(57)【要約】【課題】皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し分解活性が高い性質を有するプロテアーゼを提供する。また該プロテアーゼを含む皮膚洗浄剤組成物を提供する。【解決手段】皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有するプロテアーゼを得る。本プロテアーゼは、（ｉ）合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｕｅに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値の比が１：２〜３：６〜７：８〜９であり、（ｉｉ）カゼインに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値を１とした場合の合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの３０℃、１分間あたりの分解活性値が６〜９である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有することを特徴とするプロテアーゼ。
【請求項２】
（ｉ）合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｕｅに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値の比が１：２〜３：６〜７：８〜９であり、
（ｉｉ）カゼインに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値を１とした場合の合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの３０℃、１分間あたりの分解活性値が６〜９であることを特徴とする請求項１に記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のプロテアーゼを含むことを特徴とする皮膚洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有するプロテアーゼに関する。また該プロテアーゼを含む皮膚洗浄剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常で健康な皮膚表面では、皮膚の角層（角化細胞）が新しく作り出されるのと皮膚表面から剥がれ落ちること（ターンオーバー）が連続的にバランスよく行なわれている。しかし、このバランスがくずれると皮膚の角層（角質）が小判状に剥離した状態（以下、「落屑」という）となる。
【０００３】
この角層から落屑を除去する方法として、従来から角質を柔軟にする作用を持ったいわゆる角質軟化剤や、物理的作用を利用して角層をこすり落とすクレンジング剤が知られている。これらに用いられる材料として、角質柔軟剤としては、例えばサリチル酸、尿素などが挙げられる。また、クレンジング剤の材料としては、例えばゲルビーズ、塩、クルミの破砕物などの微粒子材が挙げられる。
【０００４】
角層を構成する角化細胞の自然剥離は皮膚角層内在性のプロテアーゼによって皮膚角質細胞をつなぎ止める接着斑である皮膚デスモソームが徐々に分解されることにより生じることが知られている。しかし、荒れ肌で落屑が生じるような皮膚状態の場合には、この内在性プロテアーゼがうまく発現しない、あるいは機能しないことにより、自然剥離が順調に行われなくなっていると言われている。
【０００５】
そこで、酵素を利用した落屑除去に対する技術も開示されている。具体的には皮膚洗浄剤の中にプロテアーゼやリパーゼを配合する技術が提案されている（特許文献１、２、および３参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６３−１３０５１４号公報
【特許文献２】特開平０２−０９６５１０号公報
【特許文献３】特表平０７−５０５３８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記角質軟化剤やクレンジング剤によるものは、効果や安全性の面で問題があった。また、上記酵素を皮膚洗浄剤組成物に配合したものでは、上記プロテアーゼは基質特異性が広く、正常皮膚のケラチンを過剰に分解してしまうために、使用者の肌への刺激など安全性での不具合があった。また、上記理由から毎日使用することができないという不具合や、効果が明確ではないといった不具合があった。
【０００８】
そこで、荒れ肌における落屑の除去能が高く、かつ毎日使い続けることができる酵素入り皮膚洗浄剤組成物の開発のためには、皮膚の外層である角質層を構成する皮膚ケラチン分解性が低く、皮膚デスモソームの分解性が高いという特異性が必須となる。
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有するプロテアーゼを提供することを目的とする。また、皮膚に対して為害性が低く、荒れ肌に存在する落屑の除去能の高いプロテアーゼを配合することにより、毎日使いつづけることができ、落屑によって美観を損ねるような荒れ肌に対して効果を発揮して良好な使用実感を得ることができる皮膚洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意研究を重ね、皮膚ケラチンの分解活性、皮膚デスモソームの分解活性を指標としたスクリーニングを行った結果、プロテアーゼ群の中から、皮膚ケラチン分解性が極めて低く、かつ皮膚デスモソームへの高い分解性を有するという特徴を持つプロテアーゼを得た。
【００１１】
