(57)【要約】【課題】  工業用殺菌剤のバイオフィルムに対する阻害効果を簡易的かつより短期間にスクリーニングする評価方法およびそれを用いた殺菌対象系における微生物障害の防止方法を提供することを課題とする。【解決手段】  殺菌対象系から採取した殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加した後、得られた複数の溶液を個別に培地と共に疎水性材料からなるマイクロチューブに採取し、貧栄養条件下で静置培養した後、得られた各検体におけるバイオフィルムの有無により工業用殺菌剤の有効性を判断することを特徴とする工業用殺菌剤のスクリーニング方法により、上記の課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺菌対象系から採取した殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加した後、得られた複数の溶液を個別に培地と共に疎水性材料からなるマイクロチューブに採取し、貧栄養条件下で静置培養した後、得られた各検体におけるバイオフィルムの有無により工業用殺菌剤の有効性を判断することを特徴とする工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
殺菌対象物が、工業用水または工業製品であり、殺菌対象物の希釈物が、微生物由来の付着物を０．１〜１重量％となるように滅菌水、蒸留水または殺菌対象系の工業用水もしくは工業製品で希釈したものである請求項１に記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
殺菌対象物またはその希釈物に対して０．１〜５００ｍｇ／リットルの工業用殺菌剤を添加する請求項１または２に記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
貧栄養条件を、滅菌水または蒸留水で５〜１００倍に希釈した希釈培地を用いることにより設定する請求項１〜３のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
溶液と培地との総量が５０〜２００μｌであり、溶液が総量の０．１〜１０重量％である請求項１〜４のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
疎水性材料が、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリプロピレンから選択される熱可塑性樹脂である請求項１〜５のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
温度２５〜５０℃で、２４時間静置培養する請求項１〜６のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
静置培養した後、染色液を用いてバイオフィルムを染色し、マイクロチューブ内を洗浄・乾燥し、染色されたバイオフィルムを溶媒に溶解させ、得られた溶液の吸光度を測定することにより、バイオフィルムの有無を評価する請求項１〜７のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
殺菌対象系が、紙パルプ製造工程水系または工業用冷却水系である請求項１〜８のいずれか１つに記載の工業用殺菌剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の工業用殺菌剤のスクリーニング方法により判断された工業用殺菌剤の有効性に基づいて、殺菌対象系に工業用殺菌剤を添加して、殺菌対象系における微生物障害を防止することを特徴とする微生物障害の防止方法。
【請求項１１】
２〜３日に１回の割合で工業用殺菌剤のスクリーニングを行う請求項１０に記載の微生物障害の防止方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、各種工業用水、工業製品などにおける微生物に由来する各種障害を的確に防止もしくは抑制するために必要な工業用殺菌剤のスクリーニング方法およびそれを用いた殺菌対象系における微生物障害の防止方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、紙パルプ製造工程水や各種工業用冷却水、海水冷却水などの工業用水系において、細菌や真菌などの微生物に由来するスライムが発生し、生産品の品質低下や熱交換効率の低下などの障害が発生している。また、多くの工業製品、例えば金属加工油剤、繊維油剤、ペイント類、紙塗工液、ラテックス、糊剤などでは、微生物による腐敗や汚染が発生し、製品の汚損などの障害が発生している。
