(57)【要約】【課題】低温液体を取り扱う機器のバクテリアチャレンジテスト方法を提供する。【解決手段】凍結乾燥バクテリアの懸濁液を調製し、常温において低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリアをトラップさせ、凍結乾燥バクテリアをトラップした低温液体フィルターを乾燥して凍結乾燥バクテリアを低温液体フィルターに保持させるか、生のバクテリアの懸濁液を調製し、常温において低温液体フィルターにバクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターにバクテリアをトラップさせ、バクテリアをトラップした低温液体フィルターを凍結乾燥条件下に置いてバクテリアを低温乾燥させ、低温液体フィルターに低温液体を透過させて濾液中のバクテリアの有無を検証するバクテリアチャレンジテスト方法。【選択図】      図１
2005249676.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温液体を取り扱う機器のバクテリアチャレンジテスト方法において、凍結乾燥バクテリアを機器に保持させることを特徴とするバクテリアチャレンジテスト方法。
【請求項２】
低温液体を取り扱う機器が低温液体フィルターであることを特徴とする請求項１に記載のバクテリアチャレンジテスト方法。
【請求項３】
凍結乾燥バクテリアの懸濁液を調製し、
常温において低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリアをトラップさせ、
凍結乾燥バクテリアをトラップした低温液体フィルターを乾燥して凍結乾燥バクテリアを低温液体フィルターに保持させ、
前記低温液体フィルターに低温液体を透過させて濾液中のバクテリアの有無を検証する
ことを特徴とする請求項２に記載のバクテリアチャレンジテスト方法。
【請求項４】
懸濁液の溶媒が、水系溶媒またはアルコール系溶媒であることを特徴とする請求項３に記載のバクテリアチャレンジテスト方法。
【請求項５】
バクテリアの懸濁液を調製し、
常温において低温液体フィルターにバクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターにバクテリアをトラップさせ、
バクテリアをトラップした低温液体フィルターを凍結乾燥条件下に置いてバクテリアを低温乾燥させ、
前記低温液体フィルターに低温液体を透過させて濾液中のバクテリアの有無を検証する
ことを特徴とする請求項２に記載のバクテリアチャレンジテスト方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温液体を取り扱う機器のバクテリアチャレンジテスト方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリアチャレンジテストは、例えば液体濾過に用いられるフィルターの除菌性能を検証するための重要な試験方法である。室温で用いられるフィルターについてはバクテリアチャレンジテストによる評価技術が確立しており、工業規格で規定されている（非特許文献１および２参照）。公知のバクテリアチャレンジテストは、概略的には以下のようにして行われる。まず、フィルターを滅菌した後、このフィルターに所定以上の濃度で指標菌を含有する水系懸濁液をチャレンジさせる。フィルターを通して濾過された濾液をメンブランフィルターに通し、そのメンブランフィルターを固体培地上で培養する。この際、フィルターによって除菌されずに濾液を通したメンブランフィルターでバクテリアが採取されたとするとバクテリアが生育してコロニーが形成されるが、コロニーが形成されなければ無菌の濾液が得られることが検証される。
【０００３】
一方、水の凝固点以下の温度にある液体、例えば液体二酸化炭素や液体窒素のような低温液体も薬品工業や食品工業において広く用いられており、生物汚染を防止する観点からこれらの低温液体に対しても滅菌フィルターが使用されている。
【０００４】
しかし、バクテリアの水系懸濁液を用いる従来のバクテリアチャレンジテストは、水の凝固点以下の低温液体に対する滅菌フィルターには適用することができない。これは、水の凝固点以下でバクテリアの水系懸濁液が凍ってバクテリアを含む氷の塊を形成するため、高い信頼性でフィルターにバクテリアをチャレンジさせることが難しくなるためである。現在までのところ、低温液体に指標菌を懸濁させて滅菌フィルターに対して適用可能なバクテリアチャレンジテストは知られていない。
【０００５】
