(57)【要約】【課題】H2O2を介する定量において検体中のビリルビン等の還元物質の影響の少ない比色定量方法、測定試薬安定化方法、ビリルビン影響抑制方法、及び当該定量のための長期間保存可能な試薬。【解決手段】検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を酵素反応により過酸化水素に導きパーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させる比色定量方法で、反応系に式(I)：【化１】2005034132.tif 000023(R:H又はメチル基)及び式(II)：【化２】2005034132.tif 000024(R:H又はメチル基。X:C12〜20アルキル。)の単量体に基く単位からなる分子量5,000〜5,000,000の重合体を存在させる比色定量方法、保存安定化方法及びビリルビン影響抑制方法、並びに該重合体を含む試薬。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象物質とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量方法において、反応系に下記式(I)：
【化１】
2005034132.tif 000017
(ここで、Rは水素原子またはメチル基を示す。)
及び式(II)：
【化２】
2005034132.tif 000018
(ここで、Rは水素原子又はメチル基を示す。Xは、炭素数12〜20のアルキル基を示す。)
で表される単量体に基く単位からなる、重量平均分子量5,000〜5,000,000の重合体Aを存在させることを特徴とする、クレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量方法。
【請求項２】
請求項１又は２記載の比色定量方法のための比色定量試薬であって、溶媒と、酵素と、前記重合体Aとを含む比色定量試薬。
【請求項３】
ビリルビンを含む検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象物質とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させる、クレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量において検体中のビリルビンの影響を抑制する方法であって、反応系に下記式(I)：
【化３】
2005034132.tif 000019
(ここで、Rは水素原子またはメチル基を示す。)
及び式(II)：
【化４】
2005034132.tif 000020
(ここで、Rは水素原子又はメチル基を示す。Xは、炭素数12〜20のアルキル基を示す。)
で表わされる単量体に基く単位からなる、重量平均分子量5,000〜5,000,000の重合体Aを存在させることを特徴とする抑制方法。
【請求項４】
検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象物質とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量における測定試薬の保存安定化方法であって、反応系に下記式(I)：
【化５】
2005034132.tif 000021
(ここで、Rは水素原子またはメチル基を示す。)
及び式(II)：
【化６】
2005034132.tif 000022
(ここで、Rは水素原子又はメチル基を示す。Xは、炭素数12〜20のアルキル基を示す。)
で表される単量体に基く単位からなる、重量平均分子量5,000〜5,000,000の重合体Aを存在させることを特徴とする保存安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診断等のための比色定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査における生化学項目の測定方法には大きく分けると化学法と酵素法が存在する。このうち酵素法には、例えば、デヒドロゲナーゼを用いてNADH等の補酵素を検出する方法と、オキシダーゼを用いて測定対象物質から定量的に発生させた過酸化水素を検出する方法がある。オキシダーゼを用いる方法は、他法より高感度であるため微量の物質を測定するのに適するが、過酸化水素を介する測定系であるため、試料中に還元作用を有する物質が存在すると、それらにより過酸化水素が還元され、測定結果に影響を及ぼし、正確な測定を妨害するという問題点がある(以下、このように定量のためのものではない還元作用を示す物質を、単に「還元物質」という)。
【０００３】
前記還元物質としては、具体的には採血時の溶血により遊離するヘモグロビンや、肝疾患患者の血中に高濃度で存在するビリルビン、あるいは栄養剤として服用されるアスコルビン酸、肝臓や赤血球、白血球等の溶液に存在する還元型グルタチオン(GSH)等が挙げられる。
【０００４】
これらの還元物質は、比較的高濃度の対象物質の濃度を測定する場合にはあまり問題とはならないが、低濃度の対象物質の濃度を測定する場合には多大な測定誤差を生じる原因となる。換言すればこれらの還元物質により消去される過酸化水素が一定量である場合、測定対象物質の濃度が低いほど大きな影響を受ける。
【０００５】
例えば腎機能のマーカーであるクレアチニンは正確な測定が要求される測定項目の1つであるが、他の生化学項目と比較して検体中の存在量は微量である。このため還元物質によって過酸化水素が僅かに消去されても測定値に著しい影響を与える。しかしクレアチニンはその臨床上の意義から正確な測定が求められるため、還元物質による影響を極力回避して低濃度おいても正確に測定することが求められる。
【０００６】
