(57)【要約】【課題】新規なトリコデルマ菌株と、それによって生産される酵素、機能性糖類及び機能性保健食品を提供する。【解決手段】新規菌株トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＴＶ１）は、シイタケ菌床に発生した汚染菌の中から見出された。この菌株は、酵素キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能を有する。これらの酵素は、キチン、キチンオリゴ糖、酵母またはラミナランを分解して、機能性が高く、代謝吸収性のよい５〜８糖のキチンオリゴ糖、機能性単糖のＮ−アセチルグルコサミン、機能性が高く代謝吸収性のよい５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖を多量に安定して生産する。また、これらの糖と、きのこまたはパン酵母分解液中の機能性成分と組み合わせることにより、優れて機能性保健食品を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
きのこ類及び酵母類の分解能に優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ並びに酵母類の分解能に優れたβ−１，３−グルカナーゼの生産能を有するトリコデルマｓｐ．ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＴＶ１）。
【請求項２】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によって生産され、キチンから機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖生産能を有することを特徴とするキチナーゼ。
【請求項３】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によって生産され、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミン生産能を有することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミニダーゼ。
【請求項４】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によって生産され、きのこ類及び酵母またはラミナランから機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖生産能を有することを特徴とするβ−１，３−グルカナーゼ。
【請求項５】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製することを特徴とするキチナーゼの製法。
【請求項６】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法。
【請求項７】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製することを特徴とするβ−１，３−グルカナーゼの製法。
【請求項８】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することを特徴とする機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖の製法。
【請求項９】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解することを特徴とする機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの製法。
【請求項１０】
請求項１記載のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解することを特徴とする機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖の製法。
【請求項１１】
請求項８で得られた機能性の高い５〜８糖からなるキチンオリゴ糖、請求項９で得られた機能性Ｎ−アセチルグルコサミン及び請求項１０で得られた機能性の高い５〜８糖からなるβ−１，３−グルカンオリゴ糖からなる群から選ばれた少なくともひとつと、きのこ類またはパン酵母分解液中のキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖及びグアニル酸等の呈味成分からなる群から選ばれた少なくともひとつとを含むことを特徴とする機能性保健食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規なトリコデルマ菌株と、それによって生産される酵素とその製法、その酵素を用いた機能性糖類の製法、及びその糖類を含む機能性保健食品に関する。
【背景技術】
【０００２】  キチンオリゴ糖は、難消化性、ビフィズス菌利用性、免疫賦活活性、抗感染病効果、急性関節症予防、植物成長促進作用等の作用が知られている。Ｎ−アセチルグルコサミンは、急性関節症の予防と治療効果が知られている。酵母およびラミナラン由来のβ−１，３−グルカンオリゴ糖は、抗がん作用、Ｃ型肝炎、糖尿病、慢性関節リュウマチ等の改善を示す機能性食品、医薬品、農業分野で応用が知られている。特に、５糖以上のキチンオリゴ糖は、その免疫機能が優れており、注目されている（非特許文献１）。さらに５糖以上のβ−１，３−グルカンオリゴ糖には、免疫調整作用、免疫賦活作用、抗腫瘍作用、抗酸化作用、抗菌作用等があり、米国では高純度免疫賦活成分の薬理作用も公開されている（非特許文献２）。
【非特許文献１】キチン、キトサン研究会編、「キチン、キトサンハンドブック」、第１版第１刷、日本、技報堂出版（株）、１９９５年、ｐ．２０９−２２６
【非特許文献２】川村賢司、「高純度超微粒子β−１、３−Ｄ−グルカンという確かな選択」、初版第一刷、日本、現代書林、２００３年、ｐ．２２−１０８
【０００３】  従来、キチンオリゴ糖は、キチンを加水分解する化学的方法により製造されてきた（特許文献１、２、３）。しかし、化学的方法では酸の混入が避けられず、安全性の観点から食品への応用は困難であった。Ｎ−アセチルグルコサミンは、キチンオリゴ糖から塩酸分解法により製造できるが、この方法では、特殊な装置を使用、食品としての安全性に問題がある。β−１，３−グルカンオリゴ糖は、今後キチンオリゴ糖と同様に、制ガン機能を含む高機能性の糖として期待されており、安全性の観点から酵素法による製法が強く望まれる。
【特許文献１】特開２００２−１７７０００号公報
【特許文献２】特開２００１−０６９９７５号公報
【特許文献３】特開２００２−２７２４５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明は、前記のごとき課題を解決したもので、新規なトリコデルマ菌株と、それによって生産される酵素とその製法、その酵素を用いた機能性糖類の製法、及びその糖類を含む機能性保健食品を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  前記課題を解決した本発明の新規なトリコデルマ菌株は、きのこ類及び酵母の分解能に優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、並びにきのこ類及び酵母またはラミナランの分解能に優れたβ−１，３−グルカナーゼの生産能を有するトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＴＶ１）であることを特徴としている。【０００６】  本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によって生産される機能性糖類の生産酵素は、キチンから機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖生産能を有するキチナーゼ、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミン生産能を有するＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、並びにきのこ類及び酵母またはラミナランから機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖生産能を有するβ−１，３−グルカナーゼからなることを特徴としている。【０００７】  本発明の機能性糖類生産酵素の製法は、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製するキチナーゼの製法、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法、及びトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製するβ−１，３−グルカナーゼの製法からなることを特徴としている。【０００８】  本発明の酵素を用いた機能性糖類の製法は、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することを特徴とする機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖の製法、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解する機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの製法、及びトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解する機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖の製法からなることを特徴としている。【０００９】  本発明の機能性保健食品は、本発明の酵素法で得られた機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖からなるキチンオリゴ糖、機能性Ｎ−アセチルグルコサミン及び機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖からなるβ−１，３−グルカンオリゴ糖からなる群から選ばれた少なくともひとつと、きのこ類または酵母分解液中のキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖及びグアニル酸等の呈味成分からなる群から選ばれた少なくともひとつとを含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１０】  本発明には、以下の産業上の効果または利点がある。
