(57)【要約】【課題】  クエン酸を化学発光により簡便かつ高精度に検出する方法および装置の提供。【解決手段】  クエン酸を含んでなる試料液を用意し、ルテニウム錯体の共存下で、クエン酸を酸化させ、それによりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせ、該化学発光を検出することにより、クエン酸を検出する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光を用いたクエン酸の検出方法であって、
クエン酸を含んでなる試料液を用意し、
ルテニウム錯体の共存下で、クエン酸を酸化させ、それによりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせ、そして
該化学発光を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記クエン酸の酸化が、
前記試料液に、導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と、対電極とを接触させ、
前記作用電極と前記対電極との間に、前記作用電極上でクエン酸の酸化を生じる電圧を印加すること
により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
参照電極をさらに用意し、該参照電極に対する前記作用電極の電位を制御することにより、前記電圧の制御を行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化時における前記試料液のｐＨが１．０〜８．０である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記酸化時における前記試料液のｐＨが１．０〜６．０であり、かつ、前記作用電極への印加電圧が１．５〜３．０Ｖ（対参照電極）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記酸化時における前記試料液のｐＨが６．０〜８．０であり、かつ、前記作用電極への印加電圧が１．０〜１．５Ｖ（対参照電極）である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記クエン酸の酸化が、前記試料液に酸化剤を添加して混合することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記酸化剤が、過マンガン酸塩、二クロム酸塩、過酸化水素、過塩素酸塩、過臭素酸塩、臭素、硫酸セリウム、および硝酸塩からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化時における前記試料液のｐＨが１．０〜４．０である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ルテニウム錯体が、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（II）錯体またはトリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（II）錯体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ルテニウム錯体が試料液に添加されてなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ルテニウム錯体が前記導電性ダイヤモンド電極の表面に担持されてなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料液の供給が、キャリア溶液を一定流速で系内を流しながら、該キャリア溶液中に試料液を注入するフローインジェクション法により行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ルテニウム錯体の供給が、ルテニウム錯体を含む第二のキャリア溶液を、前記試料液が注入されたキャリア溶液に、一定流速で添加することにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二のキャリア溶液が前記酸化剤をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料液がシュウ酸をさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料液が尿である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酸化工程に先立ち、前記試料液が注入されたキャリア溶液をカラムに通して、クエン酸とシュウ酸とを分離する工程をさらに含んでなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記カラムを通過する際の前記試料液のｐＨが１．０〜３．０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二のキャリア溶液のｐＨが７．０〜９．０であり、該第二のキャリア溶液を、前記カラムを通過した後の前記試料液に添加して混合することにより、混合後の試料液のｐＨを６．０〜８．０に調整する工程をさらに含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二のキャリア溶液のｐＨが３．０以上であり、該第二のキャリア溶液を、前記試料液が注入されたキャリア溶液に添加して混合することにより、混合後の試料液のｐＨを３．０以下に調整する工程をさらに含んでなる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二のキャリア溶液が、測定の間、一定流速で供給される前記ルテニウム錯体を含む液と、一定流速で供給される前記酸化剤を含む液とを混合することにより、連続的に調製される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記カラムにより分離されたシュウ酸を、前記ルテニウム錯体の共存下で酸化させて、それにより生じた化学発光を検出する工程をさらに含んでなる、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
クエン酸による発光を検出する工程が、発光量を測定し、得られた発光量から前記試料中のクエン酸濃度を算出することをさらに含んでなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
得られた発光量からクエン酸濃度を算出する工程が、予め作成されたクエン酸濃度と発光量との検量線と、得られた発光量とを対比することにより行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
シュウ酸による発光を検出する工程が、発光量を測定し、得られた発光量から前記試料中のシュウ酸濃度を算出することをさらに含んでなる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
得られた発光量からシュウ酸の濃度を算出する工程が、予め作成されたシュウ酸濃度と発光量との検量線と、得られた発光量とを対比することにより行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置であって、
導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と、
対電極と、
前記作用電極および対電極を、クエン酸およびルテニウム錯体を含んでなる試料液に接触させる手段と、
前記作用電極と前記対電極との間に、前記作用電極上でクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせる電圧を印加する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなる、装置。
【請求項２９】
前記試料液にルテニウム錯体を添加する手段をさらに備えてなる、請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置であって、
表面にルテニウム錯体が担持されてなる、導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と、
対電極と、
前記作用電極および対電極を、クエン酸を含んでなる試料液に接触させる手段と、
前記作用電極と前記対電極との間に、前記作用電極上でクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせる電圧を印加する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなる、装置。
【請求項３１】
化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置であって、
クエン酸を含んでなる試料液にルテニウム錯体および酸化剤を添加する手段と、
