(57)【要約】【課題】  銅を選択的に結合する新規なペプチド、及びその使用方法の提供。【解決手段】  メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3b株（ATCC 35070)の培養液中に放出され、マススペクトルによる分子量1216有し、マススペクトルの分子量と同位体パターンからのシミュレーションによる銅を含む分子の分子式C37H36N31O11Cu2を有し、そして銅を含まない分子は銅を特異的に結合することができることを特徴とするペプチド、及びその使用。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3b株（ATCC 35070)の培養液中に放出され、マススペクトルによる分子量1216有し、マススペクトルの分子量と同位体パターンからのシミュレーションによる銅を含む分子の分子式C37H36N31O11Cu2を有し、そして銅を含まない分子は銅を特異的に結合することができることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
銅を含有する材料に、請求項１に記載の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめ、そして当該ペプチドから銅を遊離せしめることを特徴とする、銅の回収または濃縮方法。
【請求項３】
銅を含有する材料に、請求項１に記載の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめることを特徴とする、銅の除去方法。
【請求項４】
銅を含有すると予想される材料に、請求項１に記載の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめることを特徴とする、銅の定量的又は定性的測定方法。
【請求項５】
前記ペプチドと銅との結合を紫外線吸収スペクトルにより測定する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、銅に特異的に結合するペプチド及びその使用、特に銅の回収、銅の除去、及び銅の定量的又は定性的分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
多数の金属イオンの中から銅イオンを特異的に結合するペプチドは知られていない。
従来の銅の定量法には様々な方法がある。と問えば、電解重量法は電気分解により銅を沈着させ、沈着した銅の重量を測定する方法であり、精度の点で優れていることが知られているが、分析に比較的時間がかかるなどの欠点がある。容量法は銅と過剰のI-との反応により生成するI2を滴定する方法であり、この方法は酸化還元を利用していることから、多くの酸化還元物質が妨害物質となる。また、吸光光度法は銅と錯形成する試薬との反応を利用し定量する方法である。様々な試薬が開発されており、比較的低濃度の銅イオンを簡便に定量できるが、Ni, Coなどのイオンが阻害物質となるため、銅イオンに対する選択性が低い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、本発明は、銅イオンを特異的に結合することが出来るペプチドを提供しようとするものである。
本発明は更に、上記の銅を特異的に結合することができるペプチドの利用方法を提供し、特に銅イオンの除去方法、銅イオンを特異的に回収する方法、及び銅イオンを特異的に測定する方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3b株（ATCC 35070)が培養液中に放出されるペプチドは、銅を生体内に輸送する化合物であると考えられ、様々な金属イオンの中で、特に銅イオンに対する選択性が高いことを見いだした。このため、本ペプチドは銅の選択的キレート剤として利用できる。特に、銅イオンの結合は吸収スペクトル変化としてとらえることができるので、簡便な銅イオンセンサーとして利用できる。
【０００５】
従って本発明は、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3b株（ATCC 35070)の培養液中に放出され、マススペクトルによる分子量1216有し、マススペクトルの分子量と同位体パターンからのシミュレーションによる銅を含む分子の分子式C37H36N31O11Cu2を有し、そして銅を含まない分子は銅を特異的に結合することができることを特徴とするペプチドを提供する。
【０００６】
本発明は更に、銅を含有する材料に、前記の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめ、そして当該ペプチドから銅を遊離せしめることを特徴とする、銅の回収または濃縮方法を提供する。
本発明はまた、銅を含有する材料に、前記の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめることを特徴とする、銅の除去方法を提供する。本発明は更に、銅を含有すると予想される材料に、前記の銅を含有しないペプチドを接触せしめることにより当該ペプチドに銅を結合せしめることを特徴とする、銅の定量的又は定性的測定方法を提供する。この方法においては、前記ペプチドと銅との結合を紫外線吸収スペクトルにより簡単に測定することが出来る。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の、銅イオンを特異的に結合することができるペプチドは、銅イオンにより汚染された環境、例えば排水、土壌などから銅イオンを容易に吸着し、除去することができる。また、銅イオンが結合したペプチドは容易に他のイオンと分離・生成ができるため、例えば、銅イオンのレメディエーションにも利用できるといえる。
