(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な糖代謝機能改善剤、詳しくは、インスリンシグナル伝達促進活性を有することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤を提供する。【解決手段】下記のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質又はそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；＜アミノ酸配列群＞（ａ）特定のアミノ酸配列、（ｂ）前記ａのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、（ｃ）前記ａのアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、（ｅ）前記ａのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質又はそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
インスリン様活性を亢進することを特徴とする、請求項１に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
インスリン様活性が、肝細胞又は筋肉細胞におけるインスリンシグナル伝達促進活性である、請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性又は筋肉細胞における糖取り込み促進活性である、請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項５】
インスリン様活性が、血糖降下作用である、請求項２に記載の治療剤又は予防剤。
【請求項６】
インスリン様活性の検定方法であって、
（１）筋肉細胞又は肝細胞と、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された測定値を、被験物質の代わりに下記の（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質を用いて前記第一工程及び第二工程を行った場合の測定値と比較し、被験物質のインスリン様活性が前記蛋白質のインスリン様活性と同等以上であることを指標として、被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程、
を有することを特徴とするインスリン様活性の検定方法；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列。
【請求項７】
インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である請求項６に記載の検定方法。
【請求項８】
インスリンシグナル伝達促進活性が、インスリン受容体、IRS-1、PI3キナーゼ又はAktのリン酸化量を指標として測定されることを特徴とする、請求項７に記載の検定方法。
【請求項９】
インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、請求項６に記載の検定方法。
【請求項１０】
インスリン様活性が、筋肉細胞への糖取り込み促進活性である、請求項６に記載の検定方法。
【請求項１１】
第一工程で使用される筋肉細胞が骨格筋細胞である、請求項６、７、８及び１０のいずれかに記載の検定方法。
【請求項１２】
第一工程で使用される肝細胞が株化肝細胞又は初代培養肝細胞である、請求項６〜９のいずれかに記載の検定方法。
【請求項１３】
被験物質が、下記の（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質又は該蛋白質をコードする遺伝子の発現を促進するか否かを指標とする、被験物質のインスリン様活性の検定方法；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列。
【請求項１４】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）  被験物質と、請求項１３に記載の蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現を亢進させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
【請求項１５】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）被験物質と、請求項１３に記載の蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現を亢進させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
【請求項１６】
下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）  被験物質と、請求項１３に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
【請求項１７】
インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の検定方法。
【請求項１８】
インスリン様活性が、筋肉細胞への糖取り込み促進活性である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の検定方法。
【請求項１９】
インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の検定方法。
【請求項２０】
請求項６〜１９のいずれかに記載の検定方法により測定された、被験物質のインスリン様活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の探索方法。
【請求項２１】
糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、筋肉細胞又は肝細胞におけるインスリンシグナル伝達促進剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の探索方法。
【請求項２２】
糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、筋肉細胞における糖取り込み促進剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の探索方法。
【請求項２３】
糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、肝臓における糖新生抑制剤であることを特徴とする、請求項２０に記載の探索方法。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれかに記載の探索方法により選抜された物質を有効成分して含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖代謝機能改善剤、詳しくは、筋肉における糖取り込み促進活性又は肝蔵における糖新生抑制活性等のインスリンシグナル伝達促進活性を有することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における糖代謝（糖の新生及びクリアランス）の恒常性が破綻した状態、特に高血糖状態が持続した病態が糖尿病である。糖尿病の病態の背景には、血糖調節ホルモンであるインスリンの分泌不全や作用不全があり、インスリン作用を是正あるいは代替することにより、糖代謝に密接に関連する疾患（糖代謝関連疾患）の治療または予防が可能となる。これまでに、糖代謝機能を改善する生体内物質（ホルモン）としてはインスリンが知られており、インスリン製剤が糖代謝機能の改善に用いられているが、更に優れた薬剤が求められている。
一方、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質は、脂肪蓄積症候群の診断に用いられること（特許文献１を参照）や、脂肪細胞において脂肪蓄積促進作用を有すること（特許文献２を参照）等が知られている。しかしながら、前記蛋白質のインスリン様活性については知られていなかった。
【特許文献１】国際公開第００／６２０７３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／１０７７２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決すべき課題は、新規な糖代謝機能改善剤、詳しくは、インスリンシグナル伝達促進活性を有することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質が、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進活性を有し、イン  ビボで糖代謝機能を改善する作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
【０００５】
〔１〕  下記の（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質（以下、本明細書において、本蛋白質と称する場合がある。）又はそのフラグメントを有効成分として含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつインスリン様活性を有するアミノ酸配列
