(57)【要約】【課題】  予め決定された抗原を、この抗原にすでに曝露されたヒトドナーに依存せずに認識する、完全ヒト抗体を調製する方法を提供すること。【解決手段】  抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下：  （ａ）未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程；  （ｂ）インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程；  （ｃ）該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程；  （ｄ）該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程；および  （ｅ）工程（ｄ）において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、を包含する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程；
（ｂ）インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程；
（ｃ）該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記リンパ球から、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｄ）の前に、第２抗原を用いて、工程（ｃ）の前記トリオーマ細胞をスクリーニングする工程、それによって、前記抗原および該第２抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を選択する工程、をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、約３０ｎＭ以下のＫｄで前記抗原を認識する、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、ＩｇＧ１抗体である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約３ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約６ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約９ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約１２ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記抗原が、ｇｐ１２０由来である、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記抗原が、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、Ｔ−ヘルパー配列を含む、方法。
【請求項１５】
単離された完全ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、ＨＩＶの少なくとも２つの株を認識する、抗体またはフラグメント。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体またはフラグメントであって、ＨＩＶの少なくとも２つの株のｇｐ１２０を認識する、抗体またはフラグメント。
【請求項１７】
請求項１６に記載の抗体またはフラグメントであって、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域を認識する、抗体またはフラグメント。
【請求項１８】
請求項１５に記載の抗体またはフラグメントであって、配列番号２〜１７からなる群より選択される、少なくとも２つの配列を認識する、抗体またはフラグメント。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、ＩｇＧである、抗体またはフラグメント。
【請求項２０】
請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、ＩｇＧ１である、抗体またはフラグメント。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
【請求項２３】
ＨＩＶ感染を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法が、有効量の請求項２１に記載の組成物を、それが必要な被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記被験体が、ＡＩＤＳに罹患している、方法。
【請求項２５】
少なくとも２つの異なる抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程；
（ｂ）インビトロで、第１抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程；
（ｃ）該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）該トリオーマ細胞を第２抗原を用いてスクリーニングして、該第１抗原および該第２抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を同定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、微生物由来である、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、微生物の２つの異なる株由来である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記微生物が、ＨＩＶである、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、ｇｐ１２０由来である、方法。
【請求項３０】
抗原を用いてリンパ球のインビトロ免疫の効率を増加する方法であって、以下：
（ａ）リンパ球の集団を提供する工程；
（ｂ）該集団からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程；ならびに
（ｃ）インビトロで、該リンパ球の集団を該抗原と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、前記ＣＤ８＋細胞および前記ＣＤ５６＋細胞が、ＣＤ８およびＣＤ５６に特異的な磁気ビーズを使用することによって除去される、方法。
【請求項３２】
インビトロ細胞集団であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから末梢血単核細胞を提供する工程；
（ｂ）該末梢血単核細胞からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程；ならびに
（ｃ）インビトロで、工程（ｂ）の該細胞を抗原と接触させて、該抗原を認識する抗体を該細胞により産生させる工程、
を包含する、方法によって調製されたインビトロ細胞集団。
【請求項３３】
抗体産生細胞であって、該抗体産生細胞が、請求項３２に記載の細胞集団をクローン条件下で培養し、そして前記抗原を認識する抗体を産生するクローンを単離することによって調製される、抗体産生細胞。
【請求項３４】
請求項３３に記載の抗体産生細胞であって、ＨＩＶ  ｇｐ１２０を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載の抗体産生細胞であって、ＨＩＶの異なる株由来の少なくとも２つのｇｐ１２０分子を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の任意の抗原に対する完全ヒト抗体の調製の方法、および得られる抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ヒト化モノクローナル抗体は、ウイルス疾患に対する治療目的で、首尾よく使用されている（非特許文献１参照）。これらの疾患は、伝統的に、感染性疾患（例えば、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）による感染）である。しかし、最近、抗体は、多くの他の障害の治療において次第に使用されるようになっており、これらの障害としては、自己免疫障害および悪性腫瘍様転移性乳癌、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球白血病および急性骨髄性白血病が挙げられる（非特許文献１および非特許文献２２を参照）。血管形成術の間の器官の拒絶または血液凝集に対する予防的な使用もまた、達成されている。
【０００３】
ヒト化抗体は、代表的に、抗原特異性のために重要ではないマウス抗体の領域を、ヒト対応物で置き換えることによって調製される。従って、得られる抗体は、残留マウス配列を有し、この配列は、ヒト患者に投与される場合、しばしば、この患者において免疫学的応答を引き起こす（ヒト抗マウス応答）。従って、非ヒト配列を回避する、完全ヒト抗体を調製することが望ましい。完全ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイ技術を使用してヒト抗体ライブラリーを構築およびスクリーニングすることによってか、免疫されたヒトドナー由来のリンパ球を重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植することによってか、またはヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを操作することによって、報告されている（非特許文献２１参照）。病原体に対する完全ヒト抗体もまた、臍帯血の広範なスクリーニングによって単離されており、これは、天然の多反応性ＩｇＭレパートリーを含む（例えば、特許文献５を参照のこと）。しかし、これらの方法は、低い親和性を有する抗体を生じるか、または所望の免疫応答を有するヒトドナーに依存するかのいずれかである。
【０００４】
