(57)【要約】【課題】大腸菌内で外来タンパク質を効率よく簡便に発現させることができるプラスミドベクターを提供する。【解決手段】大腸菌細胞内において機能しうるプロモーター配列、ＳＤ配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子及び大腸菌細胞内において機能しうる複製起点を含むプラスミドベクターであって、前記クローニング部位は前記ＳＤ配列の５’側近傍及び３’側近傍の２箇所に存在し、第一及び第二のクローニング部位は制限酵素で切断したときに粘着末端を生成する制限酵素認識配列をそれぞれ一種類以上含み、前記第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせであることを特徴とするプラスミドベクターを作製する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌細胞内において機能しうるプロモーター配列、ＳＤ配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子及び大腸菌細胞内において機能しうる複製起点を含むプラスミドベクターであって、前記クローニング部位は前記ＳＤ配列の５’側近傍及び３’側近傍の２箇所に存在し、第一及び第二のクローニング部位は制限酵素で切断したときに粘着末端を生成する制限酵素認識配列をそれぞれ一種類以上含み、前記第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせであることを特徴とするプラスミドベクター。
【請求項２】
さらにｌａｃＩｑ遺伝子を含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
第一及び第二のクローニング部位に含まれる制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩまたはＰｓｔＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの認識配列の組み合わせである、請求項１または２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
配列番号１〜３のいずれかの配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
配列番号１〜３のいずれかの配列を有するポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチドに相補鎖なポリヌクレオチドからなる二本鎖ＤＮＡを、プラスミドｐＵＳＩ２に連結することにより製造される、請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
有用タンパク質をコードする遺伝子が一又は二以上組み込まれた、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクターを用いて、ＳＤ配列と有用タンパク質をコードする配列からなる遺伝子を複数個連結させる方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のプラスミドベクターを含む形質転換大腸菌。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、該形質転換体に有用タンパク質を産生させ、産生されたタンパク質を菌体内又は培地より精製することを特徴とする有用タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて前記有用タンパク質の活性を測定する方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて化学物質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はタンパク質を効率良く発現させることが可能な新規なプラスミドベクター及びこのプラスミドベクターで形質転換した組換え大腸菌、該組換え大腸菌を用いたタンパク質の製造法、化学物質製造法、及び活性測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌を用いたタンパク質発現系は異種遺伝子にコードされる有用タンパク質を大量に生産する手段としてよく用いられる。また、酵素タンパク質を発現させた組換え大腸菌を微生物触媒として用いることにより、産業上有用な化合物を生産することも可能である（例えば、特許文献１〜３参照）。これらの発現系においてよく用いられるプラスミドベクターとしては、ｐＵＳＩ２（例えば、非特許文献１参照）、ｐＫＫ２３３−２（例えば、非特許文献２参照）、ｐＥＴ３２（例えば、非特許文献３参照）等がある。これらの発現ベクターに含まれるプロモーター領域の下流に目的のタンパク質をコードする構造遺伝子を連結し、これを大腸菌に導入して組換え大腸菌を作製し、該大腸菌を培養することで目的のタンパク質を大量に生産することが可能となる。
【０００３】
大腸菌内で外来蛋白質を生産する際の生産効率に関与する因子としては、主に（１）遺伝子数（２）転写効率（３）翻訳効率の３つが挙げられるが、生産効率を上げるためにこれらの因子について検討がなされてきた。
【０００４】
このなかで、（２）の転写効率が蛋白質の生産効率に最も関与していると考えられており、転写効率を上げるための強力なプロモーター配列がいくつか報告されている：ｔａｃプロモーター（例えば、非特許文献４参照）、ｐａｃプロモーター（例えば、非特許文献１参照）、ｔｒｃプロモーター（非特許文献５参照）。しかしながら、これらのような強いプロモーターを用いてその下流に目的の遺伝子をつないだ場合であっても、必ずしも目的とする蛋白質を大量に発現させることができる訳ではなく、生産効率を上昇させるために併せて以下のような工夫もなされてきた。
【０００５】
すなわち、前記（３）の項目については、目的外来遺伝子のコドン使用頻度を大腸菌のｔＲＮＡ量に合わせて改変したり（例えば、非特許文献６参照）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列ともいう）から翻訳の開始コドンまでの距離を変えたり（例えば、非特許文献７参照）というような努力がなされてきた。しかしながら、これらの工夫により生産効率が向上するタンパク質もあるが、普遍的にすべての遺伝子に使用できる技術ではなかった。
【０００６】
また、前記（１）の項目については、一般に高コピー数のプラスミドが発現ベクターとして用いられてきた。プラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導体（例えば、非特許文献８または９参照）はその典型的なものであり、一細胞あたり２０コピー以上となっている。さらにより高い遺伝子増幅効果を狙ったものとして、培養温度を３０℃付近から４２℃付近にシフトすることによりプラスミドのコピー数を爆発的に上昇させることができる、ランナウェイ型のベクターが開発されている（非特許文献１０参照）。しかし、通常の大腸菌では４２℃では種々のヒートショックタンパクの発現が誘導されてしまうことや、発現させようとする目的タンパク質の可溶性が著しく損なわれるなどの問題点があるため、実用的ではなかった。
【０００７】
またコピー数を上げるため、目的遺伝子をプラスミド内でタンデムにつないで発現させることも試みられてきた（例えば、特許文献４参照）。また、タンパク質の中には複数のサブユニットが複合体を形成して初めて酵素活性を示すものもあるが、かかるタンパク質を活性体として発現させる場合には、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子を別々のプラスミドに組み込んで発現させる必要があり、操作が煩雑、遺伝子導入効率が悪い、活性体の発現が困難であるなどの問題点があった。この問題点は複数の酵素が関与する一連の生体反応を宿主細胞内で再現する場合においても同様であった。かかる目的のために各サブユニットをコードする遺伝子をタンデムにつないで単一のベクターで細菌細胞に導入することも行われていた（例えば、特許文献５参照）。
