(57)【要約】      （修正有）【課題】“異常プログラミング疾患”と称する癌及びエイズを含む一定の疾患を治療するのに有用な方法及び組成物の提供。【解決手段】１つの側面によれば、異常プログラミング疾患を有する個体を治療する方法であって、発現ベクター、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド、及びアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれる有効量の組成物を前記個体に投与することを含み、前記組成物は転写調節因子の発現を調節することができ、前記転写調節因子は該異常プログラミング細胞によって発現されかつリプログラミング試験において前記細胞行動に治療的に有用な変化をもたらすことによって更に特徴付けられる方法が提供される。別の態様によれば、新規なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIV感染と関連した転写調節因子の機能を調節するための組成物であって、アンチセンス p53オリゴヌクレオチドをコードする発現ベクター、二本鎖p53オリゴデオキシヌクレオチド、及びp53アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる群から選ばれる有効量の試薬を含み、前記組成物はHIV感染細胞によって発現されるp53の発現を調節することができ、かつリプログラミング試験において前記細胞の行動に治療的に有用な変化をもたらすことによって更に特徴づけられる組成物。
【請求項２】
HIV感染細胞に不利に作用する、有効な核酸組成物を選択する方法であって、アンチセンス p53オリゴヌクレオチドをコードする発現ベクター、p53転写調節因子に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又は該p53転写調節因子のＤＮＡ結合ドメインに対する二本鎖p53オリゴデオキシヌクレオチドと共に、HIV感染細胞及び異常プログラミングを示さない正常細胞を培養して、HIV感染細胞に不利に作用するが正常細胞には不利に作用しない、これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド又は二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを特定することを含む方法。
【請求項３】
１０〜３５塩基を有し、下記の配列からなる群から選ばれる配列及び薬学的に許容できる担体を含む、HIV感染の治療のためのアンチセンスp53オリゴデオキシヌクレオチド組成物。
５’−ＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣ  ＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡ−３’
５’−ＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡ  ＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴ−３’
５’−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣ  ＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣ−３’
５’−ＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣ  ＡＣＡＴＧＧＧＡＧＧ−３’
【請求項４】
生理学的条件下で融点が４０℃に等しいか又はそれより高い請求項３に記載のオリゴデオキシヌクレオチド組成物。
【請求項５】
有効投与量が細胞外液において１ナノモル〜５マイクロモルである請求項１、３および４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、オリゴリボヌクレオチド、ホスホロチオエート主鎖、親油性主鎖、及びＲＮＡ、ＤＮＡ類縁体を含むキメラオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる修飾を含む請求項３に記載のオリゴデオキシヌクレオチド組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、臨床的障害の直接原因が正常では存在しない分化プログラムの一次疾患細胞内での発現である障害の治療に有用な方法及び組成物に関する。以下、かかる疾患を異常プログラミング（ＡＰ）疾患という。本発明は、正常細胞を治療的にリプログラムするのに有用な方法及び組成物にも関する。
【０００２】
以下でより詳細に議論するように、本発明のＡＰ疾患は、新しい疾患として分類されるので、これら疾患の病因については新規な分子モデルが提供される。本発明の分子モデルによれば、ＡＰ疾患における実体の原因となる基礎疾患は、プログラム制御に関与する一定の細胞成分間の特殊なタイプの相関的変化である。それは、これまで明らかにされたあらゆる分子病理メカニズムとは異なるものである。このモデルは、これら疾患の治療法の性質を規定し、治療的に有用な標的の可能なセットを比較的少数の遺伝子に限定し、そしてこれが一定の“正常”遺伝子の操作がＡＰ疾患の治療のための適切なアプローチであるということを包含するという意外な結論に導き、かくして本発明のＡＰ疾患の治療法への独創的なアプローチに導く。このモデルは、提案する治療法についての標的の選択をあらゆる当業者にとって簡単かつ行い易いものにする。
【０００３】
好ましい態様は、転写調節因子（ＴＲ）の操作による細胞行動のリプログラミングに関するものである。本発明は、全身的治療及びかかる治療のための組成物、並びに治療を受ける受容者に細胞を移植する前の該細胞の生体外(in vitro)操作を含む。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
癌治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途に関連するごく最近の研究が、ステイン(Stein) 及びコーエン (Cohen), Cancer Res. 48:2659 (1988)によって纏められている。幾つかのタイプのアンチセンス分子が、特定のタンパク質の合成を阻害するそれらの能力について、両方の無傷細胞及びタンパク質合成のための生体外(in vitro)系を用いてスクリーニングされている（Ld 及び Paoletti, Anti-Cancer Drug Design 2:325, 1988を参照のこと）。例えば、ｍｙｃ遺伝子から転写されたＲＮＡに特異性を有する物質がヒトＡＭＬ株ＨＬ６０（Wickstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1028 (1988)）及び正常Ｔリンパ球（Heikkila, et al., Nature 328:445 (1987)）の増殖を阻害すると報告されており、サイクリンｍＲＮＡに相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが３Ｔ３細胞の分裂を抑制すると報告されている（Jaskulski, et al. 1988）。
【０００５】
