(57)【要約】【課題】  簡便に且つ短期間で、しかも定量的に、骨吸収阻害剤の効果を評価できる、評価方法を提供すること。【解決手段】  破骨細胞の骨吸収作用を阻害する骨吸収阻害剤の、骨吸収阻害効果を評価する、骨吸収阻害剤評価方法において、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを、培地中でインキュベートする、準備工程と、準備工程後の上記プレートの培地に、単一の破骨細胞前駆細胞を播種する、播種工程と、播種後の培地を、破骨細胞の分化を活性化させる分化活性化剤を含む培地に交換して、破骨細胞の分化誘導を行うとともに、その過程において、骨吸収阻害剤を添加して被検体を作製し及び骨吸収阻害剤を添加しないで対照体を作製する、分化工程と、被検体と対照体とを比較して、分化工程後の被検体の上記プレートにおけるハイドロキシアパタイトの減少量を求める、測定工程と、を有することを特徴としている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
破骨細胞の骨吸収作用を阻害する骨吸収阻害剤の、骨吸収阻害効果を評価する、骨吸収阻害剤評価方法において、
ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを、培地中でインキュベートする、準備工程と、
準備工程後の上記プレートの培地に、単一の破骨細胞前駆細胞を播種する、播種工程と、
播種後の培地を、破骨細胞の分化を活性化させる分化活性化剤を含む培地に交換して、破骨細胞の分化誘導を行うとともに、その過程において、骨吸収阻害剤を添加して被検体を作製し及び骨吸収阻害剤を添加しないで対照体を作製する、分化工程と、
被検体と対照体とを比較して、分化工程後の被検体の上記プレートにおけるハイドロキシアパタイトの減少量を求める、測定工程と、を有することを特徴とする骨吸収阻害剤評価方法。
【請求項２】
準備工程が、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを作成する、作成工程を、有しており、
該作成工程が、カルシウムイオンを含む水溶液に浸透させ、水洗した後、リン酸イオンを含む水溶液に浸透させ、水洗する、という処理を、培養用プレートに対して、２回以上、施すものである、請求項１記載の骨吸収阻害剤評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝異常の有効な治療薬として用いられる骨吸収阻害剤の、開発研究を円滑に行うために、被検薬剤の骨吸収阻害剤としての効果を、簡便に評価することができる、評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨吸収阻害剤、例えばビスホスホネート（Bisphosphonates）の、効果の評価は、主として、動物個体や単離された破骨細胞を用いて行われていた。
【０００３】
一方、特許文献１には、破骨細胞の機能評価を行うための破骨細胞評価用基板が示されている。
【特許文献１】特開平７−３０６２０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
動物個体や単離された破骨細胞を用いる従来の評価方法では、それらの均一性が保証されないために、定量的評価が困難であるという問題があった。また、破骨細胞の単離、培養、及び播種という作業が必要であるため、作業が煩雑であるという問題もあった。更に、動物個体を用いた場合には、評価結果を得るまでに数週間という長期間を要するという問題もあった。
【０００５】
特許文献１の破骨細胞評価用基板を用いる場合でも、単離された破骨細胞を用いるので、同様に、定量的評価が困難であり、作業が煩雑であるという問題があった。
【０００６】
本発明は、簡便に且つ短期間で、しかも定量的に、骨吸収阻害剤の効果を評価できる、評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の発明は、破骨細胞の骨吸収作用を阻害する骨吸収阻害剤の、骨吸収阻害効果を評価する、骨吸収阻害剤評価方法において、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを、培地中でインキュベートする、準備工程と、準備工程後の上記プレートの培地に、単一の破骨細胞前駆細胞を播種する、播種工程と、播種後の培地を、破骨細胞の分化を活性化させる分化活性化剤を含む培地に交換して、破骨細胞の分化誘導を行うとともに、その過程において、骨吸収阻害剤を添加して被検体を作製し及び骨吸収阻害剤を添加しないで対照体を作製する、分化工程と、被検体と対照体とを比較して、分化工程後の被検体の上記プレートにおけるハイドロキシアパタイトの減少量を求める、測定工程と、を有することを特徴としている。
【０００８】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、準備工程が、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを作成する、作成工程を、有しており、該作成工程が、カルシウムイオンを含む水溶液に浸透させ、水洗した後、リン酸イオンを含む水溶液に浸透させ、水洗する、という処理を、培養用プレートに対して、２回以上、施すものであるものである。
