(57)【要約】【課題】  コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象の二次元電気泳動パターンとを高精度に比較する。【解決手段】  コンピュータに、ゲノム塩基配列情報に基づいて作成したコントロールの二次元電気泳動パターンと、解析対象のゲノムDNAを用いて二次元電気泳動を行って得られた解析対象の二次元電気泳動パターンとを表示手段に表示させる手順１と、表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのそれぞれから対応するスポットとして選択された複数のスポット対から、補正パラメータを算出する手順２とを実行させるためのプログラム。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピュータに、
ゲノム塩基配列情報に基づいて作成したコントロールの二次元電気泳動パターンと、解析対象のゲノムDNAを用いて二次元電気泳動を行って得られた解析対象の二次元電気泳動パターンとを表示手段に表示させる手順１と、
表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのそれぞれから対応するスポットとして選択された複数のスポット対から、補正パラメータを算出する手順２と、
を実行させるためのプログラム。
【請求項２】
上記表示手段に表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのいずれか一方のパターンにおいて指定されたスポットに相当する、他方のパターンにおけるスポットを上記手順２で算出された補正パラメータを用いて同定し、当該同定したスポットを上記表示手段に表示された他のパターン上に表示する手順３を更に含むことを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項３】
上記手順３では、上記同定したスポットに対応する塩基配列情報を表示することを特徴とする請求項２記載のプログラム。
【請求項４】
上記手順２の前及び/又は後に、上記解析対象の二次元電気泳動パターンに表示された分子量マーカーに基づいて、上記コントロールの二次元電気泳動パターン及び上記解析対象の二次元電気泳動パターンを所定の範囲で区画した後、上記手順３を実行することを特徴とする請求項２記載のプログラム。
【請求項５】
コントロールの二次元電気泳動パターンから選択したスポットの座標を（Xi、Yi）とし、解析対象の二次元電気泳動パターンから対応するスポットとして選択したスポットの座標を（Xi’、Yi’）としたときに、これら座標（Xi、Yi）及び（Xi’、Yi’）間に成立する関係式
【数１】
2005156361.tif 000006
におけるa、b、c及びdを上記補正パラメータとし、これら補正パラメータa、b、c及びdを算出することを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項６】
上記式においてa=c及びb=dが成立するものとし、下記式
【数２】
2005156361.tif 000007
によってa及びbを算出することを特徴とする請求項１のプログラム。
【請求項７】
上記コントロールの二次元電気泳動パターンは、上記ゲノム塩基配列情報における第一の制限酵素の認識配列及び第二の制限酵素の認識配列を検出し、当該第一の制限酵素の認識配列及び当該第二の制限酵素の認識配列により挟まれた塩基配列と、当該第一の制限酵素の認識配列及び当該第一の制限酵素の認識配列より挟まれた塩基配列とに基づいて当該コントロールの二次元電気泳動パターンを作成することを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項８】
上記第一の制限酵素及び第二の制限酵素は、メチル化非感受性制限酵素から選ばれることを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項９】
上記第一の制限酵素及び第二の制限酵素はメチル化感受性制限酵素から選ばれることを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項１０】
上記ゲノム塩基配列情報を、通信回線網を介して取得する手順を含むことを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【請求項１１】
上記コントロールの二次元電気泳動パターンに含まれる複数のスポットに対して、ゲノム上での遺伝子座情報とリンクさせることを特徴とする請求項１記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムDNAを用いた二次元電気泳動パターンを、コンピュータを用いて解析するプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高等生物のゲノム解析をより速く行うため、ゲノムスキャニング技術の開発が急速に進んでいる。ゲノムスキャニングとは、座位（遺伝子座）又はそのコピー数を一度に高速解析し、ゲノムDNAの物理的状態をゲノム全体にわたって検索するものである。ゲノムスキャニングによれば、ゲノムの遺伝子地図上における遺伝子の位置、又は1つの遺伝子産物をコードするDNA領域が占める染色体上の区画について、そのシグナルを高速に検出し有無を判定することができる。このゲノムスキャニングにおいては、ゲノム上にどのような目印を立てればよいか、ゲノム上のいかなる目印をどのようなシグナルとして検出すればよいか、さらに、より多くの目印をどのように検出し解析すればよいかということが極めて重要である。これらの目印はランドマークと呼ばれており、ランドマークの染色体上の位置情報を解析することは、ゲノムの連鎖地図又は物理的地図を作製するための大きな基礎的技術となる。従って、ゲノムスキャニングを2種類以上のゲノムDNAに適用し比較すると、欠失、増幅、転座などのゲノムDNAの変化を検出することができるようになる。
【０００３】
ところで、RLGS（Restriction Landmark Genomic Scanning）法は、制限酵素で切断したゲノムDNAの端部をランドマークとして標識し、標識されたゲノムDNA断片を二次元電気泳動を用いて展開し、得られるパターンを用いて検出する方法である。このRLGS法は、一度に多量のランドマークを検出することができるため、ゲノムDNAの変化を高速に検出できる技術であるといえる。