【０００８】
かかるタンデム化は主にＰＣＲ法を用いて行われていたことから、プライマーを合成する必要があり、さらにＰＣＲによる増幅エラー等の問題もあったため、タンデム化に利用できるベクターの改良が望まれていた。
【０００９】
【特許文献１】
特開平６−２５２９６号公報
【特許文献２】
特開平６−３０３９７１号公報
【特許文献３】
特開平７−４１５００号公報
【特許文献４】
特開平１−９５７９８号公報
【特許文献５】
特開２００２−０５１７７９号公報
【非特許文献１】
Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９８８年、第５２巻、第４号、９８３−９８８頁
【非特許文献２】
Ｇｅｎｅ．  １９８５年、第４０巻、第２−３号、１８３−１９０頁
【非特許文献３】
Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９年、第４１巻、第３号、３０１−３１１頁
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  １９８３年、第８０巻、２１−２５頁
【非特許文献５】
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８５年、第２６０巻、第６号、３５３９−３５４１頁
【非特許文献６】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８３年、第１１巻、第６号、１７０７−１７２３頁
【非特許文献７】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  １９８５年、第１６巻、２７３−２７６頁
【非特許文献８】
Ｇｅｎｅ  １９７７年、第２巻、７５−９３頁
【非特許文献９】
Ｇｅｎｅ  １９７７年、第２巻、９５−１１３頁
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８１年、第２５６巻、５２４７頁
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、有用なタンパク質をコードする各種の構造遺伝子の発現を促進するプラスミドベクター、及び該プラスミドベクターを用いたタンパク質の製造法や物質製造法、及び組換え体を利用した活性測定法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
発明者は、より多くの活性タンパク質を組換えＤＮＡ技術により形質転換体中に大量に生産させるためのベクターについて、鋭意検討を行った。その結果、かかる目的に有用なプラスミドベクターを構築し、外来遺伝子をこのプラスミドベクターに組み込んで大腸菌に導入し、得られた形質転換体を用いて組換えタンパク質を大量に生産させることに成功して、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は以下を提供する。
（１）  大腸菌細胞内において機能しうるプロモーター配列、ＳＤ配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子及び大腸菌細胞内において機能しうる複製起点を含むプラスミドベクターであって、前記クローニング部位は前記ＳＤ配列の５’側近傍及び３’側近傍の２箇所に存在し、第一及び第二のクローニング部位は制限酵素で切断したときに粘着末端を生成する制限酵素認識配列をそれぞれ一種類以上含み、前記第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせであることを特徴とするプラスミドベクター。
（２）  さらにｌａｃＩｑ遺伝子を含む、（１）のプラスミドベクター。
（３）  第一及び第二のクローニング部位に含まれる制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩまたはＰｓｔＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの認識配列の組み合わせである、（１）または（２）のプラスミドベクター。
（４）  配列番号１〜３のいずれかの配列を含む、（１）〜（３）のいずれかのプラスミドベクター。
（５）  配列番号１〜３のいずれかの配列を有するポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチドに相補鎖なポリヌクレオチドからなる二本鎖ＤＮＡを、プラスミドｐＵＳＩ２に連結することにより製造される、（４）のプラスミドベクター。
（６）  有用タンパク質をコードする遺伝子が一又は二以上組み込まれた、（１）〜（５）のいずれかのプラスミドベクター。
（７）  （１）〜（５）のいずれかのプラスミドベクターを用いて、ＳＤ配列と有用タンパク質をコードする配列からなる遺伝子を複数個連結させる方法。
（８）  （１）〜（６）のいずれかのプラスミドベクターを含む形質転換大腸菌。
（９）  （１）〜（５）のいずれかのプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、該形質転換体に有用タンパク質を産生させ、産生されたタンパク質を菌体内又は培地より精製することを特徴とする有用タンパク質の製造方法。
（１０）  （１）〜（５）のいずれかのプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて前記有用タンパク質の活性を測定する方法。
（１１）  （１）〜（５）のいずれかのプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて物質を製造する方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明のプラスミドベクター
本発明は、大腸菌細胞内において機能しうるプロモーター配列、ＳＤ配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子及び大腸菌細胞内において機能しうる複製起点を含むプラスミドベクターであって、前記クローニング部位は前記ＳＤ配列の５’側近傍及び３’側近傍の２箇所に存在し、第一及び第二のクローニング部位は制限酵素で切断したときに粘着末端を生成する制限酵素認識配列をそれぞれ一種類以上含み、前記第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせであることを特徴とするプラスミドベクターを提供する。
【００１４】
大腸菌細胞内において機能しうるプロモーターとしては、上述したようなｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターなどが挙げられる。また、ＳＤ配列とはリボソームが結合する翻訳開始配列をいい（Ｓｈｉｎｅ  Ｊ．およびＤａｌｇａｒｎｏ  Ｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．；  ｖｏｌ．  ５７，  Ｎｏ．  １，  ｐ２２１−２３０，  １９７５年）、好ましくはＡＧＧＡＧＧを含む配列をいう。
【００１５】
