(57)【要約】【課題】  蛍光像の観察に影響を与えることなく焦点位置検出を精度良く行うことができる蛍光顕微鏡の提供。【解決手段】  照明光Ｌ１を導入するためのダイクロイックミラー２３と対物レンズ８との間の光路中に、オートフォーカス用の赤外照明光を導入するためのダイクロイックミラー１７を配設する。オートフォーカス時には、オートフォーカス装置２で発生した赤外照明光をダイクロイックミラー１７で反射して試料５を照明し、試料からの反射赤外光をダイクロイックミラー１７で反射させて検出する。蛍光観察時には、ダイクロイックミラー２３により導入された照明光Ｌ１はダイクロイックミラー１７を透過して試料５に照射され、試料５からの蛍光Ｌ２はダイクロイックミラー１７を透過して結像レンズ６により結像される。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察用光束の波長と異なる波長の焦点位置検出用光束を試料に照射し、前記試料からの反射光に基づいて対物レンズの焦点位置を検出する焦点位置検出装置を備えた蛍光顕微鏡であって、
前記対物レンズと照明光学系からの照明光を前記対物レンズへ反射する蛍光観察用ダイクロイックミラーとの間の観察用光束の光路中に配設され、前記観察用光束を透過し、かつ、前記焦点位置検出装置からの前記焦点位置検出用光束を前記試料へと反射するとともに前記試料で反射された前記焦点位置検出用光束を前記焦点位置検出装置へと反射する光学部材を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、
前記光学部材は、前記観察用光束を含む特定波長域の光を透過し、前記焦点位置検出用光束を含み前記特定波長域とは異なる波長域の光を反射するダイクロイックミラーであることを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項３】
請求項２に記載の蛍光顕微鏡において、
前記光学部材の透過波長域は、前記蛍光観察用ダイクロイックミラーの透過波長域を含み、かつ、その透過波長域よりも広いことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焦点位置検出装置を備えた蛍光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡の焦点を検出する方法として、撮影した画像のコントラストを解析しコントラストがもっとも高いところを焦点位置とするコントラスト法や、焦点検出用の光を対物レンズを通して試料に照射し、試料からの戻り光を検出して焦点位置を検出する方法などが知られている。
後者の方法では、焦点検出用の光源として赤外光が使われることがある。焦点検出用の赤外光を顕微鏡に導入し、対物レンズを介して試料に照明する。試料中で反射された光は、対物レンズで集光され同じ光路を通って焦点検出用の光検出器で検出される（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平１３−２４２３７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、蛍光を検出する蛍光顕微鏡の場合、赤外光を使用した焦点検出装置で焦点検出を行い、落射照明光で試料を励起して蛍光を測定する。この場合、光路中には赤外光を反射して対物レンズに入射して試料に照射し、試料からの反射光を検出器に向かわせるハーフミラーなどの焦点検出用ミラーと、蛍光励起光を反射し、蛍光を透過させるハーフミラーなどの蛍光用のミラーが光路中に挿入される。したがって、焦点検出用のミラーによって蛍光が減少したり、蛍光用のミラーによって、焦点検出用の赤外光が弱くなってしまい、焦点が検出できない場合がある。
そこで本発明は、蛍光像の観察に影響を与えることなく、焦点位置の検出を精度良く行うことにできる蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