【０００４】
このRLGS法には、解析対象のゲノムDNAから得られた二次元電気泳動パターンと比較するため、コントロールとなる二次元電気泳動パターンを必要とする。コントロールとなる二次元電気泳動パターンは、野生型の細胞から抽出したゲノムDNAを用いて同様に二次元電気泳動を行うことによって得ることができる。RLGS法では、コントロールの二次元電気泳動パターンを得るための工程が煩わしく、また、得られたコントロールの二次元電気泳動パターンを用いた比較も煩わしい。さらに、スポットのクローニングには、著しい労力と煩雑な技術を必要とするといった問題点があった。
【０００５】
このような問題点に鑑み、本発明者等は、コントロールとなる二次元電気泳動パターンと、解析対象のゲノムDNAに基づく二次元電気泳動パターンとを用いたゲノムDNAの解析プログラムを開発した（特許文献１参照）。しかしながら、特許文献１に開示されたプログラムでは、コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象の二次元電気泳動パターンとを高精度に比較することができなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開平2002-350401号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象の二次元電気泳動パターンとを高精度に比較することができるゲノムDNA解析プログラムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
(1)  コンピュータに、ゲノム塩基配列情報に基づいて作成したコントロールの二次元電気泳動パターンと、解析対象のゲノムDNAを用いて二次元電気泳動を行って得られた解析対象の二次元電気泳動パターンとを表示手段に表示させる手順１と、表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのそれぞれから対応するスポットとして選択された複数のスポット対から、補正パラメータを算出する手順２とを実行させるためのプログラム。
【０００９】
(2)  上記表示手段に表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのいずれか一方のパターンにおいて指定されたスポットに相当する、他方のパターンにおけるスポットを上記手順２で算出された補正パラメータを用いて同定し、当該同定したスポットを上記表示手段に表示された他のパターン上に表示する手順３を更に含むことを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１０】
(3)  上記手順３では、上記同定したスポットに対応する塩基配列情報を表示することを特徴とする(2)記載のプログラム。
【００１１】
(4)  上記手順２の前及び/又は後に、上記解析対象の二次元電気泳動パターンに表示された分子量マーカーに基づいて、上記コントロールの二次元電気泳動パターン及び上記解析対象の二次元電気泳動パターンを所定の範囲で区画した後、上記手順３を実行することを特徴とする(2)記載のプログラム。
【００１２】
(5)  コントロールの二次元電気泳動パターンから選択したスポットの座標を（Xi、Yi）とし、解析対象の二次元電気泳動パターンから対応するスポットとして選択したスポットの座標を（Xi’、Yi’）としたときに、これら座標（Xi、Yi）及び（Xi’、Yi’）間に成立する関係式。
【００１３】
【数１】
2005156361.tif 000002
におけるa、b、c及びdを上記補正パラメータとし、これら補正パラメータa、b、c及びdを算出することを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１４】
(6)  上記式においてa=c及びb=dが成立するものとし、下記式
【数２】
2005156361.tif 000003
によってa及びbを算出することを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１５】
(7)  上記コントロールの二次元電気泳動パターンは、上記ゲノム塩基配列情報における第一の制限酵素の認識配列及び第二の制限酵素の認識配列を検出し、当該第一の制限酵素の認識配列及び当該第二の制限酵素の認識配列により挟まれた塩基配列と、当該第一の制限酵素の認識配列及び当該第一の制限酵素の認識配列より挟まれた塩基配列とに基づいて当該コントロールの二次元電気泳動パターンを作成することを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１６】
(8)  上記第一の制限酵素及び第二の制限酵素は、メチル化非感受性制限酵素から選ばれることを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１７】
(9)  上記第一の制限酵素及び第二の制限酵素はメチル化感受性制限酵素から選ばれることを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１８】
(10)  上記ゲノム塩基配列情報を、通信回線網を介して取得する手順を含むことを特徴とする(1)記載のプログラム。
【００１９】
(11)  上記コントロールの二次元電気泳動パターンに含まれる複数のスポットに対して、ゲノム上での遺伝子座情報とリンクさせることを特徴とする(1)記載のプログラム。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るゲノムDNA解析プログラムによれば、コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象の二次元電気泳動パターンとを高精度に比較することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るプログラムは、例えば、フレキシブルディスク、光ディスク、光磁気ディスク、相変化型光ディスク及びハードディスク等の情報記録媒体に記録されているか、又は、インターネット等の通信回線網を介してサーバーから配信されるものであっても良い。情報記録媒体に記録された本プログラム又はサーバーから配信された本プログラムは、コンピュータに以下のゲノムDNA解析を実行させることができる。
