(57)【要約】    【課題】  癌の抗体療法、特に耐性を有する癌（悪性腫瘍）の抗体療法において、補体制御因子の機能をコントロールし、抗体医薬の細胞障害活性における感受性を高める効果を有する、安全性が高い薬剤を提供すること。    【解決手段】  ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９等の補体制御因子をコードする遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有する二本鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の有効成分とする。    【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡを有効成分とする、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤。
【請求項２】
前記２本鎖ＲＮＡが、補体制御因子をコードする遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有するｓｉＲＮＡである請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記補体制御因子が、ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９から選ばれる請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記補体制御因子がＣＤ５５である請求項３に記載の薬剤。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５’末端側の一部配列に相補的な配列を有する請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５’末端側の配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断して得られる２０〜２５塩基の２本鎖ＲＮＡ又はそれらの混合物である請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
前記癌が、乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、大腸癌から選ばれる請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記癌が、抗体医薬に対する耐性を有する癌である請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗体医薬が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＣＤ２０抗体である請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体による悪性腫瘍の治療に関する医薬の開発は、分子標的治療の分野で、近年、目覚ましい発展を遂げてきた。日本では承認された抗体医薬は未だ２品目のみではあるが、現在知られているだけでも、悪性リンパ腫（CD20, HLA-DR, CD5）、急性骨髄性白血病（CD33, CD66）、慢性リンパ球性白血病（CD52, CD20）、急性リンパ球性白血病（CD19, CD20,
CD22）、多発性骨髄腫（Id-idiotype, HM1.24）、乳癌（HER2/neu）、上皮性癌（EGF-R,
VEGF）、大腸癌（17-1A, CEA）、卵巣癌（CA125）などに対する抗体医薬がある。（例えば、非特許文献１）。
【０００３】
抗体医薬の作用機序としては、１：アポトーシス誘導、２：ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞障害）の誘導、３：ＣＤＣ（補体依存性細胞障害）の誘導などが考えられている。これらのうち、ＣＤＣは、生体内の補体成分が、抗原抗体反応で腫瘍細胞に取りついた抗体を認識して、補体系の活性化経路のうちの、古典経路によって細胞傷害作用を引き起こし、腫瘍細胞を殺すというものである。
【０００４】
上記のように、抗体医薬は作用機序が化学療法剤とは異なることから、これまで難治性と分類された腫瘍に対する有力な治療法として期待されている。また、毒性も化学療法剤とは異なることから、化学療法剤との併用による相乗効果についても多数の検討が行なわれている（例えば、非特許文献２）。しかしながら、治療を行なう過程で、抗体医薬に抵抗性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難な患者も多数報告されるようになった。
【０００５】
腫瘍細胞は、様々なメカニズムで、抗体医薬に対する抵抗性を獲得することが報告されているが、中でも補体制御因子と呼ばれる分子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９）の腫瘍細胞表面での発現量が増加して、前記の３番目の作用機序における補体の古典経路を不活性化することで、抵抗性を獲得しているケースが多数報告されている（例えば、非特許文献３）。また、血液学的悪性腫瘍細胞または固形細胞の化学療法剤および抗ＣＤ２０または抗ＣＤ２２抗体に対する抵抗性を回避又は低下させるのに有用な方法が開示されている（例えば、特許文献１）。このように、抗体医薬に対する耐性機序を明らかにし、耐性を克服する方法を開発することが、抗体医薬の効果を高めるために重要であり、多くの研究者が注力するところとなっている（例えば、非特許文献４）。
【０００６】
