(57)【要約】【課題】  破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患を反映する疾患マーカーの選抜方法、および該疾患マーカーを利用した骨代謝異常疾患の改善に有用な薬物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】  NFAT2が転写因子として機能する破骨細胞分化条件下における遺伝子の発現と、転写因子NFAT2の核への移動を阻害する物質を加えてNFAT2が転写因子として機能しない条件下における遺伝子の発現と比較し、破骨細胞分化条件における遺伝子発現量が、転写因子NFAT2の核への移動を阻害する物質を加えた場合より有意に大きい遺伝子を選抜することによって、破骨細胞の分化の過程で転写因子NFAT2によって発現誘導される遺伝子を選抜する。こうして選抜された遺伝子またはその翻訳産物であるタンパク質を、骨代謝異常疾患の改善に有用な薬物のスクリーニングに利用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法：
(ａ) 破骨細胞前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質とを接触させた場合と、前記細胞に破骨細胞分化誘導物質及びNFAT2の核への移動を阻害する物質を接触させた場合とで、遺伝子の発現量を比較する工程、
(ｂ) （a）の比較結果に基づいて、NFAT2の核への移動を阻害する物質の添加により、発現量が減少した遺伝子を選択する工程。
【請求項２】
NFAT2の核への移動を阻害する物質がサイクロスポリンAまたはFK506である請求項１記載の選抜方法。
【請求項３】
破骨細胞前駆細胞がマウスRAW264細胞である請求項１または請求項２記載の選抜方法。
【請求項４】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ) （ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【請求項５】
破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の翻訳産物の発現量を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と、請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の翻訳産物を発現可能な細胞あるいは該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞あるいはその細胞画分における該翻訳産物の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞あるいはその細胞画分における発現量と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該翻訳産物の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項７】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質を、請求項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物に接触させる工程、
(ｂ) 上記(ａ)の工程に起因して生じる該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合の機能（活性）と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
【請求項８】
破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、請求項６または請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
疾患マーカー遺伝子がchemokine (C-C motif) ligand 3遺伝子、chemokine (C-C motif) receptor 1遺伝子、またはhypothetical protein BC009732遺伝子である、請求項４〜請求項８に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代謝異常疾患、例えば骨粗鬆症や慢性関節リュウマチで遺伝子発現が増大するNFAT2遺伝子が、破骨細胞分化の過程で転写因子として他の遺伝子の発現を誘導するが、その発現誘導はサイクロスポリンAまたはFK506といった化合物で抑制される、という性質をもとにした、疾患マーカーの選抜法、ならびに選抜した疾患マーカーを利用して、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患、例えば慢性関節リウマチや骨粗鬆症等の疾患の改善薬または治療薬として有効な物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とが絶えず繰り返されている動的組織である。骨芽細胞と破骨細胞の機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し様々な骨代謝異常疾患が引き起こされることが知られている。またステロイド治療等による治療の副作用によっても骨代謝異常が生じる場合がある。また骨代謝異常疾患はその進行に従って身体活動能力の低下が生じ、ひいては腰痛・関節痛等の痛みを伴うため、日常生活動作に支障をきたすことも多い。
【０００３】
近年、骨密度の測定手法（DXA法；Dual energy X-ray absorptiometry法）が改良されたことから骨密度の健診が安価で容易に受けられるようになり、これによって骨代謝異常の診断の機会も増している。
【０００４】
一方で、最近の医療現場では、骨代謝異常疾患に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのQOL（Quality of life）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカー遺伝子の選定が有用であり、その探索並びにそれらを標的とした疾患の改善薬、治療薬の開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
なお、これまでに本発明者は、NFAT2が破骨細胞分化の重要因子であることを見いだしている（特許文献１，非特許文献１）
【特許文献１】国際公開番号WO 03/027284
【非特許文献１】Journal of Biological Chemistry 277, 41147-41156 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は骨代謝異常疾患のマーカー遺伝子となる、破骨細胞分化の過程で転写因子NFAT2に制御される遺伝子の選抜方法、および選抜された遺伝子またはその翻訳産物を利用した骨代謝異常疾患の改善または治療に有用な薬物のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、破骨細胞分化の過程では非常に多くの遺伝子の発現変動を報告しており、これら発現変動遺伝子の中から転写因子をコードするNFAT2遺伝子が骨代謝異常疾患の疾患マーカーとして有用であること、またNFAT2の性質として、破骨細胞分化条件下でもサイクロスポリンAを高濃度で添加すると産生されたNFAT2タンパクは核への移動が阻害され、転写因子として機能しない、そしてその際には破骨細胞の分化が抑制されることから、NFAT2は破骨細胞分化の重要因子であることを見いだしていた（Journal of Biological Chemistry 277, 41147-41156 (2002)、国際公開番号WO 03/027284）。しかし、NFAT2については転写因子としてInterleukin-2遺伝子の発現誘導に関与することが知られている（Molecular and Cellular Biology 19, 2300-2307 (1999)）が、その他遺伝子の発現誘導に関して報告はほとんどない。まして破骨細胞分化時において重要な転写因子であるNFAT2がどの遺伝子の発現誘導に関与しているかはわからなかった。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、NFAT2が転写因子として機能する破骨細胞分化条件下における多くの遺伝子の発現と、サイクロスポリンAを加えてNFAT2が転写因子として機能しない条件下における多くの遺伝子の発現とを比較することによって、従来、破骨細胞での発現が知られているchemokine (C-C motif) ligand 3 遺伝子（以下、本明細書において「Ccl3遺伝子」ともいう。）（GenBank Accession No. NM_002983, Journal of Biochemistry 99, 885-894 (1986)）、およびCcl3タンパクの受容体をコードするchemokine (C-C motif) receptor 1遺伝子（以下、本明細書において「Ccr1遺伝子」ともいう。）（GenBank Accession No. NM_001295, Journal of Experimental Medicine 177, 1421-1427 (1993)）、さらにはNa+/H+トランスポーター、あるいはK+/H+トランスポーターをコードしていると推測されているhypothetical protein BC009732遺伝子（以下、本明細書において「BC009732遺伝子」ともいう。）の発現が破骨細胞の分化の過程で有意な発現増大を示し、さらに、これらの遺伝子は破骨細胞分化の過程で産生される転写因子NFAT2によって発現誘導されることを見いだした。しかもそれらの遺伝子は、リウマチモデルマウスの関節部位で顕著に増大していたことから、本発明者らは、破骨細胞分化の過程で転写因子NFAT2によって制御される遺伝子の選抜手法が、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の疾患マーカーの選抜に非常に有効であるとの知見を得た。
