(57)【要約】【課題】  簡便で、 in vivoでの研究上の応用等に適した光学異性体のセンシング技術を提供する。【解決手段】  光学異性体であるＳ体及びＲ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体又はＲ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体のいずれであるかを判定する光学異性体のセンシング方法。判定の対象をラセミ体等に拡大することも可能である。これらのセンシング方法を行うための光学異性体のセンシング装置。【選択図】          図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学異性体であるＳ体及びＲ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体又はＲ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体のいずれであるかを判定することを特徴とする光学異性体のセンシング方法。
【請求項２】
光学異性体であるＳ体、Ｒ体及びラセミ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体、Ｒ体又はラセミ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体、ラセミ体のいずれであるかを判定することを特徴とする光学異性体のセンシング方法。
【請求項３】
２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体及びメゾ体が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づいて前記検体がＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体のいずれであるかを判定することを特徴とする光学異性体のセンシング方法。
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
【請求項４】
２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体及びこれらの混合物が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づいて前記検体がＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物のいずれであるかを判定することを特徴とする光学異性体のセンシング方法。
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
混合物：ＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体の内のいずれか２種以上の混合物。
【請求項５】
前記２本鎖核酸における凝縮挙動を、下記の直接比較法、脱凝縮検出法、凝縮阻害検出法のいずれかによって検出することを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の光学異性体のセンシング方法。
（１）直接比較法：非凝縮状態の２本鎖核酸に検体を加えて２本鎖核酸の凝縮挙動を検出すると共に、その検出結果を対象化合物についての既知の標準データと比較することにより、判定を行う。
（２）脱凝縮検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮作用を示す光学異性体によって予め凝縮させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
（３）凝縮阻害検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮解除作用を示す光学異性体によって予め凝縮解除させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮解除状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
【請求項６】
不斉炭素原子を含む化合物である検体についてのキラリティーをセンシングする装置であって、少なくとも以下の要素を備えることを特徴とする光学異性体のセンシング装置。
（１）２本鎖核酸あるいはこれを含む生物細胞又は生物細胞モデルが保持されている反応場。
（２）前記反応場に検体を投入する投入手段。
（３）前記反応場に保持された２本鎖核酸、又は前記反応場に保持された生物細胞又は生物細胞モデルに含まれる２本鎖核酸について、その凝縮の挙動に関する観察又はデータ取得が可能な検出手段。
【請求項７】
