(57)【要約】【課題】  創傷又は疾病により又は老化現象により又はそれらの原因の組み合わせにより生じた、促進された細胞の死滅からニューロンを保護する方法。【解決手段】  動物対象体における神経細胞集団を、細胞の死をもたらす進行性の細胞損傷から保護するための薬学的組成物の製造のためのエストロゲン化合物の使用方法を提供する。本発明の好ましい態様は、細胞の死滅をもたらす進行性の又はそうでなくては介入なしに発生する細胞損傷から神経細胞集団が保護されるのに十分な有効用量のエストロゲン化合物を、動物対象における神経細胞集団に投与することを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物対象体における神経細胞集団を、細胞の死をもたらす進行性の細胞損傷から保護するための薬学的組成物の製造のためのエストロゲン化合物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の中枢神経系における細胞を細胞死から保護し、増大された成長因子生成を通してニューロンの生存を刺激する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経退行性変性症は社会に重大な影響力を与える。例えば、約3,000,000乃至4,000,000人のアメリカ人は、アルツハイマー病として知られる慢性の神経退行性変性症に悩まされている。末消の神経退行性変性症の他の例には、糖尿性末消神経病、多発性硬化症、筋萎縮性脊髄側索硬化症、ハンチントン病及びパーキンソン病が含まれる。すべての神経退行性変性症が慢性であるのではない。幾つかの神経退行性変性症には、脳、末消神経又は脊髄の損傷を生じる低血糖症及び創傷と同様に、激しい発作、精神分裂病及び癲癇が含まれる。改良された治療剤及び、それらの病気の各々に関連するニューロン損傷を後退させるか又は遅延させる方法についての必要性がある。
【０００３】
神経退行性変性症及び老化は、個々に重症度及び範囲が異なる広範囲の症状により特徴づけられる。例えば、アルツハイマー病は、機能低下、攻撃性、短期記憶の障害、思考力の障害、振動、異常興奮性及び運動不安のような症状により特徴づけられる。エストロゲンは、閉経後の女性において不十分になりそしてエストロゲンは気分に影響を与えると考えられているので、アルツハイマー病に関連する反応の症状の軽減を評価するためにいくつかの研究が企図されている。残念なことに、アルツハイマー病におけるエストロゲンの有利な効果を確立するために行われた臨床的な試みは、疾病経過又は症状において統計的に有意な改良は、その治療から得られないことを結論づけた（フィレット（Fillet）らによるPsychoneuroendocrinology、11巻、337-345頁；ホンジョーらによるSteroidBiochemistry、34巻、521-524頁）。１人の女性患者及び一人の男性患者について研究され、統計値は得られなかった研究において、絨毛性ゴナドトロピン、血管拡張剤、非ステロイド性抗炎症剤との混合として女性患者にエストロゲンを投与したときに、１週間ほどの短い期間の後に、老人生痴呆の症状に迅速な低減が見られた（Aroonsakul、米国特許4,897,389号、1990年）。長期の意味深い、症状の逆転をもたらすように、疾病を治療するのに有効な改良された治療のプロトコール及び有効な医薬がデザインされ得る根源的な方法のよりよい理解が必要である。
【０００４】
動物における神経退行性変性症機能不全及び老化の過程の通常の特徴は、ニューロン活性及び細胞の死をもたらす、中枢神経系（ＣＮＳ）の進行性細胞損傷である。この活性の損失は、記憶喪失及び認識力の欠損を含む、行動における悪い症状と相関している。ニューロン活性の損失を遅延させるために開発されてきた治療剤は、有害な副作用を有するか又は、血液脳関門を通ることができないのでその目標部位に到達することが妨害される。血液脳関門は、大きな分子及び荷電された小さな分子の両方の通過を遅延させ、それにより脳の細胞への接近を制限する形態的及び酵素的成分の複合体である。血液脳関門を容易に通過する新規な治療薬及び、損傷部位を直接標的とし、非毒性の、神経退行性変性症機能不全の治療法の新規な方法に対する必要性がある。
【０００５】
神経退行性変性症症状を治療する伝統的な方法は、ニューロン間及びニューロンに沿って伝わる電気的インパルスを変えること及び神経伝達物質の解離又は解体を変えることに焦点があてられている。現在、ニューロン細胞密度が機能に重要な影響を与えることが認識されている。種々の病理学的状態において、細胞密度の損失が、ニューロン細胞の促進された死滅から生じることが見出された。ニューロンの変性の形態は、典型的には、神経末端から始まり、細胞体に逆行して進行する（逆行性変性）。いくつかの系において、特定の脳領域に障害を起こさせることにより神経細胞軸索突起の代償性側芽形成が生じる。このニューロンの適応性は栄養上の成長因子の存在に少なくとも部分的には影響される。
【０００６】
これらの発見は、損傷を受けた領域の構造的完全性を改良するために、残存する細胞の樹枝状突起及び神経細胞軸索突起の側芽形成を促進することによる、細胞損失を保障する治療剤を特定する努力に拍車をかけた。しかし、最適のニューロンの密度及びニューロン伸長は、不足と過剰の間の精密なバランス、細胞の環境により変化するバランスである。治療薬が正常な又は不適当な組織に作用すると、このバランスは崩れる。従って、治療薬を治療用量、要求される領域に特異的に送るか又はその代わりとして、目標とする部位のみに天然の特異性を有する薬剤を特定する必要がある。
【０００７】
現在までに、ニューロン活性の損失を治療する、安全で有効な方法は存在しない。しかし、近年、ノイロトロープ因子（表１）とまとめて呼ばれる、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞及び、末消神経系の交感ニューロン及び知覚ニューロンの成長及び維持を促進する、自然に生じる蛋白質にかなりの注目がされてきた。特に、神経成長因子（ＮＧＦ）、皮質から基底核へと同様に海馬から中隔の（septal）コリン刺激性ニューロンへと完全な脳において通常逆に輸送される蛋白質は、コリン刺激性ニューロンに栄養上の支持を与えそして動物モデルにおいて創傷、疾病又は老化による神経退行性変性症の影響を減ずることにおいて有用性があることが示されてきた。中隔（septum）及び基底核は、基底の前脳として知られている脳の領域の部分である。損傷に応じて神経成長因子を投与する有効性は、コリン刺激性ニューロン中間の中隔（medialseptum）におけるコリン刺激性ニューロンは、外来性神経成長因子の長期にわたる輸注により、逆行性変性から防止されることを示す実験により裏付けられている（Rosenbergらによる、Science、242巻、1575-1578頁）。実際、神経成長因子の輸注は、采におけるコリン刺激性ニューロンの連絡の横断の後のコリン刺激性ニューロンの逆行性変性を有意に減弱することが示された（中隔−海馬通路）。
【０００８】
治療薬としてのＮＧＦの使用において直面する主な問題は、適する目標とする部位においてＮＧＦの量を増大させる適当な方法を見出すことである。ＮＧＦは大きな分子であり、通常、血液脳関門を通過することができず、従って、脳の細胞には非常に限定された接近しかできない。外部から投与されたＮＧＦを脳内に入れるための侵入法が通常行われている。それらの方法は、要求される細胞に特異的にＮＧＦを送るのに十分ではない。非局所化到達法（non-localized targgeting）は、目標部位において有効な蛋白質の量を低減させるのみではなく、不適切な部位においてニューロンの成長の促進をもたらしてしまい、患者に潜在的に有害な影響を与えてしまう。
【０００９】
ＮＧＦを治療薬として投与する他の欠点は、この蛋白質に対する免疫反応の誘導である。従って、そのもの自体が免疫応答をもたらさず、内生のＮＧＦの生成を促進することができる化合物に対する必要性がある。
【００１０】
血液脳関門を通過する神経成長因子を投与する最近の方法には、ポリマーの移植組織片（polymeric implants）、浸透性ミニポンプ、脳内への移植のためのＮＧＦを分泌する、遺伝子操作された自己移植の又は異質組織の細胞を用いる細胞治療及び、血液脳関門の透過性を増大し、それによって、脳内の細胞にそれらの分子を拡散させる方法が含まれる。外来性のＮＧＦが用いられる場合には、比較的多量の比較的高価な組み変え蛋白質が必要である。
【００１１】
蛋白質のデリバリーに対する上記の溶液ではなく、健康な組織を侵す技術を避けること、最も必要とされる部位に神経組織栄養的蛋白質のデリバリーの量及び部位を調節し、有毒な副作用を最小にすること及び、治療の健康保護のコストを最小にすることが望ましい。
【００１２】
神経症状を治療するための、その他の試みは、特定のアミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）が、N-メチル-D-アスパラテート（ＮＭＤＡ）受容体に結合する刺激性の神経伝達物質として作用する。それらのアミノ酸（ＥＡＡ）の過剰の放出は、低血糖症又は創傷の症状におけるのと同様に神経退行性変性症疾病におけるニューロンの過度刺激をもたらし、ニューロンの損失及び行動の機能不全をもたらす。N-メチル-D-アスパラテート（ＮＭＤＡ）は、強力なそして、頭の損傷、低血糖、無酸素症、低酸素症及びその他の症状と関連する、多くのニューロンの死を媒介することが動物研究において示されているグルタミン酸塩の毒性類似物質であり、血液、酸素又はグルコースの中枢神経系への流れを危険にさらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
受容体の拮抗物質として作用する、いくつかの合成化合物が記載され、動物モデルにおいて試験されている。それらの化合物はヒトにおいて毒性である可能性が解決されないままである。臨床的研究の多くの年数にもかかわらず、それらの拮抗物質は、患者を治療するための治療的生成物としてはまだ利用されていない。
【００１４】
上記の理由のために、創傷又は疾病により又は老化現象により又はそれらの原因の組み合わせにより生じた、促進された細胞の死滅からニューロンを保護する方法に対する必要性が存在する。又、血液脳関門を通過することができ、副作用が最小である小さな分子を用いて神経組織栄養的成長因子の生成を刺激する方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（概略）