（１）本発明の新菌株トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１は、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能を有する。また、β−１，６−グルカナーゼ活性もある。この新菌株は、シイタケ生産現場の菌床で発見されることから採取が容易である。加えて、栄養源として炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用でき培養も容易である。【００１１】（２）本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１により生産されるキチナーゼは、キチンから機能性が高く、代謝吸収が容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖を生産する能力を有する。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの単糖を生産する能力を有する。β−１，３−グルカナーゼは、きのこ類及び酵母類またはラミナランから制がん性等の機能性が高く、代謝吸収が容易なβ−１，３−グルカンオリゴ糖を生産する能力を有する。【００１２】（３）本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によるキチナーゼの製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製することにより、高純度のキチナーゼを確実に得ることができる。トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によるＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製することにより、高純度のＮ−アセチルグルコサミニダーゼを確実に得ることができる。トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によるβ−１，３−グルカナーゼの製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製することにより、高純度のβ−１，３−グルカナーゼを確実に得ることができる。【００１３】（４）本発明のキチンオリゴ糖の製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖を得ることができる。Ｎ−アセチルグルコサミンの製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性Ｎ−アセチルグルコサミンを得ることができる。β−１，３−グルカンオリゴ糖の製法では、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖を得ることができる。加えて、キチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼは、きのこ類や酵母の細胞壁を分解することにより、高分子β−１，３−グルカンを水溶性のオリゴ糖にしたり、グアニル酸などの呈味成分を抽出したりすることもできる。【００１４】（５）本発明の機能性保健食品は、本発明の酵素法で得られた機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖、機能性Ｎ−アセチルグルコサミン、及び機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖からなる群から選ばれた少なくともひとつと、きのこ類またはパン酵母分解液中のキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖及びグアニル酸等の呈味成分からなる群から選ばれた少なくともひとつを含むことにより、キチンオリゴ糖の難消化性、ビフィズス菌利用性、免疫賦活活性、抗感染病効果、植物成長促進作用、Ｎ−アセチルグルコサミンの急性関節症の予防や治療における有効性、β−１，３−グルカンオリゴ糖の免疫調整作用、免疫賦活作用、抗腫瘍作用、抗酸化作用、抗菌作用等を活かして、種々の機能性保健食品、医薬、農薬等を調製できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】  本発明のトリコデルマ属に属する新菌株は、シイタケ菌床に発生した汚染菌の中から、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能に関するスクリーニングにより新規に見いだされたもので、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．ＴＶ１）と命名して、平成１６年２月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。寄託番号は［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８４］である。トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の菌学的性質を下記に示す。【００１６】（１）培養的・形態的性質：トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１は、不完全菌類の一属で、集落の色調は分生子の形成により緑色となる。分生子は楕円状を呈する。形態は分岐を繰り返して不規則な輪生状となり、フィアライドを群生する。分生子は粘塊状に形成される。【００１７】  トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の培養には、通常の糸状菌無機塩類としての培養法を用いる。培養のための栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用できる。炭素源としては、グルコース、蔗糖、キチン、酵母細胞壁等を使用できる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、酵母エキス、ペプトン、米糠、シイタケ子実体、酵母細胞壁などを使用できる。無機塩類としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅の塩類、例えばリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛等を使用できる。これらの他、添加可能な栄養因子として、ビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類等を使用できる。培養は、好気的条件、例えば振とう培養法、通気攪拌培養法が好適であるが、固体培養法も可能で、ｐＨ等の条件に応じて適宜選択すればよい。培養時間に特に制限はないが、好ましくは２０〜９６時間、さらに好ましくは４０〜９６時間である。【００１８】（２）生理学的・化学分類学的性質：トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１は、優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能を有する。得られたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産菌は、キチン及び酵母細胞壁（あるいはラミナラン）を重合度の高いキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖に効率よく変換する。【００１９】  トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１は、ポテトデキストロー寒天平板培地及びポテトキャロット寒天培地に接種する。生育の範囲はｐＨ４．０〜６．０、温度２５〜３０℃、培養期間は２〜４日間である。最適生育条件は、ｐＨ５．０〜５．５、温度約２５℃、培養期間は４日である。培養後生育したカビの集落の色調及び組織を観察した結果、生育は早く、集落の色調は分生子の形成により緑色となる。分生子は楕円状を呈する。形態は分岐を繰り返して不規則な輪生状となり、フィアライドを群生する。分生子は粘塊状に形成される。【００２０】（３）同種内の公知菌株との菌学的性質の相違点：後述の表１から明らかのように、本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１は、公知菌株トリコデルマ・ｓｐ．Ｕに比較して、キチナーゼ、���−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼ活性において顕著な差異があり、すぐれた生産能を示す。【００２１】  本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の選抜では、シイタケの菌床栽培において、シイタケ子実体の傘の表面に付着していて、傘を溶解した時に得られる分生子を滅菌水にて系統的に希釈する。次いで、希釈液をもとにポテトデキストロー寒天平板培地を用いて純粋培養を行い、単一集落を示すものを純粋菌として選抜する。同定は財団法人日本食品センターに依頼する。【００２２】  本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１によるキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの製法として、トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の通気攪拌培養法または固体培養法を用いるのが実用的である。トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の培養物中には、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼが分泌される。分泌されたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼは、濾過または遠心分離等の操作で菌体を除き、培養液をそのまま粗キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼとして回収する。【００２３】  得られた粗キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼからの分離、精製には、硫安による分画沈殿、ＤＡＢＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ、Ａｍｂｅｌｉｔｅ  ＣＧ−５０によるカラムクロマトグラフィー、セファクリルによるゲル濾過等の慣用的酵素精製手段を用いる。分離精製された高純度のキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼは、下記の理化学的性質を示す。【００２４】  キチナーゼ：
