(57)【要約】【課題】  公知ＤＮＡ配列の隣接領域を単離することが可能なオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーを提供する。【解決手段】  前記アダプターは、長鎖オリゴヌクレオチドと、その３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなり、前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列からなる突出末端である。また、前記各オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがなく、最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上（長鎖）又は−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上（短鎖）であり、分子内ヘアピン構造を形成しない。前記プライマーは、前記アダプターにおける長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（ａ）長鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記長鎖オリゴヌクレオチドの３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチドアダプターであって、
（Ｂ）前記オリゴヌクレオチドアダプターにおける前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列
からなる突出末端であり、
（Ｃ）前記長鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（Ｄ）前記短鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドアダプター。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列からなる長鎖オリゴヌクレオチドと、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなる短鎖オリゴヌクレオチドとからなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアダプター。
【請求項３】
配列番号１〜３のいずれか１つで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアダプターにおける長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記部分塩基配列に関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
配列番号４で表される塩基配列、あるいは、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列を含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列における各塩基に関して、最隣接熱力学法により各塩基毎に決定される各自由エネルギーについて、５’末端側領域における自由エネルギーの平均値が、３’末端側領域における自由エネルギーの平均値よりも低い、請求項４又は５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドアダプターと、請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマーとを用いることを特徴とする、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法。
【請求項８】
公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法であって、
（１）ＤＮＡ試料を、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）により生成した各ＤＮＡ断片の５’突出末端を、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する工程、
（３）前記工程（２）により得られた各ＤＮＡ断片に、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドアダプターを連結する工程、
（４）前記工程（３）により得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、請求項４〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプライマー２種類と、前記公知ＤＮＡ配列に特異的なプライマー２種類とを用いて、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程
を含むことを特徴とする、前記単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーに関する。本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーは、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離（例えば、染色体ウォーキング）に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
公知ＤＮＡ配列に隣接する未知ＤＮＡ配列の単離及び機能解析は、例えば、染色体ウォーキング（chromosome walking）、又はプロモーター領域若しくはタグ付きＤＮＡの隣接配列の単離などに重要である。公知ＤＮＡ配列領域からその隣接領域への「ウォーキング」のために、種々の改良ＰＣＲ法が開発されてきた。公知の改良ＰＣＲ法としては、例えば、断片化したゲノムＤＮＡを環状化させることを特徴とするインバースＰＣＲ法、断片化したゲノムＤＮＡにアダプターを連結させることを特徴とするライゲーション介在（ligation-mediated）ＰＣＲ（ＬＭ−ＰＣＲ）法、あるいは、ランダムプライマーを使用することを特徴とするランダムプライマー（randomly primed）ＰＣＲ法などが知られている。
【０００３】
しかしながら、これらの公知方法では、巨大ゲノムを有する生物に適用する場合、ＰＣＲを実施する際に使用する鋳型ＤＮＡの複雑性に起因する多くの非特異的配列（すなわち、ノイズ配列）が増幅されるため、更に簡易かつ効率的なウォーキング方法が求められていた。
前記ＬＭ−ＰＣＲ法（非特許文献１）は、それ以外の公知方法と比較すれば、ノイズ配列の発生が少ない方法ではあるが、ゲノムＤＮＡ断片へのアダプター結合率が低いこと、そして、非特異的な増幅を更に抑えることが課題であった。
【０００４】
【非特許文献１】レディー・エム・ケー（Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｋ．）ら，「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），２００２年，３０６巻，ｐ．１５４−１５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、巨大なゲノムを有する生物、例えば、ユリ（ゲノムサイズ＝３６０〜９００億塩基対；ヒトのゲノムサイズは３４億塩基対）から、公知の構造遺伝子に対するプロモーター領域を単離するために、ＬＭ−ＰＣＲ法を含む各種公知方法を用いて染色体ウォーキングを実施したが、所望のＤＮＡ配列を得ることはできなかった。この理由は、ＰＣＲを実施する際に鋳型として使用するＤＮＡ試料及びその中に含まれる標的ＤＮＡ断片に関して、ゲノムサイズが巨大になるに従って、著しく複雑性が増すためである。
