(57)【要約】【課題】  基質特異性改変キメラ酵素を提供するとともに本酵素の製造方法を提供する。【解決手段】  コージビオースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を互いに置換させることによって創出したβ−グルコシド結合をもつオリゴ糖に作用することができる新規キメラ酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物中から採取することを特徴とするキメラ酵素の製造方法を提供することにより上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルコシド結合をもつオリゴ糖に作用することができ、且つ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するキメラ酵素。
【請求項２】
遺伝子を発現させて得ることのできる請求項１記載のキメラ酵素。
【請求項３】
請求項１又は２記載のキメラ酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列表における配列番号２で示される塩基配列又はその塩基配列に相補的な塩基配列を含む請求項３記載のＤＮＡ。
【請求項５】
遺伝子の縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項３又は４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
自律複製可能なベクター内に挿入された請求項３乃至５のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項７】
適宜の宿主に導入された請求項３乃至６のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のキメラ酵素をコードするＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体を栄養培地に培養し、培養物から産生したキメラ酵素を採取することを特徴とするキメラ酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ酵素に関し、詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下トレハロースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからトレハロースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素トレハロースホスホリラーゼ、及び、同じく無機リン酸の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列を互いに置換することによって創出した、野生型酵素が作用しない基質オリゴ糖を分解あるいは合成する機能を有するキメラ酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。これらホスホリラーゼとその作用については非特許文献１にまとめられている。
【０００３】
さらに本発明者等は、特許文献１及び特許文献２に開示しているように、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５０４７）が、トレハロースホスホリラーゼ及び新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見出した。
【０００４】
これら酵素を含めて、二糖類ホスホリラーゼの触媒する糖転移反応は他の糖転移酵素と比べて基質特異性が厳格であり、純度の高い糖質を合成する上で有用である。一方、基質特異性の広い酵素は、一種の酵素で様々な糖質を合成できるため、応用範囲が広く、産業的にも有用である。酵素はタンパク質から出来上がっており、酵素が示す諸特性はその酵素タンパク質のアミノ酸一次配列に起因しており、酵素の基質特異性も、アミノ酸一次配列やその一次配列で形成される高次構造によって生み出されることは一般的に認識されているところである。現在では、遺伝子操作技術を用いて、酵素タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列を解読することにより、一義的に酵素タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。また、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中の塩基を他の塩基に人為的に置換し、コードされるアミノ酸残基を変え、他のアミノ酸残基に置換した変異酵素タンパク質を作製することが可能であり、いくつかの酵素タンパク質においては、人為的に遺伝子変異を与えることによって基質特異性改変酵素が得られている。しかしながら、二糖類ホスホリラーゼにおいては、より幅広い糖質の生成が可能で産業的により有用な、基質特異性の広い酵素が望まれていたものの、その基質特異性改変酵素は実現していなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−３０４８８１号公報
【特許文献２】特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献１】『酵素ハンドブック』、朝倉書店、（１９８２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、基質特異性改変キメラ酵素を提供するとともに本酵素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、基質特異性の異なる２種類の酵素のキメラ化に着目し、鋭意研究を続けてきた。