(57)【要約】      （修正有）【課題】乳房細胞増殖障害患者、特に乳房癌腫のエストロゲン治療の予後診断及び／又は結果予測の方法を提供する。【解決手段】乳房細胞のPITX2の発現レベル、遺伝子PITX2に関連したゲノムDNAの遺伝的若しくは後成的変化を決定することにより達成される。これに際して、乳癌由来の特定な塩基配列、オリゴヌクレオチド、抗体をも用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む乳房組織の細胞増殖障害を有する対象の内分泌治療の予後診断及び／又は結果予測を提供する方法：
ａ）対象から生物学的試料を得て、
ｂ）前記試料内の遺伝子PITX2及び／又はその調節配列の発現を決定し、
ｃ）前記対象の内分泌治療の予後及び／又は結果を決定する。
【請求項２】
工程ｂ）において、遺伝子PITX2、TFF1、及びPLAU並びに／又はそれらの調節配列の発現を決定することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）において、遺伝子PITX2、及びPLAU並びに／又はそれらの調節配列の発現を決定することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）において、遺伝子PITX2、及びTFF1並びに／又はそれらの調節配列の発現を決定することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記対象がエストロゲン受容体陽性である請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
ｄ）対象に好適な治療計画を決定すること
を更に含む請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記好適な治療計画が、化学療法、放射性療法、外科療法、生物学的療法、免疫療法、抗体、分子標的薬物、エストロゲン受容体モジュレータ、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ、アロマターゼ阻害剤、卵巣除去、LHRHアナログ、及び他のエストロゲン生成に影響を与える中枢作用薬物からなる群より選択される１又はそれ以上の療法を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記乳房組織の細胞増殖障害が、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、非浸潤性小葉癌、面皰癌、炎症性癌、粘液癌、硬癌、colloid癌、管状癌、髄様癌、化生癌、乳頭癌、及び非浸潤性乳頭癌、未分化又は退形成癌及び、 及び乳房のパジェット病からなる群より選択される請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現が、mRNA、LOH、タンパク質発現の少なくとも１つの解析によって決定される請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現が、前記遺伝子及び／又はその調節領域内の１又はそれ以上のCpG位置のメチル化状態を決定することによって決定される請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を含む乳房組織の細胞増殖障害を有する対象の内分泌治療の予後を提供する及び／又は結果を予測する方法：
ａ）前記対象から得た生物学的試料からゲノムDNAを単離して、
ｂ）ゲノムDNA又はそれらのフラグメントを、5位置の非メチル化シトシン塩基を、ウラシル又は、ハイブリダイゼーション特性がシトシンとは検出可能に異なる他の塩基に変換する１又はそれ以上の試薬で処理し、
ｃ）処理されたゲノムDNA又はそれらの処理されたフラグメントを、増幅酵素及び少なくとも２つのプライマーに接触させ、該プライマーは各々の場合に、配列表の配列番号150、151、155及び156並びにそれらの相補配列からなる群より選択される配列と相補的であるか、又は中程度にストリンジェントな若しくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも長さが18ヌクレオチドの隣接配列であり、処理されたDNA又はそれらのフラグメントは、増幅されて１又はそれ以上の増幅物を生成するか、あるいは増幅されない；
ｄ）前記増幅物の有無、量又は特性に基づいて、配列表の配列番号149の少なくとも１のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、又は配列表の配列番号149の複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値を決定し、そして
ｅ）前記対象の内分泌治療の予後及び／又は結果を前記メチル化状態から決定する。
【請求項１２】
工程ｃ）において、各々の場合において、配列表の配列番号76〜103、及び153、154、157及び158並びにそれらの相補配列からなる群から選択される配列と相補的であるか、又は中程度にストリンジェントな若しくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも18ヌクレオチドの長さの隣接配列を含む少なくとも２つのプライマーを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１又はそれ以上の試薬が、重亜硫酸塩、硫酸水素塩、二亜硫酸塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択される溶液を含む、請求項１１及び１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｄ）が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション分析、Ms-SnuPE、配列決定、リアルタイム検出プローブ及びオリゴヌクレオチドアレイ解析からなる群より選ばれる１又はそれ以上の方法によって実行される請求項１１及び１２に記載の方法。
【請求項１５】
配列表の配列番号2〜5、配列表の配列番号151〜配列表の配列番号158、及び配列表の配列番号76〜配列表の配列番号103からなる群より選ばれる配列の１つに記載の長さが少なくとも18塩基の配列からなる核酸分子。
【請求項１６】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）‐オリゴマーであって、前記オリゴマーが配列表の配列番号2〜5、配列表の配列番号151〜配列表の配列番号158、及び配列表の配列番号76〜配列表の配列番号103に記載の核酸配列の１つにハイブリダイズするか、一致する少なくとも10ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列から本質的になるオリゴマー。
【請求項１７】
以下を含む組成物：
‐配列表の配列番号2〜配列表の配列番号5、配列表の配列番号151、152、155及び156並びにそれらに相補的な配列を含む群から選ばれる配列の１つに記載の化学的に前処理されたゲノムDNAのセグメントの長さが少なくとも18塩基の配列を含む核酸、及び
‐以下の物質を少なくとも１つ含む緩衝液：塩化マグネシウム、dNTP、taqポリメラーゼオリゴマー特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）オリゴマー、前記オリゴマーが配列表の配列番号2〜5、配列表の配列番号151、152、155及び156並びにそれらに相補的な配列の１つに記載の前処理されたゲノムDNAと相補的であるか、又は中程度にストリンジェントな若しくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を各々の場合において含む。
【請求項１８】
乳房組織の細胞増殖障害を有する対象の内分泌治療の予後診断及び／又は結果予測を提供するための、請求項１〜１５に記載の方法、請求項１６に記載の核酸、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド、及び請求項１８に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子PITX2の発現レベル、或いは遺伝子PITX2及び／又はその調節若しくはプロモータ領域に関連するゲノムDNAの遺伝的又は後成的な変化を決定することを特徴とする、乳房組織の細胞増殖障害と診断された患者の生存期間及び／又は治療応答を予測する方法に関する。本発明はまた、該記載された方法に用いられうる核酸配列、オリゴヌクレオチド、抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（乳癌）
ヨーロッパ及びアメリカの女性において、乳癌は最も頻繁に診断を受ける癌であり、癌による死亡の主要な原因の第２位である。４０〜５５歳の年齢の女性において、乳癌は主要な死亡原因である（Greenlee et al., 2000）。2002年には、米国では204,000の乳癌の新しい症例があり、ヨーロッパではこれに匹敵する数があった。
【０００３】
乳癌は、乳房組織内での細胞の制御のない増殖として定義される。乳房は、乳管で結合されている15〜20の小葉からなる。癌は最も一般的には乳管で発生するが、炎症性の乳癌と呼ばれる稀な型の癌を有する小葉でも発見される。乳癌の早期の検出、分類、及び治療の方法を改良する必要が引き続き存在することは当業者に認められている。子宮頸部や、皮膚のようないくつかの他の一般的な癌の検出に対して、乳癌を分類し、検出するのは本来困難である。
【０００４】
（乳癌の治療）
全ての治療の第１段階は、定まった分類の疾患に比較しての患者の状態の評価である。しかしながら、このような系の価値基準は、分類の特質に本来依存している。乳癌はその大きさ、場所、転移の発生により段階付けされる。治療方法は、外科療法、放射線療法、化学療法、及び内分泌療法の使用を含み、それは外科療法への補助療法としても使用される。一般的に、より侵攻性の疾患は、より積極的な療法で治療される。
【０００５】
早期の癌のほとんど大部分が手術可能であり、すなわち、腫瘍は外科療法によって完全に除去されうるが、リンパ節陰性疾患を有する患者の約１／３、及び、リンパ節陽性疾患を有する患者の約50〜60%は追跡期間中に転移を発現する。
【０００６】
この所見に基づいて、全身補助療法がリンパ節陽性及びリンパ節陰性乳癌の両方に導入された。全身補助療法は、腫瘍の外科的除去の後に施され、再発の危険性を著しく減少させることが示された。内分泌治療、これは（ホルモン受容体陽性腫瘍のための）ホルモン療法とも呼ばれる、異なる化学療法計画、及びハーセプチン（上皮成長因子受容体に対する抗体）のような新規薬剤に基づく抗体治療といった：いくつかの型の補助療法が利用可能である。
【０００７】
大多数の乳癌（ほぼ70〜80%）の増殖はエストロゲンの存在に依存する。従って、補助療法の１つの重要な標的は、エストロゲンの除去（例えば卵巣除去による）、或いは競合物質（例えばタモキシフェン）による受容体のブロック、若しくは、アンドロゲンのエストロゲンへの変換の阻害（例えばアロマターゼ阻害剤）のいずれかによる、エストロゲンの合成のブロック、又は、腫瘍細胞へのその作用のブロックである。この型の治療は「内分泌治療」と呼ばれている。内分泌治療は、ホルモン受容体（エストロゲン受容体（ER）及び／又はプロゲステロン受容体（PR））を発現する腫瘍においてのみ効果的であると考えられている。最近、ホルモン受容体陽性乳癌を有する女性のうち極めて大部分が、リンパ節の状態に関わらず、幾つかの形態の内分泌治療を受け入れている。最も頻繁にこのシナリオに用いられる薬物はタモキシフェンである。
【０００８】
しかしながら、ホルモン受容体陽性患者においてさえ、全ての患者が内分泌治療から利益を得るとは限らない。補助内分泌療法は死亡率を22%低減させるが、一方、転移（進展性）の場合では、内分泌治療への反応率は50〜60%である。
【０００９】
タモキシフェンは相対的に、副作用をほとんど有さないので、治療は利益の見込みの低い患者にとってすら正当化されうる。しかしながら、これらの患者は追加の、さらに積極的な補助療法を要するかもしれない。最も早期かつ最も低い侵攻性を有する腫瘍、例えばリンパ節陰性、ホルモン受容体陽性腫瘍においてさえ、患者が補助療法としてタモキシフェン単独療法のみを受ける場合、約21%の患者が最初の診断の後10年以内に再発する（Lancet. 1998 May 16;351(9114):1451-67. Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomized trials. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group.）。同様に、ホルモン受容体陰性疾患を有する相当数の患者は、外科療法と、場合によっては放射線療法だけで十分に治療されるが、一方、他の患者はさらなる化学療法を必要とする。
【００１０】
数種の細胞障害性の処方計画は、乳癌の再発の危険を低減するのに効果的であることが示されてきた（Mansour et al., 1998）。最近の治療のガイドラインによれば、大多数のリンパ節陽性患者は、アメリカとヨーロッパの両方で補助化学療法を受けており、これは再発の危険を考慮しているからである。にもかかわらず、全ての患者が再発しないというわけではなく、化学療法なしでさえ１度も再発しないが、最近使用されている基準により、やはり化学療法を受けている患者も一部存在する。ホルモン受容体陽性患者において、化学療法は通常、内分泌治療の前に施され、一方、ホルモン受容体陰性患者は化学療法のみを受ける。
【００１１】
リンパ節陰性患者に関する状況は特に複雑である。アメリカでは、腫瘍が1 cmより大きければ、細胞障害性の化学療法がリンパ節陰性患者に推奨されている。ヨーロッパでは、2 cmより大きい腫瘍、陰性のホルモン受容体の状態、又は３つの腫瘍の段階付け、或いは35歳未満の年齢等の、１又はそれ以上の危険因子が存在する場合は、化学療法がリンパ節陰性の症例について考慮される。一般的には、追加の化学療法に関しては閉経前の女性を選択する傾向があり、一方閉経後の女性に関しては、化学療法はしばしば省略される。内分泌治療、特にタモキシフェン、又はアロマターゼ阻害剤に比較して、化学療法は毒性が高く、悪心、嘔吐、骨髄減退等の短期の副作用と、心臓毒性及び２次的な癌の危険性の増大等の長期の作用を有する。
【００１２】
（従来技術において長く感じられてきた必要性）
現在、どの乳癌患者がより積極的な療法を選択されるべきか、どの乳癌患者が追加の積極的な治療なしで回復するのかということは、明らかにはなっておらず、適切な患者の選択についての多大な必要性は臨床医の一致することころである。補助治療に関して正しい患者を選択すること、及び正しい補助治療を選択することの困難性、並びに適切な基準の欠落は、New Mexico Tumor registryからのデータに基づく、化学療法が推奨されるよりずっと低い頻度で用いられていることを明らかにした最近の研究によっても示されている（Du et al., 2003）。この研究は、化学療法又は他の、乳癌療法のより積極的な形態に関して、患者をうまく選択する必要性があることの実質的な証拠を提供した。
【００１３】
（遺伝子PITX2の先行技術）
PITX2（PTX2、RS、RGS、ARP1、Brx1、IDG2、IGDS、IHG2、RIEG、IGDS2、IRID2、Otlx2、RIEG1、MGC20144としても知られている）はホメオドメイン因子のpaired様クラス内の、転写因子の新規ファミリーを定義づけているPTX1、PTX2、及びPTX3のPTXサブファミリーに属していることが知られている。遺伝子PITX2（NM_153426による）は、paired様ホメオドメイン転写因子2をコードし、これは目、歯、及び脳下垂体前葉のような前側の構造の発生中に発現されることが知られている。
【００１４】
Toyotaら(2001)（Blood 97: p 2823-9.）（非特許文献１）は、急性骨髄白血病の大部分においてPITX2遺伝子の高メチル化を発見した。 さらに、この研究において、PITX2の高メチル化は、ER遺伝子のメチル化と発現のレベルの減少とに、正に相関している。PITX2遺伝子のメチル化パターンを解析する手段はまた、多数の特許出願に記載されてきた（それぞれ、WO 02/077272（特許文献１）はAMLとALLの間の区別へのメチル化マーカーの使用に関し、WO 01/19845（特許文献２）は数種の細胞増殖障害の診断に有用な数種の異なってメチル化されている配列に関し、WO 02/00927及びWO 01/092565（特許文献３及び４）はそれぞれ、発生遺伝子に関連する、又は、DNA転写に関連する疾患の診断へのメチル化マーカーの使用に関する）。
【００１５】
染色体4のヘテロ接合性の喪失（以下では「LOH」と称することもある）は、多数の型の腫瘍の既知の特性である。Shivapurkarら［Cancer Research 59, 3576-3580, August 1, 1999］（非特許文献２）は、乳癌試料及び細胞株における染色体4の複数領域においてヘテロ接合性の喪失を観察した。4q25-26での欠失は被解析試料の67%に存在した。しかしながら、被解析領域（マーカーD4S1586とD4S175との間）はPITX2遺伝子にマッピングされておらず、PITX2発現に関する影響が全く得られなかった。さらに、実行された研究は、予後診断的用途に関する遺伝子、又は領域の座の好適性を示さなかった。
【００１６】
PITX2のメチル化は、発生、転写、癌のような疾患に関連はしているが、内分泌療法への乳癌患者の成果の予測又は応答における役割はこれまでに認識されていない。
【００１７】
（発現解析における先行技術）
遺伝子の発現、というよりむしろ遺伝子によってコードされるタンパク質は、４つの異なるレベルで研究されうる：第１に、タンパク質発現レベルが直接的に決定され得、第２に、mRNAの転写レベルで決定され得、第３に、遺伝子のDNAメチル化特性又は遺伝子のヒストン特性などの後成的な変化；が解析され得、なぜならメチル化はしばしばタンパク質発現の阻害に関連しているからであり、そして第４に遺伝子自体が、遺伝子産物の発現に影響する変異、欠失、多型等の遺伝子的変化について解析されてもよい。
【００１８】
分子生物学の近年の方法論的発展により研究されてきた観察のレベルは、遺伝子そのもの、これら遺伝子のRNAへの転写、及び生じたタンパク質への翻訳である。しかしながら、特定の細胞及び組織において、個体の発生過程における特定の時期に、特定の遺伝子の活性化及び阻害がどのように制御されているかは、遺伝子のメチル化の程度、性質、又は各々ゲノムに関連しうる。この点で、病原の状況は、個々の遺伝子、又はゲノムのメチル化パターンの変化において、それ自体明らかである。
【００１９】
全てのこれらの生物学的工程の全体的ゲノムの幅広い解析の分野に応用される、４つの用語は次のように呼ばれる：プロテオミクス（Proteomics）、トランスクリプトミクス（Transcriptomics）、エピゲノミクス（Epigenomics）（又はメチロミクス（Methylomics））及びゲノミクス（Genomics）。これらのレベルの全てについて発現の研究、又は発現に関与する変化の研究のために使用されうる方法及び技術が、文献に十分に記載されており、従って当業者には既知である。それらは、分子生物学の教科書、多数の科学論文に記載されている。
【００２０】
単一遺伝子のタンパク質発現の解析の方法は先行技術である。それは、通常、対象となる遺伝子産物に特異的な抗体を必要とする。適切な技術はELISAや免疫組織化学である。
【００２１】
mRNAのレベルの解析もまた、十分に記載されてきた。今日において価値基準は逆転写PCRである。
【００２２】
重複を避けるために、既存の公知の技術に関連する先行技術のより詳細な記載が本発明の記載内に、本発明の部分として与えられる。
【００２３】
Gareth Robertsによる米国特許出願2003/0198970は、人間の「遺伝的作製」、すなわち、個体間で種々である可能性のある欠失、多型、変異等の遺伝的変化を決定する方法についての技術及び方法のうちのいくつかを挙げており、疾患における個体の変動性、療法への応答、及び予後診断におけるこの遺伝的配列情報の潜在的役割を記載している。しかしながら後成的相違は言及されていない。遺伝子PITX2はこの出願内で、約2500の他の遺伝子の名前の長い総合的なリストのうちの１つ遺伝子の名前として挙げられており、治療応答のうちの幾つかの種類においてその発現が役割を果たしうることを示唆している。しかしながら、これは単に推測にのみ基づく仮定であり、というのもPITX2の遺伝的変化と治療応答における個体の変動との間の何らかの種類の関連を示す実験が１つも開示されていないからである。
【００２４】
このような状況においてほとんど確立されていない領域が、エピゲノミクス又はエピゲネティクスの分野、すなわちDNAメチル化パターンの解析に関連する分野である。
【００２５】
（メチル化解析における先行技術）
5-メチルシトシンは真核細胞のDNAにおいて最も高頻度の共有結合塩基の変化である。DNAのメチル化は哺乳動物細胞における遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。それは、例えば転写の調節、遺伝的刷り込み、腫瘍形成において役割を果たす。DNAメチルトランスフェラーゼはDNAメチル化に必要であり、S-アデノシルメチオニンからのシトシン残基へのメチル基の移転を触媒して、ゲノムのCpG部位で大部分が見られる修飾塩基である5-メチルシトシンを形成する。遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化CpGアイランドの存在がそれらの発現を抑制することができる。この工程は5-メチルシトシンの存在による可能性があり、これは転写因子、又は転写をブロックする他のDNA-結合タンパク質の結合により明らかに妨げられる。異なる型の腫瘍において、プロモータ領域におけるCpGアイランドの異常型又は偶発型のメチル化が、多くの癌関連遺伝子に関して発見されており、それらの発現のサイレンシングを生じる。かかる遺伝子は転移、血管形成を抑制する遺伝子、及びDNAを修復する遺伝子である腫瘍抑制遺伝子を含む（Momparler及びBovenzi (2000) J. Cell Physiol. 183:145-54）。従って、遺伝的情報の要素としての5-メチルシトシンの同定は、考慮される対象である。しかしながら、5-メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対形成挙動を有するので、5-メチルシトシンの位置は配列決定によって同定されることができる。さらに、5-メチルシトシンによって担持された後成的情報はPCR増幅中に完全に失われる。
【００２６】
（メチル化解析技術）
さらにDNAメチル化はまた、薬理遺伝学の分野でも役割を果たすことが記載されている。治療に対する個体の応答の解析への、ゲノムの遺伝的変化に関連する情報の応用に関連する同様のアプローチは、例えばGareth Robertsによって米国出願2003/0198970において記載されており、出願WO 02/037398の事項であり、DNAメチル化解析に基づくゲノムの後成的変化についての情報の応用に合わせられており、治療選択の指針、及び個体の治療応答を研究している。
【００２７】
この考え方の応用に関する例はEstellerらによって与えられ（Estellerら (2000) N Engl J Med. 2000 Nov 9;343(19):1350-4.）、グリオームでのMGMTプロモータのメチル化がアルキル化剤への腫瘍の応答の有用な予測変数であることを示した。さらに最近には、FruehwaldがDNAメチル化が様々な癌の侵攻性に関連していることを示す一連の研究をまとめた（Fruhwald MC. DNA methylation patterns in cancer: novel prognostic indicators? Am J Pharmacogenomics. 2003;3(4):245-60）。
【００２８】
治療応答の予測に関連するDNAメチル化解析のような後成的変化の解析の潜在性−乳癌に関して−の例は、Martensらの、the San Antonio Breast Cancer SymposiumでのSanAntonio, TX, December, 3-6, 2003（非特許文献３）により提示された。腫瘍の外科的除去により最初に治療された乳癌患者は、タモキシフェンを用いて転移に対して治療された。第１の腫瘍の試料は異常型メチル化パターンについて解析された。患者はその後、それらの他覚的腫瘍応答により２つのサブクラスに分けられた：進展性疾患を有する患者（転移の大きさを増大する）、及び再発した腫瘍の完全な又は部分的な寛解を有する患者（転移の大きさを減少する）。２つのサブクラスはそれらのメチル化パターンを元にして区別される。これは明らかな指標を提供し、前記研究において記載されたメチル化パターンが内分泌治療、例えばタモキシフェンについての予測治療応答ツールとして役立ちうる。この研究の結果が、2004年4月29日に公開された特許出願WO 04/035803（特許文献５）：乳癌細胞増殖疾患の改善された治療についての方法及び核酸、の事項である。PITX2はまた、前記出願において予測的なマーカーとしても挙げられており、しかしながら、前記マーカーの使用は治療応答マーカーとして記載されるだけで、予後診断マーカーとしては記載されていない。
【００２９】
最近、いくつかの予測的マーカーが評価の最中にある。最近、内分泌経路を標的とする唯一の一般的に用いられる治療はタモキシフェンであるが、しかしながら、タモキシフェン応答に関連する生物マーカーの多くが同じメカニズムの作用を有する、又は同じ経路を標的とする全ての薬物に関連していることは予測可能である。例えば、内分泌受容体（以下では「ER」とも称する）及びプロゲステロン受容体（以下では「PR」とも称する）の発現は、内分泌経路を標的とするいかなる治療についても患者を選択するために使用される。タモキシフェン応答に関連しているマーカーには、bcl-2がある。bcl-2の高発現レベルは転移疾患を有する患者でのタモキシフェン療法応答及び延命に有望な相関を示し、ER陰性患者サブグループに価値ある情報を加えた（J Clin Oncology, 1997, 15 5: 1916-1922; Endocrine, 2000, 13(1):1-10（非特許文献４及び５））。さらなる評価及び実証を必要とする進展性の乳癌を有する患者におけるc-erbB2（Her2/neu）過剰発現の独立した予測値に関連して矛盾する証拠がある（British J of Cancer, 1999, 79 (7/8):1220-1226（非特許文献６）; J Natl Cancer Inst, 1998, 90 (21): 1601-1608（非特許文献７））。
【００３０】
他の予測的マーカーはSRC-1（ステロイド受容体  コアクティベータ-1）、CGA mRNA過剰発現、細胞動態、及びS期フラクションアッセイ（Breast Cancer Res and Treat, 1998, 48:87-92; Oncogene, 2001, 20:6955-6959（非特許文献８））がある。近年、uPA（ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ）及びPAI-1（プラスミノゲンアクチベータ阻害因子１型）は共に、より不良な予後と補助全身療法から利益を得る患者のサブグループを定義するのに有用であることが示されている（J Clinical Oncology, 2002, 20 n04（非特許文献９））。しかしながら、これらのマーカの全てが将来的な試験での更なる評価を必要とし、というのもこれらの中には応答の実証されたマーカーはないからである。
【００３１】
さらに、研究結果はPaikら、the San Antonio Breast Cancer Symposium、San Antonio, TX, December, 3-6, 2003（非特許文献１０）により提示され、この問題に対する答えを、16遺伝子と、5対照のRT-PCRによるRNA発現パターンを解析することにより提供した。
【００３２】