前記検出手段が、蛍光顕微鏡、光吸収スペクトル測定手段又は光散乱測定手段であることを特徴とする請求項６に記載の光学異性体のセンシング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学異性体のセンシング方法及びセンシング装置に関する。更に詳しくは、本発明は、不斉炭素原子を含む化合物の光学異性体やラセミ体等が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせる場合があると言う新規な知見に基づいて構成された光学異性体のセンシング方法と、この方法を実施できる光学異性体のセンシング装置とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、不斉炭素原子を含む有機化合物におけるＳ体、Ｒ体等の光学異性体の有用性が注目されている。例えば、生物に対する光学活性な化学物質の作用を考えた場合、理論的には光学異性体の間で効果に違いがある。光学活性な化学物質を医薬として用いる場合に最も注意しなければならないことは、それぞれの光学異性体によって作用が異なることである。即ち、一方の光学異性体は他方の光学異性体よりも好ましい作用が劣っていたり、全く異なる作用を有していたりする場合がある。
【０００３】
このことが、サリドマイドの例に見られるような薬害副作用の原因となり得るので、製薬業では一方の光学異性体の純品のみを提供することが求められ、製品中に好ましくない光学異性体が混入していないことを検査しなければならない。農業・畜産技術において、フェロモンやホルモンを農薬や繁殖に使用する場合にも、光学異性体間の作用の違いが効果を妨げたりするので、製品の光学異性とその純度を管理することが求められる。その他、食品や香料等の産業でも添加物に使用する化学製品の光学異性体に注意を払わなければならない。ここでは、天然原料に含まれる化学製品の光学異性体の純度と化学合成品のそれとは異なるので、製品の品質管理に光学異性体を活用できる。
【０００４】
このような事情から、光学異性体の選択的な合成技術やラセミ体からの光学異性体の分離技術等と並び、光学異性体のセンシング技術（光学異性体のキラリティーを判定する技術）も注目されている。即ち、光学異性体が存在する化合物が合成され又は提供された場合において、その化合物がＳ体であるのか、Ｒ体であるのか、又はラセミ体であるのか、等を判定できる簡易で優れた技術を提供することが望まれている。このような技術が提供されると、製造業や輸入製品を扱う現場において、医薬・農薬・添加物として使われている製品に含まれる化学物質の品質を、光学異性体の純度をモニターしながら管理できる。生物細胞に含まれる化学物質等のように従来はごく微量にしか入手できない化学物質の分子不斉に関する知見が得られることによって、生化学・農芸化学・薬学・医化学等の分野で化学物質の各光学異性体間の作用の違いを応用した新たな技術開発を期待することができる。
【０００５】
従来、光学異性体のセンシング技術としては、検体たる化合物の旋光度を測定すると言う光学的な方法が良く知られている。この方法は、周知のように、そもそも光学異性体と言う呼び名の由来でもある原理を利用する方法であって、検体に対して直線偏光を透過させ、その透過光における偏光面の回転現象を測定する方法である。一般論としては、この方法は光学異性体の簡易で優れたセンシング技術であると言える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば生体分子機能の研究等において、in vivo の条件で光学異性体のセンシングを行いたい場合、上記の光学的な方法は好適とは言えない。より具体的に言えば、上記の光学的なセンシング技術では、挟雑物（不純物）の旋光度や蛍光特性による影響を大きく受けるために、センシング対象となる物質を純粋に単離することが必要となり、生物体から得られたサンプルに適用する場合にはタンパク質、核酸、糖等の除去が必要となる。
【０００７】
又、光学的なセンシングは比旋光度の符号及び絶対値と言う物理学的データに基づいており、これらの値が似通った物質と目的物質とを識別できないばかりか、物理学的データは測定温度や溶液の種類・濃度によって大きく異なるので、特に溶液条件に変動の大きな生物体試料中での測定は困難である。従って、光学的なセンシング技術におけるこのような不具合を解消できる、簡易で優れた光学異性体のセンシング技術が求められている。
【０００８】
ところで、光学異性体のセンシング技術とは一見したところ無関係な技術分野として、２本鎖核酸の凝縮制御技術がある。この技術は、２本鎖核酸を凝縮させることと、この凝縮状態を解除させることからなり、遺伝子工学においては重要な技術であると認識されている。例えば遺伝子治療において、リポソームからなる人工ベクターに遺伝子を封入し、これを標的細胞内に送り込むためには必須のテクニックである。又、一般論として、このような２本鎖核酸の凝縮制御を行うことにより、核酸、特にＤＮＡの転写や複製等の分子生物学的機能を解析し制御することが可能となる。
【０００９】
