(57)【要約】【課題】  ヒト癌細胞の運動と浸潤活性を顕著に阻害し、癌の治療や癌患者のＱＯＬ（Quality of Life）の向上をもたらす。【解決手段】  センス鎖：GACCUGACAAAAGCCAUUA(配列番号１）、およびアンチセンス鎖：UAAUGGCUUUUGUCAGGUC(配列番号２）よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にUUまたはdTdTを結合する、ヒト癌細胞の運動と浸潤を阻害するＡＭＡＰ１／ＰＡＧ２／ＡＳＡＰ１のｓｉＲＮＡ二本鎖により本発明の課題は解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖：GACCUGACAAAAGCCAUUA(配列番号１）、およびアンチセンス鎖：UAAUGGCUUUUGUCAGGUC(配列番号２）よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にUUまたはdTdTを結合する、ヒト癌細胞の運動と浸潤を阻害するＡＭＡＰ１／ＰＡＧ２／ＡＳＡＰ１のｓｉＲＮＡ二本鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌細胞の運動と浸潤活性を顕著に阻害し、癌の治療や癌患者のＱＯＬ（Quality of Life）の向上をもたらす特定の配列を持ったｓｉＲＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの最も大きな脅威はその浸潤・転移性にある。癌細胞の示す浸潤活性や転移活性を阻害することによって、癌の治療や癌患者のＱＯＬの向上を目指す試みは非常に数多くなされてきている。例えば、癌の浸潤には、癌細胞の表面に分泌される蛋白質分解酵素であるＭＭＰｓ（matrix metalloproteinases）やセリンプロテアーゼの活性が必須であることから、これらの酵素類に対する多くの種類の阻害剤が開発された（非特許文献１参照）。
しかし、それらのがん患者への投与例において、臨床適用に耐える良好な結果を与えた例は殆どない。これは、各々の癌において、その浸潤過程に一種類の蛋白質分解酵素のみが関与するのではなく、おそらく複数種の蛋白質分解酵素が同時に関与するためであると考えられている。従って、がんの浸潤に関与するより基本的、根幹的な分子装置を見い出し、その活性を阻害することが必用であると考えられる。
【非特許文献１】Coussens LM, Fingleton B, & Matrisian LM, Science, 2002, Mar. 29;295(5564):2387-2392
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、上にも記したようにまだまだ不完全である癌治療に関して、その浸潤性を抑制できる手立てを示すことである。本発明の目的は、そのことにより、癌に対する今までに無い新しくより効果的な治療法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＡＭＡＰ１／ＰＡＧ２／ＡＳＡＰ１（以下、ＰＡＧ２と略する）と呼ばれる蛋白質（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＢ０３３０７５、そのｍＲＮＡ配列を配列番号３として示す）がヒトがん細胞の浸潤に必須であり、その発現をｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘで特異的に阻害することによって、ヒトがん細胞の浸潤活性を著しく阻害できることを発見したことに基いてなされたものである。
【０００５】
即ち、本発明は、  センス鎖：GACCUGACAAAAGCCAUUA(配列番号１）、およびアンチセンス鎖：UAAUGGCUUUUGUCAGGUC(配列番号２）よりなり、両鎖はそれぞれの３’末端にUUまたはdTdTを結合するので２１マーとなる。両鎖はアニーリングされて２本鎖となり、ヒト癌細胞の運動と浸潤を阻害するＰＡＧ２のｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する。
に関する。
本発明のｓｉＲＮＡ二本鎖により治療の対象となる癌はあらゆる臓器の上皮組織由来の癌、例えば乳癌である。
【０００６】
ここに、ｓｉＲＮＡはsmall interfering ＲＮＡの略であり、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧはそれぞれアデニン、ウリジン、シトシン、グアニン塩基を有するリボヌクレオシド三燐酸の残基を示し、ｄＴはチミン塩基を有するデオキシリボヌクレオシド三燐酸の残基を示す。
【０００７】
ｓｉＲＮＡは２本鎖のオリゴリボヌクレオチドである。先ずセンス鎖オリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ  ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製したり、ＨＰＬＣで精製を行う。
【０００８】
次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ  酢酸カリウム，１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．４，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
【０００９】
ｓｉＲＮＡはリポフェクション法を用いて製剤化できる。通常ホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームが用いられる。この陰電荷を有するリン脂質（ＰＳ）のかわりに、より安定したリポソームを作りやすいＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）という陽イオン性脂質（商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることが好ましい。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｓｉＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｓｉＲＮＡを細胞内に導入することができる。
実際の癌の治療にあたっては患部またはその周辺組織に本発明のｓｉＲＮＡとリポソームの複合体を直接注入する。
実施例
【００１０】
実施例１
ｓｉＲＮＡの製造
（ｉ)センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの製造
以下の配列を有する２1マーのセンスＲＮＡ：GACCUGACAAAAGCCAUUAdTdT、および
及び以下の配列を有する２1マーのアンチセンス鎖：UAAUGGCUUUUGUCAGGUCdTdT 
を次の方法で製造した。
２’−ＡＣＥ保護基のついたアミダイドを用い、ＧＥＮＳＥＴ  ＯＬＩＧＯＳ社製のオリジナル合成機（UltraFast Parallel Synthesizer）を使用し、アミダイド法による有機合成を行った。１００ｍＭ  ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行った後、ＨＰＬＣにより２１マ−のセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを精製した。
【００１１】
（ｉｉ）アニーリングによるｓｉＲＮＡの製造
（ｉ）で製造したセンスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれ５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）の濃度になるように水溶液を調製した。各々の水溶液３０μｌずつと５×アニーリング緩衝液（５００ｍＭ  酢酸カリウム，１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム）１５μｌを混合した（合計７５μｌ）。溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温した。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２重鎖となる。その際、２重鎖オリゴヌクレオチドの濃度は２０μＭ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）であった。
実施例２
【００１２】
癌細胞へのｓｉＲＮＡの導入