ＨＩＶに対する化学療法は、しばしば、重篤な副作用および薬物耐性によって妨害されているので、ＨＩＶに対する完全ヒト抗体が、治療的に価値がある。特に興味深いものは、ｇｐ１２０（ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質）を認識する抗体である。標的細胞へのＨＩＶの侵入は、標的細胞上での、ｇｐ１２０の、ＣＤ４およびコレセプター（ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）との連続的相互作用によって開始される（非特許文献６を参照）。ｇｐ１２０は、５つの定常領域（Ｃ１〜Ｃ５）および５つの可変ループ（Ｖ１〜Ｖ５）から構成される。ＣＤ４のｇｐ１２０への結合は、大きい結合エネルギーを生じ、このエネルギーは、ｇｐ１２０のコンホメーション変化を引き起こし、コレセプター結合部位（ｇｐ１２０のＶ３〜Ｃ４）を露出させる。引き続いて、このコレセプターは、ｇｐ１２０に結合し、ウイルスおよび細胞膜の融合をもたらし、続いて、細胞にウイルスが侵入する。従って、ＣＤ４結合部位またはコレセプター結合部位を認識する抗体は、ＨＩＶ侵入を妨害し、そしてこのウイルスが細胞内で複製することを防止する。
【０００５】
ｇｐ１２０に対する完全ヒト抗体が、報告されている。特許文献２は、クローン的に感染した患者由来のｇｐ１２０に対する４つの中和ｈｕＭＡｂを開示するが、これらの全てが、ＣＤ４結合領域と反応する。特許文献３は、血清陽性の患者由来の別のＩｇＧ１中和ｈｕＭＡｂを明らかにし、これもまた、ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域と反応性である。全抗体分子に加えて、同じ領域に作用する免疫グロブリンフラグメント（Ｆａｂ）が、感染したドナーの骨髄から得られた（特許文献４および６を参照）。
【０００６】
しかし、ＣＤ４結合部位よりむしろコレセプター結合部位を認識する治療抗体は、以下の理由により好ましい。第一に、超微細構造の研究は、成熟ＨＩＶ粒子が、ｇｐ１２０ノブを含む約７２のスパイクを有することを示唆する（非特許文献１５を参照）。末梢リンパ球上のＣＤ４分子の平均数は、６５，３３０±６，０４９であると報告されている（非特許文献１３を参照）。さらに、ＣＤ４とｇｐ１２０との間の親和性は高く、低いナノモル濃度の範囲のＫｄ（すなわち、０．２〜３０ｎＭ）を有する（非特許文献２３および１０を参照）。一緒になって、ＣＤ４と、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位（どちらも豊富である）との間の結合の全体の強度（親和力）は、非常に高い。従って、多量の抗体が、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位とＣＤ４との間の相互作用をブロックするのみでなく、特に、非常に高い親和性を有する抗体は、上記親和性を克服するために必要とされる。対照的に、コレセプター結合部位は、ｇｐ１２０がすでにＣＤ４に結合するまで、効果的に露出されない。従って、ＨＩＶの、標的細胞に対する結合をブロックするためには、コレセプター結合部位に結合する抗体は実質的により少なく、そしてこれらの抗体の親和性は、ＨＩＶ感染を効果的に阻害するほどには特に高い必要はない。
【０００７】
ｇｐ１２０を標的化する治療抗体を調製する際のさらなる問題は、ｇｐ１２０の一次構造（すなわち、アミノ酸配列）が、異なるＨＩＶ−１株の間で非常に可変性であることである（非特許文献１２、９、１４、および２０を参照）。実際に、単一の患者の配列単離体でさえも、変動を示す（非特許文献８を参照）。従って、ｇｐ１２０上のコンホメーションエピトープを認識し得る、複数のＨＩＶ株に対する治療および／または予防の目的で使用され得る、完全ヒト抗体が望ましい。理想的な抗体は、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域（特に、コンホメーションエピトープ）を認識する。
【０００８】
本願の上記および他の箇所において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許出願または特許の開示が、その全体が参考として援用されるように具体的にかつ個々に示される場合と同じ程度まで、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００９】
【数１】
2005034154.tif 000002
2005034154.tif 000003
2005034154.tif 000004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によると、以下の項目１〜３７が提供され、上記目的が達成される。
【００１１】
（項目１）
抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程；
（ｂ）インビトロで、該抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程；
（ｃ）該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）該抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
【００１２】
（項目２）
項目１に記載の方法であって、工程（ｂ）の前に、前記リンパ球から、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程をさらに包含する、方法。
【００１３】
（項目３）
項目１または２に記載の方法であって、工程（ｄ）の前に、第２抗原を用いて、工程（ｃ）の前記トリオーマ細胞をスクリーニングする工程、それによって、前記抗原および該第２抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を選択する工程、をさらに包含する、方法。
【００１４】
（項目４）
項目１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、約３０ｎＭ以下のＫｄで前記抗原を認識する、方法。
【００１５】
（項目５）
項目１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、ＩｇＧ抗体である、方法。
【００１６】
（項目６）
項目１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗体が、ＩｇＧ１抗体である、方法。
【００１７】
（項目７）
項目１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約３ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【００１８】
（項目８）
項目１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約６ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【００１９】
（項目９）
項目１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約９ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【００２０】
（項目１０）
項目１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、工程（ｄ）の前記トリオーマ細胞が、細胞培養物中において、少なくとも約１２ヶ月間、前記抗体を産生し得る、方法。
【００２１】
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、ＨＩＶ抗原である、方法。
【００２２】
（項目１２）
項目１１に記載の方法であって、前記抗原が、ｇｐ１２０由来である、方法。
【００２３】
（項目１３）
項目１２に記載の方法であって、前記抗原が、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域を含む、方法。
【００２４】
（項目１４）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗原が、Ｔ−ヘルパー配列を含む、方法。
【００２５】
（項目１５）
単離された完全ヒト抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体が、ＨＩＶの少なくとも２つの株を認識する、抗体またはフラグメント。
【００２６】
（項目１６）
項目１５に記載の抗体またはフラグメントであって、ＨＩＶの少なくとも２つの株のｇｐ１２０を認識する、抗体またはフラグメント。
【００２７】
（項目１７）
項目１６に記載の抗体またはフラグメントであって、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域を認識する、抗体またはフラグメント。
【００２８】
（項目１８）
項目１５に記載の抗体またはフラグメントであって、配列番号２〜１７からなる群より選択される、少なくとも２つの配列を認識する、抗体またはフラグメント。
【００２９】
（項目１９）
項目１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、ＩｇＧである、抗体またはフラグメント。
【００３０】
（項目２０）
項目１５〜１８のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントであって、前記抗体が、ＩｇＧ１である、抗体またはフラグメント。
【００３１】
（項目２１）
項目１５〜２０のいずれか一項に記載の抗体またはフラグメントを含む、組成物。
【００３２】
（項目２２）
項目２１に記載の組成物であって、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、組成物。
【００３３】
（項目２３）
ＨＩＶ感染を予防、処置、または改善するための方法であって、該方法が、有効量の項目２１に記載の組成物を、それが必要な被験体に投与する工程を包含する、方法。
【００３４】
（項目２４）
項目２３に記載の方法であって、前記被験体が、ＡＩＤＳに罹患している、方法。
【００３５】
（項目２５）
少なくとも２つの異なる抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから一群のリンパ球を提供する工程；
（ｂ）インビトロで、第１抗原を用いて該リンパ球を免疫する工程；
（ｃ）該免疫されたリンパ球をヘテロミエローマ細胞株と融合して、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）該トリオーマ細胞を第２抗原を用いてスクリーニングして、該第１抗原および該第２抗原の両方を認識する抗体を産生する細胞を同定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）において同定された該トリオーマ細胞によって産生された該抗体を収集する工程、
を包含する、方法。
【００３６】
（項目２６）
項目２５に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、微生物由来である、方法。
【００３７】
（項目２７）
