(57)【要約】      （修正有）【課題】損傷した骨又は罹患した骨の修復誘導方法。【解決手段】損傷した骨又は罹患した骨を修復誘導ために、粉末状の生分解性骨移植構成物の有効量を損傷又は罹患した領域に移植する工程を有し、前記骨移植構成物は脊椎動物の腸部の管腔部から剥離した粘膜下組織又はその消化物からなり、移植前に所定三次元形状に圧縮した粉末状とし、損傷した骨又は罹患した骨に移植する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
温血脊椎動物の骨の修復誘導方法であって、該方法は、前記脊椎動物の修復の必要な部位に生分解性骨移植構成物を有効量移植する工程からなり、前記骨移植構成物は基本的には、移植前に所定三次元形状に圧縮した粉末状の温血脊椎動物の腸管粘膜下組織又はその消化物からなり、前記の圧縮した粉末状の骨移植構成物は移植後その移植構成物が内因性組織に代わるまでその大体の形を維持することを特徴とする方法。
【請求項２】
温血脊椎動物の骨の修復誘導方法であって、該方法は、前記脊椎動物の修復の必要な部位に生分解性骨移植構成物を有効量移植する工程からなり、前記骨移植構成物は基本的には、粉末状の温血脊椎動物の腸管粘膜下組織又はその消化物と生理学的適合性鉱物、成長因子、抗生物質、化学治療剤、抗原、抗体、酵素及びホルモンからなる群から選ばれる生物活性剤とからなり、前記粘膜下組織及び生物活性剤は移植前に所定三次元形状に圧縮し、前記の圧縮した粉末状の骨移植構成物は移植後その移植構成物が内因性組織に代わるまでその大体の形を維持することを特徴とする方法。
【請求項３】
温血脊椎動物の骨の修復誘導に有用な生分解性骨移植構成物の生成における温血脊椎動物の腸粘膜下組織の使用であって、前記骨移植構成物は基本的には粉末状の温血脊椎動物の腸管粘膜下組織又はその消化物からなり、移植前に所定三次元形状に圧縮したもので、前記の圧縮した粉末状の骨移植構成物は移植後その移植構成物が内因性組織に代わるまでその大体の形を維持することを特徴とする使用。
【請求項４】
温血脊椎動物の骨の修復誘導に有用な生分解性骨移植構成物の生成における温血脊椎動物の腸粘膜下組織の使用であり、前記骨移植構成物は基本的には粉末状の温血脊椎動物の腸管粘膜下組織又はその消化物と生理学的適合性鉱物、成長因子、抗生物質、化学治療剤、抗原、抗体、酵素及びホルモンからなる群から選ばれる生物活性剤とからなり、前記粘膜下組織及び生物活性剤は移植前に所定三次元形状に圧縮され、前記の圧縮された粉末状骨移植構成物は移植後その移植構成物が内因性組織に代わるまでその大体の形を維持することを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粉末状骨移植組成物、その製造方法及び使用に関する。更に詳しくは、本発明は、温血脊椎動物の腸管部の筋層及び少なくとも粘膜の管腔部から剥離した粘膜下組織からなる粉末状の非免疫抗原性骨移植組成物に関する。骨組織の損傷部或いは欠損部へ付着させる際に、本発明の骨移植粉末組成物は生体内組織の成長を促し、損傷或いは欠損領域を修復する。
【背景技術】
【０００２】
温血脊椎動物の腸管の粘膜下組織及び粘膜の基底部からなる組成物がシート状組織移植材料として使用可能であることが既に報告されている（例えば、特許文献１参照）。上述の特許で述べられかつ特許請求されている好ましい組成物は、例えばコンプライアンスが高く、破裂圧温度が高く、更に有効な多孔率指数により血管移植構成物に有利に使用できる等、優れた機械的性質を有することを特徴としている。この特許に開示されている移植材料は、腱および靭帯の代替用途にも使用される。このような用途に使用される場合、好ましい移植構成物は、この構成物により置き換えられる組織の再成長のためのマトリックスとして働くと思われる。
【０００３】
