(57)【要約】    【課  題】  少量の試料でも感度が良好であり、分離能に優れ、リン酸バッファーやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いる必要がないデスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量方法の提供。    【解決手段】試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量する方法であって、該デスモシンおよび／またはイソデスモシンをそれらの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：【化１】2005249493.tif 000047を式（Ｉ）：【化２】2005249493.tif 000048で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換した形で測定することを特徴とする定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量する方法であって、該デスモシンおよび／またはイソデスモシンをそれらの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化１】
2005249493.tif 000042
を式（Ｉ）：
【化２】
2005249493.tif 000043
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換した形で測定することを特徴とする定量方法。
【請求項２】
（ａ）試料を酸処理する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた酸処理物をイオン交換カラムで精製する工程、
（ｃ）前記（ｂ）工程で得られた精製物中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンをフェニルイソチオシアネートと反応させてデスモシンおよび／またはイソデスモシンの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化３】
2005249493.tif 000044
を式（ＩＩＩ）：
【化４】
2005249493.tif 000045
で示される基に変換し、さらに式（ＩＩＩ）で示される基を式（Ｉ）：
【化５】
2005249493.tif 000046
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換する工程、
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られた３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体を測定する工程、および
（ｅ）前記（ｄ）工程で得られた測定値から、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を算出する工程
を包含してなる請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
試料が哺乳動物から採取した尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血漿、血清、または組織抽出物である請求項２記載の定量方法。
【請求項４】
試料がヒト尿である請求項３記載の定量方法。
【請求項５】
イオン交換カラムが陽イオン交換カラムである請求項２記載の定量方法。
【請求項６】
試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度算出を、標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う請求項２記載の定量方法。
【請求項７】
検量線が、溶媒として生理食塩液を用いた標準溶液を用いて、請求項２の工程（ａ）〜工程（ｄ）と同様に実施して得られる測定値から作成されることを特徴とする検量線である請求項６記載の定量方法。
【請求項８】
検量線が、真度が定量下限濃度において±２０％以内であり、その他の濃度において±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である請求項６記載の定量方法。
【請求項９】
３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体の測定を液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法で行う請求項２記載の定量方法。
【請求項１０】
液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法が、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法である請求項９記載の定量方法。
【請求項１１】
試料中に、内部標準物質として安定同位体標識したアミノ酸、またはアセチルピリジノリンを添加する請求項１０記載の定量方法。
【請求項１２】
アミノ酸がバリンである請求項１１記載の定量方法。
【請求項１３】
液体クロマトグラフィーを液体クロマトグラフィー用分析カラムを冷却して行う請求項１０記載の定量方法。
【請求項１４】
液体クロマトグラフィー用分析カラムを０〜５℃に冷却して行う請求項１３記載の定量方法。
【請求項１５】
液体クロマトグラフィーの移動相がアセトニトリルと０．０１〜０．１％トリフルオロ酢酸水溶液との混合溶液である請求項１４記載の定量方法。
【請求項１６】
アセトニトリルとトリフルオロ酢酸水溶液との混合比が４０：６０〜５０：５０である請求項１５記載の定量方法。
【請求項１７】
デスモシンおよび／またはイソデスモシンの測定値の同時再現性および／または日差再現性における精度が１５％以下である範囲で実施する請求項１０記載の定量方法。
【請求項１８】
請求項２における工程（ｅ）の後にさらに、工程（ｅ）で算出されたデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を、健常人から採取した試料を用い、請求項２における工程（ａ）〜工程（ｅ）と同様に実施して算出されるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度と比較する工程を包含することを特徴とする呼吸器疾患検査法。
【請求項１９】
呼吸器疾患が、下気道疾患または下気道疾患に起因する多臓器障害である請求項１８記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２０】
下気道疾患が、全身性炎症反応症候群に伴う急性肺障害、全身性炎症反応症候群、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、慢性気管支炎、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、急性肺障害、突発性肺線維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、エンドトキシン誘発性肺損傷および非細胞肺癌から選択される１以上の疾患である請求項１９記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２１】
呼吸器疾患が、エラスターゼ活性の亢進に起因する呼吸器疾患である請求項１８記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２２】
検査法がエラスターゼ阻害薬の投与により呼吸器疾患の改善が期待できる患者を選択するためのものである請求項１８記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２３】
エラスターゼ阻害薬が、
１）シベレスタットナトリウムまたはその水和物、
２）２−［３−［［Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［Ｎ−［（１Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１−（メチルエチル）−２−オキソプロピル］カルバモイル］ピロリジニル］−１−（メチルエチル）−２−オキソエチル］カルバモイル］メチル］−２−オキソイミダゾリジニル］酢酸、
３）Ｓ−［１−メチル−２−オキソ−２−［テトラハイドロ−２−オキソ−３−チエニル）アミノ］エチル］−２−チオフェンカルボチオ酸エステル、
４）ＰＢＩ−１１０１、または
５）４−［７’’（Ｓ）−メトキシ−３’’−メチル−８’’−オキソジスピロ［シクロペンタン−１，１’−シクロプロパン−２，４’’−［５−チア［１］アザビシクロ［４．２．１］オクト［２］エン］−２’’−イルカルボニル］−１−ピペラジン酢酸ナトリウム塩  Ｓ，Ｓ−ジオキシド
である請求項２２記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２４】
エラスターゼ阻害薬がシベレスタットナトリウム水和物である請求項２２記載の呼吸器疾患検査法。
【請求項２５】
（ａ）デスモシンおよび／またはイソデスモシンである標準物質、あるいはその水溶液、
（ｂ）内部標準物質またはその水溶液、
（ｃ）前処理用イオン交換カラムおよびその洗浄液、ならびに
（ｄ）フェニルイソチオシアネート反応液およびフェニルチオヒダントイン化反応液
を含有するデスモシンおよび／またはイソデスモシン定量キット。
【請求項２６】
試験化合物を投与した呼吸器疾患動物モデルから採取した試料を用い、請求項１〜１６のいずれかに記載の定量方法により該試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量し、試験化合物の投与によるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの変動を検定することを特徴とする呼吸器疾患改善化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デスモシンおよびイソデスモシンの定量方法、呼吸器疾患検査法、定量キット及びスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
デスモシン（以下、ＤＥＳともいう）およびイソデスモシン（以下、ＩＤＥともいう）は、エラスチンがエラスターゼにより加水分解されて生成する架橋アミノ酸であり、下記構造式を有する。
（デスモシン）
【化１】
2005249493.tif 000002
（イソデスモシン）
【化２】
2005249493.tif 000003
かかるデスモシンおよびイソデスモシンは分解エラスチンの生化学的マーカーとして用いられる。例えば、非特許文献１および２には、慢性閉塞性肺疾患（以下、ＣＯＰＤともいう）は、肺エラスチンの分解を伴うので、尿中のデスモシンおよびイソデスモシンが、ＣＯＰＤ患者の測定マーカーとして利用することができる旨記載されている。
【０００３】
非特許文献３には、尿中のデスモシンとイソデスモシンをフェニルイソチオシアネート化して、これを液体クロマトグラフィーを用いて測定することにより、デスモシンとイソデスモシンを定量する方法が記載されている。
非特許文献４には、尿中のデスモシンとイソデスモシンとをキャピラリー電気泳動法を用いて定量する方法が記載されている。
非特許文献５には、尿中のデスモシンとイソデスモシンを同位体希釈と高速液体クロマトグラフィーとの組み合わせからなる手段によって定量する方法が記載されている。
【０００４】
非特許文献６には、デスモシンとイソデスモシンを放射性免疫測定法によって定量する方法が記載されている。
非特許文献７には、ヒト、ラットもしくはモルモット尿中のデスモシンおよびイソデスモシンを、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法）によって定量する方法が記載されている。
しかしながら、非特許文献１〜７に記載のいずれの方法も分離不十分であり、感度不足であるため実用的ではない。
【０００５】
また、非特許文献８には、イオンペアー試薬を用いたＬＣ／ＭＳ法によるデスモシンおよびイソデスモシンの測定法が開示され、非特許文献９には、イオンペアー試薬を用いたＬＣ／ＭＳ法によるヒトの尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの測定法が開示されている。しかしながら、いずれの方法も分離能が不十分であり、また感度不足等の問題点も見受けられる。
【０００６】
非特許文献１０には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の移動相にリン酸バッファーを使用し、かつこのリン酸バッファー中にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することにより、デスモシンおよびイソデスモシンを分離・測定する液体高速クロマトグラフィー法が開示されている。しかし、この方法も感度が充分でない。なお、感度を上げるために、この既知方法をＭＳ／ＭＳ法と組み合わせることも考えられるが、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法では、通常、適用可能な移動相条件が揮発性の塩および溶媒のみと限定されているからため、ＭＳ／ＭＳ法と組み合わせることができない。
上記各種従来法が感度不足である理由は種々考えられるが、主たる理由は、１）生体試料中のデスモシンおよびイソデスモシンの含量が微量であること、２）デスモシンおよびイソデスモシンの物性が極めて高極性を示し、通常の前処理や測定法が適用し難いこと、３）デスモシンおよびイソデスモシンが構造異性体の関係にあり、両者の分離が困難であることなどが挙げられる。
【非特許文献１】Stone PJ, Gottlieb DJ, O’Connor GT, Ciccolella DE, Breuer R,Bryan-Rhadfi J, Shaw HA, Franzblau C, Snider GL. Am J Respir Crit Care Med.1995 Apr;151(4):952-9.
