(57)【要約】【課題】  簡易かつ迅速な方法で、生体のストレスを測定することができるストレス測定方法及びストレス測定システムを提供する。【解決手段】  液状物質の吸収及び保持が可能な吸収材により、生体の唾液を採取して唾液サンプル２０とし、唾液サンプル設置部１１に設置する。その唾液サンプル２０に、還元剤付加部１２が還元剤を、酸化剤付加部１３が酸化剤をそれぞれ加える。そして、発光測定部１４が唾液サンプル２０と還元剤，酸化剤による化学発光を測定し、ストレス評価部１５が測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状物質の吸収及び保持が可能な吸収材により、生体の唾液を採取して唾液サンプルとする唾液採取工程と、
前記唾液サンプルに還元剤を加える還元剤付加工程と、
前記唾液サンプルに酸化剤を加える酸化剤付加工程と、
前記還元剤付加工程において還元剤が加えられ、前記酸化剤付加工程において酸化剤が加えられた前記唾液サンプルの化学発光を測定する発光測定工程と、
前記発光測定工程において測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価するストレス評価工程と
を備えるストレス測定方法。
【請求項２】
前記還元剤付加工程を行った後に、前記酸化剤付加工程を行うことを特徴とする請求項１記載のストレス測定方法。
【請求項３】
前記所定の基準は、前記発光測定工程において測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスが有ると評価する基準とすることを特徴とする請求項１または２記載のストレス測定方法。
【請求項４】
前記標準範囲は、前記唾液を採取する生体に応じて予め測定されたデータに基づき設定することを特徴とする請求項３記載のストレス測定方法。
【請求項５】
前記発光パラメータは、発光量、発光量の時間変化の微分係数のうち少なくとも何れか１つであることを特徴とする請求項３または４記載のストレス測定方法。
【請求項６】
前記唾液サンプルを密閉容器に密閉状態で封入して冷却保存する保存工程を更に備える請求項１〜５のいずれか一項記載のストレス測定方法。
【請求項７】
前記還元剤付加工程において付加する還元剤は、没食子酸、カテキン，ルミノ−ルのうち少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載のストレス測定方法。
【請求項８】
前記酸化剤付加工程において付加する酸化剤は、過酸化水素であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載のストレス測定方法。
【請求項９】
生体の唾液を吸収材に吸収及び保持した唾液サンプルを設置する唾液サンプル設置手段と、
前記唾液サンプルに還元剤を加えるための還元剤付加手段と、
前記唾液サンプルに酸化剤を加えるための酸化剤付加手段と、
前記唾液サンプル設置手段により設置された前記唾液サンプルの化学発光を測定する発光測定手段と、
前記発光測定手段により測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価するストレス評価手段と
を含んで構成されるストレス測定システム。
【請求項１０】
前記所定の基準は、前記発光測定手段により測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスが有ると評価する基準とすることを特徴とする請求項９記載のストレス測定システム。
【請求項１１】
前記標準範囲は、前記唾液を採取する生体に応じて予め測定されたデータに基づき設定することを特徴とする請求項１０記載のストレス測定システム。
【請求項１２】
前記発光パラメータは、発光量、発光量の時間変化の微分係数のうち少なくとも何れか１つであることを特徴とする請求項１０または１１記載のストレス測定システム。
【請求項１３】
前記唾液サンプルを密閉容器に密閉状態で封入して冷却保存する保存手段を更に含む請求項９〜１２のいずれか一項記載のストレス測定システム。
【請求項１４】
前記還元剤付加手段により付加する還元剤は、没食子酸、カテキン，ルミノ−ルのうち少なくとも何れか１つを含むことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項記載のストレス測定システム。
