(57)【要約】      （修正有）【課題】ペプチド分子又はペプチド模倣分子中の分子内ジスルフィド結合を形成し上記分子の環状化を行なう新規で欠点の少ない方法を提供する。【解決手段】ペプチドまたはペプチド模倣分子を−Ｓスルホネート基及び酸不安定保護基で保護化された−ＳＨ基を含有する線状前駆体に変換し、無水非プロトン性非極性有機溶媒中、ｐＨ３未満で、少なくとも１つのカルボカチオンスカベンジャーの存在下でこの保護されたＳＨ基を選択的に脱保護し、脱保護された線状前駆体をｐＨ５〜９で溶解し、環化させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）−Ｓ−スルホネート基及び酸不安定保護基で保護化される−ＳＨ基を含有する線状前駆体の調製、
（ｂ）ｐＨ３未満で、少なくとも１つのカルボカチオンスカベンジャーの存在下で、無水非プロトン性非極性有機溶媒中での前記酸不安定保護基で保護された−ＳＨ基の選択的遊離、
（ｃ）ｐＨ５〜９で、部分的に脱保護された線状前駆体の溶解及びその後の環化
を含むペプチド分子又はペプチド模倣分子の環化方法。
【請求項２】
酸不安定保護基が、４−メトキシトリチル、Ｓ−２，４，６−トリメトキシベンジル、Ｓ−４，４’，４”−トリメトキシトリチル及びトリチルの中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護基がトリチルであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）がトリフルオロ酢酸の存在下で実施されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
カルボカチオンスカベンジャーがトリイソプロピルシランであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）がトリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランとの混合物の存在下で実施されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
トリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランが９０：１０〜９９：１の容量比で存在する
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
トリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランが約９５：５の容量比で存在することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アニソール、トリプトファンメチルエステルなどのトリプトファン誘導体、及び／又はフェノールの存在下で実施されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
アニソール、トリプトファン誘導体及び／又はフェノールが、線状前駆体に比して１〜３当量、好ましくは２当量の量で存在することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）で用いられる無水非プロトン性非極性有機溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエチレン及び／又はテトラクロロエチレン、好ましくはジクロロメタンの中から選択されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
溶媒が、線状前駆体１モル当たり２５〜１０リットル、好ましくは２０〜１５リットルの量で存在することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）がｐＨ７〜９で、好ましくはｐＨ８〜８．５で実施される
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）の溶媒が非プロトン性極性有機溶媒と緩衝水溶液の混合物であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
非プロトン性極性有機溶媒がアセトニトリル、テトラヒドロフラン及び／又はアセトンの中から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
緩衝水溶液が、ナトリウム及び／又はカリウムのリン酸塩あるいは酢酸アンモニウムに基づく緩衝液であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
非プロトン性極性有機溶媒が、緩衝水溶液の容量当たり０．５〜１．５の容量で存在することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
非プロトン性極性有機溶媒が緩衝水溶液の容量当たり０．８〜１．２の容量で存在することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
０〜５０℃の温度で、好ましくは１５〜３０℃の温度で実施することを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
