(57)【要約】【課題】  本発明の目的は環状ジグルタミルペプチドを簡易な方法で高純度に得ることのできる製造方法を提供することにある。【解決手段】  グルタミン酸水溶液に炭酸水素塩を添加し、１００〜１４５℃で加熱処理することを特徴とする環状γ−ジグルタミルペプチドの製造方法。【選択図】      図１
2005320272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸又はその塩に、アルカリ性炭酸水素塩ＸＨＣＯ３（Ｘはアルカリ金属）を添加し、１００〜１４５℃で加熱処理することを特徴とする、下記化１に示す環状ジグルタミルペプチド又はその塩の製造方法。
【化１】
2005320272.tif 000008
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、アルカリ性炭酸水素塩は、該炭酸水素塩の水溶液がｐＨ７．５〜９．５となる濃度で添加されることを特徴とする環状ジグルタミルペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、炭酸水素塩は炭酸水素ナトリウムであることを特徴とする環状ジグルタミルペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、炭酸水素ナトリウムは０．０４〜０．７mol/lとなるように添加されることを特徴とする環状ジグルタミルペプチド又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環状ジグルタミルペプチドの製造方法、特に高純度化に関する。
【背景技術】
【０００２】
２以上のアミノ酸が結合した環状ペプチドは、さまざまな生理機能を有することが明らかになりつつある。特にグルタミン酸ならびにアスパラギン酸は生体での神経伝達に関与する物質と考えられ、それらを含むオリゴペプチド類の作用と受容体に関する研究が盛んであり、例えばカイコ蛹エキスの鎮痛活性を示す画分からは環状ジグルタミルペプチドが単離される。一方、ジ、トリペプチド類など比較的低分子量のペプチドは膜透過性を有しているため、早くより各種生理現象を検討するマテリアルとして天然あるいは合成品が供給されてきた。
【０００３】
これまで、グルタミン酸のみで構成された環状ジグルタミルペプチドの合成については、α−カルボニル位で結合されたもの（化２）あるいはγ−カルボニル位で結合されたもの（化３）が報告されているが、これらの合成方法は数種の保護基の導入を必要とするため副産物が多く、環化時にトリ、テトラペプチドの混成も伴うため、クロマトグラフィーなどによる精製を必要とする。この結果、最終目的物の収率が極めて少なく、高純度のジグルタミルペプチドを必要とする場合、製造コストが嵩む。
【化２】
2005320272.tif 000003
【化３】
2005320272.tif 000004
さらに、特開２００３−２５２８９６などにも、比較的簡易なオリゴペプチドの製造方法が開示されているが、収率、純度の点で改善の余地が残されており、また前記化３に示すような環状γ−ジペプチドの選択的な調製は考慮されていない。
【特許文献１】特開２００３−２５２８９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、アミノ酸、特にグルタミン酸の環状γ−ジペプチドに関しては、高純度、高収率での製造が技術的、コスト的に困難であり、生化学的、製薬的分野での要望に十分応えることができないものであった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は環状γ−ジグルタミルペプチドを簡易な方法で高純度に得ることのできる製造方法を提供することにある。
前記目的を達成するため、本発明者が鋭意検討を行った結果、グルタミン酸又はその塩に対し、炭酸水素塩の存在下、一定温度に保つことにより、きわめて高純度の環状ジグルタミルペプチドが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明にかかる環状γ−ジグルタミルペプチド又はその塩の製造方法は、グルタミン酸又はその塩に、アルカリ性炭酸水素塩ＸＨＣＯ３（Ｘはアルカリ金属）を添加し、１００〜１４５℃で加熱処理することを特徴とする。
【０００６】
また、前記方法において、アルカリ性炭酸水素塩は、該炭酸水素塩の水溶液がｐＨ７．５〜９．５となる濃度で添加されることが好適である。
また、前記方法において、炭酸水素塩は炭酸水素ナトリウムであることが好適である。
また、前記方法において、炭酸水素ナトリウムは０．０４〜０．７mol/lとなるように添加されることが好適である。
このように本発明にかかる製造方法は、水系、すなわち有機溶媒を一切使用せずに環状ジグルタミルペプチドの製造が可能であるため、環境に調和した新しい物質変換プロセスの開発への扉を開くクリーンクリーンケミストリーの一例でもある。
【発明の効果】
【０００７】
