(57)【要約】【課題】    全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を発揮する、自己免疫性腎障害治療又は予防剤、並びにそのための組換えベクターを提供すること。【解決手段】  トキソプラズマ・ゴンディのHSP70タンパクを投与することにより、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を得る。HSP70タンパクを生体内で生産する組換えベクターを投与することによっても自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果が得られる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該アミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮するポリペプチドを有効成分として含有する自己免疫性腎障害治療又は予防剤。
【請求項２】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するポリペプチドであって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮するポリペプチドを有効成分として含有する自己免疫性腎障害治療又は予防剤。
【請求項３】
配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを有効成分として含有する請求項１記載の自己免疫性腎障害治療又は予防剤。
【請求項４】
前記自己免疫性腎障害が全身性エリテマトーデスである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸を含み、治療又は予防処置を受ける哺乳動物体内において前記ポリペプチドを生産することができる哺乳動物用組換えベクターから成る自己免疫性腎障害治療又は予防用組換えベクター。
【請求項６】
配列表の配列番号１で示される塩基配列又は該塩基配列から成る核酸断片とストリンジェント条件下においてハイブリダイズする核酸断片であって、哺乳動物体内で発現されることにより該哺乳動物に自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を付与することができる核酸断片を含む請求項５記載の組み換えベクター。
【請求項７】
前記自己免疫性腎障害が全身性エリテマトーデスである請求項５又は６記載の組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害治療又は予防剤、並びにそのための組換えベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス(SLE)は、Ｂ細胞の過剰反応性、自己抗原に対する自己抗体、特に核抗原及びDNAに対する自己抗体、並びに重要な器官における免疫複合物の沈着に起因して糸球体腎炎及び蛋白尿を引き起こすことを特徴とする全身性自己免疫疾患である。
【０００３】
SLEの詳細な病因は未だに不明であるが、遺伝的、ホルモン的、環境的及び免疫調整的因子並びに感染物が、この疾病の発症に寄与していると考えられている（非特許文献９、１０、１１）。いくつかのグループは、詳細なメカニズムは不明であるが、ウイルス感染が自己免疫疾患の憎悪に寄与するかもしれないことを報告した（非特許文献１２、１３）。Lloydらは、マラリアが、DNAと反応するいくつかの抗体を包含する多数の自己抗体の生産を伴い、マラリア感染におけるDNA反応性抗体が、マラリア性腎炎における免疫沈着物の形成に関与しているかもしれないことを示した（非特許文献１４）。逆に、他のグループは、最良のSLEモデル動物の１つであるNZBW F1マウスをマラリアに感染させると、自己免疫疾患の発症が抑制されることを示した（非特許文献１５〜１７）。しかしながら、SLEのような自己免疫性腎障害の効果的な治療方法は確立されていない。
【０００４】
一方、本願発明者は、先にトキソプラズマ・ゴンディから熱ショック蛋白７０(HSP70)をコードする遺伝子を初めてクローニングし、その塩基配列を決定し、該遺伝子を発現させて該HSP70を生産し、HSP70を用いて体液中の抗HSP70抗体を測定することによりトキソプラズマ症の診断が可能であることを明らかにした（特開平11-225783号公報）。しかしながら、このトキソプラズマ・ゴンディのHSP70（以下、「TgHSP70」と記載することがある）が自己免疫性腎障害の治療又は予防に有効であることは全く知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平11-225783号公報
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【非特許文献４３】Hagiwara, E., T. Okubo, I. Aoki, S. Ohno, T. Tsuji, A. Ihata, A. Ueda, A. Shirai, K. Okuda, J. Miyazaki, and Y. Ishigatsubo. 2000. IL-12-encoding plasmid has a beneficial effect on  spontaneous autoimmune disease in MRL/MP-lpr/lpr mice. Cytokine 12:1035.
【非特許文献４４】Takahashi, S., L. Fossati, M. Iwamoto, R. Merino, R. Motta, T. Kobayakawa, and S. Izui. 1996.   Imbalance towards Th1 predominance is associated with acceleration of lupus-like  autoimmune syndrome in MRL mice. J. Clin. Invest. 97:1597.
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【非特許文献４９】Yano, A., H. S. Mun, T. H. Yang, H. Hata, M. Kobayashi, K. Norose, S. Hayakawa, Y. Tagawa, Y. Iwakura, S. Nakazaki, Y. Nakazaki, S. Sekiya, A. Yamaura, H. Kubosawa, N. Yumoto, and F. Aosai. 1998. Roles of IFN-γ in effector mechanisms and pathogenicity of HSPs in mice and human infected with Toxoplasma gondii. In 9th International Congress of Parasitology. Monduzzi, ed., Bologna, Italy, p. 457.
【非特許文献５０】Yano, A., F. Aosai, M. Ohta, H. Hasekura, K. Sugane, and S. Hayashi. 1989. Antigen  presentation by Toxoplasma gondii-infected cells to CD4+ proliferative T cells and CD8+  cytotoxic cells. J. Parasitol. 75:411.
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【非特許文献５５】Lindquist, S. 1986. The heat-shock response. Annu. Rev. Biochem. 55:1151.
【非特許文献５６】Kenderov, A., V. Minkova, D. Mihailova, N. Giltiay, S. Kyurkchiev, I. Kehayov, M. Kazatchkine, S. Kaveri, and A. Pashov. 2002. Lupus-specific kidney deposits of HSP90 are  associated with altered IgG idiotypic interactions of anti-HSP90 autoantibodies. Clin. Exp. Immunol. 129:169.
【非特許文献５７】Hayakawa, K., R. R. Hardy, D. R. Parks, and L. A. Herzenberg. 1983. The "Ly-1 B" cell  subpopulation in normal immunodefective, and autoimmune mice. J. Exp. Med. 157:202.
【非特許文献５８】Norose, K., H. S. Mun, M. Chen, F. Aosai, and A. Yano. 2000. Serum antibodies to HSC71 in  Vogt-Koyanagi-Harada disease. Br. J. Ophthalmol. 84:1434.
