(57)【要約】      （修正有）【課題】  PSA由来のHLA-A24結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むCTLの誘導剤などを提供する。【解決手段】  特定の９種類から成るアミノ酸配列のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチン、前記ペプチドの抗体、さらに前記ペプチドを製造する方法等を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：１）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：２）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：３）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：４）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：５）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：６）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：７）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：８）、および
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：１０）
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有するペプチド。
【請求項４】
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１および２に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：３および４に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項６】
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：５および６に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：７および８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１０に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号：１６〜５１のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３記載のペプチド。
【請求項１０】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列からなる、請求項３〜９いずれか記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１および２に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：３および４に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：５および６に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：７および８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１０に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１６〜５１に記載のアミノ酸配列、のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１０記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列をコードする、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２または１３記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項１９】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項１８記載の抗原提示細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項２１】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項２０記載のＣＴＬ。
【請求項２２】
請求項１〜１１いずれか記載のペプチド、請求項１４記載の発現ベクター、請求項１５記載の細胞、請求項１８または１９記載の抗原提示細胞、あるいは請求項２０または２１記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項２３】
ＣＴＬの誘導剤として使用される、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌ワクチンとして使用される、請求項２２記載の医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１１いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマー。
【請求項２６】
請求項２５記載のＨＬＡテトラマーを含有する癌ワクチンの効果の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性癌抗原ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体による癌細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性T細胞（以下ＣＴＬと呼ぶ）が重要な働きをしている。ＣＴＬは、癌やウイルス等に由来する抗原タンパク質のペプチド断片と細胞表面のＭＨＣクラスI分子（ヒトの場合はＨＬＡと呼ばれる）により形成された複合体をT細胞レセプターで認識して、癌細胞やウイルス感染細胞等を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生して免疫系を活性化する。ＭＨＣクラスI分子と複合体を形成するペプチド断片は抗原ペプチドと呼ばれ、通常８から１1アミノ酸程度の長さである。ＣＴＬが認識する癌抗原タンパク質としては、非特許文献１のtable1に記載のものが代表例として挙げられる。具体的にはメラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、およびチロシナーゼなどのメラノソーム抗原が挙げられ、またメラノーマ以外の癌抗原タンパク質としては、HER-2/neu、ＣＥＡ、およびＰＳＡ（非特許文献２を参照）などの腫瘍マーカー、あるいは扁平上皮癌由来のＳＡＲＴ−１やサイクロフィリンＢなどが挙げられる。これらの癌抗原タンパク質、癌抗原ペプチド及びこれらをコードするDNA、さらにはウイルス由来の抗原タンパク質や抗原ペプチドを投与して、生体内の特異的なT細胞を増強させる、いわゆるワクチン療法は、癌やウイルス感染症等の治療や予防において有用であると考えられている。実際、メラノーマ、肺癌、頭頚部癌などで過剰に発現する癌抗原タンパク質ＭＡＧＥ−３由来の抗原ペプチドを用いた臨床結果からも、腫瘍排除におけるワクチン療法の重要性が示唆されている（非特許文献３を参照）。
【０００３】
ＰＳＡは正常な前立腺上皮細胞においても特異的に発現する糖タンパク質であるが、癌化に伴い発現量が増強して癌抗原タンパク質となり、癌の診断マーカーとして利用されている（患者血清中のＰＳＡ値を測定）。前立腺癌は欧米諸国では発生率、死亡率ともに男性悪性腫瘍の第１〜３位を占め、また近年我が国においても増加傾向を認める。前立腺癌はアンドロゲン感受性癌であることより、アンドロゲン除去を目的とした治療法（内分泌療法）が施行されている。しかし前立腺癌は、内分泌療法に対して治療開始時に反応して制癌されていても、５年後には半数以上の症例が再燃癌、すなわちアンドロゲン不応性癌へと移行する。このアンドロゲン依存性喪失は前立腺癌の内分泌治療における大きな障害になっている。このような背景から、ＰＳＡ由来の癌抗原ペプチドを用いたワクチン療法の開発が望まれている。ＰＳＡ由来の癌抗原ペプチドに関しては、HLA-A2に結合性を有する抗原ペプチド（非特許文献４を参照）、HLA-A24に結合性を有する抗原ペプチド（特許文献１および非特許文献５を参照）が幾つか知られている。
【０００４】
【特許文献１】WO 02/47474 号公報
【非特許文献１】Immunity, vol.10:281, 1999
【非特許文献２】J.Natl.Cancer.Inst., 89:293, 1997
【非特許文献３】Int.J.Cancer.,80:219,1999
【非特許文献４】J.Natl.Cancer.Inst., 89:293, 1997
【非特許文献５】Int J. Cancer:100,565-570 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、PSA由来のHLA-A24結合性癌抗原ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、癌免疫療法において癌ワクチンとして臨床適応出来るPSA由来のHLA-A24結合性癌抗原ペプチドにつき、鋭意検討を行った。HLA-A24抗原に結合すると予測されるペプチド配列には規則性(モチーフ）があることが知られており、近年、これらの規則性に基づき、HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、例えばNIHのBIMASのソフト（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ）等を使用することにより検索することができる。しかしながらヒットするペプチドの数は膨大であり、またスコアの高いものほど活性が強いということは無い。
