン１：  ４つの天然の三リン酸ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＡＴＰを含むＰＣＲ（正のコントロール）、レーン２：ＴＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを含むＰＣＲ（負のコントロール）、レーン３−５：ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び図４の修飾ｄＡＴＰを含むＰＣＲ。使用した熱安定ＤＮＡポリメラーゼ：  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）（レーン１：０．０１Ｕ／μＬ，レーン２−５：０．０５Ｕ／μＬ）。
【００７５】
プライマー領域を除いて二本鎖のテンプレートの増幅領域には２５個所の非連続的なＴ配列「Ｔ」、４箇所の二連続Ｔ配列「ＴＴ」、１箇所の三連続Ｔ配列「ＴＴＴ」、１箇所の四連続Ｔ配列「ＴＴＴＴ」、２７箇所の非連続なＣ配列「Ｃ」、７箇所の二連続Ｃ配列「ＣＣ」、１箇所の三連続Ｃ配列「ＣＣＣ」、１箇所の四連続Ｃ配列「ＣＣＣＣ」、２１箇所の非連続なＡ配列「Ａ」、６箇所の二連続Ａ配列「ＡＡ」を含んでいる。プライマー１及び２の配列は、それぞれプライマー１：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’、プライマー２：３’−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣ−５’である。修飾アナログ（１ｕ−５ｕ，  １ｃ−４ｃ，  １ａ−２ａ）は、基質特性の比較研究のために用いた。それぞれファミリーＡ（Ｔａｑ）  とＢ（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）及びＫＯＤ  Ｄａｓｈ）に属するポリメラーゼを使用してＰＣＲによる修飾ＤＮＡの直接的合成を行なった。ＰＣＲ産物は２％のアガロース電気泳動によって分離し臭化エチジウム着色によって可視化し、ゲルイメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオ・ラド社）で記録した。修飾ＤＮＡの完全長生成物に対応するそれぞれのバンドの強度は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを使用することで定量化された。
【００７６】
【表１】
2005060240.tif 000026
記号は、全ての４つの天然型三リン酸、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びＴＴＰを用いた対称ＰＣＲ（ポジティブコントロール反応）によって生じた完全長の生成物の収量を１００％と設定したとき、天然型三リン酸（ＴＴＰ又はｄＣＴＰ）の代わりに対応する修飾ヌクレオシド三リン酸を用いた対称ＰＣＲによって生じた完全長の生成物の相対収量を示す。＋＋＋＋は、＞７５％、＋＋＋は、５０〜７５％、＋＋は、２５〜５０％、＋は、＜２５％を示す。−は、ＰＣＲ産物が検出されなかったことを示す。
【００７７】
その結果、Ｃ５位に（６−アミノヘキシル）カルバミルメチル基をもつ修飾ｄＵＴＰ  （５ｕ）及び修飾ｄＣＴＰ  （５ｃ）は、ファミリーＡポリメラーゼの基質にならなかったが、ファミリーＢポリメラーゼの良い基質になった。表１よりＣ５位に置換基を持つ修飾ピリミジンアナログは、ｄＣＴＰよりもＴＴＰ（ｄＵＴＰ）の誘導体のほうが、ポリメラーゼに対して良い基質であることが明らかである。しかしながら、今回開発された５−（６−アミノヘキシル）カルバミルメチルｄＣＴＰ  （５ｃ）は、ファミリーＢポリメラーゼに対して同じ置換基を持つｄＵＴＰ誘導体（５ｕ）に匹敵するほどの、優れた基質特性を示すことが分かった。既存のＣ５位置換修飾ｄＣＴＰ（１ｃ〜３ｃなど）には、このような優れた基質特性はない。
【００７８】