５分〜２４時間、好ましくは５〜６０分間実施されることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド分子又はペプチド模倣分子中の分子内ジスルフィド結合の新規の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の障害の治療に有用である多数の生物学的に活性なペプチドは、ジスルフィド結合を含有することが既知である（非特許文献１、２参照）。これらの多くは製剤として既に登録されており、一方、その他は未だ開発段階にある。ジスルフィド結合を有するペプチドのいくつかの著名な例を以下に列挙する：
オクトレオチド：
【化１】
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バプレオチド：
【化２】
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エプチフィバチド：
【化３】
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ソマトスタチン：
【化４】
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オキシトシン：
【化５】
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【０００３】
ジスルフィド結合の形成のために慣用的に用いられる方法は、種々の酸化剤により酸化工程に付されるシステイン又は遊離形態のＳＨ基を含有するその他の誘導体を含有する線状前駆体を利用する。これらの酸化方法は、文献中に十分に記載されている（非特許文献３、４参照）。
【非特許文献１】Handbook of Biochemistry, pages C-164 to C-188
【非特許文献２】Brazeau, P., et al., Science, 179, 77, 1973
【非特許文献３】Katsoyannis, P. G., The Chemistry of Polypeptides, Plenum Press, 1974, pages 60-85
【非特許文献４】Kudryavtseva, E.V, Sidorova, M.V., Ovchinnikov, M.V., Bespalova, Z.D. and Bushuev, V.N., Peptide Res., 49, 1997, 52-58
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
酸化方法の主な欠点は、不純物の生成をもたらし得る酸化剤へのペプチド分子の曝露であり、その結果、工程収率が低く、精製が困難になる。これらの処理はさらに、生物学的活性の見地から、ペプチドの部分的不活性化という結果をもたらす。
【０００５】
その他の欠点は、特に工業生産の目的に関して、これらの工程のいくつかが、−ＳＨ基脱保護化フェーズにおいて、あるいは酸化フェーズにおいて、適切な処分方法を必要とする重金属、ヨウ素、フェリシアン化カリウム等のような反応物質を使用する、という事実から生じる。
【０００６】
ペプチドの環化のための非酸化的方法は、参考文献（５）に記載されている。予め形成した−Ｓ−Ｓ−アルキル基の存在を利用するこの方法の主な欠点は、反応により放出される毒性気体（アルキルメルカプタン）を適切に処分する必要性にある。
【０００７】
−Ｓ−スルホネート基（ブンテ塩）が−ＳＨ基と反応して、ジスルフィド結合を形成する、ということも既知である（参考文献（６））。さらに文献において既知である場合、−Ｓ−スルホネート基はシステイン残基の酸化的な亜硫酸塩との反応（sulfitolysis）によりペプチド分子中に導入されており、そしてこの戦略は、同一分子中に−Ｓ−スルホネート基と遊離−ＳＨ基が同時に存在することを必要とする環状ペプチドの調製には適用され得ない。
【０００８】
ペプチド分子の合成中に予め形成した−Ｓ−スルホネート基を導入する可能性が、記載されている（参考文献（８））。我々は、分子間ジスルフィド結合を形成するために必要である遊離形態の第２の−ＳＨ基を、適切な酸性条件下で、トリチル又は少なくとも酸不安定型の保護基を選択的に除去することにより、−Ｓ−スルホネート基の存在下で得ることができる、ということをここに見出した。これは本発明の主題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、分子内ジスルフィド結合の形成によるペプチド又はペプチド模倣分子の環化のための、簡単且つ非酸化性の新規の合成方法、すなわち、
（ａ）−Ｓ−スルホネート基及び酸不安定保護で保護化された−ＳＨ基を含有する線状前駆体の調製、
（ｂ）無水酸性溶媒中で、適切なカルボカチオンスカベンジャーの存在下における−ＳＨ基の選択的遊離、
（ｃ）ｐＨ５〜９で、部分的に脱保護された線状前駆体を溶解するための環化
