(57)【要約】      （修正有）【課題】培養した細胞層を短時間で剥離することができる、透明性のある細胞培養担体の提供。【解決手段】厚さが0.01μｍ以上5μｍ以下の高分子含水ゲル層、該ゲル層に隣接するアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層、並びに細胞培養面側最表面層に細胞接着性ゲル層を有し、該高分子含水ゲル層の一方の面に物理的な補強治具が設けられている及び／又は細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層未修飾部分が設けられている細胞培養担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子含水ゲル層を含む多層構造の細胞培養担体であって、高分子含水ゲル層の厚さが0.01μｍ以上5μｍ以下である細胞培養担体。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養担体において、高分子含水ゲルの溶液状態での粘度が1000 ｍPa・ｓ以上50000 ｍPa・ｓ以下である細胞培養担体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞培養担体において、高分子含水ゲルがキトサンである細胞培養担体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養担体において、該細胞培養担体がさらにアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み、該ゲル層が高分子含水ゲル層と隣接している細胞培養担体。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞培養担体において、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層がアルギン酸ゲル層である細胞培養担体。
【請求項６】
請求項４に記載の細胞培養担体において、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルがアルギン酸カルシウムゲルである細胞培養担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養担体において、細胞培養面側最表面が細胞接着性ゲル層である細胞培養担体。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞培養担体において、細胞接着性ゲルがゼラチン及び／又はコラーゲンを含むゲルである細胞培養担体。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞培養担体において、細胞接着性ゲルが細胞接着性コラーゲンゲルである細胞培養担体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞培養担体において、高分子含水ゲル層の一方の面に物理的な補強治具が設けられた細胞培養担体。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の細胞培養担体において、細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層未修飾部分が設けられている細胞培養担体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞培養担体において、該細胞培養担体が電子線、γ線、紫外線のいずれか又は複数を照射することで滅菌された細胞培養担体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養担体を用いて細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法。
【請求項１４】
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により細胞シートを得る工程を含む細胞培養方法。
【請求項１５】
可溶化処理を、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地を用いて行う請求項１４に記載の細胞培養方法。
【請求項１６】
請求項1４又は１５に記載の細胞培養方法で得られる細胞シート。
【請求項１７】
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養担体を用いて細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法により得られる細胞培養物を他の細胞培養担体上でさらに培養する工程を含む細胞転写法。
【請求項１８】
請求項1７に記載の細胞転写法により得られる細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により得られる細胞培養物又は細胞シート。
【請求項１９】
可溶化処理を、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地を用いて行う請求項１８に記載の細胞培養物又は細胞シート。
【請求項２０】
請求項1７に記載の細胞転写法により得られる細胞培養物を他の培養細胞上に培養する工程を含む細胞重層化法。
【請求項２１】
多層構造の細胞培養担体におけるいずれか１以上の層の一方の面に設けられる物理的な補強治具。
【請求項２２】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含む細胞培養担体を用いた細胞培養における該ゲル層の可溶化処理用培地であって、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地。
【請求項２３】
請求項４〜１２のいずれか一項に記載の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を他の培養細胞上に培養する工程を含む細胞重層化法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の細胞重層化法により得られる細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により得られる重層化細胞培養物又は重層化細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養の技術に関し、具体的には、細胞培養担体、該細胞培養担体を利用した細胞の培養方法、該培養方法により得られる細胞培養物、該細胞培養物を利用した細胞層の重層化方法、該重層化方法により得られる重層化した細胞層に関する。
【背景技術】
【０００２】
高分子含水ゲルは、生体に類似した構造を持ち、温度、酸性・アルカリ性等の外部条件によって膨張、収縮する性質を有するため、人工筋肉などの人工臓器・組織への応用、内部に薬剤を封入して放出量をコントロールする医療分野への応用のみならず、各種サイトカイン等を含むゲルとして細胞を培養する際に細胞成長の足場としての利用も試みられている。
【０００３】
高分子含水ゲルの中でも温度応答性高分子であるポリN-イソプロピルアクリルアミド（poly-N-isopropylacrylamide）（以下「PNIPAM」と称する）は、低温では膨潤して液状であるが、34℃付近で相転移し急激に収縮しゲル化する。従来、培養細胞の階層化を行なうに当たり、37℃の温度条件下、ゲル化したNIPAM上で培養した細胞をPNIPAMごと別の細胞層に重ね、その後34℃以下に下げることによりPNIPAMを液状化させて取り除き、細胞同士を直接重ねるという手法が取られていた（特許文献１：特公平6−104061号公報；非特許文献１：清水達也、岡野光夫、バイオサイエンスとバイオインダストリー、58(12)、851頁(2000)；非特許文献２：大和雅之、岡野光夫、臨外、56(1)、53頁（2001）；非特許文献３：大和雅之、岡野光夫、Materials Integration、13(2)、58頁(2000)；非特許文献４：大和雅之、串田愛、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(10)、72頁(2000)；非特許文献５：大和雅之、廣瀬志弘、播元正美、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(13)、162頁(2000)）。