【０００３】
これらの微生物による障害を防止するために、イソチアゾロン類、ジチオール類、ハロゲン化酢酸エステル類、ブロモニトロ化合物などの工業用殺菌剤、静菌剤、防腐剤、スライムコントロール剤など（以下「工業用殺菌剤」と総称する）が使用されている。従来、これらの工業用殺菌剤は、微生物障害を防止すべき系の微生物数（菌数）の低減または増殖抑制を第一の指標として選択使用されてきた。
【０００４】
しかしながら、実際の製造現場、例えば、紙パルプ工業の抄紙工程においては、工業用殺菌剤の添加により細菌などの微生物数が低減したにも拘らず、スライムによるトラブルが多発したり、一方、微生物数が多いにも拘らず、スライムによるトラブルが発生しないという、矛盾も多く経験されてきた。その原因としては、耐性菌の出現、対象水系に存在する微生物の種類によるスライム形成能力の差異などが考えられる。
【０００５】
かかる観点から、特定の工程から検知されたスライム原因微生物と潜在性スライム原因微生物の両方に対して生育阻止作用または殺菌作用を有する薬剤を添加するスライム発生防止方法（特許第３０７３８５５号公報：特許文献１参照）、工業用水系から採取した微生物サンプルから単離した菌をそれぞれセルロース繊維を含む液体培地中で培養して、スライムの形成状態を観察し、その結果に基づいてスライム形成に関与する微生物に対して有効な殺菌剤を工業用水系に添加する工業用水系のスライム形成防止方法（特開平９−５７２７５号公報：特許文献２参照）、およびスライムコントロール剤に対する抵抗性微生物の種類およびその発生源を、従来の生菌数測定法に代えて、微生物ＤＮＡの塩基配列による微生物相解析とその存在比率から特定し、予め集積した薬剤検索データベースによって選定した発生源処理剤を発生源に対して添加するスライム抑制方法（特開２００３−２０５９８号公報：特許文献３参照）などが提案されている。
【０００６】
しかしながら、特許文献１および３に記載の技術では、その評価に煩雑な工程や高額な機器などが必要になるという問題点がある。また、特許文献２に記載の技術では、培地にセルロース繊維を加えて振とう培養してスライムを形成するので、振とうにより生じる液体の流動やセルロース繊維の影響により、スライムが剥離し易く、評価結果にばらつきを生じるという問題点がある。
【０００７】
一方、微生物は、外的攻撃から身を守るために、粘性のある多糖類（exopolysaccharides：ＥＰＳ）を生産し、細胞外に分泌して、高次構造体、いわゆるバイオフィルム（biofilm）を形成することが知られている。ＥＰＳは、高分子物質（Extracellular Polymeric Substances：ＥＰＳ）ともいう。このバイオフィルムは、一般に複数種の微生物群集から形成され、微生物群集は互いに影響を与え合っている。例えば、バイオフィルムを形成した緑膿菌では、抗生物質に対する耐性が浮遊細胞に比べて数百倍も上昇することが報告されている。また、感染性微生物に関するバイオフィルム研究や遺伝学的研究のためのメカニズムを解明するなどの目的で、試験管あるいは多穴型マイクロプレートを用いて病原性微生物を静置培養し、容器内表面に接着している細胞を色素で染色した後、溶媒に溶解してその吸光度を測定することにより、バイオフィルム形成能力を定量的に判定する方法が報告されている（例えば、森川正章、「バイオフィルム」、化学と生物、社団法人日本農芸化学会、２００３年、第４１巻、第１号、ｐ．３２〜３７：非特許文献１参照）。
【０００８】
また、バイオフィルムが、上記の工業用水系や工業製品の微生物障害の要因であることも知られている。そこで、バイオフィルム形成に対する工業用殺菌剤の薬剤の活性、すなわちバイオフィルム形成阻害活性を評価することにより、直接的かつ的確にスライム障害を防止する方法が提案されている（例えば、特開平６−３２７４９５号公報：特許文献４参照）。
【０００９】
