(57)【要約】【課題】薬品スクリーニングに用いられる細胞外電位測定デバイスにおいて、細胞周辺へ薬液を投入する際に投入圧力が強すぎて、細胞が揺らぎ測定データが不安定になることがある。【解決手段】基板２５と、この基板２５内に被験体細胞２１と培養液２２と薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には微小貫通孔３およびこの微小貫通孔３に連結した窪み４を少なくとも一つ以上設け、前記ウエルの側面の形状をすり鉢状としたセンサ素子１を有する構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、この基板内に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には微小貫通孔およびこの微小貫通孔に連結した窪みを少なくとも一つ以上設け、前記ウエルの壁の形状をすり鉢状としたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイス。
【請求項２】
基板と、この基板内に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には微小貫通孔およびこの微小貫通孔に連結した窪みを少なくとも一つ以上設け、前記ウエルの壁の形状を渦巻き状あるいは放射線状としたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイス。
【請求項３】
センサ素子の上部に絶縁体よりなる容器を当接し、この容器の底部にウエルより大きい第一の貫通孔を設けた請求項１または２に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項４】
基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設けたセンサ素子と、さらにこのセンサ素子の上部に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせるための絶縁体よりなる容器を当接し、さらにこの容器の底部に第一の貫通孔を設け、この第一の貫通孔の壁面を前記基板に設けられた微小貫通孔に向かってすり鉢状とした細胞外電位測定デバイス。
【請求項５】
基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設けたセンサ素子と、さらにこのセンサ素子の上部に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせるための絶縁体よりなる容器を当接し、さらにこの容器の底部に第一の貫通孔を設け、この第一の貫通孔の壁面を前記基板に設けられた微小貫通孔に向かって渦巻き状あるいは放射状とした細胞外電位測定デバイス。
【請求項６】
容器に第二の貫通孔を設け、この第二の貫通孔を微小貫通孔および窪み付近の所定の位置から放射状に貫通するように設け、この第二の貫通孔に容器内に培養液あるいは薬液を投入するためのチューブを挿入した請求項３〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項７】
第二の貫通孔に挿入するチューブを樹脂、ガラスまたはシリカのいずれかとした請求項６に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項８】
基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設け、さらに基板の一面側に測定用電極が形成されたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスであって、この測定用電極の一部を絶縁体で被覆したセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイス。
【請求項９】
測定用電極の絶縁体で被覆する面積を露出している前記測定用電極の面積よりも大きくしたセンサ素子を有する請求項８に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１０】
センサ素子の測定用電極の絶縁体の上に測定用電極を覆うように絶縁体基板を当接した請求項８に記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１１】
基板をシリコン、二酸化珪素または二酸化珪素を含むガラス材料との積層体としたセンサ素子を有する請求項１〜５、８のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイス。
【請求項１２】
基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔と窪みを設け、さらに基板の一面に測定用電極を設けたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスを用いて細胞外電位を測定する方法であって、前記センサ素子の測定用電極からの電圧あるいは電流による信号を増幅する方法と、この増幅された信号を測定してコンピュータに所定の時間取り込んだ後周波数変換を行い、この所定の時間ごとに前記周波数変換の結果をコンピュータへ描画することを含む細胞外電位の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料特に細胞の電気生理学的評価をこれら生体試料が発する電気化学的変化を指標にして、簡易に高速に行う細胞外電位測定デバイスおよびこのデバイスを用いた細胞外電位の測定方法に関するものであり、例えば化学物質によって細胞が発する反応を検出する高速薬品スクリーニング装置に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の電気的活動を指標にして薬品をスクリーニングすることはパッチクランプ法、蛍光色素または発光指示薬を用いる方法により行われている。
【０００３】
