(57)【要約】      （修正有）【課題】できるだけ正確かつ簡便に雄性ホルモン系活性を検定する方法等を提供すること。【解決手段】化学物質が有する雄性ホルモン系活性の検定方法であって、（１）化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における、特定の塩基配列を有する遺伝子等の発現レベルを測定する第一工程、及び（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する第二工程を有することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質が有する雄性ホルモン系活性の検定方法であって、
（１）化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における、以下の登録番号群１又は２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
(a)M33648（配列番号１で示される塩基配列）
(b)AI009405（配列番号２で示される塩基配列）
(c)AI014135（配列番号３で示される塩基配列）
(d)AI639037（配列番号４で示される塩基配列）
(e)AI639128（配列番号５で示される塩基配列）
(f)U75411（配列番号６で示される塩基配列）
＜登録番号群２＞
(g)AF007758（配列番号７で示される塩基配列）
(h)AA859661（配列番号８で示される塩基配列）
(i)S73007（配列番号９で示される塩基配列）
【請求項２】
検体が、雄性ホルモン依存性器官を構成する細胞又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
雄性ホルモン依存性器官が、前立腺腹葉、前立腺背側葉、精嚢、カウパー腺、陰茎亀頭、肛門挙筋、球海綿体筋を構成する細胞又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
遺伝子の発現レベルの対照値が、化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
化学物質に予め接触させられた哺乳動物が、化学物質と雄性ホルモンとの両者に予め接触させられた哺乳動物であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の方法。
【請求項７】
第一工程が、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程であり、かつ、第二工程が、当該第一工程で得られた発現レベルの測定値が対照値と有意に異なることを指標とし、当該指標に基づいて検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の方法。
【請求項８】
第一工程が、登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程であり、かつ、第二工程が、当該第一工程で得られた発現レベルの測定値が対照値と有意に異なることを指標とし、当該指標に基づいて検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載される方法により評価された、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無又はその量に基づき雄性ホルモン系活性を有する化学物質を選抜する工程を有することを特徴とする雄性ホルモン系活性を有する化学物質の探索方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載される方法により評価された、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無又はその量に基づき雄性ホルモン系活性を有する化学物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする雄性ホルモン系薬剤。
【請求項１１】
第一工程の前工程として、
（Ａ）精巣が摘出された哺乳動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等なレベルに回復するまで飼育する第Ａ工程、
（Ｂ）第Ａ工程により飼育された哺乳動物に対して化学物質を投与する第Ｂ工程、及び
（Ｃ）第Ｂ工程後、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体を得るために、化学物質が投与された哺乳動物から、当該哺乳動物由来の検体を単離する第Ｃ工程、
を追加的に有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
雄性ホルモン系活性が、雄性ホルモン活性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
雄性ホルモン系活性が、抗雄性ホルモン活性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の生殖・発生・分化・成長及び代謝は、種々の内分泌機能により影響を受ける。生体における生殖に関する主要な内分泌系として、雄性ホルモン系及び雌性ホルモン系が挙げられる。このうち、雄性ホルモン系において、化学物質が有する雄性ホルモン系活性、（具体的には、雄性ホルモン活性又は抗雄性ホルモン活性）を検定するために、例えば、精巣が摘出されたげっ歯類動物等の哺乳動物、又は、精巣が摘出されかつテストステロン化合物（雄性ホルモン）が投与されたげっ歯類動物等の哺乳動物において、雄性ホルモン依存性器官・組織の重量を測定する方法が用いられてきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Environ Health Perspect. 111, 1912-1919 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、雄性ホルモン依存性器官・組織の重量を測定する方法では、雄性ホルモン系活性を有する化学物質と、雄性ホルモン系活性を有さないが、雄性ホルモン依存性器官・組織の細胞増殖に影響を与えることにより、その重量に影響を与える化学物質とを区別して、正確に雄性ホルモン系活性を検定することができなかった。このため、これらを区別してできるだけ正確かつ簡便に雄性ホルモン系活性を検定することができる方法の開発が切望されている。
さらにまた、雄性ホルモン依存性器官・組織の重量を測定する方法では、げっ歯類動物等の哺乳動物に対して化学物質を少なくとも約７〜１０日間程度の期間中投与が通常であり、より短期間で雄性ホルモン系活性を検定することができる方法の開発が待ち望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、特定の遺伝子（具体的には、登録番号群１又は２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子）の発現レベルに関して、抗雄性ホルモン活性を有する化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値と、抗雄性ホルモン活性を有する化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値とを比較した結果、明らかな差異を生じたが、一方、抗雄性ホルモン活性を有しない化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値と、抗雄性ホルモン活性を有しない化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの測定値とを比較した結果、明らかな差異を生じないことを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．化学物質が有する雄性ホルモン系活性の検定方法であって、
（１）化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における、以下の登録番号群１又は２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明検定方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
(a)M33648（配列番号１で示される塩基配列）
(b)AI009405（配列番号２で示される塩基配列）
(c)AI014135（配列番号３で示される塩基配列）
(d)AI639037（配列番号４で示される塩基配列）
(e)AI639128（配列番号５で示される塩基配列）
(f)U75411（配列番号６で示される塩基配列）
＜登録番号群２＞
(g)AF007758（配列番号７で示される塩基配列）
(h)AA859661（配列番号８で示される塩基配列）
(i)S73007（配列番号９で示される塩基配列）；
２．検体が、雄性ホルモン依存性器官を構成する細胞又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．雄性ホルモン依存性器官が、前立腺腹葉、前立腺背側葉、精嚢、カウパー腺、陰茎亀頭、肛門挙筋、球海綿体筋を構成する細胞又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項２記載の方法；
４．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．遺伝子の発現レベルの対照値が、化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの値であることを特徴とする前項１、２、３又は４記載の方法；
６．化学物質に予め接触させられた哺乳動物が、化学物質と雄性ホルモンとの両者に予め接触させられた哺乳動物であることを特徴とする前項１、２、３、４又は５記載の方法；
７．第一工程が、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程であり、かつ、第二工程が、当該第一工程で得られた発現レベルの測定値が対照値と有意に異なることを指標とし、当該指標に基づいて検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする前項１、２、３、４、５又は６記載の方法；
８．第一工程が、登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程であり、かつ、第二工程が、当該第一工程で得られた発現レベルの測定値が対照値と有意に異なることを指標とし、当該指標に基づいて検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする前項１、２、３、４、５又は６記載の方法；
９．前項１〜８のいずれかに記載される方法により評価された、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無又はその量に基づき雄性ホルモン系活性を有する化学物質を選抜する工程を有することを特徴とする雄性ホルモン系活性を有する化学物質の探索方法；
