(57)【要約】      （修正有）【課題】任意の蛋白質を多量体化することのできるペプチドとそれを用いた蛋白質を多量体化する方法を提供する。【解決手段】下記のａまたはｂに示されたポリペプチド。ａ．Sulfolobus tokodaii由来Ｌ−イソアスパルテート−０−メチルトランスフェラーゼのＣ末端部のアミノ酸配列からなるポリペプチド。ｂ．上記ａ項に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該ポリペプチドはαへリックス構造を形成し、かつ多量体形成能を有するポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａまたはｂに示されたポリペプチド。
ａ．配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ．配列番号１に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該ポリペプチドはαへリックス構造を形成し、かつ多量体形成能を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記のａまたはｂに示されたポリペプチド。
ａ．配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ．配列番号２に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、該ポリペプチドはαへリックス構造を形成し、かつ多量体形成能を有するポリペプチド。
【請求項３】
任意の蛋白質を多量体化させる方法であって、その蛋白質のアミノ酸配列のＣ末端に配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を付加して融合蛋白質として発現させることを特徴とする、蛋白質を多量体化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の多量体化を促す機能を有する新規なポリペプチド、該ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を所望の蛋白質のＣ末端に付加することで、該蛋白質を多量体化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質は、様々な生化学反応に関与する機能性生体高分子のひとつであり、生命にとって不可欠な物質である。
【０００３】
蛋白質はアミノ酸がペプチド結合によって高分子化した物質であり、一般的に、その機能の発揮にはある特定の高次構造をとることが必要である。しかし、特殊な場合を除き、蛋白質は、生体にとって過酷な環境下、例えば高温あるいは高濃度の塩の存在、では高次構造を保つことができず、所望の機能を失う（失活）ことが多い。そのため、蛋白質の安定性を確保してその機能を発揮させるために、様々な方法が検討されてきている。
【０００４】
例えば、目的とする蛋白質の内部に新たな水素結合、疎水結合あるいはジスルフィド結合が形成されるようにアミノ酸残基を設計し、変更することが行われている。また、ある担体、例えばポリエチレングリコールや固体ビーズなどに蛋白質を結合することで、蛋白質の安定性を高めることも試みられている。
【０００５】
一方、特定の蛋白質分子のある一つの結合部位が示す標的分子に対する親和性の弱さは、その蛋白質を多量体化することによって、その見かけ上の親和性が向上、改善されることが知られている（Avidity効果と呼ぶ）。例えば、細胞表面受容体はその例であり、試験管内で性質を調べるために、受容体をビオチン化し、4量体のアビジンと結合させ、さまざまなアッセイに用いられている。しかしながら、その効率は高くなく、より汎用性が高くかつ効率のよい多量体化の手法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
水素結合、疎水結合あるいはジスルフィド結合を形成させる方法では、そのような結合が有効に生じる場所を、所望の蛋白質の立体構造情報から個々に見出して設計する必要がある。そのため、立体構造が解明されていない蛋白質あるいは高次構造が知られているタンパク質との相同性を有しないタンパク質等への、水素結合等の形成による安定化の試みは事実上不可能である。また固相ビース等への結合は、必要とする蛋白質を発現、精製した後に、更に種々の化学反応を行わねばならず、操作が煩雑である上にかかる化学反応によってタンパク質が活性を失うことも少なくなく、タンパク質の安定化方法としては簡便な方法であるとは言いがたい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ある特定のアミノ酸配列からなる短鎖のポリペプチドが互いに集まって、束（ｂｕｎｄｌｅ）を形成しあうことを見出し、さらにこのポリペプチドのアミノ酸配列を任意の蛋白質のＣ末端に付加することで、当該蛋白質を多量体化、特に３量体化させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、配列番号１または２に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは配列番号１または２に示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、αへリックス構造を形成し、かつ多量体形成能を有するポリペプチドである。