該試料液を、前記酸化剤によるクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせるように混合する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなる、装置。
【請求項３２】
前記発光を検出する手段が、発光量を測定する装置であり、該装置が得られた発光量から試料液中のクエン酸濃度を算出する手段をさらに備えてなる、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、クエン酸を化学発光を用いて検出または定量するための方法および装置に関する。
【０００２】
背景技術
被検物質を検出する方法の一つとして、電気化学発光（electrochemiluminescence）を利用する方法が知られている。この方法では、ルテニウム錯体等の電気化学発光性物質を用いて、電気化学発光性物質と被検物質との間の電荷移動によって生じた励起分子から生じる発光を検出する。
【０００３】
電気化学発光を用いた濃度測定方法として、ルテニウム錯体を用いた電気化学発光によりダイオキシン濃度を測定する方法が知られている（例えば、特開２００２−２１４２３１号公報（特許文献１）参照）。この方法では、作用電極として金電極等の一般的な電極が用いられている。
【０００４】
一方、ダイヤモンドは本来抵抗率が１０１３Ωｃｍ程度の絶縁材料であるが、微量不純物のドープにより導電性を獲得する。この導電性ダイヤモンドには、種々の用途が期待されている。その一つに電気化学用の電極としての利用がある。導電性とされたダイヤモンドを電気化学用の電極として見ると、広い電位窓を有し、かつバックグラウンド電流が極めて小さいという優れた特長を有する。さらに、物理的、化学的に安定であり、耐久性に優れるとの特長もまた有する。導電性ダイヤモンド（好ましくはその薄膜）を有する電極は、ダイヤモンド電極と一般的に呼ばれるに至っている。
【０００５】
ダイヤモンド電極に関する先駆的研究はIwakiらによって行われた（例えば、Iwaki et al., Nuclear Instruments and Methods, 209-210, 1129(1983)（非特許文献１）参照）。彼らは、アルゴンや窒素イオンを打ち込んで表面導電性を付与した単結晶ダイヤモンドの電気伝導材料としての性質を研究したものである。同時に、電解質溶液中におけるサイクリックボルタモグラムも示した。その後、ホットフィラメントを用いて気相合成した多結晶ダイヤモンド電極の特性が報告されている（例えば、Pleskov et al., J. Electroanal. Chem., 228, 19(1987)（非特許文献２）参照）。
【０００６】
本発明者らの一部は、気相合成したダイヤモンド電極を用いて、窒素酸化物の還元について先に報告した（例えば、Tenne et al., J. Electroanal. Chem., 347, 409(1993)（非特許文献３）参照）。この研究では、ドーパントとしてホウ素を導入したｐ型半導体ダイヤモンドを電極として使用した。その後、ダイヤモンド電極としては、ホウ素をドーパントとするｐ型半導体またはより導電性の高い金属様導電性ダイヤモンドの利用が主流となるに至る。１９９０年代に入って、ダイヤモンド電極の研究が複数のグループにより行われ、１９９５年以降は、より大面積のダイヤモンド薄膜が得られるプラズマＣＶＤ（ＰＣＶＤ）装置を用いて得られたダイヤモンド電極の研究が、電気化学分野にも散見されるに至っている。
【０００７】
ところで、近年、尿路結石症の患者数が増加している。この尿路結石の原因物質としては、シュウ酸塩、リン酸塩、尿酸などが知られている。また、尿路結石の結石抑制物質としてはクエン酸が知られている。そこで、尿中のクエン酸あるいはシュウ酸の濃度を測定することにより、尿路結石の予防および診断が行われている。
一般的には、シュウ酸の測定は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、キャピラリー電気泳動法、イオンクロマト法等により行われており、クエン酸の測定は酵素法により行われている。しかしながら、これらの測定方法は簡便な方法とは言い難く、分析費用も高価なものとなっている。
したがって、簡便な方法でクエン酸濃度を測定することができれば医療上極めて有益であると言える。更には、尿中のクエン酸濃度と同時にシュウ酸の濃度を簡便に測定することができれば尿路結石の予防および診断を行う上でより一層望ましい。
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２１４２３１号公報
【非特許文献１】Iwaki et al., Nuclear Instruments and Methods, 209-210, 1129(1983)
【非特許文献２】Pleskov et al., J. Electroanal. Chem., 228, 19(1987)
【非特許文献３】Tenne et al., J. Electroanal. Chem., 347, 409(1993)
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、今般、クエン酸をルテニウム錯体とともに酸化させることにより化学発光が生じ、それによりクエン酸を簡便かつ高精度で検出しかつ定量できるとの知見を得た。
したがって、本発明は、クエン酸を化学発光により簡便かつ高精度に検出することを目的としている。
【００１０】
そして、本発明の化学発光を用いたクエン酸の検出方法は、
クエン酸を含んでなる試料液を用意し、
ルテニウム錯体の共存下で、クエン酸を酸化させ、それによりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせ、そして
該化学発光を検出すること
を含んでなるものである。
【００１１】
また、本発明の第一の態様による、化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置は、
導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と、
対電極と、
前記作用電極および対電極を、クエン酸およびルテニウム錯体を含んでなる試料液に接触させる手段と、
前記作用電極と前記対電極との間に、前記作用電極上でクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせる電圧を印加する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなるものである。
【００１２】
また、本発明の第二の態様による、化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置は、
表面にルテニウム錯体が担持されてなる、導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と、
対電極と、
前記作用電極および対電極を、クエン酸を含んでなる試料液に接触させる手段と、
前記作用電極と前記対電極との間に、前記作用電極上でクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせる電圧を印加する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなるものである。
【００１３】
さらに、本発明の第三の態様による、化学発光を用いてクエン酸を検出するための装置は、
クエン酸を含んでなる試料液にルテニウム錯体および酸化剤を添加する手段と、
該試料液を、前記酸化剤によるクエン酸の酸化によりルテニウム錯体を介した化学発光を生じさせるように混合する手段と、
前記発光を検出する手段と
を備えてなるものである。
【発明の具体的説明】
【００１４】
１．被検物質
本発明の方法における被検物質はクエン酸であり、具体的な測定対象はクエン酸を含む試料液である。このクエン酸は、同一系内にルテニウム錯体が存在すると、酸化されることにより化学発光を生じさせる。この発光のメカニズムは定かではないが、ルテニウム（II）錯体の場合、以下のように考えることができる。すなわち、クエン酸は酸化されることによりラジカルを生じる。一方、ルテニウム（II）錯体は、クエン酸の酸化と同時に酸化されるか、あるいはクエン酸の酸化に先立ち別に酸化させておくことにより、ルテニウム（III）錯体となる。このルテニウム（III）錯体にラジカルが作用すると、ルテニウム（II）錯体の励起分子が生じる。そして、この励起分子が化学発光を生じるものと考えられる。もっとも、上記メカニズムはあくまで仮説であって、本発明の方法はクエン酸の存在により化学発光しさえすればよく、上記メカニズムに限定されるものではない。
【００１５】
