(57)【要約】【課題】安全な抗菌物質を生産し、低温増殖能に優れ、糖質資化能に優れた乳酸菌を開発する。【解決手段】  抗菌物質・ナイシンZを生産するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株を新規に分離した。他のナイシン生産菌に比べて、低温で良好な生育を示し、抗菌物質・ナイシンZを高生産し、糖質資化性に優れた特性を示す。つわり香や菌臭といった異臭の発生がほとんど無いという特性を持つ。その他、γ-アミノ酪酸生成能も従来のナイシン生産菌よりも高く、グルタミン酸及びその塩類より効率よく生産できるため、食品に抗菌物質による日持ち向上と低塩化を実現する他、γ-アミノ酪酸による機能性を付与することが可能である。【選択図】図１
2005192553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温で良好な生育を示し、ナイシンを高生産する糖質資化性に優れた新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D。
【請求項２】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを酒母仕込み時から添加し酵母とともに発酵を行わせ、酒母またはもろみ中でナイシンを生産させる酒類の火落ち防止方法。
【請求項３】
グルタミン酸もしくはその塩類存在下でγ-アミノ酪酸を生産し、ナイシンを高生産する新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D。
【請求項４】
グルタミン酸もしくはその塩類存在下で塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類及び／又は海水及び／又はにがり等を共存させた系中で培養することによりγ-アミノ酪酸を高生産し、ナイシンを高生産する新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D。
【請求項５】
グルタミン酸もしくはその塩類存在下で本乳酸菌及び／又はその他のナイシン生産菌を含む乳酸菌を用いた乳酸発酵によりγ-アミノ酪酸とナイシンを生産し発酵産物にγ-アミノ酪酸による機能性とナイシンによる日持ち向上効果を同時に付与する方法。
【請求項６】
グルタミン酸もしくはその塩類存在下で塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類及び／又は海水及び／又はにがり等を共存させた系中で本乳酸菌及び／又はその他のナイシン生産菌を含む乳酸菌を用いてγ-アミノ酪酸とナイシンを生産し、発酵産物にγ-アミノ酪酸による機能性とナイシンによる日持ち向上効果を同時に付与する方法。
【請求項７】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた生鮮畜肉及び／または魚類をはじめとする水産品の保存方法。
【請求項８】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた畜肉及び／又は魚類をはじめとする水産品を用いた発酵ソーセージの保存方法。
【請求項９】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた抗菌物質を含む豆乳ヨーグルトの製造方法。
【請求項１０】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた抗菌物質を含む豆乳ヨーグルトを用いた食品の保存方法。
【請求項１１】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いて抗菌物質ナイシンにより保存性が向上し、低塩化された野菜類の漬物の製造方法。
【請求項１２】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いて抗菌物質ナイシンにより保存性が向上し、安定した酵母育種が可能な天然酵母パン種の製造方法。
【請求項１３】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いて抗菌物質ナイシンにより保存性が向上し、低塩化されたハタハタずしやいずし類をはじめとする水産加工品。
【請求項１４】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、低塩分でもナイシンによる保存性が向上し、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有する生鮮畜肉加工品または魚類をはじめとする水産加工品の製造方法。
【請求項１５】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、低塩分でもナイシンによる保存性が向上し、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有する畜肉及び／又は魚類をはじめとする水産品を用いた発酵ソーセージの製造方法。
【請求項１６】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、ナイシンによる保存性が向上し、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有する豆乳ヨーグルトの製造方法及び／又は豆乳ヨーグルトを用いた食品の製造方法。
【請求項１７】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、低塩分でもナイシンによる保存性が向上し、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有する野菜類の漬物の製造方法。
【請求項１８】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、ナイシンによる保存性が向上し安定した酵母育種が可能な天然酵母パン種、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有する天然酵母パン種の製造方法。
【請求項１９】
新規乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dを用いた乳酸発酵により、低塩分でもナイシンによる保存性が向上し、さらにγ-アミノ酪酸による機能性を有するハタハタずしやいずし類またはぬか漬けまたは塩辛をはじめとする水産加工品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，温帯落葉広葉樹林帯より新規に分離した乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株（本願において、「本乳酸菌」と略す。）に関するものである。
【０００２】
詳しくは、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株は他のナイシン生産菌に比べて、低温で良好な生育を示し、抗菌物質・ナイシンZを高生産し、糖質資化性に優れた特性を示す。また、5%以下の食塩濃度環境下で良好な生育を示し、7.5%以下のアルコール濃度環境下で良好な生育を示す。
【０００３】
本乳酸菌をグルタミン酸もしくはその塩類存在下で培養すると、抗菌物質ナイシンの他にγ-アミノ酪酸を生成することから、γ-アミノ酪酸による機能性を有する食品の製造が可能である。さらに塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類や海水、にがり等の存在下ではγ-アミノ酪酸を高生産することを見いだした。
【０００４】
本乳酸菌を、グルコースを主な炭素源とする培地にて培養すると低温で良好な生育を示すとともにナイシンZを高生産する。ナイシンZとその類似化合物が火落菌の生育を阻害することから、例えば本乳酸菌KLC 1527Dをはじめとするその他のナイシン生産菌を酒母やもろみ中に添加し酵母とともに発酵を行うことで、系中にナイシンを生産することから火落菌の初発菌数を低下させ、さらに清酒貯蔵中の火落ち防止と火落菌除去が可能である。さらに本乳酸菌を用いて甘酒や米糠などを発酵した場合、つわり香の原因となるジアセチルの発生が認められないことを見いだした。
【０００５】
乳酸菌は、我が国においてきわめて需要の高い漬け物、みそ、しょうゆ、清酒をはじめとする酒類、乳発酵製品などの発酵食品の分野で広く活用されており、化学的に合成された食品保存料に比べて安全な抗菌物質を生産し、発酵力に優れた乳酸菌が強く求められている。本発明に係わる新規乳酸菌はこの要望に応えるものである。
【背景技術】
【０００６】
従来の技術では、乳酸菌は古来より漬け物、みそ、しょうゆ、清酒をはじめとする酒類、乳発酵製品などの発酵食品や発酵飲料の製造に利用されている有用な微生物であり、古来より食習慣がある安全な微生物といえる。発酵食品などの製造過程において、乳酸菌による乳酸発酵が行われ、系のpHが低下することで系中の雑菌の増殖を抑制し、製品の風味と品質が向上する。また、系中に抗菌物質を産生することで製造過程や製品において雑菌などの増殖阻害が可能となり、腐敗や品質低下を防ぐことが可能である。食品の腐敗や品質低下を防止する目的で食品保存料が使用される。これまで用いられた食品保存料の多くは主に化学合成されたものが用いられている。しかしながら、化学的に合成された食品保存料は、人体内で容易に分解されにくい性質を持ち、大量摂取は人間にとって健康面から好ましくない。乳酸菌は古来より食習慣があることから安全性の面で問題がなく、乳酸菌由来の抗菌物質は化学的に合成された物質よりも安全性が高いと考えられる。
【０００７】
酒類のうち清酒を例としてあげると、酒母・もろみ製造工程において特に酵母と乳酸菌の共存・発酵が認められている。清酒はアルコール濃度が15％程度と高いため、一般に腐敗しないと考えられるが、火落菌と呼ばれる乳酸菌により貯蔵中に腐敗することが問題となっている。
【０００８】
γ-アミノ酪酸には、機能性食品の第三次機能として高血圧症の改善作用や精神安定作用などがあることが知られている。γ-アミノ酪酸の機能性を発揮するには、100mg/day程度の摂取が必要と言われている。(例えば、非特許文献 日本農芸化学会  2003年度大会 p53, 2003)高濃度γ-アミノ酪酸の生産法としては、乳酸菌、麹菌、米胚芽のもつグルタミン酸脱炭酸酵素を利用し、グルタミン酸ナトリウムを添加することによりγ-アミノ酪酸を高生産(100mg/100g以上)できることが報告されている(例えば特許文献１)。
