(57)【要約】【課題】  既知糸状菌を排除して新規糸状菌を含む糸状菌群を広汎かつ効率的にスクリーニングする方法及びこれによる有用糸状菌の提供。【解決手段】  試料から分離した糸状菌菌糸を、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に各々１個ずつ接種して培養し、早期に成長する菌株を除去し、そのウェルに殺菌剤を入れる操作を少なくとも３日間行いつつ培養を継続し、他のウェルでその後に成長した菌株を採取することを特徴とする糸状菌の分離採取方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から分離した糸状菌菌糸を、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に各々１個ずつ接種して培養し、早期に成長する菌株を除去しそのウェルに殺菌剤を入れる操作を少なくとも３日間行ないつつ培養を継続し、他のウェルでその後に成長した菌株を採取することを特徴とする糸状菌の分離採取方法。
【請求項２】
試料から分離した糸状菌菌糸を、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に各々１個ずつ接種して培養し、２〜５日間で成長する菌株を除去し、そのウェルに殺菌剤を入れる操作を行いつつ、６日目以降に他のウェルで成長した菌株を採取する請求項１に記載の分離採取方法。
【請求項３】
土壌試料を滅菌水に分散し、超音波処理後静置して上清を除去する工程を繰り返すことにより調製した、胞子を除去した試料から分離した糸状菌菌糸を用いる請求項１に記載の分離採取方法。
【請求項４】
殺菌剤としてシクロヘキシミドを用いる請求項１に記載の分離採取方法。
【請求項５】
複数のウェルを有するマイクロプレート、抗細菌性抗生物質を含む培地及び抗真菌剤を含む請求項１乃至３のいずれかの方法に用いられる糸状菌分離採取用キット。
【請求項６】
２８ＳｒＤＮＡのＤ１〜Ｄ２領域の塩基配列において、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８または２０に記載の塩基配列との相同性が９７％以上である糸状菌。
【請求項７】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM P-19621、寄託番号FERM P-19622、寄託番号FERM P-19623、寄託番号FERM P-19624、寄託番号FERM P-19625、寄託番号FERM P-19626、寄託番号FERM P-19627、寄託番号FERM P-19628、寄託番号FERM P-19629または寄託番号FERM P-19630として寄託されている糸状菌またはそれら糸状菌との塩基配列の相同性が、２８ＳｒＤＮＡにおけるＤ１〜Ｄ２領域において９５％以上である請求項６記載の糸状菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規糸状菌の分離採取方法、その方法により分離される新規糸状菌及びその方法に用いる糸状菌分離採取キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質、抗ウイルス物質、除草活性物質、植物成長促進物質、殺虫活性物質、人または動物において各種の生理活性を示す物質、バイオマスの活用や物質生産に有用な酵素等有用物質を生産する糸状菌は多数知られている。また、糸状菌自体も有害物質の分解や防虫・殺虫に用いられている。
従って、新規な糸状菌を見出すことによって、新たな有用物質を入手し得ることが期待できる。
【０００３】
新規な糸状菌の発見のために、新しい分離源（例えば、昆虫腸内、植物生葉、汽水域）の開発も進められている。しかし、従来の分離源も新しい分離源も糸状菌叢は多数の菌種から成り立っており、個別に菌種を分離採取し得る新たな手法の開発が望まれている。
【０００４】
糸状菌の選択分離法としては、分離源から採取した糸状菌混合物を培養するとともにエタノールと共に熱処理を行なうアルコール熱処理法が知られている（非特許文献１：Warcup, J. H. and Baker, K. F. (1963) Occurrence of dormant ascospores in soil. Nature, 197, 1317-1318）。この方法では、エタノールとの熱処理によって、ムコール属(Mucor)、フサリウム属(Fusarium)、トリコデルマ属(Trichoderma)などの既知糸状菌が殺菌される一方、熱によって発芽促進される一部の子のう菌類のネオサルトルヤ属（Neosartorya）、ユーペニシリウム属(Eupenicillium)やタラロマイセス属(Talaromyces)菌などが選択的に分離できる。しかし、この方法ではエタノールとの熱処理に耐え得る糸状菌しか残らないため分離できる菌株が限られる。
【０００５】