このように、本発明の方法にあっては、クエン酸の酸化を行う。このクエン酸の酸化は、種々の手法により行うことができ、例えば、導電性ダイヤモンド電極を用いた電気化学的な酸化、あるいは酸化剤を用いた酸化によって行うことができる。特に、クエン酸は酸化電位が高い物質であるため、電位窓の広い導電性ダイヤモンド電極を用いたとしても電気化学的検出が困難な物質であるが、本発明の方法によれば簡便かつ高精度に検出および定量することができる。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、クエン酸のみならずシュウ酸も被検物質として、その両者を別個に検出または定量するのが好ましい。すなわち、シュウ酸も、クエン酸と同様に酸化されることにより、ルテニウム錯体を介して化学発光を生じさせる。特に、シュウ酸は、クエン酸と同様、尿路結石の予防および診断に有効であるため、両物質の濃度を個別に知ることにより、より信頼性の高い予防および診断が可能となる。
【００１７】
本発明においてクエン酸が検出される試料液は、クエン酸が含まれていると考えられる生体由来の血液、体液等、または食品もしくは食品の希釈溶液または懸濁液であってよい。特に、尿を被験試料とすることで、本発明の方法をクエン酸測定による尿路結石の予防および診断に活用することができる。
【００１８】
本発明の測定法によれば、被検物質の濃度を幅広い範囲で測定可能である。具体的には、被検物質がクエン酸である場合、２〜１００μMの濃度範囲で測定を行うのが好ましい。また、被検物質がシュウ酸である場合、０．２〜１０μMの濃度範囲で測定を行うのが好ましい。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、試料液のｐＨは１．０〜８．０であるのが好ましい。この範囲内であると、クエン酸の存在に伴う十分な発光量が得られるので、クエン酸の検出および定量を高い精度で行うことができる。
【００２０】
本発明のより好ましい態様によれば、試料液のｐＨは１．０〜６．０であるのが好ましく、より好ましくは１．０〜４．０である。この範囲内であると、試料溶液がシュウ酸をさらに含む場合に、シュウ酸の発光量ピークが鋭くなり、シュウ酸の検出がしやすいとの利点がある。
【００２１】
本発明の別のより好ましい態様によれば、試料液のｐＨは６．０〜８．０であるのが好ましく、より好ましくは６．５〜７．５である。この範囲内であると、クエン酸の発光量ピークが大きくなるので、クエン酸の検出および定量の精度が向上する。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、試料液がリン酸緩衝液をさらに含んでなるのが好ましく、リン酸緩衝液によりｐＨの調整を行うことができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、クエン酸以外に化学発光を生じる物質が試料液中に存在しているまたはその可能性がある場合、あるいはクエン酸およびシュウ酸の両方が存在しその各々の定量を行いたい場合には、測定に先立ち、クエン酸とそれ以外の応答性物質（例えばシュウ酸）とを分離する前処理を行い、クエン酸をそれ以外の応答性物質と峻別して、本発明による測定法に付することができる。これは、尿等の生体由来の液を試料液として、クエン酸およびシュウ酸を定量する際に特に有効である。被検物質以外の応答性物質を分離する方法は特に限定されないが、分離カラムを用いた分離方法（例えば、液体クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））が迅速かつ簡便に応答性物質を分離できる点で好ましい。また、クーロメトリックセル、前電解処理等も好ましく挙げることができる。
【００２４】
本発明のより好ましい態様によれば、分離カラムを用いて試料液中のクエン酸およびシュウ酸の分離を行う場合には、試料液のｐＨを１．０〜４．０とするのが好ましく、より好ましくは１．５〜３．５である。この範囲内であると、カラム中におけるクエン酸の移動速度と、シュウ酸の移動速度の差が顕著になり、その結果、両物質を十分に分離することが出来、より精度の高い検出および定量が可能となる。
【００２５】
２．ルテニウム錯体
本発明の方法にあっては、クエン酸を化学発光により検出するために、ルテニウム錯体を用いる。このルテニウム錯体は、クエン酸の酸化に伴い、クエン酸濃度に応じた量の発光を生じる物質である。この発光は、酸化されたルテニウム錯体およびクエン酸の間のラジカルの授受によってルテニウム錯体の励起分子を生じ、この励起分子が発光を生じるものと考えられる。また、このルテニウム錯体は、シュウ酸に対しても、その濃度に応じた量の発光を生じることができる。
本発明において用いるルテニウム錯体は、化学発光を生じることができるものであり、そのようなルテニウム錯体は、通常、２価のルテニウム（II）錯体であろう。ルテニウム（II）錯体の具体例としては、トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（II）錯体およびトリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（II）錯体が挙げられ、好ましくはトリス（ビピリジン）ルテニウム（II）錯体（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）である。
【００２６】
本発明において、ルテニウム錯体は、酸化される際にクエン酸あるいはシュウ酸と共存していればよい。したがって、ルテニウム錯体は、試料液に添加してもよいし、あるいは使用する場合には導電性ダイヤモンド電極上に担持させてもよい。
【００２７】
３．ダイヤモンド電極を用いたクエン酸の測定方法および装置
本発明の好ましい態様によれば、クエン酸の酸化は、試料液に、導電性ダイヤモンド電極からなる作用電極と対電極とを接触させ、作用電極と対電極との間に、作用電極上でクエン酸の酸化を生じる電圧を印加することにより行われる。すなわち、この態様にあっては、電圧が印加された導電性ダイヤモンド電極上でクエン酸がルテニウム錯体を介して特異的な発光を生じるとの性質を利用して、試料液中のクエン酸を検出する。また、本発明のより好ましい態様によれば、その発光量がクエン酸の濃度に正比例するとの性質を利用して、試料液中のクエン酸を定量する。この測定は発光または発光量を知ることにより行われるため、測定時間は短くかつ簡便であり、本発明による方法は短時間の内に容易にクエン酸の検出および定量を行える点で極めて有利である。また、この態様にあっては、電気化学的手法を用いるため、酸化剤を添加する必要が無く、測定系が単純になるとの利点がある。
【００２８】
この電圧が印加されたダイヤモンド電極上では、クエン酸が酸化されてラジカルを生成する。一方、ルテニウム錯体は、クエン酸と同時にダイヤモンド電極上で酸化されるが、予め前電解処理等により酸化させておいてもよい。そして、クエン酸の酸化により生成されたラジカルが、酸化されたルテニウム錯体を励起して励起分子を生じ、この励起分子が電気化学発光を生じるものと考えられる。
【００２９】
また、本発明のダイヤモンド電極は、クエン酸以外の化合物を酸化する可能性を有するが、その場合であっても、ルテニウム錯体を介して発光を生じる物質はラジカルを生成する物質に限られる。アスコルビン酸のように酸化されてもラジカルを生成しない物質は、電気化学発光により検出されることはない。したがって、本発明の測定法は、クエン酸を高い選択性で検出することを可能とする。
【００３０】
本発明による検出方法において、クエン酸測定のための電気化学的系は、ダイヤモンド電極を作用電極としたこと、および作用電極に向けて発光検出手段を設けたこと以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来る。すなわち、本発明による検出方法にあっては、ダイヤモンド電極を作用電極とし、対電極とともに試料液に接触させ、この二つの電極間に、ダイヤモンド電極上で電気化学発光の生じる電圧を印加し、その際の発光を発光量検出手段で検出する。このとき、試料液中にルテニウム錯体を添加させておくか、ダイヤモンド電極表面にルテニウム錯体を担持させておく。上記したように、クエン酸の酸化によりダイヤモンド電極上で生じる発光量は、試料液中のクエン酸濃度に正比例する。従って、一旦ある電圧値における発光量とクエン酸の濃度との関係を求めておけば、その関係から、得られた発光量に対応する試料液中のクエン酸の濃度を容易に知ることが出来る。すなわち、本発明の好ましい態様にあっては、クエン酸の濃度と発光量の検量線を予め作成しておき、この検量線と、得られた発光量とを対比することにより、クエン酸の濃度を知ることが出来る。
【００３１】
本発明にいて対電極としては、白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、ＳｎＯ２等の利用が好ましい。
【００３２】
本発明において、作用電極であるダイヤモンド電極と、対電極との間に印加される電圧は、作用電極上でクエン酸の酸化によりラジカルが生じ、ラジカルがルテニウム錯体を介して電気化学発光を生じる電圧であれば特に限定されない。そのような電圧は、クエン酸およびルテニウム錯体の酸化電位もしくはそれ以上の電圧である。前述したように、ダイヤモンド電極は、広い電位窓を有するため、従来の一般的な電極と比べてかなり高い電位まで電圧を印加することができる。したがって、この高い印加電圧により、クエン酸の酸化およびそれに伴う電気化学発光を可能としている。クエン酸およびシュウ酸の酸化電位は、予め試料液のサイクリックボルタンメトリーを発光量とともに測定しておき、得られた電圧−発光量曲線におけるピークまたはショルダーを与える電圧として知ることができる。