室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））とＰＡＧ２  ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。用いるリポフェクトアミンの量や複合体の形成法は製造元の指示に従った。具体的には、４５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００と７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）とを室温にて５分間保温し、その後、２００ｐｍｏｌの２重鎖オリゴヌクレオチドを含む７５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合した。室温にてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ））とＰＡＧ２  ｓｉＲＮＡとの複合体を形成させた。この混合液（１．５ｍｌ）を８．５ｍｌの増殖培地で培養している１ｘ１０６個のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加して、細胞内へのｓｉＲＮＡの導入を行った。
実施例３
【００１３】
ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理によるＰＡＧ２蛋白質の発現抑制
ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを常法によりアニールさせ、２０ｎＭの濃度にてヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に導入した。導入にはLipofectamine 2000（Invitrogen）を使用した。４４時間後に細胞抽出液を調製し、常法通りＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離後、抗ＰＡＧ２抗体を用いたウエスタンブロット法によりＰＡＧ２蛋白質の発現量を測定し、このｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘの効果を検討した。ｓｉＲＮＡ処理した細胞（＋）と処理しない細胞（−）、それぞれの抽出液５μｇを用いた。結果を図１に示す。対照として、抗βアクチン抗体を用いた免疫ブロットの結果を下段に示す。ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理をすることによりＰＡＧ２の蛋白質発現量が未処理細胞に比べ約３分の１以下に抑制された。
実施例４
【００１４】
ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害（Ｉ）：ゼラチンマトリックスに対する分解活性の抑制
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に実施例３と同様にＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを導入し、浸潤活性を調べた。浸潤活性は、ｓｉＲＮＡ導入後４４時間培養した細胞を、蛍光色素（Ａｌｅｘａ−５９４）にて標識しさらにパラホルムアルデヒドにて架橋したしたゼラチン膜上に移し、その後１６時間におけるゼラチンの分解活性を常法に従って測定することにより評価した。即ち、分解された標識ゼラチンの面積を測定することにより一細胞当たりのマトリックス分解活性を評価した。結果を図２に示す。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照であり、ｉｒｒはＰＡＧ２とは無関係な配列を持つｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘで同様の操作をした対照である。縦軸はｍｏｃｋ処理の細胞の示すゼラチン分解活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的分解活性を示す。ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性は１０分の１以下に抑制された。対照（ｉｒｒ）との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった。
実施例５
【００１５】
ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害（ＩＩ）：マトリゲル浸潤活性の抑制
実施例３と同様にＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘによって処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をマトリゲルを塗布したBoyden チャンバーの上に播き、その後１２時間における浸潤活性を測定した。結果を図３に示す。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照であり、ｉｒｒはＰＡＧ２とは無関係な配列を持つｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘで同様の操作をした対照である。縦軸はｍｏｃｋ処理の細胞の示すマトリゲル浸潤活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的浸潤活性を示す。ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ導入によりＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のこの評価法による浸潤活性は２分の１以下に抑制された。対照（ｉｒｒ）との差は、統計的有意差検定によりＰ＜０．００１であった。
【発明の効果】
【００１６】
がんの大きな脅威の主な原因はその浸潤・転移性にあるが、上皮癌の場合、転移の多くはまず癌細胞の基底膜への浸潤を介しておこる。このことはヒト乳癌において顕著であることがその病理学的所見により示されている。細胞の浸潤や転移をもたらす基本的分子機序やその応用による癌の浸潤を阻害する手立てに関して世界レベルにおいて既に多くの試みがあるが、有効性が確認されたものが皆無に等しいのが現状であり、まだまだ新しい方法論や分子標的の検索が行われている段階である。今回の発明によって、今まで試されたことがない蛋白質を標的とし、その発現を対応する特異的ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘを用いて阻害することにより非常に効果的に乳癌の浸潤活性を抑制できることが示された。特にｓｉＲＮＡは低分子化合物であり、実際に薬物としての生体へ投与できる可能性が高く、癌以外の他の疾患治療においても原因蛋白質の同定に伴い、それぞれのｓｉＲＮＡによって当該蛋白質の発現を抑制し治療の道を探る試みは数多く行われている。今回、がん浸潤を抑制できるｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ配列を示したことにより、今後、乳癌をはじめとする様々な上皮組織由来がんに対するより有効な薬剤や治療法の開発を促すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理によるＰＡＧ２蛋白質の発現抑制を示す電気泳動図である。（＋）はｓｉＲＮＡ処理した細胞の場合、（−）はｓｉＲＮＡは処理しない細胞の場合である。
【図２】ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害を示す、ゼラチンマトリックスに対する分解活性の抑制を示すグラフである。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照であり、ｉｒｒはＰＡＧ２とは無関係な配列を持つｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘで同様の操作をした対照である。
【図３】ＰＡＧ２ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性の阻害を示す、マトリゲルに対する浸潤活性の抑制を示すグラフである。ｍｏｃｋはｓｉＲＮＡ非添加下で同様の操作をした対照であり、ｉｒｒはＰＡＧ２とは無関係な配列を持つｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘで同様の操作をした対照である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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