〔２〕  インスリン様活性を亢進することを特徴とする、〔１〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔３〕  インスリン様活性が、肝細胞又は筋肉細胞におけるインスリンシグナル伝達促進活性である、〔２〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔４〕  インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性又は筋肉細胞における糖取り込み促進活性である、〔２〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔５〕  インスリン様活性が、血糖降下作用である、〔２〕に記載の治療剤又は予防剤；
〔６〕  インスリン様活性の検定方法であって、
（１）筋肉細胞又は肝細胞と、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された測定値を、被験物質の代わりに本蛋白質を用いて前記第一工程及び第二工程を行った場合の測定値と比較し、被験物質のインスリン様活性が前記蛋白質のインスリン様活性と同等以上であることを指標として、被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程、
を有することを特徴とするインスリン様活性の検定方法；
〔７〕  インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である〔６〕に記載の検定方法；
〔８〕  インスリンシグナル伝達促進活性が、インスリン受容体、IRS-1、PI3キナーゼ又はAktのリン酸化量を指標として測定されることを特徴とする、〔７〕に記載の検定方法；
〔９〕  インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、〔６〕に記載の検定方法；
〔１０〕  インスリン様活性が、筋肉細胞への糖取り込み促進活性である、〔６〕に記載の検定方法；
〔１１〕  第一工程で使用される筋肉細胞が骨格筋細胞である、〔６〕、〔７〕、〔８〕及び〔１０〕のいずれかに記載の検定方法；
〔１２〕  第一工程で使用される肝細胞が株化肝細胞又は初代培養肝細胞である、〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の検定方法；
〔１３〕  被験物質が本蛋白質又は本蛋白質をコードする遺伝子（以下、本明細書において本遺伝子と称する場合がある。）の発現を促進するか否かを指標とする、被験物質のインスリン様活性の検定方法；
〔１４〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔１３〕に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）  被験物質と、〔１３〕に記載の蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程；
〔１５〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔１３〕に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）被験物質と、〔１３〕に記載の蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程；
〔１６〕  下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、〔１３〕に記載のインスリン様活性の検定方法：
（１）  被験物質と、〔１３〕に記載の蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程；
〔１７〕  インスリン様活性が、インスリンシグナル伝達促進活性である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載の検定方法；
〔１８〕  インスリン様活性が、筋肉細胞への糖取り込み促進活性である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載の検定方法；
〔１９〕  インスリン様活性が、肝細胞における糖新生抑制活性である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載の検定方法；
〔２０〕  〔６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の検定方法により測定された、被験物質のインスリン様活性を指標として、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質を選別することを特徴とする、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の探索方法；
〔２１〕  糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、筋肉細胞又は肝細胞におけるインスリンシグナル伝達促進剤であることを特徴とする、〔２０〕に記載の探索方法；
〔２２〕  糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、筋肉細胞における糖取り込み促進剤であることを特徴とする、〔２０〕に記載の探索方法；
〔２３〕  糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤が、肝臓における糖新生抑制剤であることを特徴とする、〔２０〕に記載の探索方法；
〔２４〕  〔２０〕〜〔２３〕のいずれかに記載の探索方法により選抜された物質を有効成分して含有する、糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤；
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進活性を有することを特徴とする糖代謝関連疾患の治療剤もしくは予防剤、インスリン様活性の検定方法、及び当該検定方法を用いる糖代謝関連疾患の治療剤もしくは予防剤の探索方法などを提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の第一の態様は、前記本蛋白質又はそのフラグメントを有効成分として含有する糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤に関する。
本明細書において、「下記の（ａ）〜（ｈ）のいずれかのアミノ酸配列からなる蛋白質」（本蛋白質）とは、（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列、（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列、（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、（ｇ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、及び（ｈ）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつインスリン様活性を有する蛋白質である。
【０００８】
ここで、前記（ｂ）における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）における「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、当該蛋白質のインスリン様活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、（１）グリシン、アラニン；（２）バリン、イソロイシン、ロイシン；（３）アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、（４）セリン、スレオニン；（５）リジン、アルギニン；（６）フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【０００９】
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
【００１０】
前記（ｈ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M  NaCl、０．１５M  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１１】
本明細書において、本蛋白質のフラグメントとは、前記本蛋白質の１５〜１００残基、好ましくは１５〜５０残基のアミノ酸部分配列からなるペプチドフラグメントを表し、本蛋白質のインスリン様活性が保持されている限り特に限定はない。
【００１２】
本蛋白質の調製方法について以下に説明する。
