(57)【要約】【課題】  検出精度や再現性が高く、かつ、簡便な操作で検出を行うことのできる遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する方法を提供する。【解決手段】  （Ａ）検出すべき特定配列がＦＲＥＴプライマー内にくるように、ＦＲＥＴプライマーのオリゴヌクレオチドを設計する工程と、（Ｂ）設計したオリゴヌクレオチドの５’末端または５’末端側に蛍光物質を修飾し、検出すべき特定配列を挟み込むように消光物質をオリゴヌクレオチド鎖内に修飾してＦＲＥＴプライマーを得る工程と、（Ｃ）遺伝子増幅法により、検出すべき特定配列を含む標的遺伝子を増幅する工程と、（Ｄ）得られた増幅産物に、検出すべき特定配列を認識する制限酵素を作用させる工程と、（Ｅ）ＦＲＥＴプライマー内のエネルギー転移に起因する特定波長の蛍光発生の有無を検出する工程と、を含む。【選択図】        図１
2005192418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）検出すべき特定配列がＦＲＥＴプライマー内にくるように、該ＦＲＥＴプライマーのオリゴヌクレオチドを設計する工程と、
（Ｂ）設計したオリゴヌクレオチドの５’末端または５’末端側に蛍光物質を修飾し、前記検出すべき特定配列を挟み込むように消光物質を該オリゴヌクレオチド鎖内に修飾してＦＲＥＴプライマーを得る工程と、
（Ｃ）遺伝子増幅法により、前記検出すべき特定配列を含む標的遺伝子を増幅する工程と、
（Ｄ）得られた増幅産物に、前記検出すべき特定配列を認識する制限酵素を作用させる工程と、
（Ｅ）ＦＲＥＴプライマー内のエネルギー転移に起因する特定波長の蛍光発生の有無を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、検出すべき特定配列の簡易検出方法。
【請求項２】
前記検出すべき特定配列が、ＤＮＡ配列、一塩基置換ＳＮＰまたは点突然変異の配列である請求項１記載の簡易検出方法。
【請求項３】
前記工程（Ｃ）における遺伝子増幅法が、ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法である請求項１または２記載の簡易検出方法。
【請求項４】
前記工程（Ｄ）において前記検出すべき特定配列を認識する制限酵素がない場合、位置指定変異導入を利用したＡ−ＲＦＬＰ法を用いる請求項１〜３のうちいずれか一項記載の簡易検出方法。
【請求項５】
前記工程（Ｂ）における前記蛍光物質がＦＡＭである請求項１〜４のうちいずれか一項記載の簡易検出方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）における前記消光物質がＤａｂｃｙｌである請求項１〜５のうちいずれか一項記載の簡易検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出すべきＤＮＡ配列、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism：人の遺伝コード中の変種）または点突然変異の配列等、検出すべき配列の簡易検出方法に関し、詳しくは、蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）プライマーを用いた、検出精度や再現性が高く、かつ、簡便な操作で検出を行うことのできる検出すべき配列の簡易検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの姿形が千差万別であるように、３０億からなる遺伝暗号も個人間で比較するとかなり多くの部位で異なっている。この遺伝子暗号の違いは遺伝子多型（ポリモルフィズム）と呼ばれ、代表的な遺伝子多型として一塩基多型（ＳＮＰ）が知られている。
【０００３】
ＳＮＰとは、複数の個体間における一塩基の違いを意味する。ＳＮＰ部位は、ヒドゲノム中に３００万〜１０００万箇所あると考えられている。これらＳＮＰには、タンパク質の発現調節又は機能等に影響を与えるものがあり、体質や疾病に対する易罹患性等の個人差に関与しているものがあると考えられている。従って、ＳＮＰに関する情報を得ることによって、個人体質に応じた医療（オーダーメイド医療）を行うことができる。このため、ＳＮＰの発見及び同定が盛んに行われており、すでに多数のＳＮＰが報告されている。
【０００４】
現在までに、ＳＮＰを有する既知の配列を検出する方法は、数多く報告されている。例えば、タックマンＰＣＲ法は、リアルタイム検出ＰＣＲ法（非特許文献１；特許文献１）を基に、蛍光標識したアレル（対立遺伝子）特異的オリゴヌクレオチドと検出対象のＳＮＰを含む鋳型ＤＮＡとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である（非特許文献２、３）。
【０００５】
しかし、タックマンＰＣＲ法を用いてＳＮＰの検出を行う場合、タックマンプローブの厳密な設計（Ｔｍの計算）が必要であり、ＳＮＰを含む鋳型の配列によっては設計が困難な場合がある。さらに、ミスアニーリングなどにより、非特異的な蛍光強度の増加などもしばしば観察されることから、リアルタイムＰＣＲ装置による解析が必要な場合がある。
【０００６】
また、インベーダー法とは、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断する特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、ｃｌｅａｖａｓｅ）とを用いる方法である（非特許文献３〜５等）。インベーダー法は、ＳＮＰの種類によらずプローブを設計することが可能であるが、ｃｌｅａｖａｓｅを働かせるためにゲノムＤＮＡ、アレルプローブおよびインベーダープローブをＳＮＰの位置で３重にする必要がある。そのため、複雑なハイブリダイゼーションが必要であり、簡便さに欠ける。
【０００７】
さらに、ＳｎｉＰｅｒ法は、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法と呼ばれる手法を基本原理とするものであり、環状の一本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼ（主としてＢｓｔポリメラーゼ）がその上を移動しながら相補鎖ＤＮＡを連続して合成していくものである。この方法によれば、ＤＮＡ増幅が起こった場合に生じる発色反応の有無を測定することによってＳＮＰをタイピングすることができる（非特許文献６、７）。しかし、Ｂｓｔポリメラーゼを働かせるために、パドロックプローブの設計とライゲーション反応が必要である。また、ＲＣＡ法では一本鎖ＤＮＡが連続合成されるため、それに相補的な蛍光修飾プローブのハイブリダイゼーションも必要となり、煩雑である。
