(57)【要約】【課題】  簡便な方法でありながら、重力の影響を受けることなく、例えば細胞分離を高効率で行うことを可能とする。【解決手段】  微小流路中において生ずる層流により形成される液相二相界面により不溶性物質を分離する。不溶性物質は、各液相に対する親和力の相違により相移動し、いずれか１相に分配される。分離対象となる不溶性物質は、例えば血球細胞等の細胞である。赤血球と白血球を互いに異なる液相に分配する場合には、二相界面を形成する液相として、ポリエチレングリコール水溶液相とデキストラン水溶液相を用いる。【選択図】  図１
2005224787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流路中において生ずる層流により形成される液相二相界面により不溶性物質を分離することを特徴とする不溶性物質の分離方法。
【請求項２】
前記不溶性物質は、各液相に対する親和力の相違により相移動し、いずれか１相に分配されることを特徴とする請求項１記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項３】
前記各液相が水溶液相であることを特徴とする請求項１又は２記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項４】
前記液相二相界面に前記不溶性物質の懸濁液を供給し、前記懸濁液に含まれる不溶性物質を二相に分配することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項５】
前記不溶性物質が細胞であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項６】
前記懸濁液が細胞懸濁液であることを特徴とする請求項４記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項７】
前記細胞懸濁液が血液であり、赤血球と白血球を互いに異なる液相に分配することを特徴とする請求項６記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項８】
二相界面を形成する液相が、ポリエチレングリコール水溶液相と、デキストラン水溶液相であることを特徴とする請求項７記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項９】
前記液相二相界面を複数組形成し、各液相二相界面において不溶性物質の分配を行うことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の不溶性物質の分離方法。
【請求項１０】
基板上にそれぞれ異なる液相が供給される微小流路が形成されるとともに、これら微小流路が互いに合流する合流領域を有し、
前記合流領域において各液相の層流により液相二相界面が形成され、当該液相二相界面において不溶性物質の分離が行われることを特徴とする不溶性物質分離デバイス。
【請求項１１】
前記基板は、シリコンゴム材料により形成されていることを特徴とする請求項１０記載の不溶性物質分離デバイス。
【請求項１２】
前記微小流路が形成された基板の表面が酸素プラズマにより表面改質されていることを特徴とする請求項１１記載の不溶性物質分離デバイス。
【請求項１３】
前記液相二相界面に不溶性物質の懸濁液を供給する微小流路を有することを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項記載の不溶性物質分離デバイス。
【請求項１４】
前記液相二相界面を構成する微小流路対が複数組形成されていることを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の不溶性物質分離デバイス。
【請求項１５】
前記不溶性物質が細胞であり、細胞分離デバイスであることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか１項記載の不溶性物質分離デバイス。
【請求項１６】
前記懸濁液が血液であり、血液分離デバイスであることを特徴とする請求項１３記載の不溶性物質分離デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、二相分配法を応用した新規な不溶性物質の分離方法に関するものであり、さらには、例えば細胞分離デバイスや血液分離デバイスとして使用可能な不溶性物質分離デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】  生理学、医学をはじめとするバイオサイエンスの分野における最終的な研究目標の一つに、生命現象のメカニズムを解明することが挙げられる。さまざまな機能物質により生じる複雑な生命現象を、詳細に解明していくために、各々の研究分野において、対象とする物質を単離精製するための分離システムが数多く用いられており、細胞を扱う研究分野においても、細胞の分離技術が数多く用いられている。【０００３】  ただし、細胞は生きている材料であるため、独自の分離効率の評価系が存在する。具体的には、「純度」、「生存率（活性）」、「回収率」の三つが評価対象に挙げられ、それぞれが高いことが理想的であるとされている。また、同じ細胞株であっても、個々の細胞の性質が少しずつ異なっており、性質の均一な分子を分離精製する場合以上に操作が困難なものになっている。さらに、細胞は圧力等の外部からのわずかな刺激によっても性質が変化する場合があるため、より温和な条件での分離技術が要求される。【０００４】  現在、主に用いられている細胞の分離技術は大きく二つに分けられる。一つは細胞が本来有する性質の違い（大きさ、比重、膜表面の特性、電荷等）を利用して分離するものである。例えば、密度勾配遠心分離法や単位重力沈降法等、細胞の大きさや密度の違いにより分離する手法や、細胞表面のわずかな性質の違いで分離を行う水性二相分配法、細胞懸濁液に電場を印加して細胞毎の誘電率の違いにより分離する電気泳動法等である（例えば、非特許文献１〜非特許文献４等を参照）。【０００５】  もう一つは、細胞へ抗体や化学物質を結合させ、強制的に細胞の性質を変化させる手法である。これには、アフィニティークロマトグラフィー法や、蛍光標識細胞分離システム（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離システム（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）等がある（例えば、非特許文献５〜非特許文献７等を参照）。これらの方法では、蛍光物質または磁気微粒子で修飾した抗体と細胞を特異的に結合させるため、迅速性や分取純度に優れている。そのため様々な手法がある中で、近年では、抗体を利用したＦＡＣＳ、ＭＡＣＳが分離技術の主流となりつつある。【０００６】  以下、現在用いられているいくつかの分離技術について詳細を述べる。先ず、水性二相分配法（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）であるが、化学合成物質の精製方法の技術として、二種類の混合しない溶液を用いることで、物質の溶解度の違いにより分離を行う液−液抽出分離法が存在する。この手法で用いられる溶液は、主に水溶液と有機溶媒の組み合わせによるもので、目的物質の各溶媒への溶解度の違いにより分離を行う。例えば、脂質が水溶液よりも有機溶媒によく溶けるという性質から、合成した物質を溶液から取り出すために、古くから頻繁に利用されていた。この原理を、１９５６年にＰ．Ａ．Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎらが、有機溶媒を使用せずに、水溶液のみを使用した分離技術として開発したものが水性二相分配法（ＡＴＰＳ）の始まりである。その後、Ｈ．Ｗａｌｔｅｒらによってタンパク質等の生体物質の分離に応用される��うになり、さらには細胞分離技術へと応用された。これがＡＴＰＳによる細胞分離の初の試みであった。当時は密度勾配遠心分離法が主流であり、哺乳類動物細胞のほぼ全てが狭い範囲の密度（１．００５〜１．０１ｇ／ｍＬ）であるため、多種類の細胞を分離することは不可能であった。