かかる観点から、実験室レベルで実際の工業用水系などに生じるバイオフィルムを再現する方法が提案されている。例えば、４０メッシュの３１６ステンレス鋼製ワイヤーメッシュスクリーンのクーポンラックを備えたステンレス製容器に、培地と合成冷却タワー水を入れ、冷却タワーから単離したバイオフィルム産生微生物の共同体を用いて、バイオフィルムを生じさせる方法およびそれを用いた各種酵素の活性の評価方法が提案されている（特開平６−２６２１６５号公報：特許文献５参照）。この技術では、バイオフィルムを生じさせるのに７〜１０日間必要である（特許文献５、段落番号００３１参照）。
【００１０】
また、バイオリアクター（連続流れ式攪拌タンク反応容器）および工業用プロセス水系で通常見出される微生物（例えば、Pseudomonas fluorescene）を用いて、ガラス表面およびステンレススチール表面上に７２時間を要して室温でバイオフィルムを形成させる方法およびそれ用いたバイオ分散剤の評価方法が提案されている（特開平１０−８０６８９号公報：特許文献６参照）。
【００１１】
さらに、寒天などの接種された増殖培地の上に配置された切片（ガラスまたはステンレススチール）上にバイオフィルムを培養する方法およびそのバイオフィルム切片を使用して、バイオフィルムに対する殺菌剤の効力を定性的に評価する方法が提案されている（特開平２００３−５０２０６３号公報：特許文献７参照）。特許文献７（段落番号００１２）には、この方法は、実験室の基本的な装置を利用し、高速（４８時間）かつ単純に実施することができ、また再現性のあることが記載されている。この技術では、バイオフィルムを形成するのに２週間、好ましくは２〜３日間必要である（特許文献７、段落番号００２０参照）。
【００１２】
このように上記の技術では、各単離菌によるバイオフィルムの形成の有無を試験している。しかしながら、菌の単離には少なくとも２〜３日程度の時間が必要であり、単離菌によるバイオフィルムの形成には１〜３日程度の時間が必要である。実際の製造現場で発生するスライム障害を防止するためには、その障害をより短期間に予知し、有効な工業用殺菌剤を選定しなければならない。
【００１３】
【特許文献１】特許第３０７３８５５号公報
【特許文献２】特開平９−５７２７５号公報
【特許文献３】特開２００３−２０５９８号公報
【特許文献４】特開平６−３２７４９５号公報
【特許文献５】特開平６−２６２１６５号公報
【特許文献６】特開平１０−８０６８９号公報
【特許文献７】特開平２００３−５０２０６３号公報
【非特許文献１】森川正章、「バイオフィルム」、化学と生物、社団法人日本農芸化学会、２００３年、第４１巻、第１号、ｐ．３２〜３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この発明は、工業用殺菌剤のバイオフィルムに対する阻害効果を簡易的かつより短期間にスクリーニングする評価方法およびそれを用いた殺菌対象系における微生物障害の防止方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この発明の発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意研究を行った結果、微生物に汚染された各種工業用水、工業製品などの殺菌対象系中におけるバイオフィルムの形成を、殺菌対象系から採取した工業用水やスライムなどの殺菌対象物から菌を単離せず、これを実験室レベル、具体的には疎水性材料からなるマイクロチューブ内で、貧栄養条件下で静置培養することにより、極めて短期間（２４時間以内）に再現できること、１〜１００μｇといった微量の採取物から一定の確実性をもってバイオフィルムが形成されることを見出し、この発明を完成するに到った。
【００１６】
かくして、この発明によれば、殺菌対象系から採取した殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加した後、得られた複数の溶液を個別に培地と共に疎水性材料からなるマイクロチューブに採取し、貧栄養条件下で静置培養した後、得られた各検体におけるバイオフィルムの有無により工業用殺菌剤の有効性を判断することを特徴とする工業用殺菌剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１７】
また、この発明によれば、上記の工業用殺菌剤のスクリーニング方法により判断された工業用殺菌剤の有効性に基づいて、殺菌対象系に工業用殺菌剤を添加して、殺菌対象系における微生物障害を防止することを特徴とする微生物障害の防止方法が提供される。
