(57)【要約】  【課題】Brugada症候群の診断に有用なマーカーを提供すること。  【解決手段】その１番目のドメインの第５通過サブユニット（Ｓ５）と第６膜通過サブユニット（Ｓ６）の間の２９２番目の位置に存在する変異（Ｇ２９２Ｓ）および／またはその２番目のドメインの第４通過サブユニット（Ｓ４）と第５膜通過サブユニット（Ｓ５）を結ぶ細胞内のループの８３５番目の位置に存在する変異（Ｓ８３５Ｌ）を少なくとも有するナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子であって、その１番目のドメインの第５通過サブユニット（Ｓ５）と第６膜通過サブユニット（Ｓ６）の間の２９２番目の位置に存在する変異（Ｇ２９２Ｓ）および／またはその２番目のドメインの第４通過サブユニット（Ｓ４）と第５膜通過サブユニット（Ｓ５）を結ぶ細胞内のループの８３５番目の位置に存在する変異（Ｓ８３５Ｌ）を少なくとも有することを特徴とするナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における前記変異（Ｇ２９２Ｓ）および／または（Ｓ８３５Ｌ）からなるBrugada症候群マーカー。
【請求項３】
請求項１に記載のナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における前記変異（Ｇ２９２Ｓ）および／または（Ｓ８３５Ｌ）をBrugada症候群マーカーとして使用することを特徴とするBrugada症候群マーカーの使用方法。
【請求項４】
請求項２に記載のBrugada症候群のマーカーを使用してBrugada症候群を診断することを特徴とするBrugada症候群の診断方法。
【請求項５】
請求項３に記載のBrugada症候群のマーカーの使用方法を用いてBrugada症候群を診断することを特徴とするBrugada症候群の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子に関し、更に詳細には、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の変異に関するものである。ナトリウムチャンネルαサブユニットのこのＳＣＮ５Ａ遺伝子の変異は、特発性心室細動を引き起こす疾患であるBrugada症候群に関連している重要な遺伝子変異である。
【背景技術】
【０００２】
ナトリウムチャンネルは、神経・筋などの興奮性細胞の細胞膜に存在する細胞電位依存性のタンパク質分子であり、一方、興奮性細胞は、活動電位を発生させ、その伝播により情報の伝達を行っている。つまり、このナトリウムチャンネルは、カリウムチャンネルとともに、活動電位の発生ならびに情報の伝播を担っているタンパク質分子である（特許文献１）。
【０００３】
ヒトのナトリウムチャンネルは、ＳＣＮ１Ａ〜１１Ａのαサブユニット遺伝子とＳＣＮ１Ｂ〜ＳＣＮ３Ｂのβサブユニット遺伝子から構成されている。このうち、ＳＣＮ５Ａ遺伝子は心筋に発現する心筋ナトリウムチャンネル病の原因遺伝子であることが知られている。このＳＣＮ５Ａ遺伝子は、心筋の電気的興奮に非常に重要な役割を果たしていて、心電図のＱＴ間隔の延長、失神または発作を引き起こして突然死を惹起する血管障害によって特徴付けられるＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
【０００４】
また、これらの遺伝子の突然変異は、疾患原因となることも明らかにされてきており、ＳＣＮ５Ａの突然変異によりＱＴ延長症候群３型が発症することも知られている（特許文献２）。
【０００５】
一方、心室細動は、救急救命処置を要する重篤な不整脈で、発症数分以内に直流除細動器による細動の解除が必要である。Brugada症候群は、心室頻拍、心室細動が頻発し、突然死を来たす予後不良の遺伝性疾患である。Brugada症候群において、ナトリウムチャンネルαサブユニットＳＣＮ５Ａ遺伝子の変異は、心室細動から突然死をきたす遺伝的障害の原因となっている。
したがって、Brugada症候群の原因となるＳＣＮ５Ａの突然変異に関与する原因遺伝子変異を解明することは、Brugada症候群の予防ならびに治療に重要な意義を有することから、その原因遺伝子の突然変異を解明することが要望されている。
【特許文献１】特開２０００−２０１６８４号公報
【特許文献２】特表２００３−５２９３３１号公報
