(57)【要約】【課題】粉末状の検体に対する微生物数測定において、測定の信頼性を改善する。【解決手段】粉末の検体に含まれる微生物の数を測定する微生物数測定において、検体液の調製に使用する希釈液に、界面活性剤を含ませる。それにより検体液中で微生物が検体から効果的に遊離する。また、検体液の調整の際に当該希釈液を使用してストマッキング処理を行うとさらに効果的である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粉末状の検体に含まれる微生物の数を測定する微生物数測定方法であって、
（ａ）前記検体を界面活性剤を含む希釈液で希釈して培地に添加する工程と、
（ｂ）前記検体が添加された前記培地に含まれる前記微生物数を測定する工程とを備える
ことを特徴とする微生物数測定方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）は、
前記検体を前記希釈液と混合してストマッキングする工程を含む
請求項１記載の微生物数測定方法。
【請求項３】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートである
請求項１または請求項２に記載の微生物数測定方法。
【請求項４】
前記希釈液における前記界面活性剤の濃度は、０．０４〜０．０６％である
請求項３記載の微生物数測定方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）は、
前記検体を前記希釈液と混合してストマッキングする工程を含み、
前記ストマッキングの時間は、１２０秒以上である
請求項４記載の微生物数測定方法。
【請求項６】
０．０４〜０．０６％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを含有することを特徴とする微生物実験用培地。
【請求項７】
液体であることを特徴とする請求項６記載の微生物実験用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物数測定方法およびそれに供される微生物実験用培地に関し、特に、粉末状の検体に対する測定の信頼性を改善するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば食品の衛生管理を達成する目的で、食品に含まれる細菌や真菌等の微生物の数を測定することが要求されている。食品などの検体に含まれる微生物数を測定する方法として、例えば寒天培養法や酸素電極法（ＤＯＸ：dissolved oxygen electrode method）が従来から知られている。寒天培養法は、検体を寒天培地に添加して微生物を培養し、発生したコロニーの数を目視でカウントすることにより微生物数を測定するものである。また酸素電極法は、検体を液体培地に添加して微生物を培養し、酸素電極を用いて当該液体培地の溶存酸素濃度の変化を測定することにより微生物数を測定するものである。
【０００３】
一般に、微生物数測定において、検体は希釈液（例えば生理食塩水）で所定の濃度に希釈された検体液に調製されてから培地へ添加される。検体に付着していた微生物は検体液中に遊離して拡散する。このとき検体液中に微生物が均一に拡散すれば、当該検体液から採取した試料における微生物の濃度のばらつきが少なくなるので、信頼性の高い微生物数測定が可能になる。そのため、検体液の調製に際には、検体を希釈液と共に粉砕して充分に混合させるいわゆるストマッキング処理も行われる。
【０００４】
一方、Mycobacterium属菌の培養において、液体培地の表面張力を減弱させて、菌の発育を培地の表層部に限局せずに深部にまで拡散させる（分散発育）目的で、当該液体培地に界面活性剤であるポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０（商品名））を添加する技術も知られている。それによりMycobacterium属菌は培地内で分散発育し、容易に均一な菌浮遊液が調製可能になり、薬剤感受性試験などを容易に行うことができる（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】川上由行、“Ｔｗｅｅｎ  ８０は微生物の増殖を促進する？”、［online ］、平成１３ 年１２月２７ 日、［平成１５年１０月２４日検索］、インターネット＜URL ：http://www.jarmam.gr.jp/situmon/tween.html ＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に、小麦粉や調味料などの粉末の食品には、乾燥に強い微生物が強固に付着している。よって、微生物数測定の対象が粉末状の検体である場合、検体液の調製の際に、通常の生理食塩水やリン酸緩衝液等の希釈液を用いたストマッキング処理を行なっても微生物を検体から離脱させることが困難である。よって従来の微生物数測定では、調製後の検体液中で微生物は検体に付着したままであり、それを培地に添加した後においても微生物は培地中で検体に付着したまま培養されていた。
【０００７】