ＣＤ５５［ＤＡＦ：decay-accerelating factor（崩壊促進因子）とも呼ばれる。］分子は、補体活性を調節する蛋白質群のひとつで、Ｃ３変換酵素であるＣ３ｂＢｂ、Ｃ４ｂ２ａを解離、失活させることで、補体の作用を抑制することが知られている（特許文献２）。ＣＤＣの実験系に、このＣＤ５５分子の作用を中和する能力のある抗体を添加すると、腫瘍細胞のＣＤＣ感受性が向上することが、報告されている（例えば、非特許文献５）。また、抗ＣＤ５５抗体について、ＣＤ５５の作用の中和が目的ではないが、癌の治療及び診断のための抗体としての技術が開示されている（例えば、特許文献３）。しかしながら、実際に医療に用いることが可能な中和抗体を製造するためには、実用性を確認するまでに多くの時間と労力を要するのが現状であった。
哺乳動物細胞において、二本鎖ＲＮＡ（長鎖）による遺伝子発現抑制は、インターフェロンのシグナル経路の活性化によって細胞毒性を示すため、手段としては否定的であったが、２１塩基の短鎖二本鎖ＲＮＡによってＲＮＡｉ（RNA interference）が生じることが
報告されて以来、合成のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）による特異的な遺伝子の発現抑制に関する技術が革新的に進歩した（例えば、非特許文献６、非特許文献７、特許文献４、又は特許文献５）。現在この技術は、遺伝子発現の抑制研究に止まらず、ウイルス感染症への応用など多方面への応用に期待が寄せられている（例えば、非特許文献８）。
しかしながら、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制技術を利用した、抗体医薬に抵抗性（耐性）を獲得した難治性の悪性腫瘍の治療剤については、従来より知られていなかった。
【特許文献１】特表２００４−５００４１２号公報
【特許文献２】特許第２６８６２５７号公報
【特許文献３】特表２００２−５４３０４４号公報
【特許文献４】特表２００３−５２６３６７号公報
【特許文献５】特表２００３−５２９３７４号公報
【非特許文献１】最新医学、新津洋司郎・加藤和則著、第５８巻、第１２号、２００  ３年、ｐ．５−１２
【非特許文献２】モレキュラー・メディシン、竹下明裕著、第４０巻、第１０号、２  ００３年、ｐ．１１４０−１１４８、ｐ．１１６６−１１８１
【非特許文献３】オンコジーン（Oncogene）、第２２巻、２００３年、ｐ．７３５９  −７３６８
【非特許文献４】血液フロンティア、畠清彦著、第１２巻、第１１号、２００２年、  ｐ．６５−７１
【非特許文献５】ブラッド（Blood）、第９５巻、第１２号、２０００年、ｐ．３９０ ０−３９０８
【非特許文献６】ネイチャー（Nature）、第４１１巻、２００１年、ｐ．４９４−４  ９８
【非特許文献７】モレキュラー・メディシン、第４１巻、第１号、２００４年、ｐ．  １０−２９
【非特許文献８】ウイルス、第５３巻、第１号、２００３年、ｐ．７−１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癌の抗体療法、特に耐性を有する癌（悪性腫瘍）の抗体療法において、補体制御因子の機能をコントロールし、抗体医薬の細胞障害活性における感受性を高める効果を有する、安全性が高い薬剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、悪性腫瘍の患者において抗体医薬に対する耐性が確認された状態であっても、標的腫瘍細胞への抗体医薬に対する感受性が高められれば、補体系の細胞障害活性を十分に発揮させることが可能ではないかと考え、鋭意研究開発を重ねた。その結果、抗体医薬に対して耐性を有する腫瘍細胞に、補体制御因子をコードする遺伝子に対する２本鎖ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡ、を導入したところ、標的腫瘍細胞中での補体制御因子の発現が顕著に抑制され、抗体医薬と補体による細胞障害作用の感受性が高められることが判明し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
前記課題を解決する本発明は、以下のとおりである。
（１）補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡを有効成分とする、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤。
（２）前記２本鎖ＲＮＡが、補体制御因子をコードする遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有するｓｉＲＮＡである前記薬剤。
（３）前記補体制御因子が、ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９から選ばれる前記薬剤。（４）前記補体制御因子がＣＤ５５である前記薬剤。
（５）前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５’末端側の一部配列に相補的な配列を有する前記薬剤。
（６）前記ｓｉＲＮＡが、ＣＤ５５をコードする遺伝子のコード領域の５’末端側の配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断して得られる２０〜２５塩基の２本鎖ＲＮＡ又はそれらの混合物である前記薬剤。
（７）前記癌が、乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、大腸癌から選ばれる前記薬剤。
（８）前記癌が、抗体医薬に対する耐性を有する癌である前記薬剤。
（９）前記抗体医薬が、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＣＤ２０抗体である前記薬剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の抗体医薬の細胞障害活性増強剤は、癌（特に悪性腫瘍）の抗体療法において、補体と抗体医薬による細胞障害活性を増強することで、標的になる癌（悪性腫瘍）細胞を効率よく殺傷することが可能である。また、特に抗体医薬に耐性を有する癌（悪性腫瘍）細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞障害活性をリカバリーする効果も兼ね備えている。
