(57)【要約】【課題】  新規な骨粗鬆症発症リスクの検出方法を提供する。【解決手段】  被験者の染色体上のミトコンドリアα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素（DLST）遺伝子において、両対立遺伝子のうち少なくとも一方の対立遺伝子が、その第１９１１７番目の塩基がアデニンであり、かつ第１９１８３番目の塩基がシトシンである配列を有するものであるか否かを解析する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の染色体上のミトコンドリアα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素（DLST）遺伝子において、両対立遺伝子のうち少なくとも一方の対立遺伝子が、その第１９１１７番目の塩基がアデニンであり、かつ第１９１８３番目の塩基がシトシンである配列を有するものであるか否かを解析することを含む、骨粗鬆症発症リスクの判定方法。
【請求項２】
被験者の染色体上のミトコンドリアα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素遺伝子を、被験者から分離した組織から抽出して解析することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者から分離した組織が末梢血であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症の診断ならびに／または骨粗鬆症および／もしくは骨折リスクの予測を迅速、簡便かつ正確に行うことができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類動物のα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体（KGDHC）はミトコンドリア中に存在し、クレブス回路において、α−ケトグルタル酸の酸化的脱カルボキシル化の律速段階を触媒してサクシニル−ＣｏＡを合成するものである。この複合体は、３つの異なる酵素、すなわち、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロリポアミド脱水素酵素、及び中核酵素であるジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素（DLST）からなる。本発明者らの研究により、ヒトDLSTは、15エクソンからなる遺伝子によってコードされており、ヒトDLST遺伝子には３つの多型が存在することも判っている（非特許文献１参照）。すなわち、ヒトDLST遺伝子のエクソン１の最も上流の残基から数えて第１９１１７番目の塩基がアデニン（A）かグアニン（G）であり、第１９１８３番目の塩基はチミン（T）かシトシン（C）であるため、これらの組み合わせにより、第１９１１７番目の塩基がAで、かつ第１９１８３番目の塩基がCであるac型、第１９１１７番目の塩基がAで、かつ第１９１８３番目の塩基がTであるat型、および第１９１１７番目の塩基がGで、かつ第１９１８３番目の塩基がCであるgc型の3種の多型が存在し、ac型は他の遺伝子型に比べてアルツハイマー病の発症リスクが高いことも本発明者らにより見出されている（特許文献１、および非特許文献１参照）。したがって、ヒトDLST遺伝子の第１９１１７番目の塩基および第１９１８３番目の塩基を調べることによりアルツハマー病の発症リスクを測定する方法が本発明者らにより発明され、特許文献１に開示されている。なお、第１９１１７番目の塩基はイントロン１３内に位置し、第１９１８３番目の塩基はエクソン１４内に位置する。第１９１８３番目の塩基はエクソン内に位置するが、この塩基は第３６６番目のコドン（Gly）内の３番目の塩基であり、この塩基の変異によってアミノ酸の変異は起きない。
【０００３】
骨粗鬆症は骨組成が正常なまま骨密度が減少することを特徴とし、性別では特に女性に多く見られる疾患である。特に４０歳代以降の女性には閉経に伴う閉経後骨粗鬆症が高い頻度で見られる。また、男女を問わず、５０歳代から骨密度の低下が起こり、７０歳代以降には老人性骨粗鬆症が見られるようになる。骨密度の減少が進行すると、骨折や骨変形を起こしやすくなるため患者の生活の質に多大な影響を与える疾患であるが、骨密度の減少が軽度である間は、際立った臨床症状が認められないため発見されにくい疾患である。閉経後骨粗鬆症や老人性骨粗鬆症をはじめとする種々の骨粗鬆症の発症リスクを予見し、発症リスクの高い人については発症前からの予防を行うことが非常に有効であるが、現在のところ、その発症リスクを診断する方法は、TGF-β遺伝子のエクソン１のコドン10の変異を検出する方法が開示されている（特許文献２参照）。しかしながら、かかる遺伝子の変異のみでは、骨粗鬆症の発症リスクの検出方法として完全ではなく、さらに他の遺伝子に基づく発症リスクの検出方法が求められていた。
【０００４】
【特許文献１】特開平11-308996号公報
【特許文献２】特開2000-270879号公報
