(57)【要約】    【課題】α,α-1,1-グルクロニル結合切断活性を有する酵素、特に澱粉酸化物の加水分解によるD-グルクロン酸乃至D-グルクロノラクトンの製造に代わって、酸化トレハロースを原料としてこれを完全加水分解し得る酵素を提供する。    【解決手段】例えばα,α-トレハロース二酸化物に作用して、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断する活性を有する酵素、該酵素の産生能を有する微生物、およびこれらを利用して上記化合物を加水分解する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物を基質として、そのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する加水分解活性を有する酵素であって、200mMまでの基質濃度において基質阻害を受けず且つ400mMまでの生成物濃度において生成物阻害を受けないことを特徴とする酵素。
【請求項２】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である請求項1に記載の酵素。
【請求項３】
以下の酵素学的性質を有し、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断する活性を有する酵素。
(1) 作用：分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物を基質として、そのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する加水分解反応を触媒する
(2) 基質阻害および生成物阻害：200mMまでの基質濃度において基質阻害を受けず且つ400mMまでの生成物濃度において生成物阻害を受けない
(3) 基質特異性：α,α-トレハロース二酸化物に対して加水分解活性を有する
(4) 安定pH：2〜4
(5) 至適pH：3.0〜3.5
(6) 安定温度：40℃以下
(7) 至適温度：40℃
(8)α,α-トレハロース二酸化物に対するKm：7.2mM
【請求項４】
請求項1〜3のいずれかに記載の酵素の産生能を有する微生物。
【請求項５】
アスペルギルス・ニガーHCB-205 2/28株(Aspergillus niger, FERM P-19191)である請求項4に記載の微生物。
【請求項６】
請求項4に記載の微生物を培養し、培養物から請求項1〜3のいずれかに記載の酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造方法。
【請求項７】
微生物が請求項5に記載の微生物である請求項6に記載の酵素の製造方法。
【請求項８】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物に請求項1〜3のいずれかに記載の酵素を作用させて、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断された加水分解物を得ることを特徴とするグルクロニル化合物の製造方法。
【請求項９】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物に請求項4または5に記載の微生物を作用させて、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断された加水分解物を得ることを特徴とするグルクロニル化合物の製造方法。
【請求項１１】
分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断する活性を有する酵素、該酵素の産生能を有する微生物、および当該酵素および微生物を用いてグルクロン酸類乃至グルクロニル化合物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するかあるいは合成によって得られる多糖類(オリゴ糖類、糖酸類、配糖体を含む)の中には、α,α-1,1-グルクロニル結合をその分子中に有する化合物（グルクロニル化合物）が存在する。その代表例としては、α,α-1,1-グルクロニルグルクロニド（α,α-トレハロース二酸化物、即ち(O-α-D-グルクロニル(1→1)α-D-グルクロニド)、以下このものを「α,α-トレハロース二酸化物」という）が挙げられる。
【０００３】
従来よりα-D-グルクロニドをグルクロン酸に加水分解する酵素としてα-グルクロニダーゼ（α-glucuronidase；別名：α-glucosiduronase）が種々報告されている。例えば、各種のかび(Trichoderma viride, Aspergillus tubingensis)由来酵素、担子菌（Tyromyces palustris）由来酵素、細菌(Bacillus stearothermophilus)由来酵素は、ヘミセルロース中のキシラン側鎖に存在する4-O-メチル-D-グルクロニル結合を切断(加水分解)することが報告されている。しかるに、これらの酵素類は前記α,α-1,1-グルクロニル結合を切断し得るものではない。
【０００４】
カタツムリ(Helix pomatia)由来酵素は、p-ニトロフェニル α-D-グルコピラノシルウロン酸(p-nitrophenyl α-D-glucopyranosyluronic acid, PNP-GA)を加水分解し、同時に速度は遅いが2-O-α-D-グルコピラノシルウロン酸-D-キシロース(2-O-α-D-glucopyranosyluronic acid-D-xylose, GA-2X)、2-O-(4-O-メチル-α-D-グルコピラノシルウロン酸)-D-キシロース(2-O-(4-O-methyl-α-D-glucopyranosyluronic acid)-D-xylose, MeGA-2X)、2-O-(4-O-メチル-α-D-グルコピラノシルウロン酸)-D-キシロトリオース(2-O-(4-O-methyl-α-D-glucopyranosyluronic acid)-D-xylotriose, MeGA-2X3)、α-D-グルコピラノシルウロン酸-α-D-グルコピラノシルウロン酸(α-D-glucopyranosyluronic acid-α-D-glucopyranosyluronic acid, GA-GA)に作用することが知られている。しかしながら、このものもα,α-1,1-トレハロース二酸化物に作用してそのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断するものではない。
