(57)【要約】【課題】  新規な光線力学治療用増感剤の提供。【解決手段】  光増感物質がポルフィリン系光増感物質又はフタロシアニン系光増感物質の如き光増感物質とポリ−Ｌ−リジンとの結合物を含んで成る光線力学治療用増感剤を提供する。当該結合物は、腫瘍細胞に効率よく取り込まれ、しかも選択的に核に取り込まれるため、非常に高い殺腫瘍細胞効果が得られる。【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−Ｌ−リジンと光増感物質との結合物。
【請求項２】
前記光増感物質がポルフィリン系光増感物質又はフタロシアニン系光増感物質である、請求項１に記載の結合物。
【請求項３】
前記ポルフィリン系光増感物質が、クロリンe6、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン又はフェオフォルバイドａである、請求項３に記載の結合物。
【請求項４】
前記フタロシアニン系光増感物質がテトラカルボキシフタロシアニン又はその塩である、請求項２に記載の結合物。
【請求項５】
前記ポリリジンの分子量が、102〜106である請求項１〜４のいずれか１項に記記載の結合物。
【請求項６】
前記ポリリジンの分子量が、103〜105である請求項１〜４のいずれか１項に記記載の結合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合物を含んで成る、光線力学治療用光増感剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光線力学治療剤に関し、更に具体的にはポリリジンと光増感化合物との結合物、及びそれを含んで成る光線力学治療用光増感剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
光線力学治療（PDT）は腫瘍に集積する性質のある光増感剤の投与と、レーザー光による光照射を組み合わせたガンの治療法である。この治療方法は、古くから研究されているが、腫瘍への取り込み量が少ないため、治療効果が低いという欠点がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って本発明は、腫瘍細胞に取り込まれやすく、特に核に取り込まれやすい光線力学治療用光増感剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記の課題を解決すべく種々検討した結果、光増感化合物にポリリジンを結合させたものが効率よく腫瘍細胞の核に取り込まれることを見出し、本発明を完成した。
従って本発明は、ポリ−Ｌ−リジンと光増感物質との結合物を提供する。具体的には、前記光増感物質は、ポルフィリン系光増感物質又はフタロシアニン系光増感物質である。具体的には、例えば、前記ポルフィリン系光増感物質として、クロリンe6、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン又はフェオフォルバイドａなどが挙げられる。光増感剤クロリンe6（Ce6）は長波長領域のモル吸光係数が大きく、効果的に一重項酸素を発生させるため、PDTにおける利用が期待されている。
【０００５】
また、前記フタロシアニン系光増感物質の例としては、テトラカルボキシフタロシアニン又はその塩が挙げられる。
前記ポリリジンの分子量は、102〜106であり、好ましくは103〜105である。
本発明はまた、前記の結合物を含んで成る光線力学治療用光増感剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明において、ポリリジンのパートナーである光増感物質としては、従来から光増感物質として知られている物質を含めて種々の物質が使用できるが、特に、ポルフィリン系光増感物質、及びフタロシアニン系光増感物質が挙げられる。
前記ポルフィリン系光増感物質としては、例えば、クロリンe6、プロトポルフィリン、ヘマトポルフィリン、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン、ペンタカルボキシポルフィリン、フェオフォルバイドａなどが挙げられる。
【０００７】
【化１】
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【０００８】
【化２】
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また、前記フタロシアニン系光増感物質としては、テトラカルボキシフタロシアニン又はその塩が挙げられる。
【化３】
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【０００９】
ポリ−Ｌ−リジンの分子量は、102〜106が好ましく、103〜105程度が特に好ましい。
ポリ−Ｌ−リジンと光増感物質との結合は、直接の化学結合であってもよく、またリンカーを介しての結合であっても良い。直接化学結合の場合、ポリ−Ｌ−リジンのいずれかのアミノ基と光増感物質のカルボキシル基との間にペプチド結合を形成するのが好ましい。例えば、光増感物質のカルボキシル基を活性化剤、例えばＮ−ヒドロキシサクシンイミド（NHS）、N',N'−ジシクロへキシルカルビジイミド（DCC）などで活性化した後、ポリ−Ｌ−リジンと反応させればよい。
【００１０】
本発明の光線力学治療用増感剤は、上記のポリ−Ｌ−リジンと光増感物質との結合物を医薬として許容される常用のキャリヤーとともに含んで成る。また、それを使用する腫瘍の治療に当っては、本発明の光線力学治療用増感剤を腫瘍組織に適用し、光ファイバーを用いてその腫瘍組織を照射すればよい。
【実施例】
【００１１】
次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明の実施例において、ポリ−Ｌ−リジンを「pL」と称し、光増感性ポルフィリンであるクロリンe6を「Ce６」と称する。また、ポリ−Ｌ−リジン（ｐL）とクロリンe6（Ce6）との結合体を、「pL-Ce6」と称する。
【００１２】
実施例１. ポリ−Ｌ−リジンとクロリンe6との結合物の調製
