(57)【要約】【課題】  針を用いた導入物質の導入を効率良く、かつ確実に行えるようにすることを目的とする。【解決手段】  導入装置１０は、試料に挿入される針１１と、針１１の位置を制御する位置決め手段１２と、針１１の先端部１３を洗浄して活性化させる洗浄ユニット１４と、活性を付与した針１１に吸着保持させる導入物質を保持する導入物質容器１５とを有する。針１１の先端部１３の表面は、金製になっており、洗浄ユニット１４は、水などを保持する容器と、容器に超音波を印加する超音波振動子とからなる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入手段の先端部に導入物質を保持させた後に、前記導入手段を生体試料の所定部位に挿入して前記生体試料に前記導入物質を導入するにあたり、
前記導入手段の先端部の表面を洗浄して、前記導入物質を吸着する活性を付与し、この活性によって前記導入物質を、前記導入手段の先端部に吸着保持させることを特徴とする導入物質の保持方法。
【請求項２】
前記生体試料に前記導入物質を導入した後に、前記導入手段の前記先端部に吸着保持されていた前記導入物質を除去して前記導入手段の前記先端部を洗浄し、前記導入手段の表面に再度前記活性を付与することを特徴とする請求項１に記載の導入物質の保持方法。
【請求項３】
表面が洗浄されることで、導入物質を吸着する活性が付与される導入手段と、
前記導入手段の表面に前記活性を付与又は付与された活性を維持させることにより前記導入手段の前記表面を活性化する活性化手段と、
前記導入物質の溶液を保持する溶液保持手段と、
を有し、表面を活性化させた前記導入手段を前記導入物質の溶液に浸漬して前記導入物質を吸着させ、前記導入物質を吸着した前記導入手段を生体試料内の所定部位に挿入して前記導入物質を導入することを特徴とする導入物質の保持装置。
【請求項４】
前記溶液保持手段は、複数の異なる前記導入物質の溶液を保持することが可能であり、前記活性化手段は、前記導入後の前記導入手段の前記表面に吸着している前記導入物質を除去すると共に、再度前記活性を付与することを特徴とする請求項３に記載の導入物質の保持装置。
【請求項５】
前記活性化手段は、前記導入手段を洗浄する手段であることを特徴とする請求項３に記載の導入物質の保持装置。
【請求項６】
前記活性化手段は、前記表面を洗浄した後の前記導入手段の前記活性を維持する手段であることを特徴とする請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項７】
前記活性化手段は、前記導入手段の洗浄された前記表面を改質する改質手段を含むことを特徴とする請求項３に記載の導入物質の保持装置。
【請求項８】
前記改質手段は、前記導入物質を化学的に吸着する官能基を前記導入手段の先端部の表面に形成する手段であることを特徴とする請求項７に記載の導入物質の保持装置。
【請求項９】
前記導入手段は、少なくとも先端部の表面が金からなることを特徴とする請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１０】
前記導入手段は、少なくとも先端部の表面がガラスからなることを特徴とする請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１１】
前記活性化手段は、前記導入手段を超音波洗浄する手段を有することを特徴とする請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１２】
前記活性化手段は、前記導入手段に紫外線を照射する手段を有することを特徴とする請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１３】
前記活性化手段は、プラズマ発生器を有することを特徴とする請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１４】
前記活性化手段は、オゾン発生器を有することを特徴とする請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１５】
前記活性化手段は、前記導入手段の先端部を洗浄する洗浄剤と、この洗浄剤を収容する洗浄槽とを有することを特徴とする請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１６】
前記活性化手段は、洗浄された前記導入手段の先端部を純水に浸漬させるべく純水を保持する容器を有することを特徴とする請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１７】
前記活性化手段は、前記洗浄された前記導入手段の先端部を減圧下で保持する保持手段を有することを特徴とする請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【請求項１８】
前記活性化手段は、前記洗浄された前記導入手段の先端部を不活性ガス雰囲気で保持する保持手段を有することを特徴とする請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導入物質の保持方法及び導入物質の保持装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞等の生体試料に対して、選択的に遺伝子導入等のインジェクションを行うには、顕微鏡観察下で標的とする生体組織に対して、ピペット等の処置具を保持したマニピュレータを３次元的に位置決めして目標部位に導入し、予め処置具に保持している導入物質を放出する。このとき、処置具の挿入及び導入物質の放出圧力等で、生体試料がダメージを受け易いため、生存率を向上させる方法が研究されている。