そのため従来の微生物数測定では、次のような問題が生じていた。即ち、検体液中で微生物が検体に付着したままであるため、当該検体中に微生物が均一に拡散せず、微生物の濃度に斑が生じていた。よって、当該検体液から複数の試料を採取した場合、各試料で微生物の濃度が一定にならなかった。つまり従来の手法では、同じ条件の下に作成した試料であっても、微生物の濃度のばらつきが生じていた。従って、それらの試料を用いて微生物数測定を行うと、測定結果がばらついていた。例えば寒天培養法では、生成されるコロニー数が試料ごとにばらつくので微生物数の測定結果もばらついてしまう。また酸素電極法では、液体培地中の酸素の消費速度が試料ごとに（測定用セルごとに）ばらつくので、酸素電極の出力電流が所定のしきい値Ｉthに達するまでの所要時間もばらつき、初期微生物数の算出結果がばらついてしまう。このように従来の微生物数測定方法では、検体が粉末である場合、測定結果がばらついて測定の信頼性が低下していた。
【０００８】
本発明は以上のような課題を解決するためになされたものであり、粉末状の検体に対する測定の信頼性を改善することが可能な微生物数測定方法および微生物実験用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１記載の発明は、粉末状の検体に含まれる微生物の数を測定する微生物数測定方法であって、（ａ）前記検体を界面活性剤を含む希釈液で希釈して培地に添加する工程と、（ｂ）前記検体が添加された前記培地に含まれる前記微生物数を測定する工程とを備えるものである。
【００１０】
請求項２記載の発明は、請求項１記載の微生物数測定方法において、前記工程（ａ）が、前記検体を前記希釈液と混合してストマッキングする工程を含むものである。
【００１１】
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の微生物数測定方法において、前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであるものである。
【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項３記載の微生物数測定方法において、前記希釈液における前記界面活性剤の濃度が、０．０４〜０．０６％であるものである。
【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項４記載の微生物数測定方法において、前記工程（ａ）が、前記検体を前記希釈液と混合してストマッキングする工程を含み、前記ストマッキングの時間が、１２０秒以上であるものである。
【００１４】
請求項６記載の発明は、微生物実験用培地であって、０．０４〜０．０６％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを含有するものである。
【００１５】
請求項７記載の発明は、請求項６記載の微生物実験用培地が、液体であるものである。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１記載の微生物数測定方法によれば、希釈液が界面活性剤を含むので、その分散作用により検体から微生物が効果的に遊離するため、試料ごとの微生物濃度のばらつきを抑制でき、測定結果のばらつきが小さくなるので、信頼性の高い測定が可能になる。
【００１７】
請求項２記載の微生物数測定方法によれば、界面活性剤を含む希釈液と混合して検体をストマッキングするので、検体からの微生物の遊離がさらに促進され、より信頼性の高い測定が可能になる。
【００１８】
請求項３記載の微生物数測定方法によれば、界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを使用するので、その分散作用により検体から微生物が効果的に遊離するため、試料ごとの微生物濃度のばらつきを抑制でき、測定結果のばらつきが小さくなるので、信頼性の高い測定が可能になる。
【００１９】
請求項４記載の微生物数測定方法によれば、希釈液における界面活性剤の濃度は、０．０４〜０．０６％であるので、微生物の増殖への影響は殆ど無い測定が可能である。また酸素電極法に適用した場合、酸素電極に対する悪影響が無い。
【００２０】
請求項５記載の微生物数測定方法によれば、ストマッキングの時間を１２０秒以上にすることにより、検体からの微生物の遊離がさらに促進され、より信頼性の高い測定が可能になる。
【００２１】
請求項６記載の微生物実験用培地によれば、０．０４〜０．０６％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを含有するので、例えば粉末状の検体の微生物数測定の際の希釈液として用いれば、検体から微生物が効果的に遊離するため、試料ごとの微生物濃度のばらつきを抑制でき、測定結果のばらつきが小さくなるので、信頼性の高い測定が可能になる。
【００２２】
請求項７記載の微生物実験用培地は液体であるので、酸素電極法への適用が容易になり、微生物数測定の迅速化に寄与できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜実施の形態＞
以下、実施の形態として、本発明を適用した酸素電極法による微生物数測定について説明する。当該微生物数測定の対象である検体は粉末状のものであり、例えば小麦粉や調味料などがある。前述のように、粉末の検体には乾燥に強い微生物が強固に付着している。
