(57)【要約】【課題】癌細胞特異的に細胞死を誘導する細胞死誘導剤を提供すること。【解決手段】一般式（１）、（２）、（３）もしくは（４）で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する細胞死誘導剤、細胞内シグナル伝達系の調節剤、抗腫瘍剤及び細胞死を誘導する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）、（２）、（３）又は（４）：
【化１】
2005145948.tif 000011
【化２】
2005145948.tif 000012
【化３】
2005145948.tif 000013
【化４】
2005145948.tif 000014
[式中、Rは低級アルキル基を示す。]で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する細胞死誘導剤。
【請求項２】
Rがメチル基を示すものである請求項１に記載の細胞死誘導剤。
【請求項３】
細胞が、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度の細胞である請求項１又は２に記載の細胞死誘導剤。
【請求項４】
細胞が、膵臓癌細胞又は膀胱癌細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞死誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞死誘導剤を含有する、変異ras遺伝子が関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞死誘導剤を含有する、cAMPが関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤。
【請求項７】
下記式（１）、（２）、（３）又は（４）：
【化５】
2005145948.tif 000015
【化６】
2005145948.tif 000016
【化７】
2005145948.tif 000017
【化８】
2005145948.tif 000018
[式中、Rは低級アルキル基を示す。]で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項８】
下記式（１）、（２）、（３）又は（４）：
【化９】
2005145948.tif 000019
【化１０】
2005145948.tif 000020
【化１１】
2005145948.tif 000021
【化１２】
2005145948.tif 000022
[式中、Rは低級アルキル基を示す。]で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を用いることを特徴とする、細胞に細胞死を誘導する方法。
【請求項９】
細胞が、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度の細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞又は甲状腺癌細胞である請求項８又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死誘導剤、特に特定の癌細胞に特異的に細胞死を誘導する細胞死誘導剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌疾患の治療に際して広く用いられている癌化学療法剤の多くは、DNAの複製過程など細胞分裂の過程に作用する薬剤や代謝拮抗作用を有する薬剤であるため、正常な細胞や組織に対してもしばしば細胞毒として作用する。そのため、嘔吐、発熱又は脱毛といった副作用を極めて高率に発生させるという問題がある。このような問題を解決すべく、癌の原因とされる特定の遺伝子産物をターゲットとする抗癌剤の開発も多く試みられているが、成功例は数少ない。
【０００３】
癌の原因遺伝子の一つとして知られているras遺伝子は、1981年、Scolnick等によって、ラット肉腫ウイルスHarvey株及びKirsten株の癌遺伝子として最初に同定された。その後、Harvey株の癌遺伝子(v-H-ras)とKirsten株の癌遺伝子(v-K-ras)は、それぞれ正常細胞の染色体DNA上にある対応するプロト癌遺伝子(c-H-ras、c-K-ras)に由来することが明らかとなった。現在、ヒトでは、c-H-ras、c-K-ras及びN-rasの3種類のファミリー遺伝子の存在が知られている。これら遺伝子の産物はそのままでは発癌活性を有しないが、遺伝子の点突然変異により、GTPase活性をもたないトランスホーム能を獲得した活性型Ras蛋白質として産生される。ras遺伝子がコードする蛋白質は、21kDaのG蛋白質(p21ras)であり、p21rasは、翻訳後にファルネシル化を受けることが発癌活性に必須と考えられている（非特許文献1参照）。
【０００４】
H-ras遺伝子は膀胱癌で、K-ras遺伝子は膵臓癌や大腸癌で、N-ras遺伝子は白血病細胞などで高頻度に変異が検出されている。従って、ヒト癌の約30％でその変異が認められているras遺伝子が原因と考えられる癌に対して細胞死を誘導して癌細胞を殺傷することは、癌の薬物治療において極めて重要である（非特許文献2参照）。実際に、ras遺伝子産物をターゲットとする上記癌に特異的な薬剤の開発も試みられており、例えば、上記のファルネシル化の阻害剤の研究が進められている（非特許文献3及び4参照）。しかし、ras遺伝子変異細胞に選択的かつ十分に作用する抗癌剤は未だ獲得されていない。