【０００４】
PNIPAM上で細胞培養を行った場合、通常、細胞は単層状に成長する。この際、隣り合った細胞同士ではコラーゲン等の細胞外マトリックス（Extracellular Matrix）（以下「ECM」と称する）が形成される。そして、細胞が増殖するためには、ECMに接着する必要がある。しかし、細胞の上部及び細胞と基底層であるPNIPAM間は他の細胞と接着しておらず、細胞接着に必要なECMは形成されない。
従って、PNIPAM上で培養した単層の細胞層同士を重層し、細胞層を34℃以下の条件下でNIPAMを可溶化して取り除き、細胞同士が直接接するように重ねても、上部に重ねた細胞は、増殖するための足場が十分でなく、従って安定した増殖は望むことができなかった。また、液状化したNIPAMが細胞毒として作用するため細胞の正常な成長を阻害する現象も認められるため、細胞の階層化の手段としては極めて不向きで不安定な技術であった。
【０００５】
上記の手法の問題点の解決のため、各種ゲル上に細胞外マトリックス成分を重層化しゲル化させた培地での細胞培養、及び重層後に不要となったゲルを容易に除去できるような培地を使用した培養系の確立につき検討が続けられていた。特許第3261456号公報（特許文献２）においては、多孔質膜と該多孔質膜上にアルギン酸ゲル層と細胞外マトリックス成分ゲル層又は細胞外マトリックス成分スポンジ層を形成させたことを特徴とする細胞培養担体が提案されている。しかし、この細胞培養担体では、細胞外マトリックス層が厚く、乾燥膜の状態で細胞培養担体を保管することが不可能であった。また、細胞の重層化操作にも邪魔になり安定に重層化細胞を得られない問題があった。さらに、該特許公報に記載されている多孔質膜は透明性がなく、細胞培養中に生きた細胞の育成状況を目視又は顕微鏡等により直接観察することができないため、シャーレ上に置いた細胞培養担体の周りのシャーレ上での細胞の育成状態から細胞担体上の細胞の状況を同等状態である類推していたが、細胞培養担体の周りのシャーレ上での細胞の育成状態は、細胞担体上の細胞の状態と必ずしも一致せず、細胞の増殖が不足していたり、オーバーコンフルエントであったりする問題点があった。  したがって、細胞の育成状態を確実に把握するために、通常の細胞培養で用いるシャーレのような透明性を有する細胞培養担体が望まれていた。
【０００６】
また、該特許公報に記載されている方法ではアルギン酸ゲル層の溶解にEDTA水溶液を用いて細胞培養物を細胞培養担体から剥離しているが、このときのEDTA水溶液の侵襲により細胞がダメージを受ける問題があった。したがって、培養細胞を細胞培養担体から剥離する際の細胞へのダメージを可能な限り少なくすることのできる細胞培養担体が望まれていた。
【０００７】
アルギン酸又はキトサン等を含む細胞培養担体としては、特表20002−536974号公報（特許文献３）にポリサッカリド及び細胞接着性蛋白質を含む細胞増殖用基体の記載があるが、該細胞増殖用基体を用いても、細胞の育成状態を確実に把握することはできず、培養細胞層の剥離も困難である。
【特許文献１】特公平6−104061号公報
【特許文献２】特許第3261456号公報
【特許文献３】特表20002−536974号公報
【非特許文献１】清水達也、岡野光夫、バイオサイエンスとバイオインダストリー、58(12)、851頁(2000)
【非特許文献２】大和雅之、岡野光夫、臨外、56(1)、53頁（2001）
【非特許文献３】大和雅之、岡野光夫、Materials Integration、13(2)、58頁(2000)
【非特許文献４】大和雅之、串田愛、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(10)、72頁(2000)
【非特許文献５】大和雅之、廣瀬志弘、播元正美、岡野光夫、蛋白質・核酸・酵素、45(13)、162頁(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安定的かつ容易に細胞を重層する技術、及び細胞層を重層した場合に上層部の細胞と下層部の細胞とを充分に接着することができる技術を提供し、これにより、皮膚などの一部組織を除きin vitro条件下では困難とされてきた細胞の階層化技術に道を開くことを目的とする。
具体的には、本発明は、培養中の細胞の状態を直接観察でき、かつ培養した細胞層を短時間で剥離することができる、透明性のある細胞培養担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、所定の厚さの高分子含水ゲル層を有する細胞培養担体が、透明性を有し、培養中の細胞の状態を直接観察でき、かつ培養した細胞層を短時間で剥離することができることを見出した。本発明者らはさらに、該高分子含水ゲル層の一方の面に物理的な補強治具を設けること等によって、細胞層剥離の際の操作性が向上することを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
【００１０】
すなわち本発明は、高分子含水ゲル層を含む多層構造の細胞培養担体であって、高分子含水ゲル層の厚さが0.01μｍ以上5μｍ以下である細胞培養担体を提供する。本発明の好ましい態様によれば、上記の細胞培養担体において、高分子含水ゲルの溶液状態での粘度が1000 ｍPa・ｓ以上50000 ｍPa・ｓ以下である細胞培養担体；及び、上記いずれかの細胞培養担体において、高分子含水ゲルがキトサンである細胞培養担体が提供される。
【００１１】
本発明の別の好ましい態様によれば、上記いずれかの細胞培養担体において、該細胞培養担体がさらにアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含み、該ゲル層が高分子含水ゲル層と隣接している細胞培養担体；該細胞培養担体において、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層がアルギン酸ゲル層である細胞培養担体；該細胞培養担体において、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルがアルギン酸カルシウムゲルである細胞培養担体；上記いずれかの細胞培養担体において、細胞培養面側最表面が細胞接着性ゲル層である細胞培養担体；該細胞培養担体において、細胞接着性ゲルがゼラチン及び／又はコラーゲンを含むゲルである細胞培養担体；及び上記の細胞培養担体において、細胞接着性ゲルが細胞接着性コラーゲンゲルである細胞培養担体が提供される。
【００１２】
本発明のさらに好ましい態様によれば、上記いずれかの細胞培養担体において、高分子含水ゲル層の一方の面に物理的な補強治具が設けられた細胞培養担体；上記いずれかの細胞培養面側最表面が細胞接着性ゲル層である細胞培養担体において、細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層未修飾部分が設けられている細胞培養担体；及び上記いずれかの細胞培養担体において、該細胞培養担体が電子線、γ線、紫外線のいずれか又は複数を照射することで滅菌された細胞培養担体が提供される。
【００１３】
本発明の別の観点からは、上記いずれかの細胞培養担体を用いて細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法；上記いずれかの細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により細胞シートを得る工程を含む細胞培養方法；可溶化処理を、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地を用いて行う該細胞培養方法；及び該細胞培養方法で得られる細胞シートが提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の観点からは、上記いずれかの細胞培養担体を用いて細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法により得られる細胞培養物を他の細胞培養担体上でさらに培養する工程を含む細胞転写法；該細胞転写法により得られる細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により得られる細胞培養物又は細胞シート；可溶化処理を、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地を用いて行う該細胞培養物又は細胞シート；該細胞転写法により得られる細胞培養物を他の培養細胞上に培養する工程を含む細胞重層化法；上記いずれかの細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を他の培養細胞上に培養する工程を含む細胞重層化法；該細胞重層化法により得られる細胞培養物におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理により得られる重層化細胞培養物又は重層化細胞シート；多層構造の細胞培養担体におけるいずれか１以上の層の一方の面に設けられる物理的な補強治具；及びアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を含む細胞培養担体を用いた細胞培養における該ゲル層の可溶化処理用培地であって、キレート剤を含みかつ多価金属カチオンが２．６ｍＭ以下である培地が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、細胞培養中の細胞の生きた状態を直接観察でき、細胞層の重層化を容易に行なうことができる細胞培養担体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
