(57)【要約】【課題】アクアポリン機能調節作用を有する物質、並びにアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の提供。【解決手段】マンガンイオンを含むアクアポリン機能調節剤及びマンガンイオンを有効成分として含む医薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンガンイオンを含むアクアポリン機能調節剤。
【請求項２】
アクアポリンがアクアポリン４である請求項１に記載の機能調節剤。
【請求項３】
アクアポリンがアクアポリン５である請求項１に記載の機能調節剤。
【請求項４】
マンガンイオンが無機塩の形態である請求項１〜３のいずれか一項に記載の機能調節剤。
【請求項５】
マンガンイオンが脂肪酸マンガン塩の形態である請求項１〜３のいずれか一項に記載の機能調節剤。
【請求項６】
マンガンイオンが蛋白質又は糖質との複合体の形態である請求項１〜３のいずれか一項に記載の機能調節剤。
【請求項７】
マンガンイオンを有効成分として含むアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬。
【請求項８】
アクアポリンがアクアポリン４である請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
アクアポリンがアクアポリン５である請求項７に記載の医薬。
【請求項１０】
アクアポリン機能異常に起因する疾患が脳浮腫である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
アクアポリン機能異常に起因する疾患が肺水腫である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
アクアポリン機能異常に起因する疾患がアレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
アクアポリン機能異常に起因する疾患が気管支粘膜からの分泌亢進である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンガンイオンを含むアクアポリン機能調節剤、並びにアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリン（aquaporin：以下ＡＱＰと略すことがある）は、アグレにより１９９２年に発見された膜６回貫通蛋白で、細胞内の水分量を調節する水チャネルとして機能する重要な蛋白である。非特許文献１によれば、アクアポリンは細菌から哺乳類に至るまで不変的に存在しており、これまでに哺乳類で、ＡＱＰ０からＡＱＰ１２まで１３種類のアクアポリンが確認されている。
【０００３】
アグレにより最初に発見されたＡＱＰ１の役割についての研究が進んでおり、質量２８ｋDaの蛋白であること、腎臓の上皮細胞に存在して腎臓の水電解代謝、尿の濃縮に関与し、更に赤血球膜や血管内皮に存在して、これらの細胞の水の出入りに関与していることが判明している（非特許文献２）。
【０００４】
また、神経系で多く存在しているサブタイプであるＡＱＰ４については、脳浮腫との関連を示唆する報告が数多くされており（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）、さらに、ＡＱＰ４欠損マウスでは脳浮腫形成が抑えられているとの報告がなされている（非特許文献６）。
【０００５】
そのほか、腸管や腎臓等で見られる水代謝に関わる機能を各種類のアクアポリンの働きで説明しようとする種々の検討が行われている。しかしながら、これまでアクアポリンの働きを制御する物質については、報告されていない。例えば、非特許文献７にはＡＱＰ３の働きを制御する物質の開発に取り組んでいることが示されているが、具体的な内容は開示されていない。
【非特許文献１】http://www.avp.gr.jp/information/04.html
【非特許文献２】http://www.tmd.ac.jp/grad/kid/kid-AQP%20II.htm
【非特許文献３】J. Neurosci17,171-180,1997
【非特許文献４】Biochem BiophysRes Commun 270, 495-503, 2000；
【非特許文献５】Neurobiol Disease 6,245-258,1999
【非特許文献６】Nature Med 6, 159-163, 2000
【非特許文献７】http://www.kanebo.co.jp/contents/00ichi/ichi_bn/85/85htm
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アクアポリン機能調節作用を有する物質、並びにアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは利尿薬の研究の過程において利尿作用に重要な役割を果たしていることが示されているマンガンイオンに着目し、上記の課題の解決のために鋭意研究を行った。その結果、本発明者らはマンガンイオンがアクアポリンの機能を調節する作用を有することを見出した。本発明はこの知見を基に完成されたものである。
