(57)【要約】【課題】流路上に固定した粒子に物質導入を行う技術において、容易かつ確実に粒子に物質導入を行うことができる技術を提供する。【解決手段】粒子が流入する流入口と、前記粒子が流出する複数の流出口と、前記流入口と前記流出口とを連結する流路と、前記流入口側流路と前記複数の流出口側流路とを分岐する分岐部と、前記流出口側流路上に、当該流路を流れる前記粒子に液体物質を導入する少なくとも一つの物質導入部と、を備える。【選択図】図１
2005318844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含む液体が流入する流入口と、
前記液体が流出する複数の流出口と、
前記流入口と前記流出口とを連結する流路と、
前記流入口側流路と前記複数の流出口側流路とを分岐する分岐部と、
前記流出口側流路上の少なくとも一つにて当該流路を流れる前記液体に含まれる前記粒子に液体物質を導入する物質導入部と、を備える物質導入装置。
【請求項２】
前記複数の流出口に連結されるそれぞれの流出口側流路の断面積合計が、前記流入口側流路の断面積合計と同等以上となるよう構成されている、請求項1に記載の物質導入装置
。
【請求項３】
前記物質導入部が、
前記分岐点に対して流出口側に設置されており、
前記流路を流れる前記粒子を一時的に固定する粒子固定部と、
前記粒子固定部において固定された前記粒子に挿入して前記液体物質を導入する針と、を有する、請求項1に記載の物質導入装置。
【請求項４】
前記物質導入部を有さない流出口側流路の流出口が、前記流入口と連結する、請求項1
に記載の物質導入装置。
【請求項５】
粒子を含む液体が流入口から流路に流入し、
流入口側流路から分岐した複数の流出口側流路上に設けられた少なくとも一つの物質導入部において負圧固定された前記粒子に針を介して液体物質を導入する、物質導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細粒子に物質を導入する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療およびゲノム創薬等の分野において、細胞および細胞のような微細粒子（以下粒子と総称）内に、針を用いて遺伝子溶液および薬剤溶液（以下導入物質と総称）を導入して利用する機会が増加している。例えば、すでに多くの物質導入技術は、研究用途に用いられている。
【０００３】
ところで、物質導入技術の医療用途への適用は、研究用途とは異なる要求が存在する。例えば、医療用途の場合には、粒子及び導入物質の種類を問わないことが要求される。また、医療用途の場合には、粒子への導入物質の導入効率が高いことが要求される。特に、医療用途には、微量の粒子及び導入物質を用いて、多くのパターンの実験を行うための物質導入技術が、要求されている。
【０００４】
前述のような物質導入の方法としては、多くの技術が知られている。これらの技術のうち、前述の要求を満足する方法としては、例えばインジェクション法がある。インジェクション法は、その特徴として導入成功率の高さが挙げられる。インジェクション法では、針先からの粒子への物質導入作業は顕微鏡下で行われる。そして、インジェクション法では、物質導入時に粒子へのダメージを最低限に抑えるような針先制御を行う。このような針先制御は、熟練した作業者が作業することにより行われる。また、このような針先制御は、分解能の高い制御装置を用いることによっても可能である。多くの場合において、粒子の直径は１０〔μm〕から１００〔μm〕程度、針の先端外径は１〔μm〕、内径は０．
５〔μm〕程度のものが用いられる。
【０００５】
しかしながら、インジェクション法には、物質導入のスループットが低いという問題点があった。すなわち、インジェクション法に用いる従来の装置の多くは、１時間あたり数百個の生産能力が限界と考えられていた。
【０００６】
そこで、インジェクション法における前述の問題点に対して、例えば以下のような技術が提案されている。
まず、前述の問題点を解決する技術として、粒子を１次元ないし２次元のアレイ型に整列してから、微細針（以下キャピラリと呼称）のアレイを用いて粒子に対して一度にインジェクションを行う方法が提案されている。しかし、この方法は、アレイ上に整列された粒子は様々な形状を持つために、キャピラリアレイを用いるとキャピラリが粒子に刺さらない場合、あるいは逆に細胞を破壊してしまう場合があり、問題となっていた。
【０００７】
