(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なＩＬ−１２産生促進剤を提供する。【解決手段】ＩＬ−１２産生促進剤は、カバノアナタケよりなる。カバノアナタケの子実体，菌糸体，菌核，これらの混合物，培養残物に糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後に、さらには、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって得られる生理活性成分を有効成分とするインターロイキン１２産生促進剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバノアナタケよりなるインターロイキン１２産生促進剤。
【請求項２】
カバノアナタケの子実体、菌糸体、菌核、これらの混合物、これらの培養残物から選ばれる少なくとも１つを有効成分する請求項１記載のインターロイキン１２産生促進剤。
【請求項３】
カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって得られる生理活性成分を有効成分とする請求項１または２記載のインターロイキン１２産生促進剤。
【請求項４】
糖質分解酵素がマンナナーゼである請求項３記載のインターロイキン１２産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、きのこ類よりなる新規なインターロイキン１２産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン１２（以下、ＩＬ−１２と略称する）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化と細胞性免疫の活性化を介して、非特異的な免疫と抗原特異的な細胞免疫の両方を賦活化するサイトカインであり、抗癌作用や抗ウイルス作用等を有することが知られている。例えば、下記の特許文献１には、ある種の乳酸菌の菌体がＩＬ−１２産生促進活性を有することが記載されている。しかしながら、きのこ類よりなるＩＬ−１２産生促進剤については今だ報告はない。
【特許文献１】特開平１０−１３９６７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、きのこ類よりなる新規なＩＬ−１２産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の点に鑑みて種々の検討を行った結果、カバノアナタケが優れたＩＬ−１２産生促進活性を有することを知見した。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明のＩＬ−１２産生促進剤は、請求項１記載の通り、カバノアナタケよりなる。
また、請求項２記載のＩＬ−１２産生促進剤は、請求項１記載のＩＬ−１２産生促進剤において、カバノアナタケの子実体、菌糸体、菌核、これらの混合物、これらの培養残物から選ばれる少なくとも１つを有効成分する。
また、請求項３記載のＩＬ−１２産生促進剤は、請求項１または２記載のＩＬ−１２産生促進剤において、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって得られる生理活性成分を有効成分とする。
また、請求項４記載のＩＬ−１２産生促進剤は、請求項３記載のＩＬ−１２産生促進剤において、糖質分解酵素がマンナナーゼである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、きのこ類よりなる新規なＩＬ−１２産生促進剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のＩＬ−１２産生促進剤は、カバノアナタケよりなる。カバノアナタケ（Fuscoporia obliqua）は、耐寒性のきのこで、中部ヨーロッパ、シベリア、中国、日本の北部地方等の寒冷地に広く分布している。シラカバやダケカンバ等のカバノキ類に多く寄生し、それらの樹木の樹液を養分にして生育し、その黒く硬い菌核はチャーガと呼ばれ、ロシアでは古くからお茶代わりに飲用されている。
【０００８】
ＩＬ−１２産生促進剤の有効成分としては、カバノアナタケの子実体、菌糸体、菌核、これらの混合物、これらの培養残物が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、混合状態で用いてもよい。子実体や菌糸体や菌核は天然物であっても栽培物または培養物であってもよい。子実体や菌糸体や菌核は乾燥状態のものを粉砕して用いることが好ましい。粉砕する方法は特に限定されず、通常の粉砕装置を用いて粒径が数十μｍ〜数千μｍになるように粉砕してもよいし、同体気流摩擦装置（トルネードミル）を用いて粒径が数μｍ〜数十μｍになるように微粉砕してもよい。
【０００９】
ＩＬ−１２産生促進剤の有効成分は、カバノアナタケに糖質分解酵素を加えて酵素処理を行った後、酵素処理物に対して抽出操作を行うことによって得られる生理活性成分であってもよい。このようにして得られる生理活性成分は、抗酸化活性が増強されているので、ＩＬ−１２産生促進活性と相俟って優れた免疫賦活作用を期待することができる。
【００１０】
酵素処理に用いることができる糖質分解酵素としては、アミラーゼ、グルカナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、混合して用いてもよい。好ましい酵素はマンナナーゼである。マンナナーゼはマンナンを加水分解する作用を有するものであればよい。酵素の使用量は、標準的には、カバノアナタケ重量（乾燥重量）に対して０．５重量％〜５重量％である。酵素処理は、蒸留水中のカバノアナタケ（子実体や菌糸体や菌核は乾燥状態のものを粉砕して用いることが好ましい）に酵素を加え、酵素が最も活発に作用するｐＨ条件と温度条件にて３０分〜４時間ゆるやかに攪拌することで行えばよい。酵素処理は、反応系内を加熱して酵素を失活させることで終了させる。
