(57)【要約】【課題】合成が容易なカテプシンＡ阻害作用を有する基本骨格を見出し、その基本骨格を利用して特異的なカテプシンＡ阻害作用を有する化合物を見出すこと。【解決手段】本発明はフェニルアラニン骨格がカテプシンＡ阻害作用に重要な役割を果たすこと見いだしたもので、より具体的にはＬ−フェニルアラニンのカルボキシル基及びアミノ基の両者に置換基を有し、かつ分子量が２００〜５００の範囲内であり、カテプシンＡ阻害活性を有するＬ−フェニルアラニン誘導体またはその塩を有効成分とするカテプシンＡ阻害剤に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−フェニルアラニンのカルボキシル基及びアミノ基の両者に置換基を有し、かつ分子量が２００〜５００の範囲内であり、カテプシンＡ阻害活性を有するＬ−フェニルアラニン誘導体またはその塩を有効成分とするカテプシンＡ阻害剤。
【請求項２】
Ｌ−フェニルアラニン誘導体が下記式一般式（Ｉ）
【化１】
2005145839.tif 000005
（式中、Ｘは置換されていてもよい炭素数１〜６の脂肪族オキシ基、置換されていてもよい炭素数１〜６の脂肪族基、Ｙは置換されていてもよいアミノ酸残基であり、隣接するＺとアミノ基で、またＮＨとカルボニル基で結合している、Ｚは置換されていてもよいアシル基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基または置換されていてもよい炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、ｎは０または１の整数を示す）
で示されるものである請求項第１項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項３】
アミノ酸残基が下記式（ＩＩ）
【化２】
2005145839.tif 000006
（式中、Ｒは置換されていてもよい炭素数１〜１０の脂肪族基または置換されていてもよいフェニル基、ｎは０または１の整数を示す）
で示される基である請求項第２項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項４】
式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、プロポキシ基またはクロルメチル基、Ｙは式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基、ｎが０または１であり、かつ式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、ブチル基、ベンジル基、フェニル基、ｐ−シアノフェニル基またはシクロヘキシル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−シアノフェニル基またはｏ−アミノピラジニル基、請求項第３項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項５】
有効成分化合物が
（１）Ｘがエトキシ基またはプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基またはブチル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（２）式（Ｉ）において、Ｘがクロルメチル基、ｎが０または１、式（ＩＩ）におけるＲがフェニル基またはシクロヘキシル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基、である化合物、
（３）式（Ｉ）において、Ｘがプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがシクロヘキシルメチル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（４）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、Ｚがｏ−アミノピラジニル基である化合物、
（５）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがｐ−シアノフェニル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（６）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、Ｚがｏ−アミノピラジニル基である化合物、
（７）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがシクロヘキシル基、Ｚがｐ−シアノフェニル基である化合物、および
（８）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基またはプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソブチル基、Ｚがベンゾイル基、ｎが１である化合物、からなる群から選ばれる少なくとの１つの化合物である請求項第４項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項６】
カテプシンＡがヒトカテプシンＡである請求項第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項７】