クロリンe6をジメチルフォルムアミド（demethylfolmamide）(DMF) 中で、N-ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）(NHS)、N,N’-ジシクロへキシルカルボジイミド（N',N'-dicyclohexylcarbokiimide）(DCC) と混合し、クロリンe6（Ce6）のカルボキシル基をスクシンイミドエステルに変換した後、ポリ−L−リジンを加え２時間反応させた。クロリンe6のスクシンイミドエステルはポリ−L−リジンのアミノ基と共有結合（ペプチド結合）する。ポリ−L−リジン結合型クロリンe6はゲル濾過によって精製した。
【００１３】
なお、ポリ−Ｌ−リジン（ｐL）として、平均分子量が30,200のもの、72,000のもの、及び135,000のものを用い、これらから合成された結合物（pL-Ce6）をそれぞれ「pL30-Ce6」、「pL72-Ce6」及び「pL135-5.3」と称する。pL-Ce6の濃度を402nmにおける吸光度により算出し、pLの濃度をLowry法により測定し、ポリ−Ｌ−リジン（pL）１分子あたりのクロリンe6の分子数（結合数）を算出したところ、「pL30-Ce6」、「pL72-Ce6」及び「pL135-5.3」の結合数はそれぞれ、0.9、2.6及び5.3であった。
【００１４】
実施例２. pL-Ce6の腫瘍細胞への取り込み（１）
HeLa細胞へのpL30-Ce6及びCe6の取り込み量を以下のように測定した。Ce6が所定濃度となるように各光増感剤を細胞に添加し、37℃で2 時間インキュベートした。細胞を回収し、0.2 M NaOH水溶液で細胞を溶解させ、2％SDSを加え細胞抽出液を得た。細胞への光増感剤の取り込み量は細胞抽出液の蛍光強度を測定することにより決定した。励起波長は 400 nm、検出波長は 665 nmとした。
その結果、図１に示す通り、pL30-Ce6の細胞への取り込み量は、Ce6に比べ約12 倍増加した。これはカチオン性高分子のpLと細胞膜のリン脂質が引き合う為と考えられる。
【００１５】
光照射による殺細胞効果は以下のように測定した。細胞に所定濃度の光増感剤を添加し、37 ℃で2 時間インキュベート後に光照射を行った。光源は500 Wハロゲンランプで50 mW / cm2の光を8 分間照射した。光照射20 時間後にMTT法により細胞生存率を測定した。
光増感剤を加えずに光照射を行った場合の生存率を100%とした。その結果、図２に示す通り、pL30-Ce6は、Ce6に比べ、高い殺細胞効果を示すことが分かった。これはpL30-Ce6がCe6に比べHeLa細胞に多く取り込まれる為と考えられる。
以上の結果より、pL30-Ce6は高い殺細胞効果をし、Ce6に比べ効果的な光増感剤であることが示唆された。
【００１６】
実施例３. pL-Ce6の腫瘍細胞への取り込み（２）
HeLa細胞へのpL72-Ce6及びpL135-Ce6並びにCe6の取り込み量を以下のように測定した。Ce6が所定濃度となるように各光増感剤を細胞に添加し、37℃で2 時間インキュベートした。細胞を回収し、0.2 M NaOH水溶液で細胞を溶解させ、2％SDSを加え細胞抽出液を得た。細胞への光増感剤の取り込み量は細胞抽出液の蛍光強度を測定することにより決定した。励起波長は 400 nm、検出波長は 665 nmとした。
その結果、図３に示す通り、pL72-Ce6の細胞への取り込み量は、Ce6に比べ約30倍増加し、そしてpL135-Ce6の細胞への取り込み量は、Ce6に比べ約50倍増加した。これはカチオン性高分子のpLと細胞膜のリン脂質が引き合う為と考えられる。
【００１７】
光照射による殺細胞効果は以下のように測定した。細胞に所定濃度の光増感剤を添加し、37 ℃で2 時間インキュベート後に光照射を行った。光源は500 Wハロゲンランプで50 mW / cm2の光を8 分間照射した。光照射20 時間後にMTT法により細胞生存率を測定した。
光増感剤を加えずに光照射を行った場合の生存率を100%とした。その結果、図４に示す通り、pL30-Ce6は、Ce6に比べ、高い殺細胞効果を示すことが分かった。これはpL30-Ce6がCe6に比べHeLa細胞に多く取り込まれる為と考えられる。
以上の結果より、pL72-Ce6及びpL135-Ce6は高い殺細胞効果をし、Ce6に比べ効果的な光増感剤であることが示唆された。
【００１８】
キャリアーとして用いたpLの濃度に対する取り込み量を図５に示す。この図に示す通り、pLの濃度に対する取り込み量は、分子量が大きいものほど多く取り込まれることが分かった。即ち、分子量72,000のpLに比べて分子量が135,000のpLの方が効果的であった。
実施例４. pL-Ce6の核への取り込み
HeLa細胞中のpL30-Ce6及びCe6の取り込み部位を次のようにして決定した。pL30-Ce6又はCe6をHeLa細胞に添加し、37℃で2 時間インキュベートした。細胞を回収し、洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて光増感剤の局在部位を決定した。図６に示すとおり、pL30-Ce6は核に蓄積され（Ａ）、そしてCe6は細胞質に蓄積された（Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ce6（黒正方形）及びpL30-Ce6（黒丸）の濃度とHeLa細胞への取り込み量との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、Ce6（黒正方形）及びpL30-Ce6（黒丸）の濃度とHeLa細胞の生存率との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、Ce6（黒正方形）、pL72-Ce6（黒丸）及びpL135-Ce6（黒三角形）の濃度とHeLa細胞への取り込み量との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、Ce6（黒正方形）、pL72-Ce6（黒丸）及びpL135-Ce6（黒三角形）の濃度とHeLa細胞の生存率との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、pLの濃度に対する、pL72-Ce6（黒丸）及びpL135-Ce6（黒三角形）のHeLa細胞への取り込み量との関係を示すグラフである。
【図６】図５は、Ce6（右）及びpL30-Ce6（左）の、HeLa細胞内での蓄積部位を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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