(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸ガンの化学的予防について理想的な薬物を提供することであって、その薬物は、以下のプロフィールを有する薬物である：１）大腸特異的；２）限定された吸収−親および代謝物の吸収が最小である；３）全身的な活性がないこと−一旦吸収されると、代謝性の不活性化により、薬物を不活性な形態に変換され、それにより腎臓およびＧＩシステムへの全身的な効果を制限する；４）抗酸化特性−大腸特異的抗酸化活性は、発ガン物質負荷を軽減するようにさらに働く；および５）ＮＳＡＩＤ様抗炎症機構−活性代謝物は、炎症誘導性エイコサノイド経路を阻害するべきであるが、基底の維持経路を損なわないエイコサノイド阻害が好ましい。【解決手段】以下の一般式2005320326.tif 000010の２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体を含む薬学的組成物の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式
【化１】
2005320326.tif 000009
の２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体を含む薬学的組成物の使用であって、ここでＸは、−ＳＯ２−または−ＣＯ−基であり、そしてＲは、フェニルまたはカルボキシメチルフェニル基のいずれかであるか、または式−（ＣＨ２）ｎ−Ｙので示される基であり、ここでＹは、水酸基、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基、６個までの炭素原子を含有するアルキル部分、またはカルボン酸基あるいはスルホン酸基であり、そしてｎは、１〜６の全ての数であり、そしてここでアルキレン基の１個またはそれ以上の水素原子が、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基により置換され得、このアルキル部分は、６個までの炭素原子またはアルキル基を含み、そしてここで−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ基は、窒素原子に直接またはベンゼン環を介してのいずれかにより結合する（但し、Ｒ−ＮＨ−Ｘは、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基以外である）；あるいは該組成物はそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性誘導体または活性代謝物の酸化生成物の非毒性のな薬学的に受容可能な塩を含み、該組成物は大腸ガンを患う、または大腸ガンを発症する危険性にある個体を処置する方法に使用するための薬剤の製造用であり、該方法が、有効量の該薬学的組成物を、該組成物を必要とするヒトに投与する工程を包含する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  説明
技術分野
本発明は、大腸ガンの化学的予防および化学的治療に関する。
【背景技術】
【０００２】背景技術
大腸ガンは現在、アメリカ合衆国において悪性腫瘍に起因する年間の全死亡数の１１％を占める。１００，０００人あたり６２人の発症率、および１００，０００人あたり３００人の有病率で、この疾患は現在、男性の死亡原因の第３位であり、そして女性の死亡原因の第４位である。大腸ガンは、５年生存率が５０％未満と特に悪く、これは一般に、診断が後期になされることに起因する。現行の好ましい処置（化学療法と併用される外科手術）では、この生存率は増加していない。必要とされているのは、大腸ガンを発症する危険性が大きいことが知られている患者集団において、初期に開始され得る安全かつ効果的な予防的治療である。【０００３】エイコサノイドおよび胃腸細胞の分化型機能。  エイコサノイドは、胃腸上皮性細胞の成長、分化、および機能の重要な調節因子である。プロスタグランジン系列のエイコサノイド産物は、粘液分泌（ＢｅｃｋｅｌおよびＫａｕｆｆｍａｎ（１９８１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８０：７７０−７７６）ならびに電解質および流体の分泌（Ｍｉｌｌｅｒ（１９８３）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５：Ｇ６０１−Ｇ６２３）を誘導することが知られている。それらはまた、能動輸送を誘導し（ＢｕｋｈａｖｅおよびＲａｓｋ−Ｍａｄｓｅｎ（１９８０）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ７８：３２−３７）、そして上皮の複製能を増大する（Ｋｏｎｔｕｒｅｋら（１９８１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８０：１１９６−１２０１）。これらの反応により、緊密に結び付いた上皮細胞の分化型の、保護的障壁システムの維持を生じ、その上皮細胞の頂端表面は高密度の複合糖質の化学的緩衝物で覆われる。胃および上部の十二指腸において、このような障壁は、消化のために精巧に造られる酸性およびタンパク質分解の環境から保護し、一方大腸においては、このような障壁は、細菌および毒素の侵入から保護する。それゆえ、外因性の合成プロスタグランジンが、細胞保護的に活性であり（ＷｈｉｔｔｌｅおよびＶａｎｅ（１９８７）Ｉｎ：Ｊｏｈｎｓｏｎ（編）ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＧＡＳＴＲＣＩＮＴＥＳＴＩＮＡＬ  ＴＲＡＣＴ，第１巻、第２版、ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１４３−１８０頁）、そして第２の抗腫瘍処置として治療上の有用性が見い出されていることは驚くべきことではない。それゆえ胃腸「ＧＩ」システムは、局所性の環境に存在するエイコサノイド産物の特異的な分化型補体を活発に産生し、そしてこれに依存するするように発達している。全てのエイコサノイドは、共通の前駆物質であるアラキドン酸（膜リン脂質からそれ自身遊離している）から誘導されるので、ＧＩ粘膜細胞は、酵素ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により開始される比較的高い基底レベルのアラキドン酸代謝回転を有する。【０００４】  ＧＩシステムはまた、環境内の細菌、抗原、および毒素に対する主な防衛機構であり、それゆえ攻撃的かつ迅速な炎症反応を実施する能力をも所有しなければならない。この反応はまた、プロスタグランジン（ＰＧ）系列および化学走性のロイコトリエン系列（ＬＴ）の両方のエイコサノイド産物に依存し、そして活性化因子に反応して血液由来好中球、マクロファージ、および免疫���胞の流入を生じる。これら浸入する細胞のそれぞれもまた、炎症性の（分泌された）ＰＬＡ２を放出することにより、自身のリン脂質、および粘膜ならびに管腔のリン脂質を代謝する能力をもそれに加えてもたらし、アラキドン酸の放出を増幅し、次いでアラキドン酸は、ＰＧおよびＬＴの両方に代謝される。【０００５】  炎症細胞の浸潤は、不快な刺激を制限し、そして破壊するが、炎症性細胞の放出産物に起因する損傷の程度は重要である。好中球およびマクロファージは、スーパーオキシド（Ｏ２−）（Ｋｉｔａｈｏｒａら（１９８８）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．３３：９５１−９５５）、ならびに過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（ＴａｕｂｅｒおよびＢａｂｉｏｒ（１９８５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１：２６５−３０７）、およびプロテアーゼ（Ｏｈｌｓｓｏｎら（１９７７）Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ３５８：３６１−３６６）を放出する。結果として生じる浸潤が広範囲である場合、上皮層の顕著な剥落が、引き続く障壁機能の衰弱とともに生じる。次いで炎症反応の消散が、最終的に最適な上皮障壁の適用範囲を回復するために必要とされる。【０００６】慢性ＧＩ炎症およびＧＩガン誘導。  