その結果、本発明者らは、いずれも二糖類ホスホリラーゼに分類されるトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列を互いに置換させることによって創出したキメラ酵素が、意外にも、野生型のトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼのいずれもが本来的に作用しないβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖に作用し、これを加リン酸分解するとともに他の糖質へのグルコシル転移をも触媒して転移糖を合成することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、コージビオースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列を互いに置換させることによって創出したβ−グルコシド結合をもつオリゴ糖に作用することができる新規キメラ酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物中から採取することを特徴とするキメラ酵素の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者等は、先ず、特許文献１及び特許文献２に開示した、サーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７由来の配列表における配列番号３で示される塩基配列を有するトレハロースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡと、配列表における配列番号５で示される塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡとを用い、両酵素のアミノ酸配列が相同な領域で組換えることによって６種のキメラ酵素遺伝子ＤＮＡを作成した。次いで、得られた全キメラ酵素遺伝子に共通の制限酵素作用部位においてこれら遺伝子ＤＮＡをランダムに交換し、様々なアミノ酸置換が起こっている酵素遺伝子ＤＮＡ混合物を作製した。さらに、これら遺伝子ＤＮＡ混合物を大腸菌での発現プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に組換え、得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌を形質転換し、変異酵素遺伝子ライブラリーを作製した。次に、得られた遺伝子ライブラリーから組換え大腸菌を単離し、培養し、培養菌体から変異酵素を抽出し、その基質特異性を調べることによって基質特異性が変化した、すなわち、キメラ化前の酵素の基質であるトレハロース及びコージビオース以外の糖質に作用するキメラ酵素を産生する形質転換体をスクリーニングした。その結果、目的とする形質転換株を１株得ることができた。さらに、その形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの塩基配列を決定してキメラ酵素遺伝子ＤＮＡの遺伝子組換え箇所を調べたところ、該ＤＮＡは配列表における配列番号２で示される塩基配列を有しており、組換え変異前の配列表における配列番号３及び５で示される塩基配列と異同を調べたところ、配列表における配列番号３（トレハロースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ）で示される塩基配列の５´−末端から第１，１７７乃至第１，５１８番目の塩基の配列が、配列表における配列番号５（コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ）で示される塩基配列の５´−末端から第１，１５３乃至第１，５２７番目の塩基の配列に置換していることが判明した。この遺伝子置換によって、配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するトレハロースホスホリラーゼのＮ末端から第３９３番目のアミノ酸残基であるＴｙｒから第５０６番目のアミノ酸残基であるＡｓｎまでの領域が、配列表における配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するコージビオースホスホリラーゼのＮ末端から第３８５番目のアミノ酸残基であるＴｙｒから第５０９番目のアミノ酸残基であるＡｓｎの領域に置換していることが分かった。
【００１０】
得られた基質特異性改変キメラ酵素産生組換え体を培養したところ、該キメラ酵素は大腸菌内で高発現し容易に製造できることが分かった。得られた基質特異性改変キメラ酵素の諸特性を調べて、アミノ酸配列に変異がないコージビオースホスホリラーゼ（本明細書では、野生型コージビオースホスホリラーゼと略することもある。）のものと比較したところ、ｐＨ安定性や反応至適ｐＨには変化は認められなかった。熱安定性も５０℃まで安定であり、変異前の酵素と比べて若干低いものの実用上は差し支えないことが分かった。基質特異性については、得られたキメラ酵素は、野生型酵素が本来作用しないβ−１，２グルコシド結合を持つソホロース、β−１，３グルコシド結合を持つラミナリビオースに作用して転移糖とグルコースを生成することが分かった。なお、該キメラ酵素はコージビオースホスホリラーゼ活性を示したが、トレハロースホスホリラーゼ活性は示さなかった。
【００１１】
本発明の基質特異性改変キメラ酵素はβ−グルコシド結合を有するオリゴ糖に作用して転移糖を生成する特性を有することから、当該酵素を用いることによって、従来の野生型トレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼが作用しないソホロース、ラミナリビオースを原料としてオリゴ糖を生成させることができるため、本発明の基質特異性改変キメラ酵素は、新規なオリゴ糖などの糖質製造において有利に利用できる。
【００１２】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１３】
＜実験１：トレハロースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
