(57)【要約】【課題】  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の処置のために個体に受動免疫するための、抗体、ペプチド、方法および組成物を提供すること。【解決手段】    推定Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質Ｅ２／ＮＳ１のほぼアミノ酸３８４からほぼアミノ酸４１４の間の超可変領域（Ｅ２ＨＶ）は、ＨＣＶの急速に進化する領域であり、そして正の免疫選択下にあるようである。この超可変領域内に新規発見されたモチーフは、免疫原性であり、アミノ酸特性に関して保存されている。多くの分離株において、このモチーフは、アミノ酸４０１から４０６あるいは４０７の間に存在する。このモチーフの発見は、ＨＣＶを処置および診断するためのさらなる材料および方法を可能とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶのＥ２ＨＶ超可変領域からの以下の共通配列：
−Ｔ−ＶＴＧＧ−ＡＡＲＴＴ−Ｇ−−ＳＬＦ−−Ｇ−ＳＱ−ＩＱＬＩ
を有する３１マーである抗原性ポリペプチド、またはＳＬＦ−−Ｇモチーフを保持する短縮型、またはＳＬＦ−−Ｇモチーフを保持する改変体であって、ここで１つ以上のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されるか、または非天然アミノ酸アナログによって置換され、そしてここで、該短縮型または改変体の抗原性が維持される、抗原性ポリペプチド。
【請求項２】
配列：
−Ｔ−ＶＴＧＧ−ＡＡＲＴＴ−Ｇ−−ＳＬＦ−−Ｇ−ＳＱ−ＩＱＬＩ
を有する３１マーまたはその改変体である、請求項１に記載の抗原性ポリペプチドであって、ここで１つ以上のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が非天然アミノ酸アナログによって置換され、そしてここで、該改変体の抗原性が維持される、抗原性ポリペプチド。
【請求項３】
配列：
−Ｔ−ＶＴＧＧ−ＡＡＲＴＴ−Ｇ−−ＳＬＦ−−Ｇ−ＳＱ−ＩＱＬＩ
を有する３１マーである、請求項１に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項４】
キャリアタンパク質と結合されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染についての個体の処置方法において使用するための、請求項１〜４いずれか１項に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項６】
薬学的に受容可能なキャリアとともに、請求項１〜４いずれか１項に記載の抗原性ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項７】
ＨＣＶ感染についての個体を処置方法において使用するための請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
固体基質に固定化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原性ポリペプチド。
【請求項９】
生物学試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体を検出するための免疫アッセイ法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）抗ＨＣＶ抗体を含有する疑いのある抗体含有生物学的試料を、請求項１、２、３および８のいずれか１項に記載の抗原性ポリペプチドとインキュベートして、抗体−抗原複合体を形成させる工程；および
（ｂ）該抗原性ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されたか否かを検出する工程、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関し、さらに詳細には、Ｅ２／ＮＳ１領域内の免疫学的に重要なモチーフの発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、輸血後の非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主要な原因因子として同定された。ウイルスゲノム配列を得るための材料および方法は公知である。ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０４６６９号、第ＷＯ９０／１１０８９号、および第ＷＯ９０／１４４３６号を参照のこと。ＨＣＶに関する全般的な情報は、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）  １４：３８１−３８８を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶゲノムの分子の特徴づけは、ＨＣＶゲノムが、枠内の最初のメチオニンコドンで始まる約３０００アミノ酸（ａａ）の長いポリペプチドをコードし得る、長い翻訳読み取り枠（ＯＲＦ）を含有する約９，５００のヌクレオチドを有する正極性のＲＮＡ分子であることを示す。推定エンベロープ糖タンパク質Ｅ２／ＮＳ１（またはＥ２と呼ばれる）のアミノ末端に位置する超可変ドメインが存在しており、ＰＣＴ公開第Ｗ０９３／０１６１２６号；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）  １８０：８４２−８４８；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）  ８９：３４６８−３４７２；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２：３０３−３０８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【０００４】
他のＲＮＡウイルスについて観察されるように、誤りやすいレプリカーゼおよびＤＮＡ複製時に作動する修復機構の非存在による、ＨＣＶゲノムの実質的な流動性が存在する。１つの感染個体においてさえも、ＨＣＶゲノムは同質種として存在しない。むしろ、密接に関連するがやはり異質ゲノムである疑似種分布として存在する。Ｍａｒｔｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）  ６６：３２２５−３２２９。さらに、宿主選択および急速に変異するゲノムの適応のプロセスは、多様な（まだ流動性の）ＨＣＶ遺伝子型の進化を導く。少なくとも４つの異なるＨＣＶ遺伝子型が、全長配列のヌクレオチドおよびアミノ酸の関連性の実際の程度に基づいて区別され得、さらに異なる遺伝子型が、部分配列に基づいて同定された。Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９２）  １８３：３３４−３４２；Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）  ７３：１１３１；Ｃｈａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）  ８９：７１４４−７１４８。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＣＶ感染を処置するための新規なワクチン戦略およびＨＣＶ診断のためのアッセイに向けられている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
アミノ酸約３８４位とアミノ酸約４１４位との間のＥ２／ＮＳ１（Ｅ２ＨＶ）の超可変領域は、ＨＣＶの急速に進化する領域（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）であり、正の免疫選択下にあるようである。本発明は、免疫原性であって、アミノ酸特性に関して保存される、モチーフのこのサブ領域内での存在に関する。Ｅ２ＨＶアミノ酸配列はこのモチーフ内で同一である必要はないが、一定のパターンが存在する。ＨＣＶ１および他の多くの分離株において、このモチーフは、アミノ酸約４０１位から４０７位で認められる。免疫原性ポリペプチド中のこのモチーフの存在は、抗体結合によって検出
可能である。
【０００７】
このモチーフのＥ２／ＮＳ１超可変領域内での発見は、直接免疫あるいは受動免疫によって、ＨＣＶ処置のために使用され得るポリペプチドおよび抗体を含む材料の生産戦略を可能とする。さらに、イムノアッセイあるいは核酸アッセイを使用する診断方法が、これに包含される。
【０００８】
従って、本発明の１つの局面では、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染処置のために個体を受動免疫する方法が提供され、この方法は、アミノ酸配列ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６を含むモチーフに結合し得る抗体を含有する抗体組成物を、個体に投与することを包含する。ここで、ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；ａａ３は、ＦあるいはＬであり；ａａ４は、任意のアミノ酸であり；ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、ａａ６は、ＧあるいはＡである。さらなる実施態様では、ａａ７が存在し、ａａ６に接続され、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである。
【０００９】
本発明のさらなる局面では、抗原決定基を認識し得る抗体が提供され、その抗原決定基は、アミノ酸配列  ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６を含み、ここで、ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；ａａ３は、ＦあるいはＬであり；ａａ４は、任意のアミノ酸であり；ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、ａａ６は、ＧあるいはＡである。さらなる実施態様では、ａａ７が存在し、ａａ６に接続され、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである。
【００１０】
本発明のさらなる局面では、ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６  により特徴づけられるモチーフを有する免疫原性ポリペプチドが提供され、ここで、ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；ａａ３は、ＦあるいはＬであり；ａａ４は、任意のアミノ酸であり；ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、ａａ６は、ＧあるいはＡであり、但しこのモチーフは、１９９３年５月１２日の既知ＨＣＶ分離株の天然に存在するＥ２ＨＶドメインの３１アミノ酸内に含まれない。さらなる実施態様では、ａａ７が存在し、ａａ６に接続され、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである。
【００１１】
本発明のさらなる局面では、以下の（１）および（２）を含有するワクチンが提供される：（１）ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６  により特徴づけられるモチーフを含む、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチド（ここで、ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；ａａ３は、ＦあるいはＬであり；ａａ４は、任意のアミノ酸であり；ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、ａａ６は、Ｇ、あるいはＡである）；および、（２）薬学的に受容可能なキャリア。
【００１２】
本発明のさらなる局面では、ＨＣＶ感染個体の処置方法が提供され、この方法は、上記ワクチンを個体に投与することを包含する。
【００１３】
本発明のさらなる局面では、生物学的試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体を検出するためのイムノアッセイ方法が提供され、この方法は、以下の（ａ）および（ｂ）を包含する：（ａ）抗ＨＣＶ抗体を含有することが予想される抗体含有の生物学的試料と、上記のような免疫原性ポリペプチドを含有するプローブ抗原とをインキュベートして、抗体−抗原複合体形成を行わせ得る；（ｂ）プローブ抗原を含有する抗体−抗原複合体の検出。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明を実施するための態様）
例えば、本発明において、以下が提供される：
