(57)【要約】【課題】  アルギン酸を分解して調製したアルギン酸オリゴマーからなる新規免疫機構賦活剤及び該免疫機構賦活剤を含有してなる医薬組成物、飲食品及び飼料を提供すること。【解決手段】  海藻から抽出されたアルギン酸を、アルギン酸リアーゼで酵素分解或いは酸で加水分解し、分離、調製した構成単糖が３〜９個の重合度を持つアルギン酸オリゴマーは、高い免疫機構賦活作用を有する。本発明の免疫機構賦活剤の有効成分は、ヒト末血白血球に作用し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生誘導する。特に、マクロファージに作用し、ＴＮＦの産生放出を誘導する。本発明の免疫機構賦活剤の有効成分は、配合により、医薬組成物、機能性飲食品又は飼料として、生体における種々の感染症に対する抵抗性を向上するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸を酵素分解又は酸加水分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるオリゴマー又は該オリゴマーの２又はそれ以上の混合物を有効成分とする免疫機構賦活剤。
【請求項２】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤。
【請求項３】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した７〜９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤。
【請求項４】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項３記載の免疫機構賦活剤。
【請求項５】
アルギン酸リアーゼが、シュードアルテロモナス属に属する微生物の生産するアルギン酸分解酵素であることを特徴とする請求項１〜４記載の免疫機構賦活剤。
【請求項６】
シュードアルテロモナス属に属する微生物が、シュードアルテロモナス  ｓｐ．Ｎｏ．２７２株であることを特徴とする請求項５記載の免疫機構賦活剤。
【請求項７】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸を酸加水分解して調製した３〜５個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤。
【請求項８】
アルギン酸オリゴマーが、海藻から抽出されたアルギン酸を分解したオリゴマーであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の免疫機構賦活剤。
【請求項９】
海藻から抽出されたアルギン酸が、褐藻類から抽出されたアルギン酸であることを特徴とする請求項８記載の免疫機構賦活剤。
【請求項１０】
アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸を酸加水分解して分離、取得したポリマンヌロン酸又はポリグルロン酸を、アルギン酸リアーゼで酵素分解するか或いは酸加水分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるオリゴマーであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の免疫機構賦活剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる飲食品。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルギン酸を酵素分解又は酸加水分解して調製したアルギン酸オリゴマーからなる免疫機構賦活剤及び該免疫機構賦活剤を含有してなる医薬組成物、飲食品、及び飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルギン酸は、褐藻の細胞壁および細胞間に充填物質として存在する多糖質で、褐藻重量のほぼ３０％を占めている。褐藻由来のアルギン酸は広く利用され、２種類のウロン酸から構成されている。アルギン酸を構成するウロン酸は、α−Ｌ−グルロン酸（図１．ａ：以下Ｇと表記）とβ−Ｄ−マンヌロン酸（図１．ｂ：以下Ｍと表記）であり、これらが直鎖状に不規則に結合している。アルギン酸分子中には、Ｇが連なったポリ−α−Ｌ−グルロン酸（Poly-α-L-guluronate：以下ＰＧと表記）部位（図１．ｃ）、Ｍが連なったポリ−β−Ｄ−マンヌロン酸（Poly-β-D-mannuronate：以下ＰＭと表記）部位（図１．ｄ）、及びＧとＭがランダムに連なった部位（ＭＧランダム）があり、これら３つのドメインが混在している。ＧとＭの混成比、アルギン酸そのものの分子量は、褐藻類の生息場所、季節、藻体部位によって様々であり、未だ詳細な化学構造は解明されていない。
【０００３】
現在、海藻から抽出されたアルギン酸は良質の食物繊維で、食品の粘着剤や増量剤として利用されている。利用は食品のみならず、医薬品、化粧品、印刷、染色、歯科材料、水処理と多岐にわたっている。しかし、その利用はほとんどが高分子であり、オリゴマーとしての利用は、まだ稀であり、未だ実用化は進んでいない。
【０００４】
近年、多糖類の研究分野では、難消化性多糖質を酵素分解して可溶性のオリゴ糖や機能性オリゴ糖を調製する研究が行われている。例えば、フラクトオリゴ糖やキチン・キトサンオリゴ糖などの有用なオリゴ糖の多数の研究報告がなされている。海藻多糖の多くは難消化性であることから海藻多糖を分解して、機能性オリゴ糖の原料とすることも考えられている。アルギン酸についてもオリゴ糖での利用が考えられており、その利用のために、アルギン酸の分解方法や分解に用いる微生物や酵素等の多くの報告がなされている。
【０００５】
