(57)【要約】【課題】            極めて実用的な糖脂質の測定方法及び測定キット、並びに疾患の検出方法及び検出キットを提供する。【解決手段】        下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中の糖脂質の測定方法、かかる方法を用いた疾病の検出方法、下記構成成分(C)及び(D)を少なくとも含む、糖脂質の測定キット。  工程(A)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させる工程。  工程(B)：固相に固着された前記糖鎖に結合した前記糖鎖結合性タンパク質を検出する工程。  構成成分(C)糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体が固着された固相。  構成成分(D)糖鎖結合性タンパク質。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相を用いることを特徴とする検体中の糖脂質の測定方法。
【請求項２】
下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中の糖脂質の測定方法。
工程(A)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させ、該糖鎖結合性タンパク質に対し、検体中の糖脂質と該糖鎖とを競合反応させる工程。
工程(B)：固相に固着された前記糖鎖に結合した前記糖鎖結合性タンパク質を検出する工程。
【請求項３】
糖鎖結合性タンパク質が標識物質で標識されているか、又は標識されうることを特徴とする請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
糖鎖結合性タンパク質が抗糖脂質抗体であることを特徴とする請求項２又は３記載の測定方法。
【請求項５】
糖脂質がスフィンゴ糖脂質である請求項１〜４いずれか一項記載の測定方法。
【請求項６】
「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」における糖鎖とタンパク質との結合が、該糖鎖の還元末端に形成された官能基とタンパク質の官能基との共有結合によるものである請求項１〜５いずれか一項記載の測定方法。
【請求項７】
糖鎖が下記式１に示す構造からなるGb3に含まれる糖鎖であることを特徴とする請求項１〜６いずれか一項記載の記載の測定方法。
Galα1−4Galβ1−3Glc      （１）
ここで、GalはD−ガラクトースを示し、GlcはD−グルコースを示し、式中−はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する炭素番号を示し、α及びβは1位に存在する前記グリコシド結合のアノマーを示す。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法によって、検体である体液中に含まれる糖脂質を測定し、体液中の糖脂質の測定結果と生体内における糖脂質量が変動する疾病とを関連づけることによる疾病の検出方法。
【請求項９】
疾病が、糖脂質代謝異常疾患である請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
疾病が、ファブリー病である請求項８記載の検出方法。
【請求項１１】
下記構成成分(A)を少なくとも含む、糖脂質の測定キット。
(A)糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体が固着された固相。
【請求項１２】
更に下記構成成分(B)を含む、請求項１１記載の糖脂質の測定キット。
(B)糖鎖結合性タンパク質。
【請求項１３】
糖鎖結合性タンパク質が標識されていることを特徴とする請求項１２記載の測定キット。
【請求項１４】
糖鎖結合性タンパク質が抗糖脂質抗体であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の測定キット。
【請求項１５】
糖鎖が下記式１に示す構造からなるGb3に含まれる糖鎖であり、糖鎖結合性タンパク質が抗Gb3抗体であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の測定キット。
Galα1−4Galβ1−3Glc      （１）
ここで、GalはD−ガラクトースを示し、GlcはD−グルコースを示し、式中−はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する炭素番号を示し、α及びβは1位に存在する前記グリコシド結合のアノマーを示す。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の測定キットの構成成分を少なくとも含む、生体内における糖脂質量が変動する疾病の検出キット。
【請求項１７】
疾病が、糖脂質代謝異常疾患である請求項１６記載の検出キット。
【請求項１８】
疾病が、ファブリー病である請求項１６記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質の測定方法、該方法を用いる測定キットに関する。更に本発明は、疾病の検出方法及び検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、糖鎖認識性抗体が固着された固相に、検体を接触させ、検体中の糖鎖含有物質を前記糖鎖認識性抗体に結合させ、次いで、標識した糖鎖認識性抗体を接触させ、前記糖鎖含有物質に結合した前記認識性抗体を検出する工程を少なくとも含む、検体中の糖鎖抗原の測定方法が記載されている。しかしながら、上記の測定原理には、１分子あたりに抗体結合構造を１つしか含まない糖脂質等の糖鎖含有物質は理論上測定できないという問題点が存在する。
【０００３】
非特許文献２には、糖鎖をタンパク質に化学的な方法を用いて共有結合させる技術が記載されている。しかし、糖脂質の測定や、疾病の検出に関しては記載も示唆もない。
【０００４】
