(57)【要約】【課題】  動物細胞の培養物の両面を異なる流動する培地を用いて培養することができ、かつ動物細胞に接する培地において血液による剪断や物質供給を再現し、生体に近い条件下で、細胞層の剥離がない状態で細胞を培養することができるバイオリアクターを提供すること。【解決手段】   少なくとも片面上に動物細胞を付着させるための高分子含水ゲル膜を少なくとも１つ有し、かつ該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができる構造を有する、バイオリアクター。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも片面上に動物細胞を付着させるための高分子含水ゲル膜を少なくとも１つ有し、かつ該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができる構造を有する、バイオリアクター。
【請求項２】
該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができるように、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に流路が設けられている、請求項１に記載のバイオリアクター。
【請求項３】
少なくとも片面上に動物細胞を付着させるための少なくとも１つの高分子含水ゲル膜と、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができるように該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に設けられた流路と、該流路の間に該高分子含水ゲル膜を保持するための手段とを有する、請求項１又２に記載のバイオリアクター。
【請求項４】
高分子含水ゲル膜の一方の面が動物細胞接着性物質で覆われている、請求項１から３の何れか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項５】
細胞に負荷する流れずり応力が2.0dyn/ｃｍ2以上である、請求項１から４の何れか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項６】
高分子含水ゲル膜とリアクター内壁とにより流路が形成され、高分子含水ゲル膜とリアクター内壁との間隙が１０μｍ以上２ｍｍ以下である、請求項１から５のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項７】
該動物細胞が高分子含水ゲル膜表面の90％以上100％以下の領域に接着して被覆している、請求項１から６のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項８】
該高分子含水ゲル膜がキトサンを含む膜である、請求項１から７のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
【請求項９】
該高分子含水ゲルの乾燥膜厚が5μm以上200μm以下である、請求項１から８のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
該動物細胞が２種類以上１０種類以下である、請求項１から９のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
該動物細胞が２層以上１０層以下の重層構造を有している、請求項１から１０のいずれか1項に記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載のバイオリアクターを用いて、少なくとも片面上に動物細胞を付着させた高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことを特徴とする、動物細胞培養方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法で得られる動物細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養の技術に関する。より具体的には、本発明は、動物細胞培養リアクター、該動物細胞培養リアクターを利用した動物細胞の培養方法、該培養方法により得られる動物細胞培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の研究及び開発においては、古くから実験動物が用いられてきている。一方、ヒト特有の代謝機能により実験動物では予知できない医薬品の効能、副作用があることもわかっている。また、最近では動物愛護の観点から実験動物の削減が叫ばれていること、およびヒトでの治験に開発費が多くかかることから、生体と同じ機能を持つ臓器をin vitroで再現することが望まれている。近年、再生医療の技術が出現し、このようなモデルを構築できる可能性がでてきた。
【０００３】
生体内で臓器は血液をはじめとする様々な流体に接することで機能を発現しており、臓器のモデル化には流動系での細胞培養が不可欠であることから、各種のリアクターによる培養方法が提案されている（特許文献１および２参照）。
