(57)【要約】【課題】優れた鉱物油分解活性を有する鉱物油分解微生物、鉱物油分解菌を用いた鉱物油に汚染された土壌の浄化方法及び土壌浄化装置を提供すること。【解決手段】鉱物油分解微生物は、鉱物油を分解することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株である。土壌浄化方法は、上記鉱物油分解菌を用いる方法である。土壌浄化装置は、上記鉱物油分解菌を用いる装置である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉱物油を分解することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株。
【請求項２】
上記鉱物油が、重油、エンジンオイル、又はディーゼルオイルである、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が、約７４％である、請求項１又は２記載の菌株。
【請求項４】
唯一の炭素源として鉱物油を含む培地を用いたスクリーニングにより単離される、請求項１〜３のいずれか１項記載の菌株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の菌株を用いることを特徴とする、土壌浄化方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の菌株と、栄養物と、空気とを、鉱物油によって汚染された土壌に散布又は注入することを特徴とする土壌浄化方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の菌株を用いることを特徴とする、土壌浄化装置。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の菌株を培養するための培養槽、及び該培養槽内で培養した菌体を含む菌液を土壌に散布又は注入する装置を備えていることを特徴とする、土壌浄化装置。
【請求項９】
上記培養槽に栄養物を供給する栄養物貯蔵タンク、及び上記培養槽に空気を供給するエアブロアを更に備えている、請求項８に記載の土壌浄化装置。
【請求項１０】
上記栄養物貯蔵タンク内に貯蔵された栄養物を土壌に散布又は注入する装置、及び上記エアブロアから空気を土壌に注入する装置を更に備えている、請求校８又は９に記載の土壌浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた鉱物油分解能力を有する鉱物油分解菌と、鉱物油に汚染された土壌の浄化方法及び土壌浄化装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の科学技術の発展に伴い、様々な化学物質が利用される一方で、これらの化学物質による環境汚染が問題となっている。例えば、石油に含まれる成分である炭化水素や、石油に由来するクロロエチレン等のいわゆる難分解性の化学物質は、それらが環境中に廃棄された場合、長期に渡って環境中にとどまるため様々な弊害を引き起こす可能性がある。
現在、土壌が化学物質により汚染され、再利用のために土壌浄化を必要としている工業用跡地は全国で３２万ヶ所以上あるといわれている。汚染された土壌を浄化する方法として、加熱等の物理化学的手段による処理が知られているが、その方法は、一般的にコストが高く、大量の土壌を処理するには不向きである。そのため、コストパフォーマンスに優れ、大量の土壌を処理することができる、微生物を使用した方法（バイオレメディエーション法）の実用化が求められている。
【０００３】
従来の微生物を用いた汚染土壌の修復工法には、１）ランドファーミング法、２）バイオパイル法、３）バイオスラリー法、４）バイオベンディング法等がある。上記１）〜３）の方法は、いずれも汚染土壌を他所に移し、その汚染土壌に栄養物及び微生物を投入して汚染物質を分解して浄化する方法（移動処理法）である。上記４）の方法は、いわゆる原位置法と呼ばれるものであり、汚染土壌に直接その場で栄養物と微生物を投入するため、汚染土壌の移動や浄化後の復土等のコストがかからないという点で優れている。
【０００４】
鉱物油による土壌汚染の大きなものとして、原油採掘現場があり、その他の鉱物油による土壌汚染の原因として、タンカーの流出事故、ガソリンスタンド等の地下タンクからの流出、航空機用燃料の流出等が挙げられる。このような鉱物油で汚染された土壌を上記４）の方法により浄化する場合には、鉱物油を分解する微生物が必要となる。しかしながら、現在、市場で入手できる鉱物油分解菌は鉱物油分解能が低いため、充分な鉱物油分解効果を得るためには大量の微生物が必要となり、多額のランニングコストがかかってしまう。そのため、多くの場合、汚染土壌への栄養物の散布及び土壌中へのエアレーションのみを行い、元々土壌中に生息する鉱物油分解菌を活性化する方法をとっている。この方法では、通常、処理日数が約９０〜２５０日もかかることから、優れた鉱物油分解能力を有する微生物が強く求められている。
【０００５】