【０００９】
一方、乳酸菌のグルタミン酸脱炭酸酵素の合成は、塩化ナトリウムを用いた実験から塩素イオンによって誘導されることが報告されている(非特許文献１)。これは乳酸菌のもつ耐酸性機構の一つと考えられている。
【００１０】
生鮮畜肉類や魚類をはじめとする水産品の保存技術としては、冷蔵、冷凍、塩蔵、いずしなどの発酵による低pH化によって保存が行われているが、風味に変化を起こしにくいことから主に冷蔵や冷凍で保存されている。近年冷蔵流通において低温で増殖する雑菌による汚染が問題になっている。
【００１１】
生鮮畜肉類や魚類をはじめとする水産品をもちいた発酵ソーセージは日本ではあまり例がないが、主にドライソーセージ、又は、セミドライソーセージと呼ばれサラミなどが該当し、水分を減少させたソーセージである。適切な乳酸菌を原材料に接種後、摂氏25度前後で培養し、風乾した物を言う。地方によっては続いてカビを付着させたものもある。雑菌の増殖速度が添加する乳酸菌の増殖速度よりも速い場合が多々あり、その場合は製造中に腐敗する。乳酸発酵による独特の風味があるため、日本人にはあまり好まれない。
【００１２】
豆乳ヨーグルトとは、豆乳に乳酸菌を接種して培養することで、牛乳ヨーグルトと類似した豆乳のヨーグルトである。主に生食用として製造されるが、一般には牛乳と豆乳を混合したもので風味を改善している。
【００１３】
野菜の漬物とは浅漬けや一夜漬け、麹漬け、ぬか漬け、キムチなど多岐にわたるが、浅漬けや一夜漬けとは野菜類を約2.5％から5％の低い食塩濃度で低温で漬けた漬け物で、漬け後一晩で食べられることから名付けられている。しかし、食品の保存性に重大な意義をもつ食塩の濃度が低いことから、原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため消費期間は極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。また、麹漬けとは野菜類を塩と米と米麹からなる漬け床に漬け込み熟成された食品である。塩分が低いことや糖分が高く栄養価が高いことから微生物汚染を受けやすく、安定した品質の食品を長期間安定して供給することは困難であった。ぬか漬けとは、精米時に発生する米ぬかと食塩をはじめとする漬け床につけ込み熟成させて食品であり、手入れの手間や塩分が高いことから製品化が困難である。低塩化を検討した場合、食品の保存性に重大な意義をもつ食塩の濃度が低いことから、原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため消費期間は極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。
【００１４】
天然酵母パン種とはサワーブレッドとも呼ばれる天然酵母パン製造に使用される添加酵母のうち、パン製造に使用する添加酵母を自ら培養及び育種及び継代する必要があるものを言い、酵母をドライフルーツなどから分離し、優先的に増殖させる作業を「種おこし」という。種おこしが必要なパンを天然酵母パンという。種おこしは、主に以前使用した天然酵母パン種に水や小麦粉などを加えて種継ぎを行う。この時、原材料に付着して乳酸菌などが混入し、天然酵母パン種中で増殖し、焼成後のパンに酸味等をはじめとする独特の風味が付与されるが、制御が困難なため過剰な酸味を発生することが問題とされてきた。その他、一般雑菌やカビが混入し、天然酵母パン種が腐敗することもある。この雑菌汚染や過剰な酸味の発生を抑制するため、従来の解決手段として、乳酸菌添加で解決する方法(特許文献２)や生米等の乳酸菌発酵物を磨砕して得た乳液状の発酵種を、パンの第一次原料粉に添加混捏し、乳酸発酵のみを先行させて乳酸生地を一旦製出し、この乳酸生地に、第二次原料を添加混合してパン生地を製出し、常法通り製パンを行う方法(特許文献３)、さらに乳酸発酵を先行させる方法として茶葉中で増殖させた茶葉エキスで乳酸菌のみの発酵を行わせる方法(特許文献４)がある。しかしながら、根本的な混入乳酸菌の抑制や雑菌汚染の予防につながっているとは言えない。
【００１５】
ハタハタずしやいずし類をはじめとする水産加工品とは、魚類などを塩と米と米麹をはじめとする漬け床につけ込み熟成した食品である。ぬか漬けとは、精米時に発生する米ぬかと食塩をはじめとする漬け床につけ込み熟成させた食品である。塩辛とは原材料を食塩でつけ込んだ食品である。これらはいずれも原材料に付着して混入した乳酸菌によるpHの低下や塩分を高くすることで保存性を向上していた。しかし、時間の経過とともに原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため安定した品質の食品を提供するのは困難である。また、近年の低塩分志向から低塩化が進められているが、その場合日持ちが極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。
【特許文献１】特開平１１−５６２７６号公報
【特許文献２】特開２０００−１８９０４１号公報
【特許文献３】特開平１１−２６６７７５号公報
【特許文献４】特開平１１−２７６０７号公報
【非特許文献１】Sanders JW, Leenhouts K, Burghoorn J, Brands JR, Venema G, Kok J. : Mol Microbiol. 1998 Jan;27(2):299-310
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
乳酸菌は古来より食習慣があることから安全性の面で心配がない。従って、乳酸菌の生産する抗菌物質は化学的に合成された物質よりも安全性が高いと考えられる。さらに低温で増殖が可能であり、糖質資化能に優れた乳酸菌は発酵能力に優れていると言え、かような乳酸菌を見いだすことで様々な発酵食品に利用できる。本発明の目的は、低温増殖能と糖質資化能をはじめとした発酵能力に優れ、抗菌物質生産能を持ち、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵によりγ-アミノ酪酸及び抗菌物質を生産する乳酸菌を開発することにある。
【００１７】
さらに、本発明の他の目的は、開発された乳酸菌の特長を生かし、食品の腐敗に関連する微生物汚染を抑制しながらγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００１８】
酒類のうち清酒を例に挙げると、清酒は火落菌と呼ばれる乳酸菌により貯蔵中に腐敗することが問題となっている。本発明の目的は、本乳酸菌が従来のナイシン生産菌に比べて低温で抗菌物質を高生産することを生かし、本乳酸菌を酒母またはもろみ中に添加し、酵母とともに発酵を行わせることで酒母やもろみ中にナイシンを生産させる。その結果、酒類を腐敗させる火落菌の初発菌数が減少し、さらに生育を阻害することで、火落菌防除技術を開発することにある。従来の技術として「抗腐敗清酒の製造方法」(特開平４−２６２７７４)がありナイシンを用いているが、これは「プロテアーゼ失活もしくは除去した清酒にナイシンまたはナイシン含有液を添加すること」とされ、本発明における「本乳酸菌を酒母仕込み時から添加し酵母とともに発酵を行わせ、酒母またはもろみ中でナイシンを生産させる」点で異なる。また、「抗腐敗清酒の製造方法」(特許公開平6-319516)や「抗腐敗酒の製造方法」(特許公開2000-157250)があるが、これらも特開平４−２６２７７４と同様に、プロテアーゼ失活もしくは除去した清酒に対して添加することから、本発明とは異なる。
【００１９】
高濃度γ-アミノ酪酸の製造に関して、グルタミン酸ナトリウムを高濃度添加すると未反応のグルタミン酸ナトリウムも増加することが米胚芽(糠)(特許文献  特開平6-213252号公報)で知られている。食品に利用する場合、グルタミン酸ナトリウムが多量に残存すると、その食品のもつ味に影響が出ることが考えられる。一方γ-アミノ酪酸にはほとんど味がない。以上のことから、グルタミン酸ナトリウムの残存量が少なく、且つγ-アミノ酪酸を高濃度で生産させる技術が求められている。本発明は乳酸菌を用いた従来の高濃度γ-アミノ酪酸製造技術にある問題点を解消し添加するグルタミン酸もしくはその塩類の残存量が少なく、且つγ-アミノ酪酸を高濃度で含有する組成物並びにその製造法を提供することを目的とするものである。
【００２０】
生鮮畜肉類や魚類をはじめとする水産品の保存技術としては、冷蔵、冷凍、塩蔵、いずしなどの発酵による低pH化によって保存が行われているが、風味に変化を起こしにくいことから主に冷蔵や冷凍で保存されている。近年冷蔵流通において低温で増殖する雑菌による汚染が問題になっており、これらを極短時間の乳酸発酵により抗菌物質を含有させることで抑制する方法を開発する。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００２１】
生鮮畜肉類や魚類をはじめとする水産品をもちいた発酵ソーセージは酸味が強く風味に特徴があるため日本人にあまり好まれないが、添加する乳酸菌の増殖速度よりも早い雑菌が増殖する場合が多々あるため、低温で増殖速度が速く、さらに抗菌物質をつくる乳酸菌で短時間発酵させることで雑菌の増殖を抑制し、酸味が少なく日本人の味覚に好ましい発酵ソーセージ類を開発する。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００２２】
豆乳ヨーグルトは主に生食用として製造されるが、抗菌物質をつくる乳酸菌で発酵させることで豆乳ヨーグルトの品質保持期間を延長し、食品原料として使用することで最終製品の品質保持期間延長を実現させる方法を開発する。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００２３】
