(57)【要約】【課題】  電極が微小化されても所定の電極への酵素の固定化が容易であり、体格の小型化が図られる酵素センサおよびそれを用いた分析装置を提供する。【解決手段】  酵素センサ１０は、酵素固定部２３が設置されている作用極１２の径方向外側に、筒状の規定部２２を備えている。酵素固定部２２を形成する場合、液状または半固形状の流動性を有する樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液は、規定部２２の内側に充填される。これにより、流動性を有する酵素液は、規定部２２により移動が制限され、作用極１２以外の部位に流れ出ることがない。そのため、酵素センサ１０の小型化にともない電極が微小化されても、所定の電極へ容易に酵素を固定化することができる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板に設置されている第一電極を含む二つ以上の電極と、
前記二つ以上の電極のうち、前記第一電極を含む少なくとも一つの電極の外周部に設置されている規定部と、
酵素を含有し、前記規定部内の前記第一電極側において前記第一電極の少なくとも一部を覆っている酵素固定部と、
を備えることを特徴とする酵素センサ。
【請求項２】
前記規定部は、前記第一電極の外周部において前記酵素固定部を周方向に包囲する筒状に形成されていることを特徴とする請求項１記載の酵素センサ。
【請求項３】
前記基板は、前記第一電極が設置されている凹部を有し、
前記規定部は、前記凹部の端部に形成される側壁部であることを特徴とする請求項１記載の酵素センサ。
【請求項４】
前記電極は、
前記第一電極と、
前記第一電極の外周部において、前記規定部を挟んで前記第一電極と同心円状に配置される第二電極と、
前記第二電極の径方向外側において前記第一電極および第二電極と同心円状の半円形状に配置される第三電極と、
を有することを特徴とする請求項１または２記載の酵素センサ。
【請求項５】
前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極は、二種類以上の異なる材料から形成され、
前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極の少なくとも一つは、白金から形成されていることを特徴とする請求項４記載の酵素センサ。
【請求項６】
前記酵素固定部は、前記第一電極の全部を覆っていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項記載の酵素センサ。
【請求項７】
前記酵素固定部は、二種類以上が混合された複数の酵素を含有することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項記載の酵素センサ。
【請求項８】
前記酵素固定部は、一種類の酵素を含有する膜片部を複数有することを特徴とする請求項１から７のいずれか一項記載の酵素センサ。
【請求項９】
前記酵素固定部は、少なくともグルコースオキシターゼおよびマルトースホスホリラーゼを含有することを特徴とする請求項１から８のいずれか一項記載の酵素センサ。
【請求項１０】
前記酵素固定部には、４つ以上のグルコースからなる糖鎖を基質として含有する分析溶液が供給されることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項記載の酵素センサ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項記載の酵素センサと、
重力方向において前記酵素固定部の上方に設置され、前記規定部の軸方向へ前記酵素固定部に基質を含む分析溶液を供給する供給部と、
前記酵素固定部に供給された分析溶液を、前記酵素固定部の径方向外側へ排出する排出部と、
を備えることを特徴とする分析装置。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項記載の酵素センサと、
前記酵素センサが設置される基礎部材と、
前記基礎部材との間に、前記酵素センサを収容する第一収容室、および前記第一収容室に接続し前記酵素固定部に含まれている酵素と異なる酵素を含有する膜部材を収容する第二収容室を形成するケーシングと、
を備えることを特徴とする分析装置。
【請求項１３】
基板に第一電極を形成する段階と、
前記第一電極の径方向外側に、前記第一電極を周方向に包囲し前記第一電極から反基板側に立ち上がる規定部を形成する段階と、
前記規定部の内側に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階と、
を含むことを特徴とする酵素センサの製造方法。
【請求項１４】
前記規定部は、フォトリソグラフィにより形成することを特徴とする請求項１３記載の酵素センサの製造方法。
【請求項１５】
基板の一方の面側に、他方の面側に窪む凹部を形成する段階と、
前記凹部に第一電極を形成する段階と、
前記凹部に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階と、
を含むことを特徴とする酵素センサの製造方法。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか一項記載の酵素センサを用いて、アミラーゼの活性を測定することを特徴とするアミラーゼ活性測定方法。
【請求項１７】
請求項１６記載のアミラーゼ活性測定方法を用いて前記アミラーゼの活性を測定する段階を含むことを特徴とするヒトストレス判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素センサおよびそれを用いた分析装置、酵素センサの製造方法、ならびにアミラーゼ活性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酵素反応を用いて種々の物質を検出する酵素センサが広く知られている。酵素センサは、一般に酵素が固定された作用極、作用極との間に電位差を生じる対極、および基準となる電位を与える参照極を有している（特許文献１参照）。このような酵素センサは、例えばヒトが受けているストレスを判定するために、アミラーゼ活性の測定に適用される（特許文献２、非特許文献１参照）。