すなわち、本発明のプロテアーゼは、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有することを特徴とする。
【００１２】
また、かかるプロテアーゼを含む皮膚洗浄剤組成物も本発明の対象である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、皮膚に対する為害性が低いプロテアーゼを提供することができる。また、本酵素を皮膚洗浄剤組成物に配合することにより、毎日使いつづけることができ、落屑によって美観を損ねるような荒れ肌に対して効果を発揮して良好な使用実感を得ることができる皮膚洗浄剤組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有するプロテアーゼおよび該プロテアーゼを含む皮膚洗浄剤組成物である。以下、本発明の実施形態について（１）本発明のプロテアーゼを産生する微生物の培養、（２）該プロテアーゼの精製、（３）本プロテアーゼの性質、（４）皮膚洗浄剤組成物の順に説明する。
【００１５】
（１）本発明のプロテアーゼを産生する微生物の培養
本発明のプロテアーゼを産生する微生物は、本発明のプロテアーゼを産生する微生物であれば限定されないが、具体的には例えばバチルス属の微生物が挙げられ、より具体的には、ｐＨ１０〜１２で好適に生育するバチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株が挙げられる。
【００１６】
本発明の酵素は、上記のようにバチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株などの菌体から単離・精製することによって得ることができる。また、単離されたプロテアーゼをもとに遺伝子工学的な手法を用いて、本発明のプロテアーゼおよび該プロテアーゼを産生する微生物を得ることもできる。すなわち、単離・精製したプロテアーゼをもとに本発明のプロテアーゼをコードするＤＮＡを単離し、これを適当な宿主に導入し、発現させることによっても、本発明のプロテアーゼおよび微生物を作製することができる。また、バチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株から得られた本発明のプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドなどをもとにプローブを作製し、他の微生物から、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対する作用性が高い性質を有するプロテアーゼを得てもよい。種々の遺伝子組換え技法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９）などに記載されている。
【００１７】
本発明のプロテアーゼを産生する微生物の培養菌体を得るには、当該微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。このための培地はその微生物が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００１８】
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用することができる。
【００１９】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機塩のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２０】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。
【００２１】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下にてｐＨ１０〜１２、温度１５〜４０℃の範囲でｐＨおよび温度を適当に制限しつつ１２〜４８時間程度培養を行えばよい。
【００２２】
（２）プロテアーゼの精製
本発明の酵素を精製する一例として、バチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株から本発明のプロテアーゼを単離・精製する方法を説明する。まず、バチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株などの菌体から、超音波破砕等の物理的方法、あるいは細胞壁溶解酵素等を用いた酵素法等により菌体を破壊し、遠心分離等により不溶性画分を除いて菌体抽出液を調製する。
【００２３】
上記のようにして得られる菌体抽出液を、通常のタンパク質の精製法、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて分画することによって、本発明のプロテアーゼを精製することができる。
【００２４】
吸着クロマトグラフィー用の担体としては、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）などが挙げられる。本プロテアーゼを含む液をこの担体を詰めたカラムに通液させて本プロテアーゼをカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いてプロテアーゼを溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）を用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、０．５ＭのＮａＣｌで溶出される。
【００２５】