【発明の効果】
【００１８】
この発明によれば、工業用殺菌剤のバイオフィルムに対する阻害効果を簡易的かつより短期間にスクリーニングする評価方法およびそれを用いた殺菌対象系における微生物障害の防止方法を提供することができる。
すなわち、この発明によれば、微生物に汚染された各種工業用水、工業製品などの殺菌対象系中におけるバイオフィルムの形成を極めて短期間にスクリーニングでき、その判断された工業用殺菌剤の有効性、すなわち好適な工業用殺菌剤の種類およびその添加量に基づいて、殺菌対象系に工業用殺菌剤を添加することにより、殺菌対象系における微生物に由来する各種障害を的確に防止もしくは抑制することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
この発明の工業用殺菌剤のスクリーニング方法は、
（Ａ）殺菌対象系から採取した殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加した後、（Ｂ）得られた複数の溶液を個別に培地と共に疎水性材料からなるマイクロチューブに採取し、（Ｃ）貧栄養条件下で静置培養した後、（Ｄ）得られた各検体におけるバイオフィルムの有無により工業用殺菌剤の有効性を判断することを特徴とする。
各工程について具体的に説明する。
【００２０】
（Ａ）殺菌対象系から採取した殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加する。
この発明において「殺菌対象系」とは、微生物に由来するスライムが発生し、それによる各種障害が発生する系を意味する。
殺菌対象系としては、例えば、紙パルプ製造工程水系、工業用冷却水系、海水冷却水系などの工業用水系もしくは廃水系、ならびに金属加工油剤、繊維油剤、ペイント類、紙塗工液、ラテックス、糊剤などの工業製品およびこれらを使用する工程などが挙げられる。  この発明の方法は、紙パルプ製造工程水系および工業用冷却水系に好適に用いることができる。
【００２１】
殺菌対象系から公知の方法により殺菌対象物を採取する。
この発明において「殺菌対象物」は、工業用水または工業製品を意味し、「殺菌対象物の希釈物」は、殺菌対象系における微生物由来の付着物（スライム）を滅菌水、蒸留水または殺菌対象系の工業用水もしくは工業製品で希釈したものを意味する。希釈物における付着物の濃度は、０．１〜５重量％程度、好ましくは０．５〜１重量％程度である。
【００２２】
次いで、殺菌対象物またはその希釈物に複数種の工業用殺菌剤を既知量で個別に添加する。殺菌対象物が工業用水または液体の工業製品の場合には、工業用殺菌剤をそのまま添加する。その添加量は、微生物障害の状況、例えば微生物数（菌数）によって変動するが、通常、実際の殺菌対象系に添加する添加量であり、試料に対して０．１〜５００ｍｇ／リットル程度、好ましくは１〜１００ｍｇ／リットル程度である。
具体的には、工業用殺菌剤は、殺菌対象系、微生物障害の状況などにより、経験的に用いられる工業用殺菌剤の中から複数種を選択し、その添加量も経験則から数点を設定すればよい。
【００２３】
添加する工業用殺菌剤としては、有機窒素硫黄系殺菌剤、有機ブロム系殺菌剤、有機窒素系殺菌剤、有機硫黄系殺菌剤などの公知の殺菌剤が挙げられる。
【００２４】
有機窒素硫黄系殺菌剤としては、メチレンビスチオシアネート、エチレンビスチオシアネートなどのアルキレンビスチオシアネート；５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、４，５−ジクロロ−２−ｎ−オクチル−イソチアゾリン−３−オン、２−ｎ−オクチル−イソチアゾリン−３−オン、１，２−ベンゾイソチアゾリン−３−オンなどの３−イソチアゾロン系化合物；３−イソチアゾロン系化合物と金属塩とのコンプレックス；クロラミンＴ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ’−（フルオロジクロロメチルチオ）−Ｎ’−フェニルスルファミドなどのスルホンアミド系化合物；２−（チオシアノメチルチオ）ベンゾチアゾール、２−メルカプトベンゾチアゾールナトリウムなどのチアゾール系化合物などが挙げられる。
【００２５】
