(57)【要約】【課題】  外的要因が酸化ストレスに与える影響について生体内で客観的に評価して、酸化ストレスの治療や予防に役立てる方法を提供する。【解決手段】  生体内酸化ストレスを電子スピン共鳴法により評価する方法であって、被験動物に所定の電子スピンプローブを投与してＬバンド電子スピン共鳴装置に前記被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製し、前記酸化ストレスモデルに外的要因を負荷しながら前記電子スピンプローブの消失速度をモニタする。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内酸化ストレスを電子スピン共鳴法により評価する方法であって、
被験動物に所定の電子スピンプローブを投与してＬバンド電子スピン共鳴装置に前記被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製し、
前記酸化ストレスモデルに外的要因を負荷しながら前記電子スピンプローブの消失速度をモニタすることを特徴とする生体内酸化ストレスの評価方法。
【請求項２】
前記電子スピン共鳴装置がＥＳＲイメージング装置であることを特徴とする請求項１に記載の生体内酸化ストレスの評価方法。
【請求項３】
前記外的要因の因子を変化させて酸化ストレスに対する外的要因の極大値、極小値または両者を求めることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の生体内酸化ストレスの評価方法。
【請求項４】
前記外的要因に加えて、酸化剤及び酸化防止剤から成る群から選択された成分を前記被験動物に経口投与又は非経口投与して前記電子スピンプローブの消失速度をモニタすることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の生体内酸化ストレスの評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生体内酸化ストレスの評価方法に関する。より詳しく述べると、被験動物に所定の電子スピンプローブを投与してＬバンド電子スピン共鳴装置に前記被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製し、電子スピンプローブの消失速度をモニタすることにより生体内酸化ストレスの抑制又は増大を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、いわゆる生活習慣病をはじめとする種々の疾病の原因として酸化ストレスが問題視されている。例えば、疾病の原因の約９割が酸化ストレス、すなわち酸素に起因するラジカル種が原因であるとされている。【０００３】  このような酸化ストレスを改善する方法として、薬剤、サプリメント、食品等により抗酸化機能を有する成分（例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、ユビキノン、ＳＯＤ等）を経口的に又は非経口的に対象者等に直接投与する方法が知られている。すなわち、酸化ストレスに起因する疾病を有する患者、酸化ストレスに起因する疾病を予防するための健常者のみならず、例えば、家畜、家禽類、養殖魚にこのような抗酸化成分を経口投与または非経口的ルートで投与している。【０００４】  これらの抗酸化機能を有する成分の投与に加えて、あるいは抗酸化機能を有する成分の投与の代わりに抗酸化ストレスの改善方法として、種々の外的要因を患者に与えて治療することが試みられている。
例えば、アロマテラピーに代表される嗅覚による抗酸化ストレスの抑制方法、噛むこと（ｂｉｔｉｎｇ、  ｃｈｅｗｉｎｇ）、音声（音楽、特定波長の音波）等の種々の方法がヒト、哺乳動物を中心に試みられている。【０００５】  また、逆に、騒音、異臭等によりヒト、哺乳動物が酸化ストレスを受ける場合がある。例えば、飛行場、工場等に発する騒音や、混雑場所での携帯電話の着信音、ヘッドホンから音漏れする音楽等により酸化ストレスが発生する場合もある。
このような酸化ストレスの測定方法として、特許文献１には酸化ストレスのマーカーとして、グルタチオン付加ヘモグロビンを用いそのようなグルタチオン付加ヘモグロビンの測定が、血液中の赤血球からヘモグロビンを遊出せしめた後、かかるヘモグロビン中のグルタチオン付加ヘモグロビン量を測定することによって、酸化ストレスの測定方法を実施することが記載されている。また、特許文献２には表面に微細な溝のアレイを加工した基板に対して透明基板を圧着させることで形成したマイクロチャネルアレイに、ヒト又は動物の抗凝固処置した全血を流し、該マイクロチャネルアレイを通過中の全白血球からの発光量を該透明基板越しに測定し、測定された発光量を白血球の活性酸素産生量及び酸化ストレスの指標とすることを特徴とする白血球活性酸素産生量及び酸化ストレス測定方法が開示されている。更に特許文献３によると、マーカーとして生体中のモノ不飽和脂肪酸を用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法が開示されている。【０００６】
