(57)【要約】【課題】生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の再溶解時白濁及び製造時容器破損等の懸念事項のない、生理活性蛋白質例えばIL-11を含有してなる安定な凍結乾燥製剤の製造における改良を提供することにある。【解決手段】生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の種々の問題のうち特に再溶解時の白濁の問題、つまり再構成時の溶解性（濁度）を支配しているのは、溶解後の溶液中の構造変化だけではなく、製剤固体（凍結乾燥ケーキ）の物性であることを見出した。そして、凍結工程における緩衝剤の結晶化を促進すれば、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の再溶解時白濁の問題が解決されること、製剤の安定性に効果のあること、製造容器破損問題等も解決しうることを見出し、本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性蛋白質及び緩衝剤を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造工程において、緩衝剤を結晶化させる手段を含むことを特徴とする凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
【請求項２】
緩衝剤を結晶化させる手段が、凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すことを特徴とする請求項１の再溶解時白濁防止方法。
【請求項３】
生理活性蛋白質が塩基性である請求項１または２に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
【請求項４】
生理活性蛋白質がインターロイキン１１である請求項３に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
【請求項５】
緩衝剤がリン酸ナトリウムおよび／またはヒスチジンである請求項１乃至４に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
【請求項６】
生理活性蛋白質及び緩衝剤を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造工程において、緩衝剤を結晶化させる手段を含むことを特徴とする凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
【請求項７】
緩衝剤を結晶化させる手段が、凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すことを特徴とする請求項６記載のアンプル破損回避方法。
【請求項８】
生理活性蛋白質が塩基性である請求項６または７に記載の凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
【請求項９】
生理活性蛋白質がインターロイキン１１である請求項８に記載の凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
【請求項１０】
緩衝剤がリン酸ナトリウムおよび／またはヒスチジンである請求項６乃至９に記載の凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか1項に記載の方法を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１の製造方法によって調製された生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の白濁防止方法及びアンプル破損回避方法、並びに再溶解時の白濁防止（アンプル破損回避）が達成された生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤及びその製造方法に関する。より詳しくは、インターロイキン−１１（以下IL-11と記す）のような塩基性蛋白質の上記改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
生理活性蛋白質は、医薬品として様々の場で利用されており、各種インターフェロン、造血因子、TPA、ウロキナーゼ、各種CSF、各種インターロイキン（IL）類がある。これらが非経口的に投与される場合、製剤は投与時液剤化されるのが一般的である。生理活性蛋白質は保存安定性に乏しく、液状製剤化することは多々困難が存在している。一般的には、調製された製剤は凍結乾燥され、用時溶解液で液状化され非経口投与がなされる。
