(57)【要約】【課題】  新規なワクチン剤の提供。【解決手段】  マイコバクテリウム属からの感染性病原体に対する効果的な免疫応答を哺乳類宿主において促進するのに使用するためのワクチン剤であって、Ｍ．ツベルキュロシスの 110kDタンパク質、80kDタンパク質、71kDタンパク質、58kDタンパク質、45KDタンパク質、32A kDタンパク質、32B kDタンパク質、30kDタンパク質、24kDタンパク質、23.5kDタンパク質、23kDタンパク質、16kDタンパク質、14kDタンパク質及び12kDタンパク質から成る群から選択された少なくとも１種の主要な細胞外生成物を含んで成るワクチン剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）属からの病原体により惹起される疾患に対するワクチン剤であって、71kDaタンパク質及び30kDaタンパク質から成る群から選択された、精製されたマイコバクテリウム主要細胞外タンパク質を含んで成り、保護免疫応答を生じさせるワクチン剤。
【請求項２】
前記病原体が、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum)、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・アビム−イントラセルラ（Mycobacterium avium-intracellulare)、マイコバクテリウム・ホルツイタム（Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウム・キロネイ（Mycobacterium chelonei)、マイコバクテリウム・サクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum)、マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・アフリカナム（Mycobacterium africanum)、マイコバクテリウム・アルセランス（Mycobacterium ulcerans)、及びマイコバクテリウム・ミクロチ（Mycobacterium microti)から成る群から選択される請求項１に記載のワクチン剤。
【請求項３】
前記マイコバクテリウム主要細胞外タンパク質が、マイコバクテリウム30kDa主要細胞外タンパク質である、請求項１に記載のワクチン剤。
【請求項４】
前記マイコバクテリウム主要細胞外タンパク質が、マイコバクテリウム71kDa主要細胞外タンパク質である、請求項１に記載のワクチン剤。
【請求項５】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン剤。
【請求項６】
マイコバクテリウム属からの病原体に対する保護免疫応答を促進することにおいて使用するための組合せワクチンであって：
マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの 110kDタンパク質、80kDタンパク質、71kDタンパク質、58kDタンパク質、45KDタンパク質、32A kDタンパク質、32B kDタンパク質、30kDタンパク質、24kDタンパク質、23.5kDタンパク質、23kDタンパク質、16kDタンパク質、14kDタンパク質及び12kDタンパク質から成る群から選択される複数の主要細胞外タンパク質生成物を含んで成る組合せワクチン。
【請求項７】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの32A kDタンパク質、30kDタンパク質、24kDタンパク質、23kDタンパク質及び16kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項８】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの32A kDタンパク質、32B kDタンパク質、30kDタンパク質、23kDタンパク質及び16kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項９】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの32A kDタンパク質及び30kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項１０】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの32B kDタンパク質及び30kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項１１】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの30kDタンパク質及び23kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項１２】
前記組合せワクチンが、マイコバクテリウム・ツベルキュロシスの30kDタンパク質及び23.5kDタンパク質の混合物を含む請求項６に記載の組合せワクチン。
【請求項１３】
アジュバントを更に含んで成る、請求項６〜12のいずれか１項に記載の組合せワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に免疫治療剤及び病原性生物、たとえば細菌、原生動物、ウィルス及び真菌に対するワクチンに関する。より具体的には、最大の又は最とも特異的な分子免疫原性を示す病原性サブユニット又は生成物に基づく従来のワクチン及び免疫治療剤とは異なって、本発明は哺乳類宿主において効果的な免疫応答を刺激するために選択された病原体、たとえばマイコバクテリウム  ツベルキュロシス（Mycobacterium tuberculosis）により放される最とも普及しているか又は非常に豊富な免疫原性決定因子を使用する。従って、本発明を通して生成される、得られた免疫性及び免疫治療活性が、投与される化合物の比較的又は絶対的な免疫原性にかまわずに病原性感染の間、感染された宿主細胞上に最ともしばしば示されるそれらの抗原性マーカーに向けられる。
【背景技術】
【０００２】
寄生性微生物が動物を感染する能力を有し、それにより宿主の疾患及びしばしば死を引き起こすことはこれまで長く認識されて来た。病原性物質は歴史上、死の主要な原因であり、そして計り知れない苦悩を負わし続けている。過去 100年、多くの感染性疾病の予防及び処理において劇的な進歩が見られて来たが、複雑化された宿主−寄生体の相互作用は治療程度の全般的な有効性をまだ制限している。多くの病原性ベクターにより示される複雑な侵入機構の対抗手段を取ることにおける困難性は、種々の疾病、たとえば結核の再発及び細菌及びウィルスの多くの耐薬物性菌株の出現により立証されている。
【０００３】
主要な疫学的関心のそれらの病原性物質の中で、細胞内細菌が治療又は予防程度に直面して特に処理しにくいことがわかった。細胞内細菌、たとえばマイコバクテリウム属及びレジオネラ属は、細胞外的によりもむしろ感染された宿主生物の細胞内のそれらの生活環のすべて又は一部を完結する。世界各地で、細胞内細菌は、毎年、数百万人の死及び数えきれない苦悩の原因である。マイコバクテリウム  ツベルキュロスにより引き起こされる結核は、世界各地での感染性疾病からの死の主要な原因であり、そして１千万人の新しい患者及び 2.9百万人の死が毎年もたらされている。
【０００４】
さらに、細胞内細菌は数百万人のライ病患者の原因でもある。細胞内物質により伝達される他の衰弱性疾病は、皮膚リーシュマニア症及び内臓リーシュマニア症、アメリカトリパノソーマ症（Chagas病）、リステリア症、トキソプラスマ症、ヒストプラスマ症、トラコーマ、オーム病、Ｑ熱及びレジュネラ症（たとえばLegionnaires病）を包含する。この時点、それらの生物に暴露される敏感な個人における感染を防ぐことは、比較的ほとんど行なわれ得ない。
【０００５】
結核から集団を効果的に保護することのこの不可能性及び結核により引き起こされる固有のヒト罹病率及び死亡率のために、これは人類が直面する最とも重要な疾病の１つである。より特定には、Ｍ．ツベルキュロシスにより主に引き起こされるヒト肺結核は、発展途上国において死の主な原因である。マクロファージ及び単球の内部で生存することができるＭ．ツベルキュロシスは慢性の細胞内感染を生成することができる。
【０００６】
外来性要素の検出及び続く免疫システムの活性化を主に担当する細胞内に潜伏することによって、Ｍ．ツベルキュロシスは宿主生物の通常の防御を逃がれることにおいて比較的うまくいっている。それらの同じ病原特徴が効果的な免疫治療剤又は結節性感染に対するワクチンの開発をこれまで阻止して来た。同時に、結核菌は実験室条件下で比較的容易に培養でき、そして観察することができる。従って、Ｍ．ツベルキュロシスは本発明の原理及び利点を示すために特に十分に適合されている。
【０００７】
当業者は、Ｍ．ツベルキュロシス(M. tuberculosis) の次の典型的な議論が本発明の範囲をＭ．ツベルキュロシスの処理に決して制限しないことを理解できるであろう。同様に、本明細書における教授は結節性感染の処理に限定されない。対照的に、本発明は、細胞外生成物を発現するいづれかの病原性物質の免疫原性決定因子に対しての安全且つ効果的なワクチン及び免疫治療剤を提供し、そしてそれによってそれらの生物の感染性伝染を阻害するために使用され得る。
【０００８】
現在、世界の人口のほぼ半分近くが、数百万人の肺結核の患者を毎年もたらすＭ．ツベルキュロシスにより感染されていると思われる。この疾病はラテンアメリカ、アフリカ、及びアジアの発展途上国において特に急性的な健康問題であるが、それはまた、第一世界にもより流行して来ている。アメリカ合衆国においては、特定の集団、特に効外の低所得の免疫無防備状態の人々及び高い疾病流行の国々からの移住者は高い危険性を有している。AIDS流行病により、結核の発生は現在、発展途上国において、しばしば複合薬物耐性Ｍ．ツベルキュロシスの形で上昇し続けている。
【０００９】
最近、１又は複数の薬物に対して耐性の結核がアメリカ合衆国の50州のうち36州で報告されている。ニューヨーク市においては、1991年に試験されたすべての症例のうち１／３が１又は複数の薬物に耐性であった。非耐性結核は長期の抗生物質投与により治癒され得るけれども、耐薬物性菌株に関する前途は暗いものである。複数の抗生物質に対して耐性の菌株により感染された患者は約50％の死亡率を有する。従って、そのような種類のＭ．ツベルキュロシスに対して安全で且つ効果的なワクチンが切に必要とされる。
【００１０】
Ｍ．ツベルキュロシスの初期感染は、その病原体は湿った又は乾燥した痰に数週間又は数カ月間、生存したまま残っているので、エアゾール化された粒子の吸入（吸息）を通してほとんど常に生じる。感染の主要部位は肺に存在するが、前記微生物はまた、骨、脾臓、髄膜及び皮膚の感染をも引き起こすことができる。特定菌株の菌力及び宿主の耐性に依存して、感染及び対応する組織への損傷は重要ではないか又は広範であり得る。ヒトの場合、初期感染は細菌の毒性菌株に暴露される大多数の個人において調節される。初期挑戦に続いて得られた免疫性の上昇は細菌の増殖を減じ、そしてよって病変の治癒を可能にし、そして対象を無症候にするが、しかしたぶん感染性は残るであろう。
【００１１】
Ｍ．ツベルキュロシスが感染された対象により制御されない場合、それはしばしば、肺組織の広範な劣化をもたらす。敏感な個人の場合、病変は通常、肺胞又は肺マクロファージ内で結核菌は繁殖するので、肺に形成される。その生物が増殖するにつれて、それらは遠くのリンパ節にリンパ系を通して肺尖、骨髄、腎臓及び脳を囲む髄膜への血流を通して拡大する。主に、細胞介在過敏症応答の結果として、特徴的な肉芽腫性病変又は結核結節が感染の重度に比例して生成される。それらの病変は、単球、リンパ球及び線維芽細胞により境界をつけられる上皮細胞から成る。ほとんどの場合、病変又は結核結節は結果的に、壊死性になり、そして乾酪化を受ける。
【００１２】
Ｍ．ツベルキュロシスは有意な病原体であるが、他の種のマイコバクテリウム属もまた、ヒトを含む動物に疾病を引き起こし、そして明らかに本発明の範囲内である。たとえば、Ｍ．ボビス（M. bovis）はＭ．ツベルキュロシスに密接に関連しており、そして家畜、たとえば牛、ブタ、羊、馬、犬及びネコにおいて結節性感染を担当できる。さらに、Ｍ．ボビスは、小腸路を通して、典型的には原乳の摂取からヒトを感染できる。局在化された小腸感戦は結果的に呼吸路に広がり、そしてすぐに、結核の典型的な徴候が続く。マイコバクテリウム属の他の重要な病原性ベクターは、古来の疾病であるライ病を引き起こすＭ．レプラエ(M. leprae）である。
【００１３】
動物及びヒトに疾病を引き起こすこの属の他の種は、Ｍ．カンサシ（M. kansasii)、Ｍ．アビウム  イントラセルマラレ（M. avium intratellulare)、Ｍ．ホルツイタム（M. fortuitum) 、Ｍ．マリナム（M. marinum) 、Ｍ．キロネイ（M. chelonei)、Ｍ．アフリカナム（M. africanum) 、Ｍ．アルセランス（M. alcerans)、Ｍ．ミクロチ（M. microti) 及びＭ．サクロフラセウム（M. scrofulaceum)を包含する。病原性マイコバクテリウム種は、それらの代表的なDNA 及びその対応するタンパク質配列において高い程度の相同性を時おり示しており、そしていくつかの種、たとえばＭ．ツベルキュロシス及びＭ．ボビスはひじょうに関連している。
【００１４】
明らかな実際の及び道徳上の理由のために、そのような病気に関して実験的な組成物の効能を決定するためにヒトにおける初期研究は実行不可能である。従って、いづれかの薬物又はワクチンの初期開発においては、安全性及び費用の理由から適切な動物モデルを用いることが標準的な方法である。実験動物モデルを実施することの成功は、免疫優性エピトープが異なった種の宿主において時おり活性的である理解に基づいて予測される。従って、１つの種、たとえばゲッ歯動物又はテンジクネズミにおける免疫原性決定因子は一般的に、異なった種、たとえばヒトにおいて免疫反応性であろう。適切な動物モデルが十分に開発された後でのみ、ヒトにおける臨床的な研究が、ヒトにおけるワクチンの安全性及び効能をさらに示すために実施されるであろう。
【００１５】
Ｍ．ツベルキュロシスによる肺胞又は肺感染に関しては、テンジクネズミモデルが多くの観点で疾病のヒト病理学に密接に類似している。従って、ヒト及び他の哺乳類に対してこの疾病のテンジクネズミモデルを推定することが適切であることは当業者に十分に理解される。ヒトに関しては、テンジクネズミはエアゾール化されたヒト病原体Ｍ．ツベルキュロシスの低量で結節性感染に対して敏感である。初期感染が通常制御されるヒトとは異なる、テンジクネズミはエアゾール化された病原体への暴露に基づいて広められた疾病を一定して進行せしめ、従って続く分析を促進した。さらに、テンジクネズミ及びヒトの両者は、皮膚試験部位で密な単核細胞の固定化又は固定した部分の進行により特徴づけられる遅延化されたタイプの皮膚過敏性反応を示す。
【００１６】
最後に、ヒト及びテンジクネズミの特徴的な結節性病変は類似する形態学、たとえばラングハンス巨細胞を示す。テンジクネズミはヒトよりも疾病の初期感染及び進行に対してより敏感であるので、この動物モデルを用いての実験において付与されるいづれかの保護は、同じ保護免疫性がヒト又は他の低い感受性の哺乳類において生成され得ることの強い示唆を提供する。従って、説明のみの目的であって、限定の目的のためではないが、本発明は、哺乳類宿主としてテンジクネズミを主に示されるであろう。当業者は、本発明がヒト及び家畜を包含する他の哺乳類宿主により実施され得ることを認識するであろう。
【００１７】
病原性ベクター及び特に細胞内生物により感染されたいづれかの動物又はヒトは、宿主の免疫システムに対して困難な挑戦を提供する。多くの感染性物質は保護抗体の体液応答及び対応する生成により効果的に制御され得るが、それらの機構は身体の細胞外流体に位置するそれらの病原体に対してのみ主に効果的である。
【００１８】
特に、オプソニン作用を有する抗体は細胞外の外来性物質に結合し、それによってそれらを食菌作用に敏感にし、そして続いて細胞内殺害をもたらす。まだこれは、他の病原体についての例症ではない。たとえば、これまでの研究は、体液性免疫応答は細胞内細菌、たとえばＭ．ツベルキュロシスによる感染に対して有意な保護の役割を演じるとは思えないことを示唆した。しかしながら、本発明は標的の病原体に対する有益な体液性応答を生成することができ、そしてその有効性は刺激された免疫応答のいづれかの特定の成分に限定されない。
【００１９】
より具体的には、抗体介在の防御は外観上、細胞内病原体の初期感染を妨げず、そして細菌が宿主の細胞内に隠れればすぐに無効になる。水溶性タンパク質のように、抗体は細胞外流体及び血液を浸透するが、しかし細胞の指質膜を通しての移動は困難である。さらに、細菌の表面構造体に対するオプソニン作用性抗体の生成は、宿主細胞に入る細胞内病原体を実際に助けることができる。従って、細胞内物質、たとえばマイコバクテリウムに対するいづれかの効果的な予防手段は、処理された食細胞を活性化し、そしてそれらを細胞毒性的に排除する抗原特異的リンパ球の急速な増殖を導びく攻撃的な細胞介在免疫応答成分を組込むべきである。しかしながら、下記に詳細に論ぜられるであろうように、細胞介在免疫応答の誘発は保護免疫性の誘発には等しくない。細胞介在免疫性は保護免疫性に対して必要条件であるが、本発明の教授によるワクチンの生成は動物に基づく挑戦的な研究を必要とする。
【００２０】
この細胞介在性免疫応答は一般的に２つの段階を包含する。細胞が感染されることにシグナルを送る初期段階は、細胞の表面に病原体の断片を運ぶ特定の分子（主に組織適合性又はMHC 分子）により達成される。それらのMHC 分子は、感染された細胞内で分解されている細菌タンパク質の小さなフラグメントに結合し、そしてそれらを細胞の表面で表わす。Ｔ−細胞へのそれらの提供は、感染された宿主細胞を排除するために宿主の免疫システムを刺激し、又はその内部に存在するいづれかの細菌を根絶するよう宿主細胞を誘発する。
【００２１】
ほとんどの感染性細菌とは異なって、マイコバクテリウム、たとえばＭ．ツベルキュロシスは、膜により細胞の残りから実質的に遮断される小胞において増殖する傾向がある。食細胞は、この種類の病原体による感染に対してそれらを特に敏感にするそれらの保護小胞を天然において形成する。そのような小胞において、細菌は分解から効果的に保護され、感染された細胞の表面上に統合する細菌成分を免疫システムが提供することを困難にする。しかしながら、感染された細胞のMHC 分子は小胞に移動し、そしていづれかの遊離（開放された）細菌生成物を獲得し又は外来性細胞外細菌生成物が細胞表面でその生成物の正常な提供のために輸送されている宿主細胞における他の部位に移動するであろう。前に指摘したように、外来性細菌生成物の提供は宿主免疫システムにより適切な応答を刺激するであろう。
【００２２】
細胞内病原体が免疫システムについて困らせる問題はまた、ワクチン開発に特別な挑戦を構成する。従って、マイコバクテリウム感染及び特にＭ．ツベルキュロシスに対する効果的なワクチンの生成は、ほとんどの研究者を理解しにくくしている。現在、細胞内病原体に対する単に広く利用できるワクチンは、生の弱毒化されたワクチン BCG、すなわち結核菌に対しての予防手段として使用されるＭ．ボビスの無毒性菌株である。
【００２３】
さらに、1988年において、インドからの集中的な世界健康機構研究は、最良のBCG ワクチンの効能は測定できないほどわずかであったことを決定した。この凝わしい効能にもかかわらず、BCG ワクチンは、世界中の結核の高い出現地域に広く適用されて来た。問題を複雑化するが、ワクチンを接種された個人はしばしば、結核スクリーニング及び制御のために最とも通常の皮膚試験の有用性を否定するツベルクリンに対しての感受性を開発するであろう。
【００２４】
生の弱毒化されたワクチン、たとえばBCG を包含するもう１つの重大な問題は、免疫無防備状態の患者において生命をおどすような疾病を開始せしめる可能性である。それらのワクチンは、急速に増殖する誘発された感染に対して戦うそれらの減じられた能力のために、機能低下された細胞介在免疫性を有する個人のために特別な危険性を提供する。そのような個人は、栄養失調及び劣っている生活条件により弱体化された個人、器官移植受容者、及びHIV により感染された個人を包含する。BCG ワクチンの場合、高い危険性の個人はまた、肺疾患、たとえば気腫、慢性気管支炎、じん肺、珪肺症、又は前述の結核を有する個人を包含する。従って、弱毒化されたワクチンの使用は、それらが最大の可能性の利益を有する集団に限定される。
