(57)【要約】      （修正有）【課題】ループスアンチコアグラントの検出感度を高め、凝固因子欠損症やヘパリン等の血液凝固阻害剤を含有する検体とを区別して、ループスアンチコアグラントを特異的に高精度で検出できる試薬キットを提供することにある。【解決手段】試薬に含まれるリン脂質に対するホスファチジルセリンの含有量が異なった試薬においてホスファチジルエタノールアミンの含有量を調整することによりループスアンチコアグラントの検出感度を高めることを見出した。【選択図】 図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬とホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬を備え、
第１凝固時間測定試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が４０〜２８０μＭであり、第２凝固時間測定試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μＭであることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項２】
第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬とのホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンの濃度比が３〜１５である請求項１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項３】
前記第１凝固時間測定試薬および第２凝固時間測定試薬がホスファチジルコリンを含有する請求項１または２に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項４】
前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が活性化剤及びカルシウムイオンを含有する請求項１〜３にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項５】
前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びコロイドシリカからなる群より選択される請求項４に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項６】
前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が蛇毒及びカルシウムイオンを含有する請求項１〜３にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項７】
前記第１凝固時間測定試薬及び前記第２凝固時間測定試薬が組織因子及びカルシウムイオンを含有する請求項１〜３にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項８】
第１部分試薬及び第２部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第３部分試薬及び第４部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とを備え、
第１部分試薬がホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有し、第３部分試薬がホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有し、
第１部分試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が４０〜２８０μＭであり、第３部分試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μＭであることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項９】
第１部分試薬と第３部分試薬とのホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリンの濃度比が３〜１５である請求項８に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１０】
前記第1部分試薬および第３部分試薬がホスファチジルコリンを含有する請求項８または９に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１１】
前記第１部分試薬及び前記第３部分試薬が活性化剤を含有する請求項８〜１０にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１２】
前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びコロイドシリカからなる群より選択される請求項１１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１３】
前記第１部分試薬及び前記第３部分試薬が蛇毒を含有する請求項８〜１０にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１４】
前記第１部分試薬及び前記第３部分試薬が組織因子を含有する請求項８〜１０にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１５】
前記第２部分試薬及び前記第４部分試薬がカルシウムイオンを含有するからなる請求項８〜１４にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【請求項１６】
