(57)【要約】【課題】  精度が高く迅速かつ特異性を高めた検出を可能とする核酸配列の増幅方法を提供する。さらに、核酸の簡便なクローニング方法、特にＤＮＡから成熟ｍＲＮＡを作る過程で行われる選択的スプライシングにより合成される選択的スプライシングフォームの迅速かつ簡便な増幅法を提供する。【解決手段】  二本鎖核酸がステムループ構造を維持できる条件下において、前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記二本鎖核酸をインキュベートする。【選択図】        図５
2005318884.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステムループ構造を有する二本鎖核酸を増幅する方法であって、前記二本鎖核酸がステムループ構造を維持できる条件下において、前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記二本鎖核酸をインキュベートすることを含む二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項２】
溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項３】
二本鎖核酸を増幅する方法であって、一つ又は二つ以上のステムループ構造をもつ核酸と前記二本鎖核酸を結合させるステップと、
前記二本鎖核酸がステムループ構造を維持できる条件下において前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、
ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記二本鎖核酸をインキュベートするステップと
を含む二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項４】
溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれることを特徴とする請求項３に記載の二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項５】
二本鎖核酸の一端又はそれ以上の末端に、ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチドを連結するステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸を構成する第一の鎖の一部に相補的な配列、又は第二の鎖の一部に相補的な配列の、いずれか、もしくは両方を含み、
前記オリゴヌクレオチドの結合した前記二本鎖核酸を変性させて、前記オリゴヌクレオチドと前記第一の鎖の一部との間、又は前記第二の鎖の一部との間の、いずれか、もしくは両方とでそれぞれ相補的に結合することによって、二本鎖核酸に一つまたは二以上の新たなステムループ構造を特異的に形成させるステップと、
前記新たなステムループ構造のループ部分に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記核酸をインキュベートするステップと
を含む核酸の増幅方法。
【請求項６】
前記プライマーが、前記新たなステムループ構造のループ部分を構成している前記二本鎖核酸の第一の鎖の一部または第二の鎖の一部の、いずれか、もしくは両方に、相補的であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれることを特徴とする請求項５または６に記載の二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項８】
二本鎖核酸中の一部にループを形成している一本鎖部分を１箇所又は２箇所以上含む二本鎖核酸の少なくとも一端又はそれ以上の末端に第二の核酸を連結させて、ヘアピン構造、又はループ構造を作らせるステップと、
前記二本鎖核酸内のループを形成している一本鎖部分の一部、又は、末端のループを形成している一本鎖部分の一部に相補的な１種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記第二の核酸を連結された標的二本鎖核酸をインキュベートするステップと
を含む核酸の増幅方法。
【請求項９】
溶液中に、ループを形成している一本鎖部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれることを特徴とする請求項８に記載の二本鎖核酸の増幅方法。
【請求項１０】
前記二本鎖核酸が、選択的スプライシングの結果生じる２つの異なる核酸の相補鎖により形成されるループをもつ二本鎖核酸に由来する、請求項８または９に記載の増幅方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により増幅された核酸から、選択的スプライシングの結果生じる２つの異なる核酸の配列情報を得る方法。
【請求項１２】
標的核酸の一部に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドを標的核酸に連結させた後に、標的核酸との間で少なくとも一つ、又は、それ以上のステムループ構造をもつ二次的な構造を形成することができるオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
