(57)【要約】      （修正有）【課題】  反応検出チップにおいて、検出能力を向上させるために、プローブの数が安定に制御でき、かつ、プローブへの検体の供給が均一になる３次元配置プローブを作製し、シグナル成分の大きさを安定させることにより、シグナル成分を安定に増大させてＳ／Ｎ比を向上させ、ＤＮＡチップの検出能力を向上させること。【解決手段】  プローブ分子を多孔質粒子の細孔を含む表面に結合させた該多孔質粒子を複数個集合させて基板に固定することによりスポットを形成した反応検出チップにおいて、該多孔質粒子は該入射光に対し透明であり、かつ、該多孔質粒子は該基板上に単層状態に固定してあることを特徴とする反応検出チップを提供する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ分子を多孔質粒子の細孔を含む表面に結合させた該多孔質粒子を複数個集合させて基板に固定することによりスポットを形成した反応検出チップにおいて、該多孔質粒子は検出のための入射光に対し透明であり、かつ、該多孔質粒子は該基板上に単層状態に固定してあることを特徴とする反応検出チップ。
【請求項２】
前記スポットに前記入射光を照射して、前記プローブ分子と結合した検体分子を検出するための請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項３】
前記検体分子には光学的に検知可能な分子が付加されており、該分子を検出することを特徴とする請求項１又は２に記載の反応検出チップ。
【請求項４】
前記検体分子には蛍光色素分子が付加されており、該蛍光色素分子から発生する蛍光を検出することを特徴とする請求項３に記載の反応検出チップ。
【請求項５】
前記入射光に対する前記多孔質粒子の線吸収係数が10μm-1以下であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項６】
前記入射光に対する前記基板の線吸収係数が100μm-1以上であることを特徴とする請求項１又は５に記載の反応検出チップ。
【請求項７】
前記多孔質粒子の粒径は0.1μm以上、200μm以下であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項８】
前記基板上に熱可塑性の有機膜を形成し、該有機膜上に前記多孔質粒子を点着し、該基板を加温して該有機膜を軟化させることにより該多孔質粒子を該有機膜に埋め込んで該多孔質粒子を固定し、固定されない余剰の該多孔質粒子を除去することを特徴とする請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項９】
前記有機膜の厚さは、前記多孔質粒子の粒径の半分より小さいことを特徴とする請求項８に記載の反応検出チップ。
【請求項１０】
前記有機膜は、該有機膜の材料を有機溶媒に溶解しスピンコート法により形成することを特徴とする請求項８に記載の反応検出チップ。
【請求項１１】
前記点着は、前記多孔質粒子を液体に分散させて行われることを特徴とする請求項８に記 載の反応検出チップ。
【請求項１２】
前記余剰の多孔質粒子の除去は、超音波洗浄により行われることを特徴とする請求項８に記載の反応検出チップ。
【請求項１３】
前記有機膜は、酢酸ビニル膜であることを特徴とする請求項８に記載の反応検出チップ。
【請求項１４】
前記プローブ分子は、核酸、蛋白質、糖蛋白質のいずれか一種類であることを特徴とする請求項１に記載の反応検出チップ。
【請求項１５】
プローブ分子を多孔質粒子の細孔を含む表面に結合させて多孔質粒子を形成し、基板上に熱可塑性の有機膜を形成し、該有機膜上に前記多孔質粒子を点着し、該基板を加温して該有機膜を軟化させることにより該多孔質粒子を該有機膜に埋め込んで該多孔質粒子を基板上に固定し、固定されない余剰の該多孔質粒子を除去する、各工程を含む反応検出チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される多数の機能分子の認識を可能にする反応検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今のバイオテクノロジーの著しい進展に伴い、機能分子の認識を可能にする反応検出チップは、ますます重要な役割を担いつつある。反応検出チップの中でも最近注目度の高いＤＮＡチップを例に説明する。
【０００３】
遺伝子の変異、特に一塩基多型（塩基配列における一塩基の変異）の検出は、突然変異等に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献し、個々人の薬剤応答性や副作用の程度を調べる上にも必要である。また、遺伝子の発現状況、すなわち、遺伝子情報がｍRNAに読み取られ対応するタンパク質がつくられる状況を調べることは、遺伝子レベルで生命現象や病気を理解し、新薬を開発する上に非常に重要である。この遺伝子変異、あるいは、遺伝子の発現状況を速やかに検出する手段として、ＤＮＡチップが有効であることが知られている。
【０００４】
ＤＮＡチップとは、検体である各種ＤＮＡとそれぞれ特異的に結合する性質を有する分子をプローブとし、それぞれのプローブごとに、担体の表面上に、それぞれの区画に対応させて配列し固定したものである。このプローブは、一本鎖にした検体ＤＮＡに対し相補的な塩基配列を有する一本鎖のＤＮＡあるいはオリゴヌクレオチドであることが一般的である。
【０００５】
ＤＮＡチップのプローブが固定された面に検体ＤＮＡを含む検体液を接触させ、検体ＤＮＡと対応するプローブ間で結合を起こさせる。この結合は、通常、プローブと検体ＤＮＡの対合する塩基間で水素結合する性質、すなわち、ハイブリダイゼーションを利用したものである。そして、このハイブリダイゼーションによる結合を何らかの手段で検出することにより、プローブと結合した検体ＤＮＡを同定し、かつ、定量することができる。
【０００６】