慢性の胃腸炎症性疾患（例えば、潰瘍性大腸炎（Ｌｅｎｎａｒｄ−Ｊｏｎｅｓら（１９７７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ７３：１２８０−１２８５）、クローン病（Ｆａｒｍｅｒら（１９７１）Ｃａｎｃｅｒ２８：２８９−２９５）、および慢性萎縮性胃炎（Ｓｉｐｐｏｎｅｎら（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ５２：１０６２−１０６７））は、続いて起こる胃腸ガンの増加した危険性に関与する。この機構は、まだ証明されていないが、続いて起こるトランスフォーメーション、増殖の増大、および悪性腫瘍の浸潤を導き得る３つの重要な交差する経路は、多数の急性炎症エピソードの間に生じる。下記に考察されるように、（１）増加した大腸のフリーラジカルおよび発ガン物質負荷、（２）栄養性エイコサノイド調節の変化、および（３）細胞浸潤を仲介する遺伝子産物の誘導が存在する。【０００７】炎症エピソードに起因する変質した発ガン物質負荷。  大腸は、食物中の化合物の代謝および内因性の分泌物（例えば、大腸内細菌による胆汁酸）から生じる遺伝毒性の発ガン物質および腫瘍促進物質のかなり主要な基本的負荷に唯一曝され得る。糞便中の発ガン物質と大腸ガン誘導との間に関係があることは、高リスク個体の糞便中における変異原の増加が、低リスク集団のそれに対して認められることにより支持される（Ｒｅｄｄｙら（１９８０）Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．７２：５１１−５１５）。この相関はまた、食物繊維の摂取と大腸ガンの発症率との間の負の関係が繰り返し認められることに一致する（ＡｒｍｓｔｒｏｎｇおよびＤｏｌｌ（１９７５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１５：６１７−６２３）。繊維の保護効果は、糞便容積の増加によって生じると推論されており、その結果糞便中発ガン物質の希釈および輸送時間の短縮を生じ、より迅速な発ガン物質の排出をもたらす。これらの結果は、糞便発ガン物質負荷の濃度の減少が、ガンの危険性の減少を導き得るならば、発ガン物質負荷の増加は、危険性の増加を導き得るという可能性を高める。大���の発ガン物質のこのような増加の１つは、連続的な炎症事象に由来し得る。【０００８】  特に関連する例は、酸化窒素としての窒素酸化物のＬ−アルギニン依存形成を経由する発ガン性物質ニトロソアミンの炎症性好中性の産生である（Ｇｒｉｓｈａｍ（１９９３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０４：Ａ２４３）。炎症細胞により放出される他の酸化的な産物は、スーパーオキシドおよび過酸化水素を含み、これらは、鉄（Ｆｅ）のような所定の遷移金属の存在下で高反応性かつ細胞傷害性のヒドロキシルラジカル（ＯＨ：）を産生し得る（Ｇｒｉｓｈａｍ（１９９０）ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ３９：２０６０−２０６３）。炎症細胞の流入により精巧に造られる発ガン物質およびフリーラジカル負荷の増加に加えて、アラキドン酸カスケードが、変異原性代謝産物を産出し得ることも公知である。プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）の代謝産物、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、インビボで直接的に作用する変異原であり（ＭｕｋａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９１：８６８−８６９）、そして動物における発ガン物質であり（ＢａｓｕおよびＭａｒｎｅｔｔ（１９８３）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ４：３３１−３３３）、そしてトロンボキサンシンテターゼにより細胞中に高い収量で、活性シクロオキシゲナーゼ経路で酵素的に産生され得る。ＭＤＡは、ヒト大腸ｐ５３遺伝子と関連する変異に類似したフレームシフト変異を生産することが示されている（Ｍａｒｎｅｔｔら（１９８５）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．１２９：３９−４６）。ＰＧＨシンテターゼ自体は、強力なペルオキシダーゼであり、そして変異原への広範な範囲のポリサイクリック炭化水素の活性化を触媒することが示されている（Ｍａｒｎｅｔｔ（１９８１）ＬｉｆｅＳｃｉ．２９：５３１−５４６）。【０００９】  これらの知見は、胃腸管におけるアラキドン酸カスケードの慢性的および異常な（炎症細胞作動性の）活性化が、最大ＤＮＡ合成の時間の間にＤＮＡ変異の潜在的な誘導とともに発ガン物質負荷の増加をもたらす１つの経路であることを示唆する。細胞増殖の増加（炎症細胞に浸潤するこにより誘導される上皮性剥落に続く）は、このような発ガン物質の作用に影響されやすい細胞数の増加を招く。あるいは、増殖の増加は、発ガン物質により以前に誘導された変異を増幅する（クローンの拡大を通して）ように働き得る。【００１０】エイコサノイド調節の変化は、炎症エピソードに起因する増殖を駆動し得る。ＧＩ炎症に関連するさらなる機構およびＧＩガンの進行は、正常なエイコサノイド調節の崩壊であり得る。上記で考察されるように、ＧＩ粘膜の上皮の正常な分化型機能は、内因性エイコサノイドにより影響を受ける生物学的活性の多種多様な範囲に密接に連接する。これらの薬剤は、局所的に作用し、そして一般に、活発な代謝不活性化に起因する短い半減期を有するので、急性炎症事象の期間は、エイコサノイドホメオスタシスの正常な調節を劇的に変える。【００１１】  炎症部位への好中球およびマクロファージの侵入において、これらの正常な動態は、劇的に変化する。第一に、炎症細胞は、それらで広範な範囲のさらなるアゴニスト（例えば、サイトカイン���プロテアーゼ、および成長因子をもたらし（ＡｄａｍｓおよびＨａｍｉｌｔｏｎ（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２８３−３１８，Ｏｈｌｓｓｏｎら（１９７７）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５８：３６１−３６６、  Ｋｅｌｌｙら（編）、Ｔｅｘｔｂｏｏｋｏｆ  Ｒｈｃｕｍａｔｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｐｐ．１８６−２１５のＮａｔｈａｎおよびＣｏｈｎ（１９８０）））これらのアゴニストは単独で、アラキドン酸を放出するように細胞性ＰＬＡ２（ｃＰＬＡ２）を慢性的に活性化する。第二に、炎症細胞は、分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ）として知られるＰＬＡ２のさらなる形態またはｓＰＬＡ２の豊富な供給源である（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５３３５−５３３８）。ＧＩ炎症疾患におけるその活性が、最近報告されている（Ｍｉｎａｍｉら（１９９２）Ｇｕｔ３３：９１４−９２１）。【００１２】  ｃＰＬＡ２と異なり、ｓＰＬＡ２は、サイトカイン（Ｐｆｅｉｌｓｃｉｆｔｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：３８５−３９４）、および特に、エンドトキシン（ＯｋａおよびＡｒｉｔａ（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９９５６−９９６０）により、炎症細胞（Ｗｒｉｇｈｔら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６６７５−６６８１）、血小板（Ｈａｙａｋａｗａら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０４：７６７−７７２）、軟骨細胞（Ｌｙｏｎｓ−Ｇｏｉｒｄａｎｏら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４：４８８−４９５）、および平滑筋細胞（Ｎａｋａｎｏら（１９９０）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２６１：１７１−１７４）から放出される。さらに、細胞外環境は、最高のカルシウム濃度を含有するので、ｓＰＬＡ２は、一旦放出されると調節されない。