【００１１】
また、本発明の抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法によって、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難であると判断された患者に対しても、継続して抗体医薬での治療を行っていくことが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１３】
本発明の癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤（以下、単に「本発明の薬剤」と記載することがある。）の有効成分は、補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡである。
【００１４】
本発明において、「抗体医薬」とは、癌（悪性腫瘍）細胞で発現する癌細胞表面分子又は増殖因子などの可溶性分子を標的抗原とし、この標的抗原に結合する抗体を有効成分とし、前記抗体が癌細胞に結合することによって癌細胞を殺傷する医薬をいう。抗体医薬の作用としては、癌細胞が増殖するシグナルを阻害すること、細胞死シグナルを活性化することにより癌細胞を殺傷すること、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）により癌細胞を殺傷すること等を含む。
【００１５】
本発明において、「細胞障害活性を増強する」とは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を高める効果、すなわち、抗体医薬の標的になる腫瘍細胞を補体及び／又は抗体医薬が殺傷する作用を増強することに加えて、抗体医薬に耐性を有する腫瘍細胞に対して、抗体医薬に対する感受性を高めること、すなわち補体及び／又は抗体医薬による細胞障害活性をリカバリーすることを含む。また、「抗体医薬に耐性を有する」とは、抗体医薬及び／又は補体が腫瘍細胞を殺傷する作用（細胞障害活性）に耐性であること、言い換えれば、前記作用が弱いか又は同作用を受けないことをいう。
【００１６】
次に、本発明の薬剤の有効成分である補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡについて説明する。
前記補体制御因子としては、その発現を抑制することによって、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性が増強するものであれば特に制限されないが、例えば、ＣＤ５５、ＣＤ４６、及びＣＤ５９が挙げられる。
【００１７】
前記２本鎖ＲＮＡとしては、補体制御因子をコードする遺伝子の全体又はその一部に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡが挙げられる。ここで、遺伝子の配列に対して「相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡ」とは、前記遺伝子のセンス鎖又はその一部に相補的な配列を有するＲＮＡと、センス鎖又はその一部と相同な配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡからなる２本鎖を意味する。尚、ＤＮＡの配列に「相同な」配列を有するＲＮＡとは、ＤＮＡの塩基配列におけるチミンをウラシルに置換えた配列を有するＲＮＡを意味する。尚、「相補的」又は「相同」は、必ずしも完全に相補的又は相同であることを意味するものではなく、後述するｓｉＲＮＡが取込まれたＲＩＳＣ複合体によって、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断が起こり得る限り、１又は数塩基のミスマッチがあってもよい。
【００１８】
２本鎖ＲＮＡのセンス鎖は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。本明細書においては、２本鎖ＲＮＡの配列は、センス鎖のＲＮＡ配列として示す。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドによる遺伝子発現阻害については、特開２００３−２１９８９３に記載されている。
【００１９】
前記２本鎖ＲＮＡとしては、例えば、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、２０〜２５塩基、通常は２１〜２３塩基からなる２本鎖ＲＮＡであり、細胞がｓｉＲＮＡを取込むと、標的遺伝子のｍＲＮＡが特異的に分解され、同遺伝子の発現が抑制される。この技術は、ＲＮＡ干渉（RNA interferenc：RNAi）と呼ばれる。ｓｉＲＮＡは、細胞内で一本鎖に解離し、それぞれＲＮＡ分解酵素活性を有するタンパク質と結合してＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex) と呼ばれる複合体を形成する。標的ｍＲＮＡと相補的な配列を有する鎖が取込まれたＲＩＳＣが標的ｍＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡが切断され、その結果、標的遺伝子の発現が抑制されると考えられている（Molecular Medicine, 41(1), 10-29, 2004等参照）。
【００２０】
ｓｉＲＮＡは、例えば、補体制御因子をコードする遺伝子又はその一部に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡを調製し、これをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって得ることができる。Ｄｉｃｅｒ酵素は、市販されているものを使用することができる。前記２本鎖ＲＮＡは、例えば、補体制御因子をコードする遺伝子のコード領域又はその一部の配列を有する２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡポリメラーゼ反応によって調製することができる。また、２本鎖ＤＮＡは、前記遺伝子の配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより増幅することによって、調製することができる。