【０００８】
その他に、ＳＮＰ検出、解析を行う手段としては、ＤＮＡシーケンス法（塩基配列決定法）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡチップ法等が挙げられる。
【０００９】
このうちＤＮＡシーケンス法は、マキサム・ギルバート法とサンガー（ダイデオキシ）法があるが、現在は主にダイデオキシ法が用いられている。ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ法（ポリミラーゼ連鎖反応法）で増幅したのち、ＰＣＲ法で用いたプライマー若しくは増幅ＤＮＡ内に設定したプライマーを用いてシーケンスを行い、当領域内の遺伝子配列を決定する。この操作を異なるサンプルＤＮＡを用いて行うことで、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する。
【００１０】
また、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、熱変性で一本鎖にし、これを非変性ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行うことで、ＰＣＲ法で増幅した２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に２次構造（分子内水素結合）を形成させる。一塩基配列の違いによって取る２次構造（分子内水素結合）が異なるため、電気泳動距離の違いによって遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する。
【００１１】
さらに、アレル特異的ハイブリダイゼーション法では、解析したい領域をＰＣＲ法で増幅した後、メンブレン（ナイロンフィルター）の領域内に２０塩基程度のＰＣＲ産物若しくはオリゴヌクレオチドプローブを作成し、そこに放射性同位元素３２Ｐなどで標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。その際の温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、遺伝子の一塩基性ＳＮＰと点突然変異を放射性同位元素の強度の差で検出する。
【００１２】
さらにまた、ＤＮＡチップ法は、原理的にはアレル特異的ハイブリダイゼーション法とほぼ同じであるが、２０塩基程度のＰＣＲ産物若しくはオリゴヌクレオチドプローブを固定相（基盤上）に並べ、そこに蛍光標識したサンプルＤＮＡ（被検出ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションさせるものである。温度等のハイブリダイゼーション条件を調節することで、ヒトの遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を蛍光強度の差によって検出するものである。
【００１３】
アレル特異的ハイブリダイゼーション法におけるハイブリダイゼーションの場合は、ＤＮＡを放射性同位元素で標織するために、放射性同位元素の取り扱いと管理に多大な費用がかかる点が問題である。また、ＤＮＡチップ法の場合は、蛍光色素で標識すると、蛍光色素の大きな分子構造のために十分な頻度で蛍光がＤＮＡに取りこまれないことから、蛍光標識プローブの蛍光強度が高くないことと、蛍光の退色及びガラス等の基盤の有する蛍光（背景部分の蛍光）が問題になる。
【００１４】
こうした問題を踏まえて、特許文献２では、遺伝子の一塩基置換ＳＮＰと点突然変異を検出する方法、並びに検出装置及び検出チップに係る新たな技術が報告されているが、この技術では、ＤＮＡチップ法と同様に、プローブとなるオリゴヌクレオチドの基板への固定化や、ＤＮＡのハイブリダイゼーション、さらに非特異的な吸着を押えるための洗浄操作などが必要であり、検出操作が煩雑であると言える。
【００１５】
また、ＳＮＰを伴う鋳型を識別できるようにデザインしたＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うことにより、正常及び変異対立遺伝子を識別検出するＰＣＲ−ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）法などもある（非特許文献８）。ＡＲＭＳは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）（非特許文献９）あるいはＰＣＲ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｌｅｌｅｓ（ＰＡＳＡ）（非特許文献１０）とも呼ばれている。ＡＲＭＳの主な利点は、増幅ステップと診断ステップが一緒になっており、ルーチンの臨床診断では時間的に効率の良い方法と言える点である。しかし、増幅ステップと診断ステップを同時に行うこの手法は、２つのステップを別々に行う他の手法（例えば、ＰＣＲを行った後に制限酵素分析を行う方法：ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ））ほど信頼性は高くない。
【００１６】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（非特許文献１１、１２）は、制限酵素の認識配列を有する対立遺伝子の識別に適用できるため、増幅産物の分析に最も早くから用いられた方法の一つである。また、制限酵素の認識配列を有していない対立遺伝子を識別するために、位置指定変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用して、天然に存在するほとんどすべてのＤＮＡ多型に適応させたＡ−ＲＦＬＰ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ−ＲＦＬＰ）なども報告されている。しかし、ＲＦＬＰは制限酵素反応後、ゲル電気泳動等により生成物を分離し解析する必要があるため、手順がやや煩雑である。
【特許文献１】特表平６−５０００２１号公報
【特許文献２】特開２００１−０５０９３１号公報
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry
【非特許文献２】Livak,K.J.Genet.Anal.14,143(1999)
【非特許文献３】Morris T.et al.,J.Clin.Microbiol.34,2933(1996)
【非特許文献４】Livak, K.J.Biomol.Eng.14,143-149(1999)
【非特許文献５】Lyamichev, V.et al.,Science,260,778-783(1993)