クローニング部位とは一般に、外来遺伝子を組み込むための制限酵素認識配列を一種類以上含む連続した配列を意味する。本発明のプラスミドベクターにおいては、クローニング部位は前記ＳＤ配列の５’側近傍及び３’側近傍の２箇所に存在し、第一及び第二のクローニング部位は制限酵素で切断したときに粘着末端を生成する制限酵素認識配列をそれぞれ一種類以上含み、前記第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つは、それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせである。ここで、近傍とは、例えば、クローニング部位とＳＤ配列との間に存在する塩基が２０塩基以内、好ましくは１２塩基以内となる位置を挙げることができるが、ＳＤ配列の５’側に関してはクローニング部位とＳＤ配列との間隔がこれ以上であってもよい。なお、ＳＤ配列と開始コドンの間隔は、５〜１２塩基であることが好ましい。また、第一及び第二のクローニング部位に含まれる前記制限酵素認識配列は、ベクター内に一箇所しか存在しないユニークな制限酵素認識配列であることが好ましい。
【００１６】
「それぞれの制限酵素で切断したときに生じる粘着末端が共通する制限酵素認識配列の組み合わせ」とは、二種類の制限酵素認識配列について、それぞれを対応する制限酵素で切断したときに生じる粘着末端の配列が互いに一致し、切断した配列を切断部位で互いに結合させることができる制限酵素認識配列の組み合わせをいう。かかる制限酵素認識配列の組み合わせとして具体的には、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）／ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）／ＢｃｌＩ（ＴＧＡＴＣＡ）、ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）／ＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）、ＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）／ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）、ＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）／ＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）、ＰｓｔＩ（ＣＴＧＣＡＧ）／ＥｃｏＴ２２Ｉ（ＡＴＧＣＡＴ）、またはＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）／ＭｕｎＩ（ＣＡＡＴＴＧ）などの制限酵素認識配列の組み合せが挙げられる。本発明のプラスミドベクターにおいては、第一及び第二のクローニング部位に含まれる制限酵素認識配列の組み合わせのうちの少なくとも一つが、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ／ＢｃｌＩ、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ／ＭｕｎＩまたはＰｓｔＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの認識配列の組み合わせであることが好ましい。なお、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩという表記法は、ＢａｍＨＩが第一のクローニング部位に含まれ、ＢｇｌＩＩが第二のクローニング部位に含まれる場合と、ＢｇｌＩＩが第一のクローニング部位に含まれ、ＢａｍＨＩが第二のクローニング部位に含まれる場合のいずれの場合も含むことを意味し、他の組み合わせにおいても同様である。
【００１７】
ＳＤ配列と第１、第２のクローニング部位を含む配列として具体的には、配列番号１、配列番号２および配列番号３が挙げられる。これらの配列を有するポリヌクレオチド及びその相補鎖からなるＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片（Ａ）と称する）は、クローニング部位に挿入した構造遺伝子の発現を促進し、構造遺伝子産物の大量生産を可能にする。
【００１８】
薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどが挙げられる。また、大腸菌細胞内において機能しうる複製起点を含む配列は、大腸菌内で複製可能な配列であれば特に限定されないが、具体的にはｐＵＳＩ２（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８年、第５２巻、９８３頁）に含まれる配列などが挙げられる。
【００１９】
本発明のプラスミドベクターはターミネーター配列を含むものであってもよい。ターミネーター配列としては、例えば前記ｐＵＳＩ２に含まれる大腸菌リポポリプロテインｌｐｐの３’ターミネーター配列などが挙げられる。本発明のプラスミドベクターはまた、上述のプロモーターの非誘導時の発現を抑制する為に、レプレッサー遺伝子を含むものであってもよい。レプレッサー遺伝子としては、例えばｌａｃＩｑ遺伝子（特開平１−９５７９８号公報）が挙げられる。
【００２０】
本発明のプラスミドベクターは、例えば前記ＤＮＡ断片（Ａ）を、前記ｐＵＳＩ２プラスミドに連結することによって作製することができる。また、ＤＮＡ断片（Ａ）をｐＵＳＩ２プラスミドに連結することによって得られたプラスミドをさらに改変してもよい。ＤＮＡ断片（Ａ）を、ｐＵＳＩ２プラスミドに連結する方法、及び得られたプラスミドを改変する方法を以下に示す。ただし、本発明のプラスミドベクターの作製方法はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
プラスミドｐＵＳＩ２は、ｔａｃプロモーター、大腸菌リポポリプロテインｌｐｐの３’ターミネーター、ｌａｃＩｑなどを有するプラスミドである（Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９８８年、第５２巻、９８３頁）。前記ＤＮＡ断片（Ａ）とｐＵＳＩ２との連結は以下のようにして行うことができる。例えばｐＵＳＩ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を分取し、市販のライゲーションキットを用いてＤＮＡ断片（Ａ）を連結する。次に得られたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、かかるＥｃｏＲＩ部位に、例えば前記ｐＵＳＩ２のＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化によって得られたｌａｃＩｑを含むＥｃｏＲＩ断片を挿入すれば良い。このようにして得られたプラスミドベクターの例としてはｐＥＶ２３、ｐＥＶ２４等が挙げられる。前記ｌａｃＩｑ遺伝子を含むＤＮＡ断片はｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社から入手可能）を鋳型にしたＰＣＲ法によっても得ることができる。
【００２２】
ＤＮＡ断片（Ａ）をｐＵＳＩ２プラスミドに連結して得られたプラスミドを改変する場合は、例えば前記ｐＥＶ２３などにおいて複製起点以外の構成要素を他のものに置き換えるとよい。すなわち、アンピシリン耐性遺伝子を他のプラスミド由来の薬剤耐性遺伝子（例えばｐＨＳＧ３９７やｐＥＴ２４由来のカナマイシン耐性遺伝子、いずれも宝バイオ社より入手可能）に置換して用いることができる。例えばｐＥＴ２４を鋳型にしたＰＣＲ法により得られたカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片で、前記ｐＥＶ２３のアンピシリン耐性遺伝子を置き換えても良い。このようにして得られたプラスミドベクターの例としてはｐＫＶ２３、ｐＫＶ２４、ｐＫＶ３０、ｐＫＶ３１、ｐＫＶ３２等が挙げられる。プロモーター配列は、ｐＫＫ２３３−２に含まれるｔｒｃプロモーターに置換するのが好ましい。