細胞培養担体とは、細胞を培養する際の担体又は支持体となり得るものを意味する。本発明の細胞培養担体の形状は特に限定されないが、シート状であるのが好ましい。
本発明の細胞培養担体は、層の厚さが0.01μｍ以上5μｍ以下の高分子含水ゲル層を有することを特徴とする。本明細書においては、層を膜という場合もある。
【００１７】
高分子含水ゲルとは親水性高分子を意味し、特に水には溶解しないが高分子中に水を含み系全体にわたって２次元的又は３次元的な支持構造を有する吸水性高分子をいう。本発明においては、高分子含水ゲル層として、キレート剤等の物質を層中に拡散させることにより該層の一方の面から他方の面にキレート剤を到達させることができるものを用いる。また、本発明においては、高分子含水ゲル層として、該層の一方の面から他方の面にアルギン酸ゲル等のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲルは到達させないものを用いる。本発明で用いる高分子含水ゲル層は、このような層である限り特に限定されず、合成高分子であっても、天然高分子、生体高分子であってもよい。高分子含水ゲルの例としては、アクリルアミドゲル、架橋アクリル酸ゲル、寒天、ゼラチン、デキストラン、キトサン、シリカゲルなどがあげられるが、キトサンを用いることが好ましい。
本発明の細胞培養担体においては、「高分子含水ゲル層」は支持体であるのが好ましい。ここで、細胞培養担体において支持体であるとは、多層構造の細胞培養担体を作製する際の基盤となる層であることをいう。
【００１８】
本発明における高分子含水ゲル層の厚さは0.01μm以上5μm以下であることを特徴とする。好ましくは0.1μm以上4μm以下、更に好ましくは0.5μm以上3μm以下である。高分子含水ゲル層が薄すぎると充分な膜を形成できず破れや裂けや穴が空いてしまうという問題が生じ、高分子含水ゲル層が厚すぎると培地成分や剥離操作時のキレート剤成分の拡散が遅く、細胞に悪影響を及ぼすという問題が生じる。
【００１９】
本明細書において層の厚さは、特に言及のない限り充分に乾燥した状態で計測したものを示す。本明細書においては、この層の厚さを「乾燥膜厚」ということもある。層の厚さの計測は、電子顕微鏡断面像、マイクロメータ膜厚計、エリプソメーター、角度可変XPS、光干渉式膜厚計などを用いて行うことができ、好ましくはマイクロメータ膜厚計、電子顕微鏡断面像、光干渉式膜厚計を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明の細胞培養担体における高分子含水ゲル層は、一般的に知られている種々の高分子含水ゲル膜の作製方法を用いて作製することができる。例えば、高分子含水ゲルの溶液をキャストする方法（キャスト法）やバーコーターで塗布する方法（バーコート法）、ギャップコーターで塗布する方法（ギャップコート法）などが挙げられるが、これらのうちバーコート塗布法、ギャップコート塗布法が好ましい。
【００２１】
本発明に用いられる高分子含水ゲルは、後述の本明細書で定義する溶液状態での粘度が1000 ｍPa・s以上50000ｍPa・s 以下のものを用いることできるが、3000 ｍPa・s 以上30000 ｍPa・s 以下であることが好ましく、さらに6000 ｍPa・s 以上20000 ｍPa・s 以下であることが好ましい。
同一条件で調製した高分子溶液の粘度は、高分子の分子量の指標となるものであり、粘度の数値が大きいものほど高分子量であることを意味する。本明細書で定義する高分子含水ゲルの溶液状態での粘度とは、該高分子12 gを１質量％の酢酸水溶液1000 gに添加したゲル化前の溶液を、２５℃にてB型粘度計で測定したときの粘度をいう。粘度が低いとき、すなわち分子量が小さいときは、作製された高分子含水ゲル層の強度が弱いことが示唆される。また、低粘であることから高分子含水ゲル層の作製時に溶液が流れだして膜厚が不均一になったり、溶液の最表面のみが乾燥して皮膜を形成する皮張り現象を起こしたり、溶媒の乾燥に時間がかかったりする。一方、粘度が高すぎる場合、すなわち分子量が高すぎる場合、作製された高分子ゲル膜の強度はあるが、高分子含水ゲル膜の作成時に流延性がなく膜厚が不均一になる、又は塗膜が形成できないと言った不具合が生じる。粘度が上記の範囲である高分子含水ゲルを用いることにより、強度が高いとともに、上記の一定の厚さである高分子含水ゲル層を得ることができる。
【００２２】
本発明の好ましい態様として、高分子含水ゲル層がアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層と隣接しているものが挙げられる。アニオン性多糖類としては、アルギン酸、デキストラン硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ヒアルロン酸などが挙げられるが、アルギン酸が好ましく用いられる。
【００２３】
アルギン酸は、褐藻類の細胞壁構成多糖又は細胞間充填物質として天然に存在しており、これらを原料として採取可能である。原料褐藻類の具体例としては、ヒバマタ目ダービリア科ダービリア属（例えばD.potatorum）、ヒバマタ目ヒバマタ科アスコフィラム属（例えばA.nodosum）、コンブ目コンブ科コンブ属（例えばマコンブ、ナガコンブ）、コンブ目コンブ科アラメ属（例えばアラメ）、コンブ目コンブ科カジメ属（例えばカジメ、ウロメ）、コンブ目レッソニア科レッソニア属（例えばL.flavikans）の褐藻類を例示できる。また、市販のアルギン酸を使用することもできる。アルギン酸のG/Mの比は特に限定されないが、G/Mの比が大きいほどゲル形成能が大きいので、G/Mの比は大きい方が好ましく、具体的には0.1〜1であるのが好ましく、0.2〜0.5であるのがさらに好ましい。
【００２４】
「アルギン酸ゲル」とは、アルギン酸の分子中のカルボン酸基と多価金属イオンとがキレート構造を形成してゲル化したものを意味し、「アルギン酸ゲル層」とは、層状のアルギン酸ゲルを意味する。アルギン酸は、グルクロン酸（Ｇ）とマンヌロン酸（Ｍ）よりなるブロック共重合体であり、Ｍブロックが有するポケット構造に多価金属カチオンが侵入してエッグボックスを形成し、ゲル化すると考えられている。アルギン酸のゲル化を引き起こし得る多価金属カチオンの具体例としては、バリウム（Ba）、鉛（Pb）、銅（Cu）、ストロンチウム（Sr）、カドミウム（Cd）、カルシウム（Ca）、亜鉛（Zn）、ニッケル（Ni）、コバルト（Co）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、マグネシウム（Mg）等の金属イオンを例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオンを例示できる。また、「アルギン酸ゲル」はアルギン酸とカチオン残基を有する有機高分子化合物のポリイオンコンプレックスゲルでもよい。ここでいうカチオン残基を有する有機高分子化合物の例としては、ポリリジン、キトサン、ゼラチン、コラーゲンなどの複数のアミノ基を有する化合物が挙げられる。
【００２５】
