(57)【要約】【課題】アポトーシスのシグナル伝達系の調節剤を提供すること。【解決手段】式：Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４（Ｉ）［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド、又は当該ペプチドのマルチマー、あるいはそれらの塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド又はその塩。
【請求項２】
前記ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＷＥＤＴ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのアミノ酸置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護された変異ペプチドである、請求項１記載のペプチド又はその塩。
【請求項３】
変異ペプチドが、Ｐ１〜Ｐ４から選ばれるいずれか一箇所のアミノ酸の置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたものである、請求項２記載のペプチド又はその塩。
【請求項４】
変異ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＳＥＤＴ（配列番号２）、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、又はＷＥＤＣ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項３記載のペプチド又はその塩。
【請求項５】
式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド又はその塩を含有するアポトーシス調節剤。
【請求項６】
前記ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＷＥＤＴ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのアミノ酸置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護された変異ペプチドである、請求項５記載のアポトーシス調節剤。
【請求項７】
変異ペプチドが、Ｐ１〜Ｐ４から選ばれるいずれか一箇所のアミノ酸の置換により得られるものである、請求項６記載のアポトーシス調節剤。
【請求項８】
変異ペプチドが、Ｎ末端及びＣ末端が未保護である又は保護されたＳＥＤＴ（配列番号２）、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、又はＷＥＤＣ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項７記載のアポトーシス調節剤。
【請求項９】
研究用試薬である、請求項８記載のアポトーシス調節剤。
【請求項１０】
医薬である、請求項８記載のアポトーシス調節剤。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチドのマルチマー又はその塩。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチドのマルチマー又はその塩を含有する、アポトーシス調節剤。
【請求項１３】
研究用試薬である、請求項１２記載のアポトーシス調節剤。
【請求項１４】
医薬である、請求項１２記載のアポトーシス調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介してアポトーシスを調節し得る新規ペプチド、当該ペプチドのマルチマー、及び当該ペプチド及び／又はマルチマーを含有するアポトーシス調節剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）／Ｆａｓ系は、最も盛んに解析が行われているアポトーシス誘導経路である。両者はともに膜貫通タンパク質であり、Ｆａｓリガンドを細胞膜上に発現する細胞とＦａｓを発現する細胞とが結合すると、後者にアポトーシスが誘導される。また、抗Ｆａｓ抗体も同様にＦａｓ発現細胞にアポトーシスを誘導することができる。
【０００３】
ＦａｓＬ／Ｆａｓ系の異常が種々の疾患に密接に関与していることが明らかになってきている。例えば、ＦａｓまたはＦａｓリガンドの機能を欠損したマウスでは、異常Ｔ細胞の増殖蓄積が見られ、自己抗体の産生が高まり、糸球体腎炎やリウマチ様関節炎などの全身性自己免疫疾患を発症して死に至ることが知られている [非特許文献１−２]。
【０００４】
また、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）がウイルス感染細胞や癌細胞などの標的細胞を攻撃する際、ＣＴＬはＦａｓリガンドを発現するとともに、ＴＮＦなどを分泌して標的細胞にＦａｓを発現させることにより、標的細胞にアポトーシスを誘導していると考えられている [非特許文献３] 。ＨＢＶやＨＣＶによる肝炎においては、感染細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に提示されたウイルス抗原を認識して活性化したＣＴＬがＦａｓリガンドを発現するが、この際、ウイルス感染細胞だけでなく正常な肝細胞に発現しているＦａｓにも作用してアポトーシスを誘導することにより、劇症肝炎を発症するとのメカニズムが提唱されている [非特許文献３−４]。
【０００５】
さらに、ＡＩＤＳにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の減少にもＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介したアポトーシスの関与が示唆されている。ＨＩＶに感染したＣＤ４陽性Ｔ細胞はＦａｓＬを発現するとともに、ＴＮＦなどのシグナル因子を介して近傍の正常なＴ細胞に強制的にＦａｓを発現させて、これらの細胞にアポトーシスを誘導すると考えられている [非特許文献５−６]。
