(57)【要約】【課題】無血清系の培養液を用いても良好に間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の培養方法、該培養方法により培養された間葉系幹細胞、及び、該間葉系幹細胞を用いてなる培養組織を提供する。【解決手段】少なくとも塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ  ））を含有する培養液を用いる間葉系幹細胞の培養方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ  ））を含有する培養液を用いることを特徴とする間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項２】
培養液における塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ  ））の濃度が０．１〜１０００μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓであることを特徴とする請求項１記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項３】
培養液は、血清を含有しないことを特徴とする請求項１又は２記載の間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の間葉系幹細胞の培養方法により培養されたことを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項５】
請求項４記載の間葉系幹細胞を用いてなることを特徴とする培養組織。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無血清系の培養液を用いても良好に間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の培養方法、該培養方法により培養された間葉系幹細胞、及び、該間葉系幹細胞を用いてなる培養組織に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の細胞工学技術の進展によって、数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。なかでも、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨、軟骨、脂肪、靱帯、ストロマ、骨格筋、心筋、平滑筋、血管内皮、神経細胞等の種々の組織を構成する細胞に分化することが可能であり、再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
このような間葉系幹細胞は、通常は、ウシ血清（ＦＣＳ又はＦＢＳ）を５〜１０重量％程度の濃度で含有する培養液を用いて培養されている。ウシ血清は、細胞の増殖を促進する他、細胞の保護機能等も有していることから、種々の細胞の培養に広く用いられている。例えば、特許文献１には、間葉系幹細胞を基底膜細胞外基質の存在下において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培養液を用いて培養する方法が記載されている。しかしながら、近年の狂牛病の問題を見るまでもなく、ヒトへの移植を前提とした再生医療に供する細胞の培養に感染病等の危険性を有するウシ血清を用いることには問題がある。これに対して、特許文献１にはまた、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血清を用いる培養方法も記載されているが、自家の血清を用いる場合にはその採取量に限界があり、また、他家の血清を用いる場合には感染症の危険がある点ではウシ血清を用いる場合と変わりない。
そこで、血清等の生物由来成分を含有しない培養液を用いて間葉系幹細胞を効率よく培養できる培養方法が求められていた。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００３−５２３６０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、無血清系の培養液を用いても良好に間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の培養方法、該培養方法により培養された間葉系幹細胞、及び、該間葉系幹細胞を用いてなる培養組織を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、少なくとも塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ  ））を含有する培養液を用いる間葉系幹細胞の培養方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００７】
本発明の間葉系幹細胞の培養方法では、少なくとも塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ−Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ  ）：以下、ｂＦＧＦともいう）を含有する培養液を用いる。本発明者らは、鋭意検討の結果、ｂＦＧＦを配合することにより、血清を含有しない培養液を用いても、血清を含有する培養液を用いた場合と同等に間葉系幹細胞を培養できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
上記ｂＦＧＦとは、組み換えＤＮＡ等により人工的に製造された非天然由来の線維芽細胞成長因子を意味する。
上記ｂＦＧＦは、組み換えＤＮＡを作製してこれを発現させることにより製造したものを用いてもよく、また、市販のものを用いてもよい。上記ｂＦＧＦのうち市販のものとしては、例えば、「Ｔｒａｆｅｒｍｉｎ」（科研製薬社製）等が挙げられる。
【０００９】
上記培養液中におけるｂＦＧＦの濃度としては特に限定されないが、培養しようとする間葉系幹細胞の数によって適宜調整することが好ましく、好ましい下限は、０．１μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓ、好ましい上限は１０００μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓである。０．１μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓ未満であると、充分に間葉系幹細胞が増殖しないことがあり、１０００μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓを超えると、もはやそれ以上添加しても間葉系幹細胞の増殖に影響せず、培養のコストが上昇することがある。より好ましい下限は１μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓ、より好ましい上限は１００μｇ／５×１０６ｃｅｌｌｓである。
【００１０】
上記培養液のｂＦＧＦ以外の成分については特に限定されず、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培養液等の従来公知の基礎培養液又はこれらの混合物と同様のものを用いることができる。
