(57)【要約】【課題】複数種類の病原細菌を対象として、プライマー設計および特異性証明に必要な時間、労力および経費を節減すると共に精度管理に有効なマルチプレックスＰＣＲ法を利用した簡便、迅速かつ安価な一括検出方法および試薬を提供する。【解決手段】多数の既成ＰＣＲ用プライマー対から、一定温度条件下で増幅可能な有効プライマー対群を選抜し濃度調整をする工程と、具体的な試薬作製の工程を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌種特異性または菌属特異性が証明されたプライマー対群を検査用途にしたがって選抜した後グループ化し、それぞれのプライマー対の競合作用を調べ、競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には濃度比を変えた反応液列を用いて最適濃度比を決定することで、グループ化後のプライマー対群の最適濃度条件を決定することを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出方法。
【請求項２】
請求項１で選抜、調整したグループ化後プライマー対群溶液を、無菌およびＤＮＡａｓｅフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させ、使用時にホットスタート用ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを挿入し反応させることを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出方法。
【請求項３】
請求項２の組み合わせによるプライマー対群を８連０．２ｍＬマイクロチューブに分注し、乾燥させたことを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出試薬。
【請求項４】
市販の塩化アンモニウムおよび塩化カリウ厶を含有するＰＣＲバッファーを含むホットスタート用ＰＣＲ試薬を請求項３に挿入したことを特徴とする食中毒起因細菌の一括検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、食品衛生、食品工場、環境衛生、家畜衛生に係わる食中毒起因細菌を一括してスクリーニングする検査技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  食品衛生、食品工場、環境衛生、家畜衛生に係わる環境の中で、ＨＡＣＣＰを中心とした微生物制御体制が計られている今日、対象となる細菌の種類は非常に多い。加えて、１９９９年（平成１１年）１２月、食品衛生法施行規則の一部を改正する省令（厚生省令第１０５号）により、我が国においては、従来から一般的な食中毒の原因物質とされてきた腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、サルモネラ属菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、ウェルシュ菌、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターコリ、リステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシス、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びボツリヌス菌等に加えて、２類感染症であるコレラ菌、赤痢菌及びチフス菌等が食品媒介性の原因物質として追加されている。これらの細菌の検査には一般的に培養検査が行われてきたが、検査方法が細菌種ごとに異なるため、事件毎に全ての検査を網羅することは不可能に近く、一括して検査ができる新検査技法の開発が望まれてきた。【０００３】  最近では、これらの細菌に対する簡便で迅速な同定方法の一つとして、細菌の保持している遺伝子を人工的に増幅することにより同定するポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と略す。）が開発され、様々なプライマー対が設計され、市販されている。