【００２５】
生の弱毒化されたワクチンの使用はまた、他の所望しない副作用をもたらす。生ワクチンは受容体において繁殖するので、それらは広い範囲の抗体及び非感染性ワクチンよりも低い細胞介在免疫応答を誘発する。しばしばこのショットガンアプローチは細胞予防にほとんど関与される分子構造体で指図された免疫応答を閉塞する傾向がある。さらに、損なわれていない膜を有する生ワクチンの使用は、効果的な食作用のために外来性物体を調製するオプソニン作用性抗体を誘発できる。従って、標的生物の毒性菌株への宿主の暴露に基づいて、そのような抗体の存在が、それらが生存し、そして増殖できる宿主細胞中への非弱毒化された病原体の摂取を実際に増強できた。さらに、弱毒化されたワクチンは、多くの異なった分子種を含み、そしてその結果、毒性であるか又は患者において逆の免疫応答を刺激することができる分子種をより含む傾向がある。生ワクチンに関する他の問題は、菌力の変異、接触による天然での広がり、汚染ウィルス及びウィルスの障害、及び標準化の困難性を包含する。
【００２６】
同様に、非感染性ワクチン、たとえば殺害された生物又は強い抗原性の膜結合構造体で指図された殺害された生物又は従来の二次生成サブユニットワクチンは、細胞内細菌の阻害に関して制限される。弱毒化されたワクチンのように、殺害された細菌は、最とも効果的な予防決定因子を阻害できる無差別の応答を刺激する。さらに、殺害されたワクチンは免疫システムに多数の潜在的に抗原性の構造体を提供し、それによって、毒性反応又は免疫システムによるオプソニン作用化の傾向を高める。
【００２７】
膜結合構造体を組込む従来のサブユニットワクチンは、合成され又は精製されても、それらが増殖する食細胞中に細胞内病原体の侵入を促進する強いオプソニン効果を誘発できる。細菌包含の割合を高めることによって、細胞内表面抗原に向けられた、殺割されたワクチンは、病原性物質の相対的毒力を高めることができる。従って、強い抗原性細菌表面成分に対して向けられた従来の弱毒化された又は殺害されたワクチンは、細胞内病原体の場合、矛盾する。
【００２８】
従来のワクチンの使用に関係する問題を回避するために、特定の細胞内病原体に対する保護免疫性を刺激する細胞外タンパク質又はそれらの免疫原性類似体を用いての開発が行なわれた。たとえば、1992年４月28に発行された本発明者のアメリカ特許第 5,108,745号は、レジオネラ  プネウモフィラ（Legionella pneumophila）及びＭ．ツベルキュロシス並びに他の細胞内病原体に対しての保護免疫性を生成するためのワクチン及び方法を開示する。それらの従来技術のワクチンは、インビトロでブイヨン培養物中に病原性細菌により細胞外開放される及びインビボで感染された宿主細胞内に細菌により細胞外開放されたタンパク質性化合物に元来由来する細胞外生成物に広く基づかれている。ここに開示されるように、それらのワクチンは、哺乳類宿主において標的の病原体に対して強い免疫応答を刺激する細胞外生成物又はそれらの類似体の同上に選択的に基づかれている。
【００２９】
より特定的には、それらの従来技術の候補体である細胞外タンパク質は、対象の病原体に対する免疫性である哺乳類において、強いリンパ球増殖応答又は皮膚の遅延タイプ過敏性応答のいづれかを刺激するそれらの能力を決定することによってスクリーンされた。これは従来のワクチンの使用において固有の多くの欠点を回避する方法及び関連するワクチンを開示するが、交差反応性及び宿主の変動性による、矛盾する免疫応答結果が効果的な免疫化物質の選択を複雑化する。従って、分子免疫原性は効果的なワクチンの１つの示唆であるが、他の因子が、効果的な免疫応答をインビボで刺激することへのその使用を複雑化する。
【００３０】
より重要なことには、特にＭ．ツベルキュロシスに関して、効果的な保護免疫性誘発ワクチンを同定するための従来技術の方法はやっかいであり、そして潜在的に無効果であることが驚くべきことには開示されている。たとえばＭ．ツベルキュロシス細胞外タンパク質のSDS-PAGE分析、続いてのそれらの細胞外成分のほとんどの免疫原性の同定を目的とする従来のウエスターンブロット技法は、矛盾する結果を生成した。反復された試験は、細胞外生成物が最強の免疫原性応答を生成し、そして従来技術の考えと合致し、それによって最とも効果的なワクチンとして機能することの同定を失敗した。Ｍ．ツベルキュロシスの細胞外生成物の多くは、当業界において良く知られており、同定されており、そして多くの場合、配列決定されている。さらに、外来性タンパク質のように、それらの既知の化合物が免疫応答を誘発することは示され得る。しかしながら、それらの既知の化合物が従来通り同定される場合、保護免疫性を誘発するであろうことを直接的に示唆するものは当業界には存在しない。
【００３１】
従って、ワクチン又は免疫治療剤及びそれらの生成法を提供し、そしてひじょうに特異的な強い免疫原性の操作能力に基づいての選択技法及び従来のワクチン考慮によらない感染性細菌病原体に対する効果的な免疫応答を開始することにそれらを使用することが本発明の主要な目的である。
【００３２】
ワクチン又は免疫治療剤、及び細胞内病原体、たとえばＭ．ツベルキュロシス、Ｍ．ボビス、Ｍ．カンサシ、Ｍ．アビウムイントラセルマラレ、Ｍ．ホルツイタム、Ｍ．キロネイ、Ｍ．マリナム、Ｍ．サクロフラセウム、Ｍ．レプラエ、Ｍ．アフリカナム、Ｍ．アルセランス及びＭ．ミクロチに対する哺乳類宿主における得られた免疫性付与することへのそれらの使用方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
殺害された又は弱毒化されたワクチンに関して減じられた毒性を示す容易に生成されたワクチン及び免疫治療剤を提供することが本発明のさらなる目的である。
【発明の開示】
【００３３】
本発明は、ワクチン及び／又は免疫治療剤として使用するための化合物、及び病原体による感染に対して哺乳類宿主において保護又は治療免疫応答を生成するためへのそれらの生成方法を提供することによって上記及び他の目的を達成する。広い観点においては、本発明は細胞外化合物を生成する感染ベクターに対する保護又は治療免疫応答を誘発する手段を提供する。本発明の化合物は病原性細菌に対して特に効果的であるが、それらは大多数の細胞外生成物を生成するいづれかの病原体に対する保護又は治療免疫応答を生成するために使用され得る。
【００３４】
本発明の目的のためには、用語“大多数”とは、対象の病原体により多量に放されるそれらの細胞外生成物を同定する相対的用語として理解されるべきである。たとえば、約 0.5の光学密度に培養の種々の条件下で増殖するＭ．ツベルキュロシスに関して、当業者は10μｇ／ｌ又はそれ以上の程度で大多数の細胞外生成物を得ることを予期すべきである。従って、正常な又はヒートショック条件下で増殖されたＭ．ツベルキュロシスのための細胞外生成物の合計量（Ｌ）当たり合計４mgのうち、約15〜20％（単独又は組合して）又はそのような既知の細胞外生成物は合計量の約90％を構成するであろう。
【００３５】
本発明の範囲内にあるように企画された大多数の細胞外生成物が存在し、そして SDS／PAGEゲルに出現する広いバンドとして容易に同定できる。さらに、対象の細胞外生成物はさらに、アミノ酸配列決定により特徴化され、そして区別され得る。残る細胞外生成物は少々である。当業者はまた、特定の主な細胞外生成物の相対的な量が培養の条件に依存して変化することを認識するであろう。しかしながら、ほとんどの場合、個々の多量の細胞外生成物の同定は変化しないであろう。
【００３６】
従って、本発明は、ウィルス、細菌、真菌又は原生動物の病原体による感染に対して哺乳類宿主を保護するために使用され得る。多くの場合、たとえばウィルス感染の場合、大多数の細胞外生成物が感染された宿主細胞により生成され得ることは注目されるべきである。大多数の細胞外生成物を放すすべての微生物に対して活性的であるのと同様本発明のワクチン及び方法は細胞内病原体、たとえばマイコバクテリウム属の種々の種及び血清グループ(serogroup）に対する保護免疫性の生成において特に効果的である。本発明のワクチンはまた、存在する疾病状態の処理のために免疫治療剤としても効果的である。
【００３７】
驚くべきことには、細菌病原体又はそれらの免疫原性類似体により細胞外に放されるほとんど又は大多数の生成物による免疫化が投与された化合物の絶対的な免疫原性に関係のない効果的な免疫応答を刺激することができることが本発明者により見出された。生物からのそれらの開放及び従って、抗原処理及び提供に関与する宿主分子へのそれらの利用性により、及び感染の間、組織におけるそれらの自然な高濃度により、病原性物質の大多数の細胞外生成物は他の細菌成分よりもよりしばしば宿主免疫システムに処理され、そして提供される。細胞内病原体の場合、大多数の細胞外生成物が感染された宿主細胞の表面上に提供される主要な免疫原性決定因子であり、そして従って、その囲りの環境における高い存在性を示す。従って、病原性生物の大多数の細胞外生成物に対しての得られた免疫性は、宿主の防御システムの、宿主細胞の内部に隠れる病原体のすばやい検出を可能にし、そして従ってそれらを効果的に阻害する。
【００３８】
より特定的には、病原性細菌により放される主な又は大多数の生成物は、それらのそれぞれの免疫原性活性又は特異性に関係なく、膜結合病原性成分よりも早い速度で、食細胞及び他の宿主免疫システム機構により処理されるように見える。この免疫処理不等性は、病原性物質が正常な免疫活性から隠退された細胞内細菌である場合、特に有意である。感染された宿主の免疫システムへのそれらの豊富且つ連続した提供により、ほとんどの一般的な細菌性細胞外生成物又はそれらの免疫原性類似体は、それらの個々の分子免疫原性特徴にほとんど関係なく激しい免疫応答を刺激する。
【００３９】
非常に豊富な細胞外生成物は、そのとり囲む環境中に標的の病原体により放されるタンパク質及び他の分子体の主な構成成分である。現在の研究は、多くの場合、単一の大多数の細胞外生成物が微生物により放される生成物の40重量％までを含んで成ることを示唆する。よりしばしばには、個々の大多数の細胞外生成物は、感染性病原体により放される合計生成物の約 0.5％〜約25％を占める。さらに、上部５又は６の大多数の細胞外生成物は、微生物により放される合計質量の60％〜70％を含んで成ることが見出され得る。もちろん、当業者は、細胞外生成物の相対レベルが、放される生成物の絶対又は相対量のように時間に対してたえず変動することを理解するであろう。たとえば、pH、酸化剤、容量オスモル濃度、熱及び生物に対するストレスの他の条件、生活環の段階、繁殖状態及びそのとり囲む環境の組成は、放される生成物の組成及び量を変えることができる。さらに、細胞外生成物の絶対レベル及び相対レベルは種間及び種内の菌株の間でさえひじょうに異なっている。
【００４０】
細胞内病原体の場合、細胞外生成物は、生存細菌を含むマクロファージに対する抗菌効果を検出し、そして用いることができる特異的に免疫性のリンパ球の集団を拡張すると思われる。さらに、感染された細胞の表面上でのそれらの反復された表示により、大多数の又は主な細胞外生成物は効果的な抗原性マーカーとして機能する。従って、本発明の教授によれば、病原性細菌の大多数細胞外生成物又はそれらの免疫原的に同等の決定因子に向けられた保護免疫性の誘発及びワクチン接種は、標的病原体により感染される場合、強い細胞介在成分による急速で且つ効果的な免疫応答を高めるよう宿主の免疫システムを促進せしめる。
【００４１】
主にワクチンの生成及び個々のスクリーンされた病原体成分の高い特異性の分子抗原性に基づく免疫応答の刺激に焦点が合わせられて来た従来技術の免疫化活性と直接対照して、本発明は、低い普及性の細胞外生成物よりも低い免疫原性特異性を実際に示す化合物による保護免疫性を確立し又は誘発するために比較的多くの細菌性細胞外生成物又はそれらの免疫原的類似体（それらの免疫原的特異性よりもむしろ）を都合良く開発する。
【００４２】
この開示のために、免疫原的類似体は、標的病原体による続く感染に基づいて哺乳類宿主における保護免疫応答を刺激する能力を有するように、標的の病原体又はそのいづれかの画分により発現される少なくとも１種の多数の細胞外生成物に十分に類似するいづれかの分子又は化合物である。手短に言えば、本発明のワクチンは、特定の病原体により細胞外に放される大多数の生成物（又は実質的に同等の免疫応答を刺激できる分子類似体）を選択し、そしてそれらを比較的純粋な形で単離することによって同定され又は生成される。次に、標的の病原体に対する所望する予防免疫応答が、当業界において良く知られている技法を用いて前記単離された１又は複数の前記単離された免疫反応性生成物を配合し、そして標的の病原体による感染の前、哺乳類宿主を免疫化することによって誘発され得る。
【００４３】
本発明は少なくとも１種、２種又はたぶんいくつかの種の十分に定義された免疫原性決定因子から成るであろうことが予測される。結果として、本発明は、比較的容易で且つすばやく開発され、試験され、そして投与され得る、調和した標準化ワクチンを生成する。さらに、大多数の分泌性又は細胞外生成物に対応する少数の十分に定義された分子の使用が、従来のワクチンに関連する副作用の危険性をひじょうに減じ、そして効果的な免疫原性マーカーの可能な閉塞を排除する。同様に、本発明は弱毒化された又は殺害されたワクチンではないので、生成、精製の間、又は投与に基づく感染の危険性が効果的に排除される。本発明のワクチンは免疫無防備状態の個人、たとえば無症候性結核患者及びHIV により感染された個人に安全に投与され得る。さらに、体液性免疫応答は標的病原体により放される生成物に独占的に向けられるので、有害なオプソニン免疫成分を生成する機会はほとんど存在しない。従って、本発明は、刺激された体液性応答の、抗体敏感性部分からの標的病原体の排除の助けを可能にする。
【００４４】
本発明のもう１つの有益な観点は、ワクチンが収穫され又は生成され、そして続いて精製され得る場合である。たとえば、卓越して多数の細胞外生成物が、標的病原体、たとえばＭ．ツベルキュロシス又はＭ．ボビスの培養物から少ない努力で得られる。所望する化合物が増殖の間、培地から放されるので、それらは従来の技法を用いて標的病原体の細菌内及び膜結合成分から容易に分離され得る。より好ましくは、本発明のワクチンの所望する免疫反応性構成成分が、遺伝的に構築された生物から生成されそして精製され得、ここで前記生物中に、Ｍ．ツベルキュロシス、Ｍ．ボビス、Ｍ．レプラエ又は対象のいづれか他の病原体の特異的細胞外生成物を発現する遺伝子がクローン化されている。
【００４５】
当業界では知られているように、そのような構築された生物は、高レベルの選択された細胞外生成物又は変性された免疫原性類似体を生成するよう変性され得る。他方、免疫保護生成物、その一部又はその類似体は、当業界で良く知られた技法を用いて化学的に合成され得る。どんな生成源でも使用されるが、卓越した又は大多数の細胞外生成物の免疫原性成分は通常の生化学方法、たとえば分別、クロマトグラフィー処理又は他の精製法及び従来の配合技法を用いて分離され、そして続いて、供給可能なワクチンに調製され得る。
【００４６】
たとえば、本発明の典型的な態様においては、標的の病原体はＭ．ツベルキュロシスであり、そしてＭ．ツベルキュロシスによりブイヨン培地中に細胞外放出される大多数の生成物が他の細菌成分から分離され、そして哺乳類宿主に免疫応答を誘発するために使用される。次に個々のタンパク質又はタンパク質のグループが、本発明の技法に従ってワクチンとしての使用のためにそれらを適切にする保護免疫性を誘発するものを同定するために、動物に基づく挑戦実験に利用される。
【００４７】
より特定には、細菌の増殖及び収穫に続いて、それらの物理的に多量であるために、主な細胞外生成物は遠心分離及び濾過により細菌内成分及び他の成分から分離される。所望により、得られる多量の濾液が硫酸アンモニウム沈殿法を用いて分別にかけられ、そして続いて透析され、通常EPと称する細胞外生成物の混合物が得られる。透析された画分における溶解された細胞外生成物は次に、当業界において知られており、そして下記に十分に記載されているような適切なクロマトグラフィー技法を用いて実質的な均質性なものに精製される。
【００４８】
それらの典型的な方法は、 110キロダルトン（kD）〜12kDの範囲の分子量を有するＭ．ツベルキュロシスの14種の個々のタンパク質性の主な細胞外生成物の生成をもたらす。精製に続いて、個々の大多数の細胞外生成物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられる場合、そのそれぞれの分子量に対応する１つのバンドを示し、それによって大多数の細胞外生成物に対応する個々の生成物又は生成物のグループの、ワクチンとしての使用のためへの同定及び調製を可能にする。精製された大多数の細胞外生成物はさらに、当業界において共通する技法を用いて、それらのそれぞれのアミノ酸配列のすべて又は一部を決定することによって特徴づけられ、そして区別され得る。配列決定はまた、前記大多数の細胞外生成物間の可能な構造関係についての情報を提供する。
【００４９】
続いて、免疫化及び哺乳類宿主システムにおける得られた免疫性の刺激は、それらの精製された細胞外生成物の一定時間にわたっての一連の皮下又は皮膚内注射を用いて本発明の技法を通して達成され得る。たとえば不完全フロイントアジュバントにおける精製された大多数の細胞性細胞外生成物による注射、続く、約３週間後、同じアジュバントにおける２回目の注射が、毒性の病原体による続く挑戦に基づいて保護応答を誘発するために使用され得る。本発明の範囲及び教授内での他の典型的な免疫化法は、Syntex Adjuvant Formulation (SAF）における精製された細胞外生成物又はそれらの類似体の一連の３回又は４回の注射を包含する。一連の注射は一般的により効果的であるが、選択された大多数の細胞外生成物又はその免疫原性サブユニット又は類似体の一回の投与は所望の免疫応答を付与でき、そして本発明の範囲内に十分に企画される。
【００５０】
そのような典型的な手段は、従来の許容される実験モデル、たとえばテンジクネズミを用いて示され得る。たとえば、詳細に論ぜられるように、５種の大多数の細胞外生成物（前述のようにＭ．ツベルキュロシスから精製された）の組合せによる何匹かのテンジクネズミの免疫化は、対照動物の対応する偽−免疫化を伴って、SAF アジュバントにおける細菌生成物の一連の３回の注射による免疫化により達成された。個々のタンパク質の典型的な用量は 100μｇ〜２μｇであった。
【００５１】
最後のワクチン化に続いて、すべての動物は感染性で且つ潜在的に致死量のエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに同時に暴露され、そして長期間、モニターされた。対照動物は、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物の組合せにより免疫化された動物と比較する場合、体重の有意な減少を示した。さらに、対照動物の半分が、観察期間に死亡するが、しかし免疫化された動物は結核で死亡しなかった。この実験の後に行なわれた検死は、免疫化されていない対照の動物は保護された動物よりも有意に多くのコロニー形成単位(CFU) 及びそれらの肺及び脾臓における対応する損傷を有した。精製された大多数の細胞外生成物の17種の追加の組合せは、試験される場合、免疫感染防御を提供し、それによって本発明の範囲及びその教授に従って配合され得るワクチンの広範囲性を示した。
【００５２】
しかしながら、本発明は分泌性又は細胞外生成物の組合せに限定されないことが強調されるべきである。たとえば、いくつかの他の実験手段は、本発明の教授に従って哺乳類の保護免疫性を誘発する単一の多数の細胞外生成物の能力を示す。個々の実験においては、テンジクネズミが、本明細書に詳細されるクロマトグラフィー手段を用いて、Ｍ．ツベルキュロシスEDから精製された、単一の大多数の細胞外生成物により免疫化された。
【００５３】