例えば、アルギン酸の分解方法としては、微生物の産生するアルギン酸分解酵素（アルギン酸リアーゼ）を用いて、アルギン酸を分解する方法について報告されており（日本水産学雑誌、55(4)、709-713,1989）、該アルギン酸リアーゼを産生する微生物として、アルテロモナスｓｐ．Ｈ４（日本水産学雑誌、58(3)、521-527,1992）が、シュウドモナスｓｐ．ＯＳ−ＡＬＧ−９（J. Ferment. & Bioeng.,72(2),74-78,1991）が、フラボバクテリウムｓｐ．（J. Ferment. & Bioeng.,72(3),152-157,1991）,バチルス・サーキュランス(Appl. Environ. Microbiol.,47(4),704-709,1984)、クレブシラ・アロジーナス（Arch.Microbiol.,152,302-308,1989）等がそれぞれ報告されている。最近、本発明者らによって、アルテロモナスｓｐ．菌株Ｎｏ．２７２からのアルギン酸リアーゼの分離精製方法についても報告されている（Biosci. Biotechnol. Biochem.,65,133-142,2001）。
【０００６】
近年、アルギン酸オリゴマーの取得に関して、アルギン酸の分解方法や分解に用いる微生物や酵素等の多くの開示がなされている。例えば、アルギン酸分解酵素を生産するシュウドモナス属に属する微生物をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開昭５９−１４３５９７号公報）、アルギン酸分解酵素を生産するアルテロモナス属に属する微生物をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開昭６３−２１４１９２号公報）、アルギン酸分解能を有するフラボバクテリウム属菌、エンテロバクター属菌をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開平３−９４６７５号公報）、アルギン酸分解能を有するフラボバクテリウム属の細菌をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（「日本農芸化学会誌６５巻臨時増刊号」社団法人日本農芸化学会発行、1991.2.15；特開平５−１５３８７号公報）、が開示されている。
【０００７】
また、アルテロモナス属に属する微生物が産生する多糖類分解酵素（アルギン酸リアーゼ）をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開平５−３０４９７４号公報；特開平６−２３７７８３号公報）、フラボバクテリウム・ＳＰ．ＯＴＣ−６の産生するアルギン酸リアーゼを用いて、アルギン酸を分解する方法が（特開平６−１９７７６０号公報；特開２００１−１６１３５８号公報）、アルギン酸分解酵素を生産するバチルス属に属する微生物をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開平９−９９６２号公報）、アルテロモナス属に属する微生物が生産したアルギン酸分解酵素をアルギン酸に作用させて、アルギン酸を分解する方法が（特開２０００−３４２２７８号公報）、開示されている。
【０００８】
更に、酸を用いてアルギン酸を分解する方法として、例えば、リン酸を用いてアルギン酸を分解し、アルギン酸が持つ機能を保持したまま溶解性等を良くする方法が（特開平１１−８０２０４号公報）、有機塩基によって中和し溶解させたアルギン酸溶液を、酸加水分解に付し、その後ポリグルロン酸の沈殿を酸性下選択的に沈殿させて、重合度が２０未満の低重合度で、かつマンヌロン酸混入物を含まないポリグルロン酸を製造する方法が（特開２０００−３４３０２号公報）開示されている。
【０００９】
これらのアルギン酸オリゴマーの利用については、アルギン酸分解物を調製する目的自体が、アルギン酸を使用する場合の物性の改善、例えば粘度の低減や可溶化に向けられており、その多くがアルギン酸としての利用の域を出ないものが殆どである。アルギン酸オリゴマーの利用に関連する報告としては、例えば、アルギン酸の分解物が植物の生長促進作用を有する報告（J. Ferment. Bioeng.,75,68-70,1993;Biosci. Biotechnol. Biochem.,58,202-203,1994；Carbohydrate Research, 258,187-197,1994）があり、該分解物を植物の生長促進に用いることの開示もなされている（特開昭６３−２１４１２０号公報）。また、
アルギン酸分解物がスキムミルク中のビフィズス菌の生長を促進することの報告もなされている（Biosci. Biotechnol. Biochem.,56,355-356,1992）。更に、アルギン酸のオリゴマーを食物繊維として飲料等に用いることについての開示もなされている（特開平２−３０３４６８号公報、特開平２−３１２５４２号公報）。また、アルギン酸カルシウムオリゴ糖を血圧上昇抑制に用いるもの（特開平５−３０４９７４号公報）、或いは、アルギン酸カリウムオリゴ糖を血圧上昇抑制に用いるもの（特開平６−２３７７８３号公報）、の開示がなされている。
【００１０】
近年、アルギン酸の生理活性に関して、アルギン酸のある試料が、ヒトの単球を刺激してＴＮＦ−α（tumor necrosis factor-alpha）、インターロイキン−６（interleukin-6）、及びインターロイキン−１β（interleukin-1β）を生成するという報告がなされており（J. Immunother., 10, 286-291, 1991）、同じくマンヌロン酸残基を多きな割合で含有するアルギン酸が、マクロファージによるサイトカインの分泌のインデュ−サーとしての可能性があるとの報告がなされている（Infect. Immun., 61, 1917-1925, 1993）。しかしながら、精製されたＰＧやＰＭは、ヒトの単核細胞には何の影響もなく、一方で、高分子アルギン酸によるマクロフアージからのＴＮＦ放出誘導作用は分子量５万以上であることが必要との研究報告があり、その実体は明らかにされていない。