これまで報告のあった植物は、例えば、アラビドプシス（Arabidopsis taliana）、イネ、エンドウ、アブラナ属（brassica）、又はタバコであるが、最も大きなゲノムサイズを有するタバコでも約４４億塩基対である。
本発明者は、このような巨大ゲノムを有する生物からでもプロモーター領域を取得することのできる方法を鋭意探求したところ、特定の条件を満たすアダプター及びプライマーを用いることにより、前記プロモーター領域を含むＤＮＡ配列を取得することができることを新たに見出した。
【０００６】
従って、本発明の課題は、従来技術の欠点を解消し、標的ＤＮＡ断片の含有率が著しく低いＤＮＡ試料であっても、公知ＤＮＡ配列の隣接領域を単離することが可能な、新規のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、本発明による、
（Ａ）（ａ）長鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記長鎖オリゴヌクレオチドの３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなるオリゴヌクレオチドアダプターであって、
（Ｂ）前記オリゴヌクレオチドアダプターにおける前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列
からなる突出末端であり、
（Ｃ）前記長鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（Ｄ）前記短鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドアダプター
により解決することができる。
【０００８】
本発明のオリゴヌクレオチドアダプターの好ましい態様によれば、配列番号１で表される塩基配列からなる長鎖オリゴヌクレオチドと、配列番号２又は配列番号３で表される塩基配列からなる短鎖オリゴヌクレオチドとからなる。
【０００９】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチドアダプターにおける長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記部分塩基配列に関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
ことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの好ましい態様によれば、配列番号４で表される塩基配列、あるいは、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列を含む。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの別の好ましい態様によれば、前記オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列における各塩基に関して、最隣接熱力学法により各塩基毎に決定される各自由エネルギーについて、５’末端側領域における自由エネルギーの平均値が、３’末端側領域における自由エネルギーの平均値よりも低い。
【００１１】
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチドアダプターと、前記オリゴヌクレオチドプライマーとを用いることを特徴とする、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法に関する。
更に、本発明は、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法であって、
（１）ＤＮＡ試料を、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）により生成した各ＤＮＡ断片の５’突出末端を、デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する工程、
（３）前記工程（２）により得られた各ＤＮＡ断片に、前記オリゴヌクレオチドアダプターを連結する工程、
（４）前記工程（３）により得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、前記オリゴヌクレオチドプライマー２種類と、前記公知ＤＮＡ配列に特異的なプライマー２種類とを用いて、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応を実施する工程
を含むことを特徴とする、前記単離方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、標的ＤＮＡ断片の含有率が著しく低いＤＮＡ試料であっても、公知ＤＮＡ配列の隣接領域を単離することが可能である。従って、本発明によれば、巨大ゲノムを有する生物であっても、例えば、染色体ウォーキングが可能であり、プロモーター領域を取得することができる。
【００１３】
ところで、現在までに膨大な数のＤＮＡ塩基配列が決定され、その配列情報はデータベースとして保存されているが、ヒト又はマウス等の一部の生物を除き、多くの生物種においてはその多くはｃＤＮＡライブラリーに由来する構造遺伝子の情報である。これは、ゲノム上の非翻訳領域の大部分が、構造遺伝子と比較して意味のない情報であり、その塩基配列を決定するためのコストを考慮すると、構造遺伝子と比較してプライオリティーが低くなるためである。しかしながら、構造遺伝子の情報が蓄積されるに従って、それらの発現調節に影響を与えるプロモーター領域の単離及び機能解析は益々重要なものとなってきている。既に取得済みの多くのｃＤＮＡライブラリーから、各構造遺伝子の塩基配列情報を取得し、本発明方法を実施することにより、多くのプロモーター領域を、簡易かつ高効率で単離することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明による、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法は、公知のＬＭ−ＰＣＲ法の改良発明であり、本発明の主たる特徴は、これに限定されるものではないが、特定の条件を満たす本発明のオリゴヌクレオチドアダプター（以下、単にアダプターと称する）及びプライマーを用いることにある。以下、本発明方法（以下、ＬＭ−ＰＣＲ法とも称する）について図１に沿って説明した後、本発明のアダプター及びプライマーについて説明する。
【００１５】
［１］本発明による、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離方法
ＬＭ−ＰＣＲ法では、始めに、ＤＮＡ試料（例えば、ゲノムＤＮＡ又はクローン化ＤＮＡ）を制限酵素で消化する［消化工程；例えば、図１における工程（Ａ）］。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記制限酵素として、５’突出末端を生じさせる制限酵素［図１におけるＤＮＡ（ｂ）参照］を使用する。例えば、図１では、制限酵素ＢａｍＨＩ（認識配列ＧＧＡＴＣＣ）を使用しており、ＢａｍＨＩ消化［工程（Ａ）］により二本鎖ＤＮＡ断片［ＤＮＡ（ｂ）］を生じさせる。前記ＤＮＡ（ｂ）を構成する両鎖は、それぞれ、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を有する。
【００１６】
