(57)【要約】【課題】  生体内におけるP-糖蛋白質の発現の制御のメカニズムを解明し、薬剤に対する感受性や副作用の発現を判定する。【解決手段】  被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤に対する感受性の判定法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤に対する感受性の判定法。
【請求項２】
被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤投与時の副作用発現程度の判定法。
【請求項３】
被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤耐性の判定法。
【請求項４】
薬剤が、抗癌剤である請求項1〜3のいずれか1項記載の判定法。
【請求項５】
MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)である請求項1〜4のいずれか1項記載の判定法。
【請求項６】
配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するMDR1の遺伝子多型ポリペプチド。
【請求項７】
MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)であることを特徴とする、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するMDR1の遺伝子多型ポリペプチドの部分ペプチド。
【請求項８】
配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するMDR1の遺伝子多型。
【請求項９】
配列番号2で示される塩基配列を有するものである請求項6記載の遺伝子多型。
【請求項１０】
MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)であることを特徴とする、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するMDR1の部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)であることを特徴とする、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するMDR1の部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチドに相補的な部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤等の薬剤を細胞外に輸送する蛋白質であるP-糖蛋白質の遺伝子であるMDR1の遺伝子多型及び当該多型を検出することによる正常細胞および癌細胞の薬剤感受性の判定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン等のアンスラサイクリン類、ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類、塩酸イリノテカン等のカンプトテシン類、エトポシド等、ミトキサントロン等の抗癌剤は、抗悪性腫瘍効果が極めて高いことから広く用いられているが、反面、骨髄抑制、下痢などの副作用をおこすことが知られている。また、これらの抗癌剤が有効性を示すとされている癌でも、患者によっては有効性を示さないことがあることが知られている。
【０００３】
癌細胞におけるこれらの抗癌剤に対する耐性獲得のメカニズムについては、以前からよく研究されており、ABCトランスポーターの一つであるP-糖蛋白質が、これらの抗癌剤の耐性に関与していることが知られている（非特許文献１）。すなわち、P-糖蛋白質を発現する癌では、P-糖蛋白質が抗癌剤を細胞外に排出することにより、抗癌剤の細胞内蓄積を減少させる作用を有することが判明した。このP-糖蛋白質をコードする遺伝子がMDR1遺伝子である。
【０００４】
また、P-糖蛋白質は正常組織では、副腎、大腸、小腸、腎臓、血管内皮細胞、造血前駆細胞などに発現している。造血組織や小腸上皮組織は抗癌剤の副作用としての毒性を受けやすい組織であり、その副作用は骨髄抑制や激しい下痢などの症状として現れる。とりわけ抗癌剤を用いた癌の化学療法では、こうした副作用が大きな問題となっている。P-糖蛋白質は種々の抗癌剤を細胞外に輸送するため、癌患者の正常組織におけるP-糖蛋白質の発現が高い場合には抗癌剤の副作用が出にくく、逆に正常組織のP-糖蛋白質の発現が低い場合には強い副作用が出ることが予想される。
【０００５】
かかる観点から、MDR1遺伝子の発現を制御すれば抗癌剤等の薬剤の副作用や薬剤耐性が制御できると考えられている。