【０００５】
一方、中国南西部に生育するPolygonatum zanlanscianenseの根より単離されたdioscin（下記式（A））及びmethyl protodioscin（後記式（１）においてR=Me）は、それぞれフロスタノール誘導体、スピロスタノール誘導体の3位にラムノシル-ラムノシル-グルコースがβ-グリコシド結合したステロイド配糖体であり、古くから、肺疾患、心悸亢進、糖尿病などの治療に使用されてきた薬剤である。これらの中でdioscinは、ヒト急性骨髄性白血病細胞(HL-60細胞)に代表される癌細胞に対して優れた増殖阻害作用を示し、また細胞の分化及びアポトーシスを誘導することが知られている（非特許文献5参照）。また、methyl protodioscinは、HL-60細胞に対して同様の作用は示さないことが知られている（非特許文献5参照）。
【０００６】
【化１】
2005145948.tif 000002
【０００７】
【非特許文献１】Hancock J.F. et al Cell,57,1167-1177,1989
【非特許文献２】Bos J.L.(1989) Cancer Res.49,4682-4689
【非特許文献３】Crul M., de Klerl G., Beijnen J.H., Schellens J.H.(2001)  Anticancer Drugs 12,163-184
【非特許文献４】Caponigro F., Casale M., Bryce J.(2003) Expert Opin. Investig.Drugs 12,943-954
【非特許文献５】Biol.Pharm.Bull.24(2)159−162(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明は、特定の癌細胞に特異的に細胞死を誘導する細胞死誘導剤を提供することにある。より具体的には、ras遺伝子が変異している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度の細胞の細胞内シグナル伝達系を調節して、当該細胞に特異的に細胞死を誘導する薬剤及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、かかる実情に鑑み、細胞死を誘導する化合物を種々探索した結果、シュロ属Trachycarpus fortunei、フェニックス属イワヤマナツメヤシPhoenix rupicola又はフェニックス属ソテツジュロPhoenix loureirii Kunthより単離された特定の構造を有するステロイド配糖体が、ras遺伝子が変異している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度である細胞に特異的に細胞死を誘導することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記式（１）、（２）、（３）又は（４）：
【００１０】
【化２】
2005145948.tif 000003
【００１１】
【化３】
2005145948.tif 000004
【００１２】
【化４】
2005145948.tif 000005
【００１３】
【化５】
2005145948.tif 000006
【００１４】
[式中、Rは低級アルキル基を示す。]で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する細胞死誘導剤を提供する。
【００１５】
本発明はまた、上記細胞死誘導剤を含有する、変異ras遺伝子が関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤及び／又はcAMPが関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、前記式（１）、（２）、（３）もしくは（４）で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする抗腫瘍剤を提供する。
【００１７】
本発明は更に、前記式（１）、（２）、（３）もしくは（４）で表される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を用いることを特徴とする、細胞に細胞死を誘導する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞死誘導剤は、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又は細胞内cAMPの濃度が高濃度である細胞の細胞内シグナル伝達系を調節して、当該細胞に対して特異的に細胞死を誘導することができる。また、本発明の細胞死誘導剤は、このような要件を満たし膵臓癌細胞や膀胱癌細胞に代表される固形癌細胞に対して細胞死を誘導することができ、本発明の細胞死誘導剤を構成する化合物（１）、（２）、（３）又は（４）は、抗腫瘍剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