【非特許文献５９】Fumie Aosai, Mei Chen, Hyun-Kyu Kang, Hye-Seong Mun, Kazumi Norose, Lian Xun Piao, Masashi Kobayashi, Osamu Takeuchi, Shizuo Akira and Akihiko Yano. 2002. Toxoplasma gondii-derived HSP70 functions as a B-cell mitogen. Cell Stress and Chaperon 7(4), 357-364.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を発揮する、自己免疫性腎障害治療又は予防剤、並びにそのための組換えベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、鋭意研究の結果、TgHSP70が全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を発揮することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮するタンパク質を有効成分として含有する自己免疫性腎障害治療又は予防剤を提供する。また、本発明は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質又は該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するタンパク質であって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮するタンパク質を有効成分として含有する自己免疫性腎障害治療又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、請求項１ないし３のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸を含み、治療又は予防処置を受ける哺乳動物体内において前記ポリペプチドを生産することができる哺乳動物用組換えベクターから成る自己免疫性腎障害治療又は予防用組換えベクターを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を発揮する、新規な自己免疫性腎障害治療又は予防剤並びにそのための組換えベクターが提供された。本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤並びに組換えベクターは、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害に対して優れた治療及び予防効果を発揮するので、これらの疾患の治療及び予防に大いに貢献するものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤は、自己免疫性腎障害の治療、自己免疫性腎障害の予防、並びに自己免疫性腎障害の治療及び予防（同時に治療と予防を行う）のいずれにも用いることができる。
【００１１】
本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤の対象となる自己免疫性腎障害としては、全身性エリテマトーデス、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、ウエジナー肉芽腫症、全身性進行性硬化症等を例示することができる。これらのうち、全身性エリテマトーデスが最も好ましい。
【００１２】
本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤は、好ましくはTgHSP70を有効成分として含有する。TgHSP70自体は、特許文献１に記載されているように既に公知であり（配列番号１は特許文献１に記載のものと同一）、その取得方法も公知である。なお、TgHSP70としては、特許文献１に記載の方法等の、微生物宿主中でTgHSP70遺伝子を発現させる遺伝子工学的手法により生産した組換えTgHSP70（以下、「rTgHSP70」と記載することがある）を用いることが、入手容易性の観点から好ましい。
【００１３】
なお、一般に、生理活性を有するポリペプチドにおいて、該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が置換し、欠失し又は挿入されてもその生理活性が維持されることがしばしばあることは当業者にとって周知である。したがって、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換し、欠失し若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮することができるアミノ酸配列を有するタンパク質を有効成分として用いる場合も本発明の範囲に含まれる。また、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮することができるアミノ酸配列を有するタンパク質を有効成分として用いる場合も本発明の範囲に含まれる。アミノ酸配列の相同性は、好ましくは９５％以上である。また、この場合、アミノ酸配列の長さは５８０アミノ酸以上であることが好ましく、６１０アミノ酸以上であることがさらに好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、周知のホモロジー検索プログラムであるFASTAにより容易に算出することができ、このプログラムはインターネット上でも公開されている(http://www.genome.ad.jp/SIT/SIT.html)。本明細書において、「自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮する」とは、陰性対照と比較して、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果が有意に認められることを意味し、実施例記載の評価方法の少なくとも１つの評価方法で有意差が認められればよい。
【００１４】
本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤の投与経路は、非経口経路が好ましく、例として、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射等を挙げることができる。また、投与量は、症状や投与の目的等に応じて適宜選択されるが、通常、成人に対する１回の投与量は、有効成分の量として100mg〜5000mg、好ましくは、200mg〜1000mg程度であり、これを通常、7日〜14日に１回の頻度で投与することができる。
【００１５】
製剤は、注射剤として常用されている担体を用いる周知の方法により行うことができ、例えばリン酸緩衝生理食塩水に有効成分を1μg/ml〜10mg/ml程度の濃度に溶解したものを用いることができる。
【００１６】
