(57)【要約】【課題】  APP産生抑制活性またはAβ産生抑制活性を有し、アルツハイマー病などの神経変性疾患改善剤などとして有用な蛋白質(酵素)を有効成分とする医薬組成物、APP産生抑制活性またはAβ産生抑制活性を促進する候補物質のスクリーニング系などを提供する。【解決手段】(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび／または(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生抑制活性またはAβ産生抑制活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)および(b)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項1に記載のポリペプチドおよび請求項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有するAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤。
【請求項４】
被験物質の存在下および非存在下に、下記(a)または(b)のポリペプチドのAPP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制の程度を増加させる物質を選択することを特徴とする、APP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質のスクリーニング方法：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を有するポリペプチド。
【請求項５】
APP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度が、標的細胞におけるAPP発現量の低下の程度またはAβ産生量の低下の程度として求められる請求項4に記載の方法。
【請求項６】
被験物質の存在下および非存在下に、以下の(c)、(d)または(e)のポリヌクレオチドの発現物のAPP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該産生作用の抑制の程度を増加させる物質を選択することを特徴とする、APP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングする方法：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【請求項７】
APP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度が、標的細胞におけるAPP発現量の低下の程度またはAβ産生量の低下の程度として求められる請求項6に記載の方法。
【請求項８】
APP産生作用を抑制する作用が、ウェスタン・ブロッティング分析法によって求められ、またAβ産生作用を抑制する作用が、ELISA法によって求められる請求項4または6に記載の方法。
【請求項９】
以下の(1)〜(5)の工程を含む請求項1に記載のポリペプチドのAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質のスクリーニング方法：
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび標識したAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞のAPP発現量またはAβ産生量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPPの発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１０】
以下の(1)〜(5)の工程を含む請求項2に記載のポリヌクレオチドの発現物のAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する化合物をスクリーニングする方法：
(1)請求項2に記載のポリヌクレオチドおよび標識したAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のAPP発現量またはAβ産生量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPP発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１１】
以下の(1)〜(5)の工程を含む請求項1に記載のポリペプチドのAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングする方法：
(1)請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞の請求項1に記載のポリペプチド産生量を、該ポリペプチドに対する抗体を用いて求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められたポリペプチド産生量と、候補物質の存在下において求められたポリペプチド産生量とを対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたポリペプチド産生量が、非存在下において求められたそれに比して増大している場合に、該候補物質を選択する工程。
【請求項１２】
請求項1に記載のポリペプチドおよび請求項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種と、標識したAPPをコードするポリヌクレオチドの発現物とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチドまたは発現物のAPP産生作用を抑制する作用を増強する物質またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβペプチドおよびその前駆物質の産生を抑制する作用を有する医薬組成物に関する。また、本発明は、アミロイドβペプチドおよびその前駆物質の産生を抑制する作用を増強(亢進)する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(Alzheimer's Disease)は、高齢の集団における痴呆の一つである。該アルツハイマー病の古典的な病理学的特徴としては、40〜42のアミノ酸からなるアミロイドβ(Amyloidβ)ペプチド(以下「Aβ」と略す)を含有する大多数の老人性斑の蓄積が認識される。遺伝的および細胞生物学的知見は、両者とも、脳におけるAβの蓄積がアルツハイマー病の原因であることを示唆している(Yankner, (1996), Neuron, 16: 921-932; Selkoe, (1997), Science, 275: 630-631)。
【０００３】
Aβの病理学的役割を支持する強力な遺伝学的証拠は、アミロイド前駆タンパク質(amyloid precursor protein：以下「APP」と略称する)における変異を遺伝する個体が、ほとんど若年において、必ずアルツハイマー病を発症するという観察から生じている。この変異は、脳における老人性斑を形成する、Aβの長い改変体の産生を増加させる(Goateら、(1991), Nature, 349: 704-706)。
【０００４】
アルツハイマー病を発症させる上記APP以外の他の遺伝子における変異および対立遺伝子改変体(プレセニリンおよびアポリポタンパク質Eを含む)もまた、Aβの産生および沈着の増加を生じる。さらに、ダウン症候群に属する個体は、APPを過剰発現し、若年において脳にAβ沈着を惹起し、また若年においてアルツハイマー病を発症する。
【０００５】
Aβの形成は、正常な生理学的プロセスである。即ち、このペプチドは、インビトロで培養された細胞の場合に自然に産生されることが見出されている(Haassら, (1992), Nature,  359: 322-325; Seubertら, (1992), Nature, 359: 325-327; Shojiら, (1992), Science, 258: 126-129)。また、インビボでも同様の報告が種々認められる(Seubertら, (1992), Nature,  359: 325-327; Vigo-Pelfreyら, (1993), J. Neurochem., 61: 1965-1968; Tabatonら, (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 200: 1598-1603; Tellerら, (1996), Nature  Med., 2: 93-95)。
【０００６】
Aβは非分泌形態であるβ-APPの細胞内異化作用の変性副産物と考えられる(非特許文献1参照)。インビトロでは、APPの形成を阻害することによって、細胞傷害性を示さないことが明らかにされている。さらに、Aβは神経細胞に対して強い毒性を示すことが実証されている。従って、例えば脳におけるAβ産生量を減少させる薬物は、アルツハイマー病を防止することができると考えられる。
【０００７】
本発明者らは、先に、そのORF領域が1851(終止コドンを含む)であるヌクレオチド配列からなる616個のアミノ酸配列からなるHRD1という、小胞体に局在するE3ユビキチン結合酵素を見出した(非特許文献2)。本発明者らはこのHRD1は、小胞体ストレスによってその発現が誘導される、小胞体に局在する膜蛋白であること、およびこのHRD1を培養細胞内で高発現させるときには、小胞体ストレス応答細胞死を抑制できることを明らかにしている(非特許文献3参照)。
