(57)【要約】【課題】ＰＨＡ（ＰＨＢを含んでよい）生産用の培地の優れた製造方法を提供する。【解決手段】ある培地でＰＨＡ生産菌を増殖させることによって、ＰＨＡを生産させた後、菌体を破壊し、細胞内容物を溶解させ、溶解しないＰＨＡを分離して収穫する。このときの溶液となった残渣の少なくとも一部を用いて、ＰＨＡ生産用の培地を製造する。このように従来は廃棄していたものをリサイクルすることにより、生産性の向上を図ることができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物の細胞を破壊し、細胞内容物を溶解させる溶解工程と、
溶解せずに沈殿したＰＨＡを実質的に取り除いて上清を分離する分離工程と、
該上清を中和し、中和上清を得る中和工程と、
を含むＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項２】
前記ＰＨＡが、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含む請求項１記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、ＰＨＡ生合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組替え大腸菌を含む請求項１記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項４】
前記溶解工程が、アルカリ性水溶液による細胞破壊を含む請求項１記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項５】
炭素源成分、窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも一種以上を添加する成分補給工程を更に含む請求項１から４いずれか記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項６】
前記窒素源成分は、リン酸水素２アンモニウムを含むものである請求項５記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項７】
前記リン酸水素２アンモニウムの濃度が、１ｇ／Ｌから８ｇ／Ｌである請求項６記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項８】
前記ミネラル成分は、硫酸マグネシウムを含むものである請求項５記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項９】
前記硫酸マグネシウムの濃度が、０．２ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌである請求項８記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【請求項１０】
ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物にＰＨＡの生産をさせ、
前記微生物の細胞を破壊し、細胞内容物を可溶化させ、
この可溶化処理したものから不溶物を分離して上清を得て、
該上清を中和して中和上清を得て、
該中和上清を含むＰＨＡ生成菌用培地を製造し、
該ＰＨＡ生成菌用培地にポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物を接種して、ＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【請求項１１】
窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも一種以上を前記ＰＨＡ生成菌用培地に添加する請求項１０記載のＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【請求項１２】
前記窒素源成分は、リン酸水素２アンモニウムを含むものであり、及び／又は、前記ミネラル成分は、硫酸マグネシウムを含むものである請求項１０記載のＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【請求項１３】
請求項１から９いずれか記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法により製造したＰＨＡ生成菌用培地を用いてＰＨＡ生成をする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成菌を利用してＰＨＡ生成菌用の培地を製造する方法に関し、また、ＰＨＡ生成菌の再利用方法に関する。ここで、ＰＨＡは、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ＰＨＢとＰＨＶとの共重合体、ＰＨＢとＰＨＨｘとの共重合体等を含むことができる。
【背景技術】
【０００２】
いわゆる合成プラスチックは、腐りにくいため、不要になった合成プラスチックの処理は、種々の困難性を伴う。従って、自然界に存在する生物により消化分解され、最終的には水と二酸化炭素になる生分解性プラスチックが着目される（例えば、特許文献１から６）。このような生分解性プラスチックの一例として、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ、poly  (3-hydroxybutyric  acid)）を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ、polyhydroxyalkanoic  acid）が挙げられる。このＰＨＡは、ある種の菌が細胞内蓄積物質として生産するエネルギー物質であると同時に、熱可塑性で、生分解性のあるポリマーとして今後の需要の高まりが見込まれている（例えば、非特許文献１から３）。
