(57)【要約】【課題】  ヒト或いは動物に安全な多糖類を有功成分として含有する免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】  酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナン、特に、ロドトルラ属に属する酵母が菌対外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンであるβ−１，３−；β−１，４マンナンは、高い免疫賦活活性を有する。該多糖類は、特にＢリンパ球の活性化に係わっており、既に、免疫賦活剤及び抗腫瘍剤として実用化されている同種の多糖類と比較して、優れた活性を有する。該免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を含有させることにより、ヒト若しくは動物などの免疫機能を賦活し、該免疫機能の賦活により、抗腫瘍効果を発揮する医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料及び化粧品等を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類を有効性分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類が、ロドトルラ属に属する酵母が生産する多糖類であることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
ロドトルラ属に属する酵母が、ロドトルラ  ムシラギノーザであることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
ロドトルラ属に属する酵母が、ロドトルラ  ムシラギノーザＹＲ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ１８０２４）であることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類が、β−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫賦活剤。
【請求項６】
β−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンが、平均分子量約１０、０００であることを特徴とする請求項５記載の免疫賦活剤。
【請求項７】
Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−の繰り返し構造を有するβ−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンからなる多糖類を有功成分としてなる免疫賦活剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる免疫賦活活性を有する多糖類を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項９】
製薬学的に許容しうる担体と請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる免疫賦活活性を有する多糖類を含んでなる免疫賦活及び／又は抗腫瘍医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類を含んでなる免疫賦活活性及び／又は抗腫瘍活性を付与した飲食品、飼料、又は化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産する多糖類を有功成分として含有する免疫賦活剤及び抗腫瘍剤、及び、該免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を含有させて、摂取或いは投与した場合にヒト若しくは動物などの免疫機能を賦活させることにより、免疫増強、生体機能の調節、保険強壮効果を発揮させ、更に、該免疫機能を賦活させることにより、抗腫瘍効果を発揮する医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料及び化粧品等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体における免疫系は、細菌、酵母、かび、ウイルスなどの微生物による感染や有害なタンパク質等の生体内への侵入、或いは、腫瘍に対する防御等に重要な役割を果たしており、生体の免疫機能が低下すると、これらの微生物の侵入、増殖に対する防御機能の低下や、腫瘍に対する生体の防御機能低下、或いは有害物質の排除機能の低下等が起こり、生体に種々の障害を惹起する。近年、免疫学の進歩は著しく、免疫機能の不全に起因する疾病或いは感染症についての解明が急速に進められつつある。例えば、免疫機能の低下や不全は、呼吸器感染症や敗血症或いは尿路感染症等の感染症を引き起こし、更に、癌の発生率も高くなるということが知られている。免疫系は、生体の外界に対する防御に重要な役割をもつ機能であり、その機能の維持は生体の健康維持に不可欠な要素となっている。
【０００３】