【０００６】
このようなＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介したアポトーシス誘導と密接に関連する疾患の治療におけるアプローチの１つとして、この系を人為的に制御することができる物質の探索が盛んに行われている。現在のところ、その主たるターゲットは抗Ｆａｓ抗体であり、これまでに種々の抗ヒトＦａｓモノクローナル抗体が開発されているが、いずれも、毒性が高い、コントロールが困難である等の理由で、未だ臨床に応用できるようなものは得られていないのが現状である。また、抗Ｆａｓ抗体がすべてのＦａｓ発現細胞に対してアポトーシスを誘導するわけではない。例えば、種々のヒト卵巣癌細胞株におけるＦａｓ発現細胞の頻度は６０〜７８％程度であるが、同程度にＦａｓを発現する癌細胞株でも、その種類によって抗Ｆａｓ抗体により誘導されるアポトーシスに対する感受性が異なる場合がある [非特許文献７]。したがって、抗Ｆａｓ抗体に対して非感受性のＦａｓ発現細胞にアポトーシスを誘導し得る新規物質の開発が必要とされている。
【０００７】
さらに、抗Ｆａｓ抗体は、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介したアポトーシスを研究するための重要なツールとして広く使用されているが、抗Ｆａｓ抗体は高価なため、これらの機能を代替するより安価な研究用試薬が要望されている。
【０００８】
また、本発明者らは、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介したアポトーシスを調節できる数種のオリゴペプチドを以前に開発しているが［特許文献１］、当該オリゴペプチドは、設計理論が不十分、Ｆａｓに対する親和性又は活性が低い等の観点より必ずしも満足のいくものではなく、これらが改善された化合物が所望されていた。
【特許文献１】特開2001-187799号公報
【非特許文献１】Cell, 76: 969-976 (1994)
【非特許文献２】Nature, 356: 314-317 (1992)
【非特許文献３】Cell, 88: 355-365 (1997)
【非特許文献４】Nature Med., 3: 409-413 (1997)
【非特許文献５】Curr. Opin. Immunol., 6: 605-615 (1994)
【非特許文献６】Science,260: 1269-1270 (1993)
【非特許文献７】Cancer Lett., 140: 113-119 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、上記の問題点が改善された、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介してアポトーシスを調節し得る化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、RBD法（Gallet X. et al, J. Mol. Biol., 302, 917-926 (2000) 参照）、AutoDock 3.0（Morris, G. M. et al., J. Comp. Chem.,19, 1639-1662, (1998)参照）を用いてFas LigandとFas (receptor) の相互作用について鋭意研究する中で、Fas Ligand上の領域162〜165のアミノ酸配列WEDT（配列番号１）からなるペプチドが、Ｆａｓに最も強く結合することを見出した。また、本発明者らは、このペプチドWEDT（配列番号１）をリードペプチドとして、AutoDock 3.0（Morris, G. M. et al., J. Comp. Chem.,19, 1639-1662, (1998)参照）を用いて該ペプチドの変異による結合能の変化を計算したところ、式：Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４（Ｉ）において、Ｐ１が塩基性側鎖を有するアミノ酸、Ｐ２が塩基性側鎖を有するアミノ酸、Ｐ３が塩基性側鎖を有するアミノ酸であるペプチドは、Fas (Receptor) に結合し難い傾向があることを見出した。
【００１１】
以上より、本発明者らは、上記式（Ｉ）において、Ｐ１については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｐ２については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｐ３については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を有するペプチドが、ＦａｓＬ／Ｆａｓ系を介してアポトーシスを調節し得る可能性があることなどを着想し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の通りである：
（１）式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド又はその塩。
（２）前記ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＷＥＤＴ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのアミノ酸置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護された変異ペプチドである、上記（１）のペプチド又はその塩。
（３）変異ペプチドが、Ｐ１〜Ｐ４から選ばれるいずれか一箇所のアミノ酸の置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたものである、上記（２）のペプチド又はその塩。
（４）変異ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＳＥＤＴ（配列番号２）、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、又はＷＥＤＣ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記（３）のペプチド又はその塩。
