(57)【要約】    【課題】  α,β-不飽和カルボン酸を原料として、より高い光学純度で安価かつ簡便に光学活性カルボン酸を製造する新規な方法を提供する。    【解決手段】  下記一般式（Ｉ）2005318858.tif 000013で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、該化合物のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、下記一般式(ＩＩ)2005318858.tif 000014で表される光学活性カルボン酸を生成させることを特徴とする光学活性カルボン酸の製造方法(一般式（Ｉ）、（II）中、Ｒ1はハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す)。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）
【化１】
2005318858.tif 000011
（Ｉ）
で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、該化合物のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択
的に還元する能力を有する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、下記一般式(ＩＩ)
【化２】
2005318858.tif 000012
（ＩＩ）
で表される光学活性カルボン酸を生成させることを特徴とする光学活性カルボン酸の製造方法(一般式（Ｉ）、（II）中、Ｒ1はハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す)。
【請求項２】
Ｒ2またはＲ3のどちらか一方が水素原子である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がプロピル基、Ｒ3が水素原子である、請求項２に記載の
製造方法。
【請求項４】
Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がフェニル基、Ｒ3が水素原子である、請求項２に記載の
製造方法。
【請求項５】
Ｒ1がメチル基、Ｒ2が炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ3が水素原子である、請求項２に記
載の方法。
【請求項６】
微生物が、クロストリジウム(Clostridium)属細菌である請求項１〜５のいずれかに記載
の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を利用してα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元し、光学活性カルボン酸を製造
する方法に関する。光学活性カルボン酸は医薬、農薬の重要な合成中間体である。
【背景技術】
【０００２】
下記一般式（Ｉ）
【０００３】
【化１】
2005318858.tif 000002
【０００４】
で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元して
生成する下記一般式（ＩＩ）
【０００５】
【化２】
2005318858.tif 000003
【０００６】
で表される光学活性カルボン酸は、生理活性又は薬理活性成分(医薬品、農薬など)の中間原料として有用な物質である。生理活性成分は光学異性体を選択的に製造することが求められ、該カルボン酸の光学活性体は、さらに有用な中間原料となり得ると考えられる。
しかしながら、微生物を用いて炭素・炭素二重結合を不斉還元する方法は報告が少なく、α,β-不飽和カルボン酸を還元する酵素としてはクロストリジウム（Clostridium）属
微生物由来のエノエートレダクターゼの報告があるが、該酵素で生成する光学活性カルボン酸は本発明で生成する前記一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸とは逆の立体異性体である。（非特許文献１）
また、一般的に化学合成法による炭素・炭素二重結合の不斉還元は、触媒が高価である、触媒残渣の除去等プロセス上煩雑な工程が必要になること、等の難点があり、より安価で簡便な製造法の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1985) vol.24, p.539-553
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記一般式（Ｉ）で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二
重結合を光学選択的に還元することにより前記一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸を製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を光学選択的に還元する能力を有する微生物を選別し、得ら
れた微生物を用いることにより、α,β-不飽和カルボン酸を基質として光学活性カルボン酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
【０００９】
（１）  下記一般式(Ｉ)
【００１０】
【化３】
2005318858.tif 000004
【００１１】
で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、該化合物のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択
的に還元する能力を有する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、下記一般式(ＩＩ)
【００１２】
【化４】
2005318858.tif 000005
【００１３】
で表される光学活性カルボン酸を生成させることを特徴とする光学活性カルボン酸の製造方法(一般式（Ｉ）、（II）中、Ｒ1はハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す)。
【００１４】
（２）  Ｒ2またはＲ3のどちらか一方が水素原子である、（１）に記載の製造方法。
（３）  Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がプロピル基、Ｒ3が水素原子である、（２）
