(57)【要約】【課題】生体細胞の侵入が容易な大孔径を有する炭酸アパタイトとコラーゲンからなるスポンジ状体及び細胞培養培地、並びにそれらの製造方法を提供する。【解決手段】酸性コラーゲン溶液にアルカリ溶液を添加して中和し、次いで炭酸アパタイトを混合し、更に有機溶媒を添加して撹拌して得られるゲルを、円筒部側面に孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を有し、かつ前記孔径５０〜１０００μｍの貫通孔が円筒部側面積の０％を超え８０％以下を占めるアパタイトの円筒フレーム内に充填し、次いで真空中において凍結乾燥させることにより、円筒部側面に多数の孔を有する円筒フレーム内に炭酸アパタイトと酸性コラーゲン複合体のスポンジ状体が充填された細胞培養培地が得られる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内に充填されているスポンジ状体であって、スポンジ状体が炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなり、平均孔径が５００μｍ以上であるスポンジ状体。
【請求項２】
円筒フレームの円筒部側面に存在する貫通孔が孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を含む請求項１記載のスポンジ状体。
【請求項３】
円筒フレームの円筒部側面に存在する孔径５０〜１０００μｍの貫通孔が円筒部側面積の０％を超え８０％以下を占める請求項２記載のスポンジ状体。
【請求項４】
円筒フレームを形成する生体適合性材料がアパタイトである請求項１〜３のいずれか１項に記載のスポンジ状体。
【請求項５】
細胞培養用である請求項１〜４のいずれか１項に記載のスポンジ状体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のスポンジ状体からなる細胞培養培地。
【請求項７】
次の工程：
(i) コラーゲンを酸性水溶液に溶解する、
(ii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトを混合する、
(iii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトの混合前又は混合後に中和処理を行う、
(iv) 有機溶媒を添加し、混合する、
(v) 工程(i)〜(iv)を経て得られたゲルを、円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内に充填し、次いで真空中において凍結乾燥させる、
を含むスポンジ状体又は細胞培養培地の製造方法。
【請求項８】
前記ゲルが充填された円筒フレームを、真空チャンバー内に配設した熱電モジュール上に載せ、減圧して前記ゲル中に気泡を生じさせた後、熱電モジュールに直流を印加して−４０℃以下まで冷却して凍結させた後、更に減圧して凍結乾燥させ、次いで熱電モジュールを常温まで戻し、真空チャンバー内の圧力を常圧まで戻した後、内部にスポンジ状体が形成された円筒フレームを取り出すことを特徴とする請求項７記載のスポンジ状体又は細胞培養培地の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８記載の製造方法によって製造されるスポンジ状体。
【請求項１０】
請求項７又は８記載の製造方法によって製造される細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料の培養、及び生体への埋め込み等に用いられるスポンジ状体、細胞培養培地及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体骨や歯に類似している組成と結晶組織を有する炭酸アパタイトとコラーゲンからなる複合体が再生医療の分野で注目され、その製造方法や使用方法について多くの研究開発が行われている。従来、炭酸アパタイトと複合していないコラーゲンスポンジは存在しており、また平均孔径が５００μｍの大孔径を有するコラーゲンスポンジも製造され市販されている。しかしながら、生体代謝性を向上させるための炭酸アパタイト等の物質とコラーゲンを複合させた大孔径を有するスポンジ状体を製作することは困難であり、炭酸アパタイトと複合させたコラーゲンスポンジの孔径を、細胞、神経、血管等の生体細胞の侵入が容易な大きさにすることは実現されていない。特許文献１は、５〜９０ｖｏｌ％の気孔率を有する炭酸アパタイトとコラーゲンからなる多孔質スポンジ状複合体を開示しているが、その多孔質スポンジ状複合体の孔径については具体的に記載されておらず、また、特許文献１に記載の方法では平均孔径５００μｍ以上のスポンジ状体を得ることはできない。
【０００３】
本出願に関する先行技術文献情報として次のものがある。