【特許文献１】  特開２０００−０７４９２３号公報（要約書）
【特許文献２】  特開２００１−０５０９５３号公報（要約書、図１）
【特許文献３】  特開２００３−０８３９７７号公報（要約書）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  しかしながら、従来技術はいずれも、生体外での抗酸化ストレスの評価方法であり、これらの外的要因による酸化ストレスの挙動について生体内で科学的に評価する方法はなかった。例えば、特定の臭気を有する物質を患者に嗅がせることによってアロマテラピーは行われているが、このような場合、その濃度、他の臭気の組合せ等を解明する場合には、ほとんどテラピストによる勘に頼るものであった。
従って、このような外的要因が酸化ストレスに与える影響について生体内で客観的にかつリアルタイムに評価して、酸化ストレスの治療や予防に役立てる方法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  前記課題を解決するための本発明は、生体内酸化ストレスを電子スピン共鳴法により評価する方法であって、被験動物に所定の電子スピンプローブを投与してＬバンド電子スピン共鳴装置に前記被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製し、前記酸化ストレスモデルに外的要因を負荷しながら前記電子スピンプローブの消失速度をモニタすることを特徴とするものである（請求項１）。
このように構成することによって、外的要因が酸化ストレスに与える影響を客観的に評価することが可能となる。【０００９】  本発明の生体内酸化ストレスの評価方法において、前記電子スピン共鳴装置がＥＳＲイメージング装置であることを特徴とするものである（請求項２）。
このように、画像で視覚的に評価を行うことにより、すなわち、例えば被験動物の脳等を画像により評価することによって、脳等のうちのどの部分で酸化ストレス反応の抑制又は増大が行われているのか視覚的にかつリアルタイムに確認することが可能となる。【００１０】  本発明の生体内酸化ストレスの評価方法において、前記外的要因の因子を変化させて酸化ストレスに対する外的要因の極大値、極小値または両者を求めることを特徴とするものである（請求項３）。
このような構成によると、外的要因の因子が、例えば酸化ストレスを抑制する臭気成分である場合には臭気成分の濃度を変化させて測定することによって、その臭気成分の酸化ストレスに対する最適濃度を測定することが可能である。逆に、外的要因の因子が酸化ストレスを増長させる騒音である場合、騒音の大きさが酸化ストレスを与える影響を調査することが可能であり、許容騒音範囲等を効果的に測定することが可能となる。【００１１】  本発明の生体内酸化ストレスの評価方法において、前記外的要因に加えて、酸化剤及び酸化防止剤から成る群から選択された成分を前記被験動物に経口投与又は非経口投与して前記電子スピンプローブの消失速度をモニタすることを特徴とするものである（請求項４）。
このように構成することによって、例えばアロマテラピーと抗酸化成分との組合せによる抗酸化ストレスの抑制に対する評価を行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１２】  このような生体内酸化ストレス評価方法により外的要因が酸化ストレスに与える影響を生体内で客観的に評価かつリアルタイムにすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  以下、添付図面に基づいて本発明の実施の形態を説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施の形態に限定されるものではない。図１は、本発明の生体内酸化ストレスの評価方法の目的を示す概略図であり、図２は、本発明の生体内酸化ストレスの評価方法に使用するＥＳＲイメージング装置の一例を示す概略図である。