また非特許文献３には、先天性代謝異常疾患により血液中および尿中において特定の糖脂質濃度が上昇することが知られている旨記載されており、また血液中および尿中におけるそれら糖脂質を定量することはそれら先天性代謝異常疾患のスクリーニングにおいて有用である旨記載されている。さらに、非特許文献４および非特許文献５には、血液中および尿中から有機溶媒を用いてそれら糖脂質を抽出し、これを固相に固着し、これに結合する糖鎖結合性蛋白質を接触させ、前期糖脂質に結合した前記糖鎖結合性タンパク質を検出する工程を少なくとも含む、検体中のそれら糖脂質の測定方法が記載されている。
【０００５】
一方、単糖にタンパク質を化学的に結合させる方法は、特許文献１に記載されている。
しかし、タンパク質が共有結合した糖鎖が固着された固相を用いて体液中の糖脂質を測定し、これと疾病とを関連づけることについては記載も示唆もない。
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ８７／０２７７７号パンフレット
【非特許文献１】Cancer Res. 46, 2619-2626, (1986)
【非特許文献２】Methods On Glycoconjugates, pp 171-176 (1995)
【非特許文献３】グリコパソロジー, pp 217  (1991)
【非特許文献４】Analytical Biochemistry 267, 104-113 (1999)
【非特許文献５】日本先天代謝異常症学会誌 17(2), 189 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
糖脂質を、より高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できる方法が提供できれば、糖脂質の測定方法として極めて実用性が高く、このような測定方法及び測定キットが望まれていた。またこのような測定方法及び測定キットが提供できれば、体液中の糖脂質の量に変化が生じる疾病の検出も極めて容易になる。
【０００８】
すなわち本発明は、極めて実用的な糖脂質の測定方法及び測定キット、並びに疾病の検出方法及び検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、タンパク質が結合した糖鎖が固着された固相を用いることにより、糖脂質を従来の方法よりも高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）  「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相を用いることを特徴とする検体中の糖脂質の測定方法。
（２）  下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中の糖脂質の測定方法。
工程(A)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させ、該糖鎖結合性タンパク質に対し、検体中の糖脂質と該糖鎖とを競合反応させる工程。
工程(B)：固相に固着された前記糖鎖に結合した前記糖鎖結合性タンパク質を検出する工程。
（３）  糖鎖結合性タンパク質が標識物質で標識されているか、又は標識されうることを特徴とする（２）記載の測定方法。
（４）  糖鎖結合性タンパク質が抗糖脂質抗体であることを特徴とする（２）又は（３）記載の測定方法。
（５）  糖脂質がスフィンゴ糖脂質である（１）〜（４）いずれか記載の測定方法。
（６）  「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」における糖鎖とタンパク質との結合が、該糖鎖の還元末端に形成された官能基とタンパク質の官能基との共有結合によるものである（１）〜（５）いずれか記載の測定方法。
（７）  糖鎖が下記式１に示す構造からなるGb3に含まれる糖鎖であることを特徴とする（１）〜（６）いずれか記載の記載の測定方法。
式１：Galα1−4Galβ1−3Glc
ここで、GalはD−ガラクトースを示し、GlcはD−グルコースを示し、式中−はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する炭素番号を示し、α及びβは1位に存在する前記グリコシド結合のアノマーを示す。
（８）  （１）〜（７）のいずれかに記載の測定方法によって、検体である体液中に含まれる糖脂質を測定し、体液中の糖脂質の測定結果と生体内における糖脂質量が変動する疾病とを関連づけることによる疾病の検出方法。
（９）  疾病が、糖脂質代謝異常疾患である（８）記載の検出方法。
（１０）  疾病が、ファブリー病である（８）記載の検出方法。
（１１）  下記構成成分(A)を少なくとも含む、糖脂質の測定キット。
(A)糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体が固着された固相。
（１２）  更に下記構成成分(B)を含む、（１１）記載の糖脂質の測定キット。
(B)糖鎖結合性タンパク質。
（１３）  糖鎖結合性タンパク質が標識されていることを特徴とする（１２）記載の測定キット。
（１４）  糖鎖結合性タンパク質が抗糖脂質抗体であることを特徴とする（１２）又は（１３）記載の測定キット。
（１５）  糖鎖が下記式１に示す構造からなるGb3に含まれる糖鎖であり、糖鎖結合性タンパク質が抗Gb3抗体であることを特徴とする（１２）又は（１３）記載の測定キット。
式１：Galα1−4Galβ1−3Glc
ここで、GalはD−ガラクトースを示し、GlcはD−グルコースを示し、式中−はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する炭素番号を示し、α及びβは1位に存在する前記グリコシド結合のアノマーを示す。
（１６）  （１１）〜（１５）のいずれかに記載の測定キットの構成成分を少なくとも含む、生体内における糖脂質量が変動する疾病の検出キット。
（１７）  疾病が、糖脂質代謝異常疾患である（１６）記載の検出キット。
（１８）  疾病が、ファブリー病である（１６）記載の検出キット。
【００１１】