本発明方法における消化工程で使用する制限酵素は、５’突出末端を生じさせる制限酵素である限り、特に限定されるものではないが、消化後の５’突出末端の塩基長が４塩基以上であり、後述する充填工程を実施した後の５’突出末端の塩基長が３塩基以上である制限酵素が好ましい。
例えば、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素としては、例えば、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩを挙げることができる。塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素としては、例えば、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、又はＡｖｒIIを挙げることができる。
【００１７】
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記消化工程の後、５’突出末端を有するＤＮＡ断片の前記５’突出末端を、適当なデオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸を用いて部分的に充填する［充填工程；例えば、図１における工程（Ｂ）］。例えば、図１に示す工程（Ｂ）では、クレノウ酵素とデオキシグアノシン５’−三リン酸とを用いて、ＤＮＡ（ｂ）を構成する各鎖の３’末端（Ｇ）にＧを付加することによって、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を、塩基配列ＴＡＧからなる５’突出末端に改変する。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程を実施することにより、後述するアダプター連結工程において、制限酵素で断片化されたＤＮＡ断片同士が再連結するのを防止することができ、その結果、ＤＮＡ断片とアダプターとの連結効率を向上させることができる。
【００１８】
通常のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記クレノウ酵素として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたもの（５’→３’ｅｘｏ−；なお、弱い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を使用するが、本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の欠失（５’→３’ｅｘｏ−）に加え、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性も欠失（３’→５’ｅｘｏ−）させたクレノウ酵素を使用することが好ましい。
【００１９】
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程の後、得られた各ＤＮＡ断片に、長鎖オリゴヌクレオチド及び短鎖オリゴヌクレオチドからなるアダプターを連結する［アダプター連結工程；例えば、図１における工程（Ｃ）］。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法では、前記充填工程を実施するので、制限酵素で断片化されたＤＮＡ断片同士が再連結するのを防止することができ、その結果、ＤＮＡ断片とアダプターとの連結効率を向上させることができる。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法で用いる本発明のアダプターについては、後述する。
【００２０】
ＬＭ−ＰＣＲ法では、前記アダプター連結工程の後、得られた各ＤＮＡ断片を鋳型として、ネステッドＰＣＲを実施する［ネステッドＰＣＲ工程；例えば、図１における工程（Ｄ）及び（Ｅ）］。ネステッドＰＣＲでは、１組のプライマーセットを用いて第１回目のＰＣＲを実施した後、前記プライマーセットの内側に位置する別のプライマーセットを用いて第２回目のＰＣＲを実施する。ＬＭ−ＰＣＲ法におけるネステッドＰＣＲ工程では、標的とする１つの公知ＤＮＡ配列に対して、アダプターの塩基配列に基づいて設計されるアダプタープライマー（ＡＰ）２種類と、標的とする公知ＤＮＡ配列に基づいて設計される特異的プライマー（ＳＰ）２種類とを使用する。本発明のＬＭ−ＰＣＲ法で用いる本発明のアダプタープライマーについては、後述する。
【００２１】
例えば、図１におけるＤＮＡ（ｄ）を鋳型とする場合には、アダプタープライマーとして、アダプターの一方の鎖（長鎖オリゴヌクレオチド）における外側（すなわち、５’側）の部分塩基配列からなるアダプタープライマー（ＡＰ１）と、その内側（すなわち、３’側）の部分塩基配列を含む［所望により、制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）認識配列を含む］アダプタープライマー（ＡＰ２）とを使用することができる。一方、特異的プライマーとして、公知ＤＮＡ配列の一方の鎖における適当な部分塩基配列からなる特異的プライマー（ＳＰ１）と、その内側の部分塩基配列を含む特異的プライマー（ＳＰ２）とを使用することができる。
【００２２】
図１における工程（Ｄ）では、ＤＮＡ（ｄ）を鋳型とし、プライマーＡＰ１及びプライマーＳＰ１をプライマーセットとして、ネステッドＰＣＲの第１回ＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ（ｅ）を増幅することができる。続く工程（Ｅ）では、得られたＤＮＡ（ｅ）を鋳型とし、プライマーＡＰ２及びプライマーＳＰ２をプライマーセットとして、ネステッドＰＣＲの第２回ＰＣＲを実施することにより、ＤＮＡ（ｆ）を増幅することができる。
【００２３】
本発明のＬＭ−ＰＣＲ法を実施することにより最終的に増幅されるＤＮＡ断片［例えば、図１におけるＤＮＡ（ｆ）］には、標的とした公知ＤＮＡ配列の一部（すなわち、一方の末端とプライマーＳＰ２とに挟まれた領域）と共に、前記公知ＤＮＡ配列に隣接する未知領域とが含まれる。前記隣接領域は、前記公知ＤＮＡ配列との境界と、消化工程で用いた制限酵素の認識配列とに挟まれた領域である。
【００２４】
［２］本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマー
これまで述べたように、本発明方法では、本発明のオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーを使用する。本発明のアダプター及びプライマーは、公知のアダプター及びプライマーと異なる、以下に説明する特定条件を満たす必要があるため、それ自体、新規のアダプター及びプライマーである。
【００２５】
本発明のアダプターは、
（Ａ）（ａ）長鎖オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記長鎖オリゴヌクレオチドの３’末端領域の塩基配列に相補的な塩基配列を含む短鎖オリゴヌクレオチドとからなり、
（Ｂ）アダプターを形成させた場合に、前記短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端が、５’突出末端を生じさせる制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列からなる突出末端であり、
（Ｃ）前記長鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（Ｄ）前記短鎖オリゴヌクレオチドに関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成することがなく、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