【００２３】
プラスミドｐＥＶ２１、あるいはｐＫＶ２０のクローニング部位に存在するＸｂａＩ部位は、その認識配列（Ｔ／ＣＴＡＧＡ：  ／は切断部位を示す）と重なる形で大腸菌のｄａｍメチラーゼにより認識されるＧＡＴＣ配列（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９８３  ｖｏｌ．  １５３  Ｎｏ．１，  ｐ２７４−２８０）を有している。したがって、ＤＨ５αやＪＭ１０９などのｄａｍ＋の宿主大腸菌株中ではＴ／ＣＴＡＧａＴＣＴの小文字で示したアデニン塩基がメチル化されるために、このような配列はＸｂａＩでは認識・切断されなくなる。したがって、Ｄａｍメチラーゼによるメチル化受けないように改変を行ってもよい。かかるプラスミドベクターとして、例えばｐＥＶ２３及びｐＥＶ２４が挙げられる。前記ｐＥＶ２３等のプラスミドベクターは、ベクター内にＥｃｏＲＩ認識部位を２箇所含むものであるが、ＥｃｏＲＩ認識部位が１箇所になるように改変してもよい。かかるプラスミドベクターとしては、例えばｐＫＶ３０、ｐＫＶ３１及びｐＫＶ３２が挙げられる。
【００２４】
＜２＞有用タンパク質をコードする遺伝子の導入
本発明のプラスミドベクターのクローニング部位に目的タンパク質の構造遺伝子を挿入することにより、目的のタンパク質を大量に生産させ得る組換えプラスミドが構築できる。構造遺伝子はＳＤ配列の５’側、３’側のいずれのクローニング部位に組み込んでもよい。
【００２５】
例えば、プラスミドベクターｐＫＶ２４の場合、ＳＤ配列の３’側のクローニング部位にはＳｎａＢＩ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位が構築されている。この中のいずれかの部位を利用して外来タンパク質構造遺伝子を組み込んだ場合には、プラスミドベクター上のＳＤ配列を利用しての導入遺伝子の翻訳効率を高めることができる。また、ＳＤ配列の５’側のクローニング部位にはＢａｍＨＩ、ＳｐｅＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩの制限酵素部位が構築されているが、ここに人工的にＳＤ配列を付与した形で外来タンパク質構造遺伝子を挿入することも可能である。「人工的にＳＤ配列を付与した形で」とは、例えばＳＤ配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅した遺伝子を前記プラスミドベクターに組み込むことが挙げられる。
【００２６】
本発明のプラスミドベクターに組み込む構造遺伝子としては、アミラーゼ、アミダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ヒダントイナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシゲナーゼ、カタラーゼ、Ｐ４５０還元酵素等の酵素、インシュリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、カルシトニン、インターロイキン等の生理活性ペプチドをコードする遺伝子が挙げられるが、遺伝子の種類は特に限定されない。またこれらの遺伝子はポリヒスチジンやＧＳＴなどのポリペプチドをコードする公知遺伝子と連結させて融合タンパク質が発現されるようにしてもよい。
【００２７】
本発明のプラスミドベクターは、複数の遺伝子を組み込んで発現させるのに適している。複数の遺伝子の組み込みは、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず各遺伝子を別々に、本発明のプラスミドベクターのＳＤ配列の３’側のクローニング部位内の制限酵素部位に組み込む。このようにして得られる組換えプラスミドから、第１及び第２のクローニング部位内の共通の粘着末端を有する制限酵素認識配列を認識する制限酵素の組み合わせ、例えばＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩとＢｃｌＩ、ＳｐｅＩとＸｂａＩ、ＳｐｅＩとＮｈｅＩ、ＳａｌＩとＸｈｏＩ又はＰｓｔＩとＥｃｏＴ２２Ｉなどを用いて、ＳＤ配列と構造遺伝子を含む断片を切り出し、それを市販のライゲーションキットを用いて複数個連結させる。連結により得られたＤＮＡ断片を再び本発明のプラスミドベクターに挿入することで、複数の遺伝子が組み込まれたプラスミドベクター、すなわちプラスミド１分子あたりの構造遺伝子のコピー数を上げることで発現量を増幅させた発現ベクターを構築することができる。本発明のｐＫＶ２４等のプラスミドベクターには、かかる構築に使用可能な制限酵素認識配列の組合わせが複数個用意されているので、プラスミドベクターのクローニング部位に存在する制限酵素認識配列のうちの幾つかが、組み込む構造遺伝子の中に含まれている場合においても、それ以外の制限酵素の組合わせを用いることで前記のような連結（タンデム化）が可能である。
【００２８】
また、以下の方法を用いることによってもタンデム化を行うことができる。すなわち、まず、２種類以上の遺伝子を別々にＳＤ配列の３’側のクローニング部位内の制限酵素部位に組み込む。次に、ベクター内に唯一存在する制限酵素部位（例えば、ｐＫＶ３０の場合、ＥｃｏＲＩ部位）とＳＤ配列の３’側のクローニング部位内の制限酵素認識部位（例えばＢｇｌＩＩ部位）で一方のベクターを消化し、ＳＤ配列と構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出す。次に、他方のベクターを前記クローニング部位外の制限酵素部位（ここではＥｃｏＲＩ部位）とＳＤ配列の５’側のクローニング部位内の制限酵素部位（前記３’側のクローニング部位内の制限酵素認識部位と共通の粘着末端を有する部位（ここでは、ＢａｍＨＩ））で消化し、ＳＤ配列と構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出す。これらの切り出した断片同士を連結することによりＳＤ配列と構造遺伝子を含むＤＮＡがタンデムに２個連結されたベクターを構築することができる。さらに同様の操作を繰り返すことにより、３個以上のＤＮＡのタンデム化も行うことができる。
【００２９】
また、複数個連結させる構造遺伝子としては同種類のものに限定されるものではない。例えば、ニトリルヒドラターゼのような複数のサブユニット構造からなる酵素を発現させる場合に、個々のサブユニットを本発明のプラスミドベクターにタンデムに連結することで活性型の酵素を生産することに用いたり、あるいは酸化、還元、リン酸化などのタンパクの修飾を受けて初めて活性化されるような酵素を生産させる場合に、目的の酵素タンパク質の構造遺伝子とともに当該タンパク質の修飾酵素の構造遺伝子とをタンデム化した発現ベクターを構築し、活性型の酵素を生産させたりすることもできる。
【００３０】
＜３＞本発明の形質転換大腸菌
本発明の形質転換大腸菌は、例えば本発明のプラスミドベクターに目的遺伝子を組みこみ、得られた組換えベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより得ることができる。形質転換は熱ショック法やエレクトロポレーション法等の常法によって行うことができる。
【００３１】
＜４＞本発明のタンパク質製造方法
本発明のタンパク質製造方法は、本発明のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を培養して有用タンパク質を産生させ、産生されたタンパク質を菌体内又は培地より精製することを特徴とする方法である。
【００３２】