更に、腸管の粘膜下組織は、生体親和性を失うことなしに粉砕及び／又はプロテアーゼ消化により流動化されて、修復の必要なホスト組織へのより侵襲性の少ない投与方法（例えば注射による投与又は局所的な投与）で使用することが可能である（例えば、特許文献２参照）。これまで、粘膜下組織からなる粉砕され流動化された腸管組織は損傷した靭帯及び腱の再改造にうまく用いられてきた。この再改造方法を用いた場合共通して言えることは、広範囲にわたる非常に迅速な新生血管形成、顆粒化間葉細胞の増殖、移植された腸管粘膜下組織の生分解及び免疫拒絶反応の欠如が挙げられる。
【０００４】
本出願は温血脊椎動物の骨の修復を誘導する方法を開示している。本方法は、内因性組織の増殖を助けるような条件のもとで、粉末或いは圧縮粉末状の骨移植組成物を修復が必要な部位へと移植する工程からなる。この粉末状骨移植組成物は温血脊椎動物の腸管組織から形成され、更にこの腸管組織は、筋層及び少なくとも粘膜の管腔部から剥離した粘膜下組織又はそのプロテアーゼ消化物からなる。
【０００５】
米国においては、毎年約300,000件に及ぶ骨移植及び骨折修復処置が実施されている。コストが低く、容易に製造可能で、保持しやすい骨移植材料の潜在市場は３億ドル以上と推定されている。このような生体材料は骨折、脳顔面頭蓋の欠損、歯周欠損、関節固定、及び感染又は腫瘍による二次的な骨損失に続く骨格再構築等の修復に有効に用いられる。
【特許文献１】米国特許明細書第4,902,508号
【特許文献２】米国特許明細書第5,275,826号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、新鮮な自己由来の骨が、得られる骨移植材料の中では最も有効な材料である。しかし、骨の自家移植片の使用は幾つかの不利益を伴う。例えば、供給が限られていること、外科的な措置が更に必要であること、更に、採取の際に合併症の発現率が増加すること等が挙げられる。異質遺伝子型の骨移植片も臨床的に用いられているが、この移植組成物は使用の際重大な欠点を有しており、例えば、死体の骨からの取得が限られていること、保存骨の質の問題、およびヒトの疾病が広がる可能性などがその欠点として挙げられる。
【０００７】
ヒドロキシアパタイト、燐酸三カルシウム等のセラミックも検討されているが、これらの物質は骨誘導的というよりは単に骨伝導的なものである。即ち、一般に、移植片及び正常な骨に隣接して新しい骨が形成されるにすぎないのである。更に最近では、可能性のある骨移植材料としてコラグラフトという材料が検討されている。牛のコラーゲン、ヒドロキシアパタイト／燐酸三カルシウム原線維セラミック及び骨髄（患者の腸骨稜から吸引された）からなる複合物である。コラグラフトの欠点は構造的強度に欠けること、それ故に、皮質性移植が必要とされる場合に使用できないという点である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
現在行われている骨修復のための治療方法に伴う欠点故に、それにかわる骨移植材料が切望されている。脊椎動物の腸管の粘膜下組織及び粘膜の基底部からなる組成物が内因性組織の成長を誘導する組織移植材料として使用可能であることが既に報告されている。出願人は、粘膜下組織及び粘膜の基底部からなる粉末状の腸管組織が生体親和性を保持し、骨移植材料として使用可能であることを発見した。これまでの材料に代わる骨移植材料として、この粉末状の材料は、安価で、容易に製造でき、保持しやすい、豊富に存在する生物学的な副産物として役立つ。この材料は骨格組織の再生を誘導及び／又は支持し、先行結果によると、移植された領域の構造的及び機械的結合性は以前から存在している骨の結合性と少なくとも等しいことを示している。
【０００９】