【００３３】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、参照電極を試料液中に接触させ、ダイヤモンド電極と、対電極との間に、ダイヤモンド電極上で電気化学発光の生じる電圧の絶対値を制御することが、測定精度の観点から好ましい。参照電極は公知のものを利用することが出来、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、標準水素電極、銀塩化銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等が利用可能である。
【００３４】
本発明の好ましい態様によれば、酸化時における試料液のｐＨが２．０〜６．０である場合には、作用電極への印加電圧を１．５〜３．０Ｖ（対参照電極）とするのが好ましく、より好ましくは１．８〜３．０Ｖ（対参照電極）とする。この態様にあっては、試料溶液がシュウ酸をさらに含む場合に、シュウ酸の発光量ピークが鋭くなり、シュウ酸の検出がしやすいとの利点がある。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、酸化時における試料液のｐＨが６．０〜８．０である場合には、作用電極への印加電圧を１．０〜１．５Ｖ（対参照電極）とするのが好ましく、より好ましくは１．２〜１．５Ｖ（対参照電極）とする。この態様にあっては、クエン酸の発光量ピークが大きくなるので、クエン酸の検出および定量の精度が向上する。
前述の通り、クエン酸およびシュウ酸の分離をカラムにより行う場合には、カラム通過時の試料液のｐＨを１．０〜４．０とするのが好ましい。この場合であっても、カラム通過後の試料液に、ｐＨ７．０〜９．０の溶液を添加して混合することにより、混合後の試料液のｐＨが６．０〜８．０となるようにｐＨの調整を行うことができる。本発明のより好ましい態様によれば、ｐＨ７．０〜９．０の溶液がルテニウム錯体を含有しており、ルテニウム錯体の添加および混合と同時に試料液のｐＨ調整を行うのが好ましい。
【００３６】
本発明において、作用電極上で生じた電気化学発光の発光量は、光電子増倍管などの発光量検出装置を用いて行うことができる。発光量検出装置は、作用電極に対峙または接近させるなど、作用電極上で生じる発光を観察可能な位置に適宜配置することができる。
【００３７】
ダイヤモンド電極およびその製造
ダイヤモンドは本来優れた絶縁体である。しかしながら、３族や５族の不純物を添加することによって、半導体〜金属様の導電性を示すようになる。本発明の好ましい態様にあっては、半導体〜金属様の導電性を示すダイヤモンドを電極として使用する。
【００３８】
このような導電性を付与するために添加される物質としては、上記の通り３族および５族の元素が挙げられ、さらに好ましくはホウ素、窒素、リンが挙げられ、最も好ましくはホウ素または窒素である。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、ダイヤモンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば１×１０−２〜１０−６Ωｃｍ程度の導電性を与える量添加されることが好ましい。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、導電性ダイヤモンドの製造工程における添加量により制御されることが一般的である。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、基材上に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成させるとともに、導線を接続させ、電極とすることが好ましい。基材としては、Ｓｉ（例えば、単結晶シリコン）、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＣ、Ｓｉ３Ｎ４、ＺｒＯ２、ＭｇＯ、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、ｃＢＮ、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、ＳｉＣ、単結晶ダイヤモンドの利用が好ましい。
【００４０】
この態様の電極を図１を用いて更に説明する。図１（ａ）は、ダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３には導線５が例えば金コーティング４を介して接続される。図１（ｂ）は、ダイヤモンド電極１の斜視図であり、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３からなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３を電極とするための金コーティング４を介して導線５が接続される。また、図１（ｂ）に点線で示されるように、ダイヤモンド電極１の最表面の外縁および端部側面に、保護膜６を形成してもよい。この保護膜６は、エポキシ樹脂等の絶縁性の樹脂で形成されるのが好ましく、これによりダイヤモンド電極１の端部側面、金コーティング４、および導線５を電気化学的に安定な状態が確保されるように保護して、より安定かつ正確な測定を可能にする。
【００４１】
導電性ダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、１〜１００μｍ程度の厚さが好ましく、より好ましくは５〜５０μｍ程度である。
【００４２】
さらに本発明の好ましい態様によれば、本発明によるダイヤモンド電極は、マイクロ電極の形態をとることが出来る。マイクロ電極の概念は既に公知であり、本発明においてマイクロ電極形態のダイヤモンド電極とは、Ｐｔ、Ｗ、Ｍｏ等の細線の末端を鋭利に切断し、電解研磨により末端をさらに鋭利にした後、その末端表面に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成した構成のものを意味する。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜は、化学気相成長法により好ましく製造される。化学気相成長法とは、気相中で気体原料を化学反応させて物質を合成する方法であり、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition)法と一般に呼ばれる。この方法は、半導体製造プロセスにおいて広く利用されており、本発明における導電性ダイヤモンド薄膜の製造にも合目的的な改変のもと利用可能である。
【００４４】
ダイヤモンドの化学気相合成は、メタンなどの含炭素気体と水素を混合したものを原料気体として、それを励起源により励起させ、基板上に供給して堆積させることにより行われる。
【００４５】
励起源としては、熱フィラメント、マイクロ波放電、高周波放電、直流グロー放電、直流アーク放電、燃焼炎などが挙げられる。また、これらを複数組み合わせて核生成密度を調整したり、大面積化や均一化を図ることも可能である。
【００４６】
原料としては、炭素の含まれている多くの種類の、励起源により分解、励起されて、Ｃ、Ｃ２などの活性な炭素、およびＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ２などの炭化水素ラジカルを生じさせる化合物を利用可能である。好ましい具体例としては、気体としてＣＨ４、Ｃ２Ｈ２、Ｃ２Ｈ４、Ｃ１０Ｈ１６、ＣＯ、ＣＦ４、液体としてＣＨ３ＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、（ＣＨ３）２ＣＯ、固体として黒鉛、フラーレンなどが挙げられる。
【００４７】
気相合成法にあって、ダイヤモンドに導電性を付与する物質の添加は、例えば添加物質のディスクを系内に置き、炭素源原料と同様に励起させ、炭素気相に添加物質を導入する方法、炭素源に予め添加物質を添加し、系内に炭素源と共に導入し、励起源により励起し、炭素気相に添加物質を導入する方法等により行うことが出来る。本発明の好ましい態様によれば、後者の方法が好ましい。とりわけ、炭素源としてアセトン、メタノールなどの液体を用いる場合、これに酸化ボロン（Ｂ２Ｏ３）を溶解してボロン源とする方法が、ボロンの濃度の制御が容易で、かつ簡便であることから好ましい。例えば、気相合成法にあって、炭素源にホウ素を添加する場合、１０〜１２，０００ｐｐｍ程度が一般的であり、また１，０００〜１０，０００ｐｐｍ程度が好ましい。
【００４８】
