(57)【要約】      （修正有）【課題】アディポネクチンの体内産生を促進、増強する作用を有し、かつ安全で副作用のない薬剤を提供する。【解決手段】ウコン根茎を有機溶媒で抽出した抽出物やそれに含まれるクルクミンを用いるか、あるいはさらに、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンを併用して、アディポネクチンの体内産生を促進、増強するための薬剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ショウガ科ウコン属（Curcuma属）植物の根茎を有機溶媒で抽出して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強・促進剤。
【請求項２】
ウコン属（Curcuma属）植物の根茎を水蒸気蒸留した残渣を有機溶媒で抽出して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の有機溶媒抽出物をさらに活性炭に吸着させ、ついで親水性有機溶媒を含む疎水性有機溶媒で溶離して得られる溶離成分を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
【請求項４】
請求項１又２に記載の有機溶媒抽出物をシリカゲルに吸着させ、ついで親水性有機溶媒を含む疎水性有機溶媒で溶離して得られる溶離成分を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
【請求項５】
親水性有機溶媒がアセトンであり、疎水性有機溶媒がヘキサンである請求項３又は４に記載の薬剤。
【請求項６】
クルクミンを有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
【請求項７】
さらに、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1種以上を含有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
クルクミンと、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1種以上とを含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤の動物脂肪細胞におけるアディポネクチン産生促進、増強能をさらに活性化させる方法であって、これら薬剤と、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1つ以上を併用することを特徴とする、上記方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は  ショウガ科ウコン属（Curcuma属）植物の抽出物を有効成分とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強・促進剤、及び該薬剤をさらに活性化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞から放出され細胞間相互作用を媒介することにより生体の働きを制御するサイトカインの1つとして、最近アディポネクチンという蛋白質性因子が同定され、その不足が2型糖尿病や動脈硬化症等の生活習慣病の発症に密接に関連していることが明らかになった。  そして、直接的な注射投与や当該遺伝子を組みこんだアデノウイルスべクターの導入・発現で血中アディポネクチン濃度を増加させることにより、糖尿病モデルマウスの血糖値を低下させたり、動脈硬化につながる血管病変の形成を抑制できることが実験的に証明されている（非特許文献１〜３参照）。実際の応用でも、肥満の改善剤（特許文献１参照）、抗炎症剤、単球系細胞の増殖抑制剤（特許文献２参照）、肝繊維化抑制剤（特許文献３参照）等としてアディポネクチンを使用する方法が開発されている。このように、体外で生産されたアディポネクチンの投与も有用であるが、体内におけるその産生不良を改善したり、さらなる増強をはかることは、長期にわたる生活習慣病の予防と治療にとって非常に重要であると考えられる。
【０００３】
アディポネクチンは主として脂肪組織の脂肪細胞により産生される。脂肪細胞は中胚葉由来の前駆脂肪細胞からさまざまなホルモンの影響下で分化して生じる。実験的な分化の誘導は、インスリンと糖質グルココルチコイドの存在下に、cAMP分解酵素阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン（IBMX）（非特許文献４）、非ステロド系抗炎症剤のインドメタシン（非特許文献５参照）、2型糖尿病の治療薬であるチアゾリジンジオン類（TZD）（特許文献４、非特許文献６参照）、血管拡張剤のプロスタサイクリン（PGI2）（非特許文献７参照）等を作用させることにより行なわれるが、実際に分化した細胞によるアディポネクチンの産生が上記IBMXを用いたLoefflerらの研究やTZDを用いたMaedaらの研究において確認された。また、Maedaらの研究では糖尿病モデルマウスにおいてTZDを経口摂取させた群では摂取させていない群よりも血中アディポネクチン濃度が顕著に上昇したことが確認され、さらにヒトの場合でも耐糖能の低下している患者においてTZDの服用による血中アディポネクチン濃度の上昇が確認されている。
【０００４】
【非特許文献１】下村伊一郎他、実験医学、Vol．20，No．12，1762−1767（2002）
【非特許文献２】A．H．Berg et al., Nature Medicine，7，947−953（2001）
【非特許文献３】Y．Okamoto，Circulation，106，2767−2770（2002）
【非特許文献４】A．K．G．Loeffler，Horm．Metab．Res．，32，548−554（2000）
【非特許文献５】H．Ye et al．，Biochem．J., 330，803−809（1998）
【非特許文献６】N．Maeda et al．，Diabetes，50，2094−2099（2001）
【非特許文献７】R．Negrel et al．，Biochem．J., 257，399−405（1989）
【特許文献１】米国出願公開2002/0132773号明細書
【特許文献２】特開2000−256208号公報
【特許文献３】特開2002−363094号公報
【特許文献４】米国特許第6153432号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、体内のアディポネクチンレベルを上昇させる医薬品がすでに知られているが、いずれも安全性や副作用の点で問題がある。すなわち、IBMXは医薬品として認可されたものではないし、TZDは肝毒性が強いため、服用は医師の厳重なコントロール下にされねばならず、さらにインドメタシンやプロスタサイクリン等も本来別の薬理活性を持つ医薬品であるため、生活習慣病の予防や軽い段階での治療に簡単に用いられるものではない。従って、糖尿病や動脈硬化が急増しその対策が社会問題となっている現在、これらの生活習慣病の予防、治療に手軽に利用できる薬剤として、アディポネクチンの体内産生を促進、増強する作用を持つ安全な物質の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる状況において、本発明者は鋭意検討の結果、ウコン根茎の有機溶媒抽出物に目的の生物活性を発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）に係るものである。
（１）  ショウガ科ウコン属（Curcuma属）植物の根茎を有機溶媒で抽出して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強・促進剤。