【０００３】
遺伝子組み換えを行なうことなく、自然界よりＰＨＡ生産に適したシュードモナス属菌を探索・分離してＰＨＡ生産を行なうことも可能であり（例えば、特許文献８）、微生物を用いることなくＰＨＡ生産に適した化学反応を組み合わせることもでき得る（例えば、特許文献７及び９）。また、生分解性評価のための培地作成に関する文献もある（例えば、特許文献１０）。
【０００４】
しかし、ＰＨＡは、その生産コストが高いので、大規模に生産された例はあまりない。ＰＨＡ生産においてそのコストを低減させるためには、培地コストの低減、培養効率の向上、抽出・精製工程の簡略化等が望まれる。特にＰＨＢにおいては分子量３００万以上の高分子ＰＨＢ生産ができ、培養コストが削減できることがより好ましい。
【０００５】
一方、ＰＨＡ生産において、培養工程やＰＨＡ抽出工程や精製工程等で生じる廃液を処理するコストも無視できない。これらの廃液中には菌体を構成する各種成分（タンパク質、アミノ酸、核酸、脂質等）が多量に含まれており、ＢＯＤが高いので、そのまま河川に放流することは避けるべきであろう。
【特許文献１】特開平１１−３３２５８８号公報
【特許文献２】特開平６−４９２７５号公報
【特許文献３】特開平１０−２１９０８８号公報
【特許文献４】特開２００３−２６４号公報
【特許文献５】特開２００１−４００７９号公報
【特許文献６】特開２００２−１７３５５３号公報
【特許文献７】特開平８−２９５７２６号公報
【特許文献８】特開平５−３０９８０号公報
【特許文献９】特開平６−４１２８８号公報
【特許文献１０】特開平６−４６８８８号公報
【非特許文献１】Lee,  Sang  Yup  et  al.,  J. Env.  Poly.  Deg.,  Vol.  2,  No.  3  (1994)  pp.  169-176
【非特許文献２】Choi,  Jong-il  et  al.,  Biotechnology  and  Bioengineering,  Vo.  62,  No.  5  (1999)  pp.  546-553
【非特許文献３】Lee,  Sang  Yup,  Biotechnology  and  Bioengineering,  Vo.  49,  No.  1  (1996)  pp.  1-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、このような微生物生産系の生分解性プラスチックの一つであるＰＨＡ生産の生産性を向上し、廃液処理の負荷を低減し、ＰＨＡ生産のコストを抑えることを狙いとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、ＰＨＡ生産において、培地コストの低減と、廃液処理の負荷を低減とを組合わせて考慮することにより、全体の生産性を向上させようとするものである。廃液処理の負荷を低減させるために、廃液の少なくとも一部を再利用して廃液の量を減少させることができ、この再利用される廃液を培地成分の少なくとも一部とすれば、培地のコスト低減も可能である。つまり、ＰＨＡ生産をした微生物又はその微生物から生じるものを単なる廃材として処理するのではなく、更なるＰＨＡ生産をするための新しい微生物を接種する培地の成分の少なくとも一部として再利用するものである。
【０００８】
より具体的には、本発明は、以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物の細胞内容物を溶解させる溶解工程と、溶解せずに沈殿したＰＨＡを実質的に取り除いて上清を分離する分離工程と、該上清を中和し、中和上清を得る中和工程と、を含むＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１０】
（２）前記ＰＨＡが、ポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を含む上記（１）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１１】
（３）  前記微生物が、ＰＨＡ生合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組替え大腸菌を含む上記（１）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１２】
（４）  前記溶解工程が、アルカリ性水溶液による細胞破壊を含む上記（１）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１３】
（５）  炭素源成分、窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも１種以上を添加する成分補給工程を更に含む上記（１）から（４）いずれか記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１４】
（６）  前記窒素源成分は、リン酸水素２アンモニウムを含むものである上記（５）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１５】
（７）  前記リン酸水素２アンモニウムの濃度が、１ｇ／Ｌから８ｇ／Ｌである上記（６）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１６】
