(57)【要約】【課題】  ペプチド及びタンパク性薬物の活性を保持したままキトサンゲル内へ１００％固定化でき、生体適合性と生体内分解性を有する放出制御剤の調製方法及び放出制御剤を提供せんとする。【解決手段】  薬物を溶解したキトサン水溶液を金属イオン含有水溶液に滴下し、球状ゲルを調製することを特徴とする。薬物の放出制御は、調製液中の金属イオン濃度又はキトサンの脱アセチル化度、或いはキトサン水溶液のキトサン濃度、更にはキトサンを溶解する緩衝液濃度によって、球状ゲルの生体内分解速度をコントロールすることによりできる。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物を溶解したキトサン水溶液を金属イオン含有水溶液に滴下し、球状ゲルを調製することを特徴とするペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤の調製方法。
【請求項２】
調製液中の金属イオン濃度によって薬物放出を抑制する請求項１記載のペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤の調製方法。
【請求項３】
キトサンの脱アセチル化度によって薬物放出を抑制する請求項１又は２記載のペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤の調製方法。
【請求項４】
キトサン水溶液のキトサン濃度によって薬物放出を抑制する請求項１、２又は３記載のペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤の調製方法。
【請求項５】
キトサンを溶解させる緩衝液濃度によって薬物放出を抑制する請求項１、２、３又は４記載のペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤の調製方法。
【請求項６】
キトサン及び金属イオンにより形成される錯体球状ゲル内に薬物を固定化せしめたことを特徴とするペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤。
【請求項７】
薬物がインスリン、アルブミンである請求項５記載のペプチド及びタンパク性薬物放出制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物放出特性を有する薬剤の製造方法及びその薬剤に関するものであり、特にペプチド及びタンパク性薬物の放出特性に利用できるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物放出制御製剤は、薬物の供給を量的及び時間的に制御し、薬物を病巣部位に滞留させることにより、病巣部位での直接的な作用が期待できる。
又、過剰量の薬剤の放出を制御し、薬物の血中への移行を制限することにより、全身性副作用の軽減が期待でき、患者のＱＯＬ向上の観点からも、より効果的な治療に貢献できる可能性を有している。
【０００３】
発明者等は、これまでに緩和な水系条件下においてキトサンゲルを調製し、本ゲルが優れた薬物固定化能、及び薬物放出制御能を有することを報告してきた。
又、キトサンゲルは薬物保持担体としての役割を終えた後、生体内で分解され、消失することを確認しており、埋め込み型ターゲティング製剤として期待できることを示している。
【特許文献１】特開２０００−２５６２１６
【特許文献２】特開２０００−５３５８７
【特許文献３】特開平１１−１３０６９７
【特許文献４】特開平８−１２５９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記キトサンゲルからの薬物放出は、ゲルマトリックスからの薬物の拡散により制御される。そのため、水溶性の高い薬物の放出制御には限界があった。
【０００５】
又、インスリン等のペプチド及びタンパク性薬物においては、キトサンのゲル化について、グルタルアルデヒド又は無水酢酸による架橋では残存する架橋剤を取り除くために有機溶媒で洗浄する際、タンパク性の薬物はその活性が失われること、強アルカリ条件下ではゲルマトリックスが弱く、薬物の安定性が損なわれ、タンパク性薬物は活性を失うこと等の問題がある。
【０００６】
更に、ペプチド及びタンパク性薬物の輸送のための担体について、これらの薬物は生体内で活性を失いやすいため、効率的に作用部位へ到達させる必要があり、活性を保持したまま輸送担体へ固定化すること、及びこれらの薬物は一般に水溶性が高いため、高率で固定化することは困難である等の問題が提起されている。
【０００７】
一般にインスリン等のタンパク性薬物は、高分子量であるため粘膜や皮膚からの透過性は低いが、粘膜付着性を付加することにより、粘膜からの吸収性が向上することが判明している。