【００２１】
前記２本鎖ＲＮＡは、補体制御因子としてＣＤ５５に対するｓｉＲＮＡの製造に際しては、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５’末端側部分を含むものであることが好ましい。また、前記２本鎖ＲＮＡは、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５’末端側部分のみを含むことがより好ましい。５’末端側部分として具体的には、ＣＤ５５遺伝子のコード領域の５’末端から全長の１／２〜１／１まで、好ましくは１／３〜１／２まで、特に好ましくは１／３程度までの領域が挙げられる。
【００２２】
上記のようにして得られる２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断することによって、ｓｉＲＮＡが得られる。こうして得られるｓｉＲＮＡは複数種のＲＮＡ分子の混合物である。本発明においては、ｓｉＲＮＡは、このような混合物であってもよいし、この混合物から精製された均一なＲＮＡ分子であってもよい。
【００２３】
また、ｓｉＲＮＡは、化学合成によっても製造することができる。すなわち、標的配列に相当するセンス鎖とアンチセンス鎖を合成し、それらをアニールさせることによって、ｓｉＲＮＡが得られる。さらに、標的遺伝子配列に応じて設計した合成ＤＮＡを、市販のｓｉＲＮＡ発現ベクターに挿入し、適当な宿主で発現させることによっても、ｓｉＲＮＡを得ることができる。
【００２４】
本発明においては、本発明の薬剤の有効成分として、標的細胞中の内在性Ｄｉｃｅｒ酵素によって目的のｓｉＲＮＡが生成するような２本鎖ＲＮＡを用いることもできる。
【００２５】
本発明に用いる２本鎖ＲＮＡは、癌の抗体療法において抗体医薬の細胞障害活性を増強する作用を有する。該作用はPropidium iodide（PI：Dojindo社製：カタログ番号 P378）を用いた方法〔サイトメトリー（Cytometry）第８巻、第４号、１９８７年、第４２１〜４２６頁〕、又はCalcein-AM（Dojindo社製：カタログ番号 341-07901）を用いた方法〔アポトーシス（Apoptosis）、第３巻、第３号、１９９８年、第１９５〜２０２頁〕に準じて測定することができる。後述する実施例において、該測定方法について詳細に記載する。
【００２６】
上記２本鎖ＲＮＡは、抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の有効成分とすることができる。同薬剤は、抗体療法を施すヒト等の動物に投与することにより、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性が増強される。すなわち、本発明の一態様は、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強するための薬剤の製造における、補体制御因子をコードする遺伝子の発現を抑制する２本鎖ＲＮＡの使用である。また、本発明の他の態様は、本発明の薬剤を、抗体療法を施すヒト等の動物に投与することを含む、癌の抗体療法における抗体医薬の細胞障害活性を増強する方法である。
【００２７】
本発明の薬剤は、通常は、製剤学的に許容される製剤担体と組合わせて、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。本発明の薬剤の製剤形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００２８】
本発明の薬剤中に含まれる２本鎖ＲＮＡの量は、特に限定されず適宜選択すればよいが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合は、製剤中に１００μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５００μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌとするのがよい。
【００２９】
本発明の薬剤の投与時期は特に限定されず、抗体医薬の投与前、投与後、又は抗体医薬と同時のいずれであっても可能であり、対象となる癌種の治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。
【００３０】
本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としての２本鎖ＲＮＡの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００３１】
本発明の薬剤は、癌、例えば乳癌、Ｂ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫等）、白血病又は大腸癌等において、抗体医薬を用いた治療における治療剤、治療効果増強剤、治療補助剤として有用である。本発明の薬剤は、特に、前記癌の中でも、抗体医薬に耐性を有する癌に極めて著効を示す。尚、本発明に使用することが可能な抗体医薬としては、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ：rituximab）、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（トラスツズマブ：trastuzumab）、抗１７−１Ａ（ヒト腫瘍関連上皮細胞接着因子）抗体（edrecolomab）等を例示することができ、その他、癌治療における抗体療法で使用できる抗体医薬も使用することができる。また、現在知られている抗体医薬に限られ