に記載の製造方法。
（４）  Ｒ1がヒドロキシメチル基、Ｒ2がフェニル基、Ｒ3が水素原子である、（２）
に記載の製造方法。
【００１５】
（５）  Ｒ1がメチル基、Ｒが炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ3が水素原子である、（２）に記載の方法。
（６）  微生物が、クロストリジウム(Clostridium)属細菌である（１）〜（５）のい
ずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、一般式（Ｉ）で表されるα,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素
二重結合を微生物を用いて立体選択的に還元し、一般式（ＩＩ）で表される光学活性カルボン酸を簡便に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、（１）  下記一般式(Ｉ)
【００１８】
【化５】
2005318858.tif 000006
【００１９】
で表されるα,β-不飽和カルボン酸に、該化合物のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択
的に還元する能力を有する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、下記一般式(ＩＩ)
【００２０】
【化６】
2005318858.tif 000007
【００２１】
で表される光学活性カルボン酸を製造する。
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ1はハロゲン原子、置換されていてもよ
いアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい炭化水素（不飽和結合を有していてもよい。但し、カルボキシル基を除く。）、置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいアルコキシ基を示す。
【００２２】
ここで、炭化水素としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基が挙げられ、アルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ターシャリーブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ターシャリーペンチル基、イソアミル基、ｎ−へキシル基等の炭素数１〜８の直鎖、分岐鎖、環状アルキル基が挙げられる。アルキル基の中で、炭素数１〜４のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。アリール基としては、例えば、フェニル基、メシチル基、ナフチル基等が挙げられる。アルコキ
シ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ターシャリーブトキシ基等が挙げられる。アルコキシ基の中で炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましい。
【００２３】
上記アルキル基、アリール基及びアルコキシ基は置換されていてもよい。置換基としては、反応に悪影響を与えない基であれば特に限定はないが、具体的には、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、ハロゲン基、シアノ基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基及びヒドロキシル基等が挙げられる。
したがって、一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、置換された炭化水素として具体的には、ベンジル基、フェネチル基、シアノメチル基、アミノメチル基、ヒドロキシメチル基、ニトロメチル基、メトキシメチル基等が挙げられる。置換されたアリール基として具体的には、クロロフェニル基、アミノフェニル基、ヒドロキシフェニル基、ニトロフェニル基、メトキシフェニル基等が挙げられる。置換されたアルコキシ基として具体的には、ベンジロキシ基、フェノキシ基、トリフルオロメトキシ基等が挙げられる。
【００２４】
前記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3はハロゲン原子であって
もよいが、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。
上記一般式（Ｉ）および（ＩＩ）中のR1は、好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基であり、より好ましくは炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、ヒドロキシメチル基である。
【００２５】
また、R2およびR3として、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルコキシ基、ベンジル基またはフェニル基であり、より好ましくは水素原子、炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基である。
上記一般式（Ｉ）で表される化合物としては、分子量が１０００以下、好ましくは７５０以下、より好ましくは５００以下のものであり、具体的には、例えば２−ヒドロキシメチル−２−ブテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ペンテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸、２−ヒドロキシメチル−２−ヘプテン酸、２−ヒドロキシメチル−２−オクテン酸、２−ヒドロキシメチル桂皮酸、チグリン酸、２−メチル−２−ペンテン酸、２−メチル−２−ヘキセン酸、２−メチル−２−ヘプテン酸、２−メチル−２−オクテン酸等が挙げられる。
【００２６】
上記一般式(Ｉ)で表される化合物は、欧州特許第９０６９０１号明細書、欧州特許第９３７７１０号明細書、仏国特許発明第２７７２０２７号明細書、第4版実験化学講座（１
９巻、ｐ６２、１９９２年）等に記載されているような公知の方法に準じてまたはそれらの組み合わせにより、容易に合成することができる。
