(57)【要約】【課題】    従来のFRETよりも高い解像度で標的分子の観察や検出を行うことができる、標的分子の検出又は観察方法及びそれに用いられる標識剤を提供すること、並びに標的分子に外力を加えることにより、分子を操作したり接着したりする方法及びそれに用いられる分子操作剤及び分子接着剤を提供すること。【解決手段】  標的分子の検出方法は、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標的分子を標識し、他方をプローブとして用い、電子供与体分子と電子受容体分子との間の電荷移動に起因する発光を利用して標的分子の検出を行なうことを含む。標的分子の操作又は接着方法は、電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子との間に引力を作用させることを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標的分子を標識し、他方をプローブとして用い、電子供与体分子から電子受容体分子への電子の移動に起因する蛍光を利用して標的分子の検出を行なうことを含む、標的分子の検出方法。
【請求項２】
蛍光波長の異なる複数種類の電子供与体分子又は電子受容体分子で単一の標的分子の異なる部位を標識する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標的分子が生体分子である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子の両者で同一又は異なる分子を標識し、電子供与体分子から電子受容体分子への電子の移動に起因する蛍光を利用して単一の標的分子又は２種類の標的分子間の挙動を測定することを含む、標的分子の挙動の測定方法。
【請求項５】
蛍光波長の異なる複数種類の電子供与体分子又は電子受容体分子で単一の標的分子の異なる部位を標識することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記標的分子が生体分子である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、光を照射することにより電子供与体分子と電子受容体分子間に引力を作用させることを含む、標的分子の操作又は接着方法。
【請求項８】
電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方又は両方から成る分子標識剤。
【請求項９】
電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方又は両方から成る分子操作剤又は分子接着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子等の分子を標識して検出する方法及びそれに用いられる標識剤に関する。本発明は、また、生体分子等の分子に結合させ、標的分子の操作又は接着方法並びにそれに用いられる分子操作剤及び分子接着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、２種類の標識分子間のエネルギー移動を利用して分子の挙動の観察や検出を行なう方法として、２種類の蛍光色素間のエネルギー移動を利用した方法が知られている。これは、蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)と呼ばれる方法で、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が約10nm程度以下の距離に近づくと、ドナー蛍光色素からアクセプター蛍光色素に蛍光エネルギーが移動し、ドナー蛍光色素単独の場合とは異なる波長の蛍光がアクセプター蛍光色素から発せられたり、ドナー蛍光色素の発光がアクセプター蛍光色素へのエネルギー移動により消光する現象を利用して、標識した標的分子の検出や、２種の標的分子間の相互作用の測定が行なわれている。
【０００３】
しかしながら、従来のFRETでは、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素が約10nmの距離に近づくとエネルギー移動が起きるので、解像度は理論的に約10nmが限度である。従って、生体分子の挙動を分子レベルで観察することは困難である。また、FRETでは、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の間に強い引力が働くというわけではないので、標識を利用して標的分子に外力を働かせ、分子を操作したり接着したりすることはできない。
