(57)【要約】【課題】  ミオシン軽鎖リン酸化状態をリアルタイムに測定できる蛍光性プローブ、及び効率よく薬物をスクリーニングする方法の提供。【解決手段】ミオシン軽鎖の一端にドナー蛍光物質、他端にアクセプター蛍光物質が連結された蛍光性プローブ、及び前記プローブを細胞に導入し、得られる細胞について蛍光強度を測定することを特徴とするキナーゼ活性の検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオシン軽鎖の一端側にドナー蛍光物質、他端側にアクセプター蛍光物質が連結された蛍光性プローブ。
【請求項２】
ドナー蛍光物質がECFPであり、アクセプター蛍光物質がEYFP又はCitrineである請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプローブを細胞に導入し、得られる細胞について蛍光強度を測定することを特徴とする、ミオシン軽鎖のリン酸化の検出方法。
【請求項４】
蛍光強度の測定が、細胞内カルシウムの存在下で行われるものである請求項３記載の方法。
【請求項５】
蛍光強度の測定が、細胞内カルシウムの非存在下で行われるものである請求項３記載の方法。
【請求項６】
細胞が、平滑筋細胞、神経細胞若しくは癌細胞又は株化細胞である請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１又は２記載のプローブと、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する又は促進する候補化合物とを反応させることを特徴とする、医薬組成物のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１又は２記載のプローブが導入された細胞と、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する又は促進する候補化合物とを反応させることを特徴とする、医薬組成物のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞が、平滑筋細胞、神経細胞若しくは癌細胞又は株化細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
候補化合物が、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬又は活性化薬のためのものである請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
候補化合物が、Rhoキナーゼ阻害薬又は活性化薬のためのものである請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
医薬組成物が、高血圧、狭心症、癌、虚血性脳障害、腎不全、痴呆症及び消化器疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの予防用又は治療用医薬組成物である請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１又は２記載のプローブを含む、医薬組成物のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
医薬組成物が、高血圧、狭心症、癌、高血圧、狭心症、癌、虚血性脳障害、腎不全、痴呆症及び消化器疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの予防用又は治療用医薬組成物である請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
医薬組成物のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
(a) 請求項１又は２記載のプローブを細胞に導入する手段、
(b) 前記細胞と、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する又は促進する候補化合物とを反応させる手段、
(c) 蛍光強度の変化を検出する手段、及び
(d) 前記検出結果を指標として候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオシン軽鎖のリン酸化状態を実時間で測定することができる蛍光性プローブ、及び当該プローブを用いた薬物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血圧を正常な値に保つため、血管平滑筋の適度な緊張状態の維持は重要な役割を担っている。血管平滑筋の収縮は、平滑筋細胞内のカルシウム濃度変化などにより制御されている。細胞内カルシウム濃度が上昇すると、カルシウム依存的に活性化されるミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）により、平滑筋ミオシンのリン酸化率が上昇する。ミオシンは2分子の重鎖（229 kDa）と2分子の20 kDa軽鎖、及び2分子の17 kDa軽鎖からなっている。このうち20 kDa軽鎖の19位のセリン残基がリン酸化を受けると、収縮を担うアクチンとミオシンの相互作用が開始され、筋が収縮する（図１左側の経路）。細胞内カルシウム濃度が低下すると、MLCKの活性が低下し、相対的にミオシン軽鎖ホスファターゼの活性が勝って、筋は弛緩する。
【０００３】
一方、MLCKの作用だけでは説明できない平滑筋の収縮現象も知られている。その中で、近年最も注目されているのが低分子量Gタンパク質（Rho）を介する制御である。受容体刺激によりRhoが活性化されると、Rhoキナーゼが活性化され、この酵素の働きによってもミオシン20 kDa軽鎖（以下MLC）のリン酸化率が上昇する（図１右側の経路）。更に、Rhoキナーゼはミオシン軽鎖ホスファターゼ活性を阻害することでもMLCリン酸化率を上昇させる。この経路は、高血圧モデル動物における実験で血管の異常収縮に関与していることが示唆され、高血圧との関連から注目されている。
【０００４】
現在臨床応用されている抗高血圧薬は、血管収縮アゴニスト受容体を阻害するものや、細胞内カルシウム濃度上昇を抑制することにより血管平滑筋の張力を低下させるものが多いが、これらの薬物は正常収縮をも抑制する。よって、MLCKによるリン酸化又はRho経路のみを選択的に抑制する薬物が開発されれば、正常な血管張力には影響が少なく、病的な収縮を強く抑制することができる副作用の少ない抗高血圧薬となることが期待される。
【０００５】
しかし、これまでに臨床応用されたRhoキナーゼ阻害薬は知られていない。その主な理由として、候補薬物の効果を評価する簡便な実験系が不足していることが挙げられる。例えば、MLCのリン酸化状態の測定は煩雑で長時間かかる測定が必要であった。具体的には、以下のような方法がこれまでに行われている。(1)細胞を界面活性剤や有機溶媒で処理して蛋白固定し、目的のたんぱく質を抽出して電気泳動し、その移動度を比較する。(2)放射ラベルしたリン酸（32P）を含む溶液中でリン酸化反応を行い、取り込まれた32P量を測定する。(3)細胞を瞬間的に固定し、抗リン酸化抗体で免疫染色する。これらの方法は、いずれも1-2日の操作が必要である。
【０００６】
さらに、これらの技術には得られる情報に制限がある。すなわち、(1)細胞を固定するので、同一のサンプルについてある薬物処理を行う前後での比較が行えない。(2)固定には時間を要するため、1分以内に終了する反応や振動する反応を評価することが困難である。
【０００７】
また神経細胞等においても、MLCKとRhoキナーゼとによるMLCリン酸化の2重制御が報告されており、平滑筋と同様に、様々な細胞種において(1) MLCのリン酸化状態と病態との関連性を解明すること、及び、(2) 病態と関連する経路を選択的に抑制又は活性化する薬物の開発が重要な課題となると考えられる。
【非特許文献１】Somlyo AP, Somlyo AV. Nature. 1994 Nov 17; 372: 231-236
【非特許文献２】Uehata M. et al., Nature. 1997 Oct 30; 389: 990-994.