それゆえ放出において、それは、細胞膜および細菌の膜で見い出されるリン脂質のｓｎ−２位置からならびに食物およびリポタンパク質供給源からアラキドン酸、および他の脂肪酸を活発に加水分解する。多くのこのようなリン脂質に由来するｓｎ−２脂肪酸の除去した結果生じるリゾリン脂質は、周辺細胞に対して強力に溶原性である（ＯｋａｄａおよびＣｙｏｎｇ（１９７５）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４５：５３３−５３４）。従って、この反応はまた、上皮細胞の溶解および濾過されていない領域（ｕｎｆｉｌｔｅｒｅｄａｒｅａ）における剥落をも導き得、最終的には、障壁の機能を維持するために増殖の増大を必要とする。【００１３】細胞の侵入に関する炎症反応および遺伝子の活性化。  炎症反応は、正常なエイコサノイド調節を破壊するだけでなく、細胞の浸入に必要とされる遺伝子産物の活性化をも導く。１つのこのような産物、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡＲ）は、腸管内の上皮細胞により正常に発現される。細胞表面に対するその足場は、正常な陰窩細胞遊走および細胞表面のタンパク質分解による落屑の重要な決定因子であり得る（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：１７６３−１７７１）。炎症細胞において、ｕＰＡＲ遺伝子発現は���プロテインキナーゼＣの活性化因子により、ホルボールエステルＴＰＡのような腫瘍促進因子（Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５１７７−５１８１）により、そして組織浸潤（Ｓｔｏｐｐｅｌｌｉら（１９８５）Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４９３９−４９４３）に必要とされる浸潤性の表現型を誘導する種々のサイトカイン（Ｌｕｎｄら（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３３９９−３４０１）により誘導される。従って、高レベルのｕＰＡＲ発現がまた、転移能を有するいくつかの腫瘍細胞株（大腸ガン由来細胞を含有する）において検出されていることは驚くべきことではない（Ｐｙｋｅら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１０５９−１０６７）。特に重要なことは、共培養実験が、浸潤能はそのリガンドプラスミノーゲン活性化因子よりもｕＰＡＲの発現により高度に相関していたことを示していることである（Ｏｓｓｏｗｓｋｉら（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：１１０７−１１１２）。従って、炎症反応の多数のサイクルはまた、大腸粘膜の細胞におけるｕＰＡＲ過剰発現に寄与し得、これは以前の良性腫瘍における浸潤性表現型の獲得を生じる。【００１４】  それゆえＧＩ粘膜の細胞は、以下の３つの重要な経路のために、慢性炎症エピソードに唯一感受性であり得る：（１）上皮細胞は、炎症エピソードの間にさらに増加し得る高度な発ガン性物質負荷とともに環境中に位置される；（２）内因性および浸潤されたエイコサノイドカスケードの両方の産物は栄養性因子である；そして（３）炎症因子に対するそれら自体の分化した反応は、浸潤性表現型の獲得に必要とされる遺伝子産物の発現を包含する。これらの３つの経路とともに、トランスフォーメーション事象、ならびに結果として生じる腫瘍の誘導、進行、および浸潤を導き得る。それゆえ、エイコサノイドカスケードの所定のアームをブロックする因子は、大腸ガンの化学的予防において有用である。【００１５】大腸ガンの前駆体としてのポリープおよび異常陰窩の病巣。  腺腫のポリープが、結腸直腸ガンの前駆体であり、そしてそれらの外観、サイズ、および多重度が、発達中の大腸ガンの関連した危険性の前兆であることが現在広範に支持されている（Ｌｏｔｆｉら（１９８６）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：３３７−３４３を参照のこと）。腺腫のポリープは、大腸ガンの前駆体の病変であるが、異常陰窩病巣と呼ばれる所定の初期の病理学的病変は、腺腫ポリープに対する前駆体病変である。異常陰窩病巣（ＡＣＦ）は、正常な外観のヒト大腸粘膜において同定可能であり、そして散発性大腸ガン患者、または一般に家族性腺腫ポリープ症を遺伝する患者由来の検体においてより大きな数およびサイズで存在することが示されている（Ｒｏｎｕｃｕｃｃｉら（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２２（３）：２８７−２９４；Ｐｒｅｔｌｏｗら（１９９１）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１：１５６４−１５６７）。【００１６】ＮＳＡＩＤおよび大腸ガンの化学的予防。  いくつかの非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が、ラットの大腸発ガンモデルにおける腫瘍保有動物の数および動物あたりの腫瘍発症率を減少することにおいて効果的であ��という証拠がある。（Ｎａｒｉｓａｗａら（１９８１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１：１９５４−１９５７）、（Ｐｏｌｌａｒｄら（１９８３）ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．２１：５７−６１）（Ｍｏｏｒｇｈｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：３４１−３４７）（Ｒｅｄｄｙら（１９９３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０４：Ａ４４３）ここで腫瘍罹患率の７０％までの減少は、最大許容用量の８０％の用量で認められている。ジメチルヒドラジン誘導性大腸発ガンの研究において、スリンダクが、発ガン物質投与の間に存在する場合にのみ腫瘍の発症率を減少することが観察され、発ガン物質投与後１７週間に与えられた場合には観察されなかった（Ｍｏｏｒｇｈｅｎら（１９８８）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５６：３４１−３４７）。【００１７】  いくつかの回顧的な研究において、アスピリン摂取が、大腸ガン発症後における化学的予防治療として評価されている。これらの研究の結果は、大腸ガン発症の危険性の半減（Ｋｕｎｅら（１９８８）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４８：４３９９−４４０４）から危険性の５０％増加（Ｐａｇａｎｉｎｉ−Ｈｉｌｌら（１９９１）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：１１８２−１１８３）の範囲である。しかし、アスピリンおよび他のＮＳＡＩＤを用いるいずれのヒトの研究、特に回顧的な研究は、潜血スクリーニングおよびＳ状結腸鏡検査を通してＮＳＡＩＤ群におけるポリープまたは腫瘍のより早期の検出を可能にし得るＧＩ出血の誘導された頻度により否定され得ることに注目すべきである。【００１８】  回顧的なアスピリン研究は、不明確な結果を提供したが、動物研究において見い出された所定のＮＳＡＩＤについての最初の結果（上記で要約した）は、予期ヒト治験において反復されている。このＮＳＡＩＤ、スリンダクは、プラセボコントロールを用いる無作為二重盲検クロスオーバー試験において、４ヶ月未満内に９名の家族性ポリープ症患者にポリープの退行を引き起こしたことが示されている（Ｌａｂａｙｌｅら（１９９１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０１：６３５−６３９）。さらに、ポリープの成長は、スリンダク中止後に再開した。インドメタシンを用いた同様の研究ではポリープの退行に対する影響は認められなかったので（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ６０：２８６３−２８６８）、この知見は重要である。これらのＮＳＡＩＤは、両方とも抗炎症活性がシクロオキシゲナーゼの阻害に由来しているが、スリンダクは、大腸内細菌により、その活性代謝物、スリンダクスルフィドに変換されるプロドラッグである（ＳｈｅｎおよびＷｉｎｔｅｒ（１９７５）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１２：８９−２４５）。