配列表における配列番号７で示される塩基配列を有する５０塩基の合成ＤＮＡと配列表における配列番号８で示される塩基配列を有する４２塩基の合成ＤＮＡとを常法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、その混合液を常法に従って熱処理して両ＤＮＡをアニーリングした。予め、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＰｓｔＩとで切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社販売）と、アニーリングした合成ＤＮＡとを混合した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換することによって、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位の間に合成ＤＮＡを挿入して新たにＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位を有するプラスミドｐＫＳＳ２を得た。
【００１４】
特許文献１に記載のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＴＰ４を鋳型として、配列表における配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーＡと、配列表における配列番号１０で示される塩基配列を有するプライマーＢとを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＪ２０００（パーキン・エルマー社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と７２℃で４分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、トレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＴＰ１を得た。
【００１５】
＜実験２：コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
特許文献２に記載のコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＫＰ１を鋳型として、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーＣと、配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するプライマーＤとを用いて、実験１と同様の条件でコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号６で示されるアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を得た。
【００１６】
＜実験３：トレハロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ両遺伝子のキメラ遺伝子の作製＞
まず、トレハロースホスホリラーゼとコージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列間で相同性の高い領域３箇所を選択し、そのうちの１箇所で両酵素遺伝子を交換したキメラ酵素遺伝子計６種をＰＣＲ法にて作成するため、１種のキメラ酵素につき２種の鋳型ＤＮＡ断片を調製した。例えばキメラ酵素Ｉ遺伝子の場合は、ｐＫＢＫ１４を鋳型として配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有するプライマーＫＰＦと配列番号１７で示される塩基配列を有するプライマー１とを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＪ２０００（パーキン・エルマ社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と６０℃で３０秒と７２℃で２分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、０．９８ｋｂのＤＮＡ断片（Ｉ−１）を増幅した。また、ｐＫＴＰ１を鋳型として配列表における配列番号１８で示される塩基配列を有するプライマー２と配列番号１４で示される塩基配列を有するプライマーＴＰＲを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、１．３８ｋｂのＤＮＡ断片（Ｉ−２）を増幅した。それぞれのＰＣＲ産物を常法に従って精製した。他の５種のキメラ酵素遺伝子の場合も同様の操作を行った。なお、使用した鋳型ＤＮＡとプライマーの種類を表１に示した。
【００１７】
【表１】
2005034074.tif 000002
【００１８】
上記の操作で調製した、１種のキメラ酵素遺伝子につき２つのＤＮＡ断片を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。キメラ酵素Ｉの場合は、ＤＮＡ断片Ｉ−１とＩ−２を鋳型として、プライマーＫＰＦとプライマーＴＰＲを用いて、ＤＮＡ断片Ｉ−１取得時と同様の条件でＰＣＲを行った。増幅された約２．３ｋｂのキメラ酵素Ｉ遺伝子断片は、常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩ及びＳｐｅＩで消化した。他のキメラ酵素の場合も同様の操作を行った。なお、使用した鋳型ＤＮＡならびにプライマーの種類を表２に示した。こうして、６種のキメラ酵素遺伝子断片を調製した。
【００１９】
【表２】
2005034074.tif 000003
【００２０】
上述のごとく得られた６種のキメラ酵素遺伝子断片について、それぞれの断片とプラスミドｐＫＳＳ２とを、実験１と同様の方法で連結し、合計６種類のキメラ酵素遺伝子発現ベクターｐＫＢＣ１、ｐＫＢＣ２、ｐＫＢＣ３、ｐＫＢＣ４、ｐＫＢＣ５及びｐＫＢＣ６を構築した。続いて、上述の６種のプラスミドをそれぞれ２種の制限酵素ＳａｃＩ及びＢｓｐ１４０７Ｉで消化した後、これらを混合してＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造製）を用いてライゲーションした。このライゲーションミックスを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、キメラ酵素ライブラリーを作成した。このライブラリー中には、理論的には２４種類のキメラ酵素遺伝子（野生型トレハロースホスホリラーゼ、及び同コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む）が存在する。なお、このライブラリー調製のスキームを図１に示した。