【特許文献１】特開２００３−１６９８４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、生体細胞の侵入が容易な大孔径を有する炭酸アパタイトとコラーゲンからなるスポンジ状体及び細胞培養培地、並びにそれらの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内に充填されているスポンジ状体であって、スポンジ状体が炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなり、平均孔径が５００μｍ以上であるスポンジ状体。
（２）円筒フレームの円筒部側面に存在する貫通孔が孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を含む前記（１）に記載のスポンジ状体。
（３）円筒フレームの円筒部側面に存在する孔径５０〜１０００μｍの貫通孔が円筒部側面積の０％を超え８０％以下を占める前記（２）に記載のスポンジ状体。
（４）円筒フレームを形成する生体適合性材料がアパタイトである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のスポンジ状体。
（５）細胞培養用である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のスポンジ状体。
（６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のスポンジ状体からなる細胞培養培地。
（７）次の工程：
(i) コラーゲンを酸性水溶液に溶解する、
(ii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトを混合する、
(iii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトの混合前又は混合後に中和処理を行う、
(iv) 有機溶媒を添加し、混合する、
(v) 工程(i)〜(iv)を経て得られたゲルを、円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内に充填し、次いで真空中において凍結乾燥させる、
を含むスポンジ状体又は細胞培養培地の製造方法。
（８）前記ゲルが充填された円筒フレームを、真空チャンバー内に配設した熱電モジュール上に載せ、減圧して前記ゲル中に気泡を生じさせた後、熱電モジュールに直流を印加して−４０℃以下まで冷却して凍結させた後、更に減圧して凍結乾燥させ、次いで熱電モジュールを常温まで戻し、真空チャンバー内の圧力を常圧まで戻した後、内部にスポンジ状体が形成された円筒フレームを取り出すことを特徴とする前記（７）に記載のスポンジ状体又は細胞培養培地の製造方法。
（９）前記（７）又は（８）に記載の製造方法によって製造されるスポンジ状体。
（１０）前記（７）又は（８）に記載の製造方法によって製造される細胞培養培地。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のスポンジ状体は、炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなり、平均孔径が５００μｍ以上であるので、細胞、神経、血管等の生体細胞の侵入が容易であり、細胞培養効率が高い。また本発明のスポンジ状体及び細胞培養培地は、円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内にスポンジ状体が充填されているので、該スポンジ状体がシュリンクすることがなく、該スポンジ状体を前記の平均孔径が５００μｍ以上の多孔質体として維持できるので、スポンジ状体への生体細胞の侵入が妨げられることがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いる炭酸アパタイトとしては、一般式；Ｃａ１０-x（ＰＯ４）６-Ｙ（ＣＯ３）Ｙ（ＯＨ）２−Ｚ、但し、０≦Ｘ≦３〜５、０≦Ｙ≦２〜４、０≦Ｚ≦１〜２で表されるものであり、その合成方法と炭酸アパタイトについては、各種論文〔例えば“Biomaterials” 1990, Vol.11, October, p.568〜572、 M. Okazaki他４名『Insolubilized properties of UV-irradiated CO3-apatite-collagen composites』〕に報告されており、公知のものである。コラーゲンとしては、特に制限はなく、市販されているいずれのコラーゲンを用いてもよい。
【０００８】
本発明のスポンジ状体は、好ましくは、次の工程：
(i) コラーゲンを酸性水溶液（例えば、塩酸水溶液、リン酸水溶液）に溶解する、
(ii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトを混合する、
(iii) コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトの混合前又は混合後に中和処理を行う、
(iv) 有機溶媒を添加し、混合する、