【００１１】
以上の報告に見られるように、アルギン酸オリゴマーの生理活性やその利用に関しては、まだ多くのものは知られていない。
【特許文献１】特開昭５９−１４３５９７号公報
【特許文献２】特開昭６３−２１４１２０号公報
【特許文献３】特開昭６３−２１４１９２号公報
【特許文献４】特開平２−３０３４６８号公報
【特許文献５】特開平２−３１２５４２号公報
【特許文献６】特開平３−９４６７５号公報
【特許文献７】特開平５−１５３８７号公報
【特許文献８】特開平５−３０４９７４号公報
【特許文献９】特開平６−１９７７６０号公報
【特許文献１０】特開平６−２３７７８３号公報
【特許文献１１】特開平９−９９６２号公報
【特許文献１２】特開平１１−８０２０４号公報
【特許文献１３】特開２０００−３４３０２号公報
【特許文献１４】特開２０００−３４２２７８号公報
【特許文献１５】特開２００１−１６１３５８号公報
【非特許文献１】日本水産学雑誌、55(4), 709-713, 1989
【非特許文献１】日本水産学雑誌、58(3), 521-527, 1992
【非特許文献２】J. Ferment. & Bioeng., 72(2), 74-78, 1991
【非特許文献３】Appl. Environ. Microbiol., 47(4), 704-709, 1984
【非特許文献４】Arch.Microbiol., 152, 302-308, 1989
【非特許文献５】Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 133-142, 2001
【非特許文献６】「日本農芸化学会誌６５巻臨時増刊号」社団法人日本農芸化学会発行、1991.2.15
【非特許文献７】J. Ferment. & Bioeng., 75, 68-70, 1993
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 202-203, 1994
【非特許文献９】Carbohydrate Research, 258, 187-197, 1994
【非特許文献１０】Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 355-356, 1992
【非特許文献１１】J. Immunother., 10, 286-291, 1991
【非特許文献１２】Infect. Immun., 61, 1917-1925, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、アルギン酸を分解して調製したアルギン酸オリゴマーからなる新規免疫機構賦活剤及び該免疫機構賦活剤を含有してなる医薬組成物、飲食品及び飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく、海藻から抽出されたアルギン酸を、アルギン酸分解酵素であるアルギン酸リアーゼで酵素分解或いは酸で加水分解し、重合度の異なるアルギン酸オリゴマーを調製し、それらの構造と活性について鋭意研究する中で、構成単糖が３〜９個の特定の重合度を持つアルギン酸オリゴマーが、高い免疫機構賦活作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明の免疫機構賦活剤の有効成分は、ヒト末血白血球に作用し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を産生誘導する。特に、マクロファージに作用し、ＴＮＦの産生放出を誘導する。本発明の免疫機構賦活剤の有効成分においては、グルロン酸オリゴマーがマンヌロン酸オリゴマーに比較して、より高い活性を示し、特に、酵素分解により調製された構成単糖９個のグルロン酸オリゴマーは、顕著な活性を有する。
【００１５】
本発明の免疫機構賦活剤の有効成分は、オリゴマーであるためアルギン酸の高粘度、不溶性の物性が改善され、経口的に体内に摂取されても効率よく吸収することができ、製剤化して医薬組成物として免疫増強に利用することができ或いは飲食品に添加して免疫能力を活性化する機能性飲食品として利用することができる。また、家畜や魚養殖における飼料に本発明のアルギン酸オリゴマーからなる免疫機構賦活剤を添加して、種々の感染症に対する抵抗性を向上するための飼料として利用することもできる。
【００１６】
すなわち具体的には本発明は、アルギン酸を酵素分解又は酸加水分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるオリゴマー又は該オリゴマーの２又はそれ以上の混合物を有効成分とする免疫機構賦活剤（請求項１）や、アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤（請求項２）や、アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した７〜９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤（請求項３）や、アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項３記載の免疫機構賦活剤（請求項４）や、アルギン酸リアーゼが、シュードアルテロモナス属に属する微生物の生産するアルギン酸分解酵素であることを特徴とする請求項１〜４記載の免疫機構賦活剤（請求項５）や、シュードアルテロモナス属に属する微生物が、シュードアルテロモナスｓｐ．Ｎｏ．