ず、今後開発される抗体医薬も使用することができる。
【００３２】
本発明の薬剤は、抗体療法において抗体医薬とともに使用することが好ましく（但し、投与の時期が同時であるか否かは問わない）、公知の前記癌疾患の予防・治療剤（増強剤・補助剤も含まれる）と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記癌疾患の予防・治療効果を高めることができ、また、併用する前記予防・治療剤の投与量を減らすことも可能である。さらに、併用する前記癌疾患の予防・治療剤を、本発明の薬剤の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の薬剤の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化し、使用時に組み合わせても良い。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明の抗体医薬の細胞障害活性増強剤の有効成分であるｓｉＲＮＡ（２１〜２３塩基対２本鎖ｓｉＲＮＡ）を製造した。
すなわち、ヒトＣＤ５５をコードする配列番号１に記載の塩基配列を有するｃＤＮＡ（ベクトン・ディッキンソン社製）を鋳型とし、配列番号２及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、公知のＰＣＲ法によりＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列を有するｃＤＮＡ）の両端にＴ７プロモーター配列を含むリンカーを、Ｔ４リガーゼ（Block itTM、インビトロジェン社製）を用いて結合させた。次に、これを鋳型にしてＲＮＡポリメラーゼ（Block itTM
T7 Enzyme Mix、インビトロジェン社製）を用いてそれぞれの２本鎖ＲＮＡ（この２本鎖ＲＮＡを、ＣＤ５５−Ｎと記載することがある。）を調製した。配列番号８に、ＣＤ５５−Ｎのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。次いで、該２本鎖ＲＮＡを、RNaseIII活性を有するＤｉｃｅｒ酵素（ＲＮＡ切断酵素：BLOCK-iT Dicer RNAi kit、インビトロジェン社製）によって切断し、２１〜２３塩基対２本鎖ｓｉＲＮＡを製造した。
【００３４】
〔実施例２〕
ｓｉＲＮＡによる悪性腫瘍細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による細胞障害活性への効果を、リンパ腫患者から採取したＢリンパ腫（臨床検体）細胞を用いて試験検討した。
【００３５】
（１）試料の調製
実施例１で製造したｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡをＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を試験試料１とした。また、プライマーに配列番号４及び配列番号５のオリゴヌクレオチドを使用した以外は実施例１と同様にして、ｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５の中間領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ＣＤ５５−Ｍと記載することがある）をＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を対照試料１とした。ＣＤ５５−Ｍのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示す。さらに、同様に、配列番号６及び配列番号７のプライマーを使用して製造したｓｉＲＮＡ（ＣＤ５５のＣ末端領域をコードする遺伝子配列に相当する配列を有する２本鎖ＲＮＡ（ＣＤ５５−Ｃと記載することがある）をＤｉｃｅｒ酵素で切断したもの）を対照試料２とした。ＣＤ５５−Ｃのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示す。
【００３６】
ついで、前記試験試料１、対照試料１又は２について、それぞれの細胞導入用試料をBLOCK-iT Dicer RNAi kit（インビトロジェン社製）を使用して調製した。すなわち、試験試料１、対照試料１又は２それぞれについて、ａ液（LipofectamineTM 2000（インビトロジェン社製）：５μｌとOpti-MEM I（登録商標、ギブコ社製）２５０μｌの混合溶液）とｂ液（試験試料又は対照試料：０．７５μｌとOpti-MEM I（登録商標）２５０μｌの混合
溶液）を調製した。ａ液、ｂ液それぞれを室温で５分間保温した後、ａ液とｂ液を混合して室温で２０分間保温して、試験試料１及び対照試料２、３それぞれについて、細胞導入用試験試料１、細胞導入用対照試料１及び２を調製した。また、試験試料の代わりに滅菌水（陰性試料）を用いて、細胞導入用陰性試料を調製した。
【００３７】
（２）試験方法
ａ）ｓｉＲＮＡを導入した悪性腫瘍細胞におけるＣＤ５５発現の検討
Ｂリンパ腫患者から採取したＢリンパ腫（臨床検体）細胞を、７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）４枚に、それぞれ２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１、細胞導入用対照試料１又は２、及び細胞導入用陰性試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ（Fluorescein-4-isothiocyanate）標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色液（Cellstein-PI solution、同仁化学社製、品番：P378）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞培養液に添加して保温した後、各細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