従って、本発明の目的は、優れた鉱物油分解活性を有する鉱物油分解微生物を提供することにある。また、本発明の目的は、鉱物油分解菌を用いた鉱物油に汚染された土壌の浄化方法及び土壌浄化装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、鉱物油分解能力を有する細菌を単離することに成功し、さらにこの細菌が優れた鉱物油の分解活性を示すという知見を得た。本発明は、上記知見に基づいてなされたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、鉱物油を分解することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株を提供するものである。本明細書において、鉱物油とは、重油、エンジンオイル、ディーゼルオイル等を意味する。なお、本明細書において、鉱物油分解能とは、鉱物油中に含まれる炭化水素を分解する能力のことを意味する。
また、本発明の菌株の好ましい具体例としては、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が、約７４％である菌株である。
また、本発明の菌株の好ましい具体例としては、唯一の炭素源として、鉱物油としての灯油含む培地を用いたスクリーニングにより単離される菌株である。ここで培地としては、最少塩培地（ＭＳＭ培地）が挙げられる。
【０００９】
本発明の土壌浄化方法は、上述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株を用いることを特徴とする。
具体的には、本発明の土壌浄化方法は、上述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株を、鉱物油によって汚染された土壌に散布又は注入することを特徴とする。
また、本発明の土壌浄化方法の好ましい具体例としては、更に、栄養物及び空気を汚染された土壌に散布又は注入する。
【００１０】
本発明の土壌浄化装置は、上述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株を用いることを特徴とする。
本発明の土壌浄化装置の一例としては、上記菌株を培養するための培養槽、及び該培養槽内で培養した菌体を含む菌液を土壌に散布又は注入する装置を備えていることを特徴とする。
上記土壌浄化装置は、更に、上記培養槽に栄養物を供給する栄養物貯蔵タンク、及び上記培養槽に空気を供給するエアブロアを備えることが好ましい。
また、上記土壌浄化装置は、上記栄養物貯蔵タンク内に貯蔵された栄養物を土壌に散布又は注入する装置、及び上記エアブロアから空気を土壌に注入する装置を備えることが好ましい。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株について説明する。本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株は、鉱物油を分解することのできる菌株であり、以下、本明細書において「鉱物油分解菌」ともいう。本発明において、鉱物油とは、原油を精製して得られる炭化水素類のことをいい、例えば、ガソリン、灯油、軽油、及び重油等が挙げられる。さらに、原油を精製して得られる炭化水素を主成分とするオイル、例えば、エンジンオイルやディーゼルオイル等も本発明において鉱物油に含まれる。ガソリンは、芳香族炭化水素類を多く含んでおり、灯油、軽油及び重油は、脂肪族炭化水素類を多く含んでいる。本発明の鉱物油分解菌は、特に、炭素数が８〜２３の脂肪族炭化水素類が多く含まれている鉱物油を効率よく分解することができる。
【００１２】
本発明の菌株は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株であり、本発明者らが単離した一例の菌株をＷａｔＧと命名した。上記菌株は、北海道の古い灯油タンク中の水から単離されたものである。ＷａｔＧ株の分離のために、最少塩培地（ＭＳＭ）に１０ｇ／Ｌの割合で鉱物油（灯油）を添加した選択培地を使用した。ＷａｔＧ株は、ＬＢ培地を用いた場合、４℃〜５０℃の範囲の温度で生育でき、最適成長温度は３０℃である。
【００１３】
後述する実施例に記述する通り、得られた微生物の菌学的性質を調べ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株であることを確認した。１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列の分析結果から、ＷａｔＧ株はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａと１００％の類似性を示し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの新規株であると同定された。また、ＷａｔＧ株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約７４％であった。