【０００８】
そこで、本発明者等は金属イオンを利用し、薬物とキトサンゲルマトリックスとのインターラクションを強固にすることにより、薬物放出制御の可能性を見い出し、ペプチド及びタンパク性薬物の活性を保持したままキトサンゲル内へ１００％固定化でき、生体適合性と生体内分解性を有する放出制御剤の調製方法及び放出制御剤を提供せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、薬物を溶解したキトサン水溶液を金属イオン含有水溶液に滴下し、球状ゲルを調製することを特徴とするものである。
【００１０】
薬物放出の制御は、調製液中の金属イオン濃度、又はキトサンの脱アセチル化度或いはキトサン水溶液のキトサン濃度、更にはキトサンを溶解する緩衝液濃度によって、球状ゲルの生体内分解速度をコントロールすることによりできる。
【００１１】
又、本発明のペプチド及びタンパク性薬物の放出制御剤は、キトサン及び金属イオンにより形成される錯体球状ゲル内に薬物を固定化せしめたことを特徴とするものであり、ペプチド及びタンパク性薬物にはインスリンやアルブミン等が例示できる。
【００１２】
本発明は、キトサン、金属イオン、そしてペプチド及びタンパク性薬物の三者が相互に同時に作用することにより目的を達成するのである。
すなわち、キトサンと金属イオンはキトサンのゲル化を調整し、キトサンのアミノ基とペプチド及びタンパク性薬物のカルボキシル基が静電的に結合し、金属イオンがペプチド及びタンパク性薬物を不溶化し重合させることにより、ペプチド及びタンパク性薬物はゲルマトリックス中に固定化され、ゲルマトリックスからの拡散では放出せず、キトサンゲルの生分解にしたがって持続放出するものとなるのである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、キトサン、金属イオン、そしてペプチド及びタンパク性薬物の三者の相互作用を同時に行わせることにより、より強固に作用し、ペプチド及びタンパク性薬物が調製液中に漏出することなく、キトサンゲル内に１００％固定化できる効果を有する。
本キトサンゲルは、中性の水溶液中という緩和な条件下で調製できるため、タンパク性薬物の活性の保持が可能であり、固定化された薬物はゲルマトリックスからの拡散では放出せず、キトサンゲルの生分解にしたがって長期間薬物を持続放出する効果を発揮するのである。
【００１４】
又、キトサンゲルは生体内で確実に生分解し、投与時の炎症等は認められず、生体適合性に優れた効果を有し、更にキトサンはカチオン性の高分子であるから、それ自体で粘膜付着性を有し、粘膜からの薬物の吸収性を向上させることが期待できるのである。
【００１５】
そして、キトサンゲル内に固定化された薬物は、キトサンゲルの生体内分解にしたがって放出されるため、キトサンの性状を選択するだけで生体内分解速度が制御され、薬物の放出速度をコントロールできる効果を有するのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、各種キトサン（脱アセチル化度７０〜１００％、分子量１６万〜２８０万Ｄａ）を緩衝液に溶解し、そこに緩衝液に溶解させた薬物を添加し、一定時間以上撹拌した薬物含有キトサン水溶液を金属イオン（銅、亜鉛等）含有水溶液中に滴下し、キトサン球状ゲルを調製するものである。
【００１７】
調製されたキトサン球状ゲルは、ｐＨ７．２リン酸緩衝液中では膨潤することなく形状を維持し、ｐＨの低い溶液中では膨潤はするが球状を維持し、何れの溶液中でも崩壊することはなかった。
インスリンやアルブミンのような水溶性タンパク性薬物も緩和な水系条件下においてキトサンゲル内に完全に固定化できるものである。
【００１８】
キトサンゲルの調製はキトサンゲルの物性に影響を受ける。キトサンを０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、それらを４０ｍＭ硫酸銅水溶液中に滴下することにより、球状のゲルを調製した結果は、表１の通りである。
高分子量のキトサン又は低分子量のキトサンでも高濃度使用することにより、キトサン溶液の粘度が上昇するため、滴下が困難となる。
球状のゲル形成には、硫酸銅水溶液中に滴下した際、瞬時にゲル化することが必要であるが、低濃度のキトサン溶液では粘度が低いため、キトサン溶液の硫酸銅水溶液への拡散スピードが速く、球状のゲル形成は困難である。
一方、キトサンは酢酸と塩を形成することにより溶解するが、比較的脱アセチル化度が大きいキトサンを使用した場合、０．１Ｍの酢酸濃度では溶解しない場合がある。これは溶解していないキトサンが懸濁している状態であるが、このような場合においても、球状ゲルの形成は可能である。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
