(57)【要約】  【課題】  Ｘ線解析などに適した良好な品質の蛋白質結晶を得ることができる蛋白質結晶化方法を提供する。  【解決手段】  蛋白質を結晶化させるための方法において、以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質結晶化方法。(c) 蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる工程。(b)  さらに蛋白質含有試料に油相を重層する工程。  本発明によれば、蛋白質結晶化剤がゲル中から蛋白質含有試料の部分に、又は蛋白質含有試料が蛋白質結晶化剤を保持するゲル中に、ゆっくりと移行し、結晶化反応も少しずつ起こる。それと同時に油相に水分が移行し、蛋白質溶液が徐序に濃縮される。この２つの効果により、結晶化のメカニズムである、蛋白質と周囲環境（蛋白質結晶化剤の存在、蛋白質濃度、ｐＨ等）との相互作用が徐々に２方向から進行するため、短時間で良質な核発生を促し、良質な結晶を取得することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を結晶化させるための方法において、以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質結晶化方法。
(a) 蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる工程。
(b) さらに蛋白質含有試料に油相を重層する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質含有試料から蛋白質の結晶を析出させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛋白質の構造を網羅的に解析し、それに基づいて生命現象の仕組みを探索しようとするいわゆる構造ゲノム科学と呼ばれる動きが活発化している。構造ゲノム科学においては、構造解析の過程をさらに省力化及びスピードアップする必要があり、そのためにはより微量の蛋白質試料を用いて、迅速且つ効率的に結晶化条件をスクリーニングする方法の開発が望まれている。
【０００３】
蛋白質の立体構造解析を行うにはその良好な結晶が必要とされ、それを調製するための条件の探索には多量の試料と長時間を費やすことが現在の課題となっている。すなわち、既存の方法では非常に煩雑な操作を必要として非効率的であるとともに多くの蛋白質試料が必要であった。
【０００４】
この目的で結晶化スクリーニング試薬キットの開発が行われており、結晶化条件のスクリーニングに必要なスクリーニング試薬の調製時間に関する条件は改善されてきている。例えば、固体支持体に複数の種類の蛋白質結晶化剤を固定してなる蛋白質結晶化スクリーニング用固定化試薬が提案されている（特許文献１）。しかし、これも含めて従来の結晶化条件のスクリーニングは一条件あたり数マイクロリットルの溶液量で行われており、結晶化条件の探索時間は数時間から数日に及ぶ。このため更なる試料の微量化及び結晶化条件の探索時間の短縮が望まれている。
【０００５】
一方、上記の背景から蛋白質結晶化方法として種々の手法が提案されている。例えば、バッチ法、蒸気拡散法及び液-液拡散法（又は透析法）が挙げられる。
【０００６】
「バッチ法」は蛋白質溶液に結晶化剤を含む溶液を少しずつ加え、わずかに濁ったところで不溶物を遠心分離して除去し、上清を小さな試験管等に入れて密封した後、静置する方法である。この方法は、操作は簡便であるが結晶が得られにくい。さらには結晶の品質が良好ではないという問題点がある。また結晶化条件を能動的に制御する必要がある。
【０００７】
「蒸気拡散法」は蛋白質結晶化剤を含む蛋白質溶液の液滴を、より高濃度の結晶化剤を含む緩衝液（外部）の入った容器中に置き、密閉後、静置する方法である。液滴の置き方によりハンギングドロップ法、シッティングドロップ法に区別される。ハンギングドロップ法とは、蛋白質溶液の小さな液滴をカバーガラス上に設置し、カバーガラスを溶液溜め上で反転させ、密閉する方法である。シッティングドロップ法とは溶液溜め内部に液滴台を設置し、蛋白質溶液の小滴を液滴台上に設置し、カバーガラス等で液滴溜めを密閉する方法である。蒸気拡散法では、蛋白質溶液及び結晶化剤の濃度が時間と共に変化する。また使用する蛋白量が少量ですむため、幅広い結晶化条件のスクリーニングに使用されている（特許文献２）。蒸気拡散法は多数の条件をより微量の蛋白質で検討できるが、その際、高価な装置が必要となる。
【０００８】
「液-液拡散法」又は「透析法」は、蛋白質溶液を結晶化剤の入った緩衝液に対して、それぞれ両溶液の界面もしくはゲル又は半透膜を境界として接触させ、蛋白質溶液中の結晶化剤の濃度を徐序に上昇させる方法である。これらの方法は蒸気拡散法及びバッチ法の利点を有し、良質な蛋白質結晶を得るために好適である。しかし、これらの方法は比較的多量の蛋白質溶液を使用し、蛋白質溶液の液量を少量化することも困難である。また操作は煩雑で時間がかかるため、簡便とは言いがたい。
【０００９】
また本発明者は上記の背景技術を踏まえて、蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる方法によりX線結晶構造解析に適した蛋白質の結晶を簡便に取得する方法を提案している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、上記の方法は、結晶をゆっくりと成長させる点においては優れているが、適当な核を発生させるには温度、圧力等の多数のエネルギー変化（熱ゆらぎ）が必要となる。よって有利な方法とは言いがたい部分もある。