【００２２】
ここで、コンピュータとは、図１に示すように、本プログラムを実行するコンピュータは、全体の動作を制御するCPU501と、必要なプログラムデータ等を一時的に格納するRAM503と、操作者が各種情報を入力する入力部504と、インターネットを介して外部との間でデータの送受信を行う通信モデム等からなる送信／受信部505と、表示するデータ等を出力する表示手段506と、データやプログラム等が記録されているHDD507と、CD-ROM509に書き込まれたデータを読みとるCD-ROMドライブ508とを備えている。
【００２３】
また、本システムにおいては、インターネット等の通信回線網を介してコンピュータと接続されたデータベース510を備えている。なお、本プログラムは、HDD507に記録されていればよいが、テープ状又はディスク状磁気記録媒体、光学記録媒体等、一般にコンピュータの外部記憶デバイスに使用される情報記録媒体であればいかなる記録媒体にも記録することができる。
【００２４】
CPU501は、RAM503、HDD507又はCD-ROM509に記録されているプログラムに従って、システム全体を制御して後述する処理を実行する。入力部504は、例えば、スキャナーやマウス、キーボード等であり、処理を実行する上で必要な条件等を入力するとき等に操作される。表示手段506は、例えば、ディスプレイやプリンター等であり、CPU501の制御によって処理されたデータ等を表示することができる。送信／受信部505は、CPU501の制御によってデータベース510に記録されたデータをRAM503やHDD507等に取り込むことができる。
【００２５】
コンピュータにおける処理
本プログラムは、コンピュータに対して以下の手順を実行させることにより、ゲノムDNA解析を行う。すなわち、プログラムは、解析対象から抽出したゲノムDNAから得られる二次元電気泳動パターンと、コントロールとなる二次元電気泳動パターンとを、コンピュータを用いて高精度に比較するものである。
【００２６】
先ず、手順１では、ゲノム塩基配列情報に基づいて作成したコントロールの二次元電気泳動パターンと、解析対象のゲノムDNAを用いて二次元電気泳動を行って得られた解析対象の二次元電気泳動パターンとを表示手段506に表示させる。例えば、図４に示すように、コントロールの二次元電気泳動パターンを表示するための右ウィンドウと、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンを表示するための左ウィンドウとを表示手段506に表示する。
【００２７】
解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターン
先ず、解析対象となるゲノムDNAの二次元電気泳動パターンを得る方法について説明する。二次元電気泳動パターンは、制限酵素の認識部位を目印（ランドマーク）として用い、このランドマークをシグナルとして検出する方法（Restriction Landmark Genomic Scanning法（RLGS法）; Hatada, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,88, 9523-9527, 1991）を基本概念として適用する。植物のゲノムDNAの解析に関しては、Matsuyama et al. Plant. Mol. Biol. Rep. 18 : 331-338, 2000を基本理念として適用する。解析対象となるゲノムDNAの二次元電気泳動パターンは、以下の方法に準じて得ることができる。
【００２８】
(1) ゲノムDNAの第一の制限酵素による処理
本発明の解析方法の対象となるゲノムDNAは特に限定されるものではなく、植物由来のものであると他の生物種（動物、細菌、酵母等）のものであるとを問わない。ゲノムDNAとしては、高等生物由来のものを使用することもできる。植物由来のゲノムDNAとしては、例えばイネ、タバコ、アラビドプシス、コムギ、トマト等由来のものが挙げられるが、イネ又はアラビドプシス由来のものが好ましい。
【００２９】
動物由来のゲノムDNAとしては、例えばヒト、マウス、センチュウ等由来のものが挙げられる。細菌由来のゲノムDNAとしては、例えば枯草菌、大腸菌等由来のものが挙げられる。
【００３０】
本発明に係るプログラム及びDNA解析方法においては、特に、上述した植物由来のゲノムDNAを解析対象とすることが好ましい。植物由来のゲノムDNAは、従来より公知の方法（Dellaporta et al. Plant Mol. Biol.Rep.1: 19-21,1983）に準じて、植物に対して除タンパク質処理、除多糖質処理等を施すことによって得ることができる。
【００３１】
この「ゲノムDNAの第一の制限酵素による処理」では、先ず、抽出したゲノムDNAを第一の制限酵素（図２(1)において「A」の位置を切断する酵素であり、制限酵素Aとする）で切断する。制限酵素Aとしては、切断したときに生じる平均断片長が100kbを超える程度のもの、すなわち平均100kbを超える間隔でしか存在しない制限酵素部位を認識する制限酵素であって6〜8塩基認識のいわゆるレアカッター制限酵素が挙げられる。
【００３２】
上記制限酵素Aは、切断したときに生じる制限酵素部位の5'側が突出した付着末端となるように切断するもの（5'突出型という）、及び3'側が突出した付着末端となるように切断するもの（3'突出型という）のいずれを用いることもできる。なお、上記制限酵素Aとしては、平滑末端を生じるように切断するものも使用できるが、この場合、シグナル強度が弱い場合もある。さらに、突出部の長さは1塩基以上のものが挙げられ、十分なシグナル強度を得るためには、突出部の長さが2塩基以上となるように切断する酵素が好ましい。このような制限酵素Aとしては、5'突出型については例えばNotI、BssHII、AccIIIが挙げられ、3'突出型については例えばBstXI、BglI、MwoIが挙げられる。
【００３３】