まず、本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）、例えば、（I）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（II）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（III）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列）、（IV）前記（III）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（V）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、（VI）配列番号１で示される塩基配列、（VII）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（VIII）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するDNAと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列、又は（IX）配列番号１で示される塩基配列における第１８番目のヌクレオチドから第１４９３番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得する。次いで、得られた本遺伝子を用いることにより、通常の遺伝子工学的方法に準じて本蛋白質を製造・取得する。このようにして本蛋白質を調製することができる。
【００１３】
例えば、本遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物から本蛋白質を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、本蛋白質をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、宝酒造等から市販されている。当該発現ベクターに本蛋白質をコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素も宝酒造等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本蛋白質をコードする遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
【００１４】
哺乳動物細胞での発現に使用されるベクターは、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、Raus Sarcoma Virusプロモーター（ＲＳＶプロモーター）、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーター等のプロモーターを含む発現ベクターであって、これらは、東洋紡社、宝酒造社等から市販されている。
【００１５】
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本蛋白質の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。
【００１６】
形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当
な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
【００１７】
本蛋白質の取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清から本蛋白質を前記と同様にして精製してもよい。
【００１８】
本明細書において、糖代謝関連疾患としては、生体における糖代謝機能の異常を伴う疾患が挙げられ、具体的には、糖尿病、耐糖能異常、高血糖の持続に伴う動脈硬化症等の疾患が挙げられる。すなわち、糖代謝関連疾患は、インスリンの機能低下または機能不全によって生ずる種々の病態を有する疾患であれば特に限定は無い。本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤を適用可能な疾患として、好ましくは、糖尿病などの血糖の恒常性が破綻した病態をあげることができる。
本明細書において、「インスリン様活性」とは、インスリンがインスリン受容体に結合することにより生じる生理作用を表し、具体的には、血糖降下作用、肝臓における糖新生抑制活性、又は筋肉細胞における糖取り込み促進活性等が挙げられる。
インスリンがインスリン受容体に結合することによって、インスリン受容体の細胞内ドメインであるβサブユニットが自己リン酸化され、細胞内でインスリン由来のシグナル伝達が生ずる（以下インスリンシグナル伝達と称する。）。インスリンシグナル伝達として、具体的には、インスリン受容体、IRS-1、PI3キナーゼ又はAktのリン酸化反応等が挙げられる。
「インスリンシグナル伝達促進活性」とは、前記インスリンシグナル伝達を亢進する活性を表し、具体的には、肝細胞もしくは筋肉細胞におけるインスリン受容体、IRS-1、PI3キナーゼ又はAktのリン酸化反応を亢進させる活性、すなわちインスリン受容体、IRS-1、PI3キナーゼ又はAktのリン酸化体を増加させる活性を表す。
【００１９】
「肝細胞における糖新生」とは、肝臓におけるブドウ糖生合成を表し、ピルビン酸からオキサロ酢酸を経てグルコースを生合成する細胞内の代謝を表す。糖新生の律速段階はホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ（PEPCK)が触媒する反応であることが知られており、インスリンは、PEPCKの発現量を抑制することによって糖新生抑制活性を示すことが知られている。
【００２０】
「筋肉細胞における糖取り込み促進活性」とは、グルコーストランスポータを介して細胞外から細胞内へグルコースを取り込む作用を促進する活性を表す。インスリンは、細胞内に貯蔵されたGLUT４を細胞膜上へトランスロケーションさせることによって糖取り込みを促進することが知られている。取り込まれたブドウ糖は解糖系を経てピルビン酸へと変わり同時にＡＴＰを産生しエネルギーとして利用される。
【００２１】
本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤は、インスリン様活性を亢進させることを特徴とする。ここで、インスリン様活性を亢進するとは、具体的には、１）肝臓における糖新生を抑制すること、２）筋肉細胞における糖取り込みを促進すること、３）インスリンシグナル伝達を促進すること、４）血糖値を低下させること等を表す。
【００２２】
本発明の第二の態様は、インスリン様活性の検定方法であって、
（１）筋肉細胞又は肝細胞と、被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記細胞におけるインスリン様活性を測定する第二工程、及び
（３）前記第二工程により測定された測定値を、被験物質の代わりに本蛋白質を用いて前記第一工程及び第二工程を行った場合の測定値と比較し、被験物質のインスリン様活性が前記蛋白質のインスリン様活性と同等以上であることを指標として、被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程、
を有する。
【００２３】
前記第一工程において用いられる筋肉細胞には、動物の筋肉組織から分離された筋肉細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している筋肉細胞（筋肉組織）等も含まれ、インスリン受容体を発現しており、インスリンに応答して糖取り込みの促進活性を示し、インスリンの下流のシグナル伝達が機能する細胞であれば特に限定は無く、いかなる分化過程にある細胞であってもよい。例えば、筋芽細胞や分化し筋筒を形成した細胞等を挙げることができる。好ましくは、分化した筋肉細胞が挙げられる。ここで筋芽細胞とは、筋肉細胞としての素地を獲得した未分化細胞を指し、その形態としては分化後のように多核化、フィラメント化していない状態である。分化した筋肉細胞とは、通常１０〜１００μｍ径で３０ｃｍまでの多核の円筒状細胞であり、糖を取り込む能力を有する。
ここで「筋肉組織」としては、例えばヒラメ筋（Soleus muscle）もしくは長指伸筋（Extensor digitorium longus）などの骨格筋組織が挙げられる。
前記筋肉細胞の由来動物としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
【００２４】
筋肉細胞は、骨格筋組織から単離することもできるが、L6（大日本製薬）、C2C12などの株化された細胞を用いることもできる。これらは市販されているか、もしくは容易に理研細胞バンクなどの細胞寄託機関から入手できる。これらの細胞は、例えば、ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。）（ＧＩＢＣＯ製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１０％、１００ユニット／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、ＤＭＥＭ培地と記す。）などの通常の培地中で培養することができ、細胞はコンフルエントになった後、円筒状の多核筋肉細胞に分化する。
【００２５】
前記第一工程において用いられる肝細胞は、糖新生よび解糖系に関与する酵素等が機能している肝細胞、すなわちインスリン受容体を発現し、インスリンに応答して糖新生の抑制が認められる細胞であればいかなる肝細胞でも良く、動物の肝臓から分離された肝実質細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している肝細胞（肝臓組織）等も含まれる。前記肝細胞の由来動物動としては、例えば哺乳動物等を挙げることができ、さらに具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
【００２６】