項目２５に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、微生物の２つの異なる株由来である、方法。
【００３８】
（項目２８）
項目２７に記載の方法であって、前記微生物が、ＨＩＶである、方法。
【００３９】
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記第１抗原および前記第２抗原が、ｇｐ１２０由来である、方法。
【００４０】
（項目３０）
抗原を用いてリンパ球のインビトロ免疫の効率を増加する方法であって、以下：
（ａ）リンパ球の集団を提供する工程；
（ｂ）該集団からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程；ならびに
（ｃ）インビトロで、該リンパ球の集団を該抗原と接触させる工程、
を包含する、方法。
【００４１】
（項目３１）
項目３０に記載の方法であって、前記ＣＤ８＋細胞および前記ＣＤ５６＋細胞が、ＣＤ８およびＣＤ５６に特異的な磁気ビーズを使用することによって除去される、方法。
【００４２】
（項目３２）
インビトロ細胞集団であって、以下：
（ａ）未処置のヒトドナーから末梢血単核細胞を提供する工程；
（ｂ）該末梢血単核細胞からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程；ならびに
（ｃ）インビトロで、工程（ｂ）の該細胞を抗原と接触させて、該抗原を認識する抗体を該細胞により産生させる工程、
を包含する、方法によって調製されたインビトロ細胞集団。
【００４３】
（項目３３）
抗体産生細胞であって、該抗体産生細胞が、項目３２に記載の細胞集団をクローン条件下で培養し、そして前記抗原を認識する抗体を産生するクローンを単離することによって調製される、抗体産生細胞。
【００４４】
（項目３４）
項目３３に記載の抗体産生細胞であって、ＨＩＶ  ｇｐ１２０を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
【００４５】
（項目３５）
項目３４に記載の抗体産生細胞であって、ＨＩＶの異なる株由来の少なくとも２つのｇｐ１２０分子を認識する抗体を産生する、抗体産生細胞。
【００４６】
（項目３６）
ＨＩＶ感染を予防、処置、または改善することが必要な被験体において、ＨＩＶ感染を予防、処置、または改善するための、項目２１に記載の組成物。
【００４７】
（項目３７）
項目３６に記載の組成物であって、前記被験体が、ＡＩＤＳに罹患している、組成物。
【００４８】
（発明の要旨）
本発明は、予め決定された抗原を、この抗原にすでに曝露されたヒトドナーに依存せずに認識する、完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。この目的で、ネイティブなヒトドナー由来のリンパ球が、インビトロで、目的の抗原に接触され、そしてこの抗原に対する抗体を産生する細胞が同定される。リンパ球は、インビボではなくインビトロで免疫されるので、どの抗原、または抗原のどの部分が、この抗体によって認識されるかを制御することが可能である。従って、この方法は、生命を脅かす微生物に対する抗体の調製において、特に有用である。なぜなら、この方法は、生命を脅かす微生物で、ヒトは言うまでもなく、動物を免疫する必要がないからである。
【００４９】
好ましい抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０糖タンパク質、またはその免疫原性フラグメントである。より好ましくは、この抗原は、ｇｐ１２０のコレセプター結合部位を含むペプチドである。抗原性バリエーションに起因して、ｇｐ１２０に対する広範なスペクトルの抗体を産生することは、長い間問題であり、そしてｇｐ１２０に対する既存の抗体は、代表的に、１つのみのサブタイプのｇｐ１２０、またはＨＩＶの１つの分岐群（ｃｌａｄｅ）さえも認識する。本発明は、少なくとも２つの異なる抗原を認識する抗体を作製する方法を、さらに提供する。従って、リンパ球を１つの抗原で免疫し、そして免疫されたリンパ球を、別の抗原でスクリーニングすることによって、両方の抗原を認識する完全ヒト抗体が得られ得る。
【００５０】
抗体産生の能力を拡張するために、抗体産生細胞は、必要に応じて、種々のさらなる処理に供され得る。例えば、これらの細胞は、ヘテロミエローマ細胞と融合されて、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞を形成し得、これは、長期間生存し得、そして抗体を安定に産生し得る。
【００５１】
従って、本発明の１つの局面は、抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）未処置の（ｎａｉｖｅ）ヒトドナーから得られた、リンパ球の群を提供する工程；
（ｂ）これらのリンパ球を、インビトロで、抗原で免疫する工程；
（ｃ）免疫されたリンパ球を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させて、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）抗原を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において同定されたトリオーマ細胞から産生される抗体を収集する工程。
【００５２】
この方法は、工程（ｂ）の前に、リンパ球からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程をさらに包含し得る。さらに、または代替的に、この方法は、工程（ｃ）のトリオーマ細胞を、工程（ｄ）の前に、第２抗原を用いてスクリーニングする工程をさらに包含し得、これによって、上記抗原と第２抗原との両方を認識する抗体を同定し得る。
【００５３】
トリオーマ細胞が、クローン条件で培養される場合、モノクローナル抗体が、本発明を使用して調製され得る。あるいは、本発明を使用して得られた抗体産生細胞の群から、ポリクローナル抗体が調製され得、これらは、個々のクローンとして培養されない。この抗体は、好ましくは、約１００ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下のＫｄで抗原を認識する。この抗体は、好ましくは、ＩｇＧ抗体であり、特に、ＩｇＧ１である。
【００５４】
完全ヒト抗体を産生する、抗体産生細胞（例えば、上記トリオーマ細胞）を調製するための方法もまた、提供される。特に、これらの細胞は、延長された時間（例えば、細胞培養中で少なくとも約３ヶ月、少なくとも約６ヶ月、少なくとも約９ヶ月、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１５ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２１ヶ月、または少なくとも約２４ヶ月）にわたって、抗体を産生し得る。
【００５５】
本発明において使用される抗原は、好ましくは、ＨＩＶ抗原であり、より好ましくは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０分子、またはｇｐ１２０分子のフラグメントである。特に、この抗原は、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域由来のペプチドである。
【００５６】
本発明の別の局面は、本発明の方法に従って調製された、完全ヒト抗体を提供する。特に、これらの抗体は、ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐ１２０）を認識し得、そして好ましくは、２つの異なるＨＩＶ株由来の抗原を認識し得る。この抗体は、より好ましくは、３つ以上のＨＩＶ株、サブタイプ、または分岐群を認識し得る。完全ヒト抗体は好ましくは、ＨＩＶの少なくとも２つの株由来のコレセプター結合領域を認識する。例えば、この抗体は、ｇｐ１２０の異なるコレセプター結合領域を含む、少なくとも２つの抗原（例えば、配列番号２〜１７からなる群より選択される抗原）を認識する。これらの抗体は、好ましくは、ＩｇＧであり、特に、ＩｇＧＩ１抗体である。これらの抗体を含有する薬学的組成物もまた提供され、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤を含有し得る。
【００５７】
本発明のなお別の局面は、ＨＩＶ感染を防止するか、処置するか、または軽減するための方法を提供し、この方法は、有効量の本発明の抗体、またはこの抗体を含有する組成物を、この処置の必要な被験体に投与する工程を包含する。特に、この方法は、ＡＩＤＳを予防するか、処置するか、または軽減するために、使用され得る。
【００５８】
本発明のさらなる局面は、少なくとも２つの異なる抗原を認識する、完全ヒト抗体を調製する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）ネイティブなヒトドナー由来のリンパ球の群を提供する工程；
（ｂ）このリンパ球を、第１抗原で、インビトロで免疫する工程；
（ｃ）免疫されたリンパ球を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させて、トリオーマ細胞を形成する工程；
（ｄ）このトリオーマ細胞を第２抗原でスクリーニングして、第１抗原と第２抗原との両方を認識する抗体を産生するトリオーマ細胞を同定する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）において同定されたトリオーマ細胞によって産生された抗体を収集する工程。
【００５９】
第１抗原および第２抗原は、任意の目的の抗原であり得る。例えば、第１抗原および第２抗原は、独立して、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、脂質、糖脂質、細胞、ウイルス、細菌、真菌、プリオンおよび寄生生物からなる群より選択され得る。これらの抗原は好ましくは、微生物由来であり、例えば、微生物の２つの異なる株由来の表面抗原である。この微生物は、好ましくは、ＨＩＶであり、そして抗原は、好ましくはｇｐ１２０である。従って、第１抗原および第２抗原は、ＨＩＶの異なる株由来のｇｐ１２０分子であり得、特に、そのコレセプター結合領域であり得る。
【００６０】
本発明の別の局面は、抗原でリンパ球をインビトロで免疫する効力を増加させる方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
（ａ）リンパ球の集団を提供する工程；
（ｂ）この集団からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程；ならびに
（ｃ）このリンパ球の集団をインビトロで抗原と接触させる工程。
【００６１】
ＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞は、当該分野において確立された任意の方法を使用して、除去され得る。例えば、これらの細胞は、それぞれＣＤ８およびＣＤ５６に特異的な抗体を使用して、除去され得る。１つの実施形態において、これらの抗体は、磁気ビーズに付着される。
【００６２】
本発明のさらなる局面は、以下の工程を包含する方法によって調製される細胞集団を提供する：
（ａ）未処置のヒトドナー由来のリンパ球を提供する工程；
（ｂ）このリンパ球からＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を取り除く工程；および、
（ｃ）インビトロで工程（ｂ）の細胞を抗原と接触させて、この抗原を認識する抗体を産生する細胞を得る工程。
【００６３】
リンパ球は、末梢血単核細胞として提供され得る。この細胞集団は、さらに希釈され、そして個々のクローンとして培養され、そして所望の抗体を産生するクローンが、同定され得る。従って、クローン条件下で上記の細胞集団を培養し、そして上記抗原を認識する抗体を産生するクローンを単離することによって調製される、抗体産生細胞もまた提供される。この抗体産生細胞は、ＥＢＶで感染され得るかまたは融合パートナーと融合され得る。好ましくは、これらの細胞は、長期にわたって（例えば、細胞培養において、少なくとも約３ヶ月、約６ヶ月、約９ヶ月、約１２ヶ月、約１５ヶ月、約１８ヶ月、約２１ヶ月、または約２４ヶ月）抗体を産生する能力を有する。その抗原は、好ましくは、ＨＩＶ抗原であり、より好ましくは、ｇｐ１２０由来の抗原であり、そして最も好ましくは、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域である。特に、これらの細胞は、少なくとも２つの異なるＨＩＶ株からｇｐ１２０分子を認識する抗体を産生する能力を有する。
【００６４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、すでに抗原に曝されているヒトドナーに依存することなく、所定の抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。このために、未処置のヒトドナー由来のリンパ球が、インビトロで、目的の抗原で免疫され、この抗原に対する抗体を産生する細胞が、同定および選択される。このリンパ球は、インビボではなくインビトロで免疫されるので、どの抗原またはどの抗原の一部がその抗体によって認識されるのかを制御することが可能である。好ましい抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０、特に、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域である。
【００６５】
さらに詳細に本発明を記載する前に、本願において使用される用語は、他に示されない限り、以下のように定義される。
【００６６】
（定義）
「完全ヒト抗体」は、排他的にヒト配列を含む抗体である。この抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００６７】
「未処置のヒトドナー」は、目的の抗原に曝されておらず、免疫細胞または免疫因子の供給源としての役割を果たす、ヒトである。未処置のドナーは、目的の抗原に対する検出可能な循環抗体を含まない。代表的には、未処置のヒトドナーは、抗ＨＩＶ抗体にネガティブである、一貫してスクリーニングされた健康な規則的血液ドナーである。
【００６８】
細胞または動物を抗原で「免疫する」とは、細胞または動物を抗原に曝す動作をいう。この細胞または動物は、この細胞または動物の間で抗原と接触させる任意の様式で、免疫され得る。
【００６９】
「ヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞株」は、２つの異なる骨髄腫細胞の融合物由来の細胞株である。２つの異なる骨髄腫細胞は、好ましくは、ヒト骨髄腫細胞およびマウス骨髄腫細胞である。ヘテロミエローマ細胞株は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，２２８，３６１号およびＣｈｉｎら（２００１）は、種々のヘテロミエローマ細胞株の調製、特徴付けおよび使用を記載している。
【００７０】
「トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）細胞」は、細胞とヘテロミエローマ細胞との融合産物である。
【００７１】
「融合パートナー」は、有益な目的のために、抗体産生細胞と融合するために使用され得る細胞である。代表的には、この融合は、長期の抗体産生を導く。従って、この融合パートナーへの融合がないと、この抗体産生細胞は、培地中で抗体を産生しなくなる。しかし、この融合パートナーへの融合の際に、培地中で少なくとも約３ヶ月、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、約９ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月またはそれ以上の間、抗体を産生する融合細胞が選択され得る。融合パートナーとしては、骨髄腫細胞およびヘテロミエローマ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
疾患状態または医学的状態を「処置または改善する」とは、その疾患状態もしくは医学的状態の症状を軽減もしくは排除するか、またはこの疾患状態／医学的状態の進行を遅らせることを意味する。この軽減は、好ましくは、少なくとも約１０％、より好ましくは、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である。
【００７３】
疾患状態または医学的状態を「予防する」とは、この疾患状態または医学的状態の症状を示さない被験体において対策をとることを意味し、ここで、結果として、この被験体は、この疾患状態／医学的状態を発症しないか、またはより低い程度までしかこの疾患状態／医学的状態を発症しない。
【００７４】
「有効量」は、意図される効果を生じるのに十分な、薬剤の量である。例えば、疾患を処置または改善するために使用される抗体について、有効量は、この疾患の症状を軽減もしくは排除するかまたはこの疾患の進行を遅らせるのに十分な抗体の量である。
【００７５】
「サンプル」は、物質、材料または集団の、アリコートまたは代表的な部分である。例えば、サンプルは、水、汚水、油、砂、血液、生物学的組織、尿または糞のサンプルであり得る。
【００７６】
「生物学的サンプル」は、生物学的被験体（例えば、動物、植物または微生物）から回収されたサンプルである。
【００７７】
（方法）
本発明は、ヒトを含めた任意の動物を免疫する必要なしに、完全ヒト抗体を調製するための方法を提供する。この抗体を作製するために、未処置のヒトドナー由来のリンパ球を、インビトロで目的の抗原と接触させる。次いで、免疫化リンパ球を、クローン条件下で培養し、そして所望の抗体を産生するクローンを同定する。抗体のクローニングおよび特徴付けを容易にするために、この免疫化細胞を、必要に応じて、ＥＢＶで感染し得る。あるいは、またはそれに加えて、この免疫化細胞をまた、長期にわたる安定な抗体産生のために、融合パートナー（特に、ヘテロミエローマ細胞株）に融合し得る。
【００７８】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０のコレセプター結合部位を、本発明を立証するための抗原として使用した。従って、ペプチドを、ＨＩＶの異なるサブタイプ由来の、ｇｐ１２０のＶ３ループの配列に従って合成した（実施例１）。上で議論されるように、このｇｐ１２０配列は、高度に可変性である。従って、種々のペプチドが調製された。これらのペプチドとしては、サブタイプＡ〜Ｈ、サブタイプＪ、サブタイプＫおよびサブタイプＯ１〜Ｏ４由来のコンセンサス配列、ならびにＢサブタイプの２つの異なるクレードであるＭＮおよびＩＩＩＢ由来の配列（表１）が挙げられる。その抗原に対する免疫応答を増強するために、ｇｐ１２０  Ｖ３サブタイプＢ  ＭＮ株配列をまた、Ｔ細胞エピトープ配列に連結して、ハイブリッド抗原（表２）を形成した。
【００７９】
このペプチド抗原は、実施例２に記載されるような２工程の免疫化手順（Ｃｈｉｎら、１９９５；Ｚａｆｉｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９７）において、未処置のヒトドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にインビトロで添加された。伝統的に、インビトロで免疫されるべき細胞を、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ）で処理して、免疫化プロセスを阻害し得る細胞を除去する。本発明者らは、免疫化前の、ＰＢＭＣからのＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞の除去が、インビトロでの免疫化の効率を上昇させることを企図した。従って、伝統的な処理（ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ）の効果は、ＣＤ８＋細胞の除去、ＣＤ５６＋細胞の除去、またはＣＤ８＋細胞とＣＤ５６＋細胞との両方の除去の効果と比較された。実際に、ＣＤ８＋細胞とＣＤ５６＋細胞との両方を除去した場合、特異的抗体産生細胞の数は、有意に高かった（表３）。それによって、必要に応じて、ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ処理と組み合わせて、免疫化前にＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞をリンパ球から除去することが好ましい。
【００８０】
免疫化後、細胞は、所望の特異性を有する抗体の産生についてスクリーニングされる。このスクリーニング工程は、当該分野で公知の任意の方法によって（代表的には、細胞を免疫させる抗原を用いた固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用することによって）、行われ得る。実施例３において、代替方法が記載されており、ここで、ＨＩＶの１つのクレードである、サブタイプＢのＭＮ株由来のコレセプター結合領域を使用して、リンパ球を免疫し、そしてＨＩＶの別のクレードである、サブタイプＢのＩＩＩＢ株由来の対応する領域を使用して、その免疫化細胞をスクリーニングした。従って、得られる抗体は、両方の株のｇｐ１２０コレセプター結合領域を認識する。実際には、わずかな例外において、この抗体は、表１において列挙されるほとんど全てのＶ３コンセンサスペプチドを認識した。それによって、本発明は、実質的な抗原バリエーションを受ける病原体に対する診断適用および治療用適用において使用され得る、広域スペクトルの抗体を提供する。少なくとも２つの抗原（第一の抗原および第二の抗原）を認識する完全ヒト抗体を作製するための方法が、さらに提供される。この方法は、未処置のヒトドナー由来のリンパ球の群を、第一の抗原と接触させる工程、および第二の抗原を用いて抗体産生細胞についてスクリーニングする工程を包含する。次いで、このように同定された細胞によって産生された抗体を収集して、第一の抗原と反応させ、これらの抗体が両方の抗原を認識することを確認し得る。