過酸化水素を介する測定系において還元物質の影響を回避する手段としては、カチオン性界面活性剤又は両性界面活性剤を試薬に添加する方法(特許文献4)、及びベタイン系界面活性剤を試薬に添加する方法(特許文献5)が提案されている。しかしながら、これらの方法においてもビリルビン等の還元物質の影響を完全に解決しているとは言い難く、特にクレアチニンの測定においては依然として十分であるとは言い難い。
【０００７】
さらにイオン性界面活性剤は、酵素等の他の成分と共に溶液とした場合、当該他の成分を経時的に変性、若しくは沈殿させる性質があるため、性能に対する影響、特に他の成分の保存安定性に対する影響が大きい。このことは、臨床検査用の上記反応のための試薬の大半が液状試薬として提供されている現状では大きな問題となる。還元物質の影響を回避するのに十分な量のイオン性界面活性剤を添加すると、それだけ酵素等の反応を妨げることになる。この問題を解決する手段として、酵素等の反応に関与する成分を過剰量配合することが考えられるが、その場合製造コストがかかるという問題点がある。
【０００８】
ところで、臨床診断において、(メタ)アクリロイルホスホリルコリンに基づく構成単位を有する重合体を共存させて測定する方法は、例えば特許文献1〜3に開示されている。特許文献1には、抗原-抗体反応、酵素-基質反応、DNA-DNA反応等における反応促進剤が開示されている。特許文献2には、ラテックスを用いる凝集方法において、免疫学的な凝集促進剤としての(メタ)アクリロイルホスホリルコリンの用途が開示されている。特許文献3には、(メタ)アクリロイルホスホリルコリン等の重合体を用いて、ラテックスを用いる測定で希釈することなくプロゾーン現象を回避してC-反応性蛋白質を測定する方法が開示されている。
【０００９】
しかしながら、検体中の測定対象物質をオキシダーゼにより過酸化水素に導き、これをパーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させる比色定量方法において、ビリルビン等の還元物質の影響を抑制して、測定対象物質が低濃度であっても高精度の測定を可能とする方法は開示されていない。
【特許文献１】特開2002-22740号公報(第2頁)
【特許文献２】特開2002-365296号公報(第2頁)
【特許文献３】特開2001-318099号公報(第2頁)
【特許文献４】特開平3-10696号公報
【特許文献５】特開平7-39394号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、過酸化水素を介する測定対象物質の定量において、検体中に含まれるビリルビン等の還元物質の存在による影響の少ない比色定量方法、測定試薬の安定化方法又はビリルビンの影響を抑制する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、過酸化水素を介する測定対象物質の定量に用いる試薬であって、長期間保存することができ、酵素の反応性、特異性、安定性等を損なうことなく、且つ検体中に含まれるビリルビン等の還元物質の存在による影響の少ない定量を行なうことができる試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記の問題点に鑑み鋭意検討した結果、特定の重合体を反応系に存在させると、ビリルビン等の還元物質が混在していてもその影響を抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象物質とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量方法において、反応系に下記式(I)：
【００１４】
【化７】
2005034132.tif 000002
【００１５】
(ここで、Rは水素原子またはメチル基を示す。)及び式(II)：
【００１６】
【化８】
2005034132.tif 000003
(ここで、Rは水素原子又はメチル基を示す。Xは、炭素数12〜20のアルキル基を示す。)で表される単量体に基く単位からなる、重量平均分子量5,000〜5,000,000の重合体(以下、重合体Aという。)を存在させることを特徴とする、クレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量方法が提供される。
【００１７】
さらに、本発明によれば、前記比色定量のための比色定量試薬であって、溶媒と、酵素と、前記重合体Aとを含む比色定量試薬が提供される。
【００１８】
さらに、本発明によれば、ビリルビンを含む検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させる、クレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量において検体中のビリルビンの影響を抑制する方法であって、反応系に前記重合体Aを存在させることを特徴とする抑制方法が提供される。
【００１９】
さらに、本発明によれば、検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定対象とし、酵素反応により過酸化水素を導き、パーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させるクレアチニン、クレアチン又は尿酸の比色定量における測定試薬の保存安定化方法であって、反応系に前記重合体Aを存在させることを特徴とする保存安定化方法が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の比色定量方法、本発明の安定化方法及び本発明の抑制方法では、反応系に特定の重合体を存在させることにより、酵素の反応性、特異性、安定性等を損なうことなく、還元物質の影響を軽減することができる。例えば、本来は50%以上受ける負の影響を5%以下に抑えうる。したがって、本発明の比色定量方法では、検体中の測定対象物質が低濃度である場合であっても、真値に近い正確な定量を簡便に行なうことができる。