また、他の吸着クロマトグラフィー用の担体としては、ハイドロキシアパタイト樹脂（バイオラッド社製）などが挙げられる。本プロテアーゼを含む液をこの担体を詰めたカラムに通液させて本プロテアーゼをカラムに吸着させ、カラムを洗浄した後に、高塩濃度の緩衝液を用いてプロテアーゼを溶出させる。その際、段階的に塩濃度を高めてもよく、濃度勾配をかけてもよい。例えば、ハイドロキシアパタイト樹脂（バイオラッド社製）を用いた場合には、カラムに吸着した本酵素は、１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーで溶出される。
【００２６】
上記のようにして精製されたプロテアーゼは、さらにゲル濾過クロマトグラフィー等により均一に精製できる。ゲル濾過クロマトグラフィー用担体としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ２００ｐｇ（アマシャム社製）などが挙げられる。
【００２７】
上記精製操作において、本プロテアーゼを含む画分は、後述する方法等により各画分のカゼイン分解活性、皮膚ケラチン分解活性および皮膚デスモソーム分解活性を測定することにより、確認することができる。
【００２８】
（３）本プロテアーゼの性質
本プロテアーゼは、皮膚ケラチンに対する分解活性に比べて、皮膚デスモソームに対する分解活性が高いという基質特異性を有する。皮膚ケラチン分解活性および皮膚デスモソーム分解活性について詳しくは、実施例で述べるが、電気泳動法等を用いて活性測定を行なうことができる。
【００２９】
また、本発明のプロテアーゼの合成基質に対する活性は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｕｅに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値の比が１：２〜３：６〜７：８〜９である。カゼインに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値を１とした場合の合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの３０℃、１分間あたりの分解活性値は、６〜９である。
【００３０】
さらに本発明のプロテアーゼは、好ましくは以下の理化学的な性質を有することが望ましい。
（Ｉ）分子量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約３５，０００Ｄａである。
（ＩＩ）温度安定性は、ｐＨ８．０で１０分間熱処理した場合、６０℃以下で安定である。
（ＩＩＩ）阻害剤は、合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質とする場合、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモスタチンで阻害されるが、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ペプスタチン、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、ｐ−クロロマーキューリー安息香酸（ＰＣＭＢ）では阻害されない。
（ＩＶ）至適ｐＨは、合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａを基質として３０℃で反応させた場合、ｐＨ７〜９、特にｐＨ８が至適である。
【００３１】
本発明のプロテアーゼは、従来皮膚外用剤等に使用されているパパイン（長瀬産業社製）やビオプラーゼ（長瀬産業社製）に代表されるバチルス・ズブチリスが産生する化粧品種別許可基準に記載のプロテアーゼ（１）（以下、ビオプラーゼと標記）に比べ、皮膚由来ケラチン蛋白質に対する分解能は１／２０以下であるが、同等のデスモソーム構成タンパク質（デスモグレイン１）の分解性を有している特徴を持つ。即ち、健常皮膚や荒れ肌のケラチンに対する作用性は低いが、荒れ肌の落屑を繋ぎとめているデスモソームを特異的に分解できるため、荒れ肌だけに特異的に作用し、その現象を改善させることが可能となる。また、本発明のプロテアーゼは、従来皮膚外用剤等に使用されているパパインやビオプラーゼに比べ、皮膚への為害性、即ち１次刺激が認められない。さらには、ヒトの皮膚に人為的に作成した荒れ肌を用いてその効果を検証したところ、荒れ肌の改善能を有している。
【００３２】
（４）皮膚洗浄剤組成物
本発明の皮膚洗浄剤組成物は、本発明のプロテアーゼを含む。本発明のプロテアーゼを皮膚洗浄剤組成物に配合することにより、荒れ肌において外観上の美観を損ねる落屑を除去する効果を持つと同時に、正常肌の角質層を過剰に剥離することがない皮膚洗浄剤組成物の提供が可能となる。さらに、本発明のプロテアーゼを配合した皮膚洗浄剤組成物は安全性が高く、赤み、かゆみ、痛みなどの皮膚刺激を生じる事がないので、どの人でも毎日使うことができ、皮膚のガサガサ感が改善される効果を実感できるものとなる。
【００３３】
本発明の皮膚洗浄剤組成物に該プロテアーゼを配合する場合、精製したプロテアーゼを配合してもよいし、該プロテアーゼ含有物として配合してもよい。この「プロテアーゼ含有物」とは、当該プロテアーゼを含有するものであればよく、具体的形態としては、該プロテアーゼを産生する微生物の培養物、該培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物の培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質の混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される粗プロテアーゼ、さらに精製した精製プロテアーゼなども含まれる。精製処理されたプロテアーゼとしては、各種精製法によって得られる部分精製プロテアーゼ等を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清もプロテアーゼ含有物として利用できる。