このパッチクランプ法はマイクロピペットの先端部分に付けた細胞膜の微小部分（パッチと呼ぶ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法であり、この方法は一個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の一つである（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する蛍光色素または発光指示薬により、細胞内のイオンの移動をモニタすることで細胞の電気的活動を測定する方法もある。
【０００５】
しかし、パッチクランプ法ではマイクロピペットの作製及び操作に特殊な技術を必要とし、一つの試料の測定に多くの時間を要することから大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングする用途には適していない。
【０００６】
また、蛍光色素などを利用する方法は大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングすることができるが細胞を染色する工程が必要であり、測定においては色素の影響によるバックグラウンドが高い上に時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点がある。
【０００７】
これに代わる方法として、既に（特許文献１）により開示されている方法はパッチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、しかも蛍光色素を用いる方法のように簡易に高速で大量の試料を測定できるものである。
【０００８】
この（特許文献１）では、基板上に設けられた細胞の保持手段を有する少なくとも一つのウエルと、このウエルに電気信号を検出するセンサー手段とを有する細胞外電位あるいは細胞が発する物理化学的変化を測定する、いわゆる細胞外電位測定デバイスについて開示されている。
【０００９】
今少し、従来の細胞外電位測定デバイスの動作について図面を用いて説明する。
【００１０】
図３８は従来の細胞外電位測定デバイスの構造を模式図で示したものであり、ウエル５３内に培養液６０が入れられ、被験体細胞５５は基板５２に設けられた細胞保持手段によって捕捉または保持されている。この細胞保持手段は基板５２に形成された窪み５４および開口部５６を介してこの窪み５４に連絡する穴または貫通孔５７を備えている。さらに、この貫通孔５７の中にはセンサー手段である測定用電極５９が配置されており、この測定用電極５９は配線５８を経て信号検出部に連結されている。
【００１１】
測定の際には、被験体細胞５５を貫通孔５７側から吸引ポンプなどの手段により、前記被験体細胞５５が窪み５４部分に密着保持される。同時に培養液６１は貫通孔５７側にも流れだし、測定用電極５９に接触している。こうして、被験体細胞５５の活動により発生する電気信号はウエル５３中の培養液６０側に漏れることなく、貫通孔５７側に設けた測定用電極５９によって検出されている。
【非特許文献１】細胞の分子生物学、第三版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社
【特許文献１】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、前記従来の方法では被験体細胞５５と薬液を反応させるためには培養液６０内に薬液を注入する必要がある。この際、薬液の注入によって被験体細胞５５周辺の培養液６０に流れが発生する。この流れの変化が大きいと、測定用電極５９に接している培養液６１も揺らぎを起こすこととなり、結果としてこの揺らぎによって測定用電極５９へノイズが検出される。
【００１３】
このノイズは細胞外電位を測定する際には信号のＳ／Ｎを劣化させる原因となり好ましくない。この揺らぎによって発生するノイズはおよそ１００Ｈｚ以下の低周波であり、一方、細胞外電位の変化はこのＤＣ成分から５ｋＨｚ程度までの周期で変化する信号であるために両者の帯域が重なっているからである。
【００１４】
よって、電気的フィルタのような手段で余分な信号であるノイズを減らすと、ＤＣ成分付近の信号もカットされてしまう上にフィルタ特性のため１００Ｈｚより高域の信号領域までカットしてしまうこととなり、被験体細胞５５が発する細胞外電位信号をとらえることが困難になる。
【００１５】
本発明はこのような問題に鑑み、被験体細胞の周辺に薬液を投入する際にウエルに流れの変化が極力発生しないウエル構造と、薬液投入により被験体細胞の周辺で流れが変化しても測定用電極には極力伝達しない細胞外電位測定デバイスの構造を実現するものである。さらに、この測定用電極の周辺で揺らぎによるノイズが発生しても低周波カットフィルタを用いることなく細胞外電位による信号との区別を容易に判断できるようになり、被験体細胞の薬液による判定を行いやすくする方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は以下の構成を有する。
【００１７】
本発明の請求項１に記載の発明は、基板と、この基板内に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には微小貫通孔およびこの微小貫通孔に連結した窪みを少なくとも一つ以上設け、前記ウエルの壁の形状をすり鉢状としたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスであり、培養液に薬剤を投入する際に大きな流れ変化を起こすことなく培養液内に薬剤を混合させることができるようになり、安定した測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１８】
本発明の請求項２に記載の発明は、基板と、この基板内に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせる少なくとも一つ以上のウエルを設け、このウエルの底面には微小貫通孔およびこの微小貫通孔に連結した窪みを少なくとも一つ以上設け、前記ウエルの壁の形状を渦巻き状あるいは放射線状としたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスであり、培養液に薬剤を投入する際により安定して培養液と薬剤の混合ができるようになり、より安定した測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００１９】