【００１１】
上記培養液は血清を含有しないことが好ましい。血清を含有する培養液を用いて培養した間葉系幹細胞は、感染症等の原因となる危険性があることから、再生医療等の用途には用いることができない。上記ｂＦＧＦを含有することにより、血清を含有しなくとも、充分に間葉系幹細胞を培養することができる。
【００１２】
本発明の間葉系幹細胞の培養方法の対象となり間葉系幹細胞の由来としては特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物；鳥類、は虫類等に由来するものを用いることができる。なかでも再生医療の目的にはヒト由来のものが好ましい。
上記間葉系幹細胞は、上記由来生物から従来公知の方法により採取することができる。例えは、骨髄液から密度勾配遠心法により細胞を分離し、分離した細胞のなかからＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５等の細胞表面マーカーにより選択して得ることができる。
【００１３】
本発明の間葉系幹細胞の培養方法によれば、無血清系であっても良好に間葉系幹細胞を培養することができる。本発明の培養方法により培養した間葉系幹細胞は、感染症等の危険性が低いことから、培養組織を作製して再生医療の目的に好適に用いることができる。更に、本発明の間葉系幹細胞の培養方法により培養した間葉系幹細胞は極めて正常であり、培養系基材等に播種して培養組織を作製し生体に移植すれば、正常に分化して目的とする組織を生成することができる。
本発明の間葉系幹細胞の培養方法により培養された間葉系幹細胞もまた、本発明の１つである。
【００１４】
本発明の間葉系幹細胞を用いて培養組織を作製する方法としては特に限定されず、培養用基材に本発明の間葉系幹細胞を播種し、本発明の間葉系幹細胞用培養液により培養する方法等が挙げられる。このとき、目的に応じて間葉系幹細胞を分化させる培養液を併用してもよい。
上記培養基材としては特に限定されず、例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン等の天然材料；ポリ−Ｌ−乳酸、ポリグリコール酸、ポリ−ε−カプロラクトン等の合成生体内分解性高分子材料等からなるものが挙げられる。
このようにして作製した培養組織を生体に移植することにより、目的とする組織を生成することができる。再生の対象となる組織としては、例えば、皮膚、皮膚付属器、骨、軟骨、筋等が挙げられる。
本発明の間葉系幹細胞を用いてなる培養組織もまた、本発明の１つである。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）
ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）（「Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ」、ライフテクノロジー社製）にｂＦＧＦ（「Ｔｒａｆｅｒｍｉｎ」、科研製薬社製）を２．５ｎｇ／ｍＬの濃度になるように添加して間葉系幹細胞用培養液を調製した。
【００１７】
ヒト間葉系幹細胞（バイオリッタッカー社製）をダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞懸濁液を調製し、２４ウェル細胞培養プレートに２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅの濃度になるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養して細胞を培養プレートに接着させた。
次いで、培養液を間葉系幹細胞用培養液０．５ｍＬに交換した。この時点を培養０日目とした。その後３日間培養を続け、培養１、２及び３日の細胞数を測定した。
細胞数の変化を図１に示した。
【００１８】
（対照例１）
ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）（「Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ」、ライフテクノロジー社製）にウシ血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度になるように添加して培養液を調製した。
培養０日目以降に用いる培養液としてこの培養液を用いた以外は実施例１と同様にして３日間培養を続け、培養１、２及び３日の細胞数を測定した。
細胞数の変化を図１に示した。
【００１９】
（比較例１）
培養０日目以降に用いる培養液としてｂＦＧＦも血清も添加していないダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）を用いた以外は実施例１と同様にして３日間培養を続け、培養１、２及び３日の細胞数を測定した。
細胞数の変化を図１に示した。
【００２０】
（実施例２）
ヒト間葉系幹細胞（バイオリッタッカー社製）をダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）に懸濁した細胞懸濁液を調製し、直径１００ｍｍの細胞培養ディッシュに１×１０６ｃｅｌｌｓ播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養して細胞を細胞培養ディッシュに接着させた。
培養液を実施例１で調製した間葉系幹細胞用培養液１０ｍＬに交換し、３日毎に培養液を交換しながらサブコンフルエントになるまで培養を続けた。サブコンフルエントになった間葉系幹細胞を０．２５％トリプシン／１ｍＬＥＤＴＡで処理して細胞培養ディッシュから剥がして回収し、再び別の、直径１００ｍｍの細胞培養ディッシュに５×１０６ｃｅｌｌｓ播種した。この操作を４回繰り返して得た間葉系幹細胞（４継代細胞）を培養組織の製造に供した。
【００２１】
得られた４継代細胞を、ｂＦＧＦを１０μｇ添加したダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）１ｍＬに懸濁して細胞懸濁液を調製し、この全量を１．５×１．５ｃｍの大きさに切断した、コラーゲンスポンジとシリコーン層とからなる人工皮膚（「ペルナック」、グンゼ社製）に播種した。
ヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪＣ１−ｒｎｕ）の背中に１．５×１．５ｃｍの全層欠損創を作製し、得られた細胞を播種した人工皮膚を移植した。
移植後の創部を観察したところ、移植７日目には表皮化が観察された。更に、移植４２日後に創部を採取し、その切片をヘマトキシリン−エオシン染色して観察したところ、完全に皮膚組織が再生していることが確認できた。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、無血清系の培養液を用いても良好に間葉系幹細胞を培養することができる間葉系幹細胞の培養方法、該培養方法により培養された間葉系幹細胞、及び、該間葉系幹細胞を用いてなる培養組織を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、対照例１及び比較例１において培養１、２及び３日の細胞数の変化を示す図である。
【図１】
2005034030.tif 000002