(57)【要約】【課題】  癌細胞に対する抗癌剤の感受性を簡便かつ正確に判定する方法を提供する。【解決手段】  抗癌剤に対する癌細胞の感受性を判定する方法であって、下記の工程：(A)癌細胞中のチトクロームP450の発現を測定する工程、及び(B)チトクロームP450の発現が認められる場合には、その抗癌剤が上記癌細胞中で不活性化される可能性があると判定する工程を含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤に対する癌細胞の感受性を判定する方法であって、下記の工程：
(A)癌細胞中のチトクロームP450の発現を測定する工程、及び
(B)チトクロームP450の発現が認められる場合には、その抗癌剤が上記癌細胞中で不活性化される可能性があると判定する工程
を含む方法。
【請求項２】
抗癌剤が肝臓中に発現するチトクロームP450により代謝され、不活化される抗癌剤である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
チトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4からなる群から選ばれる１種又は２種以上のチトクロームP450の発現を測定する工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
発現の測定をmRNAの検出により行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
発現の測定を抗体を用いた免疫組織化学染色により行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞に対する抗癌剤の感受性を簡便かつ正確に判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床では同じ臓器あるいは同じ組織型の癌であるという理由で、抗癌剤が一律に使用されている。しかしながら、インビトロで効果のある抗癌剤もインビボでは必ずしも有効ではなく、また、臨床的に同じ臓器の組織型の癌であるにもかかわらず、ある抗癌剤は有効であり、ある抗癌剤では効果が低いという相違も日常的に認められる現象である。この現象の原因の一つは、癌が抗癌剤に耐性を持つことにあると考えられている。
【０００３】
癌における抗癌剤耐性のメカニズムは必ずしも全て解明されているとは言えないが、そのメカニズムとして次のものが考えられている。(1)細胞膜が変化して抗癌剤が細胞内に移行しにくくなる；(2)細胞内の抗癌剤が排出されやすくなる；(3)抗癌剤を不活性化する酵素が増加して抗癌剤作用が消失する；(4)抗癌剤の標的部位が変化して抗癌剤作用からエスケープする；及び(5)抗癌剤の標的部位の修復活性が亢進する。特に、上記(3)のメカニズム（癌の局所的抗癌剤代謝メカニズム）の存在から、癌細胞中で抗癌剤を特異的に不活性化する酵素を検出することは抗癌剤選択における重要な課題である。しかしながら、従来、この(3)のメカニズムに関しての報告は少ない。
【０００４】
一方、タバコ煙中などの外因性化学物質の解毒には解毒酵素であるチトクロームP450(本明細書において「CYP」と略す場合がある)が大きな役割を担っている。CYPは、肝臓のみならず気管支上皮など化学物質に暴露し易い部位に発現しており、肝臓で主として発現したCYPは抗癌剤などを含む薬剤に対して主要な代謝酵素として作用し、薬物代謝の主な経路を担っている。例えば、乳癌で投与されるシプロキサンは肝臓のチトクロームP450 3A4 (CYP3A4)で代謝されて活性化することにより抗癌作用を発揮すると考えられているが、肺癌や乳癌に対して投与されるタキソール、タキソテール、ナベルビン、又はイレッサなどは肝臓のCYP3A4で代謝されて不活性化され、体外へ排泄されると考えられている。このように、CYP3A4により多くの抗癌剤は不活性化されるが、活性化する場合もある。また、チトクロームP450 1B1は代謝活性化作用により癌の悪性化に関与している。
【０００５】
もっとも、チトクロームP450を発現する癌細胞株の報告はなく、また、切除された癌細胞にチトクローム酵素が発現していることに関する報告もほとんどない。特に肺癌や乳癌においてチトクロームP450が抗癌剤の代謝に関与するとの報告は全くない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を簡便かつ正確に判定する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、癌細胞において一群のチトクロームp450が発現している場合があり、このチトクロームP450が抗癌剤の局所的不活化に関与していることを見出した。また、チトクロームP450の発現の程度と抗癌剤の局所的不活化の程度との間には相関が認められ、チトクロームP450の発現の程度を確認することにより、抗癌剤の不活性化の程度を予測できることも見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明により、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を判定する方法であって、下記の工程：(A)癌細胞中のチトクロームP450の発現を測定する工程、及び(B)チトクロームP450の発現が認められる場合には、その抗癌剤が上記癌細胞中で不活性化される可能性があると判定する工程を含む方法が提供される。上記の発明の好ましい態様によれば、抗癌剤が肝臓中に発現するチトクロームP450により代謝され不活化される抗癌剤である上記の方法；チトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4からなる群から選ばれる１種又は２種以上のチトクロームP450の発現を測定する工程を含む上記の方法；発現の測定をmRNAの検出により行う上記の方法；及び、発現の測定を抗体を用いた免疫組織化学染色により行う上記の方法が提供される。
【０００９】
別の観点からは、上記の方法に用いるための試薬であって、癌細胞中のチトクロームP450をコードするmRNAの発現量を測定するためのプライマーセットを含む試薬、及び上記の方法に用いるための試薬であって、癌細胞中のチトクロームP450を免疫組織化学染色可能な抗体を含む試薬が本発明により提供される。これらの試薬は、チトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4からなる群から選ばれる１種又は２種以上のチトクロームP450をそれぞれ測定できるように、複数のプライマーセット又は抗体を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を簡便かつ正確に判定することができ、個々の癌に対して有効な抗癌剤を選択することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、抗癌剤に対する癌細胞の感受性を判定する方法であって、下記の工程：(A)癌細胞中のチトクロームP450の発現を測定する工程、及び(B)チトクロームP450の発現が認められる場合には、その抗癌剤が上記癌細胞中で不活性化される可能性があると判定する工程を含むことを特徴としている。
