(57)【要約】【課題】  被検試料に関する測定作業を阻害することなく、媒質温度の変化に簡便にまた安価に対応することができる、光検出装置及び光検出方法を提供する。【解決手段】    被検試料および既知試料を保持する保持手段（４）と、被検試料および既知試料に光を照射する光源手段（２）と、被検試料および既知試料からの光を検出する光検出手段（１２）と、予め取得した既知試料の物理的な性質と温度の関係を保持する手段（１３）と、既知試料の物理的な性質と温度の関係より、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正演算する手段（１３）とを有する光検出装置である。【選択図】    図１
2005062105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する装置において、
被検試料および既知試料を保持する保持手段と、
被検試料および既知試料に光を照射する光源手段と、
被検試料および既知試料からの光を検出する光検出手段と、
予め取得した既知試料の物理的な性質と温度の関係を保持する手段と、
既知試料の物理的な性質と温度の関係より、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正演算する手段と
を有することを特徴とする光検出装置。
【請求項２】
被検試料温度または被検試料近傍の温度を制御する温度制御手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の光検出装置。
【請求項３】
予め取得した既知試料の物理的な性質が、少なくとも並進拡散係数、回転拡散係数、分極率、平均粒子密度のいずれか１つを含むこと
を特徴とする請求項１または２に記載の光検出装置。
【請求項４】
光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する装置において、
被検試料を保持する保持手段と、
被検試料に光を照射する光源手段と、
被検試料からの光を検出する光検出手段と、
被検試料または被検試料近傍の温度を計測するための温度計測手段と、
前記温度計測手段によって計測された温度に基づいて、被検試料の物理的な性質を、温度に対して補正演算する手段と
を有することを特徴とする光検出装置。
【請求項５】
被検試料または被検試料近傍の温度計測手段は、被検試料溶液、または、被検試料を溶解若しくは分散している溶液と同じ組成の溶液を収容する手段と、収容されている溶液の温度を測定する手段とを更に有することを特徴とする請求項４に記載の光検出装置。
【請求項６】
被検試料の物理的な性質を、規定の温度における値として補正して出力、または、表示する手段を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の光検出装置。
【請求項７】
光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する測定方法において、
保持した被検試料および既知試料に光を照射し、
被検試料および既知試料からの光を検出し、
既知試料の物理的な性質と温度の関係と既知試料の物理的な性質の測定値より、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正することを特徴とする光検出方法。
【請求項８】
被検試料または被検試料近傍の温度を制御することを特徴とする請求７に記載の光検出方法。
【請求項９】
既知試料の物理的な性質として、少なくとも並進拡散係数、回転拡散係数、分極率、平均粒子密度のいずれか１つを測定することを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の光検出方法。
【請求項１０】
光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する方法において、
保持した被検試料に光を照射し、
被検試料からの光を検出し、
被検試料または被検試料近傍の温度を計測し、
計測された温度に基づいて、物理的な性質を温度に対して補正演算することを特徴とする光検出方法。
【請求項１１】
被検試料または被検試料近傍の温度計測は、被検試料溶液、または、被検試料を溶解若しくは分散している溶液と同じ組成の溶液を容器に収容し、収容されている溶液の温度を測定することを特徴とする請求項１０に記載の光検出方法。
【請求項１２】
被検試料または既知試料または被検試料を溶解若しくは分散している溶液が、マイクロプレートに収容されていることを特徴とする請求項７乃至１１のいずれか１項に記載の光検出方法。
【請求項１３】