本発明の請求項３に記載の発明は、センサ素子の上部に絶縁体よりなる容器を当接し、この容器の底部にウエルより大きい第一の貫通孔を設けた請求項１または２に記載の細胞外電位測定デバイスであり、基板の上部に絶縁体による容器が設置されていることにより、被験体細胞および培養液および薬液をより投入しやすくなることに加えて、容器が絶縁体であるので、容器側の培養液の電位が不用意に他に伝わることがなくなるのでより安定した測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２０】
本発明の請求項４に記載の発明は、基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設けたセンサ素子と、さらにこのセンサ素子の上部に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせるための絶縁体よりなる容器を当接し、さらにこの容器の底部に第一の貫通孔を設け、この第一の貫通孔の壁面を前記基板に設けられた微小貫通孔に向かってすり鉢状とした細胞外電位測定デバイスであり、培養液に薬剤を投入する際に大きな流れ変化を起こすことなく培養液内に薬剤を混合させることができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２１】
本発明の請求項５に記載の発明は、基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設けたセンサ素子と、さらにこのセンサ素子の上部に被験体細胞と培養液と薬剤を混ぜ合わせるための絶縁体よりなる容器を当接し、さらにこの容器の底部に第一の貫通孔を設け、この第一の貫通孔の壁面を前記基板に設けられた微小貫通孔に向かって渦巻き状あるいは放射状とした細胞外電位測定デバイスであり、この段差に沿って培養液の中に薬液を投入すれば薬液の混合をより効率よく行うことができる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２２】
本発明の請求項６に記載の発明は、容器に第二の貫通孔を設け、この第二の貫通孔を微小貫通孔および窪み付近の所定の位置から放射状に貫通するように設け、この第二の貫通孔に容器内に培養液あるいは薬液を投入するためのチューブを挿入した請求項３〜５のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、あらかじめ設けられた第二の貫通孔は、前記センサ素子の微小貫通孔および窪み付近の所定の位置を中心にした放射状に貫通しているので、前記チューブを挿入することで確実に、培養液および薬液を基板の被験体細胞が保持された領域に投入することができるとともに測定の再現性を高める細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２３】
本発明の請求項７に記載の発明は、第二の貫通孔に挿入するチューブを樹脂、ガラスまたはシリカのいずれかとした請求項６に記載の細胞外電位測定デバイスであり、チューブがこれら絶縁体で形成されているため、容器内の培養液の電位を不用意に他に漏らすことが無くなるので、より安定した測定が可能になる細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２４】
本発明の請求項８に記載の発明は、基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔および窪みを設け、さらに基板の一面側に測定用電極が形成されたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスであって、この測定用電極の一部を絶縁体で被覆したセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスであり、測定用電極側に培養液の揺らぎが発生しても、測定用電極の一部が絶縁体で覆われているので培養液の揺らぎによるノイズの発生が少ない細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２５】
本発明の請求項９に記載の発明は、測定用電極の絶縁体で被覆する面積を露出している前記測定用電極の面積よりも大きくしたセンサ素子を有する請求項８に記載の細胞外電位測定デバイスであり、測定用電極における培養液の揺らぎによるノイズの発生がより少ない細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２６】
本発明の請求項１０に記載の発明は、センサ素子の測定用電極の絶縁体の上に測定用電極を覆うように絶縁体基板を当接した請求項８に記載の細胞外電位測定デバイスであり、溶液の揺らぎがほとんど発生しない細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２７】
本発明の請求項１１に記載の発明は、基板をシリコン、二酸化珪素または二酸化珪素を含むガラス材料との積層体としたセンサ素子を有する請求項１〜５、８のいずれか一つに記載の細胞外電位測定デバイスであり、生産性に優れた細胞外電位測定デバイスを実現することができる。
【００２８】
本発明の請求項１２の発明は、基板と、この基板に少なくとも一つ以上の微小貫通孔と窪みを設け、さらに基板の一面に測定用電極を設けたセンサ素子を有する細胞外電位測定デバイスを用いて細胞外電位を測定する方法であって、前記センサ素子の測定用電極からの電圧あるいは電流による信号を増幅する方法と、この増幅された信号を測定してコンピュータに所定の時間取り込んだ後周波数変換を行い、この所定の時間ごとに前記周波数変換の結果をコンピュータへ描画することを含む細胞外電位の測定方法であり、外部からのノイズ信号と、被験体細胞の発する電気的信号との区別を視覚的に行いやすくなり、薬剤による反応の変化をとらえやすくなる細胞外電位の測定方法を実現することができる。
【発明の効果】