しかしながら、市販品の中では細菌の種類が制限されていることや、細菌を分離した後の性状試験を目的として商品化されているため高価であるといった問題点がある。このために、細菌が分離される前にスクリーニング的に応用することや一度のＰＣＲで複数の遺伝子を同定するマルチプレックスＰＣＲ（以下「Ｍ−ＰＣＲ」と略す。）へ応用することは非常に困難であった。これを解決する手段としては、自分でプライマー対をデザインし合成するか文献から選抜し合成する方法がある。しかし、前者ではまず基準菌株を用いてプライマー対の特異性を証明する必要があり、後者では膨大な数のプライマー対の中から適切なものを選抜しなければならない。【０００４】  現在まで、報告されてきたＰＣＲを用いた研究は、細菌属レベルあるいは細菌種レベルでの応用である事が多い。複数種類の微生物を検査対象としたものには「微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット」（特開２００２−２２３７６６）がある。この発明は、広範に微生物種を同定する有効な方法であるが、食中毒起因細菌を対象にしておらず、Ｍ−ＰＣＲでの実施例がなく具体的な手段を提供していない。他に、１３種類の食中毒起因細菌に対する一括検出方法の報告があるが（Ｒ−Ｆ．ＷＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、８３、７２７−７３６）、文献からのプライマー対の選抜方法について明記されておらず、実施例も少なく技術的に安定した成績がでることを証明していない。また、１種類の細菌に対し１種類のみの対象遺伝子をターゲットにしているため、判定がわかりにくい。【０００５】  Ｍ−ＰＣＲを実施する場合、対象とする細菌種数が多いことからプライマー対群の調整方法が煩雑になり、検査者毎の成績のバラツキやＤＮＡ汚染が生じやすくなる傾向にある。Ｍ−ＰＣＲに限らずＰＣＲ反応液の調製方法の不均一性は擬陽性や擬陰性の原因となっており、ＰＣＲを実施する上での適切な精度管理を困難にしている理由の一つとなっている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  このような状況の中で、本発明者等は、多数の既成ＰＣＲ用プライマー対からの有効な選抜方法を確立すること、選抜プライマー対を用途に応じてグループ化し、それらの最適濃度条件を決定して調製方法を確立すること、ならびにプライマー対群調製済みのディスポーサブルチューブを作製することにより、食中毒起因細菌に対する迅速、簡便かつわかりやすい一括検出方法を確立するとともにＰＣＲに対する最適な精度管理を提供することを目的とする。
【問題点を解決するための手段】
【０００７】  上記課題を解決するための本発明は以下の技術的手段から構成される。
（１）多種類のプライマー対の選抜方法について、グラジエント式サーマルサイクラー（ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、プライマー対と標的ＤＮＡを挿入した反応液をアニーリング温度条件を変えて反応させ、至適アニーリング温度が５５℃付近に存在するプライマー対を選び出すことで、Ｍ−ＰＣＲにおける最適および均一なアニーリング条件を提供することを特徴とする細菌の一括検出方法。
（２）前（１）項でプライマー対群を検査用途にしたがってグループ化し、それぞれの競合作用を調べ、競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には濃度比を変えた反応液列を用いて最適濃度比を決定することで、グループ化後のプライマー対群の最適濃度条件を決定することを特徴とする細菌の一括検出方法。
（３）第（１）項および前（２）項で選抜、調整したグループ化後プライマー対群溶液を、無菌およびＤＮＡａｓｅフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させ、使用時にホットスタート用ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを挿入し反応させることを特徴とする細菌の一括検出方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】  本発明について更に詳細に説明する。