分子量    ；２９，０００（測定法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）
最適ｐＨ  ；４．５〜５．０
ｐＨ安定性；３．０〜５．０
最適温度  ；約５０℃
温度安定性；約５０℃
気質特異性；キチナーゼによるキチン加水分解物からは、ＴＬＣ分析の結果、機能性が高く、代謝吸収性のよいキチンオリゴ糖の５−８糖が得られた。また、生成糖の関係を調べた結果、本酵素はエンド型のキチナーゼあることが判明した。【００２５】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：
分子量    ；約７０，０００（測定法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）
最適ｐＨ  ；約５．０
ｐＨ安定性；４．０〜６．０
最適温度  ；約５０℃
温度安定性；約５０℃
基質特異性；Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによるキチンオリゴ糖の加水分解物からは、ＴＬＣ分析の結果、機能性の高いＮ−アセチルグルコサミンが得られた。また生成糖の関係を調べた結果、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、典型的なＮ−アセチルグルコサミニダーゼナーゼあることが判明した。【００２６】  β−１，３−グルカナーゼ：
分子量    ；３０，０００（測定法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法）
最適ｐＨ  ；５．０〜５．５
ｐＨ安定性；３．０〜５．５
最適温度  ；５５〜６０℃
温度安定性；５５℃以下
気質特異性；β−１，３−グルカナーゼによるβ−１，３−グルカンを含むラミナランの加水分解物は、ＴＬＣ分析の結果、β−１，３−グルカン、機能性の高いラミナランオリゴ糖の７−８糖が得られた。また本酵素（β−１，３−グルカナーゼ）からは、酵母細胞壁から機能性が高く、代謝吸収性のよいβ−１，３−グルカンオリゴ糖の７−８糖が得られることが判明した。
【実施例１】
【００２７】  培地の調製は、次のように行った。５％のシイタケ子実体粉末を含むフスマ５ｇに、トリコデルマ合成培地（Ｎａｔｉｃｋ培地）を加えて殺菌後植菌し、３０℃で５日間培養した。トリコデルマ合成培地としては、硫酸アンモニウム１４ｇ、リン酸水素二カリウム２０ｇ、尿素０．３ｇ、塩化カルシウム３ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ及び１Ｌの蒸留水を混合したＡ液１０ｍｌと、硫酸鉄水和物０．０５ｇ、硫酸マンガン０．０１６ｇ、硫酸亜鉛水和物０．０１４ｇ、塩化カルシウム０．０２ｇ及び１００ｍｌの蒸留水を加えたＢ液１ｍｌとを混合し、蒸留水で１００ｍｌに定容したものを使用した。【００２８】  粗酵素液は、次のように調製した。トリコデルマ合成培地には、菌が旺盛に生育した。この培地内から、トリコデルマ・ｓｐ．ＴＶ１と、同時にトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１から分泌生産されたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ等の酵素を含む粗酵素液が得られた。【００２９】（試験例１：トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１由来の酵素活性）
トリコデルマ合成培地で保存している溶菌酵素Ｕ菌株を対照例として、実施例１で培養して得られた粗酵素液につき、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は、試験例２の方法によった。その結果を表１に示す。【００３０】
【表１】
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【００３１】測定結果から、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ活性は、市販されている溶菌酵素Ｕ菌よりも顕著に優れ最強であった。
【実施例２】
【００３２】  ５％のシイタケ子実体粉末を含むフスマ１００ｇに、トリコデルマ合成培地（Ｎａｔｉｃｋ培地）１００ｍｌを加えて殺菌後植菌し、アルミ製の容器を用いて３０℃で５日間培養を行った。培養後、出麹に３倍量の水を加えて１時間酵素を抽出した。抽出後濾過液を７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、培養上澄み液を得た。次に、上澄み液に対して飽和量の硫安を加えて塩析を行った。生じた沈殿物を７０００ｒｐｍ，１０分間遠心分離を行い、その沈殿物を脱イオン水１００ｍｌに溶解し、溶解後セロハンチューブに入れ、脱イオン水に対して十分に透析した。透析された溶液を凍結乾燥して、粗酵素サンプル１２ｇを得た。粗酵素サンプルは、酵素毎に次の方法により精製し、酵素の大量培養を行うために以下の各試験を行った。【００３３】β−１，３−グルカナーゼの精製：実施例２の粗酵素サンプル１ｇを０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解して、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄み液を得た。この上澄み液を０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースに吸着させた後、０．０１ｍｏｌ〜０．６ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて直線的濃度勾配で酵素タンパク質を溶出する陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。【００３４】  その結果、図２に示すように、β−１，３−グルカナーゼの活性ピークとして、ピーク１と２の２つが得られた。ピーク２のエンド型の強いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。キチナーゼはイオン強度の高い最後のピークに出現した。活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。【００３５】  さらに、コロジオンバッグによる濃縮で部分的に精製したβ−１，３−グルカナーゼのフラクションを０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通して、β−１，３−グルカナーゼを吸着させた後、０．１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出するとβ−１，３−グルカナーゼのピークが得られた。β−１，３−グルカナーゼ活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。このフラクションを透析し、セファクリルＳ１００−ＨＲカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、単一のバンドが確認されたので、これをトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１由来の精製酵素であるβ−１，３−グルカナーゼとした。本酵素の分子量は約３０，０００であると推定された。【００３６】  キチナーゼの精製：前記β−１，３−グルカナーゼの精製過程で得たキチナーゼフラクションをコロジオンバッグにより濃縮した。すなわち、キチナーゼフラクションを０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通じてキチナーゼを吸着させた後、０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出するとキチナーゼのピークが得られた。キチナーゼ活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。このフラクションを透析し、セファクリルＳ１００−ＨＲカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、単一のバンドが確認されたので、これをトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１由来の精製酵素であるキチナーゼとした。本酵素の分子量は約２９，０００であると推定された。【００３７】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの精製：粗酵素サンプル９８４．２８ｇを０．０５ｍｏｌのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上澄み液を得た。この上澄み液を０．０５ｍｏｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通してＮ−アセチルグルコサミニダーゼを吸着させ後、それぞれ０．０５ｍｏｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、リン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）及び（ｐＨ６．０）、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５００ｍｌ流して分画した。【００３８】  その結果、図３に示すように、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性ピークが３つ得られた。ピーク１（Ｐ−１）のフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。次いで透析を行った。透析液を０．０５ｍｏｌ塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通してピーク１を吸着させ、同緩衝液にグラデイエント法により０〜０．５ｍｏｌ塩化ナトリウム濃度勾配をかけて分画した。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。このフラクションを透析し、セファクリルＳ１００−ＨＲカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、単一のバンドが確認されたので、これをＴＶ１由来の精製酵素であるＮ−アセチルグルコサミニダーゼとした。本酵素の分子量は約７０，０００であると推定された。【００３９】（試験例２：酵素活性）