【００２９】
以上のように本発明は、培養液内に薬剤を投入する際、被験体細胞の周辺において培養液の揺らぎを極めて少なくすることができることから測定用電極で検出されるノイズの発生を起こりにくくする安定した細胞外電位測定デバイスを実現するとともに、その測定を簡易にまた高速に行うことができる測定方法を提供することができるという効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１を用いて、請求項１〜３、１１、１２に記載の発明について説明する。
【００３１】
図１は本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの一実施の形態を示した一部切欠分解斜視図であり、容器２の部分は切り取り図で示して内部を見えるようにしている。図２はセンサ素子１の一部切欠斜視図であり、図３はこの一部の切欠拡大斜視図である。
【００３２】
図１に示す細胞外電位測定デバイスは、シリコンおよび二酸化シリコンの積層体からなるセンサ素子１が樹脂からなる容器２に当接されるように構成しており、この容器２には中の電位を測定するための参照電極７が設けられている。
【００３３】
また、センサ素子１内の上面から開口部９を設けており、この開口部９の底面には微小貫通孔３および窪み４を設けている。また図３に示すように、微小貫通孔３の下部には検出電極８を設けている。
【００３４】
また、図１に示すように樹脂製の容器２の底部には第一の貫通孔５を設けており、その大きさはセンサ素子１に設けた開口部９の大きさより大きくしている。
【００３５】
さらに、図２に示すように開口部９の壁１０の形状をすり鉢状としている。
【００３６】
ここで、開口部９と壁１０から構成される部分をウエルと称する。このウエルは培養液２２と薬液を貯蔵する役割を担っている。
【００３７】
また、容器２の側面には第二の貫通孔６を設けてあり、この第二の貫通孔６にはチューブ１１を挿入しているが、このチューブ１１は第二の貫通孔６がガイドとなり、高精度にセンサ素子１の微小貫通孔３および窪み４の付近に位置決めされている。なお、図５および図６では窪み４および微小貫通孔３が酸化膜４６で覆われている様子を示しているが、この酸化膜４６は細胞の種類、大きさなどにより必要に応じて形成するものであり、熱酸化膜のように厚みが１００００オングストローム以上の場合もあれば、自然酸化膜のように５００オングストローム以下の場合もあり、この厚みは本発明を構成する要件ではない。
【００３８】
次に、この細胞外電位測定デバイスの使用方法について図面を用いて詳細に説明する。
【００３９】
図４は細胞外電位測定デバイスに被験体細胞２１と培養液２２を容器２に投入したときの様子を断面図で示しており、図５〜図６はセンサ素子部における微小貫通孔３および窪み４の部分の拡大断面図である。
【００４０】
まず、図４および図５にあるように容器２に培養液２２と被験体細胞２１を入れると、当初この被験体細胞２１は培養液２２中に浮遊している。また培養液２２は容器２の内部だけでなく、窪み４、微小貫通孔３を満たした後、検出電極８側にも溢れ出るようになる。
【００４１】
このようにすると、浮遊している被験体細胞２１は容器２内の圧力によって、図５および図６に示すように窪み４へ引き込まれる。この引き込みの圧力が足りない場合、検出電極８側から吸引ポンプなどの手段により吸引すると、より確実に浮遊している被験体細胞２１は窪み４側に吸引されることになる。
【００４２】
ここで、微小貫通孔３の大きさは被験体細胞２１より小さくなるよう設計しているので被験体細胞２１は窪み４の内部に保持される。
【００４３】
一方、図４に示したように容器２の側面には第二の貫通孔６を設けていることから、この微小貫通孔３および窪み４の極近傍に薬液投入のためのチューブ１１を投入することができる。ここで第二の貫通孔６は微小貫通孔３および窪み４の上部から放射線状に設けているので前記チューブ１１の投入位置を高精度に確定することができる。
【００４４】
つまり、薬液を確実に被験体細胞２１の周辺に投入するためには薬液を投入するためのチューブ１１をできるだけ被験体細胞２１が保持されている窪み４に近いところに配置する必要がある。しかしながら、チューブ１１は通常直径が１ｍｍ以下と極めて細いものを用いることから、図７および図８に示すように培養液２２で満たされた容器２の上部からチューブ１１を投入しようとすると、チューブ１１が培養液２２の表面張力を受けて曲がってしまい、チューブ１１の先端を所定の位置に高精度に位置決めすることが困難である。
【００４５】
しかしながら、本発明のように容器２の側面に所定の位置から放射線上に第二の貫通孔６が設けられていることで、容器２が培養液２２で満たされていてもチューブ１１は容易に第二の貫通孔６を通して培養液の表面張力を受けることなく、図４に示すように所定の位置へチューブ１１の先端を位置決めすることができる。これにより、常に安定した薬液の投入が可能になるのである。
【００４６】
また、開口部９がすり鉢状となっていることにより、薬液が開口部９の内部へ確実に浸透していくので、チューブ１１からの薬液投与圧力を低く設定しても被験体細胞２１付近への確実な薬液投与が可能になり、不用意に被験体細胞２１に圧力を加えて振動を発生させてしまうことを防止することができる。
【００４７】
なおこの場合、容器２の底面に設けられた第一の貫通孔５はセンサ素子１の開口部９より大きくしていることから、開口部９のすり鉢状の形状を妨げることなく、薬液は開口部９の底部へ浸透する。
【００４８】
さらに、チューブ１１の材質は樹脂、ガラスまたはシリカのいずれかによるものが好ましい。これらは絶縁体であり、容器２に挿入しても培養液２２の電位を不用意に不安定にすることはない。
【００４９】
また、開口部９の形状は図９に示すように渦巻き状になっていても良い。これにより、より低い流入速度であっても投入された薬液が培養液の中に均一に混合されることから、ばらつきの少ない高精度な測定のためにより効果的である。
【００５０】
さらに、この開口部９の形状は図１０に示すように中心に向かって放射線状に設けることも効果的である。
【００５１】
次に、本発明の細胞外電位測定デバイスを利用した測定方法について説明する。