１．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の処置のために個体に受動免疫する方法であって、アミノ酸配列ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６を含むモチーフに結合し得る抗体を含む抗体組成物を該個体に投与することを包含し、ここで、
ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；
ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；
ａａ３は、ＦあるいはＬであり；
ａａ４は、任意のアミノ酸であり；
ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、
ａａ６は、ＧあるいはＡである、
方法。
２．前記アミノ酸配列が、ａａ６に接続された付加アミノ酸ａａ７をさらに含み、ここで、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである、項目１に記載の方法。
３．前記抗体組成物が、前記モチーフを含むキャリア複合体化ペプチドで別の個体を免疫することによって得られる、項目１あるいは２に記載の方法。
４．アミノ酸配列ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６を有する抗原決定基を認識し得る抗体：
ここで、
ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；
ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；
ａａ３は、ＦあるいはＬであり；
ａａ４は、任意のアミノ酸であり；
ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、
ａａ６は、ＧあるいはＡである。
５．前記アミノ酸配列が、ａａ６に接続されたもう１つのアミノ酸ａａ７をさらに含み、ここで、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである、項目４に記載の抗体。
６．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目４あるいは５に記載の抗体。
７．ａａ１−ａａ２−ａａ３−ａａ４−ａａ５−ａａ６により特徴づけられるモチーフを含む、免疫原性ポリペプチド：
ここで、
ａａ１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；
ａａ２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；
ａａ３は、ＦあるいはＬであり；
ａａ４は、任意のアミノ酸であり；
ａａ５は、任意のアミノ酸であり；そして、
ａａ６は、ＧあるいはＡであり、
但し、該モチーフは、１９９３年５月１２日のものとして公知であるＨＣＶ分離株の天然に存在するＥ２ＨＶドメインの３１アミノ酸配列内に含まれていない。
８．前記アミノ酸配列が、ａａ６に接続された付加アミノ酸ａａ７をさらに含み、ここで、ａａ７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである、項目７に記載の免疫原性ポリペプチド。
９．項目７あるいは８に記載の少なくとも１つの免疫原性ポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、ワクチン。
１０．項目９に記載のワクチンを個体に投与することを包含する、ＨＣＶ感染個体を処置する方法。
１１．生物学的試料中の抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体を検出するためのイムノアッセイ方法であって、該方法が、
ａ）抗ＨＣＶ抗体を含有する疑いのある抗体含有生物学的試料を、項目７に記載の免疫原性ポリペプチドを含むプローブ抗原とインキュベートし、抗体−抗原複合体を形成さ
せる工程；および
ｂ）該プローブ抗原を含有する該抗体−抗原複合体を検出する工程；
を包含する、方法。
【００１５】
（Ａ．定義）
本発明の実施は、他に示されていない限り、当該分野内の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、それは当業者の範囲内である。このような方法は、文献に十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ
ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ，ＶＯＬＵＭＥＳ  Ｉ  ＡＮＤ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）；ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編
１９８４）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編
１９８６）；ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ（ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ（１９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編  １９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（それぞれに、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、ならびにＷｕ編）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）  ；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７），ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，第二版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；および、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥＳ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編  １９８６）。
【００１６】
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、この明細書で使用される。本明細書に記載されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考として援用されている。
【００１７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ペストウイルス（ブタコレラウイルスおよびウシ下痢ウイルス）およびフラビウイルス、例えば、デング熱および黄熱ウイルス、を包含する、フラビウイルス科（Ｆａｍｉｌｙ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）の新しいメンバーである。ＨＣＶの遺伝子構成の図式を図１に示す。フラビウイルスおよびペストウイルスと同様に、ＨＣＶは、非構造遺伝子ＮＳ２からＮＳ５の上流にある２つの糖タンパク質ドメイン（「Ｅ１」、「Ｅ２／ＮＳ１」）が続くウイルスポリタンパク質のＮ末端で、塩基性ポリペプチドドメイン（「Ｃ」）をコードするようである。推定タンパク質ドメインのアミノ酸位置を表１に示す。
【００１８】
【表１】
2005325126.tif 000002
【００１９】
ゲノムのＥ１およびＥ２／ＮＳ１領域は、推定エンベロープ型糖タンパク質をコードするので、これらの領域は、免疫原性およびＨＣＶ処置に関して、特に興味深いものである。
【００２０】
１つの持続性感染個体内のＨＣＶゲノムの平均変化速度は、１年あたり一部位につき１−２×１０−３ｎｔ変化であると概算された。しかし、Ｅ２／ＮＳ１糖タンパク質のＮ末端をコードする遺伝子の５’末端ではずっと高い変化速度が存在する。Ｗｅｉｎｅｒら、ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ  ＩＮ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ：  ＤＩＡＧＮＯＳＩＳ  ＯＦ  ＨＵＭＡＮ  ＶＩＲＵＳＥＳ  ＢＹ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＣＨＡＩＮ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９９２）。約３８４−４１４位（アミノ酸番号付けの基準としてＨＣＶ１を使用して）のアミノ酸に広がるこのＥ２超可変領域（Ｅ２ＨＶ）（以前に、領域Ｖと呼ばれ、例えば、Ｏｇａｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：３３９２−３３９６；Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：３３１−３４１を参照のこと）は、ＨＣＶポリタンパク質の最も可変的な領域であるようで、今までに調査された実質的に全ての分離株において異なる。Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：３４６８−３４７２。多くの個別の抗体結合エピトープがこの領域にマッピングされており、そして一人の慢性感染患者において、Ｅ２ＨＶ変異体の出現が立証されており、このことは、Ｅ２ＨＶ領域の逸出変異体が、慢性化の進展に重要な役割をなすことを示唆する。
【００２１】
本明細書で使用されているように、ウイルスタンパク質の「可変ドメイン」は、少なくとも２つのＨＣＶ分離株あるいは亜集団間で、一貫したアミノ酸変異のパターンを明示するドメインである。好ましくは、ドメインは、少なくとも１つのエピトープを含有する。可変ドメインは、１つのアミノ酸変化により、分離株と分離株との間で変化し得る。これらの分離株は、同じまたは異なるＨＣＶグループまたはサブグループ由来であり得る。可変ドメインは、分離株中の配列組成から容易に同定され得、これらの方法の例は、以下に記載されている。本発明を記載する目的のために、可変ドメインは、１位と示される開始メチオニンによって、ＨＣＶ１ゲノムによりコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号に関して定義される。別のＨＣＶ分離株中の対応する可変ドメインは、任意の可変ドメインの外側に保存ドメインをもたらし、最大配列にする様式で、２つの分離株の配列を整列させることにより決定される。これは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｔｔｎ：  Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）から入手可能なＡＬＩＧＮ  １．０のような、任意の多
くのコンピュータソフトパッケージで実施され得る。Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：２４４４−２４４８を参照のこと。特定の可変ドメインに与えられたアミノ酸番号は、いくぶん主観的であり選択事物であることが理解される。従って、可変ドメインの開始および終止は、およそのことであり、他に記載されていなければ、重複ドメインあるいはサブドメインを含むと理解されるべきである。
【００２２】
「超可変ドメイン」（ＨＶ）は、分離株間で比較的高い程度の可変性を示す可変ドメインである。特に、本明細書ではＥ２ＨＶと呼ばれる、ＨＣＶ  Ｅ２／ＮＳ１の超可変領域は、アミノ酸３８４−４１４に広がる。
【００２３】
本発明は、本明細書では４０１から４０６あるいは４０１から４０７のアミノ酸に対して「ＳＬＦ−−Ｇ」モチーフと呼ばれるアミノ酸の保存モチーフを有する、Ｅ２／ＮＳ１のＥ２ＨＶ内の領域を利用する。この領域は、少なくとも４つのＨＣＶ遺伝子型を包含する９０の分離株の配列分析により発見された。保存モチーフによりこの領域と結合する抗体で構成される抗体調製物は、ＨＣＶに対する受動免疫に有用である。
【００２４】
アミノ酸は、免疫反応性に関するモチーフの特性をとどめている限り、他の分子、例えば、これらのアミノ酸アナログと置換され得ることが、もちろん理解される。ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成されるものに比較した抗原決定基の免疫反応性は、規定の方法によって当業者により決定され得る。例えば、公知の方法には、エピトープマッピングに使用される方法、およびこのモチーフを含む抗原決定基と免疫学的に反応する（結合する）抗体への競合結合が包含される。
【００２５】
本明細書に使用されているように、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーのことであり、生産物の特定の長さのことではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に包含される。さらに、この用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などを指すわけではないが、排除しない。定義には、例えば、１つ以上のアミノ酸アナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを包含する）、置換結合を有するポリペプチド、および、天然に存在するおよび存在しない、当業者に周知の他の改変が包含される。