アルギン酸のゲル化は、常法に従って行なうことができる。アルギン酸のゲル化は、例えばイオン交換を利用して行なうことができる。例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加すると速やかにイオン交換が生じ、アルギン酸カルシウムゲルが得られる。より具体的には、0.2〜５％アルギン酸ナトリウム水溶液を、高分子含水ゲル（例えば、キトサン）層上に塗布後0.01〜1.0 M 塩化カルシウム水溶液中に浸漬して塩化カルシウムをしみ込ませ、20〜30℃で３分〜３時間放置することによりアルギン酸カルシウムゲル層が得られる。このように高分子含水ゲルを用いてアルギン酸のゲル化を行なえば、高分子含水ゲル層と該高分子含水ゲル層上に形成されたアルギン酸ゲル層とを含む細胞培養担体を得ることができる。
【００２６】
本発明の細胞培養担体におけるアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の厚さは0.01μm以上50μm以下であることが好ましく、0.1μm以上10μm以下が好ましく、0.5μm以上5μm以下であることがさらに好ましい。アルギン酸ゲル層の固形分量が少なすぎると充分な膜状の層を形成できず穴が空いてしまい、多すぎると乾燥膜でのカールや割れの発生、培養工程での変形やアルギン酸ゲル溶解工程での溶解不良といった問題が生じる。
【００２７】
本発明の細胞培養担体上に形成された培養細胞層は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理することにより細胞シートとして剥離させることができる。細胞シートは培養細胞層及び好ましくは後述の細胞接着性層を含む。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を構成するカチオン成分を除去することにより実施でき、カチオン種が多価金属イオンの場合は、培養細胞層が形成された細胞培養担体を１）リン酸などの多価金属カチオンと錯形成するもしくは難溶性塩を形成するイオンが添加された培地に浸漬する、２）キレート剤水溶液が添加された培地に浸漬する、３）多価金属イオンが低減された培地に浸漬する、又は４）該細胞の培養培地中の多価金属イオンをキレート剤によって隠蔽する方法によって実施できる。通常、細胞培養用の培地にはリン酸イオンが多く存在する。従って、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、多価金属カチオン濃度が通常細胞培養に用いられる最小培地における多価金属カチオンの濃度よりも少なく、かつキレート剤を含む培地を用いて行うことが好ましい。具体的には該濃度は２．６ｍＭ以下であることが好ましく、３μＭ以下がより好ましく、さらに好ましくは０．５μＭ以下であり、実質的に０であることが最も好ましい。また、該キレート剤の濃度は２．３ｍＭ以上かつ２６０００ｍＭ以下が好ましく、２．３ｍＭ以上かつ２６００ｍＭ以下がさらに好ましい。上記のように多価金属カチオン濃度を低減した培地を用いることにより、キレート剤の細胞への侵襲を低減したアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化が可能である。
【００２８】
本発明で用いられるキレート剤としては、例えば、エチレンジアミンジオルトヒドロキシフェニル酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、1,3-ジアミノプロパノール四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、トランスシクロヘキサンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸（edta）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸(egta)、エチレンジアミンテトラキスメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、ニトリロトリメチレンホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸、1,1-ジホスホノエタン-2-カルボン酸、2-ホスホノブタン-1,2,4-トリカルボン酸、1-ヒドロキシ-1-ホスホノプロパン-1,3,3-トリカルボン酸、カテコール-3,5-ジスルホン酸、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、1-ヒドロキシプロピリデン−1,1-ジホスホン酸、1-アミノエチリデン-1,1-ジホスホン酸やこれらの塩が挙げられる。これらのうち好ましいものとしてはedta、egta、エチレンジアミンテトラホスホン酸、１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸が挙げられる。
【００２９】
さらに、上記のアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理する際の培地においては，カチオン性アミノ酸の濃度が、通常細胞培養に用いられる最小培地におけるカチオン性アミノ酸濃度より少ない濃度であることが好ましい。具体的には、該濃度は１．０ｍＭ以下であることが好ましく、２μＭ以下がより好ましく、さらに好ましくは０．５μＭ以下であり、実質的に０であることが最も好ましい。カチオン性アミノ酸成分とは、L-Lysin（Lys）、L-Arginine（Arg）、L-Histidine（His）、L-Cystine（Cys）及びこれらの塩をいう。
【００３０】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理は、上記のいずれかの可溶化処理用培地に一回又は複数回浸漬することにより実施すればよい。複数回の場合は用いる可溶化処理用培地は同一でも異なってもよい。
【００３１】
キレート剤を用いたアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理の際、すなわち培養細胞層が形成された細胞培養担体を可溶化処理用の培地に浸漬する際には、高分子含水ゲル層側からキレート剤がしみこむように行うのが好ましい。これによって、高分子含水ゲルとアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層とを容易に分離することができ、培養された細胞層を含む細胞シートを高分子含水ゲル層から容易に剥離させることができる。アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層の可溶化処理によってアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を完全に除去する必要はなく、可溶化されなかったアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層が残っていてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層はできるだけ可溶化して除去するのが好ましい。
【００３２】
本発明の別の好ましい態様としては、細胞培養面側最表面が細胞接着性ゲル層である細胞培養担体が挙げられる。
「細胞接着性ゲル層」とは、層状の細胞接着性を有するハイドロゲルを意味し、細胞毒性が無く、通常の培養条件で細胞が付着するゲルであれば天然、合成の化合物いずれでもよいが、好ましくは層状の細胞外マトリックス成分ゲルである。細胞外マトリックスは、一般的には「動物組織中の細胞の外側に存在する安定な生体構造物で、細胞が合成し、細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の複雑な会合体」と定義されており（生化学辞典（第３版）p.570,東京化学同人（株））、細胞を物質的に支持する役割や細胞の活性を調節する役割（すなわち細胞外の情報を細胞に伝えその活性に変化を与える役割）等を担っている。「細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックスの構成成分を意味し、その具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸など）、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等を例示でき、これらのうち特に好ましいものとして、コラーゲン、アテロコラーゲン、マトリゲル（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸よりなるゲル）、ヒアルロン酸、及びゼラチンを例示できる。細胞外マトリックス成分は、常法に従って得ることができる。また、市販の細胞外マトリックス成分を使用してもよい。細胞接着性成分のゲル化は、常法に従って行なうことができる。例えば、細胞接着性成分がコラーゲンである場合には、0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を37℃で10〜20分間インキュベーションすることにより、コラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックス成分のゲル化の際には、必要に応じてゲル化剤を使用してもよい。