【０００８】
以上のように、アルツハイマー病は、Aβの産生および沈着の増加によって生じることが知られており、このようなアルツハイマー病を初めとして、他にパーキンソン病などの神経変性疾患、糖尿病のような細胞変性疾患などの治療のためには、APP産生の抑制作用を有する物質乃至Aβ産生量を減少させる作用を有する物質が有効であると考えられるが、現在、このようなAPP産生作用を抑制する作用を有する物質乃至Aβ産生量を減少させる作用を有する物質は、見出されていない。このようなAPP産生抑制作用乃至Aβ産生抑制作用を有する新たな物質(蛋白質)が見出されれば、上記疾病の新しい治療法が確立できると考えられる。
【非特許文献１】Higaki., et al., Neuron, 14: 651-659, (1995)
【非特許文献２】Kaneko, M., et al., FEBS Lett., 532: 147-152, (2002)
【非特許文献３】Nadav, E., et al., B.B.R.C., 303, (1): 91-97 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有する新たな蛋白質乃至これをコードする遺伝子が提供できれば、APP産生またはAβ産生を伴う神経変性疾患、細胞変性疾患などの作用機構の解明が可能となり、また、それらの有するAPP産生またはAβ産生を抑制する作用に基づいて、これらの疾病の治療などにも有効に利用できると考えられる。特に、このようなAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有する蛋白質およびこれをコードする遺伝子は、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患、ダウン症などの遺伝子変異性疾患などの治療剤および予防剤としての新たな用途が期待できる。さらに、これらの遺伝子および蛋白質を利用すれば、APP産生作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強(亢進)する新たな治療剤および予防剤としての候補化合物のスクリーニングも可能である。
【００１０】
本発明者らは、上記観点から、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有する新規な遺伝子の探索を目的として、鋭意研究を重ねる課程において、本発明者らが先に見出したHRD1に着目した。即ち、本発明者らは、該HRD1の発現が小胞体ストレスによって誘導されること、該HRD1が小胞体に局在する膜蛋白であること、および該HRD1を培養細胞内で高発現させるときには小胞体ストレス応答細胞死を抑制できることに着目し、該HRD1の発現が、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の結果ではないかと仮定して、先に確立したヒトHRD1安定発現細胞に更にAPPの発現能を付与し、得られたAPP発現誘導細胞のAPP発現量およびAβ産生量を調べた。その結果、このHRD1およびAPPを共発現する細胞においては、通常のAPP発現細胞に比して、APP発現量およびAβ産生量が抑制されること(低下すること)を確認した。即ち、HRD1がAPP産生作用を抑制する活性およびAβ産生作用を抑制する活性を有するという新たな知見を得た。
【００１１】
本発明はこの知見を基礎として更に研究を重ねた結果、完成されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、下記項1-12に示される要旨の発明を提供する。
【００１３】
項1．以下の(a)および(b)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を有するポリペプチド。
【００１４】
項2. 以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる少なくとも1種のポリヌクレオチドの発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【００１５】
項3. 項1に記載のポリペプチドおよび項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有するAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤。
【００１６】
項4. 被験物質の存在下および非存在下に、下記(a)または(b)のポリペプチドのAPP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制の程度を増加させる物質を選択することを特徴とする、APP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質のスクリーニング方法：
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)上記(a)のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を有するポリペプチド。
【００１７】
項5. APP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度が、標的細胞におけるAPP発現量の低下の程度またはAβ産生量の低下の程度として求められる項4に記載の方法。
【００１８】
項6. 被験物質の存在下および非存在下に、以下の(c)、(d)または(e)のポリヌクレオチドの発現物のAPP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該産生作用の抑制の程度を増加させる物質を選択することを特徴とする、APP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングする方法：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を発現可能なポリヌクレオチド。
【００１９】
項7. APP産生作用の抑制の程度またはAβ産生作用の抑制の程度が、標的細胞におけるAPP発現量の低下の程度またはAβ産生量の低下の程度として求められる項6に記載の方法。
【００２０】
項8. APP産生作用を抑制する作用が、ウェスタン・ブロッティング分析法によって求められ、またAβ産生作用を抑制する作用が、ELISA法によって求められる項4または6に記載の方法。
【００２１】
項9. 以下の(1)〜(5)の工程を含む項1に記載のポリペプチドのAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質のスクリーニング方法：
(1)項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび標識したAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞のAPP発現量またはAβ産生量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPPの発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２２】
項10. 以下の(1)〜(5)の工程を含む項2に記載のポリヌクレオチドの発現物のAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する化合物をスクリーニングする方法：
(1)項2に記載のポリヌクレオチドおよび標識したAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞のAPP発現量またはAβ産生量をそれぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPP発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２３】
項11. 以下の(1)〜(5)の工程を含む項1に記載のポリペプチドのAPP産生作用を抑制する作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングする方法：
(1)項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞の請求項1に記載のポリペプチド産生量を、該ポリペプチドに対する抗体を用いて求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められたポリペプチド産生量と、候補物質の存在下において求められたポリペプチド産生量とを対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたポリペプチド産生量が、非存在下において求められたそれに比して増大している場合に、該候補物質を選択する工程。
【００２４】
項12. 項1に記載のポリペプチドおよび項2に記載の発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種と、標識したAPPをコードするポリヌクレオチドの発現物とを構成成分として含有することを特徴とする、該ポリペプチドまたは発現物のAPP産生作用を抑制する作用を増強する物質またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キット。