【発明の効果】
【０００９】
請求項１記載の発明によれば、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレート上で、破骨細胞を分化誘導させるとともに骨吸収阻害剤の被検薬剤を投与し、その後、ハイドロキシアパタイトの減少量を測定するので、骨吸収阻害剤の効果の評価を、簡便に且つ短期間で、行うことができる。しかも、同一条件下の対照体と比較することにより、定量的な評価を行うことができる。特に、本発明は、骨粗しょう症薬のスクリーニング方法として有効に利用できる。
【００１０】
請求項２記載の発明によれば、一般的に使用されるプラスチック製シャーレである培養用プレートに、ハイドロキシアパタイトをコーティングできるので、特別な器具を必要とせず、通常の実験室において容易に実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の骨吸収阻害剤評価方法は、準備工程、播種工程、分化工程、及び測定工程を、この順に実施するものである。
【００１２】
（１）準備工程
準備工程は、作成工程とインキュベート工程とを有している。
（ａ）作成工程
作成工程は、ハイドロキシアパタイトがコーティングされている培養用プレートを作成するものである。培養用プレートとしては、一般的なプラスチック製シャーレを用いる。
作成工程は、次のように行う。即ち、カルシウムイオンを含む水溶液に浸透させ、水洗した後、リン酸イオンを含む水溶液に浸透させ、水洗する、という処理を、培養用プレートに対して、２回以上、施す。これにより、培養用プレートに、ハイドロキシアパタイトがコーティングされる。
カルシウムイオンを含む水溶液としては、例えば、塩化カルシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液を用いることができる。リン酸イオンを含む水溶液としては、例えば、リン酸水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液を用いることができる。
（ｂ）インキュベート工程
作成工程後の培養用プレートを、培地中でインキュベートする。これにより、培養用プレート上に培地が形成される。培地としては、イーグル培地を用いる。
【００１３】
（２）播種工程
インキュベート工程後の上記プレートの培地に、単一の破骨細胞前駆細胞を播種する。
破骨細胞前駆細胞としては、例えば、次のものを用いることができる。
・マウス単球マクロファージ系列細胞ＲＡＷ２６４細胞。
・胚性幹細胞、体性幹細胞、骨髄細胞、又は脾臓細胞から、誘導した前駆細胞。
【００１４】
（３）分化工程
播種後の培地を、破骨細胞の分化を活性化させる分化活性化剤を含む培地に交換して、破骨細胞の分化誘導を行うとともに、その過程において、骨吸収阻害剤を添加して被検体を作製し及び骨吸収阻害剤を添加しないで対照体を作製する。
【００１５】
この工程において、被検体においては、破骨細胞が形成されるとともに、形成された破骨細胞による骨吸収作用が、骨吸収阻害剤によって阻害される。一方、対照体においては、破骨細胞が形成されるとともに、形成された破骨細胞による骨吸収作用が、阻害されることなく発揮される。
【００１６】
分化活性化剤としては、例えば、次のものを用いることができる。
・骨芽細胞／ストローマ細胞が提示するＲＡＮＫＬ(receptor activator of NFκ-B ligand)。
・大腸菌や酵母などで発現させ精製した組換えＲＡＮＫＬ分子。
【００１７】
ここで添加する骨吸収阻害剤は、本発明の方法により評価することを目的とする被検薬剤であり、例えば、ビスホスホネート、カルシトニン、及びその誘導体を用いることができる。ビスホスホネートは、側鎖に窒素を含まないものと含むものとに大別され、含まないものとしては、エチドロネート（etidronate(ＥＨＤＰ)）を用いることができ、含むものとしては、アレンドロネート（alendronate(ＡＬＮ)）、インカドロネート（incadronate(ＩＮＣＡＤ)）を用いることができる。
【００１８】
（４）測定工程
被検体と対照体とを比較して、分化工程後の被検体の上記プレートにおけるハイドロキシアパタイトの減少量を求める。
上記減少量は、例えば、被検体及び対照体において、上記シャーレから破骨細胞を剥がした後に、ｋｏｓｓａ染色によって、ハイドロキシアパタイトを染色し、非染色部分の面積を測定し、被検体の該面積と対照体の該面積とを比較することによって、求める。
【００１９】
これによって、被検薬剤である骨吸収阻害剤の骨吸収阻害効果が評価される。
【００２０】
以上のように、本発明の方法によれば、一般的に使用されるプラスチック製シャーレである培養用プレートに、ハイドロキシアパタイトをコーティングし、その上で、破骨細胞を分化誘導させるとともに骨吸収阻害剤の被検薬剤を投与し、その後、ハイドロキシアパタイトの減少量を測定するので、骨吸収阻害剤の効果の評価を、簡便に且つ短期間で、行うことができる。しかも、同一条件下の対照体と比較することにより、骨吸収阻害剤の効果の定量的な評価を行うことができる。