後述する通り、得られた微生物の菌学的性質を調べた。得られた菌学的性質を以下に湿す。
【００１４】
〔１〕形態学的性質
（１）細胞の形：桿状
（２）グラム染色：陰性
〔２〕生育状態
コロニーは円形、凸状である。
【００１５】
〔３〕生理学的性質
（１）生育温度：ＬＢ培地を用いた場合、−１℃及び５５℃で生育できないが、４℃〜５０℃で生育できる。
（２）酸素要求性：好気的
（３）資化性：フルクトース、Ｄ−グルコース、グリセロールを同化するが、Ｌ−アラビノース、ラクトース、マルトース、Ｄ−マンノース、メリビオース、ラフィノース、スクロース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−セロビオース、イヌリンを同化しない。
（４）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約７４％である。
【００１６】
本発明の鉱物油分解菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株は、北海道の古い灯油タンク等から、例えば１０ｇ／Ｌの割合で鉱物油（灯油）を含む最小塩培地（ＭＳＭ）を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。灯油を含むＭＳＭは、唯一の炭素源として灯油を含む培地である。
【００１７】
本発明の鉱物油分解菌を培養するための培地としては、通常、これらの菌株が生育できるものであれば、天然培地であっても合成培地であってもよく、いずれも使用することができる。また、培地は固体培地、液体培地のいずれでもよい。用いられる培地には、炭素源、窒素源及び無機物等が含まれる。炭素源としては、鉱物油を用いてもよく、その他、通常に微生物を培地するために用いられるグルコース等の炭化水素等が用いられる。窒素源としては、例えば酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種アミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられる。窒素源、炭素源は、いずれも単独で用いてもよく、又は２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物としては、例えばカリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等を必要に応じて適宜使用する。用いられる培地としては、例えば、ＬＢ培地や０．１％酵母エキス含有ＭＳＭ培地等が挙げられる。本発明の鉱物油分解菌の培養方法としては、通常の方法でよく、例えば培養温度は２０〜４０℃が好ましく、２５〜３５℃がさらに好ましい。また、培地のｐＨは６〜８とすることが好ましく、７付近であることがさらに好ましい。また、培養は振盪培養を行うか、又は通気攪拌を行い、好気条件下で行うことが好ましい。
【００１８】
本発明の鉱物油分解菌は、優れた鉱物油分解能力を有するため、例えば、鉱物油を含有する廃水、海水、陸水、土壌等の浄化に利用することができる。土壌の浄化であれば、ランドファーミング法、バイオパイル法、バイオスラリー法、バイオベンディング法等に用いることができる。
【００１９】
次に、本発明の土壌浄化方法について説明する。
本発明の土壌浄化方法は、本発明の鉱物油分解菌を用いることを特徴とする。本発明の鉱物油分解菌を、鉱物油によって汚染された土壌と接触させることにより、土壌を浄化する方法である。
具体的には、鉱物油に汚染された土壌中の鉱物油を、本発明の鉱物油分解菌の分解作用によって分解し、土壌を浄化するものである。汚染土壌と鉱物油分解菌とを接触させるためには、反応槽を用いてもよいが、本発明においては、鉱物油分解菌を汚染土壌に直接散布又は注入することが好ましい。汚染の現場で処理を行えば、土壌の移動や浄化後の復土のコストを省くことができる。散布又は注入する鉱物油分解菌の量は、汚染された面積や鉱物油の濃度によって適宜設定することが好ましい。分解効率を向上させるためには、高濃度の菌液を用いることが好ましい。また、鉱物油分解菌を土壌に散布又は注入した後、土壌を攪拌して鉱物油分解菌の拡散及び好気条件を作り出すことが好ましい。また、土壌を撹拌して土壌中に空気を混入させ、土壌を好気条件にした後、鉱物油分解菌を土壌に散布又は注入してもよい。土壌の攪拌ができない場合には、例えば、鉱物油分解菌の散布又は注入時に土壌中の空気をポンプ等により吸い出すことにより土壌中を減圧状態にし、鉱物油分解菌の拡散を促進してもよい。また、空気を土壌中に送り込むことにより好気条件を作り出すことができる。また、土壌に栄養物を散布又は注入して、鉱物油分解菌の分解活性を向上させることが好ましい。栄養物としては、鉱物油分解菌が生育するうえで必要な炭素源、窒素源及び無機物を含む物が好ましい。例えば、炭素源としては、グルコース等の糖類が挙げられ、窒素源としては、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種のアミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられ、またその他の無機物としては、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等が挙げられる。なお、本発明の土壌浄化方法は、後述する土壌浄化装置によって実施することができる。