【００２４】
まず、界面活性剤を含有する希釈液（例えば生理食塩水にポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを添加したもの）を準備する。そして、検体を当該希釈液と混合させ、所定の濃度に希釈して検体液を調製する。検体液中では、界面活性剤の分散作用により微生物が検体から遊離して、検体液中に均一に拡散する。このとき、微生物の検体からの遊離をさらに促進するために、ストマッキング処理を行うとよい。
【００２５】
続いて、調製した検体液を所定の液体培地（例えば生理食塩水）に添加する。検体液中の微生物は検体から遊離しているので、液体培地中にも均一に拡散する。その後、検体を添加した液体培地から試料を採取する。このとき、液体培地中には微生物が均一に拡散しているので、一定の微生物濃度を有する試料を採取できる。言い換えれば、当該液体培地から複数個の試料を採取すれば、それらの間で微生物の濃度はほぼ同じになる。
【００２６】
そして採取した試料を内面に酸素電極を有する測定用セルに注入し、該測定用セルを測定装置にセットする。液体培地中の溶存酸素濃度は測定用セルの酸素電極により電気信号へと変換され、測定装置は、当該電気信号に基づいて液体培地中の溶存酸素濃度の変化を測定することにより、液体培地中に含まれていた微生物の初期菌数を測定する。
【００２７】
通常、この電気信号としては、酸素電極が出力する電流が用いられ、その電流値は溶存酸素濃度が高くなるほど大きな値となる。液体培地中の溶存酸素は微生物の呼吸によって消費されるので、該電流値は時間の経過と共に下がってくる。このとき、該電流値がゼロに近い所定のしきい値Ｉth以下に減少するまでの所要時間は、初期菌数によって異なり、初期菌数が多いほど短くなる。液体培地中の微生物数が多いと、それだけ酸素の消費量が多いので溶存酸素濃度が早く低下するためである。従って、酸素電極法による微生物数測定では、酸素電極の出力電流がしきい値Ｉthに達するまでの所要時間を測定し、その結果から液体培地中の初期菌数を算出することができる。例えば、液体培地中の初期菌数が１０5、１０4、１０3、１０2、１０1ＣＦＵ／ｍｌでばらつく場合における、測定時間の経過に伴う酸素電極の出力電流の変化を図３に模式的に示す。
【００２８】
しかし、本実施の形態では一定の微生物濃度を有する試料が採取されているので、測定結果も一定する。即ち、例えば上記試料を採取する工程で複数個の試料を採取し、各々について微生物数測定を行なえば、それらの間でほぼ同様の測定結果が得られる。つまり、不確かさが少なく信頼性の高い測定結果を得ることができる。
【００２９】
以上のように本実施の形態によれば、粉末状の検体に微生物が強固に付着していても、希釈液に含まれる界面活性剤の分散作用により当該微生物は検体から遊離し、検体液中に均一に拡散する。遊離した微生物は、該検体液が添加された液体培地中にも均一に拡散するので、その液体培地から採取した試料における微生物の濃度は一定する。従って、その試料を用いて微生物数の測定を行えば、測定結果の試料ごとのばらつきは抑制され、信頼性の高い測定が可能になる。
【００３０】
なお、本実施の形態においては、予め界面活性剤を含有する希釈液を準備し、それを用いて検体液の調製を行ったが、例えば、界面活性剤を含まない通常の希釈液と界面活性剤の溶液とを個別に準備して、検体液のストマッキング処理の際にそれら各々を検体に混合させるようにしてもよい。
【００３１】
また以上の説明では、本発明を酸素電極法による微生物数測定に適用した例を示した。酸素電極法では初期菌数が多いほど早く測定結果が得られ、具体的には、初期菌数が１０5ＣＦＵ／ｍｌ以上の場合で測定の所要時間は約４時間である。寒天培養法では微生物の培養に１２〜４８時間程度要することを鑑みると、酸素電極法は、微生物数測定を非常に短時間で行える手法であるといえる。また酸素電極法では、電気信号をモニタすることで測定が行われるので、測定の自動化、測定結果のデータベース化、測定システムのネットワーク化が容易であるという利点もある。
【００３２】
しかし本発明の適用はそれに限定されず、希釈液を用いて検体液を調製する工程を有するあらゆる微生物数測定の手法に適用可能である。例えば寒天培養法の場合、界面活性剤を含む希釈液を用いて検体液を調製し、当該検体液から試料を採取し、それを寒天培地に添加して培養させればよい。微生物は検体液中に均一に拡散しているので、該検体液から採取した試料における微生物の濃度は一定する。その結果、測定結果（コロニーのカウント数）の試料ごとのばらつきは抑制され、測定の信頼性は改善される。
【００３３】
以下、本発明の実施例として、微生物数測定の具体的な実験結果を示す。
【実施例１】
【００３４】
実施例１に係る実験では、粉末状の検体に対し、検体液の調製に用いる希釈液に含ませる界面活性剤の濃度を変化させて酸素電極法による溶存酸素量の測定を行ない、その結果を比較した。
【００３５】