１つの例においては、動物は30kDに相当する分子量を有する精製された多数の分泌性生成物を含むアジュバント組成物により複数の実験で接種された。本発明のもう１つの例においては、異なったテンジクネズミが、71kDに相当する分子量を有する、Ｍ．ツベルキュロシスから単離された多数の細胞外生成物を含むアジュバント組成物により接種された。それらのそれぞれの免疫化に続いて、動物及び適切な対照の両組が、ワクチンの有効性を決定するためにエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスの致死量に暴露された。
【００５４】
より特定的には、１つの実験において、６匹のテンジクネズミが、６週間にわたって３回、SAF における30kDタンパク質 100μｇにより免疫化された。対照の動物は、細胞外タンパク質（EP）又は緩衝液の多量調製物の対応する量により同時に接種された。最後の接種の後３週間で、動物はＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量により挑戦され、そして14週間、モニターされた。30kDのタンパク質により免疫化されたテンジクネズミ及び多量の細胞外調製物により免疫化された動物はそれぞれ67％及び50％の生存率を有するが（大多数の細胞外生成物対EPの予期せぬ卓越した性能を示す）、ところが偽−免疫化された動物はわずか17％の生存率を有した。実験の終結に基づいて、動物は殺され、そして生存する結核菌について試験された。驚くべきことではないが、免疫化されていない動物は、肺及び脾臓にＭ．ツベルキュロシスの著しく高い濃度を示した。
【００５５】
類似する実験を、71kDタンパク質により接種されたそれらの動物に対して行なった。１つの実験においては、６匹のテンジクネズミが、精製された71kDのタンパク質 100μｇを含むSAF アジュバント組成物により３週間にわたって２度接種された。他の動物は、精製されていない細胞外タンパク質又はEPの多量調製物により、正の対照として用いるために及び負の対照として用いるために緩衝液により同様にして免疫化された。エアゾール化された結核菌の致死量への暴露に続いて、テンジクネズミの体重を、６カ月間モニターした。もう一度、多数の細胞外生成物の精製された形により免疫化された動物は、毒性のＭ．ツベルキュロシスに対して保護免疫性を進行せしめた。その期間の最後までには、緩衝液により免疫化された動物は、免疫化された動物に比較して、体重の有意な低下を示した。さらに、陽性の対照及び71kDのタンパク質により免疫化された動物はそれぞれ63％及び50％の生存率を有したが、免疫化されていない動物のすべては、観察期間の最後までに死亡した。
【００５６】
ワクチンの配合は本発明に臨界ではなく、そして投与を促進するために最適化され得ることを注目することは重要である。大多数の病原性細胞外生成物に由来する精製された免疫原性決定因子の溶液は、保護免疫応答を生成するように企画されたいづれかの手段で単独で又は組合して投与され得る。精製されたタンパク質溶液は、単独で供給され、又は投与の前、アジュバントと共に配合され得る。選択された免疫原性決定因子の活性を高めるために本発明で使用される特定の典型的なアジュバントは、SAF 、キノホスホリル脂質Ａを含むアジュバント、フロイント不完全アジュバント及び殺害された細菌を含むフロイント完全アジュバントである。
【００５７】
本発明で有用である追加のアジュバントは、油中水型エマルジョン、無機塩（たとえばみょうばん）、核酸、ブロックポリマー界面活性剤及び微生物の細胞壁（ペプチド糖脂質）である。本発明の範囲を限定するものではないが、アジュバンドは注射の部位からの抗原のゆっくりした放出により免疫応答を強めることができると思われる。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、最初に手短に記載されるであろう図面と共に取られる好ましい典型的な態様の次の特定の記載の考慮から当業者に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明はワクチン及び免疫治療剤としての化合物及びそれらの生成方法及び病原体に対するそれらの使用に向けられる。より特定には、本発明は、ワクチン又は免疫治療剤としての、病原性生物により放される大多数の細胞外生成物又はそれらの免疫原的類似体の生成及び使用、及び感染に対して哺乳類宿主において保護免疫性を生成するための関連する方法に関する。それらの化合物は、単純性の目的のためにこの用途を通してワクチンとして言及されるであろう。
【００５９】
本発明の教授の表示である典型的な態様においては、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物が区別され、そして続いて精製された。テンジクネズミは、個々の生成物の特定の分子免疫原性の決定を伴わないで、精製された形でそれらの普及した大多数の細胞外生成物により免疫化された。さらに典型的な免疫化は、精製された細胞外生成物のみ又は組合して及び種々の用量及び投与の経路により実施された。当業者は、前述の手段がいづれかの病原性生物又は細菌により本発明の方法を実施するために利用され得、そして従って本発明はＭ．ツベルキュロシスに対して向けられたワクチン及び方法に特異的に限定されないことを理解するであろう。
【００６０】
それらの典型的な態様においては、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物がカラムクロマトグラフィーを用いて分離され、そして精製された。細胞外生成物の相対的な量及び精製の決定は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて達成された。ワクチン成分の精製の後、テンジクネズミが大多数の細胞外生成物のみ又は組合して接種され、そして続いてＭ．ツベルキュロシスにより挑戦を受けた。詳細に論ぜられるように、免疫化に続くそれらの細胞外生成物に対する予測される測定可能な応答を開発する他に、本発明のワクチンはエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスの続く致死量に対して、それらの実験動物において効果的な免疫性を意外にも付与した。
【００６１】
それらの典型的な態様は細胞外生成物の精製された形を用いるが、当業者は、本発明は当業界において良く知られている組換え手段又は化学合成の他の形を通して生成される免疫原性類似体を用いて容易に実施され得ることを理解するであろう。さらに、大多数の細胞外生成物の免疫原性類似体、相同体又は選択されたセグメントが本発明の範囲及び教授内で天然に存在する生成物の代わりに使用され得る。
【実施例】
【００６２】
本発明の追加の理解は、ワクチンとしての大多数の細胞外生成物（単独及び組合して）の同定、単離、生成及び使用のために典型的な手段を示す次の非制限的な例から当業者に提供されるであろう。
例  １．マイコバクテリウム  ツベルキュロシスからの多量細胞外タンパク質（EP）の単離及び生成
Ｍ．ツベルキュロシス Erdman 株（ATCC 35801) を、American Tissne Culture Collection (Rockville, Md.) から入手した。凍結乾燥された細菌をMiddlebrook 7H9 培養培地（Difco Laboratories, Detroit, Mich.) に再構成し、そしてMiddlebrook 7H11寒天上に維持した。7H11寒天を、Cohn (Cohn, M.L., Am. Rev. Respir. Dis. 98：295-296)により記載されているようにして、Bacto Middlebrook 7H10寒天 (Difco), OADC Enrichment Medium (Difco), 0.1 ％カゼイン酵素加水分解物(Sigma) 及びグリセロールを用いて調製した。オートクレーブによる滅菌の後、寒天を細菌用ペトリ皿上に分配し(100×15mm）、そして冷却した。
【００６３】
次に、Ｍ．ツベルキュロシスを無菌技法を用いてプレート化し、そして５％ CO2−95％空気、100 ％湿度において37℃で増殖せしめた。7H11上での７日間の培養の後、コロニーをプレートから削り取り、7H9 ブイヨン中に懸濁し、108CFU／mlにし、そして 1.8mlのNunc極低温管 (Roskilde, Denmark)中にアリコートした。それぞれブイヨン１ｌを、その混合物を6.75のpH値に調節する前、蒸留水998ml 及びグリセロール (Sigma Chemical Co.,St. Louis, Mo.)２mlによりBacto Middlebrook 7H9 粉末 4.7ｇを再水和し、そして前記ブイヨンを 121℃で15分間オートクレーブすることによって調製した。次に、アリコートされた細胞をゆっくり凍結し、そして−70℃で貯蔵した。それらの条件下で貯蔵された細胞は生存したまま無限に存続し、そして必要な時に使用された。
【００６４】
多量の細胞外タンパク質 (EP) 調製物を、上記のようにして製造されたMiddlesbrook 7H9ブイヨンにおいて増殖されたＭ．ツベルキュロシスの培養物から得た。再構成に続いて、前記ブイヨンのアリコート 150mlを 121℃で15分間オートクレーブし、そしてガス抜きされたCo-star 225cm2組織培養フラスコ中に分配した。上記のようにして−70℃で貯蔵されたＭ．ツベルキュロシス細胞を融解し、そしてそれを用いて、7H11寒天プレートを接種した。７日間の培養の後、コロニーをプレートから削り取り、数ミリリットルの7H9 ブイヨンに懸濁し、そして単一細胞懸濁液を形成するために水浴において音波処理した。Ｍ．ツベルキュロシス細胞を、Perkin-Elmer Junior モデル35分光計 (Norwalk, Conn)により決定されるように、0.05の初期光学密度で無菌の 150mlアリコートに懸濁した。次に、細胞を、その懸濁液が 0.4〜0.5 の光学密度を示すまで、37℃で３週間、５％CO2 −95％空気中でインキュベートした。
【００６５】
それらの培養物を、7H9 ブイヨンにおける続く培養のために貯蔵ボトルとして使用した。貯蔵ボトルを水浴において音波処理し、単一細胞懸濁液を形成した。Ｍ．ツベルキュロシス細胞を7H9 ブイヨンで希釈し、0.05の初期光学密度を得、そしてその懸濁液が 0.4〜0.5 の光学密度を示すまで、37℃で 2.5〜３週間、５％CO2 −95％空気中でインキュベートした。次に、培養上清液をデカントし、そしてフィルターを、 0.8μｍ及び 0.2μｍの低−タンパク質−結合フィルター (Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, Mich.) を通して連続的に滅菌した。次に、濾液を、10kDのカットオフを有するOmega 膜を備えたFiltron Minisette において約35倍に濃縮し、そして４℃で貯蔵した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE) による多量の細胞外タンパク質調製物の分析は、複数のバンドを有するタンパク質組成物を示した。多量の細胞外タンパク質混合物 (EP) を、培養濾液の40〜95％硫酸アンモニウム留分を得ることによって調製した。
【００６６】
例  ２．マイコバクテリウム  ツベルキュロシスの主な豊富な細胞外生成物の精製
硫酸アンモニウム（品種Ｉ, Sigma)を、０℃で10％〜95％の範囲の濃度で、例１の培養濾液に添加し、そして軽く攪拌し、タンパク質を分別した。次にその懸濁液をプラスチック製ボトルに移し、そして RC3B Sorvall Centrifuge上で3,000rpmでスインギングバケットローターにより遠心分離し、得られた沈殿物をペレット化した。その上清液をデカントし、そして対象の生成物に依存して、その上清流体又はペレットを、追加の精製にゆだねた。対象の生成物が上清液に得られる場合、第２の硫酸アンモニウム留分を、第１留分のそれ以上に塩濃度を高めることによって実施した。軽い攪拌期間の後、溶液を上記のようにして遠心分離し、所望する生成物を沈殿せしめ、そして第２上清液を追加の精製にゆだねた。
【００６７】
遠心分離に続いて、沈殿されたタンパク質を適切な冷たい緩衝液に再溶解し、そして塩を除去するために 6,000〜8,000 の分子量カットオフを有するスペクトラポー透析膜 (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, California) により集中的に透析した。細胞外タンパク質の濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinuis)により決定し、そして画分成分をSDS-PAGEを用いて決定した。次にその画分を追加の精製のためにクロマトグラフィーカラムに適用した。
【００６８】
上記に概略されている一般スケムを用いて、14の細胞外生成物を、例１に記載される方法により得られた多量細胞外タンパク質濾液から精製した。正確な硫酸アンモニウム沈殿法及びクロマトグラフィー処理法は、単離された個々の細胞外生成物のために下記に記載されている。
【００６９】
Ａ．110kD の細胞外生成物
１．50〜100 ％の硫酸アンモニウム沈殿物を上記のようにして得た。
２．再溶解された沈殿物を透析し、そして10％ソルビトール、10mMのリン酸カリウム、      pH７，５mMの２−メルカプトエタノール、及び0.2mM のEDTAから成るカラム緩衝液      を含む、DEAE Sepharose CL-6B又はQAE Sepharose イオン交換カラムに適用し、そ      して塩化ナトリウムグラジエントにより溶出した。約550mM で110kD のタンパク質      溶出物を含む画分を集めた。
３．集められた画分を、PBS(リン酸緩衝溶液）中、S200 Sepharoseサイズ分別カラムに      適用した。タンパク質は110kD の均質タンパク質として溶出した。
【００７０】
Ｂ．80kDの細胞外生成物
１．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット (０℃で１時間）を捨て、そして25〜60％の      硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を上記のようにして保持した。
２．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)により      充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化し、そしてタンパ      ク質サンプルを25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、そしてカラム      に適用した。そのカラムを同じ緩衝液により一晩洗浄した。25mMのトリス (pH8.7)      中、10mM〜200mM のNaclの第１の塩グラジエントを、他のタンパク質を溶出するた      めに前記カラムに通した。第２の塩グラジエント(200〜300mM のNacl) をカラムに      通し、そして80kDのタンパク質が約275mM のNaclで溶出した。
【００７１】
３．Q-Sepharose HPカラムで、25mMのトリス、 pH8.7, １ＭのNaclにより充填し、そし      て25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化した。タンパク質サンプルを      25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、そして前記カラムに適用した      。カラムを同じ緩衝液により洗浄し、そして次に、25mMのトリス (pH8.7)中、 200      〜300mM のNaclにより溶出した。
４．80kDのタンパク質を含む画分を集め、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに      対して透析し、そして次に、Speed-Vac 濃縮機で１〜２mlに濃縮した。タンパク質      サンプルをSuperdex75カラムに適用し、そして25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNacl      により溶出した。80kDのタンパク質は均質タンパク質として溶出した。
【００７２】
Ｃ．71kDの細胞外生成物
１．40〜90％の硫酸アンモニウム沈殿物を上記のようにして得た。但し、71kDの生成物      を7H9 ブイヨン中でpH7.4 及び０％CO2 でインキュベートし、そして42℃で３時間      、週当り１回、ヒートショックを与えた。沈殿物を初期緩衝液（Initial Buffer)(      20mMのHepes,２mMのMgAc, 25mMのKcl, 10mM の(NH4)2SO4, 0.8mMのDL−ジチオトレ      イトール、pH7.0)に対して透析した。
【００７３】
２．再溶解された沈殿物を、初期緩衝液により平衡化されているATP アガロースカラム      に適用した。流出液を集め、そしてATP アガロースカラムに再び適用した。71kDの      タンパク質は前記カラムに結合させた。
３．続いて、ATP アガロースカラムを、まず初期緩衝液、次に１Ｍのkcl 、続いて初期      緩衝液により洗浄した。
４．均質の71kDタンパク質を10mMのATP によりカラムから溶出し、そしてリン酸緩衝液      に対して透析した。
【００７４】
Ｄ．58kDの細胞外生成物
１．25〜50％の硫酸アンモニウム沈殿物を上記のようにして得た。
２．再溶解された沈殿物を透析し、そしてDEAE-Sepharose CL-6B又はQAE-Sepharose カ      ラムに適用し、そしてNaclにより溶出した。58kDのタンパク質を含む集められた画      分を約400mM のNaclで溶出した。
３．次に集められた画分をSepharose CL-6B サイズ分別カラムに適用した。タンパク質      は約 670〜700,000 ドルトンで溶出した。
４．溶出されたタンパク質をチオプロピルセファロースカラムに適用した。均質の58kD      タンパク質が約 250〜350mM の２−メルカプトエタノールで溶離した。その溶離さ      れたタンパク質をSDS-PAGEを用いてモニターし、そして図１Ａ、カラム２に示され      る単一バンドを示した。
【００７５】
Ｅ．45kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む2.5mM のトリス (pH8.7)          により充填し、そして25mMのトリス、10mMのNacl, pH8.7 により平衡化した。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、10mMのNacl，pH8.7 に対して透析し、          そしてカラムに適用した。次に、そのカラムを同じ緩衝液により一晩洗浄した          。
ｃ．カラムを、25mMのトリス(pH8.7) 緩衝液中、塩グラジエント (10mM〜200mM)に          より溶離した。45kDのタンパク質が約40mMのNaclで溶離した。
【００７６】
３．ａ．Q-Sepharose HP (Pharmacia)カラムを、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再び平衡化          した。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に、同じ緩衝液を用いて洗浄した。
ｃ．カラムは25mMのトリス (pH8.7)中、10〜150mM のNaclにより溶離された。
【００７７】
４．ａ．45kDの生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10m          M のNaclに対して透析し、その後、Speed Vac 濃縮機で１mlに濃縮した。
ｂ．濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperdex75          カラムに適用した。生成物は、均質のタンパク質として溶離した。その溶離さ          れたタンパク質を、SDS-PAGEを用いてモニターし、そして図１Ｂ、カラム２に          示される単一バンドをもたらした。
【００７８】