自己免疫性腎障害治療又は予防のためには、上記したポリペプチドを生体に投与してもよいが、上記ポリペプチドを生体内で生産することができる組換えベクターを投与してもよい。したがって、本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードする核酸を含み、治療又は予防処置を受ける哺乳動物体内において前記ポリペプチドを生産することができる哺乳動物用組換えベクターから成る自己免疫性腎障害治療又は予防用組換えベクターをも提供する。
【００１７】
本発明の組換えベクターは、上記した本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むものである。したがって、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドや、それに類似するアミノ酸配列を有する上記したポリペプチドをコードする核酸を含む。核酸としては、配列番号１に示す塩基配列を有する核酸及びそれに類似する塩基配列を有し、上記したポリペプチドをコードする核酸を用いることができ、さらに、配列番号１で示される塩基配列から成る核酸断片とストリンジェント条件下においてハイブリダイズする核酸断片であって、自己免疫性腎障害に対する治療又は予防効果を発揮するポリペプチドを生体内で生産することができる核酸も用いることができる。この場合も、該核酸断片によりコードされるアミノ酸配列の長さは５８０アミノ酸以上であることが好ましく、６１０アミノ酸以上であることがさらに好ましい。なお、ここで、「ストリンジェント条件」とは、5 x Denhardt's reagent, 6 x SSC,0.5% SDS又は0.1% SDSといった一般的なハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で、好ましくは５０℃と６０℃の２段階、又は、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃の４段階で反応を行なう場合を意味する。核酸は、ＤＮＡが好ましい。
【００１８】
なお、本願発明の組換えベクターは、上記した核酸断片（配列番号２をコードする配列又はそれに類似する上記配列から成る核酸断片）を含んでいればよいから、上記した核酸断片の一端又は両端に他の配列が結合された断片が哺乳動物細胞用ベクターに挿入されたものは当然本発明の範囲に含まれる。例えば、下記実施例では、配列番号１に示される塩基配列の５’末端側にSpeI部位から成る配列、３’末端側にXbaI部位から成る配列が連結されたものを哺乳動物細胞用ベクターに組み込んでいるが、作製された組換えベクターは、配列番号１で示される塩基配列から成る核酸をそっくり含んでいるのであるから当然、本発明の範囲に含まれる。核酸断片の両端に、他の核酸断片、例えば、配列番号３に示す５’側非翻訳領域若しくはその一部、TgHSP70の第６４８番目以降のアミノ酸配列をコードする領域若しくはその一部や、さらにその下流の３’側非翻訳領域若しくはその一部、さらには、Tgとは無関係の他の配列を結合したものを哺乳動物細胞用ベクターに組み込んだものも本発明の範囲に含まれる。
【００１９】
上記した核酸を組み込む哺乳動物細胞用ベクター自体は、この分野において周知であり、市販もされており、公知のベクターや市販品をそのまま用いることができる。好ましい哺乳動物細胞用ベクターの１例として、pME18-FL3（オリジナルデータは非論文発表で登録のみ。応用使用例の文献：Seiko Saito, Fumie Aosai, Naoaki Rikihisa, Hye-Seong Mun, Kazumi Norose, Mei Chen, Tomoaki Kuroki, Takao Suzuki, Takenori Ochiai, Hidekazu Hata, Masaharu Ichinose, and Akihiko Yano. (2001) Establishment of Gene-Vaccinated Skin Grafting against Toxoplasma  gondii infection in Mice. Vaccine 19; 2172-2180.)を挙げることができる。pME18-FL3の構造を図９に示す。また、pME18-FL3の全塩基配列も公知であり、GenBank Accession No. AB009864に記載されている。また、Invitrogen社から市販されているpcDNA3.1(+)(catalog No. V790-20)やpcDNA3.1(-)(catalog No. V795-20)等も好ましく用いることができる。周知のとおり、これらの哺乳動物細胞用ベクターは、哺乳動物細胞内での複製を可能にする複製開始点、哺乳動物細胞への感染を可能にするウイルス由来配列、外来遺伝子の発現を可能にするプロモーター領域、外来遺伝子を挿入するためのマルチクローニング部位等を有する。本発明の組換えベクターは、常法により、上記核酸断片を、哺乳動物細胞用ベクターのマルチクローニング部位に挿入することにより得ることができる。
【００２０】
哺乳動物への組換えベクターの投与自体は、周知の方法により行うことができる。すなわち、好ましくは、筋肉内投与(i.m.)又は静脈内投与(i.v.)等の非経口投与により投与することができる。筋肉内投与や静脈内投与では、組換えベクターをリン酸緩衝液(PBS)等の緩衝液に懸濁したものを投与することができる。投与量は、症状や対象となる疾病の種類等に応じて適宜選択することができるが、筋肉内、静脈内投与等では、通常、成人に対する１回の投与量は、0.1〜100 mg程度、好ましくは0.5〜10 mg程度であり、これを通常、半月〜２ヶ月に１回程度、好ましくは１ヶ月に１回程度の頻度で投与することができる。また、注射液中の組換えベクターの濃度は、特に限定されないが、通常0.1 mg/mlないし10 mg/ml程度である。
【実施例１】
【００２１】
材料及び方法
マウス及びトキソプラズマ・ゴンディ株
８週齢のメスC57BL/6 (B6, 感受性系統), BALB/c (耐性系統), NZB, NZW, NZBW F1マウスは、ＳＬＣ社（静岡県浜松市）から購入した。これらのマウスに、トキソプラズマ・ゴンディFukaya株の嚢子(cyst)１０個を経口投与してトキソプラズマ・ゴンディに感染させた（非特許文献３、２２）。
【００２２】
蛋白尿、組織病理学及び免疫蛍光
尿中の蛋白濃度は、アルブミン試薬ストリップ(Hema-Combistix（商品名）バイエル/三共社製）を用いて、半定量的に１ヶ月毎に評価した。尿中蛋白濃度が100 mg/dlを超える場合を陽性とした。
【００２３】
腎病巣は、盲検的に等級付けした（非特許文献２３）。光学顕微鏡による検査のために、非感染のNZBW F1マウス及び月齢２ヶ月の時にトキソプラズマ・ゴンディに感染したNZBW F1マウスの腎臓を、月齢９ヶ月の時に４％パラホルムアルデヒドで固定し、４μｍのパラフィン切片を過ヨウ素酸シッフ(PAS)及びH & Eで染色した。糸球体病巣は以下のグレードに等級付けした。
１＋：軽度な局所的血管間膜細胞過充実(focal mesangial hypercellularity)のみ；
２＋：中程度の血管間膜細胞過充実
３＋：時に軽度の梗塞又は壊死を伴う複合毛管内細胞過充実
４＋：壊死又は半月体形成を伴う重症毛管内細胞過充実糸球体腎炎
【００２４】
