(57)【要約】【課題】  本発明は、天然物由来のアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質であって、効果が顕著でかつ食品に適したものを見いだすことを課題とする。【解決手段】  卵黄由来蛋白質あるいはサケ卵由来蛋白質に、蛋白質分解酵素を作用させ得られた蛋白質分解物にアンジオテンシンI変換酵素活性阻害作用を見いだした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵黄由来蛋白質を蛋白質分解酵素により分解して得られる、アンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物。
【請求項２】
卵黄由来蛋白質が脱脂されたものである請求項１記載のアンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物。
【請求項３】
サケ卵由来蛋白質を蛋白質分解酵素により分解して得られる、アンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物。
【請求項４】
蛋白質分解酵素がBacillus subtilis由来である請求項１、２又は３記載のアンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物。
【請求項５】
請求項１、２、３又は４記載の蛋白質分解物を有効成分とするアンジオテンシンI変換酵素活性阻害剤。
【請求項６】
請求項１、２、３又は４記載の蛋白質分解物を有効成分とする血圧降下剤。
【請求項７】
請求項１、２、３又は４記載の蛋白質分解物を含有する加工食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンジオテンシンI変換酵素に対する阻害活性を有し、血圧降下などの機能を発揮する蛋白質分解物並びに該蛋白質分解物を有効成分とするアンジオテンシンI変換酵素阻害剤および該蛋白質分解物を含有する食品または医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は高脂血症、糖尿病、肥満と共に動脈硬化を起こしやすい原因の一つである。高血圧症と診断される人口は日本で２０００万人以上と推定されその予備軍も相当数に上ると言われており、その治療および予防は緊急かつ重要な課題となっている。
【０００３】
アンジオテンシンI変換酵素とはアンジオテンシンIのC末端のジペプチドを除去する酵素のことである。この酵素はレニンーアンジオテンシン系（血圧上昇系）の活性化とカリクレインーキニン系（降圧系）の不活性化作用を同時にもっており、結果として血圧を上昇させる作用を示す。従がってアンジオテンシンI変換酵素の活性を阻害するような物質は血圧の上昇を抑制できるのでそこに焦点を合わせて医薬品および阻害物質を含む食品が開発されている。
【０００４】
アンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質は化学的合成によるものの他に天然物を起源とするものが知られており、これまでにマグロ（特許登録第２０４９１４７号公報(特許文献１)）、イチジクの樹液（特許登録第２７９４０９４号公報(特許文献２)）、ナンキョクオキアミ（特許登録第２０８８６１２号公報(特許文献３)）、大豆蛋白（特許登録第１９７６３２８号公報(特許文献４)）、いわし（特許登録第２０８６０３２号公報(特許文献５)）、カゼイン（特許登録第１８１４５３１号公報(特許文献６)）、かつお節（特開平０４−６９３９７号公報(特許文献７)）、グルテン（特開平０４−６６５９４号公報(特許文献８)）、米蛋白（特開平０４−２７９５２９号公報(特許文献９)）、わかめ（特開２００３−１２８６９４号公報(特許文献１０)）、マガキ（特開２００３−８１９９７号公報(特許文献１１)）などから得られた蛋白質分解物が開示されている。しかしながらこれらの中で実用化されているものは非常にすくない。その理由としては経口摂取時の効果が不足していること、味・臭いが悪く食品として適していないことなどが挙げられる。
【０００５】
【特許文献１】特許登録第２０４９１４７号公報
【特許文献２】特許登録第２７９４０９４号公報
【特許文献３】特許登録第２０８８６１２号公報
【特許文献４】特許登録第１９７６３２８号公報
【特許文献５】特許登録第２０８６０３２号公報
【特許文献６】特許登録第１８１４５３１号公報
【特許文献７】特開平０４−６９３９７号公報
【特許文献８】特開平０４−６６５９４号公報
【特許文献９】特開平０４−２７９５２９号公報
【特許文献１０】特開２００３−１２８６９４号公報
【特許文献１１】特開２００３−８１９９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、天然物由来のアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質であって、効果が顕著でかつ食品に適したものを見いだすことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、卵黄由来蛋白質あるいはサケ卵由来蛋白質に、蛋白質分解酵素を作用させ得られた蛋白質分解物にアンジオテンシンI変換酵素活性阻害作用を見いだし、種々検討を行った結果本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は