前記リン脂質が合成リン脂質または純度９９%以上に精製された天然由来のリン脂質である請求項１〜１５にいずれか１に記載のループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床化学や医薬研究などの分野において抗リン脂質抗体症候群の診断に用いられる血液凝固試薬キットに関し、さらに詳しくはin  vitroでの血液検査でループスアンチコアグラント陽性疾患を特異的に検出できる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ループスアンチコアグラント（以下、ＬＡと略称する）はＳＬＥ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者について初めて報告された抗凝血素である。ＳＬＥ患者においてＬＡが検出される頻度は５％乃至１０％である一方、他の自己免疫性疾患、腫瘍性疾患においても検出されることがある。ＬＡは血栓症、流早産、血小板減少などの抗リン脂質抗体症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＰＳ）において検出される頻度が高く、リン脂質依存性の凝固反応で凝固するまでの時間が延長されることから、リン脂質に対する自己抗体であると考えられている。
【０００３】
また、ＬＡは不均一な抗体であり、陰性荷電リン脂質とβ２−グリコプロテインＩ（β２−ＧＰＩ）またはプロトロンビンとの複合体に対する抗体であることが、近年明らかになった。ＬＡの抗凝固作用は、ＬＡがこの複合体と結合することによりプロトロンビンがトロンビンに変化することを阻害するために起こると考えられる。
【０００４】
このような特徴を有するＬＡの検出用試薬としては、従来より一定量のリン脂質を含有する凝固試薬、例えば、ウサギ脳由来セファリン、ウシ脳由来セファリン、大豆レシチン、蛇毒などが用いられている。検体血液中にＬＡが存在すると、ＬＡが試薬中のリン脂質を中和してしまうため、検体を凝固するカスケード反応の開始に必要なリン脂質が不足することになることから、ＬＡにより中和されたリン脂質の量に比例して、各検査の凝固時間が延長し、これをもってＬＡ陽性と診断することができる。
【０００５】
また、凝固試薬中のリン脂質が少ないほど、ＬＡの検出感度が高まるので、試薬を希釈したり、正確性を期するために異なった方法を２法以上組合わせることが行われている。例えば、リン脂質の濃度が異なる２つの試薬を組合わせた活性化部分トロンボプラスチン時間測定（以下、ＡＰＴＴと略称する）試薬を使用し、各試薬の凝固時間から、ロスナー  インデックス（Ｒｏｓｎｅｒ  Ｉｎｄｅｘ）やループス比（Ｌｕｐｕｓ  Ｒａｔｉｏ）（ＬＲ値）を算出し、ＬＡ陽性率を判定する手法が知られている。
【０００６】
市販の凝固測定試薬としては、グラディポアＬＡ（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ社；オーストラリア）というラッセル蛇毒法による検査試薬がある。これは、蛇毒含有の第１試薬と蛇毒及び過剰のダイズリン脂質含有の第２試薬を組合わせた試薬キットで、第１試薬を添加したときの凝固時間／第２試薬を添加したときの凝固時間で求められる比が１．３以上の場合に、ＬＡ陽性と判定している。
【０００７】
さらに、既存の研究報告によれば、ウサギ脳由来リン脂質などによるリン脂質濃度の差を利用して、算術的にＬＡの検出が行なわれている（非特許文献１）
【０００８】
またさらに、正常血漿と患者血漿を１：１の割合で混合した試料を用いて、リン脂質濃度が異なる２種類の試薬を組合わせたＡＰＴＴ試薬または希釈ラッセル蛇毒測定（ｄＲＶＶＴ）試薬を用いたときの凝固時間を測定し、患者血漿の凝固時間が正常血漿により補正される度合いを指標にしてＬＡを検出する方法も利用されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ｖ．Ｃｈａｎｔａｒａｎｇｋｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９２，６７：３５５−３６５；Ｅ．Ｒｏｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９８７，５７：１４４−１４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来行なわれていたリン脂質依存性凝固測定においては、いずれも天然由来リン脂質が用いられ、且つそのリン脂質組成が無調整であった。天然由来リン脂質は不均一なものであるためこれが凝固時間に影響を及ぼし、ＬＡの検出感度がかなり異なるという問題があった。また、当該凝固試験は、ＬＡ以外の検体を正常血漿と混和することにより、欠損している凝固因子を補充して、凝固時間を正常化させることは可能であるが、ワーファリンやヘパリンなどの血液凝固阻害剤を含有した検体と、ＬＡ陽性患者血漿とを判別することが困難であり、これら凝固阻害剤を含有した検体についてもＬＡ陽性と判定され得るという問題がある。
【００１１】
従って、ＬＡ疾患を正確に判別するためには、ＬＡ以外の凝固活性阻止因子や凝固因子欠損症による凝固時間の延長と、ＬＡによる凝固時間の延長とを区別する必要がある。
【００１２】
本発明の課題は、ヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とを区別するとともに、ＬＡの検出感度を高め、ＬＡ弱陽性検体であても特異的に検出できる試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者は、試薬に含まれるリン脂質に対するホスファチジルセリンの含有量が異なった試薬においてホスファチジルエタノールアミンの含有量を調整することにより、ヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とを区別するとともに、ＬＡの検出感度を高め、ＬＡ弱陽性検体であても特異的に検出できるＬＡ検出用試薬キットを提供することにある。