例えば、処置具として、極細径の針を使用し、導入物質を針先に塗布して乾燥・凍結・電着等により固定して保持する。そして、標的とする細胞の目的部位まで針先を侵入させ、拡散もしくは電圧付与により能動的に導入物質を放出する（例えば、特許文献１参照）。この方法では、細胞への針侵入及び内圧によるダメージが抑えられるとされている。
【特許文献１】特開平６−３４３４７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、前記のように針先に導入物質を保持する方法において、導入物質を針に塗布した後に乾燥させたり、凍結させたりする場合には、針表面の濡れ性や、環境条件により、針先への導入物質の固定量を安定させることが困難であった。
また、導入物質を電着により針に固定する場合には、針が導入物質と逆の極性になるように電圧付与し、電界を形成することが必要であるが、針を電極として形成した場合の電界は、通常は、その先端部に極端に集中する分布となる。その結果、導入物質は、針の先端部のみに凝集し、極細径の針の鋭利な先端が鈍化するため、生体試料へのダメージの低減が困難であった。
この発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、針を用いた導入物質の導入を効率良く、かつ確実に行えるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の課題を解決する本発明の請求項１に係る発明は、導入手段の先端部に導入物質を保持させた後に、前記導入手段を生体試料の所定部位に挿入して前記生体試料に前記導入物質を導入するにあたり、前記導入手段の先端部の表面を洗浄して、前記導入物質を吸着する活性を付与し、この活性によって前記導入物質を、前記導入手段の先端部に吸着保持させることを特徴とする導入物質の保持方法とした。
この導入物質の保持方法では、導入手段を活性化手段において洗浄することで、表面に付着した有機物汚染等が除去され、その結果として導入物質に活性が付与される。
【０００５】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の導入物質の保持方法において、前記生体試料に前記導入物質を導入した後に、前記導入手段の前記先端部に吸着保持されていた前記導入物質を除去して前記導入手段の前記先端部を洗浄し、前記導入手段の表面に再度前記活性を付与することを特徴とする。
この導入物質の保持方法では、導入物質の導入に使用した導入手段を、洗浄等して、再度活性化して、再び導入物質の導入に使用する。１つの導入手段で、複数回又は複数種類の導入物質の導入が可能になる。
【０００６】
請求項３に係る発明は、表面が洗浄されることで、導入物質を吸着する活性が付与される導入手段と、前記導入手段の表面に前記活性を付与又は付与された活性を維持させることにより前記導入手段の前記表面を活性化する活性化手段と、前記導入物質の溶液を保持する溶液保持手段と、を有し、表面を活性化させた前記導入手段を前記導入物質の溶液に浸漬して前記導入物質を吸着させ、前記導入物質を吸着した前記導入手段を生体試料内の所定部位に挿入して前記導入物質を導入することを特徴とする導入物質の保持装置とした。
この導入物質の保持装置では、導入手段を活性化手段において洗浄することで、表面に付着した有機物汚染等が除去され、その結果として導入物質に活性が付与される。また、洗浄後、その活性状態を維持することもできる。さらに、導入物質を保持させた導入手段を、予め選択した生体試料の所定部位に挿入し、導入物質が生体試料内で離脱されることにより導入が行われる。このとき、極めて細い導入手段を用いれば生体試料へのダメージは抑えられる。
【０００７】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の導入物質の保持装置において、前記溶液保持手段は、複数の異なる前記導入物質の溶液を保持することが可能であり、前記活性化手段は、前記導入後の前記導入手段の前記表面に吸着している前記導入物質を除去すると共に、再度前記活性を付与することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入後の導入手段が活性化手段により再度洗浄等され、再度の導入が可能になる。このとき、一旦吸着した導入物質が除去されることにより、異なる導入物質を吸着させ、所定の生体試料内に導入することが可能になる。
【０００８】
請求項５に係る発明は、請求項３に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記導入手段を洗浄する手段であることを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入手段を洗浄することで、表面に吸着する有機物汚染等を除去し、活性を付与する。
【０００９】
請求項６に係る発明は、請求項３から請求項５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記表面を洗浄した後の前記導入手段の前記活性を維持する手段であることを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、既に洗浄等により活性付与されている導入手段が、これを維持する環境下で保持される。
【００１０】
請求項７に係る発明は、請求項３に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記導入手段の洗浄された前記表面を改質する改質手段を含むことを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入物質を改質することで、活性化を付与する。なお、活性化手段で改質と活性の維持とを同時に行うことも可能である。