【００２６】
本発明の組成物の製造に有用なポリペプチドは、組換え、合成、あるいは組織培養で作製され得る。切断型ＨＣＶ配列または全長ＨＣＶタンパク質で構成される組換えポリペプチドは、ＨＣＶ配列（１つ以上のエピトープ、連続あるいは非連続のいずれか）で、あるいは融合タンパク質における配列で全体的に構成され得る。融合タンパク質では、有用な異種配列は、組換え宿主からの分泌を与え、ＨＣＶエピトープの免疫学的反応性を増大し、あるいは、ポリペプチドの支持体またはワクチンキャリアへの結合を促進する配列を含む。例えば、欧州特許公開第１１６，２０１号、米国特許第４，７２２，８４０号、欧州特許公開第２５９，１４９号、米国特許第４，６２９，７８３号を参照のこと。
【００２７】
天然材料源からのタンパク質の単離および精製によるのではなく、組換えＤＮＡ法によりタンパク質を生産する重要な利点は、同量のタンパク質が、天然材料源からタンパク質を単離するのに必要とされるより、より少量の開始材料を使用して生産され得ることである。組換え方法によるタンパク質の生産はまた、タンパク質を、通常細胞内に存在するいくらかの分子を含まないで単離し得る。組換え非ヒト宿主により産生されるヒトタンパク質のみが、組織での組換えタンパク質であるので、実際に、極微量のヒトタンパク質夾雑物をも完全に含まないタンパク質組成物が、容易に生産され得る。天然材料源からの潜在的なウイルス因子、およびヒトに対して病原性のウイルス成分もまた排除される。
【００２８】
ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成されるポリペプチドは、化学合成によって調製され得る。化学合成によるポリペプチドの調製方法は、当該分野で公知である。タンパク質は、抗体を生産するために使用され得る。「抗体」は、特異エピトープに結合する抗体およびそれらのフラグメント（Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを含む）を包含する、任意の免疫グロブリンである。この用語には、特に、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、およびキメラ抗体が包含される。キメラ抗体の例は、米国特許第４，８１６，３９７号、および第４，８１６，５６７号に考察されている。
【００２９】
指摘の核酸配列「由来の」ポリペプチドあるいはアミノ酸配列は、配列中にコードされるポリペプチドのアミノ酸と同じアミノ酸を有するポリペプチド、あるいは、少なくとも３−５アミノ酸、および、より好ましくは少なくとも８−１０アミノ酸、および、さらに好ましくは少なくとも１１−１５アミノ酸からなるそれらの部分、あるいは、配列中にコードされるポリペプチドで免疫学的に同定され得るそれらの部分のことである。この用語はさらに、指摘の核酸配列から発現されるポリペプチドも包含する。
【００３０】
本明細書に使用されているように、用語「組換えポリヌクレオチド」は、その起源あるいは操作によって以下のような、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、あるいは合成起源のポリヌクレオチドを意図する：（１）天然で会合されるポリヌクレオチドの全体あるいは部分と会合しない；（２）天然で連結されるもの以外のポリヌクレオチドと連結される；あるいは、（３）天然には存在しない。
【００３１】
本明細書で使用されているような用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態のことである。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。それはさらに、既知のタイプの改変、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、例えば非電荷連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）を有するものおよび電荷連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジンなどを包含する）のようなペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、改変連結（例えば、αアノマー核酸など）を有するもののような、ヌクレオチド間改変物、ならびに、ポリヌクレオチドの非改変形態を包含する。
【００３２】
「レプリコン」は、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどであり、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律ユニットとして挙動し、すなわち、自身の制御下で複製し得る。これは、選択マーカーを含み得る。
【００３３】
「ベクター」は、接続セグメントの複製および／または発現を引き起こすように、他のポリヌクレオチドセグメントが接続されているレプリコンである。
【００３４】
「制御配列」とは、連結されているコーディング配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列のことである。このような制御配列の特性は、宿主生物に依存して異なる。原核生物では、このような制御配列は一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み、真核生物では、一般的にはこのような制御配列は、プロモーターおよび転写終止配列を含む。用語「制御配列」は、最少限には、その存在が発現に必要とされる全ての成分を包含することを意図し、そして、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も包含し得る。「プロモー
ター」は、ｍＲＮＡ生産が近接の構造遺伝子について通常の転写開始部位で開始するような様式でＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型への結合をなし得る共通配列で構成される、ヌクレオチド配列である。
【００３５】
「作動可能に連結された」とは、記載の成分が、それらの意図される様式で機能される関係に存在する、並列位置のことである。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列に適した条件下で達成されるように、連結される。
【００３６】
「読み取り枠」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域であり、この領域は、部分コーディング配列あるいは全コーディング配列を示し得る。
【００３７】
「コーディング配列」は、適切な制御配列の制御下におかれると、通常ｍＲＮＡを介してポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。
【００３８】
「ＰＣＲ」とは、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２４：１６３；Ｓｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３３：１０７６−１０７８；米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号に記載のような、ポリメラーゼ連鎖反応技術のことである。
【００３９】
本明細書に使用されているように、ｘは、ｘが同一の様式でｙと自然に会合されないとき、ｙに関して「異種」である。すなわち、Ｘは、天然ではｙと会合されないか、あるいは、天然に認められるのと同様の様式ではｙとは会合されない。
【００４０】
「相同性」とは、ｘとｙとの間の類似性の程度のことである。２つのポリヌクレオチド配列間の相同性は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、ポリヌクレオチドの配列情報の直接比較により決定され得る。あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハブイリダイズさせ（例えば、Ｓ１消化の前に使用されるもの）、その後、１つまたは複数の一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、消化されたフラグメントの大きさを測定することによって、決定され得る。
【００４１】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞培養物」、および他のそのような用語は、組換えベクターあるいは他の転移ＤＮＡの受容体として使用され得るか、あるいは使用されてきた、例えば、微生物、昆虫細胞、および哺乳類細胞のことであり、形質転換されたもとの細胞の子孫を包含する。１つの親細胞の子孫は、自然変異、偶発変異、あるいは意図的変異により、もとの親と、形態においてあるいはゲノムあるいは全ＤＮＡ相補体において完全に同じである必要はないことが理解される。哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびサル腎（ＣＯＳ）細胞が包含される。
【００４２】
特に、本明細書に使用されているように、「細胞系」とは、インビトロにおいて継続的にあるいは長期にわたり増殖および分裂し得る細胞群のことである。しばしば、細胞系は、１つの前駆細胞に由来するクローン群である。さらに、自発的あるいは誘導された変化が、このようなクローン群の貯蔵あるいは転移中に核型に生じ得ることが当該分野で公知である。従って、言及される細胞系由来の細胞は、祖先細胞あるいは培養物と正確に同じでなくてよく、その言及される細胞系には、このような変異体も包含される。用語「細胞系」にはまた、不死化細胞が包含される。好ましくは、細胞系は、非ハイブリッド細胞系
、あるいは２つの細胞型のみに対するハイブリドーマを含む。
【００４３】
本明細書に使用されているように、用語「微生物」には、細菌および真菌のような、原核および真核微生物種が包含され、後者には酵母および糸状菌が包含される。
【００４４】
「形質転換」とは、挿入に用いられる方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配、あるいはエレクトロポレーションに関係なく、外生ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入のことである。外生ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
【００４５】
「ゲノムの」によって、ベクターにクローン化された制限フラグメントに由来するＤＮＡ分子のコレクションあるいはライブラリーが意味される。これには、生物の遺伝物質の全てあるいは一部が包含され得る。
【００４６】
「ｃＤＮＡ」によって、ｍＲＮＡの相補鎖にハイブリダイズする相補的ｍＲＮＡ配列が意味される。
【００４７】
「精製された」および「単離された」によって、ポリペプチドあるいはヌクレオチド配列について言及するときには、指摘された分子が、同じ型の他の生物学的高分子が実質的に存在しない状態で存在することが意味される。本明細書に使用されているように、用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％で、同じ型の生物学的高分子が存在することを意味する（しかし、水、緩衝液、および他の低分子、特に１，０００未満の分子量を有する分子は存在し得る）。
【００４８】
本明細書に使用されているように、「エピトープ」は、リンパ球レセプターあるいは抗体の認識部位に相補的な構造を有する、１つの抗原決定基である。機能的に、それは、標準的なアッセイで抗原が抗体に結合する能力により決定される。一般的には、１つのエピトープは、少なくとも３から５のアミノ酸を含む。ときには、エピトープはより多くの、例えば、６、７、８、９、あるいは１０アミノ酸であり得る。
【００４９】
エピトープあるいは抗原決定基は、それが、指摘のポリペプチド中のエピトープあるいは抗原決定基に免疫学的に結合する抗体と交差反応するときは、その指摘のポリペプチド中の別のエピトープあるいは抗原決定基の等価物である。しばしば、エピトープ内に、抗体結合にとって重要ではない１つ以上のアミノ酸が存在し、従って、置換あるいは欠失さえされ得る。直鎖状エピトープは通常短い連続配列であるが（なんらかの変化を受ける）、構造的エピトープは、直鎖状アミノ酸配列内では広く間隔をあけて存在するが、タンパク質の折り畳みあるいは二次または三次構造特性によって近接させられた、数個のアミノ酸から構成され得る。
【００５０】
「抗原」は、１つ以上の抗原決定基を含むポリペプチドである。
【００５１】
「免疫原性の」は、細胞性および／または体液性の免疫応答を惹起する能力を意味する。免疫原性応答は、免疫原性ポリペプチドのみにより惹起され得るか、あるいはアジュバントの存在あるいは非存在下でキャリアの存在を必要とし得る。
【００５２】
「免疫反応性の」とは、（１）抗体および／またはリンパ球抗原レセプターに免疫学的に結合する能力あるいは（２）免疫原性である能力のことである。
