(57)【要約】【課題】  ヒトKankに対するモノクローナル抗体、並びに該抗体を用いたヒトKankの検出法およびその利用法の提供。【解決手段】  ヒトKankのアミノ酸配列第406番目〜第580番目のアミノ酸配列およびその断片を抗原とする抗Kankモノクローナル抗体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトKank遺伝子のアミノ酸配列第406番目〜第580番目およびその断片からなるペプチドを抗原とした抗Kankモノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１記載のモノクローナル抗体と生体試料を接触させることを含む生体試料中のKankを検出する方法。
【請求項３】
請求項１記載のモノクローナル抗体と生体試料を接触させることを含む癌及びその他の疾病を診断する方法。
【請求項４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を含む癌及びその他の疾病を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌抑制遺伝子Kankに対するモノクローナル抗体に関し、さらに該抗体を用いたKankの検出方法およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト染色体9p24に存在する腎臓癌関連遺伝子kank（KIAA0172）の遺伝子産物（Kank）は、1194アミノ酸、分子量約130kＤａのタンパク質である。該タンパク質は、細胞質に存在し、N末端のcoiled coilモチーフおよびC末端の164アミノ酸長のアンキリンリピートを有し、共にそれぞれタンパク質−タンパク質相互作用部位として作用することから、細胞内シグナル伝達、細胞骨格形成および細胞周期において重要な役割を担っていると推定される。本発明者等は、腎臓癌組織においてkank遺伝子の発現が減少していることを見出し、さらに癌細胞において増殖抑制機能を有することを見出した（非特許文献１を参照）。
【０００３】
ヒトKankによる癌（特に腎臓癌）の診断および遺伝子治療等が期待されているが、Kankに対するモノクローナル抗体はできにくく、腎臓癌におけるKankを簡便に検出する方法はなかった。
【非特許文献１】Sarkar,S., J. Biol. Chem. 277 (39), 36585-36591 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ヒトKankの測定を可能とする、特異性の高い抗Kankモノクローナル抗体、並びに該抗体を利用したヒトKankの測定方法を提供し、さらにヒトKankおよびその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ヒトKankの第406〜580番目のアミノ酸配列よりなるペプチド断片を抗原として用いることにより抗ヒトKank抗体の作製に成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]  ヒトKank遺伝子のアミノ酸配列第406番目〜第580番目およびその断片からなるペプチドを抗原とした抗Kankモノクローナル抗体、
[２]  [１]のモノクローナル抗体と生体試料を接触させることを含む生体試料中のKankを検出する方法、
[３]  [１]のモノクローナル抗体と生体試料を接触させることを含む癌及びその他の疾病を診断する方法、ならびに
[４]  [１]のモノクローナル抗体を含む癌及びその他の疾病を診断するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の抗体は、ヒトKankの第406〜580番目のアミノ酸配列およびその断片を抗原として作製されたものであり、ヒトKankの検出、癌の診断、遺伝子治療および癌関連実験等に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の抗体は、ヒトKankを抗原として動物に投与することにより得られる。抗原としてはヒトKankの部分ペプチドが望ましく、ヒトKankのアミノ酸残基第406〜580番目の断片が特に望ましい。ヒトKankのアミノ酸残基第406〜580番目の配列を配列番号１に示す。kank遺伝子の塩基配列は公知であるので、上記断片は遺伝子工学的手法により容易に得ることができる。Kankのアミノ酸残基第406〜580番目の部分には、何れの公知の機能ドメインも存在せず、kank遺伝子の生物種間における相同性が低い領域であった。従って、この部分に対する抗体はヒトKankを特異的に認識し、ヒトKank以外のタンパク質と交差反応する可能性が低いと考えられた。
【０００９】
免疫方法、ハイブリドーマのスクリーニング、モノクローナル抗体の産生、精製およびKankの免疫学的測定法（免疫染色、免疫沈降、イムノブロッティング等）は、当業者に知られた方法を用いた。