本発明の好ましい態様は、細胞の死滅をもたらす進行性の又はそうでなくては介入なしに発生する細胞損傷から神経細胞集団が保護されるのに十分な有効用量のエストロゲン化合物を、動物対象における神経細胞集団に投与することを含み、前記エストロゲンが一般構造、
【００１６】
【化１】
2005290007.tif 000002
互変異性体を有するか又はそれらの薬学的に認容される塩である、神経細胞の集団を死滅から保護する方法を志向する。
【００１７】
本発明の他の態様は、神経細胞集団が細胞の死滅をもたらす進行性の又はそうでなくては介入なしに発生する細胞損傷から神経細胞集団が保護されるのに有効な用量でエストロゲン化合物を投与することを含む、神経細胞集団を保護する方法を志向する。
【００１８】
本発明の他の態様は、エストロゲン化合物にニューロン活性の損失を低減させるのに有効な量、対象体にエストロゲン化合物を投与することを含む、対象体内のある部位におけるニューロン活性の損失を受けている対象体を治療する、方法である。
【００１９】
本発明の他の態様は、中枢神経系組織における神経退行性変性をする部位に利用できる自然発生神経栄養因子の量の増大をもたらすのに十分な化合物の血漿量を達成するように生理学的に適する用量で対象体のニューロンにエストロゲン化合物を投与することを含む、中枢神経系組織における神経退行性変性をする部位に利用できる自然発生神経栄養因子の量を増大する方法である。
【００２０】
本発明の他の態様は、そのような神経退行性変性症機能不全を患っている対象体に有効量のエストロゲン化合物を投与することを含む、刺激性のアミノ酸受容体の過度の刺激により誘因される神経退行性変性症機能不全を防ぐ方法である。
【００２１】
従って、本発明は、以下を提供する。
１．動物対象体における神経細胞集団に、神経細胞集団が、細胞の死をもたらすか又は、何の介入なしに起こる進行性の細胞損傷から保護されるのに有効な用量の、一般構造、
【００２２】
【化２】
2005290007.tif 000003
を有するエストロゲン化合物、それらの互変異性体又は医薬的に認容されるそれらの塩を投与することを含む、神経細胞集団を死から保護する方法。
２．Ｃ17位におけるＲ２基がα異性位置におけるヒドロキシルであり、Ｃ３におけるＲ１が、β異性位置におけるヒドロキシルであることをさらに含む、項目１に記載の方法。
３．Ｃ17位におけるＲ２基がβ異性位置におけるヒドロキシルであり、Ｃ３におけるＲ１が、β異性位置におけるヒドロキシルであることをさらに含む、項目１に記載の方法。
４．Ｒ１基及びＲ２基が、水素、ヒドロキシル、酸素、メチル、メチルエステル、アセテート、エチルエーテル、3,3-ジメチルケタール、17,17-ジメチルケタール、エチニル-α、ベンゾエート、ベンジルエーテル、グルクロニド、バレレート、シクロペンチルプロピオネート、プロピオネート、ヘミスクシネート、パルミテート、エナンテート、ステアレート、シピオネートから成る群から個々に選ばれる、項目１に記載の方法。
５．Ｒ１基及びＲ２基が、グルクロニドナトリウム、亜硫酸ナトリウム塩、燐酸ナトリウム及びトリメチルアンモニウム塩から成る群から個々に選ばれる、項目１に記載の方法。
６．細胞集団がニューロン細胞を含む、項目１に記載の方法。
７．細胞集団がコリン作動性ニューロンを含む、項目６に記載の方法。
８．細胞集団が海馬細胞を含む、項目６に記載の方法。
９．細胞集団が皮質細胞を含む、項目６に記載の方法。
10．細胞集団が神経膠質細胞を含む、項目９に記載の方法。
11．対象体におけるニューロン活性の損失を低減させるために、対象体内の部位にα-エストロゲン化合物を投与する工程が神経細胞集団にα-エストロゲン化合物投与する工程に先行する、項目１に記載の方法。
12．対象体におけるニューロン活性の損失の部位が、海馬、皮質及び基底前脳から成る群から選ばれる、項目11に記載の方法。
13．ニューロン活性の損失がコリン作動性退化変性機能不全と関連している、項目11に記載の方法。
14．ニューロン活性の損失が急性退化変性機能不全と関連している、項目11に記載の方法。
15．ニューロン活性の損失が、その部位の創傷と関連している、項目11に記載の方法。
16．ニューロン活性の損失が、アミノ酸刺激性受容体の過度の刺激と関連している、項目11に記載の方法。
17．経口、口腔、筋肉内、経皮、静脈内及び皮下から成る経路の群の１つによりエストロゲン化合物を投与することをさらに含む、項目11に記載の方法。
18．制御された放出媒体におけるエストロゲン化合物を投与することをさらに含む、項目17に記載の方法。
19．エストロゲン化合物を経口的に投与することをさらに含む、項目17に記載の方法。
20．エストロゲン化合物を皮下に投与することをさらに含む、項目17に記載の方法。
21．記憶の喪失及び学習機能の損失の反転をもたらす工程をさらに含む、項目11に記載の方法。
22．対象体に、神経細胞集団が、細胞の死をもたらすか又は、何の介入なしに起こる進行性の細胞損傷から保護されるのに十分な用量のエストロゲン化合物を投与することを含む、対象体における細胞集団を細胞の死から保護する方法。
23．細胞の死をもたらす進行性の細胞損傷の原因が、神経退行性変性症機能不全、創傷及び老化から成る群から選ばれる、項目22に記載の方法。
24．進行性の細胞損傷がニューロン活性の損失に関連しており、エストロゲン化合物の用量が、対象体におけるニューロン活性の損失をその化合物が低減させるのに十分である、項目22乃至23のいずれか１項目に記載の方法。
25．進行性の細胞損失の原因が、アミノ酸刺激性受容体の過度の刺激を含む、項目22乃至24のいずれか１項目に記載の方法。
26．受容体活性を遮断するために、エストロゲン化合物をアミノ酸刺激性受容体と反応させる工程をさらに含む、項目25に記載の方法。
27．神経退行性変性症機能不全が慢性の神経退行性変性症機能不全である、項目22乃至26のいずれか１項目に記載の方法。
28．神経退行性変性症機能不全が急性の神経退行性変性症機能不全である、項目22乃至26のいずれか１項目に記載の方法。
29．対象体に投与されるエストロゲンの用量は、細胞の集団に利用される神経栄養成長因子の量を増加させるのに十分である、項目22乃至24及び項目27及び項目28のいずれか１項目に記載の方法。
30．神経栄養因子が神経成長因子である、項目29に記載の方法。
31．神経栄養因子が脳由来神経栄養因子である、項目29に記載の方法。
32．細胞集団がニューロン細胞であり、ニューロン細胞がエストロゲン化合物の存在下で軸索の逆行性の退化変性から保護される、項目１乃至31のいずれか１項目に記載の方法。
33．細胞集団がニューロンを含み、ニューロンがエストロゲンの存在下でアポトーシス（apoptosis）から保護される、項目１乃至32のいずれか１項目に記載の方法。
34．細胞集団が、海馬、皮質及び基底前脳から選ばれる、項目１乃至33のいずれか１項目に記載の方法。
35．細胞集団が、コリン作動性ニューロンである、項目34に記載の方法。
36．経口、口腔、筋肉内、経皮、静脈内及び皮下から成る経路の群の１つによりエストロゲン化合物を投与することをさらに含む、項目１乃至35に記載の方法。
37．エストロゲン化合物を経口的に投与することをさらに含む、項目22乃至35のいずれか１項目に記載の方法。
38．エストロゲン化合物を皮下に投与することをさらに含む、項目22乃至35のいずれか１項目に記載の方法。
39．エストロゲン化合物を筋肉内に投与することをさらに含む、項目22乃至35のいずれか１項目に記載の方法。
40．ニューロンが対象体の脳内の第一部位内に位置し、ニューロンにエストロゲン化合物を投与する工程がさらにニューロンから離れた第二部位にエストロゲンを投与することをさらに含む、項目１乃至39のいずれか１項目に記載の方法。
41．エストロゲン化合物がステロイドである、項目１乃至40のいずれか１項目に記載の方法。
42．エストロゲン化合物が17-β-エストラジオールであり、17-β-エストラジオールが、17-エストラジオールの20pg／ml乃至250pg／mlの範囲での血漿レベルを与えるのに十分な量投与される、項目22乃至41のいずれか１項目に記載の方法。
43．エストロゲン化合物が17-β-エストラジオールの異性体である、項目41に記載の方法。
44．コリン作動性ニューロンによる高親和性コリン取り込みの量をモニターすることにより神経細胞の死の低減を測定する工程を含む、項目１乃至43のいずれか１項目に記載の方法。
45．コリンアセチルトランスフェラーゼの量の増加をもたらすことを含む、項目44に記載の方法。
46．明細書に記載されそして示された発明から成る、対象体における細胞集団を細胞の死から保護する方法。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
本発明は、対象体の神経細胞の集団を死滅から保護し、動物の対象体における細胞を細胞死滅から保護する、神経栄養因子を刺激する方法に向けられている。
【００２４】
「エストロゲン化合物」は、Wilton N.H．によるSteraloids Inc．による“Steroids”の11版に記載されている構造であると本明細書及び請求の範囲に定義されており、それらを参考として組み込む。この定義に含まれているものは、上記の文献に記載されている非ステロイド系エストロゲンである。この定義に含まれる他のエストロゲン化合物は、エストロゲン誘導体、エストロゲン代謝物質及びエストロゲン前駆物質及び、細胞関連エストロゲン受容体及び、結合の結果により、特徴付けられたエストロゲン効果が特異的に引き起こされる他の分子が含まれる。又、１つより多いエストロゲンの混合物が含まれ、そのような混合物は、表２に記載されている。単独または他の薬剤と組み合わせた有用性を有するα-エストロゲン構造の例は、図９に記載されている。
【００２５】
β-エストロゲンは、エストロゲン化合物のβ異性体である。用語「エストラジオール」は、特定していなければ、α-又はβ-エストラジオールである。
【００２６】
用語「Ｅ2」は、β-エストラジオール、17β-エストラジオール及びβ-Ｅ2と同意語である。αＥ2、α-Ｅ2及びα-エストラジオールは、β-Ｅ2エストラジオールの異性体である。
【００２７】
「動物対象体」は、本明細書及び請求の範囲において、進行性細胞損傷及び細胞の死滅を生じる力に付されたニューロンを有するヒトを含む高等生物体として定義されている。