被検試料の物理的な性質を、規定の温度における値として補正して出力、または、表示することを特徴とする請求項７乃至１２のいずれか１項に記載の光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に標識した担体粒子などの微細物質から発せられる散乱光、あるいは、試料に標識した蛍光物質から発せられる螢光の検出を行うための光検出装置及び光検出方法に関し、特にこれらの光の強度揺らぎの相関解析や相関分光解析(Fluorescence Correlation Spectroscopy: FCS)などを行うための光検出装置及び光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光学技術やデータ解析技術の進歩に伴い、光の強度を統計的に解析して、分子などの特性に関する情報を得る解析手法が開発されてきている。このような技術としては、蛍光相関分光解析法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)が知られている。
【０００３】
蛍光相関分光解析法では共焦点光学顕微鏡の視野の中で、蛍光物質で標識されたタンパク質やコロイド粒子などの担体粒子を溶液中に浮遊させ、これにレーザ光を照射して蛍光物質を励起する。蛍光物質から発せられる蛍光の強度は媒質中に浮遊する蛍光分子がブラウン運動をしているために時間と共に変化する時系列信号となる。一方、蛍光分子の並進拡散運動の速度は、化学反応や結合反応などによる蛍光分子の見かけの大きさの変化や媒質の温度の変化などによって変化する。そこで、この分子の細胞内での化学反応や結合反応などによる拡散運動の速度の変化を蛍光の光強度の時系列信号の統計的な変化として捉えて、これらの微細物質のブラウン運動に基づく蛍光強度のゆらぎを解析して自己相関関数を求めることで、対象とする微粒子の数や並進拡散速度などを測定することができる。
【０００４】
この技術については例えば、金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」(1999) Vol.44, No.9, p1431-1437に論じられている。さらに”Fluorescence correlation spectroscopy” R.Rigler, E.S.Elson (eds.) Springer (Berlin) などの解説がある。
【０００５】
このような、光を検出し光強度ゆらぎの相関解析などを行って被検試料の物理的な性質を測定する技術としては、次のものが知られている。
【０００６】
共焦点光学顕微鏡を用いて、試料ステージ上で蛍光標識された試料にレーザ光を照射し、試料から発せられる蛍光の強度ゆらぎを解析し、螢光分子の並進拡散係数などの統計的な性質や分子間の相互作用などを求める方法及び装置（例えば、特許文献１）。マイクロプレートに収容された蛍光物質を含む試料内に共焦点領域を生成し、これにレーザ光を照射して蛍光物質を励起し、試料から発せられる蛍光の強度や寿命などを測定する装置（例えば、特許文献２）。レーザ光をレンズにより集光し、マイクロプレートのウエルに入れられた、蛍光標識された試料を励起する技術（例えば、特許文献３）。
【特許文献１】特表平１１−５０２６０８号公報
【特許文献２】米国特許第６，０７１，７４８号明細書
【特許文献３】特表２００１−５０２０６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述の技術を適用して測定を行う際には、なお解決すべき次のような課題が存していた。
【０００８】
即ち、測定中、あるいは反応の前後で媒質の温度が変化した場合、見かけ上、蛍光分子の拡散運動の速度の変化が起きた場合と同じ状態となるため、測定結果から媒質の温度変化の影響と、反応による純粋な拡散運動による変化を区別することが困難となるという問題点が存在する。
【０００９】
例えば、室温程度の温度で媒質温度が２℃変化すると、蛍光分子の並進拡散時間は５％程度も変化することが指摘されている。そのため、測定中に媒質の温度が変化すると、測定値の誤差が増大したり、測定結果そのものが大きく変化する、という不具合があった。特に、生きている細胞の内外で起こるシグナル伝達のようなタンパク質の結合反応を測定する場合のように、比較的長時間連続して、反応の経過を測定する場合、媒質の温度変化に細心の注意を払う必要があり測定作業の大きな負担となっている。
【００１０】
そこで、このような測定誤差を打ち消すために、測定中の媒質の温度を計測したり、あるいは媒質温度をコントロールする機構を測定装置に搭載することが考えられるが、この場合、温度測定に手間がかからず、かつ被検試料測定の操作性が低下することなく、また余計な費用の発生を抑止できることが必要である。しかしながら、このような目的に適合した技術は知られていない。
【００１１】