そのためＡＴＰＳによる分離は、従来法では分離できなかった細胞の分離が可能となり、バイオサイエンスにおける新たな細胞研究の発展の一端を担う技術となった。【０００７】  ＡＴＰＳの詳細は以下のとおりである。二種類の水溶液を、溶液の臨界濃度（溶液が均一に混じりあう限界濃度）を超える比率で混合した場合、水溶液の溶質の結合力により界面を形成し上下の二相に分かれることが知られている。細胞をこの系に添加すると、各相に対する親和力の相違により、上相または二相界面に分布する。そして、水溶液条件（温度、濃度、イオン強度、電荷等）を変化させることで、これらの分布の状態が変化し、至適条件で分離を行うことができる。【０００８】  この原理を応用し、条件を最適化することで、細胞の表面特性の微妙な違いから細胞を分離することが可能となる。しかしながら、細胞の種類の違いが細胞表面の性質の違いにそのまま反映するわけではないので、細胞の分配比率に極端な差が生じることはまれである。さらに、遠沈管を用いて操作を行うため、水溶液だけでなく細胞までもが重力の影響を受け、本来上相にあるべき細胞が二相界面または下相へと移動してしまう。そのため、一度の操作のみでは目的とする細胞と、そうでない細胞とが混じった分画となる。したがって、目的とする細胞の純度を高めるには同様の操作を複数回繰り返す必要があり、それに伴い試薬を多量に消費するといった問題等がある。【０００９】  次に、蛍光標識細胞分離システム（ＦＡＣＳ）は、１９６９年にアメリカ合衆国国立予防衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ：ＮＩＨ）を中心に、カリフォルニア大学Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ科学研究所のＮ．Ａ．Ｖａｎ  Ｄｉｌｌａらのグループと、スタンフォード大学のＬ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇらが並行して細胞免疫系研究のための技術開発を行ったのがきっかけである。１９６５年に発表されたＦｕｌｗｙｌｅｒの原理を利用した超音波振動子（ｕｌｔｒａ  ｓｏｎｉｃ  ｎｏｚｚｌｅ  ｖｉｂｒａｔｏｒ）を応用することで、細胞を含む溶液を微細な液滴にし、細胞を一つずつ操作することが可能となり、細胞分離装置として１９７２年にＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から発売された。【００１０】  ＦＡＣＳの原理の詳細は以下の通りである。蛍光染色した細胞懸濁液を微細管に通し、レーザー光線を細胞に照射し散乱光と蛍光を検出する。散乱光のうち直進方向のものにより細胞の大きさを、直角方向のものにより細胞内構造を検出する。蛍光により目的とするＤＮＡや細胞表面分子等の生物学的特徴を分析する。さらに、細胞分取機能として、細胞懸濁液に超音波振動を与え液滴に変換し、荷電された後、陰陽極板間を通過させることで各液滴の軌道を変化させ、種類別に異なる収集管に収集される。こうして二種類以上の細胞に分類される。【００１１】  当初は相対的ＤＮＡ量測定に用いられていたが、細胞工学分野において細胞表面抗原の解析に利用されるようになり、さらには染色体の分取、ガン遺伝子の分析、幹細胞の分取等、広く応用されるようになった。この手法は、蛍光修飾した抗体を細胞と結合させるため、抗体の持つ高い分子認識能を利用でき、純度の高い分離精製を行うことが可能である。【００１２】  しかしながら、蛍光物質は細胞に対し毒性を示すことが知られており、これが原因で生存率の低下を生ずることもある。また、抗体を結合させることにより細胞内シグナル伝達等の生理的反応を生じさせる恐れがあるため、全ての細胞への適用が必ずしもできないという問題もある。さらに、装置が高価でかつ大型であるため、汎用性に欠けるという問題もある。【００１３】  磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ）は、１９８４年にＯｗｅｎ  Ｃ．Ｓ．らにより開発された分離手法である。ＦＡＣＳの欠点のひとつである蛍光物質の使用による細胞へのダメージの軽減を目的として開発された。【００１４】  ＭＡＣＳの詳細は以下のとおりである。目的とする細胞表面分子を特異的に認識する抗体に磁性を示す微粒子を修飾し、細胞と抗原抗体反応を起こさせる。これにより目的の細胞が磁力を帯び、磁場の発生しているカラムに通すことで磁力により誘導し分離するというものである。抗体へ修飾させる物質としては、細胞内ライソゾームにより分解が可能であるとされる直径５０ｎｍ程度の磁気微粒子が用いられている。強力な磁場を用いることで、より迅速な分離が可能であると言われている。【００１５】  しかしながら、この手法は磁気微粒子との結合が可能な抗体に限られ、また対象とする細胞が磁気微粒子を非特異的に吸着しない細胞に対してのみ有効であること等、使用に制約がある。現在この手法が用いられている細胞は、造血前駆細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、顆粒球等の非接着性の浮遊細胞がほとんどである。これは、接着細胞の場合、磁気微粒子やカラムに非特異的に吸着してしまうのが原因である。
【非特許文献１】    Ｏｔｔｅｓｅｎ  Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ  Ｒ．：Ｄｅｎｓｉｔｙ−ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｃ  Ｒ  Ｔｒａｖ  Ｌａｂ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  ２９  ４１７，（１９５５）
【非特許文献２】    Ｍｉｌｌｅｒ  Ｒ．Ｇ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｒ．Ａ．：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７３  １９１，（１９６９）
【非特許文献３】    Ｗａｌｔｅｒ  Ｈ，，Ｋｒｏｂ  Ｅ．Ｊ．：Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｗｏ−ｐｏｌｙｍｅｒ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅｓ．Ｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｂｅｅｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｐｉｄ，ｃｈａｒｇｅ  ａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｌｉｇａｎｄ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．７８  １０５，（１９７７）
【非特許文献４】    Ｈａｎｓｅｎ  Ｅ，Ｈａｎｎｉｇ  Ｋ，：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０８  １８０，（１９８４）
【非特許文献５】    Ｗｉｇｚｅｌｌ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ：Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｏｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ  ６  ３６９，（１９７２）
【非特許文献６】    野村，和弘：フローサイトメトリー手技と実際癌と化学療法社，東京