凍結乾燥製剤では、種々の安定化剤の検討がなされ、有用タンパク質と界面活性剤の併用（特許文献２）、IL-12と界面活性剤の混合（特許文献３）、IL-6への非還元糖の添加（特許文献４）、G-CSFへの各種糖類の添加（特許文献５）、人成長ホルモンへの水溶性複素環化合物の添加（特許文献６）等の報告がある。特許文献２、３、４は、それぞれに記載の蛋白質の活性低下回避を課題とするものであり、特許文献５、６は、不可逆的な凝集体生成の回避を課題とするものである。
【０００３】
生理活性蛋白質であるIL-11は、天然由来あるいは組換え遺伝子操作法により生産された蛋白質であり、種々の造血及び免疫機能を刺激する。Genetics Institute社（現Wyeth社）は、N末端のプロリン欠失体である組換えヒトIL-11（rhIL-11）からなる製剤「Neumega（製品名）」を開発し、「非骨髄性悪性腫瘍における骨髄防止化学療法後に見られる重度血小板減少症の予防及び血小板輸血の回避の向上」の適応で医療の現場に提供している。本製剤は、特許文献１に記載された凍結乾燥製剤であり、IL-11を製剤再溶解後の濃度として5ｍｇ／ｍｌ、リン酸ナトリウムを10ｍＭ（ｐＨ7.0）、グリシンを300ｍＭ含有する。
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO95/28951号公報（対応米国特許6,270,757公報）
【特許文献２】特開2001-192343号公報
【特許文献３】特開2002-275197号公報
【特許文献４】特表平8-502722号公報
【特許文献５】特表平8-504784号公報
【特許文献６】特開平10-265404号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の再溶解時の白濁の防止、良好な再溶解性及び製造時容器破損等の懸念事項のない、生理活性蛋白質、好ましくはIL-11、を含有してなる安定な凍結乾燥製剤の製造における改良を提供することにある。
IL-11は水溶液中において中性付近のｐＨ領域で比較的安定であるため、従来、様々な意味で有利とされる注射用液状製剤の形で製剤化することが望ましい。しかし、温度に依存して加水分解するため液状製剤では実用上要求とされる期間の長期保存が困難であり、実際上、凍結乾燥製剤とせざるを得ない。凍結乾燥製剤とするため、IL-11溶液を−３０℃以下まで急速に冷却し、溶液の過冷却を破って凍結させ、その後、乾燥させる一般的な凍結乾燥方法では、再溶解時に一過的に白濁が観察された。
一般的に、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の中には、再溶解に際し、凍乾ケーキの一部に難溶化し白濁することが観察されるものがある。生理活性蛋白質の凍結乾燥製剤は臨床使用に際し、注射用水を用いて再溶解して調製するため、その際、異物の混入など、製剤の異常の有無を容易に確認できるよう、速やかに再溶解されることが必要である。再溶解時の白濁を生じるような凍結乾燥製剤は臨床現場で扱いにくいものとされており、このような再溶解時の白濁を防止する方法が望まれていた。
さらに、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造時においては、頻繁にアンプル等の容器破損が生じる。注射剤には異物が混入してはならないが、製造中の少量の容器破損は飛散により他の多くの非破損品への破片混入の危険があり、製品全体の品質並びに製造コストに大きく影響を与える。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記一過的な白濁等の課題解決のために種々検討をかさね、詳細なる凍結乾燥工程における蛋白質の相互作用の分析を行い、その結果、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の種々の問題のうち特に再溶解時の白濁の問題、つまり再構成時の溶解性（濁度）を支配しているのは、溶解後の溶液中の構造変化だけではなく、製剤固体（凍結乾燥ケーキ）の物性、つまり、凍結乾燥ケーキ中における蛋白質や緩衝剤の分布や状態に由来する固体物理的性質であることを見出した。そして、凍結工程中において緩衝剤の結晶化を促進すれば、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の再溶解時白濁の問題が解決されること、溶解性が向上すること、製剤の安定性に効果があること、製造容器破損問題等も解決しうることを見出し、本発明を完成した。
つまり本発明は以下からなる。
１.生理活性蛋白質及び緩衝剤を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の凍結工程において、緩衝剤を結晶化させる手段を含むことを特徴とする凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
２.緩衝剤を結晶化させる手段が、凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すことを特徴とする前記１の再溶解時白濁防止方法。