ここで、特に解析対象を植物細胞由来のゲノムDNAとする場合、第一の制限酵素としては、シトシンのメチル化（5mC）非感受性の制限酵素を使用することが好ましい。メチル化（5mC）非感受性の制限酵素を使用することによって、植物細胞由来のゲノムDNAのようにメチル化されたシトシンを多く有するゲノムDNAであっても確実に切断することができる。メチル化（5mC）非感受性の制限酵素としては、例えば、AccIII及びPacI等を挙げることができる。
【００３４】
(2) 制限酵素切断部位への標識
次に、上記制限酵素Aの切断部位に対して標識を付加する。標識を付加する際には、シークエナーゼ（T7DNAポリメラーゼ）により、予め標識された塩基（標識用配列）を制限酵素Aの切断部位にフィルイン(fill in；埋め込むこと)することにより行う。したがって、この場合、シークエナーゼの反応対象となるために、上記制限酵素Aとしては、切断部位の5'側が突出した付着末端となるように切断するもの（5'突出型という）を使用することが好ましい。
【００３５】
標識物質としては、[α-32P]dCTP、[α-32P]dGTP等の放射性同位体、テトラメチル-ローダミン-6-ｄUTP、フルオレセイン-12-ｄUTP等の蛍光色素等が挙げられ、任意に選択することができる。
【００３６】
また、標識を付加する際には、制限酵素Aの切断部位にアダプターを付加し、当該アダプターに標識を付加してもよい。アダプターは、その一方の側を上記制限酵素Aの切断部位に連結することができる配列（連結配列という）として設計し、他方の側はアダプターを標識するための配列（標識用配列という）として設計する。アダプターの標識用配列を5'側が突出した付着末端とすることによって、シークエナーゼによる反応対象とすることができ、標識用配列に対して標識を付加することができる。
【００３７】
このようにアダプターを介して標識を付加する場合、制限酵素Aとしては、切断部位の3'側が突出した付着末端となるように切断するもの、すなわち、3'突出型を使用することが好ましい。この場合、制限酵素Aによる切断部位には、シークエナーゼ（T7DNAポリメラーゼ）によるフィルインを防止することができる。言い換えると、アダプターの連結配列は、5'側が突出した付着末端とすることが好ましい。
【００３８】
ここで、連結配列及び標識用配列は一本鎖で構成される。また、連結配列と標識用配列との間は5〜45塩基からなる二本鎖で構成され、クローニングのしやすさを考慮すると、20〜35塩基からなるものが好ましい。連結配列は、上記制限酵素Aの認識配列に対応して設計することができる。また、標識用配列及び二本鎖領域の配列は任意に設計することができる。
【００３９】
標識用配列の長さは任意に設定することができるので、標識用配列の長さが長いほど検出感度を高めることができる。但し、標識用配列が長すぎるとDNAの二次構造（例えばステムループ構造又はヘアピン構造）が形成されることがある。そこで、これらの二次構造を形成しないよう、標識用配列は2〜10塩基であることが好ましい。
【００４０】
上述したように、制限酵素Aの切断部位に標識を直接付加する場合には、タバコ、アラビドプシス等に対するスポット検出能が低いため、全てのゲノムDNAに適用することが困難である。そこで、アダプターを介して標識を付加することにより、全てのゲノムDNAに適用することができ、検出能を改善することができる。
【００４１】
また、アダプターを使用する場合、制限酵素Aとしては、認識配列中にN(NはA、G、C又はTを表す）を有するBstXIを用いても良い。BstXIのように3'突出型であれば、後述する標識の際にシークエナーゼ（T7DNAポリメラーゼ）の反応対象とならず、標的DNA断片以外の断片を標識することから防ぐことができる。なお、このような3'突出型で２塩基以上の突出部を有する酵素はBstXI、BglI及びMwoIのほかにも多数存在し（例えばAlwNI、BanII、BsiEI、BsiHKAI、BslI、BsmI、Bsp1286I、BsrDI、DraIII、DrdI、PflMI、SfiI、TspRI、BpmI、BseRI、BsgI、Eco57I）、本発明の方法ではこれらの酵素のいずれも適用することができる。
【００４２】
例えば、制限酵素AとしてBstXIを使用すると、BstXIは以下の配列を認識し、3'側が4塩基突出するように（下線部）5'末端から第8番目のNと第9番目のNとの間（*で示す位置）を切断する（図３(1)）。
センス鎖：         5'-CCANNNNN* NTGG-3'
アンチセンス鎖：   3'-GGTN *NNNNNACC-5'
【００４３】
NはA、G、C及びTのいずれでもよいので、アダプターの突出部の4つの配列は全ての組み合わせ（44=256通り）を考慮して設計される。この場合、ゲノムDNAの種類や解析の目的（具体的にはアラビドプシス突然変異体における変異領域を検出すること等）に応じて突出部の4塩基を適当な数の組み合わせとなるように規定することができる。例えば、図３(2)にはアダプターの連結配列として「GGGC」が示されており、この場合は、アダプターはBstXIによる切断断片のうち「CCCG」配列を突出配列とする1種類の断片（すなわち突出部が「CCCG」のみの配列を有する断片）と連結することとなる（図３(3)）。同様に、アダプターの連結配列を「GGGS」（SはG又はCを表す）とした場合は、アダプターはBstXIによる切断断片のうち「CCCG」又は「CCCC」配列を突出配列とする2種類の断片と連結することとなる。従って、BstXIを制限酵素Aとして使用すると、アダプターの連結配列の選択の仕方により１〜256通りのランドマーク部位を任意に選択することができる。
【００４４】
なお、アダプターの調製は、通常の化学合成装置（例えばPE Applied Biosystems社のDNA/RNAシンセサイザmodel 394）により得ることができる。そして、アダプターをDNAリガーゼで処理し、ゲノムDNAに連結する。
【００４５】
(3)他の制限酵素処理
制限酵素Aで切断された断片が100kb以上の長さを有している場合には、そのまま通常の0.3%アガロースゲル電気泳動等による分画を行うことはできない。そこで、制限酵素Aによる切断断片をさらに短い断片にするため、他の制限酵素処理を行う（図２(4)）。他の制限酵素は、切断したときに生じる平均断片長が数〜数十kbもの、すなわち平均数〜数十kbの間隔で存在する制限酵素部位を認識する制限酵素であって6塩基認識程度のものを用いることができる（図２においてBの位置を切断する酵素であり、制限酵素Bとする）。制限酵素Bとしては、例えばEcoRV、DraI等が挙げられる。