より最近では、ｍｙｂに対するＯＤＮでの癌の治療において、正常細胞に対する低度の阻害を伴って白血病細胞の増殖が阻害されたことが見出されている（Calabretta et al, PNAS, 88, 2351, 1991）。また、白血病細胞株における一時的阻害がｍｙｃに対するＯＤＮで生じたが、不運にも正常細胞に対しても匹敵する阻害が起こったことが示されている（Zon らの特許）。この特許は、ウィルス遺伝子を標的にしたＯＤＮを用いるＨＩＶ複製の阻害も開示している。ベレンスカ (Belenska) ら(Science, 250, 997, 1990) は、遺伝子を原因とする疾患の潜在的な治療剤として、ＴＲリガンドに結合している二本鎖ＯＤＮを使用することを提案している。彼らは、一例としてＨＩＶエンハンサーに結合するＮＦ−ｋＢの遮断を示している。アンチセンスオンコ遺伝子を保持するレトロウィルスベクターを癌治療に用いることは既知である。
【０００６】
前述の部分での基本的問題は、これら患者の疾患細胞における特異的な分子異常の発現（内因性遺伝子の調節の変化若しくは突然変異又は外因性遺伝子の発現）が直接にＡＰ疾患の臨床病理学的特徴の原因になっているという考えに基づいていることである。そのような考えからすると、治療的戦略はこれら分子異常を攻撃することに向けられなければならないということになる。
【０００７】
癌の場合、アンチセンス発現ベクターＯＤＮに関連する意図されている治療法は、オンコ遺伝子／アンチオンコ遺伝子癌モデルに従ってオンコ遺伝子に、又はオートクリンモデルに従って癌細胞により発現される成長因子に向けられてきた。エイズの場合、かかる物質に関連する開発中の治療戦略は、ＨＩＶ発現及び／又は感染を遮断することに向けられている。他のＡＰ疾患に対して同定された対応する病因はない。このことから、開発中の治療的アプローチはより経験的なものである。
【０００８】
該ＡＰ疾患モデルによれば、これら障害の臨床病理学的特徴の原因となる基本的病理は、相関的でありかつ動的でもある。先行技術とは際立って対照的に、本発明はＴＲ発現のパターンの操作を含む。本発明は、前記の選択した疾患の治療に全く新たなアプローチを提供し、新規な薬品のデザインに合理的、経験的基礎を提供する。ＯＤＮに関連する正常組織の治療的リプログラミングは前例がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
本発明によれば、ＴＲ発現のパターンを操作することにより治療的効果を得るために、細胞行動をリプログラミングする方法が提供される。
また、ＡＰ疾患を有する個体を治療する方法であって、発現ベクター、二本鎖ＯＤＮ、及びアンチセンスＯＤＮからなる群から選ばれる有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法が提供される。前記組成物は、ＴＲの発現を調節することができるものでなければならない。前記ＴＲはＡＰ細胞によって発現され、本発明のリプログラミング試験（以下でより詳しく説明する）において前記細胞の行動に治療的に有用な変化をもたらすという事実によって更に特徴付けられる。ＡＰ疾患がエイズである場合、前記ＴＲはＨＩＶによりコードされないことに留意すべきである。癌の場合には、前記ＴＲは本発明の反逆者遺伝子（以下でより詳しく説明する）であって、好ましくはオンコ遺伝子、例えば（変化した形態にある）ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、ｊｕｎを排除する。
【００１０】
本発明のもう一つの態様は、臨床的障害を有する個体を治療する方法であって、二本鎖ＯＤＮ及びアンチセンスＯＤＮからなる群から選ばれる有効量の組成物を前記個体に投与することを含む方法である。該組成物はＴＲの発現を調節することができる。該ＴＲは治療的に関連する細胞により発現され、本発明のリプログラミング試験において前記細胞行動に治療的に有用な変化をもたらすことによって更に特徴付けられる。
【００１１】
ここに明らかにした発明は、主として、細胞行動のリプログラミングに基づく新しいタイプの治療法を具体化する。しかしながら、(1) 疾患細胞内の特定の転写調節因子及びそれらの変異体の発現を分析することによって異常プログラミングを診断すること及び／又は病期を判定すること、及び (2) あらゆる所与の異常プログラミング疾患について、個々の患者を治療するのに最適な物質を決定するために試験物質を生体外(in vitro)で使用することを含む追加の発明にも関する。
【００１２】
かくして、ＡＰ患者のＡＰ細胞により発現されるＴＲの関連するサブセットを同定することを含むＡＰ疾患の診断又は病期の判定の方法が提供される。ＡＰ疾患の最も有効な治療養生法を選択する方法は他の態様を形作る。この態様は、ＡＰ患者のＡＰ細胞により発現されるＴＲの関連するサブセットを同定することを含む。これら態様は、以下でより詳しく説明する。
【００１３】
加えて、本発明は、臨床的障害を有する個体からの治療的に関連する細胞を、該細胞を該個体内に移植して戻す前に治療する方法（自家移植態様）を提供する。この態様は、以下の段階を含む。
ａ）該個体から治療的に関連する細胞を得る段階、及び
ｂ）該治療的に関連する細胞を、リプログラミング量の、ＴＲ調節遺伝子から転写されたＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＯＤＮ又はＴＲ細胞内に存在する転写調節因子の二本鎖ＯＤＮリガンドに曝す段階。好ましい態様においては、該細胞を出生前の組織又は治療を受ける個体とは異なるドナーから採取する（同種異系間移植）。
【００１４】
ＡＰ疾患の最も有効な治療養生法の選択は本発明の他の態様を形作る。この方法は、ＡＰ疾患患者からのＡＰ疾患細胞を分離し、ＡＰ患者からのＡＰ細胞により発現されたＴＲの関連サブセットからのＴＲに特異的なアンチセンスＯＤＮ又はかかるＴＲのＤＮＡ結合ドメインへの二本鎖ＯＤＮと共に培養して、最適な治療法を決定することを含む。
【００１５】
本発明のＡＰ疾患治療法を行うには、適当な標的を選択することが重要である。
このことから、本発明の重要な態様は、(i) 異常にプログラムされた組織、対応する正常組織又は構成的に自己更新性の正常組織により発現される転写調節因子のサブセット及びそれらの直接修飾因子を確認すること、又は本発明に従って治療的に操作されるべき他の正常組織について類似の確認をすること； (ii) 治療的にリプログラムされるべき細胞及び適当なコントロール組織からの転写調節因子又はそれらの直接修飾因子の発現を付加又は一部除去すること；(iii) 細胞プログラミングの効果を評価して、該リプログラミング試験に従い可能な治療剤を選択すること； (iv) 該選択した治療剤を用いて（該治療剤が全身用途のためのものであるなら動物モデル系るおいて）特定の転写調節因子の機能の付加又は一部除去の作用を試験すること、及び (v) 該可能な治療剤により生じるおそれのある望ましくない副作用を軽減又は除去することを含む、ＡＰ疾患治療の標的を選択する方法である。この態様は以下で詳しく説明する。
【００１６】
ＯＤＮ結合に差別的に利用できる部位を選択するのに標的ＲＮＡにおける特異的細胞型差異を利用することは本発明の他の態様を形作る。この態様は、特異的ＲＮＡ転写産物の細胞型依存標的設定方法を含む態様であって、該方法は前記ＲＮＡに結合してそれを破壊することのできるＯＤＮを、前記ＲＮＡの破壊によって副作用が生じる組織ではなく、治療的に操作されるべき組織内で選択することを含む。典型的な例は、造血組織においてシクロオキシゲナーゼＲＮＡに選択的に結合して破壊する前記ＲＮＡに向けられたアンチセンスＯＤＮを、消化器組織において前記ＲＮＡを避けながら用いることである。
【００１７】
前述の態様は全て、ＴＲ発現のパターンを操作することにより治療的効果を得るために細胞行動をリプログラムすることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
好ましい態様の説明
ＡＰ疾患モデル及びリスト
“細胞プログラム”の定義
遺伝子発現の細胞型限定パターンの時間をかけて統制された細胞内での外観であって、特定の表現型を提供し、その結果、外因性刺激への可能な細胞応答の範囲の決定を提供するもの。
