(57)【要約】【課題】天然物由来成分でありながら、生体内においても十分にその効果を持続させることができ、また、化学療法剤の有する各種の問題点を全て解消し得る、さらに、連用しても副作用の恐れが無く、効果的で安全性の高い血栓溶解剤を提供することにある。【解決手段】本発明はシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）由来成分が、強力なプロウロキナーゼ活性化促進作用を有することを見いだし、これらを血栓溶解剤、プロウロキナーゼ活性化促進剤、経口用あるいは非経口用組成物、医薬または食品等に応用したものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうち1種以上を含有する血栓溶解剤。
【請求項２】
シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分を含有する請求項１に記載の血栓溶解剤。
【請求項３】
分画成分がシロキクラゲのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である請求項２に記載の血栓溶解剤。
【請求項４】
シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物の分画成分のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分。
【請求項５】
分画成分がシロキクラゲのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である請求項４に記載の分画成分。
【請求項６】
ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうち1種以上を含有する血栓溶解剤。
【請求項７】
ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分を含有する請求項６に記載の血栓溶解剤。
【請求項８】
分画成分がホンダワラのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である請求項７に記載の血栓溶解剤。
【請求項９】
下記一般式で表す化合物（１）を有効成分として含む血栓溶解剤。
【化１】
2005145949.tif 000006
【請求項１０】
ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物の分画成分のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分。
【請求項１１】
分画成分がホンダワラのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である請求項１０に記載の分画成分。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかの成分または剤を含有する経口用組成物。
【請求項１３】
請求項1〜１１のいずれかの成分または剤を含有する非経口用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかの成分または剤を有効成分とする医薬。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物を含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロウロキナーゼ活性化促進作用を有する血栓溶解剤に関する。特に、シロキクラゲまたはホンダワラに由来する成分を用いることにより、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療に有効な剤、分画成分、それらを含有する経口用あるいは非経口用組成物、医薬又は食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓は、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などをはじめとする種々の疾患の原因因子として大きな問題となっている。現在の死亡率は癌、脳卒中、心疾患が上位を占めているが、原因別にみると血栓の生成によるものが第１位である。
血栓は生体内における止血機構により生成され、血漿中の可溶性蛋白成分であるフィブリノーゲンが、トロンビンの作用により不溶性のフィブリン（線維素）に変化するものであり、この血栓は、フィブリンを溶解する機構が作動して血栓溶解（フィブリン溶解）が起こり、止血機構において調整された機能が営まれている。そして、病的状態において過大に形成された血栓に対しては、積極的にフィブリンを溶解する血栓溶解療法が行われ、その薬剤にはプラスミノーゲン・アクチベーター（ＰＡ）としてウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｕ−ＰＡと略す）と組織型プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）などがある。
血栓溶解において、それを分解する酵素であるプラスミンは通常は酵素原であるプラスミノーゲンとして血液中に存在している。プラスミノーゲンは上記ｕ−ＰＡまたはｔ−ＰＡなどの作用により活性化され、プラスミンとなりこのプラスミンが血栓を溶解する。このうち、ｕ−ＰＡの前駆物質はプロウロキナーゼ（以下、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡと略す）である（例えば、非特許文献１参照）。
従って、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを活性化することにより血栓を分解することができ、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療に有効であると考えられている。