ここでプローブと検体液の接触は、微量な検体液をプローブに有効に作用させる目的から、プローブが固定された担体面の領域に検体液を滴下し、その上にカバーガラス等をかぶせて検体液を均等に行き渡らせる方法、いわゆる“カバーガラス法”にて行うことが一般的である。
【０００７】
また、上記検出手段として現在は、検体ＤＮＡに標識として予め蛍光色素分子を付加し、プローブと結合した検体ＤＮＡの蛍光色素分子からの蛍光の強度を測定することが一般的である。
【０００８】
特許文献１には、多孔質粒子の細孔内部表面にそれぞれに異なる検出対象と結合可能な反応性物質を担持した多孔質担体粒子を、一体として担持多孔質担体粒子プローブとして、多孔質担体粒子細孔内部表面の反応性を維持したまま、基材に設けた複数の微小区分の１つ以上の区分に配列結合固定させることを特徴とする反応検出チップが開示されている。この多孔質担体粒子プローブは、本発明の一態様において使用される。
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２８１２５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、検出時に測定される蛍光は、プローブとハイブリダイゼーション結合した検体ＤＮＡの蛍光色素分子からの蛍光、すなわち“シグナル成分”だけではない。ハイブリダイゼーション以外のメカニズムにより基板およびプローブに結合した検体ＤＮＡの蛍光色素分子からの蛍光、基板自体の蛍光、基板に付着したほこりや汚れ、または測定光学系内部の汚れなどから発せられる蛍光、さらには測定光学系が有する暗シグナルといった検出を阻害する蛍光成分（ここでは“ノイズ成分”と呼ぶ。）もある。
【００１１】
このようなノイズ成分の和が各ＤＮＡチップの各プローブで一定であるならば、測定蛍光値からその一定値を差し引くことでシグナル成分を出すことができる。しかし実際には、ノイズ成分の和は一定ではなくばらつきをもつ。そして、各プローブにおいてシグナル成分とノイズ成分をそれぞれ正確に分離することは事実上不可能である。よって、測定蛍光値の大小関係がシグナル成分の大小関係と確実に一致するように、ノイズ成分のばらつきの影響が十分小さくなるまで、測定蛍光中のシグナル成分とノイズ成分との比（Ｓ／Ｎ比）を上げることが必要である。特に一塩基多型の検出では、シグナル成分の小さな差を識別しなければならないので、このＳ／Ｎ比の向上は非常に重要である。
【００１２】
Ｓ／Ｎ比を向上させる一つの方法は、ノイズ成分を小さくすることである。この目的で、蛍光測定の際、共焦点法が一般に用いられる。共焦点法は、焦点深度が狭いため、プローブ位置と高さが数μm程度以上異なる位置から発せられる蛍光を軽減させる作用を有する。よって、プローブと高さが異なる位置から発生するノイズ成分を大幅にカットすることが可能になる。
【００１３】
しかしながら共焦点法では、厳密に焦点を合わせる必要上、蛍光測定装置は精巧な構造となり高価になる。基板も高い厚さ均一性が要求されるため高価になる。また、プローブと高さが一致する位置から発生するノイズ成分に対しては効果がない。
【００１４】
そこで、共焦点法とは異なる、Ｓ／Ｎ比を向上させる抜本的な手法が待望される。
Ｓ／Ｎ比を向上させるもう一つの方法は、シグナル成分を大きくすることである。シグナル成分を大きくする最も有力な方法の一つは、従来２次元的に配置されているプローブを、基板に垂直な方向も含めて３次元的に配置し、シグナル発生源を３次元的にして集光することである。この発想は、基板表面に垂直な方向に関して狭い範囲からのみシグナル成分を集光する、蛍光測定において標準的な共焦点法とは相反する。そのような事情から、この発想に基づくＤＮＡチップはまだ十分には開発されておらず、従来の開発品は以下の問題を有していた。
（Ｉ）プローブを２次元配置にするのに比し３次元配置にすると、基板に対する投影単位面積当りのプローブの数を安定に制御することが難しくなる。
（ＩＩ）プローブを２次元配置にするのに比し３次元配置にすると、プローブへの検体の供給を均一にすることがカバーガラス法を用いた場合難しくなる。
【００１５】
よって、プローブを３次元配置にしてシグナル成分を大きくしたにもかかわらず、シグナル成分のばらつきが大きいため、検出能力が向上しなかった。
したがって検出能力を向上させるには、プローブの数が安定に制御でき、かつ、プローブへの検体の供給が均一になる３次元配置プローブを作製し、シグナル成分の大きさを安定させることが不可欠である。
【００１６】
このように、シグナル成分を安定に増大させてＳ／Ｎ比を向上させ、ＤＮＡチップの検出能力を向上させることが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、下記の手段により前記の課題を解決した。
（１）プローブ分子を多孔質粒子の細孔を含む表面に結合させた該多孔質粒子を複数個集合させて基板に固定することによりスポットを形成し、該スポットに入射光を照射して該プローブ分子と結合した検体分子を検出する反応検出チップにおいて、該多孔質粒子は該入射光に対し透明であり、かつ、該多孔質粒子は該基板上に単層状態に固定してあることを特徴とする反応検出チップ。
（２）前記検体分子には光学的に検知可能な標識物質、例えば、蛍光色素分子、燐光色素分子、機能性色素分子等、好ましくは蛍光色素分子、が付加されており、該標識物質からの発生する光学シグナルを検出することを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
（３）前記入射光に対する前記多孔質粒子の線吸収係数が10μm-1以下であることを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
（４）前記入射光に対する前記基板の線吸収係数が100μm-1以上であることを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
（５）前記多孔質粒子の粒径は0.1μm以上、200μm以下であることを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