細胞死は死に行く細胞が示す形態学的変化の違いによって壊死（ネクローシス）及びアポトーシスに区別される。本明細書において「細胞死」とは、ネクローシス及びアポトーシスを意味する。ネクローシスは熱や物理的衝撃による細胞膜の直接的損傷や、細胞内外のイオンバランスの急激な変化などによって惹き起こされる受動的な細胞死である。ネクローシスでは細胞は膨化し、細胞膜をはじめ核や他の細胞内小器官を構成する膜が相次いで崩壊して死に陥っていく。これに対してアポトーシスは、細胞内外の種々の生物学的因子からの刺激を受けて特定のシグナル伝達系が活性化されることによって惹き起こされる能動的な細胞死である。アポトーシスでは細胞や核が縮小し、断片化していく。特に核の形態的変化が著しく、核内のクロマチンがその網状構造を失い、核膜辺縁部に移行して凝縮・断片化していくのが観察される。
【００２０】
本発明の細胞死誘導剤を構成する化合物（１）、（２）、（３）又は（４）において、Rは低級アルキル基を示す。ここで、低級アルキル基とは、炭素数1〜6のアルキル基を意味し、直鎖、分岐鎖又は環状鎖のいずれでもよいが、直鎖が好ましく、メチル基がより好ましい。
【００２１】
化合物（１）、（２）、（３）又は（４）の塩としては、アンモニア、低級アミン類の塩を挙げることができ、またナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオンとの塩も挙げられる。化合物（１）、（２）、（３）又は（４）の溶媒和物又はその塩の溶媒和物としては、結晶の晶出等に用いた溶媒が付加した溶媒和物の他に、空気中の水分を吸収して形成されるものを含む。溶媒の例としては、メタノール、エタノール等の低級アルコールをはじめ、アセトン、アセトニトリル等の有機溶媒、水等を挙げることができる。
【００２２】
化合物（１）及び（２）は、湿潤熱帯又は亜熱帯地域に自生するヤシ科シュロ属の常緑高木であるTrachycarpus fortuneiより、化合物（３）は、インド原産のヤシ科フェニックス属のイワヤマナツメヤシ Phoenix rupicolaより、化合物（４）は、ヤシ科フェニックス属のシンノウヤシ Phoenix loureirii Kunthより、抽出・分離・精製することによって得ることができる。また、通常用いられる合成方法、半合成方法又は抽出法にこれらの方法を組み合わせることによっても得ることができる。
【００２３】
以下に、化合物（１）〜（４）を抽出法によって得る方法について説明する。抽出原料は特に限定されるものではなく、植物の根、樹木、枝、葉、茎、種子等の粉砕物（生又は乾燥物）を水あるいはメタノール、エタノール等の低級アルコール、アセトンなどの水溶性有機溶媒、又は水とこれらの有機溶媒との混合溶媒を用いて、室温又は加熱下で抽出する方法、炭酸ガスを用いる超臨界抽出法などにより抽出可能である。特に細切した茎又は葉を原料として、含水アルコールや含水アセトンを用いて12〜24時間抽出することが好ましい。
【００２４】
得られた抽出物を濃縮後、濃縮物をエーテル、酢酸エチル又はn-ブタノールと水で分配し、得られた水可溶部について粉末セルロース、多孔性ポリマーゲル、化学結合シリカゲル、デキストランゲル、セファデックスLH-20などのカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって、目的物を分離・精製することができる。
【００２５】
具体的には、植物の新鮮茎又は新鮮葉をメタノールで冷浸して得られるメタノールエキスを更にエーテル次いで水飽和n-ブタノールで抽出し、得られた水飽和n-ブタノールエキスについてデキストランゲル又はセファデックスを充填したカラムクロマトグラフィーを行い、このとき溶出溶媒として特定濃度のメタノール水溶液を用いるとサポニン分画が得られる。サポニン分画は化合物（１）、（２）、（３）、（４）を含有しており、このサポニン分画をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒は、クロロホルム−メタノール−水又は酢酸エチル−エタノール−水などの含水有機溶媒）又はODSシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒は、メタノール−水又はアセトニトリル−水の混液）を行うことによって化合物（１）、（２）、（３）、（４）が純粋に単離される。化合物（１）〜（４）は、いずれも細胞死誘導活性を有することが判明した。
【００２６】
Ras蛋白質の細胞死、特にアポトーシスへの関与については、図１に記載のように多様な機構が知られている。
一般的に、Rasは、Raf/MEK/ERKやPI3K/Akt、NIK/IKK/NFκBなどの細胞内シグナル系の活性化を介してアポトーシスを抑制するように働き、細胞の不死化・癌化を促している。しかし、Rasには、TNF-α依存性の細胞死誘導の亢進や、ROS(reactive oxygen species)の産生を介する細胞死の誘導、更にはエフェクター分子であるPI3Kの活性化を介して、カスパーゼ非依存的なアポトーシスとは異なったタイプの細胞死の誘導（図の破線で示した経路）などを行う能力も備わっている。
参考文献:
口野嘉幸（２００２）  血液・腫瘍科  ４５（２）,１４６−１５５
Chi S. et al.(1999) Oncogene 18,2281-2290
Kitanaka C. et al.(2002) J.Natl.Cancer Inst.94(5),358-368
Lo Y.Y.C. et al.(1996) J.Biol.Chem.271(26),15703-15707
Archer H. et al.(2002) Methods Mol.Biol.189,67-73