【００２５】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００２６】
本明細書において、ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれる。DNAには、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAが含まれる。特定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体および変異体が含まれる。
【００２７】
ポリヌクレオチドの変異体(変異体DNA)には、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体などが含まれる。但し、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。
【００２８】
ポリペプチドの変異(アミノ酸配列の改変)は、天然において生じるもの、例えば突然変異、翻訳後の修飾などにより生じるものである必要はなく、天然由来の遺伝子(例えばHRD1遺伝子)を利用して人為的に生じさせたものであってもよい。上記ポリペプチドの変異体は、アレル体、ホモログ、天然の変異体などであって、少なくとも80％、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上が、変異前のポリペプチドと相同するものが含まれる。
【００２９】
尚、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばFASTAプログラムを使用した測定(Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994))によって解析することができる。相同性解析の最も好ましく且つ簡便な方法としては、コンピューターにより読取り可能な媒体(例えば、フレキシブルディスク、CD-ROM、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブ、DVDなど)に配列を記憶させ、ついでその記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段に従い既知の配列データベースを検索する方法を例示することができる。既知の配列データベースの具体例には、以下のものが含まれる。
・DNA Database of Japan(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/);
・Genebank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); および
・the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.htmL)。
【００３０】
相同性解析には多数の検索アルゴリズムが当業者に利用可能である。その一例としては、BLASTプログラムと称されるプログラムが挙げられる。このプログラムには5つのBLAST手段がある。そのうちの3つ(BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX)は、ヌクレオチド配列の照会用に設計されたものである。残りの2つ(BLASTPおよびTBLASTN)は、蛋白質配列の照会用に設計されたものである(Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1:543-559 (1997))。
【００３１】
更に追加的なプログラム、例えば配列アライメントプログラム、より遠縁の配列を同定するためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能である。
【００３２】
変異体DNAは、これによりコードされるアミノ酸についてサイレント(変異した核酸配列によってコードされるアミノ酸残基に変化がない)であるかまたは保存的である。保存的なアミノ酸置換の例を以下に示す。
元のアミノ酸残基          保存的な置換アミノ酸残基
Ala                        Ser
Arg                        Lys
Asn                        GlnまたはHis
Asp                        Glu
Cys                        Ser
Gln                        Asn
Glu                        Asp
Gly                        Pro
His                        AsnまたはGln
Ile                         LeuまたはVal 
Leu                        IleまたはVal
Lys                        Arg, AsnまたはGlu
Met                        LeuまたはIle
Phe                        Met, LeuまたはTyr
Ser                        Thr
Thr                        Ser
Trp                        Tyr
Tyr                        Trp またはPhe
Val                        Ile またはLeu。
【００３３】
一般にCys残基をコードする1またはそれ以上のコドンは、特定ポリペプチドのジスルフィド結合に影響を与える。
【００３４】
蛋白質の特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換には、以下のものが含まれる。
a) 疎水性残基の親水性残基への置換、例えばLeu、Ile、Phe、ValまたはAlaのSerまたはThrへの置換、
b) CysおよびPro以外のアミノ酸残基のCys またはProへの置換、
c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えばLys、Arg、Hisの、電気的陰性残基、例えば、GluまたはAspへの置換、
d) 非常に大きな側鎖を有しているアミノ酸残基、例えばPheのGlyのような側鎖を有しないアミノ酸残基への置換。
【００３５】
(1)  本発明医薬組成物の有効成分とするポリペプチド
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド(および本発明スクリーニング方法に利用するポリペプチド)(以下、単に「本発明ポリペプチド」という)は、(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるか、或いは(b)該配列番号：1で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するものである。
【００３６】
本発明ポリペプチドは、例えば、ヒト細胞、特にヒト神経細胞、神経芽細胞、膵細胞、膵β細胞、あるいはヒト組織、特に大脳(大脳皮質)、小脳、膵臓、腎臓、肝臓、脾臓、肺、胃、小腸、大腸などを起源とするヒト細胞乃至組織由来のポリペプチドであるのが好ましい。また、本発明ポリペプチドは、上記好ましいポリペプチドのアミノ酸配列情報に従って、化学合成して得られるポリペプチドであってもよい。
【００３７】
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列の一具体例としては、配列番号：1で示されるものを例示できる。本発明ポリペプチドのアミノ酸配列は、この配列番号：1で示されるものに限定されず、これと一定の相同性を有するもの(相同物)であることができる。該相同物としては、配列番号：1で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００３８】
上記APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用とは、APP発現細胞のAPP産生作用またはAβ産生作用を抑制する作用をいう。この作用は、より詳しくは、例えば後記実施例に示すように本発明ポリペプチドを発現するように形質転換したAPP発現細胞におけるAPP産生作用若しくはAβ産生作用を調べることにより確認できる。その確認は、例えばAPP産生作用（その抑制作用）は、標識したAPP発現細胞をウェスタン・ブロッティング分析法によって測定、検出することができる。また、Aβ産生作用（その抑制作用）は、培養液中に産生されたAβ量を、Aβに対する抗体(抗Aβ抗体)を用いたELISA法により測定、検出することができる。
【００３９】
上記APP産生作用またはAβ産生作用の抑制は、結果として、神経細胞変性の進行の予防または改善をもたらす。このことから、該抑制作用は、APPまたはAβの蓄積によって生じる細胞変性を抑制または改善する作用、即ち細胞変性抑制作用ということもできる。
【００４０】
尚、前記相同物におけるこの作用は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのそれと実質的に同質であればよい。ここで、「実質的に同質」とは、その作用が、生理化学的性質においてまたは薬理学的性質において同質であること（「同効物」という）を示すものであり、該APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の程度、これらの作用を有する蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００４１】