本発明において、糖鎖結合性タンパク質は標識されていることが好ましい。また、糖鎖結合性タンパク質は抗糖脂質抗体であることが好ましく、さらには、糖脂質はGb3であり、抗糖脂質抗体は抗Gb3抗体であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明測定方法は、糖脂質を高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できる方法であり、非常に実用性が高い方法である。また本発明検出方法は本発明測定方法を応用したものであり、種々の疾病を極めて簡便に検出できるので、非常に実用性が高い方法である。また本発明測定キット及び本発明検出キットは、本発明測定方法及び本発明検出方法を行うために利用するキットであるので、これを用いて糖脂質を高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定でき、また生体内における糖脂質の量が変動する種々の疾病を極めて簡便に検出できる。
また本発明測定キット及び本発明検出キットは、その構成が単純であり、安価に提供することができる。
本発明は、明細書中で説明する種々の疾病の検出のみならず、疾病の状態、進行度の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、医薬品開発の評価等へも応用することができ、極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜１＞本発明測定方法
本発明測定方法は、「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相を用いることを特徴とする検体中の糖脂質の測定方法である。より具体的には、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、検体中の糖脂質の測定方法である。
【００１４】
工程(A)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させ、該糖鎖結合性タンパク質に対し、検体中の糖脂質と該糖鎖とを競合反応させる工程。
工程(B)：固相に固着された前記糖鎖に結合した前記糖鎖結合性タンパク質を検出する工程。
【００１５】
本発明測定方法で用いることができる「結合体」は、タンパク質と糖鎖とが直接的又は間接的に結合している限りにおいて限定されない。かかる結合は化学的結合（共有結合、水素結合、イオン結合など）であっても物理的吸着による結合であってもよいが、化学的結合が好ましく、その中でも特に共有結合が好ましい。
【００１６】
両者が直接的に共有結合している結合体には、糖鎖とタンパク質とが、両方の物質（化合物）と結合しうるスペーサー物質を介して共有結合している物質（糖鎖-スペーサー物質-タンパク質）も含まれる。両者が間接的に共有結合している結合体としては、例えばタンパク質に結合性を有する非タンパク質性の物質（例えばビオチン等）を糖鎖に共有結合させ、これとアビジン、ストレプトアビジン等のタンパク質とを結合させた物質（例：糖鎖ビオチン-アビジン）等が例示される。なお、ビオチンとアビジンの間の結合は共有結合ではないが、これら両者が結合してなる複合体（ビオチン−アビジン）は極めて安定（このような特異的な複合体を形成する対物質を「特異的結合対」とも記載する）である。なお、ここでは直接的に共有結合しているものが好ましい。
【００１７】
タンパク質が共有結合する位置は、糖鎖の還元末端であることが好ましい。このような結合体は例えば実施例記載の方法により調製することが可能である。
タンパク質としては、そのタンパク質が共有結合した糖鎖を後述の固相に固着することができ、かつ前記競合反応時や後述の洗浄時の条件下においても遊離しないものである限りにおいて特に限定されないが、アミノ基を多く含有するタンパク質、又は分子量が５，０００以上のタンパク質が好ましい。なお、これら２つの性質を併有するタンパク質、すなわちアミノ基を多く含有し、かつ分子量５，０００以上のタンパク質が特に好ましい。かかるタンパク質として具体的には、例えば血清アルブミン（ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）等）、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、カゼイン、アビジン、ポリアミノ酸（ポリリジン等）等が例示されるが、血清アルブミンが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
【００１８】
タンパク質を結合させる糖鎖は、測定対象の糖脂質の糖鎖構造と同一の糖鎖又はその一部を用いる。すなわち、本発明における糖鎖は糖脂質に含まれる糖鎖である。測定対象とする糖脂質は特に限定されないが、スフィンゴ糖脂質が好ましく、特にGb3が好ましく、よってタンパク質を共有結合させる糖鎖も「Gb3に含まれる糖鎖」が好ましい。また、タンパク質を共有結合させる糖鎖の鎖長は特に限定されない。かかる糖鎖としては好ましくは、下記式１で表されるGb3に含まれる糖鎖が具体的には挙げられる。
【００１９】
Galα1−4Galβ1−3Glc      （１）
【００２０】
ここで、GalはD−ガラクトースを示し、GlcはD−グルコースを示し、式中−はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する炭素番号を示し、α及びβは1位に存在する前記グリコシド結合のアノマーを示す。
【００２１】
タンパク質と糖鎖とを共有結合させる方法（タンパク質が共有結合した糖鎖の製造方法）は、目的の共有結合をさせることができる方法である限りにおいて限定されず、公知の方法を適宜採用することができ、例えば Methods on Glycoconjugates pp 171-176  (1995) に記載の方法等を採用することもできる。
【００２２】
以下に、タンパク質と糖鎖とを共有結合させる方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
例示(1)  糖鎖の還元末端のホルミル基に適当なスペーサー化合物を介してアミノ基を導入し、SPDP(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)と反応させ、PDP化させた後、別にタンパク質のアミノ基にPDPを導入し、還元を行った活性化タンパク質と反応させ、共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、ジスルフィド結合(-S-S-)である。