【００１４】
本発明の第一の観点は、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬とホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬を備え、
第１凝固時間測定試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が４０〜２８０μＭであり、第２凝固時間測定試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μＭであることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キットに関する。
【００１５】
本発明の第二の観点は、第１部分試薬及び第２部分試薬からなる第１凝固時間測定試薬と、第３部分試薬及び第４部分試薬からなる第２凝固時間測定試薬とを備え、
第１部分試薬がホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有し、第３部分試薬がホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有し、
第１部分試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が４０〜２８０μＭであり、第３部分試薬のホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μＭであることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の試薬キットでは、ヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とを区別するとともに、ＬＡの検出感度を高め、ＬＡ弱陽性検体であても特異的に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ＬＡ検出用試薬キットは、ホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第１凝固時間測定試薬とホスファチジルセリン及びホスファチジルエタノールアミンを含むリン脂質を含有する第２凝固時間測定試薬を備え、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルエタノールアミンの濃度が４０〜２８０μＭであり、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルエタノールアミンの濃度が１〜３０μＭである。
【００１８】
さらに、第１凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリン含有量の全リン脂質含有量に対する割合が、第２凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリン含有量の全リン脂質含有量に対する割合と異なっているのが好ましい。
【００１９】
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬に含有されるホスファチジルエタノールアミン（以下、ＰＥと略記することがある）およびホスファチジルセリン（以下、ＰＳと略記することがある）は天然由来であってもよいが、天然由来リン脂質は不均一なものであるためこれが凝固時間に影響を及ぼし、ＬＡの検出感度がかなり異なるという問題があり合成品であることが好ましい。また、天然由来のものを用いる場合には、上記の点から純度９９％以上に精製されたものを用いることが好ましい。
【００２０】
上記第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬に含有されるＰＥおよびＰＳ以外のリン脂質としては、血液凝固を促進するリン脂質として、ホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略記することがある）などが挙げられる。ＰＣも同様に天然由来であってもよいが、合成品であることが好ましい。天然由来のものを用いる場合にも同様に純度９９％以上に精製されたものを用いることが好ましい。
ＰＥ、ＰＳ、ＰＣなどのリン脂質の脂肪酸側鎖は、さまざまなものが用いられるが、好ましくは、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などがあげられ、更に好ましくはオレイン酸を挙げることができる。
【００２１】
第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液凝固を起こすために必要な他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、活性化剤、蛇毒、カルシウム、組織因子などが挙げられる。活性化剤としては、エラグ酸、カオリン、セライト及びコロイドシリカからなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒からなる群より選択される１種以上を用いることが好ましい。組織因子としては、ウサギ脳やヒト胎盤由来のもの、組換え体を用いることが好ましい。
【００２２】
これらの他の成分は、凝固時間測定試薬の種類に応じて適宜選択される。例えば、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び活性化剤を含む場合には活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び蛇毒を含む場合には、ラッセル蛇毒測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬がカルシウム及び組織因子を含む場合には、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。