【非特許文献１】蒔田直昌：医学の歩み Vol.200 No. 9, 661-666 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Brugada症候群の原因となるＳＣＮ５Ａの突然変異に関与する原因遺伝子変異を解明するという要望に答えるべく鋭意研究した結果、本発明者らは、Brugada症候群患者のSCN5A遺伝子を直接シーケンス法で検索したところ、２種類の新たな変異を発見するとともに、これら２種類の遺伝子突然変異がBrugada症候群の原因と考えられることを見出して、この発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、この発明は、ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における２種類の変異を有するナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子を提供することを目的とする。
この発明の別の目的は、ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における２種類の変異をBrugada症候群マーカーとすることからなるBrugada症候群マーカーおよびBrugada症候群マーカーとして使用する方法を提供することである。
【０００８】
また、この発明は、ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における２種類の変異を有する遺伝子部分配列をBrugada症候群マーカーとしてBrugada症候群の診断に使用する診断方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、この発明は、ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子における２種類の変異を提供する。更に詳細には、１番目の変異は、ＳＣＮＡ５Ａの１番目のドメインの第５と第６膜通過サブユニットの間の細胞表面側にあるpore-lining部位と呼ばれる重要な部分にある２９２番目の位置に存在するアミノ酸グリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に変異している（以下、「Ｇ２９２Ｓ」と指称する）。また、２番目の変異は、２番目のドメインの第４と第５膜通過サブユニットを結ぶ細胞内のループの８３５番目の位置に存在するアミノ酸セリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に変異している（以下、「Ｓ８３５Ｌ」と指称する）。
また、この発明は、その別の態様としては、この発明に係るナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子の２種類の変異を、Brugada症候群の診断に使用する診断方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子は、その中心孔を囲む４つのドメイン構造を持ち、それぞれのドメインは６つの膜通過サブユニット（Ｓ１〜Ｓ６）によって構成されている。
図１に示すように、この発明に係るＳＣＮ５Ａ遺伝子の２種類の変異は、その１番目の変異が、ＳＣＮＡ５Ａの１番目のドメインの第５通過サブユニット（Ｓ５）と第６膜通過サブユニット（Ｓ６）の間の細胞表面側にあるpore-lining部位と呼ばれる重要な部分にある２９２番目の位置に存在する変異（Ｇ２９２Ｓ）とその２番目の変異が、２番目のドメインの第４通過サブユニット（Ｓ４）と第５膜通過サブユニット（Ｓ５）を結ぶ細胞内のループの８３５番目の位置に存在する変異（Ｓ８３５Ｌ）である。
なお、配列表の配列番号１は、GenBank Accession number NM 000335のSCN5A cDNA シーケンスを示していて、ＳＣＮ５Ａ遺伝子の正常アミノ酸配列を表している。
【００１１】
図１には、この発明に係る変異に加えて、これまで報告された変異についても図示している。これらの変異を持つＳＣＮ５Ａ遺伝子であっても、この発明に係る２種類の変異のいずれか一方もしくは両方を有する変異であれば、それらの遺伝子変異はこの発明に包含されることは当然である。
【００１２】
更に詳細には、この発明に係るナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子は、上記変異（Ｇ２９２Ｓ）および／または（Ｓ８３５Ｌ）を少なくとも有する遺伝子である（配列表の配列番号１）。
したがって、この発明の遺伝子は、上記変異のいずれか一方または両方を有するとともに、既に報告された下記変異のいずれをも有していてもよい遺伝子である。
【００１３】
ここで、これまで報告された変異について簡単に説明する。図１に示すように、Brugada症候群に関連する変異として報告されているものとしては、２７，３５，１０４，１６１，２２６，２３０，２８２，２９４，イントロン7スプライスエラー，３１９，３６７，３６９，３９３，４９３，５３５，５６７，６８１，７３５，７５２，８５１，８６７，８７１，８９１，８９６，９１０，９６５，１０５３，１１１８，１２２５，１２３２，１２３６，１２４０，１２９３，１３１９，１３８２，１３９８，１４０５，１４３２，１４７６，1５０２，１５１２，１６２０，１７４０，１７４３，１９２４，１９５１の位置における変異が存在する。