【００３４】
本発明の皮膚洗浄剤組成物における本発明のプロテアーゼの配合量は、通常皮膚洗浄剤組成物中に最終濃度で３５０〜１５００単位であり、より好ましくは６００〜８００単位である。３５０単位より少ないとプロテアーゼの落屑除去効果が十分発揮されない場合がある。また、１５００単位を超えると皮膚洗浄剤組成物に澱が発生するなどの悪影響を与える場合がある。
【００３５】
ここでいうプロテアーゼ１単位とは、カゼインを基質して反応を行った場合に、１分間あたりに１μgに相当する遊離チロシン残基を生じる酵素量をいう。カゼイン分解活性測定法は次のとおりである。０．６％カゼイン溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ａｔ  ３０℃））の３ｍＬを３０℃で１０分以上プレインキュベーションした。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０ａｔ  ３０℃）および２ｍＭ  Ｃａ2+からなるバッファーで希釈した酵素液０．５ｍＬを加えて反応をスタートさせ、正確に１０分後に３．２ｍＬのＴＣＡ混液を加えて反応を停止させた。さらに、３０℃で１０分間以上インキュベーションを行った後、アドバンテック社製１３１番濾紙で濾過をして、２７５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクはあらかじめＴＣＡ混液と酵素液を混ぜておき、反応終了時に基質を加え、さらに３０℃で１０分間以上インキュベートした。１分間あたりに１μｇに相当する遊離チロシン残基を生じる酵素量を１ＮＰＵ（１単位）と定義し、酵素計算式（ＮＰＵ／ｍＬ＝ΔＯＤ２７０×１８１×希釈率）で算出する。
【００３６】
本発明の皮膚洗浄剤組成物には、本発明の皮膚洗浄組成物には、身体洗浄剤等のボディソープ、手肌洗浄剤等のハンドソープ、シャンプー、その他クリーム状洗浄組成物等が含まれる。本発明の組成物は、適用態様、剤型などに応じ、公知の成分を本発明のプロテアーゼと併用することができる。例えば、界面活性剤、洗浄剤、保湿剤、増粘剤、油分、アルコール類、高分子物質、防腐剤、包接化合物、酸化防止剤・抗酸化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、生薬、アミノ酸類、薬効成分、抗菌剤、水等を配合することができる。また、本発明以外のプロテアーゼやプロテアーゼ以外の酵素を含有させることもできる。
【実施例】
【００３７】
以下、実験例、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００３８】
〔実施例１〕微生物の培養
本菌株（バチルスｓｐ．ＨＨ１９２Ｂ株）を１％  Ｎａ2ＣＯ3入り普通ブイヨン培地（極東製薬社製）に植菌し、坂口フラスコ（１００ｍＬ／５００ｍＬの仕込み量）で、培養温度３０℃、振盪数１４０ｒｐｍで一晩培養した。培養液全量を、表１に示すジャーファーメンター培養液組成の中に添加（１．５Ｌ／３Ｌの仕込み量）し、培養温度３０℃、通気量３ｖｖｍ、回転数５００ｒｐｍで本培養を行なった。
【００３９】
【表１】
2005192403.tif 000002
アデカノ−ル（製品名）は旭電化工業株式会社製のものを用いた。
【００４０】
〔実施例２〕プロテアーゼの精製
ＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー後、ハイドロキシアパタイト樹脂を用いて精製した。すなわち、培養上清を限外濾過（０．１１μｍカット、Ｍ．Ｗ．６０００カット）した後、硫安沈殿またはアセトン沈殿を行なった。次いで、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ、ハイドロキシアパタイト）を行い、粗精製酵素を得た。本精製により精製度約７０％の粗精製酵素を得ることができた。限外濾過に使用したモジュールを表２に示す。
【００４１】
【表２】
2005192403.tif 000003
【００４２】
ＵＦ濃縮液に残存する活性成分の回収には２倍量（ｖ／ｖ）アセトン沈殿により、−２０℃で一晩静置し、遠心して沈殿を回収し、バッファーに再溶解した。次に、カラムクロマトグラフィーを行った。ＤＥＡＥ樹脂には、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）を用いた。平衡化は０．１Ｍ  ＮａＣｌ／バッファー（ｐＨ８．０）で行った。洗浄は０．４Ｍ  ＮａＣｌ／バッファー（ｐＨ８．０）で行った。溶出は０．５Ｍ  ＮａＣｌ／バッファー（ｐＨ８．０）で行った。引き続き、ハイドロキシアパタイト樹脂（バイオラッド社製）による精製を行った。平衡化は１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ＰＢＫ）（ｐＨ７．０）で行った。洗浄は５０  ｍＭ  ＰＢＫ（ｐＨ７．０）で行った。溶出は１００  ｍＭ  ＰＢＫ（ｐＨ７．０）で行った。
【００４３】
〔実施例３〕プロテアーゼの分子量測定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上述のようにして得られたプロテアーゼを４〜１２％  ポリアクリルアミドグラジエントゲル（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ  ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて１５０Ｖで４０分間泳動した。標準蛋白質としてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製のタンパク質分子量マーカーであるＭａｒｋ１２（３〜２００ｋＤａ）を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した酵素蛋白質の分子量を求めた結果、約３５，０００であると算定された。