野菜の漬物とは浅漬けや一夜漬け、麹漬け、ぬか漬け、キムチなど多岐にわたるが、浅漬けや一夜漬けとは野菜類を約2.5%ないし5%の低い食塩濃度で低温で漬けた漬け物で、漬け後一晩で食べられることから名付けられている。しかし、食品の保存性に重大な意義をもつ食塩の濃度が低いことから、原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため消費期間は極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。また、麹漬けとは野菜類を塩と米と米麹からなる漬け床に漬け込み熟成された食品である。塩分が低いことや糖分が高く栄養価が高いことから微生物汚染を受けやすく、安定した品質の食品を長期間安定して供給することは困難であった。ぬか漬けとは、精米時に発生する米ぬかと食塩をはじめとする漬け床につけ込み熟成させて食品であり、手入れの手間や塩分が高いことから製品化が困難である。低塩化を検討した場合、食品の保存性に重大な意義をもつ食塩の濃度が低いことから、原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため消費期間は極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。そこで、抗菌物質をつくる乳酸菌で野菜漬物を発酵させることで雑菌の増殖を抑制し、日持ち向上剤や保存料を使用せず低食塩で日持ちする低塩化野菜漬物の開発を目指す。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００２４】
天然酵母パン種とはサワーブレッドとも呼ばれる天然酵母パン製造に使用される添加酵母のうち、パン製造に使用する添加酵母を自ら培養及び育種する必要があるものを言い、これを種おこし作業という。種おこし作業が必要なパンを天然酵母パンという。種おこし作業は、酵母の分離源となる果実や穀物などを醗酵させる事を言い、この様にしておこした種や以前使用した天然酵母パン種に水や小麦粉などを加えて種継ぎを行う。この時、原材料に付着して乳酸菌などが混入し、天然酵母パン種中で増殖し、焼成後のパンに酸味等をはじめとする独特の風味が付与されるが、制御が困難なため過剰な酸味を発生することが問題とされてきた。その他、一般雑菌やカビが混入し、天然酵母パン種が腐敗することもある。この雑菌汚染や過剰な酸味の発生を抑制するため、従来の解決手段として、乳酸菌添加で解決する方法(特許公開２０００−１８９０４１)や生米等の乳酸菌発酵物を磨砕して得た乳液状の発酵種を、パンの第一次原料粉に添加混捏し、乳酸発酵のみを先行させて乳酸生地を一旦製出し、この乳酸生地に、第二次原料を添加混合してパン生地を製出し、常法通り製パンを行う方法(特許公開平１１−２６６７７５)、さらに乳酸発酵を先行させる方法として茶葉中で増殖させた茶葉エキスで乳酸菌のみの発酵を行わせる方法(特許公開平１１−２７６０７)がある。しかしながら、根本的な混入乳酸菌の抑制や雑菌汚染の予防につながっているとは言えない。そこで、抗菌物質をつくる乳酸菌を添加した継代用培地を開発し、天然酵母種の継代を行うことで雑菌の増殖を抑制し、常に安定した品質で酸味が少なく好ましい風味を維持できる天然酵母種の開発を目指す。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【００２５】
ハタハタずしやいずし類をはじめとする水産加工品とは、魚類などを塩と米と米麹をはじめとする漬け床につけ込み熟成した食品である。ぬか漬けとは、精米時に発生する米ぬかと食塩をはじめとする漬け床につけ込み熟成させた食品である。塩辛とは原材料を食塩でつけ込んだ食品である。これらはいずれも原材料に付着して混入した乳酸菌によるpHの低下や塩分を高くすることで保存性を向上していた。しかし、時間の経過とともに原材料に付着して混入した乳酸菌や酵母により酸敗やセメダイン臭などの異臭を発生するため安定した品質の食品を提供するのは困難である。また、近年の低塩分志向から低塩化が進められているが、その場合日持ちが極端に短く、日持ち向上剤や保存料を添加しない限り製品化は困難である。そこで、抗菌物質をつくる乳酸菌で水産加工品を発酵させることで雑菌の増殖を抑制し、日持ち向上剤や保存料を使用せず低食塩で日持ちする低塩化水産加工品の開発を目指す。さらに、グルタミン酸もしくはその塩類存在下で乳酸発酵を行いγ-アミノ酪酸による機能性を付与した食品の開発にある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者は、発酵食品用乳酸菌を自然界より分離するにあたり、自然からのストレス負荷が大きく且つ未開の土壌である北緯40度以北の温帯落葉広葉樹林帯の腐葉土を分離源とし、低温で良好な生育を示し、糖質資化能に優れた抗菌物質を生産する乳酸菌について鋭意研究した結果、抗菌物質ナイシンZを高生産する乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株を新規に分離し、さらにその培養液が火落菌の生育を抑制することを確認したことで、本発明を完成した。
【００２７】
本発明は、抗菌物質であるナイシンを高生産する新規に分離した乳酸菌 ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株に関するものである。上記したように、乳酸菌は古来より食習慣があるため安全性の面で心配がなく、本乳酸菌は漬け物、みそ、しょうゆ、清酒をはじめとする酒類、乳発酵食品、乳発酵飲料など様々な発酵食品や発酵飲料に利用可能である。また本乳酸菌は低温で良好な生育を示し、抗菌物質であるナイシンZを高生産することから、発酵食品や発酵飲料製造中において系中に抗菌物質を産生することで製造過程や製品において雑菌などの増殖阻害が可能となり、腐敗や品質低下を防ぐことが可能である。さらに本乳酸菌は従来のナイシン生産菌と比較して糖質資化能が優れていることから、さまざまな食品へ利用可能である。
【００２８】
また、本乳酸菌はグルタミン酸又はその塩類の存在下で培養したときγ-アミノ酪酸を従来の抗菌物質ナイシンを生産する同種の乳酸菌と比較して高生産すること見いだした。さらに、本乳酸菌をグルタミン酸又はその塩類の存在下で培養する際、塩素イオンやその塩類、海水やにがり等を添加することでγ-アミノ酪酸の生産能が著しく上昇することを見いだし、本発明を完成した。
【００２９】
また、ナイシンＺをはじめとするナイシン類似化合物が、火落菌の増殖を良好に阻害することを確認した。さらに、本乳酸菌は低温で良好な生育を示し、抗菌物質・ナイシンZを高生産することを確認した。例えば本乳酸菌KLC 1527D株をはじめとするその他のナイシン生産菌を用いて、酒類の製造中において、本乳酸菌を酒母やもろみ中に添加し、酵母とともに発酵を行わせることで酒母やもろみ中にナイシンを生産させる。その結果、酒類を腐敗させる火落菌の初発菌数が減少し、さらに生育を阻害することで、製造過程や製品において火落菌や雑菌などの増殖阻害が可能となり、腐敗や品質低下を防ぐことが可能である。
【００３０】
さらに、本乳酸菌は低温での増殖に優れ幅広い糖質をすばやく資化できることから、生鮮畜肉や魚類をはじめとする水産品、塩漬け野菜、豆乳に本乳酸菌を接種したところ、良好に生育し抗菌活性を確認することで本発明を完成した。またこれら原料をグルタミン酸又はその塩類の存在下で乳酸発酵したとき抗菌物質の他に、機能性物質であるγ-アミノ酪酸を高生産すること見いだした。さらに、本乳酸菌をグルタミン酸又はその塩類の存在下で培養する際、塩素イオンやその塩類、海水やにがり等を添加することで抗菌物質の他、機能性物質であるγ-アミノ酪酸の生産能が著しく上昇することを見いだし、本発明を完成した。
【００３１】
本乳酸菌を甘酒に接種し発酵させた後加熱殺菌を行って製造した乳酸発酵甘酒から抗菌活性を確認し、この乳酸発酵甘酒を用いて天然酵母種の種おこしを行ったところ、原材料に由来する乳酸菌の増殖を抑制するため良好な経過を得た。さらに乳酸発酵甘酒を用いて天然酵母種の継代を行ったところ、良好な酸味の天然酵母パン種及びパンを製造できた。また、この乳酸発酵甘酒にて継代した天然酵母種を水と小麦粉を用いて継代したところ、乳酸発酵甘酒を用いて継代したときと同等の安定した品質の天然酵母パン種及びパンを製造できた事で発明を完成した。またこれら原料にグルタミン酸又はその塩類の存在下で乳酸発酵したとき抗菌物質の他、機能性物質であるγ-アミノ酪酸を高生産すること見いだした。さらに、本乳酸菌をグルタミン酸又はその塩類の存在下で培養する際、塩素イオンやその塩類、海水やにがり等を添加することで抗菌物質の他、機能性物質であるγ-アミノ酪酸の生産能が著しく上昇することを見いだし、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株は抗菌物質ナイシンZを生産し、その他のナイシン生産菌と比較して、低温増殖性に優れ、低温培養時における抗菌物質生産性も優れていた。さらに、糖質資化能にも優れていたことから、様々な環境において優勢に生育することが可能である。本乳酸菌はつわり香や菌臭といった異臭の発生がほとんど無いという特性を持つ。その他、γ-アミノ酪酸生成能も従来のナイシン生産菌よりも高く、グルタミン酸及びその塩類より効率よく生産できるため、食品に抗菌物質による日持ち向上と低塩化を実現する他、γ-アミノ酪酸による機能性を付与することが可能である。さらに本乳酸菌を含めた一般的な乳酸菌において、塩化マグネシウムをはじめとする塩素イオンやその塩類、海水、にがりの存在下でγ-アミノ酪酸の生産能が著しく向上することを見いだした。本乳酸菌のつくる抗菌物質は、火落菌をはじめ様々な細菌に対して生育阻害効果を示す。そのため、本乳酸菌を発酵食品等の製造時に添加し発酵を行わせたり、食品等に添加することによって、雑菌等の生育を阻害し、食品の腐敗や品質の低下、さらに火落菌による清酒などの腐敗を有効に防止することができる。菌臭やつわり香を発生せず抗菌物質とγ-アミノ酪酸を作る本乳酸菌を使用することによって、日持ちが向上しγ-アミノ酪酸による機能性が付与されるといった、従来に比べて高品質な食品の製造及び開発が可能である。ここでは、その例として、野菜や畜肉、魚類の低塩化と日持ち向上技術及び天然酵母パンの安全製造法を例示した。今後、この様な食品への利用がすすみ、化学的に合成された保存料を使わず発酵を利用した安全な食品の提供が可能となる。
乳酸菌は古来より食習慣があるため安全性の面では問題がなく、この抗菌性物質は乳酸菌に由来しており、しかも人体内で容易に分解されるため、従来の化学合成された食品保存料と比べ、大量に摂取しても安全性の上で心配がなく、健康面から好ましいものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明に用いられる乳酸菌KLC 1527D株は次の方法で腐葉土より分離した。
[菌株の分離と同定]