糸球体における免疫複合物の沈着を検出するために、凍結切片をFITC標識抗マウスIgM, IgG又はC3ヤギ抗体（米国カリフォルニア州のICN Pharmaceuticals社製）と共に３０分間室温でインキュベートした。
【００２５】
抗体の測定
上記の通り、B6, BALB/c, NZB, NZW及びNZBW F1マウスに、月齢２ヶ月の時に、トキソプラズマ・ゴンディの嚢子１０個を経口投与してトキソプラズマ・ゴンディに感染させた。月齢９ヶ月の時に、非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染B6, BALB/c, NZB, NZW及びNZBW F1マウスの血清中のIgM及びIgG抗１本鎖ＤＮＡ抗体及び抗２本鎖ＤＮＡ抗体を公知の方法（非特許文献２１、２４）に従ってELISAにより測定した。すなわち、ELISAプレート（住友ベークライト社製）のウェルを仔ウシ胸腺から調製した１０μg/mlの１本鎖DNA（米国ミズーリー州セントルイスのSigma Chemical社製）、又は２本鎖DNA (poly(dA-dT)/poly(dA-dT); Sigma社製）で被覆した。プレートを0.05% Tween 20（商品名）含有PBSで洗浄した後、プレートを2% BSA含有PBSでブロッキングした。月齢９ヶ月の非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染B6, BALB/c, NZB, NZW及びNZBW F1マウスの血清の1:200希釈物をウェルに添加し、２時間室温でインキュベートした。プレートをPBS-Tween（商品名）で洗浄後、アリカリホスファターゼ結合抗マウスIgM抗体（米国カリフォルニア州CamarilloのTago社製）又は抗マウスIgG抗体（米国カリフォルニア州TemeculaのChemicon International Inc社製）の1:1000希釈物をウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。波長405nmにおける吸光度を測定した。２本鎖DNAと結合するIgGサブクラスの濃度は、上記の通りウェルを10μg/mlの２本鎖DNA(Sigma社製）で被覆し、アルカリホスファターゼ結合ラット抗マウスIgGサブクラス特異的第２抗体(X56, 抗-IgG1; R19-15, 抗IgG2a; R12-3, 抗IgG2b; R40-82, 抗IgG3; 全てドイツ国Heidelberg のPharMingen社製）を用いて測定した。
【００２６】
トキソプラズマ・ゴンディ感染B6, BALB/c, NZB, NZW及びNZBW F1マウス血清中の抗TgHSP70抗体及び抗HSP70自己抗体を検出するために、感染２週間後及び９週間後に尾から採血した。血清を回収し、公知の方法（非特許文献３、４、２１）に従い、rTgHSP70及び組換えマウス(m)HSP70を用いたELISAにより、抗TgHSP70抗体及び抗HSP70自己抗体の濃度を測定した。アルカリホスファターゼ結合抗マウスIgM抗体(Tago社製）及びアルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG抗体（Chemicon International社製）を第２抗体として用いた。
【００２７】
細胞内IL-10, IL-4, IFN-γ及びIL-12の検出
月齢２ヶ月のNZBW F1マウスにトキソプラズマ・ゴンディFukaya株の嚢子(cyst)１０個を経口投与してトキソプラズマ・ゴンディに感染させた。月齢９ヶ月の非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスから、脾細胞及び腹腔滲出細胞(PECs)を回収した。次いで、Cytofix/Cytoperm kit (商品名、米国カリフォルニア州San Diego のPharMingen社製）を用いて細胞を固定及び浸透化し、0.1μgのFITC-結合ラット抗マウスIL-4 mAb(BVD-24G2（商品名）、フランスのIMMUNOTECH社製）、FITC-結合ラット抗マウスIFN-γ mAb(XMG1.2（商品名、PharMingen社製)及びPE-結合ラット抗マウスIL-12(p40/p70) mAb (C15.6; PharMingen社製)でそれぞれ染色した。最後に細胞を浸透化緩衝液で洗浄し、IL-10, IL-4, IFN-γ及びIL-12の発現をFACScan (商品名、米国カリフォルニア州Mountain ViewのDecton Dickinson社製)で解析した。
【００２８】
TgHSP70プラスミド及び組換えTgHSP70の調製
特開平11-225783号公報に記載の方法により行った。すなわち、以下の方法により行った。
(1)  トキソプラズマ・ゴンディのHSP70蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
ＭＯＳＥＩ ｃＤＮＡライブラリー（Amersham LIFE SCIENCE社より市販）はトキソプラズマ・ゴンディＲＨ株のtachyzoiteから分離したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから構成されている。これらのｃＤＮＡライブラリーに対してヒトのHSP70ＤＮＡを放射性核種である（３２Ｐ）で標識したプローブ（ＡＴＣＣ受託番号５７４９４ヒトｇＤＮＡ由来）を用いてクロスハイブリダイゼーション法によってヒトHSP70遺伝子領域と特異的に反応するトキソプラズマ・ゴンディ遺伝子のスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション時に使用したハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファーの各組成及び反応温度は次の通りであった。すなわち、３×ＳＳＣ、５×デンハート液、５０ｍＭトリスベース（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ及び６０℃で変性した２０μｇ／μｌのサケ精子を各々添加してハイブリダイゼーションに用いた。また、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを各々添加し、各々６０℃で反応及び洗浄を行った。この方法によって１×１０５個のｃＤＮＡクローンからヒトHSP70ＤＮＡプローブに対して特異的に反応する１５クローンを取得した。
【００２９】
また、これらの１５クローンの内最もｃＤＮＡのサイズが大きいｐＴＨ１４クローンをクローニングベクターpBluescript SKII(+)(Stratagene社製）のマルチクローニングサイト内の制限酵素サイトＢａｍＨＩ内に挿入し、クローン化した。
【００３０】
(2)  クローン化ＤＮＡ：ｐＴＨ１４の塩基配列の決定
塩基配列の決定は、ジェネティックアナライザー３１０（パーキンエルマー社製）を使用して行った。この際、シークエンスプライマーの標識には、サイクルシークエンスキットＦＳ（パーキンエルマー社製）を使用しダイターミネーター法により実施した。また、シークエンシングに際しては、合計１２個のプライマーを合成し（パーキンエルマー社  ＡＢＩ ＤＮＡシンセサイザー ３９１型）プライマーウォーキングによるシークエンシングに供試した。決定された塩基配列を、これがコードする推定アミノ酸配列とともに配列番号１に示す。