【００２８】
「神経栄養成長因子」は、本明細書及び請求の範囲において、生存、成長、形態的適応性又はニューロンの区別された機能のための蛋白質の合成を制御する内生的な可溶性の蛋白質として定義される。
【００２９】
「神経退行性変性症機能不全」は、本明細書及び請求の範囲に、ニューロンの神経成長因子損失が末消神経系又は中枢神経系に起こる、機能不全として定義される。神経退行性変性症機能不全の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、糖尿性末消神経病、多発性硬化症、筋萎縮性脊髄側索硬化症のような慢性の神経退行性変性症、老化及び、激しい発作、創傷の脳の損傷、神経分裂病、末消神経損傷、低血糖症、脊髄の損傷、癲癇及び無酸素症及び低酸素症が含まれる急性の神経退行性変性症機能不全が含まれる。
【００３０】
それらの例は、包括的であると理解すべきではなく、用語「神経退行性変性症機能不全」の単なる例として出されている。
【００３１】
【表１】
2005290007.tif 000004
2005290007.tif 000005
* 記載された文献は、最近の再調査又は最近の主な刊行物に関する。
【００３２】
【表２】
2005290007.tif 000006
2005290007.tif 000007
（エストロゲンの特性）
エストロゲンは、β-エストロゲン及びα-エストロゲンを含む少なくとも２つの異性体を生じる。β-エストロゲンは、多くの生物学的活性を有する多面栄養性(treotrophic)分子である。臨床的用途には骨粗鬆症、閉経症状及び生殖能力調節の治療が含まれる本発明の態様において、β-エストロゲンはニューロン損失に対して対象体を保護することも示された。
【００３３】
β-エストロゲンに比べ、α-エストロゲンは、典型的には、少なくとも100乃至1,000分の１のエストロゲン力価しかないと考えられている。β-エストロゲンの生物学的効果は、α異性体により共有されないことを示す種々の例が文献に報告されている。実際、本技術分野では、α-エストロゲンは典型的にはβ-エストロゲンに対する負の対照として用いられる。
【００３４】
本発明者らは、α-エストロゲンが神経保護に関してβ-エストロゲンの活性に匹敵する活性を有することを最初に示した。α-エストロゲンについて確認された新規な活性は、神経退行性変性症、創傷及び老化の治療に幾つかの利点を示す。それらの利点は、女性の特徴の発生を避けるべき男性の治療及び、対象体が子宮内膜癌、乳癌及び子宮頸癌の強い可能性を有する女性の治療を必要とする場合に生ずる。
【００３５】
本発明の態様において、エストロゲンの、いわゆる、ニューロンの進行性退化変性阻止及び／又は反転をもたらすための新規な使用が確認された。退化変性の進行は、究極的には、観察されるニューロン密度の減少を伴う行動の欠陥をもたらす。本発明により、疾病、創傷又は老化又はそれらの組み合わせにより個々に生じた神経退行性変性症機能不全を患っている対象体に対する、認識力、記憶力及びその他の行動の症状の改善がエストロゲンの投与により生ずる。又、本発明により、介入によるような神経退行性変性症の進行の阻止及び／又はニューロン損失の阻止により、患者は、疾病の推移においてさらなる減退に発展したり又はさらなる減退を示したりしない。この効果の証拠は、実施例に示されており、生体内で及び試験管内で確認された生化学的効果と関連付けられている。
【００３６】
実施例１では、試験管内研究により、比較的低濃度のα-Ｅ2及びβ-Ｅ2がニューロン細胞の生存力を増大する、エストロゲンの細胞保護特性が示された。本発明の他の態様では、β-Ｅ2での細胞の予備処理により、グルコース低減又は欠乏、低血糖症と呼ばれる症状によりもたらされる死滅から細胞が保護されることが示された。Ｅ2での後処理により、増大する期間の低血糖症を消失させるように細胞が低血糖症の影響から救われる（実施例２）。
【００３７】
これらの実施例は、生理学的に適当な用量におけるα-エストラジオール及びβ-エストラジオールは、試験内での神経膠質セルライン及び神経母細胞腫セルラインに細胞保護効果を発揮し、この細胞保護効果は、細胞分裂促進性作用とは区別される。理論に縛られるべきではないが、エストロゲンは、ニューロン細胞において直接の保護効果を発揮すると考えられる。
【００３８】
実施例３乃至６に記載された生体内研究により、エストロゲンは、非空間学習(non-spatial learning）における障害を反転することが示された。この障害は、前頭皮質及び海馬の両方においてコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）の時間依存性減少と相関しており、これは、エストラジオールで処理された動物において弱められる。それらの２つの脳の領域におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ含有神経末端は基底前脳(basalforebrain)に位置する細胞体を有する。実施例３では、エストロゲン欠乏卵巣摘出動物へのエストロゲンの添加による活性回避試験(activeavoidance test)により決定する行動性能における改善を示した。まとめると、これらのデーターは、ニューロン損傷に関連した学習及び記憶の喪失を低減させるために、エストロゲンで治療することによる、基底前脳コリン作動性機能の調節により対象体を治療する方法を提供する。
【００３９】
実施例１乃至６は、エストロゲン化合物が中枢神経系の細胞において細胞保護効果を発揮するいくつかの異なる経路を示している。これらには、低血糖症に対しての保護（実施例２ａ、２ｂ及び６）及び、ＥＡＡの過度刺激からの保護（実施例２ｃ及び５）及び神経栄養成長因子生成の刺激（実施例４ａ及び４ｂ）が含まれる。
【００４０】
実施例４ａは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ｍＲＮＡの増加量により決定された脳由来神経栄養因子の増加を示す実験であり、実施例４ｂには、ＮＧＦｍＲＮＡの増加量により決定された神経成長因子生成の刺激について記載されている。エストロゲンの他の細胞保護効果は、刺激性アミノ酸（ＥＡＡ）受容体の過度刺激の毒性効果の改善により示された（実施例２ｃ及び５）。ＥＡＡ受容体の過度刺激は、癲癇を含むいくつかの神経退行性変性症機能不全の特徴として確認された。本発明の他の態様において、エステロゲン化合物は、細胞の死滅をもたらす進行性細胞損傷の他の原因である低血糖症の毒性効果を改善する（実施例２ａ、２ｂ及び６）。
【００４１】
理論に縛られるべきではないが、エストロゲン化合物は、細胞の生存力及び損傷及び死滅をもたらす悪い状況に対する細胞応答に影響を与える基礎的な経過に作用すること及び、この経過は観察された現象の基礎となることが示唆されている。そのような機構の例には、細胞へのグルコースの調節が含まれる。
【００４２】
これらの観察は、従来技術の観察と対照をなす。エストロゲンは、年とった女性における閉経に関連するホルモンの波動運動を伴う行動の悪い症状を治療することに有用性を有することが確認されたが、それらの効果に関する生化学的根拠はわかっていない。そのように、ヒト対象体の行動におけるエストロゲンでの治療効果は、エストロゲンの欠乏の徴候を示す女性の閉経の治療及び、エストロゲンの代替治療により調整される閉経の続発症、いわゆる骨粗鬆症の防止に限定されている。
【００４３】
しかし、ヒトの臨床的研究により、外来的に投与されたエストロゲンは非毒性であることが示されている。その他に、筋肉内に投与されたエストロゲンは、治療の行動における効果により推断されるようにそして分子の構造から予測されるように、後に脳に到達することが示されている。
【００４４】
SherwinによるPsychoneuroendocrinology、13巻、345-357頁(1988年）、Sherwin及びPhillipsによるAnnalsof the New York Academy of Sciences、592巻474-475頁（1990年）には、エストロゲンの10mgの用量での筋肉内投与に続いて起こる卵巣摘出した女性の一般的な気分の高揚効果が示されているが、この効果が起こった機構は明らかではない。
【００４５】
アルツハイマー病の女性の臨床的研究により、短期間のエストロゲン治療に応答して気分の改善及び抑鬱症を低減させることによる、何人かの患者において急性の利点を有することが示されている（FillitらによるNeuroscience Abst.、12巻945頁（1986年）；Fillistらによる、Psychoneuroendocrinology、11巻、337-345頁（1989年）；Honjoらによる、SteroidBiochem.、34巻、521-525頁）。少数の患者にしか用いられていないので、数人の患者に限定された効果しか有しないのでそして、短期のみにしか治療を行っていないので、これらの研究からの結果は解釈するのが困難である。実際、研究は、どのエストロゲンであっても神経保護効果を評価し証明するのに十分な長い期間ではない。Aroonsakulによる米国特許第4,897,389号（1990年）におけるその他の研究には、ホルモン混合物の短期投与を行う細胞の複製及びヒト成長ホルモン生成の刺激からもたらされる症状の軽減が提示された、１人の男性と１人の女性におけるエストロゲンを含む同化ホルモンの効果が記載された。
【００４６】
生体内又は試験管内での中枢神経系の細胞におけるエストロゲンの作用における生化学的研究は矛盾する報告をしている。いくつかの研究によりエストラジオールがニューロンの成形性(plasticiy)における効果を有することが示されている。モース(Mose)らによるExperimentalNeurology、94巻、649-658頁（1986年）は、エストロゲン誘導体は、entorhinal皮質障害の結果として起こる歯列状の海馬回における連合-同化入力繊維（commissural-asociationalafferentfibers）の突起形成(sprouting)を増大することを報告した。その他に、海馬のＣＡｌにおけるシナプス密度における周期性の変化が、循環するＥ2レベルに関連し［ウーリー(Woolley)らによるJournalof Neuroscience（1992年）、12巻、2549-2554頁］、その変化が、外来性のＥ2投与により擬態され得る（Woolleyらによる、1992年）ことが示された。実際、卵巣摘出によりそしてＥ2の置換により、ラットの前頭皮質における高親和性コリン取り込み（ＨＡＣＵ）を標準化することが示された。