前記(b)として示す本発明ポリペプチドにおけるアミノ酸の改変、即ち「欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有するもの(同効物)であれば特に制限されない。上記改変の程度は、通常1から数個程度であるのが好ましい。特にこの改変の程度は、アミノ酸配列における相同性が例えば約80％以上、好ましくは約95％以上、より好ましくは約98％以上であるのがよい。
【００４２】
なお、前記(b)として示す改変されたアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドは、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用のほかに、例えば該ポリペプチド本来の蛋白活性(例えばその酵素活性)、抗原性および免疫原性活性などにおいても、改変前のアミノ酸配列、即ち、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、実質的に同質であるのが好ましい。
【００４３】
本明細書において、配列番号：1で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび該配列番号：1において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するポリペプチド（本発明ポリペプチド）が有する上記共通する活性を、以下単に「APP産生抑制活性」ということがある。
【００４４】
配列番号：1で表わされるアミノ酸配列からなる本発明ポリペプチドの相同物には、APP産生抑制活性を有する、酵母、線虫、植物組織およびヒト以外の哺乳動物を起源とする蛋白質も含まれる。該哺乳動物としては、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、マウス、ラット、ウサギなどを例示できる。
【００４５】
本発明ポリペプチドの有するAPP産生抑制活性は、本発明ポリペプチドとAPPとを同時に発現し得る細胞乃至組織、即ち適当な起源細胞に両遺伝子を導入して該細胞を培養する系（共培養系）と、本発明ポリペプチドの発現能を付与していないAPP発現細胞を培養する系(APP発現系)とを対比したときに、共培養系の方が、より低いAPP産生またはAβ産生を示すこと、即ちAPP産生および／またはAβ産生が抑制されることをもって評価される。
【００４６】
APP産生抑制作用は、標識したAPP発現細胞をウェスタン・ブロッティング分析法により、発現量の減少／低下を指標として、公知の方法で、測定、検出することができる。また、Aβ産生抑制作用は培養液中に産生されたAβに対するAβ抗体を用いるELISA法により、Aβ産生量の減少／低下として常法により測定、検出することができる。
【００４７】
より詳しくは、例えば後記実施例に記載するように、Mycやflagなどの特定エピトープで標識した組換えHRD1と組み換えAPPとを、HEK293細胞内に遺伝子導入して発現させ、遺伝子導入の所定時間後に回収した細胞溶解物について、エピトープ認識抗体を利用してウェスタン・ブロッティングにより、APP量を測定し、この測定値を、非組換え細胞(HRD1非発現細胞)の同測定値と比較することによって、APP産生抑制作用の有無乃至は該作用の程度を検出することができる。
【００４８】
また、上記においてHRD1を発現しているHEK293細胞と、HRD1を発現していないHEK293細胞とを所定時間培養後に、培地をOpti-MEMに置換し、それぞれ所定時間インキュベーション後、培養上清を回収し、抗Aβ抗体を用いて上清中のAβ量(産生量)を測定し、この測定値を非組換え細胞(HRD1非発現細胞)の同測定値と比較することによって、Aβ産生量の抑制の有無乃至はその程度を検出することができる。
【００４９】
本発明ポリペプチドの一具体例としては、後述する実施例に示される「HRD1」と名付けられたPCR産物がコードするポリペプチドを挙げることができる。HRD1のDNA配列は、配列番号：2に示すとおりであり(1851bp)、そのORFによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：1に示すとおりである。即ち、HRD1は、616アミノ酸配列からなっている(GenBank アクセッション番号AB085847)。
【００５０】
上記HRD1は、本発明者らが小胞体に局在するE3ユビキチン結合酵素として見出したものである。このHRD1は、小胞体ストレスによってその発現が誘導される小胞体に局在する膜蛋白であり、このHRD1はこれを培養細胞内で高発現させるときには、小胞体ストレス応答細胞死を抑制できる(前記非特許文献2参照)。
【００５１】
本発明ポリペプチドの他の一つの具体例としては、GenBank アクセッション番号NP 115807の616のアミノ酸配列からなるHRD1のアイソフォームを挙げることができる。そのDNA配列は、配列番号：4に示すとおりであり(1851bp)、そのORFによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号：3に示すとおりである。このHRD1のアイソフォームは、アミノ酸レベルでHRD1と99%の同一性を有している。
【００５２】
HRD1と相同性が高い物質としては、まず、616のアミノ酸配列からなるリウマチ患者の滑膜組織において特異的に発現するシノビオリン(Synoviolin)関連蛋白質を挙げることができる。該シノビオリン関連蛋白質と、HRD1とは、アミノ酸配列および核酸配列において、共に99％相同している(WO200252007号)。
【００５３】
次に、癌、動脈硬化症、貧血、高血圧症、感染症、多発性骨髄腫、創傷などの疾患の診断や治療に有用な617のアミノ酸配列からなるヒト分泌蛋白質HDLWF88をコードするヒト遺伝子4を挙げることができる。このヒト分泌蛋白質と、HRD1とは、アミノ酸配列および核酸配列において、共に99％相同している(WO2003038038号)。
【００５４】
さらに、糖尿病、癌、潰瘍性大腸炎、免疫不全症候群、AIDS、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、脳炎などの疾患の診断や治療に有用な617のアミノ酸配列からなるヒトアルブミン融合蛋白質を挙げることができる。このヒトアルブミン融合蛋白質と、HRD1とは、アミノ酸配列および核酸配列において、共に99％相同している(WO200177137号)。
【００５５】
また、細胞増殖疾患として、光線性角化症、動脈硬化症、肝硬変、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、喘息、アレルギー、アルツハイマー病、心筋梗塞、貧血、慢性心不全などの疾患の診断や治療に有用な617のアミノ酸配列からなるヒト分泌蛋白SECP17を挙げることができる。このヒト分泌蛋白SECP17と、HRD1とは、アミノ酸配列および核酸配列において、共に99％相同している(WO200262841号)。
【００５６】
更に、自己免疫疾患や癌のような医療状況を改良、予防、治療を行うために、或いは食品添加物として、21のヒト分泌蛋白質の一つをコードする核酸配列として、617のアミノ酸配列からなるヒト分泌蛋白質HRABV43をコードするヒト遺伝子4も報告されている。このヒト分泌蛋白質HRABV43と、HRD1とは、アミノ酸配列および核酸配列において、共に99％相同している(WO200134629号)。
【００５７】
以上のように、HRD1およびそのアイソフォームなどは、現在、いくつか報告されているが、それらの報告には、HRD1およびそのアイソフォームについて、これらがAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有することについては、一切教示もなければ、これを示唆するところもない。
【００５８】
本発明は、HRD1が、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するという事実の発見に基づいて完成されたものである。本発明は、該HRD1を有効成分とする医薬組成物、殊にAPP産生抑制剤およびAβ産生抑制剤を提供するものである。
【００５９】
本発明APP産生抑制剤およびAβ産生抑制剤の有するAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用によれば、例えば該抑制作用が家族性アルツハイマー病患者の大脳において示し得る場合は、神経細胞変性疾患の症状の進展予防または改善作用が期待できる。
【００６０】
APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現し得る細胞は、APPおよび／またはAβを発現可能な細胞であればよい。該細胞には、神経細胞、単核球の血液細胞、卵母細胞、胚細胞、膵β細胞、肝細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、リンパ球などを例示することができる［Autillio-Gambetti, L., et al., FEBS Lett., 241 (1-2): 94-98 (1988); Erratum, FEBS Lett., 244 (2): 509 (1989); Allen, J. S., et al., Neurosci. Lett., 132 (1): 109-112 (1991); Fisher, S., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88 (5): 1779-1782 (1991) ］。
