(57)【要約】【課題】  亜鉛イオンを広いｐＨ範囲で良好に検出することができる化合物及び蛍光プローブを提供する。また、アポトーシス細胞のみを良好に検出する。【解決手段】  下記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物。【化１】2005325074.tif 000013  ［式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、スルホニルアミド基、スルホニルアルキル基、低級アルキル基又はＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7は炭素数１〜３までのアルキル基を表す）を表し；Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；ｍ〜ｑは２または３を示し；ｒは１または２を示し；Ｙ−はハロゲンアニオン、硝酸イオン、硫酸イオンまたはカルボン酸イオンを表す。］【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
【化１】
2005325074.tif 000011
［式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、スルホニルアミド基、スルホニルアルキル基、低級アルキル基又はＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7は炭素数１〜３までのアルキル基を表す）を表し；Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；ｍ〜ｑはそれぞれ独立に２または３を示し；ｒは１または２を示す。］
【請求項２】
前記式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ4はいずれも水素原子であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記式中Ｒ3はＸＮＲ7（式中ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7はメチル基）であることを特徴とする請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
前記式中Ｒ1、Ｒ2及びＲ4はいずれも水素原子であり、Ｒ3はＸＮＲ7（式中ＸはＳＯ2を表し、Ｒ７はメチル基）であることを特徴とする請求項１記載の化合物。
【請求項５】
下記一般式（ＩＩ）で表される化合物。
【化２】
2005325074.tif 000012
［式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、スルホニルアミド基、スルホニルアルキル基、低級アルキル基又はＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7は炭素数１〜３までのアルキル基を表す）を表し；Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；ｍ〜ｑはそれぞれ独立に２または３を示し；ｒは１または２を示し；Ｙ−はハロゲンアニオン、硝酸イオン、硫酸イオンまたはカルボン酸イオンを表す。］
【請求項６】
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ4はいずれも水素原子であることを特徴とする請求項５記載の化合物。
【請求項７】
前記式（ＩＩ）中、Ｒ3はＸＮＲ7（式中ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7はメチル基）であることを特徴とする請求項５記載の化合物。
【請求項８】
前記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ4はいずれも水素原子であり、Ｒ3はＸＮＲ7（式中ＸはＳＯ2を表し、Ｒ7はメチル基）であり、Ｙ-は硝酸イオン（ＮＯ3−）であることを特徴とする請求項５記載の化合物。
【請求項９】
請求項５記載の式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法であって、
請求項１ないし４のいずれか１項記載の化合物を、亜鉛イオン存在下に配置すること、
を含む製造方法。
【請求項１０】
アポトーシス細胞の検出方法であって、
請求項１ないし４のいずれか１項記載の化合物を対象細胞へ添加する工程と、
蛍光を発光させるための励起光を細胞に照射する工程と、
蛍光染色されたアポトーシス細胞を検出する工程と、
を含むアポトーシス細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、その製造方法及びアポトーシス細胞検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の形状や各種状態を検出するために種々の蛍光発色手法が有効に用いられている。例えば、特定抗原に対する抗体に蛍光標識を施した蛍光抗体や、特定状態の細胞をよく染色する蛍光染料などが広く用いられている。