【請求項１５】
前記酸化剤付加手段により付加する酸化剤は、過酸化水素であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項記載のストレス測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のストレスを測定する方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、健康状態や精神状態の把握、また、その他医療上の目的からストレスの測定が行われている。ストレスを測定する一つの方法として、ストレスの指標（ストレスマーカ）として知られる唾液中のコルチゾールの濃度を測定する方法が提案されている（例えば下記の特許文献１参照）。
【特許文献１】特許第３１０８７６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述の方法では、取得した唾液を直接、生化学的な方法等を用いて分析装置で分析することによってストレスを測定している。従って、この方法は特別な装置を必要とし、分析には高度な知識や熟練を要するという問題がある。また、唾液中の成分濃度を同定するのに、長い分析時間を必要とするなど、ストレス測定を簡易に行うことができない。
【０００４】
本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、より簡易かつ迅速な方法で、生体のストレスを測定することができるストレス測定方法及びストレス測定システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、唾液中の成分が酸化還元反応の触媒として作用し反応における電子移動などに伴い化学発光することを見出した。さらに、本願発明者は、唾液を採取された被験者にストレスがあるとその化学発光の発光量が強くなるなどの、ストレスと化学発光との間の密接な関係を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明によるストレス測定方法は、（１）液状物質の吸収及び保持が可能な吸収材により、生体の唾液を採取して唾液サンプルとする唾液採取工程と、（２）上記唾液サンプルに還元剤を加える還元剤付加工程と、（３）上記唾液サンプルに酸化剤を加える酸化剤付加工程と、（４）上記還元剤付加工程において還元剤が加えられ、上記酸化剤付加工程において酸化剤が加えられた唾液サンプルの化学発光を測定する発光測定工程と、（５）上記発光測定工程において測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価するストレス評価工程とを備えることを特徴とする。
【０００７】
上記したストレス測定方法では、まず、唾液採取工程において、唾液を採取して唾液サンプルとする。採取は、例えばストレス測定の被験者の口中に、吸収材を含ませることなどにより行われる。
【０００８】
次に、唾液サンプルに、還元剤付加工程において還元剤を加え、酸化剤付加工程において酸化剤を加える。還元剤及び酸化剤を加えられた唾液サンプルは、上記の化学発光メカニズムにより化学発光する。その化学発光を、発光測定工程において測定する。続いて、ストレス評価工程において、測定された化学発光データを参照し所定の基準に基づいてストレスを評価する。
【０００９】
また、本発明によるストレス測定システムは、（ａ）生体の唾液を吸収材に吸収及び保持した唾液サンプルを設置する唾液サンプル設置手段と、（ｂ）上記唾液サンプルに還元剤を加えるための還元剤付加手段と、（ｃ）上記唾液サンプルに酸化剤を加えるための酸化剤付加手段と、（ｄ）上記唾液サンプル設置手段により設置された唾液サンプルの化学発光を測定する発光測定手段と、（ｅ）上記発光測定手段により測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価するストレス評価手段とを含んで構成されることを特徴とする。
【００１０】