従来より、２本鎖核酸の凝縮のメカニズムはある程度解明されている。従って、そのような核酸凝縮を引起こす凝縮剤についても、例えばポリアミン等の多価カチオンが有効であることが知られている。その他にも、凝縮剤は幾つか提案されている。例えば下記の非特許文献１及び非特許文献２では、４級アンモニウムジカチオンを用いて２本鎖ＤＮＡを凝縮させる技術例が開示されている。なお、これらの４級アンモニウムジカチオンは不斉炭素原子を含まない化合物であり、従って、そのＳ体、Ｒ体と言う光学異性体は存在しない。
【００１０】
【非特許文献１】M. P. Singh, B. Plouvier, G. C. Hill, J. Gueck,R. T. Pon, J. W. Lown,  J. Am. Chem. Soc. 116, 7006-7020(1994)
【非特許文献２】X. Qu, J. O. Trent, I. Fokt, W. Priebe,J. B. Chaires,  Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97, 12032-12037(2000)  本願発明者は、２本鎖核酸の凝縮制御技術の研究過程において次のような驚くべき現象を究明するに到った。即ち、ある種の化合物においては、その光学異性体やラセミ体等が、２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸の凝縮に関して拮抗的に作用し、あるいは「拮抗的」とまでは言えなくても、十分に判別可能な程度に異なる凝縮挙動を起こさせるのである。
【００１１】
この新規な知見は、一面においては、一定の化合物の光学異性体であるＲ体とＳ体とを使い分けて、２本鎖ＤＮＡの凝縮とその凝縮状態の解除とのスイッチング制御が可能であることを意味する。しかし他面においては、対象とする検体がＲ体、Ｓ体、ラセミ体等のいずれであるかを、２本鎖核酸の凝縮挙動に基づいて判定可能であることを意味している。そしてこの方法は、２本鎖核酸を利用する光学異性体のセンシング技術であるため、前記した光学的なセンシング技術とは異なり、例えば in vivoの条件で光学異性体のセンシングを行いたい場合等にも極めて好適である。本願発明は以上の経緯に基づいて完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、光学異性体であるＳ体及びＲ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体又はＲ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体のいずれであるかを判定する、光学異性体のセンシング方法である。
【００１３】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、光学異性体であるＳ体、Ｒ体及びラセミ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体、Ｒ体又はラセミ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から検体がＳ体、Ｒ体、ラセミ体のいずれであるかを判定する、光学異性体のセンシング方法である。
【００１４】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体及びメゾ体が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づいて前記検体がＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体のいずれであるかを判定する、光学異性体のセンシング方法である。
【００１５】
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
【００１６】
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
【００１７】
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
【００１８】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体及びこれらの混合物が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づいて前記検体がＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物のいずれであるかを判定する、光学異性体のセンシング方法である。
【００１９】
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
【００２０】
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
【００２１】
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
【００２２】
混合物：ＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体の内のいずれか２種以上の混合物。