分生子をパーコール密度勾配−遠心法で分画する方法も提案されている（非特許文献２：Okuda, T., Yanagisawa, M., Fujimori, F., Nishizuka, Y., Takehana and Sugiyama, M. (1995) New isolation methods and polymerase shain reaction strain discrimination techniques for natural products screening programs. Can. J. Bot., 73, S946-S954）。しかし、パーコール密度勾配では菌種ごとの分生子の分離が不十分であり、有効な方法ではない。
【０００６】
また、釣り餌法も知られているが（非特許文献３：Okoshi, S. and Takashio, M. (1962) Isolation of Microsporum gypseum and Keratinomyces ajelloi from soil in Japan and perfect stage, or cleistothecia, of M. gypseum. Japan. J. Med. Mycol., 3, 130-135、非特許文献４：Tribe, H. T. (1957) Ecology of micro-organisms in soils as observed during their development upon buried cellulose film. In Microbial Ecology. Edited by Specer, C. C. and Williams, R. E. O., Cambridge Univ. Press, pp. 287-298 ）、多様な菌を分離できず、それほど有効な方法とはいえない。
【０００７】
以上のように、従来の選択分離法では、一般的な糸状菌を排除して、新規糸状菌を含む多様な糸状菌群を残すことが困難である。これは、糸状菌には適当な選択圧がないという事実を反映している。すなわち、新規（すなわち、稀少）糸状菌は、多くの場合、自然界に広く存在する既知の糸状菌よりも環境に敏感で様々な選択圧によって死滅してしまうためと考えられる。従って、選択圧をかける発想とは異なる新たな糸状菌選択分離採取方法が求められている。
【０００８】
【非特許文献１】Warcup, J. H. and Baker, K. F. (1963) Occurrence of dormant ascospores in soil. Nature, 197, 1317-1318
【非特許文献２】非特許文献２：Okuda, T., Yanagisawa, M., Fujimori, F., Nishizuka, Y., Takehana and Sugiyama, M. (1995) New isolation methods and polymerase shain reaction strain discrimination techniques for natural products screening programs. Can. J. Bot., 73, S946-S954
【非特許文献３】Okoshi, S. and Takashio, M. (1962) Isolation of Microsporum gypseum and Keratinomyces ajelloi from soil in Japan and perfect stage, or cleistothecia, of M. gypseum. Japan. J. Med. Mycol., 3, 130-135
【非特許文献４】Tribe, H. T. (1957) Ecology of micro-organisms in soils as observed during their development upon buried cellulose film. In Microbial Ecology. Edited by Specer, C. C. and Williams, R. E. O., Cambridge Univ. Press, pp. 287-298
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明は、公知の糸状菌を排除して新規な糸状菌を含む糸状菌群を広汎かつ効率的にスクリーニングし、その中から新規糸状菌を分離採取する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、従来の一般的な分離方法で分離される既知の糸状菌の成長が速い点に着目し、早期に成長する菌を培養系から排除しつつ比較的成長が遅い糸状菌を選択的に分離することにより、新規な糸状菌を含む糸状菌群を広汎かつ効率的にスクリーニングし得ること、その具体的手段として複数のウェルを備えたマイクロプレートでの培養が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の糸状菌分離採取方法、特に新規糸状菌の分離採取方法、この方法により得られる糸状菌及びこの分離採取方法に用いる糸状菌分離用キットを提供する。