【００６１】
特にAPPの高発現との関連が報告されている疾患としては、アルツハイマー病、ダウン症などが例示できる。
【００６２】
家族性アルツハイマーの原因遺伝子PS1の変異がAβの産生を亢進させることが報告されている(Citron M, Westaway D, Xia W., et al., Nat. Med., (1): 67-72 (1997))。
【００６３】
ダウン症とAPPとの関連では、APPが存在する第21番染色体のトリソミーが原因であるダウン症において、APPの発現亢進、Aβの沈着、アルツハイマー病様の症状が見られることから、APP発現量、Aβの発現量の亢進がダウン症の発症に関与していると考えられている(Neve. R. L., et al., Brain Res., 15: 886 (1-2): 54-66 (2000))。
【００６４】
したがって、第21番染色体のトリソミーを有する患者のAPPの発現亢進、Aβの沈着は、本発明にかかるAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤の投与によって、改善することができ、かくして、該患者におけるダウン症の発症を予防または遅らせるか、症状を軽減させることが可能である。従って、本発明医薬組成物は、ダウン症の発症予防または改善剤としても期待できる可能性がある。
【００６５】
以上の通り、本発明によれば、APP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤を提供でき、これらはアルツハイマー病、パーキンソン病など各種神経変性疾患やダウン症などの遺伝性疾患における症状の進展予防または改善作用が期待できる。即ち、本発明はこれらの疾患に向けられた固有の薬理作用を有する医薬品、並びにこれらの疾患の予防および治療技術を提供する。
【００６６】
上記本発明に固有の薬理作用であるAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用によって、その予防および治療が可能な疾患としては、前記各種の神経変性疾患の他に、例えば、ハンチントン病、Machado-Joseph病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、糖尿病、びまん性レビー小体病、うつ病、躁うつ病などの各種の細胞変性疾患を挙げることができる。本発明はこれらの疾患に対する症状の進展予防または改善に有用な医薬組成物および予防および治療技術を提供する。
【００６７】
(2)  本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(以下、「本発明遺伝子」ということがある)の一具体例としては、配列番号：2で示されるDNA配列またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００６８】
他の本発明ポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現可能なポリヌクレオチドが包含される。ここで「ストリンジェントな条件」とは、0.1％SDSを含む0.2×SSC中、50℃でハイブリダイズし、0.1%SDSを含む1×SSC中、60℃での洗浄によっても脱離しない条件を挙げることができる。
【００６９】
更に他の本発明ポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドと80%以上、好ましくは95％以上、より好ましくは約98％以上、相同するDNA配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現可能なポリヌクレオチドが含まれる。
【００７０】
これらの他のポリヌクレオチド(以下「改変体」ということがある)は、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現可能であることをその必須の要件とする。該要件は、換言すれば、これらのポリヌクレオチド(改変体)を挿入した組換え体発現ベクターで形質転換した形質転換体が、その発現物として、本発明ポリペプチド、即ちHRD1蛋白質乃至APP産生抑制作用、またはAβ産生抑制作用を有する蛋白質を発現できることである。
【００７１】
上記改変体には、配列番号：1に示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列(改変されたアミノ酸配列) をコードするDNA配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。該改変体は、その利用によって改変前の本発明ポリヌクレオチドが検出できるものであってもよい。
【００７２】
本発明ポリヌクレオチドには、更に、配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド(HRD1遺伝子)の相同物も包含される。ここで「HRD1遺伝子の相同物」とは、HRD1遺伝子と配列相同性を有し、構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性および生物学的機能の類似性より、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味する。これにはHRD1遺伝子のアレル体(対立遺伝子)も含まれる。
【００７３】
アミノ酸配列の改変(変異)などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることがある。また天然由来の遺伝子(例えばHRD1遺伝子)に基づいて人為的に改変することもできる。本発明遺伝子は、このような改変、変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。
【００７４】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同100, 468 (1983)； Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法；リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967)；同91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981)；同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法が例示できる。より具体的には、DNAの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて、相補鎖を、化学合成した一本鎖に付加することによって得ることができる。
【００７５】
本発明遺伝子(例えばヒトHRD1遺伝子)の具体的一態様である配列番号：2で示されるDNA配列を有するDNA配列は、配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの各アミノ酸残基をコードする各コドンの一つの組合せ例である。本発明遺伝子は、かかる特定のDNA配列を有するDNA分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択したDNA配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができる。その際には例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Ncleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００７６】
(3)  本発明遺伝子の製造
本発明遺伝子は、本明細書に開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照〕。
【００７７】
該製造は、具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択して実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００７８】
上記において、cDNAの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。これら起源からの全RNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得およびそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。また、mRNAまたはcDNAライブラリーは市販されている。本発明遺伝子の製造は、それら市販のmRNAまたはcDNAライブラリー、例えばクローンテック社(Clontech Lab.Inc.)などより市販の各種mRNAまたはcDNAライブラリー、特にヒトの小脳またはアルツハイマー患者由来の大脳皮質のmRNAまたはcDNAライブラリーを用いて実施することもできる。
【００７９】
