(57)【要約】【課題】喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒阻害活性を有する口腔用製剤を提供する。【解決手段】カリン果実を５０〜１００％低級アルコール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒で抽出したエキス、またはこのエキスから抽出したトリテルペン誘導体を含有してなる口腔用製剤。【効果】本発明製剤は、副作用の心配がなく、喉炎症起因菌である溶血性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ビオゲネス）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒（ストレプトリジンＯ）阻害活性を有しており、喉の炎症および化膿性疾患等種々の感染症に対して有効に作用するので食品への添加使用等広範な利用に供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリン果実を５０〜１００％低級アルコール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒で抽出したエキスを含有してなり、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒阻害活性を有することを特徴とする口腔用製剤。
【請求項２】
低級アルコール水溶液がエチルアルコール水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の口腔用製剤。
【請求項３】
次に示すトリテルペン誘導体
【化１】
2005213269.tif 000013
【化２】
2005213269.tif 000014
【化３】
2005213269.tif 000015
【化４】
2005213269.tif 000016
のいずれか１以上を有効成分としてなり、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒阻害活性を有することを特徴とする口腔用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒阻害活性を有する口腔用製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：ストレプトコッカス  ピオゲネス）は、ヒトの口腔内や咽頭などに分布する通性嫌気性グラム陽性球菌である。本菌は、連鎖球菌の中で最も病原性が強く、粘膜では咽頭炎、扁桃炎、中耳炎等を起こし、皮膚では種々の化膿性炎症を引き起こすことが知られており、いずれも咽頭もしくは扁桃腺において増殖する。
【０００３】
本菌の病原性因子として、溶血毒（ストレプトリジンＯ）、ディック毒素、ストレプトキナーゼ、ＤＮＡ分解酵素、ヒアルロニダーゼ等が知られており、咽頭炎、扁桃炎、気管支炎等の呼吸器系疾患の病因的役割を果たしている。
【０００４】
これらの呼吸器系疾患を予防および治療するためには、病巣において本菌類の生育を阻害することや、菌の病原性因子を抑制することが重要であることはいうまでもない。
【０００５】
菌の抑制という観点では、本菌類に対して有効な抗菌性物質の応用が効果的である。従来では、ペニシリン系、セフェム系、セファロスポリン系の抗生物質が用いられていたが、これらは作用が強力である反面、耐性菌の出現、副作用等から日常的な利用に適しているとはいえない。
【０００６】
従って、日常的な利用に適する本菌類に有効な抗菌性物質としては、果実、野菜、その他の日常食用に供されている天然物由来のものが好適である。このようなものの例として従来、カリン果実が注目されている。
【０００７】
特開昭５９−１８７７６９号公報および特開平２−３１２５６５号公報は、それぞれ健康増進目的で、カリンを蜂蜜で抽出した果汁乃至エキスを利用することを開示しているが、対象物は蜂蜜で抽出された物に限られており、しかもその効果については甚だ抽象的である。
【０００８】
また、いずれも本出願人の出願による特開昭６２−６１５３８号公報および特開昭６２−２２８２３０号公報は、カリンの溶剤抽出エキスにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する抗菌作用があることを開示しているが、ストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性は明らかにされていない。
【０００９】
さらに、特公昭６３−２６０８３号公報および特開平１−２９０６１９号公報は、天然に広く存在するといわれるオレアノール酸等の五環性酸性トリテルペン化合物に抗う蝕作用、即ちＳ．ｍｕｔａｎｓに対する特異的抗菌作用があることを開示しているが、カリン果実にオレアノール酸他の特定の五環性酸性トリテルペン化合物が含まれていることおよびこれらのものにストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性があることは開示していない。
【００１０】
【特許文献１】特開昭５９−１８７７６９号公報
【特許文献２】特開平２−３１２５６５号公報
【特許文献３】特開昭６２−６１５３８号公報
【特許文献４】特開昭６２−２２８２３０号公報
【特許文献５】特公昭６３−２６０８３号公報