（５）式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド又はその塩を含有するアポトーシス調節剤。
（６）前記ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＷＥＤＴ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はそのアミノ酸置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護された変異ペプチドである、上記（５）のアポトーシス調節剤。
（７）変異ペプチドが、Ｐ１〜Ｐ４から選ばれるいずれか一箇所のアミノ酸の置換により得られるＮ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたものである、上記（６）のアポトーシス調節剤。
（８）変異ペプチドが、Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＳＥＤＴ（配列番号２）、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、又はＷＥＤＣ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記（７）のアポトーシス調節剤。
（９）研究用試薬である、上記（８）のアポトーシス調節剤。
（１０）医薬である、上記（８）のアポトーシス調節剤。
（１１）式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチドのマルチマー又はその塩。
（１２）式（Ｉ）：
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４  （Ｉ）
［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチドのマルチマー又はその塩を含有する、アポトーシス調節剤。
（１３）研究用試薬である、上記（１２）のアポトーシス調節剤。
（１４）医薬である、上記（１２）のアポトーシス調節剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のペプチド又はマルチマー、あるいはそれらの塩は、Ｆａｓへの結合を通じてアポトーシスのシグナル伝達系を調節し得ることから、アポトーシスに関連する研究の試薬として有用である。また、本発明のペプチド又はマルチマー、あるいはそれらの塩は、アポトーシスの誘導が所望される疾患に対する医薬として有用である。さらに、本発明のペプチドは、Ｆａｓに対して優れた結合活性を有するため、上記用途に非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、式：Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４（Ｉ)［式中、Ｐ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護された非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ２は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ３は非塩基性側鎖を有するアミノ酸を、Ｐ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護された任意のアミノ酸を示す。］で表されるペプチド又はその塩を提供する。Ｐ１が塩基性側鎖を有するアミノ酸、Ｐ２が塩基性側鎖を有するアミノ酸、又はＰ３が塩基性側鎖を有するアミノ酸であるペプチドは、AutoDock 3.0 (Morris, G. M. et al., J. Comp. Chem.,19, 1639-1662, (1998)参照) を用いた自由エネルギーの計算結果より、Fas (Receptor) に結合し難い傾向が見出されている（表１参照）。従って、Ｐ１については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｐ２については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｐ３については塩基性側鎖を有するアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｐ４については任意のアミノ酸からなるペプチドは、Ｆａｓに結合する可能性があると考えられる。
【００１５】
一般式（Ｉ）中、Ｐ１で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ１における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはグルタミン酸が好ましい。一方、Ｐ１における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸、非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ１における極性側鎖を有するアミノ酸としては、セリンが好ましい。また、Ｐ１における非極性側鎖を有するアミノ酸としてはトリプトファンが好ましい。最も好ましくは、Ｐ１で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はトリプトファンである。
【００１６】