Ｆ．32kDの細胞外生成物（Ａ）
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．カラムを、25mMのトリス (pH8.7)緩衝液中、塩グラジエント (10mM〜200mM)に          より溶出した。32kDのタンパク質を約70mMのNaclで溶出した。
【００７９】
３．ａ．32kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。32kDの生成物が均質          のタンパク質として溶離した。
【００８０】
４．ａ．Q-Sepharose HPカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化し          た。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、続いて同じ緩衝液により洗浄した。
ｃ．カラムを 100〜300mM のNaclグラジエントにより溶出した。ラベルされた32Ａ          、すなわち均質のタンパク質が約120mM のNaclで溶出し、そして図１Ｂ、カラ          ム４において単一バンドとして示されている。
【００８１】
Ｇ．32kDの細胞外生成物（Ｂ）
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【００８２】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．25mMのトリス (pH8.7)中、10mM〜200mM のNaclの予備塩グラジエントを行ない          、種々のタンパク質を溶出した。カラムの平衡化に続いて、第２の塩グラジエ          ント(200〜300mM のNacl) を行なった。32kDのタンパク質が約225mM のNaclで          溶離した。
【００８３】
３．ａ．Q-Sepharose HPカラム(Pharmacia) を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化し          た。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、続いて同じ緩衝液により洗浄した。
ｃ．カラムを同じ緩衝液中、 200〜300mM のNaclグラジエントにより溶出した。
【００８４】
４．ａ．32kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。手段Ｈを用いて分離          された32kDのタンパク質と32kD生成物とを区別するためにラベルされた32Ｂが          均質タンパク質として溶出し、そして図１Ｂ、カラム３上に単一バンドとして          示されている。
【００８５】
Ｈ．30kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【００８６】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．カラムを、25mMのトリス (pH8.7)緩衝液中、塩グラジエント (10mM〜200mM)に          より溶出した。30kDのタンパク質を約140mM のNaclで溶出した。
【００８７】
３．ａ．30kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。30kDの生成物が均質          タンパク質として溶出し、そして図１Ｂ、カラム５上に単一のバンドとして示          される。
【００８８】
Ｉ．24kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【００８９】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．25mMのトリス (pH8.7)中、10mM〜200mM のNaclの予備塩グラジエントを行ない          、種々のタンパク質を溶出した。カラムの平衡化に続いて、第２の塩グラジエ          ント(200〜300mM のNacl) を行なった。24kDのタンパク質が約250mM のNaclで          溶離した。
【００９０】
３．ａ．Q-Sepharose HPカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化し          た。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、続いて同じ緩衝液により洗浄した。
ｃ．カラムを同じ緩衝液中、 200〜300mM のNaclグラジエントにより溶出した。
【００９１】
４．ａ．24kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。24kDの生成物が均質          タンパク質として溶出し、そして図１Ｂ、カラム７上に単一のバンドとして示          されている。
【００９２】
Ｊ．23.5kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【００９３】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．カラムを、25mMのトリス (pH8.7)緩衝液中、塩グラジエント（10mM〜200mM)に          より溶出した。23.5kDのタンパク質を約80mMのNaclで溶出した。
【００９４】
３．ａ．Q-Sepharose HPカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化し          た。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、続いて同じ緩衝液により洗浄した。
ｃ．カラムを同じ緩衝液中、 100〜300mM のNaclグラジエントにより溶出した。
ｄ．段階３ａ〜３ｃを反復した。
【００９５】
４．ａ．23.5kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10m          M のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク          質サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そして同じ緩衝液により溶出した。23.5kDの生成物が均          質のタンパク質として溶出した。その溶出されたタンパク質をSDS-PAGEを用い          てモニターし、そして図１Ｂ、カラム６に示される単一のバンドをもたらした          。
【００９６】
Ｋ．23kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％（０℃で１時間）及び25〜60％（０℃で一晩）の硫酸アンモニウムの          カットを捨てた。
ｂ．60〜95％の硫酸アンモニウムのカットを保持した。
【００９７】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む50mMのBis-トリス (pH7.          0)により充填し、そして50mMのBis-トリス、pH7.0, 100mMのNaclにより平衡化          した。
ｂ．タンパク質サンプルを、50mMの Bis−トリス、pH7.0, 100mMのNacl緩衝液に対          して透析し、そしてカラムに適用し、その後、同じ緩衝液により一晩カラムを          洗浄した。
ｃ．カラムを、50mMの Bis−トリス (pH7.0)中、 100〜300mM のNacl線状グラジエ          ントにより溶出した。
ｄ．約 100〜150mM のNaclで溶出される23kDのタンパク質を含む画分を集めた。
【００９８】
３．ａ．タンパク質画分を、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、そし          てSarant Speed Vac濃縮機上で１〜２mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用した。生成物は、図１Ｂ、カラム８に示されるように均質の          タンパク質として溶出した。
【００９９】
Ｌ．16kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【０１００】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．カラムを、25mMのトリス (pH8.7)緩衝液中、塩グラジエント（10mM〜200mM)に          より溶出した。16kDのタンパク質を約50mMのNaclで溶出した。
【０１０１】
３．ａ．16kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex 75 カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。16kDの生成物が均          質のタンパク質として溶出した。その溶出されたタンパク質をSDS-PAGEを用い          てモニターし、そして図１Ｂ、カラム９に示される単一のバンドを得た。
【０１０２】
Ｍ．14kDの細胞外生成物
１．ａ．０〜25％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で１時間）を捨てた。
ｂ．25〜60％の硫酸アンモニウムのカット（０℃で一晩）を保持した。
【０１０３】
２．ａ．DEAE CL-6Bカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.7)に          より充填し、そして次に25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより平衡化した          。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、次に同じ緩衝液により一晩洗浄した。
ｃ．カラムを、25mMのトリス (pH8.7)緩衝液中、塩グラジエント（10mM〜200mM)に          より溶出した。14kDのタンパク質を約60mMのNaclで溶出した。
【０１０４】
３．ａ．Q-Sepharose HPカラム (Pharmacia)を、１ＭのNaclを含む25mMのトリス (pH8.          7)により充填し、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclにより再平衡化し          た。
ｂ．タンパク質サンプルを、25mMのトリス、pH8.7, 10mM のNaclに対して透析し、          そしてカラムに適用し、続いて同じ緩衝液により洗浄した。
ｃ．カラムを同じ緩衝液中、10〜150mM のNaclグラジエントにより溶出した。
ｄ．段階３ａ〜３ｃを反復した。
【０１０５】
４．ａ．14kD生成物を含む画分を集め、プールし、そして25mMのトリス、pH8.7, 10mM           のNacl溶液に対して透析し、その後、Speed-Vac 濃縮機により前記タンパク質          サンプルを１mlに濃縮した。
ｂ．前記濃縮物を、25mMのトリス、pH8.7, 150mMのNaclにより平衡化されたSuperd          ex75カラムに適用し、そしてこの緩衝液により溶出した。14kDの生成物が均質          のタンパク質として溶出した。その溶出されたタンパク質をSDS-PAGEを用いて          モニターし、そして図１Ｃ、カラム２に示される単一のバンドをもたらした。
【０１０６】
Ｎ．12kDの細胞外生成物
１．０〜10％の硫酸アンモニウム沈殿物を得た（４℃で一晩）。
２．再溶解された沈殿物を、S200 Sephacrylサイズ分別カラムに適用し、12kDの分子と      してタンパク質を溶出した。
３．タンパク質画分を、DEAE-Sepharose CL-6B又はQAE-Sepharose イオン変換カラムに      適用し、そして上記のようにNaclグラジエントにより溶出した。約12kDの分子量を      有する２種の均質タンパク質を含む画分が約 300〜350mM のNaclで溶出し、そして      集めた。前記タンパク質はラベルされた12Ａ及び12Ｂであり、そして図10、カラム      ２に示されるダブレットとして精製された。
【０１０７】
図１のSDS-PAGEプロフィールに示されるように、Ｍ．ツベルキュロシスの主な又は多数の細胞外タンパク質を、上記例２Ａ−２Ｎに記載されている手段を用いることにより均質性に精製した。より特定には、図１は、SDS-PAGEを用いて展開された４種の典型的な12.5％アクリルアミドゲルを例示しており、そしてそれらはラベルされた１Ａ，１Ｂ，１Ｃ及び１Ｄであった。ゲル１Ａ−１Ｃのレーン１での標準は、66, 64, 36, 29, 24, 20及び14kDの分子量を有する。ゲル１Ｄにおいては、レーン１における標準は、68, 45, 31, 29, 20, 及び14kDの分子量を有するタンパク質を含む。それぞれの精製された細胞外生成物を含むレーンは、個々のタンパク質の報告された分子量で実質的に１つのバンドを示す。ゲル１Ｄにおいて、12kDのタンパク質はレーン２に見られるダブレットとして進行することが注目されるべきである。配列の分析は、低部の12kD（又は12B kDバンド）は上部の12kD（又は12A kD) バンドに等しいことを示す。但し、それは最初の３個のＮ−末端アミノ酸を欠いている。
【０１０８】
それらの個々の典型的な大多数の細胞外生成物の追加の分析が図２に提供される。より特定には、図２は、単離された生成物が実際、異なっていることを示すそれらの精製された細胞外生成物から得られたＮ−末端配列のデータの表編集である。タンパク質32A, 32B及び30はすべて、同じ5N- 末端アミノ酸を有し、従って追加の配列決定はそれらを完全に特徴づけそして区別するために必要であった。図３は、それらの３種の精製された分泌性生成物のための拡張されたＮ−末端アミノ酸配列を示す。16, 31及び36の位置での異なったアミノ酸は、それらの単離されたタンパク質が、分子量におけるそれらの類似性にもかかわらず、お互い異なっていることを示す。
【０１０９】
タンパク質30, 32A 及び32B の他に、他の大多数の細胞外生成物の拡張されたＮ−末端アミノ酸配列が、主要構造データを提供するために、及びタンパク質間の可能な関係を暴露するために決定された。配列決定は、当業界において良く知られている技法を用いて、例２に従って精製された細胞外生成物に対して行なわれた。それぞれ個々の細胞外生成物について決定された、Ｎ−末端アミノ酸配列の種々の長さが、損なわれていないタンパク質の見掛分子量により同定され、そして天然に存在するアミノ酸について標準の１つ文字略語を用いて表わされている。
【０１１０】
記号による表示の確立した規則に従って、Ｎ−末端配列は、カルボキシル末端へのアミノ末端の方向において左から右に書かれている。決定されたアミノ酸の同定が一定以下であるそれらの位置は下線が引かれている。特定の位置でのアミノ酸が未知であり又はあいまいである場合、配列中のその位置は点線により表示されている。最後に、２つのアミノ酸がスラッシュにより分けられている場合、正しい構成成分は明白に同定されてはおらず、そしていづれか１つがその配列中の位置を占めている。
【０１１１】
【表１】
2005104983.tif 000002
【０１１２】
【表２】
2005104983.tif 000003
【０１１３】
SDS-PAGEを用いて確かめられた物性と組合されたこの配列データは、本発明のそれらの代表的な大多数の細胞外生成物の特徴化及び区別を可能にする。記載される分析は、それらのタンパク質がＭ．ツベルキュロシスの細胞外生成物の大部分を構成し、そして71kD, 30kD, 32A kD, 23kD及び16kDの生成物が合計の利用できる細胞外生成物の約60重量％から構成されていることを示唆する。30kDのタンパク質は、Ｍ．ツベルキュロシスにより放される合計生成物の25重量％までを構成できることがさらに評価される。従って、本発明の実施において有用なＭ．ツベルキュロシスの個々の典型的な大多数の細胞外生成物は、細胞外生成物の合計重量の約 0.5％〜約25％までの範囲を占める。
【０１１４】
前述のように、ほとんどの免疫原的に特異的な細胞外生成物を適切に同定する従来のウェスターンブロット分析の無能性のために、本発明者は、大多数の細胞外生成物の免疫原性をそれらの多数性に基づいて分析することを決定し、そして従って、同定及び単離の容易さを付与できる。驚くべきことには、それらの大多数の細胞外生成物が、本発明者にそれらがワクチンとして機能できる結論を導びく、予期できない効果的な免疫応答を誘発することが見出された。この驚くべき発見は、上記本発明の非制限的な機能的理論の進歩を誘導する。
【０１１５】
本発明の効能を示すために、追加の実験が、当業界において許容される実験モデルに保護免疫性を誘発するために種々の典型的な用量で、個々の大多数の細胞外生成物及びそれらの組合せを用いて行なわれた。より特定には、精製された個々の大多数の細胞外生成物を用いて、続いてＭ．ツベルキュロシスにより挑戦されるテンジクネズミにおける保護免疫性を誘発せしめた。それらのタンパク質が保護免疫性を誘発できたことを示した後、５種の精製された大多数の細胞外生成物の組合せが、異なって投与路を用いて同様に試験された。特に、30kDの多数の細胞外生成物が、71kDの細胞外生成物の精製された形と同様、許容される動物モデルにおいて保護免疫性を誘発するために使用された。個々の典型的な大多数の細胞外生成物に関しては、５種の大多数の細胞外生成物の組合せワクチンがＭ．ツベルキュロシスの致死量での挑戦に対して保護を付与した。本発明のそれらの典型的なワクチンの種々の研究の結果は次の通りである。
【０１１６】
特定の病原体フリーの雄のHartley テンジクネズミ（Charles River Breeding Laboratories, North Wilmington, Massachusetts）を、Ｍ．ツベルキュロシスによる免疫原性又はエアゾール挑戦を包含するすべての実験で使用した。動物はステンレス鋼製カゴに２又は３匹で収容され、そして標準のテンジクネズミの食べ物及び水に自由に近づくことができた。動物の施設に到着した後、テンジクネズミを、それらが健康であることを確認するために個々の実験の開始前、少なくとも１週間観察した。
【０１１７】
初期実験は、通常存在する合計の細胞外タンパク質の３％〜25％を含むと思われている個々の大多数の細胞外生成物を用いて行なわれた。それらの実験は、大多数の細胞外生成物が効果的な免疫応答を誘発することを示す。より詳しくは、単離された30kD及び71kDの細胞外生成物は、Ｍ．ツベルキュロシスの致死量への暴露に基づいてテンジクネズミを保護する細胞介在免疫応答を個々に生成することができることを示された。
【０１１８】
例  ３．30kDのタンパク質により免疫化されたテンジクネズミの細胞介在免疫性についての精製された30kDタンパク質皮膚試験
測定可能な免疫応答が多数の細胞外生成物の精製された形により誘発され得ることを示すために、皮膚過敏性アッセイを行なった。テンジクネズミを、例２で精製され、そしてＭ．ツベルキュロシスの合計の細胞外生成物の約25％を占めると思われる、典型的な大多数の、Ｍ．ツベルキュロシスからの30kD分泌生成物により免疫化した。３回の個々の実験において、テンジクネズミは、SAF アジュバント中、実質的に精製された30kDタンパク質 100μｇにより３週間ごとに３回免疫化された。対照動物はSAF 中、緩衝液により同様に免疫化された。最後の免疫化の後、３週間で、テンジクネズミは、皮膚過敏性アッセイにおいて、典型的な30kDタンパク質により挑戦された。
【０１１９】