【０００３】
現在、血栓症の治療には、主にウロキナーゼ（以下、ＵＫと略す）を用いる線溶療法が行われている。そして、ＵＫは、凍結乾燥したものを使用時に生理食塩水又はブドウ糖注射液などに溶解し、静脈注射又は点滴注射する方法によって投与されている。
しかしながら、ＵＫによる線溶療法は、１）注射によるため厳格な医師の管理下に行わなければならないと共に患者に苦痛を与える。２）パイロジェンによる副作用の発現。３）大量投与により生ずるプラスミノーゲンの枯渇あるいはアンチプラスミンの増加による一過性の血液凝固亢進、抗体の出現。４）大量の遊離型プラスミノーゲンが活性化されることによる出血などの種々の問題点がある。
【０００４】
一方、天然物由来成分として納豆菌培養エキス中に含まれるナットウキナーゼという酵素蛋白質がｐｒｏ−ｕ−ＰＡを活性化することにより血栓を溶解することが知られている。しかし、このような酵素蛋白質は ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては有効性を示すが、生体内においては胃酸などにより変性を受け、実際に効果を示すとは考えにくい（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】「原書17版 医科生理学展望」、丸善株式会社、１９９６年、ｐ５３５
【非特許文献２】納豆と血液、［平成１５年８月１４日検索］、インターネット＜URL：http://finedays.org/natto/blood.html＞
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、上記従来の問題点を解決した血栓溶解剤等を提供することにある。すなわち、天然物由来成分でありながら、生体内においても十分にその効果を持続させることが期待でき、かつ、化学療法剤の有する各種の問題点を全て解消し得る、さらに、連用しても副作用の恐れが無く、効果的で安全性の高い血栓溶解剤、分画成分、これらを含有する経口用あるいは非経口用組成物、医薬、又は食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、シロキクラゲ科シロキクラゲ属であるシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及び褐藻綱 (Phaeophyceae)であるホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）が強いプロウロキナーゼ活性化促進作用を有することを見出し、さらにまた本作用を有する化合物を単離し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、（１）シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうち1種以上を含有する血栓溶解剤。
（２）シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分を含有する上記（１）に記載の血栓溶解剤。
（３）分画成分がシロキクラゲのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である上記（２）に記載の血栓溶解剤。
（４）シロキクラゲ、シロキクラゲの乾燥体、シロキクラゲより得られる搾汁、シロキクラゲまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物の分画成分のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分。
（５）分画成分がシロキクラゲのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である上記（４）に記載の分画成分。
（６）ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうち1種以上を含有する血栓溶解剤。
（７）ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分を含有する上記（６）に記載の血栓溶解剤。
（８）分画成分がホンダワラのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である上記（７）に記載の血栓溶解剤。
（９）下記一般式で表す化合物（１）を有効成分として含む血栓溶解剤。
【化２】
2005145949.tif 000002
（１０）ホンダワラ、ホンダワラの乾燥体、ホンダワラより得られる搾汁、ホンダワラまたは乾燥体の水抽出物または有機溶媒抽出物の分画成分のうちプロウロキナーゼ活性を有する分画成分。
（１１）分画成分がホンダワラのアルコール抽出物を遠心分離して得られる沈殿部分である上記（１０）に記載の分画成分。
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかの成分または剤を含有する経口用組成物。
（１３）上記（1）〜（１１）のいずれかの成分または剤を含有する非経口用組成物。
（１４）上記（１）〜（１１）のいずれかの成分または剤を有効成分とする医薬。
（１５）上記（１２）に記載の組成物を含有する食品。
【発明の効果】
【０００７】