【００５２】
まず、容器２内の培養液２２にチューブ１１を通して薬剤（図示せず）を投与すれば、薬剤は培養液２２の内部および被験体細胞２１の周辺に浸透する。
【００５３】
これによって被験体細胞２１が薬剤によって活性化した場合、図６に示すように被験体細胞２１が細胞膜内のイオンチャネル（図示せず）を通してＮａ+、Ｋ+、Ｃａ2+などのイオンを取り込んだり、逆に排出したりする頻度が増える。
【００５４】
このことは、被験体細胞２１の周辺および微小貫通孔３の内部の培養液２２中におけるイオン濃度を変化させることとなり、一方微小貫通孔３の内部の培養液２２は容器２の内部の培養液２２と電気的に絶縁されているので、検出電極８によってこの微小貫通孔３の内部のイオン濃度変化を電気的信号として取り出すことができる。
【００５５】
ここで、被験体細胞２１が培養液２２間でイオンを交換する頻度については被験体細胞２１の種類によってまちまちであるが、一般的にはこのイオン交換現象は特定の周期で同期しているものではなく、それぞれのイオンチャネルで確率的にイオン交換が行われていると考えられている。つまり、検出される電気的信号は特定の周波数のみで観測されるものではなく、ＤＣから５ｋＨｚ程度までの周波数での信号が幅広く検出されるものである。
【００５６】
次に、本発明の細胞外電位の測定方法について図３６を用いて説明する。図３６は本発明の細胞外電位の測定方法を示す流れ図であり、まずセンサ部で検出された電圧あるいは電流の信号をアンプ（ａ）で増幅し、次にこの増幅された信号を所定の時間測定し（ｂ）、次に高速フーリエ変換による周波数ドメイン変換を行い（ｃ）、次にこの周波数ドメインでの信号強度を所定の時間ごとにコンピュータへ描画する（ｄ）。このように、測定データを周波数変換した上でコンピュータに描画することにより、外部からの電源ノイズなどが発生している場合においても、このようなノイズは周期的な周波数成分をもつことから、ＤＣから高周波領域に観測される被験体細胞２１の発する電気的信号との区別を視覚的に行いやすくなり、薬剤による反応の変化をとらえやすくなる測定方法とすることができる。
【００５７】
図３７はこの方法によって得られた測定データの特性図である。図３７において、横軸は測定時刻を秒単位で記しており、この測定時刻における周波数の信号強度を描画したものである。図中のIIIおよびIVは横線が見られるがこれは周期的な周波数成分を持っているので外部の電源などから混入したノイズであり、ＩおよびII部分は周期的な周波数成分を持っておらず、被験体細胞２１付近のイオン濃度が変化することで観測された信号であると判断することができる。
【００５８】
次に、本実施の形態１の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図面を用いて説明する。図２４、図２７〜図３２はこれの製造方法を示す断面図であり、図２５および図２６は一部拡大断面図である。
【００５９】
前記細胞外電位測定デバイスの製造方法は図２４に示すようにシリコンからなるベース４１と、二酸化シリコンからなる中間層４２と、シリコンからなる薄板４３で構成される基板４０を用意し、この基板４０の薄板４３面側にレジストマスク４４を所定のパターンで形成する。なお、前記のような基板４０はＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際によく用いられ、入手は容易であるのでこの基板の製造方法については省略する。
【００６０】
次に、図２５に示すように、ドライエッチングによって微小貫通孔３を薄板４３の所定のエッチング深さに達するまで形成する。このときのエッチング法はドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエッチングの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。このエッチングを促進するガスとしてはＸｅＦ2、ＣＦ4、ＳＦ6などがある。また、エッチングを抑制するガスとしてはＣＨＦ3、Ｃ4Ｆ8などがある。これらのガスを混合してエッチングすることにより、エッチングされた壁面にＣＦ2のポリマーである保護膜を作製していくことができることから、ドライエッチングによる微小貫通孔３の形成をレジストマスク４４の下方のみに進行させることが可能となる。
【００６１】
ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みをもう少し詳しく説明する。
【００６２】
まず、エッチングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことによって、ほぼ垂直なエッチング形状とすることができるのである。この工程では、エッチングを促進するガスによるドライエッチングの際に外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中で高周波を基板４０に加えることで基板４０にマイナスのバイアス電圧が発生することにより、プラズマ中のプラスイオンであるＳＦ5+やＣＦ3+が基板４０に向かって衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むことになり、ドライエッチングを抑制させる際には基板４０に高周波を加えなければ基板４０にはバイアス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となるＣＦ+が偏向を受けなくなり、基板４０のドライエッチング穴の壁面に対して均一な保護膜の形成ができることになる。実験ではエッチングを促進するガスとしてＳＦ6、抑制するガスとしてＣ4Ｆ8を用いて確認した。
【００６３】
これらのガスを用いると以上述べたようなそれぞれの作用によって、微小貫通孔３の形成をレジストマスク４４の下方のみに進行させることが可能となり、さらに同時にエッチングを抑制するガスを用いることにより、微小貫通孔３の側面には保護膜６２が形成される。
【００６４】
