(57)【要約】【課題】セクレターゼ阻害活性を有する化合物の新たな医薬用途を探索すること。【解決手段】セクレターゼ阻害活性を有する化合物は、顕著な網膜神経細胞死抑制作用を有するので、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セクレターゼ阻害剤を有効成分とする網膜神経細胞の保護剤。
【請求項２】
セクレターゼ阻害剤を有効成分とする視神経障害を伴う眼疾患の治療剤。
【請求項３】
セクレターゼ阻害剤がβ−セクレターゼ阻害剤またはγ−セクレターゼ阻害剤である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
眼疾患が緑内障である請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
眼疾患が網膜疾患である請求項２記載の治療剤。
【請求項６】
網膜疾患が網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症またはレーベル病である請求項５記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セクレターゼ阻害剤を有効成分とする網膜神経細胞の保護剤であり、特に網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜は、外部からの光を受容する機能を有しており、視機能に関して重要な役割を果たしている。構造的には網膜色素上皮層を始め、内網状層、神経節細胞層、神経線維層等の１０層から成る、厚さ０．１〜０．５ｍｍの組織である。内網状層には、アマクリン細胞という神経節細胞突起と対をなしてシナプスを形成する神経細胞が存在するが、光の照射開始時と終了時によく応答することから、この神経細胞は光強度の検出器として働くと考えられている。神経節細胞層には、網膜のもっとも内側に位置する神経節細胞（以下「ＲＧＣ」とする。）が存在しており、運動視、周辺視、色覚、形態覚などに深く関与している。また、神経線維層には、網膜中心動静脈の分枝である網膜血管が走行しており、網膜神経細胞に酸素および栄養を供給する役割を担っている。
【０００３】
ところで、網膜血管が攣縮、血栓、動脈硬化等の要因により閉塞または狭窄すると網膜循環に障害が生じ、網膜神経細胞への酸素ならびに栄養の供給が閉ざされる。網膜循環障害は、網膜疾患の中でも特に重要な位置を占めており、網膜循環障害により酸素や栄養の供給が不足すれば、最終的には網膜神経細胞は死に至り、視神経障害が引き起こされる。視神経障害を伴う症状の代表的な例として、網膜静脈や網膜動脈が閉塞あるいは狭窄した網膜血管閉塞症、網膜剥離まで引き起こす可能性のある糖尿病網膜症、視機能の障害が出現する虚血性視神経症がある。さらに、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病などにおいても、この網膜神経細胞死が発症に深く関与すると考えられている。
【０００４】
緑内障は、適切に治療されなければ失明に至る重篤な視機能障害をもたらす眼疾患のひとつである。緑内障においては網膜神経細胞のうち特にＲＧＣが選択的に障害を受け、視神経障害が引き起こされる結果、視野障害へと進行していくことから、ＲＧＣ障害を予防あるいは最小限に抑える治療を考えることが究極的な緑内障治療につながるという、いわゆる「ニューロプロテクション」という考え方が確立されつつある（非特許文献１）。
【０００５】
緑内障性視神経障害の詳細なメカニズムは未だ明らかではないが、眼圧上昇により視神経が直接圧迫され、視神経萎縮が生ずるという機械的障害説と視神経乳頭の循環障害が視神経萎縮の主因であるという循環障害説が提唱されており、これら機械的障害と循環障害に基づく両メカニズムが複雑に関与していると考えられている。そして、機械的障害および循環障害は、いずれも視神経軸索輸送障害を引き起こし、この軸索輸送障害に伴って神経栄養因子の供給が途絶することがＲＧＣ障害の一因になっていると考えられている（非特許文献２）。また、グルタミン酸は網膜内の神経伝達物質の一つであるが、何らかの原因によりこのグルタミン酸シグナルカスケードが過度に活性化することもＲＧＣ障害の一因であると考えられている（非特許文献３）。
【０００６】
以上のことから、ＲＧＣなどの網膜神経細胞に対して保護効果を有する薬物が存在すれば、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療に有用であることが期待される。
【０００７】
他方、セクレターゼとしては、α−、β−およびγ−のサブタイプが知られているが、それらのうちβ−またはγ−セクレターゼに対して阻害活性を有する化合物は、β−アミロイドペプチドの生成を抑制し、アルツハイマー病の治療に有効であることが報告されている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、網膜疾患や緑内障などの眼疾患に関して、セクレターゼ阻害活性を有する化合物がいかなる薬理作用を示すかについては全く検討されていない。
【特許文献１】特表２００１−５０３７８２号公報
【特許文献２】特表平１１−５０６９２３号公報
【非特許文献１】眼科，40, 251-273,1998
【非特許文献２】眼科，44, 1413-1416,2002
【非特許文献３】Surv. Ophthalmol. 48, S38-S46, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
セクレターゼ阻害活性を有する化合物の新たな医薬用途を探索することは非常に興味ある課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、β−セクレターゼ阻害剤やγ−セクレターゼ阻害剤などのセクレターゼ阻害剤について初代培養した網膜神経細胞、ＲＧＣおよびラットを用いて薬理試験を実施したところ、セクレターゼ阻害剤が優れた細胞死抑制効果を発揮することを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、セクレターゼ阻害剤を有効成分とするＲＧＣなどの網膜神経細胞の保護剤であり、かかるセクレターゼ阻害剤は網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症およびレーベル病に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用である。
【００１１】