標的とする二本鎖核酸を構成する第一の鎖の一部に相補的な配列および第二の鎖の一部に相補的な配列を含み、二本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドを連結させた後に、前記オリゴヌクレオチドと前記第一の鎖の一部との間、又は前記第二の鎖の一部との間のいずれか、もしくは両方とでそれぞれ相補的に結合することによって、新たなステムループ構造をもつ二次的な構造を形成することができるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のオリゴヌクレオチドと、前記ループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む、核酸を増幅させるためのキット。
【請求項１５】
ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの前記増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーをさらに含む請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列特異的な核酸の増幅方法に関する。より詳しくは、本発明は、従来の方法と比較して、精度が高く迅速かつ特異性を高めた検出を可能とする核酸配列の増幅方法を提供する。さらに、核酸の簡便なクローニング方法、特にＤＮＡから成熟ｍＲＮＡを作る過程で行われる選択的スプライシングにより合成される選択的スプライシングフォームの迅速かつ簡便な増幅法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子診断、農作物の核酸検査及び感染症診断など核酸を検出する技術が幅広く利用されている。このような検査及び診断などを目的とした核酸検出の方法は種々知られている。例えば、検査したい核酸配列を含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅物の有無を調べる方法、検査したい核酸配列に結合する標識プローブを使用する方法などが挙げられる。また、検査したい核酸配列の増幅方法として最も良く利用されているＰＣＲの他にＲＴ−ＰＣＲ法、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）などがある。さらに、ＰＣＲのような複雑な温度調整を必要としない等温増幅方法としては、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法）、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ローリングサークル法などが知られている。これらの方法を用いた検出技術も開発され、検査キットとして販売されている。しかし、これらの技術は、１）検出に時間が掛かる、２）検出の工程が煩雑である、３）精度が低いなどの問題があり、例えば空港での感染症検査、農作物の現場での検査など迅速性、簡便性が求められるケースには実用化が難しかった。
【０００３】
【非特許文献１】Tsugunori Notomiet. al. (2000)：Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research、 Vol.28、 No.12: e63
【非特許文献２】Kentaro Ngamine and Tesu Hase、 Tsugunori Notomi:Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes Vol.16 、No.3 、223-229、 2002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
今回の発明の目的は、目的とする核酸配列を増幅するにあたり、速度を高め、さらにバックグランドや非特異的な配列の増幅を無くして、目的とする配列増幅の特異性を高めること、さらにこの増幅物の有無をもとに目的とする核酸配列が検体に含まれるか否かを迅速かつ精度良く検出手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明の一態様において、ステムループ構造を有する二本鎖核酸を増幅する方法であって、前記二本鎖核酸がステムループ構造を維持できる条件下において、前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記二本鎖核酸をインキュベートすることを含む二本鎖核酸の増幅方法が提供される。
この態様において、溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれてもよい。
【０００６】
本発明の別の態様において、二本鎖核酸を増幅する方法であって、一つ又は二つ以上のステムループ構造をもつ核酸と前記二本鎖核酸を結合させるステップと、前記二本鎖核酸がステムループ構造を維持できる条件下において前記ステムループ構造の一つ又は二つ以上のループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記二本鎖核酸をインキュベートするステップとを含む二本鎖核酸の増幅方法が提供される。
この態様において、溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれてもよい。
【０００７】
本発明のさらに別の態様において、二本鎖核酸の一端又はそれ以上の末端に、ステムループ構造を形成するオリゴヌクレオチドを連結するステップと、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖核酸を構成する第一の鎖の一部に相補的な配列、又は第二の鎖の一部に相補的な配列の、いずれか、もしくは両方を含み、前記オリゴヌクレオチドの結合した前記二本鎖核酸を変性させて、前記オリゴヌクレオチドと前記第一の鎖の一部との間、又は前記第二の鎖の一部との間の、いずれか、もしくは両方とでそれぞれ相補的に結合することによって、二本鎖核酸に一つまたは二以上の新たなステムループ構造を特異的に形成させるステップと、前記新たなステムループ構造のループ部分に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記核酸をインキュベートするステップとを含む核酸の増幅方法が提供される。