【非特許文献２】Gottlieb DJ, Stone PJ, Sparrow D, Gale ME, Weiss ST, Snider GL,O’Connor GT. Am J Respir Crit Care Med. 1996 Nov;154(5):1290-5.
【非特許文献３】Salomoni M, Muda M, Zuccato E and Mussini E, J Chromatogr. 572(1991) 312-6.
【非特許文献４】Viglio S, Zanaboni G, Luisetti M, Trisolini R, Grimm R, Cetta G andIadarola P. J, Chromatogr B Biomed Sci Appl. 714 (1998) 87-98.
【非特許文献５】Stone PJ, Bryan-Rhadfi J, Lucey EC, Ciccolella DE, Crombie G, FarisB, Snider GL and Franzblau C, Am Rev Respir Dis. 144 (1991) 284-90.
【非特許文献６】King GS, Mohan VS and Starcher BC, Connect Tissue Res. 7 (1980)263-7.
【非特許文献７】第51回質量分析総合討論会 (2003)  講演要旨集 266-267.
【非特許文献８】Kaga N, Soma S, Fujimura T, Seyama K, Fukuchi Y and Murayama K, AnalBiochem. 318 (2003) 25-9.
【非特許文献９】Ma S, Lieberman S, Turino GM and Lin YY, Proc Natl Acad Sci U S A.100 (2003) 12941-3.
【非特許文献１０】Cumiskey WR, Pagani ED and Bode DC, J Chromatogr B Biomed Appl.668 (1995) 199-207.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、少量の試料でも感度が良好であり、分離能に優れ、リン酸バッファーやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いる必要のないデスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンをそれらの分子内に存在する部分構造式：
【化３】
2005249493.tif 000004
を式（Ｉ）：
【化４】
2005249493.tif 000005
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換した形で測定すると、少量の試料でも感度が良好であり、分離能に優れ、移動相にリン酸バッファーを用いる必要がなく、また、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して用いる必要がなく、デスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量が工業的有利に実施できることを見出し、さらに検討を重ねて、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
１）  試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量する方法であって、該デスモシンおよび／またはイソデスモシンをそれらの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化５】
2005249493.tif 000006
を式（Ｉ）：
【化６】
2005249493.tif 000007
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換した形で測定することを特徴とする定量方法、
【００１０】
２）  （ａ）試料を酸処理する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた酸処理物をイオン交換カラムで精製する工程、
（ｃ）前記（ｂ）工程で得られた精製物中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンをフェニルイソチオシアネートと反応させてデスモシンおよび／またはイソデスモシンの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化７】
2005249493.tif 000008
を式（ＩＩＩ）：
【化８】
2005249493.tif 000009
で示される基に変換し、さらに前記式（ＩＩＩ）で示される基を式（Ｉ）：
【化９】
2005249493.tif 000010
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換する工程、
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られた３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体を測定する工程、および
（ｅ）前記（ｄ）工程で得られた測定値から、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を算出する工程
を包含してなる上記１）記載の定量方法、
【００１１】
３）  試料が哺乳動物から採取した尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血漿、血清、または組織抽出物である上記２）記載の定量方法、
【００１２】
４）  試料がヒト尿である上記３）記載の定量方法、
５）  イオン交換カラムが陽イオン交換カラムである上記２）記載の定量方法、
６）  試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度算出を、標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う上記２）記載の定量方法、
【００１３】
７）  検量線が、溶媒として生理食塩液を用いた標準溶液を用いて、上記２）の工程（ａ）〜工程（ｄ）と同様に実施して得られる測定値から作成されることを特徴とする検量線である上記６）記載の定量方法、
８）  検量線が、真度が定量下限濃度において±２０％以内であり、その他の濃度において±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である上記６）記載の定量方法、
【００１４】
９）  ３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体の測定を液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法で行う上記２）記載の定量方法、
１０）  液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法が、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法である上記９）記載の定量方法、
【００１５】
１１）  試料中に、内部標準物質として安定同位体標識したアミノ酸、またはアセチルピリジノリンを添加する上記１０）記載の定量方法、
１２）  アミノ酸がバリンである上記１１）記載の定量方法、
１３）  液体クロマトグラフィーを液体クロマトグラフィー用分析カラムを冷却して行う上記１０）記載の定量方法、
【００１６】
１４）  液体クロマトグラフィー用分析カラムを０〜５℃に冷却して行う上記１３）記載の定量方法、
１５）  液体クロマトグラフィーの移動相がアセトニトリルと０．０１〜０．１％トリフルオロ酢酸水溶液との混合溶液である上記１４）記載の定量方法、
１６）  アセトニトリルとトリフルオロ酢酸水溶液との混合比が４０：６０〜５０：５０である上記１５）記載の定量方法、
【００１７】
１７）  デスモシンおよび／またはイソデスモシンの測定値の同時再現性および／または日差再現性における精度が１５％以下である範囲で実施する上記１０）記載の定量方法、
１８）  上記２）における工程（ｅ）の後にさらに、工程（ｅ）で算出されたデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を、健常人から採取した試料を用い、上記２）における工程（ａ）〜工程（ｅ）と同様に実施して算出されるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度と比較する工程を包含することを特徴とする呼吸器疾患検査法、
【００１８】
１９）  呼吸器疾患が、下気道疾患または下気道疾患に起因する多臓器障害である上記１８）記載の呼吸器疾患検査法、
２０）  下気道疾患が、全身性炎症反応症候群に伴う急性肺障害、全身性炎症反応症候群、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、慢性気管支炎、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、急性肺障害、突発性肺線維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、エンドトキシン誘発性肺損傷および非細胞肺癌から選択される１以上の疾患である上記１９）記載の呼吸器疾患検査法、
【００１９】
２１）  呼吸器疾患が、エラスターゼ活性の亢進に起因する呼吸器疾患である上記１８）記載の呼吸器疾患検査法、
２２）  検査法がエラスターゼ阻害薬の投与により呼吸器疾患の改善が期待できる患者を選択するためのものである上記１８）記載の呼吸器疾患検査法、
【００２０】
２３）  エラスターゼ阻害薬が、
１）シベレスタットナトリウムまたはその水和物、
２）２−［３−［［Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［Ｎ−［（１Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１−（メチルエチル）−２−オキソプロピル］カルバモイル］ピロリジニル］−１−（メチルエチル）−２−オキソエチル］カルバモイル］メチル］−２−オキソイミダゾリジニル］酢酸、