本発明は、粉末状の非免疫抗原性の骨移植組成物を提供するものである。この組成物は、筋層及び少なくとも粘膜の管腔部から剥離した粘膜下組織からなることを特徴とする大腸又は小腸の組織を乾燥凍結し粉砕した組成物である。また、本発明は、筋層及び少なくとも粘膜の管腔部から剥離した粘膜下組織からなる、乾燥凍結し、プロテアーゼ消化した腸組織である骨移植組成物を提供する。
【００１０】
これらの組成物は、骨の融合の増加、危険度の高い骨折の補助、骨欠損の充填又はブリッジ形成、金属又はプラスチックの人工補助器具の装着等の整形外科的手術における各種の臨床的用途を有している。更に、これらの組成物は歯周病の治療さらに、他の歯の修復工程においても有用である。
【００１１】
本発明の骨移植組成物は更に、他の生物活性剤と混合、結合或いは配合することにより、局所的な骨の障害を治療するための組成物を生成することも可能である。
【００１２】
好ましい態様において、本出願で述べている骨移植組成物は温血脊椎動物の骨の修復を誘導する方法において有利に用いられる。この方法は損傷或いは欠損領域に粉末状の骨移植組成物を移植する工程からなり、前記骨移植組成物は脊椎動物の腸管部の粘膜下組織と粘膜の基底部、又はそのプロテアーゼ消化物からなる。一態様において腸管組織は基本的には、温血動物の腸管組織の粘膜下組織、粘膜筋板及び粘膜の緻密層からなる。
【００１３】
本発明の更なる目的、特徴及び効果は、ここで理解された本発明を実施するための最良の形態を例示する好ましい態様の次の詳述を考察することによって、同業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の骨移植組成物の好ましい出発材料は、温血脊椎動物の粘膜下組織からなる。この粘膜下組織は、食肉製造のために育成された例えば豚、子牛、羊、その他の温血脊椎動物等の動物から採取した腸管組織を始めいろいろな所から得ることが可能である。
【００１５】
本発明において用いられる粘膜下組織は好ましくは温血脊椎動物の腸管、更に好ましくは小腸管由来の組織である。腸管粘液下組織は、粘膜の基底部を含む。本組成物の生成に好ましい材料は、小腸片の筋層及び粘膜の管腔部から剥離した粘膜筋板薄片及び粘膜の緻密層を伴う粘膜下組織からなる。通常本文中ではこのような材料を腸粘膜下組織という。
【００１６】
小腸片からの腸管粘膜下組織の生成については、米国特許第4,902,508号に詳しく述べられており、開示内容は引用文献としてはっきりと本明細書に記されている。小腸の一片をまず長さ方向の拭き取り動作により研磨し、外側層（特に漿膜及び筋層）と内部層（粘膜の管腔部）の両方を除去する。一般的には腸管粘膜下組織は食塩水で洗浄し、任意に次に述べる使用まで、凍結水和状態に保存する。
【００１７】
好ましい一実施態様では、本発明による骨移植組成物は、脊椎動物の腸管の筋層及び粘膜組織の管腔部から剥離した粘膜下組織からなる腸管組織から生成される。もしくは、粉末状の骨移植組成物は流動化した腸管粘膜下組織からも生成可能である。
【００１８】
流動化した腸管粘膜下組織は米国特許第5,275,826号に述べられた様に生成されるが、この文献の開示については、本文中に引用文献としてはっきりと述べられている。小腸粘膜下組織の出発材料は裂いたり、切ったり、砕いたり、せん断したりすることにより微粉砕する。粘膜下組織片の懸濁液を高速（高せん断）ブレンダーで処理し、脱水、必要ならば余分な水を遠心作用を加えデカントすることによっても良好な結果を得ることが可能であるが、凍結あるいは、凍結乾燥した状態で、小腸粘膜下組織を粉砕するのが好ましい。粘膜下組織を可溶化してほぼ均一な溶液を生成するための十分な時間、酸性pHの条件下で、酵素消化により、例えば粘膜下組織をトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼで消化することにより、微粉砕した組織を可溶化することができる。
【００１９】