従来より、生体における免疫系の機能維持のために、低下する生体における免疫機能を高める方策として、種々の免疫賦活物質の探索が行われてきた。そして、多くの免疫賦活物質が見い出され、免疫賦活剤が開発された。特に、それらの免疫賦活物質の中で、毒性が低く、有効性がある免疫賦活物質として、微生物やキノコ或いは植物等が生産する免疫賦活物質が注目されてきた。例えば、パン酵母のような微生物の細胞壁多糖類や、アガリクスやシイタケのようなキノコ（担子菌類）の多糖類が免疫機能を高める物質としてよく知られているところであり、微生物やキノコ或いは植物等に由来する種々の多糖類が免疫賦活物質として見い出され、そのいくつかは、免疫賦活剤或いは抗腫瘍剤として実用化されている。
【０００４】
例えば、シイタケから熱水抽出して得られるβ−（１→３）グルコシド結合を主査とする多糖類（レンチナン）（特公昭４９−４８４号公報）や、カワラタケから水性溶媒で抽出して得られるα−（１→６）グルコシド結合、α−（１→４）グルコシド結合、及びα−（１→３）グルコシド結合を有する多糖類（クレスチン）（特公昭５６−４６４８１号公報）等が代表的な例として挙げられ、実用化されている。また、酵母を熱水抽出及びアルコール、アセトン沈殿によって調製したグルコマンナンを主体とする制癌物質も取得されている（特公昭４３−７３２２号公報）。
【０００５】
近年、微生物や植物に由来する多糖類からなる免疫賦活物質或いは抗腫瘍物質は、グルコシド結合を有する多糖類を中心に種々のものが開示されている。例えば、酵母を自己消化させ、更に、細胞壁溶解酵素等を作用させて取得した５'−ヌクレオチド類、遊離アミノ酸、β−グルカン及びマンナンを含有する酵母エキス組成物からなる免疫増強作用物質（特開平７−１８４５９５号公報）が、カードラン等の多糖類を酸やβ−１，３−グルカナーゼ等により加水分解して取得したβ−１，３−グルコシド結合を持つ、及び、直鎖の糖類からなる免疫賦活物質（特開平１０−１９４９７７号公報）が、酵母の細胞壁に含まれるβ−１，３−グルカンや、アルカリゲネス属及びアグロバクテリウム属の微生物が産生するカードラン等の加水分解物、或いは、該加水分解により低分子化して水溶性としたオリゴマーをヒドロキシエチル化、ヒドロキシプロピル化、カルボキシメチル化、硫酸エステル化又はリン酸エステル化したβ−１，３−グルカン誘導体からなる免疫賦活物質（特開２００１−３５４５７０号公報）が開示されている。
【０００６】
また、植物組織原料の存在下でバシディオマイセス属の微生物を培養した液中から抽出，分離されるα（１→４）結合Ｄ−グルコース単位からなり、その２，３位の水酸基の約３０％がアセチル化された構造を有する多糖類からなる免疫増強又は賦活物質（特開平８−２５９６０２号公報）が、サッカロミセス属、クルイベロミセス属或いはカンジダ属のような酵母等の自己消化によって調製されたβ−グルカンーマンナンからなる免疫刺激性物質（特表平１１−５０８７７２号公報）が、及び、アゾトバクター属の変異株を培養して調製されるガラクツロン酸、ラムノース及びグルコースを含有する多糖類からなる免疫賦活物質（ＷＯ９７／００６８７）がそれぞれ開示されている。
【０００７】
酵母のような微生物やキノコ（担子菌）或いは植物等に由来する多糖類からなる免疫賦活物質や抗腫瘍物質は、毒性が低く、安全性の面からも副作用の少ない免疫賦活剤或いは抗癌剤として用いることが可能であり、従来より、その有効な免疫賦活活性及び抗腫瘍活性を有する物質の開発が期待されているところであるが、これらの物質の免疫賦活活性や抗腫瘍活性は一般的には必ずしも高くないという問題がある。また、免疫賦活活性や抗腫瘍活性を有する物質が、例えば、酵母やキノコ（担子菌）の細胞壁成分のような生体を構成する成分であるような場合には、その抽出・精製に煩雑な操作が必要であり、その利用のために時間とコストの浪費が問題となることも有る。したがって、今日、その免疫賦活活性や抗腫瘍活性において、高い活性を有し、その利用に際しての処理も比較的容易な多糖類を開発することが強く要望されている。
【特許文献１】特公昭４９−４８４号公報
【特許文献２】特公昭５６−４６４８１号公報
【特許文献３】特公昭４３−７３２２号公報
【特許文献４】特開平７−１８４５９５号公報
【特許文献５】特開平１０−１９４９７７号公報
【特許文献６】特開２００１−３５４５７０号公報
【特許文献７】特開平８−２５９６０２号公報
【特許文献８】特表平１１−５０８７７２号公報
【特許文献９】国際公開第９７／００６８７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産する、ヒト或いは動物に安全な多糖類を有功成分として含有する免疫賦活剤及び抗腫瘍剤、及び、該免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を含有させて、摂取或いは投与した場合にヒト若しくは動物などの免疫機能を賦活させることにより、免疫増強、生体機能の調節、保険強壮効果を発揮させ、更に、該免疫機能を賦活させることにより、抗腫瘍効果を発揮する医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料及び化粧品等を提供することにある。更に、本発明は、より優れた免疫賦活活性及び抗腫瘍活性を有し、かつ、その精製が容易であり、実用上その調製がし易い免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、先に、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナン、特に、ロドトルラ属に属する酵母が菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンであるβ−１，３−；β−１，４マンナンを見い出し、その製造方法を確立した（特開２００２−９５４９２号公報）。