一般的に、腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、チフス菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、ウェルシュ菌、カンピロバクタージェジュニ、カンピロバクターコリ、リステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシス、セレウス菌、黄色ブドウ球菌及びボツリヌス菌のような細菌を検出し同定するためには、選択分離培地による培養や有機物の分解性を観察する性状試験、染色法による形態観察および薬物感受性試験等により細菌固有の性状を証明することが行われてきた。これらの検査方法は、細菌種ごとに異なっており、食中毒事件毎に全ての細菌種を網羅することは不可能に近く、事件の発生状況や検査者の判断で菌種の絞り込みを行い検査に供してきた。もちろん全ての事件に対して全ての検査を実施することは現実的ではなく必要性も乏しいが、一方で検査に供しても目的の細菌が検出されず、原因不明となることも少なくない。従って、多数の細菌種を一括して検査ができる新検査技法の開発が望まれてきた。【０００９】  ＰＣＲが食品衛生検査に応用されるようになって久しいが、前述の食中毒起因細菌に対して、様々な研究者により様々なプライマー対が設計され、それぞれの特異性が証明されてきた。この中で細菌株間や数種類の細菌種間ではＭ−ＰＣＲが応用され、方法論も確立してきたが、前述の細菌種を全般にわたって調査した報告は少ない。唯一、１３種類の食中毒起因細菌に対する一括検出方法（Ｒ−Ｆ．ＷＡＮＧ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９７、８３、７２７−７３６）が報告されているが、実用性の面から未だ未完成である。【００１０】  報告されてきた様々なプライマー対は、標的細菌種に対する特異性については充分に証明されており、この面では全く新規性はない。しかしながら、これらのデータは各研究者の至適条件下で評価されたものであり、相対的な評価は全くなされていない。また、本来ＰＣＲの良否を問うべきプライマーの設計はＰＣＲ法のコアをなすべき部分であるが、標的遺伝子を保持した細菌株や類属細菌の基準株の入手はもちろん、プライマーの設計と実験の繰り返しとが必要であるため、その証明は非常に困難であるとともに、標的細菌種数が多くなればなるほど莫大な時間、手間および費用を費やさなければならない。【００１１】  既成のプライマー対は、かなりの数が報告されてきており、中には非常に有効なものが存在する。本発明のようにＭ−ＰＣＲを目的とする場合には有効なプライマー対を効率よく選抜し、組み合わせることで全く別の用途が生じる。例えば、鶏や豚の食肉工場では、サルモネラ属菌、リステリア属菌およびカンピロバクター属菌が重要な病原菌であるが、水産漁場ではビブリオ属菌、赤痢菌や大腸菌が主要な標的である。一方、乳製品工場では基本的に汚染の是非が最重要点であり、加えて大腸菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌およびカンピロバクターといった病原細菌のスクリーニングが必要である等、製品の種類によって重要管理点となる細菌の種類が異なっている。このように、製品の種類に応じて様々な細菌種の組み合わせが要求されるた��に、プライマー対の効率的な選抜方法を確立することは非常に有効なことである。【００１２】  本発明者等は、既報の様々な文献や特許から抽出した多数のプライマー対の中から有効なプライマー対を簡便且つ効率的に抽出する方法を提案する。ＰＣＲのコアの試薬であるプライマー対は２０〜２５対程度のオリゴヌクレオチドからなり、ＰＣＲの成否がこれにより左右されると言っても過言ではなく、その特性は塩基配列から計算されるＧＣ含量とＴｍ値による。ここで、Ｔｍ値は、簡便的にＡとＴとを２℃、ＧとＣとを４℃として塩基配列から簡易的に算出できることが知られている。一般的にＰＣＲで用いられるアニーリング温度はプライマー対のＴｍ値から５℃程度下げた温度が用いられる。