【０００７】
本発明者は、従来in vivoでのアッセイを行ってきた種々の癌抗原ペプチドにおける経験則に基き、PSA由来の10種類のペプチド（天然型ペプチド5種、その第2位のチロシンへの改変型ペプチド5種、配列番号：１〜10）を選択した。これら選択したペプチドによりHLA-A24発現トランスジェニックマウス（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）を免疫し、in vivoでのCTL誘導能を測定した。その結果、1つのペプチド（配列番号：9）を除いた全てのペプチドが良好なCTL誘導活性を示すことが明らかとなった。この新たな知見により、HLA-A24陽性の癌患者に対してPSA特異的なCTLを誘導することのできる新たな癌ワクチン療法が可能となった。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち本発明は、
（１）  以下のアミノ酸配列：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：１）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：２）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：３）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：４）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：５）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：６）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：７）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：８）、および
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：１０）
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、
（２）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、前記（１）記載のペプチド、
（３）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有するペプチド、
（４）  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１および２に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、前記（３）記載のペプチド、
（５）  配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：３および４に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、前記（３）記載のペプチド、
（６）  配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：５および６に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、前記（３）記載のペプチド、
（７）  配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：７および８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、前記（３）記載のペプチド、
（８）  配列番号：１５に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１０に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含む、前記（３）記載のペプチド、
（９）  配列番号：１６〜５１のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含む、前記（３）記載のペプチド、
（１０）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列からなる、前記（３）〜（９）いずれか記載のペプチド、
（１１）  配列番号：１１に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１および２に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：３および４に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：５および６に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：７および８に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：１０に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：１６〜５１に記載のアミノ酸配列、のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、前記（１０）記載のペプチド、
（１２）  前記（１）〜（１１）のいずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（１３）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列をコードする、前記（１２）記載のポリヌクレオチド、
（１４）  前記（１２）または（１３）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（１５）  前記（１４）記載の発現ベクターを含有する細胞、
（１６）  前記（１５）記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、前記（１）〜（１１）のいずれか記載のペプチドの製造方法、
（１７）  前記（１）〜（１１）のいずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
（１８）  前記（１）〜（１１）のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、
（１９）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（１８）記載の抗原提示細胞、
（２０）  前記（１）〜（１１）のいずれか記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
（２１）  配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８および１０のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（２０）記載のＣＴＬ、
（２２）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のペプチド、前記（１４）記載の発現ベクター、前記（１５）記載の細胞、前記（１８）または（１９）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（２０）または（２１）記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
（２３）  ＣＴＬの誘導剤として使用される、前記（２２）記載の医薬組成物、
（２４）  癌ワクチンとして使用される、前記（２２）記載の医薬組成物、
（２５）  前記（１）〜（１１）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原とを含有するＨＬＡテトラマー、ならびに
（２６）  前記（２５）記載のＨＬＡテトラマーを含有する癌ワクチンの効果の診断薬、に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、PSA由来のHLA-A24結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むCTLの誘導剤などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、HLA-A24陽性の多くの癌患者に適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（Ｉ）本発明のペプチド
本発明のペプチドは、ヒトPSA（Biochem. Biophys. Res. Commun., 160:903, 1989、NCBIデータベースAccession No. M26663）に由来し、イン・ビボでHLA-A24拘束性のCTL誘導活性（免疫原性）を有する。
本発明のペプチドは、抗原提示細胞に提示されて、イン・ビボにてHLA-A24抗原拘束性にCTLを誘導するという特性を有するものである。当該特性は、HLA-A24モデルマウス（HLA-A24発現トランスジェニックマウス； WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）を用いることにより調べることができる。
【００１１】