【００１０】
このようにして得られた抗体を使用することにより、Kankの生成、蓄積または消失が関与する疾患（例えば腎臓癌など）の検査方法、並びに該疾患に対する治療薬の薬効評価方法等を提供する。
【実施例】
【００１１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例1.抗Kankモノクローナル抗体の作製
Kankタンパク質のアミノ酸406-580（図１および配列番号１）に関してPCRで増幅したcDNAを、ベクターpGEX(Amersham Bioscience社)にグルタチオンS-トランスフェラーゼと一緒にフレームを合わせて融合した。そしてイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを用いて大腸菌にて融合タンパク質を誘導した後、該タンパク質をグルタチオン-セファロースビーズ(Amersham Bioscience社)で精製し、これを抗原としてマウス免疫に使用した。使用したマウスはB6C3F1である。ELISA法によってハイブリドーマのスクリーニングを実施した。免疫された血清は、同一の抗原性を有するグルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質をセファロースに結合して調製したアフィニティーカラムで精製した。
【００１２】
実施例2. 該抗体を用いた免疫染色実験1
kank cDNA をpCMVベクター（Invitorogen社）にクローン化し、pCMV-Kankを得、トランスフェクションに使用した。カバースリップ上に増殖させたHEK293細胞に、LipogfectAMINE 2000（Invitrogen社）用いて製品使用説明書に従って前記pCMV-Kankをトランスフェクションした。24時間後、細胞を冷却メタノール（-２０℃）で固定し、PBSで洗浄し、室温にて実施例１で作製した抗Kankモノクローナル抗体と1時間インキュベーションした。フルオレセインイソチオシアネート標識ウサギIgG(ICN/Capple社)を蛍光共焦点顕微鏡LSM-410（Carl Zeiss社）下のKankタンパク質の可視化に使用した。核はHoechst33258で染色した。写真は、Axioskop 2 plus（Carl Zeiss社）を用いて撮影した。その結果を図２に示す。また、HEK293細胞にGFP-Kankを安定発現させ、同様に解析した結果を図３に示す。該抗体はin vitro系の組換えヒトKankタンパク質を特異的に認識し、鮮明に免疫染色され得ることが分かる。
【００１３】
実施例3. 該抗体を用いた免疫染色実験2
Kankを恒常的に発現している腎臓癌細胞系VMRC-RCW細胞を、実施例1で作製した抗Kankモノクローナル抗体で免疫染色した。細胞の固定、可視化、核染色、写真撮影等は2と同様に実施した。その結果を図４Aおよび図４Bに示す。該抗体は、in vivo系においてもヒトKankタンパク質を特異的に認識し、鮮明に免疫染色され得ることがわかる。
【００１４】
実施例4.該抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロッティング実験
細胞抽出物を調製するために、細胞をPBSで3回洗浄し、50mM  Tris-HCl（pH 7.5）,140mM  NaCl,10％  glycerol, 1% NP-40, 100mM NaF, 200mM NA3VO4, 1mM PMSF, 10μg/ml leupeptin, 10μg/ml aprotinin, 10μg/ml chymotrypsinを含有する緩衝液で氷上15分間溶解した。溶解物を４℃で15分間遠心し、免疫沈降に使用した。細胞溶解物および免疫沈降物をSDS-PAGEによって分析し、PVDF膜にトランスファーした。PVDF膜を5％スキムミルクでブロッキングし、次いで実施例１の抗Kank抗体でプローブした。アルカリホスファターゼコンジュケートウサギIgG（Promega社）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム（Invitrogen社）をKankの検出に用いた。HEK293T細胞溶解物を正常IgGおよび実施例1で作製した抗Kankモノクローナル抗体を用いて免疫沈降した結果を、図5のレーン1およびレーン2に示す。ウエスタンブロッティングは実施例１の抗体を用いて実施し、二次抗体には抗マウスHRPコンジュゲート(Cell Signaling社)を用い、ECL検出システム(Amersham社)によって検出した。IMCDマウス細胞溶解物(レーン4)は免疫交差反応性を見るために用いられた。以上の結果により、該抗体は内因性Kankタンパク質を認識し、免疫沈降法およびウエスタンブロッティングに用いることができることが判明した。
【００１５】
実施例5.該抗体を用いた免疫沈降およびウエスタンブロッティング実験