【非特許文献３】Somlyo AP, Somlyo AV. J Physiol. 2000 Jan 15; 522: 177-185.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ミオシン軽鎖リン酸化状態をリアルタイムに測定できる蛍光性プローブ、及び効率よく薬物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、ミオシン軽鎖の両端に蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素を連結することにより、上記課題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
（１）ミオシン軽鎖の一端側にドナー蛍光物質、他端側にアクセプター蛍光物質が連結された蛍光性プローブ。
【００１２】
上記プローブにおいて、ドナー蛍光物質としてはECFPが挙げられ、アクセプター蛍光物質としてはEYFP又はCitrineが挙げられる。
【００１３】
（２）上記(1)記載のプローブを細胞に導入し、得られる細胞について蛍光強度を測定することを特徴とするミオシン軽鎖のリン酸化の検出方法。
【００１４】
蛍光強度の測定は、細胞内カルシウムの存在下又は非存在下で行われる。また、細胞は平滑筋細胞、神経細胞若しくは癌細胞又は株化細胞であることが好ましい。
【００１５】
（３）上記(1)記載のプローブと、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する又は促進する候補化合物とを反応させることを特徴とする、医薬組成物のスクリーニング方法。また本発明は上記(1)記載のプローブが導入された細胞と、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する又は促進する候補化合物とを反応させることを特徴とする、医薬組成物のスクリーニング方法も提供する。
【００１６】
候補化合物としては、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬若しくは活性化薬のためのもの、又はRhoキナーゼ阻害薬若しくは活性化薬のためのものが挙げられる。また、医薬組成物としては、高血圧、狭心症、癌、虚血性脳障害、腎不全、痴呆症及び消化器疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの予防用又は治療用医薬組成物が挙げられる。
【００１７】
（４）上記(1)記載のプローブを含む、医薬組成物のスクリーニング用キット。
【００１８】
医薬組成物としては、高血圧、狭心症、癌、虚血性脳障害、腎不全、痴呆症及び消化器疾患からなる群から選ばれる少なくとも１つの予防用又は治療用医薬組成物が挙げられる。
【００１９】
（５）医薬組成物のスクリーニングシステムであって、以下の手段：
(a) 上記(1)記載のプローブを細胞に導入する手段、
(b) 前記細胞と、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する候補化合物とを反応させる手段、
(c) 蛍光強度の変化を検出する手段、及び
(d) 前記検出結果を指標として候補化合物を選別する手段、
を含む前記システム。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法によれば、細胞の固定や電気泳動を必要としないので、操作が簡便である。また、生きた細胞内でリン酸化率変化を測定できるため、同一サンプルについてリン酸化状態の推移を実時間で繰り返し測定できる。そして、反応が速やかで可逆的であるため、複雑な反応の評価が可能である。さらに、カルシウム濃度上昇を完全に阻害した条件下で実験を行うことにより、MLCKによるMLCのリン酸化とRho-Rhoキナーゼ系によるMLCのリン酸化とを分離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer： FRETともいう)の原理に基づいて、ミオシン軽鎖(MLC)のリン酸化状態を検出することを特徴とするものである。
【００２３】
FRETとは、ドナー物質とアクセプター物質とが離れて存在する場合は、それぞれの物質の蛍光スペクトルが検出されるのに対し、ドナー物質とアクセプター物質が互いに近い位置（通常100Å以内）に存在する場合は、ドナーの励起波長のエネルギーを当てると、ドナーの蛍光が減衰し、アクセプターの蛍光が増加してアクセプターからの蛍光が観察される現象をいう。
【００２４】
１．プローブの作製
本発明において、MLCKやRhoキナーゼによりリン酸化を受ける基質であるMLCの両端に、2種類の波長特性を持つ蛍光性物質（一端側にドナー蛍光物質、及び他端側にアクセプター蛍光物質）を連結することにより蛍光プローブを作製する。MLCがリン酸化を受けると、その構造が変化して、脱リン酸化のときと比較してMLCの両端の蛍光物質間の立体的な位置関係が変化すると予想される(図2A）。この変化によってFRET現象を生じさせ、各蛍光物質の蛍光強度の変化を測定し、その測定結果を指標としてリン酸化の有無を検出する。このリン酸化の検出は、本発明のプローブを用いることにより簡易かつ迅速に、しかもリアルタイムに行なうことが可能である。
