(57)【要約】【課題】  水中に存在するプロテオバクテリアを効率的に採取する手段を提供する。【解決手段】  植物エキス含有培地を含浸させた担体を水中に設置し、前記担体に付着した微生物を回収することを特徴とする水中プロテオバクテリアの採取方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物エキス含有培地を含浸させた担体を水中に設置し、前記担体に付着した微生物を回収することを特徴とする水中プロテオバクテリアの採取方法。
【請求項２】
植物エキス含有培地が、微生物に物理的かつ化学的選択圧を加える様な物質、又は特定の微生物の増殖に好ましい物質を含むことを特徴とする請求項１記載の水中プロテオバクテリアの採取方法。
【請求項３】
植物エキス含有培地を含んでいることを特徴とする水中プロテオバクテリア採取用担体。
【請求項４】
植物エキス含有培地が、微生物に物理的かつ化学的選択圧を加える様な物質、又は特定の微生物の増殖に好ましい物質を含むことを特徴とする請求項３記載の水中プロテオバクテリア採取用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中プロテオバクテリアの採取方法に関し、特に、海洋、河川あるいは湖沼などの水中に存在するプロテオバクテリアを培養した状態で採取できるようにした水中プロテオバクテリアの採取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、現場において海水試料を採水後、採取した水を滅菌したメンブランフィルターに注いでろ過、濃縮することによって水中の微生物を採取していた。
【０００３】
また、水中のプランクトンやデトリタスのような水中に浮遊する微小な固形物、あるいは海藻や船底、発電所の熱交換器、採水パイプ等の海水構造物に付着して生活する微生物を調べる場合には、様々な付着基材サンプルを固定したサンプルホルダーを1週間程度水中に浸漬させて、引き上げたサンプルに付着した微生物の付着数の算出、菌株の同定等が行われていた。
【０００４】
比較的少量の水を採取し、かつ、その中の微生物を採取するのみで、所期の目的が達成される場合には、上記の採取方法に格別の問題はない。しかし、水中での微生物濃度が希薄であったり、少量の採水では所望量の微生物を採取できない場合には、反復した採水作業が必要となり、時間的にも作業的にも問題となっている。また、そこで水中にわずかに存在する微生物を採取してくる確率は非常に低い。更に、微生物の機能性の面で、ニーズに合った菌を水中で増殖させ優先的に分離してくることは産業的にも非常に重要な課題であると考える。
【０００５】
以上の問題を解決するため、本発明者らは、培地を含浸させた担体を水中に設置し、それによって水中の微生物を効率的に採取する方法を発明し、先に出願を行った（特許文献１）。
【特許文献１】特開2003-334064号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
水中に存在するプロテオバクテリアの中には、ポリフェノール資化菌など産業上有用な細菌が多いが、これまでプロテオバクテリア選択的、効率的に採取する方法は知られていなかった。
【０００７】
本発明は、水中に存在するプロテオバクテリアを効率的に採取する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、植物エキス含有培地をしみ込ませた担体を使用することにより、ポリフェノール酸化活性を持つプロテオバクテリアなどを効率的に採取できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）を提供するものである。
（１）植物エキス含有培地を含浸させた担体を水中に設置し、前記担体に付着した微生物を回収することを特徴とする水中プロテオバクテリアの採取方法。
（２）植物エキス含有培地が、微生物に物理的かつ化学的選択圧を加える様な物質、又は特定の微生物の増殖に好ましい物質を含むことを特徴とする（１）記載の水中プロテオバクテリアの採取方法。
（３）植物エキス含有培地を含んでいることを特徴とする水中プロテオバクテリア採取用担体。
（４）植物エキス含有培地が、微生物に物理的かつ化学的選択圧を加える様な物質、又は特定の微生物の増殖に好ましい物質を含むことを特徴とする（３）記載の水中プロテオバクテリア採取用担体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の採取方法により、ポリフェノールなどの芳香族炭化水素を分解するプロテオバクテリアなどを選択的に採取できるようになる。このような芳香族炭化水素分解能を持つプロテオバクテリアは、バイオレメディエーションや有機化合物の合成などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の水中プロテオバクテリアの採取方法は、植物エキス含有培地を含浸させた担体を水中に設置し、前記担体に付着した微生物を回収することを特徴とするものである。
【００１３】
植物エキスに使用する植物の種類は特に限定されず、例えば、モクマオウ、クサトベラ、ヤシ、アダン、マングローブのような海浜植物などを使用することができる。
【００１４】
植物エキスの調製法も特に限定されず、例えば、上記植物の葉をすり潰し、滅菌海水等で希釈し、その後、濾過することにより調製できる。