これらのことから、設計されたプライマーの塩基配列から至適アニーリング温度を便宜的に推測することは可能である。しかしながら、プライマー対と標的塩基配列との相性は周辺塩基配列の状況や繰り返し配列の存在あるいは反応液の組成等により千変万化であるため、実際には温度条件を変えて反応させることが簡便な最良の検証手段である。現在はグラジエント温度列によるＰＣＲが可能なグラジエント式温度サイクラーを用いることにより至適アニーリング温度範囲を簡単に決定することができる。以上のことから、最初に各プライマー対の至適アニーリング温度範囲を決定することにより有効なプライマー対を選抜する。【００１３】  図１により、文献や特許等から抽出した様々なプライマー対を調整した。即ち、これらのプライマー対は、カラム精製グレードで合成されたものを用い（依頼合成、インビトロジェン）、合成された乾燥状態のオリゴヌクレオチドを滅菌蒸留水で２００μＭに調製し、−３０℃で凍結保存した。単プライマー対の場合はセンス及びアンチセンスを終濃度１０μＭになるように調製し、マルチプレックスプライマー対の場合は最適濃度比となるように調製して使用溶液とし、−３０℃で凍結保存した。【００１４】  試験に供した細菌株の一覧表を表１に示した。一部の菌株を除き全て野生株を用いた。図１に示した処理方法により、これらの菌株からＤＮＡを抽出した。即ち、０．５ｍＬ用マイクロチューブに２００μＬの滅菌蒸留水を分注し、予めＴＳＡ寒天培地に純培養した細菌集落の１／３白菌耳を懸濁した。１００℃、１０分間煮沸するかヒートブロックで加熱したのち、１２，０００ｒｐｍ×３分間遠心分離した上清２．５μＬを粗ＤＮＡ溶液として試験に供した。
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【００１５】  各プライマー対の至適アニーリング温度範囲を測定した。ＰＣＲ反応液は、至適ｐＨを維持するためのＰＣＲ緩衝液、耐熱性ポリメラーゼ、プライマー対、４種のヌクレオチドおよび標的粗ＤＮＡ溶液から構成される。最終的にＭ−ＰＣＲを目的とするため、本発明におけるポリメラーゼは、硫酸アンモニウムと塩化カリウムとをＰＣＲ緩衝液に使用することで高度な特異性が期待できるホットスタータックマスターミックスキット（キアゲン）を用いた。メーカー手順書に沿ってマスターミックスを調製し（終濃度塩化マグネシウム：１．５ｍＭ，ｄＮＴＰ：２００μＭ，その他の試薬組成未公表）、プライマー対濃度を最終０．４μＭに統一して挿入し、最後に標的ＤＮＡ溶液２．５μＬを入れて最終反応液量２５μＬで反応させた。ＰＣＲ装置は、グラジエント式サーマルサイクラー（ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて、９５℃×１５ｍｉｎの前熱変性（ホットスタート用ポリメラーゼの活性化に必要）の後、９５℃×３０ｓｅｃの熱変性と４５．０−７０．０のグラジエントなアニーリング温度での反応（４５ｓｅｃ）を３５回繰り返し、７２．０℃×７ｍｉｎの後伸長反応を行った。グラジエント温度の詳細は４５．０、４６．８、４９．８、５４．１、６０．６、６５．２、６８．２、７０．０℃である。【００１６】  増幅産物は、終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように臭化エチジウムを添加した２％アガロースゲル（アガロースＬ０３，宝酒造）を用いて、１×ＴＡＥ溶液により１００Ｖ、３５ｍｉｎ電気泳動した。この成績において、明確なバンドを形成する温度範囲を各プライマー対の至適アニーリング温度範囲とした（図２）。【００１７】  測定したプライマー対は、用途とプライマー対数を考慮に入れて、大腸菌用、サルモネラ赤痢菌用、ビブリオ属菌用、キャンピロバクター・ウェルシュ菌用および黄色ブドウ球菌用にグループ化し、それぞれのマスターミックスの作製を試みた。各プライマー対は１００μＭの保存溶液を適宜希釈混合して各々１０μＭの試作混合液を調製し、最終濃度０．４μＭで試験に供した。