【００３１】
(3)  塩基配列のデータ解析
遺伝子塩基配列及びアミノ酸配列の解析は、Genetyx-Mac software(
Software development)を用いて行った。
【００３２】
(4)    組換えトキソプラズマ・ゴンディHSP70蛋白質の発現と精製
(i)発現ベクターの構築
発現ベクターを構築する際には、ｐＴＨ１４クローンを鋳型としてＰＣＲ法を用いてトキソプラズマ・ゴンディHSP70を増幅し、発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（米国Novagen社より市販）の制限酵素サイトＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ内に再クローニングした。この際、５’末端の転写開始コドンを設定プライマー内から除外する事で削除した。この際目的領域を増幅する為に使用したプライマーを以下に示す。
【００３３】
TH: 5'-cgggatccttaaccgagagagagaggcgc-3'
T7: 5'-catctcgagctggagacagctggtggt-3'
【００３４】
(ii)目的遺伝子の発現及び発現蛋白質の精製
トキソプラズマ・ゴンディHSP70蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクター ｐＥＴ１５ｂで形質転換した宿主細胞 Escherichia coli BL21を培養して目的遺伝子の発現を行った。その際、培養液としてＬＢ培地（ＢＩＯ １０１社製）を使用し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／μｌになる様に添加した。また、培養温度は３７℃で実施した。更に、蛋白質の発現は終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（ナカライ タスク社製）を添加し、３時間誘導した。
【００３５】
(iii)発現蛋白質の回収及び精製
５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに発現抗原を浮遊させ、超音波破砕装置（オリンパス社製）によって２００Ｗ、５分、０℃の条件で細胞を破砕した。次に、これらの細胞破砕物を除外する為に１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃の条件で遠心沈殿した。
【００３６】
次に、細胞破砕物を結合バッファ中（６０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）でホモジナイズした。遠心沈殿後の上清をニッケルキレートカラム精製の為にProbond column(Invitrogen、San Diego、CA)に１０ｍｌアプライした。次に、Probond columnを洗浄バッファー（６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）４ｍｌで２回洗浄した。
【００３７】
そして最終的にカラムに結合した精製発現蛋白質は、溶出バッファー（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）５ｍｌを用いて溶出した。これらの蛋白質は、セントリプレップ−３０（アミコン社製）濃縮器を用いて遠心濃縮した。その結果、これらの組換え蛋白質の収量は、１Ｌの培養で約１ｍｇであった。更に、これらの精製済み発現蛋白質の精製度は、クマシーブリリアントブルー蛋白質染色で７６ＫＤａ，４６ＫＤａ，３１ＫＤａの三本のメジャーなバンドとして確認出来た。
【００３８】
rTgHSP70の注射
１μg、１０μg若しくは１００μgのrTgHSP70又は100μgのベクター対照タンパクをNZBW F1マウスに月齢２ヶ月から２週間毎に腹腔内注射した。注射液の溶媒は、生理食塩水であり、１回当りの注射液の体積は、0.2ｍｌであった。
【００３９】
統計処理
平均値間の差は、独立スチューデントt検定により解析した。Ｐ値が0.05未満の場合に有意差ありとした。
【００４０】
結果
NZBW F1マウスにおける生存率及び蛋白尿に対するトキソプラズマ・ゴンディ感染の効果
図１Ａに示すように、非感染NZBW F1マウスは、月齢７ヶ月の時から死亡し始め、月齢１０ヶ月以内に１００％のマウスが死亡した。逆に、トキソプラズマ・ゴンディに感染したNZBW F1マウスは、月齢９ヶ月時に１００％生存しており、月齢１０ヶ月以内に５％が死亡した。トキソプラズマ・ゴンディ非感染のNZBW F1マウスでは、蛋白尿の発病率が月齢５ヶ月から徐々に増大し（図１Ｂ）、月齢７ヶ月から急に増大した。トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスでは、月齢７ヶ月時に蛋白尿は検出されなかったが、月齢7.5ヶ月から低い発病率がわずかに増大した。なお、図１において、Ａは、非感染NZBW F1マウス（○）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス（●）における累積死亡率を示す。Ｂは、非感染NZBW F1マウス（○）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス（●）における蛋白尿の発生率を示す。
【００４１】
トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおける糸球体腎炎の発症抑制
光学顕微鏡による観察の結果、非感染NZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月時に糸球体における顕著な血管間膜細胞の増殖及び血管間膜マトリックスの増大が起きた。いくつかの症例では、ループ状病変、梗塞、半月体形成及び糸球体小房(glomerular tuft)のボーマン嚢への接着が観察された（グレード４＋）。これに対し、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスでは、これらの変化は、より顕著ではなかった（グレード２）。非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおけるループス腎炎の発症を検証するために、IgM、IgG及びC3の糸球体中の沈着を調べた。トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月の時点で、糸球体におけるIgM、IgG及びC3の沈着が、非感染マウスに比べて抑制されていた。これらの知見により、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月時において、糸球体腎炎の緩和されていることが確認された。
【００４２】
NZBW F1マウスにおける、抗１本鎖DNA抗体及び抗２本鎖DNA抗体の形成に対するトキソプラズマ・ゴンディ感染の効果
