(57)【要約】【課題】長鎖の標的核酸を単離及び／又は処理可能なターゲットＤＮＡとその関連技術とを提供する。【解決手段】ターゲットＤＮＡ１の両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子２を結合する。ターゲットＤＮＡ１の片端をスライドガラス３にスポティングし、ＤＮＡマイクロアレイ４を作製する。ＤＮＡマイクロアレイ４と対向に磁石５を配置し、磁性粒子２に磁界を印加して、磁性粒子２を磁石５側に吸引する。これにより、ターゲットＤＮＡ１を線状に引き延ばす。以下、この状態を保持したまま、スライドガラス３に標的核酸６を含む試料を流し、ターゲットＤＮＡ１に標的核酸６をハイブリダイゼーションさせる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をハイブリダイゼーションさせることにより前記核酸の配列を同定するターゲットＤＮＡにおいて、このターゲットＤＮＡの両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されていることを特徴とするターゲットＤＮＡ。
【請求項２】
両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡを用い、前記磁性粒子に磁界を印加して前記ターゲットＤＮＡを線状に変形させ、この状態で前記ターゲットＤＮＡに標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、前記標的核酸の単離及び／又は処理を行うことを特徴とする標的核酸の単離及び／又は処理方法。
【請求項３】
標的核酸を単離及び／又は処理するためのキットであって、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡと、以下に記載の少なくとも何れか１種の調整剤との組合せからなることを特徴とする標的核酸の単離及び／又は処理用キット。
（ａ）ポリメラーゼ
（ｂ）逆転写酵素
（ｃ）制限エンドヌクレアーゼ
（ｄ）適当な緩衝液
（ｅ）ジデオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの
（ｆ）デオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの
（ｇ）オリゴヌクレオチドであって、ラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されているもの
（ｈ）標準的ＰＣＲ５′−プライマー及び／又は３′−プライマーであって、ラベル付けされていても良いもの
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットＤＮＡとその利用技術とに係り、特に、長鎖の標的核酸をハイブリダイゼーション可能なターゲットＤＮＡの構成とその利用技術とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学的研究においては、特定の核酸物質を複合混合物から単離してこれに広範な処理を施すことが多く、当該特定の核酸物質の配列が既知である場合、その核酸物質、即ち標的核酸の単離及び／又は処理にはターゲットＤＮＡをアレイ化してなるＤＮＡマイクロアレイが使用される。
【０００３】
従来より、この種のＤＮＡマイクロアレイとしては、スライドガラス上にターゲットＤＮＡをスポティングしたもの、適当な平均粒度まで微粉砕された磁鉄鉱の表面を所要の官能基を有する物質で被覆し、この被覆層にオリゴヌクレオチドを結合させたもの（例えば、特許文献１参照。）及び単分散超常磁性粒子の表面を所要の官能基を有する物質で被覆し、この被覆層に所要のプローブを修飾したもの（例えば、特許文献２参照。）が提案されている。
【特許文献１】米国特許第４６７２０４０号明細書
【特許文献２】特許第３０２０２７１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ターゲットＤＮＡは標的核酸の単離及び／又は処理に極めて有用であり、生化学的研究の対象が広がるに連れて、より広範囲の標的核酸の単離及び／又は処理に適用可能なターゲットＤＮＡの開発が望まれている。
【０００５】
しかしながら、長鎖のターゲットＤＮＡは、アレイ化したときに線状に固定されず、糸くず状に丸まってしまうため、長鎖の標的核酸をハイブリダイゼーションすることができない。このため、従来より実用に供されているターゲットＤＮＡは、せいぜい２００塩基ベース程度の短鎖の標的核酸を単離及び／又は処理するものに限定されており、それ以上の長鎖の標的核酸を単離及び／又は処理可能なターゲットＤＮＡの開発が望まれている。