（８）  前記ミネラル成分は、硫酸マグネシウムを含むものである上記（５）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１７】
（９）  前記硫酸マグネシウムの濃度が、０．２ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌである上記（８）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法。
【００１８】
（１０）  ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物にＰＨＡの生産をさせ、前記微生物の細胞内容物を可溶化させ、この可溶化処理したものから不溶物を分離して上清を得て、該上清を中和して中和上清を得て、該中和上清を含むＰＨＡ生成菌用培地を製造し、該ＰＨＡ生成菌用培地にポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）生成能を備える微生物を接種して、ＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【００１９】
（１１）  窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも一種以上を前記ＰＨＡ生成菌用培地に添加する上記（１０）記載のＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【００２０】
（１２）  前記窒素源成分は、リン酸水素２アンモニウムを含むものであり、及び／又は、前記ミネラル成分は、硫酸マグネシウムを含むものである上記（１０）記載のＰＨＡ生成菌用培地を再利用する方法。
【００２１】
（１３）上記（１）から（９）記載のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法により製造したＰＨＡ生成菌用培地を用いてＰＨＡ生成をする方法。
【００２２】
一般に、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、細菌ポリエステルに該当し、生物界における重要な高分子、核酸、蛋白質、多糖につぐ第四の生体高分子と考えられる。ＰＨＡは細菌が細胞内に合成するエネルギー／炭素の貯蔵物質となり得るが、生分解性と同時に熱可塑性を持つため、生分解性プラスチックとしての応用が期待されている。
【００２３】
このＰＨＡの一種であるポリβヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）は、生分解性のポリマーとして広く研究されている。このポリマーは、３−ヒドロキシ酪酸が数十〜数千個重合したものを含んでよい。このポリマーは、微生物等により分解され得、疎水性が強く、水に溶け難いが、可塑性を有する。
【００２４】
ここで、ＰＨＡ生合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組替え大腸菌とは、所定の条件を整えれば、ＰＨＢを始めとするＰＨＡを生成できるように遺伝子を組替えて導入した大腸菌を含んでよい。塩基性の水溶液は強塩基性の水溶液を含んでよく、水酸化ナトリウムを含む水溶液を含んでよい。溶解には、分散により沈殿しない状態とすることを含むことができる。沈殿は、遠心分離することにより溶液と分離されるものを含んでよい。分離されたＰＨＢを始めとするＰＨＡを含む沈殿は、ＰＨＢを始めとするＰＨＡの精製工程へと利用されてよい。中和は、塩基性の水溶液に対して酸を加えることにより行うものを含んでよい。この酸は、塩酸を含んでよい。
【００２５】
ＰＨＡ（ＰＨＢを含んでよい）生成能を備える微生物の細胞内容物を溶解させる溶解工程により、微生物内からＰＨＢを始めとするＰＨＡが抽出できる。ここで、該溶解工程は、ＰＨＡ生成能を備える微生物の細胞を破壊し、細胞内容物を溶解させる溶解工程を含んでよい。また、微生物の細胞内容物を可溶化させることは、該微生物の細胞を破壊することを含んでよい。この溶解工程の後に、溶解せずに沈殿したＰＨＢを始めとするＰＨＡを取り除いた溶液を遠心分離する。この分離した上清を酸で中和し、この中和後の上清を微生物の取り込み成分として、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌用培地の製造に使用する。このようにして、微生物由来のタンパク質、アミノ酸、核酸等を含む成分をＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌用培地の製造に利用することができる。このＰＨＡ生成微生物の上清を培地製造に利用することにより、廃液の再利用ができる。従って、廃液処理に要するコストと、培地製造に要するコストとが削減できる。さらに、ＰＨＡ生成微生物由来のタンパク質、アミノ酸、核酸等がＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌の増殖因子となって、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産性を向上させることができる。
【００２６】
なお、本発明における塩基性の水溶液は、濃度範囲が０．０５〜１Ｎ、温度範囲が３０〜８０℃に調整した水酸化ナトリウム水溶液であることがより好ましい。更により好ましくは、その濃度範囲は、０.１〜０.３Ｎである。また、反応時間は、好ましくは、３〜６０分であり、更に好ましくは、２０〜４０分である。ＰＨＡ（ＰＨＢを含んでよい）を分離後、残渣を７０〜１００℃にして、より好ましくは７５〜８５℃にして、菌体残渣中の不純物を除去する工程を更に追加することもできる。このような工程を加えると、再利用する成分から不純物をより多く取り除くことができ、より好ましい。尚、不純物の分離には、遠心分離を用いることができる。