【００４６】
なお、制限酵素Aで切断されてなる断片が平均数〜数十kbである場合には、そのまま電気泳動による分画を行うことができるため、制限酵素Bによる処理を行う必要はない。
【００４７】
(4) 一次元分画
制限酵素Bによる処理を施したのち、各断片について一次元分画を行う（図２(5)）。一次元分画は、直径3〜4.5mm、長さ60cm程度の細長いキャピラリー状のチューブを用いることにより行う。上記(4)の項において処理された断片をチューブの原点に注入し、分画する。一次元分画は、0.7〜1.0%程度のアガロース電気泳動が好ましく、5%シュクロースの存在下、室温(より好ましくは22〜26℃)で20〜48時間行う。
【００４８】
なお、一次元分画工程により、制限酵素Bによる切断断片は、原点（一次元分画の開始点）から末端部に向かってDNA断片の長さが順に短くなるように泳動される（図２(5)の拡大図）。例えば、図２(5)の拡大図において長さの長い断片1は原点に近く、長さの短い断片2は原点から離れるように泳動する。従って、原点からの位置は、断片の長さを反映することとなる。
【００４９】
(5) 第二の制限酵素処理
分画終了後、チューブを第二の制限酵素溶液に浸して一次元分画産物について制限酵素処理を行う。第二の制限酵素は、制限酵素A及びBよりも切断頻度の高い酵素であって、切断したときに生じる平均断片長が数百bp、例えば300bp程度の間隔で存在する制限酵素部位を認識するものである（図２において「C」の位置を切断する酵素であり、制限酵素Cとする。）。
【００５０】
制限酵素Cには4〜6塩基認識程度のものを用いることができ、例えばMboI、HinfI等を採用することができる。
【００５１】
(6) 二次元分画
制限酵素Cで断片を処理すると、制限酵素認識部位AとBとで挟まれた断片（A-B断片という）は制限酵素認識部位AとCとで挟まれた断片（A-C断片という）、及び制限酵素認識部位CとBとで挟まれた断片（B-C断片という）に切断され、得られるDNA断片の平均鎖長はそれぞれ数百bp以下になる。
【００５２】
これらの断片について二次元分画を行う。二次元分画法としては、例えば、5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2v/cmで20〜24時間の条件）による方法等が挙げられる。または、6M尿素を含む5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うことによって、より正確なパターンを得ることができる。
【００５３】
以上(1)〜(6)によって得られた解析対象の二次元電気泳動パターンを、スキャナー等の入力部504を用いて画像データに変換してコンピュータに入力することができる。入力した解析対象の二次元電気泳動パターンに関する画像データは、例えばRAM503に保存する。そして、本プログラムにおいては、入力した二次元電気泳動パターンに含まれるスポットを検出し、各スポットにつき座標(Xi’、Yi’)を算出する。なお、座標におけるiは、二次元電気泳動パターンに含まれる全てのスポットに対応して割り振られた番号を意味する。
【００５４】
解析対象の二次元電気泳動パターンに含まれるスポットの検出は、標識物質の種類に応じた手法を採用することにより行うことができる。例えば、標識物質として32Pを用いた場合はオートラジオグラフィーによる検出が挙げられ、蛍光色素を用いた場合は蛍光イメージアナライザー(例えばFMBIO II Multi-View, TaKaRa)による検出が挙げられる。なお、二次元分画後のB-C断片は標識されていないため、スポットは生じない。
【００５５】
こうして得られた各スポットの位置を原点からX、Y方向の距離（X1’ , Y1’）、（X2’ , Y2’）、・・・（Xn’ , Yn’）で表すと、このX座標は制限酵素Aの認識部位から制限酵素Bの認識部位まで（A-B断片）の距離を、Y座標は制限酵素Aの認識部位から制限酵素Cの認識部位まで（A-C断片）の距離を反映する（図２(6)）。従って、スポットのパターンを解析することにより、ゲノムの変異箇所を特定したり、DNA修飾による変異を検出することができる。例えば、スポットの濃さは検出された断片のコピー数を反映するので特定領域の重複であることがわかり、図２(6)のスポットのパターンにおいて二次元分画後の位置（X2’ , Y2’）がずれた場合又は消滅した場合は、DNA断片の塩基配列の一部が変異（欠失、置換又は付加等）したことがわかる。
【００５６】
コントロールの二次元電気泳動パターン
一方コントロールの二次元電気泳動パターンは、コンピュータで以下のように作成することができる。すなわち、先ず、データベース510に記録されているゲノム塩基配列情報を、インターネット等の通信回線網を介して取得する。ここで、ゲノム塩基配列情報は、解析対象となるゲノムDNAの野生型として登録されている塩基配列である。データベース510としては、例えば、Genbank、EMBL、DDBJ、TAIR及びKAOS等を挙げることができる。なお、本プログラムは、ゲノム塩基配列情報としてデータベース510に記録されているものに限定されず、例えば、HDD507、CD-ROM509及びその他各種情報記録媒体等に記録されているゲノム塩基配列情報を使用することができる。
【００５７】
またこのとき、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を検出することが好ましい。具体的に、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を検出し、異常情報をソーティングして例えばRAM503に一時的にデータとして保存する。
【００５８】