低温液体の滅菌フィルターのバクテリアチャレンジテスト性能を、低温でコンディショニングした後に室温で他の液体を用いたときのバクテリアチャレンジテストで検討する報告もある（非特許文献３参照）。しかし、フィルターおよびフィルターハウジングに用いられる材料およびバクテリアは、特に極低温にさらされるとその性質や生態の変化をリアルタイムで評価できなくなる可能性がある。
【０００６】
液体窒素の滅菌濾過システムでは、液体窒素に胞子を入れ、濾過後の液体窒素を乾燥して胞子の有無を検証する方法も考えられるが、このような方法で用いることができるバクテリア種は胞子を形成するものに限定される。ところが、無芽胞菌たとえば滅菌フィルターのバクテリアチャレンジテストのために米国ＦＤＡ(Food and Drug Administration)によって規定されている指標菌であるBrevundimonas diminuta (B. diminuta, ATCC 19146)は胞子を形成しないので、上記のような方法によって低温液体の滅菌フィルターのバクテリアチャレンジテストを実施することはできない。
【非特許文献１】ＡＳＴＭ  Ｆ８３８−８３
【非特許文献２】ＪＩＳ  Ｋ３８３５
【非特許文献３】Leesa D. McBurnie & Barry Bardo, "Validation of sterile filtration of liquid nitrogen", Pharmaceutical Technology, p. 82, October 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、低温液体を取り扱う機器のバクテリアチャレンジテスト方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様に係るバクテリアチャレンジテスト方法は、低温液体を取り扱う機器、例えば低温液体フィルターのバクテリアチャレンジテスト方法であって、凍結乾燥バクテリアを機器に保持させることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るバクテリアチャレンジテスト方法は、例えば、凍結乾燥バクテリアの懸濁液を調製し、常温において低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターに凍結乾燥バクテリアをトラップさせ、凍結乾燥バクテリアをトラップした低温液体フィルターを乾燥して凍結乾燥バクテリアを低温液体フィルターに保持させ、前記低温液体フィルターに低温液体を透過させて濾液中のバクテリアの有無を検証することにより実施される。この方法では、凍結乾燥バクテリアの代わりに胞子を用いることも考えられる。この方法では、懸濁液の溶媒として、水系溶媒を用いてもよいし、アルコール系溶媒（エタノール、プロパノールなど）を用いてもよい。
【００１０】
また、本発明に係るバクテリアチャレンジテスト方法は、例えば、生のバクテリアの懸濁液を調製し、常温において低温液体フィルターにバクテリア懸濁液をチャレンジさせて低温液体フィルターにバクテリアをトラップさせ、バクテリアをトラップした低温液体フィルターを凍結乾燥条件下に置いてバクテリア乾燥させ、前記低温液体フィルターに低温液体を透過させて濾液中のバクテリアの有無を検証することにより実施してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、低温液体で生存可能なバクテリアのソースとして凍結乾燥バクテリアを用い、低温液体を取り扱うフィルターなどの機器に凍結乾燥バクテリアを保持させることにより、低温液体下でのバクテリアチャレンジテスト方法が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
凍結乾燥はバクテリアを保存するのに最適な方法の１つである。凍結乾燥により脱水された形態のバクテリアは非常に安定で、生のバクテリアと比較すると外部環境の影響を受けにくい。
【００１３】
本発明者らは、いくつかの実験を行い、凍結乾燥したバクテリアの懸濁液をフィルターにチャレンジし、市販滅菌フィルターを通したガスによって乾燥した後、さらに低温液体に１時間以上さらした場合でも生存可能なままであることを見出した。これらの実験結果から、凍結乾燥バクテリアは種々の低温用途、例えば低温液体フィルターの有効性の検証、低温ガスサンプラーの有効性の検証に有効に使用できることがわかる。
【００１４】
また、本発明者らは、凍結乾燥したバクテリアが高濃度アルコール系溶媒（たとえば純エタノール［３０％〜８０％の低濃度アルコールは殺菌剤なので不適である］）中でも生存可能であることを見出した。したがって、凍結乾燥バクテリアのエタノール中の懸濁液を用いてフィルターなどの機器に凍結乾燥バクテリアを保持させ、低温液体下でのバクテリアチャレンジテストを実施することもできる。このようにエタノールを用いる方法では、疎水性のフィルター表面を親水性にするための追加の操作を行う必要なしに、バクテリアチャレンジテストを実施できる。