【００２３】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る２本鎖核酸における凝縮挙動を、下記の直接比較法、脱凝縮検出法、凝縮阻害検出法のいずれかによって検出する、光学異性体のセンシング方法である。
【００２４】
（１）直接比較法：非凝縮状態の２本鎖核酸に検体を加えて２本鎖核酸の凝縮挙動を検出すると共に、その検出結果を対象化合物についての既知の標準データと比較することにより、判定を行う。
【００２５】
（２）脱凝縮検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮作用を示す光学異性体によって予め凝縮させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
【００２６】
（３）凝縮阻害検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮解除作用を示す光学異性体によって予め凝縮解除させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮解除状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
【００２７】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、不斉炭素原子を含む化合物である検体についてのキラリティーをセンシングする装置であって、少なくとも以下の要素を備える、光学異性体のセンシング装置である。
（１）２本鎖核酸あるいはこれを含む生物細胞又は生物細胞モデルが保持されている反応場。
（２）前記反応場に検体を投入する投入手段。
（３）前記反応場に保持された２本鎖核酸、又は前記反応場に保持された生物細胞又は生物細胞モデルに含まれる２本鎖核酸について、その凝縮の挙動に関する観察又はデータ取得が可能な検出手段。
【００２８】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第６発明に係る検出手段が蛍光顕微鏡、光吸収スペクトル測定手段又は光散乱測定手段である、光学異性体のセンシング装置である。
【発明の効果】
【００２９】
（第１発明〜第４発明の効果）
第１発明〜第４発明に係る光学異性体のセンシング方法は、ある種の化合物においては、その光学異性体やラセミ体等が、２本鎖ＤＮＡ等の２本鎖核酸の凝縮に関して拮抗的に作用し、あるいは十分に判別可能な程度に異なる凝縮挙動を起こさせる、と言う新規な知見に基づき完成されたものであり、全く新しい光学異性体のセンシング方法を提供できる。
【００３０】
しかも、これらのセンシング方法は、例えば蛍光顕微鏡観察、光吸収スペクトルの測定、光散乱の測定等のありふれた手段で実現できるため、比較的簡単に実施することができる。更に、これらのセンシング方法は、２本鎖核酸を利用するセンシングであるため、例えば生物細胞や生物細胞モデル等に含まれる２本鎖のＤＮＡをそのまま利用して実施することが可能である。
【００３１】
次に、検体たる化合物の旋光度を測定すると言う光学的な方法等に比較して、挟雑物（不純物）の旋光度や蛍光特性による影響を特段に受けないし、対象物質をセンシングのために光学異性体を純粋に単離することも必要ではない。又、比旋光度の符号及び絶対値などと言う物理学的データに基づかないので、物理学的データにおいて似通った物質との識別も明瞭である。更に、溶液条件の変動の大きな生物体試料中での測定が容易である。
【００３２】
（第５発明の効果）
上記した各発明における２本鎖核酸の凝縮挙動の検出方法は特段に限定されないが、例えば第５発明に列挙する直接比較法、脱凝縮検出法、凝縮阻害検出法を好ましく例示することができる。
【００３３】
（第６発明の効果）
第１発明〜第５発明のセンシング方法は、例えば第６発明の光学異性体のセンシング装置を用いることにより、有効に行うことができる。このセンシング装置は、第６発明の（１）の反応場と、（２）の投入手段と、（３）の検出手段のみからシンプルに構成されるので、コスト的にも有利である。
【００３４】
（第７発明の効果）
上記した第６発明の光学異性体のセンシング装置において、（３）の検出手段の内容は、その目的を達成できるものである限りにおいて限定されないが、例えば第７発明のように、蛍光顕微鏡、光吸収スペクトル測定手段又は光散乱測定手段とすることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
次に、本願の第１発明〜第７発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。
【００３６】
〔光学異性体のセンシング方法〕
本発明に係る光学異性体のセンシング方法は、以下の（イ）〜（ニ）の好適な実施形態を含んでいる。
【００３７】
（イ）光学異性体であるＳ体及びＲ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体又はＲ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体のいずれであるかを判定するセンシング方法。