Kim B.Y. et al.(2002) Oncogene 21(29),4490-4497
Alavi A. et al.(2003) Science 301(5629),94-96
Ivanov V.N. et al.(2003) Oncogene 22(20),3152-3161
Chang F. et al.(2003) Leukemia 17(7),1263-1293
Zhong H. et al.(2002) Mol Cell 9,625-636
【００２７】
また、cAMPの細胞死への関与については、図１に示すような、CREBを介するアポトーシス抑制経路が知られている。具体的には、cAMPがPKAを活性化し、活性化されたPKAが更にCREBをリン酸化し、リン酸化されたCREBがアポトーシスを阻害する。すなわち、CREBの活性化により、アポトーシス抑制の経路が恒常的に活性化されることによって細胞が不死化状態となり、細胞死誘導剤が存在しない条件下では、このまま不死化状態が維持されている。
参考文献：
Dawson TM et al.Nature Medicine 8,450-451
【００２８】
本発明の細胞死誘導剤が特異的に細胞死誘導活性を示す細胞は、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度の細胞であり、好適には変異ras遺伝子を発現し、かつcAMP濃度が高濃度の細胞である。従って、本発明の細胞死誘導剤は、Ras蛋白質が関与するアポトーシス誘導経路についてはアポトーシス誘導を増強する態様で、Ras蛋白質が関与するアポトーシス抑制経路については当該経路を阻害する態様で、図１に記載のいずれかの経路に作用してアポトーシスを誘導するものと発明者は考えている。尚、「cAMP濃度が高濃度」の意味については後述する。
【００２９】
また、本発明の細胞死誘導剤が特異的に細胞死誘導活性を示す細胞は、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又は細胞内cAMP濃度が高濃度の細胞であり、好適にはcAMP濃度が高濃度で、かつ変異ras遺伝子を発現している細胞である。従って、本発明の細胞死誘導剤は、cAMPが関与するアポトーシス抑制経路を阻害することにより、上記細胞に特異的に細胞死を誘導するものと考えられる。
【００３０】
また、本発明の細胞死誘導剤は、好適には、変異ras遺伝子を発現している細胞及び／又はcAMP濃度が高濃度の細胞に対してのみ特異的に活性を示すことから、変異ras遺伝子が関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤として用いることができる。すなわち、図１記載のいずれかの経路を促進して細胞死を誘導あるいは阻害して細胞死を誘導することができ、また細胞死誘導剤を構成する化合物の種類や投与量によって細胞死誘導活性を調節することができる。同様に、CREBを介する経路を阻害して細胞死を誘導し、またその細胞死誘導活性を調節することができ、cAMPが関与する細胞内シグナル伝達系の調節剤として用いることもできる。本発明の細胞死誘導剤は、これら両方の調節剤として用いることもできる。
【００３１】
化合物（１）、（２）、（３）もしくは（４）、その塩又はその溶媒和物が特異的に細胞死誘導を示す細胞としては、好適には、後記試験例1に示すように、一般に抗腫瘍剤が作用しにくいとされる固形癌細胞、例えば膵臓癌細胞や膀胱癌細胞である。これらの癌細胞は、変異ras遺伝子が発現している。また、後記試験例2に示すようにcAMP濃度が高濃度である。
【００３２】
本明細書において、「cAMP濃度が高濃度」とは、陰性対照となる細胞と比較して、明らかにcAMP濃度が高いことを意味する。陰性対照となる細胞の細胞内cAMP濃度に対して、1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは2.5倍以上、更に好ましくは3倍以上のcAMP濃度である細胞は、細胞内cAMP濃度が高濃度であると判断できる。陰性対照としては、実施例で使用した、IMR32細胞、TMK-1細胞、U251細胞等の細胞株を好適に用いることができる。細胞内cAMP濃度の測定は、エンザイムイムノアッセイ（EIA）技術等を利用した方法等で測定できる。対象細胞の単位蛋白質量（単位蛋白質重量）当たりのcAMP量（モルなど）を求め、陰性対照と比較するとよい。
【００３３】
従って、化合物（１）、（２）、（３）もしくは（４）、その塩又はその溶媒和物は、変異ras遺伝子が発現している細胞であって、cAMP濃度が高濃度の細胞に対する抗腫瘍剤として有用である。このような癌細胞としては、膵臓癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、白血病細胞、甲状腺癌細胞が挙げられる（参考文献）。
参考文献：
Gazdar A.F. et al.(2001) Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(18)10028-10030
Dajee M. et al.(2003) Nature 421,639-643
【００３４】
変異ras遺伝子の発現は、ウエスタンブロット法、酵素抗体法等の免疫学的手法等を用いて分析できる（参考文献）。一方、細胞内のcAMPの濃度は、例えば、後記試験例2に記載の方法で測定することができる。
参考文献：
Chi S. et al.(1999) Oncogene 18 2281-2290