（６）前記基板上に熱可塑性の有機膜を形成し、該有機膜上に前記多孔質粒子を点着し、該基板を加温して該有機膜を軟化させることにより該多孔質粒子を該有機膜に埋め込んで該多孔質粒子を固定し、固定されない余剰の該多孔質粒子を除去することを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
（７）前記有機膜の厚さは、前記多孔質粒子の粒径の半分以下であることを特徴とする第６項に記載の反応検出チップ。
（８）前記有機膜は、該有機膜の材料を有機溶媒に溶解しスピンコート法により形成することを特徴とする第６項に記載の反応検出チップ。
（９）前記点着は、前記多孔質粒子を液体に分散させて行われることを特徴とする第６項に記載の反応検出チップ。
（１０）前記余剰の多孔質粒子の除去は、超音波洗浄により行われることを特徴とする第６項に記載の反応検出チップ。
（１１）前記有機膜は、酢酸ビニル膜であることを特徴とする第６項に記載の反応検出チップ。
（１２）前記プローブ分子と前記検体分子は、核酸、蛋白質、糖蛋白質のうちのいずれか一種類であることを特徴とする第１項に記載の反応検出チップ。
【００１８】
通常のＤＮＡチップでは平面基板にプローブを直接固定するので、プローブの配置は２次元的である（図７参照）。もし、基板表面に平行な方向のみならず基板表面に垂直な方向にもプローブが分布するようにプローブの配置を３次元的にすることができれば、基板表面に対する投影単位面積当りのプローブ数が格段に増加することになる。したがって、プローブと結合した検体からの基板表面に垂直な方向に関するシグナルを集めることができれば、プローブ配置を３次元的にすることによりシグナル成分を増大させることができる。
【００１９】
まず、プローブ配置を３次元的にする目的で、特開2001-281251号公報に開示された手段を用いる。すなわち、プローブの担体として多孔質粒子を用い、多孔質粒子の内部の細孔を含む全表面にプローブを結合させる。そして、このプローブ付き多孔質粒子を基板上に固定し、反応検出チップのスポットを形成する（図４参照）。検体は細孔を経由して多孔質粒子の内部に拡散していけるので、多孔質粒子の内部に存在するプローブも検体との結合反応に寄与することが可能である。
【００２０】
次に、多孔質粒子内部のプローブと結合した検体からのシグナルを集める方法を提示する。このシグナルは、現在のＤＮＡチップにおける標準的な検出法と同様に、予め検体に付加した光学的に検知可能な標識物質、一般的には色素に入射光を照射した時の応答光とする。この色素に蛍光色素を選び、入射光として励起光を照射し、応答光として蛍光を検出することが一般的である。
【００２１】
多孔質粒子内部のプローブと結合した検体の場合、検体に付加された蛍光色素、すなわち蛍光標識を励起するには、多孔質粒子という媒体を通過させて励起光を照射することになる。よって、励起光に対し透明な多孔質粒子を選択すれば、励起光は多孔質内部を減衰することなく透過して蛍光標識を照射する。励起光照射により励起された蛍光の波長は、励起光の波長に対し20nm程度長いだけで励起光の波長との差は小さい。よって、蛍光の多孔質粒子に対する透過度は、励起光の多孔質粒子に対する透過度とほぼ等しく、多孔質粒子が励起光に対して透明であるならば蛍光に対しても透明であると考えてよい。したがって、励起された蛍光も多孔質内部を減衰することなく透過する。このように励起光に対して透明な多孔質粒子を選択することにより、多孔質粒子内部全体にわたる蛍光標識からのシグナルを集めることが可能になり、ひいてはシグナル成分を増大させることが可能になる。
【００２２】
最後に、３次元的に増大するプローブの数を制御し、かつ、プローブへの検体の供給を均一にすることによりシグナル成分の大きさを安定させる方法を提示する。
プローブの数の制御は、スポット間の厚さばらつきを抑制することにより達成される。基板に対する投影単位面積当りのプローブ数はスポットの厚さに比例するので、シグナル成分の大きさはスポットの厚さに比例するからである。
【００２３】
プローブへの検体の供給を均一にするには、結合反応時に用いられるカバーガラス法、すなわち、基板のスポット部に滴下した微量な検体液をカバーガラスをかぶせることにより均等に広げる方法に適したスポット形態にすることが必要である。これは結合反応を均一に行うため、スポット上に広がる検体液の層の厚さを均一にすることが必須条件であることによる。
【００２４】
プローブ付き多孔質粒子の基板への固定に関しては、例えば、同粒子をゾルやポリマーに分散させたペーストを基板に点着し固定する方法が特開2001-281251号公報に例示されている。ゾルやポリマーには固まった際、検体分子が拡散できる網目構造になるものもあり、この場合、検体分子はプローブに到達することが可能である。更に固まった際、透明になり、かつ自蛍光が小さいゾルやポリマーであれば、蛍光強度測定に支障は生じない。
【００２５】
しかしながらこの方法の問題点は、スポットの厚さ、すなわち、スポットの厚さ方向におけるプローブ付き多孔質粒子の数を制御することができないことである。この方法を行うと、必然的にスポットはプローブ付き多孔質粒子が積み重なって構成されることになるが、このスポットの厚さと断面形状は、たとえペースト中の同粒子の濃度やペーストの点着量を一定にしても、安定に制御することが困難だからである。つまりこの方法だと、スポットの厚さは、スポット間においてもスポット内においても大きくばらついてしまう。
【００２６】
このようにスポットの厚みがばらついているため、カバーガラス法を用いても、カバーガラス下面とスポット上面の間隔が一定にならないため、スポット上に広がる検体液の層の厚さは均一にはならない。よって検体液の浸透の仕方にばらつきが出てしまい、プローブと検体の結合反応は不均一になってしまう。また、検体液がプローブに十分浸透・到達しても、蛍光が通過するプローブ付き多孔質粒子や固定用ペースト層の厚さが位置によって異なるので、光透過の変動を生じ、外から観察される蛍光強度が大幅にばらついてしまう。
【００２７】