【００４４】
〔実施例４〕合成基質分解活性
３０℃に保温したセルに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ａｔ  ３０℃）と２ｍＭ  Ｃａ2+からなるバッファー２．４６ｍＬを入れ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０  ａｔ  ３０℃）と２ｍＭ  Ｃａ2+からなるバッファーで希釈した酵素液２０μＬを加えてよく攪拌後、１２５ｍＭ  Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｐＮＡ（ＡＰＡ）のＮ−メチルピロリドン溶液を２０μＬ加えて素早く攪拌し、反応を開始させた。４１０ｎｍの吸収の経時変化を測定し、１分間あたりの吸光度の増加から活性を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐＮＡを遊離させる酵素量を１ＥＵと定義した。合成基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ（ＡＡＡ）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ＡＡＰＦ）、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｕｅ（ＡＡＰＬ）の場合も同様に測定を行なった。なお、カゼインは、メルク社製のハンマーシュタインカゼインを用いた。
【００４５】
その結果、表３に示すように合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｕｅに対する３０℃、１分間あたりの分解活性値の比が１：２〜３：６〜７：８〜９であった。また、カゼインに対する３０℃、１分間あたりでの分解活性値を１とした場合の合成基質Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａの３０℃、１分間あたりの分解活性値が６〜９であった。
【００４６】
【表３】
2005192403.tif 000004
【００４７】
〔実施例５〕プロテアーゼ阻害剤の効果
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と２ｍＭ  Ｃａ2+を含むバッファーを使用して本発明のプロテアーゼが１００ＥＵ／ｍＬとなる様に調整した。この酵素溶液に各種阻害剤を１ｍＭになるように添加し、３０℃で３０分間保温処理した後に、各溶液の残存活性を測定し、各溶液の相対活性を求めた。その結果、表４にしめすように、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびキモスタチンにより酵素活性が強く阻害されることが認められた。なお、ＰＣＭＢはｐ−クロロマーキューリー安息香酸、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸ナトリウム、ＴＰＣＫはＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトンを表す。
【００４８】
【表４】
2005192403.tif 000005
【００４９】
〔実施例６〕プロテアーゼの至適ｐＨ
各ｐＨに調整した１２．５ｍＭの合成基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐＮＡ（ＡＡＡ）に本発明のプロテアーゼを１００ＥＵ／ｍＬとなる様に加え、３０℃で反応させて活性を測定し、至適ｐＨでの活性を１００％としたときの各ｐＨでの相対活性を求めた。図１に示すように中性〜アルカリ性領域で活性が高く、至適ｐＨは７〜９であることが認められた。特にｐＨ８が最も至適である。
【００５０】
〔実施例７〕プロテアーゼの温度安定性
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）と２ｍＭ  Ｃａ2+を含むバッファーを使用して本発明のプロテアーゼが１００ＥＵ／ｍＬとなる様に調整し、各温度で１０分間熱処理し、氷冷した後、熱処理前の酵素活性を１００％として残存活性率を求めた。その結果、３０〜６０℃で残存活性率１００％であり、７０℃で失活した。
【００５１】
〔実施例８〕皮膚蛋白質に対する作用性
a）ヒト表皮ケラチン分解活性
ケラチン（ＳＩＧＭＡ社製、ヒト表皮由来）３ｍｇ／ｍＬを８Ｍ  ＵＲＥＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏＥｔＯＨ、０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅからなる溶液に溶解した。ケラチン分解性検討には、１．５μＬのケラチン溶液に各酵素（０〜２００ｍＮＰＵ）を添加し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と、２ｍＭ  Ｃａ2+からなるバッファー中で全量を１５μＬとし、３７℃、１０分間保温した。反応後の溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、５５ｋＤａ付近のケラチンメインバンドの消失によりケラチン分解活性を確認した。その結果、表５に示すように、本発明のプロテアーゼのケラチンに対する分解活性が他の酵素（パパイン、ビオプラ−ゼ）に比べて低いことが確認された。なお、表５中、○はケラチンの分解が認められたことを表す。また、パパインおよびビオプラーゼは長瀬産業社製を用いた。