【０００８】
すなわち本発明は、マンガンイオンを含むアクアポリン機能調節剤を提供する。この発明の好ましい態様によれば、アクアポリンがアクアポリン４である上記の機能調節剤及びアクアポリンがアクアポリン５である上記の機能調節剤が提供される。この発明のさらに好ましい態様によれば、マンガンイオンが無機塩の形態である上記いずれかの機能調節剤、マンガンイオンが脂肪酸マンガン塩の形態である上記いずれかの機能調節剤、及びマンガンイオンが蛋白質又は糖質との複合体の形態である上記いずれかの機能調節剤が提供される。
【０００９】
また本発明は、マンガンイオンを有効成分として含むアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬を提供する。この発明の好ましい態様によれば、アクアポリンがアクアポリン４である上記の医薬、及びアクアポリンがアクアポリン５である上記の医薬が提供される。この発明のさらに好ましい態様によれば、アクアポリン機能異常に起因する疾患が脳浮腫である上記いずれかの医薬；アクアポリン機能異常に起因する疾患が肺水腫である上記いずれかの医薬；アクアポリン機能異常に起因する疾患がアレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進である上記いずれかの医薬；アクアポリン機能異常に起因する疾患が気管支粘膜からの分泌亢進である上記いずれかの医薬；注射剤である上記いずれかの医薬；固形剤である上記いずれかの医薬；外用薬である上記いずれかの医薬；及び噴霧薬である上記いずれかの医薬が提供される。
【００１０】
本発明の別の観点からは、アクアポリン機能調節方法であってマンガンイオンを細胞に接触させる方法；アクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療方法であってヒトを含む哺乳類動物に有効量のマンガンイオンを投与する工程を含む方法；及び上記いずれかの医薬を製造するためのマンガンイオンの使用が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によりアクアポリン機能調節に用いるためのマンガンイオンが提供される。マンガンイオンを有効成分として含むアクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬は、従来有効な予防及び／又は治療手段がなかった脳浮腫、肺水腫、アレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進、又は気管支粘膜からの分泌亢進等の、アクアポリン、特にアクアポリン４及び／又はアクアポリン５の異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において用いられる「アクアポリン機能調節」の用語には、アクアポリン機能阻害及びアクアポリンの機能促進が含まれる。アクアポリン機能調節として具体的には、アクアポリンの水透過機能を制御して水を透過させにくくする働きなどが挙げられる。アクアポリンはＡＱＰ０からＡＱＰ１２まで１３種類のアクアポリンが確認されている。本明細書において用いられる「アクアポリン機能調節」の用語には、これら全ての種類のアクアポリンの機能調節のほか、上記１３種類のアクアポリンから選ばれる１以上の種類のアクアポリンの機能調節が含まれる。本発明において、好ましいのはアクアポリン４又はアクアポリン５のいずれかの機能の調節、並びにアクアポリン４及びアクアポリン５の両者の機能の同時調節であり、より好ましいのはアクアポリン４の機能の調節である。
【００１３】
アクアポリン１は、利尿に関わる機能を有するが、後述の実施例に示すようにマンガンイオンのアクアポリン１に対する機能調節作用はアクアポリン４及びアクアポリン５に対する作用と比較して小さい。従って、マンガンイオンは、生体に投与されたとき利尿障害等の副作用を起こしにくいと考えられる。
【００１４】
アクアポリン機能調節に用いられるマンガンイオンはどのような形態でもよく、例えば、溶液状態、無機塩、有機酸塩、又は蛋白質若しくは糖質との複合体の形態がよい。無機塩としては、例えば、リン酸マンガン、亜リン酸マンガン、硫酸マンガン、亜硫酸マンガン、及び塩化マンガン等を挙げることができ、これらの中では緩衝液に溶解しやすいリン酸マンガンが好ましい。
【００１５】
本発明において、有機酸塩の形態のマンガンイオンは、胃腸、鼻、又は肺などの上皮粘膜から吸収されやすいため好ましい。さらに好ましくは脂肪酸塩の形態のマンガンイオンを用いることができる。その際の脂肪酸としては、例えば、クエン酸、アジピン酸、グルタミン酸、マレイン酸、酪酸、ピルビン酸、ピコリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレイン酸等を挙げることができる。これらの中では、生代謝経路で代謝されやすいピルビン酸が好ましい。
【００１６】