２７２株であることを特徴とする請求項５記載の免疫機構賦活剤（請求項６）や、アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸を酸加水分解して調製した３〜５個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマーであることを特徴とする請求項１記載の免疫機構賦活剤（請求項７）や、アルギン酸オリゴマーが、海藻から抽出されたアルギン酸を分解したオリゴマーであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の免疫機構賦活剤（請求項８）や、海藻から抽出されたアルギン酸が、褐藻類から抽出されたアルギン酸であることを特徴とする請求項８記載の免疫機構賦活剤（請求項９）や、アルギン酸オリゴマーが、アルギン酸を酸加水分解して分離、取得したポリマンヌロン酸又はポリグルロン酸を、アルギン酸リアーゼで酵素分解するか或いは酸加水分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるオリゴマーであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の免疫機構賦活剤（請求項１０）
からなる。
【００１７】
また本発明は、請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる医薬組成物（請求項１１）や、請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる飲食品（請求項１２）や、請求項１〜１０のいずれか記載の免疫機構賦活剤を含有してなる飼料（請求項１３）からなる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の免疫機構賦活剤の有効成分であるアルギン酸オリゴマーは、マクロファージに作用し、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）の産生放出を誘導し、生体の免疫機能を高める。該免疫機構賦活剤を、医薬組成物、飲食品、及び飼料に添加して摂取することにより、生体の免疫学的防機能を活性化させ、種々の感染症や腫瘍に対する抵抗性の向上を図ることができる。本発明の免疫機構賦活剤の有効成分は、オリゴマーであるためアルギン酸の高粘度、不溶性の物性が改善され、経口的に体内に摂取されても効率よく吸収することができ、製剤化して医薬組成物或いは飲食品に添加して免疫能力を活性化する機能性飲食品として利用することができる。また、家畜や魚養殖における飼料に本発明のアルギン酸オリゴマーからなる免疫機構賦活剤を添加して、種々の感染症に対する抵抗性を向上するための飼料として利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、アルギン酸を酵素分解又は酸加水分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるオリゴマー又は該オリゴマーの混合物を有効成分とする免疫機構賦活剤よりなる。本発明のアルギン酸オリゴマーの調製に用いるアルギン酸は、コンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻類の海藻から抽出されたアルギン酸を用いることができる。既に、調製された市販のアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）を用いることができる。
【００２０】
アルギン酸を酵素分解又は酸加水分解し、アルギン酸オリゴマーを調製するに際して、予めアルギン酸よりＰＧ（ポリグルロン酸）及びＰＭ（ポリマンヌロン酸）を分離、精製しておくことができる。アルギン酸よりＰＧ及びＰＭを分離、精製するには、Ｈａｕｇらの方法（不均一酸性加水分解法）に準じて行うことができる（Acta Chem. Scand., 20, 183-190, 1966; Acta Chem. Scand., 21, 691-704, 1967）。例えば、アルギン酸（アルギン酸ナトリウム）を、０．３Ｍ塩酸塩溶液に懸濁し、１００℃で加熱した後、固形物を遠心分離又は濾過によって酸性溶液から分離する。得られた固形物（沈殿物）及び懸濁液をそれぞれ希水酸化ナトリウム溶液で中和し、可溶化した後、エタノールを加えて、ＰＧ及びＰＭをそれぞれ沈殿させる。
【００２１】
アルギン酸を分解して、アルギン酸オリゴマーを調製するには、酵素分解又は酸加水分解により行う。用いる酵素としては、既に公知のアルギン酸リアーゼを用いることができる。該酵素として、本発明者らが精製、分離したシュードアルテロモナスｓｐ。Ｎｏ．２７２株の産生するアルギン酸リアーゼ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 133-142, 2001）を特に好ましく用いることができる。該精製酵素を用いて、ＰＧ或いはＰＭを分解することにより、不飽和結合のウロン酸を非還元末端とするオリゴマーを生成する。酸でアルギン酸を分解する場合には、塩酸、リン酸のような鉱酸等を用いることができるが、塩酸等を特に好ましい酸として挙げることができる。
【００２２】
生成されたアルギン酸オリゴマーを、それぞれの構成単糖の数のものに分離し、取得するには、ゲル濾過や各種クロマトグラフィー等、公知の分離手段を用いることができる。本発明においては、その活性から、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した３〜９個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマー、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した７〜９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマー、及び、アルギン酸を酸加水分解分解して調製した３〜５個の構成単糖からなるマンヌロン酸オリゴマーを調製することが好ましい。特に、アルギン酸をアルギン酸リアーゼで酵素分解して調製した９個の構成単糖からなるグルロン酸オリゴマーは、高い活性を有する。
