(57)【要約】【課題】  精製ウイルスに対する必要性（例えば、遺伝子治療のためのウイルス性ベクターとしての使用が増え続けていること）に関して、改良された精製方法を提供すること。【解決手段】  ウイルス調製物の精製方法であって、以下：ａ）該ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程；およびｂ）工程Ａのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス調製物の精製方法であって：
ａ）該ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程；および
ｂ）工程Ａのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここで該ウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ウイルスの培養および精製は、遺伝子治療およびワクチン開発のためにますます重要になってきている。Ｈｕｙｇｈｅら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：  １４０３−１４１６  （１９９５））は、組換えアデノウイルスの精製のためのいくつかの方法（これにはアニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化亜鉛アフィニティークロマトグラフィー、超遠心が包含される）の比較を開示し、組換えアデノウイルスの精製のための好ましいプロセスは、細胞溶解物をヌクレアーゼで処理し、次いでメンブレンフィルターを通して濾過し、次いでＤＥＡＥクロマトグラフィーにかけ、次いで亜鉛アフィニティークロマトグラフィーにかけることであると結論している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
精製ウイルスに対する必要性、例えば遺伝子治療のためのウイルス性ベクターとしての使用が増え続けていることを考えると、改良された精製方法が非常に所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（項目１）ウイルス調製物の精製方法であって：
ａ）このウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでこのウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程；および
ｂ）工程Ａのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでこのウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程
を包含する、方法。
（項目２）上記ウイルス調製物が細胞溶解物である、項目１に記載の方法。
（項目３）上記細胞溶解物が工程ａの前に濾過される、項目２に記載の方法。
（項目４）上記ウイルスが組換えアデノウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目５）上記サイズ排除媒体が、イオン強度がカラムの頂部から底部に向かって減少する塩勾配となるように調製されたカラムの中に提供され、このカラムの頂部が工程ａの生成物のイオン強度と実質的に等しいイオン強度を有する緩衝液を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）上記ウイルスがＡＣＮ５３である、項目１に記載の方法。
（項目７）上記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、ウイルス調製物を適用する前に徹底的に洗浄される、項目１に記載の方法。
（項目８）項目１の方法で精製されるウイルス。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明の１つの局面は、ウイルス調製物の精製方法であって：
ａ）ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程；および
ｂ）工程ａのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であって、ここでウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程を包含する、方法である。ウイルス調製物は細胞溶解物であり得、これは工程Ａの前に濾過され得る。ウイルスは組換えアデノウイルス、例えばＡＣＮ５３（ＷＯ  ９５／１１９８４に開示されている）であり得る。
【０００５】
アニオン交換媒体はジエチルアミノエチル基を架橋アガロース、セルロース、ポリアクリルアミドまたはポリスチレン骨格上に含み得、例えばＦＲＡＣＴＯＧＥＬＴＭ−ＤＥＡＥである。サイズ排除媒体は架橋多糖を含み得、そして架橋アガロースとデキストランとの複合体であり得る。サイズ排除媒体の例はＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００である。アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ウイルス調製物を付与する前に、徹底的に洗浄され得る。
【０００６】
サイズ排除媒体は、イオン強度がカラムの頂部から底部に向かって減少する塩勾配となるように調製されたカラムの中に提供され、このカラムの頂部は工程ａの生成物のイオン強度と実質的に等しいイオン強度を有する緩衝液を有する。