【００１１】
請求項８に係る発明は、請求項７に記載の導入物質の保持装置において、前記改質手段は、前記導入物質を化学的に吸着する官能基を前記導入手段の先端部の表面に形成する手段であることを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、活性化手段において導入手段を洗浄等すると共に、改質処理を行う場合は、洗浄と同時もしくは洗浄後の改質手段で所定の官能基形成処理を行い、導入に適用する。
【００１２】
請求項９に係る発明は、請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記導入手段は、少なくとも先端部の表面が金からなることを特徴とする。
請求項１０に係る発明は、請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記導入手段は、少なくとも先端部の表面がガラスからなることを特徴とする。
これらの導入物質の保持装置では、導入物質を吸着保持させる部分が、前記活性が付与されやすい材料である金製又はガラス製になっているので、導入物質を吸着保持するような活性化を容易に行え、導入物質が一様に吸着保持されるようになる。
【００１３】
請求項１１に係る発明は、請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記導入手段を超音波洗浄する手段を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入手段を超音波洗浄することで、その表面を清浄化し、又は表面に所定の官能基を形成し、活性化するものである。
【００１４】
請求項１２に係る発明は、請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記導入手段に紫外線を照射する手段を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入手段に紫外線を照射し、その表面を清浄化し、又は表面に所定の官能基を形成し、活性化するものである。
【００１５】
請求項１３に係る発明は、請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、プラズマ発生器を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入手段をプラズマに曝すことで、その表面を清浄化し、又は表面に所定の官能基を形成し、活性化するものである。
【００１６】
請求項１４に係る発明は、請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、オゾン発生器を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、導入手段をオゾンに曝すことで、その表面を清浄化し、又は表面に所定の官能基を形成し、活性化するものである。
【００１７】
請求項１５に係る発明は、請求項３から請求項１０のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記導入手段の先端部を洗浄する洗浄剤と、この洗浄剤を収容する洗浄槽とを有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置は、導入手段を洗浄剤で洗浄することで、その表面を清浄化し、活性化するものである。なお、洗浄剤としては、純水、中性洗剤、アルカリ性溶液などがあげられる。
【００１８】
請求項１６に係る発明は、請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、洗浄された前記導入手段の先端部を純水に浸漬させるべく純水を保持する容器を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置は、洗浄により活性化された導入手段の活性状態を、純水に浸漬させることにより維持する。活性を付与するタイミングと、導入するタイミングが異なる場合や、活性を付与する場所と導入する場所とが離れているときに効果的である。
【００１９】
請求項１７に係る発明は、請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記洗浄された前記導入手段の先端部を減圧下で保持する保持手段を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、洗浄により活性化された導入手段の活性状態を、減圧下で維持する。活性を付与するタイミングと、導入するタイミングが異なる場合などに効果的である。
【００２０】
請求項１８に係る発明は、請求項３から請求項１５のいずれか一項に記載の導入物質の保持装置において、前記活性化手段は、前記洗浄された前記導入手段の先端部を不活性ガス雰囲気で保持する保持手段を有することを特徴とする。
この導入物質の保持装置では、洗浄により活性化された導入手段の活性状態を、不活性雰囲気内で維持する。活性を付与するタイミングと、導入するタイミングが異なる場合などに効果的である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、導入手段の鋭利な先端部を鈍化させることなく、針の表面への吸着を利用して導入物質を保持するので、細い導入手段で生体試料への侵入時におけるダメージを抑えて導入物質を導入することが可能になる。また、導入物質を導入手段の先端部の外表面に略均一に吸着させることで、導入物質の量を安定して保持することが可能になる。これらのことから、生体組織への導入後の生存率を高め、導入効率を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明を実施するための第１の実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