また、本発明のペプチドは、溶液中にCo, Ni, Mg, Caなどこれまでの吸光光度法において阻害剤であるイオンが共存しても、銅イオンと選択的に結合し、このペプチドが銅イオンと結合する際に、吸収スペクトルが変化する。この変化を従来の吸光光度法と同様に分光光度計などの測定装置により定量することができる。
【０００８】
従来の銅の定量法では定量に時間がかかったり、大型の機械での測定が必要であるなど問題点があった。吸光光度法は短時間での定量が可能であり、高感度であるため有用な方法であるが妨害物質の除去が必要であることから、環境中のように多くのイオンが共存する条件での測定には不向きであった。本発明を用いることにより、多くのイオンが共存するような条件でも銅イオン選択的に定量できるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
銅イオンを特異的に結合するペプチド
本発明の、銅イオンを特異的に結合するペプチドは、メチロシヌス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）OB3b株（ATCC 35070)の培養液中に放出される。培養は、例えば、銅イオン及び鉄イオンを含む無機培地で、メタンを炭素現として培養することが出来る。培養液からの回収・精製は、培養液からのペプチドの回収・精製に用いられる常法に従って行なうことができる。精製後又は精製の過程で陰イオン交換カラムにより処理することにより、銅を含有するペプチドと銅を含有しないペプチドとに分離することが出来る。この銅を含有しないペプチドは、銅イオンを特異的に結合し銅を含むペプチドに変化する。
【００１０】
銅を含有するペプチドと銅を含有しないペプチドとの分離は、具体的には、例えば、次のようにして行はれる。陰イオン交換クロマトグラフィー（例えばBio Assist Q（東ソー（株）社製）、4.6mm×50mm）に銅を含有するペプチドと含有しないペプチドを添加し、ともに吸着させる。その後、25mM Tris-HCl buffer（pH8.0）で十分に洗浄した後、上記緩衝液中のNaCl濃度を1Mまで、直線的に変化させることにより、銅を含有するペプチドと含有しないペプチドが分離できる。
【００１１】
銅を含有するペプチドについて、更に逆相カラムにおいて精製し、質量分析を行なったところ、図１に示すスペクトルが得られた。この結果２原子の銅を含むペプチドの分子量は1216であった。また、マススペクトルの分子量と同位体パターンよりシュミレーションを行なった結果、分子式C37H36N31O11Cu2と最もよく一致することから、精製されたペプチドは２個の銅と結合していると考えられる。なお、上記ペプチドは、X-X-Met-Tyr-Pro-Gly-X（Xは未同定）の配列を有すると予想される。
【００１２】
銅の選択的除去
本発明のペプチドは銅と特異的に結合するので、銅の特異的又は選択的除去のために用いることができる。例えば、銅を含有していない本発明のペプチドを固体担体に固定化しておき、これを、銅を含有する液体と接触せしめることにより、液体中の銅を固体担体に固定することが出来、この固定化担体と液とを分離することにより、液体中の銅を除去することが出来る。
【００１３】
ここで使用するペプチドの固定化は、固定化酵素の製造のための常法により行うことができる。ジアゾ法による固定化のための固体担体としては、多糖類誘導体、例えばセルロース誘導体、例えばｐ−アミノベンゼンセルロース、ｐ−アミノベンゾイルセルロース、ｍ−アミノアニソールセルロースなど、澱粉誘導体、例えば澱粉−メチレンジアニリン化合物など；アミノ酸共重合体、例えばｐ−アミノ−DL−フェニルアラニン−L−ロイシンなど；ポリアクリルアミドの誘導体、例えばBio-Gel P-2−アミノエチルなど；スチレン系樹脂、例えばポリアミノポリスチレン；無機担体、例えば多孔性ガラスのアミノシラン誘導体、などが上げられる。
【００１４】
ペプチド法による固定化のための固定化担体としては、酸アジド誘導体、例えばCMC−セルロースのアジド誘導体；カルボキシクロリド樹脂、例えばアンバーライト系樹脂；カルボジイミド樹脂；無水マレインサン誘導体、例えばエチレン−無水マレイン酸共重合物；セルロースカルボンート誘導体；縮合剤としてカルボジイニド試薬を用いるAE−セルロース、CM−セファデックスなどが挙げられる。また、架橋剤による固定化のための担体としてAE−セルロース、DEAE−セルロース、AE−ポリアクリルアミドなどが挙げられる。
【００１５】
また、イオン結合により固定化するための担体として、DEAE−セルロース、TEAE−セルロース、アンバーライトIR-45、CM−セルロース、Dowex−50などが挙げられる。
また、物理的固定化のための担体として、活性炭、多孔性ガラス、酸性白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、澱粉、コンカナバリンAなどが挙げられる。
【００１６】
銅の回収