【００２３】
尚、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬には、さらに必要に応じて、ヘペスおよびトリスなどの緩衝剤を含んでもよい。緩衝液の濃度は、一般的に臨床化学の分野で用いられている濃度であればよく、簡単な繰り返し実験により決定することができる。
【００２４】
第１凝固時間測定試薬および第２凝固時間測定試薬のリン脂質の含有量は、検体と第１凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を等量混合して（検体５０μＬと第1凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を５０μＬ混合する場合）、凝固時間測定する測定方法においては以下の通りである。第１凝固時間測定試薬中のＰＥ濃度は４０〜２８０μＭ、好ましくは６５〜２６９μＭ、より好ましくは１００〜２００μＭであり、ＰＳ濃度は３０〜３７０μＭ、好ましくは３７〜２５０μＭ、より好ましくは６０〜２５０μＭであり、ＰＣ濃度は１０〜１４０μＭ、より好ましくは２５〜６４μＭである。
また、第２凝固時間測定試薬中のＰＥ濃度は１〜３０μＭ、好ましくは１〜２７μＭ、より好ましくは６〜２１μＭであり、ＰＳ濃度は１〜２５μＭ、より好ましくは６〜１９μＭであり、ＰＣ濃度は１０〜１４０μＭ、より好ましくは２５〜６４μＭである。ＰＥ濃度が低いと凝固時間が延長するため好ましくない。
【００２５】
上記リン脂質の濃度は検体５０μＬと第1凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬を５０μＬを混合する場合の濃度を記載したが、検体と凝固時間測定試薬との混合割合が異なる場合、検体と第1凝固時間測定試薬または第２凝固時間測定試薬とを混合した後のリン脂質の終濃度が上記の場合と同様の範囲となるようにすればよい。
【００２６】
また、第１凝固時間測定試薬に含まれるＰＥ濃度またはＰＳ濃度が第２凝固時間測定試薬に含まれるＰＥまたはＰＳ濃度の３〜１５倍であることが好ましい。倍率が低いとＬＡ陽性患者とヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿と区別が困難となるため好ましくない。また、倍率が高いと正常血漿の凝固時間の差が第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬で大きくなるため好ましくない。
【００２７】
また、第１凝固時間測定試薬及び第２凝固時間測定試薬は、それぞれリン脂質及び上記他の成分の混合物であってもよい。
【００２８】
また、第１凝固時間測定試薬が別々の容器に収容された第１部分試薬と第２部分試薬から構成され、第２凝固時間測定試薬が別々の容器に収容された第３部分試薬と第４部分試薬から構成されてもよい。第１部分試薬中のＰＥ濃度は４０〜２８０μＭ、好ましくは６５〜２６９μＭ、より好ましくは１００〜２００μＭであり、ＰＳ濃度は３０〜３７０μＭ、好ましくは３７〜２５０μＭ、より好ましくは６０〜２５０μＭであり、ＰＣ濃度は１０〜１４０μＭ、より好ましくは２５〜６４μＭである。
また、  第３部分試薬のＰＥ濃度は１〜３０μＭ、好ましくは１〜２７μＭ、より好ましくは６〜２１μＭであり、ＰＳ濃度は１〜２５μＭ、より好ましくは６〜１９μＭであり、ＰＣ濃度は１０〜１４０μＭ、より好ましくは２５〜６４μＭである。
【００２９】
活性化部分トロンボプラスチン時間測定の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬からなり、第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬と第４部分試薬からなるとともに、第１部分試薬及び第３部分試薬ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及び活性化剤を含有し、第２部分試薬及び第４部分試薬にカルシウムが含有するものが挙げられる。
【００３０】
ラッセル蛇毒測定の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬からなり、第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬と第４部分試薬からなるとともに、第１部分試薬及び第３部分試薬ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及び蛇毒を含有し、第２部分試薬及び第４部分試薬にカルシウムが含有するものが挙げられる。
【００３１】
プロトロンビン時間測定の原理に基づく凝固時間測定試薬では、第１凝固時間測定試薬が第１部分試薬と第２部分試薬からなり、第２凝固時間測定試薬が第３部分試薬と第４部分試薬からなるとともに、第１部分試薬及び第３部分試薬ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及び組織因子を含有し、第２部分試薬及び第４部分試薬にカルシウムが含有するものが挙げられる。
【００３２】
本発明の試薬キットは、以上のような組成を有する第１部分測定試薬および第２部分測定試薬からなる第１凝固時間測定試薬及び、第３部分測定試薬および第４部分測定試薬からなる第２凝固時間測定試薬における凝固時間が異なる２種類の試薬の組合わせである。
【００３３】
次に、上記構成を有する本発明の試薬キットを用いて、ＬＡを検出する方法について説明する。
