(57)【要約】【課題】  メラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送を簡便かつ正確に検出する手段の提供。【解決手段】  蛍光標識されたケラチノサイト及び非標識メラノサイトを共培養し、当該培養細胞と蛍光標識メラノソーム特異的抗体との結合体を得、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識されたケラチノサイト及び非標識メラノサイトを共培養し、当該培養細胞と蛍光標識メラノソーム特異的抗体との結合体を得、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法。
【請求項２】
ケラチノサイトの蛍光標識が、フルオレセイン骨格を有する蛍光標識である請求項１記載の検出法。
【請求項３】
蛍光標識されたケラチノサイト及び非標識メラノサイトを共培養し、当該培養細胞と蛍光標識メラノソーム特異的抗体との結合体を得、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出するメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出系を用い、被験物質によるメラノソーム転送量の変化を検出することを特徴とするメラノソーム転送阻害剤のスクリーニング法。
【請求項４】
ケラチノサイトの蛍光標識が、フルオレセイン骨格を有する蛍光標識である請求項３記載のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノサイトからケラチノサイトへのメラニン顆粒であるメラノソームの転送を簡便かつ正確に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線を受けた皮膚が黒化するのは表皮中のメラノサイト中のメラノソームという細胞内小器官（オルガネラ）でチロシナーゼの作用等によりメラニンが生成することにはじまり、メラノソームが表皮の大部分を占めるケラチノサイトに転送され、当該ケラチノサイトに貯蔵されることによる。従来から美白剤としては、メラニンの生成を抑制するためのチロシナーゼ阻害剤が最も多い。
【０００３】
一方、メラノサイトで生成されたメラノソームのケラチノサイトへの転送が制御できれば、有効な美白剤になり得ると考えられる。このような、メラノソーム転送阻害剤を探索するには、メラノソーム転送を測定する手段が必要であり、当該手段としては、ＣＦＤＡ等の蛍光物質存在下でメラノサイトを一定時間培養することによってメラノソームを含む全てのオルガネラを蛍光標識した後、ケラチノサイトとの共培養を行い、ケラチノサイト特異抗体とＣＦＤＡの両方の標識が得られた細胞の割合を求める方法（非特許文献１）、メラノサイト及びケラチノサイトを共培養した細胞又は組織切片を電子顕微鏡を用いて観察し、ケラチノサイト内のメラノソームを数える方法（非特許文献１）、ＨａＣａＴ細胞に単離したメラノソームを添加し、取り込まれたメラノソームをフォンタナ・マッソン染色後、画像解析により定量する方法（非特許文献２）が知られている。
【０００４】
しかしながら、非特許文献１の方法では、ＣＦＤＡによる標識はメラノソームに特異的なものではなく、正確な測定は不可能であったまた、非特許文献１の方法では、電子顕微鏡下にメラノソームを数える方法であり、非常に煩雑であり、多数のサンプルの評価は不可能である。また非特許文献２の方法では、単離したメラノソームを直接添加するため、エンドサイト−シス等による転送が検出できず、正確な評価はできない。
【非特許文献１】Pigment Cell Res. 14：p185-194(2001)
【非特許文献２】The Journal of Investigative Dermatology, Vol. 115, No.2, August 2000, p162-167
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、正確かつ簡便にメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソームの転送を検出する方法及びこの方法を用いたメラノソーム転送阻害剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々検討した結果、蛍光標識したケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養し、これに蛍光標識メラノソーム特異抗体を結合させた後フローサイトメーターを用いて解析すれば、蛍光活性化されたケラチノサイト中のメラノソームのみを選択的に検出できること、さらにこの検出系を用いればメラノソーム転送阻害剤のスクリーニングが可能になることを見出した。
すなわち、本発明は、蛍光標識されたケラチノサイト及び非標識メラノサイトを共培養し、当該培養細胞と蛍光標識メラノソーム特異的抗体との結合体を得、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することを特徴とするメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送の検出法を提供するものである。