【０００４】
生体内の流体は毛管を流れ細胞に各種物質を供給し、排泄物を流出させている。また、さらに血管内皮細胞などの流体に直接接する細胞は血流の剪断が細胞への刺激となることが知られている。これらの条件を充たす培養条件を構築するためには、マイクロリアクターでの細胞培養が生体系のモデル化に適していると考えられ、多くの研究がなされている（非特許文献１〜３参照）。
【０００５】
特に肝臓をモデル化するには胆汁に相当する培地が血液に相当する培地に逆流することなく、かつ両培地と細胞間の物質移動が可能な状態での培養が必要となる。このような観点で作製された肝臓モデルとしては、血液側培地から胆汁側培地に流れを作りその途中で細胞培養する方法がある。しかしながら、実際の肝臓では胆汁と血液の間には細胞が存在し、直接することはなく、完全な肝臓モデルとはいえない。
【０００６】
２種類の培地を隔壁を設けて分けて培養する方法としては糸状菌等を用いた物質生産用のバイオリアクターで提案されている（特許文献３及び４参照）。しかしながら、これらの方法では血液の流れを模し、血流の剪断によって細胞への刺激をあたえることが難しく、動物細胞の培養、生体モデルの構築には適さない。
【特許文献１】特開2001-190270号公報
【特許文献２】米国特許第5,202,254号公報
【特許文献３】特開平7-322874号公報
【特許文献４】特開平8-9958号公報
【非特許文献１】Manabu Tokeshi et al, Anal. Chem., 74, 1565 (2002)
【非特許文献２】Shuichi Takayama et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5545 (1999)
【非特許文献３】M. J. Powers et al, Tissue Eng., 8, 499 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、動物細胞の培養物の両面を異なる流動する培地を用いて培養することができ、かつ動物細胞に接する培地において血液による剪断や物質供給を再現し、生体に近い条件下で、細胞層の剥離がない状態で細胞を培養することができるバイオリアクターを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、動物細胞を付着させるための担体として高分子含水ゲル膜を使用し、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができる構造を有するバイオリアクターを用いることによって、上記課題を解決できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明によれば、少なくとも片面上に動物細胞を付着させるための高分子含水ゲル膜を少なくとも１つ有し、かつ該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができる構造を有する、バイオリアクターが提供される。
【００１０】
本発明のバイオリアクターでは好ましくは、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができるように、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に流路が設けられている。好ましくは、本発明のバイオリアクターは、少なくとも片面上に動物細胞を付着させるための少なくとも１つの高分子含水ゲル膜と、該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができるように該高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に設けられた流路と、該流路の間に該高分子含水ゲル膜を保持するための手段とを有する。
【００１１】
好ましくは、高分子含水ゲル膜の一方の面は動物細胞接着性物質で覆われている。好ましくは、細胞に負荷する流れずり応力は2.0dyn/ｃｍ2以上である。好ましくは、高分子含水ゲル膜とリアクター内壁とにより流路が形成され、高分子含水ゲル膜とリアクター内壁との間隙が１０μｍ以上２ｍｍ以下である。好ましくは、動物細胞は高分子含水ゲル膜表面の90％以上100％以下の領域に接着して被覆している。
【００１２】
好ましくは、高分子含水ゲル膜はキトサンを含む膜である。好ましくは、高分子含水ゲルの乾燥膜厚は5μm以上200μm以下である。好ましくは、動物細胞は２種類以上１０種類以下である。好ましくは、動物細胞は２層以上１０層以下の重層構造を有している。