【特許文献６】特開平１−２９０６１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者等は、天然物の溶媒抽出物を試料とし、ストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性および本菌の産生する溶血毒（ストレプトリジンＯ）阻害活性を指標としてスクリーニングを行った結果、カリン果実の溶媒抽出物にそれらの効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、カリン果実を５０〜１００％低級アルコール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒で抽出したエキスおよびこのエキスより得られるトリテルペン誘導体を含有してなり、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒阻害活性を有する口腔用製剤である。
【００１３】
本発明口腔用製剤の原料となるカリン（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｙｄｏｎｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｃｙｄｏｎｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、バラ科、中国原産の植物で世界各地で栽培されている落葉の高木であり、その果実は食品素材として用いられる他、漢方で木瓜（モッカ）と呼ばれ、焼酎で薬用酒としたものが鎮咳、去痰の目的で用いられている。しかしながらその有効成分は不明であり、またどのような作用機作により鎮咳、去痰の効果を発現するのかも不明である。
【００１４】
本発明口腔用製剤は、以下のようにしてカリン果実より抽出製造することができる。
【００１５】
先ず、カリン果実をそのまま或いは乾燥させた後、適当な手段で機械的に粉砕し、これに５０〜１００％低級アルコール水溶液、好ましくはエタノール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒を充分量適用して抽出操作を行う。これらの溶媒は市販されている通常のものを使用すればよく、また混合溶媒は、これらの２種以上を任意に選択し、任意の混合割合で混合して使用すればよい。抽出操作は、粉砕したカリン果実を、常温で前記溶媒に適当時間浸漬する方法によってもよいが、好ましくは５０〜１００℃の温度で１〜５時間、一層好ましくは約３時間かけて加熱還流する方法で行う。
【００１６】
次に、このようにして得られる抽出液を、減圧濃縮することにより本発明口腔用製剤が得られる。
【００１７】
このようにして得られた組成物を、さらにカラムクロマトグラフィーに付し、分離精製を行う。用いるカラムクロマトグラフィーは任意であり、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、或いは高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の技法を用いればよい。また、用いる展開液はメタノール等の低級アルコール、これの水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン等でよい。得られる分離精製物は、本発明のもう一つの口腔用製剤を構成するトリテルペン誘導体である。
【００１８】
本発明にかかるトリテルペン誘導体は、次の構造を有している。
【００１９】
【化１】
2005213269.tif 000002
【００２０】
【化２】
2005213269.tif 000003
【００２１】
【化３】
2005213269.tif 000004
【００２２】
【化４】
2005213269.tif 000005
【００２３】
本発明口腔用製剤では、これらの誘導体のいずれか１以上を有効成分として使用する。
【００２４】
このようにして得られる溶媒抽出組成物およびトリテルペン誘導体である本発明口腔用製剤は、広範な用途に用いることができるが、特にその香り、呈味性が優れ、安全性が高いことを考慮すれば、チューインガム、キャンディ、錠菓、含そう剤などに配合して日常的な利用に供することもできる。このような用途に供する場合、本発明口腔用製剤を、製品中に０．０１〜１０重量％の割合で含有するように添加すれば好適である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明口腔用製剤は、喉炎症起因菌である溶血性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）に対して特異的に強い生育阻害効果を有するばかりでなく、本菌種の産生する溶血毒（ストレプトリジンＯ）に対する阻害効果を併せ有しており、喉の炎症および化膿性疾患を始め種々の感染症に対して有効に作用する。
【００２６】
以下、本発明の実施例、試験例および応用例を挙げて説明する。
【実施例】
【００２７】
実施例１
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに５０％エタノール５リットルを加え、１００℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤３２４ｇを得た。
【００２８】
実施例２
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに１００％エタノール５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤７７ｇを得た。
【００２９】
実施例３
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤４５ｇを得た。
【００３０】
実施例４
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに酢酸エチル５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤３５ｇを得た。
【００３１】
実施例５