【００４７】
その他に、GiibbsらによるSocietyfor Neuroscience Abstract、19：５（1993年）には、その場でのChＡＴｍＲＮＡのハイブリッド形成を用いて１週間後に効果が観察されなかったが、治療の２日後および２週間後の中膜中隔(medialseptum)におけるエストラジオール治療によるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChＡＴ）の量の上昇調節（upregulation）が報告されている。LuineらによるBrainResearch、191巻、273-277頁（1980年）には、エストラジオールの治療に応答してラットの脳の前四丘体及び視床下部領域における増加したChＡＴ量が報告されている。
【００４８】
本発明の態様において、生理学的用量のエストロゲンの投与により、卵巣摘出された（ＯＶＸ）メスのラットにおいて非空間性の学習の障害の反転が生じられる。これらの短期のＯＶＸ及びＥ2置換の行動における効果は、脳の海馬及び前頭皮質の生化学的変化、特に、ＯＶＸ及びＥ2ペレットで処理されたラットにおいてそれぞれ高親和性のコリンの取り込み（ＨＡＣＵ）の減少及び増加のそれぞれに相関関係がある。短期のＥ2置換は海馬においてコリンアセチルトランスフェラーゼ活性（ChＡＴ）に正の効果を有するが、前頭皮質においては有しない。長期のＥ2置換は、前頭皮質におけるChＡＴの時間依存性減少を防ぎ、その場におけるChＡＴ活性減少を弱めるようであった。まとめると、これらのデーターは、エストロゲンは、中枢神経系における細胞において細胞保護効果を有し、大人のメスのラットのエストロゲン環境は、学習及び、基底の前頭のコリン作動性ニューロンの活性に影響を与えることを示し、そしてメスのラットにおける基底前頭コリン作動性ニューロンの維持及び適切な機能におけるエストロゲンの重要性を示している。
【００４９】
1977年には、Perez-Poloらは、LifeSci、21巻、1535-1543頁において“Steroid Induction of Nerve Growth Factor Synthesisin Cell Culture”と題する論文を公表した。試験管内で神経膠質細胞によるＮＧＦの生成におけるステロイドの正の効果を示唆しているが、その論文をよく読むと、反対であることが明らかになる。非特異的ポリクローナル抗体を用いることにより、多量のエストロゲンに応答して増加された量の高分子量分子が確認され、一方、β-ＮＧＦを含有することが知られている、抗体生成により同様に認識される低分子量（ＭＷ）フラクションの量に増加はなかった。その実験に用いられたエストロゲンの用量は、正常量より5,500倍高かった。ＮＧＦに寄与し、培養基に分泌される低分子量フラクションの量は、最近の方法を用いるＮＧＦ生成に対して予測された量よりも1000倍高いことが見出された。この研究者達または他の者による、ＮＧＦ生成におけるエストロゲンの生体内効果を決定するための、さらなる研究は行われていない。その後のGibbsらによる生体内研究（1993年）により、ステロイド（17-β-エストラジオール）が海馬において低減された量のＮＧＦｍＲＮＡをもたらし、続いて中膜中隔及びブローカ氏対角帯（diagnalband of Broca）において低減された量をもたらすことが報告された。
【００５０】
上記の報告に反し、本発明の態様は、いかにエストロゲンが神経栄養成長因子ｍＲＮＡの生成を刺激するかを記載するものである。初めて、エストロゲン化合物は、血液脳関門を通過して脳の組織に容易に接近するのみでなく、最も必要な場合に、神経退行性変性の影響を反転し相殺するために、成長因子の入手性を刺激することができることが記載された。
【００５１】
本発明の好ましい態様では、エストロゲン化合物について、神経退行性変性症の症状を単に治療するのではなく、神経退行性変性症機能不全の進行を阻止及び／又は反転させるためにエストロゲンを用いる方法を最初に提供する新規な特性が確認された。
【００５２】
好ましい態様では、エストラジオールの両方の立体異性体、17-β-エストラジオール及び17-α-エストラジオールが神経退行性変性症を反転させるのに有効であることが見出された。
【００５３】
好ましい態様では、エストロゲンがラットに及びヒトにも中枢神経系において神経保護効果を発揮するのに十分な濃度で投与される。その用量は、個々の変数、投与経路及び用いられるエストロゲン配合物により変化する。例えば、ラットにおいては、約50pg/mlの血漿量を達成するためにシラスチック・チューブ（sylastic tube）を用いて皮下に投与される。ヒトにおいては、一日当り、0.2-10mg以上の、特に1-2mgの経口投与のエストラーゼ（estrase）（エストラジオール）が、閉経の後の一連の徴候に苦しむ患者に通常投与される。その量は、又、ヒト対象体における神経退行性変性症機能不全を治療することにおいても有効であると予測される。
【００５４】
エストロゲン化合物の投与の推奨できる経路には、経口、筋肉内、経皮、口腔、静脈内及び皮下が含まれる。エストロゲンを投与する方法は、服用量により（by dose）または制御された放出の媒体物による。
【００５５】
エストロゲンの投与には、単一のエストロゲン化合物かまたはそれらの混合物の使用が含まれる。
【００５６】
深刻な退化変性からのコリン作動性ニューロンの保護は、急性のまたは慢性の神経退行性変性症機能不全の、例えば、慢性の疾患がアルツハイマー病である患者に対する治療の重要な面である。アルツハイマー病の患者には、エストロゲン置換又は補充は、重要な治療的使用であり得る。エストロゲン治療が効果的である他の疾病には、パーキンソン病、ハンチントン氏病，ＡＩＤＳ痴呆、ウエルニッケ−コルサコフ病様痴呆（アルコール誘因痴呆）、年齢による痴呆、年齢に関係した記憶障害、頭の創傷、激しい発作、低血糖症、局所貧血、無酸素症、低酸素症、大脳浮腫、動脈硬化症、血腫及び癲癇のいずれかによる脳細胞損失、脳細胞損失で示された条件のいずれかによる脊髄細胞損失及び末消神経病が含まれる。その細胞保護特性のために、エストロゲンに関する作用の１つの経路は、アポトーシス（apoptpsis）の阻止である。
【実施例】
【００５７】
（実施例１ａ：試験管内研究により、エストロゲン化合物の存在下で神経細胞の増大された生存力が示され、エストロゲンが細胞保護効果を発揮することが示された。）
（実験デザイン）
神経母細胞腫（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ）セルラインは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（メリーランド州、ロックビル）から入手した。培養条件は、以前に記載されている（Kellerらによる、1976年；Kolbeらによる1976年）。すべての実験は、パッセージ番号（passage number）３−６にある細胞で行った。各実験を３つの処理グループに分けた：グループ１は、10％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ培地、グループ２は、ＦＢＳなしのＲＰＭＩ培地（血清がないグループ）そしてグループ３は、544pgＥ2／mlを補充した、血清がないＲＰＭＩ培地［ステラロイド（Steraloid）Inc．（ニューハンプシャー州ウィルトン）により提供されたＥ2］であり、ＦＢＳに通常見出されるエストロゲンの16pg/mlより非常に多い。Ｅ2は、最初に100μｌの無水エタノール中に溶解させ、次に、培地で希釈した。他の２つのグループの培地を、付加的な100μｌの無水エタノールを培地に添加して同様に作った。48時間で培地を栄養補充物の標準の予定を維持するための実験に変えた。
【００５８】
各実験グループにおける細胞の集団の成長の速度を測定した。
【００５９】
（細胞の生存力の定量）
細胞生存力を、ブラックらによるトリパンブルー染色排除法（Exp．Cell Research、35巻９乃至13頁）を用いて評価した。各試料について、総細胞数と死細胞の２つの別々の計数をした。染色のトリパンブルー法の重要な制限はその時間依存性である。従って、細胞の再懸濁液、染色剤の添加及び血球計における実際の計数の間の時間を標準化するように注意をした。
【００６０】
（データーの分析）
すべてのデーターを、ml当り細胞の数として表わさせる希釈因子について矯正後に平均±ＳＥＭとして表わす。データーを変動の分析により続いてシェッフェ（Scheffe's）Ｆ試験により分析した。有意性に対する基準はｐ＜0.05であった。
【００６１】
死滅した細胞（細胞の数／ml）を総数（細胞の数／ml）で割ることにより、有糸分裂割合を計算した。この指数は、有糸分裂と実験デザインにおいて用いられる治療の細胞保護効果との間を区別する手段を提供する。死滅／総細胞の割合を用いて、有糸分裂を培地におけるＥ2の細胞保護効果と区別するのに用いた。
【００６２】
（実験結果）
総細胞数に対する死細胞数の割合が培地からのＦＢＳの除去で２乃至３倍増加した。（表３）。Ｅ2の添加により、この血清除去効果が防がれ、各試料採取時間において、ＦＢＳグループにおいて観察されたものと同様の割合を生じた。48時間の間、生細胞数に対する死細胞数の割合は、Ｅ2処理細胞に関しては一定のままであったが、血清がない細胞については２倍近かった。96時間までに、３つのすべてのグループにおいて、その割合は増大し、そのことは、時間とともに細胞保護効果が減ずることを示唆している。
【００６３】
24時間及び48時間における、ＦＢＳグループにおける総ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞数は、Ｅ2で処理した細胞で見られた数の約２倍であったが、生細胞のフラクションは類似であった。しかし、Ｅ2処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ総細胞は、ＦＢＳにおいて増殖させた細胞に見られた指数相関数的な増殖パターンを示さなかった。総ＳＫ−Ｎ−ＳＨ処理細胞に対する死細胞の割合は、３つのすべてのグループにおいて時間とともに増加した（表３）。しかし、各試料採取時間において、この割合は、類似で、血清がない条件下のものよりもＥ2及びＦＢＳグループの両方において非常に低かった。
【００６４】