また、前述の問題点を解決する別の技術として、粒子を個別に顕微鏡で観察しながら物質導入を行うことを意図した方法が提案されている。この方法は、シリコン基板側面に１次元アレイ状に形成した固定部に粒子を固定し、粒子を上部から観察しながら焦点深度内でキャピラリを動かして物質を導入する。しかし、この方法は、粒子の供給および取り出しの自動化が意図されていないため、装置全体としてのスループットは改善されないと考えられた。
【０００８】
さらに、前述の問題点を解決するためのもう一つの方法として、粒子の供給および取り出しの自動化による物質導入のスループットの向上を意図した方法が提案されている。この方法は、流路内に粒子を流し、流路上に設置された物質導入部において、インジェクシ
ョンにより物質を導入する。この方法では、１０6〔cell/mL〕の濃度の細胞懸濁液を使用し、０．１〔μL/min〕程度の流量で流路内に細胞を流した場合、理論的には１００〔cell/min〕程度のスループットが期待できる。
【０００９】
図７は、上記方法の概要を示す図である。図７において、細胞４５の粒子および粒子を含んだ懸濁液は、外部のチューブ（不図示）等に接続された流入口４１から流路４３に流入する。流入口４１から懸濁液に含まれて流路４３に流入した細胞４５は、流路４３の底面に設けた穴（粒子固定部）４４に接続されたポンプ４７によって生じる負圧によって固定（保持）される。
【００１０】
負圧吸引するポンプ４７によって粒子固定部４４に固定された細胞４５は、挿入された針４６の内部から物質が注入（導入）される。物質導入後の細胞４５は、ポンプ４７による負圧固定が解除されて懸濁液とともに流出口４２を経て外部のチューブ等に流出する。
【００１１】
なお、本願発明に関連する先行技術として、例えば、下記の特許文献１から３に開示される技術がある。
【特許文献１】特開平８−２９０３７７号公報
【特許文献２】特開２００２−３２５７７２号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述した技術では、例えば以下のように、細胞４５が確実に固定できるとは限らなかった。
一般に、細胞４５の固定の難易度は、流路内を移動する細胞粒子の流速、粒子固定部４４・粒子の径、及び流路４３の幅によって異なる。すなわち、細胞４５の固定の難易度は、図８のように粒子径に対して流路幅を広くすると、流速が低下して粒子固定部４４に固定しやすくなると考えられる。しかしながら、この場合には、粒子がポンプ４７によって負圧が生じる粒子固定部４４付近ではなく流路側面４３ａを通過するため、細胞４５の負圧固定に失敗することがあった。
【００１３】
逆に図９のように流路幅を狭くすると、細胞４５は流路側面４３ａを通過することが無くなる。しかしながら、この場合は、流速が高いために、ポンプ４７が吸引することで粒子固定部４４に生じる負圧によって細胞４５を捕らえるのが困難になる。このため、前述の技術では、物質導入が行われない細胞４５が流出口から多数出てくるために、前述の理論上のスループットに近づくことが困難であった。
【００１４】
本発明は上記事項に鑑みられてなされたものである。すなわち、その課題は、流路上に固定した粒子に物質導入を行う技術において、容易かつ確実に粒子に物質導入を行うことができる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は上記課題を解決するため、以下の手段を備える。すなわち、本発明は、粒子が流入する流入口と、前記粒子が流出する複数の流出口と、前記流入口と前記流出口とを連結する流路と、前記流入口側流路と前記複数の流出口側流路とを分岐する分岐部と、前記流出口側流路上の少なくとも一つにて当該流路を流れる前記粒子に液体物質を導入する物質導入部と、を備える。
【００１６】
本発明は、粒子が流れる流路の流出口側を複数に分岐し、そのうちの少なくとも一つに負圧固定を行う物質導入部を備えることによって、幅の狭い流路において、負圧固定の容
易な流速を実現する。
【００１７】
従って、本発明によれば、流路上に固定した粒子に物質導入を行う技術において、容易かつ確実に粒子に物質導入を行うことができる技術を提供することができる。
【００１８】
また、本発明は、前記複数の流出口に連結されるそれぞれの流出口側流路の断面積合計が、前記流入口側流路の断面積合計と同等以上となるよう構成されている、ことを特徴とする。
【００１９】
このようにすれば、本発明は、幅の狭い流路において、負圧固定の容易な速度を実現することができるため、容易かつ確実に粒子に物質導入を行うことができる。