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜の製造はプラズマ化学気相合成法により行われることが好ましい。このプラズマ化学気相合成法は、化学反応を引き起こす活性化エネルギーが大きく、反応が速いとの利点を有する。さらに、この方法によれば、熱力学的に高温でなければ存在しない化学種を生成して、低い温度での反応が可能となる。プラズマ化学気相合成法による導電性ダイヤモンド薄膜の製造は、本発明者らの一部を含めいくつかの報告が既にあり（例えば、Yano et al., J. Electrochem. Soc., 145(1998) 1870）、これら報告に記載の方法に従って行うことが好ましい。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、作用電極は、何ら処理が施されていない作製されたまま（as grown）の導電性ダイヤモンドからなるのが好ましい。このような未処理のダイヤモンド電極は電位窓が極めて広いため、高い電圧を印加することができる。
【００５０】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、ダイヤモンド電極として、ダイヤモンドディスク電極を用いてもよい。このダイヤモンドディスク電極は、例えば、基板上に厚さ約１．０ｍｍのダイヤモンド薄膜を成膜し、上記基板からダイヤモンド薄膜を剥離した後、研磨を行い、最終的に電極面を鏡面仕上げを施すことにより製造することができる。好ましいダイヤモンドディスク電極の厚さは０．３〜０．６ｍｍであり、より好ましくは約０．５ｍｍである。ダイヤモンドディスク電極を用いる場合、電極表面には研磨処理が施されているため、使用前に２Ｎ  ＨＣｌ水溶液中で−５Ｖ〜＋５Ｖの印加電圧、０．５Ｖ／ｓのスキャン速度で、ＣＶ（サイクリックボルタンメトリー）測定を２０サイクル以上行うことにより、活性化処理を行うのが好ましい。これにより、測定の安定性が向上する。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、作用電極は、その表面にルテニウム錯体が担持されてなるのが好ましい。この態様の場合によれば、試料液にルテニウム錯体を添加する手間を省略して、より効率的かつ簡便に測定を行うことができる。ルテニウム錯体がルテニウム錯体の場合、ダイヤモンド電極表面へのルテニウム錯体の好ましい担持方法として、例えば、以下の二つの方法が挙げられる。
【００５２】
（１）まず、ダイヤモンド電極を塩素雰囲気中で加熱することにより、電極表面を塩素終端化する。次いで、アンモニア共存下で紫外光照射することにより、電極表面にアミノ基を導入する。こうして得られたアミノ修飾ダイヤモンド電極を、塩化カルボニル基を有するビピリジル配位子によるルテニウム錯体と混合する。ダイヤモンド電極表面にルテニウム錯体をアミド結合を介して化学結合により固定化する。
【００５３】
（２）ダイヤモンド電極表面を、負に帯電した官能基を有するナフィオン（Nafion）膜で被覆する。次いで、この薄膜内部に正に帯電したルテニウム錯体を溶液浸漬法により導入し、静電的な引力により膜内部にルテニウム錯体を固定化する。
【００５４】
測定装置
本発明のダイヤモンド電極を用いた測定装置は、ダイヤモンド電極を作用電極としたこと、および作用電極に向けて発光検出手段を設けたこと以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来る。本発明の好ましい態様によれば、所定の溶液を一定流速でキャリアとして系内を流し、そのキャリア溶液中に試料液を注入して測定を行う、フローセルを用いたフローインジェクション法による測定が好ましい。
【００５５】
本態様におけるフローセルを用いたフローインジェクション法の概略は図２（ａ）に示される通りである。ミキサー１５には、キャリア溶液タンク１０からポンプ１１によりキャリア溶液が注入される。ポンプ１１とミキサー１６との間には、試料液注入口１４が設けられ、キャリア溶液に試料液が注入可能とされる。また、ミキサー１６には、第二のキャリア溶液タンク１２からポンプ１３によりルテニウム錯体を含有する溶液も注入される。すなわち、ルテニウム錯体は第二のキャリア溶液に予め溶解させておくことができる。ミキサー１６は、試料液、ルテニウム錯体溶液、およびキャリア溶液を混合して、得られた混合液をフローセル１７に送り込む。フローセル１７を通過したキャリア溶液は、廃液タンク１８に集められる。また、図２（ａ）に示される装置にあっては、被検物質の測定に先立ち、被検物質以外の応答性物質を分離する前処理を行うために、試料液注入口１４とミキサー１６との間に、分離カラムまたは前電解装置等の分離装置１５が設けられている。この分離装置１５は、ミキサー１６とフローセル１７との間に配置してもよい。
【００５６】
フローセル１７の基本構造は図２（ｂ）に示されるとおりである。フローセル１７は、ダイヤモンド電極１、対電極１９、および参照電極２０が、キャリア溶液および試料液が流れる流路２１内に露出され、試料液と接触出来るよう構成されている。また、ダイヤモンド電極１の表面と対峙する位置に発光量測定装置２２が配置されている。ダイヤモンド電極１は、基本的に図１に示される構造を有し、その表面が流路２１に露出され、キャリア溶液および試料液と接触する。キャリア溶液は、流路２１の流入口２３から入り、図中の矢印のように流れ、流出口２４に至る。なお、排出口２４およびその近傍はステンレス製のチューブで構成されており、このステンレス製チューブ自体を対電極１９として機能させる。流路２１の両端部はガスケット２５を設けて密閉される。ダイヤモンド電極１の導線Ａおよび対電極１９の導線Ｂの間に、ダイヤモンド電極１上で被検物質による電気化学発光を生じさせる電圧を印加する。
【００５７】
なお、ダイヤモンド電極１として、ルテニウム錯体を担持させた電極を使用する場合には、ルテニウム錯体溶液タンク１２、ポンプ１３およびミキサー１６を不要にすることができる。
【００５８】
測定は以下のように行われる。まず、試料液を試料液注入口１４より注入する。この注入は継続して行われてもよいが、電気化学発光を測定可能な程度の量を一時期に注入してもよい。被検物質が試料液中に含まれている場合、被検物質がダイヤモンド電極１上で酸化または還元されてラジカルを生じ、ルテニウム錯体を介して電気化学発光を生じる。この発光を発光量測定装置２２により検出することにより、被検物質の存在を知ることができる。また、その際の発光量から、予め作成した検量線を用いて被検物質濃度を知ることができる。
【００５９】
さらに、本発明の別の態様によれば、試料液中の被検物質濃度を測定する装置が提供される。この装置の基本構成は図３に示される通りである。図３の装置において、電源３１には、図２に記載のフローセルより、ダイヤモンド電極１に接続される導線Ａ、対電極１９に接続される導線Ｂ、および参照電極２０に接続される導線Ｃが接続される。この電源３１は、ダイヤモンド電極と対電極との間にダイヤモンド電極上で電気化学発光の生じる電圧を印加する手段である。発光量比較・濃度算出装置３２には、発光量測定装置２１に接続された導線Ｄを介して発光量が送られるとともに、電源３１から印加した電圧値が送られる。発光量比較・濃度算出装置３２には、上記電圧値に対応する被検物質の検量線データ３３が送られる。この装置３２内において、発光量測定装置２２から送られた発光量と、検量線データとを比較し、被検物質の濃度を算出する。すなわち、得られた発光量から試料液中の被検物質濃度を算出する手段を備える。得られた被検物質濃度は、表示装置３４により表示される。
【００６０】
４．酸化剤を用いたクエン酸の測定方法および装置
本発明の別の好ましい態様によれば、クエン酸の酸化は、試料液に酸化剤を添加して混合することにより行われる。すなわち、この態様にあっては、酸化剤の存在下でクエン酸がルテニウム錯体を介して特異的な発光を生じるとの性質を利用して、試料液中のクエン酸を検出する。また、本発明のより好ましい態様によれば、その発光量がクエン酸の濃度に正比例するとの性質を利用して、試料液中のクエン酸を定量する。この測定は発光または発光量を知ることにより行われるため、測定時間は短くかつ簡便であり、本発明による方法は短時間の内に容易にクエン酸の検出および定量を行える点で極めて有利である。また、この態様にあっては、クエン酸の反応量が大幅に増大するため、検出感度が上昇するとの利点がある。
【００６１】
本発明に用いる酸化剤は、クエン酸を酸化させることができるものであれば限定されないが、好ましくはクエン酸のみならずルテニウム錯体も酸化できるものが好ましい。好ましい酸化剤の例としては、過マンガン酸塩、二クロム酸塩、過酸化水素、過塩素酸塩、過臭素酸塩、臭素、硫酸セリウム、および硝酸塩が挙げられ、より好ましくは過マンガン酸カリウムである。
【００６２】
このような酸化剤の存在下では、クエン酸が酸化されてラジカルを生成する。一方、ルテニウム錯体は、クエン酸と同時に酸化剤により酸化されるが、予め酸化剤あるいは前電解処理等により酸化させておいてもよい。そして、クエン酸の酸化により生成されたラジカルが、酸化されたルテニウム錯体を励起して励起分子を生じ、この励起分子が電気化学発光を生じるものと考えられる。
【００６３】
また、本発明の酸化剤は、クエン酸以外の化合物を酸化する可能性を有するが、その場合であっても、ルテニウム錯体を介して発光を生じる物質はラジカルを生成する物質に限られる。アスコルビン酸のように酸化されてもラジカルを生成しない物質は、化学発光により検出されることはない。したがって、本発明の測定法は、クエン酸を高い選択性で検出することを可能とする。
【００６４】
