(57)【要約】【課題】  シュードノカルジア菌と該菌を利用してコンパクチンを生物転化して  プラバスタチンとなす方法の提供。【解決手段】  本発明は増菌培地により高濃度キノリン（ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）を分解させられ、コンパクチンナトリウムに対する高い耐性を示し、コンパクチンナトリウムをプラバスチンナトリウムに転化させる水酸化活性を有することに特徴を有する新規微生物シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４２を提供する。本発明はまた、上記新規微生物シュードノカルジア菌の発酵によりコンパクチンナトリウムをプラバスチンナトリウムに転化させるプロセスを提供する。プラバスチンナトリウムは高コレステロール症に対する有効なコレステロール低減薬となりうる。【選択図】        図１
2005192569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４）であり、キノリン（ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）を分解でき、５００マイクログラム／ミリリットル以上のコンパクチンナトリウムに対して耐性を有し、且つ生物転化方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを有効に合成でき、以下の微生物化学特性を有することを特徴とする、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４。
（ｉ）細胞化学成分分析
細胞壁アミノ酸及び全細胞糖類成分はそれぞれｍｅｓｏ−ＤＡＰ、ガラクトース、アラビノース、ブドウ糖、リボースとされ、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ氏等の分類によると、ケモタイプ（Ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ）  III Ａ型に属し、ミコール酸（ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含有せず、主要なメソキノン（ｍｅｓｏｑｕｉｎｏｎｅ）種類はＭＫ−８（Ｈ4 ）であり、且つ大量の分岐状脂肪酸（ｉｓｏ−Ｃ１６：０，ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０）と、少量のメチル基脂肪酸（１０  メチル−Ｃ１６：０，Ｃ１７：０，１８−０）を含有する
（ｉｉ）菌株の形態特徴
菌株は培地上の栄養菌糸は黄褐色或いは乳黄色とされ、気生菌株は乳白色（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ）とされ、可溶性色素或いはメラニンを発生せず、気生菌糸上に直鎖状胞子鎖が発生し、胞子表面は滑らかで、栄養菌糸は多くの分岐を有し且つ断裂を発生しうる
（ｉｉｉ）菌株の各種炭水化物及び物質に対する利用は以下のとおりであり、
分解：
Ｌ−チロシン：陽性反応
乳蛋白：陽性反応
キサンチン：陽性反応
第２キサンチン：陽性反応
エスクリン（ｅｓｃｕｌｉｎ）：陽性反応
ウレアーゼ発生：陰性反応
硝酸酵素発生：陰性反応
溶菌酵素耐性：陰性反応
メラニン発生：陰性反応
ゼラチン液体化：陰性
以下の化合物を唯一の炭素源としての利用：
ｍｅｓｏ−イノシトール：弱反応
Ｄ−マンニトール：陽性反応
Ｌ−ラムノース（Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ）：陽性反応
Ｌ−アラビノース：弱反応
ブドウ糖：陽性反応
キシロース：陽性反応
スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）：弱反応
果糖：陽性反応
植物蜜糖：弱反応
サリチル酸：陽性反応
リビトール：陽性反応
プロリン：陽性反応
セロビオース：陽性反応
ガラクトース：陽性反応
グルコン酸：陽性反応
ウラシル：陰性反応
ラクトース：弱反応
ソルビトール：弱反応
麦芽糖：陽性反応
（ｉｖ）以上の結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ対比後に、この菌株はシュードノカルジア  アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｌｎｉ）と鑑定される。
【請求項２】
請求項１記載のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４において、食品工業発展研究所に寄託され、菌種コードはＢＣＲＣ９１０２０９であることを特徴とする、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４。
【請求項３】
コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、請求項１記載のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４を使用し、発酵方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成し、そのうち該発酵方法において、種菌を乳蛋白加水分解物０．１％；酵母抽出物０．１５％；可溶性澱粉１％；ＫＨ2 ＰＯ4   ０．０５％；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．１％；プラバスタチンナトリウム０．００５％；バクト（Ｂａｃｔｏ）寒天２．０％を含むｐＨ７．０の種菌培地に接種し、摂氏２８度で７日〜２０日培養し、５００ミリリットル三角フラスコ内の酵母抽出物０．４％、麦芽抽出物０．３５％、ペプトン０．６％、ブドウ糖１．０％、綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１％、Ｎａ2 ＨＰＯ4 
