(57)【要約】  【課題】  短時間かつ簡単に信頼性ある分析が実施できる比色分析方法を提供する。  【解決手段】  エレクトロクロミック物質およびグルコースデヒドロゲナーゼを含む試薬と、血液等の試料とを混合して反応させ、前記エレクトロクロミック物質の発色を測定する。前記酵素反応により遊離した電子がエレクトロクロミック物質に伝達され、グルコース濃度に応じてエレクトロクロミック物質が透明から赤紫色に発色するため、これを測定することによって、グルコース濃度を定量できる。前記エレクトロクロミック物質としては、例えば、ビオロゲン、ビオロゲン誘導体が使用できる。この反応は、過酸化水素を必要としないため、測定値の信頼性も高い。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロクロミック物質の存在下で、分析対象物に酸化還元酵素を作用させ、前記酵素反応により前記分析対象物から遊離した電子が前記エレクトロクロミック物質に伝達される結果生じる前記エレクトロクロミック物質の色調変化を測定することにより、前記分析対象物の定性もしくは定量を行う比色分析方法。
【請求項２】
前記エレクトロクロミック物質が、ビオロゲンおよびビオロゲン誘導体の少なくとも一方である請求項１記載の比色分析方法。
【請求項３】
ビオロゲン誘導体が、ジフェニルビオロゲンおよびジニトロフェニルビオロゲンの少なくとも一方である請求項２記載の比色分析方法。
【請求項４】
酸化還元酵素が、脱水素酵素若しくは酸化酵素である請求項１〜３のいずれか一項に記載の比色分析方法。
【請求項５】
分析対象物が、グルコース、コレステロール、尿酸または乳酸であり、酸化還元酵素が、前記各物質に対応する脱水素酵素または酸化酵素である請求項１〜４のいずれか一項に記載の比色分析方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の比色分析方法に使用する試薬であって、酸化還元酵素および電子の授受により色調が変化するエレクトロクロミック物質を含む試薬。
【請求項７】
前記エレクトロクロミック物質が、ビオロゲンおよびビオロゲン誘導体の少なくとも一方である請求項６記載の試薬。
【請求項８】
ビオロゲン誘導体が、ジフェニルビオロゲンおよびジニトロフェニルビオロゲンの少なくとも一方である請求項６記載の試薬。
【請求項９】
酸化還元酵素が、脱水素酵素または酸化酵素である請求項６〜８のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１０】
分析対象物が、グルコース、コレステロール、尿酸または乳酸であり、酸化還元酵素が、前記各物質に対応する脱水素酵素若しくは酸化酵素である請求項６〜９のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の試薬を含む試験片。
【請求項１２】
さらに、無機ゲルを含む請求項１１記載の試験片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比色分析方法およびそれに用いる試薬ならびに試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査や生化学検査等の分野において、グルコース、コレステロール等の成分分析が行われており、その一手法として比色分析がある。グルコースの比色分析では、例えば、まずグルコースオキシダーゼをグルコース（基質）に作用させて、グルコノラクトンおよび過酸化水素を発生させ、過酸化水素を、ペルオキシダーゼの存在下、トリンダー試薬等の発色剤により検出するのが一般的である。このように、過酸化水素を介して間接的に基質濃度を測定するという手法は、グルコースに限らず、コレステロール等の他の成分分析にも適用されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
しかし、従来の比色分析では、つぎのような問題がある。まず、分析対象物を直接測定するのではなく、過酸化水素を介して間接的に測定するため、測定に時間がかかり、例えば、グルコースの測定の場合、３０〜６０秒かかる。また、従来の比色分析法では、２種類の酵素反応系を同時に安定化する必要があり、条件設定が難しい。そして、酸素を必要とするため、従来の比色分析法では、酸素が不十分であると、反応が十分におこらないという問題もある。さらに、従来の比色分析法は、過酸化水素を介する反応であるため、試料中に存在するアスコルビン酸などの還元物質が過酸化水素を還元すれば、測定値の信頼性に問題が生じる。すなわち、血漿および血清中に存在するアスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、ビリルビン等による干渉を、従来の比色分析方法が受ける可能性は大きい。これらの干渉物質は、酸化酵素により生成する過酸化水素を消費したり、生成した色素を還元して消色するため、分析対象物質の定量値に多大な影響を与える。
【特許文献１】特開平５−３７９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、反応系が一段階であり、分析時間が短時間であり、分析値に信頼性がある比色分析方法の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の比色分析法は、エレクトロクロミック物質の存在下で、分析対象物に酸化還元酵素を作用させ、前記酵素反応により前記分析対象物から遊離した電子が前記エレクトロクロミック物質に伝達される結果生じる前記エレクトロクロミック物質の色調変化を測定することにより、前記分析対象物の定性もしくは定量を行う方法である。