３.生理活性蛋白質が塩基性である前記１または２に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
４.生理活性蛋白質がインターロイキン１１である前記３に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
５.緩衝剤がリン酸ナトリウムおよび／またはヒスチジンである前記１乃至４に記載の凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法。
６.生理活性蛋白質及び緩衝剤を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造工程において、緩衝剤を結晶化させる手段を含むことを特徴とする凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
７.緩衝剤を結晶化させる手段が、凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すことを特徴とする前記６記載のアンプル破損回避方法。
８.生理活性蛋白質が塩基性である前記６または７に記載の凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
９.生理活性蛋白質がインターロイキン１１である前記８に記載の凍結乾燥製剤のアンプル破損回避方法。
１０.前記１乃至１０のいずれか1に記載の方法を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造方法。
１１.前記１０の製造方法によって調製された生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤。
【０００７】
本発明は、少なくとも生理活性蛋白質及び緩衝剤を含む生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の凍結工程において、緩衝剤の結晶化を促進することを特徴とする凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法及びアンプル破損回避方法である。
ここで生理活性蛋白質とは、医薬活性成分として用いられる蛋白質であり、具体的には、サイトカイン、成長因子、造血因子、ペプチドホルモン、酵素等が挙げられる。具体的にサイトカインとしては、インターフェロン類（α型、β型、γ型等）、インターロイキン類（IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23等）、腫瘍壊死因子（TNF）等、成長因子としては、骨形成因子（BMP-1, 2, 3, 4等）、神経成長因子（NGF-1, 2等）、神経栄養因子（NTF）、上皮細胞成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF-1, 2, 3等）、線維芽細胞増殖因子（aFGF, bFGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、軟骨由来因子（CDF）、トランスフォーミング成長因子（TGF-α、-β等）等が挙げられる。
また造血因子としては、コロニー刺激因子類（G-, M-, GM-CSF等）、トロンボポエチン（TPO）、エリスロポエチン（EPO）、血小板増殖刺激因子等、ペプチドホルモンとしては、成長ホルモン（GH）、成長ホルモン放出因子（GRF）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体形成ホルモン（LH）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、メラノサイト刺激ホルモン（MSH）、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、カルシトニン、ナトリウム利尿ペプチド等、酵素としては、組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）、ウロキナーゼ（UK）、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、アスパラギナーゼ、カリクレイン、ストレプトキナーゼ、プロテインC、メタロプロテアーゼ類、第VIIIおよびIX因子、プルオキシダーゼ等が挙げられる。
またその他のものとして、チトクロームC  、ホスホリパーゼA2、リゾチーム、アシルフォスファターゼ、エラスターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、NGF、トリプシン、Kunitzインヒビター、ラクトフェリン、リボヌクレアーゼA、血液凝固因子XI、プラスミン、プラスミノーゲンプロアクチベータ、アデニルサンカイネース、アビジン、アルコール脱水素酵素、プロエラスターゼ、エンテロトキシンB、エンテロトキシンC1、カリクレイン、キモトリプシンAα、キモパパインA、キモパパインB、D-グリセルアルデヒドりん酸脱水素酵素、グルコース6りん酸イソラーゼ、グルタミニルｔRNAシクロトランスフェラーゼ、ケラチナーゼ、TSH、高電化鉄硫酸タンパク質、コリシンE1、スブチリシン、セファリスポリナーゼ、DNAポリメラーゼβ、トリプシノーゲン、トロポニン阻害サブユニット、ヌクレアーゼ、バクテリオリシンDFB、パパイン、フィシン、プラズマB2等が挙げられる。