なお、自由エネルギーは温度に依存するため、本明細書におけるアダプターに関する自由エネルギーの各値は、特に断らない限り、アダプターを用いた連結反応（例えば、アダプター連結工程）の一般的な実施温度（例えば、１６℃）における算出値である。
【００２６】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ａ）について、長鎖オリゴヌクレオチドの塩基数は、本発明のアダプターが満たすべき各種条件を満足することができる限り、特に限定されるものではないが、通常、３０〜５０であり、好ましくは３３〜４５であり、より好ましくは３６〜４０である。
【００２７】
また、短鎖オリゴヌクレオチドの塩基数は、本発明のアダプターが満たすべき各種条件を満足することができる限り、特に限定されるものではないが、通常、８〜２０であり、好ましくは１０〜１８であり、より好ましくは１２〜１７である。短鎖オリゴヌクレオチドは、長鎖オリゴヌクレオチドとアダプターを形成させた場合に、二重鎖部分を構成する部分（３’末端を含む大部分）と、５’突出末端となる部分（５’末端）とからなる。
【００２８】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｂ）において、「５’突出末端を生じさせる制限酵素」とは、本発明方法における消化工程で使用する前述の「５’突出末端を生じさせる制限酵素」を意味し、本発明方法における消化工程において先述した説明がそのまま当てはまる。
【００２９】
短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端（すなわち、５’突出末端となる部分）は、前記制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列の部分配列からなる。前記部分配列としては、前記制限酵素で消化することにより生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列から、その５’末端の塩基１又は数個が欠失した配列を挙げることができる。前記部分配列は、１〜３塩基であることが好ましく、２〜３塩基であることがより好ましい。
【００３０】
例えば、５’突出末端を生じさせる制限酵素が、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（例えば、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩ）である場合には、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列はＧＡＴＣであり、その相補的な塩基配列はＧＡＴＣである［図１におけるＤＮＡ（ｂ）参照］ので、短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端の塩基配列は、例えば、ＡＴＣ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＧＡＴＣ）から、その５’末端の塩基１個（Ｇ）が欠失した配列；図１におけるアダプター参照］、又はＴＣ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＧＡＴＣ）から、その５’末端の塩基２個（ＧＡ）が欠失した配列］であることができる。
【００３１】
また、５’突出末端を生じさせる制限酵素が、塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（例えば、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＸｂａＩ、又はＡｖｒII）である場合には、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列はＣＴＡＧであり、その相補的な塩基配列はＣＴＡＧであるので、短鎖オリゴヌクレオチドの５’末端の塩基配列は、例えば、ＴＡＧ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＣＴＡＧ）から、その５’末端の塩基１個（Ｃ）が欠失した配列］、又はＡＧ［すなわち、前記制限酵素により生じる５’突出末端の塩基配列に相補的な塩基配列（ＣＴＡＧ）から、その５’末端の塩基２個（ＣＴ）が欠失した配列］であることができる。
【００３２】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（１）に示すように、長鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがない。本明細書において「３’末端ホモダイマー」とは、２つの同一のオリゴヌクレオチドから最も安定的な３’末端ホモダイマーを形成させた場合に、相補的塩基対形成を行う塩基が連続する領域（但し、３’末端の塩基を含む領域に限る）の塩基数が２以上であるダイマー［例えば、後述の式（Ｖ）で表される３’末端ホモダイマー］を意味する。
【００３３】
アダプターの一方の鎖が３’末端ホモダイマーを形成する傾向がある場合、所望のアダプター構造をとらない可能性がある。しかも、３’末端ホモダイマーが形成された状態でＰＣＲを実施すると、３’末端ホモダイマーにおける一本鎖部分が鋳型となって、５’→３’方向へのＤＮＡ合成が行われるため、所望のアダプター構造の形成にとって不利である。本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００３４】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（２）について、長鎖オリゴヌクレオチドの最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。前記自由エネルギーが−６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であると、安定なホモダイマーを形成する傾向が高くなり、所望のアダプター構造をとらない可能性がある。
【００３５】
前記自由エネルギーは、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 3746-3750又はProc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 9373-9377に記載の方法により算出することができ、より具体的には、本明細書に記載の各数値は、市販のソフトウェア（OLIGOTMPrimer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いて算出した値である。
【００３６】
公知のアダプター（例えば、ＬＭ−ＰＣＲ法に用いる公知アダプター）は、ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片のクローニングの便宜を考慮して、その配列中に制限酵素認識部位を含むことが一般的である。ほとんどの制限酵素認識部位は少なくとも４〜６個の塩基からなるパリンドローム構造を有するため、制限酵素認識部位を含む公知アダプターは、前記制限酵素認識部位により安定的なホモダイマーを形成する。それに対して、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、安定なホモダイマーを形成することがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００３７】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｃ）（３）に示すように、長鎖オリゴヌクレオチドは、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