近年、予めプログラムされた細胞死であると共に重要な生命現象のひとつであるアポトーシスに関する研究が進められている。アポトーシスは、外的損傷による細胞死（ネクローシス）とは異なる現象であり、アポトーシスの現象を特定するには、ネクローシスと区別する必要がある。その一方で、アポトーシス現象には、亜鉛イオンが関与していることが確認されている。このため、この知見に基づいて亜鉛感受性の蛍光化合物をプローブとして使用し、アポトーシスをネクローシスと精度よく区別することが行われている。また亜鉛は生体に必須の元素であるため、種々の生命現象に深く関与していることがわかっている。
【０００３】
このような亜鉛イオンによって蛍光発色可能な亜鉛蛍光プローブとしては、ダンシルサイクレン（dansylamidodethylcyclen）など下記に示されるようなものが広く用いられている（例えば、非特許文献１乃至４及び特許文献１参照）。
【０００４】
【化１】
2005325074.tif 000002
【０００５】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100(7), 3731
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 1778-1787
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 3889-3895
【非特許文献４】J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 712-713
【特許文献１】特開２０００−２３９２７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、生体には亜鉛イオンのほかに種々のイオンが存在しているため、微量の亜鉛イオンを効果的に検出するには、高感度且つ短時間で生理的条件下にて亜鉛イオンに選択的に反応して錯体を形成し、且つ強く蛍光発色する必要がある。また、細胞を対象とする場合、血液細胞などではｐＨ７．４の弱アルカリ性を示すことが多いが、好酸球など、細胞によってはより低いｐＨを示すものもある。各種の細胞に対して同様に蛍光プローブとして用いる場合には、錯体形成ができるだけ広いｐＨ範囲で生じることと、錯体形成前の化合物のみの蛍光強度ができるだけ低いことが要求されている。さらに、このような亜鉛イオンが深く関与しているアポトーシス過程にある細胞を、選択的に染色することが要請されている。
【０００７】
従って、本発明の目的は、亜鉛イオンを広いｐＨ範囲で良好に検出することができる化合物及び蛍光プローブを提供することである。
また本発明の他の目的は、アポトーシス細胞のみを良好に検出することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の化合物は、下記一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物である。
【０００９】
【化２】
2005325074.tif 000003
【００１０】
［式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、スルホニルアミド基、スルホニルアルキル基、低級アルキル基又はＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7は炭素数１〜３までのアルキル基を表す）を表し；Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示し；ｍ〜ｑはそれぞれ独立に２または３を示し；ｒは１または２を示し；Ｙ-はハロゲンアニオン、硝酸イオン、硫酸イオンまたはカルボン酸イオンを表す。］
【００１１】
本発明の上記一般式（ＩＩ）で表される化合物の製造方法は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物を、亜鉛イオン存在下に配置すること、を含むことを特徴としている。
さらに本発明のアポトーシス細胞の検出方法は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物を、対象細胞へ添加する工程と、蛍光を発光させるための励起光を細胞に照射する工程と、蛍光染色されたアポトーシス細胞を検出する工程と、を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、一般式（Ｉ）で表される化合物は亜鉛イオンに対して高選択性で短時間に錯体を形成して、強い蛍光強度を示す一般式（ＩＩ）で表される化合物を生成する。これらの化合物のこのような特性は広いｐＨ範囲で認められるので、亜鉛イオンを広いｐＨ範囲で良好に検出することができる。
また上記の新規な化合物を用いることによって、亜鉛イオンが存在するアポトーシス細胞を良好に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の化合物は下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
【００１４】
【化３】
2005325074.tif 000004