配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、本発明ペプチド由来の癌抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTLを誘導するという特性を有する限り、何ら制限されないが、その長さは通常9〜100個、好ましくは9〜50個、より好ましくは9〜30個、さらに好ましくは9〜20個、そしてさらに好ましくは9〜11個のアミノ酸残基である。ここに、癌抗原ペプチドとは、抗原提示細胞に提示される、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
【００１２】
本発明ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Peptide Synthesis ），Interscience，New York，1966；ザ・プロテインズ（The Proteins），Vol 2 ，Academic Press Inc. ，New York，1976；ペプチド合成，丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第14巻・ペプチド合成，広川書店，1991）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１３】
また本発明のペプチドは、本発明ペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。当該DNA合成や各種プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収などの操作は、当業者に周知の方法、文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))、あるいは後述の（II）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００１４】
以下、本発明のペプチドについてより詳細に説明する。
【００１５】
(1)配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド
本発明は前述のように、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10に示されるPSA由来のペプチドが、イン・ビボにてCTL誘導活性を有するという新たな知見を得たことに基づく。ここで配列番号：1、3、5、7に示されるペプチドはPSA由来の天然型ペプチドであり、配列番号：2、4、6、8、10に示されるペプチドはPSA由来の改変型ペプチドである。
配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10に示される新規なペプチドがイン・ビボにおいてCTL誘導活性を確かに示すという知見は、従来知られていなかった。これらペプチドのいずれかを含む本発明のペプチドは、癌免疫療法におけるCTL誘導剤の有効成分として、また癌ワクチンの有効成分として有用である。
【００１６】
本発明のペプチドは、具体的には以下のアミノ酸配列：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：1）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：2）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：3）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：4）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：5）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：6）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：7）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：8）、および
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：10）のいずれかを含む。
【００１７】
本発明のペプチドとして、より具体的には以下の(1-1)〜(1-3)に挙げるペプチドを例示することができる。
【００１８】
(1-1) 配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド
配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの具体例として、以下に示す癌抗原ペプチドを例示することができる：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：1）からなる癌抗原ペプチド、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：2）からなる癌抗原ペプチド、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：3）からなる癌抗原ペプチド、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：4）からなる癌抗原ペプチド、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：5）からなる癌抗原ペプチド、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：6）からなる癌抗原ペプチド、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：7）からなる癌抗原ペプチド、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：8）からなる癌抗原ペプチド、
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：10）からなる癌抗原ペプチド。
【００１９】
これらのペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またWO 02/47474 号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)に記述のヒトモデル動物に供することによりイン・ビボでのCTL誘導活性を測定することができる。
【００２０】
(1-2) 配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列を含むエピトープペプチド
近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、イン・ビボで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープを連結した約30merのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。
【００２１】
またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にCTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Immunity., 1:751, 1994）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとCTLエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、CTLエピトープ（メラノーマ抗原gp100の第280位〜288位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Tヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024）。
【００２２】
従って、前記(1-1)に記述したような本発明の癌抗原ペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であってイン・ビボでCTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここで、本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがCTLエピトープの場合、用いるCTLエピトープとしては、PSA由来のHLA-A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A24, -A3, -A11, -B53などに拘束性のCTLエピトープが挙げられる。これらCTLエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのCTLエピトープの長さとしては、各種HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics，41:178，1995）、8〜1４アミノ酸程度を挙げることができる。
【００２３】
また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。
【００２４】
本発明のエピトープペプチドとして、より具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上とヘルパーエピトープとを連結させたペプチドを挙げることができる。より具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばPhe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号：52）とを連結させたペプチドや、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上とAla Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu（配列番号：53、Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024）とを連結させたペプチドなどが挙げられる。