肝細胞として、例えば、初代培養肝細胞が挙げられ、以下の方法で調製することができる。すなわち、ラット(Wister rat,150〜250g)は 腹部切開、腸を脇に寄せ門脈を露出させ、22G留置針（テルモ）を挿入し縫合糸で固定する。ペリスタポンプのチューブに輸液チューブ結合させ、灌流液(Liver Perfusion Medium)（Gibco社）を流出させながら空気が入らないように留置針とチューブを結合し、同時に腹部下大静脈を切開、放血し３７℃に保った灌流液で灌流を開始する。10分間灌流後、恒温層で37℃に保たれたコラーゲナーゼ灌流液（Liver Digest Medium）（Gibco社）を10分間灌流する。灌流終了後、肝臓を摘出、シャーレ上で minceし洗浄用培地（Hepatocyte Wash Medium）（Gibco社）,あるいは5%FBSを含むMedium 199（Gibco社）で懸濁、250μmメッシュフィルターでろ過した後、500rpm、1min. 遠心分離し上清を除去する。沈殿は洗浄用培地で懸濁、遠心分離、上清除去をさらに3回繰り返し、100μｍセルストレーナー(FALCON社)でろ過後、10%FBSを含むWilliam's Medium E（Sigma社）で懸濁、遠心分離、上清除去を行う。最後に沈殿を10%FBS、1nM インスリン（Sigma製）、100nM デキサメサゾン（Sigma製）を含むWilliam's Medium Eで懸濁し、70μｍセルストレーナー(FALCON社)でろ過後、血球計算版をもちいて細胞数を計測し、コラーゲンコートプレート（イワキ製）に0.5〜1.5×105cells/cm2の密度でまきこむ。まきこみから2〜3時間後に同じ培地で培地交換する。このように調製された初代培養肝細胞は、通常は翌日からアッセイに使用可能である。
【００２７】
また、H4IIＥ、HepG2などの株化された細胞を用いることもでき、これらは大日本製薬などから市販されており、容易に入手できる。これらの肝細胞は通常の細胞培養法にて培養可能であり、例えばＤＭＥＭ培地に、デキサメサゾン（Sigma社）、cAMP（Sigma社）をそれぞれ終濃度１００ｎＭ、および  ５０μＭとなるように添加した培地（以下、肝細胞用培地）などにて培養できる。
【００２８】
被験物質として用いられる化合物には特に限定は無く、蛋白質、ペプチド、核酸、無機化合物、天然もしくは合成化学的に調製された有機化合物等が挙げられる。被験物質として、具体的には、アミノ酸３〜５０残基、好ましくは５〜２０残基のペプチドライブラリーや、当業者に公知のコンビナトリアルケミストリーの技術を用いて調製された分子量１００〜２０００、好ましくは２００〜８００の低分子有機化合物ライブラリーを挙げることができる。
【００２９】
筋肉細胞もしくは肝細胞と接触させる被験物質の濃度としては、特に限定は無く、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、好ましくは１μＭ〜５０μＭであればよい。筋肉細胞もしくは肝細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常５分間〜３０分間程度あり、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。被験物質は適宜、水、リン酸バッファーもしくはトリスバッファー等のバッファー、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシドもしくはこれらの混合物などの溶媒に溶解又は懸濁して用いることができる。
【００３０】
前記第二工程において、インスリン様活性を測定する方法としては、以下の１）〜３）が挙げられる：
１）筋肉細胞あるいは筋肉組織における糖取り込み促進活性
筋肉細胞あるいは筋肉組織に含まれる取り込み糖量を測定する方法としては、筋肉細胞あるいは筋肉組織中の取り込み糖量を測定する方法であればどのような方法であってもよいが、例えば、取り込まれた放射標識グルコースを定量する方法等を挙げることができる。筋肉組織あるいは細胞内に取り込まれた放射標識グルコースを定量する方法の具体的な例としては、（１）生体から単離した筋肉組織を用いて、組織中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法、（２）分化筋肉細胞を用いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法等が挙げられる。筋肉組織を用いた糖取り込み測定方法（前者）としては、例えば、Molecular Cell, vol.2, p.559 (1998)等に記載される方法を用いることができる。分化筋肉細胞を用いて、当該細胞中に取り込まれた放射標識グルコースの量を測定する方法（後者）としては、例えば、「Am. J. Physiol., vol.276, E849 (1999)  」や「医学の歩み, 184(6), 503-506, 1998」等に記載される方法を用いることができる。
【００３１】
２）肝細胞における糖新生抑制活性
肝細胞における糖新生量を測定する方法としては、例えば、文献等に記載される方法を用いることができる。より詳細には、肝細胞用培地にて培養したＨ４ＩＩＥ細胞を１２ウエルプレートに１ウエル当たり約３ｘ１０５細胞の量でまきこみ、細胞がコンフルエントになった後に、５ｍＭのグルコースを含む以外は前記記載と同一の肝細胞用培地に交換し、終夜培養する。細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、糖新生用バッファー（８．３ｇ／Ｌ  ＤＭＥＭ−base、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、３．７ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、０．９ｇ／Ｌ  乳酸、１００ユニット／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン）に交換して、さらに終夜細胞を培養する。翌日、細胞上清を回収して、適宜希釈し、上清中に含まれる糖（グルコース）量を定量する。グルコース定量のためのキットは多数市販されており、例えばＦ−キットグルコース（ＪＫンターナショナル社）などを用いることが出来る。
【００３２】
３）筋肉細胞又は肝細胞におけるインスリンシグナル伝達促進活性
ここで、筋肉細胞または肝細胞におけるインスリンシグナル伝達を測定する方法としては、インスリン受容体やその下流分子であるIRS-１蛋白質、PI3キナーゼ、Akt蛋白質のリン酸化量を定量する方法などがあげられる。ここで、IRS-１蛋白質、PI3キナーゼ、Akt蛋白質は公知であり、その構造や機能については、Molecular Medicine Vol.36, 110-115(1999；中山書店)に記載されている。これらの分子のリン酸化量を定量する方法としては、抗体を用いたウエスタンブロッティング法などがあげられ、当該方法に用いる抗体は、例えばシグマ社やUｐstate Biotechnology社などから市販されており、通常の方法に準じて行うことができる。
【００３３】
本発明の第三工程において、「被験物質の代わりに本蛋白質を用いて前記第一工程及び前記第二工程を行った場合の測定値」とは、（ｉ）筋肉細胞又は肝細胞と、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質等の本蛋白質を接触させ、（ｉｉ）次いで前記細胞におけるインスリン様活性を測定することによって得られる測定値を表す。
ここで筋肉細胞や肝細胞と接触させる本蛋白質の濃度としては、通常約０．１ｎｇ／ｍｌ（２ｐＭ）〜約１００μｇ／ｍｌ（２μＭ）であればよく、約１ｎｇ／ｍｌ（２０ｐＭ）〜約２０μｇ／ｍｌ（０．４μＭ）が好ましい。筋肉細胞もしくは肝細胞と本蛋白質とを接触させる時間は、通常５分間〜1日、好ましくは5分〜３０分間程度である。筋肉細胞もしくは肝細胞と接触させる被験物質の濃度としては、通常約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、１μＭ〜５０μＭが好ましい。筋肉細胞もしくは肝細胞と被験物質とを接触させる時間は、通常５分間〜１日程度、好ましくは５分〜３０分間程度であり、更に好ましくは１０分間〜２０分間程度である。
【００３４】
本発明第二工程により測定された測定値と、被験物質の代わりに配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質等の本蛋白質を用いた場合の前記第一工程及び前記第二工程を行った場合の測定値を比較し、本蛋白質と同等以上のインスリン様活性を示す被験物質を、インスリン様活性を有する物質であると評価することができる。
【００３５】
また、被験物質を哺乳動物に投与した後、当該哺乳動物の血糖値を測定し、該測定値を、被験物質の代わりに配列番号２で示される蛋白質等の本蛋白質を投与した哺乳動物における血糖値を比較することによって、当該被験物質が配列番号２で示される蛋白質等の本蛋白質と同等以上の血糖降下作用を示すか否かを判断することもできる。
更に、被験物質を哺乳動物に投与した後当該哺乳動物の血糖値を測定し、該測定値を、被験物質の代わりに配列番号２で示される蛋白質等の本蛋白質を哺乳動物内で過剰発現させた場合の血糖値を比較することによって、当該被験物質が配列番号２で示される蛋白質等の本蛋白質と同等以上のインスリン様活性を示すか否かを判断することもできる。本蛋白質を哺乳動物内で過剰発現させる方法としては、たとえば、トランスジェニックやアデノウイルス感染などの方法があり、いずれの方法も文献等で公知である。
【００３６】