しかしながら、前記マーカーが非常に多数の遺伝子による商業的試験における使用に適していることはありそうもない。商業的に利用可能な試験について、より限定された数の遺伝子が解析されることが好ましい。
【００３３】
また、最近発表されたのは、乳癌患者のメチル化解析の予後診断力に関する研究である。Mullerら（Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Widschwendter M. (2003) DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker. Cancer Res. 2003 Nov 15; 63(22): 7641-5.（非特許文献１１））は、治療前の血清の解析によって乳癌患者における予後診断の生物マーカーとして使用されうる１セットの遺伝子を記載した。癌患者の治療前の血清からのDNAに見つかった２つの遺伝子の特定の異常なメチル化パターンは、それらの予後が良好か不良かについて示した。解析されたDNAは組織由来DNAではなく、血清DNAであった。最も有望な腫瘍特異的パターンの存在は腫瘍由来DNAが存在することを示し、しかしながら、特定のメチル化パターンの不存在は、このメチル化パターンを示さない腫瘍、又は十分なDNAを血液流に流し込まない腫瘍による可能性がある。良好な又は不良な予後は補助療法なしの外科療法後の長期又は短期の「全生存期間」として定義される。この結果は従って、外科治療後の治療を受けない患者に関連する。マーカーは従って、（他に証明されなければ） 純粋に予後診断的であると考えられる。マーカーは、治療応答に関する情報は全く提供しないが、腫瘍の侵攻性に関する極めて基本的な指針のみを提供しうる。この基礎において、臨床医は治療選択肢の好適性においてただ憶測することしかできない。しかしながら、腫瘍の侵攻性に関係なく、患者の大部分に補助療法としてのタモキシフェン（又は他の内分泌療法）を提供することは標準であるので、 これらのマーカーはほとんどの患者に適用できない。
【００３４】
従って、現状の技術では満たされていない乳癌患者についての改良された治療技術の必要性が従来より長く感じられており、なお存在しておいる：より詳細には、これらのマーカーのうち、上記で概略を述べた特定の問題に答えることができるものはなく、すなわち、１次治療（多くの場合は外科治療）によって処置された患者が、内分泌治療、例えば限定はされないが、タモキシフェン、又はアロマターゼ阻害剤のみを用いた治療に好適な候補であるのかどうか、又は前記患者が、前記内分泌治療の代わりに、又はそれに加えて、さらなる補助治療（例えば限定はされないが化学療法）で治療された場合により良好な予後を示すのかどうか、についてである。
【００３５】
治療に関わらず癌患者の純粋な予後診断のマーカーは、上述の通り従来技術での必要性に対する好ましい解決ではない。前記マーカーは腫瘍の侵攻性の指標を幾つか提供し、従って必要であろう治療の選択を導くが、それらは治療応答に関する癌の世代交代を考慮していない。従って、不良な予後を有する患者（前記純粋な予後診断のマーカーを使用して決定される）は疾患の侵攻性に関係なく、内分泌治療と共に補助治療にもよく応答するかもしれないが、患者が前記治療に不十分な応答を有する場合は、代替の及び／又は追加の治療が前記患者が良好な予後を有していても治療に好適であろう。
【００３６】
一側面では、本発明は予後診断マーカー、PITX2（これはタンパク質PITX2をコードする遺伝子として認識されている：そのmRNA転写物はNM_153426である）を提供し、これはしかしながら、「純粋な予後診断」ではない。このマーカーは補助化学毒性療法が、タモキシフェンのような内分泌による治療に加えて是認されるかどうか、又はこれが患者に不必要な重荷となるかどうかという問題における指針的情報を提供することによって、上で概要を説明したような従来技術における要求に解決をもたらす。
【００３７】
遺伝子PITX2の異常な発現は乳房細胞増殖障害患者、特に乳房癌腫のエストロゲン治療による治療の予後診断及び／又は結果予測に相関していることがここで、開示される。
【００３８】
このマーカーは従って、乳房癌腫の特性付けの新規手段を提供する。遺伝子PITX2の異常な発現は乳癌患者の再発及び／又は生存期間の指標である。ここに記載される発明は、従って改良された治療決定を下すのに特に有用である。
【００３９】
それは、エストロゲン受容体、合成、又は変換経路を標的にする、或いは、それ以外にはエストロゲンの代謝、生成又は分泌に必要である１又はそれ以上の治療により治療された場合の、前記患者の再発及び／又は生存期間の指標でもある。
【００４０】
ここで記載される発明は、前記治療に加えて又は代わりに他の治療により随意に治療された個体からの、エストロゲン受容体経路を標的とする、又はエストロゲン代謝、生成、若しくは分泌に必要である１又はそれ以上の治療により適切に治療された個体の区別について特に有用である。好ましくは「他の治療」とは、限定はされないが、化学療法又は放射線療法を含む。
【００４１】
従って、前記患者が内分泌経路を標的とする補助療法によって治療された場合、それらのありそうな治療結果により患者の分類を可能にすることによって、前記マーカーが乳癌患者の治療において使用されることが特に好ましい。前記内分泌療法の代わりに又は追加してさらなる補助治療、限定はされないが特に化学療法を、不良な治療結果を有する患者に提供することがさらに好ましい。前記目的に適しているマーカーは、以下で「補助マーカー」とも称する。
【００４２】
本発明はまた、PITX2の「補助マーカー」としての使用にも関連し、それは「予後診断的マーカー」として、特に全く内分泌治療を受けなかったホルモン受容体陰性女性において役立つ。
【特許文献１】WO 02/077272
【特許文献２】WO 01/19845
【特許文献３】WO 02/00927
【特許文献４】WO 01/092565
【特許文献５】WO 04/035803
【非特許文献１】Toyotaら(2001)、Blood 97: p 2823-9.
【非特許文献２】Shivapurkarら、Cancer Research 59, 3576-3580, August 1, 1999
【非特許文献３】Martensら、the San Antonio Breast Cancer Symposium、SanAntonio, TX, December, 3-6, 2003
【非特許文献４】J Clin Oncology, 1997, 15 5: 1916-1922
【非特許文献５】Endocrine, 2000, 13(1):1-10
【非特許文献６】British J of Cancer, 1999, 79 (7/8):1220-1226
【非特許文献７】J Natl Cancer Inst, 1998, 90 (21): 1601-1608
【非特許文献８】Breast Cancer Res and Treat, 1998, 48:87-92; Oncogene, 2001, 20:6955-6959
【非特許文献９】J Clinical Oncology, 2002, 20 n04
【非特許文献１０】Paikら、the San Antonio Breast Cancer Symposium、San Antonio, TX, December, 3-6, 2003
【非特許文献１１】Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Widschwendter M. (2003) DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker. Cancer Res. 2003 Nov 15; 63(22): 7641-5.
【発明の開示】
【００４３】
（説明）
予後診断及び／又は治療結果に関する乳癌の特性付けにより、医師は、患者にとっての危険と利益の適切なバランスを持つ治療計画に関する、情報に基づく決定が可能となる。
【００４４】
本発明において、乳房細胞増殖障害を記載するのに用いられる場合の用語「エストロゲン受容体陽性」及び／又は「プロゲステロン受容体陽性」は、増殖細胞が前記ホルモン受容体を発現することを意味する。
【００４５】
本発明において、用語「侵攻性」は外科療法後の再発の高い可能性；平均値より下、又は中央値より下の、患者の生存期間；平均値より下の、又は中央値より下の無病生存期間；平均値より下、又は中央値より下の無再発生存期間；平均値より下の腫瘍関連合併症発生；腫瘍又は転移の速い進展；の１又はそれ以上を意味する。疾患の侵攻性により、適当な１の治療又は複数の治療が化学療法、放射性療法、外科療法、生物学的療法、免疫療法、抗体治療、分子標的薬物を使う治療、エストロゲン受容体モジュレータ治療、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ治療、アロマターゼ阻害剤治療、卵巣除去、LHRHアナログを与える治療、又は他のエストロゲン生成に影響する中枢作用薬物からなる群から選択されても良い。癌が「侵攻性」として特徴付けられる場合、限定はされないが化学療法のような治療が内分泌標的治療に加えて、又はこれに代わって提供されることが特に好ましい。従来技術において腫瘍の侵攻性基準の指標は、限定はされないが、腫瘍ステージ、腫瘍グレード、リンパ節の状態及び生存期間を含む。
【００４６】
特記されない限り、ここで用いられるように、用語「生存期間」は以下の全てを含むと考える：死亡までの生存期間、全生存期間としても知られている（前記死亡は原因に関わらない、又は乳房腫瘍に関連している、のどちらかである）；「無再発生存期間」（用語再発は、局所での、及び離れた場所での再発の両方を含む）；転移のない生存期間；無病（疾患）生存期間（用語疾患は、乳癌及びそれらに関連した疾患を含む）。前記生存期間の長さは定まった出発時点（例えば、診断時又は治療開始時）及び最終時点（例えば、死、再発、又は転移）を参照することによって計算されてもよい。
【００４７】
ここで使用されるように、用語「予後診断マーカー」は、疾患の予後の可能性の指標、特に乳房腫瘍の侵攻性及び転移潜在性を意味する。
【００４８】
ここで使用されるように、用語「予測マーカー」は療法への応答の指標を意味し、好ましくは前記応答は患者の生存期間により定義される。好ましくは、高い、低い、中間の長さの生存期間又は治療後の再発を有する患者を定義付けるために使用され、これは疾患の経路の本質的不均一性の結果である。
【００４９】
ここで定義されるように、用語予測マーカーは、幾つかの状況ではここに記載される「予後診断マーカー」の範囲内に入る場合もあり、例えば、予後診断マーカーが治療に応じて異なる生存期間結果を有する患者を識別する場合、前記マーカーはまた前記治療の予測マーカーでもある。従って、特記されない限り、２つの用語が相互に相容れないことはない。
【００５０】
ここで使用されているように、用語「発現」は遺伝子の転写及び翻訳、並びにマーカー遺伝子及び／又はその調節若しくはプロモータ領域に関連するゲノムDNAの遺伝的又は後成的変化を意味する。遺伝的変化はSNP、点変異、欠失、挿入、反復長、転位、及び他の多型を含む。タンパク質又はmRNAのいずれかの発現レベルの解析、或いは、患者の個体の遺伝的又は後成的マーカー遺伝子の変化の解析が、ここでは遺伝子の「発現」の解析としてまとめられる。
【００５１】
遺伝子の発現のレベルは、限定はされないが、メチル化解析、ヘテロ接合性の喪失（ここではLOHとも称される）、RNA発現レベル及びタンパク質発現レベルを含む遺伝子の転写及び翻訳のレベルに関連する又は示す因子の解析によって決定される。
【００５２】
さらには、転写された遺伝子の活性は、限定はされないが、遺伝的変化（限定はされないが、SNP、点変異、欠失、挿入、反復長、転位、及び他の多型）などの遺伝的変異によって影響されうる。
【００５３】
用語「内分泌治療」又は「内分泌療法」は、エストロゲン受容体経路又はエストロゲン合成経路又はエストロゲン変換経路を標的とする療法、単一の治療、又は複数の治療を含むことを意味し、これらはエストロゲン代謝、生成又は分泌に必要である。前記治療は、限定はされないが、エストロゲン受容体モジュレータ、エストロゲン受容体ダウンレギュレータ、アロマターゼ阻害剤、卵巣除去、LHRHアナログ、及びエストロゲン生成に影響する中枢作用薬剤を含む。
【００５４】
用語「単独療法」は、単一の薬物の使用又は他の療法を意味する。
【００５５】
本発明において、用語「化学療法」は癌を治療するための医薬品又は化学物質の使用を意味する。この定義は、放射性療法（高エネルギー光線又は粒子を用いた治療）、ホルモン療法（ホルモン又はホルモンアナログを用いた治療）及び外科治療を除く。
【００５６】
本発明において、用語「補助治療」は最初の非化学療法剤の療法、例えば外科療法のすぐ後の癌患者の治療を意味する。一般的に、補助療法の目的は再発の危険を減らすことである。
【００５７】
本発明において、用語「患者に好適な治療計画を決定する」とは、本発明の解析結果に基づいて、又は本質的にこれに基づいて、又は少なくとも部分的にはこれ基づいて、開始され、変更され、及び／又は終了される、患者のための治療計画（すなわち、患者における癌の予防及び／又は治療に用いられる単一の療法、或いは異なる療法の組み合わせ）の決定を意味する。１つの例は、外科療法の後、補助内分泌療法を開始することであり、もう１つは、特定の化学療法の用量を変更することである。 決定は、本発明による解析結果に加えて、治療される対象の個人的特性に基づくことが可能である。ほとんどの場合において、対象に好適な治療計画の実際の決定は、在籍する内科医又は医者によって実行される。
【００５８】
本発明において、用語「生物学的試料を得る」又は「対象から試料を得る」とは、個体からの試料の活性な回収、例えば生検の実行を含まない。前記用語は、個体から先に単離された試料の取得を意味する。前記試料は、限定はされないが、生検、外科的除去、吸引により単離された体液を含む、従来技術における標準の手段によって単離されうる。さらに、前記試料は、臨床医、宅配業者、商業的試料の提供者、及び試料収集者を含む３つの関係者によって提供されうる。
【００５９】
本発明において、用語「CpGアイランド」は（１）「観察／予測比」＞0.6に対応するCpGジヌクレオチドの頻度を有し、（２）「GC含有量」＞0.5を有する標準を満たすゲノムDNAの連続領域を示す。CpGアイランドは典型的に、しかし常にではないが、約0.2から約1kbの長さの間にある。
【００６０】
本発明において、遺伝子の、用語「調節領域」は遺伝子の発現に影響するヌクレオチド配列を意味する。前記調節領域は前記遺伝子内、近位、又は遠位に位置しうる。前記調節領域は、限定はされないが、構成的プロモータ、組織特異的プロモータ、発生特異的プロモータ、誘導性プロモータ等を含む。プロモータ調節エレメントもまた、遺伝子の転写又は翻訳効率を制御する特定のエンハンサー配列エレメントを含んでもよい。
【００６１】
本発明において、用語「メチル化」はDNA配列内の１又は複数のCpGジヌクレオチドにおける5-メチルシトシン（「5-mCyt」）の存在、又は不存在を示す。
【００６２】
本発明において、用語「メチル化状態」は対象となる核酸に存在するメチル化の度合いを意味し、これは絶対的又は相対的用語において表現され得、すなわちパーセント若しくは他の数値、又は他の組織との比較、及び高メチル化、低メチル化のようにここで記載され、有意に類似の又は同一のメチル化状態を有するとして表現される。
【００６３】
本発明において、用語「ヘミ‐メチル化」又は「ヘミメチル化」はCpGメチル化部位のメチル化状態を示し、二重鎖のCpGメチル化部位の２つのCpGジヌクレオチド配列のうちの１つにおいて単一のシトシンのみがメチル化されている（例えば、5'-NNCMGNN-3' （上側の鎖）：3'-NNGCNN-5'（下側の鎖））。
【００６４】
本発明において、用語「高メチル化」は、試験DNA試料のDNA配列内の１又は複数のCpGジヌクレオチドでの5-mCytが、正常対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて見られる5-mCytの量に対して、増大して存在しているのに対応する平均メチル化状態を示す。
【００６５】
本発明において、用語「低メチル化」は、試験DNA試料のDNA配列内の１又は複数のCpGジヌクレオチドでの5-mCytが、正常対照DNA試料内の対応するCpGジヌクレオチドにおいて見られる5-mCytの量に対して、低減して存在しているのに対応する平均メチル化状態を示す。
【００６６】
本発明において、用語「マイクロアレイ」は「DNAマイクロアレイ」、及び「DNAチップ」の両方を広く示し、従来技術において認識されるように、全ての従来技術の認識する固体支持体を包含し、それに核酸分子を貼りつける又はその上で核酸を合成する全ての方法を包含する。
【００６７】
「遺伝的パラメータ」は、遺伝子の変異及び多型、並びにそれらの調節に更に必要とされる配列である。遺伝的変化又は変異として明示されることは、特に、挿入、欠失、点変異、反転、及び多型であり、特に好ましくはSNP（一塩基多型）である。
【００６８】
「後成的変化」又は「後成的パラメータ」はゲノムDNAのDNA塩基の変化、及びそれらの調節にさらに必要である配列、特に、そのシトシンのメチル化である。さらに、後成的パラメータは、例えば、記載された方法を用いて直接的には解析されることができないが、次にDNAメチル化に関連するヒストンのアセチル化を含む。
【００６９】
本発明において、用語「重亜硫酸塩試薬」とは、重亜硫酸、二硫酸塩、硫酸水素塩又はそれらの組み合わせを含む試薬を示し、メチル化CpGジヌクレオチド配列と非メチル化CpGジヌクレオチド配列を区別するのにここで開示されるように有用である。
【００７０】
本発明において、用語「メチル化分析」とはDNAの配列内の１又はそれ以上のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定する全ての分析を示す。
【００７１】
本発明において、用語「MS.AP-PCR」（Methylation-Sensitive Arbitrarily-Primed Polymerase Chain Reaction）は、CpGジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に焦点をしぼるために、CG-リッチプライマーを用いるゲノムの全体的スキャンを可能にする従来技術の認識する技術を示し、これはGonzalgoら、Cancer Research 57:594-599, 1997によって記載される。
【００７２】
本発明において、用語「MethyLightTM」はEadsら、Cancer Res. 59:2302-2306, 1999によって記載される従来技術が認識する蛍光ベースのリアルタイムPCRを示す。
【００７３】
本発明において、用語「HeavyMethylTM」分析は、ここで実行されたその実施例において、増幅プライマー間のCpG位置をカバーするメチル化特異的ブロックキングプローブを含むメチル化分析を示す。
【００７４】
用語「Ms-SNuPE」（Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension）は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997によって記載される従来技術の認識する分析を示す。
【００７５】
本発明において、用語「MSP」（メチル化特異的PCR（Methylation-specific PCR））は、Hermanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996、及び米国特許No. 5,786,146によって記載される従来技術の認識する分析を示す。
【００７６】
本発明において、用語「COBRA」（Combined Bisulfite Restriction Analysis）は、Xiong & Laird、Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997によって記載される従来技術の認識するメチル化分析を示す。
【００７７】
本発明において、用語「ハイブリダイゼーション」は、二重鎖構造を形成している試料DNA中のワトソン‐クリック塩基対の線に沿って相補的な配列へのオリゴヌクレオチドの結合として理解されていることである。
【００７８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ここで記載されているように、68℃で5×SSC/5×デンハルト溶液／1.0% SDS中でハイブリダイズさせ、室温で0.2×SSC/0.1% SDSで洗浄し、又は従来技術が認識するそれらの同等のものを含む（例えば、60℃で2.5×SSC緩衝液中でハイブリダイゼーションを実行し、37℃で低濃度の緩衝液で数回洗浄する工程が続き、そして安定なままである条件）。中程度のストリンジェントな条件とは、ここで定義するように、3×SSC中で42℃で洗浄することを含み、又は従来技術が認識するそれと同等のものを含む。塩濃度及び温度のパラメータは、プローブと標的核酸との同一性の最適なレベルを達成するために変更可能である。そのような条件に関する手引きは従来技術で利用可能であり、例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；及びAusubelら(編), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.)、Unit 2.10である。
【００７９】
「バックグラウンドDNA」はここで使用されるように、乳房細胞以外の他の原料から生じる全ての核酸を示す。
【００８０】
ここに記載されている方法及び核酸を用いて、患者の再発、無病生存期間、無転移生存期間、全生存期間及び／又は疾患の進展性の統計的に有意なモデルが開発でき、治療計画において含まれる好適な治療選択肢の決定において患者と臨床医を助けるのに活用できる。
【００８１】
一面では、本方法は、乳房組織の細胞増殖障害のための予後診断マーカーを提供する。好ましくは、この予後診断は再発；患者の全生存期間；無転移生存期間；無病生存期間又は疾患の進展の可能性からなる群より選択される結果について提供される。
【００８２】
本発明のさらに一側面では、前記マーカーはエストロゲン受容体経路を標的とする、又は、乳房組織の細胞増殖障害を患う患者のための療法としてエストロゲン代謝、生成、分泌に必要である治療の結果の予測マーカーとして使用される。本方法のこの側面により、内科医が前記内分泌治療に加えて、又はその代わりにどの治療が使用するかを決定することが可能になる。前記追加の治療は、限定はされないが、化学療法のような、より積極的な療法であることが好ましい。従って、本発明は現存の乳房細胞増殖障害の予後診断、予測及び治療応答予測方法に関連する問題を減少させることがわかる。
【００８３】
ここに記載の方法及び核酸を用いて、患者の生存期間は、疾患のありそうな進展について患者及び内科医に基準の情報を提供するために、乳癌組織の細胞増殖障害についての治療の前又は最中に評価されうる。従って、ここに例示される方法及び核酸は、患者と内科医の両方が患者の治療の選択肢のより正確な判定ができるようにすることによって、患者の生活の質と治療成功の見込みを向上するために役立ちうる。
【００８４】
ここで記載される方法は、閉経の前及び後の両方、リンパ節又はエストロゲン受容体状態に関わらず、全ての乳癌細胞増殖障害患者の治療の向上のために使用されうる。しかしながら、前記患者はリンパ節陰性及びエストロゲン受容体陽性であることが特に好ましい。
【００８５】
本発明は、患者の生存期間の予測の向上を可能にすることによって、特に補助内分泌治療のある、なしの両方で、外科療法後の再発の可能性を予測することによって、乳房細胞増殖障害の向上した治療のための方法を利用可能にする。さらに、本発明は、内分泌療法による治療結果の向上した予測のための手段と提供し、前記療法はエストロゲン状態経路、又はエストロゲン代謝、生成、分泌に必要である１又はそれ以上の治療を含む。
【００８６】
本発明による方法は、限定はされないが、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、非浸潤性小葉癌、面皰癌、炎症性癌、粘液癌、硬癌、colloid癌、管状癌、髄様癌、化生癌、乳頭癌、及び非浸潤性乳頭癌、未分化又は退形成癌及び、 及び乳房のパジェット病を含む、広く種々の乳房組織の細胞増殖障害の解析に使用されうる。
【００８７】
本発明による方法は、乳房細胞増殖障害患者の予後診断を提供するのに使用され得、さらに前記方法は、内分泌療法による治療後の患者の生存期間及び／又は再発の予測を提供するために使用されうる。
【００８８】
ここで開示されたマーカー、方法、及び核酸が予後診断マーカーとして使用される場合、前記予後診断は患者の生存期間及び／又は再発の点から見て、定義されていることが特に好ましい。この実施態様において、患者の生存期間の時間及び／又は再発はそれらの遺伝子発現又はそれらの遺伝的若しくは後成的変化によって予測される。本発明のこの側面において、全ての補助内分泌治療を受ける前に、前記患者が試験されることが特に好ましい。
【００８９】
ここで開示されたマーカー、方法、及び核酸が予測マーカーとして用いられる場合、図１に示すように、例えば外科療法のような最初の非化学療法剤の療法に、２次療法として内分泌治療を受ける患者の結果の予測に応用される（以下では「補助設定」とも称される）。かかる治療はステージ１〜３の乳房癌腫を患う患者にしばしば処方される。患者の生存期間及び／又は再発に関して、前記「結果」が定義されることもまた好ましい。
【００９０】
この実施態様において、患者の生存期間の時間及び／又は再発はそれらの遺伝子発現又はそれらの遺伝的若しくは後成的変化によって予測される。平均値より下、若しくは中央値より下の無転移生存期間若しくは無病生存期間の時間、及び／又は、再発の可能性が高い患者を検出することによって、内科医は内分泌標的療法の代わりに、又はこれに加えて、特に限定はされないが化学療法といった更なる治療を患者に薦めることを選びうる。 
【００９１】
ここに記載される発明は、新規な乳癌細胞増殖障害に予後診断及び予測の生物マーカーを提供する。
【００９２】
遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域の異常な発現が乳房細胞増殖障害患者、特に乳房癌腫のエストロゲン治療の予後診断及び／又は結果予測に関連していることが、ここに記載される。
【００９３】
このマーカーは、それによって、乳房細胞増殖障害の性質決定をする新規手段を提供する。ここに記載されるように、遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域の発現の決定は、乳房組織の増殖障害を有する患者の予後の予測を可能にする。代わりの実施態様において、遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域の発現はエストロゲン受容体、合成、若しくは変換経路を標的とするか、それ以外ではエストロゲン代謝、生成、分泌に必要である１又はそれ以上の治療により治療された患者の治療応答の予測を可能にする。
【００９４】
ここに記載される発明は、それによって、エストロゲン受容体経路を標的とし、又はエストロゲン代謝、生成、若しくは分泌に必要である１又はそれ以上の治療により適当に治療されうる個体の、前記治療に加えて他の療法により付加的に治療される個体からの区別にも有用である。好ましくは「他の治療」は、限定はされないが、化学療法又は放射性療法を含む。前記予後診断及び／又は治療応答が再発、生存期間又は結果の可能性に関して示されることが特に好ましい。 
【００９５】
本発明の更なる実施態様において、遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域を含む複数の遺伝子の異常な発現が解析される。前記複数の遺伝子は以下ではまた「遺伝子パネル」とも称される。多数の遺伝子の解析はエストロゲン治療の提供された予後診断及び／又は結果予測の正確さを増大させる。遺伝子パネルは、乳房癌腫患者の治療応答の予後診断及び／又は予測に関連する７つ以下の遺伝子及び／又はそれらのプロモータ領域からなることが好ましい。前記パネルは、遺伝子PITX2及び、ABCA8、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3及びTFF1から選択される１又はそれ以上の遺伝子、及び／又はそれらの調節領域からなることが更に好ましい。遺伝子パネルは以下からなる遺伝子パネルの群から選択されることが特に好ましい：