【００３８】
ｂ）ｓｉＲＮＡが導入された悪性腫瘍細胞の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）の感受性の検討
前記ａ）で観察した細胞の培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、中外製薬社製、製品名：Rituxan）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのCellstein-PI solutionを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。
【００３９】
（３）試験結果
本試験の結果を、図１及び図２に示す。図１は、各試料について、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ５５抗体を用いた免疫染色（Ｂリンパ腫臨床検体細胞中のＣＤ５５の発現を示す）、ＰＩによる染色像、及び抗ＣＤ２０抗体処理後のＰＩ染色（抗体医薬と補体による細胞障害活性を示す）の結果について示した図である。図２に、ＣＤＣの実施前（−）、及び実施後（＋）のＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。
【００４０】
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞では、他の試料でトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞に比して、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された（図１）。また、図２より、ＣＤＣを実施した後（＋）、ＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞は、他の試料でトランスフェクションしたＢリンパ腫細胞におけるＰＩで染色された細胞（死細胞の割合：約１０％）に比して、顕著に多い（死細胞の割合：約７０％）ことが確認され、抗体医薬のＢリンパ腫細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＣＤ２０抗体による細胞障害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。
【００４１】
〔実施例３〕
ｓｉＲＮＡによるＢリンパ腫細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による
細胞障害活性への効果を検討した。
【００４２】
（１）試料の調製
実施例２と同様の方法により、試験試料１及び陰性試料を用いて細胞導入用試験試料１及び細胞導入用陰性試料を調製した。
【００４３】
（２）試験方法
ａ）２本鎖ＲＮＡのＢリンパ腫瘍細胞への導入によるＣＤ５５発現の検討
ヒトバーキットリンパ腫細胞であるＲａｊｉ細胞（ATCC No.：CCL-86）を７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）４枚にそれぞれ２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１および細胞導入用試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にDAPI染色液（Cellstein-DAPI solution、同仁化学社製、品番：D523）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した後、各細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
【００４４】
ｂ）ｓｉＲＮＡが導入されたＢリンパ腫細胞の補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）の感受性の検討
前記ａ）で観察した細胞培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、中外製薬社製、製品名：Rituxan）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１６時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのDAPI染色液（Cellstein-DAPI solution、同仁化学社製、品番：D523）を５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＤＡＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。
【００４５】
（３）試験結果
本試験の結果を、図３及び図４に示す。図３は、各試料について、バーキットリンパ腫細胞中のＣＤ５５の発現、及び抗体医薬と補体による細胞障害活性の結果（ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果）について示した図である。また図４に、ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。
【００４６】
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションしたバーキットリンパ腫細胞では、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された。また、ＣＤＣを実施した後、ＤＡＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションしたバーキットリンパ腫細胞は、ＤＡＰＩで染色される細胞（死細胞）が多い（６８．８％、ただし陰性試料は１１．１％）ことが確認され、抗体医薬のバーキットリンパ腫細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＣＤ２０抗体による細胞障害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。