(１)卵黄由来蛋白質を蛋白質分解酵素により分解して得られる、アンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物、
(２)卵黄由来蛋白質が脱脂されたものである(１)記載のアンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物、
(３)サケ卵由来蛋白質を蛋白質分解酵素により分解して得られる、アンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物、
(４)蛋白質分解酵素がBacillus subtilis由来である(１)、(２)又は(３)記載のアンジオテンシンI変換酵素活性を阻害する蛋白質分解物、
(５)(１)、(２)、(３)又は(４)記載の蛋白質分解物を有効成分とするアンジオテンシンI変換酵素活性阻害剤、
(６)(１)、(２)、(３)又は(４)記載の蛋白質分解物を有効成分とする血圧降下剤、
(７)(１)、(２)、(３)又は(４)記載の蛋白質分解物を含有する加工食品
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明で得られた卵黄由来蛋白質分解物あるいはサケ卵由来蛋白質分解物は、強力なアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有するので、高血圧の予防、治療に有用である。
【００１０】
また、本発明で得られた蛋白質分解物は風味が良く、経口による摂取が可能であることから、有用な作用を有する食品、健康食品および特定保健用食品としての利用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係る蛋白質分解物は、卵黄由来蛋白質、特に脱脂された卵黄由来蛋白質あるいはサケ卵由来蛋白質分解物を蛋白質分解酵素で分解することにより得られる。本発明において用いられる卵黄由来蛋白質の原料となる卵は、家禽類の卵であれば何でもよく、産地、形態も問わない。入手の方法から好ましくは鶏卵が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００１２】
本発明に用いられる卵黄由来蛋白質あるいはサケ卵由来蛋白質を得る方法は、特に限定されないが、原料となる卵黄は生卵黄液、冷凍卵黄液、粉末卵黄などのいずれの形態であってもよく、サケ卵についても生サケ卵、冷凍サケ卵、粉末サケ卵などいずれの形態であってもよい。生卵黄液、冷凍卵黄液、生サケ卵、冷凍サケ卵などの含水原料については、噴霧乾燥（スプレードライ）や凍結乾燥（フリーズドライ）させて水分を除去する方が脂質抽出効率が良好となるため好ましい。また、脱脂の方法は、通常抽出溶剤として用いられるエタノール、ヘキサン、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトン、エーテル、クロロホルム、メタノール等から選ばれる１種または２種以上の有機溶剤で脂質成分を抽出除去する方法が用いられる。この脱脂された卵黄またはサケ卵から残存する有機溶剤を水洗することによって、本発明に用いられる卵黄由来蛋白質あるいはサケ卵由来蛋白質が得られる。
【００１３】
本発明において用いられる蛋白質分解酵素としては、例えばBacillius属（Bacillius subtilis, Bacillius stearothermophilus, Bacillius licheniforisなど）の生産する酵素、Aspergillus属（例えばAspergillus niger, Aspergillus mellens, Aspergillus oryzaeなど）の生産する酵素、Rhizopus属（例えばRhizopus niveus, Rhizopus delemarなど）の生産する酵素、ペプシン、パンクレアチン、パパインなどが挙げられる。これらの酵素は、単独または２種類以上を順次作用させてもよい。
【００１４】
脱脂卵黄由来蛋白質またはその他の卵黄由来蛋白質を蛋白質分解酵素で分解する方法は、常法に従って行う。例えば、本発明に係る蛋白質分解物を含有している卵黄由来蛋白質を所望により水に分散させた後、使用する酵素の至適温度まで加温し、pHを使用する酵素の至適値に調整し、酵素を加えてインキュベートする。酵素分解の温度およびpHは、その酵素の至適温度、至適pHで行うことが反応時間の短縮や酵素の安定性上望ましいが、それに限定されるものでなく常識的に許容される範囲内の条件であればよい。所定時間経過後に酵素を失活させて得た酵素処理液を遠心分離、ろ過等で未分解の蛋白質を除去し上清を得る。こうして得た上清をフリーズドライ等で乾燥させることでアンジオテンシンI変換酵素阻害活性が高く、風味の良いアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質を得ることができる。
【００１５】
本発明で得られる蛋白質分解物は必要に応じて賦形剤などの添加剤と混合して例えば注射剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤などの形態で製品化することができる。さらに本発明で得られる蛋白質分解物は、味、臭いに特異な厭味がないことから、経口により摂取することが可能である。投与量は、通常、成人で蛋白質分解物の重量として１日あたり２０ｍｇ以上〜６００ｍｇ以下を数回に分けて服用するのが適当である。そのため、本発明で得られる蛋白質分解物それ自体、あるいは該蛋白質分解物を食品に配合、添加し提供することができる。
