(57)【要約】【課題】簡便な操作で短時間に核酸増幅物を測定できる手段を提供すること。【解決手段】光学的なシグナルを発する標識と、ある物質に特異的に結合し得る特異結合性物質とが核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅し、液体搬送能を有するマトリックスに、前記工程で得られた核酸増幅物を含む溶液を施し、該溶液を前記マトリックス内で移動させながら前記特異結合性物質と対応特異結合性物質とを結合させ、それによって前記マトリックスの前記対応特異結合性が不動化された部位に前記核酸増幅産物を不動化し、次いで不動化された核酸増幅産物中の前記標識を測定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的なシグナルを発する標識と、ある物質に特異的に結合し得る特異結合性物質とが核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅する第１工程と、前記特異結合性物質と特異的に結合する対応特異結合性物質が不動化された、液体搬送能を有するマトリックスに、前記工程で得られた核酸増幅物を含む溶液を施し、該溶液を前記マトリックス内で移動させながら前記特異結合性物質と対応特異結合性物質とを結合させ、それによって前記マトリックスの前記対応特異結合性が不動化された部位に前記核酸増幅産物を不動化する第２工程と、不動化された核酸増幅産物中の前記標識を測定する第３工程とを含む、標的核酸の測定方法。
【請求項２】
前記第１工程は、前記標識が結合されたオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとして用い、前記特異結合性物質が結合されたオリゴヌクレオチドを他方のプライマーとして用いて核酸増幅法を行うことにより行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記特異結合性物質が、ビオチン、抗原若しくはハプテン、α−Ｄ−グルコース残基若しくはα−Ｄ−マンノース残基を含む糖、免疫グロブリンＧ若しくはその定常領域、レセプターと結合可能なホルモン若しくは薬剤であり、前記対応特異結合性物質が、これらの特異結合性物質とそれぞれ特異的に結合する、アビジン若しくはその誘導体、抗体若しくはその抗原結合性断片、コンカナバリンＡ、プロテインＡ、又は前記ホルモン若しくは薬剤と結合するレセプターである請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記特異結合性物質がビオチンであり、前記対応特異結合性物質がストレプトアビジンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記標識は、蛍光物質又は色素物質である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルミノール又はアクリジウムエステルであり、前記色素物質は、メチレンブルー、メルドラブルー又はメチルオレンジである請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記マトリックスは、セルロース、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロースの濾紙、ポリスチレン、ポリビニール、活性化されたナイロン膜のうちいずれか一つを材質として構成されたものである請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法により複数の標的核酸を同時に測定する方法であって、各標的核酸の増幅産物中に含まれる特異結合性物質が、標的核酸の種類ごとに異なっており、前記マトリックスには、各特異結合性物質に対する対応特異結合性物質がマトリックス上の異なる部位に不動化されており、各部位に不動化された前記標識を測定することにより、複数種類の標的核酸を同時に測定する方法。
【請求項９】
前記マトリックスと、該マトリックス内の一領域であって、前記対応特異結合性物質が不動化された検出領域と、該検出領域よりも上流に位置し、前記核酸増幅物の溶液を施す試料導入部位と、前記検出領域よりも下流に位置し、前記検出領域を通過した後の溶液を吸収する溶液吸収部位とを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の測定方法を行うためのセンサー。
【請求項１０】
前記マトリックスと、該マトリックス内の一領域であって、前記複数種類の対応特異結合性物質が互いに異なる部位に不動化された検出領域と、該検出領域よりも上流に位置し、前記核酸増幅物の溶液を施す試料導入部位と、前記検出領域よりも下流に位置し、前記検出領域を通過した後の溶液を吸収する溶液吸収部位とを含む、請求項８記載の測定方法を行うためのセンサー。
【請求項１１】
