(57)【要約】【課題】  安価なディスポーザブル材料を用いた抗体の精製方法、特に抗体水溶液中に溶解している抗体凝集体の除去方法を提供する。【解決手段】  抗体水溶液中の抗体凝集体をポリアミドに吸着させることを特徴とする抗体凝集体の除去方法。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体水溶液中の抗体凝集体をポリアミドに吸着させることを特徴とする抗体凝集体の除去方法。
【請求項２】
ポリアミドが脂肪族ポリアミドであることを特徴とする請求項１記載の抗体凝集体の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の精製方法、特に抗体水溶液中に溶解している抗体凝集体の除去方法に関するものであり、特に医薬品および／または研究用試薬の製造工程に好適に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
古くから免疫グロブリンＧを主成分とするγ−グロブリン製剤が各種感染症などの予防や治療に役立てられてきた。しかし、γ−グロブリン製剤は血圧降下を伴うアナフィラキシー様の重篤な副作用を起こすので筋肉投与に限定されている。静注内投与を可能とするためには、副作用の原因である抗補体価を低減させる必要があるが、この抗補体価は抗体モノマーの凝集化によって生じることがわかっている。また、最近ではがんやアレルギーをターゲットとした抗体医薬が注目されてきているが、抗体凝集体は免疫源として作用し、所望でない免疫応答を引き起こす。また、タンパク質の構造解析の分野では、タンパク質の精製度が重要であり、抗体の解析時に、抗体中から抗体凝集体は除去することが求められている。
【０００３】
この抗体凝集体を除去する方法として、超遠心により除去する方法や限外ろ過膜を用いた手法（特許文献１）やプロテインＡカラム、イオン交換カラム、サイズ排除カラムを組み合わせた手法（特許文献２）、疎水ゲルを用いた手法（非特許文献１）などがある。超遠心法は研究分野では、用いることは可能であるが、大量生産プロセスには向かない。限外ろ過膜による手法は、膜の分画がシャープでないため、精製度において不十分である。また、カラムやゲルを用いた手法は、高価なカラムの使用におけるコスト面やグラジエント溶出などの操作が煩雑であったり、継続使用による劣化の問題や精製抗体が希釈されることによる精製後の濃縮または乾燥工程への負担が大きくなる欠点がある。また、抗体の精製に時間がかかり、抗体の変性の問題がある。
【０００４】
一方、ポリアミドは安価であるため、縫合糸や人工腎臓などディスポーザブル製品として医療分野に用いられており、特にポリアミド繊維は縫合糸やフィルターなどに利用されている。
【特許文献１】特開昭５６−５９７１６号公報
【特許文献１】第２６３８６８０号特許公報
【非特許文献１】ＨＬＣ  ＭＡＩＬ  ＧＲＡＭ，東ソー株式会社，２００３年８月２５日，第９７巻，第３号，ｐ．１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、安価なディスポーザブル材料を用いた抗体の精製方法、特に抗体水溶液中に溶解している抗体凝集体の除去方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本発明は以下の構成を有する。
【０００７】
すなわち本発明は、抗体水溶液中の抗体凝集体をポリアミドに吸着させることを特徴とする抗体凝集体の除去方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗体凝集体の除去方法は、γ−グロブリン製剤や免疫療法に用いられる抗体医薬などの製造工程における抗体の精製方法として用いられ、本精製方法を用いることにより効率よく、安価なディスポーザブル材料で抗体凝集体を除去できることから、極めて有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で用いられるポリアミドは脂肪族ポリアミドであるナイロン−６、ナイロン−６，１０、ナイロン−６，６、ナイロン−７、ナイロン−１１に加え、芳香環を有するポリアミドとして、メタキシリレンジアミン（ＭＸＤＡ）とアジピン酸からのナイロンＭＸＤ６、ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸からのナイロン６Ｔ、更に、全芳香族系ポリアミドであるアラミドとして、ポリパラフェニレンテレフタルアミドやこれらの共重合ポリアミドなどが挙げられる。特に脂肪族ポリアミドは、親水性と疎水性のバランスがとれており、疎水性のより高い抗体凝集体を吸着し、抗体モノマーは吸着しないという選択的な吸着性能をもつ。中でもナイロン−６やナイロン−６，６は古くから医療用途に用いられており、安価でディスポーザブルとして利用可能であり、入手も容易であることから好適に用いられる。
【００１０】
その重量平均分子量は特に限定されるものではないが、あまり重合度が高くなると繊維にする際には、紡糸性が悪くなるため、２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。また、ポリアミドを紡糸する場合は加熱時の重合促進による高分子量化を防ぐために、アミノ基末端を酢酸などで封鎖されていてもよい。
【００１１】
ポリアミドは繊維状、平膜状、中空糸膜状、ビーズ、ゲル、スポンジ状などどのような形状で用いられてもよいが、製造コストや表面積の点から繊維状が望ましい。繊維状で用いる場合、繊維径は特に限定されないが、０．１μｍ〜１００μｍ、より好ましくは１μｍ〜１００μｍのものが好ましい。繊維は、織布の形でもよいし、不織布の形でもよい。また、糸くずなどの漏出の点からは長繊維であることが望ましい。長繊維からなる不織布を得る場合はメルトブロー法やスパンボンド法などによって得ることができる。
【００１２】
また、本発明でいうポリアミドには他の成分、例えば親水性成分であるポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールやイオン性成分であるポリアクリル酸などがブレンドまたはグラフト、コーティングされているものも含まれる。