カテプシンＡがヒト組換えカテプシンＡである請求項第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤。
【請求項８】
請求項第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，新規なカテプシンＡ阻害剤及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトカテプシンＡ（hCath A）遺伝子は、第２０番染色体に存在する。この遺伝子変異により、ガラクトシアリドーシスと呼ばれる、全身性の症状を示す日本人種に多い常染色体劣性遺伝病が発症する。カテプシンＡ（別名：保護タンパク質）はリソソーム性の多機能糖タンパク質であり、酸性セリンカルボキシペプチダーゼ活性（触媒機能）を有するとともに、リソソーム性ノイラミニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼと高分子複合体を形成して、これらの糖質加水分解酵素の活性化や安定化機能（保護機能）を示す。
ガラクトシアリドーシス（カテプシンＡ欠損症）では、カテプシンＡの保護機能と触媒機能が同時に欠損し、糖質加水分解酵素の低下に基き生体内基質が過剰に蓄積する。一方、触媒機能の低下と病態との関連については不明な点が多い。従って、培養細胞内のカテプシンＡ活性を特異的に阻害するような化合物が見い出されれば、その阻害剤の投与時の表現型の変動を観察することにより、カテプシンＡの生理機能を推察することができる。
【０００３】
また、最近ヒトメラノーマの悪性化に伴い、組織内カテプシンＡ活性が増大するという報告が提出されている。従って、カテプシンＡ活性の低下によりヒトメラノーマの悪性化が抑制される可能性がある。
また、最近、カテプシンＡがリソソーム膜面でのリソソーム結合性膜タンパク質（Lysosome-associated membrane protein; Lamp）type 2a（Lamp2a）の分解に関与し、シャペロン依存のオートファジーを抑制的に調節していることが報告されている。しばしば細胞や組織におけるシャペロン依存のオートファジーの低下と老化促進との関連が示唆されている。Lamp2aは、飢餓状態の細胞内のオートファジーの際に、特定配列をもつ細胞質タンパク質をシャペロン依存的にリソソーム内に輸送する受容体としての機能をもつ酵素であり、細胞内カテプシンＡ活性の異常な亢進が、この酵素の分解を促進し、このオートファジーの低下や老化の原因になっている可能性も考えられる。従ってこのようなカテプシンＡ活性の亢進を伴う疾患に対しては、その特異的阻害剤を患者に投与することにより、該阻害剤がシャペロン依存のオートファジーの正常化を促して細胞の老化を防止するので、疾患の治療につながることが期待される。
従来カテプシンＡ阻害剤としてはプロテアソーム阻害剤であるラクタシシスチン（Lactacystin）等が報告されている（非特許文献１）。しかしながらこれらの酵素は酵素特異性が低く合成も比較的難しいため、より合成が楽で特異性の高いカテプシンＡ阻害剤の開発が望まれている。
【非特許文献１】日本薬学会年会講演要旨集  Ｖｏｌ．１２３ｒｄ  Ｎｏ．３；Ｐ１０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は第一により合成が容易なカテプシンＡ阻害作用を有する基本骨格を見出すこと、第二にその基本骨格を利用してより特異的なカテプシンＡ阻害作用を有する化合物を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは，上記課題を克服するべく鋭意研究を行った結果，フェニルアラニン骨格がカテプシンＡ阻害作用に重要な役割を果たすこと、特にジペプタイド以下の低分子量のフェニルアラニン誘導体は、合成が比較的容易で、かつ適切に置換基を選択することによりカテプシンＡ阻害作用を有するを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は
１．  Ｌ−フェニルアラニンのカルボキシル基及びアミノ基の両者に置換基を有し、かつ分子量が２００〜５００の範囲内であり、カテプシンＡ阻害活性を有するＬ−フェニルアラニン誘導体またはその塩を有効成分とするカテプシンＡ阻害剤、
２．  Ｌ−フェニルアラニン誘導体が下記式一般式（Ｉ）
【化３】
2005145839.tif 000002
（式中、Ｘは置換されていてもよい炭素数１〜６の脂肪族オキシ基、置換されていてもよい炭素数１〜６の脂肪族基、Ｙは置換されていてもよいアミノ酸残基であり、隣接するＺとアミノ基で、またＮＨとカルボニル基で結合している、Ｚは置換されていてもよいアシル基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基または置換されていてもよい炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、ｎは０または１の整数を示す）
で示されるものである上記第１項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
３．アミノ酸残基が下記式（ＩＩ）
【化４】
2005145839.tif 000003
（式中、Ｒは置換されていてもよい炭素数１〜１０の脂肪族基または置換されていてもよいフェニル基、ｎは０または１の整数を示す）