・PITX2、PLAU及びTFF1 
・PITX2及びPLAU
・PITX2及びTFF1 
【００９６】
PITX2及びTFF1を含む遺伝子パネルは内分泌治療による患者の治療の結果を予測するのに用いられることが特に好ましい。PITX2及びPLAUを含む遺伝子パネルは患者の予後診断を提供するのに用いられることが特に好ましい。前記患者は全ての内分泌治療を受ける前に解析されることが好ましい。
【００９７】
更なる実施態様において、本発明は乳房細胞増殖疾患と診断された患者の予後診断についての新しい方法及び配列に関する。更なる側面において、本発明は新しい方法及び配列に関し、それは再発、生存期間又は結果のの可能性の予測に基づいて乳房細胞増殖疾患と診断された患者の好適な治療を選択するためのツールとして使用されうる。
【００９８】
更に詳細には、本発明は乳房細胞増殖疾患と診断された患者についての新しい方法及び配列を提供し、これは好適な補助療法の選択の向上を可能にする。さらに、内分泌単独療法後に不良予後である患者が内分泌療法に加えて、又はその代わりに化学療法を受けることが好ましい。
【００９９】
本発明の一面は、乳房組織の細胞増殖障害を有する患者の内分泌治療の予後診断及び／又は結果予測を提供する方法の提供である。好ましくは、前記予後診断及び／又は予測は前期患者の再発若しくは生存期間の可能性に関して与えられる。前記生存期間が無病生存期間又は無転移生存期間であることが更に好ましい。前記疾患が乳癌であることもまた好ましい。これらの方法は遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節領域の発現レベルの解析を含む。
【０１００】
更なる実施態様において、方法は遺伝子PITX2及び、ABCA8、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3及びTFF1からなる群より選択される１又はそれ以上の遺伝子、及び／又はそれらの調節領域を含む「遺伝子パネル」の発現の解析を含む。前記遺伝子パネルは以下からなる遺伝子パネルの群より選択されることが特に好ましい：
・PITX2、PLAU及びTFF1 
・PITX2及びPLAU
・PITX2及びTFF1 
【０１０１】
PITX2及びTFF1を含む遺伝子パネルの発現は、内分泌治療による患者の治療の結果を予測するために決定されることが特に好ましい。PITX2及びPLAUを含む遺伝子パネルの発現は患者の予後診断を提供するために決定されることもまた特に好ましい。前記患者は全ての内分泌治療の前に解析されることが好ましい。
【０１０２】
発現の決定は従来技術で標準である任意の手段によって達成されうるが、しかしながら、LOH、メチル化、タンパク質発現、mRNA発現、ゲノム配列の遺伝的又は他の後成的変化の解析によって達成されることが最も好ましい。
【０１０３】
特に好ましいのは、配列番号149に示された遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域のゲノム配列のDNAメチル化プロファイルの解析である。更に好ましいのは、配列番号149の以下の部位内：ヌクレオチド2,700-ヌクレオチド3,000；ヌクレオチド3,900-ヌクレオチド4,200；ヌクレオチド5,500-ヌクレオチド8,000；ヌクレオチド13,500-ヌクレオチド14,500；ヌクレオチド16,500-ヌクレオチド18,000；ヌクレオチド18,500-ヌクレオチド19,000；ヌクレオチド21,000-ヌクレオチド22,500のCpG位置のメチル化状態の解析である。特に好ましいのは、配列番号1、13、18及び19に示される前記配列番号149の４つのサブ配列にカバーされる、８つの特異的CpGジヌクレオチドのメチル化状態の解析である。該方法はPITX2及び、ABCA8、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3及びTFF1から選択される１又はそれ以上の遺伝子、及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域を含む遺伝子パネルの解析を含む場合、前記遺伝子の配列は表１に記載の配列番号69から配列番号75及び配列番号150からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０４】
この方法論は、該方法がエストロゲン及び／又はプロゲステロン受容体の状態に関わらずいかなる対象にも適用されうるという点で、従来技術の現状に更なる進歩を与える。従って、好ましい実施態様において、対象はエストロゲン又はプロゲステロン受容体の状態について試験される必要がない。
【０１０５】
本発明の更なる側面において、開示された事項は前記遺伝子内のメチル化の解析に有用な新規核酸配列を提供し、他の側面は乳房細胞増殖疾患と診断された患者の内分泌治療の予後診断を提供し及び／又は結果予測をすることを目的とする該遺伝子及び遺伝子産物の新規使用並びに、方法、分析、及びキットを提供する。
【０１０６】
１つの実施態様において、本発明は、遺伝子PITX2及び／又はその調節領域の発現の解析によって、乳房細胞増殖疾患を患っている患者の内分泌治療の予後診断を提供する、及び／又は結果を予測する方法を開示する。好ましくは、前記内分泌治療は補助内分泌単独療法である。前記方法は、限定はされないが、mRNA発現解析、又はタンパク質発現解析を含む任意の遺伝子発現解析によって、或いは（LOHを含む）代わりの発現を導く遺伝的変化の解析によって可能でありうる。しかしながら、本発明の最も好ましい実施態様においては、前記発現は遺伝子PITX2及びそのプロモータ又は調節エレメント内のCpG部位のメチル化領域の解析によって決定される。
【０１０７】
本方法の一実施態様において、遺伝子PITX2及び／又はそのパネルの異常な発現は、遺伝子のヘテロ接合型の喪失の解析によって検出されてもよい。第１工程において、DNAは患者の腫瘍の生物学的試料から単離される。単離されたDNAは限定はされないが遺伝子座又は関連したマイクロサテライトマーカーの増幅を含む従来技術の標準である任意方法によってLOHについて解析される。前記増幅は、ポリメーラーゼチェーン反応（PCR）、鎖置換増幅（SDA）及び等温増幅を含む従来技術の標準である任意の方法によって実行されてもよい。
【０１０８】
次いで、増幅のレベルが、限定はされないがゲル電気泳動及びプローブによる検出（リアルタイムPCRを含む）を含む従来技術において知られている方法によって検出される。さらに、増幅は前記検出を助けるために、標識されてもよい。好適な検出可能な標識は、限定はされないが蛍光標識、放射性標識、及びマスラベルを含み、それらの好適な使用はここに記載される。
【０１０９】
ヘテロ接合性の対照試料に関して、試験試料における増幅された対立遺伝子の１つに対応する増幅物の量の減少の検出は、LOHを示す。
【０１１０】
乳癌再発のための検出系において、PITX2及び／又は前記遺伝子を含むパネルをコードするmRNAのレベルを検出するために、試料が患者から得られる。前記試料の取得は、生検の実行におけるような試料の回収というよりはむしろ、意図された用途に関連する特定の組織を表す単離された生物学的材料の利用可能性を目的とすることを意味することが好ましい。試料としては、外科的に除去された腫瘍からの腫瘍組織試料、外科医により取得され分析者に提供されるような生検試料、又は、血液、血漿、血清等の試料が可能である。試料は、その中に含まれる核酸を抽出するために処理されてもよい。試料から生じた核酸は、ゲル電気泳動又は他の分離技術に供される。検出は、プローブとして働くDNA配列と、試料の核酸、及び特にmRNAを接触させて、ハイブリッド二重鎖を形成させることを要する。ハイブリダイゼーションのスントリンジェントさは、ハイブリダイゼーション中及び洗浄手順中の、温度、イオン強度、時間の長さ、及びホルムアミドの濃度を含む多数の因子によって決定される。こららの因子は、例えばSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989）に概要がある。得られた二重鎖の検出は、通常、標識プローブの使用によって達成される。代わりに 、プローブが標識されていなくてもよいが、標識されたリガンドとの特異的結合によって、直接的にもしくは間接的に検出可能であってもよい。好適な標識及びプローブ及びリガンドを標識する方法は、従来技術で知られており、例えば既知の方法（例えば、ニックトランスレーション、又はkinasing）によって組み入れられうる放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学蛍光基（例えばジオキセタン、特にトリガーされたジオキセタン）、酵素、抗体等を含む。
【０１１１】
PITX2及び／又は前記遺伝子を含むパネルをコードするmRNAの試料における検出の感度を増大させるために、逆転写／ポリメラーゼチェーン反応の技術がPITX2及び／又は前記遺伝子を含むパネルをコードするmRNAから転写されたcDNAを増幅させるために用いられることができる。逆転写／PCRの方法は従来技術で公知である（例えば、Watson及びFleming, supraを参照）。
【０１１２】
逆転写／PCR法は次のようにして実行されることができる。細胞全RNAを例えば標準的グアニジンイソシアネート法によって単離し、全RNAを逆転写する。逆転写法は逆転写酵素及び3'プライマーを用いた、RNAの鋳型におけるDNAの合成を伴う。典型的には、プライマーはオリゴ(dT)配列を含みむ。このようにして生成されたcDNAは、次いでPCR法を用いて増幅され、PITX2及び／又は前記遺伝子を含むパネルの特異的プライマーを用いて増幅される（Belyavsky ら、Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989；Krug及びBerger、Methods in Enzymology, Academic Press,N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987、これは参照によってここに組み込まれる）。
【０１１３】
本発明はまた、生物学的試料の試験により、補助内分泌単独療法のある又はない、外科的腫瘍除去の前又は後の、乳癌患者の再発及び／又は生存期間の可能性を予測するのに使用されるキットとして、ある実施態様において記載される。代表的キットはPITX2 mRNA及び／又は前記PITX2を含むパネルの遺伝子からのmRNAに選択的にハイブリダイズする上記のような１又はそれ以上の核酸、及び、１又はそれ以上の核酸セグメントの各々についての容器を含んでもよい。ある実施態様においては、核酸セグメントは単一のチューブ中に混合されていてもよい。更なる実施態様において、核酸セグメントはまた、標的mRNAを増幅するための１のプライマー対を含んでいてもよい。かかるキットはまた、緩衝液、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、又はハイブリダイゼーション、増幅、もしくは検出反応用の他の成分を含んでいてもよい。好ましいキット成分は、逆転写PCR、in situ ハイブリダイゼーション、ノザン解析及び／又はRPA用の試薬を含む。
【０１１４】
本発明は、さらに、患者から得られた試料中に、PITX2及び／又は前記タンパク質を含むパネルのポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。前記配列は図１０に示されるような配列と本質的に同じであることが好ましい。タンパク質を検出するための従来技術で既知の任意の方法が用いられることができる。かかる方法は、限定はされないが、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫化学法、バインダ−リガンド分析（binder-ligand assay）、免疫組織学技術、凝集、及び補体分析（complement assay）を含む（例えば、Basic and Clinical Immunology, Sites及びTerr編, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991を参照、これは参照によりここに組み込まれる）。好ましいのは、PITX2及び／又はそのパネルの１又は複数のエピトープと抗体を反応させ、標識PITX2タンパク質及び／又はそのパネル又はそれらの誘導体を競合的に置換することを含むバインダ−リガンド免疫分析法（binder-ligand immunoassay method）である。
【０１１５】
本発明のある実施態様は、遺伝子PITX2及び前記遺伝子を含むパネルによってコードされるポリペプチドに特異的である抗体の使用を含む。かかる抗体は、PITX2マーカー発現及び／又はPITX2を含むパネルの発現の患者のレベルを、正常な個体における同じマーカーの発現と比較することによって、好ましくは補助内分泌単独療法下での、乳癌患者の再発及び／又は生存期間の可能性の予後を提供するのに有用でありうる。ある実施態様において、モノクローナル又はポリクローナル抗体の生成はPITX2及び／又はパネルの他のポリペプチドの抗原としての使用によって誘導されることができる。かかる抗体は、順次、補助内分泌単独療法下での乳癌患者の再発の予後に関するマーカーとして発現したタンパク質を検出するのに使用されてもよい。患者の末梢血液に存在するかかるタンパク質のレベルは、従来の方法によって定量してもよい。抗体−タンパク質結合は、従来技術において知られている種々の方法、例えば、蛍光又は放射活性リガンドで標識することによって検出され、定量されうる。本発明は上記の手順を実行するためのキットをさらに含み、ここでかかるキットはPITX2及び／又はそれらの遺伝子パネルのポリペプチドに特異的な抗体を含む。
【０１１６】
多くの競合的及び非競合的タンパク質結合免疫分析は、従来技術でよく知られている。かかる分析に用いられる抗体は、例えば凝集試験に用いられるように非標識でもよいし、広く種々の分析方法に用いるために標識されていてもよい。ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素免疫分析、例えば、酵素結合免疫吸着分析（ELISA）、蛍光免疫分析等に用いるために、標識は放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、酵素基質、又は補因子、酵素阻害物質、粒子、色素等を含むことができる。PITX2及び／若しくはそれらのパネル又はそれらのエピトープに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体は、従来技術で既知の多くの方法のいずれによっても、免疫分析に用いるために作製されることができる。あるタンパク質に対する抗体を調製する１つの方法は、タンパク質の全て又は一部のアミノ酸配列の選択及び調製、その配列の化学合成、及びそれを適切な動物、通常ウサギ又はマウスに注射することである（Milstein及びKohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre及び Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone及びBanatis編, Academic Press, 1981、これらは参照によりここに組み込まれる）。PITX2及び／又はそれらのパネル、又はそれらのエピトープの調製の方法は、限定はされないが、化学合成、組み換えDNA技術、又は生物学的試料からの単離を含む。
【０１１７】
一側面において、本発明は、それが補助内分泌単独療法下の乳癌患者の再発又は生存期間の可能性を予測するのに用いられることのできる、最初の１つのマーカーであるという点で、従来技術の現状に著しい進歩を提供する。
【０１１８】
本発明の最も好ましい実施態様において、発現の解析はメチル化解析によって実行される。配列番号149によるゲノム配列及びそれに相補的な配列内のCpGジヌクレチドのメチル化状態が解析されることがさらに好ましい。配列番号149は遺伝子PITX2並びにそのプロモータ及び調節エレメントを開示し、前記フラグメントは内分泌治療特異的メチル化パターンの、予後診断を示す、及び／又は結果を予測するCpGジヌクレオチドを含む。更に好ましいのは、配列番号149の以下の部位内：ヌクレオチド2,700-ヌクレオチド3,000；ヌクレオチド3,900-ヌクレオチド4,200；ヌクレオチド5,500-ヌクレオチド8,000；ヌクレオチド13,500-ヌクレオチド14,500；ヌクレオチド16,500-ヌクレオチド18,000；ヌクレオチド18,500-ヌクレオチド19,000；ヌクレオチド21,000-ヌクレオチド22,500のCpG位置のメチル化状態の解析である。配列番号1に示される遺伝子PITX2のサブ配列の解析もまた好ましい。
【０１１９】
該方法が、遺伝子及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域、並びにABCA、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3及びTFF1からなる群より選択された１又はそれ以上の遺伝子を含む「遺伝子パネル」の発現の解析を含む場合、前記発現の解析はメチル化解析によって実行されることが、ほとんど最も好ましい。以下を含む遺伝子パネルの群から選択される遺伝子パネルのCpGメチル化が解析されることが特に好ましい： 
・PITX2、PLAU及びTFF1 
・PITX2及びPLAU
・PITX2及びTFF1。
【０１２０】
PITX2及びTFF1を含む遺伝子パネルのメチル化は内分泌治療による患者の治療の結果を予測するために決定されることが特に好ましい。PITX2及びPLAUを含む遺伝子パネルのメチル化は患者の予後診断を提供するために決定されることもまた特に好ましい。前記患者は全ての内分泌治療の前に解析されることが好ましい。
【０１２１】
PITX2及びここにあるような選択された他の遺伝子及び／又はそれらの配列の高メチル化は、乳房細胞増殖障害、最も好ましくは乳房癌腫の内分泌治療の、不良な予後診断及び／又は結果に関連している。
【０１２２】
遺伝子PITX2及びそのプロモータ及び調節エレメントのメチル化パターンは、これまで、乳房細胞増殖障害と診断された患者の内分泌治療の予後診断又は結果の予測に関して解析されたことがなかった。遺伝コードの縮重により、配列番号149に特定されるような配列が、PITX2によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモータ領域の上流に、全ての実質的に類似及び等価である配列を含むように解釈される。
【０１２３】
最も好ましくは、以下の方法は遺伝子PITX2及び／又はその調節若しくはプロモータ領域内のメチル化を検出するのに用いられ、ここで前記メチル化核酸は過剰のバックブラウンドDNA中に存在し、バックグラウンドDNAが検出されるDNAの濃度の100〜1000倍存在する。
【０１２４】
メチル化の解析方法は、少なくとも１つの試薬又は一連の試薬に対象から得られた核酸を接触させることを含み、ここで前記試薬又は一連の試薬は、標的核酸内のメチル化と非メチル化CpGジヌクレオチドを区別する。
【０１２５】
好ましくは、前記方法は以下の工程を含む：第１工程において、解析される組織の試料が得られる。原料はいかなる好適な原料であってもよく、好ましくは試料の原料は組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、血清、糞便、尿、血液、乳頭吸引物及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましくは、原料は腫瘍組織、生検、血清、尿、血液、又は乳頭吸引物である。最も好ましい原料は、患者から外科的に除去された又は前記患者の生検試料からの腫瘍試料である。
【０１２６】
DNAは、次いで、試料から単離される。ゲノムDNAは、商業的に利用可能なキットの使用を含む従来技術の標準である任意の方法によって単離されてもよい。簡単には、対象となるDNAが細胞膜内／細胞膜によって包まれている場合、生物学的試料は酵素的、化学的、又は物理的手段によって粉砕、溶解されなくてはならない。DNA溶液は、次いで、タンパク質及び他の汚染物質を、例えばプロテアーゼKによる分解により取り除かれてもよい。ゲノムDNAは次いで、 溶液から回収される。これは、塩析、有機的抽出、又は固相支持体へのDNAの結合を含む種々の手段によって実行されうる。方法の選択は、時間、損失、及びDNAの必要な量を含むいくつかの因子によって影響をうける。
【０１２７】
ゲノムDNA試料は、次いで、5'位置でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、又は、ハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンとは異なる他の塩基に変換する様式で処理される。これは「処理」又は「前処理」としてここで理解される。
【０１２８】
上記のゲノムDNAの前処理は好ましくは、重亜硫酸塩（硫酸水素塩、二硫酸塩）を用いて行われ、続いて非メチル化シトシン核酸塩基の、ウラシル又は塩基対形成挙動に関してシトシンとは異なる他の塩基への変換を生じるアルカリ分解が行われる。アガロースマトリックスへの解析されるDNAの封入、それによるDNAの拡散及び復元の防止（重亜硫酸塩は一本鎖DNAとしか反応しない）、全ての沈殿物の除去、及び早い透析による精製工程（Olek Aら, A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996）が、前記前処理を実行する方法の１つの好ましい例である。重亜硫酸塩処理はラジカルスカベンジャー又はDNA変性剤の存在下で行われることがさらに好ましい。
【０１２９】
処理済みDNAは次いで、内分泌治療の予後診断及び／又は結果に関連して、（治療前の）遺伝子PITX2及び／又はその調節領域のメチル化状態を決定するために解析される。該方法の更なる実施態様において、遺伝子PITX2及び／又はその調節領域のメチル化状態、並びにABCA8、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3及びTFF1を含む群から選択される１又はそれ以上の遺伝子、及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域のメチル化状態が決定される。PITX2、PLAU及びTFF1；PITX2及びPLAU；PITX2及びTFF1を含む遺伝子パネルの群より選択される遺伝子パネルのメチルか状態が決定されることが特に好ましい。添付の配列表（表３参照）に記載の前記遺伝子の配列が解析されることが更に好ましい。
【０１３０】
該方法の第３の工程において、前処理されたDNAのフラグメントは増幅される。DNAの原料が血清からの遊離DNAや、パラフィンから抽出されたDNAである場合、増幅物フラグメントの大きさは100と200塩基対長の間であることが特に好ましく、前記DNA原料が細胞原料（例えば、組織、生検、細胞株）から抽出される場合、増幅物は100と350塩基対長の間であることが好ましい。前記増幅物は、少なくとも３つのCpGジヌクレオチドを含む少なくとも20塩基対の配列を含むことが特に好ましい。前記増幅物は、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドのセット、及び好ましくは熱安定性ポリメラーゼを用いて行われる。いくつかのDNAセグメントの増幅は、１つの同じ反応容器で同時に行うことができ、該方法の一実施態様において、６又はそれ以上のフラグメントが同時に増幅される。典型的には、増幅物はポリメラーゼチェーン反応（PCR）を用いて行われる。プライマーオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号2-5、配列番号76から配列番号103及び配列番号151から配列番号158の塩基配列及びこれらに相補的な配列の少なくとも18塩基対長セグメントに、各々、逆相補的、同一、又はストリンジェント、若しくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１３１】
該方法の好ましい実施態様において、プライマーは配列番号6から配列番号10からなる群から選択されてもよい。
【０１３２】
該方法の代わりの実施態様において、配列番号1、配列番号60から配列番号75、配列番号149及び配列番号150を含む核酸配列内の予め選択されたCpG位置のメチル化状態は、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドによって検出されてもよい。この技術（MSP）は、Hermanの米国特許No. 6,265,171に記載されている。メチル化状態特異的プライマーの、重亜硫酸塩処理DNA増幅のための使用は、メチル化と非メチル化核酸との区別を可能にする。MSPプライマー対は、重亜硫酸塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。従って、前記プライマーの配列は、少なくとも１つのCpG、TpG又はCpAジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに特異的なMSPプライマーは、CpG中のC位置の3'位置における「T」を含む。好ましくは、従って、前記プライマーの塩基配列は、配列番号2から配列番号5、及び配列番号151、152、155及び156及びこれらに相補的な配列による前処理された核酸配列にハイブリダイズする少なくとも18ヌクレオチドの長さを有する配列を含むことを必要とし、ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのCpG、tpG又はCpaジヌクレオチドを含む。本発明による方法の一実施態様において、MSPプライマーは2と4の間のCpG、tpG又はCpaジヌクレオチドを含むことが特に好ましい。前記ジヌクレオチドは、例えばプライマーが18塩基長である場合、特定のジヌクレオチドが分子の3'末端からの最初の9塩基内に存在するプライマーの3'の半分内に局在することが更に好ましい。CpG、tpG又はCpaジヌクレオチドに加えて、前記プライマーがいくつかの重亜硫酸塩変換塩基（すなわち、チミンに変換されたシトシン、又はハイブリダイズ鎖においてアデニンに変換されたグアニン）を更に含むことが更に好ましい。更なる実施態様において、前記プライマーは多くても２シトシン又はグアニン塩基を含むように設計される。
【０１３３】
増幅によって得られたフラグメントは、直接又は間接的に検出可能な標識を持つことができる。好ましいのは、蛍光標識、放射性核種、又は、質量分析計で検出されることの可能な典型的質量を有する分離可能な分子フラグメントの形態の標識である。前記標識がマスラベルである場合、標識された増幅産物は質量分析計でより良い検出性能のために、１つの正又は負の正味の電荷を有することが好ましい。検出は例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析計（MALDI）よって、又は、電子スプレー質量分析計（ESI）を用いて実行され、可視化される。