上記したストレス測定方法及びストレス測定システムによれば、唾液を採取し、採取されたサンプルの発光を計測するという、簡易な方法で生体のストレスを測定することができる。また、測定システムを簡単な構成で低コスト化することができる。また、発光の計測は通常数十秒〜数分程度行えば充分であるので、迅速な測定が可能である。また、化学発光を測定対象とする上記構成では、フォトンカウンティングなどの手法を用いることにより、ごく微量物質による発光まで精度よく測定して、確実にストレス測定を行うことが可能である。また、唾液の採取に吸収材を用いているため、唾液を液状のまま取り扱うよりもサンプルの局所濃度が高くなり、化学発光の測定を容易かつ高効率で行うことができる。
【００１１】
なお、吸収材とは、液状物質の吸収及び保持が可能なものであり、特に、ろ紙を用いることが好ましい。あるいは、ろ紙以外のもの、例えばスポンジ等を用いることとしても良い。また、ストレス評価工程における所定の基準とは、例えば発光量が多ければストレスが多いと評価するというような、ストレスを定性的または定量的に評価可能な基準であるものとする。また、化学発光の測定は、例えば光電子増倍管やフォトンカウンタなどを用いて行うことができる。
【００１２】
また、唾液サンプルからの発光測定の対象となる化学発光は、サンプルに酸化剤及び還元剤を加えたときの酸化・還元反応に伴って、光エネルギーが放出されることによる発光である。このような化学発光がストレスと関係しているのは、化学発光に関わっている化学物質が、被験者がストレスを感じると、より多く分泌されるストレスマーカであるからであると推測される。
【００１３】
ここで、ストレス測定方法は、還元剤付加工程を行った後に、酸化剤付加工程を行う構成とすることが好ましい。
【００１４】
また、ストレス測定方法において、より具体的には、上記所定の基準は、上記発光測定工程において測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスが有ると評価する基準とすることが好ましい。同様に、ストレス測定システムにおいて、より具体的には、上記所定の基準は、上記発光測定手段により測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスが有ると評価する基準とすることが好ましい。
【００１５】
このように、ストレスの評価に標準範囲を利用する場合には、上記標準範囲は、上記唾液を採取する生体に応じて予め測定されたデータに基づき設定することが好ましい。これにより、被験者（生体）毎に標準範囲が設定されるので、個人差の影響等も含めてより正確に被験者毎のストレスの測定を行うことができる。
【００１６】
また、ストレス測定方法及びストレス測定システムにおいて、より具体的には、上記発光パラメータは、発光量、発光量の時間変化の微分係数のうち少なくとも何れか１つであることを特徴とすることが好ましい。このような発光パラメータを用いることにより、ストレスを好適に評価することができる。また、これら以外の発光パラメータを用いても良い。
【００１７】
また、ストレス測定方法は、上記唾液サンプルを密閉容器に密閉状態で封入して冷却保存する保存工程を更に備えることが好ましい。同様に、ストレス測定システムは、上記唾液サンプルを密閉容器に密閉状態で封入して冷却保存する保存手段を更に含むことが好ましい。これにより、生体の唾液を採取した後、時間を開けてその唾液の化学発光の測定を行うことができる。したがって、例えば複数の被験者の唾液を採取し、その後それらの唾液の分析を一度に行うなどの柔軟なストレス測定を行うことができる。
【００１８】
また、ストレス測定方法において、より具体的には、上記還元剤付加工程において付加する還元剤は、没食子酸、カテキン，ルミノ−ルのうち少なくとも何れか１つを含むことが好ましい。同様に、ストレス測定システムにおいて、上記還元剤付加手段により付加する還元剤は、没食子酸、カテキン，ルミノ−ルのうち少なくとも何れか１つを含むことが好ましい。
【００１９】
