(57)【要約】【課題】  バイオリアクター内の生物物質活性のモニタリングや、細胞融合等に用いる単一生物物質の活性測定を瞬時に簡便に行うことができるようにする。【解決手段】  非対称電場中に生じる誘電泳動力と重力・浮力のバランスにより、生物物質の誘電特性を算出し、誘電特性と生物活性の関係より、生物物質の活性解析を瞬時に行うことができるようにする。【選択図】  図１
2005224171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極に高周波電圧を印加して懸濁液中に高周波不平等電界を発生させ、懸濁液中の生物物質に働く誘電泳動力と重力・浮力の相関から、静止位置の差によって生物物質の活性を測定することを特徴とする誘電泳動活性解析方法。
【請求項２】
高周波電圧を定常的に印加することを特徴とする請求項１に記載の誘電泳動活性解析方法。
【請求項３】
高周波電圧を断続的に印加することを特徴とする請求項１に記載の誘電泳動活性解析方法。
【請求項４】
高周波電圧を正弦波、矩形波、パルス波のいずれかを印加することを特徴とする請求項１に記載の誘電泳動活性解析方法。
【請求項５】
電極に印加する高周波電圧の周波数を１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲とすることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の誘電泳動活性解析方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかの方法のための装置であって、細胞等の生物物質を含む懸濁液に高周波電圧を印加するための高周波電源と電極と、前記懸濁液容器とその供給手段、並びに高周波電圧の印加によって生物物質に働く誘電泳動力と重力・浮力の相関から、生物物質の静止位置を提供する手段と静止位置の差から活性を判定する判定手段とを備えていることを特徴とする誘電泳動活性解析装置。
【請求項７】
用いる電極の電極間間隔が５００μｍ以下であることを特徴とする請求項６に記載の誘電泳動活性解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、細胞・微生物等の生物物質の活性解析を行うことができる新規活性解析方法とそのための活性解析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細胞等の生物物質の活性を測定、評価するための方法として様々な方式のものが知られているが、これら従来法による活性解析では、たとえば染色法による生死の識別、培養による増殖速度の測定、代謝産物濃度の測定などにおいていずれも長時間の操作や待機が必要とされていた。また、フローサイトメトリーを利用したセルソーターも知られているが、この方法は活性解析法ではなく、それぞれの電気的な違いを利用する分析方法であり、しかも高価であるため研究機関以外では使用されていないのが実情である。
【０００３】
このような状況において、この出願の発明者らによって電場を利用すること、誘電泳動法を利用して生細胞と死細胞とを分離することも検討されてきている（非特許文献１−７）。また、誘電泳動フィルターについても国内外の研究者による報告がなされている（非特許文献８−９）。
【０００４】
しかしながら、これまでのところ、研究機関だけではなく、産業技術としても、バイオリアクター内の生物物質活性のモニタリングや、細胞融合等に用いる単一生物物質の活性測定が必要とされているものの、従来では、必要とされる時点での生物物質の活性測定を瞬時に行うことができないと言う問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
【非特許文献１】M.Hakoda and N.Shiragami: Separation of Dead cells from Culture Broth by Using Dielectrophoresis.International Conference on Bioseparation Engineering, Nikko, 27, July 1999
【非特許文献２】箱田  優、市川佳秀、脇坂嘉一、白神直弘：「不均一電場を用いた酵母菌の生・死による分離」、化学工学会第64年会、名古屋、1999年３月
【非特許文献３】M.Hakoda and N.Shiragami:“Separation of Dead cells from Culture Broth by Using Dielectrophoresis”in Bioseparation Engineering”,editors by I. Endo, T. Nagamune, S. Katoh and T. Yonemoto, Elsevier Science, Netherlands,53−58（2000）