（２）  ウコン属（Curcuma属）植物の根茎を水蒸気蒸留した残渣を有機溶媒で抽出して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
（３）  （１）又は（２）に記載の有機溶媒抽出物をさらに活性炭に吸着させ、ついで親水性有機溶媒を含む疎水性有機溶媒で溶離して得られる溶離成分を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
（４）  （１）又は（２）に記載の有機溶媒抽出物をシリカゲルに吸着させ、ついで親水性有機溶媒を含む疎水性有機溶媒で溶離して得られる溶離成分を有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
（５）  親水性有機溶媒がアセトンであり、疎水性有機溶媒がヘキサンである上記（３）又は（４）に記載の薬剤。
（６）クルクミンを有効成分として含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強・促進剤。
（７）  さらに、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1種以上を含有することを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の薬剤。
（８）  クルクミンと、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1種以上とを含有することを特徴とする、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生増強、促進剤。
（９）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載の薬剤におけるアディポネクチン産生促進、増強能をさらに活性化させる方法であって、これら薬剤と、テオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか1つ以上を併用することを特徴とする、上記方法
【発明の効果】
【０００７】
本発明のウコン抽出物あるいはその含有成分であるクルクミンは、動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生を増強ないし促進する。
一方、アディポネクチンの産生増強物質として知られている上記したＴＺＤ等の物質は、安全性、副作用の問題を抱えているのに対し、ウコンは、従来から、カレー粉の原料として、あるいは健康増進剤として、喫食あるいは服用されていたものであり、本発明の薬剤は極めて安全性が高いものといえる。
さらに、上記したように、アディポネクチンは、インスリンが産生されているにもかかわらず血糖値が低下しないいわゆる生活習慣病の２型糖尿病を予防、治療する効果を有するが、これのみでなく動脈硬化につながる血管病変の抑制、肥満改善、抗炎症、単球系細胞の増殖抑制、肝繊維化抑制等、多くの重要な生理作用を有するものであり、本発明により提供される薬剤は、安全で極めて有用な薬剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ウコン根茎はカレー粉の原料として世界的に広く食用とされ、さらに中国や我が国では薬用植物として古くから利用されてきたため、ウコン抽出物の安全性は高い。
本発明においてはウコン（学名Curcuma longa）の根茎あるいはその水蒸蒸留残渣をエチルアルコール等の有機溶媒で抽出したエキスはそれ単独で、もしくはテオフィリンやカフェインの共存下で、ヒトやマウスの前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を促進し、それに伴いこれらの動物脂肪細胞におけるアディポネクチンの産生も促進・増強する。
このようなウコン抽出物のアディポネクチン産生増強作用は、粗抽出物を活性炭処理やシリカゲルカラムクロマトグラフィーの処理で分画することにより濃縮される。また、このような処理によって当該活性を阻害、抑制するような成分も除かれる。
【０００９】
このような本発明におけるウコン抽出物のアディポネクチン産生増強作用はテオフィリン、カフェイン、テオブロミン等、茶やコーヒーに通常含まれるキサンチン誘導体を併用することにより一層増大するが、これは本発明の重要なポイントの1つである。
これらキサンチン誘導体は平滑筋弛緩、中枢神経興奮、利尿など多彩な生理作用を示すが、生化学的には生体内セカンドメッセンジャーのcAMPを分解するホスホジエステラーゼを阻害することが知られている。アディポネクチン遺伝子のプロモーター部分にはC/EBP結合モチーフが多数存在する（Das et al．，Biochem．Biophys．Res．Commun．，280，1120−1129（2001）；Schaeffler et al．，Biochem．Biochim．Acta，1399，187−197（1998）；Saito et al．，Gene，229，67−73(1999））ことから考えて、C/EBPの発現増加と活性化に寄与するcAMPの分解を抑制し体内レベルを上昇させればアディポネクチン遺伝子の転写も促進されるのではないかと予想される。この発想に基づいて既知のcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤の中で、通常の食物に含まれる化合物としてテオフィリン等を取り上げて検討した結果、これらのキサンチン誘導体とウコン抽出物の組み合わせが培養細胞におけるアディポネクチンの産生増強に著効を示すことを見出した。
【００１０】
一方、このエキスを各種のカラムクロマトグラフイーで分画したところ、マウス3T3−Ll細胞に対する脂肪蓄積促進活性は複数のフラクションに現れたが、その1つのフラクションにはクルクミン（ジフェルロイルメタン）が含まれていた。クルクミンはウコンやカレー粉の黄色のもとになる色素であるが、強力な抗酸化作用（特開2003−064360）を持つと共に、抗糖尿病・抗うつ病・抗腫瘍・抗炎症作用等を持つ生理活性物質であることが明らかにされ（特開2003−128539、特開2003−113117、特開2003−055202、Chan et al．，Biochem．Pharmacol．，55，1955−1962（1998））市販もされている。そこで、クルクミンの純品を用いて培養細胞におけるアディポネクチン産生促進作用を検討した結果、クルクミンとテオフィリンやカフェインの併用によりアディポネクチンの産生が増大することを見出し、課題を解決する手段の1つになることを明らかにした。ただし、ウコン抽出物に含まれるアディポネクチン産生増強活性はクルクミンのみによるものではなく、他の未知成分も関与している可能性が強い。
【００１１】
本発明の原料となるウコン根茎としては、秋ウコンと称される狭義のウコン（Curcuma longa）の他、春ウコン（キョウオウ、Curcuma aromatica）、紫ウコン（ガジュツ、Curcuma zedoaria）等の根茎が用いられる。これらは亜熱帯地域や沖縄県などで商品作物として栽培されているが、本発明に用いる場合、産地はとくに限定されない。
【００１２】