対照的に、インドメタシンは、全身への送達のために、上部ＧＩ管から主として吸収される場合、その活性形態で経口摂取される（Ｈｕｃｋｅｒら（１９６６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１５３：２３７−２４９）。それゆえ、大腸へスリンダクにより送達される活性代謝物の濃度は、インドメタシン由来の濃度よりも有意に高いようである。この結果は、観測されたＮＳＡＩＤの化学的予防効果の有意な部分が、粘膜−管腔界面での薬物の局所的な作用に由来することを示唆する。【００１９】  動物モデルにおける大腸腫瘍発生のＮＳＡＩＤ誘導性阻害のこの証拠は、腫瘍細胞のシクロオキシゲナーゼによる阻害の機構を示唆するが、このような機構の確認は成されていない。ＮＳＡＩＤ処置動物から摘出した腫瘍組織は、劇的に減少したレベルのＰＧＥ２を分泌することが示され、この仮説に一致する（Ｒｅｄｄｙら（１９９２）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１３：１０１９−１０２３）。しかし、ほとんどの大腸腫瘍は、常在性の細胞タイプに関して異種であり、そしていくつかの報告は、結腸直腸の腺ガンから産生された上皮細胞株が、ＰＧＥ２または他のプロスタノイドの高生産者ではないことを報告している（Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４７７０−４７７５）。しかし、ヒト大腸組織から分画された細胞のエイコサノイド産生に関する報告は、腫瘍上皮細胞が単純な組織と同様のＰＧＥ２レベルを産生し、一方腫瘍由来単核細胞がそれらの正常な対応物よりも有意に多いエイコサノイド合成を示した（Ｍａｘｗｅｌｌら（１９９０）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４７：１６０−１６６）。それゆえ、ＮＳＡＩＤ阻害に対して感受性の標的細胞は、腫瘍上皮細胞であり得ないが、上皮細胞が反応性であるような高いＰＧレベルを産生する他のいくつかの他の常在物であり得る。【００２０】好ましい化学的予防治療のプロフィール  全てのＮＳＡＩＤは、有意な副作用プロフィールを保有する。ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ産物のＮＳＡＩＤの阻害において組織特異的ではなく、そして腎臓および胃腸の両システムは、特に感受性である。ＮＳＡＩＤは、腎臓の灌流を減少し、腎毒性を生じ（ＣｌｉｖｅおよびＳｔｏｆｆ（１９８４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０：５６３−５７２）、そしてプロスタグランジンは、ＧＩ上皮の通常の分化型機能に必要であるので、ＮＳＡＩＤ誘導性胃潰瘍形成は、このクラスの薬物に関連した罹病率および死亡率に対する有意な寄与物である（Ｌａｎｇｍａｎ（１９８９）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９６：６４０−６４６，Ｂｊａｒｎａｓｏｎら（１９９２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０４：１８３２−１８４７）。より下位の腸において、長期のＮＳＡＩＤ治療は、直腸炎から汎大腸炎（ｐａｎｃｏｌｉｔｉｓ）の範囲の大腸炎を生じることが報告されている（ＴａｎｎｅｒおよびＲａｇｈｕｎａｔ（１９８８）Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ４１：１１６−１２０）。ある回顧的研究では、大小の腸穿孔および出血を示す患者のうち２５％にＮＳＡＩＤ摂取が見い出されることを推定した（Ｌａｎｇｍａｎら（１９８５）Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．２９０：３４７−３４９）。最後に、すでに結腸直腸のガンを発症する高い危険性のある、現存する慢性炎症性腸疾患の患者において、５−ＡＳＡを含まないＮＳＡＩＤおよびアスピリン治療は、現存する病態の悪化のため禁忌である（ＲａｍｐｔｏｎおよびＳｌａｄｅｎ（１９８１）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ２１：４１７−４２５）。それゆえ、大腸ガンの化学的予防について理想的な薬物は、以下のプロフィールを有する薬物である：
１）大腸特異的−上部ＧＩ管において作成される活性を有しないプロドラッグであるが、大腸への到達時には活性な形態に変換されるべきである（スリンダク様）；
２）限定された吸収−親および代謝物の吸収が（特にその活性形態に一旦変換されると）最小である；
３）全身的な活性がないこと−一旦吸収されると、代謝性の不活性化により、薬物を不活性な形態に変換すべきであり、それにより腎臓およびＧＩシステムに対する全身的な効果を制限する；
４）抗酸化特性−大腸特異的抗酸化活性は、発ガン物質負荷を軽減するようにさらに働く；および
５）ＮＳＡＩＤ様抗炎症機構−活性代謝物は、炎症誘導性エイコサノイド経路を阻害するべきであるが、基底の維持経路を損なわないエイコサノイド阻害が好ましい。【００２１】  要約すると、所定のＮＳＡＩＤは、発ガン物質誘導性動物モデルにおける大腸腫瘍の発生を阻害し、そしてヒトのポリープの成長を阻害することが示されている。ＮＳＡＩＤによる腫瘍阻害に関する機構は、証明されていないが、これらの薬物は、胃腸のエイコサノイド産生および代謝を調節し得る。不幸なことに、ＮＳＡＩＤはまた、それらの長期使用を妨げ得る妨害性の、および重大な胃腸の副作用のプロフィールを有する。それゆえ、化学的予防薬剤として効果的であるがこれらの副作用を欠失しているＮＳＡＩＤを同定することが、極めて望ましい。Ｃｈａｎ，米国特許第４，４１２，９９２号は、２−ハイドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体、および潰瘍性大腸炎の処置におけるそれらの使用について記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】  本発明のある実施態様に従い、大腸ガンを患うまたは大腸ガンを発症する危険にある個体を処置する方法であって、以下の一般式の２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体を含む薬学的組成物の有効量をヒトに投与する工程を包含する方法が提供される：【００２３】
【化２】
2005320326.tif 000002
【００２４】ここでＸは、−ＳＯ２−または−ＣＯ−基であり、そしてＲは、フェニルまたはカルボキシメチルフェニル基のいずれかであるか、または式−（ＣＨ２）ｎ−Ｙで示される基であり、ここでＹは、水酸基、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基、６個までの炭素原子を含有するアルキル部分、あるいはカルボン酸基あるいはスルホン酸基であり、そしてｎは、１〜６の全ての数であり、そしてここでアルキレン基の１個またはそれ以上の水素原子が、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基により置換され得、このアルキル部分は、６個までの炭素原子またはアルキル基を含み、そしてここで−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ基は、窒素原子に直接またはベンゼン環を介してのいずれかにより結合する（但し、Ｒ−ＮＨ−Ｘ−は、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基以外である）；あるいはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物の非毒性の薬学的に受容可能な塩である。【００２５】  本発明の別の実施態様に従い、本方法の薬学的組成物は、固体または液体の薬学的希釈剤またはキャリアとの混合物中に、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物の塩から本質的になる。【００２６】  本発明のさらに別の実施態様において、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体は、バルサラジドである。【００２７】  本発明のさらなる実施態様において、活性代謝物は５−ＡＳＡである。【００２８】  本発明のさらなる実施態様において、活性代謝物の酸化生成物は、５−ＡＳＡの酸化生成物である。【００２９】  本発明のさらなる実施態様において、５−ＡＳＡの酸化生成物は、ゲンチジン酸または５−ニトロ−サリチル酸である。【００３０】  本発明のさらなる実施態様において、薬学的組成物は、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物の塩の１〜１４ｇ／７０ｋｇ体重／日の範囲の１日用量を、大腸ガンを患うまたは大腸ガンを発症する危険にある個体に経口投与される。【００３１】  本発明の別の実施態様において、薬学的組成物は、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物の塩の１〜１４ｇ／７０ｋｇ体重／日の範囲の１日用量を、大腸ガンを患うまたは大腸ガンを発症する危険にある個体に直腸から投与される。