まず検体試料を２つに分け、一方には第１凝固時間測定試薬を添加し、もう一方の検体試料には、第２凝固時間測定試薬を添加する。凝固時間測定試薬がそれぞれ第１部分試薬と第２部分試薬とに分かれている場合には、第１部分試薬と第２部分試薬とを混合してから、検体に添加してもよいし、まず第１部分試薬（又は第２部分試薬）を検体に添加した後、第２部分試薬（又は第１部分試薬）を添加してもよい。第１部分試薬又は第２部分試薬を別々に添加する場合、第１部分試薬（又は第２部分試薬）添加後、第２部分試薬（又は第１部分試薬）添加前に、必要に応じて検体と部分試薬の混合物を加熱してもよい。
検体に各試薬を添加した後、試料の凝固時間を測定する。凝固時間の測定は、公知の方法で行えばよく、例えば公知の自動測定装置を用いて測定すればよい。
【００３４】
ここで、検体に用いる試料としては、血液をそのまま用いるよりも血漿を用いることが好ましく、より好ましくは血小板除去血漿である。さらに好ましくは、患者の血漿に、正常血漿または血小板除去正常血漿を混合したものを試料とする。正常血漿を混合しておくことにより、凝固因子欠損に基づく凝固時間の延長を防止することができ、リン脂質依存性血液凝固検査の感度が高まるからである。患者血漿と正常血漿の混合比は、一般的に４：１乃至１：４であり、好ましくは１：１である。
【００３５】
本発明の試薬キットを用いた凝固検査では、ＬＡ陽性患者、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者などの抗凝血疾患由来の試料の凝固時間は、正常血漿の凝固時間よりも長くなる。さらに、ＬＡ陽性患者検体については、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬による凝固時間の差異も認められる。すなわち、ＬＡ陽性患者由来の試料では、第１凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間よりも、第２凝固時間測定試薬を用いたときの凝固時間の方が長くなる。一方、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、ヘパリン投与患者由来の試料では、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との間で、凝固時間の顕著な差異は認められなかった。従って、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬との凝固時間の差異に基づいて、ＬＡを特異的に検出することができる。
【００３６】
ＬＡの検出は、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬により測定した凝固時間の差異によって判定することができるが、より高精度に判定するためには、正常血漿の凝固時間に対する患者由来の試料の凝固時間の比、例えばＲｏｓｎｅｒ  Ｉｎｄｅｘ（Ｅ．Ｒｏｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍａｓｔ．１９８７，５７：１４４−１４７）またはＬｕｐｕｓ  Ｒａｔｉｏ（ＬＲ値）（Ｒ．Ｓｃｈｊｅｔｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９３，６９：２３９−２５０）により、判定を行うことが好ましい。
【００３７】
正常血漿の場合、第１凝固時間測定試薬と第２凝固時間測定試薬を用いて算出するＬＲ値は１程度である。また、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、またはヘパリン投与患者由来の場合であっても、正常血漿と比べて凝固時間は延長されるものの、第１凝固時間試薬と第２凝固時間試薬の凝固時間の差はほとんど認められないため、ＬＲ値は１程度となる。これに対して、ＬＡ陽性の場合には、第１凝固時間測定試薬、第２凝固時間測定試薬の各濃度、組合わせにもよるが、第２凝固時間測定試薬の方が第１凝固時間測定試薬よりも凝固時間が延びるために、ＬＲ値を比較することによりＬＡ陽性患者由来の検体を自動的に検出することができる。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
ＰＥの濃度の検討
ヘペス、エラグ酸、トリス、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を混合し、第１部分試薬１〜６及び第３部分試薬を調製した。
第１部分試薬１の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＳが１２３μＭ、ＰＣが３８μＭ、ＰＥが１３μＭであった。また、ＰＥ濃度を６７μＭ、１０１μＭ、１３４μＭ、２０２μＭ、２６９μＭに変更する以外は第１部分試薬1と同様にして、第１部分試薬２〜６を調製した。第１部分試薬１〜６のｐＨは７．３５であった。
第３部分試薬の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＳが１２μＭ、ＰＥが１３μＭ、ＰＣが３８μＭであった。ｐＨは７．３５であった。なお、ＰＥ、ＰＳ、ＰＣは脂肪酸側鎖がオレイン酸である合成リン脂質を使用した。
【００３９】
また、塩化カルシウム濃度が２５ｍＭになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第４部分試薬とした。
９種類のＬＡ強陽性患者血漿、９種類のＬＡ弱陽性患者血漿及び５種類のワーファリン投与患者血漿を入手した。各患者血漿は、正常血漿と１：１で混合したものを測定試料とした。
【００４０】
正常血漿、上記で調製した測定試料をそれぞれ５０μＬづつ２セット準備し、一方のセットの各試料に、第１部分試薬１（又は第３部分試薬）５０μＬを添加し、３７℃に３分間加温した後、各試料に第２部分試薬（又は第４部分試薬）を５０μＬづつ添加した。全自動血液凝固分析装置コアグレックス８００（島津製作所株式会社）を用いて、凝固時間を測定した。また、第１部分試薬1に代えて第１部分試薬２〜６を用いる以外は同様にして凝固時間を測定した。
【００４１】
