(57)【要約】【課題】    遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖（ＦＬＣ）の測定においては、従来の測定法では必ずしも効果的ではなく、より特異性の高い測定系の開発が切望されていた。【解決手段】本発明は、ＦＬＣに特異的に反応する２種類の抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中に存在するＦＬＣを特異的に測定する方法であって、試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ＦＬＣの免疫学的測定法及びキットに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的に反応する２種類の抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中に存在する遊離イムノグロブリン軽鎖を特異的に測定する方法であって、試料中の遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を捕獲（トラップ）するための抗体として遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされた遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を検出するための抗体として遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖の免疫学的測定法。
【請求項２】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖をトラップするための抗体が、固相化された抗遊離ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体である、請求項１記載の測定法。
【請求項３】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を検出するための抗体が、標識剤で標識された抗遊離ヒトイムノグロブリンモノクローナル抗体である、請求項１記載の測定法。
【請求項４】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖がベンスジョーンズ蛋白質（Bence Jones protein）である、請求項１記載の測定法。
【請求項５】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的に反応する２種類の抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中に存在する遊離イムノグロブリン軽鎖を特異的に測定するためのキットであって、試料中の遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を捕獲（トラップ）するための抗体として遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされた遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を検出するための抗体として遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖の免疫学的測定用キット。
【請求項６】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖をトラップするための抗体が、固相化された抗遊離ヒトイムノグロブリンポリクローナル抗体である、請求項５記載のキット。
【請求項７】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を検出するための抗体が、標識剤で標識された抗遊離ヒトイムノグロブリンモノクローナル抗体である、請求項５記載のキット。
【請求項８】
遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖がベンスジョーンズ蛋白質（Bence Jones protein）である、請求項５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離したヒトイムノグロブリンの軽鎖（遊離ヒトヒトイムノグロブリン軽鎖：ＦＬＣ）の免疫学的測定方法及びそれに使用するキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遊離したイムノグロブリン軽鎖のκ型（free immunoglobulin light chain kappa：ＦＬＣκ）またはλ 型(free immunoglobulin light chain lambda：ＦＬＣλ)は、これまでの臨床検討において、多発性骨髄腫やアミロイドーシスなど免疫異常疾患の診断に有用であることが示され、臨床検査用マーカーとして期待されているものである。
【０００３】
このＦＬＣを測定するため、これまでＦＬＣに特異的な抗体、特にポリクローナル抗体が広く用いられてきた。しかしながら、ヒト由来成分、特に血清中にはＦＬＣの濃度の数千倍ものインタクトイムノグロブリンが含まれており、このインタクトイムノグロブリンの影響を回避するにはポリクローナル抗体の特異性では不十分であり、満足できる測定法とは言い難いものであった。また、蛋白尿を伴う患者などにおいては、血中のインタクトイムノグロブリンが糸球体を通過し尿中に多量に排泄されるため、尿試料においてもインタクトイムノグロブリンの影響が懸念される。
【０００４】
本発明者ら、固相化抗ＦＬＣモノクローナル抗体とヒトイムノグロブリンの軽鎖に特異的なモノクローナル抗体（この抗体は、インタクトイムノグロブリンの軽鎖とＦＬＣに反応する）とを用いた測定系を開発したが（Journal of Immunological Methods, 275(2003), 9-17）、ポリクローナル抗体を用いた従来の測定系よりは優れたものであったが、この測定系であってもインタクトイムノグロブリンの影響を完全に回避することはできていない。