このような不都合が生じるため、プローブ付き多孔質粒子を積み重ねて固定する方法は、結合反応時に用いられるカバーガラス法に適さない。
そこで、プローブ付き多孔質粒子をスポット厚さが一定になるように一層に並べて基板に固定する方法を採用することが必要になる。そのためには、基板の上に接着層を形成し、この接着層にプローブ付き多孔質粒子を埋没させて固定する方法が最適である。接着層の厚さは、プローブ付き多孔質粒子の粒径の半分以下にして、プローブ付き多孔質粒子の体積の半分以上は接着層の外に露出するようにし、この露出部が検体液に直接接触できるようにする。
【００２８】
具体的な製法例としては、接着層として熱可塑性の有機膜をスピンコート法等により基板の上に形成し、この有機膜の上に液体分散させたプローブ付き多孔質粒子を点着する。そして、基板を加温することにより有機膜を軟化させ、プローブ付き多孔質粒子を埋没させる。基板を冷却して有機膜が硬化した後、固定されたプローブ付き多孔質粒子の上に重なった余剰のプローブ付き多孔質粒子を超音波洗浄等で除去する。
【００２９】
こうしてプローブ付き多孔質粒子が一層分だけ並んで基板に固定されたスポットが形成される。このスポットは厚さばらつきが抑制されるため、基板に対する投影単位面積当りのプローブの数を制御することが可能になり、結合反応時に用いられるカバーガラス法も問題なく使用することが可能になる。
【００３０】
多孔質粒子の透明度は高ければ高いほど良く、励起光に対する線吸収係数が10μm-1以下であることが望ましい。大雑把に言うと、これは励起光が多孔質粒子内部に0.1μm程度以上進入できることに対応する。プローブ分子同士の平均間隔は一般に数10nmなので、これより透明度が低いと励起光進入距離内に存在するプローブ数が数個以下になってしまい、励起光進入方向、すなわち基板表面に垂直な方向におけるシグナルの積算効果は小さくなってしまうからである。
【００３１】
本発明では、透明な多孔質粒子内部全体にわたる蛍光標識からのシグナルを積算させるので、蛍光検出を行う際、特に多孔質粒子の粒径が10μmを超える場合は共焦点法を用いることは避けるべきである。共焦点法だと焦点深度が狭いため、基板に垂直な方向に関しては数μm程度の領域からしかシグナルを積算できないからである。
【００３２】
Ｓ／Ｎ比の向上を図る観点から、ノイズ成分の一つである基板自体の蛍光を小さくすることも重要である。従来のＤＮＡチップにおいても、基板として自蛍光の小さいスライドガラスが用いられてきた。本発明において注意すべきことは、プローブ付き透明多孔質粒子に対して蛍光を積算することと同じ理由で、透明基板に対しても蛍光を積算するということである。たとえ自蛍光の小さい材質から構成されていても、透明基板ではこの積算の影響でノイズ成分が大きくなる懸念がある。よって基板は、励起光に対し自蛍光が小さいという従来からの要請に加えて不透明であることが要求され、具体的には、線吸収係数が100μm-1以上であることが好ましい。
【００３３】
従来のＤＮＡチップではプローブ分子を基板に直接固定するため、結合の容易さから基板の材質はガラスが好まれた。一方本発明では、プローブ分子は多孔質粒子に固定され、この多孔質粒子を接着層を介して固定することが基板の役割なので、基板の材質はガラスに拘る必要はない。また、共焦点法を用いないので、基板の厚さ均一性の高さは要求されない。不透明であるという条件が付いても、基板の選択範囲は、従来のＤＮＡチップより広がることになる。
【００３４】
多孔質粒子の粒径は、特開2001-281251号公報に開示されているように0.1μm以上200μm以下、好ましくは0.1μｍ以上100μm以下、更に好ましくは1μｍ以上10μm以下であることが望ましい。プローブ分子同士の平均間隔は一般に数10nmなので、粒径が0.1μmを下回ると励起光進入距離内に存在するプローブ数が数個以下になってしまい、シグナルの積算効果が小さくなり意味がない。
【００３５】
また、粒径が200μmを超えると、プローブと検体の結合反応を起こさせる際、不都合が生じる。この理由を以下に述べる。
ＤＮＡプローブとＤＮＡ検体の結合反応であるハイブリダイゼーションを行う時は、微量な検体液をプローブに有効に作用させる目的でカバーガラス法を用いるのが一般的である。検体液は入手が難しく貴重であるため、ＤＮＡチップ１枚当たりの検体液の使用量は40μl以下の量、通常は10μl程度である。基板スポット部の上に検体液を10μl滴下し、その上に20mm角のカバーガラスをかぶせて検体液を均等に広げるとすると、検体液は基板とカバーガラスの間に厚さ25μmの液層として介在する。この液層の厚さは、検体液量とカバーガラスサイズにより変化するが、通常では高々数十μm程度である。一方、粒径が200μmより大きくなりスポットが基板から200μmを超えて突出すると、カバーガラスをかぶせても検体液は均等に広がらず、スポット間で検体液の接触の仕方に差異が生じてしまう。よって、カバーガラス法への適応性という観点から、粒径は200μm以下であることが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
最初に、検体分子を標識する蛍光色素を決める。そして、この蛍光色素を励起する励起光に対する線吸収係数が10μm-1以下になるような多孔質粒子をプローブの担体として選択する。
【００３７】
この線吸収係数は、多孔質粒子の構成物質固有の光学特性、及び多孔体としての性質を反映しており、多孔質粒子の細孔径、細孔容積等に依存する。
蛍光色素としては、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）、Cy3、Cy5などが挙げられる。これらの蛍光色素を励起するのに必要な励起光の波長は450〜650nmの範囲内にある。よって多孔質粒子としては、可視光に対して透明なものが候補になる。プローブの担体としての好適な表面性状と化学的安定性も兼ね備えている観点から、ガラス、あるいは、ポリプロピレン、ポリスチレンのような透明なプラスチックから成る多孔質粒子が最適である。