【０００３】
唾液中のアミラーゼの活性を測定する原理は、次の通りである。
複数のグルコースの糖鎖からなる基質としてのデンプンは、被験者から採取した唾液と混合される。これにより、デンプンは、唾液中のアミラーゼの作用によりマルトースに分解する。分解したマルトースは、酵素センサに固定化されているα−グルコシダーゼの作用によりグルコースに分解する。分解したグルコースは、さらに酵素センサに固定化されているグルコースオキシダーゼにより酸化され、グルコノラクトンおよび過酸化水素を生成する。生成した過酸化水素が酸素と水とに分解する際に生じる電子を検出することにより、唾液中のアミラーゼの活性が測定される。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−６５８９２号公報
【特許文献２】特開２００２−１６８８６０号公報
【非特許文献１】Biosensor and Bioelectronics 18(2003)835-840
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のような酵素センサには、取り扱いを容易にするため小型化および軽量化が要求される。近年では、酵素センサの製造には例えばフォトリソグラフィや印刷技術が用いられている。これにより、平面上に複数の電極を形成することができ、酵素センサの小型化および軽量化ならびに量産化が図られている。
しかしながら、酵素センサの小型化を進めると、酵素が固定化される作用極、ならびに作用極に近接する対極および参照極は微小化する。そのため、微小な作用極にのみ酵素を固定化することは困難となっている。
【０００６】
そこで、本発明は、電極が微小化されても所定の電極への酵素の固定化が容易であり、体格の小型化が図られる酵素センサおよびそれを用いた分析装置を提供することを目的とする。
また、本発明は、所定の電極への酵素の固定化が容易な酵素センサの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の第一の目的を達成するため、本発明による酵素センサによると、基板と、前記基板に設置されている第一電極を含む二つ以上の電極と、前記二つ以上の電極のうち、前記第一電極を含む少なくとも一つの電極の外側に設置されている規定部と、酵素を含有し、前記規定部内の前記第一電極側において前記第一電極の少なくとも一部を覆っている酵素固定部と、を備えることを特徴とする。複数の電極のうち少なくとも一つの第一電極の外周部に第一電極を包囲する規定部を設置することにより、規定部の内側に酵素固定部が設置される。そのため、例えば塗布、硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は規定部の内側に塗布される。このとき、酵素液は規定部によって移動が制限される。その結果、酵素液が所定外の位置へ塗布されることはない。したがって、本発明による酵素センサは、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。また、電極が微小化されるため、酵素センサの小型化を図ることができる。ここで、電極の外周部とは、電極側壁の外側もしくは電極上面の側壁側端部をいうものとする。
【０００８】
さらに本発明による酵素センサによると、前記規定部は、前記第一電極の外周部において前記酵素固定部を周方向に包囲する筒状に形成されている。そのため、酵素固定部となる酵素液および硬化した酵素固定部の移動は、第一電極の周方向の全周において制限することができる。
【０００９】
さらに、本発明による酵素センサによると、前記基板は前記第一電極が設置されている凹部を有し、前記規定部は前記凹部の端部に形成される側壁部である。そのため、酵素固定部となる酵素液および硬化した酵素固定部の移動は、凹部の端部に形成される側壁部により制限することができる。
【００１０】
さらに、本発明の酵素センサによると、前記電極は、前記第一電極と、前記第一電極の外周部において、前記規定部を挟んで前記第一電極と同心円状に配置される第二電極と、前記第二電極の径方向外側において前記第一電極および第二電極と同心円状の半円形状に配置される第三電極とを有している。そのため、基板の大型化を招くことなく、第一電極、第二電極および第三電極との対向部分の全長を延長することができる。したがって、性能の低下を招くことなく、体格の小型化を図ることができる。
【００１１】
さらに、本発明の酵素センサによると、前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極は、二種類以上の異なる材料から形成され、前記第一電極、前記第二電極および前記第三電極の少なくとも一つは、白金から形成されている。白金のイオン化傾向は小さいため、電極の電気分解がされにくい。この結果、電極の劣化による性能（感度）の低下がおきにくいという効果がある。
【００１２】
さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、前記第一電極の全部を覆っている。そのため、酵素固定部と第一電極との接触面積が拡大する。したがって、酵素反応により生じた電位差を高精度に検出することができる。
【００１３】
さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、二種類以上が混合された複数の酵素を含有する。そのため、単一の酵素固定部で複数の反応が進行する。したがって、酵素ごとに酵素固定部を設置する必要がなく、体格の小型化を図ることができる。
【００１４】
さらに、本発明の酵素センサによると、一種類の酵素を含有する膜片部を複数有している。そのため、各膜片部において単一の反応が進行する。したがって、反応速度が小さい場合でも、各膜片部において確実に反応を進行することができる。また、親和性の低い複数の酵素を用いる場合、酵素間の相互作用を低減することができる。
【００１５】
さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部は、少なくともグルコースオキシターゼおよびマルトースホスホリラーゼを含有する。例えば、アミラーゼの活性を測定する場合、マルトペンタオース（Ｇ５）を分解して生成するマルトース（Ｇ２）およびマルトトリオース（Ｇ３）をα−グルコシダーゼを用いて分解し、生成したグルコースの量を測定することが知られている。しかし、α−グルコシダーゼは、酵素固定部への固定化が困難であり、固定化による活性の低下を招きやすい。これに対し、マルトースホスホリラーゼは、酵素固定部への固定化が容易であり、固定化による活性の低下も小さい。したがって、酵素の固定化を容易にすることができ、酵素の活性を高めることができる。
さらに、本発明の酵素センサによると、前記酵素固定部には、４つ以上のグルコースからなる糖鎖を基質として含有する分析溶液が供給される。したがって、アミラーゼの活性を精度よく測定することができる。
【００１６】
本発明に係る分析装置によると、上述の酵素センサと、重力方向において前記酵素固定部の上方に設置され、前記規定部の軸方向へ前記酵素固定部に基質を含む分析溶液を供給する供給部と、前記酵素固定部に供給された分析溶液を、前記酵素固定部の径方向外側へ排出する排出部とを備えることを特徴とする。これにより、基質を含む分析溶液は酵素センサの酵素固定部に概ね垂直に流入する。そのため、分析溶液と酵素固定部とは確実に接触する。また、酵素固定部へ供給された分析溶液は、酵素固定部の径方向外側へ排出される。そのため、分析溶液が酵素固定部に留まることはない。さらに、供給部と排出部とは概ね垂直な位置関係となり、分析装置の設置に必要な容積は低減する。したがって、分析装置の体格の小型化が図られるとともに、酵素センサによる測定精度を高めることができる。
【００１７】
また、本発明に係る分析装置によると、上述の酵素センサと、前記酵素センサが設置される基礎部材と、前記基礎部材との間に、前記酵素センサを収容する第一収容室、および前記第一収容室に接続し前記酵素固定部に含まれている酵素と異なる酵素を含有する膜部材を収容する第二収容室を形成するケーシングと、を備えることを特徴とする。これにより、基質を含む分析溶液は、第二収容室において第一段階の化学反応を経た後、酵素センサを収容する第一収容室に流入する。そのため、酵素センサでは所定の化学反応が確実に進行する。したがって、酵素センサによる測定精度を高めることができる。
【００１８】
上記の第二の目的を達成するため、本発明の酵素センサの製造方法によると、基板に第一電極を形成する段階と、前記第一電極の径方向外側に、前記第一電極を周方向に包囲し前記第一電極から反基板側に立ち上がる規定部を形成する段階と、前記規定部の内側に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階とを含むことを特徴とする。第一電極の外側に規定部を形成することにより、規定部の内側に酵素固定部が容易に形成される。例えば硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は規定部の内側に塗布される。このとき、酵素を含有する液状の酵素液は規定部によって移動が制限される。その結果、酵素液は所定外の位置へ塗布されることがない。したがって、本発明による酵素センサの製造方法では、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。
さらに、本発明の酵素センサの製造方法によると、前記規定部はフォトリソグラフィにより形成する。したがって、微小な電極の外側に微小な規定部を容易に形成することができる。
【００１９】
上記の第二の目的を達成するため、本発明の酵素センサの製造方法によると、基板の一方の面側に、他方の面側に窪む凹部を形成する段階と、前記凹部に第一電極を形成する段階と、前記凹部に、酵素を含有し前記第一電極を覆う酵素固定部を形成する段階とを含むことを特徴とする。第一電極を基板の一方の面側に形成された凹部に形成することにより、凹部の内部に酵素固定部が容易に形成される。例えば硬化することにより酵素固定部を形成する液状の樹脂に酵素を固定化する場合、酵素を含有する液状の酵素液は凹部の内側に塗布される。このとき、酵素を含有する液状の酵素液は凹部の側壁部によって移動が制限される。その結果、酵素液は所定外の位置へ塗布されることがない。したがって、本発明による酵素センサの製造方法では、電極が微小化されても所定の電極に酵素を容易に固定化することができる。
【００２０】
本発明のアミラーゼ活性測定方法によると、上述の酵素センサを用いて、アミラーゼの活性を測定することを特徴とする。したがって、体格の小さな酵素センサにより、アミラーゼの活性を高い精度で測定することができる。
本発明のヒトストレス判定方法によると、上述のアミラーゼ活性測定方法を用いて前記アミラーゼの活性を測定する段階を含むことを特徴とする。したがって、アミラーゼの活性によりヒトストレスを高い精度で測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（１．酵素センサ）
まず、本発明による酵素センサの複数の実施形態を図面に基づいて説明する。
（第１実施例）
本発明の第１実施例による酵素センサを図１に示す。図１は、第１実施例による酵素センサを示す概略図である。
酵素センサ１０は、ガラスなどの絶縁体から形成されている基板１１を備えている。基板１１は、絶縁体であれば例えば樹脂あるいはセラミックスなどを適用してもよく、ガラスに限るものではない。基板１１の一方の面には、ポテンショスタットを構成する第一電極としての作用極１２、第二電極としての対極１３および第三電極としての参照極１４が設置されている。作用極１２および対極１３は、白金により形成されている。また、参照極１４は、銀により形成されている。なお、作用極１２、対極１３および参照極１４は、白金または銀に限らず、銅などの金属または炭素などの導電体で形成してもよい。
【００２２】
作用極１２は、第一配線部１５により第一パッド１６と接続されている。対極１３は、第二配線部１７により第二パッド１８と接続されている。参照極１４は、第三配線部１９により第三パッド２０と接続されている。第一パッド１６、第二パッド１８および第三パッド２０には、外部に接続される導線などの図示しない配線部材が接続される。対極１３および参照極１４は、作用極１２を中心とする同心円状に配置されている。そのため、作用極１２の外周側には、作用極１２の周方向に沿って対極１３が対向して設置されている。また、対極１３のさらに外周側には、対極１３の周方向に沿って参照極１４が設置されている。