本発明はシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）由来成分が、強力なプロウロキナーゼ活性化促進作用を有することを見出し、これらを血栓溶解剤、プロウロキナーゼ活性化促進剤、経口用あるいは非経口用組成物、医薬または食品等に応用したものである。これらは、血栓を溶解し、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用されるシロキクラゲ、ホンダワラは、約４００種類の種々の植物等からスクリーニングを行って得た。例えば、シクンシ（果実）、ショウノウ（精油）、センボウ（根茎）、ニクズク（種子）、バショウ（根）、ボウシュウボク（葉）、メシマコブ（子実体）、ヤマブシタケ（子実体）、イヌホオズキ（全草）、カワラタケ（子実体）、クロレラ（全藻）、シャクヤク（花）、タイシジン（塊根）などである。これらのアルコール抽出物について、後述するプロウロキナーゼ活性化作用を測定することによってスクリーニングを行った。この際、プロウロキナーゼ活性化作用を有するとして公知の物質であるｓｕｒｆａｃｔｉｎＣ（５μＭ）を基準としてこれと同様の活性曲線を示す植物を選択した。
以上からシロキクラゲとホンダワラに高いプロウロキナーゼ活性化作用があることが分かり、新たな知見を得た。
本発明で使用されるシロキクラゲ科シロキクラゲ属であるシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及び褐藻綱 (Phaeophyceae)であるホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）は、産地などは特に限定されるものではない。
本発明におけるシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）とは、シロキクラゲ科シロキクラゲ属のキノコの一種のことであり、広葉樹の枯れ木に発生し、全体白色で花びら状の形態をしている。中国では不老長寿の薬とされ、珍しいきのことされる。最近では、人工栽培が行われているものもある。
【０００９】
本発明におけるホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）とは、褐藻綱 (Phaeophyceae)の海藻の一種であり、三陸沿岸を除いた本州および九州と四国の南部を除いた沿岸域に分布し、京都府では、日本海に面した丹後半島沿岸域の水深1〜3ｍに多くみられる。ホンダワラの仮根は固着力の弱い仮盤状なので、波が若干遮蔽（しゃへい）されるような場所に多いという分布上の特徴がある。
【００１０】
本発明において、シロキクラゲは、菌糸、子実体、担子器、粒子、担子胞子等全ての部位が使用可能である。また、ホンダワラは、葉、茎、芽、枝、仮根、気胞等全ての部位が使用可能である。
また、菌の液体培養を行って得た培養液も同様に使用可能である。
【００１１】
本発明でいう乾燥体とは、上記シロキクラゲまたはホンダワラの使用可能部位を乾燥させた乾燥物またはその粉砕物をいう。
また、搾汁とはそれ自身を圧搾抽出することにより得られる搾り汁をいう。
また、水抽出物とはそれ自身、乾燥物、またはその粉砕物を水で抽出して得た抽出物をいう。
有機溶媒抽出物とは、エチルアルコール、メチルアルコール、ジエチルエーテル、アセトン等の溶媒によって抽出して得た抽出物をいう。
これらの抽出溶媒のうち、水またはアルコールがより好ましい。
抽出物は、水抽出物または有機溶媒抽出物の粗抽出物、および粗抽出物を分配、カラムクロマト等の各種クロマトグラフィー等で段階的に精製して得られた精製抽出物等のいずれも含まれる。
分画成分とは、水抽出物または有機溶媒抽出物の粗抽出物をいくつかに分配して得られた各成分をいう。分画成分は、適切な方法で濃縮、または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥しても良い。
これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。
【００１２】
例えば、シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）の乾燥物１ｋｇに９９．５％エタノール抽出液３Ｌを加え、室温で一晩浸漬することにより得た粗抽出液を、そのまま血栓溶解剤またはｐｒｏ−ｕ−ＰＡ活性化促進剤として使用しても良いし、各種クロマトグラフィーを組み合わせて、精製した精製抽出液を使用しても良い。
【００１３】
また、本発明の化合物は、ホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の分画成分を精製することにより得ることが出来た。
本発明の化合物は、下記一般式（１）で表され、式中のＲ１がオレイン酸、Ｒ２がパルミチン酸の場合と、Ｒ１がパルミチン酸、Ｒ２がオレイン酸の場合の２通りがある。
前者の場合、化合物（１）は1-oleoyl-2-palmitoyl-3-O-a-glucopyranosylglycerol であり、後者の場合、化合物（１）は1-palmitoyl-2-oleoyl-3-O-a-glucopyranosylglycerolである。
なお、本化合物の薬学的に許容される塩も本発明の範囲に含まれる。
【化３】
2005145949.tif 000003
【００１４】
これらの本発明で用いるシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の乾燥物及、抽出物及び化合物（１）が、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ活性化促進作用を有することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。
また、本発明で用いるシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）はｐｒｏ−ｕ−ＰＡ活性化促進作用を有しており、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療剤及びこれらを含有する食品、医薬として使用可能である。
【００１５】