また、この選抜手法により得られた骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子であるCcr1遺伝子、Ccl3遺伝子およびBC009732遺伝子の発現抑制や、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現抑制や機能（活性）抑制を指標としたスクリーニング系は新たなメカニズムに基づく骨代謝異常疾患の予防、改善または治療薬の探索に有効であるとの確信を得た。
本発明はかかる知見を基礎として完成するに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
項１．下記の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法：
(ａ) 破骨細胞前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質とを接触させた場合と、前記細胞に破骨細胞分化誘導物質及びNFAT2の核への移動を阻害する物質を接触させた場合とで、遺伝子の発現量を比較する工程、
(ｂ) （a）の比較結果に基づいて、NFAT2の核への移動を阻害する物質の添加により、発現量が減少した遺伝子を選択する工程、
項２．NFAT2の核への移動を阻害する物質がサイクロスポリンAまたはFK506である項１記載の選抜方法、
項３．破骨細胞前駆細胞がマウスRAW264細胞である項１または項２記載の選抜方法、
項４．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の発現を制御する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ) （ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程、
項５．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項４に記載のスクリーニング方法、
項６．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の翻訳産物の発現量を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質と、項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子の翻訳産物を発現可能な細胞あるいは該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞あるいはその細胞画分における該翻訳産物の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞あるいはその細胞画分における発現量と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該翻訳産物の発現量を抑制する被験物質を選択する工程、
項７．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する物質のスクリーニング方法：
(ａ) 被験物質を、項１記載の選抜方法で得られた疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物に接触させる工程、
(ｂ) 上記(ａ)の工程に起因して生じる該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合の機能（活性）と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程、
項８．破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、項６または項７に記載のスクリーニング方法、
項９．疾患マーカー遺伝子がchemokine (C-C motif) ligand 3遺伝子、chemokine (C-C motif) receptor 1遺伝子、またはhypothetical protein BC009732遺伝子である、項４〜項８に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、破骨細胞分化の過程で遺伝子の発現がNFAT2の関与によって増大し、また、骨代謝異常疾患、例えば慢性関節リウマチなどの疾患で発現が増大している遺伝子の選抜方法が確立された。また、この選抜方法により見いだされたCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）としても有用である。かかるマーカー遺伝子を用いることによって破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患であるかどうか、その原因を明らかにすることができ（診断精度が向上）、より適切な治療を施すことが可能となる。すなわち、骨代謝異常疾患の適切な治療のためのツールとして利用することができる。
【００１０】
更に、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子の発現増加と破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患との関連性から、該遺伝子の発現を抑制する化合物は、上記骨代謝異常疾患の治療薬として有用であると思われる。従って、本発明の遺伝子を用いることによって、その発現の抑制若しくは減少を指標にすることにより、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の治療薬となり得る候補薬をスクリーニング選別することが可能である。すなわち、本発明は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患の治療薬の開発に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本明細書において、アミノ酸、ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, European Jouranal of Biochemistry, 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１２】
本明細書において「DNA」とは、２本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖DNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書においてDNAとは、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む２本鎖DNAおよびcDNAを含む１本鎖DNA（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖DNA（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。なお、DNAは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本明細書において「RNA」とは、１本鎖RNAのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖RNA、さらにはそれらから構成される2本鎖RNAを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００１３】
本明細書において「遺伝子」または「ポリヌクレオチド」とは、特定の塩基配列で示される「RNA」または「DNA」だけでなく、ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子、およびその断片の「RNA」または「DNA」が含まれる。なお、上記DNAには、cDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAのいずれもが含まれる。また上記RNAには、total RNA、mRNA、rRNA、及び合成のRNAのいずれもが含まれる。
【００１４】
従って本明細書において「Ccl3遺伝子」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるヒトCcl3遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号１に記載のヒトCcl3遺伝子(GenBank Accession No. NM_002983)や、そのマウスホモログである配列番号３に記載のマウスCcl3遺伝子（GenBank Accession No. NM_011337）などが包含される。
【００１５】
また、本明細書において「Ccr1遺伝子」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定塩基配列（配列番号５）で示されるヒトCcr1遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号５に記載のヒトCcr1遺伝子(GenBank Accession No. NM_001295)や、そのマウスホモログである配列番号７に記載のマウスCcr1遺伝子（GenBank Accession No. NM_009912）などが包含される。