【０１３４】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析計（MALDI-TOF）は生体分子の解析に極めて有効な開発である（Karas及びHillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988）。分析物は光吸収マトリックスに包埋される。マトリックスは短いレーザーパルスによって蒸着され、分析物分子をフラグメント化されない様式で蒸気相へ運ぶ。分析物は、マトリックス分子との衝突によりイオン化される。負荷電荷は、イオンをフィールドフリー飛行管へ加速する。それらの異なる質量により、イオンは異なる速度で加速される。小さいイオンは大きいものより早く検出器に到達する。MALDI-TOF分析計は、ペプチド及びタンパク質の解析によく適している。核酸の解析は、幾分か難しい（Gut及びBeck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995）。核酸解析に関する感度は、ペプチドよりもほぼ100倍悪く、フラグメントの大きさが増すにつれて不均一に減少する。さらに、多数の負に電荷された骨格を有する核酸に関して、マトリックスを介したイオン化工程は、効率を著しく減少させる。MALDI-TOF分析計において、マトリックスの選択は極めて重要な役割を果たす。ペプチドの脱着に関して、非常に細かい結晶体を作るいくつかの極めて有効なマトリックスが発見された。しかしながら、現在いくつかのDNA反応性のマトリックスがあるが、ペプチドと核酸との感度の相違は低減されていない。しかしながら、感度のこの相違はペプチドにより似る様式でDNAを化学的に変化させることにより減少させることができる。例えば、ホスホロチオエート核酸、骨格の通常のリン酸がチオリン酸で置換されたもの、を簡単なアルキル化化学を用いて中性DNAに変換することができる（Gut及びBeck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995）。この修飾DNAへの電荷のタグの結合は、ペプチドで見られるのと同じレベルまで、、MALDI-TOF感度の増加を生じる。電荷のタグ付けの更なる利点は、不純物に対する分析物の安定性を増大させることであり、これは非修飾基質の検出を著しく難しくする。
【０１３５】
該方法の特に好ましい実施態様においては、工程３の増幅が少なくとも一種のブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で行われる。かかるブロッカーオリゴヌクレオチドの使用はYuら、BioTechniques 23:714-720, 1997に記載されている。ブロッキングオイゴヌクレオチドの使用は、核酸のサブ集団の増幅の特異性を向上させうる。核酸にハイブリダイズしたブロッキングプローブは前記核酸のポリメラーゼ介在増幅を抑制又は妨げる。該方法の１つの実施態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドはバックグラウンドDNAにハイブリダイズにさせるために設計される。該方法の更なる実施態様において、前記オリゴヌクレオチドは、メチル化核酸に対して非メチル化核酸の増幅を妨げる、又は抑制するように、或いはこれとは逆であるように設計される。
【０１３６】
ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは重亜硫酸塩処理核酸に、PCRプライマーと共に同時にハイブリダイズされる。核酸のPCR増幅物はブロッキングプローブの5'位置で終了され、かくして核酸の増幅はブロッキングプローブに相補的な配列が存在する場所で抑制される。プローブはメチル化状態特異的様式で重亜硫酸処理核酸にハイブリダイズするように設計されるていてもよい。例えば、非メチル化核酸の集団内のメチル化核酸の検出のために、問題の位置ではメチル化されていない核酸の増幅の抑制が「CpG」に対して、問題の位置で「TpG」を含むブロッキングプローブの使用によって実行される。該方法の一実施態様において、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、１又はそれ以上のCpG、TpG、CpAジヌクレオチドを好ましくは含む、配列番号2から5、151、152、155及び156からなる群より選択される、少なくとも18塩基対長の配列に相補的であるか同一である分子と同一又は相補的である。該方法の一実施態様において、前記オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号15及び配列番号16及びそれらに相補的な配列からなる群から選択される。
【０１３７】
ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いるPCR法に関して、ポリメラーゼ介在増幅の効率的な妨害は、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼにより伸長されないことを必要とする。好ましくは、これは3'デオキシオリゴヌクレオチド又は「自由な」ヒドロキシ基以外により3'位置での誘導体化されたオリゴヌクレオチドであるブロッカーの使用により達成される。例えば、3'-O-アセチルオリゴヌクレオチドが、ブロッカー分子の好ましいクラスの代表である。
【０１３８】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ介在分解は予め妨げられる。好ましくは、かかる予防は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を失ったポリメラーゼの使用、又は、例えばブロッカー分子ヌクレアーゼ抵抗性を示す5'末端にチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用のいずれかを含む。特定の応用はブロッカーのかかる5'修飾を必要としないかもしれない。例えば、ブロッカー及びプライマー結合部位が重複していて、これによってプライマーの結合を（例えば過剰のブロッカーにより）妨げる場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は実質的に妨げられる。これは、ポリメラーゼが（5'-3'方向において）ブロッカーに向かって及びこれを通ってプライマーを伸長すること−ハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解を通常もたらす工程はないからである。
【０１３９】
特に好ましいブロッカー／PCRの実施態様は、本発明の目的のために、ここに説明されるように、ブロッキングオリゴヌクレオチドとしてのペプチド核酸（PNA）オリゴマーの使用を含む。かかるPNAブロッカーオリゴマーは、申し分なく適しており、というのもそれらはポリメラーゼによって分解も伸長もされないからである。
【０１４０】
該方法の一実施態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの結合部位はプライマーのそれと同一であるか、重複しており、これによってプライマーの結合部位へのハイブリダイゼーションを妨げる。該方法のさらに好ましい実施態様においては、２又はそれ以上のかかるブロッキングオリゴヌクレオチドが使用される。特に好ましい実施態様においては、１つのブロッキングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションがフォワードプライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、もう１つのプローブ（ブロッカー）オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが前記フォワードプライマーの増幅産物に結合するリバースプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。
【０１４１】
該方法の代わりの実施態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは処理されたバックグラウンドDNAのリバースとフォワードプライマーの位置の間の場所にハイブリダイズし、これによってプライマーオリゴヌクレオチドの伸長を妨げる。
【０１４２】
ブロッキングオリゴヌクレオチドが、プライマーの濃度の少なくとも5倍で存在することが特に好ましい。
【０１４３】
該方法の第４の工程において、該方法の第３工程中に得られた増幅物は、処理前にCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確認するために解析される。
【０１４４】
増幅物がMSP増幅によって得られた増幅及び／又はブロッキングオリゴヌクレオチドによって得られた一実施態様において、増幅物の存在又は不存在は、本来、それらの塩基配列によるプライマー及び又はブロッキングオリゴヌクレオチドによってカバーされるCpG位置のメチル化状態の指標である。全ての可能である既知の分子生物学的方法は、この検出に可能であり、限定はされないが、ゲル電気泳動、配列決定、液体クロマトグラフィー、ハイブリダイゼーション、リアルタイムPCR解析、又はこれらの組み合わせを含む。本方法のこの工程はさらに、前の工程の定量的対照として作用する。
【０１４５】
該方法の第４の工程において、標準、及びメチル化特異的PCRの両方によって得られた増幅物は該方法の第１工程で単離されたゲノムDNAのCpGのメチル化状態を決定するために、さらに解析される。これは、限定はされないが、アレイ技術、及びプローブベースの技術等のハイブリダイゼーションベースの方法によって、並びに、配列決定、及び伸長目的の鋳型のような技術によって実行されてもよい。
【０１４６】
該方法の一実施形態において、工程３において合成された増幅物は、オリゴヌクレオチド及び／又はPNAプローブのセット又はアレイに引き続いてハイブリダイズされる。これに関連して、ハイブリダイゼーションは次の様式で行う：ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブのセットは、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はPNAオリゴマーから好ましくは構成され；該過程において、増幅物は固相に予め結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして作用し；ハイブリダイズしていないフラグメントは続いて取り除かれ；前記オリゴヌクレオチドは配列番号2から配列番号5及び配列番号151、152、155及び156において特定された塩基配列のセグメントに逆相補的又は一致する、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、かつ該セグメントは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む。更なる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103において特定された塩基配列のセグメントに逆相補的又は一致する少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含み、かつ該セグメントは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む。
【０１４７】
好ましい実施態様において、前記ジヌクレオチドは、オリゴマーの１／３の中央に存在する。例えば、オリゴマーが１つのCpGジヌクレオチドを含む場合、前記ジヌクレオチドは13-merの5'末端から、好ましくは５番目から９番目のヌクレオチドである。更なる実施態様において、１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号1及び149による配列内の各CpGジヌクレオチド及び配列番号2から5及び配列番号151、152、155及び156内の等価の位置の解析のために存在する。１つのオリゴヌクレオチドが、配列番号1、配列番号149、150、及び配列番号60から75による配列内の各CpGジヌクレオチド及び配列番号2-5及び配列番号151-158、配列番号76-103内の等価の位置の解析のために存在する。前記オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形態で存在してもよい。ハイブリダイズしていない増幅物は次いで、取り除かれる。ハイブリダイズした増幅物は検出される。これに関連して、増幅物に付与された標識は、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置に一致しうることが好ましい。
【０１４８】
該方法のなおも更なる実施態様において、CpG位置のゲノムメチル化状態は、PCR増幅プライマーにより同時に重亜硫酸塩処理DNAにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドによって確認される（前記プライマーは、メチル化特異的、又は標準的のいずれかであってよい）。
【０１４９】
本方法の特に好ましい実施態様は、蛍光ベースのリアルタイム定量PCRの使用である（Heidら、Genome Res. 6:986-994, 1996；アメリカ合衆国特許No. 6,331,393も参照）。この方法を利用する２つの好ましい実施態様がある。TaqManTM分析として知られている１つの実施態様は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを用いる。TaqManTMPCR反応はTaqManTMプローブと呼ばれる伸長できない応答性オリゴヌクレオチドの使用を用い、これはフォワードとリバース増幅プライマー間に存在するCpGリッチ配列にハイブリダイズするように設計される。TaqManTMプローブは、TaqManTMオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに付与されたリンカー部分（ 例えばホスホルアミダイト（phosphoramidite））に共有結合されている蛍光の「レポーター部分」及び「クエンチャー部分」を更に含む。ハイブリダイズされたプローブは、増幅反応のポリメラーゼによって置換され、及び分解され、それによって蛍光の増加を誘導する。重亜硫酸塩処理の後の核酸内のメチル化の解析のために、 MethyLight分析としても知られる、アメリカ合衆国特許No. 6,331,393（その全体が参照によってここに組み入れられる）に記載のように、プローブがメチル化特異的であることが必要である。このMethyLight技術の第２の好ましい実施態様は、二重プローブ技術（Lightcycler（登録商標））の使用であり、各プローブはドナー又はレシピエント蛍光部分を持ち、互いに近接した２つのプローブのハイブリダイゼーションは増大する又は蛍光の増幅プライマーによって示される。これらの両方の技術は、重亜硫酸塩処理DNAを用いた使用、及び、さらにはCpGジヌクレオチド内のメチル化解析に好適な様式で適応されても良い。
【０１５０】
また、これらのプローブの任意の組み合わせ又はこれらのプローブと他の既知のプローブとの組み合わせが使用されてもよい。
【０１５１】
該方法の更なる好ましい実施態様において、該方法の第４工程はGonzalgo及びJones、Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載のようにMS-SNuPEのようなオリゴヌクレオチド伸長目的の鋳型の使用を含む。前記実施態様において、メチル化特異的単一ヌクレオチド伸長プライマー（methylation specific single nucleotide extension primer）（MS-SNuPEプライマー）は、配列番号2から配列番号5及び配列番号151、152、155及び156の群から選択される配列の１又はそれ以上の、少なくとも9だが、好ましくは、たった25ヌクレオチドの長さの配列と一致するか相補的であることが好ましい。しかしながら、放射性標識ヌクレオチドの代わりに、蛍光により標識されたヌクレオチドを使用することも好ましい。 
【０１５２】
該方法のなおも更なる実施態様において、該方法の第４工程は該方法の第３工程において発生した増幅物の配列決定、続いての配列解析を含む（Sanger F.ら、Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977）。
【０１５３】
メチル化解析方法の最も好ましい実施態様において、ゲノム核酸は上記に概要説明した最初の３つの工程、つまり：
ａ）対象から対象のゲノムDNAを有する生物学的試料を得て；
ｂ）ゲノムDNAを抽出するか、さもなければ単離し；
ｃ）ハイブリダイゼーション特性に関してシトシンに検出可能であるように異なる他の塩基又はウラシルにその5位置でメチル化されていないシトシン塩基を変換する１又はそれ以上の試薬により、ｂ）のゲノムDNA又はそのフラグメントを処理して；ここで、
ｄ）メチル化特異的様式、すなわちメチル化特異的プライマー又はブロッキングオリゴヌクレオチドの使用によって、ｃ）の処理の後の増幅が実行され、さらには、
ｅ）増幅物の検出が、上記のようにリアルタイム検出プローブによって実行される：
によって単離され処理される。
【０１５４】
好ましくは、後のｄ）の増幅が、上記のようなメチル化特異的プライマーによって実行され、前記メチル化特異的プライマーは、配列番号2から配列番号5及び配列番号151、152、155及び156の１つによる処理された核酸配列、及びそれらに相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する配列を含み、前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのCpGジヌクレオチドを含む。加えて、更なるメチル化特異的プライマーはまた、上述のような遺伝子パネルの解析にも用いられ、前記プライマーは配列番号76から配列番号103及び配列番号153、154、157及び158の１つによる処理された核酸配列、及びそれらに相補的な配列にハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する配列を含み、前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのCpGジヌクレオチドを含む。
【０１５５】
該方法の代わりの最も好ましい実施態様において、後のｄ）の増幅は上記のようにブロッキングオリゴヌクレオドの存在下で行われる。前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号2から配列番号5、配列番号151、152、155及び156による処理された核酸配列及びそれらに相補的な配列にハイブリダイズする、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する配列を含むことが好ましく、ここで前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む。
【０１５６】
加えて、更なるブロッキングオリゴヌクレオチドは上記のような遺伝子パネルの解析にも用いられてもよく、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号76から配列番号103及び配列番号153、154、157及び158の１つによる処理された核酸配列、及びそれらに相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する配列を含み、前記オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む。
【０１５７】
該方法の工程ｅ）、つまり配列番号2-5、配列番号151-158、及び配列番号76から配列番号103、最も好ましくは配列番号2から配列番号5、及び配列番号151、152、155及び156による１又はそれ以上のCpG位置のメチル化状態の特異的増幅物の指標の検出が、上記のリアルタイム検出方法によって実行される。
【０１５８】
該発明の更なる実施態様は、前処理の必要のない遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節領域のメチル化状態の解析の方法を提供する。更に、前記方法は、遺伝子PITX2及び／又はそれらの調節領域のメチル化解析に用いられてもよく、ABCA8、CDK6、ERBB2、ONECUT2、PLAU、TBC1D3、TFF1を含む群から選択された１又はそれ以上の遺伝子、及び／又はそれらの調節若しくはプロモータ領域のメチル化状態が決定される。PITX2、PLAU及びTFF1；PITX2及びPLAU；PITX2及びTFF1を含む遺伝子パネルの群から選択される遺伝子パネルのメチル化状態が決定されることが特に好ましい。
【０１５９】
かかる追加の実施態様の第１工程において、ゲノムDNA試料は、組織又は細胞原料から単離される。好ましくは、かかる原料は細胞株、組織学的スライド、生検組織、体液、又はパラフィン包埋乳房腫瘍組織を含む。抽出は、限定はされないが、界面活性剤溶解物、ソニフィケーション（sonification）及びガラスビーズでのボルテックスの使用を含む当業者に標準的な手段によってもよい。いったん核酸が抽出されて、ゲノム二重鎖のDNAが解析に使用される。
【０１６０】
好ましい実施態様において、DNAは処理前に分解されて、これは従来技術の現状において標準的な手段によってもよいが、好ましくはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによればよい。
【０１６１】
第２の工程において、DNAは次いで１又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素により分解される。分解は制限部位におけるDNAの加水分解が特異的CpGジヌクレオチドのメチル化状態の情報を与えるように実行される。
【０１６２】
随意であるが好ましい実施態様である第３の工程において、制限フラグメントが増幅される。これは好ましくは、ポリメラーゼチェーン反応を用いて実行され、前記増幅物は上で検討したように好適な検出可能な標識、つまり、フルオロフォア標識、放射性核種及びマスラベルを有する。
【０１６３】
第４の工程において、増幅物が検出される。検出は従来技術の標準である手段によってもよく、例えば、限定はされないが、ゲル電気泳動解析、ハイブリダイゼーション解析、PCR産物内への検出可能なタグの組み入れ、DNAアレイ解析、MALDI又はESI解析によってもよい。
【０１６４】
該方法の最終工程において、内分泌治療の予後診断及び／又は結果の予測が決定される。好ましくは、内分泌治療の予後診断及び／又は結果の予測との遺伝子の発現レベルの相関が、実質的にヒトの介入なしで行われる。内分泌治療の不良な予後及び／又は結果の予測は、mRNA及び／又はタンパク質の異常なレベル及び高メチル化によって決定される。前記高メチル化が前記特異的設定において前記疾患の平均値より上、又は中央値より上であることが特に好ましい。 
【０１６５】
試料の分類がアルゴリズム手段によって実行されることが特に好ましい。
【０１６６】
１つの実施態様において、予測因子を習得する機械は、既知の状態を有する試料の被研究CpG部位におけるメチル化パターンについて訓練される。予測因子を習得する機械のために区別可能であるCpG位置の選択は、該パネルに使用される。該方法の特に好ましい実施態様において、両方の方法が組み合わされる；つまり、分類因子を習得する機械は、統計学的解析によるクラス間で実質的に異なってメチル化されている選択されたCpG位置でしか訓練されない。
【０１６７】
該パネル内のCpG位置のメチル化状態に基づく試料の分類についてのアルゴリズム的方法の発展は実施例に示される。
【０１６８】
開示された発明は、ゲノムの配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75由来の処理された核酸を提供し、ここで該処理はゲノムDNA配列の少なくとも１つの非メチル化シトシン塩基を、ウラシル又は、ハイブリダイゼーションに関してシトシンに検出可能に異なる他の塩基に変換するのに適している。問題のゲノム配列は、１又はそれ以上の連続的した又はランダムなメチル化CpG位置を含んでもよい。前記処理は好ましくは、重亜硫酸塩、二硫酸塩、硫酸水素塩及びそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬の使用を含む。本発明の好ましい実施態様において、目的物は配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75のからなる群より選択される配列の長さが少なくとも16の近接したヌクレオチド塩基の配列を含む非天然に生じた変化した核酸の解析を含み、ここで前記配列は少なくとも１つのCpG、TpA、又はCpAジヌクレオチド及び、これらに相補的な配列を含む。配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103の配列は、配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75による核酸の非天然に生じた変化型を提供し、ここで各ゲノム配列の変化は、以下のように前記ゲノム配列から独特で、かつ別個である配列を有する核酸の合成をもたらす。各センス鎖ゲノムDNA、例えば配列番号1に関して、4つの変換された型が開示される。「C」から「T」、しかし「CpG」は「CpG」のまま残っている第１の型（すなわち、ゲノム配列に関して、「CpG」ジヌクレオチド配列の全ての「C」残基がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）；第２の型は開示されたゲノムDNA配列の相補物（すなわち、アンチセンス鎖）を開示し、「C」から「T」、しかし「CpG」は「CpG」のまま残っている（すなわち、CpGジヌクレオチドの全ての「C」残基に関して、配列がメチル化され、従って変換されない場合に対応する）。配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75の「アップメチル化（upmethylated）」変換配列は、配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103の配列に対応する。各ゲノム配列の第３の化学的に変換された型が提供され、全ての「C」残基に関し「C」から「T」がCpGジヌクレオチド配列のそれを含み（すなわち、ゲノム配列に関して、CpGジヌクレオチド配列の全ての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）；各配列の最後の化学的に変換された型が、開示されたゲノム配列の相補物（すなわちアンチセンス鎖）を開示し、全ての「C」残基に関する「C」から「T」が「CpG」ジヌクレオチド配列のそれを含む（すなわち、各ゲノム配列の相補物（アンチセンス鎖）に関し、CpGヌクレオチド配列の全ての「C」残基がメチル化されていない場合に対応する）。配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75の「ダウンメチル化」変換配列は、配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103に対応する。
【０１６９】
本発明は、配列番号1、配列番号149から配列番号158及び配列番号60から配列番号103による、ゲノム又は、前処理DNA内のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチド又はオリゴマーを開示する。前記オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、（ここで上に定義されるように）中程度のストリンジェント又はストリンジェントな条件下で、配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103による処理された核酸配列、及び／又はそれらに相補的な配列、或いは配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75によるゲノム配列及び／又はそれらに相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも9つの（9）オリゴヌクレオチドの長さを有する核酸配列を含む。
【０１７０】
従って、本発明は、配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103の配列の全部又は一部に、或いはそれらの相補物に、中程度のストリンジェント及び／又はストリンジェンなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド、及びペプチド核酸（PNA）分子（PNAオリゴマー））を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は典型的には、少なくとも9、15、20、25、30又は35の長さのヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子は発明の有用性を有し、従って、本発明の範囲内である。