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【００１８】  大腸菌用マスターミックス（以下「ＥＣＭＸ」。）は、ｍａｌＢ遺伝子検出用プライマー対Ｅｃｏ−１＆Ｅｃｏ−２（以下「ｐＥｃｏ」。）、志賀毒素様毒素ＳＬＴ遺伝子検出用プライマー対ｍＭＫ２−１＆ｍＭＫ２−２（以下「ｐｍＭＫ」。）、毒素原性大腸菌易熱性毒素ＬＴ遺伝子検出用プライマー対ＬＴ−１１＆ＬＴ−２（以下「ｐＬＴ」。）、毒素原性大腸菌耐熱性毒素ＳＴ遺伝子検出用プライマー対ＳＴ１ａ−ｓ＆ＳＴ１ａ−ａｓ＆ＳＴ１ｂ−ｓ＆ＳＴ１ｂ−ａｓ（以下「ｐＳＴ」。）、およびｉｎｖＥ遺伝子検出用プライマー対Ｉ−１＆Ｉ−５１（以下「ｐＩ」。）が含まれる（表２）。
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【００１９】  サルモネラ赤痢菌用マスターミックス（以下「ＳＳＭＸ」。）は、ｄＨ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ遺伝子検出用プライマー対ＳＴ３＆ＳＴ４（以下「ｐＳＴ」。）、ｉｎｖＡ遺伝子検出用プライマー対ｓａｌｍ３＆ｓａｌｍ４（以下「ｐｓａｌｍ」。）、ｈｉｌＡ遺伝子検出用プライマー対ＨＩＬＡ２−Ｆ＆ＨＩＬＡ２−Ｒ（以下「ｐＨＩＬＡ」。）、ｉｐａＨ遺伝子検出用プライマー対Ｓｈｉ−１＆Ｓｈｉ−２（以下「ｐＳｈｉ」。）、およびｉｎｖＥ遺伝子検出用プライマー対Ｉ−１＆Ｉ−５１（以下「ｐＩ」。）、ｖｉｒＡ遺伝子検出用プライマー対ｖｉｒＡ−ｆ＆ｖｉｒＡ−ｒ（以下「ｐｖｉｒＡ」。）が含まれる（表２）。【００２０】  ビブリオ属菌用マスターミックス（以下「ＶＩＢＭＸ」。）は、ｃｔｘ遺伝子検出用プライマー対ＣＴ１＆ＣＴ２（以下「ｐＣＴ」。）、ｃｔｘ遺伝子検出用プライマー対ＶＣ−１＆ＶＣ−２（以下「ｐＶＣ」。）、耐熱性溶血毒素ＴＤＨ遺伝子検出用プライマー対ＴＤＨ−１＆ＴＤＨ−２（以下「ｐＴＤＨ」。）、ＴｏｘＲ遺伝子検出用プライマー対ＴｏｘＲ３３９−１＆ＴｏｘＲ３３９−２（以下「ｐＴｏｘＲ」。）、およびｃｙｔｏｔｏｘｉｎ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ遺伝子検出用プライマー対ＶＶｐ１＆ＶＶｐ２（以下「ｐＶＶｐ」。）が含まれる（表２）。【００２１】  キャンピロバクター・ウェルシュ菌用マスターミックス（以下「ＣＣＷＭＸ」。）は、１６ＳｒＲＮＡ検出用プライマー対Ｃ−ｃ＆ｊ−Ｆ＆Ｃ−ｃ＆ｊ−Ｒ（以下「ｐＣ−ｃ＆ｊ」。）、ｈｉｐｐｕｒｉｃａｓｅ遺伝子検出用プライマー対ＣＪ−ＨＩＰ−Ｆ＆ＣＪ−ＨＩＰ−Ｒ（以下「ｐＨＩＰ」。）、Ｃ．Ｃｏｌｉ（ＮＣＴＣ１１３６６Ｔ株）オープンリーディングフレームＯＲＦ検出用プライマー対ＣＣ１８−Ｆ＆ＣＣ１８−Ｒ（以下「ｐＣＣ」。）、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＣ遺伝子検出用プライマー対ＰＬ３＆ＰＬ７（以下「ｐＰＬ」。）、およびｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ遺伝子検出用プライマー対Ｐ１４５＆Ｐ１４６（以下「ｐＰ」。）が含まれる（表２）。【００２２】  リステリア・エルシニア・セレウス菌用マスターミックス（以下「ＬＹＢＭＸ」。）は、ｉａｐ遺伝子検出用プライマー対ＭＯＮＯＡ＆ＬＩＳ１Ｂ（以下「ｐＬｍ１」。）、ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ  Ｏ遺伝子検出用プライマー対ＬＬ５＆ＬＬ４（以下「ｐＬｍ２」。）、ａｉｌ遺伝子検出用プライマー対Ｙｅ１＆Ｙｅ２（以下「ｐＹｅ」。）、ｉｎｖ遺伝子検出用プライマー対ＹＰ−３＆ＹＰ−４（以下「ｐＹｐ」。）、ｈｅｍｏｌｙｓｉｎＢＬ遺伝子検出用プライマー対ＨＥＬ−Ｆ＆ＨＥＬ−Ｒ（以下「ｐＨＥＬ」。）、ｃｅｒｅｏｌｙｓｉｎ  ＡＢ遺伝子検出用プライマー対ＣＥＬ−Ｆ＆ＣＥＬ−Ｒ（以下「ｐＣＥＬ」。）、およびｈｅｍｏｌｙｓｉｎ遺伝子検出用プライマー対ＢＣ−１＆ＢＣ−２（以下「ｐＢｃ」。）が含まれる（表３）。【００２３】  黄色ブドウ球菌用マスターミックス（以下「ＳＡＭＸ」。）は、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＡ遺伝子検出用プライマー対ＧＳＥＡＲ−１＆ＧＳＥＡＲ−２（以下「ｐＧＳＥＡＲ」。）