その基本的プログラムを、環境的及び他の外因性キューへの細胞のサブプログラム応答を順繰りに制御する分化プログラムとして考えることができる。この場合、該サブプログラムは細胞の成育能力（アポプトシス）及び増殖を含む。
【００１９】
“異常プログラミング疾患”の定義
臨床的障害の直接原因が正常では存在しない分化プログラムの一次疾患細胞内での発現である疾患。即ち、異常な組み合わせで特定の分化表現型を提供する正常遺伝子の発現がある。その結果、これら冒された細胞は細胞分化、成育能力及び増殖に関連する病因的行動を発現できるようになる。一次疾患細胞のこれら属性は、それらの組織環境において病的変化を誘発することもできる。
【００２０】
病因論に関する“直接原因”という用語は“危険因子”と区別されるべきである。典型的には、ＡＰ疾患は、種々の組み合わせで該疾患の外観の“原因”になると考えられる多数の危険因子と関係づけられるであろう。しかしながら、事実、それらは、転写調節因子（ＴＲ）発現及び順繰りに該疾患の原因になるクロマチンドメイン利用性のパターンに変化を起こす。これは、プログラムが進化してそれらの誘発に関連するあらゆる危険因子に依存しなくなるので重要である。危険因子には、突然変異誘発、ウィルス、染色体異常、遺伝形質、及び食物摂取が含まれる。
【００２１】
異常プログラミング疾患は、増殖性又は発育不全性（変性）疾患又はそれら両方の組み合わせのいずれかとして現れ得る。
異常プログラム表現型を発現する疾患の例は以下の通りである。
癌
骨髄増殖性疾患
−  一次性赤血球増加症
−  病因不明骨髄化生
−  本態性血小板血症
脊髄形成異常症
−  治療抵抗性貧血症
−  環状担鉄芽球を有する治療抵抗性貧血症
−  過剰芽球を有する治療抵抗性貧血症
−  過渡期にある過剰芽球を有する治療抵抗性貧血症
アテローム硬化症
エイズ関連症候群
エイズ
【００２２】
分子モデル
本明細書に記載する分子モデルによれば、ＡＰ疾患における実体の原因となる基礎疾患は、プログラム制御に関与する一定の細胞成分間の特殊なタイプの相関的変化である。それは、これまで明らかにされたあらゆる分子病理メカニズムとは異なるものである。このモデルは、これら疾患の新規な治療法の性質を規定し、治療的に有用な標的の可能なセットを比較的少数の遺伝子に限定し、そして一定の“正常”遺伝子の操作がＡＰ疾患の治療のための適切なアプローチであるという意外な結論に導き、このようにして、このモデルは、提案した治療法の実施化をあらゆる当業者にとって簡単かつ行い易いものにする。
【００２３】
具体的には、ＡＰ疾患における本質的な分子病理学は、ＴＲ発現及び／又は転写のためのクロマチンドメイン利用性の相互依存パターンの変化からなる。これら相関的変化は引き続き、細胞分化に関連する病的な異常細胞プラグラムの発現を与える。ドメイン状態の制御と関係する特定のＴＲ又は一定の分子が構造的に異常であるのかも知れない。しかしながら、必ずしも治療的介入に有用な標的があるとは限らない。
【００２４】
具体的治療法の開発に関連するモデルの教義：
Ａ）正常及び異常プログラミング両方に当てはまる教義：
１）ドメイン利用性のパターンは、細胞内で発現され得る遺伝子の可能な範囲を決定し、従って、発現され得る細胞プログラムの範囲を限定する。
２）ＴＲ発現のパターンは、プログラミングコードの分子相応物である。言語と類比して、単位（単語）として働くＴＲ（文字）の特定の組み合わせは、統制された様式で遺伝子セットの発現を調節すると共に、所与の細胞内で使用されるＴＲの組み合わせの全セット（センテンス）は、該細胞がいずれの可能な表現型を発現するかを決定し、従って、該細胞の分化プログラムの全体的な特徴を決定する（より詳しくは一例として癌を用いている表Ｉを参照のこと）。
３）生体全体の細胞分化の制御に関連するＴＲの全体数のうち１つのサブセットが所与の細胞型内で発現されるだけなのでそれらの数はほんの少しである。
４）遺伝子発現の特定のパターン（プログラミング）への類似の作用がＴＲの２以上の具体的組み合わせにより得られる（同義語）。
５）発現される特定のＴＲの具体的な機能的結果は前後依存性である。即ち、細胞プログラミングに関するその作用は、特定の遺伝子セットを調節するのに他のどのＴＲと組み合わさるか（どのような単語を表すか）及び該細胞により発現される異なるＴＲの組み合わせの全体セット（センテンス）に依存する。
【００２５】
Ｂ）正常細胞ではなくＡＰ細胞に当てはまる教義：
１）ＡＰ細胞に見られるＴＲの組み合わせは、正常細胞に見られるものとは異なっている（そのセンテンスはいずれの正常細胞によっても発現されない）。
２）従って、ＡＰ細胞内で発現される所与の特定のＴＲの具体的な機能的結果は、正常細胞に見られる結果と異なるであろう。
３）従って、ＡＰ細胞はあらゆる正常な分化プログラムとは異なる細胞分化プログラムを発現する。その結果、ＡＰ細胞は、それらの変化した分化、成育能力及び増殖特性から生じる病的行動を発現する。
４）このことから、正常細胞内における所与のＴＲの発現を、異常にプログラムされた細胞と同等に操作すると、細胞行動に差別的な効果をもたらし得る。これは治療的介入の基礎を形成し得る。
５）ＡＰ細胞により発現されるＴＲのサブセットは、対応する正常細胞によっては発現されないＴＲを含むと考えられ、及び／又はその逆の場合も考えられる。ＡＰ細胞内のこれらＴＲは、異所的に発現されたか又は修飾されたか（互い違いのスプライシングプロモーターの使用又は翻訳後修飾）又は変化した結合特性を有するＴＲに突然変異した正常ＴＲであろう。
【００２６】
標的の性質
ＴＲは該モデルに基づく治療的操作のための一次標的である。それらを直接に又はチロシンキナーゼの如き分子を介して間接に操作してもよく、リン酸化の如き構造的変換によりＴＲを１つのタイプから他のタイプに変化させることができる。
【００２７】
治療的介入の性質
この新規な治療法の基礎は、ＴＲ発現のパターンを変えることによってＡＰ細胞における遺伝子発現のパターンを差別的に変化させることである。該モデルは、あらゆる所与のＴＲの発現の具体的な機能的結果が前後依存性であることを明瞭に示す。従って、正常細胞及びＡＰ細胞の両方に存在する同一のＴＲを同じように操作しても細胞行動に関して異なる効果を得ることができるといえる。しかしながら、ＡＰ細胞によってのみ発現されるＴＲを標的にしてもよい。その結果、ＡＰ細胞における遺伝子発現のパターンは、最終的にそれらの疾患発生活性の少なくとも実質的な部分を失うことになる。これは、ＡＰ細胞の死滅、疾患発生因子産生における付随的変化又は増殖能力の喪失を伴うそれらの分化状態における変化を含む多数の可能な様式で現れ得る。
【００２８】
あらゆる所与の細胞型内で操作されることとなる転写調節因子の数は非常に少ないであろう。３×１０9ｂｐのＤＮＡに分布するヒトゲノム内に３０,０００〜１００,０００遺伝子があると見積もられる。あらゆる所与の細胞型において、約１０,０００遺伝子が発現されることを示すことができる。これらの９０％以上は多くの細胞型により発現され、これらの大部分は“ハウスキーピング遺伝子”といわれる。
【００２９】
典型的には、あらゆる所与の細胞型において差別的に発現されることが示され得る遺伝子の数は数百に過ぎないと考えられる。例えば、肝細胞と脳細胞の違いはこれら遺伝子が作っている。これらの大部分は、細胞型を特徴付ける機能を果たすのに関与している。例えば、肝細胞は身体から多くのタイプの化学物質を除去するのに関与する広範囲の酵素を発現する。本特許にとって興味の対象である遺伝子は、細胞型特異性遺伝子の分化調節に関与する分子をコードする遺伝子の小さなサブセットである。特に、転写調節因子及びそれらの直接修飾因子である。
