(57)【要約】【課題】  オオムギ等のイネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用法を提供する。【解決手段】  オオムギの詳細な連鎖地図を作成し、連鎖解析を行なうことにより、オオムギ１Ｈ染色体上に座乗する頴色を支配する遺伝子座に連鎖する２つの遺伝子マーカーを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記頴色を支配する遺伝子座から０ないし３センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝マーカー。
【請求項４】
上記ゲノムＤＮＡが１Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項６】
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とするＤＮＡ断片の単離方法。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを指標としてイネ科植物における頴色を判別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーと、その利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネ科植物の頴色を支配する遺伝子は、その対立遺伝子により頴にメラニン色素があり黒色を示す表現型（黒色型）、または頴にメラニン色素がない表現型（普通型）を表す。前者の頴の黒色型形質は、野生オオムギやエチオピアおよびヒマラヤ周辺の在来品種の一部に由来するものであり、改良品種ではほとんど見られないものである。よって頴色は、野生オオムギあるいは在来品種を用いて優良品種を育種する際に、作出した植物個体がどちらの親の形質を有するかを判断する指標（形質マーカー）の１つとして利用が可能である。また異品種の混入を識別する指標としても利用が可能である。
【０００３】
ところで従来、作物の育種は目標形質を有する品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、頴の黒色型形質を普通型にすることを目標とした場合には、選抜対象集団を栽培し、各個体が出穂した後に頴が普通色であるか黒色であるかを実際に調査することにより、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。
【０００４】
そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により目標形質の有無の推定が容易となるため、幼苗段階で選抜が可能となる。したがって、遺伝マーカーを利用すれば効率的な育種が実現可能である。そして、遺伝マーカーを利用した育種を実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。
【０００５】
ところで頴色は、単一の主働遺伝子が支配する形質である。このような単一主働遺伝子の遺伝子座を推定する方法としては、連鎖解析が知られている。連鎖解析は、遺伝法則を利用して複数の遺伝子座の位置（座位）を解析する方法であり、複数の座位のうち１つを目的形質を支配する遺伝子座位、他を遺伝マーカー座位とすると、遺伝マーカー座位のデータから目的形質を支配する遺伝子座位を特定することが可能である。
【０００６】
遺伝マーカーは、１９８０年代後半にＤＮＡマーカーが登場し、ＤＮＡマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進んだ。その結果、そのような高密度連鎖地図に基づいて多くの生物で連鎖解析が行われるようになった。
【０００７】
以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバーできる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高い連鎖解析により可能となり、得られた遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。
【０００８】
上記遺伝マーカーに関する技術としては、オオムギを例に挙げると、１）オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術（特許文献１参照）や、２）オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット（特許文献２参照）とその利用に関する技術等が、本発明者らによって提案されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４７４号公報（２００２（平成１４）年１０月８日公開）
【特許文献２】特開２００３−１１１５９３号公報（２００３（平成１５）年４月１５日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、イネ科植物、特にオオムギ、コムギ、イネ等の作物においては、頴が黒色か普通色を示すかは、実際に対象とする植物個体が出穂し成熟の後に観察しなければ判定できず、頴色を育種の形質マーカーや異品種の混入の識別指標として利用するためには多大な時間と労力を必要としていた。したがって頴色を上記用途に利用するためには、遺伝マーカーを利用することが得策である。頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーが開発され利用可能となれば、頴色の判断が迅速かつ容易となり、上記育種の形質マーカー等に利用が可能となる。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、イネ科植物、特にオオムギにおける頴色を支配する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーと、その代表的な利用法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列に基づいてプライマー対を設計し、当該プライマー対により増幅されるオオムギゲノム断片の多型の有無により遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を開発した。さらに、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」の交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（doubled haploid、以下「ＤＨ」と略記する。）集団を材料として、上記遺伝マーカー間の連鎖を検出して、当該ＤＨ系統の連鎖地図を作成し、この連鎖地図に基づいて頴色を支配する遺伝子座の連鎖解析を行なった。その結果、頴色を支配する遺伝子座を１Ｈ染色体上に検出した。本発明者らはさらに解析を進め、頴色を支配する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーを見いだした。すなわち本発明は、上記新規知見により完成されたものであり、以下の発明を包含する。
【００１２】
すなわち本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、上記頴色を支配する遺伝子座から０ないし３センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴としている。上記遺伝マーカーは、頴色を支配する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと頴色を支配する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率は低い。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、例えば頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、頴色が黒色であるか否かの判別等を行なうことが可能となる。