（項目１）  以下の一般式の２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体を含む薬学的組成物の使用であって：【００３２】
【化１】
2005320326.tif 000003
ここでＸは、−ＳＯ２−または−ＣＯ−基であり、そしてＲは、フェニルまたはカルボキシメチルフェニル基のいずれかであるか、または式−（ＣＨ２）ｎ−Ｙので示される基であり、ここでＹは、水酸基、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基、６個までの炭素原子を含有するアルキル部分、またはカルボン酸基あるいはスルホン酸基であり、そしてｎは、１〜６の全ての数であり、そしてここでアルキレン基の１個またはそれ以上の水素原子が、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基により置換され得、このアルキル部分は、６個までの炭素原子またはアルキル基を含み、そしてここで−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ基は、窒素原子に直接またはベンゼン環を介してのいずれかにより結合する（但し、Ｒ−ＮＨ−Ｘは、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基以外である）；あるいは該組成物はそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性誘導体または活性代謝物の酸化生成物の非毒性のな薬学的に受容可能な塩を含み、該組成物は大腸ガンを患う、または大腸ガンを発症する危険性にある個体を処置する方法に使用するための薬剤の製造用であり、該方法が、有効量の該薬学的組成物を、該組成物を必要とするヒトに投与する工程を包含する、使用。
（項目２）．前記薬剤が、固体または液体の薬学的希釈剤またはキャリアとの混合物中に、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物、あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物の塩から本質的になる、項目１に記載の使用。
（項目３）．前記２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体が、バルサラジドである、項目１に記載の使用。
（項目４）．前記活性代謝物が５−ＡＳＡである、項目１に記載の使用。
（項目５）．前記活性代謝物の酸化生成物が５−ＡＳＡの酸化生成物である、項目１に記載の使用。
（項目６）．前記５−ＡＳＡの酸化生成物がゲンチジン酸である、項目５に記載の使用。
（項目７）．前記５−ＡＳＡの酸化生成物が５−ニトロ−サリチル酸である、項目５に記載の使用。
（項目８）．前記薬学的組成物が、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性誘導体または活性代謝物の酸化生成物の塩の１〜１４ｇ／７０ｋｇ体重／日の範囲の１日用量において、該組成物を必要とするヒトに経口投与される、項目１に記載の使用。
（項目９）．前記薬学的組成物が、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性代謝物または活性代謝物の酸化生成物あるいは２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体またはそれらのエステルまたは活性誘導体または活性代謝物の酸化生成物の塩の１〜１４ｇ／７０ｋｇ体重／日の範囲の１日用量において、該組成物を必要とするヒトに直腸から投与される、項目１に記載の使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】発明の実施態様
２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体、特にバルサラジドおよびその活性な代謝産物は、大腸ガンの化学的予防に有効であることが見出されている。これらの２−ヒトロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体は、以下の一般式を有する：【００３４】
【化３】
2005320326.tif 000004
【００３５】ここで、Ｘは−ＳＯ２−または−ＣＯ−基であり；そしてＲはフェニルまたはカルボキシメチルフェニル基のいずれか、または式−（ＣＨ２）ｎ−Ｙで示される基であり、ここで、Ｙは水酸基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、またはジアルキルアミノ基であり、このアルキル部分は６個までの炭素原子、またはカルボン酸基またはスルホン酸基を含み、そしてｎは１〜６の全ての数であり、そしてここでアルキレン基中の１個またはそれ以上の水素原子が、アミノ基、モノアルキル−あるいはジアルキル−アミノ基により置換され得、このアルキル部分は、６個までの炭素原子またはアルキル基を含み、そしてここで、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ基は、窒素原子に直接またはベンゼン環を介してのいずれかにより結合する（但し、Ｒ−ＮＨ−Ｘ−は、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ基以外である）。【００３６】  本明細書中で使用されるように、用語「２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体」はまた、この化合物のエステルまたは活性な代謝産物、あるいはこの化合物またはそのエステルまたは活性な代謝産物の非毒性の薬理学的に受容可能な塩を包含する。【００３７】  用語「活性な代謝産物」は、例えば、大腸細菌の作用を経ての、ヒト体内での２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体の代謝の産物をいい、これは、大腸ガン細胞の増殖を阻害する。例えば、以下で議論するように、５−ＡＳＡは、バルサラジドの活性な代謝産物である。【００３８】  用語「酸化生成物」は、２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体の活性な代謝産物（例えば、５−ＡＳＡ）を酸化条件（例えば、次亜塩素酸塩または過酸化水素）に曝すことにより生成する産物である。【００３９】  バルサラジドナトリウムは、大腸特異的であり、非ステロイド性の抗炎症アミノサリチル酸塩である。進行中の潰瘍性大腸炎の処置に有用である。バルサラジドおよびその１次代謝産物は、培養ヒト大腸ガン細胞の増殖を阻害する。そしてバルサラジドは、発ガン物質であるアゾキシメタンで処置した動物の異常陰窩形成を阻害する。他のＮＳＡＩＤのように、バルサラジドはヒト大腸ガンの化学的予防に有用である。しかし、バルサラジドは３つの重要な安全性の利点を有する：（１）薬剤の送達が大腸特異的である：（２）胃潰瘍または十二指腸潰瘍の徴候は全く観察されなかった；そして（３）腎毒性の徴候は、今日までに処置された５００人にわたる患者の間に、何人かについては３年間もの期間において、全く報告されていない。従って、バルサラジドは、大腸ガンの化学的予防に対して、効力と安全性との理想的な組み合わせを有する。【００４０】大腸特異的送達。