１０．前項１〜８のいずれかに記載される方法により評価された、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無又はその量に基づき雄性ホルモン系活性を有する化学物質若しくはその薬学的に許容される塩を有効成分として含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする雄性ホルモン系薬剤；
１１．第一工程の前工程として、
（Ａ）精巣が摘出された哺乳動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等なレベルに回復するまで飼育する第Ａ工程、
（Ｂ）第Ａ工程により飼育された哺乳動物に対して化学物質を投与する第Ｂ工程、及び
（Ｃ）第Ｂ工程後、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体を得るために、化学物質が投与された哺乳動物から、当該哺乳動物由来の検体を単離する第Ｃ工程、
を追加的に有することを特徴とする前項１記載の方法；
１２．雄性ホルモン系活性が、雄性ホルモン活性であることを特徴とする前項１記載の方法；
１３．雄性ホルモン系活性が、抗雄性ホルモン活性であることを特徴とする前項１記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、特定の遺伝子の発現レベルを指標とした、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の正確かつ簡便な検定方法等が提供可能となる。当該検定方法を用いれば、化学物質が有する雄性ホルモン系活性をより短期間で検定することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において検体とは、例えば、雄性ホルモン依存性器官を構成する細胞（ここで「細胞」とは、哺乳動物から採取された下記のような組織内に存在している状態にある細胞も含んでよい。）又はその内容物が含まれる可能性のある生体試料をあげることができ、具体的には例えば、被験哺乳動物から採取された前立腺腹葉、前立腺背側葉、精嚢、カウパー腺、陰茎亀頭、肛門挙筋、球海綿体筋等の組織或いはこれら組織から分離された細胞又はその培養細胞等を挙げることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。検体を提供する哺乳動物としては、例えば、ラット、マウス等のげっ歯類動物等を挙げることができる。好ましくは、３週齢（生後３週間経過した個体）以上のげっ歯類動物が挙げられる。
【０００９】
本発明において発現レベルが測定される遺伝子は、以下の登録番号群１又は２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログ（以下、一括して本遺伝子と記すこともある。）から選ばれる１以上の遺伝子である。
【００１０】
＜登録番号群１＞
(a)M33648（配列番号１で示される塩基配列）
(b)AI009405（配列番号２で示される塩基配列）
(c)AI014135（配列番号３で示される塩基配列）
(d)AI639037（配列番号４で示される塩基配列）
(e)AI639128（配列番号５で示される塩基配列）
(f)U75411（配列番号６で示される塩基配列）
【００１１】
＜登録番号群２＞
(g)AF007758（配列番号７で示される塩基配列）
(h)AA859661（配列番号８で示される塩基配列）
(i)S73007（配列番号９で示される塩基配列）
【００１２】
Genbankに登録されている塩基配列に関する情報は、例えば、National Center for Biotechnology Information のWEBペ−ジ（URL；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から、Genbankによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号 (Accession No.)をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、GenBnak、DDBL及びEMBLの各デ−タバンクが公開しているデ−タ全てを誰でも制限なしで利用でき、INSDに登録されたデ−タは科学資料として永久に保存され公開されることは、上記３デ−タバンクで構成される国際塩基配列デ−タベ−ス（international Nucleotide Sequence Databases, INSD）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「DDBL/EMBL/GenBnakの登録デ−タの取り扱い」（2002年5月23−24日）で明文化されており、如何なる当業者であっても登録番号 (Accession No.)に基づきデ−タの照合、検索、入手等は可能である。
本発明において利用される本遺伝子には、上記の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【００１３】
本遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、当該遺伝子の転写物であるmRNA量を測定する。特定の遺伝子のmRNA量の測定は、具体的には、例えば、定量的リアルタイム−ポリメラ−ゼチェイン反応（以下、定量的RT−PCRと記す。）、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法［J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラ−・クロ−ニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コ−ルドスプリング・ハ−バ−・ラボラトリ−（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年］、DNAアレイ法、インサイチュ−ハイブリダイゼ−ション法等により実施することができる。
また、本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ−等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【００１４】
本遺伝子の転写物量の測定方法についてさらに説明する。
本遺伝子の転写物であるmRNA量は、例えば、本遺伝子の塩基配列に基づいて設計、調製されたプロ−ブ又はプライマ−を使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法、定量的RT−PCR、DNAアレイ法、インサイチュ−ハイブリダイゼ−ション法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著；モレキュラ−・クロ−ニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コ−ルドスプリング・ハ−バ−・ラボラトリ−（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、組織における発現レベルが恒常的に一定であることが知られている遺伝子（以下、対照遺伝子と記す。）、例えば、β−actin遺伝子（Nucl.Acids.Res., vol.12,No.3, p.1687,1984）や36B4（Acidic Ribosomal Phosphoprotein）（Nucl.Acids.Res., vol.19,No.14, p.3998,1991）遺伝子等のmRNA量を同時に測定しても良い。そして、対照遺伝子のmRNA量若しくはその指標値当たりの本遺伝子のmRNA量又はその指標値を算出することにより、本遺伝子の発現レベルを求めてもよい。
【００１５】
（１．ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）
まず、mRNA量を測定しようとする遺伝子のDNAを調製し、次いで、その全部又は一部からなるDNAを標識してプロ−ブを調製する。
上記遺伝子は、市販のcDNA（例えば宝酒造から入手）又は以下に示した方法により調製したｃDNAを鋳型にしてPCR等によって調製することができる。例えば、まず当該遺伝子を発現する組織から、塩酸グアニジン／フェノ−ル法、SDS−フェノ−ル法、グアニジンチオシアネ−ト／CsCl法等の通常の方法によって全RNAを抽出する。例えばISOGEN（ニッポンジ−ン製）等の市販のキットを利用して全RNAを抽出してもよい。
抽出された全RNAから、例えば、以下のようにしてmRNAを調製する。まず、オリゴdTをリガンドとして有するポリAカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全RNAをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに5倍カラム容量のWashing buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］で洗浄する。続いて、3倍カラム容量のelution buffer［10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、1mM EDTA、0.05％(w/v)SDS）でmRNAを溶出させることによってmRNAを得る。
次いで、オリゴdTプライマ−を前記全RNA又はmRNAのポリＡ鎖にアニ−ルさせ、例えばcDNA合成キット（宝酒造）のプロトコ−ルに従って、一本鎖cDNAを合成する。この時、鋳型とするRNAは、全RNA又はmRNAのどちらでも良いが、mRNAを用いる方がより好ましい。
前記一本鎖cDNAを鋳型にして、TaKaRa taq（宝酒造）等のDNA polymeraseを用いてPCRすることにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するプライマ−の配列等により異なるが、例えば、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM NTP存在下で、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件等を挙げることができる。
【００１６】
このようにして増幅された本遺伝子のDNAはpUC118等のベクタ−に挿入してクロ−ニングしておいてもよい。当該DNAの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560,1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F.&A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975 、Sanger,F,& Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463,1977等に記載される）等により確認することができる。
【００１７】