【００２４】
例示(2)  糖鎖の還元末端のホルミル基に適当なスペーサーを介してアミノ基を導入し、SMCC(Succinimidyl-trans-4(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate)またはGMBS(N-(4-Maleimidobutylryloxy)succinimide)と反応させた後、別にタンパク質のアミノ基にPDPを導入し、還元を行った活性化タンパク質と反応させ、共有結合させる方法。
【００２５】
例示(3)  糖鎖の還元末端のホルミル基に適当なスペーサーを介してカルボキシル基を導入し、タンパク質のアミノ基とカルボジイミド等を用いて共有結合させる方法。これにより生じる共有結合は、アミド結合(-CO-NH-)である。
【００２６】
例示(4)  ビオチンのカルボキシル基にヒドラジド基を導入したビオチンヒドラジドを用い、このアミノ基と、糖鎖の還元末端のホルミル基に適当なスペーサーを介して導入したカルボキシル基とを、EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride)等の縮合剤を用いて共有結合させ（これにより生じる共有結合はアミド結合(-CO-NH-)である）、このビオチン部分でアビジンと結合させる方法。
【００２７】
例示(5)  糖鎖の還元末端のホルミル基にp-aminophenyl基を導入し、二塩化チオカルボニル（thiophosgene）によりp-aminophenyl基をphenylisothiocyanateとし、タンパク質のアミノ基と共有結合させる方法。
【００２８】
以上に記載の方法の他、特許第2728757号、特許第2739232号に記載の方法を採用することも可能である。
このような方法で製造される「タンパク質が共有結合した糖鎖」は、固相に固着して用いられる。
【００２９】
固相としては、タンパク質が共有結合した糖鎖が固着可能な水不溶性の固相である限りにおいて、その形状、材質等は限定されない。
固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等を例示することができる。固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００３０】
これらの固相にタンパク質が共有結合した糖鎖を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００３１】
物理的吸着法として具体的には、例えば次の方法が挙げられ、かつ好ましい。
タンパク質が共有結合した糖鎖を、ｐＨ７〜９程度の緩衝液(例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)、炭酸緩衝液等)に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置して固着させる方法。
【００３２】
なお、この後にブロッキング物質を固相に添加して、タンパク質が共有結合した糖鎖が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
以上の方法で、タンパク質が共有結合した糖鎖が固着された固相を製造することができる。
【００３３】
工程(A)は、このようにして製造された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させ、該糖鎖結合性タンパク質に対し、検体中の糖脂質と該糖鎖とを競合反応させる工程からなる。
【００３４】
検体としては、測定対象とする糖脂質が含有されているか、含有されている可能性があるものである限りにおいて限定されない。また検体は予め精製されている必要もない。すなわち検体中に、測定対象とする糖脂質以外の糖鎖構造を有する物質や、その他の各種タンパク質等が含有されていても、本発明測定方法では測定対象とする糖脂質を特異的に測定することができる。
【００３５】
検体として具体的には、糖脂質含有溶液（医薬品製造工程サンプルなど）、細胞培養上清、体液等が例示される。これらの中でも体液が好ましい。体液としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、関節液、胸水、腹水、骨髄液、脊髄液等が例示されるが、尿、血清および血漿が特に好ましい。
【００３６】
本明細書において「糖鎖結合性タンパク質」とは、糖脂質の糖鎖部分に特異的に結合する性質を有するタンパク質を意味する。本発明測定方法は、特に糖脂質Gb3を測定対象とすることが好ましいことから、糖鎖結合性タンパク質としてはGb3に特異的に結合するタンパク質が好ましい。
【００３７】
糖鎖結合性タンパク質として具体的には以下のものが例示されるが、糖鎖に結合する性質を有するタンパク質である限りにおいてこれらに限定されるものではない。
【００３８】
(1)糖鎖認識性抗体
抗Gb3抗体、抗Lactosyl ceramide抗体等の中性糖脂質糖鎖を認識する抗体、抗GM1抗体、抗GM2抗体、抗GD1抗体、抗酸性糖脂質を認識する抗体、糖タンパク質の糖鎖を認識する抗体等。これら抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良く、抗体分子は完全な分子であっても良く、或いはFab、Fab2、F(ab')2等のフラグメントであってもよい。
【００３９】
(2)植物および細菌性の糖鎖結合タンパク質
AALABAConA、LCA、PHA、PNA、RCA、WGAANA等の植物レクチン、ベロ毒素等の細菌性糖鎖結合性タンパク質等。
【００４０】
(3)動物由来の糖鎖結合タンパク質
セレクチン、ガレクチン、コレクチン、MBP、糖鎖認識部位を持つ細胞レセプター、糖鎖認識性部位を持つプロテオグリカン等。これらタンパク質は完全な分子であっても良く、或いは糖鎖認識部位を含む分子断片でも良い。
【００４１】
これらの糖鎖結合性タンパク質の由来は特に限定されない。例えば天然材料から分離したタンパク質であってもよく、遺伝子工学的手法により製造した組換えタンパク質であってもよい。その中でも特に本発明測定対象が糖脂質Gb3を測定対象とすることが最も好ましいことから、糖鎖結合性タンパク質としては抗Gb3抗体が最も好ましい。なお、抗Gb3抗体については、「anti-Gb3」として生化学工業株式会社から販売されている。