で示される基である上記第２項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
４．  式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、プロポキシ基またはクロルメチル基、Ｙは式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基、ｎが０または１であり、かつ式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、ブチル基、ベンジル基、フェニル基、ｐ−シアノフェニル基またはシクロヘキシル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基、ｐ−シアノフェニル基またはｏ−アミノピラジニル基である上記第３項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
５．有効成分化合物が
（１）Ｘがエトキシ基またはプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基またはブチル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（２）式（Ｉ）において、Ｘがクロルメチル基、ｎが０または１、式（ＩＩ）におけるＲがフェニル基またはシクロヘキシル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基、である化合物、
（３）式（Ｉ）において、Ｘがプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがシクロヘキシルメチル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（４）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、Ｚがｏ−アミノピラジニル基である化合物、
（５）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがｐ−シアノフェニル基、Ｚがｔ−ブトキシカルボニル基である化合物、
（６）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソプロピル基、Ｚがｏ−アミノピラジニル基である化合物、
（７）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがシクロヘキシル基、Ｚがｐ−シアノフェニル基である化合物、および
（８）式（Ｉ）において、Ｘがエトキシ基またはプロポキシ基、ｎが１、式（ＩＩ）におけるＲがイソブチル基、Ｚがベンゾイル基、ｎが１である化合物、からなる群から選ばれる少なくとの１つの化合物である上記第４項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
６．  カテプシンＡがヒトカテプシンＡである上記第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
７．  カテプシンＡがヒト組換えカテプシンＡである上記第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤、
８．  上記第１項〜第５項に記載のカテプシンＡ阻害剤を含む医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によるカテプシンＡ阻害剤はカテプシンＡ阻害作用が強く、かつ特異性もあり、合成が比較的楽であることから、カテプシンＡの作用機作の解明のための試薬として、またカテプシンＡ活性の亢進に伴って引き起こされる種々の疾病の悪化の防止、予防治療剤などとして応用できる可能性がある。
すなわち、カテプシンＡ特異的阻害剤は、その生理機能や病態との相関を解析するためのプローブ試薬として応用できる。また、該カテプシンＡ特異的阻害剤はカテプシンＡの性の増大によるヒトメラノーマの悪性化の抑制やカテプシンＡ活性の異常亢進によるシャペロン依存のオートファジーの低下を防ぎ、細胞の老化を防止ための薬剤などとして応用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において使用されるカテプシンＡ阻害活性を有するＬ−フェニルアラニン誘導体は、いずれもＬ−フェニルアラニンのアミノ基及びカルボキシル基に、常法により、アミノ酸やその他の比較的低分子量の置換基を導入することにより容易に得ることができ、該誘導体の分子量は２００〜５００の範囲内が好ましい。そのようなＬ−フェニルアラニン誘導体としては、アミノ酸分子としてＬ−フェニルアラニン１分子のみを含む誘導体やＬ−フェニルアラニンと他のアミノ酸一分子からなるジペプチドの誘導体などが挙げられ、好ましくは前記一般式（Ｉ）で示される化合物を具体的に挙げることができる。これらの化合物は酸、例えば塩酸、硫酸などの強酸、または有機酸などとの塩になっていてもよい。
【０００８】
本発明において、炭素数１〜６の脂肪族基としては、直鎖状、分岐状、環状いずれでもよく、また、不飽和結合を含んでいても良い。例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ヘプチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