０．４％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０２％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ  ０．００２％、ＣａＣｌ2   ０．００２％、コンパクチンナトリウム  ０．００５％を含む５０ミリリットルのｐＨ６．５のＹＭＧ液体培地に、３−１０％種菌を接種し、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度で４８時間振動培養した後、５００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養することを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法。
【請求項４】
請求項３記載のコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４は食品工業発展研究所に寄託され、菌種コードはＢＣＲＣ９１０２０９であることを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法。
【請求項５】
請求項３記載のコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、ＹＭＧ液体生産培地のコンパクチンナトリウムの添加量は３００−３，０００マイクログラム／ミリリットルであることを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４と該菌を利用してコンパクチンを生物転化して  プラバスタチンとなす方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳血管疾病、心臓病及びその併発症は、いずれも動脈粥状効果に起因し、血液中の脂肪の異常はその最も主要な悪化因子であり、そのうち、高脂血症とは血液中の主要な脂肪即ちコレステロールとトリグリセライドが多くなり過ぎることを指す。コレステロールは基本のアセチルコエンザイムＡ（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）単位が２０個を超えるステップを経ることで合成され、そのうちネック反応はＨＭＧ−ＣｏＡがメバロン酸（Ｍｅｖａｌｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）に転化するステップであり、このステップはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素による触媒反応によりなる。１９８７年、メバコル（Ｍｅｖａｃｏｒ（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ））が市販されて後、いわゆる「スタチン（Ｓｔａｔｉｎｓ）世紀」が開けた。常用されるスタチンには、メバコル（Ｍｅｖａｃｏｒ）、ゾコール（Ｚｏｃｏｒ，Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ，Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）、及びリピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ，Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）等がある。このような薬物の主成分の作用メカニズムはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を抑制して、これによりコレステロールの生成量を減らすことである。
【０００３】
プラバスタチンは一つの水酸基を有し、一種の高親水性の化合物であり、選択的にコレステロール合成の主要器官（肝臓及び小腸）に作用し、コレステロールの生合成を阻害し、肝コレステロール含有量を減らし、低密度リポ蛋白受容体の活性を増強し、血中の肝臓に向かう低密度リポ蛋白摂取を増加し、これにより血清中の低密度リポ蛋白−コレステロールを低減し、迅速且つ強力に血清コレステロールを低減し、血清脂質を改善する。このほか、プラバスタチンはその有する器官選択性により、肝臓と小腸以外の器官（ホルモン生成の器官を含む）に対する作用は非常に弱く、これにより副作用は比較的小さい。プラバスタチン製造工程は最も煩瑣ではあるが、現在知られている最も有効なコレステロール降下薬の一つであり、低密度リポ蛋白−コレステロールの低減に対して卓越した治療効果を有し、また臨床で分かったことは、動脈粥状硬化防止或いは心血管疾病減少の治療効果はその他のコレステロール硬化薬物よりも遥かに優れ、長期の使用しても非常に安全であり、且つ癌症の発生率を増加させず、使用に便利で、副作用が少ない。これにより、市場でも一位を占有している。また一方で、プラバスタチンの治療効果は続々と発見され、例えば非特許文献１によると、現在、老人性痴呆症はプラバスタチンにより発生率を７３％に下げることができる。このほか非特許文献２によると、中風の発生率を平均約２２％に下げることができる。これらの初歩の観察結果は医療の根拠となすことはできず、医師は処方時にこれらの暗示を受けてプラバスタチンの容量或いは使用時機を増し得て、さらには製剤成分及び技術が改良される発展傾向下にあって、プラバスタチンも処方薬から製薬に転化され得て、その市場の規模には見るべきものがある。
【０００４】
プラバスタチンの二段階生産法は発酵法でコンパクチンを合成し、更に微生物の発生する酵素群でコンパクチンをプラバスタチンと成す。コンパクチン生物転化してプラバスタチンを合成する菌株にはストレプトマイセスロゼオクロモゲヌＲＲＲＬ−１２３３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕ  ＲＲＲＬ−１２３３）、ストレプトマイセスロゼオクロモゲヌスＩＦＯ−３３６３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ  ＩＦＯ−３３６３）、ストレプトマイセスロゼオクロモゲヌスＩＦＯ−３４１１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｕｓ  ＩＦＯ−３４１１）（特許文献１）、ストレプトマイセスカルボフィルスＳＡＮＫ−６２５８５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ  ＳＡＮＫ−６２５８５）（Ｆｅｒｍ  ＢＰ−１１４５，特許文献２）等の放線菌がある。