培養に用いる培地は、当該組換え微生物が生育し、当該酵素を生産することのできるものであれば良く、特に限定されるものではない。窒素源と炭素源を適当な濃度で適宜組み合わせ、この他に適当な濃度の無機塩類、金属塩等を添加した培地でよいが、Ｌ−ｂｒｏｔｈ等が好ましい。また、培地のｐＨに関しては、用いる組換え微生物が生育し得る範囲内のｐＨであれば、特に限定されないが、ｐＨ６〜８に調整することが好適である。さらに、培養条件については、１５℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃で数時間〜１日間振盪または、通気攪拌培養すれば良い。適当な量のＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−Ｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して目的タンパク質の発現を誘導してもよいが、誘導剤添加無しの培養で得られた培養物を用いた方が、目的タンパク質の活性型もしくは可溶性型が効率よく得られる場合もある。
【００３３】
培養後の精製は、目的タンパク質が培地中に蓄積する場合は培地を用いて、菌体内に蓄積するときは、菌体を超音波破砕法などによって抽出した抽出液を用いて行うことができる。精製はカラムクロマトグラフィー等によって行うことができるが、ポリヒスチジン等との融合タンパク質として発現させたときは、アフィニティー精製等により簡便に精製することができる。
【００３４】
＜５＞本発明の活性測定法
本発明の活性測定法は、本発明のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて前記有用タンパク質の活性を測定する方法である。具体的には、酵素タンパク質を発現させた形質転換体を用いて、化合物の酵素阻害活性を評価する方法、種々の変異酵素タンパク質を発現させた形質転換体を用いて酵素活性を測定することにより、各変異の酵素活性に与える影響を評価する方法等が挙げられる。尚、活性測定系に用いる為の形質転換体は、必要に応じて抽出、精製、造粒化、固相化できる。
【００３５】
＜６＞本発明の化学物質製造法
本発明の化学物質製造法は、本発明のプラスミドベクターに有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込んでタンパク質発現用プラスミドベクターを作製し、作製したプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を用いて化学物質を製造する方法である。例えば、酵素タンパク質をコードする遺伝子を本発明のプラスミドベクターに組み込んで導入した形質転換体を作製し、得られた形質転換体に原料の化学物質を添加し、酵素反応によって目的物質に変換する方法等が挙げられる。具体的には、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体を用いて、ニトリル類をアミド類に変換する方法などを挙げることができる。化学物質製造法に用いる為の形質転換体は、必要に応じて抽出、精製、造粒化、固相化できる。
【００３６】
【実施例】
以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
＜実施例１  プラスミドｐＥＶ１１およびｐＥＶ１２の構築＞
プラスミドｐＵＳＩ２とｐＫＫ２３３−２（ファルマシア製＃２７−５００５−０１）を制限酵素ＳｃａＩとＮｄｅＩで其々切断し、得られたｐＵＳＩ２由来の約２．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＫＫ２３３−２由来の約１．５ｋｂのＤＮＡ断片Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、得られた連結産物で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＵＳＩ２ΔＰ１を含むものを選択し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。結果的に得られたプラスミド、ｐＵＳＩ２ΔＰ１はｐＵＳＩ２のアンピシリン耐性遺伝子上に存在するＰｓｔＩ部位を消失したものである。
【００３８】
次に、ｐＵＳＩ２ΔＰ１をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで切断し、更にライゲーション時のセルフライゲーションを抑制するために、ＣＩＰ（仔牛小腸アルカリフォスファターゼ）を用いてＤＮＡ断片の３’末端のリン酸基を外して水酸基に変換したものを調製した。５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸基を付与した配列番号４と配列番号５に示すオリゴヌクレオチドを熱変性後にアニーリングさせ、得られたＤＮＡを前記のＣＩＰ処理したＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。連結産物で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換し、得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＥＶ１１及びｐＥＶ１２を含むものを選択し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、更には塩基配列を確認した。
【００３９】
＜実施例２  プラスミドｐＥＶ２１の構築＞
ｐＥＶ１１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断し、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、及びクローニング部位、ｌｐｐターミネーター配列、複製の起点、アンピシリン耐性遺伝子を含む約３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を常法により調製した。約３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＫＫ２３３−２より調製した約３００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、得られた連結産物で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＥＶ２０を含むものを選択した。
【００４０】
次にｐＥＶ２０をＥｃｏＲＩで切断し、更にＣＩＰ処理を行ったものを調製し、ｌａｃＩｑ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結して、得られた連結産物で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＥＶ２１を含むものを選択した。ｐＥＶ２１に挿入されたｌａｃＩｑ遺伝子の挿入方向はｐＥＶ１１と同じ向きであった。
【００４１】
＜実施例３  プラスミドｐＫＶ２０の構築＞