本発明による検出方法において、クエン酸測定のための系は、試料液、酸化剤、およびルテニウム錯体を混合する手段と、発光検出手段を設けた系であることが出来る。すなわち、本発明による検出方法にあっては、試料液、酸化剤、およびルテニウム錯体を混合することにより、試料液中のクエン酸を酸化し、それによりルテニウム錯体を介して発光を生じさせ、その際の発光を発光量検出手段で検出する。このとき、試料液は、発光検出の直前にルテニウム錯体および酸化剤と混合されてもよいし、あるいは、予めルテニウム錯体および酸化剤のいずれか一方と混合させておき、発光検出の直前にそれらの他方と混合させてもよい。上記したように、クエン酸の酸化により生じる発光量は、試料液中のクエン酸濃度に正比例する。従って、一旦ある電圧値における発光量とクエン酸の濃度との関係を求めておけば、その関係から、得られた発光量に対応する試料液中のクエン酸の濃度を容易に知ることが出来る。すなわち、本発明の好ましい態様にあっては、クエン酸の濃度と発光量の検量線を予め作成しておき、この検量線と、得られた発光量とを対比することにより、クエン酸の濃度を知ることが出来る。
【００６５】
本発明において、作用電極上で生じた電気化学発光の発光量は、光電子増倍管などの発光量検出装置を用いて行うことができる。発光量検出装置は、作用電極に対峙または接近させるなど、作用電極上で生じる発光を観察可能な位置に適宜配置することができる。
【００６６】
測定装置
本発明の酸化剤を用いる測定装置は、酸化剤、クエン酸、およびルテニウム錯体を混合する手段と、発光検出手段を設けた系であることが出来る。本発明の好ましい態様によれば、所定の溶液を一定流速でキャリアとして系内を流し、そのキャリア溶液中に試料液を注入して測定を行う、フローセルを用いたフローインジェクション法による測定が好ましい。
【００６７】
本態様におけるフローセルを用いたフローインジェクション法の概略は、フローセル１６において電極を使用しないこと以外は、図２（ａ）に示される通りであってよい。ミキサー１６には、キャリア溶液タンク１０からポンプ１１によりキャリア溶液が注入される。ポンプ１１とミキサー１６との間には、試料液注入口１４が設けられ、キャリア溶液に試料液が注入可能とされる。また、ミキサー１６には、第二のキャリア溶液タンク１２からポンプ１３によりルテニウム錯体および酸化剤を含有する溶液も注入される。すなわち、ルテニウム錯体および酸化剤は第二のキャリア溶液に予め溶解させておくことができる。ミキサー１６は、試料液、ルテニウム錯体溶液、酸化剤、およびキャリア溶液を混合しながら、得られた混合液をフローセル１６に送り込む。ミキサーおよびフローセル内における混合液の望ましい温度は３０〜７０℃である。フローセル１６を通過したキャリア溶液は、廃液タンク１７に集められる。また、図２（ａ）に示される装置にあっては、被検物質の測定に先立ち、被検物質以外の応答性物質を分離する前処理を行うために、試料液注入口１４とミキサー１６との間に、分離カラムまたは前電解装置等の分離装置１５が設けられている。この分離装置１５は、ミキサー１６とフローセル１７との間に配置してもよい。
【００６８】
本発明の好ましい態様によれば、第二のキャリア溶液のｐＨが３．０以上であり、第二のキャリア溶液を、試料液が注入されたキャリア溶液に添加して混合することにより、混合後の試料液のｐＨを３．０以下に調整するのが好ましい。好ましい第二のキャリア溶液のｐＨは３．０〜７．０であり、より好ましくは４．０〜５．０である。また、好ましい混合後の試料液のｐＨは１．０〜３．０、より好ましくは２．０〜２．５である。第二のキャリア溶液のｐＨを３．０以上とすることにより、被検物質との接触前におけるルテニウム錯体の酸化による不必要な発光を防止して、測定時におけるバックグランド発光の経時劣化による影響を低減し、それにより測定の安定性を向上できる。また、発光検出時には発光に適したｐＨである３．０以下に調整されているので、被検物質を高感度で検出することができる。この態様の場合、ルテニウム錯体および酸化剤を溶解させた第二のキャリア溶液を一度に調製して、第二のキャリア溶液タンク１２内に入れておくことができる。
【００６９】
本発明の別の好ましい態様によれば、第二のキャリア溶液が、測定の間、一定流速で供給されるルテニウム錯体を含む液と、一定流速で供給される酸化剤を含む液とを混合することにより、連続的に調製されるのが好ましい。本発明のより好ましい態様によれば、ルテニウム錯体を含むキャリア溶液の流速と、酸化剤を含むキャリア溶液の流速との合計が、第二のキャリア溶液の装置内への供給流速と一致するように、各流速を調整する。すなわち、酸化剤とルテニウム錯体とを混合しながら、常に混合直後の新鮮な混合液を装置内に供給することにより、被検物質との接触前におけるルテニウム錯体の酸化による不必要な発光を防止するか、またはその発光時間を最小限にして、測定時におけるバックグランド発光の経時劣化による影響を低減し、それにより測定の安定性を向上できる。
【００７０】
測定は以下のように行われる。まず、試料液を試料液注入口１４より注入する。この注入は継続して行われてもよいが、電気化学発光を測定可能な程度の量を一時期に注入してもよい。被検物質が試料液中に含まれている場合、被検物質が酸化剤の存在下で酸化されてラジカルを生じ、ルテニウム錯体を介して化学発光を生じる。この発光を発光量測定装置２２により検出することにより、被検物質の存在を知ることができる。また、その際の発光量から、予め作成した検量線を用いて被検物質濃度を知ることができる。
【００７１】
さらに、本発明の別の態様によれば、試料液中の被検物質濃度を測定する装置が提供される。この装置の基本構成は、電極に接続される導線Ａ、Ｂ、およびＣを使用しないこと以外は、図３に示される通りである。すなわち、図３の装置において、発光量比較・濃度算出装置３２には、発光量測定装置２２に接続された導線Ｄを介して発光量が送られる。発光量比較・濃度算出装置３２には、被検物質の検量線データ３３が送られる。この装置３２内において、発光量測定装置２２から送られた発光量と、検量線データとを比較し、被検物質の濃度を算出する。すなわち、得られた発光量から試料液中の被検物質濃度を算出する手段を備える。得られた被検物質濃度は、表示装置３４により表示される。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７３】
例１：導電性ダイヤモンド電極の作製
公知の方法に従い、導電性ｎ型シリコン（１１１）面上に、ホウ素を高濃度（１０，０００ppm、Ｂ／Ｃ比）で導入したダイヤモンド薄膜を、マイクロ波プラズマＣＶＤ装置を用いて形成した。こうして、導電性ダイヤモンド電極を得た。得られたダイヤモンド薄膜の抵抗は１０−３Ωｃｍであった。シリコン基板の裏面に、銀ペーストを用いて銅線を固着した。
【００７４】
例２：装置の作製
図２（ａ）および（ｂ）に示される装置を作製した。このとき、作用電極として先に作製したダイヤモンド電極を、対電極としてステンレスまたは白金電極を、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。カラム１５としては、Inertsil社製のInertsil ODS-3を用い、カラム内の温度３０℃に設定した。発光量測定装置２１としては、光電子増倍管（PMT, Hamamatsu R928）を用いた。
【００７５】
例３：クエン酸の検出
クエン酸を蒸留水に溶解させた。こうして、クエン酸濃度１００μＭの試料液を得た。
キャリア溶液タンク１０にｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ６．８の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。ルテニウム錯体としてはＲｕ（ｂｐｙ）３Ｃｌ２・６Ｈ２Ｏ（Aldrich, Milwaukee, WI）を使用した。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して１．２Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。
その結果は図４に示される通りであった。図４に示されるように、クエン酸に起因する強いピークが確認された。すなわち、クエン酸が検出された。
【００７６】
例４：印加電圧と、クエン酸およびシュウ酸の検出ピークとの関係
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、クエン酸濃度１００μＭおよびシュウ酸濃度１０μＭの試料液を得た。
キャリア溶液タンク１０にｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して２．６Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。その結果は、図５に示される通りであった。図５に示されるように、シュウ酸に起因するピークと、クエン酸に起因するピークが確認された。すなわち、シュウ酸およびクエン酸が検出された。
さらに、上記同様にして、１．２Ｖ、１．６Ｖ、１．８Ｖ、２．０Ｖ、２．２Ｖ、２．４Ｖ、および２．８Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の各電圧を印加した場合についても発光量の測定を行った。