前記試料導入部位及び前記溶液吸収部位には、水を吸収するパッドが設けられている請求項９又は１０記載のセンサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の測定方法及びそのためのセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、病原性の微生物やウイルス等の遺伝子の存在を調べたり、型判別を行ったりするため、さらに、各種疾病の遺伝子検査のために、ＰＣＲ等の核酸増幅法が広く行われている。従来の核酸増幅法では、増幅産物を電気泳動にかけ、そのバンドを検出したり、増幅産物と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて増幅産物の検出を行ったりしている。
【０００３】
しかしながら、電気泳動や、プローブとのハイブリダイゼーションは、操作が煩雑で時間もかかるという欠点を有する。
【０００４】
【特許文献１】
特開２０００−６０５７０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便な操作で短時間に核酸増幅物を測定できる手段を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、光学的なシグナルを発する標識と、ある物質に特異的に結合し得る特異結合性物質とが核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅し、液体搬送能を有するマトリックスに、前記工程で得られた核酸増幅物を含む溶液を施し、該溶液を前記マトリックス内で移動させながら前記特異結合性物質と対応特異結合性物質とを結合させ、それによって前記マトリックスの前記対応特異結合性が不動化された部位に前記核酸増幅産物を不動化し、次いで不動化された核酸増幅産物中の前記標識を測定することにより、簡便な操作で短時間に標的核酸の測定が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、光学的なシグナルを発する標識と、ある物質に特異的に結合し得る特異結合性物質とが核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅する第１工程と、前記特異結合性物質と特異的に結合する対応特異結合性物質が不動化された、液体搬送能を有するマトリックスに、前記工程で得られた核酸増幅物を含む溶液を施し、該溶液を前記マトリックス内で移動させながら前記特異結合性物質と対応特異結合性物質とを結合させ、それによって前記マトリックスの前記対応特異結合性が不動化された部位に前記核酸増幅産物を不動化する第２工程と、不動化された核酸増幅産物中の前記標識を測定する第３工程とを含む、標的核酸の測定方法を提供する。さらに、本発明は、前記マトリックスと、該マトリックス内の一領域であって、前記対応特異結合性物質が不動化された検出領域と、該検出領域よりも上流に位置し、前記核酸増幅物の溶液を施す試料導入部位と、前記検出領域よりも下流に位置し、前記検出領域を通過した後の溶液を吸収する溶液吸収部位とを含む、上記本発明の測定方法を行うためのセンサーを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の方法の第１工程では、光学的なシグナルを発する標識と、ある物質に特異的に結合し得る特異結合性物質とが核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅する。
【０００９】
ここで、標的核酸としては、何ら限定されるものではなく、その存在を検出し、又は定量しようとするいずれの核酸であってもよく、また、遺伝子の型判別やＳＮＰｓの検出等を行おうとするいずれの核酸であってもよい。典型的な例として、病原性の微生物やウイルス等の遺伝子やヒトや他の動物、植物の各種遺伝子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
光学的なシグナルを発する標識としては、蛍光物質や色素物質が好ましく、蛍光物質の例として、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ルミノール及びアクリジウムエステル等を挙げることができ、色素物質の例としてメチレンブルー、メルドラブルー及びメチルオレンジ等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】
また、本発明の方法に用いられる「特異結合性物質」は、ある物質に特異的に結合し得る物質を意味し、好ましい例として、ビオチン、抗原（ジゴキシゲニン等）及びハプテン、α−Ｄ−グルコース残基若しくはα−Ｄ−マンノース残基を含む糖、免疫グロブリンＧ及びその定常領域、並びにレセプターと結合可能なホルモン（例えばエストロゲンとそのレセプター、アンドロゲンとそのレセプター）及び薬剤（例えばセロトニンやヒスタミンとそのレセプター）を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、ビオチンは分子量が小さくて核酸の増幅を妨害しないので、特に好ましい。
【００１２】
