(57)【要約】【課題】  酸化ストレスが精子の活性に与える影響を解明した上で、安全性が高い有効成分からなり、操作上の問題点もなく、且つ効率良く哺乳動物の精子を活性化する活性化剤及び活性化方法を提供することを目的とする。【解決手段】  カテキンを含有することを特徴とする哺乳動物の精子の活性化剤、並びに、哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えることを特徴とする哺乳動物の精子の活性化方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテキンを含有することを特徴とする哺乳動物の精子の活性化剤。
【請求項２】
カテキンがエピガロカテキンガレートであることを特徴とする請求項１記載の活性化剤。
【請求項３】
哺乳動物の精子がウシ精子又はブタ精子であることを特徴とする請求項１又は２記載の活性化剤。
【請求項４】
哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えることを特徴とする哺乳動物の精子の活性化方法。
【請求項５】
カテキンがエピガロカテキンガレートであることを特徴とする請求項４記載の活性化方法。
【請求項６】
哺乳動物の精子がウシ精子又はブタ精子であることを特徴とする請求項４又は５に記載の活性化方法。
【請求項７】
ウシ精子を１×１０５／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液に、カテキンを０．０５〜０．３７ｍＭの割合で加えることを特徴とする請求項６記載の活性化方法。
【請求項８】
ブタ精子を８×１０７／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液に、カテキンを０．０５〜０．９ｍＭの割合で加えることを特徴とする請求項６記載の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の精子の活性化剤及び活性化方法に関するものであり、詳しくは、体外受精や人工授精の実施される哺乳動物の精子を、効率良く活性化できる活性化剤及び活性化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の体外受精方法においては、精子の受精能獲得を誘起し、その生存性を高めるために、ヘパリン、テオフィリン等の試薬が添加されている（非特許文献１及び２参照）。ところが、テオフィリンは中毒を起こす危険性が非常に高い物質であり、取り扱いに注意が必要であった。しかも、必ずヘパリン及びテオフィリンの両方の試薬を用いる必要があるために、操作上問題点があった。
このような状況下、取り扱いが容易で、且つ効果の高い哺乳動物精子の活性化方法が求められている。
【０００３】
一方、活性酸素による胚の発生阻害作用が注目され、ウシ体外受精における媒精培地にハイポタウリンをヘパリンと共に添加すると、培養環境が改善され、胚の発生率を向上させることができることが既報告されている（非特許文献３参照。）。しかし、この報告は体外受精胚の発生状況へのハイポタウリン等の影響に関するものであり、精子の活性化に関するものではない。
また、β−メルカプトエタノールを精子懸濁液に添加すると、ウシ卵子への精子侵入率を促進させることができることも報告されているが（非特許文献４参照。）、β−メルカプトエタノールは消防法により指定されている危険物であるため、保管に厳重な管理が必要であり、実際の体外受精には使いにくいという問題点があった。また、β−メルカプトエタノールは活性酸素除去物質の１つであるが、非特許文献４においては、β−メルカプトエタノールを必ずヘパリンと共に添加していることから、精子侵入率の促進効果が、β−メルカプトエタノール単独によるものであるかどうかが解明されているとは必ずしも言えなかった。
【０００４】
【非特許文献１】J．J．Parrish et al．Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen．Theriogenology，25；591-600（1986）
【非特許文献２】S．Hamano and M．Kuwayama．In vitro fertilization and development of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual donors：a comparison between the cutting and aspiration method．Theriogenology，39；703-712（1993）
【非特許文献３】本多  巌ほか．媒精時のハイポタウリン添加によるウシ体外受精胚発生への影響ならびに凍結融解後の生存性．福島畜試研報  ５−７（２００３）