このようにして調製された本遺伝子のDNAの全部又はその一部を、次のようにして放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプロ−ブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたDNAを鋳型とし、当該DNAの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ−に用いて、[α−32P]dCTP又は[α−32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してPCRを行うことにより32Pで標識されたプロ−ブが得られる。また、上記のようにして調製されたDNAを、例えば、Random prime labeling Kit（ベ−リンガ−マンハイム社）、MEGALABEL（宝酒造）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００１８】
次に、上記プロ−ブを使用して、ノ−ザンハイブリダイゼ−ション分析を行う。具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から全RNA又はmRNAを調製する。調製された全RNA 20μg又はｍRNA 2μgをアガロ−スゲルで分離し、10×SSC（1.5Ｍ NaCl、0.35Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブラン［例えば、Hybond−N（アマシャム製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼ−ションバッファ−〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコ−ル400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％BSA］、0.1％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベ−トした後、ハイブリダイゼ−ションバッファ−を捨て、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼ−ションバッファ−を加える。更に上記方法で得られたプロ−ブを加え、50℃、一晩インキュベ−トする。ハイブリダイゼ−ションバッファ−としては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベ−リンガ−マンハイム社)等を用いることができる。メンブランを取り出して、50〜100mlの2×SSC、0.1％ SDS中で室温、15分間インキュベ−トし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベ−トする。メンブラン上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写産物であるmRNAの量を測定することができる。
【００１９】
（２．定量的RT−PCR）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに例えばMMLV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DTT］中、0.5mM dNTP及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜1時間反応させ、対応するcDNAを調製する。cDNA合成キット（宝酒造）を用いて対応するcDNAを調製しても良い。調製されたcDNAを鋳型にして、本遺伝子の塩基配列の一部分を有するDNAをプライマ−としてPCRを行う。プライマ−としては、例えば、Genbankに登録番号M33648で登録されている塩基配列を有する本遺伝子の部分塩基配列を有するプライマ−を挙げることができる。PCRの条件としては、例えば、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、2.5mM dNTP及び［α32P］−dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたDNAの放射活性量を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。或いはまた、例えば、TAKARA taq（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50mM KCl，1.5mM MgCl2］中、SYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，１分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの蛍光を測定することにより、本遺伝子のmRNAの量を測定することができる。
【００２０】
（３．DNAアレイ解析）
本発明の転写物量の測定には、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルタ−等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本遺伝子の塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常18〜25merの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプロ−ブアレイ等、公知の技術に基づいたDNAアレイを利用することができる。これらのアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコ−ル  実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またAffymetrix社等から市販されているGenechip等を利用することもできる。
【００２１】
以下、DNAアレイを用いて本遺伝子の転写物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１．マクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mMdNTP、［α32P］−dCTP、及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させて、標識DNAを調製し、これをプロ−ブとする。このとき、cDNA合成キット（宝酒造）等を用いても良い。メンブランフィルタ−に本遺伝子のcDNAをスポットして作製されたマクロアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼ−ションバッファ−〔6×SSC（0.9Ｍ NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコ−ル400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1％ BSA］、0.1％(w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25mlを加えて、50℃、2時間インキュベ−トした後、ハイブリダイゼ−ションバッファ−を除去し、新たに2ml〜6mlのハイブリダイゼ−ションバッファ−を添加する。更に上記プロ−ブを加え、50℃、一晩インキュベ−トする。ハイブリダイゼ−ションバッファ−としては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベ−リンガ−マンハイム社)等を用いることもできる。マクロアレイを取り出して、50ml〜100mlの2×SSC、0.1％ SDSに浸し室温にて15分間程度インキュベ−トした後、さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50ml〜100mlの0.1×SSC、0.1％ SDS中で68℃、30分間インキュベ−トする。マクロアレイ上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２２】
（３−２．マイクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えばMMLV（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl、及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM dNTP、Cy3−dUTP、（又はCy5−dUTP）及び25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分間〜１時間反応させる。アルカリバッファ−（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、MicroconYM−30等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより蛍光標識DNAを調製し、これをプロ−ブとする。得られたプロ−ブを用いてマイクロアレイに対して（３−１  DNAマクロアレイによる定量）に記載された方法と同様にしてハイブリダイゼ−ションを行う。アレイ上のシグナル量をスキャナ−により測定することによって、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２３】
（３−３．プロ−ブアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載された方法と同様の方法でmRNAを調製する。調製されたmRNAに、例えば、cDNA合成キット（GENSET社）等を用いてcDNAを調製する。調製されたcDNAを、例えば、ビオチンラベル化cRNA合成キット（In Vitro Transcription社）（Enzo社）等によりビオチン標識し、cRNA cleanup and quantitation キット（In Vitro Transcription社）により精製する。生成されたビオチン標識DNAをFragmentation バッファ−（200mMトリス酢酸（pH8.1）、500mM KOAc、150mM MgOAc）により断片化する。これに内部標準物質Contol Oligo B2 （Amersham社製）、100×Control cRNA Cocktail、Herring sperm DNA （Promega社製）、Acetylated BSA（Gibco−BRL社製）、2×MES Hybridization Buffer〔200mM MES、2M [Na＋], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7〕及びDEPC処理滅菌蒸留水を加え、ハイブリカクテルを作製する。
