(57)【要約】      （修正有）【課題】シクロスポリン類を、簡単かつ高収率で合成により製造する方法を提供する。【解決手段】下記の工程（１）〜（４）を含むことを特徴とする、特定式で表されるシクロスポリン類の製造方法：（１）特定式で表されるペプチドセグメントをＮ−メチル化する；（２）得られた特定式で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、縮合剤の存在下に、Ｚ２−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨと反応させる（Ｚ２は保護基を表す）；（３）得られた特定式で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、特定式で表されるＮ−メチルアミノ酸含有ペプチドと、縮合剤の存在下に反応させる；（４）保護基を除去して得られた特定式で表されるペプチドを、縮合剤の存在下に環化させて、特定式で表されるシクロスポリン類を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程１）〜４）を含むことを特徴とする、次の式（１）で表されるシクロスポリン類の製造方法：
【化１】
2005325061.tif 000011
（式中、Ｒ１はＨ−又はＨＯ−；Ｒ２は（ＣＨ３）２ＣＨ−，ＣＨ３（ＣＨ２）４−又はＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−；Ｒ３はＣＨ３−，ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−，（ＣＨ３）２ＣＨ−又はＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−；Ｒ４はＨ−又はＣＨ３−；Ｒ５は（ＣＨ３）２ＣＨ−又は（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−；Ｒ６はＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−又は（ＣＨ３）２ＣＨ−；Ｒ７はＣＨ３−又はＣＨ３ＣＨ２−を表す。）：
１）次の式（２）で表されるペプチドセグメントをＮ−メチル化する、
【化２】
2005325061.tif 000012
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ１は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）；
２）得られた次の式（３）で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、
【化３】
2005325061.tif 000013
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ１は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）
縮合剤の存在下に、Ｚ２−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨと反応させる；
３）得られた次の式（４）で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、
【化４】
2005325061.tif 000014
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ２は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）
次の式（５）で表されるＮ−メチルアミノ酸含有ペプチドと、縮合剤の存在下に反応させる、
【化５】
2005325061.tif 000015
（式中、Ｒ３〜Ｒ７は上記式（１）と同じであり、Ｚ３は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）；
４）保護基を除去して得られた次の式（６）で表されるペプチドを、縮合剤の存在下に環化させて、上記式（１）で表されるシクロスポリン類を得る。
【化６】
2005325061.tif 000016
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は上記式（１）と同じである。）
【請求項２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でＣＨ３ＩとＡｇ２Ｏを使用して、１）のＮ−メチル化を行なうことを特徴とする請求項１に記載のシクロスポリン類の製造方法。
【請求項３】
２）、３）及び４）の縮合剤として、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフロロホスフェートを使用することを特徴とする請求項１又は２に記載のシクロスポリン類の製造方法。
【請求項４】
４）保護基の除去を接触水素化により行なうことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のシクロスポリン類の製造方法。
【請求項５】
式（１）で表されるシクロスポリンが、シクロスポリンＯであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のシクロスポリン類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するシクロスポリン類を合成により効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロスポリン類は、５〜７個のＮ−メチルアミノ酸を含む、１１個のアミノ酸残基が環状に連った環状ペプチドであり、免疫抑制剤として使用されている。これまで、シクロスポリン類としては、シクロスポリンＡ〜Ｚとして２６種類のシクロスポリンが知られており、これらのシクロスポリン類を合成により製造することが種々検討されてきた（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、Ｎ−メチルアミノ酸を含むペプチド類の合成は、Ｎ−メチルアミノ基の立体障害による反応性の低下や、縮合時のアミノ酸誘導体のラセミ化等により、極端に収率が低下するので実用化には到っておらず、シクロスポリン類は培養法により製造されているのが現状である。特に、シクロスポリンＡやシクロスポリンＯのように、Ｎ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するシクロスポリン類は合成による製造が極めて困難であり、これらのシクロスポリン類を高収率で合成する方法が求められていた。