ヘアピン構造の解析は、例えば、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83, 9373-9377又はNucleic Acids Res. 16, 11725-11735に記載の方法により算出することができ、より具体的には、市販のソフトウェア（OLIGOTMPrimer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いて解析することができる。なお、ヘアピン構造における自由エネルギーは、ヘアピンループのステムとループ長より計算される自由エネルギーの和である。
【００３８】
また、本明細書において「分子内ヘアピン構造を形成しない」とは、ステム領域の塩基長が３塩基以上のヘアピン構造を形成しないことを意味する。本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドは、安定なヘアピン構造をとることがないため、短鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００３９】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（１）に示すように、短鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがない。本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、３’末端ホモダイマーを形成することがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００４０】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（２）について、短鎖オリゴヌクレオチドの最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であり、より好ましくは−３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、安定なホモダイマーを形成することがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００４１】
本発明のアダプターにおける前記条件（Ｄ）（３）に示すように、短鎖オリゴヌクレオチドは、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のアダプターを構成する短鎖オリゴヌクレオチドは、安定なヘアピン構造をとることがないため、長鎖オリゴヌクレオチドと一緒になって所望のアダプター構造をとることができる。
【００４２】
本発明のプライマーは、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドの部分塩基配列（以下、長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列と称する）を含み、前記部分塩基配列に関して、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。
なお、本明細書におけるプライマーに関する自由エネルギーの各値は、特に断らない限り、２５℃における算出値である。
【００４３】
本発明のプライマーにおける前記条件（１）に示すように、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、３’末端ホモダイマーを形成することがないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−２．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定した３’末端ホモダイマーを形成することがないため、プライマーダイマーの生成が起こらない。
【００４４】
本発明のプライマーにおける前記条件（２）について、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列の最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギー、より具体的には、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列における自由エネルギーは、−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、好ましくは−４．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、より好ましくは−３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定なホモダイマーを形成することがないため、アダプターに対する高いアニール効率を得ることができる。
【００４５】
本発明のプライマーにおける前記条件（３）について、本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である。本発明のプライマーは、安定なヘアピン構造をとることがないため、アダプターに対する高いアニール効率を得ることができる。
【００４６】
本発明のプライマーにおいて、本発明のアダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列に由来する塩基配列の塩基長は、本発明のプライマーが満たすべき各種条件を満足する限り、特に限定されるものではないが、通常、１８〜３０塩基である。
【００４７】
本発明のプライマーは、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列のみからなることもできるし、あるいは、前記部分配列と、その５’末端に付加した付加配列（例えば、制限酵素認識部位を含む配列）とからなる配列であることもできる。本発明のプライマーを本発明のＬＭ−ＰＣＲ法におけるネステッドＰＣＲ工程に使用する場合、第１回ＰＣＲに用いるプライマーとしては［図１における工程（Ｄ）及びプライマーＡＰ１参照］、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列のみからなるプライマーが好ましく、第２回ＰＣＲに用いるプライマーとしては［図１における工程（Ｅ）及びプライマーＡＰ２参照］、前記長鎖オリゴヌクレオチドの部分配列と、その５’末端に付加した付加配列（例えば、制限酵素認識部位を含む配列）とからなるプライマーが好ましい。
【００４８】
本発明のプライマーにおける長鎖オリゴヌクレオチド由来部分塩基配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列における各塩基に関して、最隣接熱力学法（Breslauer,K.J., Frank,R., Blocker,H. and Marky,L.A. (1986) A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad.Sci.USA, 83, 37）により各塩基毎に決定される各自由エネルギー（ΔＧ値）について、プライマー全体を見渡した場合に、５’末端側領域の自由エネルギーが、３’末端側領域の自由エネルギーよりも低いことが好ましい。例えば、プライマーにおける５’末端側の１／３（より好ましくは１／２）の領域に含まれる各塩基の自由エネルギーの平均値が、プライマーにおける３’末端側の１／３（より好ましくは１／２）の領域に含まれる各塩基の自由エネルギーの平均値よりも低いことが好ましい。また、５’末端の自由エネルギーが低く、３’末端に行くに従って自由エネルギーが高くなり（すなわち、安定性が減少する）、３’末端では適当なΔＧ（例えば、−９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）より多少安定性の低い値で終了することが好ましい。