バルサラジドは、スリンダクのようなその不活性な形態が、大腸細菌の作用により活性な抗炎症薬に変換されるプロドラックである。図１に示すように、バルサラジドは、アミノサリチレートである５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）と不活性のキャリア分子である４−アミノベンゾイル−β−アラニン（４−ＡＢＡ）とをアゾ結合を介して結合する。細菌のアゾリダクターゼは、この結合を加水分解し、局所作用のために５−ＡＳＡを放出する。【００４１】限局性全身的吸収。バルサラジドを経口投与した場合、上部ＧＩ管で分解され��、そして実質的に吸収されずに通過する。プロドラックの摂取用量の０．３％程度しか血漿または尿中に見出されない。薬物の９９％が完全なまま大腸に到達する。大腸で、この薬物は加水分解されて５−ＡＳＡおよび４−ＡＢＡを形成し、これが大腸粘膜と相互作用し、そしてそれらのＮ−アセチル形態に変換される。１回の用量のバルサラジドから生じる５−ＡＳＡの大部分は、９６時間にわたってＮ−アセチル−５−ＡＳＡ（Ｎａｃ５ＡＳＡ）に変換され、そして尿中に排出される。一方、４−ＡＢＡおよびそのＮ−アセチル代謝産物は、ほとんど吸収されない。５−ＡＳＡのＮ−アセチル代謝産物は不活性であるため、送達された５−ＡＳＡの全身的な活性もまた減少する（Ｃｈａｎら（１９８３）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．２８：６０９−６１５）。【００４２】抗酸化的特性。前で論じたように、有効な抗酸化的特性を有する化学的予防剤はまた、大腸発ガン物質荷重の減少、ならびに浸潤炎症細胞からのフリーラジカル放出により誘導される損傷を減少させるのに寄与し得る。５−ＡＳＡは、アルギニン依存性の五酸化二窒素からのニトロソアミン形成を阻害する（Ｇｒｉｓｈａｍ（１９９３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０４：Ａ２４３）。さらに、完全なバルサラジドおよび５−ＡＳＡの両方が、Ｏ２−およびＯＨ：に対する効果的なフリーラジカル捕獲剤である。バルサラジドおよび５−ＡＳＡは、潰瘍性大腸炎を有する患者由来の直腸バイオプシーとともにインキュベートした場合、直腸粘膜の反応性酸素代謝物産生を９０％以上減少させる。両方の薬剤はまた、同様の濃度で使用された場合、抗酸化剤であるタウリン、アスコルベート、またはＮ−アセチルシステインよりも効果的である（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら（１９９２）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０２：Ａ６９６）。【００４３】上部胃腸効果を有しない大腸抗炎症活性。パルサラジドは、いくつかの大腸炎症の動物モデルならびに進行中の潰瘍性大腸炎（Ｇｒｅｅｎら（１９９３）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１０４：Ａ７０９）および鎮静期の潰瘍性大腸炎（Ｇａｉｆｆｅｒら（１９９２）Ａｉｌｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：４７９−４８５）において抗炎症活性を有する。重要なことは、この薬物が優れた胃腸耐性を示すことである。【００４４】バルサラジドおよび５−ＡＳＡは、インビトロにおいて大腸ガン細胞の増殖を阻害する。５−ＡＳＡならびにバルサラジドは、ヒトの大腸ガン細胞に有意な増殖阻害活性を示す。【００４５】５−ＡＳＡの酸化生成物は、インビトロにおいて大腸ガン細胞の増殖を阻害する。５−ＡＳＡの酸化生成物は、５−ＡＳＡと比較した場合、ヒト大腸ガン細胞に対して驚異的な予期せぬ増殖阻害活性を示す。【００４６】大腸ガンの化学的防止および／または化学的治療の方法
従って、本発明の２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体、特にバルサラジドおよびその代謝産物は、大腸ガンの化学的治療に有用である。これらは好ましくは、大腸ガンを患っている、または大腸ガンを発症する危険性のあるヒト個体に、２−ヒドロキシ−５−フェニル安息香酸誘導体を含有する薬学的組成物の形態で投与される。薬学的組成物はまた、１またはそれ以上の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、および／または希釈剤を含み得る。経口投与が好ましい。標準的な薬学的処方技術が用いられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，最新版に開示されている）。【００４７】  組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、舐剤、液体、またはゲル投与物の形態であり得る。経口投与のための錠剤およびカプセルは、単位用量投与に適切な形態であり得、従来の賦形剤を含有し得る。これらの例は、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、およびポリビニルピロリドン）；増量剤（例えば、ラクトース、しょ糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール、またはグリシン）；錠剤化潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、ポリエチレングリコール、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン）；または受容可能な湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）である。錠剤は、通常の薬学的実践で周知の方法に従ってコーティングされ得る。経口用液体調製物は、例えば、水性または油性の懸濁物、溶液、乳剤、シロップ、またはエリキシルの形態であり得、あるいは、使用前に水または他の適切な媒体で再構成するための乾燥産物として与えられ得る。このような液体調製物は、従来の添加物、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチン、ソルビタンモノオレアート、またはアラビアゴム；非水性媒体（食用油を含む）（例えば、アーモンド油、分留ヤシ油、グリセリンのような油性エステル、プロピレングリコール、またはエチルアルコール）；防腐剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）および、所望であれば従来の香料または着色料を含有し得る。【００４８】  本発明の薬学的組成物の活性物質の割合は変化し得、それは、所望の治療効果についての適切な用量が得られるように、比率を構築すべきであることが必要とされる。一般に、本発明の調製物は、１日・７０ｋｇ体重あたり１〜１４ｇの活性物質を与えるように、ヒトに経口投与または直腸投与されるべきである。【００４９】  以下の実施例は、例示のためであり、そして限定するためのものではない。
【実施例】
【００５０】実施例１：バルサラジドおよび５−ＡＳＡは、インビトロで大腸ガン細胞の増殖を阻害する
バルサラジドおよびその代謝産物である５−ＡＳＡのヒト大腸ガン細胞の増殖に対する活性を、ヒト腺腫細胞ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔを使用してインビトロで実証した。細胞は、１０％仔ウシ血清を添加したダルベッコの改変Ｅａｇｌｅ培地で、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にて増殖させた。増殖試験のために、細胞を２４ウェル組織培養皿（２ｃｍ２／ウェル）に、２０，０００細胞／ウェルの密度で播き、そして１２時間接着させた。次いで、増殖培地を交換し、そして試験薬物を含有する新鮮培地で置き換えた。【００５１】  試験薬物を、所望の濃度で組織培養培地に溶解し、そして個々のウェルに添加した。ウェルあたりの細胞数を決定するために、培地を除去し、そして細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。次いで、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で１５分間、分離するまでインキュベートした。次いで、分離した細胞をウェルから取り出し、そしてＣｏｕｌｔｅｒＣｏｕｎｔｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＺＢＩ）を使用して計数した。図２および３に示されるように、ヒト大腸ガン細胞株ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔの両方が、漸増濃度の５−ＡＳＡにより増殖阻害された。１０ｍＭ５−ＡＳＡの用量では、阻害はそれぞれ８２％および８５％に達した。【００５２】  比較研究もまた、バルサラジドとその２つの代謝物５−ＡＳＡおよび４−ＡＢＡならびにアセチルサリチル酸（アスピリン）とのガン細胞の増殖への有効性を試験するために実行した。表Ｉに示したように、アセチルサリチル酸（これは、共有結合的にシクロキシゲナーゼを阻害する）は、親薬物のバルサラジドが阻害したように、このアッセイで強力に阻害性であった。しかし、４−ＡＢＡ（バルサラジドのキャリア分子）は不活性であった。表Ｉに示した細胞数は、３つの培養ウェルの平均である。【００５３】