【０００７】
本発明のさらなる局面は、請求項１の方法で精製されるウイルスである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（好適な実施態様の説明）
本発明は、ウイルスの精製に関し、このウイルスは例えば、細胞宿主中で培養され、そして次に細胞の溶解および細胞細片（ｄｅｂｒｉｓ）からの分離によって遊離されることによって生成されたものであり得る。用語「ウイルス」は、野生型、変異体、および組換えウイルスを包含し、特に異種核酸配列の発現のためのアデノウイルスベクターである。
【０００９】
本発明の実施態様は、ウイルス調製物の吸着クロマトグラフィーと、それに続いてのサイズ排除クロマトグラフィーという概略的なストラテジーに分けられる。典型的には、アニオン交換クロマトグラフィーは、高分子骨格に結合した側鎖の塩基性基からなるアニオン交換樹脂上で行われる。塩基性基は好ましくは置換アミノ基であり、特にジ低級アルキルアミノアルキル基であり、ここで各低級アルキル基は１個から４個、好ましくは２個の炭素原子を有し、そして各アルキル基は２個から４個、好ましくは２個の炭素原子を有する。骨格はシリカまたは有機マトリックス、例えば架橋アガロース、セルロース、ポリアクリルアミドまたはポリスチレンから構成され得る。架橋アガロース骨格上のジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ基）または特にジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ基）からなるアニオン交換樹脂の使用が特に好ましく、特に好ましいＤＥＡＥタイプの樹脂は商品名「ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ」として販売されている樹脂であり、例えば「ＦＲＡＣＴＯＧＥＬＴＭ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ」および「ＦＲＡＣＴＯＧＥＬＴＭ  ＡＥ」である。本発明のいくつかの実施態様において、「骨格」はビーズのような固体支持体であり得る。
【００１０】
アニオン交換樹脂は、好ましくは、アジ化ナトリウムおよびエタノールのような保存剤ならびに他の外来性物質を除去するために、ウイルス調製物をロードする前に、約５〜１０カラム容量の塩基性溶液（例えば５０ｍＭ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌ）、次に約５〜１０カラム容量の中和溶液（例えば５０ｍＭ  ＨＣｌ／１Ｍ  ＮａＣｌ）、次に約５〜３０容量のローディングおよび／または溶離緩衝液でカラムを洗浄することによって、徹底的に洗浄される。任意に、ローディングおよび／または溶離緩衝液で洗浄する前に、ローディングおよび／または溶離緩衝液より塩濃度の低い緩衝液でカラムを洗浄する。
【００１１】
典型的には、細胞溶解物のようなウイルス調製物は、ｐＨが約７．０〜８．５で塩濃度が約１００〜３６０ｍＭの緩衝溶液中のクロマトグラフィー媒体にロードされる。この塩は典型的にはＮａＣｌである。いくつかの実施態様では、リン酸塩またはＴｒｉｓのような他の緩衝液も使用され得る。混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）は、カラムを塩濃度が約２５０〜３８０ｍＭの緩衝液で洗浄することによって優先的に溶離し得る。次にウイルスを約３６０〜６００ｍＭの塩濃度での溶液で溶離し得る。この塩は典型的にはＮａＣｌである。典型的には、約５〜５０，より好ましくは約３０容量の緩衝液を用いてウイルスを溶離する。画分を採取し、そしてＡ２６０またはＡ２８０を測定し、そしてピーク画分をプールすることによってウイルスの存在についてアッセイする。あるいは、Ａ２６０またはＡ２８０ピークを含む溶離物を単一画分として採取しても良い。この、ウイルスを含む溶離物中の単一のＡ２６０またはＡ２８０の画分またはプールした画分を、本明細書中で「アニオン交換プール」と名付ける。
【００１２】
サイズ排除クロマトグラフィー工程において、分子は、不活性多孔質媒体、特に不活性ゲル媒体を充填したベッド（ｂｅｄ）中でサイズに従って分離される。この不活性ゲル媒体は、好ましくは、球形ビーズ状の架橋多糖類の複合体、例えば、架橋アガロースおよびデキストランである。膨潤したゲルビーズ中の最も大きな孔よりも大きい分子はゲルビーズ中に進入せず、従って、クロマトグラフィーベッドを通って最も速く移動する。より小さな分子は、そのサイズおよび形に応じて異なる度合いでゲルビーズ中に進入し、ベッドの通過が遅延する。このようにして分子は一般に分子サイズが小さくなる順に溶出する。ウイルスはそのサイズが大きいので、通常、空隙容量で溶出する。例えば、アデノウイルスは直径が約８０ｎｍである。アデノウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適した媒体としては、Ｇ６０００ＰＷＸＬ（ＴｏｓｏＨａａｓ）；ＳＢ−８０６（Ａｌｌｔｅｃｈ）；Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００  ＳＦ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２００、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  分取グレード（ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ）、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  分取グレード（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ＴＳＫ  ６０００ＰＷＸＬ（Ｂｏｄｍａｎ）、およびＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２０００（Ｗａｔｅｒｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