【０１７１】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103の配列又は、それらの一部、或いはそれらの相補物に少なくとも95%、又は少なくとも98%、又は100%同一である。
【０１７２】
ここに記載される型のハイブリダイズする核酸が、例えばプライマーとして（例えばPCRプライマー）、又は診断的及び／又は予後診断的プローブ又はプライマーとして使用されることができる。好ましくは、核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われ、プローブは標的配列に100%同一である。核酸の二重鎖又はハイブリダイズの安定性は、溶融温度又はTmとして表され、これはプローブが標的DNAから解離する温度である。この溶融温度が要求されるストリンジェントさの条件を定義するために使用される。
【０１７３】
同一よりもむしろ、配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75の対応する配列に関連し、かつ実質的に同一である標的核酸（例えば対立遺伝子変異体及びSNPs）に関して、特定の塩（例えばSSC又はSSPE）濃度でホモ接合性のハイブリダイゼーションのみが生じる最も低い温度を最初に構築することが有用である。次いで、1%ミスマッチがTmの1℃減少を生じると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応における最後洗浄の温度はそれに応じて低減される（例えば、もし、プローブと＞95%の同一性を有する配列が検索された場合、最後洗浄の温度は5℃減少する）。実際に、Tmの変化は、1%のミスマッチ当たり0.5℃と1.5℃の間にありうる。
【０１７４】
長さX（ヌクレオチドで）の本発明のオリゴヌクレオチドの例は、例えば配列番号1に参照されるようなポリヌクレオチドの位置によって示されるように、長さXの連続的に重複するオリゴヌクレオチドのセット（センス及びアンチセンスのセット）に対応するものを含み、ここで（所定のX値に対応する）各連続的に重複するセット内のオリゴヌクレオチドがヌクレオチド位置からZオリゴヌクレオチドの限定されたセットとして定義される：
nから(n + (X-1)); 
ここでn=1, 2, 3,…(Y-(X-1));
Yは配列番号1（9001）の長さ（ヌクレオチド又は塩基対）に等しい;
Xはセットにおける各オリゴヌクレオチドの共通の長さ（ヌクレオチドで）に等しい（例えば、 連続的に重複している20-merのセットに関してはX=20）;及び
所定の配列番号の長さYに関し、長さXの連続的に重複するオリゴマーの数（Z）は、Y-(X-1)に等しい。例えばX=20の場合、配列番号1のセンス又はアンチセンスセットのいずれかに関しては、Z=9001-19=8,982。
【０１７５】
好ましくは、セットは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含むそれらのオリゴマーに限定される。
【０１７６】
本発明の20-merオリゴヌクレオチドの例は、オリゴマーの以下のセット（及びそれらに相補的であるアンチセンスのセット）を含み、配列番号1に参照されるポリヌクレオチド位置：1-20、2-21、3-22、4-23、5-24、…… 及び8,982-9,001によって示される。
【０１７７】
好ましくは、セットは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含むそれらのオリゴマーに限定される。
【０１７８】
同様に、本発明の25-merオリゴヌクレオチドの例はオリゴマーの以下のセット（及びそれらに相補的であるアンチセンスのセット）を含み、配列番号1に参照されるポリヌクレオチド位置：1-25、2-26、3-27、4-28、5-29、………… 及び8,977-9,001によって示される。
【０１７９】
好ましくは、該セットは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含むそれらのオリゴマーに限定される。
【０１８０】
本発明は、配列番号1-5、配列番号149から配列番号158及び配列番号60から配列番号103（センス及びアンチセンス）の各々に関して、長さX、例えば、X=9、10、17、20、22、23、25、27、30又は35ヌクレオチドである、のオリゴヌクレオチド又は変化したオリゴヌクレオチドの多数の連続的に重複するセットを包含する。
【０１８１】
本発明によるオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、 配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75に対応するゲノム配列の遺伝的及び後成的パラメータを確認するのに有用な効果的なツールを構成する。長さXのかかるオリゴヌクレオチド又は変化したオリゴヌクレオチドの好ましいセットは、配列番号1-5、配列番号49から配列番号158及び配列番号60から配列番号103（及びそれらの相補物）に対応するオリゴマーのそれらの連続的に重複するセットである。好ましくは、前記オリゴマーは少なくとも１つのCpG、TpG、又はCpAジヌクレオチドを含む。
【０１８２】
本発明による特に好ましいオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、CpGジヌクレオチド（又は、対応する変換されたTpG又はCpAジヌクレオチド）配列のシトシンがオリゴヌクレオチドの１／３の真ん中内にあるものである；つまり、オリゴヌクレオチドは、例えば、13塩基の長さであり、CpG、TpG又はCpAジヌクレオチドは5'末端から５番目から９番目のヌクレオチド内に位置する。
【０１８３】
本発明のオリゴヌクレオチオはまた、オリゴヌクレオチドの活性、安定性又は検出を増強する１又はそれ以上の部分或いは共役物にオリゴヌクレオチドを化学的に結合させることによって、変化されうる。かかる部分又は共役物は、発色団、フルオロフォア、コレステロール等の脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（PEG）、パルチミン部分、及び例えばアメリカ合衆国特許No.5,514,758、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,597,696及び5,958,773に開示されるような他のものを含む。プローブは特に好ましい対形成特性を有するPNA（ペプチド核酸）の形態でも存在してよい。従って、オリゴヌクレオチドはペプチドのような他の付加された基を含んでいてもよいし、ハイブリダイゼーション誘導開裂剤（Krolら、BioTechniques 6:958-976, 1988）又はインターカレーティング剤（Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を含んでいてもよい。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、例えば、発色団、フルオロフォア、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘導開裂剤等のもう１つの分子に共役されてもよい。
【０１８４】
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの技術の認識する、変化した糖及び／又は塩基部分を含んでいてもよいし、或いは変化した骨格又は非天然ヌクレオシド内結合を含んでもよい。
【０１８５】
本発明の特定の実施態様によるオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、典型的には「セット」において使用され、これはゲノム配列の配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75及びこれらに相補的な配列のCpGジヌクレオチドの各々の解析のために少なくとも１つのオリゴマーを含み、又は配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103による処理された核酸の配列及びそれらに相補的な配列内の対応するCpG、TpG、CpAジヌクレオチドである。しかしながら、経済的又は他の要素のために、前記配列内のCpGジヌクレオチドの限定された選択を解析することが好ましいこと、及びオリゴヌクレオチドのセットの内容がそれに応じて変更されることは予測できる。
【０１８６】
従って、特定の実施態様において、本発明は、処理されたゲノムDNA（配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103）又はゲノムDNA（配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75並びにそれらに相補的な配列）のメチル化状態を検出するのに有用な少なくとも２つ（2）の（オリゴヌクレオチド及び／又はPNAオリゴマー）のセットを提供する。これらのプローブは、肺細胞増殖障害の遺伝的及び後成的パラメータの診断及び／又は分類を可能にする。オリゴマーのセットは、処理されたゲノムDNA（配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103）において、又はゲノムDNA（配列番号1、配列番号149、配列番号150及び配列番号60から配列番号75及びそれらに相補的な配列）において、単一のヌクレオチドの多型（SNPs）を検出するためにも使用されてよい。
【０１８７】
好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドのセットの少なくとも１つ、及びより好ましくは全てのメンバーが固相に結合されている。
【０１８８】
更なる実施態様において、本発明は配列番号2-5、配列番号151から配列番号158及び配列番号76から配列番号103及びそれらに相補的な配列又はそれらのセグメントの１つのDNA配列を増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用される１セットの少なくとも２つ（2）のオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１８９】
オリゴヌクレオチドは「アレイ」又は「DNAチップ」（すなわち、固相に結合された異なるオリゴヌクレオチド及び／又はPNAオリゴマーの配置）の全て又は一部を構成することが予測される。かかる異なるオリゴヌクレオチド及び／又はPNAオリゴマー配列のアレイは、例えば、長方形又は六角形の格子の形態の固相に配置される点において、特徴付けられうる。固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀又は金から構成されてもよい。これはペレットの形態で、又は樹脂マトリックスとしても存在することができる、ニトロセルロース並びにナイロンのようなプラスチックもまた使用されてよい。オリゴマーアレイ製造における先行技術の概要はNature Geneticsの特別編から集めることができる（Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999, 及びここに引用される文献より）。蛍光により標識されたプローブは、しばしば固定化されたDNAアレイの走査に用いられる。特定のプローブの5'-OHにCy3及びCy5色素の容易な付与が蛍光標識に関しては特に適している。ハイブリダイゼーションされたプローブの蛍光の検出が、例えば共焦点顕微鏡により実行されても良い。多くの他のものに加えて、Cy3及びCy5色素が商業的に利用可能である。 
【０１９０】
オリゴヌクレオチド又はそれらの特定の配列は、「仮想アレイ」の全て又は部分を構成してもよいこともまた予測され、ここでオリゴヌクレオド又はそれらの特定の配列は例えば、分析物の複合混合物を解析するための独特の標識プローブの種々の集団の一部として又はそれに組み合わせにおける「特定因子」として使用される。かかる方法は例えば、米国 2003/0013091 （アメリカ合衆国シリアルNo.09/898,743、2003年1月16日公開）に記載されている。かかる方法において、十分な標識が集められるので、複合混合物（例えば、各分析物）中の各核酸は、独特の標識によって、独特に結合され、かくして検出される（各標識は、直接的に計数され、混合物中の各分子種のデジタル読み出しを生じる）。
【０１９１】
記載された発明は、更に、乳癌患者の内分泌治療の予後診断及び／又は結果の予測を提供するのに有用な組成物を提供する。前記組成物は、配列番号2から5及び配列番号151、152、155及び156に開示された核酸配列のセグメントの長さが18塩基対の少なくとも１つの核酸、及び以下を含む群から選択される１又はそれ以上の物質を含む：塩化マグネシウム、dNTP、taqポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（PNA）オリゴマー、前記オリゴマーは配列番号2から配列番号5及び配列番号151、152、155及び156並びにそれらに相補的な配列の１つによる前処理されたゲノムDNAに、相補的であるか、又は中程度にストリンジェントな、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも9ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を各々の場合において含む。前記組成物は水溶液中の前記核酸の安定化及び前記溶液内でのポリメラーゼベースの反応を可能にするのに適している緩衝溶液を含むことが好ましい。好適な緩衝液は従来技術で既知であり、商業的に利用可能である。
【０１９２】
更に、本発明の追加の側面は、例えば以下を含むキットである：重亜硫酸塩含有試薬、並びに、配列番号2から5及び配列番号151、152、155及び156の配列の18塩基の長さのセグメントに、各々場合で対応する、相補的である、又はストリンジェントな若しくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を持つ少なくとも１つのオリゴヌクレオド。前記キットは、配列番号2-5、配列番号151-158及び配列番号76から103の配列の18塩基の長さのセグメントに、各々場合で対応する、相補的である、又はストリンジェントな若しくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を持つ少なくとも１つのオリゴヌクレオドを更に含んでもよい。前記キットは、記載された方法を実行する、及び評価するための使用説明書を更に含んでいてもよい。更に好ましい実施態様において、前記キットはCpG位置特異的メチル化解析を実行するための標準的な試薬を更に含んでいてもよく、前記解析は１又はそれ以上の以下の技術を含む：MS-SNuPE、MSP、MethyLight（登録商標）、HeavyMethyl（登録商標）、COBRA、及び核酸配列決定。しかしながら、本発明の方針に沿ったキットはまた、前述の成分の一部のみを含むこともできる。
【０１９３】
COBRA解析のための典型的な試薬（例えば、典型的なCOBRAベースのキットに見られうるように）は、限定はされないが以下のものを含む：特定の遺伝子（又はメチル化変化を受けたDNA配列、又はCpGアイランド）用のPCRプライマー；制限酵素及び適当な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ；対照ハイブリダイゼーションオリゴ；オリゴヌクレオチドプローブ用のキナーゼ標識化キット；及び放射活性ヌクレオチド。更に、重亜硫酸変換試薬は以下を含む：DNA変性緩衝液；スルホン化緩衝液；DNA回収試薬又はキット（例えば、沈殿、限外ろ過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；及びDNA回収成分。
【０１９４】
MethyLight（登録商標）解析用の典型的な試薬は（例えば、典型的なMethyLight（登録商標）ベースのキットに見られうるように）、限定はされないが以下のものを含む：特定の遺伝子（又はメチル化変化を受けたDNA配列、又はCpGアイランド）用のPCRプライマー；TaqMan（登録商標）プローブ；最適PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド；及びTaqポリメラーゼ。
【０１９５】
Ms-SNuPE解析のための典型的な試薬（例えば、典型的なMs-SNuPEベースのキットに見られうるように）は、限定はされないが以下のものを含む：特定の遺伝子用のPCRプライマー（又はメチル化変化を受けたDNA配列、又はCpGアイランド）；最適PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性対照プライマー；特定の遺伝子用のMs-SNuPEプライマー；反応緩衝液（Ms-SNuPE反応用）；及び放射活性ヌクレオチド。更に、重亜硫酸変換試薬は以下を含む：DNA変性緩衝液；スルホン化緩衝液；DNA回収試薬又はキット（例えば、沈殿、限外ろ過、アフィニティカラム）；脱スルホン化緩衝液；及びDNA回収成分。
【０１９６】
MSP解析用の典型的な試薬は（例えば、典型的なMSPベースのキットに見られうるように）、限定はされないが以下のものを含む：特定の遺伝子（又はメチル化変化を受けたDNA配列、又はCpGアイランド）用のメチル化されている及びメチル化されていないPCRプライマー；最適PCR緩衝液及びデオキシヌクレオチド；及び特定のプローブ。
【０１９７】
本発明はあるその好ましい実施態様に従い特異性をもって記載されているが、以下の実施例及び図面は本発明を説明するためのみに働き、最も広い説明とそれらの均等な構成の原理及び範囲内に本発明を限定することを意図するものではない。
【０１９８】
配列番号6から9は実施例4に記載された本発明による乳癌患者の生存期間を予測するのに有用であるプライマー及びプローブの核酸配列を提供する。
【０１９９】
配列番号10から12は実施例4及び5において使用された対照遺伝子によるプライマー及びプローブの核酸配列を提供する。
【０２００】
配列番号13は、配列番号1のサブ配列を提供し、これはヒト遺伝子PITX2の核酸配列を表す。
【０２０１】
配列番号14から17は実施例5に記載された本発明による乳癌患者の生存期間を予測するのに有用であるプライマー及びプローブの核酸配列を提供する。
【０２０２】
配列番号21は、遺伝子PITX2によりコードされるポリペプチドの核酸配列を提供する。PITX2によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は図10にも示されている。
【０２０３】
（図面）
図１はステージ1-3の乳房腫瘍の単純化されたモデルを示し、最初の治療は外科療法（点１）であり、内分泌治療の例としてタモキシフェンによる補助療法が続く。Y軸は、腫瘍（単数又は複数）の量（又は大きさ）を表し、線「３」は前記腫瘍の量の検出可能な限界を示している。X軸は時間を表している。最初のシナリオでは、内分泌治療（４）中に再発のない患者は、観察の継続時間中には検出可能な限界以下を維持することが示される。癌の再発のある患者（５）は、無病生存期間（２）の期間を有し、癌腫の量が検出可能なレベルに達するときに再発が続く。
【０２０４】
図２は実施例４に記載される分析（QM分析）の結果を示す：リアルタイムメチル化特異的プローブ解析によるPITX2遺伝子の３つのCpG部位についてのカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線（QM分析）。下の曲線が中央値より上のメチル化レベルを有する集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線が中央値より下のメチル化レベルを有する集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は月数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の集団の割合を示す。
【０２０５】
図３は、実施例２に記載されるチップハイブリダイゼーションの結果を示す。メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子の２つのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線。下の曲線は中央値より上のメチル化レベルを有する集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は月数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の集団の割合を示す。
【０２０６】
図４は、メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子の２つのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。下の線は中央値より上のメチル化レベルを有する55患者の集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する54患者の集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は数年において患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。これは最初の研究において達成された最初のデータのセットから得られた。
【０２０７】
図５は、メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内に位置する6つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。下の線は中央値より上のメチル化レベルを有する118患者の集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する118患者の集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は年数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。これは第２の研究において達成された第２のデータのセットから得られた。
【０２０８】
図６は、メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内の6つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。今回は、グレードG1又はG2の腫瘍であると特徴付けられた148患者のサブ集団のみが解析された：下の曲線は中央値より上のメチル化レベルを有する74患者の集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する74患者の集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は年数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。これは実施例２に示されるような第２のデータのセットから得られた。 
【０２０９】
図７は、メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内の4つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。今回は、ステージ1又は2（T1又はT2）の腫瘍であると特徴付けられた224患者のサブ集団のみが解析された：下の曲線は中央値より上のメチル化レベルを有する112患者の集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する112患者の集団における転移のない患者の割合を示す。X軸は年数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。これは第２の実施例において達成されるた第２のデータのセットから得られた。 
【０２１０】
図８は、遺伝子TBC1D3及びCDK6からの各々の２つのオリゴヌクレオチドと、２つのCpG部位をカバーする遺伝子PITX2からの１つのオリゴヌクレオチドの組み合わせの無病生存期間の曲線を示す。黒色の曲線は中央値より上のメチル化スコアを有する集団において無病患者の割合を示し、灰色の曲線は中央値より下のメチル化スコアを有する集団における無病患者の割合を示す。
【０２１１】
図９は、図８によるプロットを示し、 St. Gallen法によってセットされた試料の分類を示す。途切れのない線はメチル化解析を表し、黒色の曲線は中央値より上のメチル化スコアを有する集団において無病患者の割合を示し、灰色の曲線は中央値より下のメチル化スコアを有する集団における無病患者の割合を示す。破線は試料セットのSt. Gallen分類を表し、黒色の曲線は高リスク集団の無病生存期間の時間を示し、灰色の曲線は低リスク集団の無病生存期間を示す。
【０２１２】
図１０は遺伝子PITX2によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を図示する。
【０２１３】
図１１は実施例７において配列決定された増幅物の位置を図示する。「A」は主要なエキソンが注釈された遺伝子の図を示し、「B」は注釈されたmRNA転写変異体を示し、及び「C」は遺伝子のCpGリッチ領域を示す。増幅物1から11の位置は図の右に示されている。
【０２１４】
図１２は実施例７による遺伝子PITX2の11増幅物の配列決定データを示す。カラム「A」及び「B」のマトリックスの各カラムは、１つの増幅物に関する配列決定データを示す。増幅物の番号はマトリックスの左に示されている。マトリックスの各列はフラグメント内の単一のCpG部位を表し、各カラムは個々のDNA試料を表す。「A」とマークの付されたカラムのマトリックスは、QM分析によって測定された中央値より下のメチル化を示し、「B」とマークの付されたカラムのマトリックスは、QM分析によって測定された中央値より下のメチル化を示す。
【０２１５】
左の縦棒は、100%メチル化を表す黒色から0%メチル化を表す薄灰色のカラム内の各位置の暗度によって表されるメチル化の度合いにより、百分率メチル化のスケールを表す。白い位置はデータが利用できなかった測定を表した。
【０２１６】
図１３は、オンラインのEnsemblデータベースに注釈されるような、PITX2のmRNAの転写変異体の概略図を示す。
【０２１７】
図１４は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２１８】
図１５は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２１９】
図１６は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２０】
図１７は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２１】
図１８は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２２】
図１９は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２３】
図２０は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２４】
図２１は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２５】
図２２は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２６】
図２３は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２７】
図２４は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２８】
図２５は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２２９】
図２６は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３０】
図２７は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３１】