【００１５】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、スルホニルアミド基、スルホニルアルキル基、低級アルキル基又はＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7は炭素数１〜３までのアルキル基を表す）を表す。なお、ここでいう低級アルキル基には、炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、合成容易性の観点からメチル基であることが特に好ましい。また式中ＸにかかるハロゲンとしてはＣｌ、Ｂｒ、Ｉを挙げることができる。Ｘとしては、ＳＯ2であることが好ましい。
【００１６】
このうち、合成の観点から、Ｒ1、Ｒ2及びＲ4はいずれも水素原子であること、Ｒ3がＸＮＲ7（ＸはＳＯ2又はハロゲンを表し、Ｒ7はメチル基を表す）であることがそれぞれ好ましく、これらの両者を共に備えたものであることが特に好ましい。
【００１７】
また一般式（Ｉ）中、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はそれぞれ独立に水素原子又は低級アルキル基を示す。ここで低級アルキル基としては、上記で説明したものが該当する。合成容易性の観点から、Ｒ8、Ｒ9及びＲ10はいずれも水素原子であることが好ましい。一般式（Ｉ）中、ｍ〜ｑはそれぞれ独立に２または３、好ましくは２であり、ｒは１または２を示し、好ましくは１である。
【００１８】
一般式（Ｉ）の化合物は、塩であってもよい。塩としては、塩酸塩、シュウ化水素酸塩、シュウ酸塩などを挙げることができる。
【００１９】
上記の一般式（Ｉ）に該当する化合物として特に好ましい化合物は、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物である。
【００２０】
【化４】
2005325074.tif 000005
【００２１】
本発明の化合物は、例えば、以下のようにして合成することができる。
【００２２】
【化５】
2005325074.tif 000006
【００２３】
１，４，７−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−サイクレン［１］（３Ｂｏｃ−サイクレン）とキノリノール誘導体２を反応させて［３］とし、Ｂｏｃ基を含めた全ての保護基を脱保護することによって本発明の化合物［４］を得ることができる。
【００２４】
本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物は、上記一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物と亜鉛イオンとで形成された錯体である。上記一般式（Ｉ）の化合物は、８−キノリノールを有するので、亜鉛イオンとの反応性が高く、亜鉛イオン存在下でキノリノールの酸素と窒素、および環状ポリアミン部の４つの窒素原子が亜鉛イオンに配位して、容易に錯体を形成する。錯体を形成した化合物（式（ＩＩ））は、式（Ｉ）で表される化合物（リガンド）と比較して、強く蛍光発色する。このため、式（Ｉ）の化合物と亜鉛イオンとで形成された式（ＩＩ）の化合物は共に、微量の亜鉛であっても有効に検出することができる感度のよい亜鉛蛍光プローブをとして利用することができる。
【００２５】
【化６】
2005325074.tif 000007
【００２６】
【化７】
2005325074.tif 000008
【００２７】
上記式（ＩＩ）中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、それぞれ上記一般式（Ｉ）について定義されたものが、好ましい例示を含めて、そのまま該当する。また式中Ｙ−はハロゲンアニオン、硝酸イオン（ＮＯ３−）、硫酸イオンまたはカルボン酸イオンを表す。
【００２８】
この一般式（ＩＩ）で表される化合物は、上記式（Ｉ）の化合物を、亜鉛イオン存在下に配置することを含む方法によって製造することができる。
亜鉛イオン存在下に配置するとは、亜鉛イオンが存在する可能性のある系に、式（Ｉ）の化合物を添加すればよく、或いは、式（Ｉ）の化合物が存在する系に、亜鉛イオンが存在する可能性のある系を付加すればよい。亜鉛イオンが存在する可能性のある系とは、実際に亜鉛イオンが存在している場合のみならず、所定の反応によって系に亜鉛イオンが発生する場合も含む。
【００２９】
亜鉛イオン存在下に配置することには、式（Ｉ）の化合物を、例えば、亜鉛イオン放出性の細胞の培養系に添加することを挙げることができ、特に、アポトーシス初期に亜鉛イオンが生成されると考えられることから、アポトーシスを起こしている細胞の存在下に添加することができる。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物を亜鉛イオン存在下に配置するために、化合物の水溶液を調整し、それを亜鉛イオンが存在する可能性のある溶液中に添加するか、あるいは、亜鉛イオンが存在する可能性のある溶液に上記で調整した化合物の水溶液を添加すれば良い。
【００３１】
従って、本発明には、アポトーシス細胞の検出方法が含まれる。このアポトーシス細胞の検出方法は、上記式（Ｉ）の化合物を対象細胞へ添加する工程と、蛍光を発光させるための励起光を細胞に照射する工程と、蛍光染色されたアポトーシス細胞を検出する工程と、が含まれる。
【００３２】
一般式（Ｉ）の化合物の対象細胞への添加は、対象細胞の培養系へ本発明の化合物の水溶液を添加すればよい。