プラスミドｐＥＶ２１は選択マーカーとしてアンピシリン耐性マーカーを持つプラスミドであるが、同様なプラスミドで選択マーカーがカナマイシン耐性マーカーとなったプラスミド、ｐＫＶ２１を以下のようにしてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）を用いて構築した。ＰＣＲはＭＪリサーチ社のＭＪ１００を使用して、使用説明書に基づき、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を使って行った。すなわち、基質となるカナマイシン耐性マーカーをもつプラスミドｐＥＴ２４のＤＮＡを０．５μＬ（１０ｎｇ相当量）、１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］を７．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓミックスを６μＬ、４０μＭプライマーを各０．４μＬ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．４μＬを加えて７５μＬの系とした。＋鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号６のプライマーを用い、これと組み合わせる−鎖ＤＮＡプライマーとしては、配列番号７のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの反応は９５℃、１分間の前処理後、９５℃、３０秒間（変性ステップ）、５８℃、１分間（アニーリングステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを１８サイクル行った。最後に７２℃で５分間のインキュベーションを行い反応を終了した。
【００４２】
このようにして得られた反応液のうち、２５μＬを１．２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的に増幅された約１．２ｋｂのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメントを回収し、更にＢＩＯ１０１社のＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて、添付の説明書に従ってゲルスライスからＤＮＡ断片を抽出・精製した。得られた約２５μＬのＤＮＡ断片溶液のうち１０μＬを用いて制限酵素ＡｌｗＮＩとＥｃｏＲＩとで切断し、これを予め常法によりｐＥＶ２１のＡｌｗＮＩとＥｃｏＲＩ消化物から調製した約３ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。連結産物で大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを形質転換し、カナマイシン耐性で選択することにより、目的のプラスミド、ｐＫＶ２０を含むクローンを得、さらに常法によりプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４３】
＜実施例４  プラスミドｐＥＶ２３、ｐＥＶ２４、ｐＫＶ２３、及びｐＫＶ２４の構築＞
プラスミドｐＥＶ２１、あるいはｐＫＶ２０のクローニング部位に存在するＸｂａＩ部位はその認識配列（Ｔ／ＣＴＡＧＡ：  ／は切断部位を示す）と重なる形で大腸菌のｄａｍメチラーゼにより認識されるＧＡＴＣ配列を有している。すなわち、ＤＨ５αやＪＭ１０９などのｄａｍ＋の宿主大腸菌株中ではＴ／ＣＴＡＧａＴＣＴの小文字で示したアデニン塩基がメチル化をされるためにこのような配列はＸｂａＩでは認識・切断されなくなる。このような配列を有していても、例えばＤＭ１などのｄａｍ−変異を有する大腸菌に導入してプラスミドを調製することで、前述のようなメチル化は受けなくなり再びＸｂａＩで切断される様になるが、ＤＭ１のコンピテントセルの形質転換効率はＤＨ５αのような汎用される大腸菌宿主に比べて悪く、ＤＭ１のような宿主を用いて発現ベクターの構築をするのは効率的ではない。
【００４４】
そこで以下に示すようにしてＰＣＲを用いてｐＥＶ２１のＸｂａＩ部位をメチル化の影響を受けない配列に変換すると共に、プラスミドベクター中で２箇所に存在するＥｃｏＲＩ部位のうちの一方を改変してＥｃｏＲＩで切断されなくしたプラスミドベクターを構築した。
【００４５】
ＰＣＲはＭＪリサーチ社のＭＪ１００を使用して、使用説明書に基づき、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を使って行った。すなわち、基質となるプラスミドｐＥＶ２１のＤＮＡを０．５μＬ（１０ｎｇ相当量）、１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］を７．５μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓミックスを６μＬ、４０μＭプライマーを各０．４μＬ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．４μＬ加えて７５μＬの系とした。＋鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号８のプライマーを用い、これと組み合わせる−鎖ＤＮＡプライマーとしては、配列番号９の配列を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの反応は９５℃、１分間の前処理後、９５℃、３０秒間（変性ステップ）、５８℃、１分間（アニーリングステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを１８サイクル行った。最後に７２℃で５分間のインキュベーションを行い反応を終了した。
【００４６】
このようにして得られた反応液のうち、２５μＬを１．２％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的に増幅された約１．５ｋｂのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメントを回収し、更にＢＩＯ１０１社のＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて、添付の説明書に従ってゲルスライスからＤＮＡ断片を抽出・精製した。得られたＤＮＡ溶液約２５μＬのうち０．２μＬを用いて精製ＤＮＡ断片を宝バイオ社のｐＴ７−ＢｌｕｅベクターにＴＡクローニング法によりクローン化した。
【００４７】
得られたクローンからプラスミド、ｐＴＢ−ｌａｃＩｑ／ｔｒｃのＤＮＡを常法により調製し、制限酵素ＭｕｎＩとＢｇｌＩＩで切断して得られるｌａｃＩｑを含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。これをｐＥＶ２１、あるいはｐＫＶ２０を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩで切断して得られるそれぞれ３．１ｋｂ、３．３ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、最終的にプラスミド、ｐＥＶ２３およびｐＫＶ２３を得た。
【００４８】
また、ｐＴＢ−ｌａｃＩｑ／ｔｒｃを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｄＮＴＰｓ存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより突出末端をフィルインにより平滑化した後にＭｕｎＩで切断して得られるｌａｃＩｑを含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＥＶ２１、あるいはｐＫＶ２０を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、ｄＮＴＰｓ非存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより突出末端を削って平滑化した後にＥｃｏＲＩで切断して得られるそれぞれ３．１ｋｂ、３．３ｋｂのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、最終的にプラスミド、ｐＥＶ２４およびｐＫＶ２４を得た。
【００４９】
＜実施例５  プラスミドｐＫＶ３０の構築＞