有機ブロム系殺菌剤としては、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、１，１−ジブロモ−１−ニトロ−２−プロパノール、２，２−ジブロモ−２−ニトロ−１−エタノール、１，１−ジブロモ−１−ニトロ−２−アセトキシエタン、１，１−ジブロモ−１−ニトロ−２−アセトキシプロパン、２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−ジアセトキシ−プロパン、トリブロモニトロメタンなどの有機ブロモニトロ系化合物；２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド、２−ブロモ−２−ブロモメチル−グルタロニトリルなどの有機ブロムシアノ系化合物；１，２−ビス−（ブロモアセトキシ）−エタン、１，２−ビス−（ブロモアセトキシ）−プロパン、１，４−ビス−（ブロモアセトキシ）−２−ブテン、１，２，３，−トリスブロモアセトキシプロパンなどの有機ブロム酢酸エステルまたはアミド類；ビストリブロモメチルスルホンなどの有機ブロモスルホン系化合物などが挙げられる。
【００２６】
有機窒素系殺菌剤としては、１−ブロモ−３−クロロ−５，５−ジメチルヒダントイン、１，３−ジブロモ−５，５−ジエチルヒダントイン、１，３−ジブロモ−５−メチル−５−ブチルヒダントイン、１−ブロモ−３−クロロヒダントインなどのヒダントイン化合物；５−クロロ−２，４，６−トリフルオロイソフタロニトリル、５−クロロ−２，４−ジフルオロ−６−メトキシイソフタロニトリルなどのイソフタロニトリル化合物；ヘキサヒドロ−１，３、５−トリエチル−ｓ−トリアジン、ヘキサヒドロ−１，３、５−トリス−（２−ヒドロキシエチル）−ｓ−トリアジンなどのｓ−トリアジン系化合物；α−クロロベンズアルドキシム、ジクロログリオキシムなどのハロゲン化オキシム系化合物；ジクロロイソシアネート、ジクロロイソシアヌール酸ナトリウム、トリクロロイソシアヌール酸などの塩素化イソシアヌール酸系化合物；塩化ベンザルコニウムなどの第４級アンモニウム化合物；Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−アミノメタノール、２−（ヒドロキシメチルアミノ）エタノールなどのアミノアルコール系化合物；２−ピリジンチオールナトリウムオキシドなどが挙げられる。
【００２７】
有機硫黄系殺菌剤としては、３，３，４，４−テトラクロロテトラヒドロチオフェン−１，１−ジオキシド、４，５−ジクロロ−１，２−ジチオール−３−オンなどが挙げられる。
また、その他の公知の殺菌剤としては、グルタルジアルデヒド、過酸化水素、次亜塩素酸塩、次亜臭素酸塩などが挙げられる。
【００２８】
（Ｂ）得られた複数の溶液を個別に培地と共に疎水性材料からなるマイクロチューブに採取する。
この発明において用いられる培地としては、ブイヨン培地、ツァペック培地、デンプン培地、Ｌ培地、スタンダード培地などの公知の培地が挙げられ、殺菌対象系やそれに含まれる菌種によって選択される。
次工程において貧栄養条件下で静置培養するためには、培地は、滅菌水または蒸留水で５〜１００倍、好ましくは１０〜５０倍に希釈された希釈培地であるのが好ましい。
また、短期間にバイオフィルムを形成するためには、ツァペック培地またはＬ培地の希釈物を用いるのが好ましい。
【００２９】
希釈培地としては、殺菌対象物が紙パルプ製造工程水系、工業用冷却水系、海水冷却水系などの工業用水系もしくは廃水系から採取された用水およびスライムである場合には、用水の上澄み液や濾過液にツァペック培地を加えたものでもよい。
殺菌対象物が金属加工油剤、繊維油剤、ペイント類、紙塗工液、ラテックス、糊剤などの工業製品や採取されたスライムである場合には、その工業製品の滅菌水や蒸留水などの水希釈物にツァペック培地を加えたものでもよい。
また、糊剤がデンプン糊である場合には、培地を添加することなく、デンプン糊の滅菌水や蒸留水などの水希釈物を使用してもよい。
【００３０】
工業用殺菌剤が添加された溶液と培地との総量は、５０〜２００μｌ程度、好ましくは５０〜１００μｌ程度であり、溶液は総量の０．１〜１０重量％程度、好ましくは０．５〜１重量％程度である。
【００３１】