図２８は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３２】
図２９は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３３】
図３０は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３４】
図３１は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３５】
図３２は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３６】
図３３は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３７】
図３４は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりONECUT遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３８】
図３５は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりONECUT遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２３９】
図３６は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４０】
図３７は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間のを有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４１】
図３８は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりABCA8遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４２】
図３９は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりABCA8遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４３】
図４０は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４４】
図４１は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４５】
図４２は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４６】
図４３は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４７】
図４４は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４８】
図４５は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２４９】
図４６は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５０】
図４７は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５１】
図４８は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５２】
図４９は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５３】
図５０は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５４】
図５１は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５５】
図５２は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５６】
図５３は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５７】
図５４は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５８】
図５５は、実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における転移のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０２５９】
図５６は実施例８によるPITX2遺伝子分析１を用いて解析されたマッチドペアのPET及び新鮮凍結組織の散布図である。PET試料の定量的メチル化CTスコアは、Y軸上に示され、新鮮凍結試料の定量的メチル化CTスコアはX軸上に示される、対の試料間の相関は0.81である（Spearman's rho）。この解析はn=89の試料に基づく。
【０２６０】
図５７は、実施例８によるカプラン−マイヤー生存期間プロットにおけるランダムに選択されたER+、N0、治療のされていない患者集団の無病生存期間（Disease free survival）（DFS）を示す。疾患のない患者の割合は、Y軸上に示され、年数での時間はX軸上に示される。139事象が観察された（観察された事象率=33%）。5年後の無病生存期間：74.5% [70.3%, 78.9%]、10年後は59.8% [54.2%, 66%]。95%信頼区間がプロットされている。
【０２６１】
図５８は、実施例８によるER+、N0、治療のされていない集団における追跡期間の分布を示す。頻度はY軸上に示され、月数での時間はX軸上に示される。左の図は、事象（全ての種類の再発）を有する患者を示す。平均追跡時間は45.8ヶ月（標準偏差=31）、中央値=38（範囲=[2, 123]）。右の図は、打ち切り（censored）患者を示す。平均追跡期間は93ヶ月（標準偏差=35.6）、中央値=94（範囲=[1, 190]）。
【０２６２】
図５９は、実施例８によるカプラン−マイヤー生存期間プロットにおけるER+、N0、TAM治療された集団の無病生存期間（DFS）を示す。疾患のない患者の割合は、Y軸上に示され、年数での時間はX軸上に示される。56事象が観察された（観察された事象率=10%）。5年後のDFS：92.4% [90%, 94.9%]、10年後：82.1% [77.3%, 87.2%]。95%信頼区間がプロットされている。  
【０２６３】
図６０は、実施例８によるER+、N0、治療のされていない集団における追跡期間の分布を示す。頻度はY軸上に示され、月数での時間はX軸上に示される。左の図は、全ての事象（全ての種類の再発）を有する患者を示す。平均追跡時間は47.9ヶ月（標準偏差=24.4）、中央値=45（範囲=[2, 98]）。
右の図は、打ち切り患者を示す。平均追跡期間は65.3ヶ月（標準偏差=31.6）、中央値=64（範囲=[0, 158]）。
【０２６４】
図６１は実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル3522（分析１）及び2265についての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月でのプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、かつ特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらはKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.32分位）についての値がプロットされる。
【０２６５】
図６２は実施例８によるER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル3522（分析１）のみについての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらはKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.42分位）についての値がプロットされる。
【０２６６】
図６３は実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル2265についての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらは異なる閾値（=5、6、7、8年）についてのKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.78分位）についての値がプロットされる。
【０２６７】
図６４は実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル2395についての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらは異なる閾値（=5、6、7、8年）についてのKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.77分位）についての値がプロットされる。
【０２６８】
【表１】
2005224238.tif 000002
【実施例】
【０２６９】
（実施例１：研究１）
第１の研究は109患者の集団に基づき、それはN0及びN+の両方のリンパ節状態の患者を含む。全ての患者はER+（エストロゲン受容体陽性）であった。全ての患者は外科療法又は診断の後直ぐに、タモキシフェン単独療法を受けた。試料は117候補遺伝子を表す２つのチップパネルによる出願人のチップ技術を用いて解析された。更なる詳細に関しては、公開特許出願WO 04/035803及びEP 03 090 432.0の実施例を参照されたく、これらは参照によりここに組み入れられる。今回の研究において、最も有意なマーカー遺伝子の１つはPITX2であった。転写因子をコードするPITX2のメチル化の状態は、補助タモキシフェン治療を受けている患者の無病生存期間と、統計学的に有意に相関していた。これは、診断の時に患者のリンパ節の状態を考慮してコックス回帰モデルを用いて計算された。
【０２７０】
この研究からの結果‐PITX2に関して‐は図４に示される。X軸は年数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。中央値より下のメチル化レベルを有する54患者（上の線）の中には、中央値より上のメチル化レベルを有する55患者（下の線）よりも有意に長い無転移生存期間の時間を有する。結果に示すように、タモキシフェン単独療法を組み合わせた外科療法の10年後に転移がない患者は、PITX2で中央値より上のメチル化を有する患者うちでは60%未満であるのに対して、PITX2で中央値より下のメチル化を有する患者のうちでは75%より多い。
【０２７１】
乳癌患者の生存期間が患者のリンパ節の状態にも関連があると知られているので、この混合集団のにおけるマーカーの区別する力は、均一集団において、より小さいと予測される。
【０２７２】
他の研究は、患者試料の完全に異なるセットにおいて、同じマーカーが独立して同定されうるかどうかについて解析し、全てがN0である患者のサブグループについて生存期間を予測することをに対して区別力を特徴付けるために行われた。
【０２７３】
（実施例２：研究２）
第２の研究は、5つの異なる試料提供者からの236患者からの試料に基づき、その全ての患者はN0（リンパ節状態陰性）であり、35歳より年上であった。全ての症例において、外科療法が1988年より前に行われた。全ての患者はER+（エストロゲン受容体陽性）であり、腫瘍はT1-3、G1-3であるとグレード付けされた。この研究において、全ての患者は外科療法後直接、タモキシフェンを受け、結果は無病生存期間の長さに応じて判定された。最終の標的グループについてできるだけ示すために、患者及びそれらの腫瘍試料が以下の基準を満たさなければならなかった：
患者の追跡期間の範囲及び中央値は以下であった：
中央値：64.5月
範囲：3ヶ月から142ヶ月
（観察期間の最後に疾患のなかった患者に基づいて計算された）。
外科療法の後直ぐに補助療法としてタモキシフェンで治療された患者試料（図１）のメチル化パターンの解析が図５から７によるプロットに記載される。増幅物のために、増幅物に関する4オリゴ対を越える平均メチル化が計算され、集団はそれらの平均メチル化値によりグループへ分かれ、第１のグループは中央値より高いメチル化スコアを有する個体から構成され、第２のグループは中央値より低いメチル化スコアを有する固体から構成される。
【０２７４】
アレイ実験で解析された増幅物を生成するために用いられたプライマーオリゴヌクレオチドは以下である：
アレイプライマー PITX2_Q21: GTAGGGGAGGGAAGTAGATGT (配列番号22)
アレイプライマー PITX2_R23: TCCTCAACTCTACAAACCTAAAA (配列番号23)
前記増幅物の対応するゲノム領域は配列番号13にて与えられる。
【０２７５】
このアレイ実験において用いられたオリゴヌクレオドの配列は以下である：
配列番号xx: AGTCGGGAGAGCGAAA 
配列番号xx: AGTTGGGAGAGTGAAA 
配列番号xx: AAGAGTCGGGAGTCGGA 
配列番号xx: AAGAGTTGGGAGTTGGA 
配列番号xx: GGTCGAAGAGTCGGGA 
配列番号xx: GGTTGAAGAGTTGGGA 
配列番号xx: ATGTTAGCGGGTCGAA 
配列番号xx: TAGTGGGTTGAAGAGT
【０２７６】
メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によってPITX2遺伝子の好ましい増幅された領域内に位置される、6つの異なるCpG部位を解析することから派生するデータがカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線としてプロットされる場合、マーカーPITX2の区別する力がN0患者の選択により増大されることを理解することができる。これは図５から７に示される。X軸は年数での患者の無転移生存期間の時間を示し、Y軸は無転移生存期間の患者の割合を%で示す。下の線は中央値より上のメチル化レベルを有する118患者の集団における転移のない患者の割合を示し、上の曲線は中央値より下のメチル化レベルを有する118患者の集団における転移のない患者の割合を示す。 
【０２７７】
例えば、図５に示されるように、外科療法のみの10年後には、高メチル化状態を有する118患者の患者の約65%のみは転移がないが、一方、低メチル化状態を有する118患者の約90%が転移はない。
【０２７８】
図６、ステージG1又はG2の腫瘍であると特徴付けられた148患者のサブ集団についての類似カプラン−マイヤー解析に示されるように、この区別する力は再度増加する：外科療法10年後には、高メチル化状態を有する74患者の約60%のみが転移がなく、一方低メチル化状態を有する74患者の約95%が転移がない。
【０２７９】
図７は、T1又はT2の腫瘍ステージと特徴付けられた150患者のサブ集団について類似カプラン−マイヤー解析を示すことによって、外科療法における腫瘍ステージにどのように生存期間も相関しているのかを示す：10年MFSを有する患者の数は高メチル化状態を有する112の患者の約68%であり、一方、低メチル化状態を有する112患者の約95%は転移がない。
【０２８０】
（実施例３：）
異なるグループ間での区別の正確性は、異なる遺伝子からの複数のオリゴヌクレオチドを組み合わせることによってさらに増大される。本文書に記載されるように、解析にさらに情報を与えるマーカーを加えることは、生存期間の試験の予後診断力を潜在的に増加させうることが認識された。従って、遺伝子TBC1D3及びCDK6からの各々の２つのメチル化特異的オリゴヌクレオチド、及び遺伝子PITX2からの１つのオリゴヌクレオチドの組み合わせが、良好な、又は不良な予後のグループをいかにして区別するかが計算された。結果はカプラン−マイヤー曲線により図８に示される。 
【０２８１】
図９は‐図８の上部で‐St. Gallen法（無病生存期間を推定するための選択の最近の方法）による試料セットからの患者の分類を示し、これによって、最近の方法中の、特に80ヵ月後のメチル化解析の効果の向上を示す。
【０２８２】
（実施例４：リアルタイム定量的メチル化解析）
ゲノムDNAは重亜硫酸変換後、リアルタイムPCRを用いて解析された。この解析において４つのオリゴヌクレオチドが各反応において用いられた。２つの非メチル化特異的PCRプライマーがメチル化可変オリゴヌクレオチドプローブ結合部位を含む処理されたゲノムDNAのセグメントを増幅するために用いられた。２つのオリゴヌクレオチドプローブは結合部位に競合的にハイブリダイズし、一方は結合部位のメチル化型に特異的であり、他方は結合部位の非メチル化型に特異的である。従って、プローブの一方が、メチル化可変位置にCpGを含み（すなわち、メチル化重亜硫酸塩処理部位にアニールする）、他方が前記位置でTpGを含む（すなわち、非メチル化重亜硫酸塩処理部位にアニールする）。各種のプローブは、CpG及びTpGオリゴヌクレオチドが異なる色素で標識されている5'蛍光レポーター色素及び3'クエンチャー色素で標識されている。
【０２８３】
試料内のメチル化のレベルを定量するために、既知のメチル化レベルのDNA標準を参照して、反応が補正される。DNA標準は重亜硫酸塩処理phi29増幅ゲノムDNA（すなわちメチル化されていない）、及び／又はSss1メチラーゼ酵素により処理されたphi29増幅ゲノムDNA（これによって試料中の各CpG位置をメチル化する）（これは次いで重亜硫酸塩溶液で処理される）から構成される。７つの異なる参照標準は0%（すなわち、phi29増幅ゲノムDNAのみ）、5%、10%、25%、50%、75%及び100%（すなわち、phi29 Sss1処理されたゲノムのみ）で用いられた。 
【０２８４】
増幅された試料DNAの量は遺伝子（βアクチン（ACTB））を参照して定量されて、インプットDNAのために正規化する。標準化に関して、ACTB遺伝子の解析のためのプライマー及びプローブはCpGジヌクレオチドを欠いていおり、かくして増幅はメチル化レベルに関わらず可能である。メチル化可変位置がないので、１つのプローブしか必要でない。 
【０２８５】
以下のオリゴヌクレオチドが対照増幅物を増幅する反応において使用された：
対照プライマー1： TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT (配列番号10)
対照プライマー2： AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA (配列番号11)
対照プローブ： 6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA 又は Dabcyl (配列番号12)
【０２８６】
遺伝子PITX2の核酸配列は（配列番号1）に与えられ、重亜硫酸塩処理後、２つの異なる鎖が発生され、鎖の各々は２度表され、１度はメチル化型を処理する前に（配列番号2及び3）、そして１度は非メチル化型を処理する前に（配列番号4及び5）であり、これらはシトシン塩基を含まないことで（グアニンに隣接し、処理前にメチル化された5'にかかわらず）特徴付けられる。
【０２８７】
対象となるCpG部位を含むPITX2配列内の増幅物を発生するために以下のプライマーが用いられる：
PITX重亜硫酸塩増幅物の長さ：144 bp用のプライマー
PITX2: GTAGGGGAGGGAAGTAGATGTT (配列番号6)
PITX2: TTCTAATCCTCCTTTCCACAATAA (配列番号7)
【０２８８】
長さ144 bpの発生した増幅物によるゲノム領域は配列番号18に与えられている。
プローブ：
PITX2cg1: FAM-AGTCGGAGTCGGGAGAGCGA-Darquencher (配列番号8)
代わりのクエンチャーTAMRAもまた、追加実験において使用された： 
FAM-AGTCGGAGTCGGGAGAGCGA-TAMRA 
PITX2tg1: YAKIMA YELLOW-AGTTGGAGTTGGGAGAGTGAAAGGAGA-Darquencher (配列番号9)
更なる実験において以下もまた使用された：
VIC- AGTTGGAGTTGGGAGAGTGAAAGGAGA -TAMRA 
【０２８９】
特定の座におけるメチル化の度合いが、以下の式によって決定された：
メチル化率 = 100 * I (CG) / (I(CG) + I(TG))
(I = CG-プローブ又はTG-プローブの蛍光の強度)
PCR成分はEurogentecから注文された： 
3 mM MgCl2 緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ
プログラム (45サイクル)：95℃、10分；95℃、15秒；62℃、1分
【０２９０】
この分析は実施例２において使用されたものと同一の236試料について行われた。結果は図２に示される。図２は、上記の通りリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によってPITX2遺伝子の3CpG位置について、カプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す。下の曲線が中央値より上のメチル化レベルを有する集団における疾患のない患者の割合を示し、上の曲線が中央値より下のメチル化レベルを有する集団における疾患のない患者の割合を示す。X軸は月数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間の患者の集団の割合を示す。ｐ値（観察された分布が偶然によって起こる可能性）は0.0031と計算され、それによってアレイ解析によって得られたデータを確認する。
【０２９１】
比較に関して、図３は、検出オリゴが用いられた（詳細はEP 03 090 432.0を参照、これは参照によりここに組み入れられる）実施例２において記載されたチップハイブリダイゼーション実験による前記遺伝子のアレイ解析からの結果を示す。ｐ値（観察された分布が偶然によって起こる可能性）は0.0011として計算された。
【０２９２】
（実施例５）
もう１つのQM分析が開発され、これもまた極めてうまく実行された。以下のPITX2特異的オリゴヌクレオチドが164 bpの増幅物を生成するのに用いられた。オリゴヌクレオチドは3つのコメチル化CpG位置に関して特異的である：
162 bpの長さを有するPITX2重亜硫酸塩増幅物用のプライマー：
PITX2: AACATCTACTTCCCTCCCCTAC (配列番号14)
PITX2: GTTAGTAGAGATTTTATTAAATTTTATTGTAT (配列番号15)
生成された長さ162 bpの増幅物によるゲノム領域は配列番号19にて与えられる。
【０２９３】
プローブ（ABIから）：
PITX2-IIcg1: FAM-TTCGGTTGCGCGGT-MGBNQF (配列番号16) 
PITX2-IItg1: VIC-TTTGGTTGTGTGGTTG- MGBNQF (配列番号17)
【０２９４】
特定の座のメチル化の度合いが以下の式によって決定された：
メチル化率 = 100 * I (CG) / (I(CG) + I(TG))
(I = CG-プローブ又はTG-プローブの蛍光の強度)
PCR成分はEurogentecから注文された：
2,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ
プログラム (45サイクル)：95℃、10分；95℃、15秒；60℃、1分
【０２９５】
（実施例６：LOH解析）
患者材料
この研究に用いられる材料は、新鮮凍結の健康な乳房組織、治療されていない乳癌患者（＞10年を越えて追跡された）からの新鮮凍結の乳房腫瘍組織、及びタモキシフェン治療された患者（タモキシフェン治療から＞10年を越えて追跡された）からの試料からなる。これらのマイクロ切開された病変からのDNAの水溶液がPCRベースのLOH（ヘテロ接合性の喪失）解析用の、原料鋳型として用いられた。全ての腫瘍試料はER+リンパ節陰性患者から由来した。
【０２９６】
LOH解析
全ての組織試料からのDNAは２つの4q25-26マーカー（D4S1284及びD4S406）を用いてPCRベースのLOHに供された。これらのマーカーはPITX2遺伝子を含む染色体4上の領域を定めるが、前記領域は乳房癌腫におけるLOHを受けていると予め示された領域の8.5 kbpよりも大きい距離である［Cancer Research 59, 3576-3580, 1999年8月1日］。
【０２９７】
DNA抽出
Wizzard Kit（Promega）を用いて試料からDNAを抽出する。
PCR反応
更なる詳細に関してClin. Cancer Res., 5: 17-23, 1999を参照。
以下のプライマーを用いてシングルプレックスPCRにより各々の試料を解析する：
【０２９８】
D4S406
フォワードプライマー： GAAAGGCAGAGTCATAACAGGAAG (配列番号32)
リバースプライマー： TAAGGATAGAGTGATTTCCAAGAAAG (配列番号33)
PCR産物の大きさ：205 (bp)
GenBank Accession：Z16728
【０２９９】
D4S1284
フォワードプライマー： CTTATCTGACAACAAGCGAGTATG (配列番号34)
リバースプライマー： CAATTATTGTATTGTAGCATCGGAG (配列番号35)
PCR産物の大きさ：172 (bp)
GenBank Accession：L14168
5'末端に蛍光FAMタグ（D4S1284）又は蛍光TETタグ（D4S406）のいずれかを有するフォワードプライマーを合成。
好適な量の表２に記載のヌクレオチド混合物を調製。
別々のPCRチューブに各DNA試料の水溶液1μlを入れ、表３による9μlの反応混合物を加え、以下の条件に従って熱サイクルを行う。
熱サイクル条件：
95℃、15分間；39サイクル：95℃、1分間；55℃、0:45間；72℃、1:15間；及び72℃、10 間。
【０３００】
ゲル電気泳動
水平式超薄ハイスループット蛍光ベースDNAフラグメントゲル電気泳動（Horizontal ultrathin, high throughput fluorescence-based DNA fragment gel electrophoresis）がPCR生成対立遺伝子を分離し、そして解析するのに好ましい技術である。電気泳動の前に2μlホルムアミドローディング色素（APB）に増幅材料の１マイクロリットルを混合する。ROX 350蛍光サイズマーカー（0.7μl；ABI）を、増幅された腫瘍DNAに加え、対立遺伝子の大きさ決定を可能にする。試料を95℃まで熱し、70μmにロードし、5%水平式ポリアクリルアミドゲルで、1時間15分、30Wで、1×TBE中で電気泳動する。
【０３０１】
従来技術で一般的に知られているようにデータを収集すればよい（例えばClin. Cancer Res., 5: 17-23, 1999参照）。
対立遺伝子検出が個々のマーカーで生じたかどうかを決定するために、対立遺伝子を計算し、標準化の後で、対応する正常な試料と比較して処理された及び未処理の腫瘍試料の強度の喪失の百分率（Ｄ値）として表す。腫瘍DNAにおける対立遺伝子比が、正常DNAにおいて見られるよりも、40%より多く（DO.40） 減少した場合、試料はその座においてLOHを有するとして意味される。
【０３０２】
【表２】
2005224238.tif 000003
【０３０３】
【表３】
2005224238.tif 000004
【０３０４】
（実施例７：遺伝子PITX2の配列決定）
CpG位置のコメチル化が全てのエキソンにわたって関連していることを確認するために、遺伝子PITX2の配列決定が行われた。重亜硫酸塩配列決定のために、増幅プライマーが、遺伝子PITX2内の11配列をカバーするように設計された。より詳細には図１１を参照されたい。実施例４において解析された16試料は、アンプリコン生成のために利用された。各試料は重亜硫酸ナトリウムによって処理されて、配列決定された。配列データは、ABI 3700シークエンシング技術を用いて得られた。得られた配列トレースは正規化されて、メチル化百分率が、出願人の所有である重亜硫酸塩配列配列決定トレース解析プログラムを用いて計算された（更なる情報についてはWO 2004/000463を参照）。