ｐＫＶ２４を制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩで切断し、更にライゲーション時のセルフライゲーションを抑制するためにＣＩＰ（仔牛小腸アルカリフォスファターゼ）を用いてＤＮＡ断片の３’末端のリン酸基を外して水酸基に変換したものを調製した。オリゴヌクレオチドの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸基を付与した配列番号１０と配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを熱変性後にアニーリングさせ、得られたＤＮＡを前記のＣＩＰ処理したＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結産物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＫＶ３０（図１）を含むものを選択し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、更には塩基配列を確認した。
【００５０】
＜実施例６  プラスミドｐＫＶ３１及びｐＫＶ３２の構築＞
ｐＫＶ３０を制限酵素ＳｐｅＩとＭｕｎＩで切断し、更にライゲーション時のセルフライゲーションを抑制するためにＣＩＰ（仔牛小腸アルカリフォスファターゼ）を用いてＤＮＡ断片の３’末端のリン酸基を外して水酸基に変換したものを調製した。オリゴヌクレオチドの５’末端にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸基を付与した配列番号１２と配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドを熱変性後にアニーリングさせ、得られたＤＮＡを前記のＣＩＰ処理したＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結産物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルに形質転換し、得られた形質転換体の中から目的のプラスミド、ｐＫＶ３１（図１）を含むものを選択し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、更には塩基配列を確認した。
【００５１】
同様にして、配列番号１２と配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドの代りに配列番号１４と配列番号１５に示すオリゴヌクレオチドを用いてプラスミドｐＫＶ３２（図１）を構築し、塩基配列を確認した。
【００５２】
＜実施例７  ヒトＰ４５０オキシドレダクターゼ遺伝子の発現プラスミドベクターの構築＞
ヒトＰ４５０オキシドレダクターゼ遺伝子（ＰＯＲ遺伝子）は以下の様にＰＣＲ法を用いて増幅し取得した。
【００５３】
ＰＣＲはＭＪリサーチ社のＭＪ１００を使用して、使用説明書に基づき、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝バイオ社製）を使って行った。すなわち、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック製、＃）を約０．５μｇ、１０培濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］を７．５μＬ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓミックスを６μＬ、４０μＭプライマーを各０．４μＬ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．４μＬ加えて７５μＬの系とした。＋鎖ＤＮＡプライマーとして配列番号１６のプライマーを用い、これと組み合わせる−鎖ＤＮＡプライマーとしては、配列番号１７の配列を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの反応は９５℃、２分間の前処理後、９５℃、２０秒間（変性ステップ）、５８℃、３０秒間（アニーリングステップ）、７２℃、２分間（伸長ステップ）のインキュベーションを３０サイクル行った。最後に７２℃で５分間のインキュベーションを行い反応を終了した。
【００５４】
このようにして得られた反応液のうち、２５μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供し、特異的に増幅された約２ｋｂのバンドを常法に従って切り出してＤＮＡフラグメントを回収し、更にＢＩＯ１０１社のＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩキットを用いて、添付の説明書に従ってゲルスライスからＤＮＡ断片を抽出・精製した。得られたＤＮＡ溶液約２５μＬのうち０．２μＬを用いて、精製ＤＮＡ断片を宝バイオ社のｐＴ７−ＢｌｕｅベクターにＴＡクローニング法によりクローン化した。
【００５５】
得られたクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、常法に従って塩基配列の解析を行い、目的のヒトＰＯＲ遺伝子（配列番号１８）を含むクローン、ｐＣＲ−ＰＯＲ１１を取得した。次にｐＣＲ−ＰＯＲ１１のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断して得られるＰＯＲ遺伝子を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、これを制限酵素ＭｕｎＩ−ＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＫＶ３０、ｐＫＶ３１、及びｐＫＶ３２にそれぞれ挿入し、３種類の発現プラスミド、ｐＫＰＯＲ１、ｐＫＰＯＲ１１、ｐＫＰＯＲ１２をそれぞれ得た（図１）。
【００５６】
＜実施例８  ヒトＰ４５０オキシドレダクターゼ遺伝子の発現＞
実施例７で構築した３種類の発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に導入し、タンパク質の発現を試みた。すなわち、得られたそれぞれの形質転換体を５００μＬのＬＢ（３０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン含有）培地に接種し３０℃で一昼夜培養した後、５ｍＬのＬＢ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシン含有）培地に植え継いだ後、３０℃で１時間培養し、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるよう添加し、さらに３０℃で６時間培養した。
【００５７】
培養液から７５０μＬ分を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに分取して遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分）により菌体を集め、菌体を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、２ｘサンプルバッファーを１００μＬを加えた後に９５℃、５分間の処理を行い、１５００ｒｐｍで５分遠心した後の上清を、常法に従って１２．５％のＳＤＳ−ポリアクリルドゲル電気泳動に供し、Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  ＮＡＤＰＨ  Ｐ−４５０  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（第一化学薬品（株）、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ２２３０２０）を用いたウエスタンブロッティングによる解析を行なった。