図１に、導入物質の保持方法及び保持装置を適用した遺伝子導入装置を備えている遺伝子導入システムの構成例を示す。この遺伝子導入システム１は、例えば、培地中に存在する対象の細胞（生体試料）の核内に適当な遺伝子（導入物質）を導入し、遺伝子にコードされているタンパク質を発現させるものである。
【００２３】
遺伝子導入システム１は、細胞等を拡大して観察するための倒立顕微鏡２と、倒立顕微鏡２のＸＹステージ３上に載置され、生体試料を収容する試料容器（試料保持手段）４と、生体試料に導入物質を導入する遺伝子導入装置５とを主な構成要素としている。
【００２４】
倒立顕微鏡２は、試料容器４等を設置して水平２軸方向（前後及び左右）に移動可能なＸＹステージ３と、このＸＹステージ３を支持する主架台６と、試料容器４内の生体試料を下方から観察するための対物レンズ（不図示）と、対物レンズで観察された画像を観察する接眼レンズ７と、主架台６の上部に設けられた光源８とを備える拡大手段である。なお、接眼レンズ７の代わりに、又はこれと併用して生体試料の像を撮影する撮像手段及び撮影した像を表示するモニタを備えても良い。また、ＸＹステージ３には、生体試料を透過した光を顕微鏡に導くための光学窓（不図示）が設けられている。
【００２５】
遺伝子導入装置５は、生体試料の細胞等に導入する導入物質を保持する保持装置１０からなる。
保持装置１０は、生体試料の細胞等に挿入される導入手段である針１１と、針１１の位置を制御する位置決め手段１２と、針１１の先端部１３を洗浄して活性化する活性化手段である洗浄ユニット１４と、針１１に吸着保持させる導入物質が収容される導入物質容器１５とからなる。
針１１は、鋭利な先端部１３を有し、相対的に大径な基部１６が位置決め手段１２に保持されている。この実施の形態において、針１１は、金で製造されている。
位置決め手段１２は、針１１の基部１６を保持する退避ステージ２１と、退避ステージ２１をＺ方向（上下方向）に移動可能なＺステージ２２と、前記ＸＹステージ３とから主に構成されている。なお、ＸＹステージ３は、倒立顕微鏡２と兼用されている。
退避ステージ２１は、針１１の基部１６を保持する保持部材２１ａを有し、この保持部材２１ａを水平移動可能に支持する構成になっている。Ｚステージ２２は、支持部材２３によって、主架台６に固定されている。
【００２６】
図１及び図２に示すように、導入物質容器１５は、上部が円筒形状を有し、下部が径を縮小するようなテーパを有するテーパ部１５ａになっている。テーパ部１５ａは、下向きに凸の略円錐形状を有している。この導入物質容器１５は、生体試料に導入する導入物質の溶液が保持される溶液保持手段である。この実施の形態では、複数の導入物質容器１５ごとに異なる複数種類のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）溶液が分注されている。なお、導入物質の溶液には、針１１の先端部１３のみが浸漬すれば十分であるので、導入物質容器１５には、テーパ部１５ａの頂点付近のみに導入物質の溶液が保持されている。
このような導入物質容器１５は、ＸＹステージ３上に位置決めして固定されている容器台２４に保持されている。容器台２４は、導入物質容器１５の形状に合わせて、略円錐形状の凹部２４ａが設けられている。図１に示すように、容器台２４には、使用する導入物質の種類、つまり導入物質容器１５の数に応じて、凹部２４ａが複数配列されている。
【００２７】
図１及び図３に示すように、洗浄ユニット１４は、防塵のためのカバー２５を有している。カバー２５は、略方形状で内部に空間を有している。カバー２５の上面部２５ａの略中央には、針１１を挿入する開口部２６が設けられている。この開口部２６の径は、防塵のために、最小限の大きさになっている。カバー２５内には、超音波洗浄槽（洗浄槽）２７と、超音波振動子２８とが配置されている。超音波洗浄槽２７には、針１１の先端部を十分に浸漬させられる程度の媒質（例えば、純水）が保持されている。超音波振動子２８は、超音波洗浄槽２７の下部に取り付けられている。超音波振動子２８には、駆動配線２９が接続されている。この駆動配線２９は、カバー２５を貫通し、不図示の電源に接続されている。
【００２８】
このような導入装置１０を用いて、針１１の先端部１３に導入物質を保持させ、生体試料に導入物質を導入する手順について説明する。
まず、図１に示す位置決め手段１２を移動させて、針１１を洗浄ユニット１４の開口に挿入し、図３に仮想線で示すように、針１１の先端部１３を超音波洗浄槽２７内の媒質に浸漬させる。この状態で、電源から駆動配線２９を介して超音波振動子２８に電力を供給し、超音波振動子２８を振動させる。超音波洗浄槽２７内の媒質には、超音波が印加され、針の先端部１３の表面が洗浄される。例えば、針１１の先端部１３の表面が有機物等で汚染されていた場合には、その有機物が除去される。これにより、針１１の先端部１３の表面は、清浄化され、他の元素などとの吸着を阻害する物質がない状態、つまり活性状態になる。
【００２９】
洗浄によって、針１１に活性を付与したら、位置決め手段１２を移動させて、針１１の先端部１３を所定の導入物質容器１５内に挿入させる。このとき、針１１の先端部１３は、導入物質容器１５のテーパ部１５ａの最下端付近まで、最下端に接触させることなく侵入させ、導入物質の溶液に浸漬させる。針１１の先端部１３は、洗浄により活性化されているので、導入物質は、針１１の先端部１３の表面に一様に吸着する。