【００２７】
上清を酸で中和した後に、炭素源成分、窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも一種以上を添加する成分補給工程を含んでもよい。これにより、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌の増殖により好ましい成分を添加することができ、さらなるＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産性を向上させることができる。また、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌の増殖により好ましい成分を添加したＰＨＢを始めとするＰＨＡ生成菌用培地は、合成培地であるＭＲ培地より多くのＰＨＢを始めとするＰＨＡを生産すると考えられる。
【００２８】
窒素源成分は、アミノ酸成分を含まないものであってよいが、リン酸水素２アンモニウム（以下、「（ＮＨ４）２ＨＰＯ４」という）を含むものであることがより好ましい。この（ＮＨ４）２ＨＰＯ４の濃度は、好ましくは、１ｇ／Ｌから８ｇ／Ｌであり、より好ましくは、２ｇ／Ｌから６ｇ／Ｌであり、更により好ましくは、２ｇ／Ｌから４ｇ／Ｌである。
【００２９】
ミネラル成分は、硫酸マグネシウム７水和物（以下、「ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ」という）を含むものであることがより好ましい。このＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏの濃度は、好ましくは、０．２ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌであり、より好ましくは、０.２ｇ／Ｌから０.８ｇ／Ｌであり、更により好ましくは、０.２ｇ／Ｌから０.６ｇ／Ｌである。
【００３０】
ビタミン成分は、栄養素のうちで、糖質、脂肪、アミノ酸、ミネラル成分以外に必要とされる有機物を含むものであってよい。また、脂溶性ビタミン又は水溶性ビタミンを含むものであってよい。例えば、脂溶性ビタミンとして、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＦを含んでよく、水溶性ビタミンとして、ビタミンＢ群又はＣを含んでよい。また、ユビキノンのようなビタミン様作用因子を含むこともできる。
【００３１】
尚、ビタミン成分は、必要に応じて添加若しくは無添加とすることができる。例えば、ＰＨＡ（ＰＨＢを含んでよい）生成能を有するＰＨＡ生成菌が、ビタミンＢ1要求性株であるときに、ビタミンＢ1を添加してもよいが、そうでなければ、必ずしも添加しなければならないものではない。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産において、再利用により廃液処理の負荷を低減させることができる。また、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産用の培地の原料を再利用材とすることができる。従って、培地製造のコスト低減が可能と考えられる。また、再利用によるサイクルにより、ＰＨＢを始めとするＰＨＡ生産の生産性を向上することも可能と考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、図面を参照しつつ、本発明のＰＨＡ生成菌用培地の製造方法等に関する具体的な実施例についてＰＨＢ生成遺伝子組み替え大腸菌を使用し、アルカリによる細胞破壊を例にして説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
＜ＰＨＢ生成菌用培地の製造方法＞
［ＰＨＢの生成及び生成菌の溶解］
図１に、本発明の１の実施例であるＰＨＢ生成菌用培地の製造方法を示す。まず、トリプトン、酵母エキス、及び塩化ナトリウムから成る市販のＬＢ培地にグルコース１５g/lを添加したもの（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔａｒｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）  塩化ナトリウム（関東化学））に、ＰＨＢ生成菌の１つである組換え大腸菌（E.coli  XL1-Blue  (pSYL105)  文献：Lee,S.Y.,Lee,K.M.,Chang,H.N.,and  Steinbuchel,A:Comparison  of  recombinant  Escherichia  coli  strains  for  synthesis  and  accumulation  of  poly-(3-hydroxybutyric  acid),and  morphological  changes.  Biotechnol.  Bioeng.,  44,  1337-1347）を接種し、３７℃の下で６４時間、この大腸菌を培養し、ＰＨＢを生成させた（１０１）。培養した大腸菌を集菌し、洗浄して、さらに再懸濁した（１０２）。この再懸濁した大腸菌を、約４０℃の０．１ＮのＮａＯＨ水溶液に約３０分間で溶解し、ＰＨＢを抽出した（１０３）。
【００３５】
［再利用によるＰＨＢ生成菌用の基本培地の製造］