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００，６５，２９５１−２９５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明はシクロスポリン類のなかでも特に合成が困難な、Ｎ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するシクロスポリン類を、簡単な工程でかつ高収率で合成により製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、これらのシクロスポリン類に含まれるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するセグメントに着目し鋭意検討した結果、このようなセグメントに対応するＮ−メチル化されていないアミノ酸からなる前駆体を作製し、この前駆体を一気にＮ−メチル化することにより、これらのシクロスポリン類の合成による製造工程を簡単なものとし、収率を大幅に改善することができることを見出し、本発明を完成したものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の１〜５の構成をとるものである。
１．下記の工程１）〜４）を含むことを特徴とする、次の式（１）で表されるシクロスポリン類の製造方法：
【０００７】
【化１】
2005325061.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１はＨ−又はＨＯ−；Ｒ２は（ＣＨ３）２ＣＨ−，ＣＨ３（ＣＨ２）４−又はＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−；Ｒ３はＣＨ３−，ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−，（ＣＨ３）２ＣＨ−又はＣＨ３ＣＨ（ＯＨ）−；Ｒ４はＨ−又はＣＨ３−；Ｒ５は（ＣＨ３）２ＣＨ−又は（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−；Ｒ６はＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−又は（ＣＨ３）２ＣＨ−；Ｒ７はＣＨ３−又はＣＨ３ＣＨ２−を表す。）：
１）次の式（２）で表されるペプチドセグメントをＮ−メチル化する、
【０００９】
【化２】
2005325061.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ１は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）；
２）得られた次の式（３）で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、
【００１１】
【化３】
2005325061.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ１は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）
縮合剤の存在下に、Ｚ２−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨと反応させる；
３）得られた次の式（４）で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するペプチドセグメントを、
【００１３】
【化４】
2005325061.tif 000005
【００１４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は上記式（１）と同じであり、Ｚ２は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）
次の式（５）で表されるＮ−メチルアミノ酸含有ペプチドと、縮合剤の存在下に反応させる、
【００１５】
【化５】
2005325061.tif 000006
【００１６】
（式中、Ｒ３〜Ｒ７は上記式（１）と同じであり、Ｚ３は（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−，Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−から選択された保護基を表す。）；
４）保護基を除去して得られた次の式（６）で表されるペプチドを、縮合剤の存在下に環化させて、上記式（１）で表されるシクロスポリン類を得る。
【００１７】
【化６】
2005325061.tif 000007
【００１８】
（式中、Ｒ１〜Ｒ７は上記式（１）と同じである。）
【００１９】
２．Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中でＣＨ３ＩとＡｇ２Ｏを使用して、１）のＮ−メチル化を行なうことを特徴とする１に記載のシクロスポリン類の製造方法。
３．２）、３）及び４）の縮合剤として、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフロロホスフェートを使用することを特徴とする１又は２に記載のシクロスポリン類の製造方法。
４．４）保護基の除去を接触水素化により行なうことを特徴とする１〜３のいずれかに記載のシクロスポリン類の製造方法。
５．式（１）で表されるシクロスポリンが、シクロスポリンＯであることを特徴とする１〜４のいずれかに記載のシクロスポリン類の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、上記一般式（１）で表されるＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するシクロスポリン類の製造工程を簡略化し、収率を大幅に改善して製造コストを低下させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明では、上記式（１）で表されるシクロポリン類中に存在する４個のＮ−メチルアミノ酸が連続して含まれるセグメントに対応するＮ−メチル化されていないアミノ酸からなる前駆体を調製し、この前駆体を一気にＮ−メチル化することによって、従来のＮ−メチルアミノ酸を予め調製後段階的に伸長する方法に比較して製造工程を簡略化し、大幅に収率を改善するものである。