【非特許文献４】郡司さとみ・浜野晴三．ウシ凍結融解精子の受精能獲得に対するβ−メルカプトエタノールの効果．日本畜産学会報，７２（９）：Ｊ３２９−Ｊ３３６，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、酸化ストレスが精子の活性に与える影響を解明した上で、安全性が高い有効成分からなり、操作上の問題点もなく、且つ効率良く哺乳動物の精子を活性化する活性化剤及び活性化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、カテキン類を単独で添加することにより、採取後間もない精子のみならず、採取後凍結保存されたのち融解された精子であっても、効率良い活性化を導くことを見出して、本発明に到達した。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、カテキンを含有することを特徴とする哺乳動物の精子の活性化剤である。
請求項２記載の本発明は、カテキンがエピガロカテキンガレートであることを特徴とする請求項１記載の活性化剤である。
請求項３記載の本発明は、哺乳動物の精子がウシ精子又はブタ精子であることを特徴とする請求項１又は２記載の活性化剤である。
【０００８】
請求項４記載の本発明は、哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えることを特徴とする哺乳動物の精子の活性化方法である。
請求項５記載の本発明は、カテキンがエピガロカテキンガレートであることを特徴とする請求項４記載の活性化方法である。
請求項６記載の本発明は、哺乳動物の精子がウシ精子又はブタ精子であることを特徴とする請求項４又は５に記載の活性化方法である。
請求項７記載の本発明は、ウシ精子を１×１０５／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液に、カテキンを０．０５〜０．３７ｍＭの割合で加えることを特徴とする請求項６記載の活性化方法である。
請求項８記載の本発明は、ブタ精子を８×１０７／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液に、カテキンを０．０５〜０．９ｍＭの割合で加えることを特徴とする請求項６記載の活性化方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、哺乳動物の精子が活性化する際に、過剰に存在すると阻害的な働きをする活性酸素をカテキンが除去するため、効率良く活性化することができる。このカテキンは、食品の一種である緑茶由来成分であることから、安全性も保証されている。
しかも、本発明によれば、カテキン１種類のみを有効成分とするので、操作上の問題点もない。
このような本発明により活性化された精子は、人工授精及び体外受精のいずれにも利用することができる。従って、本発明は、畜産業、再生医療をはじめとする哺乳動物の生殖に関するあらゆる分野で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、哺乳動物の精子の活性化剤及び活性化方法に関するものであり、カテキンを有効成分とし、哺乳動物の精子の活性化を図る点で共通している。
まず、哺乳動物の精子の活性化剤について説明する。
【００１１】
本発明に係る活性化剤は、請求項１に記載されているように、カテキンを含有することを特徴とする。
カテキンとしては、ガロカテキン、エピガロカテキン、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート等が挙げられ、それぞれを単品で、或いは２種類以上の混合物で用いることができる。これらのうち、請求項２に記載するように、特にエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）は、最も効率良い活性化を図ることができる点で好ましい。カテキンは、茶抽出物から抽出・精製して得られるものでも良いし、合成品でも良い。
【００１２】
また、本発明に係る活性化剤は、請求項１に記載されているように、哺乳動物の精子を対象とする。
哺乳動物としては、体外受精や人工授精の実施される哺乳動物であれば良い。例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜や、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類等の実験動物が挙げられる。中でも、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜が好ましく、特に請求項３に記載するように、ウシ又はブタであることが好ましい。
精子は、採取後すぐのものでも良いが、採取後しばらく常温保存或いは液体窒素等を用いて凍結保存されたのち融解されたものでも良い。
【００１３】
請求項１に係る本発明の活性化剤は、カテキンを含有するものであり、この他に、哺乳動物の精子の活性化を妨げないことを条件として種々の成分を含有するものとすることができる。例えばウシ精子を対象とする場合、グルコース欠ＢＯ液、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＢＯ液等の通常使用する培養液にカテキンを溶解させたものを用いることができる。また、ブタ精子を対象とする場合、ＴＹＨ培地等の通常使用する培地にカテキンを溶解させたものを用いることができる。