【０００５】
PNP-GAに作用する他の酵素としては、好熱性細菌(Thermotoga maritime)由来の酵素が報告されているが、これらも、α,α-1,1-グルクロニル結合には作用しない。
【０００６】
前記特定のグルクロニル結合、即ちα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する作用を有する酵素についての文献としては、唯一、特許文献1が存在する。
【０００７】
この特許文献1には、α,α-トレハロース二酸化物からグルクロン酸またはD-グルクロノラクトンを生成する活性(グルクロニダーゼ活性)を有する微生物として、Bacillus macerans, IFO3490およびArthrobacter globiformis, IFO12137の2種の微生物が挙げられている。該特許文献1は、これらの微生物の利用によって、従来法に比して高収率でグルクロン酸を製造できるとしているが、その原料基質に対する収率は約40-60重量％に過ぎない。より具体的には、最も加水分解活性に優れたものとして示されているBacillus macerans, IFO3490を用いた場合の結晶D-グルクロノラクトンの収率は、原料トレハロース二酸化物に対して50.4%と記されており、またArthrobacter globiformis, IFO12137を用いた場合の同収率は45%と記されている。
【０００８】
また、特許文献1には、市販の酵素剤の中にもグルクロニダーゼ活性を有するものがある旨記載されており、その具体例として「セルロシンAC-10」(上田化学工業株式会社製)、「セルロシンAF-10」(同上社製)、「セルレースナガセ」(ナガセ生化学工業株式会社製)および「セルラーゼ」(セルバ社製)を挙げている。これらはいずれもAspergillus niger由来である。しかしながら、これらの内の前3者については単に活性を定性的に認めた旨の記載があるだけであり、具体的に活性の程度は記されていない。活性の程度が具体的に記されている最後の酵素剤(セルラーゼ)についても、D-グルクロン酸の収率は約43.8%(α,α-トレハロース二酸化物の10w/w%溶液に該酵素剤をpH4.5、40℃で5日間作用させた後の収率)に過ぎない。基質であるα,α-トレハロース二酸化物自体が安定な化合物であり、上記酵素反応条件下で自然分解することなどは考えられないことから、この収率(分解収率)が40%程度に留まっており、完全に加水分解され得ないという事実は、該酵素の加水分解活性が非常に微弱である（上記条件では尚加水分解反応が完全に進行しない）か、或いは、上記加水分解条件下で該酵素は基質阻害もしくは生成物阻害を受けることを明らかにしている。このような酵素剤は、その実用的な用途に際して、多量の酵素剤の利用、基質および生成物濃度の管理、反応条件の制御などの大きな制約を受け、しかも効率的に充分な収率で目的物を得ることはできないという重大な欠点を有している。
【０００９】
以上のように、特許文献1に開示の微生物および酵素剤は、グルクロン酸の製造に際して実用的ではなく、その利用によっても高収率で目的物を得ることはできないという致命的欠点がある。このような酵素（および微生物）に代わって、酵素蛋白として安定であり、酵素を菌体外に単離することが可能で、しかも基質阻害・生成物阻害を受けず、目的物を高収率で生成することができる酵素および該酵素を産生する微生物の開発が望まれている。
【００１０】
一方、従来より、最も低分子量のグルクロニル化合物であるD-グルクロン酸乃至D-グルクロノラクトン（両者は水溶液中では平衡関係にある）の製造は、工業的には、澱粉酸化物の化学的加水分解(酸加水分解)によって行われている。しかしながら、その一つの方法である硝酸酸化によって得られた澱粉酸化物を原料とする方法は、酸化反応の際に一酸化窒素の発生による発泡があること、反応・分画工程が複雑なこと、酸化および加水分解の全工程を通じて多数の副生成物が生じることなどの欠点を有している。しかも、目的とするグルクロニル化合物の収率は、僅か10-15%に過ぎない(例えば、特許文献2、特許文献3など参照）。
【００１１】
他の方法であるD-グルコースを原料としてそのC1位に保護基を導入後、C6位の酸化を行う方法は、確実にグルクロン酸を取得できる利点はあるが、官能基の保護反応、保護基の脱保護反応などの工程が必要で、操作が煩雑で、コストも高くなり、大量生産には不向きである。しかも、この方法でも、全工程を通じてのD-グルクロン酸もしくはD-グルクロノラクトンの収率は、10-20%と非常に低い(例えば、特許文献4参照）。
【００１２】
これらの方法を改善する方法として、例えば、トレハロースを原料として用いて、該原料を酸化後、得られる酸化物を酸(または加水分解酵素)で加水分解する方法が提案されている(例えば、特許文献1および特許文献5参照)。この方法では、酸化反応の際にC1位への保護基の導入は必要でなく、C6位ヒドロキシメチル基の一級水酸基への酸化反応が定量的に進行する。しかるに、得られる酸化トレハロースは、対称性のよい構造ゆえに化学的に安定で、その加水分解には、かなり過酷な条件が必要である。例えば、0.135N塩酸中、100℃で6時間または90℃で9時間の加熱還流条件が必要である。このような加水分解条件では、原料とする酸化トレハロースが分解したり副生成物が生成して、目的とするD-グルクロノラクトンの収率は低下する(精製後の収率は35-44％である)。即ち、この方法の最大の問題点は、酸化トレハロースの加水分解工程にある。
【００１３】
尚、特許文献5には、酸化トレハロースの加水分解が酵素を利用して実施できる旨記載されてはいるが、その酵素は単に「加水分解酵素」と記載されているのみで、酸化トレハロースのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断できる加水分解酵素についての具体的記載はない。現在知られている酵素は、前述した特許文献1に示されるように、僅か数種に過ぎず、しかもそれらは全て充分な収率を達成できないものである。かかる酵素を利用した酸化トレハロースの加水分解反応の実用性は極めて乏しい。