本発明において、蛋白質又は糖質との複合体の形態のマンガンイオンを用いることができる。該蛋白質としては、例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼ等、糖質としては例えば、ヒアルロン酸及びヘパリン等を挙げることができる。
【００１７】
マンガンイオンはアクアポリンの機能を調節する作用を有するため、アクアポリン機能異常に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用である。アクアポリン機能異常とは、健常な組織内の細胞のアクアポリンの状態とは異なる病態下の組織内細胞でのアクアポリンの状態をいい、アクアポリンの機能亢進及び減退のほか、細胞におけるアクアポリンの数の増加及び減少などを含む。
アクアポリン機能異常に起因する疾患の例としては、例えば、脳浮腫、肺水腫、アレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進（鼻粘膜の浮腫）、及び気管支粘膜からの分泌亢進（気管支粘膜の浮腫）等が挙げられ、この中で好ましい例としては、脳浮腫が挙げられる。
【００１８】
脳浮腫は、例えば、頭部損傷、脳卒中及び脳炎等に伴う頭蓋内圧が亢進する疾患で、アクアポリン４の機能異常に起因すると考えられている。脳浮腫の予防及び／又は治療のための医薬としてマンガンイオンを用いる場合、患部である頭部にマンガンイオンを含む注射剤として直接皮下注射、くも膜下注射、又は静脈注射することが好ましい。
【００１９】
肺水腫もまた、アクアポリン５の機能異常に起因すると考えられている。肺水腫の予防及び／又は治療薬として用いる場合、マンガンイオンは、好ましくは有機酸塩の形態のマンガンイオンを含む噴霧薬として口から肺内に吸引させることが好ましい。この噴霧薬中に含まれるマンガンイオンが肺内の粘膜に付着してアクアポリンに作用する結果、肺細胞の水分による膨潤を阻止することができる。
【００２０】
アレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進の対症療法に用いる場合、マンガンイオンは、好ましくは塩の状態で、噴霧薬として鼻の内部に直接投与することが好ましい。また、アレルギー疾患による鼻粘膜の分泌亢進の予防及び／又は治療薬として用いる場合は、好ましくは有機酸塩の形態のマンガンイオンを含む噴霧薬として鼻に吸引させる。この噴霧薬中に含まれるマンガンイオンが鼻の粘膜に付着してアクアポリンに作用する結果、鼻水の流下を阻止することができる。
【００２１】
気管支粘膜からの分泌亢進もまた、アクアポリン５の機能異常に起因すると考えられている。気管支粘膜からの分泌亢進の対症療法に用いる場合には、マンガンイオンまたは塩の形態のマンガンイオンを噴霧薬として喉に直接噴霧することが好ましい。
【００２２】
本発明の医薬は、患部に直接注射で投与する場合は、注射剤の１成分として、マンガンイオンを含む無機塩が溶解した薬剤であることが好ましい。マンガンイオンを無機塩として投与する際の注射剤は、生理食塩水を主成分とし、必要に応じて他の水溶性の添加剤、薬液等を配合したものを用いることができる。添加剤としては、例えば、カリウム、マグネシウム等のアルカリ金属イオン、乳酸、各種アミノ酸、脂肪、グルコース、フラグトース、サッカロース等の糖質等の栄養剤、ビタミンA、Ｂ、C、D等のビタミン類リン酸イオン、塩素イオン、ホルモン剤、アルブミン等の血漿蛋白、及び、デキストリンン、ヒドロキシエチルスターチ等の高分子多糖類等を挙げることができる。
【００２３】
慢性あるいは、症状の軽い肺水腫、アレルギー疾患による鼻粘膜からの分泌亢進等の予防及び／又は治療に用いる場合において、本発明の医薬は、固形剤として生体に投与することができる。固形剤としては、粉末、細粒、顆粒、マイクロカプセル、及び錠剤等を挙げることができる。このような固形剤の中では、嚥下しやすい錠剤やカプセル剤が好ましい。本発明の医薬を錠剤とする場合の賦形剤及び結合剤としてはオリゴ糖等の公知のものを使用することができる。錠剤の直径は２〜１０ｍｍ、厚さは１〜５ｍｍの範囲にあることが好ましい。マンガンイオンを含む予防及び／又は治療薬は、他の薬剤と混合されていてもよい。
【００２４】
固形剤には通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、及び保存剤等を挙げることができる。
上記固形剤において、マンガンイオンの濃度は固形剤１００重量％に対して０．０１重量％以上、好ましくは０．１〜１０重量％であることが好ましい。
【００２５】
本発明の医薬は、噴霧薬として生体に投与することができる。すなわち、マンガンイオンの粉体、水分散微粒子、又は有機溶媒分散体を気体の圧力で微細化して、鼻、気管内に投与することができる。噴霧薬として用いることのできる分散体は、例えば、脂肪酸マンガンを溶媒に溶解したものを、水溶性高分子もしくは界面活性剤を含有する水と混合、又は水中に高速ミキサー等で撹拌混合し、さらに超音波により分散処理した後、溶媒を蒸発除去する方法により製造することができる。
【００２６】