【００４９】
最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーに関して、プライマーにおける自由エネルギーが低い領域ほど、プライマーと鋳型ＤＮＡとの結合力が高くなるので、前記条件を満たすプライマーは、５’末端側領域の結合力が３’末端側領域の結合力よりも強くなる。ここで、ＰＣＲにより５’→３’方向のＤＮＡ合成が開始されるためには、プライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡと結合することが必須である。前記条件を満たすプライマーは、３’末端が鋳型ＤＮＡと結合する条件下では、当然、５’末端側領域も結合しており、従って、その全塩基配列に亘ってプライマーと鋳型ＤＮＡとが結合するため、配列特異性を向上させることができる。
一方、前記条件を満たさないプライマー、例えば、５’末端側領域の結合力が３’末端側領域の結合力よりも弱い場合には、３’末端が鋳型ＤＮＡと結合する条件下では、５’末端側領域が鋳型ＤＮＡと結合していない場合があり、この場合、３’末端側領域でのみ配列特異性を保証しているため、配列特異性が低い。
【００５０】
本発明のアダプターを本発明のＬＭ−ＰＣＲ法に使用する場合、前記アダプターは、前記条件（１）〜（３）を満たす本発明のプライマー２種類と一緒に使用するため、前記アダプター自身が前記条件（１）〜（３）に相当する条件を満たすことが好ましい。
すなわち、本発明のアダプターは、本発明のアダプターに関する前記条件（Ａ）〜（Ｄ）に加えて、
（Ｅ）アダプターを構成する長鎖オリゴヌクレオチドが、その塩基配列中に、
（１）３’末端ホモダイマーを形成しないか、あるいは、形成したとしても、相補的塩基対形成を行う３’末端領域の自由エネルギーが−２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（２）最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、前記ホモダイマーにおける自由エネルギーが−４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上であり、
（３）分子内ヘアピン構造を形成しないか、あるいは、形成したとしても、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上である
部分塩基配列を、少なくとも２つ含む
ことが好ましい。
【００５１】
本発明のアダプターは、本発明のアダプターに関する前記条件（Ａ）〜（Ｄ）［好ましくは前記条件（Ａ）〜（Ｅ）］を満たす限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる制限酵素の種類等に応じて適宜決定することができる。より具体的には、例えば、用いる制限酵素の認識部位の塩基配列等を考慮して、長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列を設計し、３’末端ホモダイマーの形成の有無、最も安定的なホモダイマーを形成させた場合の自由エネルギー、そして、分子内ヘアピン構造の形成の有無を検討することにより、長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列を絞り込むことができる。これらの項目の検討は、例えば、市販のソフトウェア（例えば、OLIGOTM Primer Analysis Software; Maxim Biotech, Inc.）を用いることにより、容易に判定することができる。得られた長鎖オリゴヌクレオチドの候補塩基配列から、更に、短鎖オリゴヌクレオチド及びプライマーを設計し、同様にして、各種条件を検討することにより、本発明のアダプターを形成する長鎖オリゴヌクレオチド及び短鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせ、並びに本発明のプライマーを取得することができる。
【００５２】
本発明のアダプターの長鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｆと称する）を挙げることができる。配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆは、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（Ｉ）：
【化１】
2005192490.tif 000002
で表される最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列［式（Ｉ）において実線で塩基対を示す、３塩基対からなる配列］における自由エネルギーが−５．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝１６℃）であり、
（３）式（II）：
【化２】
2005192490.tif 000003
で表されるヘアピン構造（ループ＝２１塩基）を形成させた場合に、前記ヘアピン構造における自由エネルギーが１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝１６℃）である。
【００５３】
本発明のアダプターの短鎖オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｒ１と称する）又は配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＲＷ−Ｒ２と称する）を挙げることができる。
【００５４】
配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（III）：
【化３】
2005192490.tif 000004
で表される最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列［式（III）において実線で塩基対を示す、２塩基対からなる配列］における自由エネルギーが−３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝１６℃）であり、
（３）ヘアピン構造を形成しない。
【００５５】
また、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（IV）：
【化４】
2005192490.tif 000005
で表される最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列［式（IV）において実線で塩基対を示す、２塩基対からなる配列］における自由エネルギーが−３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝１６℃）であり、
（３）ヘアピン構造を形成しない。
【００５６】
本発明のアダプターとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１との組み合わせ（短鎖オリゴヌクレオチドであるＲＷ−Ｒ１の５’末端の塩基配列はＡＴＣ）、又は配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２との組み合わせ（短鎖オリゴヌクレオチドであるＲＷ−Ｒ２の５’末端の塩基配列はＴＡＧ）を挙げることができる。
【００５７】