本乳酸菌は秋田県山本郡八森町の世界自然遺産「白神山地」緩衝地域より所管官庁の許可を得て採取した腐葉土0.1gをアジ化ナトリウム20ppm,クロラムフェニコール20ppm,塩化ナトリウム0.9%, 蒸留水5mlの組成からなる生理食塩水中に縣濁した後、この縣濁液1mlを、アジ化ナトリウム20ppm,クロラムフェニコール20ppm,炭酸カルシウム0.8%, 寒天1%を加えたLactobacilli MRS培地（組成：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、Tween 80  ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、ディフコ社製）20mlの組成からなるMRS寒天培地で混釈培養を行い、30℃,3日間培養し純粋に分離したものである。
【００３４】
このように分離した乳酸菌から、ラクトバシラス・ブレビス IFO 12005に対する抗菌活性を指標として、ペーパーディスク検定法（Hoover, D.G. & Harlander, S.K., In Bacteriocins of lactic acid bacteria, Academic Press 社刊、23-39 、1993) によって抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。選択した乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性の解析（Mori, K. et al.:Int. J. Syst. Bacteriol., 47巻、54-57 、1997) によりラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1と100％の相同性を示したこと、糖質資化能による分類をAPI50 CH / CHL(日本ビオメリュー社製)により行ったところ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1と99.9％以上一致した等の性質から、本菌はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1に属する菌株と同定し、菌株番号をKLC 1527Dとした。
【００３５】
Sneath, P. H. A.らの方法[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology volume 2]で調べた本乳酸菌KLC 1527D株のその他の菌学的性質は、菌体の形：球菌、グラム染色性：陽性、胞子形成：陰性、カタラーゼ活性：陰性、運動性：陰性、であった。その他、ガス発生：陰性である。
【００３６】
本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに15 産生寄  第 1561号（ＦＥＲＭ Ｐ−19608）として寄託されている。
【００３７】
本発明に用いられる乳酸菌KLC 1527D株の生産する抗菌物質ナイシン類似化合物は次の方法により決定した。
【００３８】
Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体から全DNAを抽出し、ナイシンに特異的なプライマーを設計してPCRによりナイシンを暗号化した領域を含む934bpの増幅断片を得た。得られた断片をダイレクトシーケンス法を用いて塩基配列を解析し、相同性比較を行ったところ、ナイシンZと100%一致したことから、乳酸菌KLC 1527D株の抗菌物質をナイシンZと同定した。
【００３９】
本乳酸菌の生産するナイシンZとその他のナイシン類似化合物が火落菌の生育を阻害することは次の方法で決定した。
【００４０】
複数の火落菌を検定菌として、本乳酸菌とその他のナイシン生産菌の培養上清、さらに試薬ナイシンを用意し、アガーウェル法にて抗菌活性を調べた。その結果、火落菌に対して生育を良好に阻害する効果が認められた。
【００４１】
本乳酸菌をはじめとするその他のナイシン生産菌が酒類の製造中において系中に抗菌物質を産生することは、次の方法にて確認した。
【００４２】
酒類のうち清酒を例とし、酒母やもろみのモデル系として甘酒を作成した。甘酒は、米と米麹と水を1:1:2の割合で混合し、60℃で4時間糖化後、80℃で2時間殺菌して調整した。この甘酒に本乳酸菌やその他のナイシン生産菌を植菌し、30℃で12時間培養したところ、甘酒から抗菌活性が認められた。さらに、米と米麹と水を1:1:3の割合で混合し、55℃で2時間糖化後15℃まで冷却した甘酒に、本乳酸菌やその他のナイシン生産菌を植菌し、15℃で24時間培養したところ、甘酒から抗菌活性が認められた。さらに、ジアセチルの発生は官能的に認められず、乳酸菌の菌臭などもない、非常に高品質な乳酸発酵甘酒ができたことから、清酒においてもつわり香などのない高品質な発酵を行うことができる。
【００４３】
本発明に用いられる乳酸菌KLC 1527D株の生産するグルタミン酸脱炭酸酵素によるγ-アミノ酪酸生産能力は次の方法により決定した。
【００４４】
Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体を、0.5%(w/v)になるようにグルタミン酸ナトリウムを加えたLactobacilli MRS培地にて培養し、上清中に含まれるグルタミン酸ナトリウムとγ-アミノ酪酸を薄層クロマトグラフィーにて展開した後ニンヒドリンにより染色を行い、グルタミン酸ナトリウムの減少量とγ-アミノ酪酸の増加量を比較した。必要に応じて0.5%(w/v)グルタミン酸ナトリウムを含む培地に塩化ナトリウムや塩化マグネシウムなどの塩素イオンを含む塩類や、滅菌した海水やにがりを加えた。γ-アミノ酪酸生成量の定量は、全自動アミノ酸分析機 JLC-500V-GA(日本電子株式会社製)を用いて行った。その結果、0.5%(w/v)になるようにグルタミン酸ナトリウムを加えたLactobacilli MRS培地のみでもγ-アミノ酪酸の生成を確認した。さらに1ないし2%(w/v)となるように塩化ナトリウムを加えた場合は加えない場合に比べてγ-アミノ酪酸生成量が約3倍増加し、0.1ないし0.3Mとなるように塩化マグネシウムを加えた場合は加えない場合に比べてγ-アミノ酪酸生成量が約6倍増加したことから、γ-アミノ酪酸生成量の著しい増加を確認した。
【００４５】
本発明に用いられる乳酸菌KLC 1527D株の食塩耐性やアルコール耐性は次の方法により決定した。
【００４６】
食塩耐性は、Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体を、0ないし8%(w/v)になるように1%刻みで塩化ナトリウムを加えたLactobacilli MRS培地にて培養し、上清中の濁度の変化を調べた。アルコール耐性は、Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体を、0ないし12.5%(w/v)になるように2.5%刻みで99.5%エタノールを加えたLactobacilli MRS培地にて培養し、上清中の濁度の変化を調べた。その結果、食塩濃度5%、アルコール濃度7.5%まで良好に生育することがわかった。
【００４７】
次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４８】
以下、その他のナイシン生産菌とは、ラクトコッカス・ラクティス IFO 12007株(以下、IFO 12007株)と、ラクトコッカス・ラクティス ATCC 11454株(以下、ATCC 11454株)を用いた。
【００４９】
以下、火落菌とは、ラクトバシラス・フルクチボランス IFO 13954株(以下、IFO 13954株)、ラクトバシラス・ホモヒオチ JCM 1199株 (以下、JCM 1199株)、清酒製造場より入手した3株の未同定株を用いた。
【実施例１】
【００５０】
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527Dの分離と同定
【００５１】
秋田県山本郡八森町の世界自然遺産「白神山地」緩衝地域より所管官庁の許可を得て採取した腐葉土0.1gをアジ化ナトリウム20ppm,クロラムフェニコール20ppm,塩化ナトリウム0.9%, 蒸留水5mlの組成からなる生理食塩水中に縣濁した後、この縣濁液1mlを、アジ化ナトリウム20ppm,クロラムフェニコール20ppm,炭酸カルシウム0.8%, 寒天1%を加えたLactobacilli MRS培地（組成：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、Tween 80  ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、ディフコ社製）20mlの組成からなるMRS寒天培地で混釈培養を行い、30℃,3日間培養し純粋に分離した。
【００５２】
このように分離した乳酸菌から、ラクトバシラス・ブレビス IFO 12005に対する抗菌活性を指標として、ペーパーディスク検定法（Hoover, D.G. & Harlander, S.K., In Bacteriocins of lactic acid bacteria, Academic Press 社刊、23-39 、1993) によって抗菌性物質生産能を有する乳酸菌を選択した。選択した乳酸菌の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性の解析（Mori, K. et al.:Int. J. Syst. Bacteriol., 47巻、54-57 、1997) によりラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1と100％の相同性を示したこと、糖質資化能による分類をAPI50 CH / CHL(日本ビオメリュー社製)により行ったところ、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1と99.9％以上一致した等の性質から、本菌はラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1に属する菌株と同定し、菌株番号をKLC 1527Dとした。
【００５３】
Sneath, P. H. A.らの方法[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology volume 2]で調べた本乳酸菌KLC 1527D株のその他の菌学的性質は、菌体の形：球菌、グラム染色性：陽性、胞子形成：陰性、カタラーゼ活性：陰性、運動性：陰性、であった。その他、ガス発生：陰性である。