また、これらの根茎の収穫時期は食用、薬用等の目的で従来収穫されてきた時期とする。収穫された新鮮根茎はそのままでもエタノール等で当該活性成分を抽出することができるが、薄切り後、陰干し等で乾燥させたものや、それをさらに細断・粉砕したものが抽出効率の点からは好適である。また、ウコン粉末等から水蒸気蒸留等で精油を採取した残渣も原料に用いることができる。抽出に用いる溶媒としてはエタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル等が挙げられ、これらを乾燥ウコン根茎スライス・粉末の1グラムあたり3 mlから30 ml程度添加し、攪拌もしくは密栓静置して抽出する。パーコレーター等の公知の抽出器具を用いることもよい。抽出時間は溶媒の種類、原料の形態、原料／溶媒の量比、攪拌の有無、温度等によりさまざまに異なり、場合に応じて適当な条件を選択する。例えば乾燥スライスを5倍量のエタノールに沈積して静置しておく場合、2週間程度で目的活性は十分に抽出される。また、乾燥粉末を10倍量のエタノールと共に室温で攪拌するなら一昼夜で抽出される。
【００１３】
このようにして得られた抽出物はロータリーエバポレーター等で濃縮し、溶媒を減圧下に除く。この残液はこのままでもアディポネクチン産生促進・増強物質として用いられるが、より好ましくは活性炭処理やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の手段で不要成分や活性阻害成分を除いてから用いるのがよい。例えば、粗抽出物の濃縮エキスを酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒で再抽出し、活性炭に吸着させる。非吸着成分をヘキサンで洗い去り、吸着成分を5％から50％のアセトンを含むへキサンで溶離回収したものは粗抽出物よりも強い活性を示す。また、乾燥根茎粉末をあらかじめヘキサンで抽出後、5％から100％のアセトンやエタノールを含むヘキサンで抽出しても、阻害成分を除いて力価を高めたアディポネクチン産生増強物質が得られる。さらに、粗抽出物をシリカゲルに吸着させ、ヘキサンないしは数％のアセトンを含むヘキサンで洗浄後、吸着成分を5％から70％のアセトンを含むヘキサンで溶出させても力価を高めることができる。ただし、上述の精製法は例示であって、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
これらの抽出物、溶出物は溶媒を減圧で除去後、アディポネクチンの産生増強に用いられるが、その方法として、エタノールに溶解し飲用水に添加する方法、適当なリン脂質等の界面活性剤を含む水に懸濁し飲用水や食物に添加する等の他、適当な補助剤と混合し錠剤の形で利用する方法等が挙げられる。これらのウコン抽出物に代え、その当該活性成分の1つであるクルクミンを用いる場合、クルクミンはウコン抽出物からクロマトグラフィー等公知の方法で製取することもできるし、公知の方法で化学合成も容易にできる。
【００１５】
一方、これらのウコン抽出物と組み合わせてアディポネクチンの産生をさらに増強するために使用するキサンチン誘導体はテオフィリン、カフェイン、もしくはテオブロミンのいずれか１つまたは2つ以上の混合物である。これらは茶葉やコーヒー豆、カカオ豆等から抽出できるし、公知の方法で容易に合成もできる。本発明に用いる場合、これらはウコン抽出物に混合してもよいし、単独で飲用水等に添加し、ウコン抽出物を含む飲用水等の摂取後、引き続いて飲用摂取することにより利用してもよい。本発明に用いる場合のウコン抽出物の添加量は精製の方法や程度により加減する。ウコン抽出物に代えて、その当該活性成分の1つであるクルクミンを利用する場合の添加量は飲用水の1 mlもしくは食物の1 gあたり1 mgから10 mg以下を目安にする。キサンチン誘導体の添加量については常用されるコーヒーや緑茶に含まれる濃度に準ずるものとする。すなわち、カフェインは飲用水の1 mlもしくは食物の1 gあたり0．1 mgから0．5 mg（約3 mM）、テオフィリンは飲用水の1 mlもしくは食物の1 gあたり0．01 mgから0．05 mg（約0．3 mM）、テオブロミンは飲用水の1 mlもしくは食物の1 gあたり0．1 mgから2 mg（約10 mM）等を目安にするが、総摂取量や摂取形態に応じて、生理的に安全な範囲内で適宜増減する。
次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００１６】
ウコン根茎の乾操スライス31 gをエタノール160 mlに浸漬し、1ヶ月暗所に静置した。エタノール溶液をデカンテーションで回収し、根茎を少量のエタノールで洗浄した。上記の溶液と洗液を合し、ロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、粗抽出物1．42 g（Sample１−１）を液体として得た。
【実施例２】
【００１７】
実施例1で得た粗抽出物の1．4 gを2 mlの酢酸エチルに溶解し、ヘキサン100 mlを加えた。沈殿を濾別し、濾液に1 gの活性炭と2 gのセライトを添加し、よく混合した。目の細かいガラスフィルターを用いて活性炭とセライトを含む固形分を濾集し、それを2％、20％、及び50％のアセトンを含むヘキサン各50 mlで順次抽出した。これらの濾液、抽出液をそれぞれロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾操し、油状物0．896 g（活性炭非吸着分、Sample2−1）、60 mg（2％アセトン溶出分、Sample 2−2）、119 mg（20％アセトン溶出分、Sample 2−3）、及び64 mg（50％アセトン溶出分、Sample2−4）をそれぞれ得た。
【実施例３】
【００１８】
ウコン根茎の乾燥粉末10 gを50 mlのへキサンと混合し、マグネチックスターラーで室温において12時間攪拌した。ウコン粉末を濾集し、5％、10％、30％、及び50％のアセトンを含むへキサン50 mlづつで順次抽出した。これらの濾液、抽出液をそれぞれロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、油状物0．492 g（へキサンのみでの溶出分、Sample3−1）、56 mg（5％アセトン溶出分、Sample  3−2）、32 mg（10％アセトン溶出分、Sample 3−3）、49 mg（30％アセトン溶出分、Sample 3−4）、及び48 mg（50％アセトン溶出分、Sample 3−5）をそれぞれ得た。
【実施例４】
【００１９】
春ウコン（キョウオウ）根茎の乾燥粉末20 gをエタノール100 mlと混合し、マグネチックスターラーで室温において36時間攪拌した。ウコン粉末を濾別しエタノール溶液をロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、粗抽出物1．09 g（Sample 4−1）を得た。この1.0 gを2 mlの酢酸エチルに溶解し、ヘキサン100 mlを加えた。沈殿を濾別し、濾液に0．75 gの活性炭と2 gのセライトを添加し、よく混合した。目の細かいガラスフィルターを用いて活性炭とセライトを含む固形分を濾集し、それを5％、20％、及び50％のアセトンを含むヘキサン各50 mlで順次抽出した。これらの濾液、抽出液をそれぞれロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、油状物259 mg（活性炭非吸着分、Sample4−2）、75 mg（5％アセトン溶出分、Sample４−3）、96 mg（20％アセトン溶出分、Sample4−4）、及び107 mg（50％アセトン溶出分、Sample4−5）をそれぞれ得た。
【実施例５】
【００２０】
紫ウコン（ガジュツ）根茎の乾燥粉末20 gをエタノール100 mlと混合し、マグネチックスターラーで室温において36時間攪拌した。ウコン粉末を濾別しエタノール溶液をロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、粗抽出物0．66 g（Sample 5−1）を得た。この0．65 gを実施例4と同様に処理し、油状物152 mg（活性炭非吸着分、Sample5−2）、22 mg（5％アセトン溶出分、Sample 5−3）、45 mg（20％アセトン溶出分、Sample5−4）、及び50 mg（50％アセトン溶出分、Sample 5−5）をそれぞれ得た。