各試料について測定した凝固時間から、下式１で示すＬｕｐｕｓ  Ｒａｔｉｏ（ＬＲ値）を算出した。ＬＲ値の計算は、文献（Ｒ．Ｓｃｈｊｅｔｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９３，６９：２３９−２５０）に基づいて行った。
［式１］
Ｌｕｐｕｓ  Ｒａｔｉｏ（ＬＲ）＝（ｂ／ａ）／（ｄ／ｃ）＝ｂｃ／ａｄ
ここで、式１中のａ、ｂ、ｃ、およびｄは、表１に示す組み合わせで得られた測定値を表す。
【００４２】
【表１】
2005249778.tif 000003
【００４３】
測定結果を図１に示す。図１は９種類のＬＡ強陽性患者血漿、９種類のＬＡ弱陽性患者血漿及び５種類のワーファリン投与患者血漿を測定したときのＬＲ値の平均を棒グラフで表し、各検体を測定したときのＬＲ値の標準偏差（ＳＤ）をバーで示している。また、横軸は第1部分試薬１〜６中のＰＥ濃度を示している。図１に示すように第１部分試薬１〜６を用いるとワーファリン投与患者血漿と、ＬＡ弱陽性患者血漿及びＬＡ強陽性患者血漿とを区別可能であることが明らかになった。
【００４４】
（実施例２）
ＰＳの濃度の検討
ヘペス、エラグ酸、トリス、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）を混合し、第１部分試薬７〜１２及び第３部分試薬を調製した。
第１部分試薬7の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＥが６７μＭ、ＰＣが３８μＭ、ＰＳが３７μＭであった。また、ＰＳ濃度が６２μＭ、９３μＭ、１２３μＭ、１８５μＭ、２４７μＭに変更する以外は第１部分試薬7と同様にして第１部分試薬８〜１２を調製した。第１部分試薬7〜１２のｐＨは７．３５であった。
第３部分試薬の各成分の濃度はヘペスが５０ｍＭ、エラグ酸が０．１ｍＭ、トリスが２５ｍＭ、ＰＳが１２μＭ、ＰＥが１３μＭ、ＰＣが３８μＭであった。ｐＨは７．３５であった。なお、ＰＥ、ＰＳ、ＰＣは脂肪酸側鎖がオレイン酸である合成リン脂質を使用した。
また、塩化カルシウム濃度が２５ｍＭになるように精製水で調製したものを、第２部分試薬、第４部分試薬とした。ここで調製した各試薬を用いること以外は実施例１と同様にして凝固時間を測定した。
【００４５】
測定結果を図２に示す。図２は９種類のＬＡ強陽性患者血漿、９種類のＬＡ弱陽性患者血漿及び５種類のワーファリン投与患者血漿を測定したときのＬＲ値の平均を棒グラフで表し、各検体を測定したときのＬＲ値の標準偏差（ＳＤ）をバーで示している。また、横軸は第1部分試薬７〜１２中のＰＥ濃度を示している。図２に示すように第１部分試薬７〜１２を用いるとワーファリン投与患者血漿と、ＬＡ弱陽性患者血漿及びＬＡ強陽性患者血漿とを区別可能であることが明らかになった。また、第１部分試薬中のＰＳ濃度が１２３μＭまではワーファリン投与患者血漿とＬＡ弱陽性患者血漿及びＬＡ強陽性患者血漿のＬＲ値の差が大きくなったが、それ以上の濃度ではＬＲ値の差がほぼ一定となった。
【００４６】
（実施例３）
各種検体の反応性の検討
ＬＡ強陽性検体(表２に示す検体番号１〜９)、ＬＡ弱陽性検体（表２に示す検体番号１０〜１７）、ワーファリン投与患者検体（表２に示す検体番号１８〜２２）、ＶＩＩＩ因子欠乏患者血漿検体（表２に示す検体番号２３〜２５）、ヘパリン投与患者血漿検体（表２に示す検体番号２６、２７）について、実施例１で用いた試薬(第1部分試薬１〜６、第２部分測定試薬、第３部分測定試薬及び第４部分測定試薬)と市販のＬＡ測定試薬である希釈ラッセル蛇毒試薬（表２に示すｄＲＶＶＴ）を用いて測定した。
【００４７】
操作は実施例１と同様に行い、ＬＲを測定した。また、希釈ラッセル蛇毒試薬を用いた各検体の測定は、用法用量に従い凝固時間を測定し「凝固時間の比率」を算出することにより行った。また、「ＬＲ値」、「凝固時間の比率」が１．２以上のものをＬＡ陽性と判定した。
その結果を表２に示す。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
表２に示すように希釈ラッセル蛇毒試薬を用いた場合はＬＡ弱陽性検体である検体番号１５、１６について陰性と判定され、ワーファリン投与患者検体である検体番号２０、２１及びヘパリン投与患者検体である検体番号２７について陽性と判定された。
また、ＰＥ濃度が１３μＭの第１部分試薬１を用いた場合はＬＡ弱陽性検体である検体番号１５について陰性と判定された。
しかし、第１部分測定試薬２〜６を用いることにより、ＬＡ強陽性患者検体、ＬＡ弱陽性検体とも陽性と判定され、ワーファリン投与患者検体、ＶＩＩＩ因子欠乏患者血漿検体、ヘパリン投与患者血漿検体については陰性と判定され、ＬＡ陽性患者検体をパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とを区別するとともに、ＬＡの検出感度を高め、ＬＡ弱陽性検体であても特異的に検出できるＬＡ検出用試薬キットを提供できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上説明したように試薬に含まれるリン脂質に対するホスファチジルセリンの含有量が異なった試薬においてホスファチジルエタノールアミンの含有量を調整することによりヘパリン投与患者血漿やワーファリン投与患者血漿とを区別するとともに、ＬＡの検出感度を高め、ＬＡ弱陽性検体であても特異的に検出できるＬＡ検出用試薬キットの供給が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】第１部分試薬中のＰＥ濃度とＬＲ値との関係のグラフを示す図である。
【図２】第１部分試薬中のＰＳ濃度とＬＲ値との関係のグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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