【００２３】
本発明の免疫機構賦活剤を添加して医薬組成物として製剤化し、免疫機構賦活のために投与するには、本発明の有効成分であるグルロン酸オリゴマー及びその２以上の混合物を、生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、免疫機構賦活剤として用いることができる。
【００２４】
本発明の有効成分は低分子化されており、可溶化されていて、経口的に摂取することが可能である。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。また、非経口的に摂取することも可能である。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。
【００２５】
本発明の免疫機構賦活剤は、飲食品に配合し、免疫機構賦活機能を有する機能性飲食品として用いることができる。本発明の免疫機構賦活剤を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」としては、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、有効成分が摂取されるような含有量を適宜定めることができる。本発明においては、本発明の免疫機構賦活剤の有効成分をそのまま、或いは前記のような製剤の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明の飲食品は、本発明の有効成分を適宜基材と配合して、そのまま飲食品として調製したもの、或いは、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、更には、一般の飲食品へ添加、配合したもの等、種々の利用形態を採ることができる。
【００２６】
本発明における食品としては、免疫機構賦活機能を持たせた、健康食品、機能性食品、或いは病者用食品として調製することができる。また、特に、食品の形態に限定されるものではなく、免疫機構賦活機能を持たせた飲料の形態であってもよい。本発明による有効成分は、免疫機構賦活作用を有するため、日常摂取する飲食品等に本発明の有効成分を配合することにより、継続的に摂取可能な、免疫機構賦活機能を併せ持つ飲食品として提供することができる。
【００２７】
本発明の免疫機構賦活剤を添加して免疫機構賦活機能を付与する飲食品としては、具体的には、菓子類、麺類、練り製品、畜肉製品、調味食品類、乳製品、各種総菜、各種粉末飲食品、及びアルコール飲料や非アルコール飲料のような種々の飲料等の各種飲食品を挙げることができる。
【００２８】
本発明の免疫機構賦活剤は、家畜や魚養殖における飼料に配合して、免疫機構賦活機能を付与することにより、種々の感染症に対する抵抗性を向上するための飼料として利用することができる。本発明の有効成分を飼料に添加するに際しては、本発明の免疫機構賦活剤の有効成分をそのまま、或いは適宜の補助剤と配合して、飼料の調製段階で飼料に配合することができる。又は、本発明の有効成分を担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、飼料の給餌時に飼料に混合して、用いることができる。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（実験に用いる細胞の培養）
１．ＲＡＷ２６４．７細胞
マウス単球由来細胞株（マウスマクロファージ系株化細胞）ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ７１）細胞を培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞の培地は、ＲＰＭＩ−１６４０培地に抗生物質（BenzylPenicilin Potassium, Streptomycin Sulfate）を１００ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、５６℃、３０分間熱処理をした牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％（ｖ／ｖ）添加したものを生育培地として用いた。
【００３１】
細胞の培養は、セラムチューブ中の細胞懸濁液（１０％ＤＭＳＯ）を含む細胞の生育培地の中で、−８０℃に保存されている細胞）を融解し、１５ｍｌチューブに移し、これに生育培地を加え、室温で２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心を行い、その上清を除き、約５ｍｌの生育培地を加え細胞を分散させて培養フラスコ（ファルコン社製、２５ｃｍ2プラスチックフラスコ）に移し、３７℃、５％ＣＯ2ガス培養器で培養を行った。一晩放置し、細菌などの混入がないこと、また、細胞が培養フラスコの底面に付着していることを確認して、培地交換・継代培養を行った。
【００３２】
ＲＡＷ２６４．７細胞の継代培養は、フラスコ内の生育培地を除き、０．２％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡ溶液と入れ換え、３７℃、５％ＣＯ2ガス培養器内で細胞が個々に分かれるまで静置後、フラスコ内の溶液を取り除き、再びガス培養器内で１５分ほど静置した。フラスコ底面から細胞が剥がれてきたことを確認してから、生育培地を加え、細胞を分散させ、再びガス培養器で培養を行った。
【００３３】
２．Ｌ９２９細胞
ＴＮＦα細胞障害性試験（インビトロＬ９２９アッセイ）に用いるマウス繊維芽細胞（fibrosarcoma由来の樹立細胞：ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）Ｌ９２９細胞を培養した。Ｌ９２９細胞の継代培養は、ＲＡＷ２６４．７細胞と同様の培地を用いて行った。Ｌ９２９細胞はＲＡＷ２６４．７細胞よりも剥がれやすいため、トリプシン処理時間を数秒間にして、同様の操作を行った。