【表３】
2005290007.tif 000008
#P<0.05対E2及びFBSの両グループ
*P<0.05対血清なし及びFBSの両グループ
ＦＢＳ補充培地における神経母細胞腫細胞の増殖パターンは、６乃至９日の倍加時間を示した。５日間の評価の間、血清がない条件下では、死滅細胞の総数の相当する増加とともに細胞の総数の低減が観察された。
【００６５】
まとめると、それらのデーターは、観察された増大した総細胞数と生細胞数は、有糸分裂ではなく、用いた特異的試験管内Ｅ2の細胞保護効果に起因する。
【００６６】
（実施例１ｂ．試験管内研究により、エストロゲンの存在下で神経細胞の増大した生存力が示され、α-エストロゲンが細胞保護効果を発揮することが示された。）
（実験デザイン）
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を２mlの0.02％のＥＤＴＡ［シグマ・ケミカル・コーポレーション（Sigma Chemical Corporation）、ミズーリー州、セントルイス］で逆培養（backcultured）し、37℃で30分間インキュベーションし、下記のようにml当り１×105細胞の濃度で再懸濁した。各実験は３つの処理グループを有した。グループ１は、10％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地（ＦＢＳグループ）であり、グループ２は、ＦＢＳを有しないＲＰＭＩ培地（血清がないグループ）であり、グループ３は、544pg/mlの17-α-Ｅ2pg/mlを補充した、血清がないＲＰＭＩ培地（α-Ｅ2グループ）（ステラロイド・インク、ニューハンプシャー州、ウィルトン）であった。処理培地を実験の日に作った。α-Ｅ2を最初に100μｌの無水エタノールに溶解し、次に培地で希釈した。他の２つのグループの培地は、添加して、100mlの無水エタノールで希釈をして同様に調製した。ＦＢＳを約16pg/mlの濃度を決定するβ-Ｅ2について検定した。ＲＰＭＩ1640培地は、β-Ｅ2の検知できない量しか有しなかった。しかし、ＦＢＳも培地もα-Ｅ2について検定しなかった。
【００６７】
細胞の生存力を実施例１ａに記載したように評価した。細胞をそれぞれの処理培地で24時間又は48時間インキュベーションした後、培地をデカントし、それぞれのフラスコを0.02％のＥＤＴＡ２mlで30分間インキュベーションすることにより細胞懸濁液を調製した。続いて細胞を適する培地で再懸濁した。次に、５乃至６つの異なるフラスコの２mlの部分試料を500μｇの0.4％トリパンブルー染色（シグマ・ケミカル・コーポレーション、ミズーリー州、セントルイス）で処理した。死細胞と生細胞とを区別するためのトリパンブルー染色法の重要な制限は、時間依存性である。従って、細胞の再懸濁と染色剤の添加と血球計における実際の計数の間の時間を標準化するように注意をした。
【００６８】
（実験結果）
実施例１ａにおけるように、培地からＦＢＳを除去すると総細胞数に対する死細胞の割合は、２乃至３倍に増加した（図８）。α-エストロゲンの添加により、この血清除去効果は防止されそして各試料採取時間においＦＢＳグループに見られるものと同様の割合を生じた。
【００６９】
（実施例１ｃ．エストロゲンは、皮質ニューロン初代培養における細胞の時間依存性死滅を遅延せるか又は防ぐ。）
（実験デザイン）
原発性皮質ニューロンを、０乃至１日齢であるラットの脳からMonyerらによりBrain Research、483巻、347-354頁に記載された一連の方法を用いて生成した。分散された脳組織をＤＭＥＭ／10％ＰＤＨＳ（妊娠給血馬血清）において３日間増殖し、次にシトシンアラビノシド（ＡＲＣ）で２日間処理してＤＭＥＭ／10％ＰＤＨＳで置換した。ニューロン細胞をさらに４−７日間培養して用いた。
【００７０】
対照のニューロン初代培養物は、12日と18日の間の培養物における斬進性の細胞の死滅を示す。ＤＭＥＭ及び10％のＰＤＨＳ中に９日維持した６つの培養物にエストロゲンを添加し、残りの培養物を対照として維持した後に、酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）の量について12培養物を12日及び16日で評価した。WroblewskiらによるProc．Soc．Exp．Bio．Med．、90巻、210-213頁（1955年）に記載された一連の方法を用いてＬＤを検定した。ＬＤは、臨床研究及び基礎研究の両方に通常用いられるサイトソル（cytosolic）酵素である。培地ＬＤにおける増加は細胞の死滅に直接関係する。
【００７１】
（結果）
エストロゲンの９日における単一の処理により、12日及び16日での６つのすべての複製物において観察されたＬＤにおける増加が有意に減少した（ｐ＜0.05）。それらのデーターは、初代ニューロンにおいて、エストロゲン暴露により、少なくとも７日間の培養物における時間依存性死滅を遅延又は防止すること（図１）、光学顕微鏡による培養物の検査によりさらに支持される観察を示唆する。ここでは、エストラジオールが老化退化変性（ニューロン伸長の退行）を防ぐこと及び細胞体内のサイトソルの封入体（物質のクラスター）の出現を低減させることが見出された。老化退化変性及び前記封入体の両方は、試験管内においてニューロン初代培養物における老化によりそして生体内における退行性変性症機能不全により通常観察される。
【００７２】
（実施例２ａ．試験管内研究によりエストロゲン化合物は、低血糖症により誘発される細胞毒性に対して細胞を保護する。）
（実験による試み）
ファルコン（Falcon）（登録商標）25cm2の組織培養フラスコ中でＡＴＣＣから入手したＣ６神経膠腫細胞を１×106細胞／mlの濃度でＦＢＳを有するＲＰＭＩ培地中に置いた。低血糖症の始まり前の４時間、維持培地を捨て、単層(monolayers)を適する培地で２回洗滌し、血清がない又は血清がなくそして544pg／mlのＥ2を有するものを37℃で４時間インキュベーションした。クレブスリンゲル(Kreb'sRinger)リン酸緩衝液を用いて単層を２回洗滌し、その後に、適するグルコース処理の添加をした。ＲＰＭＩ培地は、２mgのグルコース／mlを含有する。
【００７３】
フラスコの内容物を各々が100％のグルコース(2mg/ml)、80％のグルコース（1.6mg/ml）、60％のグルコース（1.2mg/ml）又は、ステロイドの添加がなく又は544pg/mlのＥ2を補充した0％のグルコース（緩衝液）を入れた６つのグループに分けた。すべてのフラスコを20時間インキュベーションをし、総細胞数、生細胞数及び死細胞数を、先に記載したトリパンブルー法を用いて評価した。
【００７４】
（結果）
図２は、Ｅ2処理がされていない対照フラスコにおいて総Ｃ６細胞数及び生Ｃ６細胞数の両方において低血糖症により注目される用量依存性低減がもたらされた。対照してみると、試験された低血糖のレベルの各々において、Ｅ2暴露により、低血糖と関連する、総細胞及び生細胞の損失が防がれた。トリパンブルーは、染色剤に対して透過性になった死につつある細胞を染色する。悪条件では、死細胞の崩壊の結果として、測定された総細胞集団における細胞数は低減する。従って、グルコースの最適度以下のレベルで20時間維持された試料中の細胞の総細胞数は図２において総細胞数における減少を示している。しかし、多割合のこの減少する集団は生細胞である。最適度以下のレベルのグルコース中に維持された培養物へのエストロゲンの添加により、集団を細胞の死滅から防ぎ、全体にわたる多数の生細胞を生じる。エストロゲンの存在下での試料と比較したときにエストロゲンの非存在下での総細胞及び生細胞における統計的に有意な減少を有するそれらの試料にアステリスクを付ける。
【００７５】
（実施例２ｂ：エストロゲン化合物は、先在する低血糖により誘因される細胞毒性から細胞を保護する。）
（実験デザイン）
Ｃ６細胞を実施例ａに記載したように培養した。実験の当日に、フラスコ（処理グループ当り５乃至６）を５つのグループに分けた。１つのグループは、標準グルコース培地に維持された（常態血糖：ＲＰＭＩにおいて２mg／mlグルコース）で維持され、残りの４グループは、80％の標準グルコースの濃度を有する（低血糖）ＲＰＭＩ中に置いた。低血糖状態の開始後１時間又は４時間において、フラスコをＲＰＭＩ（対照）で又はＥ2（544pg/mlＲＰＭＩ）で処理した。低血糖の開始後24時間において、生細胞と死細胞を上記のように計数した。この研究デザインにより、低血糖の細胞毒性効果から救われたＣ６細胞の時間−経過の決定がされた。
【００７６】
（結果）
その結果は表４に示されており、先在する低血糖状態の細胞毒性効果からＣ６細胞を救う能力を示している。低血糖の開始後１時間においてＥ2での処理後に、生細胞の数が２倍より多く増加し、死滅細胞数は半分に減少した。対照してみると、低血糖の開始後４時間において、Ｅ2での処理により、生細胞数における効果はなく、わずかに減少した死細胞数のみであった。
【００７７】
【表４】
2005290007.tif 000009
記載したのは、平均±ＳＥＭ
ＳＦ＝血清がないＲＰＭＩ培地
*１時間における血清がないグループからのＰ＜0.05。
【００７８】
（実施例２ｃ：エストロゲン化合物は、毒性促進アミノ酸により誘因される細胞毒性に対して細胞を保護できる。）
（実験デザイン）
上記のように、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経母細胞腫細胞を含有する５つの培養皿をＥ2（544pg/ml）で処理し、５つの培養皿をＰＲＭＩ培地で処理した。４時間後、すべての細胞をＮＭＤＡ(500μＭ)で５分間処理した。次に総細胞数及び死滅細胞数を決定した。
【００７９】
（結果）
細胞集団の生存力におけるエストロゲンの保護効果を図３に示している。エストロラジオールでの予備処理により、ＮＭＤＡでの処理を行った神経母細胞腫培養物において生細胞数が増加し、神経細胞数が減少した。そのデーターは、Ｅ2予備処理により、毒性促進アミノ酸に関連する神経毒性から細胞が保護されることを示している。
【００８０】
（実施例３：生体内研究により、エストロゲン化合物の神経保護効果により生じる行動の改善が示される。）
中枢神経系におけるコリン作動性機能を保護することにおけるエストラジールの役目及びこの効果の、学習及び記憶との関連が下記のように示された。
【００８１】
（実施例３ａ：エストロゲンで処理された卵巣摘出ラットにおける学習及び記憶の改善）