【００１２】
１．試料から分離した糸状菌菌糸を、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に各々１個ずつ接種して培養し、早期に成長する菌株を除去しそのウェルに殺菌剤を入れる操作を少なくとも３日間行ないつつ培養を継続し、他のウェルでその後に成長した菌株を採取することを特徴とする糸状菌の分離採取方法。
２．試料から分離した糸状菌菌糸を、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に各々１個ずつ接種して培養し、２〜５日間で成長する菌株を除去し、そのウェルに殺菌剤を入れる操作を行いつつ、６日目以降に他のウェルで成長した菌株を採取する前記１に記載の分離採取方法。
３．土壌試料を滅菌水に分散し、超音波処理後静置して上清を除去する工程を繰り返すことにより調製した、胞子を除去した試料から分離した糸状菌菌糸を用いる前記１に記載の分離採取方法。
４．殺菌剤としてシクロヘキシミドを用いる前記１に記載の分離採取方法。
５．複数のウェルを有するマイクロプレート、抗細菌性抗生物質を含む培地及び抗真菌剤を含む前記１乃至３のいずれかの方法に用いられる糸状菌分離採取用キット。
６．２８ＳｒＤＮＡのＤ１〜Ｄ２領域の塩基配列において、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１８または２０に記載の塩基配列との相同性が９７％以上である糸状菌。
７．独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号FERM P-19621、寄託番号FERM P-19622、寄託番号FERM P-19623、寄託番号FERM P-19624、寄託番号FERM P-19625、寄託番号FERM P-19626、寄託番号FERM P-19627、寄託番号FERM P-19628、寄託番号FERM P-19629または寄託番号FERM P-19630として寄託されている糸状菌またはそれら糸状菌との塩基配列の相同性が、２８ＳｒＤＮＡにおけるＤ１〜Ｄ２領域において９５％以上である前記６記載の糸状菌。
【００１３】
Ａ．糸状菌分離採取方法
以下に本発明による糸状菌分離採取方法を説明する。
【００１４】
本発明による糸状菌分離採取方法では、初めに糸状菌分離源から糸状菌混合物試料を調製する。分離源の環境は特に限定されないが、通常は土壌、淡水域、汽水域、植物体表面等を含む自然環境あるいは動物体内外（例えば、動物表面や昆虫腸内等）の生体内環境である。また、これらの環境から採取した糸状菌叢に突然変異源を付与して突然変異を誘発した糸状菌混合物をも用いることができる。
【００１５】
糸状菌混合物試料は、公知の任意の方法（例えば、Warcup, J.H. (1955) Isolation of fungi from hyphae present in soil. Nature 175: 953-954）を用いて調製できる。例えば、土壌等の粒子状分離源から採取する場合は、粒子を滅菌イオン交換水に懸濁させ、撹拌後静置して上清を捨てる操作を上清が清澄になるまで、例えば、５〜１０回程度繰り返し、菌糸体を含む沈殿物を採取する。淡水域等からの水性試料の場合は、懸濁化処理を省略できるほかは同様である。
【００１６】
上記の懸濁時には、超音波洗浄器等による超音波振動を加えることが好ましい。これにより、土壌中の団粒構造が壊れ、菌糸の採取が容易になる。
【００１７】
残った沈殿物の一部をぺトリ皿に広げ、実体顕微鏡（１００倍）等で観察しながら菌糸の採取を行ない（例えばピンセットで取り出す）、マイクロプレートの複数のウェル中の培地に１本（片）ずつ接種する。
【００１８】
マイクロプレートは、培養用の穴（ウェル）を複数有するプレートであり、市販のものが利用できる。マイクロプレートとしては、一般に６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、１９２ウェル、３８４ウェルマイクロプレートが市販されているが、これらに限られず任意のウェル数のものが利用できる。好ましいウェル数は、試料に含まれる菌糸の数と作業効率によって決まるが、通常は４８〜１９２ウェル、典型的には９６ウェルのマイクロプレートである。
【００１９】
ペトリ皿のような連続する培地に菌糸を接種した場合には、成長の速い糸状菌（多くは公知の糸状菌）が培地面に拡大する。このため、それ以外の糸状菌の分離採取が困難であるが、本発明によれば、マイクロプレートを用いて菌糸１本１本を個別のウェルで培養することにより成長の遅い糸状菌を確実に分離採取することが可能となる。
【００２０】