【００４２】
なお、本発明測定方法においては、糖鎖結合性タンパク質は標識物質で標識されていることが、工程(B)において検出が容易であることから好ましい。
【００４３】
糖鎖結合性タンパク質の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位元素等が挙げられるが、通常タンパク質の標識に可能なものであれば、特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等（「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法(Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照)、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭63-17843号公報記載の方法等から適宜選択できる。
【００４４】
また、糖鎖結合性タンパク質が予め標識されたものでなく、工程(B)において糖鎖結合性タンパク質を検出する際に、例えば、糖鎖結合性タンパク質を認識する標識された抗体と糖鎖結合性タンパク質とを反応させることにより最終的に標識され得る態様であってもよい。
【００４５】
前記固相（タンパク質が共有結合した糖鎖が固着された固相）に検体及び糖鎖結合性タンパク質を接触させると、糖鎖結合性タンパク質に対して、検体中の糖脂質と固相に固着された糖鎖（タンパク質と共有結合したもの）とが競合反応して結合する。
【００４６】
タンパク質が結合した糖鎖が固着された固相への検体及び糖鎖結合性タンパク質の接触方法は、当該固相に固着された糖鎖、検体中の糖脂質及び糖鎖結合性タンパク質の３者が接触し、反応する限りにおいて特に限定されないが、本発明方法は、糖鎖の糖鎖結合性タンパク質に対する競合反応を利用し、かつ検体中の糖脂質を測定する方法であるので、糖鎖結合性タンパク質を最後に接触させるか、少なくとも検体と糖鎖結合性タンパク質とを接触させると同時又は接触させた後に前記固相に接触させることが好ましい。具体的には下記の態様が例示される。なお下記の態様はあくまで例示であり、本発明測定方法がこれらに限定されるものではない。前記３者を接触させる順序や方法は、例えば下記の態様を参考にして当業者が適宜決定することができる。
【００４７】
態様(1)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に検体を添加して接触させ、必要に応じて固液分離（洗浄を含む）を行い、次いでこれに糖鎖結合性タンパク質を添加して接触させる。
【００４８】
態様(2)：検体に、「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相を添加して接触させ、必要に応じて固液分離（洗浄を含む）を行い、次いでこれに糖鎖結合性タンパク質を添加して接触させる。
【００４９】
態様(3)：「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に、検体及び糖鎖結合性タンパク質を同時に添加して接触させる。
【００５０】
態様(4)：検体に、糖鎖結合性タンパク質を添加して接触させてインキュベートし、次いでこれを「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相に添加して接触させる。
【００５１】
なおこれら３者を接触させた後、十分に競合反応させるために、0〜45℃、好ましくは32〜40℃でインキュベートすることが好ましい。インキュベートの時間は、前記３者が十分に反応できる限りにおいて特に限定されないが、30分〜1時間程度を例示することができ、かつ好ましい。３者を別々に反応させる阻害反応をさせるためには、同様の温度条件下で、各々10〜1時間程度がインキュベート時間として例示される。
【００５２】
また前記三者の反応後、固液分離、特に固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着した、「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」及びこれに結合した糖鎖結合性タンパク質が遊離しない条件で行われる。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液(例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝生理的食塩水（PBS）、トリス塩酸緩衝液等)を用いることが好ましい。
【００５３】
以上の工程(A)を経た後、工程(B)に移行する。
工程(B)は、固相に固着された「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」に結合した糖鎖結合性タンパク質を検出する工程である。
【００５４】
前記した通り、本発明測定方法は糖鎖結合性タンパク質に対する、糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体（固相に固着されている）と検体中の糖脂質との競合反応を利用しているので、固相に固着された前記糖鎖に結合した糖鎖結合性タンパク質を検出することにより、検体中の糖脂質を測定することができる。
【００５５】
すなわち、固相に固着された前記糖鎖に結合した糖鎖結合性タンパク質の検出量が多ければ、検体中の糖脂質の量が少ないと判定される。逆に、固相に固着された前記糖鎖に結合した糖鎖結合性タンパク質の検出量が少なければ、検体中の糖脂質の量が多いと判定される。
【００５６】
固相に固着された「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」に結合した糖鎖結合性タンパク質の検出は、糖鎖結合性タンパク質に特異的に反応する抗体を用いて行ってもよく、また工程(A)において糖鎖結合性タンパク質を標識物質で標識したものを用いた場合には、用いた標識物質に応じて当業者が適宜検出方法を選択することができる。