【００１５】
以下、本発明者らが行った実験について説明する。以下の実験においては、凍結乾燥バクテリアとして理研から購入した凍結乾燥したB. diminutaを用いた。  
実験１
液体窒素に直接さらすことにより凍結乾燥バクテリアの生存可能性を調べた。  
凍結乾燥バクテリアの粉末を直接、液体窒素に１時間さらした後、生理食塩水に凍結乾燥バクテリアを加え、希釈し、ペトリフィルム上に接種し、培養して、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を調べた。
【００１６】
比較のために、液体窒素にさらすことなく、生理食塩水に凍結乾燥バクテリアの粉末を加え、希釈し、ペトリフィルム上に接種し、培養してＣＦＵを調べた。
【００１７】
その結果、液体窒素に１時間さらした場合でも、さらさない場合でも、ＣＦＵに有意な差は認められなかった。このことから、凍結乾燥したB. diminutaは液体窒素にさらした後でも生存可能であることがわかった。
【００１８】
実験２
フィルター上に凍結乾燥バクテリアを保持させる方法を用い、フィルターに液体窒素を通してフィルターに保持させた凍結乾燥バクテリアの生存可能性を調べた。
【００１９】
フィルターとして、図１に示す液体窒素中の微生物をサンプリングするためのサンプラーを用意した。ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）製のメンブランフィルター１は支持フィルター２に支持される。ＰＴＦＥメンブランフィルター１および支持フィルター２の周縁部を両面から挟むように、１対のＰＴＦＥ環状ガスケット３ａ、３ｂが設けられる。また、下流側のＰＴＦＥ環状ガスケット３ｂとホルダ４ｂとの間にスプリング５が設けられる。これらの部材は、いずれもステンレス鋼製の上流側および下流側のホルダ４ａ、４ｂによって両面から挟まれ、これらの間に封入される。具体的には、下流側のホルダ４ｂに設けられた凹部にスプリング５、ＰＴＦＥガスケット３ｂ、支持フィルター２、ＰＴＦＥメンブランフィルター１、およびＰＴＦＥガスケット３ａを収容し、上流側のホルダ４をねじ込んでホルダどうしを締め付ける。スプリング５はガスケット３ｂに押圧力を与えて、液体窒素下でのＰＴＦＥメンブランフィルター１の変形を抑え、シール性を失われるのを防止する作用を有する（スプリングは液体窒素にさらす場合にのみ用いる）。このサンプラー中のＰＴＦＥメンブランフィルター１にエタノールおよび水を順次通して親水性にした後、さらにオートクレーブ中で滅菌した。
【００２０】
一方、生理食塩水に１０％の凍結乾燥バクテリアを加えた（この試料を別途ＴＳＢ（trypticase soy broth）培地中において３２℃で培養したところ、バクテリアの初期濃度は２．１×１０8ＣＦＵ／ｍＬであった）。この試料を順次１０倍希釈する操作を繰り返した。そのうち、１０-3希釈液と１０-5希釈液を用いた。
【００２１】
それぞれの希釈液を、別々に、ＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、凍結乾燥バクテリアをトラップさせた。それぞれのＰＴＦＥフィルターに滅菌窒素ガスを６．５Ｌ／ｍｉｎの流量で１０分間流して乾燥し、ＰＴＦＥフィルターに凍結乾燥バクテリアを保持させた。その後、それぞれのＰＴＦＥフィルターに、１Ｌの液体窒素（滅菌フィルターを通して滅菌している）を通した。１０-3希釈液−乾燥−液体窒素という処理を行ったものをフィルターＡ、１０-5希釈液−乾燥−液体窒素という処理を行ったものをフィルターＢとする。
【００２２】
比較のために、液体窒素を通す処理を行わなかった以外は上記と同様な操作を行った。１０-3希釈液−乾燥という処理を行ったものをフィルターＣ、１０-5希釈液−乾燥という処理を行ったものをフィルターＤとする。
【００２３】
それぞれのフィルターを１００ｍＬのＴＳＢ培地に入れ、５分間超音波処理した後、３０℃で所定時間培養し、培養液の濁度（Optical Density）を波長６８０ｎｍで測定した。その結果を表１および図２に示す。また、それぞれの試料についてバクテリアの純度をチェックし、B. diminutaであることを確認した。
【表１】
2005249676.tif 000003
【００２４】