(v) 工程(i)〜(iv)を経て得られたゲルを、円筒部側面に貫通孔を有し、かつ生体適合性材料又は生分解性材料からなる円筒フレーム内に充填し、次いで真空中において凍結乾燥させる、
を含む方法により製造する。
【０００９】
工程(ii)におけるコラーゲン溶液と炭酸アパタイトの混合割合は、通常、コラーゲン溶液１ｇに対して炭酸アパタイト０．００１〜０．０１ｇ、好ましくは０．００３〜０．０１ｇである。
【００１０】
工程(iii)の中和処理は、コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトの混合前及び混合後のいずれに行ってもよい。また、中和処理は、コラーゲンを含む溶液を中性又はアルカリ性にするものであれば、特に制限はないが、好ましくは当該溶液のｐＨを７〜９の範囲内にすることが好ましい。
【００１１】
工程(iv)で用いる有機溶媒としては、コラーゲン溶液及び炭酸アパタイトの混合物に添加することにより、その粘度を低下させ得るものであれば特に制限はなく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、sec-ブタノール、tert−ブタノール等のアルコール系溶媒；メチルエーテル、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル、メチルエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン等のエーテル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソプロピルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチル tert-ブチルケトン、ジエチルケトン、ジイソプロピルケトン、メチルビニルケトン、シクロブタノン、シクロペンタノン、シクロヘキサノン等のケトン系溶媒；ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸プロピル、プロピオン酸イソプロピル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソブチル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸プロピル、酪酸イソプロピル、酪酸ブチル、酪酸イソブチル等のエステル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ノナデカン、シクロヘキサン、キシレン、トルエン等の炭化水素系溶媒；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；酢酸等のカルボン酸系溶媒；ジメチルスルホキシドが挙げられる。工程(iv)で用いる有機溶媒としては、特にエタノールが好ましい。
【００１２】
有機溶媒の添加は、通常、工程(i)〜(iii)を実施した後に行うが、(i)もしくは(ii)の後に行ってもよい。有機溶媒の添加量は、通常、コラーゲン溶液１ｇに対して０．０１〜０．５ｇ、好ましくは０．１〜０．３ｇである。また、有機溶媒の添加量は、添加後の混合物の粘度が１００〜５０００ｍＰａ・ｓの範囲内になる量であることが好ましい。
工程(i)〜(iv)を実施することにより、炭酸アパタイト及びコラーゲンを含むゲルが得られる。
【００１３】
このようにして得られたゲルを、生体適合性材料又は生分解性材料からなり、円筒部側面に貫通孔を有する円筒フレーム（円筒型のフレーム）に充填した後、減圧しながら急速冷却して凍結乾燥させることにより、５００μｍ以上の平均孔径を有するスポンジ状体が得られる。平均孔径が５００μｍ未満であると、細胞、神経、血管等の生体細胞の侵入が容易ではなく、生体細胞の形成が十分に行われない。なお、工程(iv)の有機溶媒の添加を省略すると、５００μｍ以上の平均孔径を有するスポンジ状体は得られない。
【００１４】
前記円筒フレームとしては、円筒部側面に貫通孔を有するものが好ましく、前記貫通孔が孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を含むものが更に好ましく、円筒フレームの円筒部側面に存在する孔径５０〜１０００μｍの貫通孔が円筒部側面積の０％を超え８０％以下を占めるものが特に好ましい。この円筒フレームは、前記ゲルを充填する容器であるのみならず、円筒フレーム内で凍結乾燥させたスポンジ状体が収縮することなく、５００μｍ以上の平均孔径を維持させることを可能とし、更に円筒部側面に孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を有することにより、細胞、神経、血管等がこの円筒部側面の孔を通り、更に炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体の平均孔径５００μｍ以上の孔に侵入して生体組織を形成させるために、生体内に埋め込むことを目的としている。