また励起光の照射は、通常、蛍光染色に用いられている方法に従って行えばよい。一般的には、上記化合物を細胞に添加後、励起光の照射を行い、照射後に、本発明の亜鉛蛍光プローブの蛍光発色を検出することによって容易にアポトーシス細胞を検出することができる。亜鉛蛍光プローブの蛍光発色は、通常蛍光プローブを発色させる条件をそのまま適用すればよく、例えば３３０〜３８５ｎｍの励起光を亜鉛蛍光プローブに照射すればよい。例えば上記式（ＩＩ）で表される化合物では、３３０ｎｍの励起光を照射することによって、５２８ｎｍの蛍光を発色することができる（量子発光効率（Φ）＝０．０４）。
【００３３】
また蛍光染色されているアポトーシス細胞の検出は、通常、蛍光染色に用いられている条件をそのまま適用することができる。特に、本発明の亜鉛蛍光プローブは、広いｐＨ範囲において亜鉛イオンと容易に等量で反応して錯体を形成することができるため、細胞種にもよるが、検出時間を５〜３０分、好ましくは３０分とすることができる。また、検出時のｐＨとしてはいずれにおいて良好に検出することができるが、好ましくは、ｐＨ３．５以上、特に好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ９．０とすることができる。ｐＨ３．５以下では、錯体形成の効率が低下するため、好ましくない。
【００３４】
また、本発明の化合物を添加すると同時に又は連続して、死細胞を染色する他の蛍光染料を対象細胞へ添加する工程を含めても良い。これにより、より確実にアポトーシス細胞を検出することができる。このように併用して使用可能な蛍光染料としては、当業界で公知の蛍光染料が挙げられ、例えばヨウ化プロピジウムなどを挙げることができる。
【００３５】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、広いｐＨで使用可能であるため、アポトーシス細胞の検出に用いられる細胞には特に制限なく使用することができる。例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ６０細胞を挙げることができ、特に、アポトーシス初期の細胞を効果的に検出することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００３７】
［実施例１］
化合物の合成
本発明の化合物の合成方法を、代表的な化合物を例に、以下に説明する。実施例中の化合物番号は、下記のスキーム中の化合物番号に対応している。
【００３８】
【化８】
2005325074.tif 000009
【００３９】
８−ベンゼンスルホニルオキシ−２−メチルキノリン−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド［２］の合成
８−ヒドロキシ−２−メチルキノリン−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド［１］（１．７ｇ，６．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１３ｍｌに溶かし０℃まで氷冷後、トリエチルアミン（７８０ｍｇ，７．７ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）を加え、ベンゼンスルホニルクロライド（１．３ｇ，７．１ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）を１時間かけて滴下した。さらに室温で１．５時間撹拌し、水５ｍｌを加えて０．５時間撹拌後、炭酸カリウム水溶液とジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を炭酸カリウムで脱水し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘキサン＝１：４）で精製して［２］を無色透明のアモルファスとして得た。（２．５ｇ，６．１ｍｍｏｌ，９６％）
1Ｈ  ＮＭＲ      （ＣＤＣｌ3）  δ＝  ８．９３（１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ｄ），  ８．１０（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ８．０１（２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ７．７３（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ７．６２（１Ｈ，Ｊ＝７．６，１．４Ｈｚ，ｄｄ），  ７．４８  （２Ｈ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ，ｄｄ），  ７．３５（１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｄ），  ２．８１（６Ｈ，ｓ），  ２．５５（３Ｈ，ｓ）
【００４０】
８−ベンゼンスルホニルオキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド−２−ブロモメチルキノリン［３］の合成