その結果、印加電圧とクエン酸のピーク高さとの関係は、図６に示される通りであった。また、印加電圧とシュウ酸のピーク高さとの関係は、図７に示される通りであった。図６および７に示されるように、シュウ酸は１〜３Ｖの印加電圧の全域にわたってピークが検出されたのに対し、クエン酸は１．６Ｖを超える印加電圧においてはピークが検出され、それ以下の印加電圧ではピークが検出されなかった。
【００７７】
例５：ｐＨと、クエン酸およびシュウ酸の検出時間との関係
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、クエン酸濃度１００μＭおよびシュウ酸濃度１０μＭを得た。
キャリア溶液タンク１０にｐＨ２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して２．４Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定するとともに、測定試料液を注入してから発光ピークが検出されるまでの時間を測定した。
同様にして、ｐＨが３、４、および７の試料液についても、キャリア溶液およびルテニウム錯体溶液のｐＨを試料液と同じｐＨにしたことを以外は上記同様にして、発光量の測定を行った。
その結果、クエン酸およびシュウ酸の各検出時間とｐＨとの関係は、図８に示される通りであった。図８に示されるように、ｐＨが４未満、特にｐＨ２〜３の範囲内においてクエン酸とシュウ酸との検出時間に十分な差を生じる、すなわちクエン酸とシュウ酸との分離検出に適することが分かる。
【００７８】
例６：ダイヤモンド電極を用いた酸性条件下における電気化学発光による、クエン酸およびシュウ酸の検量線の作成
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、下記表に示されるクエン酸濃度およびシュウ酸濃度を有する４種類の試料液を得た。
クエン酸濃度（μＭ）      シュウ酸濃度（μＭ）  
１０                      １            
２０                      ２              
５０                      ５            
１００                    １０              
キャリア溶液タンク１０にｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して２．６Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。
得られた発光量とクエン酸の濃度から、図９に示される検量線が得られた。また、得られた発光量とシュウ酸の濃度から、図１０に示される検量線が得られた。これらの検量線を用いることにより、クエン酸濃度およびシュウ酸濃度が未知の試料液について、得られた各発光量からこれらの濃度を同時に求めることができる。
【００７９】
例７：ダイヤモンド電極を用いた酸性条件下における電気化学発光による、尿中のクエン酸およびシュウ酸の定量
尿を採取して、蒸留水で１００倍に希釈して、試料液を得た。キャリア溶液タンク１０にｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ３．２の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して２．６Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。
その結果は図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、クエン酸およびシュウ酸に起因する発光ピークがそれぞれ確認された。すなわち、クエン酸およびシュウ酸を検出することができた。
【００８０】
次に、上記試料液にクエン酸を５０μＭ、１００μＭ添加した溶液、およびシュウ酸を５μＭ、１０μＭ、２０μＭ添加した溶液をそれぞれ調製した。これらの試料液についても上記同様にして発光量の測定を行った。
【００８１】
得られた発光量と添加されたクエン酸の濃度から、図１２に示される検量線が得られた。また、得られた発光量と添加されたシュウ酸の濃度から、図１３に示される検量線が得られた。これらの検量線を外挿して、ピーク高さが０となる位置の濃度を読み取り、希釈倍率を考慮して１００倍することにより、尿中のクエン酸およびシュウ酸濃度を算出した。その結果、尿中のクエン酸濃度は３．７ｍＭ、尿中のシュウ酸濃度は５２０μＭであった。
そして、この検量線を用いることにより、クエン酸濃度およびシュウ酸濃度が未知の尿試料について、得られた発光量からこれらの濃度を容易に求めることができる。
【００８２】
例８：ダイヤモンド電極を用いた中性条件下における電気化学発光による、クエン酸の検量線の作成
まず、クエン酸を蒸留水に溶解させた。こうして、クエン酸濃度１０、２０、５０、１００μＭの試料液を得た。
キャリア溶液タンク１０にｐＨ３．２の０．０１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ９の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して１．４Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。
その結果は図１４に示される通りであった。図１４に示されるように、クエン酸濃度に依存した鋭い発光ピークが確認された。
得られた発光量とクエン酸の濃度から、図１５に示される検量線が得られた。この検量線を用いることにより、クエン酸濃度が未知の試料液について、得られた発光量からこれらの濃度を求めることができる。
【００８３】
例９：ダイヤモンド電極を用いた中性条件下における電気化学発光による、尿中のクエン酸の定量
尿を採取して、蒸留水で１００倍に希釈して尿含有試料液を得た。キャリア溶液タンク１０にｐＨ３の０．０１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、ルテニウム錯体溶液タンク１２にルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を３００μＭ溶解した、ｐＨ９の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、図３に示される装置を介して１．４Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）の電圧を印加して電気化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。
その結果は図１６に示される通りであった。図１６に示されるように、クエン酸に起因する発光ピークがそれぞれ確認された。すなわち、クエン酸を検出することができた。
【００８４】
次に、尿含有試料液にクエン酸を１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ添加した溶液をそれぞれ調製した。これらの試料液についても上記同様にして発光量の測定を行った。
【００８５】
得られた発光量と添加されたクエン酸の濃度から、図１７に示される検量線が得られた。この検量線を外挿して、ピーク高さが０となる位置の濃度を読み取り、希釈倍率を考慮して１００倍することにより、尿中のクエン酸濃度を算出した。その結果、尿中のクエン酸濃度は１．３ｍＭであった。
そして、この検量線を用いることにより、クエン酸濃度が未知の尿試料について、得られた発光量からこの濃度を求めることができる。
【００８６】
例１０：酸化剤を用いた化学発光による、クエン酸およびシュウ酸の検出
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、クエン酸濃度５０μＭ（０．９６ｍｇ／ｄｌ）、シュウ酸濃度５μＭ（０．０４５ｍｇ／ｄｌ）の試料液を得た。
キャリア溶液タンク１０にｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れた。一方、ルテニウム錯体溶液タンク１２に、３００μＭのルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋および  ３００μＭの過マンガン酸カリウムを溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れ、測定の間、各溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。なお、上記方法に代えて、ルテニウム錯体溶液タンク１２に３００μＭのルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れ、別のタンクに３００μＭの過マンガン酸カリウムを溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れ、等量混合させながら、０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいてもよい。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、ＭｎＯ４−イオンによるルテニウム錯体およびクエン酸の酸化を介した化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。このとき、作用電極への電圧を印加を行わなかった。