前記のようにして被験物質が有する１）筋肉細胞への糖取り込み能力、２）肝細胞における糖新生抑制能力、３）筋肉細胞もしくは肝細胞におけるインスリンシグナル活性化能力、４）哺乳動物に投与した際の血糖低下能力等のインスリン様活性を検定することができる。本発明検定方法により評価された能力に基づき、インスリン様活性促進剤、具体的には、１）筋肉細胞への糖取り込み促進剤、２）肝細胞における糖新生抑制剤、３）筋肉細胞もしくは肝細胞におけるインスリンシグナル伝達促進剤、及び４）血糖低下剤を、糖代謝機能改善剤、即ち糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤として選抜することができる（本発明探索方法）。
具体的には、被験物質のインスリン様活性が、本蛋白質のインスリン様活性に比べて１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２倍以上である場合、当該被験物質を、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進活性を有する糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質として選別することができる。
例えば、被験物質の糖取り込み促進能力を表わす糖取り込み促進率が、統計学的に有意な値を示す物質、具体的には、配列番号２で示される蛋白質の糖取り込み促進率の１．２倍以上の値、より好ましくは１．５倍以上を示す物質を、糖取り込み促進能力を有する物質として選抜する。
【００３７】
本発明の第三の態様は、被験物質が、本蛋白質又は本蛋白質をコードする遺伝子(本遺伝子）の発現を促進（誘導）するか否かを指標とする、被験物質のインスリン様活性の検定方法に関する。以下に詳細に説明する。
１）本遺伝子の発現量を指標とする検定方法
本発明は、下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定方法を提供する。すなわち、
（１）  被験物質と、本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
ここで、被験物質としては上記と同じものが挙げられる。
「本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）を発現可能な細胞」としては、本遺伝子を発現する細胞であれば特に限定はく、本遺伝子を発現し得る細胞をそのまま用いてもよいし、本遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞を用いてもよい。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。
具体的には、ヒト腎臓由来細胞であるHEK293、ハムスター卵巣由来細胞であるCHO-K1、又はアフリカミドリザル腎臓由来細胞であるCOS-1もしくはCOS-7が挙げられる。また、哺乳動物の脂肪由来細胞、肝臓由来細胞、筋肉由来細胞などを用いてもよく、例えば、株化脂肪細胞である3T3-L1、株化肝細胞であるHepG2等が挙げられる。
【００３８】
本遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。具体的には、本蛋白質遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、RNA中の本遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプローブもしくはプライマーは、本蛋白質遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。
【００３９】
ノーザンブロット法を利用する場合、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００４０】
RT-PCR法を利用する場合は、細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的の本蛋白質遺伝子の領域が増幅できるように、本蛋白質遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００４１】
２）本蛋白質の発現量を指標として用いる検定方法
本発明は、下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定方法を提供する。すなわち：
（１）被験物質と、本蛋白質を発現可能な細胞とを接触させる第一工程、
（２）被験物質を接触させた細胞における、前記蛋白質の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記蛋白質の発現量と比較する第二工程、及び
（３）前記第二工程の比較結果に基づいて、被験物質が前記蛋白質の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
ここで、被験物質としては前記と同じものが挙げられる。また、「本蛋白質を発現可能な細胞」としては、前記１）における「本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）を発現可能な細胞」と同じものが挙げられる。
本蛋白質の発現レベルの検出及び定量は、本蛋白質を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体として本蛋白質を認識する抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本蛋白質を認識する抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
【００４２】
抗体は、その形態に特に制限はなく、前記本蛋白質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには本蛋白質を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００４３】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。
【００４４】
３）本遺伝子の発現制御領域を用いたレポーター遺伝子アッセイを用いる検定方法
本発明は、下記の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする、インスリン様活性の検定方法を提供する。すなわち：
（１）  被験物質と、本蛋白質をコードする遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞とを接触させる第一工程、
（２）  被験物質を接触させた細胞における、前記レポーター遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質に接触させない対照細胞における前記遺伝子の発現量と比較する第二工程、及び
（３）  前記第二工程の比較結果に基づいて、前記レポーター遺伝子の発現量を増加させるか否かを指標として被験物質のインスリン様活性を評価する第三工程。
ここで、被験物質は、前記と同じものが挙げられる。
「本蛋白質をコードする遺伝子（本遺伝子）の発現制御領域」とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数ｋｂから数十ｋｂの範囲を指し、例えば、（i）５’-レース法（5'-RACE法）(例えば、５’full Race Core Kit（宝酒造社製）等を用いて実施されうる)、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ii）Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて５’-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；、を含む手法等により同定することが出来る。
【００４５】
本蛋白質遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子は、当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出された本蛋白質遺伝子の発現調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
【００４６】
レポーター遺伝子としては、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光タンパク質（GFP）等が挙げられる。
調製した本蛋白質遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することができる。レポーター遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を得ることができる。
【００４７】
また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピッカジーンデュアルキット（登録商標；東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。
【００４８】
上記１）〜３）において、「本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞」、「本蛋白質を発現可能な細胞」又は「本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」と、被験物質との接触は、当該細胞が成育可能な条件で培養しながら行えばよく、例えば、哺乳動物細胞を宿主とする本発明形質転換細胞の場合、適宜ウシ胎児血清等の哺乳動物由来の血清を添加したＤ−ＭＥＭ、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製）等の市販の培地中で培養できる。