1×MESハイブリダイゼ−ションバッファ−で満たしたプロ−ブアレイ［例えば、Genechip（Affymetrix社製）等］を、ハイブリオ−ブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼ−ションバッファ−を除去する。その後、該プロ−ブアレイに上記のハイブリカクテル200μlを添加し、ハイブリオ−ブン内で45℃、60rpm、16時間回転させる（ハイブリダイゼ−ション）。続いてハイブリカクテルを除去し、Non−Stringent Wash Buffer〔6×SSPE［20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈］、0.01％ Tween20、及び0.005％ Antifoam0−30(Sigma社)を含む〕で満たした後、GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に上記プロ−ブアレイを装着し、プロトコ−ルに従って洗浄する。次いで、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコ−ルEuKGE−WS2に従って該プロ−ブアレイを染色する。HP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)により570nmの蛍光輝度を測定することにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００２４】
（４．インサイチュ−ハイブリダイゼ−ション法）
基本的には１）組織の固定、包埋、及び切片の作製、２）プロ−ブの調製、３）ハイブリダイゼ−ションによる検出からなり、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプロ−ブとすること以外は、例えば、Heiles,H.et al., Biotechniques,6,978,1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック,羊土社,214,1992、細胞工学ハンドブック,羊土社,222,1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
RNAプロ−ブを調製する場合には、まず、例えば前記（１  ノ−ザンハイブリダイゼ−ション法）に記載した方法と同様にして本遺伝子のDNAを取得し、当該DNAをSP6、T7、T3RNAポリメラ−ゼプロモ−タ−をもったベクタ−（例えばStratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等）に組み込んで大腸菌に導入し、プラスミドDNAを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロ−ル用）、アンチセンス（ハイブリダイゼ−ション用）RNAができるようにプラスミドDNAを制限酵素で切断する。これらDNAを鋳型とし、放射性標識の場合はα−35S−UTP等、非放射性標識の場合にはディゴキシゲニンUTP又はフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3RNAポリメラ−ゼを用いてRNAを合成しながら標識し、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼ−ションに適したサイズに切断することによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたRNAを調製する。なお、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはRNAラベリングキット（アマシャム社）が、非放射性標識用にはDIG RNAラベリングキット（ベ−リンガ−・マンハイム社）やRNAカラ−キット（アマシャム社）が市販されている。
また、DNAプロ−ブを調製する場合には、例えば、32Ｐ等で標識した放射性ヌクレオチド又はビオチン、ディゴキシゲニン若しくはフルオレセインで標識したヌクレオチドを、ニックトランスレ−ション法(J.Mol.Biol.,113,237,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,10,6−10,12,Cold Spring Harbor Lab.)又はランダムプライム法(Anal.Biochem., 132,6,Anal.Biochem.,137,266)によって取り込ませることによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたDNAを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレ−ションキット（アマシャム社）やRandom Prime Labeling Kit（ベ−リンガ−マンハイム社）が、非放射性標識用にはDIG DNA標識キット（ベ−リンガ−マンハイム社）、DNAカラ−キット（アマシャム社）等が市販されている。
具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製しスライドグラスに張り付ける。又は、上記の組織又は細胞をOCTコンパウンドに包埋後、液体窒素又は液体窒素で冷却したイソペンタン中にて凍結させ、その薄切切片を作製し、スライドグラスに張り付ける。このようにしてスライド標本を得る。
次に、上記の組織又は細胞中にあって使用されるプロ−ブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナ−ゼＫ処理し、アセチル化する。次いで、該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを行う。例えば、上記のプロ−ブを90℃で3分間加熱した後ハイブリダイゼ−ション溶液で希釈し、該溶液を前処理の終了したスライドグラス切片上に滴下してフィルムでおおい、モイスチャ−チャンバ−中で45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼ−ションの後、非特異的吸着又は未反応プロ−ブを洗浄等（RNAプロ−ブを用いた場合はRNase処理も加える）により除去する。転写物量は、例えば、スライドグラス切片上の標識量を測定すること、或いは薄切切片中のラジオアイソト−プ若しくは蛍光活性を示す部分の面積若しくは細胞数をカウントすることにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量又はそれに相当する値を測定することができる。
【００２５】
本発明検出方法においては、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の検体における発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、登録番号群１又は２に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログを複数選んでもよい。
【００２６】
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量又は翻訳産物量を測定する方法を好ましく挙げることができる。
【００２７】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する。
【００２８】
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルの値を挙げることができる。かかる対照値は、化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における本遺伝子の発現レベルを、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。また、雄性ホルモン系活性を有する公知の化学物質又は雄性ホルモン系活性を有しない公知の化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における本遺伝子の発現レベルを測定して求めてもよい。
例えば、化学物質に予め接触していない哺乳動物由来の検体における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における、登録番号群１又は登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログの発現レベルの測定値が対照値と有意に異なれば、当該化学物質は雄性ホルモン系活性を有すると評価することができる。
【００２９】
より具体的には例えば、雄性ホルモン系活性が雄性ホルモン活性である場合には、対照哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における本遺伝子又はそのオ−ソログの発現レベルの値を対照値として、被験哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、化学物質に雄性ホルモン活性があると検定することができる。また、被験哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における登録番号群２に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高ければ、化学物質に雄性ホルモン活性があると検定することができる。
【００３０】
一方、雄性ホルモン系活性が抗雄性ホルモン活性である場合には、対照哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における本遺伝子又はそのオ−ソログの発現レベルの値を対照値として、被験哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高ければ、化学物質に抗雄性ホルモン活性があると検定することができる。また、被験哺乳動物由来の前立腺組織等の検体における登録番号群２に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも低ければ、化学物質に抗雄性ホルモン活性があると検定することができる。
【００３１】
本発明検定方法においては、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体が用いられるが、このような検体は、本発明検定方法の第一工程の前工程として、
（Ａ）精巣が摘出された哺乳動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等なレベルに回復するまで飼育する第Ａ工程、
（Ｂ）第Ａ工程により飼育された哺乳動物に対して化学物質を投与する第Ｂ工程、及び
（Ｃ）第Ｂ工程後、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体を得るために、化学物質が投与された哺乳動物から、当該哺乳動物由来の検体を単離する第Ｃ工程、
を追加的に有する方法により調製すればよい。
【００３２】
前工程（Ａ）に関して、精巣が摘出された哺乳動物は、例えば、以下のように調製すればよい。
まずエーテル等の適切な麻酔薬を用いて被験哺乳動物に麻酔をかける。腹部を上にして当該被験動物を手術台に置き、陰嚢及びその周辺をアルコール綿等で消毒する。陰嚢の皮膚を６mm程度切開し、その下の筋膜を切開する。さらに精巣の周りの精巣鞘膜を切開し精巣をピンセットでつまみ出す。輸精管や精巣血管をそれらに付着している脂肪体と一緒に縫合糸で結紮し、精巣のみ又は精巣と精巣上体とを一緒に摘出する。対側の精巣も同様に摘出する。筋膜と皮膚とを合わせて縫合糸又は縫合器で縫合する。傷口をヨードチンキ等で消毒する。
このような手順により精巣の摘出を行うとよい。
次いで、精巣が摘出された哺乳動物を、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等なレベルに回復するまで飼育するには、例えば、以下のように行えばよい。