【００５４】
本菌の同定に関する知見を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2005192553.tif 000003
【実施例２】
【００５６】
抗菌物質ナイシンZの決定
【００５７】
本発明に用いられる乳酸菌KLC 1527D株の生産する抗菌物質ナイシン類似化合物は次の方法により決定した。
【００５８】
Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体から全DNAを抽出し、ナイシンに特異的なプライマーを設計してPCRによりナイシンを暗号化した領域を含む934bpの増幅断片を得た。得られた断片をダイレクトシーケンス法を用いて塩基配列を解析し、相同性比較を行ったところ、ナイシンZと100%一致したことから、乳酸菌KLC 1527D株の抗菌物質をナイシンZと同定した。ナイシンの同定に関する知見を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2005192553.tif 000004
【実施例３】
【００６０】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌の培養温度を変えた生育速度の比較
【００６１】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌で、培養温度を10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃に設定したのち所定時間静置培養し、本菌の生育状態について調べた。培養温度を変化させた場合の増殖量をＯＤ 660 で測定した。
【００６２】
培養温度を10℃、15℃、20℃で培養した結果を図１に、培養温度を25℃、30℃、37℃で培養した結果を図２に示した。KLC 1527D株とATCC 11454株は温度にかかわらずIFO 12007株と比較して生育が良かった。また、KLC 1527D株とATCC 11454株の間では、KLC 1527D株の方が初期生育が良好であった。最高濁度はATCC 11454株の方がKLC 1527D株を上回ることがあった。
【００６３】
いずれの温度条件においてもKLC 1527D株はその他のナイシン生産菌と比較して初期生育がよいことがわかった。この結果から、どんな環境下においても環境中で優先的に増殖することがわかった。
【００６４】
図１は、本乳酸菌とその他のナイシン生産菌を摂氏１０度、１５度、２０度で培養した結果の生育状態を示すグラフである。
【００６５】
図２は、本乳酸菌とその他のナイシン生産菌を摂氏２５度、３０度、３７度で培養した結果の生育状態を示すグラフである。
【実施例４】
【００６６】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌の培養温度を変えた抗菌活性の比較
【００６７】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌で、培養温度を15℃、25℃、37℃に設定したのち所定時間静置培養し、抗菌性ペプチドの生産性について調べた。抗菌活性をラクトバシラス・サケイ IFO 3541に対する抗菌活性を指標としたアガーウェル法によって調べた。抗菌活性単位は、抗菌活性を含む溶液を段階的に希釈し、検定菌に滴下し、生育阻止円を形成したもっとも希釈率の高い溶液の活性を1とし、その逆数をArbitrary Unit (以下、AUと略す)と定義した。1mlの溶液中に含まれる抗菌活性をAU /mlとして示した。
【００６８】
その結果を図３に示す。図１より15℃にて培養した場合、IFO 12007株のみきわめて生育が遅く、ATCC 11454株とKLC 1527D株はKLC 1527D株の方が生育が良かった。その培養上清中に含まれる抗菌活性は、培養開始後24時間目でKLC 1527D株は800 AU/mlの抗菌活性に対し、ATCC 11454株、IFO 12007株は200 AU / mlであった。図２より25℃にて培養した場合、IFO 12007株のみきわめて生育が遅く、ATCC 11454株とKLC 1527D株ではKLC 1527D株の方が初期生育が良好であった。その培養上清中に含まれる抗菌活性は、培養開始後24時間目でKLC 1527D株は1600 AU/mlの抗菌活性に対し、ATCC 11454株、IFO 12007株は800 AU / mlであった。図2より37℃にて培養した場合、IFO 12007株のみ若干生育が遅く、ATCC 11454株とKLC 1527D株ではKLC 1527D株の方が初期生育が良好であり、最高濁度ではATCC 11454の方が高かった。その培養上清中に含まれる抗菌活性は、培養開始後24時間目でKLC 1527D
株は1600 AU/mlの抗菌活性に対し、ATCC 11454株は400 AU / ml、IFO 12007株は800 AU / mlであった。
【００６９】
いずれの培養条件においてもKLC 1527D株の抗菌活性はその他のナイシン生産菌と比較して活性が高く、抗菌物質生産性が高いことがわかった。
【００７０】
図３は、本乳酸菌とその他のナイシン生産菌とで、培養温度を変えた抗菌活性を比較したグラフである。
【実施例５】
【００７１】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他ナイシン生産菌の糖質資化性の比較
【００７２】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌で、糖質資化能をAPI50 CH / CHL(日本ビオメリュー社製)により比較した結果を表３に示す。
【００７３】
その結果、KLC 1527D株はATCC 11454株、IFO 12007株と比較して糖質資化性の点で劣っている点はなく、逆にL-Arabinose、D-Xylose、Galactose、Mannitol、Amygdaline、Arbutine、Lactose、Trehalose、Gluconateの資化性において優れていることがわかった。
【００７４】
【表３】
2005192553.tif 000005
【実施例６】
【００７５】
本乳酸菌KLC 1527D株の生産するナイシンZとその他のナイシン生産菌が生産するナイシンの火落菌に対する効果
【００７６】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌をLactobacilli MRS培地にて24時間培養した培養上清と、試薬ナイシン(シグマ社製)を用いて、火落菌に対する増殖阻害効果をアガーウェル法にて調べた。増殖阻害効果は形成された阻止円の大きさから相対的に示した。火落菌の培養は、火落菌検査液(SI検査液、（財）日本醸造協会製)を用い、必要で有れば、1%となるように寒天を加え、煮沸溶解し、平板培地として使用した。
【００７７】
その結果、本乳酸菌の生産するナイシンZをはじめとする全てのナイシン類似物質から火落菌の生育阻害効果が認められた。得られた知見を表４に記す。
【００７８】
【表４】
2005192553.tif 000006
【実施例７】
【００７９】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産菌の酒母における抗菌物質の生産性
【００８０】
本乳酸菌をはじめとするその他のナイシン生産菌が酒類の製造中において系中に抗菌物質を産生することは、次の方法にて確認した。
【００８１】
酒類のうち清酒を例とし、酒母やもろみのモデル系として甘酒を作成した。甘酒は、米と米麹と水を1:1:2の割合で混合し、60℃で4時間糖化後、80℃で2時間殺菌して調整した。この甘酒に本乳酸菌やその他のナイシン生産菌を植菌し、30℃で12時間静置培養した。さらに、米と米麹と水を1:1:3の割合で混合し、55℃で2時間糖化後15℃まで冷却した甘酒に、本乳酸菌やその他のナイシン生産菌を植菌し、15℃で所定時間培養した。抗菌活性の検出はアガーウェル法にて行った。また、できあがった乳酸発酵甘酒を官能試験を行った。
【００８２】
その結果、甘酒から抗菌活性が認められた。実施例6の結果と本結果より、貯蔵中清酒の火落ち防止効果が認められた。得られた知見を表５に記す。さらに、ジアセチルの発生は官能的に認められず、乳酸菌の菌臭などもない、非常に高品質な乳酸発酵甘酒ができたことから、清酒においてもつわり香などのない高品質な清酒製造を行うことができる。
【００８３】
【表５】
2005192553.tif 000007
【実施例８】
【００８４】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産性乳酸菌におけるγ-アミノ酪酸生産性
【００８５】
本乳酸菌をはじめとするその他の乳酸菌が系中のグルタミン酸及びその塩類よりγ-アミノ酪酸を生成することは次の方法により確認した。
【００８６】
その他の乳酸菌として本乳酸菌と同種でナイシン生産菌として知られているATCC 11454株とIFO 12007株を用いた。本乳酸菌とその他の乳酸菌を、0.5%のグルタミン酸ナトリウムを含むLactobacilli MRS培地にて30℃で4日間培養した。培養上清に含まれるγ-アミノ酪酸生成量の定量は、全自動アミノ酸分析機 JLC-500V-GA(日本電子株式会社製)を用いて行った。さらに、上清中に含まれる抗菌活性をアガーウェル法にて行った。
【００８７】
その結果、本乳酸菌とATCC 11454株、IFO 12007株からγ-アミノ酪酸の生成を確認した。結果を図４に示す。γ-アミノ酪酸の生成量は本乳酸菌がわずかにATCC株を上回った。さらに、本乳酸菌の培養上清からは抗菌活性が確認された。
【００８８】
図４は、本乳酸菌とその他のナイシン生産性乳酸菌におけるγ−アミノ酪酸生産性を示すグラフである。
【実施例９】
【００８９】
本乳酸菌KLC 1527D株の食塩耐性とアルコール耐性
【００９０】
本乳酸菌とその他ナイシン生産乳酸菌の食塩耐性とアルコール耐性は次のようにして調べた。
【００９１】
