(57)【要約】【課題】  オオムギ等のイネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用法を提供する。【解決手段】  オオムギの詳細な連鎖地図を作成し、ＱＴＬ解析を行うことにより、オオムギ４Ｈ染色体上に座乗する出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する一組の遺伝子マーカーと、オオムギ５Ｈ染色体上に座乗する出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する二組（３つ）の遺伝子マーカーとを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記出穂期に関与する遺伝子座から０ないし１２センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴とする遺伝マーカー。
【請求項２】
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１に記載の遺伝マーカー。
【請求項３】
上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝マーカー。
【請求項４】
上記ゲノムＤＮＡが４Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項５】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項６】
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝マーカー。
【請求項７】
上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝マーカー。
【請求項８】
配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または７に記載の遺伝マーカー。
【請求項９】
配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または７に記載の遺伝マーカー。
【請求項１０】
配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項１または２または３または７に記載の遺伝マーカー。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを用いて出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴とするＤＮＡ断片の単離方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離方法により得られた上記出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴とする出穂期改変イネ科植物の生産方法。
【請求項１３】
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項１２に記載の出穂期改変イネ科植物の生産方法。
【請求項１４】
上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項１３に記載の出穂期改変イネ科植物の生産方法。
【請求項１５】
請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の出穂期改変イネ科植物の生産方法によって得られた出穂期改変イネ科植物。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝マーカーを指標として、出穂期改変イネ科植物を選抜する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーと、その利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
イネ科植物の出穂期は早生、晩生の指標となる形質である。出穂期の改変は地域適応性や収穫作業の分散化等のために重要な育種目標となっている。
【０００３】
従来、作物の育種は目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、出穂期を目標形質とした場合には、選抜対象集団を栽培し、各個体の出穂期を実際に調査することにより、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。また、目標形質が栽培環境因子に影響を受けやすい形質であれば、選抜個体が発現している目標形質が遺伝子の表現型であるか否かの判定が困難であった。
【０００４】
そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減、有用遺伝子の確実な選抜を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により幼苗段階で選抜が可能となり、目標形質の有無の確認も容易となる。したがって、遺伝マーカーを利用すれば効率的な育種が実現可能である。そして、遺伝マーカーを利用した育種を実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。
【０００５】
ところで、出穂期などの農業上重要な形質の多くは、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は、時間や長さなどの量的な尺度で測定されるので量的形質と呼ばれている。量的形質は一般に、単一主働遺伝子支配の形質ではなく、複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多い。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質であることが多い。
【０００６】
このような量的形質を司る遺伝子が染色体上に占める遺伝的な位置をＱＴＬ（Quantitative Trait Loci、量的形質遺伝子座）と称する。ＱＴＬを推定する方法として、ＱＴＬの近傍に存在する遺伝マーカーを利用するＱＴＬ解析が用いられる。１９８０年代後半にＤＮＡマーカーが登場すると、ＤＮＡマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進み、その地図に基づいて多くの生物でＱＴＬ解析が行われるようになった。
【０００７】
以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバーできる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高いＱＴＬ解析により可能となり、得られた遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。
【０００８】
上記遺伝マーカーに関する技術としては、オオムギを例に挙げると、１）オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術（特許文献１参照）や、２）オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット（特許文献２参照）とその利用に関する技術等が、本発明者らによって提案されている。
【特許文献１】特開２００２−２９１４７４号公報（２００２（平成１４）年１０月８日公開）
【特許文献２】特開２００３−１１１５９３号公報（２００３（平成１５）年４月１５日公開）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、イネ科植物、特にオオムギ、コムギ、イネ等の作物の出穂期の改変は重要な育種目標の１つである。しかし、出穂期は栽培環境因子に影響を受けやすい形質であり、複数の遺伝子座が関与する場合が多いため、実際に出穂期を調査する選抜方法では出穂期に関与する遺伝子（遺伝子座）を確実に選抜しているか否かを確認することが困難である。そこで出穂期を改変した植物の育種には遺伝マーカーを利用することが非常に有効である。出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーが開発され、利用可能となれば、出穂期改変植物の育種の大幅な効率化を実現することが可能となる。