［２］（１．５ｇ，３．７ｍｍｏｌ）を蒸留四塩化炭素１９０ｍｌに溶かした。その後Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（３８０ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ，０．６ｅｑ）と２，２'−アゾビス−２−メチルプロピオニトリル（ＡＩＢＮ）（触媒量）を少量ずつ加えながら８時間還流した。室温まで放冷した後、溶媒を減圧留去し、残渣をジクロロメタンに溶かして炭酸ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム＝１：１飽和水溶液で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出し、ジクロロメタン層を合わせて無水硫酸ナトリウムで脱水した。溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ＡｃＯＥｔ／ｎ−ヘキサン＝１：５）で精製し、無色透明のアモルファスとして［３］を得た。（２５０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ，１４％）。
1ＨＮＭＲ      （ＣＤＣｌ3）  δ＝９．０５（１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ｄ），  ８．１８（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ８．００（２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｄ），  ７．８０（１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ７．６７（１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，  ｄ），  ７．６５（１Ｈ，  Ｊ＝７．４），  ７．５２（２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ｔ），  ４．４２（２Ｈ，ｓ），  ２．８３（６Ｈ，ｓ）
【００４１】
１−（８−ベンゼンスルホニルオキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド−キノリニルメチル）−４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［５］の合成
３Ｂｏｃ−サイクレン［４］（１６０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）（Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T.; Shiro, M. .J.Am.Chem.Soc. 1997, 119, 3068-3076）と［３］（２００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をアセトニトリル５０ｍｌに溶かし、炭酸ナトリウム（６０ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ，１．７ｅｑ）の存在下、６０℃で１日撹拌した。室温まで放冷し不要物をろ去した後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルクラマトグラフィー（展開溶媒：ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2＝１：８０）で精製して、［５］を薄黄色のアモルファスとして得た。（２６０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ，９３％）
1ＨＮＭＲ  （ＣＤＣｌ3）  δ＝８．９６（１Ｈ，  Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｄ），  ８．１１（１Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ，  ｄ），  ８．００（２Ｈ，  Ｊ  ＝  ７．１，  １．２Ｈｚ，  ｄｄ），  ７．６５  （１Ｈ，  Ｊ＝４．４，  ｔ），  ７．６１  （２Ｈ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ｄ），  ７．５３（２Ｈ，  Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｔ），  ３．９６（２Ｈ，ｓ），  ２．３４−３．５６（１３Ｈ，ｂｒ），  ２．７９−２．８３（１０Ｈ，ｂｒ），  １．４２−１．５４  （３５Ｈ，  ｂｒ）．
【００４２】
１−（８−ヒドロキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド−キノリニルメチル）−４，７，１０−トリス（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン［６］の合成
［５］（１．０ｇ，１．１ｍｍｏｌ）をメタノール４０ｍｌに溶かし、２８％アンモニア水溶液３５ｍｌを加えて５日間還流した。溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2＝１：１００）で精製し、［６］を薄黄色のアモルファスとして得た。（８２０ｍｇ，１．１ｍｍｏｌ，９７％）