３）Ｓ−［１−メチル−２−オキソ−２−［テトラハイドロ−２−オキソ−３−チエニル）アミノ］エチル］−２−チオフェンカルボチオ酸エステル、
４）ＰＢＩ−１１０１、または
５）４−［７’’（Ｓ）−メトキシ−３’’−メチル−８’’−オキソジスピロ［シクロペンタン−１，１’−シクロプロパン−２，４’’−［５−チア［１］アザビシクロ［４．２．１］オクト［２］エン］−２’’−イルカルボニル］−１−ピペラジン酢酸ナトリウム塩  Ｓ，Ｓ−ジオキシド
である上記２２）記載の呼吸器疾患検査法、
【００２１】
２４）  エラスターゼ阻害薬がシベレスタットナトリウム水和物である上記２２）記載の呼吸器疾患検査法、
２５）  （ａ）デスモシンおよび／またはイソデスモシンである標準物質、あるいはその水溶液、
（ｂ）内部標準物質またはその水溶液、
（ｃ）前処理用イオン交換カラムおよびその洗浄液、ならびに
（ｄ）フェニルイソチオシアネート反応液およびフェニルチオヒダントイン化反応液
を含有するデスモシンおよび／またはイソデスモシン定量キット、および
【００２２】
２６）  試験化合物を投与した呼吸器疾患動物モデルから採取した試料を用い、上記１）〜１６）のいずれかに記載の定量方法により該試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量し、試験化合物の投与によるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの変動を検定することを特徴とする呼吸器疾患改善化合物のスクリーニング方法
に関する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、少量の試料でも感度が良好であり、分離能に優れているため、工業的有利にデスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量が実施できる。また、本発明は、リン酸バッファーやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いる必要がないので、取り扱いやすく、特に液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法によるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量が容易に実施できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量する方法であって、該デスモシンおよび／またはイソデスモシンをそれらの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化１０】
2005249493.tif 000011
を式（Ｉ）：
【化１１】
2005249493.tif 000012
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換した形で測定することを特長とする。
【００２５】
上記部分構造式（ＩＩ）を上記式（Ｉ）で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換する方法は、公知方法であってよく、例えば、上記部分構造式（ＩＩ）中のアミノ基の水素原子１個を式
【化１２】
2005249493.tif 000013
で表される一価の置換基で置換し、ついでカルボキシル基と前記置換基中の―ＮＨ―基とを脱水縮合させる方法などが挙げられる。
【００２６】
上記３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換された形のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量する方法としては、液体クロマトグラフィー・質量分析法、または液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法等が挙げられる。
【００２７】
本発明に用いられる試料としては、生物試料などが挙げられる。生物試料としては、例えば哺乳動物から採取した尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血漿、血清、または組織抽出物等が挙げられるが、とりわけヒトから採取した尿（ヒト尿）が好ましい。このヒト尿は、健常人から採取したものであってもよいし、例えば呼吸器疾患患者などの非健常人から採取したものであってもよい。
【００２８】
本発明の好ましい工程としては、例えば、
（ａ）試料を酸処理する工程、
（ｂ）前記（ａ）工程で得られた酸処理物をイオン交換カラムで精製する工程、
（ｃ）前記（ｂ）工程で得られた精製物中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンをフェニルイソチオシアネートと反応させてデスモシンおよび／またはイソデスモシンの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）：
【化１３】
2005249493.tif 000014
を式（ＩＩＩ）：
【化１４】
2005249493.tif 000015
で示される基に変換し、さらに前記式（ＩＩＩ）で示される基を式（Ｉ）：
【化１５】
2005249493.tif 000016
で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換する工程、
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られた３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体を測定する工程、および
（ｅ）前記（ｄ）工程で得られた測定値から、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を算出する工程
が挙げられる。
以下、上記した好ましい各工程についてより具体的に説明する。
【００２９】
上記（ａ）工程は、上記試料を酸処理できさえすれば特に限定されず、酸処理に用いられる酸としては、例えば、塩酸（例えば濃塩酸など）、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。処理時間は、通常約１〜７２時間、好ましくは約５〜２４時間である。処理温度は、通常約０〜２００℃、好ましくは約５０〜１５０℃である。この酸処理により、試料中に含まれているタンパク質を分解して、デスモシンおよび／またはイソデスモシンを遊離させることができる。
【００３０】
上記（ｂ）工程は、前記（ａ）工程で得られた酸処理物をイオン交換カラムで精製できさえすれば特に限定されず、公知の手段であってよいが、とりわけ陽イオン交換カラムを用いて精製するのが好ましい。溶出溶媒は、単一溶媒であってもよいし、混合溶媒であってもよい。例えば弱アルカリ性の溶媒と低級アルコールとの混合溶媒などが挙げられ、より具体的には、アンモニア水／メタノールなどが挙げられる。この精製処理により、酸処理物中に含まれるタンパク質分解物等を除去することができる。
【００３１】
上記（ｃ）工程は、前記（ｂ）工程で得られた精製物中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンをフェニルイソチオシアネートと反応させてデスモシンおよび／またはイソデスモシンの分子内に存在する部分構造式（ＩＩ）を式（ＩＩＩ）で示される基に変換し、さらに生成物を酸処理して前記式（ＩＩＩ）で示される基を式（Ｉ）で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換することにより好適に実施できる。上記反応を式で示せば次の通りである。
【化１６】
2005249493.tif 000017
【化１７】
2005249493.tif 000018
【００３２】
上記反応の第１工程で使用するフェニルイソチオシアネートの使用量は、特に限定されないが、通常試料１ｍｌ当たり、約０．１ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌ、好ましくは約０．２ｍｍｏｌ〜１ｍｍｏｌが好ましい。第１工程の反応温度は、通常、約２０℃〜１００℃であり、好ましくは約４０℃〜６０℃である。反応時間は、通常、約１秒〜１日間であり、好ましくは約２０分〜１時間である。第１工程には溶媒を用いるのが好ましく、反応を阻害しない溶媒であればどのようなものでもよい。溶媒の具体例としては、例えば、水、アルコール（例えばメタノール、エタノール等）、テトラヒドロフラン、エーテル、ベンゼン、キシレン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。第１工程は、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、メチルリチウム、ｎ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチルリチウム、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、フェニルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、ナトリウムメトキシド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド、炭酸カリウム等の塩基存在下で好適に行われ得る。これら塩基の使用量は、特に限定されないが、通常試料１ｍｌ当たり、約０．１ｍｍｏｌ〜３０ｍｍｏｌ、好ましくは約０．５ｍｍｏｌ〜３ｍｍｏｌが好ましい。反応終了後、反応成積体を濃縮、転溶、抽出、結晶化、遠心分離、クロマトグラフィーなどの精製手段に付して精製してもよいし、そのまま第２工程を行ってもよい。
【００３３】