【０００８】
本発明の好ましい生理活性蛋白質としては、塩基性蛋白質であり、具体的にはラクトフェリン、リボヌクレアーゼA、血液凝固因子XI、プラスミン、プラスミノーゲンプロアクチベータ、アデニルサンカイネース、アビジン、アルコール脱水素酵素、プロエラスターゼ、エンテロトキシンB、エンテロトキシンC1、カリクレイン、キモトリプシンAα、キモパパインA、キモパパインB、D-グリセルアルデヒドりん酸脱水素酵素、グルカゴン、グルコース6りん酸イソラーゼ、グルタミニルｔRNAシクロトランスフェラーゼ、ケラチナーゼ、TSH、高電化鉄硫酸タンパク質、コリシンE1、スブチリシン、セファリスポリナーゼ、DNAポリメラーゼβ、トリプシノーゲン、トロポニン阻害サブユニット、ヌクレアーゼ、バクテリオリシンDFB、パパイン、フィシン、プラズマB2、チトクロームC、ホスホリパーゼA2、リゾチーム、アシルフォスファターゼ、エラスターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、NGF、トリプシン及びKunitzインヒビターなどが挙げられ、チトクロームC、ホスホリパーゼA2、リゾチーム、アシルフォスファターゼ、エラスターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、NGF、トリプシン、Kunitzインヒビター、インターロイキン類などが更に好ましい。またその中でもIL-11が特に好ましい。なお、本発明でいう塩基性蛋白質とは、等電点が７よりも大きい蛋白質のこと意味し、当該等電点の測定方法としては等電点電気泳動などにより簡単に測定するすることができる。
また本発明における生理活性蛋白質としては、分子量約1,000乃至200,000のものが用いられ、好ましくは約5,000乃至70,000のものである。これらの生理活性蛋白質は、天然由来あるいは遺伝子組換え技術等によって得られた改変体であってもよく、それらの修飾体（例えばポリエチレングリコールなどによる化学修飾体）であってもよい。またこれらは単量体として用いても、ホモまたはヘテロの多量体として用いてもよい。
【０００９】
本発明の最適な態様として選ばれる生理活性蛋白質は、IL-11であり、例えば米国特許第5,215,895号、米国特許第5,270,181号、米国特許第5,292,646号に記載の蛋白質が挙げられる。また組み換え遺伝子操作法により生産された蛋白質、IL-11を生産する細胞ソースから精製された蛋白質または化学的方法により合成された蛋白質または上記の組み合わせにより得られる蛋白質を包含し、特にＮ末端のプロリン欠失体である組換えヒトIL-11（rhIL-11）を、好適なものとして選択することができる。本発明の目的を達成しうるIL-11であれば他のものを選択することも可能である。
なお本明細書中で、IL-11とは、天然型IL-11のみならず、天然型IL-11の配列又は乃至数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／若しくは挿入された配列を含み、IL-11活性（造血作用）を示す蛋白質を意味する。
【００１０】
本発明で生理活性蛋白質の凍結乾燥前調製時の濃度は、0.1乃至20ｍｇ／ｍｌの濃度に調整されることが好ましく、より最適には1乃至10ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは3乃至8ｍｇ／ｍｌに調整される。所望により、各蛋白質の安定化剤或は／及び溶解補助剤を選択し、各目的効果の達成範囲で添加することも可能である。例えば、IL-11の場合、凍結乾燥前調製時の蛋白質濃度は0.1ｍｇ／ｍｌから20.0ｍｇ／ｍｌまでの範囲が好ましく、より好ましくは1ｍｇ／ｍｌから10ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約5ｍｇ／ｍｌである。溶解補助剤としてアミノ酸、好ましくはグリシンが添加され、その至適濃度は100ｍＭから400ｍＭまでの範囲が好ましく、より好ましくは150ｍＭから350ｍＭ、約300ｍＭが最も好ましい。
【００１１】
本発明で緩衝剤とは、水溶液のｐＨの安定化を目的とする添加剤等を意味し、医薬製造の分野で一般的に使用されているものを選択することができる。
IL-11の製剤化の場合、リン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液を選択することも可能である。また、他の緩衝剤として、ヒスチジン、トリス緩衝液、へぺス緩衝液等を選択することも可能である。また、例えばリン酸ナトリウムとヒスチジンを組み合わせて用いることも可能である。