この発明で用いられるマイクロチューブを構成する疎水性材料の「疎水性」は、ガラスやステンレスに比較してより疎水性を有することを意味する。このような材料としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリプロピレンから選択される熱可塑性樹脂が挙げられる。このような熱可塑静樹脂では、そのメカニズムは明らかでないが、経験的にガラスやステンレスに比較して、短期間で再現性のあるバイオフィルムを形成することができる。
【００３２】
この発明は、少量の殺菌対象物でバイオフィルムを形成することを特徴とする。
マイクロチューブとしては、公知のものを用いることができ、多検体の試料を一括して評価できる点で、多穴型マイクロプレートが特に好ましい。日本ベクトン・ディッキンソン株式会社や株式会社パーキンエルマージャパンから市販されているマイクロチューブやマイクロプレートを好適に用いることができる。具体的には、９６穴マイクロタイタープレート（バイオログ社製、ＦＡＬＣＯＮ３５３９１１：９６ウェル、Ｕ底、蓋なし、ポリ塩化ビニル製）が挙げられる。
【００３３】
（Ｃ）貧栄養条件下で静置培養する。
この発明において「貧栄養条件」とは、実質的に培地が希釈され、希釈前の培地に比較して、貧栄養の状態であることを意味する。工程（ｃ）の説明で記載したように、貧栄養条件を、滅菌水または蒸留水で５〜１００倍に希釈した希釈培地を用いることにより設定するのが好ましい。
静置培養の温度条件としては、短期間にバイオフィルム有無を評価できる点で、２０〜５０℃が好ましく、通常３７℃程度である。殺菌対象系の条件に合せる意味で、温度条件を３５〜５０℃に設定してもよい。
また、培養時間は、１２〜７２時間程度、好ましくは２４時間程度である。
振とう培養をしたは、液体の流動により生成したバイオフィルムが剥離して、評価結果にばらつきが生じことがあるので好ましくない。
【００３４】
（Ｄ）得られた各検体におけるバイオフィルムの有無により工業用殺菌剤の有効性を判断する。
この評価は、静置培養した後、染色液を用いてバイオフィルムを染色し、目視で行なってもよいが、マイクロチューブ内を純水などで洗浄・乾燥し、染色されたバイオフィルムを溶媒に溶解させ、得られた溶液の吸光度を測定することにより行うのが、より客観的な定量評価ができる点で好ましい。
【００３５】
染色液は、菌種や用いた培地の種類などにより適宜選択され、クリスタルバイオレット、メチレンブルーなどの塩基性色素が好適に使用できる。
また、染色されたバイオフィルムを溶解するための溶媒としては、ジメチルスルホキシド、アルコール類などの色素を溶解する溶媒であれば特に限定されない。
【００３６】
吸光度の測定において、その波長は染色液の種類により適宜設定すればよく、例えば、染色液としてクリスタルバイオレットを使用した場合には、波長を５９０ｎｍに設定すればよい。用いる測定機器は特に限定されないが、マイクロプレートリーダーなどで測定するのが簡便で好ましい。
【００３７】
上記のように、この発明のスクリーニング方法によって、殺菌対象系における微生物障害を防止するために有効な工業用殺菌剤の種類およびその添加量を簡便かつ短期間に選定できる。すなわち、この発明は、実際の殺菌対象系で生じ得るバイオフィルム形成に関与する微生物群集の環境変化や耐性菌の出現に対して、有効な工業用殺菌剤およびその添加量を的確に選定することができ、将来生じるであろう微生物障害の発生を予防することできる。
【００３８】
したがって、上記の工業用殺菌剤のスクリーニング方法により判断された工業用殺菌剤の有効性に基づいて、殺菌対象系に工業用殺菌剤を添加して、殺菌対象系における微生物障害を防止することができる。すなわち、この発明のスクリーニング方法を適時実施することにより、より的確に工業用殺菌剤の添加を管理することができる。ここで「管理」とは、工業用殺菌剤の種類の選定、添加時期および添加量を設定し、適用実施することを意味する。具体的には、定期的に、例えば２〜３日に１回の割合でスクリーニングを実施し、その結果に基づいて、殺菌対象系に工業用殺菌剤を添加するのが好ましい。
【実施例】
【００３９】
この発明を試験例および実施例により具体的に説明するが、この発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００４０】
試験例１（貧栄養下条件での静置培養によるバイオフィルム形成能試験）