【実施例６】
【００２１】
ウコン根茎乾燥粉末を水蒸気蒸留した残渣10 gを50 mlのエタノールと混合し、室温においてマグネチックスターラーで6時間攪拌した。残渣を濾別しエタノール溶液をロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、粗抽出物0．92 g（Sample 6−1）を得た。この0．9 gを実施例4と同様に処理し、油状物767 mg（活性炭非吸着分、Sample 6−2）、92 mg（2％アセトン溶出分、Sample 6−3）、80 mg（20％アセトン溶出分、Sample 6−4）、28 mg（50％アセトン溶出分、Sample 6−5）、45 mg（100％アセトン溶出分、Sample 6−6）、及び25 mg（100％エタノール溶出分、Sample 6−7）をそれぞれ得た。
【実施例７】
【００２２】
ウコン根茎乾燥粉末を水蒸気蒸留した残渣10 gを100 mlのへキサンと混合し、室温においてマグネチックスターラーで6時間攪拌した。残渣を濾集し、5％、10％、30％、及び50％のアセトンを含むヘキサン100 mlづつで順次抽出した。これらの濾液、抽出液をそれぞれロータリーエバポレーターで濃縮後、オイルポンプで減圧乾燥し、油状物1.0 g（へキサンのみでの溶出分、Sample 7−1）、115 mg（5％アセトン溶出分、Sample 7−2）、35 mg（10％アセトン溶出分、Sample 7−3）、70 mg（30％アセトン溶出分、Sample 7−4）、47 mg（50％アセトン溶出分、Sample 7−5）、及び24 mg（100％アセトン溶出分、Sample 7−6）をそれぞれ得た。
【実施例８】
【００２３】
実施例7で得た30％アセトン溶出分（Sample 7−4）の57 mgをシリカゲルカラム（Wakogel C300、2 x15 cm）に吸着させ、10％から100％のアセトンを含むヘキサン50 mlづつで溶離した。溶出液は1／3づつフラスコに集め、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞を用いたバイオアッセイ（後述）において脂肪蓄積活性の強かった50％アセトン溶出物の主成分である黄色化合物を薄層クロマトグラフィーで検討した結果（シリカゲル、アセトン：へキサン＝2：3の混合溶媒で展開、Rf 0.55）、Rf値、波長365 nmのUVランプ照射下での黄色蛍光、１０％濃硫酸を含むエタノール溶液をスプレー後、加熱した時の橙色蛍光等すべての点でクルクミンの純品[BIOMOL Research Inc. 社 (Plymouth Meeting, PA, U.S.A.)製]のスポットと一致したことにより、クルクミンと同定した。
【実施例９】
【００２４】
マウス３T3-L1前駆脂肪細胞株（大日本製薬株式会社より購入）を１０％の牛胎仔血清を含むDMEM培地で3日間前培養後、EDTA-トリプシン液で回収し、8.3 x 104 cells/mlの懸濁液とし0.2 mlづつ96-wellのプレートに植え込んだ。５％のCO2存在下、３７℃で2日間培養後、実施例６，７で得たウコン抽出物を50 mg/mlのエタノール溶液とし、2μl/wellで各ウェルに添加し、さらに12日間培養を継続した。培地をアスピレーターで吸引除去し、１％ホルムアルデヒドを含むPBSの0.1mlづつを各ウェルに入れ、細胞を固定した。室温で30分固定後、水洗し、次いで５０％２−プロパノールで洗浄後（0.1 ml/well）、Oil  Red  O(ORO)溶液(Ramirez-Zacarias et al., Histochemistry, 97, 493 − 497 (1992))を入れ細胞内脂肪滴を染色した。1時間室温に放置後、色素液をアスピレーターで除去し、５０％２−プロパノール含有水、次いで水で洗浄し、1時間風乾した。１００％ ２−プロパノールを0.1 ml/wellで添加し、細胞内脂肪滴に取り込まれたORO色素を抽出し、プレートリーダー（波長510nm）を用いて吸光度を測定した。結果を図１に示すが、脂肪細胞分化の指標となる細胞内脂肪の蓄積がウコン抽出物、粗精製物により促進されていることがわかる。
【実施例１０】
【００２５】
実施例9と同様にして前培養したマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞を7 x 104  cells/mlの懸濁液とし、あらかじめコラーゲンコーティングを施した12−wellのマルチウェルプレートに1ウェルあたり2 ml植え込んだ。3日間培養後、培地（10％の牛胎仔血清を含むDMEM培地）の新鮮培地（2 ml／well）に交換し、実施例1〜7で得たウコン抽出物、粗精製物のうち、実施例9の結果に基づいて選択した代表的なサンプルのエタノール溶液（2〜5 μ1）を添加した。添加量は以下の通りである：実施例1のウコン抽出物（Sample l−1）、200 μg；実施例2の2％アセトン溶出分（Sample 2−2）、120 μg；実施例3の10％アセトン溶出分（Sample 3−3）、60 μg；実施例4の春ウコン抽出物（Sample 4−1）、44 μg；実施例4の5％アセトン溶出分（Sample 4−3）、35μg；実施例5の紫ウコン5％アセトン溶出分（Sample  5−3）、44μg；実施例6のウコン根茎水蒸気蒸留残渣抽出物の活性炭処理20％アセトン溶出分（Sample 6−4）、150μg；実施例7のウコン根茎水蒸気蒸留残渣30％アセトン溶出分（Sample 7−4）、180μg。  コントロールには純エタノールを2〜5 μ1添加した。7日間から10日間培養し、位相差顕微鏡による観察で細胞内脂肪球の発達が十分認められた段階で培地を捨て、PBS（1 ml/well）で2回洗浄後、各ウェルの細胞を1 mlのPBSと共にセルスクレーパーで剥がし、遠心分離（10000 rpm、6分）で集めた。上清を捨て、各チューブの細胞を1％のTween20を含む1ysis緩衝液の100 μ1と共にピペッティングし、次いでボルテックス処理で破壊・抽出した。これを遠心分離にかけ（12000 rpm、20分）上清を回収し、蛋白濃度を測定した。この上清中の蛋白濃度が１mg/mlになるようlysis緩衝液で希釈し、その５０μｌを２ｘ SDS緩衝液の５０μlとよく混和し、  ９５℃で５分間加熱しSDS処理を施した。このサンプルの５μlづつをポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ、常法によりウェスタンブロッティングでマウスのアディポネクチンを検出した。用いた1次抗体はケミコン社製のmouse anti−adiponectin，mouse monoclonal antibody （Catalog No．MAB3608）であり、2次抗体はZymed社製のrabbit anti−mouse Ig Gl−HRP conjugate（Catalog No．61−0120）である。バンドの検出にはPharmacia社製ECL測定キットを用いた。さらに、比較のためβ−アクチンもウェスタンブロッティングで検出したが、用いた1次抗体はSanta Cruz社製のanti-β-actin（C-11，sc-1615）であり、2次抗体はZymed社製のrabbit anti−goat Ig G（H＋L）-HR conjugate（Catalog No.81−1620）である。結果を図2、図3、及び図4に示す。図2から各種ウコン属植物根茎抽出物やその粗精製物にマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞より分化した脂肪細胞のアディポネクチン産生を増強する作用のあることがわかる。また、図3から当該産生増強作用は濃度依存性があり、実施例6で得た粗精製物（Sample 6−4、すなわち活性炭から20％ acetone/hexane混合溶媒で溶出される分画）の場合には、75 μg/ml前後の濃度で添加することが適当であることがわかる。