【００１５】
培地中に含まれる植物エキスの量も特に限定されず、通常、培地100ml当り、20-40gの植物から得られた植物エキスが含まれていればよい。
【００１６】
採取対象とする細菌は、プロテオバクテリアに属するものであれば特に限定されず、例えば、γ−プロテオバクテリア、好ましくは、ポリフェノール酸化活性を持つγ−プロテオバクテリアなどを採取対象とすることができる。また、採取対象とするプロテオバクテリアは水中に存在するものであればよく、例えば、海洋、河川、湖沼等に存在する微生物を採取対象とすることができる。
【００１７】
植物エキス含有培地は、例えば、海洋微生物を採取しようとする場合には、海水などを主体とした培地に植物エキスを添加し使用することができる。また、水中に担体を設置したときに培地成分が流出しないように、培地中には固化剤を添加しておく。固化剤としては、寒天を使用することができるが、ゼラチン、ゲランガム、アガロース、カラギーナン、アラビアガムなどを使用してもよい。植物エキスを添加することにより、植物エキス中の成分、例えば、ポリフェノール、ステロール、テルペン、芳香族化合物、炭化水素等を生育に必要とする菌を優占的に採取できる。
【００１８】
培地中に微生物に物理的かつ化学的選択圧を加える様な物質、特定の微生物の増殖に好ましい物質を添加することにより、特定の微生物を優占的に採取することが可能になる。このような物質としては、特開2003-334064号公報（特許文献１）に記載されている物質を使用することができる。
【００１９】
担体の素材は、培地を保持できるものであればどのようなものでもよく、例えば、人工スポンジ、脱脂綿、ヘチマ、天然スポンジ、ナイロンネット、ポリプロピレン、ポリエステル、多孔質セルロース、メラミン樹脂、高分子樹脂などを使用できる。また、樹脂を培地に含む固化剤で包括したものでもよい。担体の形状及び大きさも特に限定されないが、形状は直方体もしくは球形が好ましく、大きさは1 cm〜30 cm程度で、5 cm程度の直方体が好ましい。担体の設置場所は限定されず、採取しようとする微生物に応じて任意に決めることができる。担体を水中に設置しておく期間も特に限定されないが、1日〜10日程度で、通常3日程度が好ましい。
【００２０】
担体から付着した微生物の回収は常法に従って行うことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２２】
〔実施例１〕  微生物の採取
以下の3種類培地を調製した。
(１)海水アガー培地：海水に寒天を濃度が1.5 ％ になるように添加して滅菌調製した。
(２)植物エキス（モクマオウ）アガー培地：モクマオウの葉、根、茎30gを滅菌したすり鉢ですり潰し、これに20-50 mlの滅菌海水を加えた後、0.22マイクロの滅菌フィルターでろ過した。このようにして得られた植物エキスに、寒天を濃度が1.5 ％ になるように添加して調製した。
(３)植物エキス（クサトベラ）アガー培地：クサトベラの葉、茎20gを滅菌したすり鉢ですり潰し、これに20-50 mlの滅菌海水を加えた後、0.22マイクロの滅菌フィルターでろ過した。このようにして得られた植物エキスに、寒天を濃度が1.5 ％ になるように添加して調製した。
【００２３】
各培地に滅菌済みの人工スポンジ（ポリウレタン製、50mm×50mm×70mmの直方体）を入れ、培地を浸み込ませた後、培地中の寒天を凝固させ、培地を含浸させた人工スポンジを作製した。この人工スポンジを、2002年5月と2003年5月に沖縄県恩納村の海底5〜6mの位置に吊り下げた。人工スポンジ設置箇所は、サンゴ礁付近とした。設置した人工スポンジは、3日後に引き上げ、付着した微生物を同定した。微生物の同定は、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（DGGE）により分離した16S rDNAの解析と単離した微生物の16S rDNAの解析との二通りの方法で行った。以下これらの方法について説明する。
【００２４】
〔実施例２〕  DGGEによる同定
スポンジに付着した微生物由来DNAをフェノール法に従い以下のように抽出した。微生物が付着した人工スポンジの小片にTE・bufferを加え、滅菌した乳鉢ですりつぶした。これにTE飽和フェノールを等量加え、チューブに移し替えた後浸透、遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、TE飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、25:24:1の溶液を等量加え、浸透、遠心分離をした。上清をクロロホルム、イソアミルアルコール24:1の溶液でさらに精製し、得られた上清からプロパノール沈殿によりDNAを取り、これをガラス繊維カラム（GFXカラム Amersham pharmacia）で精製した。
【００２５】
抽出したDNAを鋳型とし、細菌の16S rDNAのV3領域を特異的に増幅できるプライマーを用いてPCRを行い、その増幅産物をDGGEにより分離した。この結果を図１に示す。図中の1〜10のレーンと含浸させた培地との関係は、表1に示す通りである。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