【００５７】
例えば、標識物質にビオチンを使用した場合には、アビジン、ストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとアビジン、ストレプトアビジンとを結合させ、次いでアビジン、ストレプトアビジン等に結合した酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。
【００５８】
本発明測定方法において、検体中の糖脂質の濃度は、予め既知濃度の糖脂質標準液を用いて糖脂質の濃度と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線を作成しておき、未知濃度の検体についての検出結果と前記検量線とを用いることにより求めることができる。
【００５９】
＜２＞本発明検出方法
本発明検出方法は、本発明測定方法によって体液中の糖脂質を測定し、体液中の糖脂質の量と動物（ヒト、ペット、家畜など）の疾病とを関連づけることによる疾病の検出方法である。
【００６０】
本発明検出方法による検出対象となる疾病は、体液中の糖脂質の量に変化が生じるような疾病である限りにおいて特に限定されない。
検出対象となる疾病に応じて、検体として用いる体液の種類、及び測定する糖脂質の種類を適宜選択することができる。
また、体液中の糖脂質の量と疾病との関連づけ、及びこれによる疾病の検出も、検出対象となる疾病に応じて適宜行うことができる。
【００６１】
例えば検出対象とする疾病が、体液中の糖脂質の量が増加するような疾病の場合は、体液中の糖脂質の量が健常な動物（当該疾病がない動物）の体液中の糖脂質の量に比して増加するので、本発明測定方法で測定された糖脂質の量が健常動物の体液中の量に比して多い場合には、「当該疾病を罹患している」、又は「当該疾病を罹患している可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾病を検出することができる。
【００６２】
また例えば検出対象とする疾病が、体液中の糖脂質の量が減少するような疾病の場合は、体液中の糖脂質の量が健常な動物（当該疾病がない動物）の体液中の糖脂質の量に比して減少するので、本発明測定方法で測定された糖脂質の量が健常動物の体液中の量に比して少ない場合には、「当該疾病を罹患している」、又は「当該疾病を罹患している可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾病を検出することができる。
【００６３】
また上記のような体液中の糖脂質の量が増加又は減少するような疾病を検出対象とする場合において、本発明測定方法で測定された糖脂質の量が健常動物の体液中の糖脂質の量と同等であれば、「当該疾病を罹患していない」、又は「当該疾病を罹患している可能性は低い」と関連づけることができる。
【００６４】
また本発明検出方法においては、上記疾病の有無のみでなく、上記疾病の程度の検出も含まれる。例えば各個体の体液中の糖脂質の量を本発明測定方法により定期的に測定し、糖脂質の量が健常動物のレベルから離れる傾向にある場合には「上記疾病が進行している」、又は「上記疾病が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法で測定された糖脂質の量が健常動物のレベルに近づく傾向にある場合には、「上記疾病が改善方向にある」、又は「上記疾病が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法で測定された糖脂質の量が健常動物のレベルの範囲内で変化しない場合には、「健常性に変化がない」、又は「健常性に変化がない可能性が高い」と関連づけることができ、糖脂質の量が健常動物のレベルの範囲外で変化しない場合には、「上記疾病の程度に変化がない」、又は「上記疾病の程度に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
【００６５】
なお、上記疾病の検出基準となる糖脂質の量は、糖脂質標準品濃度と標識物質の検出結果との関係について作成した検量線を用いて求めた糖脂質の濃度であっても良く、また当該検量線を用いずに健常な動物（上記疾病がない動物）の体液中の糖脂質の量に対する比であっても良い。
【００６６】
本発明検出方法において用いることができる体液、測定対象とする糖鎖、これにより検出できる疾病、当該疾病に伴う体液中の糖脂質の量の変化の例をまとめて表１に示す。
なお表１はあくまで例示であり、本発明検出方法がこれらに限定されるものではない。
【００６７】
【表１】
2005062114.tif 000002
【００６８】
例えばファブリー病の検出を行う場合、尿中のGb3を本発明測定方法により測定し、このGb3が健常な動物（ファブリー病でない動物）の尿中のGb3量に比して増加している場合には、「ファブリー病である」、又は「ファブリー病である可能性が高い」と関連づけることができる。
【００６９】
なお本発明検出方法は、本発明測定方法によって尿中のGb3を測定し、尿中のGb3量とファブリー病とを関連づけることによりファブリー病を検出する方法であることが好ましい。
【００７０】
＜３＞本発明測定キット
本発明測定キットは、下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、糖脂質の測定キットである。
【００７１】
(A)「糖脂質に含まれる糖鎖とタンパク質との結合体」が固着された固相。
(B)糖鎖結合性タンパク質。
(A)の固相及び(B)のタンパク質についての説明は、＜１＞本発明測定方法と同様である。
【００７２】
本発明測定キットは、上記(A)及び(B)を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度の糖脂質標準品、標識物質の検出試薬、糖鎖結合性タンパク質を標識する試薬、あるいは糖鎖結合性タンパク質を検出する試薬（標識された、当該タンパク質に対する抗体等）等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、前記ブロッキング物質、前記洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００７３】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