【００５２】
【表５】
2005192403.tif 000006
【００５３】
ｂ）デスモソーム構成タンパク質（デスモグレイン１）の分解活性
デスモグレイン（以下、ＤＧ１と表記）はヒト頭部角層（ヘアカラー薬剤処理後、２４時間にて剥離された角層）から文献（Ｊ．  Ｓｏｃ．  Ｃｏｓｍｅｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｊｐｎ．３３（１）：１６−２６，１９９９）に従って抽出した。すなわち、角層２ｍｇに対し、５００μＬの抽出溶液（９Ｍ  ＵＲＥＡ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（９．０）、２％ＳＤＳ、１％  β−ｍｅｒｃａｐｔｏＥｔＯＨ、以下、「９Ｍ尿素」と表記）を加えて抽出し、１０ｋｒｐｍで１分間の遠心上清をサンプルとして調製した。次に、得られたＤＧ１画分について、酵素による分解試験を実施した。
【００５４】
酵素反応は、０．１５μＬのヒトＤＧ１抽出画分に０〜１０ｍＮＰＵの各酵素を添加してトリス溶液中にて全量を１５μＬとし、３７℃、１０分間保温した。１０分間保温後、各反応系に５μＬずつＳＤＳ電気泳動用バッファーを添加し、５分間煮沸して反応を停止した。上記のＤＧ１画分酵素処理サンプルのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、一次抗体（抗ヒトＤＧ１抗体、マウスモノクローナル（ＰＲＯＧＥＮ社製））と二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識、羊（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製））を使用したウエスタンブロッティングによりＤＧ１の消失を確認した。画像処理により、デスモグレインバンドの分解量を画像処理により確認した。その結果、表６に示すように各酵素のデスモグレインに対する分解活性は同等であった。
【００５５】
【表６】
2005192403.tif 000007
【００５６】
〔実施例９〕荒れ肌による落屑の改善（落屑改善試験）
荒れ肌を１％ＳＤＳの３０分パッチによって作製したのち、作製後３日目の落屑ピーク時より酵素パッチを開始した。８００ＮＰＵ／ｍＬの濃度の本発明のプロテアーゼを５０μＬ、ヒト荒れ肌の落屑部位に、酵素連続パッチ処理（計２０回）によって塗布した。基剤群（生食、無浸漬（無処理））の比較により、落屑がどの程度抑制されるかを、標準写真をもとにして評価した。（Ｎ＝５）試験の結果、図２に示すように、本発明のプロテアーゼ部位では基剤群に比較して、連続パッチ処理８回目、１２回目という早期から落屑が抑制されていた。この事から、本発明のプロテアーゼは落屑を改善する効果を持つ酵素として優れていると考えられた。なお、図２のグラフの縦軸は、荒れ肌スコアを示している。落屑がどの程度抑制されるかは、標準写真をもとに表７に示す荒れ肌スコアにより評価を行った。
【００５７】
【表７】
2005192403.tif 000008
【００５８】
〔実験法１０〕皮膚一次刺激試験
本発明のプロテアーゼをヒト健常皮膚ならびに荒れ肌への酵素連続パッチ処理（計16回）を実施した。比較対照として、市販の酵素配合洗浄料に配合されているパパイン、ビオプラーゼをもちいた。パパインおよびビオプラーゼは長瀬産業社製を用いた。３種の酵素は、カゼイン分解活性を予め測定し、１５００ＮＰＵ／ｍＬに合わせた。評価指標は、皮膚赤み・かゆみなどの一次刺激と、外観の落屑的変化とした。試験の結果、表５に示すように、一次刺激に関しては、健常皮膚・荒れ肌ともに、パパイン、ビオプラーゼによって発疹、発赤などの皮膚一次刺激が観察された。一方、本発明のプロテアーゼによる一次刺激は観察されなかった。この事から、本発明のプロテアーゼは落屑除去に効果を持ち、刺激性の低い酵素として皮膚への作用に優れている酵素であると考えられる。なお、表８中、皮膚蛋白質への反応性の欄の「○」は反応性が高い、「×」は反応性が低い、「＋」は一次刺激有り、「−」は一次刺激無し、荒れ肌改善の欄の「○」は改善効果有りを表す。
【００５９】
【表８】
2005192403.tif 000009
【００６０】
〔実験法１１〕
表９および１０に示すように、本発明のプロテアーゼを一般的な組成のハンドソープ、クリーム状洗浄剤組成物に各組成物１ｇに対し８００ＮＰＵとなるように配合した。その結果、製剤中においても優れた有効性を示した。なお、表中の会社名は、その会社製の製品を用いたことを表す。
【００６１】
【表９】
2005192403.tif 000010
【００６２】
【表１０】
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【産業上の利用可能性】
【００６３】
以上のように、本発明にかかるプロテアーゼは、皮膚ケラチンに比べ、皮膚デスモソームに対し高い分解活性を有するため、皮膚洗浄剤組成物に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明のプロテアーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】本発明のプロテアーゼを用いた落屑改善試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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