【００１４】
上記酸化トレハロースの加水分解工程が副反応や原料の損失を伴わず、温和にかつ速やかに進行すれば、D-グルクロノラクトンの収率は向上し、分離精製工程が簡略化されると考えられる。特に、酸化トレハロースに作用してこれを加水分解する反応を触媒し得る酵素が得られれば、温和な条件下で酸化トレハロースの加水分解が可能となり、基質の分解や副生成物を伴わず、分離精製工程が簡略化されかつ収率も上昇することが期待できる。
【特許文献１】特開2002-153294号公報
【特許文献２】特公昭42-2595号公報
【特許文献３】特公昭43-5882号公報
【特許文献４】特公昭44-7325号公報
【特許文献５】特開平10-251263号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、α,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物に作用して、該化合物の上記特定の結合を効率よく加水分解する酵素、該酵素を産生する微生物、および当該酵素または微生物を用いて、高収率で且つ簡便にグルクロニル化合物を製造する方法を提供することにある。
【００１６】
特に、本発明は、酸化トレハロース、即ちα,α-トレハロース二酸化物に作用してそのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する活性を有する酵素、該酵素を産生する微生物、およびこれらの酵素および微生物を用いて上記化合物を加水分解してD-グルクロン酸およびD-グルクロノラクトンを得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、α,α-トレハロース二酸化物を加水分解して、D-グルクロン酸およびD-グルクロノラクトンを生成する酵素の産生能を有する微生物をスクリーニングするに成功し、また該微生物の培養によって該酵素を単離、精製するに成功した。本発明はこれらの知見を基礎として完成されたものである。
【００１８】
本発明は、下記項1-11に記載の要旨の発明を提供する。
【００１９】
項1. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物を基質として、そのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する加水分解活性を有する酵素であって、200mMまでの基質濃度において基質阻害を受けず且つ400mMまでの生成物濃度において生成物阻害を受けないことを特徴とする酵素。以下、この酵素を「本発明酵素」ということがある。
【００２０】
項2. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である項1に記載の酵素。
【００２１】
項3. 以下の酵素学的性質を有し、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断する活性を有する酵素；
(1) 作用：分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物を基質としてそのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する加水分解反応を触媒する
(2) 基質阻害および生成物阻害：200mMまでの基質濃度において基質阻害を受けず且つ400mMまでの生成物濃度において生成物阻害を受けない
(3) 基質特異性：α,α-トレハロース二酸化物に対して加水分解活性を有する
(4) 安定pH：2〜4
(5) 至適pH：3.0〜3.5
(6) 安定温度：40℃以下
(7) 至適温度：40℃
(8)α,α-トレハロース二酸化物に対するKm：7.2mM。
【００２２】
項4. 項1〜3のいずれかに記載の酵素の産生能を有する微生物。以下、この微生物を「本発明微生物」ということがある。
【００２３】
項5. アスペルギルス・ニガーHCB-205 2/28株(Aspergillus niger, FERM P-19191)である項4に記載の微生物。
【００２４】
項6. 項4に記載の微生物を培養し、培養物から項1〜3のいずれかに記載の酵素を採取することを特徴とする該酵素の製造方法。
【００２５】
項7. 微生物が項5に記載の微生物である項6に記載の酵素の製造方法。
【００２６】
項8. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物に項1〜3のいずれかに記載の酵素を作用させて、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断された加水分解物を得ることを特徴とするグルクロニル化合物の製造方法。
【００２７】
項9. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である項8に記載の方法。
【００２８】
項10. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物に項4または5に記載の微生物を作用させて、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断された加水分解物を得ることを特徴とするグルクロニル化合物の製造方法。
【００２９】
項11. 分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物が、α,α-トレハロース二酸化物である項10に記載の方法。
【００３０】
以下、本発明酵素の産生能を有する本発明微生物、本発明酵素およびこれらを利用したグルクロニル化合物の製造につき詳述する。
【００３１】
(1)  本発明微生物
本発明酵素の産生能を有する微生物(本発明酵素生産菌)としては、アスペルギルス(Aspergillus)属に属する真菌類であって、本発明酵素の生産能を有するものを挙げることができる。
【００３２】