【００３３】
本発明における細胞接着性ゲル層の厚さは0.005μm以上5.0μm以下が好ましく、0. 005μm以上1.0μm以下がより好ましく、0. 005μm以上0.5μm以下がさらに好ましい。細胞接着性ゲル層が厚いと乾燥時に層に亀裂が発生するばかりか、細胞の転写が著しく困難になる。
【００３４】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層上に細胞接着性ゲル層を形成させる際には、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層と細胞接着性成分ゲル層とを別々に作製した後、両者を重ねてもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層上に細胞接着性成分含有水溶液を添加した後、該水溶液をゲル化させるのが好ましい。細胞接着性ゲル層は脱着を行なうのに十分な物理的強度を有していないため、細胞接着性ゲル層を形成させた容器（例えばディッシュ、シャーレ等）から細胞接着性ゲル層を剥離するのは困難だからである。また、極薄層の細胞接着性ゲル層は、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を再簿接着性成分の溶液に浸漬すること（浸漬法）や塗布すること（塗布法）、又はキャストすること（キャスト法）で簡便に得ることができるが、本発明の細胞培養担体の作成ではこれらのいずれの方法を用いてもよい。このうちキャスト法が好ましく用いられる。例えば、アルギン酸ゲル上にコラーゲンゲル層を形成する場合には、市販の0.3〜0.5％コラーゲン水溶液を必要により適当な濃度に希釈し、上記の方法で作成したアルギン酸カルシウムゲル上にこの溶液をキャストし、乾燥させることで、アルギン酸ゲル上にコラーゲンゲル層が形成したものが得られる。
【００３５】
本発明の細胞培養担体上に形成された培養細胞層は、上述のようにアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理することにより細胞シートとして剥離させることができる。本発明の細胞培養担体としては、その際の操作性を向上させるために、細胞接着性ゲル層と反対側の高分子含水ゲル層の面に、物理的な補強治具を設けてもよい。物理的な補強治具の材質は、細胞に影響を与えない材質であれば特に限定はないが、金属類（たとえば鉄、ステンレス、チタン、金など）、プラスチック類（たとえばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリルなど）、陶器などの無機材料類などであり、ステンレス、チタン、プラスチック類が好ましい。
物理的な補強治具は、本発明の細胞培養担体の取り扱い性を向上させることができればいかなる形状をしていてもよいが、板状であることが好ましく、厚さは、好ましくは0.1μｍ以上10ｍｍ以下、より好ましくは1μｍ以上1ｍｍ以下、さらに好ましくは10μｍ以上200μｍ以下である。
物理的な補強治具は、細胞観察用に本発明の細胞培養担体が見える部分があればその形状は特に限定はないが、円、多角形（三角形、四角形、六角形など）、又はその組み合わせ（扇型など）等が例として挙げられる。そのなかで、円に近い形状であることが好ましい。また、細胞観察用に本発明の細胞培養担体が見える部分は1個でも複数でもよい。また高分子含水ゲル層の補強治具を接着した面の判別を容易にするために、非対称な形状であることが好ましい。
【００３６】
物理的な補強治具は、細胞培養に影響を及ぼさない限りいかなる方法で高分子ゲル膜に接着させてもよい。たとえば、高分子ゲル膜を作製した後市販の接着剤（たとえばアロンアルファ、ボンドなど）を使用して接着させる方法や高分子ゲル膜を作成する際に補強治具を未乾燥状態の高分子ゲル膜におくことで接着させてもよい。
【００３７】
物理的な補強治具は、その材質にもよるが、補助治具の縁が鋭利である場合がある。この場、補助治具の鋭い縁によって高分子含水ゲルが破けるばかりでなく、取り扱う作業者にも危険を及ぼす懸念がある。したがって、鋭い縁をなくすことが好ましい。鋭い縁をなくす方法として、細胞培養に支障がない限りいかなる方法を用いてもよいが、物理的な研磨（たとえば、やすりなどで磨くなど）や化学処理（たとえば、ケミカルエッチングなど）する方法が挙げられる。本発明において、物理的な補強治具はステンレス製の場合、ケミカルエッチングなどの化学処理を行うことが好ましい。
【００３８】
本発明の細胞培養担体上に形成された培養細胞層を細胞シートとして剥離させる際の操作性を向上させるために、細胞培養面側最表面に細胞接着性ゲル層を有する細胞培養担体においては、該細胞培養面側最表面の一部に該細胞接着性ゲル層未修飾部分、すなわち該細胞接着性ゲル層が形成されていない部分を設けてもよい。細胞接着性ゲル層未修飾部分は、高分子含水ゲル層又はアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層となる。細胞接着性ゲル層未修飾部分を設けることによって、高分子含水ゲル層と細胞接着性ゲル層を剥離する際の取り扱い性を向上させることができる。すなわち、細胞接着性ゲル層未修飾部分の高分子含水ゲル層をピンセットなどでつかむことにより細胞接着性ゲル層に触れないで高分子含水ゲル層を取り除くことができるため、細胞に悪影響が少ない。細胞接着性ゲル層未修飾部分は、本発明の細胞培養担体における高分子含水ゲル層の隅の部分であることが好ましい。
【００３９】
細胞接着性ゲル層未修飾部分を設ける方法としては細胞培養に支障がない限りいかなる方法を用いてもよいが、例えば一般的に良く知られているマスキング法が挙げられる。すなわち、高分子含水ゲル層上で細胞接着性ゲル層未修飾とする部分をあらかじめ別材料で覆い、該高分子含水ゲル層を細胞接着性ゲル成分で修飾した後、覆っていた別材料を除去することによって、細胞接着性ゲル層未修飾部分を設ける方法である。
細胞接着性ゲル層未修飾部分を設けるために覆う別材料の材質は、細胞培養に支障がない限りいかなる材質のものを用いてもよく、例えばシリコンゴム、市販のマスキングテープや粘着テープ、プラスチック類（例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリルなど）、金属類（例えば鉄、ステンレス、チタン、金など）などが挙げられるが、シリコンゴム、市販のマスキングテープが好ましい。
【００４０】
細胞接着性ゲル層未修飾部分の形状は、細胞培養に支障がない限り特に限定はないが、円もしくは多角形（三角形、四角形、六角形）又はこれらの組み合わせ（扇型など）であることが好ましく、三角形、扇形であることが好ましい。細胞接着性ゲル層未修飾部分の大きさは、細胞培養に支障がない限り特に限定はないが、円相当で好ましくは直径0.1 ｍｍ以上10 ｍｍ以下、より好ましくは直径1 ｍｍ以上5 ｍｍ以下である。
【００４１】
本発明の細胞培養担体を用いて、培養し得る細胞の具体例としては、繊維芽細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨芽細胞、骨髄間葉細胞等を例示でき、好ましいものとしては繊維芽細胞を例示できる。細胞の培養の際には、通常、細胞濃度１〜1.5万cells/mlの培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を細胞接着性ゲル層上に添加する。細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。細胞接着性ゲル層上で細胞を培養する場合には、通常、細胞接着性ゲル層上にコンフルエントな単層の細胞層が形成されるまで行なう。
【００４２】