【００２５】
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法(Molecular Cloning, T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))や後述の(II)項に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００２６】
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをWO 02/47474 号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)に記載のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのCTL誘導活性を測定することができる。
【００２７】
(1-3) 配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列を含み、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチド
前記(1-1)〜(1-2)に例示したような本発明のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能である。
【００２８】
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
【００２９】
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
【００３０】
(2)配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含むペプチド（改変ペプチド）
前述のように本発明においては、配列番号：1、3、5、7に示されるPSA由来の天然型ペプチド、および配列番号：2、4、6、8、10に示されるPSA由来の改変型ペプチドが、イン・ビボでCTL誘導活性を有するという新たな知見を得た。このようなイン・ビボでのCTL誘導活性を有するペプチドのアミノ酸配列をさらに改変することにより、同等またはそれ以上のCTL誘導活性を有するさらなる改変ペプチドを得ることができる。従って本発明においては、このような配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに示されるペプチドの改変アミノ酸配列を含むペプチド（以下改変ペプチドと称することもある）を提供することができる。
【００３１】
すなわち本発明は、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列を含み、かつHLA-A24拘束性のCTL誘導活性を有するペプチドを提供するものである。
より具体的には、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列中にアミノ酸残基の改変を含有する改変アミノ酸配列からなり、かつHLA-A24拘束性のCTL誘導活性を有するペプチドを提供するものである。
【００３２】
本発明におけるアミノ酸残基の「改変」とは、1個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加を意味し、好ましくは置換である。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数、位置および種類は、イン・ビボでのCTL誘導活性を保持する限り特に限定されない。このような改変アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドの具体例として、以下に挙げるペプチドが例示される。
【００３３】
HLA-A24の結合モチーフとして、8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第2位のアミノ酸がチロシン（Tyr）、フェニルアラニン(Phe)、メチオニン（Met）またはトリプトファン（Trp）であり、C末端のアミノ酸がフェニルアラニン(Phe)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、トリプトファン(Trp)またはメチオニン(Met)となることが知られている（J.Immunol.,152,p3913,1994、Immunogenetics,41,p178,1995、J.Immunol.,155,p4307,1994）。よって、本発明における改変ペプチドでは、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列の第2位および/またはC末端のアミノ酸残基を、前記モチーフ上とり得るアミノ酸残基に置換することが可能である。
具体的には、以下に列挙するアミノ酸配列を含みかつイン・ビボでCTL誘導活性を有するペプチドを挙げることができる（ただし配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）。
【００３４】
Trp Xaa Pro Val Val Phe Leu Thr Xaa（ここで第2位のXaaはVal、Tyr、Phe、MetまたはTrpであり、第9位のXaaはLeu、Phe、Ile、TrpまたはMetである：配列番号11）、
Thr Xaa Ile Gly Ala Ala Pro Leu Xaa（ここで第2位のXaaはTyr、Phe、MetまたはTrpであり、第9位のXaaはLeu、Phe、Ile、TrpまたはMetである：配列番号12）、
Asp Xaa Ser Leu Leu Lys Asn Arg Xaa（ここで第2位のXaaはTyr、Phe、MetまたはTrpであり、第9位のXaaはLeu、Phe、Ile、TrpまたはMetである：配列番号13）、
Lys Xaa Met Leu Cys Ala Gly Arg Xaa（ここで第2位のXaaはTyr、Phe、MetまたはTrpであり、第9位のXaaはLeu、Phe、Ile、TrpまたはMetである：配列番号14）、
Val Xaa Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Xaa（ここで第2位のXaaはTyr、Phe、MetまたはTrpであり、第10位のXaaはLeu、Phe、Ile、TrpまたはMetである：配列番号15）。
【００３５】
より具体的には、前記配列番号：11に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：1および2に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：12に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：3および4に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：13に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：5および6に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：14に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：7および8に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、配列番号：15に記載のアミノ酸配列（ただし配列番号：10に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）、のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつイン・ビボでCTL誘導活性を有するペプチドが挙げられる。
【００３６】
前記置換にかかる本発明の改変ペプチドの好ましい形態として、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列におけるC末端のアミノ酸残基を、前記のモチーフ上とり得るアミノ酸に置換した改変ペプチドを挙げることができる。
【００３７】
すなわち、この態様における本発明の改変ペプチドとして、以下に列挙するアミノ酸配列を含みかつイン・ビボでCTL誘導活性を有するペプチドを挙げることができる：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Phe（配列番号：16）、
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Ile（配列番号：17）、
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Trp（配列番号：18）、
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Met（配列番号：19）、
【００３８】
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Phe（配列番号：20）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Ile（配列番号：21）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Trp（配列番号：22）、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Met（配列番号：23）、
【００３９】