以上説明したように本発明にかかる環状ジグルタミルペプチドの製造方法によれば、グルタミン酸を炭酸水素塩とともに１００〜１４５℃に維持するのみで、きわめて高純度の環状ジグルタミルペプチドを製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者は、有機溶媒を一切使用しないＬ−グルタミン酸（あるいはＤ−グルタミン酸）の環状γ−ジグルタミルペプチドの調整を試み、トータル収率９８％以上で主目的物ＬＬ体（あるいはＤＤ体）を選択的に得る製造法を確立した。生成物は種々の測定モードによるＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲ、ＣＤスペクトルから高純度の環状γ−グルタミルジグルタミルペプチドと確認された。
【実施例１】
【０００９】
図１に示す反応式により環状γ−ジグルタミルペプチドの製造を行った。すなわち、市販Ｌ−グルタミン酸を２．７％ＮａＨＣＯ３水溶液(ｐＨ７．８)に加え、封管中１１８〜１２０℃で７２時間加熱した。冷却後、この反応溶液をアンバーライトＩＲＣ−５０弱陽イオン交換樹脂に通じ、未反応のＮａＨＣＯ３を除き、得られた溶出液を減圧乾固し、主生成物（１ａ）を得た。図２に主生成物１ａのＦＤ−ＭＳチャートを示す（HR-MS:m/z 325.0385 Na付加分子イオンとして）。
また、これを１．０％ＫＨＳＯ４（ｐＨ２．０）に溶解し、同量のブタノールで分配してＮａフリー（ｐＨ２．２−２．３）のペプチド（１）を調製した。図３にNaフリーペプチド１のＭＳチャートを示す（ESI-MS  negative  mode:m/z 257 [M-H]-）。
【００１０】
一方、Ｄ−グルタミン酸から得られたものは、前記Ｌ−グルタミン酸から得られたものと全く同一のＭＳ、ＮＭＲ−ＤＡＴＡを与え、比旋光度は逆の符号を示した。また、Ｌ−、Ｄ−グルタミン酸の１：１混合物を同じく処理したところ、前記同様のＭＳ、ＮＭＲ−ＤＡＴＡを与える主生成物が得られたが、このものは旋光性を示さなかった。
次に本発明者は炭酸水素塩濃度、及び反応条件を変え反応結果（混合物）中の原料、中間体、目的物の比率を定量した。定量は、反応結果の与える1H-NMR（D2O, 45℃）スペクトル中のメチンプロトンシグナル（OC-CH-NH）の与える面積比により行った。
分解物については分子構造が特定できていないので、そのシグナルから原料、中間体、生成物との比較のための生成モル比は推定できない。
【００１１】
なお、用いた試薬は以下のとおりである。
グルタミン酸（メルク社製  特級）--------- Glu
炭酸水素ナトリウム （和光純薬製  特級）---NaHCO3
H2O （蒸留水  pH 6.5-7.5）---H2O
以上を沸石とともに耐熱製ガラスチューブ（15 ml入り）に入れフッ素樹脂製ネジ口キャップで密封後、所定の温度と時間により処理し、脱塩後、NMRの測定を行った。
以下に、各種反応条件の検討結果を示す。
【００１２】
［反応条件の検討］
（表１）
試験例                  １      ２      ３      ４      ５      
原料
グルタミン酸         60mg    60mg    60mg   60mg    60mg
炭酸水素ナトリウム  240mg   240mg  240mg   240mg   240mg
水                   9ml     9ml     9ml     9ml     9ml  
反応条件                                                                    
温度               110℃   120℃   135℃   140℃   145℃
時間                48h     48h     48h     20h     14h   
生成物                                                                      
原料                1.83    0.01    0.01    0       0
中間体              1.0     0.0     0.0     0       0
目的物              2.79    1.0     1.0     1.0    12.71
分解物              5.62    N.D     N.D     0.04    5.67  
【００１３】
上記結果より明らかなように、グルタミン酸の環化は１００℃以上で進行するが、収率、分解物の生成量を考慮すると１１０〜１４０℃が好ましく、１４５℃になると収率は良好であるが大量の分解物が生成する傾向にある。
原料、中間体については下記化４〜６に示すように構造が明らかであり、除去が容易であるが、分解産物については構造不明の物質が多く、除去が困難である。
したがって、反応温度は１００〜１４５℃、好ましくは１１０〜１４０℃であり、本発明者の詳細な検討によれば１１８〜1２０℃がもっとも好ましい。
【化４】
2005320272.tif 000005
【化５】
2005320272.tif 000006
【化６】
2005320272.tif 000007
【００１４】
次に本発明者は、反応温度と反応時間の関係についてさらに検討を行った。
（表２）
試験例                  ６      ７      ８    
原料
グルタミン酸         60mg    60mg    60mg  
炭酸水素ナトリウム   60mg    60mg    60mg 