【００２２】
つぎに、シクロスポリンＯを例として、本発明について詳細に説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
本発明では、次の反応スキームにしたがってシクロスポリンＯのＮ−末端セグメントを調製する。
【００２３】
【化７】
2005325061.tif 000008
【００２４】
シクロスポリンＯには、９〜１１及び１位に４個のＮ−メチルアミノ酸が連続して含まれるが、本発明では上記反応スキームの第４段階で対応するＮ−メチル化されていないアミノ酸からなるペプチドをＣＨ３ＩとＡｇ２Ｏを使用して一気にメチル化することによって、１００％の収率で４個のＮ−メチルアミノ酸からなるペプチドを得、これを伸長してＮ−末端セグメントを調製するものである。
【００２５】
一方、シクロスポリンＯのＣ−末端セグメントは、次の反応スキームにしたがって調製する。
【００２６】
【化８】
2005325061.tif 000009
【００２７】
そして、得られたＮ−末端セグメントとＣ−末端セグメントを、次の反応スキームにしたがって縮合することにより、目的とするシクロポリンＯを得る。
【００２８】
【化９】
2005325061.tif 000010
【００２９】
本発明では、上記のような手順でシクロスポリンを合成することによって、シクロスポリンの製造工程を簡略化し、大幅に収率を改善することができる。
【実施例】
【００３０】
つぎに、実施例により本発明をさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではなく、例えば保護基や縮合剤を他の慣用のものと置換する等、適宜変更できることは勿論である。
なお、以下の実施例では、次のような略号を使用した。
【００３１】
（アミノ酸誘導体）
Boc-Gly-OH : t-ブトキシカルボニル−グリシン
Boc-Ala-OH : t-ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン
Z-D-Ala-OH :ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アラニン
Boc-Leu-OH・H2O : t-ブトキシカルボニル−Ｌ−ロイシン・モノヒドレート
Boc-Val-OH : t-ブトキシカルボニル−Ｌ−バリン
Boc-Nva-OH : t-ブトキシカルボニル−Ｌ−ノルバリン
Boc-Sar-OH : t-ブトキシカルボニル−サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）
Boc-MeLeu-OH : t-ブトキシカルボニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン
【００３２】
（ペプチド合成用試薬）
DCC : N, N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
EDC・HCl : 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド  ヒドロクロライド
HATU: O-(7-アザベンゾトリアゾール−１−イル)-1, 1, 3, 3-テトラメチルウロニウム  ヘキサフロロホスフェート
HOBt : 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
NMM : N-メチルモルホリン
DIEA : N, N'-ジイソプロピルエチルアミン
TFA : トリフロロ酢酸
Pd-C : 5% パラジウム−炭素
(Boc)2O : ジ−ｔ−ブチルジカルボーネート
p-TosOH・H2O : p-トルエンスルホン酸モノヒドレート
Z-OSu : N-(ベンジルオキシカルボニルオキシ)スクシンイミド
SOCl2 : チオニルクロライド
【００３３】
（N-メチル化試薬）
NaH : ナトリウムハイドライド
CH3I : ヨードメタン
Ag2O : 酸化銀
【００３４】
（溶媒）
THF : テトラヒドロフラン
CHCl3 : クロロホルム
AcOEt : 酢酸エチル
DMF : N, N'-ジメチルホルムアミド
MeOH : メタノール
Et2O : ジエチルエーテル
【００３５】
［アミノ酸誘導体の合成］
（合成１：Boc保護アミノ酸の合成）
L-アミノ酸 (1.0 mol)を4M NaOH (250 ml, 1.0 mol) に溶かし、氷-MeOHで冷却しながら最少量のジオキサンに溶かした(Boc)2O (240.0 g, 1.1 mol) を30分かけて徐々に加えた。氷浴で1時間、室温で1時間半攪拌した。析出したNa2CO3を濾去し、4M HClでpH3にしてAcOEtで3回抽出した。AcOEt層を水、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をヘキサンで結晶化させた。その後、AcOEt-ヘキサンで再結晶を行ない、Boc-L-アミノ酸を得た。
【００３６】
（合成２：Z保護アミノ酸の合成）
Z-OSu (36 mmol) を1,2-ジメトキシエタン (120ml) に溶かし、予め氷浴で攪拌した。そこに、D-アミノ酸 (30 mmol) を最少量の10%NaHCO3水溶液に溶かしたものを加え、氷浴で1時間、室温で12時間攪拌した。析出したNa2CO3を濾去し、4M HClでpH3にしてAcOEtで3回抽出した。AcOEt層を水、飽和食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をヘキサンで結晶化させた。その後、AcOEt-ヘキサンで再結晶を行ない、Z-D-アミノ酸を得た。
【００３７】
（合成３：アミノ酸メチルエステルの合成）
塩化カルシウムをつめた乾燥管を取りつけた1000 mlの三口フラスコに、脱水MeOH (500 ml)を入れ、氷‐MeOHで冷却した。これにマグネチックスターラーで攪拌しながらSOCl2 (110 ml, 1.5 mol)をゆっくり滴下した。この混合溶液にL-アミノ酸 (0.5 mol) を加え、室温で一晩攪拌した。この反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、MeOHを加えた濃縮を数回繰り返し、過剰に存在する塩酸、SOCl2を除去し、脱水Et2Oで結晶化させ、白色の結晶を得た。この結晶をガラスフィルターでろ過し、デシケーターに入れ減圧乾燥した。その後、結晶を必要最小限のMeOHに温めながら溶かした後、Et2Oで再結晶を行ない、濾過、減圧乾燥し、白色結晶のL-アミノ酸メチルエステル（L-アミノ酸-OMe）を得た。