マイクロプレートの各ウェルには、糸状菌の培養に通常用いられる培地を入れておく。培地は、炭素源として、ブドウ糖、ショ糖、水飴、スターチ、デキストリン等の炭水化物、窒素源として、酵母エキス、大豆粉、ペプトン、小麦胚芽、コーンスティープ、硝酸塩、アンモニア塩等を使用することができる。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄その他の各種無機塩類および菌の成長を促進する有機または無機化合物を添加する。ｐＨは３〜１３の範囲、好ましくは５〜７の範囲である。また、細菌類等の繁殖を防ぐため抗細菌性抗生物質（クロラムフェニコール等）を添加することが好ましい。
【００２１】
マイクロプレートの各ウェルに分注する培地の量は、用いるマイクロプレートの種類により異なるが、９６穴マイクロプレートを用いた場合には、１００〜２００μｌ程度である。
各ウェルの培地に菌糸を１個ずつ接種した後、培養を行う。培養温度は１０〜４０℃、至適温度は２５〜３０℃の範囲である。成長の確認は肉眼または実体顕微鏡で行う。
【００２２】
マイクロプレート上の菌糸の成長速度が様々であり、速いものは２〜３日のうちに成長するが、これらは通常、既知の糸状菌であるムコール属(Mucor spp.)、トリコデルマ属（Trichoderma spp.）、ペニシリウム属(Penicillium spp.)、フサリウム属（Fusarium spp.）ニューロスポラ属（Neurospora spp.）、アスペルギルス属（Aspergillus spp.）、ペシロミセス属(Paecilomyces spp.)等の菌種である。これら成長速度の早い菌種はマイクロプレートのウェルから培地ごと取り除いても、近傍のウェルに拡大する場合がある。そこで、本発明では、早期に成長が認められたウェルについては、培地ごと除去した後、他のウェルへの汚染を確実に防止するために、そのウェルに殺菌剤を添加する。その後、シールでウェルを塞いでもよい。
【００２３】
殺菌剤としては、早期に成長する菌の成長を確実に抑制できるものであれば特に制限はなく、例えば、硫酸等の強酸性物質、水酸化ナトリウム等の強塩基物質、抗真菌剤等の水溶液を挙げることができる。抗真菌剤としては、抗真菌剤として慣用されるものであればいずれも用いることができるが、水溶性でしかも無色であることからシクロヘキシミドが好ましい。また、高濃度の無機塩類（塩化ナトリウム等）水溶液を用いることもできる。
【００２４】
早期成育菌糸の除去殺菌は適宜なタイミングで行なう。培養開始後、例えば、７日後等に任意の日までに成長した株を除去し殺菌する。通常は５日以内、典型的には２〜４日の間に成長する菌株を除くことが好ましい。
【００２５】
残る他のウェルでその後に成長したものを採取することにより従来知られていない新規の糸状菌を得ることができる。菌株の採取時期は、通常６日以後、好ましくは６日以後４０日以内が、培養条件や採取しようとする菌株の特性によってはこの範囲外でもよい。
【００２６】
取得した菌株は、形態学的または遺伝子解析による系統解析を行なって新規糸状菌であるか否かを確認できる。系統解析にはリボソーム（特に２８Ｓ）ＤＮＡ領域を用いることが好ましい。具体的には、２８ＳｒＤＮＡのＤ１−Ｄ２および／またはＩＴＳ領域の塩基配列による系統解析が有効である。
【００２７】
分子系統学的解析は、例えば、糸状菌用プライマーＮＬ１（５’−ｇｃａｔａ  ｔｃａａｔ  ａａｇｃｇ  ｇａｇｇａ  ａａａｇ−３’（配列番号１））とＮＬ４（５’−ｇｇｔｃｃ  ｇｔｇｔｔ  ｔｃａａｇ  ａｃｇｇ−３’（配列番号２））を用いて（O ’Donnell, K. (1993) Fusarium and its near relation. In The fungal homolorph: mitotic, metotic and pleomotphic speciation in fungal systematics. Edited by Reynolds, D. R. and Taylor, J. W., CAB International, pp. 225-233）ＰＣＲ反応を行ない、決定された塩基配列についてＢＬＡＳＴ検索によって系統樹を作成して近縁種を検索する。上記以外のプライマーを用いることも可能である。
【００２８】
Ｂ．新規糸状菌
以下、本発明の方法により分離される糸状菌について説明する。
【００２９】
本発明により分離される糸状菌は、従来用いられている培地では成長が遅く、かつ、胞子を形成しないものが多い。一般には２８ＳｒＤＮＡにおけるＤ１−Ｄ２領域の塩基配列において公知の菌株との相同性が９５％未満であれば新種の菌株の可能性が高い。また、２８ＳｒＤＮＡにおけるＤ１−Ｄ２領域の塩基配列において公知の菌株との相同性が９０％未満であれば別属の菌株である可能性が高いが、本発明の方法によれば、例えば９６ウェルのマイクロプレートを用いる１回の分離採取操作で、１〜５程度のウェルにこれまで知られていない新規な糸状菌を培養、分離することができる。
【００３０】
本発明の方法により現時点までに糸状菌に属する以下の新規菌株が見出された。これらの菌株は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年１月８日付で寄託され、以下の寄託番号が付与されている。