また、ストレス測定方法において、より具体的には、上記酸化剤付加工程において付加する酸化剤は、過酸化水素であることが好ましい。同様に、ストレス測定システムにおいて、上記酸化剤付加手段により付加する酸化剤は、過酸化水素であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、唾液を採取し、採取されたサンプルの発光を計測するという、簡易かつ迅速な方法で生体のストレスを測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面とともに本発明によるストレス測定方法及びストレス測定システムの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００２２】
図１は、ストレス測定システム１０の実施形態の機能構成図である。ストレス測定システム１０は、被験者（生体）から採取された唾液の発光現象を利用して被験者のストレスを測定するものである。具体的には、本システム１０は、唾液サンプル設置部１１と、還元剤付加部１２と、酸化剤付加部１３と、発光測定部１４と、ストレス評価部１５とを含んで構成されている。
【００２３】
唾液サンプル設置部１１は、発光測定の対象となる生体の唾液を含む唾液サンプルを設置する設置手段である。唾液サンプルとしては、液状物質の吸収及び保持が可能な吸収材を利用し、この吸収材に生体の唾液を吸収及び保持したものが用いられる。吸収材としては、好ましくはろ紙が用いられる。あるいは、ろ紙以外のもの、例えばスポンジ等を用いることとしても良い。
【００２４】
唾液サンプル設置部１１に設置された唾液サンプルに対し、測定システム１０には、還元剤付加部１２、及び酸化剤付加部１３が設けられている。還元剤付加部１２は、唾液サンプルに還元剤を加える。また、酸化剤付加部１３は、唾液サンプルに酸化剤を加える。還元剤としては例えば、没食子酸、カテキン，ルミノ−ルなどを含むものを用いるのが好ましい。また、酸化剤としては例えば、過酸化水素であることが好ましい。これらの還元剤及び酸化剤は、唾液サンプルで化学発光を生じさせるために用いられる。
【００２５】
発光測定部１４は、唾液サンプル設置部１１に対して所定位置に設けられており、設置部１１に設置された唾液サンプルの化学発光を測定する。また、発光測定部１４で測定された化学発光データは、ストレス評価部１５に入力されている。ストレス評価部１５は、測定された化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価する。なお、所定の基準とは、化学発光データからストレスの測定を可能とする基準であり、具体的な内容については後述する。
【００２６】
図２は、図１に示した実施形態のストレス測定システム１０における、具体的装置構成の一例を示す。図２に示す構成例においては、ストレス測定システム１０は、シャーレ１０ａと、還元剤付加用シリンジ１０ｂと、酸化剤付加用シリンジ１０ｃと、光電子増倍管１０ｄと、暗箱１０ｅと、フォトンカウンタ１０ｆと、情報処理装置１０ｇとの各装置を含んで構成されている。
【００２７】
シャーレ１０ａは、唾液サンプル２０を設置するためのものであり、唾液サンプル設置部１１に相当する。還元剤付加用シリンジ１０ｂは、液体物質を吐出する装置であり、液体の還元剤をシャーレ１０ａに設置された唾液サンプル２０に付加するためのものである。即ち、還元剤付加用シリンジ１０ｂは、図１における還元剤付加部１２の機能を実現する。また、酸化剤付加用シリンジ１０ｃも構造は還元剤付加用シリンジ１０ｂ同様であり、液体の酸化剤をシャーレ１０ａに設置された唾液サンプル２０に付加するためのものである。即ち、酸化剤付加用シリンジ１０ｃは、図１における酸化剤付加部１３の機能を実現する。なお、還元剤付加用シリンジ１０ｂ及び酸化剤付加用シリンジ１０ｃは、情報処理装置１０ｇにより、還元剤及び酸化剤の唾液サンプル２０に対する吐出の量やタイミングなどが制御される構成とするのが好ましい。
【００２８】
光電子増倍管１０ｄは、シャーレ１０ａに設置されたサンプル２０の発光、即ち還元剤、酸化剤とサンプル２０との酸化還元反応の結果生じるフォトン（光子）を検出する。暗室１０ｅは、シャーレ１０ａでの微弱な発光を検出するために、外部からの光を遮断し、シャーレ１０ａ及び光電子増倍管１０ｄの周囲を暗くするために設けられている。このような構成において、光電子増倍管１０ｄにより検知されたフォトンに対応して出力された検出信号が、計数回路などから構成されたフォトンカウンタ１０ｆによりカウントされる。これにより、シャーレ１０ａからの化学発光が計測され、化学発光データが取得される。光電子増倍管１０ｄ、及びフォトンカウンタ１０ｆは、図１における発光測定部１４の機能を実現する。