粗酵素サンプル中のキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼについて、下記の力価測定法により測定した。測定結果、キチナーゼ活性は１６．２８ｕｎｉｔ／ｇ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性は２４．４２ｕｎｉｔ／ｇ、β−１，３−グルカナーゼは４，１４４ｕｎｉｔ／ｇであった。【００４０】  キチナーゼの活性測定法：４５℃の恒温槽中で、試験管に酵素液１ｍｌにつき１％のコロイダルキチン１ｍｌを加え、４５℃で３０分間反応させた。この時のブランクには、基質に０．０５ｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えたものを使用した。反応後、フィルター濾過し、別の試験管に上澄み液を０．５ｍｌとり、それにｐＨ９．１のホウ酸緩衝液０．５ｍｌを添加し、管口に蓋をして沸騰水中で３分間煮沸した。直ちにこれを冷却し、酢酸で１０倍に希釈したＤＭＡＢ溶液３ｍｌを加え、３８℃の恒温槽中に２２０分間静置し、５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したＮ−アセチルグルコサミン量を求め、酵素力価を算出した。上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミン量（分子量２２１．２１）を生成する酵素量を１単位とする。【００４１】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性測定法（Ｒｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｌｇａｎ法）：４５℃の恒温槽中で試験管に酵素液０．１ｍｌに０．３４％のｐ−ニトロフェニール−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）０．９ｍｌを加え、４５℃で３０分間反応させた。この時のブランクには、基質に０．１ｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えたものを使用した。反応後、１ｍｏｌの炭酸ナトリウム溶液２ｍｌを加え、５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したｐ−ニトロフェニール量を求め、酵素力価を算出した。上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニール量（１３９．１１）を生成する酵素量を１単位とする。【００４２】  β−１，３−グルカナーゼの活性測定法：４５℃の恒温槽中で試験管に酵素液０．５ｍｌにつき１％のラミナラン溶液（ｐＨ５．０）０．５ｍｌを加え、４５℃で３０分間反応させた。この時のブランクには、基質に０．１ｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えたものを使用した。反応後、銅試薬を加え、管口に蓋をして沸騰水中で１０分間煮沸した。直ちにこれを冷却し、ヒ素モリブデン酸塩試薬２ｍｌを加え攪拌後、蒸留水を加えて１０ｍｌに希釈し、１５分間に静置し、５００ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したグルコース量を求め、酵素力価を算出した。上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコース量（分子量１８０．１６）を生成する酵素量を１単位とする。【００４３】  β−１，６−グルカナーゼ活性の測定法：４５℃の恒温槽中で試験管に酵素液０．５ｍｌにつき、１％のパストラン溶液（ｐＨ５．０）０．５ｍｌを加え、４５℃で３０分間反応させた。この時のブランクには、基質に０．１ｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えたものを使用した。反応後、銅試薬を加え、管口に蓋をして沸騰水中で１０分間煮沸した。直ちにこれを冷却し、ヒ素モリブデン酸塩試薬２ｍｌを加え攪拌後、蒸留水を加えて１ｏｍｌに希釈し、１５分間に静置し、５００ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したグルコース量を求め、酵素力価を算出した。上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコース量（分子量１８０．１６）を生成する酵素量を１単位とする。【００４４】（試験例３：粗酵素液による乾燥シイタケ子実体片の溶解性）
実施例１で得られた粗酵素液１０ｍｌを大型試験管に入れ、これに乾燥シイタケ子実体片を加え、４５℃で１２時間、恒水槽中で作用させた。結果を図１に示す。図１の写真から明らかなように、粗酵素液のキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ等の酵素により、シイタケ子実体片は完全に分解された。【００４５】（試験例４：最適基質の測定）
トリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１株由来の酵素キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの基質との性質につき、下記の方法で試験した。【００４６】  キチナーゼ：実施例２の精製酵素に、調製済みの各基質［０．２％グリコールキチン、０．２％キトサンＥＬ、０．２％キトサン９Ｂ、０．２％キトサン１０Ｂ、０．２％コロイダルキチン、０．２％キトサン７Ｂ、０．２％ＰＤＣ（部分的に脱アセチル化したキチン）、０．２％シイタケ菌糸液］を基質として加え、４５℃において反応させ、Ｒｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法にしたがって、酵素活性を測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、脱アセチル度７０％のキトサン７Ｂで最も高い活性を示した。また本酵素は、ある程度脱アセチル化されたキチンに対してもよく反応した。【００４７】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：実施例２の精製酵素に調製済みのアセチルキチンオリゴ糖液を基質として加え、４５℃において反応させ、生成糖をＨＰ薄層クロマトグラフィーで調べた。結果を図５に示す。図５から明らかなように、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、アセチルキチンオリゴ糖を完全にＮ−アセチルグルコサミンにした。【００４８】  β−１，３−グルカナーゼ：実施例２の精製酵素に、調製済みの各基質［１％ラミナラン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ．ｄｉｇｉｔａｔａ）、１％ラミナラン（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｂｉｃｙｃｌｉｓ）、酵母細胞壁、シイタケ菌糸液］を基質として加え、４５℃において反応させ、Ｎｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法により生成糖を定量して酵素活性を測定した。結果図６に示す。図６から明らかなように、β−１，３−結合もつ基質によく作用した。特に酵母細胞やシイタケ菌糸によく作用した。【００４９】（試験例５：最適ｐＨの測定）
キチナーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に、０．２％ＰＤＣを基質として加え、４５℃において反応させ、Ｒｏｎｄｅｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法にしたがって酵素活性を測定した。結果を図７に示す。最適ｐＨは４．５〜５．０であった。【００５０】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニール−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、４５℃において反応させ、生成したｐ−ニトロフェニール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図８に示す。図８から明らかなように、最適ｐＨは５．０であった。【００５１】  β−１，３−グルカナーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に０．２％ＰＤＣを基質として加え、４５℃において反応させ、生成糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量して、酵素活性を測定した。結果を図９に示す。図９から明らかなように、最適ｐＨは５．０〜５．５であった。【００５２】（試験例６：ｐＨ安定性の測定）
キチナーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液を一定時間静置後、０．２％ＰＤＣを基質として加え、４５℃において反応させ、Ｒｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法にしたがって酵素活性を測定した。結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０で安定性を保った。【００５３】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニール−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、４５℃において反応させ、生成したｐ−ニトロフェニール量を求め酵素活性を測定した。結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ｐＨは４．０〜６．０で安定性を保った。【００５４】  β−１，３−グルカナーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に１％ラミナラン溶液を基質として加え、４５℃において反応させ、生成糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量して、酵素活性を測定した。結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、ｐＨは３．０〜５．５で安定性を保った。【００５５】（試験例７：最適温度の測定）
キチナーゼ：実施例２の精製酵素液に０．２％ＰＤＣを基質として加え、２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽で反応させ、Ｒａｎｄｏｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法にしたがって酵素活性を測定した。結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、最適温度は５０℃付近であった。【００５６】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニール−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽で反応させ、生成したｐ−ニトロフェニール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図１４に示す。図１４から明らかなように、最適温度は５０℃附近であった。【００５７】  β−１，３−グルカナーゼ：実施例２の精製酵素液に１％ラミナラン溶液を基質として加え、２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽で反応させ、生成糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量して、酵素活性を測定した。結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、最適温度は５５〜６０℃であった。【００５８】（試験例８：温度安定性の測定）
キチナーゼ：２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽に、実施例２の精製酵素液を一定時間静置した後、実施例２の精製酵素液に０．２％ＰＤＣを基質として加え反応させ、Ｒｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｒｇａｎ法にしたがって酵素活性を測定した。結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、キチナーゼの温度安定性は、５０℃付近まで安定であり、７０℃で７５％失活した。【００５９】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽に、実施例２の精製酵素液を一定時間静置した後、実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニール−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加えて反応させ、生成したｐ−ニトロフェニール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図１７に示す。図１７から明らかなように、最適温度は５０℃附近であった。【００６０】  β−１，３−グルカナーゼ：２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽に、精製酵素液を一定時間静置した後、精製酵素液に１％ラミナラン溶液を基質として加えて反応させ、生成糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法で定量して、酵素活性を測定した。結果を図１８に示す。図１８から明らかなように、温度安定性は５０℃まで安定であった。【００６１】（試験例９：加水分解物産物のＨＰＴＬＣによる分析）
キチナーゼ：基質である１％ＰＤＣ溶液０．９ｍｌに、実施例２の精製酵素０．１ｍｌを加え、４５℃で各０、１、６、１２、２４時間反応させた後、１０分間煮沸して反応を停止させ、凍結乾燥により濃縮し、これを薄層プレートにスポットした。展開溶液は、ブタノール：エタノール：アンモニア＝４：３：３（ｖ・ｖ）を用いた。展開後、３０％硫酸を噴霧し、１２０℃で１５分間静置した。標準試料によるＨＰＴＬＣの結果を図１９に示す。図１９から明らかなように、１時間反応後から機能性の高いとされる機能性５〜８糖のキチンオリゴ糖の生成が認められた。【００６２】  Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：実施例２の精製酵素中のキチンオリゴ糖からＮ−アセチルグルコサミニダーゼにより、図５に示すようにＮ−アセチルグルコサミンの生成が認められた。【００６３】  β−１，３−グルカナーゼ：基質である２％ラミナラン溶液０．９ｍｌに、実施例２の精製酵素０．１ｍｌを加え、４５℃で各０、１、３、６、１２、２４時間反応させた後、１０分間煮沸して反応を停止させ、凍結乾燥により濃縮し、これを薄層プレートにスポットした。展開溶液は、酢酸：クロロホルム：蒸留水＝１０：３：１（ｖ・ｖ）を用いた。展開後、３０％硫酸を噴霧し、１２０℃で１５分間静置した。標準試料のよるＨＰＴＬＣの結果を図２０に示す。図２０から明らかなように、１時間反応後から機能性の高いとされる５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖の生成が認められた。【００６４】（試験例１１：β−１，３−及びβ−１，６−グルカン由来の還元糖並びにＮ−アセチルアミノ糖の検出）
実施例２の粗酵素を使用して、シイタケ子実体粉末とビール酵母細胞壁を基質として、シイタケ子実体粉末とビール酵母細胞壁から生成するβ−１，３−及びβ−１，６−グルカン由来の還元糖およびＮ−アセチルアミノ糖の検出を行った。【００６５】  シイタケ子実体粉末とビール酵母細胞壁をそれぞれ試験管に入れ、それに実施例２の粗酵素液５ｍｌを加え、４５℃の恒温槽中で１２時間反応させた後、濾過した反応液上澄み液の生成還元糖をＮｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｙｉ法及びＮ−アセチルアミノ糖をＲｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｌｇａｎ法で測定した。結果を表２、図２１、図２２、図２３、図２４、図２５に示す。これらの図表から明らかなように、生成還元糖およびＮ−アセチルアミノ糖量の増加が認められた。これにより、シイタケ子実体粉末とビール酵母細胞壁の成分は、キチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ等の酵素により完全に分解することが分かった。【００６６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６７】  本発明の新菌株トルコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１、新菌株により得られる酵素とその製法、その酵素を用いた機能性糖類の製法、その糖類を含む機能性保健食品は、その機能の選択により、機能性健康補助食品分野、医薬品分野、農業分野等に広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼによるシイタケ子実体の分解結果を示す写真である。
【図２】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂで分画した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂで分画した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適基質の測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適基質の測定結果を示す説明図である。
【図６】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適基質の測定結果を示すグラフである。
【図７】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図８】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図１０】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１４】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１５】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１６】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１７】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１８】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１９】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するキチナーゼによる部分的脱アセチル化キチン分解産物の薄層クロマトグラフ法で分画した結果を示す説明図である。
【図２０】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼによるラミナランの分解産物の薄層クロマトグラフ法で分画した結果を示す説明図である。