【００２１】
＜実験４：活性型キメラ酵素のスクリーニング＞
実験３の方法で作製した組換え大腸菌ライブラリーを用いて、１％トリプトン（バクト社製造）、０．５％酵母エキス（バクト社製造）、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩、及び１．５％寒天を含む培養プレート上で組換え大腸菌をコロニーとして分離し、この分離したコロニーのうち、４３２個を別々に同じ培地組成のスラント培地に移植し３７℃で２４時間培養した。培養した菌体を１白金耳採り、１．６％トリプトン、１％酵母エキス（バクト社製造）、０．５％塩化ナトリウム、及び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩からなる液体培地（５ｍｌ）が入った試験管に移植し、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液の全量を、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）からなる水溶液（５ｍｌ）が入った試験管に加え、３７℃で３時間振とうし溶菌した。対照として、アミノ酸置換の無いトレハロースホスホリラーゼの発現プラスミドｐＫＴＰ１を有する組換え大腸菌『ＫＴＰ１』、及びアミノ酸置換の無いコージビオースホスホリラーゼの発現プラスミドｐＫＢＫ１４を有する組換え大腸菌『ＫＢＫ１４』を同様に培養し処理した。得られた酵素液５０μｌを２００ｍM  β−Ｇ１Ｐ、１００ｍMグルコース及び５０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．５）を含む溶液５０μｌに作用させ、５０℃で一晩反応させた。反応液をＴＬＣ分析に供することによって、転移糖の生成が見られた組換え大腸菌をスクリーニングした結果、試験した４３２コロニーのうち、４３株に糖転移酵素活性を認めた。
【００２２】
＜実験５：基質特異性の変化したキメラ酵素のスクリーニング＞
実験４で得られた４３株の活性型キメラ酵素の酵素液５０μｌを、濃度２％の糖質、５０ｍMリン酸及び５０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．５）を含む溶液５０μｌに作用させ、５０℃で９６時間反応させ、これらの反応液をＴＬＣに供した。糖質としては、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース及びゲンチオビオースの１０種を用いた。試験した４３株の組換え大腸菌のうちＮｏ．４３株由来の酵素は、基質コージビオース、ニゲロース、ソホロース、ラミナリビオースを用いた反応液からＴＬＣにおいて複数の糖質スポットを生じ、これらの糖質に作用することが分かった。しかしながら、本酵素はトレハロースには作用しなかった。なお、対照であるトレハロースホスホリラーゼはトレハロースのみに、コージビオースホスホリラーゼはコージビオースのみにそれぞれ作用した。このＮｏ．４３株をＫＢＫＣＣと名づけた。
【００２３】
＜実験６：ＤＮＡ分析＞
実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫＣＣを常法に従い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号２で示される塩基配列のＤＮＡを含んでおり、併記したアミノ酸配列をコードしていることが判明した。遺伝子組換え前の配列表における配列番号３及び５で示される塩基配列と異同を調べたところ、第１乃至第１，１７６番目の塩基が配列表における配列番号３で示される塩基配列の第１乃至第１，１７６番目の塩基と、第１，１７７乃至第１，５５１番目の塩基が配列表における配列番号５で示される塩基配列の第１，１５３乃至第１，５２７番目の塩基と、第１，５５２乃至第２，３５８番目の塩基が配列表における配列番号３で示される塩基配列の第１，５１９乃至第２，３２５番目の塩基とそれぞれ一致していることが分かった。これは、図１に示したキメラ酵素Ｖ‐ＩＩＩ遺伝子、すなわち、実験３で得たプラスミドｐＫＢＣ５上に存在するキメラ酵素遺伝子（図1におけるキメラ酵素Ｖ遺伝子）のＮ末端側コード領域とプラスミドｐＫＢＣ３上に存在するキメラ酵素遺伝子（図1におけるキメラ酵素ＩＩＩ遺伝子）のＣ末端側コード領域がＢｓｐ１４０７Ｉ制限部位で結合したものに相当する。
【００２４】
＜実験７：基質特異性改変キメラ酵素の調製＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫＣＣを接種し、２７℃で約２４時間回転振とう培養したものを種培養液とした。次に、５ｇ／ｌデキストリン、２０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌポリペプトン及び１ｇ／ｌリン酸１水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ７．０に調整し、１０ｌ容ジャーファメンターに７ｌ入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し、冷却した後、アンピシリンナトリウム塩７００ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製し、種培養液を７０ｍｌ接種し、２７℃で約２４時間通気攪拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して湿重量約２０１ｇの菌体を回収し、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６７０ｍｌに懸濁し、リゾチーム２７０ｍｇを加えて３７℃で１時間静置した後、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した。それを６０℃で１時間熱処理し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して不溶物を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４８時間透析し、再度、遠心分離して不溶物を除去して、酵素液約７５０ｍｌを得た。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性及びオリゴ糖合成活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算するとそれぞれ約０．００７単位、約０．３２単位の当該酵素活性が産生されていた。