【００２９】
フォトンカウンタ１０ｆにより測定された化学発光データは情報処理装置１０ｇに送信される。情報処理装置１０ｇは、ＣＰＵ及びメモリなどから構成され、ストレスを評価するための所定の基準を記憶しており、ストレスを評価するための演算などを行う。情報処理装置１０ｇは、受信した化学発光データを参照し、所定の基準に基づいて被験者のストレスを評価する。これにより、情報処理装置１０ｇは、図１におけるストレス評価部１５の機能を実現する。また、この情報処理装置１０ｇは、ストレス評価以外の機能、例えば測定システム１０の各部の制御機能などを併せて有していても良い。
【００３０】
なお、各装置には必要に応じて電源が備えられており、動作に必要な電力が供給される。また、情報処理装置１０ｇに対しては、キーボードやマウスなどの入力装置、ＣＲＴディスプレイや液晶ディスプレイなどの表示装置などが、必要に応じて接続される。入力装置は、ストレス測定実行の指示情報や、測定条件の情報などの入力に用いることができる。また、表示装置は、ストレスの測定結果や、測定の実行状況などの表示に用いることができる。
【００３１】
次に、図１及び図２に示したストレス測定システム１０を用いた本発明によるストレス測定方法について、図３に示すフローチャートを参照しつつ説明する。
【００３２】
まず、ろ紙やスポンジなどの吸収材を用いて、ストレスの測定対象となる生体の口中から唾液を採取し、唾液サンプル２０とする（ステップＳ１０１、唾液採取工程）。唾液サンプル２０は、シャーレ１０ａ上に設置される。
【００３３】
次に、還元剤付加用シリンジ１０ｂを用いて、唾液サンプル２０に没食子酸などの還元剤を加える（ステップＳ１０２、還元剤付加工程）。また、酸化剤付加用シリンジ１０ｃを用いて、唾液サンプル２０に過酸化水素などの酸化剤を加える（ステップＳ１０３、酸化剤付加工程）。なお、各シリンジ１０ｂ、１０ｃには、それぞれ予め必要量の還元剤、酸化剤を入れておくものとする。
【００３４】
還元剤及び酸化剤が加えられた唾液サンプル２０では、唾液中に含まれ被験者のストレスと何らかの相関を有する物質（ストレスマーカ）が、還元剤と酸化剤との反応を促進する。そして、この酸化還元反応での電子移動等に伴って、化学発光する。このときの化学発光は、唾液を採取した被験者のストレスと相関を有することとなる。光電子増倍管１０ｄは、その化学発光によるフォトンを検知する。さらに、フォトンカウンタ１０ｆが、光電子増倍管１０ｄにより検知されたフォトンをカウントし、化学発光を測定する（ステップＳ１０４、発光測定工程）。フォトンカウンタ１０ｆは測定された化学発光データを情報処理装置１０ｇに送信する。
【００３５】
次に、情報処理装置１０ｇは、受信した化学発光データを参照し、所定の基準に基づいてストレスを評価する（ステップＳ１０５、ストレス評価工程）。ここで、所定の基準ととしては、例えば、測定された化学発光における所定の発光パラメータの値が予め定められた標準範囲から外れている場合、ストレスが有ると評価する基準を用いることが好ましい。具体的には、化学発光の発光量に対し、閾値によって標準範囲を設定し、発光量が閾値を超えている場合にストレスが有るとする構成がある。
【００３６】
また、ストレス評価の基準で用いることができる発光パラメータとしては、発光量以外にも例えば、発光量の時間変化の微分係数（微分係数が大きい、即ち発光が急激に増加していればストレスがある）などを用いてもよい。また、ストレスマーカとなる唾液中の成分の量は、通常、個人差があると考えられる。このため、ストレスを測定する生体毎に、予めストレスが無い状態などのデータを取得しておき、そのデータに基づき基準を設定することが好ましい。また、上記の例では、ストレスの有り無しという定性的なストレスの評価について示したが、ストレスを数値化する定量的な基準を設定してもよい。なお、ここで、ストレスが「有る」とはある一定以上のストレスを感じている状態をいう。
【００３７】
上記実施形態によるストレス測定方法及びストレス測定システム１０の効果について説明する。
【００３８】