【０００４】
【特許文献１】特開2003-75442号公報
【特許文献２】特開2003-42955号公報
【特許文献３】特表2002-535655号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、従来のFRETよりも高い解像度で標的分子の観察や検出を行うことができる、標的分子の検出又は観察方法及びそれに用いられる標識剤を提供することである。また、本発明の目的は、標的分子に外力を加えることにより、分子を操作したり接着したりする方法及びそれに用いられる分子操作剤及び分子接着剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、電荷移動錯体の形成能を有する電子供与体分子と電子受容体分子を標識剤として利用することにより、従来のFRETよりも高い解像度で標的分子の観察や検出を行うことができることに想到し、本発明を完成した。また、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方又は両方を、同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子の間に引力を作用させることにより、分子の形態や位置を操作することができ、また、分子同士を接着することができることに想到し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標的分子を標識し、他方をプローブとして用い、電子供与体分子と電子受容体分子との間の電荷移動に起因する発光を利用して標的分子の検出を行なうことを含む、標的分子の検出方法を提供する。また、本発明は、電子供与体分子及び電子受容体分子を用いて、同一又は異なる分子を標識し、電子供与体分子と電子受容体分子間の電荷移動に起因する発光を利用して単一の標的分子又は２種類の標的分子間の挙動を観察することを含む、標的分子の挙動の観察方法を提供する。さらに、本発明は、電荷移動錯体の電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子との間に引力を作用させることを含む、標的分子の操作又は接着方法を提供する。さらに、本発明は、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方から成る分子標識剤を提供する。さらに、本発明は、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方から成る分子操作剤又は分子接着剤を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、従来のFRETの1/10以下の数オングストロームの距離に電子供与体分子と電子受容体分子が接近した際に電荷移動が起こり、発光が観察される。従って、本発明の方法により、標的分子の検出や観察を数オングストロームの解像度で行うことができる。また、電荷移動錯体の電子供与体分子と電子受容体分子の間には引力が働くので、本発明の方法により分子の位置や形態を操作したり分子同士を接着したりすることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法では、電荷移動錯体を用いる。電荷移動錯体とは、電子供与体分子と電子受容体分子が数オングストロームの距離に接近した場合に、電子供与体分子から電子受容体分子に電子が移動して形成される錯体分子対を意味する。電子供与体分子から電子受容体分子に電子が移動すると、それらの分子の組み合わせに固有の蛍光を発するようになるので、それらの蛍光を検出することにより、電子供与体分子と電子受容体分子が数オングストロームの距離にまで近づいたことを確認することができる。
【００１０】