【００２１】
本発明の比色定量試薬は、酵素等の成分に加えて特定の重合体を含むので、長期間保存することができ、酵素の反応性、特異性、安定性等を損なうことなく、検体中の測定対象物質が低濃度である場合であっても、真値に近い正確な定量を簡便に行なうことを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の比色定量方法、本発明の安定化方法又は本発明の抑制方法では、反応系に特定の重合体(重合体A)を存在させることを特徴とする。重合体Aは、前記式(I)で表される単量体(以下、単量体A1という。)及び前記式(II)で表される単量体(以下、単量体A2という。)に基く単位からなる。具体的には、下記式(III)で表わされる単位及び(IV)で表される単位を含むことができる。下記式(III)及び(IV)において、R及びXは、式(I)及び(II)中のものと同じものを示す。
【００２３】
【化９】
2005034132.tif 000004
【００２４】
【化１０】
2005034132.tif 000005
【００２５】
式(II)又は(IV)において、Xで表されるアルキル基を炭素数12以上のものとすることにより、反応系中に存在する還元物質の影響を良好に軽減することができる。
単量体A2としては、具体的には例えば、ラウリル(メタ)アクリレート及びステアリル(メタ)アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル(メタ)アクリレート等が挙げられる。重合体Aにおいて、式(III)の単位及び式(IV)の単位は、ランダム重合、交互重合、ブロック共重合等のいずれの形態をとって共重合していてもよい。
【００２６】
重合体Aは、単量体A1及びA2を通常のラジカル共重合等により共重合し、さらに必要に応じて溶媒等に溶解し精製することにより製造することができる。具体的には、特許文献1〜3記載の方法に準じて製造することができる。
【００２７】
単量体A1及び単量体A2を共重合させる際のこれらの比は、特に限定されないが、通常、モル比で単量体A1/単量体A2=99/1〜10/90、好ましくは90/10〜20/80、さらに好ましくは80/20〜30/70とすることができる。単量体A1及び単量体A2の合計に対する単量体Aの割合を10モル%以上とすることにより、ホスホリルコリン基による効果を十分に発揮することができる。
【００２８】
重合体Aの分子量は、重量平均分子量として5,000〜5,000,000の範囲であり、10,000〜1,000,000の範囲であることが好ましい。重合体Aの分子量を5,000以上とすることにより十分に生化学的反応を促進することでき、5,000,000以下とすることにより重合体Aの粘性による生化学的反応の阻害を避けることができる。
【００２９】
本発明の比色定量方法、本発明の安定化方法又は本発明の抑制方法では、前記の重合体Aの存在下、検体中の測定対象物質を酵素反応により過酸化水素に導き、これからパーオキシダーゼの存在下で発色色素を生成させる。
【００３０】
前記測定対象物質は、クレアチニン、クレアチン又は尿酸である。
【００３１】
前記酵素反応としては、前記測定対象物質から過酸化水素を導く反応を適宜選択することができる。前記酵素反応は、１段階の反応でもよく、複数段階の反応でもよい。前記酵素反応は、その少なくとも１段階において、前記測定対象物質又は前記測定対象物質と他の物質との反応物から過酸化水素を発生させる反応を含む。当該過酸化水素を発生させる反応としては、具体的には例えば、ウリカーゼ、ザルコシンオキシダーゼ等のオキシダーゼによる反応を挙げることができる。
【００３２】
前記パーオキシダーゼは、過酸化水素を水に還元し発色色素を生成させうるものであれば特に限定されないが、具体的には例えば、西洋ワサビ由来、又は大豆由来のパーオキシダーゼを用いることができる。
【００３３】
前記発色色素は、パーオキシダーゼにより過酸化水素量に応じて発生することができるものであれば特に限定されず、各種のキノン系色素等を発生させることができる。前記発色色素は、パーオキシダーゼと組み合わせて過酸化水素量に応じて前記発色色素を発生させる発色色素生成物質を反応系に存在させることにより発生させることができる。前記発色色素生成物質としては、ロイコ体又は各種のトリンダー試薬等を用いることができる。前記トリンダー試薬は、4-アミノアンチピリン等の発色色素生成を補助する物質と組み合わせて用いることができる。前記発色色素生成物質のうちの前記ロイコ体としては、具体的には例えば、N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4,4'-ビス(ジメチルアミノ)-ジフェニルアミン、及び10-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-3,7'-ビス(ジメチルアミノ)-フェノシアジン等が挙げられる。また前記発色色素生成物質のうちの前記トリンダー試薬としては、具体的には例えば、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メトキシアニリン、N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3,5-ジメトキシアニリン、3-ヒドロキシ-2,4,6-トリヨード安息香酸等が挙げられる。
【００３４】
本発明の比色定量の測定対象物質及びその測定に用いる酵素の組み合わせの具体例を下記表１に示す。