【００２３】
作用極１２は、略円形状に形成されている。本実施例の場合、作用極１２の面積は２．５４ｍｍ２に設定している。対極１３は、周方向の一部に切欠部２１を有する略円弧状に形成されている。対極１３は、切欠部２１を除き作用極１２を周方向に包囲している。作用極１２に接続する第一配線部１５は、対極１３の切欠部２１を経由して第一パッド１６に接続している。参照極１４は、略半円弧状に形成され、対極１３の外側を周方向に包囲している。
【００２４】
略円形状に形成されている作用極１２と、所定の間隔を形成して作用極１２と周方向に対向する対極１３との間には、規定部２２が設置されている。規定部２２は、樹脂により略円筒状に形成され、作用極１２と対極１３との間、および第一配線部１５の反基板側に設置されている。これにより、規定部２２は、作用極１２の外周側を周方向に筒状に包囲している。第１実施例の場合、作用極１２、対極１３、参照極１４、第一配線部１５、第二配線部１７および第三配線部１９を形成する白金または銀からなる金属層の厚さは０．４μｍから１．０μｍ程度であるのに対し、規定部２２の厚さすなわち軸方向の長さは０．１ｍｍ程度である。したがって、規定部２２は、基板１１の一方の面から立ち上がって形成されている。なお、規定部２２は、樹脂に限らず絶縁体の材料により形成することができる。
【００２５】
筒状の規定部２２の内側には、酵素固定部２３が設置されている。規定部２２は作用極１２の径方向外側に周方向へ形成されているため、規定部２２の内側に設置された酵素固定部２３は作用極１２の全面を覆っている。これにより、酵素固定部２３の面積は、作用極１２と概ね同一となる。なお、酵素固定部２３は、作用極１２の一部を覆う構成としてもよい。
【００２６】
酵素固定部２３は、酵素を固定化した樹脂が硬化したものである。第１実施例の場合、酵素は架橋法により固定化されている。酵素は、架橋法に限らず、例えば包括法あるいは担体結合法など任意の手法により固定化してもよい。酵素固定部２３は、単一種の酵素または複数種の酵素を含有している。酵素固定部２３に複数種の酵素を固定化する場合、酵素固定部２３には複数種の酵素を混合して固定化することができる。なお、酵素固定部２３は、図２に示すように種類の異なる酵素をそれぞれ膜片部２３１、２３２に固定化し、膜片部２３１、２３２を規定部２２の軸方向に積層する構成としてもよい。また、図３に示すように種類の異なる酵素をそれぞれ膜片部２３３、２３４に固定化し、膜片部２３３、２３４を隣接して配置してもよい。酵素は、酵素センサを適用する基質に応じて任意に選定することができる。また、酵素固定部２３および膜片部２３１、２３２、２３３、２３４には、単一または複数種の酵素を固定化することができる。
【００２７】
次に、第１実施例による酵素センサ１０の製造方法について説明する。
第１実施例による酵素センサ１０は、フォトリソグラフィにより製造される。図４に示すように、基板１１となるガラス板３０が準備される。なお、ガラス板３０には複数の酵素センサが形成されるが、ここでは説明の簡単のため単一の酵素センサの製造について説明する。
【００２８】
準備されたガラス板３０の一方の面には、図５に示すように例えばスパッタリングにより白金膜３１が形成される。ガラス板３０に白金膜３１が形成されると、図６に示すようにフォトレジストによりパターンマスク３２が形成される。パターンマスク３２は、図１に示す酵素センサ１０の作用極１２、対極１３、第一配線部１５、第二配線部１７、第一パッド１６および第二パッド１８の形状に対応している。
【００２９】
パターンマスク３２を形成した後、図７に示すように白金膜３１はドライエッチングされる。これにより、図１に示す酵素センサ１０の作用極１２、対極１３、第一配線部１５、第二配線部１７、第一パッド１６および第二パッド１８の形状に対応する白金膜３１が形成される。パターンマスク３２を除去することにより、図８に示すようにガラス板３０には白金膜３１からなる導電パターン３３が形成される。
【００３０】
形成された白金膜３１からなる導電パターン３３は、図９に示すように保護マスク３４で保護される。保護マスク３４は、白金膜３１からなる導電パターン３３を覆う。保護マスク３４は、例えばフォトレジストにより形成される。保護マスク３４が形成されると、図１０に示すようにガラス板３０の全体に銀膜３５を形成する。銀膜３５は、例えばスパッタリングにより形成される。このとき、白金膜３１からなる導電パターン３３は、保護マスク３４に保護されている。そのため、銀膜３５は、ガラス板３０のうち保護マスク３４で覆われていない部分に形成される。
【００３１】
ガラス板３０に銀膜３５が形成されると、銀膜３５の上方に図１１に示すようにフォトレジストによりパターンマスク３６が形成される。パターンマスク３６は、図１に示す酵素センサ１０の参照極１４、第三配線部１９および第三パッド２０の形状に対応している。パターンマスク３６を形成した後、図１２に示すように銀膜３５はドライエッチングされる。これにより、図１に示す酵素センサ１０の参照極１４、第三配線部１９および第三パッド２０の形状に対応する銀膜３５が形成される。パターンマスク３６および保護マスク３４を除去することにより、図１３に示すようにガラス板３０には、白金膜３１からなる導電パターン３３、および銀膜３５からなる導電パターン３７が形成される。
【００３２】
導電パターン３３および導電パターン３７が形成されると、図１４に示すように導電パターン３３のうち作用極に対応する電極の外周部に図１に示す酵素センサ１０の規定部２２となる突部３８が形成される。突部３８は、フォトリソグラフィーによりフォトレジストなどの樹脂で形成される。なお、突部３８は、図１に示すように作用極１２の上に形成してもよいし、作用極１２の外側の基板１１上に形成してもよく、または作用極１２と基板１１とにまたがって形成してもよい。さらに、作用極１２と対極１３との間を埋めるように形成してもよい。
【００３３】