本発明において、セクレターゼ阻害剤は、セクレターゼ阻害活性を有する化合物であれば特に制限されず、例えばβ−セクレターゼ阻害剤であっても、γ−セクレターゼ阻害剤であってもよい。セクレターゼ阻害剤は、ＵＳ２００３／０１２５２５７、特表２００１−５０３７８２、Biochem. Biophys. Res. Commun., 268, 133-135 (2000) 、Int. J. Pept. Protein Res., 20, 16-25 (1982)、特開２００２−３７７３１、ＵＳ２００２／００１３３１５、ＵＳ２００２／０１１５６１６、ＵＳ２００３／００５５００５、ＵＳ２００３／０１０９５５９、ＵＳ２００３／０１３５０４４などに記載されており、具体例としては、グルタミル−バリル−アスパラギル−３−ヒドロキシ−６−メチル−γ−アミノヘプタノイル−バリル−アラニル−グルタミル−フェニルアラニンアミド、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−バリル−ロイシル−ロイシナールなどのβ−セクレターゼ阻害剤、Ｎ−(３，５−ジフルオロフェニルアセチル) −Ｌ−アラニル−(Ｓ) −フェニルグリシン−メチルエステル、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−(t−ブチル)システイル−イソロイシル−ロイシナールなどのγ−セクレターゼ阻害剤などが挙げられる。
【００１２】
本発明のセクレターゼ阻害剤による網膜神経細胞の保護作用は、後述する血清除去によって細胞死を惹起したラット胎児培養網膜神経細胞を用いた薬理試験、グルタミン酸によって細胞死を惹起したラット培養ＲＧＣを用いた薬理試験、およびラットの軸索圧迫誘発網膜障害に対する薬理試験において、β−セクレターゼ阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤などのセクレターゼ阻害剤が優れた網膜神経細胞死抑制効果を発揮することに基づくものである。
【００１３】
本発明のセクレターゼ阻害剤は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤または配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。
【００１４】
本発明に係るセクレターゼ阻害剤は、非経口でも、経口でも投与することができる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが、経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、汎用される技術を用いて製剤化することができる。例えば、点眼剤であれば、添加物として、等張化剤、緩衝剤、pH調節剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合することができる。また、pH調節剤、増粘剤、分散剤などを添加することにより、薬物を懸濁化させて、安定な点眼剤を得ることもできる。
【００１５】
等張化剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール等を挙げることができる。
【００１６】
緩衝剤としては例えば、リン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸、ε-アミノカプロン酸等を挙げることができる。
【００１７】
ｐＨ調節剤としては、例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を挙げることができる。
【００１８】
可溶化剤としては、例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、マクロゴール４０００等を挙げることができる。
【００１９】
増粘剤、分散剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を、また、安定化剤としては、例えばエデト酸、エデト酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００２０】
保存剤（防腐剤）としては、例えば汎用のソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。
【００２１】
点眼剤のｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４．０〜８．５の範囲が好ましく、また、浸透圧比を１．０付近に設定することが望ましい。また、注射剤には、溶液、懸濁液、乳濁液および用時液中に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤が包含され、例えば薬物を液中に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。
【００２２】
投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、点眼剤であれば０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）のものを１日１回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常１日０．０００１〜１ｍｇを１回または数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常１日当り１０μｇ〜１ｇを１回または数回に分けて投与することができる。
【発明の効果】
【００２３】
後述する薬理試験の項で詳細に説明するが、培養液中にセクレターゼ阻害薬を添加すれば培養網膜神経細胞死および培養ＲＧＣ死を顕著に抑制することができた。またラットの軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を検討したところ、セクレターゼ阻害薬はＲＧＣに対して顕著な細胞死抑制作用を示した。これらのことから、本発明のセクレターゼ阻害剤は、網膜神経細胞の保護剤、および網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患の治療剤として有用であることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、薬理試験および製剤例を掲げて、本発明を詳しく説明するが、これらは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
［薬理試験］