請求項１の発明による蛍光顕微鏡は、観察用光束の波長と異なる波長の焦点位置検出用光束を試料に照射し、試料からの反射光に基づいて対物レンズの焦点位置を検出する焦点位置検出装置を備えるものである。そして、対物レンズと照明光学系からの照明光を対物レンズへ反射する蛍光観察用ダイクロイックミラーとの間の観察用光束の光路中に配設され、観察用光束を透過し、かつ、前記焦点位置検出装置からの焦点位置検出用光束を試料へと反射するとともに試料で反射された前記焦点位置検出用光束を焦点位置検出装置へと反射する光学部材を備えたことを特徴とする。
請求項２の発明は、請求項１に記載の蛍光顕微鏡において、光学部材を、観察用光束を含む特定波長域の光を透過し、焦点位置検出用光束を含み特定波長域とは異なる波長域の光を反射するダイクロイックミラーとしたものである。
請求項３の発明は、請求項２に記載の蛍光顕微鏡において、光学部材の透過波長域を、蛍光観察用ダイクロイックミラーの透過波長域を含み、かつ、その透過波長域よりも広くした。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、蛍光像の観察に影響を与えることなく、焦点位置の検出を精度良く行うことができる蛍光顕微鏡を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、図を参照して本発明を実施するための最良の形態を説明する。図１は正立型の蛍光顕微鏡の概略構成を示す図である。顕微鏡には落射型の観察用照明装置１、スリット投影方式オートフォーカス装置２およびステージ４を上下動するための駆動制御系３を備えている。観察対象である標本はスライドガラス５ｂとカバーガラス５ａとの間に挟持され、これらの試料５はステージ４上に載置される。
【０００８】
蛍光観察を行う場合には、観察用照明装置１により試料５が照明される。観察用照明装置１の光源２１には水銀ランプ等が用いられる。光源２１を出射した光束は照明光学系２２ａ，２２ｂによって対物レンズ８の瞳位置近傍に結像される。照明光学系２２ａ，２２ｂを出射した光束は、フィルタユニット２６に設けられた励起フィルタ２４に入射する。励起フィルタ２４は標本中の蛍光物質を励起する波長域の光束を透過するフィルタである。
【０００９】
励起フィルタ２４を透過した照明光束Ｌ１は蛍光観察用のダイクロイックミラー２３で反射され、赤外カットフィルタ１９およびオートフォーカス用のダイクロイックミラー２３を透過し、対物レンズ８を介して試料５に照射される。詳細は後述するが、赤外カットフィルタ１９およびダイクロイックミラー２３は、照明光束Ｌ１および標本から発せられる蛍光Ｌ２の波長域の光を透過するように設定されている。
【００１０】
励起フィルタ２４を透過した照明光束Ｌ１が試料５の標本に照射されると、標本に含まれる蛍光物質が励起されて蛍光Ｌ２を発生する。この蛍光Ｌ２の波長は、照射された照明光束Ｌ１の波長よりも長波長側にシフトしている。蛍光Ｌ２は対物レンズ８を通って平行光束とされ、ダイクロイックミラー１７，赤外カットフィルタ１９を透過してダイクロイックミラー２３に入射する。
【００１１】
蛍光Ｌ２は上述したように照明光束Ｌ１よりも長波長側にシフトしているため、ダイクロイックミラー２３を透過する。吸収フィルタ２５は、観察に使用する蛍光Ｌ２以外の波長域の光を吸収する。吸収フィルタ２５を透過した蛍光Ｌ２は結像レンズ６によって結像位置７に結像される。励起フィルタ２４，ダイクロイックミラー２３および吸収フィルタ２５は全て一つのフィルタユニット２６に設けられており、これらは一種類の励起光に対応するフィルタセットを構成している。観察用照明装置１は、標本に含まれる蛍光物質に応じてフィルタセットを交換して用いることができる。
【００１２】
図２は図１と同様の構成図であるが、照明光束Ｌ１，蛍光Ｌ２に代えてオートフォーカス装置２を説明するための光束Ｌ３を表示したものである。光源１１には近赤外光を発生するＬＥＤ等が用いられる。光源１１の前方には、紙面垂直方向に横長の矩形スリットが形成されたスリット板１２が配設されている。図２に示すように座標軸を設定した場合、長辺がｙ軸に平行で短辺がｚ軸に平行な矩形スリットがスリット板１２に形成されている。