ここで、異常情報は、所定の位置における塩基が未確定であることを意味する情報であり、例えば、塩基配列中に「m」、「r」、「w」、「s」、「y」、「k」、「v」、「h」、「d」、「b」及び「n」等の文字情報として含まれている。「m」は、その位置がA又はCであることを意味する。「r」は、その位置がG又はAであることを意味する。「w」は、その位置がA又はT若しくはUであることを意味する。「s」は、その位置がG又はCであることを意味する。「y」は、T若しくはU又はCであることを意味する。「k」は、その位置がG又はT若しくはUであることを意味する。「v」は、その位置がA又はG又はCであることを意味する。「h」は、その位置がA又はC又はT若しくはUであることを意味する。「d」は、その位置がA又はG又はT若しくはUであることを意味する。「b」は、その位置がG又はC又はT若しくはUであることを意味する。「n」は、その位置がA又はG又はC又はT若しくはUであるか、又はその位置が不明であることを意味する。
【００５９】
そして、データベース510から得たゲノム塩基配列情報を用いてコントロールの二次元電気泳動パターンを作成する際には、先ず、ゲノム塩基配列情報から制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列を検索し、A-A断片及びA-B断片を予測する。すなわち、キーボードやマウス等の入力部504で入力された制限酵素Aの認識配列及び制限酵素Bの認識配列に基づいて、RAM503に保存されたゲノム塩基配列情報に含まれる当該認識配列を検索する。
【００６０】
次に、解析対象の二次元電気泳動パターンがアダプターを使用した場合には、予測したA-A断片及びA-B断片にアダプターの塩基配列数や配列情報を加算する。すなわち、先の工程で予測したA-A断片及びA-B断片の塩基配列に対して、キーボードやマウス等の入力部504で入力されたアダプターの塩基配列を付加する。これにより、「(3)他の制限酵素処理」で得られた複数のA-A断片及びA-B断片に対応する、複数の推定A-A断片及び推定A-B断片をゲノム塩基配列情報から予測することができる。
【００６１】
次に、複数の推定A-A断片及び推定A-B断片の塩基配列数及び推定される等電点等に基づいて、「(4) 一次元分画」を行った場合に推定される泳動パターンを予測する。この泳動パターンは、Southern,E.M.（Measurement of DNA Length by Gel Electrophoresis, Analytical Biochemistry:100,319-323,1979）により報告された方法により算出することができる。なお、泳動パターンは、ゲルの濃度及び種類、泳動を行う電圧、泳動時間及び温度等の諸条件をパラメータとして入力することによって推定することができる。言い換えると、本プログラムでは、これらの諸条件をパラメータとして泳動パターンを推定できるような補正値を予め備えることが好ましい。
【００６２】
次に、推定A-A断片及び推定A-B断片における制限酵素Cの認識配列を検索し、A-C断片を予測する。これにより、「(5) 第二の制限酵素処理」で得られた複数のA-C断片に対応する、複数の推定A-C断片をゲノム塩基配列情報から予測することができる。
【００６３】
次に、複数の推定A-C断片の塩基配列数及び推定される等電点等に基づいて、「(6) 二次元分画」を行った場合に推定される二次元電気泳動パターンを予測する。二次元電気泳動パターンは、上述した「泳動パターン」を予測する場合と同様に、ゲルの種類、泳動を行う電圧、泳動時間及び温度等の諸条件をパラメータとして入力することによって推定することができる。言い換えると、本プログラムでは、これらの諸条件をパラメータとして二次元電気泳動パターンを推定できるような補正値を予め備えることが好ましい。このように、本プログラムでは、データベース510から得たゲノム塩基配列情報に基づいて、予測されるスポットの位置を推定座標（Xi、Yi）として得ることができる。このとき、X座標（Xi）は、アダプターの塩基配列数を加算したA-B断片のサイズ分画位置を示し、Y座標（Yi）は、アダプターの塩基配列数を加算したA-C断片のサイズ分画位置を示す。
【００６４】
そして、得られた推定座標（Xi、Yi）における各座標の値を、X-Y平面にプロットすることによってコントロールの二次元電気泳動パターンを画像データとして得ることができる。
【００６５】
なお、上述した説明では、推定A-B断片に基づいて泳動パターンを作成したが、解析対象の二次元電気泳動パターンを作成するに際して「(3) 他の制限酵素処理」を行わない場合には、制限酵素A及び制限酵素C処理によって得られると推定された推定A-A断片及び推定A-C断片に基づいて泳動パターンを作成すればよい。また、解析対象の二次元電気泳動パターンを作成するに際してアダプターを付加していない場合には、上述した処理においてアダプターの塩基配列を考慮しなくて良い。
【００６６】
さらに、コントロールの二次元電気泳動パターンは、ゲノム塩基配列情報が不確定な部分が多いため、所定の領域を排除したものとして作成されることが好ましい。排除される領域としては、ゲノムDNA端部のテロメア領域や、ゲノムDNAの動原体付近等の高度反復塩基配列を挙げることができる。具体的には、第三の制限酵素処理前に、一方の端部のみに制限酵素Aの認識配列を有する断片は、ゲノムDNA端部のテロメア領域由来或いは塩基配列決定の際のギャップ領域由来であるとしてスポットとして同定しない。
【００６７】
ところで、本方法において、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を検出している場合には、当該異常情報以外のゲノム塩基配列情報を検索対象として制限酵素A等の認識配列を検索する。すなわち、異常情報として検索された位置の塩基は、制限酵素A等の認識配列を検索する際の対象から除外される。
【００６８】
また、本方法において、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を検出している場合には、予想されたスポットと当該異常情報とを関連付けておく。具体的には、予想されたスポットに含まれるDNA断片に異常情報が含まれるか否か、及び予想されたスポットに含まれる異常情報の種別を、スポット毎に関連付ける。
【００６９】
本プログラムによる解析