【００５３】
ＨＣＶエピトープを含むアミノ酸配列は、共有結合、あるいは融合されたポリヌクレオ
チドを発現させて融合タンパク質を形成することのいずれかにより、別のポリペプチド（例えば、キャリアタンパク質）と連結され得る。所望であれば、エピトープの複数繰り返しを挿入あるいは接続し得、そして／または、種々のエピトープを取り込み得る。キャリアタンパク質は、任意の材料源由来であり得るが、一般的には、ＢＳＡ、ＫＬＨなどのような、比較的大きな免疫原性タンパク質である。所望であれば、キャリアとして実質的に全長のＨＣＶタンパク質を使用し得、免疫原性エピトープ数を増大する。あるいは、ＨＣＶエピトープ由来のアミノ酸配列は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端で、非ＨＣＶアミノ酸配列に連結され得、よって、ポリペプチドは融合ポリペプチドである。ポリペプチドのアナログ型は、他の指摘されるウイルスタンパク質由来のエピトープを用いて構築され得る。
【００５４】
「個体」は、脊椎動物、特に哺乳類種のメンバーのことであり、げっし類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、および霊長類（例えば、チンパンジー、アフリカミドリザル、ヒヒ、オランウータン、およびヒト）を包含するが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書に使用されているように、「処置」とは、任意の（ｉ）従来のワクチンとしての、感染あるいは再感染の予防、（ｉｉ）ＨＣＶ感染状態に関連する１つ以上の症候の軽減あるいは除去、および（ｉｉｉ）ウイルスの実質的あるいは完全な除去のいずれかのことである。処置は、予防的（感染前）あるいは治療的（感染後）に有効であり得る。
【００５６】
本明細書に使用されているように、「生物学的試料」とは、個体から単離した組織試料あるいは液体試料のことであり、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液；皮膚、気道、腸管、生殖管の外部切片；涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、生検、およびインビトロ細胞培養構成要素の試料（細胞培養培地における細胞、例えば、Ｍａｂ産生ミエローマ細胞、組換え細胞、および細胞成分、の増殖から得られる馴化培地を包含するがこれらに限定されない）を包含するが、これらに限定されない。
【００５７】
組成物あるいはワクチンに対する「免疫応答」は、標的抗原をコードする細胞内感染因子に対する、細胞性および／または抗体仲介免疫応答の宿主中での進展である。通常、このような応答は、個々の産生細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＢ細胞、および／または標的抗原を発現する抗原提示細胞に対して特異的な種々のクラスのＴ細胞を含む。
【００５８】
（Ｂ．発現系）
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の利用性により、これらのポリペプチドをコードする発現ベクターの構築が可能になる。融合型であっても成熟型であっても、そして分泌を行わせるシグナル配列を含んでも含まなくても、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡが、任意の好都合な宿主に適した発現ベクターに連結され得る。真核および原核宿主系の両方が、組換えポリペプチドを形成するために現在使用されており、そしてより一般的な制御系および宿主細胞系のいくつかの概要が下記に記載されている。次いで、ポリペプチドが、溶解細胞あるいは培地から単離され、そして意図される用途のために必要な程度にまで精製される。精製は、当該分野で公知の技術、例えば、分離抽出、塩分画、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離などによって行われ得る。例えば、タンパク質精製のための種々の方法については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。このようなポリペプチドは診断薬として使用され得、あるいは、中和抗体を生じさせるポリペプチドがワクチンに処方され得る。これらのポリペプチドに対して誘起された抗体は診断薬として、あるいは受動免疫療法に使用され得る。
【００５９】
原核および真核宿主細胞の両方が、指摘宿主に適合した適切な制御配列が使用されると
き、所望のコーディング配列の発現のために使用され得る。このような発現のための方法は、当該分野で公知である。原核宿主中では、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に使用される。原核生物用の発現制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター部分、およびリボソーム結合部位を含有する。原核宿主に適した転移ベクターは、一般的に、例えば、ｐＢＲ３３２、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含有するプラスミド、および種々のｐＵＣベクター（これもまた抗生物質耐性マーカーを与える配列を含有する）由来である。これらのマーカーは、選択によって成功した形質転換体を得るために使用され得る。通常使用される原核制御配列は、Ｂ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）  １９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）、およびλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）  ２９２：１２８）、および、ｔｒｐおよびｌａｃ  ＵＶ５プロモーター配列由来のハイブリッドｔａｃプロモーター（Ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）２９２：１２８）を含む。前記の系は特にＥ．ｃｏｌｉに適し、所望であれば、バチルスあるいはシュードモナス株のような他の原核宿主が、対応の制御配列とともに使用され得る。
【００６０】
真核宿主は、培養系中の酵母および哺乳類細胞を包含する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓは最も一般的に使用される酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求株に原栄養性を付与するかあるいは野生型株に重金属耐性を付与することによって、成功した形質転換体の選択を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベクターは、２μ複製起点（Ｂｒｏａｃｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９８３）１０１：３０７）、ＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組み合わせ、あるいは、適切なフラグメントが宿主細胞ゲノムへ取り込まれる結果となる配列のような、複製を確実にする他の手段を使用し得る。酵母ベクターに対する制御配列は、当該分野で公知であり、解糖酵素の合成のためのプロモーターを含む（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ（１９６８）７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７８）１７：４９００）。このプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーターを含む（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７３）。エノラーゼ遺伝子由来もののようなターミネーターもまた含まれ得る（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：１３８５）。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターあるいはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）制御プロモーター、さらにＧＡＰＤＨ由来のターミネーター、および分泌が所望されれば酵母α因子からのリーダー配列を含む制御系である。さらに、作動可能に連結される転写制御領域および転写開始領域は、野生型生物では天然には会合されないようなものであり得る。これらの系は、１９８４年１０月３日に公開された欧州特許公開（ＥＰＯ）第１２０，５５１号、１９８４年８月２２日に公開された欧州特許公開（ＥＰＯ）第１１６，２０１号、および１９８５年１２月１８日に公開された欧州特許公開（ＥＰＯ）第１６４，５５６号に詳細に記載されていて、これらは全て譲渡人に譲渡されており、本明細書に参考として援用されている。
【００６１】
発現用宿主として入手可能な哺乳類細胞系は当該分野で公知であり、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、新生仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、および他多くの細胞系を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を包含する。哺乳類細胞用の適切なプロモーターもまた当該分野で公知であり、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）に由来のプロモーターのような、ウイルスプロモー
ターを包含する。哺乳類細胞はまた終止配列およびポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増加するエンハンサー配列もまた含まれ得、遺伝子増幅を引き起こす配列もまた望ましいとされ得る。これらの配列は当該分野で公知である。
【００６２】
哺乳類細胞での複製に適したベクターは当該分野で公知であり、ウイルスレプリコン、あるいはＮＡＮＢＶエピトープをコードする適切な配列を宿主ゲノム中に確実に組み込ませる配列を含み得る。
【００６３】
外来ＤＮＡを発現するために使用され、ワクチン調製に使用され得るベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合、異種ＤＮＡがワクシニアゲノム中に挿入される。ワクシニアウイルスゲノムに外来ＤＮＡを挿入するための技術は当該分野で公知であり、例えば、相同的組換えを利用する。異種ＤＮＡの挿入は、一般的に天然では必要でない遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）中であり、これはまた選択マーカーを提供する。組換えウイルスの構築を多大に促進するプラスミドベクターが記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８４）４９：８５７：Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３；Ｍｏｓｓ（１９８７）ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．），ｐ．１０を参照のこと）。次に、ＨＣＶポリペプチド発現が、細胞、あるいは生組換えワクシニアウイルスで免疫される個体で起こる。
【００６４】
真核あるいはウイルスゲノム発現のための他の系は、昆虫細胞およびこれらの細胞での使用に適したベクターを包含する。これらの系は当該分野で公知であり、例えば、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現転移ベクターを含み、これは、例えば、培養におけるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞での使用のための、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクターである。この系由来の発現ベクターは、異種遺伝子の発現を操作するために、強ウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを通常使用する。外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するために、最近最も一般的に使用される転移ベクターはｐＡｃ３７３である（図７０）。当業者に公知の他の多くのベクターもまた、改良発現用に設計された。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＡＴＴから下流にＢａｍＨＩクローニング部位３２塩基対を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が含まれる。
【００６５】