複数の酵素センサ１０に対応する導電パターン３３および導電パターン３７が形成されたガラス板３０は、酵素センサ１０の基板１１に対応する大きさにダイシングされ、洗浄される。基板１１の洗浄が完了すると、形成された規定部２２の内側に酵素固定部２３が設置される。液状または半固形状の流動性のある樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液は、規定部２２の内側に所定量充填される。充填された酵素液を例えば乾燥して硬化させることにより、規定部２２の内側に酵素固定部２３が形成される。
【００３４】
なお、酵素固定部２３は、酵素を分散または溶解した光架橋性の樹脂を規定部２２の内側に充填した後、所定の波長の光を照射することにより硬化させる方法など、他の方法を用いて形成してもよい。また、酵素の安定性が高く酵素活性の低下が小さい場合、ガラス板３０をダイシングする前に、規定部２２の内部に酵素固定部２３を設置する手順としてもよい。さらに、酵素固定部２３を硬化させた後、レジストを溶かす等により、規定部２２を除去する工程を追加してもよい。
【００３５】
以上の手順により第１実施例による酵素センサ１０は製造される。
第１実施例による酵素センサ１０は、作用極１２の周囲に規定部２２を有している。そのため、硬化する前は流動性を有している酵素固定部２３は、規定部２２により所定の位置以外への移動が制限される。これにより、酵素固定部２３は作用極１２にのみ形成され、酵素を含む酵素固定部２３が作用極１２以外の部位に流動することは防止される。したがって、酵素センサ１０の小型化にともない作用極１２が微小化しても、確実かつ容易に酵素固定部２３を作用極１２にのみ形成することができる。
【００３６】
また、第１実施例による酵素センサ１０は、対極１３および参照極１４が作用極１２を中心とした同心円状に配置されている。そのため、酵素センサ１０の小型化を図る場合でも、作用極１２、対極１３および参照極１４に要求される電極の全長は確保される。したがって、性能の低下を招くことなく、酵素センサ１０の小型化を図ることができる。
【００３７】
（第２実施例）
本発明の第２実施例による酵素センサを図１５に示す。図１５は、第２実施例による酵素センサ４０を示す断面図である。なお、第１実施例と実質的に同一の構成部位には同一の符号を付し、説明を省略する。
第２実施例による酵素センサ４０は、ガラスなどの絶縁体から形成されている基板４１を備えている。基板４１は、一方の面側に他方の面側に窪んでいる凹部４２を有している。これにより、基板４１は、中央部に凹部４２を有し、凹部４２の両端部に凸部４３および凸部４４を有している。また、基板４１は、凹部４２の一方の端部において凸部４３との間に形成される側壁部４５と、凹部４２の他方の端部において凸部４４との間に形成される側壁部４６とを有している。基板４１は、凹部４２に第一電極としての作用極１２を有している。また、基板４１は、凸部４３および凸部４４に第二電極としての対極１３を有し、凸部４３に第三電極としての参照極１４を有している。
【００３８】
凹部４２に設置されている作用極１２は、酵素を含有する酵素固定部４７により覆われている。酵素固定部４７は、流動性を有している場合でも、側壁部４５および側壁部４６によって移動が制限される。すなわち、側壁部４５および側壁部４６は、特許請求の範囲に記載の規定部を構成している。
第２実施例による酵素センサ４０を製造する場合、まず基板４１となるガラス板に凹部４２を形成する。凹部４２は、例えば研磨や切削などの機械的な加工、またはエッチングなどの化学的な加工により形成される。凹部４２が形成されると、凹部４２に作用極１２が形成され、凸部４３、４４に対極１３および参照極１４が形成される。作用極１２、対極１３および参照極１４は、第１実施例と同様にフォトリソグラフィにより形成される。作用極１２、対極１３および参照極１４が形成されると、凹部４２に酵素を含有する酵素固定部４７を設置する。このとき、液状または半固形状の流動性のある樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液は、凹部４２に所定量充填される。充填された酵素液を硬化させることにより、凹部４２の内部に酵素固定部４７が形成される。
【００３９】
第２実施例では、基板４１に形成された凹部４２に酵素固定部４７を設置している。そのため、基板４１の凹部４２と凸部４３または凸部４４との間に形成される側壁部４５および側壁部４６は流動性のある酵素液の移動を制限する。これにより、酵素固定部４７は凹部４２に設置されている作用極１２にのみ形成され、酵素を含む酵素固定部４７が作用極１２以外の部位に流動することは防止される。したがって、酵素センサ４０の小型化にともない作用極１２が微小化しても、作用極１２にのみ酵素固定部４７を確実かつ容易に形成することができる。
【００４０】
（第３、第４実施例）
本発明の第３実施例および第４実施例について説明する。図１６は第３実施例による酵素センサの断面図であり、図１７は第４実施例による酵素センサの断面図である。なお、第１実施例と実質的に同一の構成部位には、同一の符号を付し、説明を省略している。
図１６に示す第３実施例および図１７に示す第４実施例は、酵素を含有する酵素固定部の形成方法が上述の第１実施例または第２実施例と異なる。
【００４１】
第３実施例では、図１６（Ａ）に示すように基板１１にはフォトリソグラフィにより作用極１２、対極１３および参照極１４をはじめとする各種の導電パターンが形成される。これらの電極および配線部などの導電パターンの形成は、第一実施例と同様である。導電パターンが形成されると、基板１１の作用極１２を除く部位に保護シート２５を貼付する。保護シート２５は、例えば低温発泡テープなどを用いることができる。これにより、保護シート２５は作用極１２を除く部分を覆う。
【００４２】
保護シート２５の貼付が完了すると、樹脂に酵素を分散または溶解した酵素液を基板に塗布し硬化させる。このとき、作用極１２を除く部分は保護シート２５で覆われているため、酵素を含む酵素液は作用極１２にのみ塗布される。酵素液が硬化し、酵素を含む酵素固定部２６が形成されると、基板１１に貼付されている保護シート２５は除去される。これにより、図１６（Ｂ）に示すように作用極１２にのみ酵素固定部２６が形成される。なお、変形例として、保護シート２５を除去せず残してもよい。また、保護シート２５に代えて、基板１１上に撥水性を向上させる処理を施し、酵素液が他の基板１１領域に付着しないようにしてもよい。
【００４３】