【００３４】
３．細胞の保存
培養した細胞の保存は、凍結保存法を用いた。培養フラスコから細胞をとり、それを１０％ＤＭＳＯを含むGrowth Medium懸濁し、セラムチューブに移し、−８０℃で凍結した。
【実施例２】
【００３５】
（アルギン酸オリゴマーの調製）
１．ＰＧ、ＰＭの調製法
市販のアルギン酸ナトリウムより Haugらの方法（Acta. Chem. Scand., 20, 183-190, 1966）に若干の改良を加えてＰＧ、ＰＭを調製した。調製のフローチャートを図２に示す。
【００３６】
すなわち、アルギン酸（アルギン酸ナトリウム：ナカライテスク製）２０ｇを２Ｌの０．３Ｍ  ＨＣｌ溶液に懸濁し、１．５時間１００℃に加熱して部分加水分解を行った。沈殿を採取して、０．３ＭＨＣｌで洗浄した後、２５０ｍｌの水に懸濁し、希ＮａＯＨでｐＨ７に中和して水に溶解した後、凍結乾燥して、抗分別粉末を得た。該粉末５ｇを１Ｌの０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に溶解し、１Ｌの酸性水溶液（３００ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌ＋７００ｍｌの水）を加えｐＨ２．８５に調整する。沈殿したＰＧと懸濁したＰＭとを分離する。沈殿したＰＧをｐＨ２−３のＨＣｌで洗浄し、３００ｍｌの水に懸濁させ、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し溶解する。エタノール（ＰＧ／エタノール＝１／２  ｖ／ｖ）を加えて、ＰＧを沈殿させ、沈殿したＰＧをエタノールで洗浄（２回）した後、沈殿を水に溶解し、凍結乾燥によって、精製されたＰＧの粉末を得る。
【００３７】
一方、懸濁したＰＭは、ＮａＯＨでｐＨ７に調整し、エタノール（ＰＭ／エタノール＝１／２  ｖ／ｖ）を添加して、ＰＭを沈殿させる。沈殿をエタノールで洗浄（２回）した後、水に溶解し、凍結乾燥によって、精製されたＰＭの粉末を得る。
【００３８】
２．酵素消化オリゴマーの調製法
不飽和オリゴマーの調製に用いた酵素は、アルギネートリアーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）であった。これを１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で１０ｍｇ／ｍｌにした。この酵素の活性をRapid法で測定した。０．２％のＰＧ、ＰＭを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、２．０ｍｌを３７℃で１０分間予めインキュベートしておき、この基質溶液に酵素溶液を０．２ｍｌ添加して、２分間反応を行った。活性の定義は、２３５ｎｍにおける吸光度が一分間に０．１増加する酵素量を１単位（ｕｎｉｔ）とした。
【００３９】
５ｇのＰＧ、ＰＭを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍｌに融解し、酵素０．０１ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ、比活性７．２４ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を１時間半毎に５回加えた、３７℃で反応させた。このオリゴマー溶液をメンブランろ過し、予め５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で緩衝化したBio-Gel P-6カラム（８．８×９５ｃｍ）に各サンプルを供した。流速は１．３ｍｌ／ｍｉｎであった。各重合度ごとのピークをプールし、濃縮した。重合度の決定は、ブルーデキストラン２，０００とガラクツロン酸を用いて Whitaker の方法に従って行った。この操作で得られた各オリゴマーは多量のリン酸塩を含むため、水を溶出液としたゲルろ過カラムを用いて脱塩操作を行った。蒸留水で緩衝化した Bio-Gel P-2 カラム（２．５×９５ｃｍ）にリン酸塩を含む試料をかけ、流速０．２６ｍｌ／ｍｉｎで水で溶出した。リン酸塩の定量はモリブデンブルー法にて行った。リン酸塩を含まない部分のみをプールし、凍結乾燥にて乾燥標品として各オリゴマーを得た。
【００４０】
３．酸加水分解オリゴマーの調製法
酸加水分解オリゴマーの調製法は、両オリゴマーとも塩酸加水分解で行った。１％ＰＧ、ＰＭ溶液（０．１Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ４．０に調製）２００ｍｌをオートクレーブにて１２１℃でそれぞれ、８０、４０分間加水分解した。冷却後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和し、凍結乾燥で５０ｍｌに濃縮した。各ポリマー体の純度検定はＣＤスペクトルにて行った。
【００４１】
濃縮サンプルを予め５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したBio-Gel P-6カラム（８．８×９５ｃｍ）に各サンプル５０ｍｌを供した。流速１．３ｍｌ／ｍｌであった。各重合度ごとのピークをプールし、濃縮した。重合度の決定、脱塩操作、リン酸塩の定量は上記１．と同様の方法で行った。リン酸塩を含まない部分のみをプールし、凍結乾燥にて乾燥標品として各オリゴマーを得た。
【００４２】
４．ウロン酸の定量法
ウロン酸の定量は、BitterとMuirによるカルバゾール硫酸法の改良法を用いた。試薬の調製は次のように行った。
１）０．０２５％硫酸溶液