異種ＤＮＡのバキュロウイルス中の所望の部位への導入方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６−２１６５．；および、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと。）例えば、挿入は、相同的組換えにより、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子へなされ得る。挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に施された制限酵素部位へなされ得る。
【００６６】
（Ｃ．ＨＣＶのワクチン処置）
本発明の１つの実施態様では、ＳＬＦ−−Ｇモチーフを含有する抗原決定基に対して特異的な抗体を結合する領域を有するポリペプチドで構成される免疫原性組成物が、そのモチーフを含有する１つまたは複数のＨＣＶ抗原決定基に対する免疫応答性を刺激するためのワクチン適用に使用される。好ましくは、ポリペプチドは、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１６１２６号；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４２−４８；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：３
４６８−７２；Ｗｅｉｎｅｒら、（１９９２），Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２：３０３−０８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに開示されている特異的Ｅ２ＨＶ配列を含有しない。
【００６７】
予備的な証拠は、Ｅ２／ＮＳ１の１つまたは複数の超可変ドメインが逸出変異体に起因し得、それが慢性ＨＣＶ感染に導くことを示唆する。しかし、超可変領域中の保存領域は、その保存領域が重要な機能を有し、ウイルス結合および／または宿主細胞への侵入および／または宿主細胞での複製に必須の役割をなすことを示唆する。ウイルス結合では、その結合が、細胞、および／または、ウイルスの結合および／または侵入および／または複製を促進する別の分子と行われ得ることが予想される。以下に示す実施例は、トランスチレチンおよび／または甲状腺結合グロブリン（ＴＢＧ）へのウイルス結合が、感染過程に関与することを示唆する。従って、保存ＳＬＦ−−Ｇ配列を含有する抗原決定基に対する免疫応答を増大することは、ＨＣＶ感染の予防および／または軽減だけではなく、ＨＣＶ感染の慢性化の減少を導き得る。さらに、保存領域はまた、ＳＬＦ−−Ｇモチーフを有する領域を有する免疫反応性ポリペプチドで構成されるワクチンが交差反応性であり得ることを示唆する。
【００６８】
ワクチンの好ましい適用では、本明細書に記載のポリペプチド組成物は、他のＨＣＶサブユニット抗原、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０８７３４号に記載の抗原と組み合わせられる。組成物がＨＣＶ処置のために使用される場合には、この組成物は免疫原性であることが望ましい。合成ポリペプチドが、適切なエピトープを提供するように正確に配置されているが、免疫原性であるには小さすぎる場合には、そのポリペプチドは、適切なキャリアに連結され得る。このような連結を得るための多くの技術が当該分野で公知であり、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いるジスルフィド結合の形成が包含される（ペプチドがスルフヒドリル基を有さない場合は、これはシステイン残基を付加することにより提供され得る）。これらの試薬は、それ自身と１つのタンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合、およびリジン上のε−アミノ基、あるいは他のアミノ酸中の他の遊離アミノ基を介したアミド結合を生成する。このような種々のジスルフィド／アミド形成試薬は公知である。例えば、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．（１９８２）  ６２：１８５を参照のこと。ジスルフィド結合ではなくチオエーテル用の他の二官能性カップリング試薬。これらのチオエーテル形成試薬の多くは商業的に入手可能であり、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステルを包含する。カルボキシル基は、それ自身と、スクシンイミドあるいは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせて活性化され得る。カップリング抗原のさらなる方法は、欧州特許公開（ＥＰＯ）第２５９，１４９号に記載されているロタウイルス／「結合ペプチド」系を使用する。前述の一覧表は網羅されていることを意味せず、命名された化合物の修飾物も明らかに使用され得る。
【００６９】
宿主に対して有害である抗体の産生をそれ自身誘導しない、任意のキャリアが使用され得る。適切なキャリアは、典型的には大きくて徐々に代謝される高分子；例えば、タンパク質、ラテックス機能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビースなどのような多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのようなポリマーアミノ酸；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子である（以下を参照のこと）。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。
【００７０】
ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される抗原の免疫原性は、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原と会合されたもののような、粒子形成タンパク質と融合あるいは会合されて、真核系でそれらを調製することにより増大され得る。米国特許第４，７２２，８４０号を参照のこと。これらの構築物はまた、ＳＶ４０−ジヒドロ葉酸レダクターゼベクターを用いて、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞で発現され得る（Ｍｉｃｈｅｌｌｅら（１９８４），ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＮ  ＶＩＲＡＬ  ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ）。
【００７１】
さらに、粒子形成タンパク質コーディング配列の一部は、ＨＣＶ超可変ドメイン由来のＳＬＦ−−Ｇエピトープをコードするコドンと置換され得る。この置換で、酵母あるいは哺乳類中で免疫原性粒子を形成するユニットの凝集を仲介するのに必要とされない領域が欠失され得る。従って、さらなるＨＢＶ抗原性部位を、１つまたは複数のＨＣＶエピトープとの競合から除去する。
【００７２】
これらのワクチンは予防的（感染を予防するため）あるいは治療的（感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
【００７３】
このようなワクチンは、通常は、組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生をそれ自身が誘導しない任意のキャリアを包含する「薬学的に受容可能なキャリア」と組み合わせて、単数の抗原あるいは複数の抗原を含有する。適切なキャリアは、典型的には大きくて徐々に代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴あるいはリポソーム）、および不溶性ウイルス粒子である。このようなキャリアは当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは、免疫刺激因子（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、抗原は、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体からのトキソイドのような、細菌トキソイドと複合体化され得る。
【００７４】
組成物の効果を増強するための好ましいアジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）油中水エマルジョン処方物（ムラミルペプチド（下記を参照のこと）あるいは細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激剤を含有するあるいは含有しない）、例えば、（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（要求されないが、必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下記を参照のこと））を含有する、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）マイクロフルイダイザーによりサブミクロンエマルジョンにするか、あるいはボルテックスして大きな粒子のエマルジョンにされるかいずれかの、１０％  Ｓｑｕａｌａｎｅ、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下記を参照のこと）を含有する、ＳＡＦ、および（ｃ）２％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および、モノホスホリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ  ＋  ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）よりなる群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、あるいはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のような、それらから生成された粒子；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン；および（６）組成物の効果を促進するための免疫刺激因子として作用する他の物質を包含するが、それらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９が好ま
しい。
【００７５】
上記のように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するが、これらに限定されない。
【００７６】
免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は典型的に、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどのような希釈剤を含有する。さらに、湿潤あるいは乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このような媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）に存在し得る。
【００７７】
典型的には、免疫原性組成物は、液体溶液あるいは懸濁液のいずれかとして、注射可能に調整され得る。注射の前に液体媒体に入れて溶液あるいは懸濁液とするのに適切な固形形態もまた、調製され得る。調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアについて上記で考察したように、アジュバント効果を増強するために、乳化され得るかあるいはリポソーム中にカプセル化され得る。
【００７８】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原性ポリペプチド、および上記のいずれもの他の成分を必要であれば含有する。「免疫学的に有効な量」は、単回あるいは連続投与の一部として個体に投与される量が、治療に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康あるいは生理的状況、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御程度、ワクチンの処方、処置医の医学的な状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。その量は、規定の試験により決定され得、比較的広範囲に及ぶことが予想される。
【００７９】
免疫原性組成物は、例えば、皮下あるいは筋肉内注射により、都合よく非経口投与される。投与の他の様式に適したさらなる処方剤は、経口および肺処方剤、坐薬、および経皮塗布剤を包含する。投与処置は単回投与スケジュールあるいは複数回投与スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と合わせて投与され得る。
【００８０】
上記に加えて、ＳＬＦ−−Ｇモチーフを有する領域で構成される組換えポリペプチドを発現する弱毒微生物の生ワクチンを調製することもまた可能である。適切な弱毒微生物は当該分野で公知であり、例えば、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）および細菌を包含する。