DGGEによって分離されたDNA断片の塩基配列を決定し、その配列をデーターベースで検索し、スポンジに付着していた微生物を同定した。この結果、植物エキス含有培地を含浸させたスポンジ209、233、101、102には、γ-プロテオバクテリア（Gammaproteobacteria）に属するMarinomonas属の菌と95-97％相同性のある新種菌が優占化していた。また植物エキス含有培地を含浸させたスポンジ209にはα-プロテオバクテリア（Alphaproteobacteria）に属するMarine bacterium Y41の菌と100％相同性のある既知の菌が優占化していた。Marinomonas mediterranea は2000年のJ.Bacteriol 182.(13).3754-3760にF. Solano等がポリフェノール酸化酵素をもつと報告している。Marine bacterium Y41(AF388307)は2001年のAppl. Environ. Microbiol. 67.(12).5801-5809に A. Buchan等が芳香環開環ジオキシゲナーゼ遺伝子を持つと報告している。今回用いた植物からは、タンニン等の成分の分離も報告されている。
【００２８】
〔実施例３〕  単離した微生物の16S rDNAによる同定
培地を含浸させた人工スポンジから細菌を単離した。細菌の単離は、各スポンジを滅菌海水に入れ、付着細菌懸濁液を作製し、この菌懸濁液をマリンアガー培地、炭酸カルシウム含有マリンアガー培地、酢酸ナトリウム含有マリンアガー培地、ピルビン酸ナトリウム含有NSW培地に塗抹することにより行った。単離した細菌の16S rDNAの塩基配列を決定し、その配列をデーターベースで検索し、単離した微生物を同定した。同定された微生物を図２に示す（但し、図中のO6、O20、Q27、O2、O52の５株は本発明の採取方法以外の方法によって単離された株である。また、囲み字の株はタイプストレインである。）。また、単離した細菌の16S rDNAの塩基配列を、DGGEにより分離されたDNA断片の塩基配列（実施例２）と比較し、一致したものについては、図２に記入した。
【００２９】
図２に示すように、植物エキス含有人工スポンジからは、γ-プロテオバクテリアのMarinomonas 属やNeptunoonas属の菌と相同性のある菌が得られた。Neptunoonas naphthovorans は、1999年Appl. Environ. Microbiol. 65.(1).251-259にB.P. Hedlund等が多環芳香族炭化水素を分解する海洋細菌として報告している。
【００３０】
〔実施例４〕  生育試験
今回得られた細菌19株、および分類学的に近縁な株であるが、異なる方法で分離した2株（Marinomonas sp. MBIC05287, MBIC05856）について、以下のような方法で生育試験を実施した。生育試験を実施するに当たり、Solano et al. (2000)を参考にし、2,6-ジメトキシフェノールを唯一の炭素源として利用し、試験菌株が生育するかどうかを調べた。試験を実施するに当たり、すでにポリフェノール酸化酵素活性を持つことが知られているMarinomonas mediterranea MMB-1 (ATCC 700492)株をAmerican type Culture Collection (ATCC)から分譲を受け陽性判定株として使用した。使用に用いた培地は以下の方法で作製した。人工海水（ダイゴ社製）36 g、ゲルライト（和光純薬工業社製）10 gを、純水  1 Lに懸濁し、121度で15分間加圧滅菌処理を行った後、フィルター滅菌したIMK溶液（ダイゴ社製）100 mlと、200 mM DMP溶液  10 mlを加えたのち、滅菌シャーレに注ぎ、固化させた。作製した培地表面に、各菌株を塗布し室温（25度）で1週間放置したのちの各菌株の生育の度合いを確認した。その結果、本方法で植物エキス含有培地を含浸させたスポンジから分離された17株および海水アガー含有培地を含浸させたスポンジから分離された2株のうち、唯一MBIC06130を除く18株は、Marinomonas mediterranea MMB-1 (ATCC 700492)株と同様の生育を示した。一方、他の方法で分離した2株（Marinomonas sp. MBIC05287, MBIC05856）はいずれも上記の条件では生育を示さなかった。以上の結果は、本方法は海洋環境からポリフェノール系の物質を資化する細菌の分離に有効であることを示唆している。
【００３１】
今回得られたMarinomonas属に近縁の細菌についてはF. Solano等の論文に記載しているポリフェノール酸化酵素の簡易活性試験を行ったところ、いずれも陽性を示した。
【００３２】
以上の結果より、人工スポンジに植物エキスを含む培地を含浸させることにより、微生物の付着量が著しく増大し、また植物エキスをしみ込ませることにより植物エキスに含まれる成分を利用するような微生物が優占化してくることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】人工スポンジに付着したDNAのDGGE解析の結果を示す図。
【図２】DGGE解析により同定された微生物を表す表。
【図２】
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【図１】
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