【００３８】
（合成４：アミノ酸ベンジルエステルの合成）
L-アミノ酸(0.1 mol)、p-TosOH・H2O (22.8 g, 0.12 mol)、ベンジルアルコール (50 ml)、ベンゼン (200 ml) を1000 ml丸フラスコに入れ、還流冷却器をつけたDean-Stark装置を組み立て、油浴 (110℃)で5時間加熱した。放冷後、濃縮しEt2Oを加えて結晶化した。結晶をガラスフィルターで濾過し、減圧乾燥した。得られた粗結晶をEtOH-Et2Oで再結晶し、濾過、減圧乾燥後、白色結晶のアミノ酸ベンジルエステルｐ−トルエンスルホン酸塩を得た。
【００３９】
［（１）N-メチルアミノ酸の合成］
（Ａ：Boc-MeLeu-OHの合成）
300mlナスフラスコにBoc-Leu-OH・H2O (4.96 g, 20 mmol) を入れ、ベンゼンを用い水和している水を共沸で除いた。蒸留THF (60 ml) に溶解させ、CH3I (10 ml, 160 mmol) を加え氷冷下で撹拌し、NaH (2.64 g, 60 mmol) を少量ずつ加えた。その後、塩化カルシウム管を付け室温で24時間反応させた。TLCで反応終了を確認しAcOEt (100ml) を加え、水をNaHと反応しなくなるまで少量ずつ加えた。ロータリーエバポレーターで濃縮し、Et2O (60ml) 、水 (200ml) に溶解させ分液漏斗で水層と有機層を分けた。有機層に飽和NaHCO3水溶液を加え、分液で分け水層を合わせた。水層にクエン酸を加え酸性にし、AcOEtで抽出した。水2回、5%チオ硫酸ナトリウム水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、水を加え結晶化を行なった。その後、アセトン-水で再結晶を行ない濾過、減圧乾燥後白色粉末結晶のBoc-MeLeu-OHを得た。
収量: 4.20 g (85.7 %); Rf: 0.43 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -30.4°(c=1, DMF); M.p. 56−58℃
【００４０】
［（２）Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMeの合成］
（Ｂ：Boc-Val-Leu-OMeの合成）
500mlのナス型フラスコに上記Ａの生成物から常法により調製したHCl・H-Leu-OMe (5.50 g, 30.3 mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、NMM (3.33 ml, 30.3 mmol) を添加した。その後、Boc-Val-OH (7.89 g, 36.4 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらDCC (7.51 g, 36.4 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、副生物のDCUを濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、ヘキサンを加え結晶化を行なった。その後、CHCl3-ヘキサンで再結晶を行ない濾過、減圧乾燥後、白色針状結晶のBoc-Val-Leu-OMeを得た。
収量: 9.69 g (92.8 %); Rf: 0.77 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -56.4°(c=0.1, MeOH); M.p. 131−133℃
【００４１】
（Ｃ：Boc-Leu-Val-Leu-OMeの合成）
500mlのナス型フラスコに上記Ｂの生成物から常法により調製したHCl・H-Val-Leu-OMe (7.58 g, 27.0 mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、NMM (2.97 ml, 27.0 mmol) を添加した。その後、Boc-Leu-OH・H2O (8.07 g, 32.4 mmol) 、HOBt (4.38 g, 32.4 mmol) を添加し、氷-MeOH−10℃に冷却しながらEDC・HCl (6.21 g, 32.4 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、脱イオン水を加え沈殿させた。それをガラスフィルター上で10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、Et2O1回で洗浄した。減圧乾燥後、CHCl3-ヘキサンで再結晶を行ない濾過、減圧乾燥後、白色粉末結晶のBoc-Leu-Val-Leu-OMeを得た。
収量: 10.9 g (87.9 %); Rf: 0.83 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -77.9°(c=0.1, MeOH); M.p. 138−140℃
【００４２】
（Ｄ：Boc-Leu-Leu-Val-Leu-OMeの合成）
500mlのナス型フラスコに上記Ｃの生成物から常法により調製したHCl・H-Leu-Val-Leu-OMe (7.35 g, 18.7 mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、NMM (2.06 ml, 18.7 mmol) を添加した。その後、Boc-Leu-OH・H2O (5.58 g, 22.4 mmol) 、HOBt (3.03 g, 22.4 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらEDC・HCl (4.29 g, 22.4 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、脱イオン水を加え沈殿させた。それをガラスフィルター上で10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、Et2O1回で洗浄した。減圧乾燥後、CHCl3-ヘキサンで再結晶を行ない濾過、減圧乾燥後、白色粉末結晶のBoc-Leu-Leu-Val-Leu-OMe（配列番号１）を得た。