【００３５】
【表１】
2005034132.tif 000006
【００３６】
本発明の比色定量方法は、測定対象物質、各種酵素、発色色素生成物質及び重合体A等を水等の溶媒中において混合し、反応させることにより行なうことができる。具体的には例えば、測定対象物質を含む検体と、各種酵素、発色色素生成物質及び重合体A等を含む溶液とを混合することにより行なうことができる。各種酵素、発色色素生成物質及び重合体Aを含む溶液は、これらを別々に含む2以上の溶液として別々に調製し、反応を開始するにあたりそれらを混合することにより反応を行なうことができる。また、かかる溶液は、必要に応じて、前記発色色素の生成を補助する物質、緩衝剤等の他の物質を適宜含むことができる。
【００３７】
本発明の比色定量方法における反応系中の各成分の濃度は、測定対象物質、各種酵素、発色色素生成物質及び重合体Aを含む混合液中の終濃度として、以下の濃度とすることができる。測定対象物質の濃度は、例えばクレアチニンの場合、0.0008〜1.6mg/dL、尿酸の場合0.002〜2.0mg/dLとすることができるが、特に、クレアチニンの場合0.016mg/dL(約1.4μmol/L)以下、尿酸の場合0.06mg/dL(3.6μmol/L)以下程度の低濃度である場合でも、還元物質の影響を受けずに正確な測定ができる。オキシダーゼの濃度は1〜100u/mL、好ましくは5〜20u/mLとすることができる。パーオキシダーゼの濃度は1〜100u/mL、好ましくは5〜20u/mLとすることができる。オキシダーゼの添加割合に対するパーオキシダーゼの添加割合は、オキシダーゼ1uに対してパーオキシダーゼ0.3〜100uとすることができる。発色色素生成物質の濃度は0.5〜10mmol/L、好ましくは1〜5mmol/Lとすることができる。さらに、発色色素生成物質と共に4-アミノアンチピリン等の発色色素の生成を補助する物質を用いる場合、その濃度は、0.5〜10mmol/L、好ましくは1〜5mmol/Lとすることができる。
【００３８】
反応系中の重合体Aの濃度は、反応系に含まれる測定対象物質、還元物質及び他の試薬の量に応じて適宜選択することができるが、具体的には例えば終濃度として概ね0.05〜0.75w/v%であることが好ましい。
【００３９】
反応系に重合体Aを存在させることにより、還元物質による影響を抑制することができる。重合体Aは、生体膜の成分であるリン脂質と類似の構造を持ち、タンパク質を変性、失活、沈殿させる等の悪影響が少なく、したがって酵素に対する影響が少なく酵素の反応性、特異性、安定性を損なうことが無い。そのため、酵素を含む反応系に高濃度添加することも可能であり、ビリルビンの影響回避に十分な濃度を添加することが可能である。また予め調製した比色定量用の試薬に重合体Aを配合してから長期間経過しても試薬の劣化が少ないので、予め調製した試薬による簡便な定量の操作を行なうことができる。
【００４０】
本発明の比色定量方法の好ましい例として、還元物質としてビリルビンを含む検体中のクレアチニン、クレアチン又は尿酸を測定する方法が挙げられる。本発明によるクレアチニン、クレアチン及び尿酸の比色定量は、それぞれ下記反応式(i)〜(iii)に示される反応に基いて行なうことができる：
【００４１】
【化１１】
2005034132.tif 000007
【００４２】
【化１２】
2005034132.tif 000008
【００４３】
【化１３】
2005034132.tif 000009
【００４４】
略号は次のものを示す。
CRN：クレアチニナーゼ
CR：クレアチナーゼ
SOD：ザルコシンオキシダーゼ
POD：パーオキシダーゼ
TODB：N,N-ビス(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン
4AAP：4-アミノアンチピリン
【００４５】
上記反応による比色定量は、各成分を適宜混合することにより発色させ、吸光度の変化を測定することにより行なうことができる。各成分の混合の手順は特に限定されないが、具体的には例えばクレアチニンの定量の場合、以下の手順により行なうことができる：
【００４６】
(1) N,N-ビス(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン、クレアチナーゼ及びザルコシンオキシダーゼを含む試薬1と、4-アミノアンチピリン、クレアチニナーゼ及びパーオキシダーゼを含む試薬2とを調製する。試薬1又は2のいずれか一方又は両方に重合体Aを配合する。
(2) クレアチニンとビリルビン等の還元物質とを含む検体と、試薬1とを混合し、37℃で5分間保温する。
(3) (2)の混合物に試薬2を添加する。
(4) (3)の混合物中で発色したキノン色素の生成量を、500〜600nmの吸光度変化として測定することによりクレアチニンの濃度を定量する。
【００４７】
前記試薬1及び試薬2中の各成分の配合割合は、試薬1、試薬2及び検体との混合物中の終濃度として、クレアチニナーゼは20〜400u/mL、クレアチナーゼは50〜100u/mL、ザルコシンオキシダーゼは1〜20u/mL、パーオキシダーゼは1〜100u/mL、好ましくは5〜20u/mL、N,N-ビス(4-スルホブチル)-3-メチルアニリン及び4-アミノアンチピリンはそれぞれ0.5〜10mmol/L、好ましくは1〜5mmol/Lとすることができる。重合体Aの配合割合は、例えば検体中に50mg/dLのビリルビンが存在し、検体と試薬1及び2の合計との量比がおよそ1:60(体積比)の場合、重合体Aは反応系中に、終濃度として概ね0.05〜0.75w/v%含まれていることが好ましい。
【００４８】