本発明のシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）乾燥物又は抽出物は、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療剤及びこれらを含有する食品、医薬として製造することができる。
本発明の血栓溶解剤、ｐｒｏ−ｕ−ＰＡ活性化促進剤、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療剤及びこれらを含有する医薬は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。
投与に際しては、有効成分を経口投与、経皮投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。
【００１６】
上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００１７】
食品としては、そのまま、又は種々の栄養成分を加えて、若しくは飲食品中に含有せしめて、pro-u-PA活性化促進作用剤、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などの予防・治療に有用な保健用食品又は食品素材として食される。例えば、上述した適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、茶、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。
【００１８】
本発明において、シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の溶媒抽出物又は化合物（１）の有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定される。例えば、経口投与の場合、一般に１日当たり０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度とされ、数回に分けて投与してもよい。
【００１９】
本発明のシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）乾燥物、抽出物又は化合物（１）の毒性は低く、例えばシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）のエタノール抽出物を毎日１０００ｍｇ／ｋｇ、１００日間という長期間に亘ってラットに経口投与しても、死亡例は認められず、体重変化も観察されなかった。
【実施例】
【００２０】
次に実施例を挙げて、具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
製造例［シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）の粗抽出］
シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）の乾燥体１００ｇに７０％エタノール２２００ｍＬを加え、５０℃で２時間加熱攪拌抽出し、熱時ろ過することによりろ過液を得た。さらに、残査に７０％エタノール２０００ｍＬを加え、５０℃で２時間加熱攪拌することにより、ろ過液を得た。残査に同様の操作をもう一回行い、得られた抽出液を混合し、減圧濃縮（液温 ４０〜４５℃）することにより、シロキクラゲ７０％エタノール抽出物（以下、Ｔ−１と略す）１６．７６ｇを得た。
さらに、Ｔ−１を９０％エタノール１００ｍＬで溶解洗浄し、遠心分離を行うことにより、上清部分と沈殿部分とに分離した。得られた上清部分を、そのまま減圧濃縮することによりシロキクラゲエタノール抽出物水溶性部（以下、Ｔ−２と略す）を得、沈殿部分を９０％エタノールにて溶解後、減圧濃縮することによりシロキクラゲエタノール抽出物非溶解部（以下、Ｔ−３と略す）を得た。
【００２１】
［ホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の粗抽出］
ホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の乾燥体をミキサーにて粉砕し、その粉砕乾燥体１００gに９５％エタノール５００ｍＬを加え、６０℃で２時間加熱攪拌抽出し、熱時ろ過することによりろ過液４１０ｍＬを得た。さらに、残査に９５％エタノール４１０ｍＬを加え、６０℃で２時間加熱攪拌することにより、ろ過液４１５ｍＬを得た。残査に同様の操作をもう一回行い、得られた抽出液を混合し、濃縮することにより、ホンダワラ９５％エタノール抽出物（以下、Ｓ−１と略す）１３．５７ｇを得た。
さらに、Ｓ−１を５ｇ分取し、熱水２００ｍＬを加えて溶解し、遠心分離を行うことにより、上清部分と沈殿部分とに分離した。得られた溶解部分を、そのまま減圧濃縮することによりホンダワラエタノール抽出物水溶性部（以下、Ｓ−２と略す）を得、沈殿部分を９５％エタノールにて溶解後、減圧濃縮することによりホンダワラエタノール抽出物非溶解部（以下、Ｓ−３と略す）を得た。
【００２２】
薬理試験［プロウロキナーゼ活性化作用の測定］
プロウロキナーゼ活性に対する植物抽出物の活性化促進作用の測定は、T.Kikuchi and K.Hasumiの方法（Biochim. Biophys. Acta, 1596, 234-245 (2002)）に準じて行った。
すなわち、０．１ ｍＭ Spectrozyme ＵＫ （ウロキナーゼの発色基質）、１０ｎＭ プラスミノーゲン、２０ｎＭ プロウロキナーゼ、５０ｍＭ Tris-HCl 、１００ ｍＭ ＮａＣｌ 及び２ｍｇ／ｍＬbovine serum albumin （ｐＨ ７．５）から成る緩衝液に、製造例で得られた被験物質を各種濃度に調製したものを添加し、３７℃で２００分まで経時的に４０５ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