後者には、例えば、特定の転写調節因子を修飾し、実際上、それを機能的に異なる転写調節因子に変化させることのできる一定のチロシンキナーゼが含まれる (Berk Biochem Biophys. Ann. 1009, 103, 1989) 。本発明においては、転写調節因子は、異なる遺伝子により幾通りにも発現される特異的ＤＮＡ配列に及び／又はその少なくとも１つが特異的ＤＮＡ配列に結合しなければならない他の転写調節因子に結合する分子として定義される。その結果、それらはＲＮＡポリメラーゼ活性を調節することにより遺伝子発現のレベルを制御する。該転写調節因子は、その起源が内因性であっても外因性であってもよい。それらは天然のものでも突然変異されていてもよい。
【００３０】
転写調節因子の互いに幾通りにも相互作用する能力は、組み合わせ調節系の基礎を与える。これは、非常に少数の転写調節因子が多数の遺伝子の多様なパターンでの発現を制御するのを可能にする。特定の遺伝子のセットが、細胞により発現される転写調節因子の一定のサブセットによって制御される。従って、それぞれの転写調節因子サブセットは、特定の遺伝子セットの発現を指示するプログラミングコード又は指令又は“単語”である。所与の細胞型により発現される遺伝子発現の全体パターンは、一定の単語だけが一緒に現れるので、センテンスと考えることができる。
【００３１】
真核性遺伝子発現に関連する組み合わせ調節のための一般的役割はこれまで幾つかの研究により仮定されている (Scherrer, and Marcand J. Cell Phys 72,
181, 1968; Scherrer Adv. Esp. Med. Biol. 44, 169, 1924; Gierer Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 38; 951, 1973; Stubblefield J. Theor Biol 118, 129, 1986, Bodnar J. Theor Biol 132, 479, 1988）。リン(Lin) 及びリッグス(Riggs) (Cell 4, 107, 1975) は、生物物理的議論を用いて、真核細胞内の各遺伝子全てに別々の調節因子を有することが不可能であることを証明した。真核性遺伝子発現の組み合わせ調節モデルは転写に加えて複数のレベルの調節を一般的に仮定する。原則的には、これらモデルは、そのうちの小さなサブセットが本明細書で定義したレベルにおいて転写調節因子として働くに過ぎないたった５０ほどの調節分子によりどのようにして理論的に１０0,０００遺伝子を選択的に制御できるかを示している。Bodnar J. Theor Biol 132, 479, 1988 。
【００３２】
ヒト転写調節因子の現実の数は、およそ１００以上のオーダーの数と見積もられる。（文献に記載された数を表ＩＩに列挙している。）しかしながら、多くは一定の細胞型においてのみ発現されることが知られている。ちょうど数百の遺伝子が個々の分化した細胞型間の違いを決定し、これらの大部分が該細胞の特定の機能的特徴を決定し、これらのごく少数だけが調節因子遺伝子産物であり得る。
【００３３】
従って、あらゆる所与の適用について本発明により明記された効果を得るために操作しなければならない調節因子の数は少なく、比較的少ない努力で扱うことができるといえる。また、組み合わせ調節の観念から、所与の細胞型により発現される転写調節因子全てが本発明が実施される以前に必ずしも既知であることを要しないということもいえる。
【００３４】
本発明者は、アンチセンスｐ５３オリゴヌクレオチドが幹細胞自己更新の遮断を含む原発性ヒト白血病芽球の増殖を阻害し、最終的にそれを死滅させることができると共に、新鮮な正常骨髄細胞には類似の作用をもたらさないことを見出した。この意外な結果は、ＡＰ細胞における細胞分化及び増殖及び成育能力に関与する環境情報分子(environmental informational molecules)の検出、解釈及びそれへの応答の相互作用メカニズムがそれらの（シグナル導入及び解釈を包含する）動的相互作用に関して正常な状態から相当に変化しているので、このプロセスに関与するタンパク質をコードする単一の遺伝子又は遺伝子のセットのアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻害が該情報分子の影響を変化させるのに十分である結果、細胞死滅又は成育阻害プログラムの如き細胞プログラミングの変化がＡＰ細胞内で選択的に起こることを示している。“反逆者遺伝子”という用語は、本発明によるアンチセンス分子での阻害の標的にするのに適するＡＰ細胞内の遺伝子を説明するために本明細書で用いている。適する標的又は反逆者遺伝子は、それら自身機能的に異常であっても正常であってもよいが、遺伝子発現の異常パターンの一部として病的表現型ＡＰ細胞を維持するよう機能する。かかる治療により、選択した投与量範囲にわたってＡＰ細胞（それらの正常な等価物ではない）の分化プログラミングがもたらされる。好ましい態様においては、標的とされるべき反逆者遺伝子はＴＲである。
【００３５】
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、骨髄に存在する癌性細胞型を含む因子の数、そのタイプ、及び選択した個々のアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性、及び正常細胞についての該オリゴヌクレオチドの相対毒性に依存して変動してもよい。本発明者は細胞外液中での僅か１ナノモルのオリゴヌクレオチド濃度で有意なＡＰ細胞プログラミングを認めたが、最適な阻害は以下に説明するモデル系において少なくとも１０ナノモルの濃度で認められた。投与量範囲の上限は、毒性及び治療効力により決められるが一般に５マイクロモルを越えることはないだろう。本明細書に記載した技術を使用すれば、当業者は所与の場合において使用すべき最適濃度を決定できる筈である。
【００３６】
実施のための“ハードウェア”
確立された技術、分析法及び薬品を使用すれば、以下の能力が容易に得られる。
当業者ならだれでもこれらを使用して、本発明の主要な態様及び追加の態様を実施することができる。
【００３７】
１）転写調節因子及びそれらの直接修飾因子の分析法
好ましい分析法：ＲＮＡ in situ ハイブリダイゼーション法 (Lum Biotech. 4, 32, 1986) 又はＰＣＲ法 (Block, Biotech. 30, 2735, 1991) 又はタンパク質レベルでの発現を検出するための代謝標識法 (Ausubel et al (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley NY, 1989（半年毎に更新される））。
目的：
特定の細胞型により発現される既知の転写調節因子のサブセット又はそれらの直接修飾因子を確認すること。これは、以下の目的に役立つであろう。
ａ）実施するに際して操作されるべき標的である転写調節因子のサブセット又
はそれらの直接修飾因子の確認；
ｂ）特定の転写調節因子又はその直接修飾因子細胞の発現を付加又は一部除去
するのに潜在的な治療剤の効果の評価；
ｃ）特定の異常プログラム疾患の診断及び／又は病期の判定；
ｄ）所与の疾患に２以上の選択が可能な場合の臨床的実践における最適な治療
剤の決定。
【００３８】
２）治療的に操作されるべき細胞内での特定の転写調節因子又はそれらの直接修
飾因子の発現を付加又は一部除去するための物質。
ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド (Zon, Pharmaceut. Res., 5, 539, 1988)。
この物質は、細胞から特定の遺伝子の発現を一部除去するのに使用することができる。