【００１６】
本明細書において「BC009732遺伝子」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定塩基配列（配列番号９）で示されるヒトBC009732遺伝子（DNA）や、その同族体、変異体および誘導体などをコードする遺伝子を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号９に記載のヒトBC009732遺伝子(GenBank Accession No. NM_178833)や、そのマウスホモログである配列番号１１に記載のマウスBC009732遺伝子（GenBank Accession No. NM_178877（マウスオーソログ遺伝子：C80638遺伝子））などが包含される。
【００１７】
本明細書において「タンパク質」または「ポリペプチド」には、特定のアミノ酸配列で示される「タンパク質」または「ポリペプチド」だけでなく、ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子からの翻訳産物である「タンパク質」または「ポリペプチド」、およびその断片、さらにはこれらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、誘導体、および変異体が包含される。なお、上記変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％相同なものを挙げることができる。
【００１８】
従って本明細書において「Ccl3タンパク」または「Ccl3」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトCcl3タンパクや、生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、誘導体、および変異体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号２に記載のヒトCcl3(GenBank Accession No. NP_002974)や、そのマウスホモログである配列番号4に記載のマウスCcl3(GenBank Accession No. NP_035467)などが包含される。
【００１９】
また、本明細書において「Ccr1タンパク」または「Ccr1」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号６）で示されるヒトCcr1タンパクや、生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、誘導体、および変異体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号６に記載のヒトCcr1(GenBank Accession No. NP_001286)や、そのマウスホモログである配列番号８に記載のマウスCcr1(GenBank Accession No. NP_034042)などが包含される。
【００２０】
本明細書において「BC009732タンパク」または「BC009732」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号１０）で示されるヒトBC009732タンパクや、生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、誘導体、および変異体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号１０に記載のヒトBC009732(GenBank Accession No. NP_849155)や、そのマウスホモログである配列番号１２に記載のマウスBC009732（GenBank Accession No. NP_849208（マウスオーソログ遺伝子：C80638遺伝子））などが包含される。
【００２１】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００２２】
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患、例えば慢性関節リウマチや骨粗鬆症などの罹患の有無若しくは罹患の程度の指標するために、直接または間接的に利用されるものであり、例えば、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連して生体内での発現が変動する遺伝子、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、ポリペプチド、およびそれらを特異的に認識し、また結合することのできるポリヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらのポリヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内で発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、またポリヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして、さらにタンパク質は結合する化合物のスクリーニングに有効に利用することができる。従って本明細書における「疾患マーカー遺伝子」とは、疾患マーカーとなる遺伝子のことを指す。
【００２３】
本発明は、前述するように、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子が、破骨細胞分化の過程で産生される転写因子NFAT2によって発現誘導され、しかもそれらの遺伝子の発現は、リウマチモデルマウスの関節部位で顕著に増大しているという知見に基づくものである。従って、破骨細胞の分化の過程で産生される転写因子NFAT2によって制御される遺伝子の選抜方法は、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法として非常に有用である。また、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子及びその翻訳産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、骨代謝異常疾患、特に破骨細胞の分化や活性化の亢進に関連して生じる骨代謝異常疾患の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。個体または骨組織における、上記遺伝子の発現またはその翻訳産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、骨代謝異常疾患の解明や診断に有効に利用することができる。さらに、これらの遺伝子及びその翻訳産物並びにそれらからの派生物（例えば、抗体など）は、上記骨代謝異常疾患の治療、並びに該治療に有効に用いられる薬剤の開発に好適に利用することができる。
【００２４】
以下、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法、およびこの選抜方法で得られた骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の具体的な用途を説明する。
【００２５】
（１）骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法
本発明は、前述のように、骨代謝異常疾患、例えば骨粗鬆症や慢性関節リュウマチで遺伝子発現が増大するNFAT2遺伝子が、破骨細胞分化の過程で転写因子として他の遺伝子の発現を誘導するが、その発現誘導能はサイクロスポリンAまたはFK506といった化合物で抑制される、という知見に基づいて、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子を選抜する方法を提供するものである。
【００２６】
本発明の選抜方法は次の(a)及び(b)の工程を含むものである：
(ａ) 破骨細胞前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質とを接触させた場合と、前記細胞に破骨細胞分化誘導物質及びNFAT2の核への移動を阻害する物質を接触させた場合とで、遺伝子の発現量を比較する工程、
(ｂ) （a）の比較結果に基づいて、NFAT2の核への移動を阻害する物質の添加により、発現量が減少した遺伝子を選択する工程。
【００２７】
ここでNFAT2の核への移動を阻害する物質としては、サイクロスポリンA、FK506などを挙げることができる。
また、破骨細胞前駆細胞としては、マウスやラットなどの動物あるいはヒトの骨髄や脾臓から採取し、調製され、破骨細胞へと分化可能な細胞、若しくはRAW264細胞株、RAW264.7細胞株などを挙げることができるが、好ましくはRAW264細胞株である。RAW264細胞株は理研バイオリソースセンター（http://www.brc.riken.jp/）から、RAW264.7細胞株はATCC（http://www.atcc.org/Home.cfm ）から入手することができる。
【００２８】
ここで用いられる破骨細胞分化誘導物質は、マウスやラットなどの動物あるいはヒト由来のRANKL（Receptor Activator of NFkappaB Lignad）タンパクまたはTnfsf11遺伝子（GenBank Accession No. NM_003701, NM_033012, NM_011613, NM_057149）の翻訳産物を一部あるいは全体を含み、上記破骨細胞前駆細胞に添加することで、破骨細胞に分化させることができるものであればよい。好ましくは、RANKLタンパクを含む。Tnfsf11遺伝子からRANKLタンパクを含む破骨細胞分化誘導物質の調製法は公知であり、Biochemical Biophysical Research Communication 282, 278-283 (2001)や特開2003-169687に記載の方法に従えばよい。またRANKLタンパクは、Santa Cruz Biotechnology社製の製品を購入することもできる。