【０３０５】
試料
実施例４に記載されたようにQM分析を用いた解析において、8試料が高メチル化を示し、8試料が低メチル化を示した。
【０３０６】
増幅
対象となるフラグメントが以下の条件を用いて増幅された。
PCR反応溶液：
Taq 5 U/μl            0,2
dNTPs 25mM 各々        0,2
10x 緩衝液             2,5
水                    10,1
プライマー (6,25μM)   2
DNA (1ng/μl)         10
サイクル条件： 
15分、95℃；30s、95℃；30s、58℃；1:30分、72℃（40サイクル）
【０３０７】
【表４】
2005224238.tif 000005
【０３０８】
配列決定
gリッチプライマーだけが、１つの例外で配列決定するために用いられた：増幅番号２はフォワード及びリバースプライマーの両方を用いて配列決定された。
ExoSAP-IT 反応溶液：
4μl PCR産物 + 2μl ExoSAP-IT
45分/37℃ 及び 15分/95℃
サイクル配列決定：
1μl BigDye v.1.1
1μl water
4μl Sanger buffer
4μl dNTP mix (0,025 mM each)
-----
10μl
+
5μl プライマー (2pmol/μl)
+
6μl ExoSAP-IT産物
サイクル
2分、96℃、26サイクル（30s/96℃、15s/55℃、4分/60℃）
【０３０９】
精製
96ウェルMultiScreen（Millipore）プレートを適当な配分装置を用いてSephadex G50（Amersham）で満たした。300μlの水を各ウェルに加えて、3時間4℃でインキュベートした。水は910gで5分間回転されることによって除去された。サイクル配列決定産物はプレートにロードされ、910gで5分間回転されることによって精製された。10μlのホルムアミドが各々の溶出液に加えられた。
【０３１０】
結果：
全てのPCRは産物を生成した。
図１２は出願人所有のソフトウェア（更なる情報に関してはWO 2004/000463を参照）によって解析された重亜硫酸塩配列決定データから生成されたマトリクスを提供する。カラム「A」及び「B」のマトリクスの各カラムは、１つの増幅物に対する配列決定データを表す。増幅物の数字はマトリックスの左に示されている。マトリックスの各列はフラグメント内の単一のCpG部位を表し、各カラムは個々のDNA試料を表す。「A」とマークの付されたカラムのマトリクスはQM分析（実施例４参照）により測定された中央値より下のメチル化を示し、「B」とマークの付されたカラムのマトリクスはQM分析により測定された中央値より下のメチル化を示した。
【０３１１】
左の縦棒は、100%メチル化を表す黒色から0%メチル化を表す薄灰色のカラム内の各位置の暗度によって表されるメチル化の度合いにより、百分率メチル化のスケールを表す。白い位置はデータが利用できなかった測定を表した。
【０３１２】
重亜硫酸塩配列決定は、試料の２つの選択されたクラス間のCpG部位の異なるメチル化を示し、更にはコメチル化が遺伝子にまたがって観察された。特に増幅物４から７は解析グループの間での、高いレベルの異なるメチル化を示した。
【０３１３】
（実施例８）
ERBB2、TFF1、PLAU、PITX2、ONECUT、TBC1D3、及びABCA8のセットからの最も有望であるマーカーパネルを検証するために、リアルタイム分析は設計され、最適な正確さを有する分析を提供するために最適化された。該分析はパラフィン包埋組織（以下ではPETとも称する）及び新鮮凍結組織試料との組み合わせで行われた。PET由来のDNAはしばしば「低品質」であり（例えば、DNAの断片化の度合いが高い、及び試料からのDNA回収率が低い）、従ってPETでの分析結果の確認は分析のロバスト性、及びマーカーの有用性の増大を示す。
【０３１４】
定量的メチル化分析は、遺伝子ERBB2、TFF1、PLAU、PITX2、ONECUT、TBC1D3、及びABCA8のために設計され、415エストロゲン受容体陽性リンパ節陰性試料の治療されていない乳癌患者、及び541エストロゲン受容体陽性リンパ節陰性試料のタモキシフェンの治療のされた試料の試料セットを用いて試験された。ほぼ100のこれらの試料が、マイクロアレイ研究において事前に解析された。
【０３１５】
QM分析（定量的メチル化分析（Quantitative Methylation Assay））は、定量的DNAメチル化検出のためのリアルタイムPCRベースの方法である。分析原理は、標的領域の非メチル化特異的増幅物、及びCG又はTG状態に特異的である２つの異なるプローブの競合的ハイブリダイゼーションによるメチル化特異的検出に基づく。本研究については、TaqManプローブは２つの異なる蛍光色素（CG特異的プローブについては「FAM」、TG特異的プローブについては「VIC」）を用いて標識され、クエンチャー分子によって更に修飾された（「TAMRA」又は「Minor Groove Binder/non-fluorescent quencher」）ものが使用された。
QM分析の生データの評価は、２つの異なる方法を用いて可能である：
１．増幅物のログ相における絶対蛍光強度（FI）の測定
２．CG及びTG特異的プローブの閾値サイクル（Ct）における差 。
Ct法を用いることによって、この研究の結果は生成される。
【０３１６】
以下の一連の定量的メチル化分析において、増幅された試料DNAの量は、遺伝子GSTP1を参照することによって定量され、インプットDNAのために正規化する。標準化のために、GSTP1遺伝子の解析用のプライマー及びプローブはCpGジヌクレオチドを欠いており、かくして増幅はメチル化レベルに関わらず可能である。メチル化可変位置がないので、１つのプローブオリゴヌクレオチドしか必要とされない。
【０３１７】
試料セット
ER+ N0 治療のされていない集団
同定されたマーカーが強い予後診断成分を有することを示すために、いかなる補助療法によっても治療されていない患者からのER+ N0腫瘍試料が解析された。この集団において有意に生存期間の差を示すことができるマーカーは予後診断的であると考えられる。このセットの全ての508試料が細胞核ペレットとして大学の共同研究者から得られた（新鮮凍結試料）。試料集団は、２つのサブセットに分けられることができる：１つは（打ち切り及び再発している患者の両方から）ランダムに選択された415の試料を有するものであり、再発の自然な分布を有する集団を表し、もう１つの93試料は再発している患者のみからのものである。後者の試料は感受性／特異性解析にのみ用いられた。
【０３１８】
図１６はカプラン−マイヤープロットにおけるランダムに選択された集団の無病生存期間を示し、図１７は再発した打ち切り患者についての追跡期間の分布を度数分布表で示す。表６は異なる種類の再発によって中断された事象の数を列挙する。まとめると、この集団の生存期間は、文献から予測されるものに一致している。
【０３１９】
ER+ N0 TAM治療された集団
本発明の１つの意図された標的集団はホルモン療法で治療されたER+ N0腫瘍を有する患者である。この集団においてマーカー候補の性能を調査するために、タモキシフェンにより治療された患者からのER+ N0腫瘍からの589試料が解析された。全ての試料はパラフィン包埋組織（PET）として受けられた。3から10の10μm片が提供された。
【０３２０】
さらに、89のPETのために、同じ腫瘍からの新鮮凍結試料に対応する患者試料が、対照として本研究に含まれた。これらの試料は既にフェーズ１において使用されているので、それらは２種類の同一の研究を可能にした：
・チップ 対 QM分析
・新鮮凍結試料 対 PET試料
【０３２１】
ER+、N0、TAM治療された集団の試料が8つの異なる提供者から受け入れられた。全部の589試料が処理されて、そのうち48が種々の理由により研究から除外されなくてはならなかった（例えば同じ腫瘍からの２つのサンプル、含める基準を満たしていない患者からの試料、等）。 
【０３２２】
図１８はカプラン−マイヤープロットにおける全集団の無病生存期間を示し、図１９は再発した打ち切り患者についての追跡期間の分布を度数分布表にして示す。表５は異なる種類の再発により中断された事象の数を列挙する。まとめると、この集団の生存期間（10年後に82.1%）は、文献から予測されるもの（79.2%）に一致する。
【０３２３】
DNA抽出
新鮮凍結試料からのDNA抽出
>細胞核ペレットとして利用可能な508の新鮮凍結試料の全部からQIAamp Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてゲノムDNAが単離された。抽出は幾つかの改良をしながらプロテアーゼKを用いて細胞培養プロトコルに従って行われた。
PET試料からのDNA抽出
589の提供されたPET試料が提供者によって運ばれてきたチューブ内で直接脱パラフィンされた。組織は次いで溶解され、QIAGEN DNeasy Tissue kitを用いてDNAが抽出された。
【０３２４】
重亜硫酸塩処理
重亜硫酸塩処理は、Olekら、Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6によって開示される方法に基づいて、出願人の研究室の作業の流れに最適化されて実行された。
【０３２５】
定量標準
反応は、試料内のメチル化レベルを定量するために既知のメチル化レベルのDNA標準を参照して補正された。DNA標準は、重亜硫酸塩処理されたphi29増幅ヒトゲノムDNA（Promega）（すなわちメチル化されていない）、及び／又はSss1メチラーゼ酵素によって処理されたphi29増幅ゲノムDNA（これによって、試料内の各CpG位置をメチル化する）（これは次いで、重亜硫酸塩処理される）から構成された。7つの異なる参照標準が0%（すなわち、phi29増幅ゲノムDNAのみ） 、5%、10%、25%、50%、75%及び100%（すなわち、phi29 Sss1処理ゲノムのみ）で用いられた。ヒトゲノムDNA（Promega） の2000 ngのバッチが重亜硫酸塩により処理された。メチル化MDA DNAを生成するために、4.5 μg MDA-DNA （700ng/μl）の13のチューブが、 Sss1によって処理された。
【０３２６】
対照分析
GSTP1-C3分析設計は、新鮮な／凍結された試料、血漿又は血清などのような微々たる試料、及びパラフィン包埋材料のような保管庫内の検体から得られたDNAを含む、異なる原料からのDNAを定量するのに好適になる。以下のオリゴヌクレオチドは対照増幅物を増幅させるために反応に使用された：
対照プライマー1： GGAGTGGAGGAAATTGAGAT (配列番号104)
対照プライマー2： CCACACAACAAATACTCAAAAC (配列番号105)
対照プローブ： FAM-TGGGTGTTTGTAATTTTTGTTTTGTGTTAGGTT-TAMRA (配列番号06)
サイクルプログラム（40サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
58℃、 1分
【０３２７】
分析設計及び反応条件
２つの分析が遺伝子PITX2（配列番号23）の分析に関して開発された。
分析1：
プライマー： GTAGGGGAGGGAAGTAGATGTT (配列番号107)
TTCTAATCCTCCTTTCCACAATAA (配列番号108)
プローブ： FAM-AGTCGGAGTCGGGAGAGCGA-TAMRA (配列番号109)
VIC-AGTTGGAGTTGGGAGAGTGAAAGGAGA-TAMRA (配列番号110)
アンプリコン（配列番号111）：
【化１】
2005224238.tif 000006
フラグメントの長さ：143 bp
プライマー、プローブ、及びCpGジヌクレオチドの位置がハイライトされている。
PCR成分（Eurogentecによって供給される）：3 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
サイクルプログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分 
【０３２８】
分析2：
プライマー： AACATCTACTTCCCTCCCCTAC (配列番号112)
GTTAGTAGAGATTTTATTAAATTTTATTGTAT (配列番号113)
プローブ： FAM-TTCGGTTGCGCGGT-MGBNQF (配列番号114) 
VIC-TTTGGTTGTGTGGTTG-MGBNQF (配列番号115)
アンプリコン（配列番号116)：
【化２】
2005224238.tif 000007
フラグメントの長さ：164 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。 
プローブは３つのコメチル化CpG位置をカバーする。
PCR成分（Eurogentecによって供給される）：2,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３２９】
特定の座でのメチル化の程度は、以下の式によって決定された：
絶対蛍光強度を使用：メチル化率= 100 * I (CG) / (I(CG) + I(TG))
(I = CGプローブ又はTGプローブの蛍光の強度）
閾値サイクルCtを使用：メチル化率= 100*CG/(CG+TG)= 100/(1+TG/CG)= 100/(1+2^デルタ(ct))
（PCR効率E=2と仮定；デルタ(Ct)= Ct(メチル化) - Ct(非メチル化)）
【０３３０】
遺伝子PLAU 
プライマー： GTTAGGTGTATGGGAGGAAGTA (配列番号117)
TCCCTCCCCTATCTTACAA (配列番号118)
プローブ： FAM-ACCCGAACCCCGCGTACTTC-TAMRA (配列番号119)
VIC-ACCCAAACCCCACATACTTCCACA-TAMRA (配列番号120)
アンプリコン (配列番号121)：
【化３】
2005224238.tif 000008
フラグメントの長さ： 166 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：2,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３３１】
遺伝子ONECUT2 
プライマー： GTAGGAAGAGGTGTTGAGAAATTAA (配列番号122)
CCACACAAAAAATTTCTATACTCCT (配列番号123)
プローブ： FAM- ACGGGTAGAGGCGCGGGT -TAMRA (配列番号124)
VIC- ATGGGTAGAGGTGTGGGTTATATTGTTTTG-TAMRA (配列番号125)
アンプリコン (配列番号126)：
【化４】
2005224238.tif 000009
フラグメントの長さ： 266 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：3 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３３２】
遺伝子ABCA8 
プライマー： GTGAGGTATTGGATTTAGTTTATTTG (配列番号127)
CCCTAAATCTCATCCTAAAAACAC (配列番号128)
プローブ： FAM- TGAGGTTTCGGTTTTTAACGGTGG -TAMRA (配列番号129)
VIC- TGAGGTTTTGGTTTTTAATGGTGGGAT -TAMRA (配列番号130)
アンプリコン (配列番号131)：
【化５】
2005224238.tif 000010
フラグメントの長さ： 168 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：3 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３３３】
遺伝子ERBB2 
プライマー： GGAGGGGGTAGAGTTATTAGTTTT (配列番号134)
ACTCCCAACTTCACTTTCTCC (配列番号135)
プローブ： FAM- TAATTTAGGCGTTTCGGCGTTAGG -TAMRA (配列番号136)
VIC- TAATTTAGGTGTTTTGGTGTTAGGAGGGA -TAMRA (配列番号137)
アンプリコン (配列番号138)：
【化６】
2005224238.tif 000011
フラグメントの長さ： 144 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：2,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３３４】
遺伝子TFF1 
プライマー：AGTTGGTGATGTTGATTAGAGTT (配列番号139)
CCCTCCCAATATACAAATAAAAACTA (配列番号140)
プローブ： FAM- ACACCGTTCGTAAAA-MGBNFQ (配列番号141)
VIC- ACACCATTCATAAAAT-MGBNFQ (配列番号142)
アンプリコン (配列番号143)：
【化７】
2005224238.tif 000012
フラグメントの長さ： 189 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：2,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分
95℃、15秒
62℃、 1分
【０３３５】
遺伝子TBC1D3 
プライマー：TTTTTAGTTGGTTTTTATTAGGGTTTT (配列番号 144)
CCAACATATCCACCCACTTACT (配列番号 145)
プローブ： FAM- TTTCGACTAATCTCCCGCCGA-TAMRA (配列番号 146)
VIC- TTTCAACTAATCTCCCACCAAATTTACTATCA-TAMRA (配列番号 147)
アンプリコン (配列番号 148)：
【化８】
2005224238.tif 000013
フラグメントの長さ： 142 bp
プライマー、プローブ、及びCpG位置の位置がハイライトされている。
Eurogentecによって供給されるPCR成分：4,5 mM MgCl2緩衝液、10x緩衝液、Hotstart TAQ、200 μM dNTP、625 nM 各プライマー、200 nM 各プローブ
プログラム（45サイクル）：  95℃、10分；95℃、15秒；62℃、 1分
【０３３６】
設計された分析の各々は以下のセットの試料について試験された：
・治療中に再発した（全ての再発）、タモキシフェン治療された患者。
・離れた転移のみにより治療中に再発した、タモキシフェン治療された患者。
・治療中に再発した（全ての再発）、タモキシフェン治療されていない患者。
・離れた転移のみにより治療中に再発した、タモキシフェン治療されていない患者。
【０３３７】
生データの処理
全ての解析はCT評価に基づいて行われた（蛍光強度を用いた評価が要望に応じて利用可能である）。指数関数の増幅相における最適なリアルアタイムPCR条件を想定すれば、メチル化DNAの濃度（Cmeth）は、
【数１】
2005224238.tif 000014
によって決定され、
式中CTCGはCG受容体（FAMチャンネル）の閾値サイクルを示し、
CTTGはTG受容体（VICチャンネル）の閾値サイクルを示す。
サイクル用の閾値は、Amplification Plots［ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System User Guide］の映像検査の後、人間の専門家によって決定された。サイクルの値（CTCG及びCTTG）は、ABI 7900ソフトウェアによってこれらの閾値を用いて計算された。増幅曲線は閾値を越えない場合はいつでも、サイクルの値は最大サイクル、すなわち50に設定された。
【０３３８】
統計学的方法
コックス回帰
無病生存期間の時間（DFS）（又は、無転移生存期間、MFS）と共変数の間の関係は、コックス比例ハザードモデル（Cox Proportional Hazard model）（Cox及びOates, 1984; Harrel, 2001）を用いてモデル化された。ハザード、すなわち再発の即時の危険性は、不変及び複数回帰解析に関して、各々
h(t|x) = h0(t)×exp(βx)                              (3)
及び
h(t|x1,…,xk) = h0(t)×exp(β1x1 + … + βkxk)        (4)
としてモデル化され、式中tは外科療法後の月数で計測された時間であり、h0(t)はベースラインのハザードであり、xは共変数のベクターであり（例えば分析の測定値）及びβは回帰係数のベクター（モデルのパラメータ）である。βはコックス比例ハザードモデルの部分的尤度を最大化することによって推定される。
尤度の比の試験は、メチル化がハザードに関連しているかどうかを試験するために行われる。完全モデルとゼロのモデルの〜Log（尤度）の間の相違は、ゼロ仮説β1 = … =βk = 0の下でk自由度によるほぼ'2分布である。
【０３３９】
比例ハザードの仮定はスケールドSchoenfeld残差によって確認された（Thernauら、2000）。
【０３４０】
計算のために、「生存期間」パッケージのコックス比例ハザードモデルの解析及び診断 R関数coxph, coxph.zphが用いられた。
【０３４１】
ステップワイズ回帰解析
多変数のコックス回帰モデルに関して、ステップワイズ手順（Venablesら、1999；Harrel、2001）が関連する変数のみを含むサブモデルを見つけるために使用された。２つの効果がこれらの手順により通常達成される：
・依存変数（DFS/MFS）に基本的には関連していない変数（メチル化率）は、モデルに関係のある情報を追加しないので、除外される。
・高い相関のある変数のセットのうち、依存変数に最も関連しているもの１つだけが保持される。
両方の型の変数の包含が、数的不安定性、及び力の喪失を導きうる。さらに、予測性能はオーバーフィッティングにより低くなりうる。
【０３４２】
適用されるアルゴリズムは、赤池の情報量基準（AIC）を最小化することを目的とし、それは
AIC = -2×最大対数尤度 + 2×パラメータ数
として定義される。
AICはモデルの予測性能に関連し、値が小さいほどより良い性能を約束する。更なる変数の包含はモデルの適合性を常に向上させ、従って可能性を増加させうが、第２タームは更なるパラメータの推定を不利にする。最も良いモデルは、良い適合性と通常変数の数が小さい又は中程度である、折衷のモデルを与える。
【０３４３】
AICによるステップワイズ回帰計算はR関数"step"により行われた。
【０３４４】
カプラン−マイヤー生存期間の曲線及びログランク試験
生存期間の曲線はカプラン−マイヤー法を用いてDFS/MFSデータから推定される（Kaplan及びMeier、1958）。Log-rank試験は２つの生存期間の曲線、例えば高メチル化グループ 対 低メチル化グループの差について試験するために用いられた。この試験の記載にいついては（Cox及びOates、1984）を参照されたい。
【０３４５】
カプラン マイヤー分析に関しては、"survival"パッケージの関数"survfit"及び"survdiff"パッケージが用いられた。
【０３４６】
他の共変数からのマーカーの独立性
我々のマーカーパネルが追加かつ独立の情報を与えるかどうかを確認するために、他の関連のある臨床因子をコックス比例ハザードモデルに含めて、各因子の重みに関してｐ値が計算された（Wald試験）（Thernauら、2000）。コックス比例ハザードモデルにおける追加の因子の解析に関して、R関数"coxph"が用いられた。
【０３４７】
相関分析
Pearson及びSpearman相関係数が計算されて、測定値間の一致性を推定する（例えば、一致する新鮮凍結試料及びPET試料におけるメチル化）。
【０３４８】
密度推定
数的変数に関して、核密度推定がガウス核及び変数の帯域幅を用いて実行される。帯域幅はSilvermanの"rule-of-thumb"を用いて決定される（Silverman、1986）。密度の計算にはR関数"density"が用いられた。
【０３４９】
感受性及び特異性の分析
単一の分析及びマーカーパネルの感受性及び特異性の分析に関しては、ROCが計算された。ROCの計算は２つの方法により行われた：第１の方法は、時間に関する所定の閾値TThresholdについての感受性及び特異性を計算することである。その閾値を用いて、真の陽性、偽の陽性、真の陰性、偽の陰性が定義され、感受性と特異性についての値がモデルの異なるカットオフについて計算された。TThreshold前に打ち切りとなった患者は除外された。ROCは異なる時期のTThresholdについて計算された（3年、4年、...、10年）。第２の方法は、所定の時期TThresholdに関し、マーカー陽性及びマーカー陰性グループにおける生存期間の可能性について、カプラン−マイヤー推定に基づいてBayes式を用いることによって感受性及び特異性を計算することである（Heagertyら、2000）。ROCは異なる時期のTThresholdについて計算された（3年、4年、...、10年）。
【０３５０】
k分割交差検定
モデル選択及びモデルロバスト性の分析のために、k分割交差検定（Hastieら、2001）が用いられた。観察のセットは、乱数によってk部分に分けられた。順に、全ての部分は試験セットとして用いられ、残りのk-1部分は訓練セットとして用いられた。この手順はn回繰り返された。
【０３５１】
Population Charts
打ち切りと共変数との間の関係を説明するために、Population Charts（Moecksら、2002）が用いられた。共変数のベースラインは、事象を有する全ての観察を含んで計算された。所定の時間tに関して、時間tに設定された危険性における全ての打ち切り患者について、平均（年齢のような実際の変数の場合）、又は分数（絶対的な変数の場合）が計算され、ベースラインの値に加えられた。
【０３５２】
技術的性能
分析の繰り返しの比較
各マーカーは少なくとも３回繰り返して測定され、分析繰り返し間の変動は、新鮮凍結試料よりもPETについてより高く見られた。
【０３５３】
新鮮凍結試料 対 PET試料の一致性の研究
本研究で解析されたマーカー（実施例２）は、最初に、新鮮凍結試料を用いてチッププラットフォーム上で同定された（実施例１）。 ER+ N0の治療されていない集団は実施例２において新鮮凍結試料についても解析された。一致性の研究は、測定されたメチル化比が新鮮凍結試料及びPET試料について比較可能であることを示さなければならない。この目的のために、チップに既に使用された３つの異なる提供者からの89の新鮮凍結試料が、同じ腫瘍から由来する対応するPET試料と平行して再度処理された。
【０３５４】
図１５は、（QM分析を用いて）新鮮凍結試料及びPET試料間の散布図としてマーカー候補PITX2分析1についての、かかる一致性の研究を示す。対をなす試料間の関連は0.81である（Spearman's rho）。これはn=89試料に基づく。
【０３５５】
結果
単一マーカーの評価
８つの構築されたQM分析の各々は、N0、ER+の治療されていない患者集団（ランダムな選択及び更なる再発）からの508試料を、３回繰り返して測定するために用いられた。質的基準を満たしていない測定点をフィルタしコックス解析を実行した後、各単一マーカーについてのカプラン−マイヤー生存期間の曲線及びROC曲線が生成された。 
２つの異なる臨床的終点は解析のために用いられた：
・無病生存期間、すなわち事象として全ての種類の再発（離れた転移、原位置での再発、反対の乳房における再発）を用いる。
・無転移生存期間、すなわち事象として離れた転移のみを扱う。
【０３５６】