【００１１】
酵素処理で得られた酵素処理物に対する抽出操作は、例えば、エタノールなどのアルコールを抽出溶媒として用いて行えばよい。具体的には、酵素処理物にアルコールを加えて還流抽出を行うことで生理活性成分を含むアルコール抽出液を得る。生理活性成分の抽出効率を高めるために、アルコールを用いた抽出操作により生成した抽出残渣に熱水を加えて還流抽出などの抽出操作を行い、生理活性成分を含む熱水抽出液を得てもよい。このようにして得られたカバノアナタケの生理活性成分を含む抽出液は、例えば、抽出溶媒を除去することで生理活性成分組成物に調製されて実用に供せられる。
【００１２】
本発明のＩＬ−１２産生促進剤は、感染症、自己免疫疾患、炎症、腫瘍、ＡＩＤＳ等、多くの疾患の治療と予防に有効な手段になるものと期待され、顆粒や錠剤などに製剤化して、服用することができる。その服用量は、服用者の年齢、性別、体重、体調等に応じて適宜決定すればよい。なお、製剤化に際して、必要に応じて所定の添加剤を添加してもよいことはいうまでもない。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定して解釈されるものではない。
【００１４】
実施例１：カバノアナタケのＩＬ−１２産生促進活性
Ａ．検体
１．チャーガ（ウクライナ産）の殺菌粉末（ハンマーミルを用いて粒径を約２０μｍ〜約２００μｍとしたもの）
２．チャーガのマンナナーゼ処理組成物｛チャーガ（ウクライナ産）の殺菌粉末（ハンマーミルを用いて粒径を約２０μｍ〜約２００μｍとしたもの）２５ｇを蒸留水２００ｍＬに懸濁し、マンナナーゼ（スミチームＡＣＨ：新日本化学工業株式会社）０．４ｇを加え、ｐＨ４、温度７０℃の条件にて２時間ゆるやかに攪拌することで酵素処理を行い、反応系内を加熱して酵素を失活させた後、エタノール６０ｍＬを加え、３０℃にて１６時間還流抽出し、カバノアナタケの生理活性成分を含むエタノール抽出液を上清として回収し、さらに、抽出残渣に蒸留水２００ｍＬを加え、８０℃にて２時間還流抽出し、カバノアナタケの生理活性成分を含む熱水抽出液を上清として回収し、得られたエタノール抽出液と熱水抽出液を混合してスプレードライすることで約７．５ｇ得た、粉末状の生理活性成分組成物｝
３．マンナナーゼを加えないこと以外は上記と同じ操作を行って調製した組成物（酵素コントロール）
【００１５】
Ｂ．試薬
・  ＩＬ−１２アッセイキット（和光純薬工業株式会社）
・  Ｈａｎｋ’ｓ液（ペニシリン、ストレプトマイシン含有）
・  １０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液（ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬工業株式会社）溶液と牛胎児血清（ＦＣＳ）とを容量比９：１で混合したもの）
・  リポポリサッカライド（ＬＰＳ：和光純薬工業株式会社）溶液（１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１００ｎｇ／ｍＬに調製したもの）
【００１６】
Ｃ．サンプル液
検体２００ｍｇを乳鉢で粉砕した後、Ｈａｎｋ’ｓ液１．８ｍＬに溶解した。これを１５ｍＬチューブに移し、室温にて１時間静置した。その後、１０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清０．５ｍＬを回収した。回収した０．５ｍＬを原液とし、Ｈａｎｋ’ｓ液４ｍＬを加えサンプル液とした。
【００１７】
Ｄ．ＩＬ−１２産生促進活性の測定方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♀６週齢、ｎ＝８）を１週間予備飼育した７週齢の実験マウスの腹腔内に、調製した各サンプル液をそれぞれ０．５ｍＬ投与した。サンプル液の投与から１８時間後に腹腔内細胞を回収した。回収した細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液にて洗浄し、溶血バッファーにて赤血球を除去した後、細胞数を算定し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０溶液を用いて１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、２４穴カルチャープレートにて培養した。その際に、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを１０μＬ加えた場合と加えなかった場合との２通りで培養した。ＬＰＳ添加から１８時間後に培養上清を回収し、ＩＬ−１２アッセイキットを用い、その製品プロトコールに準じてＩＬ−１２産生量を測定した。
【００１８】
Ｅ．測定結果
ＬＰＳを加えて培養した場合における、検体のＩＬ−１２産生量を図１に示す。図１から明らかなように、カバノアナタケは、優れたＩＬ−１２産生促進活性を有していることがわかった。なお、ＬＰＳを加えないで培養した場合におけるＩＬ−１２産生促進活性は認められなかった。
【００１９】
参考例１：チャーガのマンナナーゼ処理組成物の抗酸化活性（ＳＯＤ様活性）の測定
Ａ．方法（Ｎｉｔｒｉｔｅ法）
１．試薬
（ａ）基質
ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）１３．６ｍｇと、ヒドロキシルアミン−Ｏ−スルフォン酸１００ｍｇを、１００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4・ほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２：以下、単に緩衝液と略称する）１００ｍＬに溶解したものを用いた。