【非特許文献７】    Ｋｅｍｓｈｅａｄ  Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅａｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ，ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．５４，７７１，（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】  以上のように、従来、細胞分離に用いられている技術を見てみると、特異性の高いものや、迅速に行えるもの等、複数の手法がある。しかしながら、煩雑な操作による作業時間の増加、多量の必要試薬量、大型装置によるコスト、分離可能細胞種の限定等、様々な問題点も数多く存在し、そのため生理現象の解明に関わる研究における発展の妨げの要因となっている。このような状況から、より優れた細胞の分離技術の登場が期待されている。新たな分離技術が確立されれば、細胞生物学、免疫学、創薬、医療等、幅広い研究分野での応用にもつながることが期待される。【００１７】  そこで、本発明は、例えば抗体による標識を行わず細胞への影響を軽減しながら細胞分離を高効率で行うことができ、しかもシステムの小型化や簡便化を実現することが可能な新規な不溶性物質の分離方法、不溶性物質分離デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】  上述の目的を達成するために、本発明の不溶性物質の分離方法は、微小流路中において生ずる層流により形成される液相二相界面により不溶性物質を分離することを特徴とする。また、本発明の不溶性物質分離デバイスは、基板上にそれぞれ異なる液相が供給される微小流路が形成されるとともに、これら微小流路が互いに合流する合流領域を有し、前記合流領域において各液相の層流により液相二相界面が形成され、当該液相二相界面において不溶性物質の分離が行われることを特徴とする。【００１９】  細胞等の不溶性物質の分離技術は、生物化学、医学等の研究分野のみならず、医療等の身近な分野においても必要かつ重要な技術であることは明白である。しかしながら、現在の細胞分離技術を見てみると、さまざまな問題があり、研究の技術的な律速段階を迎えているものもある。このため、新たな分離技術の登場が望まれている。【００２０】  そこで、本発明においては、細胞への修飾等がないために負担の少ない水性二相分配法と、反応効率の上昇を期待できる微細加工技術の二つに注目した。本発明は、これらの二つの技術を組み合わせることで互いの長所を生かした、全く新しい分離方法、分離デバイスである。【００２１】  本発明の分離方法、分離デバイスでは、二相分配をフローシステムで行うが、これによりサンプル調製及び分離が単純な操作で済むようになり、解析へ容易に移行できるため、時間、労力、コストの削減へとつながる。これらの特徴は汎用機器に必須のものであり、例えば、これらを満たす細胞分離装置は研究の新たな一歩へ大きく貢献できると考えられる。さらに、このデバイスでは、生体内の状態により近い状態を保った細胞を分離することが可能となるので、再生医療に用いられる幹細胞の高純度化等、細胞生物学的な研究に貢献できると考えられる。また、デバイスの流路をマルチ化させれば、より多くの細胞を同時に分離することも可能である。
【発明の効果】
【００２２】  本発明によれば、重力の影響を受けることなく、不溶性物質を二相分配法により効率的に分離することができる。したがって、例えば抗体による標識を行わず細胞への影響を軽減しながら細胞分離を高効率で行うことが可能である。また、本発明は、微細加工技術により形成される微小流路を利用しているので、システムの小型化や簡便化を実現することが可能である。これらのことより、本発明により、例えば、学術的な利用から臨床等の実用的な利用まで、幅広く応用することが可能な新規細胞分離システムを実現することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  以下、本発明を適用した不溶性物質の分離方法、不溶性物質分離デバイスについて、図面を参照して詳細に説明する。【００２４】  本発明の不溶性物質の分離方法は、微細加工技術により形成された微小流路中において、層流により形成される液相二相界面における二相分配により不溶性物質を分離するというのが基本的な考えである。【００２５】  微細加工技術は１９５０年代から半導体素子等の電子回路の分野で発展を遂げた技術である。その後、光感受性樹脂を用いたフォトリソグラフィー技術が開発され、１９８０年代にはマイクロマシン技術へと発展し、今日のマイクロデバイスへと応用されるようになった。微細加工技術をさまざまな装置の作製に応用することで、装置や反応槽の小型化、検出系における総試薬量の減少、さらには高感度化が得られることもあり、近年、ますます脚光を浴びるようになった技術である。最近では、微細加工技術が医療現場等にも応用されるようになり、例えば、無痛針の開発、極微ＰＣＲを用いた遺伝子診断等、様々な手法が新たに登場してきている。【００２６】  微細加工技術は細胞の分離技術にも既に応用され始めており、新たなデバイスも登場してきている。微小流路に電極パターンを蒸着し誘電泳動力により細胞を分離するデバイス、微小流路全体に電場をかけることで電気泳動により細胞分離を行うデバイス、微小流路で蛍光標識抗体と結合させた細胞を識別し分離するデバイス、微小流路に磁場をかけ磁気粒子標識抗体と結合させた細胞を分離するデバイス等である。しかしながら、これら従来のデバイスは分離システムの反応槽のみが小型化されているにすぎず、原理に関しては従来のＦＡＣＳやＭＡＣＳ等と同様であり、検出器を含めた装置全体としては依然として大型のものとなってしまっている。また、デバイスの制御装置の操作や分離のための前処理に関しても、やはり高度な専門知識と熟練した技術を必要とし、従来法における問題点の根本的な解決には至っていない。そのため、依然として分離可能な細胞種の限定、細胞へのダメージ、煩雑な作業による経過時間、大型で高価な分析装置であること等、以前と状況は変わっていない。【００２７】  そこで本発明では、微細加工技術を応用した新規フロー型デバイスを作製し、分離から検出、及び採取までを一連の作業で行うことを可能とした。本発明は、二相分配法を応用し、蛍光物質や抗体等による標識を必要としない分離方法であるため、分離に伴う前処理を必要とせず、例えば細胞活性の低下を抑えることができるシステムである。さらに、煩雑な作業による時間経過を抑えることが見込めるだけでなく、装置全体の小型化、簡便化も見込むことができ、より汎用性の高い分離システムの作製が可能である。したがって、本発明の分離方法、分離デバイスによれば、従来法の問題点を根本的に回避しうるシステムを確立することが可能である。【００２８】  図１は、本発明の分離方法、分離デバイスにおいて不溶性物質を分離する原理を示すものである。本発明の分離方法、分離デバイスにおいては、微小流路１と微小流路２を形成し、これら微小流路１，２にそれぞれ異なる液相Ａ，Ｂを供給する。そして、これら微小流路１，２は、領域１ｂ，２ｂにおいて合流させ、この領域１ｂ，２ｂにおいて、層流により液相Ａ，Ｂ間に液相二相界面Ｃを形成する。【００２９】  一方、これら微小流路１，２の合流地点には、各種不溶性物質を含む懸濁液を前記液相二相界面に供給する懸濁液供給路３を設ける。この懸濁液供給路３から懸濁液を供給すると、不溶性物質は、各液相Ａ，Ｂに対する親和力の相違により相移動し、いずれか１相に分配される【００３０】  例えば、前記懸濁液供給路３から供給される懸濁液中に、親水性の不溶性物質△、疎水性の不溶性物質□、両親媒性の不溶性物質○が混在しているとする。微小流路１では、親水性の液相Ａが、供給路１ａから前記液相二相界面Ｃを形成する領域１ｂを通って、排出路１ｃにおいて液相Ｂと分離されて排出される。微小流路２では、疎水性の液相Ｂが、供給路２ａから前記液相二相界面Ｃを形成する領域２ｂを通って、排出路２ｃにおいて液相Ａと分離されて排出される。【００３１】  このとき、懸濁液中の親水性の不溶性物質△は、二相分配によって親水性の液相Ａ側に移行し、そのまま液相Ａとともに排出路１ｃにおいて他の不溶性物質と分離されて排出される。同様に、懸濁液中の疎水性の不溶性物質□は、二相分配によって疎水性の液相Ｂ側に移行し、そのまま液相Ｂとともに排出路２ｃにおいて他の不溶性物質と分離されて排出される。懸濁液中の両親媒性の不溶性物質○は、液相Ａや液相Ｂのいずれか一方に移行することなく、そのまま懸濁液供給路３から排出される。以上により、重力の影響を受けることなく、懸濁液中の不溶性物質の分離が行われる。