本発明遺伝子をcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばcDNAによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するcDNAクローンを選択する方法、目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、およびこれらの組合せを例示することができる。
【００８０】
上記において用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のDNA配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどが一般的である。また、既に取得された本発明遺伝子およびその断片も上記プローブとして有利に利用できる。更に、本発明遺伝子のDNA配列情報に基づき設定したセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００８１】
プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号：2に対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも15個の連続したDNA、好ましくは少なくとも100個の連続したDNA、より好ましくは少なくとも150個の連続したDNA、最も好ましくは少なくとも200個の連続したDNAを有するものである。前記した本発明遺伝子の製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。
【００８２】
本発明遺伝子の取得に際しては、PCR法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得難い場合には、RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に5'-RACE法〔M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。
【００８３】
PCR法の実施の際に用いられるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定し、常法に従って合成することができる。尚、PCR法で増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は、常法に従い例えばゲル電気泳動法などによって実施することができる。
【００８４】
上記で得られる本発明遺伝子或いは各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕、マキサム-ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのDNA配列を決定することができる。
【００８５】
(4)  本発明ポリペプチドの遺伝子工学的製造
本発明ポリペプチド(発現物)は、本発明遺伝子を利用して、通常の遺伝子工学的手法(例えばScience, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など)に従って、該遺伝子の発現物としてまたはこれを含む蛋白質として、容易に、大量に且つ安定して製造することができる。より詳細には、所望の蛋白質をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNA(発現ベクター)を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的蛋白質を回収することにより、本発明ポリペプチド(発現物)を得ることができる。
【００８６】
本発明は、本発明遺伝子によってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの製造のための、例えば本発明遺伝子を含有するベクター、該ベクターによって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養して本発明ポリペプチドを製造する方法などをも提供する。
【００８７】
上記において、宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主は、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるもののいずれでもよい。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12株を利用できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞であるCOS細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００８８】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびSD(シャイン・アンド・ダルガーノ)配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばpGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech社)、pMAL-C2，pMAL-P2(New England Biolabs社)、pET21，pET21/lacq(Invitrogen社)、pBAD/His(Invitrogen社)などを例示できる。
【００８９】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的には、例えばSV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕などが例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばpEGFP-N，pEGFP-C(Clontrech社)、pIND(Invitrogen社)、pcDNA3.1/His(Invitrogen社)などの動物細胞用ベクター、pFastBac HT(GibciBRL社)、pAcGHLT(PharMingen社)、pAc5/V5-His，pMT/V5-His，pMT/Bip/V5-his(以上Invitrogen社)などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００９０】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するpAM82〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばpPICZ(Invitrogen社)、pPICZα(Invitrogen社)なとが包含される。
【００９１】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどを例示できる。
【００９２】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として発現させるためのpGEX(Promega 社)などを例示できる。
【００９３】
また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列などが例示できる。これらの配列には、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグが含まれる。
【００９４】
所望の組換えDNA(発現ベクター)の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００９５】
得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
【００９６】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００９７】
かくして得られる組換え蛋白質(本発明ポリペプチド)は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第1版第1刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００９８】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理(塩析法)、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００９９】
尚、本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの設計に際しては、配列番号：2に示されるHRD1遺伝子のDNA配列を利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【０１００】
また、HRD1遺伝子によりコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基乃至アミノ酸配列を置換、挿入、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法を採用することができる。
【０１０１】
(5)  本発明医薬組成物の有効成分とするDNA分子の発現物
本発明医薬組成物において有効成分とする特定のDNA分子の発現物(および本発明スクリーニング方法に利用する同発現物)(以下、単に「本発明発現物」という)は、前記(4)に示す遺伝子工学的手法により得ることができる。
【０１０２】