【非特許文献１】Nakano, K.ら、Lancet 350 1367-1368 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明では、アルツハイマー病と並ぶ代表的な老化関連疾患である骨粗鬆症の発症リスクと上記遺伝子多型との関連性について調べたところ、40〜59歳のヒトでは、両対立遺伝子のうち少なくとも一方が、その第１９１１７番目の塩基がAであり、かつ第１９１８３番目の塩基がCである対立遺伝子である被験者群では、他の多型タイプを有するヒトに比べて骨密度の低下が進んでおり、骨粗鬆症の発症リスクが高いことが示された。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、上記知見に基づき、新たに、遺伝子診断による骨粗鬆症の発症リスクの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者は、鋭意研究の結果、DLST遺伝子の第１９１１７番目と第１９１８３番目の塩基がそれぞれAとCである遺伝子をもつヒトの骨密度が、有意に低下していることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ミトコンドリアα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素の遺伝子の第１９１１７番目及び第１９１８３番目の塩基が、少なくともひとつの対立遺伝子が上記順にA、Cになっているか否かを調べることから成る、骨粗鬆症の発症リスクの測定方法を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の態様：
１．少なくとも一方の対立遺伝子が、その第１９１１７番目の塩基がアデニンであり、かつ第１９１８３番目の塩基がシトシンである配列を有するものであるか否かを解析することを含む、骨粗鬆症発症リスクの判定方法；
２．被験者の染色体上のミトコンドリアα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体のジヒドロリポアミドサクシニル転移酵素遺伝子を、被験者から分離した組織から抽出して解析することを特徴とする、上記１記載の方法；
３．被験者から分離した組織が末梢血であることを特徴とする、上記２記載の方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規な遺伝子診断による骨粗鬆症の発症リスクの検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、被験者の組織を用いて実施することができ、該組織は被験者の任意の部位から採取することができ、染色体を単離することができるものであれば、いかなる組織、例えば毛髪、末梢血等でもよい。該組織を用いてゲノム中のDLST遺伝子の塩基配列を調べることができる。
【００１１】
DLST遺伝子の塩基配列はNakanoらの文献（Nakano,Kら、Eur. Biochem. 1994;224: 179-189）に記載されており、該遺伝子の第１９１１７番目および第１９１８３番目の塩基を調べることは常法により容易に行うことができる。例えば、目的の部位を含む断片をPCR等の核酸増幅法により増幅し、増幅断片の塩基配列を決定することにより行うことができる。あるいは、増幅断片について周知のPCR-SSPC法を行うことにより調べることができる。あるいは、正常遺伝子及び変異遺伝子における塩基も上記の通り判明しているので、増幅断片についてミスマッチプローブ又はミスマッチプライマーを用いた周知の点突然変異検出法を適用することにより調べることができる。あるいは、増幅断片について、上記部位の塩基の変異に基づいて制限酵素部位が生じたり消失したりする制限酵素を用いて常法であるPCR-RFLP法により行うこともできる。
【００１２】
かかる塩基を調べる方法は、最も直接的な方法である標的領域の塩基配列決定法（シークエンス法）、特定位置の塩基置換だけを検出する目的の場合に特に有効である20塩基程度の合成オリゴヌクレオチドと標的塩基配列とのハイブリッド形成の有無を利用したアレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法（MASA法）、標準RNAプローブと標準DNA断片とのハイブリッドをリボヌクレアーゼAで処理しミスマッチ位置でのプローブRNAの切断で塩基置換の存在とおよその位置を知るリボヌクレアーゼAミスマッチ切断法（RNaseプロテクション法）、ならびに、DNA配列をPCRで増幅する際にその一端にGCに富んだ塩基配列（GCクランプ）をつけて変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturing gradient gel electrophoresis：DGGE）を行い一塩基置換を検出する方法（PCR−DGGE法）などを用いることができる。
【００１３】