被験物質にプロウロキナーゼ活性があると、プロウロキナーゼは活性化され、ウロキナーゼとなり、ウロキナーゼの発色基質と反応、発色するため、これを吸光度計を用いて測定する。
これらの測定方法により得られたＴ−１およびＳ−１の試験結果を図1及び図2に示す。
【００２３】
本発明のシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）のエタノール抽出物は、図１で示したように、濃度依存的にプロウロキナーゼ活性を促進し、５μｇ／ｍＬ以上で十分な活性化促進作用を有することがわかる。なお、図１において濃度０の場合も経時的にプロウロキナーゼ活性が促進されているように見えるのは、吸光度が経時的に上昇するためである（他の図においても同様）。
また、本発明のホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）のエタノール抽出物は、図２に示したように、濃度依存的にプロウロキナーゼ活性を促進し、０．０７５μｇ／ｍＬの濃度においても十分な活性化促進作用が認められる。
さらに、製造例で得られたシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）のＴ−２、Ｔ−３画分及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）のＳ−２、Ｓ−３のプロウロキナーゼ活性化促進作用について測定を行った結果を図３〜図６に示した。
【００２４】
以上のことから、シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）のエタノール抽出物Ｔ−１及びホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）のエタノール抽出物中Ｓ−１にはプロウロキナーゼ活性化促進作用を有する成分が含まれており、さらに、その成分は、図３〜図６の結果より、どちらも非溶解部（Ｔ−３，Ｓ−３）により強い活性が存在すると考えられる。
【００２５】
[シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）の活性物質の抽出・精製]
図７に示したように、シロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）の乾燥体６００ｇをミルサーで粉砕し、これにｎ−ｈｅｘａｎｅ２４００ ｍＬ、２−ｐｒｏｐａｎｏｌ６００ ｍＬを加え、ホモジナイザーにてさらに粉砕し、スターラーで室温にて一晩攪拌し、その後、エバポレーターで濃縮し、さらに、溶媒を２−ｐｒｏｐａｎｏｌで置換しながら濃縮した。得られた濃縮物に２−ｐｒｏｐａｎｏｌ３０ｍＬを加え、−３０℃で一晩静置し、その後、２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ．遠心分離を行うことにより、得られた上清をシロキクラゲ粗分画物とした。
さらに、上述のシロキクラゲ粗分画物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：Φ３．０ｃｍ×高さ２８ｃｍ、溶出溶媒：ｎ−ｈｅｘａｎｅ：２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（９８：２、９５：５、９：１、８：２））に供した。得られた活性画分（ｎ−ｈｅｘａｎｅ：２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（９：１）画分；１４２ｍｇ）を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとする）に供することにより、活性物質ＦＬ３７８（４２ｍｇ）を得た。この得られたＦＬ３７８のプロウロキナーゼ活性化促進作用を上記薬理試験の方法と同様に測定し、図８に示した。
【００２６】
図８で示したように、ＦＬ３７８は、濃度依存的にプロウロキナーゼ活性を促進し、１０μｇ／ｍＬ以上で十分な活性化促進作用を有することがわかる。
【００２７】
[ホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）の活性物質の抽出・精製・活性]
１．活性物質の抽出
図９に示したように、乾燥ホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）２００ｇから、クロロホルムとメタノールによる抽出を３回繰り返すことにより、減圧濃縮と真空乾固を経て、抽出物１５．１ｇを得た。
【００２８】
２．クロロホルムとアセトンの溶解性をもとにした活性物質の分離
図１０に示すとおり、図９で得たこの抽出物はアセトンに難溶、クロロホルムに易溶であり、アセトン沈殿により夾雑物を取り除いた。上述の抽出物１５．１gに１５．１ ml のクロロホルムを加えて溶解し、アセトンを添加して活性物質を沈殿として回収した(図 １０)。得られた回収物は５００mgである。
【００２９】
３．シリカカラムクロマトグラフィーによる精製
図１１に示すとおり、クロロホルムとメタノールを移動相としてシリカカラムクロマトグラフィーによりアセトンに溶けない回収物を溶出してから、活性画分(100 : 0と90 : 10)を濃縮した。90 : 10の画分の濃縮物に対して図１０と同様の操作を行い、沈殿物を回収した。90 : 10の画分から得られた回収物(図１１)は７０ mgである。
【００３０】
４．シリカカラムクロマトグラフィーによる活性物質の純化
図１２に示すように、上述の粗精製物（90:10画分）に対して１％酢酸を含んでいる展開溶媒(CHCl3/CH3OH)を用いてもう一度シリカカラムクロマトグラフィーを行い、クロロホルムの画分を濃縮し、図１０と同様のアセトン沈殿を行った。ただし、その際に、アセトンに1%酢酸を添加した。沈殿物を乾固して、１５．１mgの精製標品（以下、FL337-1とする）を得た。また、同様に90:10および80:20画分からも活性物質をそれぞれ９．１mg（以下、FL337-2とする）、６２mg（以下、FL337-3とする）得た。