【００８１】
さらに、保存モチーフＳＬＦ−−Ｇで構成される抗原決定基を有するポリペプチドを含有するワクチンは、他の免疫調節剤、例えば、免疫グロブリンと合わせて投与され得る。
【００８２】
（Ｄ．抗体）
本発明のさらなる実施態様では、上記のように調製された免疫原性ポリペプチドは、ポリクローナルおよびモノクローナルを含む、抗体を産生させるために使用される。ポリクローナル抗体が所望であれば、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど）を、１つまたは複数のＨＣＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫する。免疫された動物からの血清を採集し、公知の手順に従って処理する。ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に対するポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有するときは、ポリクローナル抗体はイムノ
アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清の産生およびプロセッシングの方法は当該分野で公知であり、例えば、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ（１９８７）を参照のこと。
【００８３】
あるいは、ポリクローナル抗体は、ＨＣＶで予め感染された哺乳動物から単離され得、そして、ＳＬＦ−Ｇ−モチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に対して特異的な抗体が単離され得る。ＨＣＶエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体もまた当業者により容易に生産され得る。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体作成の一般的な方法は周知である。不死化抗体産生細胞系は細胞融合により創製され、また、Ｂリンパ球の癌遺伝子ＤＮＡでの直接形質転換、あるいはエプスタイン・バールウイルスでのトランスフェクションのような他の方法によっても創製される。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０），ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９８１）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＥＩＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ：Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳを参照のこと；また、米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号、および第４，４９３，８９０号を参照のこと。ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される１つまたは複数のＨＣＶエピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性について、すなわち、イソタイプ、エピトープ親和性などについてスクリーニングされ得る。
【００８４】
ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される１つまたは複数のＨＣＶエピトープに対して特異的な抗体（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）は、特に診断に有用であり、そして中和する抗体は受動免疫療法に有用である。特に、モノクローナル抗体は、抗イディオタイプ抗体を誘起するために使用され得る。
【００８５】
抗イディオタイプ抗体は、防御が所望される感染因子の抗原の「内部イメージ」を有する免疫グロブリンである。例えば、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（１９８１）２１：３９７−４０６；およびＤｒｅｅｓｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ（１９８５）１５１：７６１を参照のこと。抗イディオタイプ抗体を誘起する方法は当該分野で公知である。例えば、Ｇｒｚｙｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１６：７４、ＭａｃＮａｍａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２６：１３２５、およびＵｙｔｄｅｈａａｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８５）１３４：１２２５を参照のこと。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、ＨＣＶ感染の処置、ワクチン接種、および／または診断に、および、ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成されるＨＣＶ抗原の１つまたは複数の免疫原性領域の解明に有用である。
【００８６】
（Ｅ．受動免疫）
本発明のさらなる実施態様では、ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に特異的な中和抗体で構成される組成物が、ＨＣＶ感染の予防および／または処置のための個体の受動免疫に使用される。抗体がポリクローナルのときは、活性画分、例えば、特にＩｇＧおよびＩｇＭを分離および濃縮するために、投与の前に抗体調製物を分画するのが好ましい。抗体の種々の画分を分離する技術は当業者に周知であり、規定の方法のみを必要とする。モノクローナル抗体が受動免疫に使用されるときには、１つ以上のＨＣＶ抗原決定基に特異的な種々のモノクローナル、およびＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される１つまたは複数の抗原決定基に特異的な抗体を含むことが好ましいとされ得る。
【００８７】
受動免疫の方法およびプロトコールは当該分野で公知であり、上記に記載のいくつかの参考文献で考察されている。一般的には、抗体は適切な賦形剤と混合される。抗体は、単回あるいは複数回投与、および有効な量で与えられ得る。一般的には、抗体が投与される
個体間で異なるので、投与量およびレジメは、投与を管理する者により決定される。
【００８８】
（Ｄ．診断アッセイ）
診断適用には、抗原として本発明の組成物を使用するのが有用であり得、それにより、種々のＨＣＶ分離株に対する抗体を検出する能力を改良する。典型的には、ポリペプチドは均一あるいは不均一イムノアッセイフォーマットに直接使用され得、後者は、好ましくは、固体基質（例えば、マクロタイタープレートウエル、プラスチックビーズ、ニトロセルロースなど）上にポリペプチドを固定することを包含する。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０８９号、欧州特許公開（ＥＰＯ）第３６０，０８８号；ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ（前出）を参照のこと。これらのＳＬＦ−−Ｇモチーフを有する領域を含むポリペプチドで構成される免疫原性組成物は、生物学的試料（例えば、血液あるいは血清試料を含む）中の抗ＨＣＶ抗体を検出するために使用される。イムノアッセイは、ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される抗原決定基を有する少なくとも１つの抗原を使用する。ＳＬＦ−−Ｇモチーフをで構成される抗原決定基に特異的な抗体が、生物学的試料中で、このモチーフを有する抗原を検出するために使用され得ることもまた予想される。イムノアッセイの設計には多数の変形があり、これらの多様性は当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコールは、例えば、競合、あるいは直接反応、あるいはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコールはまた、例えば、固体支持体を使用し得るか、あるいは免疫沈降法によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識抗体あるいはポリペプチドの使用を包含する。その標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射性、あるいは染料分子であり得る。プローブからシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。その例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、および、ＥＬＩＳＡアッセイのような、酵素標識および仲介イムノアッセイである。
【００８９】
免疫診断に適した適切な標識試薬を含有するキットが、適切な容器に入れられた本発明の組成物を含む適当な材料、アッセイを実施するために必要な残りの試薬および材料（例えば、適切な緩衝液、塩類溶液など）、およびアッセイの適切な使用説明書一式を包装することにより、組まれている。
【００９０】
（Ｅ．遺伝子療法）
本発明の別の実施態様では、ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＨＣＶ感染を予防および／または軽減するための個体の遺伝子療法の目的に使用される。ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される領域を含む免疫原性ポリペプチドをコードする配列が、転写制御領域に作動可能に連結される。転写制御領域は当該分野で公知である。
【００９１】
本発明のある実施態様では、転写制御領域はハイブリッドであり得、エンハンサー領域、多量体転写因子結合部位（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）（例えば、ＮＦ−ＡＴおよび／またはＮＦＫＢ）、分泌シグナル、あるいは組換えポリヌクレオチドを有する細胞の選択を可能にする正のマーカー（ｍａｒｔｈｅｒｓ）を含む。
【００９２】
複製のための原核あるいは真核宿主細胞への導入用に調製されたポリヌクレオチド構築物は、宿主により認識される複製系を含み、所望のポリペプチドをコードする意図された組換えポリヌクレオチドフラグメントを含む。このようなベクターは、当該分野で公知であって、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）あるいはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）で考察されている標準的な組換え技術により調製され得る。
【００９３】
本発明のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、いくつかの方法で個体に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、宿主細胞、例えば、樹状細胞あるいは皮
膚生検からの細胞に、エキソビボ導入され得る。組換えポリヌクレオチドを含有する細胞は、個体に免疫を与えるために使用され得る。細胞は通常、注入によって投与され、各注入は、少なくとも１０６〜１０１０細胞／ｍ２の範囲、好ましくは少なくとも１０７〜１０９細胞／ｍ２の範囲である。クローンは、単回注入にって投与され得るか、ある期間にわたる複数回注入によって投与され得る。しかし、個々の個体は応答性において変化が予想されるので、注入される細胞のタイプおよび量、ならびに注入回数および複数回注入が与えられる期間範囲は、診察している医師または獣医により決定され、そして規定通りの試験により決定され得る。
【００９４】
ＳＬＦ−−Ｇモチーフで構成される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用を含む形質導入を包含する当該分野で公知の方法によって、そして特に当該分野で公知のレトロウイルス遺伝子転移方法を用いて、所望の細胞にエキソビボ導入され得る。
【００９５】
遺伝子送達のために組換え感染ウイルス粒子を利用する、当該分野で公知の種々の感染技術が開発されてきた。レトロウイルスベクターは、真核細胞への遺伝子転移に非常に有効な方法を提供する。多くのレトロウイルベクター構築物が、多くの外来遺伝子を発現させるために首尾よく使用されてきた（例えば、Ｃｏｆｉｎ，ｉｎ  Ｗｅｉｓｓら（編）、ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，第二版、ｖｏｌ．２（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，ｐｐ．１７−７１）を参照のこと）。
【００９６】