【００１３】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のバイオリアクターを用いて、少なくとも片面上に動物細胞を付着させた高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことを特徴とする、動物細胞培養方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記した動物細胞培養方法で得られる動物細胞培養物が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のバイオリアクターを用いることにより、動物細胞の培養物の両面を異なる流動する培地を用いて培養することができ、また動物細胞に接する培地において血液による剪断や物質供給を再現し、生体に近い条件下で、細胞層の剥離がない状態で細胞を培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本発明で用いる高分子含水ゲルは、少なくとも片面上に動物細胞を付着させるために使用するものであり、高分子が化学結合によって網目状構造をとり、網目に多量の水を保有した物質であれば任意の物質を使用することができる。ハイドロゲルを形成する高分子化合物としては、アニオン性多糖類（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースなど）やその塩、カチオン性多糖類（キトサン、部分脱アセチルキチン、アミノ化セルロースなど）やその塩、ノニオン性多糖類（デキストラン、セルロース、酢酸セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、アガロース、アミロース、グリコマンナンなど）、ポリペプチド（コラーゲン、ゼラチン、絹フィブロインなど）、合成高分子（ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、無機（シリカゲルなど）、並びにこれらの混合物や複合体が挙げられる。
【００１６】
本発明で用いる高分子含水ゲルとしては、キトサン含有ゲルが好ましく用いられる。本明細書で言うキトサン含有ゲルとは、キトサンを酸で溶解し、ｐＨを上昇させ水不溶化したもの、キトサンと水溶性アニオン性高分子（アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、アガロペクチン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸やその共重合体、ポリメタクリル酸やその共重合体、ポリスチレンスルホン酸やその共重合体など）もしくは両性高分子（ゼラチン、コラーゲンなど）とポリイオンコンプレックスを作らせたものが挙げられる。ポリイオンコンプレックスの作り方としては、キトサン水溶液とアニオン性もしくは両性高分子水溶液を混合させる方法や、キトサン水溶液とアニオン性もしくは両高分子水溶液に交互に浸漬するいわゆる交互積層（layer-by-layer）法などが挙げられる。ここで交互積層法を用いる場合は最上層（最終浸漬液）をキトサンとすることが好ましい。本発明で用いるキトサン含有ゲルにはゲル化に直接寄与しない化合物を添加してもよい。
【００１７】
本発明で用いる高分子含水ゲルの厚さとしては、乾燥膜厚として5μm以上200μm以下が好ましく、10μm以上100μm以下が特に好ましい。高分子含水ゲルの厚さが薄いと強度が不足し、培地を流動させた際に破ける問題が生じる。また、高分子含水ゲルの厚さが厚いと物質の拡散に時間がかかる問題が生じる。
【００１８】
本発明のバイオリアクターにおいては、高分子含水ゲル膜の少なくとも一方の面は動物細胞接着性物質で覆われていることが好ましい。本発明で用いることができる動物細胞接着性物質は、培養する細胞種によって異なるが、ポリペチドが好ましく用いられる。このようなポリペプチドとしては、いわゆる細胞接着性ペプチドであり、細胞毒性が無く、通常の培養条件で動物細胞が付着するペプチドであれば天然又は合成のペプチドのいずれでもよいが、好ましくは層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）p.570,東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。細胞外マトリックス成分であるポリペプチドとは、細胞外マトリックスの構成成分を意味し、その具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）を例示できる。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を37℃で10〜20分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。
【００１９】
本発明のバイオリアクターにおいては、高分子含水ゲル膜の少なくとも一方の面上において動物細胞を培養する。培養し得る動物細胞の具体例としては、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞等を例示できる。動物細胞の培養の際には、通常、細胞濃度１〜1.5万cells/mlの培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を細胞接着性ゲル層上に添加する。動物細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。細胞接着性ゲル層上で細胞を培養する場合には、通常、細胞接着性ゲル層上にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行う。