上述のようにして、ＰＨＢを抽出したものは、遠心分離によりＰＨＢを沈殿させ、ＰＨＢを分離した（２０１）。この遠心分離により生じた上澄みはＰＨＢを実質的に含んでいなかった（１０４）。この上澄みを８０℃に加熱し、約１５分間反応させて余分なタンパク質等を沈殿させた（１０５）。これを再度遠心分離して沈殿物として不純物を除去した（２０２）。除去された不純物は廃材となるが、上澄みは以下のように再利用されるため、廃材処理量を減少させることができる。不純物を除去した上澄みは、塩基性を示しており、塩酸を用いて中和した（１０６）。この中和後の上澄みをリサイクル基本培地とした（１０７）。
【００３６】
［成分補給］
上記リサイクル基本培地に、炭素源成分、窒素源成分、ミネラル成分、アミノ酸成分、及びビタミン成分からなる群から選ばれる少なくとも一種以上を添加した。リン酸２水素１カリウム（以下、「ＫＨ2ＰＯ4」という）、リン酸水素２アンモニウムを加えたリサイクル基本培地をオートクレーブして、更に、硫酸マグネシウム７水和物、チアミン、グルコース、消泡剤を添加した（１０８）。このようにして、再利用によるＰＨＢ生成菌用の培地を製造した（１０９）。
【００３７】
［ＰＨＢ生成菌によるＰＨＢ生成のサイクル］
上述のようにして準備したＰＨＢ生成菌用の培地に、ＰＨＢ生成菌を接種して、上述と同様にして、ＰＨＢ生成菌を培養することにより、ＰＨＢの生成を再び行うことができる。これにより、廃材の量を減少させたＰＨＢ生成菌によるＰＨＢ生成のサイクルを作ることができ、生産性の高いＰＨＢ生成を行うことができる。
【００３８】
＜ＰＨＢ生成菌用培地中の成分＞
上記実施例で用いたＰＨＢ生成菌の１つである組換え大腸菌（E.coli  XL1-Blue  (pSYL105)  文献：Lee,S.Y.,Lee,K.M.,Chang,H.N.,and  Steinbuchel,A:Comparison  of  recombinant  Escherichia  coli  strains  for  synthesis  and  accumulation  of  poly-(3-hydroxybutyric  acid),and  morphological  changes.  Biotechnol.  Bioeng.,  44,  1337-1347）は、一般に合成培地で培養すると著しい糸状化を起こす。これは菌体内に蓄積されたＰＨＢそのもの、又は組み込んだＰＨＢ合成系遺伝子の過発現によるものと考えられる。この糸状化が原因でＬＢ培地で培養時に比べて菌体量、ＰＨＢ生産量ともに極端に低い値となり、合成培地でのＰＨＢの工業生産は不可能と考えられている。しかし、合成培地であるＲ培地にトリプトン等の複合培地成分やある種のアミノ酸を添加することである程度菌体増殖、ＰＨＢ生産性等を改善することができると考えられるが、これらの成分は高価であり、ＰＨＢ生産のコストの上昇につながることになる。
【００３９】
ところが、上述のＮａＯＨ抽出法によるＰＨＢ抽出工程で排出されるＰＨＢ以外の菌体成分を含む廃液中には大腸菌由来の様々な生体成分（アミノ酸、タンパク質、脂質、ビタミン等）が含まれていると考えられる。従って、上述のようにして得た再利用によるＰＨＢ生成菌用の培地（以下「リサイクル培地」という）に炭素源、窒素源等の増殖に不可欠な成分を添加すれば、それ以外の高価な複合培地成分等を追加することなく増殖、ＰＨＢ生産に好都合な培地を得ることができると考えられる。
【００４０】
上述のようにして得られたリサイクル基本培地と、トリプトン、酵母エキス、及び塩化ナトリウムから成るＬＢ培地と、に含まれる成分を比較検討した。その結果を表１及び表２に示す。
【００４１】
【表１】
2005192401.tif 000002
【００４２】
【表２】
2005192401.tif 000003
【００４３】
表１に示すように、リサイクル培地は０．８５ｇ／Ｌのタンパク質が含まれていたことが分かる。ＬＢ培地では、３．１２ｇ／Ｌであり、リサイクル培地のタンパク質量は明らかに、ＬＢ培地のそれよりも少なかった。しかし、表２に示すように、リサイクル培地中のイソロイシンは２３．６ｍｇ／Ｌとリサイクル培地中の他のアミノ酸と比較して高い値を示した。イソロイシンが菌体増殖、ＰＨＢ生産性を上昇させるという報告もあることから、リサイクル培地は、全体のタンパク質量が少なくても、イソロイシンを多く含むことにより、菌体増殖、ＰＨＢ生成には優れる培地であると考えられる。（参考文献：Lee,S.Y.,Lee,Y.K.,Chang,H.N.1995  Stimulatory  effects  of  amino  acids  and  oleic  acid  on  poly(3-hydroxybutyric  acid)  synthesis  by  recombinant  Escherichia  coli.  J.  Ferment.Bioeng.  79:  177-180）
【００４４】
＜ＰＨＢ生産性に対する窒素源成分添加の影響＞
トリプトンや酵母エキスなどに含まれるアミノ酸やタンパク質は窒素源として利用可能であるが、高価であることから、安価な窒素源を用いるのがより好ましい。そこで、安価な窒素源である各種アンモニウム塩、有機物である尿素によるＰＨＢ生産性を比較・検討した。
【００４５】