次に、図２６に示すように例えばＸｅＦ2などのエッチングを促進するガスのみを用いてドライエッチングを行う。このガスは微小貫通孔３の壁面に形成された保護膜６２はエッチングせず、底面のシリコン面のみをエッチングすることになるので、結果として微小貫通孔３よりも大きな窪み４が形成される。
【００６５】
次に、図２７に示すようにベース４１面側にレジストマスク４５を形成してエッチングを行うことで、図２８に示すように開口部９を形成する。このときのエッチング方法には例えばＸｅＦ2やＳＦ6などのエッチングを促進するガスのみを用いたドライエッチングを行う。これにより、開口部９の側壁はすり鉢状とすることができる。なお、開口部９を渦巻き状、放射状にするためには適宜、適当なエッチングマスクを用いることにより形成することが可能である。この場合にはエッチングガスとして、エッチングを促進するガスだけではなく、エッチングを抑制するガスを用いる必要もある。
【００６６】
次に、図２９に示すように中間層４２をウエットエッチング、ドライエッチングなどの通常の手段でエッチングする。
【００６７】
次に、図３０に示すようにシリコンの表面に熱酸化膜４６を通常の熱酸化工程によって形成する。なお、この工程はシリコンの表面抵抗を極力あげたい場合に用いればよく、それほど高い表面抵抗を必要としないのであればシリコンの表面に自然に形成される自然酸化膜だけで十分である。
【００６８】
次に、図３１に示すように薄板４３面側に例えばＡｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒなどをスパッタリング、真空蒸着など通常の薄膜形成手段により形成し、検出電極８とする。
【００６９】
このように基板４０の材料をシリコンおよび二酸化シリコンの積層体からなるＳＯＩ基板とすることで、上述した製造工程において高精度な加工が極めて簡便に行われることから、より効率的な製造を可能にすることができる。
【００７０】
最後に、図３２に示すように容器２に接着剤５０などを用いてセンサ素子１を接着する。なお、この容器２は樹脂成形など通常の手段で形成することができるので説明は省略する。
【００７１】
その後、参照電極７およびチューブ１１は測定時に挿入する。
【００７２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２により請求項４〜７に記載の発明を説明する。
【００７３】
図１１は本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの一部切欠斜視図であり、図１２は図１１における容器１３の一部切欠斜視図、図１３はセンサ素子１２の一部切欠斜視図、図１４はこれの一部の切欠拡大斜視図である。
【００７４】
図１１において、本実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの構成はシリコンおよび二酸化シリコンの積層体からなるセンサ素子１２が樹脂からなる容器１３に当接された構成としている。この容器１３の内部には電位を測定するための参照電極１８がセットされており、前記センサ素子１２には下部に開口部２０が設けられており、上部には微小貫通孔１４および窪み１５が設けられている。
【００７５】
さらに、微小貫通孔１４の下部には検出電極１９が設けられており、樹脂製の容器１３の底部は図１２に示すように第一の貫通孔１６が形成されている。この第一の貫通孔１６の形状はすり鉢状である。さらに容器１３の側面には第二の貫通孔１７が設けられており、この第二の貫通孔１７は容器１３の底部にセットされるセンサ素子１２の微小貫通孔１４および窪み１５付近の所定の位置から放射線上に貫通している。
【００７６】
ここで、第一の貫通孔１６がすり鉢状となっていることにより、実施の形態１と同様に測定時において、より低い流入速度での薬液投入でも確実に窪み１５に保持された被験体細胞２１の周辺への薬液浸透ができ、この被験体細胞２１の周辺の培養液に大きな流れ変化を起こすことなく、より安定した測定が可能になる。
【００７７】
さらに、図１５に示すように第一の貫通孔１６には中心に向かって渦巻き状の壁２３を形成しておくと、より低い流入速度であっても投入された薬液が培養液の中に均一に混合されることから、ばらつきのない高精度な測定のためにはより効果的である。なお、この壁の形状はそのほか中心に向かう放射線状としても良い。
【００７８】
次に、本実施の形態２の細胞外電位測定デバイスの製造方法について図１６〜図２３を用いて説明する。
【００７９】
図１６に示すように、前記細胞外電位測定デバイスの製造方法はシリコンからなるベース２６と、二酸化シリコンからなる中間層２７と、シリコンからなる薄板２８で構成される基板２５を用意し、ベース２６面側にレジストマスク２９を形成する。なお、前記基板２５はＳＯＩ基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際によく用いられ、入手は容易であるのでこの基板２５の製造方法については省略する。
【００８０】
次に、図１７に示すようにベース２６のエッチングを行い開口部２０を形成する。このときのエッチング方法はドライエッチング、ウエットエッチングなど通常の方法を用いることにより形成することができる。
【００８１】
次に、図１８に示すように薄板２８面側にレジストマスク３０を所定のパターンで形成する。
【００８２】
次に、図１９に示すようにドライエッチングによって薄板２８面側からエッチングを行う。このときエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用いる。この種のエッチングを促進するガスにはＳＦ6、ＣＦ4、ＸｅＦ2などを用いることができる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなく、横方向へのエッチングも促進する作用がある。実験ではＸｅＦ2を用いて効果を確認している。これによって、エッチング形状は図１９に示すようにレジストマスク３０の開口部を中心とする半球形となり、窪み１５が形成される。またレジストマスク３０はＸｅＦ2によっては殆どエッチングされないことから、図のように最初の形状を保っている。
【００８３】