「サイズ排除」クロマトグラフィーは本明細書で使用される限りにおいて、ゲル濾過クロマトグラフィーを包含することを意図する。特に好ましいサイズ排除媒体は商品名「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」として販売されているものである（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  カタログ、１９９６、第３３８−３３９頁、コード番号１７−１０４３−０１（バルク）、あるいは１７−１０６９−０１または１７−１０７１−０１（予備充填カラム）参照のこと）。低分子量の不純物からのウイルスのグループ分離が達成されるので、アニオン交換樹脂プールからの出発物質のローディング容量は比較的大量（例えば、ベッド容量の２０％まで、より好ましくは１５％まで）であり得る。
【００１４】
本発明のアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の実施のための物質の例を表Ｉに示す。変数および制御の例を表ＩＩおよび表ＩＩＩに示す。
【００１５】
（表Ｉ：  アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーで使用する物質の例）
【００１６】
【表１】
2005318898.tif 000002
【００１７】
（表ＩＩ：  アニオン交換クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作変数）
【００１８】
【表２】
2005318898.tif 000003
【００１９】
（表ＩＩＩ：  サイズ排除クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作変数）
【００２０】
【表３】
2005318898.tif 000004
【００２１】
本発明の実施態様において、ウイルスをアニオン交換プールからサイズ排除カラムへとロードする。いくつかの実施態様においては、カラムは、イオン強度がカラムの頂部から底部へ向かって減少する塩勾配で調製される。ローディングの後、ウイルスはこの塩勾配を通って下に移動し（なぜならウイルスは優先的に樹脂に吸着しないので）、そしてイオン強度の穏やかな変化によりウイルスに対する損傷が避けられる。塩勾配に追いついた後、ウイルスは低塩（例えば、０〜２００ｍＭ  ＮａＣｌ）緩衝液で溶離する。このような低塩緩衝液は、長期貯蔵または患者への投与のための処方物を包含するが、これらに限定されない。
【００２２】
いくつかの実施態様において、溶離緩衝液のようなクロマトグラフィー緩衝液、またはウイルスを含むプールされた画分に、グリセロールを添加する。典型的にはグリセロールは最終濃度５〜２０％、より典型的には１０％で存在する。従って、いくつかの実施態様ではグリセロールはプロセス全体にわたって全ての溶液中に存在する。さらなる実施態様において、他の賦形剤、例えば約２〜１６％のショ糖をグリセロールの代わりに使用し得る。
【００２３】
好ましい実施態様において、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは低い塩濃度の緩衝液（例えば、約１００〜１５０ｍＭ、特に約１３０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化される。フィードをローディングする直前に、塩勾配を与える。これはベッド容量の中間の画分、例えば１０〜２０％、好ましくは約１５％に等しく、低塩濃度（約１３０ｍＭ  ＮａＣｌ）から、より高い塩濃度のフィード（例えば、４００〜４５０ｍＭのＮａＣｌ、特に約４２０ｍＭのＮａＣｌ）までである。
【００２４】
単純な試験を行ってＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプールの品質を決定し、そして次に塩勾配を使用すべきかどうかを決定する。この試験は、適切なｐＨ７．５の緩衝液で数分間（例えば５分間）にわたって希釈したＤＥＡＥ−ＦｒａｃｔｏｇｅｌプールのＡ３２０／Ａ２６０比の定常性に依存する。適切な緩衝液は５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２％ショ糖からなり、ＮａＣｌを含まない。Ａ３２０／Ａ２６０比が５分間にわたって実質的に一定であるなら（例えば、０．０４を越えて増加しないならば）、試料はアイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）または塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーのいずれかに適する。Ａ３２０／Ａ２６０比がこの時間の間に約０．０４を越えて増加するならば、ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプールは、収率を上げるために、好ましくは塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーで行われる。表ＩＶは、塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーの使用のための物質およびプロトコルの例を示す。