NZBマウスはトキソプラズマ・ゴンディ感染３週間後に１００％死亡し、NZWマウスはトキソプラズマ・ゴンディ感染後１０ヶ月を超えても１００％生存したが、ループス腎炎に罹りやすい(lupus-prone)NZBW F1マウスは、トキソプラズマ・ゴンディ感染１０ヵ月後に９５％生存していた。非感染NZB, NZW及びNZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月時に血清中に高濃度のIgM（図２Ａ）、IgG（図２Ｂ）抗１本鎖DNA抗体が観察された。この月齢において、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZW及びNZBW F1マウスにおけるこれらの血清濃度は、非感染NZW及びNZBW F1マウスに比較して有意に低かった。同様に、非感染NZB, NZW及びNZBW F1マウスでは、血清中のIgM（図２Ｃ）及びIgG（図２Ｄ）抗２本鎖DNA抗体の濃度が高く、一方、トキソプラズマ・ゴンディ感染後のNZW及びNZBW F1マウスでは、血清中でのこれらの形成は阻害されていた。
【００４３】
トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおける、IgG1、IgG2a及びIgG3抗２本鎖抗体生産の減少
トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおいて、抗２本鎖DNA抗体のIgGサブクラスパターンが変化するか否かを確かめるために、月齢２ヶ月の時にトキソプラズマ・ゴンディに感染させたNZBW F1マウス及び非感染NZBW F1マウスから月齢９ヶ月の時に血清を採取して調べた。IgG2b抗２本鎖抗体の血清濃度は非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス間で同様な範囲にあったが（図３Ｃ）、IgG1（図３Ａ）、IgG2a（図３Ｂ）及びIgG3（図３Ｄ）の濃度は、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスの方が低く、特にIgG2a及びIgG3の形成は、有意に低かった。
【００４４】
トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおける抗HSP70自己抗体の形成
B6, BALB/c, NZW及びNZBW F1マウスにおける、トキソプラズマ・ゴンディ感染９週間後の抗TgHSP70 IgM抗体の濃度は、有意に増加していた（図４Ａ）。同様に、B6, BALB/c, NZW及びNZBW F1マウスにおける、トキソプラズマ・ゴンディ感染９週間後の抗TgHSP70 IgG抗体の濃度は、有意に増加していた。トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスの血清中の抗TgHSP70 IgG抗体の濃度は、トキソプラズマ・ゴンディ感染B6, BALB/c, NZWマウスにおける濃度よりも有意に高かった（図４Ｂ）。B6, BALB/c, NZB, NZW及びNZBW F1マウスの血清中の抗HSP70 IgM（図４Ｃ）及び抗HSP70 IgG（図４Ｄ）自己抗体の濃度を、トキソプラズマ・ゴンディ感染９週間後に測定した。抗HSP70 IgM自己抗体及び抗HSP70 IgG自己抗体の血清濃度は、感染後、NZBW F1マウス及び対照系統において増加していた。NZBW F1マウスの血清中の抗HSP70 IgG自己抗体の濃度は、トキソプラズマ・ゴンディ感染９週間後の対照マウスにおける濃度よりも有意に高かった。
【００４５】
非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスからの脾細胞及びPECs中の細胞内サイトカイン発現
NZBW F1マウスのTh1及びTh2サブセットにおけるトキソプラズマ・ゴンディ感染の影響を調べるために、月齢２ヶ月のNZBW F1マウストキソプラズマ・ゴンディを経口感染させた。月齢９ヶ月の非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスからの脾細胞及びPECs中におけるIL-10, IL-4, IFN-γ及びIL-12の発現を観察した（図５）。非感染NZBW F1マウスの脾臓中では、IL-10及びIFN-γの高レベルの発現が観察されたが、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス中のそれらの発現は有意に減少していた。非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスの脾細胞中のIL-4の発現は、それぞれ低い及び変化なしであった。非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスのPECs中ではIL-10及びIL-4の低い発現が観察された。非感染NZBW F1マウスのPECs中では、IFN-γが高レベルに発現していたが、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスのPECs中では顕著に低下していた。この研究において、月齢９ヶ月の非感染及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスのPECsのいずれにおいてもIL-12の発現は検出されなかった。
【００４６】
NZBW F1マウスの生存例津及び蛋白尿に対するTgHSP70注射の効果
図６．１に示すように、ベクター注射NZBW F1マウス（比較例）は、月齢８ヶ月で死亡し始め、月齢１０ヶ月で100％死亡した。一方、100μgのTgHSP70を注射したNZBW F1マウスでは、100％のマウスが月齢１３ヶ月を超えて生存した。１μgのTgHSP70を注射したNZBW F1マウスは月齢12ヶ月までに100％死亡し、10μgのTgHSP70を死亡したマウスでは、40％が月齢10ヶ月までに死亡した。
【００４７】
ベクターを注射したNZBW F1マウスにおける蛋白尿の発生率は、月齢７ヶ月から徐々に増加し、8ヶ月から急に増加した。100μgのTgHSP70を注射したNZBW F1マウスでは、月齢11ヶ月までに蛋白尿は検出されず、月齢13ヶ月までに20％のマウスが蛋白尿を示した。1μgのTgHSP70を注射したマウスでは、月齢11ヶ月までに100％のマウスが蛋白尿を発生し、10μgのTgHSP70を注射したマウスでは、月齢13ヶ月までに60％のマウスが蛋白尿を発生した。これらの結果に従い、100μgのベクター又はTgHSP70を注射した実験群についてさらに比較のための実験を行った。
【００４８】
TgHSP70を注射したNZBW F1マウスにおける糸球体腎炎の発症の抑制
光学顕微鏡による観察の結果、ベクターを注射したNZBW F1マウスでは、月齢9ヶ月において、糸球体毛細管壁の肥厚を伴う顕著な血管間膜細胞の増殖及び糸球体中の血管間膜マトリックスの増大が起き、その結果、毛細管腔の閉塞が起きた。いくつかの症例では、ループ状病変、梗塞、半月体形成及び糸球体小房(glomerular tuft)のボーマン嚢への接着が観察された（グレード４＋）。これに対し、100μgのTgHSP70を注射したNZBW F1マウスでは、これらの変化は、より顕著ではなかった（グレード２）。ベクター及びTgHSP70注射NZBW F1マウスにおけるループス腎炎の発症を検証するために、IgM、IgG及びC3の糸球体中の沈着を調べた。TgHSP70を注射したNZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月の時点で、糸球体におけるIgM、IgG及びC3の沈着が、ベクター注射マウスに比べて抑制されていた。これらの知見により、TgHSP70注射NZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月時において、糸球体腎炎の緩和されていることが確認された。