【００２０】
次に、本発明の土壌浄化装置について説明する。
本発明の土壌浄化装置は、本発明の鉱物油分解菌を用いることを特徴とする。
具体的には、本発明の鉱物油分解菌を培養するための培養槽、及び該培養槽内で培養した菌体を含む菌液を土壌に散布又は注入する装置を備えている装置が挙げられる。
【００２１】
本発明の土壌浄化装置について図面を参照しつつ説明する。
図１は、本発明の一実施形態に係る土壌浄化装置の要部構成を示す概略構成図である。
図１に示す土壌浄化装置は、鉱物油分解菌を培養するための培養槽１、培養槽１で培養した菌体を含む菌液を土壌に注入する装置である、菌液注入管１１を備えている。培養槽１は、本発明の鉱物油分解菌を培養することができるものであれば、その材質、形状及び大きさは特に限定されない。実験室レベルの小型容器から工業用大型タンク等まで種々の培養槽を用いることができる。また、培養槽１は、攪拌手段や、鉱物油分解菌の増殖に最適な温度に保温するための加温手段を有している。
【００２２】
菌液注入管１１は、培養槽１で培養した菌体を含む菌液を土壌中に注入するものであり、その材質、形状及び長さは特に限定されない。形状については、例えば、全面に多数の孔が設けられた金属製の管であってもよく、枝分かれした形状のものであってもよい。また、図１に示す土壌浄化装置においては、菌液注入管１１は１本のみであるが、複数本設け、それぞれを、異なる方向に設置してもよい。また、図１には示していないが、培養槽１で培養した菌体の土壌中への注入を容易にするための注入手段を備えることもできる。この場合、培養槽１内の菌体の増殖状況に応じて、自動的に菌液を土壌中に注入できるようにすることが好ましい。
【００２３】
図１に示す土壌浄化装置においては、培養槽１で培養するための菌体を貯蔵するための菌株保存タンク２が備えられており、菌株保存タンク２内には、本発明の鉱物油分解菌が貯蔵されている。装置を作動する際に、菌株保存タンク２内に貯蔵されている鉱物油分解菌は培養槽１と接続されている菌株供給管２１を通って培養槽１に供給される。
また、図１に示す土壌浄化装置においては、培養槽１に供給するための水を貯蔵するための水貯蔵タンク４が備えられている。水貯蔵タンク４内に貯蔵されている水は、培養槽１と接続されている水供給管４１を通って培養槽１に供給される。
【００２４】
また、図１に示す土壌浄化装置においては、培養槽１に供給するための栄養物を貯蔵するための栄養物貯蔵タンク６が備えられている。栄養物貯蔵タンク６内に貯蔵されている栄養物は、培養槽１と接続されている栄養物供給管６１を通って培養槽１に供給される。ここで、栄養物は、鉱物油分解菌が増殖するのに必要な、炭素源、窒素源、無機物等であり、上述したものが挙げられる。炭素源、窒素源、無機物は、それぞれ別個に貯蔵できるように、栄養物貯蔵タンク６内に、それぞれの栄養物を貯蔵するためのタンクを設けてもよい。
図１に示す土壌浄化装置は、水貯蔵タンク４、及び栄養物貯蔵タンク６を備えているので、培養槽１に連続的に水及び栄養物を供給することができる。従って、鉱物油分解菌の培養を連続的に行い、土壌に菌体を連続的に注入することができ、迅速に土壌を浄化することが可能となる。
【００２５】
図１に示す土壌浄化装置を用いて土壌を浄化する場合、まず水貯蔵タンク４から水を水供給管４１を通して培養槽１に供給し、次いで栄養物貯蔵タンク６から、栄養物を栄養物供給管６１を通して培養槽１に供給する。水貯蔵タンク４内に貯蔵される水、及び栄養物貯蔵タンク６に貯蔵される栄養物は、それぞれのタンクに貯蔵する前に滅菌しておいてもよい。栄養物を栄養物貯蔵タンク６に貯蔵する前に滅菌する場合、栄養物は水に溶解したものを使用することが好ましい。水、及び栄養物は、培養槽１に供給した後に滅菌してもよい。従って、培養槽１は、培養槽１内を滅菌することができるように、例えば１２１℃程度の温度に加熱できるような加熱装置を備えていることが好ましい。
【００２６】
培養槽１に水及び栄養物を供給する前、又は供給した後、培養槽１内を、例えば１２１℃で２０分加熱滅菌した後、培養槽１内を、図示しない保温装置によって鉱物油分解菌が増殖できる温度、例えば３０℃に保温する。次いで、菌株保存タンク２内に保存されている鉱物油分解菌を培養槽１に供給する。鉱物油分解菌が培養槽１に供給された後、図示しない撹拌装置によって培養槽１内を撹拌し、エアブロア８から空気供給管８１を通して空気を供給しながら、培養槽１内で鉱物油分解菌の培養を行う。培養は、好ましくは２〜３日間行う。
エアブロア８の容量は、特に限定されないが、土壌浄化装置が処理する土壌の面積や培養槽１の大きさに合わせて設定することが好ましい。また、エアブロア８は、空気流量計や、培養槽１の状態によって自動的に適量の空気を供給できる手段が備えていることが好ましい。