【００２０】
細胞培養担体（高分子含水ゲル膜）を用いた動物細胞の培養は具体的には次のようにして行うことができる。高分子含水ゲル膜をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち12〜24時間放置し、培養液を細胞培養担体（高分子含水ゲル膜）中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体の細胞接着性ゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加する。37℃で１〜２時間放置し、細胞接着性ゲル層に保持（接着）させた後、37℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養0.5〜２日ごとに培養液を交換する。ついで高分子含水ゲル膜をリアクターに組み込み培地をポンプで送液する。
【００２１】
あるいは別法としては、高分子含水膜を予めリアクターに組み込み細胞を液体に分散し高分子含水ゲル膜表面に送り込み、付着、増殖、培養を行ってもよい。
【００２２】
本発明に用いる動物細胞は2種類以上10種類以下であることが好ましく、複数の動物細胞を平面共培養（高分子含水ゲル層上に複数種の細胞を培養）或いは重層化することができる。平面共培養の具体例としては、繊維芽細胞、肝細胞等のポリペプチド上にのみ接着する細胞を予め培養したのち、アニオン性多糖類上に接着する血管内細胞等の細胞を培養する方を例示できる。
【００２３】
本発明のリアクターを用いた動物細胞培養物上に、別に調製した細胞シートを載せることによって重層化培養を行うこともでき、これは本発明の好ましい態様でもある。重層のする層の数は2層以上10層以下が好ましい。重層化する動物細胞層として、例えば、血管内皮細胞層、肝細胞層を使用すれば、肝臓の３次元組織構造物を構築できる。この３次元組織構造物は、in vitroにおける薬物の透過性試験へ適用できるとともに、動物実験代替モデルや移植用臓器へ応用できる。重層化した動物細胞層は、細胞層を構成する細胞の種類に応じた培養条件で培養することができる。培養の際には、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地等の培地を使用できる。高分子含水ゲル膜を用いた細胞培養物が平面共培養となっている場合、さらに重層化することで３次元状に細胞組織を構築することが可能となる。
【００２４】
本発明のリアクターは、高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流すことができる構造を有することを特徴とするものであり、高分子含水ゲル膜の一方の側と他方の側に異なる液体を流しながら動物細胞の培養を行う。本明細書で言う「異なる液体」とは、同じ組成の液体を循環させないで流すことも含まれるが、一方の側と他方の側に異なる組成の液体を流す態様が好ましい。動物細胞側に流す液体としては血液を模した液体、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF１２、HamF１０培地に酸素を飽和させたものなどが挙げられ、動物細胞とは逆側に流す液体としては、胆汁を模した液体、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF１２培地、HamF１０培地、等潮リン酸緩衝液などが挙げられ、胆汁成分として胆汁酸等を添加してもよい。液体の流量は流れずり応力として2.0dyn/ｃｍ2以上が細胞に負荷する流速が好ましく、2.0〜3.0dyn/ｃｍ2の負荷が細胞に負荷する流速が特に好ましい。また、流れずり応力を細胞に負荷するためには、本発明のバイオリアクターはマイクロリアクターであることが好ましい。本発明のマイクロリアクターのサイズは、適当な流れずり応力を付加できるサイズであれば特に限定されず、例えば、用途によって、メートルスケール（物質生産）からマイクロスケール（センサー）にすることができる。
【００２５】
本発明のバイオリアクターにおいては、高分子含水ゲル膜とリアクター内壁とにより流路を形成することができる。この場合、高分子含水ゲル膜とリアクターの内壁との間隙は、１０μｍ以上２ｍｍ以下であることが好ましく、特に好ましくは２０μｍ以上１ｍｍ以下である。間隙が狭すぎると動物細胞がリアクターの内壁に接してしまい、液を流すことができない。また、間隙が広すぎると液層の遠い部分から動物細胞へ物質供給が遅くなる問題や動物細胞に適当な剪断を付与するのが難しいという問題が生じる。
【００２６】
上記した流路は、固体基板上に微細加工技術により作成することができる。使用される材料の例としては、金属、シリコン、テフロン、ガラス、セラミックスまたはプラスチックなどである。耐熱、耐圧および耐溶剤性が必要な場合、好ましい材料は金属、シリコン、テフロン、ガラスまたはセラミックスであるが、特に好ましくは金属である。金属の例を挙げれば、ニッケル、アルミ、銀、金、白金、タンタル、ステンレス、ハステロイ（Ｎｉ−Ｆｅ系合金）またはチタンであるが、好ましくは耐腐食性の高いステンレス、ハステロイもしくはチタンである。