本発明は、係る事情に鑑みてなされたものであって、被検試料に関する測定作業を阻害することなく、媒質温度の変化に簡便にまた安価に対応することができる、光検出装置及び光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る請求項１に記載の光検出装置は、光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する装置において、被検試料および既知試料を保持する保持手段と、被検試料および既知試料に光を照射する光源手段と、被検試料および既知試料からの光を検出する光検出手段と、予め取得した既知試料の物理的な性質と温度の関係を保持する手段と、既知試料の物理的な性質と温度の関係より、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正演算する手段とを有する。
【００１３】
また本発明に係る請求項３に記載の光検出装置は、上記記載の発明である光検出装置において、被検試料温度または被検試料近傍の温度を制御する温度制御手段を更に有する。
【００１４】
また本発明に係る請求項３に記載の光検出装置は、上記記載の発明である光検出装置において、予め取得した既知試料の物理的な性質が、少なくとも並進拡散係数、回転拡散係数、分極率、平均粒子密度のいずれか１つを含む。
【００１５】
また本発明に係る請求項４に記載の光検出装置は、光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する装置において、被検試料を保持する保持手段と、被検試料に光を照射する光源手段と、被検試料からの光を検出する光検出手段と、被検試料または被検試料近傍の温度を計測するための温度計測手段と、前記温度計測手段によって計測された温度に基づいて、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正演算する手段とを有する。
【００１６】
また本発明に係る請求項５に記載の光検出装置は、上記記載の発明である光検出装置において、被検試料または被検試料近傍の温度計測手段は、被検試料溶液、または、被検試料を溶解若しくは分散している溶液と同じ組成の溶液を収容する手段と、収容されている溶液の温度を測定する手段とを更に有する。
【００１７】
また本発明に係る請求項６に記載の光検出装置は、上記記載の発明である光検出装置において、被検試料の物理的な性質を、規定の温度における値として補正して出力、または、表示する手段を有する。
【００１８】
また本発明に係る請求項７に記載の光検出方法は、光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する測定方法において、保持した被検試料および既知試料に光を照射し、被検試料および既知試料からの光を検出し、既知試料の物理的な性質と温度の関係と既知試料の物理的な性質の測定値より、被検試料の物理的な性質を温度に対して補正する。
【００１９】
また本発明に係る請求項８に記載の光検出方法は、上記記載の発明である光検出方法において、被検試料または被検試料近傍の温度を制御する。
【００２０】
また本発明に係る請求項９に記載の光検出方法は、上記記載の発明である光検出方法において、既知試料の物理的な性質として、少なくとも並進拡散係数、回転拡散係数、分極率、平均粒子密度のいずれか１つを測定する。
【００２１】
また本発明に係る請求項１０に記載の光検出方法は、光を用いて被検試料の物理的な性質を測定する方法において、保持した被検試料に光を照射し、被検試料からの光を検出し、被検試料または被検試料近傍の温度を計測し、計測された温度に基づいて、物理的な性質を温度に対して補正演算する。
【００２２】
また本発明に係る請求項１１に記載の光検出方法は、上記記載の発明である光検出方法において、被検試料または被検試料近傍の温度計測は、被検試料溶液、または、被検試料を溶解若しくは分散している溶液と同じ組成の溶液を容器に収容し、収容されている溶液の温度を測定する。
【００２３】
また本発明に係る請求項１２に記載の光検出方法は、上記記載の発明である光検出方法において、被検試料または既知試料または被検試料を溶解若しくは分散している溶液が、マイクロプレートに収容されている。
【００２４】
また本発明に係る請求項１３に記載の光検出方法は、上記記載の発明である光検出方法において、被検試料の物理的な性質を、規定の温度における値として補正して出力、または、表示する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、被検試料に関する測定作業を阻害することなく、媒質温度の変化に簡便にまた安価に対応することができる