【００２７】
エアブロア８には、空気吸／散気管８２が接続されており、この空気吸／散気管８２は土壌中に挿入されている。土壌中に挿入された空気吸／散気管８２により、土壌から空気が吸気され、土壌中に空気が散気される。空気吸／散気管８２は土壌中から空気を吸気し、土壌中に空気を散気できるものであれば、その材質、形状には特に限定されない。菌液注入管１１と同様に、全面に多数の孔が設けられた金属製の管であってもよく、枝分かれした形状のものであってもよい。また、空気吸／散気管８２は複数設けられてもよい。空気吸／散気管８２により、土壌中から吸気することにより、土壌中を減圧状態にすることができ、これにより、土壌中に注入された菌体が土壌中で拡散しやすくなる。一方、散気することにより、土壌中を好気条件とすることができ、これにより、土壌中に注入された菌体の増殖が促進され、土壌中の鉱物油の分解を促進する効果がある。
【００２８】
また、栄養物貯蔵タンク６には、栄養物注入管６２が接続されており、この栄養物注入管６２は土壌中に挿入されており、栄養物貯蔵タンク６に貯蔵された栄養物が栄養物注入管６２を通って土壌中に注入される。栄養物注入管６２は、土壌中に栄養物を注入することができるものであれば、その材質、形状には特に限定されない。菌液注入管１１と同様に、全面に多数の孔が設けられた金属製の管であってもよく、枝分かれした形状のものであってもよい。また、栄養物注入管６２は複数設けられてもよい。また、栄養物を土壌中に注入するタイミングや、栄養物の量は、プログラム等によって自動的に制御することもできる。栄養物注入管６２を通って土壌中に注入された栄養物によって、土壌中に注入された菌体の増殖が促進され、土壌中の鉱物油の分解を促進する効果がある。
【００２９】
本発明の土壌浄化装置は、上記の構成物を一体化したものであるが、装置全体の大きさや培養槽等の構成物の容量は、目的に合わせて適宜設定することができる。使用時に汚染土壌まで土壌浄化装置を輸送することを考慮すると、土壌浄化装置は分割できるものであることが好ましい。すなわち、本発明の土壌浄化装置は、分割されているものを、必要な場所まで移動した後に組み立てて一体化するようにされていてもよい。
【００３０】
本発明の土壌浄化装置の処理能力は、培養槽等の容量によって決定されるものであり、浄化しようとする土壌の面積によって、培養槽等の容量を決定すればよい。土壌の浄化までの期間は、汚染の度合いや環境条件にもよるが、例えば、土壌に１％程度のディーゼル油が含まれており、土壌の温度が２０℃の場合、１週間で２０〜４０％を分解することができる。従って、菌液の培養、注入を繰り返すことにより、迅速に土壌を浄化することができる。
【００３１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
【００３２】
＜鉱物油分解菌の単離＞
北海道の古い灯油タンク中から採取した水から鉱物油分解菌を単離した。まず初めに、採取した水１ｍｌを、０．１質量％の酵母エキスを添加した最少塩培地（ＭＳＭ培地）が１０ｍｌ入った５０ｍｌフラスコに移した。次に、このフラスコを旋回シェーカーを用いて３０℃で２週間培養した。得られた培養液を、ＭＳＭ培地で１０−１、１０−２、１０−３の濃度に希釈した。これらの希釈液から鉱物油分解菌を単離するために、選択培地としてＭＳＭ培地に１０ｇ／Ｌの割合で灯油を添加した寒天培地を使用した。使用したＭＳＭ培地には、塩として、ＮＨ４ＮＯ３が０．４質量％、ＫＨ２ＰＯ４が０．４７質量％、Ｎａ２ＨＰＯ４が０．０１１９質量％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが０．００１質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが０．１質量％、及びＦｅＳＯ４が０．００１５質量％含まれている。また、単離するために用いられた寒天培地中に含まれる唯一の炭素原は、添加した灯油のみである。この選択培地の上に希釈液を希釈し、コロニーが観察されるまで３０℃の温度で培養した。成長した個々のコロニーを、選択培地にストリーキングを行い、この継代培養を数回繰り返すことにより鉱物油分解菌の単離及び精製を行った。得られた鉱物油分解菌を、ＷａｔＧと命名した。
また、ＷａｔＧ株はＬＢ培地を用いた場合、４℃〜５０℃の範囲で生育でき、最適生育温度は３０℃であった。
【００３３】
実施例２
微生物の同定
ＷａｔＧを、一般の生化学的方法及び分子系統学的分析方法により同定した。