この態様では、前記プライマーを、前記新たなステムループ構造のループ部分を構成している前記二本鎖核酸の第一の鎖の一部または第二の鎖の一部の、いずれか、もしくは両方に、相補的なものとすることができる。
また、この態様では、溶液中に、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれていてもよい。
【０００８】
本発明のさらに別の態様では、二本鎖核酸中の一部にループを形成している一本鎖部分を１箇所又は２箇所以上含む二本鎖核酸の少なくとも一端又はそれ以上の末端に第二の核酸を連結させて、ヘアピン構造、又はループ構造を作らせるステップと、前記二本鎖核酸内のループを形成している一本鎖部分の一部、又は、末端のループを形成している一本鎖部分の一部に相補的な１種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む溶液中で、前記第二の核酸を連結された標的二本鎖核酸をインキュベートするステップとを含む核酸の増幅方法が提供される。
この態様では、溶液中に、ループを形成している一本鎖部分の一部に相補的な前記プライマーの増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーがさらに含まれていてもよい。
前記二本鎖核酸が、選択的スプライシングの結果生じる２つの異なる核酸の相補鎖により形成されるループをもつ二本鎖核酸に由来するものを使用することができる。また、このように増幅された核酸から、選択的スプライシングの結果生じる２つの異なる核酸の配列情報を得ることができる。
【０００９】
本発明のさらに別の態様では、標的核酸の一部に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドを標的核酸に連結させた後に、標的核酸との間で少なくとも一つ、又は、それ以上のステムループ構造をもつ二次的な構造を形成することができるオリゴヌクレオチドが提供される。
また、さらに別の態様では、標的とする二本鎖核酸を構成する第一の鎖の一部に相補的な配列および第二の鎖の一部に相補的な配列を含み、二本鎖核酸と前記オリゴヌクレオチドを連結させた後に、前記オリゴヌクレオチドと前記第一の鎖の一部との間、又は前記第二の鎖の一部との間のいずれか、もしくは両方とでそれぞれ相補的に結合することによって、新たなステムループ構造をもつ二次的な構造を形成することができるオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の態様では、これらのオリゴヌクレオチドと、前記ループ部分の一部に相補的な1種類又は２種類以上のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼとを含む、核酸を増幅させるためのキットが提供される。このキットは、ループ部分の一部に相補的な前記プライマーの前記増幅産物に相補的な配列をもつ1種類又は２種類以上の第二のプライマーをさらに含むものを用いることができる。
これらのオリゴヌクレオチドまたはキットは、本発明の核酸の増幅方法に使用するのに適している。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、ステムループ構造のループ部分の一部に相補的な１種類又は２種類以上のプライマーを起点として、二本鎖核酸を鋳型に核酸の増幅が行なわれ、目的とする配列を含む長い一本鎖ＤＮＡが合成される。特に、この増幅産物に相補的な配列を持つ１種類又は２種類以上の第二のプライマーをさらに用いると、増幅されて生じた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、目的とする配列を含む一本鎖ＤＮＡが合成されるため、増幅効率が高まる。
【００１１】
標的二本鎖核酸を形成する第一の鎖の一部に相補的な配列、又は第二の鎖の一部に相補的な配列のいずれか、又は両方を含むオリゴヌクレオチドを、標的二本鎖核酸に連結させることにより、変性後、前記オリゴヌクレオチドと第一の鎖の一部との間、又は第二の鎖の一部との間の、いずれか又は両方とでそれぞれ相補的に結合することによって、一つ又は二つ以上の新たなステムループ構造を形成させることができる。この構造は、標的二本鎖配列に特異的に生じるものであるため、新たなステムループ構造のループ部分に相補的なプライマーを用いることにより、標的二本鎖核酸に特異的な増幅を行なうことができる。さらに、このプライマーの配列を、新たなステムループを構成しているループ部分のうち、標的二本鎖核酸のうちの第一の鎖及び／又は第二の鎖に相補的に設計することにより、標的配列にさらに特異的な増幅を行なうことができる。この場合においても、この増幅産物に相補的な配列を持つ１種類又は２種類以上の第二のプライマーをさらに用いることにより増幅効率を高めることができる。
【００１２】
さらに、本発明では、ループ部分の一部に相補的なプライマーを用いることから、ループ構造をもつ二本鎖核酸のみを特異的に増幅できる。ループ構造をもつ二本鎖核酸として、例えば、選択的スプライシングの結果により生じる、２つの異なる核酸の相補鎖により形成される二本鎖核酸を例示できる。
【００１３】