第４実施例では、図１７に示すようにフォトリソグラフィにより作用極１２、対極１３および参照極１４をはじめとする各種の導電パターンが形成される。これらの導電パターンの形成は、第一実施例と同様である。導電パターンが形成されると、スタンプ装置５０は、樹脂に酵素を分散または溶解させた酵素液を基板１１に塗布する。スタンプ装置５０は、タンク５１内に酵素液を蓄えている。タンク５１に蓄えられている酵素液は、浸透部５２を経由して基板１１側へしみ出す。これにより、スタンプ装置５０を導電パターンが形成された基板１１の所定の位置に押し付けることにより、所定の位置に酵素液が塗布される。本実施例の場合、スタンプ装置５０は、作用極１２に酵素液を塗布する。塗布された酵素液を硬化させることにより、作用極１２にのみ酵素を含む酵素固定部が形成される。
なお、スタンプ装置５０による酵素液の塗布に限らず、例えば印刷技術を利用して所定の位置に酵素を含む酵素液を印刷する構成としてもよい。
【００４４】
（２．アミラーゼ活性測定装置）
次に、上述の複数の実施例で説明した酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムの実施例について説明する。
図１８は、酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システム６０の一実施例を示す模式図である。アミラーゼ活性測定システム６０は、基質タンク６１、ポンプ６２、試料導入部６３、分析装置７０および廃液タンク６４を備えている。アミラーゼ活性測定システム６０では、ヒトストレス判定の指標となるα−アミラーゼ（以下、「α−ＡＭＹ」と省略する。）の活性を測定する。α−ＡＭＹの活性測定は、唾液に含まれるα−ＡＭＹを基質に作用させ、生成した反応生成物を検出することにより実施する。基質としては、例えばデンプン、オリゴ糖およびこれらの誘導体を用いることができる。本実施例の場合、次の反応を用いてα−ＡＭＹの活性を測定する。基質がデンプンである場合、デンプンをα−ＡＭＹの作用によりマルトースに分解する。分解したマルトースは、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）の作用によりブドウ糖（グルコース）に分解する。さらに、生成したグルコースには、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を作用させることによりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。ここで、生成した過酸化水素が分解する際に放出される電子を検出することにより、α−ＡＭＹの活性を測定する。
【００４５】
【化１】
2005249530.tif 000003
【００４６】
本実施例のアミラーゼ活性測定システム６０は、酵素センサを有する分析装置７０を備えている。酵素センサは、上述の第１実施例から第４実施例で説明した酵素センサを適用することができる。ここでは、第１実施例による酵素センサ１０を用いた例について説明する。本実施例の反応系では、基質としてマルトペンタオースを適用するとともに、酵素センサ１０の酵素固定部２３には、酵素としてＭＰおよびＧＯＤを固定化している。酵素センサ１０の酵素固定部２３には、混合されたＭＰおよびＧＯＤが固定化されている。なお、酵素固定部２３には、ＭＰを固定化した固定化膜とＧＯＤを固定化した固定化膜とを積層または隣接して設置してもよい。なお、α−ＡＭＹの基質としては、デンプンあるいはマルトペンタオースに限らず、他のグルコース単位で構成されるマルトオリゴ糖、あるいはそれらの誘導体などを適用することができる。
【００４７】
アミラーゼ活性測定システム６０は、基質タンク６１を備えている。基質タンク６１には、アミラーゼ活性測定システム６０に適用される基質溶液が蓄えられている。基質溶液は、適当なｐＨの緩衝溶液に基質となるマルトペンタオースを溶解したものである。基質の濃度は、通常は０．０５ｍＭから１Ｍ程度に調整される。酵素としてＭＰを用いる場合、緩衝溶液にはリン酸緩衝溶液を用いる。
【００４８】
基質タンク６１に蓄えられている基質溶液は、ポンプ６２により分析装置７０に供給される。分析装置７０に供給される基質溶液には、分析装置７０へ導入される前に試料導入部６３から試料溶液が混合される。試料には被験者から採取した唾液を用いる。唾液には、α−ＡＭＹが含まれている。基質溶液に試料溶液を混合することにより、試料溶液に含まれるα−ＡＭＹは基質であるマルトペンタオースをマルトースに分解する。基質の分解反応時における反応温度は、常温付近であり、特に限定されない。また、反応時間は、基質の種類などに依存するものの、数分程度である。
【００４９】
試料溶液が混合された基質溶液は、分析溶液として分析装置７０に供給される。分析装置７０は、図１９に示すように酵素センサ１０およびケーシング７１を備えている。ケーシング７１は、酵素センサ１０の基板１１に結合され、酵素センサ１０の規定部２２側の面を覆っている。ケーシング７１は、例えば樹脂で形成されており、供給部７２および排出部７３を有している。供給部７２はポンプ６２に接続している。ポンプ６２により供給された分析溶液は、供給部７２を経由して酵素センサ１０に供給される。供給部７２は、酵素センサ１０の酵素固定部２３の上方に設置されている。すなわち、供給部７２と酵素固定部２３とは概ね同軸上に配置されている。そのため、ポンプ６２により供給された分析溶液は、酵素固定部２３に対し概ね垂直に流入する。一方、排出部７３は、酵素固定部２３の径方向外側に配置されている。そのため、酵素固定部２３に対し概ね垂直に流入した分析溶液は、流入方向とは概ね垂直な水平方向へ流出する。これにより、供給部７２から酵素センサ１０の酵素固定部２３へ概ね垂直に流入した分析流体は、排出部７３から酵素固定部２３の径方向外側へ排出される。分析流体は、廃液タンク６４に排出される。また、ポンプ６２は、分析流体の流速を酵素センサ１０における反応時間に対応するように調整する。
【００５０】