本発明測定キットを用いた糖脂質の測定は、上記＜１＞の本発明測定方法に従って行うことができる。
【００７４】
＜４＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明測定キットの構成成分を少なくとも含む、疾病の検出キットである。本発明検出キットの構成成分等の説明は、上記＜３＞の本発明測定キットと同じである。
本発明検出キットを用いた疾病の検出は、上記＜２＞の本発明検出方法に従って行うことができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
初めに、本実施例中で使用した材料及びその入手をまとめて説明する。
【００７６】
（材料）
イムノプレート（ナルジェヌンク社製）
糖脂質Gb3に含まれる糖鎖（前記式（１））-エタノールアミン−BSA（Gb3糖鎖-BSA結合体）
BSA（生化学工業株式会社販売）
抗Gb3抗体（マウスIgG抗体：生化学工業株式会社製）
Gb3（生化学工業株式会社製）
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体（以下、HRP標識2次抗体という；生化学工業株式会社製）
テトラメチルベンジジン溶液（以下、TMB溶液という；Moss社製）
【００７７】
Gb3糖鎖-BSA結合体は、以下の方法で製造した。
BSA 350mg/3mL 0.1mol/L PB溶液に、SPDP 9.5mg/1mL エタノール溶液を滴下し、室温で30分攪拌した後、Sephadex G-50（商標名：ファルマシア社製）にてゲルろ過し、活性画分を得た。この活性画分に対しジチオスレイトール（DTT）を5倍量投入し、室温で60分間攪拌した後、Sephadex G-50（商標名：ファルマシア社製）にてゲルろ過した。得られた活性画分を活性画分１とした。
【００７８】
次に、Gb3糖鎖-エタノールアミンを調製した。すなわちGb3糖鎖（212.3mg, 0.421mmol）をピリジン（5ml）に溶解し、無水酢酸（5ml）を加え、室温で2時間攪拌した。その溶液をトルエンで共沸させながら留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Toluene：AcOEt = 2：2.5）により精製し、化合物１（407mg, qu.）を得た。
【００７９】
Rf = 0.39, 0.31(Toluene：AcOEt = 1：1)
1H-NMR δ(CDCl3)
6.251(d, 0.5H, J = 3.9Hz, H-1aα), 5.690(d, 0.5H, J = 8.3Hz, H-1aβ)
2 .175, 2.135, 2.130, 2.124, 2.115, 2.098, 2.096, 2.090, 2.086, 2.072, 2.069, 2,065, 2.063, 2.059, 2.051, 2.042, 2.032, 2.012, 1.991, 1.985(20s, 33H, 11Ac)
【００８０】
化合物１（407mg, 0.421mmol）をN,N-ジメチルホルマミド（2ml）に溶解し。ヒドラジン・酢酸（66.5mg, 1.7eq.）を加え、-2℃から5℃で1時間攪拌した。更に、ヒドラジン・酢酸(3.4eq.)を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（hexane：AcOEt = 1:3）により精製し、化合物２（389mg, qu）を得た。
【００８１】
Rf = 0.32 (hexane：AcOEt = 1：3)
【００８２】
化合物２（389mg, 0.421mmol）をジクロロメタン（3.0ml）に溶解し、トリクロロアセトニトリル（652μl、15.0eq.）、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン（1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene：45μl, 0.7eq.）を加え、0℃で3時間攪拌した。反応液を直接シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Toluene：AcOEt = 2：3）により精製し、化合物３（417.5, mg, 92.8%）を得た。
【００８３】
Rf = 0.37(Toluene：AcOEt = 2：3)
1H-NMR δ(CDCl3)  
8.650(s, 1H, NH), 6.483(d, 1H, J=3.9Hz, H-1a), 5.589(bd, 1H, H-1c or H-4c), 5.566(bt, 1H), 5.000(d, 1H, J=3.4Hz, H-1c or H4c), 4.540(d, 1H, J=7.8Hz, H-1b), 4.025(d, 1H, J=2.4Hz, H-4b), 2.131, 2.108, 2.096, 2.092, 2.074, 2.067, 2.062, 2.041, 2.012, 1.986(10s, 30H, 10Ac)
【００８４】
化合物３（417mg, 0.390mmol）と化合物７（151.8mg, 0.778mmol）をジクロロメタン(5ml)に溶解し、アルゴンガス存在化、モレキュラシーブ4Åと共に室温で５分間攪拌した。その反応液を−１０℃まで冷却し、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（TMSOTf：21.7μl, 0.3eq.）を加え、そのまま1時間攪拌した。更に、TMSOTf（43.4μl, 0.6eq.）を加え、そのまま1時間攪拌した。反応液をセライトろ過した後、有機層を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Toluene：AcOEt = 1：3）により精製し、化合物４（203,7mg, 47.4%）を得た。
【００８５】
Rf = 0.38(Toluene：AcOEt = 1：3)
1H-NMR δ(CDCl3) 