【００３１】
５．各分画成分の活性
これら得られたFL337-1、FL337-2およびFL337-3のプロウロキナーゼ活性化促進作用の結果を図１３〜図１５に示した。
図１３〜図１５で示したように、FL337-1、FL337-2およびFL337-3は濃度依存的にプロウロキナーゼ活性を促進し、何れの化合物も０．００６４μg／mlの濃度においても十分な活性化促進作用が認められる。
【００３２】
[化合物（１）の構造／活性]
１．構造
上記で得られたFL337-1（１５．１mg）について構造解析を行ったところ、以下の一般式で表される化合物（１）であることがわかった。その物理化学的性質を以下に示す。
構成糖については、1H NMRおよび13C NMRのデータから、1位置換O-a-グルコピラノース（又はα−Ｄ−グルコピラノースともいう）構造であり、グリセロールの3位に糖が結合していることが示された。構成脂肪酸については、化合物（１）を塩酸メタノールでメタノリシス後、得られた脂肪酸メチルエステルをGC-MSにより分析した結果、パルミチン酸およびオレイン酸が検出されたこと、及びFAB-MS (negative ion mode) において脂肪酸エステル由来の特徴的なフラグメントイオンピーク（m/z 281, 255）が観察されたことから、構成脂肪酸はパルミチン酸及びオレイン酸であることがわかった。
【化４】
2005145949.tif 000004
化合物（１）の物理化学的性質分子式  C43H80O10分子量  756FAB-MS (positive ion mode): m/z 779 (M + Na)+
UV: 末端吸収
IR: vmax (cm-1) 3400 (br), 2920, 2852, 1742, 1219, 1171, 1035, 771
1H NMRおよび13C NMR: 表1
【表１】
2005145949.tif 000005
【００３３】
２．構造解析の条件および用いた装置
質量分析
装置：JEOL model SX-102 spectrometer
マトリックス：diethanolamine for negative ion measurements 
trimethanolamine for positive ion measurements
NMR
装置：JEOL model alpha-600 spectrometer
溶媒：DMSO-d6 
測定温度：40°C
UV  
装置：  Hitachi model 320 spectrometer  
溶媒：  MeOH
IR  
装置：JASCO model IR-810 spectrometer  
測定方法：NaCl結晶に塗布
構成脂肪酸の分析
FL337-1 (０．１ mg) を0.1 mlの６ M HClを含むMeOH中で、減圧下に１００°Cで３時間処理した。溶液をn-hexaneで３回抽出後、抽出液をまとめて乾固した。その一部をMeOHに溶解後、silica capillary column (30 m×0.25 mm; Agient Technologies) を用いたGC-MS (JMS-GC mate II) により分析した。
【００３４】
３．化合物（１）のプロウロキナーゼ活性化促進作用  化合物（１）のプロウロキナーゼ活性化促進作用を前記分画成分と同様に測定した。結果を図１６に示す。これより、化合物（１）は、濃度依存的にプロウロキナーゼ活性を促進した。
【００３５】
４．化合物（１）のプロウロキナーゼ活性化の確認試験  
化合物（１）がｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性化を通してプラスミノーゲンを活性化することを確認するため、化合物（１）をｐｒｏ−ｕ−ＰＡ、ｔｃｕ−ＰＡ及びプラスミノーゲンに添加し、各固有の蛍光強度の変化を測定した。
結果を図１７に示す。これより、化合物をｐｒｏ−ｕ−ＰＡに添加した場合は、その蛍光強度が増大しているが、ｔｃｕ−ＰＡ及びプラスミノーゲンに添加した場合には、各物質の蛍光強度は増大していない。従って、化合物（１）は選択的にｐｒｏ−ｕ−ＰＡに働きかけてプラスミノーゲンを活性化していることがわかる。
【００３６】
＜測定方法＞
各蛋白質（１００nM）を化合物１とともに０．８mlＴＢＳ中、室温下で５分間、インキュベートした後、２９１nm及び３３１nmの波長で蛍光測定した。コントロールは、化合物（１）の代わりにバッファーを用いて測定した。
【００３７】
５．化合物（１）のフィブリン溶解活性
化合物（１）のフィブリン溶解作用について、１０% ヒト血漿及び０．１nM ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを入れてインキュベートされたFITC標識フィブリンプレートを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験を行った。結果を図１８に示す。これより、化合物（１）は、前記希釈された血漿中のFITC-フィブリンの低下を増大させた。
【００３８】
＜測定方法＞
フィブリンプレートは井上、蓮見らの方法（下記参考文献）で作成した。９８ウェルの組織培養プレートの各ウェルには１０%（v/v）の血小板を除いたヒト血漿（platelet-poor  plasma）と０．１nM  ｐｒｏ−ｕ−ＰＡを含む１００μl TBS/BSA  が入っており、そこに２０μgのFITC−フィブリンを添加した。３７℃で６０分間インキュベーションした後、FITC-フィブリン凝固物中の蛍光物質を４９４nmと５２０nm で測定した。