【特許文献１】特開平９−８９８９８
【特許文献２】ＷＯ００／６０３４５
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題点を解決するため鋭意検討を行った結果、蛋白質を結晶化させるための方法において、蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる工程に加え、蛋白質含有試料に油相を重層する工程を付加することにより、短時間で良質な核発生を促し、さらにはX線結晶構造解析に適した蛋白質の結晶を簡便に取得することができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、
蛋白質を結晶化させるための方法において、以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質結晶化方法である。
【００１３】
(a)蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる工程。
【００１４】
(b)さらに蛋白質含有試料に油相を重層する工程。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、蛋白質結晶化剤がゲル中から蛋白質含有試料の部分に、又は蛋白質含有試料が蛋白質結晶化剤を保持するゲル中に、ゆっくりと移行し、結晶化反応も少しずつ起こる。それと同時に油相に水分が移行し、蛋白質溶液が徐序に濃縮される。この２つの効果により、結晶化のメカニズムである、蛋白質と周囲環境（蛋白質結晶化剤の存在、蛋白質濃度、ｐＨ等）との相互作用が徐々に２方向から進行するため、短時間で良質な核発生を促し、良質な結晶を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書中で使用される「蛋白質」という用語は、天然又は合成のペプチド、ポリペプチド、蛋白質及び蛋白質複合体を包含する。これらの物質は、天然若しくは合成材料から抽出・単離、又は遺伝子工学的手法若しくは化学合成手法等により生成した後、通常の精製法、例えば溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどを組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００１７】
本明細書中で使用される「結晶化」という用語は、蛋白質溶液から結晶を成長又は析出させて結晶を得ることを指す。
【００１８】
本明細書中で使用される「蛋白質含有試料」という用語は、結晶化対象の蛋白質、又は結晶化条件を特定しようとする対象の蛋白質を含む試料を指す。
【００１９】
本明細書中で使用される「蛋白質結晶化剤」という用語は、蛋白質の溶解度を下げる働きをする化合物を意味し、沈殿剤、ｐＨ緩衝剤、その他附加物等が挙げられる。
【００２０】
本明細書中で使用される「ポリマーゲル」という用語は、重合性モノマー若しくはその溶液を、重合反応によりポリマー化若しくはゲル化させたもの、あるいは、合成ポリマーや天然ポリマーの添加により溶液の流動性をなくしたものを意味する。
【００２１】
本発明は、蛋白質を結晶化させるための方法において、以下の工程を含むことを特徴とする蛋白質結晶化方法である。
【００２２】
(a)    蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するゲルポリマーに供し、前記蛋白質溶液と結晶化剤を接触させる工程。
【００２３】
(b)    さらに蛋白質含有試料に油相を重層する工程。
【００２４】
蛋白質の結晶化には、種々の相互作用が複雑に影響を及ぼしている。本発明は、このような種々の相互作用が徐々にゆっくりと変更するために、ゲルにおける拡散現象を利用して蛋白質と蛋白質結晶化剤とをゆっくりと接触させ、それらの間の相互作用及びその他の相互作用を徐々に変更した状態を作り出す。さらに、蛋白質含有試料に油相を重層することにより、油相部に蛋白質溶液の水分が移動し、蛋白質溶液が濃縮される。その結果、本蛋白質結晶化方法により、短時間で良質な核発生を促し、良好な品質の蛋白質結晶を簡便かつ高効率に析出することができる。
【００２５】
本蛋白質結晶化方法の工程（ａ）では、蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルに供する。ここで、蛋白質含有試料は、結晶化対象の蛋白質の他、さらに、蛋白質の溶解を助ける蛋白質可溶化剤、還元剤等の安定化剤などを含有してもよい。蛋白質可溶化剤としては、例えば膜蛋白質を溶解させる界面活性剤などを例示することができる。またここで、蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルは、以下のように調製することができる。
【００２６】
本発明に用いることができるポリマーゲルの種類は特に制限されないが、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類又は二種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等との多官能性単量体を、例えば水性媒体中で共重合したゲルを用いることができる。その他本発明に用いることのできるポリマーゲルとして、例えばアガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル、又はこれらを架橋したゲルを用いることができる。