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにｎ−ヘキサン５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより酸味および芳香を有する淡緑色の固形物である本発明製剤５ｇを得た。
【００３２】
実施例６
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに５０％エタノール３リットルおよびアセトン２リットルの混合溶媒を加え、１００℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤２８０ｇを得た。
【００３３】
実施例７
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに１００％エタノール３リットルおよび酢酸エチル２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤８２ｇを得た。
【００３４】
実施例８
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに１００％エタノール３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤７２ｇを得た。
【００３５】
実施例９
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン３リットルおよび酢酸エチル２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤５８ｇを得た。
【００３６】
実施例１０
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤４２ｇを得た。
【００３７】
実施例１１
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに酢酸エチル３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤３５ｇを得た。
【００３８】
実施例１２
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに１００％エタノール１リットル、アセトン１リットル、酢酸エチル１リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明製剤６３ｇを得た。
【００３９】
実施例１３
実施例２で得られた本発明製剤の６０ｇに水を加えて分散させた後、酢酸エチルで分配し、酢酸エチル可溶画分（１７．１ｇ）を得た。
【００４０】
この酢酸エチル可溶画分をシリカゲル（ワコーゲルＣ−２００、和光純薬）１ｋｇを充填したカラムに吸着させた。このカラムをｎ−ヘキサン酢酸エチル（１０：１〜１：１）にて溶出させ、分画を行った。ＴＣＬプレート（６０Ｆ２５４、メルク）を用いてｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で展開した時、Ｒｆ値０．２〜０．５付近に１０％硫酸により青または紫色のスポットを呈する画分を集めた。
【００４１】
この画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のオクタデシルシラノール型（ＯＤＳ）分取カラム（センシュー科学）を用いて、メタノール−水（９０：１０〜１００：０）で溶出させ、２０５ナノメータのＵＶ吸収をモニターしながら各ピークを分取する。
【００４２】
それぞれのピークはさらにＨＰＬＣ用ＯＤＳカラムを用いてアセトニトリル−水（９５：５〜１００：０）、メタノール−水（９０：１０〜１００：０）で繰り返し精製することにより、本発明製剤である４種類の無色結晶性化合物１（２８５０ｍｇ）、化合物２（２５０ｍｇ）、化合物３（２５ｍｇ）、化合物４（２５ｍｇ）を得た。
【００４３】
これらの化合物について、融点、マススペクトル、赤外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルにより分析した結果、前記化合物１〜４はオレアノール酸、３−アセチルオレアノール酸、エリスロジオールおよびウバオール等のトリテルペン誘導体であることを確認した。
【００４４】
試験例１
実施例１〜５および１３で示した方法により調製した本発明製剤の溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌およびう蝕原因菌に対する抗菌活性を以下の方法により試験した。
【００４５】
試験方法
１）供試菌株、使用培地および培養条件
【００４６】
【表１】
2005213269.tif 000006
【００４７】
２）抗菌活性試験法
各菌株をそれぞれの培地および培養条件で２４時間培養し、菌を充分に生育させる。９６穴平底マイクロプレートを用い、各ウエル中で試料溶液（１００μｌ）の２倍希釈系列を調製する。２倍濃度で調製した培地に各々の菌を接種し、その１００μｌを各ウエルに添加する。２４時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの濁度（５５０ｎｍ）を測定し、菌の生育を判定し、その最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求める。
【００４８】
試験結果
試験結果を表２に示す。本発明製品（実施例１〜５および化合物１〜４）は、黄色ブドウ球菌やう蝕原因菌に対しても抗菌活性を示すが、溶血性連鎖球菌に対する抗菌活性は、さらに強いものである。カリンの水や３０％エタノール抽出物では本発明製品のような抗菌活性はみられなかったことから、カリンを抽出する場合のエタノール濃度は、５０％以上でなくてはならないことが明らかである。