まず、天秤を用いて毎日１回体重を被験哺乳動物の個体別に測定し、前日からの差を体重増加量とする。摂餌量については、餌を入れた給餌器の重量を天秤で測定した後、当該餌を当該哺乳動物に与え、２日後に残餌の重量を給餌器込みで測定し、両者の差を仮摂餌量とする。ケージ当たりの実験動物数及び測定期間（２日）で補正し、１日１匹当たりの摂餌量を算出する。このようにして、精巣摘出後の体重増加量及び摂餌量が精巣摘出前の体重増加量及び摂餌量と同等程度（例えば、約95から105％程度）にまで回復するまで飼育する。通常、約１〜２週間の飼育期間を設置するとよい。
【００３３】
前工程（Ｂ）に関して、哺乳動物に対して化学物質を投与する方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
このようにして、被験哺乳動物から採取された前立腺腹葉、前立腺背側葉、精嚢、カウパー腺、陰茎亀頭、肛門挙筋、球海綿体筋等の組織或いはこれら組織から分離された細胞又はその培養細胞と、化学物質とを間接的な手段によって接触させることができる。
【００３４】
より具体的には例えば、第Ａ工程により飼育された哺乳動物に対して化学物質を投与するには、以下のように行えばよい。
前記被験哺乳動物に対して化学物質を、例えば、３日間以上、少なくとも１日１回以上、経口投与、皮下投与又は吸入投与する。
【００３５】
当該工程における化学物質の経口投与は、例えば、以下の手順で行えばよい。
まず、投与液の作製に関して、化学物質を必要量秤量し、これをそのまま投与液とする。必要に応じて適当な溶媒（コーンオイルや約0.25〜0.5％のメチルセルロース溶液等）を用いて溶液又は均一な懸濁液を作製する。経口投与は注射筒及び弾性カテーテル等を用いて１匹当たり約5〜10mL/kg/dayの液量で少なくとも１日１回以上経口投与する。これを３日間以上継続して行う。
【００３６】
当該工程における化学物質の皮下投与は、例えば、以下の手順で行えばよい。まず、投与液の作製に関して、化学物質を必要量秤量し、これをそのまま投与液とする。必要に応じて適当な溶媒（コーンオイルや約0.25〜0.5％のメチルセルロース溶液等）を用いて溶液又は均一な懸濁液を作製する。皮下投与は注射筒及び注射針等を用いて、１匹当たり約0.5〜１mL/kg/dayの液量で少なくとも１日１回以上皮下投与する。これを３日間以上継続して行う。
【００３７】
当該工程における化学物質の吸入投与は、例えば、以下の手順で行えばよい。まず、投与液の作製に関して、化学物質を必要量秤量し、これをそのまま投与液とする。必要に応じて適当な溶媒（コーンオイルやアセトン等）を用いて作製した溶液を噴霧装置に装着する。吸入投与は適当な曝露チャンバーを用いて、実験動物の自発呼吸により吸引させることにより行う。少なくとも、１日１回以上、１回当たり連続約４時間以上吸入投与する。これを３日間以上継続して行う。
【００３８】
尚、上記の方法において、（１）精巣が摘出された後、テストステロン等の雄性ホルモンが投与されていない哺乳動物を利用する場合には、化学物質が有する雄性ホルモン活性（具体的には例えば、雄性ホルモン受容体を介する情報伝達系への刺激作用又は雄性ホルモンの分解阻害作用等に相当する活性）を評価する場合に用いられる。一方、（２）精巣が摘出された後、テストステロン等の雄性ホルモンが投与された哺乳動物を利用する場合には、化学物質が有する抗雄性ホルモン活性（具体的には例えば、雄性ホルモン受容体を介する情報伝達系への阻害作用又は雄性ホルモンの分解促進作用等に相当する活性）を評価する場合に用いられる。
ここで「雄性ホルモン」としては、例えば、テストステロン、テストステロンプロピオネート、メチルテストステロン、テストステロンβ−シクロペンチルプロピオネート、テストステロンエナントエート等のテストステロンエステル、視床下部又は下垂体に働いて性腺刺激ホルモンの分泌を抑制する作用を有するテストステロン様化合物等を挙げることができる。
後者（２）の場合において、化学物質の投与と同時に雄性ホルモンを約0.1〜１mg/kg/dayの割合で体重値を補正した投与量を少なくとも１日１回以上皮下投与するには、まず、雄性ホルモンを必要量秤量する。次に、秤量された雄性ホルモンを適当な溶媒（コーンオイルが望ましい。）を用いて溶解した後、これを１匹当たり約0.5〜１mL/kg/dayの液量で、肩甲部に少なくとも１日１回以上皮下投与する。
尚、投与液の逆流を防ぐため、化学物質の投与を先に実施し、その後、すみやかに（例えば20分以内）に雄性ホルモンを投与するのが望ましい。
【００３９】
前工程（Ｃ）に関して、第Ｂ工程後、化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体を得るために、化学物質が投与された哺乳動物から、当該哺乳動物由来の検体を単離するには、当該分野における通常の方法により行えばよい。
【００４０】
より具体的には例えば、まず、最終投与（前工程（Ｂ））の翌日、被験哺乳動物をエーテル等の適切な麻酔薬により麻酔する。次に、麻酔された被験哺乳動物の腹大動脈から採血し致死させた後、当該哺乳動物から前立腺（腹葉又は背側葉）を摘出する。摘出された前立腺について、紙ウエス等により水分を吸収させた後、定法に準じて天秤用いて前立腺の湿重量を測定するとよい。
尚、次の工程に即座に着手できない場合には、重量測定後、前立腺をDNAレーター中にて保存するか、又は、例えば、液体窒素等を用いて前立腺を即座に凍結し、−80℃で保存すればよい。
【００４１】
次に、上記のようにして化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、同一の登録番号群に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオ−ソログを複数選んでもよい。
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量を測定する方法を好ましく挙げることができる。
【００４２】
上記のようにして化学物質に予め接触させられた哺乳動物由来の検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における化学物質が有する雄性ホルモン系活性の有無或いはその発生程度を評価する。
【００４３】
さらに、上記のような本発明検定方法は、雄性ホルモン系活性を有する化学物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明検定方法により評価された雄性ホルモン系活性の有無又はその量に基づき雄性ホルモン系活性を有する化学物質を選抜することによって、雄性ホルモン系活性を有する化学物質を探索することができる。勿論、本発明検定方法は内分泌攪乱作用を有する化学物質の検出等にも応用することもできる。
選抜された雄性ホルモン系活性を有する化学物質若しくはその薬学的に許容される塩は、雄性ホルモン系薬剤の有効成分として用いることができる。当該有効成分を薬学的に許容される担体中に製剤化することにより、雄性ホルモン系薬剤を製造することができる。
尚、選抜された抗雄性ホルモン活性を有する化学物質は、例えば、前立腺癌等の抗がん剤としても利用することも期待される。
【００４４】
上記の雄性ホルモン系活性を有する化学物質は、当該化学物質の薬学的に許容される塩（例えば、酸付加塩又は塩基付加塩）の形で雄性ホルモン系薬剤の有効成分として利用してもよい。酸付加塩としては、例えば、無機酸付加塩又は有機酸付加塩が挙げられ、無機酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸塩等が挙げられ、有機酸付加塩としては、例えば、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩等が挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、無機塩基付加塩又は有機塩基付加塩が挙げられ、無機塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられ、有機塩基付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸付加塩等が挙げられる。かかる塩は公知の手段によって製造することができる。
また、上記の雄性ホルモン系活性を有する化学物質は、当該化学物質の薬学的に許容される塩の水和物等の溶媒和物の形で雄性ホルモン系薬剤の有効成分として利用してもよい。
【００４５】
当該雄性ホルモン系薬剤の投与は、通常の投与経路、例えば経口、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、鼻孔内等により行うことができる。投与量及び投与回数は投与経路、症状の程度、年齢、体重等によって異なるが、通常は成人１日当たり約１ｍｇ乃至１ｇを１日１回又はそれ以上の回数で投与される。投与剤形としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、座剤、注射剤、経鼻剤等が挙げられる。製剤化の際は、通常の製剤担体を用い、常法により製造することができる。即ち、経口用製剤を調製する場合には、必要に応じて結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤等を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、必要に応じてｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により注射剤とすることもできる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
実施例１  （被験哺乳動物の準備及び精巣摘出）
５週齢のCrj:CD(SD)IGS雄ラット（日本チャールス・リバーから購入）を、１週間の検疫期間の後、６週齢で精巣を摘出する手術に供した。エーテル麻酔下、80％エタノール水溶液で下腹部を消毒した後、陰嚢切開式にて精巣摘出を実施した。即ち、陰嚢の皮膚を６mm程度切開し、その下の筋膜を切開した。さらに精巣の周りの精巣鞘膜を切開し精巣をピンセットでつまみ出し、輸精管及び精巣血管をそれらに付着している脂肪体と一緒に縫合糸で結紮した後、精巣と精巣上体とを一緒に摘出した。対側の精巣も同様に摘出した。筋膜と皮膚とを合わせて縫合器で縫合した後、傷口にヨードチンキを塗布することによって術後消毒を行った。手術後の雄ラットは１週間の飼育期間をおき投与に供した。
【００４８】
実施例２  （テストステロンプロピオネートの投与）
実施例１により回復するまでに飼育された雄ラットに、リファレンスケミカルとして、雄性ホルモン活性を有するテストステロンプロピオネート（以下、TPと記すこともある。）を0.2mg/kg/dayの投与量で、かつ0.5mL/mg/dayの液量で、１日１回４日間（４日投与群）または10日間（10日投与群）肩甲部に注射により皮下投与した。投与液は、いずれも溶媒としてコーンオイルを用いた。TPの投与は、注射筒及び針を用いて投与し、化学物質の投与の後、20分間以内に投与した。
【００４９】
実施例３  （化学物質の投与）