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Immunological Methods, 275(2003), 9-17
【特許文献１】特開昭５３−４４６２２号公報
【特許文献２】特公平２−３９７４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
免疫学測定法において、測定上の特異性を向上させる１つの手段として、測定しようとする抗原をトラップする抗体としてモノクローナル抗体を用いるか（特開昭５３−４４６２２号公報参照）、トラップする抗体と検出する抗体の両方にモノクローナル抗体を用いる方法（特公平２−３９７４７号公報）が常識とされている。
【０００７】
本発明者らも、これらの方法を検討してみたが、ＦＬＣの測定においては、必ずしも効果的ではなく、より特異性の高い測定系の開発が切望されていた。
【０００８】
本発明者らは、インタクトイムノグロブリンの影響を回避し、特異性の高いＦＬＣ測定法を開発すべく試行錯誤を繰り返した結果、試料中の遊離ヒトイムノグロブリン軽鎖を捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することにより、試料中に存在するＦＬＣを特異的かつ高感度で測定できることを見いだした。このことは、上記した免疫学的測定における特異性向上のための常識からは、全く予想外のことであった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、ＦＬＣに特異的に反応する２種類の抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中に存在するＦＬＣを特異的に測定する方法であって、試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ＦＬＣの免疫学的測定法に関するものである。
【００１０】
また、ＦＬＣに特異的に反応する２種類の抗体を使用し、免疫学的測定法により試料中に存在するＦＬＣを特異的に測定するためのキットであって、試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、ＦＬＣの免疫学的測定用キットに関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用すると言う特殊な抗体の組み合わせによって、血清試料中のインタクトイムノグロブリンの影響を回避し、かつ高感度にＦＬＣを測定することができることが可能となった。
また、蛋白尿を伴う患者などにおいては、尿試料においてもインタクトイムノグロブリンの影響が懸念されるが、本発明ではインタクトイムノグロブリンの影響を回避することが可能であるため、尿中のモノクローナルなＦＬＣであるベンスジョーンズ蛋白質（Bence Jones protein：ＢＪＰ）の測定にも適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明で使用する試料は、ＦＬＣを含有するものであれば特に限定されず、具体的には血液自体または血清、血漿などの血液画分または尿などを試料として使用することができる。
【００１３】
本発明で使用する抗体は、ＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体と、ＦＬＣに特異的に反応するポリクローナル抗体との２種類の抗体である。このような抗体は、抗体自体あるいはそれらの活性フラグメント〔Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’など〕であってもかまわない。
【００１４】
ここで、ＦＬＣに特異的に反応する抗体とは、インタクトイムノグロブリン中に存在する重鎖と結合した軽鎖に対する反応性が極めて弱いかまたは全く認識せず、重鎖に結合していない軽鎖には強く反応する抗体を意味する。
【００１５】
このようなＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、常法により作製することができる。たとえばＦＬＣを抗原とし、モノクローナル抗体を調製し、得られた抗体の中からインタクトイムノグロブリンとは結合せず、ＦＬＣと特異的に結合する抗体を選出すればよい。
【００１６】
また、ＦＬＣに特異的に反応するポリクローナル抗体は、常法により作製することができる。たとえばＦＬＣを抗原とし、ポリクローナル抗体を調製し、得られた抗体成分のうちインタクトイムノグロブリンに結合する抗体を吸収、除去すればよい。さらに、このような抗体は既に市販されており、利用可能である。ただしＦＬＣに対する特異性を確認する必要がある。
【００１７】
本発明は、上述のような抗体を用いた免疫測定法により試料中のＦＬＣを定量しようとするにあたり、試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としてＦＬＣに特異的なポリクローナル抗体を使用し、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としてＦＬＣに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用するものである。免疫測定法自体は、従来行われている方法、手順など何等変わるものではない。
【００１８】
試料中のＦＬＣを捕獲（トラップ）するための抗体としては、担体に結合した固相抗体を例示することができる。
固相抗体を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。
【００１９】
担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。
担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接行ってもよく、両物質の間に他の物質を介して行ってもよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、ＢＳＡなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００２０】