【００２５】
本発明において、MLCの両側に結合させる蛍光物質としては、FRETを起こさせるものであれば特に限定されるものではない。例えば、ドナー物質としてECFP、BFPなどの蛍光タンパク質、fluoresceinなどの蛍光化合物を用いることができる。また、アクセプター物質として、例えばEYFP、Citrine、GFPなどの蛍光タンパク質、rhodamineなどの蛍光化合物を用いることができる。本発明においては、ドナーとしてECFP、アクセプターとしてEYFP又はCitrineの組合せが好ましい。また、ドナー物質、アクセプター物質をMLCの両端に直接連結してもよく、FRET効率等を考慮して、ドナー物質とMLCとの間又はアクセプター物質とMLCとの間に適当なリンカーを挿入してもよい。
【００２６】
蛍光物質とMLCとの連結は、各蛍光物質をコードするDNA及びMLCをコードするDNAを通常の遺伝子工学的手法により行なうことができる。
【００２７】
ドナー物質としてECFP、アクセプター物質としてCitrineを用いて、MLCの両端に連結したときのプローブのアミノ酸配列を配列番号2に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号1に示す。配列番号1において、1〜714番の配列はECFPをコードし、721〜1233番の配列はMLCをコードし、1249〜1962番の配列はCitrneをコードする塩基配列である。ただし、715〜720番及び1234〜1248番の配列は、それぞれGly-Ser及びThr-Ser-Pro-Lys-Leuをコードする配列であって、2つの蛋白を接続し、かつリン酸化に伴うFRET効率の変化が有効に検出できる構造にするために選択した配列である。
【００２８】
また、ドナー物質としてECFP、アクセプター物質としてEYFPを用いて、MLCの両側に連結したときのプローブのアミノ酸配列を配列番号4に、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号3に示す。配列番号3において、1〜1248番の配列は前記と同様であり、1249〜1962番の配列はEYFPをコードする塩基配列である。
【００２９】
本発明のプローブは、単独で、あるいは細胞内への導入用試薬とともに、キットに含めることができる。また、キットは、プローブの各構成要素（ドナー、MLC、アクセプター）をそれぞれコードするDNAとし、それぞれのDNAを別々に分けておいて、用時調製する形態としてもよい。
【００３０】
２．リン酸化の検出
上記のようにして作製したプローブをコードするDNAを適当なベクターに組み込んで目的の細胞内に導入し、細胞を所定のCa2+環境に設定することにより蛍光強度を測定する。
【００３１】
その蛍光強度の変化を指標としてMLCのリン酸化の有無を検出する。MLCのリン酸化の有無は、Ca2+濃度の上昇によってMLCKを活性化させるMLCK系、及びRhoによってRhoキナーゼを活性化させるRho系がある。本発明は、上記MLCK系及びRho系のいずれの経路であっても測定することが可能である。
【００３２】
本発明において使用することができる細胞は特に限定されるものではなく、各種動物細胞が挙げられる。例えば、平滑筋細胞、神経細胞など、Ca2+環境と深く関係する細胞のほか、癌細胞を用いることもできる。また、株化された細胞株であってもよい。細胞が樹立（line化）された細胞株である場合も、本発明のプローブを利用して新規薬物のスクリーニング（詳細は後述する）を行うことができる。この細胞はMLCのリン酸化に必要なキナーゼおよびそのキナーゼを活性化するのに必要な分子を含む必要がある。しかし、もともと必要なキナーゼや分子が内在している細胞である必要はない。場合によっては、MLCのリン酸化反応に必要なキナーゼ（MLCKまたはRhoキナーゼ）を発現させた細胞を用いることができる。
【００３３】
なお、プローブの細胞内への導入は、プローブを適当なベクターに連結した後、既に確立された一般的遺伝子工学的手法により行なうことができる。株化細胞への導入は、上記キナーゼをコードする遺伝子を細胞に導入することにより酵素蛋白を発現させるもので、この場合も一般的遺伝子工学的手法を用いて達成することができる。この手法を用いれば、MLCKまたはRhoキナーゼのいずれか一方しか活性化され得ないものを用いて、より簡便で効率的に目的のキナーゼ阻害薬またはキナーゼ活性化薬をスクリーニングすることができる。
【００３４】
MLCK系におけるキナーゼ活性を測定する場合は、細胞内のカルシウム濃度が上昇することが必須であり、そのためには細胞内外にカルシウムが存在する必要がある。その様な環境でカリウム刺激を行なうことで細胞外のカリウム濃度を上昇させて細胞膜電位を上昇させる。その結果、カルシウムチャネルが開口して細胞内にカルシウムを流入させることができる。
【００３５】
これに対し、Rhoにより活性化されたRhoキナーゼは、直接MLCをリン酸化するとともに、ミオシン結合サブユニット(MBS)をリン酸化することによりミオシンホスファターゼの活性を抑制する。その結果、リン酸化されたミオシンのレベルが上昇するため、平滑筋収縮が起こる。Rho系におけるキナーゼ活性を選択的に測定する場合は、MLCK経路が活性化しないようにすることが好ましい。そのためには、細胞内外のカルシウムが存在しない環境であることが好ましい。