（実験デザイン）
動物の３つのグループを標準両側性活性回避パラダイム（standard 2-way active avoidance paradigm）を用いて分析した。３つのグループの動物は、卵巣摘出していない（無処置）動物、卵巣摘出した動物及びエストラジオール置換の卵巣摘出した動物であった。
【００８２】
（動物）
若年の成長したメス（３−４月齢）のＣＤ-Sprague-Dawley ラット［チャールス・リバー・ブリーディング・ラボラトリース（Charles River BreedingLaboratories）、マサチュセッツ州ウイルミントン］を標準飼育状態に維持した。
【００８３】
（動物の外科的操作）
動物をメトキシフルラン［メトファーン（Metofane）ピットマン-ムーア（Pitman-Moore）、ワシントン・クロッシング（ニュージャージー州）］を用いて麻酔をかけた。ラットの２／３は、背部接近法(dorsalapproach)を用いて両側の卵巣を摘出した。卵巣摘出後３週間、卵巣摘出された動物の部分集合（Ｅ2置換グループ）は、コレステロール（ステラロイド・インク、ニューハンプシャー州ウィルトン）と17-βエストラジオールの１：１混合物を含有する、皮下に埋め込められた５mmのシラスチック（登録商標名）（ダウ・コーニング、ミズーリー州ミッドランド）ペレットを収容した。拡散から生じるシラスチック管によるエストラジオールのデリバリーは、高濃度勾配及び、シラスチックペレットのまわりに時間に対して生じる繊維形成を下げ、拡散を低減させる。卵巣摘出後、Ｅ2置換の管理を２又は25週間維持し、その後に３週間休止期間にした。卵巣摘出して５週間及び28週間後、動物を行動上の試験をした。長期の処理管理において、シラスチック（登録商標）ペレットを２乃至３週間毎に除去し置き直し、シラスチックからのＥ2拡散を維持した。卵巣摘出グループは、２乃至３週間毎に同様に置き換えた偽(sham)ペレットを受けた。埋め込みの前にＥ2及び偽ペレットを100％のエタノールで２回洗滌し、次に室温でＰＢＳにおいて48時間インキュベーションした。得られた実験グループは、卵巣が処理されていない（無処置）（INTACT）、卵巣摘出された(OVX)（５又は28週間）及びエストラジオール置換された（Ｅ2ペレット）であった。
【００８４】
（行動試験；活性回避）
学習を評価するために、MountonらによるBrain Research、444巻、104-108頁（1988年）に記載された両側性活性回避パラダイムを用いた。動物の３つのすべてのグループを連続して14日間試験し、１日は15の試験から成っていた。各試験は１分間続き、最初の５秒間条件刺激の刺激性授与そして７秒間の間隔、続いて1.4mAの電気の２秒継続時間、脚におけるショックから成った（光と音の合図）。成功した学習を、正しい応答、すなわち「回避」の数により決定し、脚のショック開始前に、各試験最初の12秒間内に移動箱の片側から他に移動すると定義した。異なる処理グループにおける動物間での潜在的動機付け差異を評価するために、「移動しない」数も記録した。このパラメーターは、電気的ショックでの刺激時に動物が移動箱の片側から他に移動しない試験の数を記載する。
【００８５】
（統計的分析）
行動データーは、Kruskal-Wallisの変動の片側分析（one-wayanalysis ovariance）及びグループの差異の評価のためにMann WhitneyＵ試験を用いて非母数的に分析した。
【００８６】
（結果）
ＯＶＸ動物に比較して無処置動物及びＥ2ペレット動物は、両側性活性回避パラダイムにおいてより良好に行動した。図４及び５は、動物の３つのグループにおいて５週間及び28週間の終りに開始する14日の試験期間の間、各動物によりなされた回避の総数の平均を示している。ＯＶＸラットは、無処置の動物に比べ、回避の数において59％の低下を示したが、この差異は有意ではなかった。ＯＶＸラットのＥ2置換は、ＯＶＸグループに比べて回避の数において8.5倍の増加をもたらした。それらの同じ動物がそれぞれの処理で維持され、28週間行動において試験されたときに、５週間の試験期間に比べ、すべてのグループにおいて回避の総数は増加した。しかし、この28週間試験時点で、ＯＶＸは61％、回避の総数を有意に低下させ、ＯＶＸラットに対して4.5倍回避を増加させた。さらに、Ｅ2ペレットラットは、28週間での学習の割合において、試験の1.3±0.3日による所定の日において可能な15回のうち11回、正しく行動する基準をなす注目される促進を示した（表５）。完全な無処置ラットは、基準に達するために９±2.8日を要し、学習における促進を示さなかった。ＯＶＸ動物は、基準に達するまで９±2.8日を要し、学習において促進を示した。ＯＶＸ動物は、割り当てられた14日において仕事を学習することに対する無能力を維持し、従って、15日の値を指定された。
【００８７】
５週間及び28週間において、各グループにおけるラットは活性回避における進歩の相対的順番を維持し、すべての動物は、第一試験よりも第二試験においてより良く遂行された（図４及び５）。パラダイムに対する第二暴露におけるこの増大された性能は、第一試験中に学習した行動の想起を映すものであるようである。この長期の記憶は特にＥ2ペレットグループにおいて明らかであり、28週間の時点では、1.3±0.3日において性能基準に達した（表５）。低用量のＥ2に対する慢性暴露により、この活性回避パラダイムの刺激の他に長期の記憶が増大されたようである。
【００８８】
【表５】
2005290007.tif 000010
#Ｐ≦0.05対卵巣摘出された動物及び無処置の動物
#Mann-Whitney Ｕ非母数的統計を用いたＰ≦0.05対卵巣摘出された動物。
【００８９】
（実施例３ｂ：神経化学的評価は、エストラジオールの神経保護効果を示す。）
細胞保護効果が生体内に検知され、行動改善と相関づけられるか否か確立するために、通常、健康なコリン作動性ニューロンにより生成される酵素における生化学的試験を行った。
【００９０】
（実験デザイン）
ニューロンの生存力を測定するために２つの評価法が用いられた。それらの評価法は、高親和性コリン取り込み（ＨＡＣＵ）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChＡＴ）活性であった。ＨＡＣＵをラットの前頭皮質及び海馬の両方からの組織において行なった。卵巣摘出又はＥ2置換の結果として起こる行動（活性回避行動）におけるそしてコリン作動性ニューロンの活性（ＨＡＣＵ）及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChＡＴ）活性における時間の異なる長さの効果を測定した。
【００９１】
メスのSprague-Daweyラットを卵巣摘出（ＯＶＸ）するのみか又は卵巣摘出して３週間の後、17-β-エストラジオール（Ｅ2ペレット）を含有するシラスチックペレット皮下埋め込みを行い、Ｅ2の生理的レベルまでの置換を生じさせた。卵巣が完全な動物を正の対照とした。
【００９２】
前頭皮質及び海馬における活性回避行動及びコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChＡＴ）活性を、卵巣摘出後５週間でそして28週間で評価し、一方、高親和性コリン取り込み（ＨＡＣＵ）を５週間時点でのみ測定した。
【００９３】
（活性回避試験）
この試験は、実施例３ａに記載されたように行なわれた。
【００９４】
（生化学的分析）
(a)血漿エストラジオール評価
行動試験の後又は、試験されない動物の場合は治療期間の後に、動物の首を切り、血液幹（trunk blood）の血液を得た。その血液を13,500×ｇで1.5分間遠心分離し、得られた血漿を異なる管に入れて後日でのエストラジオール量決定のための試料にした。Ｅ2の血漿濃度を、ダイアグノスチック・プロダクト・コーポレーション(DiagnosticProduct Corp.、カリフォルニア州ロスアンゼルス）により供給される市販のキットを用いて評価した。評価の検知性の範囲は、20乃至3600pg/mlであった。すべての試料を単一の検定で定量した。
【００９５】
(b)高親和性コリン取り込み（ＨＡＣＵ）
ＨＡＣＵを行動の実験を受けたことがない動物において評価した。首切りの後に脳を頭葢から取り出し、氷で冷却した面においた。次に、前頭皮質と海馬を切開し、氷で冷却した0.32Ｍのスクロース緩衝液（0.32Ｍのスクロース、1.0mMのＥＤＴＡ、100μＭのＴＲＩＳ-HCl、ｐＨ＝４℃で7.4）中にすぐ入れた。切開された組織領域に対する平均の湿重量は、前頭皮質及び海馬についてそれぞれ０mgと100mgであった。次に、組織試料を400ｒｐｍにおけるダンス型ホモジェナイザーで均質化した。続いて均質化した試料を４℃において1000×ｇで８分間遠心分離をした。この回転の後に、ろ液を捨て、得られたペレット（Ｐ２フラクション）を２mlの冷却された酸素化クレブス緩衝液（130ｍＭのNaCl、５mMのＫCl、13mMのNaHCO3、１mMのMgCl2、1mMのNaH2PO4、10mMのグルコース、1mMのCaCl2そして95％のＯ2／５％のCO2で15分間酸素化された）中に再懸濁させた。高親和性コリン取り込みを１μＭの[3H]-コリン（最終特異活性：4.5Ci/ミリモル、ニューイングランド・ニュクリアー（NewEngland Nuclear、マサチュセッツ州、ケンブリッジ）の存在下で３つのもので決定した。非特異性取り込みを５μｇのヘミコリニウム-3［シグマ・ケミカル・コーポレーション（ミズーリー州セントルイス）］を添加することにより見積もった。
【００９６】
それらのヘミコリニウム-3値を総計数から引いて高親和性値を出した。各反応管は、200μｇのＰ２懸濁液を含有した。用いない組織を次のChＡＴ活性及び蛋白質量の決定のために−30℃で保存した。Ｐ２製剤における蛋白質の分析を、クーマシーブルー染色剤(5)を用いるBradfordの方法により行った。
【００９７】
無処置対ＯＶＸ及びＯＶＸ対Ｅ2処理について、２つの別の研究について各々一度しか評価していないので、ＨＡＣＵ差をｔ試験を用いて分析した。他の神経化学的分析のために分散分析法（ＡＮＯＶＡ）を用いた。シェッフェの因果関係試験（Scheffe's post-hoc test）を用いてグループ間の多数の比較を行った。
【００９８】
(C)ChＡＴ評価