しかしこれらの微生物のオリジナル菌株のコンパクチンに対する耐性は高くなく、このためプラバスタチンの生産量の低下がもたらされる。最近続々とコンパクチンに対する耐性が非常に高い菌株が発表されて特許を受けており、転化率が５０％以上のものには、例えば、ストレプトマイセスエクスフォリエーテス  ｙｊ−１１８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ  ｙｊ−１１８）（特許文献３）、マイクロモノスポラｓｐ．（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）（特許文献４）、アクティノマドゥラ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ５５６７８（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ５５６７８）（特許文献５）がある。
【０００５】
ストレプトマイセスカルボフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｂｏｐｈｉｌｕｓ）を例に挙げると、コンパクチンを生物転化してプラバスタチンを合成する時、この水酸化反応は単一酵素により完成されるのではなく、シトクロームＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）、還元酵素、ＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨ再生システムにより構成される。これにより、コンパクチンを転化してプラバスタチンとなす微生物は自然界中に普遍に存在するものの、コンパクチンに対する耐性及び転化効率に対して経済価値を有するものは非常に少ない。
【０００６】
【非特許文献１】Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０００；５７：１４３９−１４４３
【非特許文献２】Ｂｙｉｎｇｔｏｎ  ＲＰ，Ｄａｖｉｓ  ＢＲ，Ｐｌｅｈｎ  ＪＦ，Ｗｈｉｔｅ  ＨＤ，Ｂａｋｅｒ  Ｊ，Ｃｏｂｂｅ  ＳＭ，Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  Ｊ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｏｋｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ：ｔｈｅＰｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ  Ｐｏｏｌｉｎｇ（ＰＰＰ）Ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００１  Ｊａｎ  ２３；１０３（３）：３８７−９２．
【特許文献１】米国特許第４，３４６，２２７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１７９，０１３号明細書
【特許文献３】米国特許第３，３０６，６２９号明細書
【特許文献４】ＷＯ特許第０１０３６４７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２７４，３６０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、一種の新規微生物シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４を提供することにあり、この菌の特徴は、キノリン（ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）を分解させられ、コンパクチンナトリウムに対する非常に高い耐性を示し、生物転化方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスチンナトリウムを有効に合成できることにある。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスチンナトリウムを合成する方法を提供することにある。その特徴は、上述のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４を使用して生物転化方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１の発明は、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４）であり、キノリン（ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）を分解でき、５００マイクログラム／ミリリットル以上のコンパクチンナトリウムに対して耐性を有し、且つ生物転化方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを有効に合成でき、以下の微生物化学特性を有することを特徴とする、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４である。
（ｉ）細胞化学成分分析
細胞壁アミノ酸及び全細胞糖類成分はそれぞれｍｅｓｏ−ＤＡＰ、ガラクトース、アラビノース、ブドウ糖、リボースとされ、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ氏等の分類によると、ケモタイプ（Ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ）  III Ａ型に属し、ミコール酸（ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含有せず、主要なメソキノン（ｍｅｓｏｑｕｉｎｏｎｅ）種類はＭＫ−８（Ｈ4 ）であり、且つ大量の分岐状脂肪酸（ｉｓｏ−Ｃ１６：０，ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０）と、少量のメチル基脂肪酸（１０  メチル−Ｃ１６：０，Ｃ１７：０，１８−０）を含有する
（ｉｉ）菌株の形態特徴