さらに、図4から当該産生増強作用は時間依存性があり、前記Sample 6−4の場合には、サンプル添加・培養開始後11日目前後にアディポネクチンの産生は最高になることがわかる。
【実施例１１】
【００２６】
アディポネクチン遺伝子発現の増強をRT−PCRで確認した。実施例9と同様にして前培養したマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞を4 ｘ 104 cells/mlの懸濁液とし、あらかじめコラーゲンコーティングを施した12−Wellのマルチウェルプレートに1ウェルあたり2 ml植え込んだ。3日間培養後、培地（10％の牛胎仔血清を含むDMEM培地）を新鮮な培地（2 ml／well）に交換し、実施例6で得たウコン根茎水蒸気蒸留残渣抽出物の活性炭処理20％アセトン溶出分のエタノール溶液（4μ1；抽出物106、159、212μg含有）を添加した。コントロールには純エタノールを4 μ1添加した。12日間培養し、位相差額微鏡による観察でサンプル添加ウェルにおいて細胞内脂肪球の発達を確認後培地を捨て、PBS（1ml／well）で1回洗浄後、各ウェルの細胞を0．3 mlのイソゲン（和光純薬製）と混和しRNAを抽出した。製造元から添付の説明書にしたがってDNAと蛋白質を除き、全RNAをイソプロピルアルコールで沈殿させ、エタノールで洗い、風乾後、10 μ1の水に溶かし、RNA量を260／280nmにおける吸光度から求めた。このRNAをプロメガ社の逆転写酵素システムでcDNAとし、このテンプレートを用いてアディポネクチン遺伝子発現をPCRで確認した。用いたプライマーは次の通りである：マウスアディポネクチン、5’一AAGGACAAGGCCGTTCTCT−3’及び5’−TATGGGTAGTTGCAGTCAGTTGG−3’；対照用のβ−アクチン、5’−GACGAGGCCCAGAGCAAGAGA−3’及び5’−TAGATGGGCACAGTGTGGGTGA−3’。PCRはアプライドシステムズ社製のAmpli Taq DNA Polymeraseを用い、添付のマニュアルに従って行なった。変性は94℃で1分、アニーリングは64℃で1分、重合は72℃で1分間行ない、全部で30回繰り返した。PCR産物の電気泳動結果を図5に示す。予想サイズ（アディポネクチンで219bp、アクチンで332bp）のバンドが見られ、サンプルを添加して培養した細胞では明らかにバンドの強度（アディポネクチン遺伝子の発現量）がコントロールよりも増加している。
次いでこの結果を定量PCRで確認した。コルベット社製のRotor−Gene 2000 Real−Time Cyclerを用い、Qiagen社製のQuantiTect SYBR Green PCRシステムでβ−アクチンに対するアディポネクチンの遺伝子の相対的な発現量を定量した。プライマーは上記と同様である。結果を図6に示す。サンプルの添加により、アディポネクチンの遺伝子発現は7倍ないしは40倍に増強されることがわかる。
【実施例１２】
【００２７】
マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞株を10％の牛胎仔血清を含むDMEM培地で3日間前培養後、1．3 x 104個の細胞を含む0．2 mlづつの懸濁液を96−Wellプレートに植え込んだ。3日間培養後、培地を0、20、100、400μMのカフェイン、100、400μMのテオブロミン、もしくは100、400μMのテオフィリンを含む上記新鮮培地0．2 mlづつに交換し、次いで実施例2で得たウコン抽出粗精製物（50 mg/mlのエタノール溶液）を2 μ1/wellで各ウェルに添加し、さらに12日間培養を継続した。培地をアスピレーターで吸引除去し、1％ホルムアルデヒドを含むPBSの0．1 mlづつで細胞を固定後、Oil Red O（ORO）溶液で細胞内脂肪滴を染色し、さらに細胞核をギムザ試薬で染色した。染色された細胞の顕微鏡写真を図7に示す。脂肪細胞分化の指標となる脂肪蓄積促進作用がウコン抽出物に加えて100μM以上のカフェイン、テオブロミン、もしくはテオフィリンを加えるとさらに一層増強されることがわかる。
【実施例１３】
【００２８】
実施例9と同様にして10％の牛胎仔血清を含むDMEM培地を用いて前培養したマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞を7 x 104  cells/mlの懸濁液とし、あらかじめコラーゲンコーティングを施した12−Wellのマルチウェルプレートに1ウェルあたり2 ml植え込んだ。3日間培養後、培地を400μMのテオフィリンを含む新鮮培地もしくは含まない新鮮培地（2 ml/well）に交換し、次いで10、20、又は30 nmolのクルクミンを含むエタノール溶液もしくは実施例４で得た粗抽出物を11 mg/mlで含むエタノール溶液を４μlづつ添加した。コントロールには純エタノールを4μ1添加した。10日間培養後、実施例10と同様に細胞を回収し、1ysis緩衝液で抽出した蛋白質をSDS処理、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行いウェスタンブロッティングでアディポネクチンを検出した。結果を図8に示すが、テオフィリンがウコン抽出物やクルクミンによるアディポネクチン産生増強をさらに強化することがわかる。
【実施例１４】
【００２９】
正常ヒト前駆脂肪細胞（三光純薬製）を10％のFBSと2 mMグルタミンを添加したPBM培地（PBM増殖培地、PBMは三光純薬製）で4日間前培養後、細胞をEDTA−トリプシン液で回収し、PBM増殖培地に4 x 104  cells/mlの割合で懸濁し、あらかじめコラーゲンでコートした12−wellプレートに2 mlづつ植え込んだ。5％のCO2存在下、37℃で3日間培養後、培地をPBM分化培地[PBM増殖培地にインスリン（10 μg/ml）とデキサメタゾン（0.1 μM）を添加した培地]に交換した（2 ml/well）。この培養物に20 mMのテオフィリン水溶液を最終濃度500μMになるように添加し、次いで実施例1で得たウコン粗抽出物（Sample l−1、200 μg）、実施例2又は６で得た粗精製物（Sample 2−2、100 μg又はSample ６−４、212 μg）、またはクルクミン（20 nmol）を4μ1のエタノール溶液として添加した。コントロールには4 μ1のエタノールのみを添加した。また、別なウェルにはテオフィリンを入れず、同量の水（50μ1）を入れ、後は上記と同様にサンプルを添加した。14日間インキュベート後、テオフィリンに加えてサンプルまたはクルクミンを添加したウェルでは細胞内に著明な脂肪球が形成されていることを位相差顕微鏡で確認した。顕微鏡写真を図9に示す。同様の条件下で96-wellプレートで培養・処理した細胞をホルマリン固定後ORO試薬とGiemsa試薬で染色したサンプルの顕微鏡写真（図１０）からも、テオフィリンとクルクミンを同時に添加した場合に脂肪細胞が顕著に増加していることが確認された。次いで12-wellプレートの培養物について培地を吸引除去し、PBSで2回洗浄後、実施例10と同様にして細胞を回収し、1ysis緩衝液で抽出処理した。抽出液は蛋白濃度を測定後、蛋白質として約１ mg/ml（図１１のレーン１〜９用サンプルの場合）又は0.7 mg/ml（同図のレーン１０〜１２用サンプルの場合）の濃度でSDS処理し、それらのサンプルの５μlづつをポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ、ウェスタンブロッティングでアディポネクチンとβ−アクチンを検出した。1次抗体としてケミコン社製のhuman anti−adiponectin，mouse monoclonal antibody (Catalog No.MAB3604)を用いた以外は実施例10と同じ抗体を用いた。結果を図11に示す。テオフィリンに加えてウコン抽出サンプルまたはクルクミンを添加した場合にアディポネクチンの産生が増強されている。