【００３０】
次に、試料容器４内の生体試料を顕微鏡観察し、導入対象となる細胞を選択し、該当する細胞の核等の所定位置を標的位置として、針１１の下方に標的位置が来るようにＸＹステージ３を移動させる。なお、細胞を倒立顕微鏡２で観察する間は、退避ステージ２１を移動させ、針１１を倒立顕微鏡２の視野外に退避させ、透過光による観察を可能にしておく。
ＸＹステージ３の移動が終了したら、針１１の位置がＸＹステージ３上の標的位置と一致するように退避ステージ２１を移動させた後、Ｚステージ２２を制御して、針１１を降下させ、選択した細胞の所定位置に針１１の先端部１３を挿入する。
針１１の先端部１３を細胞の所定位置に挿入したら、その状態で所定時間保持する。そして、所定時間の保持が終了したら、Ｚステージ２２で針１１を上昇させ、その細胞に対する導入物質の導入を終了する。細胞に針１１を挿入してから上昇させるまでの間に、針１１の先端部１３に吸着していた導入物質が細胞の核内等に脱落し、これにより遺伝子導入が行われる。
【００３１】
さらに、異なる細胞への導入を行う際には、針１１を洗浄ユニット１４に挿入し、針１１に残留している導入物質及び細胞内で付着した物質を洗浄除去する。以降は、予定している全ての箇所への導入が終了するまで、洗浄ユニット１４で、針１１に再び活性を付与し、所定の導入物質を吸着させてから、針１１を生体試料の所定位置に挿入し、その細胞に対して導入物質の導入を行う。
【００３２】
この実施の形態では、導入物質が吸着し易い材料（金）から針１１を製造し、かつ洗浄ユニット１４で、針１１を超音波洗浄することで、針１１の先端部１３表面の洗浄と活性化とを行い、針１１の先端部１３への導入物質の吸着を促すようにした。したがって、生体試料に挿入する針１１の先端部１３に、一様に導入物質を保持させることが可能になる。このため、針１１の先端が鈍化することがなく、生体試料へのダメージを低減できる。また、安定した量の導入物質を針１１に吸着させられ、安定したレベルで導入物質を生体試料に導入することが可能になる。さらに、複数回に渡って導入物質を生体試料に導入する場合に、超音波洗浄のみで針１１を再度活性化させることができるので、作業効率を向上できる。
【００３３】
なお、針１１は、金の代わりに、ガラスや、白金、銅、シリコン等の半導体といった、ＤＮＡ溶液を吸着しやすい材料から製造しても良い。また、針１１は、先端部１３の表面のみを、前記のいずれかの材料で製造しても良い。
洗浄ユニット１４で使用する液体媒質としては、純水の代わりに、中性洗剤や、アルカリ性溶液などの薬剤を用いても良い。洗剤や薬剤を使用する際には、洗剤などを保持する洗浄槽を複数設けて、針１１の先端部１３の中和及び濯ぎを十分に行うようにする。
【００３４】
次に、本発明の第２の実施の形態について図面を参照して説明する。なお、第１の実施の形態と同一の構成要素には同じ符号を付してある。また、第１の実施の形態と重複する説明は省略する。
この実施の形態では、図４に示すような洗浄ユニット３１を活性化手段として用いることを特徴とする。
洗浄ユニット３１は、略方形で内部に空間を有するケース３２を有し、ケース３２内にプラズマ発生器３３を備えている。ケース３２の上面部３２ａの略中央には、針１１の先端部１３を挿入可能な開口部３４を有し、ケース３２の側面部３２ｂには、所定のガスをケース３２内に導入するガス導入管３５と、ケース３２内のガスを排気する排気管３６とが取り付けられている。
【００３５】
プラズマ発生器３３の一例としては、針１１の先端部１３に向けて配置された一対の電極板と、交流電源とを備えるものがあげられる。交流電源は、一対の電極板間に、所定の高周波電圧を印加し、高周波放電を発生させる。また、ケース３２内に導入されるガスとしては、水蒸気や、酸素ガスがあげられる。
これらのガスは、高周波放電によってプラズマ化され、プラズマにより生じたラジカルやイオンにより針１１の先端部１３が洗浄される。例えば、酸素ガスの場合には、針１１の先端部１３の表面の有機物が、酸素ラジカルによって酸素、水素、水、二酸化炭素、一酸化炭素等に分解され、ガス化されて除去される。
【００３６】
このように、針１１の先端部１３をプラズマ処理によってドライ洗浄すると、表面が清浄化される。清浄化された針１１の先端部１３の表面は、金原子等が露出した状態になり、他の分子などが吸着し易い活性化状態になる。このため、この針１１を導入物質容器１５（図２参照）に挿入すると、導入物質が針１１の先端部１３の表面に一様に吸着保持される。
また、プラズマ処理によって、針１１の先端部１３の表面に吸着している分子に、ヒドロキシル基（‐ＯＨ）や、カルボキシル基（‐ＣＯＯＨ）等の酸素を含む官能基が形成されることがある。このような官能基は、その極性により、他の分子（例えば、タンパク質等）との結合（例えば、水素結合）をし易いので、このような官能基を表面に備える針１１は、特定の導入物質を吸着保持し易くなる。
この実施の形態によれば、針１１の先端部１３をプラズマによってドライ洗浄するようにしたので、洗浄をさらに確実に、かつ短時間で行うことが可能になる。その他の効果は、前記第１の実施の形態と同様である。
【００３７】
なお、プラズマ発生器３３の代わりに、オゾン発生器を用いても良い。オゾン発生器は、例えば、一対の誘導電極と、これら電極に接続される交流電源とからなる。この場合にケース３２内に導入されるガスは、空気又は酸素ガスとする。２つの電極間に高周波電圧を印加すると、電極間にマイクロ放電が発生し、このマイクロ放電により、酸素ガスがオゾン化される。オゾンは、針１１の先端部１３の表面の有機物を酸化して除去したり、針１１の先端部１３の表面にヒドロキシル基などの前記官能基を形成したりして、針１１を活性化させる。