【００１４】
次に、本発明に係る哺乳動物の精子の活性化方法について説明する。
本発明に係る活性化方法は、請求項４に記載されているように、哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えることを特徴とする。ここで、哺乳動物の精子については、本発明の活性化剤について説明したのと同様であり、請求項６に記載するように、ウシ精子又はブタ精子であることが好ましい。
【００１５】
哺乳動物の精子の懸濁液とは、哺乳動物の精子を、グルコース欠ＢＯ液、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＢＯ液等の通常使用する培養液に攪拌混合等させて得られる懸濁液である。また、ブタ精子を対象とする場合、ＴＹＨ培地等の通常使用する培地に攪拌混合等させて得られる懸濁液である。尚、懸濁液作製の際、必要に応じて希釈や遠心洗浄を行うこともできる。
精子の濃度は、対象とする哺乳動物の種類や精子の保存状況等によって異なり、一概に定めることができないが、ウシ精子の場合、請求項７に記載するように、１×１０５／ｍｌ以上、好ましくは１×１０５〜１×１０８／ｍｌとすることができる。また、ブタ精子の場合、請求項８に記載するように、８×１０７／ｍｌ以上、好ましくは８×１０７〜４×１０９／ｍｌとすることができる。
【００１６】
本発明の活性化方法においては、このような哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加える。カテキンについては、本発明の活性化剤について説明したのと同様であり、請求項５に記載するように、エピガロカテキンガレートであることが好ましい。
カテキンの添加量は、ウシ精子の場合、請求項７に記載するように、ウシ精子を１×１０５／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液当たり０．０５〜０．３７ｍＭ、好ましくは０．０８〜０．３６ｍＭとすることができる。また、ブタ精子の場合、ブタ精子を８×１０７／ｍｌ以上懸濁させた懸濁液当たり０．０５〜０．９ｍＭ、好ましくは０．１〜０．５ｍＭとすることができる。
【００１７】
哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加える際の手順については特に条件はなく、哺乳動物の精子の懸濁液を予め準備しておいて、これに添加することもできるし、先に懸濁液の培養液や培地に添加しておいて、後から哺乳動物の精子を添加する形にしても良い。
【００１８】
このようにして哺乳動物の精子の懸濁液にカテキンを加えた後、得られる精子懸濁液は、通常体外受精に用いる精子懸濁液として用いることにより、体外受精に利用できる。また、対象となる哺乳動物への人工授精にも利用することができる。
尚、カテキンの抗酸化力は、精子の代わりに卵子の活性化にも応用可能であると考えられる。
【実施例】
【００１９】
実施例１〔ウシ精子の体外受精事例〕
黒毛和種凍結精液を融解し、グルコース欠ＢＯ液（ＢＯ液）で希釈した後、遠心洗浄を２回繰り返した。グルコース欠ＢＯ液（１００ｍｌ）は、ＮａＣｌ  ０．０６５５ｇ、ＫＣｌ  ０．００３ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．００３３ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．００１ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．００１２８ｇ、１％フェノールレッド  ０．０１ｍｌ、ＮａＨＣＯ３  ０．３１０４ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．０１１ｇ及び抗生物質（ゲンタマイシン）０．１ｍｌを、超純水で溶解し、合計１００ｍｌとしたものである。
このＢＯ液に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１０ｍｇ／ｍｌ添加して得られるＢＳＡ添加ＢＯ液に、最終ＥＧＣｇ濃度が０．１，０．２及び０．４ｍＭとなるようにＥＧＣｇを加えた培地により、最終精子濃度が１×１０７／ｍｌとなるように等倍希釈した精子懸濁液３種類を調製した。対照として、ＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）とした他は同様に精子懸濁液を用意した。
次に、各精子懸濁液を用いた媒精を行った。すなわち、食肉市場由来卵巣より吸引採取し、５％牛胎児血清（ＦＢＳ）加ＴＣＭ−１９９で２０〜２２時間体外成熟培養を行って得られた卵丘細胞−卵子複合体を、表１に示す供試卵数で各精子懸濁液に導入して、５時間処理した。
【００２０】