【００４３】
1Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤ3ＯＤ）  δ＝９．０１  （１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ｄ），  ８．１０  （１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｄ），  ７．７５  （１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｄ），  ７．２０  （１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ｄ），  ４．１２  （２Ｈ，ｓ），  ３．３１−３．６４  （１０Ｈ，ｂｒ），  ３．３０  （５Ｈ，ｓ），  ２．６８−２．７７  （１０Ｈ，  ｂｒ），  ０．９１−１．４９  （３０Ｈ，  ｂｒ）
13Ｃ−ＮＭＲ    （ＣＤ3ＯＤ）  δ＝１５９．６，  １５９．２，  １５７．９，  １５７．５，  １５７．４，  １４０．９，  １３９．２，  １３５．４，  １３４．０，  １２６．２，  １２５．８，  １２３．０，  １２０．７，  １１５．４，  １１０．２，  ９７．３，  ９５．６，  ９５．５，  ８１．３，  ８１．２，  ５９．１，  ５７．７，  ５７．５，  ５７．４，  ５６．１，  ５６．０，  ３７．８，  ２９．１，  ２８．９，  １７．８，  １７．６，  １７．５，  １７．３，  １７．２，  １７．１，  １６．９，  １１．１
【００４４】
１−（８−ヒドロキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド−キノリニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラヒドロクロリド塩［７］の合成
［６］（５００ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）をメタノール６０ｍｌに溶かし、氷冷下１Ｎ塩酸（１５ｍｌ，２２ｅｑ）を加えて一時間撹拌し、さらに６０℃で２日間撹拌した。溶媒を減圧留去し、水とエタノールから再結晶して、［７］を黄色針状晶として得た（３９０ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ，８９％）。
1ＨＮＭＲ    （Ｄ2Ｏ）  δ＝９．００（１Ｈ，Ｊ＝９．０，ｄ），  ８．１７（１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，ｄ），  ７．６６（１Ｈ，Ｊ＝９．０，ｄ），７．３４（１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，ｄ），  ４．２４（１Ｈ，ｓ），  ３．０８−３．３７（１６Ｈ，ｂｒ），  ２．８１（６Ｈ，ｓ）
13ＣＮＭＲ    （Ｄ2Ｏ）  δ＝１６１．２，  １５９．８，  １４１．０，  １３７．８，  １３５．７，  １２８．３，  １２６．３，  １２３．７，  １１３．７，  ９８．７，  ６０．４，  ５２．３，  ４７．３，  ４５．３，  ４４．９，  ３９．６
元素分析  理論値    Ｃ  ：  ３７．９５  ％，  Ｈ  ：  ６．７４  ％，  Ｎ  ：  １３．０２  ％，  Ｓ  ：  ４．９７
測定値    Ｃ  ：  ３７．５０  ％，  Ｈ  ：  ７．２３  ％，  Ｎ  ：  １３．２１  ％，  Ｓ  ：  ５．３９
【００４５】
１−（８−ヒドロキシ−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）スルホンアミド−キノリニルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＺｎ（ＮＯ3）錯体の合成［８］の合成
［７］（４０ｍｇ，０．０６２ｍｍｏｌ）を水１０ｍｌに溶かし、水３ｍｌに溶かした過塩素酸亜鉛六水和物（２７ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に合わせ、不要物をろ去した後、室温で減圧濃縮して、［８］を黄色直方体結晶として得た。（１５  ｍｇ，  ０．０２５  ｍｍｏｌ，  ４０  ％）
1ＨＮＭＲ    （Ｄ2Ｏ）  δ＝  ９．００  （１Ｈ，  Ｊ＝９．２，  ｄ），  ８．０９  （１Ｈ，  Ｊ＝８．８Ｈｚ，  ｄ），  ７．６５  （１Ｈ，  Ｊ＝８．８，  ｄ），  ６．９６  （１Ｈ，  Ｊ＝８．８Ｈｚ，  ｄ），  ４．３２  （１Ｈ，  ｓ），  ３．２５−２．７８  （１６Ｈ，  ｍ），  ２．７３  （６Ｈ，  ｓ）
元素分析  理論値    Ｃ  ：  ４０．０１  ％，  Ｈ  ：  ５．２０  ％，  Ｎ  ：  １４．００  ％，  Ｓ  ：  ５．３４  ％
測定値    Ｃ  ：  ３９．９２  ％，  Ｈ  ：  ５．１９  ％，  Ｎ  ：  １３．８９  ％，  Ｓ  ：  ５．４８  ％
【００４６】