Ａ製紙会社の抄紙工程において採取した、循環系白水の１次スクリーンおよびＰＤＦ（ポリディスクフィルター）に付着したスライムを、通常のＬ培地および純水で１０倍希釈したＬ培地を用いて静置培養し、それらのバイオフィルム形成能を試験した。
【００４１】
９６穴マイクロタイタープレート（バイオログ社製、ＦＡＬＣＯＮ３５３９１１：９６ウェル、Ｕ底、蓋なし、ポリ塩化ビニル製）の各ウェルに、通常のＬ培地（Ｌｅｎｎｏｘ培地、下記の組成）および純水で１０倍希釈したＬ培地（滅菌済み）を各１００μｌ注ぎ、採取したスライムを０．３重量％となるように純水に分散させ、その１μｌを各ウェルの培地に添加した。その後、乾燥を防止するために、マイクロタイタープレートをガラス製シャーレに入れ、３７℃に調節した高温槽で静置培養した。２４時間後、各ウェルの培地を除去し、純水で洗浄した後、７０℃に調節した高温槽で５〜１０分間乾燥させた。次いで、各ウェルに１％クリスタルバイオレット溶液（溶媒：エチルアルコール）を１００μｌ加え、室温で２０分間放置した。その後、各ウェルのクリスタルバイオレット溶液を除き、各ウェルの内壁の染色状態を目視で観察し、バイオフィルム（ＢＦ）の有無を判断した。一方、溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で５分間放置し、クリスタルバイオレットを溶解させた。その後、得られた溶液の５９０ｎｍにおける吸光度（ａｂｓ）を測定した。なお、吸光度が１．０ａｂｓを越える場合には、溶液を任意にＤＭＳＯで希釈して、吸光度を再測定した。
得られた結果を、スライム採取場所と共に表１に示す。
【００４２】
Ｌ培地の組成：Bacto-Tryptone          １０ｇ
Bacto-Yeast extract       ５ｇ
NaCl                      ５ｇ
ブドウ糖                  １ｇ
蒸留水            １０００ｍｌ
ｐＨ：                        ７．２
【００４３】
【表１】
2005318825.tif 000002
【００４４】
得られた吸光度から次の基準でバイオフィルム形成能を判定した。
吸光度：０．６７ａｂｓ未満                −（形成能なし）
０．６７以上１．３３ａｂｓ未満    ±
１．３３ａｂｓ以上                ＋（形成能あり）
【００４５】
表１および上記の判定基準から、純水で１０倍希釈したＬ培地の貧栄養条件下で、スライムを静置培養できることがわかる。したがって、微量の試料（採取スライム分散液）によりバイオフィルムが形成されることがわかる。
【００４６】
実施例１（工業用殺菌剤のスクリーニング）
Ｂ製紙会社の抄紙工程において採取した、循環系白水（ｐＨ７．０、亜硫酸イオン濃度２７ｐｐｍ、菌種：Acidovorax sp.、Acinetobacter sp.、Enterococcus sp.、生菌数２．２×１０7ＣＦＵ／ｍｌ）および１次スクリーンに僅かに付着したスライム（菌種：Enpedobacter sp.、Stenotrophomonas sp.、Enterobacter sp.）について、工業用殺菌剤のスクリーニングを行った。
この抄紙工程の現場では、２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−ジアセトキシ−プロパンを、添加量１５ｍｇ／リットル、１回当たりの添加時間２０分間、１日３回の条件で添加し、スライムの付着は殆どなく、安定操業ができている。
【００４７】
採取した循環系白水２００ｍｌに、同じく採取したスライムを０．３重量％となるように加え、この循環系白水１０ｍｌをＬ字管に採取した。表２に示す工業用殺菌剤をその規定量で循環系白水に添加し、３０℃で２０分間振とう培養した。その後、循環系白水中の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