一実施態様において、脊椎動物の腸の筋層及び粘膜の管腔部から剥離した粘膜下組織からなる粉末状の温血脊椎動物の腸管組織は、液体窒素下で腸管粘膜下組織を粉砕して粒子サイズ０．１から１ｍｍ２の粒子を生成することにより生成される。得られた粒子を一晩凍結乾燥し、滅菌して、固形で、ほぼ無水粒状の複合材料を得る。
【００２０】
もう一つの実施態様では、粉末状の骨移植組成物は流動化した腸管の粘膜下組織から形成する。この実施態様においては、微粉砕した腸管粘膜下組織の懸濁液及び溶液を乾燥して本発明の粉末化組成物を形成する。
【００２１】
本発明の骨移植組成物は、公知の滅菌方法、例えばグルタルアルデヒドを用いたグルタルアルデヒドタンニング、酸性pHでのホルムアルデヒドタンニング、酸化プロピレン処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ照射、電子ビーム、過酢酸滅菌等により滅菌することができる。組織の滅菌は、骨移植組成物の生成中に行なわれるか、又は、組成物の生成後かつホストへの移植前に行われる。移植物の機械的強度、構造及び生体親和性をさほど弱めない滅菌技術が好ましく用いられる。例えば、強いガンマ照射は、移植材料の強度の喪失につながる。本発明の骨移植組成物の興味深い特徴の一つが、この組成物が有するホスト改造反応を誘導する能力であるので、その性質を減じるような滅菌方法を用いないことが望ましい。好ましい滅菌方法としては、移植物を過酢酸、１-４Mradsガンマ照射、更に好ましくは1-2.5Mradsガンマ照射、ガスプラズマに暴露して滅菌する方法があり、この中で過酢酸による滅菌が最も好ましい。代表的な方法としては、粘膜下組織は2種以上の滅菌工程に付される。粘膜下組織を滅菌した後、粘膜下組織はプラスチック又はホイルでラップし、電子ビーム又はガンマ照射滅菌技術を用いて再度滅菌する。
【００２２】
本発明による骨移植組成物は、温血脊椎動物の骨組織の損傷個所又は欠損個所の修復を誘導するための方法に利用可能である。この方法は、生体内組織の増殖を助けるような条件下で損傷個所又は疾病個所に骨移植組成物を移植する工程からなる。
【００２３】
本発明の一態様では、凍結乾燥した骨移植組成物は、修復の必要のある骨組織用の移植可能な異種移植片として使用できるが、最も典型的には、外傷又は疾病による組織の損傷を修復するために用いられる。粉末状の腸管粘膜下組織は、患者への移植のために成形された形状を保持する種々の形に圧縮可能であることが、有利な点である。本発明に従って、粉末状の腸管粘膜下組織からなる組織移植混合物を上述の様に成形し、この混合物を三次元形状の構成物に圧縮成形することによってこのような成形された骨移植構成物が製造される。組織移植混合物は、同業者には公知の標準技術を用いることにより、一定形状に圧縮成形可能である。
【００２４】
このようにして、粉末状の腸管粘膜下組織は、内因性骨形成を目的とした領域に合うような形の三次元の構成物に圧縮可能である。圧縮された粉末状骨移植組織は、移植後内因性組織が移植構造物にとって変わる間その大体の形を保持するのが最も好ましい。
【００２５】
組織移植混合物は、温血脊椎動物の腸の筋層及び粘膜の管腔部から剥離した腸管粘膜下組織からなる。更に、粉末状組成物を所望の形状に圧縮する前に骨移植粉末と支持物質を化合してもよい。例えば、ヒドロキシアパタイト及び／又は他の生体適合性の鉱物含有カルシウムを粉末状の骨移植組織と化合させて、再改造代替組織の構造的支持体とする。患者に対して構造／人工器具の移植を行なう前に粉末骨移植組成物をその構造又は人工器具上に押し付けて骨移植層を形成してもよい。
【００２６】
更に、燐酸三カルシウム或いは他の適当な生理学的鉱物材料を骨移植組成物と化合させて損傷或いは罹患した骨の修復を助ける。好ましい態様においては、生理学的適合性鉱物は骨移植組成物の80%以下である。好ましくは、生理学的適合性鉱物は骨移植組成物の約５から約50%からなり、最も好ましくは骨移植組成物の約５から30%からなる。