【００３８】
この多孔質粒子の粒径は前述のように0.1μm以上200μm以下、好ましくは0.1μm以上100μm以下、より好ましくは1μm以上10μm以下になるようにする。また多孔質粒子の細孔径は経験的に10nm以上200nm以下になるように、より好ましくは50nm以上100nm以下になるようにするのが良い。
【００３９】
次に、この多孔質粒子にプローブ分子を結合させる。これは、公知の方法に倣い、表面処理によりリンカーを結合させた多孔質粒子を、このリンカーと結合するように末端を修飾したプローブ分子の溶液に浸して行われる。
【００４０】
または、多孔質粒子表面上にプローブ分子を直接化学合成する手法を用いることもできる。例えばオリゴヌクレオチドプローブ分子の場合は、ホスホアミダイト法のような確立された合成法が存在する。
【００４１】
続いて図１〜５を用いて、プローブ分子を結合させた多孔質粒子を基板に固定する工程を説明する。まず基板１として、励起光に対して不透明であり、大きさ25mm×75mm、厚さ1mm程度の板を用意する。シリコン板、金属板、可視光領域で不透明なプラスチック板などが使用可能である。
【００４２】
この基板１の上に、プローブ２を結合させた多孔質粒子３、すなわち、プローブ付き多孔質粒子４を固定するための接着層として、熱可塑性の有機膜５を形成する。形成方法としては、有機膜５の材料を有機溶媒に溶解して適当な粘性にした後、スピンコートを行うことが好適である。有機膜５の材料に要求されることは、自蛍光が小さいこと、基板１との密着性が高いこと、プローブ付き多孔質粒子４に対する接着力が強いこと、ハイブリダイゼーション反応に支障がない程度の耐水性があることであり、具体的には、酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニル、合成ゴム等を用いることができる。
【００４３】
図１に示すように、この有機膜５の上に、水等の液体に分散させたプローブ付き多孔質粒子４を適当なスポッター６によりスポッティングする。この段階では、図２に示すように、プローブ付き多孔質粒子４は積層された集合体になっている。
【００４４】
この集合体に含まれる液体が蒸発した後、基板１を水平にして加熱し、図３に示すように、軟化した有機膜５にプローブ付き多孔質粒子４を埋没させる。加熱は恒温機を用いて基板１周囲の大気温度を上げることにより行われる。基板１としてシリコン板や金属板のような熱伝導性の高いものを用いる場合は、ホットプレートにより加熱することも可能である。加熱温度、加熱時間は有機膜５の種類に合わせて決められる。有機膜５が酢酸ビニル膜の時は、加熱温度100℃、加熱時間10分程度が適当である。このような加熱処理により、プローブ付き多孔質粒子４は、軟化した有機膜５の中を自然に沈降し基板面に到達する。
【００４５】
冷却して有機膜５が硬化した段階で、有機膜５に埋め込まれたプローブ付き多孔質粒子４は基板１に固定される。続いて、固定されたプローブ付き多孔質粒子４の上に重なった固定されていないプローブ付き多孔質粒子４を水中での超音波洗浄等により排除し、基板１をエアガン等で乾燥させる。
【００４６】
こうしてプローブ付き多孔質粒子４が隙間なく一層に並んで基板１上に固定されたスポット７が完成する。スポット７の断面図を図４に、上面図を図５に示す。多孔質粒子３の細孔８にプローブ２が結合している様子を視覚化する目的で、プローブ付き多孔質粒子４の一部の拡大図も図４に合わせて示す。プローブ付き多孔質粒子４が重なり合わず一層なので、スポット７の厚みが安定し、基板１表面に垂直な方向におけるプローブ２の数を安定に制御することが可能になる。スポット７の直径は、プローブ付き多孔質粒子４の粒径の10倍以上とし、各ＤＮＡチップに必要とされるスポット密度に合わせて10〜1000μmの中で決めればよい。スポット７を構成するプローブ付き多孔質粒子４の数は少なくとも約100個以上になるので、プローブ付き多孔質粒子４の粒径に多少のばらつきがあってもスポット７の単位では平均化され、スポット７の間での厚さばらつきは極めて小さいと言える。また、スポット７を構成するプローブ付き多孔質粒子４の数は、ある程度のばらつきが許容される。スポット７の蛍光強度は、スポット７の基板１に対する投影全面積ではなく投影単位面積当たりのプローブ２の数に依存するからである。
【００４７】
固定の際、プローブ付き多孔質粒子４の全体が有機膜５の中に埋もれてしまっては、検体とプローブ２の結合が不可能になる。そこで、基板面に接触させて固定するプローブ付き多孔質粒子４の体積の半分以上が露出するようにするために、有機膜５の厚さはプローブ付き多孔質粒子４の粒径の半分以下にする。十分な固定強度が得られるならば、有機膜５の厚さは、検体のプローブ付き多孔質粒子４への浸入面積を増大させる観点から、また、自蛍光を小さくする観点から薄い方が好ましい。
【００４８】
このようにして本発明の反応検出チップが完成される。基板からのスポットの突出量が粒径200μm以下の多孔質粒子一層分なので、この反応検出チップにおいては、微量な検体液をスポット部に均一に広げるために通常行われるカバーガラス法を用いて、均一な結合反応を起こすことが可能である。反応後の洗浄、検出に関しても従来の反応検出チップと全く同様の扱いが可能である。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例及び比較例により、オリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡチップの場合を例にとり、さらに本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
【００５０】
［実施例］
検体の蛍光標識分子としてFITC（フルオレセインイソチオシアネート）を用いる。対応する励起波長は494nmであり、蛍光波長は518nmである。
【００５１】