炭素数１〜６の脂肪族オキシ基としては、上記脂肪族基に酸素が結合した基を挙げることができる。
上記脂肪族基上の置換基としてはハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基、シアノ基、フェニル基、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基などの置換基を挙げることができる。ハロゲン原子としてしては塩素原子、臭素原子、フッ素原子などを挙げることができる。
アミノ酸残基は特に制限はないが、本発明においてはα−アミノ酸残基又はβ−アミノ酸残基が好ましい。前記式（ＩＩ）で示されるβ−アミノ酸残基はより好ましい。
炭素数１〜１０の脂肪族基としては、直鎖状、分岐状、環状いずれでもよく、また、不飽和結合を含んでいても良い。例えば、上記炭素数１〜６の脂肪族基の個所で例示したものに、更に、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などを挙げることができる。これらの脂肪族基上の置換基としては、ハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基、シアノ基、フェニル基、シクロアルキル基などの置換基を挙げることができる。
【０００９】
アシル基としては脂肪族アシル基または芳香族アシル基いずれでもよく、アシル基における脂肪族基または芳香族基はその中に１〜３個の酸素原子、窒素原子、硫黄原子などの異項原子を含んでいてもよい。例えば脂肪族アシル基としては前記炭素数１〜１０の脂肪族基の個所で挙げた基が挙げられる。また、芳香族基としてはフェニル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピラジニル基、ナフチル基などの炭素原子若しくは異項原子を含む６〜１０員環からなる単環若しくは縮合環の基が挙げられる。アシル基上における置換基としては脂肪族アシル基のときはハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基またはシアノ基などの置換基を挙げることができる。これらの置換基は複数個あってもよい。芳香族アシル基のときの置換基としては上記脂肪族アシル基上の置換基または炭素数１〜１０の脂肪族基等を挙げることができる。これらの置換基は複数個あってもよい。
フェニルスルホニル基上の置換基としては上記芳香族アシル基上の置換基として挙げたものと同じものが挙げられる。炭素数１〜４の低級アルキル基が好ましい。
【００１０】
上記アルコキシ基上の置換基としてはハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシ基またはシアノ基などの置換基を挙げることができる。
Ｘの前記脂肪族オキシ基としては炭素数１〜４のアルコキシ基が好ましく、エトキシ基またはプロポキシ基がより好ましい。また、Ｘの炭素数１〜６の脂肪族基としてはハロゲン置換されてもよいＣ１〜Ｃ４アルキル基が好ましく、クロル置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル基がより好ましく、具体的にはクロル置換メチル基を挙げることができる。
Ｙのアミノ酸残基としては前記式（ＩＩ）で示されるアミノ酸残基が好ましく、式（ＩＩ）においてＲがＣ３〜Ｃ６のアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基またはＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基が好ましく、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基、シクロヘキシルメチル基、フェニル基（シアノ基で置換されていてもよい）、シクロプロピル基またはシクロヘキシル基がより好ましい。
Ｚとしては置換されていてもよい芳香族アシル基、置換されていてもよいフェニルスルホニル基または分岐状Ｃ３〜Ｃ４アルコキシカルボニル基が好ましい。置換されていてもよい芳香族アシル基としてはシアノ基で置換されていてもよいベンゾイル基、アミノ基で置換されていてもよいピラジニル基がより好ましい。また、置換されていてもよいフェニルスルホニル基および分岐状Ｃ３〜Ｃ４アルコキシカルボニル基としてはそれぞれＣ１〜Ｃ３アルキル置換フェニルスルホニル基およびｔ−ブトキシカルボニル基がよりこのましい。Ｚとして最も好ましい基はｐ−シアノベンゾイル基、ｏ−アミノピラジニル基またはｔ−ブトキシカルボニル基である。
【００１１】
本発明で使用する代表的な化合物を例示すれば下記の通りである。
【化５】
2005145839.tif 000004
【００１２】
表１                                                                      
化合物番号          Ｚ                    Ｒ            ｎ        Ｘ      
１      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      ｎ−Ｃ６Ｈ１３−  １    −ＯＣ２Ｈ５