結論として、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  などのファミリーＢポリメラーゼのための基質となるＣ５位置換新規修飾２’−デオキシシチジン三リン酸、及び、Ｎ６位置換新規修飾プリン−２’−デオキシヌクレオチド三リン酸（５ｃ，  ３ａ）を首尾よく発明した（図３，５）。特に、修飾２’−デオキシシチジン三リン酸（５ｃ）は、ファミリーＢポリメラーゼの良い基質となり、これを用いた対称ＰＣＲは、既存のＣ５位置換修飾ｄＣＴＰを用いた場合に比べ、はるかに収率良く対応する修飾ＤＮＡを与えた（図３）。
【００７９】
このように、これらデオキシシチジン誘導体或いはデオキアデノシン誘導体を組み込んだ修飾ＤＮＡが数種のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の鋳型となることが分かった。また、本発明者らが既に報告した方法で容易に得られるデオキシウリジン誘導体は、側鎖の末端にアミノ基等を持っているので、これら修飾デオキシヌクレオチド誘導体を持つ修飾ＤＮＡには標識化合物又は機能性化合物を結合させることができ、ＤＮＡプローブの合成、又は試験管内選択法を用いた触媒ＤＮＡの合成に有用であることが判明した。
【００８０】
本発明者らはファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが効率よく２’−デオキシシチジン誘導体、或いは２’−デオキシアデノシン誘導体を基質として受け入れ、また、２’−デオキシシチジン誘導体、或いは２’−デオキシアデノシン誘導体を含む修飾ＤＮＡが鋳型として作用することを見出した。
【００８１】
一方、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含め、ファミリーＡ  ＤＮＡ合成酵素にはこのような活性は無い。Ｃ５位のα−位置にｓｐ３混成の炭素を持つ２’−デオキシシチジン誘導体、或いはＮ６位が修飾された２，６−ジアミノプリンヌクレオシド誘導体がＤＮＡポリメラーゼ反応に対して、基質又は鋳型としての活性を発揮することを、本発明者らが初めて見出した。
【００８２】
【発明の効果】
本発明の誘導体は、ＳＥＬＥＸ法に適用することにより、種々の生体関連物質などに対するアプタマーや特定反応を触媒するリボザイムなど、実用可能性があるさまざまな機能性修飾ＤＮＡを提供し得るという有利な効果を奏する。
【００８３】
また、本発明の誘導体を用いた方法により、標識機能物質が結合した修飾ＤＮＡ類を酵素的に効率良く且つ充分な量得ることができる。この標識機能物質が結合した修飾ＤＮＡ類は特定の核酸を特異的に検出することが可能であり、種々の分野に応用することができる。例えば、前記修飾ＤＮＡ類は診断薬としての利用が可能であり、また特定の核酸の働きを制御する医薬品としての利用が可能である。更に、ポリアミンのような機能性物質を導入した修飾ＤＮＡ類は、酵素合成法（ＰＣＲ法）と試験管内選択法を用いることで、特定の化学反応を触媒する触媒ＤＮＡとしての利用、又は特定の低分子物質を特異的に結合するＤＮＡアプタマーとしての利用が可能である。
【００８４】
また、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いたゲノム研究には、プローブＤＮＡ（蛍光標識ＤＮＡ）が使用されているが、本発明の核酸の合成方法により、異なる２種類の蛍光標識が導入されたプローブＤＮＡを酵素的に合成することが可能であるという有利な効果を奏する。蛍光標識がｎ種類あれば、ｎ（ｎ＋１）／２通りのＤＮＡ標識化が可能となる。
【００８５】
末端のアミノ基に既知の酵素阻害剤を修飾した誘導体を原料として、ＳＥＬＥＸ法により酵素活性を阻害する機能性修飾ＤＮＡを提供し得るという有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々の修飾アナログの合成スキームを示す。
【図２】図２は、本発明の一実施態様における、使用したＣ５位置換ピリミジンヌクレオシド三リン酸を示す。
【図３】図３は、１０８塩基長のＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施態様における、使用したＮ６位置換デオキシアデノシン三リン酸を示す。
【図５】図５は、１０８塩基長のＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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