実施例２によりTPが投与された雄ラットに、化学物質として、抗雄性ホルモン活性を有することが知られている1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene  （以下、p,p’-DDEと記すこともある。）又はフルタマイドを投与した。また他の化学物質として抗雄性ホルモン活性を有さないことが知られているベノミルを投与した。p,p’-DDEは100 mg/kg/day、フルタマイドは10mg/kg/day、ベノミルは1000mg/kg/dayの投与量で１日１回４日間又は10日間反復強制経口投与した。投与液は、いずれも溶媒としてコーンオイルを用いた。化学物質の投与は、注射筒及び弾性カテーテルを用いた。尚、各化学物質は、４日投与群及び10日投与群について、各４匹の雄ラットに投与した。即ち、化学物質当たり、８匹の雄ラットに投与した。
尚、対照哺乳動物として、化学物質を含む投与液の代わりに、化学物質を含まない投与液（コーンオイルのみ）を、被験哺乳動物と同様にして投与した。
【００５０】
実施例４  （前立腺の摘出及び重量測定）
最終投与の翌日、被験哺乳動物及び対照哺乳動物をCO2にて安楽死させた。致死させた哺乳動物から前立腺を摘出した。すみやかに天秤を用いて湿重量を測定した。その結果、抗雄性ホルモン活性を有するフルタマイド又はp,p’−DDEが投与された哺乳動物の前立腺重量、並びに抗雄性ホルモン活性を有さないベノミルが投与された哺乳動物の前立腺重量は、対照哺乳動物の前立腺重量に比べて低い値を示した（図１参照）。尚、重量測定後、前立腺をRNA later中に入れ、その後24時間（室温）浸漬させたのち、-20℃で保存した。
【００５１】
実施例５  （本遺伝子の発現レベルの測定）
（１）total RNAの調製
実施例４で保存した被験哺乳動物及び対照哺乳動物の前立腺組織について、それぞれ４匹分を合わせ、それぞれ湿重量1gに対して10mlのTRIZOL Reagent(Gibco-BRL社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置した。次いで、４℃、9,000rpm、１０分間遠心分離した後、水層を50ml遠心チューブ（IWAKI社製）に回収した。TRIZOL Reagentの1/5容量のクロロホルム（関東化学社製）を添加し、15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置した。次いで、4℃、9,000rpm、10分間遠心分離した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収した。更に、TRIZOL Reagentの1/2容量の2-プロパノール（関東化学社製）を添加して、転倒混和後、室温で10分間静置した。4℃、9,000rpm、10分間遠心分離後、上清を除去しペレットを得た。得られたペレットを、TRIZOL Reagentの1/10容量のDEPC処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解した。得られるRNA溶液0.1mlにRNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)添付のRLT buffer (10μL β−メルカプトエタノール/mL RLT buffer)350μLを添加し、混和した。更に、250μL エタノール(関東化学社製)を添加し、混和した。当該混和液をRNeasy Mini Kit添付のRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈したRNeasy Mini Kit添付のRPE bufferを500μLアプライし、室温、10,000rpm、15秒間遠心分離した。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで希釈したRPE bufferを500μLアプライし、室温、14,000rpm、2分間遠心分離した。その後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Mini Kit添付の蒸留水を50μL添加し、1分間室温で静置した。静置後、室温、10,000rpm、1分間遠心分離によって溶出し、total RNAを得た。
【００５２】
（２）cDNAの調製
上記（１）で前立腺組織から調製されたtotal RNA 10μg、T7-(dT)24プライマー(Amersham社製) 100pmolを含む11μLの混合液を、70℃、10分間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、SuperScript Choice System for cDNA Synthesis(Gibco-BRL社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μL、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μL及び当該キットに含まれる10mM dNTP Mix 1μLを添加し、42℃、2分間加熱した。更に、当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μL(400U)を添加し、42℃、1時間加熱後、氷上で冷却した。冷却後、DEPC処理滅菌蒸留水91μL、当該キットに含まれる5×Second Strand Reaction Buffer 30μL、10mM dNTP Mix 3μL、当該キットに含まれるE. coli DNA Ligase 1μL(10U)、当該キットに含まれるE. coli DNA Polymerase I 4μL(40U)及び当該キットに含まれるE. coli RNaseH 1μL(2U)を添加し、16℃、2時間反応させた。次いで、当該キットに含まれるT4 DNA Polymerase 2μL(10U)を加え、16℃、5分間反応させた後、0.5M EDTA 10μLを添加した。次いで、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）162μLを添加し、混合した。当該混合液を、予め室温、14,000rpm、30秒間遠心分離しておいたPhase Lock Gel Light(エッペンドルフ社製)に移し、室温、14,000rpm、2分間遠心分離後、145μLの水層をエッペンドルフチューブに移す。これに、7.5M酢酸アンモニウム溶液72.5μL、エタノール362.5μLを加え混合した後、4℃、14,000rpm、20分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、DNAペレットを得た。その後、DNAペレットに80%エタノール0.5mLを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離後、上清を捨てた。DNAペレットに再度80%エタノール0.5mLを添加し、4℃、14,000rpm、5分間遠心分離後、上清を捨てた後、当該ペレットを乾燥させ、DEPC処理滅菌蒸留水12μLに溶解し、ｃDNA溶液を得た。一方、正常組織から調製した total RNAについても、上記と同様の操作を行うことによりｃDNA溶液を調製した。
【００５３】
（３）ラベル化cRNAの調製
被験哺乳動物及び対照哺乳動物の前立腺組織由来のｃDNAを用いて、それぞれラベル化cRNAを調製した。即ち、上記（２）で得られたcDNA溶液5μL、DEPC処理滅菌蒸留水17μL、BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit(ENZO社製)に含まれる10×HY Reaction Buffer 4μL、当該キットに含まれる10×Biotin Labeled Ribonucleotides 4μL、当該キットに含まれる10×DTT 4μL、当該キットに含まれる10×RNase Inhibitor Mix 4μL及び当該キットに含まれる20×T7 RNA Polymerase 2μLを混合し、37℃、5時間反応させた。当該反応液にDEPC処理滅菌蒸留水60μLを加えたのち、上記（１）に記載された RNeasy Mini Kitを用いてラベル化cRNAの精製を行った。
【００５４】
（４）ラベル化cRNAのフラグメント化
精製されたラベル化cRNA 20μg、5×Fragmentation Buffer（200mMトリス−酢酸  pH8.1(Sigma社製)、 500mM酢酸カリウム(Sigma社製)及び150mM酢酸マグネシウム(Sigma社製)）8μLを含む反応液40μLを、94℃、35分間加熱後、氷冷し、フラグメント化cRNA溶液を得た。
【００５５】
（５）フラグメント化cRNAとプロ−ブアレイとのハイブリダイズ
被験哺乳動物及び対照哺乳動物の前立腺組織由来のフラグメント化cRNAを、以下のようにしてそれぞれプローブアレイとハイブリダイズさせた。即ち、上記（４）で得られたフラグメント化cRNA溶液 40μL、5nM Contol Oligo B2 （Amersham社製）4μL、100×Control cRNA Cocktail 4μL、Herring sperm DNA （Promega社製）40μg、Acetylated BSA（Gibco-BRL社製）200μg、2×MES Hybridization Buffer(200mM MES、2M [Na+], 40mM EDTA、0.02% Tween20 (Pierce社製)、pH6.5〜6.7) 200μL及びDEPC処理滅菌蒸留水144μLを混合し、400μLのハイブリカクテルを得た。得られたハイブリカクテルを99℃、5分間加熱、更に45℃、5分間加熱した。加熱後、室温、14,000rpm、5分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
1×MESハイブリダイゼーションバッファーで満たしたヒトゲノムU95プローブアレイ（Affymetrix社製）を、ハイブリオーブン内で、45℃、60rpm、10分間回転させた後、1×MESハイブリダイゼーションバッファーを除去した。その後、当該プローブアレイに当該ハイブリカクテル上清200μLを添加し、ハイブリオーブン内で45℃、60rpm、16時間回転させ、ハイブリダイズ済みプローブアレイを得た。
【００５６】
（６）プロ−ブアレイの染色
上記（５）で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイからハイブリカクテルを除去し、Non-Stringent Wash Buffer［6×SSPE(20×SSPE(ナカライテスク社製)を希釈)、0.01%Tween20を含む］で満たした。GeneChip Fluidics Station 400(Affymetrix社製)の所定の位置に前記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って前記プローブアレイを洗浄した後、MicroArray Suite(Affymetrix社)の染色プロトコールEuKGE-WS2に従って以下の方法により前記プローブアレイを染色した。まず１次染色液［10μg/mL Streptavidin Phycoerythrin (SAPE)(Molecular Probe社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl(Ambion社製)、0.05%Tween20を含む］に45分間浸漬した。次いで、2次染色液［100μg/mL Goat IgG (Sigma社製)、3μg/mL Biotinylated Anti-Streptavidinantibody (Vector Laboratories社製)、2mg/mL Acetylated BSA、100mM MES、1M NaCl、0.05%Tween20及び0.005%Antifoam0-30を含む］に10分間浸漬し、最後に１次染色液に45分間浸漬した。