【００８１】
さらに、上記の抗体は、ＭＮ株由来の抗原またはＩＩＩＢ株由来の抗原のいずれとも強く反応したが、これらの抗原が変性された場合、その反応性は有意に低かった。これらの結果は、この抗体が、いずれの抗原の直鎖状配列でもなく、それらの抗原によって共有されるコンホメーションエピトープを認識することを示している。従って、本発明はまた、コンホメーションエピトープ（特に、２つ以上の抗原によって共有されるコンホメーションエピトープ）に特異的な完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。
【００８２】
融合の代わりに、インビトロ免疫化細胞を使用して、抗体ライブラリーを構築し得、次いで、目的の抗体を、このライブラリーから同定し得る。従って、インビトロでの免疫化後、抗体産生細胞は、その抗原を用いて同定され得る（この段階における細胞は、必要に応じて、ＥＢＶで感染され得る）。次いで、これらの抗体産生細胞を使用して、ファージディスプレイライブラリーが構築され、その抗原を用いてこのライブラリーをスクリーニングすることによって、目的の抗体フラグメントを含むファージが同定され得る。ファージディスプレイライブラリーを構築する方法は、当該分野で公知である（例えば、
【００８３】
【数２】
2005034154.tif 000005
を参照のこと）。
【００８４】
この実施形態は、１つの抗原を使用して細胞を免疫し、第二の抗原を使用して抗体についてスクリーニングする場合に、特に有用である。例えば、リンパ球は、第一の抗原で免疫され、抗体産生細胞は、この免疫化細胞を第二の抗原と反応させることによって同定され、そしてこの抗体産生細胞を使用して、ファージディスプレイライブラリーが構築され得る。次いで、抗原を用いてこのライブラリーをスクリーニングして、目的の抗体フラグメントを含むクローンを同定する。抗原の一様に広範な範囲を認識するクローンを同定するために、第三の抗原を使用して、そのファージライブラリーをスクリーニングし得る。次いで、この第三の抗原を認識する任意のクローンの特異性は、この第一の抗原および第二の抗原を用いて決定され得る。この様式で同定された抗体フラグメントは、これらの抗体フラグメント間で共有されるコンホメーションエピトープに結合させることによって、３つ全ての抗原を認識する可能性が高い。
【００８５】
本発明の別の局面は、疾患を有する被験体を処置するための治療方法を提供し、この方法は、本発明に従って調製された抗体を被験体に投与する工程を包含し、ここで、この抗体は、疾患を処置または改善し得る。同様に、この抗体は、人々がこの疾患に罹患するのを防ぐために使用され得る。例えば、人々は、遺伝的疾患または他の素因化された疾患に対する高い危険性のある群に属し得るか、微生物感染が広がっている領域に居住し得るか、あるいは彼らの職業に起因してしばしば病原体に接触しなければならないかもしれない。この局面の実施のために有用な抗体は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。例えば、病原体または毒素を中和する抗体の能力は、予防、処置または改善におけるその抗体の能力の指標として測定され得る。好ましくは、抗体の量は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、約７０％、約８０％または約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％の中和を達成するために使用される。
【００８６】
好ましくは、疾患は、微生物によって引き起こされる腫瘍または感染性疾患である。腫瘍は、好ましくは、以下からなる群より選択される：造血性悪性腫瘍（例えば、リンパ腫、白血病、および骨髄腫）；腺癌のような癌腫（これは、食道、肺、胸部、卵巣、肝臓、子宮内膜、頸部、結腸、膵臓、前立腺、胃、腸、直腸、または子宮における原発腫瘍部位を有し得る）；および扁平上皮癌腫（これは、口腔、舌、咽頭、食道、肺、皮膚、膀胱、頸部、眼瞼、結膜、膣などに原発起源を有し得る）。他のクラスの処置され得る腫瘍の型としては、以下が挙げられる：肉腫（例えば、線維肉腫、筋原性肉腫）；神経腫；黒色腫；栄養膜腫瘍および生殖細胞腫瘍；神経内分泌腫瘍および神経外胚葉腫瘍。特に、腫瘍は、転移性胸部癌、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病からなる群より選択される。
【００８７】
微生物は、好ましくはＨＩＶである。しかし、他のヒト慢性ウイルス感染（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、１型ヒトＴリンパ球向性ウイルスおよび２型ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２）、パルボウイルス、ヒト疱疹ウイルス（１型および２型の単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）を含む）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）ならびにヒト疱疹ウイルス６（ＨＨＶ−６））は、本発明を用いて、予防、処置または改善され得る。細胞内で複製する他の因子（例えば、病原性原生生物（例えば、トリパノソーマ、マラリアおよびトキソプラズマ）；細菌（例えば、ミコバクテリア、サルモネラ、トラコーマクラミジアおよびリステリア）；および真菌（例えば、カンジダ）による感染はまた、慢性になり得、従って本発明を用いての処置／予防に対する良好な候補である。
【００８８】
本発明が適用可能である他の病状としては、例えば、毒素による中毒が挙げられる。毒素としては、微生物および動物の毒素、例えば、エンテロトキシン、外毒素、内毒素、グリオトキシン、オクラトキシン（ｏｃｈａｒｔｏｘｉｎ）、アフラトキシンおよび毒液が挙げられる。
【００８９】
本発明はさらに、ヒト細胞へのＨＩＶの結合をブロックする方法およびヒト細胞のＨＩＶによる感染を防ぐ方法を提供する。これらの方法は、本発明に従って調製される抗ＨＩＶ抗体（例えば、実施例４に記載される抗体）と、ヒト細胞とを接触させる工程を包含する。これらのヒト細胞は、好ましくは、ヒト中に位置し、ここで有効量の抗体が、ＨＩＶ結合をブロックするか、またはＨＩＶによる感染を防ぐためにヒトに投与される。
【００９０】
これらの抗体は、当該分野で公知の適切な方法（例えば、脈管内、鞘内、静脈内、筋内、非経口、皮下、延髄内、腹腔内、局所的、経口、直腸、膣、鼻腔、肺および腫瘍内の経路を介する）によって投与され得る。
【００９１】
サンプル中のＨＩＶの存在を検出する方法もまた、提供される。この方法は、抗体とサンプル中に存在する任意のＨＩＶとの間に抗体−抗原複合体を形成するために、本発明の抗体と適切なサンプルとを接触させる工程、およびそのように形成された任意の複合体の存在を検出し、それによってサンプル中のＨＩＶの存在を検出する工程を包含する。１つの実施形態において、ヒト抗体は検出マーカーで標識される。この方法において有用である適切なサンプルとしては、ヒト被験体由来の生物学的流体、例えば、血液、血清、血漿、尿、鼻粘膜分泌物、口腔粘膜分泌物、膣粘膜分泌物、精液、肛門粘膜分泌物および漿膜流体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
（組成物）
本発明の別の局面は、本発明に従って調製された完全ヒト抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、この抗体は、高い親和性でその抗原に結合する。Ｋｄは、好ましくは約１００ｎＭ以下、より好ましくは約３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１０ｎＭ以下、なおさらに好ましくは約３ｎＭ以下、そして最も好ましくは約１ｎＭ以下である。特に、抗体は、少なくとも２つの関連する抗原（例えば、抗原性のバリエーションのみに起因して異なる微生物抗原、または同じ遺伝子の対立遺伝子によってコードされるタンパク質）を認識し得る。
【００９３】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、活性成分として１つ以上の抗体を含む、薬学的組成物を含む。本発明の組成物の調製において、活性成分／抗体は、通常、賦形剤と混合されるか、賦形剤によって希釈されるか、あるいはカプセル、サシェ、紙または他の容器の形態であり得るこのようなキャリア内に封入される。薬学的に受容可能な賦形剤が希釈剤として働く場合、この賦形剤は、固体、半固体、または液体物質であり得、活性成分のためのビヒクル、キャリアまたは溶媒として作用する。従って、これらの組成物は、以下の形態であり得る：溶液（特に、滅菌の注射可能溶液）、錠剤、丸剤、散剤、トローチ剤、サシェ、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ、エアロゾル（固体または液体媒体中の）、例えば、１０％重量までの抗体を含有する軟膏、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセル、坐剤、および滅菌充填された散剤。
【００９４】
適切な賦形剤のある例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。処方物は、さらに以下を含み得る：潤沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；保存剤（例えば、メチルベンゾエートおよびプロプルヒドロキシベンゾエート）；甘味剤；ならびに矯味剤。本発明の組成物は、当該分野で公知の手順を使用することによる患者への投与後に、活性成分の迅速な放出、持続的な放出または遅延された放出を提供するように処方され得る。
【００９５】
錠剤のような固体組成物を調製するために、主な活性成分／抗体は、本発明の化合物の均質な混合物を含む固体予備処方組成物を形成するために、薬学的賦形剤と混合される。これらの予備処方組成物を均質であると言及する場合、活性成分が、この組成物が等しく有効な単位投薬形態（例えば、錠剤、丸剤およびカプセル）に容易に細分され得るように、組成物全体にわたって均一に分散されることを意味する。
【００９６】