５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地にＫＨ2ＰＯ4の６.７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏの０．８ｇ／Ｌ、チアミンの１０ｍｇ／Ｌ、グルコースの１５ｇ／Ｌを加えたものに、窒素源として硫酸アンモニウム（以下、「（ＮＨ４）２ＳＯ４」という）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４及び尿素についてはそれぞれ３０ｍＭ、硝酸アンモニウム（以下、「ＮＨ４ＮＯ３」という）、塩化アンモニウム（以下、「ＮＨ４Ｃｌ」という）についてはそれぞれ６０ｍＭ加えた。また、緩衝剤として、リン酸２水素カリウム（以下、「ＫＨ２ＰＯ４」という）６．６７ｇ／Ｌ、リン酸水素２ナトリウム（以下、「Ｎａ２ＨＰＯ４」という）４．０ｇ／Ｌを加えた。ただし、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を用いたときのみＮａ２ＨＰＯ４は加えなかった。その結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2005192401.tif 000004
【００４７】
表３に示した通り、尿素を用いたときのみ、菌体量、ＰＨＢ生産量ともに他と比較して少なかった。また、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を用いたとき、最もＰＨＢが大量に生産された。それ以外のアンモニウム塩については大差がなかった。この結果からも明らかであるように、本発明に用いる窒素源としては、ＰＨＢ生産性を考慮して（ＮＨ４）２ＨＰＯ４が適当であると考えられる。また、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４はリン酸バッファーの成分としても利用可能である。
【００４８】
次に、窒素源としては、ＰＨＢ生産性を考慮して（ＮＨ４）２ＨＰＯ４が好ましいが、この（ＮＨ４）２ＨＰＯ４の濃度について検討した。ここで、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４が窒素源として好ましいが、リン酸の影響を除去するために、表３で（ＮＨ４）２ＨＰＯ４の結果とほとんど差が見られず、同じアンモニウム塩である（ＮＨ４）２ＳＯ４を実験に用いた。そこで、５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地にＫＨ2ＰＯ4の６.７ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏの０．８ｇ／Ｌ、チアミンの１０ｍｇ／Ｌ、グルコースの１５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４の４．０ｇ／Ｌを加えたものに、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０ｇ／Ｌから６．０ｇ／Ｌまで変化させたものを添加し、菌体量、ＰＨＢ生産性を検討した。その結果を図２に示す。
【００４９】
図２に示した通り、乾燥菌体重量は、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度４．０ｇ／Ｌまでは増加したが、それ以上の濃度では減少した。また、ＰＨＢ生産量は、２．０ｇ／Ｌ以降はほぼ一定であった。これにより、流下培養や連続培養を行う際に菌体量が多い方が好ましいことから、（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度は４．０ｇ／Ｌ又はそれ以上がより好ましいと考えられる。この図及び以降のすべての図において、ＰＨＢ蓄積率は、ＰＨＢ重量を乾燥菌体の重量で割ったものを百分率（％）で表したものである。
【００５０】
＜ＰＨＢ生産性に対するミネラル成分添加の影響＞
ＮａＯＨ抽出法で得た廃液を用いたリサイクル基本培地にミネラル成分ＭｇＳＯ４7Ｈ2Ｏを添加することによる乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量、ＰＨＢ蓄積率への影響について検討した。
【００５１】
培地は、リサイクル基本培地にＫＨ２ＰＯ４の６．６７ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４の４．０ｇ／Ｌ、チアミンの１０ｍｇ／Ｌ、グルコースの１５ｇ／Ｌを添加したものを用いた。５００ｍｌ坂口フラスコを用いてこの培地に、ＭｇＳＯ４７Ｈ2Ｏを０ｇ／Ｌから１．２ｇ／Ｌまで変化させたものを添加し、６４時間培養した後の乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量、ＰＨＢ蓄積率を測定した。その結果を図３に示す。
【００５２】
図３に示した通り、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏを添加しないとＰＨＢはほとんど生産されない。解糖系、ＴＣＡサイクルでＭｇ２＋が必須であることは知られている。つまり、リサイクル基本培地には、Ｍｇ２＋がわずかしか含まれていなかったと考えられる。しかし、０．４ｇ／Ｌより高い濃度では、ほとんどＰＨＢ生産量に変化はみられなかった。これにより、ＭｇＳＯ４７Ｈ2Ｏ濃度は、０．４ｇ／Ｌ又はそれ以上であることがより好ましいと考えられる。
【００５３】
＜ＰＨＢ生産性に対するクエン酸添加の影響＞
ＮａＯＨ抽出法で得たリサイクル培地に対するクエン酸添加の影響を検討した。即ち、クエン酸添加によって乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量、ＰＨＢ蓄積率がどのように変化するかについて検討した。
【００５４】