【非特許文献１】Methods in Enzymology, 292: 248-594 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、生体内におけるP-糖蛋白質の発現の制御のメカニズムを解明し、薬剤に対する感受性や副作用の発現を判定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、種々検討した結果、正常組織におけるP-糖蛋白質の発現には、患者の個人差があることを見出した。そこで、こうした個人差を規定している一塩基多型（Single nucleotide polymorphisms）に着目した。すなわち、P-糖蛋白質の遺伝子であるMDR1遺伝子上の塩基配列の1個または数個の違いが、MDR1 mRNAの発現の増大あるいは減少、P-糖蛋白質の発現の増大あるいは減少、P-糖蛋白質の機能の増大、減少もしくは喪失としてあらわれると考えた。そして、本発明者はヒトの末梢白血球におけるMDR1遺伝子の構造を調べた結果、MDR1遺伝子には遺伝子多型が存在し、当該多型によってP-糖蛋白質による薬剤耐性獲得能が大きく減弱することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤に対する感受性の判定法を提供するものである。
また本発明は、被験細胞のMDR1の遺伝子多型を同定することを特徴とする被験細胞の薬剤耐性又は薬剤投与時の副作用発現程度の判定法を提供するものである。
また本発明は配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するP-糖蛋白質の遺伝子多型ポリペプチドを提供するものである。
また本発明は、MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)であることを特徴とする、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するMDR1の遺伝子多型ポリペプチドの部分ペプチドを提供するものである。
さらに本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するMDR1の遺伝子多型を提供するものである。
さらに本発明は、MDR1の遺伝子多型がMDR1(C3583T)であることを特徴とする、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するMDR1の部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチド及び当該部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチドに相補的な部分ポリヌクレオチド又は部分オリゴヌクレオチドを提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の遺伝子多型を同定すれば、被験細胞を保有する被験者に抗癌剤等の薬剤を投与した場合の副作用の発現程度を予測することが可能であり、また薬剤耐性の程度を予測することも可能であり、より安全な薬剤治療指針の策定に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の遺伝子多型は野生型MDR1の遺伝子を構成する塩基の1個が他の塩基に置換しているものであり、例えば配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するP-糖蛋白質(H1195Y) 〔野生型P-糖蛋白質の1195番目のヒスチジン(H)がチロシン(Y)に変異したアミノ酸配列を有する〕が挙げられる。当該MDR1(C3583T)の塩基配列は、例えば配列番号2で示される。
【００１１】
本発明の遺伝子多型は、例えばヒト末梢白血球細胞由来の全RNAを用いて、野生型MDR1遺伝子全長を増幅するRT-PCRを行い、得られたcDNAからクローニングすることができる。得られた変異がPCRのエラーでなく遺伝子多型であることは、多型が得られた細胞のDNAを増幅して塩基配列を確認すればよい。
【００１２】
かくして得られる本発明の遺伝子多型は、野生型MDR1の同一のプロモーターを用いて発現させたときに、発現するｍRNA量が低下するために生成するP-糖蛋白質の量が低下するか、生成したP-糖蛋白質が細胞表面に発現しないために、あるいは生成したP-糖蛋白質の機能が低下しているために、その結果として、細胞の薬剤に対する感受性が高くなる。
【００１３】
本発明においては、被験細胞、例えば、末梢血中の白血球を用い、MDR1の遺伝子多型を同定することにより、抗癌剤等の薬剤に対する感受性を判定する。正常細胞におけるこの感受性を把握することにより、抗癌剤等の薬剤投与時の副作用の発現の程度を判定（予測）することが可能となり、結果的に安全な薬剤投与が達成できる。また、被験細胞として、患者より切除した癌細胞（組織）、あるいはバイオプシー検体を用いれば、同様にその感受性を判定し、結果的に癌細胞（組織）の抗癌剤耐性等の薬剤耐性を判定できる。
【００１４】