【００１２】
本発明の方法を適用すべき抗癌剤の種類は特に限定されないが、肝臓中のチトクロームP450により代謝を受けて不活性化することが知られている抗癌剤であることが好ましい。このような抗癌剤としては、例えば、タキソール、タキソテール、ナベルビン、又はイレッサなどが知られているが、本発明の方法の適用対象となる抗癌剤はこれらに限定されることはない。肝臓中でチトクロームP450による代謝を受けて不活性化されるか否かについては、例えば、文献（Annual Rev. Pharmacol. Toxicol., 39, pp.1-17, 1999など）に記載された方法により容易に確認することができる。癌細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは乳癌細胞又は肺癌細胞である。なお、本明細書において「癌」という用語は固形癌のほか、血液癌などの非固形癌（肉腫を包含する）を含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。また、「抗癌剤」という用語は、固形癌又は非固形癌を治療対象とする薬剤を意味しており、抗腫瘍剤を包含する概念である。
【００１３】
チトクロームP450としては、チトクロームP450に属する一群の酵素を全部測定対象としてもよいが、好ましくは、チトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4からなる群から選ばれる１種又は２種以上のチトクロームP450をそれぞれ測定対象とすることができる。
【００１４】
癌細胞中でのチトクロームP450の測定方法は特に限定されず、チトクロームP450の発現を検出可能なものであれば、いかなる測定方法を採用してもよい。遺伝子レベル又は蛋白質レベルのいずれでも測定を行うことができる。例えば、mRNAを定量するノーザンブロッティング法や、チトクロームP450に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いる方法などを適宜採用できる。２種以上の測定方法を組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
例えば、ノーザンブロッティング法では、癌細胞から全RNAを抽出した後、通常の方法に従ってアガロースゲル電気泳動を行ってmRNAを分離し、例えば、ニトロセルロースフィルターに転写した後に標識プローブを作用させ、チトクロームP450に対応するスポットを検出できる。このスポットの大きさや濃さでmRNAの定量を行うことができる。また、抗体を用いる方法では、免疫組織化学染色法により、癌細胞内に発現しているチトクロームP450を方法を採用することもできる。さらにマイクロアレイ法による検出も可能である。チトクロームP450に特異的に反応するモノクローナル抗体は、例えばGentest社から入手可能である。これらの測定にあたり、対照となる正常細胞又は癌細胞を用いることが好ましい。測定のための生体試料としては、患者から分離採取した生検組織、患者の血液、手術により分離した器官や組織などを用いることができる。
【００１６】
より具体的には、本発明の方法は、下記に示す工程に従って行うことができる。
(1)患者から分離採取した生検組織、患者の血液、手術により分離した器官や組織などの生体試料からmRNAを抽出する。この抽出操作は、例えば、SV total RNA Isolation System, Promega社製で行うことができる。
(2)Real-Time PCRによりチトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4についてmRNA発現量を測定する。この測定は、例えば、ABI PRISM 7000, Applied Biosystem社製で行うことができる。
(3)上記工程(2)に加えて、あるいは上記工程(2)に替えて、生体試料をホルマリン固定した後、組織切片を作成し、免疫組織化学染色により癌細胞におけるチトクロームP450 1A1、チトクロームP450 1B1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4の発現量を測定する。これらの各チトクロームP450に特異的に反応する標識抗体は、例えば、Gentest社から入手できる（商品名：MAB-2A6及びMAB-2E1）。
【００１７】
本発明の方法の工程(A)により癌細胞中にチトクロームP450の発現が認められた場合には、抗癌剤がこの癌細胞中で不活性化される可能性があると判定することができる。この判定により、個々の癌について抗癌剤に対する感受性を簡便かつ正確に判定することができ、癌の個性に応じて有効な抗癌剤を選択することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例１
Gentest社から市販されている抗体を用いて、肺癌細胞中のチトクロームP450 1A1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4の発現量を測定できるか否かをヒト肝臓組織をモデルとして用いて検討した。チトクロームP450は、主として中心静脈周囲の肝細胞に高度に発現していることが認められた。CYP 3A4抗体によるヒト肝臓の免疫組織化学染色結果を図１に示す。つぎに、約100例の切除されたヒト肺癌を免疫組織化学染色で検討した結果、20%の肺癌中にチトクロームP450 1A1、チトクロームP450 2A6、チトクロームP450 2E1、及びチトクロームP450 3A4の発現が認められた。肺腺癌のCYP 3A4による染色結果を図２に示す。図２に示したように、明らかにチトクロームP450を発現している癌細胞が存在しており、これらの癌では、癌細胞自身が抗癌剤を局所的に不活性化する可能性が示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】チトクロームP450 3A4に特異的な抗体を用いたヒト肝臓の免疫組織化学染色の結果を示した写真である。
【図２】ヒト切除肺腺癌標本における肺腺癌中のチトクロームP450 3A4を免疫組織化学染色により測定した結果を示した写真である。左の写真はヘマトキシリン−エオシン染色、右の写真はCYP 3A4に対する抗体を用いた免疫組織化学染色の結果を示す。
【図１】
2005034150.tif 000002
【図２】
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