適当な緩衝剤の凍結乾燥前調製時の濃度は、5ｍＭから40ｍＭの範囲であり、より好ましくは7乃至30ｍＭ、特に好ましくは約10乃至20ｍＭである。IL-11を選択し、リン酸ナトリウムを使う場合、5ｍＭから40ｍＭの範囲であり10ｍＭが好ましく、ヒスチジンの場合は5ｍＭから40ｍＭの範囲であり約20ｍＭが好ましい。
【００１２】
本発明は、凍結工程における緩衝剤の結晶化促進を主要なる手段とする。通常の凍結乾燥は、薬物溶液充填品を凍結乾燥庫内に入庫し、棚の上に静置する。次に、凍結乾燥庫の棚を−３０℃以下に冷却し充填品を凍結させる。凍結後、凍結乾燥庫内を減圧し、棚温を充填品が融解しない温度まで上昇させて水分を昇華させて一次乾燥を行う。その後、棚温を上昇させて付着水を除去することにより二次乾燥を行う。
このような通常の凍結乾燥工程では、緩衝剤の結晶化を促進するために本発明では以下のような手技から選ばれる手段を具体的に導入することができる。
１）凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すこと。
２）減圧させることにより−２０乃至０℃で溶液を凍結させること。
また、本発明の方法である上記緩衝剤の結晶化促進の手段に加え、以下の手段から選択される少なくとも１を組み合わせることにより、凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止を達成することができる。
３）調整液に非イオン性界面活性剤を添加すること。
４）調整液に糖類を添加すること。
【００１３】
従来の凍結乾燥方法で製した凍結乾燥製剤、特に塩基性蛋白質であるIL-11の再溶解時に生じる、一過的な白濁現象は、再溶解時に生じる恐らくは生理活性蛋白質の一過的なコンフォメーション変化に起因し、特に製剤中（凍結乾燥ケーキ中）で生理活性塩基性蛋白質と非晶質の緩衝剤とが近接して共存する場合（従来の凍結法で製造の場合）は、蛋白質表面が一過的に疎水性となることが一要因と考えられる。本発明では、この緩衝剤の影響をなくすには、緩衝剤を結晶化させた状態で、凍結工程を終了すれば良いことを見出した。緩衝剤を結晶化するためには、処理温度、処理時間、処理圧力、安定剤の導入等を適宜選択することができる。
【００１４】
乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すこととは、上記緩衝剤を結晶化させるための具体的な手段の一を例示するものである。前処理には、より好ましくは−１５℃乃至−２℃、さらに好ましくは−１０℃乃至−２℃の温度条件を選択することが可能である。生理活性蛋白質を含む溶液（調製液）を−２０℃以上の温度で強制的に前処理として凍結し、この前処理によって調製液中に存在する緩衝剤を予め結晶化させる。この処理により、生理活性物質と緩衝剤との相互作用を回避させた後、通常の凍結乾燥処理である、−２０℃から−５０℃まで冷却後に凍結乾燥を行うのである。
【００１５】
注射剤のように非常に孔径の小さい（０．２２μｍ）フィルターで濾過された液を清浄な容器（アンプル或いはバイアル）に加えて凍結する場合、氷の核になる物質が非常に少ないため、−２０℃付近以下の低温になるまで通常は凍結しない。従って、高温で凍結させるためには、氷の結晶核を加える、具体的には予め凍乾庫を−３０℃から−５０℃に冷却して凍結乾燥庫内に氷核を形成させておく、或いは溶液を減圧（およそ10mmHg以下）し、溶液表面に刺激を与え凍結するような手段を用いることも有効であり、本発明にて使用することができる。
【００１６】
IL-11とリン酸緩衝液との組み合わせにおいて上記のごとき通例の急速な冷却工程を採用した場合には、溶液は−２０℃を越えて過冷却した後、溶液全体がすべて一度に凍結するが、その際、リン酸ナトリウム等のリン酸緩衝液は結晶化することができず非晶質のまま凍結する。このような非晶質のリン酸イオンは、生理活性塩基性蛋白質と静電的に相互作用するため、再溶解時の一過的な白濁を引き起こす。そこで、凍結温度を０℃から−２０℃にすることによりリン酸ナトリウムを選択的に結晶化させ、静電相互作用を回避することで、再溶解性の良い、白濁防止された凍結乾燥品を得ることができると考えられる。このような高温（０℃から−２０℃）では凍結が開始されても溶液全体がすべて凍結することはなく、未凍結の液体が残っているためリン酸ナトリウムが結晶化するだけの分子運動性が保持されている。実際上、更に好ましくは−２℃から−１５℃の範囲で凍結させるのがよく、リン酸ナトリウムを完全に結晶化させるため、この温度範囲で数時間以上放置するのが望ましい。
【００１７】
凍結時に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を加えない場合（従来の凍結の場合）には、リン酸ナトリウムは非晶質のまま凍結するが、乾燥工程になってから結晶化する。乾燥工程での結晶化では、水の結晶化が伴い体積の膨張が起こるため、アンプルが破損する。前処理を加えることにより、乾燥工程に入る前にすでにリン酸ナトリウム及び水が結晶化し終わっているため、乾燥工程での体積膨張は起こらず、アンプルの破損が生じない。このようにして、前処理は白濁を防止するだけでなく、アンプルの破損を回避することもできる。