【００４９】
上記１)〜３）において、「被験物質に接触させない対照細胞」とは、各第一工程で用いられる「本蛋白質をコードする遺伝子を発現可能な細胞」、「本蛋白質を発現可能な細胞」又は「本遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を含有する細胞」において、被験物質を接触させない場合の当該細胞を表す。「被験物質を接触させない場合」には、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、本遺伝子、本蛋白質もしくはレポーター遺伝子の発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
【００５０】
上記１)〜３）において、各第一工程及び第二工程で測定した本遺伝子、本蛋白質又はレポーター遺伝子の発現レベルに基づき、本遺伝子もしくは本蛋白質の発現誘導活性を有する被験物質を選択することができる。すなわち、被験物質を添加した細胞における本遺伝子、本蛋白質又はレポーター遺伝子の発現が被験物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２倍以上であれば、該被験物質は本遺伝子もしくは本蛋白質の発現促進剤（発現誘導剤）として選択することができる（本発明探索方法）。
上記のように選択される本遺伝子もしくは本蛋白質の発現誘導物質もまた、糖代謝機能を改善する活性、詳しくはインスリンシグナル伝達促進活性を有する本発明の糖代謝関連疾患の治療剤又は予防剤の候補物質である。
【００５１】
本蛋白質及びそのフラグメント、あるいは本発明探索方法で見出される化合物は、これらを医薬品として用いるにあたり、そのままもしくは公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤等などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。
【００５２】
前記の適当な投与剤型は許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分（本蛋白質、又は本発明探索方法により選抜される物質またはその薬学的に許容される塩等）を配合することにより製造することができる。また注射剤型で用いる場合には、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは５ｍｇ〜数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよく、１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００５３】
上記有効成分物質として、本遺伝子そのものを挙げることができる。この場合は、本遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００５４】
上記遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えば本遺伝子またはそれらの化学的修飾体を直接糖代謝関連疾患に罹患した哺乳動物（患者）の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはこれらの遺伝子を患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。
【００５５】
ここで前記化学修飾体としては、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデートなどの、細胞内への移行性または細胞内での安定性を高め得る誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY-LISS刊、1992年、pp.1-50、J. Med. Chem. 36:1923-1937, 1993)が含まれる。これらは常法に従い合成することができる。
本遺伝子は、その投与に当たり、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
【００５６】
本遺伝子を患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるポリヌクレオチドは、好ましくは100塩基以上、より好ましくは300塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞に遺伝子を導入するin vivo法および一旦体外に取り出した細胞に遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すex vivo法を包含する(日経サイエンス, 1994年4月号, 20-45頁、月刊薬事, 36 (1), 23-48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15), 全頁 (1994)など参照）。この内ではin vivo法が好ましく、これには、ウイルス的導入法(組換えウイルスを用いる方法)と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照)。
【００５７】
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムに本遺伝子のポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
【００５８】
遺伝子治療用製剤組成物は、本遺伝子又はこれらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。in vivo法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本遺伝子を含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態(センダイウイルス(HVJ)-リポソームなど)とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、本遺伝子を含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、患者成人1人当たり約0.0001-100mg、好ましくは約0.001-10mgが数日ないし数カ月に1回投与される量とすればよい。本遺伝子を含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、1日患者体重1kg当たり約1ｘ103pfu-1ｘ1015pfuとなる量範囲から選ぶことができる。本遺伝子を導入した細胞の場合は、1ｘ104細胞/body-1ｘ1015細胞/body程度を投与すればよい。
【００５９】
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
（本遺伝子の単離：配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子の単離）
ヒト腹腔内脂肪組織からグアニジンチオシアネート／セシウムクロライド法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979）により調製された全ＲＮＡ１．０μｇを鋳型にして、これとｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）に添付のオリゴｄＴプライマーとを混合した後、１ｍＭ  ｄＮＴＰの存在下でＭＭＴＶ逆転写酵素（宝酒造製）５０ユニットを添加し、室温で１０分間、次いで４２℃、１５分間、さらに９９℃、５分間保温することによって、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
続いて当該１本鎖ｃＤＮＡ２．０μｇを鋳型に用いて、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの各２０ｐｍｏｌをプライマーとして、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2存在下でＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）１ユニットを添加し、９４℃、１分間、さらに７２℃、２分間の保温を１サイクルとしてこれを５５サイクル行う条件下でＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲル電気泳動に供し（泳動バッファー；トリス−硼酸緩衝液（ナカライテスク製））、約１．５ｋｂｐのＤＮＡバンドをゲルから切り出し、Sambrook, J.、Fritsch, E. F.、Maniatis, T.著：「Molecular Cloning Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）に記載される方法により、プラスミドベクターｐＵＣ１１８（宝酒造製）のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングした。クローニングされたＤＮＡの塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Sequencing KitおよびTaq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ製）を用いてアプライドバイオシステムズ製の３７３Ａ型のＤＮＡシークエンサーにより決定した。当該ＤＮＡは配列番号１で示される塩基配列からなり、当該塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードしていた。