本発明の錠剤または丸剤は、長期作用の利点を生じる投薬形態を提供するために、コーティングまたはさもなければ配合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含み得、後者は、前者の被覆形態である。２つの成分は、胃での分解を防ぐように作用する腸溶性層によって分けられ得、そして内部成分が十二指腸にインタクトなまま通過するのを可能にするか、放出を遅らせる。種々の物質は、このような腸溶性層またはコーティングのために使用され得、このような物質としては、多くのポリマー酸ならびにシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような物質とポリマー酸との混合物が挙げられる。
【００９７】
本発明の新規組成物が経口投与または注射のために組み込まれ得る液体形態としては、水溶液（例えば、ＰＢＳ）、適切な味のついたシロップ、水性懸濁液または油性懸濁液、および食用油（例えば、コーン油、綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油）を含む味付けされた乳濁液、ならびにエリキシルおよび類似の薬学的ビヒクルが挙げられる。
【００９８】
吸入またはガス注入用の組成物としては、薬学的に受容可能な水性溶媒または有機溶媒中の溶液および懸濁液、あるいはそれらの混合物、ならびに粉末が挙げられる（例えば、米国特許第６，５１４，４９６号および同第６，５９２，９０４号を参照のこと）。液体組成物または固体組成物は、本明細書中に記載される適切な薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。好ましくは、これらの組成物は、局所効果または全身効果について注射または鼻腔呼吸経路によって投与され得る。好ましくは、薬学的に受容可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接吸入され得るか、または噴霧デバイスはフェイスマスクテントもしくは断続性加圧呼吸器に装着され得る。溶液、懸濁液、または粉末の組成物は、好ましくは、適切な様式で処方物を送達するデバイスから経口または経鼻投与され得る。
【００９９】
本発明の方法において使用される別の好ましい処方物は、経皮送達デバイス（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量の、本発明の抗体の連続的吸入または断続的吸入を提供するために使用され得る。薬学的因子の送達のための経皮パッチの構築および使用は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号（参考として、本明細書中に援用される）を参照のこと。このようなパッチは、薬学的因子の連続的な送達、拍動性送達、または要求された送達のために構築され得る。
【０１００】
本発明における使用にとって適切な他の処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて見出され得る。
【０１０１】
さらに、細胞、特に、本発明に従って調製される抗体産生細胞が提供される。従って、本発明は、未処置のヒトドナーからＰＢＭＣを単離する工程、ＰＢＭＣからＣＤ８＋細胞およびＣＤ５６＋細胞を除去する工程、ならびに得られた細胞と抗原とを接触させる工程によって調製された細胞集団を提供する。本発明はさらに、上記の細胞集団から単離された細胞を提供し、これらの細胞は、抗原を認識する抗体を産生し得る。これらの細胞は、ＥＢＶに感染され得るか、または融合パートナー（例えば、骨髄腫細胞株またはヘテロミエローマ細胞株）と融合され得る。これらの細胞は、代表的に、少なくとも約３ヶ月、より好ましくは少なくとも約６ヶ月、約９ヶ月、約１２ヶ月、約１５ヶ月、約１８ヶ月、約２１ヶ月または約２４ヶ月、そして最も好ましくは２４ヶ月より長く、培養物中で抗体を産生し得る。
【０１０２】
好ましくは、これらの細胞は、ＨＩＶ抗原、特にｇｐ１２０、そしてさらに特定するとｇｐ１２０のコレセプター結合領域を認識する抗体を産生する。さらに、これらの細胞は、好ましくは、ＨＩＶの少なくとも２つの株、サブタイプまたはクレード由来の抗原を認識する抗体を産生し得る。好ましくは、抗体は、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１である。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明の範囲を制限するように、多少なりとも解釈されるものではない。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例において、以下の略号は、以下の意味を有する。定義されていない略号は、一般的に受け入れられる意味を有する。
【０１０５】
℃＝摂氏
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
ｍｌ＝ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
Ｍａｂ＝モノクローナル抗体
ｈｕＭａｂ＝ヒトモノクローナル抗体
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
ＭＥＭ＝改変イーグル培地
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＨＡＮＫＳ＝ハンクス平衡塩溶液
ＦＢＳ＝胎仔ウシ血清
ＨＩＶ＝ヒト免疫不全ウイルス
ＨＴＬＶ＝ヒトＴ細胞白血病ウイルス
ＨＣＶ＝Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＢｓＡｇ＝Ｂ型肝炎表面抗原
ＡＬＴ＝アラニントランスフェラーゼ
ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞
ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ＝Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル
（材料および方法）
（培養材料）
この開示において使用した培養培地は、他に示されない限り、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよびカナマイシン（Ｃｈｉｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＱＴＭ；ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）であった。
【０１０６】
（ヒト末梢血単核細胞の調製）
ＨＩＶ−１／２、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢｓＡｇついてネガティブスクリーニングされた、正常レベルのアラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のを含む健康な血液ドナーからの軟膜を、Ｔａｉｎａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｔａｉｎａｎ，Ｔａｉｗａｎ）から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での密度遠心分離（４００×ｇ）によって単離した。次いでこれらの細胞を、ＰＢＳで２回洗浄して、１００×ｇ遠心分離によって回収した。
【０１０７】
（磁性細胞精製）
ＰＢＭＣを、まず、ＣＤ４５ＲＯ  ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）で磁性標識し、次いでＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）機器を用いて分離した。まとめると、細胞を、超常磁性ＭＡＣＳマイクロビーズで特異的に標識した。磁性標識後、これらの細胞を、強い永久磁石に置いた分離カラムに通した。磁化可能なカラムマトリクスは、高勾配磁場を作るように働いた。磁性標識した細胞をカラム内に保持し、通過した未標識細胞から分離した。磁場からカラムを取り出した後、保持された細胞を溶出した。溶出したＣＤ４５ＲＯ＋細胞を、１００×ｇ遠心分離によって回収して、すぐに使用した。
【０１０８】
（ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞置換因子）
ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、１×非必須アミノ酸、１０％ヒト血清、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン／カナマイシン、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび１０ｍｇ／ｍｌヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中、２×１０６細胞／ｍｌの密度で、組織培養フラスコ中で培養した。２４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離して、そして４００×ｇ遠心分離によって除去した。最終的に、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞置換因子（すなわち、培地上清）を、培地上清を回収することによって調製し、０．４５ｍｍフィルタで濾過して、−２０℃で凍結保存した。
【０１０９】
（ＰＢＭＣからの細胞傷害性細胞の枯渇）
細胞傷害性細胞集団（これは、インビトロでの免疫を阻害する）の除去を、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ）処理または磁性細胞枯渇を使用することによって実行した。ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ処理を、以前に記載された（Ｏｈｌｉｎら、１９８９；Ｃｈｉｎら、１９９４；Ｃｈｉｎら、１９９５）ように、ＰＢＭＣ（１０７細胞／ｍｌ）の懸濁液に、２５０ｍＭ  Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステルヒドロ−ブロミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することによって実行した。磁性枯渇を、上記の磁性細胞精製の節に記載したように、モノクローナル抗マウスＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合体化されたコロイド超常磁性マイクロビーズを用いて実行した。
【０１１０】
（インビトロ免疫）