食塩耐性は、Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体を、0ないし8%(w/v)になるように1%刻みで塩化ナトリウムを加えたLactobacilli MRS培地にて培養し、上清中の濁度の変化を調べた。アルコール耐性は、Lactobacilli MRS培地にて純粋培養した菌体を、0ないし12.5%(w/v)になるように2.5%刻みで99.5%エタノールを加えたLactobacilli MRS培地にて培養し、上清中の濁度の変化を調べた。
【００９２】
その結果、食塩濃度5%、アルコール濃度7.5%まで良好に生育することがわかった。また、全ての条件において本乳酸菌がその他のナイシン生産菌に比べて生育が早かった。図５は本乳酸菌の食塩耐性試験における濁度変化を示す。図６は本乳酸菌と他のナイシン生産菌の食塩濃度4ないし6%における濁度変化を示している。この結果より、従来のナイシン生産菌に比べて食塩ストレス環境下での生育が良く、漬物など食塩を多く使用する食品への利用が可能だと認められた。
【００９３】
図５は、本乳酸菌の食塩耐性試験における濁度変化を示すグラフである。
【００９４】
図６は、本乳酸菌と他のナイシン生産菌の食塩濃度4ないし6%における濁度変化を示すグラフである。
【実施例１０】
【００９５】
本乳酸菌KLC 1527D株とその他のナイシン生産乳酸菌の食塩ストレス環境下における増殖性比較とγ-アミノ酪酸生産性
【００９６】
本乳酸菌をはじめとするその他のナイシン生産菌が食塩ストレス環境下における系中のグルタミン酸及びその塩類よりγ-アミノ酪酸を生成することは次の方法により確認した。
【００９７】
その他の乳酸菌として、本乳酸菌と同種でナイシン生産菌として知られているATCC 11454株とIFO 12007株を用いた。本乳酸菌とその他の乳酸菌を、0.5%のグルタミン酸ナトリウムを含むLactobacilli MRS培地に塩化ナトリウムを加えない非添加区と、1%の塩化ナトリウムを加えた1%塩化ナトリウム添加区の2種類の培地で、30℃で4日間培養した。培養上清に含まれるγ-アミノ酪酸生成量の定量は、全自動アミノ酸分析機 JLC-500V-GA(日本電子株式会社製)を用いて行った。さらに、上清中に含まれる抗菌活性をアガーウェル法にて行った。
【００９８】
その結果、全ての乳酸菌からγ-アミノ酪酸の生成を確認した。結果を図７に示す。全ての乳酸菌において、塩化ナトリウムを加えて培養したときの方がγ-アミノ酪酸の生成量が増大することがわかった。また、本乳酸菌において、γ-アミノ酪酸生成量が最も多いのは食塩濃度2%の時であり、1ないし3%で効率よくγ-アミノ酪酸を生成することがわかった。同様の実験をγ-アミノ酪酸高生産菌として知られるラクトバシラス・ブレビス IFO 12005株を用いて行ったところ、γ-アミノ酪酸の生産量が向上することを確認した。さらに、本乳酸菌の培養上清からは抗菌活性が確認されたため、系中に抗菌物質ナイシンとγ-アミノ酪酸を同時に生成することが確認された。
【００９９】
図７は、本乳酸菌とその他のナイシン生産乳酸菌の食塩ストレス環境下における増殖性比較とγ-アミノ酪酸生産性を示すグラフである。
【実施例１１】
【０１００】
本乳酸菌KLC 1527D株の増殖とγ-アミノ酪酸生産性に対する塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類が与える効果
【０１０１】
本乳酸菌KLC 1527D株の増殖とγ-アミノ酪酸生産性について、塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類の効果は次の方法により確認した。
【０１０２】
塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類として、塩化ナトリウムの他、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムを使用した。塩濃度は全て0.2Mとなるように調整し、各塩類を0.5%のグルタミン酸ナトリウムを含むLactobacilli MRS培地に加えた後、30℃で4日間培養した。カルシウム及びマグネシウムは2価のイオンであることから、0.1Mとなるように塩類を添加した培地も用意した。コントロールとして塩類を加えない非添加区を用意した。30℃で4日間培養した培養上清に含まれるγ-アミノ酪酸生成量の定量を、全自動アミノ酸分析機 JLC-500V-GA(日本電子株式会社製)を用いて行った。さらに、上清中に含まれる抗菌活性をアガーウェル法にて行った。各塩類における増殖性について上清中の濁度の変化を調べた。塩化カルシウムは水に完全には溶解しないため、濁度は測定できなかった。
【０１０３】
本乳酸菌の増殖に伴う濁度変化は図８に示す。γ-アミノ酪酸の生成量は図９に示す。図８より、各塩類は本乳酸菌の生育に影響を与えないことがわかった。図９より、γ-アミノ酪酸の生成量は0.2M の塩化マグネシウムを加えた場合が最も多かった。0.1Mの塩化マグネシウム添加時でも、0.2Mの塩化ナトリウムに比べて約2倍のγ-アミノ酪酸を生成することがわかった。塩化ナトリウムや塩化マグネシウムは海水に多く含まれる成分であり、塩化マグネシウムを主体として海水から抽出された混合物がにがりとして市販されている。海水やにがりの使用で同様の効果が得られることが示唆された。系中に添加したグルタミン酸ナトリウムは0.5%だが、グルタミン酸残量と生成したγ-アミノ酪酸量を合計すると0.5%に満たない。これは、本乳酸菌の生育に伴いグルタミン酸及びγ-アミノ酪酸が消費されたためと思われた。また、培養上清から抗菌活性が認められた。また、同様の実験をその他のナイシン生産菌やIFO 12005株にて行ったところ、塩素イオンもしくはその塩類を加えることでγ-アミノ酪酸生成量向上効果があることがわかった。
【０１０４】
図８は、本乳酸菌の増殖に伴う濁度変化を示すグラフである。
【０１０５】
図９は、γ-アミノ酪酸の生成量を示すグラフである。
【実施例１２】
【０１０６】
本乳酸菌KLC 1527D株をはじめとするその他の乳酸菌におけるγ-アミノ酪酸生産性に及ぼす塩化マグネシウム濃度及び海水またはにがりの効果
【０１０７】
本乳酸菌KLC 1527D株をはじめとするその他の乳酸菌の増殖とγ-アミノ酪酸生産性に対して最も効果が高かった塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類は塩化マグネシウムであった。また、海水やにがりの使用でγ-アミノ酪酸の生産性を向上させる可能性が示唆された。そこで次の方法により最適な塩化マグネシウム濃度と海水又はにがりの効果を確認した。
【０１０８】
塩素イオンもしくは塩素イオンを含む塩類として、塩化マグネシウムを使用した。塩濃度は0ないし0.5Mの間を0.1M刻みに調整し、各濃度になるよう0.5%のグルタミン酸ナトリウムを含むLactobacilli MRS培地に加えた後、30℃で7日間培養した。コントロールとして塩類を加えない非添加区を用意した。30℃で4日間及び7日間培養した培養上清に含まれるγ-アミノ酪酸生成量の定量を、全自動アミノ酸分析機 JLC-500V-GA(日本電子株式会社製)を用いて行った。海水は、八森沖の海水を採水し、0.45マイクロメートルのフィルターにて濾過したものを3倍希釈にて使用した。にがりは市販のにがり「瀬戸内の海水にがり」(錦海ソルト株式会社製)を10倍希釈して使用した。海水やにがり添加していない非添加区を用意し、薄層クロマトグラフィーにてγ-アミノ酪酸の生成を確認した。さらに、それぞれの上清中に含まれる抗菌活性をアガーウェル法にて行った。各塩濃度における増殖性について上清中の濁度の変化を調べた。
【０１０９】
塩化マグネシウム濃度を変化させたときの濁度の変化を図１０に示す。また、培養4日目と7日目の培養上清中に含まれるγ-アミノ酪酸生成量を図１１に示す。図１０より、塩化マグネシウム濃度は0.2M以下では非添加区とほぼ同様の生育だったが、0.3M添加区では生育が若干低下した。しかし、非添加区から明確な差があるものの、濁度が1.5を超えることから、生育に問題はないと考えられた。0.4M以上では明らかに生育が低下し、塩による生育阻害が考えられた。すなわち、塩化マグネシウム濃度が0.3M以下で有れば、本乳酸菌の生育に影響を与えないことがわかった。図１１より、γ-アミノ酪酸の生成は0.2M の塩化マグネシウムを加えた場合が最も効率が良かった。培養を7日間行った場合、0.1Mの塩化マグネシウム添加時でも、0.2Mの塩化マグネシウム添加時とほぼ同量のγ-アミノ酪酸を生成することがわかった。海水やにがりを使用した場合、非添加区に比べてγ-アミノ酪酸の生成量が明確に増加した。この結果より、にがりや海水を使用することで塩化マグネシウムや塩化ナトリウムを使用せずに発酵食品などの製品中にγ-アミノ酪酸を効率よく生産できることがわかった。また、抗菌活性は0.3M以下の塩化マグネシウムを添加した場合に確認できた。海水やにがりを使用したときも同様に上清から抗菌活性を確認した。
【０１１０】
図１０は、塩化マグネシウム濃度を変化させたときの濁度の変化を示すグラフである。
【０１１１】
図１１は、培養4日目と7日目の培養上清中に含まれるγ-アミノ酪酸生成量を示すグラフである。
【０１１２】
以上、実施例１０、１１及び１２によって新規に得られた知見をまとめると、本乳酸菌KLC 1527Dをはじめ、その他のナイシン生産菌やγ-アミノ酪酸高生産菌として知られているIFO 12005株などその他の乳酸菌を用いて、グルタミン酸又はその塩類からγ-アミノ酪酸を生産する場合、塩化マグネシウムや塩化ナトリウムなどをはじめとする塩素イオンもしくはその塩類を同時に添加することでγ-アミノ酪酸の生産性を向上させることができた。また、海水やにがりを用いた場合も同様にγ-アミノ酪酸の生産性を効果的に向上させることができた。さらに、本乳酸菌をはじめとするその他のナイシン生産菌を用いた場合、γ-アミノ酪酸の生産と同時に抗菌物質ナイシンを生産させることができた。これらより、本乳酸菌やその他のナイシン生産菌を用いて発酵食品製造を行った場合、食品中に高濃度のγ-アミノ酪酸を生産させγ-アミノ酪酸による機能性を付与すると同時に抗菌物質ナイシンによる保存性向上効果が期待された。
【実施例１３】
【０１１３】
本乳酸菌KLC 1527D株における畜肉及び魚類をはじめとする水産品での増殖性と抗菌物質生産性及びγ-アミノ酪酸生産性とそれらを用いた発酵ソーセージの製造
【０１１４】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いた生鮮食品保存技術の開発を目的に、生の畜肉及び魚類に本乳酸菌を接種し、その増殖特性と抗菌物質生産性及びγ-アミノ酪酸生産性について次の方法で確認した。また、畜肉を使用した発酵ソーセージの製造法についても検討した。