【００３８】
（ロ）光学異性体であるＳ体、Ｒ体及びラセミ体が２本鎖核酸に対して異なる凝縮挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳ体、Ｒ体又はラセミ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮挙動から前記検体がＳ体、Ｒ体、ラセミ体のいずれであるかを判定するセンシング方法。
【００３９】
（ハ）２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体及びメゾ体が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づき前記検体がＳＳ体、ＲＲ体又はメゾ体のいずれであるかを判定するセンシング方法。
【００４０】
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
【００４１】
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
【００４２】
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
【００４３】
（ニ）２以上の不斉炭素原子を含み、光学異性体である下記のＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体及びこれらの混合物が２本鎖核酸の凝縮に対してそれぞれ異なる挙動を起こさせることが確認された化合物を対象化合物とし、そのＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物であり得る検体を２本鎖核酸に作用させて、２本鎖核酸における凝縮の挙動に基づいて前記検体がＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体又はこれらの混合物のいずれであるかを判定するセンシング方法。
【００４４】
ＳＳ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＳ体型の立体配置を取る。
【００４５】
ＲＲ体：２以上の不斉炭素原子がいずれもＲ体型の立体配置を取る。
【００４６】
メゾ体：２以上の不斉炭素原子が、Ｓ体型の立体配置を取るものと、Ｒ体型の立体配置を取るものとからなる。
【００４７】
混合物：ＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体の内のいずれか２種以上の混合物。
【００４８】
〔凝縮挙動の判定方法〕
以上の光学異性体のセンシング方法においては、その２本鎖核酸における凝縮挙動の判定方法は特段に限定されないが、好ましくは、下記の（１）〜（３）のいずれかの方法を採用することができる。
【００４９】
（１）直接比較法：非凝縮状態の２本鎖核酸に検体を加えて２本鎖核酸の凝縮挙動を検出すると共に、その検出結果を対象化合物についての既知の標準データと比較することにより、判定を行う。
【００５０】
（２）脱凝縮検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮作用を示す光学異性体によって予め凝縮させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
【００５１】
（３）凝縮阻害検出法：２本鎖核酸を、キラリティーが既知で核酸凝縮解除作用を示す光学異性体によって予め凝縮解除させておき、これに検体を加えて、２本鎖核酸が凝縮解除状態を維持するか否かを検出することにより、検体が前記の既知のキラリティーと同一であるか異なるかを判定する。
【００５２】
〔光学異性体のセンシング装置〕
本発明に係る光学異性体のセンシング装置は、対象化合物である検体についてのキラリティーをセンシングする装置であり、少なくとも（１）２本鎖核酸あるいはこれを含む生物細胞又は生物細胞モデルが保持されている反応場と、（２）前記反応場に検体を投入する投入手段と、（３）前記反応場に保持された２本鎖核酸、又は前記反応場に保持された生物細胞又は生物細胞モデルに含まれる２本鎖核酸について、その凝縮の挙動に関する観察又はデータ取得が可能な検出手段と、を備える装置である。
【００５３】
反応場及び投入手段としては、目的に合致した一般的な反応場と投入手段を準備すれば良い。検出手段としては、例えば蛍光顕微鏡、光吸収スペクトル測定手段又は光散乱測定手段を好ましく例示できる。
【００５４】
蛍光顕微鏡を利用する場合には、反応場に対して、検体と共に、２本鎖核酸に結合する周知の蛍光発色剤を投入することが好ましい。光吸収スペクトル測定手段又は光散乱測定手段による２本鎖核酸の凝縮挙動の検出原理は、周知の事項ではあるが、それぞれ次の通りである。
【００５５】