次に、図２０に示すように再び薄板２８面側からドライエッチングを行う。このときのエッチングガスとしてはエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを混合させて用いる。これによって、エッチングは垂直下方のみに進行するので窪み１５から微小貫通孔１４が連結して形成される。
【００８４】
次に、図２１に示すように二酸化シリコンよりなる中間層２７をベース２６面側からドライエッチング、ウエットエッチングなどの通常の方法によりエッチングする。
【００８５】
次に、図２２に示すように基板２５のベース２６面側から通常の薄膜形成技術により、Ａｕを主体とする検出電極１９を形成することによりセンサ素子１２を得ることができる。なお、必要であればこの工程の前に熱酸化処理によりシリコンの表面を熱酸化膜４６で覆うことも可能である。
【００８６】
次に図２３に示すように、別途作製した樹脂よりなる容器１３の底面にセンサ素子１２の薄板２８面を上にして接着剤６４などで貼り付ける。なお容器１３の製造方法についてはプレス成形、光造形、切削加工などの通常の手段を用いることができ、これらの方法を用いれば底面には第一の貫通孔１６、側面には第二の貫通孔１７を所定の形状となるよう形成することは特に困難なことではないのでここでは説明を省略する。
【００８７】
このようにして、本実施の形態２で使用される細胞外電位測定デバイスを作製することができる。
【００８８】
（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３により請求項８〜１０に記載の発明を説明する。
【００８９】
図３３は本実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの構成を示した断面図であり、被験体細胞４８および培養液４９を既に投入した状態が示されている。
【００９０】
本実施の形態３で開示される方法は実施の形態１あるいは実施の形態２で示した細胞外電位測定デバイスのどちらにおいても適用できるものであり、効果は同じものが得られる。よって説明は、実施の形態１で説明した細胞外電位測定デバイスに適用する内容で行う。
【００９１】
本実施の形態３が実施の形態１と違う点の一つは、センサ素子３８に形成された検出電極４７の一部が図３３のように絶縁層３１で被覆されており、微小貫通孔３７の開口部近傍のみに検出電極４７が露出するようになっていることであり、さらにガラスからなる絶縁基板３９が検出電極４７を所定の空隙を介して覆っている。
【００９２】
さて、細胞外電位を検出する手順は実施の形態１と同様であるので説明を省略し、ここでは検出電極４７面側に絶縁層３１および絶縁基板３９を設ける効果について説明する。
【００９３】
実施の形態１の図４および図５でも説明したように、測定時において培養液２２は検出電極８側にも流れ出し、検出電極８の露出している面と接触する。
【００９４】
一方、被験体細胞２１が発する電気的活動によりイオン濃度あるいは電位が変化する領域は被験体細胞２１の極近傍のみである。しかしながら、実施の形態１の場合、培養液２２は微小貫通孔３付近のイオン濃度あるいは電位変化だけではなく、微小貫通孔３から離れた領域（例えば、図４の丸で囲んだ領域Ｃ）において、被験体細胞２１の活動とは関係のないノイズによるイオン濃度あるいは電位変化も検出することとなり、検出電極８はこれらを平均した変化を検出することとなり、結果として被験体細胞２１の活動によるイオン濃度あるいは電位変化を検出することが困難になる。しかしながら、本実施の形態３の図３３に示すように絶縁層３１が検出電極４７の一部を被覆し、微小貫通孔３７の極近傍のみを露出させることで、被験体細胞４８の活動とは関係のないノイズによるイオン濃度あるいは電位変化（例えば図３３の丸印で囲んだ領域Ｄ部で起こる変化）も検出するということがなくなることから安定した測定が可能になる。
【００９５】
このとき、検出電極４７を露出させる面積は少ないほどより安定した測定が可能になるが、少なくとも絶縁層３１によって覆われている面積が露出させる面積より大きい方が好ましい。
【００９６】
さらに、絶縁基板３９は検出電極４７面側の培養液４９の揺らぎによるノイズの低減を押さえる。すなわち、実施の形態１の図４に示すように検出電極８面側で培養液２２が露出していると、外部振動や圧力変動などにより液滴の表面が揺らぎやすい。この液滴の表面が揺らぐと培養液２２の流れが発生し、微小貫通孔３付近の培養液２２にも流れが発生するのでイオン濃度あるいは電位変化の正確な測定ができなくなることがある。
【００９７】
また、微小貫通孔３付近の圧力にも変動が発生し、被験体細胞２１を保持している圧力にも変化が生じる。この被験体細胞２１が圧力を受けると微小貫通孔３と容器２側を隔てているシール抵抗が変化するとともに被験体細胞２１は外部圧力によっても電気活動状態を変化させることから、被験体細胞２１が薬剤との反応によって発する電気活動を正確に測定できることができなくなることがある。
【００９８】
しかしながら、図３３に示すように本実施の形態３における細胞外電位測定デバイスによれば、絶縁基板３９が一定の空隙を有して検出電極４７面側に当接されていることから、培養液４９はセンサ素子３８と絶縁基板３９の間に閉じ込められるので外部からの力を受けることが極力少なくなり、培養液４９が振動や圧力変化によって揺らぐことがなくなる。
【００９９】
結果として、安定した細胞外電位の検出を可能にするデバイスを実現することができる。なお培養液４９を閉じ込めるための基板は絶縁体である必要があり、これにより培養液の電位を不用意に不安定にすることがなくなる。
【０１００】
次に、実施の形態３における細胞外電位測定デバイスを製造する方法について簡単に説明する。
【０１０１】
検出電極４７を形成するまでの工程は実施の形態１と同じであるので、それ以降の工程についてのみ説明する。
【０１０２】
図３４に示すように、検出電極４７を形成した後ポリイミド、フッ素樹脂、二酸化珪素などの絶縁体材料をスパッタ、真空蒸着、スピンコーティングなどの方法で絶縁層３１として形成する。
【０１０３】
次に、図３５に示すように所定のパターンをもつ絶縁層３１を形成し、微小貫通孔３７の極近傍のみの検出電極４７を外部に露出させてセンサ素子３８を得る。