前記試薬1及び試薬2には、必要に応じて緩衝剤を配合し所望のpHに維持することができる。緩衝剤は特に限定されず通常の比色定量において用いられているものを適宜選択することができる。具体的には例えば、2-ヒドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(以下「TAPSO」という。)又はN-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(以下「TAPS」という。)を10〜1000mmol/Lの範囲内で配合し、さらに塩酸、水酸化ナトリウム等で所望のpHに調整することができる。
【００４９】
本発明の比色定量試薬は、前記本発明の比色定量方法のための試薬であって、溶媒と、酵素と、重合体Aとを含む。当該溶媒としては、水等を挙げることができる。当該酵素としては、オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、測定対象物質を基質としてオキシダーゼにより過酸化水素を定量的に発生させうる物質を生成しうる酵素、又はこれらの組み合わせを含むことができる。また、必要に応じて、上記の緩衝剤、発色色素生成物質、発色色素生成を補助する物質等を含むことができる。より具体的には例えば、上記試薬1及び2のように、2液以上を混合することにより本発明における反応を行なえるようにした複数の試薬の組み合わせにおいて、それら複数の試薬の1以上において重合体Aを含んだ試薬とすることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、実施例中、同一の略語で示された試薬等は、別に断らない限り同一の製品を用いた。
【００５１】
合成例1
(PC重合体-1の合成)
メタクリロイルホスホリルコリン(MPC) 29.1g及びステアリルメタクリレート(C18MA)8.4gをエタノール204gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でアゾビスイソブチロニトリル(以下AIBNと略す)0.67gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-1 30.1gを粉末として得た。
【００５２】
合成例2
(PC重合体-2の合成)
MPC50.0gをエタノール100gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でAIBN 0.24gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-2 29.6gを粉末として得た。
【００５３】
合成例3
(PC重合体-3の合成)
MPC 35.7g及びブチルメタクリレート(BMA)4.3gをエタノール160gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でAIBN 0.82gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-3 29.6gを粉末として得た。
【００５４】
合成例4
(PC重合体-4の合成)
MPC 23.0g及び式CH2=C(CH3)-CO-(OCH2CH2)4-OHで表されるメトキシポリ(エチレンオキシド)モノメタクリレート7.7gをエタノール160gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でAIBN 0.82gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-4 19.8gを粉末として得た。
【００５５】
合成例5
(PC重合体-5の合成)
MPC 12.0g及びメタクリル酸8.0gを水40gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でコハク酸パーオキサイド 0.82gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-5 19.8gを粉末として得た。
【００５６】
合成例6
(PC重合体-6の合成)
MPC 13.4gと、2-ヒドロキシ-3-メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド50w/w%含有水溶液9.2gとを水77gに溶解し4つ口フラスコに入れ、30分間窒素を吹き込んだ後に、60℃でコハク酸パーオキサイド 0.15gを加えて8時間重合反応させた。反応終了後、反応液を3Lのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、48時間室温で真空乾燥を行って、PC重合体-6 14.8gを粉末として得た。
【００５７】
合成例1〜5で得たPC重合体-1〜6の分子量をゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)により分析した。分析条件は20mMリン酸緩衝液(pH7.4)を溶離液とし、ポリエチレングリコールを標準物質とし、共重合体の溶出を屈折率により検出した。結果を表２に示す。また、これらの重合体の共重合組成比を1H-NMRにより分析した。結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2005034132.tif 000010
【００５９】
実施例1-1〜1-4及び比較例1
(ビリルビン存在下及び非存在下におけるクレアチニン濃度測定の対比；その1)