図１〜図３に示したストレス測定方法及びストレス測定システム１０によれば、唾液を採取し、採取されたサンプルの発光を計測するという、簡易な方法で生体のストレスを測定することができる。また、生化学的な分析装置などの特別な装置を必要としないので、測定システムを簡単な構成で低コスト化することができる。また、ストレス測定を行う測定者において、高度な知識や熟練が不要になる。また、化学発光を測定することによるストレス測定では、発光の計測は通常数十秒〜数分程度行えば充分であるので、迅速な測定が可能である。
【００３９】
また、化学発光を測定対象とする上記構成では、フォトンカウンティングなどの手法を用いることにより、ごく微量物質による発光まで精度よく測定して、確実にストレス測定を行うことが可能である。また、唾液の採取にろ紙という吸収材を用いている。このような吸収材を用いた唾液サンプルでは、唾液を液状のまま取り扱うよりもサンプルの局所濃度が高くなり、化学発光の測定を容易かつ高効率で行うことができる。また、このような唾液サンプルは、サンプルの保存等を行う上でも好適である。
【００４０】
このようなストレス測定は、例えば、病院において入院患者に対して１日１回ずつ、例えば起床時に唾液の発光測定を行うなど、被験者の日常的な健康状態や精神状態の把握に利用することができる。また、この他にも様々な目的に対して化学発光測定によるストレス測定を応用することが可能である。例えば、医療上の目的としては、健康状態のモニタリングの他、うつ病や極端なストレス状態の測定、神経内科へのサポート、健康機器への応用などが挙げられる。また、医療上の目的以外にも、音楽ＣＤなどリラクゼーション機器や健康食品の研究開発の支援などに利用することが可能である。
【００４１】
ここで、唾液サンプルからの発光測定の対象となる化学発光は、上記したように唾液中に含まれストレスと何らかの相関を有する物質（ストレスマーカ）が、酸化還元反応の触媒として作用して生じる化学発光である。ただし、化学発光の原因となる唾液中の物質については、既知となっている必要はなく、実際に測定される化学発光とストレスとの相関がわかっていれば良い。また、ストレスと相関を有し化学発光の原因となる物質については、１種類または複数種類の物質であって良い。
【００４２】
また、上記実施形態では、比較的不安定な酸化剤（例えば過酸化水素）を還元剤の後に加えることとしている。これにより、安定した条件で化学発光を起こさせることができ、より確実にストレスを測定することができる。ただし、唾液サンプルに加える具体的な酸化剤、還元剤の種類などによっては、必ずしも還元剤、次に酸化剤という順序には限定されない。
【００４３】
また、唾液サンプルの発光測定においては、測定作業の効率などの観点から、例えば複数の被験者についてそれぞれ唾液の採取を行い、その後に、それらの唾液の分析を一度に行う場合がある。この場合、唾液の採取から発光測定までの間で、唾液サンプルの状態が変化しないように保存を行うことが好ましい。このようなサンプルの保存方法としては、唾液サンプル２０を密閉容器に密閉状態で封入して低温で冷却保存しておくことが好ましい。これにより、被験者の唾液の採取から時間を開けて、良好な状態で唾液の化学発光の測定を行うことが可能となる。ただし、唾液の採取後に直ちに発光測定を行っても良い。
【００４４】
また、本実施形態においては、シリンジにより還元剤及び酸化剤を唾液サンプル２０に加えることとしているが、還元剤及び酸化剤の付加手段としては、シリンジ以外の構成を用いても良い。また、例えば、酸化剤及び還元剤のうちの少なくとも一つを、吸収材に予め含ませておき、唾液を採取した時点で加えられた状態となるようにしてもよい。そのような方法としては、ろ紙にお茶のカテキン等を染み込ませておく方法がある。この場合、より簡便なストレス測定が可能となる。
【００４５】
次に、実施例により本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
本実施例においては、６０人の学生に対し単位認定試験の３０分前、試験直後、試験の３０分後の３度、唾液を採取し、ストレスの測定を行った。ここで、単位認定試験は、学生にとり、通常かなり緊張する、即ちストレスの原因となる試験である。
【００４７】