（１）HK-7d-3：寄託番号FERM P-19626、
（２）AK-9d-5：寄託番号FERM P-19622、
（３）AK-9d-3：寄託番号FERM P-19621、
（４）TH-6d-1：寄託番号FERM P-19628、
（５）TH-6d-2：寄託番号FERM P-19629、
（６）TG-21d：寄託番号FERM P-19627、
（７）AY-7d-1：寄託番号FERM P-19623、
（８）AY-7d-2：寄託番号FERM P-19624、
（９）GS-7d-3：寄託番号FERM P-19625、
（10）YH-22d-2：寄託番号FERM P-19630。
【００３１】
上記菌株の菌学的性状は次のとおりである。なお、菌の培養に使用した培地の組成は以下に示すとおりである。
ポテトデキストロースアガー（以下ＰＤＡと記す）：ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）３９ｇ、蒸留水1000ｍＬ、
モルトエキスアガー(Malt Extract Agar:以下ＭＥＡと記す)：バクトモルトエキス２０ｇ、寒天１５ｇ、蒸留水1000ｍＬ、
オートミールアガー(Oatmeal Agar:以下ＯＡと記す)：バクトオートミール寒天培地72.5ｇ、蒸留水1000ｍＬ、
三浦培地（ＬＣＡ培地：以下ＬＣＡと記す）：グルコース１ｇ、酵母エキス0.2ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  0.2ｇ、ＫＣｌ  0.2ｇ、ＮａＮＯ３  ２ｇ、寒天１３ｇ、蒸留水 1000ｍＬ。
【００３２】
（１）HK-7d-3：寄託番号FERM P-19626
各培地上で２５℃、１週間後および７週間培養後の培養性状を表１に示す。
「色調」の欄ではコロニーの表面と裏面で色調に違いが見られた場合のみ「表面」「裏面」に分けて記載し、表裏に違いが認められなかった時にはまとめて記載した。括弧内はKornerup and Wanscher(1978)で用いられている「色」のCode No.を示している。
また、「＊可溶性色素」の欄で「−」は観察されなかったことを示す。
【００３３】
【表１】
2005224123.tif 000002
【００３４】
栄養菌糸(vegetative hyphae)は、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、有隔壁菌糸の形成が認められる。菌糸幅はほぼ一定で、菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。長期間培養しても、厚壁胞子(chlamydospore)の形成は認められない。分生子柄(conidiophore)は分岐が認められず、栄養菌糸との差が見られない。分生子形成細胞(conidiogenous cell)は、不明瞭である。分生子については、栄養菌糸の先端部から不規則な切れ込みが入り、各細胞が分生子となる分節型(arthlic)の分生子形成構造が認められた。栄養菌糸の分断により形成された分生子は鎖状につながり、１細胞性で円筒型(cylindrical)から長楕円形(oblong)である。分生子の両端はせつ断状(truncate)を示す。また球形(globose)から亜球形(sub globose)の分節型分生子に側生する無柄の分生子(lateral sessil conidia)の形成が認められた。テレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。以上の性質から本菌株は不完全菌類のアルスログラフィス属(Arthrographis) に属する菌株と考えられる。
【００３５】
（２）AK-9d-5：寄託番号FERM P-19622
各培地上で２５℃、１週間後および７週間培養後の培養性状を表２に示す。「色調」、「可溶性色素」の欄の記載方法は表１と同じ。
【００３６】
【表２】
2005224123.tif 000003
【００３７】
栄養菌糸(vegetative hyphae)は、暗褐色に着色し、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、有隔壁菌糸の形成が認められる。菌糸幅はほぼ一定で、菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。長期間培養しても分生子(conidium)、厚壁胞子(chlamydospore)およびテレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。
【００３８】
（３）AK-9d-3：寄託番号FERM P-19621
各培地上で２５℃、１週間後および７週間培養後の培養性状を表３に示す。「色調」、「可溶性色素」の欄の記載方法は表１と同じ。
【００３９】
【表３】
2005224123.tif 000004
【００４０】