本発明のプライマーとしては、例えば、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＷＰ１と称する）又は配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、ＷＰ２と称する）若しくは配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。配列番号４で表される塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列の１番〜２２番までの塩基からなる配列に相当する。また、配列番号５で表される塩基配列における１１番〜３５番の塩基からなる配列は、配列番号１で表される塩基配列の１４番〜３８番までの塩基からなる配列に相当し、配列番号５で表される塩基配列における３番〜１０番の塩基からなる配列は、制限酵素ＮｏｔＩの認識配列である。
【００５８】
配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ１は、
（１）式（Ｖ）：
【化５】
2005192490.tif 000006
で表される最も安定的な３’末端ホモダイマーを形成させた場合に、相補的塩基対形成を行う３’末端領域［式（Ｖ）において実線で塩基対を示す、２塩基対からなる配列］の自由エネルギーが−１．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）であり、
（２）式（VI）：
【化６】
2005192490.tif 000007
で表される最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列［式（VI）において実線で塩基対を示す、２塩基対からなる配列］における自由エネルギーが−３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）であり、
（３）ヘアピン構造を形成しない。
また、最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーを、図２に示す。図２に示す各ΔＧ値は、５塩基長のサブシークエンスブロック内の各塩基のΔＧ値の合計である（温度＝２５℃）。配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ１では、５’末端側領域における各塩基の自由エネルギーは概ね−９〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）の範囲内にあり、３’末端側領域における各塩基の自由エネルギーは概ね−６〜−７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）の範囲内にあり、５’末端側領域における自由エネルギーは、３’末端側領域における自由エネルギーよりも低い。
【００５９】
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＷＰ２は、
（１）３’末端ホモダイマーを形成せず、
（２）式（VII）：
【化７】
2005192490.tif 000008
で表される最も安定的なホモダイマーを形成させた場合に、ミスマッチを含まず連続して水素結合を形成する塩基対の配列の内、最も長い塩基対の配列［式（VII）において実線で塩基対を示す、２塩基対からなる配列］における自由エネルギーが−３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ（温度＝２５℃）であり、
（３）ヘアピン構造を形成しない。
また、最隣接熱力学法により決定される各塩基の自由エネルギーを、図３に示す。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００６１】
《実施例１：植物ゲノムＤＮＡを試料とする公知ＤＮＡ配列の上流領域の単離及び配列決定》
本実施例では、以下に示す手順に従って、イネ（Oryza glaberrima；ゲノムサイズ＝４４０Ｍｂ）、タバコ（Nicotiana tabacum；ゲノムサイズ＝４，４３４Ｍｂ）、及びユリ（Lilium regale；ゲノムサイズ＝３１，０００Ｍｂ）由来のゲノムＤＮＡを試料とし、それぞれ、ζグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ζglutathione S-transferase；以下、ＧＳＴＺと略称する) 遺伝子（Genbank accession No. AB121668）、アセトラクテートシンターゼ（acetolactate synthase gene；以下、ＡＬＳと略称する）遺伝子（Genbank accession No. X07645）、及びＭＡＤＳボックス（MADS-box；以下、ＬＲＤＥＦと略称する）遺伝子（Genbank accession No. AB071378）の各上流領域を単離した。
【００６２】
（１）アダプター及びプライマーの設計及び調製
本実施例で使用したアダプター及びプライマー並びにその塩基配列を図４に示す。
本発明のアダプターとしては、長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆ（配列番号１）と短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１（配列番号２）との組み合わせからなるアダプター（以下、アダプター１と称する）、及び長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆと短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ２（配列番号３）との組み合わせからなるアダプター（以下、アダプター２と称する）を使用した。アダプタープライマーとしては、本発明のプライマーであるプライマーＷＰ１（配列番号４）及びプライマーＷＰ２（配列番号５）を使用した。プライマーＷＰ２は、その５’末端にＮｏｔＩ認識配列を有する。
前記公知遺伝子に関する特異的プライマーとしては、イネＧＳＴＺ遺伝子についてはプライマーＧＳＴＺ１（配列番号６）及びプライマーＧＳＴＺ２（配列番号７）を、タバコＡＬＳ遺伝子についてはプライマーＡＬＳ１（配列番号８）及びプライマーＡＬＳ２（配列番号９）を、ユリＬＲＤＥＦ遺伝子についてはプライマーＤＥＦ１（配列番号１０）及びプライマーＤＥＦ２（配列番号１１）を使用した。
長鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｆの５’末端を脱リン酸化し、短鎖オリゴヌクレオチドＲＷ−Ｒ１及びＲＷ−Ｒ２の各３’末端の水酸基を一級アミノ基でブロッキングした。
【００６３】
（２）ゲノムＤＮＡ試料の調製と各種酵素処理（制限酵素消化、部分的末端充填、及びアダプター連結）
各植物由来のゲノムＤＮＡは、ＣＴＡＢ法［Rogers, O. S. and J. A. Bendich (1988) Extraction of DNA from plant tissues. In: Gelvin, S.B., R.A. Schiliperoort and D.P.S. Verma (eds.) Plant molecular biology manual. Kluwer Academic Pulblishers, Dordrecht Boston London A6:1-10.］により、各植物から抽出した。
【００６４】
イネゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）、タバコゲノムＤＮＡ（４００ｎｇ）、ユリゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）を、それぞれ、各制限酵素（ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII，ＢｃｌＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＳｐｅＩ，ＮｈｅＩ，又はＸｂａＩ）１０ユニットにより３７℃（ＢｃｌＩのみ５５℃）で６時間反応させることにより、完全に消化した。これらの制限酵素は、すべて、４塩基の５’突出末端を生じさせた。
【００６５】
得られた各反応液の内、塩基配列ＧＡＴＣからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（以下、ＧＡＴＣ型制限酵素と称する。具体的には、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、又はＳａｕ３ＡＩ）で消化した反応液については、ｄＧＴＰの存在下にて、クレノウ酵素（３’→５’ｅｘｏ−；NEW ENGLAND）１ユニットにより部分的な充填（fill in）反応を実施した。また、塩基配列ＣＴＡＧからなる５’突出末端を生じさせる制限酵素（以下、ＣＴＡＧ型制限酵素と称する。具体的には、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、又はＸｂａＩ）で消化した反応液については、ｄＣＴＰの存在下にて、クレノウ酵素（３’→５’ｅｘｏ−）１ユニットにより部分的な充填（fill in）反応を実施した。
【００６６】
充填反応を実施した後、各反応液を７５℃で２０分間加熱することにより、クレノウ酵素活性を失活させた。
ＧＡＴＣ型制限酵素で処理した反応液については、前記実施例１（１）で調製したアダプター１（ＲＷ−Ｆ及びＲＷ−Ｒ１が各々１００ｐｍｏｌ）と市販のライゲーションキット（Ligation high；TOYOBO）とを用いて１５時間反応させることにより、部分的に末端を充填された制限酵素断片化ＤＮＡと前記アダプター１とを連結させた。
一方、ＣＴＡＧ型制限酵素で処理した反応液については、前記実施例１（１）で調製したアダプター２（ＲＷ−Ｆ及びＲＷ−Ｒ２が各々１００ｐｍｏｌ）と市販のライゲーションキット（Ligation high；TOYOBO）とを用いて１５時間反応させることにより、部分的に末端を充填された制限酵素断片化ＤＮＡと前記アダプター２とを連結させた。
【００６７】
（３）ネステッドＰＣＲ、クローニング、及び配列決定
前記実施例１（２）で得られた、アダプター連結ＤＮＡ断片を含有する各反応液から１μＬを取り、それらを水１００μＬでそれぞれ希釈したものを、以下の第１回ＰＣＲの鋳型として使用した。第１回ＰＣＲは、実施例１（１）で調製した各特異的プライマー（ＧＳＴＺ１、ＡＬＳ１、又はＤＥＦ１）とプライマーＷＰ１との組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼ（KOD DNA polymerase；TOYOBO）とを使用して実施した。また、ＰＣＲ条件としては、ホットスタート法を採用し、変性処理（９４℃、２分間）の後、９４℃（３０秒間）、６５℃（３０秒間）、及び６８℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。
【００６８】
第１回ＰＣＲを実施して得られた各反応液から１μＬをとり、それぞれ５０倍希釈したものを、次の第２回ＰＣＲの鋳型として使用した。第２回ＰＣＲは、実施例１（１）で調製した各特異的プライマー（ＧＳＴＺ２、ＡＬＳ２、又はＤＥＦ２）とプライマーＷＰ２との組み合わせを使用したこと、そして、ＰＣＲのサイクルを３０回としたこと以外は、第１回ＰＣＲと同様にして実施した。
【００６９】
得られた各反応液を１％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色によりＤＮＡバンドを可視化した。
前記電気泳動の結果を図５（イネ）、図６（タバコ）、及び図７（ユリ）にそれぞれ示す。図５〜図７において、レーン１〜レーン７は、それぞれ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌII、ＢｃｌＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、及びＸｂａＩを制限酵素として用いた場合の結果である。図５及び図６におけるレーンＭは分子量マーカーであり、図７におけるレーンＭ１及びＭ２は、それぞれ、φX174/HaeIII 分子量マーカー及びλDNA/HindIII 分子量マーカーである。
【００７０】
得られたＤＮＡバンドを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、pBluescript SK(-) プラスミドベクターのＨｉｎｃII及びＮｏｔＩ部位間に連結した。各ＤＮＡバンドの塩基配列を、それぞれの両端から、ＤＮＡシークエンサー（ABI PRISMTM 3100 DNA sequencer）を用いて決定した。
【００７１】
イネ及びタバコについては、得られたＤＮＡバンドの３’末端領域の塩基配列と、公知ＤＮＡ配列（イネＧＳＴＺ遺伝子又はタバコＡＬＳ遺伝子）の５’末端領域の塩基配列とが完全に一致した。
ユリについて比較した結果を図８に示す。得られたＤＮＡバンドの３’末端領域の塩基配列（図８において記号ＰＲＯで示す配列）と、公知ＤＮＡ配列（ユリＬＲＤＥＦ遺伝子）の５’末端領域の塩基配列（図８において記号ＤＥＦで示す配列）とが、一塩基を除いて一致した。
これらの結果から明らかなように、イネ及びタバコだけでなく、全生物中、最も巨大なゲノムサイズを有する生物の１つであるユリからも、公知ＤＮＡ配列の隣接領域をクローニングすることができた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のアダプター及びプライマーは、公知ＤＮＡ配列の隣接領域の単離（例えば、染色体ウォーキング）の用途に適用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１〜５で表される各塩基配列は、それぞれ、アダプターＲＷ−Ｆ、アダプターＲＷ−Ｒ１、アダプターＲＷ−Ｒ２、プライマーＷＰ１、及びプライマーＷＰ２である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明のＬＭ−ＰＣＲ法の各工程の概略を示す説明図である。
【図２】本発明のプライマーＷＰ１における各塩基の自由エネルギーを示すグラフである。
【図３】本発明のプライマーＷＰ２における各塩基の自由エネルギーを示すグラフである。
【図４】実施例１で使用したアダプター及びプライマー並びにその塩基配列を示す説明図である。
【図５】本発明方法におけるネステッドＰＣＲ実施後の反応液（イネ）をアガロースゲル電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図６】本発明方法におけるネステッドＰＣＲ実施後の反応液（タバコ）をアガロースゲル電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図７】本発明方法におけるネステッドＰＣＲ実施後の反応液（ユリ）をアガロースゲル電気泳動した結果を示す、図面に代わる写真である。
【図８】本発明方法により得られたＤＮＡ断片（ユリゲノムＤＮＡ由来）の塩基配列と、公知ＤＮＡ配列（ユリＬＲＤＥＦ遺伝子）の塩基配列とを比較した結果を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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