【００３８】
次に、本発明の第３の実施の形態について詳細に説明する。なお、前記各実施の形態と同じ構成要素には同一の符号を付してある。また、前記各実施の形態と重複する説明は省略する。
この実施の形態では、図５に示すような洗浄ユニット４１を活性化手段として用いることを特徴とする。
洗浄ユニット４１は、略方形で内部に空間を有するケース４２を有している。ケース４２の上面部４２ａの略中央には、針１１を挿入可能な開口部４３が設けられている。また、ケース４２内には、紫外線ランプユニット４４が配設されている。紫外線ランプユニット４４は、複数の紫外線ランプ４５が針１１の先端部１３に向かうように保持されている。この紫外線ランプ４５は、中心波長が３００ｎｍ以下、例えば、１８５ｎｍ又は、２５４ｎｍ、或いはこれら両方の波長の光を発生する光源で、具体的には水銀ランプ等を用いることができる。なお、紫外線ランプユニット４４は、ケース４２の側面部４２ｂを貫通する電気ケーブル４６を介して、不図示の電源に接続されている。
【００３９】
この洗浄ユニット４１に、針１１を挿入し、紫外線照射を行うと、針１１の表面に付着している有機物の炭素結合などが切断され、有機物が除去される。また、紫外線照射により針１１の周囲の空気中の酸素ガスがオゾン化され、オゾンの酸化力により有機物汚染が除去される。また、針１１の先端部１３の表面に吸着している分子に酸素を含む官能基が形成され、極性や、水素結合に依存する吸着に対して活性となる。
【００４０】
この実施の形態によれば、針１１の先端部１３を紫外線、又は紫外線の照射によって発生する分子によってドライ洗浄するようにしたので、洗浄をさらに確実に、かつ短時間で行うことが可能になる。その他の効果は、前記第１の実施の形態と同様である。
【００４１】
次に、本発明の第４の実施の形態について詳細に説明する。なお、前記各実施の形態と同じ構成要素には同一の符号を付してある。また、前記各実施の形態と重複する説明は省略する。
図６に示すように、遺伝子導入システム１は、倒立顕微鏡２と遺伝子導入装置５を備えている。遺伝子導入装置５には保持装置５０が適用されている。
保持装置５０は、針５１を交換可能に保持する吸着保持ユニット５２が、退避ステージ２１の保持部材２１ａに取り付けられている。さらに、ＸＹステージ３上には、複数の針５１をその活性化を維持させた状態で保持する活性化手段である針保持ユニット５３が配設されている。
【００４２】
吸着保持ユニット５２は、針５１を保持する針ホルダ５４と、針ホルダ５４に針５１を吸着するためのチューブである吸引管５５と、吸引管５５に接続された吸引ポンプ（不図示）とから構成されている。
図６及び図７に示すように、針ホルダ５４は、略円柱形状を有し、その中心軸に沿って、貫通孔５６が設けられている。さらに、貫通孔５６の上側の開口の周縁部は、中心軸に沿って上方に延設され、吸引管５５に嵌合する上側突起部５４ａになっている。また、貫通孔５６の下側の開口部の周縁部は、中心軸に沿って下方に延設され、針５１に嵌合する下側突起５４ｂになっている。
このような吸着保持ユニット５２に保持される針５１は、円錐形状の基部５７と、基部５７の先端の頂点部分から延設された先端部５８とからなる。基部５７において、円錐形状の底部にあたる端面には、針ホルダ５４側の下側突起５４ｂと嵌合する芯出し穴５９が設けられている。この芯出し穴５９の中心は、針５１の中心軸と一致している。このため芯出し穴５９と下側突起５４ｂとを係合させると、針５１が芯出しされた状態で針ホルダ５４に保持されることになる。
【００４３】
針保持ユニット５３は、内部に純水を貯溜可能なケース６０を有している。ケース６０の上面部６０ａには、針５１を挿入する開口部６１が複数（図６においては６つ）配列されている。この開口部６１のそれぞれには、使用していない針５１が所定量挿入された状態で保持されている。ここで、所定量とは、針５１の先端部５８を純水に浸漬させるのに十分な侵入量である。なお、針５１の基部５７の最大外径は、開口部６１の径よりも大きくなっており、針保持ユニット５３に対する針５１の侵入量は、基部５７の外径によって制御されている。
また、ケース６０の側面部６０ｂには、不図示の純水供給手段に接続された純水供給管６２及び純水排出管６３が取り付けられている。なお、純水供給手段は、例えば、イオン交換樹脂及びポンプを有し、ケース６０内の純水を循環させつつ、清浄化するようになっている。この純水供給手段によって、ケース６０内の純水の水位は略一定に保たれる。
【００４４】
この実施の形態の作用について説明する。なお、針５１は、その先端部５８が前記各実施の形態のいずれかの洗浄ユニット１４，３１，４１により予め活性が付与された後に、針保持ユニット５３に配列保持されている。このとき、針５１の先端部５８は、純水に浸漬されており、予め付与された導入物質の吸着に対する活性を維持している。さらに、針ホルダ５４には、針５１が吸着保持されていないものとする。
まず、図６に示す位置決め手段１２を移動させて、針ホルダ５４を針保持ユニット５３の所定の針５１に対して軸を一致させてから、Ｚステージ２２を降下させて針ホルダ５４と針５１とを、下側突起５４ｂと芯出し穴５９とで嵌合させる。この状態で、吸引ポンプを駆動させて、吸引管５５及び針ホルダ５４内の貫通孔５６を介して、針５１を吸引することで締結させ、針５１を針ホルダ５４に固定する。
【００４５】
次に、前記第１の実施の形態と同様にして、導入物質を針５１の先端部５８に吸着保持させてから、細胞の核等に挿入し、所定時間保持する。