、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ遺伝子検出用プライマー対ＧＳＥＢＲ−１＆ＧＳＥＢＲ−２（以下「ｐＧＳＥＢＲ」。）、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＣ遺伝子検出用��ライマー対ＧＳＥＣＲ−１＆ＧＳＥＣＲ−２（以下「ｐＧＳＥＣＲ」。）、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＤ遺伝子検出用プライマー対ＧＳＥＤＲ−１＆ＧＳＥＤＲＦ−２（以下「ｐＧＳＥＤＲ」。）、及びｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＥ遺伝子検出用プライマー対ＧＳＥＥＲ−１＆ＧＳＥＥＲ−２（以下「ｐＧＳＥＥＲ」。）が含まれる（表３）。【００２４】  ポツリヌス菌用マスターミックス（以下「ＣＢＭＸ」。）は、ＢｏｎＴＡ遺伝子検出用プライマー対ＣＢＭＬＡ１＆ＣＢＭＬＡ２（以下「ｐＣＢＭＬＡ」。）、ＢｏｎＴＢ遺伝子検出用プライマー対ＣＢＭＬＢ１＆ＣＢＭＬＢ２（以下「ｐＣＢＭＬＢ」。）、ＢｏｎＴＥ遺伝子検出用プライマー対ＣＢＭＬＥ１＆ＣＢＭＬＥ２（以下「ｐＣＢＭＬＥ」。）、ＢｏｎＴＦ遺伝子検出用プライマー対ＣＢＭＬＦ１＆ＣＢＭＬＦ２（以下「ｐＣＢＭＬＦ」。）、ＢｏｎＴＡ遺伝子検出用プライマー対ＡＳ１１＆ＡＳ−２２（以下「ｐＡＳ」。）、ＢｏｎＴＢ遺伝子検出用プライマー対ＢＳ−１１＆ＢＳ−２２（以下「ｐＢＳ」。）、ＢｏｎＴＣ遺伝子検出用プライマー対ＣＳ−１１＆ＣＳ−２２（以下「ｐＣＳ」。）、ＢｏｎＴＤ遺伝子検出用プライマー対ＤＳ−１１＆ＤＳ−２２（以下「ｐＤＳ」。）、ＢｏｎＴＥ遺伝子検出用プライマー対ＥＳ−１１＆ＥＳ−２２（以下「ｐＥＳ」。）、およびＢｏｎＴＦ遺伝子検出用プライマー対ＦＳ−１１＆ＦＳ−２２（以下「ｐＦＳ」。）が含まれる（表３）。【００２５】  以上のマスターミックス群を用いて、表１の菌株について、ＰＣＲを実施した。この成績により、プライマー対同士の競合作用が認められる場合は、増幅されるべきバンドが消失したり、薄く反応して増幅効率に影響が認められ、そうでない場合は明瞭なバンドが形成される。ここで、図３に示したフローに沿って最適濃度比を決定するために競合ＰＣＲを次により実施した。競合しないプライマー対群はそのままの条件を用い、競合するプライマー対群には影響される側のプライマー濃度を１とし、影響する側のプライマー対を２倍段階希釈したプライマー溶液を６列作製して、コンペティティブに反応させる。その成績により、両者プライマー対の最適濃度比を決定し、最終的にミックスプライマーの濃度比を決定した。【００２６】  ＥＣＭＸにおいてｐＥｃｏは他の４種全てと競合作用を示した。成績（図４）により決定した各プライマー対の濃度比はｐｍＭＫ：ｐＬＴ：ｐＳＴ：ｐＩ：ｐＥｃｏ＝２：１：２：１：４（プライマー対最終濃度は各々０．２μＭ：０．１μＭ：０．２μＭ：０．１μＭ：０．４μＭ）であった（表２）。【００２７】  ＳＳＭＸでは、ｐＳＡＬとｐＨＩＬＡがそれぞれ競合作用を示した。成績（図４）により決定した各プライマー対の濃度比はｐＳＴ：ｐＳＡＬ：ｐＨＩＬＡ：ｐＳｈｉ：ｐＩ：ｐｖｉｒＡ＝２：１：２：２：２：１（プライマー対最終濃度は各々０．４μＭ：０．２μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．２μＭ）であった（表２）。【００２８】  ＶＩＢＭＸでは、ｐＴｏｘＲとｐＴＤＨおよびｐＶＶｐが競合作用を示した。成績（図４）により決定した各プライマー対の濃度比はｐＣＴ：ｐＶＣ：ｐＴｏｘＲ：ｐＴＤＨ：ｐＶＶｐ＝４：２：４：１：１（プライマー対最終濃度は各々０．４μＭ：０．２��Ｍ：０．４μＭ．０．１μＭ：０．１μＭ）であった（表２）。【００２９】  ＣＣＷＭＸでは、ｐＣ−ｃ＆ｊとｐＨＩＰおよびｐＣＣが、それぞれ競合作用を示した（図４）。成績により決定した各プライマー対の濃度比は、ｐＰＬ：ｐＰ：ｐＣ−ｃ＆ｊ：ｐＨＩＰ：ｐＣＣ＝４：４：４：４：１（プライマー対最終濃度は各々０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．１μＭ）であった（表２）。