【０００９】
また、本発明のもう一つの態様は、蛋白質のアミノ酸配列のＣ末端に配列番号１または２のアミノ酸配列を付加して融合蛋白質とすることを特徴とする、該蛋白質を多量体化させる方法である。
【００１０】
本発明のポリペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、Cα８PPと称する）、および配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、CαHLXと称する）である。Cα８PPは、Sulfolobus tokodaii （ATCC  
Japan Collection of Microorganisms number 10545）が産生するＬ−イソアスパルテート−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（以下、ST1123と表す）のＣ末端に認められるループとそれに続く８番目のαヘリックスを形成するアミノ酸配列に相当する。また、CαHLXはCα８PPのαヘリックスに相当する。ST1123自体のアミノ酸配列ならびにそれをコードする遺伝子の核酸配列（配列番号３）は、Y. Kawarabayasiら（Y. Kawarabayasi, et. al., DNA RESEARCH, 8巻, 123〜140頁、 2001年））によって報告されている。
【００１１】
本発明者らは、このST1123の立体構造の解明を、次の方法により試みた。
（１）ST1123の調製
Sulfolobus tokodaiiからYamagishi, A. and Oshima, T. (Nucleic Acids. Res., 18巻, 1133〜1136頁、1990年)らの方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、以下の２つプライマーＤＮＡを用いてPCR反応を行い、ST1123をコードする遺伝子の増幅を行った。
【００１２】
Ｆプライマー  NNNGGATCCTTAAGTTTTCTTTACTAAATTATCTAATATTG
Ｒプライマー  NNNNCCATGGCCAGTGAAAAAGAGGAAATATTGAGAAAG
714bpに相当するDNA増幅産物をゲルから単離精製後、NcoI及びBamHIで両端を切断し、同じくNcoI及びBamHIで開環させたベクターpET15bに挿入して、プラスミドｐST1123を得た。ｐST112に組み込まれたST1123のアミノ酸配列読取枠（Open Reading frame、ORF）の塩基配列ならびにこれから演繹推定されるアミノ酸配列は、配列番号２に示されるとおりである。プラスミドｐST1123では、βガラクトシダーゼプロモーターの下流にST1123をコードするORFがインフレームで連結されている。
【００１３】
このｐST1123で形質転換したE.coli BL21(DE3)を培養し、終濃度1mMのIPTGを添加してST1123の発現を37℃で3時間誘導させた後に菌体を回収し、50mM NaCl を含む50mＭ Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に懸濁して超音波破砕処理し、14000×g、30分の遠心分離で上澄を得た。上澄に対して80℃、30分の熱処理を行い、生じた沈殿を除去後、HiTrapQXL、26/60HiLoad Superdex75カラムに通して、高純度の精製ST1123（PIMT）を得た。
【００１４】
26/60 HiLoad Superdex200 pg (Amersham bioscience)を用いたゲルろ過法により、上記の精製ST1123の分子量を測定したところ、分子量（m.w.）=約150kDaと確認された（図１）。ｐST1123に組み込まれたORFにコードされるST1123の分子量はそのアミノ酸配列から約26kDaと推定されることから、ST1123は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が６分子会合した６量体を形成していると考えられる。
【００１５】
（２）ST1123の結晶構造解析
精製ST1123を10mM Tris-HCl(pH8.0)緩衝液に透析後、蛋白濃度が20mg/mlとなるまで濃縮し、ST1123の高濃度溶液を得た。この溶液2μｇを用いてハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行ったところ、0.8M LiSO4, 0.1M クエン酸ナトリウム(pH5.4), 0.2M 硫酸アンモニウム中で良好な結晶を得ることができた。さらに、X線結晶構造解析に必要な同結晶の重原子置換体を、発現宿主をE.coli B834(DE3)とし、培地をセレノメチオニン（SeMet）を含むM9最小培地に変更した以外はすべて上記の条件および操作により調製し、SeMet置換体タンパク質の結晶を得た。
【００１６】