【図２１】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケ子実体粉末の酵素無処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２２】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケ子実体粉末の酵素処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２３】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるビール酵母細胞壁の酵素無処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２４】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるビール酵母細胞壁の酵素処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２５】本発明のトリコデルマ  ｓｐ．ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケシイタケ子実体粉末及びビール酵母細胞壁の酵素処理区分によるアミノ酸類の増加を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2005224230.tif 000025
【図２２】
2005224230.tif 000026
【図２３】
2005224230.tif 000027
【図２４】
2005224230.tif 000028
【図２５】
2005224230.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月2日(2004.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
きのこ類及び酵母類の分解能に優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ並びに酵母類の分解能に優れたβ−１，３−グルカナーゼの生産能を有するトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＴＶ１）。
【請求項２】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によって生産され、キチンから機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖生産能を有することを特徴とするキチナーゼ。
【請求項３】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によって生産され、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミン生産能を有することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミニダーゼ。
【請求項４】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によって生産され、きのこ類及び酵母またはラミナランから機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖生産能を有することを特徴とするβ−１，３−グルカナーゼ。
【請求項５】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製することを特徴とするキチナーゼの製法。
【請求項６】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製することを特徴とするＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法。
【請求項７】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製することを特徴とするβ−１，３−グルカナーゼの製法。
【請求項８】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することを特徴とする機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖の製法。
【請求項９】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解することを特徴とする機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの製法。
【請求項１０】
請求項１記載のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解することを特徴とする機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖の製法。
【請求項１１】
請求項８で得られた機能性の高い５〜８糖からなるキチンオリゴ糖、請求項９で得られた機能性Ｎ−アセチルグルコサミン及び請求項１０で得られた機能性の高い５〜８糖からなるβ−１，３−グルカンオリゴ糖からなる群から選ばれた少なくともひとつと、きのこ類またはパン酵母分解液中のキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖及びグアニル酸等の呈味成分からなる群から選ばれた少なくともひとつとを含むことを特徴とする機能性保健食品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
前記課題を解決した本発明の新規なトリコデルマ菌株は、きのこ類及び酵母の分解能に優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、並びにきのこ類及び酵母またはラミナランの分解能に優れたβ−１，３−グルカナーゼの生産能を有するトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＴＶ１）であることを特徴としている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によって生産される機能性糖類の生産酵素は、キチンから機能性の高い５〜８糖のキチンオリゴ糖生産能を有するキチナーゼ、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミン生産能を有するＮ−アセチルグルコサミニダーゼ、並びにきのこ類及び酵母またはラミナランから機能性の高い５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖生産能を有するβ−１，３−グルカナーゼからなることを特徴としている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の機能性糖類生産酵素の製法は、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製するキチナーゼの製法、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法、及びトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製するβ−１，３−グルカナーゼの製法からなることを特徴としている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の酵素を用いた機能性糖類の製法は、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することを特徴とする機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖の製法、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解する機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの製法、及びトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解する機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖の製法からなることを特徴としている。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明には、以下の産業上の効果または利点がある。
（１）本発明の新菌株トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１は、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能を有する。また、β−１，６−グルカナーゼ活性もある。この新菌株は、シイタケ生産現場の菌床で発見されることから採取が容易である。加えて、栄養源として炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用でき培養も容易である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
（２）本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１により生産されるキチナーゼは、キチンから機能性が高く、代謝吸収が容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖を生産する能力を有する。Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、キチンオリゴ糖から機能性Ｎ−アセチルグルコサミンの単糖を生産する能力を有する。β−１，３−グルカナーゼは、きのこ類及び酵母類またはラミナランから制がん性等の機能性が高く、代謝吸収が容易なβ−１，３−グルカンオリゴ糖を生産する能力を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