次に、キトサンゲル中に取り込まれる金属量を各条件で検討する。
１％キトサン７Ｂ（前記表１におけるキトサン種の表示で記す。以下の説明、図表でも同様とする。）を０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解した場合の調製溶液中の硫酸銅濃度と、調製されたキトサンゲル中に取り込まれる銅の量の関係は図１のグラフの通りであった。
【００２１】
この結果、調製溶液中の硫酸銅濃度の上昇に伴って、キトサンゲル中への銅の取り込み量は増大する。
又、調製溶液中の銅の濃度と、キトサンゲル内の銅の濃度が平衡に達したと仮定した場合を理論値（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｖａｌｕｅ）とした場合、実測値（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｖａｌｕｅ）は常に理論値より大きく、銅はキトサンゲル内に積極的に取り込まれることが判明した。
【００２２】
各種キトサンゲル１％を０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅水溶液中で調製されたキトサンゲル中に取り込まれる銅の量とキトサン種との関係は、図２のグラフの通りであり、キトサンの脱アセチル化度の増大に伴ってゲル中への銅の取り込み量が増大した。これは、銅との結合部位とされるキトサンのアミノ基の数が多くなるためであると考えられる。
【００２３】
各種キトサンを０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅水溶液中で調製されたキトサンゲル中に取り込まれる銅の量とキトサン濃度との関係は、図３のグラフの通りである。
キトサンの濃度上昇に伴って、ゲル中への銅の取り込み量が増大した。これも、キトサン濃度の上昇に伴い、銅との結合部位とされるキトサンのアミノ基の数が多くなるためであると考えられる。
【００２４】
更に、調製したキトサンゲルから固定化した薬物が放出される関係を各条件で検討する。
１％インスリン含有１％キトサン７Ｂを０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解した場合の調製溶液中の硫酸銅濃度と、調製されたキトサンゲル中からの溶出液ｐＨ７．２リン酸緩衝液２０ｍｌ中におけるインスリンの放出挙動との関係は、図４のグラフの通りであった。
【００２５】
この結果、１％キトサン７Ｂゲルにおいて、インスリンはキトサンゲルから徐々に放出されるが、２日後においてもマトリックスからの拡散によっては約２０％しか放出されない。又、２日以降はほとんど放出されない。
更に、調製溶液中の硫酸銅濃度が高い場合、インスリンの放出は抑制される。キトサンを分解することが知られているリゾチームを溶出液中に添加しても、ゲルの崩壊は観察されず、インスリン放出はさらに抑制される。
尚、インスリンと同様のタンパクであるアルブミンの場合、１００％固定化されるものの、インスリンのように放出制御されず、２４時間以内に全て放出され、このゲルからの放出はインスリン特有であると考えられる。
【００２６】
１％インスリン含有各種キトサン１％を０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅溶液中で調製された場合、各種キトサンゲル中からの溶出液ｐＨ７．２リン酸緩衝液２０ｍｌ中におけるインスリンの放出挙動は、図５のグラフの通りである。
キトサンの脱アセチル化度が大きい場合ほど、インスリンの拡散による放出は抑制される。又、この条件でキトサン１０Ｂは不溶性のキトサンを含んでいるが、このような場合の方が、より強くインスリン放出を抑制する。
【００２７】
１％インスリン含有各種キトサンを０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅溶液中で調製されたキトサンゲル中からの溶出液ｐＨ７．２リン酸緩衝液２０ｍｌ中におけるインスリンの放出挙動と、キトサン濃度との関係は、図６のグラフの通りであり、キトサン濃度の上昇に伴い、インスリンの放出は抑制される。
更に、キトサン９Ｂにおいて、その変化率が大きいのは、この条件においてキトサン９Ｂは１％では完全に溶解しているが、２％では不溶性のキトサンが存在するためであると考えられる。
【００２８】
１％インスリン含有各種２％キトサンを酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅溶液中で調製されたキトサンゲル中からの溶出液ｐＨ７．２リン酸緩衝液２０ｍｌ中におけるインスリンの放出挙動と、酢酸緩衝液の濃度との関係は、図７の通りであり、キトサンを溶解させるための酢酸緩衝液濃度を上昇させ、キトサンを完全に溶解させることにより、インスリンの放出は促進される。