四ホウ酸ナトリウム（Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ）９．５ｇを濃硫酸１Ｌに溶かして調製した。
２）０．１２５％カルバゾール溶液
カルバゾール０．１２５ｇを１０ｍＬの蒸留エタノールに湯浴上で溶かし
て調製した。これらの試薬を使い次のように定量した。
３ｍＬの１）液を試験管にとり、氷冷し、試料溶液０．１ｍＬと水０．４ｍＬを、順次１）液状に層をなすように注意して加え、室温以上にならないように氷水で冷却しながら最初はゆっくり、次いで激しく振り混ぜた。試料溶液は含まれるウロン酸の量により水を用いて濃度を調製し、合計が０．５ｍＬになるようにした。ガラス球でふたをして沸騰浴中で１０分間加熱した後、冷水で室温まで冷却し、２）液を０．１ｍＬ加えて混合後、さらに１５分間沸騰浴中で加熱した。それを室温まで冷やし、生じた赤桃色を５３０ｎｍの吸光度で測定した。なおブランクには水を用いた。
【００４３】
５．円偏光二色性（ＣＤスペクトル）の測定法
ＣＤの測定は、円偏光二色性分散計J500A（日本分光製）を用いた。測定中は、装置内に窒素ガスを流入させ空気中の酸素の影響をできるだけさけた。また測定条件は次の通りであった。
溶媒：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
波長：１９０〜２６０ｎｍ
セル：１ｍｍ
感度：１ｍo／ｃｍ
時定数：８ｓｅｃ
走査速度：２０ｎｍ／ｍｉｎ
実験室内温度：約２０℃
【００４４】
６．リン酸の定量法
リン酸の定量にはモリブデンブルー法を用いた。試薬の調製は次のように行った。
１）モリブデン試薬
モリブデン酸アンモニウム７．５ｇを１５０ｍＬの温水に溶かし（不要物はろ過で取り除く）、冷却後５００ｍＬにした。
２）塩化第一スズ溶液
塩化第一スズ溶液（ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）２．０ｇを濃硫酸５ｍＬに溶かし着色瓶に入れ、低温室に保管した（２ヶ月以上の保存に耐えられない）。使用前８時間以内にその溶液０．１ｍＬを３３．２ｍＬの水で希釈して使用した。
３）０．０５Ｎ  ＨＣｌ
濃塩酸を０．０５Ｎに調製した。
【００４５】
これらの試薬を用い、次のように定量した。すなわち、試験管に試料溶液０．１ｍＬと水２．４ｍＬを入れ、これに３）液を加え、ｐＨ３付近に調整した（ｐＨメーターで実際に測定はしなかった）。次に１）液を０．１ｍＬ加え、振り混ぜた。これに２）液を０．５ｍＬ加えて、混和し、生じる青色を６２０ｎｍの吸光度で測定した。なおブランクは水を用いた。
【００４６】
７．結果
（アルギン酸オリゴマーの調製）
上記方法により、市販のアルギン酸ナトリウム２０ｇより、ＰＧ  ３ｇ、ＰＭ  ５ｇを得、この操作を繰り返し、実験に十分と思われる量を調製した。調製したＰＧ、ＰＭから前記酵素分解及び酸加水分解によりオリゴマーを調製し、Bio-Gel P-6によるゲルろ過から重合度の異なるオリゴマーを得た。酵素分解或いは酸加水分解オリゴマーの結果をそれぞれ図３（酵素消化）及び図４（酸加水分解）に示す。
【実施例３】
【００４７】
（アルギン酸オリゴマーの免疫機構賦活活性の測定）
調製した酵素分解或いは酸加水分解オリゴマーのそれぞれの構成単糖について、該オリゴマーの免疫機構賦活活性について測定を行った。
１．アラマブルー法
９６ｗｅｌｌプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を１ｗｅｌｌ当たり３×１０4個になるように播いた。細胞数は、血球計算版にて測定した。３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で一晩放置後、サンプルを添加し、２４時間培養した。
７００×ｇで１０分間遠心した後、上清を回収した。actinomycin D（２μｇ／ｍｌ）入りの培地で、上清を希釈し、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり３×１０4個播いたＬ９２９細胞に添加した。３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で一晩放置後、アラマブルーを１ｗｅｌｌ当たり１０μｌ加えた。
【００４８】
３時間放置後、プレートリーダーで吸光度を測定した（Ａ  ５７０〜６００ｎｍ）。なお、既知の濃度のＴＮＦをＬ９２９細胞に添加し、同様の操作を行って、ＴＮＦの検量線を作成し、それを用いて上清中のＴＮＦ量を求めた。
【００４９】
アラマブルー法とは細胞の生死を調べる方法で、アラマブルー溶液を細胞に添加し、数時間３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で静置すると、生きている細胞の場合、細胞のミトコンドリアにあるコハク酸デヒドロゲナーゼの働きによって色が変化する。その吸光度を測定することで細胞の生存率が分かる。
【００５０】
２．ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）法
ＥＬＩＳＡ用９６ｗｅｌｌプレートに滅菌ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈した一次抗体（purified rat anti-mouse TNF-α）を１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ添加した。３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で１時間静置後、wash用液（ＰＢＳ中に０．０５％のTween20を含む）で１回洗った。次に、Blocking溶液（１％ＢＳＡ、ＰＢＳ中に０．０５％のTween20を含む）を１ｗｅｌｌ当たり１００μずつ添加し、２時間３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で静置した（４℃でover nightでも可）。洗浄用液で２回洗った後、培地で５０％に希釈した試料の上清を１ｗｅｌｌ当たり１００μずつ添加した。３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で１時間静置後、洗浄用液で２回洗った。０．２５％ＢＳＡ、０．０５％ tween２０  ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈した二次抗体（anti-rabbit IgG , horseradish peroxidase linked whole antibody）を１ｗｅｌｌ当たり１００μずつ添加した。