２  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｎ−Ｃ６Ｈ１３−  １    −ＯＣ２Ｈ５
３  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  iso−propyl−     １    −ＯＣ２Ｈ５
４      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      ｎ−Ｃ６Ｈ１３−  １    −ＯＣ３Ｈ７
５      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      ｎ−Ｃ６Ｈ１３−  １    −ＯＣ３Ｈ７(iso)
６      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      iso-propyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
７        ｐｈ−ＣＯ−              iso-propyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
８  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｐｈ−            １    −ＯＣ２Ｈ５
９  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｐｈ−ＣＨ２−    １    −ＯＣ２Ｈ５
１０  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｎ-butyl          １    −ＯＣ２Ｈ５
１１  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  cyclohexyl        １    −ＣＨ２Ｃｌ
１２  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｐｈ−            １    −ＣＨ２Ｃｌ
１３      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      cyclopropyl       １    −ＯＣ２Ｈ５
１４        ｐｈ−ＣＯ−              iso−butyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
１５        ｐｈ−ＣＯ−              iso-propyl        １    −ＯＣ３Ｈ７
１６  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  cyclohexylmethyl  １    −ＯＣ３Ｈ７
１７      ＣＨ３−ｐｈ−ＳＯ２−      iso-propyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
１８  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−  ｐ−ＣＮ−ｐｈ−  １    −ＯＣ２Ｈ５
１９  ｏ−ＮＨ２−pyradinyl−ＣＯ−   iso-propyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
２０  ｔ−（ＣＨ３）３Ｃ−Ｏ−ＣＯ−      −            ０    −ＣＨ２Ｃｌ
２１      ｐ−ＣＮ−ｐｈ−ＣＯ−      cyclohexyl        １    −ＯＣ２Ｈ５
【００１３】
前記一般式（１）の化合物について、合成法をより具体的に説明する。
上記一般式（１）の化合物は通常、その構造を３つ、あるいは２つ（ｎ＝０の時）の部分に分けて合成し、それぞれのユニットを縮合することで製造することができる。３つの部分とは一般式（１）の左側に位置するＺ部分、中央部に位置するＹ部分、および右側に位置するフェニルアラニン誘導体部分である。これらのユニットが市販の場合はそのまま、あるいは反応に関与しない官能基を保護することで、またそうでない場合は、各ユニットを適当な方法で合成した後で、以下に述べるペプチド化学における一般的な手法によって製造できる。さらに、各ユニットの合成前駆体を縮合後に、必要な官能基への誘導を行って目的の化合物を得ることもできる。
【００１４】
上記各ユニットを合成する場合は、ペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、「ザ ペプチド(The Peptides)」第１巻〔Schroder and Luhke著, Academic Press,  New York, U.S.A.(1966年)〕、「ペプチド合成の基礎と実験」〔泉屋信夫ら著丸善（株）(1985年)〕等に記載されている方法によって製造することが可能である。