栄養菌糸(vegetative hyphae)は、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、褐色〜暗褐色に着色した有隔壁菌糸の形成が認められる。菌糸幅はほぼ一定であるが、ところどころくびれが認められる。菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。長期間培養しても分生子(conidium)およびテレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。
【００４１】
（４）TH-6d-1：寄託番号FERM P-19628
各培地上で２５℃、１週間後および７週間培養後の培養性状を表４に示す。「色調」、「可溶性色素」の欄の記載方法は表１と同じ。
【００４２】
【表４】
2005224123.tif 000005
【００４３】
栄養菌糸(vegetative hyphae)は、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、暗褐色に着色した有隔壁菌糸の形成が認められる。菌糸幅はほぼ一定で、菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。分生子柄(conidiophore)は発達し、不規則に分岐し、分生子の形成個所から斜めにずれてさらに分生子柄が伸長し、ジグザグに伸長する。分生子形成細胞(conidiogenous cell)は、顕著ではない。分生子形成個所からは１個の分生子のみ形成される。分生子(conidium)は、ポロ型分生子(poroconidium)で、楕円形(ellipsoid)〜倒卵形(obovoid)である。褐色、２細胞で赤道面に隔壁があり連鎖しない。分生子の基端には着脱痕と思われる構造が認められる。テレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。
【００４４】
５）TH-6d-2：寄託番号FERM P-19629
各培地上で２５℃、１週間後および７週間培養後の培養性状を表５に示す。「色調」、「可溶性色素」の欄の記載方法は表１と同じ。
【００４５】
【表５】
2005224123.tif 000006
【００４６】
栄養菌糸(vegetative hyphae)は、寒天表面上もしくは寒天内に形成され、暗褐色に着色した有隔壁菌糸の形成が認められる。菌糸幅はほぼ一定で、菌糸の表面は平滑(smooth)である。かすがい連結(clamp connection)の形成は確認できない。長期間培養しても分生子(conidium)、厚壁胞子(chlamydospore)およびテレオモルフ(teleomorph)の形成は認められない。
【００４７】
本発明は、本発明による上記新規糸状菌の分離採取方法により得られる任意の新規な菌株だけでなく、これらの新規菌株と同種（２８ＳｒＤＮＡにおけるＤ１−Ｄ２領域の塩基配列における相同性が９７％以上）の菌株をも含む。
【００４８】
このような新規糸状菌の培養物から、これまで知られていない、抗生物質、抗ウイルス物質、植物成長調整物質、殺虫活性物質、人または動物において各種の生理活性を示す物質が得られる可能性があり、バイオマスの活用や物質生産に有用な酵素等が発見される可能性がある。また、新規糸状菌自体が物質分解や防虫・殺虫剤として用いられ得る可能性もあり、新規化合物が見出される可能性もある。
【００４９】
抗生物質には、抗細菌性抗生物質、抗真菌性抗生物質、抗原生動物物質が含まれる。植物成長調整物質には、除草活性物質、植物成長促進物質が含まれる。人または動物における生理活性物質は、各種の薬理作用物質、例えば、抗動脈硬化剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、制癌剤が含まれる。物質分解の対象には、各種の有害物質（例えば、ダイオキシン等）が含まれる。防虫・殺虫としては、いわゆる昆虫天敵糸状菌としての使用が含まれ、水稲食害昆虫、野菜食害昆虫、果樹食害昆虫、樹木食害昆虫がその対象として含まれる。新規化合物には、例えば、有色物質、立体異性を有する化合物が含まれる。
【００５０】
Ｃ．糸状菌分離キット
以下、本発明方法を用いて糸状菌を分離するためのキットについて説明する。
【００５１】
本発明方法を用いて糸状菌を分離するためのキットは、多ウェル型マイクロプレート、培地、及び殺菌剤（抗真菌剤等）を含む。
【００５２】
多ウェル型マイクロプレートは前述の通り、市販の６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、１９２ウェル、３８４ウェルマイクロプレート等、任意のウェル数のプレートを用い得る。
【００５３】
本発明の糸状菌分離採取用キットは、マイクロプレートにおける菌糸の成長識別を容易にするための手段を含んでもよい。
【００５４】
本発明のキットに用いる培地（抗細菌性抗生物質等の細菌汚染防止剤を含む。）及び早期成長菌株除去後の殺菌用薬剤（抗真菌剤等）は本発明の糸状菌の分離採取方法で述べた通りである。