【００２７】
本発明の別の態様においては、生物活性剤を粉末状の腸管粘膜下組織移植材料と混合し、骨の障害または疾患の局所的治療のためのデリバリシステムを作る。特に本発明の骨移植組成物は有効量の生物活性成分、例えば抗生物質、化学治療剤、成長因子、抗原、抗体、酵素或いはホルモンと化合可能である。
【００２８】
例えば、腸管粘膜下組織材料と抗生物質からなる組織移植組成物は骨髄炎の治療に有用であり、それにより非経口抗生物質の必要性及び危険性を減らすことができる。さらに、腸管粘膜下組織材料と抗腫瘍剤からなる組織移植組成物は骨腫瘍の局所治療に使用可能であり、又、腸管粘膜下組織材料と骨形成因子又は他の成長因子（例えば、オステオゲニン、骨形態発生蛋白、副甲状腺ホルモン,TGFβ）からなる組織移植組成物は、過度の外傷或いは骨形成不全症や骨そしょう症等の骨格障害に伴いおこるような骨格欠損の修復を促進するために有用である。
【実施例】
【００２９】
実施例１  粉末状骨移植組成物
脊椎動物の腸管の粘膜下組織及び基底部からなる小腸組織を組織切りばさみ、片刃かみそりの刃或いは他の適当な切断器具で任意の小片に切り刻む。得られた組織標本を丸底ステンレス鋼容器にいれ、液体窒素を容器に導入して組織標本を微粉砕用に凍結する。
【００３０】
得られた凍結標本を微粉砕し、粗粉末を形成する。この微粉砕加工は例えば、凍結標本の上に円筒状の真ちゅう塊を有する手動アーバープレスを置いて実施する。真ちゅう塊は、標本とプレスのアーバー間の接点として働く。通常、標本を凍結しておくために、液体窒素を定期的に添加する必要がある。
【００３１】
本発明の粉末状骨移植組成物を生成するには、粘膜下組織からなる小腸組織を微粉砕する他の方法が利用可能である。例えば、粘膜下組織からなる小腸組織を乾燥凍結してから粉砕する方法である。また、粘膜下組織からなる小腸組織を高せん断ブレンダーで加工し、脱水及び乾燥を経て粉末状骨移植組成物を生成する方法もある。予め冷却しておいた乳鉢と乳棒を用いて粘膜下組織粉末をさらに粉砕することによりばらつきのないより微細な製品を得ることができる。最終的な粉砕においても固形凍結粒子を保持するために必要に応じて液体窒素を用いる。
【００３２】
実施例２  粉末状の可溶化した骨移植組成物
微粉砕した腸の粘膜下組織からなる骨移植組成物は、酵素で消化することにより可溶化されほぼ均一な溶液を形成する。好ましい一態様においては、粉末状の微粉砕腸管粘膜下組織（実施例１と同様に生成した）は金網で容器にふるい入れ、再度浮遊させる。次にこの粉末を、塩酸でpHを2.5に調節した１mg/mlのペプシン（ミズーリ州、セントルイスのシグマ社）の0.1M酢酸溶液に入れ、48時間にわたり室温で消化した。反応溶媒は水酸化ナトリウムで中和し、ぺプシンの活動を不活性化した。可溶化した粘膜下組織は、次に溶液の塩析により濃縮し、分離してさらに精製及び／又は凍結乾燥し、粉末状のプロテアーゼ可溶化腸管粘膜下組織を生成した。
【００３３】
実施例３  用途
腸管粘膜下組織からなる2種類の骨移植組成物について、それらの骨組織の内因性成長の誘導を検討した。一方は自然の水和状態の粘膜下組織からなるもので、もう一方は乾燥凍結した粉末状の腸管粘膜下組織である。
【００３４】
腸管粘膜下組織の骨成長能を求めるために、出願人は、一般的に認められている動物のモデルを用いた。モデルはSprague Dawleyラットの成体（年齢は6ヶ月以上）で頭頂骨に円形欠損部（直径8mm）が形成されている。欠損部は臨界サイズ即ち、この骨内の傷がこの動物の一生の間に骨形成によって直らないサイズである。欠損部の縁内の硬膜上に種々の処方のラット又は豚の小腸粘膜下組織を置いた。全く置かないラット及び、無機成分除去した異種遺伝子型の骨粉末をのせたラットをそれぞれネガティブ対照、ポジティブ対照とした。骨膜及び皮膚層は縫合し、閉じた。これらの動物は二ヶ月から一年かけて快復した。部検で、頭蓋冠を検査し、放射線体型測定を用いて骨格の欠損部の放射線不透過を測定した。組織学的評価を行なうために、次に硬膜を採取し、固定し、切開し、染色した。