実施例１で合成されたキノリノールサイクレン［７］と亜鉛イオンの１対１錯体のＸ線結晶構造解析を行った。その結果を図１に示す。これにより、キノリノール部の水酸基が脱プロトン化され、亜鉛イオンに配位していることが証明された。
【００４７】
［実施例２］
化合物の蛍光特性
実施例１で合成されたキノリノールサイクレン［７］の蛍光特性について調べた。
５μＭのキノリノールサイクレン［７］を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ水溶液（ｐＨ７．４，Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））に溶解し、３３８ｎＭを励起波長として各波長における蛍光スペクトルを、蛍光光度分光計（日本分光社製）で測定した。結果を図２および図３に示す。
【００４８】
図２に示されるように、錯体形成前のキノリノールサイクレンの蛍光スペクトルは、４００ｎｍ〜７００ｎｍにわたってほとんどピークが認められなかった（Φ＝０．００２）。これに対して亜鉛イオンと錯体を形成すると、５１２ｎｍに最大強度を有する蛍光スペクトルを示した（Φ＝００４４）。また、図３に示されるように、励起波長３３８ｎｍとし蛍光波長５１２ｎｍとしたとき、蛍光発色の強度は、亜鉛イオンの濃度に依存して強くなり、等量で最大となることが示された。このとき錯体形成前と比較して１７倍にまで蛍光強度が増大した。
【００４９】
従って、本実施例のキノリノールサイクレンは、亜鉛イオンと１：１で錯体を形成することができ、蛍光波長５１２ｎｍ（励起波長３３８ｎｍ）で１７倍まで蛍光強度が増大することが明らかとなった。また５１２ｎｍでの蛍光強度は亜鉛イオンの量に依存して変化するので、亜鉛イオンの濃度を定量的に測定することができる。
【００５０】
［実施例３］
亜鉛選択性
（１）各種金属イオンに対する選択性
次に本実施例の化合物の亜鉛選択性を評価した。
種々の金属イオン（５μＭ又は５ｍＭ）を含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、Ｉ＝０．１（ＮａＮＯ3））に５μＭの実施例１のキノリノールサイクレンを添加して、励起波長３３８ｎｍ、蛍光波長５１２ｎｍとして蛍光強度を前記同様にして測定した。結果を図４に示す。
【００５１】
図４に示されるように、亜鉛イオン存在下では１７倍まで蛍光強度が増加するのに対して、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの生体に多く存在するイオンや、アルミニウムイオンや銀イオンなどの各種金属イオンに対して蛍光強度が上がらないことが示された。
【００５２】
（２）ダンシルサイクレンとの比較
また亜鉛イオン及び銅イオンに関して、既存の亜鉛蛍光プローブであって広く使用されているダンシルサイクレン（ダンシルアミドエチルサイクレン；同仁化学社製）と、本実施例１のキノリノールサイクレンと比較した。ダンシルサイクレンの亜鉛錯体の蛍光特性は、励起波長３２３ｎｍ及び蛍光波長５２８ｎｍであり、亜鉛イオンに対する解離定数はｐＨ７．４で８ｐＭ（ｌｏｇＫapp＝１１．１）であることがわかっている。
【００５３】
【化９】
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【００５４】
５μＭのキノリノールサイクレンを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に、亜鉛イオン又は銅イオンを１μＭずつ添加して、前記と同様にして蛍光スペクトルを測定した。結果を図５に示す。
【００５５】
図５（Ａ）に示されるように、本実施例のキノリノールサイクレンでは、５１２ｎｍでの蛍光強度は、銅イオンに対して殆ど増強されないが、亜鉛イオンに対しては錯体を形成して１７倍まで蛍光強度が増強された。これに対してダンシルサイクレンでは、図５（Ｂ）に示されるように、５２８ｎｍの蛍光波長において亜鉛イオンに対する選択性はあるものの５倍までの増強効果しか示さなかった。
従って、本実施例のキノリノールサイクレンは、亜鉛イオンに対する選択性が高いだけでなく、従来の亜鉛蛍光プローブよりも３倍以上強い蛍光強度を示すことができ、精度よく亜鉛イオンを検出するために有効な亜鉛蛍光プローブであることが明らかになった。
【００５６】
［実施例４］
ｐＨ依存の錯体形成
通常の細胞では７付近のｐＨを有しているが、細胞種によっては酸性域又はアルカリ性域のｐＨを有するものもある。このため、錯体を形成したときの蛍光プローブとしての安定性を各種のｐＨ範囲で調べた。
【００５７】
実施例３で用いられたダンシルサイクレン又は本実施例のキノリノールサイクレンを、それぞれ５μＭで、ｐＨ３からｐＨ１２のｐＨ緩衝液中に溶かし、その蛍光スペクトルを２５℃で測定した。
結果を図６に示す。なお、本実施例のキノリノールサイクレンを図６（Ａ）に、及びダンシルサイクレンを図６（Ｂ）に示し、それぞれにおいて、錯体を形成した亜鉛蛍光プローブを実線で示し、錯体形成前のものを破線で示す。
【００５８】
図６（Ａ）に示されるように、本実施例のキノリノールサイクレンでは、ｐＨ３では、錯体を２５％程度しか形成しないが、ｐＨが上昇すると急激に錯体を形成するようになり、ｐＨ４ではほぼ１００％が錯体を形成して亜鉛蛍光プローブとなることがわかった。本実施例のキノリノールサイクレンの亜鉛イオンに対する解離定数（Ｋd）は、ｐＨ７．４で１ｆＭ以下（ｐＨ６．２ではＫd＝８ｆＭ）であり（ｌｏｇＫapp＞１５）、錯体形成速度（ｔ1/2）は３０ｍｓｅｃであった。このため、ｐＨ４以上であれば、本実施例のキノリノールサイクレンと亜鉛イオンとが１：１で確実に且つ迅速に錯体を形成するので、亜鉛イオンを定量的に測定することができる。