上記一般式（１）においてｎ＝１の場合の化合物は分子内に２つのアミド結合、あるいは１つのアミド結合と１つのスルホンアミド結合を有することから、各ユニットを縮合することによって得ることができる。ペプチド結合（アミド結合）を形成するための縮合方法としては、アジド法、酸ハライド法、酸無水物法、カルボジイミド法、カルボジイミド−アディティブ法、活性エステル法、カルボニルイミダゾール法、酸化還元法、酵素法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法等を例示することができる。またスルホンアミドを形成するための縮合法としては、酸ハライド法、酸無水物法などを用いる方法等を例示することができる。
【００１５】
次に各ユニットの入手法に関して以下により詳しく述べる。
Ｚ部分は、市販のカルボン酸あるいはその誘導体を購入できる。Ｙ部分で規定されるβ−アミノ酸は、βアミノ酸の一般的な合成法にしたがって得ることができる。例えば、「Enantioselective Synthesis of β−Amino acids」 Eusebio Juaristiら,  アルドリチミカ(Aldrichimica)  アクタ(Acta),   第27巻(No.1),  3-11ページ、1994年発行およびその中で引用されている文献等に記載されている方法などによって製造することができる。また、β−ラクタムの誘導体は、そのラクタム環の加水分解による開環によって、置換β−アミノ酸を与えることから、「合成化学的見知から見た最近のβ−ｌａｃｔａｍ環形成反応の進歩 II 」仲井功一、有機合成化学  第５０巻、第２号、１１２〜１３０頁、１９９２年発行、「The Ester Enolate-Imine Condensation Route to beta-Lactams」David J. Hart とDeok-Chan Ha、ケミカルレビューズ(Chemical Reviews)、第89巻(No.7)、1447〜1465頁、1989年発行およびそれらの中で引用されている文献等に記載されている方法などによってβ−ラクタムを製造後、加水分解によって容易にまた安価に得ることができる。また、フェニルアラニン誘導体部分は、市販の誘導体を購入してもいても良いし、あるいは、フェニルアラニンのカルボキシル基を、目的化合物の対応部分に相当するアルコールを用いてエステル化してもよい。
【００１６】
前記一般式（１）の化合物は公知化合物か、公知で無くとも公知化合物に準じて、上記の文献等に記載方法に準じて容易に合成することができる。例えば、後記表１に示す化合物の多くはJ. MED. Chem. 1999, Vol. 42, p 312-323にその合成法が記載されている。また、該文献記載されていない化合物、例えば化合物番号１１，１２，２０等の化合物も、合成用フェニルアラニン誘導体として、フェニルアラニンクロロメチルケトンを使用することにより、該文献に記載の方法に準じて、容易に合成することができる。
【００１７】
前記フェニルアラニン誘導体をカテプシンＡ阻害剤として使用する場合には該化合物をそのまま若しくは不活性な担体例えばジメチルスルホキシドなどの有機溶媒、その他の溶媒で希釈した組成物として、カテプシンＡ、好ましくはヒトカテプシンＡに作用させればよい。
【００１８】
また前記フェニルアラニン誘導体または薬理学的に許容されるその塩を、カテプシンＡ活性の亢進や過剰発現に伴って引き起こされる種々の疾病の悪化の防止、予防または治療剤などとして使用する場合は、単独または賦形剤あるいは担体と混合して液剤または固形剤などとして、経口的に、若しくは非経口的に上記疾病を患う患者に有効量を投与すればよい。
製剤中における本化合物の含量は製剤により種々異なるが通常０．１〜１００重量％好ましくは１〜９８重量％である。例えば注射剤の場合には、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の有効成分を含むようにすることがよい。経口剤の場合には、添加剤とともに錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒、散剤は一般に５〜１００重量％、好ましくは１５〜９９重量％、更に好ましくは２０〜９８重量％の有効成分を含む。残部は医薬用添加剤である。
【００１９】
すなわち、カテプシンＡ特異的阻害剤は、その生理機能や病態との相関を解析するためのプローブ試薬として応用できる。また、該カテプシンＡ特異的阻害剤はカテプシンＡの活性の増大によるヒトメラノーマの悪性化の抑制やカテプシンＡ活性の異常亢進によるシャペロン依存のオートファジーの低下を防ぎ、細胞の老化を防止するためための薬剤などとして応用が期待される。
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
Ｌ−フェニルアラニン誘導体のヒトカテプシンＡ阻害活性の測定
一定数のヒトカテプシンＡ（hCath A）恒常発現株を集め、氷上、蒸留水中でソニケートした後、12,000 x gで遠心分離した上清を酵素抽出液とした。各化合物（Ｌ−フェニルアラニン誘導体：阻害剤）の１０ｍＭジメチルスルホキシド保存溶液を調製し、その２μｌと上記酵素抽出液１２．５μｌとを混合した後、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６またはｐＨ６．５）２５．５μｌと４ｍＭのジペプチド性基質Ｚ−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン溶液６０μｌを加え、室温で３０分放置した。１００℃、２分加熱して反応を停止させ、これを一次反応溶液とした。