【００２７】
任意の容器（例えばマイクロアレイ）にゲルを充填するには、ゲル構成成分であるアクリルアミド等の単量体、多官能性単量体及び開始剤を含む液を該容器に注入し、重合、ゲル化させればよい。ゲル化は多官能性単量体の存在下に共重合させる方法の他、多官能性単量体の非存在下に共重合させたのち架橋剤を用いて行ってもよい。またアガロースゲルの場合には温度降下によってゲル化を行ってもよい。
【００２８】
蛋白質結晶化剤をポリマーゲルに保持させるための方法は、特に制限されるものではない。ここで「保持」とは、蛋白質結晶化剤をポリマーゲルに固定化することを意味する。例えば、蛋白質結晶化剤と上記重合性モノマーを混合して予め適当な容器に導入しておき、その後、重合過程を経てポリマーゲルを形成させて蛋白質結晶化剤を固定化することができる。ポリマーゲルに保持させる蛋白質結晶化剤は、結晶化対象の蛋白質の種類及び濃度などにより異なるが、当業者であれば適切な蛋白質結晶化剤を選択し、適宜その濃度及び量を設定して、ポリマーゲルに保持させることができる。
【００２９】
あるいは、蛋白質結晶化剤を多孔性粒子などに含浸させ、その粒子をポリマーゲルに包括させることも可能である。
【００３０】
蛋白質結晶化剤としては、例えばGrid ScreenTM、Crystal ScreenTM I ＆ II、WizardTM I ＆ II等の市販されているものと同様の条件を使用することができる。
【００３１】
ここで、結晶化の様子が顕微鏡等で経時的に観察可能とするために、蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルは、透明であることが好ましい。「透明」とは、必ずしも光の透過率が１００％であることを意味せず、結晶化の様子が観察できる程度に透明であればよい。
【００３２】
例えば、ＮａＣｌをゲル中に保持させる場合には、該ゲルは、アクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、メタクリル酸ジメチルアミノメチルクロライド塩から作製されることが好ましい。その他、蛋白質結晶化剤の種類に応じて上述したモノマー等を適宜選択することにより、透明な蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルを得ることができる。
【００３３】
上述のように調製された蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルに、蛋白質含有試料をアプライする。蛋白質含有試料のアプライは、任意の手法により行うことができ、例えば、蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルに蛋白質含有試料を滴下したり、シリンジなどで手動若しくは機械的に充満させたり、又はポリマーゲルを蛋白質含有試料中に浸漬することなどにより蛋白質含有試料をアプライする。アプライする蛋白質含有試料の量は、蛋白質の結晶化条件などを考慮して設定する。
【００３４】
次に工程（ｂ）において、使用される油相としては、蛋白質に変性などの影響を及ぼさずに、水と分層するものであれば使用可能である。例えば流動パラフィンが使用される。前記油相は結晶化させる蛋白質の種類、及び分配係数等を考慮し適宜選択される。
【００３５】
この油相は蛋白質含有溶液の液面に重層するように供する。その量は適宜選択される。
【００３６】
上述のように、蛋白質含有試料を、蛋白質結晶化剤を保持するポリマーゲルにアプライした後、さらに油相を蛋白質含有溶液の液面に重層することにより、蛋白質と蛋白質結晶化剤とが接触し、さらに蛋白質溶液が徐序に濃縮されることにより結晶化が進行する。本蛋白質結晶化方法においては、蛋白質結晶化剤がゲル中から蛋白質含有試料の部分に、又は蛋白質含有試料が蛋白質結晶化剤を保持するゲル中に、ゆっくりと移行し、結晶化反応も少しずつ起こる。それと同時に油相に水分が移行し、蛋白質溶液が徐序に濃縮される。この２つの効果により、結晶化のメカニズムである、蛋白質と周囲環境（蛋白質結晶化剤の存在、蛋白質濃度、ｐＨ等）との相互作用が徐々に２方向から進行するため、良質な結晶が析出することになる。
【００３７】
蛋白質含有試料をアプライした後は、蛋白質が析出するのに十分な時間にわたって、適切な温度条件下にて、ポリマーゲルを密閉状態又は大気中に静置する。
【００３８】
蛋白質が析出するのに十分な時間とは、特定の蛋白質、濃度、結晶化条件などにより異なるが、約１時間〜１０日である。また適切な温度条件もまた特定の蛋白質、濃度、結晶化条件などにより異なるが、約４℃〜３０℃である。
【００３９】
そして蛋白質が析出するのに十分な時間が経過した後、蛋白質の結晶析出状況を、例えば光学顕微鏡、Ｘ線回折装置などにより観察する。本蛋白質結晶化方法においては、ポリマーゲルにおける蛋白質の結晶化をモニタリングするための公知のシステムを組み合わせて用いることができる。例えば、結晶析出の様子を、顕微鏡に搭載したＣＣＤカメラにより撮影記録し、画像処理することによって、結晶化の成否を高速に判断することが可能である。
【００４０】
以上のように、本蛋白質結晶化方法は、蛋白質含有試料と蛋白質結晶化剤とを、ゲル中の拡散を利用して徐々に接触・反応させて、蛋白質を結晶化させる。従って、本発明では、単に蛋白質含有試料をアプライする操作のみでＸ線解析などに適した良好な品質の蛋白質結晶を得ることができる。