【００４９】
【表２】
2005213269.tif 000007
【００５０】
試験例２
実施例１〜５および１３で示した方法により調製した本発明製剤の溶血毒（ストレプトリジンＯ）阻害活性を以下の方法により試験した。
【００５１】
試験方法
ウサギ脱繊維血液２５ｍｌを緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で３回洗浄（３０００ｒｐｍ×１０分間）し、赤血球を集める。緩衝食塩水で２００ｍｌに希釈し、ウサギ赤血球浮遊液とする。試料規定量をエタノールに溶解してから、さらに緩衝食塩水に溶解し（エタノール２％）、試料溶液とする。試料溶液６００μｌとストレプトリジンＯ（栄研）水溶液（１結合力価）３００μｌを１３ｍｍ径の試験管中で混合し、３７℃で３０分反応させる。ウサギ赤血球浮遊液３００μｌを添加し、３７℃で４５分間反応させる。反応終了後、１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清の溶血度合を肉眼で判定する。判定基準は次のようにした。
【００５２】
判定基準 −：溶血のみられないもの、＋：不完全溶血、＋＋：完全溶血
【００５３】
試験結果
試験結果を表３に示す。本発明製剤（実施例１〜５および化合物１〜４）は、溶血毒阻害活性を示し、１０００μｇ／ｍｌ濃度では、いずれの試料でも溶血を完全に阻害した。１００μｇ／ｍｌ濃度においても阻害活性を示し、完全溶血を起こすものはみられなかった。抗菌活性と同様に、カリンの水や３０％エタノール抽出物では本発明製剤のような溶血毒阻害活性はみられなかったことから、カリンを抽出する場合のエタノール濃度は、５０％以上でなくてはならないことが明らかである。
【００５４】
【表３】
2005213269.tif 000008
【００５５】
応用例
実施例１、２および１３で示した方法により調製した本発明製剤を用いて、次の処方によりチューインガム、キャンディ、錠菓、含そう剤を製造した。
【００５６】
【表４】
2005213269.tif 000009
【００５７】
【表５】
2005213269.tif 000010
【００５８】
【表６】
2005213269.tif 000011
【００５９】
【表７】
2005213269.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明口腔用製剤の原料であるカリンは食用素材や薬用酒として用いられており、その安全性については問題がないので本発明口腔用製剤の安全性にも問題がなく、従って抗生物質を応用した場合にみられる副作用等の心配はないと認識される。
【００６１】
本発明口腔用製剤は、副作用等の心配はなく、香り、呈味性が優れているので食品への添加使用等、広範な利用に供することが可能な汎用性の高いものである。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月4日(2005.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリン果実より得られるトリテルペン誘導体
【化１】
2005213269.tif 000017
【化２】
2005213269.tif 000018
【化３】
2005213269.tif 000019
【化４】
2005213269.tif 000020
のうちいずれか１以上を有効成分とする喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性剤を含有し、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性を有するものであることを特徴とし、喉に用いられるものである旨の表示を付した口腔用組成物。
【請求項２】
カリン果実より得られるトリテルペン誘導体
【化５】
2005213269.tif 000021
【化６】
2005213269.tif 000022
【化７】
2005213269.tif 000023
【化８】
2005213269.tif 000024
のうちいずれか１以上を有効成分とする喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性剤を含有し、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性を有するものであることを特徴とし、喉に用いられるものである旨の表示を付した飲食品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性剤を含有し、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性を有するものであることを特徴とする口腔用組成物及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ：ストレプトコッカス・ピオゲネス）は、ヒトの口腔内や咽頭などに分布する通性嫌気性グラム陽性球菌である。本菌は、連鎖球菌の中で最も病原性が強く、粘膜では咽頭炎、扁桃炎、中耳炎等を起こし、皮膚では種々の化膿性炎症を引き起こすことが知られており、いずれも咽頭もしくは扁桃腺において増殖する。
【０００３】
本菌の病原性因子として、溶血毒（ストレプトリジンＯ）、ディック毒素、ストレプトキナーゼ、ＤＮＡ分解酵素、ヒアルロニダーゼ等が知られており、咽頭炎、扁桃炎、気管支炎等の呼吸器系疾患の病因的役割を果たしている。
【０００４】
これらの呼吸器系疾患を予防および治療するためには、病巣において本菌類の生育を阻害することや、菌の病原性因子を抑制することが重要であることはいうまでもない。
【０００５】