供給部７２から酵素センサ１０の酵素固定部２３へ流入した分析溶液に含まれるマルトースは、酵素固定部２３に固定化されているＭＰの作用によりグルコースに分解される。さらに、分解されたグルコースからは、酵素固定部２３に固定化されているＧＯＤの作用によりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。生成した過酸化水素は酸素とともに電子を放出し、酵素センサ１０の作用極１２では放出された電子を検出する。この放出された電子により変化する電位を検出することにより、基質を分解するα−ＡＭＹの活性が測定される。
【００５１】
以上説明したアミラーゼ活性測定システム６０では、分析装置７０は酵素センサ１０の酵素固定部２３の上方に設置される供給部７２を備えている。そのため、供給部７２を経由して酵素センサ１０に流入する分析溶液は酵素固定部２３に確実に供給される。また、酵素固定部２３に供給された分析溶液は、酵素固定部２３の径方向外側に設置されている排出部７３から排出される。そのため、酵素固定部２３には分析流体が確実に供給されるとともに、反応を終えた分析流体は酵素固定部２３の近傍に留まることなく排出部７３から排出される。したがって、酵素センサ１０による測定精度を高めることができる。
また、供給部７２と排出部７３との位置関係を概ね垂直にすることにより、分析装置７０の設置に要する容積は低減する。したがって、分析装置７０の体格の小型化を図ることができる。
【００５２】
（分析装置の変形例）
次に、上述のアミラーゼ活性システムに適用される分析装置の変形例について説明する。図２０は、酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムに含まれる分析装置の変形例を示す模式図である。
変形例による分析装置８０は、酵素センサ、基礎部材８１およびケーシング８２を備えている。酵素センサは、上述の第１実施例から第４実施例で説明した酵素センサを適用することができる。ここでは、第１実施例による酵素センサ１０を用いた例について説明する。酵素センサ１０は、ガラスなどの絶縁体で形成されている基礎部材８１に設置されている。基礎部材８１には、酵素センサ１０を収容可能な図示しない凹部が形成されている。これにより、基礎部材８１のケーシング８２側の面と酵素センサ１０のケーシング８２側の面（下面）とは、段差を形成することなく同一平面上に位置する。
【００５３】
ケーシング８２は基礎部材８１側が反基礎部材側へ窪んでいる。これにより、基礎部材８１とケーシング８２とを結合したとき、基礎部材８１とケーシング８２とは、第一収容室８３、第二収容室８４、接続通路８５、供給通路８６および排出通路８７を形成する。第一収容室８３は、酵素センサ１０を収容している。変形例による分析装置８０の場合、酵素センサ１０の酵素固定部２３には酵素としてＧＯＤのみが固定化されている。一方、第二収容室８４には、膜部材８８を収容している。膜部材８８は、酵素を含有する固定化膜である。本例の場合、膜部材８８にはＭＰが固定化されている。
【００５４】
接続通路８５は、第一収容室８３と第二収容室８４とを接続している。供給通路８６は、一方の端部が第二収容室８４に接続し、他方の端部がポンプ６２に接続している。排出通路８７は、一方の端部が第一収容室８３に接続し、他方の端部が廃液タンク６４に接続している。そのため、分析装置８０に供給される分析溶液は、供給通路８６を経由して第二収容室８４に流入する。第二収容室８４に流入した分析溶液は、接続通路８５を経由して第一収容室８３に流入する。そして、分析溶液は、第一収容室８３から排出通路８７を経由して廃液タンク６４へ排出される。
【００５５】
供給通路８６から第二収容室８４に流入した分析溶液は、α−ＡＭＹによりマルトペンタオースを分解して生成したマルトースを含んでいる。分析溶液に含まれるマルトースは、膜部材８８に固定化されているＭＰによりグルコースに分解される。分解されたグルコースは、分析溶液とともに接続通路８５を経由して第一収容室８３に流入する。第一収容室８３に流入した分析溶液は、酵素センサ１０の酵素固定部２３に固定化されているＧＯＤの作用を受ける。これにより、分析溶液に含まれるグルコースからは、ＧＯＤの作用によりグルコノラクトンと過酸化水素とが生成する。生成した過酸化水素が酸素とともに放出する電子は、酵素センサ１０の作用極１２により検出される。
【００５６】
以上説明した変形例による分析装置８０は、第一収容室８３および第二収容室８４を有している。第一収容室８３は酵素固定部２３にＧＯＤが固定化されている酵素センサ１０を収容し、第二収容室８４はＭＰが固定化されている膜部材８８を収容している。これにより、分析溶液は、第二収容室８４の膜部材８８に固定化されたＭＰによる化学反応を経た後、酵素センサ１０を収容する第一収容室８３に水平に流入する。そのため、酵素センサ１０ではＧＯＤの作用によるグルコースの酸化反応が先立って進行する。したがって、酵素センサ１０による測定精度を高めることができる。
【００５７】
また、変形例による分析装置８０では、水平に配置することにより、酵素センサ１０の酵素固定部２３と膜部材８８とが別個に設置される。例えば、異なる種類の酵素間における親和性や相互作用の問題から、混合して固定化することに適さない酵素を用いる場合がある。このような場合でも、変形例による分析装置８０では、酵素固定部２３と膜部材８８とにそれぞれ酵素が固定化される。したがって、複数の酵素を混合する必要がなく、酵素間の相互作用を低減することができる。
【００５８】
（３．ヒトストレスの判定）
上述のアミラーゼ活性測定システム６０を用いたヒトストレスの判定について説明する。
ヒトの唾液に含まれるα−アミラーゼの酵素活性を測定することにより、ヒトが受けた肉体的ストレス、精神的ストレスを包括するヒトストレスの判定が可能であることが知られている（特開２００２−１６８８６０号公報参照）。
【００５９】
具体的には、被験者の安静時に採取した唾液中のα−ＡＭＹの活性を基準値として、被験者の任意の状態におけるα−ＡＭＹの活性と比較する。基準値よりも酵素活性が大きなとき、被験者は不快なストレスを受けていると判定でき、基準値よりも酵素活性が小さなとき、被験者は快適なストレスを受けていると判定することができる。また、基準値との差が大きなときほど、受けているストレスも大きくなることが知られている。
【００６０】
図２０に示す分析装置８０を適用したアミラーゼ活性測定システム６０を用いる場合、図２１に示すようにα−ＡＭＹの活性と検出される電流との間は相関を示す。アミラーゼの活性測定は、次の通りである。