本プログラムにおける手順１では、以上のようにして得られた解析対象の二次元電気泳動パターンとコントロールの二次元電気泳動パターンとを、ディスプレイ等の表示手段506に表示する。例えば、図５に示すように、右ウィンドウにコントロールの二次元電気泳動パターンを表示するとともに左ウィンドウに解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンを表示する。
【００７０】
なお、図５に示すように、本プログラムにおいては、後述するように補正パラメータを算出するに先立って、解析対象の二次元電気泳動パターンに表示された分子量マーカーに基づいて、コントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンを所定の範囲で区画してもよい。すなわち、予め区画されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンを用いて、後述するように補正パラメータを算出してもよい。
【００７１】
本プログラムでは、表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンのそれぞれから対応するスポットとして選択された複数のスポット対から、補正パラメータを算出する（手順２）。ここで、補正パラメータとは、コントロールの二次元電気泳動パターンに含まれるスポットと、解析対象の二次元電気泳動パターンに含まれるスポットとを対応付ける目的で設定され、コントロールの二次元電気泳動パターンにおける推定座標（Xi、Yi）及び解析対象の二次元電気泳動パターンにおける座標（Xi’、Yi’）のいずれか一方を他方に対応付ける値である。
【００７２】
補正パラメータを算出する場合、操作者は、例えば、表示されたコントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンそれぞれから対応するスポットを交互に複数選択する。すなわち、操作者は、コントロールの二次元電気泳動パターンにおける所定のスポットと、当該スポットに対応する解析対象の二次元電気泳動パターンにおけるスポットとを一組のスポット対として、複数のスポット対を選択する。例えば、操作者はマウス等の入力部504を操作して、複数のスポット対を選択する。
【００７３】
例えば、図６に示すように、右ウィンドウに表示されたコントロールの二次元電気泳動パターンにおけるスポットを選択すると、選択された推定スポットが四角で囲われ、左ウィンドウに表示された解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンにおける対応するスッポットを選択すると、選択されたスポットが丸で囲われる。
【００７４】
本プログラムは、複数のスポット対が選択されると、各スポット対を構成する一組のスポットの座標を用いて、各スポット対が対応するように補正パラメータを算出することができる。具体的に補正パラメータとしては、コントロールの二次元電気泳動パターンから選択した推定座標（Xi、Yi）と、解析対象の二次元電気泳動パターンから対応するスポットとして選択した座標（Xi’、Yi’）との間に関係式
【００７５】
【数３】
2005156361.tif 000004
を成立させ、当該関係式におけるa、b、c及びdとして算出される。
【００７６】
これら補正パラメータa、b、c及びdは、操作者が選択した複数のスポット対の推定座標及び座標の値から、最小二乗法を使って算出することができる。なお、補正パラメータa、b、c及びdは、最小二乗法に限定されず、例えば、デミング（Deming）による曲線のあてはめ（「次元解析・最小二乗法と実験式」本間仁、春日屋伸昌共著、応用数学講座第５巻（コロナ社）、第255頁〜第262頁）を適用して算出することもできる。
【００７７】
より具体的に、最小二乗法を適用して補正パラメータを算出する方法としては、上記式においてa=c及びb=dが成立するものとし、下記式
【００７８】
【数４】
2005156361.tif 000005
によってa及びbを算出することができる。
【００７９】
次に、本プログラムによれば、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンを、上述したように得られた補正パラメータ及びコントロールの二次元電気泳動パターンを使用して解析することができる。具体的には、上述したような補正パラメータを用いて、コントロールの二次元電気泳動パターンにおける推定スポットの座標（Xi、Yi）を上記式に従って変換し、変換後の推定スポットを解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンに重ね合わせて表示する。
【００８０】
例えば、図７に示すように、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンが表示されている右ウィンドウに、変換後の推定スポットを表示する（図７において「＋」と表示）。なお、図７に示した例は、破線で囲った領域（二次元分画方向における100〜200bp）において、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンに含まれるスポットに対して、変換後の推定スポットを高精度に一致させることができたことを示している。
【００８１】
例えば、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンにおける所定のスポットに関する情報を得る場合には、先ず、当該スポットをマウス等の入力部504で選択する。解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンにおいて所定のスポットが選択されると、本プログラムは、上述した補正パラメータを用いて対応付けられた、コントロールの二次元電気泳動パターンにおける推定スポットに関する情報を表示手段506に表示する。例えば、図７に示すように、別ウィンドウとして当該スポットの配列情報を表示することができる。コントロールの二次元電気泳動パターンは、データベース510から取得したゲノム塩基配列情報に基づいて作成されているため、各スポットの塩基配列情報を対応させることができる。
【００８２】
なお、必要であれば、別ウィンドウに表示した配列情報をインターネット等の通信回線網を解して配列解析システム（例えば、BLAST検索システム）に送信してもよい。
【００８３】