【００２９】
又、キトサンゲル中に取り込まれた銅の量とインスリン放出の関係は、図８の通りであり、キトサン溶液が完全に溶解している場合（ｈｏｍｏ）、キトサンゲルから拡散によって放出されるインスリン量は、キトサンゲル中に取り込まれた銅の量と良好な相関関係（ｒ2：相関係数）が認められる。
一方、キトサン溶液が完全に溶解せず、不溶性のキトサンが存在している場合（ｈｅｔｅｒｏ）、インスリンの放出はさらに強く抑制される。
【００３０】
このように、キトサンゲルの調製はキトサンの物性に影響され、調製溶液中の硫酸銅の濃度上昇に伴って、ゲル中への銅の取り込み量が増大し、常に調製溶液との平衡状態より多く取り込まれた。
又、キトサンの脱アセチル化度が大きいものほど、銅はゲル中に多く取り込まれた。更に、キトサン濃度を上昇させることにより、銅の取り込み量も増加した。
【００３１】
そして、キトサンゲルに固定化した薬物放出速度は、薬物の性状により異なったが、ゲル中への銅の取り込み量の増大（調製溶液中の銅濃度上昇、脱アセチル化度の大きいキトサンの使用、キトサン濃度上昇）にしたがって、薬物放出は抑制された。
特に、調製溶液へ滴下前のキトサン溶液が完全に溶解していない場合に、薬物放出はより強く抑制された。
本ゲルからの薬物放出挙動は、キトサン、薬物及び金属イオン間のインターラクションの強さに起因すると考えられる。
【実施例１】
【００３２】
２０Ｕインスリン含有２種（７Ｂ、９Ｂ）のキトサンを０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶解し、４０ｍＭ硫酸銅溶液中で調製して得たインスリン含有キトサンゲルを、ストレプトゾトシン惹起糖尿病マウスの皮下に投与した結果の血糖値変化を図９に示す。比較として、０．１Ｕインスリン懸濁液の場合も併せて表した。
【００３３】
インスリン含有キトサンゲルを生体内に投与することにより、確実に糖尿病マウスの血糖値を降下させる。このことは、キトサンゲル中に固定化されたインスリンが活性を保持していることを意味する。
又、２％キトサン９Ｂにおいては、溶出液中（図６）では約２％しかインスリンを放出しないが、生体内では確実にインスリンを放出している。
更に、生体内において３日以内に分解するタイプのキトサン７Ｂに対して、１４日かけて徐々に分解していくタイプのキトサン９Ｂを投与した場合には、インスリンの活性が持続する。これは、キトサンゲルからのインスリン放出はゲルの生体内での分解にしたがって行われ、キトサンの脱アセチル化度の違いによる生体内分解速度の差異より、インスリンの放出をコントロールできる可能性を意味する。
【実施例２】
【００３４】
実施例１と同様の条件でのインスリン含有キトサンゲル及び比較のインスリン懸濁液の血糖値のファーマコキネティックパラメーターは、表２の通りであり、インスリン含有１％キトサン７Ｂを投与した場合、インスリン懸濁液投与時に比べ、ＡＵＣは約１２倍、ＭＲＴは約２３倍に増大する。
２％キトサン９Ｂの場合は、インスリン懸濁液投与時に比べ、ＡＵＣは約４７番、ＭＲＴは約５１倍に増大させることができる。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】調製溶液中の硫酸銅濃度とキトサンゲル中に取り込まれる銅の量の関係を示すグラフである。
【図２】キトサン種とキトサンゲル中に取り込まれる銅の量の関係を示すグラフである。
【図３】キトサン濃度とキトサンゲル中に取り込まれる銅の量の関係を示すグラフである。
【図４】調製溶液中の硫酸銅濃度とキトサンゲル中からのインスリン放出の関係を示すグラフである。
【図５】キトサン種とキトサンゲル中からのインスリン放出の関係を示すグラフである。
【図６】キトサン濃度とキトサンゲル中からのインスリン放出の関係を示すグラフである。
【図７】キトサンを溶解するための酢酸緩衝液濃度とキトサンゲル中からのインスリン放出の関係を示すグラフである。
【図８】キトサンゲル中に取り込まれた銅の量とインスリン放出の関係を示すグラフである。
【図９】インスリン含有キトサンゲルをストレプトゾトシン惹起糖尿病マウス皮下に投与した場合の血糖値変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005145873.tif 000009
【図６】
2005145873.tif 000010
【図７】
2005145873.tif 000011
【図８】
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【図９】
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