本発明の細胞培養担体を用いた細胞の培養は具体的には次のようにして行なうことができる。細胞培養担体をシャーレ等の内部に設置し、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち12〜24時間放置し、培養液を細胞培養担体中に浸潤させる。シャーレ内の培養液を捨て、細胞培養担体の細胞接着性ゲル層上に細胞を播き、シャーレ内に適当な培養液（例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地）を添加する。37℃で１〜２時間放置し、細胞接着性ゲル層に保持（接着）させた後、37℃で培養を続ける。培養の際には、必要に応じて培養液を交換してもよい。通常は培養0.5〜２日ごとに培養液を交換する。
【００４３】
本発明の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物は本発明の細胞培養担体と該細胞培養担体に保持された細胞層とを含む。「細胞培養担体に保持された細胞層」は好ましくは細胞接着性ゲル層上に形成された細胞層である。
【００４４】
アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化処理して得られる細胞シートは、細胞層を含んでいるので、細胞層の重層化ならびに転写に使用できる。細胞層の重層化の際には、本発明の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を予め培養した細胞上に荷重をかけた状態又はかけない状態で重ね、さらに培養した後、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シート同士を重層化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞シートを別に作製した細胞層に重層化してもよい。また、上記の方法などにより重層化した細胞層を含む細胞シート又は細胞培養物を、さらに別に作製した細胞層に重層化してもよい。別に作製した細胞層としては、本発明の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物の細胞層でもよく、他の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物の細胞層でもよく、また細胞シートでもよい。重層化する細胞層の細胞の種類は、同一であっても異なっていてもよい。重層化する細胞層の数は特に限定されないが、通常１〜１０、好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３である。
【００４５】
細胞層の転写の際には、別の細胞培養用基材上に本発明の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を荷重をかけた状態又はかけない状態で載せて、さらに培養した後、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化してもよいし、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を可溶化して得られる細胞培養物を他の媒体に転写してもよい。また、転写される細胞培養物は重層化細胞培養物であってもよい。
好ましい重層化ならびに転写方法としては、本発明の細胞培養担体を用いて培養された細胞培養物を予め培養した細胞上もしくは別の細胞培養基材上で培養したのちアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を溶解する方法が挙げられる。
【００４６】
荷重をかけた状態の細胞の培養法とは、細胞が転写される細胞もしくは基材にムラが生じない程度に充分荷重がかけられていればいかなる方法でもよい。ここで、荷重をかける際に細胞が密閉されると窒息をすることから、転写する側もしくは受ける側の少なくとも一方の細胞培養基材が水透過性のゲルや高分子含水ゲルもしくはこれらの組み合わせでできていることが好ましい。また、ムラ無く転写するには細胞面を充分に覆う状態で荷重をかける必要があるが、均一に接触することで酸素の拡散を妨害することとなるため、不織布（ナイロン、ポリエステル、ステンレスなど）等を介して酸素の拡散を妨げないで荷重することが好ましい。
【００４７】
荷重をかけた細胞の培養法の荷重は0.1 g/cm2以上50 g/cm2以下であることが好ましく、0.5 g/cm2以上10 g/cm2以下であることがさらに好ましい。荷重をかけた細胞の培養の時間は充分な細胞の転写が実現できれば制限はないが4時間以上72時間以下が好ましく、6時間以上48時間以下がさらに好ましい。本発明においては、荷重をかけない状態で培養することが好ましい。
【００４８】
本発明の細胞培養担体を作製する際、密着性を改善する目的で、カルボジイミド類を含んだ調製液を用いてもよい。カルボジイミド類及びN-ヒドロキシコハクイミドはいかなる層の調製液に添加してもよいが、アニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層調製液もしくは予め高分子含水ゲルに含浸させておくこと、あるいはアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層塗布後に塩化カルシウムと共溶解した液に浸漬することが好ましい。該カルボジイミド類は水溶性のものが好ましく、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩などが挙げられる。該カルボジイミドを用いる場合その濃度としては0.01 mg/l以上200 g/l以下が好ましい。このときN-ヒドロキシコハクイミドを触媒として使用してもよく、濃度としては該カルボジイミドに対して1質量％以上50質量％以下が好ましい。
本発明においては、特に必要がない限りカルボジイミドは用いないことが好ましい。
【００４９】
本発明の細胞培養担体は、いかなる方法で滅菌されてもよいが、電子線、γ線、X線、紫外線などの放射線による滅菌が好ましく用いられ、電子線、γ線、紫外線がさらに好ましく用いられ、電子線滅菌が特に好ましい。電子線滅菌の照射線量としては0.1 kGy以上65 kGy以下が好ましく、1 kGy以上40 kGy以下が特に好ましい。EOG滅菌などの化学滅菌、高圧蒸気ガス滅菌などの高熱をかける滅菌は細胞接着性層やアニオン性多糖類及び多価金属イオンを含むゲル層を分解するため好ましくない。このように滅菌した細胞培養担体は無菌条件下であれば長期間に渡って室温保管が可能である。
滅菌法は単独もしくは複数種の組み合わせで実施されてもよく、同一種の滅菌法を繰り返し使用してもよい。
【００５０】
重層化する細胞層として、例えば、血管内皮細胞層、肝細胞層を使用すれば、肝臓の３次元組織構造物を構築できる。この３次元組織構造物は、in vitroにおける薬物の透過性試験へ適用できるとともに、動物実験代替モデルや移植用臓器へ応用できる。重層化した細胞層は、細胞層を構成する細胞の種類に応じた培養条件で培養することができる。培養の際には、例えば、D-MEM培地、MEM培地、HamF12培地、HamF10培地等の培地を使用できる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
〔例１〕高分子含水ゲル膜の作製
（１）含水キトサンゲル膜  A  （A-1〜A-4）の調製
キトサンCT-1000（和光純薬製）12ｇを1質量％の酢酸水溶液1000ｇに徐々に添加して40℃で３時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。
ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、あらかじめ用意しておいたポリエチレンテレフタレートフイルム（フイルム厚185ミクロン）上にアプリケータで表１に示す乾燥膜厚となるように塗布し、40℃にて5時間乾燥した。
乾燥したキトサンゲル膜を、10質量％の水酸化ナトリウムのメタノール溶液に60分間浸漬し、引き続きPBS（Dulbecco's Phosphate buffered Saline）溶液に60分間浸漬した。その後、流水下で60分洗浄後、キトサンゲルを得た。こうして得たキトサンゲル膜を32℃で1晩乾燥後、ビニール袋に入れ室温にて保存した。
【００５２】
（２）含水キトサンゲル膜  B  （B-1〜B-4）の調製
キトサンCT-10、100、500、1000（それぞれ和光純薬製）をそれぞれ  12ｇを1質量％の酢酸水溶液1000ｇに徐々に添加して40℃で３時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。
ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、あらかじめ用意しておいたポリエチレンテレフタレートフイルム（フイルム厚185ミクロン）上にアプリケータで乾燥膜厚1μmとなるように塗布し、40℃にて3時間乾燥した。
【００５３】
（３）高分子含水ゲル膜の評価
上記（１）及び（２）で得た高分子含水ゲル膜を下記のように評価した。
（Ａ）ウェット膜強度
乾燥したキトサン膜を37℃で蒸留水に3時間浸漬したあとの膜強度を評価した。
膜強度の評価は下記の基準でおこない、○を許容とした。
膜をピンセットつかむことができ、ちぎれがなく実用上問題なし。・・・・・○
ピンセットでつかむことはできるが、ちぎれる場合がある。・・・・・・・・△
膜がゼリー状であり、ピンセットでつかめない。・・・・・・・・・・・・・×
【００５４】
（Ｂ）拡散性
乾燥したキトサン膜を介して両側に空洞を有した平衡型透析セル（サンプラテック社製）に設置し、37℃にて片側にキレート剤水溶液、反対側に蒸留水を添加した。蒸留水側を経時でサンプリングして透過したキレート剤膜を定量することによって膜中の物質の拡散性を評価した。
拡散性の評価は下記の基準でおこない、○を許容とした。
30分間で透過するキレート剤含量がキレート剤水溶液の80％以上・・・・・○
30分間で透過するキレート剤含量がキレート剤水溶液の20％以上80％未満・・・・・△
30分間で透過するキレート剤含量がキレート剤水溶液の20％未満・・・・×
【００５５】
（Ｃ）  粘度
キトサンの酢酸水溶液の粘度をB型粘度計25℃で測定した。
結果を表１及び表２に示す。
本発明の高分子含水ゲルは、本発明の領域で良好な結果を示した。
【００５６】
【表１】
2005318887.tif 000002
【００５７】
【表２】
2005318887.tif 000003
【００５８】
〔例２〕細胞培養担体の作製
（１）高分子含水キトサンゲル膜／アルギン酸カルシウム積層膜の調製
例１の（１）及び（２）で得た含水キトサンゲルA膜及びB膜上に、２質量％のアルギン酸ナトリウム水溶液をウェット塗布膜厚500μmとなるように塗布した。この塗布物を0.25 Mの塩化カルシウムを含む25％メタノール水溶液に60分浸漬したのち、流水で30分洗浄することで含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜AA又はBBを得た。アルギン酸ゲル層乾膜の厚さは電子顕微鏡断面像から計測すると1.0μmであった。
また、アルギン酸ナトリウム水溶液のウェット塗布膜厚を100、300、1000μmに変更しても同様のサンプルを作成することができた。
【００５９】
（２）コラーゲン層修飾
上記（１）で得た乾燥させていない含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層膜AA又はBBの上にCellmatrix I-P（新田ゼラチン製）の3倍希釈水溶液をキャストしたのち、乾燥することで極薄コラーゲン層修飾膜AA-11〜13及びBB-11〜13を得た（表３）。
【００６０】
【表３】
2005318887.tif 000004
【００６１】
〔例３〕滅菌
例１の膜をUV滅菌1、2、3時間、電子線滅菌20、40、60、80、100 kGyの6種類の滅菌を施したところ、いずれも菌が確認されなかった。このとき、滅菌処理を施していないサンプルからは8600個/m2の菌が確認された。
【００６２】
〔例４〕細胞培養担体を用いた細胞の培養
次のようにして細胞培養担体を用いた細胞の培養を行なった。
（１）使用細胞
・CHL（チャイニーズハムスター肺由来細胞）
（２）使用培地
・Eagle最小培地、10%牛胎児血清
（３）細胞培養担体
例１で作製した本発明の細胞培養担体を細胞接着性層を上向にポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いたもの、及びポリスチレン製細胞培養用シャーレのみの比較例をUV滅菌もしくは電子線滅菌を施したのち、培地を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返したのち二晩放置し、培地を細胞培養担体中に浸潤させた。
【００６３】
（４）細胞の播種
予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を42000 cell/mlに調製した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数7500 cell/cm2となるようにシャーレ内に播種し培地を添加した。
（５）培養
CO2インキュベーターを用いて37℃で３日間培養した。
【００６４】
（６）結果
例１で作製した本発明の細胞培養担体をポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いたものは、透明性を有することから細胞培養中の細胞の生育状態が詳細に観察でき、細胞接着性や毒性に問題はなく、ポリスチレン製細胞培養用シャーレのみのサンプルとほぼ同様の状態であった。
また、本発明の細胞培養担体のサンプルにおいては、細胞培養中に高分子含水ゲルからの細胞接着性層の剥離はなく、問題はなかった。
また、細胞の種類をＨＥＰＧ２（ヒト肝癌由来細胞）やＢＡＥ（ウシ大動脈血管内皮細胞）に変更しても同様の結果が得られた。
【００６５】
〔例５〕細胞シートの剥離、転写
例２で作成したサンプルを例４のように培養したサンプルを下記２種類の可溶化処理用培地に37℃で10分間浸漬したのちの細胞培養担体からの細胞接着性層の剥離状況を観察した。次いで、剥離した細胞シートをポリスチレン製細胞培養用シャーレ上に置き培地を添加したのち、CO2インキュベーターを用いて37℃で３日間培養し、光学顕微鏡で観察した。結果を表４に示す。
（１）可溶化処理用培地
(a) Eagle最小培地に、2.6 mMの１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸を添加した培地
(b) (a)からカルシウムイオン、マグネシウムイオン及びカチオン性アミノ酸であるLys、Arg、  Hisを除去した培地
＜剥離状況の評価基準＞  ◎、○を許容範囲とした。
◎：高分子含水ゲル層から細胞接着層が自然と浮くように剥離する。
○：細胞接着層をピンセットで引っ張ることで高分子含水ゲル層から容易に剥離できる。
△：細胞接着層をピンセットで引っ張ることで高分子含水ゲル層から剥離できるが、剥離しない部    分がある。
×：細胞接着層をピンセットで引っ張っても高分子含水ゲルから剥離しない。
＜細胞生存率の評価基準＞  ◎、○を許容範囲とした。
◎：  90%以上の細胞は生きている。
○：  70%以上の細胞は生きている。
△：  40%以上の細胞は生きている。
×：  生きている細胞が40%以下である。
【００６６】
【表４】
2005318887.tif 000005
本発明の領域で良好な剥離性と剥離後の細胞の良好な生存率を両立させることができた。
【００６７】
〔例６〕細胞層の重層培養
UV滅菌を3時間施したポリスチレン製細胞培養用シャーレに例４と同様に下記の細胞を培養した。
・CHL（Chinese Hamster Lung Cell）
・BRL（Buffalo Rat Liver 3A, ATCC No. : CRL 1442）
・BAE（Bovine Aortic Endothelial Cell）
シャーレ上に培養した上記各３種の細胞上に、例５の可溶化処理用培地(b)を用いて例５と同様に細胞の転写を行い、重層化細胞を得た。この重層化細胞を倍地中４日間培養したのち、トリパンブルーで染色して光学顕微鏡で状況を確認したところ、本発明の領域においていずれの重層化細胞も良好に培養されていることがわかった。
【００６８】
〔例７〕
図１に示すステンレス製の物理的補強治具をキトサン塗布直後にキトサン上に置いた以外は例１と同様な方法で厚さ０．１μｍのキトサン膜を作成した。
ステンレス製の物理的補助治具は、厚み90μｍ、内径15ｍｍ、外径20ｍｍであり、ケミカルエッチング処理を施したものを使用した。
作製したキトサン膜をポリエチレンテレフタレートフイルム（PET）から分離するときの状況を取り扱い性として評価した。補助冶具を付けたものは０．１μｍのキトサン膜が破壊されることなくまたシワになることなく膜状を維持して  PETから分離することができる。また、例３、４、５、６、と同様に細胞培養を行った結果、本発明の範囲で良好な結果を得た。