その結果は図１８に示される通りであった。図１８に示されるように、クエン酸およびシュウ酸に起因する発光ピークがそれぞれ確認された。すなわち、クエン酸およびシュウ酸を検出することができた。
【００８７】
例１１：酸化剤を用いた化学発光による、クエン酸およびシュウ酸の検量線の作成
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、下記表に示されるクエン酸濃度およびシュウ酸濃度を有する６種類の試料液を得た。
クエン酸濃度（μＭ）            シュウ酸濃度（μＭ） 
２                          ０．２
５                          ０．５
１０                          １
２０                          ２
５０                          ５
１００                        １０
キャリア溶液タンク１０にｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れ、測定の間、この溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。一方、ルテニウム錯体溶液タンク１２において、３００μＭのルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋および３００μＭの過マンガン酸カリウムを溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液が常に新鮮な状態となるように連続的に調製しながら、測定の間、この溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。このとき、ルテニウム錯体溶液タンク１２における溶液の連続調製は、６００μＭのルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋を溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液と、６００μＭの過マンガン酸カリウムを溶解したｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液とを、ポンプを用いて各々０．３ｍｌ／分の流速で別個にタンク１２内に供給すると同時に、それらの液を混合することにより行った。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、ＭｎＯ４−イオンによるルテニウム錯体およびクエン酸の酸化を介した化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。このとき、作用電極への電圧を印加を行わなかった。
得られた発光量とクエン酸の濃度から、図１９に示される検量線が得られた。また、得られた発光量とシュウ酸の濃度から、図２０に示される検量線が得られた。これらの検量線を用いることにより、クエン酸濃度およびシュウ酸濃度が未知の試料液について、得られた各発光量からこれらの濃度を同時に求めることができる。
【００８８】
例１２：酸化剤を用いた化学発光による、クエン酸およびシュウ酸の検量線の作成
クエン酸およびシュウ酸を蒸留水に溶解させた。こうして、下記表に示されるクエン酸濃度およびシュウ酸濃度を有する４種類の試料液を得た。
クエン酸濃度（μＭ）            シュウ酸濃度（μＭ） 
１０                          １
２０                          ２
５０                          ５
１００                        １０
キャリア溶液タンク１０にｐＨ１．６９の０．１Ｍリン酸水溶液を入れ、測定の間、この溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。一方、ルテニウム錯体溶液タンク１２に、３００μＭのルテニウム錯体Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋および３００μＭの過マンガン酸カリウムを溶解したｐＨ５の０．１Ｍリン酸緩衝液を入れ、測定の間、この溶液を０．６ｍｌ／分の流速で装置内に流しておいた。その結果、ミキサー１６において、両溶液が混合された時点で、その混合液のｐＨが２〜２．５になるようにした。
試料液を、試料液注入口１４に注入し、フローセル１７を通過させながら、ＭｎＯ４−イオンによるルテニウム錯体およびクエン酸の酸化を介した化学発光を生起した。このとき、その発光量を光電子増倍管により測定した。このとき、作用電極への電圧の印加を行わなかった。
その結果は図２１に示される通りであった。図２１に示されるように、クエン酸濃度およびシュウ酸濃度に依存した鋭い発光ピークが確認された。
得られた発光量とクエン酸の濃度から、図２２に示される検量線が得られた。また、得られた発光量とシュウ酸の濃度から、図２３に示される検量線が得られた。
【００８９】
例１３：酸化剤を用いた化学発光による、尿中のクエン酸およびシュウ酸の定量
尿を採取して、蒸留水で１００倍に希釈して、尿含有試料液を得た。この尿含有試料液を試料液として用いたこと以外は、例１２と同様にして、発光量の測定を行った。
その結果は図２４に示される通りであった。得られたクエン酸の発光量と例１２で得られたクエン酸の検量線とを比較して、次いで希釈倍率を乗ずることにより、実尿中のクエン酸濃度を算出したところ、７４６．６μＭであった。また、得られたシュウ酸の発光量と例１２で得られたシュウ酸の検量線とを比較し、次いで希釈倍率を乗ずることにより、実尿中のシュウ酸濃度を算出したところ、１２８．６μＭであった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明によるダイヤモンド電極の構造を示す図であり、（ａ）はダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなる。（ｂ）はダイヤモンド電極１の斜視図である。
【図２】本発明によるフローインジェクション法を用いた測定系を示す模式図であり、（ａ）はフローセルを含む系全体の概略を示す図であり、（ｂ）はフローセルの基本構造を示す図である
【図３】本発明による濃度測定装置の基本構成を示す図である。
【図４】例３において得られた、クエン酸の発光ピークである。
【図５】例４において得られた、クエン酸とシュウ酸の発光量ピークを示す図である。
【図６】例４において得られた、印加電圧（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）と、クエン酸の発光量ピークの高さとの関係を示す図である。
【図７】例４において得られた、印加電圧（対Ａｇ／ＡｇＣｌ電極）と、シュウ酸の発光量ピークの高さとの関係を示す図である。
【図８】例５において得られた、ｐＨと、クエン酸およびシュウ酸の検出に要した時間との関係を示す図である。
【図９】例６において得られた、クエン酸の検量線である。
【図１０】例６において得られた、シュウ酸の検量線である。
【図１１】例７において得られた、クエン酸とシュウ酸の発光量ピークを示す図である。
【図１２】例７において得られた、クエン酸の検量線である。
【図１３】例７において得られた、シュウ酸の検量線である。
【図１４】例８において得られた、クエン酸の発光量ピークを示す図である。
【図１５】例８において得られた、クエン酸の検量線である。
【図１６】例９において得られた、クエン酸の発光量ピークを示す図である。
【図１７】例９において得られた、クエン酸の検量線である。
【図１８】例１０において得られた、クエン酸とシュウ酸の発光量ピークを示す図である。
【図１９】例１１において得られた、クエン酸の検量線である。
【図２０】例１１において得られた、シュウ酸の検量線である。
【図２１】例１２において得られた、クエン酸とシュウ酸の発光量ピークを示す図である。図中、ＣＡがクエン酸を、ＯＡがシュウ酸を示す。
【図２２】例１２において得られた、クエン酸の検量線である。
【図２３】例１２において得られた、シュウ酸の検量線である。
【図２４】例１３において得られた、実尿希釈液におけるクエン酸とシュウ酸の発光量ピークを示す図である。図中、ＣＡがクエン酸を、ＯＡがシュウ酸を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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