【００１６】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の蛋白質分解物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の蛋白質分解物の他に、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００１７】
ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。  
【００１８】
崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例としてあげることができる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例としてあげることができる。また、蛋白質分解物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００１９】
非経口剤として本発明の所望の効果を発現せしめるには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で糖脂質の重量として１日あたり１〜６０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の蛋白質分解物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤等があげられ、これらも常法に従って製造される。
【００２０】
本発明の他の組成物の好適な態様は食用組成物である。すなわち、前述のようにして得られるアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００２１】
これらの食品類あるいは食用組成物における本発明のアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明のアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質は、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【００２２】
本発明の医薬用組成物および食用組成物は、高血圧、動脈硬化、心不全を予防する作用あるいは治癒作用をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用されるが、とりわけ血圧降下剤として有効である。また、これらの疾患の予防措置の手段としても使用することが可能である。
以下に本発明のアンジオテンシンI変換酵素活性阻害物質について具体的に説明する。
【実施例１】
【００２３】
ビオプラーゼ分解による卵黄由来蛋白質
鶏卵黄をフリーズドライで乾燥し卵黄乾燥物を得た。卵黄乾燥物１００gにエタノール５００ml加え５０℃で油分を抽出した。ろ過により残渣を得、さらにエタノール４００ml加え５０℃で油分を抽出した。ろ過により残渣を得、フリーズドライにより乾燥し、卵黄由来蛋白質を５０ｇ得た。卵黄由来蛋白質１gを水３０mlに分散させ、これにビオプラーゼ（登録商標名、Bacillus subtilis由来、ナガセケムテックス(株)製）、４０mgを添加して５０℃、pH７で２０時間処理した。２０時間後、１００℃で１０分間煮沸し酵素失活した。酵素失活後ろ過し、ろ過液を得た。ろ過液をフリーズドライし蛋白質分解物を０．５g得、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を測定した。その結果を表１に示す。
【００２４】
なお、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定は下記の方法で行った。ヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン（シグマ社製）２５mgをpH８．３のホウ酸緩衝液１０mlに溶解し、５．８３mMのヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシン基質溶液を得た。アンジオテンシン変換酵素阻害溶液は、アンジオテンシン変換酵素（シグマ社製）０．２５UをpH８．３のホウ酸緩衝液１．２５mlに溶解し、さらに４倍希釈した。つまり２．５mU/５０μl濃度のアンジオテンシン変換酵素溶液を得た。試料は蒸留水で８mg/１０ml濃度に調製した。試験管に試料溶液５０μl、基質溶液１５０μlおよびアンジオテンシンI変換酵素溶液５０μlを添加し、３７℃で２時間反応した後１Nの塩酸２５０μlを加え反応を停止した。１．５mlの酢酸エチルを加えて激しく振とうし、その液を３５００rpmで２分間遠心分離した。酢酸エチル層を１ml採取し、減圧下で酢酸エチルを除去した。蒸留水１mlを加え溶解させ、２２８nmにおける吸光度により、ヒプリル酸の量を測定して酵素活性とした。またポジティブコントロールとしてイワシペプチドを用いた。アンジオテンシンI変換酵素阻害活性は次式により算出した。
アンジオテンシン変換酵素阻害活性（％）＝（Ec−Es）/（Ec−Eb）×１００
Es：試料を添加して反応させた時の吸光度
Ec：試料の代わりに緩衝液を添加した時の吸光度
Eb：アンジオテンシンI変換酵素を添加せずに反応させた時の吸光度
【実施例２】
【００２５】
パパイン分解による卵黄由来蛋白質