【実施例１５】
【００３０】
正常ヒト前駆脂肪細胞を用い、テオフィリンの代わりに500 μMのカフェインを用いた以外には実施例14と同様に実験を行ない、カフェインの共存下におけるウコン抽出物またはクルクミンによるアディポネクチン産生増強を確認した。結果を図12に示す。なお、本図の電気泳動において添加したサンプル量は蛋白質として7.5μg（レーン３〜８）又は5μg（レーン１、２、9〜14）である。また、カフェインの濃度を100 μMに下げて同様の実験を行ない、この濃度においてもカフェインとクルクミンの共存によりアディポネクチンの産生が増強されることを確認した。結果を図１３に示す。本図の電気泳動において添加したサンプル量は蛋白質として各レーン5μgである。さらに、クルクミンの濃度を３、１０、１５ μMの３段階として実験を行ない、カフェインの共存下において、アディポネクチン産生増強はクルクミン濃度に依存するが、１０ μM前後が最も適当であることを確認した。結果を図１４に示す。本図の電気泳動において添加したサンプル量は蛋白質として各レーン3.8μgである。なお、図１４の実験では異なる濃度においてもクルクミンとカフェインに相乗効果のあることが確認される。
【実施例１６】
【００３１】
正常ヒト前駆脂肪細胞を用い、PBM分化培地にデキサメタゾンの代りにコルチゾール（別名ヒドロコーチゾン、0．１μM）を添加した以外には実施例14と同様に実験を行ない、蛋白質として4μgづつのサンプルを電気泳動にかけ、ウコン抽出物またはクルクミンによるアディポネクチン産生増強を確認した。結果を図15に示す。
【実施例１７】
【００３２】
正常ヒト前駆脂肪細胞を実施例14と同様に4日間前培養後、細胞をEDTA−トリプシン液で回収し、PBM増殖培地に4ｘ104  cells/mlの割合で懸濁し、あらかじめコラーゲンでコートした96−wellプレートに0．2 mlづつ植え込んだ。3日間培養後、培地をPBM増殖培地にインスリン（10 μg/ml）と0．1 μMのデキサメタゾン又はヒドロコーチゾン、及び500 μMのカフェイン又はテオブロミンを添加した培地に交換した（0．2 ml/well）。これらの培養物に実施例2で得た活性炭処理2％アセトン溶出分のエタノール溶液（5 mg/ml）、クルクミン（1 mM、エタノール溶液）またはエタノールを2 μ1づつ添加した。12日間インキュベート後、サンプルまたはクルクミンを添加したウェルでは細胞内に著明な脂肪球が形成されていることを位相差顕微鏡で確認した。次いで、培地を吸引除去後、1％ホルムアルデヒド−PBS（＋＋）溶液で固定、0．2％Triton X 100−PBS（＋＋）溶液で細胞膜透過性処理、2％ BSA−10％正常ヤギ血清入りPBS（＋＋）でブロッキング処理を順次行なった後、anti−human adiponectin入り2％ BSA−PBS（＋＋）で1次抗体反応を37℃において1時間行なった。細胞をPBS（＋＋）で繰返し洗浄後、Sigma社製のFITC−Conjugated anti−mouse IgG (Catalog No. F0257)を含む2％ BSA−PBS（＋＋）で2次抗体反応を1時間行い、洗浄後、蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡写真を図16に示す。サンプルをテオフィリン、カフェインまたはテオブロミンと共に添加した湯合に脂肪蓄積細胞が出現するが、それらの細胞が抗体を介して結合したFITCによる強い緑色蛍光を発していることから、アディポネクチンを発現していることが確認された。
【実施例１８】
【００３３】
正常ヒト前駆脂肪細胞を用い、PBM増殖培地にインスリン（10 μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾンを添加した基本分化培地にさらに下記の化合物、サンプルを添加した培地中で13日間培養した。培地を除去、洗浄後、各ウェルの細胞をイソゲン0.3 mlで抽出した。実施例11と同様にRNAを精製、RT-PCRを行ないアディポネクチン遺伝子の発現を確認した。ヒトアディポネクチンのプライマーは文献（Yokota  et al., J. Clin. Invest., 109, 1303 − 1310 (2002)）に記載の5‘−TGTTGCTGGGAGCTGTTCTATG−3’及び5‘−ATGTCTCCCTTAGGACCAATAAG−3’を用い、β−アクチンのプライマーは実施例11と同じもの（マウス、ヒト共通部分）を用いた。PCRの条件は、アディポネクチンについてアニーリングを６０℃で行ない、３５回増幅を繰返した以外は実施例１１に記載したところと同様である。PCR産物を電気泳動で分析した結果を図１７に示す。培養時に基本分化培地に添加した化合物・サンプルは以下の通りである：レーン１と２、 200μMインドメタシン＋500μM  IBMX（ポジティブコントロールとして使用）；レーン３と４、500μMカフェイン＋エタノール（2μl）；レーン５と６、500μMカフェイン＋10μMクルクミン；レーン７と８、エタノール（コントロール用、２μl）；レーン９と１０、10μMクルクミン；レーン１１と１２、エタノール（コントロール用、２μl）；レーン１３と１４、10μMクルクミン；レーン１５と１６、500μMテオフィリン＋エタノール（2μl）；レーン１７と１８、500μMテオフィリン＋10μMクルクミン。この結果からクルクミンとカフェイン又はテオフィリンの相乗作用によりヒトアディポネクチン遺伝子の発現が促進・増強されていることがわかる。さらに、実施例１１と同様にこの結果を定量PCRで確認した。コルベット社製のRotor−Gene 2000 Real−Time Cyclerを用い、Qiagen社製のQuantiTect SYBR Green PCRシステムでβ−アクチンに対するアディポネクチンの遺伝子の相対的な発現量を定量した。プライマーは上記と同様である。その結果、アディポネクチンの遺伝子発現はコントロール（レーン１１と１２に相当）に比べて、10μMクルクミンの添加で2倍ないしは4.2倍に、500μMカフェインと10μMクルクミンの同時添加で12.6倍、500μMテオフィリンと10μMクルクミンの同時添加で36.6倍に増強されることを確認した。
【実施例１９】
【００３４】