光吸収スペクトル測定手段の検出原理：コイル状態（非凝縮状態）のＤＮＡ分子のコロイド溶液状態では核酸塩基部分に基づく吸収スペクトルを観察できる。一方、凝縮状態のＤＮＡ分子では粒子が小さく沈殿し易くなり、サンプルを暫く静置するか又は遠心分離することによって溶液から分離できるため、吸収が無くなり、あるいは弱くなる。
【００５６】
光散乱測定手段の検出原理：コイル状態（非凝縮状態）のＤＮＡ分子のコロイド溶液状態では核酸塩基部分に基づく大きな光散乱を観察できる。一方、凝縮状態のＤＮＡ分子では粒子が小さく沈殿し易くなり、サンプルを暫く静置するか又は遠心分離することによって溶液から分離できるため、光散乱が無くなり、あるいは弱くなる。
【００５７】
〔２本鎖核酸の凝縮挙動〕
検出の対象となる２本鎖核酸の凝縮挙動とは、要するに２本鎖核酸が特定の対象化合物の光学異性体の作用によって、凝縮したり凝縮を解除されたりすること、あるいはその程度上の差異を言う。このような現象が起こる理由については、必ずしも完全に解明された訳ではない。しかし本願発明者は、次のような推定が合理的かつリーズナブルであると考えている。
【００５８】
図１のように、同一の対象化合物の光学異性体１、２が分子の両端部に１対の陽荷電部３を備え、かつ１対の陽荷電部３が分子軸に対して逆方向へ突出している構造である場合を考える。この場合、図示するように、光学異性体１、２における陽荷電部３の突出方向は、立体構造の相違に起因して、互いに対称になり得る。このような対象化合物が２重螺旋構造を取る２本のＤＮＡ鎖４、４’に対して方向性を以て結合（例えば、マイナーグルーブへの結合、又は塩基の層間へのインターカレート）する場合、光学異性体１では、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５（リン酸結合部）に近接して位置する。即ち、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して良好にマッチングするため、２本鎖核酸に対する強い凝縮作用を発揮する。
【００５９】
一方、光学異性体２では、１対の陽荷電部３がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５から離隔して位置することとなり、上記のマッチングが悪いため、却って２本鎖核酸に対する凝縮解除作用を発揮するのである。
【００６０】
次に、図１よりも特殊化したケースとして、対象化合物が２個の不斉炭素原子を有する場合の光学異性体６、７、８について、図２に説明する。光学異性体６は２個の不斉炭素原子がいずれもＳ型の立体配置を取るものであり、その分子の両端部に備えた１対の陽荷電部９は図示の方向へ突出している。光学異性体７は、２個の不斉炭素原子がいずれもＲ型の立体配置を取るものであり、その１対の陽荷電部９が、光学異性体６の場合とは対称となる方向へ突出している。更に光学異性体８は２個の不斉炭素原子の一方がＳ型、他方がＲ型の立体配置を取るものであり、その１対の陽荷電部９が分子軸に対して同一方向へ突出している。
【００６１】
図２に示すように、光学異性体６においては、図１の異性体１の場合と同様に、１対の陽荷電部９がＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して良好にマッチングし、２本鎖核酸に対する強い凝縮作用を発揮する。光学異性体７では、図１の異性体２の場合と同様に、ＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対する１対の陽荷電部９のマッチングが悪いため、却って２本鎖核酸に対する凝縮解除作用を発揮する。更に、光学異性体８では、ＤＮＡ鎖４、４’の陰荷電部５に対して、片方の陽荷電部９のマッチングが良く、他の片方の陽荷電部９のマッチングが悪いため、２本鎖核酸に対する凝縮作用と凝縮解除作用とが相殺され、実質的にいずれの作用も示さない。
【００６２】
〔対象化合物と光学異性体〕
キラリティー判定の対象となる対象化合物は、その各種光学異性体又はそれらの混合物（ラセミ体を含む）が、それぞれ異なった２本鎖核酸の凝縮挙動を示す限りにおいて、限定されない。判定が最も明確に成されるケースは、判定内容が２種類のキラリティーのみであり、かつ、その一方のキラリティーを持つ光学異性体が核酸凝縮作用を、他方のキラリティーを持つ光学異性体が核酸凝縮解除作用を示すと言う典型的な拮抗的作用関係にある場合である。
【００６３】
対象化合物は、光学異性体が２種類しか存在しないものでも、光学異性体が３種類以上存在するものでも、それらが２本鎖核酸の異なる凝縮挙動を引き起こす限りにおいて、構わない。対象化合物の各種光学異性体やそれらの混合物（ラセミ体を含む）の内、２本鎖核酸に判定可能な凝縮挙動を引き起こさないものは、判定の対象から除外することもできる。
【００６４】
一般的に、対象化合物としては、その分子中に２個の陽荷電部を備えるものが該当し易い傾向がある。これらの２個の陽荷電部がスペーサーとして機能する任意の中間構造部分により互いに隔てられた化学構造を有するものが、特に該当し易い。上記の２個の陽荷電部が分子の長軸方向の両端又はその近傍に位置しているものが、とりわけ該当し易い。