（３）本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によるキチナーゼの製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製することにより、高純度のキチナーゼを確実に得ることができる。トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によるＮ−アセチルグルコサミニダーゼの製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製することにより、高純度のＮ−アセチルグルコサミニダーゼを確実に得ることができる。トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によるβ−１，３−グルカナーゼの製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の培養液中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製することにより、高純度のβ−１，３−グルカナーゼを確実に得ることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
（４）本発明のキチンオリゴ糖の製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製し、得られたキチナーゼによりキチンを分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のキチンオリゴ糖を得ることができる。Ｎ−アセチルグルコサミンの製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたＮ−アセチルグルコサミニダーゼを分離精製し、得られたＮ−アセチルグルコサミニダーゼによりキチンオリゴ糖を分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性Ｎ−アセチルグルコサミンを得ることができる。β−１，３−グルカンオリゴ糖の製法では、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１を培養し、培養物中に分泌生産されたβ−１，３−グルカナーゼを分離精製し、得られたβ−１，３−グルカナーゼによりきのこ類及び酵母またはラミナランを分解することにより、高純度で、効率よく、容易に多量の機能性が高く、代謝吸収の容易な５〜８糖のβ−１，３−グルカンオリゴ糖を得ることができる。加えて、キチナーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼは、きのこ類や酵母の細胞壁を分解することにより、高分子β−１，３−グルカンを水溶性のオリゴ糖にしたり、グアニル酸などの呈味成分を抽出したりすることもできる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明のトリコデルマ属に属する新菌株は、シイタケ菌床に発生した汚染菌の中から、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能に関するスクリーニングにより新規に見いだされたもので、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＴＶ１）と命名して、平成１６年２月１２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。寄託番号は［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６８４］である。トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の菌学的性質を下記に示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
（１）培養的・形態的性質：トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１は、不完全菌類の一属で、集落の色調は分生子の形成により緑色となる。分生子は楕円状を呈する。形態は分岐を繰り返して不規則な輪生状となり、フィアライドを群生する。分生子は粘塊状に形成される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の培養には、通常の糸状菌無機塩類としての培養法を用いる。培養のための栄養源としては、炭素源、窒素源、無機塩類を適宜含有する培地であれば、天然培地でも合成培地でも使用できる。炭素源としては、グルコース、蔗糖、キチン、酵母細胞壁等を使用できる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、酵母エキス、ペプトン、米糠、シイタケ子実体、酵母細胞壁などを使用できる。無機塩類としてはナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅の塩類、例えばリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化カルシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛等を使用できる。これらの他、添加可能な栄養因子として、ビタミン類、アミノ酸、核酸及びその塩類等を使用できる。培養は、好気的条件、例えば振とう培養法、通気攪拌培養法が好適であるが、固体培養法も可能で、ｐＨ等の条件に応じて適宜選択すればよい。培養時間に特に制限はないが、好ましくは２０〜９６時間、さらに好ましくは４０〜９６時間である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
（２）生理学的・化学分類学的性質：トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１は、優れたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産能を有する。得られたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼ生産菌は、キチン及び酵母細胞壁（あるいはラミナラン）を重合度の高いキチンオリゴ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−１，３−グルカンオリゴ糖に効率よく変換する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１は、ポテトデキストロー寒天平板培地及びポテトキャロット寒天培地に接種する。生育の範囲はｐＨ４．０〜６．０、温度２５〜３０℃、培養期間は２〜４日間である。最適生育条件は、ｐＨ５．０〜５．５、温度約２５℃、培養期間は４日である。培養後生育したカビの集落の色調及び組織を観察した結果、生育は早く、集落の色調は分生子の形成により緑色となる。分生子は楕円状を呈する。形態は分岐を繰り返して不規則な輪生状となり、フィアライドを群生する。分生子は粘塊状に形成される。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
（３）同種内の公知菌株との菌学的性質の相違点：後述の表１から明らかのように、本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１は、公知菌株トリコデルマ・ｓｐ．Ｕに比較して、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼ活性において顕著な差異があり、すぐれた生産能を示す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の選抜では、シイタケの菌床栽培において、シイタケ子実体の傘の表面に付着していて、傘を溶解した時に得られる分生子を滅菌水にて系統的に希釈する。次いで、希釈液をもとにポテトデキストロー寒天平板培地を用いて純粋培養を行い、単一集落を示すものを純粋菌として選抜する。同定は財団法人日本食品センターに依頼する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１によるキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの製法として、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の通気攪拌培養法または固体培養法を用いるのが実用的である。トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の培養物中には、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼが分泌される。分泌されたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼは、濾過または遠心分離等の操作で菌体を除き、培養液をそのまま粗キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼとして回収する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
粗酵素液は、次のように調製した。トリコデルマ合成培地には、菌が旺盛に生育した。この培地内から、トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１と、同時にトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１から分泌生産されたキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ等の酵素を含む粗酵素液が得られた。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
（試験例１：トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１由来の酵素活性）
トリコデルマ合成培地で保存している溶菌酵素Ｕ菌株を対照例として、実施例１で培養して得られた粗酵素液につき、キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びβ−１，６−グルカナーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は、試験例２の方法によった。その結果を表１に示す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