一般式（Ｉ）中、Ｐ２で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ２における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはグルタミン酸が好ましい。一方、Ｐ２における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでもグリシンがより好ましい。最も好ましくは、Ｐ２で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｐ３で示される「非塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、酸性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。Ｐ３における酸性側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸が好ましい。一方、Ｐ３における中性側鎖を有するアミノ酸としては、非極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでもトリプトファンがより好ましい。最も好ましくは、Ｐ３で示される非塩基性側鎖を有するアミノ酸はアスパラギン酸又はトリプトファンである。
【００１８】
一般式（Ｉ）中、Ｐ４で示される「任意のアミノ酸」としては、塩基性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸が挙げられるが、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸、中性側鎖を有するアミノ酸であり得る。Ｐ４における塩基性側鎖を有するアミノ酸としてはヒスチジンが好ましい。一方、Ｐ４における中性側鎖を有するアミノ酸としては、極性側鎖を有するアミノ酸が好ましく、なかでも、グルタミン、アスパラギン、スレオニンが好ましい。最も好ましくは、Ｐ４で示される任意のアミノ酸はアスパラギン又はスレオニンである。
【００１９】
別の局面では、本発明のペプチドは、上記式（Ｉ)においてＰ１がＷを、Ｐ２がＥを、Ｐ３がＤをＰ４がＴを示すＷＥＤＴ（配列番号１）、又はそのアミノ酸置換により得られる変異体であり得る。アミノ酸置換を施したペプチドは、上記４つのアミノ酸からなるペプチドにおいて１〜４個のアミノ酸を置換したペプチドであり得るが、３個以下のアミノ酸を置換したペプチドが好ましく、２個以下のアミノ酸を置換したペプチドがより好ましい。最も好ましくは、１個のアミノ酸を置換したペプチドである。
【００２０】
本発明におけるアミノ酸の置換としては、特定のアミノ酸が他の任意のアミノ酸で置換される限り特に限定されず、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換が挙げられる。
【００２１】
「保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。一方、「非保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と異なる性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、非保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と異なるグループに属する他のアミノ酸により置換される。
【００２２】
同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性（即ち、正に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性（即ち、負に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性（即ち、荷電していない）側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、及び非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。
【００２３】
また、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸の他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）なども挙げることができる。
【００２４】
ＷＥＤＴの１箇所のアミノ酸を置換したペプチドは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４の各該当部位のアミノ酸の置換により分類することができる。
【００２５】
ＷＥＤＴのＰ１部位（即ち、Ｗ）を置換したペプチドとしては、ＳＥＤＴ（配列番号２）、ＥＥＤＴ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＳＥＤＴ（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。
【００２６】
ＷＥＤＴのＰ２部位（即ち、Ｅ）を置換したペプチドとしては、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）、ＷＮＤＴ（配列番号７）、ＷＣＤＴ（配列番号８）、ＷＬＤＴ（配列番号９）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＧＤＴ（配列番号４）、ＷＰＤＴ（配列番号５）、ＷＴＤＴ（配列番号６）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＧＤＴ（配列番号４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【００２７】
ＷＥＤＴのＰ３部位（即ち、Ｄ）を置換したペプチドとしては、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）、ＷＥＩＴ（配列番号１３）、ＷＥＦＴ（配列番号１４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＥＷＴ（配列番号１０）、ＷＥＧＴ（配列番号１１）、ＷＥＴＴ（配列番号１２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＥＷＴ（配列番号１０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【００２８】