本発明の方法において、上記一般式（Ｉ）で表される化合物に、後述する微生物の菌体、該菌体処理物及び／または培養液を作用させ、該化合物の炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元し、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成させる。
【００２７】
上記一般式（ＩＩ）で表される化合物としては、具体的には、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル酪酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル吉草酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘプタン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルオクタン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸、（Ｓ）−２−メチル酪酸、（Ｓ）−２−メチル吉草酸、（Ｓ）−２−メチルヘキサン酸、（Ｓ）−２−メチルヘプタン酸、（Ｓ）−２−メチルオクタン酸等が挙げられる。
【００２８】
（本発明に用いられる微生物）
本発明に用いることの出来る微生物としては、α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・
炭素二重結合を立体選択的に還元する能力（以下これを「立体選択的還元活性」と略称することがある。）を有するものであれば特に限定されない。α,β-不飽和カルボン酸のα,β炭素・炭素二重結合を立体選択的に還元する能力を有する微生物は、該微生物が有す
る立体選択的還元活性を確認することにより選別することができ、立体選択的還元活性を確認方法としては、例えば、式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸を含む水溶液に対象となる微生物、その菌体処理物又は培養液を作用させ、その反応液を薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーを用い、基質および生成物である式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸を定性・定量することによりスクリーニングすることができる。
【００２９】
本発明に用いることのできる微生物は、上記立体選択的還元活性の確認方法に供し、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質の減少が確認しうるもの、具体的には、数時間以上、好ましくは１日以上反応させたときに原料基質が１％以上、好ましくは５％以上減少するものである。
式（Ｉ）の化合物を立体選択的に還元し、式（ＩＩ）の 光学活性カルボン酸を製造す
る能力を有する微生物としては、例えばクロストリジウム(Clostridium)属に属する微生
物が挙げられる。
【００３０】
クロストリジウム(Clostridium)属に属する微生物として、好ましくは、クロストリジ
ウム  アセチレデュセンス（Clostridium acetireducens）  DSM10703等のクロストリジ
ウム  アセチレデュセンス（Clostridium acetireducens）、クロストリジウム  バラテ
ィ（Clostridium barati） JCM1385等のクロストリジウム  バラティ（Clostridium barati）、クロストリジウム  バーケリ（Clostridium barkeri） DSM1223等のクロストリジ
ウム  バーケリ（Clostridium barkeri）、クロストリジウム  カダベリス（Clostridium
cadaveris）  JCM1392等のクロストリジウム  カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム  コクレアリウム（Clostridium cochlearium）  JCM1396等のクロストリジウム  コクレアリウム（Clostridium cochlearium）、クロストリジウム  コクレア
タム（Clostridium cocleatum）  JCM1397等のクロストリジウム  コクレアタム（Clostridium cocleatum）、クロストリジウム  ファラクス（Clostridium fallax）  JCM1398等のクロストリジウム  ファラクス（Clostridium fallax）、クロストリジウム  ゴニ（Clostridium ghonii）  JCM1400等のクロストリジウム  ゴニ（Clostridium ghonii）、ク
ロストリジウム  グリコリカム（Clostridium glycolicum）  JCM1401等のクロストリジ
ウム  グリコリカム（Clostridium glycolicum）、クロストリジウム  ヒラノニス（Clostridium hiranonis）  JCM10541等のクロストリジウム  ヒラノニス（Clostridium hiranonis）、クロストリジウム  ハイドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum） DSM7310等のクロストリジウム  ハイドロキシベンゾイカム（Clostridium hydroxybenzoicum）、クロストリジウム  イレギュラリス（Clostridium irregularis） JCM1425等
のクロストリジウム  イレギュラリス（Clostridium irregularis）、クロストリジウム
ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans） DSM14214等のクロストリジウム  ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、クロス
トリジウム  レントピュトレセンス（Clostridium lentoputrescens） DSM2153等のクロ
ストリジウム  レントピュトレセンス（Clostridium lentoputrescens）、クロストリジ
ウム  マレノミナタム（Clostridium malenominatum） JCM1405等のクロストリジウム  