上記反応の第２工程に使用する酸としては、無機酸、有機酸等が挙げられる。無機酸としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、テトラフルオロホウ酸、過塩素酸、過ヨウ素酸等挙げられる。有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、吉草酸、ヘキサン酸、クエン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、サリチル酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、フタル酸、酒石酸、リンゴ酸、グリコール酸等のカルボン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸等のスルホン酸等が挙げられる。これら酸は、夫々単独で用いても、２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。酸の使用量は、通常試料１ｍｌ当たり、約０．１ｍｍｏｌ〜３０ｍｍｏｌ、好ましくは約１ｍｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌが好ましい。
【００３４】
第２工程における反応温度は、通常、約２０℃〜１００℃であり、好ましくは約４０℃〜６０℃である。反応時間は、通常、約１秒〜１日間であり、好ましくは約２０分〜１時間である。反応には溶媒を用いるのが好ましく、反応を阻害しない溶媒であればどのようなものでもよい。溶媒としては、例えば上記第１工程で用いられる溶媒と同じものが挙げられる。反応終了後、反応成積体を濃縮、転溶、抽出、結晶化、遠心分離、クロマトグラフィーなどの精製手段により精製してもよいし、そのまま上記（ｄ）工程に付してもよい。
【００３５】
上記（ｄ）工程は、前記（ｃ）工程で生成した３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体を測定できさえすれば特に限定されないが、通常、液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法で実施することができる。かかる方法の具体例としては、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（例えばＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ等）法または液体クロマトグラフィー・質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法などが挙げられる。
これらのうち、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析法を用いるのが好ましい。この場合、上記（ｃ）工程で得られた処理液を液体クロマトグラフィーで各成分を分離する際、カラムを冷却（好ましくは、０℃〜５℃に冷却）し、移動相としてアセトニトリルと０．０１〜０．１％トリフルオロ酢酸水溶液との混合溶液を用いて実施するのが好ましい。移動相のアセトニトリルと０．０１〜０．１％トリフルオロ酢酸水溶液との混合比率は、４０：６０〜５０：５０であるのが好ましい。ただし、上記分離条件は処理される試料により変動し、特に限定されない。
ついで、液体クロマトグラフィーで分離・溶出された成分をタンデム質量分析装置のイオン化室に導入してイオン化し、第一段目の質量分析計（ＭＳ）でイオンを選択し、ついでアルゴン等を衝突させてイオンを解離させ新しいイオン群を発生させ、この新しいイオン群を第２段目の質量分析計（ＭＳ）で分析することにより実施することができる。質量分析計は、二重収束磁場型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、四重極型質量分析計などが用いられる。
【００３６】
上記（ｅ）工程は、前記（ｄ）工程で得られた測定値から、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を算出できさえすれば特に限定されない。本工程に用いられる濃度の算出手段としては、例えばデスモシン及び／又はイソデスモシンの標準溶液を用いて作成した検量線を用いて行う手段等が挙げられる。検量線は内部標準物質を用いて作成された検量線であるのが好ましく、具体的には、標準溶液に内部標準物質を添加した試料を用いて、上記工程（ａ）〜工程（ｄ）を実施して得られる測定値から作成される。上記内部標準物質としては、例えば安定同位体（例えば安定同位炭素）標識したアミノ酸、またはアセチルピリジノリンなどが挙げられるが、とりわけ、安定同位体標識したバリンであるのが好ましい。なお、内部標準物質として安定同位体（例えば安定同位炭素）標識したアミノ酸（例えばバリン）を用いるときは、該アミノ酸の部分構造式：―ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨも前記した式（Ｉ）で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換される。したがって、内部標準物質であるアミノ酸も３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル変換体の形で測定されることになる。
また、本工程において用いる検量線は、真度が定量下限濃度において±２０％以内であり、その他の濃度において±１５％以内であり、かつ相関係数が０．９９以上である検量線を用いるのが好ましい。検量線を作成するに際しては、上記標準溶液に内部標準物質を添加した溶液を用いることにより検量線の信頼性を向上させることができる。内部標準物質としては、たとえば、前記したものと同一のものを使用することができ、とりわけ、安定同位体（例えば安定同位炭素）標識したアミノ酸（例えばバリン）であるのが好ましい。さらに、安定同位体（例えば安定同位炭素）標識したデスモシンおよびイソデスモシンがより好ましい。内部標準物質を用いた場合には、たとえば、試料中のデスモシンまたはイソデスモシンの面積ピークと内部標準物質の面積ピークとの比を求め、この比をグラフ上にプロットすることにより信頼性の高い検量線を作成することができる。また、標準物質を健常人の試料に溶解した標準溶液を用いることにより、健常人の試料中に存在するデスモシンおよび／またはイソデスモシンの内因性含量の影響を除くことができる。すなわち、かかる検量線を用いることにより、患者における疾病に起因するデスモシンおよび／またはイソデスモシンの増加量を直接算出できるので、好都合である。また、標準物質を生理食塩液に溶解して調製した標準溶液を用いることによって、健常人の試料に含まれる内因性デスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度以下の濃度域においても定量的に定量することもできる。上記定量下限濃度は、検量線作成のために用いる標準物質を添加した試料のうち、試料中の標準物質の濃度の一番薄い濃度を意味する。上記真度は、定量値の平均から添加濃度を減じた値を添加濃度で除することで算出される。上記相関係数は、例えば表計算ソフト「マイクロソフトエクセル９７」を用いて算出できる。
【００３７】
本発明においては、上記（ｄ）工程で、液体クロマトグラフィーと質量分析法との組み合わせからなる方法を採用した場合、上記（ｅ）工程で得られたデスモシンおよび／またはイソデスモシンの測定値の同時再現性および／または日差再現性における精度が、１５％以下である範囲とすることができる。同時再現性および日差再現性における精度は、例えば下記実施例において測定した手段を用いて測定することができる。
【００３８】
また、本発明においては、上記（ｅ）工程の後にさらに、工程（ｅ）で算出されたデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度を、健常人から採取した試料を用い、上記工程（ａ）〜工程（ｅ）と同様に実施して算出されるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの濃度と比較する工程を設けることで、呼吸器疾患を検査することができる。具体的には、本発明の定量方法を用いて、呼吸器疾患を伴うあるいは疑いのある患者の尿、喀痰、血液、血漿、または血清中のデスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度を測定し、一定濃度以上のデスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度を有する患者の病態を評価することができる。病態とは、肺組織の障害の程度あるいはその障害に伴う呼吸器機能（呼気最大流量（ＰＥＦ値）、強制呼出１秒量（ＦＥＶ１）など）の低下の程度を示すもので、呼吸器疾患において共通のものとして評価することができる。複数からなる健常人および呼吸器疾患患者から採取した試料中のデスモシンまたはイソデスモシン濃度の測定値から、両群の該測定値から統計的に有意な差異を生じる濃度域を決定して、該濃度域以上であれば羅患の可能性を診断することができる。また、該濃度域の決定は、個別の呼吸器疾患ごとに決定することができる。
また、病態の進行とデスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度の解析により、呼吸器疾患の進行程度を評価することができる。病態進行度の様々な複数からなる呼吸器疾患患者から採取した試料中のデスモシンまたはイソデスモシン濃度の測定値を統計的に処理することにより、呼吸器疾患の病態進行度と該濃度の相関を決定することができ、該濃度を測定することで、呼吸器疾患の病態進行度を診断することができる。同様に、相関の決定は個別の呼吸器疾患ごとに行うことができる。
上記解析においては、その他の組織障害パラメータ、例えばγ−ＧＴＰ、クレアチニン等により任意に補正することができる。かかる検査は、呼吸器疾患の診断法となり得るほか、エラスターゼ阻害薬の投与により呼吸器疾患の改善が期待できる患者を選択するための検査にもなり得る。
デスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度の高い呼吸器疾患患者は、肺中のエラスターゼ活性が亢進していると考えられ、肺組織障害または肺機能低下におけるエラスターゼの関与が大きいと疑われている。従って、そのような患者に対して、エラスターゼ阻害薬の投与は、より有効的な治療方法となる。
具体的には、エラスターゼ阻害薬の投与により呼吸器疾患が改善した複数の患者から採取した投与前後のデスモシンまたはイソデスモシン濃度の測定値を統計的に処理することによって、該阻害薬の投与により呼吸器疾患の改善が期待できる該濃度域を決定し、改善が期待できる患者を選択することができる。
【００３９】