【００２９】
破骨細胞への分化誘導方法は公知であり（Biochemical Biophysical Research Communication 282, 278-283 (2001)、Journal of Biological Chemistry 277, 21971-21982 (2002)）、例えば、上記破骨細胞前駆細胞に上記破骨細胞分化誘導物質を加えることで分化誘導することができる。また市販の破骨細胞培養キット（ホクドー社製）を用い、付属のプロトコールに従い、破骨細胞へ分化誘導することも可能である。
【００３０】
ここで用いられるサイクロスポリンAまたはFK506の添加量は、NFAT2タンパクの核への移動を抑制することができる濃度であればよく、何ら限定されない。具体的にはJournal of Biological Chemistry 277, 41147-41156 (2002)に基づいて設定することができる。例えば、サイクロスポリンAは0.5〜1μg/mlの濃度、好ましくは1μg/mlの濃度においてNFAT2タンパクの核への移動を抑制することができる。
【００３１】
破骨細胞前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質を添加して得られた細胞試料、あるいは破骨細胞前駆細胞に破骨細胞分化誘導物質とNFAT2の核への移動を阻害する物質を添加して得られた細胞試料の採取、RNAの調製、および遺伝子の発現量の測定、対照試料との遺伝子発現量の比較は、Journal of Biological Chemistry 277, 41147-41156 (2002)に基づいて行うことができる。また、遺伝子の発現量の測定は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法などの公知の方法で実施し、測定結果の数値データをもとに遺伝子発現量の比較を行うことができる。
【００３２】
骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子を選抜するには、具体的には、破骨細胞前駆細胞を破骨細胞分化誘導物質にて分化誘導させた条件下における、サイクロスポリンAまたはFK506を添加した細胞の遺伝子発現量と非添加細胞での遺伝子発現量とを比較して、サイクロスポリンAまたはFK506を添加した細胞での発現量が約１／２以下に減少している遺伝子を疾患マーカー遺伝子として選抜すればよい。
この際、分化誘導条件下でサイクロスポリンAまたはFK506を添加しない細胞での当該疾患マーカー遺伝子発現量は分化誘導していない細胞での発現量よりおよそ2倍以上大きいこと、分化誘導条件下でサイクロスポリンAまたはFK506を添加しない細胞とサイクロスポリンAまたはFK506を添加した細胞からの両方の試料が分化誘導処理後の時間にしてほぼ同時に採取されたものであること、また両方の細胞試料の採取時間はNFAT2タンパクが核へと移動している時間であること、さらには両方の細胞試料の採取時間が異なる複数の細胞試料からが選抜することが好ましいが、これらはJournal of Biological Chemistry 277, 41147-41156 (2002)および下記実施例に基づいて設定し、実施することができる。
【００３３】
（２）候補薬のスクリーニング方法
(２-１) 遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、前述（１）項に記載の選抜方法で得られる骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の発現量を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
(ａ) 被験物質と骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子の発現量と比較する工程、
(ｃ) （ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３４】
本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選択方法で得られる疾患マーカー遺伝子としては、例えば、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子などを挙げることができる。そのため、本発明のスクリーニング方法は、具体的には、これらの遺伝子の発現量を指標にして行うことができる。
【００３５】
本発明のCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現量を抑制する物質をスクリーニングする方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a) Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子を発現可能な細胞と被験物質を接触させる工程、
(b) 被験物質を接触させた細胞におけるCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の遺伝子発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
(c) (b)の比較結果に基づいて、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の遺伝子発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
【００３６】
かかるスクリーニングに用いられる細胞は、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子を発現する細胞であって、かつ破骨細胞への分化が可能である細胞であればよい。例えば、前述の破骨細胞前駆細胞を挙げることができ、好ましくはRAW264細胞である。RAW264細胞は、後述する実施例に示すように、RANKLタンパクを含む破骨細胞分化誘導物質の添加によって破骨細胞に分化し、その過程でCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子が発現誘導されることが確認されている。
【００３７】
また、スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用することが好ましい。
【００３８】
実施例に示すように、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子は破骨細胞分化の過程で遺伝子の発現が増大し、また、リウマチモデルマウスの関節部位でも該遺伝子の発現が増大している。これらの知見から、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子の発現は、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現あるいはその発現誘導が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したものである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現レベルの減少、あるいは発現誘導の抑制が指標とされる。
【００３９】
すなわち、本発明のスクリーニング方法はCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００４０】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、ヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００４１】
候補物質の選別は、具体的にはCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子が発現している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞における該遺伝子の発現量が被験物質（候補物質）を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなること、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質（例えば、RAW264細胞の場合はRANKLタンパクを含む破骨細胞分化誘導物質）によって誘導される該遺伝子の発現が候補物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質存在下で候補物質を接触させた細胞の遺伝子発現が、発現誘導物質存在下で候補物質を接触させない対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることをもって、行うことができる。
【００４２】