参考文献：T., Hasumi, K., Sugimoto, M., and Endo, A., Enhancement of fibrinolysis byplactins: Structure-activity relationship and effects in human U937 cells and inmice. Thromb. Haemost. , 79, 591-596 (1998).
【００３９】
以下に処方例を示す。
処方例１
［錠剤の製造］
製造例で得られたシロキクラゲ（Tremella fuciformis Berkeley）のエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
【００４０】
（組       成）                           （配合：重量％）        
シロキクラゲ抽出物                                  24   
乳糖                                                63     
コーンスターチ                                      12      
グァーガム                                           1  
【００４１】
処方例２
［ジュースの製造］
製造例で得られたホンダワラ（Sargassum fulvellum (Turner) C. Agardh）のエタノール抽出物を用いて、常法に従って、下記の組成のジュースを製造した。
（組       成）                           （配合：重量％）
冷凍濃縮温州みかん果汁                               5.0       
果糖ブドウ糖液糖                                    11.0        
クエン酸                                             0.2        
Ｌ-アスコルビン酸                                    0.02        
香料                                                 0.2        
色素                                                 0.1        
ホンダワラ抽出物                                     0.2        
水                                                  83.28 
【産業上の利用可能性】
【００４２】
ホンダワラまたはシロキクラゲ由来成分を用いて血栓溶解剤、これを有効成分とする医薬、これを含有する食品等を提供することにより、副作用を抑え、末梢動静脈血栓症、肺塞症、心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網脈動静脈血栓症などを有効に予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ｔ−１のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図２】Ｓ−１のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図３】Ｔ−２のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図４】Ｔ−３のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図５】Ｓ−２のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図６】Ｓ−３のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図７】シロキクラゲの活性物質の抽出・精製工程を示す図
【図８】FL378のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図９】ホンダワラの活性物質の抽出工程を示す図
【図１０】ホンダワラの活性物質抽出物の分離工程を示す図
【図１１】シリカカラムクロマトグラフィーによる活性物質の精製工程を示す図
【図１２】シリカカラムクロマトグラフィーによる線溶活性物質の純化工程を示す図
【図１３】FL337-1のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図１４】FL337-2のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図１５】FL337-3のプロウロキナーゼ活性化促進作用を示すグラフ
【図１６】化合物（１）のプロウロキナーゼ活性化促進作用を表すグラフ
【図１７】化合物（１）のｐｒｏ−ｕ−ＰＡ、ｔｃｕ−ＰＡ及びプラスミノーゲンへの影響を表すグラフ
【図１８】化合物（１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのフィブリン溶解作用への影響を表すグラフ
【図１】
2005145949.tif 000007
【図２】
2005145949.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１７】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005145949.tif 000022
【図１６】
2005145949.tif 000023
【図１８】
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