本発明のペプチドは銅と特異的に結合するので、銅の回収のために用いることができる。例えば、銅を含有していない本発明のペプチドを固体担体に固定化しておき、これを、銅を含有する液体と接触せしめることにより、液体中の銅を固体担体に固定することが出来、この固定化担体と液とを分離することにより、銅が固定されて担体を得ることが出来、次に、ペプチドに結合した銅を、放出させることにより、銅を回収することが出来る。
ペプチドに結合した銅を放出させるには、塩酸などによる酸処理を行えばよい。
【００１７】
銅イオンの特異的測定
本発明のペプチドは、銅を含まないペプチドに比べて、銅を含むペプチドは350nm及び400nm付近の吸光度が減少する。従って、350nm付近又は400nm付近の吸光度を測定することにより、銅を測定することが出来る。例えば、本発明の銅を含まないペプチドの溶液を２個用意し、一方に銅を含まないブランク液を添加し、もう一方に被験試料を添加し、反応後に350nm及び／又は400nmにおける吸光度を測定して両者の吸光度の差を求めればよい。或いは、銅を含まないペプチドの溶液を用意し、その350nm及び／又は400nmにおける吸光度を測定したが、被験試料を添加し、反応させた後、再度350nm及び／又は400nmにおける吸光度を測定し、350nm及び／又は400nmにおける吸光度の変化を測定すればよい。本発明の方法においては、複雑な機器や試薬を必要とせず、簡単な操作で、銅イオンを特異的に測定することが出来る。
【実施例】
【００１８】
次に、本発明を実施例により、更に具体的に説明する。
実施例１. ペプチドの製造
メチロシヌス・トリコスポリウム（M. trichosporium）OB3b (ATCC35070)を、CuSO4およびFeSO4を含む無機培地で、メタンを炭素源として培養した。培養液の組成を表１に示す。
【００１９】
【表１】
2005104906.tif 000002
【００２０】
メチロシヌス・トリコスポリウム（M. trichosporium）を、500 ml三角フラスコで、銅イオンCu 0.25 μM を含む培養液130 ml中で30oC、24時間培養した。その後、5 L三角フラスコで、銅イオンCu 0.5 μM を含む培養液1.1 L中で、室温、３〜４日間培養した。得られた培養上清をSep-Pak Plus ENVにより濃縮後、70%アセトニトリル／水により、抽出した。
【００２１】
その後、Bio Assist Qを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。溶出は30%アセトニトリルを含む25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 中のNaCl濃度を0 Mから1 Mに直線的に変化させることにより行った。さらにOligo R3を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。溶出は0.01% HCOOHを含む水溶液中のアセトニトリル濃度を5 -70%に変化させることにより行った。精製物の質量分析には、ESI-TOF-MSを用いた。培養上清からの抽出物を陰イオン交換カラムにより精製した結果、銅を含むペプチドと含まないペプチドに分離された。
【００２２】
銅を含むペプチドについて、さらに逆相カラムにおいて精製し、質量分析を行なった。精製物の分子量は1216であることがわかった。また、マススペクトルの分子量と同位体パターンよりシミュレーションを行った結果、C37H36N31O11Cu2と最も一致することから、精製したペプチドは2つの銅と結合していると考えられる。
【００２３】
実施例２. 銅添加による吸収スペクトル変化
溶媒20mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液中銅を含有しないペプチド（2.5μM濃度）の溶液に、図２に示す濃度のCuSO4を添加し、室温にて10分間静置した後、島津製作所製、紫外可視フォトダイオードアレイ分光光度計(Multispec-1500形)を用いて、銅イオンの添加による吸収スペクトル変化を光路長1 cmの石英製セル中で測定した。
結果を図２に示す。銅イオンを含む溶液を添加することにより、350 nm付近および、400 nm付近の吸光度が減少する。
【００２４】
実施例３. 銅イオンに対する選択性
実施例１と同様の実験を行なったが、反応系のイオンとして、次の場合について試験した。
(1）ペプチドのみ
(2）ペプチド＋10μM CoSO47H2O、10μM NiCl2、10μM MgSO47H2O、10μM CaCl22H2O
(3）ペプチド＋10μM CoSO47H2O、10μM NiCl2、10μM MgSO47H2O、10μM CaCl22H2O、20μM CuSO45H2O
結果を図３に示す。図３の結果から明らかな通り、Co、 Ni、 Mg及び Caイオンの存在下でも、本発明のペプチドは、Cuイオンに対して選択的に結合することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、銅を含む本発明のペプチドのマススペクトルを示す。
【図２】図２は、本発明の銅を含まないペプチドに、種々の濃度の銅イオンを含む溶液中で、銅イオンを結合させた場合の吸光スペクトルを示す。
【図３】図３は、本発明のペプチドが、選択的（特異的）に銅イオンと結合することを示す、吸光スペクトルを示す。
【図１】
2005104906.tif 000003
【図２】
2005104906.tif 000004
【図３】
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