【００２７】
従来のバッチ式反応装置では酸性物質などを扱う時に金属（ステンレス等）表面にガラスライニングした装置が用いられるが、マイクロリアクターでも金属表面にガラスコーティングしてもよい。ガラスに限らず目的に応じて、金属の上に別の金属もしくは他の材料をコーティングしても良いし、金属以外の材料（例えばセラミック）に金属もしくはガラスなどをコーティングしてもよい。
【００２８】
流路を作成するための微細加工技術として代表的なものを挙げれば、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、EPON SU-8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、Deep RIEによるシリコンの高アスペクト比加工法、Hot Emboss加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。好ましい微細加工技術は、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、EPON SU-8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、および機械的マイクロ切削加工法である。
【００２９】
本発明のバイオリアクターを組み立てるためには、接合技術を用いることができる。通常の接合技術は大きく固相接合と液相接合に分けられ、一般的に用いられている接合方法は、固相接合として圧接や拡散接合、液相接合として溶接、共晶接合、はんだ付け、接着等が代表的な接合方法である。更に、組立に際しては高温加熱による材料の変質や大変形による流路等の微小構造体の破壊を伴わない寸法精度を保った高度に精密な接合方法が望ましいが、その技術としてはシリコン直接接合、陽極接合、表面活性化接合、水素結合を用いた直接接合、HF水溶液を用いた接合、Au-Si共晶接合、ボイドフリー接着などがある。
【００３０】
本発明のバイオリアクターを用いた動物細胞の培養は、流路の中を流れながら、すなわちフローで行う。
【００３１】
本発明のバイオリアクターの流路は目的に応じて表面処理してもよい。特に水溶液を操作する場合、ガラスやシリコンへの試料の吸着が問題になることがあるので表面処理は重要である。マイクロサイズの流路内における流体制御では、複雑な製作プロセスを要する可動部品を組み込むことなくこれを実現することが望ましい。例えば、流路内に表面処理により親水性と疎水性の領域を作成し、その境界に働く表面張力差を利用して流体を操作することが可能になる。
【００３２】
リアクターのマイクロサイズの流路中へ試薬やサンプルなどを導入して混合するために、流体制御機能が必要である。特に、微小領域における流体の挙動は、マクロスケールとは異なる性質を持つため、マイクロスケールに適した制御方式を考えなければならない。流体制御方式は形態分類すると連続流動方式と液滴（液体プラグ）方式があり、駆動力分類すると電気的駆動方式と圧力駆動方式がある。これらの方式を以下に詳しく説明する。
【００３３】
流体を扱う形態として、最も広く用いられるのが連続流動方式である。連続流動式の流体制御では、リアクターの流路内は全て流体で満たされ、外部に用意したシリンジポンプなどの圧力源によって、流体全体を駆動するのが一般的である。この場合、比較的簡単なセットアップで制御システムを実現できることが一つの利点であるが、複数ステップの反応やサンプルの交換を伴うような操作は困難で、システム構成の自由度が小さいこと、また駆動媒体が溶液そのものであるため、デッドボリュームが大きいことなどが難点である。連続流動方式とは異なる方式として、液滴（液体プラグ）方式がある。この方式では、リアクター内部やリアクターに至る流路内で、空気で仕切られた液滴を動かすものであり、個々の液滴は空気圧によって駆動される。その際、液滴と流路壁あるいは液滴同士の間の空気を必要に応じて外部に逃がすようなベント構造、及び分岐した流路内の圧力を他の部分と独立に保つためのバルブ構造などを、リアクターシステム内部に用意する必要がある。また、圧力差を制御して液滴の操作を行うために、外部に圧力源や切り替えバルブからなる圧力制御システムを構築する必要がある。このように液滴方式では、装置構成やリアクターの構造がやや複雑になるが、複数の液滴を個別に操作して、いくつかの反応を順次行うなどの多段階の操作が可能で、システム構成の自由度は大きくなる。
【００３４】