上記呼吸器疾患としては、例えば下気道疾患または下気道疾患に起因する多臓器障害等が挙げられ、前記下気道疾患としては、例えば、全身性炎症反応症候群に伴う急性肺障害、全身性炎症反応症候群、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、慢性気管支炎、肺炎、急性呼吸窮迫症候群、喘息、急性肺障害、突発性肺線維症、肺炎、肺水腫、肺閉塞性疾患、エンドトキシン誘発性肺損傷および非細胞肺癌から選択される１以上の疾患が挙げられる。
本発明においては、上記呼吸器疾患が、エラスターゼ活性の亢進に起因する呼吸器疾患であるのが好ましい。また、上記疾患以外にエラスターゼ活性の亢進に起因する疾患においても使用することができる。
【００４０】
上記エラスターゼ阻害薬としては、例えば、
１）シベレスタットナトリウムまたはその水和物、
２）２−［３−［［Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［Ｎ−［（１Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１−（メチルエチル）−２−オキソプロピル］カルバモイル］ピロリジニル］−１−（メチルエチル）−２−オキソエチル］カルバモイル］メチル］−２−オキソイミダゾリジニル］酢酸（ＡＥ−３７６３）、
３）Ｓ−［１−メチル−２−オキソ−２−［テトラハイドロ−２−オキソ−３−チエニル］アミノ］エチル］−２−チオフェンカルボチオ酸エステル（ｍｅｄｅｓｔｅｉｎｅ）、
４）ＰＢＩ−１１０１、または
５）４−［７’’（Ｓ）−メトキシ−３’’−メチル−８’’−オキソジスピロ［シクロペンタン−１，１’−シクロプロパン−２，４’’−［５−チア［１］アザビシクロ［４．２．１］オクト［２］エン］−２’’−イルカルボニル］−１−ピペラジン酢酸ナトリウム塩  Ｓ，Ｓ−ジオキシド（ＳＹＮ−１３９０／ＳＹＮ−１３９６）等が挙げられるが、中でも、シベレスタットナトリウム水和物を有効成分として含むものが好ましい。
【００４１】
また、上記したようにデスモシンおよび／またはイソデスモシンの定量方法によって、呼吸器疾患改善化合物をスクリーニングすることができる。スクリーニング方法は、試験化合物を投与した呼吸器疾患動物モデルから採取した試料を用い、上記定量方法により該試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量し、試験化合物の投与によるデスモシンおよび／またはイソデスモシンの変動を検定することにより行われる。具体的には、呼吸器疾患動物モデル（例えば、タバコ暴露モデル、ＬＰＳもしくは起炎物質惹起モデル、エラスターゼ投与モデル、ブレオマイシン投与モデル、または塩酸惹起モデルなど）に経口あるいは非経口的に試験化合物またはその溶媒の投与後一定期間の尿、気管支肺胞洗浄液、血液、血漿、血清、肺組織、または気管支組織中のデスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度を測定し、対照溶媒群のデスモシンおよび／またはイソデスモシン濃度に対する試験化合物投与群の濃度の比から、試験化合物の呼吸器疾患に対する改善作用を評価できる。このような検定を行うことにより、デスモシンおよび／またはイソデスモシンの量を減少させる物質、すなわち呼吸器疾患改善化合物を見出すことができる。従って、本発明のスクリーニング方法は、呼吸器疾患治療薬の創製に極めて有用である。
呼吸器疾患改善化合物とは、エラスターゼ阻害化合物に限られず、呼吸器疾患に対して改善が期待できる化合物をも含む。
【００４２】
呼吸器疾患改善化合物をスクリーニングするために用いる試験化合物は、いかなる化学物質であってもよい。合成化合物であってもよいし、天然物由来のもの（例えば、天然物の抽出物、培養物など）であってもよい。
【００４３】
本発明は、デスモシンおよび／またはイソデスモシン定量キットをも提供する。前記キットは、（ａ）デスモシンおよび／またはイソデスモシンである標準物質、あるいはその水溶液、
（ｂ）内部標準物質またはその水溶液、
（ｃ）前処理用イオン交換カラムおよびその洗浄液、ならびに
（ｄ）フェニルイソチオシアネート反応液およびフェニルチオヒダントイン化反応液
を具備する。このキットにおいて、フェニルイソチオシアネート反応液とは、フェニルイソチオシアネート或いはこれと塩基とを含有する溶液をいい、フェニルチオヒダントイン化反応液とは、上記式（ＩＩＩ）で示される基を上記式（Ｉ）で示される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換するための酸溶液（例えば前記した酸の溶液）をいう。前記キットの利用法としては、（ａ）所定量のデスモシンおよび／またはイソデスモシン（標準物質）、あるいはその水溶液（例えば、健常人から採取された対照となる試料または生理食塩液に溶解させた水溶液）に、（ｂ）内部標準物質またはその水溶液、及び必要により試料を添加し、ついで、（ｃ）前処理用イオン交換カラムおよびその洗浄液を用いて前処理を行い、その後、（ｄ）フェニルイソチオシアネート反応液およびフェニルチオヒダントイン化反応液を用いて、上記部分構造式（ＩＩ）を上記式（Ｉ）で表される３−フェニル−２−チオヒダントイン−５−イル基に変換し、この変換体を測定して、まず検量線を作成する。一方、上記（ａ）の代わりに試料を用いて同様の操作を行い、測定値を検量線にあてはめることにより、試料中のデスモシンおよび／またはイソデスモシンを定量することができる。
【実施例１】
【００４４】
（ヒト尿の添加検量線の作成）
（Ａ）混合標準溶液の調製
デスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。また、イソデスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してイソデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を得た。
上記で得たデスモシン標準原液及びイソデスモシン標準原液からそれぞれ０．１ｍＬずつ分取し、水を加えて正確に１０ｍＬとした（ＤＥＳ及びＩＤＥの各濃度：１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）。この混合液を５つ用意し、それぞれに水を加えて希釈し、デスモシン及びイソデスモシンの各濃度が５００、２００、１００、４０および２０ｐｍｏｌ／ｍＬの混合標準溶液をそれぞれ調製した。
【００４５】
（Ｂ）内部標準溶液の調製
Ｌ−バリン−１３Ｃ５（分子量１２２）（以下、内部標準物質またはＩ．Ｓ．ともいう）６．１０ｍｇを精密に量り取り、少量の水で溶解後、水で正確に１０ｍＬとして内部標準原液（Ｉ．Ｓ．濃度：５μｍｏｌ／ｍＬ）。この内部標準原液を水で正確に希釈し、Ｉ．Ｓ．濃度が２０００ｐｍｏｌ／ｍＬの内部標準溶液を調製した。
【００４６】
（Ｃ）混合標準溶液添加ヒト尿の調製
下記表１に示す濃度の混合標準溶液５０μＬをそれぞれヒト尿（健常な２８才の男性Ｓ．Ｋより採取したもの）１００μＬに添加し、十分に混和して、混合標準溶液添加ヒト尿とした。
【００４７】
【表１】
2005249493.tif 000019
【００４８】
（Ｄ）前処理試料の調製
１）ヒト尿の前処理用試料の調製
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社製）に上記調製した混合標準溶液添加ヒト尿約１００μＬを分取し、上記調製した内部標準溶液（Ｉ．Ｓ．濃度：２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬおよび水５０μＬを加えてミキサーで約１０秒間撹拌した。混合物に濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間撹拌し、９２℃で１５時間以上インキュベートし、ヒト尿の添加検量線試料とした。
【００４９】
２）注入試料の調製（前処理操作）
上記１）で調製したヒト尿添加検量線試料に水３ｍＬを添加してミキサーで約１０秒間攪拌した後、５℃で２分間遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．）した。陽イオン交換カラム［Ｏａｓｉｓ（登録商標）ＭＣＸカラム、Ｗａｓｔｅｒｓ社製、６０ｍｇ／３ｍＬ］に上清を負荷し、カラム内を水２ｍＬで洗浄した後、２５％アンモニア水／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）２ｍＬで、目的物質を１２ｍＬ容ポリエチレン製チューブに溶出した。これらの固相抽出操作は、すべて遠心操作（１０００ｒ．ｐ．ｍ．、２分、５℃）により行った。溶出液を窒素気流下６０℃で蒸発乾固した後、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）反応液（エタノール３．２ｍＬ、トリエチルアミン０．８ｍＬ及び水０．８ｍＬを混合し、使用直前にイソチオシアン酸フェニル０．４ｍＬを混合して調製した）２００μＬを加えてミキサーで約１０秒間攪拌し、５０℃で３０分間インキュベートした。反応後、水２００μＬを加えてジエチルエーテル４００μＬを添加し、振盪（水平方向、５ｍｉｎ）および遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．、２分、５℃）した。有機層を取り除いた後、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）化反応液（６ｍｏｌ／Ｌ塩酸６ｍＬとメタノール６ｍＬを混合して調製した）４００μＬを加えてミキサーで約１０秒間攪拌し、５０℃で３０分間インキュベートした。反応後、反応液に水５００μＬを加え、さらに酢酸エチル３ｍＬを添加して振盪（水平方向、５分）および遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．、２分、５℃）した。有機層を１２ｍＬ容ポリエチレン製チューブ（ヌンクミニソープチューブ、日本インターメット株式会社製）に分取し、残った水層に酢酸エチル３ｍＬを添加して、再度、振盪（水平方向、５分）および遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．、２分、５℃）した。有機層を分取して、先に分取した有機層と合わせ、窒素気流下５０℃で蒸発乾固した。残渣にアセトニトリル／水（４：６、ｖ／ｖ）２００μＬを加え、ミキサーで約１０秒間攪拌し、遠心濾過フィルター（セントリカット超ミニＷ−ＭＯ型（０．４５μｍ）、倉敷紡績株式会社製）を用いて遠心濾過（１００００ｒ．ｐ．ｍ．、２分）し、濾液を前処理試料（注入試料）とし、下記する条件の下で、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析を実施した。