５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地に、ＫＨ２ＰＯ４６．６７ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＰＯ４４．０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４７Ｈ2Ｏ濃度は、０．４ｇ／Ｌ、チアミン１０ｍｇ／Ｌ、グルコース１５ｇ／Ｌを加えたものに、クエン酸を０ｇ／Ｌから１.２ｇ／Ｌまで変化させたものを添加し、６４時間培養した後の乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量、ＰＨＢ蓄積率を測定した。その結果を図４に示す。
【００５５】
図４に示した通り、ＰＨＢ生成菌用培地にクエン酸を添加しても菌体量、ＰＨＢ生産性ともに変化はみられなかった。これにより、ＰＨＢ生成菌用培地の成分は、クエン酸に代わる別の成分が含まれていると考えられる。
【００５６】
＜ＰＨＢ生成菌用培地への様々な成分添加による影響＞
５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地に、６．６７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４７Ｈ2Ｏからなる群から選ばれる少なくとも一種以上を添加し、６４時間培養後、乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量、ＰＨＢ蓄積率を測定し比較した。その結果を表４に示す。いずれもグルコース１５g/lを含み、ＬＢ以外は１０ ｍｇ／Ｌのチアミンを含む。また表中のリン酸バッファーとはＫＨ２ＰＯ４ｇ／ＬとＮａ2ＨＰＯ4ｇ／Ｌを示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
表４に示すとおり、リサイクル基本培地に、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、又は（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を単独若しくは組合わせて添加しても、乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量ともにあまり増加しなかった。これにより、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、及び（ＮＨ４）２ＨＰＯ４とを添加することが好ましいことがわかった。尚、表４においてＭＲは合成培地であり、ＬＢは、上述のＬＢ培地である。リサイクル基本培地にＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、及び（ＮＨ４）２ＨＰＯ４とを添加すると、合成培地よりも乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量が増加していることがわかる。
【００５９】
次に、培養温度依存性について検討した。５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地に、６．６７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、さらにチアミン１０ ｍｇ／Ｌ、グルコース１５ ｇ／Ｌを加えた。この培地により培養温度を３０℃から４０℃に変化させてＰＨＢ生産菌を培養したときの乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量（濃度及び蓄積率）を図５に示す。この図から、約４０℃以下の温度での培養が好ましく、３７℃近傍での培養がより好ましいことがわかる。また、約３３℃以上の温度での培養がより好ましいことがわかる。
【００６０】
細菌の増殖には微量の金属が必要であると考えられるが、合成培地であるＭＲ培地には、微量の金属溶液が含まれている。合成培地であるＲ培地に少量のアミノ酸（特にイソロイシン、システイン）を添加することで菌体増殖、ＰＨＢ生産ともに大幅に改善することができ得る。また、合成培地で培養を行うと著しい糸状化を引起すこともある。菌体の糸状化は高密度菌体培養時に重要な障害となり得る。糸状化が起きると細胞分裂が進み難いこととなる。つまり大量のＰＨＢを得ることが困難となる。糸状化が起きる原因はよく分かっていないが、高発現外来遺伝子の導入による菌体へのストレスが原因と考えることもできる。一方、人における悪性貧血の原因としてビタミンＢ１２、葉酸の吸収障害が挙げられる。ビタミンＢ１２、葉酸はＤＮＡの合成に深く関与しており、ビタミンＢ１２、葉酸欠乏状態ではＤＮＡが合成されず、細胞が肥大することが知られている。大腸菌は本来ビタミンＢ１２、葉酸共に合成することができるが、外来遺伝子の導入により、この合成遺伝子が阻害されている可能性がある。これらの要因を考慮してそれぞれの成分を添加することによるＰＨＢ生産性、菌体増殖による影響を検討した。
【００６１】
５００ｍｌ坂口フラスコを用いてリサイクル基本培地に、６．６７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、さらにチアミン１０ｍｇ／Ｌ、グルコース１５ｇ／Ｌを加え、それぞれの成分を所定量添加し、６４時間培養した（表５）。この結果リサイクル基本培地にＫＨ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４以外の物質を添加してもＰＨＢ生産量、菌体量ともに減少もしくはほとんど変化がなかった。
【００６２】
【表５】
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【００６３】