分子系統学的分析については、１６ＳリボソームのＤＮＡを、ＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲ法では、テンプレートとして菌の完全ＤＮＡと、フォワードとしてそのオリゴヌクレオチドである配列番号１で表わされる塩基配列を有するもの及び配列番号２で表される塩基配列を有するリバースプライマーとを用いた。ＰＣＲ増幅の熱的条件は、プレヒートは９４℃で５分間、次いで、９４℃で１分間の変性を行い、５５℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の伸長を３０サイクル繰り返した。ＰＣＲ生成物は、精製した後、配列決定した。得られた配列は、データベースから引用した関連細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンスに照らし合わせた。
その結果、ＷａｔＧの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのものと１００％一致した。
【００３４】
実施例３
形態学的特性
ＷａｔＧのグラム染色を行い、顕微鏡により観察を行った。結果は、グラム陰性の桿菌であった。また、コロニーは円形、凸状であった。コロニーの生育は４℃及び４０℃では観察されなかった。
【００３５】
実施例４
生化学的特徴
炭素源の同化試験を常法に従って行ったところ、ＷａｔＧ株はフルクトース、グルコース、グリセロール、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グリシン及びＬ−プロリンは同化したが、Ｌ−アラビノース、ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、スクロース、キシロース、ソルビトール、ラムノース、セロビオース、イヌリン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−スレオニンは同化しなかった。
また、ＷａｔＧは好気性の菌株であった。
【００３６】
実施例５
１６Ｓ−ｒＤＮＡ及びＤＮＡ塩基組成の解析
培養した菌株を集菌し、標準手段（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，他（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ．  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって染色体ＤＮＡを生成した。すなわち、細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（最終濃度：２ｍｇ／ｍｌ）及びドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度：０．５％）に溶解し、細菌細胞を溶菌させた。溶菌液からフェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理及びエタノール沈殿を行い、精製ＤＮＡを得た。なお、エタノール沈殿は２度行った。
ＤＮＡ塩基組成、すなわちグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、Ｋｕｍａｇａｉ，  Ｍ．（１９８０）  Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  １６，  １１１−１２０に記載された方法に従って高速液体クロマトグラフィーにより測定した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＪＣＭ５９６２Ｔ株はについても、同様にグアニン＋シトシン含量を測定した。
ＷａｔＧのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、７３．６％であり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＪＣＭ５９６２Ｔ株は６７．２％であった。
【００３７】
実施例６
＜ＷａｔＧによる、鉱物油の分解＞
ディーゼルオイルの分解
ＷａｔＧは、ＬＢ培地を用いて、３０℃で１晩前培養を行った。５０ｍｌのスクリューキャップフラスコ中で、鉱物油としてディーゼルオイルを１％（体積比）添加したＭＳＭ培地に、ＷａｔＧを接種し、この試料を２０℃（平均的な日本の土壌温度は２０℃前後である。）で２週間振盪培養を行った。培養終了後、培養液から残留鉱物油を、内部標準として３ｍｇ／ｍｌのｎ−ドデカン（Ｃ１２）（関東化学（株）製）を含有するジクロロメタン（和光化学（株）製）（培養液と等量）を用いて抽出し、水素炎イオン化検出器とキャピラリーカラム（ＴＣ−１、３０ｍ×０．２５ｍｍ、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ３５３Ｂ、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）によって分析した。キャリアガスとしてｗはヘリウムを用いた。なお、カラム温度は、最初５０℃に設定し、その後５℃／ｍｉｎの速度で２７０℃まで上昇させた。また、検出器の温度は２９０℃に設定した。培養前及び培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図２に示す。図２において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図２から明らかなように、ディーゼルオイルに由来するＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークは、培養後の培地にはほとんど認められず、ＷａｔＧによってディーゼルオイルが分解されたことが示された。