唾液の取得はろ紙を３０秒間、被験者の舌の上に載せることにより行われた。そして、得られた唾液サンプルを密閉可能なポリ袋に入れて、冷凍庫で−３０℃の温度で冷凍保存し、後日、以下の測定を行った。測定日には、冷凍保存されたサンプルを一度０℃の氷の温度まで戻し、次に室温まで戻して測定を行った。
【００４８】
唾液サンプルの保存については、具体的には図４に示すように、唾液を採取した後、唾液を含むろ紙（図４（ａ））を採取者の手で、チャック付ポリ袋（ユニパックＡ−４、株式会社生産日本社製）に入れて封をした（図４（ｂ））。さらに、氷上にて冷却した回収ポリ袋（ユニパックＪ−４、株式会社生産日本社製）に入れた（図４（ｃ））。そして、単位認定試験の実習終了後（最初に採取した人は約５時間後、最後に採取した人は直後）に、−３０℃に設定した冷凍庫（Medical Freezer, SANYO製）にて保存し、発光測定の当日までそのまま保管した（図４（ｄ））。
【００４９】
発光測定においては、シャーレに設置された唾液サンプルに対して、まず３mMの没食子酸（還元剤）１mlを滴下し、その２０秒後に３％w/vの過酸化水素（酸化剤）１mlを滴下させ化学反応させた。なお、発光の測定は没食子酸の滴下時から開始し、１２０秒間行われた。
【００５０】
測定された化学発光の発光量の時間波形を図５のグラフに示す。図５のグラフは、横軸に測定時間、縦軸に１秒あたりにカウントされたフォトンの数、即ち発光量をとったものである。このグラフでは、試験の３０分前、試験直後、及び試験の３０分後のいずれの場合も、測定開始から２０秒後の過酸化水素が滴下された時点から化学発光が立ち上がっていることがわかる。いずれの場合も，測定開始10秒後に没食子酸を滴下しているが，その時には化学発光の立ち上がりはない。
【００５１】
また、図５では、試験の３０分前及び３０分後と比較して、通常最も緊張した状態となる試験の直後における発光量は２〜３倍と、高い値となっている。このグラフは６０人のうちで特定の被験者に関するものであるが、各被験者に対して得られた化学発光スペクトルの典型例を示すものである。具体的には、約６０％の被験者において、試験３０分前及び３０分後と比較して試験の直後の発光量が高いという、図５と同様の発光パターンとなっていた。最も緊張が高いと考えられる、試験直後の発光量が最も高くなっている上記結果より、本測定方法により適切にストレスを測定可能であることがわかる。また、このような化学発光の発光量の変化に対して、閾値などにより標準範囲を設定しておけば、上記したように簡易にストレスの評価を行うことが可能となる。
【００５２】
また、図５に示す各グラフの立ち上がり、即ち、発光量の時間変化開始時における発光スペクトルの傾きに着目すると、試験の３０分前及び３０分後と比較して、試験の直後における発光スペクトルの傾きが急に（微分係数が大きく）なっていることがわかる。したがって、発光量、あるいは発光量の時間変化の微分係数を用いてもストレスの測定を好適に行うことができる。
【００５３】
次に、唾液の中に含まれ、ストレスマーカとして知られているIgAの濃度と、各測定時点での総発光量との関係を図６及び図７のグラフに示す。ここで、IgA（免疫グロブリンＡ）は、局所的生体防御を支配していて、外界と接する粘膜面で防御機能を発揮するものであり、ストレス刺激で上昇することが知られている。また、以下のグラフにおいてIgAの濃度は、唾液中のIgAの精製を行わず、唾液を１０ｍＭのＰＢＳ（Phosphate buffered saline、ｐＨ７．４）にて２００倍に希釈してＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００５４】