第１工程では、上記した標識及び特異結合性物質が核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅する。ＰＣＲのような核酸増幅法は、この分野において周知であり、そのためのキットも市販されているので、核酸増幅法自体は市販のキットを用いて容易に行うことができる。上記標識及び特異結合性物質が核酸増幅産物中に含まれるように、核酸増幅法により標的核酸を増幅する方法としては、例えば、上記標識が結合されたプライマーと、上記特異結合性物質が結合されたプライマーを用いて核酸増幅法を行う方法を例示することができる。この場合、１つのプライマーに標識と特異結合性物質とを結合することも可能な場合があるが、増幅の妨げにならないように、１つのプライマーには標識か特異結合性物質かのいずれか一方を結合することが好ましい。また、プライマー中の結合部位は、特に限定されないが、増幅を妨害しないように、プライマーの５’末端に結合することが好ましい。プライマーに標識又は特異結合性物質を結合する方法自体は周知であり、また、ビオチン結合プライマーや、蛍光標識プライマーは市販されているので、市販品を用いることも可能である。あるいは、一方のプライマーとして特異結合性物質が結合されたプライマーを用い、他方のプライマーとしては通常のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、増幅反応を蛍光標識ヌクレオシドトリフォスフェートの存在下で行うことによっても、蛍光標識され、かつ、特異結合性物質が結合された核酸増幅産物を得ることが可能である。このような、蛍光標識ヌクレオシドトリフォスフェートも市販されているので、市販品を用いることができる。なお、感度を上げるために、異なるプライマー対を用いて２回増幅を行ってもよい（いわゆるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ等）。すなわち、１回目の増幅で得られた増幅産物の中に２回目の増幅のためのプライマーを設定し、２回目の増幅を行ってもよい。この場合、前記標識又は特異結合性物質が結合されたプライマー対は、２回目の増幅のみに用いればよい。
【００１３】
続く第２工程では、前記特異結合性物質と特異的に結合する対応特異結合性物質が不動化された、液体搬送能を有するマトリックスに、前記工程で得られた核酸増幅物を含む溶液を施し、該溶液を前記マトリックス内で移動させながら前記特異結合性物質と対応特異結合性物質とを結合させ、それによって前記マトリックスの前記対応特異結合性が不動化された部位に前記核酸増幅産物を不動化する。ここで、「対応特異結合性物質」は、上記特異結合性物質と特異的に結合する物質であり、上記特異結合性物質がビオチンの場合には、アビジンやストレプトアビジンのようなアビジン誘導体であり、抗原若しくはハプテンの場合には、これと抗原抗体反応する抗体又はそのＦａｂ断片やＦ（ａｂ）２のような抗原結合性断片であり、α−Ｄ−グルコース残基若しくはα−Ｄ−マンノース残基を含む糖の場合には、コンカナバリンＡであり、免疫グロブリンＧ若しくはその定常領域の場合には、プロテインＡであり、ホルモン若しくは薬剤の場合にはそのホルモン若しくは薬剤と結合するレセプターである。なお、特異結合性物質と対応特異結合性物質の組み合わせはこれらに限定されるものではない。
【００１４】
「液体搬送能を有するマトリックス」は、液体をマトリックスに施した場合に、毛管現象により該液体を搬送することができるものであり、好ましい例としてセルロース、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロースの濾紙、ポリスチレン、ポリビニール、活性化されたナイロン膜のうちいずれか一つを材質として構成されたものを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】
マトリックスは、前記対応特異結合性物質が不動化された領域を含む。ストレプトアビジンや抗体等の対応特異結合性物質をマトリックスに結合させる方法自体は周知であり、物理吸着による方法や、アミノ基等の官能基を利用して、リンカーを用いて共有結合させる方法を挙げることができる。後者の方法のためのキットも市販されており、それらを用いて容易に不動化を行うことができる。
【００１６】
対応特異結合性物質を不動化した領域（検出領域）以外の、マトリックス上の領域に第１工程で得られた核酸増幅産物の溶液を施すと、マトリックスの毛管現象により溶液が搬送され、溶液が前記マトリックス内で移動する。そして、溶液内に含まれる核酸増幅物が、検出領域まで移動してくると、特異結合性物質と対応特異結合性物質とが反応して結合し、核酸増幅物がマトリックスの検出領域上に不動化される。
【００１７】
続く第３工程では、マトリックス上に不動化された核酸増幅物中の前記標識を測定する。なお、「測定」には検出、定量及び半定量が包含される。もっとも、簡便性を重視する場合には、目視による検出が好ましい。これらは、例えば蛍光標識の場合には、励起光を照射してその蛍光を測定するといった周知の方法により行うことができる。試料中に標的核酸が存在する場合には、核酸増幅産物が検出領域にトラップされ、標識が検出され、試料中に標的核酸が存在しない場合には、核酸増幅産物が検出領域にトラップされず、標識は検出されない。よって、本発明の方法により、試料中の標的核酸を検出することができる。また、標識の強度を測定することにより、標的核酸を半定量又は定量することも可能である。