アスペルギルス属に属する好ましい真菌株としては、本発明者らが新たに土壌から分離し、「HCB-205 2/28」と命名した菌株および該菌株と同一の菌学的性質を有する本発明酵素産生能を有する微生物を例示することができる。ここで、同一の菌学的性質とは、下記に示す菌学的性質において同一であることを意味し、その他の菌学的性質の一致、不一致は問わない。
【００３３】
アスペルギルス属菌株HCB-205 2/28の菌学的性質は、下記の通りである。尚、本菌株は、平成15年1月24日に、茨城県つくば市東1-1-1  中央第6の「独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター」に、受託番号「FERM P-19191」として寄託されている。
(a). 培養的・形態的性質
本菌株を寒天平板培地に摂取して培養し、生育してくるカビを麦芽エキス寒天平板培地(MEA)およびツアベック・イースト寒天平板培地(CYA)に接種して培養し、生育してくるカビについて、その集落の色調、組織、分生子形成構造などを観察した結果(25℃、7日間培養後)は次の通りである。
(a-1)生育速度：
MEAでは集落の直径4cm、CYAでは集落の直径8cm以上に及ぶ。
(a-2)集落色調：
集落表面の色は、MEAでは黒色、CYAでは灰緑色である。集落裏面の色は、MEAでは無色、CYAでは淡黄緑色である。
(a-3)分生子柄：
分生子柄は透明、滑面である。
(a-4)頂のう：
頂のうは球形で、全体がメトレを伴うフィアランドで覆われている。
(a-5)分生子：
分生子は球形で、粗面(褐色)である。
(b). 生理学的・分類学的性質
(b-1)安定pH：2.8〜7.0
(b-2)至適pH：4〜5
(b-3)安定温度：8〜46℃
(b-4)至適温度：25〜35
(b-5)その他の特徴：
特に、本発明酵素の産生能を有する点において特徴づけられる。
【００３４】
以上の菌学的性質を有する本菌株について、宇田川俊一著「防菌防黴」19, p.489(1991)：宇田川俊一著、松田良夫監訳「食品菌類ハンドブック」(1984)医歯薬出版)：宇田川俊一、椿啓介他著「菌類図鑑」(1978)講談社：K.Raper, D.Fennell, "The genus Aspergillus", p.293(1973)：M.B.Ellis, "Dematiaceous Hyphomycetes", p.547(1971)などを参考にしてその同定を行った結果、本菌株はアスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)に属すると同定された。しかるに、従来アスペルギルス属に属する菌について、本発明酵素産生能は報告されておらず、従って、本発明者は、この菌株をアスペルギルス ニガーの新菌株と認定し、アスペルギルス属菌株HCB-205 2/28と命名した。
【００３５】
(2)  本発明微生物の培養(本発明酵素の単離、精製)
本発明微生物を利用して本発明酵素を製造するためには、当該微生物を適当な培地に接種し、常法に従って培養すればよい。
【００３６】
培地としては当該微生物が生育し、酵素を生産することができる適当な炭素源、窒素源、無機塩などを含有する合成培地または天然培地が用いられる。炭素源としては、例えばグルコース、マルトース、キシロース、スクロース、デンプン、フスマ、パガス、コーヒー粕などが例示できる。窒素源としては、例えばイーストエキス、ペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、大豆抽出物、グルタミン酸などのアミノ酸類などの有機窒素または硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素が例示できる。無機塩としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩類、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどのリン酸塩類、塩化カリウムなどのカリウム塩類、塩化ナトリウムなどのナトリウム塩類、塩化カルシウムなどのカルシウム塩類などが例示できる。これらの各成分は、それぞれ1種単独でまたは2種以上を適宜組み合わせて使用することができる。
【００３７】
培地pHは、通常3〜8、好ましくは4〜6の範囲とすることができる。これは適当な酸またはアルカリを加えることにより調整できる。培養温度は、微生物の生育温度範囲内であればよく、一般には約10〜50℃、好ましくは約25〜40℃の範囲から選ぶことができる。この温度条件下で約20〜170時間、好気的に振とう培養、通気撹拌培養、静置培養などを行うことによって、目的とする本発明酵素が産生される。
【００３８】
特に好ましい培養方法としては、例えば小麦ふすまなどの培養原料を110〜130℃で15〜120分間高圧蒸気滅菌後、冷却し、これに種菌としての本発明微生物を添加混合し、混合物を製麹装置などの中で25〜40℃で2〜7日間培養する方法を例示することができる。
【００３９】
上記培養によって、培養物中に著量の本発明酵素が生産される。培養物からの培養液と菌体との分離は、従来から行われている各種の方法、例えば遠心分離法、濾過法などの方法、好ましくは遠心分離法に従うことができる。得られる培養液乃至培養濾液は、そのまま本発明酵素の粗酵素液とすることができる。また、本発明酵素は菌体内にも蓄積されている。該菌体内酵素は、常法に従って、例えば超音波による菌体破砕、ガラス・ビーズとともに回転させるダイノミル細胞破砕機による菌体破砕、リゾチームなどの酵素や、トルエンなどの有機溶媒による細胞膜の破壊などの方法によって、菌体から抽出することができる。
【００４０】
上記で得られる粗酵素液は、更に必要に応じて精製することができる。この精製は、公知の方法、例えば限外濾過膜を利用した脱塩法、濃縮法、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、DEAE-セファデックス、ブチルトヨパールなどを利用した吸着溶出法、セファデックス、トヨパールなどを利用したカラム分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法、アフィニティクロマトグラフィーなどに従って実施することかできる。また、これらの精製法は適宜組み合わせて実施することもできる。