オリゴヌクレオチドプローブの担体として、粒径7μm、細孔径50nm、細孔容積1.3ml/gの多孔質ガラス粒子を選ぶ。この多孔質ガラス粒子に対して吸光度測定を行ったところ、波長494nmにおける線吸収係数は0.1μm-1であった。必要条件である10μm-1以下を満足し、透明度は十分に高い。この多孔質ガラス粒子上にオリゴヌクレオチドプローブを直接合成し担持させるために、特願2002-254558号公報に開示された以下の手法を用いた。
【００５２】
N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランをトルエンに溶解した溶液に、多孔質ガラス粒子を浸漬する。溶液温度110℃で数時間保つことにより、多孔質ガラス粒子表面にアミノ基を導入する。このアミノ化多孔質ガラス粒子を、オリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドに対応するβ-シアノエチルホスホアミダイトのアセトニトリル溶液に浸漬し、同粒子に最初のヌクレオチドを結合させる。続いて、通常のホスホアミダイト法により、各プローブに対応するオリゴヌクレオチド鎖を合成する。そして、合成オリゴヌクレオチド鎖付き多孔質ガラス粒子をアンモニア水に数十時間浸漬して鎖に残存する保護基を除去し、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子を完成させる。
【００５３】
他方、検出を確認する検体として、ガン抑制遺伝子ｐ５３のコドン２４８を含むＤＮＡ断片を選び、正常型とコドン２４８に点変異を起こした２種類の変異型１、変異型２の検体３種類を用意した。それぞれ3’末端にFITC標識が付加されてあり、以下の構造を持つ。
【００５４】
正常型検体：5’ AT GGG CCT CCG GTT CAT GCC 3’- FITC
変異型１検体：5’ AT GGG CCT CCA GTT CAT GCC 3’- FITC
変異型２検体：5’ AT GGG CCT CTG GTT CAT GCC 3’- FITC
これらの検体に対応させて以下の相補鎖プローブと非相補的な陰性対照プローブを、前述の方法により多孔質ガラス粒子に直接合成し担持させた。
【００５５】
正常型プローブ：PG -3’ TA CCC GGA GGC CAA GTA CGG 5’
変異型１プローブ：PG -3’ TA CCC GGA GGT CAA GTA CGG 5’
変異型２プローブ：PG -3’ TA CCC GGA GAC CAA GTA CGG 5’
陰性対照プローブ：PG -3’ TT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 5’
A、C、G、Tは糖残基に結合する４種類の塩基：アデニン、シトシン、グアニン、チミンを、PGは多孔質ガラス粒子をあらわす。
【００５６】
続いて図１〜５を用いて、オリゴヌクレオチドプローブ分子を結合させた多孔質ガラス粒子を基板に固定する工程を説明する。最初にスライドガラスサイズに対応する大きさ25mm×75mm、厚さ0.73mmの、励起波長494nmに対して完全に不透明なシリコン基板１上に、酢酸ビニルのアセトン溶液をスピンコートすることにより、厚さ約3μmの酢酸ビニル層５を形成しておく。この酢酸ビニル層５は、オリゴヌクレオチドプローブ２を結合させた多孔質ガラス粒子３、すなわち、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４をシリコン基板１に固定する接着層の役割をする。
【００５７】
次に図１に示すように、各種のオリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４をそれぞれ水に分散させた分散液を、適当なスポッター６を用いて酢酸ビニル層５上にスポッティングする。この時、酢酸ビニル層５は、以降の工程から明らかであるが、完全に乾燥していて良く、これは他の材質の接着層に関しても当てはまる。よって、接着層付き基板は作り貯めが可能であり、量産に有利である。
【００５８】
スポッティング直後の段階では、図２に示すように、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４は積層された集合体になっている。
この集合体に含まれる水分が蒸発した後、恒温機により、シリコン基板１を水平な状態で100℃、10分間、大気雰囲気にて加熱する。酢酸ビニル層５が軟化し、図３に示すように、酢酸ビニル層５の中にオリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４が埋め込まれる。冷却し酢酸ビニル層５が硬化した後、シリコン基板１を水中で振動数28kHzで1分間超音波洗浄し、酢酸ビニル層５に固定されなかった余分なオリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４をシリコン基板１上から除去する。その後、シリコン基板１をエアガンで乾燥させて、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４が一層だけシリコン基板１に固定されたスポット７を完成させる。スポット７の断面図を図４に、上面図を図５に示す。多孔質ガラス粒子３の細孔８にオリゴヌクレオチドプローブ２が結合している様子を視覚化する目的で、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４の一部の拡大図も図４に合わせて示す。酢酸ビニル層５の厚さはオリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４の粒径の半分以下であるから、同粒子の体積の半分以上は酢酸ビニル層５の外に露出することになり、この露出部は検体液に直接接触することができる。
【００５９】
スポット７のサイズは約1000μmである。上記の正常型プローブに対応するスポット７１、変異型１プローブに対応するスポット７２、変異型２プローブに対応するスポット７３、陰性対照プローブに対応するスポット７４の４種類をそれぞれ５つずつ、図６に示すように、間隔2000μmの正方格子状にして酢酸ビニル層５上に配置する。