【００１３】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記イネ科植物がムギ類であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギ・コムギ等のムギ類において頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、頴色が黒色であるか否かの判別等を行なうことが可能となる。
【００１４】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ムギ類がオオムギであることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギにおいて頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、頴色が黒色であるか否かの判別等を行なうことが可能となる。
【００１５】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが１Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの１Ｈ染色体上に存在する頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、頴色が黒色であるか否かの判別等を行なうことが可能となる。
【００１６】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、イネ科植物の頴色が黒色であるか否かの判別を容易に行なうことができる。
【００１７】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、イネ科植物の頴色が黒色であるか否かの判別等を容易に行なうことが可能となる。
【００１８】
本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを用いて頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴としている。本発明にかかる遺伝マーカーは頴色を支配する遺伝子座に強連鎖するものであり、上記遺伝マーカーを目標にクローニングを行なえば、頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を容易に単離することが可能となる。
【００１９】
また本発明にかかるイネ科植物における頴色を判別する方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として、イネ科植物の頴色が黒色であるか否かの判別を行なう方法である。上記本発明にかかる遺伝マーカーは、頴色を支配する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと頴色を支配する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率が非常に低い。それゆえ上記遺伝マーカーを検出することによって、試験対象植物における頴色を支配する遺伝子座の遺伝子型を容易に判別することができ、頴色が黒色であるか否かの判別を容易に行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明にかかる遺伝マーカーは、頴色を支配する遺伝子座と連鎖するため、当該遺伝マーカーを指標として試験対象植物の頴色が黒色であるか否かの判別が可能となる。したがって、頴色を栽培品種と野生種等から優良品種を育種する際の形質マーカーの１つとして利用が可能となるという効果を奏する。また頴色を異品種の混入を識別する指標としても利用が可能となり、植物の品種検定等が容易に行なえるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、イネ科植物における頴色を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用の一例とに関するものである。以下、本発明にかかる遺伝マーカー、本発明の有用性、並びに本発明の利用の一例について説明する。
【００２３】
（１）本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、頴色を支配する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。
【００２４】
ここで「頴」とは、イネ科植物の花または小穂の基脚外側にある葉状の二つの小片のこと、簡単にはイネ科植物の穂先のことである。頴の色は、出穂後、頴（穂先）を目視することにより観察することができる。ここで「頴が黒色である（黒色型頴）」とは、頴にメラニン色素により黒色の着色が見られることを意味し、逆に頴にメラニン色素が見られず普通色を示すものを「頴が普通色（普通色型頴）である」という。
【００２５】
頴色は、単一の主働遺伝子が支配する形質であり、メンデルの法則にしたがって遺伝する。頴色を支配する遺伝子座には、黒色の頴を発現する遺伝子と普通色の頴を発現する遺伝子との２つの対立遺伝子があり、黒色の頴（黒色型頴）が優性である。また上述のごとく黒色型頴は野生品種に主に見られる形質である。
【００２６】
かかる頴色は、優良品種を交雑育種する際の形質マーカーとして利用が可能である。例えば、普通色型頴を有する品種に、黒色型頴を有する野生種由来の有用形質を普通色型頴に有する品種に交雑育種により導入しようとする場合に、目的とする形質を支配する遺伝子が、頴色を支配する遺伝子と同一染色体上にあれば、目的とする形質のみでなく頴色を支配する遺伝子が同時に導入される場合がある。よって黒色型頴を有する品種を選抜すれば、目的とする形質が導入された品種に当たる可能性が高いといえる。かかる黒色型頴を有する品種の選抜に、本発明にかかる頴色を支配する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーを利用すれば、カルス等の細胞レベルにおいて黒色型頴か否かを判断することができ、効率的な選抜が可能となる。また頴色を異品種の混入を識別する指標としても利用が可能となり、植物の品種検定等を容易に行なうことが可能となる。以下、本発明者らがオオムギにおいて開発した頴色を支配する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーを例にあげてさらに詳細に説明する。なお、本発明に係る遺伝マーカーはこれらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明者らは、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」との交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を用いて、高密度連鎖地図を作成した。すなわち、本発明者らが有するオオムギＥＳＴ（expressed sequence tag）配列に基づいて設計されたプライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを増幅し、「はるな二条」と「Ｈ６０２」との間に増幅断片長の多型を有するものや、増幅断片長の制限酵素による消化のパターンが異なる多型を有するものを特定し、これらのＤＮＡマーカーを含む約５００遺伝子座からなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図および本発明者らが観察した上記ＤＨ集団９３個体についての頴色の表現型のデータに基づいて、頴色を支配する遺伝子座の連鎖解析を行った。その結果、頴色を支配する遺伝子座を１Ｈ染色体上に検出した。本発明に係る遺伝マーカーは１Ｈ染色体上に座乗する頴色を支配する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーである。発明者らはこれらの遺伝マーカーを「ｋ０００９７」および「ｋ０２７９６」と命名した。