より具体的には、例えばRAW264細胞を用いて破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質をスクリーニングするには、破骨細胞分化誘導物質を添加したRAW264細胞（対照細胞）と、破骨細胞分化誘導物質と被験物質とを同時に加えたRAW264細胞とで、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現量を比較し、該発現量の減少を指標として候補物質を選別することができる。また、破骨細胞分化誘導物質を添加して、既にCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子が発現誘導された状態のRAW264細胞に被験物質を添加し、被験物質を添加しない対照のRAW264細胞の対応する遺伝子発現量を比較して、その発現量の低下を指標として候補物質を選別することもできる。
【００４３】
このような本発明スクリーニング方法における遺伝子の発現量の検出及び定量は、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法の他、DNAチップなどを利用して実施することができる。指標とする遺伝子発現の低下（減少）の程度は、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるCcl3遺伝子、Ccr1 遺伝子またはBC009732遺伝子の発現が被験物質（候補物質）を添加しない対照細胞での発現量と比較して10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上の低下（減少）を例示することができる。
【００４４】
またCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現量の検出及び定量は、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することで実施することもできる。本発明のCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現制御物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において前述（１）項の選抜方法で得られた「遺伝子」の概念には、当該遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
【００４５】
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましく、具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子も使用することができる。またここでCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現制御領域としては、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１kb、好ましくは約2kbを用いることができる。融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法により選別される被験物質は、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子の発現を抑制することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進を抑制し得ると考えられる。よって、これらの物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００４７】
(２-２) タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、前述（１）項に記載の選抜方法で得られる骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の翻訳産物の発現量を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
(ａ) 被験物質と、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の翻訳産物を発現可能な細胞または該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(ｂ) 被験物質を接触させた細胞あるいはその細胞画分における該翻訳産物の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞あるいはその細胞画分における発現量と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該翻訳産物の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
【００４８】
本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選別方法で得られる疾患マーカー遺伝子の翻訳産物としては、例えば、Ccl3、Ccr1またはBC009732などを挙げることができる。そのため、本発明のスクリーニング方法は、具体的には、これらの発現量を指標にして行うことができる。
【００４９】
本発明のCcl3、Ccr1またはBC009732の発現量を抑制する物質をスクリーニングする方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a)被験物質とCcl3、Ccr1またはBC009732を発現可能な細胞あるいは該細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
(b)被験物質を接触させた細胞あるいは細胞画分におけるCcl3、Ccr1またはBC009732の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞あるいはその細胞画分における対応するタンパク質の発現量と比較する工程、
(c) (b)の比較結果に基づいてCcl3、Ccr1またはBC009732の発現量を抑制する被験物質を選択する工程。
【００５０】
本発明スクリーニングに用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子またはBC009732遺伝子を発現し、発現産物としてCcl3、Ccr1またはBC009732を有する細胞を挙げることができる。Ccl3、Ccr1またはBC009732の発現は、公知のウエスタン法にて検出することにより、容易に確認することができる。該細胞としては、具体的には、前記(1)項に記載したような破骨細胞前駆細胞などが挙げられる。また細胞画分とは、かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであり、例えば細胞膜画分、細胞質画分、および細胞核画分などを挙げることができる。
【００５１】
実施例に示すように、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子は破骨細胞分化の過程で遺伝子の発現が増大し、また、リウマチモデルマウスの関節部位でも遺伝子の発現が増大している。これらの知見から、Ccl3、Ccr1およびBC009732の発現量が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法はCcl3、Ccr1またはBC009732が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したものである。よって本発明のスクリーニング方法は、Ccl3、Ccr1またはBC009732のタンパク発現量を指標として、該発現量を減少させる物質（発現レベルを正常に戻す物質）を探索する方法を包含する。このスクリーニング方法によって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、Ccl3、Ccr1またはBC009732の発現量を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
【００５２】
斯くして選抜取得される被験物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００５３】
候補物質の選別は、具体的にはCcl3、Ccr1またはBC009732を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるCcl3、Ccr1またはBC009732のタンパク量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して低くなることを指標として、行うことができる。
【００５４】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、ヌクレオチド、ペプチド、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法にかかるCcl3、Ccr1またはBC009732の発現量は、例えば、抗Ccl3抗体、抗Ccr1抗体または抗BC009732抗体を用いたウエスタンブロット法などの公知方法に従って定量できる。
【００５６】
ウエスタンブロット法は、一次抗体として抗Ccl3抗体、抗Ccr1抗体または抗BC009732抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器(BAS-1800II：富士フィルム社製など)、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として抗Ccl3抗体、抗Ccr1抗体または抗BC009732抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャム  ファルマシアバイオテク社製)を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム  ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００５７】