特に、高等生物等の染色体構造を有する細胞を解析対象とする場合、ゲノムDNA端部のテロメア領域や、塩基配列決定の際に不明瞭なデータを示す動原体付近等の高度反復塩基配列を比較対象とすると、ノイズの原因となってしまう。そこで、ゲノムDNA端部のテロメア領域や、ゲノムDNAの動原体付近等の高度反復塩基配列を除外したコントロールの二次元電気泳動パターンを使用することによって、ノイズとなるようなスポットについて比較することを防止できる。一方で、最初の段階において、各クローンの両端をマーキングしておくことで、パターン中に出現したノイズを明確に識別できるようにしておく。これらにより、ノイズ成分を低減してより精度の高い比較を行うことができる。
【００８４】
また、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を検出している場合、コントロールの二次元電気泳動パターンにおいて解析対象の二次元電気泳動パターンと一致しないスポットを同定し、当該スポットに異常情報が含まれるが否かを判断することもできる。例えば、同定したスポットに異常情報が含まれている場合には、異常情報を修正してコントロールの二次元電気泳動パターンを再構築することもできる。同定したスポットに異常情報として「m」が含まれる場合、異常情報の位置をAとしたときのコントロールの二次元電気泳動パターンと、異常情報の位置をCとしたときのコントロールの二次元電気泳動パターンとを再構築する。
【００８５】
そして、再構築したコントロールの二次元電気泳動パターンと、解析対象の二次元電気泳動パターンとを用いて再び、同様に補正パラメータに基づいて比較する。例えば、同定したスポットに異常情報として「m」が含まれており、異常情報の位置をAとしたときのコントロールの二次元電気泳動パターンと、異常情報の位置をCとしたときのコントロールの二次元電気泳動パターンとを再構築した場合には、これら二種類のコントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象の二次元電気泳動パターンとを比較する。
【００８６】
これにより、ゲノム塩基配列情報に含まれる異常情報を反映して、解析対象の二次元電気泳動パターンについて、より高精度な解析を行うことができる。なお、異常情報が修正不可能な場合には、同定したスポットに異常情報が含まれているという情報を関連付けておく。
【００８７】
以上説明したように、本発明に係るプログラムによれば、データベース510等に記録されたゲノム塩基配列情報を用いてコントロールの二次元電気泳動パターンを作成し、補正パラメータ及びコントロールの二次元電気泳動パターンを用いて解析対象の二次元電気泳動パターンを解析する。これにより、このプログラムによれば、ゲノムDNAから得られた二次元電気泳動パターンを解析するに際して、コントロールの二次元電気泳動パターンと正確な比較を行うことができる。
【００８８】
特に、コントロールの二次元電気泳動パターンは、広く一般に公開された不正確な塩基配列情報に基づいて作製される場合もあるため、推定スポットの位置がずれてしまったり表示されてなかったりすることもある。一方、解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンにおいては、Aトラクトといった特異配列に起因して泳動距離が塩基長に依存しなかったりすることによってスポットの位置がずれてしまったり、パターン自体がゆがんでしまうこともある。すなわち、解析対象がゲノムDNAである場合には、コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンとが大きくずれてしまうことがある。
【００８９】
しかしながら、本プログラムによれば、複数のスポット対を選択することによって非常に簡易に、コントロールの二次元電気泳動パターンと解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンとを比較することができる。また、本プログラムにおいては、解析対象の二次元電気泳動パターンに表示された分子量マーカーに基づいて、コントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象の二次元電気泳動パターンを所定の範囲で区画することによって、より正確な比較を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明に係るプログラムを記録した記録媒体を実行するシステムを概略的に示す構成図である。
【図２】解析対象のゲノムDNAを用いて二次元電気泳動パターンを作成する工程を示す図である。
【図３】アダプターを用いて標識を行う工程を示す図である。
【図４】コントロールの二次元電気泳動パターン及び解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターンを表示するためのウィンドウを表示した表示手段を示す図である。
【図５】左右ウィンドウにそれぞれ解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターン及びコントロールの二次元電気泳動パターンを表示した表示手段を示す図である。
【図６】解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターン及びコントロールの二次元電気泳動パターンからスポット対を選択した状態の表示手段を示す図である。
【図７】本プログラムによって解析対象のゲノムDNAの二次元電気泳動パターン及びコントロールの二次元電気泳動パターンを比較した結果を表示した表示手段を示す図である。
【符号の説明】
【００９１】
501  CPU、503  RAM、504  入力部、505  送信/受信部、506  出力部、507  HDD、508  CD-ROMドライブ、509  CD-ROM、510  データベース
【図１】
2005156361.tif 000008
【図２】
2005156361.tif 000009
【図３】
2005156361.tif 000010
【図４】
2005156361.tif 000011
【図５】
2005156361.tif 000012
【図６】
2005156361.tif 000013
【図７】
2005156361.tif 000014