キットにはピンセット等の釣菌装置や器具、さらに菌株及び培地の除去装置や器具を含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
実施例１：
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１５０μｌずつ培地を注入した。培地には、クロラムフェニコール（最終濃度１００〜２００ｐｐｍ）を含むポテト・デキストロース寒天（ＰＤＡ）培地または麦芽寒天（ＭＥＡ）培地の２種類を用いた。ＰＤＡ培地は、日水製薬社製「ポテトデキストロース寒天培地」顆粒３９ｇと１リットルの蒸留水で調整した。ＭＥＡ培地は、ディフコ社製「麦芽エキス」２０ｇ、グルコース２０ｇ、ペプトン１ｇ、寒天１５ｇと１リットルの蒸留水で調製した。
【００５６】
土壌試料は、愛知県長久手町および神奈川県藤沢市江ノ島で採取した土壌１ｇを１００ｍｌ容ビーカーに入れ、１００ｍｌの滅菌イオン交換水に懸濁し、薬さじで撹拌しながら超音波洗浄機（１５０Ｗ、３８ｋＨｚ）に約２０分間かけて、土壌粒子を分散させた。次に、約１．５分間静置して菌糸を沈降させ、上清（糸状菌の胞子を含む）を捨て、新たに滅菌イオン交換水を１００ｍｌ添加した。上清が清澄になるまで、この操作を５〜１０回繰り返した。残った沈殿物を実体顕微鏡（１００倍）で観察し、菌糸をピンセットで取り出し、前記の９６ウェルマイクロプレート中の培地に接種した。
【００５７】
これを、２５℃で静置して培養した。
培養２日目以後、菌株の成長が認められた。成長が認められた菌株の数を、接種してからの日数とともに表１に示した。表に示されるように、培養日数による成長は５日以内に出現する菌株、１４日目以後に出現する菌株の２群に大きく分かれる。
【００５８】
培養２〜４日目に出現する菌株をウェルの内容物ごと除去し、このウェルに殺菌剤として最終濃度２，０００ｐｐｍのシクロヘキシミド溶液を２００μｌずつ添加した。１〜４日目に増殖した糸状菌は、トリコデルマ（Trichoderma spp.）やペニシリウム(Penicillium spp.)の割合が高かった（表１括弧内の菌株数）。なお、同定は形態学的に行なった。これ以降に出現する糸状菌は胞子を形成していないものが多く、形態学的な同定が困難であった。また１５日前後に成長を確認した糸状菌の多くは、黒色から暗緑色のコロニーを形成していた。この傾向は、ＰＤＡ培地とＭＥＡ培地で差がなかった。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
江ノ島の土壌から分離された糸状菌の一部について、成長が特に速い群（２日目に出現）と遅い群（１７日〜３０日目に出現）からいくつかを選び、２８ＳｒＤＮＡのＤ１−Ｄ２配列に基づいた分子系統学的手法を用いて分類学的位置を比較した。
【００６１】
具体的には、ＰＣＲ反応は糸状菌用プライマーＮＬ１（５’−ｇｃａｔａ  ｔｃａａｔ  ａａｇｃｇ  ｇａｇｇａ  ａａａｇ−３’：配列番号１）とＮＬ４（５’−ｇｇｔｃｃ  ｇｔｇｔｔ  ｔｃａａｇ  ａｃｇｇ−３’：配列番号２）を用い、９８℃２０秒（初回９８℃２分）、５２℃２０秒、７２℃２分（最後７２℃４分）を３０サイクル行ない、決定された塩基配列についてＢＬＡＳＴ検索を用いて系統樹を作成した。結果を図１に示す。なお、比較のために、一般的な土壌糸状菌として、フィアロフォア属(Phialophora)、トリコデルマ属(Trichoderma)、フサリウム属(Fusarium)、バーティシリウム属(Verticillium)、ペシロマイセス属(Paecilomyces)およびアスペルギルス属(Aspergillus)の菌も系統樹に記載した。
【００６２】
例えば、培養２日目に出現した菌株2day-4はPenicillium spp.であり、また2day-1と2day-2はTrichosporn spp.との類縁性が示され、ごく一般的な糸状菌であった。これに対し、成長が遅い菌株30day-1、17day-2および30day-2は、Fonsecaea compactaと９２％〜９３％の相同性であり、データベースにこれまで登録されていない一群を形成していた。さらに、菌株17day-1 は、最も近縁なChalara kendrickiiでも９１％の相同性であり、属レベルで近縁の糸状菌はデータベース上に存在しないものと考えられた。
【００６３】
比較例１：
培養早期に出現した菌株の除去を行なわないほかは実施例１と同様に実験を行ったところ、ムコール属（Mucor spp.）やニューロスポラ属（Neurospora spp.）、ペニシリウム属（Penicillium spp.）と思われる菌株がマイクロプレート上、広範囲に広がり、拡散した早期成長株と後期成長株の識別はほとんどできなかった。
【００６４】
比較例２：
培養早期に出現した菌株除去後の殺菌を行なわないほかは実施例１と同様に実験したところ、ムコール属（Mucor spp.）やニューロスポラ属（Neurospora spp.）と思われる菌糸やペニシリウム属（Penicillium spp.）の胞子が近隣のウェルにまで拡がるのが観察された。
【００６５】