菌の抑制という観点では、本菌類に対して有効な抗菌性物質の応用が効果的である。従来では、ペニシリン系、セフェム系、セファロスポリン系の抗生物質が用いられていたが、これらは作用が強力である反面、耐性菌の出現、副作用等から日常的な利用に適しているとはいえない。
【０００６】
従って、日常的な利用に適する本菌類に有効な抗菌性物質としては、果実、野菜、その他の日常食用に供されている天然物由来のものが好適である。このようなものの例として従来、カリン果実が注目されている。
【０００７】
特開昭５９−１８７７６９号公報および特開平２−３１２５６５号公報は、それぞれ健康増進目的で、カリンを蜂蜜で抽出した果汁乃至エキスを利用することを開示しているが、対象物は蜂蜜で抽出された物に限られており、しかもその効果については甚だ抽象的である。
【０００８】
また、いずれも本出願人の出願による特開昭６２−６１５３８号公報および特開昭６２−２２８２３０号公報は、カリンの溶剤抽出エキスにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する抗菌作用があることを開示しているが、ストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性は明らかにされていない。
【０００９】
さらに、特公昭６３−２６０８３号公報および特開平１−２９０６１９号公報は、天然に広く存在するといわれるオレアノール酸等の五環性酸性トリテルペン化合物に抗う蝕作用、即ちＳ．ｍｕｔａｎｓに対する特異的抗菌作用があることを開示しているが、カリン果実にオレアノール酸他の特定の五環性酸性トリテルペン化合物が含まれていることおよびこれらのものにストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性があることは開示していない。
【００１０】
【特許文献１】特開昭５９−１８７７６９号公報
【特許文献２】特開平２−３１２５６５号公報
【特許文献３】特開昭６２−６１５３８号公報
【特許文献４】特開昭６２−２２８２３０号公報
【特許文献５】特公昭６３−２６０８３号公報
【特許文献６】特開平１−２９０６１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者等は、天然物の溶媒抽出物を試料とし、ストレプトコッカス・ピオゲネスに対する抗菌活性および本菌の産生する溶血毒（ストレプトリジンＯ）阻害活性を指標としてスクリーニングを行った結果、カリン果実の溶媒抽出物にそれらの効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、カリン果実を５０〜１００％低級アルコール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒で抽出したエキスおよびこのエキスより得られるトリテルペン誘導体を含有してなり、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性剤を含有し、喉炎症起因菌（溶血性連鎖球菌）に対する抗菌活性および本菌種の産生する溶血毒に対する阻害活性を有するものであることを特徴とする口腔用組成物及び飲食品である。
【００１３】
本発明品の原料となるカリン（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｃｙｄｏｎｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｃｙｄｏｎｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は、バラ科、中国原産の植物で世界各地で栽培されている落葉の高木であり、その果実は食品素材として用いられる他、漢方で木瓜（モッカ）と呼ばれ、焼酎で薬用酒としたものが鎮咳、去痰の目的で用いられている。しかしながらその有効成分は不明であり、またどのような作用機作により鎮咳、去痰の効果を発現するのかも不明である。
【００１４】
本発明品は、以下のようにしてカリン果実より抽出製造することができる。
【００１５】
先ず、カリン果実をそのまま或いは乾燥させた後、適当な手段で機械的に粉砕し、これに５０〜１００％低級アルコール水溶液、好ましくはエタノール水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン或いはこれらの２種以上の混合溶媒を充分量適用して抽出操作を行う。これらの溶媒は市販されている通常のものを使用すればよく、また混合溶媒は、これらの２種以上を任意に選択し、任意の混合割合で混合して使用すればよい。抽出操作は、粉砕したカリン果実を、常温で前記溶媒に適当時間浸漬する方法によってもよいが、好ましくは５０〜１００℃の温度で１〜５時間、一層好ましくは約３時間かけて加熱還流する方法で行う。
【００１６】
次に、このようにして得られる抽出液を、減圧濃縮することにより本発明の口腔用組成物及び飲食品に含有される製剤が得られる。
【００１７】
このようにして得られた組成物を、さらにカラムクロマトグラフィーに付し、分離精製を行う。用いるカラムクロマトグラフィーは任意であり、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、或いは高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の技法を用いればよい。また、用いる展開液はメタノール等の低級アルコール、これの水溶液、アセトン、酢酸エチルまたはｎ−ヘキサン等でよい。得られる分離精製物は、本発明のもう一つの口腔用組成物及び飲食品に含有される製剤を構成するトリテルペン誘導体である。
【００１８】
本発明にかかるトリテルペン誘導体は、次の構造を有している。
【００１９】
【化１】
2005213269.tif 000025
【００２０】
【化２】