なお抗Ccl3抗体、抗Ccr1抗体または抗BC009732抗体は、公知の方法に従って作製することができるが、市販されているなどを用いてもよい。これらの抗体は、その形態に特に制限はなく、Ccl3、Ccr1またはBC009732を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらにCcl3、Ccr1またはBC009732のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も含まれる。
抗体の製造方法はすでに周知であるため、これらの常法に従って製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したCcl3、Ccr1またはBC009732を用いて、あるいは常法に従ってこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を含有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したCcl3、Ccr1またはBC009732、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を含有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００５８】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるCcl3、Ccr1またはBC009732は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：1、3、5、7、9、11）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。Ccl3、Ccr1またはBC009732タンパク質の部分ペプチドは、アミノ酸配列の情報（配列番号：2、4、6、8、10、12）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００５９】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods, 81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
【００６０】
(２-３) 機能（活性）を指標とするスクリーニング方法
本発明は、前述（１）項に記載の選抜方法で得られる骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
(ａ) 被験物質を、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物に接触させる工程、
(ｂ) 上記(a)の工程に起因して生じる該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合の機能（活性）と比較する工程、
(ｃ)（ｂ）の比較結果に基づいて、該遺伝子またはその翻訳産物の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
【００６１】
本発明の骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選別方法で得られる疾患マーカー遺伝子またはその翻訳産物としては、例えば、Ccl3、Ccr1またはBC009732などを挙げることができる。そのため、本発明のスクリーニング方法は、具体的には、これらの機能（活性）を指標にして行うことができる。
【００６２】
本発明のCcl3、Ccr1またはBC009732の機能（活性）を抑制する物質をスクリーニングする方法は、次の工程(a)、(b)及び(c)を含む：
(a)被験物質をCcl3、Ccr1またはBC009732に接触させる工程、
(b)被験物質を接触させたCcl3、Ccr1またはBC009732の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合の対応するタンパク質の機能（活性）と比較する工程、
(c) (b)の比較結果に基づいてCcl3、Ccr1またはBC009732の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
【００６３】
かかるスクリーニングに用いられるCcl3、Ccr1またはBC009732としては、内来性及び外来性などの由来に関わらずCcl3、Ccr1またはBC009732を有する細胞やその細胞画分を挙げることができる。また細胞画分とは、かかる細胞に由来する各種の画分を意味するものであり、例えば細胞膜画分、細胞質画分、および細胞核画分などを挙げることができる。
【００６４】
実施例に示すように、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子は破骨細胞分化の過程で遺伝子の発現が増大し、また、リウマチモデルマウスの関節部位でも遺伝子の発現が増大している。これらの知見から、Ccl3、Ccr1およびBC009732の機能（活性）が破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連する骨代謝異常疾患と関連していると考えられる。すなわち、本発明のスクリーニング方法はCcl3、Ccr1またはBC009732が、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患と関連していることを利用したものである。よって、該骨代謝異常疾患の緩和／抑制作用を有する（骨代謝異常疾患に対して改善／治療効果を発揮する）物質の探索には、上記タンパク質の機能または活性の低下もしくは抑制が指標とされる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、Ccl3、Ccr1またはBC009732の機能（活性）を抑制する物質を探索することによって、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患の改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。本発明のスクリーニング方法は、具体的には、例えばJournal of Biological Chemistry 273, 15687-15692 (1998)に記載されている方法などを用いて行うことができる。
【００６５】
斯くして選抜取得される被験物質は、破骨細胞の分化・活性化の亢進によって生じる骨代謝異常疾患を緩和、抑制（改善、治療）する薬物の有力な候補物質となる。
【００６６】
候補物質となりえるものとしては、制限されないが、ヌクレオチド、ペプチド、有機化合物、無機化合物などであり、スクリーニングは、具体的にはこれらの候補物質となり得る被験物質を含む試料（被験試料）を上記細胞と接触させて行うことができる。かかる被験試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これに制限されない。
【００６７】
上記に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに骨代謝異常疾患モデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに骨代謝異常疾患患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な骨代謝異常疾患改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
【００６８】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００６９】
マウスRAW264細胞の破骨細胞分化誘導とサイクロスポリンA処理による破骨細胞分化誘導の抑制
破骨細胞への分化誘導は、マウスRAW264細胞（Leukemic monocyte由来のマクロファージ様細胞）に、終濃度500ng/mlのRANKLタンパク（GST／RANKL融合タンパク質、調製法は特開2003-169687に記載）を加えることによって行った。また、破骨細胞への分化を抑制は、終濃度1μg/mlのサイクロスポリンA（Sigma社製）をRANKLタンパクと同時に加えて行った。
【００７０】
具体的には、マウスRAW264細胞は、予めE-MEM培地（ウシ胎児血清10％、ペニシリン50U/mLを含む）で、37℃、CO2濃度5％の条件下で培養しておき、このRAW264細胞を一晩培養した翌日、調製したRANKLタンパク（GST/RANKL融合タンパク質）またはGSTタンパク（コントロールタンパク質）、さらにはRANKLタンパク+サイクロスポリンAまたはGSTタンパク+サイクロスポリンAを含む培地と交換し、同条件でさらに4日間培養した。それら細胞の破骨細胞への分化状況はTRAP染色（tartrate-resistant acid phosphatase 染色、Endocrinology 122, 1373-1382 (1988)）を行うことによって調べた。RANKLタンパクを添加したRAW264細胞は、TRAP染色から72時間後には、TRAP陽性の多核細胞が見え始め、96時間後には大多数の細胞が破骨細胞様多核細胞に分化しているのが観察された。それに対して、上記RANKLタンパクに代えてGSTタンパクをRAW264細胞に加えた場合には、破骨細胞への分化は見られなかった。また、RANKLタンパクとサイクロスポリンAを同時に加えた場合には、破骨細胞への分化はほとんどみられなかった。            
【実施例２】
【００７１】
RAW264細胞からのtotal RNAの調製