【００１０】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、イネ科植物、特にオオムギにおける出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーと、その代表的な利用法とを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列に基づいてプライマーセットを設計し、当該プライマーセットにより増幅されるオオムギゲノム断片の多型の有無により遺伝マーカー（ＤＮＡマーカー）を開発した。さらに、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」の交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（doubled haploid、以下「ＤＨ」と略記する。）集団を材料として、上記遺伝マーカー間の連鎖を検出して、当該ＤＨ系統の連鎖地図を作成し、この連鎖地図に基づいて出穂期に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行なった。その結果、出穂期に関与する遺伝子座を４Ｈ染色体上に１つ、５Ｈ染色体上に１つ検出した。本発明者等はさらに解析を進め、これら出穂期に関与する遺伝子座にそれぞれ連鎖する新規遺伝マーカーを見いだした。すなわち本発明は、上記新規知見により完成されたものであり、以下の発明を包含する。
【００１２】
すなわち本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、上記出穂期に関与する遺伝子座から０ないし１２センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴としている。上記遺伝マーカーは、出穂期に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと出穂期に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率は低い。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、例えば出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、出穂期改変イネ科植物の生産（作出）・判別等を行なうことが可能となる。
【００１３】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記イネ科植物がムギ類であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギ・コムギ等のムギ類において出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、出穂期改変ムギ類の生産（作出）・判別等を行なうことが可能となる。
【００１４】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ムギ類がオオムギであることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギにおいて出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、出穂期改変オオムギの生産（作出）・判別等を行なうことが可能となる。
【００１５】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが４Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの４Ｈ染色体上に存在する出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、出穂期改変オオムギの生産（作出）・判別等を行なうことが可能となる。
【００１６】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、出穂期改変イネ科植物の判別を容易に行なうことができる。
【００１７】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、出穂期改変イネ科植物の判別を容易に行なうことができる。
【００１８】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムＤＮＡが５Ｈ染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの５Ｈ染色体上に存在する出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の取得、出穂期改変オオムギの生産（作出）・判別等を行なうことが可能となる。
【００１９】
さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第三プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、出穂期改変イネ科植物の判別を容易に行なうことができる。
【００２０】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第四プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、出穂期改変イネ科植物の判別が容易に行なうことができる。
【００２１】
また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第五プライマーセットを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、出穂期改変イネ科植物の判別が容易に行なうことができる。
【００２２】
一方、本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを用いて出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することを特徴としている。本発明にかかる遺伝マーカーは出穂期に関与する遺伝子座に強連鎖するものであり、上記遺伝マーカーを目標にクローニングを行なえば、出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を容易に単離することが可能となる。
【００２３】
また本発明にかかる出穂期改変イネ科植物の生産方法は、上記本発明にかかるＤＮＡ断片の単離方法により得られた上記出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、イネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することを特徴としている。上記イネ科植物はムギ類であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。当該生産方法により、出穂期改変イネ科植物を生産することが可能となる。
【００２４】
また本発明にかかる出穂期改変イネ科植物は、上記本発明にかかる出穂期改変イネ科植物の生産方法によって得られることを特徴としている。当該出穂期改変イネ科植物によれば、容易に収穫時期をずらすことが可能となる。
【００２５】
また本発明にかかる出穂期改変イネ科植物を選抜する方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として、出穂期改変イネ科植物を選抜する方法である。上記本発明にかかる遺伝マーカーは、出穂期に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと出穂期に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率が非常に低い。それゆえ上記遺伝マーカーを検出することによって、試験対象植物における出穂期に関与する遺伝子座の遺伝子型を容易に判別することができ、選抜すべき個体を容易に見出すことが可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明にかかる遺伝マーカーは、出穂期に関与する遺伝子座と連鎖するため、当該遺伝マーカーを指標として出穂期を改変したイネ科植物の育種を可能とする。したがって、出穂期改変植物の効率的な育種が実現できるという効果を奏する。より具体的には、幼苗段階で目的個体を選抜できるため、実際に植物個体の出穂期を観察した後に目的の個体を選抜する必要がなくなり、育種期間を短縮できるという効果を奏する。また、複数の遺伝子座を同時に選抜できるために、観察によって選抜するよりも、確実に目的とする遺伝子型を得ることができる。さらに、労働力および圃場面積を縮減できるという効果を奏する。
【００２７】