セクレターゼ阻害活性を有する化合物の網膜神経細胞保護作用を検討するべく、βセクレターゼ阻害薬であるグルタミル−バリル−アスパラギル−３−ヒドロキシ−６−メチル−γ−アミノヘプタノイル−バリル−アラニル−グルタミル−フェニルアラニンアミド（以下「ＧＬ−１８９」とする。ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、βセクレターゼ阻害薬であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−バリル−ロイシル−ロイシナール（以下「Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ」とする。ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、γセクレターゼ阻害薬であるＮ−(３，５−ジフルオロフェニルアセチル) −Ｌ−アラニル−(Ｓ) −フェニルグリシン−メチルエステル（以下「ＤＡＰＭ」とする。ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、γセクレターゼ阻害薬であるＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｓ−(t−ブチル)システイル−イソロイシル−ロイシナール（以下「γＸＩＶ」とする。ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を用いて、（Ａ）血清除去によって惹起したラット胎児網膜神経培養細胞死に対する作用、（Ｂ）グルタミン酸添加によって惹起したラット新生児培養ＲＧＣに対する作用、（Ｃ）ラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を以下の方法で検討した。
【００２６】
（Ａ）血清除去によって惹起したラット胎児網膜神経培養細胞死に対する作用
（１）ＧＬ−１８９の作用
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，９６７，２５７−６６，２００３に記載された試験方法に準じて、ラット胎児（１８日齢）の網膜神経細胞を単離し、ポリエチレンイミンコートされたプラスチックカバースリップ上に播種後、１０％ウシ胎児血清を含有させたイーグル基礎培地中にて５日間培養した。培養６日目よりシトシンアラビノシド（培地中濃度１０μM）を添加した１０％ウシ胎児血清を含有させたイーグル基礎培地中で培養をすることにより非ニューロン性の細胞の増殖を抑制した。培養８日目に培地を１０％ウマ血清を含有させたイーグル基礎培地に変更し２４時間培養した後、試験に用いた。なお、培養は３７℃、５％ＣＯ２条件下で行った。培養９日目に溶媒（０．１％ジメチルスルホキシド）あるいはＧＬ−１８９（１μＭ、１０μＭ）を含有し、かつ、血清を含まないイーグル基礎培地中にて網膜神経細胞を２４時間インキュベート（３７℃、５％ ＣＯ２）した後、細胞の生死判定を行い、０．１％ジメチルスルホキシドを添加した１０％ウマ血清を含有させたイーグル基礎培地中で２４時間インキュベートした対照群（１００％）に対する各群の生存率を算出した。細胞の生死判定はトリパンブル−染色法により実施した。すなわち、１．５％トリパンブルー溶液で１０分間細胞を染色した後、１０％中性ホルマリン溶液にて固定し、生理食塩液で洗浄した後、染色細胞は死細胞として、また、非染色細胞は生存細胞として判定し、顕微鏡下で死細胞数および生存細胞数（総計数細胞数２００以上）を計数した。実験結果を図１のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００２７】
（２）Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯの作用
ＧＬ−１８９に代えて、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（１ｎＭ、１０ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図２のグラフに示す。
【００２８】
（３）ＤＡＰＭの作用
ＧＬ−１８９に代えて、ＤＡＰＭ（１０ｎＭ、１００ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図３のグラフに示す。
【００２９】
（４）γＸＩＶの作用
ＧＬ−１８９に代えて、γＸＩＶ（１ｎＭ、１０ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図４のグラフに示す。
【００３０】
（Ｂ）グルタミン酸添加によって惹起したラット新生児培養ＲＧＣに対する作用
（１）ＧＬ−１８９の作用
Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，９６７，２５７−６６，２００３に記載された試験方法に準じて、ラット新生児（７日齢）のＲＧＣを２−ステップパンニング法により単離した。培養培地としては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン-ストレプトマイシン（１００単位／ｍｌ−１００μｇ／ｍｌ）、フォルスコリン（５μＭ）、およびＢ−２７添加物を含有させた神経細胞培養用培地を用いた。ＲＧＣを単離後、溶媒（０．１％ジメチルスルホキシド）あるいはＧＬ−１８９（１μＭ）を含有する培養培地中で２４時間インキュベートした後、培養液中の濃度が２５μＭになるようにグルタミン酸を添加し、さらに２日間インキュベートした。インキュベートは（３７℃、５％ ＣＯ２）の条件下で行った。対照群は同期間溶媒（０．１％ジメチルスルホキシド）含有培養培地中でインキュベートした。グルタミン酸処置後、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いて生存ＲＧＣの同定を行った。すなわち、１μｇ／ｍｌのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ溶液中で１５分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、Ｃａｌｃｅｉｎ陽性かつ細胞直径以上の長さの突起を有する細胞を生存ＲＧＣとみなし、蛍光顕微鏡下で生存ＲＧＣ数を計数し、対照群と同数のＲＧＣが生存していた際を１００％とする生存率を算出した。実験結果を図５のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００３１】
（２）Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯの作用