【００２５】
この方法で得た酵素液を、さらに特許文献２に記載の方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０ゲル、ウルトロゲル  ＡｃＡ−４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、得られた精製酵素を分析したところ、本発明の基質特異性改変キメラ酵素の比活性（オリゴ糖合成活性）は蛋白質ｍｇ当たり２．７０単位であった。
【００２６】
第一の対照として、実験２の方法で得た野生型コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫ１４株を、上述の場合と同一条件で、培養し、培養菌体（約２２０ｇ）から菌体破砕物の上清を採取し、透析して酵素液を調製し、オリゴ糖合成活性を測定したところ、酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約７．８単位であった。第二の対照として、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７を特許文献２に記載の方法に準じて、温度６０℃、約４０時間嫌気培養し、培養液約４０ｌを遠心分離して採取した湿重量９２ｇの培養菌体を上述と同一の条件で処理して、酵素液を調製した。酵素液のオリゴ糖合成活性を測定したところ、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約０．０６単位であった。本発明の基質特異性改変キメラ酵素産生組換え体ＫＢＫＣＣ株の酵素活性産生能は、第一の対照のＫＢＫ１４株のそれと比較して低い値であるものの、遺伝子供与体のサーモアナエロビウム・ブロッキイ  ＡＴＣＣ  ３５０４７株のものと比較して有意に高い産生能であることが分かった。
【００２７】
なお、コージビオースホスホリラーゼ活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、３５℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃で３０分間放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。
【００２８】
オリゴ糖合成活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％β−Ｇ１Ｐ及び１．０ｗ／ｖ％Ｄ−グルコースを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、３５℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液に氷冷下で脱イオン水２．８ｍｌを添加、攪拌する。続いて氷冷下で５Ｎ硫酸０．５ｍｌ、２．５％ｗ／ｖモリブデン酸アンモニウム溶液０．５ｍｌ、Ｆｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗ試薬０．２ｍｌを順に添加、攪拌し、２５℃で２０分間放置した後、７４０ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌの無機リン酸を生成する酵素量とする。Ｆｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗ試薬は、１−アミノ−ナフトール−４−スルホン酸０．５ｇを１５ｗ／ｖ％亜硫酸ナトリウム１９５ｍｌに溶解した後、２０ｗ／ｖ％硫酸ナトリウム５ｍｌを添加、攪拌して調製する。
【００２９】
＜実験８：基質特異性改変キメラ酵素の性質＞
実験７の方法で得た本発明の基質特異性改変キメラ酵素と、第一の対照のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼとを用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。即ち、温度の影響を調べる際には、活性測定方法における反応温度３５℃に代えて約２０℃乃至８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４．５乃至７のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定方法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。至適温度は、ｐＨ５．５、３０分間反応の条件で、本発明の基質特異性改変キメラ酵素の場合、３５℃付近で、対照の酵素の場合、６５℃付近であった。至適ｐＨは、本発明の基質特異性改変キメラ酵素と対照の酵素とも、５．５付近であった。酵素の温度安定性は、酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約３０乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０．５のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。本発明の基質特異性改変キメラ酵素の温度安定性は５０℃付近までで、対照の酵素は６５℃付近までであった。本発明の基質特異性改変キメラ酵素のｐＨ安定性は、約４．５乃至９．５で、対照の酵素は約５．５乃至１０．０であった。
【００３０】