TAPSO 50mmo1/L、TODB 1mmo1/L、CR(キッコーマン株式会社製)30u/mL及びSOD(キッコーマン株式会社製)10u/mL、ならびに各種濃度のPC重合体-1を含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.0に調整し、試薬1-1を得た。なお、試薬1-1中のPC重合体-1の濃度は、後述する試薬1-2及び血清検体1又は2と混合した際の終濃度が0.00w/v%(比較例1)、0.15w/v%(実施例1-1)、0.30w/v%(実施例1-2)、0.45w/v%(実施例1-3)又は0.75w/v%(実施例1-4)となる濃度とした。
【００６０】
一方、TAPSO 50mmo1/L、4AAP 1mmo1/L、CRN(キッコーマン株式会社製)400u/mL及びPOD(天野エンザイム株式会社製)10u/mLを含む水溶液を調製し、lmo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.0に調整し、試薬1-2を得た。
【００６１】
クレアチニン0.85mg/dL、尿酸3.1mg/dL及びクレアチン1.0mg/dLを含有するヒト血清(商品名「スイトロールN」、日本水産株式会社製、ベース血清)(血清検体1)、及びそれにビリルビンを50mg/dL添加したもの(血清検体2)を調製した。
【００６２】
5μLの血清検体1又は2に、試薬1-1を240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬1-2を80μL加えて、546nmの吸光度変化を自動分析装置H7170型((株)日立製作所製)を用いて、反応系内の温度を37℃に保って測定した。測定方法にはエンドポイント法を適用した。
【００６３】
血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
2005034132.tif 000011
【００６５】
PC重合体-1を添加しなかった比較例1では、ビリルビンに基く-56%の負の影響を認めたが、PC重合体-1を添加した実施例1-1〜1-4においてはビリルビンの影響が軽減し、-4〜-2%の負の影響に止まった。よってPC重合体-1にビリルビンの影響を軽減する効果があることがわかる。以上より、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減し、クレアチニン濃度を正確に定量できることがわかった。
【００６６】
実施例2-1〜2-5及び比較例2
(ビリルビン存在下及び非存在下におけるクレアチニン濃度測定の対比；その2)
TAPS 50mmo1/L、TODB 1mmo1/L、CR 50u/mL及びSOD 15u/mLを含む水溶液を調製し、1mo1/L塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.0に調整し、試薬2-1を得た。
【００６７】
一方、TAPS 100mmo1/L、4AAP 3mmo1/L、CRN 450u/mL及びPOD 15u/mL、並びに各種濃度のPC重合体-1を含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.0に調整し、試薬2-2を得た。なお、試薬2-2中のPC重合体-1の濃度は、試薬2-1及び血清検体1又は2と混合した際の終濃度が0.00%(比較例2)、0.05%(実施例2-1)、0.10%(実施例2-2)、0.15%(実施例2-3)、0.20%(実施例2-4)又は0.25%(実施例2-5)(W/V)となる濃度とした。
【００６８】
5μLの血清検体1又は2に、試薬2-1を240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬2-2を80μL加えて、546nmの吸光度変化を自動分析装置H7170型を用いて測定した。測定方法にはエンドポイント法を適用した。
【００６９】
血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表４に示す。
【００７０】
【表４】
2005034132.tif 000012
【００７１】
PC重合体-1を添加しなかった比較例2では、ビリルビンに基く-56%の負の影響を認めたが、PC重合体-1を添加した実施例2-1〜2-5においてはビリルビンの影響が軽減し、-17〜-5%の負の影響に止まった。よってPC重合体-1にビリルビンの影響を軽減する効果があることがわかる。以上より、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減し、クレアチニン濃度を正確に定量できることがわかった。
【００７２】
また実施例1及び2の結果より、PC重合体-1は、クレアチナーゼを含む試薬(試薬1-1又は2-1)とクレアチニナーゼを含む試薬(試薬1-2又は試薬2-2)とを混合する反応系において、そのいずれの試薬に添加してもビリルビンの影響の軽減に有効であることがわかる。
【００７３】
実施例3
(他のベタイン型界面活性剤を含む反応系との対比)
TAPS 50mmo1/L、TODB 1mmo1/L、CR 50u/mL、SOD 15u/mL、及びPC重合体-1 0.3w/v%を含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH7.9に調整し、試薬3-1を得た。
【００７４】
一方、TAPS 100mmo1/L、4AAP 3mmo1/L、CRN 450u/mL及びPOD 15u/mLを含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.3に調整し、試薬3-2を得た。
【００７５】
5μLの血清検体1又は2に、試薬3-1を240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬3-2を80μL加えて、546nmの吸光度変化を自動分析装置H7170型を用いて測定した。測定方法にはエンドポイント法を適用した。