ＷＥＤＴのＰ４部位（即ち、Ｔ）を置換したペプチドとしては、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、ＷＥＤＣ（配列番号２０）、ＷＥＤＲ（配列番号２１）、ＷＥＤＷ（配列番号２２）、ＷＥＤＶ（配列番号２３）、ＷＥＤＥ（配列番号２４）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられるが、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）、ＷＥＤＦ（配列番号１８）、ＷＥＤＭ（配列番号１９）、ＷＥＤＣ（配列番号２０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、ＷＥＤＮ（配列番号１５）、ＷＥＤＱ（配列番号１６）、ＷＥＤＨ（配列番号１７）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましく、ＷＥＤＮ（配列番号１５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが最も好ましい。
【００２９】
「Ｎ末端が未保護である」アミノ酸とは、Ｎ末端が−ＮＨ２、又はＮＨ３＋であるアミノ酸をいう。
【００３０】
「Ｎ末端が保護された」アミノ酸とは、Ｎ末端が−ＮＨ２、又はＮＨ３＋以外であるアミノ酸をいい、例えば、−ＮＨＲ１、−ＮＨ２Ｒ１＋、−ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＲ１Ｒ２＋であるアミノ酸であり得る。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。具体的には、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ同一又は異なって、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、オキサリル基、スクシニル基、ピバロイル基、２−クロロアセチル基、２−ブロモアセチル基、２−ヨードアセチル基、２，２−ジクロロアセチル基、２，２，２−トリクロロアセチル基、２，２，２−トリフルオロアセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、ナフチルカルボニル基、アダマンチルカルボニル基、フタロイル基、ピロリドンカルボニル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、２−クロロエトキシカルボニル基、２−ヨードエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、ビス−（４−メトキシフェニル）メトキシカルボニル基、フェナシルオキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基、２−トリフェニルシリルエトキシカルボニル基、フルオレニル−９−メトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ビニルオキシカルボニル基、２−プロペニルオキシカルボニル基、２−クロロ−２−プロペニルオキシカルボニル基、３−メトキシカルボニル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−メチル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−ブテニルオキシカルボニル基、シンナミルオキシカルボニル基等のアルケニルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等の低級アルキルシリル基；エチレンビス（ジメチルシリル）基、プロピレンビス（ジメチルシリル）基、エチレンビス（ジエチルシリル）基等のアルキレンビス（ジアルキルシリル）基；メチルチオカルボニル基、エチルチオカルボニル基、ブチルチオカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルチオカルボニル基等のアルキルチオカルボニル基；ベンジルチオカルボニル基等のアラルキルチオカルボニル基；ジシクロヘキシルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基、ジベンジルホスホリル基、ジ−（４−ニトロベンジル）ホスホリル基、フェノキシフェニルホスホリル基等のホスホリル基；ジエチルホスフィニル基、ジフェニルホスフィニル基等のホスフィニル基；カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ベンジルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基、ピリジルカルバモイル基等のカルバモイル基であり得る。また、Ｒ１、Ｒ２としては、後述のＲ３、Ｒ４と同様のものを用いることもできる。
【００３１】
「Ｃ末端が未保護である」アミノ酸とは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当するアミノ酸をいう。
【００３２】
「Ｃ末端が保護された」アミノ酸とは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当しないアミノ酸をいい、例えば、アミド（−ＣＯＮＨＲ３、−ＣＯＮＲ３Ｒ４）、カルボキシ（−ＣＯＲ３）、エステル（−ＣＯＯＲ３）であり得る。Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。具体的には、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ同一又は異なって、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基及び当該Ｃ1-6アルキル基のハロゲン化物（例えば、−ＣＨ２Ｆなど）；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基及び当該Ｃ3-8シクロアルキル基のハロゲン化物；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基及び当該Ｃ6-12アリール基のハロゲン化物；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基及び当該Ｃ7-14アラルキル基のハロゲン化物；並びに経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。また、Ｒ３、Ｒ４としては、前述のＲ１、Ｒ２と同様のものを用いることもできる。