【００３２】  前述の分離方法において、液相Ａ，Ｂの組み合わせは任意であり、不溶性物質に対する親和力が異なればよい。例えば、水性の液相と油性の液相の組み合わせ、水性の液相同士の組み合わせ、油性の液相同士の組み合わせ等を挙げることができる。後述の細胞、例えば血液の分離等においては、水性の液相同士の組み合わせによる分配、すなわち水性二相分配が好適である。具体的には、水性二相として、ポリエチレングリコール水溶液相とデキストラン水溶液相の組み合わせ等を用いる。【００３３】  分離対象となる不溶性物質としても、あらゆる種類の不溶性物質に適用することが可能であり、例えば細胞、特に血液細胞（赤血球、白血球）の分離等に応用することができる。細胞の分離に応用する場合には、懸濁液として細胞懸濁液、例えば血液を二相界面に供給することになる。【００３４】  本発明の分離デバイスは、前述の微小流路を基板上に形成したものであり、基板上にそれぞれ異なる液相が供給される微小流路が形成されるとともに、これら微小流路が互いに合流する合流領域を有し、前記合流領域において各液相の層流により液相二相界面が形成され、当該液相二相界面において不溶性物質の分離が行われるものである。分離対象となる不溶性物質が細胞である場合、細胞分離デバイスであり、血液である場合には、血液分離デバイスである。【００３５】  前記基板には、液相に応じて任意の材料を使用することができるが、例えばポリジメチルシロキサン等のシリコンゴム材料が汎用性が高い。また、微小流路が形成された基板の表面を、酸素プラズマや、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマー等により表面改質することも可能である。【００３６】  以上が本発明の分離方法、分離デバイスの基本構成であるが、さらに様々な変形、応用が可能である。例えば、前記液相二相界面を構成する微小流路対を複数組形成し、より多くの種類の不溶性物質を分離することも可能である。図２は、基板１１上に、液相二相界面を構成する微小流路１２を、いわばトーナメント表のように形成し、懸濁液中の不溶性物質を下流に行くにしたがって次々に分離するようにしたものである。図２の例では、例えばＡ〜Ｊの１０種類の不溶性物質の分離が可能である。
【実施例】
【００３７】  以下、本発明の分離方法、分離デバイスについて、具体的な実験結果に基づいて説明する。【００３８】＜微小流路における微小粒子の分配挙動＞
本発明において用いる細胞の分離技術は、水性二相分配法（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：ＡＴＰＳ）である。用いる二種類の水溶液は、種類、分子量、濃度、塩濃度、温度等の条件により、二相界面の形成の有無が生じる。また、細胞は表面の性質の違いに依存してＰＥＧ相またはＤｅｘ相及び二相界面に分布する。そのため、細胞の分離条件を最適化するためには、溶液の分配による二相界面の形成条件、物質表面の性質の違いと溶液における分布の相関関係を検討する必要がある。【００３９】  そこで本実験では、先ず、溶液の分配による二相界面の形成の有無を検証するため、ＰＥＧ及びＤｅｘの分子量、濃度をさまざまに変えることで、二相界面の形成条件の検討を行った。なお、本実験では、基本原理の最適化の段階から細胞を想定した実験を行った。細胞のモデルとしては、細胞と同程度の大きさと密度を有する微粒子を用いた。これらの結果からＡＴＰＳによる微粒子の分配における最適条件を導き出すことを試みた。また、従来法のＡＴＰＳにおける欠点である重力の影響を軽減するために、微細加工技術を用いて微小流路を作製し、微小流路中において生じる層流により形成される二相界面により、ＡＴＰＳをおこない微粒子を分離することを試みた。微小流路においては、通常の試験管で行う系とは異なり、流路の形状や送液する液量、組成等により、溶液の二相界面の形成の有無に変化が生じることが推測されるため、流路の形状及び送液流量の検討を行うことにより、フロー型ＡＴＰＳ及び微粒子の分配の最適化を行った。【００４０】試料、試薬
試料及び試薬は、従来法である試験管におけるＡＴＰＳ及び微小流路におけるフロー型ＡＴＰＳのいずれにおいても、同様の試薬を用いた。二相系を形成する水溶性高分子の組み合わせはいくつかあるが、本実験では、細胞の分配によく用いられているポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）及びデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ：Ｄｅｘ）を用いて行った。ただし、ＰＥＧは分子量６００以下のものは細胞毒性（発ガン促進作用）を持つことが知られており、分子量６００以上のもので検討の実験を行った。ＰＥＧは平均分子量３３５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、６０００（ナカライテスク社製）、及び８０００（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）を用いた。Ｄｅｘは平均分子量４０，０００（商品名＃４００００，和光純薬社製）、及び５０００００（商品名Ｔ−５００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）のものを用いた。なお、試薬の溶解、希釈はリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−），ｐＨ７．４）を用いて行った。調製した試薬は、メディウム瓶に入れオートクレーブ（ＳＤ−３２０，トミー精工社製）にて滅菌（１２１℃，２ａｔｍ）した後、使用した。【００４１】  微小流路の作製は、一般的な細胞の大きさが６〜２０μｍであるため、その大きさに流路形状を合わせ、フォトリソグラフィーにより作製した。デバイスの作製は、特別な記述のない限り電子工業用（ＥＬ）を用いて行った。また、デバイスには透明で、蛍光観察等の際に光の吸収及び自家蛍光が少なく、生体試料への毒性がないとされている材料である、シリコン系樹脂のｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ（ＰＤＭＳ，商品名ＳＹＬＧＡＲＤ  １８４  ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｅｌａｓｔｏｍｅｒ，Ｄｏｗ  ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ  ｓｉｌｉｃｏｎｅ社製）を用いた。細胞のモデルとして用いる微小粒子は、ポリスチレン製のものを選択した。大きさは直径１μｍ及び６μｍのビーズ［ＰｏｌｙｂｅａｄＴＭＰｏｌｙｂｅａｄｓ６μｍ，１μｍ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）］を用いて実験を行った。【００４２】器具、装置
二相界面の形成条件の検討においては、調製した溶液を丸底チューブ（５ｍＬ，Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）へ分注し、ボルテックス（ＭＳ１−Ｓ１、ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社製）を用いて均一となるように攪拌を行った。また、遠心分離を行う必要がある場合には、遠心分離機（ＳＲＸ−２０１，トミー精工社製）を用いて行った。【００４３】  フォトリソグラフィーにおいては、ホットプレート（ＤＡＴＡＰＬＡＴＥ，井内盛栄堂社製）による加熱と、紫外線照射装置（ＭＪＢ３，Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ社製）によるリソグラフィーを行った。【００４４】  微小流路における送液に関しては、最大容量が１ｍＬ及び５００μＬのガラスシリンジ（テフロンルアーロック型，ＨＡＭＩＬＴＯＮ社製）とマイクロシリンジポンプ（ＥＳＰ−６４，エイコム社製）、ＦＥＰチューブ（直径０．１５±０．０５ｍｍ，ＢＡＳ社製）、チューブコネクタ（ＢＡＳ社製）を用いた。【００４５】ＡＴＰＳにおける微小粒子の分配