テンジクネズミの背部の毛を削り、そして30kDタンパク質 0.1，１及び10μｇの注射を皮膚内にし、得られる紅斑（皮膚の赤変）及び硬化を、下記表３に示されるように24時間後に測定した。データは、従来の方法を用いて決定される場合、グループについての平均測定値±標準誤差 (SE) で報告されている。NDは、本発明のこの特定の観点が行なわれなかったことを示す。
【０１２０】
【表３】
2005104983.tif 000004
【０１２１】
表３に示されるように、典型的な30kD分泌生成物により免疫化されたテンジクネズミは、著しい紅斑及び硬化により明白なように強い細胞介在免疫応答を示した。対照的に、対照動物は最少の応答を示した。
30kD分泌生成物の免疫反応性を確かめ、そして感染性結核へのその適用性を示すために、免疫化されていないテンジクネズミを、Ｍ．ツベルキュロシスにより感染せしめ、そしてこのタンパク質により次のようにして挑戦せしめた。
【０１２２】
例  ４．Ｍ．ツベルキュロシスにより感染されたテンジクネズミの細胞介在免疫応答についての精製された30kDタンパク質試験
テンジクネズミの感染を要する実験に使用するための細菌を得るために、Ｍ．ツベルキュロシスをまず、7H11寒天上で培養し、そしてテンジクネズミの肺に一度、継代し、それらが毒性であることを確めた。このために、テンジクネズミは、１ml当たり５×104 個の細菌を含む7H9 ブイヨンにおける細菌の懸濁液10mlによるエアゾールより挑戦された。
【０１２３】
テンジクネズミが病気になった後、動物を殺害し、そして顕著なＭ．ツベルキュロシス病変を含む肺を取り出した。個々の肺をすりつぶし、そして7H11寒天上で７〜10日間培養した。細菌をプレートから削り取り、10％グリセロールを含む7H9 ブイヨンに希釈し、水浴において音波処理し、単一細胞懸濁液を得、そして約２×107 個の生存細菌／mlの濃度で−70℃でゆっくり凍結した。凍結された細胞の生存率を、その細菌懸濁液を融解し、そしてその懸濁液の一連の希釈物を7H11寒天上で培養することによって測定した。挑戦のすぐ前で、バイアルの細菌細胞を融解し、そして7H9 ブイヨンにおいて所望する濃度に希釈した。
【０１２４】
テンジクネズミを、特別に企画されたルーサイト製エアゾールチャンバーにおいて生存するＭ．ツベルキュロシスのエアゾールに暴露した。エアゾールチャンバーは14×13×24 (インチ) の大きさであり、そしてテンジクネズミを導入し又は除くために反対側上に２つの直径６インチの入口を含んだ。真空ポンプ（Gast Mfg. Co., Benton Harbor, Michigan）は、30ポンド／インチ2 で空気をネビュライザーベンチュリ単位 (nebulizer-venturi unit) (Mes Inc., Burbank California)に供給し、そしてエアゾールを、バチルス属の10ml懸濁液から生成した。 0.2μｍの呼吸回路フィルター単位 (Pall Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rics) を、アセンブリーの内部圧及び外部圧を平衡化するためにチャンバーの１つの端で配置した。安全性の考慮のために、エアゾール挑戦は、ラミナーフローフード内に完全に配置されたチャンバーにより行なわれた。
【０１２５】
動物を病原性エアゾールに30分間暴露し、この間、噴霧器におけるハチルス属の懸濁液が完全に使い尽くされた。個々のエアゾールを、１ml当たり約 5.0×104 個の細菌粒子を含む懸濁液10mlから生成した。前の研究は、細菌のこの濃度へのテンジクネズミの暴露が保護されていない動物において確実に感染を引き起こすことを示した。エアゾール感染に続いて、テンジクネズミを、ラミナーフローバイオハザード (laminer flow biohazard) 安全性密封容器 (Airo Clean Englineering Inc., Edgemont, Pennsylvania) 内に含まれるステンレス鋼製カゴに収容し、そして病気の徴候について観察した。動物は実験を通して、標準のテンジクネズミ用食物及び水に自由に近づくことができた。
【０１２６】
この実験においては、感染されたテンジクネズミを殺害し、そして脾臓性リンパ球増殖を、種々の濃度の30kDタンパク質に対する応答において測定した。より詳しくは、脾臓性リンパ球を、Briemanand Horwitz (J. Exp. Med. 164 : 799-811)により記載されるようにして得、そして精製した。リンパ球を、ペニシリン(100Ｕ／ml)、ストレプトマイシン(100μｇ／ml) 及び10％ウシ胎児血清 (GIBCO)を含むRPMI 1640 (GIBCO Laboratories, Grand Island, New York)において 107／mlの最終濃度に調整し、そして種々の濃度の精製された30kD分泌生成物と共に、合計 100μｌの体積でマイクロテストウェル (96−ウェルの丸底組織培養プレート：Falcon Labware, Oxnard, California) において、２日間37℃で、５％CO2-95％空気及び 100％湿度でインキュベートした。感染されなかった動物は負の対照として使用された。
【０１２７】
インキュベーション期間の最後で、0.25μCiの〔3H〕チミジン (New England Nucloar, Boston, Massachusetts) を個々のウェルに添加し、そして細胞を37℃で、５％CO2-95％空気及び 100％湿度で２時間さらにインキュベートした。複数サンプル自動細胞収穫機（Skatron Inc., Sterling, Virginia) を用いて、個々のウェルを洗浄し、そして流出液をフィルターマット (filtermat)(Skatron) に通した。別々のマイクロテストウェルを表わすフィルターマット部分を、シンチレーションバイアルに配置し、そして２mlのEcoscint H液体シンチレーションカクテル (National Diagnostics, Manville, New Jersey) を添加した。β粒子放出を、βシンチレーションカウンター (Beckman Instruments Inc., Fullerton. California)で測定した。
【０１２８】
感染された及び感染されていないテンジクネズミからの組織サンプルを、1 及び10μｇ／mlの単離された30kD分泌タンパク質に対してアッセイした。次に、サンプルを、それらの〔3H〕チミジンを結合する能力についてモニターした。それらのアッセイの結果は、下記表４に示されている。
データは、刺激指数として報告されており、この開示のためには次のように定義される：抗原と共にインキュベートされたリンパ球の平均〔3H〕チミジン取り込み／抗原を伴わないでインキュベートされたリンパ球の平均〔3H〕チミジン取り込み。
【０１２９】
【表４】
2005104983.tif 000005
【０１３０】
表４に示されるように、感染された動物の細胞は、この大多数の分泌生成物への暴露に対する応答において投与量依存性脾臓性リンパ球増殖により明らかなように、典型的な30kDタンパク質に対して強い応答を示した。逆に言えば、感染されなかった対照動物は、低いリンパ球増殖を示した。従って、30kD分泌生成物は明らかに、Ｍ．ツベルキュロシスにより感染された哺乳類において細胞介在免疫応答を誘発する。
本発明のワクチンの保護観点を示すために、テンジクネズミを精製された30kDタンパク質により免疫化し、そして次のようにしてＭ．ツベルキュロシスに暴露した。
【０１３１】
例  ５．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスによる、30kD免疫化テンジクネズミの挑戦
前述のように、動物を、SAF 中、典型的な30kD分泌タンパク質 100μｇにより３週間隔で３度免疫化した。対照のテンジクネズミは、SAF 中、EP 120μｇにより免疫化し、又は同じアジェバント中、緩衝液により偽−免疫化した。最後の免疫化の後、３週間で、動物は、例４に記載されているようにして、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめられた。動物の３つのグループについての生存率をモニターし、そして図４にグラフにより示す。絶対的な死亡率は、下記表５に示されるように、挑戦後14週で決定された。
【０１３２】
【表５】
2005104983.tif 000006
【０１３３】
図４に示されるように、典型的な30kDタンパク質により３度免疫化されたテンジクネズミは死に対して保護された。30kDタンパク質により免疫化されたテンジクネズミのうち約67％が生存し、ところが対照の偽免疫化されたテンジクネズミはわずか17％が生存した。
免疫化された動物の体重維持をまたモニターし（データは示されていない）、そしてさらに、本発明により教授されるように病原性細菌により生成される大多数の細胞外生成物を組み込むワクチンの予防能力を示す。免疫化された動物はそれらの体重を維持するように見えるが、偽免疫化された動物の高い死亡率は免疫化された動物と対照の動物との間のグラフ比較を除外した。
【０１３４】
体重をモニターする研究の結論に続いて、生存する動物を殺害し、そして個々の動物の右肺及び脾臓を、生存Ｍ．ツベルキュロシスについてアッセイした。動物を２％アンフィル溶液（National Laboratories, Montvalo, New Jerssy)によりリークし、そして肺及び脾臓を無菌状態で取り出した。肺における肉眼で見える一次表面病変部を、肉眼での観察により数えあげた。右肺及び脾臓におけるＭ．ツベルキュロシスのコロニー形成単位 (CFU)を、10mlの7H9 における個々の器官を、乳鉢及び乳棒及び90−メッシュのNorton Alundum (Fisher) により均質化し、前記組織均質物を7H9 に連続的に希釈し、そして一滴当たり 0.1mlで、7H11寒天の重複プレート上で前記希釈液を培養することによって決定した。すべてのプレートはモジュールインキュベーターチャンバーに維持され、そして37℃で、５％CO2,  95％空気及び 100％湿度で12〜14日間インキュベートされた。このアッセイはこの手段を用いて行なわれ、そして計数の結果は、平均コロニー形成単位 (CFU)±標準誤差 (SE) として下記表６に示される。
【０１３５】
【表６】
2005104983.tif 000007
【０１３６】
表６に示されるように、典型的な30kD分泌タンパク質による免疫化は、肺及び脾臓におけるＭ．ツベルキュロシスの増殖を制限した。１匹の生存する為免疫化された動物からのデータのみが比較目的のために利用できるが、４匹の生存する30kD免疫化動物は生存する偽免疫化された動物よりも、それらの肺において 0.7対数少ないCFU 及びそれらの脾臓において１対数少ないCFU を有した。CFU 計数と死亡率との間の高い相互関係の前の論証に基づけば、生存する動物は、CFU 分析が行なわれる前に死亡した動物よりも、肺及び脾臓において少ないCFU を多分有した。免疫化された動物の肺及び脾臓におけるCFU のこの低下は、結論的に、本発明の範囲及び操作能力を示すものである。
Ｍ．ツベルキュロシスからのもう１つの大多数の細胞外生成物、すなわち71kDの細胞外生成物の免疫保護能力を、その免疫保護能力を示すためにその単離された形で試験した。
【０１３７】
例  ６．EPの多量調製物により免疫化されたテンジクネズミの精製された71kDタンパク質の皮膚試験
動物において効果的な免疫応答を刺激する71kDタンパク質の可能性を示すために、この単離された大多数の細胞外生成物を用いて、皮膚過敏性アッセイにおいてＭ．ツベルキュロシス細胞外タンパク質 (EP) の多量調製物により免疫化されたテンジクネズミの皮膚試験行なった。上記のように、EPは、Ｍ．ツベルキュロシスによる感染に対して獲得された免疫性を付与するが、しかし本発明のワクチンよりも低かった。
【０１３８】
テンジクネズミを、例２に記載されているようにして調製されたEPの多量調製物 120μｇにより、３週間隔で２回免疫化した。接種は、EPの代わりに緩衝液を受ける偽免疫化された動物により不完全フロイントアジュバントにおいて調製した。最後の接種の後、３週で、個々のグループからのテンジクネズミを、その背部の毛を削り取り、そして0.1, 1.0及び10μｇの71kDタンパク質の皮膚内注射により皮膚試験した。10.0μｇの緩衝液を、対照として用い、そしてすべての注射は、合計体積 0.1mlで行なわれた。紅斑及び硬化の直径を24時間後に測定し、そしてその結果は下記表７に示されている。データは、従来の方法を用いて決定される場合、グループについての平均測定値±標準誤差（SE) で報告されている。
【０１３９】
【表７】
2005104983.tif 000008
【０１４０】
免疫化された動物の応答は、緩衝液のみにより挑戦されたテンジクネズミの応答のほとんど２倍であり、そして動物を免疫化するために使用されたEPと同一の多量EPにより挑戦された応答に匹敵できた（データは示されていない）。
【０１４１】
精製された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物が細胞介在免疫応答を誘発することをさらに確かめるために、多量EPにより免疫化されたテンジクネズミを殺し、そして脾臓性リンパ球の増殖を、種々の濃度の71kDタンパク質に応答して測定した。免疫化されていない動物は対照として用いた。例４の手段に従って、リンパ球を、71kDタンパク質と共に及びそれを伴わないで２日間インキュベートし、そして次に、〔3H〕チミジンを結合するそれらの能力についてアッセイした。
データは、例４におけるようにして計算された刺激指数として報告されている。この71kD挑戦の結果は、下記の表８に示されている。
【０１４２】
【表８】
2005104983.tif 000009
【０１４３】
表８に示されるように、リンパ球増殖アッセイに関する刺激指数は、皮膚過敏性アッセイにおいて得られた結果に匹敵した。71kD及び多量EPにより試験されたサンプルは、対照により得られた応答よりも２〜３倍高い応答を示しており、これは、単離された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物がＭ．ツベルキュロシス抽出物により免疫化された動物において細胞介在免疫応答を刺激できることを示唆する。しかしながら、精製された大多数の又は主な細胞外生成物は、従来技術の又は多量組成物に関連する問題を有さず、そして本発明のワクチンを従来技術のものよりも卓越したものにする合成及び商業的生産に容易に適応され得ることが再び強調されるべきである。
【０１４４】
より詳しくは、多量調製物は、近代の生物分子技法を通して、大規模には容易に製造することができない。すべての細胞外生成物を含むそれらの精製されていない多量調製物の商業的な生成は、模大な量の標的病原体又は密接に関連する種の培養及び得られる上清液の収穫を包含する。そのような生成法は、標的病原体、毒性副生成物又は他の寄生物質による汚染にひじょうに敏感である。さらに、そのような調製における大多数の免疫原決定因子が、免疫化された集団の敏感なセグメントにおいて毒性免疫反応を刺激しがちである。それらの精製されていない多量調製物の使用はまた、結核のスクリーニング及び制御のために現在使用される最とも普及している皮膚試験の使用を否定する。
【０１４５】
対照的に、本発明のワクチンは、高い収率の形質転換宿主を用いて比較的安全に多量生成され得る。同様に、本発明のワクチンは、多量細胞外生成物の広範囲の種類の生成法に対立ものとして、標準化されたバッチ法で容易に生成され得る。さらに、宿主免疫システムに提供される免疫原性決定因子の数が比較的少ないので、毒性反応及び通常のスクリーニング試験の無効の機会がひじょうに減じられる。
【０１４６】
例  ７．71kD免疫化テンジクネズミの精製された71kDタンパク質皮膚試験
単離された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物がEP免疫化動物において細胞介在免疫応答を生成することを示した後、この大多数の細胞外生成物の精製された形が71kDにより免疫化された動物において細胞介在免疫応答を誘発できたことことが示された。
テンジクネズミを、SAF 中、精製された71kDタンパク質 100μｇにより３週ごとに２度接種した。対照動物は、同じスケジュールでSAF 中、緩衝液により偽免疫化された。最後の免疫化の後、３週で両組の動物を、単離された71kDタンパク質１及び10μｇにより皮膚内投与した。得られた紅斑及び硬化症を、24時間後に測定し、そしてその結果は下記表９に示されている。
【０１４７】
【表９】
2005104983.tif 000010
【０１４８】
硬化及び紅斑の程度は、免疫化されていない対照動物においてよりも免疫化された動物においてより強く、これは71kDタンパク質に対する強い細胞介在免疫応答が本発明の接種手段により開始されたことを示している。
【０１４９】
本発明の教授に従って効果的な免疫応答自体を誘発するこの大多数の細胞外生成物の能力をさらに確かめるために、リンパ球増殖アッセイを行なった。表９におけるように免疫化された動物を殺し、そして脾臓リンパ球増殖アッセイを例４において確立された方法を用いて実施した。71kD免疫化テンジクネズミからの組織サンプル及び対照のテンジクネズミからの組織サンプルを、0.1,１及び10μｇ／mlの単離された71kDタンパク質により挑戦せしめ、そして〔3H〕チミジンを結合するそれらの能力についてモニターした。刺激指数を前記のようにして計算した。それらのアッセイの結果は、下記表10に示されている。
【０１５０】
【表１０】
2005104983.tif 000011
【０１５１】
皮膚過敏性アッセイに関して、71kD免疫化動物は、偽免疫化された対照よりも精製された71kDに対してより高い応答を示した。外来性タンパク質が期待されるけれども、そのような結果は、大多数の細胞外生成物が細胞介在免疫応答を誘発する能力を有することを明確に示している。
単離された大多数の細胞外タンパク質が効果的な細胞介在免疫応答を誘発するであろうことを確立した後、追加の実験が、いづれかのそのような応答が次のように結核菌に対して交差反応することを確かめるために実施された。
【０１５２】
例  ８．Ｍ．ツベルキュロシスにより感染されたテンジクネズミの精製された71kDタンパク質挑戦
免疫化されていないテンジクネズミを、例４に報告されているようにしてエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより感染せしめた。精製されたタンパク質誘導体（PPD-CT68；Connaught Laboratories Ltd.)を、感染された動物がＭ．ツベルキュロシスの徴候である細胞介在免疫応答を示すことを確かめるために正の対照として用いた。結核暴露のためにMantoux 試験において広く使用される場合、PPD は一般的に、硫酸アンモニウム分別により調製され、そして約10kDの平均分子量を有する小さなタンパク質の混合物を含んで成る。PPD に対する免疫応答は、例１において単離された多量EP画分により刺激される応答に実質的に類似している。
【０１５３】
感染の後、３週で、テンジクネズミに、0.1,１及び10μｇの典型的な精製された大多数の71kD細胞外タンパク質を皮膚内投与した。対照として使用される感染されていない動物は同様に、前記単離されたタンパク質により挑戦せしめられた。紅斑及び硬化の程度を24時間後に測定し、そしてその結果は下記表11に報告されている。
【０１５４】
【表１１】
2005104983.tif 000012
【０１５５】
表11に示されるように、強い免疫応答が、本発明の典型的な精製された大多数の細胞外タンパク質により挑戦された感染動物において存在する。これらの応答は、感染されていない動物の応答よりも、紅斑に関して３〜４倍、及び硬化に関しては10倍高かく、これは顕著な71kD細胞外タンパク質がＭ．ツベルキュロシス感染動物において強い細胞介在免疫応答を誘発することを確証する。
【０１５６】
それらの結果をさらに確証するために、感染された動物及び感染されていない動物を殺し、そして例４の手段に従って、リンパ球増殖アッセイにゆだねた。両組のテンジクネズミからの組織サンプルを、0.1,１及び10μｇ／mlの単離された71kDタンパク質及びPPD に対してアッセイした。次に、サンプルを、前記のようにして〔3H〕チミジンを結合するそれらの能力についてモニターし、そしてそれらのアッセイの結果は下記表12に示される。
【０１５７】
【表１２】
2005104983.tif 000013