【００４７】
〔実施例４〕
ｓｉＲＮＡによる乳癌細胞での補体制御因子の発現への影響と、抗体医薬による細胞障害活性への効果を検討した。
【００４８】
（１）試料の調製
実施例２と同様の方法により、試験試料１及び陰性試料を用いて細胞導入用試験試料１及び細胞導入用陰性試料を調製した。
【００４９】
（２）試験方法
ａ）２本鎖ＲＮＡの癌細胞への導入によるＣＤ５５発現の検討
ヒト乳癌細胞であるＳＫ−Ｂｒ３細胞（ATCC No.：HTB-30）を７．５％ウシ胎児血清並びにペニシリン及びストレプトマイシン（各１％）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を用いて懸濁した。グラスボトムマイクロウェルディッシュ（Glass Bottom Microwell Dishes、品番：P35G-0-14-C、MatTec Co.製）に２×１０5個／ディッシュとなるように細胞懸濁液を添加し、２４〜４８時間培養した後、前記細胞導入用試験試料１および細胞導入用陰性試料の全量を培養液に添加し、トランスフェクションを行った。２４時間、３７℃で保温した後、新鮮な培地に置換して、さらに４８時間、３７℃で培養した。各細胞は、ＦＩＴＣ標識の抗ＣＤ５５抗体（PharMingen社製、品番：555693）を用いて染色した。さらに、観察の３０分前にCellstein-DAPI solution（同仁化学社製、品番：D523）５００μｇ／ｍｌを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。各細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（バイオラッド社製、Radiance 2100MP）を用いて観察した。
【００５０】
前記で観察した細胞培養液に、５００μｌのHuman Serum AB（コスモバイオ社製、品番：832000027）と、抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、日本ロシュ社製、製品名：Herceptin）を最終濃度で４０μｇ／ｍｌとなるように添加し、６時間培養した。次いで、観察の３０分前に５００μｇ／ｍｌのCellstein-DAPI solutionを５μｌずつ各々細胞に添加して保温した。ＣＤＣによる細胞の生死は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、核がＤＡＰＩで染まっている（死細胞を示す）ことを指標に観察した。
【００５１】
（３）試験結果
本試験の結果は、図５に示すとおりである。図５は、各試料について、乳癌細胞中のＣＤ５５の発現、及び抗体医薬と補体による細胞障害活性の結果（ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果）について示した図である。また図６に、ＣＤＣ実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を測定した結果を示す。図中に示された時間は、各々、観察開始時を０時間としている。
【００５２】
その結果、ＣＤ５５のＮ末端領域をコードする遺伝子配列に相補的な配列を有する２本鎖ＲＮＡから調製したｓｉＲＮＡを含む試験試料１をトランスフェクションした乳癌細胞では、ＣＤ５５の発現が抑制されていることが確認された。また、ＣＤＣを実施した後、ＤＡＰＩによる染色を行った場合、試験試料１をトランスフェクションした乳癌細胞は、ＤＡＰＩで染色される細胞（死細胞）が多い（約３７％）ことが確認され、抗体医薬の乳癌細胞に対する感受性が増加したことが明らかとなった。すなわち、抗体医薬である抗ＨＥＲ２抗体による細胞障害活性が、試験試料１によって増強されることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の抗体医薬の細胞障害活性増強剤は、癌（特に悪性腫瘍）の抗体療法において、補体と抗体医薬による細胞障害活性を増強することで、標的になる癌（悪性腫瘍）細胞を効率よく殺傷することが可能である。また、特に抗体医薬に耐性を有する癌（悪性腫瘍）細胞に対して、補体と抗体医薬による細胞障害活性をリカバリーする効果も兼ね備えているので、抗体療法の補助剤として利用することが可能である。
【００５４】
また、本発明の抗体医薬は、抗体医薬に耐性を持った悪性腫瘍が再発し、抗体医薬での治療が困難であると判断された患者に対しても継続して抗体医薬での治療を行いたいとい
う要望に応えるものである。このことは、取りも直さず癌治療における抗体医薬耐性の克服への新規な道標を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｂリンパ腫臨床検体細胞に対する抗体医薬の細胞障害活性増強効果を示す図（写真）である。
【図２】Ｂリンパ腫臨床検体細胞に対する抗体医薬によるＣＤＣの実施前（−）、及び実施後（＋）のＰＩ染色細胞の割合を示す図である。
【図３】バーキットリンパ腫細胞に対する抗体医薬の細胞障害活性増強効果を示す図（写真）である。
【図４】バーキットリンパ腫細胞に対する抗体医薬によるＣＤＣの実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を示す図である。
【図５】乳癌細胞に対する抗体医薬の細胞障害活性増強効果を示す図（写真）である。
【図６】乳癌細胞に対する抗体医薬によるＣＤＣの実施後のＤＡＰＩ染色細胞の割合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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