本実験では、従来法によるＡＴＰＳにおける、表面特性の異なる微小粒子の分離のための条件検討を行った。この実験において、二相界面を形成させるための水溶液は、ＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液を用いて検討を行った。ＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液の混合体積比率は同率とし、濃度を１〜１０％の間を１％刻みで検討した。薬剤として用いられるＤｅｘの濃度が１０％であることを参考に１０％を越えない濃度での条件検討とした。また、分子量についてはＰＥＧを３種類（Ｍ．Ｗ．３，３５０，６，０００，８，０００）、Ｄｅｘを２種類（Ｍ．Ｗ．４０，０００，５００，０００）用いて、合計６通りの組み合わせで検討した。また、微小粒子は親水性及び疎水性の２種類を用いて実験を行った。ポリスチレンは本来疎水性の特性を有する。そのため、親水性の微小粒子には、粒子表面にカルボキシル基が修飾されたポリスチレンビーズを用いて実験を行った。従来法のＡＴＰＳは重力の影響を受けやすいので、微小粒子がコロイド溶液となる直径１μｍのものを用いて検討を行った。また、観察の利便性のために、親水性ビーズはＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）がとり込まれたポリスチレンビーズを用いた。なお、二相界面の形成及び、微粒子の分離の観察は、１時間静置後及び２４時間静置後に目視で行った。【００４６】送液条件の検討
流路の作製
微小流路の作製工程はクリーンルームにおいて行った。手順を以下に示す。先ず、４インチ半導体シリコンウェハー（結晶面１，０，０）片面鏡面研磨（信越化学工業社製）を超音波洗浄器（２５１０Ｊ−ＭＴＨ，日本エマソン社製）により超純水の超音波洗浄（５ｍｉｎ）で表面の埃等を洗浄した。次いで、アセトン煮沸洗浄（５ｍｉｎ）により表面の有機物を除去し、最後にフッ化水素酸（関東化学社製）・フッ化アンモニウム（関東化学社製）（混合比１：６）を用いた洗浄（５ｍｉｎ）により自然酸化膜の除去を行い、表面を乾燥させたものを基板とした。【００４７】  基板上に光硬化性樹脂（商品名ＮＡＮＯＴＭ  ＳＵ−８  １００、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製）を、厚みが１００μｍになるようにプログラム（１０００ｒｐｍ，３０ｓｅｃ）したスピンコート装置（１Ｈ−ＤＸ２，ミカサ社製）で塗布した。次いで、ホットプレート上で、露光前段階硬化（６５℃：１０ｍｉｎ，９５℃：３０ｍｉｎ）を行った。ＯＨＰシートに印刷したフォトマスク（山田写真製版社製）と、紫外線露光装置（ＭＪＢ−３，Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ社製）を用いて、紫外線照射（１０ｓｅｃ）を行い、流路形状に樹脂を硬化させた。さらに、ホットプレート上で、露光後段階硬化（６５℃：１ｍｉｎ，９５℃：１０ｍｉｎ）を行った。【００４８】  現像液として商品名ＮＡＮＯＴＭ  ＳＵ−８  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒに浸潤（１０ｍｉｎ）させ、樹脂の非硬化部を除去し、鋳型とした。シリコン系樹脂（ＰＤＭＳ）の商品名ＳＹＬＧＡＲＤ  １８４  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ主剤と架橋剤とを均一になるように混合（混合比１０：１）し、デシケータで減圧脱泡した後、鋳型の上に流し込んだ。オーブン（ＤＫＮ  ３０１，ヤマト科学社製）で加熱（８０℃，１５０ｍｉｎ）しＰＤＭＳを硬化させた。鋳型からゆっくりとはがし、流路構造を有するＰＤＭＳを得た。ＰＤＭＳを超純水で濯いだ後、沸騰したアセトンに浸漬（１０ｓｅｃ）し、表面の有機物を除去した。表面を乾燥させた後、反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ，Ｓａｍｃｏ社製）によりプラズマ照射（Ｏ２，１００ＳＣＣＭ，８．８Ｐａ，１００Ｗ，１０ｓｅｃ）して表面改質した。表面改質により流路と平板を不可逆的に貼り合せて微小流路デバイスとした。【００４９】流路形状による二相界面の形成条件の検討
微小流路に溶液を二種類以上の導入部から送液し、合流させた場合に、層流現象により界面が形成される。本実験では、この層流現象を利用して、微小流路中に二相界面を形成するための条件の検討を行った。ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液はともに粘性が高いため、流路形状に伴い、層流現象による二相界面の形成位置に変化が生じると考えられる。そこで、導入部と回収部の合流部位の角度を検討することで、形成される二相界面の安定化が図れると考え実験を行った。具体的には、先に検討したＡＴＰＳで微小粒子が分離する組成の水溶液をもとに、作製したデバイスへ溶液を送液した。なお送液には、微量でも正確に送液を行うことが可能なシリンジポンプと、ガスタイトシリンジを使用した。層流現象は流速の速い場合に起こる現象であるため、３μＬ／ｍｉｎで送液した。微小流路の合流部位の角度は、１０，１５，３０，４５度のそれぞれで検討を行った。【００５０】流速による二相界面の形成条件の検討
微小流路で起こる層流現象において、長時間二相の界面が接することで溶質の拡散が起こり、二相界面が不明瞭なものになる場合がある。そこで本項では、層流現象により形成されたＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液の二相界面が、流路終末部においても安定して形成されるための送液条件の検討を０．１〜３μＬ／ｍｉｎの範囲で行った。評価は送液量を固定して１時間後に、顕微鏡下で観察を行った。【００５１】微小流路デバイスにおける微小粒子の分配挙動
本実験では、先に検討した層流現象による二相界面形成のための流路形状、及び送液量をもとに、微小流路中で起こるＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液による二相界面を用いて、表面特性の異なる微小粒子の分離を試みた。具体的には、前項までで最適であると考えた条件をもとに送液を行った。流路形状は、導入部の合流部が１５°のものを用いた。組成はＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）をもとに、送液量は２〜３μＬ／ｍｉｎの間で検討を行った。微小粒子は細胞と比重が近いポリスチレンのビーズ（１．０５ｇ／ｃｍ３）で、細胞と同程度の大きさの直径６μｍのものを用いて実験を行った。表面特性としては、疎水性の非修飾ポリスチレンビーズ、及び親水性のカルボキシル基修飾ポリスチレンビーズを用いて実験を行った。微小粒子の挙動は、親水性ポリスチレンビーズとしてＦＩＴＣ含有のものを用い、蛍光顕微鏡により観察した。サンプルの送液は、二相界面形成のためのＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液の流速と等しくなるように算出した送液量（０．１〜０．４μＬ／ｍｉｎ）をもとに考察を行った。【００５２】結果
ＡＴＰＳにおける微小粒子の分配