収量: 9.83 g (92.1 %); Rf: 0.59 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -92.2°(c=0.1, MeOH); M.p. 204−206℃
【００４３】
（Ｅ：Boc-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMeの合成）
100mlナス型フラスコにBoc-Leu-Leu-Val-Leu-OMe (1.14 g，2.00 mmol) を入れ、DMFに溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、CH3I (29.9 ml, 480 mmol) 、Ag2O (13.0 g, 56.1 mmol) を添加し室温で24時間撹拌した。反応の終了をTLCで確認した後、大過剰にMeOHを加え室温で2時間撹拌し、過剰のCH3Iを失活させた。Ag2O、AgIをメンブランフィルターで濾別後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー (CHCl3 : MeOH = 98 : 2) で単離し、濃縮後、無色オイル状の生成物Boc-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMe（配列番号２）を得た。
収量: 1.30 g (100 %); Rf: 0.89 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４４】
（Ｆ：Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMeの合成）
100mlのナス型フラスコにHCl・H-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMe (0.85 g, 1.67 mmol) を入れ、DMFに溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、DIEA (0.28 ml, 1.67 mmol) を添加した。その後、Z-D-Ala-OH (0.45 g, 2.00 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらHATU (0.76 g, 2.00 mmol)、DIEA (0.34 ml, 2.00 mmol)を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で10時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ CHCl3 ）で単離し、濃縮後、無色オイル状の生成物Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMeを得た。
収量: 0.58 g (51.8 %); Rf: 0.85 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４５】
［（３）Boc-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzlの合成］
（Ｇ：Boc-MeLeu-Ala-OBzlの合成）
300mlナス型フラスコにp-Tos・H-Ala-OBzl (3.35g，10.0mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶解させNMM (1.1ml, 10.0mml)を加えた。Boc-MeLeu-OH (2.94g, 12.0mmol) を加え溶解後に氷−MeOHで冷却しDCC (2.48g, 12.0mmol) を加え氷冷下で2時間室温で16時間撹拌し、TLCによる原料の消失を確認した。ロータリーエバポレーターで濃縮後、残渣をAcOEtに溶解させDCUを濾過後、濾液を10 %クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。Na2SO4で乾燥後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮しオイル状の生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（CHCl3 : MeOH=98：2）で単離し濃縮後、オイル状の生成物Boc-MeLeu-Ala-OBzlを得た。
収量: 3.47 g (85.4 %); Rf: 0.83 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４６】
（Ｈ：Boc-Val-MeLeu-Ala-OBzlの合成）
300mlナス型フラスコに上記Ｇの生成物から常法により調製したHCl・H-MeLeu-Ala-OBzl (2.08g，6.07mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶解させDIEA (2.27, 13.3mml) を加えた。Boc-Val-OH (1.58g, 27.28mmol) を溶解後、氷−MeOHで冷却しHATU (2.77g, 7.28mmol) を加え氷冷下にて2時間室温で12時間撹拌し、TLCによる原料の消失を確認しロータリーエバポレーターで濃縮した。濾液をAcOEtに溶解させ10 %クエン酸水溶液、水、飽和NaHCO3水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。Na2SO4で乾燥後、濾液をロータリーエバポレーターで濃縮しオイル状の生成物を得た。カラムクロマトグラフィー（CHCl3:MeOH=99:１）で単離し濃縮後、オイル状の生成物Boc-Val-MeLeu-Ala-OBzlを得た。
収量: 2.16 g (70.6 %); Rf: 0.75 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４７】
（Ｉ：Boc-Gly-Leu-OMeの合成）