実施例１でRANKLタンパク、GSTタンパク、RANKLタンパク+サイクロスポリンAまたはGSTタンパク+サイクロスポリンAで処理した細胞からそれぞれtotal RNAを調製した。具体的には実施例１に記載の濃度で各物質を添加した後、培養2, 5, 12, 24, 36, 48, 60 及び72時間経過後のRAW264細胞からそれぞれtotal RNAを調製した。同様にして、比較対照のために何も添加しないで培養したRAW264細胞（以下、本明細書において「未処理RAW264細胞」ともいう。）からtotal RNAを調製した。なお、total RNAの調製は、培養上清を除去した細胞を氷冷したPBS（phosphate-buffered saline）で3回洗浄した後、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて付属のプロトコールに従って行った。得られたtotal RNAはTE溶液（10mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA）に溶解した。
【実施例３】
【００７２】
DNAチップ解析
実施例２で調製したtotal RNAを用いてDNAチップ解析を行った。具体的には、解析は、total RNAからcDNAの調製、該cDNAからラベル化cRNAの調製、ラベル化cRNAのフラグメント化、フラグメント化cRNAとプローブアレイとのハイブリダイズ、プローブアレイの染色、プローブアレイのスキャン、及び遺伝子発現解析、の順に、特開2003-169687に記載の方法と同様の方法で行った。なお、DNAチップ解析はAffymetrix社Gene Chip Murine Genome U74A ver.2を用いた。遺伝子の発現量はGeneChip Workstation System(Affymetrix社製)の解析ソフトウェアMicroarray Suite version 5.0によって解析した。解析で得られたそれぞれの細胞試料由来の遺伝子発現量（Signal）と発現の有無（Detection）のデータは必要に応じて、2試料間での遺伝子発現量の比較解析に用いた。遺伝子発現量の比較解析はMicroarray Suite version 5.0 (Affymetrix社製)にある解析ツールComparison Analysisを用いて比較した。Comparison Analysisは解析プロトコールに基づいて行い、得られた遺伝子発現の増減の判定（Change）および発現変動倍率（Signal Log Ratio）データは2試料間での発現変動遺伝子の選抜に利用した。
【００７３】
具体的には、2試料間での遺伝子発現量の比較解析は、以下(a),(b),(c),(d)について行った。
（a）RANKLタンパクを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量と、未処理RAW264細胞における発現量の比較解析
（b）RANKLタンパクを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量と、GSTタンパクを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞での遺伝子発現量の比較解析
（c）RANKLタンパクを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量と、RANKLタンパク+サイクロスポリンAを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞での遺伝子発現量の比較解析
（d）GSTタンパクを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞における遺伝子発現量と、GSTタンパク+サイクロスポリンAを添加した後、培養12, 24, 36, 48, 60及び72時間経過後の各RAW264細胞での遺伝子発現量の比較解析
【実施例４】
【００７４】
破骨細胞分化過程での発現誘導がサイクロスポリンAにより抑制される遺伝子の選抜
まず、破骨細胞分化の過程で発現誘導する遺伝子の選抜を行い、それら遺伝子の中からサイクロスポリンAにより抑制される遺伝子を選抜した。
（１）破骨細胞分化の過程で発現誘導する遺伝子の選抜
破骨細胞分化の過程で発現誘導する遺伝子の選抜は、まず、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞と未処理RAW264細胞との遺伝子発現量の比較解析結果から、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞の方が、2倍以上発現が大きい（ChangeがIの判定、かつSignal Log Ratioが1以上）と示されたプローブセット（遺伝子）をタイムポイントごとに選抜した。次に、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞とGSTタンパクを添加したRAW264細胞との遺伝子発現量の比較解析結果から、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞の方が、2倍以上発現が大きい（ChangeがIの判定、かつSignal Log Ratioが1以上）と示されたプローブセットをタイムポイントごとに選抜した。そして最終的にはタイムポイントごとに共通に選抜されたプローブセット（遺伝子）を、破骨細胞分化の過程で発現誘導する遺伝子とした。
【００７５】
（２）サイクロスポリンAにより発現が抑制される遺伝子の選抜
サイクロスポリンAにより発現が抑制される遺伝子の選抜は、まず、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞とRANKLタンパク+サイクロスポリンAを添加したRAW264細胞との遺伝子発現量の比較解析結果から、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞の方が、2倍以上発現が大きい（ChangeがIの判定、かつSignal Log Ratioが1以上）と示されたプローブセットをタイムポイントごとに選抜した。次に、GSTタンパクを添加したRAW264細胞とGSTタンパク+サイクロスポリンAを添加したRAW264細胞との遺伝子発現量の比較解析結果から、GSTタンパクを添加したRAW264細胞の方が、2倍以上発現が大きい（ChangeがIの判定、かつSignal Log Ratioが1以上）と示されたプローブセットをタイムポイントごとに選抜し、RANKLタンパクを添加したRAW264細胞とRANKLタンパク+サイクロスポリンAを添加したRAW264細胞との比較解析をもとに選抜したプローブセットから除いた。そして最終的にタイムポイントごとに選抜されたプローブセット（遺伝子）を、サイクロスポリンAにより発現が抑制される遺伝子とした。
【００７６】
（３）破骨細胞分化過程での発現誘導がサイクロスポリンAにより抑制される遺伝子の選抜
破骨細胞分化過程での発現誘導がサイクロスポリンAにより抑制される遺伝子の選抜は、上記（１）,（２）でタイムポイントごとに共通のプローブセットを選抜することで行った。
こうして得られた破骨細胞分化過程での発現誘導がサイクロスポリンAにより抑制される遺伝子は70プローブセットあった。これら遺伝子の中にCcl3遺伝子（Gene Chip Murine Genome U74A ver.2のプローブセットID：102424_at）、Ccr1遺伝子（同プローブセットID：99413_at）、C80638遺伝子（ヒトBC009732のマウスオーソログ遺伝子、同プローブセットID：96481_at）が含まれていた。また、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子、BC009732遺伝子（C80638遺伝子）はいずれも、RANKLタンパク添加後36あるいは48時間のRAW264細胞での遺伝子発現量が、同じタイムポイントにおけるRANKLタンパク+サイクロスポリンA添加、GSTタンパク+サイクロスポリンA添加、GSTタンパク添加、および未処理RAW264細胞での遺伝子発現量より、2倍以上発現が大きい遺伝子であった（図１）。よって、上記方法により、破骨細胞分化の過程で転写因子NFAT2が発現誘導に関与する遺伝子として、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子（C80638遺伝子）を選抜することができた。
【実施例５】
【００７７】
破骨細胞分化時における転写因子NFAT2の遺伝子転写制御領域への結合の検出
RANKLタンパク、GSTタンパクあるいはRANKLタンパク+サイクロスポリンA添加後48時間のRAW264細胞からそれぞれ核画分を調製し、Ccl3遺伝子の転写調節領域に存在する推定NFAT2結合領域に該当するオリゴヌクレオチドとの結合を確認した。
細胞からの核画分の調製は、まず、採取した細胞を緩衝液1（10mM Hepes-OH(pH7.4), 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 100KIU/ml aprotinin）に入れて15分間氷冷した後、IGEPAL CA-630 (Sigma社製) を終濃度0.625%となるように加えて10秒間攪拌、その後、15000rpmで1分間遠心し、不溶性画分を回収した。次に回収した画分を緩衝液2(10mM Hepes-OH(pH7.4), 400mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 100KIU/ml aprotinin)に懸濁して15分氷冷後、15000rpmで5分間遠心した。こうして得られた上清画分を核画分として採取した。