ＰＢＭＣ、特に細胞傷害性細胞枯渇ＰＢＭＣを、２工程免疫プロトコルを使用して、インビトロで免疫した。一次免疫を、ペプチド抗原（ＴＴ−Ｖ３Ｂ（ＭＮ））１０ｎＭ、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％熱不活化ヒト血清、０．０５ｎｇ／ｍｌ  ｒＩＬ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５％（ｖ／ｖ）Ｔ細胞置換因子を含む培地中で、６日間細胞をインキュベートすることによって実施した。７日目に、一次免疫から細胞を収集し、そして４０％  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを通して遠心分離した。二次免疫について、３×１０７細胞を、５ｍｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４；Ｖｉｎｃｉ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｖｉｎｃｉ、Ｉｔａｌｙ）で一晩免疫したフラスコ中で、ペプチド抗原と混合した。これらの細胞を、５％ヒト血清、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよび１０ｎＭペプチド抗原を補充した培地中で、３〜５日間培養した。
【０１１１】
（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）感染）
インビトロ免疫した細胞に、ＥＢＶを感染させた。簡潔には、１０７個のリンパ球を、ＥＢＶ生成マーモセット細胞株Ｂ９５−８（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１２；Ｄｒ．Ｌ．−Ｆ．Ｓｈｕ．Ｔｒｉ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｔａｉｐｅｉの厚意により提供された）由来の１ｍｌのＥＢＶ含有上清と共に、時々再懸濁しながら、３７℃で２時間インキュベートした。感染細胞を、支持細胞（１０４／ウェル）としての、マイトマイシン（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏｕ  Ｋｏｇｙｏ、Ｔｏｙｏｋｏ、Ｊａｐａｎ）処理したＰＢＭＣと一緒に、９６ウェルプレート中に１０５／ウェルで播種した。
【０１１２】
（電気融合による体細胞ハイブリダイゼーション）
体細胞ハイブリダイゼーションを、以前に記載されたような電気融合（Ｃｈｉｎら、１９９４；Ｃｈｉｎら、１９９５）によって実施した。簡潔には、リンパ芽球細胞を、２４ウェル組織培養プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、ＤＫ）において、等張培地（２８０ｍＭ  ソルビトール、０．５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ  酢酸カルシウムおよび１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；ｐＨ６．９〜７．１）中で、１個のヒトリンパ芽球細胞に対して２個のヘテロミエローマ（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細胞の比率で、ヘテロミエローマ（Ｃｈｉｎら、２００１）細胞と融合させた。ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  Ｍｏｄｅ  ２００を使用して、細胞融合を、３８Ｖ（２００Ｖ／ｃｍ）で３０秒間実施し、その後、２８５Ｖ（１５００Ｖ／ｃｍ）で１５マイクロ秒の持続時間の３回のパルスを実施した。これらの細胞を、融合後２０〜３０分間マイクロキュベット中に放置し、次いで、１０％  ＦＣＳを補充した培養培地中に穏やかに再懸濁した。抗原特異的ハイブリッドを選択し、そしてＣｈｉｎら、２００１に記載されるようにクローニングした。
【０１１３】
（ペプチド抗原とキャリアとの結合体化）
表１および２に示されるような合成ペプチドを、ＥＬＩＳＡについてのアッセイ抗原として使用した。これらのペプチドの各々を凍結乾燥し、そしてＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を架橋剤として使用する、２工程反応によって、ＢＳＡと結合体化した。最初に、ＢＳＡを、２ｍｌの蒸留水で再構成して、１０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。２００μｌの再構成ＢＳＡを、試験管中で、１００μｌのＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、そして室温で１時間攪拌した。マレイミド活性化ＢＳＡ（約１００μｌ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０カラムで精製して、過剰な架橋剤を除去した。その後、結合体化緩衝液中のスルフヒドリル含有ペプチド（４ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを添加し、そしてこの混合物を、室温で２時間インキュベートした。反応生成物を透析し、次いで、さらなる使用のために凍結乾燥した。ＥＬＩＳＡについて、結合体（２ｍｇ／ｍｌ）を、１００μｌ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、そしてこれらのプレートを、抗原の免疫のために、４℃で一晩インキュベートした。
【０１１４】
（酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））
抗原特異的ＥＬＩＳＡを、最初に、１ｍｇ／ｍｌバキュロウイルス発現組換えＨＩＶ−１  ＩＩＩＢまたはＭＮ  ｇｐ１２０（ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、５ｍｇ／ｍｌ  ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍｇ／ウェルのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）または破傷風トキソイド（ＡＤＩｍｍｕｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｉｃｈｕｎｇ、Ｔａｉｗａｎ）を、マイクロタイタープレート上に室温で一晩コーティングすることによって、実施した。培養物上清を、０．５Ｍ  塩化ナトリウムおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中で所望のレベルにまで希釈した。コーティングしたプレートを、希釈した培養物上清と共にインキュベートし、洗浄し、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭに対するペルオキシダーゼ標識したヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と共にインキュベートし、そして１００μｌの発色性基質であるｏ−フェニレンジアミン（ｐｈｅｎｙｌａｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、発色させた（１５分間）。この反応を、１Ｍの硫酸を添加することによって、３０分後に停止させ、そして吸光度を４９０ｎｍで読み取った。
【０１１５】
（競合的ＥＬＩＳＡ）
ｈｕＭＡｂの特異性を、競合的阻害ＥＬＩＳＡによって確認した。簡潔には、０．１〜１００ｍＭのペプチド抗原を、希釈緩衝液（０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｐＨ８．０））中にて、４℃で一晩、１ｎＭの目的のｈｕＭＡｂと共にインキュベートした。この混合物を、組換えｇｐ１２０でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに移した。３７℃で２時間のインキュベーション後、プレートに結合したｇｐ１２０特異的ｈｕＭＡｂの量を、ヒトＩｇＧに特異的なペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用して評価した。
【０１１６】
（ＨＩＶ−１中和）
試験されるべきｈｕＭＡｂを、９６ウェルＵ底プレート（Ｎａｇｌｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）中、２０μｌ／ウェルで、４０μｌのＩＬ−２培養培地／ウェルと合わせた。ｈｕＭＡｂを、所望の場合、最初に希釈し得る。次いで、１４μｌのＨＩＶ−１  ＭＮまたはＩＩＩＢウイルス（５００〜２５００  ＴＣＩＤ５０）を各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベーシトした。その後、１００μｌのＰＢＭＣ（５００，０００個の生存細胞を含む）を各ウェルに添加し、そして３７℃で一晩インキュベートした。次いで、この培養物を、同じ培地で３回洗浄して、培地からウイルスを除去した。（ＰＢＭＣの添加から）４日目に、２５μｌの培養物上清を、非放射性方法（ＲｅｔｒｏＳｙｓＴＭ  Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）による、逆転写酵素（ＲＴ）活性の測定のために、新たな９６ウェルプレートの対応するウェルに移した。ＲＴ活性の減少を、ネガティブコントロール（ｈｕＭａｂと同じ様式で希釈された、ヒト骨髄腫ＩｇＧ１ｋ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ））に対して計算した。
【０１１７】
（実施例１）
（ペプチド抗原の調製）
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＶ３ループに対応する合成ペプチドを、表１に示す。
【０１１８】
【表１】
2005034154.tif 000006
アミノ酸残基およびアミノ酸配列を、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ、ＮＭ；Ｋｏｒｂｅｒら、２００１を参照のこと）から得た。但し、サブタイプＥコンセンサス＊の１つは、Ｓｈｉｉｎｏら、２０００から採用した。ダッシュ（−）は、アラインメント中の上の配列との一致を示し、そしてピリオド（．）は、欠失を示す。
【０１１９】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＶ３ループ由来のペプチド配列を、表２に示す。例えば、Ｔ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープの両方を含む免疫原を生成するために、アミノ酸８３０〜８４４を含む破傷風毒素由来の「ヘルパー」配列（表２中のペプチド「ＴＴ」、配列番号２０；Ｃｈｉｎら、１９９４；Ｃｈｉｎら、１９９５；Ｄｅｍｏｔｚら、１９８９を参照のこと）を、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のＶ３のフラグメント（表１中のペプチド「Ｖ３Ｂ（ＭＮ）」、配列番号６）と合わせて、ＴＴ−Ｖ３Ｂ（ＭＮ）（表２、配列番号１）を形成した。