【００４９】
NZBW F1マウスにおける、抗１本鎖DNA抗体及び抗２本鎖DNA抗体の形成に対するTgHSP70注射の効果
100μgのTgHSP70を隔週注射したNZBW F1マウスは、注射後１０ヶ月を超えても１００％生存した。図７に示すように、ベクターを注射したNZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月時に、血清中に、無処理のNZBW F1マウスと同等の高濃度のIgM及びIgG抗１本鎖DNA抗体が観察された。この月齢において、rTgHSP70を注射したNZBW F1マウスにおけるこれらの血清濃度は、ベクター注射NZBW F1マウスに比較して有意に低かった。同様に、ベクター注射NZBW F1マウスでは、血清中のIgM及びIgG抗２本鎖DNA抗体の濃度が高く、一方、TgHSP70注射後のNZBW F1マウスでは、血清中でのこれらの形成は阻害されていた。
【００５０】
TgHSP70注射NZBW F1マウスにおける、IgG1、IgG2a及びIgG3抗２本鎖抗体生産の減少
TgHSP70注射NZBW F1マウスにおいて、抗２本鎖DNA抗体のIgGサブクラスパターンが変化するか否かを確かめるために、月齢２ヶ月の時にベクター又はTgHSP70を注射したNZBW F1マウスから月齢９ヶ月の時に血清を採取して調べた（図８）。IgG2b抗２本鎖抗体の血清濃度はベクター注射及びTgHSP70注射NZBW F1マウス間で同様な範囲にあったが、IgG1、IgG2a及びIgG3の濃度は、TgHSP70注射NZBW F1マウスの方が低く、特にIgG2a及びIgG3の形成は、有意に低かった。
【実施例２】
【００５１】
(1)  組換えベクターの作製
トキソプラズマ・ゴンディＲＨ株から常法によりＤＮＡを抽出し、これを鋳型とし、一組のプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、配列番号２に示す塩基配列を含む核酸断片を増幅した。なお、鋳型となるTgHSP70遺伝子の全長（上流及び下流の非翻訳領域を含む）は、配列番号５に示す通りである。用いたプライマーは、フォワード側がggactagtatggcggactctcctgct、リバース側がggtctagacatcccgccgggcataccである。フォワード側プライマー中、５’末端のggは、フォワード側の融解温度とリバース側の融解温度を合わせるために導入した無関係な配列であり、その下流のactagtがSpeI部位であり、その下流が配列番号１のアミノ酸配列の第１番目〜第６番目のアミノ酸をコードする領域である。リバース側プライマー中、５’末端のggは、フォワード側の融解温度とリバース側の融解温度を合わせるために導入した無関係な配列であり、その下流のtctagaがXbaI部位であり、その下流が配列番号１のアミノ酸配列の第６４７番目〜第６４２番目のアミノ酸をコードする領域に対応する領域である。したがって、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行うと、配列番号２で示される塩基配列の全長の両端に、それぞれ、上記したggと制限酵素部位（５’側がSpeI部位、３’側がXbaI)が連結された核酸断片が増幅される。なお、ＰＣＲは、市販のキット及び装置を用いてマニュアル通りに行い、熱的条件は、94℃、2.5分間の変性工程、60℃、5分間のアニーリング工程、７２℃、2分間の伸長工程から成るサイクルを38回繰り返すことにより行った。増幅断片を、制限酵素SpeI及びXbaIでNEバッファー中で消化し、一方、上記した公知の哺乳動物用ベクターであるpME18-FL3も制限酵素SpeI及びXbaIで消化し、これらを市販のＤＮＡライゲーションキット(TaKaRa DNAライゲーションキットVer 1. Code No. 6021)を用いて連結することにより、pME18-FL3のSpeI-XbaI間に、制限酵素処理後の上記増幅断片を挿入し、本発明の組換えベクターの好ましい１例のである環状プラスミドを得た。この環状プラスミド中のTgHSP70の塩基配列を、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit (米国カリフォルニア州Foster CityのApplied Biosystems社から市販）を用いて確認した。また、比較のため、トキソプラズマ・ゴンディ由来の遺伝子を含まないpME18-FL3も後述の実験に供した。
【００５２】
(2)  組換えベクターの投与
50μg／マウスの組換えベクターを含む100μlの蒸留水を、NZBW F1マウスに腹腔内注射した。月齢２ヶ月のマウスに最初の腹腔内注射を行い、その後１ヶ月毎に同じ注射液を腹腔内注射した。マウスは１群１０匹であった。
【００５３】
(3)  結果
実施例１と同様にして、生存率及び蛋白尿の発病率を経時的に調べた。結果をそれぞれ図１０．１及び図１０．２に示す。図１０．１及び図１０．２中、●は、本発明の組換えベクターを投与した群、白丸は対照としてTgHSP70遺伝子を含まないpME18-FL3ベクターを投与した群についての結果を示す。
【００５４】
図１０．１  に示すように、ベクター注射したNZBW F1マウスは月齢７ヶ月の時から死亡し始め、月齢１０ヶ月以内に１００％のマウスが死亡した。逆に、TgHSP70遺伝子含有組換えベクターを注射したNZBW F1マウスは月齢１０ヶ月に１００％生存しており、月齢１１ヶ月以内に１０％が死亡した。ベクター遺伝子注射NZBW F1マウスでは、蛋白尿の発病率が月齢５ヶ月から徐々に増大し（図１０．２）月齢７ヶ月から急に増大した。TgHSP70遺伝子注射NZBW F1マウスでは月齢７ヶ月時には蛋白尿が検出されなかったが、月齢８ヶ月から低い発病率が認められ、以後わずかに増大した。
【００５５】
一方、顕微鏡観察の結果、対照のベクター遺伝子を注射したNZBW F1マウスでは、月齢９ヶ月でグレード４＋の糸球体の病理所見がみられたが、TgHSP70遺伝子を注射したNZB F1マウスではグレード２で著名な病変は見られず、月齢９ヶ月時において、TgHSP70遺伝子注射による糸球体腎炎が緩和されていることが確認された。
【００５６】
さらに、実施例１と同様にして、TgHSP70遺伝子を注射したNZB F1マウス及び対照ベクターを注射したマウスの血清中の抗２本鎖DNA IgG1, IgG2a及びIgG3抗体の濃度を測定した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、TgHSP70遺伝子注射NZBW F1マウスでは血清中のIgG1, IgG2a及びIgG3抗２本鎖DNA抗体産生の減少が見られた。しかし、IgG2b抗２本鎖DNA抗体の血清濃度はベクター遺伝子注射マウスとTgHSP70遺伝子注射マウスとの間で同様な範囲であった。