一方、９６穴マイクロタイタープレート（試験例１参照）の各ウェルに、循環系白水９ｍｌとツァペック培地１ｍｌとの混合培地（滅菌済み）を各１００μｌ注ぎ、次いで、生菌数を測定した上記の循環系白水１μｌを各培地に添加した。その後、乾燥を防止するために、マイクロタイタープレートをガラス製シャーレに入れ、３７℃に調節した高温槽で静置培養した。２４時間後、各ウェルの培地を除去し、純水で洗浄した後、７０℃に調節した高温槽で５〜１０分間乾燥させた。次いで、各ウェルに１％クリスタルバイオレット溶液（溶媒：エチルアルコール）を１００μｌ加え、室温で２０分間放置した。その後、各ウェルのクリスタルバイオレット溶液を除き、各ウェルの内壁の染色状態を目視で観察し、バイオフィルム（ＢＦ）の有無を判定した。一方、溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各ウェルに１００μｌ加え、室温で５分間放置し、クリスタルバイオレットを溶解させた。その後、得られた溶液の５９０ｎｍにおける吸光度（ａｂｓ）を測定した。なお、吸光度が１．０ａｂｓを越える場合には、溶液を任意にＤＭＳＯで希釈して、吸光度を再測定した。
試験例１と同様の基準で、得られた吸光度からバイオフィルム形成能を判定した。
得られた結果を、用いた工業用殺菌剤およびその添加量と共に表２に示す。
【００４８】
【表２】
2005318825.tif 000003
【００４９】
表２における工業用殺菌剤の略号は、次の化合物を表す。
ＤＢＮＰＡ：２，２−ジブロモ−３−ニトリロプロピオンアミド
ＢＢＡＢ  ：１，４−ビス−（ブロモアセトキシ）−２−ブテン
ＭＡＣ    ：２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−ジアセトキシ−プロパン
ＣＬ−ＢＡ：α−クロロベンズアルドキシム
【００５０】
表２の結果から、この実施例の条件下では、使用した工業用殺菌剤の中で２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−ジアセトキシ−プロパンが、より低濃度の添加（１５ｍｇ／リットル）で、バイオフィルムの形成を阻害できることがわかる。また、バイオフィルムの形成阻害効果は、生菌数の低減効果とは相関関係がないことがわかる。
上記の結果は、循環系白水およびスライムを採取したＢ製紙会社の抄紙工程における工業用殺菌剤の添加の実状と一致している。
したがって、この発明によれば、バイオフィルム形成を有効に阻害する工業用殺菌剤の選定とその添加量の設定ができることがわかる。
【００５１】
実施例２（模擬殺菌対象系における微生物障害の防止方法）
実施例１で用いた循環系白水中に、同じく実施例１で用いたスライムを０．３重量％となるように加え、試験液を調整した。５００ｍｌビーカーの側面内側にポリエチレン製のプラスックワイヤー（９０ｍｍ×２７０ｍｍ）を取り付け、これに調整した試験液５００ｍｌを入れ、恒温槽付きジャーテスターで温度３０℃、回転数６０ｒｐｍで試験液を攪拌した。直ちに表３に示す工業用殺菌剤をその規定量の原液で試験水に添加した。添加２０分後に、ビーカー中の試験水を静かに捨てた。
新たに、５００ｍｌビーカーに、工業用殺菌剤を含まない調整した試験液を入れた。恒温槽付きジャーテスターで温度３０℃、回転数６０ｒｐｍで試験液を１２時間攪拌した。直ちに表３に示す工業用殺菌剤をその規定量の原液で試験水に添加した。添加２０分後に、ビーカー中の試験水を静かに捨てた。
新たに、５００ｍｌビーカーに、工業用殺菌剤を含まない調整した試験液を入れた。恒温槽付きジャーテスターで温度３０℃、回転数６０ｒｐｍで試験液を１２時間攪拌した。
以上の操作を１日２回繰り返して、１０日間試験を行った。
１０日後に、ビーカーから試験水を静かに捨てた後、ビーカーに取り付けたプラスチックワイヤーを取り外し、これを乾燥して、付着しているスライムの表面積を求めた。
得られた結果を、用いた工業用殺菌剤およびその添加量と共に表３に示す。
【００５２】
プラスチックワイヤーに付着したスライムの表面積の割合（汚れの量）を次の基準で判定した。
全体の  ０％以上  ２５％未満：１
全体の２５％以上  ５０％未満：２
全体の５０％以上  ７５％未満：３
全体の７５％以上１００％未満：４
【００５３】
【表３】
2005318825.tif 000004
【００５４】
表３の結果から、この実施例の条件下では、使用した工業用殺菌剤の中で２−ブロモ−２−ニトロ−１，３−ジアセトキシ−プロパンが、より低濃度の添加（１５ｍｇ／リットル）で、バイオフィルムの形成を阻害できることがわかる。
上記の結果は、実施例１の結果と同様に、循環系白水およびスライムを採取したＢ製紙会社の抄紙工程における工業用殺菌剤の添加の実状と一致している。
したがって、この発明の方法は、殺菌対象系の現状との相関があり、これに適用できることがわかる。