また、トラップされたＦＬＣを検出するための抗体としては、標識剤で標識された抗体を例示することができる。
標識剤としては、放射性同位体（たとえば３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠分子族（たとえば、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネートなど）、ウンベリフェロンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノ−ル誘導体〔たとえば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど〕などを例示することができる。
抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
【００２１】
このような固相抗体と標識抗体を用いての測定手順は、通常の免疫測定法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、固相抗体と被検試料を反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに標識抗体を反応させる（ツーステップ法）か、固相抗体、被検試料及び標識抗体を同時に反応させ（ワンステップ法）、以後のそれ自体公知の方法により試料中のＦＬＣを検出または定量することができる。
【００２２】
なお、免疫測定法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
(1)入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(2)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(3)臨床病理  臨時増刊  特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(4)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
【００２３】
(5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A)）
(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)）
(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D: 
Selected Immunoassay)）
(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E: 
Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行］
【００２４】
本発明のキットは、上述の測定法を実施するためのものであり、たとえば、下記の試薬から構成される。
1)固相化ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体
2)標識化ＦＬＣ特異モノクローナル抗体
また、標識化ＦＬＣ特異モノクローナル抗体の代わりに標識化してないＦＬＣ特異モノクローナル抗体と二次抗体を使用してもよく、その場合には次の試薬から構成される。
1)固相化ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体
2)ＦＬＣ特異モノクローナル抗体
3)標識化抗イムノグロブリン抗体
上記各試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、試料前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付すればよい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００２６】
＜方法＞
（１）ＦＬＣ特異モノクローナル抗体
ＦＬＣ特異モノクローナル抗体はＦＬＣ(Bethyl laboratories 社, Montgomery, TX)をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、作製した(J. Immunol. Methods,275, 9-17.(2003)）。得られた抗体のＦ（ａｂ'）２フラグメントをホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した(J. Histochem. Cytochem., 22, 1084-91. (1974))。
また、遊離型と結合型両方のイムノグロブリン軽鎖に反応する抗全軽鎖モノクローナル抗体(抗total light chain 抗体)も同様に作製し、本実験に用いた(J. Immunol. Methods,275, 9-17.(2003)）。
【００２７】
（２）ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体
ＦＬＣκ並びにＦＬＣλ特異ポリクローナル抗体は Dakopatts社(Stockholm, Sweden)より購入した。
なお、ＦＬＣκ特異ポリクローナル抗体は、ＩｇＧを結合したＣＮＢｒ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムにてＩｇＧと交差反応する抗体を除去したのち使用し、ＦＬＣλ特異ポリクローナル抗体はＦＬＣλを結合したＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに供試し、ＦＬＣλに特異的に反応する抗体を回収して使用した。また、これらの抗体についてもＦ（ａｂ'）２を作製し、ＨＲＰ標識した。
【００２８】
（３）免疫測定法
ＦＬＣκ測定法