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Phe（配列番号：24）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Leu（配列番号：25）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Trp（配列番号：26）、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Met（配列番号：27）、
【００４０】
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Phe（配列番号：28）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Leu（配列番号：29）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Trp（配列番号：30）、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Met（配列番号：31）、
【００４１】
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Leu（配列番号：32）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Ile（配列番号：33）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Trp（配列番号：34）、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Met（配列番号：35）、
【００４２】
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Leu（配列番号：36）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Ile（配列番号：37）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Trp（配列番号：38）、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Met（配列番号：39）、
【００４３】
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Phe（配列番号：40）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Leu（配列番号：41）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Ile（配列番号：42）、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Met（配列番号：43）、
【００４４】
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Phe（配列番号：44）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Leu（配列番号：45）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Ile（配列番号：46）、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Met（配列番号：47）、
【００４５】
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Leu（配列番号：48）、
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Ile（配列番号：49）、
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Trp（配列番号：50）、
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Met（配列番号：51）。
【００４６】
より具体的には、前記配列番号：16〜51のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりかつかつイン・ビボでCTL誘導活性を有するペプチドが挙げられる。
【００４７】
また、配列番号：7、8、14、40〜47に記載のアミノ酸配列中にはシステイン残基が存在し、それは溶液中にて酸化されてジスルフィド結合を生じる可能性がある。これを避けるには、当該システイン残基を他のアミノ酸残基、例えばアラニン残基やセリン残基などに置換したり、システイン残基と化学構造の類似するα−アミノ酪酸に置換し、改変ペプチドとしたものが挙げられる。
以上に示した改変ペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、WO 02/47474 号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)に記載のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのCTL誘導活性を測定することができる。
【００４８】
以上述べた本発明の改変ペプチドに関しても、前記(1-2)と同様の複数のエピトープを連結させたペプチド、あるいは前記(1-3)と同様のアミノ基もしくはカルボキシル基を修飾したペプチドとすることができる。
【００４９】
以上のような本発明のペプチドは、例えば、1)後述するCTLの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、また2)後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
【００５０】
（II）本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、および形質転換細胞
本発明はまた、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
【００５１】
このような本発明のポリヌクレオチドとしては、以下に示すポリヌクレオチドが例示される：
Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：1）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：2）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：3）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：4）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：5）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：6）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：7）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：8）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：10）を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００５２】
具体的には、例えば前記(1-2)に記述したような配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列を含むエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上とヘルパーペプチドとを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばPhe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号：52）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかのアミノ酸配列の1種または2種以上とAla Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu（配列番号：53、Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-3024）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５３】
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
【００５４】
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００５５】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど）を有するGST融合タンパクベクター（pGEX4Tなど）や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a）などを用いることができる。
【００５６】
以上のような本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターをWO 02/47474 号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)に記載のヒトモデル動物に供することにより、イン・ビボでのCTL誘導活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターは、例えば、1)後述する本発明のペプチドの製造において、2)後述する遺伝子治療において、また3)後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