電子供与体分子としては、電子供与性基を有する、ベンゼン誘導体、ナフタレン誘導体、アントラセン誘導体、その他ピレン、ペリレン等の多環式芳香族化合物の誘導体が好ましい。電子受容体分子としては、テトラシアノベンゼンに代表される芳香族シアノ化合物、ジニトロベンゼン、トリニトロベンゼン等の芳香族ニトロ化合物等の誘導体を例示することができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。これらの電子供与体分子、および電子受容体分子は、上記の化学構造に加えて、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、スルホン酸基、水酸基等の反応性に富む官能基を有する。但しテトラシアノベンゼンのような反応性に富む官能基を持たない化合物も、ポリマー等のマトリックス中に均一に分散させることにより、プローブとして使用することが出来る。本発明に係わる電荷移動錯体は、上記の電子供与体分子と電子受容体分子の任意の組み合わせに基づいて、それらの分子間相互作用によって形成される。
【００１１】
本発明の方法において、検出又は観察される標的分子は、何ら限定されるものではなく、有機分子でも無機分子でもよい。本発明の方法では、数オングストロームという極めて高い解像度での検出又は観察が可能になるので、生体分子を標的分子にした場合に特に威力を発揮する。すなわち、特定の生体分子の細胞内や細胞小器官内での分布状態や、２種類の生体分子の相互作用が細胞内又は細胞内小器官内のどの部位で、どのような時期に起きるのか、さらには、単一の生体分子の形態変化等を調べることができる。
【００１２】
本発明の方法では、電子供与体分子又は電子受容体分子は、標的分子と化学的に結合させて用いる。例えば、タンパク質については、アミノ基、水酸基等の官能基を有する電子供与体分子、電子受容体分子とタンパク質のC末端のカルボキシル基との反応により、あるいはカルボキシル基、スルホン基等の官能基を有する電子供与体分子、電子受容体分子とタンパク質のN末端のアミノ基との反応により、目的とする化学構造を生じる。核酸については、吸収波長の異なる電子供与体分子で化学修飾した、塩基が異なる４種類のヌクレオチドを合成し、標的の１本鎖DNAを鋳型として、これらのヌクレオチドを用いて２本鎖DNAを合成し、標的DNAの塩基配列の解析に供することが出来る。但し、テトラシアノベンゼンのような官能基を持たない化合物を選択する場合には、ポリマーマトリックス等に分散させて探針の先端を被覆し、走査型のプローブとして使用する。
【００１３】
本発明の第１の方法では、標的分子を電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方で標識し、他方をプローブとして用いる。例えば、特定の生体高分子を電子供与体分子で標識し、電子受容体分子の溶液で細胞を処理することにより、細胞内での標的分子の分布をイメージ化することができる。また、連続的又は経時的にイメージ化を行なうことにより、標的分子の挙動を測定することができる。また、化学反応性の官能基を持たない、例えばテトラシアノベンゼンをプローブとする場合には、原子間力顕微鏡(AFM)のカンチレバーのような探針の先端部に付着させて被観察面を走査し、測定された蛍光と、その時の探針の位置から、被観察面中の標的分子の分布をイメージ化することができる。
【００１４】
蛍光測定時の励起波長は、用いる電子供与体分子と電子受容体分子の組み合わせにより異なるが、例えば、アントラセンとテトラシアノベンゼンの場合には、励起波長は532nmが好ましく、測定波長は580〜650nmが好ましい。なお、好ましい励起波長と測定波長は、用いる電子供与体分子と電子受容体分子の組み合わせに対して、常法によりスペクトル測定することにより容易に決定することができる。
【００１５】
標的分子が十分なサイズを有する場合、例えばタンパク質や核酸のような生体高分子の場合には、単一の標的分子の異なる部位を、蛍光波長の異なる複数種類の電子供与体分子又は電子受容体分子で標識することも可能である。その結果、標的分子の単なる位置だけではなく、その立体構造も推測することが可能になる。さらに、例えば、核酸を構成する各ヌクレオチドを、蛍光波長が異なる電子供与体分子で標識しておくと、電子受容体分子をプローブとして核酸の塩基配列を決定することも可能である。すなわち、それぞれ異なる電子供与体分子で化学修飾した４種類のヌクレオチドを用いて、塩基配列を決定したいDNAの１本鎖を鋳型として、合成した２本鎖の核酸（DNA）を基体上に固定し、先端にプローブ（電子受容体分子）を付着させた探針で走査することによって行うこともできる。あるいは周縁部にプローブ（電子受容体分子）を配置した透孔を作製し、線状の核酸をその中に通過させ、通過時の蛍光波長を順次測定することにより行うこともできる。核酸は、例えば、溶液を流通させる等により、プローブ間の透孔を通過させることができる。なお、これらの測定方法に用いられる核酸試料は、予めそれぞれ異なる電子供与体分子で化学修飾されたヌクレオチドを原料として用いて、PCR等の核酸増幅法を行なうことにより、容易に調製することができる。