【００６０】
このようにして作製したＤＮＡチップは、通常のＤＮＡチップと同様の扱いが可能である。
まず、上記の検体３種類をハイブリダイゼーションバッファー液でそれぞれ希釈した検体液３種類をＤＮＡチップ３枚のスポット部にそれぞれ１種類ずつ10μl滴下し、その上に20mm角のカバーガラスをかぶせて検体液を均等に行き渡らせる。
【００６１】
続いて、基板をハイブリダイゼーションチャンバーの中に収納し、恒温機中で45℃、12時間保持しインキュベーションを行う。
その後、チャンバーから基板を取り出し、2×SSC溶液にSDSを0.01%溶解させた１次洗浄液に浸し、カバーガラスをはずす。引き続き、１次洗浄液中で基板を揺動させながら5分間洗浄を行う。
【００６２】
次に、0.2×SSC溶液にSDSを0.01%溶解させた２次洗浄液に基板を浸し、揺動させながら5分間洗浄を行う。
それから、SDSを除去する目的で、0.2×SSC溶液に基板を浸し、揺動させながら１分間すすぎを行う。
【００６３】
すすぎ後、基板をエアガンにより乾燥させる。
このようにしてハイブリダイゼーションが終了した基板のスポットを通常の蛍光顕微鏡にて観察し、各スポットの蛍光強度を測定した。
【００６４】
デジタル化したスポット画像のピクセルの明るさを平均して各スポットの蛍光強度を算出した。同一種類のプローブからなる５つのスポットの値を平均して、各検体に対する各プローブの蛍光強度をまとめた結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2005249429.tif 000003
【００６６】
各検体に対し、パーフェクトマッチングの蛍光強度とミスマッチングの蛍光強度の比、すなわち識別比を括弧の中に記述してある。正常型検体に対しては、正常型プローブがパーフェクトマッチングであり、変異型１プローブと変異型２プローブがミスマッチングである。変異型１検体に対しては、変異型１プローブがパーフェクトマッチングであり、正常型プローブと変異型２プローブがミスマッチングである。変異型２検体に対しては、変異型２プローブがパーフェクトマッチングであり、正常型プローブと変異型１プローブがミスマッチングである。パーフェクトマッチングに相当する枠内は網掛けを施してある。各検体において、パーフェクトマッチングの方がミスマッチングより、ハイブリダイゼーション結合の強度が大きいので、蛍光強度が大きくなるはずである。よって識別比は１より大きくなり、この値が大きいほど検出能力が高いことを意味する。
【００６７】
表１を見ると６つの識別比がすべて1を超えており、点変異の識別が可能であることがわかる。
また、網掛け枠のパーフェクトマッチングにおいては、いずれの組合せも150以上の蛍光強度を示しているのに対し、網掛け枠以外のミスマッチングにおいては、最大でも127とパーフェクトマッチングに比し有意に低くなっている。この結果、点変異の識別が十分可能になっている。
【００６８】
陰性対照プローブのスポット蛍光強度は、ハイブリダイゼーションによるシグナル成分が含まれないため、ノイズ成分のみから成るとみなせる。ノイズを生じる主な原因としては、正規なハイブリダイゼーション以外の検体分子のいわゆる非特異的吸着機構が考えられる。これは主として洗浄操作の不足などによって検体分子がプローブ分子自体に機械的に付着している場合や、多孔質粒子に直接付着している場合を含むと考えられる。
【００６９】
表１に示すように、ノイズ成分は、検体３種類の陰性対照プローブのスポット蛍光強度を平均して、37.6と見積られる。検体３種類のパーフェクトマッチングにおけるスポット蛍光強度を平均すると171.3となるので、シグナル成分は133.7(=171.3−37.6)と求められる。したがってＳ／Ｎ比は3.56(=133.7／37.6)と求められる。また、同一種類スポットのシグナル成分のばらつきはノイズ成分を一定として求めると、相対標準偏差で5.5%であった。
【００７０】
［比較例１］
本発明をプローブ配置が２次元のＤＮＡチップと対比させる目的で、図７に示すような、スライドガラス９の表面上にプローブ２を直接固定する方式での２次元ＤＮＡチップを作製した。通常のスポッティング法を用いて、活性エステル処理したスライドガラス上に、末端をアミノ化修飾した上記の合成プローブ分子を共有結合により固定した。スポット径、スポット配置は、本実施例と共通である。
【００７１】
本発明と同様のハイブリダイゼーションを行い、各スポットの蛍光強度の数値化を行った。その結果を表２に示す。
【００７２】
【表２】
2005249429.tif 000004
【００７３】
表２のパーフェクトマッチングに対応する網掛け枠内の蛍光強度は、それ以外のミスマッチングに対応する蛍光強度との有意差が見られない。
６つの識別比はいずれも1を超えてはいるが、本発明に比し１との差は小さく識別は不可能となっている。また、本発明と同様に求めたシグナル成分が5.3であるのに対し、ノイズ成分は30.7とシグナル成分よりはるかに大きいという不都合を生じている。
【００７４】
［比較例２］
続いて、本発明をプローブ配置が３次元ではあるがシグナル成分の制御がなされていない従来の製法によるＤＮＡチップと対比させる目的で、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子が一層ではなく、積み重なって厚さが制御されていないスポットから成るＤＮＡチップを作製した。具体的には、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４をシリカゾル１０に分散させてシリコン基板１の上に点着固定し、図８に示す断面形状を有するスポット７を形成した。スポット７の断面形状は不規則な凸型になり、厚い部分はオリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子４が約３層から約６層とスポット７の間でばらつく。本発明と同様のスポットサイズ、スポット配置とし、本発明と同様のハイブリダイゼーションを行い、スポット蛍光強度を測定した。その結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】