【００３９】
“試験”アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザイン
ｉ）“オリゴ”(Rychik and Rhoads, Nucl. Acids Res., 17, 8543, 1989)の如きコンピューターブログラムを用いて、えり抜きのＲＮＡ標的に結合する以下の特徴を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのセットを選択する：(1) １０〜３５塩基の長さ、なお一般には２０塩基の長さが用いられる；(2) 生理的条件下で無視し得る自己相互作用（自己二量体及びヘアピン）；(3) 生理的条件下で≧４０℃の溶融温度；及び (4) オリゴヌクレオチドの４０％以下がグアニン又はシトシンの連なりである；
ｉｉ）ジェンバンクの如き資料を用いて、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが他の遺伝子のＲＮＡ転写産物と≦８５％の相同性を有することを確認する。これに対する１つの例外は、配列相同性に基づいて（ホメオボックス遺伝子の如き）転写調節因子ファミリーの２以上のメンバーに結合するその能力に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する場合である。
ｂ）試験アンチセンスオリゴヌクレオチドのセットからの“プロトタイプ治療”アンチセンスオリゴヌクレオチドの確認。これらプロトタイプ化合物は実施するのに用いられるであろう。
ｉ）標準的操作、例えば、ホスホロチオエート (phosphorothioate) を調製するための操作 (Vu et al, Tetrahedron Lett, 32, 3005, 1991) を用いて、試験アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する。
ｉｉ）転写調節因子又はそれらの直接修飾因子の分析法を用いて、治療的に操作されるべき細胞型内での標的遺伝子の発現の禁止に基づき、試験化合物のセットの中からプロトタイプ治療アンチセンスオリゴヌクレオチドを選択する。実際に、種々の細胞型内で標的遺伝子発現を禁止できるプロトタイプ物質の同じセットが、複数の治療目的のために以下の第２段階を実施するに際して使用することができた。
ｂ）１又は２以上の転写調節因子のＤＮＡ結合ドメインのためのリガンドである合成二本鎖オリゴヌクレオチド（Wu et al, Gene, 89, 203, 1990)
実施する際に用いるこのタイプのプロトタイプ治療剤は、ゲル・モービリティ・シフト分析法の如き標準法を用いて転写調節因子がそれに結合することが示されることになる現実の遺伝子配列と一致するであろう。 (Ausubel et al (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley NY, 1989（半年毎に更新される））。
ｃ）発現ベクター
好ましい態様においては、転写調節因子又はその直接修飾因子の全コード配列を保持する組換えウィルス性ベクターが用いられるであろう (Miller and Rosman, Biotech, 7, 980, 1989）。これは、興味の対象である細胞内で調節因子又は修飾因子を発現するであろう。それは、標準法を用いて構築及び試験されるであろう。（Ausubel et al,前記文献）また、該ウィルス性ベクターは、興味の対象である細胞内での標的遺伝子の発現を遮断するために、かかる調節因子又は修飾因子に対する十分に長いアンチセンス配列を保持するであろう。
【００４０】
３）組織の調製
好ましい組織は、一次移植片又は初期継代 (early passaged) 移植片である。それは標準的な外科的操作を用いて得られるであろう。培養及び／又は異種移植のための組織調製は確立されている方法によるであろう。種々の異常プログラム疾患からの障害細胞又はそれらの正常等価物の培養条件については表ＩＩＩに参考文献を掲げている。これら参考文献は、適当な細胞の獲得及び調製に関する情報も提供する。
【００４１】
以下のことを行うための供給源を提供するために使用する。
ａ）特定の細胞型により発現される既知の転写調節因子のサブセット又はそれらの直接修飾因子の確認。
ｂ）追加の発明の実施。即ち、異常プログラム疾患の診断及び病期の判定又は臨床的実践における最適な治療の選択。
ｃ）構成的に自己更新性の３大組織（骨髄、消化器官上皮、及び皮膚）の培養での異常プログラム疾患治療の起こり得る副作用の評価。これら培養は、正常組織の治療的操作を含む幾つかの実施においても用いられるだろう。培養条件は表ＩＶを参照のこと。
ｄ）実施に際して用いられる他の培養及び異種移植。
【００４２】
４）混合種個体群中での正常細胞と悪性細胞の識別。
染色体及び／又は転座特異的変化を検出するための標準的 in situハイブリダイゼーション操作が利用されるであろう。(Trask Trends in Genet. 7, 149, 1991)
【００４３】
５）転写調節因子機能又はそれらの直接修飾因子の操作の細胞プログラミングへ
の効果を評価するための分析法を確立する。
ａ）異常プログラム疾患組織−
これら障害における疾患細胞を確定することにより、特有の臨床病理的特徴をもたらす遺伝子発現の異常パターンを発現させる。これら両方は、確立されている分子及び細胞技術を用いてモニターすることができる。例として挙げた異常プログラム疾患のそれぞれのタイプについて分析されるべき具体的パラメーターを表ＩＩＩに示す。
ｂ）正常組織−
関連するプログラムが分化、増殖及び成育能力である正常細胞行動のリプログラムは、種々の治療的用途に役立ち得る。これらには、次の一定の生体外(in vitro)及び全身治療が含まれるがそれらに限定されない：(1) 移植前の生体外(in vitro)での正常細胞数の拡大；(2) 消化性潰瘍及び炎症性腸疾患の治療における消化器細胞の成長促進；(3) 例えば、ウィルス又は有毒化学物質による肝臓の部分的破壊後の再生；(4) 免疫不全における免疫機能の再構築、骨髄に有毒な物質の作用の阻止及び感染との闘いを含む種々の臨床目的のための１又は２以上の造血細胞系列 (lineages) の拡大。
正常細胞プログラミングのこれら変化全ては、確立されている技術を用いて容易に評価することができる。
【００４４】
Ｂ）実施
段階１）異常にプログラムされた組織、対応する正常組織、及び構成的に自己更新性の正常組織により発現された転写調節因子のサブセット及びそれらの直接修飾因子を確認する。別に、本発明に従って治療的に操作されるべきあらゆる他の正常組織について同様の確認を行う。
【００４５】
段階２）先に詳細に記したように、治療的にリプログラムされるべき細胞及び適当なコントロール組織からの転写調節因子又はそれらの直接修飾因子の発現を付加又は一部除去する。
ａ）付加−特定の転写調節因子又は転写調節因子の直接修飾因子の発現可能な遺伝子を異常にプログラムされた細胞の中に挿入するのに発現ベクターを用いる。挿入された遺伝子は、異常にプログラムされた細胞ではなく対応する正常細胞により発現される遺伝子であろう。
ｂ）一部除去−
ｉ）特定の転写調節因子若しくは直接修飾因子のＲＮＡ又は１若しくは２以上の転写調節因子のＤＮＡ結合ドメインのための二本鎖オリゴヌクレオチドリガンドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより達成することができる。
プロトタイプアンチセンスオリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、リプログラミングにより治療的に操作されるべき異常にプログラムされた細胞又は正常細胞内の特異的転写調節因子の機能を遮断する。また、転写調節因子の直接修飾因子に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。