【０１１５】
生畜肉として豚の挽肉を、また、生魚としてハタハタを用意し、それぞれに対して3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加えた。あらかじめ、本乳酸菌KLC 1527D株を5mlのLactobacilli MRS培地で30℃にて一晩培養した培養液の全量を遠心分離にて集菌しておいた。100gの豚肉及びハタハタに対して本乳酸菌KLC 1527D株の5ml一晩培養液分の菌体を添加し、25℃で16時間培養を行い、発酵肉又は発酵魚を製造した。これらの発酵肉または発酵魚を4℃にて保存し、保存試験を行った。対照として、乳酸菌非添加区を用意した。さらに、豚挽肉に3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加え、豚挽肉100gに対して5ml分の一晩培養液から集菌した本乳酸菌の菌体のみを加え、良く混合した後、羊の腸または豚の腸に詰め、25℃にて16時間培養することで、発酵ソーセージを作った。γ-アミノ酪酸の生成は薄層クロマトグラフィーにて確認した。抗菌物質の生産はアガーウェル法にて確認した。
【０１１６】
乳酸菌を添加した発酵肉や発酵魚は発酵終了後、やや酸臭を伴ったがフライパン又は焼き網で焼いて試食したところ、酸臭や酸味は感じられなかった。一方、乳酸菌を添加しなかった肉や魚では強い酸臭と腐敗臭が感じられたため、試食を行わなかった。乳酸菌を添加した肉や魚からは抗菌活性が検出され、pHの低下が認められた。また、挽肉において4℃で1週間保存したところで乳酸菌添加区からγ-アミノ酪酸を確認した。さらに、4℃で1ヶ月保存したところ、乳酸菌添加区は特に変化が認められなかったが、非添加区では保存後2日間で表面に微生物の繁殖と思われる白い粘質の物質が付着し、腐敗した。発酵ソーセージは、発酵終了後軽い酸臭が認められたが、沸騰水中で10分間煮た後試食したところ、香りや味の変化は認められなかった。
【実施例１４】
【０１１７】
本乳酸菌KLC 1527D株における豆乳中での増殖性と抗菌物質生産性及びγ-アミノ酪酸生産性とそれらを用いた豆乳ヨーグルトの製造及び利用
【０１１８】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いた抗菌活性をもつ豆乳ヨーグルトの開発とこの豆乳ヨーグルトを利用した食品保存技術の開発を目的に、次の方法により検討した。
【０１１９】
市販の豆乳「調整豆乳」または「成分無調整豆乳」(いずれも株式会社  紀文フードケミファ社製)に1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加えた。あらかじめ、本乳酸菌KLC 1527D株を1mlのLactobacilli MRS培地で30℃にて一晩培養した培養液、全量を遠心分離にて集菌しておいた。100mlの豆乳に対して本乳酸菌KLC 1527D株の1ml一晩培養液分の菌体を添加し、30℃で16時間培養を行い、豆乳ヨーグルトを作成した。この豆乳ヨーグルトを加熱殺菌した物を用いて、白菜の一夜漬けに使用し、保存性向上効果を調べた。白菜重量の3%になるように塩化ナトリウムを加えた物に、白菜重量の30%重量の3%塩化ナトリウム溶液で差し水を行った。この差し水の20%を豆乳ヨーグルトに置き換えたものと置き換えなかった物を用意し10℃で保存し、それぞれの1日目と7日目の風味について特に酸味の増加について検討した。γ-アミノ酪酸の生成は薄層クロマトグラフィーにて確認した。抗菌物質の生産はアガーウェル法にて確認した。
【０１２０】
豆乳に乳酸菌を添加し30℃で12時間以上培養すると豆乳が凝固し、豆乳ヨーグルトができた。この豆乳ヨーグルトからは抗菌活性が認められた。また、30℃で4日間培養した物からはγ-アミノ酪酸が検出された。さらに、2日間培養して適度な酸味で加熱殺菌した豆乳ヨーグルトを利用して製造した白菜の一夜漬けは、1日目は適度な酸味と風味を持っており、7日間保存した後もその風味を維持していた。一方豆乳ヨーグルトを使用しなかった白菜の一夜漬けは1日目は適度な酸味と風味を持っていたが、7日目では過剰な酸味とつわり香や酸臭が強くなり、腐敗ではないが過剰発酵していることがわかったため、抗菌物質を含む豆乳ヨーグルトを利用することで食品の保存が可能だと認められた。
【実施例１５】
【０１２１】
本乳酸菌KLC 1527D株における低塩分の塩漬け野菜中での増殖性と抗菌物質生産性及びγ-アミノ酪酸生産性とそれらを用いた野菜漬物の製造
【０１２２】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いて低塩分でも抗菌活性により日持ちが向上し、さらにγ-アミノ酪酸を含有する野菜漬物の開発を目的に、次の方法により検討した。
【０１２３】
野菜漬物にはキュウリを使用し、ぬか漬け、米と米麹を利用した麹漬け、一夜漬けの3種類の漬け床を用意して試験を行った。全てにおいて本乳酸菌を加えない非添加区を用意した。漬け床には3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加えた。あらかじめ、本乳酸菌KLC 1527D株を5mlのLactobacilli MRS培地で30℃にて一晩培養した培養液の全量を遠心分離にて集菌しておき、乳酸菌菌体5mlとして使用した。ぬか床は、市販米ぬか1kgを80℃で2時間殺菌し、米糠100gに対し、100mlの滅菌した水道水を添加し、乳酸菌菌体5mlを加え、良く混合後、30℃で4日間培養したものをぬか床とした。米と米麹を利用した麹漬けは、米と米麹と水を例えば1:1:2の割合で混合し、55℃で糖化を行い加熱殺菌した甘酒を造り、この甘酒100gに対して乳酸菌菌体5mlを添加し、30℃で4日間培養して麹漬けの漬け床とした。ぬか漬けと麹漬けではこれらの漬け床に塩もみしたキュウリを漬け込み、4℃で保存した。それぞれの3日目と7日目の風味について特に酸味の増加について検討した。一夜漬けにはキュウリ重量に対して3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加え、さらにキュウリ100gに対して乳酸菌菌体5mlを加え、キュウリ重量の30%重量の3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウム溶液で差し水を行った。15℃で24時間培養後10℃で7日間漬けた。一夜漬けの3日目と7日目の風味について特に酸味の増加について検討した。γ-アミノ酪酸の生成は薄層クロマトグラフィーにて確認した。抗菌物質の生産はアガーウェル法にて確認した。
【０１２４】
本乳酸菌を加えて調整したぬか床、麹漬け床から、抗菌活性とγ-アミノ酪酸が確認された。また、一夜漬けでは15℃で24時間培養した上清から抗菌活性が認められ、さらに10℃で7日間漬けた物からは抗菌活性とγ-アミノ酪酸の生成が確認された。また、それぞれ本乳酸菌を添加した物は15日以上保存後も酸味の増大が認められず、漬け後3日目の風味を維持することができたが、非添加区では、漬け後7日以上で酸味が増大し、腐敗に似た状態となった。以上より、低塩分野菜漬物の保存が可能だと認められた。また、ぬか床及び麹漬けにキュウリを漬け込み12時間経過したキュウリをすり下ろした絞り汁から、γ-アミノ酪酸が確認できた。また、漬け終えたキュウリの一夜漬けのキュウリも同様に絞り汁からγ-アミノ酪酸が確認できたことから、これらの漬物はγ-アミノ酪酸を含有する漬物であることが確認された。また、ぬか漬け、麹漬け、一夜漬け、いずれもつわり香などの異臭が認められず、たとえば、γ-アミノ酪酸の製造を目的としてつわり香の原因物質ジアセチルを高生成するIFO
12005株を用いた場合よりも高品質な漬け物の製造が可能であった。
【実施例１６】
【０１２５】
本乳酸菌KLC 1527D株とグルタミン酸及びその塩類を含む米と米麹混合物を用いた、抗菌物質により低塩分でも日持ちが向上し、γ-アミノ酪酸を高含有するハタハタずしとイカの塩辛の製造
【０１２６】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いて低塩分でも抗菌活性により日持ちが向上し、さらにγ-アミノ酪酸を含有する水産加工品の開発を目的に、ハタハタの麹漬けであるハタハタずしとイカの塩辛を例として、次の方法により検討を行った。
【０１２７】
ハタハタは常法に従い、食酢と5%食塩にて下漬けを行った。この下漬けされたハタハタを、実施例15で製造した抗菌活性をふくみさらにγ-アミノ酪酸を含有する麹漬けの漬け床に4℃で3日間漬け込み、ハタハタずしとした。対照として乳酸菌非添加の麹漬けの漬け床に漬け込んだ。これを4℃で2週間保存し、酸味の増大や腐敗の有無を確認した。イカの塩辛は常法に10%の麹漬けの漬け床を添加して製造を行い、塩分を3.5%とした。その後4℃で貯蔵を行った。
【０１２８】
本乳酸菌を加えて調整した麹漬け床を使用したハタハタずしとイカの塩辛からは、抗菌活性とγ-アミノ酪酸が確認された。それぞれ本乳酸菌を添加した物は15日以上保存後も酸味の増大が認められず、漬け後3日目の風味を維持することができたが、非添加区では、漬け後7日以上で酸味が増大した。以上より、低塩分でハタハタずしやイカの塩辛が作れたことから、ハタハタずしなどいずし類や塩辛類を低塩分で日持ち向上が実現したと認められた。いずれも、つわり香などの異臭が認められず、たとえば、γ-アミノ酪酸の製造を目的としてつわり香の原因物質ジアセチルを高生成するIFO 12005株を用いて製造した場合よりも高品質な漬け物の製造が可能であった。
【実施例１７】
【０１２９】
本乳酸菌KLC 1527D株とグルタミン酸及びその塩類を含む米ぬかを用いたハタハタ糠漬けの製造
【０１３０】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いて低塩分でも抗菌活性により日持ちが向上し、さらにγ-アミノ酪酸を含有する水産加工品の開発を目的に、魚類の糠漬けであるハタハタのぬか漬けを例として、次の方法により検討を行った。
【０１３１】
ハタハタは常法に従い、食酢と5%食塩にて下漬けを行った。この下漬けされたハタハタを、実施例15で製造した抗菌活性をふくみさらにγ-アミノ酪酸を含有するぬか床に4℃で3日間漬け込み、ハタハタのぬか漬けとした。対照として乳酸菌非添加のぬか床に漬け込んだ。これを4℃で2週間保存し、酸味の増大や腐敗の有無を確認した。