2005249429.tif 000005
【００７６】
６つの識別比はいずれも1を超えてはいるが、本発明に比し１との差は小さく識別は２次元配置プローブと同様にほとんど不可能となっている。また、本発明と同様に求めたシグナル成分は182.3、ノイズ成分は57.8、Ｓ／Ｎ比は3.15となるが、同一種類スポットのシグナル成分のばらつきは25.6%と非常に大きいという弊害がある。
【００７７】
［まとめ］
以上比較を行ってきた、プローブ配置が３次元でスポット厚さが制御されている本発明のＤＮＡチップ、プローブ配置が２次元である比較例１のＤＮＡチップ、プローブ配置が３次元ではあるがスポット厚さが制御されていない比較例２のＤＮＡチップにおける検出能力を表４にまとめる。上述した不都合な問題点に関わる箇所には×印が付してある。
【００７８】
【表４】
2005249429.tif 000006
【００７９】
このように本発明のＤＮＡチップの検出能力が向上するのは、次の２つの理由によることがわかる。
・本発明は、プローブ配置が２次元のＤＮＡチップに比し、シグナル成分が格段に増大することに対しノイズ成分があまり増大しないためＳ／Ｎ比が格段に増大する。
・本発明は、プローブ配置が３次元ではあるがスポット厚さが制御されていないＤＮＡチップに比し、シグナル成分のばらつきが小さい。
【００８０】
本発明におけるシグナル成分の格段の増大は、多孔質粒子の内部にプローブが３次元的に配置され、基板への投影単位面積当りのプローブ数が２次元配置に比し格段に増大することにより、かつ、励起光に対し透明な多孔質粒子を用いるため、多孔質粒子の内部のプローブにも励起光が減衰することなく照射されることに起因する。ここで、多孔質粒子の励起光に対する線吸収係数が10μm-1を超えて大きくなると、多孔質粒子内での励起光の減衰が大きくなるため、蛍光強度が著しく低下し２次元配置プローブＤＮＡチップとほとんど変わらなくなってしまうことが確認されている。したがって、励起光に対する線吸収係数が10μm-1以下の多孔質粒子を用いることが必須である。
【００８１】
一方、ノイズ成分の増大が小さいのは、プローブ配置を３次元にすることにより増加すると懸念される非特異的吸着が十分抑制されていることに起因する。これは、プローブ分子および多孔質粒子表面における非特異的吸着サイトがプローブ合成時に十分にキャッピングされたことと、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄が適切に行われたことによると考えられる。
【００８２】
また、本発明におけるシグナル成分のばらつきの減少は、プローブ付き多孔質粒子を基板に固定してスポットを形成する際、一層に並べてスポットの厚さばらつきを抑制したため、プローブ数が安定に制御され、かつ、カバーガラスを用いたハイブリダイゼーション反応が均一に行えることに起因する。
【００８３】
このように本発明のＤＮＡチップは、３次元配置によりプローブの数を増大させたことに加えて、増大させたプローブからのシグナル成分を安定に制御できるスポット形態にしたことにより、高い検出能力を得ることが可能になった。
【００８４】
以上述べてきた結果と考察により、本発明のＤＮＡチップを用いれば、小さなシグナル差を識別する必要がある一塩基多型解析等を高い検出能力で行うことが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
ＤＮＡチップ等の反応検出チップにおいて、励起光に対して透明な多孔質粒子の内部にプローブを配置させることにより、３次元的に数が増大したプローブに励起光が減衰することなく照射されるので、蛍光色素標識検体の検出におけるシグナルが格段に増大する。また、プローブ付き多孔質粒子を基板に固定してスポットを形成する際、同粒子を一層に並べるため、スポットの厚さばらつきに起因するシグナルばらつきを抑制できる。よってＳ／Ｎ比が安定して増大するため、反応検出チップの検出能力が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】プローブ付き多孔質粒子を基板に固定する工程を説明する断面図である。
【図２】図１に続く工程を説明する断面図である。
【図３】図２に続く工程を説明する断面図である。
【図４】図３に続く工程を説明する断面図、及び多孔質粒子に固定されたプローブを示す説明図である。
【図５】プローブ付き多孔質粒子から構成されるスポットである。
【図６】本実施例のＤＮＡチップにおけるスポットの配置図である。
【図７】２次元配置プローブから成るＤＮＡチップの断面図である。
【図８】オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子が積み重なって固定されるスポットの断面図である。
【符号の説明】
【００８７】
１ 基板、シリコン基板
２ プローブ、オリゴヌクレオチドプローブ
３ 多孔質粒子、多孔質ガラス粒子
４ プローブ付き多孔質粒子、オリゴヌクレオチドプローブ付き多孔質ガラス粒子
５ 有機膜、酢酸ビニル層
６ スポッター
７ スポット
８ 細孔
９ スライドガラス
１０ シリカゾル
７１ 正常型プローブに対応するスポット
７２ 変異型１プローブに対応するスポット
７３ 変異型２プローブに対応するスポット
７４ 陰性対照プローブに対応するスポット
【図５】
2005249429.tif 000007
【図６】
2005249429.tif 000008
【図１】
2005249429.tif 000009
【図２】
2005249429.tif 000010
【図３】
2005249429.tif 000011
【図４】
2005249429.tif 000012
【図７】
2005249429.tif 000013
【図８】
2005249429.tif 000014
【配列表】
2005249429000001.app