【０００６】
つぎに、本発明の試薬は、前記本発明の比色分析方法に使用される試薬であり、酸化還元酵素および電子の授受により色調を変化するエレクトロクロミック物質を含む試薬である。また、本発明の試験片は、前記本発明の試薬を含む試験片である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、酵素反応は１段階であるため、反応系が簡単で安定性が良く、かつ測定時間も短くなり（例えば、グルコースを基質とした場合、約５秒以下で測定可能）、さらに、過酸化水素を介さず、酸素を必要としないようにすることも可能であることから、分析値の信頼性も高い。このような本発明の方法は、前記本発明の試薬を用いれば容易に行うことができる。また、本発明の試験片は、従来の過酸化水素を介する比色分析の試験片に比べ、極めて短時間で分析が可能であり、分析値の信頼性も高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、前記エレクトロクロミック物質としては、電子の授受によって色調が変化するものであれば特に制限されないが、例えば、ビオロゲン、ビオロゲン誘導体があげられる。前記ビオロゲン誘導体としては、例えば、ジフェニルビオロゲン、ジニトロフェニルビオロゲン等があげられる。これらの中でも好ましくはジニトロフェニルビオロゲンである。なお、これらのエレクトロクロミック物質は、市販品を使用してもよいし、従来公知の方法に従って調製することもできる。
【０００９】
本発明において、酸化還元酵素は、脱水素酵素若しくは酸化酵素が好ましい。また、分析対象物は、例えば、グルコース、コレステロール、尿酸、乳酸等があげられ、この場合に使用する酸化還元酵素としては、前記各物質に対応する脱水素酵素若しくは酸化酵素があげられる。
【００１０】
本発明において、前記酵素反応により前記分析対象物から遊離した電子は、前記エレクトロクロミック物質に直接伝達されてもよいし、間接的に伝達されてもよい。前記エレクトロクロミック物質に電子が間接的に伝達される場合には、前記エレクトロクロミック物質に加え、例えば、さらにメディエータを使用することが好ましい。本発明においては、前記エレクトロクロミック物質もメディエータとして働くが、これは電子の授受という機能だけではなく、これにより色調が変化するという機能も併せ持つ。したがって、追加的に使用するメディエータは、前記エレクトロクロミック物質とは別のメディエータである。メディエータを用いると、電子の授受スピードが向上し、このため前記エレクトロクロミック物質の色調変化のスピードも向上する。この結果、酸化還元酵素の使用量を少なくすることができ、コスト的に有利となる。前記メディエータとしては、従来公知のメディエータの他に、例えば、オスミウム錯体、ルテニウム錯体等も使用できる。
【００１１】
本発明の試験片において、前記試薬に加え、さらに無機ゲルを含むことが好ましい。前記エレクトロクロミック物質は、電子伝達の結果、還元されて色調変化を起こすが、周囲に酸素があると、再酸化されて退色するおそれがあるが、無機ゲルを含んでいれば、この退色を防止できるからである。
【００１２】
つぎに、本発明の比色分析方法を試験片に適用した例について説明する。この例において、エレクトロクロミック物質としてはビオロゲンを使用し、かつグルコースを分析対象とする。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて脱水素酵素を変える以外は、基本的に同様である。
【００１３】
まず、ビオロゲン溶液を準備する。前記溶液の溶媒としては、例えば、水や各種緩衝液が使用できる。前記溶液中のビオロゲン濃度は、例えば、１０〜５０ｍＭである。
【００１４】
このビオロゲン溶液にバインダーを溶解し、さらに、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を溶解して、試薬液とする。前記バインダーとしては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアクリルアミド、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等があげられ、この中でもＨＰＣが好ましい。また、前記バインダーの濃度は、例えば、０．５〜５質量％の範囲である。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０００〜５００００Ｕ／ｍｌである。
【００１５】
そして、前記試薬液をろ紙等の多孔質シートに含浸させ、その後乾燥させることにより、グルコース分析用の試験片が作成できる。なお、前記試薬液の含浸に先立ち、無機ゲル溶液を前記多孔質シートに含浸させ、乾燥させることが好ましい。前記無機ゲル溶液の無機ゲル濃度は、例えば、１〜５質量％、好ましくは１〜３質量％、より好ましくは１．５〜２質量％である。前記無機ゲル溶液には、さらにＣＨＡＰＳ等の両性界面活性剤を含有させてもよい。前記無機ゲル溶液全体に対する前記両性界面活性剤の濃度は、例えば、０．１〜２質量％、好ましくは０．１〜１質量％、より好ましくは０．２〜０．４質量％である。前記無機ゲルの前記多孔質シートに対する含浸量は、多孔質シート空隙体積基準で、例えば、１〜５０ｍｇ／ｃｍ3、好ましくは、１０〜３０ｍｇ／ｃｍ3、より好ましくは１５〜２０ｍｇ／ｃｍ3である。前記多孔質シートは、孔径が厚み方向若しくはシート面方向にしたがい変化する非対称多孔質膜でもよいし、対称多孔質膜でもよい。
【００１６】