【０１０４】
次に、図３２に示すように容器２の底面に前記で作製したセンサ素子３８を検出電極４７面側が下に向かうようにして接着剤などで接着した後、図３３に示すようにセンサ素子３８の検出電極４７面側に所定の隙間を有して絶縁基板３９を接着する。このときの接着方法としては絶縁性の樹脂を利用することが好ましい。
【０１０５】
以上の方法により、図３３で示す実施の形態２と同様の細胞外電位測定デバイスを得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明にかかる細胞外電位測定デバイスは培養液内に薬剤を投入する際、被験体細胞周辺において培養液の揺らぎが極めて少ないことから、測定用電極で検出されるノイズの発生が起こりにくく、安定した測定を可能にするという効果を有している。さらに、この細胞外電位測定デバイスを用いた測定方法は被験体細胞が発する信号と、これとは異なる余分なノイズを視覚的にとらえやすいデータ解析を行うことができることから、より確実に細胞外電位の変化を測定することができるという効果を有し、化学物質によって細胞が発する反応を検出する高速薬品スクリーニング装置等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞外電位測定デバイスの一部切欠分解斜視図
【図２】同センサ素子の一部切欠斜視図
【図３】同要部の一部切欠拡大斜視図
【図４】同使用方法を示す断面図
【図５】同拡大断面図
【図６】同拡大断面図
【図７】同断面図
【図８】同断面図
【図９】同細胞外電位デバイスの一部を示す斜視図
【図１０】同細胞外電位デバイスの一部を示す斜視図
【図１１】本発明の実施の形態２における細胞外電位測定デバイスの一部切欠斜視図
【図１２】同細胞外電位デバイスの一部切欠斜視図
【図１３】同センサ素子の一部切欠斜視図
【図１４】同要部の一部切欠拡大斜視図
【図１５】同一部の切欠斜視図
【図１６】同細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図
【図１７】同断面図
【図１８】同断面図
【図１９】同断面図
【図２０】同断面図
【図２１】同断面図
【図２２】同断面図
【図２３】同断面図
【図２４】同断面図
【図２５】同断面図
【図２６】同断面図
【図２７】同断面図
【図２８】同断面図
【図２９】同断面図
【図３０】同断面図
【図３１】同断面図
【図３２】同断面図
【図３３】本発明の実施の形態３における細胞外電位測定デバイスの断面図
【図３４】同細胞外電位測定デバイスの製造方法を示す断面図
【図３５】同断面図
【図３６】本発明の実施の形態１における細胞外電位の測定方法を示す流れ図
【図３７】同測定データの特性図
【図３８】従来の細胞外電位測定デバイスの模式断面図
【符号の説明】
【０１０８】
１  センサ素子
２  容器
３  微小貫通孔
４  窪み
５  第一の貫通孔
６  第二の貫通孔
７  参照電極
８  検出電極
９  開口部
１０  壁
１１  チューブ
１２  センサ素子
１３  容器
１４  微小貫通孔
１５  窪み
１６  第一の貫通孔
１７  第二の貫通孔
１８  参照電極
１９  検出電極
２０  開口部
２１  被験体細胞
２２  培養液
２３  壁
２４  チューブ
２５  基板
２６  ベース
２７  中間層
２８  薄板
２９  レジストマスク
３０  レジストマスク
３１  絶縁層
３２  基板
３３  ベース
３４  中間層
３５  薄板
３６  貫通孔
３７  微小貫通孔
３８  センサ素子
３９  絶縁基板
４０  基板
４１  ベース
４２  中間層
４３  薄板
４４  レジストマスク
４５  レジストマスク
４６  熱酸化膜
４７  検出電極
４８  被験体細胞
４９  培養液
５０  接着剤
【図１】
2005156234.tif 000003
【図２】
2005156234.tif 000004
【図３】
2005156234.tif 000005
【図４】
2005156234.tif 000006
【図５】
2005156234.tif 000007
【図６】
2005156234.tif 000008
【図７】
2005156234.tif 000009
【図８】
2005156234.tif 000010
【図９】
2005156234.tif 000011
【図１０】
2005156234.tif 000012
【図１１】
2005156234.tif 000013
【図１２】
2005156234.tif 000014
【図１３】
2005156234.tif 000015
【図１４】
2005156234.tif 000016
【図１５】
2005156234.tif 000017
【図１６】
2005156234.tif 000018
【図１７】
2005156234.tif 000019
【図１８】
2005156234.tif 000020
【図１９】
2005156234.tif 000021
【図２０】
2005156234.tif 000022
【図２１】
2005156234.tif 000023
【図２２】
2005156234.tif 000024
【図２３】
2005156234.tif 000025
【図２４】
2005156234.tif 000026
【図２５】
2005156234.tif 000027
【図２６】
2005156234.tif 000028
【図２７】
2005156234.tif 000029
【図２８】
2005156234.tif 000030
【図２９】
2005156234.tif 000031
【図３０】
2005156234.tif 000032
【図３１】
2005156234.tif 000033
【図３２】
2005156234.tif 000034
【図３３】
2005156234.tif 000035
【図３４】
2005156234.tif 000036
【図３５】
2005156234.tif 000037
【図３６】
2005156234.tif 000038
【図３７】
2005156234.tif 000039
【図３８】
2005156234.tif 000040