表１および図２（特に６２時間培養後の濁度の結果）から、液体窒素を通したフィルターＡ、Ｂと液体窒素を通していないフィルターＣ、Ｄとで、凍結乾燥したB. diminutaの生存可能性に有意な差がない。すなわち、凍結乾燥したB. diminutaをチャレンジさせたフィルターＡ、Ｂに液体窒素を通してもB. diminutaが生存していることがわかる。したがって、本発明の方法によりＰＴＦＥフィルターに凍結乾燥したB. diminutaをチャレンジさせ、液体窒素を通すことにより、液体窒素下でのバクテリアチャレンジテストが可能になる。
【００２５】
実験３
実験２と同様の実験を行ったが、液体窒素を通したＰＴＦＥフィルターを寒天平板上に載せて培養した。この実験でも実験２と同様に、凍結乾燥したB. diminutaをチャレンジさせたフィルターに液体窒素を通してもB. diminutaが生存していることが確認された。
【００２６】
実験４
生理食塩水に凍結乾燥バクテリアを加えて順次１０倍希釈する操作を繰り返して、１０-5希釈液を用意した。この希釈液を、ポア径０．２μｍのセルロースフィルターを通して濾過し、凍結乾燥バクテリアをトラップさせ、乾燥して凍結乾燥バクテリアを保持させた。その後、セルロースフィルターを培地に載せ、液体窒素（公称０．２２μｍポアサイズのフィルターを通した）を約２０分間で数回に分けてかけた後、液体窒素を蒸発させた。比較のために、液体窒素を通す処理を行わなかった以外は上記と同様な操作を行った。
【００２７】
それぞれのフィルターを寒天培地に載せ、培養してＣＦＵを調べた。その結果、液体窒素を通したフィルターでは２１６ＣＦＵ、液体窒素を通していないフィルターでは２２１ＣＦＵであり、凍結乾燥したB. diminutaの生存可能性にはほとんど差がなかった。
【００２８】
実験５
エタノール中での凍結乾燥バクテリアの生存可能性を調べた。  
９９．５％エタノールに凍結乾燥バクテリアを加えた。これを、ポア径０．２μｍのセルロースフィルターを通して濾過し、凍結乾燥バクテリアをトラップさせ、乾燥して凍結乾燥バクテリアを保持させた。
【００２９】
このフィルターをＰＣＡ寒天平板に載せ、クリーンベンチ内で乾燥し、３０℃で培養してＣＦＵを調べた。２つのＣＦＵは両方ともB. diminutaのコロニーであることが確認された。このように、凍結乾燥したB. diminutaは９９．５％以上の高濃度エタノール中でも生存可能であることがわかる。したがって、凍結乾燥バクテリアのエタノール中の懸濁液を用いてフィルターに凍結乾燥バクテリアを保持させ、液体窒素下でのバクテリアチャレンジテストを実施することもできる。
【００３０】
実験６
フィルター上に生のバクテリアをトラップさせ、凍結乾燥して凍結乾燥バクテリアを保持させ、フィルターに液体窒素を通して凍結乾燥バクテリアの生存可能性を調べた。
【００３１】
ポア径０．１μｍのＰＴＦＥフィルターをステンレス製のモジュールにセットして滅菌した。ＰＴＦＥフィルターに無水エタノールを通して親水化処理を行った後、滅菌水で洗浄した。
【００３２】
一方、スキムミルクに１０％の未処理B. diminutaを加えた。親水化処理したＰＴＦＥフィルターにポンプを用いてB. diminuta懸濁液を通して未処理B. diminutaをトラップさせた。これを−８０℃で３時間以上冷却して予備凍結を行った。凍結乾燥機によってフィルターモジュールの凍結乾燥を一晩行い、凍結乾燥したB. diminutaをＰＴＦＥフィルターに保持させた。このＰＴＦＥフィルターに、１Ｌの液体窒素（滅菌フィルターを通して滅菌している）を通した。常温に戻った後、ＰＴＦＥフィルターをモジュールからはずした。このＰＴＦＥフィルターをＴＳＢ培地に入れ、３０℃で１週間、静置培養した。さらにＰＣＡ寒天培地上に白金耳で適量まいてB. diminutaを増殖させ、その後、純度を確認した。
【００３３】
このように、低温液体フィルターに生のバクテリアの懸濁液を接触させてフィルターにバクテリアをトラップさせた後に、フィルターを凍結乾燥条件下に置いて凍結乾燥バクテリアを低温液体フィルターに保持させるという方法を用いた場合でも、凍結乾燥したバクテリアは液体窒素下で生存可能なままであり、バクテリアチャレンジテストを有効に実施できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る実験において用いた低温液体中の微生物のサンプラーを分解して示す図。
【図２】凍結乾燥バクテリアをチャレンジさせ、液体窒素を通したフィルターと液体窒素を通していないフィルターを入れて培養した培養液の濁度を示す図。
【符号の説明】
【００３５】
１…ＰＴＦＥメンブランフィルター、２…支持フィルター、３ａ、３ｂ…ＰＴＦＥ環状ガスケット、４ａ、４ｂ…ホルダ、５…スプリング。
【図１】
2005249676.tif 000004
【図２】
2005249676.tif 000005