本発明の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明によってさらに￥明らかになる。しかしながら、本発明の詳細な説明および実施例は、例示のために示されるものであり、この詳細な説明により当業者に明らかである各種の変更や修正は、本発明の範囲内にあることを理解するべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明では、標的配列にステムループを形成する配列（以下、連結オリゴヌクレオチドという）を連結させて増幅の鋳型核酸を形成する。すなわち、本発明では、標的配列とその相補的配列との間に連結オリゴヌクレオチドを連結させて二本鎖核酸の増幅鋳型を形成する。
【００１５】
このような二本鎖核酸は、標的配列とその相補的配列との間で二本鎖構造が形成されたとき、二本鎖部分の末端または両端に一本鎖のループが形成される。二本鎖部分の両端にループが形成されるのが望ましい。二本鎖部分の両端にそれぞれ１つずつループをもつ構造をダンベルフォームと呼ぶ。
【００１６】
連結オリゴヌクレオチドと標的となる二本鎖核酸の連結は、お互いの突出末端部分がハイブリダイズした後、化学的または酵素的に行われる。連結はリガーゼにより酵素的に行なうのが望ましい。
【００１７】
プライマーは、連結された二本鎖核酸の任意の場所にアニーリングするようにデザインできる。例えば、ステムループ構造のループ部分又はステム部分の一部にアニーリングするようにデザインできる。増幅の効率の点からは、ステムループ構造のループ部分の一部にアニーリングするようデザインするのが望ましい。プライマーの塩基数は、鋳型となる核酸にアニーリングする限り、特に限定されない。アニーリングするプライマーは、１種類以上用いることができ、連結された二本鎖核酸の複数の部位にそれぞれアニーリングする複数種のプライマーを用いることができる。連結された二本鎖核酸に相補的なプライマーに加えて、連結された二本鎖核酸の一部の配列と同じ配列をもつ第二のプライマーを用いることによって、増幅効率をさらに高めることもできる。連結された二本鎖核酸の一部の配列と同じ配列をもつプライマーは、連結された二本鎖核酸の任意の配列と同じ配列を持つものであってもよいが、増幅効率の点からステムループ構造のループ部分の一部と同じ配列を持つものが望ましい。
【００１８】
本発明による核酸合成方法において使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このＤＮＡポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｈｉ２９ファージＤＮＡポリメラーゼを例示できる。また、他の例として、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacilluscaldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。さらには、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ 、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ 、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９oＮｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。より耐熱性にさせるためにトレハロースなどを添加したり、より酵素を安定化させるためにグリセロールなどを添加したりすることも可能である。さらに、目的核酸がRNAの場合、逆転写酵素活性が強いＢｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。逆転写酵素活性が弱い場合は、これらの酵素と逆転写酵素活性のあるＭ−ＭｕＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ等を組み合わせて使用することが望ましい。
【００１９】
本発明はゲノム上の任意の配列を検出したい場合にも利用することができる。本発明では、プライマーのプライミング効率を顕著に増幅させ、結果として増幅の速度を速め、かつ特異性を高めることが可能である。本発明による増幅の特異性の高さから、ＳＮＰ（一塩基多型）の検出を行なうこともできる。さらに、この増幅された核酸に相補的な配列を持つ第２のプライマーを添加することにより、指数関数的に標的配列を増幅させることもできる。
【００２０】
また、本発明では、直鎖状二本鎖核酸の両端に連結オリゴヌクレオチドを連結させて増幅に利用することもできる。この場合、ステムループ部に相補的配列を持つプライマーを用いて増幅反応を行なうことにより、ＤＮＡの各々の鎖が交互に連結した一本鎖の長鎖核酸の合成効率を高めることを可能とし、さらにＷＯ０１／０４０５１６に記載の方法では必要とされている熱変性の工程を必要とせず簡便に増幅することが可能となった。
【００２１】
さらに、本発明では、連結オリゴヌクレオチドが標的配列に正確に連結したときのみ増幅反応が開始するように、連結オリゴヌクレオチドをデザインすることができる。これにより、複数種の核酸分子の混合物から標的核酸だけを選択的に増幅することができ、また、この増幅反応の有無を測定することにより、検体に含まれる標的核酸の検出も可能となった。
【００２２】
この特異性を高めた連結オリゴヌクレオチドの具体的デザインは、例えば、図１に示すものである。連結オリゴヌクレオチドが、標的核酸以外の他の分子と連結されると、ローリングサークル増幅法により誤って連結された分子が増幅され、標的核酸の特異的な増幅や検出が難しくなる。このような非特異的な増幅を防ぐため、このデザインでは、標的核酸と連結オリゴヌクレオチドとを連結させた後、標的核酸の末端配列がステムループのループ部分の一部を形成するように連結オリゴヌクレオチドをデザインする。連結オリゴヌクレオチドと標的核酸とが連結したもの以外は、ステムループを形成することがない。さらに、連結後に形成されたステムループのループ部、好ましくは、ループ部分の一部を形成している標的核酸の末端配列に相補的配列を持つ増幅用プライマーを利用する。