ＦＬＣκ特異抗体 １０μｇ／ｍｌ溶液を９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｉ）に１００μｌ毎分注し、４℃で１晩反応させた。抗体液を吸引除去後、ＰＢＳで洗浄し、３００μｌの０.５％スキムミルクを含むＰＢＳにてブロッキング（４℃、一晩）を行った。反応後、ブロッキング液を吸引除去し、プレートを乾燥した。
この９６穴マイクロプレートの各ウェルに標準濃度溶液、適宜希釈したＩｇＧ、ならびに検体試料などを１００μｌ毎加え、室温で反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液で洗浄した後、ＨＲＰ標識ＦＬＣ特異抗体または抗全軽鎖モノクローナル抗体を１００μｌ加え室温で反応させた。
未反応のＨＲＰ標識抗体を洗浄除去後、ウェル内に残っているＨＲＰ活性をその基質であるテトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)により検出し、得られた色素の吸光度をマイクロプレートリーダー(TECAN Spectra)で測定した。なおアッセイバッファとして０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ならびに１％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ｐＨ７．５を用いた。
【００２９】
ＦＬＣλ測定法
ＦＬＣκ測定法と同様の手順で行った。ただし洗浄液として０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水 (ＰＢＳ) を、またアッセイバッファとして１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを用いた。
【００３０】
（４）血清検体
本実験に使用した血清検体は健常ボランティア４３例より得た。
【００３１】
＜結果＞
（１）各種抗体を用いた免疫測定法におけるＦＬＣに対する特異性の比較
ＦＬＣ定量のための免疫測定法において、以下４種の抗体の組み合わせを検討した。
（測定法１）
固相ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体とＨＲＰ標識ＦＬＣ特異モノクローナル抗体
（測定法２）
固相ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体とＨＲＰ標識抗全軽鎖モノクローナル抗体
（測定法３）
固相ＦＬＣ特異モノクローナル抗体とＨＲＰ標識ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体
（測定法４）
固相ＦＬＣ特異モノクローナル抗体とＨＲＰ標識ＦＬＣ特異モノクローナル抗体
【００３２】
図１は測定法１〜３の結果を示したものである。測定法２または３ではＩｇＧに対するＦＬＣの特異性が約１００〜１０００倍であるのに対し、測定法１はＦＬＣκに対しては１０万倍、ＦＬＣλに対しては１万倍と高い特異性を示した。
なお、測定法４については、得られた抗ＦＬＣκモノクローナル抗体９種、抗ＦＬＣλモノクローナル抗体８種を用い、可能なすべての組み合わせについてＦＬＣκまたはＦＬＣλ測定の有用性を評価したが、ＦＬＣを検出可能な組み合わせは見いだせなかった。
これらの結果より、ＦＬＣに対し高い特異性を示した測定法１ならびに測定法２について、血清中インタクトイムノグロブリンの影響を続けて評価した。なお、測定法３は特異性が低いこと、測定法４については検出可能な組み合わせがなかったことから以後の実験には用いなかった。
【００３３】
（２）血清中インタクトイムノグロブリンの影響
測定法１ならびに２を用いて血清４３検体中のＦＬＣ濃度を測定した（図２）。また、それらの測定値へのインタクトイムノグロブリンの影響を確認するため、血清中インタクトイムノグロブリンを、サブクラス特異抗体カラムを用い吸収除去した検体についても同様に測定を行った。なお、吸収前のＩｇＧ，ＩｇＡならびにＩｇＭの濃度は平均１２．０ｍｇ／ｄｌ，２．１ｍｇ／ｄｌ，１．３ｍｇ／ｄｌで、吸収後は０．０２ｍｇ／ｄｌ，０．００５ｍｇ／ｄｌ，０．００４ｍｇ／ｄｌであった。
【００３４】
吸収後の検体の測定値はＦＬＣを添加したウシ血清を用いて得られた回収率により補正した。測定の結果、測定法１では吸収前後においてその値はほぼ一致していたが、測定法２ではインタクトイムノグロブリン吸収前の血清で値が非常に高くなっており、インタクトイムノグロブリンが交差反応していることがわかった。
これらの結果から、ＦＬＣを特異的に検出するには、固相化ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体とＦＬＣ特異標識モノクローナル抗体の組み合わせがもっとも有用であることが示された。また、この組み合わせによる測定では血清中インタクトイムノグロブリンの明らかな影響は見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａは、測定法１（固相ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体とＨＲＰ標識ＦＬＣ特異モノクローナル抗体を用いた免疫測定法）によるＦＬＣとＩｇＧの測定結果を示す。  図１Ｂは、測定法２（固相ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体とＨＲＰ標識抗全軽鎖モノクローナル抗体を用いた免疫測定法）によるＦＬＣとＩｇＧの測定結果を示す。  図１Ｃは、測定法３（固相ＦＬＣ特異モノクローナル抗体とＨＲＰ標識ＦＬＣ特異ポリクローナル抗体を用いた免疫測定法）によるＦＬＣとＩｇＧの測定結果を示す。  なお、左の図はＦＬＣκの測定結果を、右の図はＦＬＣλの測定結果を示す。
【図２】図２は、測定法１ならび測定法２における血清４３検体またはそれらのインタクトイムノグロブリン吸収後の測定結果を示す。ＡとＢはそれぞれＦＬＣκとＦＬＣλの測定結果を示す。
【図１】
2005249592.tif 000002
【図２】
2005249592.tif 000003