【００１５】
円筒フレームを構成する生体適合性材料としては、際立った炎症反応を起こすものでなければ特に制限はなく、好ましくはアパタイト、例えば、溶解性が極めて高い結晶性の低いアパタイト、骨に類似した組成及び結晶性を有する炭酸アパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、及びこれらの複合体が挙げられる。
【００１６】
円筒フレームを構成する生分解性材料としては、生体内で酵素的又は非酵素的に分解され、生分解生成物が毒性を示すことがなく、代謝吸収されるものであれば特に制限はなく、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリα−アミノ酸、ラミニン、ヘパラン硫酸、フィブロネクチン、ヒドロネクチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、コラーゲンが挙げられるが、スポンジ状体の一部を構成するコラーゲンで構成されていることが、より好ましい。
【００１７】
前記円筒フレームは、例えば、以下のようにして作製することができる。アパタイトのように焼結が可能な材料については、アパタイト等の粉末とパラフィンワックスを、通常、重量比で１：０．２〜１：２、好ましくは１：１の割合で混合し、アセトン等のパラフィンワックスを溶解する溶媒を添加し、次いで加熱して溶媒を蒸発させ、前記粉末表面にパラフィンワックスを付着させる。得られた前記粉末を円筒形状の金型に充填し、プレス成形して円筒フレームの原型に成形し、６００℃で加熱脱脂した後、１０００℃以上に加熱して焼結する。また、生分解性材料のように加熱すると分解する材料については、プレス成形のみで円筒フレームを製造する。このようにして円筒フレームが成形される。この円筒フレームは、外径が２〜２０ｍｍ、外径と内径の差（側壁厚み）が０．５〜５ｍｍ、長さが１〜２０ｍｍであることが好ましい。
【００１８】
次いで、このようにして得られた円筒フレームの円筒部側面に、マイクロドリル加工などの方法を用いて孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を穿設する。貫通孔の孔径が５０μｍ未満であると細胞等の通過が極めて困難であり、１０００μｍを超えると円筒フレームの形状を維持することが困難になる。円筒部側面に穿設する孔径は５００〜１０００μｍであることがより好ましい。
【００１９】
また、前記貫通孔は、円筒フレームの円筒部側面積において０％を超え８０％以下を占めることが好ましい。貫通孔の面積は、スケール付きのルーペ等で円筒の側面の全て、又は一部分を観察し、貫通孔の孔径と個数を測定することにより求められる。
【００２０】
前記の工程(i)〜(iv)を経て得られたゲルを、前記円筒フレーム内に充填し、次いで真空中において凍結乾燥させることにより、前記円筒フレーム内にスポンジ状体が形成される。
このようにして得られる本発明のスポンジ状体は、細胞培養培地として用いることができる。
【００２１】
前記の凍結乾燥によるスポンジ状体の形成方法としては、前記ゲルが充填された円筒フレームを、真空チャンバー内に配設した熱電モジュール上に載せ、減圧して前記ゲル中に気泡を生じさせた後、熱電モジュールに直流を印加して−４０℃以下まで冷却して凍結させた後、更に減圧して凍結乾燥させ、次いで熱電モジュールを常温まで戻し、真空チャンバー内の圧力を常圧まで戻した後、内部にスポンジ状体が形成された円筒フレームを取り出す方法が好ましい。
【００２２】
前記の好ましい方法の一例を図１を用いて説明する。
図１に示すように、前記のようにして得られる円筒フレーム３に、前記ゲル２を充填し、次いで真空チャンバー１内に配設した熱電モジュール４上に載せ、真空チャンバー１内を真空ポンプ５により減圧して前記ゲル２中に微小気泡を生じさせる。この状態で熱電モジュール４に外部直流電源６から直流を印加して−４０℃以下、好ましくは−５０℃まで急速冷却して前記ゲル２を凍結させる。次いで真空チャンバー１内を更に減圧し、２０時間前後放置して凍結状態を保持しながら乾燥させる。次いで熱電モジュール４を徐々に常温まで戻し、真空チャンバー１内を徐々に常圧まで戻した後、取り出し、５００μｍ以上の平均孔径を有するスポンジ状の炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体が充填された円筒型の細胞培養培地が得られる。これらの急速冷却操作及び加熱操作は、−４０℃以下まで急速冷却することが可能な装置であれば、特に熱電モジュールを用いることに限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を更に詳細に説明する。
なお、以下において、スポンジ状体の平均孔径は次のようにして測定した。
【００２４】
（平均孔径の測定方法）