また、２本鎖DNA断片を１本鎖に解離させ、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することにより一塩基置換を移動度の差として検出する方法（PCR−SSCP法）、塩基配列特異的プローブ（SSOP）を用いたハイブリダイゼーション法（PCR−SSOP法）、およびその変法（PCR−RD法やPCR−MPH法）、ある領域をPCR法などで増幅した後に点突然変異が生じた部位を切断部位と認識する制限酵素で処理して点突然変異を生じなかったDNAとはサイズの違ったアリルとして検出するPCR−RFLP法（特開平5-308999号公報）、ならびに、標的DNAの3'末端のヌクレオチド部位に隣接する核酸配列に対して検出プライマーをアニールさせてDNAポリメラーゼを用いて検出するヌクレオチドに対して相補的であるシングルラベルのヌクレオチド三リン酸で該プライマーを伸長する方法（ミニシークエンシング法）等も用いることができる。
【００１４】
また、TaqManPCR法、インベーダー法等種々の公知のSNPタイピング法によっても検出することができる。例えば、TaqManPCR法による場合は、上記変異塩基部位に該当する位置を含み、その周囲の約20塩基程度の配列にマッチするよう設計したプローブを作製する。該プローブの5’末端には蛍光色素を、3’末端にはクエンチャーを付加し、さらに3’末端をリン酸化しておく。そして、該プローブを被検体から採取した組織サンプル(任意の組織であってよい)から抽出した鋳型DNAにハイブリダイズさせて、さらに該プローブ領域を増幅するように設計したPCRプライマーとTaqDNAポリメラーゼを用いてPCR反応を行う。TaqDNAポリメラーゼは5’ヌクレアーゼ活性を有しているため、プライマーからの伸長反応がプローブの5’末端に到達するとプローブの5’末端を切断する。これにより、蛍光色素がクエンチャーから離れて蛍光を発するようになる。該蛍光を計測することによりプローブが鋳型にハイブリダイズしていたか否かが判り、それにより上記第１９１１７番目の塩基がAであるか否か、第１９１８３番目の塩基がCであるか否かを、それぞれ解析することができる。TaqManPCR法の具体的な方法は、種々の文献に開示されている。
【００１５】
かかる解析に用いる最良の方法としては、PCR増幅および適切な制限酵素処理により、増幅産物の切断断片をゲル電気泳動により分離して検出することにより解析することができる。第１９１１７番目の塩基から第１９１８３番目の塩基までの領域を増幅し得るような位置にフォワードおよびリバースPCRプライマーを常法に従って設計する。被験者の組織から抽出したDNAをこれらのプライマー対を用いてPCR法により増幅させる。かかるPCRの条件は当業者が適宜設定することができる。
【００１６】
一塩基の変異を検出できる方法であれば、上記の方法に限定されることなく、本発明に用いることができる。
【００１７】
例えば、GGATTATGGACTGACTTTAGGTG（配列番号１）、GCATTTAGTTGGATTTCCCTTTC（配列番号２）のプライマー対を用いた場合、10ngのDNAを15μl中で2mM MgCl2存在下で、94℃にて30秒、55℃にて30秒、72℃にて30秒を35回繰り返し、DNA断片を増幅させることにより、309bpの増幅産物を得ることができる。
【００１８】
得られた増幅産物を適切な制限酵素、すなわち上記第１９１１７番目の塩基がAおよびGのどちらかである場合にのみかかる塩基を含む配列を認識する酵素で処理し、その切断断片の大きさをゲル電気泳動等で検出することにより、切断の有無により第１９１１７番目の塩基がAであるかCであるかを判定することができる。さらに、上記第１９１８３番目の塩基がCおよびTのどちらかである場合にのみかかる塩基を含む配列を認識する酵素で処理して同様に、第１９１８３番目の塩基がCであるかTであるかを判定することができる。
【００１９】
例えば、第１９１１４〜第１９１１９位の配列はCTTAATまたはCTTGATであるため、TTAAを認識して該部位で切断する制限酵素MseI、および第１９１８２〜第１９１８５位の配列はGCGGまたはGTGGであるため、GCGGを認識して該部位で切断する制限酵素AciIを用いるとよい。上記の309bpからなる増幅断片をMseIとAciIで処理し、その切断断片をゲル電気泳動にて分離した場合、該遺伝子がac型であれば200bpと68bpと41bpの断片が検出される。該遺伝子がat型であれば、268bpと41bpの断片が検出される。該遺伝子がgc型であれば、200bpと109bpの断片が検出される。
【００２０】
また、被験者が、ac、at、gc型のいずれか２つからなるヘテロ個体であった場合、両対立遺伝子の遺伝子型に由来するそれぞれの切断断片が検出される。例えば、ac/atの遺伝子型を有するヘテロ個体の場合は、268bp（at型に由来）200bp（ac型に由来）、68bp（ac型に由来）および41bp（atおよびac型に由来）の４つの断片が検出される。他の遺伝子型の組み合わせからなるヘテロ個体である場合も同様である。
【００２１】
したがって、ゲル電気泳動の泳動パターンから、その被験者が両対立遺伝子においてどのような遺伝子型を有しているか判定できる。すなわち、ac/acホモ個体ならびにac/atおよびac/gcのヘテロ個体は、いずれか一方または両方の対立遺伝子の第１９１１７番目の塩基がAでありかつ第１９１８３番目の塩基がCである（これら３つのタイプをacタイプと分類する）。一方、at/at、gc/gcホモ個体およびat/gcヘテロ個体は、第１９１１７番目の塩基がAであり第１９１８３番目の塩基がCである対立遺伝子を有していない（これら３つのタイプを非acタイプと分類する）。