【表１】
2005320326.tif 000005
【００５４】  バルサラジドおよび５−ＡＳＡで見られる増殖阻害効果の用量応答関係を調べるために設計されたさらなる研究は、ＨＴ−２９細胞またはＬＳ１７４Ｔ細胞のいずれかを使用して試験した場合、両方の化合物が同様の結果を生じることを示した。用量応答研究のために、９６ウェルプレートにおいて多数の薬剤および用量を同時にアッセイすることを可能にするように、敏感な色素結合アッセイを適合させた。細胞をプレートし、そして試験薬物を添加する前に２４時間接着させた。次いで、４日後に細胞密度を、ウェルを固定し、そしてスルホロダミンＢ色素で染色することにより測定した。次いで、染色培養物の光学密度を、９６ウェルプレートリーダーを４９５ｎｍで使用して測定した（Ｓｋｅｈａｎら（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１１１２）。【００５５】  図５に示したように、バルサラジドは、低濃度で５−ＡＳＡより大きな阻害応答を一貫して生成する。ＨＴ−２９細胞を使用する場合、ＩＣ５０値は、それぞれ５．７ｍＭおよび１１．８ｍＭであるが、一方ＬＳ１７４Ｔ細胞を使用する場合、それぞれのＩＣ５０値は５．２ｍＭおよび１１．５ｍＭである。試験した５−ＡＳＡの最低の濃度（ＬＳ１７４Ｔは０．１〜１．０ｍＭ、ＨＴ−２９は０．１〜４ｍＭ）では、約２０％の細胞数の再現性があり、そして統計学的に有意な増大が、両方の細胞タイプで観察された。これは、他者により以前に出版された結果と一致する（彼らは、低濃度の他のＮＳＡＩＤにより誘導されるタンパク質合成の増大に続き、より高い濃度での阻害を観察した（Ｈｉａｌら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２０２：４４６−４５２））。【００５６】実施例２：ラットの異常陰窩形成におけるバルサラジドおよび代謝産物の影響
異常陰窩は、発ガン物質に誘導される大腸粘膜中の「大きさ、厚さの増大した上皮内層および増大した周陰窩帯」の陰窩として最初に記載された（Ｂｉｒｄら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．８：１８９−２００）。ＮＳＡＩＤは、ラットにおいて発ガン物質のアゾキシメタン（ＡＯＭ）により誘導される異常陰窩形成の最も強力なインヒビターのうちの一つである（Ｗａｒｇｏｖｉｃｈら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６Ｇ：５１−５４）。これらの薬剤のいくつかの抗腫瘍活性は、より長期なＡＯＭ動物研究で確証されている。従って、異常陰窩モデルは、バルサラジドおよび代謝産物の効力についての理想的なインビボアッセイである。【００５７】異常陰窩誘導の阻害。異常陰窩形成の阻害に対するバルサラジド（ＢＳＺ）およびその代謝産物の５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）および４−アミノベンゾイル−β−アラニン（４−ＡＢＡ）の効力を、ラットのアゾキシメタン（ＡＯＭ）により誘導される大腸ガンのモデルで測定した。【００５８】  ４群の５匹の雄Ｆ３４４ラットを使用した。動物は、全体の平均の＋／−２０％以内の出発体重範囲であり、投薬開始時に６〜８週齢であった。公開された研究から予測されるＡＯＭ処理に対する応答は、動物あたり１００〜１４０の異常陰窩形成である（Ｗａｒｇｏｖｉｃｈら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６Ｇ：５１−５４）。これらの応答率および９５％信頼限界のχ２検定を使用すると、動物あたり５０〜７５の異常陰窩が観察された場合、群あたり５動物のサンプルサイズで、試験薬物による統計的に有意な（ｐ＜０．０５のレベルで）阻害の検出を可能にする。【００５９】  動物を、体重のクラスにより試験群に無作為化する前に、１０日間馴化させた。試験薬物を、動物・１日あたり５０ｍｌの平均水消費に基づいて、動物・１日あたり所望の用量を与える濃度で飲料水に溶解した。２つの群に、ＡＯＭ注射の前に１週間の薬物処理を受けさせた。発ガンは、２週目および３週目のはじめに与えた２０ｍｇ／ｋｇのＡＯＭの２回の皮下注射により誘導された。次いで、試験品目の投薬を、５週目の終わりまで続けた。【００６０】  バルサラジドの用量レベルの選択は、大腸モデルでの効力についての他の臨床前研究の概説により行われる。５００ｇのラットでの２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量は、７０ｋｇのヒトでの１日あたり１４ｇの用量、進行中の潰瘍性大腸炎の処置における治療用量の約２倍、および緩解を維持するための用量の４倍以上に匹敵する。この用量レベルにより、５−ＡＳＡの大腸での濃度が５〜２０ｍＭとなる。ラットのバルサラジドの最大許容用量は、１２，０００ｍｇ／ｋｇ／日を越える。【００６１】  体重を週２回記録し、そして動物の各ケージの水消費を週２回測定した。消費は、平均ｍｌ／動物／ケージとして計算する。【００６２】  異常陰窩分析のために、動物を投薬の３週目または５週目のいずれかの終わりにＣＯ２安楽死により屠殺した。大腸を盲腸および肛門で切除し、摘出し、縦方向に切開した。組織から内容物を除き、生理食塩水ですすぎ、そして２％パラホルムアルデヒド中で４℃にて２時間固定し、そして０．２％メチレンブルーで３〜５分間染色した。生理食��水ですすいだ後、異常陰窩の病巣の数を４０〜１００×の倍率の顕微鏡下で数えることにより得点を付けた。大腸組織の長さもまた測定した。大ざっぱに同定された病変の代表的サンプルを、グリコールメタクリレートに４℃にて包埋した；それぞれの病巣の３〜４μｍの切片を、組織学的評価のためにヘマトキシリン、エオシン、およびアズール（ＨＥＡ）で染色する。【００６３】  胃十二指腸のびらん分析のために、底部、洞、および十二指腸を摘出し、そして上記のように別々に処理した。胃のびらんは、記載されたように長さおよび重篤度の胃のびらん指数を使用して得点を付けた（Ｐｅｓｋａｒら（１９８６）Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ３１：２８３−２８７）。【００６４】  結果を図４に示す。これは、２回のアゾキシメタンの皮下注射後１週または３週間目のいずれかで試験した動物について、大腸組織の縦方向の１ｃｍあたりの平均異常陰窩数をしめす。両時点とも、バルサラジドで処理した動物は、コントロール動物よりも非常に少ない平均異常陰窩数を有した。平均異常陰窩数は、１週目では６１．８％阻害であり、そして５週目では５８．１％阻害であった。【００６５】異常陰窩進行の阻害。図４に示すデータは、大腸組織の末端７〜８ｃｍから収集した。これらの初期の時点では、この領域は８０％以上の総異常陰窩病巣を含んでいた。従って、別の研究を、より長期の時点を試験するため、大腸全長２５ｃｍでの全体の分布を評価するため、そして薬物処理を２回目のＡＯＭ注射後に開始し得るか否かを決定するために設計した。この後の目的は、特に興味深い。なぜなら、化学的予防剤が、発ガン物質による初期のトランスフォーメーション事象に続く異常陰窩増殖の進行を阻害することを実証するために重要であるからである。【００６６】  第２の研究では、８動物の群に、１週間の間隔をあけて２回のアゾキシメタンの注射を受けさせた。次いで、２回目の注射の２４時間後に１つの群でバルサラジド処理を開始した。６週間後、動物を異常陰窩分析について処理した。陰窩を安楽死下での１５分間の０．