本発明発現物のAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用は、前記(1)項に記載した本発明ポリペプチドのAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用と同義である。この抑制作用の検出は、前記(1)項に示したように、公知の方法によって行うことができる。
【０１０３】
APP産生抑制作用は、標識したAPPの発現細胞をウェスタン・ブロッティング分析法により、発現量の減少／低下を指標として、公知の方法で、測定、検出することができる。また、Aβ産生抑制作用は培養液中に産生されたAβに対するAβ抗体を用いるELISA法により、Aβ産生量の減少／低下として常法により測定、検出することができる。
【０１０４】
より詳しくは、Mycエピトープで標識した組み換えHRD1とflagエピトープで標識した組み換えAPPをHEK293 細胞内に遺伝子を導入し、遺伝子導入13時間、37時間後に回収した細胞溶解物を用いて、抗flag抗体ウェスタン・ブロッティングにより細胞内のAPP量を測定し、この測定値を、非組換え細胞(HRD1非発現細胞)の同測定値と比較することによって、APP産生抑制作用の有無またはその程度を検出することができる。
【０１０５】
また、上記においてHRD1を発現ベクターしているHEK293細胞と、HRD1を発現していないHEK293形質転換細胞を10時間培養後に培地をOpti-MEMに置換して、それぞれ3時間と27時間インキュベーション後、培養上清を回収し、上清中のAβをAβ1-40 ELISAキットまたはAβ1-42 ELISAキットを用いて、細胞からのAβの産生量をそれぞれ測定し、非組換え細胞(HRD1非発現細胞)の同測定値と比較することによって、Aβ産生量抑制作用の有無またはその程度を検出することができる。
【０１０６】
(6)  本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、配列番号：1に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することもできる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【０１０７】
ペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【０１０８】
ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。例えばアジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)法、DCC＋添加物(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシサクシンアミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミドなど)法、ウッドワード法などに従うことができる。
【０１０９】
これら各方法に利用される溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることの知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【０１１０】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第3級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、p-メトキシベンジルエステル、p-ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【０１１１】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第3級ブチル基などで保護してもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、p-メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン-2-スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【０１１２】
保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア/ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【０１１３】
かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製することができる。
【０１１４】
(7)  本発明医薬組成物
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチドおよび本発明発現物を有効成分とする。該医薬組成物は、例えばAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤として、また該脳神経細胞においてAPP産生またはAβの蓄積によって生じる神経細胞などの細胞変性に対する細胞変性の予防・改善剤として有用である。
【０１１５】
また、上記APP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤および細胞変性予防・改善剤としての作用を利用して、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などに対する治療剤および予防剤としても有用である。
【０１１６】
より詳しくは、本発明医薬組成物において有効成分とする本発明ポリペプチドおよび本発明発現物(例えば組換えHRD1)は、それらに特有のAPP産生またはAβの蓄積によって生じる神経細胞などの細胞変性によって誘導された各種の症状を、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用によって、抑制または改善する作用を有しており、この作用乃至活性を利用して、各種細胞のAPP産生またはAβの蓄積および細胞変性に関連する疾患の処置に利用することができる。かかるAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の影響を受ける細胞としては、神経細胞、神経芽細胞、単核球の血液細胞、卵母細胞、胚細胞、膵β細胞、肝細胞、上皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、リンパ球などを挙げることができる。これらの細胞を含む重要な組織としては、小脳、大脳皮質、中脳、脳下垂体、膵臓、胃、小腸、肺、肝臓、腎臓、大腸、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、膵臓などを挙げることができる。上記細胞の具体例には、ニューロブラストーマ、グリオーマ細胞、その他の神経細胞、例えばN2aSK-N-SH細胞(ATCC No. HTB-11)、N18TG-2, IMR-32 (ATCC No. CCL-127)、GOTO、NBI、C6BU-1、U251、KNS42、KNS81、NG108-15細胞、PC12細胞(ATCC No. CRL-1721)などが含まれる。またヒト胎児腎臓由来細胞HEK293T細胞も上記細胞の具体例に包含される。
【０１１７】
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド(発現物)には、その医薬的に許容される塩もまた包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチド(発現物)と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩(トシレート)、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。
【０１１８】
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチド(発現物)およびそれらの塩を活性成分として、その薬学的有効量を、適当な医薬担体ないし希釈剤と共に含有させて医薬製剤形態に調製される。
【０１１９】
該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、製剤形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。特に好ましい医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用される各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１２０】
上記において安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のL-アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１２１】
L-アミノ酸としては、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１２２】
糖類としても、特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１２３】
界面活性剤としても、特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。その具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１２４】