【非特許文献６】Lizardi,P.M.et al.,Nature Genet.,19,225-232(1998)
【非特許文献７】Piated, A.S.et al.,Nature Biotech.,16,359-363(1998)
【非特許文献８】Newton, C.R.,Markham, A.F.(1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acid Res.17,2503-2516
【非特許文献９】Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 2757-2760
【非特許文献１０】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１８，  ３８８−４０２
【非特許文献１１】Haliassos, A. et al., Nucleic Acids Research, 17:3606,1989;Haliassos A. et al., Nucleic Acids Research, 17:8093-8099, 1989
【非特許文献１２】川上文清ほか、細胞工学、15:1637-1643、1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
上述のように、ＳＮＰの検出方法に関しては、様々に検討、提案がなされてきているが、夫々に問題点を有するものであり、未だ十分な技術は確立されていなかった。従って、従来の方法におけるような問題点を有さず、かつ、操作が簡易で検出結果の信頼性が高い検出技術が求められていた。
【００１８】
そこで本発明の目的は、上記従来技術の問題点を踏まえて、高検出精度でかつ再現性良く、検出すべき特定配列を簡便な操作で検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＦＲＥＴとＲＦＬＰを利用した新たな手法により、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
即ち、本発明の、検出すべき特定配列の簡易検出方法は、
（Ａ）検出すべき特定配列がＦＲＥＴプライマー内にくるように、該ＦＲＥＴプライマーのオリゴヌクレオチドを設計する工程と、
（Ｂ）設計したオリゴヌクレオチドの５’末端または５’末端側に蛍光物質を修飾し、前記検出すべき特定配列を挟み込むように消光物質を該オリゴヌクレオチド鎖内に修飾してＦＲＥＴプライマーを得る工程と、
（Ｃ）遺伝子増幅法により、前記検出すべき特定配列を含む標的遺伝子を増幅する工程と、
（Ｄ）得られた増幅産物に、前記検出すべき特定配列を認識する制限酵素を作用させる工程と、
（Ｅ）ＦＲＥＴプライマー内のエネルギー転移に起因する特定波長の蛍光発生の有無を検出する工程と、
を含むことを特徴とするものである。
【００２１】
本発明において、前記検出すべき特定配列として、ＤＮＡ配列、一塩基置換ＳＮＰまたは点突然変異の配列を好適に挙げることができる。また、前記工程（Ｃ）における遺伝子増幅法として、ＰＣＲ法またはＬＡＭＰ法を好適に採用することができる。さらに、前記工程（Ｄ）において前記検出すべき特定配列を認識する制限酵素がない場合、位置指定変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を利用したＡ−ＲＦＬＰ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ−ＲＦＬＰ）を好適に採用することができる。さらにまた、前記工程（Ｂ）における前記蛍光物質は、好ましくはＦＡＭであり、また、前記消光物質は、好ましくはＤａｂｃｙｌである。
【発明の効果】
【００２２】
ＤＮＡ配列、一塩基置換ＳＮＰまたは点突然変異の配列等、検出すべき特定配列（以下「一塩基ミスマッチ」と総称するが、この一塩基ミスマッチには、一塩基ミスマッチ以外の調べたいＤＮＡ配列も含むものとする）をＦＲＥＴプライマーを用いて検出する本発明の方法は、タックマンＰＣＲ、インベーダー法、ＲＣＡ法等に比べ、ＦＲＥＴプローブの設計が容易である。また、ＤＮＡチップ法、インベーダー法のようなハイブリダイゼーションプロセスが不要であり、さらに、一塩基ミスマッチの検出に制限酵素反応を利用しているので、従来技術に比べ、検出精度、再現性、簡便性などの点で優れている。また、Ａ−ＲＦＬＰ法と比べても、制限酵素反応後のゲル電気泳動ステップを設ける必要がなく、非常に簡便である。このように、従来の技術では、一塩基ミスマッチを検出する場合、複雑かつ厳密な検出を行う必要があったが、本発明では、簡単かつ正確に一塩基ミスマッチの検出が可能であり、臨床検査現場などでの簡易診断法として、非常に有効な手段である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態につき具体的に説明する。
先ず工程（Ａ）において、図１（Ａ）に示すように、標的ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）内の検出すべき一塩基ミスマッチの配列がＦＲＥＴプライマー内にくるように、このＦＲＥＴプライマーのオリゴヌクレオチドを設計する。
【００２４】
次に、工程（Ｂ）において、設計したオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質を修飾し、かつ一塩基ミスマッチを挟み込むように消光物質をこのオリゴヌクレオチド鎖内に修飾する。この際、３’末端側は工程（Ｃ）における増幅反応における伸長反応に利用するので、未修飾のままにする。なお、通常、タックマンプローブやモレキュラービーコンは、伸長反応を起こさないように３’末端をリン酸化などにより不活性化する。図１（Ａ）に示す状態では、ＦＲＥＴが起こっているため、蛍光物質に特定の波長の光（例えば、蛍光物質がＦＡＭの場合には約４９０ｎｍの光）を当てても、蛍光を発することはない。
【００２５】
図１（Ｂ）は、実際に作製したＦＲＥＴプライマーの配列であり、５’末端に蛍光物質として６−ＦＡＭが、また鎖内に消光物質としてＤａｂｃｙｌが修飾してある。この配列では、５’末端から数えて９番目の塩基Ｔが一塩基ミスマッチで、下線で示した配列（ＡＣＧＴＧＴ）は、制限酵素Ａｆ１  IIIの認識配列となっている。なお、蛍光物質の修飾は５’末端に限定されず、図１（Ｃ）に示すように、設計したオリゴヌクレオチドの５’末端側であっても同様の効果を得ることができる。
【００２６】