300mlのナス型フラスコにHCl・H-Leu-OMe (2.75 g, 15.1 mmol)を入れ、蒸留CHCl3に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、NMM (1.67 ml, 15.1 mmol) を添加した。その後、Boc-Gly-OH (3.18 g, 18.2 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらDCC (3.75 g, 18.2 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、副生物のDCUを濾過し、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10%クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（CHCl3 : MeOH＝98 : 2）で単離し濃縮後、無色オイル状の生成物Boc-Gly-Leu-OMeを得た。
収量: 4.84 g (100 %); Rf: 0.71 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４８】
（Ｊ：Boc-Sar-MeLeu-OMeの合成）
100mlナス型フラスコにBoc-Gly-Leu-OMe (0.90 g，3.0 mmol)を入れ、DMFに溶解させCH3I (18.7ml,300mmol) 、Ag2O (9.98 g，42 mmol) を加え室温で24時間撹拌した。TLCによる原料の消失を確認し大過剰にMeOHを加え過剰のCH3Iを失活させた。副生成物のAgIと考えられる固体を濾過によって取り除いた。ロータリーエバポレーターで濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH=99 : 1)で単離し濃縮後、オイル状の生成物Boc-Sar-MeLeu-OMeを得た。
収量: 0.89 g (89.8 %); Rf: 0.76 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００４９】
（Ｋ：Boc-Sar-MeLeu-OHの合成）
100mlのナス型フラスコにBoc-Sar-MeLeu-OMe (0.84 g, 2.54mmol)を入れ、最少量のMeOHに溶解させマグネチックスターラーで攪拌し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながら１Mに調整したNaOH水溶液 (2.79 ml, 2.79 mmol)を添加した。氷浴上で1時間反応させ、反応の終了をTLCで確認した後、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、10 ％クエン酸水溶液でpH３まで酸性にし、AcOEtで抽出した。水2回、飽和食塩水1回で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、白色粉末の生成物Boc-Sar-MeLeu-OHを得た。
収量: 0.70 g (87.5 %); Rf: 0.02 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -22.5°(c=0.1, MeOH); M.p. 119−121℃
【００５０】
（Ｌ：Boc-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzlの合成）
100mlのナス型フラスコに上記Ｈの生成物から常法により調製したHCl・H-Val-MeLeu-Ala-OBzl (0.40 g, 0.90 mmol) を入れ、蒸留CHCl3に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、NMM (0.10 ml, 0.90 mmol) を添加した。その後、上記Ｋで得たBoc-Sar-MeLeu-OH (0.34 g, 1.09 mmol) 、HOBt (0.15 g, 1.09 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらEDC・HCl (0.21 g, 1.09 mmol)を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で18時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（CHCl3 : MeOH＝98 : 2）で単離し濃縮後、無色オイル状の生成物Boc-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl（配列番号３）を得た。
収量: 0.63 g (100 %); Rf: 0.61 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００５１】
（Ｍ：Boc-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzlの合成）
100mlのナス型フラスコに上記Ｌの生成物から常法により調製したTFA・H-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (857 mg, 1.19 mmol) を入れ、DMFに溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、DIEA (445 ml, 2.62 mmol) を添加した。その後、Boc-Nva-OH (311 mg, 1.43 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらHATU (544 mg, 1.43 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で16時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮後、残渣をカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 99 : 1)で単離し濃縮後オイル状の生成物Boc-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl（配列番号４）を得た。収量は0.74 g、収率は77.4 ％であった。
収量: 0.74 g (77.4 %); Rf: 0.74 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００５２】
［（４）Cyclo(-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-)の合成］
（Ｎ：Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OHの合成）