このような水分散体の調製に用いることのできる水溶性高分子としては、例えば、ポリアミドアミン、ポリビニルアルコール、ポリリンゴ酸、ポリ（ω−ヒドロキシアルキル）アクリレート及びメタクリレート、水酸基含有モノマー単位を含むコポリマー、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アスパラギン酸等の合成水溶性ポリマー、デキストラン、キトサン、ペクチン、ヒアロン酸、セルロース、スターチ、プルラン、イヌリン、ヘパリン等の天然水溶性ポリマー等を挙げることができる。
【００２７】
水分散体製造においては、好ましくは水中に界面活性剤を添加する。このような界面活性剤としては、高級脂肪酸石鹸；アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルＮ−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤；アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤；及びポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤等を挙げることができる。
【００２８】
マンガンイオンを含む水分散体には、通常用いられる種々の添加剤を配合することができる。このような添加剤としては、例えば、安定剤、界面活性剤、可塑剤、甘味剤、抗酸化剤、着香剤、着色剤、乳化剤、及び保存剤等を挙げることができる。
噴霧薬におけるマンガンイオンの濃度は、0.01〜1000 mg/Lの範囲とすることが好ましい。
【００２９】
本発明の医薬は、外用薬として例えば、乳液状、クリーム状もしくはジェル状の軟膏、又は貼付剤として患部に供することができる。該外用薬では、マンガンイオン以外に、油性原料、界面活性剤、無機充填剤、増粘剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、防腐剤、栄養剤、色剤、香料、美白剤、血行促進剤、局所刺激剤、抗炎症剤、収斂剤、清涼剤、肌荒れ防止剤、制汗剤、ビタミン類、ホルモン類、又は抗ヒスタミン剤等の各種薬剤を用途に応じて適宜配合することができる。
【００３０】
上記の油性原料としては、例えば、オリーブ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油等の油脂類；カルナバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ミツロウ、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、パラフィン、ワセリン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン等の炭化水素類；脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール等の高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸２−オクチルドデシル、２−エチルヘキサンン酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル等のエステル類；及びシリコーン油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
上記の界面活性剤としては、例えば、高級脂肪酸石鹸；アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アシルＮ−メチルタウリン塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム等のカチオン界面活性剤；アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤；及びポリオキシエチレン型、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
上記の無機充填剤は、粘度調整、及び感触改良等の目的のため配合され、例えば、タルク、マイカ又は二酸化チタン等を用いることができる。
上記の増粘剤としては、例えば、カルボキシセルロース、エチルセルロース、可溶性デンプン、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、カラギーナン、ゼラチン、及びポリアクリル酸エステル共重合体等を挙げることができる。
上記の紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸及びその誘導体、ブチルメトキシベンゾイルメタン、パラメトキシケイ皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ベンゾフェノン誘導体、イミダゾリン誘導体等を挙げることができる。
【００３３】
上記の酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、及びノルジヒドログアヤレチック酸（ＮＤＧＡ）等が挙げられる。