ＡＴＰＳにおいて、微小粒子の表面特性と二相界面形成水溶液との相互作用の様子を観察したところ、二相界面を形成する濃度条件、分子量の組み合わせのうち、表面特性に依存して微小粒子を分離することが可能なものは、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）であった。懸濁後１時間静置すると、微小粒子のうち、表面にカルボキシル基が修飾された親水性のポリスチレンビーズは、Ｄｅｘ相へ分布することが観察された。また、表面になにも修飾されていない疎水性のポリスチレンビーズは、ＰＥＧ相へ分布することが観察された。ただし、懸濁後２４時間静置すると、親水性ビーズ及び疎水性ビーズが、共に二相界面に分布することが観察された。【００５３】  微小粒子の表面特性に依存して分離を行うことができたのは、以下の二点のように考えられる。先ず、ＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液は、相対的にみるとＰＥＧ水溶液が疎水性でＤｅｘ水溶液が親水性を示す。そのため、疎水性のポリスチレンビーズがより疎水性のＰＥＧ相に分布し、親水性のカルボキシル基修飾ポリスチレンビーズがより親水性のＤｅｘ相に分布したと考えられる。次に、親水性ビーズに修飾されているカルボキシル基は、水酸基と水素結合を示すことが知られており、ＰＥＧ分子に比べＤｅｘ分子には水酸基が多く存在するためにＤｅｘ相へ分布する。しかしながら、疎水性のポリスチレンビーズは、表面に官能基がないために極性を持たない。よって、本来のコロイド溶液の形態をとるが、比重によりＰＥＧ相に分布すると考えられる。【００５４】  一方、２４時間の静置により、それぞれのビーズが二相界面に移動した理由は、ポリスチレンの比重（１．０５ｇ／ｃｍ３）がＤｅｘの比重（１．０７７ｇ／ｃｍ３）よりも小さく、ＰＥＧの比重（１．０４６〜１．０４７ｇ／ｃｍ３）よりも大きいからであると考えられる。このような比重の影響による粒子の移動は、細胞のような密度分布が狭い範囲に集中する物質においては、回収が困難となり分離精度を低下させる大きな要素となると考えられる。【００５５】流路形状による二相界面の形成条件
ＡＴＰＳにおいて、表面特性に依存した分離が可能である組成ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）をもとに、合流部流路形状の異なるものを用いて、微小流路における層流の形成を試みた。合流部の相対角度が３０°及び４５°のものでは、送液した場合にＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液が導入部において混じりあい、白濁した溶液となることが観察された。また、１０°のものでは、合流部に空間のようなものが観察された。１５°のものでは、回収部まで安定して二相界面が形成された。その結果、形状により二相界面の形成に違いが観察された。ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液の導入部形状は、反応槽流路に対して１５°程度の角度があるものが、最も安定して二相界面を形成することができたことから、以後のフロー型ＡＴＰＳでは、この条件で設定した流路を用いることとした。【００５６】  この現象に関しては以下のことが考えられる。３０°及び４５°の流路においては、ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液が反応槽に流れ込み、回収部へ流れていく力と、ＰＥＧ水溶液がＤｅｘ水溶液導入部へ流れていく力が近いために、懸濁され白濁溶液になると考えられる。一方１０°の流路においては、フォトリソグラフィーによる流路作製の精度限界によるものであると考えられる。ＳＵ−８を用いた技術で作製が可能な流路は２０μｍ程度以上であるとされているが、合流部の角度が小さいと流路同士の隔壁が正確に作製されないために、流れの影響により空間が形成されると考えられる。【００５７】流速による二相界面の形成条件
最適化した流路形状をもとに、微小流路における二相界面形成のための最適送液量の検討を行った。その結果、送液量が少ない０．１〜０．９μＬ／ｍｉｎの場合は、流路の終末部においてＤｅｘ相にエマルジョンが形成され、二相界面の維持が不安定であることが観察された。送液量が１〜３μＬ／ｍｉｎ以上の条件においては、長時間の送液を行った場合でも安定した二相界面が形成されていることが確認された。エマルジョンは、Ｄｅｘ水溶液中に混じりあったＰＥＧ水溶液が、安定な形状をとるために発生する液胞である。この現象により、ＰＥＧ相に分布していた物質が、エマルジョンが形成される際にＰＥＧ水溶液に取り込まれ、Ｄｅｘ相のエマルジョンに含まれてしまう。これにより、Ｄｅｘ相から本来ＰＥＧ相へ分布するべき物質が回収され分離能が低下することも考えられる。よって、１μＬ／ｍｉｎ以上の送液量を最適な送液量とした。【００５８】微小粒子の分配
最適化した溶液の送液条件をもとに、微小流路において形成された層流による二相界面を用いて、微小粒子の分離を試みた。その結果、ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液の送液量が２．１〜３μＬ／ｍｉｎの場合では、同時に送液するポリスチレンビーズのサンプル溶液と層流現象を起こし、三相界面を形成してしまうため分離が行えなかった。ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液の送液量が１〜２μＬ／ｍｉｎの場合には、ポリスチレンビーズの溶媒がＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液に拡散し、反応槽中で二相界面を形成した。水溶液の組成は、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；７％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）の場合において、ポリスチレンビーズの表面の特性に依存した分布の違いが生じた。試験管で行うＡＴＰＳによるものよりもＰＥＧ水溶液の濃度が１％高いが、これは、同時に送液を行うポリスチレンビーズのサンプル溶液の溶媒により、全体的な濃度が希釈されているからであると考えられる。送液量は、迅速性を求めるため、ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液の送液量を２μＬ／ｍｉｎとした。また、ビーズサンプル溶液の送液量は０．３μＬ／ｍｉｎで行った。これは、算出したＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液の送液速度よりも若干速い送液速度になる送液量であるが、溶液を合流させるための力として、送液量が多くなったと考えられる。【００５９】  微小粒子の分離は、ＡＴＰＳの場合と同様に、表面にカルボキシル基を修飾した親水性のポリスチレンビーズが、Ｄｅｘ相へ移動することが観察された（図３）。また、非修飾の疎水性のポリスチレンビーズは、二相界面の位置から移動しないことが観察された。これは、ＡＴＰＳによる分離と同様に、親水性のポリスチレンビーズの表面に修飾されたカルボキシル基とＤｅｘとの親和性がＰＥＧと比べて高いからであると考えられる。疎水性のポリスチレンビーズは、表面に官能基がないため、どちらの水溶液とも引力が働かないために、二相界面から移動しなかったと考えられる。フロー型ＡＴＰＳにおける微小粒子の移動は、重力方向と直交する方向への移動であるため、比重等の影響によるものではなく、表面特性に依存した移動であると考えられる。【００６０】＜微小流路における細胞の分配挙動＞
生きている材料である細胞は、細胞周期等により個々の性質が微妙に異なる集団であるため、同種の細胞であっても均一な集団ではない。そのため、種別に分離することが困難なものになっている。ＡＴＰＳは、細胞表面に存在する脂質や糖鎖等の分子のわずかな違いでも分離することが可能であるため、原理上、表面特性の類似した異種細胞を分離することが可能であるとされている。しかしながら、細胞そのものの比重により混在してしまい、正確な分離が困難となっているのが現状である。【００６１】  先の実験においては、ＰＥＧとＤｅｘによるＡＴＰＳにより、微小粒子が表面特性（親水性、疎水性）に依存して、異なった相に分布することが観察されたが、比重による微小粒子の移動が観察され、ＡＴＰＳにおける問題点も浮き彫りにされた。一方、重力の影響を大幅に軽減することが可能である微小流路において、送液による層流現象を発生させ、二相界面を形成させることが可能であることを観察した。さらに、フロー型ＡＴＰＳにおいて、重力の方向と直交する方向への微小粒子の移動が観察され、フロー型ＡＴＰＳの有効性が確認された。【００６２】  そこで、本実験においては、先に得られた知見をもとに、フロー型ＡＴＰＳにおいて実際の細胞サンプルを分離する実験を行った。先ず、ＡＴＰＳにおける赤血球細胞とヒト急性リンパ性白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の分離において、ＰＥＧ水溶液、及びＤｅｘ水溶液の濃度を検討した。次いで、フロー型ＡＴＰＳにおいて、赤血球及びＪｕｒｋａｔのそれぞれの細胞と二種類の水溶液との相互関係を観察した。最後に、血液から白血球細胞及び赤血球細胞の分離を試みた。【００６３】試料、試薬