2005213269.tif 000026
【００２１】
【化３】
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【００２２】
【化４】
2005213269.tif 000028
【００２３】
本発明の口腔用組成物及び飲食品に含有される製剤では、これらの誘導体のいずれか１以上を有効成分として使用する。
【００２４】
このようにして得られる溶媒抽出組成物およびトリテルペン誘導体である本発明の口腔用組成物及び飲食品に含有される製剤は、広範な用途に用いることができるが、特にその香り、呈味性が優れ、安全性が高いことを考慮すれば、チューインガム、キャンディ、錠菓、含そう剤などに配合して日常的な利用に供することもできる。このような用途に供する場合、前記製剤を、製品中に０．０１〜１０重量％の割合で含有するように添加すれば好適である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明品は、喉炎症起因菌である溶血性連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）に対して特異的に強い生育阻害効果を有するばかりでなく、本菌種の産生する溶血毒（ストレプトリジンＯ）に対する阻害効果を併せ有しており、喉の炎症および化膿性疾患を始め種々の感染症に対して有効に作用する。
【００２６】
以下、本発明の実施例、試験例および応用例を挙げて説明する。
【実施例】
【００２７】
実施例１
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに５０％エタノール５リットルを加え、１００℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤３２４ｇを得た。
【００２８】
実施例２
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに１００％エタノール５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤７７ｇを得た。
【００２９】
実施例３
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤４５ｇを得た。
【００３０】
実施例４
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに酢酸エチル５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮し、溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤３５ｇを得た。
【００３１】
実施例５
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにｎ−ヘキサン５リットルを加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより酸味および芳香を有する淡緑色の固形物である本発明品に含有される製剤５ｇを得た。
【００３２】
実施例６
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに５０％エタノール３リットルおよびアセトン２リットルの混合溶媒を加え、１００℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤２８０ｇを得た。
【００３３】
実施例７
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに１００％エタノール３リットルおよび酢酸エチル２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤８２ｇを得た。
【００３４】
実施例８
生食用カリン果実の粉砕物１ｋｇに１００％エタノール３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤７２ｇを得た。
【００３５】
実施例９
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン３リットルおよび酢酸エチル２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤５８ｇを得た。
【００３６】
実施例１０
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇにアセトン３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤４２ｇを得た。
【００３７】
実施例１１
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに酢酸エチル３リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤３５ｇを得た。
【００３８】
実施例１２
カリン乾燥果実粉砕物１ｋｇに１００％エタノール１リットル、アセトン１リットル、酢酸エチル１リットルおよびｎ−ヘキサン２リットルの混合溶媒を加え、８０℃の温度で３時間加熱還流抽出を行った。得られた抽出液を濾過し、濾液を減圧下、濃縮して溶媒を除去することにより、酸味および芳香を有する赤褐色の固形物である本発明品に含有される製剤６３ｇを得た。
【００３９】
実施例１３
実施例２で得られた本発明品に含有される製剤の６０ｇに水を加えて分散させた後、酢酸エチルで分配し、酢酸エチル可溶画分（１７．１ｇ）を得た。
【００４０】