【００１８】
なお、従来から蛋白質製剤では再溶解時の不溶化等が品質上の問題となることが報告されている。しかし、この問題解決のためには、Sarciauxらが、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Journal of Pharmaceutical Science）第88巻、12号：1354〜1361頁（1999年）で報告したように、ウシ IgG に各種の添加剤を加えることで、あるいは、凍結時にアニーリングを加えることで再溶解時の溶状の改善を図るなどの手法が知られている。一般に、アニーリングとは、−３０℃以下で完全に凍結した試料を−３０℃以上（０℃未満）の高温にして数時間放置し、−３０℃以下に再度冷却し乾燥する処理であり、通常、薬物の安定化、乾燥時間の短縮、凍乾ケーキの崩壊の防止などの目的で行われるものである。本発明はこの所謂アニーリングとは本質的に異なるものであり、蛋白質製剤を−２０℃以上の温度での前処理を導入して凍結させるのであって、−３０℃以下の低温で急速凍結を行うものとは本質的に異なる。なお、ポリソルベート80のような界面活性剤により、 ウシ IgG の不溶性凝集物が減少はしたが、消失はしなかった旨の報告もなされており、本発明の再溶解時の白濁防止および良好な再溶解性を達成した技術とは相違する。
【００１９】
上記−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理する場合において、さらに減圧条件下（10ｍｍＨｇ以下、好ましくは1ｍｍＨｇ以下）でこの前処理を行ってもよい。減圧で前処理することで、設定温度を０℃にすれば実際の品温は−１０℃程度の低下に止めることができ、十分な目的効果が達成可能である。
【００２０】
上記の"凍結乾燥処理前に−２０℃乃至０℃の温度条件下で前処理を施すこと"及び"凍結乾燥処理前に減圧条件下で前処理を施すこと"における、前処理の処理時間は、一般的には10分間以上、好適には5乃至24時間、より好適には10乃至20時間である。
【００２１】
本発明は以上のような手技を選択することで、再溶解時における白濁を防止する手段、及び、乾燥工程時におけるアンプル破損回避の手段を提供する。
【００２２】
かくして凍結乾燥製剤の再溶解時白濁防止方法の手段を導入して製造される非経口用医薬製剤は、通常製薬的に許容される剤形であれば特に制限されない。なお、凍結乾燥製剤の製造時の凍結乾燥条件は、前処理条件に関係する条件を除いて自体公知の条件を適宜設定することができる。
【００２３】
本発明の生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造方法としては、以下に示す生理活性蛋白質としてIL-11を選択した例に代表される方法を採用することができる。まず所望の濃度となるようにIL-11を含む水溶液とリン酸緩衝液を混合し、液を調製する。調製した液を容器に充填し、予め凍結乾燥庫を−３０℃から−５０℃に冷却して凍結乾燥庫内に氷核を形成させた棚を−１５℃に昇温させ、液を充填した容器を入庫する。一夜放置後、−２０℃以下へ冷却し、完全に凍結させた後に、減圧、乾燥して本発明凍結乾燥製剤を得る。
【００２４】
本発明の生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤には、通常非経口用医薬組成物に添加される医薬品添加物（例えば、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、着色剤、増粘剤）を配合することもできる。例えば、溶解補助剤としては、Ｌ−アルギニン、シクロデキストリン類等が挙げられる。保存剤としては、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸メチル等が挙げられる。乳化剤としては、レシチン等が挙げられる。無痛化剤としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム等が挙げられる。賦形剤としては、マルトース等が挙げられる。増粘剤としては、ヒアルロン酸等が挙げられる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明では、容器破損なく、凍結乾燥製剤の再溶解に際し良好な再溶解性を有する生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の製造方法を提供し、生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤の臨床現場における利便性の向上を達成した。