マレノミナタム（Clostridium malenominatum）、クロストリジウム  マンゲノティ（Clostridium mangenotii）  JCM1428等のクロストリジウム  マンゲノティ（Clostridium mangenotii）、クロストリジウム  マヨンベイ（Clostridium mayombei） DSM6539等のクロストリジウム  マヨンベイ（Clostridium mayombei）、クロストリジウム  オセアニカム（Clostridium oceanicum）  JCM1407等のクロストリジウム  オセアニカム（Clostridium oceanicum）、クロストリジウム  ペプチディヴォランス（Clostridium peptidivorans）  DSM12505等のクロストリジウム  ペプチディヴォランス（Clostridium peptidivoran
s）、クロストリジウム  プロピオニカム（Clostridium propionicum）  JCM1430等のク
ロストリジウム  プロピオニカム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム  ピ
ュトリフィカム（Clostridium putrificum）  JCM1410等のクロストリジウム  ピュトリ
フィカム（Clostridium putrificum）、クロストリジウム  スカトロゲネス（Clostridium scatokogenes）  JCM1414等のクロストリジウム  スカトロゲネス（Clostridium scatokogenes）、クロストリジウム  スティクランディ（Clostridium sticklandii）  JCM1433等のクロストリジウム  スティクランディ（Clostridium sticklandii）、クロストリジウム  サブターミナレ（Clostridium subterminale）  JCM1417等のクロストリジウム  
サブターミナレ（Clostridium subterminale）、クロストリジウム  シンビオサム（Clostridium symbiosum）  JCM1297等のクロストリジウム  シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム  テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）  DSM4474等のクロストリジウム  テタノモーファム（Clostridium tetanomorphum）などが挙げられる。
【００３１】
尚、上記微生物はJapan Collection of Microorganism(JCM)のインターネットカタログ( HYPERLINK http://www.jcm.riken.go.jp) http://www.jcm.riken.go.jp)、またはDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)のインターネットカタログ(http://www.dsmz.de/)に記載されており、該JCMまたはDSMZから入手することができる。
【００３２】
また、上記微生物は、ＵＶ照射やニトロソグアニジン処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
また、組換え株の発現株としては、もとの菌株の他、大腸菌等のバクテリアや酵母などを用いてもよく、これらの組換え株も上記微生物という概念に含まれる。
【００３３】
本発明の製造方法においては、上記微生物の１種あるいは２種以上が菌体、菌体処理物及び／又は培養液として用いられる。
具体的には、上記微生物を培養して得られた菌体又はその培養液をそのまま用いることや、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理したもの、風乾または凍結乾燥処理したもの、菌体を物理的、化学的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。
【００３４】
また、これらの菌体または菌体処理物から、式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸に作用し式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸に変換するする能力を有する酵素画分を粗製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等を通常の固定化技術を用いて、すなわち、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本明細書において、「菌体及び／または該菌体処理物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、及びそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。
【００３５】
また、上記微生物は、通常、培養して用いられるが、この培養については定法通り行うことができる。本微生物の培養の為に用いられる培地には本微生物が資化しうる炭素源、窒素源、及び無機イオン等が含まれる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、サッカロース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類、有機酸その他が適宜使用される。窒素源としては、ＮＺアミン、トリプトース、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、大豆抽出物などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム塩、硝酸アンモニウム塩などの無機窒素源、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が必要に応じ適宜使用される。培養はｐＨ約３〜１０、好
ましくはｐＨ６〜８、温度４〜８０℃、好ましくは２５〜６０℃の適当な範囲に制御しつつ１〜１００時間行う。
【００３６】
上記微生物がClostridium属のように偏性嫌気性菌の場合は、培地にシステイン、チオ
グリコール酸、Na2Sまたはアスコルビン酸のような還元剤を添加することが効果的であり、培養はCO2やN2気流を通気して酸素を除去する必要がある。上記微生物が通性嫌気性菌
または好気性菌の場合は好気的条件下で培養することにより、培養液あたりの菌体量、酵素活性量を増加することも可能である。