５’末端または５’末端側を修飾する蛍光物質としては、ＦＡＭの他に、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Fluorescein、Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ等、多数の既知のものを使用することができ、特に制限されるべきものではない。また消光物質としてはDabcylの他に，Black Hole Quencher、ＴＡＭＲＡ等を挙げることができ、エネルギー転移が起こる物質であれば、特に制限されるべきものではない。
【００２７】
次に、工程（Ｃ）において、遺伝子増幅法により、一塩基ミスマッチを含む標的ＤＮＡを増幅する。かかる遺伝子増幅法としては、プライマーのアニーリング、伸長反応などを利用する遺伝子増幅法を広く採用することができ、特に制限されるべきものではないが、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法およびＬＡＭＰ（Loop mediated isothermal amplification）法などの既知の手法を好適に採用することができる。図２（Ａ）は、作製したＦＲＥＴプライマーを用いてＰＣＲなどのＤＮＡ増幅反応により標的ＤＮＡが増幅される工程を示す。この増幅工程の操作により、図２（Ｂ）に示すＦＲＥＴプライマーを含む増幅産物が得られる。
【００２８】
次に、工程（Ｄ）において、得られた増幅産物に、図３（Ａ）に示す制限酵素サイトにて、一塩基ミスマッチを含む配列を認識する制限酵素を作用させる。この際、図３（Ｂ）の「１．ミスマッチなし」に示すように、鋳型となるＤＮＡ配列に制限酵素認識配列があるものは、制限酵素により切断され、ＦＲＥＴプライマー内のエネルギー転移が起こらなくなり蛍光を発する。一方、鋳型ＤＮＡに認識配列を有していない場合、図３（Ｂ）の「２．ミスマッチあり」に示すように、制限酵素による切断を受けず、ＦＲＥＴプライマー内のエネルギー転移が起こり蛍光を発することはない。この２つの差により、一塩基ミスマッチを検出することができる。なお、図３（Ｂ）では、一塩基ミスマッチを持たない場合に蛍光を発し、持つ場合は消光状態という例を示したが、ＦＲＥＴプライマー設計の際に、ミスマッチを含む配列を認識する制限酵素を用いることで、ミスマッチがあった場合に蛍光を示すようにすることも可能である。
【００２９】
また、検出したいＤＮＡ配列を認識する制限酵素が見つからなかった場合、位置指定変異導入を利用した既知のＡ−ＲＦＬＰ法が有効である（非特許文献１１、１２参照）。予め、ＦＲＥＴプライマーの設計の際、制限酵素の認識配列になるように、人為的なミスマッチを組み込んでおくことで、ほぼすべての配列に対応でき、簡便に一塩基ミスマッチの検出が可能になる。
【００３０】
そこで以下に本発明による、ヒトのアポリポ蛋白Ｅ（Human apoliporotein E）のε４遺伝子をターゲットとした一塩基ミスマッチの蛍光検出の応用例を示す。
アポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）はリポ蛋白を構成している主要なアポリポ蛋白の一つである。ＡｐｏＥは第１９番染色体上に遺伝子がコードされ、３１７個のアミノ酸からなる蛋白質として合成されるが、Ｎ末端１８個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切り離され、２９９個のアミノ酸からなる成熟蛋白（分子量：約３４，０００）として細胞外に分泌される。
【００３１】
ＡｐｏＥ遺伝子にはε２、ε３、ε４の３つの対立遺伝子（アレル）があり、それぞれに対応するＥ２、Ｅ３、Ｅ４の３つのアイソフォームがＡｐｏＥには存在する。これらのアイソフォーム間には、１１２位と１５８位のアミノ酸に違いがある。ＡｐｏＥ３は正常型（Wild Type）であり、ＡｐｏＥ４はアルツハイマー病（ＡＤ）の危険因子と見なされている。又、ＡｐｏＥ２は受容体との結合力が低く高脂血症の原因となる。
【００３２】
上述したように、アポＥは、１１２位と１５８位のアミノ酸が異なる。つまり、アポＥ遺伝子上に２箇所の一塩基ミスマッチが存在する。そこで、図４（Ａ）に示すように、標的遺伝子を増幅する際、フォワード、リバースの両プライマーに、波長の異なる２つの蛍光色素を夫々修飾したＦＲＥＴプライマーを用いる。例えば、フォワードＦＲＥＴプライマー（１１２）は５２０ｎｍの蛍光色素とし、リバースＦＲＥＴプライマー（１５８）は５８０ｎｍの蛍光色素とする。
【００３３】
この条件下でＤＮＡを増幅し、制限酵素で切断すると、アポＥのアイソフォームを特定できる（図４（Ｂ））。例えば、制限酵素Ａｆｌ  IIIを用いた場合、ε２を検出することが可能であり、ＨｈａＩを用いれば、ε４を検出することが可能である。
【００３４】
このように、ＦＲＥＴプライマーの設計と制限酵素の選択により、様々な既知のミスマッチの検出が可能になる。図５はＡｆｌ  IIIを用いた制限酵素反応の蛍光強度変化を示す。図４（Ｂ）でも示したように、Ａｆｌ  IIIは、ε２、３を切断する制限酵素である。サンプルＤＮＡを、ＦＲＥＴプライマーを用いて増幅し、切断した結果、図５から蛍光強度が増加していることが分かる。この結果から、サンプルＤＮＡは、ε２もしくはε３を有していることが分かる。
【実施例】
【００３５】
以下、ヒトのアポリポ蛋白Ｅのε４遺伝子をターゲットとした一塩基ミスマッチの蛍光検出実験例に基づき本発明を具体的に説明する。
実験例１
ＦＲＥＴ プライマー:6-FAM-AGGACGTGTGCGGCCGCCT(-Dabcyl)GTTをフォワードプライマーとし、CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGをリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記条件のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ条件
９５℃−２ｍｉｎ
９８℃−１５ｓｅｃと６８℃−１５ｓｅｃとを４０サイクル
【００３６】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                    ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                      ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                          ０．７５μｌ
１０μＭ  6-FAM-AGGACGTGTGCGGCCGCCT(-Dabcyl)GTT           １．２５μｌ