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明に係る光検出装置の実施形態を蛍光測定装置に基づいて説明する。
【００２７】
［第１の実施の形態］
図１は、本発明に係る第１の実施の形態の蛍光測定装置の概略構成を示す図であり、図２は、本発明に係る第１の実施の形態の蛍光測定装置を示す側面図である。図１、２を参照しつつ蛍光測定装置の構成と動作について説明する。
【００２８】
蛍光測定装置の本体部分の基本的な装置構成は共焦点光学顕微鏡をベースとしている。
【００２９】
蛍光測定装置は、試料ステージ１、光源２、対物レンズ３、マイクロプレート４、ウエル５、ダイクロイックミラー６、バンドパスフィルタ７、反射プリズム８、レンズ９、ピンホール１０、レンズ１１、光検出器１２、コンピュータ１３及び対物レンズ縦軸調整機構１７で構成されている。
【００３０】
マイクロプレート４は、試料を収容するための反応容器であり、一般的には樹脂、及びガラスが用いられる。ウエル５は、マイクロプレート４に設けられた試料を収容するための穴であり、マイクロプレート４に多数配列（３８穴など）されている。各ウエル５の底面はガラスなどの可視光を透過する素材で作成された窓となっている（図示しない）。
【００３１】
試料ステージ１は、試料を収容したマイクロプレート４を載置して固定する。この試料ステージ１を水平または垂直に移動させることにより、試料の位置を調整する。対物レンズ縦軸調整機構１７は、試料ステージ１の位置を垂直方向に調整する。
【００３２】
光源２には、アルゴン・レーザ（発振出力１０ｍＷ、波長：４８８ｎｍ）を用いる。対物レンズ３は、試料ステージ１に搭載されたマイクロプレート４の下方に設置され、レーザ光束を集光して、その集光領域（共焦点領域）をウエル５内に形成する。対物レンズとしては、例えば×４０水浸対物レンズ（ＮＡ０．９）を用いる。これにより、ウエル５内で得られる共焦点領域の大きさとして、直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状となる。
【００３３】
ダイクロイックミラー６は、波長に応じて選択的に光を透過あるいは反射させる。ダイクロイックミラー６はプリズム形状のガラス製のブロックの斜面に多層膜コーティングを施して、透過、反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。なお、ダイクロイックミラー６には平板を用いても良い。
【００３４】
バンドパスフィルタ７は、特定の範囲の波長の光を透過させ、ノイズ成分を除去する。レンズ９、ピンホール１０は、ウエル５内の共焦点領域からの光を透過し、共焦点領域外からのバックグラウンド光を除去する。
【００３５】
光検出器１２は、レンズ１１の焦点位置に受光面を合わせて配置され、信号光を電気信号（光電流パルス）に変換する。光検出器１２は例えばアバランシェ・フォトダイオード（略称：ＡＰＤ）、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。コンピュータ１３は、相関解析などの演算を実行する処理装置である。
【００３６】
次に、蛍光測定装置の動作について説明する。
【００３７】
光源２から発せられたレーザ光は蛍光測定装置本体内に設置されたダイクロイックミラー６により反射されて対物レンズ３に入り、試料を収容したマイクロプレート４内のウエル５内で集光する。レーザ光の集光位置は水平方向（Ｘ−Ｙ軸）については、ウエルの中央部分、垂直方向（Ｚ軸）については、ウエルの底面の上壁位置から１５０μｍ上方となっている。
【００３８】
集光されたレーザ光は試料内の蛍光分子を励起するので、蛍光分子から蛍光が発せられる。この蛍光は再び対物レンズ３、続いてダイクロイックミラー６を通過して、バンドパスフィルタ７に入射する。バンドパスフィルタ７は円板状の形状となっており、蛍光の発光スペクトルに合わせて透過光のスペクトルが調整されており、信号光となる蛍光の発光スペクトルの波長域の光のみが通過する。これにより、試料容器内で発生する散乱光やウエル５の壁などから反射して入射光路に戻ってくる入射光の一部などのノイズ光をカットすることができる。なお、ノイズ光を遮断できるのは、蛍光の波長とバックグラウンド光の波長が異なるためである。
【００３９】
バンドパスフィルタ７を通過した信号光は反射プリズム８で反射され、レンズ９を介してレンズ９の後方に配置されたピンホール１０のピンホール面に集光する。すなわちレンズ９の焦点面とピンホール１０の開口面とが一致している。ピンホール１０のピンホール径は例えば直径５０μｍである。このピンホール１０により、反応容器内の共焦点領域外からのバックグラウンド光が除去される。
【００４０】