【００５７】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
【００５８】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００５９】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な（ペプチドの発現可能な）条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリぺプチドを、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
【００６０】
（III）本発明の抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
【００６１】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。
【００６２】
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００６３】
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００６４】
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、PSA遺伝子が発現している癌、例えば前立腺癌や乳癌等の診断において有効である。
【００６５】
（IV）本発明の抗原提示細胞
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりCTL誘導活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された癌細胞を特異的に傷害するCTLが誘導されたことを示すものである。このような、HLA-A24抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（DC療法）において有効に用いられる。
【００６６】
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良いが、具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。
【００６７】
細胞療法において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、HLA-A24抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なHLA-A24抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
【００６８】
本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を体外でパルスし、HLA-A24抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を作製することにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158:p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999)。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM-CSFおよびIL-4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００６９】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載の配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがDNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Immunol.,161: p5607,1998などを参考にして行うことができる。また、DNAのみならずRNAの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができるが、この場合は、 J.Exp.Med., 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
以上のようにして作製された本発明の抗原提示細胞は、後述するCTLの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、細胞療法（DC療法）において有効に用いられる。
【００７０】
（V）本発明のCTL
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体を認識するCTLを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりCTL誘導活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された癌細胞を特異的に傷害するCTLが誘導されたことを示すものである。このような、HLA-A24抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
【００７１】
本発明のCTLは、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとHLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するCTLを挙げることができる。
【００７２】
養子免疫療法において用いられるCTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載の配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669）。
【００７３】
以上のようにして作製された本発明のCTLは、癌ワクチンの有効成分として、養子免疫療法において有効に用いられる。
【００７４】
（VI）癌ワクチンとしての医薬組成物
以上に記載した本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、本発明の発現ベクターを含有する細胞、本発明の抗原提示細胞、および本発明のCTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
【００７５】
(6−1) 本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、CTLの誘導能を有するものであり、誘導されたCTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンをHLA-A24陽性かつPSA陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA-A24抗原にペプチド（例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示されたペプチドとHLA-A24抗原との複合体に特異的なCTLが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、PSA遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば前立腺癌や乳癌の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量をHLA-A24陽性かつPSA陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
【００７６】
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のCTLエピトープを有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194には、PSA由来のHLA-A2, -A3, -A11, B53拘束性CTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約30merのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療または予防が達成される。
【００７７】
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウム如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
【００７８】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００７９】
(6−2) 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とするDNAワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のためのDNAワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明のDNAワクチンの有効量をHLA-A24陽性かつPSA陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
【００８０】
近年、複数のCTLエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925には、HBV由来HLA-A2拘束性抗原ペプチド６種類、HLA-A11拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
【００８１】