菌株は培地上の栄養菌糸は黄褐色或いは乳黄色とされ、気生菌株は乳白色（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ）とされ、可溶性色素或いはメラニンを発生せず、気生菌糸上に直鎖状胞子鎖が発生し、胞子表面は滑らかで、栄養菌糸は多くの分岐を有し且つ断裂を発生しうる
（ｉｉｉ）菌株の各種炭水化物及び物質に対する利用は以下のとおりであり、
分解：
Ｌ−チロシン：陽性反応
乳蛋白：陽性反応
キサンチン：陽性反応
第２キサンチン：陽性反応
エスクリン（ｅｓｃｕｌｉｎ）：陽性反応
ウレアーゼ発生：陰性反応
硝酸酵素発生：陰性反応
溶菌酵素耐性：陰性反応
メラニン発生：陰性反応
ゼラチン液体化：陰性
以下の化合物を唯一の炭素源としての利用：
ｍｅｓｏ−イノシトール：弱反応
Ｄ−マンニトール：陽性反応
Ｌ−ラムノース（Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ）：陽性反応
Ｌ−アラビノース：弱反応
ブドウ糖：陽性反応
キシロース：陽性反応
スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）：弱反応
果糖：陽性反応
植物蜜糖：弱反応
サリチル酸：陽性反応
リビトール：陽性反応
プロリン：陽性反応
セロビオース：陽性反応
ガラクトース：陽性反応
グルコン酸：陽性反応
ウラシル：陰性反応
ラクトース：弱反応
ソルビトール：弱反応
麦芽糖：陽性反応
（ｉｖ）以上の結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ対比後に、この菌株はシュードノカルジア  アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｌｎｉ）と鑑定される。
請求項２の発明は、請求項１記載のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４において、食品工業発展研究所に寄託され、菌種コードはＢＣＲＣ９１０２０９であることを特徴とする、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４としている。
請求項３の発明は、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、請求項１記載のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４を使用し、発酵方法を利用してコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成し、そのうち該発酵方法において、種菌を乳蛋白加水分解物０．１％；酵母抽出物０．１５％；可溶性澱粉１％；ＫＨ2 ＰＯ4   ０．０５％；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．１％；プラバスタチンナトリウム０．００５％；バクト（Ｂａｃｔｏ）寒天２．０％を含むｐＨ７．０の種菌培地に接種し、摂氏２８度で７日〜２０日培養し、５００ミリリットル三角フラスコ内の酵母抽出物０．４％、麦芽抽出物０．３５％、ペプトン０．６％、ブドウ糖１．０％、綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１％、Ｎａ2 ＨＰＯ4   ０．４％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０２％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ  ０．００２％、ＣａＣｌ2   ０．００２％、コンパクチンナトリウム  ０．００５％を含む５０ミリリットルのｐＨ６．５のＹＭＧ液体培地に、３−１０％種菌を接種し、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度で４８時間振動培養した後、５００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養することを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法としている。
請求項４の発明は、請求項３記載のコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４は食品工業発展研究所に寄託され、菌種コードはＢＣＲＣ９１０２０９であることを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法としている。
請求項５の発明は、請求項３記載のコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法において、ＹＭＧ液体生産培地のコンパクチンナトリウムの添加量は３００−３，０００マイクログラム／ミリリットルであることを特徴とする、コンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成する方法としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４は窒素含有の多環芳香水酸化−キノリンに対して非常に良好な分解能力を有し、またコンパクチンナトリウムに対する高い耐性を有し、発酵培養方式を利用してコンパクチンナトリウムを転化して有効にプラバスタチンナトリウムを合成でき、プラバスタチンはコレステロール低減の原料薬とされ得る。現在のところこの菌種を利用してプラバスタチンを生産する特許或いは文献報告はない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に本発明の新規なシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４について詳細に説明する。
【００１２】
１．菌種スクリーニング