なお、本発明において使用する用語「外的要因」とは、酸化を促進または抑制する成分を生体内に投与することとは異なり、生体内に所定の要因を負荷することを意味し、アロマテラピー、嗅覚を刺激すること、噛むこと（ｂｉｔｉｎｇ、ｃｈｅｗｉｎｇ）、特定の部位を運動させること、音声（音楽、特定波長の音波）等の聴覚を刺激すること、特定の形状または硬度の物に触れる等の触覚を刺激すること、特定の色、形状の物品等を見せる等の視覚を刺激すること及びこれらの組合せを含むことを意味している。【００１４】  また、本発明において使用する被験動物とは、後述するＬ−バンド電子スピン共鳴装置の試料台に、その対象とする測定個所が収納可能な動物であれば特に限定されるものではなく、ラット、マウス、モルモット、ラビット等の動物実験に使用される小動物以外にも、ヒトを含むことを意味する。
ラジカル種による酸化ストレスは、例えば「ガン」、「潰瘍性大腸炎」、「肝炎」、「急性膵炎」、「虚血性心疾患」、「虚血性腸炎」、「血管透過性が亢進」、「高血圧」、「紫外線障害」、「自己免疫疾患」、「ショック」、「腎炎」、「心筋梗塞」、「ストレス性潰瘍」、「成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）」、「テンカン発作」、「糖尿病」、「動脈硬化」、「脳卒中」、「パーキンソン病」、「放射線障害」、「薬剤性肝障害」、「リウマチ」、「老化」等の種々の疾病の原因となるだけでなく、図１に示す通り、加齢障害に対する評価・予知に使用することが可能である。【００１５】  すなわち、図１に示す通り、活性酸素・フリーラジカル（図１左側）と、生体内抗酸化酵素とのバランスがとれていることが重要であるが、加齢により（生活習慣病・老化等）、生体内の活性酸素種と、生体内抗酸化物質（酵素）とのバランスが若干ではあるがくずれてしまう。。本発明においては、このような生体内の活性酸素種と、抗酸化酵素とのバランスを活性酸素種と抗酸化物質との酸化還元反応をＥＳＲ測定装置（本発明においてはＬバンドのＥＳＲ装置）を使用して評価する。
すなわち、生体内の生体内の活性酸素種と、生体内抗酸化物質（酵素）とのバランスの崩れを一般には、抗酸化物質（ビタミンＣ、その誘導体、アントシアニン及びその誘導体、ＣｏＱ１０等）の投与によって、補っているが、本発明では、外的要因による生体内の活性酸素種と、生体内抗酸化物質（酵素）との反応の変化をＥＳＲ装置により評価することを特徴とするものである。具体的には、外的要因が活性酸素・フリーラジカル側に作用するのかあるいは抗酸化酵素側に作用するのかをＥＳＲ装置を用いて生体内評価する。【００１６】  なお、本発明は、前述のラジカル種による酸化ストレスに起因する疾病に対する外的要因の負荷の影響や、加齢障害に対する外的要因の負荷の影響に加えて、正常な状態での騒音や異臭等の外的要因による酸化ストレスの測定も本発明の対象である。
本発明においては、本発明の目的・効果を達成するＬ−バンドＥＳＲ装置であれば特に限定されるものではなく、ＥＳＲイメージング装置を使用することが、好ましい。すなわち、ＥＳＲイイメージング装置を使用して、例えば被験動物の脳等を画像により評価すると、測定した脳等の測定部位のうちの具体的にどの部分で酸化ストレス反応の抑制又は増大が行われているのか視覚的に確認することが可能となる。【００１７】  ＥＳＲイメージング装置は、静磁場中に置かれた試料に、静磁場の方向と直交する方向に高周波磁界を印加して、試料中に含まれる不対電子による高周波の共鳴吸収を観測する装置である。近年、このＥＳＲ装置の静磁場に勾配磁場を重畳して、不対電子の空間分布を画像化する装置である。
例えば図２に示すＥＳＲイメージング装置は、以下のような構成を有している。
高周波発振器１から発振された高周波を、ステップアッテネータ２で適切な電力に減衰した後、サーキュレータ３と高周波線路４とを介して、静磁場コイル６と勾配磁場コイル７から発生した磁場が重畳された磁極間隙に配置されたループギャップ共振器５に供給する。【００１８】  前記ループギャップ共振器５の共振器軸は、静磁場方向（２軸方向）と直交する方向（すなわち、ｘ軸方向）に配置され、高周波磁場と静磁場が互いに直交する構成になっている。ループギャップ共振器５内部は、本発明で使用する被験動物を測定対象物として載置するための試料台９を、前記ループギャップ共振器５の共振器軸に沿って挿入されている構成を有している。【００１９】  ループギャップ共振器５に供給された高周波は、移動式のカップラー１０によって反射波のない状態に結合を調整されている。もし、測定対象物８がＥＳＲ現象によって高周波の吸収を引き起こせば、ループギャップ共振器５と高周波線路４との結合がずれてループギャップ共振器５から反射波を生じる。この反射波を、サーキュレータ３を介して取り出し、高周波検出器１１に送り、高周波検出器１１で検波した結果をデータ処理装置１２で画像データに変換している。【００２０】  尚、高周波検出器１１に適当なバイアスをかけるため、高周波発振器１から発振された高周波の一部を方向性結合器１３によって分岐させ、移相器１４で位相を調節した後、再び方向性結合器１５で合流させる操作を加えている。【００２１】  本発明において使用可能な電子スピンプローブは、ＥＳＲ装置に従来使用されている電子スピンプローブから測定部位を考慮して適宜選択することが可能である。