ｉｉ）特定の転写調節因子又は転写調節因子の直接修飾因子に向けられたアンチセンスＤＮＡを保持する発現ベクターを用いて、異常にプログラムされた細胞内に新たな遺伝子を導入する。その治療効果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって予め確認されるであろう。
【００４６】
段階３）リプログラミング試験：
“実施のためのハードウェア”に記載した方法及び操作を用い、表ＩＩＩ及びＩＶに示した情報を用いて、以下のことを行う。
ａ）治療的にリプログラムされるべき正常細胞又はＡＰ疾患細胞、ＡＰ細胞＋対応する正常細胞及び構成的に自己更新性の正常細胞（消化器官、骨髄、皮膚）について適当な培養条件を用いる；
ｂ）ＡＰ疾患について、表ＩＩＩに示したものの如きＡＰ細胞の１又は２以上の病的特徴を確立されている操作に従って評価する；
ｃ）（ＴＲに対するオリゴヌクレオチド、ＴＲについてのオリゴヌクレオチドリガンド、又は発現ベクターのような）リプログラミング潜在能力を有するプロトタイプ物質で培養液を処理する；
ｄ）プログラミングにおける変化を評価して治療的に有用な物質を選ぶ。例えば、
１）癌、脊髄形成異常症及び脊髄増殖性症候群及びアテローム硬化症−ＡＰ細胞を死滅させる物質；
２）エイズ、ＣＤ４+ リンパ球を再生させる物質；
３）骨髄移植のための正常造血幹細胞を拡大する物質。
【００４７】
段階４）該治療剤が全身用途のためのものである場合は動物モデル系に該選択した  物質を用いて、特定の転写調節因子の機能の付加又は一部除去の効果を試験する。
対応するヒト転写調節因子又はその直接修飾因子と高度の標的相同性が必要なので、該動物は必然的に殆ど常にヒト以外の霊長類になるだろう。
異常プログラム疾患治療用の物質を評価する場合、該動物は該疾患及び治療の効力と文献に記載されている副作用の両方で苦しむか又は該動物自身は正常であって副作用についてのみ試験されるかのいずれかであろう。
【００４８】
段階５）潜在的な治療剤により生じるおそれのあるあらゆる望ましくない副作用は幾つかの可能な方法で軽減又は除去できる。それら全ては現存する技術を用いて行うことができる。
ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド
図１は、特異的ＲＮＡ転写産物上の異なる部位を標的にした特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果における細胞型特異的差異が細胞行動に存在することを明らかにしている。かかる差異は、最小限の望ましくない副作用で望ましい治療効果をもたらすアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択するのに用いることができる。
ｂ）二本鎖オリゴヌクレオチドリガンド
一般に、親和性が異なるとはいえ２以上の転写調節因子が同一の二本鎖ＤＮＡ配列に結合できる。従って、塩基変換を導入することによって、標的転写調節因子の潜在的なセットに関してかかる物質の競合的阻害効果を変化させることが可能である。これらはミス対合を含んでもよい。しかしながら、得られる該２本鎖の溶融温度は生理的条件下で≧４０℃でなくてはならない。従って、かかる変換の効果はより有望な治療指数をもたらすことができる。
ｃ）発現ベクター
発現のレベル及び遺伝子移動の効率は、遺伝子発現を行うために用いるウィルスエンベロープ及び／又はプロモーター／エンハンサーの組み合わせを変化させることによって組織特異性を勘案して容易に調整することができる。
【００４９】
Ｐ５３標的での実例
段階１−
ｐ５３が原発性ヒト白血病芽球により代謝標識法 (Smith et al., J. Exp. Med. 164, 751, 1986)を用いて発現されることは既知である。
【００５０】
段階２−
ｐ５３ＲＮＡに向けられた４つの異なるホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドのセットを、アプライド・バイオシステムズ社（ＡＢＩ）のＤＮＡ合成装置（モデル３８０Ｂ）を用いてメーカーの実験手順に従って調製した。ＨＩＶｒｅｖ遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを負のコントロールとして用いた。その配列を以下の配列表に配列番号：１〜４として記載している。これらを用いて原発性ヒト白血病芽球、正常ヒト骨髄、正常ヒト循環Ｔリンパ球、正常成人消化器官上皮、正常ヒト胎児消化器官上皮及びアカゲザルＴリンパ球を処理した。該アンチセンスｐ５３オリゴヌクレオチドによるｐ５３ＲＮＡの破壊をＰＣＲ及び／又はドットブロット法を用いて証明した。
【００５１】
段階３−
細胞プログラミングに関するアンチセンスｐ５３オリゴヌクレオチドの以下の作用が、得られた結果から明らかになった。
１）それらは、非可逆的に幹細胞の増殖を遮断し、幹細胞自己更新を遮断し、又はヒト癌細胞を死滅させることができる。これは、正常組織への中毒作用を欠くものであって、これらの物質が癌の治療においてある役割を有していることを示すものである。（表Ｖ〜ＶＩＩを参照のこと）。
２）それらは消化器官上皮の増殖を促進する。これは、消化性潰瘍及び炎症性腸疾患の治療におけるある役割を示すものである（図１）。成熟リンパ球（表ＩＸ）増殖へのこれら物質の抑制作用も、自己免疫成分を有する炎症性腸疾患の如き疾患におけるそれらの役割を支持している。
３）該データは、同じ遺伝子のＲＮＡ転写産物上の異なる部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応して細胞型特異的差異が存在することも証明している（図１）。このことは、治療効果を最大にし望ましくない副作用を最小限にするための基礎を提供する。
４）これら結果は、転写調節因子に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、移植を含む種々の医療目的にその後使用できるであろう特定の正常な成人又は胎児の組織を生体外(in vitro)で拡大するのに使用できるという一般原則を支持する（図１）。
５）転写調節因子に向けられた特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の細胞型依存性は、一般的には該細胞プログラムモデル、特に該異常プログラムモデルを支持する。
【００５２】
段階４−
アカゲザルのｐ５３ＲＮＡを認識するアンチセンスｐ５３オリゴヌクレオチドの能力を、アカゲザル及びヒト細胞の両方についての成熟Ｔ細胞増殖への類似の阻害作用を示すことによって証明した（表ＩＸ）。
体重8.９ｋｇ及び6.８ｋｇの２匹のアカゲザルに５2.５ｍｇ及び７5.８ｍｇの放射標識ＯＬ（１）ｐ５３アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：４）を４時間かけて点滴した。げっ歯類のデータと同じく、組織分布分析法により、ｐ５３発現を遮断するのに必要なレベルに匹敵するかなりのオリゴヌクレオチド取り込みがみられた。排泄物を調べた結果、点滴した物質の保持期間は２週間を越えたことが明らかとなった。この間及びその後、毒性の兆候について該動物を幅広くモニターしたが何も見られなかった。
【００５３】
段階５−
許容できない副作用が該アカゲザルに無かったので、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾する必要はなかった。