【００２０】
また、本発明は、前記物質導入部が、前記分岐点に対して流出口側に設置されており、前記流路を流れる前記粒子を一時的に固定する粒子固定部と、前記粒子固定部において固定された前記粒子に挿入して前記液体物質を導入する針と、を有する、ことを特徴とする。
【００２１】
このようにすれば、本発明は、幅の狭い流路において、負圧固定の容易な速度を実現することができるため、容易かつ確実に粒子に物質導入を行うことができる。
【００２２】
また、本発明は、前記物質導入部を有さない流出口側流路の流出口が、前記流入口と連結する、ことを特徴とする。
【００２３】
このようにすれば、本発明は、物質導入のおこわなれていない粒子を環流させて再度物質導入を行うため、物質導入の効率を向上させることができる。
【発明の効果】
【００２４】
以上のように、本発明によれば、流路上に固定した粒子に物質導入を行う技術において、容易かつ確実に粒子に物質導入を行う技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、図面を参照して本発明を実施するための最良の形態について説明する。以下の実施の形態の構成は例示であり、本発明は実施の形態の構成に限定されない。
〈物質導入装置の構成〉
図１は、本発明の一実施の形態である、物質導入装置１０の概要を示す図である。物質導入装置１０は、基材７上に、少なくともひとつの流入口３を有する。また、物質導入装置１０は、同様に基材７上に、流入口３から分岐点８を経て、少なくともふたつ（複数）以上の流出口５に分岐する流路６を有する。そして、物質導入装置１０は、流出口５側の流路６のうち、少なくともひとつの流路６ａ上に物質導入部４を有する。この物質導入部４には、粒子１を負圧固定するために吸引するポンプ９が備えられている。
【００２６】
図２は、物質導入装置１０の物質導入部４を詳細に示した図である。物質導入部４は、流入口３から流入した細胞の粒子１を負圧固定するための粒子固定部２１を備える。この粒子固定部２１は、流路６に形成された穴であり、吸引するポンプ９によって負圧を生じさせて粒子１を一時的に固定し、物質導入後ポンプ９の吸引を止めて固定を解除する。また、物質導入部４は、利用者が操作する針２を挿入するための開口部２４を備える。利用者は、物質導入部４を観察可能な位置に設けられた顕微鏡５０を介して、ポンプ９によって生じる負圧で粒子固定部２１に固定された粒子１に針２を挿入して、物質導入を行う。
【００２７】
また、物質導入装置１０は、流路６内部の透過観察による視認性を向上するため、例え
ばポリカーボネート等の透明樹脂材を用いて形成されている。そして、物質導入装置１０は、このような透明樹脂材にレーザ等を用いて流入口３、流路６、物質導入部４および流出口５を形成する。なお、物質導入装置１０は、シリコンゴムに鋳型を用いて同様の構成要素を形成しても良い。
【００２８】
また、物質導入装置１０は、流路６内部からの細胞等の粒子および粒子を含んだ懸濁液の漏洩を防止するために、流路６の上面から任意の平滑な板状の部材によって閉じた流路（閉流路）を構成することが好ましい。
【００２９】
物質導入装置１０における、適切な流路６の横幅は、物質導入を行う粒子1の直径に依
存する。例えば、代表的な細胞の径である直径１５〔μm〕程度の粒子１の場合には、流
路６の横幅は、３０から１００〔μm〕程度が好ましい。
【００３０】
また、基材７の寸法は、同時に使用する物質導入用針２の位置を制御する、制御機構の大きさに依存する。また、基材７の寸法は、利用者が既存の光学系を用いて観察することを考慮すると、長辺８０〔mm〕程度、短辺４０〔mm〕程度が好ましい。
【００３１】
図３は、図１に示す物質導入装置１０における、分岐点８付近を拡大した図である。なお、以下の説明において、Ａ−Ａ断面側（流入口３側）を上流とし、Ｂ−Ｂ断面側（流出口５側）を下流とする。一般に、流路６内の流量が一定である場合には、流路６内の流速は、流路６の断面積に反比例する。物質導入装置１０は、このような原理を利用することで、上流側及び下流側の流路６の断面積について、所望の寸法の組み合わせを選択することができる。これによって、物質導入装置１０は、それぞれの流路６内の流量を変化させることができる。すなわち、物質導入装置１０は、分岐点１１を境にして、下流における流速を上流の流速に対して同等の速度ないしそれ以下にするためには、分岐後の下流側流路１３の断面積を合計した値を、分岐前の上流側流路１２の断面積を合計した値と同等もしくはそれ以上にすればよい。