鉱物油の分解率は、培養前の試料から検出されたＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークの合計と、培養後の試料から検出された対応するピークの合計との差を分解された鉱物油の量として算出した。結果を表１に示す。
【００３８】
実施例７
エンジンオイルの分解
ディーゼルオイルに代えてエンジンオイルを用いた以外は実施例６と同様にして培養を行った。培養液の残留鉱物油の分析については、カラム温度を最初５０℃に設定し、その後５℃／ｍｉｎの速度で２７０℃まで上昇させた。また、検出器の温度は２９０℃に設定した。鉱物油の分解率については、Ｃ１３〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
実施例８
重油の分解
ディーゼルオイルに代え、Ａ重油を用いた以外は実施例６と同様にして培養を行った。培養液の残留鉱物油の分析については、カラム温度は、最初５０℃に設定し、その後５℃／ｍｉｎの速度で２７０℃まで上昇させた。また、検出器の温度は２９０℃に設定した。培養前及び培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図３に示す。図３において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図３から明らかなように、重油に由来するＣ１１〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークが、培養後ほとんど見られず、ＷａｔＧによって重油が分解されたことが分かる。鉱物油の分解率については、Ｃ１３〜Ｃ２３（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
比較例１
ＷａｔＧに代え、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を用いた以外は実施例１と同様にして、分解試験を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図４に示す。図４において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図４から、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＪＣＭ５９６２Ｔ株はディーゼルオイルを分解する能力を有していないことが分かる。
【００４１】
【表１】
2005034022.tif 000002
【００４２】
実施例９
土壌中でのディーゼルオイルの分解
土壌２ｇに、ディーゼルオイルを１質量％濃度になるように添加した。この土壌に、ＷａｔＧを接種し、２０℃で１週間静置培養した。培養後、土壌中の残留鉱物油は、内部標準として３ｍｇ／ｍｌのｎ−ドデカン（Ｃ１２）（関東化学（株）製）を含有するジクロロメタン（和光化学（株）製）を用いて抽出した。抽出物は、上記ディーゼルオイルの分解試験と同様の条件でガスクロマトグラフによる分析を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図５に示す。図５において、（Ａ）はＷａｔＧを接種しないで培養した結果であり、（Ｂ）はＷａｔＧを接種して行った結果である。図５から明らかなように、ディーゼルオイルに由来するＣ１０〜Ｃ２２（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークが、培養後にはかなり小さくなっており、ＷａｔＧが土壌中の条件においてもディーゼルオイルを分解したことが分かる。鉱物油の分解率については、Ｃ１０〜Ｃ２２（Ｃ１２を除く）の炭化水素を示すピークを対象に算出した。分解率は２０〜４０％であった。
２％であった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、鉱物油を分解することができるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する菌株が提供される。本発明によって提供される菌株は、重油、エンジンオイル、ディーゼルオイル等の鉱物油を分解することができる。また、本発明の菌株を用いることにより、土壌中に含まれる鉱物油を分解することができ、鉱物油によって汚染された土壌を浄化することができる。
【００４４】
【配列表】
2005034022.tif 000003
2005034022.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る土壌浄化装置の構成を示す模式図である。