【００２５】
（表ＩＶ：  塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーの使用のための物質およびプロトコルの例）
【００２６】
【表４】
2005318898.tif 000005
【００２７】
本発明の精製方法はスケールアップ（またはスケールダウン）および大規模な混入物に適する。当該分野で周知の適切な手順およびガイドラインを使用し、それに従って、ウイルスを制御し、そしてバイオハザード的状況を回避することができる：例えば「Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」第３版、Ｒｉｃｈｍａｎ  および  ＭｃＫｉｎｎｅｙ編、米国厚生省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国疾病管理センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）および国立衛生研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、米国政府印刷局（Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）、１９９３年５月発行を参照のこと。
【００２８】
本発明の方法は広範囲のウイルスに適用しやすく、これらのウイルスにはアデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、およびロタウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは好ましくは組換えウイルスであるが、臨床的な単離物、弱毒化ワクチン株などを包含し得る。
【００２９】
それゆえ、例えば、本発明の方法で精製され得る組換えアデノウイルスの例はＡＣＮ５３であり、これはＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９５／１１９８４に開示される。
【００３０】
第１の工程において、ＡＣＮ５３アデノウイルスベクターをアニオン交換クロマトグラフィーでＤＥＡＥカラムを用いて精製する。このためには、ウイルスは典型的には２９３腎細胞中で増殖され、採取され、そして濃縮および限外濾過に供される。濃縮物を凍結し、そして約−２０℃で使用時まで貯蔵する。凍結濃縮物を解凍し、０．４５μｍのフィルターで浄化し、調製物の伝導度を約２５０〜３６０ｍＭ  ＮａＣｌに調節し、そしてＤＥＡＥクロマトグラフィーに供する。このクロマトグラフィーで使用する溶液は表１に示される。
【００３１】
第２工程において、ＡＣＮ５３アデノウイルスベクターをサイズ排除クロマトグラフィーでＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムを用いて精製する。ウイルスを含む選択された画分をＡ２６０またはＡ２８０で同定し、そしてプールする。プールした画分は精製されたバルクのＡＣＮ５３アデノウイルスベクターから構成され、これを次に０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過し、そして約−２０℃で貯蔵する。
【００３２】
ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプール中のウイルスは高濃度の塩（約４２０ｍＭ  ＮａＣｌ）の存在のため、不安定であり得る。これは、好ましくは、すぐに処理されるか、あるいは４〜１２℃で約２４時間を越えない間、保存される。
【００３３】
溶離プロフィールがＡ２６０またはＡ２８０で決定されるＡＣＮ５３アデノウイルスベクターピークを示す画分を、さらなる処理のためにプールする。このサイズ排除プールを０．２μｍフィルターで濾過する。この濾液は最終的な精製されたバルクのＡＣＮ５３アデノウイルスベクターであり、これを次に滅菌プラスチックボトル（例えばＴｅｆｌｏｎ）に移し、そして約−２０℃で貯蔵する。この工程のインプロセス制御を表ＩＩＩに示す。
【００３４】
この精製方法の各工程でのＡＣＮ５３アデノウイルスベクターの純度の上昇はＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ＨＰＬＣによって追跡され得る（Ｈｕｙｇｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  第６巻（１９９５年１１月）、第１４０５頁の第１４０３−１４１６頁参照）。第１および第２のクロマトグラフィープール中のウイルスの品質はまた、分光学的方法によってもモニターされる。Ａ２６０／Ａ２８０の特徴的な比は最終的な精製ウイルスについて１．２３〜１．３１：１である。ウイルスの高分子量の結果である光散乱はＡ３２０／Ａ２６０  ｎｍの比から導出され、そしてこれもまたクロマトグラフィープールのモニターに使用される。精製された遊離のウイルス粒子は約０．２２〜０．３０：１の光散乱比を示す。
【００３５】
以下の実施例は本発明の例示として役立つ。選択されたベクターおよび宿主ならびに他の物質、試薬の濃度、温度、および他の変数の値は、本発明をどのように実行し得るかの単に例示であり、その限定と考えられるべきではない。
【実施例】
【００３６】