Ｘ線解析装置Spring-8 BL41XUにて2.8Å分解能の3波長（peak 0.9793Å,edge 0.9795Å,remote 0.9700Å）の回折データを収集した。SeMet-ST1123の結晶の空間群はF23で、格子定数はa=b=c=277.16Å、α=β=γ=90°であった。構造解析はpeakのデータのみを用いたSAD法により行われ、最終的なモデルのR-value、 Rfree-valueはそれぞれ、19.8％、24.5％となった。上記実験により明らかとなったST1123の立体構造を示すX線解析データと座標データは、公的データベースであるProtein Data Bankに登録準備中である。
【００１７】
Molscriptプログラムを用いたコンピューターグラフィクス上で上記の座標データを基に再現されるST1123全体の立体構造（リボンモデル）を図２に示す。
【００１８】
以上の実験結果から、以下の事実が判明した。
【００１９】
ST1123は9つのβ−ストランド（β１〜β９）と８つのα−ヘリックス（α１〜α８）から構成されていた。このβ１〜β８およびα１〜α７から成る構造は、これまでに報告されている典型的な蛋白Ｌ−イソアスパルテート−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（PIMT）ドメインであるが、ST1123にはこのドメインの他に、Gly197−Leu209からなるループ及びα8からなるC末端α−ヘリックスで構成されるドメイン（Cα８PPドメイン）が存在することが確認された。このCα８PPドメインは、PIMTドメインのC末端に長く飛び出た形で連結されていた。
【００２０】
また、ST1123は結晶中でも６量体を形成していることが確認された。この６量体は６つのポリペプチド（A、B、C、D、E、F）が３回軸とそれに直交する２回軸によって構築されており、中心部では3つのCαHドメイン同士が会合し2つのヘリックスバンドル（helix-bundle、A、C、Eの３ポリペプチドから成るものとB、D、Fの３ポリペプチドから成るもの）を形成していた（図３）。これまでに報告されたPIMTには、多量体を形成する例もCαHドメインを有する例はなく、ST1123は極めて特徴的な構造を有していると言える。
【００２１】
本発明者らは、ST1123に特徴的なＣα８ＰＰドメインについて、更に詳しく調べた。
【００２２】
まず、Ｃα８PPドメインすなわちGly197からC末端までを削除した変異体をコードする遺伝子（配列番号４）を、ｐST1123を基にPCR反応を利用して作成し、ST1123の調製と同様の条件下で形質転換を培養して、変異体（ST1123_frag2）を精製した。
【００２３】
この変異体ST1123_frag2の分子量をゲルろ過にて評価したところ、６量体は確認されず、変異遺伝子にコードされる蛋白質の分子量に相当する単量体画分とその２量体に相当する画分が確認された。同変異体をSDS-PAGEで分析することにより、Cys149によるジスルフィド結合により、２つの単量体が２量体を形成したものであることが確認された。
【００２４】
以上から、ST1123の６量体は ２量体の３量体化（trimer of dimer）であり、Ｃα８PPドメインが３量体形成を促しているということが判明した。
【００２５】
さらに、Cα８PPドメインを構成するアミノ酸配列を任意の蛋白質のＣ末端側にTagとして付加する、すなわち任意の蛋白質とCα８PPドメインとの融合蛋白を作成すると、当該蛋白質が３量体化することが確認された。例えば、ST1123とは全く関係のないタンパク質であるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（Glutathione-S-transferase、ＧＳＴ）やマルトース結合タンパク質（Maltose binding protein、ＭＢＰ）のＣ末端にＣα８PPドメインを構成するアミノ酸配列を付加して融合タンパク質を生成させると、この融合タンパク質は３量体として存在するようになる。従って、このCα８PPドメインを構成するアミノ酸配列を任意の蛋白質のＣ末端に付加することで、その蛋白質を３の倍数の多量体へと変化させることが出来る。また、Cα８PPドメインを構成するループは、それ自身は蛋白質の３量体化をもたらすものではないことから、３量体化させようとする蛋白質に当該ループとは異なる適当なアミノ酸配列を介在させてCαHLXを癒合させても、当該蛋白質を３量体化することができる。
【００２６】
Ｃα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列の付加は、任意の蛋白質の熱安定性、高濃度の塩に対する安定性、あるいは蛋白質の生理活性を高める機能を有する。Ｃα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列を有することで多量体化している蛋白質は、単量体として存在する場合に比して安定性や生理活性が上昇することが確認された。従って、Ｃα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列を任意の蛋白質のＣ末端に付加することにより、その蛋白質の安定性及び／又は生理活性を高めることも可能である。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のCα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列は、これを任意の蛋白質にtagとして付加することにより、当該蛋白質を多量体化することのできる機能を有する点できわめて有用である。蛋白質の多量体化は、当該蛋白質の安定性、特に熱安定性や高塩濃度の変性剤に対する安定性を高める、また標的分子に対して低親和性を持つ各種蛋白質を多量体化することによりその見かけ上の機能を向上させることも可能である、などの利点を有する。