【００１４】
ＱＴ延長症候群に関連する変異として、５７２，６１５，６１８，９４１，９９７，１２５０，１２９６，１３０４，１３２５，１３３０，１５０１，１５０５，１６１７，１６２３，１６４４，１６４５，１７８４，１７８７，１７９０，１８２６，１８４０の位置における変異が存在する。
また、ＣａｒｄｉａｃＣｏｎｄｕｃｔｉｏｎＤｅｆｅｃｔ(家族性心臓ブロック)に関連する変異として、１５６，２２５，２９８，４１５，１４０６，１５２６の位置における変異が存在する。
また、ＭｉｘｅｄＰｈｅｎｏｔｙｐｅ(混合型)に関連する変異として、１１１４，１５００，１７１０，１７６６，１７７７，１７９５の位置における変異が存在する。
【実施例１】
【００１５】
（対象）
福岡大学病院循環器科にてBrugada症候群と診断された互いに関係しない患者１２名を対象とした。この例におけるBrugada症候群は、（１）心電図上右胸部誘導のＳＴ−部分上昇、（２）Ｎａチャネル・ブロッカーであるピルジカイニドを体重１キロあたり１−２mg静注後、Ｊ−波型の２mm以上の上昇、（３）明らかな失神発作、心室頻拍、心室細動の病歴にて診断した。この例に対するインフォームドコンセントは、福岡大学倫理委員会の承認を得て、全ての患者、家族、正常コントロールより得た。
【００１６】
(PCRサーマルサイクラーを用いたＤＮＡの増幅)
16.5mlの末梢血をそれぞれの患者から採取し、ＤＮＡ抽出までは−２０℃に保存した。解凍した血液（血球）サンプルよりＤＮＡを直ちに抽出した。基本的にはWangらの報告したプライマーを用いて、ＳＣＮ５ＡのエクソンをＰＣＲ法にて増幅した。表１に示すエクソン２，６，２０，２１，２２，２５，２８についてはエクソン周辺の配列よりオリジナルプライマーを作製して用いた。全てのプライマーは、北海道システムサイエンスに依頼して作製した。ＰＣＲの反応条件は、初期変性（denaturation）が９５℃で２分間、denaturationが９６℃で３０秒間、アニーリングが５８−６１℃で３０秒間、extensionが７２℃で１分間を１サイクルとして、３０〜３５サイクル繰り返し行なった。ＰＣＲ産物は、５-８％ポリアクリルアミドゲルにて確認した。
【００１７】
【表１】
2005192413.tif 000002
【００１８】
（ＤＮＡシーケンス解析）
ＰＣＲ産物より、過剰のプライマーなどをMicroSpin S-300HRカラムで除いた後、Big Dye Terminator v3.0 Cycle Sequencing KitとABI Prism 3100 genetic analyzerによりダイレクトシーケンスを行った。また、検出した変異部分は、確定のためサブクローニングを行った後、再度シーケンスを行い確認した。得られたシーケンス配列は、GenBank Accession number NM 000335のSCN5A cDNA シーケンスと比較し、変異、多型を判別した。
【００１９】
（ＰＣＲを応用した制限酵素切断端多型による検出）
Ｇ２９２Ｓ、Ｓ８３５ＬおよびＨ５５８Ｒの変異および多型の検出には、ＰＣＲを応用した制限酵素切断端多型を用いた。Ｇ２９２Ｓの検出には、プライマーＡ(5'-CCACCTCTGG  TTGCCTACAC  TG-3')（配列番号２）とＢ(5'-CAAGCAGTCG  GCCTCCACGG  CGC-3')（配列番号３）で増幅、Ｓ８３５Ｌの検出には、プライマーＣ(5’-GAGCCAGAGA  CCTTCACAAG  GTCCCCT-3’)（配列番号４）とＤ(5’-AGTGTCAGGT  TCCCCAGTGC  CCCCATT-3’) （配列番号５）で増幅、Ｈ５５８Ｒの検出には、 プライマーＥ(5’-AGCGGGGGAG  AGCGAGAGCC  AGC-3’) （配列番号６）とＦ(5’-CTGTCCCTGG  GCACTGGTCC  GACG-3’) （配列番号７）でそれぞれ増幅して、変異の有無を検出する制限酵素切断部位を作製した。 プライマーB, D , E の3’側は、元のＡＧＣ、ＡＣＴおよびＡＣＣを、それぞれＣＧＣ、ＡＴＴおよびＡＧＣに変更して、それぞれ制限酵素BbeI, MseIおよびHhaIの切断部位とした。Ｐ１０８９Ｌ多型は、プライマーＧ(5’-AGGGTCTAAA  CCCCCAGGGT  CA-3’)（配列番号８）とＨ(5’-CCCAGCTGGC  TTCAGGGACA  AA-3’) （配列番号９）で増幅後、MspI制限酵素多型で検出した。ＰＣＲの反応条件は、denaturationが９６℃で３０秒間、アニーリングが６０℃で３０秒間、extension が７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行なった。ＰＣＲ産物は、制限酵素切断後、８％ポリアクリルアミドゲルにて確認した。