【００１６】
本発明の第２の方法では、電荷移動錯体を形成する電子供与体分子及び電子受容体分子の両者で、同一又は異なる分子を標識する。単一の分子の形態変化を観察する場合等には、単一の分子の２つの異なる部位を電子供与体分子及び電子受容体分子でそれぞれ標識する。例えば、ある立体構造をとるタンパク質のN末端を電子供与体分子で標識し、C末端を電子受容体分子で標識する。N末端とC末端が離れている時には、蛍光は観察されないが、タンパク質が三次元的に折りたたまれてN末端とC末端が数オングストロームの距離に接近した場合には、蛍光が観察される。このように、単一の分子中の２箇所の標識部位が数オングストロームの距離まで接近したか否かを測定することができる。この方法により得られる知見は、タンパク質や核酸等の生体高分子の形態変化やその時期の予測等に大いに役立つ。
【００１７】
２種の標的分子の一方を電子供与体分子で標識し、他方を電子受容体分子で標識することにより、２種の標的分子の相互作用を高解像度で測定することが可能になる。例えば、遺伝子調節タンパク質等のタンパク質を電子供与体分子で標識し、調節を受けるDNAを電子受容体分子で標識し、蛍光を観察することにより、両者の相互作用の状態や、相互作用が起きる時期等を調べることが可能になる。あるいは、酵素と基質、抗原と抗体のように、互いに結合して相互作用することが知られている分子のペアにおいて、一方を、電子供与体分子で、他方を電子受容体分子で標識し、蛍光を観察する。蛍光が観察されない場合には、標識部位を変えて繰返し行なう。あるいは、蛍光波長が異なる複数種類の標識で、単一分子の異なる部位を標識しておいてもよい。これにより、一方の標的分子のどの部位と、他方の標的分子のどの部位とが接近しているのかを知ることができる。これは、どの部位とどの部位が相互作用しているのかの推測に役立ち、ひいては、例えば、酵素タンパク質の活性中心の同定や、抗原のエピトープの決定等に役立つ。
【００１８】
電荷移動錯体を形成する電子供与体分子と電子受容体分子は、近接して電荷移動が生じた場合に、両者の間に引力が働くことが知られている。本発明の第３の方法は、これを利用した、分子の操作又は接着方法に関するものである。すなわち、電子供与体分子及び電子受容体分子のいずれか一方、又は両方を同一又は異なる標的分子に結合させ、電子供与体分子と電子受容体分子との間に引力を作用させることを含む、標的分子の操作又は接着方法である。例えば、ある立体構造をとるタンパク質のN末端に電子供与体分子を結合させ、C末端に電子受容体分子を結合させる。電子供与体分子と電子受容体分子の間に引力が作用するので、N末端とC末端が接近するようにタンパク質が折りたたまれることを促進することができる。あるいは、異なる２種類の標的分子にそれぞれ電子供与体分子と電子受容体分子を結合させ、２種類の標的分子同士を接着させることができる。
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２０】
参考例１    孤立電荷移動錯体分子対の単一分子分光
ポリスチレン1gあたりのアントラセン、およびテトラシアノベンゼンの濃度が、それぞれ10-5〜10-8moleであって、しかもアントラセンとテトラシアノベンゼンの比率が等モルであるポリスチレンのトルエン溶液を調製した。スピンコーターを用いて、このポリマー溶液をガラス基板上に展開し、風乾により固化して、厚み100nmの薄膜を形成した。
この薄膜試料を用いて、レーザー走査顕微分光を行った結果、アントラセンとテテラシアノベンゼンの相互作用で形成された、単一分子状に孤立化した電荷移動錯体分子対からの発光スペクトルを捉えることに成功した。レーザー走査顕微分光は、具体的に次のようにして行なった。波長532nmのYAG-SHGレーザ光を開口数1.3の油浸対物レンズを通して錯体分子対を含む試料薄膜にスポット照射し、単一錯体分子対からの蛍光を再び対物レンズで集光した。蛍光のみをバンドパスフィルターで選択的に通過させ、アバランシェフォトダイオードにてその光子数を計測する。試料薄膜をピエゾ素子で走査することにより、単一の錯体分子対が２次元的に分布する蛍光イメージが得られた。また、発光スペクトルの測定は、具体的に次のようにして行なった。対物レンズで集光した蛍光をバンドパスフィルター通過後、分光器へと導き、冷却CCDカメラによってマルチチャンネル計測をおこなった。