本発明を実施するために選択するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ステイン及びコーエン, Cancer Res. 48:2569-2668 (1988) に記載されたいずれのタイプであってもよく、未修飾オリゴデオキシヌクレオチド、エチル又はメチルホスホン酸修飾オリゴデオキシヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾オリゴヌクレオチド、ジチオエート、並びにリボザイム (ribozyme) 構造を組み込んだものを含む他のオリゴヌクレオチド類縁体、及びイノブ(Inove) ら, Nucleic Acids Res. 15: 6131 (1987)に記載されたものの如きオリゴリボヌクレオチド；及び複合ＲＮＡ、ＤＮＡ類縁体（Inove, et al, FEBS Lett. 2115: 327 (1987) を含むがそれらに限定されない。親油性主鎖を有するオリゴヌクレオチド、例えば、リボザイム構造を有するメチルホスホン酸類縁体は一定の状況では有益であり得る。
即ち、該親油性構造が腎臓浄化の速度を低下させると共に該リボザイム構造が標的ＲＮＡの開裂を促進するので、これら分子はin vivo でより長い半減期を有することができる。Gerlach, Nature 334: 585 (1988) 。
【００５４】
該オリゴヌクレオチドを医薬組成物に配合して個々の製剤に相応しい治療養生法を用いて投与することができる。以下に更に記載するように、本明細書を用いて、化学療法技術分野における熟練者は、該化合物を含有する多くの好適な組成物のいずれについても適した投与量及び投与スケジュールを導き出せる筈である。かくして、本発明の範囲内の医薬組成物には、患者に許容できない中毒作用を起こさずに癌細胞を死滅させるのに有効な量の活性成分を含有する組成物が含まれる。しかしながら、好ましい投与量は、約１〜約５マイクロモルの有効血中濃度に達するのに十分な投与量を含む。このように好ましい範囲を記載したとはいえ、それぞれのタイプの腫瘍を治療するための有効量は、化学療法剤投与の分野における熟練者によって決定され得る。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物に加えて、本発明の医薬組成物は、該活性化合物を薬学的に使用できる製剤に加工するのを容易にするあらゆる数種の適当な賦形剤及び補助剤を含有することができる。好ましくは、該製剤は非経口投与用にデザインされよう。しかしながら、経口又は直腸投与用にデザインされた組成物も本発明の範囲内に入ると考えられる。好ましい組成物は、約0.１〜約１重量％の活性成分を含むだろう。
【００５６】
非経口投与に適する製剤には、水溶液又は水分散形態にある活性物質の水性溶液剤が含まれる。また、適当な親油性キャリヤー中の活性物質の懸濁剤を投与してもよい。該製剤は粘度を増加させる物質、例えば、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、及び／又はデキストランを含有してもよい。任意に、該製剤は安定剤も含有してもよい。更に、本発明の化合物は、リポソーム中に封入して投与してもよい。該オリゴヌクレオチドは、その溶解性に依り、水性層中及び脂質層中の両方に、又は一般にリポソーム性懸濁液と呼ばれるものの中に存在してもよい。該疎水層は、一般に、レシチン及びスフィンゴミエリンの如きリン脂質、コレステロールの如きステロイド、ジアセチルホスフェート、ステアリルアミン、又はホスファチジン酸の如き多少のイオン性界面活性剤、及び／又は疎水性を有する他の物質を含むが他を排除するものではない。
【００５７】
表  Ｉ
言語との類比
以下の言語との類比は、本特許出願において与えられる臨床上の癌のモデルの重要な性質及び示した標的又は反逆者遺伝子に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療剤として使用するための基本原理を説明するものである。
これが新規であり進歩性を有しそして有用なアプローチであることは明らかな筈である。
取決め：
生物学                                            言語との相応        
主なプログラムが分化、成育能力及び増殖で      単語
ある遺伝子発現（プログラム）の特定のパタ
ーンのための指令
転写調節因子（又は標的又は反逆者遺伝子と      文字
して掲げた他のタイプの調節因子のいずれか）
プログラムされた細胞の死                      無意味な文字の組み合わせ
悪性細胞は対応する正常細胞及び概して正常      悪性細胞は特有の単語を表現する
な細胞とは異なるプログラム指令を有する        
分化の段階が異なる正常細胞は他の細胞型と      異なる正常細胞型はそれら自身の語彙
は異なるプログラム指令を発現する              を有する
悪性細胞により使用される全て又は殆ど全て      正常及び悪性細胞のアルファベットは
の文字は構造的に正常であり正常細胞中に現      本質的に同じである
れている
個々のプログラムは発達する (unfold) ので      細胞は異なるプログラム段階で異なる
発現される調節因子のパターンは変化する        単語を表現する
注）以下の例で用いる単語は、現実の細胞行動又はプログラムとあまり相関関係
がない。
【００５８】
仮説的な例
細胞型１                  細胞型２
（例えば、肝臓）          （例えば、腎臓）
正常                          ｒｅｔａｒｄ              ｓｔｏｐ
低度悪性                      ｓｔａｒｔ                ｓｗａｒｍ
高度悪性                      ｓｐｒｅａｄ              ｇｒｏｗ
【００５９】
Ｉ．基本的臨床病理メカニズムとの類比
ａ）悪性細胞型１ではなく正常細胞型２における“ｔ”と“ｐ”はアンチオンコ遺伝子と相似していると考えられる。それらは悪性進行のためには削除されなければならないからである。即ち、“ｓｔｏｐ”という単語が“ｓｗａｒｍ”という単語に変換される場合についてである。これら削除は“ｏ”の削除及び“ｗ”、“ａ”、“ｒ”と“ｍ”の付加と一緒に起こらなければならない。しかしながら、同じ文字“ｐ”が高度悪性細胞型１にあり“ｔ”が低度悪性型にある。これは、アンチオンコ遺伝子がヒトの癌において例外なく欠損しているとは決していえない、複数の遺伝子変化が発癌性に関連していると考えられる、及び臨床上の癌は典型的には表現型で発達してゆくとの観察結果に相応する。
ｂ）“ｍ”と“ｗ”は“オンコ遺伝子”と相似していると考えられる。それらは“ｓｔｏｐ”が“ｓｗａｒｍ”に進化するのに必要でありかつそれらは他の正常成体細胞において発現されないからである。また、“ｍ”と“ｗ”は、胚〜胎児の発達段階においてのみ正常に発現され得る。
ｃ）“ｓ”は悪性細胞型１において発現される（異所性発現）と共に細胞型１ではなく細胞型２において正常に発現される。
ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド治療戦略との類比
ａ）“ｔ”発現を阻害すると正常細胞型１及び２ではなく低度悪性細胞型１が死滅するであろう。“ｒｅｔａｒｄ”と“ｓｔｏｐ”はそれぞれ単語である“ｒｅａｄ”と“ｓｏｐ”になるが、“ｓｔａｒｔ”は単語ではない“ｓａｒ”になるからである。
ｂ）“ｗ”ではなく“ｍ”を遮断すると低度悪性段階の細胞型２が死滅するであろう。“ｓｗａｒｍ”から“ｍ”を取ると、単語ではない“ｓｗａｒ”になるからである。しかし、“ｓｗａｒｍ”から“ｗ”を取っても単語である“ｒａｍｓ”になる。