【００１８】
上記本発明の方法において、複数種類の標的核酸の増幅産物中に含まれる特異結合性物質が、標的核酸の種類ごとに異なっており、前記マトリックスには、各特異結合性物質に対する対応特異結合性物質がマトリックス上の異なる部位に不動化しておき、各部位に不動化された前記標識を測定することにより、複数種類の標的核酸を同時に測定することが可能になる。なお、核酸増幅には、通常、増幅が正常に起きたか否かをチェックするための内部標準が用いられるが、標的核酸増幅産物中の特異結合性物質に対応する対応特異結合性物質と、内部標準の増幅産物中の特異結合性物質に対応する対応特異結合性物質とを同じマトリックスの異なる部位に不動化しておけば、内部標準の測定も同時に行うことができ簡便である。もっとも内部標準の増幅産物中の特異結合性物質に対応する対応特異結合性物質は、別のマトリックスに不動化しておいてもよい。
【００１９】
本発明はさらに、上記本発明の方法に用いるためのセンサーをも提供する。すなわち、本発明のセンサーは、前記マトリックスと、該マトリックス内の一領域であって、前記対応特異結合性物質が不動化された検出領域と、該検出領域よりも上流に位置し、前記核酸増幅物の溶液を施す試料導入部位と、前記検出領域よりも下流に位置し、前記検出領域を通過した後の溶液を吸収する溶液吸収部位とを含むものである。ここで、「上流」及び「下流」は、核酸増幅産物の溶液の流れの方向を基準にした表現である。複数の標的核酸を同時に測定する場合には、上記の通り、マトリックスの異なる部位に、各核酸増幅産物中の特異結合性物質に対応する対応特異結合性物質を不動化する。前記試料導入部位及び前記溶液吸収部位には、水を吸収するパッドが設けられていることが好ましい。パッドは、例えば不織布やフェルト等により形成することができる。このようなパッドを設けておくと、比較的多量の溶液をマトリックスに施すことが可能になり、より高感度に測定を行うことができるので好ましい。また、試料導入部位側からキャリアー液（緩衝液）を導入し、洗浄効果をもたせることで定量性を向上する効果も併せ持つことができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１    センサーの作製
ニトロセルロースメンブレン（長さ２５ｍｍ）を０．０５％ポリビニルピロリドン含有リン酸緩衝液に浸し、乾燥させた。次いでマトリックスのレセプター結合部にストレプトアビジンを吸着固定した。これは、２．５ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン溶液（５ｘＰＢＳ）を２μＬ／ｃｍでディスペンサーを用いて塗布し、５０℃で一晩乾燥させることにより行った。次に、メンブレンの両端に、セルロースから成る厚さ１ｍｍのパッドを結合し、試料導入パッド及び吸収パッドとした。メンブレンを幅５ｍｍに切断し、本発明のセンサーを作製した。なお、試料導入パッドの長さは５ｍｍであり、その全体が上記ニトロセルロースメンブレンの一端領域に積層され、一方、上記吸収パッドの長さは２０ｍｍであり、  ニトロセルロースメンブレンの他端領域上に５ｍｍだけ積層し残りの１５ｍｍはニトロセルロースメンブレンの他端から突出させた。従ってセンサーの全長は４０ｍｍであった。また、ストレプトアビジンは、ニトロセスロースメンブレンの試料導入側の端部から１０ｍｍの位置にバンド状に塗布した。
【００２２】
実施例２    大腸菌遺伝子の検出
大腸菌のラクト−スオペロン（ラクトース代謝に関するタンパク質をコードする遺伝子群）を、ダイレクトＰＣＲにより増幅した。プライマーの配列及び増幅部位を図１に示す。ＰＣＲはｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲにより行った。図１中、「１ｓｔ  ｆｏｒ」は第１回目の増幅に用いたフォワード側プライマー（配列番号１）、「１ｓｔ−ｒｅｖ」は、第１回目の増幅に用いたリバース側プライマー（配列番号２）、「Ｂｉｏｔｉｎｆｏｒ」は、第２回目の増幅に用いた、５’末端にビオチンを結合したビオチン結合フォワード側プライマー（配列番号３）、「ＦＩＴＣｒｅｖ」は、第２回目の増幅に用いた５’末端にＦＩＴＣを結合したＦＩＴＣ標識リバース側プライマー（配列番号４）である。４桁の数字は、大腸菌ラクトースオペロンのヌクレオチド番号を示す。なお、プライマーへのビオチン又はＦＩＴＣの結合は、それぞれ次のようにして行った。
ビオチン標識：プライマーの５’末端のリン酸をフォスファターゼで除き、ポリヌクレオチドキナーゼとビオチン化ヌクレオチドを用いて、リン酸化反応にてビオチン標識を行なった。
ＦＩＴＣ標識：ＤＮＡ合成機でプライマーの５’末端にアミノリンカーをカップリングさせ、その後アミノリンカーにＦＩＴＣをカップリングさせてＦＩＴＣ標識プライマーを作製した。
【００２３】
ＰＣＲ反応液の組成は、次の通りであった。
１０×ＰＣＲ反応用緩衝液              １０μｌ
塩化マグネシウム（２５ｍＭ）            ８μｌ（最終濃度  ２ｍＭ）