中國石油股ふん有限公司の菌種バンク中には自由汚染土壌からの多株の多環芳香族炭化水素転化菌株があり、単独或いは同時にキノリン、ベンズ〔ａ〕アントラセン（ｂｅｎｚ〔ａ〕ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）或いはナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）を分解可能で、これらの菌株種をそれぞれＹＭ液体培地（酵母抽出物０．３％、麦芽抽出物０．３％、ペプトン０．５％、ブドウ糖１％、ｐＨ６．５）中で、回転速度２００ｒｐｍ、摂氏２８度で４８時間培養した後、１００−１，０００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、続けて２４−７２時間培養し、ＨＰＬＣでコンパクチンナトリウムの利用率とプラバスタチンナトリウム転化率を定量した。その結果、７株の菌株がこの条件下でコンパクチンをプラバスタチンに転化する能力を有した。そのうちシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４はコンパクチンナトリウムに対して最高の耐性を有し、並びに有効にコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成できた。この菌株は一種のキノリン分解菌とされる。
【００１３】
２．菌株鑑定
シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４に対して食品工業発展研究所で菌種鑑定を行ない、以下の菌株細胞化学成分分析、菌株の形態特徴及び菌糸の生理、生化学特性対比の結果、この菌種はシュードノカルジア  アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｌｎｉ）とされ、シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４と命名され、この菌種は食品工業発展研究所に寄託され、菌種コードはＢＣＲＣ９１０２０９とされた。
【００１４】
（ｉ）細胞化学成分分析
細胞壁アミノ酸及び全細胞糖類成分はそれぞれｍｅｓｏ−ＤＡＰ、ガラクトース、アラビノース、ブドウ糖、リボースとされた。Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ氏等の分類によると、ケモタイプ（Ｃｈｅｍｏｔｙｐｅ）III Ａ型に属し、ミコール酸（ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含有せず、主要なメソキノン（ｍｅｓｏｑｕｉｎｏｎｅ）種類はＭＫ−８（Ｈ4 ）であり、且つ大量の分岐状脂肪酸（ｉｓｏ−Ｃ１６：０，ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０）と、少量のメチル基脂肪酸（１０  メチル−Ｃ１６：０，Ｃ１７：０，１８−０）を含有する。
【００１５】
（ｉｉ）菌株の形態特徴
菌株は培地上の栄養菌糸は黄褐色或いは乳黄色とされ、気生菌株は乳白色（ｙｅｌｌｏｗｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ）とされ、可溶性色素或いはメラニンを発生しない（表１）。気生菌糸上に直鎖状胞子鎖が発生し、胞子表面は滑らかで、栄養菌糸は多くの分岐を有し且つ断裂を発生しうる（図１、２）。
【００１６】
【表１】
2005192569.tif 000003
【００１７】
（ｉｉｉ）菌株の各種炭水化物及び物質に対する利用は表２のとおりである。
【００１８】
【表２】
2005192569.tif 000004
【００１９】
（ｉｖ）以上の結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ対比後に、この菌株はシュードノカルジア  アルニ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｌｎｉ）と鑑定された。
【００２０】
３．シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４のコンパクチンナトリウムに対する耐性
（１）種菌培養
種菌を種菌培地（乳蛋白加水分解物０．０５−０．２％；酵母抽出物０．０５−０．２％；可溶性澱粉０．５−２．０％；ＫＨ2 ＰＯ4   ０．０１−０．０８％；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０５−０．２％；プラバスタチンナトリウム０．００５−０．０１％；バクト（Ｂａｃｔｏ）寒天２．０％，ｐＨ７．０）に接種し、摂氏２８度で７日〜２０日培養する。
【００２１】
（２）フラスコ発酵
種菌をコンパクチンナトリウムを含有するＹＭＧ液体培地（酵母抽出物０．１−１．０％、麦芽抽出物０．１−１．０％、ペプトン０．１−１．０％、ブドウ糖０．５−２．０％、綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）０．５−０．５％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１−０．５％、Ｎａ2 ＨＰＯ4   ０．３−０．７％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０１−０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００１−０．０１％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ  ０．００１−０．０１％、ＣａＣｌ2   ０．００１−０．０１％、コンパクチンナトリウム  ０．００２−０．０１％、ｐＨ６．５）中で、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度で培養した。
【００２２】
（３）シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４のコンパクチンナトリウムに対する耐性
上述のフラスコ培養４８時間の後、３００−３，０００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養し、２４時間毎にＨＰＬＣでコンパクチンナトリウムの利用率とプラバスタチンナトリウム転化率を定量した。その結果、コンパクチンナトリウム添加量が２，５００マイクログラム／ミリリットルを超えると、菌体生長は相当に緩慢となり、そのプラバスタチン生成の転化率も３０％を超えない。
【００２３】