【００５０】
（Ｅ）液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析
１）液体クロマトグラフ装置
HPLCシステム：Agilent  1100  Series      Agilent  Technologies社
２）液体クロマトグラフ測定条件
カラム    ：Symmetry shieldTM  RP18、3.5μｍ、2.1mm I.D.×150mm L.  Waters社
移動相    ：アセトニトリル／0.02%トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液（44：56）
流量      ：0.16mL/分
カラム温度：氷冷（1〜3℃）
注入量    ：25μL
【００５１】
３）質量分析計装置
装置：API 3000  Applied Biosystems/MDS SCIEX社
【００５２】
４）質量分析計測定条件
インターフェース      ：Turbo Ionspray
イオンスプレー電圧    ：4500V
ターボプローブ温度    ：425℃
Declustering Potential：DES-PTHおよびIDE-PTH   80V
L-バリン-13C5-PTH      28V
Focusing Potential    ：130V
Entrance Potential    ：−10V
ネブライザーガス流量  ：設定値 12、空気
カーテンガス流量      ：設定値 14、窒素
コリジョンガス圧      ：設定値   4、窒素
ヒーターガス流量      ：7 L/分、窒素
イオン検出モード      ：MS/MS、MRM  mode、Positive  ion  detection  mode
モニターイオンおよびコリジョンエネルギー：
DES-PTHおよびIDE-PTH    m/z  994.2  →    m/z  84.0      100eV
L-バリン-13C5-PTH       m/z  239.7  →    m/z  76.0       28eV
【００５３】
（Ｆ）ヒト尿の添加検量線の作成
上記液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析で得られたヒト尿の添加検量線試料のピーク面積比（標準物質のピーク面積／Ｉ．Ｓ．のピーク面積）をＹ、添加濃度をＸとし、パーソナルコンピューター用ソフト「臨床試験データ分析システム  ＷＤＰ３２  ｖｅｒ．２．０」を用いて最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ；１／Ｙで重み付け）を算出して、検量線（ヒト尿の添加検量線）を作成した。ヒト尿の添加検量線を図１（デスモシン）および図２（イソデスモシン）に示す。
【実施例２】
【００５４】
（生理食塩液の添加検量線の作成）
（Ａ）混合標準溶液添加生理食塩液の調製
上記実施例１（Ｃ）で用いた混合標準溶液と同じ濃度の混合標準溶液５０μＬをそれぞれ生理食塩液１００μＬに添加し、十分に混和して、混合標準溶液添加生理食塩液とした。
【００５５】
（Ｂ）生理食塩液の添加検量線の作成
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社製）に上記様に調製した混合標準溶液生理食塩液約１００μＬを分取し、上記調製した内部標準溶液（Ｉ．Ｓ濃度：２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬおよび水５０μＬを加えてミキサーで約１０秒間撹拌した。混合物に濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間撹拌し、９２℃で１５時間以上酸処理を行い、生理食塩液の添加検量線試料とした。
試料として生理食塩液の添加検量線試料を用いる以外は、実施例１の（Ｄ）−２と同様にして「前処理操作」を行った後、実施例１の（Ｅ）と同様にして「液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析」を行い、さらに実施例１の（Ｆ）と同様にして検量線（生理食塩液の添加検量線）を作成した。生理食塩液の添加検量線を図３（デスモシン）および図４（イソデスモシン）に示す。
【実施例３】
【００５６】
（生理食塩液の添加検量線の傾きおよびヒト尿の添加検量線の傾きの有意差検定）
実施例１及び実施例２を３回繰り返し行った。得られた添加検量線の傾きを用いて、有意差検定（１元配置分散分析（Ｆ検定））を行った。有意差検定は、表計算ソフト「マイクロソフトエクセル９７」を用いて、１元配置分散分析（Ｆ検定）により行った。添加検量線の傾きの有意差検討において得られたデータを用いて、各平方和、分散、Ｆ値及びＰ値を求め、５％の有意水準により行った。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
2005249493.tif 000020
【００５８】
表２から、生理食塩液とヒト尿間においては、デスモシンやイソデスモシンの添加検量線の傾きに統計上の差異がないものと判断し、生理食塩液による添加検量線を用いてヒト尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量値を算出することに問題はないものと判断した。
【実施例４】
【００５９】
（A）混合標準溶液添加生理食塩液の調製
下記表３に示す濃度の混合標準溶液５０μＬをそれぞれ生理食塩液１００μＬに添加し、十分に混和して、混合標準溶液添加検量生理食塩液とした。
【００６０】
【表３】
2005249493.tif 000021
【００６１】
（Ｂ）生理食塩液の添加検量線の作成
実施例２（Ｂ）に記載の方法と同様にして調整したものを、生理食塩液の添加検量線試料とし、（Ｂ）記載の後段と同様にして検量線を作成した。この検量線につき、傾き、相関係数および各ポイントの真度（％）を求めた。デスモシンについての結果を表４に示し、イソデスモシンについての結果を表５に示す。
【００６２】
【表４】
2005249493.tif 000022
【００６３】
【表５】
2005249493.tif 000023
これらの結果から、混合標準溶液添加検量生理食塩液を使用した定量方法においては、デスモシンおよびイソデスモシンともに、１〜１００ｐｍｏｌ／ｍＬの定量範囲で良好な直線性を示すと判定した。
【実施例５】
【００６４】
（ヒト尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量）
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社製）にヒト尿（健常な２８才の男性Ｓ．Ｋより採取したもの）約１００μＬを分取し、実施例１と同様にして調製した内部標準溶液（Ｉ．Ｓ．濃度：２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬおよび水５０μＬを加えてミキサーで約１０秒間撹拌した。混合物に濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間撹拌し、９２℃で１５時間以上インキュベートし、これを前処理用試料とした。
上記前処理用試料を実施例１の（Ｄ）−２と同様にして「前処理操作」を行った後、実施例１の（Ｅ）と同様にして「液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析」を行った。得られたデスモシンまたはイソデスモシンとＩ．Ｓ．とのピーク面積比を、実施例１で得られたヒト尿の添加検量線のＹ切片をゼロとなるようにした式、つまりＹ切片を除した式に代入して、ヒト尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの内因性含量（単位：ｐｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。結果を表６に示す。なお、表６中の内因性含量は、小数第２位を四捨五入して小数第１位まで表示した。
【００６５】
【表６】
2005249493.tif 000024
【実施例６】
【００６６】
（検量線の相関係数および真度）
実施例１と同様の操作をさらに２回行った（全部で３回）。その結果から、検量線の傾き、相関係数および各ポイントの真度（％）を求めた。デスモシンについての結果を表７に示し、イソデスモシンについての結果を表８に示す。なお、検量線の各ポイントの真度は、「臨床試験データ分析システム  ＷＤＰ３２  ｖｅｒ．２．０」を用いて算出した。
【００６７】
【表７】
2005249493.tif 000025
【００６８】
【表８】
2005249493.tif 000026
表７および８に示す結果から、ＳＴＤ．１（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）の３回の測定結果の平均真度が約１０％であることから、本発明の定量方法は、定量限界として約０．１ｐｍｏｌ／ｍＬのデスモシンおよびイソデスモシンを測定できることが示唆された。
【実施例７】
【００６９】
（同時再現性試験）
健常な２９才の男性Ｓ．Ｋ．より採取したヒト尿を用いて、実施例１と同様にして、検量線の作成およびヒト尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量を５回繰り返し行った。得られた定量値から、定量値の平均値、標準偏差、精度を求めた。なお、精度は表計算ソフト「マイクロソフトエクセル」を用いて、定量値の標準偏差を平均値で除することで算出した。デスモシンについての結果を表９に示し、イソデスモシンについての結果を表１０に示す。
【００７０】
【表９】
2005249493.tif 000027
【００７１】
【表１０】
2005249493.tif 000028
上記表９および１０から、デスモシンにおける精度が３．４％、イソデスモシンにおける精度が４．３％であることが分かる。
【実施例８】
【００７２】
（日差再現性試験）