さらに、コロジオンバッグによる濃縮で部分的に精製したβ−１，３−グルカナーゼのフラクションを０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通して、β−１，３−グルカナーゼを吸着させた後、０．１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出するとβ−１，３−グルカナーゼのピークが得られた。β−１，３−グルカナーゼ活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。このフラクションを透析し、セファクリルＳ１００−ＨＲカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、単一のバンドが確認されたので、これをトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１由来の精製酵素であるβ−１，３−グルカナーゼとした。本酵素の分子量は約３１，３００であると推定された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
キチナーゼの精製：前記β−１，３−グルカナーゼの精製過程で得たキチナーゼフラクシヨンをコロジオンバッグにより濃縮した。すなわち、キチナーゼフラクションを０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填したカラム（２．６×３０ｃｍ）に通じてキチナーゼを吸着させた後、０．０１ｍｏｌ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出するとキチナーゼのピークが得られた。キチナーゼ活性の高いフラクションを集め、コロジオンバッグによる濃縮を行った。このフラクションを透析し、セファクリルＳ１００−ＨＲカラムによるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。このフラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、単一のバンドが確認されたので、これをトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１由来の精製酵素であるキチナーゼとした。本酵素の分子量は約３６，０００であると推定された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性測定法（Ｒｏｎｄｏｌｅ−Ｍｏｌｇａｎ法）：４５℃の恒温槽中で試験管に酵素液０．１ｍｌに０．３４％のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）０．９ｍｌを加え、４５℃で３０分間反応させた。この時のブランクには、基質に０．１ｍｏｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加えたものを使用した。反応後、１ｍｏｌの炭酸ナトリウム溶液２ｍｌを加え、５３０ｎｍにおける吸光度を測定し、生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、酵素力価を算出した。上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノール量（１３９．１１）を生成する酵素量を１単位とする。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
（試験例４：最適基質の測定）
トリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１株由来の酵素キチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びβ−１，３−グルカナーゼの基質との性質につき、下記の方法で試験した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、４５℃において反応させ、生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図８に示す。図８から明らかなように、最適ｐＨは５．０であった。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：ｐＨ２．０〜ｐＨ７．０の各ｐＨの緩衝液で希釈した実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、４５℃において反応させ、生成したｐ−ニトロフェノール量を求め酵素活性を測定した。結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ｐＨは４．０〜６．０で安定性を保った。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加え、２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽で反応させ、生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図１４に示す。図１４から明らかなように、最適温度は５０℃附近であった。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：２０〜７０℃まで５〜１０℃毎に設定した恒温槽に、実施例２の精製酵素液を一定時間静置した後、実施例２の精製酵素液に０．３４％のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミニド溶液（ｐＨ５．０）を基質として加えて反応させ、生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、酵素活性を測定した。結果を図１７に示す。図１７から明らかなように、最適温度は５０℃附近であった。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明の新菌株トルコデルマ  ビリデ  ＴＶ１、新菌株により得られる酵素とその製法、その酵素を用いた機能性糖類の製法、その糖類を含む機能性保健食品は、その機能の選択により、機能性健康補助食品分野、医薬品分野、農業分野等に広く利用可能である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【図１】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、及びβ−１，３−グルカナーゼによるシイタケ子実体の分解結果を示す写真である。
【図２】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂで分画した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂで分画した結果を示すグラフである。
【図４】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適基質の測定結果を示すグラフである。
【図５】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適基質の測定結果を示す説明図である。
【図６】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適基質の測定結果を示すグラフである。
【図７】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図８】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適ｐＨの測定結果を示すグラフである。
【図１０】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適ｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１４】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１５】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの最適温度の測定結果を示すグラフである。
【図１６】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１７】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するＮ−アセチルグルコサミニダーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１８】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼの温度安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１９】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するキチナーゼによる部分的脱アセチル化キチン分解産物の薄層クロマトグラフ法で分画した結果を示す説明図である。
【図２０】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産するβ−１，３−グルカナーゼによるラミナランの分解産物の薄層クロマトグラフ法で分画した結果を示す説明図である。
【図２１】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケ子実体粉末の酵素無処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２２】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケ子実体粉末の酵素処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２３】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるビール酵母細胞壁の酵素無処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２４】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるビール酵母細胞壁の酵素処理区分の分解結果を示す写真である。
【図２５】本発明のトリコデルマ  ビリデ  ＴＶ１の生産する酵素製剤（原粉末）の溶液によるシイタケシイタケ子実体粉末及びビール酵母細胞壁の酵素処理区分によるアミノ酸類の増加を示す説明図である。