本発明者は、上記課題を解決すべく、免疫賦活活性を有する物質について鋭意探索する中で、このロドトルラ属に属する酵母が菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンが高い免疫賦活活性を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。該多糖類は、特にＢリンパ球の活性化に係わっており、既に、免疫賦活剤及び抗腫瘍剤として実用化されている同種の多糖類と比較して、優れた活性を有する。
【００１０】
本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤は、酵母が生産する多糖類を有効成分としているため、ヒト或いは動物に安全な免疫賦活剤及び抗腫瘍剤であり、該免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を用いて、ヒト若しくは動物などの免疫機能を賦活させることにより、免疫増強、生体機能の調節、保健強壮効果を発揮することができ、更に、該免疫機能を賦活させることにより、抗腫瘍効果を発揮することができる。
【００１１】
本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤は、ヒト若しくは動物などへの摂取あるいは投与に際して、各種製品に含有させて用いることができ、免疫賦活機能、更には抗腫瘍効果を有する医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料及び化粧品等として提供することができる。更に、本発明の多糖類は、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産する多糖類であり、特に、酵母が菌体外に生産するロドトルラ属に属する酵母が生産するβ−１，３−；β−１，４−マンナンのような場合は、従来の多糖類のように多糖類が菌体の構成成分からの抽出により取得するような場合に比較して、その精製が容易であり、その調製がし易いというような実用上の効果がある。
【００１２】
すなわち本発明は、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類を有効性分として含有することを特徴とする免疫賦活剤（請求項１）や、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類が、ロドトルラ属に属する酵母が生産する多糖類であることを特徴とする請求項１記載の免疫賦活剤（請求項２）や、ロドトルラ属に属する酵母が、ロドトルラ  ムシラギノーザであることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫賦活剤（請求項３）や、ロドトルラ属に属する酵母が、ロドトルラ  ムシラギノーザＹＲ−２株（ＦＥＲＭ  Ｐ１８０２４）であることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活剤（請求項４）や、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類が、β−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の免疫賦活剤（請求項５）や、β−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンが、平均分子量約１０、０００であることを特徴とする請求項５記載の免疫賦活剤（請求項６）や、Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−の繰り返し構造を有するβ−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナンからなる多糖類を有功成分としてなる免疫賦活剤（請求項７）からなる。
【００１３】
また本発明は、請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる免疫賦活活性を有する多糖類を有効成分とする抗腫瘍剤（請求項８）や、製薬学的に許容しうる担体と請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる免疫賦活活性を有する多糖類を含んでなる免疫賦活及び／又は抗腫瘍医薬組成物（請求項９）や、請求項１〜７のいずれか記載のβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類を含んでなる免疫賦活活性及び／又は抗腫瘍活性を付与した飲食品、飼料、又は化粧品（請求項１０）からなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の免疫賦活剤は、Ｂリンパ球活性化作用を有しており、免疫賦活、抗腫瘍剤として実用化されている公知のβ−１，３；１，６−グルカンよりも強い免疫賦活作用を有する。したがって、本発明により、安全性の高い天然多糖類からなる免疫賦活剤として、公知のβ−１，３；１，６−グルカンよりも優れた免疫賦活効果を発揮する免疫賦活剤、感染防御剤、及び抗腫瘍剤を提供することが可能となる。本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤は、各種疾病の予防、治療薬として、及び各種感染症に対する予防、治療薬として、薬剤の形でヒト或いは動物に投与することができるが、本発明の多糖類を各種製品に含有させて、例えば、免疫賦活活性、抗腫瘍活性を付与した、機能性飲食品、機能性飼料、又は機能性化粧品等として、摂取或いは投与することができる。