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）                ８μｌ（最終濃度  ２００μＭ）
フォワード側プライマー（１００μＭ）    ０．５μｌ（最終濃度  ０．５μＭ）
リバース側プライマー（１００μＭ）      ０．５μｌ（最終濃度  ０．５μＭ）
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ）（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ                            ＜１μｇ
なお、鋳型ＤＮＡの量は、大腸菌数を反応溶液当たり５  ｃｆｕ、１０  ｃｆｕ，  ２５  ｃｆｕ，  ５０  ｃｆｕ，  １００  ｃｆｕ，  １０００  ｃｆｕ，  １００００  ｃｆｕと変化させた。また、鋳型ＤＮＡを含まないネガティブコントロールも行った。
【００２４】
上記の溶液に滅菌水を加えて１００μｌとした。該反応液２５μｌを滅菌ＰＣＲ用チューブに分注後サーマルサイクラーにセットし、サイクル前に熱変性９５℃／５分を行い、１サイクル、熱変性９５℃／３０秒、アニーリング５８℃／２秒、ポリメラーゼ反応７２℃／１０秒のプロトコールを３０サイクル行い、第一回目のＰＣＲ増幅とした。その増幅産物１μＬを新しいＰＣＲ反応液に入れ、第一回目のＰＣＲ増幅と同様の条件で第二回目のＰＣＲ増幅を行なった。
【００２５】
得られた核酸増幅産物水溶液の２５μＬを、実施例１で作製したセンサーの試料導入パッドに施した。次いで、キャリア液（ＰＢＳ）２５μＬを流し、１分後、検出領域に波長４９０ｎｍの励起光を当て、蛍光を観察した。その結果、５  ｃｆｕの大腸菌を含む試料由来の増幅産物についても検出領域にバンドが観察された。これに対し、ネガティブコントロールでは、バンドは全く観察されなかった。これにより、本発明の方法により、高感度に、簡便、迅速に標的核酸の測定が可能なことが明らかになった。
【００２６】
実施例３    トウモロコシ遺伝子の検出
トウモロコシの実（種子）の部分を液体窒素下で凍結させて、乳鉢ですりつぶした。それを凍結乾燥させて、抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ中の、トウモロコシの貯蔵タンパク質Ｚｅｉｎをコードする遺伝子を、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは１対のプライマーＺｅｉｎｆｏｒ及びＺｅｉｎｒｅｖを用いて通常のＰＣＲ法により行った。「Ｚｅｉｎｆｏｒ」は５´末端にＦＩＴＣを結合したフォワード側プライマー（配列番号６）、「Ｚｅｉｎｒｅｖ」は５´末端にビオチンを結合したリバース側プライマー（配列番号７）である。このプライマーデザインは厚生労働省発表のもので増幅領域は１５７ｂｐである。
【００２７】
ＰＣＲ反応液の組成は次の通りであった。
１０×ＰＣＲ反応用緩衝液                  １０μｌ
塩化マグネシウム（２５ｍＭ）                ８μｌ（最終濃度２ｍＭ）
ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）                    ８μｌ（最終濃度２００μＭ）
フォワード側プライマー（１００μＭ）        ０．５μｌ（最終濃度０．５μＭ）
リバース側プライマー（１００μＭ）          ０．５μｌ（最終濃度０．５μＭ）
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）          ０．５μｌ
鋳型ＤＮＡ                                ＜１μｇ
【００２８】
上記溶液に滅菌水を加えて１００μｌとした。該反応液２５μｌを滅菌ＰＣＲチューブに分注後サーマルサイクラーにセットし、サイクル前に熱変性９５℃／５分を行い、１サイクル、熱変性９５℃／３０秒、アニーリング５３℃／３０秒、ポリメラーゼ反応７２℃／１０秒のプロトコールを３０サイクル行った。
【００２９】
得られた核酸増幅産物溶液の２５μｌを、実施例１で作製したセンサーの試料導入パッドに施した。ついで、キャリア液２５μｌを流し、１分後、検出領域に４９０ｎｍの励起光を当て、検出領域の蛍光を観察した。その結果、試料由来の増幅産物について、バンドが確認された。
【００３０】
【発明の効果】
本発明により、簡便な操作で短時間に核酸増幅物を測定できる新規な手段が提供された。
【００３１】
【配列表】
2005034031.tif 000002
【００３２】
2005034031.tif 000003
【００３３】
2005034031.tif 000004
【００３４】
2005034031.tif 000005
【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において用いたプライマー及び鋳型ＤＮＡの配列とそれらの位置関係を示す図である。
【図１】
2005034031.tif 000010