【非特許文献４】脇坂嘉一、箱田  優、白神直弘：「不均一電場中における細胞挙動」、化学工学会第33回秋季大会、静岡、2000年９月
【非特許文献５】箱田  優、脇坂嘉一、白神直弘：「誘電泳動法を用いた培地の中での細胞分離に及ぼす操作条件の影響」、化学工学論文集、（2001）
【非特許文献６】脇坂嘉一、箱田  優、白神直弘：「誘電泳動による生細胞と死細胞の分離に及ぼす電極形状の影響」、化学工学会神奈川大会、横浜、2001年８月
【非特許文献７】脇坂嘉一、箱田  優、白神直弘：「不均一電場による生・死細胞の分離に及ぼす電極形状の影響」化学工学会第34回秋季大会、北海道、2001年９月
【非特許文献８】A.Docoslis et al．“A Novel Dielectrophoresis-Based Device for the Selective Retention of Viable Cells in Cell Culture Media” Biotech Bioeng 54,p239-250(1997)
【非特許文献９】周  広斌ら“懸濁微粒子の除去及び回収を目的とした誘電泳動フィルターの開発”静電気学会講演論文集、ｐ55−58（2001）  そこで、この出願の発明においては、以上のような背景から、必要とされる時点において、瞬時に生物物質の活性測定を行うことのできる、新しい活性解析方法とそのための活性解析装置を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、電極に高周波電圧を印加して懸濁液中に高周波不平等電界を発生させ、懸濁液中の生物物質に働く誘電泳動力と重力・浮力の相関から、静止位置の差によって生物物質の活性を測定することを特徴とする誘電泳動活性解析方法を提供する。
【０００７】
そして、第２には、上記方法において、高周波電圧を定常的に印加することを特徴とする誘電泳動活性解析方法を、第３には、高周波電圧を断続的に印加することを特徴とする誘電泳動活性解析方法を、第４には、高周波電圧を正弦波、矩形波、パルス波のいずれかを印加することを特徴とする請求項１に記載の誘電泳動活性解析方法を提供する。
【０００８】
また、第５には、上記いずれかの方法において、電極に印加する高周波電圧の周波数を１ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの範囲とすることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の誘電泳動活性解析方法を提供する。
【０００９】
さらに、この出願の発明は、第６には、上記いずれかの方法のための装置であって、細胞等の生物物質を含む懸濁液に高周波電圧を印加するための高周波電源と電極と、前記懸濁液容器とその供給手段、並びに高周波電圧の印加によって生物物質に働く誘電泳動力と重力・浮力の相関から、生物物質の静止位置を提供する手段と静止位置の差から活性を判定する判定手段とを備えていることを特徴とする誘電泳動活性解析装置を提供し、第７には、用いる電極の電極間間隔が５００μｍ以下であることを特徴とする誘電泳動活性解析装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
以上のとおりのこの出願の発明によれば、細胞等の生物物質の活性と誘電特性の相関という全く新しい知見に基づいた方法とそのための装置とすることにより、必要な時点で瞬時に誘電特性を測定することにより細胞活性を評価できる細胞活性解析システム及び装置が提供される。
【００１１】
電荷がない物質、表面電荷が同じ物質、および生物物質の大きさが異なっても解析可能な誘電泳動を用いた活性解析が可能になる。さらに、細胞の培養周期における細胞の大きさに影響を受けない特徴を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
この出願の発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１３】
まず、この出願の発明における基本的事項として、誘電泳動力について説明する。
【００１４】
誘電泳動力とは、以下の現象において生じる力のことである。
【００１５】
粒子を電場中におくと分極する。分極で生じた正および負の電荷は、電極の正および負の電荷と引きつけあう。均一な電場の場合、正電極と粒子の負電荷が引き合う力と、負電極と粒子の正電荷が引きつけ合う力は等しく、電荷を持たない粒子の電気力は相殺されるために粒子は移動しない。不均一電場の場合、粒子の誘電率が周囲媒質の誘電率より大きいとき、強電場の電極と粒子の強電場側が引きつけ合う力は、弱電場の電極と粒子の弱電場側が引きつけ合う力より大きく、結果的には粒子は強電場側に移動する。
【００１６】
また、粒子の誘電率が周囲媒質の誘電率より小さい場合、粒子は弱電場側に移動する。このように不均一な電場で、粒子が移動する現象を誘電泳動と呼び、この際に粒子に働く力を誘電泳動力という。
【００１７】