以上より、本ＰＨＢ生産菌株によるＰＨＢ合成のリサイクル培地を用いた培養でのより好ましい条件は、リサイクル培地に６．６７ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＰＯ４、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、チアミン１０ｍｇ／Ｌ、さらに適当量のグルコースを添加し、約３７℃で培養することであろう。
【００６４】
［ＬＢ培地、ＭＲ培地での培養時の菌体量、ＰＨＢ生産量等の経時変化］
Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ処方により、トリプトン、酵母エキス、及び塩化ナトリウムから成る培地をＬＢ培地と呼び、これにグルコースを添加したものを比較例１とした。２Ｌ坂口フラスコを用いてこのＬＢ培地で培養時の経時変化によるＰＨＢ生産性の結果を図６に示す。ここで、菌体重量は菌体成分とＰＨＢとの和であるため、乾燥菌体重量からＰＨＢを引いた菌体残渣を正味の菌体量として評価できる。図６から増殖の誘導期はほとんどなく、培養開始後にすぐに増殖が確認できた。対数増殖は、２４時間以内に完了していることがわかる。ＰＨＢ生産は、菌体増殖より遅れて開始され、３０時間まで増加した。またグルコースは４８時間以内にほぼ完全に消費された。５８時間の培養で、乾燥菌体７．４６ｇ／Ｌ、ＰＨＢ４．５２ｇ／Ｌ、ＰＨＢ蓄積率６０．５％であった。
【００６５】
［比較例２］
ブドウ糖、及びリン酸―水素カリウム、リン酸水素２アンモニウム、クエン酸、硫酸マグネシウム７水和物、チアミン、微量金属溶液からなる培地をＭＲ培地と呼び、比較例２とした。２Ｌ坂口フラスコを用いてこのＭＲ培地で培養時の経時変化によるＰＨＢ生産性の結果を図７に示す。ＭＲ培地で培養すると誘導期が長く対数増殖期に入ったのは１０時間以降で、２４時間で定常期に入った。ＰＨＢ生産は増殖に遅れて開始され、２４時間以降５８時間まで少量ずつ増加した。５８時間の培養で乾燥菌体３．５１ｇ／Ｌ、ＰＨＢ１．３６ｇ／Ｌ、ＰＨＢ蓄積率３８．７％であった。
【００６６】
［リサイクル培地での培養時の菌体量、ＰＨＢ生産量等の経時変化］
上述のより好ましい培養条件で、２Ｌ坂口フラスコを用いてリサイクル培地での培養時の菌体量、ＰＨＢ生産量等の経時変化を調べた。その結果を図８に示す。リサイクル培地で培養すると、培養開始後１０時間まではＭＲ培地同様誘導期が見られ、１０時間以降から対数増殖が始まった。増殖は２４時間以内に終了したが、ＰＨＢ量は２４時間以降も少量ずつ増加した。また、グルコースは４８時間以内にほぼ完全に消費された。５８時間の培養で乾燥菌体５．３１ｇ／Ｌ、ＰＨＢ２．５４ｇ／Ｌ、ＰＨＢ蓄積率４８．０％であった。リサイクル培地での培養時はＬＢ培地の場合に比べ、誘導期が長く対数増殖期に入るまでの時間が長かったことがわかる。しかし、合成培地であるＭＲ培地で培養する場合と比較して、グルコースをほぼ完全に消費する点、菌体量、ＰＨＢ生産量が多い点、更にリサイクル培地はＭＲ培地に比べて添加成分が少ないことを考慮すると、ＭＲ培地よりリサイクル培地の方が優れていることは明らかであった。
【００６７】
図９は、リサイクル培地を継続して使用した場合において、５００mlの坂口フラスコに１００ｍｌの培地を入れ３７℃で６４時間培養した後の乾燥菌体量、ＰＨＢ生産量等のリサイクル回数毎の変化を示す。このとき各実験では１００ｍｌの培養液を遠心分離で集菌し、洗浄後５０ｍｌの蒸留水に再懸濁し、ＮａＯＨで処理を行い、生じた廃液（リサイクル基本培地）を塩酸で中和後、１００ｍｌにメスアップし、炭素源など上述の好ましい条件になるよう必要な成分を添加し、再度培地として利用した。このサイクルを繰り返し行った。ＬＢ培地から開始される第１回目の培養に比べて、リサイクル培地の第２回目の培養では、乾燥菌体量等が減少した。しかし、第３回目の培養では、第２回目の培養とほぼ同等のＰＨＢ生産が行われた。従って、リサイクル培地の使用が再現性のあるものと考えられる。しかるに、第４回目の培養では、かなり乾燥菌体量等が減少した。第５回目以降では、第４回目よりも乾燥菌体量等が多く、リサイクル培地によるＰＨＢ生産がサイクルとして成立していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＰＨＢ抽出廃液の培地への再利用のフローチャートである。
【図２】リサイクル培地で培養時の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度の影響を示すグラフである。
【図３】リサイクル培地のＭｇＳＯ４濃度の影響を示すグラフである。
【図４】リサイクル培地におけるクエン酸添加の影響を示すグラフである。
【図５】リサイクル培地で培養時の培養温度の影響を示すグラフである。
【図６】ＬＢ培地で培養時の経時変化を示すグラフである。
【図７】ＭＲ培地で培養時の経時変化を示すグラフである。
【図８】リサイクル培地で培養時の経時変化を示すグラフである。
【図９】リサイクル培地で培養した場合のリサイクル回数毎の乾燥菌体量等の変化を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６９】
１０１    ＬＢ培地の準備工程
１０２    集菌、洗浄、再懸濁工程
１０３    ＰＨＢの抽出工程
１０４    溶液分離工程
１０５    加熱工程
１０６    中和工程
１０７    リサイクル基本培地の準備工程
１０８    成分添加工程
１０９    リサイクル培地の準備工程
２０１    ＰＨＢの分離工程
２０２    廃材の分離工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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