【００３３】
本発明のペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３４】
本発明のペプチド又はその塩がＦａｓ結合活性を有するか否かはバインディングアッセイ等の自体公知の方法により確認することができる。また、本発明のペプチド又はその塩がアポトーシス調節活性を有するか否かは、細胞の形態学的変化の観察、フローサイトメトリーによるＤＮＡ断片化の検出、ゲル電気泳動法による染色体ＤＮＡの断片化の検出により確認することができる。
【００３５】
本発明のペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、必要に応じて保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法、並びに保護基の導入方法及び脱離方法としては、例えば、M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966); Schroeder et al., The Peptide, Academic Press, New York (1965) に記載された方法が挙げられる。
【００３６】
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３７】
具体的には、本発明のペプチドは、下記の固相法によって合成が可能である。なお、本発明のペプチドの製造方法は、これらに限定されるものではない。
Ｌｉｂｒａ  ＴｕｂｅTM（島津総合科学研究所）を反応容器に用いた固相法による操作を行う。分取ＨＰＬＣによるペプチドの精製はギルソンＨＰＬＣシステム（ギルソン社）により行う。なお、ギルソンＨＰＬＣシステムは、ギルソン３０５ポンプ、ギルソン３０６ポンプ、ギルソン８１１Ｃダイナミックミキサー、ギルソン２１５リキッドハンドラー、ヒューレットパッカードＨＰ１１００フォトダイオードアレイ検出器により構成されたものである。システムの制御は、ＵｎｉＰｏｉｎｔTMシステムソフトウェア（バージョン2.10）を用いて行い、分取用ＨＰＬＣカラムは、ＹＭＣ  Ｃｏｍｂｉ  Ｐｒｅｐ  ＯＤＳ−Ａ（ワイエムシイ社、カラムサイズ：２０ｍｍ（i.d.）×５０ｍｍ、粒子径：５μｍ）を使用する。ペプチドの分析は、アジレント１１００シリーズＨＰＬＣシステム（アジレントテクノロジー社）とサーモクエストフィニガンＡＱＡ質量分析計より構成されるＬＣ−ＭＳシステムにより行う。ＨＰＬＣシステムの制御とデータ解析はケミステーションソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて行い、分析用ＨＰＬＣカラムは、Ｂｅｔａ−Ｂａｓｉｃ−１８（キイストーンサイエンティフィック社、カラムサイズ：２ｍｍ（i.d.）×５０ｍｍ、粒子径：５μｍ、ポアサイズ：１５０Ａ）を使用する。質量分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法により行い、質量電荷比（m/z）５００−１６３６の測定範囲で１価の正イオン(M+H)+又は２価の正イオン(M+2H)2+を検出する。質量分析計の制御とデータ解析はＸ−キャリバーソフトウェアを用いて行い、ペプチドの同定はモノアイソトピック質量のm/z実測値とモノアイソトピック質量で計算する(M+H)+又は(M+2H)2+の理論値と比較することにより行う。
【００３８】
Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  レジン（ノババイオケム社、１００−２００ｍｅｓｈ、ロード量０．４５ｍｍｏｌ／ｇ  ｒｅｓｉｎ）（１００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を出発原料とし、以下の操作にしたがって合成することができる。Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の縮合は、レジンとＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍｌ）中混合し、反応混合物を室温で２−１６時間振とうすることにより行う。縮合反応後ＤＭＦで洗浄したレジンに無水酢酸（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍｌ）溶液を加え、室温で１０−２０分間放置することにより、縮合不完全で残存するレジン上のアミノ基をアセチル化する。Ｆｍｏｃ基の除去は、レジンを２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）に膨潤し、室温で１５−３０分間放置することにより行う。各工程間のレジンの洗浄はすべてＤＭＦで行う。Ｇｌｕ（ＯＡｌ）のＡｌ基およびＬｙｓ（Ａｌｏｃ）のＡｌｏｃ基の除去は、レジンをクロロホルム／酢酸／ＮＭＭ（９５／５／２．５  ｖ／ｖ／ｖ）（４ｍｌ）に膨潤し、アルゴンガスを１５分間吹き込んだ後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間振とうすることにより行う。Ｇｌｕ側鎖カルボン酸とＬｙｓ側鎖アミノ基の縮合によるラクタム環形成反応は、レジンとＰｙＢｏｐ（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（９当量、０．４０５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（３ｍｌ）中混合し、反応混合物を室温で１６時間振とうすることにより行う。ペプチドのレジンからの切り出しと脱保護は、ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ（９５／５／２．