ｄ）“ａ”を追い出すと低度悪性細胞型１及び２並びに高度悪性細胞型１が死滅するであろうが正常細胞型１も死滅するであろう。“ａ”のアンチセンス阻害は、悪性細胞型１又は２の骨髄を清浄にするのに有用であるかも知れないが全身治療には有用ではない。
ｅ）“ｒ”を削除すると正常細胞型１は死滅しないであろう（“ｒｅｔａｒｄ”は“ｄａｔｅ”になる）が、４つの悪性細胞型のうち３つが死滅するであろう。
例外は“ｓｔａｒｔ”が“ｓａｔ”になる低度悪性細胞型１である。
ｆ）“ｅ”を除去すると正常及び高度悪性細胞型１が死滅するであろうから、全身治療法には良い標的とは考えられないであろう。
ｇ）残りの文字のうち“ｄ”又は“ｇ”を除いてもどの細胞型も死滅しないであろう。“ｓ”を除去すると高度悪性細胞型１は死滅するであろうが、それが現れている他のどの細胞型も死滅しないであろう。“ｏ”を遮断すると両方の悪性細胞型２が死滅するであろう。そして、“ｐ”を阻害すると高度悪性細胞型１が死滅するであろうが、正常細胞型２は死滅しないであろう。
【００６０】
【表１】
2005320337.tif 000002
2005320337.tif 000003
2005320337.tif 000004
2005320337.tif 000005
2005320337.tif 000006
2005320337.tif 000007
2005320337.tif 000008
2005320337.tif 000009
2005320337.tif 000010
2005320337.tif 000011
2005320337.tif 000012
【００６１】
【表２】
2005320337.tif 000013
2005320337.tif 000014
2005320337.tif 000015
2005320337.tif 000016
【００６２】
【表３】
2005320337.tif 000017
【００６３】
【表４】
2005320337.tif 000018
2005320337.tif 000019
【００６４】
【表５】
2005320337.tif 000020
【００６５】
【表６】
2005320337.tif 000021
【００６６】
【表７】
2005320337.tif 000022
【００６７】
【表８】
2005320337.tif 000023
2005320337.tif 000024
2005320337.tif 000025
【００６８】
好ましい態様及び具体例と共に本発明を記載してきたが、この記載は本発明を限定することを意図したものではない。当業者は本明細書を用いて、記載した方法及び組成物に対して種々の変換、均等物との置換及びその他の変更を行うことができる。従って、特許によって与えれる保護は、以下に記載する請求の範囲の文言による以外に限定されることはない。
【００６９】
“配列表”
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：ネブラスカ大学理事会
（ｉｉ）発明の名称：細胞リプログラミング方法及び組成物
（ｉｉｉ）配列の数：５
（ｉｖ）通信連絡先：
（Ａ）受信人：ジョン  Ｐ．フロイド
（Ｂ）通り：２００ラジャー・ウェブスター
（Ｃ）市：ウィルアムスバーグ
（Ｄ）州：バージニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：２３１８７−３６０９
（ｖ）コンピューター可読型：
（Ａ）媒体：フロッピーディスク，5.２５インチ，３６０Ｋｂ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ−適合，４８６／３３
（Ｃ）作動システム：ＭＳ−ＤＯＳ  5.０
（Ｄ）ソフトウェアー：ワードパーフェクト5.１
（ｖｉ）現出願データ
（Ａ）出願番号：記載不可
（Ｂ）出願日：記載不可
（Ｃ）分類：記載不可
（ｖｉｉ）先行出願データ：なし
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：
（Ａ）氏名：フロイド，ジョン  Ｐ．
（Ｂ）登録番号：１９５２８
（Ｃ）整理／事件番号：６３０３２ＰＣＴ
（ｉｘ）電気通信情報：
（Ａ）電話：（８０４）２２０−０９３０
（Ｂ）テレファクシミリ：（８０４）２２０−０９３０
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０ヌクレオチド塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：No
（ｉｖ）アンチセンス：yes
（ｘｉ））配列の記載：配列番号：１：
ＴＣＴＣＴＣＣＧＣＴ  ＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣ      ２０
（２）配列番号：２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０ヌクレオチド塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：No
（ｉｖ）アンチセンス：yes
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：
ＡＴＣＴＧＡＣＴＧＣ  ＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡ      ２０
（２）配列番号：３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０ヌクレオチド塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：No
（ｉｖ）アンチセンス：yes
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：
ＧＡＣＡＧＣＡＴＣＡ  ＡＡＴＣＡＴＣＣＡＴ      ２０
（２）配列番号：４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０ヌクレオチド塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：No
（ｉｖ）アンチセンス：yes
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：
ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣ  ＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣ      ２０
（２）配列番号：５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０ヌクレオチド塩基
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：他の核酸
（Ａ）説明：オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：No
（ｉｖ）アンチセンス：yes
（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：
ＡＧＴＣＴＴＧＡＧＣ  ＡＣＡＴＧＧＧＡＧＧ      ２０
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、特異的ＲＮＡ転写産物上の異なる部位を標的にした特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果における細胞型特異的差異が細胞行動に存在することを明らかにしている。
【図１】
2005320337.tif 000026