【００７８】
Ccl3遺伝子の転写調節領域に存在する推定NFAT2結合領域については、Ccl3遺伝子の転写開始点上流約1kbからNFAT2結合に重要な5'-GGAAAA-3'配列（Journal of Biological Chemistry 277, 47136-47148 (2002)）を調べた結果、複数箇所見いだすことができた。そのうち2箇所について配列番号13の2本鎖オリゴヌクレオチドと配列番号14の2本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、それらを32Pで標識した後、前出の核画分との結合実験に用いた。
結合実験は緩衝液３(10mM Hepes-OH(pH7.4), 80mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 6% glycerol, 25μg/ml poly(dI-dC), 25μg/ml salmon sperm DNA)中で、前出の32P標識した合成オリゴヌクレオチド0.5μgと1 μgの核画分を加えて、総量20μlとし、室温で30分間行った。こうして結合実験で得られた溶液は、6% acrylamide, 6% glycerol, 1×Tris glycine-EDTAのゲルでの電気泳動にかけた。電気泳動後、乾燥したゲルにX線フィルムを当て、標識オリゴヌクレオチドと転写因子タンパクの結合産物由来のバンドを検出した。
その結果、RANKLタンパク添加後48時間のRAW264細胞由来の核画分と配列番号13のオリゴヌクレオチドを用いた場合には標識オリゴヌクレオチドと転写因子タンパクの結合産物によるものと推定されるバンドが検出された（図2）。ここで検出された転写因子タンパクがNFAT2であるかを確認するために、前記の結合実験の溶液中に抗NFATc1(NFAT2)モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を1μg加えて、同様の手法でバンドを検出したところ、標識オリゴヌクレオチドと転写因子タンパク、さらには抗体が結合したと推定されるバンドが検出されたため、標識オリゴヌクレオチドと結合している転写因子タンパクはNFAT2タンパクであることが確認できた（図3）。
一方で、配列番号14のオリゴヌクレオチドを用いた場合では、RANKLタンパク添加後48時間のRAW264細胞由来の核画分でも標識オリゴヌクレオチドとNFAT2タンパクの結合産物のバンドが検出できなかった（図2）。
以上のことから、Ccl3遺伝子では、破骨細胞分化の過程で核内に存在するNFAT2が、Ccl3遺伝子上流の転写調節領域に結合することがわかった。このことはCcl3遺伝子が、破骨細胞分化の過程で転写因子NFAT2の制御を受けて遺伝子発現の増大が引き起こされることを強く支持するものである。
【実施例６】
【００７９】
リウマチモデルマウスの関節部位と正常マウスの関節部位での遺伝子発現量の比較解析
コラーゲン誘導関節炎マウス（American Journal of Reproductive Immnunology and Microbiology 11, 44-54 (1986)）でリウマチ様症状の確認された関節部位１サンプルと、コラーゲンで誘導しない正常なマウスの関節部位１サンプルからtotal RNAを調製した。DNAチップ解析は、実施例３と同様な方法でAffymetrix社Gene Chip Murine Genome U74A ver.2を用いて行った。表１に示すように、正常な関節部位に比べてリウマチモデルマウスの関節部位では、TRAP5（acid phosphatase 5, tartrate resistant、GenBank Accession No. NM_001611）、Cathepsin K（GenBank Accession No. NM_000396）など破骨細胞で特に多く発現している遺伝子（Development 122,  3151-3162 (1996)、Journal of Bone and Mineral Research 10, 1197-1202 (1995)）の増大がみられた。さらにCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子、BC009732遺伝子（C80638遺伝子）でも同様の発現増がみられた。表１のリウマチモデル関節部位での発現は、正常関節部位における遺伝子発現量を１とした場合のリウマチモデルマウスの関節部位での遺伝子発現量の相対比を示すものであり、+は発現増であることを示す。破骨細胞での発現は、未処理RAW264細胞における遺伝子発現量を１とした場合のRANKLタンパク添加後72時間のRAW264細胞での遺伝子発現量の相対比を示すものであり、+は発現増であることを示す。
【００８０】
【表１】
2005224188.tif 000002
【００８１】
図１および表１の結果からわかるように、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子、BC009732遺伝子（C80638遺伝子）は、正常な関節部位より、リウマチの関節部位での発現が増大しているため、骨代謝異常疾患に関するマーカー遺伝子として応用可能な遺伝子であると考えられた。また、これらの遺伝子を用いることによって破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連のある骨代謝異常疾患を緩和、抑制する治療薬の候補薬をスクリーニングすることが可能である。
【実施例７】
【００８２】
Ccl3遺伝子またはCcr1遺伝子あるいはBC009732遺伝子の発現抑制剤のスクリーニング
前記のRAW264細胞を5x103細胞/cm2となるようにプレートに播種し、37℃、CO2濃度5%で一夜培養する。翌日、実施例1と同様にRANKLタンパク質を終濃度500ng/ml含む培地と交換し、それぞれ100μM、10μM、および1μMの濃度に調製した被験物質含有溶液を添加し、37℃、CO2濃度5%で2日間培養する。ここで、対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様に培養する（コントロール）。これらの各培養細胞より抽出したRNAを用いて実施例３に記載された方法で、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子あるいはBC009732遺伝子（C80638遺伝子）の発現量を調べる。その発現量からコントロールと比べてCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子あるいはBC009732遺伝子（C80638遺伝子）の発現量が10%、好ましくは30%、特に好ましくは50%以上減少させる被験物質を骨代謝異常疾患の緩和、抑制（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、破骨細胞の分化・活性化の亢進に関連した骨代謝異常疾患を反映する骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子の選抜方法、骨代謝異常疾患の疾患マーカー遺伝子であるCcl3遺伝子、Ccr1遺伝子およびBC009732遺伝子、および該疾患マーカー遺伝子およびその翻訳産物を利用した骨代謝異常疾患の改善に有用な薬物のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図1は、実施例3のDNAチップ解析から得られた、RANKLタンパクまたはGSTタンパク、さらにはRANKLタンパク+サイクロスポリンAまたはGSTタンパク+サイクロスポリンAでそれぞれ処理したRAW264細胞における、Ccl3遺伝子、Ccr1遺伝子、BC009732遺伝子（C80638遺伝子）の遺伝子発現量（Signal）の経時変化を示した図である。RANKLタンパクで処理したRAW264細胞での発現量を黒丸で、RANKLタンパク+サイクロスポリンAで処理した細胞での発現量を白丸で、GSTタンパクで処理した細胞での発現量を黒四角で、GSTタンパク+サイクロスポリンAで処理した細胞での発現量を白四角で示している。
【図２】図2は、実施例5において、RANKLタンパクまたはGSTタンパク、さらにはRANKLタンパク+サイクロスポリンA添加後48時間のRAW264細胞からそれぞれ調製した核画分と、32Pで標識した配列番号13または配列番号14のオリゴヌクレオチドを用いて、DNAと転写因子タンパクの結合産物の検出を行った結果の図である。配列番号13のオリゴDNAとRANKLタンパク添加48時間のRAW264細胞由来の核画分を用いた場合に、結合産物と推定されるバンド（矢印）が検出された。
【図３】図3は、配列番号13のオリゴDNAとRANKLタンパク添加48時間のRAW264細胞由来の核画分を用いた場合の結合実験の溶液中に抗NFATc1(NFAT2)抗体を加えて、結合産物を検出した結果の図である。抗NFATc1抗体を加えた場合にのみ、オリゴDNA、NFAT2タンパク、抗NFAT2抗体の結合産物と推定されるバンド（＊印）が検出された。
【配列表フリーテキスト】
【００８５】
配列番号：１３に記載の塩基配列は、実施例５で用いたオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号：１４に記載の塩基配列は、実施例５で用いたオリゴヌクレオチドの配列である。
【図１】
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【図２】
2005224188.tif 000004
【図３】
2005224188.tif 000005
【配列表】
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