具体的には、まず、９６ well plate（Falcon製、353912）の各wellに、mouse IgG 抗 human IgA（１０mM のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０．５μg/mlに希釈したもの）を １００μlずつ加え、４℃で数時間吸着させた。その後、１％Ｔ−ＴＢＳ（Tris-buffered saline-including 0.5mL/L tween20）で３回洗浄して、Block液（１％BSA（Sigma製）：５％ skim-milk（Wako製）＝１：１ in ＴＢＳ）を各well に２００μＬずつ加え、４℃で３時間吸着させた。次いで１％Ｔ−ＴＢＳで３回洗浄後、１０mM のＰＢＳにて２００倍に希釈した唾液１００μl、スタンダードとしてhuman IgA（PROTOS IMMUNORESEARCH製、CAT NO.502, LOT.NO 1766-8）を１０mM のＰＢＳにて段階希釈（167,125,83,63,42,31,21ng/ｍL）したもの、及びブランクとして１０mMのＰＢＳを１００μlずつ加え、室温で１時間吸着させた。続いて、１％Ｔ−ＴＢＳで５回洗浄後、HRP-Goat抗 human IgA（SIGMA製、Product No.A 0295をBlock液にて2.16 μg/ml に希釈したもの）を加え、室温で１時間吸着させた。続いて、１％T-TBSで５回洗浄後、ABTS （0.2g ABTS-50mM citrate buffer ｐＨ４．０）にＨ２Ｏ２（1/600の量）を直前に加え、各wellに１００μlずつ加えて、その２０分後に４１５nmの波長にて吸光度を測定した。
【００５５】
図６は、試験の３０分前、直後、３０分後及び６０分後のそれぞれの時点における、IgAの濃度と、総発光量（図５のグラフに示したような化学発光の発光量の時間変化を時間で積算したもの、測定時間２０秒〜１２０秒の間）との値を示したものである。なお、グラフにおいて折れ線部分がIgA濃度であり、棒グラフが総発光量である。図６から分かるとおり、最も緊張する試験直後におけるIgA濃度及び総発光量が他の時点よりも高くなっている。このことから、化学発光による総発光量が、上記のＥＬＩＳＡ法によるIgA濃度などの化学発光現象を利用しないストレスマーカと同様に、被験者のストレスを評価するための好適な指標となっていることがわかる。
【００５６】
図７は、横軸をIgA濃度、縦軸を総発光量（測定時間２０秒〜１２０秒の間）とした測定データのプロット図である。また、図中に引かれている直線は、図中のデータから算出された回帰直線である。IgA濃度と総発光量との相関係数は０．６７２であり、また図７に示されるデータからも分かるように、IgAと本実施例における化学発光とは、強い相関があると考えられる。従って、これらデータからも本方法で、ストレスの測定を行うことができると推測される。
【００５７】
本発明によるストレス測定方法及び測定システムは、上記した実施形態及び実施例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、化学発光を測定する発光測定手段としては、上記した光電子増倍管１０ｄ及びフォトンカウンタ１０ｆを用いた構成以外にも、測定対象となる化学発光の強度などに応じて、様々な構成を用いて良い。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ストレス測定システムの実施形態の機能構成図である。
【図２】ストレス測定システムの実施形態における、具体的装置構成の一例を示す図である。
【図３】図１及び図２に示したストレス測定システムを用いたストレス測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】唾液サンプルの保存方法について示す図である。
【図５】実施例における測定時間と発光量との関係を示したグラフである。
【図６】実施例におけるIgA濃度と総発光量とを示したグラフである。
【図７】実施例におけるIgA濃度と総発光量とのプロット図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０…ストレス測定システム、１０ａ…シャーレ、１０ｂ…還元剤付加用シリンジ、１０ｃ…酸化剤付加用シリンジ、１０ｄ…光電子増倍管、１０ｅ…暗箱、１０ｆ…フォトンカウンタ、１０ｇ…情報処理装置、１１…唾液サンプル設置部、１２…還元剤付加部、１３…酸化剤付加部、１４…発光測定部、１５…ストレス評価部、２０…唾液サンプル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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