異なる細胞への導入を行う場合には、位置決め手段１２で針５１を図示しない針回収位置に移動させ、針５１の吸着を解除する。針５１は、針ホルダ５４から解放されて脱離する。この後、空の針ホルダ５４を針保持ユニット５３の別の針５１の上方に位置決めし、前記と同様にして、その針５１を針ホルダ５４に保持させる。
以降は、予定された全ての細胞に導入物質を導入するまで、前記の動作を繰り返す。また、針５１を交換することで、異なる種類の導入物質を導入するようにしても良い。
【００４６】
この実施の形態によれば、針ホルダ５４で、針５１を吸着保持するように構成したので、複数の針５１を交換しつつ、導入物質の導入を行うことが可能になる。また、予め活性を付与した針５１を針保持ユニット５３内に純水に浸漬させることで、活性状態を維持させることができる。この針保持ユニット５３は、針５１を複数、配列保持できるので、複数の針５１を連続して使用することができる。さらに、針５１の吸着保持と、針５１側の芯出し穴５９とを用いることで、針５１と針ホルダ５４を芯出ししつつ、容易に固定することができる。これらのことから、複数の細胞等に導入物質を導入する際の作業効率を向上させることができる。
なお、この実施の形態においても、前記のように針５１の先端部５８に導入物質を一様に保持させたり、針５１の先端部５８が鈍化することを防止したりできる。
【００４７】
次に、本発明の第５の実施の形態について詳細に説明する。なお、前記各実施の形態と同じ構成要素には同一の符号を付してある。また、前記各実施の形態と重複する説明は省略する。
この実施の形態では、図８に示すような針保持ユニット７０を活性化手段として備えることを特徴とする。
針保持ユニット７０は、略方形で内部に空間を有するケース７１を有している。このケース７１の上面部７１ａには、複数の開口部７２が形成されており、活性を付与された針５１を複数、配列保持することが可能になっている。開口部７２の上縁部には、Ｏリング等のシール材７３が取り付けられており、針５１とケース７１内との間の気密性が保たれるようになっている。また、ケース７１の側面部７１ｂには、ガス供給管７４及びガス排出管７５がそれぞれ固定されている。このガス供給管７４は、不活性ガスのボンベに接続されている。不活性ガスとしては、清浄かつ高純度なアルゴンガスや、窒素ガス等が用いられる。ガス排出管７５は、ケース７１内のガスを外部に排気するために用いられる。
【００４８】
このような針保持ユニット７０は、各開口部７２に針５１を保持させると、ケース７１内が密閉される。さらに、ガス供給管７４からケース７１内に不活性ガスを供給し、充填する。これにより、針５１が針保持ユニット７０で保持されている間は、先端部５８が大気と接触することがなくなり、予め針５１の先端部５８に付与された導入物質の吸着に対する活性が維持される。
なお、針５１の使用中、つまり針５１を針ホルダ５４（図６参照）に吸着保持して針保持ユニット７０から脱離させたときには、図示しない機構によって、針５１が離脱した開口部７２を閉栓し、針保持ユニット７０の密閉状態を維持する。
【００４９】
この実施の形態によれば、針保持ユニット７０に複数の針５１を交換可能に保持させ、不活性ガスで先端部５８の活性を維持するようにしたので、前記第４の実施の形態と同様に効果が得られる。特に、活性化の維持のために液体を用いないので、装置構成及びメンテナンスが容易になる。
なお、不活性ガスを用いる代わりに、ケース７１内を真空状態に維持しても良い。この場合には、ケース７１の側面部７１ｂに排気管を固定し、排気管に真空ポンプを接続する。
【００５０】
次に、本発明の第６の実施の形態について詳細に説明する。なお、前記各実施の形態と同じ構成要素には同一の符号を付してある。また、前記各実施の形態と重複する説明は省略する。
図９に示すように、この実施の形態における遺伝子導入システム８０は、ＸＹステージ上に、試料容器４と、針保持ユニット５３と、導入物質容器１５及び容器台２４と、活性化手段である改質ユニット８１とが配置されている。
図１０に示すように、改質ユニット８１は、略方形で内部に空間を有するケース８２を有している。ケース８２の上面部８２ａの略中央には、針５１（図７参照）を挿通可能な開口部８３が形成されている。このケース８２内には、誘導体溶液が保持されている。誘導体溶液の貯溜量は、開口部８３から挿入される針５１の先端部５８（図７参照）が浸漬可能な量になっている。
【００５１】
誘導体溶液は、導入物質であるＤＮＡ分子に吸着し易い官能基を一方の末端に有し、他方の末端に金や、白金等に結合する性質を有するような分子を所定の溶媒に溶かし込んだ溶液である。このような誘導体としては、例えば、チオール誘導体があげられる。チオール誘導体は、イオウと水素が結合した官能基を有し、金‐イオウ結合によって分子が金表面に固定され、アルキル基のファンデルワールス力により、高い配向性を持って配列する自己組織化単分子膜を形成することが知られている。このため、導入物質の溶液がＤＮＡ溶液である場合には、針５１の先端部５８を金製にし、誘導体溶液を、末端をチオール化したＤＮＡ溶液とすると、針５１の先端部５８の表面に、ＤＮＡ溶液を化学的に吸着する単分子化学吸着膜を形成することができる。なお、この誘導体溶液の溶媒としては、エタノールや、メタノール等が用いられる。また、この場合の針５１は、規則正しく原子配列した表面を持つことが望ましく、例えば、金（１１１）などの単結晶が用いられる。
また、誘導体の他の例としては、イオウ‐イオウ結合を有するジスルフィド基や、イオウ元素と他の特定の元素との結合を有するスルフィド基等を末端に備えるＤＮＡを用いることができる。スルフィド基を用いる場合には、針５１の先端部５８の表面を銅製にすることができる。
【００５２】