また本発明は、上記メラノソーム転送の検出系を用い、被験物質によるメラノソーム転送量の変化を検出することを特徴とするメラノソーム転送阻害剤のスクリーニング法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の検出法によれば、簡便な操作により、正確にメラノサイトからケラチノサイトへのメラノソーム転送量を測定できる。また、大量かつ正確にメラノソーム転送阻害剤のスクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のメラノソーム転送検出法においては、まず、蛍光標識されたケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養する。ケラチノサイトとしては、ヒトケラチノサイト、さらにヒト正常ケラチノサイト、特にメラノソームを有さないヒト正常ケラチノサイトが好ましい。このようなケラチノサイトとしては、例えばクラボウ社、ＣＡＭＢＲＥＸ社から市販されているものを用いることができる。メラノサイトとしては、ヒトメラノサイトが好ましく、さらにヒト正常メラノサイトがより好ましい。このようなヒトメラノサイトとしては、例えばクラボウ社、ＣＡＭＢＲＥＸ社から市販されているものを用いることができる。
【０００９】
ケラチノサイトの蛍光標識としては、フルオレセイン骨格を有する蛍光標識、例えば３′，６′−ジ（Ｏ−アセチル）−２′，７′−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミノメチル］フルオレセインテトラアセトキシメチルエステル（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学社））、カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）等が挙げられる。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭが特に好ましい。
蛍光標識の方法としては、常法に従って行うことができる。例えば回収した細胞を蛍光標識用試薬中で数十分インキュベートすることにより蛍光標識できる。
【００１０】
蛍光標識ケラチノサイトと非標識メラノサイトの共培養は、常法に従って行うことができる。例えば、それぞれ継代培養した蛍光標識ケラチノサイトとメラノサイトを、両細胞の培養に適した培地中で培養すればよい。ここで、ケラチノサイトの単独培養に適する培地としては、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ社）にＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ社）を加えたもの等が挙げられる。一方、メラノサイトの単独培養に適する培地としては、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）にＨＭＧＳ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を加えたもの等が挙げられる。蛍光標識ケラチノサイトとメラノサイトの共培養に適する培地としては、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ社）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔなし、とＭｅｄｉｕｍ１５４Ｓ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に特注添加剤ＨＭＧＳ（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）からホルボールエステル（ＰＭＡ）を除く全ての添加剤を加えた培値、を２：１の比率で混合したもの等が挙げられる。共培養の条件としては、ケラチノサイトをケラチノサイトの単独培養に適する培地条件下で播種した２４時間後に、ケラチノサイトの半量のメラノサイトを重ねて播種し、メラノサイトとケラチノサイトの共培養に適する培地に置き換えて４〜７日間培養するのが好ましい。
【００１１】
次に、共培養された細胞と、蛍光標識メラノソーム特異抗体との結合体を得る。ここで、当該結合体は、培養細胞とメラノソーム特異抗体とを反応させた後、蛍光標識をする方法、又は培養細胞と予め蛍光標識をされたメラノソーム特異抗体を反応させる方法により得ることができる。
【００１２】
メラノソーム特異抗体としては、メラノソームに特異的に反応する抗体であれば特に制限されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。このうち、ヒトメラノソームに特異的な抗体が好ましい。ただし、ヒトメラノソームに特異的な抗体は、マウスやウサギ等のヒト以外の動物由来であってもよい。このようなメラノソーム特異抗体としては、例えばマウス抗ヒトメラノソーム抗体  ＨＭＢ４５、抗チロシナーゼ抗体、抗ＴＲＰ２抗体、抗ＴＲＰ１抗体等が挙げられる。中でも、マウス抗ヒトメラノソーム抗体が好ましく、マウス抗ヒトメラノソーム抗体ＨＭＢ４５が特に好ましい。