実施例２：
実施例１と同様の操作により、神奈川県藤沢市引地橋（ＨＫ株）、茨城県つくば市（ＴＫ株）、鹿児島県奄美大島（ＡＫ株）、東京都小笠原村（ＴＨ株）および山梨県山中湖村（ＹＨ株）の森林土壌から成長の遅い糸状菌を分離し、これらの分子系統学的位置を調べた。具体的には実施例１と同様に２８ＳｒＤＮＡのＤ１−Ｄ２配列についてＢＬＡＳＴ検索によって既報の菌株との相同性が９５％以下の分離株に関して、これらの近縁種および一般的な土壌菌とともに系統樹を作成した（図２）。このような菌株は、ひとつの供試土壌から作成したマイクロプレート１枚あたり１〜６菌株あった。いくつかの菌株（HK-7d-3、AK-9d-5、AK-9d-3、TH-6d-1およびTH-6d-2）では、系統樹の非常に深いところで分岐が認められ、新属の可能性が示唆された。これらはいずれもデータベース上の近縁種との相同性が９０％以下であった。すなわち、HK-7d-3（配列番号３）は、Piedraia hortae（寄託番号：AY016366、配列番号４）との相同性が８１．３％、AK-9d-5（配列番号５）は、Lasallia pennsylvanica（寄託番号：AF356665、配列番号６）との相同性が８０．９％、AK-9d-3（配列番号７）は、Exophiala sp.（寄託番号：AF050274、配列番号８）との相同性が８７．０％、TH-6d-1（配列番号９）は、Sticta fuliginosa（寄託番号：AF286825、配列番号１０）との相同性が８３．５％、TH-6d-2（配列番号１１）は、Pleospora herbarum（寄託番号：AF382386、配列番号１２）との相同性が８４．６％であった。
【００６６】
実施例３：
実施例１と同様の操作により、沖縄県本島の安波川流域（TG株）、鹿児島県奄美大島の湯湾岳付近（AY株）、群馬県水上町（GS株）、山梨県山中湖周辺（YH株）の土壌から成長の遅い糸状菌を分離し、これらの分子系統学的位置を調べた。具体的には実施例１と同様に２８ＳｒＤＮＡのＤ１−Ｄ２配列についてＢＬＡＳＴ検索によって既報の菌株との相同性が９５％以下の分離株に関して、これらの近縁種および一般的な土壌菌とともに系統樹を作成した（図３）。このような菌株は、1つの供試土壌から作成したマイクロプレート１枚あたり１〜６菌株あった。いくつかの菌株（TG-21d、AY-7d-1、AY-7d-2、GS-7d-3、YH-22d-2）では、系統樹の非常に深いところで分岐が認められ、新属の可能性が示唆された。これらはいずれもデータベース上の近縁種との相同性が９０％以下であった。すなわち、TG-21d（配列番号１３）は、Pleospora herbarum（寄託番号：AF382386、配列番号１２）と相同性８３．１％、AY-7d-1（配列番号１４）はPertusaria scaberula（寄託番号：AF274099、配列番号１５）と相同性８６．３％、AY-7d-2（配列番号１６）はPertusaria erythrella（寄託番号：AF274100、配列番号１７）と相同性８６．７％、GS-7d-3（配列番号１８）はCandida santjacobensis（寄託番号：U45811、配列番号１９）と相同性８７．５％、YH-22d-2（配列番号２０）はCenococcum geophilum（寄託番号：AY112935、配列番号２１）と相同性８７．８％であった。
【００６７】
以上の結果から、新規な糸状菌分離法としてのマイクロプレート法によって、成長の遅い糸状菌を確実に分離でき、稀少な糸状菌を効率良く取得できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法は選択圧をかける従来の発想とは異なり、成長の早い糸状菌を排除して成長の遅い糸状菌の成長を待つという選択分離法を採用することにより、新規な糸状菌の確実な分離採取を可能としたものである。本発明の方法は、トリコデルマ(Trichoderma spp.)やペニシリウム(Penicillium spp.)など成長の速い菌がきわめて多い環境（例えば熱帯地域）の植物、昆虫、土壌サンプルからの菌分離にも有効と考えられる。また、本発明の方法により分離される新規菌株は種々の有用性を有する可能性がある。そのためこのように分離された新規糸状菌は、医薬、農薬等の生理活性物質を開発する多くの企業にとって魅力的であり、菌株あるいはそれらの培養液自体が商品となる。さらに、本発明の糸状菌分離採取用キットにより、こうした分離採取を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明方法（実施例１）により分離した糸状菌株と既知菌株との分子系統学的関係を示す系統樹。
【図２】本発明方法（実施例２）により分離した糸状菌株と既知菌株との分子系統学的関係を示す系統樹。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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