５  ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍｌ）で室温３時間処理することにより行う。レジンを除いたろ液にエーテル／ヘキサン（１／１  ｖ／ｖ）（１４ｍｌ）を加えてペプチドを沈殿させ、遠心分離、デカント後、さらに沈殿をエーテル／ヘキサン（１／１  ｖ／ｖ）で２回洗浄する。沈殿をアセトニトリル／水（１／１  ｖ／ｖ）に溶解し、ワコーゲル５０Ｃ１８（和光純薬、粒子径３８−６３μｍ）を充填したカラム（充填容積：１０ｍｍ（i.d.）×１０ｍｍ）を通してろ過し、ろ液を凍結乾燥することにより粗ペプチド（２０−５０ｍｇ）を得る。粗ペプチドを３０ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリル／水（１／１  ｖ／ｖ）に溶解し、分取用ＨＰＬＣカラムに注入する。溶出は下記条件で行い、目的のペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥する。
分取ＨＰＬＣ溶出条件
・流速：１５ｍｌ／ｍｉｎ
・移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ
・移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ、９０％  ＣＨ3ＣＮ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ
・グラジエント：０−  ３ｍｉｎ  移動相Ｂ  ０％
３−１１ｍｉｎ  移動相Ｂ  ０％→７５％
【００３９】
合成したペプチドの分析はＬＣ−ＭＳシステムにより行う。純度は分析用ＨＰＬＣ（流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎＣＨ3ＣＮ、グラジエント：移動相Ｂ  ５％→９５％  ｉｎ  ９ｍｉｎ）で９０％以上であることを確認する。ペプチドの同定は主ピークのモノアイソトピック質量のm/z実測値とモノアイソトピック質量で計算する(M+H)+又は(M+2H)2+の理論値と比較することにより行う。
【００４０】
また、本発明は、上述した本発明のペプチドが複数集合してなるマルチマーを提供する。本発明のマルチマーは、土台となる物質に共有結合又は非共有結合（例えば、吸着）しているものであり得る。土台となる物質としては、リジンポリマー、例えば、ＭＡＰ（Multiple antigenic peptide）−４、ＭＡＰ−８、ＭＡＰ−１６（なお、ＭＡＰ−ＸのＸは付加が可能な最大のペプチド数を示す）などが挙げられる。例えば、ＭＡＰ−８の場合、リジン７個の骨格に本発明のペプチドを最大８個まで導入することができる。また、土台となる物質としては、金コロイド、リポソーム等を用いることができる。これら土台となる物質は、自体公知の方法により本発明のペプチドと結合させることができる。
【００４１】
本発明のマルチマー又はその塩がＦａｓ結合活性を有するか否かはバインディングアッセイ等の自体公知の方法により確認することができる。また、本発明のマルチマー又はその塩がアポトーシス誘導活性を有するか否かは、細胞の形態学的変化の観察、フローサイトメトリーによるＤＮＡ断片化の検出、ゲル電気泳動法による染色体ＤＮＡの断片化の検出により確認することができる。
【００４２】
本発明のマルチマーは、アポトーシスのシグナル伝達系の研究用試薬、アポトーシスの調節が所望される疾患に対する医薬などとして有用である。
【００４３】
本発明はまた、本発明のペプチド若しくはそのマルチマーを含有する組成物を提供する。例えば、当該組成物は、研究試薬用組成物、又は医薬組成物であり得る。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチド若しくはそのマルチマーと、薬学的に許容され得る担体とを含有する。薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができるが、好ましくは非経口投与される。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤、外用液剤、坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００４５】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（ペプチド、マルチマーなど）の種類などにより異なるが、例えば、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg （あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００４６】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に0.1μg／ml担体〜10mg／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、例えば、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
【００４７】
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
【００４８】
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、アポトーシスの誘導又は抑制が所望される任意の疾患の治療、並びに該疾患に伴う病状を軽減するための医薬として有用である。アポトーシスの誘導が所望される疾患としては、例えば、癌（例えば、卵巣癌）、自己免疫疾患などが挙げられる。一方、アポトーシスの抑制が所望される疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患、エイズ、肝炎などが挙げられる。
【００５０】
なお、本願明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字あるいは一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。