【００５１】
３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で１時間静置後、洗浄用液で２回洗った。０．２５％  ＢＳＡ、０．０５％  tween20  ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈した酵素−抗体コンジュゲート（anti-rabbit IgG , horseradish peroxidase linked whole antibody）を１ｗｅｌｌ当たり１００μずつ添加した。３７℃、５％  ＣＯ2インキュベーター内で１時間静置後、洗浄用液で２回洗った。
TMB peroxidaseとsubstrate solution Bを同量ずつ混合した染色液を１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ添加した。２〜３分間静置し、色がほどよく発色した所でリン酸を加え、酵素反応をストップさせた。
Ａ  ４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
なお、既知の濃度のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ用プレートに添加し、同様の操作を行って、ＴＮＦ−αの検量線を作成し、サンプルのＴＮＦ−α量を求めた。
【００５３】
３．結果
（酵素分解オリゴマーのＴＮＦ−α産生放出誘導活性）
アルギン酸オリゴマーのＲＡＷ  ２６４．７に対するＴＮＦ−αの産生放出誘導について実験を行った。アルギン酸オリゴマーによって誘導されたＴＮＦ−αはＥＬＩＳＡ法によって定量した。結果を図５に示す。
【００５４】
図５中、縦軸は誘導されたＴＮＦ−α量で、横軸は重合度３〜９のオリゴマーと酵素未消化の重合度２０〜２４のポリマーである。グルロン酸オリゴマーではＧ７、Ｇ８、Ｇ９で強い活性が見られた。マンヌロン酸オリゴマーでは全てのオリゴマーで活性が認められ、特にＭ３、Ｍ７、Ｍ９において強い活性が見られた。特に、グルロン酸オリゴマーのＧ９では、高い活性が見られた。
（酸加水分解オリゴマーのＴＮＦ−α産生放出誘導活性）
アルギン酸分解酵素は全てリアーゼであるため、生成産物の非還元末端に二重結合を有する。一方、酸加水分解によって得られたオリゴマーは二重結合は有しない。これらの構造の違いがＴＮＦ−αの産生放出誘導に与える影響を調べるために現在得られているサンプルを用いて実験を行った。結果を図６に示す。
【００５５】
図６中、縦軸は酸加水分解オリゴマーによって誘導されたＴＮＦ−α量で、横軸は重合度の異なるオリゴマーである。マンヌロン酸オリゴマーでは、Ｍ３及びＭ５の範囲のもので高い活性が見られた。グルロン酸オリゴマーでは活性が確認されなかった。
（ＬＰＳのＴＮＦ−αの産生放出誘導活性）
アルギン酸オリゴマーのＴＮＦ−α誘導能力の強さについて調べるために、強いＴＮＦ−α誘導能力を持つことが知られている、グラム陰性細菌の外膜を構成する重要な成分であるLipopolysaccharide（ＬＰＳ）を用いて同様の実験を行った。結果を図７に示す。
【００５６】
図７中、縦軸がＬＰＳによって誘導されたＴＮＦ−α量で、横軸はＬＰＳの濃度である。この結果と、前記アルギン酸オリゴマーのＴＮＦ−α誘導能力の強さの試験の結果とを比較すると、特に高い活性が見られた酵素分解によって調製されたＧ９は、ＬＰＳとほぼ同等のＴＮＦ−α誘導能力を持っているということが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の免疫機構賦活剤の有効成分であるアルギン酸オリゴマーの調製原料であるアルギン酸を構成するポリグルロン酸（ＰＧ）及びポリマンヌロン酸（ＰＭ）、及びそれらの構成単糖であるグルロン酸（Ｇ）及びマンヌロン酸（Ｍ）の構造を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、ＰＧ及びＰＭの調製についてのフローチャートを示す図である。
【図３】本発明の実施例において、アルギン酸を酵素分解し、ゲルろ過カラムを用いて、それぞれの構成単糖の重合度のものに分離した結果を表す図である。
【図４】本発明の実施例において、アルギン酸を酵素分解し、ゲルろ過カラムを用いて、それぞれの構成単糖の重合度のものに分離した結果を表す図である。
【図５】本発明の実施例において、酵素分解オリゴマーのそれぞれの構成単糖の重合度のものについてのＴＮＦ−α産生放出誘導活性の程度を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、酸加水分解オリゴマーのそれぞれの構成単糖の重合度のものについてのＴＮＦ−α産生放出誘導活性の程度を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、本発明のアルギン酸オリゴマーのＴＮＦ−α誘導能力と比較するために、ＬＰＳの誘導活性を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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