上記の防腐剤としては、例えば、安息香酸及びその塩、サリチル酸及びその塩、デヒドロ酢酸及びその塩、ヘキサクロロフェン、ホウ酸、レゾルシン、ジンクピリチオン、ヒノキチオール等を挙げることができる。
上記の栄養剤としては、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＢ類、ビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸等の各種ビタミンやアミノ酸等を挙げることができる。
【００３４】
上記の美白剤としては、例えば、液状ラノリン、コガネバナ根抽出エキス、トリアジン誘導体等のアスコルビン酸及びその誘導体、甘草エキス、茶抽出物、トコフェノール及びその誘導体、トラネキサム酸及びその塩、アズレン、γ−ヒドロキシ酪酸等を挙げることができる。
血行促進剤としては、例えばニコチン酸アミド、グリチルレチン酸及びその誘導体、サポニン類、トラネキサム酸、セファランジン、センブリエキス等を挙げることができる。
上記の局所刺激剤としては、例えば、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、ニコチン酸ベンジルエステル等を挙げることができる。
【００３５】
上記の抗炎症剤としては、例えば、グリチルリチン酸誘導体、アズレン、アミノカプロン酸、ヒドロコルチゾン等を挙げることができる。
上記の収斂剤としては、例えば、酸化亜鉛、硫酸亜鉛、塩化アルミニウム、タンニン酸、及び没食子酸等を挙げることができる。上記の清涼剤としては、例えばメントール、カンフル等を挙げることができる。
【００３６】
本発明の予防及び／又は治療薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、予防及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、適宜選択することができる。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は有効成分であるマンガンイオンの質量として1〜1000 mg程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。該医薬を注射剤として用いる場合には、成人に対して有効成分質量として、一日1〜1000 mgを連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【実施例】
【００３７】
次に実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（例１）細胞膜水透過性に対するマンガンイオンの作用
細胞として、コンフルエントカルチャーまで培養した後、50 mM EDTAを含むリン酸緩衝液でピペッティングして剥がしたマウス肺上皮細胞株MLE-12を用いた。1×107 cells/ml の懸濁液を調製した。該懸濁液、及び最終濃度１mMとなるようにマンガンイオンを添加した該懸濁液を300 mOsの高浸透圧で刺激し、ストップフロー装置（大塚電子）を用いて散乱光強度を測定した。散乱光強度は細胞容積と反比例するため、水分の漏出による細胞容積の変化の指標となる。結果を図１に示す。マンガンイオンを加えた懸濁液では高浸透圧刺激による細胞容積の変化が抑えられており、マンガンイオンが細胞の水分漏出を調節する機能を有することが示された。なお、コントロールとして用いたリチウムイオンでは顕著な作用はなかった。
【００３８】
（例２）アクアポリンの水透過性に対するマンガンイオンの作用
細胞として、コラーゲン処理により分散させたアフリカツメガエル卵母細胞を用いた。アクアポリン１、アクアポリン４、及びアクアポリン５のそれぞれをコードするｃＤＮＡ 50 mgを注入後、48時間培養し、各アクアポリンを発現させた細胞を調製した。マンガンイオンを添加する際は、細胞懸濁液におけるマンガンイオン濃度が 1 mMとなるようにした。対照（コントロール）としては10 mlの滅菌水を注入したアクアポリンを発現させていない細胞を用い、それぞれの細胞の低浸透圧刺激後の細胞容積の変化を測定した。結果を図２に示す。図からわかるように、アクアポリン５を発現した細胞及びアクアポリン４を発現した細胞では、水分吸収がマンガンイオンの添加により抑えられた。一方、アクアポリン１を発現した細胞への水分吸収はマンガンイオンの添加によってほとんど変化しなかった。この結果より、マンガンイオンはアクアポリン４及びアクアポリン５の機能を顕著に調節する作用を有すること、及びマンガンイオンのアクアポリン１の機能を調節する作用は弱いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウス肺上皮細胞株MLE-12の細胞膜水透過性に対するマンガンイオンの作用を示した図である。
【図２】アフリカツメガエル卵母細胞に発現させたアクアポリンの水透過性に対するマンガンイオンの作用を示した図である。
【図１】
2005325047.tif 000002
【図２】
2005325047.tif 000003