（Gly／G）グリシン、（Ala／A）アラニン、（Val／V）バリン、（Leu／L）ロイシン、（Ile／I）イソロイシン、（Ser／S）セリン、（Thr／T）スレオニン、（Asp／D）アスパラギン酸、（Glu／E）グルタミン酸、（Asn／N）アスパラギン、（Gln／Q）グルタミン、（Lys／K）リジン、（Arg／R）アルギニン、（Cys／C）システイン、（Met／M）メチオニン、（Phe／F）フェニルアラニン、（Tyr／Y）チロシン、（Trp／W）トリプトファン、（His／H）ヒスチジン、（Pro／P）プロリン。また、アミノ酸は天然のαアミノ酸であり、Ｌ体、Ｄ体であり得るがＬ体が好ましい。
【００５１】
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明は、以下の特定の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
参考例１：FasL中のFas結合領域を用いたアポトーシス誘導ペプチドの設計
Fas Ligandの細胞外領域にあたる144〜281位をRBD法（例えば、Gallet X. et al, J. Mol. Biol., 302, 917-926 (2000) 参照）にかけ、Fasとの結合領域を151〜176位 (GKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKY(配列番号25)) と同定した。次に、この領域を、Ｎ末側から4残基ずつ抽出し、計23個の断片化ペプチドを得た。
次いで、Fas (Receptor) に対してもFas Lとの結合領域をRBD法（例えば、Gallet X. et al, J. Mol. Biol., 302, 917-926 (2000) 参照）により99〜102位に同定した。この99〜102位のアミノ酸配列SKCR（配列番号２６）を標的領域として、該標的領域と結合し得るペプチドを、AutoDock 3.0（Morris, G. M. et al., J. Comp. Chem.,19, 1639-1662, (1998)参照）を用いて計算した。結果を図１に示す。
その結果、Fas Ligand上の領域162〜165のアミノ酸配列WEDT（配列番号１）からなるペプチドが最も強く結合することが明らかとなった (Ki=0.19μM)（図１）。
【００５３】
参考例２：WEDT変異体の結合能の評価
次いで、参考例２により得られたペプチドWEDT（配列番号１）をリードペプチドとして1残基目から4残基目まで一残基アミノ酸置換を実施し、変異による結合能の変化を、AutoDock 3.0（Morris, G. M. et al., J. Comp. Chem.,19, 1639-1662, (1998)参照）を用いて計算した。結果を以下の表１に示す。
【００５４】
【表１】
2005213160.tif 000002
【００５５】
その結果、１番目、２番目及び３番目のアミノ酸が塩基性側鎖を有するアミノ酸である場合には、Fas (Receptor) に結合し難い傾向が見出された。また、WEWT（以下FRAP-4と省略）（配列番号１０）の予測Ki値は0.083μMであった。
以上より、Fas (Receptor) に対する結合という観点から、１番目、２番目及び３番目のアミノ酸として、塩基性側鎖を有するアミノ酸が好ましくないことが示唆された。また、WEWT（配列番号１０）が優れた結合活性を有するペプチドであることが予測された。
【００５６】
試験例１：ＦＲＡＰ−４マルチマーによるin vitroでのアポトーシス誘導
WEWT（配列番号１０）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを合成した。次いで、Fasは3量体となって作用することから、Fas 3量体の形成する空間37Å四方にFRAP-4がうまくはまり込むようにするために、固相法を用いて、FRAP-4をMAP-8の4アミノ基を保護化した残り4つのブランチに結合させMAP化させることにより、FRAP-4マルチマーを作製した(図２)。
次に、Fasを発現しているヒト卵巣癌培養細胞株NOS4を用いて、FRAP-4マルチマーによるアポトーシス誘導能を解析した。なお、NOS4は、重症の卵巣癌患者から切除した癌細胞より、本発明者らの研究室で樹立され、維持されている。具体的には、ヒト卵巣癌培養細胞株NOS4は、10%ウシ胎仔血清含有RPMI培地中、5%CO2湿気下、37℃で培養した。5×106個のヒト卵巣癌培養細胞株NOS4を、FRAP-4マルチマーの存在下で37℃、24時間処理し、次いでDNA断片化を測定した。DNA断片化は、細胞核をヨウ化プロピジウムで染色し、FACS装置（FACS Calibur, Jose., CA）を用いたフローサイトメトリーにより測定した。結果を以下の表２に示す。
【００５７】
【表２】
2005213160.tif 000003
【００５８】
その結果、FRAP-4マルチマーは、約0.1μg/mlの濃度において、約50%のヒト卵巣癌培養細胞株NOS4にアポトーシスを誘導した(表２)。
以上より、FRAP-4が非常に強い生理活性を有することが明らかとなった。また、FRAP-4のみならず、表１に示されるΔＧが低い値を示すWEDTおよびその変異体についても非常に強い生理活性を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明のペプチド又はマルチマー、あるいはそれらの塩は、Ｆａｓへの結合を通じてアポトーシスのシグナル伝達系を調節することから、アポトーシスに関連する研究の試薬として有用である。また、本発明のペプチド又はマルチマー、あるいはそれらの塩は、アポトーシスの調節が所望される疾患に対する医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Ｆａｓ標的領域に対するＦａｓ Ｌ結合領域の、ＲＢＤ法による解析結果を示す図である。
【図２】ＦＲＡＰ−４マルチマーの概要を示す図である。
【図１】
2005213160.tif 000004
【図２】
2005213160.tif 000005
【配列表】
2005213160000001.app