本発明で使用可能な電子スピンプローブの代表例として、３−カルボキシル−２，２，５，５−テトラメチル−ピロリジン−１−イルオキシ（カルバモイルＰＲＯＸＹＬ）（顎顔面部位、心臟、膀胱、肝臓、脾臓等）、３−メトキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−イルオキシ（ＭＣ−ＰＲＯＸＹＬ）（脳）が挙げられるが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、本発明において複数の異なる部位を同時に測定する場合、異なる電子スピンプローブ、例えばカルバモイルＰＲＯＸＹＬとＭＣ−ＰＲＯＸＹＬとを同時に投与してもよい。被験動物に電子スピンプローブを投与する方法についても、従来公知の方法、例えば被験動物への静脈内接種により投与することができる。【００２２】  なお、被験動物に点滴等の手段で継続的に電子スピンプローブを加えることで、電子スピンプローブの消失速度を長期間に亘って測定することも可能である。【００２３】  本発明は、このようなＬ−バンドのＥＳＲ装置を使用して、被験動物に外的要因を負荷しつつ前記被験動物の所定個所の酸化ストレス状態の変化を測定する。
まず、ＬバンドＥＳＲ装置に前記被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製する。この際、酸化ストレスモデルとして、例えば脳内酸化モデルとして、マウス、ラット、ラビット等の小動物を挙げることができる。また、他の部位の酸化モデルとしてＳＨＲ種ラットを挙げることができる。更に、ヒト等の皮膚等の局部を酸化ストレスモデルとすることも可能である。【００２４】  一般に、酸化ストレスモデルとして使用する被験動物は、図４（ａ）に示すように、測定個所が酸化ストレス状態にある動物であって、先ず麻酔を施した後に、後述する特定個所に対応した電子スピンプローブを接種する。例えば、脳内に酸化ストレスを有するラット、マウス等の小動物を酸化ストレスモデルとする場合、麻酔を施した後に、スピンプローブ（例えばＭＣ−ＰＲＯＸＹＬ）を静脈内接種した後に前記ＥＳＲ装置の試料台にセットして、ループギャップ共振器の所定位置に被験動物がセットされた試料台を挿入する。
なお、例えば後述する外的要因が噛むこと等の場合、図４（ｂ）に示す通り予め被験動物に対象となるサンプルを噛ませてからループギャップ共振器の所定位置に被験動物がセットされた試料台を挿入してもよい。
本発明においては、このようにしてＥＳＲに酸化ストレスモデルをセットした後、外的要因を負荷しつつ、外的要因が酸化ストレスモデルに与える影響をＥＳＲ装置により電子スピンの消失速度として連続的に測定することを特徴とするものである。
すなわち、外的要因が嗅覚的刺激である場合、所定の臭い、例えばアロマテラピーに適用しようとする成分、刺激臭等の成分等の臭気成分を所定濃度で被験動物に曝露しながら電子スピンの消失速度を測定することによって、酸化ストレスに対する臭気成分の影響を評価することが可能である。【００２５】  電子スピンの消失速度は、例えば、図３に示す通り、時間とともに減少する一次関数のグラフとして示すことができる。このグラフの勾配（絶対値）が大きい程酸化ストレスが大きいことを示している。【００２６】  この場合、コントロールとして、外的要因を負荷しない被験動物の電子スピンの消失速度を測定することによって、あるいは所定の臭気成分の濃度変化による電子スピンの消失速度を測定することによって、酸化ストレスに対する臭気成分の影響を、コントロールとの比較により評価したり、あるいは臭気成分の酸化ストレスに対する影響の濃度依存性を評価することが可能となる。【００２７】  なお、濃度依存性とは、例えば臭気成分がアロマテラピー用の成分（候補成分を含む）の場合、臭気成分の濃度を変化させて、酸化ストレスモデルのＥＳＲ測定を繰り返すことによって、特定の臭気成分の抗酸化ストレスに対する最適濃度を類推することが可能である。逆に、臭気成分が異臭である場合には、臭気成分の濃度を変化させて、酸化ストレスモデルのＥＳＲ測定を繰り返すことによって、その臭気成分の許容濃度を決定するための指標を与えることが可能である。
さらに、二種類以上の臭気成分をブレンドして、これらの臭気成分の抗酸化ストレスに対する最適の混合比を類推することも可能である。【００２８】  本発明の別の実施の形態において、外的要因として、臭気成分の濃度を連続的に変化させて、電子スピンプローブの消失速度の勾配の変化をモニタすることが可能である。