具体的な測定条件は次のとおりである。粉末状の検体としては小麦粉を使用した。希釈液としては生理食塩水に界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレート含有させたものを使用した。希釈液における界面活性剤の濃度は、０％（即ち、生理食塩水のみ）〜０．１％の範囲で変化させた。検体液の調製の際にはストマッキング処理を行い、その処理時間は全て１２０秒とした。そして調製した検体液をそれぞれペプトン０．１％の液体培地に添加し、検体液を添加した液体培地からそれぞれ３つの試料を採取して、酸素電極法を用いて各試料における酸素電極の出力電流を測定した。
【００３６】
図１は、実施例１における主な測定結果を示す図であり、測定時間の経過に伴う酸素電極の出力電流の変化を示している。図１（ａ）は界面活性剤を含まない希釈液で調製した３つの試料（試料Ａ１〜Ａ３）での測定結果、図１（ｂ）は界面活性剤を０．０３％含む希釈液で調製した３つの試料（試料Ｂ１〜Ｂ３）での測定結果、図１（ｃ）は界面活性剤を０．０５％含む希釈液で調製した３つの試料（試料Ｃ１〜Ｃ３）での測定結果、図１（ｄ）は界面活性剤を０．０７％含む希釈液で調製した３つの試料（試料Ｄ１〜Ｄ３）での測定結果である。
【００３７】
図１（ａ）に示すように、希釈液が界面活性剤を含まない場合、各試料の間で電流値がゼロ付近に低下するまでの所要時間が大きくばらついた。一方、図１（ｂ）〜（ｄ）に示すように、希釈液が界面活性剤を含む場合には、そのばらつきは少なくなる。この結果から、界面活性剤を含まない希釈液で調製した試料では微生物の濃度がばらついており、界面活性剤を含む希釈液で調製した試料試料では当該濃度が一定であったことが分かる。つまり、界面活性剤を含まない希釈液で調製した試料を用いて測定を行う方が、信頼性の高い測定結果が得られることが確められた。
【００３８】
特に、界面活性剤を０．０５％含む希釈液で調整した試料Ｃ１〜Ｃ３の間では、電流波形はほぼ同じであり、電流値がゼロ付近に低下するまでの所要時間もほぼ一定になった（図１（ｃ））。図示は省略するが、この実験において、希釈液における界面活性剤の濃度が０．０４〜０．０６％の範囲で、これと同様の良好な結果が得られた。つまり、本発明において希釈液における界面活性剤の濃度は、高ければよいというわけではなく０．０４〜０．０６％にすることにより、特に信頼性の高い測定結果が得られることが分かった。濃度が０．０６％を超えるとばらつきが大きくなるのは、高濃度のポリオキシエチレンソルビタンモノオレートが微生物の増殖へ影響を与えてしまったり、酸素電極に対して悪影響を与えてしまうからであると考えられる。
【実施例２】
【００３９】
実施例２に係る実験では、粉末状の検体に対し、検体液の調製の際のストマッキング時間を変化させて酸素電極法による溶存酸素量の測定を行ない、その結果を比較した。
【００４０】
具体的な測定条件は次のとおりである。粉末状の検体としては小麦粉を使用し、希釈液としては生理食塩水に界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレートを０．０５％含有させたものを使用した。検体液の調製の際にはストマッキング処理を行い、その処理時間を３０秒〜１８０秒の範囲で変化させた。そして実施例１と同様に、調製した検体液をそれぞれペプトン０．１％の液体培地に添加し、検体液を添加した液体培地からそれぞれ３つの試料を採取して、酸素電極法を用いて各試料における酸素電極の出力電流を測定した。
【００４１】
図２は、実施例２における主な測定結果を示す図であり、測定時間の経過に伴う酸素電極の出力電流の変化を示している。図２（ａ）はストマッキング時間３０秒で調製した３つの試料（試料Ｅ１〜Ｅ３）での測定結果、図２（ｂ）はストマッキング時間６０秒で調製した３つの試料（試料Ｆ１〜Ｆ３）での測定結果、図２（ｃ）はストマッキング時間１２０秒で調製した３つの試料（試料Ｇ１〜Ｇ３）での測定結果、図２（ｄ）はストマッキング時間１８０秒で調製した３つの試料（試料Ｈ〜Ｈ３）での測定結果である。
【００４２】
図２（ａ）〜（ｄ）に示すように、ストマッキング時間が長くなるほど、各試料の間で電流値がゼロ付近に低下するまでの所要時間のばらつきが少なくなった。この結果から、短時間のストマッキングで調製した試料では微生物の濃度がばらついており、ストマッキング時間が長くなるほど当該濃度が一定になることが分かる。つまり、ストマッキング時間を長く行って調製した試料を用いて測定を行う方が、信頼性の高い測定結果が得られることが確められた。
【００４３】
特に、ストマッキング時間を１２０秒以上行って調整した試料の間では、電流波形はほぼ同じであり、電流値がゼロ付近に低下するまでの所要時間もほぼ一定になった（図２（ｃ），（ｄ））。つまり、本発明においてストマッキング時間を１２０秒以上にすることによって、微生物が検体から充分に遊離し、より信頼性の高い測定結果が得られることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施例１に係る微生物数測定の実験結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例２に係る微生物数測定の実験結果を示す図である。
【図３】酸素電極法における初期微生物数のばらつきの影響を示すための図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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