【０１５８】
皮膚感受性アッセイの結果に関して、表12は、刺激指数が感染されていないサンプルよりも感染された組織においてより高いことを示す。より詳しくは、感染された動物の平均ピーク刺激指数は、感染されていない対照よりも、典型的な71kDタンパク質の場合、２倍高く、そしてPPD の場合、３倍高く、これは、強い細胞介在免疫応答が本発明の典型的な大多数の細胞外タンパク質ワクチンにより、Ｍ．ツベルキュロシスより感染された動物に誘発されたことを確証する。
【０１５９】
典型的な精製された71kDの大多数のタンパク質とＭ．ツベルキュロシスとの間の交差反応性のこの表示に続いて、追加の実験を行ない、効果的な免疫応答が本発明により開示されているように、大多数の細胞外生成物のそれらの典型的な精製されたサンプルにより刺激された。
【０１６０】
例  ９．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスによる71kD免疫化テンジクネズミの挑戦
典型的な大多数の又は主要な細胞外タンパク質ワクチンの免疫保護能力を示すために、テンジクネズミを、例２に従って精製された典型的な大多数の71kDタンパク質により３週間ごとに２度免疫化した。対照動物を例１からの多量EP 120μｇ又は緩衝液により免疫化した。すべての動物を、アジュバントSAF を用いて免疫化した。最後の免疫化の後、３週で、典型的な71kDタンパク質により免疫化されたテンジクネズミを、細胞介在免疫応答が進められたかいづれかを評価するために前記材料10μｇにより皮膚試験した。対照動物及び71kD免疫化テンジクネズミを、例４に記載されるようにしてエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより感染せしめた。感染に続いて、動物をモニターし、そして６カ月間、体重を計量した。
【０１６１】
図５のグラフは、71kD及び多量EDにより免疫化された動物により示される比較的正常な重要の増加に対する偽免疫化されたグループにより経験された重量の低下を対比する。データは個々のグループについての平均重量±SEである。同じ動物についての死亡率曲線が、図６のグラフに示されている。この研究についての絶対死亡率が下記表13に報告されている。
【０１６２】
【表１３】
2005104983.tif 000014
【０１６３】
体重低下曲線及び死亡率の両者は、本発明の大多数の細胞外タンパク質が予防免疫応答を付与することを明白に示す。これは、免疫化されていない動物の 100％が、モニター期間の最後の前に死亡した。
【０１６４】
例  10．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスによる71kD免疫化テンジクネズミの挑戦
前記例の結果を実証し、そして典型的な主要細胞外タンパク質の投与が動物に保護免疫応答を付与することを示すために、類似する実験を行なった。この実験においては、テンジクネズミが再び、SAF 中、71kD細胞外タンパク質 100μｇにより３週ごとに３度免疫化された。対照テンジクネズミは、SAF 中、緩衝液により偽免疫化された。
【０１６５】
最後の免疫化の後、３週で、動物を、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめ、そして13週間、毎週体重を計量した。６匹のテンジクネズミの個々のグループについての平均体重±SEを計算しそして図７にグラフで示されている。この曲線は、偽免疫化された動物がモニター期間中、相当量の体重を失ない、ところが免疫化された動物はほとんど一定した体重を維持した。体重の減少又は“消耗”は結核の伝統的な副作用の１つであるので、それらの結果は、免疫化された動物における結核菌の増殖及び成長が本発明の典型的なワクチンにより阻害されたことを示唆する。
【０１６６】
保護免疫性は単離された形での多数の細胞外生成物による接種を通してテンジクネズミに生ぜしあ得たので、本発明のワクチンの種間免疫反応性を示すために、及びテンジクネズミモデルの有効性及び適用性をさらに確かめるために実験が行なわれた。
【０１６７】
例  11．精製された71Dkタンパク質によるPPD 陽性ヒトの細胞介在免疫性の試験
典型的な71kDの大多数の細胞外タンパク質に対するヒト免疫応答の細胞介在成分を評価するために、PPD-陽性及びPPD-陰性の個人からの末梢血液リンパ球の増殖を、上記例４に報告されているようにして標準リンパ球増殖アッセイにより研究した。陽性PPD 又はツベルクリン応答は、Ｍ．ツベルキュロシスへの前もっての暴露の表示であるものとして当業界においては良く知られている。増殖応答及び対応する〔3H〕チミジンの結合を、２及び４日目で測定した。それらの研究についてのデータは図８Ａ及び８Ｂに示されている。図８Ａは、２日後、種々のレベルの71kDに対する応答を示しており、そして図８Ｂは４日目での同じ応答を示す。
【０１６８】
図８Ａ及び８Ｂに示されるように、PPD-陽性個人の平均ピーク刺激指数は、71kDのタンパク質に対して２倍高く、そしてPPD 陰性個人のその指数よりもPPD に対して３倍高かった。PPD-陽性個人間では、典型的な71kDタンパク質に対するピークの刺激指数とPPD に対するその指数との間に直線の相互関係が存在し、これは強い細胞介在応答がＭ．ツベルキュロシスに前もっての暴露されたヒトにおいてＭ．ツベルキュロシスの最とも顕著な又は大多数の細胞外生成物により刺激されることを示す。このデータは、テンジクネズミに見られる反応性プロフィールに対応し、そして感染しやすい他の哺乳類に対するテンジクネズミモデルの適用性を確証する。
【０１６９】
従って、前述の30kDの典型的なタンパク質に関しては、大多数の71kD細胞外生成物に対する強い免疫応答の進行は、その71kD生成物はまたヒトにおいて細胞介在免疫性を刺激するこど効果的である事実により明らかなように、本発明の広い範囲を示す。
再び、本発明はＭ．ツベルキュロシスの細胞外生成物に又は典型的な71kDタンパク質の使用に限定されないことが強調されるべきである。むしろ本発明の教授は、例に示されるようないづれかの大多数の細胞外生成物に適用できる。
【０１７０】
追加の研究が、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物の組合せが十分に保護免疫性を提供できるかいづれかを確かめるために行なわれた。一般的に、それらの研究は、SAF 中、Ｍ．ツベルキュロシスの５種の精製された細胞外タンパク質の組合せん含んで成る種々の用量のワクチンにより３又は４週間ごとに３度、経皮内又は皮下のいづれかで免疫化されたテンジクネズミを利用した。
【０１７１】
組合せＩとしてラベルされた、この免疫化方法のために使用される第１のタンパク質組合せは、例２に記載される手段により精製された、71kD, 32A kD, 30kD, 23kD及び16kDタンパク質から構成された。この組合せは、Ｍ．ツベルキュロシス培養上清液に通常存在する合計の細胞外タンパク質の60％までを占める。組合せＩに使用のために選択されたそれらのタンパク質は、図２において星印で示されている。 100μｇ, 20μｇ又は２μｇの個々のタンパク質を含む組合せＩのワクチンを、アジュバントSAF と共に経皮内投与した。20μｇの個々のタンパク質を含む組合せＩのワクチンをまた、類似する実験のために皮下投与した。負の対照のテンジクネズミは、同じスケジュールに基づいてSAF 及び緩衝液の同体積により偽免疫化され、そして正の対照はSAF 中、例１からの多量細胞外タンパク質 120μｇを用いて免疫化された。すべての注射体積は緩衝液を用いて標準化された。
【０１７２】
例  12．組合せＩのワクチンによる挑戦に対する組合せＩ免疫化テンジクネズミの応答
動物が主要な細胞外生成物の組合せＩの混合物による接種の後、測定可能な免疫応答を進行せしめたかいづれかを測定するために、皮膚過敏性アッセイを行なった。テンジクネズミの背部の毛を削り、そして５種の精製された細胞外タンパク質の同じ組合せ 1.0μｇ及び10.0μｇにより経皮内注射した。10.0μｇの緩衝液を対照として使用し、そしてすべての注射を 0.1mlの合計体積で行なった。皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、注射後24時間で測定した。
測定の結果を、下記表14に示す。データは再び、従来の方法を用いて測定されるように、グループについての平均測定値±標準誤差（SE) により報告されている。NDは、この実験の特定の観点が行なわれなかったことを示す。
【０１７３】
【表１４】
2005104983.tif 000015
【０１７４】
前記データは、細胞外タンパク質の組合せＩに対する強い細胞介在免疫応答が接種された動物により生成されたことを明確に示している。免疫化されたテンジクネズミは、対照動物よりもほとんど3倍高い紅斑及び硬化の測定値を示す。
【０１７５】
例  13．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに対する組合せＩのワクチンの免疫保護分析
最後の免疫化の後、３週で、前述の過敏性アッセイのために使用されたテンジクネズミを、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシス（Erdman株）により挑戦せしめ、そして毎週、10週間、体重を計量した。エアゾール挑戦は、例４の手段を用いて行なわれた。同じ大きさのグループの正及び負の対照と共に、組合せＩの主要細胞外生成物 100μｇにより免疫化された６匹の動物を、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより同時に挑戦せしめた。正の対照は、SAF 中、EP 120μｇにより３度免疫化された。
観察期間が終了前に死亡したテンジクネズミを検死し、そして全体の結核病変の証拠について試験した。そのような病変は、研究の間に死亡したすべての動物に見出された。
【０１７６】
エアゾール挑戦の後、平均体重のプロフィールにおける免疫化された動物と対照の動物との間の差異を、反復された分散測定分析（ANOVA)により分析した。挑戦後の生存における、免疫化された及び対照のテンジクネズミの差異を、two-failed Fisher exact testにより分析した。データは、６匹のテンジクネズミから成る個々のグループについての平均体重±標準誤差（SE) である。
【０１７７】
挑戦後の毎週の体重測定の結果は図９に示されている。細胞外生成物の組合せにより免疫化されたテンジクネズミと比較する場合、偽免疫化された動物はそれらの合計体重の15.9％を失なった。正の対照の体重は、５種の精製された細胞外タンパク質の組合せにより免疫化された動物の体重に類似していた。体重は、挑戦のすぐ前で標準に合せられた。組合せＩにより免疫化された動物と偽免疫化された対照との間の差異は、反復されたANOVA 測定によれば、Ｐ＜0.0000001 を伴って有意に高かった。
死亡率を、挑戦後、10.5週で測定した。すべての３種の偽免疫化された動物は、挑戦後10週〜10.5週間で、お互い３日以内に死亡した。実験の死亡率結果は、下記表15に与えられる。
【０１７８】
【表１５】
2005104983.tif 000016
【０１７９】
体重モニター研究の結論に続いて、生存する動物を高炭酸ガスにより殺し、そして個々の動物の右肺及び脾臓を、例５の手段を用いて生存Ｍ．ツベルキュロシスについてアッセイした。実験の最後の週で死亡した３匹の動物を包含する、その計数の結果は、平均コロニー形成単位（CFU)±標準誤差 (SE) として下記表16に与えられる。
【０１８０】
【表１６】
2005104983.tif 000017
【０１８１】
精製されたタンパク質の組合せにより免疫化された動物の肺における結核菌の濃度と偽免疫化された動物のその濃度との間の対数差異は 1.4であり、そして脾臓における結核菌の対数差異は 0.9であった。これと同様に、検死での全体的な検査に基づけば、免疫化された動物は、偽免疫化された対照に比較して、結核による肺関与を著しく低めた。例１の多量細胞外調製物（EP) により免疫化された正の対照動物は、精製された細胞外タンパク質の組合せＩ混合物により免疫化された動物よりも、肺において 0.7対数高い結核菌及び 0.5対数高い結核菌を示した。
【０１８２】
例  14．経皮内及び皮下投与を通しての低い用量での組合せＩワクチンの免疫保護分析
例13は組合せＩタンパク質が個々のタンパク質（30＋32Ａ＋16＋23＋71)100μｇにより４週間隔で３度免疫化された動物において免疫保護を示したことを確証したが、他の研究も、低い用量の組合せＩタンパク質、特に20μｇ又は２μｇの個々のタンパク質の免疫保護能力を示すために行なわれた。例13におけるように、テンジクネズミ（グループ当たり６匹の動物）を、SAF 中、組合せＩタンパク質（30＋32Ａ＋16＋23＋71）により３週ごとに４度免疫化した。
【０１８３】
動物は、免疫化当たり個々のタンパク質20μｇ又は２μｇのいづれかを受けた。対照の動物を、前述の手段を用いて偽免疫化した。３週間後、動物をエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめ、そして体重を９週間、毎週測定した。すべての免疫化された動物は実験の最後まで生存したが、ところが偽免疫化された動物の１匹が実験の終りの前に死亡した。次の結果が示すように、例13の用量よりも５倍及びさらに50倍低い用量で、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスからの免疫化された動物を保護し、そして経皮及び皮下経路の両者による供給が効果的であった。
【０１８４】
組合せＩの個々のタンパク質20μｇにより免疫化されたテンジクネズミに比較して、偽免疫化された動物は９週間の実験の間、それらの合計体重の12％を失なった（体重は挑戦のすぐ前で標準化されている）。組合せＩの個々のタンパク質２μｇにより免疫化されたテンジクネズミに比較して、偽免疫化された動物は、それらの標準化された合計体重の11％を失なった。従って、低い用量の組合せＩタンパク質により経皮による免疫化されたテンジクネズミは、Ｍ．ツベルキュロシスによるエアゾール挑戦の後、体重の低下に対して保護された。
【０１８５】
同様に、低い用量の組合せＩタンパク質により経皮から免疫化されたテンジクネズミもまた、脾臓へのＭ．ツベルキュロシスの散在に関連する巨脾症に対して保護された。表17に示されるように、20μｇ又は２μｇの組合せＩの個々のタンパク質により免疫化された動物はそれぞれ平均 4.6±1.29及び 4.0±0.8 ｇ（平均±SE）の重量の脾臓を有するが、偽免疫化された動物は、平均 9.6±1.8 ｇの重量の脾臓を有し、それは２倍以上重いことを示している。
【０１８６】
【表１７】
2005104983.tif 000018
【０１８７】
低い量の組合せＩタンパク質により経皮的に免疫化されたテンジクネズミはまた、それらの脾臓においてＭ．ツベルキュロシスの少ないCFU を有した。表18に示されるように、偽−免疫化された動物と比較する場合、組合せＩの個々のタンパク質20μｇ又は２μｇにより免疫化されたテンジクネズミは、それらの脾臓においてそれぞれ平均 0.6及び 0.4対数低いCFU を有した。
【０１８８】
【表１８】
2005104983.tif 000019
【０１８９】
さらに、組合せＩタンパク質により皮下的に免疫化されたテンジクネズミもまた、体重の低下、巨脾症及び脾臓におけるＭ．ツベルキュロシスの増殖に対して保護された。例14に記載される同じ実験においては、テンジクネズミはまた、20μｇの組合せＩタンパク質により経皮的に免疫化されるよりもむしろ皮下的に３週ごとに４度免疫化された。それらの動物は、20μｇの組合せＩタンパク質により経皮的に免疫化された動物とほとんど同じほど挑戦から保護された。
【０１９０】
例  15．組合せＩ及びIIによる挑戦に対する、組合せＩ及びIIにより免疫化されたテンジクネズミの応答
追加の研究が、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物の他の組合せが同様に保護免疫性を付与できるかいづれかを確かめるために実施された。１つの研究は、２種の組合せ、すなわち組合せＩ（71, 32Ａ，30, 23、及び16）及び組合せII（32Ａ，30，24, 23及び16）を含んで成るワクチンにより免疫化されたテンジクネズミを用いた。組合せIIは、Ｍ．ツベルキュロシス上清液に通常存在する合計の細胞外タンパク質の62％までを占めると思われる。動物（グループ当たり６匹）を、SAF 中、組合せＩ又はIIにおける個々のタンパク質 100μｇにより、３週ごとに４度、免疫化した。負の対照動物を同量のSAF 及び緩衝液により同じスケジュールで偽免疫化した。
【０１９１】
例12におけるように、動物が、接種に続いて測定可能な免疫応答を進行せしめるかいづれかを決定するために遅延タイプの皮膚過敏性について動物を試験した。組合せIIにより免疫化された動物は、その組合せIIによる皮膚試験に応答して16.8±1.3mm(平均±SE）の紅斑及び12.8±1.2mm の硬化を有するが、ところが偽免疫化された動物は、その組合せIIに応答してわずか 1.3±0.8mm の紅斑及び 0.3±３mmの硬化を有した。従って、組合せIIにより免疫化された動物は、対照よりも12倍大きな紅斑及び40倍大きな硬化を有した。
【０１９２】
比較すれば、組合せＩにより免疫化された動物は組合せＩによる皮膚試験に応答して21.3±2.0mm の紅斑及び15.8±0.1mm の硬化を有し、ところが偽免疫化された動物は、組合せＩに応答して、わずか 6.4±0.8mm の紅斑及び 2.6±0.7mm の硬化を有した。従って、組合せＩにより免疫化された動物は、対照よりも、３倍以上大きな紅斑及び６倍以上の大きな硬化を有した。組合せIIタンパク質に関しての対照からの差異は、組合せＩタンパク質に関してのその差異よりも大きかった。
【０１９３】
同じ実験において、より低い量の組合せIIタンパク質（個々のタンパク質20μｇ対 100μｇ）により免疫化された動物はまた、組合せIIに対して強い皮膚過敏性を進行せしめた。それらは組合せIIに対する応答において21.0±2.0mm の紅斑及び15.3±0.9mm の硬化を有し、ところが偽免疫化された動物は上記のようにわずか 1.3±0.8mm の紅斑及び 0.3±0.3mm の硬化を有した。従って、より低い量の組合せIIタンパク質により免疫化された動物は対照よりも16倍以上の紅斑及び50倍以上の硬化を有し、その差異は高い量の組合せII
タンパク質により免疫化された動物に関してよりも高かった。
【０１９４】
例  16．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに対しての組合せＩ及びIIワクチンの免疫保護分析
最後の免疫化の後、３週目で、前の過敏性アッセイのために使用されたテンジクネズミを、例13におけるように、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシス（Erdman株）により挑戦せしめ、そして７週間、毎週、体重を計った。例13におけるように、個々のグループは６匹の動物から成った。挑戦の後、初めの７週間、偽免疫化された動物は平均19.5ｇを失なった。対照的に、組合せII( 個々のタンパク質 100μｇ）により免疫化された動物は52.4ｇを得、そして低い量（個々のタンパク質20μｇ）での組合せIIにより免疫化された動物は平均67.2ｇを得た。
【０１９５】
比較すれば、組合せＩにより免疫化された動物は68ｇを得た。従って、組合せII(100μｇ）により免疫化されたテンジクネズミと比較する場合、偽免疫化された動物はそれらの合計体重の11％を失なった。低い量（20μｇ）での組合せIIにより免疫化されたテンジクネズミと比較する場合、偽免疫化された動物は、それらの合計体重の14％を失なった。組合せＩにより免疫化された動物と比較する場合、偽免疫化された動物は、それらの合計体重の14％をまた失なった。
【０１９６】
例  17．同じワクチン又はその成分による挑戦に対しての、組合せIII 〜ＸIIにより免疫化されたテンジクネズミの応答