【００４１】
より具体的には、本発明酵素は、例えば、前記培養方法に従い得られる培養物に水を加えて酵素を抽出し、次いで得られる粗酵素液を除菌濾過、限外濾過濃縮または減圧濃縮し、最終的にアルコール沈殿、濾過、真空乾燥、噴霧乾燥などを行うことにより原末として得ることができる。
【００４２】
また、本発明酵素（粗酵素液及び精製品）は、これを常法に従って適当な固定化担体に固着あるいは包括して、固定化酵素の状態とすることもできる。
【００４３】
(3)  本発明酵素
前記項(2)に従って得られる本発明酵素は、以下の特徴を有している。
(a)作用：分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する化合物を基質として、そのα,α-1,1-グルクロニル結合を切断する反応を触媒する。
(b) 基質阻害および生成物阻害：200mMまでの基質濃度において基質阻害を受けず且つ400mMまでの生成物濃度において生成物阻害を受けない。例えば、基質として200mMのα,α-トレハロース二酸化物を含む100mMの酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH3.5)中に、本発明酵素を0.01U/mLとなるように加えて、30℃で反応させると、72時間後にはα,α-トレハロース二酸化物は完全に加水分解され、全てグルクロン酸になる。
(c)基質特異性：α,α-トレハロース二酸化物に対して加水分解活性を有する。即ち、α,α-トレハロース二酸化物(O-α-D-グルクロニル(1→1)α-D-グルクロニド)に作用して、D-グルクロン酸およびD-グルクロノラクトンを生成する。
【００４４】
蔗糖二酸化物(O-α-D-グルクロニル(1→2)β-D-フラクツロニド)には作用しない。
【００４５】
PNP-α-グルクロニドには作用しない。
(d)安定pHおよび至適pH：図1および図2に示すとおり、pH2〜4で安定であり、至適pHは3.0〜3.5である。尚、図1における残存活性の測定は次の通り行った。
【００４６】
即ち、0.1U/mLの酵素液200μLに、1M酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH1.0, 2.0, 3.0または4.0)または1M酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH4.0, 5.0または5.5)の各200μLおよび脱イオン水1.6mLを加え、30℃で24時間放置後、各pHで処理した後の酵素液(10μL)に、1M酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH4.0)20μL、脱イオン水130μLおよび100mMトレハロース二酸化物(100mM酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH4.0)を含む)40μLを加え、pH4.0、40℃で2.5時間反応させて、α-グルクロニダーゼ活性を後記力価の測定法に従い測定し、処理前の該活性を基準(100％)として、処理後の活性の割合(百分率)を残存活性として算出した。
【００４７】
また、図2における相対活性の測定は次の通り行った。即ち、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液および酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液のそれぞれを用いてpHを1.0, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.2, 5.0および5.5に調整した各液中に、終濃度で酵素0.01U/mLを添加し、酵素活性を後記力価の測定法に従い測定し、pH3.5における測定値を基準(100%)として各pHにおける酵素活性の相対値を相対活性として算出した。
【００４８】
各図中、黒丸印は、酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液および黒三角印は酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液を示す。
(e) 安定温度および至適温度：図3および図4に示すとおりであり、安定温度は30℃以下であり(図3参照)、至適温度は40℃である(図4参照)。
【００４９】
尚、図3における残存活性の測定は、次の通り行ったものである。即ち、0.1U/mL酵素液10μL、1M酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH3.0)20μLおよび脱イオン水150μLを混合し、終濃度で酵素0.01U/mLおよび酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液100mMとなるように調製した酵素液を、4, 30, 40, 50および60℃で24時間処理し、その後、100mMトレハロース二酸化物20μLを加えて、40℃で15分間酵素反応を行い、ソモギーネルソン法で残存酵素活性を測定し、処理前の該活性を基準(100％)として、処理後の活性の割合(百分率)を残存活性として算出した。
【００５０】
また、図4における相対活性の測定は、次の通り行ったものである。即ち、0.1U/mL酵素液20μL、100mMトレハロース二酸化物20μL、1M酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH3.0)20μLおよび脱イオン水140μLを混合し、終濃度で酵素0.01U/mL、トレハロース二酸化物10mMおよび酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液100mMとなるように調製した反応液を、20, 30, 40, 50および60 ℃で15分間反応させ、ソモギ−ネルソン法で活性測定を行い、最も高い活性を示した40℃における活性を100%として、相対活性を求めた。
(f)失活条件：
100℃で5〜10分間の加熱により失活する。また、pH1以下またはpH10以上のpH条件下では数分間で失活する。