【００２３】
また、増幅用プライマーは複数使用できるが、標的配列に相補的な配列を持ったプライマーを利用することによっても、増幅の特異性を高めることができる。また、連結用オリゴヌクレオチド配列にあらかじめ制限酵素認識配列を組み込むことにより、増幅反応で合成された長鎖核酸分子を切断し、同じ長さの核酸分子に分解することもできる。
【００２４】
さらに、この方法を応用して、選択的スプライシングフォームを特異的に増幅することも可能である。選択的スプライシングは、ひとつの遺伝子座位から複数の異なるたんぱく質を合成する仕組みであり、これにより生理的活性の異なるたんぱく質や疾病の原因となるたんぱく質が合成されることが多々知られており、非常に注目される生物のシステムである。同一遺伝子座から生じた複数の選択的スプライシングフォームから２種のスプライシングフォームを二本鎖核酸の形で収集する方法はいくつか知られている。この二本鎖核酸では、選択的スプライシングの対象となるエクソンがループを形成して一本鎖の形状をとっている。この２種の異なる選択的スプライシングフォームから得られた二本鎖核酸を、上記方法を用いて増幅する際、ループを形成したエクソンの配列に相補的な配列を持ったプライマーを用いることにより、目的とする遺伝子座位の選択的スプライシングフォームを特異的に増幅させることが可能となる。
【００２５】
上記で本発明を一般的に説明したが、さらに下記では、本発明を実施例により具体的に説明する。しかし、この実施例は説明することを目的とするものであり、本発明の範囲をこれら実施例に限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２６】
＜ループカセットの連結、ならびに、それを鋳型とした増幅＞
図５に示すようなＳＵＲＣＡＳ法（Ｓｕｐｅｒ Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）により、鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを使用してマウスのｍｕｓｃｕｌｕｓ ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｏｍｏｌｏｇ−ｌｉｋｅ 3 （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ａｓｃｌ３）遺伝子、ＩＤ Ｎｕｍｂｅｒ: ＮＭ＿０２００５１（配列番号１）の増幅を試みた。インサートの配列を下記に示す。下線部は、プライマーの３’末端側とアニーリングする配列であり、制限酵素（ＢａｍＨＩ）切断部位は網掛けで示した。
【００２７】
【化１】
2005318884.tif 000003
【００２８】
増幅は、下記に示すプライマーを用いて行なった（配列番号２及び配列番号３）。
【００２９】
【化２】
2005318884.tif 000004
【００３０】
プライマーの配列において、下線の付された配列は、インサートの下線の付された配列とアニーリングする配列である。各プライマーの５’側領域には、ＢｓｔＸＩの制限酵素認識配列（太字部分）を付加した。増幅用プライマーの合成は、インビトロジェン株式会社に依頼した。
【００３１】
これらのプライマーを用いてインサートをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応液は下記の表１に示すとおりであり、９４℃;２分、（９５℃；３０秒、６５℃；１分、７２℃；１分）、３５サイクルで行なった。
【００３２】
【表１】
2005318884.tif 000005
【００３３】
ＰＣＲ増幅後、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ  ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ で未反応のプライマーを除去し、目的の増幅産物を精製した。
精製した増幅産物（インサート部分）の末端をＢｓｔＸＩにより制限酵素処理を行った。反応試薬の組成は以下のとおりであり、５０℃で９０分間制限酵素処理を行った。
【００３４】
【表２】
2005318884.tif 000006
【００３５】
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用いて、制限酵素により末端が切断された増幅産物を精製した。
【００３６】
精製後の増幅産物を、ループカセットにライゲーションさせた。ループカセットの配列を下記に示した。このループカセットは、５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドである。下線部分がループ部分である。ループカセットにおいて、下線部で示されるループ中の太字の配列は、ループプライマーとアニーリングする配列である。それぞれのループカセットは、３’末端が４塩基分の突出を持つよう設計した（太字で示す）。
【００３７】
以下に示す反応試薬で１６℃にて９０分間処理して、増幅産物とループカセット（配列番号４及び配列番号５）とをライゲーションさせた。その後、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ライゲーションされなかった短鎖のループカセットを除去し、ループカセットが連結したダンベルフォーム型の産物を精製した。
【００３８】
【化３】
2005318884.tif 000007
【００３９】
【表３】
2005318884.tif 000008
【００４０】