本発明においては、具体的な遺伝子多型MDR1(C3583T)が、野生型MDR1の同一のプロモーターを用いて発現させたときに、細胞の表面に発現するP-糖蛋白質の量が非常に少ないということが判明した。この遺伝子多型を持つ癌患者は、副腎、大腸、小腸、腎臓、血管内皮細胞、造血前駆細胞の正常組織における細胞表面のP-糖蛋白質の発現量が少なく、したがって、遺伝子多型を持つ患者に抗癌剤を投与した場合にこれらの正常組織の傷害が大きい、つまり抗癌剤の副作用が強く出ると予想される。また、被験細胞がこの遺伝子多型を持つということは、細胞表面のP-糖蛋白質の発現量が少なく、したがって抗癌剤に感受性が高いと考えられる。したがって、本発明のMDR1遺伝子多型の同定は、抗癌剤投与量、投与方法の設定などより安全な抗癌剤治療のために有効である。
【００１５】
本発明の遺伝子多型MDR1(C3583T)は、野生型に比べて、細胞表面のP-糖蛋白質の発現量が少なく、また発現したP-糖蛋白質が抗癌剤排出ポンプとして十分に機能しないために、細胞の抗癌剤感受性が高く、上記の抗癌剤投与時の副作用の発現程度の判定及び抗癌剤耐性の判定に特に有用である。また、この遺伝子多型がホモで存在するかヘテロで存在するかによっても副作用の発現程度等は異なるため、この点を判定の指標とすることも可能である。
【００１６】
本発明の遺伝子多型を検出または測定するには、たとえばMDR1(C3583T)に特異的なプライマーを用いたPCR法およびインベーダーアッセイ法、コドン1195を含む領域をPCRで増幅して直接塩基配列を決定するダイレクトシークエンス法、コドン1195を含む領域をPCRで増幅して電気泳動して塩基配列の異なるフラグメントが増幅しているかを調べるPCR-SSCP法、P-糖蛋白質(H1195Y)に特異的な抗体を用いた免疫学的測定法等により実施することができる。
【００１７】
ここでMDR1(C3583T)に特異的なプライマーとしては、2種のプライマーのうちの1種がコドン1195のTATに相補的な配列を含むプライマーであり、他の1種がMDR1の他の部分の配列を含むプライマーが挙げられる。より具体的にはコドン1195のTATに相補的な配列を含むプライマーとして、5'- ATC CAA AAG CAA AAT ATA AG -3'（配列番号3）、MDR1の他の部分の配列を含むプライマーとして5'-GTG GGG CAA GTC AGT TCA TT -3'（配列番号4）が挙げられる。
【００１８】
上記の2つのプライマーを用いて、細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行う。具体的には、94℃で5分の反応を行った後、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で1分の反応を30回繰り返し、最後に94℃で30秒、72℃で15分の反応を1回行って、638塩基対の増幅産物を得ることができる。
【００１９】
本発明において、副作用程度判定及び薬剤耐性判定の対象となる抗癌剤としては、P-糖蛋白質により耐性を生じる抗癌剤であれば制限されないが、例えば塩酸ドキソルビシン、ダウノマイシン、塩酸エピルビシン等のアンスラサイクリン類、ビンクリスチン等のビンカアルカロイド類、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン類、塩酸イリノテカン、トポテシン等のカンプトテシン類、エトポシド等、マイトマイシン等、ミトキサントロン等が挙げられる。
抗癌剤以外では、エリスロマイシン、クラリスロマイシン等のマクロライド系抗菌薬、レボフロキサシン等のニューキノロン系抗菌薬、硫酸インジナビル、サキナビル等の抗ＨＩＶ薬、イトラコナゾール等の深在性・表在性抗真菌薬、ケトコナゾール等の表在性抗真菌薬、イベルメクチン等の線虫症治療薬、塩酸メフロキン等の抗マラリア薬、シクロスポリン、タクロリムス水和物等の免疫抑制薬、塩酸プロメタジン等のフェノチアジン系抗ヒスタミン薬、スピロノラクトン等のＫ保持性利尿薬、ルセルピン等の末梢性交感神経抑制薬、塩酸ジルチアゼム等のベンゾチアゼピン系降圧薬、塩酸ベラバミル等のCa拮抗薬、硫酸キニジン、塩酸プロパフェノン等のNaチャネル遮断薬、塩酸アミオダロン等のベータ遮断薬、ジゴキシン等のジギタリス心不全治療薬・昇圧薬、ドンペリドン等の抗ドパミン薬、塩酸ロペラミド等の止瀉薬、塩酸クロルプロマジン等のフェノチアジン系抗精神病薬、ピモジド等の抗精神病薬、塩酸オンダンセトロン等の５−ＨＴ3受容体拮抗制吐薬等が挙げられる。
【００２０】
また、本発明の抗癌剤投与時の副作用の程度判定及び抗癌剤耐性判定の対象癌は、前記の抗癌剤の適用対象となる癌であれば特に制限されない。また被験正常細胞としては、前記のP-糖蛋白質が発現している正常組織由来の細胞、末梢血細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）MDR1遺伝子
P-糖蛋白質は、抗癌剤耐性に関与するABC transporterとして最初に同定された。P-糖蛋白質の遺伝子であるMDR1遺伝子のヒトの全長cDNAの配列は米国の研究グループにより既に報告されている。
MDR1と名付けられた遺伝子はGenBankのaccession number M14758に登録されており、Chen, C., J., et al., Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. Cell 47:381-389 (1986)などに発表されている。