１０μＭ  CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG                        １．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                    ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                ０．２５μｌ
【００３７】
つぎに、ＰＣＲにより得られたサンプルを下記反応条件にて制限酵素Ａｆｌ  IIIを用いて切断した。またこの際、ＦＲＥＴプライマーの切断による蛍光強度変化を観察するため、リアルタイムＰＣＲ装置であるスマートサイクラーを用いて測定を行った。なお、比較のために、ヒトゲノムＤＮＡ（鋳型）無しの場合と、制限酵素Ａｆｌ  III無しの場合についても同様の実験を行った。
【００３８】
Ａｆｌ  III反応条件
３７℃−６０ｍｉｎ
【００３９】
Ａｆｌ  III反応溶液
１０×ＮＥＢ  緩衝液                                      ２．５μｌ
１００×ＢＳＡ                                          ０．２５μｌ
Ａｆｌ  III                                             ０．２５Ｕ
Ｈ2Ｏ                                                     ９．５μｌ
ＰＣＲ増幅産物                                          １２．５μｌ
【００４０】
得られた結果を図６に示す。図６中、鋳型（＋）／（−）はヒトゲノムＤＮＡ（鋳型）の有無によるＰＣＲの意味であり、制限酵素（＋）／（−）は制限酵素（Ａｆｌ  III）の有無による制限酵素反応の意味である。図６に示すグラフより、制限酵素（Ａｆｌ  III）反応の結果、ＰＣＲ増幅が認められたサンプルのみ、蛍光強度が変化することが分かった。
【００４１】
実験例２，３
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTをフォワードプライマーとし、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGGをリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記の条件のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ条件
９５℃−２ｍｉｎ
９８℃−１５ｓｅｃと６８℃−１５ｓｅｃとを４０サイクル
【００４２】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                    ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                      ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                          ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGTT                          １．２５μｌ
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG         １．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                    ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                  ０．５μｌ
【００４３】
つぎに、ＰＣＲにより得られたサンプルを下記の反応条件にて制限酵素Ｈａｅ  IIを用いて切断した（実験例２）。また、Ｈｈａ  Ｉを用いて下記の反応条件にて同様の実験を行った（実験例３）。なお、夫々比較のために制限酵素未処理の場合の実験も行った。
【００４４】
Ｈａｅ  ＩＩ反応条件
３７℃−６０ｍｉｎ
【００４５】
Ｈａｅ  ＩＩ反応溶液
１０×Ｍ  緩衝液                                            ２．５μｌ
Ｈａｅ  ＩＩ                                                ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                       ９．５μｌ
ＰＣＲ増幅産物                                            １２．５μｌ
【００４６】
Ｈｈａ  Ｉ反応条件
３７℃−６０ｍｉｎ
【００４７】
Ｈｈａ  Ｉ反応溶液
１０×ＴＡ  緩衝液                                            ２．５μｌ
１０×ＢＳＡ                                                  ２．５μｌ
Ｈｈａ  I（５０００Ｕ／ｍｌ）                                 ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                         ７．０μｌ
ＰＣＲ増幅産物                                              １２．５μｌ
【００４８】
得られた実験例２の結果を図７に、また実験例３の結果を図８に夫々に示す。これらグラフより、夫々の制限酵素反応の結果、ＰＣＲ増幅が認められたサンプルのみ、蛍光強度が変化することが分かった。
【００４９】
上記実験例１〜３から、制限酵素が認識する配列がある場合のみ、ＦＲＥＴプライマーにより増幅されたＤＮＡが切断され、蛍光強度が変化することが分かった。
次に、実際の血液（全血）から、ＦＲＥＴプライマーを用いてＰＣＲを行い、制限酵素（Ｈａｅ  II）で増幅産物を切断した際の蛍光強度変化を調べた。
【００５０】
実験例４
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTをフォワードプライマー、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGGをリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記条件のＰＣＲ法により増幅した。
【００５１】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