Kitanaka C. et al.(2002) J.Natl.Cancer Inst.94(5),358-368
【００３５】
本発明の細胞死誘導剤は、その使用目的に応じ、医薬製剤としてこの分野で慣用されている各種の投与形態で使用される。かかる製剤は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を無毒性薬理担体として用いて調製される。剤形は、治療目的に応じて各種の形態が選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、点眼剤等が挙げられる。
【００３６】
このような担体としては、例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等の水溶性の単糖類、オリゴ糖類又は多糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース等のゲル形成性又は水溶性のセルロース類；結晶性セルロース、α-セルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性のセルロース類；ヒドロキシプロピル澱粉、カルボキシメチル澱粉、架橋澱粉、アミロース、アミロペクチン、ペクチン及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性の多糖類；アラビアゴム、トラガントゴム、グリコマンナン及びそれらの誘導体の水吸収性でかつ水難溶性のガム類；ポリビニルピロリドン、架橋ポリアクリル酸及びその塩、架橋ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレート及びそれらの誘導体の架橋ビニル重合体類；リン脂質、コレステロール等のリポソーム等分子集合体を形成する脂質類等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の細胞死誘導剤は、細胞死誘導作用に基づいて、各種疾患に適用でき、所望の薬理効果を期待できる。適用疾患としては、前述の癌の他に、例えば、脊髄症、呼吸器障害、関節症、ブドウ膜炎などのHTLV-I関連疾患、自己免疫疾患、慢性関節リウマチなどの膠原病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、橋本病、インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病が挙げられる。また、血小板減少を伴う各種の疾患、例えば骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、汎発性血管内凝固症などにも適用できる。更に、本発明の細胞死誘導剤は、Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型などの各種肝炎、心筋炎、成人呼吸急迫症候群、感染症、肝硬変、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎老人性白内障、慢性疲労症候群、筋ジストロフィーなどの各種疾患にも適用可能である。
【００３８】
本発明の細胞死誘導剤を構成する化合物（１）、（２）、（３）もしくは（４）、その塩又はその溶媒和物を抗腫瘍剤として用いる場合、その投与により癌細胞に対して細胞死を誘導し、制癌作用を発揮する。また、この場合、本発明の細胞死誘導剤は、製剤形態及び投与経路にかかわらず、例えばこれを癌の化学療法剤として知られている他の各種抗腫瘍剤や放射線療法と併用することができる。化学療法剤としては、例えば、5-フルオロウラシル、マイトマイシンなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の細胞死誘導剤の成人に対する一日当たりの投与量は、広範囲に適宜選択されるが、通常一日当たり50μg/body〜50mg/body程度とするのが望ましい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
製造例１
シュロ属Trachycarpus fortuneiより、dioscin、化合物(1-2)、Pb及び化合物(2-2)の単離
シュロ新鮮茎(5.2 kg)をメタノールで冷浸し、メタノールエキス(430 g)を得た。メタノールエキスを水に懸濁後、エーテル、水飽和n-ブタノールで順次抽出し、エーテルエキス(40 g)、ブタノールエキス(45 g)を得た。ブタノールエキスをアビセル（溶媒：CHCl3-MeOH-H2O=8:1.5:1〜7:2.5:1の下層）及びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：CHCl3-MeOH-H2O=80:20:2又は75:25:3）で分離し、文献(Biol.Pharm.Bull.24(2)159−162(2001))記載のdioscin(1.4 g)、Pb(0.7 g)、及び化合物(1-2)含有分画(Fr.I)と化合物(2-2)含有分画(Fr.II)を得た。Fr.I及びFr.IIをそれぞれ2時間加熱還流し、Fr.Iより化合物(1-2)(5.8 g)、Fr.IIより化合物(2-2)(0.9 g)を得た。
【００４２】
dioscin：式（A）
化合物(1-2)：式(1)においてR=Me
Pb：式（A）
化合物(2-2)：式(2) においてR=Me
【００４３】
dioscin：
無色針状晶 (dil.MeOH)
mp. 243-246℃(dec.) 