この試験片は、前記エレクトロクロミック物質がビオロゲンの場合、当初透明または薄黄色であるが、血液等のグルコースを含む試料を点着すると、ビオロゲンが電子を受け取り、その濃度に応じて橙色または赤褐色に変化する。この色調変化により、グルコースの定性若しくは定量分析が可能である。また、分析に必要な時間は、試料点着後、約３〜５秒である。この試験片に無機ゲルが含浸させてあれば、色調変化後の再酸化による退色が防止され、測定に供する時間を幅広くとることが可能となる。
【００１７】
前記無機ゲルは、例えば、膨潤性粘土鉱物を使用することが好ましい。膨潤性粘土鉱物のうち、更に好ましいものはベントナイト、スメクタイト、バーミキュライトまたは合成フッ素雲母であり、特に好ましくは合成ヘクトライトもしくは合成サポナイト等の合成スメクタイト、または合成フッ素雲母で代表される膨潤性合成雲母（又はＮａ型雲母）等の合成雲母（天然の雲母は通常非膨潤性の粘土鉱物である）である。
【００１８】
つぎに、本発明の比色分析方法を、液系分析に適用した例を示す。この例において、エレクトロクロミック物質としてはビオロゲンを使用し、かつグルコースを分析対象とする。なお、コレステロール等のその他の成分分析は、それに応じて脱水素酵素を変える以外は、基本的に同様である。
【００１９】
まず、ビオロゲンとＧＤＨとを、溶媒に溶解して試薬液を調製する。前記溶媒としては、水や各種緩衝液が使用できるが、酵素の至適ｐHに調製し易いことから、緩衝液が好ましい。前記緩衝液のｐＨは、例えば、ｐＨ６〜８の範囲であり、好ましくはｐＨ６．５〜７の範囲である。また、ビオロゲンの濃度は、例えば、０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは０．５〜１０ｍＭであり、より好ましくは１〜３ｍＭである。ＧＤＨの濃度は、例えば、１０〜１０００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは、５０〜５００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは、１００〜２００Ｕ／ｍｌである。
【００２０】
この試薬液に血液等のグルコースを含む検体を添加すると、酵素反応により遊離した電子がビオロゲンに伝達され、例えば、５秒以内の短時間に、前記試薬液の色が、検体のグルコース濃度に応じ、透明から赤紫色に変化する。この変化は目視で確認しても良いし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定してもよい。前記検体の添加量は、前記試薬液１ｍｌに対し、例えば、１〜１００μｌの範囲であり、好ましくは３〜１０μｌの範囲であり、より好ましくは５〜１０μｌの範囲である。
【実施例１】
【００２１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、以下においてＰＱＱは、ピロロキノリンキノンを示す。
【００２２】
グルコース水溶液試料について、ビオロゲン誘導体およびＧＤＨを用いて、グルコースの分析を行った。なお、エレクトロクロミック物質としては、ジニトロフェニルビオロゲンとジフェニルビオロゲンとを、それぞれ使用した。
【００２３】
３０ｍＭグルコース水溶液１０μＬに、下記試薬Ｂ ５００μＬおよび下記試薬Ａ ５００μＬをこの順序で添加し、室温で１分間反応させた。この反応溶液について、９００ｎｍ〜４００ｎｍの吸光度スキャンを行った。なお、この吸光度の測定は、分光光度計（商品名Ｖ-５５０；日本分光社製）を用いて、バンド幅２ｎｍ、１０ｍｍ長セルの条件で行った。なお、下記試薬Ａ、Ｂについて「終濃度」とは、反応液における濃度である。
【００２４】
（試薬Ａ）
終濃度
200ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ6.5）            100ｍＭ
0.1％    ＣＨＡＰＳ・２Ｈ2Ｏ              0.05％
1ｍＭ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ               0.5ｍＭ
0.1％    ウシ血清アルブミン               0.05%
200 U/ml ＰＱＱ-ＧＤＨ                    100U/ml
（試薬Ｂ）
終濃度
4ｍＭ  ビオロゲン誘導体水溶液                2ｍＭ
これらの結果を図１および図２に示す。両図は、測定波長400〜900ｎｍにおける、反応前後の反応液の吸光度を示すグラフであり、図１は、エレクトロクロミック物質としてジニトロフェニルビオロゲンを使用した結果であり、図２は、エレクトロクロミック物質としてジフェニルビオロゲンを使用した結果である。
【００２５】
両図に示すように、酵素反応により遊離した電子がビオロゲン誘導体に伝達された結果、ビオロゲン誘導体が発色し、反応前には見られなかった波長で吸収を示した。特にジニトロフェニルビオロゲンは、図１に示すように、４２５ｎｍ付近で極めて顕著なピークが見られた。以上の結果から、エレクトロクロミック物質を使用すれば、多段階の酵素反応を行うことなく、迅速かつ簡便に分析可能であることがわかった。
【００２６】
以上のように、本発明の比色分析方法によれば、短時間かつ簡単に信頼性のある分析を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施例における吸光度変化（色調変化）を示すグラフである。
【図２】本発明のその他の実施例における吸光度変化（色調変化）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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