【００６９】
〔例８〕コラーゲン未修飾部分付細胞培養担体の作製
例１のA-2のキトサンサンプル膜を用い、キトサンサンプル膜にシリコンゴム製で二辺が３ｍｍの直角二等辺三角形のマスキングシート（シリコンゴム）を１２ｍｍ間隔で置いた以外は、例２と同様にアルギン酸カルシウム層及びコラーゲン層を作製した。
乾燥後、作製した重層膜を切断しマスキングシートを除去してコラーゲン未修飾部分がある細胞培養担体D（図２）を得た。図２の黒い部分（二辺が３ｍｍの直角二等辺三角形）がコラーゲン未修飾部分である。
細胞培養担体Dを例３、４、５と同様に細胞培養及び剥離を行い、剥離性を評価した結果、本発明のコラーゲン未修飾部分がある細胞培養担体Dでは剥離時にコラーゲン層に触れることなく、ピンセットでキトサン層を容易に剥離することができた。
【００７０】
〔例９〕細胞培養、細胞層の転写・重層化、及び高分子含水ゲル層の剥離
（１）  含水キトサンゲル膜  S  （S1〜S7）の調製
ダイキトサン１００D（大日精化工業株式会社製）の6ｇを1質量％の酢酸水溶液500ｇに徐々に添加して室温で7時間攪拌して溶解し、富士写真フイルム製ミクロフィルターFG-30でろ過した。
ろ過したキトサンの酢酸水溶液を、ポリエチレンテレフタレートフイルム（縦20ｃｍ、横18ｃｍ、フイルム厚195μｍ）上にアプリケータで表５に示す乾燥膜厚となるように塗布し、37℃にて一晩乾燥させた。得られた膜を、1.9質量％の水酸化ナトリウムのメタノール溶液浴に30分間浸漬し、引き続きPBS（Dulbecco's Phosphate buffered Saline）溶液浴に30分間浸漬した。その後、蒸留水浴に30分浸漬してキトサンゲル膜を得た。こうして得たキトサンゲル膜を室温で1晩乾燥後、ビニール袋に入れ保存した。
大日精化工業株式会社製ダイキトサン１００Dの代わりに、同社製ダイキトサンＨ及びＭ並びに株式会社キミカ製キミカキトサンＨ及びＢをそれぞれ用い、同様にキトサンゲル膜を作製した。
【００７１】
【表５】
2005318887.tif 000006
【００７２】
（２）含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層膜の調製
上記（１）で得られたキトサンゲル膜上に、２質量％の株式会社キミカ製キミカアルギンB-1水溶液をウェット塗布膜厚300μmとなるように塗布した。この塗布物を表６に示す濃度の塩化カルシウムを含む25％メタノール水溶液浴に10分間浸漬したのち、蒸留水浴に３０分間浸漬し含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜を得た。アルギン酸ゲル層乾膜の厚さは膜厚計から計測すると6μmであった。
また、アルギン酸ナトリウム水溶液のウェット塗布膜厚を100、500、又は1000μmに変更して、アルギン酸ゲル層乾燥膜厚の異なる含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜を作製した。
【００７３】
（３）含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン積層膜の調製
上記（２）で得られた乾燥させていない含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層ゲル膜上にシリコンゴムとアルミ金属製（内径縦12ｃｍ、横7ｃｍ、厚み5ｍｍ）の枠を置いた。Cellmatrix I-P（新田ゼラチン社製）8 mlに１０倍濃縮されたHam'ｓ  F-12培地1 mlを添加して，氷冷下で１分間スターラー混合した後、さらに混合物に、氷冷下で緩衝液（NaHCO3 2.2 g又は4.7 gを0.05N  NaOH水溶液100 mlに溶解したもの）1 mlを添加して泡立てないように混合した溶液を枠内に6.5 mlキャストした。これを室温下で一晩乾燥させ、蒸留水で洗浄後再度乾燥させて含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／極薄コラーゲン層修飾膜を得た（V1〜V10）（表６）。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
（４）上記（３）で得られた含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／極薄コラーゲン層修飾膜（V1〜V10）に2時間UV滅菌を行い、細胞培養担体として用いて、細胞の培養を行った。
(a)使用細胞
ＢＡＥ（ウシ大動脈血管内皮細胞）
(b)使用培地
Eagle最小培地、10%牛胎児血清
(c)前処理
上記で滅菌した含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜を細胞接着性層を上向にPET製支持体上に置き、この支持体ごとポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いた。培地を添加して5分浸漬後培地交換することを3回繰り返した。
(d)細胞の播種
予め培養しておいた細胞をトリプシン処理で回収し、細胞濃度を40000cell/mlに調製した。セル及びシャーレ内の培地を捨てた後、この細胞液を細胞数7000cell/cm2となるようにシャーレ内に播種し培地を添加した。
(e)培養
CO2インキュベーターを用いて37℃で３日間培養した。
(e)結果
本発明の含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン積層膜をPET製の支持体に置いてポリスチレン製細胞培養用シャーレの底面に置いたものは、良好な透明性を有し、培養中の細胞の生育状態が詳細に観察でき、細胞接着性や毒性に問題がなく、ポリスチレン製細胞培養用シャーレのみのサンプルとほぼ同様の状態となった。
また、細胞の種類をＨＥＰＧ２（ヒト肝癌由来細胞）やCHL（チャイニーズハムスター肺由来細胞）に変更しても同様の結果が得られた。
【００７６】
（５）細胞層の転写・重層化、及び含水キトサン層の剥離
上記（４）でPET上に置いた含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜を、PET支持体から取り外し、あらかじめポリスチレン製細胞培養用シャーレ上で培養していた同種又は別種の細胞上に、細胞面が接触するように置いて細胞層を重層化し、培地を加えCO2インキュベーターにて２４時間培養した。
経時後、培地を可溶化処理用培地（Eagle最小培地に、Eagle最小培地中に存在するカルシウムイオン、マグネシウムイオンの総モル数に対して275モル%の１-ヒドロキシエチリデン-1,1-ジホスホン酸を添加した培地）に入れ替えCO2インキュベーターにて37℃で20分間浸漬した後、可溶化処理用培地を取り除き、含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜から含水キトサンゲルのみをピンセットで摘んで取り去り、コラーゲン層との剥離状況を観察した。
引き続き、このサンプルに培地を添加してCO2インキュベーターにて37℃で１日間培養し、光学顕微鏡で観察した。結果を表７に示す。表中、剥離状況の評価基準及び細胞生存率は例5で示した評価基準に従った。
なお、キトサン膜としてS1又はS3を用いた含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜（アルギン酸塗布膜厚300μｍ、塩化カルシウムの濃度0.02 mol／L）では、表７中のV1と、キトサン膜としてS５を用いた含水キトサンゲル／アルギン酸カルシウム積層／コラーゲン層修飾膜（アルギン酸塗布膜厚300μｍ、塩化カルシウムの濃度0.02 mol／L）では、表７中のV4と同様の結果が得られた。
以上の結果から本発明の細胞培養担体を用いた培養で良好な剥離性と剥離後の細胞の良好な生存率を両立できることが示された。
【００７７】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】物理的な補強治具の形状を示した図である。
【図２】例８で用いた細胞培養担体における細胞接着性ゲル層を示した図である。
【図１】
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【図２】
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