【実施例】
【００６５】
次に、本発明に係る実施例を説明する。これらの実施例が本発明の技術的範囲を限定するものでないことは、もちろんである。
【００６６】
（実施例１）
試料用の核酸を含む下記濃度組成の溶液を調製した。下記において「核酸」としては非凝縮状態にある約１６５．６ｋｂｐの２本鎖ＤＮＡ（Ｔ４  ＤＮＡ）を用いた。「検体」としては、２，３−イソプロピリデンジオキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−ヘキサメチル−１，４−ブタンジアンモニウムのＳＳ体、ＲＲ体及びメゾ体を用いた。これらの光学異性体の構造を図４（ａ）〜（ｃ）に示す。更に、これらの異性体の任意の組合わせに係る混合物も用いた。従って、混合物がラセミ体（ＳＳ体とＲＲ体の等量混合物）である場合も含まれる。
【００６７】
１０ｍＭ    トリス緩衝溶液
０．２μＭ  核酸
４％        ２−メルカプトエタノール
０．２μＭ  ＤＡＰＩ（蛍光染色剤）
検体        各所定濃度
上記の各溶液について、蛍光顕微鏡にて各２本鎖ＤＮＡの長軸長を観察した。その結果を図５の（ａ）〜（ｃ）に示す。図５の（ａ）は核酸凝縮剤がＳＳ体である場合の結果を、図５の（ｂ）は核酸凝縮剤がＲＲ体である場合の結果を、図５の（ｃ）は核酸凝縮剤がメゾ体ある場合の結果を、それぞれ示す。又、図５の（ａ）〜（ｃ）において、「 [SS], M」等と表記した軸は核酸凝縮剤の濃度を、「L/μm 」と表記した軸は２本鎖ＤＮＡの長軸長を、「population」と表記した軸は該当する長軸長の２本鎖ＤＮＡの個数割合を、それぞれ示している。図５より分かるように、全体的には２本鎖ＤＮＡの長軸長が核酸凝縮剤の高濃度化に対応して相対的に短縮化する傾向が見られるが、ＳＳ体では２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布が短縮化方向に著しくシフトしており、ＲＲ体では長軸長が短縮化していない傾向が顕著であり、メゾ体ではそれらの中間である。即ち、これらの各異性体で、２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布に大きな相違のあることが明瞭であった。
【００６８】
又、上記の図５のデータに基づき、長軸長が１μｍを超えるコイル状態（非凝縮状態）の２本鎖ＤＮＡと、長軸長が１μｍ以下のグロビュール状態（凝縮状態）の２本鎖ＤＮＡとの個数をカウントした。その結果を図６に示す。図６において、横軸（ [dication] / M ）は核酸凝縮剤の濃度を表し、縦軸（ coil population, ％）は２本鎖ＤＮＡ中のコイル状態のものの個数割合（パーセンテージ）を表す。図６中、「ＳＳ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がＳＳ体である場合の結果を、「ＲＲ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がＲＲ体である場合の結果を、「ｍｅｓｏ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がメゾ体である場合の結果を、「ｒａｃ」と表記したグラフは核酸凝縮剤がラセミ体である場合の結果を、それぞれ示す。
【００６９】
更に、図７に、各異性体とその混合物の核酸凝縮能力を対比して示す。図７の「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」のグラフにおいては、「ＳＳ」はＳＳ体を、「ＲＲ」はＲＲ体を、「ｍｅｓｏ」はメゾ体をそれぞれ表す。更に、各グラフの中央に表記した「ｍｉｘ」とは、その両側に表記された異性体の等量混合物を表す。又、これらのグラフの縦軸は凝縮能（ compaction activity）を示す。凝縮能とは、上記した試料溶液中の全２本鎖ＤＮＡの内、５０％に凝縮状態を与える濃度の逆数を言う。
【００７０】
図７の「Ａ」に示すように、ＳＳ体とＲＲ体では凝縮能に顕著な相違が認められる。一方、図７の「Ｂ」及び「Ｃ」に示すように、メゾ体はＳＳ体とＲＲ体との中間程度の凝縮能を示す。なお、図７の「Ｃ」に示すように、メゾ体とＲＲ体との間にも凝縮能にかなりの相違が認められる。更に、図７の各グラフの全体から分かるように、２種異性体の混合物である「ｍｉｘ」は、ラセミ体も含めて、常に混合された２種異性体の凝縮能の中間値を示している。
【００７１】
以上の結果から、本実施例に係る対象化合物のＳＳ体、ＲＲ体、メゾ体、及びこれらの異性体の上記した組合わせに係る混合物については、本発明によって互いに明瞭に区別してキラリティーを判定することができる。この実施例及び次の実施例２は、前記第５発明の「直接比較法」に相当する。
【００７２】
（実施例２）