被験者３名から唾液を採取する。採取した唾液は、α−ＡＭＹ活性が９０ｋＵ／Ｌから１９０ｋＵ／Ｌである。採取した唾液を試料溶液として基質溶液に混合する。その結果、図２１に示すように、α−ＡＭＹ活性に比例して３１ｎＡから７５ｎＡ程度の電流振幅を検出することができる。一回の分析には、数十秒程度を要する。図２０に示す分析装置８０を適用してアミラーゼの活性を測定すると、図２１の検量線に示すようにＲ２値＝０．９５、ＣＶ値＝１０．６％（ｎ＝１２）と良好な相関を示す。
【００６１】
このように、測定した検量線を用いて被験者のα−ＡＭＹ活性が測定される。測定されたα−ＡＭＹ活性を用いて基準値と比較することにより、上述のように被験者が受けているストレスを判定することができる。これにより、図２０に示す分析装置８０を用いてヒトストレス判定の材料となるα−ＡＭＹ活性を測定することができる。したがって、分析装置８０の小型化が可能となるとともに、短時間で連続的に測定を実施することができる。
【００６２】
以上説明した実施例では、酵素センサをデンプンあるいはマルトペンタオースを基質とする反応系に適用し、酵素センサに固定化する酵素としてα−ＡＭＹあるいはＭＰを適用する例について説明した。しかし、本発明の酵素センサは、上述の基質に限らず他の基質を用いる反応系に適用してもよく、基質に応じて固定化する酵素を変更することができる。また、本発明では、酵素センサの作用極に固定化酵素部を設置する構成としたが、他の電極に固定化酵素部を設置する構成、あるいは二以上の電極に固定化酵素部を設置する構成としてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の第１実施例による酵素センサを示す図であって、（Ａ）は概略平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図２】本発明の第１実施例による酵素センサの酵素固定部を示す変形例である。
【図３】本発明の第１実施例による酵素センサの酵素固定部を示す変形例である。
【図４】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図５】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図６】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図７】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図８】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図９】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１０】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１１】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１２】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１３】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１４】本発明の第１実施例による酵素センサの製造手順を示す模式図であって、（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は（Ａ）のＢ−Ｂ線における断面図である。
【図１５】本発明の第２実施例による酵素センサを示す断面図である。
【図１６】本発明の第３実施例による酵素センサを示す断面図であって、（Ａ）は保護シートを貼付した図であり、（Ｂ）は保護シートを除去した図である。
【図１７】本発明の第４実施例による酵素センサを示す断面図である。
【図１８】本発明の酵素センサを適用したアミラーゼ活性測定システムの一実施例を示す模式図である。
【図１９】図１８に示すアミラーゼ活性測定システムの分析装置を示す模式図である。
【図２０】図１８に示すアミラーゼ活性測定システムの分析装置の変形例を示す模式図である。
【図２１】図２０に示す分析装置を用いて測定したアミラーゼの活性と検出電流との相関を示す模式図である。
【符号の説明】
【００６４】
１０、４０  酵素センサ、１１、４１  基板、１２  作用極（第一電極）、１３  対極（第二電極）、１４  参照極（第三電極）、２２  規定部、２３、４７  酵素固定部、４２  凹部、４５、４６  側壁部、７０  分析装置、７２  供給部、７３  排出部、８０  分析装置、８１  基礎部材、８２  ケーシング、８３  第一収容室、８４  第二収容室、８８  膜部材、２３１、２３３  膜片部
【図１】
2005249530.tif 000004
【図２】
2005249530.tif 000005
【図３】
2005249530.tif 000006
【図４】
2005249530.tif 000007
【図５】
2005249530.tif 000008
【図６】
2005249530.tif 000009
【図７】
2005249530.tif 000010
【図８】
2005249530.tif 000011
【図９】
2005249530.tif 000012
【図１０】
2005249530.tif 000013
【図１１】
2005249530.tif 000014
【図１２】
2005249530.tif 000015
【図１３】
2005249530.tif 000016
【図１４】
2005249530.tif 000017
【図１５】
2005249530.tif 000018
【図１６】
2005249530.tif 000019
【図１７】
2005249530.tif 000020
【図１８】
2005249530.tif 000021
【図１９】
2005249530.tif 000022
【図２０】
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【図２１】
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