【００３０】  ＬＹＢＭＸでは、ｐＨＥＬとｐＣＥＬおよびｐＢＣに競合作用が認められた。成績（図４）により決定した各プライマー対の最終濃度比は、ｐＬｍ１：ｐＬｍ２：ｐＹｅ：ｐＹｐ：ｐＨＥＬ：ｐＣＥＬ：ｐＢｃ＝４：４：４：４：４：２：１（プライマー対最終濃度は各々０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．２μＭ：０．１μＭ）であった（表３）。【００３０】  ＳＡＭＸは、既製のＭ−ＰＣＲ用プライマーであり、文献から引用した濃度比により目的のバンドが良好に増幅された。決定した各プライマー対の濃度比は、ｐＧＳＥＡＲ：ｐＧＳＥＢＲ：ｐＧＳＥＣＲ：ｐＧＳＥＤＲ：ｐＧＳＥＥＲ＝１：１：１：１：１（プライマー対最終濃度は各々０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ）であった（表３）。【００３１】  ＣＢＭＸは、既製のＭ−ＰＣＲ用プライマーであり、ｐＣＢＭＬＡを除き、文献から引用した濃度比により目的のバンドが良好に増幅された。ｐＣＢＭＬＡでは７８２ｂｐのバンドが増幅されるはずであったがｐＣＢＭＬＢと同じ２０５ｂｐ程度のバンドが検出された。したがって、同様にボツリヌス神経毒を対象としている別のＭ−ＰＣＲでデザインされたプライマーと組み合わせて使用することにした。決定した各プライマー対の最終濃度比は、ｐＣＢＭＬＡ：ｐＣＢＭＬＢ：ｐＣＢＭＬＥ：ｐＣＢＭＬＦ：ｐＡＳ：ｐＢＳ：ｐＣＳ：ｐＤＳ：ｐＥＳ：ｐＦＳ＝１：１：１：１：１：１：１：１：１（プライマー最終濃度は各々０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ：０．４μＭ）であった（表２）。【００３２】  以上の方法で調製したプライマー対溶液を、無菌およびＤＮＡａｓｅフリーのディスポーサブルチューブに分注し、乾燥させることを試みた。合成プライマーは全て保存溶液が２００μＭとなるように調製した。これらの保存溶液を用いて、各種マスターミックスを、前述の濃度比で０．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬ調製した。即ち、ＥＣＭＸはｐｍＭＫ原液、ｐＬＴ原液、ｐＳＴ原液、ｐＩ原液、およびｐＥｃｏ原液の各々２．５μＬ、０．６２５μＬ、２．５μＬ、０．６２５μＬおよび５μＬずつを０．５ｍＬマイクロチューブに入れ滅菌蒸留水で１００μＬとした。同様にＳＳＭＸ、ＶＩＢＭＸ、ＣＣＷＭＸ、およびＳＡＭＸを調製した。これらのマスターミックスを滅菌済み８連チューブ用分割リザーバー（Ｂ−０８１７−１，ビーエ厶機器）にその順番で注入し、第８番目の分割容器にはＤＷを１００μＬ注入した。これらをよく混釈した後、８連マイクロピペットを用いて、各々の分割容器から１μＬをキャップ付き８連チューブに分注し、濃縮乾燥機（マイクロ遠心エバポレーター、旭テクノグラス）を用いて、６０℃で３時間程度���理して完全に乾燥させた。これを食中毒起因細菌一括検出試薬とした。
【実施例１】
【００３３】  食中毒起因細菌一括検出試薬を使用して特異性を確認した。耐熱性ポリメラーゼは、高度な特異性が期待でき、簡便な操作で準備できるホットスタータックマスターミックスキット（キアゲン）を用いた。メーカー手順書に沿ってマスターミックスを調製し（終濃度塩化マグネシウム：１．５ｍＭ，ｄＮＴＰ：２００μＭ，その他の試薬組成未公表）、無菌的に、食中毒起因細菌一括検出試薬にチューブ当たり２２．５μＬずつ分注した。最後に表１で準備した標的ＤＮＡ溶液２．５μＬを株番号の順番で各々のマスターミックスに対応するように入れて反応させた。サーマルサイクラーの温度条件は、９５℃×１５ｍｉｎの前熱変性（ホットスタート用ポリメラーゼの活性化に必要）の後、９５℃×３０ｓｅｃの熱変性、５５．０℃×３０ｓｅｃのアニーリング、７２℃×３０ｓｅｃの伸長反応を３５回繰り返し、７２．０℃×７ｍｉｎの後伸長反応を行った。増幅産物は、マスターミックス毎に株番号の順番で泳動した。電気泳動は終濃度０．５μｇ／ｍＬとなるように臭化エチジウムを添加した２％アガロースゲル（アガロースＬ０３，宝酒造株式会社）を用いて、１×ＴＡＥ溶液により１００Ｖ、２５ｍｉｎ行った。【００３４】  成績を図５〜１０に示した。