この実施の形態における導入物質の導入手順について説明する。なお、針５１は、先端部５８の少なくとも表面が、金又は白金で製造されているものとし、洗浄ユニット（例えば、図３に示す洗浄ユニット１４）によって予め活性が付与された状態で、針保持ユニット５３に保持されているものとする。
まず、図６に示すような位置決め手段１２を稼動し、針ホルダ５４に針５１を吸着保持させる。次に、吸着保持した針５１の先端部５８を、図１０に示すような、改質ユニット８１の開口部８３から挿入し、誘導体溶液に浸漬させる。誘導体溶液に浸漬させることで、誘導体分子におけるチオール基が針５１の表面の金原子と一様に結合する。この誘導体分子は、針５１の表面に配列し、他方の末端でＤＮＡ分子に吸着し易い状態になる。
【００５３】
針５１の先端部５８の表面にチオール基を備える誘導体分子からなる単分子化学吸着膜を形成したら、針５１の先端部５８を導入物質容器１５（図６参照）内に浸漬させ、誘導体分子と、導入物質容器１５内のＤＮＡ分子とを結合させ、針５１にＤＮＡ分子を吸着させる。そして、ＤＮＡ分子を吸着させた針５１を所定の細胞の核等に挿入し、ＤＮＡ分子をこれに導入する。なお、ＤＮＡ分子が細胞の核内で脱落しやすいように、針表面に負電荷を与えても良い。
そして、異なる細胞への導入を行う際には、図示しない針回収位置に針５１を移動し、吸着保持を解除して針５１を針ホルダ５４から解放する。その後、針保持ユニット５３に別の針５１を位置決めし、針ホルダ５４にその針５１を吸着保持させる。
【００５４】
この実施の形態によれば、所定の誘導体を用いて、針５１の先端部５８の表面に化学吸着膜を形成し、この化学吸着膜で導入物質であるＤＮＡ分子を吸着するようにしたので、特定のＤＮＡ分子を針５１の先端部５８に一様に吸着させることができる。このため、ＤＮＡ分子の吸着量を安定させることができると共に、針５１の先端部５８の鈍化が防止される。したがって、精度良くＤＮＡの導入を行うことができる。
なお、針保持ユニット５３は、図８に示すような針保持ユニット７０でも良い。また、針保持ユニット６０，７０の代わりに、又はこれと併用するために、いずれかの洗浄ユニット１４，３１，４１を備えても良い。
【００５５】
なお、本発明は、前記各実施の形態に限定されずに広く応用することができる。
例えば、図６に示す遺伝子導入システム１は、いずれかの洗浄ユニット１４，３１，４１を備えても良い。洗浄ユニット１４，３１，４１と、針保持ユニット５３，７０とを備える場合には、使用後の針５１を洗浄ユニット１４，３１，４１にセットして洗浄するようにし、洗浄の間に他の針５１を用いて導入物質の導入を行うようにしても良い。
また、洗浄ユニット１４，３１，４１は、針５１を挿入可能な開口部２６，３４，４３を複数配列させた構成にしても良い。この場合には、一度に複数の針１１，５１の洗浄及び活性化が行える。
【００５６】
図６に示すような、吸着保持ユニット５２の代わりに、針５１の基部５７を把持する把持ユニットを備えても良い。把持ユニットは、導入後の針５１を所定位置で解放した後に、針保持ユニット５３で保持する異なる針５１を再度把持して、再度同一もしくは異なる導入物質を吸着保持し、所定の生体試料内に導入させる。
また、図６に示すような針保持ユニット５３に超音波振動子２８や、オゾン発生器などを取り付けて、針５１の洗浄と共に改質も行うようにしても良い。同様に、図７に示すような針保持ユニット７０に、プラズマ発生器３３、オゾン発生器、又は紫外線ランプユニット４４を取り付けて、針５１の洗浄と共に改質も行うようにしても良い。この場合には、洗浄と同時もしくは洗浄後の改質ユニット８１（図１０参照）で所定の官能基形成処理を行い、導入に適用する。さらに、針保持ユニット５３，７０で改質と活性の維持を同時に行うことも可能である。
そして、遺伝子導入システム１，８０には、細胞を培養する手段を持たせることが可能であり、細胞培養装置を追加したり、システム全体を細胞培養装置に入れて動作させたりしても良い。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明の実施の形態における遺伝子導入システムの概略構成を示す図である。
【図２】導入物質容器の構成を示す側部断面図である。
【図３】洗浄ユニットの構成を示す側部断面図である。
【図４】洗浄ユニットの構成を示す側部断面図である。
【図５】洗浄ユニットの構成を示す側部断面図である。
【図６】本発明の実施の形態における遺伝子導入システムの概略構成を示す図である。
【図７】針保持ユニットの構成を示す側部断面図である。
【図８】針保持ユニットの構成を示す側部断面図である。
【図９】改質ユニットの配置を説明する斜視図である。
【図１０】改質ユニットの構成を示す側部断面図である。
【符号の説明】
【００５８】
４      試料容器（試料保持手段）
１０    導入装置
１１，５１    針（導入手段）
１２    位置決め手段
１４，３１，４１    洗浄ユニット（洗浄手段，活性化手段）
１５    導入物質容器（溶液保持手段）
２７    超音波洗浄槽（洗浄槽）
２８    超音波振動子
３３    プラズマ発生器
４４    紫外線照射ユニット
５３，７０    針保持ユニット（活性化手段）
６０    ケース（容器）
７１    ケース（保持手段）
８１    改質ユニット（改質手段，活性化手段）
【図１】
2005224115.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005224115.tif 000009
【図８】
2005224115.tif 000010
【図９】
2005224115.tif 000011
【図１０】
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