(g)力価の測定法：
本酵素のα,α-1,1-グルクロニル結合の加水分解活性の測定には、基質としてα,α-トレハロース二酸化物を用い、本酵素を作用させた後に生じる還元力を、ソモギーネルソン法により測定することで行った。即ち、0.1Mα,α-トレハロース二酸化物20μLに酵素液20μLを加え、40℃で15分間保温する。これにソモギ液0.2mLを加えて反応を停止させ、10分間煮沸した後、流水下で冷却しネルソン液0.4mLを加え混和する。15分後、水3.4mLを加えて希釈し、660nmにおける吸光度を測定する。活性の1単位は、この条件下で1分間2μMのグルクロン酸を遊離する酵素量と定義する。
(h)精製方法：塩析、溶媒沈殿、カラムクロマトグラフィー(イオン交換、ゲル濾過、疎水性クロマト)により精製できる。
(i)α,α-トレハロース二酸化物に対するKm値：α,α-トレハロース二酸化物160μL（反応時の終濃度：25mM, 50mM, 100mMおよび200mM）に、1M酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液(pH3.0)20μLおよび希釈した酵素液20μL(0.19U/mL, 0.33U/mLまたは0.72U/mL)を加え、40℃で10分間反応させ、生成する還元糖量をソモギーネルソン法により測定した。基質濃度、反応速度のHanes-WoolfプロットからKm値を算出した。本酵素のα,α-トレハロース二酸化物に対するKm値は、7.2mMであった（図5参照）。
【００５１】
(4) 微生物の利用によるグルクロニル化合物の製造
本発明酵素産生能を有する微生物は、これを触媒として利用して、分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有するグルクロニル化合物から、該α,α-1,1-グルクロニル結合を切断された加水分解物を製造することができる。この方法は、本発明微生物を例えば水などの適当な溶媒中で原料グルクロニル化合物と接触させ、一定温度で一定時間インキュベートすることによって実施することができる。
【００５２】
ここで原料グルクロニル化合物としては、分子内にα,α-1,1-グルクロニル結合を有する限り特に制限はない。その具体例としては、α,α-トレハロース二酸化物を挙げることができる。
【００５３】
原料化合物と微生物との接触による加水分解反応は、一般には、微生物の生育およびこれによる酵素の産生および該酵素の作用に適した条件下で実施することができる。該条件としては、例えば20〜30℃程度の温度、3〜8程度のpHおよび約20〜96時間の反応時間を挙げることができる。上記pH条件は、例えば塩酸、水酸化ナトリウムなどの適当な酸またはアルカリを用いて、またリン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの適当な緩衝液を利用して適宜調整することができる。
【００５４】
所望の加水分解反応物は、該化合物の物理化学的性質を利用して、反応系内より常法に従い単離、精製することができる。その単離、精製法には、例えば、濾過、抽出、分液、分別沈澱、透析、蒸留などの方法を採用することができる。更に目的化合物の高純度精製方法としては、例えば、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、蒸留、結晶化などの各種方法を単独でまたは適宜組合わせて適用することができる。
【００５５】
(5) 酵素の利用によるグルクロニル化合物の製造
本発明酵素を用いてグルクロニル化合物を製造するためには、例えば、原料とする化合物100〜500mMを含む水溶液に、本酵素液（精製酵素または粗酵素）を0.005〜5.0U/mL添加し、pH2〜5、温度20〜40℃にて1〜96時間程度酵素反応を行うことができる。かくして本発明方法によれば、高収率で所望の加水分解されたグルクロニル化合物を得ることができる。尚、上記反応系には、適当な緩衝液、各種アルコール類、アセトニトリル、アセトンなどを添加することも可能である。また、pH調整剤として酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、水酸化カリウムなどの適当な酸またはアルカリを添加することもできる。
【００５６】
より詳しくは、例えばα,α-1,1-グルクロニル結合を含むウロン酸類およびグルクロニド（ウロン酸配糖体）に本発明酵素を作用させることによって、D-グルクロノラクトン乃至D-グルクロン酸を製造することができる。この場合、α,α-トレハロース二酸化物のようなウロン酸100〜500mMに本発明酵素0.005〜5.0単位/mLを加え、20〜40℃で1〜96時間反応させる。このときに用いる溶媒としては、原料が溶解するものであればよく、例えば水、適当な緩衝液、各種低級アルコール、アセトニトリル、アセトンなど、これらの混合溶液が使用できる。反応時には、必要に応じて加温、攪拌、pHコントロ−ルなどを行うこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本発明を実施例によって詳しく説明する。
【実施例１】
【００５８】
(1)  微生物の培養
廃水処理場、焼却炉、畑、公園などから任意に採取した土壌64サンプルから、α,α-トレハロース二酸化物を唯一炭素源とする最小寒天培地にてα,α-1,1-グルクロニル結合を加水分解する活性を有する微生物をスクリーニングした。得られた微生物を小麦ふすま培地で30℃で5日間培養し、α,α-1,1-グルクロニル結合を加水分解する活性の最も高い微生物として、HCB-205 2/28株(FERM P-19191)を得た。
【００５９】
上記菌株をポテトデキストロース寒天培地で生育させ、予め120℃で20分間殺菌した麦汁培地30mLを入れた坂口フラスコ(内容500mL)中に接種した。接種後、30℃で3日間振盪培養を行って得られた菌を、予め殺菌したジャーファーメンター中の麦汁培地10L中に接種し、30℃で2日間通過撹拌培養した。更に、得られた菌を、予め殺菌した2000L容シードタンク（麦汁培地1000L）に植菌し、30℃で1日間通気撹拌培養して、本培養用種菌を調製した。
【００６０】