また、本発明にかかる遺伝マーカーを指標として選抜育種を行えば、栽培環境因子による表現型への影響を排除することが可能となる。したがって、有用遺伝子（遺伝子座）の確実な選抜ができるという効果を奏する。
【００２８】
さらに、上記遺伝マーカーを指標として選択的に育種された出穂期改変植物は、収穫時期を栽培地域に適合させることができるという効果を奏する。また、出穂期の異なる作物を栽培することにより、収穫作業の分散化が可能となるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
本発明は、イネ科植物における出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用の一例とに関するものである。以下、本発明にかかる遺伝マーカー、本発明の利用の一例について説明する。
【００３１】
（１）本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムＤＮＡ中に存在し、出穂期に関与する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。
【００３２】
出穂期とは、止め葉から穂が出現する日を意味し、１個体に複数の穂を有する場合には当該個体において最初に穂が出現する日を記録する。出穂期は、通常集団栽培されている個体のうち４０〜５０％の個体が出穂した日を基準として出穂した日までの日数あるいは暦日で表す。
【００３３】
イネ科植物において出穂期の改変は重要な育種目標である。第一に、出穂期を改変することにより、栽培地域に最も適した収穫時期を有する作物ができれば非常に有用である。さらに、出穂期が少しずつ異なる品種を栽培すれば収穫作業を分散化することができ、農作業の効率化や障害への危険回避を図ることが可能となる。また、日本においては本州以南のムギ類（オオムギ、コムギ等）の栽培は水田の裏作として行われるので、梅雨や田植えの前に収穫する必要がある。そのため日本においては早生品種の開発がムギ類の重要な育種目標の１つである。
【００３４】
出穂期は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。量的形質はＱＴＬ解析により当該量的形質に関与している遺伝子座の染色体上の位置を推定することができる。以下、本発明者らがオオムギにおいて開発した出穂期に関与する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーについて詳細に説明する。なお、本発明に係る遺伝マーカーはこれらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明者らは、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「Ｈ６０２」との交雑Ｆ１から作出した倍加半数体（ＤＨ）集団を用いて、高密度連鎖地図を作成した。すなわち、本発明者らが有するオオムギＥＳＴ（expressed sequence tag）配列に基づいて設計されたプライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを増幅し、「はるな二条」と「Ｈ６０２」との間に増幅断片長の多型を有するものや、増幅断片長の制限酵素による消化のパターンが異なる多型を有するものを特定し、これらのＤＮＡマーカーを含む約５００遺伝子座からなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図および本発明者らが観察した上記ＤＨ集団９３個体についての出穂期のデータに基づいて、出穂期に関与する遺伝子座のＱＴＬ解析を行った。その結果、出穂期に関与する遺伝子座を４Ｈ染色体上に１つ、５Ｈ染色体上に２つ検出した。本発明に係る遺伝マーカーは４Ｈ染色体上に座乗する出穂期に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、５Ｈ染色体上に座乗する２つの出穂期に関与する遺伝子座のうち一方の出穂期に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーと、他方の出穂期に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する２つの遺伝マーカーである。ただし、５Ｈ染色体上に座乗する２つの出穂期に関与する遺伝子座は１つの遺伝マーカーを挟み隣り合った位置に検出されたため、上記５Ｈ染色体上の遺伝マーカーは３つである。発明者らは４Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０５０４２」および「ｋ０３２８９」、５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「ｋ０２３２１」、「ｋ００８３５」および「ｋ００８２６」と命名した。
【００３６】
ｋ０５０４２は、
ＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧ（配列番号１）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＡＴＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＡＧＧＧ（配列番号２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅されるＤＮＡマーカーであり、上記４Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座から短腕側に約３.３センチモルガン（以下ｃＭと表示する）の距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：basd1e04、配列番号１９）に基づいて設計されている。図１に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号１）および上記プライマー配列（配列番号２）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰ（single nucleotide polymorphisms；一塩基多型）がある。図２に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１１）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１２）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨａｐＩＩの認識配列（CCGG）を示す。図２から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＨａｐＩＩの認識配列（CCGG）を有しているためＨａｐＩＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＡに変異しているため（CAGG）制限酵素ＨａｐＩＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０５０４２は、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーであり、上記第一プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨａｐＩＩ切断により、対象個体が当該４Ｈ染色体に座乗する出穂期に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００３７】
ｋ０３２８９は、
ＴＧＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＣＡＧＣＧＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記４Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座から長腕側に約２．５ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：bags3h19、配列番号２０）に基づいて設計されている。図３に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号３）および上記プライマー配列（配列番号４）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰがある。図４に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１３）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１４）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＳａｃＩＩの認識配列（CCGCGG）を示す。図４から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素ＳａｃＩＩの認識配列（CCGCGG）を有しているためＳａｃＩＩで切断されるが、Ｈ６０２の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（CCGTGG）制限酵素ＳａｃＩＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０３２８９は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＳａｃＩＩ切断により、対象個体が当該４Ｈ染色体に座乗する出穂期に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００３８】
ｋ０２３２１は、
ＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣＧＡＴＴＴＧＧＧＡＴ（配列番号５）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＧＣ（配列番号６）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する２つの遺伝子座のうち、一方の遺伝子座から短腕側に約１．１ｃＭの距離に座乗しており、他方の遺伝子座から長腕側に約０．１ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：bags19i06、配列番号２１）に基づいて設計されている。図５に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号５）および上記プライマー配列（配列番号６）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰがある。図６に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１５）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１６）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＡｆａＩの認識配列（GTAC）を示す。図６から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＡｆａＩの認識配列（GTAC）を有しているためＡｆａＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（GTAT）制限酵素ＡｆａＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ０２３２１は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第三プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＡｆａＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する出穂期に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００３９】
ｋ００８３５は、
ＴＣＣＡＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＡ（配列番号７）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣ（配列番号８）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座から長腕側に約１０．４ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：baak46e06、配列番号２２）に基づいて設計されている。図７に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号７）および上記プライマー配列（配列番号８）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間に断片長多型があり、はるな二条のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約８９０ｂｐ、Ｈ６０２のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される断片のサイズは約８７０ｂｐと異なる。図８に第四プライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図８（ａ）、（ｂ）とも両端は分子量マーカーである。図８（ａ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団の１〜４５の増幅断片である。図８（ｂ）は、左端（分子量マーカーを除く）から順に、ＤＨ集団の４６〜９３の増幅断片である。図８から明らかなように、増幅産物のサイズを確認することにより、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する出穂期に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００４０】
ｋ００８２６は、
ＣＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＴＴＣＴ（配列番号９）に示される塩基配列を有するプライマー、および
ＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡＣＣＧＴＡ（配列番号１０）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いてオオムギゲノムＤＮＡを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座から短腕側に約１０．７ｃＭの距離に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギＥＳＴ配列の１つ（ESTクローン名：baak46p24、配列番号２３）に基づいて設計されている。図９に当該ＥＳＴの塩基配列を示した。下線を付した部分が上記プライマー配列（配列番号９）および上記プライマー配列（配列番号１０）の相補配列である。はるな二条の増幅産物とＨ６０２の増幅産物との間にＳＮＰがある。図１０に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記ＳＮＰを含む部分の塩基配列を示した。上がＨ６０２の塩基配列（配列番号１７）であり、下がはるな二条の塩基配列（配列番号１８）である。□で囲んだ塩基がＳＮＰである。下線部が制限酵素ＨａｅＩＩＩの認識配列（GGCC）を示す。図１０から明らかなように、Ｈ６０２の増幅産物は制限酵素ＨａｅＩＩＩの認識配列（GGCC）を有しているためＨａｅＩＩＩで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のＣがＴに変異しているため（GGTC）制限酵素ＨａｅＩＩＩで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーｋ００８２６は、ＣＡＰＳマーカーであり、上記第五プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素ＨａｅＩＩＩ切断により、対象個体が当該５Ｈ染色体に座乗する出穂期に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、Ｈ６０２型の遺伝子型を有するかを判別できる。
【００４１】
ここで、１センチモルガン（１ｃＭ）とは、２つの遺伝子座の間に１％の頻度で交叉が起きるときの、両遺伝子座間の距離を表す単位である。
【００４２】
ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムＤＮＡは、植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムＤＮＡを抽出するための一般法（Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照）が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムＤＮＡは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官（雄性・雌性生殖器官を含む）や種子も含まれる。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、オオムギの幼苗期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。さらに、幼苗段階で個体の選抜が可能となり、育種期間を大幅に短縮できる点が挙げられる。
【００４３】
またオオムギのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーの組み合わせを用いて増幅する方法は、従来公知のＤＮＡ増幅法を採用することができる。一般には、ＰＣＲ法（ポリメラ−ゼ連鎖反応法）や、その改変法が用いられる。ＰＣＲ法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。
【００４４】
（２）本発明の利用
〔出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０５０４２、ｋ０３２８９）は、オオムギ４Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座に連鎖するものである。一方本発明にかかる遺伝マーカー（ｋ０２３２１、ｋ００８３５、ｋ００８２６）は、オオムギ５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座に連鎖するものである。よって、ｋ０５０４２、ｋ０３２８９の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ４Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができ、ｋ０２３２１、ｋ００８３５、ｋ００８２６の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ５Ｈ染色体上に検出された出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離することができる。
【００４５】
単離とは、目的のＤＮＡ断片、すなわち出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をクローニングすることを意味することはいうまでもないが、広義には交雑Ｆ１集団から戻し交配等により、両親のうち一方の出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する個体を選抜し、その遺伝子座領域のみを目的品種に導入する同質遺伝子系統の作製も単離に含まれる。
【００４６】
本発明にかかる遺伝マーカーを用いて出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する方法としては特に限定されるものではないが、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００４７】
オオムギでは本発明者らが開発を進めている「はるな二条」を含めて、ゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリーが２種類作成されており、現在複数のＢＡＣライブラリーが開発中である。そこで、このようなＢＡＣライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、出穂期に関与する遺伝子座と当該遺伝子座に連鎖する本発明の遺伝マーカーとで当該マーカーを含むＢＡＣクローンを同定し、そこからＢＡＣのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的に出穂期に関与する遺伝子座に到達することができる。
【００４８】
また、上述のように、交雑Ｆ１に一方の親を戻し交配することにより、他方の親の出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を目的品種に導入して（広義の）単離をすることができる。
【００４９】
なお、上記方法をはじめとする出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を単離する際には、目的とする出穂期に関与する遺伝子座に対してなるべく近傍に座乗する遺伝マーカーを選択して用いることが好ましい。目的とする出穂期に関与する遺伝子座と遺伝マーカーの間で組み換えが起こる確率がより低くなり、より確実に出穂期に関与する遺伝子座を含む断片を単離することができるからである。
【００５０】
〔出穂期改変植物の生産方法、および当該生産方法によって得られた出穂期改変植物〕
上記本発明にかかる出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の単離方法によって得られた出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって、出穂期改変イネ科植物を生産することが可能である。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。また、例えば、オオムギから単離された出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片をオオムギ以外のイネ科植物に導入することも可能であり、同一属間のみでの単離、導入に限定されるものではない。
【００５１】
上記ＤＮＡ断片を導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。より具体的には、例えばアグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いてイネ科植物のゲノムＤＮＡに導入することによって生産すればよく、これにより、出穂期改変品種が得られることとなる。例えば、雑誌The Plant Journal(1997) 11(6),1369-1376 には、Sonia Tingay等により、Agrobacterium tumefaciens を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを生産可能である。
【００５２】
また、目的とする出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を有する植物個体と、当該ＤＮＡ断片を導入しようとする植物個体との交雑により、出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を、植物に導入することも可能である。この方法では、交雑が可能である限りにおいて、他の種や属の植物が有する出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片の導入が可能である。
【００５３】
本発明にかかる出穂期改変植物は、上記本発明にかかる生産方法により得られるものである。当該出穂期改変植物は、出穂期を遅くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には晩生型品種となり、出穂期を早くする表現型を有する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入した場合には早生型品種となる。例えば優良品種に他種の出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片を導入することにより、出穂期のみが元の優良品種と異なるが他の形質は元の優良品種と同じである同質遺伝子系統の植物を得ることが可能となる。さらに、複数の出穂期に関与する遺伝子座を含むＤＮＡ断片が単離されていれば、それぞれの断片を別の個体に導入することにより、出穂期が数日ずつ異なる優良品種を得ることができる。このような出穂期が異なる優良品種が得られれば、栽培地域に適した収穫時期となる品種を選択することが可能となり、収量の増加に大きく貢献できる。また、栽培地域の一定区画ごとに出穂期の異なる品種を植えれば、収穫作業を分散化でき、農作業の効率化が可能となる。
【００５４】
〔出穂期改変イネ科植物の選抜方法〕
本発明にかかる出穂期改変イネ科植物の選抜方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として出穂期改変イネ科植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の作物育種法を利用することができる。