しかしながらこのMDR1 cDNAの配列は突然変異剤ethylmethane sulfonateで処理したコルヒチン耐性癌細胞より得られたものであり、日本人に最も多いタイプのMDR1遺伝子（いわゆる野生型）と比べて、C540T、G554T、A555T、T1236Cの違いがある。なお、この場合、野生型MDR1遺伝子の塩基配列が数字の左側に記載されている。これらの塩基配列の違いの内、C540Tは180番目のセリンをコードするコドンにあり、多型によるアミノ酸の変化を生じない遺伝子多型である。また、T1236Cは412番目のグリシンをコードするコドンにあり、多型によるアミノ酸の変化を生じない遺伝子多型である。G554TとA555Tは野生型のMDR1遺伝子の185番目のグリシンをコードするCCAがGTTとなり、バリンに変異する。これはこの癌細胞が突然変異剤で処理された後に起きた変異であり、人為的な突然変異と考えられている。
【００２３】
本発明でヒト野生型MDR1 cDNAと呼ぶ遺伝子は、ヒトの副腎のcDNAライブラリーより単離されたものである。Kioka, N., et al. P-glycoprotein gene (MDR1) cDNA from human adrenal: Normal P-glycoprotein carries Gly185 with an altered pattern of multidrug resistance. Biochem Biophys Res Commun 162: 224-231 (1989)に記載されている。
【００２４】
（１）DNAの抽出
ヒト末梢血細胞よりDNAをQIAGEN RNA/DNA Maxi kit (Qiagen)を用いて抽出した。抽出手順はKit添付のプロトコールに従った。このようにして末梢血14 mLよりおよそ100-200μgのDNAを得た。
【００２５】
（２）PCRによるMDR1遺伝子のexon27の増幅
MDR1遺伝子のそれぞれのexonの塩基配列を決定するため、ヒト末梢血DNAを鋳型として、DNAを増幅した。MDR1遺伝子のexon27の増幅には、5'- CTT TAC TTT CAG TTC TAC TTT CA -3'（配列番号5）と、5'- GAG AAT ACA GCA TTT TTA AGG A -3'（配列番号6）の2本のプライマーを用い、Applied Biosystems社のAmpliTaq Goldを用いて、95℃で9分、5℃で30秒、72℃で1分の反応を1回行った後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分の反応を30回繰り返し、最後に72℃で15分の反応を1回行い、256bpの増幅されたDNAを得た。
【００２６】
（３）シークエンス
上記のPCRで増幅したDNAを鋳型とし、5'- CAG TTC TAC TTT CAT AAC AAC AA -3'（配列番号7）のプライマーとApplied BioSystems社のBigDye Terminator Cycle Sequence Kitを用いてシークエンス反応を行った。Applied Biosystems社のABI PRISM377 DNAシークエンサーを用いて塩基配列を決定した。その結果、MDR1遺伝子のC3583Tの遺伝子多型を同定した（配列番号2）。この多型によりコドン1195のヒスチジン（CAT）がチロシン（TAT）に変わることが判明した（配列番号1）。
【００２７】
（４）MDR1(C3583T)を発現するベクターの作成
野生型MDR1 cDNAを鋳型とし、プライマー  5'- AGA CAG CCT TAT ATT TTG CTT -3'（配列番号8）を用いて、Site Directed MutagenesisのためのKitであるMutan-Super Express Km（宝酒造）により添付のプロトコールに従ってMDR1(C3583T)を作成した。増幅されたcDNAの塩基配列を決定し、遺伝子多型が導入されていることとPCRによる変異のないことを確認した。これらのcDNAをSst IIとXho Iの２種の制限酵素を用いてバイシストロニックプラスミドベクターであるpHaL-IRES-DHFRにT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。作成されたプラスミドをpHa-MDR(C3583T)-IRES-DHFRと名付けた。また、野生型MDR1 cDNAを導入したベクターはpHa-MDR-IRES-DHFRである。
【００２８】
（５）MDR1(C3583T)の導入によるビンクリスチン耐性コロニーの出現の有無
マウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるPA317 細胞にリン酸カルシウム法を用いてpHa-MDR-IRES-DHFRあるいはpHa-MDR(C3583T)-IRES-DHFRを導入した。遺伝子導入後の細胞を30 ng/mLのビンクリスチンで選択したところ、pHa-MDR-IRES-DHFRを導入した細胞のディッシュでは1枚あたり100個以上のビンクリスチン耐性コロニーが得られたが、pHa-MDR(C3583T)-IRES-DHFRを導入した細胞のディッシュでは細胞は全て死滅し、ビンクリスチン耐性コロニーは得られなかった。このことは、MDR1(C3583T)を導入した細胞が高いビンクリスチン耐性を獲得することはなかった、ということを示す。