実施例７を実施してから、７日及び１４日経過後に実施例７と同様の操作を行った。得られた測定値から、実施例７と同様にして、定量値の平均値、標準偏差および精度を求めた。デスモシンについての結果を表１１に示し、イソデスモシンについての結果を表１２に示す。
【００７３】
【表１１】
2005249493.tif 000029
【００７４】
【表１２】
2005249493.tif 000030
上記表１１および１２から、デスモシンにおける精度が６．７％、イソデスモシンにおける精度が７．６％であったことが分かる。
【実施例９】
【００７５】
（ハムスター尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量）
［生理食塩液の添加検量線の作成］
（Ａ）混合標準溶液の調製
デスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。また、イソデスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してイソデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を得た。
上記で得たデスモシン標準原液及びイソデスモシン標準原液からそれぞれ０．１ｍＬずつ分取し、水を加えて正確に１０ｍＬとした（ＤＥＳ及びＩＤＥの各濃度：１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）。この混合液を７つ用意し、それぞれに水を加えて希釈し、デスモシン及びイソデスモシンの各濃度が２００、１００、４０、２０、１０、４および２ｐｍｏｌ／ｍＬの混合標準溶液をそれぞれ調製した。
【００７６】
（Ｂ）内部標準溶液の調製
内部標準物質であるＬ−バリン−１３Ｃ５（分子量１２２）６．１０ｍｇを精密に量り取り、少量の水で溶解後、水で正確に１０ｍＬとして内部標準原液（５μｍｏｌ／ｍＬ）。この内部標準原液を水で正確に希釈し、Ｉ．Ｓ．濃度が２０００ｐｍｏｌ／ｍＬの内部標準溶液を調製した。
【００７７】
（Ｃ）混合標準溶液添加生理食塩液の調製
下記表１３に示す濃度の混合標準溶液５０μＬをそれぞれ生理食塩液１００μＬに添加し、十分に混和して、混合標準溶液添加生理食塩液とした。
【００７８】
【表１３】
2005249493.tif 000031
【００７９】
（Ｄ）前処理試料の調製
上記（Ｂ）および（Ｃ）で調製した内部標準溶液および混合標準溶液添加生理食塩液を用いたこと以外は、実施例１（Ｄ）と同様にして、前処理試料（注入試料）を調製した。得られた前処理試料（注入試料）を用いて、下記する条件の下で、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析を実施した。
（液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析）
（Ａ）  液体クロマトグラフ装置
HPLCシステム：Agilent  1100  Series    Agilent  Technologies社
（Ｂ）  液体クロマトグラフ測定条件
カラム    ：Symmetry shieldTM  RP18、3.5μｍ、2.1mm I.D.×150mm L.  Waters社
移動相    ：アセトニトリル／0.02%トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液（41.5：58.5）
流量      ：0.16mL/min
カラム温度：氷冷（1〜3℃）
注入量    ：25μL
オートサンプラー温度：  10℃
タイムプログラム    ：  0  min  Valve  ON
9  min  Valve  OFF（溶出液を質量分析計へ導入）
18.5  min  Valve  ON
保持時間            ：  DES-PTH      約12  min
IDE-PTH      約13  min
I.S.-PTH     約15  min
【００８０】
（Ｃ）  質量分析計装置
装置：API  3000  Applied  Biosystems/MDS  SCIEX社
【００８１】
（Ｄ）  質量分析計測定条件
インターフェース      ：Turbo  Ionspray
イオンスプレー電圧    ：5500V
ターボプローブ温度    ：425℃
Declustering  Potential：DES-PTHおよびIDE-PTH    80V
L-バリン-13C5-PTH       28V
Focusing  Potential    ：130V
Entrance  Potential    ：−10V
ネブライザーガス流量  ：設定値  12、空気
カーテンガス流量      ：設定値  14、窒素
コリジョンガス圧      ：設定値  12、窒素
ヒーターガス流量      ：7L/min、窒素
イオン検出モード      ：MS/MS、MRM  mode、Positive  ion  detection  mode
モニターイオンおよびコリジョンエネルギー：
DES-PTHおよびIDE-PTH    m/z  994.2  →    m/z  84.0      100eV
I.S.-PTH                m/z  239.7  →    m/z  76.0      28eV
【００８２】
上記液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析で得られた生理食塩液の添加検量線試料のピーク面積比（標準物質のピーク面積／Ｉ．Ｓ．のピーク面積）をＹ、添加濃度をＸとし、パーソナルコンピューター用ソフト「臨床試験データ分析システム  ＷＤＰ３２  ｖｅｒ．２．０」を用いて最小二乗法により一次回帰式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ；１／Ｙで重み付け）を算出して、添加検量線（生理食塩液の添加検量線）を作成した。デスモシンについての生理食塩液の添加検量線を図５に示し、イソデスモシンについての生理食塩液の添加検量線を図６に示す。
【実施例１０】
【００８３】
１）１０倍希釈ハムスター尿の調製
ハムスター尿（動物番号０３０２０３−０１）１３０μＬを１．５ｍＬ容ポリプロピレン製チューブに分取し、遠心分離（１５０００ｒ．ｐ．ｍ．、２ｍｉｎ、５℃）した。その上清１００μＬを１２ｍＬ容ポリエチレン製チューブに分取し、水９００μＬを加えてミキサーにて約１０秒間撹拌して１０倍に希釈した（１０倍希釈ハムスター尿）。
【００８４】
２）１０倍希釈ハムスター尿の酸処理
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社製）に１０倍希釈ハムスター尿約１００μＬをそれぞれ分取し、上記で調製したＩ．Ｓ．溶液（２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬおよび水５０μＬを加えてミキサーで約１０秒間撹拌した。濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間撹拌し、９２℃で１５時間以上インキュベートし、これを試料とした。
【００８５】
３）ハムスター尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量
上記２）で得た試料を用いる以外は、実施例９（Ｄ）と同様にして前処理試料（注入試料）を調製し、ついで、実施例９と同様の条件で「液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析」を行った。
得られた試料のデスモシンまたはイソデスモシンとＩ．Ｓ．とのピーク面積比を、上記ハムスター尿添加検量線のＹ切片をゼロとなるようにした式、つまりＹ切片を除した式に代入して、得られた値を１０倍してハムスター尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの内因性含量（単位：ｐｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。結果を表１４に示す。なお、表中の定量値は、小数第２位を四捨五入して小数第１位まで表示した。
【００８６】
【表１４】
2005249493.tif 000032
【実施例１１】
【００８７】
（生理食塩液の添加検量線の傾きおよびハムスター尿の添加検量線の傾きの有意差検定）
実施例９及び実施例１０を３回繰り返し行った。得られた添加検量線の傾きを用いて、有意差検定（１元配置分散分析（Ｆ検定））を行った。有意差検定は、表計算ソフト「マイクロソフトエクセル９７」を用いて、１元配置分散分析（Ｆ検定）により行った。添加検量線の傾きの有意差検討において得られたデータを用いて、各平方和、分散、Ｆ値及びＰ値を求め、５％の有意水準により行った。デスモシンについての結果を表１５に示し、イソデスモシンについての結果を表１６に示す。
【００８８】
【表１５】
2005249493.tif 000033
【００８９】
【表１６】
2005249493.tif 000034
【００９０】
生理食塩液とハムスター尿間においては、デスモシンおよびイソデスモシンの添加検量線の傾きには統計的に差異がないものと判断し、生理食塩液による添加検量線を用いてヒト尿中のデスモシンおよびイソデスモシンの定量値を算出することに問題はないものと判断した。
【実施例１２】
【００９１】
（検量線の相関係数および真度）
上記実施例９の検量線について、検量線の傾き、相関係数および各ポイントの真度（％）を求めた。デスモシンについての結果を表１７に示し、イソデスモシンについての結果を表１８に示す。なお、検量線の各ポイントの真度は、「臨床試験データ分析システム  ＷＤＰ３２  ｖｅｒ．２．０」を用いて算出した。
【００９２】
【表１７】
2005249493.tif 000035
【００９３】
【表１８】
2005249493.tif 000036
上記表１７および１８から、各ポイントの真度が１０％未満であることが分かる。
【実施例１３】
【００９４】
（同時再現性）
３匹のハムスター（動物番号：０３０２０３−０７、０３０２０３−１０および０３０２０３−１２）を用い、実施例９と同様にして尿中のデスモシンおよぼイソデスモシンを定量した。この定量値から、ハムスターの個体ごとの定量値の平均値、標準偏差および精度を求めた。なお、精度は、表計算ソフト「マイクロソフトエクセル」を用いて、定量値の標準偏差を平均値で除することで算出した。デスモシンについての結果を表１９に示し、イソデスモシンについての結果を表２０に示す。