【００２２】
上記acタイプのヒトは、非acタイプのヒトに比べて、40〜59歳における骨密度が低く、骨粗鬆症を発症しているかその予備軍であり将来的な発症リスクが高いと判定することができる。
【００２３】
なお、上記解析は、遺伝子の第１９１１７番目の塩基がAであるかA以外の塩基であるか、および第１９１８３番目の塩基がCであるかC以外の塩基であるかということを解析すればよく、これらの塩基が何であるかを特定する必要はない。
【００２４】
また、両対立遺伝子とも、第１９１１７番目の塩基がAであり第１９１８３番目の塩基がCであるacタイプの遺伝子を有するヒト、すなわちac型ホモ（ac/ac）のヒトはアルツハイマー病の発症リスクが高いことを、本発明者らは見出しており（特許文献１参照）、骨粗鬆症の発症リスクについても、やはりac型ホモ個体の方が、ac/at、ac/gcのヘテロ個体（これらの個体では、対立遺伝子のうちどちらかが、第１９１１７番目の塩基がA以外の塩基であるか、または第１９１８３番目の塩基がC以外の塩基である）に比べて高いことが、当然に推測され得る。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２６】
大府市民および東浦市民の中から無作為に抽出した被験者を年齢と性別で群別した。男女の数を同数にし、40歳から79歳までを対照として、40〜59歳、60〜79歳と各年齢層別に群分けし、骨密度（BMD）を測定した。
【００２７】
被験者のDLST遺伝子のハプロタイプの決定は、以下の方法により実施した。
被験者から採取した末梢血よりゲノムDNAを常法に従って抽出し、配列番号１に示す配列および配列番号２に示す配列を有するプライマー対を用いて、10ngのDNAを15μl中で2mM MgCl2存在下で、94℃にて30秒、55℃にて30秒、72℃にて30秒を35回繰り返し、DNA断片を増幅させた。増幅産物を制限酵素MseIおよびAciIで処理した後、10%アクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色により可視化することにより、該被験者のDLST遺伝子の遺伝子型を判定した。それぞれの遺伝子型の電気泳動パターンを図２に示す。その結果、ac/ac、ac/atおよびac/gcの遺伝子型を有する、すなわち両対立遺伝子のうち少なくともいずれか一方の第１９１１７番目の塩基がAでありかつ第１９１８３番目の塩基がCである被験者をacタイプ群と分類し、それ以外の遺伝子型（at/at、gc/gc、at/gc）を有する被験者を非acタイプ群と分類した。（なお、第１９１１７番目の塩基がGでありかつ第１９１８３番目の塩基がTである遺伝子を有するヒトは認められなかった。）
【００２８】
骨密度測定は、常法に従い定量的コンピュータ支援末梢骨断層撮影法で測定し、D50（海綿質骨を含む断層内部面積の50％についての橈骨遠位BMD）、D100（海綿質骨および皮質骨を含む断層全面積についての橈骨遠位BMD）、およびP100（海綿質骨および皮質骨を含む断層全面積についての橈骨近位BMD）として表した（図３）。腰椎（L2−L4）、右大腿骨頚部、右転子、右ワード三角部、および全身について、二重エネルギーX線吸収測定法より測定した（図４）。
【００２９】
図３および図４に示すように、40〜59歳の被験者群では、acタイプ群が、D50およびD100（図２参照）、非acタイプ群に比べて、測定した全部位の骨密度が有意に高かった。一方、60〜79歳の被験者群では、acタイプ群と非acタイプ群においていずれの結果でも有意差は検出されなかった（図３）。
被験者群のデータおよび測定結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
以上より、acタイプの遺伝子型を有するヒトは、比較的早期に骨密度の低下が始まり、骨粗鬆症の発症リスクが大きいことがわかった。したがって、DLST遺伝子が第１９１１７番目の塩基がAであるか否か、および第１９１８３番目の塩基がCであるか否かを解析することにより、骨粗鬆症の発症リスクが検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、DLSTの各遺伝子型のMseI-AciI消化産物の電気泳動パターンを示す。右側に、各バンドの塩基長を示す。左端のレーンは100bpラダーマーカーである。
【図２】図２は、D50（海綿質骨を含む断層内部面積の50％についての橈骨遠位BMD）、D100（海綿質骨および皮質骨を含む断層全面積についての橈骨遠位BMD）、およびP100（海綿質骨および皮質骨を含む断層全面積についての橈骨近位BMD）を測定した結果である。
【図３】図３は、全身、右大腿頚部、右ワード三角部、腰椎（L2−L4）および右転子の骨密度測定結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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