正常ヒト前駆脂肪細胞を、PBM増殖培地にインスリン（10μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾン又は0.1μMのヒドロコーチゾンを添加した基本分化培地にさらに下記の化合物、サンプルを添加した培地中で14日間培養した。培地を除去、洗浄後、各ウェルの細胞をイソゲン0.3mlで抽出し、実施例１８と同様にアディポネクチン遺伝子の発現をRT-PCRで確認した。結果を図１８に示す。培養時に基本分化培地に添加した化合物・サンプル：レーン１と２、 500μMテオフィリン＋エタノール（コントロール用、3μl）；レーン３と４、500μMテオフィリン＋10μMクルクミン；レーン５と６、200μMインドメタシン＋500μM IBMX（ポジティブコントロール）；レーン７と８、500μMテオフィリン＋エタノール（3μl）；レーン９と１０、500μMテオフィリン＋実施例６で得た粗精製物(Sample6-4、75μg/ml)。ただし、グルココルチコイドとしてはレーン１、２、３、４の細胞には0.1μMのヒドロコーチゾン、その他のレーンの細胞には0.1μMのデキサメタゾンを使用した。図１８の結果から、グルココルチコイドがヒドロコーチゾンの場合にもクルクミンとテオフィリンの併用によりヒトアディポネクチン遺伝子の発現が促進、増強されることがわかる。また、ウコンの粗抽出物でも同様にヒトアディポネクチン遺伝子の発現を促進、増強することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例6と7で得られたウコン抽出物またはその粗精製物を添加して培養した時の細胞内脂肪蓄積量をORO法で測定した結果を示すグラフである。Controlには溶媒（エタノール）のみ添加した。サンプルの番号についての説明は実施例6と7に記載のところと同様である。
【図２】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例1から7で得られたサンプルを添加して培養した時のアディポネクチンの産生をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。同一のサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示す。用いたサンプルの1はコントロールとして溶媒のエタノール、2と3はそれぞれ実施例4で得た粗抽出物（Sample 4−1）と活性炭吸着・5％アセトン溶出分（Sample 4−3）、4は実施例5で得たSample 5−3、5は実施例1で得た粗抽出物（Sample1-1）、6は実施例2で得たSample 2−2、7は実施例3で得たSample 3−3、8は実施例6で得たSample 6−4、9は実施例7で得たSample 7−4である。
【図３】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例6で得たSample 6−4を濃度を変えて添加し培養した時のアディポネクチンの産生をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。濃度は図中に示してある。各濃度について3つづつのウェルを使用して実験した。ただし、濃度0はコントロールとしてエタノールのみ（3μ1）を添加した。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図４】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例6で得たSample 6−4を添加して培養し、7、11、14、及び21日日に細胞を回収してアディポネクチンの産生をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。コントロール（エタノールのみ3μ1を添加）とサンプル（3μ1エタノール溶液添加）につき、各日に3つづつのウェルを使用して実験した。各ウェルのサンプル中のβ−アクチンを検出した結果を右側に、対応するアディポネクチンの検出結果を左側にやや下げて示してある。
【図５】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例6で得たSample 6−4又はコントロールとしてエタノールのみを添加し12日間培養後、RNAを抽出し、β−アクチンとアディポネクチンのmRNAをRT−PCR法で増幅し、PCR産物（それぞれ長さ332bp及び219bpと予測）を寒天ゲル電気泳動で検出した結果を示す写真である。＋は逆転写酵素（RT）を添加して反応を行ない、−は同酵素を添加せずに反応を行なったことを示す。
【図６】マウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に実施例6で得たSample 6−4を濃度を変えて添加し（濃度0はコントロールとしてエタノールのみを添加）、12日間培養後、定量PCR法でβ−アクチンに対するアディポネクチン遺伝子の相対的な発現量を求めた結果を示すグラフである。コントロールと各濃度のサンプルについて3つづつのウェルを用いて実験した。棒グラフは平均値、エラーバーは標準備差である。
【図７】実施例2で得たSample2−2（50μg／ml）に加えてカフェイン、テオブロミン、もしくはテオフィリンを濃度を変えてマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に添加し、12日間培養後、細胞内脂肪球をORO（赤）で、次いで細胞核をギムザ（赤紫）で染色した標本の顕微鏡写真である（倍率57倍）。カフェイン、テオブロミン、テオフィリンの濃度は図中に示してある。
【図８】実施例４で得たSample4-1（44μg/ml）又はクルクミン（0〜15μM）に加えてテオフィリン（0、100、又は400μM）をマウス3T3−Ll前駆脂肪細胞に添加し10日間培養後、細胞を回収し、アディポネクチンの産生をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。同一のサンプルについて標準のβ−アクチンを検出した結果を右側に、対応するアディポネクチンの検出結果を左側にやや下げて示してある。
【図９】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリンとデキサメタゾンの存在下において、テオフィリンとサンプル（A〜D）またはテオフィリンなしにサンプルのみ（E〜H）を添加、13日間培養後、生じた細胞内脂肪球を位相差顕微鏡で観察・記録した顕微鏡写真である（倍率60倍）。AとEはコントロール（エタノールのみ添加）であり、BとFには実施例1で得たウコン粗抽出物（Sample 1−1、100 μg/ml）、CとGには実施例2で得た粗精製物（Sample 2−2、50μg/ml）、DとHには10 μMのクルクミンを添加した。
【図１０】正常ヒト前駆脂肪細胞を96-wellプレートでインスリンとデキサメタゾンの存在下に、テオフィリン及び/又はクルクミンを添加、培養し、13日後に細胞内脂肪球をOROで染色した細胞の顕微鏡写真である(倍率約45倍)。ORO染色後、全体をギムザで染色した。Aは10μMクルクミン、Bはコントロールとしてクルクミン溶液と同量（２μl）のエタノールのみ添加、Cは10μMクルクミンと500μMのテオフィリンを添加、Dは500μMのテオフィリンとエタノール(2μl)を添加した。
【図１１】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリン（10 μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾンの存在下において、サンプル及び/又はテオフィリン(500μM)を添加し13日間培養後、細胞を回収しアディポネクチンの生成をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。添加物：１、エタノール（4μl、コントロール）；２、実施例6で得た粗精製物（Sample 6-4、4μl、最終濃度106 μg/ml）；３、10μMのクルクミン；４〜６、500μMテオフィリン＋エタノール（4μl）；７〜９、500μMテオフィリン＋Sample 6-4；１０〜１２、500μMテオフィリン＋10 μMのクルクミン。