上記で調製した種菌を、殺菌の後冷却された培養原料に添加混合し、混合物を製麹装置に分注し、20-40℃で2-7日間培養した。培養終了後、抽出缶に得られた麹を分注し、水道水を加えて酵素を抽出して粗酵素液を得た。該粗酵素液を除菌濾過するかまたはそのまま、限外濾過濃縮または減圧濃縮後、アルコール沈殿、濾過、真空乾燥または噴霧乾燥して、酵素原末を調製した。
【００６１】
(2)産生された酵素の単離、精製
上記(1)で培養した菌体を水に懸濁し、本酵素を抽出し、抽出酵素に硫安分画を行い、硫安0.4〜0.8飽和で沈殿する画分を回収した。回収物を少量の酢酸緩衝液(pH3.5)に溶解し、限外濾過にて脱塩・濃縮し、10mM酢酸緩衝液(pH4.0)で平衡化したSP-Toyopearlカラム（東ソー社製）にかけ、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。同様にして、濃縮した残渣をSephacryl S-100 (Amersham Biosciences)を用いてゲル濾過し、Butyl-Toyopearl 650M (東ソー社製)を用いて疎水性クロマトグラフィーを実施して、 精製酵素標品を得た。
【００６２】
以下の実施例においては、この精製された酵素(本発明酵素という)を用いた。
【００６３】
(3)酵素の性質
(3-1)  本酵素は、前記(3)項の(a)-(i)に記載した性質を有するものであった。
【００６４】
(3-2)  α-グルクロニダーゼ活性
本酵素のα-グルクロニダーゼ活性を以下の方法に従い求めた。即ち、終濃度で10mMとなる量のα,α-トレハロース二酸化物および100mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH3.0)を含む溶液に、1.5重量％となる量の本発明酵素試料（比較のため市販酵素剤）を溶解させ、40℃で2時間反応させた。本発明酵素を利用して得られた反応液については、この時点でHPAEC-PAD (High performance anion exchange chromatography; 陰イオン交換カラムと電気化学検出器を用いた高速液体クロマトグラフィ)分析によって著量のグルクロン酸の生成が確認された。
【００６５】
尚、HPAEC分析は、ダイオネクス社製糖質分析装置DX-5000システムを用いて以下の条件で実施した。
【００６６】
カラム：Carbopac PA-1
溶出および溶離液：100mM水酸化ナトリウムを含む酢酸ナトリウムの濃度勾配溶出(150mMから300mM)
流速：1.0mL/分
温度：40 ℃
検出器：電気化学検出器ED-40
検出モード：インテグレーテッドアンペロメトリ
市販酵素剤を利用して得た反応液では同一分析においてグルクロン酸の生成は確認できなかったため、更に反応時間を24時間に延長して酵素反応を行わせた。得られた反応液を100℃で5分間加熱して酵素を熱失活させた後、脱イオン水で500倍に希釈し、孔径40μmの酢酸セルロースフィルターで濾過し、HPAEC-PAD分析に供した。
【００６７】
得られた結果を図6に示す。図6は、HPAEC-PAD分析チャート(横軸：保持時間(分)、縦軸：信号強度)であり、図中、「本酵素」は本発明酵素の2時間後の分析結果、「AC10」は市販酵素(「セルロシンAC-10」、上田化学工業株式会社製)の24時間後の分析結果（以下「AC10」もしくは「セルロシンAC10」と略記する）および「ナガセ」は市販酵素(「セルレースナガセ」、ナガセ生化学工業株式会社製)の24時間後の分析結果（以下「ナガセ」もしくは「セルレースナガセ」と略記する）をそれぞれ示す。尚、グルクロン酸のピークを「GlcUA」として表示する。
【００６８】
図６から、次のことが判る。即ち、市販酵素剤AC-10では、微量のグルクロン酸の生成を認めた。市販酵素剤「セルロシンAF-10」(上田化学工業株式会社製)は、同一試験においてAC-10とほぼ同様の結果を示した(図示せず)。また、市販酵素剤ナガセは、AC10よりも更に微少のグルクロン酸を生成した。これらに対して、本発明酵素では、反応時間2時間で、前記市販酵素剤(反応時間24時間)の場合の数十倍のグルクロン酸を生成することが明らかとなった。
【００６９】
これらのグルクロン酸生成量から、各酵素の活性（α-グルクロニダーゼ活性）を対比したところ、本発明酵素の活性を100として、AC10およびAF-10の比活性はそれぞれ0.22であり、ナガセの比活性は0.16と算出された。このことから、本発明酵素は、α,α-1,1-グルクロニル結合を切断する酵素としては、卓越した酵素活性を有することが明らかである。
【００７０】
(3-3)  基質阻害および生成物阻害
本発明酵素を、100、200および300mMのα,α-トレハロース二酸化物に下記条件で作用させ、得られる反応液中のα,α-トレハロース二酸化物量および生成グルクロン酸量を経時的に測定して、分解率を算出した。
【００７１】
即ち、終濃度で100mM、200mMおよび300mMとなる量のα,α-トレハロース二酸化物のそれぞれと、100mM酢酸ナトリウム−塩酸緩衝液(pH3.5)とを含む基質溶液に、12.5重量％となるように本発明酵素を加え、30℃で72時間反応させた。その間、数回反応液をサンプリングし、反応液組成を分析した。分析は、サンプリングした反応液を100℃で5分間加熱して酵素を失活させた後、脱イオン水で500倍に希釈し、更に基質および生成物濃度に応じて25-50倍に希釈し、孔径40μmのフィルターで濾過後、濾液100μLを採りHPAEC-PAD分析することにより実施した。
【００７２】
得られた結果を図7および8に示す。図7は、横軸に反応時間（h）をとり、経時的に原料基質の濃度(mM)および生成グルクロン酸濃度(mM)をプロットしたグラフである。図中黒塗りのプロットは生成グルクロン酸濃度であり、白抜きのプロットは基質濃度(mM)であり、丸印は基質初濃度300mMの場合、三角印は基質初濃度200mMの場合、および四角印は基質初濃度100mMの場合をそれぞれ示す。
【００７３】