得られたダンベルフォーム型の産物を鋳型にして、以下のような試薬組成を用いて、室温(２５℃)で４時間、ローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った。プライマー配列は、以下のとおりである。Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔはループ配列に、Ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔはステム配列に、それぞれアニーリングできるような設計とし、各プライマーセット（配列番号６〜９）を用いて増幅を行った。
【００４１】
【化４】
2005318884.tif 000009
【００４２】
【表４】
2005318884.tif 000010
【００４３】
目的の配列が増幅されているかどうか確認するために、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。なお、本実験で用いたダンベルフォーム型産物の制限酵素の切断部位を図２に示す。
【００４４】
【表５】
2005318884.tif 000011
【００４５】
制限酵素処理した反応液５μｌを1.5％ ヌシーブ ３：１ アガロースゲル（宝酒造社製）にて８０分、１００Ｖで電気泳動した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色して核酸を確認した。結果を図３に示す。各レーンのサンプルは以下のとおりである。
【００４６】
レーン１：２０ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ
レーン２：Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔで増幅後、制限酵素で未処理
レーン３：Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔで増幅後、BamHIで処理
レーン４：Ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔで増幅後、制限酵素で未処理
レーン５：Ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔで増幅後、BamHIで処理
レーン６：２−Ｌｏｇ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ
【００４７】
Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用い増幅させたもののうち、レーン２は制限酵素で未処理のものであり、約１０Ｋｂｐ付近に制限酵素で切断されていない増幅産物が確認された。レーン３はＢａｍＨＩで切断され、約４８０ｂｐと約７１０ｂｐのバンドが確認された。これらの結果は、図２で示す制限酵素地図から予想されるサイズと一致した。このことから、インサート配列とループカセットを連結したものを鋳型として、増幅されたことが確認された。しかし、Ｓｔｅｍ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔで増幅したものは、増幅物は得られず、制限酵素処理を行っても、切断後の目的サイズのバンドは得られなかった。また、ダンベルフォーム型の連結された二本鎖DNAを増幅させる場合は、熱変性して、鋳型を完全に1本鎖状にする必要は無く、１本鎖を形成するループ部分に３末端を提供するＬｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔを用いることで、特異的に増幅されることが示された。
【実施例２】
【００４８】
＜クローバーリーフ増幅＞
図６に示すようなＣｌｏｖｅｒ Ｌｅａｆ法 により、鋳型としてマウスゲノム DNAを使用してマウスのｍｕｓｃｕｌｕｓ ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｈｏｍｏｌｏｇ−ｌｉｋｅ ３ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（Ａｓｃｌ３） 遺伝子、ＩＤ Ｎｕｍｂｅｒ： ＮＭ＿０２００５１（配列番号１０）の増幅を試みた。インサートの配列を下記に示す。下線部は、プライマーの３’末端側とアニーリングする配列であり、制限酵素（ＢａｍＨＩ）切断部位は網掛けで示した。このインサートを鋳型Ａと呼ぶ。
【００４９】
【化５】
2005318884.tif 000012
【００５０】
増幅は、下記に示すプライマー（配列番号１１及び配列番号１２）を用いて行なった。このプライマーの合成は、ＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて行った。
【００５１】
【化６】
2005318884.tif 000013
【００５２】
プライマーの配列において、下線の付された配列は、インサートの下線の付された配列とアニーリングする配列である。各プライマーの５’末端領域には、Ｉ−ＣｅｕＩの制限酵素認識配列（太字部分）を付加した。
【００５３】
これらのプライマーを用いてインサートＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応液は下記の表６に示すとおりであり、９４℃;２分、（９５℃；３０秒、６５℃；１分、７２℃；１分）、３５サイクルの反応条件で行なった。
【００５４】
【表６】
2005318884.tif 000014
【００５５】
ＰＣＲ増幅後、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ ｓｙｓｔｅｍで未反応のプライマーを除去し、目的の増幅産物を精製した。