このようにして配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子を単離した。
【実施例２】
【００６１】
（配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質の発現プラスミドの調製）
配列番号２で示されるアミノ酸配列における第1番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質を産生させるための発現プラスミドは、実施例１において増幅・単離されたＤＮＡを、通常の遺伝子工学的方法によって公知の発現ベクター（pcDL-SRα296：Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K., Yoshida, M., and Arai, N., Mol. Cell Biol. Jan. 1988, p466-472）に組み込みことにより調製した。このようにして調製した発現プラスミドで、フュージーン試薬（ベーリンガー製）を用いて、試薬に添付のプロトコールに記載の方法と同様な方法によりサル由来のＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ製）を形質転換した。
【実施例３】
【００６２】
実施例３  （本蛋白質の調製：配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質標品の調製）
配列番号２で示されるアミノ酸配列における第1番目のアミノ酸から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、実施例２で形質転換されたサル由来のＣＯＳ１細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１００ユニット／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌとなるように添加したOPTI-MEM培地（ＧＩＢＣＯ製）中で培養することにより培地中に当該蛋白質を分泌させ、形質転換後２日目から８日目までの細胞培養上清を集めた。培養上清を限外ろ過膜にてろ過し、順次DEAEsepharose、ANX-Sepharose、Octyl-Sepharose、Mono-Qカラム（すべてアマシャムファルマシア製）に供して精製した。最終的に得られた本蛋白質標品は、銀染色的に単一のバンドであった。
【実施例４】
【００６３】
（本蛋白質の筋肉細胞における糖取り込みに関する試験）
（１）筋肉細胞の培養
起眠したラットＬ６細胞を、ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ製）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ製）をそれぞれ終濃度１０％、１００ユニット／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、ＦＢＳ含有培地と記す。）３０ｍｌに懸濁し、当該懸濁液を細胞培養用フラスコ（接着細胞用Ｔ１５０。岩城硝子製）に注入し、３７℃、５％ＣＯ2存在下で終夜培養した。細胞を１５ｍＬのリン酸緩衝液（０．２０ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、０．２０ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、８．００ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２．１６ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、以下ＰＢＳと記す）で洗浄した後、当該フラスコにトリプシン−エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（以下、ＥＤＴＡ・４Ｎａと記す。）溶液（０．０５%トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａを含む。ＧＩＢＣＯ製）１〜２ｍｌを細胞が浸るように添加し、３７℃で５分放置した。これに、ＦＢＳ含有培地をトリプシン−ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液の約１０倍量添加し、細胞懸濁液を得た。当該細胞濁液を１２ウエルプレートに１ｘ１０５細胞／ウエルの濃度で捲き込み、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。２日後に、２％のＦＢＳを含むＦＢＳ含有培地に置換し、さらに５日間培養した。
（２）糖取込み活性の測定
（１）で得られた供試細胞を含むウエルをリン酸緩衝液で洗浄し、ＦＢＳ含有培地からＦＢＳのみを除いた培地（以下、無血清培地と記す。）に置換して、１８時間培養した。ウエルをＫＲＢ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２３．８ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１％  ＢＳＡ、０．２２μｍのフィルターでろ過）で洗浄し、５００μＬのＫＲＢ緩衝液を加えて３７℃で３０分間インキュベートした。ウエル内の緩衝液を除去し、５００μＬのＫＲＢ緩衝液に０〜３０ｎＭとなるように実施例３で得られた本蛋白質の標品を添加し、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。さらに、ＫＲＢ緩衝液で０．０１μＣｉ／μＬに希釈した２−デオキシ−Ｄ−［１−３Ｈ］グルコース（アマシャム製）を１０μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ウエル内の液を除去し、予め氷冷しておいたリン酸緩衝液１ｍＬを添加し、ウエルを洗浄した。さらに１回リン酸緩衝液でウエル内を洗浄した後、１Ｎ  ＮａＯＨ  を３００μＬ添加し、よく攪拌した。ウエルから２５０μＬの液を回収し、予め液体シンチレーター（パッカード社製）４ｍｌを注入したバイアルびんに添加し、液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で総放射能量を測定した（以下、測定値１と記す。）。実施例５（１）で得られた供試細胞を含むウエルに本蛋白質標品の代わりにリン酸緩衝液を添加する以外は同様の操作を行い、総放射能量を測定した（以下、測定値２と記す。）これらの測定値から、下記の式に従って、本蛋白質の糖取込み促進率を算出した。
糖取込み促進率（％）＝（測定値１／測定値２）×１００
３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭの本蛋白質標品による糖取込み促進率は、それぞれ１１６％、１３９％および１４５％であった。
また、本蛋白質標品の代わりに３ｎＭ、１０ｎＭおよび３０ｎＭのインスリンを添加すること以外は上記に記載される方法と同様な方法に準じてインスリンによる糖取込み促進率を算出した結果、それぞれ１００％、１３８％および１５０％であった。
【実施例５】
【００６４】
（本蛋白質の筋肉細胞におけるインスリンシグナル活性化率の測定）
実施例４（１）にて起眠したＬ６細胞を９０ｃｍのディッシュにまきこんで、ＦＢＳ含有培地でコンフルエントになるまで培養した。培地を除去した後、リン酸緩衝液で洗浄し、無血清培地で２０時間培養した後、再び培地を除去した。１００ｎｇ／ｍＬの実施例３で得られた本蛋白質標品を含む無血清培地で３７℃、１０分間インキュベートした。培地を除去して反応を停止させ、予め氷冷したリン酸緩衝液で２回細胞を洗浄した。液体窒素で細胞を凍結した後、１ｍＬの細胞破砕用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、２μｇ／ｍＬ アプロチニン、１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を加えることで細胞を破砕した後、４℃、１５，０００ｇで３０分遠心し、細胞破砕上清を得た。抗ＩＲＳ−１抗体＃０６−２４８（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）５μｇを予めＰｒｏｔｅｉｎＧ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア製）ビーズ２０μＬに結合しておき、得られた細胞破砕上清１ｍＬと混合し、４℃で終夜インキュベートした。翌日、ビーズを数回細胞破砕用緩衝液で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、３％ＳＤＳ、２％  メルカプトエタノール、５％  グリセロール）を添加して１００℃、５分間過熱してビーズに結合した蛋白を溶出した。溶出蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学製）にて分離後、抗リン酸化チロシン抗体ＲＣ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）あるいは抗ＰＩ３キナーゼｐ８５抗体＃０６−１９５（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いてイムノブロットを実施し、ＥＣＬ検出キット（アマシャム製）を用いて、それぞれリン酸化ＩＲＳ−１およびリン酸化ＰＩ３キナーゼ蛋白質を検出・定量した。