7.376-7.287(m, 5H, ph), 5.583(d, 1H, 3.4Hz, H-4c), 5.392(dd, 1H, J=3.4, 10.7Hz), 4.986(d, 1H, J=3.4Hz, H-1c), 4.874(dd, 1H, J=8.3, 9.3Hz), 4.735(dd, 1H, J=3.0, 10.7Hz), 4.010(d, 1H, J=2.0Hz, H4b), 2.126-1.981(30H, 10Ac)
【００８６】
化合物４（197mg, 0.178mmol）をメタノール：テトラヒドロフラン（1：1）（5ml）溶液に溶解し、1N-NaOH（1ml）を加え室温で1日間攪拌した。その溶液をアンバーリスト15E（商標名：オルガノ株式会社製）により中性とした後、溶媒を留去した。残渣をセファデックスLH-20(商標名：ファルマシア社製、CHCl3：MeOH：H2O = 1：4：2)にて精製、更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3：MeOH：H2O = 5：5：1）により精製して、化合物５（114.6mg, 94%）を得た。
【００８７】
Rf = 0.63(CHCl3：MeOH：H2O = 5：5：1)
1H-NMR δ  (CD3OD) 
7.436-7.409(m, 5H), 5.115(bs, 2H, 2CH2), 4.936(d, 1H, J=3.9Hz, H-1c), 4.480(d, 1H, J=7.8Hz, H-1a or h-1b), 4.446(bd, 1H, J=7.3Hz), 4.340(t, 1H, J=6.4Hz)
【００８８】
化合物５（114.6mg, 0.168mmol）をメタノール：水（2：１）（10ml）溶液に溶解し、パラジウム炭素(Pd-C：10%)（120mg）を加え、水素下、室温で5.5時間攪拌した。セライトろ過した後、Sphadex LH-20（商標名：ファルマシア社製、MeOH：H2O = 3：2）により精製を行い、化合物６（92mg, qu.）を得た。
【００８９】
Rf = 0.38(MeOH：H2O：NH3(28%) = 1：3：1)
1H-NMR δ  (CD3OD)  
4.934(d, 1H, J=3.9Hz, H-1c), 4.534(d, 1H, J=8.3Hz, H-1a or H-1b), 4.497(d, 1H, J=7.8Hz, H-1a or H-1b)
【００９０】
この様に調製したGb3糖鎖-エタノールアミンに対して3等量のSPDPを添加し、室温で30分間撹拌した後、Sephadex G-10（商標名：ファルマシア社製） にてゲルろ過して活性画分２とした。この得られた活性画分２に活性画分１を等量となるよう滴下し、4℃で16時間撹拌し、これを糖鎖-BSA結合体とした。
【００９１】
＜実施例１＞  Gb3の定量及び検量線の作成
イムノプレートのウェルにGb3糖鎖-BSA結合体溶液(0.5μg/mL)を100μL加え、4℃で一晩静置して固相化した。その後１％BSA溶液でブロッキングし、このプレートを洗浄液(0.05％の Tween 20（商標名）を含むPBS)で洗浄した。
このプレートに、種々の濃度(0.125-8μｇ/mL)のGb3水溶液を50μL加え、更に抗Gb3抗体溶液(1600ng/mL)を50μL加えて室温で1時間反応させた。
【００９２】
その後再度洗浄し、HRP標識2次抗体溶液(1μg/mL)を100μL加えて37℃で1時間反応させた。その後再度洗浄し、TMB溶液を100μL加えて発色させた。1mol/L H2SO4を100μL添加して反応を停止させ、450nmの吸光度を測定し、検量線を作成した。結果を図１に示す。
【００９３】
＜実施例２＞  Gb3の添加回収試験
イムノプレートのウェルにGb3糖鎖-BSA結合体溶液（0.5μg/mL）を100μL加え、4℃で一晩静置して固相化した。BSAでブロッキングした後、Gb3(終濃度4μg/mL)を添加した尿(以下、Gb3添加尿ともいう)の2倍希釈液を50μl加え、更に抗Gb3抗体溶液(1000ng/ml)を50μl加えて室温で1時間反応させた後、実施例１と同様に反応を行い、Gb3添加尿のGb3量を測定して添加回収率を求めた。Gb3添加尿を使用した場合の結果を表２に示す。
【００９４】
【表２】
2005062114.tif 000003
【００９５】
表２に示すように、Gb3無添加の正常尿の測定値は、Analytical Biochemistry  267, 104-113  (1999) において報告されている正常尿での測定値 0.9±0.4μg/ml と同程度の値であった。また、上記文献で報告されている疾病尿でのGb3濃度の下限値 6μg/ml に近い濃度での添加回収試験でも95〜100％の範囲で回収率が得られ、本発明測定方法の正確性が高いことが示された。
この結果から、タンパク質が共有結合した糖鎖を用いることにより、特異的かつ正確に糖脂質を測定することができることが示された。
【００９６】
＜実施例３＞  本発明測定キット及び本発明検出キットの作成
以下の構成からなる本発明測定キット及び本発明検出キットを作成することが考えられる。
【００９７】
１．Gb3糖鎖-BSA結合体がウェルに固着されたイムノプレート(96ウェル)    １枚
２．抗Gb3抗体（マウスIgG抗体）    １本
３．HRP標識2次抗体（ウサギ抗マウスIgG抗体）    １本
４．TMB(テトラメチルベンジジン)溶液    １本
５．反応停止液(1mol/L 塩酸)  １本
６．Gb3標準液    １セット
Gb3標準液１(0.125μg/mL)  １本
Gb3標準液２(0.25μg/mL)  １本
Gb3標準液３(0.5μg/mL)    １本
Gb3標準液４(1μg/mL)      １本
Gb3標準液５(2μg/mL)      １本
Gb3標準液６(4μg/mL)      １本
Gb3標準液７(8μg/mL)      １本
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】Gb3糖鎖-エタノールアミンの調製スキームを示す図である。
【図２】Gb3糖鎖-BSA結合体を固相化したプレートを用いた場合のGb3の検量線を示す図である。
【図１】
2005062114.tif 000004
【図２】
2005062114.tif 000005