【００２８】
ｋ０００９７は、
ＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＴ（配列番号１）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣ（配列番号２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されるＤＮＡマーカーであり、上記１Ｈ染色体上に検出された頴色を支配する遺伝子座から短腕側に約０センチモルガン（以下ｃＭと表示する）離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：ｂａａｋ１４ｅ２３、配列番号９）に基づいて設計されている。図１に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１）および上記プライマー配列（配列番号２）の相補配列である。
【００２９】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰ（single nucleotide polymorphisms；一塩基多型）がある。図２に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号５）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号６）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨａｐＩＩの認識配列（ＣＣＧＧ）を示す。図２から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＨａｐＩＩの認識配列（ＣＣＧＧ）を有しているためＨａｐＩＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（ＣＴＧＧ）制限酵素ＨａｐＩＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０００９７は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第一プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨａｐＩＩ切断により、対象個体が当該１Ｈ染色体に座乗する頴色を支配する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。換言すれば、第一プライマーセットを用いて得られる増幅産物が、制限酵素ＨａｐＩＩによって切断されれば、当該試験対象植物Ｈ６０２型、すなわち黒色頴型であると判別でき、逆に当該制限酵素によって切断されなければはるな二条型、すなわち普通色頴型であると判断できる。
【００３０】
なお、上記制限酵素による切断の有無の確認は、特に限定されるものではないが、例えば上記制限酵素ＨａｐＩＩで消化したものと、未消化のものを電気泳動にかけ、そのときにみられるＤＮＡ断片バンドの数が未消化のものに比して増加していれば上記ＨａｐＩＩで切断されたと判断でき、変化がなければ上記ＨａｐＩＩで切断されないと判断できる。なお以下に示す他のプライマーセットを用いたその他の遺伝マーカーの検出・判別においても同様に行なえばよい。
【００３１】
またｋ０２７９６は、
ＧＣＧＧＡＡＣＧＡＣＣＡＴＴＧＴＡＴＣＴ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマー、およびＴＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＧ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記１Ｈ染色体上に検出された頴色を支配する遺伝子座から長腕側に約２．２ｃＭ離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ＥＳＴクローン名：ｂａｇｓ３１ａ２２、配列番号１０）に基づいて設計されている。図３に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号３）および上記プライマー配列（配列番号４）の相補配列である。
【００３２】
はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰ（single nucleotide polymorphisms；一塩基多型）がある。図４に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号７）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号８）である。□（四角）で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨｉｆＩの認識配列（ＧＡ［ＡまたはＣまたはＧまたはＴ］ＴＣＧ）を示す。図４から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＨｉｎｆＩの認識配列（ＧＡＧＴＣ）を有しているためＨｉｎｆＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＡがＴに変異しているため（ＧＴＧＴＣ）制限酵素ＨｉｎｆＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０２７９６は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨｉｎｆＩ切断により、対象個体が当該１Ｈ染色体に座乗する頴色を支配する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。換言すれば、第一プライマーセットを用いて得られる増幅産物が、制限酵素ＨｉｎｆＩによって切断されれば、当該試験対象植物はるな二条型、すなわち普通色頴型であると判別でき、逆に当該制限酵素によって切断されなければＨ６０２型、すなわち黒色頴型であると判断できる。
【００３３】
ここで、１センチモルガン（１ｃＭ）とは、２つの遺伝子座の間に１％の頻度で交叉が起きるときの、両遺伝子座間の距離を表す単位である。
【００３４】
ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの幼苗期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。さらに、幼苗段階で個体の選抜が可能となり、育種期間を大幅に短縮できる点が挙げられる。
【００３５】
またオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーの組み合わせを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００３６】
（２）本発明の利用
〔頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０００９７、ｋ０２７９６）は、オオムギ１Ｈ染色体上に検出された頴色を支配する遺伝子座に連鎖するものである。よって、ｋ０００９７、ｋ０２７９６の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ１Ｈ染色体上に検出された頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
【００３７】
単離とは、目的のＤＮＡ断片、すなわち頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をクローニングすることを意味することはいうまでもないが、広義には交雑Ｆ１集団から戻し交配等により、両親のうち一方の頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する個体を選抜し、その遺伝子座領域のみを目的品種に導入する同質遺伝子系統の作成も単離に含まれる。