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドを癌ワクチン（DNAワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００８３】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチド含有発現ベクターを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で前記発現ベクターを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊, 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo法がより好ましい。
【００８５】
in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ）-リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００８６】
以上のような本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、PSA遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば前立腺癌や乳癌の予防または治療のために使用することができる。
【００８７】
(6−3) 本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（DC療法）が報告されている (Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158:p1796,1997、Cancer Res.,59:p1184,1999、Cancer Res.,56:p5672,1996、J.Immunol.,161: p5607,1998、J.Exp.Med., 184: p465,1996)。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
【００８８】
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、HLA-A24陽性かつPSA陽性の患者の体内で効率良く特異的なCTLが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、PSA遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば前立腺癌や乳癌の予防または治療のために使用することができる。
【００８９】
(6−4) 本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のCTLは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００９０】
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159 、1994）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで癌抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Med.,185:453,1997 ）。これは、抗原提示細胞のHLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のCTLを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
【００９１】
本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチンは、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、HLA-A24陽性かつPSA陽性の患者の体内でCTLによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明のCTLを有効成分とする癌ワクチンは、PSA遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば前立腺癌や乳癌の予防または治療のために使用することができる。
【００９２】
本発明はまた、本発明のペプチドとHLA−A24抗原とを含有するHLAテトラマーを提供する。
ここでHLAテトラマーとは、HLA抗原のα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド（抗原ペプチド）と会合させた複合体（HLAモノマー）をビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーが市販されており（例えば(株)医学生物学研究所）、本発明のペプチドとHLA-A24抗原とを含有するHLAテトラマーを容易に作製することができる。
具体的には、例えば配列番号：1、2、3、4、5、6、7、8および10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA-A24抗原とを含有するHLAテトラマーが挙げられる。
【００９３】
当該HLAテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン（PE）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ペリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP）などにより標識されたHLAテトラマーが挙げられる。
【００９４】
HLAテトラマーの成分であるHLA-A24抗原（HLA-A24抗原のα鎖）は、Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)および Genbank Accession No.M64740に開示されているHLA-A2402の公知の塩基配列の情報に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。
【００９５】
HLAテトラマーの成分であるβ2ミクログロブリンは、ヒト由来のβ2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒトβ２ミクログロブリンは GenBank Acc.No.AB021288 に開示されているヒトβ2ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。
【００９６】
以上のHLAテトラマーの成分を含有するHLAテトラマーの作製法については、文献（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)等）により周知であるが、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA-A24α鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例えばBL21）を用いることが好ましい。得られた単量体HLA-A24複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性のHLA-ペプチド複合体を形成させる。次にHLA-ペプチド複合体におけるHLA-A24α鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4：1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
【００９７】
また本発明は、本発明のHLAテトラマーを含有する癌ワクチンの効果の診断薬を提供する。
本発明のHLAテトラマーを含有する癌ワクチンの効果の診断薬を用いることにより、本発明のペプチド特異的CTLを検出し、癌ワクチンの効果の診断を行うことができる。具体的には、癌ワクチンを投与した被験患者より生体試料（被験試料）を単離し、本発明のHLAテトラマーと前記生体試料とを接触させ、HLAテトラマーに結合した本発明ペプチド特異的なCTLの存在頻度または量を、フローサイトメーター等で測定することにより癌ワクチン投与によりペプチド特異的なCTLが誘導・増強されたかの診断を行うことができる。
【００９８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００９９】
ＰＳＡ由来ＨＬＡ結合候補ペプチド領域の選定
ＰＳＡ（Biochem. Biophys. Res. Commun., 160:903, 1989、NCBIデータベースAccession No. M26663）のアミノ酸配列中のＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ（第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン）若しくはそれに類似する配列の中から、発明者の経験に基き９アミノ酸あるいは１０アミノ酸よりなるＨＬＡ−Ａ２４結合候補ペプチド領域を選定した。即ち、ペプチドＡ（配列番号：１）およびその改変体のペプチドＢ（配列番号：２）、ペプチドＣ（配列番号：３）およびその改変体のペプチドＤ（配列番号：４）、ペプチドＥ:（配列番号：５）およびその改変体のペプチドＦ（配列番号：６）、ペプチドＧ:（配列番号：７）およびその改変体のペプチドＨ（配列番号：８）、ペプチドＩ（配列番号：９）およびその改変体のペプチドＪ（配列番号：１０）である。なお、ペプチドＡはＰＳＡの第２−１０位、ペプチドＣは第１３−２１位、ペプチドＥは第１０２−１１０位、ペプチドＧは第１９４−２０２位、ペプチドＩは第７２−８１位の部分に該当するものである。これらのペプチドはＦｍｏｃ法により合成した。
【０１００】
ペプチドＡ：Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：１）