また、細胞破砕上清１０μＬを直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学製）にて分離し、抗リン酸化Ａｋｔ抗体＃９２７１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ製）を用いてイムノブロットを実施し、ＥＣＬ検出キット（アマシャム製）を用いてリン酸化されたＡｋｔ蛋白質を検出・定量した。
その結果、本蛋白質標品を添加した場合、無添加の陰性対照と比較して、ＩＲＳ−１、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ分子のリン酸化が促進されていた（図１）。陽性対照として、本蛋白質の代わりにインスリン１００ｎｇ／ｍＬを添加した場合の各リン酸化蛋白シグナルも表されている。
【実施例６】
【００６５】
（本蛋白質の肝細胞における糖新生抑制に関する試験）
（１）供試細胞の調製
Ｈ４IIＥ細胞(第日本製薬より購入)を、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ｃＡＭＰ（シグマ製）、デキサメサゾン（シグマ製）をそれぞれ終濃度１０％、１００ユニット／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μＭおよび１００ｎＭとなるように添加したダルベッコ改変イーグル培地（４．５ｇ／Ｌグルコースおよび５８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン含有。ＧＩＢＣＯ製）（以下、肝細胞用培地）で培養した。実施例４に記載の方法にて細胞を培養器から回収し、１２ウエルプレートに３ｘ１０５細胞／ウエルの濃度で捲き込み、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。さらに細胞がコンフルエントになるまで培養を続けた。細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、５ｍＭグルコースを含む肝細胞用培地に置換して、24時間培養した。
細胞をリン酸緩衝液で２回洗浄し、実施例３で得られた本蛋白質標品０〜１ｎＭを含む糖新生緩衝液１ｍＬ（８．３ｇ／Ｌ  ＤＭＥＭ−base、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、３．７ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム、０．９ｇ／Ｌ  乳酸、１００ユニット／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、０．２２μｍのフィルターでろ過）に交換して、さらに終夜細胞を培養し、翌日、細胞上清を回収した。Ｆ−キットグルコース（ＪＫンターナショナル社）を用いて、プロトコールに従って回収した培養上清中に含まれる糖（グルコース）濃度を測定した。
陽性対照であるインシュリンによる糖新生促進試験については、実施例３で得られた本蛋白質標品の代わりに０〜１ｎＭのインシュリンを添加する以外は同様の操作を行い、測定を行った。
その結果、本蛋白質標品を添加しない場合の培地中の糖濃度、すなわち糖新生量である４．０１  ｆｍｏｌ／細胞／時間を１００％とした時の、本蛋白質標品の各濃度による糖新生量は、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭおよび１ｎＭにおいて、それぞれ、９８％、３２％および３％であり、本蛋白質が濃度依存的に肝細胞の糖新生を抑制することが確認できた。一方、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭおよび１ｎＭのインスリンにおいては、それぞれ、８２％、２０％および４％であった。
【実施例７】
【００６６】
（本蛋白質の肝細胞におけるインスリン作用促進率の測定）
Ｈ４IIＥ細胞（大日本製薬製）を、実施例６と同様に肝細胞用培地で培養し、９０ｍｍのシャーレにまきこみ、細胞がコンフルエントになるまで培養した。培地を除去した後、リン酸緩衝液で洗浄し、ＦＢＳを含まない肝細胞用培地（以下、無血清肝細胞用培地）で２０時間培養した後、再び培地を除去した。さらに、１００ｎｇ／ｍＬの本蛋白質標品を含む無血清肝細胞用培地で３７℃、１０分間インキュベートした。培地を除去して反応を停止させ、予め氷冷したリン酸緩衝液で２回細胞を洗浄した。以降の操作は、実施例５に記載の方法で行い、リン酸化された各分子を検出・定量した。
その結果、実施例３で得られた本蛋白質標品を添加した場合、無添加の陰性対照と比較して、ＩＲＳ−１、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ分子のリン酸化が促進されていた（図２）。陽性対照として、本蛋白質の代わりにインスリン１００ｎｇ／ｍＬを添加した場合の各リン酸化蛋白シグナルも表されている。
【実施例８】
【００６７】
（本蛋白質の生体における糖代謝制御に関する試験１）
１０週齢の雄性ＫＫＡｙマウス（日本クレア）の麻酔下に、尾静脈からリン酸緩衝液（陰性対照）あるいは４８７ｐmolの本蛋白質標品あるいは４８７ｐmolのインスリンを投与した。投与前および投与１５分、３０分、４５分、６０分および１２０分後に当該マウスの眼窩より採血した。採取した血液中の糖濃度は、Ｆ−キットグルコース（ＪＫンターナショナル社）を用いて、プロトコールに従って測定した。表１にＫＫＡｙマウスの血糖値（各群n=4の平均値）を示した。
上記の結果、表１および図３に示すように、本蛋白質は、陽性対照として用いたインスリンと同等の血糖降下作用を示した。
【００６８】
【表１】
2005213206.tif 000002
【実施例９】
【００６９】
（本蛋白質の生体における糖代謝制御に関する試験２）
（１）  組換えアデノウイルス作製
実施例１において増幅・単離されたＤＮＡ、すなわち本蛋白質をコードする遺伝子を有する組換えウイルス粒子は、アデノウイルス発現ベクターキット（宝酒造製）を用いて、キットに記載の方法に従って作製した。実施例１において増幅・単離されたＤＮＡを有さないネガティブコントロールとしては、キットに添付されているβ―ガラクトシダーゼ遺伝子含有ウイルス粒子を用いた。ＨＥＫ２９３細胞（Ａmerican Type Culture Collection製）にウイルス粒子を感染させて３回増幅し、１００，０００ｇｘ９０分のＣｓＣｌ密度勾配超遠心により得られるウイルス液の層をシリンジで抜き取った。得られた部分精製ウイルス液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で希釈し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心（１００，０００ｇｘ１６時間）を行って、再びウイルス液の層を回収した。得られた精製ウイルス液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  グルコースに対して透析し、−８０℃で凍結保存した。
（２）  アデノウイルス投与による本蛋白質の生体内糖代謝制御試験  
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび１０週齢の雄性ＫＫＡｙマウス（日本クレア）に、（１）で作製したウイルスをマウス１匹当たり１．０ｘ１０８ユニット接種した後、飼育を続け、接種４日後のマウスより採血した。血中の糖濃度は、Ｆ−キットグルコース（ＪＫンターナショナル社）を用いて、プロトコールに従って測定した。試験は、各群５匹で行った。
その結果、表２および図４に示したように、本遺伝子を有するウイルスを感染させた場合、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいては有意な血糖値降下が起こらなかったのに対して、遺伝的に糖尿病を発症し、高血糖であるＫＫＡｙマウスの血糖値を降下させる作用が認められた（ｐ＜０．００７）。
【００７０】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】筋肉細胞における、ＩＲＳ−１、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ分子のリン酸化を示す図である。
【図２】肝細胞における、ＩＲＳ−１、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ分子のリン酸化を示す図である。
【図３】ＫＫＡｙマウスに、実施例３で得られた本蛋白質標品、又はインスリンを投与し、投与前および投与１５分、３０分、４５分、６０分および１２０分後に血糖値（各群n=4の平均値）を測定した結果を示す図である。
【図４】ＫＫＡｙマウスに、実施例９で得られる本蛋白質遺伝子を有するウイルスを感染させ、血糖値を測定した結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号３
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
遺伝子を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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