行動について実験を行っていない動物（５週間グループ）と行動について試験を行った動物（28週間グループ）の両方についてChＡＴ活性を決定した。FonnumによるJ．Neurochem．、24巻、407-409頁（1975年）の変更版を行ってChＡＴを評価した。Ｐ２試料を溶かし、１％の1-ブタノールの存在下で超音波処理を行いそして13000×ｇにおいて５分間遠心分離を行った。得られたろ液20μｌを各反応管に用いた。この反応混合物は0.28mMの[3H]-ACoA［特異活性：45μCi／モル、ニューイングランド・ニュクリアー（マサチュセッツ州ケンブリッジ）］、7.8mMの塩化コリン及び0.2mMのフィゾスチグミン［シグマ・ケミカル・コーポレーション（ミズーリー州セントルイス）］を含有した。[3H]-ACoAでのインキュベーションを30分間行った。ｐＨ8.6における、氷で冷却したグリシル-グリシン緩衝液(GLY-GLY)の添加により反応を停止させた。４℃での10分間インキュベーションの後に、ブチロニトリル(10mg/ml)中に溶解したテトラフェニルホウ素を反応管に添加しアセチルコリン（ＡCh）の液体カチオン交換抽出をさせた。
【００９９】
試料を渦巻き運動及び、桶状遠心分離機で低速度（185×ｇ）で５分間遠心分離に付し、有機相及び水性相を沈降させ、分離した。次に100μｇの有機相を試料として７ml容のシンチレーション瓶に入れ、４mlのシンチレーション流体［リクイシント（Lquiscint）（登録商標）、ナショナル・ダイアグノスチックス（NationalDiagnostics）、ジョージア州アトランタ］を添加した。次に瓶をハウレット-パッカード（Hewlett-Packard）シンチレーションカウンターで各々５分間カウントし、ｄｐｍをピコモル（pmoles）に変換し、値を蛋白質含量について標準化した。
【０１００】
結果
(a)エストラジオール濃度
血清Ｅ2濃度は、無処置グループ及びＥ2ペレットグループに関してそれぞれ43±10及び36±５pg／mlであった。卵巣摘出されたものは、試料にした、すべてのしかし５匹の動物において血清Ｅ2濃度を用いたラジオイムノアッセイの感度（20pg／mg）未満に低減した。しかし、それらの５匹の動物は、ラジオイムノアッセイの感度限界に非常に近い血清レベルを有していた。
【０１０１】
(b)高親和性コリン取り込み
卵巣摘出したものは、前頭皮質では24％（図６）、海馬では34％（図７）、ＨＡＣＵを有意に低減した。Ｅ2置換は、前頭皮質では82％（図６）、海馬では46％（図７）、ＨＡＣＵを増加させ、卵巣摘出されたもののこの影響の反転を生じた。ＨＡＣＵは、コリン作動性活性の尺度であるので、これらの結果から、エストラジオール が前頭皮質及び海馬におけるコリン作動性活性の低下を反転させること及び、これらの領域に対してコリン作動性の白色神経繊維(projections)をさらに刺激することが結論付けられた。
【０１０２】
(c) コリンアセチルトランスフェラーゼ活性
前頭皮質において、卵巣摘出後５週間の時点でChＡＴにおける有意な差は検知されなかった。28週間の時点では、前頭皮質におけるChＡＴレベルは、無処置グループ及びＯＶＸグループにおいて、それぞれ61％及び56％低減させた。しかし、Ｅ2ペレットグループでは、この減少は16％のみであった。海馬では、卵巣摘出後５週間は、ChＡＴにおいて有意な減少をさせるのに十分な期間であり、Ｅ2置換の３週間でこの影響を反転させた（表７）。無処置動物及びＯＶＸ動物における５乃至28週間での海馬ChＡＴ活性における低減は、前頭皮質に見られるのに匹敵した。Ｅ2動物において、海馬ChＡＴ活性の損失は、前頭皮質において見られるものよりも大きかったが、ＯＶＸの動物又は無処置の動物に見られるよりも少なかった。
【０１０３】
【表６】
2005290007.tif 000011
５週期間に対する卵巣摘出されたグループ及びＥ2ペレットグループではｎ＝６
５週期間に対する無処置グループではｎ＝５
28週間に対するすべての処理グループでｎ＝６
*ｐ≦0.05対無処置グループ及びＯＶＸグループ
【０１０４】
【表７】
2005290007.tif 000012
５週期間に対する卵巣摘出されたグループ及びＥ2ペレットグループではｎ＝６
５週期間に対する無処置グループではｎ＝５
28週間に対するすべての処理グループでｎ＝６
*ｐ≦0.05対無処置グループ及びＥ2ペレット。
【０１０５】
（実施例４ａ：その場での雑種形成は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ｍＲＮＡの増加量はエストラジオールにより刺激されることを示す。）
本実施例は、エストロゲンは、ＢＤＮＦのような神経栄養因子の生成を刺激することを示す。
【０１０６】
（実験デザイン）
動物を12週間卵巣摘出し、一方、Ｅ2処理された動物を３週間卵巣摘出し、次に９週間のＥ2処理を行った。第２組の動物を28週間卵巣摘出し、Ｅ2処理動物を同様に３週間卵巣摘出し、25週間のＥ2置換を行った。無処置の対照動物について各組の動物と平行して実施した。ラットを、0.1Ｍの燐酸緩衝液中４％のペントバルビタールナトリウムで強く鎮静した。翌日、頭葢から脳を取り出し、一連の溶液（４℃において冷４％パラホルムアルデヒド溶液に２日間続いて、20％（重量／容量のスクロースを含有する４％パラホルムアルデヒド溶液）に浸した。
【０１０７】
スクロース溶液から取り出した後に、脳を神経遮断（blocked）（臭球、脳幹及び小脳を除去）し、ドライアイスで凍結し、使用するときまで−80℃においてすぐに保存した。ミクロトームを用いて25μｍの脳のスライスにし、４％のパラホルムアルデヒド溶液中に入れた。３週間以内に、そのスライスを、GellらによりScience、245巻、758-761頁（1989年）に記載された方法により雑種形成した。ＢＤＮＦプローブは、全アミノ酸コード領域に相当する、750b.p．のラットＢＤＮＦ  ｃＤＮＡであった。そのプローブを、Ｔ３ポリメラーゼキットを用いて35Ｓで標識した。雑種形成したスライスをベクタボンド（Vectabond）処理戴物ガラスにのせ、４日間、オートラジオグラフィーフィルムに暴露した。各スライスにおける放射能信号（雑種形成信号）の変化する強度をフイルムにおいて異なる光学密度に変え、ＢＲＳ２イメージングシステム（ImagingSystem）［イメージング・リサーチ・インク（Imaging Research Inc．）］を用いて分析した。相対する光学密度及びバックグラウンドレベルを記録した。信号を、脳のスライスに隣接したフイルムの部分により評価した平均バックグラウンドレベルで割った。用いた映像系において、光学密度が高ければ高いほど、信号は低い。
【０１０８】
それ自体、データーの提示を容易にするために、ノイズに対する信号の割合の逆数にデーターを変換した。
【０１０９】
（結果）
卵巣摘出された動物は、無処置の動物対照に比べ、皮質部分においてＢＤＮＦの有意な減少を生じた。卵巣摘出したラットのエストラジオール置換により、無処置の対照に通常観察されるＢＤＮＦ信号よりＢＤＮＦ信号が増加された。表８におけるデーターは、各処理グループにおける動物の大脳皮質の複数のスライスがＢＤＮＦ合成においてエストロゲンの刺激効果を示すことを導いた。
【０１１０】
【表８】
2005290007.tif 000013
*ｐ≦0.05対無処置動物及びＥ2ペレット動物。
【０１１１】
（実施例４ｂ：生体内研究により、エストラジオールにより刺激されたＮＧＦｍＲＮＡの増大したレベルが示される。）
本実施例は、エストロゲンが、ＮＧＦのような神経栄養成長因子の生成を刺激できることを示す。実施例４ａにおけるのと同様に処理された動物を用いて、ドットブロット技術を用いるＮＧＦ  ｍＲＮＡの量を測定した。動物を12週間卵巣摘出し、一方、Ｅ2処理された動物を３週間卵巣摘出し、Ｅ2処理を９週間行った。ＲＮＡをチオシアン酸グアニジンを用いて、続いてフェノール／クロロホルム抽出により前頭皮質及び海馬から単離した。ドットブロット技術の使用は、ノーザンブロットを行うことにより、最初に確認され、ＮＧＦの全プレープロ配列を認識する771b.p．のＮＧＦプローブでの雑種形成は、ＮＧＦ  ｍＲＮＡの長さに相当する単一のバンドを生じることを保証した。ＮＧＦ  ｍＲＮＡ信号を次のアクチン雑種形成により生成された信号の量により見積もられた充填れたＲＮＡの量に対して標準化された。
【０１１２】
卵巣摘出の３か月の後に、前頭皮質におけるＮＧＦ  ｍＲＮＡ量は有意に低減した（45％）（表９）。ＯＶＸグループとは非統計的に有意ではないが、Ｅ2処理は部分的回復を生じた。この検知法を用いて、海馬ＮＧＦ  ｍＲＮＡが対照とは異ならないことが見出された。しかし、Ｅ2処理は、ＮＧＦ  ｍＲＮＡ量の有意な増加を生じた（表９）。
【０１１３】
【表９】
2005290007.tif 000014
#ｐ≦0.05対無処置
*ｐ≦0.05対卵巣摘出された。
【０１１４】
（実施例５：刺激性アミノ酸神経毒性におけるエストロゲンの生体内効果についての提示された評価）
成長したメスのラットを卵巣摘出し、２週間後に、コレステロール（対照）又はエストラジオールを正常の範囲において血漿エストラジオール量を高めるのに十分な量含有するシラスチックペレットで処理した。そのようなエストロゲン置換治療の１乃至２週間後、ラットに、脳の神経の広範囲の毒性を引き起こす量のN-メチル-D-アスパラギン酸又は人工脳脊髄液の大脳内注射をした。
【０１１５】
この研究の終りとして、海馬ＣＡＩ領域におけるニューロンの数及び大脳皮質におけるニューロンの数を決定した。その他に、コリンアセチルトランスフェラーゼ、コリン作動性ニューロンのマーカー酵素の検索のために両領域における神経末端を染色した。
【０１１６】
エストロゲン置換治療により海馬内及び大脳皮質内の神経細胞の損失を低減するかなくすことが予測される。そのような結果により、生理学的エストロゲン置換は、脳細胞を刺激性アミノ酸の神経毒性効果から保護することが教示される。
【０１１７】
（実施例６：エストロゲンが脳内における部位で大脳のグルコースを増加させる。）
選ばれた動物モデルについて、種々の数のエステラジオールベンゾエート（Ｅ2Ｂ）受容体を含有する種々の脳領域における大脳のグルコース取り込みにおけるエストラジオールベンゾエートの効果を記載し、エストラジオールベンゾエートの存在下で脳に輸送されたグルコースの量における増加に関する決定も記載する。
【０１１８】
メスのラットを両側の卵巣を摘出し、内生的なエストロゲンをなくし、２乃至３週間後に、麻酔をかけていないラットにＣ14-2-デオキシグルコース(Ｃ14-2-DG)の静脈内投与のための心房カニューレを埋めこんだ。研究を開始する前に、４乃至５日間、動物をカニューレ挿入から回復させた。