５×Ａｍｐ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｇ／Ｃ                            ５．０μｌ
５×Ａｍｐ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ−４                            ５．０μｌ
ｄＮＴＰ  混合物（１０ｍＭ  各々）                        ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGTT                            ２．５μｌ
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG           ２．５μｌ
全血                                                        ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     ０．７５μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                  ０．５μｌ
２．５％ＰＶＰ                                              ７．５μｌ
【００５２】
つぎに、ＰＣＲにより得られたサンプルを制限酵素Ｈａｅ IIを下記の条件で用いて切断した。
【００５３】
Ｈａｅ  II反応条件
１０×Ｍ  緩衝液                                            ２．５μｌ
Ｈａｅ  II                                                  ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                       ９．５μｌ
ＰＣＲ増幅産物                                            １２．５μｌ
【００５４】
Ｈａｅ  ＩＩ反応条件
３７℃−６０ｍｉｎ
【００５５】
その結果、図９に示すように、全血を用いた場合でも、用いた制限酵素が認識する配列を有するサンプルが存在するときのみ、蛍光強度変化が得られることがわかった。
【００５６】
実験例５
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTをフォワードプライマー、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGGおよびＦＡＭ修飾プライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGを夫々リバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。なお、比較のため、ＦＡＭ−Ｄａｂｃｙｌ修飾のものに対し、制限酵素Ｈａｅ  II無しの場合についても同様の実験を行った。
【００５７】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                      ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                        ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                            ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGTT                            １．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                      ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                       １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                    ０．５μｌ
ＦＲＥＴ  プライマーの場合
【００５８】
上記反応溶液に、
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG          １．２５μｌ
ＦＡＭ修飾プライマーの場合
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG                   １．２５μｌ
を夫々添加した。
【００５９】
つぎに、ＰＣＲにより得られたサンプルを制限酵素Ｈａｅ  IIを用いて下記の条件で切断した。
【００６０】
Ｈａｅ  II反応条件
１０×Ｍ  緩衝液                                          ２．５μｌ
Ｈａｅ  II                                                ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     ９．５μｌ
ＰＣＲ増幅産物                                          １２．５μｌ
【００６１】
Ｈａｅ  II反応条件
３７℃−６０ｍｉｎ
【００６２】
図１０に示す結果から分かるように、ＦＡＭ修飾プライマーを用いてＤＮＡを増幅した後、その増幅産物を制限酵素Ｈａｅ IIにより切断したところ、蛍光強度に変化はみられなかった。一方、Ｄａｂｃｙｌを鎖内修飾したＦＲＥＴプライマーの場合には、制限酵素反応により蛍光強度が増幅した。この結果から、作製したプライマーにＦＡＭ、Ｄａｂｃｙｌを修飾することでＦＲＥＴが生じていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