【００３５】
天然水和状の腸管粘膜下組織は前述の米国特許明細書第4,902,508号−開示については引用として本文中にはっきりと示した−に記載されていたように豚とラットの小腸から得た。この材料を、抗生物質（硫酸ゲンタマイシン）及びプロテアーゼ抑制剤（弗化フェニルメチルスルフォニル）を含有する硫酸緩衝液ですすぎ、過酢酸、ガンマ照射等の方法で滅菌した。移植に先立って、材料を１x１ｍｍ２片に切り刻み、滅菌食塩水ですすいだ。
【００３６】
液体窒素下で腸管粘膜下組織を粉砕しサイズ０．１から１ｍｍ２の粒子を得ることにより脱水した粉末状の腸管粘膜下組織を生成した。得られた粒子を一晩凍結乾燥し、次に滅菌して固形無水粒子複合物を生成した。
【００３７】
欠損部に何も材料を施さない場合、欠損部の縁のみに新しい骨の成長が限られていたが、一方欠損部の中央は無秩序な線維性結合組織基質を示した。手術から12週で欠損部の快復は明らかに不完全（10%未満）であった。
【００３８】
無機成分を除去した骨粒子を移植してから四週後、欠損領域全体にわたって、新しい骨の成長のスピクラが見られた。八週までに、無機成分除去骨粒子間及び欠損部のエッジと無機成分除去骨粒子間に新しく編まれた橋が見られた。放射線透過写真のデータによると、最初の欠損領域の約70-80%が新しい骨でうまっていた。その後新しい骨の成長は密度及び成熟度を増し、最初の欠損領域は残っていなかった。
【００３９】
腸管粘膜下組織の種々の処方についての検討によると、移植後4週間で欠損部のエッジ及び欠損領域全体にわたって新しい骨の島が形成されていた。8週間までには、新しい骨の成長は密度及び成熟度を増し、欠損部の縁は新しい骨により橋渡しされていた。新しい骨は、最初の欠損領域の70-80%を占めていた。新しい骨は欠損部の両脇の古い骨と効果的に融合していた。
【００４０】
同時に得られたデータによると、新しい骨の形成を誘導するために用いる場合、自然水和状態の腸管粘膜下組織と凍結乾燥した粒子状の腸管粘膜下組織の効果を比較すると、違いは認められない。初期の時点で（移植4週間後）、双方共、骨形成作用においては、効果的である。自然水和状態の腸管粘膜下組織及び凍結乾燥粒子状の腸管粘膜下組織は、現在用いられている治療方法と比べて、新しい骨の成長を更に効果的にかつより迅速に誘導したことが明らかである。腸管粘膜下組織により誘導された新しい骨の成長はポジティブ対照動物で観察されるよりも更に均一であった。
【００４１】
本発明の凍結乾燥粒子状の組成物は、例えば骨の欠損部に合うように、成形、圧縮し、かたどることができるという利点を有する。更に、腸管粘膜下組織と他の各種材料（例えば、ヒドロキシアパタイト、燐酸三カルシウム等）からなる複合物を生成し、組織修復にも使用できる。
【００４２】
本発明の凍結乾燥した粘膜下組織組成物は、組織の代替及び修復双方の広い用途を有している。本発明で開示された方法に従って用いられる骨移植組成物は、存在する欠損領域の自然結合組織或いは骨の再成長を誘導することができる。骨の損傷或いは欠損領域は腸粘膜下組織からなる骨移植組成物と接触させることにより修復できる。
【００４３】
本発明の組成物のもっとも際立った面はおそらく、患部の自然骨組織の再成長を誘導する能力である。骨組織の損傷或いは欠損部と、本発明の乾燥凍結した腸粘膜下組織組成物の有効量を接触させることにより、自然の骨の成長を誘導し、損傷又は欠損部を修復することができる。
【００４４】
いくつかの好適態様との関連で本発明につき詳細に述べたが、以下に示す請求項で規定した本発明の範囲及び精神を逸脱しない範囲で変更及び修正は存在する。