すなわち、電子スピンプローブの消失速度は、一般に酸化ストレスモデルに一定の負荷を与えた場合には直線的に減少するが、外的負荷を連続して変化させた場合には、電子スピンプローブの消失速度変化曲線を微分することによって、消失速度の変化率を求め、極小値又は極大値を求めることも可能である。【００２９】  前記の臭気成分と同様にして、例えば噛むことの酸化ストレスに対する影響をＥＳＲ装置を使用して評価することが可能である。この場合、例えば小動物を被験動物として用いてＥＳＲ装置の試料台に設置するのに先立って、予め小動物に対象となる物を噛ませてから試料台に搭載して、ＥＳＲ測定を行うことも可能である。従って、請求項１に記載の被験動物に所定の電子スピンプローブを投与してＬバンド電子スピン共鳴装置に被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製し、前記酸化ストレスモデルに外的要因を負荷しながらＥＳＲ測定を行うとは、予め被験動物をセットして酸化ストレスモデルを作製する際に、外的要因を負荷した酸化ストレスモデルを作製して、ＥＳＲ測定を行うことも包含するものである。【００３０】  本発明において、音等のその他の外的負荷を与えつつ同様にＬバンドＥＳＲ装置を用いて電子スピンプローブの消失速度をモニターすることによって、その外的負荷が酸化ストレスに与える影響を測定することが可能となる。
なお、所望に応じて外的要因に加えて、酸化防止剤又は酸化剤等を被験動物に添加して外的要因との相互作用を調べることも本発明の範囲内である。【００３１】  前記スピンプローブの消失速度に加えて、特定部位、例えば脳内での酸化還元反応を画像データとして表示して、視覚的に解析することが可能である（図６参照）。
【実施例】
【００３２】  以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
図２に示す、装置を使用して、スピンプローブとしてＭＣ−ＰＲＯＸＹＬを用いて、被験動物としてＳＨＲ種マウス（コントロール）、図４（ａ）に示す通り拘束を３０分間行ったＳＨＲ種（実施例１）及び図４（ａ）に示す通り拘束を３０分間行った後、図４（ｂ）に示す通り咬合を行ったＳＨＲ種（実施例２）について電子スピンプローブの消失速度を測定した。結果を図５及び図６に示す。
図５は、電子スピンの消失速度の傾きの変化を示すグラフである。図５から明らかな通り、コントロールにおけるＫ１値よりも拘束ストレスを与えた場合のＫ１値の方が大きいので、拘束を与えることによって酸化ストレスが上昇したことが判る。更に、拘束を与えた後、咬合させることによってＫ１値が減少した。従って、外的要因として拘束を与えることによって酸化ストレスが上昇し、また外的要因として噛むことが抗酸化ストレスに対して効果があることが判る。
また、図６は、電子スピンの消失をイメージとして表示した参考図面であり、図６（ａ）、図６（ｂ）及び図６（ｃ）は各々コントロール、実施例１及び実施例２におけるイメージを示してイる。図５と同様に図６からも外的要因として拘束を与えることによって酸化ストレスが増大し（実施例１）、そして噛むことが抗酸化ストレスに対して効果がある（実施例２）ことが判る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】  本発明の生体内酸化ストレスの評価方法の目的を示す概略図である。
【図２】  本発明の生体内酸化ストレスの評価方法に使用するＥＳＲイメージング装置の一例を示す概略図である。
【図３】  実施例及び比較例の電子スピンの消失速度を示すグラフである
【図４】  実施例及び比較例における被験動物の測定状況を示す図面である。
【図５】  実施例及び比較例の電子スピンの消失速度を示すグラフである。
【図６】  実施例及び比較例の電子スピンの消失をイメージとして表示した参考図面である。
【符号の説明】
【００３４】  １      高周波発振器
２      ステップアッテネータ
３      サーキュレータ
４      高周波線路
５      ループギャップ共振器
６      静磁場コイル
７      勾配磁場コイル
８      測定対象物
９      試料台
１０    移動式のカップラー
１１    高周波検出器
１２    データ処理装置
１３    方向性結合器
１４    移相器
１５    方向性結合器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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