ピンホール１０を通過した信号光は再びレンズ１１で集光される。レンズ１１の焦点位置に受光面を合わせて配置された光検出器１２によって、信号光は電気信号（光電流パルス）に変換され、増幅・波形整形を受けた後、ＯＮ−ＯＦＦ電圧パルスとなって、コンピュータ１３に導かれる。この電圧パルスはコンピューター１３のメモリ（図示しない）に記憶され、続いて相関解析などの演算が行なわれる。この演算によって得られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、あるいは相互相関関数など測定結果がコンピュータ１３の画面上に提示される。
【００４１】
続いて、被検試料の物理的な性質の測定値を温度補正する方法について説明する。
【００４２】
あらかじめ既知の試料を用意する。ここで、既知の試料は、少なくとも分子の大きさがわかっていることが必要である。分子の濃度がわかっているとさらに有用である。そこで、既知の試料として、例えばローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＲｈＧ）を用いる。ローダミン・グリーンは励起光のピーク波長が４９０ｎｍ付近にあり、発光波長は５３０ｎｍ付近にピークを持っている。
【００４３】
次に、ローダミン・グリーンについて媒質温度と拡散時間の関係を示す検量線を予め求めておく。この媒質温度と拡散時間には以下に示す関係式が成立する。
【００４４】
一般にブラウン運動する分子の並進拡散係数Ｄ（ｍ２／ｓ）は、分子の形状を球形と仮定した場合、以下のアインシュタイン・ストークスの式で表わされる。
【００４５】
Ｄ＝ｋＢＴ／（６πηｒ）                                  …（１）
ｋＢ：ボルツマン定数（Ｊ／Ｋ）
Ｔ：媒質の絶対温度（Ｋ）
ｒ：分子の半径（ｍ）
η：媒質の粘性係数（Ｎ・ｓ／ｍ２）
尚、式（１）は、金城政孝「蛋白質 核酸 酵素」Vol.44, No.9, (1999) p1431-1437に記載されている。
【００４６】
また蛍光相関分光法において、蛍光色素分子の並進ブラウン運動の拡散時間をτとすると、以下の式（２）が成立する（文献３）。
【００４７】
τ＝ｗ０２／（４・Ｄ）                                      …（２）
ｗ０：共焦点領域の最も細くなっている部分の半径（ｍ）
尚、式（２）は、S.R.Aragon and R.Pecora : J.Chem.Phys. Vol.64, No.4, (1971) p1971-1803に記載されている。
【００４８】
式（１）のＤを式（２）に代入して式（３）を得る。
【００４９】
τ＝（３π／２ｋＢ）・ｗ０２・ｒ・（η／Ｔ）                    …（３）
蛍光色素ローダミン・グリーンの並進拡散係数Ｄは、媒質を２２℃の水としたときには、２．８×１０−１０（ｍ２／ｓ）が測定値として得られている。これを用いると媒質を水とした場合の、媒質温度とローダミン・グリーン分子の拡散時間の関係（検量線）を求めることができる。尚、ローダミン・グリーンの並進拡散係数Ｄの測定値は、R.Rigler, U.Mets, J.Widengren and P.Kask: Eur. Biophys. J. , Vol.22, (1993), p169-175に記載されている。
【００５０】
図３は、媒質温度とローダミン・グリーン分子の拡散時間の検量線を示す図である。このときのローダミン・グリーンの濃度は１０ｎＭとなっている。なお、この検量線は、測定により作成してもよい。作成された検量線は、データまたはデータテーブルなどの形態でコンピュータ１３内に格納され、以降の処理において使用される。
【００５１】
次に既知の試料であるローダミン・グリーンをマイクロプレート４内の１つのウエル５に収容し、レーザ光を照射して蛍光相関分光測定を行なう。この測定によって蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、または相互相関関数を得ることができ、これらの相関関数に基づいて媒質温度での既知の試料の拡散時間τＡを求めることができる。このτＡを図３に示す検量線に当てはめることにより、媒質の温度ＴＡが求められる。
【００５２】
次に測定しようとする試料をマイクロプレート４内の別のウエル５に収容し、試料ステージ１を動かして、このウエル５に入射レーザ光が当たるように位置を調整する。そしてレーザ光を照射して蛍光相関分光測定を行い、未知の試料（被検試料）の拡散時間τＢを求める。得られた未知の試料（被検試料）の拡散時間τＢと媒質の温度ＴＡを式（３）に代入することにより、未知の試料（被検試料）の半径ｒを先に得られた既知の試料の拡散時間と比較して求めることができる。なお、測定が長時間にわたる場合は、適宜の時間間隔で既知の試料の拡散時間τＡを求め、その都度未知の試料（被検試料）の半径ｒを求めていけば良い。