【００１３】
光源１１で発生された赤外照明光Ｌ３は、スリット板１２を通過した後に投影レンズ１３によりスリット状の光束とされる。この赤外照明光Ｌ３はその断面の上半分側に相当する光束が瞳制限絞り１６Ａにより遮光され、スリット状光束の下側半分がハーフミラー１５に入射する。ハーフミラー１５に入射した赤外照明光Ｌ３の一部はハーフミラー１５を透過し、さらに、可視光をカットするフィルタ１８を透過する。
【００１４】
このフィルタ１８を設けることによりオートフォーカス装置２への可視光の入射が阻止され、オートフォーカス時の誤動作などが防止される。また、ダイクロイックミラー１７とダイクロイックミラー２３との間に赤外カットフィルタ１９を配設することにより、結像レンズ６方向への赤外照明光Ｌ３の漏れを防止できる。
【００１５】
フィルタ１８を透過した赤外照明光Ｌ３は、蛍光観察用ダイクロイックミラー２３と対物レンズ８との間に挿入されたフォーカス用ダイクロイックミラー１７に入射する。ダイクロイックミラー１７は励起光Ｌ１や蛍光Ｌ２（図１参照）を透過し赤外照明光Ｌ３を反射する特性を有している。フィルタ１８を透過した赤外照明光Ｌ３は、ダイクロイックミラー１７によって対物レンズ８へと反射されて試料５に照射される。
【００１６】
試料５に照射された赤外照明光Ｌ３は、カバーガラス５ａの表面や、カバーガラス５ａと標本との界面などで反射される。その反射赤外光Ｌ４は対物レンズ８を透過してダイクロイックミラー１７により反射される。ダイクロイックミラー１７で反射された反射赤外光Ｌ４はフィルタ１８を透過した後、その一部がハーフミラー１５によってｚ軸方向に反射される。ハーフミラー１５で反射された反射赤外光Ｌ４は瞳制限絞り１６Ｂを通った後に結像レンズ１４によって結像され、光電変換素子２０上にスリット像が形成される。
【００１７】
なお、瞳制限絞り１６Ｂによって遮光される領域は、瞳制限絞り１６Ａによって遮光される領域に対応している。また、光電変換素子２０としては、例えばＣＣＤ撮像素子が用いられ、受光素子がライン状に配設されたラインセンサでも良いし、受光素子が二次元的に配設されたエリアセンサであっても良い。
【００１８】
光電変換素子２０からの出力信号は信号処理部３１に入力され、焦点位置が演算される。試料５の位置が合焦位置から上下方向（ｚ方向）にずれると、そのずれ量に応じて光電変換素子２０上におけるスリット像の結像位置もｘ方向にずれる。すなわち、信号処理部３１では、結像位置のｘ方向ずれ量に応じて、対物レンズ８の合焦位置からの相対距離である焦点位置が演算される。
【００１９】
駆動制御系３の駆動部３２はステージ４をｚ方向に上下移動させる。ＣＰＵ４１は信号処理部３１から入力される焦点情報に基づいて駆動部３２を制御し、ステージ４を合焦位置に移動する。メモリ４２には、オートフォーカスに関する各種パラメータが記憶されている。入力部４３にはオートフォーカスを指示するスイッチや、ステージ４をマニュアルで上下させるスイッチなどが設けられている。
【００２０】
次に、図３を参照して、ダイクロイックミラー１７の波長域設定について説明する。図３において横軸は光の波長を表し、縦軸は各光学部材の透過率を表している。曲線５３は励起フィルタ２４の透過特性を示したものであり、波長５００ｎｍ近辺の光（青色）を励起光（照明光束Ｌ１）として透過する。また、曲線５４は吸収フィルタ２５の透過特性を表したものであり、励起フィルタ２４よりも長波長側にシフトした約５５０ｎｍを中心とする波長域で透過率が大きくなっている。吸収フィルタ２５の透過波長域は蛍光Ｌ２の波長域が含まれるように設定されている。
【００２１】
曲線５２はダイクロイックミラー２３の透過特性を示すものであり、励起フィルタ２４の透過波長域では透過率はほぼ０％になっている。励起フィルタ２４の透過波長域よりも僅かに波長が大きくなると透過率が急激に大きくなり、７００ｎｍよりやや小さな波長付近まで大きな状態が保たれる。すなわち、ダイクロイックミラー２３は励起フィルタを透過した光を反射し、蛍光Ｌ２が含まれる波長域の光を透過する。