【０１３２】
本乳酸菌を加えて調整したぬか床を使用したハタハタのぬか漬けからは、抗菌活性とγ-アミノ酪酸が確認され、それぞれ本乳酸菌を添加した物は15日以上保存後も酸味の増大が認められず、漬け後3日目の風味を維持することができたが、非添加区では、漬け後7日以上で酸味が増大した。以上より、低塩分でハタハタのぬか漬けが作れたことから、ハタハタのぬか漬けの他、ニシンのぬか漬けなどが低塩分で日持ちが向上したと認められた。また、つわり香などの異臭が認められず、たとえば、γ-アミノ酪酸の製造を目的としてつわり香の原因物質ジアセチルを高生成するIFO 12005株を用いて製造した場合よりも高品質な漬け物の製造が可能であった。
【実施例１８】
【０１３３】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いた乳酸発酵甘酒の製造と、それを用いた種おこし及び天然酵母パン種の継代及び天然酵母パン製造
【０１３４】
本乳酸菌KLC 1527D株を用いて抗菌物質を含む乳酸発酵甘酒を製造し、この乳酸発酵甘酒を利用して天然酵母パンに使用される天然酵母種の安全製造とパン種の継代、及び天然酵母パンの製造を行った。
【０１３５】
実施例１５で製造した本乳酸菌を使用し乳酸発酵を行った抗菌活性を含みさらにγ-アミノ酪酸を含有する麹漬け漬け床を非加熱で、又は加熱殺菌して乳酸発酵甘酒とした。対照として本乳酸菌を加えない甘酒を加熱殺菌し、乳酸菌非添加区とした。この乳酸発酵甘酒に天然酵母の分離源となるレーズンなどのドライフルーツを加え、15℃で3日培養したものの味や香りを確認し、腐敗の有無などを確認した。また、この様にして分離された天然酵母の継代を乳酸発酵甘酒を用いて行い、天然酵母パン種として味や香りを確認し、腐敗の有無などを確認した。また、この様にして製造した天然酵母パン種を小麦重量の10%添加し、天然酵母パンを製造した。
【０１３６】
乳酸発酵甘酒を使用して天然酵母の分離を試みたところ、酵母のみが効率よく増殖し、また、異常な酸味や臭気の発生は認められなかった。一方、非添加区の甘酒を使用した物は、酵母のみならず一般細菌も増殖するため、過剰な酸味と異常な臭気を伴い腐敗したため、天然酵母種の分離には使用できなかった。また、乳酸発酵甘酒を使用して継代した天然酵母パン種は、過剰な酸味の生成も認められず、純粋に酵母を継代することができたが、非添加区の甘酒を用いたものでは、過剰な酸味を伴い、通常の小麦を用いた継代よりも劣ることがわかった。さらに、乳酸発酵甘酒を用いて継代した天然酵母パン種を用いたパンは酸味が弱く、日本人向きなパンが作れ、また、ふっくらとした風味有るパンが焼けた。しかし、乳酸菌非添加区の甘酒で継代したパン種を用いた場合は、雑菌汚染による過剰な酸味と酸臭を伴うパンで、日本人には好まれない味となった。これらは、乳酸発酵甘酒が低pHで有ることや抗菌物質が含まれることにより、ドライフルーツに付着した一般の乳酸菌などが増殖できず、酵母のみの純粋な培養に成功したと考えられる。また、乳酸発酵甘酒に含まれるγ-アミノ酪酸が酵母の健全な発酵に良い影響を与えている可能性が示唆された。以上より、天然酵母パン種の種おこし、継代をはじめとする天然酵母パンの製造に乳酸発酵甘酒を使用する優位性が認められた。
【実施例１９】
【０１３７】
本乳酸菌KLC 1527D株と水と小麦粉を用いた天然酵母用培地の製造と、それを用いた種おこし及び天然酵母パン種の継代及び天然酵母パン製造
【０１３８】
水と小麦粉から構成される天然酵母継代用の培地(以下、継代培地)を開発し、さらに本乳酸菌KLC 1527D株を用いて抗菌物質を含む継代培地(以下、乳酸発酵継代培地)を製造し、この乳酸発酵継代培地を利用して天然酵母パンに使用される天然酵母種の安全製造とパン種の継代、及び天然酵母パンの製造を行った。
【０１３９】
水と小麦粉を例えば2:1の割合で混合し加熱殺菌して継代培地とした。継代培地には麦芽や麦芽糖を添加しても良い。あらかじめ、本乳酸菌KLC 1527D株を5mlのLactobacilli MRS培地で30℃にて一晩培養した培養液、全量を遠心分離にて集菌しておき、乳酸菌菌体5mlとして使用した。この継代培地に乳酸菌菌体5mlを加え、30℃で1日間培養し、非加熱で又は加熱殺菌したものを乳酸発酵継代培地とした。対照として本乳酸菌を加えない継代培地を加熱殺菌し、乳酸菌非添加区とした。この乳酸発酵継代培地に天然酵母の分離源となるレーズンなどのドライフルーツを加え、15℃で3日培養したものの味や香りを確認し、腐敗の有無などを確認した。また、この様にして分離された天然酵母の継代を乳酸発酵継代培地を用いて行い、天然酵母パン種として味や香りを確認し、腐敗の有無などを確認した。また、この様にして製造した天然酵母パン種を小麦重量の20%添加し、天然酵母パンを製造した。さらに、継代培地に3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加えて乳酸発酵を行い、γ-アミノ酪酸の生成を試みた。γ-アミノ酪酸の生成は薄層クロマトグラフィーにて確認した。乳酸発酵継代培地に含まれる抗菌物質はアガーウェル法にて確認した。
【０１４０】
乳酸発酵継代培地からは抗菌活性が確認され、pHが低下したことから、KLC 1527D株の増殖が確認された。また、継代培地に3%塩化ナトリウム、1%塩化マグネシウム、0.5%グルタミン酸ナトリウムを加えて乳酸発酵を30℃で4日間行ったところ、抗菌活性とγ-アミノ酪酸の生成が確認された。乳酸発酵時に乳酸発酵継代培地を使用して天然酵母の分離を試みたところ、酵母のみが効率よく増殖し、また、異常な酸味や臭気の発生は認められなかった。一方、非添加区の継代培地を使用した場合は、酵母のみならず一般細菌も増殖するため、過剰な酸味と異常な臭気を伴い腐敗したため、天然酵母種の分離には使用できなかった。また、乳酸発酵継代培地を使用して継代した天然酵母パン種は、過剰な酸味の生成も認められず、純粋に酵母を継代することができたが、非添加区の継代培地を用いたものでは、過剰な酸味を伴い、通常の小麦を用いた継代と変わらないことがわかった。さらに、乳酸発酵継代培地を用いて継代した天然酵母パン種を用いたパンは酸味が弱く、日本人向きなパンが作れ、また、ふっくらとした風味有るパンが焼けた。しかし、乳酸菌非添加区の継代培地で継代したパン種を用いた場合は、雑菌汚染による過剰な酸味と酸臭を伴うパンで、日本人には好まれない味となった。これらは、乳酸発酵継代培地が低pHで有ることや抗菌物質が含まれることにより、ドライフルーツに付着した一般の乳酸菌などが増殖できず、酵母のみの純粋な培養に成功したと考えられる。また、乳酸発酵継代培地に含まれるγ-アミノ酪酸が酵母の健全な発酵に良い影響を与えている可能性が示唆された。以上より、天然酵母パン種の種おこし、継代をはじめとする天然酵母パンの製造に乳酸発酵継代培地を使用する優位性が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス・クラス 1 KLC 1527D株は抗菌物質ナイシンZを生産し、その他のナイシン生産菌と比較して、低温増殖性に優れ、低温培養時における抗菌物質生産性も優れていた。さらに、糖質資化能にも優れていたことから、様々な環境において優勢に生育することが可能である。本乳酸菌はつわり香や菌臭といった異臭の発生がほとんど無いという特性を持つ。その他、γ-アミノ酪酸生成能も従来のナイシン生産菌よりも高く、グルタミン酸及びその塩類より効率よく生産できるため、食品に抗菌物質による日持ち向上と低塩化を実現する他、γ-アミノ酪酸による機能性を付与することが可能である。さらに本乳酸菌を含めた一般的な乳酸菌において、塩化マグネシウムをはじめとする塩素イオンやその塩類、海水、にがりの存在下でγ-アミノ酪酸の生産能が著しく向上することを見いだした。本乳酸菌のつくる抗菌物質は、火落菌をはじめ様々な細菌に対して生育阻害効果を示す。そのため、本乳酸菌を発酵食品等の製造時に添加し発酵を行わせたり、食品等に添加することによって、雑菌等の生育を阻害し、食品の腐敗や品質の低下、さらに火落菌による清酒などの腐敗を有効に防止することができる。菌臭やつわり香を発生せず抗菌物質とγ-アミノ酪酸を作る本乳酸菌を使用することによって、日持ちが向上しγ-アミノ酪酸による機能性が付与されるといった、従来に比べて高品質な食品の製造及び開発が可能である。ここでは、その例として、野菜や畜肉、魚類の低塩化と日持ち向上技術及び天然酵母パンの安全製造法を例示した。今後、この様な食品への利用がすすみ、化学的に合成された保存料を使わず発酵を利用した安全な食品の提供が可能となる。
【０１４２】
乳酸菌は古来より食習慣があるため安全性の面では問題がなく、この抗菌性物質は乳酸菌に由来しており、しかも人体内で容易に分解されるため、従来の化学合成された食品保存料と比べ、大量に摂取しても安全性の上で心配がなく、健康面から好ましいものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】本乳酸菌とその他のナイシン生産菌を摂氏１０度、１５度、２０度で培養した結果の生育状態を示すグラフである。
【図２】本乳酸菌とその他のナイシン生産菌を摂氏２５度、３０度、３７度で培養した結果の生育状態を示すグラフである。
【図３】本乳酸菌とその他のナイシン生産菌とで、培養温度を変えた抗菌活性を比較したグラフである。
【図４】本乳酸菌とその他のナイシン生産性乳酸菌におけるγ−アミノ酪酸生産性を示すグラフである。
【図５】本乳酸菌の食塩耐性試験における濁度変化を示すグラフである。
【図６】本乳酸菌と他のナイシン生産菌の食塩濃度4ないし6%における濁度変化を示すグラフである。
【図７】本乳酸菌とその他のナイシン生産乳酸菌の食塩ストレス環境下における増殖性比較とγ-アミノ酪酸生産性を示すグラフである。
【図８】本乳酸菌の増殖に伴う濁度変化を示すグラフである。
【図９】γ-アミノ酪酸の生成量を示すグラフである。
【図１０】塩化マグネシウム濃度を変化させたときの濁度の変化を示すグラフである。
【図１１】培養4日目と7日目の培養上清中に含まれるγ-アミノ酪酸生成量を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１４４】
ＡＵ  Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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