【００２９】
（６）MDR1(C3583T)導入細胞の作成
上記と同様に、マウスのamphotropic retrovirus packaging cell lineであるPA317 細胞にリン酸カルシウム法を用いてpHa-MDR-IRES-DHFRあるいはpHa-MDR(C3583T)-IRES-DHFRを導入した。今度は遺伝子導入後の細胞を120 ng/mLのメソトレキセートで選択した。pHa-MDR-IRES-DHFRを導入した細胞のディッシュ、pHa-MDR(C3583T)-IRES-DHFRを導入した細胞のディッシュともディッシュでは1枚あたり100個以上のメソトレキセート耐性コロニーが得られた。この細胞をPA317/MDRおよびPA317/MDR(C3583T)と名付けた。
【００３０】
（７）細胞増殖試験
PA317細胞、PA317/MDR細胞、PA317/MDR(C3583T)細胞のビンクリスチンに対する感受性を細胞増殖阻害試験にて調べた。これらの細胞を１２穴プレート（イワキ）に2500個/mL/ウェルでまき、続いてメディウムで各濃度に希釈した薬剤をウェルあたり1mL加えた。このプレートを5%炭酸ガス培養器で37℃、5日間で培養した。５日後、リン酸緩衝バッファーで細胞を洗浄後、0.5mLのトリプシン-EDTAで細胞をはがしメディウム1mLで懸濁し、9mLのセルパック希釈液（東亞医用電子）をいれたビーカーに各ウェルの細胞液をそれぞれ加え、Sysmex CDA-500自動細胞数計測装置（東亞医用電子）にて細胞数を計測した。その結果として、細胞数を50%に減少させるビンクリスチン濃度（IC50）を求めた。親株PA317細胞のビンクリスチンに対するIC50は2.09 ng/mLであったのに対し、野生型MDR1 cDNAを導入したPA317/MDR細胞のビンクリスチンに対するIC50は16.61 ng/mLであり、約8倍のビンクリスチン耐性となった。これに対し、PA317/MDR(C3583T)細胞のビンクリスチンに対するIC50は4.46 ng/mLであり、約2倍のビンクリスチン耐性しか示さなかった。以上より、MDR(C3583T)を導入したPA317/MDR(C3583T)細胞は野生型MDR1 cDNAを導入したPA317/MDR細胞よりも明らかに低い耐性を示した。
【００３１】
（８）細胞表面のP-糖蛋白質の発現
細胞表面のP-糖蛋白質の発現を抗ヒトP-糖蛋白質抗体であるMRK16を用いたフローサイトメトリーで調べた。PA317細胞、PA317/MDR細胞、PA317/MDR(C3583T)細胞の細胞浮遊液を作成し、1%ウシ血清アルブミン、0.1%アジ化ナトリウム添加ハンクス（ニチレイ）液に懸濁した。それぞれ約50万個の細胞に対し、最初にビオチン標識したMRK16抗体のF(ab')2フラグメントを最終濃度が0.1 mg/mLになるように加え、氷浴上30分反応させた後、未反応の抗体を上記ハンクス液にて洗浄除去した。次にファイコエリスリン標識ストレプトアビジン（日本ベクトン）を加え、氷浴上30分反応させた後、未反応のファイコエリスリン標識ストレプトアビジンを上記ハンクス液にて洗浄除去した。細胞の蛍光を日本ベクトン社のFACS Caliburで測定した。
その結果が図1〜3である。図1〜3で、太い実線がMRK16を添加した場合、細い点線がMRK16を加えなかった場合を示す。PA317細胞では、太い実線と細い点線がほぼ一致しており、抗ヒトP-糖蛋白質抗体であるMRK16に反応する細胞がなかったことを示す。PA317/MDR細胞では、MRK16を添加した太い実線をみると、ほとんどの細胞が大きく右側に移動しており、蛍光の強度が高かったこと、つまり抗ヒトP-糖蛋白質抗体であるMRK16に強く反応したことが明らかになった。一方、PA317/MDR(C3583T)細胞では抗ヒトP-糖蛋白質抗体であるMRK16に弱い反応性を示し、PA317/MDR細胞より蛍光強度の低い細胞がほとんどであった。すなわち、MDR1(C3583T)遺伝子でコードされるH1195Y型のP-糖蛋白質は、細胞表面における発現が低いために細胞を抗癌剤耐性とする能力が弱い、ということが示された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】PA317細胞表面のP-糖蛋白質の発現を抗ヒトP-糖蛋白質抗体を用いてフローサイトメトリーで調べた結果を示す。
【図２】PA317/MDR細胞表面のP-糖蛋白質の発現を抗ヒトP-糖蛋白質抗体を用いてフローサイトメトリーで調べた結果を示す。
【図３】PA317/MDR(C3583T)細胞表面のP-糖蛋白質の発現を抗ヒトP-糖蛋白質抗体を用いてフローサイトメトリーで調べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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