【００１３】
メラノソーム特異抗体の蛍光標識は、ケラチノサイトの蛍光標識とは異なる色を生じる蛍光標識が好ましい。蛍光標識の例としては、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）等が挙げられ、中でもローダミンが特に好ましい。
【００１４】
次いでフローサイトメーターによってケラチノサイト中のメラノソームを検出する。蛍光標識で検出されたケラチノサイト中のメラノソームが、異なる色の蛍光として定量される。
【００１５】
このメラノソーム転送検出系を用いれば、メラノソーム転送阻害剤のスクリーニングが可能である。例えばメラノサイトとケラチノサイトの共培養時に被験物質を添加してメラノソーム転送量を測定し、被験物質非添加の場合と対比すれば、当該被験物質がメラノソーム転送を阻害するか否かが判定できる。被験物質の添加は、メラノサイト又はケラチノサイトの単独培養の時点でもよい。
【実施例】
【００１６】
実施例１
（１）市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を４０００cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態でダルベッコのリン酸緩衝液(D-PBS, Invitrogen社)で２回洗浄の後、０．２５％トリプシン−EDTA(Invitrogen社)処理によって回収し、７０００cells/cm2の密度で継代する。
（２）継代した細胞をセミコンフルエントの状態でトリプシン処理によって回収し、２００００cells/cm2の密度で播種・培養した。ケラチノサイト単独の培養にはK-SFM(Invitrogen社)にサプリメント(Invitrogen社)を加えた培地を用いた。ケラチノサイトを培養した後、Ｃａｌｃｅｉｎ-AM（同仁化学社）を用いてプロトコールに従って蛍光標識を行なった。その後２００００cells/cm2の密度で播種・培養した。ケラチノサイト単独の培養にはK-SFM(Invitrogen社)にサプリメント(Invitrogen社)を加えた培地を用いた。
（３）蛍光標識ケラチノサイトを播種して２４時間後、３継代培養したヒト正常メラノサイト(NHEM(F)、クラボウ社)を１００００cells/cm2の密度で添加し、Medium154(クラボウ社)にPMAを除くHMGS(クラボウ社)を添加したメラノサイト至適培地と、サプリメントを除いたK-SFMを１：２の比率で混合した培地を用いて４日間培養した。転送阻害のポジティブコントロールとしては、０．１％大豆−トリプシンインヒビター(STI)、１mMナイアシンアミドを用い、それぞれ２４時間毎に１回、１２時間毎に１回添加した。
（４）４日間培養した後、PBSで２回洗浄を行ない、５mM EDTA/PBSを添加して３７℃、３０分処理することによって細胞を回収した後、２％パラホルムアルデヒド（PFA）／PBSを加え、室温で２０分間固定した。
（５）PBSで２回洗浄した後、細胞数を５０００００cells/tubeに調整し、０．５％サポニン・０．５％BSA/PBSで室温、１０分間処理した後、マウス抗ヒトメラノソーム抗体HMB45(DAKO社)を加え、室温で１時間振盪した。ネガティブコントロールとしてはマウスユニバーサルネガティブコントロール(DAKO社)を用いた。
（６）０．５％サポニン・０．５％BSA/PBSで２回洗浄した後、ヒツジ抗マウスＩｇＧ TRITC標識(CHEMICO社)を添加し、室温で１時間振盪した。
（７）０．５％サポニン・０．５％BSA/PBSで２回洗浄した後、０．５％BSA/PBSに置換し、セルストレーナー付きFACS解析用チューブ（FALCON社）中に滴下して、FACS(BECTON DICKINSON社)にて解析した（図１、２）。
（８）Ｃａｌｃｅｉｎ-AMで標識されたケラチノサイト中の、抗メラノソーム抗体であるHMB45を認識する２次抗体のTRITC蛍光強度を、メラニン転送量とした。その結果、ケラチノサイト中のメラノソームが正確に検出できた。
PBSを添加したサンプルをコントロールとし、そのメラニン転送量を１００としたとき、メラノソーム転送阻害剤である大豆トリプシンインヒビター（STI）、ナイアシンアミドを添加すると、それぞれ約４０％、２０％の転送阻害効果が認められた。（図３)
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】フローサイトメーターによるメラノサイト及びケラチノサイトの分離結果を示す図である。
【図２】ケラチノサイト中の抗メラノソーム抗体の蛍光強度と細胞数を示したヒストグラムである。
【図３】大豆トリプシンインヒビター（STI）、ナイアシンアミドのメラノソーム転送阻害作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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