【０００６】
本発明は、かかる要請に対応するものであり、その目的は、例えば２００塩基ベース以上の長鎖の標的核酸を単離及び／又は処理可能なターゲットＤＮＡを提供すること、及びこれを用いた標的核酸の単離及び／又は処理方法並びに標的核酸の単離及び／又は処理用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、前記の課題を解決するため、ターゲットＤＮＡについては、核酸をハイブリダイゼーションさせることにより前記核酸の配列を認識するターゲットＤＮＡにおいて、このターゲットＤＮＡの両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されているという構成にした。
【０００８】
また、標的核酸の単離及び／又は処理方法については、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡを用い、前記磁性粒子に磁界を印加して前記ターゲットＤＮＡを線状に変形させ、この状態で前記ターゲットＤＮＡに標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、前記標的核酸の単離及び／又は処理を行うという構成にした。
【０００９】
さらに、標的核酸の単離及び／又は処理用キットについては、標的核酸を単離及び／又は処理するためのキットであって、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡと、以下に記載の少なくとも何れか１種の調整剤との組合せからなるという構成にした。
【００１０】
（ａ）ポリメラーゼ
（ｂ）逆転写酵素
（ｃ）制限エンドヌクレアーゼ
（ｄ）適当な緩衝液
（ｅ）ジデオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの
（ｆ）デオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの
（ｇ）オリゴヌクレオチドであって、ラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されているもの
（ｈ）標準的ＰＣＲ５′−プライマー及び／又は３′−プライマーであって、ラベル付けされていても良いもの
ターゲットＤＮＡの両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子を結合すると、前記磁性粒子に所要の磁界を印加し、前記磁性粒子を印加された磁界の方向に移動させることにより、糸くず状に丸まったターゲットＤＮＡを線状に引き延ばすことができるので、長鎖の標的核酸のハイブリダイゼーションが可能となり、ターゲットＤＮＡを用いて単離及び／又は処理が可能な標的核酸の範囲を拡張することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のターゲットＤＮＡは、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子を結合したので、前記磁性粒子に所要の磁界を印加することにより、糸くず状に丸まったターゲットＤＮＡを線状に引き延ばすことができる。よって、これまで実現が困難とされていた長鎖の標的核酸のハイブリダイゼーションが可能となり、単離及び／又は処理が可能な標的核酸の範囲を拡張することができる。
【００１２】
本発明の標的核酸の単離及び／又は処理方法は、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡを用い、前記磁性粒子に磁界を印加して前記ターゲットＤＮＡを線状に変形させ、この状態で前記ターゲットＤＮＡに標的核酸をハイブリダイゼーションさせ、前記標的核酸の単離及び／又は処理を行うので、これまで実現が困難とされていた長鎖の標的核酸のハイブリダイゼーションが可能となり、ターゲットＤＮＡを用いて単離及び／又は処理が可能な標的核酸の範囲を拡張することができる。
【００１３】
本発明の標的核酸の単離及び／又は処理用キットは、両端又は片端の５′末端又は３′末端に磁性粒子が結合されたターゲットＤＮＡと必要な調整剤とを含んで構成されているので、これを用いることにより、これまで実現が困難とされていた長鎖の標的核酸のハイブリダイゼーションが可能となり、長鎖の標的核酸の単離及び／又は処理を簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、本発明に係るターゲットＤＮＡの実施形態を図１及び図２に基づいて説明する。図１は本発明に係るターゲットＤＮＡの第１例を模式的に示す図、図２は本発明に係るターゲットＤＮＡの第２例を模式的に示す図である。