次に、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｎ−エチルマレイミドおよびο−ジアニシジンの混合溶液０．５ｍｌを一次反応溶液に加え、３７℃で６０分インキュベートした後、６Ｎ塩酸０．５ｍｌを加えて反応を停止・発色させた。ＯＤ５５０ｎｍの吸光度を測定することにより、一次反応で遊離したロイシン量を定量し、カテプシンＡ活性を測定した。
（１）下表に各化合物（最終濃度１００μＭ）のヒトカテプシンＡ活性に対するin vitroでの阻害効果を示す。下表の数値は、コントロール（阻害剤無し）におけるヒトカテプシンＡ活性を１００％としたときの、各化合物の最終濃度１００μＭにおけるヒトカテプシンＡ残存活性を示す。
【００２１】
表２
各化合物のヒトカテプシンＡ活性に対する阻害効果（in vitro）    
化合物番号  ｐＨ５．６での残存活性％  ｐＨ６．５での残存活性％
２              ９８．０９                ５１．６３
３              ３４．４５                ６０．７０
８              ６９．４０                ５６．４７
１０              ３７．９６              １１２．７０
１１              １４．９４                ８８．５１
１２              ３０．６６              １０８．４６
１３              ５６．４９              １００．６０
１４              １６．０６              １０６．６５
１５              ４３．０１              １０９．０７
１６              ４１．３３                ５７．６８
１７              ４０．７６                ６１．３１
１８              ３７．３９                ５２．２４
１９              ３７．９６                ５９．４９
２０              ２４．４８                ３９．５４
２１              ３４．０３                ５１．０３      
【００２２】
上表から明らかなようにｐＨ５．６では、化合物Ｎo.３(３５％)、１０(３８％)、１１(１５％)、１２(３１％)、１４(１６％)、１８(３７％)、１９(３８％)、２０(２５％)、２１(３４％)が非添加（コントロール）の場合の５０％以上の阻害作用を示した。
またｐＨ６．５では、化合物Ｎo.２(５２％)、３(６１％)、８(５７％)、１６(５８％)、１７(６１％)、１８(５２％)、１９(６０％)、２０(４０％)、２１(５１％)が非添加の４０〜６０％程度の阻害作用を示した。
また、化合物Ｎo.２はｐＨ６．５で阻害活性を示したが、ｐＨ５．６では阻害活性を示さなかった。一方、化合物Ｎo.６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５は、ｐＨ６．５ではほとんど阻害作用を示さなかった。
なお、この細胞抽出液中に存在するカテプシンＡ活性は、すべて導入したヒトカテプシンＡ遺伝子の発現産物（組換えヒトカテプシンＡ）に基くことがこの測定系の特徴である。
（２）次に、ヒトカテプシンＡに対する各化合物の１００μＭ存在下での阻害率と５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ５０％）を算出した。また対照のセリンプロテアーゼとして、キマーゼ（Chyma)、キモトリプシン（Chymo)、カテプシンＧ（CathＧ)、エラスターゼ（Elas)およびトリプシン（Tryp)に対する各化合物の阻害効果（ＩＣ５０％）も検討した。その結果を表３に示す。
【００２３】
表３
各化合物のセリンプロテアーゼに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）                
化合物番号    CathA    Chyma      Chymo        CathG        Elas        Tryp    
３    １４．２    ５．３    ０．０６２  ０．０９８    ０．３        ４．７
１０      ２０    ＞１０００      １４        ６９        ８９        ２７０
１１      ４．１    １５０      ３．３      ２．５      ７．１          １８
１２      ５７    ＞１０００    ２８０      １１０        ３２          ７０
１４      ４３      ２．４      ４．１      ３．４        ２３          ５０
１５      ８２        ２４      ３１０      １７０        ３８      ＞１０００
１６      ８２      ８３０        ４３        ４６      １５０      ＞１０００
１７      ８０      １３００  ＞１０００  ＞１０００  ＞１０００    ＞１０００
１８      ７８    ＞１０００  ＞１０００  ＞１０００  ＞１０００    ＞１０００