【００１５】
本発明において免疫賦活に用いる多糖類は、酵母が菌体外及び／又は菌体外に生産する多糖類であり、特に、ロドトルラ属に属する酵母が生産するβ−１，３；１，４−マンナンの場合は、菌体外に生産されるから、従来の天然多糖類のように、細胞膜のような菌体の構成成分から抽出されていた場合に比較して、その抽出精製が容易であり、その利用に際しての多糖類の調製がし易いという実用上の効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類を有効性分として含有する免疫賦活剤からなる。更に、本発明は、該β−１，３−結合を有するマンナンの免疫賦活機能により発揮される抗腫瘍効果に基づく抗腫瘍剤よりなる。
【００１７】
酵母が菌体内及び／又は菌体外に生産するβ−１，３−結合を有するマンナンからなる多糖類としては、ロドトルラ属（Rhodotorula）の酵母が生産するβ−１，３−結合を有するマンナンがあり（Can. J. Chem., 43:950, 1965）、特に、好ましい本発明の多糖類として、ロドトルラ ムシラギノーザ（Rhodotorula mucilaginosa）が菌体外に生産するβ−１，３−及びβ−１，４−結合を有するマンナン（β−１，３；β−１，４−マンナン）を挙げることができる（特開２００２−９５４９２号公報）。
【００１８】
該ロドトルラ ムシラギノーザが生産するβ−１，３；β−１，４−マンナン（以下「ＢＭ」という）は、分子内にβ−１，３−Ｄ−マンノピラノシド結合、及び、β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を交互に一個づつ持つ特異なマンナン、すなわち、Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−の繰り返し構造を有する式［１］
【００１９】
【化１】
2005060288.tif 000002
【００２０】
で表される多糖類であり、平均分子量約１０，０００、比旋光度−９３．４°のマンナンである。
【００２１】
該ＢＭを生産するロドトルラ属に属する酵母菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、ロドトルラ ムシラギノーザＹＲ−２株（ＦＥＲＭ Ｐ１８０２４）として寄託されている。
【００２２】
本発明のβ−１、３−結合を有するマンナンからなる多糖類を製造する方法としては、特開２００２−９５４９２号公報に開示した方法を例示することができる。すなわち、β−１、３−結合を有するマンナン生産能を有する酵母を培養して、培地中にβ−１、３―マンナンを生成・蓄積させ、これを単離・精製することにより、β−１、３−結合を有するマンナンを取得する。培地としては、固形培地や液体培地を用いることができるが、液体培地が特に好ましい。培養に使用する炭素源は、蔗糖を用いることができるが、その培地に対する添加量は、１０％Ｗ／Ｖが好ましい。炭素源の添加方法は、全量を一括、逐次的或いは連続的に添加することができる。
【００２３】
窒素源は、硫酸アンモニウムを用いることができ、培地に対する添加量は２％Ｗ／Ｖが好ましい。炭素源、窒素源の他に、微量のＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、７Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、ＮａＣｌ及び酵母エキスを添加することが望ましい。培養温度は、２５〜３０℃、好ましくは約３０℃であり、培養は、ｐＨ４．０〜７．０、好ましくは約６．０で開始し、その後、ｐＨ１．６〜２．０、好ましくは約１．８に保持する。
【００２４】
培養によって得られた液は、遠心分離後、珪藻土濾過により菌体を取り除き、更に、限外濾過による濃縮を経て、エタノールを２〜４倍量添加して粗精製のマンナンを得る。
【００２５】
本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤は、各種疾病の予防、治療薬として、及び各種感染症に対する予防、治療薬として、薬剤の形でヒト或いは動物に投与することができるが、本発明の多糖類を各種製品に含有させて、例えば、免疫賦活活性、抗腫瘍活性を付与した、機能性飲食品、機能性飼料、又は機能性化粧品等として、摂取或いは投与することができる。
【００２６】