【００２０】
（症例の臨床的評価）
今回解析した１２例のプロフィールを表２に示す。すべての患者に、心電図所見として右脚ブロック、胸部誘導Ｖ１-Ｖ３のＳＴ部分の上昇を認めた。ケース３,４,６,１０には、心室頻拍から心肺停止の病歴があった。無症状のケース８,１１,１２以外の患者には、意識消失発作の病歴があった。ケース２と１１では、突然死の家族歴を認めた。胸部誘導V1のS波幅は、全ての患者で80mse以上であった。ケース２,９,１２を除いた患者では、ベースラインのＳＴ上昇が0.18mV以上であった。ケース７を除く全ての患者では、ピルジカイニドの静注で明らかにＳＴ部分の上昇が認められた。また、ケース１では、静注により心室頻拍が誘発された。植え込み型除細動器（ICD）は、無症状のケース６および１２とICD植え込み前に予期しない脳梗塞で死亡されたケース８を除いた患者に植え込まれた。１２例中１１例では、診察所見や心エコーなどでは器質的心疾患を認めなかった。残りの１例、ケース１１は、６６歳の男性で、急性非Ｑ心筋梗塞を認めた。心筋梗塞後に心電図上右脚ブロックとcoved type ST上昇を認めた。Naチャネル・ブロッカーであるピルジカイニド50mgの静注でJ-waveと0.2mV以上のＳＴ上昇を示した。ケース１１の兄と姉はどちらも６０歳で突然死していた。また、このケースでは、心室頻拍は電気的刺激により容易に誘発された。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
（遺伝子変異解析）
変異を検出するために、１２例のBrugada症候群患者と４例の正常対照者に対して、ＳＣＮ５Ａ遺伝子のシーケンスを行った。表３に示すように２例（ケース1と11）で新たな変異を発見した。また、２種類の遺伝子多型Ｈ５５８ＲとＰ１０８９Ｌを３例の患者および１例の正常対照者で検出した。ケース11では、SCN5Aのエクソン７より新たな変異が検出された。この変異は、c-DNAシーケンスでは874番目核酸のGがA置換しており（図２Ａ）、アミノ酸のコードでは、SCN5A蛋白質（αサブユニット）に４つあるドメインの１番目のドメインの第５と第６膜通過サブユニットの間の細胞表面側にあるpore-lining部位と呼ばれる重要な部分にある292番目アミノ酸グリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に変異していた（Ｇ２９２Ｓ）。ケース１では、c-DNAシーケンス２５０４番目核酸のＣがＴに置換した新たな変異が検出された（図２Ｂ）。この変異はアミノ酸コードでは、２番目のドメインの第４と第５膜通過サブユニット間の細胞内ループに位置する８３５番目のアミノ酸セリン（Ｓ）がロイシン（Ｌ）に置換していた。
この遺伝子解析では、表３に示すように、２つのアミノ酸は変異しない多型Ａ２９ＡとＤ１８１９Ｄも検出された。これら２つの多型は、GenBank（NIHのインターネット上サイト）に正常多型としてすでに登録されたものであった。
検出した新たな変異および多型を確認するため、ＰＣＲを応用した制限酵素切断端多型による検出を行った。変異Ｇ２９２Ｓでは、プライマーＡとＢによるＰＣＲ後、変異があればBbeI切断部位が消失することによるフラグメント長の差異で検出した（図３Ａ）。変異Ｓ８３５ＬではプライマーＣとＤで、変異Ｈ５５８ＲではプライマーＥとＦで増幅後、それぞれMseIとHhaI切断部位が変異で出現することにより、フラグメント長の差異で検出した（図３Ｂ、Ｃ）。データは示していないが、Ｐ１０８９Ｌ多型は、プライマーＧとＨで増幅後、MspIによる切断端多型で検出した。
【００２３】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００２４】
この発明に係るナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子に含まれる２個の変異（Ｇ２９２Ｓ）と（Ｓ８３５Ｌ）は、Brugada症候群のマーカーとしてBrugada症候群の診断マーカーとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ナトリウムチャンネルαサブユニットのＳＣＮ５Ａ遺伝子の変異部位を示す図。
【図２Ａ】ＳＣＮ５Ａ遺伝子のシーケンス結果による遺伝子変異を示す図。
【図２Ｂ】ＳＣＮ５Ａ遺伝子のシーケンス結果による遺伝子変異を示す図。
【図３Ａ】フラグメント長でのＳＣＮ５Ａ遺伝子変異の検出結果を示す図。
【図３Ｂ】フラグメント長でのＳＣＮ５Ａ遺伝子変異の検出結果を示す図。
【図３Ｃ】フラグメント長でのＳＣＮ５Ａ遺伝子変異の検出結果を示す図。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【配列表】
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