【００７６】
血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表５に示す。
【００７７】
比較例3-1
PC重合体-1 0.3w/v%を添加しなかった他は、実施例3と同様に操作し、試薬を調製し、反応させ、吸光度変化を測定し、血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表５に示す。
【００７８】
比較例3-2〜3-12
PC重合体-1 0.3w/v%の代わりに、アンヒトール24B(商品名、花王株式会杜製、ラウリルベタイン)(比較例3-2)、アンヒトール20BS(商品名、花王株式会杜製、ラウリルベタイン)(比較例3-3)、AM-3130N(商品名、日光ケミカルズ株式会杜製、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインR-CO-NH-(CH2)3-N+(CH3)2-CH2COO-) (比較例3-4)、AM-301(商品名、日光ケミカルズ株式会杜製、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインR-N+(CH3)2-CH2-COO-)(比較例3-5)、SB3-8(商品名、3-(N,N-ジメチルオクチルアンモニオ)プロパンスルホン酸、シグマ社製)(比較例3-6)、SB3-12(商品名、3-(ドデシルジメチルアンモニオ)プロパンスルホン酸、シグマ社製)(比較例3-7)、又はPC重合体-2〜6(比較例3-8〜3-12)を0.3w/v%添加した他は、実施例3と同様に操作し、試薬を調製し、反応させ、吸光度変化を測定し、血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表５に示す。
【００７９】
【表５】
2005034132.tif 000013
【００８０】
各試薬でのビリルビンの影響は、PC重合体-1の場合、-1%；アンヒトール24Bの場合、-8%；アンヒトール20BSの場合、-7%；AM-3130Nの場合、-6%、AM-301の場合、-19%；SB3-8の場合、-9%；SB3-12の場合、-9%；PC重合体-2〜6の場合、概ね-50%であった。この結果よりPC重合体-1は、他のベタイン型界面活性剤と比較して、ビリルビンの影響をおよそ1/5以下、また他のPC重合体と比較して1/50以下とすることができ、ビリルビンの影響を軽減する効果が著しいことがわかる。以上より、ベタイン系界面活性剤(比較例3-2〜比較例3-7)、及び重合体A以外のPC重合体(比較例3-8〜比較例3-12)を用いた場合と比較すると、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減し、クレアチニン濃度を正確に定量できることがわかった。
【００８１】
実施例4
(試薬の保存安定性;その1)
TAPS 50mmo1/L、TODB 1mmo1/L、CR 50u/mL、SOD 15u/mL、及びPC重合体-1 0.3w/v%を含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH7.9に調整し、試薬4-1を得た。
【００８２】
一方、TAPS 100mmo1/L、4AAP 3mmo1/L、CRN 450u/mL及びPOD 15u/mLを含む水溶液を調製し、1mo1/Lの塩酸または水酸化ナトリウムでpH8.3に調整し、試薬4-2を得た。
【００８３】
さらに、検体として、クレアチニンの5mg/dL水溶液(検体3)を調製した。
【００８４】
試薬4-1を、調製後直ちに(実施例4A)又は調製後37℃で1週間保存後(実施例4B)、5μLの検体3に240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬4-2を80μL加えて、546nmの吸光度変化を自動分析装置H7170型を用いて測定した。吸光度変化は、試薬4-1を添加した時点を0分として、経時的に測定した。結果を図1に示す。図1中、白抜き円及び中黒円のプロットは、それぞれ実施例4A及び実施例4Bの結果をそれぞれ示す。
【００８５】
図1の結果より、PC重合体-1を添加した試薬を用いた反応系においては、37℃で1週間保存した後にも反応速度の低下が見られず、PC重合体-1による試薬の安定性の低下がないことがわかる。
【００８６】
比較例4-1
PC重合体-1 0.3w/v%を添加しなかった他は、実施例4A及び4Bと同様に操作し、試薬を調製し、反応させ、吸光度変化を経時的に測定した。結果を図2に示す。図2中、白抜き円及び中黒円のプロットは、それぞれ試薬4-1を調製後直ちに用いた場合(比較例4-1A)又は調製後37℃で1週間保存後に用いた場合(比較例4-1B)の結果をそれぞれ示す。
【００８７】
比較例4-2〜4-3
PC重合体-1 0.3w/v%の代わりに、アンヒトール24B(比較例4-2)、又はAM-301(比較例4-3)を0.3w/v%添加した他は、実施例4A及び4Bと同様に操作し、試薬を調製し、反応させ、吸光度変化を経時的に測定した。比較例4-2及び4-3の結果をそれぞれ図3及び図4に示す。図3及び図4中、白抜き円及び中黒円のプロットは、それぞれ試薬4-1を調製後直ちに用いた場合(比較例4-2A、4-3A)又は調製後37℃で1週間保存後に用いた場合(比較例4-2B、4-3B)の結果をそれぞれ示す。
【００８８】