１９      ７３        ６０      １８００  ＞１０００      ３１      ＞１０００
２０      ６５      ０．５８      ３３        ５９        ９３        １２００
２１      ７４      ２７０          ５        １９          ５      ＞１０００
【実施例２】
【００２４】
in vitro culture系における細胞内カテプシンＡに対する阻害剤の効果
一定数のhCath A恒常発現株の培養液に、最終濃度５〜２００μＭになるように各化合物を添加した後、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。２４時間後に細胞を集め、蒸留水で懸濁後、抽出液を調製し、細胞内カテプシンＡ活性をｐＨ５．６で測定した。また対照のリソソーム酵素として、ノイラミニダーゼ(Neur)、β−ガラクトシダーゼ(β-Gal)およびβ−ヘキソサミニダーゼ(β-Hex)活性を蛍光基質を用いてｐＨ４．２〜４．５で測定した。その結果を表４に示す。
【００２５】
表４                                                                          
化合物番号  阻害剤濃度  CathA        Neur          β-Gal          β-Hex
(μＭ）    ％of          ％of          ％of            ％of
control      control        control        control    
８        ５０    ８０．６３  １２３．９９    ８３．１１    １００．１４
１００    ４２．２７  １０１．３３    ４７．８１      ８６．８３
１０        ５０    ６５．４７    ４８．８４    ３４．２４      ５５．６９
１００    ７３．２３    ６９．３５    ３５．６０      ６３．５９
１１        ５０    ４９．３７    ４１．１７    ３７．３８      ６９．１５
１００    ４８．６５    ２３．１６    ２５．４９      ４９．９５
１２          ５    ７１．７８    ９３．４６    ６４．９１      ９６．１５
１０    ６６．１７    ９８．５０    ６１．７５      ７９．６０
２５    ５３．６５    ８７．６４    ５６．６８      ８２．２０
５０    ２３．５７    ３０．７２    ５３．７８      ９０．４０
１００    １８．４０    ５２．５４    ４４．７８    １５１．３８
１９        ５０    ６９．２１    ９４．９４    ６４．９６      ９０．８１
１００    ４２．０６    ９６．９０    ４１．１９      ７４．１４
２０        ５０    ３５．７４    ３４．３９    ３２．８１      ７２．９２
１００    ３２．９３    ３２．３６    ５４．１９      ９０．７１  
【００２６】
参考例１
ヒトカテプシンＡ（hCath A）恒常発現株の作成
公知の方法（Y.,Naganawa et al., Biochemical J., 340, 467-474, 1999）に従って形質転換を行い、ヒト野生型保護蛋白／カテプシンＡ(protective protein/ cthepsin A)（ＰＰＣＡ） ｃＤＮＡの全長を含有するｐＣＸＮ２ベクター（ｐＣＸＮ２−ＰＰという）を作成した。
また、一方、神経芽細胞腫株ＧＯＴＯ（Y.,Saito et al., FEBS Lett, 353, 327-331, 1994)を（１−２×１０５細胞）を６０−ｍｍのコラーゲンタイプＩの皿の上にトランスフェクションの１８時間前に播種し、ＦＣＳの添加されていないＲＰＭＩ培地中で培養した。プラスミドＤＮＡの前記ＧＯＴＯ細胞へのトランスフェクション（リポフェクション）は、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用い、この製造会社のプロトコールに従って行った。  簡単に説明すると、ｐＣＸＮ２−ＰＰ又はコントロールとしてｐＣＸＮ２を前記ＧＯＴＯ細胞にトランスフェクションするため、このプラスミドベクターＤＮＡ（ｐＣＸＮ２−ＰＰ又はコントロールとしてｐＣＸＮ２）（５μｇ）とＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（１０μｌ）からなる混合物を上記のＦＣＳの添加されていないＲＰＭＩ培地中で培養されているＧＯＴＯ細胞に添加した。５時間培養した後、培養培地を１０％ＦＣＳを含有している培地に換えた。４８時間後、それぞれの６０−ｍｍ皿上の細胞をトリプシン化した後、選択培地（１０％ＦＣＳ及び８００μｇ／ｍｌＧ４１８を含有するＲＰＭＩ１６４０）を含有している１００−ｍｍ皿中に１：５に分割した。１４日後、全長のヒト−ＰＰＣＡ ｃＤＮＡでトランフェクションされたＧ４１８−抵抗細胞株（ｈ  Ｃａｔｈ Ａ恒常発現株）を選択した。選択した細胞株中のＣａｔｈ Ａ活性は、擬−トランスフェクションした細胞株及び親のＧＯＴＯ細胞に比べて、約４倍増加した。