（ｂ）酵素液
キサンチンオキシダーゼ（Ｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ：和光純薬工業株式会社）１０μＬと、ＥＤＴＡ・２Ｎａ３７２ｍｇを緩衝液１００ｍＬに溶解した溶液０．５ｍＬと、緩衝液９．５ｍＬを混合したものを用いた。
（ｃ）発色液
スルファニル酸２２５ｍｇと、Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン・２ＨＣｌ５ｍＬと、酢酸１２５ｍＬを混合し、蒸留水で全量を５００ｍＬにしたものを用いた。
【００２０】
２．サンプル液
チャーガのマンナナーゼ処理組成物（検体）１５０ｍｇを蒸留水３ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーにて３０秒間混和した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清を回収した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターにて濾過し、濾液をサンプル原液とした。このサンプル原液より希釈系列を調製し、サンプル液とした。
【００２１】
３．測定方法
試験管にサンプル液０．１ｍＬと蒸留水０．５ｍＬと基質０．２ｍＬを入れ、３７℃の温浴で５分間加熱した。その後、酵素液０．２ｍＬを加え、３７℃の温浴でさらに３０分間加熱した後、発色液２ｍＬを加え、室温で２時間放置してから５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとして蒸留水を用い、各サンプル液の希釈倍率における発色阻害率（％）を｛(コントロール吸光度−サンプル液吸光度)／コントロール吸光度｝×１００から求めた。
発色阻害率が５０％であるサンプルの希釈倍率を求めて、その値を１ユニット（１  Ｎｉｔｒｉｔｅ  ｕｎｉｔ）とした。これに希釈倍率をかけてサンプル原液のユニット数を求めた。サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求め、これをＳＯＤ様活性値とした。すなわち、例えば、原液を２倍希釈してなるサンプル液の阻害率が５０％であった場合、サンプル原液のユニット数は１（ユニット）×２（希釈率）＝２ユニットとなり、サンプル原液は検体５０ｍｇ／ｍＬで調製してあるので、サンプル原液のユニット数を２０倍して検体１ｇあたりのユニット数を求めると４０ユニットとなり、これをＳＯＤ様活性値とした。
【００２２】
Ｂ．結果
チャーガのマンナナーゼ処理組成物の１ｇあたりのＳＯＤ様活性値を、チャーガの殺菌粉末と酵素コントロールの１ｇあたりのＳＯＤ様活性値とともに図２に示す。図２から明らかなように、カバノアナタケにマンナナーゼを加えて酵素処理を行うことで、カバノアナタケのＳＯＤ様活性を増強できることがわかった。
【００２３】
参考例２：チャーガのマンナナーゼ処理組成物のメラニン含有量の測定
１．試薬
・  ２％水酸化ナトリウム水溶液
・  濃塩酸
・  メラニン（シグマ社）
・  ０．２５％過マンガン酸カリウム水溶液
・  ５％シュウ酸水溶液
【００２４】
２．測定方法
チャーガのマンナナーゼ処理組成物（検体）１５０ｍｇを蒸留水３ｍＬに懸濁し、ボルテックスミキサーにて３０秒間混和した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、上清を回収した。回収した上清を濃塩酸にてｐＨ２に調製し酸性化した。これを３０００ｒｐｍで１５分間遠沈し、得られた沈殿物を２％水酸化ナトリウム水溶液３ｍＬに溶解してサンプル液とした。このサンプル液の４９０ｎｍの吸光度を測定することで、抗酸化能の主要有効成分と目されるメラニンの含有量を測定した。
【００２５】
３．測定結果
チャーガのマンナナーゼ処理組成物から調製したサンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量を、チャーガの殺菌粉末と酵素コントロールから調製したサンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量とともに図３に示す。図３から明らかなように、カバノアナタケにマンナナーゼを加えて酵素処理を行うことで、サンプル液１ｍＬあたりのメラニン含有量を増量できることがわかった。なお、メラニンの存在の確認は、上記の上清を用いて過マンガン酸カリウム−シュウ酸法により行った。具体的には、上清２ｍＬに０．２５％過マンガン酸カリウム水溶液３８ｍＬを加え、常温にて４時間放置した後、濃塩酸にてｐＨ２に調製し、これを３０００ｒｐｍで１５分間遠沈し、得られた沈殿物に５％シュウ酸水溶液３０ｍＬを加え、それを１０分放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠沈し、得られた沈殿物が漂白されていることで確認した。
【００２６】
製造例１：錠剤品の製造
チャーガのマンナナーゼ処理組成物を打錠機にて打錠し、錠剤品を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明は、新規なＩＬ−１２産生促進剤を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１におけるＩＬ−１２産生促進活性を示すグラフ。
【図２】参考例１における抗酸化活性を示すグラフ。
【図３】参考例２におけるメラニン含有量を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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