ペプチドＢ：Trp Tyr Pro Val Val Phe Leu Thr Leu（配列番号：２）
ペプチドＣ：Thr Trp Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：３）
ペプチドＤ：Thr Tyr Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile（配列番号：４）
ペプチドＥ：Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：５）
ペプチドＦ：Asp Tyr Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe（配列番号：６）
ペプチドＧ：Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：７）
ペプチドＨ：Lys Tyr Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp（配列番号：８）
ペプチドＩ：Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：９）
ペプチドＪ：Val Tyr Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe（配列番号：１０）
【実施例２】
【０１０１】
ペプチドワクチンの薬剤調整と投与
実施例１で選定した各々のＨＬＡ−Ａ２４結合候補ペプチドについて、破傷風毒素由来のマウスＭＨＣクラスＩＩのＩ−Ａｂ結合ヘルパーペプチド（FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE、配列番号：52）と共に、ＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウス（WO 02/47474 号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002)）に免疫した。すなわち、DMSOにより各々の合成ペプチドを40mg/mlに、またヘルパーペプチドを20mg/mlに調整し、生理食塩水で2mg/ml及び1mg/mlに希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、等量の不完全フロイントアジュバント（和光純薬株式会社製）と混合することによりwater-in-oilエマルションを作製した。200μlの当該薬剤をトランスジェニックマウスの尾根部皮下に免疫した。
【実施例３】
【０１０２】
脾細胞の調整とイン・ビトロ再刺激
実験開始7日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ACKバッファー（0.15M NH4Cl,10mM KHCO3,0.1mM EDTA,pH7.2-7.4）にて溶血処理した脾細胞の一部に免疫したペプチドを100μg/mlで１時間パルスして0.7×106個／wellで24穴プレートに播種した。このとき、非ペプチドパルスの7×106個／wellの脾細胞を同時に加えて37℃下で再刺激を施行した（ペプチド終濃度1μg/ml）。培養液には、RPMI1640培地に10%FCS、10mM HEPES、20mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、1mM MEM非必須アミノ酸、1%MEMビタミン、55μM 2-メルカプトエタノールを含む培養液（CTM培養液）を10ml用い、イン・ビトロで再刺激した。
【実施例４】
【０１０３】
細胞傷害性試験
イン・ビトロ刺激培養開始５−６日後に常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細胞（T）としてEL4-A2402/Kb 細胞およびペプチドパルスしたEL4-A2402/Kb 細胞を用いた。なお、ここで用いたEL4-A2402/Kb 細胞は、HLA-A2402/Kbをコードする遺伝子（WO02/47474）を発現ベクターpEF1/myc-His A（Invitrogen社）に挿入し、EL-4細胞（ATCC T1B-39)を形質転換して作製したものである。
これらの細胞は1.875MBq/5×105個で51Crラベルし、ペプチドパルスは１００μｇ／ｍｌで１時間実施された（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを添加）。イン・ビトロ刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（E）として、E／T比８０，４０，２０，１０あるいは４０，２０，１０で作用させ、傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイ（J.Immunol., 159:4753, 1997）により測定した。結果を、図１〜図１０に示す。図中、縦軸は細胞傷害性活性（% Specific lysis）を示す。また図中、pep+は標的細胞としてペプチドパルスした細胞を用いた結果を、pep-は標的細胞としてペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【０１０４】
この図から明らかな通り、選定した天然型ペプチドの中ではペプチドＡ、Ｃ、ＥおよびＧが、改変型ペプチドの中ではペプチドＢ，Ｄ，Ｆ，ＨおよびＪが免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有していることが示された。天然型ペプチドＡ、ＥおよびＧは、改変により免疫原性が増強された。一方、天然型ペプチドＩは免疫原性を有さないが、改変によって免疫原性を有するようになった。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、PSA由来のHLA-A24結合性癌抗原ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらペプチドやポリヌクレオチドを含むCTLの誘導剤などが提供される。本発明のCTLの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、HLA-A24陽性の多くの癌患者に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】ペプチドAでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドAをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図２】ペプチドBでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドBをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図３】ペプチドCでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドCをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図４】ペプチドDでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドDをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図５】ペプチドEでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドEをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図６】ペプチドFでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドFをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図７】ペプチドGでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドGをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図８】ペプチドHでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドHをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図９】ペプチドIでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドIをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図１０】ペプチドJでHLA-A24発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的CTL誘導活性を調べた結果を示すグラフである。図中、縦軸は細胞傷害活性（% Specific Lysis）を示し、横軸はE／T比を示す。また黒丸はペプチドJをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【図１】
2005034049.tif 000002
【図２】
2005034049.tif 000003
【図３】
2005034049.tif 000004
【図４】
2005034049.tif 000005
【図５】
2005034049.tif 000006
【図６】
2005034049.tif 000007
【図７】
2005034049.tif 000008
【図８】
2005034049.tif 000009
【図９】
2005034049.tif 000010
【図１０】
2005034049.tif 000011
【配列表】
2005034049000001.app