【実施例１】
【００２１】
（１）準備工程
（ａ）作製工程
直径１０ｃｍのプラスチック製シャーレを、２００ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌの水溶液３ｍｌに１分間浸透させた後、水洗し、次いで、１２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４の水溶液２ｍｌに１分間浸透させた後、水洗した。これを、もう一度繰り返した。
【００２２】
（ｂ）インキュベート工程
作製工程後の上記シャーレを、２４時間、１０％血清を含むイーグル培地中で、インキュベートした。
【００２３】
（２）播種工程
インキュベート工程後の上記シャーレの培地に、ＲＡＷ２６４細胞を、上記シャーレ１個当り５０００００細胞、播種した。
【００２４】
（３）分化工程
上記シャーレの播種後の培地を、２４時間後に、ＲＡＮＫＬを含む培地に交換するとともに、骨吸収阻害剤の被検薬剤を該培地に投与し及び投与しないで、１２０時間培養を続けた。なお、ＲＡＮＫＬを含む培地に交換後、７２時間後と９６時間後には培地を交換した。投与した場合を被検体とし、投与しなかった場合を対照体とした。
被検薬剤としては、ＥＨＤＰ、ＡＬＮ、ＩＮＣＡＤを用いた。投与量は、１０−４〜１０−７Ｍの範囲とした。
【００２５】
（４）測定工程
被検体及び対照体について、次の作業を行った。即ち、分化工程後の上記シャーレを、１％ドデシル酸硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で２回処理した後、滅菌蒸留水で２回洗うことにより、破骨細胞を上記シャーレから剥がした。次いで、ｋｏｓｓａ染色を施した。即ち、５％硝酸銀溶液を加えた後、１時間光を当てることにより、ハイドロキシアパタイトを染色した。そして、光学顕微鏡により、１個のシャーレについて１０個の視野の画像を取り込み、ＮＩＨイメージ解析ソフトを用いて非染色部分の面積を数値化することにより、ハイドロキシアパタイトの減少量、即ち、骨吸収量、を求めた。
【００２６】
図１はｋｏｓｓａ染色による染色状況を各被検薬剤毎及び各投与量毎に示す光学顕微鏡写真である。図２は各被検薬剤毎及び各投与量毎のハイドロキシアパタイトの減少比率を示す図である。図２においては、縦軸がハイドロキシアパタイトの減少量を示し、対照体におけるハイドロキシアパタイトの減少量を１００％として示している。
【００２７】
両図からわかるように、いずれの被検薬剤においても、投与量が多いと、ハイドロキシアパタイトの減少量が減っており、即ち、破骨細胞による骨吸収作用が大きく抑制されている。従って、いずれの被検薬剤も、骨吸収阻害効果について用量依存性があった。また、ＩＮＣＡＤが最も骨吸収阻害性に優れていると言える。
【００２８】
以上のように、実施例１の評価方法によれば、一般的に使用されるプラスチック製シャーレに、ハイドロキシアパタイトをコーティングし、その上で、破骨細胞を分化誘導させるとともに骨吸収阻害剤の被検薬剤を投与し、その後、ハイドロキシアパタイトの減少量を測定するので、骨吸収阻害剤の効果の評価を簡便に行うことができる。また、インキュベート工程で２４時間、分化工程で１４４時間を要し、他の工程は短時間を要するだけであるので、略１週間という短期間で、評価を行うことができる。更に、同一条件下の対照体と比較するので、定量的な評価を行うことができる。
【実施例２】
【００２９】
分化工程における被検薬剤の投与を、ＲＡＮＫＬを含む培地に交換後の９６時間後の、更に１２時間後に行い、その他は実施例１と同じとした。
【００３０】
図３は図１に対応する写真である。図４は図２に対応する図である。両図からわかるように、いずれの被検薬剤においても、投与量が多いと、ハイドロキシアパタイトの減少量が減っており、即ち、破骨細胞による骨吸収作用が大きく抑制されている。従って、いずれの被検薬剤も、骨吸収阻害効果について用量依存性があった。しかしながら、いずれの被検薬剤においても、投与量が少なすぎると、骨吸収阻害効果が発揮されない場合があった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の評価方法は、非常に簡便に、且つ、定量的に、骨吸収阻害剤の効果を評価できるものであり、特に、骨粗しょう症薬のスクリーニング方法として有効に利用できる方法であるので、産業上の利用価値が大である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１におけるｋｏｓｓａ染色による染色状況を各被検薬剤毎及び各投与量毎に示す光学顕微鏡写真である。
【図２】実施例１における各被検薬剤毎及び各投与量毎のハイドロキシアパタイトの減少比率を示す図である。
【図３】実施例２におけるｋｏｓｓａ染色による染色状況を各被検薬剤毎及び各投与量毎に示す光学顕微鏡写真である。
【図４】実施例２における各被検薬剤毎及び各投与量毎のハイドロキシアパタイトの減少比率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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