流体制御を行うための駆動方式として、流路（チャンネル）両端に高電圧をかけて電気浸透流を発生させ、これによって流体移動させる電気的駆動方法と、外部に圧力源を用意して流体に圧力をかけて移動させる圧力駆動方法が一般に広く用いられている。両者の違いは、たとえば流体の挙動として、流路断面内で流速プロファイルが電気的駆動方式の場合にはフラットな分布となるのに対して、圧力駆動方式では双曲線状に、流路中心部が速くて、壁面部が遅い分布となることが知られており、サンプルプラグなどの形状を保ったまま移動させるといった目的には、電気的駆動方式の方が適している。電気的駆動方式行う場合には、流路内が流体で満たされている必要があるため、連続流動方式の形態をとらざるを得ないが、電気的な制御によって流体の操作を行うことができるため、例えば連続的に２種類の溶液の混合比率を変化させることによって、時間的な濃度勾配をつくるといった比較的複雑な処理も実現されている。圧力駆動方式の場合には、流体の電気的な性質にかかわらず制御可能であること、発熱や電気分解などの副次的な効果を考慮しなくてよいことなどから、基質に対する影響がほとんどなく、その適用範囲は広い。その反面、外部に圧力源を用意しなければならないこと、圧力系のデッドボリュームの大小に応じて、操作の応答特性が変化することなど、複雑な処理を自動化する必要がある。
【００３５】
流体制御方法として用いられる方法はその目的によって適宜選ばれるが、好ましくは連続流動方式の圧力駆動方式である。
【００３６】
リアクターの温度制御は、装置全体を温度制御された容器中に入れることにより制御してもよいし、金属抵抗線や、ポリシリコンなどのヒーター構造を装置内に作り込み、加熱についてはこれを使用し、冷却については自然冷却でサーマルサイクルを行ってもよい。温度のセンシングは、金属抵抗線ではヒーターと同じ抵抗線をもう一つ作り込んでおき、その抵抗値の変化に基づいて温度検出を行い、ポリシリコンについては熱電対を用いて検出を行う。また、ペルチェ素子をリアクターに接触させることによって外部から加熱、冷却を行ってもよい。どの方法を用いるかは用途やリアクター本体の材料などに合わせて選択される。
【００３７】
本発明のバイオリアクターは、いかなる方法で滅菌されてもよい。滅菌法としてはアルコール滅菌、湿熱滅菌、乾熱滅菌、EOG滅菌、電子線、γ線、X線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、放射線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。本発明における電子線滅菌の照射線量としては0.1kGy以上65kGy以下が好ましく、1kGy以上40kGy以下が特に好ましい。EOG滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性層やアルギン酸ゲル層を分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体（（高分子含水ゲル膜））は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。上記した滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施してもよく、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００３８】
本発明のバイオリアクターの構造の一例を図１〜図３に示す。図１〜図３に示したバイオリアクターは、図１に示す上部部品１と下部部品５との間に、図２に示す高分子含水ゲル膜保持用ステンレス９を、図３の示すように挟みこんだ構造を有している。上部部品１と下部部品５にはそれぞれ流路４及び８が形成されており、該流路４及び８の両端にはホース接続部２及び６が形成されている。また、上部部品１、下部部品５及び高分子含水ゲル膜保持用ステンレス９にはそれぞれ対応する位置にねじ穴３、７及び１０が設けられており、該ねじ穴にねじをはめ込むことにより各部品を一体化することができる。
【００３９】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
〔実施例１〕リアクターの作製
ポリメチルメタクリレートの板を機械的マイクロ切削加工法で加工し、切削した表面を研磨することにより図１に記載のバイオリアクターを作成した。上部部品の流路の深さは500μmとし、下部部品の流路深さは2mmとした。また高分子含水ゲル膜保持用に厚さ100μmステンレスを図２のように加工し、図１のリアクターに組み込み、図３の形態とした。なお、図は模式的に示したものであり寸法および各部の寸法の比率は実際に則していない。
〔実施例２〕高分子含水ゲル膜の作製
キトサン（和光純薬製CT-100）20ｇを1質量％の酢酸水溶液1000ｇに徐々に添加して40℃で３時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、あらかじめ用意しておいたポリエチレンテレフタレートフイルム（フイルム厚200ミクロン）上にアプリケータでウェット膜厚250ミクロンとなるように塗布し、40℃にて3時間乾燥した。乾燥したキトサンゲル膜を、10質量％の水酸化ナトリウムのメタノール溶液に60分間浸漬し、引き続きPBS溶液に60分間浸漬した。その後、流水下で60分洗浄後、40℃で3時間乾燥してキトサンゲルを得た。以上の膜を3時間 UV滅菌することで高分子含水ゲル膜を得た。
〔実施例３〕動物細胞培養
1)剥離型細胞培養膜