時間平均の誘電泳動力FDEPは次式で表される。
【００１８】
【数１】
2005224171.tif 000003
ここでｒは粒子の半径、εmは周囲媒質の誘電率、Ｅは電場強度を示す。Re[K(ω)]は、次式で表されるClausius-Mossotti関数の実数部分を示す。
【００１９】
【数２】
2005224171.tif 000004
この出願の発明の活性解析システムでは、誘電泳動力と重力・浮力をバランスさせ、細胞を静止させ、静止位置から細胞活性を評価する。細胞に掛かる重力、浮力、そして誘電泳動力から(3)式が成立する。
【００２０】
【数３】
2005224171.tif 000005
ここで、ρp：細胞の密度、ρm：周囲溶液の密度を示す。
この式から(4)式が導かれるが、Re[K(ω)]は細胞径に依存せず、これを細胞の誘電特性と見なす。
【００２１】
【数４】
2005224171.tif 000006
(1)式に示すように右辺の誘電泳動力は、粒子と液の誘電率、粒子径、液の粘性率、電場強度の２乗の勾配（∇E2）により決定する。すなわち、細胞の誘電率によって細胞へ作用する誘電泳動力が変化する。また、∇E2は、不均一電場内では電極間の位置の関数であるため、細胞へ作用する誘電泳動力は電極間の位置によって異なる。
【００２２】
このような誘電泳動力と、重力・浮力とのバランスによって細胞等の生物物質の静止位置が定まることになる。この静止位置の差は、生物物質の活性を示すことになる。
【００２３】
この出願の発明の活性解析方法は、たとえば次のようなシステム・装置の構成として実施することができる。
【００２４】
すなわち、この出願の発明の活性解析装置では、たとえば図１に示されるように、活性測定電極セル（２）に目的生物物質懸濁液をシリンジポンプ（１）により供給し、電磁弁等（１０）により測定時間の間、流れが停止するよう設置されている。
【００２５】
活性測定用電極セル（２）は、たとえば図２に示すように、不均一電場が生じるように一対の電極を設置してあり、誘電泳動力と重力バランスするよう設置されている。
【００２６】
交流電圧はたとえば、ファンクッション・ジェネレータ（４）、アンプ（５）により印加する。
【００２７】
細胞等の静止位置は、たとえば、ＣＣＤカメラによりパソコンに画像を入力し、細胞の移動がある場合は出力電圧を制御することにより静止させ、その位置を測定することができる。その静止位置を細胞の培養日数と図２における平板電極からの距離（μｍ）との関係として例示したのが図３である。この図３は、マウスハイブリドーマ細胞を用いた場合の細胞の静止位置を示している。
【００２８】
上記の位置と電極間の電位から、その静止位置での電場強度の２乗の勾配（▽Ｅ２  ）を求め、たとえば図４のように例示することができる。この図４においては、縦軸の数値は、ピン−プレートにおける電界の理論解析から算出するか、電磁界シミュレーションソフトを用いて解析することができる。どちらの場合も同様の結果が得られる。それを用いて誘電泳動力を算出し、その結果より誘電特性を算出することができる。図５は、Re[K(ω)]を比増殖速度との関係で示したものである。この図５の縦軸の数値は、図４における▽Ｅ２と前記（４）式を用いて算出することができる。
【００２９】
同様の方法で、それぞれの生物物質の誘電特性と生物物質の活性の関係を事前に求めておくことにより、単一生物物質の活性解析を行うことができる。
【００３０】
あるいは、ある活性の場合の静止位置を測定し、その静止位置と活性との関係を求めておくことにより、生物物質の活性解析を行う方法もある。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
以上のように、この出願の発明によって単一の生物物質の誘電特性を測定することにより、それに関係する活性を解析することができ、バイオリアクター内の生物物質活性のモニタリングや、細胞融合等に用いる単一生物物質の活性測定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】細胞活性解析装置の概略図である。
【図２】活性解析用電極セルの概略図である。
【図３】培養細胞の増殖段階における静止位置を例示した図である。
【図４】静止位置での電場強度の２乗の勾配を例示した図である。
【図５】誘電特性と増殖活性の関係を例示した図である。
【符号の説明】
【００３３】
１  生物物質懸濁液供給ポンプ
２  活性測定用電極セル
３  生物物質懸濁液回収槽
４  ファンクッション・ジェネレータ
５  アンプ
６  オシロスコープ
７  ＣＣＤカメラ
８  モニター
９  パソコン
１０  電磁弁
１１  サンプリング用三方バルブ
【図１】
2005224171.tif 000007
【図２】
2005224171.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
2005224171.tif 000011