本発明の他の実施態様では、ＳＬＦ−−Ｇモチーフを含む免疫原性ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、処置および／または免疫されるべき個体に直接導入される。これらの実施態様では、ポリヌクレオチドは発現ベクター形態、およびより好ましくは環状プラスミド形態であることが好ましい。ポリヌクレオチドは適切な賦形剤と混合され、そして例えば、非経口（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、および皮下を含む）摂取、リポフェクション、および経皮を包含する当該分野で公知の任意の適切な手法により投与される。
【００９７】
（Ｆ．実施例）
例示目的のみで提供されており、そして本発明の範囲を限定しない実施例を、以下に記載する。本発明の開示を考慮すると、請求の範囲の範囲内にある多くの実施態様が当業者には明白である。
【実施例１】
【００９８】
（Ｅ２ＨＶ中の保存モチーフの同定）
Ｅ２ＨＶドメイン内の１つまたは複数の保存モチーフは、保存特性について世界中からの分離株由来の９０のＥ２ＨＶ配列を調査することにより同定された。調査されたＨＣＶ配列を図２に示す。調査は、Ｅ２ＨＶ配列の有意な可変性を示した。
【００９９】
ＨＣＶ感染後に引続く患者からのＥ２ＨＶ配列データは、変異が、アミノ酸３９５から４０７の間で高頻度に、そして時間とともに、Ｅ２ＨＶドメインの残りの部分を通して現れることを示している。図３を参照のこと（この図は、３人の患者についての配列データを示す：Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ（Ｈ）（Ｏｇａｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：３３９２−３３９６）；ＨＣ−Ｊ４（Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：３３１−３４１）；およびＮＹ／ＲＳ（Ｋａｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９２）１８１：２７９−２８５））。
【０１００】
患者ＲＳは、異なるパターンの時間経過に伴って集積される点突然変異のより少ない無作為な分布を有するようであることもまた、図３より観察される。アミノ酸置換のＲＳパターンは、ＨＣＶ感染患者の一部、および慢性感染チンパンジーで観察された（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２（前出）を参照のこと）。例えば、患者ＲＳおよびＮＹにおける時間に伴って集積される変異パターンの差違については、ＲＳのような個体は１つまたは複数のＥ２ＨＶエピトープに対して抗体を生じないことによって説明される。正の免疫選択が起こらない場合、配列は、ＨＣＶ変異体進化の類似種分布として無作為に変異する。ＨＣＶ抗原に対して免疫応答が乏しい慢性感染チンパンジーは、患者ＲＳと類似するＥ２ＨＶ変異パターンを示した。
【０１０１】
配列調査の結果を図４に示し、それは、アミノ酸３８４から４０７の特性の保存の程度を示す。２つのＥ２ＨＶ配列は同一ではないが、アミノ酸４０１から４０３および４０６から４０７は、それらの位置のアミノ酸の特性について強く保存されている。アミノ酸４０１は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、あるいはＴであり；アミノ酸４０２は、Ｌ、Ｆ、Ｉ、Ｍ、あるいはＷであり；アミノ酸４０３は、ＦあるいはＬであり；アミノ酸４０６は、ＧあるいはＡであり；アミノ酸４０７は、Ａ、Ｐ、あるいはＳである。調査された９０配列中のこれらの位置のアミノ酸の相対分布を、表２に示す。
【０１０２】
【表２】
2005325126.tif 000003
【実施例２】
【０１０３】
（ＨＣＶ１  Ｅ２ＨＶエピトープのマッピング）
Ｅ２／ＮＳ１のＥ２ＨＶ領域のエピトープマッピングについては、次の改変を伴って、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／００３６５号を参照のこと。ピンに接続されたＨＣＶ１の３８４から４１３のアミノ酸位にわたる配列由来の重複ペプチドを調製した。そのペプチドは、同じ領域由来の複合体化３０量体ペプチドで免疫したヒツジからのＩｇＧ調製物と反応し
た。
【０１０４】
抗ＨＶ  Ｅ２抗体を含有するヒツジＩｇＧ調製物は、ジフテリアトキソイドに結合されたペプチドで免疫したヒツジから調製した。そのペプチドは、ＨＣＶ１  Ｅ２ＨＶ領域にわたり、次の配列を有した：
アセチル−Ｃ−Ｂ−Ｅ−Ｔ−Ｈ−Ｖ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｓ−Ａ−Ｇ−Ｈ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｖ−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｋ−Ｑ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−Ｌ−酸
ここで、Ｂはブチルアラニンである。
【０１０５】
複合体化３０量体で免疫したヒツジからのヒツジ血清ＩｇＧ  ｓ１６３４−２およびｓ１６３５−２を用いるスクリーニングの結果を図５に示す。結果は、ヒツジ１６３４−２
ＩｇＧが最小（ｍｉｎｕｍｕｍ）エピトープ４００ＶＳＬＬＡ４０４と反応することを示す。ヒツジ１６３５−２からのＩｇＧは、より広範囲の反応性プロフィールを有し、血清は、最小４００ＶＳＬＬＡ４０４エピトープを含むペプチドと反応し、さらに、最小エピトープ４０１ＳＬＬＡＰＧＡ４０７および４０３ＬＡＰＧＡ４０７を含むペプチドと反応する。従って、Ｅ２ＨＶの３０量体ペプチドで免疫したヒツジからのＩｇＧ調製物は、アミノ酸４００から４０７の間の１つまたは複数の直鎖状エピトープと反応する。
【０１０６】
Ｅ２ＨＶの保存領域内では、ＨＣＶ１の保存モチーフ配列は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−ａａ４−ａａ５−Ｇ−（Ａ／Ｐ／Ｓ）である。Ｓ−Ｌ−Ｆ−ａａ４−ａａ５−Ｇ−（Ａ／Ｐ／Ｓ）モチーフ中でのＬのＦへの置換は、アミノ酸特性に関して保存性である。
【０１０７】
この実施例で使用される方法を以下に記載する。
【０１０８】
（重複ペプチドの合成）
重複ペプチドの合成は以下のようであった。１つのブロック上に８×１２配列で並べた特別に調製され誘導体化されたポリエチレンピン（Ｃｏｓｅｌｃｏ  Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、室温で３０分間、そのピンを浴中（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％  ｖ／ｖピペリジン）に入れることによって調製した。次に、そのピンを取り出し、ＤＭＦ中で５分間洗浄し、次に、メタノール中で４回洗浄した（１回の洗浄あたり２分間）。ピンを少なくとも１０分間風乾し、次に、ＤＭＦ中で最後の洗浄を行った（５分間）。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、３６７  ｍｇ）を、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸の結合での使用のために、ＤＭＦ（８０  ｍｌ）中に溶解した：Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｏｐｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ）−ＯＰｆｐ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＤｈｂｔ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＰｆｐ、およびＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ−ＯＰｆｐ。
【０１０９】
保護アミノ酸を、ＨＯＢｔとともにマイクロタイターウエルに移し、ピンブロックをプレートの上にのせ、ウエル中にピンを浸した。その組み立てたものを、次にプラスチック袋中に封入し、２５℃で１８時間反応させて第一アミノ酸をピンに結合させた。次に、ブロックを取り出し、ピンを、ＤＭＦ（２分）、ＭｅＯＨ（４×２分）で洗浄し、そして再度ＤＭＦ（２分）で洗浄して清澄化し、結合アミノ酸を脱保護した。全８量体が調製されるまで、結合される各付加アミノ酸についてこの手順を繰り返した。次に、ほとんどのエ
ピトープがＮ末端に認められず、従って会合正電荷を有さないので、遊離アミドを補償するために、遊離Ｎ末端をアセチル化した。アセチル化は、マイクロタイタープレートのウエルを、ＤＭＦ／無水酢酸／トリエチルアミン（５：２：１  ｖ／ｖ／ｖ）で満たし、ピンを２０℃で９０分間ウエル中で反応させることにより完了した。次に、そのピンをＤＭＦ（２分）およびＭｅＯＨ（４×２分）で洗浄し、少なくとも１０分間風乾した。
【０１１０】
ピンを、室温で４時間、ポリプロピレン袋中でトリフルオロ酢酸／フェノール／ジチオエタン（９５：２．５：２．５，ｖ／ｖ／ｖ）で処理して、側鎖保護基を除去した。次に、ピンをジクロロメタン（２×２分）、５％  ジ−イソプロピルエチルアミン／ジクロロメタン（２×５分）、ジクロロメタン（５分）中で洗浄し、そして少なくとも１０分間風乾した。次に、ピンを水（２分）、ＭｅＯＨ（１８時間）で洗浄し、真空乾燥し、シリカゲルを入れた密封プラスチック袋に保存した。
【０１１１】
（結合アッセイ）
ペプチドへの結合をアッセイするために、上記記載のように調製した８量体保有ピンをまず、６０℃において破砕緩衝液（１％  ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％  ２−メルカプトエタノール、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４）中で３０分間音波処理することにより処理した。次に、ピンを水（６０℃）に数回浸し、その後ＭｅＯＨを煮沸し（２分）、そして風乾させた。
【０１１２】
次に、ピンを、２５℃にて１時間、２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中の、１％  オボアルブミン、１％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、および０．０５％
ＮａＮ３）を含むマイクロタイターウエル中で撹拌しながら、プレコートした。次に、ピンを、Ｅ２ＨＶペプチドで免疫したヒツジから得た２つのＩｇＧ調製物を含むマイクロタイターウエルに浸した。
【０１１３】
（抗ＨＣＶ  ＨＶ  Ｅ２抗体含有ＩｇＧの調製）
ヒツジＩｇＧおよび複合体化ペプチドの調製は以下のようであった。ヒツジを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の５０〜１００  ｎｍｏｌの複合体化ペプチドで免疫した。１４日後にそのヒツジに２回目の免疫を施したが、しかし複合体化ペプチドは不完全フロイントアジュバント中であった。３〜４週間後にそのヒツジから採血して、そして血清中のＩｇＧを５０％硫酸アンモニウムで沈降させた。沈澱を集めて、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．３％  トリ−Ｎ−ブチルホスフェート（ＴＮＢＰ）を含有する溶液で処理した。処理後に、界面活性剤を、５０％硫酸アンモニウムでＩｇＧ画分を沈澱させて回収し、その沈澱物を５０％硫酸アンモニウム含有溶液で２回洗浄し、その後、可溶化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２日間透析することにより、除去した。得られたＩｇＧ調製物を、免疫に使用する前にフィルターに通過させて滅菌した。
【０１１４】
（ジフテリアトキソイドキャリアタンパク質のＭＣＳへの結合）
ペプチド−ジフテリアトキソイド複合体を、以下のプロトコールによって調製した。
【０１１５】
（材料：）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ  Ｎａ２．２Ｈ２Ｏ）（ＭＷ  ３７２）
６−マレイミド−カプロン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）（Ｓｉｇｍａ）−９５％純度
オルトリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）
窒素
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水
５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有の０．１  Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ６．６６
０．１Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ８．０
０．１Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．０