【００３２】
また、物質導入装置１０は、例えば直径１５〔μm〕の細胞の粒子を使用する場合にお
いて、流路６の詰まりにくさあるいは懸濁液を送る際の安定性と、細胞４５に物質を導入する際における粒子固定のしやすさとを両立させることが考えられる。このために、流入口３から分岐点１１までの流路（上流側流路）の寸法は、例えば幅１００〔μm〕、深さ
５０〔μm〕とする。また、分岐点１１から物質導入部４を経て流出口５までの流路（下
流側流路）の寸法は、３方向に３３〔μm〕程度の幅（深さは分岐前と同一）とする。そ
して、上流側及び下流側の流路６の寸法をこのように設定することで、物質導入装置１０は、粒子を固定するために必要な最低限の流路幅であり、かつ分岐前（上流側）と同一の流速を得ることが可能となる。
【００３３】
また、物質導入装置１０は、チューブを介して流入口に接続された送液ポンプの流量を、例えば０．１〔μL/min〕としている。この送液ポンプの流量は、一般の分析用ポンプ
の一部で実現できる流量である。そして、分岐前流路（上流側流路）の寸法が例えば幅１００〔μm〕、深さ５０〔μm〕である場合に、この送液ポンプが流す細胞１を含んだ粒子懸濁液がこの分岐前流路を通過するときの流速は、約３３０〔μm/s〕となる。
【００３４】
前述の流速は、顕微鏡視野を約1秒で通過する程度の速さである。また、この流速は、
粒子の接近を画像で感知して固定制御を行うには、やや流速が速いと考えられる。そこで、分岐後流路の断面積合計を分岐前流路の断面積合計よりも大きく取ることによって、物質導入装置１０は、分岐後の流速を分岐前よりも小さくすることができる。
【００３５】
そして、物質導入装置１０は、上記における分岐後流路のうち、例えば、物質導入部４
を有しないものの幅を８０〔μm〕とし、物質導入部４を有するものの幅を４０〔μm〕とする。分岐後流路の幅をこのような寸法にすることで、物質導入装置１０は、分岐後の各流路における流速を１６５〔μm/s〕程度に落とすことができる。従って、物質導入装置
１０によれば、従来の物質導入装置と比較して、より確実に負圧による粒子固定（保持）が行いやすくなる。
【００３６】
〈物質導入部の構成〉
図４は、物質導入装置１０における、物質導入部４の構成、及び分岐点８と物質導入部４の位置関係に関する一実施例を示す図である。物質導入部４は、流路底面に形成された粒子固定部２１を備える。また、物質導入部４は、前記粒子固定部２１において固定された粒子２２（細胞１）に挿入される針２を備える。この針２は、内部が中空になっており、その内部に液体状の導入物質を含むことができる。そして、針２は、先端部分に物質導入用の穴（不図示）が貫通している。すなわち、針２は、粒子固定部２１に固定された粒子２２に先端が挿入されると、針内部に注入された導入物質が、穴を介して粒子２２に導入される。
【００３７】
粒子固定部２１は、流路内部の透過観察による視認性を向上するため、例えばポリカーボネート等の樹脂材料からなる基材にレーザ加工を行って形成することが好ましい。粒子固定部２１の最適な開口径は、物質導入を行う粒子径に依存するが、例えば直径１５μm
程度の粒子の場合は、３から５〔μm〕程度の開口径が好ましい。
【００３８】
粒子に挿入する針２は、前述のように中空であり、ガラス製が望ましい。この針２３の寸法は、例えば先端外径１〔μm〕程度、内径０．５〔μm〕程度のものが好ましい。この針２は、一般の中空ガラス針を加熱して引き伸ばすことにより作成できる。
【００３９】
また、物質導入装置１０は、針２を流路６内に挿入するために、流路６の上部に、針２３が通過できる開口部２４を作成する。そして、物質導入装置１０は、この開口部２４を通して針２を挿入できるようになっている。本実施例では、例えば、開口部２４の直径が２０〔μm〕程度、開口部２４の蓋（不図示）の厚さは２００〔μm〕程度で作成している。
【００４０】
前述のように形成された物質導入部４は、例えば流路６の分岐点１１より下流に設ければよい。また、分岐後（下流側流路）の懸濁液の流れが安定した部分を利用して粒子固定を行うために、物質導入装置１０は、例えば分岐前の流路幅が１００〔μm〕程度の流路で
あれば、分岐点１１から物質導入部４の間隔が５００〔μm〕程度以上離れていることが
好ましい。なお、このような分岐点１１から物質導入部４までの好ましい距離の最低値は、流路を形成する寸法や形状などの要素に依存する。