臨床検査分野においては、大型分析機器の対極として、医療、介護現場など、その場で利用できる分析技術が求められ続けてきた。特に、携帯型血糖値センサーに代表されるようなオンサイトでの分析、検出（ＰＯＣＴ：ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を可能とするセンサー技術は、住宅医療における臨床検査、患者の自己検査、初期診断、手術時における緊急処理やモニタリングなど、様々なケースに利用できるため、非常に高い需要がある。さらに近年、遺伝子解析技術、μＴＡＳの進歩とともに、感染症、遺伝病など、ＰＯＣによる迅速遺伝子診断に関心が寄せられるようになった。こうした遺伝子診断の多くは、特定の遺伝子配列の変異によるものであり、このような変異に対し、本発明の一塩基ミスマッチの検出法は極めて有効である。また、ＰＯＣによる迅速遺伝子診断には、正確、簡便、安価、そして安全性など、多くの面で制約があり、これを包括するセンサー技術は未だ登場していない。しかしながら、本発明の、ＦＲＥＴプライマーを用いた一塩基ミスマッチの検出法は、上述した多くの制約を満たしており、ＰＯＣセンサーを構築する上での非常に重要な技術であると言える。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＦＲＥＴプライマーの設計を示す概念図である。
【図２】ＦＲＥＴプライマーを用いて遺伝子増幅法によりＤＮＡを増幅させる工程を示す概念図である。
【図３】制限酵素によるＦＲＥＴプライマーを含んだ増幅産物の切断を示す概念図である。
【図４】アポリポ蛋白Ｅ（ε４）をターゲットとした一塩基ミスマッチの蛍光検出を示す概念図である。
【図５】アポリポ蛋白Ｅ（ε２またはε３）の検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図６】実験例１のアポリポ蛋白Ｅの検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図７】実験例２のアポリポ蛋白Ｅの検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図８】実験例３のアポリポ蛋白Ｅの検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図９】実験例４の全血を用いた場合の検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１０】実験例５のプライマーの修飾形態を変えた場合の検出結果を示す、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１】
2005192418.tif 000003
【図２】
2005192418.tif 000004
【図３】
2005192418.tif 000005
【図４】
2005192418.tif 000006
【図５】
2005192418.tif 000007
【図６】
2005192418.tif 000008
【図７】
2005192418.tif 000009
【図８】
2005192418.tif 000010
【図９】
2005192418.tif 000011
【図１０】
2005192418.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月23日(2004.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
図１（Ｂ）は、実際に作製したＦＲＥＴプライマーの配列（配列番号１）であり、５’末端に蛍光物質として６−ＦＡＭが、また鎖内に消光物質としてＤａｂｃｙｌが修飾してある。この配列では、５’末端から数えて９番目の塩基Ｔが一塩基ミスマッチで、下線で示した配列（ＡＣＧＴＧＴ）は、制限酵素Ａｆ１  ＩＩＩの認識配列となっている。なお、蛍光物質の修飾は５’末端に限定されず、図１（Ｃ）に示すように、設計したオリゴヌクレオチドの５’末端側であっても同様の効果を得ることができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
上述したように、アポＥは、１１２位と１５８位のアミノ酸が異なる。つまり、アポＥ遺伝子上に２箇所の一塩基ミスマッチが存在する。そこで、図４（Ａ）に示すように、標的遺伝子を増幅する際、フォワード、リバースの両プライマーに、波長の異なる２つの蛍光色素を夫々修飾したＦＲＥＴプライマーを用いる。例えば、フォワードＦＲＥＴプライマー（１１２）（配列番号１）は５２０ｎｍの蛍光色素とし、リバースＦＲＥＴプライマー（１５８）（配列番号２）は５８０ｎｍの蛍光色素とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
以下、ヒトのアポリポ蛋白Ｅのε４遺伝子をターゲットとした一塩基ミスマッチの蛍光検出実験例に基づき本発明を具体的に説明する。
実験例１
ＦＲＥＴ  プライマー：6-FAM-AGGACGTGTGCGGCCGCCT(-Dabcyl)GGT（配列番号１）をフォワードプライマーとし、CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG（配列番号２）をリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記条件のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ条件
９５℃−２ｍｉｎ
９８℃−１５ｓｅｃと６８℃−１５ｓｅｃとを４０サイクル
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                       ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                         ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                             ０．７５μｌ
１０μＭ  6-FAM-AGGACGTGTGCGGCCGCCT(-Dabcyl)GGT（配列番号１）１．２５μｌ
１０μＭ  CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG（配列番号２）             １．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                       ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                        １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                   ０．２５μｌ
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
実験例２，３