を含む方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、分子間ジスルフィド結合を形成するために必要である遊離形態の第２の−ＳＨ基を、適切な酸性条件下で、トリチル又は少なくとも酸不安定型の保護基を選択的に除去することにより、−Ｓ−スルホネート基の存在下で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の方法は、少なくとも２つのシステイン又は側鎖に−ＳＨ基を有するその他の残基を含有する任意の線状ペプチド又はペプチド模倣化合物に適用され得る。第１の−ＳＨ基を含有するアミノ酸誘導体（普通はシステイン）は、Ｓ−スルホネート基に関して選択的に除去され得る保護基で最初に保護される。上記保護基及び関連した使用条件は、当該技術分野で既知であり、例えば、参考文献（７）（この記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。好ましくは、それらは、４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４，４’，４”−トリメトキシトリチル（ＴｍＴｒ）、トリチル（Ｔｒｔ）の中から選択され、トリチル（Ｔｒｔ）が特に好ましい保護基である。次にジスルフィド結合を形成するために用いられる２つのＳＨ基のうちの残り１つは、したがって、Ｓ−スルホネート基で保護される。このようなＳ−スルホネート基及び関連適用方法は同様に当該技術分野で既知であり、例えば、参考文献（８）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【００１２】
実際、環化されるペプチドは、考え得る選択性問題を回避するため、既に保護化された−ＳＨ基（酸不安定保護及びスルホネート基の両方のケースで）を含有するアミノ酸誘導体を用いて化学的に合成される。
【００１３】
その後の工程は次に、第１の酸不安定保護基の選択的除去を包含する。このように、遊離−ＳＨ基及びＳ−スルホネート基により保護された−ＳＨ基を含むペプチドが得られる。しかしながら上記保護基を除去するための既知の従来技術条件は、一連の欠点を示す。例えば、保護基の不適当な脱保護は、ポリペプチド鎖を損傷し、特にスルホネート基により保護される第２の−ＳＨ残基も脱保護することがある。
【００１４】
したがって本発明の特徴的態様のうちの１つは、スルホネート基により保護される−ＳＨ基に関して第１の−ＳＨ基の選択的脱保護を可能にする特定の反応条件を見出したことである。
【００１５】
本発明の好ましい一態様では、−ＳＨ基の選択的遊離は、無水トリフルオロ酢酸及び適切なカルボカチオンスカベンジャー、例えばトリイソプロピルシランの存在下で、無水非プロトン性非極性有機溶媒中で実施される。好ましくは、保護基はトリチルであり、そして脱保護反応は、トリフルオロ酢酸及びトリイソプロピルシランの９０：１０〜９９：１の容積比の、さらに好ましくは約９５：５の容積比の混合物の存在下で実施される。
【００１６】
反応条件は、カルボカチオンを捕捉できるさらなるスカベンジャー、例えば、アニソール、トリプトファンメチルエステル（Ｈ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ）などのトリプトファンの誘導体、及び／又はフェノールの存在と適合する。上記スカベンジャーは、環化されるペプチドに比して１〜３当量、好ましくは約２当量の数量で用いられる。フェノールは、これらのうちで最良であることが立証された。
【００１７】
最後に、無水非プロトン性非極性溶媒は、好ましくはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、トリクロロエチレン及び／又はテトラクロロエチレンの中から選択され、ジクロロメタンが特に好ましい。この溶媒は、好ましくは環化されるペプチド１モル当たり２５〜１０リットル、好ましくは２０〜１５リットルの数量で用いられる。溶媒とトリフルオロ酢酸間の好ましい比率は、容量で約２．２：１である。
【００１８】
ｐＨ５〜９で、遊離ＳＨ基及びＳ−スルホネート基により保護された−ＳＨ基を含むペプチドを単に溶解することにより、他の反応物質を必要とせずに、Ｓ−スルホネート基の置換によりジスルフィド結合の形成が自然に生じる。
【００１９】
表１及び２に示したように、環化を実施するためのｐＨ範囲を規定するために、異なるｐＨ値での経時的な転換パーセンテージ、反応時間及び純度を評価した。最適ｐＨは５〜９であることが立証され、特に用いられるｐＨはｐＨ８．３である。
【００２０】
表中、８ＳＨは、線状中間体を示し、一方、オクトレオチドはジスルフィド架橋を有する環化ペプチドの例である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
【表２】
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【００２３】
５未満のｐＨの使用は、遅い反応時間、不完全な反応及び不十分な純度を生じる。９より高いｐＨの使用は、塩基性ｐＨを有するペプチドの代表であるジアステレオマーの同定を困難にする潜在的ラセミ化反応のために避けるべきである（９、１０）。９より高いｐＨの使用は、二量体又はオリゴマーの潜在的生成に伴いジスルフィド架橋を破壊させる潜在的不均化反応のためにも、避けるべきである（１１）。
【００２４】