【００２８】
また、本発明のCα８PPドメインまたはCαHLX自体にさらに任意の物質、たとえば医薬等を化学的あるいは生物学的に結合させることにより、かかる物質を３量体の形態で提供することも可能である。この態様により、単位形態当たりの生理活性を事実上高めることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の機能性ポリペプチドであるCα８PPドメインまたはCαHLXは、一般的な遺伝子組換え的手法により容易に生産することができる。すなわち、宿主、発現ベクター、プロモーターを適宜組み合わせて目的とするポリペプチドを発現し、回収すればよい。また、全長が比較的短いことから、ペプチドシンセサイザー等を利用して化学合成的に生産することも可能である。これらの方法で行われる操作それ自体は、全て当業者に周知の操作である。
【００３０】
また、本発明の機能性ポリペプチドであるCα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列は、その機能、すなわち蛋白質の多量体化機能を損なわない範囲内において、そのアミノ酸配列を変更することも可能である。すなわち本発明には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの他に、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されることで配列番号１または２に示されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるものの、依然として蛋白質の多量体化機能を有するポリペプチドも含まれるのである。
【００３１】
一般に、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質の機能に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【００３２】
従って、配列番号１または２に示したアミノ酸配列に置換、挿入、欠失等が生じた場合でも、その結果として蛋白質の多量体化活性を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。
【００３３】
このようなアミノ酸の改変は、当業者に公知の方法である組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法その他の方法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の改変部位および個数は、ポリペプチドが蛋白質多量体化活性を保持する限り特に制限はないが、変異個数は１０アミノ酸以内、好ましくは数個である。
【００３４】
また、本発明は上記で述べたポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列も提供する。かかる塩基配列は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を特定した後に、用いる宿主に好適なコドンの選択、ｍＲＮＡの二次構造の形成、適当な制限酵素認識部位の導入あるいは削除などを考慮しながら決定すればよい。その様な考慮すべき事項あるいは具体的な塩基配列の決定は、全て当業者が通常の操作の範囲内で容易に行うことができる。
【００３５】
本発明である蛋白質を多量体化する方法において、Cα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列を所望の蛋白質のＣ末端に直接付加すればよいが、適当なリンカーをさらに使用しても良く、またST1123のGly197〜Arg212をまでで構成されるループをその他のリンカー配列に置き換えて付加することもできる。このリンカー配列は、Cα８PPドメインまたはCαHLXを構成するアミノ酸配列が有する多量体化機能を損なわない範囲で、自由にそのアミノ酸配列を設計することができる。例えば、ある特定のアミノ酸配列とこれを特異的に認識する抗体とを組み合わせることで、あるいは特定のリガンドと結合することのできる特殊な配列を利用すれば、融合蛋白質の精製に有利である。
【００３６】
本発明の方法により蛋白質を多量体化する方法は、任意の蛋白質をコードする遺伝子の下流に本発明のCα８PPドメインまたはCαHLXをコードする核酸配列を直接、あるいは上述のリンカー配列をコードする核酸配列を挟んで付加するだけでよく、かかる付加に必要な操作は当業者であればなんら格別の困難性なくして実施することができる。
【００３７】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明を更に詳しく説明する。
【実施例１】
【００３８】
Ｃα８PPドメインを構成するアミノ酸配列の付加によるタンパク質の多量体化