【図２】ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図３】エンジンオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図４】重油を含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図５】ディーゼルオイルを含有する土壌の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【符号の説明】
１  培養槽
２  菌株保存タンク
４  水貯蔵タンク
６  栄養物貯蔵タンク
８  エアブロア
１１  菌液注入管
２１  菌株供給管
４１  水供給管
６１  栄養物供給管
６２  栄養物注入管
８１  空気供給管
８２  空気吸／散気管
【図１】
2005034022.tif 000005
【図２】
2005034022.tif 000006
【図３】
2005034022.tif 000007
【図４】
2005034022.tif 000008
【図５】
2005034022.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月3日(2003.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
比較例１
ＷａｔＧに代え、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を用いた以外は実施例１と同様にして、分解試験を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図４に示す。図４において、（Ａ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種して行った結果である。図４から、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株はディーゼルオイルを分解する能力を有していないことが分かる。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る土壌浄化装置の構成を示す模式図である。
【図２】ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図３】重油を含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図４】対照としたP. aeruginosa JCM5962Tを用いた時の、ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図５】ディーゼルオイルを含有する土壌の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。




【手続補正書】
【提出日】平成15年11月14日(2003.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
比較例１
ＷａｔＧに代え、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を用いた以外は実施例１と同様にして、分解試験を行った。培養前と培養後の試料のガスクロマトグラフ分析結果を図４に示す。図４において、（Ａ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種しないで２週間振盪培養した結果であり、（Ｂ）はPseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株を接種して行った結果である。図４から、Pseudomonas aeruginosa  ＪＣＭ５９６２Ｔ株はディーゼルオイルを分解する能力を有していないことが分かる。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る土壌浄化装置の構成を示す模式図である。
【図２】ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図３】重油を含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図４】対照としたP. aeruginosa JCM5962Tを用いた時の、ディーゼルオイルを含有する試料の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【図５】ディーゼルオイルを含有する土壌の培養前及び培養後のジクロロメタン抽出物のガスクロマトグラムである。
【符号の説明】
１  培養槽
２  菌株保存タンク
４  水貯蔵タンク
６  栄養物貯蔵タンク
８  エアブロア
１１  菌液注入管
２１  菌株供給管
４１  水供給管
６１  栄養物供給管
６２  栄養物注入管
８１  空気供給管
８２  空気吸／散気管