【００５６】
さらに、本法の特異性を示すために、鋳型Ａと一部異なる塩基配列をもつ鋳型ＤＮＡ（鋳型Ｂと呼ぶ。配列番号１３）を人工的に作製し、鋳型Ａと同様に増幅し増幅産物を精製した。鋳型Ｂの配列を下記に示す。鋳型Ａと異なる配列部分を太字で記した。
【００５７】
【化７】
2005318884.tif 000015
【００５８】
鋳型Ａ及び鋳型Ｂのそれぞれの増幅産物の末端をＩ−ＣｅｕＩにより制限酵素処理を行った。反応試薬組成は以下のとおりであり、３７℃で、３時間、制限酵素処理を行った。
【００５９】
【表７】
2005318884.tif 000016
【００６０】
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、制限酵素で末端が切断された増幅産物を精製した。
【００６１】
精製後の増幅産物を、ループカセットにライゲーションさせた。ループカセットの配列は下記に示した。このループカセットは、５’末端リン酸化オリゴヌクレオチドである。下線部分がループ部分である。それぞれのループカセットは、３’末端が４塩基分の突出を持つよう設計した（太字で示す）。さらに、ループカセットの連結後、増幅用プライマーがアニーリングする配列を四角で囲んで記した（センス鎖とアンチセンス鎖を含む）。また、前記記載のプライマー配列に相当する配列を下線で記し、さらに、そのプライマーが目的領域配列を含む増幅後、ループカセットを結合して熱変性後に、その連結物が異なる構造を形成できるような（目的核酸が増幅されている時のみ、ループ内の配列と相同な領域ができる）配列部分を網掛けで記した。反応試薬組成は以下のとおりで、１６℃で、９０分間、ライゲーション反応を行った。その後、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、ライゲーションされなかった短鎖のループカセットを除去し、ループカセットが連結したものを精製した。
【００６２】
【化８】
2005318884.tif 000017
＜ループカセット配列＞
【００６３】
【表８】
2005318884.tif 000018
【００６４】
得られたダンベルフォーム型の産物を鋳型にして増幅を行った。鋳型Ａ及び鋳型Ｂを９５℃で５分熱変性させ、その後、室温で５分放置した後に、以下のような試薬組成を用いて、室温(25℃)で4時間、ローリングサークル増幅を行った。プライマー配列は、以下のとおりである。Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒはループ配列にアニーリングできるような設計とし増幅を行った。
【００６５】
【化９】
2005318884.tif 000019
【００６６】
【表９】
2005318884.tif 000020
【００６７】
目的の配列が増幅されているかどうか確認するために、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。
【００６８】
【表１０】
2005318884.tif 000021
【００６９】
制限酵素処理した反応液５μｌを1.5％ ヌシーブ ３：１ アガロースゲル（宝酒造社製）にて８０分、１００Ｖで電気泳動した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色して核酸を確認した。結果を図４に示す。各レーンのサンプルは以下のとおりである。
【００７０】
レーン１：２０ｂｐ  ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ
レーン２：鋳型（Ａ）を用い、増幅後、制限酵素で未処理
レーン３：鋳型（Ａ）を用い、増幅後、BamHIで処理
レーン４：配列変更の鋳型（Ｂ）を用い、増幅後、制限酵素で未処理
レーン５：２−Ｌｏｇ  ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ
【００７１】
レーン２は制限酵素で未処理のものであり、約１０Kｂｐ付近に制限酵素で切断されていない増幅産物が確認された。レーン３はＢａｍＨＩで切断され、約６００ｂｐと約８００ｂｐのバンドが確認された。これらの結果は、制限酵素地図から予想されるサイズと一致した。このことから、インサート配列とループカセットを連結したものを鋳型として、増幅されたことが確認された。しかし、鋳型Ａの配列の一部を変更させた鋳型Ｂを増幅し、ループカセットを結合させたものを鋳型として増幅したものからは増幅が確認されなかった。 
本法により、目的核酸領域（インサート）が増幅、ループカセットが結合し、その後、特定の２次構造が形成できるものからのみ、特異的に増幅が起こることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本発明の一実施態様を示す図である。
【図２】図２は、実施例１で用いたダンベルフォーム型産物の制限酵素の切断部位を示す図である。
【図３】図３は、実施例１の結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例２の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例１の方法を示す概念図である。
【図６】図６は、実施例２の方法を示す概念図である。
【図１】
2005318884.tif 000022
【図２】
2005318884.tif 000023
【図３】
2005318884.tif 000024
【図４】
2005318884.tif 000025
【図５】
2005318884.tif 000026
【図６】
2005318884.tif 000027
【配列表】
2005318884000001.app