ＥＣＯＭＸにより非病原性大腸菌（株番号ＥＣ１−７）、腸管毒素原性大腸菌（株番号ＥＣ３＆４）、腸管侵入性大腸菌（株番号ＥＣ５＆６）および腸管出血性大腸菌（株番号ＥＣ７＆８）を明確に分別することが可能となった。ＳＳＭＸによりチフス菌（株番号ＳＳ１＆２）、赤痢菌（株番号ＳＳ３，４，５＆６）、サルモネラ属菌（株番号ＳＳ７＆８）を明確に分別することが可能となった。ＶＩＢＭＸによりコレラ菌（株番号ＶＩＢ１＆２）、耐熱性毒素産生性腸炎ビブリオ（株番号ＶＩＢ３＆４）、耐熱性毒素非産生性腸炎ビブリオ（株番号ＶＩＢ５＆６）およびビブリオバルニフィカス（株番号ＶＩＢ７＆８）を明確に分別することが可能となった。ＣＣＷＭＸにより毒素産生性ウェルシュ菌（株番号ＣＣＷ１＆２）、毒素非産生性ウェルシュ菌（株番号ＣＣＷ３＆４）、キャンピロバクタージェジュニ（株番号ＣＣＷ５＆６）およびキャンピロバクターコリ（株番号ＣＣＷ７＆８）を明確に分別することが可能となった。ＬＹＢＭＸによりリステリアモノサイトゲネス（株番号ＬＹＢ１＆２）、エルシニアエンテロコリティカ（株番号ＬＹＢ３，４＆５）、エルシニアシュードチュベクローシス（株番号ＬＹＢ６）およびセレウス菌（株番号ＬＹＢ７＆８）を明確に分別することが可能となった。ＳＡＭＸによりエンテロトキシンＡ陽性株（株番号ＳＡ１）、エンテロトキシンＡ＆Ｂ陽性株（株番号ＳＡ２）、エンテロトキシンＢ陽性株（株番号ＳＡ３＆７）、エンテロトキシンＣ陽性株（株番号ＳＡ５，６＆８）およびエンテロトキシンＤ陽性株（株番号ＳＡ４）を明確に分別することが可能となった。ＣＢＭＸによりニューロトキシンＡ陽性株（株番号ＣＢ１＆４）、ニューロトキシンＢ陽性株（株番号ＣＢ２）およびエンテロトキシンＥ陽性株（株番号ＣＢ３）を明確に分別することが可能となった。【００３５】  以上の試験は模擬的に実施したものであるが、実際は１セットの食中毒起因細菌検出試薬により１検体をスクリーニングするのに用いられるため、以上の株の内どれかのバンド形態をもって検出されることになる。このことにより、１セットの食中毒起因細菌検出試薬を用いた１８細菌種の一括検出が可能となる。
【発明の効果】
【００３６】  本発明により次の効果が得られた。
▲１▼以上のように、請求項１記載の発明によれば、複数種類の病原細菌を対象として、プライマー対設計並びに特異性証明に必要な時間、労力および経費を節減することができる。
▲２▼請求項２，請求項３および請求項４記載の発明によれば、精度管理に有効なマルチプレックスＰＣＲ法を利用した簡便、迅速かつ安価な一括検出方法および試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ検査フローを示す図である。
【図２】選抜プライマーグラジエント成績一覧を示す写真である。
【図３】競合ＰＣＲ検査フローを示す図である。
【図４】プライマー対同士の競合作用を示す写真である。
【図５】ＥＣＯＭＸによる大腸菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図６】ＳＳＭＸによるサルモネラ属菌株と赤痢菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図７】ＶＩＢＭＸによるビブリオ属菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図８】ＣＣＷＭＸによるカンピロバクター属菌株およびウェルシュ菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図９】ＳＡＭＸによる黄色ブドウ球菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図１０】ＬＹＢＭＸによるリステリアモノサイトゲネス、エルシニアエンテロコリティカ、エルシニアシュードチュベクローシスおよびセレウス菌の一括検出成績とＣＢＭＸによるボツリヌス菌株の一括検出成績を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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