100mlのナス型フラスコに上記Ｆで得られたZ-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OMe (578 mg ,0.855mmol) を入れ、最少量のMeOHに溶解させマグネチックスターラーで攪拌し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながら１Mに調整したNaOH水溶液 (0.94 ml, 0.94 mmol)を添加した。氷浴上で1時間反応させ、反応の終了をTLCで確認した後、濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をイオン交換水に溶解させ、それをEt2O洗浄した。10 ％クエン酸水溶液でpH３まで酸性にし、AcOEtで抽出した。水2回、飽和食塩水1回で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、オイル状の生成物Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OHを得た。
収量: 633 mg (100 %); Rf: 0.05 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００５３】
（Ｏ：Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzlの合成）
100mlのナス型フラスコに上記Ｍの生成物から常法により調製したTFA・H-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (742 mg, 0.908 mmol) を入れ、DMFに溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、DIEA (304 ml, 1.82 mmol) を添加した。その後、上記Ｎで得られたZ-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OH (560 mg, 0.780 mmol) を添加し、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらHATU (345 mg, 0.908 mmol) を添加した。氷浴上で2時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH =99 : 1)で単離し濃縮後、オイル状の生成物Z-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzlを得た。
収量: 1.09 g (99.5 %); Rf: 0.74 (CHCl3 : MeOH=9 : 1)
【００５４】
（Ｐ：H-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OHの合成）
100mlのナス型フラスコに上記Ｏで得られたZ-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar- MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OBzl (976 mg, 0.696 mmol) を入れ、MeOHに溶かし、5% Pd-Cを添加した。室温で攪拌しながら水素ガスを吹き込み36時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、5% Pd-Cをメンブランフィルターで濾去した。濾液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、石油エーテルを加え結晶化させ、濾過、減圧乾燥後、白色粉末結晶のH-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar- MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OHを得た。
収量: 724 mg (88.3 %);  [α]D= -165.8°(c=0.1, MeOH); M.p. 139−141℃
【００５５】
（Ｑ：Cyclo(-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-
MeLeu-Ala-)の合成 ）
100mlのナス型フラスコに上記Ｐで得られたH-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar- MeLeu-Val-MeLeu-Ala-OH (589 mg, 0.50 mmol) を入れ、DMF (295ml) に溶かし、マグネチックスターラーで攪拌しながら、DIEA (102 ml, 0.60 mmol) を添加した。その後、氷-MeOHで−10℃に冷却しながらHATU (228 mg, 0.60 mmol) を添加した。氷浴上で1時間反応させた後、室温で12時間反応させた。反応の終了をTLCで確認した後、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残留物をAcOEtに溶かした。それを10 %クエン酸水溶液2回、水2回、飽和NaHCO3水溶液2回、水2回、飽和食塩水1回で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。Na2SO4を濾過後、濾液を減圧濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2)で単離し濃縮後、MeOH−H2Oで結晶化を行ない濾過、減圧乾燥後、白色結晶のcyclo(-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-)即ちシクロスポリンＯを得た。
収量: 287 mg (49.5 %); Rf: 0.66 (CHCl3 : MeOH=9 : 1); [α]D= -213.7°(c=0.1, MeOH); M.p. 123−125℃
【００５６】
上記の例では、シクロスポリンＯを例として本発明のＮ−メチルアミノ酸残基が４残基連続するシクロスポリン数の製造方法について具体的に説明したが、本発明がシクロポリンＡ等の上記一般式（１）で表される他のシクロポリンにも適用できることは言うまでもない。
【配列表】
2005325061000001.app