【００１３】
本発明における抗体凝集体とは、抗体水溶液中に溶解されているものであり、プレフィルターなどで除去されるものではない。抗体凝集体は、具体的には抗体水溶液中において、抗体が３分子以上凝集したもののことをいい、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、主要となる抗体のモノマーピークおよびダイマーピークよりも高分子量側に存在するピークとして検出される。通常、抗体水溶液中では抗体凝集体は１％〜３０％程度含まれている。
【００１４】
抗体水溶液中に溶解している抗体凝集体をポリアミドに吸着させる場合は、抗体の水溶液をポリアミドに浸漬または通液するだけでよい。抗体の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ以下であることが望ましく、また、用いられるポリアミドは、多いほどよいが、抗体量に対して１０倍以上、好ましくは５０倍以上であることが望ましい。
【００１５】
抗体は凝集することにより、疎水化度が上がるため、疎水性の材料によって吸着されやすくなると考えられる。しかし、抗体のモノマーも分子内に疎水部分をもっているため、抗体水溶液を疎水性の強い材料に浸漬すると、抗体凝集体とともに精製されるべき抗体モノマーも吸着除去されてしまう。
【００１６】
ポリアミドは、分子内に疎水性部分と親水性部分をあわせもつポリマーであり、疎水性と親水性のバランスにより抗体凝集体だけが選択的に吸着除去されると考えられる。
【００１７】
抗体の水溶液は、抗体が溶解され、失活されないのであればどのような条件でもよいが、ｐＨ６〜８のリン酸緩衝液に塩化ナトリウムが１５０ｍＭ含むものが好適に用いられる。
【００１８】
抗体はヒト由来に限らず、ヒト以外の動物由来の抗体においても用いることができる。
【００１９】
本発明における抗体凝集体の除去方法は、γ−グロブリン製剤や免疫療法に用いられる抗体医薬などの製造工程における精製方法として好適に使用することができる。
【実施例】
【００２０】
抗体凝集体の濃度は、高速液体クロマトグラフィーで測定した（溶離液：０．５Ｍ  酢酸緩衝液、ｐＨ４．５、カラム：東ソー製  Ｇ３０００ＳＷＸＬ、装置：東ソー社、ＨＰＬＣシステム、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）。本測定条件では、抗体モノマーは１７．５分、抗体凝集体は１２．５分付近にピークが観測される。
【００２１】
（実施例１）
ＮａＣｌを１５０ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍｌに溶解したヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製）１ｍｌをナイロン−６，６長繊維不織布（繊維径１０μｍ）０．１ｇに浸漬した。高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、浸漬前に２０％含まれていたヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体は浸漬後には完全に除去されていた。一方、ヒト免疫グロブリンＧのモノマーは９０％以上残存していた。
【００２２】
（比較例１）
実施例１と同様にしてポリプロピレン長繊維不織布０．１ｇに浸漬したところ、ヒト免疫グロブリンＧの凝集体とともにヒト免疫グロブリンＧのモノマーも吸着された（総量で６０％吸着）。さらに浸漬後のヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体の含量は２０％のままであった。
【００２３】
（比較例２）
実施例１と同様にしてポリエチレンテレフタレート長繊維不織布０．１ｇに浸漬したところ、ヒト免疫グロブリンＧの凝集体とともにヒト免疫グロブリンＧのモノマーも吸着された（総量で６０％吸着）。さらに、浸漬後のヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体の含量は２０％のままであった。
【００２４】
（比較例３）
実施例１と同様にして硫酸基の導入されたポリスチレン編み地０．１ｇに浸漬したところ、ヒト免疫グロブリンＧの凝集体とともにヒト免疫グロブリンＧのモノマーも吸着された（総量で９０％吸着）。
【００２５】
（実施例２）
実施例１と同様にして、ナイロン−６短繊維不織布（繊維径７μｍ）０．１ｇに浸漬した。高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、浸漬前に２０％含まれていたヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体は浸漬後には完全に除去されていた。一方、ヒト免疫グロブリンＧのモノマーは９０％以上残存していた。
【００２６】
（実施例３）
実施例１と同様にして、アクリル酸をグラフトしたナイロン−６短繊維不織布（繊維径７μｍ）０．１ｇに浸漬した。高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、浸漬前に２０％含まれていたヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体は浸漬後には完全に除去されていた。一方、ヒト免疫グロブリンＧのモノマーは８０％以上残存していた。
【００２７】
（実施例４）
実施例１と同様にして、ポリビニルピロリドンが５重量％ブレンドされたナイロン−６，６長繊維織布（繊維径１０μｍ）０．１ｇに浸漬した。高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、浸漬前に２０％含まれていたヒト免疫グロブリンＧ水溶液中のヒト免疫グロブリンＧの凝集体の含量は浸漬後には１％未満であった。一方、ヒト免疫グロブリンＧのモノマーは９５％以上残存していた。