Sulfolobus tokodaiiからYamagishi, A. and Oshima, T. (Nucleic Acids. Res., 18巻, 1133〜1136頁、1990年)らの方法に従って調製したゲノムDNAを鋳型として、以下の２つのプライマーＤＮＡを用いてPCR反応を行った。
【００３９】
プライマー３  NNNGGATCCTTAAGTTTTCTTTACTAAATTATCTAATATTG
プライマー４  NNGAATTCGGAGGTCTTTACGGTTTTTATGATGATTATG
これらのPCRプライマーは、MBPをコードする遺伝子を有するプラスミドpMAL-C2のMBP遺伝子の下流に、ST1123のGly197-Thr231をコードするＤＮＡを連結させるためのＤＮＡカセットが増幅されるように設計されている。
【００４０】
このＰＣＲ反応で増幅されたDNA産物をアガロースゲルを用いて精製し、さらにEcoRI及びBamHIを用いて切断、精製し、これを同じ制限酵素で開環させたpMAL-C2のMBP遺伝子の下流に挿入して、プラスミドpMBP-Cαを得た。このプラスミドに含まれているMBPとCα８PPドメインとの融合蛋白質（MBP―Ｃα）のDNA配列ならびにアミノ酸配列を配列番号５に示す。MBP―Ｃαでは、392-427番目のアミノ酸残基がCα８PPドメインに相当する。
【００４１】
同様にして、S. tokodaiiのゲノムDNAを鋳型として、以下の２つのプライマーＤＮＡを用いてPCR反応を行った。
【００４２】
プライマー５  NGAATTCTTAAGTTTTCTTTACTAAATTATCTAATATTG
プライマー６  NNNGGATCCGGAGGTCTTTACGGTTTTTATGATGATTATG
これらのPCRプライマーは、ＧＳＴをコードする遺伝子を有するプラスミドpGEX-4T-1のGST遺伝子の下流に、ST1123のGly197-Thr231をコードするＤＮＡを連結させるためのＤＮＡカセットが増幅されるように設計されている。
【００４３】
このＰＣＲ反応で増幅されたDNA産物をアガロースゲルを用いて精製し、さらにEcoRI及びHindIIIを用いて切断、精製し、これを同じ制限酵素で開環させたpGEX-4T-1のGST遺伝子の下流に挿入して、プラスミドpGST-Cαを得た。このプラスミドに含まれているGSTとCα８PPドメインとの融合蛋白質（GST‐Cα）のDNA配列ならびにアミノ酸配列を配列番号６に示す。GST‐Cαでは、227-262番のアミノ酸残基がCα８PPドメインに相当する。
【００４４】
各ベクターを用いて、実施例１と同様に形質転換体を得、各融合蛋白質を発現させ、精製した。精製した融合蛋白質の分子量の変化をゲルろ過により観測したところ、MBP―Ｃα、GST―ＣαともにCα８PPドメインを構成するアミノ酸配列の付加によるオリゴマー化が確認され、特にMBPの場合は３量体として存在していた（図４）。GST―Ｃαの場合にはピークが複数現れているが、これはGST自身が２量体を形成することから、３量体のみならず６量体や１２量体にもなるためと考えられる（図５）。
【００４５】
以上の結果より、ST1123のCα８PPドメインを構成するアミノ酸配列は、他の蛋白質のC末端に融合させることにより、当該他の蛋白質をも３量体化させることが出来ることが示された。
【実施例２】
【００４６】
Ｃα８PPドメインを構成するアミノ酸配列の付加によるタンパク質の安定化
ａ）Ｃ末端欠失型変異ST1123の調製
ST1123のGly197からC末端までを削除した変異体（ST1123_frag2）をコードする遺伝子（配列番号４）を、ｐST1123を基に作成し、実施例１と同様の条件下で形質転換を培養し、遺伝子を発現し、変異体を精製した。
【００４７】
ｂ）ST1123_frag2とST1123の安定性の評価
精製された各タンパク質を、種々の濃度の塩酸グアニジン（GdnHCl）を含む緩衝溶液で希釈した。常温にて24時間静置した後、各々の円偏向二色性（CD）スペクトルを測定した。GdnHCl濃度に対し222nmのCD強度をプロットし、2つのタンパク質のCDスペクトルの変化を比較し、GdnHClに対する安定性を評価した。ST1123に比して、ST-1123_frag2の顕著な安定性の低下が観察された。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ST1123及びST1123fragの26/60 HiLoad Superdex200 pg (Amersham bioscience)を用いたゲル濾過溶出パターンを示す。
【図２】ST1123全体の立体構造（リボンモデル）を示す。
【図３】ST&1123のヘキサマー構造を表す。
【図４】MBP-Cα８のゲル濾過溶出パターンを示す。
【図５】GST-Cα８のゲル濾過溶出パターンを示す。
【図１】
2005213166.tif 000002
【図２】
2005213166.tif 000003
【図３】
2005213166.tif 000004
【図４】
2005213166.tif 000005
【図５】
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【配列表】
2005213166000001.app