【００５７】
なお、TgHSP70遺伝子注射マウスでは月齢１０ヶ月で肝機能（生化学的、病理学的）に異常をきたす副作用は認めらなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の自己免疫性腎障害治療又は予防剤並びに組換えベクターは、全身性エリテマトーデスのような自己免疫性腎障害の治療又は予防に効果的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】NZBW F1マウスにおける生存率及び蛋白尿に対するトキソプラズマ・ゴンディ感染の効果を示す。Ａは、非感染NZBW F1マウス（○）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス（●）における累積死亡率を示す。Ｂは、非感染NZBW F1マウス（○）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス（●）における蛋白尿の発生率を示す。非感染NZBW F1マウスは１２匹、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスは２０匹用いた。
【図２】非感染（白抜き）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染（黒塗り）NZBW F1マウス並びに他の対照系統の血清中の抗１本鎖抗体及び抗２本鎖抗体量を測定したELISAにおける吸光度を示す。Ａは、IgM１本鎖DNA抗体、Ｂは、IgG１本鎖DNA抗体、ＣはIgM２本鎖DNA抗体、Ｄは、IgG２本鎖DNA抗体についての結果を示す。12匹の非感染マウス及び２０匹のトキソプラズマ・ゴンディ感染マウスの平均+SDを示す。*,P<0.05; **,P<0.01（非感染マウスの血清に対して）、nd,データなし
【図３】月齢９ヶ月における非感染（○）及び感染（●）NZBW F1マウスの血清中の抗２本鎖抗体IgGサブクラスの量を測定したELISAにおける吸光度を示す。ＡはIgG1、ＢはIgG2a、ＣはIgG2b、ＤはIgG3についての結果を示す。一群６匹のマウスを用いた。水平な線は各群の平均を示す。*,P<0.05; **,P<0.01（非感染マウスの血清に対して）。
【図４】トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウスにおける抗HSP70自己抗体量を測定したELISAにおける吸光度を示す。Ａ及びＢは、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス及び他の対照系統中で生成した抗TgHSP70抗体のアイソタイプ特異性を示す。Ａは抗TgHSP70 IgM抗体の測定結果、ＢはTgHSP70 IgG抗体の測定結果を示す。横軸に示す「2週間」及び「９週間」は、測定時におけるトキソプラズマ・ゴンディ感染からの期間を示す。Ｃ及びＤは、トキソプラズマ・ゴンディ感染NZBW F1マウス及び他の対照系統中で生成した抗HSP70抗体のアイソタイプ特異性を示す。Ｃは抗HSP70 IgM抗体の測定結果、ＤはTgHSP70 IgG抗体の測定結果を示す。横軸に示す「2週間」及び「９週間」は、測定時におけるトキソプラズマ・ゴンディ感染からの期間を示す。データは、別々に行った３回の実験に用いた３匹から５匹の平均+2SDを示す。*,P<0.05（他の対照系統の血清と比較して）、nd,データなし。
【図５】非感染（点線）及びトキソプラズマ・ゴンディ感染（太線）NZBW F1マウスからの脾細胞及びPECs中のIL-10, IL-4, IFN-γ及びIL-12の細胞内発現を調べたFACS分析の結果を示す。細線は、非特異的対照抗体を用いたバックグランドの結合を示す。３回の独立した実験で得られた代表的な結果を示す。
【図６．１】TgHSP70投与したNZBW F1マウス及び対照としてベクター対照タンパクを投与したNZBW F1マウスの月齢と生存率との関係を示す図である。図中、●は100μgのTgHSP70を投与したマウス、▲は10μgのTgHSP70を投与したマウス、■は1μgのTgHSP70を投与したマウス、○はベクター対照タンパクを投与したマウスについての結果を示す。
【図６．２】TgHSP70投与したNZBW F1マウス及び対照としてベクター対照タンパクを投与したNZBW F1マウスの月齢と蛋白尿の発生率との関係を示す図である。図中、●は100μgのTgHSP70を投与したマウス、▲は10μgのTgHSP70を投与したマウス、■は1μgのTgHSP70を投与したマウス、○はベクター対照タンパクを投与したマウスについての結果を示す。
【図７】対照ベクタータンパク投与NZBW F1マウス（白抜き）及びTgHSP70投与NZBW F1マウス（黒塗り）NZBW F1マウスの血清中の抗１本鎖抗体及び抗２本鎖抗体量を測定したELISAにおける吸光度を示す。１群12匹の平均+SDを示す。*,P<0.05; **,P<0.01（非感染マウスの血清に対して）。
【図８】月齢９ヶ月における対照ベクタータンパク投与（□）及びTgHSP70投与（■）NZBW F1マウスの血清中の抗２本鎖抗体IgGサブクラスの量を測定したELISAにおける吸光度を示す。ＡはIgG1、ＢはIgG2a、ＣはIgG2b、ＤはIgG3についての結果を示す。一群５匹のマウスを用いた。水平な線は各群の平均を示す。*,P<0.05; **,P<0.01（対照ベクタータンパク投与マウスの血清に対して）。
【図９】本発明の実施例の組換えベクターの構築に用いたpME18-FL3ベクターの構造を示す図である。
【図１０．１】TgHSP70遺伝子を含む本発明の組換えベクター又はTgHSP70遺伝子を投与したNZBW F1マウスの生存率の経時変化を示す図である。
【図１０．２】TgHSP70遺伝子を含む本発明の組換えベクター又はTgHSP70遺伝子を投与したNZBW F1マウスの蛋白尿発生率の経時変化を示す図である。
【図１１】TgHSP70遺伝子を含む本発明の組換えベクター又はTgHSP70遺伝子を投与したNZBW F1マウスの血清中の抗２本鎖DNA IgG1, IgG2a及びIgG3抗体の濃度を測定したELISAにおける吸光度の測定値を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６．１】
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【図６．２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０．１】
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【図１０．２】
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【図１１】
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【配列表】
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