【００５３】
これにより媒質の温度Ｔを測定することなく、未知の試料（被検試料）の分子の大きさｒを求めることができる。ただし、既知の試料と未知の試料（被検試料）について、媒質は同じ物質（例えば、水など）とする。もし、既知の試料と未知の試料（被検試料）について、媒質が異なる場合は、双方の粘性係数を求め、測定値を補正する必要があることは、式（３）により明らかである。
【００５４】
未知の試料（被検試料）の半径ｒが求まることにより、例えば、たんぱく分子の細胞内での反応などを捉えることができる。何故ならば、たんぱく質が反応を起こして結合した場合は見かけ上、結合分子の大きさが大きくなり、その結果、分子の拡散時間に変化が表れるからである。
【００５５】
［第２の実施の形態］
図４は、本発明に係る第２の実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図である。第２の実施の形態では、媒質の温度測定を行なう点が、第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付してその詳細の説明は省略する。
【００５６】
第２の実施の形態では、熱電対などの温度計１４を未知の試料（被検試料）が収容されたマイクロプレート４のウエル５内に入れて、媒質の温度Ｔを計測する。そして、測定した温度に基づいて媒質の粘性係数ηを求める。尚、粘度に関しては、粘度計を用いて直接測定しても良い。
【００５７】
次に、マイクロプレート１のウエル２内の未知の試料（被検試料）に対して蛍光相関分光測定を行ない、未知の試料（被検試料）の拡散時間τＢを求める。このようにして求めた未知の試料（被検試料）の拡散時間τＢと媒質の粘性係数η、さらに媒質の温度Ｔを式（３）に代入して、未知の試料（被検試料）の分子の大きさｒを求めることができる。ある参照温度における未知の試料（被検試料）の分子の大きさｒを求めるためには、ある参照温度における媒質の粘性係数ηを求め、これと参照温度の値を式（３）に代入して、未知の試料（被検試料）の分子の大きさｒを求めることができる。これにより検量線を用いずに、未知の試料（被検試料）の分子の大きさｒを求めることができる。
【００５８】
ここで、媒質の温度の測定は、被検試料そのものの温度を測定するのが最も好ましいが、被検試料が収容されている容器（ウエル）の近傍であれば、被検試料との温度差は小さいので、被検試料が収容されている容器の近傍の温度とすることも可能である。
【００５９】
容器近傍の温度としては、当該容器自体の温度を含み、当該容器の周囲のマイクロプレート４の温度、当該容器の周囲の容器の温度、当該容器の周囲の容器に収容されている媒質の温度、当該容器と隣接する容器の隙間の温度等が該当する。
【００６０】
被検試料そのものに熱電対や測温抵抗対等の温度センサを入れて温度測定することも可能であるが、温度センサに付着した被検試料が、他の被検試料に混入することも考えられるので、十分洗浄する必要がある。そこで、被検試料を分散または溶解している溶液と同じ組成の溶液をマイクロプレートの複数の位置に配置し、そこに温度センサを入れて温度を測定すると、温度センサを洗浄する必要が無く、複数の位置での温度をモニターできるので、より精密に温度による補正を行なうことが可能となるので好ましい。
【００６１】
また、媒質の温度は、熱電対などの接触式の温度センサだけでなく放射温度計、温度画像計測装置などの非接触式のサーモメータにより測定することも可能である。被検試料をマイクロプレートに多数収容した場合は、すべての被検試料をサーモメータにより同時にモニターすることが可能となり、より精密に温度による補正を行なうことが可能となる。更に、非接触式であるため観測に際して障害とならずに、被検試料の温度を測定することができるので好ましい。
【００６２】
また、多数の被検試料が収容されたマイクロプレートにおいて、複数の温度センサをマイクロプレート内の、いくつかのウエルに入れて測定を行なうことがある。このとき、複数の温度センサ間で測定値が異なる場合は、各温度測定値と各ウエルの空間位置の関係から、各ウエル内の媒質の温度を計算により推定して、各ウエル内の媒質の温度値とすることができる。
【００６３】
［第３の実施の形態］
図５は、本発明に係る第３の実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図である。第３の実施の形態では、試料ステージ１に温度コントローラ１５が装着されている点が、第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付してその詳細の説明は省略する。
【００６４】
温度コントローラ１５はペルチエ素子で構成されており、マイクロプレート１を周囲より加熱または冷却することで温度制御を行う。