[α]D-110.3°(c=0.55, MeOH) 
IR (KBr) cm-1: 3600-3200 (OH), 980, 920, 900, 864 (intensity 920<900, 25(R)-spiroketal). 
Anal. Calcd for C45H72O16: C, 62.19, H, 8,35. Found: C, 61.86; H, 8.48. 
13C-NMR (400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００４４】
化合物(1-2) : 
無色針状晶 (MeOH)
mp. 185-189℃(dec.) 
[α]D-102.9°(c=1.00, pyridine) 
IR (KBr) cm-1: 3540-3220 (OH). 
Anal. Calcd for C52H86O22・H2O: C, 57.76, H, 8.02. Found: C, 57.86; H, 8.33.
13C-NMR (400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００４５】
Pb: 
無色針状晶 (MeOH)
mp. 243-245℃(dec.) 
[α]D-104.7°(c=0.55, MeOH) 
IR (KBr) cm-1: 3600-3240 (OH),984,920,902,865 (intensity 920<902, 25(R)-spiroketal). 
Anal. Calcd for C51H82O20・3/2H2O: C, 58.77, H, 8.22. Found: C, 58.64; H, 8.25. 
13C-NMR (400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００４６】
化合物(2-2):
白色粉末
[α]D-86.4°(c=1.03, pyridine) 
IR (KBr) cm-1: 3600-3250 (OH). 
Anal. Calcd for C58H96O26: C, 57.60, H, 8.00. Found: C, 57.28; H, 8.00. 
13C-NMR (400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００４７】
製造例２
イワヤマナツメヤシ Phoenix rupicolaより化合物(3-2)(式(3)においてR=Me)の単離
イワヤマナツメヤシ新鮮葉(3.2 kg)をメタノールで冷浸し、メタノールエキス(273 g)を得た。メタノールエキスを水に懸濁後、エーテル、水飽和n-ブタノールで順次抽出し、エーテルエキス(61 g)、ブタノールエキス(67 g)を得た。ブタノールエキスをSephadex LH-20（溶媒：MeOH）およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：CHCl3-MeOH-H2O=13:7:1）で分離し、化合物(3-2)含有フラクションを得た。化合物(3-2)含有フラクションを1時間加熱還流し、化合物(3-2)(0.3 g)を得た。
【００４８】
化合物(3-2):
白色粉末
[α]D -82.6°(c=0.71, pyridine) 
IR (KBr) cm-1: 3600-3200.
Anal. calcd for C64H106O31・3/2 H20: C, 54.96; H, 7.86. Found: C, 55.08; H,7.77. 
13C-NNR (400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００４９】
製造例３
化合物(3-2)の酵素加水分解
化合物(3-2)(0.30 g)を水(10 mL)に溶解し、エムルシン(0.5 g)を加え、37℃にて8時間反応させた。反応終了後、析出物をろ取し、メタノールより再結晶を行い無色針状晶のrupicolaside （式（A））(0.18 g)を得た。
【００５０】
rupicolaside:
白色粉末
[α]D -97.6° (c=0.50, pyridine)
IR (KBr) cm-1: 3600-3200, 980, 920, 900, 860 (intensity 920 < 900, 25(R)-spiroketal).
Anal. ca1cd for C57H82O25・5/2H2O: C, 55.01; H, 7.83. Found: C, 55.89; H, 7.83. 
13C-NNR(400MHz,pyridine-d5, 50℃): 表１及び２
【００５１】
【表１】
2005145948.tif 000007
【００５２】
【表２】
2005145948.tif 000008
【００５３】
製造例４
シンノウヤシ Phoenix loureirii Kunthより化合物(4-2)(式(4)においてR=Me)の単離
シンノウヤシ新鮮葉(6.4 kg)を室温下、メタノールで3回抽出し、抽出液を併せて減圧下濃縮乾固し、エキス(454 g)を得た。これを水(500 mL)に懸濁し、脂溶性成分をエーテルで抽出(400 mL × 3)し、除去した。水層は更に水飽和n-ブタノールにて抽出(500 mL × 3)した。n-ブタノール溶液を減圧下濃縮乾固し、その濃縮物をSephadex LH-20(メタノール)カラムクロマトグラフィーにより、Fr. 1 (49.7 g)、 2 (34.8 g)、 3 (6.7 g)及び 4 (1.3 g)の4つに分画した。Fr. 1についてシリカゲルクロマトグラフィー(溶媒：CHCl3-MeOH-H2O= 13:7:1)を行い、化合物(2-2) (0.45 g)、化合物(3-2) (0.34 g)と共に、化合物（4-2）：methyl (25R)-proto-loureiroside(0.30 g) を得た。
【００５４】
化合物(4-2)：
白色粉末
mp. 183-186℃(dec.)