【００３６】
３．医薬組成物のスクリーニング及びスクリーニングシステム
前述のように、MLCがリン酸化することによって平滑筋では収縮が生じ、癌細胞では増殖・浸潤・転移その他に関する性質が変化し、神経細胞では軸策や突起の伸張過程の変化及びそれに起因する神経回路形成の異常を生じ、その結果、当該変化に基づく各種疾患が引き起こされると考えられる。そこで、MLCK系、Rho系又はこれらの両者の経路を阻害又は促進する物質を選別することにより、上記変化に起因する疾患に対する薬物を開発することが可能となる。
【００３７】
平滑筋細胞、癌細胞、神経細胞等の性質変化に起因する疾患としては、例えば高血圧、狭心症、脳血管攣縮、癌、虚血性脳障害、腎不全、痴呆症及び消化器疾患などが挙げられる。また、株化された細胞株を用いてもよい。
【００３８】
従って、本発明の方法は、上記疾患の予防又は治療用組成物をスクリーニングするのに適している。スクリーニングの対象となる化合物が医薬組成物として有用であるか否かは、本発明のプローブと候補化合物とを反応させる。「プローブと候補化合物とを反応させる」とは、(i)本発明のプローブを直接候補化合物で刺激すること、(ii)本発明のプローブを導入した細胞を候補化合物の存在下で刺激すること、あるいは(iii)適当な阻害薬又は活性化薬の存在下において候補薬物で細胞を刺激することのいずれをも意味する。そして、これら刺激後の蛍光強度の変化を測定すればよい。その変化を指標として医薬組成物を選別する。例えば、リン酸化を阻害する化合物（阻害薬）をスクリーニングする場合は、以下の(a)及び(b)のいずれか又は両方の条件を満たす場合に、リン酸化が阻害されたものと判断し、その範囲内に含まれる候補化合物を選択する。
【００３９】
(a) 阻害薬候補化合物非存在下において既知のMLCリン酸化活性化薬により細胞を刺激した時、本発明のプローブの蛍光強度の比（アクセプター/ドナー比、例えばF535/F480）が、刺激前に比べて3％以上、好ましくは5-10％上昇したものが、阻害薬候補薬物存在下では２％以下、好ましくは1-0.00％の上昇しか生じなくなったとき
(b) 実験を複数回（例えば2回以上、好ましくは5回以上、更に好ましくは7-10回）繰り返した場合において、候補化合物の存在下・非存在下における蛍光強度比の変化の差が統計的に有意であるとき
また、リン酸化を促進する化合物（活性化薬）をスクリーニングする場合は、以下の(a)及び(b)のいずれか又は両方の条件を満たす場合に、リン酸化が促進されたものと判断し、その範囲内に含まれる候補化合物を選択する。
【００４０】
(a) 活性化薬の候補化合物により細胞を刺激したとき、本発明のプローブの蛍光強度比（アクセプター/ドナー比、例えばF535/F480）が、刺激前の蛍光強度比よりも３％以上、好ましくは５％以上上昇するとき
(b) 実験を複数回（例えば2回以上、好ましくは5回以上、更に好ましくは7-10回）繰り返した場合において、刺激前後における蛍光強度比の差が統計的に有意であるとき
本発明のスクリーニングシステムは、以下の手段：
(a) 本発明のプローブを細胞に導入する手段、
(b) 前記細胞を、ミオシン軽鎖のリン酸化を阻害又は促進する候補化合物の存在下で刺激するか、あるいは適当な阻害薬又は活性化薬の存在下において候補薬物で細胞を刺激する手段、
(c) 蛍光強度の変化を検出する手段、
(d) 前記検出結果を指標として候補化合物を選別する手段、
により構成される。
【００４１】
本発明のプローブを細胞に導入する手段は、例えば形質転換手段であり、一般的な培養装置に加え、以下のような形質転換のための装置を備える。例えば、マイクロインジェクション法の際には倒立位相差顕微鏡・ガラス注入針・マニュピレーター・インジェクターを備え、エレクトロポレーション法の際にはBio-Rad社のジーンパルサーIIエレクトロポレーションシステムなどのエレクトロポレーション装置を備える。リポフェクション法の際にはInvitrogen社のLipofectamine TM 2000 試薬等の試薬を備える。レトロウイルスをはじめ、アデノウイルス・シンドビスウイルス・レンチウイルスなどの各種ウイルスベクターを用いた目的遺伝子の導入の際にはウイルスベクタープラスミド・パッケージング細胞・安全キャビネット・安全基準を満たした実験室などを備える。
【００４２】
細胞とミオシン軽鎖のリン酸化を阻害する候補化合物とを反応させる手段は、細胞又は候補化合物を所定の量に調製し、両者を混合する手段を備える。反応に必要な手段としては培養装置が挙げられ、所定の湿度、CO2濃度、温度などを設定することができる。また、カリウム刺激を行なうことにより、細胞内カルシウム濃度を上昇させる手段、U46619刺激を行なうことにより、細胞内Rhoキナーゼ活性を上昇させる手段を含んでもよい。
【００４３】
蛍光強度の変化を検出する手段は、細胞内のプローブから発せられた蛍光を測定する手段を備える。例えば、浜松ホトニクス社のAQUACOSMOS  w-viewシステム、日本分光社のSpectrofluorometer、OLYMPUS社Floeviewシステム、などの一般的な蛍光強度測定システムを使用することができる。