追加の実験を、Ｍ．ツベルキュロシスの大多数の細胞外生成物の種々の組合せの有効性を示すために行なった。それらの研究においては、Hartlyタイプのテンジクネズミを、例２におけるようにして精製された２又はそれ以上の大多数の細胞外生成物の組合せを含んで成るワクチンにより経皮的に免疫化した。その精製された細胞外生成物を、SDS-PAGEにより決定されるようにそれらの見掛分子量を用いて同定した。テンジクネズミを、大多数の細胞外生成物の次の組合せにより免疫化した。
【０１９７】
【表１９】
2005104983.tif 000020
【０１９８】
個の組合せのワクチンは、個々の列挙されたタンパク質 100μｇを含んだ。それらの組合せのワクチンは体積的に調整され、そしてアジュバントSAF において経皮内投与された。前述のように、テンジクネズミは、３週ごとに４回、免疫化された。
【０１９９】
皮膚過敏性アッセイを実施し、動物が組合せIII 〜ＸIIによる接種の後、測定できる免疫応答を進行せしめたかいづれかを測定した。６匹のテンジクネズミから成るグループの背部の毛を削り、そしてそれらが免疫化される、精製された細胞外生成物の同じ組合せにより経皮内注射した。この挑戦のために、組合せにおけるそれぞれ10μｇのタンパク質を注射した。すべての注射は、 0.1mlの合計体積を用いて行なわれた。SAF のみにより免疫化された偽免疫化された対照をまた、それぞれの組合せにおける個々のタンパク質10μｇを再び用いて、組合せIII 〜ＸIIにより皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、例３に記載されているようにして、注射後24時間で測定した。
【０２００】
それらの測定の結果は下記表20に示される。データは再び、従来の方法を用いて決定されるように、グループに関する平均測定値±標準誤差（SE）として報告されている。
【０２０１】
【表２０】
2005104983.tif 000021
【０２０２】
その結果は、強い細胞介在免疫応答が精製された細胞外タンパク質の個々の組合せに対して生成されたことを明確に示す。免疫化されたテンジクネズミは、すべての組合せについて対照の紅斑の少なくとも２倍及び通常３倍又はそれ以上の紅斑を示した。さらに、免疫化されたテンジクネズミは、すべての組合せに関して対照の硬化の少なくとも３倍の硬化を示した。
【０２０３】
例  18．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに対する組合せIII 〜ＸIIの免疫保護分析
精製された細胞外生成物のそれらの典型的な組合せの予防効能を示すために、組合せIII 〜ＸIIにより免疫化されたテンジクネズミを、例４の手段を用いて、最後の免疫化の後、３週でＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめた。
【０２０４】
前述の結果と合致して、組合せIII 〜ＸIIにより免疫化されたテンジクネズミは、挑戦の後、死に対してすべて保護された。挑戦の後、４週で、６匹の偽免疫化された動物のうち２匹（33％）が死亡し、そして対照的に、組合せIV〜ＸIIにより免疫化されたグループ中の動物はすべて死亡せず、そして組合せIII により免疫化されたグループ中の６匹の動物のうち１匹（17％）が死亡した。挑戦の後10週で、偽免疫化された動物の50％が死亡し、そして対照的に、組合せIX及びＸIIにより免疫化されたグループ中の動物はすべて死亡せず（０％）、組合せIII ，IV，Ｖ，VI，Ｘ及びＸＩにより免疫化されたグループ中の動物６匹のうち１匹が死亡し（17％）、組合せVIIIにより免疫化された動物の５匹のうち１匹が死亡し（20％）、そして組合せVII により免疫化された動物の６匹のうち２匹が死亡した（33％）。
【０２０５】
観察期間の最後の前に死亡したテンジクネズミを検死し、そして全体の結核病変の証拠について試験した。病変は、研究の間に死亡したすべての動物に見出された。
死亡率研究の結論に続いて、生存する動物を高炭酸ガスにより殺し、そして個々の動物の脾臓を例５の手段を用いて生存Ｍ．ツベルキュロシスについてアッセイした。その結果は、偽免疫化された動物からの対数の低下と共に、平均コロニー形成単位(CFU）により下記表21に示される。CFU 値の次の星印は、脾蔵の計数が個々のグループ中の１匹の動物に対してゼロであることを示す。計算のためには、ゼロの計数は、脾臓当たり103 CFU 又は３対数として処理された。
【０２０６】
【表２１】
2005104983.tif 000022
【０２０７】
組合せIII ，IV，VI，VII ，IX，Ｘ，ＸＩ及びＸIIにより免疫化された動物は、偽免疫化された対照よりも平均で、それらの脾臓においてＭ．ツベルキュロシスの少なくとも 0.5対数少ないコロニー形成単位を有した。特に、組合せIV及びVII は、特に効果的であることがわかっており、大まかに10の因子、コロニー形成単位の平均数を減じている。組合せＶ及びVIIIにより免疫化された動物は、偽免疫化された対照よりも、平均で、それらの脾臓において、それぞれ 0.3及び 0.1の対数少ないコロニー形成単位(CFU）を有した。本発明の教授に従って免疫化された動物におけるコロニー形成単位のこの劇的な低下は、本発明の免疫保護実施可能性をもう１度例示している。
【０２０８】
例  19．組合せＸIII による挑戦に対しての、３種の異なった量の組合せＸIII により免疫化されたテンジクネズミの応答
本発明の実施可能性及び範囲をさらに定義し、並びに精製された細胞外生成物の追加の組合せの効能を示すために、テンジクネズミを、他の接種用量を用いて、前述のようにして免疫化した。特に、３種の大多数の細胞外生成物の他の組合せ50μｇ,  100μｇ及び 200μｇが組合せＸIII として同定され、そして30kD, 32（Ａ）kD及び16kDのタンパク質を含んで成る。前述の例に関して、動物のグループを、SAF 中、前記用量の組合せＸIII により３週ごとに４度、経皮的に免疫化した。
【０２０９】
皮膚過敏性アッセイを行ない、動物が接種の後、測定可能な免疫応答を進行せしめたかいづれかを決定した。動物の背部の毛を削り、そして精製された細胞外生成物の個々10.0μｇを含む組合せＸIII により経皮的に投与した。すべての注射は 0.1mlの合計体積を用いて行なった。偽免疫化された対照をまた、同じ用量の組合せＸIII により皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、注射の後24時間で測定した。
結果は、従来の方法を用いて測定される場合、グループについての平均測定値±標準誤差（SE）として下記表22に示されている。
【０２１０】
【表２２】
2005104983.tif 000023
【０２１１】
さらに再び、それらの結果は、組合せＸIII に対する強い細胞介在免疫応答が、３種の用量の組合せＸIII の個々により免疫化された動物に生成されたことを明確に示している。免疫化された動物は、対照の紅斑の約２〜３倍の紅斑を示した。さらに著しいことには、免疫化された動物は、すべての場合において最少の応答を示した対照の動物の硬化の少なくとも35倍の硬化を示した。
【０２１２】
例  20．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに対する、３種の異なった用量での組合せＸIII の免疫保護分析
種々の用量での本発明のワクチンの保護免疫性観点をさらに示すために、前述の皮膚過敏性アッセイのために使用された、免疫化されたテンジクネズミ（グループ当たり６匹）を、最後の免疫化の後、３週目で、エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめた。エアゾール挑戦を、例４に記載される手段を用いて実施した。12匹の偽免疫化された動物の対照グループを同時に挑戦せしめた。
【０２１３】
挑戦後の毎週の体重測定の結果は、図10にグラフにより示されており、そして３種の用量の組合せＸIII の個々により免疫化されたテンジクネズミが体重の低下を保護したことを明確に示している。より高い用量の組合せＸIII (100及び 200μｇ）により免疫化された動物は実際、体重の正味の上昇を示し、そしてより低い用量（50μｇ）により免疫化された動物は比較的少ない体重の低下を示した。対照的に、偽免疫化された動物は、挑戦後すぐに、その週でそれらの合計体重の約22％を失ない、そして10週の観察期間にわたって平均 182ｇの低下があった。
【０２１４】
下記表23は、挑戦の最後での平均体重を取り、挑戦の開始での平均体重を引き算し、そして挑戦の開始での平均体重により前記結果を割り算することによって測定されるような、免疫化された動物及び対照の動物についての％体重変化を示している。同様に、％保護率は、免疫化された動物の平均％体重の上昇又は低下から対照の平均％体重の低下を引き算することによって決定された。
【０２１５】
【表２３】
2005104983.tif 000024
【０２１６】
表23は、偽免疫化された動物が、免疫化された動物に比較して、モニター期間にわたって相当量の体重（18％〜29％）を失なったことを示す。図10は、10週間のモニター期間にわたって週ごとにプロットされた、免疫化された動物の個々のグループに関しての正味の体重の低下対偽免疫化された対照動物のグラフを示す。体重の低下又は“消耗”は結核の伝統的な副作用の１つであるので、それらの結果は、免疫化された動物における結核菌の増殖及び生長が本発明の典型的な組合せのワクチンの３種の異なった用量により阻害されたことを示している。
【０２１７】
例  21．組合せＸIV〜ＸVIIIによる挑戦に対する、組合せＸIV〜ＸVIIIの免疫保護分析
本発明の範囲、及び本発明の教授に従って配合され得る広範囲の効果的なワクチンをさらに実証するため、５種の追加の組合せのワクチン、すなわち組合せＸIV〜ＸVIIIを、テンジクネズミにおいて試験した。SDS-PAGEを用いて決定された、精製された細胞外生成物の見掛分子量により同定される、前記組合せのワクチンの個々の組成が下記表24に示されている。
【０２１８】
【表２４】
2005104983.tif 000025
【０２１９】
新しい組合せのワクチン及び適切な対照の他に、組合せＩをまた、この一連の実験に使用した。テンジクネズミを、組合せＸIV又はＸＶの個々のタンパク質50μｇ及び組合せＩ, ＸVI，ＸVII 、及びＸVIIIの個々のタンパク質 100μｇ(SAFアジバンドにおける）により経皮的に免疫化した。動物を、３週ごとに合計４回、免疫化した。
【０２２０】
皮膚過敏性アッセイを行ない、動物が前述の手段を用いて接種の後の測定できる免疫応答を進行せしめたかいづれかを決定した。テンジクネズミの背部の毛を削り、そしてそれらが免疫化された、精製された細胞外タンパク質の同じ組合せにより経皮的に注射した。10μｇの個々のタンパク質を含む適切な組合せのワクチンを、個々の挑戦のために注射した。すべての注射は、 0.1mlの合計体積を用いて実施された。偽免疫化された対照をまた、同じ用量の個々の組合せにより皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、例３に記載されるようにして注射の後24時間で測定した。
それらの測定の結果は、従来の方法を用いて測定されるような、グループについての平均測定値±標準誤差（SE）として、下記表25に示されている。
【０２２１】
【表２５】
2005104983.tif 000026
【０２２２】
それらの結果は、強い細胞介在免疫応答が組合せＸIV〜ＸVIII及び前のように、組合せＩに対して生成されたことを明確に示している。免疫化された動物は、対照の紅斑よりも約２倍の紅斑を示した。さらに著しい事には、免疫化された動物は、すべての場合において最少の応答を示した偽免疫化された対照よりも少なくとも10倍大きな硬化を示した。
【０２２３】
例  22．エアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスに対しての組合せＸIV〜ＸVIII及び組合せＩの免疫保護分析
例21の組合せのワクチンの免疫反応性を確かめるために及び感染性結核へのそれらの適用能力を例示するために、前述の皮膚過敏性アッセイのために使用された、免疫化されたテンジクネズミが最後の免疫化の後、３週目でエアゾール化されたＭ．ツベルキュロシスにより挑戦せしめられ、そして例４の手段を用いてモニターされた。12匹の偽免疫化された動物の対照グループ（例20に使用されるのと同じ）は同様に挑戦せしめられた。それらの挑戦の結果は、図11にグラフにより示されており、そして下記に表26として示されている。
【０２２４】
％重量変化を、挑戦の最後で平均体重を取り、挑戦の開始での平均体重を引き算し、そして挑戦の開始での平均体重により前記結果を割り算することによって決定した。同様に、％保護を、免疫化された動物の平均％体重の上昇又は低下から対照の平均％体重の低下を引き算することによって決定した。
【０２２５】
【表２６】
2005104983.tif 000027
【０２２６】
表26に示されるように、組合せワクチンのそれぞれにより免疫されたテンジクネズミは体重の低下を保護された、偽免疫化された動物は、それらの合計の組合された体重の約22％を失なった。対照的に、組合せワクチンの予防効果は、試馬グループの１つのために実際の体重増加をもたらし、そして他においては、減じられた量の体重の低下をもたらした。特に、組合せＸIVにより免疫化された動物は３％の体重の上昇を示し、そして他の組合せにより免疫化された動物はそれらの合計の組合された体重のわずか４％〜15％を失なった。
【０２２７】
それらの結果は、エアゾール化された挑戦に続いて動物の個々のグループについての正味の体重の上昇又は低下により毎週の体重の測定値をプロットする図11にグラフにより示される。免疫化された動物についての正味の体重の低下と偽免疫化された対照のそれとの間のこの統計学的に有意な差異は、本発明の組合せのワクチンにより生成される免疫予防応答のための追加の証拠を提供する。
【０２２８】
例  23．３種の異なったアジュバントにより免疫化されたテンジクネズミにおける細胞介在免疫性
本発明のワクチン配合物の広い適用性及び多様性をさらに示すために、免疫原研究を異なったアジュバントを用いて行なった。特に３種の異なった免疫原、すなわち精製された30kDタンパク質、組合せＩ（30, 32Ａ，16, 23, 71）及び組合せＸIII （30, 32Ａ，16）を、３種の異なったアジュバント、すなわちSyntex Adjuvant Formulation I (SAF) 、不完全フロイントアジュバント(IFA）及びモノホスホリル脂質Ａを含むアジュバント(MPL）を用いて個々に配合した。そのようなアジュバントは一般的に、免疫原と共に投与される場合、生物の免疫応答を高めることが知られている。
【０２２９】
テンジクネズミを、個々の３種の異なったアジュバント配合物中、組合せＩ及びＸIII における個々のタンパク質 100μｇ及び精製された30kDタンパク質 100μｇにより経皮的に免疫化した。テンジクネズミは、３週間ごとに合計３回、個々の配合物により免疫化された。
【０２３０】
免疫化に続いて、皮膚過敏性アッセイを行ない、テンジクネズミが測定可能な免疫応答を進行せしめたかいづれかを決定した。テンジクネズミの背部の毛を削り、そしてそれらが免疫化されたのと同じ免疫原により経皮的に免疫化した。挑戦のためには、組合せＩ及びＸIII における個々のタンパク質10μｇ又は精製された30kDタンパク質10μｇを、 100μｌの合計体積で注射した。３種のアジュバントの１つにより接種された偽免疫化されたテンジクネズミを、同じアジュバントを含む免疫原配合物の個々により皮膚試験した。皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、例３に記載されるようにして挑戦後24時間で測定した。
【０２３１】
それらの測定の結果は、下記表27に示される。前述のように、データは、許容された統計学的な技法を用いて決定されるように、グループについての平均測定値±標準誤差（SE）により報告されている。
【０２３２】
【表２７】
2005104983.tif 000028
【０２３３】
表27に提供されるデータに示されるように、本発明の組合せのワクチン及び精製された細胞外生成物は、異なったアジュバントと共に配合される場合、強い細胞介在免疫原性応答を付与する。さらに、３種のアジュバントの個々の１つは、個々のそれぞれの免疫原のために同じ免疫原性応答を提供する。一般的に、免疫化されたテンジクネズミは、偽免疫化されたテンジクネズミの紅斑の約７〜10倍の直径の紅斑を示し、そして硬化は対照動物において測定されるよりも約４〜６倍大きかった。
【０２３４】
異なったアジュバントと組合して強い免疫原性応答を刺激する本発明の能力は、ワクチンの最適化を促進する。すなわち、本発明の教授に従って効果的なワクチン配合物を生成するために使用されるアジュバントは、二次的な基準、たとえば安定性、副作用の欠如、費用及び貯蔵の容易さの考慮に強く基づいて選択され得る。それらの及び他の基準（免疫応答の刺激に直接関連しない）は、比較的原始的な条件下で広く使用するためのワクチン配合物を開発する場合、特に重要である。
【０２３５】
例  24．組合せＸIX〜ＸＸVIIIによる挑戦に対しての、組合せＸIX〜ＸＸVIIIの免疫保護分析
本発明の広い範囲は、10種の追加の組合せワクチン、すなわち組合せＸIX〜ＸＸVIIIを用いての免疫応答の生成によりさらに例示された。前記の新しい組合せワクチン及び適切な対照の他に、組合せIV及びＸIII がまた、テンジクネズミにおける免疫応答を刺激するために正の対照として使用された。SDS-PAGEを用いて決定された、精製された細胞外生成物の見掛分子量により同定される、前記組合せワクチンの個々の組成が下記表28に与えられている。
【０２３６】
【表２８】
2005104983.tif 000029
【０２３７】
テンジクネズミを、３週ごとに合計４回、免疫化した。動物を免疫化するために使用される個々の組合せのワクチンは、SAF アジュバント中、個々のタンパク質 100μｇから成り、 0.1mlの合計体積で注射した。
【０２３８】
例３に記載される手段を用いて、皮膚過敏性アッセイを行ない、動物が選択された組合せのワクチンによる接種に続いて、測定可能な免疫応答を進行せしめたかいづれかを決定した。テンジクネズミの背部の毛を削り、そしてそれらが免疫化された、精製された細胞外タンパク質の同じ組合せにより経皮的に注射した。挑戦に使用されるタンパク質の組合せは10μｇの個々のタンパク質から成った。偽免疫化された対照をまた、同じ用量の個々の組合せにより皮膚試験した。例３におけるように、皮膚試験部位での紅斑及び硬化の直径を、注射後24時間で測定した。
それらの測定の結果は下記表29に示されており、ここでは、動物のグループについての平均測定値±標準誤差（SE）により表わされている。
【０２３９】
【表２９】
2005104983.tif 000030
【０２４０】
表29に示される結果は、強い細胞介在免疫応答が、同じ免疫原により挑戦される場合、組合せＸIX〜ＸＸVIIIに対して生成されたことを明白に示す。前述のように、強い細胞介在免疫応答が、組合せIV及びＸIII により刺激された。免疫化されたテンジクネズミにより示される紅斑は、その対応する偽免疫化された対照動物において刺激される反応の少なくとも２倍であり、そして一般的にはその４倍及びそれ以上であることがわかった。同様に、免疫化された動物により示される硬化は、免疫化されていない対照の硬化の少なくとも２倍、及び一般的には３〜４倍大きいことがわかった。本発明に従って免疫化された動物の間で生成された実質的に強い免疫応答は、再び、本発明の組合せのワクチンの免疫保護実施可能性を示す。
【０２４１】
当業者はまた、本発明のワクチン及び方法の追加の利点を理解するであろう。たとえば、個々の化合物又は高く精製された分子種の選択された組合せが、完全な細菌又はその成分よりもむしろ対象のワクチンのために使用されるので、本発明のワクチンは、従来技術の弱毒化された又は殺された細菌性ワクチンと比較される場合、相当に低く毒性応答を刺激する傾向がある。さらに、本発明の分子ワクチンは、免疫無防備状態の個人への生命の脅威ではない。事実、本発明の組成物は、感染された個人における病原性物質に対して直接的な免疫応答を刺激するために治療的に使用され得る。
【０２４２】
豊富なの細胞外生成物又はそれらの免疫原的類似体の選択的な使用がまた、細胞内細菌の病因を高めることができるオプソニン作用性体液応答の進行を妨げる。本発明により生成される保護免疫性は未結合タンパク質に対して向けられているので、いづれかのオプソニン性応答は、寄生細菌の早められた封入よりもむしろ、本願発明の大多数の細胞外生成物の食作用及び破壊を単純にもたらすであろう。