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図１２】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリン（10μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾンの存在下に、サンプル及び/又はカフェイン（500μM）を添加し13日間培養後、細胞を回収しアディポネクチンの生成をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。添加物：１、エタノール（3μl、コントロール）；２、500μMカフェイン＋エタノール（3μl）；３と４、実施例２で得た粗精製物（Sample 2-2、3μl、最終濃度50μg/ml）；５〜８、500μMカフェイン＋Sample 2-2；９と１０、10μMクルクミン；１１〜１４、500μMカフェイン＋10μMクルクミン。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図１３】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリン（10μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾンの存在下に、３〜15μMのクルクミン及び/又はカフェイン（500μM）を添加し13日間培養後、細胞を回収しアディポネクチンの生成をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。添加物：１、エタノール（3μl、コントロール）；２と３、100μMカフェイン＋エタノール（２μl）；４と５、500μMカフェイン＋エタノール（3μl）；６と７、10μMクルクミン；８〜１０、100μMカフェイン＋10μMクルクミン；１１〜１３、500μMカフェイン＋10μMクルクミン。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図１４】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリン（10μg/ml）と0.1μMのデキサメタゾンの存在下に、3〜15μMのクルクミン及び/又はカフェイン（500μM）を添加し13日間培養後、細胞を回収しアディポネクチンの生成をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。添加物：１、エタノール（２μl、コントロール）；２、３μMクルクミン；３と４、10μMクルクミン；５と６、15μMクルクミン；７、500μMカフェイン＋エタノール（２μl）；８と９、３μMクルクミン＋500μMカフェイン；１０と１１、10μMクルクミン＋500μMカフェイン；１２と１３、15μMクルクミン＋500μMカフェイン。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図１５】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリン（10μg/ml）、0.1μMのコルチゾール（ヒドロコーチゾン）及び500μMテオフィリンの存在下においてサンプルを添加し14日間培養後、細胞を回収しアディポネクチンの生成をウェスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。添加物：１、エタノール（3μl、コントロール）；２と３、実施例６で得た粗精製物（Sample6-4、75μg/ml）；４、10μMクルクミン。各ウェルのサンプルについてβ−アクチンを検出した結果を上段に、アディポネクチンの検出結果を下段に示してある。
【図１６】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリンの存在下で下記の化合物と10μMのクルクミンを添加し12日間培養後、細胞を固定しアディポネクチンを蛍光ラベルした抗体で染色した。これを蛍光顕微鏡で観察・記録するとともに（A、C、E、G）、同一視野内の細胞内脂肪球を位相差顕微鏡で観察・記録した顕微鏡写真（B、D、F、H）である（倍率約60倍）。AとB、CとD、EとF、及びGとHは同一視野の写真であり、それぞれ10μMのクルクミンに加えて500μMテオフィリン＋0．1μM  デキサメタゾン、500μMテオブロミン＋0．1μMヒドロコーチゾン、500μMテオブロミン＋0．1μMデキサメタゾン、500μMカフェイン＋0．1μMヒドロコーチゾンを添加して培養した。
【図１７】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリンとデキサメタゾンの存在下に500μMのカフェインもしくはテオフィリン及び/又は10μMクルクミン（10 mMエタノール溶液、2μl/well）を添加、13日間培養後、RNAを抽出し、β−アクチンとアディポネクチンのmRNAをRT−PCR法で増幅し、PCR産物（それぞれ長さ332bp及び235bpと予測）を寒天ゲル電気泳動で検出した結果を示す写真である。培養において添加したサンプル、化合物は以下の通りである：１と２、 200μMインドメタシン＋500μM  IBMX（ポジティブコントロール）；３と４、500μMカフェイン＋エタノール（2μl）；５と６、500μMカフェイン＋10μMクルクミン；７と８、エタノール（コントロール、２μl）；９と１０、10μMクルクミン；１１と１２、エタノール（コントロール、２μl）；１３と１４、10μMクルクミン；１５と１６、500μMテオフィリン＋エタノール（2μl）；１７と１８、500μMテオフィリン＋10μMクルクミン。なお、＋は逆転写酵素（RT）を添加して反応を行ない、−は同酵素を添加せずに反応を行なったことを示す。
【図１８】正常ヒト前駆脂肪細胞にインスリンとヒドロコーチゾン又はデキサメタゾンの存在下に10μMクルクミン又は実施例６で得たウコン抽出精製物（Sample6-4）を下記の化合物と共に添加し、14日間培養後、RNAを抽出し、β−アクチンとアディポネクチンのmRNAをRT−PCR法で増幅、PCR産物を寒天ゲル電気泳動で検出した結果を示す写真である。培養において添加したサンプル、化合物は以下の通りである：１と２、 エタノール（3μl）＋0.1μMヒドロコーチゾン＋500μMテオフィリン；３と４、10μMクルクミン＋0.1μMヒドロコーチゾン＋500μMテオフィリン；５と６、200μMインドメタシン＋500μM IBMX（ポジティブコントロール）；７と８、エタノール（3μl）＋0.1μMデキサメタゾン＋500μMテオフィリン；９と１０、実施例６で得た粗精製物(Sample6-4、75μg/ml) ＋0.1μMデキサメタゾン＋500μMテオフィリン。なお、＋は逆転写酵素（RT）を添加して反応を行ない、−は同酵素を添加せずに反応を行なったことを示す。
【図１】
2005060308.tif 000002
【図２】
2005060308.tif 000003
【図３】
2005060308.tif 000004
【図４】
2005060308.tif 000005
【図５】
2005060308.tif 000006
【図６】
2005060308.tif 000007
【図７】
2005060308.tif 000008
【図８】
2005060308.tif 000009
【図９】
2005060308.tif 000010
【図１０】
2005060308.tif 000011
【図１１】
2005060308.tif 000012
【図１２】
2005060308.tif 000013
【図１３】
2005060308.tif 000014
【図１４】
2005060308.tif 000015
【図１５】
2005060308.tif 000016
【図１６】
2005060308.tif 000017
【図１７】
2005060308.tif 000018
【図１８】
2005060308.tif 000019