【００５５】
より具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムＤＮＡを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を指標として植物を選抜する方法が挙げられる。遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、対象とする植物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として上記第一ないし第五プライマーセットのいずれかを用いて増幅したＤＮＡ断片について、断片長または断片の制限酵素消化パターンの観察を挙げることができる。
【００５６】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５７】
〔使用植物〕
醸造用オオムギ「はるな二条」（Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo）と野生オオムギ「Ｈ６０２」（Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602）との交配から得られたＦ１の花粉を培養して半数体（haploid）を育成し、自然倍加した倍加半数体（doubled haploid）９３個体からなる集団を使用した。
【００５８】
〔連鎖地図の作成〕
本発明者らが有するオオムギＥＳＴ配列約１２万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って３’端約６万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とＨ６０２との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、３９種類の制限酵素に対してＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）化が可能なものをマーカーとして選択した。
【００５９】
以上により、上記はるな二条とＨ６０２との交雑Ｆ１由来のＤＨ集団について、合計４９９遺伝子座のマーカーからなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図の平均マーカー密度は3.0cM/locus、全長は1,470cMである。
【００６０】
〔遺伝子型の判定〕
ＤＨ集団各個体の遺伝子型の判定は、上記ＤＨ集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したＤＮＡを鋳型として、ＥＳＴ配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。断片長多型マーカーについてはＰＣＲ産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）マーカーについては、ＰＣＲ産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。
【００６１】
〔出穂期の観察〕
ＤＨ集団の各個体について、実際に出穂した日を観察し、記録した。出穂期の分布を図１１に示した。図１１において、白矢印ははるな二条、黒矢印はＨ６０２の出穂期を示し、縦軸は個体数を横軸は４月１日から数えた出穂期までの日数を示す。図１１から明らかなように本ＤＨ集団の出穂期は１０日〜４０日の間に分布した。
【００６２】
〔ＱＴＬ解析〕
ＱＴＬ解析のアルゴリズムには、シンプルインターバルマッピング（simple interval mapping、以下「ＳＩＭ」と略記する。）とコンポジットインターバルマッピング（composite interval mapping以下「ＣＩＭ」と略記する。）を用い、解析ソフトウエアにはそれぞれ、ＭＡＰＭＡＫＥＲ／ＱＴＬとＱＴＬ Ｃａｒｔｏｇｒａｐｈｅｒを用いた。ＬＯＤスコアの閾値を２に設定し、ＬＯＤスコアが２を超えた場合に当該２つのマーカー区間内の最もＬＯＤの大きな位置にＱＴＬの存在を推定した。
【００６３】
〔結果〕
結果を表１に示した。表１から明らかなように、ＳＩＭにより出穂期に関与する２つのＱＴＬが検出された。また、ＣＩＭにより出穂期に関与する１つのＱＴＬが検出された。ＳＩＭにより４Ｈ染色体上に検出されたＱＴＬは、遺伝マーカーk05042から3.3cMの位置で遺伝マーカーk03289に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは2.6である。このＱＴＬで表現型の分散の12.9％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で6.3日出穂が遅くなる。ＳＩＭにより５Ｈ染色体上に検出されたＱＴＬは、遺伝マーカーk02321から1.1cMの位置で遺伝マーカーk00835に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは27.7である。このＱＴＬで表現型の分散の77.0％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で13.3日出穂が早くなる。ＣＩＭにより５Ｈ染色体上に検出されたＱＴＬは、遺伝マーカーk00826から10.7cMの位置で遺伝マーカーk02321に挟まれる位置に座乗し、ＬＯＤスコアは3.2である。このＱＴＬで表現型の分散の25.1％を説明できる。また、このＱＴＬの存在で9.7日出穂が早くなる。
【００６４】
【表１】
2005224220.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明にかかる遺伝マーカーは、出穂期改変植物の育種、出穂期に関与する遺伝子の単離等に用いることができ、育種の効率化に大きく貢献することが期待される。したがって、広く農業全般に利用可能であり、さらには、オオムギ等を原料とする食品産業においても有効である。また、生物分野の基礎研究、特に植物ゲノム研究等にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】オオムギＥＳＴクローン：basd1e04の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図２】遺伝マーカーｋ０５０４２における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図３】オオムギＥＳＴクローン：bags3h19の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図４】遺伝マーカーｋ０３２８９における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図５】オオムギＥＳＴクローン：bags19i06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図６】遺伝マーカーｋ０２３２１における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図７】オオムギＥＳＴクローン：baak46e06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図８】（ａ）、（ｂ）は遺伝マーカーｋ００８３５における、Ｈ６０２とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像である。（ａ）は、左から、はるな二条、Ｈ６０２、はるな二条とＨ６０２の交雑Ｆ１、ＤＨ集団１〜４５の増幅断片の電気泳動画像であり、（ｂ）は、左から、ＤＨ集団４６〜９３の増幅断片の電気泳動画像である。
【図９】オオムギＥＳＴクローン：baak46p24の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。
【図１０】遺伝マーカーｋ００８２６における、Ｈ６０２とはるな二条との間のＳＮＰおよびＳＮＰ周囲の塩基配列を示す図である。
【図１１】ＤＨ集団各個体の出穂期の分布を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005224220.tif 000011
【図１０】
2005224220.tif 000012
【図１１】
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【配列表】
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