（実験的実施例）
（Ａ．アデノウイルスの小規模精製）
（１）  アニオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）
ＤＥＡＥ−ＥＭＤ  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ６５０Ｍカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）（５×１８ｃｍ）を５ベッド容量（Ｂ．Ｖ．）の０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌ、次いで６Ｂ．Ｖ．の０．１Ｍ  ＨＣｌ／１Ｍ  ＮａＣｌ、そして次に２０Ｂ．Ｖ．の緩衝液Ａ（２６５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％（ｗ／ｖ）ショ糖、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で、線形流速２ｃｍ／分で予備平衡化した。このカラムのフィードは２リットルの凍結粗ウイルス溶液から誘導され、これを解凍し、０．４５μメンブレンを通して微量濾過し、そして小容量の４Ｍ  ＮａＣｌで調節して伝導度が緩衝液Ａのものと等しくなるようにした。このフィードを線形流速１ｃｍ／分でカラムにロードした。カラムを４Ｂ．Ｖ．の緩衝液Ａで洗浄した。次にカラムを８Ｂ．Ｖ．の９４％緩衝液Ａ／６％緩衝液Ｂ（ＮａＣｌを６００ｍＭとしたこと以外は緩衝液Ａと同じ）で洗浄した。カラムを３０Ｂ．Ｖ．の、９４％緩衝液Ａ／６％緩衝液Ｂから１００％緩衝液Ｂまでの線形勾配で溶離した。実質的なウイルスを含む画分をプールし、次のカラムのためのフィード（「ＤＥＡＥプール」）を形成した。
【００３７】
（２）  アイソクラチックサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００）
サイズ排除クロマトグラフィーを、０．５Ｂ．Ｖ．の０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１Ｂ．Ｖ．のＨ２Ｏ、および２Ｂ．Ｖ．の緩衝液Ｃ（１３０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２％（ｗ／ｖ）ショ糖、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で線形流速０．６ｃｍ／分で予備平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５×７３  ｃｍで行った。フィードは２２０ｍｌのＤＥＡＥプールから構成され、これをカラムにロードした。ＡＣＮ５３を緩衝液Ｃで線形流速０．６ｃｍ／分で溶離した。実質的なウイルスを含む画分をプールし、０．２μのミクロフィルターを通し、そして貯蔵した。ウイルス濃縮物は低温（例えば０〜１０℃、好ましくは約４℃）で貯蔵され得、あるいは容量が小さい（例えば、約５０ｍｌ未満）場合、−８０℃で凍結され得る。
【００３８】
（３）  塩勾配サイズ排除クロマトグラフィー
（ａ）．  塩希釈試験
ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプール（０．４ｍｌ）を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％ショ糖から構成され、ＮａＣｌを含まない緩衝液（０．８ｍｌ）と混合し、そしてすぐに石英キュベット中に入れ、そして２６０ｎｍおよび３２０ｎｍの吸光度を光ダイオードアレイを備えたＵＶ分光器で測定した。試料をキュベットから取り出さずに、読みとりを１〜２分間隔で５分間にわたって繰り返した。Ａ３２０／Ａ２６０の比がこの期間の間実質的に一定であれば、このＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプールはアイソクラチックまたは塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーのいずれかに適する。Ａ３２０／Ａ２６０の比がこの期間の間に約４％を越えて増加する場合、ＤＥＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌプールは、収率を上げるために、塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーを必要とする。
【００３９】
（ｂ）  塩勾配サイズ排除クロマトグラフィー
塩勾配クロマトグラフィーを、０．５Ｂ．Ｖ．の０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１Ｂ．Ｖ．のＨ２Ｏ、および２Ｂ．Ｖ．の緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ、ＭｇＣｌ２、２％ショ糖）で予備平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラム（２．６  ｃｍ×６０  ｃｍ）を用いて行った。ＤＥＡＥプールをロードする直前に、１００％緩衝液Ｃから１００％緩衝液Ｄ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ、ＭｇＣｌ２、２％ショ糖）の０．１５Ｂ．Ｖ．（４８ｍｌ）の線形勾配をＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００カラムに付与した。上記試験に不合格の２０ｍｌのＤＥＡＥプールからなるフィードを次にカラムにロードし、そして緩衝液Ｄで線形流速０．６ｃｍ／分で溶離した。空隙容積内またはその近傍で溶離した、実質的なウイルスを含む画分をプールし、滅菌フィルターを通し、そして−８０℃で貯蔵した。この工程の収率は６０％であり、そしてＡ３２０／Ａ２６０比は０．２４：１であった。