【００４４】
前記検出結果を指標として候補化合物を選別する手段は、一定の値以上の蛍光強度比の変化があったときに、上記化合物を選別する手段を備える。選別のための判断基準は前記と同様であり、その判断基準の範囲内に含まれる候補化合物を選択するようにプログラムされる。
【実施例１】
【００４５】
プローブの細胞への導入
本実施例では、MLCKやRhoキナーゼによりリン酸化を受ける基質であるMLCの両端に、蛍光性蛋白質GFPの改変型であるECFP及びEYFP（又はCitrine）という2種類の波長特性を持つ蛍光性蛋白を接続した蛍光プローブを作製した（図2A）。
【００４６】
すなわち、ECFP、EYFP、Citrine、MLCをコードする遺伝子を以下のようにして得、３者をMolecular Cloning, CSHL Press, ３rd editionに記載の方法に従って遺伝子工学的に接続した。
【００４７】
まず、ECFP及びEYFPをコードするDNAをClontech社のpECFP-C1ベクター及びClontech社のpEYFP-C1ベクターよりPCRにて得た。
【００４８】
pECFP-C1よりECFPを得たときに用いたPCRプライマー及びPCR条件を以下に示す。
【００４９】
F： TAGCGCGAGCTCGCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC（配列番号５）
R： TATTCCCCGCGGAGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA（配列番号６）  
反応組成
────────────────────────────────
ポリメラーゼ（TOYOBO社KOD-plus）                1unit
template  DNA                                   適量（約30ng）
kit添付の10xbuffer                              5μl/50μl
dNTP                                            0.2ｍM
MgSO4                                           1.2ｍM
primerF                                         50pmol/50μl
primerR                                         50pmol/50μl
────────────────────────────────
PCRは、（94℃ 30秒の変性、45℃ 30秒のアニーリング、68℃ 1分の伸長）のサイクルを30サイクル行なった。
【００５０】
pEYFP-C1よりEYFPを得たときに用いたPCRプライマー及びPCR条件を以下に示す。
【００５１】
F： TATAGGACTAGTCCCAAGCTTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC（配列番号７）  
R： GCCGCCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA（配列番号８）  
反応組成
────────────────────────────────
ポリメラーゼ（TOYOBO社KOD-plus）                1unit
template  DNA                                   適量（約30ng）
kit添付の10xbuffer                              5μl/50μl
dNTP                                            0.2ｍM
MgSO4                                           1.2ｍM
primerF                                         50pmol/50μl
primerR                                         50pmol/50μl
────────────────────────────────
PCRは、（94℃ 30秒の変性、48℃ 30秒のアニーリング、68℃ 1分の伸長）のサイクルを30サイクル行なった。
【００５２】
EYFPの配列の一部をStratagene社pBluescriptベクターにサブクローニングした後、PCRにて変異を入れることによりCitrine遺伝子を得た。実際にはMLCとEYFPとを接続してpBluescriptにサブクローニングしたものをテンプレートとして、2つのPCRを行い、2つのPCR産物を同一の制限酵素で切断し、それぞれひとつずつの断片を選択してライゲーションした。ライゲーションにはTakara社のligation  kitを用いた。
【００５３】
EYFPからCitrineを得るときに用いたPCRプライマー及びPCR条件を以下に示す。
【００５４】
PCR1
F：CGGGATCCTCGAGCAAAAGAGCGAAGACCAAGACCAC（配列番号９）