【００５７】
（７）プロ−ブアレイのスキャン、解析
上記（６）で染色された被験哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイ及び対照哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイをそれぞれHP GeneArray Scanner(Affymetrix社製)に供し、シグナルを570ｎｍの蛍光輝度を測定することによって読み取た。得られた結果をGeneChip Microarray Suite(Affymetrix社製)によって比較解析し、対照哺乳動物と被験哺乳動物とで発現レベルが異なる遺伝子を抽出した。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子の場合には、４日投与群及び10日投与群のいずれにおいても、抗雄性ホルモン活性を有するフルタマイド投与哺乳動物又はp,p’−DDE投与哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルが、対照哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルを上回った。一方、抗雄性ホルモン活性を有さないベノミル投与哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルは対照哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルと同等であった（表１参照）。
＜登録番号群１＞
M33648、AI009405、AI014135、AI639037、AI639128、U75411
【００５８】
【表１】
2005318842.tif 000002
【００５９】
＊  表中の数値は、被験哺乳動物と対照哺乳動物の前立腺組織における本遺伝子の発現量の比を示した。網掛け部分は有意な高値を意味している。
【００６０】
一方、登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子の場合には、４日投与群及び10日投与群のいずれにおいても、抗雄性ホルモン活性を有するフルタマイド投与哺乳動物又はp,p’−DDE投与哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルが、対照哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルを下回った。一方、抗雄性ホルモン活性を有さないベノミル投与哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルは対照哺乳動物の前立腺組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルと同等であった（表２参照）。
＜登録番号群２＞
AF007758、AA859661、S73007
【００６１】
【表２】
2005318842.tif 000003
【００６２】
＊  表中の数値は、被験哺乳動物と対照哺乳動物との前立腺組織における本遺伝子の発現量の比を示した。網掛け部分は有意な低値を意味している。
【００６３】
実施例６  （本発明検定方法の優位性確認のための評価）
実施例４での前立腺の重量測定の結果、フルタマイド、p,p’−DDE及びベノミルを投与された哺乳動物の前立腺重量は、いずれも４投与群及び10日投与群ともに対照哺乳動物の前立腺重量に比べて低い値を示した（図１参照）。したがって、フルタマイド、p,p’−DDE及びベノミルはいずれも抗雄性ホルモン作用を有するかのように見かけ上判断された。しかしながら、フルタマイド及びp,p’−DDEは抗雄性ホルモン活性を有することが知られている一方、ベノミルは抗雄性ホルモン作用を有しないことが知られている。このような場合でも、実施例５に示すように、被験哺乳動物及び対照哺乳動物の前立腺組織において、登録番号群１又は登録番号群２に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルを測定し、比較することにより、抗雄性ホルモン活性を有するフルタマイド及びp,p’−DDEと、抗雄性ホルモン作用を有しないベノミルとを明確に区別して検定できることが確認された（表１及び表２参照）。
【００６４】
実施例７  （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた雄性ホルモン系活性検定方法）
（１）哺乳動物への化学物質の投与及び前立腺組織の採取
実施例１から実施例４までの操作と同様な操作にて前立腺組織を採取する。
【００６５】
（２）遺伝子の発現解析
化学物質投与群由来の前立腺組織及び基礎飼料のみの投与群（以下、基礎飼料投与群と記すこともある。）由来の前立腺組織のそれぞれから、実施例５（１）の操作と同様な操作によりtotal RNAを調製した後、実施例５（２）の操作と同様な操作により化学物質投与群由来の前立腺組織及び基礎飼料投与群由来の前立腺組織のそれぞれからcDNAを調製する。次に、調製されたcDNAを鋳型として、以下のようにしてPCRを行うことにより増幅されたDNAを定量する。即ち、当該cDNA 1μl、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマ−１ 20pmol、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマ−２ 20pmol及びSYBR Green PCR ReagentsPCR(ABI社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(ABI社)を用いて、50℃ 2分間次いで95℃ 10分間保温した後、95℃ 15秒次いで60℃ 1分間の保温を１サイクルとして、これを40サイクル実施する条件でPCRを行う。増幅されたDNAの量から、化学物質投与群由来の前立腺組織における本遺伝子の発現レベル及び基礎飼料投与群由来の前立腺組織における本遺伝子の発現レベルのそれぞれを求める。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルにおいて、化学物質投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織の発現レベルの測定値（即ち、対照値）の２分の１以下であれば、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して２倍以上であれば、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価する。一方、登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルにおいて、化学物質投与群の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織の発現レベルの測定値（即ち、対照値）の２分の１以下であれば、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して２倍以上であれば、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価する。
【００６６】
実施例８  （インサイチュ−ハイブリダイゼ−ションを用いた雄性ホルモン系活性検定方法）
（１）哺乳動物への化学物質の投与及び前立腺組織の採取
実施例１から実施例４までの操作と同様な操作にて前立腺組織を採取する。
【００６７】
（２）前立腺組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
採取された前立腺組織を、固定液（4％パラホルムアルデヒド＋0.5％グルタ−ルアルデヒド／0.075Mリン酸緩衝液、pH7.2〜7.4）中で4℃、一晩固定する。固定後、化学物質投与群由来の前立腺組織及び基礎飼料投与群由来の前立腺組織のそれぞれをアルコ−ル脱水し、パラフィンに包埋した後、これをミクロスライサ−を用いて2〜10μmの厚さで薄切し、次いでこれをスライドグラスに載せることにより、スライド標本を作製する。
【００６８】
（３）cDNAの調製
化学物質投与群由来の前立腺組織及び基礎飼料投与群由来の前立腺組織のそれぞれから、実施例５（１）の操作と同様な操作によりtotal RNAを1μg/μlになるように調製する。次に目的遺伝子（例えば、M33648）の約1kbpを選定し、選定された約１kbpの塩基配列を有するＤＮＡをPCRで増幅するためのプライマ−の合成を行う。プライマ−は、そのsense primerの5'末端にT3プロモ−タ−配列（aat taa ccc tca cta aag gga ac）を、antisense primerの5'末端にT7プロモ−タ−配列（gta ata cga ctc act ata ggg ag）を付加したものとする。合成は、遺伝子工学的手法にて用いられる通常の方法により行う。RT−PCRには、ThermoScript RT−PCR System (Gibco社)及びPLATIUM taq DNA Polymerase High fidelity (Gibco社)の各キットを用いる。まず、Antisenseのプライマ−20pmol、total RNA 1μl及び当該キット内のH20を混合した後、当該混合物を65℃、5分間保温し、その後、氷上で冷却する。次いで、5×DNA Synthesis Buffer 4μl、0.1M DTT 1μl、RNase OUT 1μl、滅菌水1μl、10mM dNTP Mix 2μl及びThermoScript RT 1μlを加え、得られた混合物を65℃で1時間保温した後、85℃で5分間加温し、ThermoScript RTを失活させる。得られた混合物を氷上で冷却した後、これに1μlのRNase H (Gibco社)を加え、得られた混合物を37℃で20分間反応させることによりcDNAを作製する。作製されたcDNA 5μlに、sense primer 20pmol、×10 High Fidelity PCR Buffer 5μl、50mM MgSO 2μl、10mM dNTPmix 1μl、PLATINUM taq DNA Polymerase Hight Fidelity 0.2μl及び滅菌水34.8μlを加え、得られた混合物を94℃で2分間加温した後、94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 1分間を１サイクルとして40サイクル実施し、最後に68℃で5分間反応を行う。このPCR反応液を1％アガロ−スゲル電気泳動に供し、目的PCR産物をゲルから切り出した後、等量のイソプロパノ−ルと混合し、当該キット内のカラムに供して、2分間遠心分離する。遠心後、カラムに新しいチュ−ブを繋ぎ、当該キット内のEB buffer 50μlをカラムに供して遠心分離することにより、目的PCR産物を得る。