平均孔径の測定は、ＣＣＤカメラ付き画像処理装置を用いて行った。スポンジ状体中の細孔を任意に５０個ほどピックアップし、画像処理装置のモニタ上のスケールによって細孔径を測定した。５０個の細孔径の平均を平均細孔径とした。
【００２５】
（実施例１）
（１）炭酸アパタイトとコラーゲンの混合ゲルの作製
コラーゲンを塩酸水溶液に溶解させた０．５％濃度の酸性コラーゲン溶液２ｇに対して、０．０３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を２０μＬ添加して中和した後（ｐＨ７．２）、炭酸アパタイトを０．００６ｇ混合した。更に、エタノールを０．６ｇ添加して充分に撹拌して炭酸アパタイトとコラーゲンを混合してなるゲル（粘度：２０００ｍＰａ・ｓ）を作製した。
【００２６】
（２）円筒フレームの作製
アパタイト２．５ｇとパラフィンワックス２．５ｇを２０ｇのアセトン中で混合し、次いでアセトンを蒸発させた後、プレス成形により、内径５ｍｍ、外径７．２ｍｍ、長さ２．４ｍｍのアパタイト円筒型の原型を作製した。そして円筒型の円筒部側面にマイクロドリル加工により、０．６ｍｍ径の細孔を孔部の全面積が７０％となるように穿設した後、昇温速度２℃／分で６２０℃まで加熱して２時間保持した後、徐冷してパラフィンを除去した。次ぎに、昇温速度１０℃／分で１２００℃まで加熱して２時間保持した後、徐冷して、内径５ｍｍ、外径６ｍｍ、長さ２ｍｍの円筒型焼結体のフレームを得た。
【００２７】
（３）スポンジ状体及び細胞培養培地の作製
前記（２）で得られたアパタイト円筒フレーム中に前記（１）で作製した炭酸アパタイトとコラーゲンを混合してなるゲルを充填した。図１に示すように、この炭酸アパタイトとコラーゲンを混合してなるゲル２を充填した円筒フレーム３を、真空チャンバー１内に配設した熱電モジュール４上に載せ、外部直流電源６から直流を印加して−１０℃まで冷却しながら真空ポンプ５を用いて真空チャンバー１内を圧力ゲージ８で−０．０７ＭＰａとなるまで減圧し、炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体に微小気泡が生成するのを確認した。次いで熱電モジュール４に外部直流電源６から直流を印加して−５０℃（熱電対７で確認）まで急速冷却して凍結させた。次いで真空チャンバー１内をピラニーセンサー９で１ｔｏｒｒ以下となるまで更に減圧し、この状態で２０時間保持して凍結乾燥させた。
【００２８】
その後、熱電モジュール４の温度を徐々に室温まで戻し、次いで真空チャンバー１内の圧力を常圧まで戻した後、気泡が生成した炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体２からなるスポンジ状体が充填されたアパタイト円筒フレーム３からなる細胞培養培地を取り出した。このようにして得られた細胞培養培地の炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体を顕微鏡で観察したところ、１００〜１０００μｍの細孔が形成されており、それらの細孔の平均孔径が５００μｍ以上であることが確認された。
【００２９】
（比較例１）
実施例１の（１）炭酸アパタイトとコラーゲンの混合ゲルの作製において、エタノール０．６ｇの代わりに、蒸留水０．６ｇを添加する以外は、実施例１と同様に処理した。
その結果、３００〜４００μmの細孔を持つコラーゲンスポンジが作製されるだけで、平均孔径が５００μｍ以上のものは作製できなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明のスポンジ状体は、炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなり、平均孔径が５００μｍ以上の細孔を有しており、細胞、神経、血管等の生体細胞が侵入して培養しやすい。また、本発明のスポンジ状体はアパタイト円筒フレームに充填されており、スポンジ状体を得る際に孔径が収縮することがない。またアパタイト円筒フレーム自体にも多数の細孔が円筒側面部に穿設されているので、細胞、神経、血管等の生体細胞がこれらのアパタイト円筒フレームの細孔を通して炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体に容易に侵入して培養することができる。そのため、本発明のスポンジ状体及び細胞培養培地は人工骨、骨補填剤、培養実験用担体等に極めて有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明のスポンジ状体及び細胞培養培地の製造装置の一例を示す概略図。
【符号の説明】
【００３２】
１    真空チャンバー
２    ゲル（炭酸アパタイトとコラーゲンの複合体）
３    円筒フレーム
４    熱電モジュール
５    真空ポンプ
６    直流電源
７    熱電対
８    圧力ゲージ
９    ピラニーセンサー
１０    バルブ
１１    コールドトラップ
【図１】
2005224219.tif 000003