４．シュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４のコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを生成する能力
３−１０％の種菌を０．００２−０．０１％のコンパクチンナトリウムを含有するＹＭＧ液体培地中に接種し、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度下で４８時間培養した後、５００−１，５００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養し、ｐＨ値が７．０より高くなった時、０．１−０．８％のブドウ糖、０．０５−０．５％の酵母抽出物、及び０．０５−０．５％の綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）を添加する。２４時間毎にＨＰＬＣでコンパクチンナトリウムの利用率とプラバスタチンナトリウム転化率を定量した。その結果、３６−７２時間内に、コンパクチンナトリウムの利用率は９０％を超え、プラバスタチンナトリウム生成の添加率は約５０−６８％であった。
【００２４】
本発明はまた上述の本発明の新規なシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４を利用しコンパクチンナトリウムををプラバスタチンナトリウムに転化する生物転化方法を提供する。それは上述の発酵方法を使用して有効にコンパクチンナトリウムを転化してプラバスタチンナトリウムを合成し、その転化率は５０−６８％とされうる。
【００２５】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するものであるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２６】
種菌を種菌培地（乳蛋白加水分解物０．１％；酵母抽出物０．１５％；可溶性澱粉１％；ＫＨ2 ＰＯ4   ０．０５％；ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．１％；プラバスタチンナトリウム０．００５％；バクト（Ｂａｃｔｏ）寒天２．０％，ｐＨ７．０）に接種し、摂氏２８度で７日〜２０日培養する。５００ミリリットル三角フラスコ内の５０ミリリットルのＹＭＧ液体培地（酵母抽出物０．４％、麦芽抽出物０．３５％、ペプトン０．６％、ブドウ糖１．０％、綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4   ０．１％、Ｎａ2 ＨＰＯ4   ０．４％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．０２％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ  ０．００５％、ＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ  ０．００２％、ＣａＣｌ2   ０．００２％、コンパクチンナトリウム  ０．００５％、ｐＨ６．５）に、３−１０％種菌を接種し、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度で４８時間振動培養した後、５００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養し、１２時間毎にＨＰＬＣでコンパクチンナトリウムの利用率とプラバスタチンナトリウム転化率を定量した。その結果は表３に示されるとおりである。
【００２７】
ＨＰＬＣ分析条件は以下のとおり：
カラム：Ｃ１８，４．６×２５０ミリメートル
検出器：  ＵＶ２３８ｎｍ
流速：  ０．８ミリリットル／分
移動相：  メタノール：トリエチルアミン（ＴＥＡ）：酢酸：Ｈ2 Ｏ＝７０：０．１：０．１：３０
天火温度：摂氏３５度
【００２８】
【表３】
2005192569.tif 000005
【実施例２】
【００２９】
実施例１の条件で、但し、１，０００マイクログラム／ミリリットルコンパクチンナトリウムを添加する。その結果は表４に示されるとおりである。
【００３０】
【表４】
2005192569.tif 000006
【実施例３】
【００３１】
実施例１の条件で、まず５％種菌を、０．００５％コンパクチンナトリウムを含有するＹＭＧ液体生産培地中に接種し、回転速度２２０ｒｐｍ、摂氏２８度で４８時間培養した後、１，０００マイクログラム／ミリリットルのコンパクチンナトリウムを加え、同じ条件で続けて培養する。培養液に４８時間毎に０．１−０．８％のブドウ糖、０．０５−０．５％の酵母抽出物及び０．０５−０．５％綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）を添加する。２４時間毎にＨＰＬＣでコンパクチンナトリウムの利用率及びプラバスタチンナトリウム転化率を定量する。結果は表５のようである。
【００３２】
【表５】
2005192569.tif 000007
【実施例４】
【００３３】
実施例３の条件で、但し、１２−４８時間毎に１，０００マイクログラム／ミリリットルコンパクチンナトリウムを添加し、同じ条件で続けて培養し、培養液ｐＨが７．０より高くなった時、０．１−０．８％ブドウ糖、０．０５−０．５％の酵母抽出物及び０．０５−０．５％綿実抽出物（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）を添加する。９日後に、コンパクチンナトリウム総添加量は７，０００マイクログラム／ミリリットルであり、コンパクチンナトリウムの利用率は約７６％、プラバスタチン生成の転化率は約５３％であった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４の気生菌糸及び胞子鎖の電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明のシュードノカルジア菌ＲＭＲＣ  ＰＡＨ４の栄養菌糸の写真である。
【図１】
2005192569.tif 000008
【図２】
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