【０２４３】
さらに、精製された細胞外生成物の選択的な使用は、免疫原性物質の宿主の認識に基づく、広く使用されるスクリーニング及び制御技法の使用をあらかじめ排除する応答を生成するための可能性を減じる。従来技術のワクチンとは異なって、スクリーニング試験は、病原体により発現されるが、しかし本発明に従って製造されたワクチンには含まれない免疫反応性分子を用いて行なわれる。そのような免疫原性決定因子の使用は、標的病原体に暴露された個人における応答を単に刺激し、適切な測定値の計測を可能にする。
【０２４４】
本発明のもう１つの利点は、精製された細胞外生成物は、容易に多量に得られ、そして従来技術のワクチン中の弱毒化された細菌及び細菌成分に反して、当業界において良く知られている技法を用いて容易に単離されることである。本発明の免疫反応性生成物はほとんどの生物のためのそのとり囲む環境中に天然において細胞外放出されるので、細胞内汚染及び細胞残骸の除去が簡単である。
【０２４５】
さらに、最とも卓越した又は大多数の細胞外生成物又はその免疫原性類似体が所望する免疫応答を刺激するために使用される場合、収穫できる生成物の発現レベル及び培養濃度がほとんどの生成システムにおいて一般的に高められる。従って、どんな形の生成が用いられても、所望する生成物の大規模の単離が、通常の化学方法、たとえばクロマトグラフィー又は限外濾過を通して容易に達成される。本発明に使用される免疫原性決定因子のそれらの固有の特性及び分子特徴は、大規模的な使用のために首尾一貫した、標準化された高品質の組成物の生成を高く刺激する。
【０２４６】
他方、標的病原体の最とも卓越した又は大多数の細胞外生成物の免疫原性質に基ついての、精製された分子化合物の使用はまた、本発明の免疫活性ワクチン成分の大規模合成を比較的容易にする。たとえば、対象の細胞外生成物又はそれらの免疫原性類似体は、組換えDNA 技法を用いて非病原性宿主細菌中にクローン化され、そして安全に収穫される。当業界において良く知られている分子クローニング技法が、対象の細胞外生成物、それらの相同体又はそれらのセグメントに対応するDNA を単離し、そして宿主細菌、たとえばＥ．コリへの株ののための選択された高い発現ベクターに発現するために使用され得る。
【０２４７】
典型的な技法は、IIR. Anon, Synthetic Vaccines 31-77 (1987), Tam et al, Incorporation of T and E Epotopes of the Circumsporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Agniast Malaria, 171 J. Exp. Med. 299-306 (1990) 、及びStover et al, Protective Immunity Elicited by Recombinant Bacille Calmette-Guerin (BCG) Expressing Outer Surface Protein A (OspA) Lipoprotein : A Candidate Lyme Diseaso Vaccine, 178 J. Exp. Med. 197-209 (1993) に見出され得る。
【０２４８】
同様に、細胞外タンパク質、それらの類似体、相同体又は免疫反応性タンパク質サブユニットは、通常の実験技法及び自動化されたスクエンサー技法を用いて、比較的純粋な形で大規模に化学的に合成され得る。この生成方式は、細胞外生成物の抗原決定基に対応するペプチドサブユニット又はそれよりも低い分子量の類似体を構築するために特に魅力あるものである。より小さなタンパク質サブユニットの生成のための典型的な技法は、当業界においては良く知られており、そしてIIR. Anon. Synthetic Vaccines 15-30 (1987)及びA. Streitwieser, J., Introduction to Organic Chemistry 953-55 (3rd ed. 1985)に見出され得る。
【０２４９】
他の技法は、Gross et al, "Nonenzymatic Cleavage of Peptide Bonds : The Methionine Residues in Bovine Pancreatic Ribonuclease," 237 The Journal of Biological Chemistry No. 6 (1962), Mahoney, "High-Yield Cleavage of Tryptophany Peptide Bonds by O-Iodosobenzoic Acid," 18 Biochemistry No. 17 (1979),及びShoolnik et al, "Gonococcal Pili," 159 Journal of Experimental Medicine (1984)に見出され得る。他の免疫原技法、たとえばペプチド、ヌクレオチド又は他の分子、たとえば擬症物を用いての抗−イディオタイプ又は指図された分子発生法がまた、所望する予防応答を生成できる効果的な免疫反応性化合物を生成するために使用され得る。
【０２５０】
ワクチンとしての裸のDNA の利用のための従来技術は、Robinson, Protection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization with a Hemagglutinin-Expressing Plasmid DNA, 11 Vaccine 9 (1993)及びUlmer et al, Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Encoding a Viral Protein, 259 Science (1993) に見出され得る。
【０２５１】
他方、強い免疫原性タンパク質末端（tail）の融合のための技法は、Tao et al, Idiotype/Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma, 362 Nature (1993)及びT-cell epitope mapping in Good et al, Human T-Cell Recognition of the Circumsporozuite Protein of Plasmodiun falciparum : Immunodominant T-Cell Domains Map to the Polymorphic Regions of the Molecule, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)、及びGao et al, Identification and Characterization of T Helper Epitopes in the Nucleoprotein of Influenza A Virus, 143 The Journal of Immunology No. 9 (1989))に開示されている。
【０２５２】
多くの細菌属は相同性を示すので、前述の例は例示の目的であって、本発明の範囲及び内容を限定するものではなく、又は本発明をマイコバクテリウム属、特定の種又はその中の血清グループ、又はツベルキュロシスのみに対するワクチンに限定するものではない。微生物のDNA 及び対応するタンパク質における種間相同性の普及が、本発明のワクチンの交差反応性免疫性の誘発を可能にする。大多数の細胞外生成物の免疫優性エピトープが他の血清グループ及び選択された属の種による挑戦に対する交差保護免疫性を提供するので、当業者は、１つの種に対して向けられたワクチンが他の種の細胞外生成物又は免疫学的類似体を用いて開発できることを理解するであろう。
【０２５３】
たとえばＭ．ボビスはＭ．ツベルキュロシスと90％〜100 ％相同であり、そして免疫応答を刺激する上でひじょうに交差反応性である。従って、Ｍ．ボビス又は他のマイコバクテリウムの多数細胞外生成物に基づくワクチンは、Ｍ．ツベルキュロシスによる感染に対して種々の程度の保護を提供する。従って、適切な大多数の細胞外生成物の高い相同性の免疫原性決定因子を用いて、同じ属中のいくつかの細菌種に対する免疫予防応答を提供することが、本発明の範囲であるものとして企画されている。
【０２５４】
本発明を実施するために選択された免疫原決定因子が効果的な免疫応答を誘発するよう多くの異なった形で使用されることがまた、強調されるべきである。従って、宿主免疫システムへの選択された大多数細胞外生成物の１又は複数の免疫原性決定因子の提供は臨界ではなく、そして生成又は投与を促進するよう変えられ得る。たとえば、本発明のワクチンは、完全な細胞外生成物又はその免疫刺激画分、たとえばペプチド、タンパク質サブユニット、免疫原類似体及び上記のような相同体を用いて配合され得る。
【０２５５】
大多数の細胞外生成物のより小さなタンパク質サブユニット及びその分子類似体は、それらが効果的な免疫予防を刺激する限り、本発明の範囲内にある。さらに、組換えタンパク質生成物、たとえば既知の分子組換え技法を通して変性された融合タンパク質又は細胞外生成物は、本発明の教授と完全に適合する。さらに、選択された免疫活性決定因子の免疫原的に生成された類似体、たとえば抗−イディオタイプ抗体、ペプチド及びヌクレオチドもまた、本発明の範囲内にある。
【０２５６】
同様に、宿主免疫システムへの免疫原性物質の配合及び提供は、アジュバントにおけるタンパク質又はそれらの類似体の溶液に限定されない。たとえば、適切な細胞外タンパク質に由来する免疫原決定因子は、非病原性であり、そして組換え技法を用いて変性される、異なった種の細菌、ファージ、マイコプラズマ又はウィルス上に発現され得る。そのような場合、完全な生存生物が、所望する応答を刺激するために配合され、そして使用され得る。逆に言えば、敵対環境下での大規模なワクチン形成プログラムは、複雑なアジュバントを伴わないで、ひじょうに安定した配合物を必要とする。さらに、ワクチン配合物は、過酷な条件、たとえば凍結乾燥又は経口投与又はカプセル封入にゆだねられる場合、活性成分の安定性又は免疫反応性を促進するように指図され得る。従って、本発明は、生成物の意図された使用に依存して、対象のワクチンを含んで成る、免疫原性決定因子のばく大に異なった配合物を包含する。
【０２５７】
当業者は、ワクチン用量が日常の実験に利用する個々の病原体及び宿主のために決定されるべきであることを理解するであろう。現在、最少の実際的な用量は、 0.1μｇ程度であるが、但し、 2.0μｇ，20.0μｇ， 100μｇ及び１mgの用量も適切なシステムのために最適であり得る。適切な用量が、いづれかの従来の免疫化技法及び当業界において知られている順序で投与され得る。
【０２５８】
当業者は、本発明が本発明の範囲内で他の特定の形で具体化され得ることをさらに理解するであろう。本発明の前述の記載は、本発明の典型的な態様のみを開示しているものであり、従って本発明の範囲内で他の変更が行なわれ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は本明細書に詳細に記載されて来た特定の態様に限定されない。むしろ、本発明の範囲及び内容の表示として請求の範囲は言及されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１Ａ】図１Ａは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。
【図２】図２は、Ｍ．ツベルキュロシスの12種の典型的な大多数の細胞外生成物の５個のＮ−末端アミノ酸及び14種のそのような生成物の見掛分子量を同定する表である。
【図３】図３は、図２に示される５個のＮ−末端アミノ酸により区別されなかった、Ｍ．ツベルキュロシスの３種の典型的な大多数の分泌性生成物の拡張されたＮ−末端アミノ酸配列の表である。
【図４】図４は、Ｍ．ツベルキュロシスの精製された典型的な大多数の30kD分泌性生成物により免疫化されたテンジクネズミ、従来技術の細胞外タンパク質の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての生存率の比較グラフである。
【図５】図５は、精製された71kDの大多数の細胞外生成物により免疫化されたテンジクネズミ、Ｍ．ツベルキュロシスからの従来技術の細胞外タンパク質の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図６】図６は、Ｍ．ツベルキュロシスの精製された71kDの大多数の細胞外生成物により図５におけるように免疫化されたテンジクネズミ、Ｍ．ツベルキュロシスからの細胞外タンパク質の従来技術の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての生存率の比較グラフである。
【図７】図７は、典型的な精製された71kDの大多数の細胞外生成物及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロスのエアゾール化された致死量への暴露に続いてのテンジクネズミの平均体重の２回目の別の実験における比較グラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、 PPD+ （Ｍ．ツベルキュロシスによる感染の表示である）及び PPD- ヒト対象における精製された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物に対するリンパ球増殖性応答の比較グラフである。図８Ａはこの抗原と共にリンパ球をインキュベートした後、２日後に測定された値のグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、 PPD+ （Ｍ．ツベルキュロシスによる感染の表示である）及び PPD- ヒト対象における精製された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物に対するリンパ球増殖性応答の比較グラフである。図８Ｂは、インキュベーション後、４日目で測定された値のグラフである。
【図９】図９は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の組合せを含んで成るワクチンにより免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されされていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図１０】図10は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の組合せを含んで成るワクチンの３種の異なった用量により免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図１１】図11は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の６種の異なった組合せを含んで成るワクチンにより免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図１】
2005104983.tif 000031
【図２】
2005104983.tif 000032
【図３】
2005104983.tif 000033
【図４】
2005104983.tif 000034
【図５】
2005104983.tif 000035
【図６】
2005104983.tif 000036
【図７】
2005104983.tif 000037
【図８】
2005104983.tif 000038
【図９】
2005104983.tif 000039
【図１０】
2005104983.tif 000040
【図１１】
2005104983.tif 000041
【配列表】
2005104983000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月8日(2005.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
【図１】図１のＡは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。  図１のＢは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。  図１のＣは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。  図１のＤは、クーマシーブル染色ゲルの代表であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により同定される場合、Ｍ．ツベルキュロシスの典型的な大多数の細胞外生成物の精製を示す。
【図２】図２は、Ｍ．ツベルキュロシスの12種の典型的な大多数の細胞外生成物の５個のＮ−末端アミノ酸及び14種のそのような生成物の見掛分子量を同定する表である。
【図３】図３は、図２に示される５個のＮ−末端アミノ酸により区別されなかった、Ｍ．ツベルキュロシスの３種の典型的な大多数の分泌性生成物の拡張されたＮ−末端アミノ酸配列の表である。
【図４】図４は、Ｍ．ツベルキュロシスの精製された典型的な大多数の30kD分泌性生成物により免疫化されたテンジクネズミ、従来技術の細胞外タンパク質の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての生存率の比較グラフである。
【図５】図５は、精製された71kDの大多数の細胞外生成物により免疫化されたテンジクネズミ、Ｍ．ツベルキュロシスからの従来技術の細胞外タンパク質の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図６】図６は、Ｍ．ツベルキュロシスの精製された71kDの大多数の細胞外生成物により図５におけるように免疫化されたテンジクネズミ、Ｍ．ツベルキュロシスからの細胞外タンパク質の従来技術の多量調製物により免疫化された正の対照、及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての生存率の比較グラフである。
【図７】図７は、典型的な精製された71kDの大多数の細胞外生成物及び免疫化されていない負の対照のＭ．ツベルキュロスのエアゾール化された致死量への暴露に続いてのテンジクネズミの平均体重の２回目の別の実験における比較グラフである。
【図８】図８のＡは、 PPD+ （Ｍ．ツベルキュロシスによる感染の表示である）及び PPD- ヒト対象における精製された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物に対するリンパ球増殖性応答の比較グラフである。図８Ａはこの抗原と共にリンパ球をインキュベートした後、２日後に測定された値のグラフである。  図８のＢは、 PPD+ （Ｍ．ツベルキュロシスによる感染の表示である）及び PPD- ヒト対象における精製された典型的な71kDの大多数の細胞外生成物に対するリンパ球増殖性応答の比較グラフである。図８のＢは、インキュベーション後、４日目で測定された値のグラフである。
【図９】図９は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の組合せを含んで成るワクチンにより免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されされていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図１０】図10は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の組合せを含んで成るワクチンの３種の異なった用量により免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。
【図１１】図11は、本発明の教授に従って生成された細胞外生成物の６種の異なった組合せを含んで成るワクチンにより免疫化されたテンジクネズミ及び免疫化されていない対照のＭ．ツベルキュロシスのエアゾール化された致死量への暴露に続いての平均体重の比較グラフである。