【００５８】
その結果、ＰＯＲのコード領域のアミノ酸配列（配列番号１９）から推定される分子量に相当する位置にＰＯＲ抗体と特異的に反応するタンパク質のバンドが観察され、ＰＯＲ遺伝子を持たないプラスミドｐＫＶ３０を導入した形質転換体では反応するバンドが確認されなかった。また、この発現条件ではｐＫＰＯＲ１１を持つ形質転換体が最もＰＯＲを多く発現し、ｐＫＰＯＲ１２を導入したものが最もＰＯＲ発現量が少なかった。
【００５９】
＜実施例９  ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子産物の活性発現＞
ヒトＰ４５０は実施例８に記載されたＰＯＲ遺伝子産物による還元を受け、活性型のＰ４５０となることが知られている（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，  ｖｏｌ．  ３９７，  ｐ２１０−２１４  （１９９６），  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  ｖｏｌ．  ３２７，  ｐ２５４−２５９  （１９９６））。そこで、大腸菌の中でＰＯＲとＰ４５０を共発現させることで、活性型のＰ４５０を発現させる系の構築を行なった。
【００６０】
Ｐ４５０としてはヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子を用いる事とし、同遺伝子を実施例７と同様にしてＰＣＲ法により増幅し、取得した。
【００６１】
すなわち、配列番号２０及び配列番号２１のプライマーを用いて、実施例７と同じ肝臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、同じＰＣＲの反応条件で反応を行なった。
【００６２】
得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を切りだし、ｐＴ７−Ｂｌｕｅにクローン化してＣＹＰ２Ｃ９遺伝子（配列番号２２）を持つクローン、ｐＣＲ−ＣＹＰ２Ｃ９ｍを取得した。次にｐＣＲ−ＣＹＰ２Ｃ９ｍから２Ｃ９遺伝子を含む約１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を切りだし、ｐＫＶ３０のＭｕｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入して発現プラスミドベクター、ｐＫＣＰ２Ｃ９を得た（図２）。
【００６３】
実施例７で構築したプラスミド、ｐＫＰＯＲ１１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｔｒｃプロモーターとＳＤ配列、及びＰＯＲの構造遺伝子を含む２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片として切りだし、ｐＫＣＰ２Ｃ９からＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩで切り出されるプロモーター配列と入れ換えてＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、最終的にＰＯＲ遺伝子とＣＹＰ２Ｃ９遺伝子がベクター上でタンデムに連結されたプラスミド、ｐＫＲＰ２Ｃ９を得た（図３）。
【００６４】
このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に導入し、得られた２ＣＹ２Ｃ９タンパク質（配列番号２３）を発現する形質転換体を用いて組換えＰ４５０膜画分の調製を行なった。
【００６５】
＜実施例１０  ヒトＣＹＰ２Ｃ９発現大腸菌からの膜画分調製と活性測定＞
実施例９で調製・保存した培養後の菌体を氷上にてｂｕｆｆｅｒ  Ａ  （１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）２０ｍＬで懸濁した。そこに等量のｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２ｍｇ／ｍＬ  ミリＱ水）を添加し、氷中で３０ｍｉｎ穏やかに振とうした。４，０００ｘｇ、１０分、４℃の遠心で得られた沈殿画分を９ｍＬのｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（１００ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、６ｍＭ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、２０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）に懸濁した。さらに終濃度２．５ｍＭとなるようにＰＭＳＦを加え、食塩添加氷浴中で冷却しながらソニケーションを行なって細胞を破砕し、１０，０００ｘｇ、１０分、４℃での遠心を行った。得られた上清画分を更に２５７，０００ｘｇ、１０分、４℃での遠心を行い、得られた沈澱画分を１ｍＬのｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、−８０℃で保存した。
【００６６】
得られたサンプルのＰ４５０含量測定は常法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９７４，  ｖｏｌ．  ６０  Ｎｏ．  １，  ｐ８−１４）に従い行なった。また、ＣＹＰ２Ｃ９活性測定は、常法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２４８，  ｐ１８８−１９０  （１９９７））に従い７−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｏｕｍａｒｉｎ  の脱メチル化を指標として行なった。また、ＣＹＰ２Ｃ９の選択的阻害剤であるＳｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅを対照薬として用いた。得られた膜標品のＰ４５０含量は１３．７５ｎｍｏｌ／ｍＬ、蛋白濃度は３２．４ｍｇ／ｍＬ、Ｓｕｌｆａｐｈｅｎａｚｏｌｅによる阻害のＩＣ５０値は０．４３μＭであった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明のプラスミドベクターを用いてタンパク質を発現させることにより、効率よく大量のタンパク質を発現させることができる。また、本発明のプラスミドベクターを用いることにより、複数のタンパク質を単一のプラスミドベクターで発現させることができる。本発明のプラスミドベクターで形質転換した大腸菌はタンパク質の生産、活性測定、化学物質の製造等に有用である。
【００６８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＰ４５０オキシドレダクターゼ遺伝子発現プラスミドベクターの構築を示す図。
【図２】ヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子発現プラスミドベクターの構築を示す図。
【図３】ヒトＰ４５０オキシドレダクターゼ遺伝子とヒトＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の共発現プラスミドベクターの構築を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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