【実施例１】
【００２１】
参考例１の知見に基づいて、アントラセンを単独でポリスチレンマトリックス中に分散させて調製した薄膜試料を、先端にテトラシアノベンゼンを付着させた石英製プローブ、あるいは金属探針で走査し、電荷移動現象に起因する蛍光を測定した。石英製プローブ、あるいは金属探針の先端にテトラシアノベンゼンを付着させることは、具体的に次のようにして行った。
【００２２】
の参考例１に記した、ポリスチレンの1gあたり、10-5〜10-8moleのテトラシアノベンゼンを均一に分散させたポリマー溶液を調製し、この溶液に石英製プローブ、あるいは金属探針を浸漬し、引き上げる操作を行うことにより、プローブ、あるいは探針の先端部を、テトラシアノベンゼンを含むポリマー薄膜で被覆した。必要に応じて、ブローブ、あるいは探針は、前もってアミノトリエトキシシラン等の、所謂シランカップリング剤で処理することがある。
蛍光の測定は、具体的に次のようにして行なった。アントラセンを含むポリスチレン薄膜の表面とプローブ先端との距離を相互に働く原子間力によって制御しながら、プローブを薄膜表面上でピエゾ素子によって走査した。プローブを通して、あるいは外部のレンズ光学系にて波長532nmのYAG-SHGレーザ光を常時照射した。走査の過程でアントラセンとテトラシアノベンゼンが数オングストロームまで接近したとき、これらの分子が錯体を形成し、レーザ光の吸収と蛍光の発光が生じた。この蛍光をNA1.3の対物レンズで集光し、バンドパスフィルター通過後、アバランシェフォトダイオードで光子数を計測した。上記により、マトリックス中のアントラセンの位置に蛍光スポットが検出された。
【実施例２】
【００２３】
(1)  アントラセンによるタンパク質の標識
タンパク質をアントラセンで標識する。これは、具体的に次のようにして行なう。タンパク質を、例えばジオキサン等の極性溶媒の割合が30％以下の濃度である水溶液に溶解し、37〜40℃の温度で、水溶性カルボジイミドの存在下で、カルボキシル基を有するアントラセン誘導体と反応させた。カルボキシル基は、例えば9-アントラセンカルボン酸のように、アントラセン環に直結していてもよく、あるいは9-アントラセン酪酸のようにメチレン鎖等のスペーサーを介して結合していてもよい。この方法により、タンパク質のN末端にアミド結合を介してアントラセンを導入することが出来た。
【００２４】
(2)  電子供与体分子によるヌクレオチドの標識、およびDNAの塩基配列の解析への応用
アデニン、グアニン、シトシン及びチミンが核酸塩基であるヌクレオチドを、それぞれアントラセン、9−メチルアントラセン、ピレン、アントラセン等の吸収波長の異なる電子供与体分子で化学修飾をして標識化した。電子供与体分子のヌクレオチドへの結合は、電子供与体が有するカルボキシル基、スルホン酸基等の反応性の官能基と、塩基のプリン環あるいはピリミジン環のアミノ基等との反応、あるいは糖の水酸基との反応で形成される。このようにして調製した４種類の化学修飾されたヌクレオチドを用いて、一方の末端をビオチンで修飾した１本鎖DNAを鋳型として、DNAポリメラーゼにより、２本鎖DNAを合成した。ビオチン基を末端に有する２本鎖DNAは、アビジンで被覆したビーズ、あるいは基板に結合させて固定化することにより、電子受容体分子をプローブとして電荷移動錯体の発光を測定し、塩基配列を逐次、解読することが出来た。
【実施例３】
【００２５】
(3)  電子供与体分子と電子受容体分子間の引力を用いる分子操作
タンパク質のN末端に電子受容体であるトリニトロベンゼン誘導体を結合させる。これは具体的に次のようにして行なう。タンパク質を4％の炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かし、37〜40℃の温度でトリニトロベンゼンスルホン酸を加えてアミノ基との反応を行った。タンパク質への電子受容体分子の導入は、C末端とジニトロアニリン等のアミノ化合物との反応であってもよい。電子供与体分子をタンパク質に導入する方法としては、タンパク質のN末端と、9−アントラセンカルボン酸、ピレン酪酸等を水溶性カルボジイミドの存在下で反応させて、所期の目的に適した化合物が得られた。 
実施例３の方法に準じて蛍光スポットを観察する。次にアントラセンとテトラシアノベンゼンの間に引力を作用させる。この状態で、前記と同様に蛍光スポットを観察する。蛍光スポットの数が有意に増え、タンパク質分子が折りたたまれてN末端とC末端が接近したことがわかる。