したがって、ジスルフィド結合の形成は、好ましくはｐＨ７〜９で、さらに好ましくはｐＨ８〜８．５で実施される。
【００２５】
反応溶媒は、好ましくは適切なｐＨでの緩衝溶液／非プロトン性極性有機溶媒の混合物である。緩衝液は、ナトリウム又はカリウムのリン酸塩あるいは酢酸アンモニウム、好ましくはリン酸ナトリウムのような塩を用いて調製される。非プロトン性極性有機溶媒は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドの中から選択され、より好ましくはアセトニトリルである。上記の非プロトン性極性有機溶媒は、好ましくは上記緩衝水溶液１容量当たり０．５〜１．５容量の数量で、さらに好ましくは上記緩衝水溶液１容量当たり０．８〜１．２容量の数量で存在する。
【００２６】
さらに反応は、好ましくは０〜５０℃の温度で、さらに好ましくは１５〜３０℃の温度で実施される。環化を実施するのに要する時間は、通常は５分〜２４時間、好ましくは５〜６０分である。
【００２７】
その結果生じたペプチドは次に、ペプチドの精製のために通常用いられる方法（転相、イオン交換等）により、単離されるか及び／又はさらなる精製に付される。特にそれは、沈降により、例えば緩衝水溶液へのメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン又はｎ−ヘプタンの付加により、単離され得る。メチル−ｔ−ブチルエーテルが特に好ましい。
【００２８】
側鎖に関する保護、ならびにその後の末端アミノ基の保護及び脱保護を提供する、ペプチド合成において既知である方法を用いて、アミノ酸誘導体の逐次結合により、又は断片により、線状前駆体は、溶液中又は固相中で調製され得る。カルボキシル活性化は、活性エステル、ＥＤＣ、ＤＣＣ又はその他の典型的ペプチド合成方法の使用を可能にする（１０）。
【００２９】
新規の環化方法は、ジスルフィド結合を有する種々の環状ペプチド、例えばバプレオチド、エプチフィバチド及びオクトレオチドの合成に用いられてきた。スキーム１は、単に例として、ペプチドオクトレオチドの調製への当該方法の適用を示す。そのペプチドは、線状前駆体Ｈ−ＤＰｈｅ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ｏｌ（８ＳＨ）の環化により生成される。
【００３０】
以下の実施例は単に例として示されており、本発明を限定しない。
【実施例１】
【００３１】
モデル生成物としてＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＮａ及びＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて、トリチル除去条件下でのスルホネート保護基の安定性を評価した。２つの生成物（各々１００ｍｇ）を別々にジクロロメタン（１ｍｌ）及びトリフルオロ酢酸（０．５  ｍｌ）中に懸濁し、トリイソプロピルシラン（０．０５ｍｌ）を付加した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（保護基の除去により得られる生成物）の生成をＨＰＬＣにより評価した。
【００３２】
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨの生成をＶｙｄａｃ  Ｃ１８（５μｍ）（４．６×２５０）ｍｍカラムを用いて評価した。
溶離剤Ａ：Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ  ９０／１０（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
溶離剤Ｂ：ＣＨ３ＣＮ（０．１％トリフルオロ酢酸含有）
勾配：％Ｂ：１０〜４０（２０分）、８０（１０分）
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＮａの保持時間＝１６．９
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨの保持時間＝３５．０
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨの保持時間＝２５．３
【００３３】
ＬＣ−ＭＳ；［Ｍ＋Ｈ］＋＝３４４によりＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨを同定した。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
１５分後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨからのトリチルの除去は事実上完了したが、一方、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＮａからの保護基の除去は、少量で、そして３０分から開始しただけで、他には観察されなかった。
【実施例２】
【００３６】