【００３７】
(製造方法)
次に、本発明の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法は、原料として式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸を用い、これに水性媒体中で上記微生物の菌体、該菌体処理物及び／又は培養液を作用させて、式（ＩＩ）の光学活性カルボン酸を製造するものである。
【００３８】
反応の方法としては、ａ)上記培養微生物の菌体、該菌体処理物及び／又は培養液と式
（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸とを水性媒体中で接触させる方法、ｂ) 式（Ｉ）のα,
β-不飽和カルボン酸含有培地を用い、培養と反応を同時に行う方法等が挙げられ、これ
らは適宜用いることができるが、工業的には、微生物増殖に転用されるエネルギーロスが無い方が好ましいため、上記ａ)の方法が好ましい。
【００３９】
反応系中での式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸の濃度は０．０００１〜５０％(ｗ／
ｖ)、好ましくは０．０１〜５％(ｗ／ｖ)、の範囲が望ましく、必要ならば反応の間、α,β-不飽和カルボン酸は逐次添加してもよい。
上記水性媒体としては、リン酸カリウムやトリス−塩酸塩等を含有する緩衝能力を有する水溶液が一般的には用いられるが、反応中、ｐＨをモニターし、塩酸や水酸化ナトリウム等の酸・アルカリによりｐＨ変化を制御するのであれば緩衝成分を省略することもできる。
【００４０】
また、基質の溶解度を増加させるためメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ジオキサン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォキシド等の親水性溶媒を添加してもよいし、同じ目的でTween80や
シュガーエステルのような界面活性剤を添加してもよい。
さらに、基質や生成物による反応阻害を抑えるために反応液の０．１〜１０倍容量程度の酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、１―オクタノール等の疎水性溶媒を添加することもできる。
【００４１】
反応液中には還元反応のエネルギー源としてグルコース、エタノール、イソプロピルアルコール、蟻酸等が基質の１〜２０倍モル等量含まれていることが好ましい。
また、還元反応において補酵素として利用される酸化型または還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(
ＮＡＤＰ)を０．００１〜０．１％(ｗ／ｖ)、添加すると効果的である。
【００４２】
さらに、補酵素の還元型への再生を促進するために、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、蟻酸脱水素酵素等を添加することも効果的である。
反応条件は、微生物の種類によっても異なるが、通常４〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、さらに好ましくは２８〜４２℃の範囲で行い、ｐＨは通常３〜１０、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８の範囲で行う。
【００４３】
反応形態としては、バッチ法でも連続法でも何れでも構わないが、連続法の場合には、
式（Ｉ）のα,β-不飽和カルボン酸、微生物の培養液、菌体及び／または該菌体処理物を、必要に応じて、適宜添加して行われ、また、目的生成物から分離された菌体をリサイクル使用しても良い。
上記反応で得られた光学活性カルボン酸の採取方法としては、微生物などの固形分を遠心分離、フィルタープレス、限外濾過などの通常の分離装置によりを除去した後に反応液を有機溶媒による抽出、晶析、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留などの分離精製手段に供することにより分離することができ、分離精製手段は単独でまたは複数の手段を組み合わせて利用できる。
【００４４】
抽出に用いる有機溶媒としては、例えばブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン等の炭化水素類、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ノルマルブチルなどのエステル類、ケトン類、エーテル類、これらの混合溶媒などが利用できる。
［実施例］
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
【実施例１】
【００４５】
＜クロストリジウム属細菌による（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム  オセアニカム（Clostridium oceanicum）  JCM1407株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃
で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を単離した。該菌体を２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸  10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー  100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケ
ンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ  ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層を遠心エバポレーターで乾固させた。得られたサンプルをヒドロキシカルボン酸分析キット（ＹＭＣ社製）で誘導体化し、ＨＰＬＣにて分析を行った。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【００４６】
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ  （ダイセル社製、４．６×２５０ｍｍ、３０℃）
溶離液：Ｈｅｘａｎｅ／２−Ｐｒｏｐａｎｏｌ  ＝  ９０／１０、０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ４００ｎｍ