【００６９】
（４）ラベル化cRNAの調製
実施例８（３）で調製されたcDNAを鋳型とし、T3 polymerase又はT7 polymeraseを用いてcRNAプロ−ブ（FITC標識）を合成する。具体的には、cDNA 0.2〜1μlに、×10 transcription buffer(DTT＋)（宝酒造）2μl、×10 FITC−laveling mix (ベ−リンガマンハイム) 2μl及びRNase inhibitor（ニッポンジ−ン）1μlを加え、さらにH2Oを加えて総量を18μlにする。当該混合物にsense probeを合成する場合には2μlのT3 polymerase(宝酒造) 、anti−sense probeを合成する場合には2μlのT7 polymerase(宝酒造)をそれぞれ加え、得られた混合物を37℃で3〜5時間保温する。次いで、当該混合物に1μlのRNase freeのDNase I（ベ−リンガマンハイム社）を加え、さらに20分間保温する。合成されたcRNAをエタノ−ル沈澱させ、得られたペレットを60℃に加温した100μLの 40mM NaHCO3, 60mM Na2CO3 (pH10.2)に溶解し、その後、アルカリ分解により約150bの断片になるように、次の計算式から得られた時間、60℃で保温する。加温時間(分) = (cDNA長(kb)−加水分解後の平均断片長(kb))/(0.11×cDNA長(kb)×加水分解後の平均断片長(kb))。反応後、当該混合物を氷上で冷却し、１μlの酢酸を加える。更に、当該混合物に10分の1量の4M LiClを添加し、15000rpmで10分間遠心分離する。上清を棄てた後、残ったペレットに500μlのエタノ−ルを加え洗浄した後、これにTE buffer 20μl、0.1M DTT 2μl、RNase inhibitor 1μlを加え溶解する。
【００７０】
（５）ハイブリダイゼ−ション
実施例８（２）で作製されたスライド標本を室温で脱パラフィンし、再水和する。次に、これに前処理として1×Target Retrieve Solution (DAKO)を加え、オ−トクレ−ブにより121℃で20分間加温する。60℃まで温度が下がった後、これを取り出し、室温に20分間放置することにより更に冷却する。冷却後、これを室温でDEPC処理滅菌水に2分×2回、3％過酸化水素水/DEPC処理滅菌水に30分間、DEPC処理滅菌水に2分×3回、90％エタノ−ル/DEPC処理滅菌水に3分間、100％エタノ−ルに3分間浸漬した後、風乾する。実施例８（４）で調製されたcRNAプロ−ブをhybridization buffer（組成：40％ホルムアミド(ニッポンジ−ン), 4×SCC (pH5.0)(Gibco), 1 mM EDTA, 1×Denhardet's(Nippon gene)，250μg/ml yeast tRNA (Gibco),125μg/ml サケ精子DNA (Gibco), 10％dextran sulfateで0.1〜0.3μg/ml/kbとなるように希釈し、これを切片上に滴下した後、EasiSeal（HYBAID社）を用いて封入する。封入されたスライドグラスを湿潤箱に並べ、60℃で5時間以上保温する。その後、当該スライドグラスを、65℃に保温された5×SSC (pH5.0)中に浸し、65℃に加温された洗浄液Ａ（組成：2×SSC［pH5.0］, 1％SDS）に30分間×2回浸漬し、室温の洗浄液Ｂ（組成：10 mM Tris−HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 0.1％ Tween 20）に5分間×3回浸漬した後、37℃に加温された洗浄液Ｂに20μg/ml RNase A (SIGMA)を加えたものに20分間浸漬する。その後、当該スライドグラスを65℃に加温された洗浄液Ｃ（組成：2×SSC［pH5.0］, 50％ ホルムアミド［和光］）で30分間×2回、室温のTBS buffer（組成：50 mM Tris−HCl ［pH7.5］, 150mM NaCl）で3分間×3回洗浄する。洗浄後、切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、組織周囲をPAP PEN（大道産業株式会社）で囲んだ後、FITC標識プロ−ブ検出キット（DAKO）に含まれるアルカリフォスファタ−ゼ標識抗FITC抗体を1％Bovine serum albumin/TBSで希釈したものを、切片上に滴下した後、これを湿潤箱中に37℃で60分間放置する。反応後、当該スライドグラスを室温のTBST（組成：TBS ＋ 0.1% Tween 20）に5分間×3回、室温のTBSに2〜3分浸漬する。切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、AP基質溶液（DAKO、BCIP/NBT発色基質溶液）を切片上に滴下した後、これを湿潤箱中に37℃で60分〜2日間放置する。反応後、当該スライドグラスを流水中で洗浄することにより、発色液を洗い流し、次いで透徹、封入する。
【００７１】
（６）遺伝子の発現解析
本遺伝子の転写物量は、化学物質投与群由来の前立腺組織の薄切切片及び基礎飼料投与群由来の前立腺組織の薄切切片のそれぞれにおける各蛍光活性を示す部分の面積又は細胞数をカウントすることにより、本遺伝子の転写物であるmRNAの量又はそれに相当する値を測定することができる。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログにおいて、化学物質投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値より有意な減少を示す場合には、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して有意な増加を示す場合には、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価する。登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログにおいて、化学物質投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値の２分の１以下であれば、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して２倍以上であれば、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価する。
【００７２】
実施例９  （免疫組織化学的検査を用いた雄性ホルモン系活性検定方法）
（１）哺乳動物への化学物質の投与及び前立腺組織の採取
実施例１から実施例４までの操作と同様な操作にて前立腺組織を採取する。
【００７３】
（２）前立腺組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
採取された前立腺組織から適度な大きさの組織片を切り出した後、これをOCTコンパウンドに包埋した後、液体窒素にて冷却されたイソペンタン中で凍結させる。当該凍結物を−20℃に冷却されたクリオスタット中で約5μmの厚さに薄切した後、これをスライドグラスに載せ、乾燥させる。
【００７４】
（３）薄切切片の免疫組織化学的染色
上記（２）で作製された薄切切片を70％エタノ−ルで1分間固定した後、当該切片をPBS buffer（組成：10 mM リン酸ナトリウム ［pH7.4］, 100mM NaCl）で洗浄することによりOCTコンパウンドを落とした後、これを0.3％過酸化水素水で5分間処理する。処理後、当該切片をPBS bufferで5分間×3回洗浄した後、これを正常血清で室温20分間処理する。次いで、当該切片をPBS bufferで適度に希釈された登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子の翻訳産物に対する抗体（以下、一次抗体）で室温60分間処理する。反応後、当該切片をPBS bufferで5分間×3回洗浄し、PBS bufferで適度に希釈された一次抗体と同じ免疫哺乳動物のVECTASTAIN/ABC試薬（フナコシ）で室温30分間処理する。更に、当該切片をPBS bufferで5分間×3回洗浄した後、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ）を用いて発色させる。その後、当該切片を蒸留水で洗浄した後、次いで、脱水、透徹、封入を行う。
【００７５】
（４）遺伝子翻訳産物の発現解析
画像解析装置IPAP（住化テクノサ−ビス（株））を用いて染色性の確認された前立腺細胞巣の面積又は細胞数を測定することにより、本遺伝子の翻訳産物に相当する値を測定することができる。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログにおいて、化学物質投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値より有意な減少を示す場合には、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して有意な増加を示す場合には、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価する。登録番号群２に示される登録番号のいずれかでGenbankに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログにおいて、化学物質投与群由来の前立腺組織における発現レベルの測定値が、基礎飼料投与群由来の前立腺組織の発現レベルの測定値の２分の１以下であれば、当該化学物質は抗雄性ホルモン活性を有すると評価し、これに対して２倍以上であれば、当該化学物質は雄性ホルモン活性を有すると評価する。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によって、特定の遺伝子の発現レベルを指標とした、化学物質が有する雄性ホルモン系活性の正確かつ簡便な検定方法等が提供可能となる。当該検定方法を用いれば、化学物質が有する雄性ホルモン系活性をより短期間で検定することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、実施例４において哺乳動物から摘出された前立腺の重量測定の結果を示す図である。図中の棒グラフは、各群とも左から右への順に「対照」、「ベノミル」、「p,p’−DDE」、「フルタマイド」の場合における前立腺重量を示している。また図中の*及び**は、標準偏差ｐ＜0.05及びｐ＜0.01を意味している。フルタマイド（抗雄性ホルモン活性有り）、p,p’−DDE（抗雄性ホルモン活性有り）及びベノミル（抗雄性ホルモン活性無し）を投与された哺乳動物の前立腺重量は、いずれも４投与群（図中の左群）及び10日投与群（図中の右群）ともに対照哺乳動物の前立腺重量に比べて低い値を示した。
【図１】
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【配列表】
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