【０１１９】
実験の当日、動物をランダムに、下記の用量及び時間で皮下内に投与される油中Ｅ2Ｂ又は油のみ（対照）を受けるグループに割り当てた。初期の研究では、動物を油又はＥ2Ｂ（10μ／kg体重）で処理し、２、４、８、12又は24時間において殺した。付加的な研究では、ラットを、１、10、又は100μ／kg体重の用量で油又はＥ2Ｂで処理し、４時間後に殺した。殺す前に、45分間、すべてのラットに、Ｃ14-2-デオキシグルコース［25μCi／ml塩水／kg体重、特異活性49-53mCi／ミリモル、ニューイングランド・ニュクレアー（NewEngland Nuclear）、マサチュセッツ州ボストン］の心房カニューレにより単一の注射をした。
【０１２０】
血液脳関門を通過するグルコースの輸送におけるＥ2Ｂの効果を評価するために、オルデンドルフ（Oldendorf）の技術［オルデンドルフによるブレイン・リサーチ（BrainRes.）、24巻、37-46頁（1970年）及びAm．J．Physiol．、221巻、1629-1638頁（1971年）］を用いた。１μCi／mlのＣ14-2-DG（特異活性49-53Ci／ミリモル、ニューイングランド・ニュクリアー、マサチュセッツ州ボストン）及び約５μCi／mlの3Ｈ2Ｏ（特異活性１mCi／ml、ニューイングランド・ニュクリアー、マサチュセッツ州ボストン）を、10mMのＨＥＰＥＳでｐＨ7.4に緩衝されたクレブスリンゲルホスフェート溶液と混合し、メスのラットの頸動脈に注射した。
【０１２１】
注射15秒後、動物を断頭により殺し、血管幹（trunk）血液を、Ｅ2Ｂ血清濃度の後の評価のために回収し、内基底視床下部（medialbasal hypothalamus）（ＭＢＨ）、視束前領域（preoptic area）（ＰＯＡ）、皮質、海馬、線状体（striatum）、小脳及び脳幹の領域の剖検のために、頭葢から取り出した。下垂体前葉（ＡＰ）も頭葢から単離した。Growinski及びIversenの方法［Glowinskiらによる、J．Neurochem．、13巻、655-669頁（1966年）］により脳組織の剖検を行った。組織をすぐに秤量し、調査分析のためにシンチレーション瓶に入れた。
【０１２２】
この研究において用いた組織のmg重量（平均±ＳＥＭ）は、ＭＢＨ＝13.4±1.3、ＰＯＡ＝10.5±0.5、皮質＝38.7±3、海馬＝27.7±1.7、線状体＝24.3±2、小脳＝32.5±1.9、脳幹＝32.9±1.9及び下垂体前葉＝8.6±0.6であった。
【０１２３】
工程の間、末梢血漿グルコース値は、90-120mg％の正常範囲であった。
【０１２４】
その代わりとして、脳の半分を中脳に対し嘴状にそして注射側に対して同側性に切開し、組織を20ゲイジの針に通し、試料を通常の消化に付し、次に、上記のように液体シンチレーションカウンティングのために調製した。もとのアイソトープ混合物の試料は、注射の注射器における残存する混合物を回収することにより得られた。次に部分試料及び組織試料を通常の液体シンチレーションカウンティングによりＨ3及びＣ14を計数した。抽出（Ｅ）に関する下記の式を用いて有効性をカウントするために矯正した後に脳取り込み指数（BrainUptake Index）（ＢＵＩ）により取り込みを計算した。
【数１】
2005290007.tif 000015
【０１２５】
表９は、１つの実験から出たデーターの試料を提供する。グルコース取り込みにおけるＥ2Ｂの時間又は用量効果の評価を片側性ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【０１２６】
因果関係比較をダンネット試験（Dunntt's tests）を用いて行った。ｄｐｍｓをＥ2Ｂ処理グループについてその対照（油）グループと評価された各用量及び各時点において比較することにより統計的分析を生のデーター（ｄｍｓＣ14／mg）において行った。次に、提示を明らかにするために、生のデーターを平均対照の％として表わした。各Ｅ2Ｂ処理された動物の応答の大きさを油で処理した対照グループにおける2-ＤＧの平均値に対する2-ＤＧの増加割合を計算することにより決定した。ＢＵＩデーターを片側ｔ試験により個々の試料について分析した。統計的な差をすべての試験についてｐ＜0.05に設定した。
【０１２７】
グルコース取り込みについてのＥ2Ｂの10μｇ／kg体重用量の効果の時間経過を表10に示す。全体的に、卵巣摘出したラットは検査した８領域のうち７領域において20乃至120％Ｅ2Ｂはグルコース取り込みを有意に増加させた。しかし、有意な増加が観察された時間は領域間で変化した。８つの領域のうち５つ、ＰＯＡ、海馬、線状体及び下垂体前葉では、ピークＥ2Ｂ効果は２乃至４時間で観察され、２つの領域（中央基底視床下部及び大脳皮質）は、12時間でピーク効果を示した。５つの領域は、Ｅ2Ｂにより引き起こされて増加の後のいくつかの時点においてグルコース取り込みにおいて有意な減少を示した。それらの領域は、ＰＯＡ、海馬、線状体、小脳及びＡＰであった。脳幹グルコース取り込みにおいてＥ2Ｂの有意な効果は観察されなかった。
【０１２８】
Ｅ2Ｂ注射４時間後における脳グルコース取り込みにおけるＥ2Ｂ効果の用量依存性が表11に示されている。対照的に、Ｅ2Ｂの10μ／kg用量は、４時間の時点で、８領域のうちの６領域においてグルコース取り込みを増加させた。さらに、２つの領域、ＭＢＨとＰＯＡのみが、100μｇ／kgにおいて取り込みを増加させた。検査した他のすべての領域は、低減したグループ取り込みを示し、線状体、小脳及び脳幹は、有意な減少を示した。
【０１２９】
Ｅ2Ｂ注射の４時間後の用量依存様式で増加させる血清Ｅ2濃度が見出された。１μｇ／kgのＥ2Ｂ用量は、卵巣摘出されたラットに観察された量より血清Ｅ2Ｂ量を増加させず、10μｇ／kg用量は血清Ｅ2Ｂ量を正常の範囲に増加させ、そして100μｇ／kg用量は血清Ｅ2Ｂ量を、交尾前駆期におけるピーク血清Ｅ2Ｂ濃度の間に見られる量の12乃至30倍であった。Ｅ2Ｂの10μｇ／kg用量の投与後４時間でピーク血清Ｅ2Ｂ量が観察された。
【０１３０】
オルデンドルフ法を用いるＢＵＩの評価は、Ｅ2Ｂに対する４時間暴露により、約40％、血液脳関門を通過するグルコースの輸送を増加させることを示した。
【０１３１】
ＢＵＩにおける40％の増加は、Ｃ14-2-ＤＧ抽出におけるＥ2Ｂによる増加により伴われ、血液脳関門を通過する3Ｈ2Ｏ抽出において変化はなかった（表12）
エストロゲン置換治療により、海馬における及び大脳皮質における神経細胞の損失を低減させるかなくすことが予測される。そのような結果は、生理学的エストロゲン置換は、低血糖症の神経毒性効果から脳細胞を保護することを示している。
【０１３２】
本発明の特定の好ましい態様を記載したが、本発明の精神及び範囲は、先に記載したものに決して限定されない。例えば、実施例は、ラット及び培養された細胞において成された実験を記載しているが、それらは、ヒトにおける化合物の活性を予測するための正確なモデルであると考えられている。
【０１３３】
【表１０】
2005290007.tif 000016
*脳領域内のp<0.05対対照。時間における効果の評価を片側性ANOVAにより行なった。分析後そして、表示の明白性のためにデーターを対照の平均値の％に変換した。
【０１３４】
【表１１】
2005290007.tif 000017
*p<0.05対対照値。用量における効果の評価を片側性ANOVAにより行なった。ダンネット(Dunnett´s)試験により、時間との因果関係(posthoc)の比較を行なった。分析後そして、表示の明白性のためにデーターを対照の平均の％に変換した。
【０１３５】
【表１２】
2005290007.tif 000018
*油の対照と比較したときのp＜0.05。
個々の試料についてのt-試験で分析、n=7、平均±SEM.
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
上記のそして他の特徴は、下記の記載、請求の範囲及び図面に関連してより良好に理解される。
【図１】図１は、第一期の皮質ニューロン培養物における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）の年齢相関放出における、17β-エストラジオール（Ｅ2）の効果の柱状グラフを示している。
【図２】図２は、Ｃ6細胞における種々のレベルの低血糖症により誘因される細胞毒性におけるＥ2の保護効果の柱状グラフを示している。
【図３】図３は、神経母細胞腫細胞におけるN-メチル-D-アスパラテート（ＮＭＤＡ）の細胞毒性効果にけるＥ2の保護効果の柱状グラフを示している。
【図４】図４は、無処置（intact）動物、卵巣摘出された動物及びＥ2で置換された動物における卵巣摘出５週間後の活性回避性能を示している。
【図５】図５は、無処置動物、卵巣摘出された動物及びＥ2で置換された動物における卵巣摘出28週間後の活性回避性能を示している。
【図６】図６は、行動的に過敏なラットの前頭皮質における高親和性コリンの取り込みにおける５週間の卵巣摘出及びＥ2置換の効果を示している。
【図７】図７は、行動的に実験を受けていない（behaviorally naive）ラットの、海馬における高親和性コリンの取り込みにおける５週間の卵巣摘出及びＥ2置換の効果を示している。
【図８】図８は、24時間における及び8(b)は48時間におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の生存力におけるα-Ｅ2の保護効果を示している。
【図９Ａ】図９は、神経保護物質として作用できるα-及びβ-エストラジオールの分子構造の例を示している。
【図９Ｂ】（図９−１の続き）。
【図１】
2005290007.tif 000019
【図２】
2005290007.tif 000020
【図３】
2005290007.tif 000021
【図４】
2005290007.tif 000022
【図５】
2005290007.tif 000023
【図６】
2005290007.tif 000024
【図７】
2005290007.tif 000025
【図８】
2005290007.tif 000026
【図９Ａ】
2005290007.tif 000027
【図９Ｂ】
2005290007.tif 000028