この酢酸エチル可溶画分をシリカゲル（ワコーゲルＣ−２００、和光純薬）１ｋｇを充填したカラムに吸着させた。このカラムをｎ−ヘキサン酢酸エチル（１０：１〜１：１）にて溶出させ、分画を行った。ＴＣＬプレート（６０Ｆ２５４、メルク）を用いてｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：１）で展開した時、Ｒｆ値０．２〜０．５付近に１０％硫酸により青または紫色のスポットを呈する画分を集めた。
【００４１】
この画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用のオクタデシルシラノール型（ＯＤＳ）分取カラム（センシュー科学）を用いて、メタノール−水（９０：１０〜１００：０）で溶出させ、２０５ナノメータのＵＶ吸収をモニターしながら各ピークを分取する。
【００４２】
それぞれのピークはさらにＨＰＬＣ用ＯＤＳカラムを用いてアセトニトリル−水（９５：５〜１００：０）、メタノール−水（９０：１０〜１００：０）で繰り返し精製することにより、本発明品に含有される製剤である４種類の無色結晶性化合物１（２８５０ｍｇ）、化合物２（２５０ｍｇ）、化合物３（２５ｍｇ）、化合物４（２５ｍｇ）を得た。
【００４３】
これらの化合物について、融点、マススペクトル、赤外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルにより分析した結果、前記化合物１〜４はオレアノール酸、３−アセチルオレアノール酸、エリスロジオールおよびウバオール等のトリテルペン誘導体であることを確認した。
【００４４】
試験例１
実施例１〜５および１３で示した方法により調製した本発明品に含有される製剤の溶血性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌およびう蝕原因菌に対する抗菌活性を以下の方法により試験した。
【００４５】
試験方法
１）供試菌株、使用培地および培養条件
【００４６】
【表１】
2005213269.tif 000029
【００４７】
２）抗菌活性試験法
各菌株をそれぞれの培地および培養条件で２４時間培養し、菌を充分に生育させる。９６穴平底マイクロプレートを用い、各ウエル中で試料溶液（１００μｌ）の２倍希釈系列を調製する。２倍濃度で調製した培地に各々の菌を接種し、その１００μｌを各ウエルに添加する。２４時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの濁度（５５０ｎｍ）を測定し、菌の生育を判定し、その最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を求める。
【００４８】
試験結果
試験結果を表２に示す。本発明製品（実施例１〜５および化合物１〜４）は、黄色ブドウ球菌やう蝕原因菌に対しても抗菌活性を示すが、溶血性連鎖球菌に対する抗菌活性は、さらに強いものである。カリンの水や３０％エタノール抽出物では本発明製品のような抗菌活性はみられなかったことから、カリンを抽出する場合のエタノール濃度は、５０％以上でなくてはならないことが明らかである。
【００４９】
【表２】
2005213269.tif 000030
【００５０】
試験例２
実施例１〜５および１３で示した方法により調製した本発明品に含有される製剤の溶血毒（ストレプトリジンＯ）阻害活性を以下の方法により試験した。
【００５１】
試験方法
ウサギ脱繊維血液２５ｍｌを緩衝食塩水（ｐＨ６．５）で３回洗浄（３０００ｒｐｍ×１０分間）し、赤血球を集める。緩衝食塩水で２００ｍｌに希釈し、ウサギ赤血球浮遊液とする。試料規定量をエタノールに溶解してから、さらに緩衝食塩水に溶解し（エタノール２％）、試料溶液とする。試料溶液６００μｌとストレプトリジンＯ（栄研）水溶液（１結合力価）３００μｌを１３ｍｍ径の試験管中で混合し、３７℃で３０分反応させる。ウサギ赤血球浮遊液３００μｌを添加し、３７℃で４５分間反応させる。反応終了後、１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清の溶血度合を肉眼で判定する。判定基準は次のようにした。
【００５２】
判定基準  −：溶血のみられないもの、＋：不完全溶血、＋＋：完全溶血
【００５３】
試験結果
試験結果を表３に示す。本発明品に含有される製剤（実施例１〜５および化合物１〜４）は、溶血毒阻害活性を示し、１０００μｇ／ｍｌ濃度では、いずれの試料でも溶血を完全に阻害した。１００μｇ／ｍｌ濃度においても阻害活性を示し、完全溶血を起こすものはみられなかった。抗菌活性と同様に、カリンの水や３０％エタノール抽出物では本発明品に含有される製剤のような溶血毒阻害活性はみられなかったことから、カリンを抽出する場合のエタノール濃度は、５０％以上でなくてはならないことが明らかである。
【００５４】
【表３】
2005213269.tif 000031
【００５５】
応用例
実施例１、２および１３で示した方法により調製した本発明品に含有される製剤を用いて、次の処方によりチューインガム、キャンディ、錠菓、含そう剤を製造した。
【００５６】
【表４】
2005213269.tif 000032
【００５７】
【表５】
2005213269.tif 000033
【００５８】
【表６】
2005213269.tif 000034
【００５９】
【表７】
2005213269.tif 000035
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明品の原料であるカリンは食用素材や薬用酒として用いられており、その安全性については問題がないので本発明品の安全性にも問題がなく、従って抗生物質を応用した場合にみられる副作用等の心配はないと認識される。
【００６１】
本発明品は、副作用等の心配はなく、香り、呈味性が優れているので食品への添加使用等、広範な利用に供することが可能な汎用性の高いものである。