２％メチレンブルー溶液の直腸点滴注入によりインサイチュで染色した。次いで、動物から放血し、肛門から盲腸までの大腸組織を切除し、清浄し、そして２％パラホルムアルデヒド中で２時間固定した。陰窩を４０×の倍率で見ることにより数えた。病巣数のデータ収集に加えて、データをまた病巣あたりの異常陰窩の多重度についても収集した。これらのデータを、図６に示す。図から明らかなように、バルサラジドを２回目のＡＯＭ注射の２４時間後に与えた場合ですら、異常陰窩病巣の劇的な阻害（これは、図４に示した以前の実験（全体として約６０％阻害）に匹敵する）が観察されたことである。【００６７】  Ｐｒｅｔｌｏｗら（Ｐｒｅｔｌｏｗら（１９９２）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１３：１５０９−１５１２）による以前の研究は、同一の発ガンモデルを使用する異常陰窩多重度と最終的な腫瘍発達との関係を報告している。これらの研究では、４またはそれより多い異常陰窩を含む異常陰窩数が、腫瘍形成と強く相関していた。これは、これらのより大きな病巣が、より腫瘍に進行し易いことを示唆する。上記の実験のデータを、異常陰窩多重度に対するバルサラジドの効果を決定するために分析した。これらのデータを以下の表ＩＩに示し、そしてこのデータにより、バルサラジドは、４未満の異常陰窩を含む病巣数よりも、４またはそれより多い異常陰窩を含む病巣数のより大きな阻害を発揮することが明らかとなる。１〜３の陰窩を有する病巣では、平均阻害は、５７〜６１％の範囲である（ｐ＜０．００３、Ｆｉｓｃｈｅｒの精密度試験）が、４またはそれより多い陰窩を含む病巣数は平均７２〜７６％減少した（ｐ＜０．００１）。４またはそれより多い陰窩を含む病巣数についての結果を３またはそれより少ない陰窩を含む病巣数と比較した場合、この差異は、Ｆｉｓｃｈｅｒの精密度試験を用いてｐ＜０．０２２レベルで統計学的に有意である。【００６８】
【表２】
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【００６９】  これらの結果は、最も多くの異常陰窩を含む病巣が、２〜３の異常陰窩を含む病巣の約２倍減少したことを示す。Ｐｒｅｔｌｏｗらの結果に関連して解釈すると、この阻害は、動物がより後の時点で試験される場合の腫瘍形成の阻害と言い替え得るであろう。
実施例３：インビトロでの大腸ガン細胞の増殖における５−ＡＳＡの酸化生成物の影響
上記の実施例でバルサラジドで見られた阻害は、両方の細胞タイプの間で同一であったが、ＬＳ１７４Ｔ細胞は、常にＨＴ−２９細胞よりも５−ＡＳＡの作用に対してより感受性であった。さらに、５−ＡＳＡに対する両方の細胞タイプでの阻害応答は、個々の実験間で最大７０％から最低１０％まで変化した。この可変性の原因を決定するための実験の設計において、細胞に添加する最小３日前に作製された５−ＡＳＡ貯蔵溶液は、一貫してより大きな阻害効果を生じることが決定された。この差異を、図７に示す。【００７０】  この実験では、溶解直後の１０ｍＭ  ５−ＡＳＡに曝したＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖は、４日間にわたって、コントロール細胞により示される増殖応答の８２．７％の増殖応答を示した。対照的に、実験開始４日前に培養培地に溶解した１０ｍＭ５−ＡＳＡに曝した平行培養物の増殖は、４日間にわたって、コントロール培養により示される増殖応答のわずか２２．９％の増殖応答を示した。この著しい差異は、５−ＡＳＡが特定の培地成分の存在している間に、より活性な代謝産物に変換されつつあることを示唆した。【００７１】  ５−ＡＳＡに関連する重要な活性の１つは、抗酸化性である。実際、胃の炎症の処置における治療上の利点のいくらかは、炎症細胞から放出されたＯ２−を含むフリーラジカルを捕獲する能力に由来し、従って、酸化による損傷を減少させると考えられる。これは、組織培養培地中でプレインキュベートする場合に５−ＡＳＡに関係する阻害活性で観察される変化が、酸化事象と一致し得ることを示唆した。この可能性を試験するために、５−ＡＳＡを種々の比の次亜塩素酸ナトリウムを使用して酸化させ、次いで、続いて起こる細胞増殖阻害活性を評価した。以下の表ＩＩＩに示されるように、次亜塩素酸塩の量が増加するにつれて５−ＡＳＡの阻害活性が増大した。【００７２】
【表３】
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＊未酸化の５−ＡＳＡの基底の阻害活性は４５％であった。０．４ｍＭ  ＮａＯＣｌによるバックグランドの阻害活性は２％未満であった。【００７３】  他者による以前の研究は、次亜塩素酸塩または過酸化水素への曝露のような酸化条件が数種の異なる５−ＡＳＡ代謝産物を生じ得ることを示している。このような酸化生成物の２つ、ゲンチシン酸（Ｄｕｌｌら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：２４６７−２４７２）および５−ニトロ−サリチレート（Ｌａｆｆａｆｉａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：１８６９−１８７４）が解明されている。上記の結果を考慮して、５−ＡＳＡのこれらの酸化生成物の両方を、大腸ガン細胞の増殖阻害活性について試験した。４つの異なるヒト大腸ガン細胞株を使用して以下の表ＩＶに示されるように、５−ニトロ誘導体がより強力であるようであるが、両代謝産物とも細胞増殖を阻害した。各細胞株の増殖阻害における、バルサラジド、その１次代謝産物の５−ＡＳＡ、および２つの可能な５−ＡＳＡ酸化生成物の相対有効性を、以下の表ＩＶにまとめて示す。【００７４】
【表４】
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【００７５】  本明細書中に引用されている全ての刊行物および特許出願は、参考として援用されているそれぞれの個々の出版物または特許出願が詳細におよび個々に示されると同程度に、本明細書中に参考として援用されている。【００７６】  本発明は今や十分に記載されているが、添付の請求の範囲の意図および範囲から逸脱することなく、多くの変更および改変が行われ得ることは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、２−ヒドロキシ−５−フェニルアゾ安息香酸誘導体（ここで、一般名は、バルサラジドである）の化学構造を示す。アミノサリチレート部分、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は、キャリア分子である４−アミノベンゾイル−β−アラニン（４−ＡＢＡ）にアゾ結合を介して結合している。
【図２】図２は、腺ガン細胞株ＨＴ−２９の増殖への０、０．１、１．０、および１０ｍＭの用量における５−ＡＳＡの効果を示す。示した細胞数は、３回の実験の平均である。
【図３】図３は、腺ガン細胞株ＬＳ１７４Ｔの増殖への０、０．１、１．０、および１０ｍＭの用量における５−ＡＳＡの効果を示す。示した細胞数は、３回の実験の平均である。
【図４】図４は、飲料水中に投与したバルサラジドの存在下または非存在下での発ガン物質アゾキシメタンでのラット群の処理により誘導された異常大腸陰窩数の分析を示す。
【図５】図５は、低濃度でのバルサラジドおよび５−ＡＳＡにより生成される相対的な阻害応答を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、それぞれコントロール動物および第２回の注射の６週間後のＡＯＭ（２０ｍｇ／ｋｇ）注射動物の大腸全体の異常陰窩病巣の分布を示す。１、２、３、４、または５あるいはそれ以上の数を含む病巣数を示す（それぞれパネルの低い曲線から高い曲線）。
【図７】図７は、細胞に曝す４日前に培地に溶解した種々の濃度の５−ＡＳＡ（黒）、または、細胞に曝す直前に培地に１０ｍＭで溶解した５−ＡＳＡ（白）によるＬＳ１７４Ｔ細胞の増殖の阻害を示す。細胞は、定量前にさらに４日間増殖させた。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、種々の濃度の５−ＡＳＡの２つの酸化生成物、ゲンチジン酸塩および５−ニトロサリチル酸塩による大腸ガンの細胞増殖の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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