水                   9ml     9ml     9ml  
反応条件                                      
温度               100℃   100℃   100℃  
時間                24h     48h     72h   
生成物                                        
原料                0.1     0      0      
中間体             11.28    5.96   4.24   
目的物              1.0     1.0    1.56   
分解物              N.D     N.D    N.D    
【００１５】
表２より明らかなように、反応温度が低い場合には分解物の生成は少ないが、目的物の収率は反応時間を長くしてもさほど上昇しない。
（表３）
試験例                  ９      10      11    
原料
グルタミン酸         60mg    60mg    60mg  
炭酸水素ナトリウム  240mg   240mg   240mg 
水                   9ml     9ml     9ml  
反応条件                                      
温度               120℃   120℃   120℃  
時間                 6h     24h     48h   
生成物                                        
原料                1.0     1.0     1.0      
中間体              0.0     0.0     0.0   
目的物              3.7     5.95   14.3   
分解物              N.D.    N.D.    N.D    
【００１６】
表３より明らかなように、反応温度１２０℃では収率、純度の両観点から極めて良好な結果が得られ、特に２４〜７２時間の反応で良好な収率が得られた。
（表４）
試験例                  12      13      14      15      ５    
原料
グルタミン酸         60mg    60mg    60mg    60mg   60mg  
炭酸水素ナトリウム  240mg   240mg   240mg   240mg  240mg  
水                   9ml     9ml     9ml     9ml     9ml 
反応条件                                                      
温度               145℃   145℃   145℃   145℃   145℃ 
時間                0.5h    1.0h    2.0h    6.0h   14.0h 
生成物                                                       
原料                1.07   1.00    0.11    0        0   
中間体              1.82   3.00    0.22    0        0  
目的物              1.00   3.81    1.0    12.71    12.71
分解物              5.79   9.00    0.78    5.67     5.71
【００１７】
以上のように、反応温度を上昇させると短時間で反応が進行するようになり、１４５℃においては６時間で９８％以上の収率が得られるが、分解物も多くなる傾向にある。
このため、反応効率の観点からは１００℃以上、特に１１０℃以上が好ましく、収率を向上させるという観点からは１４５℃以下、また純度を向上させるという観点からは１４０℃以下で反応させることが好ましい。
【００１８】
［炭酸水素塩の添加量］
本発明者はさらに炭酸水素塩の添加量について検討した。結果を次の表に示す。
（表５）
試験例                  16      17      18      19      20    
原料
グルタミン酸          60mg    60mg    60mg   60mg    60mg
炭酸水素ナトリウム   120mg   240mg   480mg  960mg    60mg
水                    9ml     9ml     9ml    9ml     9ml  
反応条件                                                      
温度                110℃   110℃   110℃   110℃   140℃
時間                 48h     48h     48h     48h     20h  
生成物                                                       