【００５９】
これに対して図６（Ｂ）に示されるように、ダンシルサイクレンでは、ｐＨ５から亜鉛イオンと錯体を形成し始めて、ｐＨ７．４でほぼ１００％錯体を形成した。このため、約ｐＨ７以下では、亜鉛イオンが存在しても錯体を形成しない場合があり、定量的に亜鉛イオンを測定することが困難である。
また血液細胞などのｐＨであるｐＨ７．４でのそれぞれのＫdを比較すると、本実施例のキノリノールサイクレンが１ｆＭ以下に対して、ダンシルサイクレンが８ｆＭであり、本実施例のキノリノールサイクレンの方が迅速に亜鉛を錯体を形成できることが明らかとなった。
さらに、図６（Ａ）と図６（Ｂ）中、灰色で示した領域が、それぞれ本実施例のキノリノールサイクレンとダンシルサイクレンとの亜鉛イオンの定量可能領域である。本実施例のキノリノールサイクレンの方が、亜鉛イオン定量可能なｐＨ領域が広いことがわかる。
【００６０】
従って、本実施例のキノリノールサイクレンは酸性域のｐＨであっても亜鉛イオンと錯体を形成することができるため、広い範囲のｐＨで定量的な亜鉛イオンの検出に用いることができる。
【００６１】
［実施例５］
アポトーシス細胞の検出
１０％ウシ胎児血清を補填したＨＢＳＳ培地中でＨｅＬａＳ３細胞（Cell Resource Center for Biomedical Research、東北大学）を１日間培養した後に、ＴＮＦα（１ｍｇ／ｍｌ）及びアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ、０．３μｇ／ｍｌ）を含むＨＢＳＳ培地に交換し、６時間インキュベートして、アポトーシスを誘導した。
【００６２】
インキュベート後の細胞に、実施例１のキノリノールサイクレン及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Aldrich社製）をそれぞれ１００μＭ、３０μＭの濃度で添加して、１０分間インキュベートした後、蛍光顕微鏡（カール・ツァイス株式会社製）下で観察した。３００〜３５０ｎｍの励起光を照射してキノリノールサイクレンを励起し、一方、４６０〜４９０ｎｍの励起光を照射してＰＩを励起した。結果を図７に示す。
【００６３】
図７（Ａ）〜（Ｄ）は同じ視野を二重染色した染色像を示している。ＨｅＬａＳ３細胞は、ＴＮＦα及びＡｃｔＤによってアポトーシスが誘導されており、視野には完全に死滅した細胞、アポトーシス後期の細胞及びアポトーシス初期の細胞と、生細胞とがある（Ａ）。このうち、実施例のキノリノールサイクレンはアポトーシス初期の細胞を染色し、死細胞を染色しなかった（Ｂ）。一方、ＰＩは死細胞とアポトーシス後期の細胞を共に染色する（Ｃ）が、アポトーシス初期の細胞を染色しなかった。従って、実施例のキノリノールサイクレンとＰＩとで二重染色することによって、アポトーシス初期の細胞を容易に検出することができた（Ｄ）。
【００６４】
このように、本発明の化合物を用いることによって、広いｐＨで選択性よく亜鉛イオンを検出することができる亜鉛蛍光プローブを得ることができ、この亜鉛蛍光プローブを用いることによって定量的に亜鉛イオンを検出し、また効率よくアポトーシス初期の細胞を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本実施例にかかる化合物（キノリノールサイクレン）が亜鉛イオンと１対１錯体化合物を生成していることを示した図（結晶構造）である。
【図２】本実施例にかかる化合物（キノリノールサイクレン）の蛍光特性を示すグラフである。
【図３】本実施例にかかるキノリノールサイクレンが亜鉛イオンと１対１錯体を生成することに伴う蛍光の変化を示したグラフである。
【図４】本実施例にかかるキノリノールサイクレンの各種金属イオンに対する選択性を説明するグラフである。
【図５】（Ａ）は本実施例にかかるキノリノールサイクレン（５μＭ）の亜鉛イオン又は銅イオンに対する反応性を示したグラフであり、（Ｂ）はダンシルサイクレンの亜鉛イオン又は銅イオンに対する反応性を示したグラフである。
【図６】（Ａ）は本実施例にかかるキノリノールサイクレン（５μＭ）について、亜鉛イオン存在下及び非存在下においてｐＨを変化させたときの蛍光強度の変化を示すグラフであり、（Ｂ）はダンシルサイクレン（５μＭ）について、亜鉛イオン存在下及び非存在下において、ｐＨを変化させたときの蛍光強度の変化を示したグラフである。
【図７】（Ａ）はアポトーシスを誘導させたＨｅＬａＳ３細胞の顕微鏡像（×４００）を示し、（Ｂ）は（Ａ）の本実施例にかかるキノリノールサイクレンによる染色像、（Ｃ）は（Ａ）のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色像、（Ｄ）は本実施例にかかるキノリノールサイクレン及びＰＩによる二重染色像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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