【００２２】
一方、オートフォーカス用のダイクロイックミラー１７の透過特性は、蛍光観察に影響を与えないようにするために、曲線５１のように近紫外域から可視域が透過され、近赤外域が反射されるような特性に設定される。すなわち、約７００ｎｍ付近を境にして赤外照明光Ｌ３の波長域を含む長波長側では透過率がほぼ０％と非常に小さく、短波長側では透過率がほぼ１００％となるように設定される。
【００２３】
具体的には、波長３６０ｎｍ〜６５０ｎｍでの透過率が７０％以上、波長７５０ｎｍ〜８５０ｎｍでの透過率が１０％以下であることが望ましい。さらに、波長４００ｎｍ〜６５０ｎｍでの透過率が８５％以上、波長７５０ｎｍ〜８５０ｎｍでの透過率が５％以下であればより望ましい。
【００２４】
ダイクロイックミラー１７の透過特性を上述したように設定すると、ダイクロイックミラー２３で反射された照明光束Ｌ１や試料５からの蛍光Ｌ２はダイクロイックミラー１７を透過する。また、オートフォーカス用の赤外照明光Ｌ３はダイクロイックミラー１７によって反射され、ダイクロイックミラー２３側に達することがない。そのため、ダイクロイックミラー１７の存在が蛍光観察に影響を与えることがなく、蛍光観察とは別に常時オートフォーカス動作を行わせることが可能となる。さらに、ダイクロイックミラー１７で反射される近赤外光をオートフォーカス用の照明に用いているので、蛍光を使用して焦点調整を行う場合に生じる蛍光の褪色も避けることができる。
【００２５】
図１のフィルタユニット２６は蛍光物質に応じて最適なユニットに交換されるが、フィルタユニット２６に設けられた励起フィルタ２４，ダイクロイックミラー２３および吸収フィルタ２５の透過波長域が、図３に示すようにダイクロイックミラー１７の透過波長域に含まれるものであれば、蛍光観察に使用することができる。
【００２６】
上述した実施の形態では正立型の蛍光顕微鏡を例に説明したが、本発明は倒立型の蛍光顕微鏡にも適用することができる。図４は、倒立型の蛍光顕微鏡の概略構成を示す模式図である。試料５が載置されるステージ４には開口４ａが形成されており、対物レンズ８はステージ４の下方に設けられている。倒立型蛍光顕微鏡では、開口４ａを通して試料５の下方から標本を観察する。
【００２７】
対物レンズ３の下方にはオートフォーカス装置２が設けられ、さらにその下方に観察用照明装置１が設けられている。すなわち、オートフォーカス用ダイクロイックミラー１７は、蛍光照明用のダイクロイックミラー２３と対物レンズ８との間の観察光路上に配置されている。観察用照明装置１およびオートフォーカス装置２は、それぞれ図１，２に示したものと同様である。駆動制御系３は対物レンズ８を駆動し、対物レンズ８を上下させる。
【００２８】
光源２１で発生されて励起フィルタ２４を透過した照明光束（励起光）は、蛍光観察用ダイクロイックミラー２３により上方（ｚ方向）に反射され、赤外カットフィルタ１９およびオートフォーカス用ダイクロイックミラー１７を透過した後に対物レンズ８を介して試料５を底面側から照明する。試料５から発生した蛍光は対物レンズ８を通って平行光束とされ、ダイクロイックミラー１７，赤外カットフィルタ１９，ダイクロイックミラー２３を透過し、リレーレンズ４７ａおよび反射ミラー４８ａによって位置４９に中間像が形成される。さらに、リレーレンズ４７ｂ，反射ミラー４８ｂおよび結像レンズ６によって位置７に観察像が形成される。
【００２９】
一方、オートフォーカス用の赤外照明光は観察光路上に配置されたダイクロイックミラー１７により反射され、対物レンズ８を介して試料５に照射される。試料５で反射された赤外照明光は対物レンズ８を通った後にダイクロイックミラー１７で反射され、オートフォーカス装置２側へと取り込まれる。図４の装置の場合も、ダイクロイックミラー１７の透過特性は図３の曲線５１のように設定されているので、観察用照明光束や蛍光はダイクロイックミラー１７を透過し、顕微鏡観察に対して影響を及ぼすことがない。