上記実施例２で得たキトサンゲル膜を0.1ｍｏｌ／ｌの塩化カルシウム水溶液に5分間浸漬した。その後、キトサンゲル膜を取り出し、ＳＵＳ版の上にしわにならないように置いた。あらかじめ40℃で1時間乾燥しておいたスポンジローラーでキトサンゲル上の水分を吸収後、アプリケータでウェット膜厚500ミクロンとなるように塗布した。塗布物を0.5ｍｏｌ／ｌ塩化カルシウムおよび０．０５ｍｏｌ／ｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルアミノ）カルボジイミド塩酸塩の混合水溶液に６０分間浸漬し、引き続き流水下で30分間洗浄後、皿状のテフロン版上に移し変え、0.04mol/lのＨＥＰＥＳ水溶液で希釈した0.03質量％のCELLMATRIX  TypeＩ-C（新田ゼラチン社製）コラーゲン水溶液15ｇをキャ
ストし、３７℃で一昼夜乾燥した。以上の膜を3時間 UV滅菌することで剥離型細胞培養膜を得た。
2)重層細胞培養物の作成
(a)高分子含水ゲル膜上への培養
・使用細胞：HepG2(ヒト肝臓ガン由来細胞)
・使用培地：Eagle最小培地(MEM)、10%牛胎児血清
・細胞培養担体：
実施例２の高分子含水ゲル膜をシャーレの中に置き、培地を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち一晩放置し、培地を細胞培養担体中に浸潤させた。予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を50000cell/mlに調製した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数10000cell/cm2となるようにシャーレ内に播種し培地を添加した。その後、
CO2インキュベーターを用いて37℃で2日間培養した。
(b)剥離型細胞培養膜上への培養
・使用細胞：BAE(牛大動脈内皮細胞)
・使用培地：Eagle最小培地(MEM)、10%牛胎児血清
・細胞培養担体：
実施例３1)の剥離型細胞培養膜をシャーレの中に置き、培地を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち一晩放置し、培地を細胞培養担体中に浸潤させた。予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を50000cell/mlに調製した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数10000cell/cm2となるようにシャーレ内に播種し培地を添加した。その後、
CO2インキュベーターを用いて37℃で2日間培養した。
(c)細胞の重層化
上記(a)で作成した細胞培養物上に上記(b)の細胞培養物を細胞同士が接するように重ねMEM培地中で一晩培養した。この細胞培養物を剥離液(MEM培地に3mMの1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid：HEDPを加えたもの)に10分間浸しアルギン酸カルシウム層を溶解させナイロンミクロフィルターを取り除いた。
〔実施例４〕リアクターの組み上げと培養
実施例３の細胞培養物を、実施例１のリアクター（図１〜図３に示すリアクター）の高分子含水ゲル膜保持用ステンレス９の枠内に組み込んだ。さらに培地Aとして細胞層側にMEMを、培地Bとして細胞層とは逆側にpH7.2の等張リン酸緩衝液にコール酸40g/lの濃度で溶かし込んだものを流した。血流による剪断をモデル化するため組織壁での流れずり応力に相当する2.5dyn/cm2が細胞に負荷できる
ように培地Aの流量をあげて培養したところ、生体モデルに近い、良好な培養物が得られた。なお、本実施例の培養物には１％未満の細胞層の剥離が観察された。
〔比較例１〕
実施例３の細胞培養物を、実施例１のリアクター（図１〜図３に示すリアクター）の高分子含水ゲル膜保持用ステンレス９の枠内に組み込んだ。細胞層側と逆側にMEM培地を、上下のホース接続口を連結して循環させた。流量は組織壁での流れずり応力に相当する2.5dyn/cm2が細胞に負荷できるようにした。結果、膜面か
ら全細胞の１０％の剥離が観察され、剥離した細胞は死滅していた。
〔実施例５〕
実施例３の細胞培養物をリアクター内壁と高分子含水ゲル膜の間隙(上部部品の流路深さ)が3mmとした以外は同様のリアクターで実験をしたところ良好な培養物が得られた。送液ホース接続部で漏れと、５％の細胞層の剥離という二つの問題が発生したが、剥離細胞の９０％は生きていた。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明のバイオリアクターを構成する上部部品と下部部品の側面図と上面図を示す。
【図２】図２は、本発明のバイオリアクターを構成する高分子含水ゲル膜保持用ステンレスを示す。
【図３】図３は、本発明のバイオリアクターの構成を示す。
【符号の説明】
【００４２】
１  上部部品
２  ホース接続部
３  ねじ穴
４  流路
５  下部部品
６  ホース接続部
７  ねじ穴
８  流路
９  高分子含水ゲル膜保持用ステンレス
１０  ねじ穴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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