本実験では、先ず、実際のサンプルとして、操作が容易である非接着性血球細胞を用いることとした。ヒトＴリンパ球細胞は、正常成人で５００〜２，０００個／μＬであるため、実験等に用いるのに適当な細胞数（１０６〜１０７個／ｍＬ）を用意するのには、ヒト血液を１０〜３０ｍＬ必要とする。一方、ヒトの全血液量は体重の７〜８％であり、また血球成分の回復には時間が必要である。そのため、本実験のサンプルには、増殖能を有するＪｕｒｋａｔ（Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を選択し、用いることとした。培地には１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）−１％合成抗生物質（ＧＩＢＣＯ）−ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）を孔径０．２μｍのフィルターで濾過滅菌して使用した。【００６４】  ＡＴＰＳ及びフロー型ＡＴＰＳの条件検討に用いる試薬は、先の実験と同様のＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液を使用して行った。また、フロー型ＡＴＰＳに用いる微小流路は、先の実験において最適化されたものを用いた。【００６５】器具、装置
Ｊｕｒｋａｔの培養操作は、全てクリーンベンチ（ＣＣＶ−Ｅ，日立産機システム社製）内で行い、培養はインキュベーター（５４００Ｓｅｒｉｅｓ  Ｗａｔｅｒ−Ｊａｃｋｅｔｅｄ  ＣＯ２  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉａｎｃｅ社製）を用いて、３７℃、ＣＯ２濃度５％雰囲気下で行った。細胞の観察は蛍光顕微鏡（ＩＸ  ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて行った。また、撮影にはＣＣＤカメラ（Ａｘｉｏ  Ｃａｍ，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）及び解析ソフトウェア（Ａｘｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．６．２０  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｃｋ  ２，Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いた。フロー型ＡＴＰＳのための送液は、先の実験と同様、ガラスシリンジ及びシリンジポンプを用いて行った。【００６６】従来法におけるヒト血球細胞の分離
ヒト急性リンパ性白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の培養
本実験では、実サンプルとしての、ヒト急性リンパ性白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ，Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の培養を行った。培養手順は以下のとおりである。先ず、コンフルエントとなった細胞培養液（５ｍＬ）を遠心（２０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）し、上清を除去した。次に、培地を１０ｍＬ加え懸濁し、遠心（２０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）し、細胞を洗浄した。上清を除去し、培地１ｍＬを加え懸濁して細胞懸濁液とした。血球計算板を用いて細胞密度を計算した。スラントネック培養フラスコ（５０ｍＬ，Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に培地５ｍＬを加えた後、細胞を１×１０５個／ｍＬになるように調整して播種した。２〜３日でコンフルエント（１０７個／ｍＬ）になるので、継代培養を行った。【００６７】ＡＴＰＳによるヒト赤血球とＪｕｒｋａｔの分離条件の検討
ここでは、ＡＴＰＳにおける赤血球と白血球の二種類の水溶液との相互関係を観察するために実験を行った。実サンプルは、Ｊｕｒｋａｔ及びヘパリン採血した赤血球を用いた。ＡＴＰＳに用いる水溶液は、先の実験で最適化したＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）をもとに、検討を行った。手順は以下のとおりである。培養したＪｕｒｋａｔを遠沈管に回収し、遠心（２０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した。上清を除去した後、ＰＢＳ（−）を５ｍＬ添加し懸濁し、細胞を洗浄した。遠心（２０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した後、上清を除去し再度洗浄した。ＰＢＳ（−）を添加し、１×１０５個／ｍＬに調整し、Ｊｕｒｋａｔサンプルとした。ヘパリン採血をした血液１ｍＬをＰＢＳ（−）で倍希釈した後、遠心（２０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した。上清及びペレット上部の白血球を除去した後、ＰＢＳ（−）を添加し、１×１０５個／ｍＬに調整し、赤血球サンプルとした。遠沈管にＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液をそれぞれ１ｍＬ入れ、懸濁した溶液に、Ｊｕｒｋａｔサンプル及び赤血球サンプルをそれぞれ１００μＬ添加した。静かに懸濁した後、１時間静置し、二相界面を形成させた。二相界面の形成を確認した後、ＰＥＧ相とＤｅｘ相から溶液をそれぞれ１０μＬずつ採取し、顕微鏡下で血球計算板を用いて細胞密度を計算し、ＡＴＰＳによる細胞の分離効率を観察した。【００６８】密度勾配遠心分離法による血球細胞の分離
ＡＴＰＳによる血球細胞の分離能との比較のために、血球細胞の分離の際に一般的に用いられる密度勾配遠心分離法を用いた分離を行った。手順は以下のとおりである。ヘパリン採血を行ったヒト血液０．５ｍＬに、ＰＢＳ（−）を０．５ｍＬ添加し倍希釈し、血液サンプルとした。ここで、血球計算板を用いて、母集団の白血球の密度を観察した。ヒトリンパ球比重分離液（リンホセパールＩ，免疫生物研究所社製）を２ｍＬ入れた遠沈管に、血液サンプルを溶液が混ざらないように静かに重層し、遠心（２，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した。パスツールピペットを用いて、多層に分離したサンプルのうち、白血球層のみを回収した。ＰＢＳ（−）で５倍希釈し細胞を洗浄した後、遠心（２，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ，４℃）した。ＰＢＳ（−）を１ｍＬ添加し、血球計算板で白血球密度を観察した。【００６９】本発明法（フロー型ＡＴＰＳ）による血球細胞の分離挙動
フロー型ＡＴＰＳによるＪｕｒｋａｔの分離挙動
先に最適化した形状の微小流路において、微小流路中で起こるＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液による二相界面を用いて、ヒト白血球のモデル細胞としてのＪｕｒｋａｔの挙動を観察した。水溶液の組成は、先の「ＡＴＰＳによるヒト赤血球とＪｕｒｋａｔの分離条件の検討」の項において最適化したＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）及びＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；１０％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；６％）をもとに実験を行った。送液量は、微小粒子の分離を行った際の条件をもとに送液を行った。ＰＥＧ水溶液及びＤｅｘ水溶液は２μＬ／ｍｉｎでおこない、Ｊｕｒｋａｔサンプルは０．３μＬ／ｍｉｎをもとに送液を行った。また、用いた試薬及び実験の手順は、先に行った微小流路における操作と同じ手順で検討を行った。なお、送液するＪｕｒｋａｔ懸濁液は、細胞数が１０５個／ｍＬになるようにＰＢＳ（−）で調整したものを使用した。【００７０】フロー型ＡＴＰＳによるヒト赤血球細胞の分離挙動