R：GGGATATCGGGCGAAGCACATCAGGCCGTAGCCGAAGGTGG（配列番号10）
PCR2
F：CCCGATATCCCGACCACATGAAGCAGC（配列番号11）
R：GCCGCCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA（配列番号12）
反応組成
────────────────────────────────
ポリメラーゼ（TOYOBO社KOD-plus）                1.2unit
template  DNA                                   適量（約30ng）
kit添付の10xbuffer                              5μl/50μl
dNTP                                            0.2ｍM
MgSO4                                           1ｍM
primerF                                         50pmol/50μl
primerR                                         50pmol/50μl
────────────────────────────────
PCR1は、（94℃ 30秒の変性、55℃ 30秒のアニーリング、72℃ 40秒の伸長）のサイクルを30サイクル行なった。
【００５５】
PCR2は、（94℃ 30秒の変性、50℃ 30秒のアニーリング、72℃ 40秒の伸長）のサイクルを30サイクル行なった。
【００５６】
MLCをコードするDNAはClontech社のcDNAライブラリー（Rat Lung 5’-stretch Plus cDNA Library）よりPCR法により得た。
【００５７】
Rat lung cDNA libraryからMLCを得たときに用いたPCRプライマー及びPCR条件を以下に示す。
【００５８】
F： TATTCCCCGCGGTCGAGCAAAAGAGCGAAGACCAAG（配列番号13）
R： GTAGGGACTAGTGTCATCTTTGTCTTTCGCTCCGTGC（配列番号14）  
反応組成
────────────────────────────────
ポリメラーゼ（TOYOBO社KOD-plus）                1unit
template  DNA                                   kit溶液5μl
kit添付の10xbuffer                              5μl/50μl
dNTP                                            0.2ｍM
MgSO4                                           1.2ｍM
primerF                                         50pmol/50μl
primerR                                         50pmol/50μl
────────────────────────────────
PCRは、（94℃ 30秒の変性、45℃ 30秒のアニーリング、68℃ 1分の伸長）のサイクルを30サイクル行なった。
【００５９】
３種の遺伝子を、接続部が設計した配列になるように一つのpBluescriptベクターに組み込み、ECFP-MLC-Citrine又はECFP-MLC-EYFPをコードする遺伝子を得た。ECFP-MLC-Citrineをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ECFP-MLC-EYFPをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。
【００６０】
これらの遺伝子により発現するプローブは、いずれも分子量75 kDaの蛋白質であり、アクセプターの種類によりCRY（アクセプターがEYFP）及びCRCit（アクセプターがCRCit）と名づけた。なお、図２B及び図２CではCRYを用いた場合の結果を示し、図２Dから図５ではCRCitを用いた場合の結果を示す。CRY及びCRCitは、ともにリン酸化MLCプローブとしての性質を有し、分化させた細胞内で観察される繊維状の蛍光分布も同様に観察された（図２C）。なお、CRCit、CRYのアミノ酸をそれぞれ配列番号２、配列番号４に示す。この蛋白質を血管平滑筋培養細胞に導入するため、CRCit又はCRYをコードする遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込んだ。
【００６１】
具体的には、レトロウイルスベクターpMXにCRY遺伝子又はCRCit遺伝子をサブクローニングすることにより、pMX-CRY及びpMX-CRCitESを得た。
【００６２】
ラット大動脈から初代血管平滑筋細胞を作製した。培養液はDMEM/12培地を基礎とし、血清（10％）を含む増殖用培地と血清を含まない分化用培地の2種類を調製した。細胞は凍結保存することが可能であり、急性単離後、増殖培地にて培養し、1回継代したものを液体窒素中で凍結保存した。