媒精後８時間目に卵子のホールマウント標本を作製し、固定染色後位相差顕微鏡下で観察し、尾部を伴った精子頭部の存在あるいは雄性前核の有無により精子侵入状況を判定した。精子侵入状況の判定は、卵細胞質内への精子侵入率（精子侵入卵子数）の算出及び卵細胞質内へ２個以上の精子が侵入した場合の侵入率（多精子侵入卵子数）の算出により行った。得られた成績は、χ２−検定による有意差検定を行った。精子侵入状況の判定結果を、表１に示す。尚、表中のアルファベットは、異なったアルファベット間に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す（以下、同じ。）。
【００２１】
【表１】
2005213147.tif 000002
【００２２】
表１から明らかなように、ＥＧＣｇを０．１ｍＭ又は０．２ｍＭ加えた培地で調製した精子懸濁液の場合は、ＥＧＣｇを０．４ｍＭ加えた培地で或いはＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）の対照精子懸濁液と比較して精子侵入率が高いこと、特にＥＧＣｇを０．２ｍＭ加えた培地で調製した精子懸濁液の場合は、他の場合と比較して有意差がある。
【００２３】
実施例２〔ウシ精子の体外受精事例〕
実施例１において、各精子懸濁液による媒精終了後の卵（それぞれ表２に示す供試卵数）を、５％ＦＢＳ加ＴＣＭ−１９９中で卵丘細胞単層との共培養に供した。媒精終了後４８時間目に分割状況を観察し、４細胞期以上に発生した胚を選択し、その培養を継続した。媒精終了後４８時間目に観察された２細胞期以上の胚数を計数し、その供試卵数に占める割合を分割卵数（％）とした。また、媒精日をＤａｙ  ０とした場合のＤａｙ７及び８における胚盤胞発生数（％）を算出した。結果を表２に示す。
尚、全ての培養は３８．５℃、２％ＣＯ２、９８％空気の条件で行った。
【００２４】
【表２】
2005213147.tif 000003
【００２５】
表２から明らかなように、ＥＧＣｇを０．１ｍＭまたは０．２ｍＭ加えた培地で調製した精子懸濁液で媒精した場合はＥＧＣｇを０．４ｍＭ加えた培地あるいは対照としてＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）の培地で調製した精子懸濁液で媒精した場合と比較して、分割卵率及び胚盤胞発生率のいずれも高かった。
実施例１及び２の結果から、カテキンを添加することによりウシ精子を活性化させることができることが明らかとなった。
【００２６】
実施例３〔従来の活性化法との比較〕
従来の活性化方法であるヘパリン・テオフィリン法に基づくヘパリン・テオフィリン添加区として、実施例１で用いたものと同様の凍結精液を融解し、テオフィリン添加ＢＯ液で希釈後、遠心洗浄を２回繰り返した。続いて、ヘパリン及びＢＳＡを添加したＢＯ液を用いて、最終精子濃度を１×１０７／ｍｌになるように等倍希釈し、精子懸濁液を調製した。
また、カテキン添加区として、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ添加ＢＯ液にＥＧＣｇを最終濃度が０．２ｍＭになるように加えた培地を用い、実施例１と同様に作成した精子懸濁液を調製した。
一方、無添加区（対照）として、ＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）とした他は同様に精子懸濁液を用意した。
【００２７】
媒精は、実施例１と同様にして成熟培養を終えた卵丘細胞−卵子複合体を各精子懸濁液に導入し、５時間行った。
媒精終了後４８時間目に観察された２細胞期以上の胚数を計数し、その供試卵数に占める割合を分割卵数（％）とした。また、媒精日をＤａｙ  ０とした場合のＤａｙ７及び８における胚盤胞発生数（％）を算出した。結果を表３に示す。
【００２８】
【表３】
2005213147.tif 000004
【００２９】
表３から明らかなように、カテキン（ＥＧＣｇ）を０．２ｍＭ加えた培地で調製した精子懸濁液で媒精した場合は、ヘパリン・テオフィリン添加培地あるいは対照としてカテキン（ＥＧＣｇ）無添加（０ｍＭ）の培地で調製した精子懸濁液で媒精した場合と比較して、分割卵率及び胚盤胞発生率のいずれも高かった。
このことから、カテキン（ＥＧＣｇ）を添加することにより、従来の活性化方法と比較して、より効率良く精子を活性化することができることが明らかとなった。
【００３０】
実施例４〔複数のカテキン類を用いた体外受精事例〕
ＥＧＣｇの代わりにカテキン類が６０％以上含まれているカテキン粉末（ポリフェノン６０Ａ：（株）三井農林）を用いた他は、実施例１と同様にして行った。ポリフェノン６０Ａは、表４に示すカテキン類の組成からなるポリフェノンＧ（（株）三井農林：カテキン類３０％以上含有）をさらに精製したものである。従って、ポリフェノン６０Ａのカテキン類組成も表４に示すとおりであると考えられる。
【００３１】
【表４】
2005213147.tif 000005
【００３２】
このカテキン粉末を、１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ添加ＢＯ液に、最終カテキン濃度が表５に示す濃度となるように加えた培地を用いた他は実施例１と同様に作成した精子懸濁液を調製した。