293T細胞にそれぞれコントロールのベクターあるいはFLAGタグ付ヒトkank遺伝子を発現させて、タンパク質を抽出し、抗Kankモノクローナル抗体で該タンパク質を免疫沈降法によって分離した後、anti-FLAG M2 抗体(SIGMA社)を用いてFLAGタグ付ヒトKankタンパク質をウエスタンブロッティングにて検出した。一次抗体に（1）実施例１の抗Kank モノクローナル抗体および抗原Kank（実施例１でモノクローナル抗体作製に用いたペプチド）の混合物、および（2）実施例１の抗Kank モノクローナル抗体のみ、をそれぞれ用いた結果を図6のレーン1および2に示す。以上の結果により、該抗体が免疫沈降並びにウエスタンブロッティングにより認識するタンパク質はKankタンパク質であることが判明した。
【００１６】
実施例6.該抗体を用いたヒト腎臓癌組織切片の免疫染色実験
ヒト腎臓癌組織切片を公知の方法にて固定し、実施例1で作製した抗体を1次抗体に、2次抗体に抗マウスHRPコンジュゲート（Cell Signaling社）を使用し、DAB染色した。核をヘマトキシリンで濃青に染色した。その写真を図7のA、BおよびCに示す。Kankタンパク質は、茶色に染色され、遠位尿細管および近位尿細管の周辺、血管中膜（平滑筋）に存在していることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗Kankモノクローナル抗体の作製に用いたKankタンパク質のアミノ酸406-580の配列である。
【図２】Kank cDNAをトランスフェクトしてから24時間後のHEK293細胞の写真である。細胞を抗Kankモノクローナル抗体で免疫染色した。
【図３】HEK293細胞にGFP-Kankをトランスフェクトした安定なクローンの写真である。細胞を該抗Kankモノクローナル抗体で免疫染色し、FITC-コンジュゲートしたマウスIgGで可視化し、核はHoechst33258で染色した。
【図４Ａ】Kankを発現している腎臓がん細胞系VMRC-RCW細胞の写真である。細胞を該抗Kank抗体を用いて免疫染色した。可視化には、FITC-コンシュゲートしたマウスIgGを用いた。
【図４Ｂ】Kankを発現している腎臓がん細胞系VMRC-RCW細胞の写真である。細胞を該抗Kank抗体を用いて免疫染色した。可視化には、FITC-コンシュゲートしたマウスIgGを用いた。
【図５】抗Kankモノクローナル抗体を用いた免疫沈降およびウェスタンブロッティングの図である。HEK293T細胞溶解物を正常IgGおよび該抗Kankモノクローナル抗体を用いて免疫沈降した結果をレーン1およびレーン2に示す。ウエスタンブロッティングは、同じ抗体を用いて実施した。IMCDマウス細胞溶解物(レーン4)は免疫交差反応性を確認するために使用された。
【図６】抗Kankモノクローナル抗体 12Cのウェスタンブロッティングの図である。293T細胞にコントロールのベクターおよびFLAGタグ付ヒトkankを発現させて、タンパク質を抽出し、anti-FLAG M2 (SIGMA社)で精製したFLAGタグ付ヒトkankタンパク質をウエスタンブロッティングにて検出した。一次抗体に（1）抗Kank mAb12Cに抗原をまぜたものおよび（2）抗Kank mAb 12Cをそれぞれ用い、二次抗体には抗マウスHRPコンジュゲート(Cell Signaling社)を用い、ECL検出システム(Amersham Bioscience社)によって検出した。
【図７Ａ】ヒト腎臓癌組織切片を公知の方法にて固定し、実施例1で作製した抗体を1次抗体に、2次抗体に抗マウスHRPコンジュゲート（Cell Signaling社）を使用し、DAB染色したものを示す写真である。Kankタンパク質は茶色に染色され、遠位尿細管および近位尿細管の周辺細胞（尿細管細胞）、血管中膜（平滑筋）には存在しているが、糸球体には存在していないことがわかる。
【図７Ｂ】ヒト腎臓癌組織切片を公知の方法にて固定し、実施例1で作製した抗体を1次抗体に、2次抗体に抗マウスHRPコンジュゲート（Cell Signaling社）を使用し、DAB染色したものを示す写真である。Kankタンパク質は茶色に染色され、遠位尿細管および近位尿細管の周辺細胞（尿細管細胞）、血管中膜（平滑筋）には存在しているが、糸球体には存在していないことがわかる。
【図７Ｃ】ヒト腎臓癌組織切片を公知の方法にて固定し、実施例1で作製した抗体を1次抗体に、2次抗体に抗マウスHRPコンジュゲート（Cell Signaling社）を使用し、DAB染色したものを示す写真である。Kankタンパク質は茶色に染色され、遠位尿細管および近位尿細管の周辺細胞（尿細管細胞）、血管中膜（平滑筋）には存在しているが、糸球体には存在していないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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