【００６５】
まず図３に示すように、あらかじめ既知の試料（例えばローダミン・グリーン）に対して検量線を作成し、さらに設定温度を決めておく。例えば２０℃などとする。次に既知の試料、例えばローダミン・グリーンをマイクロプレート４内のウエル５に収容し、レーザ光を照射し、蛍光相関分光測定を行なう。この測定により、既知の試料（ローダミン・グリーン）の拡散時間τＡが求められる。このτＡを検量線に当てはめて、媒質の温度が求められる。
【００６６】
もし、媒質の温度と設定温度とが異なる場合は、コンピュータ１３は温度コントローラ１５に温度偏差に対応した制御信号を出力し、媒質の温度が設定温度になるように制御する。
【００６７】
媒質の温度が設定温度になったときは測定しようとする試料をマイクロプレート４のウエル５内に収容し、蛍光相関分光測定を行なう。得られた未知の試料（被検試料）の拡散時間τＢを式（３）に代入することにより、未知の試料（被検試料）の見かけの半径ｒを求めることができる。これにより媒質の温度Ｔを測ることなく、未知の試料（被検試料）の分子の見かけの半径ｒを求めることができる。ただし、既知の試料と未知の試料（被検試料）について、媒質は同じ物質とする。既知の試料と未知の試料（被検試料）について、媒質が異なる場合は、粘性係数の補正を行なう必要がある。
【００６８】
［第４実施の形態］
図６は、本発明に係る第４実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図である。第４実施の形態では、マイクロプレート４内のウエルのうち、１つのウエルを温度参照用ウエルとし、このウエル内には既知の試料を含む媒質を収容し、温度計１４で媒質の温度をモニターする点が第１の実施の形態と異なっている。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付してその詳細の説明は省略する。
【００６９】
温度計１４で測定した温度参照用ウエル内の媒質の温度に基づいて、マイクロプレート４は温度コントローラ１５により温度調節される。温度コントローラ１５は光が通過する部分のみ空隙となっているか、あるいは可視光の透過率の良いガラス板の窓になっており、測定を阻害することなくマイクロプレート４の周囲から各ウエルの中の媒質の温度を調節することができる。尚、温度コントローラ１５として、上述のペルチエ素子の他に、温熱ヒータを用いても良く、あるいは温度調節水によって循環式の温度制御を行なっても良い。
【００７０】
図７は、温度コントロールの有無による拡散時間変化を示す図である。図７は、ローダミン・グリーンの拡散時間を測定した結果である。図７中の●は温度コントロールを行わなかった場合の拡散時間の変化を示し、□は、温度コントロールを行なった場合の拡散時間の変化を示す。
【００７１】
本発明による温度コントロールを実施することにより、長時間にわたる測定にもかかわらず、ほぼ一定の拡散時間データが得られている。
【００７２】
また、本実施の形態に係る蛍光測定装置で測定値を温度補正する際には、測定値を規定温度における値に補正することが望ましい。種々の媒質の粘性係数は２０℃の値がよく調べられているので、式（１）や式（３）におけるηを直ちに参照することができるので規定温度は２０℃が好ましい。また、規定温度を２７℃とすると、３００Ｋ（絶対温度）になるので、２７℃で規定することも計算が容易になり好ましい。
【００７３】
図８は、並進拡散時間の測定値を規定温度での値に補正した結果を示す図である。
【００７４】
本測定では、ローダミン・グリーンを被検試料とした。媒質の温度は、温度センサにより測定し、規定温度を２０℃として温度補正をおこなっている。
【００７５】
本実施例では、ローダミン・グリーンを被検試料としたが、ある分子同士の反応状態の検出時にも、反応後の分子の大きさが分かる反応系であれば、本実施例と同様にして、式（１）〜式（３）を用いて、２０℃や２７℃の規定温度で補正して出力を行なったり表示を行うことが可能である。例えば、異なった時期に測定を行った場合、被検試料の温度が異なる場合がある。このときは、本発明により実測値を規定温度での値に補正すると、結果の比較が非常に容易になる。
【００７６】
なお、本発明は蛍光物質から発せられる蛍光の強度ゆらぎに限らず、例えばラテックス粒子のようなコロイド粒子による抗原抗体反応の測定などをレーザ光による散乱光強度ゆらぎの相関解析から行なう方法にも適用することができる。
【００７７】
以上説明したように本実施の形態では、あらかじめ既知の蛍光分子による媒質温度と並進拡散時間の関係を求めておき、未知試料の蛍光相関分光による蛍光分子の並進拡散速度などの測定値と既知の蛍光分子による並進拡散時間とを比較し、これをあらかじめ求めておいた既知の蛍光分子による並進拡散時間と温度の関係を示す検量線に当てはめ、これから逆に媒質温度を推定し、この媒質温度に対応する未知試料の蛍光分子の並進速度を導く。