【００４１】
また、物質導入部４は、複数の分岐後流路上に設置してもよい。このように複数の分岐後流路に物質導入部４を設けることによって、物質導入装置１０は、単位時間内における物質導入動作を行うことができる粒子数が増加することが考えられる。すなわち、物質導入装置１０における複数の分岐後流路に物質導入部４を設けることによって、スループットの値は、理論上の限界値（１０6〔cell/mL〕の細胞懸濁液を０．１〔μL/min〕で流し
た場合は、１００〔cell/min〕程度）に近づくことが考えられる。
【００４２】
〈物質導入部を有しない流路を還流させた物質導入装置〉
図５は、流出口５に至るまでの間に物質導入部４を通過しない流路６ｂについて、流出口５から送液ポンプ３１を介して流入口３に連結した実施例を示す図である。このように構成することによって、物質導入装置１０は、全粒子中に占める、物質導入動作を行われる粒子の割合を向上させることを意図している。
【００４３】
図５において、物質導入装置１０は、流出口５から例えばテフロン（登録商標）あるいはシリコンなどの樹脂製のチューブ等により細胞１の粒子を含んだ懸濁液を取り出す。そして、物質導入装置１０は、一般のチューブ接続具により、このチューブを送液ポンプ３１と連結する。また、図５において用いるチューブは、例えば内径０．２５〔mm〕のテフロン（登録商標）チューブとしている。このように、物質導入部４を有しない流路６を還流させることによって、物質導入装置１０は、例えば粒子が貴重な材料であるような場合においても、無駄に捨てることなく再利用することができる。
【００４４】
さらに、物質導入装置１０は、樹脂製のチューブ等によって液体の流れを流路面の外に出すことによって流路を環流させることに限定されない。図６は、基材７内に作られた流路によって、送液ポンプ３１を介して流入口３に連結して環流させた例を示す図である。このように、物質導入装置１０は、経路の形態を問わず、様々な方法をもって環流させることによって、粒子への物質導入の効率を向上させることができる。
【００４５】
〈実施の形態の効果〉
以上説明した本発明の一実施の形態である物質導入装置１０によれば、以下のような効果を得ることができ，再生医療・ゲノム創薬等の事業に供することが期待できる。すなわち、物質導入装置１０は、幅を狭めた流路と低流速の両立によって、粒子固定効率を向上することができる。また、物質導入装置１０は、複数の物質導入部、及び還流装置（送液ポンプ）を備えることによって、導入粒子の量及び割合を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の一実施の形態である、物質導入装置の概要を示す図である。
【図２】物質導入装置において、物質導入部を拡大した図である。
【図３】物質導入装置において、分岐点付近を拡大した図である。
【図４】物質導入部の構成、及び分岐点と物質導入部の位置関係に関する一実施例を示す図である。
【図５】流出口に至るまでの間に物質導入部４を通過しない流路について、流出口５から送液ポンプを介して流入口に連結した実施例を示す図である。
【図６】基材内に作られた流路によって、送液ポンプを介して流入口に連結して環流させた例を示す図である。
【図７】従来の技術に係る方法の概要を示す図である。
【図８】従来の技術において、粒子径に対して流路幅を広くした状態を示す図である。
【図９】従来の技術において、粒子径に対して流路幅を狭くした状態を示す図である。
【符号の説明】
【００４７】
１  細胞
２  針
３  流入口
４  物質導入部
５  流出口
６  流路
７  基材
８  分岐点
９  ポンプ
１０  物質導入装置
１１  分岐点
１２  上流側流路
１３  下流側流路
２１  粒子固定部
２２  粒子
２４  開口部
３１  送液ポンプ
４１  流入口
４２  流出口
４３  流路
４４  粒子固定部
４５  細胞
４６  針
４７  ポンプ
５０  顕微鏡
【図１】
2005318844.tif 000003
【図２】
2005318844.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005318844.tif 000007
【図６】
2005318844.tif 000008
【図７】
2005318844.tif 000009
【図８】
2005318844.tif 000010
【図９】
2005318844.tif 000011