[α]D -84.1°(c=1.06, pyridine)
13C-NMR (400 MHz, pyridine-d5) δ ppm：38.0, 30.7, 78.5, 39.5, 141.0, 121.8, 32.7, 32.2, 50.9, 37.7, 21.7, 40.3, 41.0, 57.1, 32.9, 81.6, 64.6, 16.7, 20.0, 41.3, 16.9, 112.9, 31.3, 28.8, 34.8, 75.3, 17.8 (diosgenin  C-1〜C-27), 47.7 (OMe C-22), 100.5, 78.9, 76.9, 78.5, 77.9, 61.9 (β-D-glucose at C-3  C-1〜C-6), 102.2, 72.6, 73.1, 74.5, 69.7, 19.1 (α-L-rhamnose  C-1〜C-6), 109.9, 83.4, 78.6, 84.3, 70.6 (α-L-arabinose  C-1〜C-5), 105.4, 75.5, 78.1, 72.1, 78.5, 63.2 (terminal β-D-glucose  C-1〜C-6), 105.0, 75.5, 78.2, 72.3, 78.9, 63.4 (β-D-glucose at C-28  C-1〜C-6).
【００５５】
試験例１
・  細胞の培養
IMR90、TMK-1、U251、Panc-1、T24、FRO、ARO、WRO、TPC、A549の各細胞約1 万個をディッシュ (12穴プレート) に播種し、10% 牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地にて 37℃、5% CO2下24時間培養した。その後、上記製造例で製造した化合物(1-2)、(2-2)、（3-2）及び(4-2)（各々10μM）を加え、培養を継続した。
【００５６】
IMR90:ヒト繊維芽細胞株
TMK-1:ヒト胃癌細胞株
U251:ヒト悪性脳腫瘍細胞株
Panc-1:ヒト膵臓癌細胞株
T24:ヒト膀胱癌細胞株
FRO:ヒト甲状腺癌細胞株
ARO:ヒト甲状腺癌細胞株
WRO:ヒト甲状腺癌細胞株
TPC:ヒト甲状腺癌細胞株
A549：ヒト肺癌細胞株
【００５７】
(2)殺細胞活性の測定
24時間及び48時間培養したところでディッシュから培地を吸引除去し、リン酸緩衝液 (PBS) 1 mLを用いて細胞を洗浄した。洗浄後、PBSを吸引除去し、1×トリプシン溶液 100 μLを加えて4〜5分間培養器内で加温した。剥離した細胞をエッペンドルフチューブ (1.5 mL) に移し取り、1,500 rpmで5分間遠心処理して集めた。遠心処理後上清を除去、沈殿した細胞を新たな培地200 μLに懸濁した。懸濁液40 μLを96穴プレートに移し取り、これにトリパンブルー染色液 (0.4%トリパンブルー/PBS) 40 μLを加え、細胞と混和した。混和後懸濁液10 μLを血球計算盤に流し込み、顕微鏡下で全細胞数と青く染まった細胞(死細胞)数をそれぞれカウントし、次式に従って薬剤の殺細胞活性を測定した。
【００５８】
殺細胞活性 (%) = 青色細胞/全細胞数 × 100
【００５９】
結果を表3及び4に示す。評価基準の記号において、左側の欄は24時間培養後の殺細胞活性評価を、右側の欄は48時間培養後の殺細胞活性評価を示す。
【００６０】
評価基準の記号
◎:80%,100%
○:50〜80%,60〜80%
△:50%
(△):30-50%
−:30%以下
【００６１】
【表３】
2005145948.tif 000009
【００６２】
【表４】
2005145948.tif 000010
【００６３】
表3から明らかなように、化合物(1-2)〜(3-2)は、いずれもPanc-1及びT24に対して特異的に殺細胞活性を示し、特に化合物(1-2)及び(2-2)は、48時間培養後には100％の殺細胞活性を示した。また、表4から明らかなように、化合物(4-2)は、試験したすべての甲状腺癌細胞に対して有意な殺細胞活性を示した。
【００６４】
試験例２  cAMPの測定
Amersham pharmacia biotechのcAMP enzymeimmunoassay (EIA) system (code RPN 225)を使用した。添付マニュアルのnew protocol 3 (p35〜)に準じて細胞内cAMP濃度を測定した。
【００６５】
(1)Bufferの調製
調製した以下のbuffer は4℃で保存し、2週間以内に使用した。
1.Assay buffer: 蒸留水 500 mLで溶解した。