原料                 7.16    1.83   0.62    0.60    0
中間体               9.50    1.0    0.17   定量不能 0
目的物              10.38    2.79   1.00    1.18    1.0
分解物               N.D     5.62   1.79    >>100   0.04 
【００１９】
なお、試験例１９については中間体は分解物のシグナルと重複し、定量不能であった。
さらに詳細な検討の結果、炭酸水素ナトリウム（炭酸水素塩）は６０ｍｇ／９ｍｌ（０．０４ｍｏｌ／Ｌ）から４８０ｍｇ／９ｍｌ（１．２８ｍｏｌ／Ｌ）で反応は進行するが、特に良好には１２０ｍｇ／９ｍｌ（０．３２ｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ８．１（単独水溶液））〜２４０ｍｇ／９ｍｌ（０．６４ｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ９．０）の場合に特に良好である。９６０ｍｇ／Ｌ（略飽和濃度）になると分解産物が大量に生じるようになる。
さらに詳細な検討の結果、炭酸水素塩は単独水溶液でｐＨ７．５〜９．５程度となるように調整することで、目的物の製造が可能であり、特に高純度、高効率を図る場合にはｐＨ８〜９が好ましい。
【００２０】
以上のように、グルタミン酸（MW 147, 0.045mol/L=60mg/9mL）に対しNaHCO3（特に好ましくはMW 83, 0.321mol/L=240mg/9ml〜0.642mol/L=480mg/9mL；平均0.48 mol/L）を加え、密封反応試験管中で118-120℃に加熱すると72hr.で目的物がほぼ98％以上で生成する。
また反応温度をこれより上げれば生成時間は短縮する（145℃で6hr、98％生成、原料消失）が同時に分解物も生成し始めるため、反応後の単純な精製操作が可能な条件（135℃で48hr、140℃で20hr、いずれも98％生成）としては140℃までが好ましいと思われる。
【００２１】
アルカリ濃度については本条件［NaHCO3  aq.; 0.321 mol/L(pH8.1、室温)〜0.642 mol/L(pH9.0、室温)］を超えると加熱時に反応溶液のｐＨが理論上pH9.5-10以上となる為、これによる原料のラセミ化が危惧され採用しがたい。
一方、アルカリ濃度あるいは反応温度が本条件より低い場合は、目的物の生成は少なく、中間体の生成に留まる傾向にある。すなわち中間体が反応溶液の加熱によって精製する炭酸-グルタミン酸Na複合体と推定されるため、中間体から目的物へ遷移するエネルギーが不足するためか目的物の生成が不良となり、結果、実質的な反応時間での反応完了は望めない。
【００２２】
なお、本発明において、アミノ酸はα位以外にカルボニル基を有すれば特に限定されるものではないが、特にグルタミン酸が好ましい。
また、炭酸水素塩も特に限定されるものではないが、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムなどのアルカリ性炭酸水素塩、特に炭酸水素ナトリウムが好ましい。
なお、炭酸水素カリウムを用いた場合の結果を以下に示す。
（表６）
試験例                  21      22      23    
原料
グルタミン酸         60mg    60mg    60mg  
炭酸水素カリウム    286mg   286mg   286mg 
水                   9ml     9ml     9ml  
反応条件                                      
温度               120℃   120℃   120℃  
時間                 6h     24h     48h   
生成物                                        
原料                1.0     1.0     1.0      
中間体              0.0     0.0     0.0   
目的物              6.76   10.17   15.9   
分解物              0.6     0.6     0.6   
【００２３】
炭酸水素ナトリウムを用いた場合と比較し、やや分解物の生成が多い傾向にあるが、収率は良好であり、炭酸水素塩を広く用いることが可能である。
また、本発明により製造された環状γ−ジグルタミルペプチドは、必要に応じて各種金属塩(Ｎａ、Ｋ、Ｚｎなど)として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の反応式の説明図である。
【図２】本発明により製造された環状γ−ジグルタミルペプチドのＮａ塩のＭＳチャートである。
【図３】本発明により製造された環状γ−ジグルタミルペプチドのＮａフリー体のＭＳチャートである。
【図１】
2005320272.tif 000009
【図２】
2005320272.tif 000010
【図３】
2005320272.tif 000011