本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を、薬剤の形でヒト或いは動物に投与するには、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、その投与量は、投与経路、投与時間，併用薬剤（例えば、ＭＭＣ、ＡＤＭ、５−ＦＵ、Ａｒａ−Ｃ、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン等の抗癌剤、或いは、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン等の免疫賦活剤等）、患者又はその対象となる疾病によって、適宜の量が定められる。
【００２７】
本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を、経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等に調製し、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等に調製することができる。製剤化の方法は、それ自体よく知られた方法で製剤化することができ、例えば、本発明のマンナンからなる多糖類と製薬学的に許容し得る担体若しくは希釈剤、更には、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、所望の剤形とすることができる。
【００２８】
また、本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を、飲食品中に配合して、機能性飲食品の形で、摂取或いは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。また、適宜、飲食品原料中に混合して飲食品を調製し、機能性飲食品として製品化することによって摂取することができる。また、本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を、化粧品等に配合して投与するには、適宜液状或いはクリーム状化粧品中に混合して機能性化粧品等として調製することができる。その場合、化粧品等の調製に際してよく知られている、可溶化剤、安定剤、乳化剤等を用いることができる。
【００２９】
更に、本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤を、飼料中に混合して、家畜などに投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、飼料としての用事（喫食時）に飼料に添加して投与することもできる。すなわち、本発明の免疫賦活剤及び抗腫瘍剤は、豚、鶏、牛、馬、羊などの家畜や、魚類、ペット（犬、猫、鳥）などの飼料に添加することにより、安全かつ生体防御調節機能を有する機能性飼料として用いることができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［試験例１］
試験例では、比較対照群としてβ−１，３；１，６−グルカン（以下「ＢＧ」という）（クレスチン：呉羽化学工業製造の商品名）を用いた。
ＩＣＲ雄性マウス各々６匹（週齢６〜７、体重３１〜３６．５ｇ）に、ＢＧ及びＢＭ（Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→３）−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシル−（１→４）−の繰り返し構造を有する本発明のβ−１，３；β−１，４マンナン）を、表１に示すように３００若しくは１０００ｍｇ／ｋｇ、また、コントロールとしては生理食塩水を、２８日間、経口投与した。２８日間のマウス体重の経時的変化を図１に示した。
【００３１】
【表１】
2005060288.tif 000003
【００３２】
図１に見るが如く、投与期間中、一般状態では各群とも異常が見られず、体重推移も各投与群間において差は見られなかった。
【００３３】
［試験例２］
試験例１において、投与２５日にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を静脈内投与して感作した後、投与期間終了後採血し、感作血清を用いてＳＲＢＣ凝集反応を行った結果を表２及び図２に示した。
【００３４】
【表２】
2005060288.tif 000004
【００３５】
表２及び図２に見るが如く、平均ＳＲＢＣ凝集価はコントロール群で３５倍、ＢＭ−３００群で２３倍、ＢＭ１０００群では６７倍、ＢＧ−１０００群で４３倍であり、ＢＭ−１０００群ではＳＲＢＣ凝集価の著しい増加が認められた。また、ＢＧに比べ、ＢＭの免疫賦活作用が強いことが認められた。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施例の試験において、マウスに本発明のマンナン多糖類ＢＭを投与した場合と、対照群として公知のグルカンＢＧを投与した場合の２８日間のマウス体重の経時的変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例の試験において、マウスに本発明のマンナン多糖類ＢＭ及び公知のグルカンＢＧを投与した後、２５日にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を静脈内投与して感作した後、感作血清を用いてＳＲＢＣ凝集反応を行った結果を示す図である。
【図１】
2005060288.tif 000005
【図２】
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