この結果、本反応での（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の生成濃度は３．９８ｍMであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【００４７】
また、その他のクロストリジウム属細菌の菌株についても同様の試験を行い、（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸の収量、光学純度を下記にまとめた。
【００４８】
【表１】
2005318858.tif 000008
【００４９】
本結果より、２−ヒドロキシメチル−２−ヘキセン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｒ）−２−ヒドロキシメチルヘキサン酸が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。
【実施例２】
【００５０】
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム  コクレアリウム（Clostridium
cochlearium）  JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体を２−ヒドロキシメチル桂皮酸  10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー  100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（
三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ  ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層を遠心エバポレーターで乾固させた。定量は乾固サンプルの２−プロパノール溶液を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
【００５１】
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５ＰＹＥ  （ナカライテスク社製）  ４０℃
溶離液：０．０５％（ｖ／ｖ）  リン酸水溶液／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
また、２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の光学純度は特開平１１−１０６３６３号公報に記載の方法で測定することができる。
【００５２】
この結果、本反応での（S）−２−ヒドロキシメチル−３−フェニルプロピオン酸の生
成濃度は８．２１ｍMであり、光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【実施例３】
【００５３】
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム  コクレアリウム（Clostridium
cochlearium）  JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体をチグリン酸  50mM、グルコース100mM、リン酸カリウムバッファー  1
00mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ  ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層をGCにて分析した。GCの条件は以下の通りである。
【００５４】
カラム：β−ＤＥＸ１２０  （ＳＵＰＥＬＣＯ社製、３０ｍ×０．２５ｍｍＩＤ、０．２５μｍ  ｆｉｌｍ）
キャリア：Ｈｅ  １．５ｍｌ／ｍｉｎ、  ｓｐｌｉｔ  １／５０
カラム温度：１２０℃
注入温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ  ２５０℃
ＧＣ：島津ＧＣ−１４Ａ（島津製作所社製）
この結果、本反応での（Ｓ）−２−メチル酪酸の生成濃度は３９．９ｍMであり、光学
純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【００５５】
また、その他の菌株についても同様の試験を行い、（Ｓ）−２−メチル酪酸の収量、光学純度を下記にまとめた。
【００５６】
【表２】
2005318858.tif 000009
【００５７】
本結果より、チグリン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｓ）−２−メチル酪酸
が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。
【実施例４】
【００５８】
＜クロストリジウム属細菌による（Ｓ）−２−メチル吉草酸の生成＞
GAMブイヨン培地（日水製薬社製）にクロストリジウム  コクレアリウム（Clostridium
cochlearium）  JCM1396株を接種し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学社製）中、37℃で72時間静置して培養した。培養終了後，培養液(５ｍＬ)を集め、遠心分離し菌体を
単離した。該菌体を２−メチル−２−ペンテン酸  10mM、グルコース20mM、リン酸カリウムバッファー  100mM(pH7.5)からなる反応液200μＬに懸濁し、アネロパック・ケンキ（
三菱ガス化学社製）中、37℃で静置して反応させた。反応開始18時間後６Ｎ  ＨＣｌを10μＬを添加し、酢酸エチル500μLで抽出後、酢酸エチル層をGCにて分析した。GCの条件は欧州特許第１２９１４３５号明細書に記載の方法に従った。
【００５９】
この結果、本反応での（Ｓ）−２−メチル吉草酸の生成濃度は３．１１ｍMであり、光
学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
また、その他の菌株についても同様の試験を行い、（Ｓ）−２−メチル吉草酸の収量、光学純度を下記にまとめた。
【００６０】
【表３】
2005318858.tif 000010
【００６１】
本結果より、２−メチル−２−ペンテン酸から、クロストリジウム属細菌により（Ｓ）−２−メチル吉草酸が効率よく、高光学純度で生成できることが明らかになった。