【０１２０】
【表２】
2005034154.tif 000007
（実施例２）
（ＣＤ８＋集団およびＣＤ５６＋集団の除去は、抗原応答体の増加を生じた）
細胞傷害性細胞集団または阻害細胞集団の除去は、インビトロの抗原応答性において不可欠な役割を果たすので（Ｏｈｌｉｎら、１９８９；１９９２）、細胞傷害性細胞の除去において有用であり得る異なる試薬の影響を、インビトロの免疫研究において比較した。これらの試薬としては、ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ、抗ＣＤ８抗体を使用する磁気細胞枯渇、抗ＣＤ５６抗体を使用する磁気細胞枯渇、ならびに抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ５６抗体の組み合わせを使用する磁気細胞枯渇が挙げられる。従って、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、各試薬に供したか、またはコントロールとして、さらなる試薬に供しなかった（ｎｉｌ）。４つの異なるドナーからのＰＢＭＣを試験した。インビトロ免疫を、ペプチド抗原ＴＴ−Ｖ３Ｂ（ＭＮ）に対する一次免疫および二次免疫を含めて、材料および方法において記載したように実施した。免疫した細胞の寿命を延長させるため、これらの細胞を、次いで、上記のようにＥＢＶに感染させた。各処理の効力を、特異的効率（すなわち、抗原ＴＴ−Ｖ３Ｂ（ＭＮ）に特異的な抗体を分泌した、培養プレート中のウェルの数）に基づいて評価した。
【０１２１】
表３に示すように、ＣＤ８細胞またはＣＤ５６細胞の除去は、特異的効率の増加を生じた。ＣＤ８細胞およびＣＤ５６細胞の両方が除去された場合、この特異的効率は、さらにより高かった。この効果は、ＬｅｕＬｅｕＯＭｅ処理（これは、最も一般に使用される方法である）の効果に勝った。処理なし（ｎｉｌ）では、抗体産生はスコアされなかった。従って、これらの結果は、ＣＤ８細胞およびＣＤ５６細胞の除去が、インビトロ免疫の効率を有意に改善したことを実証する。
【０１２２】
【表３】
2005034154.tif 000008
特異的効率を、以下のように規定する：
特異的抗体産生を含むウェルの数／ＥＢＶ活性化およびインビトロ免疫の後に増殖するリンパ芽球細胞を含むウェルの数
＊リンパ芽球細胞を含むウェルを、以下の場合に、特異的抗体産生としてスコアした：
１．組換えｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）に対するＥＬＩＳＡ  ＯＤ値が、ネガティブコントロールのＯＤ値の、少なくとも５倍高かった場合；
２．反応性指数（ＲＩ）＞２の場合（ここで、ＲＩ＝［ＯＤｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）−ＯＤｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）に対する培地コントロール］／［ＯＤＢＳＡ−ＯＤＢＳＡに対する培地コントロール］）。
【０１２３】
（実施例３）
（複数の抗原を認識する抗体の調製）
ＨＩＶ処置の分野における主要な未解決の問題の１つは、広範なＨＩＶ改変体を中和する単一の試薬を如何にして開発するかである。コレセプター結合領域を認識する、今日までに報告された抗体のほとんどは、株特異的である。他方、本発明は、コレセプター結合領域中のコンフォメーションエピトープを認識する抗ＨＩＶ抗体の産生を導く、免疫のための新規方法を提供する。従って、これらの抗体は、ＨＩＶの複数の株を認識する。この方法は、他の抗原／微生物も同様に認識する、広いスペクトルの抗体を調製するために使用され得る。
【０１２４】
この実施例において、ＰＢＭＣを、ＨＩＶ−１の１つの株のコレセプター結合領域で免疫し、そして引き続いて、このコレセプター結合領域中に異なるアミノ酸配列を有する別のＨＩＶ株由来の抗原を用いたＥＬＩＳＡによって、スクリーニングした。従って、ＨＩＶ−１  ＭＮ株のｇｐ１２０領域のアミノ酸配列に基づいて合成されたペプチドである、ＴＴ−Ｖ３Ｂ（ＭＮ）（表２を参照のこと）を免疫のために使用し、一方、異なる一次構造を有するＩＩＩＢ株由来の組換えｇｐ１２０配列（表１を参照のこと）を、スクリーニングのために使用した。
【０１２５】
抗体産生細胞（これらは、両方の株のｇｐ１２０を認識する抗体を産生する）を、このような免疫／スクリーニング手順を使用して得た。これらの抗体を、実施例４に記載されるように特徴付けた。
【０１２６】
（実施例４）
（ヒトＩｇＧ１を安定に分泌する特異的トリオーマ細胞株の、生成および特徴付け）
長期抗体産生のために、上記実施例においてインビトロで生成された抗体産生細胞を不死化するために、これらの細胞を、ヘテロミエローマ細胞株と融合させた。（２年より長きにわたって）安定なヒトトリオーマ細胞株を、クローニングおよびスクリーニングの後に確立した。この細胞株から産生されたモノクローナル抗体を、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋと称する。このｈｕＭａｂは、ｋ軽鎖を有するＩｇＧ１アイソタイプのものであり、そして生産性は、１ｍｇ／（１０６細胞×２４時間）であった。図１は、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋの特異性を実証する。この抗体は、ｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）およびｇｐ１２０（ＭＮ）の両方と強力に反応したが、無関係の抗原（例えば、破傷風トキソイド、トランスフェリンおよびＢＳＡ）とは、バックグラウンドレベルのみの反応性を示した。さらに、この抗体は、ＩＩＩＢまたはＭＮのいずれかに起源する変性ｇｐ１２０との、かなり減少した反応性を示した。変性タンパク質中の線状エピトープのみが認識され得るので、これらの結果は、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋが、いくつかのＨＩＶ−１株のｇｐ１２０中に共通に見出されるコンフォメーションエピトープと反応することを示す。実際、ＤサブタイプおよびＯ１サブタイプ以外、このｈｕＭａｂは、表１に列挙される全てのＨＩＶ−１株のＶ３コンセンサスペプチドを認識する。さらに、ＤサブタイプおよびＯ１サブタイプのペプチドについて観察された応答の減少は、これらのペプチドのＣ４領域の一部を付加することによって、レスキューされ得、ｈｕＭａｂがコレセプター結合部位に結合することを確認した。抗体の特異性もまた、図４に示されるように、競合的ＥＬＩＳＡを用いて確認した。
【０１２７】
ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋは、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢおよびＭＮを、用量依存的な様式で中和した。このウイルスを、宿主細胞に感染し得る条件下で培養し、そして抗体を培養物に添加して、ウイルス活性に対するその影響を決定した。ウイルス逆転写酵素活性を、ウイルスの感染性の指標として測定した。図３に示されるように、０．３８μｇ／ｍｌの濃度の抗体は、このウイルスの逆転写酵素活性の９０％の中和を生じた。従って、この抗体は、ＨＩＶ感染に対する有効な治療剤または予防剤である。
【０１２８】
本発明は、以前に抗原に曝露されたヒトドナーに頼ることなく、所定の抗原を認識する完全ヒト抗体を調製する方法を提供する。このために、未処置のヒトドナー由来のリンパ球を、目的の抗原を用いてインビトロで免疫し、そしてこの抗原に対する抗体を産生する細胞を同定する。リンパ球は、インビボではなく、インビトロで免疫されるので、どの抗原がこの抗体によって認識されるか、またはこの抗原のどの部分がこの抗体によって認識されるかを制御することが可能である。好ましい抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０、特に、ｇｐ１２０のコレセプター結合領域である。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、破傷風トキソイド、ヒトトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ならびにＨＩＶ−１のＩＩＩＢ株およびＭＮ株由来の、未処置のｇｐ１２０および１０Ｍ尿素変性組換えｇｐ１２０に対する、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋ  ｈｕＭＡｂの代表的なＥＬＩＳＡ反応性プロフィールを示す。
【図２】図２は、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋと、ｇｐ１２０およびウイルスサブタイプの種々の領域由来の合成ペプチドとのＥＬＩＳＡ反応性プロフィールを示す。
【図３】図３は、ｈｕＭＡｂ  ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋを用いたＨＩＶ−１中和アッセイを示す。中和を、ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）活性の相対阻害として測定した。使用したＨＩＶ株は、ＩＩＩＢ（黒四角）およびＭＮ（白丸）であった。ヒト骨髄腫タンパク質（白三角）を、試験抗体の代わりにコントロールとして使用した。
【図４】図４は、ＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋと、Ｖ３Ｂ（ＩＩＩＢ）ペプチド（黒四角）およびＶ３Ｂ（ＭＮ）ペプチド（白丸）との反応性を示した競合性ＥＬＩＳＡ分析を示す。ペプチドＴＴ（白三角）を、コントロールとして使用した。ｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）およびｇｐ１２０（ＭＮ）へのＬＴＣ−ｇｐ１２０−ＩｇＧ１ｋの結合から得られる平均のＥＬＩＳＡ読み取りを、それぞれ、ＡおよびＢにおいて１００％として設定した。競合ペプチドの濃度増加の存在下において、ｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）への抗体結合も、ｇｐ１２０（ＭＮ）への抗体結合も減少した。
【図１】
2005034154.tif 000009
【図２】
2005034154.tif 000010
【図３】
2005034154.tif 000011
【図４】
2005034154.tif 000012
【配列表】
2005034154000001.app