Ｊｕｒｋａｔのフロー型ＡＴＰＳにおける分離の最適化条件をもとに、同様の微小流路におけるフロー型ＡＴＰＳによるヒト赤血球細胞の挙動を観察した。水溶液の組成はＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；７％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）として実験を行った。なお、実験用サンプルは、ヘパリン採血を行ったヒト血液から赤血球のみを採取し、赤血球サンプルとして用いた。また、用いた試薬及び実験の手順は、「フロー型ＡＴＰＳによるＪｕｒｋａｔの分離挙動」の場合と同様である。なお、送液する赤血球懸濁液は、細胞数が１０５個／ｍＬになるようにＰＢＳ（−）で調整したものを使用した。【００７１】フロー型ＡＴＰＳによるヒト全血細胞の分離挙動
「フロー型ＡＴＰＳによるＪｕｒｋａｔの分離挙動」及び「フロー型ＡＴＰＳによるヒト赤血球細胞の分離挙動」で得られた知見をもとに、ヒト全血からの赤血球及び白血球の分離を試みた。なお、送液する全血サンプルは、ヘパリン採血を行った全血をＰＢＳ（−）で１０倍希釈したものを用いて行った。また、用いた試薬及び実験の手順は、「フロー型ＡＴＰＳによるＪｕｒｋａｔの分離挙動」の場合と同様にして行った。【００７２】結果
従来法におけるヒト血球細胞の分離
先ず、ＡＴＰＳにおける血球細胞と、水溶液との相互関係について観察した。赤血球とＪｕｒｋａｔが異なる相に分離する組成は、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）、及びＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；１０％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；６％）であった。ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）の組成の場合は、ＪｕｒｋａｔがＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液の二相界面に分布し、赤血球がＤｅｘ相に分布することが観察された。分離能については、赤血球サンプルの９７％がＤｅｘ相で観察され、Ｊｕｒｋａｔサンプルの６８％が界面付近で観察された。Ｊｕｒｋａｔサンプルは、１７％がＤｅｘ相でも観察された。また、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；１０％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；６％）の組成の場合は、ＪｕｒｋａｔがＰＥＧ相に分布し、赤血球がＰＥＧ水溶液とＤｅｘ水溶液の二相界面に分布することが観察された。分離能については、赤血球サンプルの８２％が界面付近で観察され、Ｊｕｒｋａｔサンプルの５１％がＰＥＧ相で観察された。赤血球サンプルは１１％がＤｅｘ相でも観察され、Ｊｕｒｋａｔサンプルは４３％が界面付近で観察された。ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；１０％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）の組成の場合は、赤血球とＪｕｒｋａｔがともに二相界面に分布することが観察された。これらの結果から、ＡＴＰＳにおける血球成分の分離は、細胞が比重の影響を受けて沈降するため、効率のよい分離が行えないことがわかる。【００７３】  次に、血球成分の分離に頻繁に使用される密度勾配遠心分離法であるが、全血に含まれる白血球の約７５％を分離することができた。しかしながら、分離した溶液中に全血の約１％の赤血球が含まれていた。この結果から、現在主流である分離手法においても、各血球を単離することが困難であることが示唆された。【００７４】本発明法（フロー型ＡＴＰＳ）による血球細胞の分離
フロー型ＡＴＰＳによるＪｕｒｋａｔの分離
前項の結果をもとに、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）及びＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；１０％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；６％）の組成をもとにした送液を行った。しかしながら、層流現象による二相界面が安定に形成された組成は、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；６％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）だけであった。そして、フロー型ＡＴＰＳにおけるＪｕｒｋａｔの移動が観察されたのは、ＰＥＧ（Ｍ．Ｗ．６，０００；７％）−Ｄｅｘ（Ｍ．Ｗ．４０，０００；１０％）の組成のものであり、図４に示すように、ＪｕｒｋａｔはＰＥＧ相へ移動することが観察された。さらに、ＰＥＧ側の回収部から回収した溶液の細胞密度は、送液したサンプルの９６％であった。分離を行うＰＥＧ水溶液の濃度が若干高くなったが、これは、ビーズを用いて行ったフロー型ＡＴＰＳにおける微小粒子の分離と同様に、送液するサンプルの溶媒により二種類の水溶液が希釈されるために、若干高濃度になったと考えられる。ＡＴＰＳとフロー型ＡＴＰＳにおいて、Ｊｕｒｋａｔの分布が異なることが観察されたが、これは、Ｊｕｒｋａｔは本来ＰＥＧと弱い親和性を有する表面特性の細胞であるが、比重の影響により二相界面に分布していたのが、重力の影響を無視できる環境下であるためにＰＥＧ相へ移動したと考えられる。【００７５】フロー型ＡＴＰＳによるヒト赤血球細胞の分離
フロー型ＡＴＰＳによるヒト赤血球細胞懸濁液の挙動を観察した結果、図５に示すように、赤血球細胞がＤｅｘ相へ移動することが観察された。さらに、Ｄｅｘ側の回収部から回収した溶液の細胞密度は、送液したサンプルの９９％であった。これは、赤血球細胞の表面にある糖鎖が、Ｄｅｘ分子と相互作用することで水素結合を起こした結果、赤血球に働くＤｅｘ相方向の引力が増加するためであると考えられる。【００７６】フロー型ＡＴＰＳによるヒト全血血球細胞の分離
フロー型ＡＴＰＳによるヒト全血血球細胞の分離を試みた結果、図６に示すように、赤血球細胞がＤｅｘ相へ移動し、白血球細胞がＰＥＧ相へ移動することが観察された。【００７７】  以上のように、赤血球細胞及びＪｕｒｋａｔがそれぞれ９９％、９６％という高い分離能を示したこと、また全血サンプルにおいても赤血球及び白血球が異なった相へ移動することが観察されたことから、本発明で提案したフロー型ＡＴＰＳという新規分離システムの有効性が示されたものと考える。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】  本発明の分離方法の原理を説明する模式図である。
【図２】  液相二相界面を構成する微小流路対を複数組形成した分離デバイスの一例を示す平面図である。
【図３】  表面にカルボキシル基を修飾した親水性のポリスチレンビーズがＤｅｘ相へ移動する様子を示す図及び図面代用写真である。
【図４】  ヒト急性リンパ性白血病Ｔ細胞がＰＥＧ相へ移動する様子を示す図面代用写真である。
【図５】  赤血球細胞がＤｅｘ相へ移動する様子を示す図面代用写真である。
【図６】  フロー型ＡＴＰＳによるヒト全血血球細胞の分離の様子を示す図面代用写真である。
【符号の説明】
【００７９】１，２  微小流路、３  懸濁液供給路、Ａ，Ｂ  液相、Ｃ  液相二相界面、１１  基板、１２  微小流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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