アミノ酸であるリシンやアルギニンには、光学異性体の存在が知られている。そこで、リシン及びアルギニンについて、それぞれＳ体の３量体ペプチドとＲ体の３量体ペプチドとを調製し、これらを検体として上記の実施例１の場合と同様の濃度組成で試料用溶液を調製した。そして実施例１の場合と同様に蛍光顕微鏡にて２本鎖ＤＮＡの長軸長を観察し、コイル状態（非凝縮状態）のものと、グロビュール状態（凝縮状態）のものとの個数をカウントした。
【００７３】
リシンの３量体ペプチドについての評価結果を図８の（ａ）に、アルギニンの３量体ペプチドについての評価結果を図８の（ｂ）にそれぞれ示す。又、図８の（ａ）、（ｂ）において、横軸は試料用溶液における核酸凝縮剤の濃度を表し、縦軸は全２本鎖ＤＮＡ中におけるグロビュール状態の２本鎖ＤＮＡの割合を表す。「Ｓ」の表記で示すグラフはＳ体の３量体ペプチドについての評価結果を示し、「Ｒ」の表記で示すグラフはＲ体の３量体ペプチドについての評価結果を示す。図８に示す結果から分かるように、リシンの３量体ペプチドにおいてはＳ体とＲ体との核酸凝縮能の差異がかなり明瞭であり、アルギニンの３量体ペプチドの場合はその差異が相対的に小さい。
【００７４】
従って、本実施例に係る上記対象化合物の内、リシンの３量体ペプチドについては、Ｓ体とＲ体とのキラリティーの判定を、十分な信頼性を以て行い得ると判断できる。アルギニンについても、２本鎖核酸の凝縮挙動の検出精度を向上させれば、そのＳ体とＲ体とのキラリティーの判定を有効に行える可能性がある。
【００７５】
（実施例３）
試料用の核酸を含む下記濃度組成の溶液を調製した。核酸としては実施例１の場合と同じものを用いた。「ＳＳ体核酸凝縮剤」とは、実施例１で定義したＳＳ体である核酸凝縮剤のことである。
【００７６】
１０ｍＭ    トリス緩衝溶液
０．２μＭ  核酸
４％        ２−メルカプトエタノール
０．２μＭ  ＤＡＰＩ（蛍光染色剤）
７ｍＭ      ＳＳ体核酸凝縮剤
上記の溶液における各２本鎖ＤＮＡの長軸長を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果としての長軸長の分布を図９の「ＳＳ」と表記したグラフに示した。図９において「L/μm 」と表記した軸は２本鎖ＤＮＡの長軸長を示し、「population」と表記した軸は該当する長軸長の２本鎖ＤＮＡの個数割合を示している。従って、大半の２本鎖ＤＮＡが、前記図３（ｂ）に示すような十分に短縮化（凝縮）したグロビュール状態にあることが分かる。
【００７７】
次に、上記の溶液に対して実施例１で定義したＲＲ体である核酸凝縮剤を２０ｍＭとなるように添加し、その３０分後、及び１日後に、溶液における各２本鎖ＤＮＡの長軸長を蛍光顕微鏡にて観察した。その結果としての長軸長の分布を、３０分後のものについては図９の「ＳＳ＋ＲＲ」と表記したグラフに、１日後のものについては図９の「ＳＳ＋ＲＲ  １ｄａｙ」と表記したグラフに、それぞれ示した。これらのグラフの長軸長分布から、溶液中の２本鎖ＤＮＡの大半が前記図３（ａ）に示すような凝縮を解除されたコイルに移行したことが分かる。
【００７８】
即ち、２本鎖ＤＮＡをＳＳ体によって凝縮させ、ＲＲ体によって凝縮解除させると言うサイクルにより、光学異性体のキラリティーを明瞭に判定することができる。この実施例の方法は前記第５発明の脱凝縮検出法に相当する。又、この実施例の結果から、前記第５発明の凝縮阻害検出法も有効に行い得るであろうことが、明らかに推定される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によって、簡便で、 in vivoでの研究上の応用等に適した光学異性体のセンシング技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】不斉分子の異性体による作用の相違を簡略化して説明する図である。
【００８１】
【図２】不斉分子の異性体による作用の相違を簡略化して説明する図である。
【００８２】
【図３】２本鎖核酸の凝縮したグロビュール状態と、凝縮していないコイル状態とを示すスケッチ図である。
【００８３】
【図４】実施例で用いた不斉分子の異性体構造を示す図である。
【００８４】
【図５】２本鎖ＤＮＡの長軸長の分布を示すグラフである。
【００８５】
【図６】２本鎖ＤＮＡにおけるコイル状態のものの個数割合を表すグラフである。
【００８６】
【図７】実施例で用いた各異性体の核酸凝縮能力を対比して示すグラフである。
【００８７】
【図８】比較例で用いた不斉分子の各異性体の核酸凝縮能力を示すグラフである。
【００８８】
【図９】２本鎖ＤＮＡのスイッチング制御に関わるデータを示すグラフである。
【符号の説明】
【００８９】
１          光学異性体
２          光学異性体
３          陽荷電部
４、４’    ＤＮＡ鎖
５          陰荷電部
６          光学異性体
７          光学異性体
８          光学異性体
９          陽荷電部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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