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）をフォワードプライマーとし、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）をリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記の条件のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ条件
９５℃−２ｍｉｎ
９８℃−１５ｓｅｃと６８℃−１５ｓｅｃとを４０サイクル
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                         ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                           ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                               ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）                 １．２５μｌ
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）１．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                         ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                          １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                       ０．５μｌ
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実験例４
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）をフォワードプライマー、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）をリバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子を下記条件のＰＣＲ法により増幅した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
５×Ａｍｐ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｇ／Ｃ                               ５．０μｌ
５×Ａｍｐ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ−４                               ５．０μｌ
ｄＮＴＰ  混合物（１０ｍＭ  各々）                           ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）                 ２．５μｌ
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）２．５μｌ
全血                                                           ０．５μｌ
Ｈ2Ｏ                                                        ０．７５μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                     ０．５μｌ
２．５％ＰＶＰ                                                 ７．５μｌ
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実験例５
AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）をフォワードプライマー、ＦＲＥＴプライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）およびＦＡＭ修飾プライマー：6-FAM-CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG（配列番号２）を夫々リバースプライマーに用いてアポリポ蛋白Ｅ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。なお、比較のため、ＦＡＭ−Ｄａｂｃｙｌ修飾のものに対し、制限酵素Ｈａｅ  ＩＩ無しの場合についても同様の実験を行った。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ＰＣＲ反応溶液（２５μｌスケールの場合）
１０×Ｒ−ＰＣＲ  緩衝液                                    ２．５μｌ
２５０ｍＭ  Ｍｇ2+溶液                                      ０．２μｌ
ｄＮＴＰ  混合物                                          ０．７５μｌ
１０μＭ  AGGACGTGTGCGGCCGCCTGGT（配列番号１）            １．２５μｌ
ヒトの女性ゲノム  ＤＮＡ                                    ２．０μｌ
Ｈ2Ｏ                                                     １６．８μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                                  ０．５μｌ
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
ＦＲＥＴ  プライマーの場合
上記反応溶液に、
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCT(-Dabcyl)GCAGGTCATCGG（配列番号２）１．２５μｌ
ＦＡＭ修飾プライマーの場合
１０μＭ  6-FAM-CCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGG（配列番号２）      １．２５μｌを夫々添加した。