ER+、N0、TAM治療された集団を解析するために、５つのマーカー候補が、N0、ER+の治療のされていない患者の集団からの541試料について解析された。分析は３回繰り返して測定された。治療のされていない集団について測定された３つの分析（PITX-2、ONECUT、及びABCA8）は、TAM治療された集団について利用可能である限定された材料により測定されなかった。これらの分析は、治療のされていない集団においてそれらが悪く実行されるか（ONECUT及びABCA8）、PITX2-II場合にこのマーカー（PITX2-I）の他の分析より有意に悪く実行されるかであるため、却下された。質的基準を満たしていない測定点のフィルタの後、各単一マーカーについて、カプラン−マイヤー生存期間の曲線及びROC曲線が生成された。
２つの異なる臨床的終点が用いられた：
・無病生存期間、すなわち事象として全ての種類の再発（離れた転移、原位置での再発、反対の乳房における再発）を用いる。
・無転移生存期間、すなわち事象として離れた転移のみを扱う。
【０３５７】
各単一分析のカプラン−マイヤー推定による無病生存期間又は無転移生存期間の曲線は、図１４から３９に示され、分析の組み合わせは図４０から５５に示される。X軸は年数での患者の無病生存期間の時間を示し、Y軸は無病生存期間を有する患者の割合を示す。黒色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの上を有する集団における疾患のない患者の割合を示し、灰色のプロットは最適なカットオフポイントのメチル化レベルの下を有する集団における疾患のない患者の割合を示す。
【０３５８】
以下のｐ値（観察された分布が偶然によって起こる可能性）は、カットオフが最適化されたときに計算された。カットオフの最適化に関して、両方のグループの分位は、0.2と0.8の間で変動し、そして曲線の分離についてのｐ値は各分位に関して計算された。最も低いｐ値を持つ分位は、次いで最も良いカットオフであった。百分率値は、カットオフポイントでメチル化率に帰する。
【０３５９】
単一遺伝子分析
タモキシフェン治療
TAM治療（全ての再発）ERBB2（図１４）：ｐ値0.089；カットオフポイント：1.3% 
TAM治療（離れたもののみ）ERBB2（図１５）：ｐ値0.084；カットオフポイント：0.1%
TAM治療（全ての再発）TFF1（図１６）：ｐ値0.037；カットオフポイント：50.9%
TAM治療（離れたもののみ）TFF1（図１７）：ｐ値0.029；カットオフポイント：52.9%
TAM治療（全ての再発）PLAU（図１８）：ｐ値0.056；カットオフポイント：4.8%
TAM治療（離れたもののみ）PLAU（図１９）：ｐ値0.065；カットオフポイント：4.8%
TAM治療（全ての再発）PITX2（図２０）：ｐ値0.01；カットオフポイント：13.1%
TAM治療（離れたもののみ）PITX2（図２１）：ｐ値0.0012；カットオフポイント：14.3%
TAM治療（全ての再発）TBC1D3（分析II）（図２２）：ｐ値0.28；カットオフポイント：94.6%
TAM治療（離れたもののみ）TBC1D3（分析II）（図２３）：ｐ値 0.078；カットオフポイント： 97%
【０３６０】
図６２は、ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデルPITX2（分析1）のみについての、異なる時期におけるROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらはKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.42分位）についての値がプロットされる。
AUC 60月：0.6
AUC 72月：0.69
AUC 84月：0.69
AUC 96月：0.67
【０３６１】
図６３は、ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデルTFF1についての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらは異なる閾値（=5、6、7、8年）のKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.78分位）についての値がプロットされる。
AUC 60月： 0.7
AUC 72月：0.65
AUC 84月：0.61
AUC 96月：0.64
【０３６２】
図６４は、ER+N0 TAM治療された集団においてマーカーモデルPLAUについての異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらは異なる閾値（=5、6、7、8年）のKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.77分位）についての値がプロットされる。
AUC 60月： 0.6
AUC 72月： 0.63
AUC 84月： 0.57
AUC 96月： 0.6
【０３６３】
タモキシフェン治療なし
タモキシフェン治療なし（全ての再発）ERBB2（図２４）：ｐ値0.21；カットオフポイント：0%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）ERBB2（図２５）：ｐ値0.23；カットオフポイント：0.6%，
タモキシフェン治療なし（全ての再発）TFF1（図２６）：ｐ値0.012；カットオフポイント：49.6%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）TFF1（図２７）：ｐ値0.016；カットオフポイント：45.4%；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）PLAU（図２８）：ｐ値0.011；カットオフポイント： 3.2%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）PLAU（図２９）：ｐ値0.0082；カットオフポイント：5.5%；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）PITX2(I)（図３０）：ｐ値1.4e-06；カットオフポイント：35.4%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）PITX2(I)（図３１）：ｐ値1.7 e-05；カットオフポイント：41.2%；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）PITX2(II)（図３２）：ｐ値0.00026; cut off point: 56.1%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）PITX2(II)（図３３）：ｐ値0.0026；カットオフポイント：61.9%；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）ONECUT（図３４）：ｐ値0.26；カットオフポイント：0%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）ONECUT（図３５）：ｐ値0.77；カットオフポイント：0%;
タモキシフェン治療なし（全ての再発）TBC1D3（図３６）：ｐ値0.004；カットオフポイント：98.6%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）TBC1D3（図３７）：ｐ値0.00022；カットオフポイント：98.6%；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）ABCA8（図３８）：ｐ値0.0065；カットオフポイント：60.9%；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）ABCA8（図３９）：ｐ値0.15；カットオフポイント：49.2%；
【０３６４】
パネル
単一のマーカー評価の結果に基づいて、マーカー候補PITX2-分析I、TFF1及びPLAUを用いたモデルの構築が決定された。これらのマーカの組み合わせの全可能性が評価された。
【０３６５】
タモキシフェン治療
TAM治療（全ての再発）TFF1及びPLAU（図４０）：ｐ値0.023；カットオフポイント：0.7分位；
TAM治療（離れたもののみ）TFF1及びPLAU（図４１）：ｐ値0.00084；カットオフポイント：0.72分位；
TAM治療（全ての再発）TFF1及びPLAU及びPITX2（図４２）：ｐ値0.037；カットオフポイント：0.72分位；
TAM治療（離れたもののみ）TFF1及びPLAU及びPITX2（図４３）：ｐ値0.0014；カットオフポイント：0.4分位；
TAM治療（全ての再発）PITX2及びTFF1（図４４）：ｐ値0.17；カットオフポイント：0.78分位；
TAM治療（離れたもののみ）PITX2及びTFF1 （図４５）：ｐ値0.0048；カットオフポイント：0.32分位；
TAM治療（全ての再発）PITX2及びPLAU（図４６）：ｐ値0.1；カットオフポイント：0.74分位；
TAM治療（離れたもののみ）PITX2及びPLAU（図４７）：ｐ値0.0081；カットオフポイント：0.44 分位。
【０３６６】
図６１はER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデルPITX2（分析1）及びTFF1について異なる時期でのROCプロットを示す。図Aは60月のプロットを示し、図Bは72月でのプロットを示し、図Cは84月でのプロットを示し、及び図Dは96月でのプロットを示す。離れた転移のみが事象として定義される。感度（不良な予後グループにおける全ての再発患者の割合）はX軸に示され、特異性（良好な予後グループにおける全ての再発のない患者の割合）はY軸に示され、これらはKM推定から計算され、曲線下の推定領域（AUC）が計算される。中央値カットオフ（三角）及び最もよいカットオフ（菱形、0.32分位）についての値がプロットされる。
AUC 60月： 0.62
AUC 72月： 0.67
AUC 84月： 0.63
AUC 96月： 0.65
【０３６７】
タモキシフェン治療なし
タモキシフェン治療なし（全ての再発）TFF1及びPLAU（図４７）：ｐ値0.0015；カットオフポイント：0.78分位；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ） TFF1及びPLAU（図４７）：ｐ値0.003；カットオフポイント：0.8分位；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）TFF1及びPLAU及びPITX2 （図４７）：ｐ値8.9e-07；カットオフポイント：0.64分位；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ）TFF1及びPLAU及びPITX2 （図４７）：ｐ値5.4e-05；カットオフポイント：0.66分位；
タモキシフェン治療なし（全ての再発）PITX2及びTFF1（図４７）：ｐ値1.9e-06;；カットオフポイント：0.72分位；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ） PITX2及びTFF1（図４７）：ｐ値3.5e-05；カットオフポイント：0.76分位；
タモキシフェン治療なし（全ての再発） PITX2及びPLAU （図４７）：ｐ値1.1e-06；カットオフポイント：0.68分位；
タモキシフェン治療なし（離れたもののみ） PITX2及びPLAU （図４７）：ｐ値1.5e-05；カットオフポイント：0.64分位。
【０３６８】
マーカーモデルのロバスト性
モデルのロバスト性を評価するために、交差検定がモデルマーカーパネルPITX2（分析1）とTFF1及びマーカーパネルPITX2（分析1）のみで、200回繰り返して行われた。ある特定の患者の悪い又は良い結果グループへの割り当ての安定性が図６５に示されており、左手の図は、モデルマーカーパネルPITX2（分析1）とTFF1を示し、右手の図はマーカーパネルPITX2（分析1）のみを示す。プロットは、どれくらいの数の交差検定の繰り返しで、各患者がグループ１（薄灰色）又はグループ２（濃灰色）に割り当てられるかを示している。
【表５】
2005224238.tif 000015
【表６】
2005224238.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０３６９】
【図１】ステージ1-3の乳癌腫瘍の単純なモデルを示す。
【図２】実施例４に記載される分析（QM分析）の結果を示す。
【図３】実施例２に記載されるチップハイブリダイゼーションの実験の結果を示す図である。
【図４】メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子の２つのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図５】メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内の6つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図６】メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内の6つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である（グレードG1又はG2の腫瘍であると特徴付けられた148患者のサブ集団のみの分析）。
【図７】メチル化特異的検出オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション解析によるPITX2遺伝子（配列番号13）の好ましい領域内の6つの異なるCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である（ステージ1又は2（T1又はT2）の腫瘍であると特徴付けられた224患者のサブ集団のみの分析）。
【図８】遺伝子TBC1D3及びCDK6からの各々の２つのオリゴヌクレオチドと、２つのCpG部位をカバーする遺伝子PITX2からの１つのオリゴヌクレオチドの組み合わせの無病生存期間の曲線を示す図である。
【図９】図８によるプロットを示し、 St. Gallen法にってセットされた試料の分類を示す図である。
【図１０】遺伝子PITX2によりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の図である。
【図１１】実施例７において配列決定された増幅物の位置の図である。
【図１２】実施例７による遺伝子PITX2の11増幅物の配列決定データを示す図である。
【図１３】オンラインのEnsemblデータベースに注釈されるように、PITX2のmRNAの転写変異体の概略図である。
【図１４】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図１５】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図１６】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図１７】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図１８】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図１９】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図２０】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図２１】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図２２】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図２３】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図２４】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図２５】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりERBB2遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図２６】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図２７】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図２８】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図２９】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図３０】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図３１】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図３２】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図３３】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図３４】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりONECUT遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図３５】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりONECUT遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図３６】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図３７】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTBC1D3遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図３８】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりABCA8遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図３９】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりABCA8遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図４０】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図４１】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子のCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図４２】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図４３】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図４４】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図４５】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図４６】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図４７】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図４８】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図４９】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図５０】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図５１】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりTFF1及びPLAU及びPITX遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図５２】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図５３】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びTFF1遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図５４】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無病生存期間の曲線を示す図である。
【図５５】実施例８によるリアルタイムメチル化特異的プローブ解析によりPITX及びPLAU遺伝子の組み合わせのCpG位置に関するカプラン−マイヤー推定による無転移生存期間の曲線を示す図である。
【図５６】実施例８によるPITX2遺伝子分析１を用いて分析されたマッチドペアPET及び新鮮凍結組織の散布図である。
【図５７】ランダムに選択されたER+、N0、実施例８によるカプラン−マイヤー生存期間のプロットにおける治療のされていない患者の集団の無病生存期間（DFS）を示す図である。
【図５８】ER+、N0、実施例８による治療のされていない集団における追跡期間の分布を示す図である。
【図５９】ER+、N0、実施例８によるカプラン−マイヤー生存期間のプロットにおけるTAM治療された集団の無病生存期間（DFS）を示す図である。
【図６０】ER+、N0、実施例８による治療のされていない集団における追跡期間の分布を示す図である。
【図６１】マーカーモデル3522（分析１）及び実施例８による ER+N0 TAM治療された集団における2265について異なる時期でのROCプロットを示す図である。
【図６２】実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル3522（分析１）のみについての異なる時期でのROCプロットを示す図である。
【図６３】実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル2265についての異なる時期でのROCプロットを示す図である。
【図６４】実施例８による ER+N0 TAM治療された集団におけるマーカーモデル2395についての異なる時期でのROCプロットを示す図である。
【図６５】ある特定の患者の悪い又は良い結果のグループへの割り当ての安定性を示す図である。
【図１】
2005224238.tif 000017
【図１０】
2005224238.tif 000018
【図５６】
2005224238.tif 000019
【図５８】
2005224238.tif 000020
【図６０】
2005224238.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2005224238.tif 000050
【図３２】
2005224238.tif 000051
【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2005224238.tif 000060
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2005224238.tif 000063
【図４５】
2005224238.tif 000064
【図４６】
2005224238.tif 000065
【図４７】
2005224238.tif 000066
【図４８】
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【図４９】
2005224238.tif 000068
【図５０】
2005224238.tif 000069
【図５１】
2005224238.tif 000070
【図５２】
2005224238.tif 000071
【図５３】
2005224238.tif 000072
【図５４】
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【図５５】
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【図５７】
2005224238.tif 000075
【図５９】
2005224238.tif 000076
【図６１】
2005224238.tif 000077
【図６２】
2005224238.tif 000078
【図６３】
2005224238.tif 000079
【図６４】
2005224238.tif 000080
【図６５】
2005224238.tif 000081
【配列表】
2005224238000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月10日(2005.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
このアレイ実験において用いられたオリゴヌクレオドの配列は以下である：
配列番号24: AGTCGGGAGAGCGAAA 
配列番号25: AGTTGGGAGAGTGAAA 
配列番号26: AAGAGTCGGGAGTCGGA 
配列番号27: AAGAGTTGGGAGTTGGA 
配列番号28: GGTCGAAGAGTCGGGA 
配列番号29: GGTTGAAGAGTTGGGA 
配列番号30: ATGTTAGCGGGTCGAA 
配列番号31: TAGTGGGTTGAAGAGT
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０３】
【表３】
2005224238.tif 000082
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３８】
統計学的方法
コックス回帰
無病生存期間の時間（DFS）（又は、無転移生存期間、MFS）と共変数の間の関係は、コックス比例ハザードモデル（Cox Proportional Hazard model）（Cox及びOates, 1984; Harrel, 2001）を用いてモデル化された。ハザード、すなわち再発の即時の危険性は、不変及び複数回帰解析に関して、各々
h(t|x) = h0(t)・exp(βx)                              (3)
及び
h(t|x1,…,xk) = h0(t)・exp(β1x1 + … + βkxk)        (4)
としてモデル化され、式中tは外科療法後の月数で計測された時間であり、h0(t)はベースラインのハザードであり、xは共変数のベクターであり（例えば分析の測定値）及びβは回帰係数のベクター（モデルのパラメータ）である。βはコックス比例ハザードモデルの部分的尤度を最大化することによって推定される。
尤度の比の試験は、メチル化がハザードに関連しているかどうかを試験するために行われる。完全モデルとゼロのモデルの〜Log（尤度）の間の相違は、ゼロ仮説β1 = … =βk = 0の下でk自由度によるほぼx2分布である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
適用されるアルゴリズムは、赤池の情報量基準（AIC）を最小化することを目的とし、それは
AIC = 〜2・最大対数尤度 + 2・#パラメータ数
として定義される。
AICはモデルの予測性能に関連し、値が小さいほどより良い性能を約束する。更なる変数の包含はモデルの適合性を常に向上させ、従って可能性を増加させうが、第２タームは更なるパラメータの推定を不利にする。最も良いモデルは、良い適合性と通常変数の数が小さい又は中程度である、折衷のモデルを与える。
【外国語明細書】
2005224238000001.pdf
2005224238000002.pdf
2005224238000003.pdf
2005224238000004.pdf