ＧＬ−１８９に代えて、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（１００ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図６のグラフに示す。
【００３２】
（３）ＤＡＰＭの作用
ＧＬ−１８９に代えて、ＤＡＰＭ（１０ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図７のグラフに示す。
【００３３】
（４）γＸＩＶの作用
ＧＬ−１８９に代えて、γＸＩＶ（１０ｎＭ）を用いる以外は、上記（１）と同様の操作を行い、各群の生存率を算出した。実験結果を図８のグラフに示す。
【００３４】
（Ｃ）ＤＡＰＭおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯのラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用
Ｊ.  Ｏｃｕｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，１８，２４１−９，２００２に記載された試験方法に準じ、５％フルオロゴールドをラット中脳上丘へ注入することにより、ＲＧＣを逆行性標識した。フルオロゴールド注入の７日後、ラットをアトロピン点眼液で散瞳させ、３％ハロタンで麻酔導入し、１％ハロタンで維持した。（ハロタンは、酸素０．５Ｌ／分、笑気１．５Ｌ／分で気化させた）。実体顕微鏡下で視神経を露出させ、眼球から１〜２ｍｍの位置にある軸索を６０ｇの圧力のクリップで３０秒間挟むことにより軸索圧迫処置を行った。軸索圧迫処置の５分後に溶媒（０．１％ジメチルスルホキシド）、ＤＡＰＭ（１０００ｐｍｏｌ／眼）あるいはＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯ（１００ｐｍｏｌ／眼）を硝子体内投与した。軸索圧迫処置の７日後に眼球を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド液中４℃で１時間固定した。角膜、虹彩、水晶体を除去し、４％パラフォルムアルデヒド液中４℃でさらに３０分固定した後、網膜を花弁状に６分割し、フラットマウント標本を作製した。蛍光顕微鏡およびＣＣＤカメラを用いて、６分割した各区画の視神経乳頭部から約１．５ｍｍの部位および網膜の端から０．５ｍｍの部位それぞれを中心とした画像を取得し（各網膜につき計１２枚）、画像解析ソフトＯｐｔｉｍａｓを用いて解析を行い、平均ＲＧＣ密度を算出した。実験結果を図９のグラフに示す。なお、グラフ中の棒は各群の平均値を、誤差線は標準誤差を示す。
【００３５】
［製剤例］
製剤例１（点眼剤）
処方：ＧＬ−１８９                                      １ｍｇ
濃グリセリン                                  ２５０ｍｇ
ポリソルベート８０                            ２００ｍｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物                  ２０ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム                              適量
１Ｎ塩酸                                          適量
滅菌精製水                                        適量  
合計                                          １０ｍｌ
【００３６】
滅菌精製水にＧＬ−１８９およびそれ以外の上記成分を加え、十分に混合して点眼剤とする。
【００３７】
製剤例２（錠剤）
処方：ＤＡＰＭ                                          １ｍｇ
乳糖                                            ６６．４ｍｇ
トウモロコシデンプン                            ２０ｍｇ
カルボキシメチルセルロースカルシウム              ６ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース                      ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ０．６ｍｇ
合計                                            １００ｍｇ
【００３８】
ＤＡＰＭ、乳糖およびトウモロコシデンプンを混合機中で混合し、その混合物にカルボキシメチルセルロースカルシウムおよびヒドロキシプロピルセルロースを加えて造粒し、得られた顆粒を乾燥後整粒し、その整粒顆粒にステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で打錠する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】血清除去による、ＧＬ−１８９を用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図２】血清除去による、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図３】血清除去による、ＤＡＰＭを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図４】血清除去による、γＸＩＶを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図５】グルタミン酸添加による、ＧＬ−１８９を用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図６】グルタミン酸添加による、Ｚ−ＶＬＬ−ＣＨＯを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図７】グルタミン酸添加による、ＤＡＰＭを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図８】グルタミン酸添加による、γＸＩＶを用いた場合の各群の生存率を示すグラフである。
【図９】ＤＡＰＭおよびＺ−ＶＬＬ−ＣＨＯのラット軸索圧迫誘発網膜障害に対する作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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