【００３０】
図５は上述した蛍光顕微鏡の変形例であり、オートフォーカス装置２に遮光フィルタ６０を追加した。ところで、スリット状の赤外照明光Ｌ３は、図６に示すように対物レンズ８の中心部分でその一部Ｌ０が反射されることがある。対物レンズ８は、種類によっては反射率の非常に大きな材質が使われることがあり、そのような場合には、対物レンズ８の中心部分で反射された光も光電変換素子２０によって検出されることになり、焦点位置検出が正常に行われなくなるおそれがある。
【００３１】
しかし、図５に示したオートフォーカス装置２では、遮光フィルタ６０を用いて中心部分の光束を遮光することにより、そのような弊害を防止することができる。図７（ａ）は遮光フィルタ６０を示す図であり、透過領域６０ａの中心部分に遮光領域６０ｂが形成されている。そのため、図７（ｂ）に示すようにスリット状の赤外照明光６１は上側半分を瞳制限絞り１６Ａにより遮光され、さらに、遮光フィルタ６０の遮光部６０ｂにより中心部分が遮光される。
【００３２】
遮光フィルタ６０を用いると、図８に示すように斜線で示した部分以外の赤外照明光Ｌ３が試料５に入射されるため、光軸付近の光束は対物レンズ８に入射されない。その結果、図６に示す対物レンズ８の中心部分で反射される光Ｌ０の発生を防止することができ、オートフォーカス装置２の焦点位置検出動作に影響を与えることがない。
【００３３】
なお、図５のように遮光フィルタ６０を挿入する代わりに、瞳制限絞り１６Ａの形状を図９（ａ）に示すような形状にして遮光フィルタ６０を兼用させるようにしても良い。すなわち、瞳制限絞り１６Ａの光軸に対応する位置に半円形の遮光部１６０を形成する。その結果、図９（ｂ）に示すように、遮光部１６０によってスリット状赤外照明光６１の中心部分が遮光されることになる。
【００３４】
以上説明した実施の形態と特許請求の範囲の要素との対応において、照明光束Ｌ１および蛍光Ｌ２は観察用光束を、赤外照明光Ｌ３および反射赤外光Ｌ４は焦点位置検出用光束を、オートフォーカス装置２は焦点位置検出装置を、観察用照明装置１は照明光学系を、ダイクロイックミラー２３は蛍光観察用ダイクロイックミラーを、ダイクロイックミラー１７は光学部材をそれぞれ構成する。また、本発明の特徴を損なわない限り、本発明は上記実施の形態に何ら限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】正立型の蛍光顕微鏡の概略構成を示す模式図である。
【図２】オートフォーカス装置２を説明する図である。
【図３】ダイクロイックミラー１７などの波長域を示す図である。
【図４】倒立型蛍光顕微鏡の概略構成を示す模式図である。
【図５】図２に示した蛍光顕微鏡の変形例を示す図である。
【図６】試料５に入射するスリット状照明光の光路を示す図である。
【図７】遮光フィルタ６０を説明する図であり、（ａ）遮光フィルタ６０の平面図、（ｂ）は遮光フィルタ６０を用いたときのスリット状赤外照明光６１の断面形状を示す図である。
【図８】スリット状照明光の光軸付近を遮光した場合の、試料５に入射するスリット状照明光の状態を表した図である。
【図９】瞳制限絞り１６Ａの変形例を示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１  観察用照明装置
２  オートフォーカス装置
３  駆動制御系
４  ステージ
５  試料
６  結像レンズ
８  対物レンズ
１６Ａ，１６Ｂ  瞳制限絞り
１７，２３  ダイクロイックミラー
１８  可視カットフィルタ
１９  赤外カットフィルタ
２４  励起フィルタ
２５  吸収フィルタ
２６  フィルタユニット
６０  遮光フィルタ
Ｌ１  照明光束
Ｌ２  蛍光
Ｌ３  赤外照明光
Ｌ４  反射赤外光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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