2.Lysis reagent 1
1A : lysis reagent (粉) をassay buffer 60 mLで溶解し、20分以上攪拌してよく溶解した後、assay bufferで80 mLまでメスアップした。
1B : 1A 10 mLをassay bufferで100 mLまでメスアップした。
3. Lysis reagent 2
2A : lysis reagent 2をassay buffer 80mLで20分以上攪拌してよく溶解した後、100 mLまでメスアップした。
2B : 2A 10 mLにassay buffer 30 mLを混合した。
4. Standard: Lysis reagent 1B 2 mLで溶解した（32 pmol/mLのcAMP溶液に相当）。
5. Antiserum: Lysis reagent 2B 11 mLで泡立てないように溶解した。
6. cAMP peroxidase conjugate: assay buffer 11 mLで溶解した。
7. Stopping buffer: 1 M硫酸を調製した。
8. Wash buffer: 蒸留水 500 mLで溶解した。
【００６６】
(2)サンプルの調製
細胞は6 cmディッシュに2×10 5で播き、10% 牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地にて 37℃、5% CO2下、24時間培養した。cAMP濃度を蛋白質量で標準化するため、サンプル調製前にサンプル名を1.5 mL チューブに書いてその重さを測っておいた。これを2セット準備した。尚、細胞数で標準化するときは１セット準備した。
培地を吸引して捨て、ディッシュに1 mLの1B bufferを加えた。シェーカーで揺らしながら室温で10分間インキュベートした。ディッシュ内のbufferを1.5 mL チューブに回収して重さを測り、サンプルの正確な重さを計算した。このサンプルのうち100μLを１サンプルとしてELISA測定に使用した。1B bufferを回収したディッシュに1×SDS bufferを100μL入れて細胞を溶解し、lysateを蛋白質定量用のサンプルとした。総蛋白質量を求めるため、ここでlysateの重さを測り、超音波処理した後、PeirceのBCA regentを用いて蛋白質濃度を測定した。
【００６７】
(3)Working standardの作成
エッペンドルフチューブ8本を用意して、500μLずつ1B bufferを入れておき、スタンダードを500μL加えて順次2倍希釈してworking standardを作成した。
【００６８】
(4)cAMPの測定
bufferは使用する１時間以上前に室温に戻しておき、付属の96 wellプレートを氷上に準備した。何も入れないwell 1つをblankとし、NSB (non-specific binding) として1B 100μL、2B 100μLをwellに入れ、更にゼロスタンダードとして1B buffer 100μLをwellに入れた。その他のスタンダードを100μLずつ (12.5〜3200 pmol/mL)、未知サンプルを100μLずつ入れた。スタンダードとサンプルの入ったwell (blankとNSBの入っているwellには入れない) にantiserumを100μLずつ加えた。プレートに蓋をして軽くゆすり、氷上で2時間インキュベートした。50μLのcAMP peroxidaseをすべてのwellに加えて、再び3〜5℃で1時間インキュベートした。bufferをデカントして捨て、400μLのwash bufferで4回洗浄し、水気をよくきった。cAMP peroxidase conjugate 150μLをすべてのwellに入れ、室温で1時間揺らしながらインキュベートした。stop buffer 100μLを入れ、反応を停止させた。30分以内にプレートリーダーで450 nmの吸光度を測定し、スタンダードの吸光度から標準曲線を作成し、サンプルのcAMP濃度を計算した。結果を図2に示す。
【００６９】
図2より明らかなように、変異ras遺伝子が発現しているPanc-1及びT24においては、IMR90、TMK-1びU251に比較して細胞内cAMPの濃度が高濃度であった。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】Ras蛋白質及び細胞内cAMPの細胞死への関与を示す図である。
【図２】各種細胞の細胞内cAMP濃度を示す図である。
【図１】
2005145948.tif 000023
【図２】
2005145948.tif 000024