【００４０】
（Ｂ．  アデノウイルスの大規模精製）
（１）  アニオン交換クロマトグラフィー
発酵および回収工程からの凍結ウイルス濃縮物を解凍し、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０”  Ｏｐｔｉｃａｐカプセル中の０．４５μｍ親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅメンブレンを通して濾過した。濾液を閉鎖タンク中に採取した。損失を最小限とするために、フィルターカートリッジを、約１．５Ｌの緩衝液Ｊ−１（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２６５ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）ショ糖）に５．４％（ｗ／ｗ）の溶液Ｊ−３（４Ｍ塩化ナトリウム）を補充したもので洗浄した。濾液の塩濃度を５．４％（ｗ／ｖ）の溶液Ｊ−３（４Ｍ塩化ナトリウム）の添加により調節した。次にこのフィード溶液を、緩衝液Ｊ−１（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２６５ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）ショ糖）で予備平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ  カラム（直径７ｃｍ、ベッド高さ１４．８ｃｍ、ベッド容量５７０ｍｌ）に付した。アデノウイルスはアニオン交換樹脂に結合し、他方、培地および宿主細胞の不純物の大部分はこの費やされたチャージの間にカラムを通過する。カラムを最初に４ベッド容量の緩衝液Ｊ−１で洗浄し、次に第２のアイソクラチック洗浄を８ベッド容量の９４％緩衝液Ｊ−１および６％緩衝液Ｊ−２（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、６００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）ショ糖）で行い、さらなる不純物を除去した。ウイルスはカラムから３０ベッド容量の６％〜１００％緩衝液Ｊ−２の線形勾配で溶離した。Ａ２８０で決定される溶離プロフィールのアデノウイルスピークを採取し、そしてさらなるプロセシングのためにプールした。アニオン交換クロマトグラフィー工程のインプロセス制御および操作パラメータを表Ｖにまとめる。
【００４１】
（表Ｖ：  アニオン交換クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作パラメータ）
【００４２】
【表５】
2005318898.tif 000006
【００４３】
（２）  サイズ排除クロマトグラフィー
ＤＥＡＥプールをすぐに、緩衝液Ｋ−１（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２％（ｗ／ｖ）ショ糖）で予備平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズ排除カラム（直径１４  ｃｍ、ベッド高さ７７  ｃｍ、ベッド容量１１．９  Ｌ）に付した。カラムを緩衝液Ｋ−１で溶離した。Ａ２８０で決定される溶離プロフィールのアデノウイルスピークを採取し、そしてプールした。このクロマトグラフィー工程により緩衝液の交換およびアデノウイルス生成物からの低分子量不純物の分離が達成される。サイズ排除クロマトグラフィー工程のためのインプロセス制御および操作パラメータを表ＶＩにまとめる。
【００４４】
（表ＶＩ：  サイズ排除クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作パラメータ）
【００４５】
【表６】
2005318898.tif 000007
【００４６】
（３）  最終の０．２μｍ濾過
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プールを、２〜１５℃で０．２μｍ親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅメンブレン（Ｓｔｅｒｉｃｕｐ、Ｍｉｌｌｉｏｐｏｒｅ）を通して濾過した。この工程は、生物安全キャビネット（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  ｃａｂｉｎｅｔ）中で滅菌条件下で行った。いくつかのの濾過装置を使用したので、個別の濾液をプールし、そして次にオートクレーブにかけた容器中にアリコートを採った。バルクの薬物物質の溶液の容器をドライアイス／エタノール浴中で凍結し、そして約−２０℃で貯蔵した。
【００４７】
本明細書中で引用された全ての刊行物ならびに特許出願は、個々の刊行物または特許出願が詳細かつ独立して参考として援用されているのと同じ程度に本明細書中に参考として援用される。
【００４８】
本発明の改変および変形は当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施態様は例示のみのために提供され、本発明はここで限定されるように解釈されるべきではない。