図7から、基質初濃度が100mMの場合、反応24時間で基質は完全に加水分解されて全てグルクロン酸になることが判る（図中、四角印参照）。基質初濃度が200mMの場合、反応72時間で同様に基質は完全に加水分解されてグルクロン酸になることが判る（三角印参照）。また、基質濃度300mMの場合、反応72時間では尚若干の基質が残存するが、この基質は更に反応を続けることにより減少する傾向を示すこと（プラトーに達していないこと）が判る。
【００７４】
図8は、上記図7に示す基質濃度および生成物濃度から、基質の分解率(%)を求めたグラフ（横軸：反応時間(h)、縦軸：分解率(%)）である。該図から、基質濃度100mMおよび200mMの場合、いずれも72時間の試験時間内に分解率100%が達成できることが判る。また、基質濃度300mMの場合、設定した試験時間72時間での分解率は87%であった（このときのグルクロン酸濃度は図7から約520mMである）が、その後も分解反応は進行することが明らかであり、この試験条件下で本発明酵素は実質的に基質阻害および生成物阻害を受けず、基質とするα,α-トレハロース二酸化物の完全加水分解が可能であることが明らかとなった。
【００７５】
(3-4)酵素蛋白質の安定性および菌体外酵素
本発明酵素は、本酵素産生微生物から遊離させた際にも、pH2〜4、30℃以下の条件では24時間後もほぼ100％の活性を保持しており、空気(酸素)との接触による酸化失活はなく、微生物体からの遊離による失活は実質的に認められなかった。
【００７６】
また、本酵素は、硫安分画、有機溶媒沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーなどの通常の単離、精製操作によって単離することができる。
【実施例２】
【００７７】
本発明酵素を利用したグルクロニル化合物の製造
α,α-トレハロース二酸化物0.265mM(0.1g)に本発明酵素(2.0U/mL)を加え、30℃で20時間反応させた。なお、反応を行うにあたり、クエン酸緩衝液(pH4.0)を溶媒として用いた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、濃縮物をバイオゲル(Biogel P-2, Bio-rad社)を用いたゲル濾過カラムにかけ、同緩衝液で溶出後、凍結乾燥して、目的物95.1mgの白色粉末を得た。
【００７８】
上記凍結乾燥前の生成物についてマススペクトル分析を行った結果、m/Z=240 (M+2Na)のピークを確認した。このことから、目的物の分子量は194であると推定された。この分子量はグルクロン酸の式量C6H10O7に一致した。
【００７９】
また、調製した試料(上記ゲル濾過後に凍結乾燥を行った標品)を重水に溶解し、3-トリメチルシリルプロパンスルホン酸を内部標準に用いて13C-NMR分析(75MHz, D2O)を行い、D-グルクロン酸標品の同条件下での分析結果およびD-グルクロン酸についてのH-NMR分析結果(文献データ)と比較した。その結果、以下のシグナルの帰属が確認され、酵素反応による生成物はD-グルクロン酸であると同定された。
179.6ppm;C6β
178.6ppm; C6α
98.6ppm; C1β
94.8ppm; C1α
78.9ppm; C3β
78.3ppm; C5β
76.7ppm; C2β
75.2ppm; C3α
74.8ppm;C4α
74.5ppm; C4β
74.5ppm; C2α
74.0ppm; C5α
上記反応の結果から明らかなとおり、0.1g(0.265 mM)のα,α-トレハロース二酸化物から95mg(0.48 mM)のD-グルクロン酸が得られ、そのモル収率は90.6％であった。
【実施例３】
【００８０】
α,α-トレハロース二酸化物26.5mM(10g)に本発明酵素(2.0U/mL)を加え、30℃で24時間反応させた。なお、反応を行うにあたり、クエン酸緩衝液(pH4.0)を溶媒として用いた。反応終了後、反応液に活性炭を投入し撹拌静置後、活性炭を濾別することにより脱臭、脱色し、かくして得られる液を濃縮し、濃縮物を噴霧乾燥して、目的物の白色粉末9.7gを得た。
【実施例４】
【００８１】
α,α-トレハロース二酸化物26.5mM(10g)に本発明酵素(2.0U/mL)を加え、30℃で24時間反応させた。なお、反応を行うにあたり、クエン酸緩衝液(pH4.0)を溶媒として用いた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、イオン交換樹脂カラムにかけ、塩酸溶液で溶出して生成物を単離、精製し、凍結乾燥して、目的物の白色粉末9.4gを得た。
【実施例５】
【００８２】
α,α-トレハロース二酸化物0.265M(100g)に本発明酵素(20U/mL)を加え、30℃で72時間反応させた。なお、反応を行うにあたり、クエン酸緩衝液(pH4.0)を溶媒として用いた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、溶液を90℃に加熱し、脱水した。その後、種となるD-グルクロノ-6,3-ラクトン結晶を加え、穏やかに冷却して、目的物結晶87gを得た。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により提供されるα,α-1,1-グルクロニル結合切断活性を有する酵素は、特に、酸化トレハロースを原料としてD-グルクロン酸乃至D-グルクロノラクトンを製造する技術に有利に利用でき、効率よく高収率で目的物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明酵素のpH安定性を示すグラフである。
【図２】本発明酵素の至適pHを示すグラフである。
【図３】本発明酵素の温度安定性を示すグラフである。
【図４】本発明酵素の至適温度を示すグラフである。
【図５】本発明酵素のα,α-トレハロース二酸化物に対するKm値を求めたグラフである。
【図６】本発明酵素を利用して得られるグルクロン酸の生成量から本酵素の相対活性を求めたグラフである。
【図７】本発明酵素を利用して基質を加水分解した時の経時的基質濃度および生成物濃度を求めたグラフである。
【図８】本発明酵素を利用して基質を加水分解したときの経時的基質分解率を求めたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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