実施例１と同様の方法で得られた卵黄由来蛋白質１gを水３０mlに分散させ、これにパパイン(Carica papaya L由来、ナガセケムテックス(株)製)、４０mgを添加して５０℃、pH７で２０時間処理した。２０時間後、１００℃で１０分間煮沸し酵素失活した。酵素失活後ろ過し、ろ過液を得た。ろ過液をフリーズドライし蛋白質分解物を０．１８g得、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表１に示す。
【実施例３】
【００２６】
デナチーム分解による卵黄蛋白分解物
実施例１と同様の方法で得られた卵黄由来蛋白質１gを水３０mlに分散させ、これにデナチーム(登録商標名、Aspergillus oryzae由来、ナガセケムテックス(株)製)、４０mgを添加して５０℃、pH７で２０時間処理した。２０時間後、１００℃で１０分間煮沸し酵素失活した。酵素失活後ろ過し、ろ過液を得た。ろ過液をフリーズドライし蛋白質分解物を０．２５g得、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表１に示す。
【実施例４】
【００２７】
デナプシン分解による卵黄蛋白分解物
実施例１と同様の方法で得られた卵黄由来蛋白質１gを水３０mlに分散させ、これにデナプシン(登録商標名、Aspergillus niger由来、ナガセケムテックス(株)製)、４０mgを添加して５０℃、pH３で２０時間処理した。２０時間後、１００℃で１０分間煮沸し酵素失活した。酵素失活後ろ過し、ろ過液を得た。ろ過液をフリーズドライし蛋白質分解物を０．２８g得、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2005145827.tif 000002
【００２９】
各酵素の中で、ビオプラーゼ処理による蛋白分解物が最も強いアンジオテンシン変I換酵素阻害活性を示した。
表２に各酵素処理による卵黄由来蛋白分解物の収率を示す。
【００３０】
【表２】
2005145827.tif 000003
ビオプラーゼ処理による卵黄由来蛋白分解物の収率が、最も良い結果であった。
【実施例５】
【００３１】
ビオプラーゼ分解によるサケ卵蛋白分解物
サケ卵をフリーズドライで乾燥しサケ卵乾燥物を得た。サケ卵乾燥物１００gにエタノール５００ml加え５０℃で油分を抽出した。ろ過により残渣を得、さらにエタノール４００ml加え５０℃で油分を抽出した。ろ過により残渣を得、フリーズドライにより乾燥し、サケ卵由来蛋白質を４０ｇ得た。サケ卵由来蛋白質１gを水３０mlに分散させ、これにビオプラーゼ（登録商標名、Bacillus subtilis由来、ナガセケムテックス(株)製）、４０mgを添加して５０℃、pH７で２０時間処理した。２０時間後、１００℃で１０分間煮沸し酵素失活した。酵素失活後ろ過し、ろ過液を得た。ろ過液をフリーズドライし蛋白質分解物を０．５g得、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を実施例１と同様に測定した。その結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
2005145827.tif 000004
【００３３】
各酵素の中で、ビオプラーゼ処理による蛋白分解物が最も強いアンジオテンシン変I換酵素阻害活性を示した。
表４にビオプラーゼ処理によるサケ卵由来蛋白質分解物の収率を示す。
【００３４】
【表４】
2005145827.tif 000005
【００３５】
ビオプラーゼ処理によるサケ卵由来蛋白質の収率が、最も良い結果であった。
表５に卵黄由来蛋白質分解物、サケ卵由来蛋白質分解物とポジティブコントロールとして用いたイワシペプチドのアンジオテンシン変I換酵素阻害活性を示した。
【００３６】
【表５】
2005145827.tif 000006
【００３７】
卵黄由来蛋白質分解物はサケ卵由来蛋白分解物およびイワシペプチドより同濃度において明らかに高い阻害活性を示した。
また、サケ卵由来蛋白質分解物もイワシペプチドに比べ、２倍以上のアンジオテンシン変I換酵素阻害活性を示した。
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月26日(2003.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
各酵素の中で、ビオプラーゼ処理による蛋白分解物が最も強いアンジオテンシンI変換
酵素阻害活性を示した。
表２に各酵素処理による卵黄由来蛋白分解物の収率を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
各酵素の中で、ビオプラーゼ処理による蛋白分解物が最も強いアンジオテンシンI変換
酵素阻害活性を示した。
表４にビオプラーゼ処理によるサケ卵由来蛋白質分解物の収率を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ビオプラーゼ処理によるサケ卵由来蛋白質の収率が、最も良い結果であった。
表５に卵黄由来蛋白質分解物、サケ卵由来蛋白質分解物とポジティブコントロールとして用いたイワシペプチドのアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
卵黄由来蛋白質分解物はサケ卵由来蛋白分解物およびイワシペプチドより同濃度において明らかに高い阻害活性を示した。
また、サケ卵由来蛋白質分解物もイワシペプチドに比べ、２倍以上のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を示した。