一方、無添加区（対照）として、カテキン無添加（０ｍＭ）とした他は同様に精子懸濁液を用意した。
媒精は、実施例１と同様にして成熟培養を終えた卵丘細胞−卵子複合体を各精子懸濁液に導入し、５時間行った。
媒精終了後４８時間目に観察された２細胞期以上の胚数を計数し、その供試卵数に占める割合を分割卵数（％）とした。
【００３３】
【表５】
2005213147.tif 000006
【００３４】
表５から明らかなように、０．０８ｍＭの割合で添加すると、無添加区の結果と比較して、やや受精成績が向上する傾向にあった。
このことから、カテキンの混合物を添加した場合でも、精子を活性化することができることが明らかとなった。
【００３５】
実施例５〔ＥＧＣｇによるブタ精子活性化試験〕
ブタ（交雑種、３歳齢）から試験当日の朝精液を採取した。これを、遠心分離にかけて精しょう部分を除去後、ＴＹＨ培地で希釈・遠心洗浄した。ＴＹＨ培地の組成（１００ｍｌ）中は、ＮａＨＣＯ３  ０．２１０６g、ＮａＣｌ  ０．６９７６ｇ、ＫＣｌ  ０．０３５６ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２５１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０１６２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２９３ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．０１１ｇ、グルコース０．１００２ｇ、ＢＳＡ０．３ｇ、及び１％フェノールレッド０．０１ｍｌである。
精子懸濁液を、ＴＹＨ培地に最終ＥＧＣｇ濃度が０．４及び１．０ｍＭとなるようにＥＧＣｇを加えて得られるＥＧＣｇ添加ＴＹＨ培地により等倍希釈し、最終精子濃度が２×１０8／ｍｌとなるように調整して、２種類の精子懸濁液を用意した。一方、対照として、ＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）とした他は同様に対照精子懸濁液を得た。
これらの精子懸濁液を用いて、３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で５時間の前培養を行った。前培養終了後、生存精子率及び活性精子率をＨＴＭ−ＣＥＲＯＳ（ＨＡＮＳＥＮ＆ＣＯ．，ＬＴＤ）を用いて解析した。結果を表６に示す。
【００３６】
【表６】
2005213147.tif 000007
【００３７】
表６から明らかなように、ＥＧＣｇを０．４ｍＭの割合で加えたＴＹＨ培地で調製した精子懸濁液で前培養を行った場合は、ＥＧＣｇを１．０ｍＭ加えた培地あるいはＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）培地で調製した精子懸濁液で前培養した場合と比較して、生存精子率が高かった。また、生存精子のうち活性化していた精子の割合も高かった。
【００３８】
実施例６〔ＥＧＣｇによるブタ精子活性化試験〕
最終精子濃度を１×１０８／ｍｌに調整する他は実施例５と同様に行った。ブタ精液をＴＹＨ培地で希釈・洗浄し、最終ＥＧＣｇ濃度が０．０５、０．１及び０．２ｍＭとなるようにＥＧＣｇを加えて得られるＥＧＣｇ添加ＴＹＨ培地により等倍希釈し、最終精子濃度が１×１０８／ｍｌとなるよう調整して、３種類の精子懸濁液を用意した。一方、対照としてＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）とした他は同様に対照精子懸濁液を得た。
これらの精子懸濁液を用いて３８．５℃、５％ＣＯ２の条件で５時間の前培養を行った。前培養終了後、生存していた精子の割合を顕微鏡下で観察して生存精子率を算出した。結果を表７に示す。
【００３９】
【表７】
2005213147.tif 000008
【００４０】
表７から明らかなように、ＥＧＣｇを０．１及び０．２ｍＭの割合で加えたＴＹＨで調整した精子懸濁液で前培養を行った場合は、ＥＧＣｇを０．０５ｍＭ加えた培地あるいはＥＧＣｇ無添加（０ｍＭ）培地で調整した精子懸濁液で前培養した場合と比較して、生存精子率がより高かった。
実施例５及び６の結果から、ブタの前培養培地にカテキンを添加することにより精子を活性化できることが明らかとなると共に、培養する精子濃度に応じてカテキンの添加濃度を調整することが望ましいことも明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明によれば、哺乳動物の精子が活性化する際に、過剰に存在すると阻害的な働きをする活性酸素をカテキンが除去するため、効率良く活性化することができる。このカテキンは、食品の一種である緑茶由来成分であることから、安全性も保証されている。
しかも、本発明によれば、カテキン１種類のみを有効成分とするので、操作上の問題点もない。
このような本発明により活性化された精子は、人工授精及び体外受精のいずれにも利用することができる。従って、本発明は、畜産業、再生医療をはじめとする哺乳動物の生殖に関するあらゆる分野で有用である。