本発明の基質特異性改変キメラ酵素について、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ソホロース、ラミナリビオースに対する作用を調べた。濃度２％の糖質、５０ｍM無機リン酸及び５０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．５）を含む溶液５０μｌに、実験７で得られた基質特異性改変キメラ酵素を糖質１ｇあたりオリゴ糖合成活性で１９０単位作用させ、３５℃で９６時間反応させ、１００℃で１０分間熱処理して酵素を失活させ、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯ  ＡＣＩＬＹＺＥＲ  Ｇ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、反応液の糖組成を分析した。ＨＰＬＣカラムはＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０４ＳＳカラム（三菱化学株式会社製造）を２本連結したものを用い、カラム温度８０℃で、溶出液がミリＱ水で流速０．４ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。コージビオースを基質とした場合、ＨＰＬＣチャート上には基質以外に多数のピークが検出された。ニゲロース、ソホロース、ラミナリビオースを基質とした場合、単糖及び三糖以上の画分にピークが認められた。トレハロースを基質とした場合、基質以外のピークは検出されなかった。対照として、アミノ酸置換の無いトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼを用いて同様の操作を行った。前者はトレハロースを基質とした場合のみ、後者はコージビオースを基質とした場合のみに、それぞれ基質以外のピークがＨＰＬＣチャート上に認められた。
【００３１】
無機リン酸を反応系から除いて、上記と同様の操作を行った。本発明の基質特異性改変キメラ酵素は、ソホロース及びラミナリビオースを基質とした場合、無機リン酸存在下と同様に単糖及び三糖以上の画分のピークがＨＰＬＣチャート上に認められた。ラミナリビオースを基質とした場合、三糖、四糖、五糖を生成し、それぞれのピーク面積比は２１．０％、４．８％、０．８％であった（図２）。ソホロースを基質とした場合は三糖及び四糖を生成し、それぞれのピーク面積比は７．４％、０．４％であった（図３）。その他の糖質については、基質以外のピークは見られなかった。アミノ酸置換の無いトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼについても同様の操作を行ったが、いずれの糖質についても基質以外のピークを観察しなかった。以上の結果から、本発明の基質特異性改変キメラ酵素は、無機リン酸非存在下においても、β−グルコシド結合を持つソホロース、ラミナリビオースに作用し、転移糖を生成することが明らかとなった。
【００３２】
以上の実験の結果は、本来、トレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼを産生する微生物から該酵素遺伝子をクローン化し、両者を任意の位置で人為的に組換えることによって、それがコードするアミノ酸残基を置換し、適当なベクターに組換え、適当な宿主に形質転換して組換え微生物を得、その組換え微生物を培養し、酵素を生産させ採取することによって、本発明の基質特異性改変キメラ酵素を製造できることを示している。本発明の基質特異性改変キメラ酵素は、従来のアミノ酸置換の無いトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼが作用しない、β−グルコシド結合を持つオリゴ糖に作用して転移糖を生成する能力を有し、新たなオリゴ糖の生産に有利に利用できることを示している。また、該酵素は、無機リン酸の非存在下においても上述の転移糖生成作用を有するため、糖化反応後排水中のリン酸を低減することができ、環境に対する負荷を軽くすることができる点でも有利である。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
叙上のように本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用し、トレハロースホスホリラーゼ遺伝子及びコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡを任意の位置で組換えることにより、コードするアミノ酸残基を置換し、これまで得ることができなかった基質特異性改変キメラ酵素を作製するものである。本発明の基質特異性改変キメラ酵素は、従来のアミノ酸置換の無いトレハロースホスホリラーゼ及びコージビオースホスホリラーゼが作用しない、β−グルコシド結合を持つオリゴ糖に作用して転移糖を生成する能力を有し、更に組換え微生物からの酵素生産も高いことが判明した。したがって、本発明の酵素を利用すれば、β−グルコシド結合を持つ新たなオリゴ糖を大量且つ安価に製造できることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義ある発明といえる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のキメラ酵素を含む酵素遺伝子ライブラリーの作成スキームを示す図である。
【図２】本発明のキメラ酵素をラミナリビオースに作用させた場合の反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明のキメラ酵素をソホロースに作用させた場合の反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００３５】
ＤＰ：重合度（ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３は単糖、二糖、三糖をそれぞれ意味する。）
Ｌａｍ：ラミナリビオース
Ｓｏｐ：ソホロース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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