【００６３】
実験時に細胞を融解して増殖培地にて2日間培養し（37℃、５％CO2）、この2日間にレトロウイルスを感染させた。これにより、培養血管平滑筋細胞にCRY遺伝子又はCRCit遺伝子を導入した。その後分化用培地に置換して2日間培養し、細胞が分化型に変化した後に蛍光測定に用いた。
【００６４】
ウエスタンブロッティングにより、CRY遺伝子又はCRCit遺伝子は、実際に平滑筋培養細胞に発現していることが確認された。図中ではCRYの結果を示した（図2B、75kDaのバンド）。図2Bにおいて、「M」はサイズマーカー、「WT」は遺伝子非導入細胞、「CRY」はCRY遺伝子を導入した平滑筋細胞である。
【００６５】
CRY遺伝子を導入した血管平滑筋細胞では、CFP由来及びEYFP由来の2種類の波長（それぞれ480 nm、535 nm）の蛍光が観測された。培養平滑筋細胞の培養液から血清を除去すると、細胞は増殖型から分化型に変化し、ミオシンの発現量が上昇し、線維状の構造が形成されることが知られている。そこで、CRYを発現させた細胞の培養液から血清を除くと、血清除去前（図2C左）に対して除去後ではCRYの蛍光像は線維状となり（図2C右）、CRYがミオシン分子に組み込まれていることが示された。CRYと同様の結果は、CRCitを用いた場合にも観察された。
【実施例２】
【００６６】
高カリウム刺激によるMLCのリン酸化
CRCit遺伝子又はCRY遺伝子を導入し、血清除去処理を行った細胞に対してMLCのリン酸化を引き起こすために、高カリウム（80K）刺激を行った。80K刺激とは、細胞外カリウム濃度を4 mMから80 mMにまで上昇させて細胞膜電位を上昇（脱分極）させる刺激法である。膜電位が上昇すると電位依存性のカルシウムチャネルが開口し、細胞内にカルシウムが流入して細胞内カルシウム濃度が上昇するためMLCKが活性化される。この80K刺激に対して、蛍光強度比F535/F480が速やかに変化し、刺激の終了にしたがって蛍光強度比は静止状態の値に戻った（図2D）。図2Dにおいて、aはCFP・Citrineの各蛍光タンパク質の蛍光強度の推移であり、実線はF480の蛍光強度の変化、破線はF535の蛍光強度の変化を示す。bは蛍光強度比の変化である。図2Dの各パネルから分かる通り、80K刺激によって細胞内カルシウム濃度を上昇させると、MLCのリン酸化が生じて蛍光強度が変化した。この変化は80K刺激の間（測定開始後60秒〜90秒の間）に観察され、MLCのリン酸化をリアルタイムで測定することができた。
【００６７】
このとき、535 nm、480 nmの各波長の蛍光強度は、それぞれ上昇・低下しており、ECFPとCitrineの間の蛍光エネルギー移動（FRET）効率が変化したことを示している。このFRET効率変化の時間経過は、これまでに予測されている細胞内カルシウム濃度上昇によるMLCのリン酸化の時間経過とよく対応していた。
【００６８】
次に、図2Dに示した80K刺激によるCRCitの蛍光強度変化がMLCのリン酸化状態の変化によることを示すため、以下の実験を行った。
【００６９】
80K刺激によるMLCリン酸化は、カルシウム及びMLCK依存的な反応である。従って、(i)細胞内カルシウム濃度上昇を阻害する、又は(ii)MLCKの酵素活性を阻害すると、反応は消失すると考えられる。そこでまず、細胞外カルシウムを除去した溶液中で80K刺激を行った。この条件下では脱分極が生じても細胞内にカルシウムが流入しないため、MLCKは活性化されない。したがってMLCはリン酸化されないと考えられ、実際にこの条件下ではCRCitの蛍光特性は変化しなかった（図3Ad、3B）。次に2種類のMLCK阻害薬（ML-7及びwortmannin(WM)）の効果を観察した。これらの薬物は、共に80K刺激時のCRCitの蛍光特性の変化を有意に抑制した（図3Ab、3Ac、3B）。図３Aにおいて、aは阻害剤のない対照試験の結果、bはML-7を用いて試験した結果、cはWMを用いて試験した結果、dは上に述べた細胞外カルシウムを除去した溶液中で80K刺激を行った場合の結果である。従って、80K刺激時に観察されるCRCitの蛍光強度比の変化はMLCKを介するMLCのリン酸化に基づくと考えられた。
【００７０】
本実施例においては、プローブの蛍光強度の比の変化が、対照実験では4.1％（例数14）上昇したものが、阻害薬の存在下または細胞外のカルシウムを除去した環境下では1.3％（ML-7、例数5）、0.6％（WM、例数）、0.2％（カルシウム除去、例数6）の変化に留まっていたため、MLCK阻害薬または細胞外カルシウム除去によって確かにリン酸化が阻害されたものと判断することができた。
【実施例３】
【００７１】
MLCの変異体を用いたリン酸化反応試験
CRCitの蛍光強度比変化とMLCのリン酸化反応との相関を確実に証明するために、以下の実験を行った。MLCのリン酸化部位は19位のセリン（Ser19）及び18位のスレオニン（Thr18）であることが知られている。そこで、Ser19をアラニンに変えたCRCitの変異体（AS）、Thr18をアラニンに変えた変異体（TA）、並びにThr18及びSer19をともにアラニンに変えた変異体（AA）を作製した。これらの変異体は、変異を入れる残基を中心とした部分配列に相補的であって、目的の残基をアラニンをコードする塩基に変えるプライマーを設計し、PCR法にて作製した。