コハク酸ナトリウム［（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２．６Ｈ２０］
システイン
塩酸（２％溶液）
０．１Ｍ  コハク酸ナトリウム／０．１  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ５．６
精製ジフテリアトキソイド（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、Ｌｅｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）１７：７４９；Ｐａｒｔｉｓら、Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）２：２６３；Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９）１２０：１３３；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９）１２３：２１１に記載されている方法に従って、ＭＣＳに結合させた。ジフテリアトキソイド１００  ｍｌを、Ｇ２５  セファデックスカラム（１７ｃｍ  ×  ４ｃｍ）に通してチオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）を除去した。トキソイドを０．１  Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で溶出し、溶出物のタンパク質含有量をＢＣＡタンパク質測定法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアッセイした。得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットで、最終濃度１０  ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１１６】
トキソイド溶液１  ｍｌを、０．１  Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）で透析し、次に２００μｌ  ＤＭＦ中の１．５ｍｇ  ＭＣＳ溶液と混合した。得られた溶液を暗所にて、適宜撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ＭＣＳ−トキソイドから非結合ＭＣＳを分離するために、溶液を０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．６６）で平衡化したセファデックスＰＤ１０カラムに通し、タンパク質画分を集めた。
【０１１７】
キャリア分子あたり結合されるマレイミド基数は、それにＨＣＶペプチドを結合する前に測定した。３０ｍｌのコハク酸／ＥＤＴＡ緩衝液を窒素で２分間スパージングした。５ｍｇのシステインを２５ｍｌ容フラスコに移し、最終容量２５ｍｌのスパージングされた緩衝液に溶解した。表３に示す溶液のアリコートを、２５ｍｌのねじぶた式のビンに２組で移した。分離ピペットを用いて、各々のアリコートに窒素をバブリングした。次に各ビンを密閉し、暗所で４０分間、適宜撹拌しながら室温にてインキュベートした。
【０１１８】
【表３】
2005325126.tif 000004
【０１１９】
（スルフヒドリル定量測定のためのエルマン試験）
必要な材料：
リン酸緩衝液、ｐＨ  ８．０
１５．６ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４あるいは１２．０  ｇの無水ＮａＨ２ＰＯ４を約７００  
ｍｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ水に溶解する。５０％  ＮａＯＨを用いてｐＨ  ８．０に調整する。Ｍｉｌｌｉ  Ｑウォーターを加えて最終容量を１０００  ｍｌにし、次に必要であればｐＨを調整する。
エルマン試薬
１０．０  ｍｇの５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）を、２．５
ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）に溶解する。
【０１２０】
０．１  ｍｌのエルマン試薬を、上記のように調製した、すなわち、試料溶液、標準溶液、およびブランク（ｂｌａｎｄ）溶液の各０．１  ｍｌアリコートに加えた。次に、５
ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）を各アリコートに加え、よく混合して１５分間静置した。各アリコートの吸光度を、１  ｃｍ光路長セル中で４１２  ｎｍで測定した。
【０１２１】
キャリアタンパク質上に存在するマレイミド基数を次の方法に従って測定した。溶液１ｍｌあたり０．０１μｍｏｌの−ＳＨは、１  ｃｍ光路長セル中で４１２  ｎｍで吸光度０．１３６を示す。標準あるいは試料（Ａ）の吸光度は、活性化キャリアタンパク質上の結合マレイミド基と反応したシステインの量に等しい。１  ｍｏｌの有効−ＳＨが１  ｍｏｌのマレイミドと反応するので、試験されるアリコート中に存在するマレイミド基μｍｏｌ濃度は、Ａ（０．０１）／０．１３６μｍｏｌ／ｍｌに等しい。溶液の総容量は５．２  ｍｌであった。従って、存在するμｍｏｌ総数は、Ａ（０．０１）（５．２）／０．１３６に等しかった。試料溶液は総容量１．３  ｍｌで、そのうち０．３  ｍｌは活性化キャリアタンパク質からなるものであった。試料溶液に存在するマレイミド基数は、Ａ（０．０１）（５．２）（１．３）／（０．１３６）（０．１）（０．３）＝  Ａ（１６．５７）μｍｏｌ／ｍｌとして計算された。ＭＣＳ−活性化キャリアタンパク質は−２０℃で貯蔵した。
【０１２２】
（ＨＣＶペプチドの還元）
ＨＣＶペプチドをＭＣＳ−活性化キャリアタンパク質に結合する前に、ペプチドに存在するチオール基が完全還元−ＳＨ型であるのを確実にするように、ペプチドを還元した。必要な材料：
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、メタノール
ＳＥＰ−ＰＡＫ（Ｃ１８カートリッジ、水）、各８  ｍｇペプチドにつき１カートリッジ０．１  Ｍ  炭酸水素アンモニウム緩衝液
１  Ｌ  Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水に７．９  ｇ  ＮＨ４ＨＣＯ３を溶解する。
緩衝液Ａ；Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水中の０．１％  ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ；６０％  ｖ／ｖアセトニトリル、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ水中の                    
０．１％  ｖ／ｖ  ＴＦＡ
１５  ｍｇのＨＣＶペプチドを、１０倍モル過剰のＤＴＴを含有する０．１  Ｍ  炭酸水素アンモニウム２．５  ｍｌに加えた。得られた溶液をペプチドが溶解するまで混合し、次に室温で１時間静置した。１組のＳＥＰ−ＰＡＫを一並びに接続し、この１組のＳＥＰ−ＰＡＫに約２０  ｍｌのメタノールそして２０  ｍｌの緩衝液Ａを通すことにより活性化した。ペプチド／ＤＴＴ試料を１組のＳＥＰ−ＰＡＫにゆっくり通過させた。ＤＴＴを約２０  ｍｌの緩衝液Ａで溶出した。還元ペプチドを７  ｍｌの緩衝液Ｂで、予め秤量したビンに溶出し、次に一晩凍結乾燥した。そのビンを秤量して回収ペプチド量を測定した。そして直ちに、還元ペプチドをＭＣＳ活性化キャリアタンパク質に結合させた。
【０１２３】
（ＨＣＶペプチドのＭＣＳ活性化キャリアタンパク質への結合）
５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含む約１００  ｍｌの０．１  Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ６．６６）を真空下で脱気し、１０分間窒素でスパージングした。１０  ｍｇ／ｍｌのＭＣＳ活性化キャリアタンパク質溶液２０  ｍｌを、過剰に泡立たないように注意深く窒素でスパージングした。５  ｍｇの還元ペプチドを、約０．２  ｍｌの脱気スパージングされたリ
ン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ  ６．６６）に溶解し、次いでＭＣＳ活性化キャリアタンパク質溶液と混合した。得られた混合物をねじぶた式ビンに移し、次いでその中に窒素を満たし密閉した。ビンをＢｒａｎｓｏｎ  ２０００（登録商標）音波処理浴中に２分間保持して、その溶液をさらに脱気した。そのビンをアルミ箔で覆い、振盪台上でおだやかに撹拌しながら、一晩室温でインキュベートした。
【０１２４】
得られた複合体は可溶性であり、そして非結合ペプチドを、リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ  ６．６６）で平衡化したセファデックスＰＤ  １０カラムにその混合物を通すことにより除去した。タンパク質画分を集めた。キャリアタンパク質に複合体化されたペプチド量をアミノ酸分析により決定した。
【０１２５】
複合体およびキャリアタンパク質の両方の１５０μｌアリコートのアミノ酸分析を実施した。キャリアタンパク質によって単独に与えられたアミノ酸レベルの平均率を測定して、生成された複合体化ペプチド量を算出した。セリン、トレオニン、トリプトファン、メチオニン、チロシン、およびシステインのレベルは、これらのアミノ酸は標準的な加水分解条件下で改変されるので、測定しなかった。
【実施例３】
【０１２６】
（抗チロキシンモノクローナル抗体のＨＣＶ  Ｅ２ＨＶドメインペプチドへの結合）
チロキシン（Ｔ４）に結合するモノクローナル抗体は、Ｄｒ．Ｍａｒｉｏ  Ｇｅｙｓｅｎ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｍｉｍｉｔｏｐｅｓ  Ｌｔｄ，Ａｕｓｔｒａｌｉａにより調製された。これらの抗体のＥ２ＨＶ領域に広がる重複ペプチドへの結合を評価した。ピン上のペプチドは、ＨＣＶ  Ｅ２ＨＶ配列がＨＣＶ１のアミノ酸３８３から４１３にわたること以外は、本質的に実施例２において上述されたように調製した。抗Ｔ４モノクローナル抗体のＨＣＶ  Ｅ２ＨＶミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）への結合を２回実施した。結合結果を図６に棒グラフで示し、無地の棒および陰をつけた棒は２回の各回の試料の結合を示す。図に見られるように、抗Ｔ４抗体は、ａａ３９５からａａ４０７にわたるＨＣＶ１配列内に含まれるエピトープと、免疫学的に反応した。
【実施例４】
【０１２７】
（血清タンパク質のＨＣＶへの結合）
三種の血清タンパク質、ヒトプレアルブミン、ヒト血清アルブミン、および甲状腺結合グロブリン（ＴＢＧ）の、Ｅ２ＨＶにわたる重複ペプチドへの結合を実施した。８量体保有ピンを、実施例１に記載されているように調製した。指摘される血清タンパク質の８量体への結合は、特定のタンパク質に対して特異的な抗体を使用した、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。コントロールは、血清タンパク質なしに、各抗体の存在下に行った。結果は、差異プロットとして、図７に示す。結果に基づくと、トランスチレチンは、超可変領域の少なくとも１つの最小エピトープに結合するようである。さらに、この結果は、ＴＢＧが２つの最小エピトープに結合し、その１つがＳＬＦ−−Ｇモチーフを含むことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ＨＣＶの遺伝子構成の図式である。
【図２Ａ】図２は、９０  ＨＣＶ分離株のＥ２ＨＶ配列を示す。
【図２Ｂ】図２は、９０  ＨＣＶ分離株のＥ２ＨＶ配列を示す。
【図３】図３は、ＨＣＶ感染後に引き続いて起こる個体からのＨＣＶ  Ｅ２ＨＶ配列データを示す。
【図４】図４は、Ｅ２ＨＶの３８４位から４０７位の各アミノ酸の保存割合（パーセント）を示す。
【図５】図５は、ＨＣＶ１  Ｅ２ＨＶ領域に広がるペプチドで免疫したヒツジ由来の血清の同じ領域に広がる８量体重複ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）への結合を示す、エピトープマッピングの棒グラフを示す。
【図６】図６は、モノクローナル抗チロキシン抗体のＥ２ＨＶ領域の重複ペプチドへの結合を示す、エピトープマッピングの棒グラフを示す。
【図７】図７は、ヒト血清アルブミン、プレアルブミン、およびＴＢＧの、Ｅ２ＨＶ領域の重複ペプチドへの結合を示す、エピトープマッピングの棒グラフを示す。
【図１】
2005325126.tif 000005
【図２Ａ】
2005325126.tif 000006
【図２Ｂ】
2005325126.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005325126.tif 000010
【図６】
2005325126.tif 000011
【図７】
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