【００９５】
【表１９】
2005249493.tif 000037
【００９６】
【表２０】
2005249493.tif 000038
【実施例１４】
【００９７】
（日差再現性試験）
ハムスター（動物番号０３０２０３−１０）を用い、前記実施例１３を実施してから、１４日後および２１日後に、実施例１３と同様にしてハムスター尿中のデスモシンおよびイソデスモシンを定量した。デスモシンについての結果を表２１に示し、イソデスモシンについての結果を表２２に示す。
【００９８】
【表２１】
2005249493.tif 000039
【００９９】
【表２２】
2005249493.tif 000040
【実施例１５】
【０１００】
（Ｉ）ＢＡＬＦ媒体の添加検量線の作成
（Ａ）混合標準溶液の調製
デスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。また、イソデスモシン１μｍｏｌ入りガラスバイアルに水１ｍＬを添加し、混和してイソデスモシン標準原液（１μｍｏｌ／ｍＬ）を得た。
上記で得たデスモシン標準原液及びイソデスモシン標準原液からそれぞれ０．１ｍＬずつ分取し、水を加えて正確に１０ｍＬとした（ＤＥＳ及びＩＤＥの各濃度：１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）。この混合液を７つ用意し、それぞれに水を加えて希釈し、デスモシン及びイソデスモシンの各濃度が４０、２０、１０、４、１、０．４及び０．２ｐｍｏｌ／ｍＬの混合標準溶液をそれぞれ調製した。
【０１０１】
（Ｂ）内部標準溶液の調製
内部標準物質であるＬ−バリン−１３Ｃ５（分子量１２２）６．１０ｍｇを精密に量り取り、少量の水で溶解後、水で正確に１０ｍＬとして内部標準原液（Ｉ．Ｓ．濃度：５μｍｏｌ／ｍＬ）を調製した。この内部標準原液を水で正確に希釈し、Ｉ．Ｓ．濃度が２０００ｐｍｏｌ／ｍＬの内部標準溶液を調製した。
【０１０２】
（Ｃ）混合標準溶液添加ＢＡＬＦ媒体の調製
下記表１８に示す濃度の混合標準溶液５０μＬをそれぞれＢＡＬＦ媒体（輸血用クエン酸ナトリウム注射液５ｍＬと生理食塩液４５ｍＬとを混合したもの）０．５ｍＬに添加し、十分に混和して、混合標準溶液添加ＢＡＬＦ媒体とした。
【０１０３】
【表２３】
2005249493.tif 000041
【０１０４】
（Ｄ）ＢＡＬＦ媒体の添加検量線の作成
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社製）に前記（Ｃ）で調製した混合標準溶液添加ＢＡＬＦ媒体約１００μＬを分取し、上記（Ｂ）で調製した内部標準溶液（Ｉ．Ｓ濃度：２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬおよび水５０μＬを加えてミキサーで約１０秒間撹拌した。混合物に濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間撹拌し、９２℃で１５時間以上酸処理を行い、ＢＡＬＦ媒体の添加検量線試料とした。
【０１０５】
試料としてＢＡＬＦ媒体の添加検量線試料を用いる以外は、実施例１の（Ｄ）−２と同様にして「前処理操作」を行った後、実施例１の（Ｅ）と同様にして「液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析」行い、さらに実施例１の（Ｆ）と同様にして検量線（ＢＡＬＦ媒体の添加検量線）を作成した。ＢＡＬＦ媒体の添加検量線を図７（デスモシン）および図８（イソデスモシン）に示す。
【０１０６】
（ＩＩ）前処理の別法
１５ｍＬ容ポリプロピレン製遠沈管（アサヒテクノグラス株式会社）に前記（Ｃ）で調整した混合標準溶液添加ＢＡＬＦ媒体約５００μＬを分取し、ミキサーで約１０秒間攪拌した。濃塩酸２００μＬを添加して、ミキサーで約１０秒間攪拌し、９２℃で１５時間以上酸処理を行い、ＢＡＬＦ媒体の添加検量線試料とした。
【０１０７】
酸処理を施した上記添加検量線試料に水３ｍＬを添加してミキサーで約１０秒間攪拌した後、５℃で２分間遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．）した。陽イオン交換カラム［ＯＡＳＩＳ（登録商標）ＭＣＸカラム（ウェスターズ（Ｗａｓｔｅｒｓ）社製）、６０ｍｇ／３ｍＬ］に上清を負荷し、カラム内をメタノール／２５％アンモニア水（２００：１ｖ／ｖ）２ｍＬで２度洗浄し、続いて２５％アンモニア水／メタノール（１：１，ｖ／ｖ）２ｍＬで、１２ｍＬ容ポリエチレン製チューブに目的物質を溶出した。これらの固相抽出操作は、すべて遠心操作（１０００ｒ．ｐ．ｍ．，２分，５℃）により行った。溶出液にＩ.Ｓ.溶液（２０００ｐｍｏｌ／ｍＬ）５０μＬを添加して窒素気流下６０℃で蒸発乾固した後、フェニルイソシアネ−ト（ＰＩＴＣ）反応液（実施例１（Ｄ）２記載と同じ。）２００μＬを加えてミキサーで約１０秒間攪拌し、５０℃で３０分間インキュベートした。反応後、水２００μＬを加えて酢酸エチル４００μＬを添加し、振盪（５分）及び遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．，２分，５℃）した。有機層を取り除いた後、ＰＴＨ化（実施例１（Ｄ）２記載と同じ。）反応液４００μＬを加えてミキサーで約１０秒間攪拌し、５０℃で３０分間インキュベートした。反応後、水５００μＬを加え、酢酸エチル３ｍＬを添加して振盪（５分）及び遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．，２分，５℃）した。有機層を１２ｍＬ容ポリエチレン製チューブに分取し、残った水層に酢酸エチル３ｍＬを添加して、再度、振盪（５分）及び遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．，２分，５℃）した。有機層を分取して、先に分取した有機層と合わせ、窒素気流下５０℃で蒸発乾固した。アセトニトリル／水（４：６，ｖ／ｖ）８０μＬを加えてミキサーで約１０秒間攪拌し、遠心濾過フィルターを用いて遠心濾過（１００００ｒ．ｐ．ｍ．，２分）したものを注入試料とし、下記する条件の下で、液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析を実施した。
【０１０８】
（液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析）
（Ａ）  液体クロマトグラフ装置
HPLCシステム：  SIL-HTC及びLC-10AVP  （株）島津製作所
（Ｂ）  液体クロマトグラフ測定条件
カラム：  Discovery（登録商標）HS C18, 3μm, 2.1mmI.D.×150mmL.
シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）
移動相：  アセトニトリル／0.05%トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液
（50：50）
流量  ：  0.16mL/min
カラム温度：  氷冷（1〜3℃）
注入量：      ２０μＬ
オートサンプラー温度：１０℃
タイムプログラム：  0min       Valve  ON
9min       Valve  OFF（溶出液を質量分析計へ導入）
30min      Valve  ON
保持時間：          DES-PTH    約12min
IDE-PTH    約13min
I.S.-PTH   約15min
（Ｃ）質量分析計装置
装置：  API  4000  Applied  Biosystems/MDS  SCIEX社
（Ｄ）質量分析計測定条件
インターフェース：      Turbo  Ionspray  
イオンスプレー電圧：    5500  V
ターボプローブ温度：    600℃
Declustering  Potential：DES-PTH及びIDE-PTH    80  V
I.S.-PTH              60  V
Focusing  Potential：  130  V
Entrance  Potential：  −10  V
ネブライザーガス流量：設定値  40，空気
カーテンガス流量：    設定値  20，窒素
コリジョンガス圧：    設定値  6，窒素
ヒーターガス流量：    設定値  80，窒素
イオン検出モード：    MS/MS，MRM  mode，Positive  ion  detection  mode
モニターイオン及びコリジョンエネルギー：
DES-PTH及びIDE-PTH    m/z  994.2  →  m/z  84.0      110  eV
I.S.-PTH              m/z  239.7  →  m/z  76.0       28  eV
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、生化学的マーカーとして、特に呼吸器疾患の測定マーカーとして利用できるデスモシンまたはイソデスモシンの定量に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】実施例１におけるヒト尿の添加検量線（ＤＥＳ）を示す。
【図２】実施例１におけるヒト尿の添加検量線（ＩＤＥ）を示す。
【図３】実施例２における生理食塩液の添加検量線（ＤＥＳ）を示す。
【図４】実施例２における生理食塩液の添加検量線（ＩＤＥ）を示す。
【図５】実施例９における生理食塩液の添加検量線（ＤＥＳ）を示す。
【図６】実施例９における生理食塩液の添加検量線（ＩＤＥ）を示す。
【図７】実施例１５におけるＢＡＬＦ媒体の添加検量線（ＤＥＳ）を示す。
【図８】実施例１５におけるＢＡＬＦ媒体の添加検量線（ＩＤＥ）を示す。
【図１】
2005249493.tif 000049
【図２】
2005249493.tif 000050
【図３】
2005249493.tif 000051
【図４】
2005249493.tif 000052
【図５】
2005249493.tif 000053
【図６】
2005249493.tif 000054
【図７】
2005249493.tif 000055
【図８】
2005249493.tif 000056