【００７２】
細胞内カルシウム濃度が上昇した時、最初にリン酸化されるのはSer19であり、Thr18のリン酸化は、より強い刺激や特殊な条件下で起こると考えられている。80K刺激に対して、CRCitのAS変異体は野性型(TS)とほぼ同様の反応性を示し、TA変異体はやや反応性が低かった。リン酸化部位をすべてアラニンに変えたAA変異体では、80Kに対する反応が消失した（図4Ad）。さらに、細胞膜のカルシウム透過性を高めるカルシウムイオノフォアであるイオノマイシンによる、強い細胞内カルシウム濃度上昇刺激に対する反応も解析した。AS及びTA変異体は野生型TSと同等の反応性を示したが、AA変異体では、全く反応が見られなかった。以上の結果により、CRCitの蛍光強度比変化がMLCのリン酸化に基づくものであることが示された。
【実施例４】
【００７３】
Rhoキナーゼ活性の解析
CRCitを用いてRhoキナーゼの活性を解析できるかについて実験を行った。
【００７４】
一般的に血管収縮アゴニストは、細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こしてMLCKを活性化すると共に、Rhoキナーゼも活性化する。アゴニストによりRhoキナーゼの活性化の程度が異なるが、トロンボキサンA2受容体に作用するU46619は、相対的にRhoキナーゼ活性化能が高いことが知られている。
【００７５】
そこで、CRCitの蛍光強度変化に対するU46619の作用を解析した。実験は、MLCK経路が同時に活性化されないようにして行った。すなわち、細胞内カルシウム濃度上昇を完全に阻害するため、細胞外液にはカルシウム・キレート薬のEGTAを加えて細胞外カルシウムを除去すると共に、細胞をあらかじめタプシガルギンで処理し、細胞内のカルシウム貯蔵部位からのカルシウム放出も阻害した条件下で実験を行った。U46619投与により細胞内カルシウム濃度が上昇しないことは、カルシウム蛍光指示薬を用いた実験により確認した。
【００７６】
このように細胞内カルシウム濃度上昇を完全に阻害した条件下でU46619を投与した時、CRCitの蛍光強度比は明らかに上昇した（図5A実線）。このときの蛍光強度は３％変化した。この反応は、Rhoキナーゼ阻害薬Y-27632により強く抑制され、蛍光強度は0.7％の変化にとどまった（図5A破線及び図5B）。以上の結果は、CRCitがRhoキナーゼによるMLCのリン酸化を直接検出できることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
（１）CRCit発現細胞の薬物応答観察は自動化できる。これにより、Rho-Rhoキナーゼ系によるMLCリン酸化を選択的に阻害する（又は亢進する）薬物のハイスループットスクリーニング系の構築が可能である。従って、Rho系選択的な新規抗高血圧薬などの開発に利用できる。また、Rho系は癌の浸潤や転移等に関連する細胞運動にも関与することが示唆されており、Rho系の抑制薬は抗癌薬としての効果も期待できる。
【００７８】
（２）高カリウム刺激を用いると、カルシウム-ミオシン軽鎖キナーゼ系によるミオシン軽鎖リン酸化状態をモニターすることができる。従って、刺激方法を変えるだけで、カルシウム-ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）系を選択的に阻害する（又は亢進する）薬物のハイスループットスクリーニング系に変更が可能である。リン酸化MLCの増加は神経伸張を抑制することが示唆れされており、MLCのリン酸化抑制薬は神経回路形成障害を改善する神経障害改善薬としての効果も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ミオシン軽鎖のリン酸化の経路を示す図である。
【図２】本発明のプローブの構築及び蛍光機構(A)、ミオシンの発現結果(B,C)、及びプローブの蛍光強度の変化(D)を示す図である。
【図３】80K刺激によるMLCリン酸化の測定結果及びそれに対する細胞外カルシウム除去とMLCK阻害薬の作用を示す図である。
【図４】CRCitの変異体を用いたときのMLCリン酸化の測定結果を示す図である。
【図５】Rhoキナーゼ活性の解析結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号１：EYFP、MLC及びCitrineの融合DNA
配列番号２：EYFP、MLC及びCitrineの融合タンパク質
配列番号３：EYFP、MLC及びEYFPの融合DNA
配列番号４：EYFP、MLC及びEYFPの融合タンパク質
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号10：合成DNA
配列番号11：合成DNA
配列番号12：合成DNA
配列番号13：合成DNA
配列番号14：合成DNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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