本発明の生理活性蛋白質含有凍結乾燥製剤からなる非経口用医薬組成物あるいは製剤は、溶液状態あるいは凍結乾燥状態において、優れた保存安定性を示す。特に、凍結乾燥状態においては、熱安定性が良好で、さらに凍結乾燥製剤は優れた再溶解性及び再溶解時の白濁防止効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下で本発明を実施例、参考例、実験例等で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、具体例としてIL-11（rhIL-11）を使用したが、他の蛋白質については同様に自体公知の各方法が適用される。凍結乾燥処理の前処理条件の検討を、以下の実施例１乃至５、実験例、参考例１乃至３で行った。なお、参考例とは、比較実験に供するための試料の調製法を意味する。
【００２７】
（参考例１）
急速冷却による凍結乾燥製剤の調製（試料１）
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようにリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを７に調整して容器（ガラスアンプル）に充填した。これを−２０℃以下に冷却済みの凍結乾燥庫に入れて、急速に−２０℃以下へ冷却後減圧・乾燥を行うことによって凍結乾燥製剤を調製した。
【００２８】
（参考例２）
緩慢冷却による凍結乾燥製剤の調製（試料２）
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填した。これを凍結乾燥庫へ入れて、およそ1時間あたり約１０℃の割合で温度を下げ、−２０℃以下まで冷却後さらに濁り対照用として同様の液を充填した容器をこの時点で入庫し、これらを完全に凍結した後、減圧・乾燥を行うことによって凍結乾燥製剤を調製した。
【００２９】
（参考例３）
冷却後昇温させ（アニーリング）再度冷却させることによって調製した凍結乾燥製剤（試料３）
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填した。これを凍結乾燥庫へ入れて、−２０℃以下へ冷却後およそ−６℃に昇温させ数時間保持後再び−２０℃以下へ冷却後、さらに濁り対照用として同様の液を充填した容器を入庫し、これらを完全に凍結した後減圧・乾燥を行うことによって凍結乾燥製剤を調製した。
【実施例１】
【００３０】
−１５℃で前処理凍結させた凍結乾燥製剤
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填し、予め凍結乾燥庫を−３０から−５０℃に冷却して凍結乾燥庫内に氷核を形成した棚を−１５℃に昇温させ、液を充填した容器を入庫した。一夜放置後、−２０℃以下へ冷却し、さらに濁り対照用として、同様の液を充填した容器を入庫して完全に凍結した後、減圧・乾燥を行う方法により凍結乾燥製剤を調製した。
【実施例２】
【００３１】
−１０℃で前処理凍結させた凍結乾燥製剤
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填し、予め凍結乾燥庫を−３０から−５０℃に冷却して凍結乾燥庫内に氷核を形成した棚を−１０℃に昇温させ、液を充填した容器を入れた。一夜放置後、−２０℃以下へ冷却し、さらに濁り対照用として、同様の液を充填した容器を入庫して完全に凍結した後、減圧・乾燥を行う方法により凍結乾燥製剤を調製した。
【実施例３】
【００３２】
−６℃で前処理凍結させた凍結乾燥製剤
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填し、予め凍結乾燥ｙして凍結乾燥庫内に氷核を形成した棚を−６℃に昇温させ、その他は実施例２と同様に操作して、凍結乾燥製剤を調整した。
【実施例４】
【００３３】
−２℃で前処理凍結させた凍結乾燥製剤
−２℃で凍結させる以外は、実施例３と同様に処理して凍結乾燥製剤を調整した。
【実施例５】
【００３４】
減圧して前処理凍結させた凍結乾燥製剤
IL-11を5ｍｇ／ｍｌ、グリシンを300ｍＭ、リン酸として10ｍＭを含むようリン酸ナトリウムを溶解し、ｐＨを7に調整して容器（ガラスアンプル）に充填し、予め凍結乾燥庫をおよそ０℃に冷却後、凍結乾燥庫内を減圧して-２０℃以上の溶液温度で凍結させた。その後、−２０℃以下へ冷却後、減圧・乾燥を行う方法により凍結乾燥製剤を調製した。
【００３５】
（実験例１）
以下、本発明の実施例１乃至５及び参考例１〜３で調製された凍結乾燥製剤について比較実験例を示す。
［試験方法１］ 吸光度測定による再溶解液の濁度評価
IL-11を5 mg含む凍結乾燥製剤に、注射用水(1.2 mL)を注入し、3, 5, 7分経過後の再溶解液のOD650 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度測定による溶液の濁度評価方法に関しては、以下に記す２報を参考にした。
（1） 医薬品研究 26(4) 223-230 (1955)「医薬品の溶状試験における濁度評価方法に関する検討」