実施例4及び比較例4-1〜4-3において、各反応系中のクレアチニン濃度の指標として、試薬4-2を添加した後35秒から71秒間の吸光度(mAbs)の変化量を算出した。実施例4Aの吸光度変化量に対する実施例4Bの吸光度変化量の割合を、保存安定性(%)として求めた。また、比較例4-1〜4-3についても、同様に保存安定性を求めた。求めた値を表６に示す。また、これらの結果と並べて、実施例3、比較例3-1、アンヒトール24Bを用いた比較例3-2、及びAM-201を用いた比較例3-5におけるビリルビンに対する効果についての実験結果を、併せて表６に示す。
【００８９】
【表６】
2005034132.tif 000014
【００９０】
表６より、本願発明の比色定量試薬は、その保存安定性に優れることが分かった。更に、表3、表4、表5及び表6より、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減しクレアチニン濃度を正確に定量することができ、且つ試薬の保存安定性を維持できることがわかった。
【００９１】
実施例5
(尿酸の測定)
水に、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(以下BESという。)50mmol/L、TODB 2mmol/L及びPOD 5u/mL、ならびにPC重合体-1を溶解し、1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整し、試薬5-1を調製した。なお、試薬5-1中のPC重合体-1の濃度は、後述する試薬5-2及び血清検体1又は2と混合した際の終濃度が0.4w/v%となる濃度とした。
【００９２】
一方、水に、BES 50mmol/L、4AAP 2mmol/L及びウリカーゼ(東洋紡績株式会社製) 1u/mLを溶解し、1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウムでpHを7.5に調整し、試薬5-2を調製した。
【００９３】
5μLの血清検体1又は2に、試薬5-1を240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬5-2を60μL加えて、546nmの吸光度を自動分析装置H7170型((株)日立製作所製)を用いて、反応系内の温度を37℃に保って測定した。測定方法にはエンドポイント法を適用した。
【００９４】
血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表７に示す。
【００９５】
比較例5
試薬5-1にPC重合体-1を添加しなかった他は、実施例5と同様に操作し、吸光度変化を測定した。結果を表７に示す。
【００９６】
【表７】
2005034132.tif 000015
【００９７】
PC重合体-1を添加しなかった比較例5においては、ビリルビンに基づく-73%の負の影響を認めたが、PC重合体-1を添加した実施例5においてはビリルビンの影響が軽減し、-5％の負の影響に止まった。以上より、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減し、尿酸濃度を正確に定量できることがわかった。
【００９８】
実施例6
(クレアチンの測定)
水に、TAPS 30mmol/L、TODB 1mmol/L及びSOD 15u/mL、ならびにPC重合体-1を溶解し、1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウムでpHを8.2に調整し、試薬6-1を調製した。なお、試薬6-1中のPC重合体-1の濃度は、後述する試薬6-2及び血清検体1又は2と混合した際の終濃度が0.4w/v%となる濃度とした。
【００９９】
一方、水に、TAPS 30mmol/L、4AAP 2mmol/L、CR150u/mL及びPOD 20u/mLを溶解し、1mol/Lの塩酸又は水酸化ナトリウムでpHを8.0に調整し、試薬6-2を調製した。
【０１００】
5μLの血清検体1又は2に、試薬6-1を240μL添加し、37℃で5分間加温後、更に試薬6-2を80μL加えて、546nmの吸光度から600nmの吸光度を減じた値の変化を自動分析装置H7170型((株)日立製作所製)を用いて、反応系内の温度を37℃に保って測定した。測定方法にはエンドポイント法を適用した。
【０１０１】
血清検体1における吸光度変化に対する、血清検体2における吸光度変化を、相対感度(%)として求めた。結果を表８に示す。
【０１０２】
比較例6
試薬6-1にPC重合体-1を添加しなかった他は、実施例6と同様に操作し、吸光度変化を測定した。結果を表８に示す。
【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
PC重合体-1を添加しなかった比較例6においては、ビリルビンに基づく-72%の負の影響を認めたが、PC重合体-1を添加した実施例6においてはビリルビンの影響が軽減し、-3％の負の影響に止まった。以上より、本発明の比色定量方法及び比色定量試薬を用いることにより、還元物質であるビリルビンの影響を軽減し、クレアチン濃度を正確に定量できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】実施例4における、反応時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図２】比較例4-1における、反応時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図３】比較例4-2における、反応時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図４】比較例4-3における、反応時間と吸光度との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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