【００３８】
本発明にかかる遺伝マーカーを用いて頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては特に限定されるものではないが、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００３９】
オオムギでは本発明者らが開発を進めている「はるな二条」を含めて、ゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが２種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、頴色を支配する遺伝子座と当該遺伝子座に連鎖する本発明の遺伝マーカーとで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的に頴色を支配する遺伝子座に到達することができる。
【００４０】
また、上述のように、交雑Ｆ１に一方の親を戻し交配することにより、他方の親の頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を目的品種に導入して（広義の）単離をすることができる。
【００４１】
なお、上記方法をはじめとする頴色を支配する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する際には、目的とする頴色を支配する遺伝子座に対してなるべく近傍に座乗する遺伝マーカーを選択して用いることが好ましい。目的とする頴色を支配する遺伝子座と遺伝マーカーの間で組み換えが起こる確率がより低くなり、より確実に頴色を支配する遺伝子座を含む断片を単離することができるからである。
【００４２】
〔イネ科植物における頴色の判別方法〕
本発明にかかる頴色の判別方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として試験対象であるイネ科植物の頴が黒色型か普通色型かを判別する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。
【００４３】
より具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーがいずれの遺伝子型を有するかを指標として植物を選抜する方法が挙げられる。遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、対象とする植物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として上記第一または第二プライマーセットのいずれかを用いて増幅したＤＮＡ断片について、断片の制限酵素消化パターンの観察を挙げることができる。
【００４４】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００４５】
〔使用植物〕
醸造用オオムギ「はるな二条」（Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo）と野生オオムギ「Ｈ６０２」（Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602）との交配から得られたＦ１の花粉を培養して半数体（haploid）を育成し、自然倍加した倍加半数体（doubled haploid）９３個体からなる集団（ＤＨ集団）を使用した。
【００４６】
〔連鎖地図の作成〕
本発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列約１２万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って３’端約６万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とＨ６０２との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、３９種類の制限酵素に対してＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）化が可能なものをマーカーとして選択した。
【００４７】
以上により、上記はるな二条とＨ６０２との交雑Ｆ１由来のＤＨ集団について、合計４９９遺伝子座のマーカーからなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図の平均マーカー密度は3.0cM/locus、全長は1,470cMである。
【００４８】
〔遺伝子型の判定〕
ＤＨ集団各個体の遺伝子型の判定は、上記ＤＨ集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したＤＮＡを鋳型として、ＥＳＴ配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。断片長多型マーカーについてはＰＣＲ産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーについては、ＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。
【００４９】
〔頴色の観察〕
ＤＨ集団の各個体について、出穂後に頴色が黒色型か普通色型かを観察し記録した。
【００５０】
〔連鎖解析〕
連鎖解析は、頴色の表現型と上記連鎖地図上のマーカーの遺伝子型との組換え頻度を調べ、最も組換え頻度の少ないマーカーを特定し、頴色を支配する遺伝子座の位置を推定した。  
〔結果〕
結果を表１に示した。
【００５１】
【表１】
2005224221.tif 000002
【００５２】
表１から明らかなように、１Ｈ染色体上に頴色を支配する遺伝子座を検出した。また１Ｈ染色体上に存在する頴色を支配する遺伝子座は、ｋ０００９７及びｋ０２７９６によって挟まれる位置に座乗し、ｋ０００９７から長腕側に約０ｃＭ、ｋ０２７９６から短腕側に約２．２ｃＭの距離に位置していた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明にかかる遺伝マーカーは、頴色を支配する遺伝子の単離、及びイネ科植物頴色の早期判断に用いることができる。頴色は交雑育種の際の形質マーカーとして有用であり、育種の効率化に大きく貢献することが期待される。またまた頴色を異品種の混入を識別する指標としても利用が可能となり、植物の品種検定等を容易に行なうことが可能となる。したがって、広く農業全般に利用可能であり、さらには、オオムギ等を原料とする食品産業においても有効である。また、生物分野の基礎研究、特に植物ゲノム研究等にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】オオムギＥＳＴクローン：ｂａａｋ１４ｅ２３の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図２】遺伝マーカーｋ０００９７における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図３】オオムギＥＳＴクローン：ｂａｇｓ３１ａ２２の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図４】遺伝マーカーｋ０２７９６における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１】
2005224221.tif 000003
【図２】
2005224221.tif 000004
【図３】
2005224221.tif 000005
【図４】
2005224221.tif 000006
【配列表】
2005224221000001.app