【００１５】
第１例に係るターゲットＤＮＡ１Ａは、図１に示すように、ターゲットＤＮＡ１の両端の５′末端又は３′末端に磁性粒子２を結合してなる。一方、第２例に係るターゲットＤＮＡ１Ｂは、図２に示すように、ターゲットＤＮＡ１の片端の５′末端又は３′末端のみに磁性粒子２を結合してなる。
【００１６】
ターゲットＤＮＡ１は、ＰＣＲ法又はプラスミドを用いたＤＮＡ増殖法により調製される。
【００１７】
磁性粒子２は、ターゲットＤＮＡ１の５′末端又は３′末端に結合可能な粒状磁性体をもって形成される。一例としては、表面にグリシジルメタリレートが被覆された直径が４ｎｍのＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子を用いることができる。直径が４ｎｍのＦｅ５０Ｐｔ５０磁性粒子は、ＦｅとＰｔとを含む錯体をアルコール還元することにより得ることができる。グリシジルメタリレートがもつエポキシ基は、ＤＮＡ中のグアニン、シトシン、アデニン等のアミノ基と良く結合するので、この性質を利用することにより、ターゲットＤＮＡ１の５′末端又は３′末端に磁性粒子２を修飾させることができる。
【００１８】
次に、前記第２実施形態例に係るターゲットＤＮＡ１Ｂを用いた標的核酸の単離及び／又は処理方法を、図３に基づいて説明する。
【００１９】
高能率に多数のＤＮＡを解析するため、図３（ａ）に示すように、ターゲットＤＮＡ１Ｂの磁性粒子２を有しない片端をスライドガラス３にスポティングし、ＤＮＡマイクロアレイ４を作製した。この状態においては、図３（ａ）に示すように、ターゲットＤＮＡ１は糸くず状に丸まっている。そこで、図３（ｂ）に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ４のターゲットＤＮＡ１Ｂがスポティングされた面と対向に磁石５を配置し、磁性粒子２に磁界を印加して、磁性粒子２を磁石５側に吸引する。これにより、ターゲットＤＮＡ１は、図３（ｂ）に示すように、線状に引き延ばされる。以下、この状態を保持したまま、スライドガラス３に標的核酸６を含む試料を流し、ターゲットＤＮＡ１に標的核酸６をハイブリダイゼーションさせる。しかる後に、定法にしたがって、ハイブリダイゼーションされた標的核酸６の単離及び／又は処理を行う。
【００２０】
なお、前記実施形態においては、第２実施形態例に係るターゲットＤＮＡ１Ｂを用いたが、第１実施形態例に係るターゲットＤＮＡ１Ａを用いた場合にも、これと同様の方法で標的核酸６の単離及び／又は処理を行うことができる。
【００２１】
本発明に係るターゲットＤＮＡ１Ａ，１Ｂは、単独で取引の対象とすることもできるが、ユーザの利便のため、ターゲットＤＮＡ１Ａ，１Ｂと所要の調整剤との組合せからなるキットの形で取り引きすることが特に好ましい。前記調整剤としては、（ａ）ポリメラーゼ、（ｂ）逆転写酵素、（ｃ）制限エンドヌクレアーゼ、（ｄ）適当な緩衝液、（ｅ）ジデオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの、（ｆ）デオキシヌクレオチドであって、そのうちのいくらかがラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されていても良いもの、（ｇ）オリゴヌクレオチドであって、ラベルを担持しているか又はラベルを担持するように適合されているもの、（ｈ）標準的ＰＣＲ５′−プライマー及び／又は３′−プライマーであって、ラベル付けされていても良いもの、のうちの少なくとも何れか１種とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係るターゲットＤＮＡの第１例を模式的に示す図である。
【図２】本発明に係るターゲットＤＮＡの第２例を模式的に示す図である。
【図３】実施形態例に係るターゲットＤＮＡを用いた標的核酸の単離及び／又は処理方法を示す図である。
【符号の説明】
【００２３】
１，１Ａ，１Ｂ    ターゲットＤＮＡ
２    磁性粒子
３    スライドガラス
４    ＤＮＡマイクロアレイ
５    磁石
６    標的核酸
【図１】
2005318847.tif 000003
【図２】
2005318847.tif 000004
【図３】
2005318847.tif 000005