保護化オクタペプチド［Ｂｏｃ−ＤＰｈｅ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ−オール］（０．２７ｍｏｌ；４２０ｇ）及び塩化メチレン（４．９Ｌ）を５０リットル反応器中に導入した。フェノール（０．５４  ｍｏｌ；５０ｇ）及びトリフルオロ酢酸［ＴＦＡ］（２．１９Ｌ）を付加し、混合物を２３℃で１０分間撹拌した。トリイソプロピルシラン［ＴＩＳ］（１．２ｍｏｌ；２４７ｍｌ）を溶液に付加し、混合物を５分間撹拌した。最後に、メチル−ｔ−ブチルエーテル［ＭＴＢＥ］（１９．７Ｌ）を付加し、混合物を少なくとも６０分間撹拌した。固体を濾取し、ＭＴＢＥ（１０．４Ｌ）で洗浄し、真空下で３０℃で少なくとも１５時間乾燥した。
【００３７】
得られた固体［２ＴＦＡ。Ｈ−ＤＰｈｅ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール］をアセトニトリル（３９．１Ｌ）と一緒に１００リットル反応器中に導入し、混合物を２３℃で少なくとも５分間撹拌した。
【００３８】
予め窒素でフラッシュしておいたリン酸塩緩衝溶液（１３９４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３９．１ＬのＨ２Ｏを用いて調製し、Ｈ３ＰＯ４の付加によりｐＨ＝８．３に調整した０．２Ｍ緩衝液３９．１Ｌ）を反応混合物に付加し、ジスルフィド結合が生成するまで、混合物を２３℃で窒素下で撹拌した。反応混合物をトリフルオロ酢酸（０．７３１Ｌ）でｐＨ＝３に酸性化した。
【００３９】
揮発性分画を真空下で除去し、次にＮａＣｌ（５．７ｋｇ）及びテトラヒドロフラン（１２．６Ｌ）を導入した。混合物を撹拌し、析出させて、相を分離した。水性相をテトラヒドロフラン（１２．６Ｌ）とともに反応器中に再導入し、混合物を撹拌して、析出させて、相を分離した。撹拌可能な残渣が得られるまで、併合有機相を真空下で濃縮した。残渣をイソプロパノール（２９．７Ｌ）とともに３回、再懸濁し、次にイソプロパノール（３．５Ｌ）を付加した。水の完全除去がカール・フィッシャー分析により一旦立証されたら、塩を濾取し、イソプロパノール（１．５Ｌ）で洗浄した。アルコール溶液（８．１Ｌ）をｎ−ヘキサン（６０Ｌ）及びＭＴＢＥ（１９．９Ｌ）の混合物に０℃で滴下した。沈殿物を少なくとも１５分間撹拌した。生成物を濾取し、ｎ−ヘキサン（７．５Ｌ）で洗浄して、真空下、３０℃で少なくとも１５時間乾燥した。
【００４０】
４１８  ｇ（０．３０  ｍｏｌ）を得た。ＬＯＤ：１０％。
【００４１】
ＬＣ−ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝１０１９及びＨＰＬＣにより、生成物を同定した（標準に対応する同定）。
【００４２】
使用したＨＰＬＣ法：
カラム：ＪＵＰＩＴＥＲ  ５μｍ  Ｃ１８  ３００Ａ（４．６×２５０  ｍｍ）
溶離剤：Ａ＝１０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ；Ｂ＝ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ
温度：３０℃
流量：１  ｍｌ／分
勾配：％Ｂ＝１０〜３０（３０’）−８０（１０’）
波長：２２０  ｎｍ
試料：１  ｇ／ｌ（注入容積：２０  μｌ）。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、分子間ジスルフィド結合を形成するために必要である遊離形態の第２の−ＳＨ基を、適切な酸性条件下で、トリチル又は少なくとも酸不安定型の保護基を選択的に除去することにより、−Ｓ−スルホネート基の存在下で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】説明なし 参照文献(5) US-3,929,758, Lawrence et al., 30 December 1975(6) Schwartz, G. et al., Biochemistry, 15, 1976, 4071-4076(7) Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, Third edition, 6th chapter, Wiley Interscience.(8) Maugras, I., Gosteli, J., Rapp, E., Nyfeler, R., Int. J. Peptide Protein Res., 45, 1995, 152-156(9) Williams, M.W., Young, G. T., J. Chem. Soc. 27, 1962, 3409(10) The Peptides, Editors: E. Gross and J. Meienhofer; Academic Press, Vol. 1, 1979(11) Andreu D., Albericio F., Sole N., Munson M., Ferrer M., Barany G., Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols; Vol. 35, p. 117: Edited by: M.W. Pennington and B.M. Dunn, 1994 Humana Press Inc., Totowa, NJ
【図１】
2005325109.tif 000011
【外国語明細書】
2005325109000001.pdf