【００７８】
また、推定された媒質温度を標準測定温度まで温度コントローラにより変化させ、媒質温度が標準測定温度になるまで測定を中断し、温度環境が整うのを待って、測定を開始する。
【００７９】
従って、試料の温度変化に伴う、試料の媒質中での物理的な性質の変化を自動的に補正することができるので、試料の温度が変化しても、高精度で媒質中での試料の物理的な性質の測定を行なうことができる。また、既知試料の測定値に基づく検量線を用いれば、温度測定を必要とせず、媒質の温度変化に無関係に試料の物理的な性質を簡便に測定することができる。
【００８０】
なお、上述の実施の形態では、被検試料の物理的な性質として拡散時間、粘性係数などを求めたが、本発明は、これ以外の物理的な性質として例えば、「並進拡散係数、回転拡散係数、分極率、平均粒子密度」を求める場合にも適用することができる。これらの値は種々の光検出装置により計測可能な値であり、またこれらの値は、分子間の反応、また分子の挙動と関連性を有している。
【００８１】
並進拡散係数と分子間の反応の関係は、ある分子が結合すると質量が大きくなるので、ブラウン運動による分子の移動速度が遅くなる結果、並進拡散係数が小さくなる。また、ある分子が解離すると質量が小さくなるので、ブラウン運動による分子の移動速度が速くなる結果、並進拡散係数が大きくなる。
【００８２】
回転拡散係数と分子間の反応の関係は、ある分子が結合すると質量が大きくなったり、分子の形状が変化するので、回転ブラウン運動が変化して（一般的には小さくなり）、分子の回転速度が変化するので回転拡散係数が変化する。また、ある分子が解離すると質量が小さくなったり、分子の形状が変化するので、回転ブラウン運動が変化して（一般的には大きくなり）、分子の回転速度が変化するので回転拡散係数が変化する。
【００８３】
分極率と分子間の反応は、ある分子が結合すると分子の形状や分子の電子状態が変化するので、分極率が変化する。また、ある分子が解離すると分子の形状や分子の電子状態が変化するので、分極率が変化する。
【００８４】
粒子密度と分子間の反応は、ある分子が結合すると分子数が減少するので粒子密度は低くなる。また、ある分子が解離すると分子数が増加するので粒子密度は高くなる。
【００８５】
そして、これらの物理的な性質を測定する際にも、上述の実施の形態で述べたと同様に温度に対する補正が必要不可欠である。
【００８６】
並進拡散係数と温度の関係は、媒質の温度が上昇するとブラウン運動が激しくなるので、分子の移動速度が速くなる結果、並進拡散係数が大きくなる。
【００８７】
回転拡散係数と温度の関係は、媒質の温度が上昇すると回転ブラウン運動が激しくなるので、分子の回転速度が大きくなる結果、回転拡散係数が大きくなる。
【００８８】
分極率と温度の関係は、媒質の温度が上昇すると分子を構成している原子の振動が激しくなるので、分子の形状変化が大きくなる結果、分極率が大きくなる。
【００８９】
粒子密度と温度の関係は、媒質の温度が上昇すると媒質及び分子の振動が激しくなる結果、分子密度が小さくなる。
【００９０】
したがって、これらの物理的な性質と温度との関係を予め測定し、本発明を適用することで、被検試料の温度を補正して精度の良い測定を行うことができる。
【００９１】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明に係る第１の実施の形態の蛍光測定装置の概略構成を示す図。
【図２】本発明に係る第１の実施の形態の蛍光測定装置を示す側面図。
【図３】媒質温度とローダミン・グリーン分子の拡散時間の検量線を示す図。
【図４】本発明に係る第２の実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図。
【図５】本発明に係る第３の実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図。
【図６】本発明に係る第４の実施の形態の蛍光測定装置の測定状態を示す図。
【図７】温度コントロールの有無による拡散時間変化を示す図。
【図８】並進拡散時間の測定値を規定温度での値に補正した結果を示す図。
【符号の説明】
【００９３】
１…試料ステージ、２…光源、３…対物レンズ、４…マイクロプレート、５…ウエル、１２…光検出器、１３…コンピュータ、１４…温度計、１５…温度コントローラ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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