（2） J. Pharm. Sci. Tech., 48(2) 64-70 (1994)「A turbidimetric method to determine visual appearance of protein solutions」
（実験方法）
参考例１の試料１と同様に調製した濁り対照用製剤および実施例１から５で製した製剤を日局注射用水で再溶解し、３分後の650ｎｍの波長での吸光度をＵＶ計で測定し、その結果を図１に示す。なお、濁度の測定は、試験方法１に従って行い、後述する図１の「濁りの程度が小さい」とは、再溶解液添加３分後の吸光度が試料１と同様に調製した濁り対照用製剤の吸光度に対し0.6以下であることを意味する。
また、参考例の試料１から３および実施例１から５で調製した製剤の再溶解後３分、２０分後の性状を肉眼で観察し、その結果を表１に示す。
さらに、試料１および実施例３については凍結乾燥終了後、容器の外観を観察し、容器破損の有無を確認した。その結果を表２に示す。
【００３６】
（実験結果）
図１は、試料１と同様に調製した濁り対照用製剤の再溶解後３分の濁りに対する実施例１から４の再溶解後３分の濁りの比を示すグラフである。また、表１は試料１から３および実施例１から５を再溶解後3分および20分に肉眼観察した結果である。いずれも試料１から３に比べて実施例の方が濁りに関して良好な結果を示した。表２は試料１と実施例３の凍結乾燥試料の調製数と容器（ガラスアンプル）の破損数を示したものである。試料１では容器破損が発生したのに対し、実施例３では容器破損が認められなかった。
【表１】
2005060378.tif 000002
【表２】
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【００３７】
以上の結果、試料１、２の再溶解液は白濁したことから、この白濁は冷却速度によらず、−２０℃以下で凍結させて乾燥することにより発生した。また、試料３も白濁したことから、凍結工程で、凍結させた後に昇温させる方法の追加によっても（アニーリング処理を施しても）、製剤の溶状は改善されなかった（表１）。一方、実施例から明らかなように、実施例１から４のIL-11製剤の再溶解性は、−２０℃以下で凍結後に乾燥させた対照用製剤の再溶解性と比較して濁りの程度が小さく、凍結時の温度を−２０℃から０℃、好ましくは−１５℃から−２℃に設定することが望ましいことが確認された（図１）。さらに、溶液を減圧することにより凍結させて製した製剤の再溶解性も良好であることが確認された（表１）。また、実施例３で製した製剤には容器破損がみられず、本発明による製造方法は容器破損の懸念のない方法であることが示された（表２）。
【００３８】
（実験例２）
前処理無しの凍結乾燥処理（参考例１）におけるリン酸ナトリウムの結晶化をＤＳＣ（Differential Scanning Calorimetry）で検出した（図２）。横軸は温度、縦軸は発熱量を表したものである。−１８℃付近で発熱ピークがみられ、結晶化が観察された。凍結工程において、蛋白質のような主薬が存在するとリン酸ナトリウムは結晶化できないことから、非晶質のリン酸イオンが主薬と相互作用することが強く示唆された。リン酸ナトリウムはリン酸−水素二ナトリウム（Na2HPO4,HPO42-）の二価アニオンを半分ほど含み（ｐＨ7.0）、多価カチオン性の主薬と静電気的に結合したものと推察された。二価アニオンを供給する非晶質のリン酸一水素二ナトリウムが凍結時に主薬の蛋白質と結合することが、再溶解時の溶状の悪化及び溶液の白濁化につながるものと推察された。DSCにより、一次乾燥時における昇温に伴うリン酸ナトリウムの結晶化が観測されたことから、凍結工程時には結晶化できなかったこと、及び、凍結工程に結晶化できない場合には乾燥工程で結晶化が起こることが示された。
【００３９】
（実験例３）
実施例３に示す調製液に、飽和したメチルレッド・エタノール溶液を0.2%の濃度となるように添加した。さらに実施例３、および参考例１に示す方法により、それぞれ凍結乾燥製剤を調製したところ、実施例３の方法で調製した凍結乾燥製剤においては、冷却時（−２７℃）に調製液が赤色化したのに対し、参考例１の方法で調製したものにおいては、調製液の赤色化は認められなかった。調製液の赤色化は、調製液が酸性化したことを示すものであり、よって、前処理により、調製液中のリン酸ナトリウムが結晶化したことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】試料１と同様に製した濁り対照用製剤の再溶解後３分の濁りに対する実施例１から４の再溶解後３分の吸光度の比を示した結果である。
【００４１】
【図２】リン酸ナトリウムのＤＳＣ測定結果である。
【図１】
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【図２】
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