セルロース誘導体としても、特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１２５】
上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01-10mg程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001-0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。L-アミノ酸の添加量は、有効成分1μg当り約0.001-10mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。
【０１２６】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、製剤中に約0.00001-70重量％、好ましくは0.0001-5重量％程度が含まれる量とするのが適当である。
【０１２７】
本発明医薬製剤中には、また各種の添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε-アミノカプロン酸、グルタミン酸および/またはそれらに対応する塩(例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)などを例示できる。など張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１２８】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として調製できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。
【０１２９】
本発明医薬製剤の投与単位形態は、治療目的に応じて適宜選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態および溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１３０】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１３１】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、該投与量は、通常、1日当り体重1kg当り、約0.01μg-10mg程度、好ましくは約0.1μg-1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1-数回に分けて投与することができる。
【０１３２】
(8)  遺伝子治療
後記実施例に示すように、本発明遺伝子(HRD1遺伝子)の発現は、神経細胞、神経芽細胞、アルツハイマー患者由来大脳皮質などの組織において認められることから、本発明にかかるHRD1遺伝子のセンスDNAの全部または一部は、これを直接またはこれを含む任意の遺伝子発現ベクターの形態で、大脳、、中脳、小脳、大脳皮質などの組織細胞内に、ウイルスやリポソームを利用して導入することによって、該細胞内で相補的配列を有するRNAを作り出し、翻訳を促進することによって、強制的にHRD1遺伝子の発現を増加させることができる。かくして、大脳、小脳、などの組織におけるAPPの産生やAβ蓄積を抑制し、結果としてAPP産生またはAβ蓄積によって生じる神経細胞変性を抑制して、APPの産生やAβ蓄積をによって生じる細胞変性に関連した疾患の病態進展を抑制または改善することができる。このような作用によって、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの進展の抑制または改善に利用することができる。本発明は、このようなAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有する遺伝子治療用組成物或いは遺伝子治療剤をも提供する。
【０１３３】
本発明は、上述したように、HRD1遺伝子の全部または一部を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりHRD1遺伝子を導入した細胞を有効成分とする医薬組成物を提供する。より詳しくは、本発明は、配列番号：2で示されるDNA配列のセンスDNAの全部または一部の配列を含むセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞並びに該遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤を提供する。なお、上記および以下において「一部の配列」とは、APP産生抑制活性またはAβ産生抑制活性を発現し得る配列を含む部分配列を意味する。
【０１３４】
また、本発明は、配列番号：2で示されるDNA配列のセンスDNAの全部または一部の配列を含むセンス遺伝子を含有する遺伝子治療用ベクターおよび該ベクターによりセンス遺伝子を導入した細胞を、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの患者の骨格筋細胞または筋肉組織部位に投与することによって、これら組織から所望の標的組織におけるAPPの産生またはAβ蓄積によって生じる身体障害の進行を抑制または改善し、上記各疾患における病態の進展を抑制または改善する方法、即ちAPP産生抑制方法またはAβ産生抑制作方法を提供する。
【０１３５】
以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。尚、以下の遺伝子治療の実施においては、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学および免疫学の慣用的な方法を用いることができる。これらは、例えばマニアティス(Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)))、サムブルック(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1981)))、アウスベル(Ausbel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, (1992)))、グローバー(Glover, D., DNA Cloning, I and II (Oxford Press) (1985))、アナンド(Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, Academic Press (1992))、グスリー(Guthrie, G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press (1991))およびフィンク(Fink, et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992))などに記載されている。
【０１３６】
本発明遺伝子治療は、HRD1遺伝子を発現する細胞において、該細胞内のmRNAに対して相補的配列を持つRNAを作り出し、翻訳を阻害し、HRD1遺伝子の発現を抑制するためのセンス医薬によるAPP産生またはAβ蓄積の抑制方法、特に脳神経細胞におけるAPP産生またはAβ蓄積により生じた身体障害の進行の抑制または改善方法、または細胞もしくは組織におけるAPP産生またはAβ蓄積により生じた神経細胞変性の抑制方法を包含する。該治療法は、例えばHRD1遺伝子の発現が低下しているかもしくは著しく低下しているHRD1遺伝子発現細胞に対して、HRD1発現細胞本来の量もしくは過剰量のmRNAを提供することによって、転写或いは翻訳の過程を亢進させて、標的とする遺伝子の発現を増加させる方法である。
【０１３７】
該方法においては、標的遺伝子のmRNAと相補的なセンス・オリゴヌクレオチドを製造し、該センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する。このように、HRD1遺伝子の発現機能を促進する作用を標的細胞に供給すれば、受容細胞/標的細胞におけるAPP産生またはAβ蓄積を抑制することができ、また神経細胞におけるAPP産生またはAβ蓄積に基づく神経細胞変性を抑制することができる。
【０１３８】
上記センス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に供給する具体例としては、センス・オリゴヌクレオチドを含有するベクターまたはプラスミドを標的細胞に導入してその染色体外に該センス・オリゴヌクレオチドを維持する方法を挙げることができる。
【０１３９】
本発明に係わるセンス・オリゴヌクレオチドを用いたAPP産生抑制作用乃至Aβ産生抑制作用に基づく細胞変性抑制の遺伝子治療によれば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV; adeno-associated virus)由来のベクターなどに、センス・オリゴヌクレオチドを組み込み、これをHRD1発現細胞に感染させて、センス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることにより、所望のAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を増加または亢進させることができ、かくしてAPP産生抑制効果またはAβ産生抑制効果を得ることができる。
【０１４０】
HRD1遺伝子を有する標的細胞に、センス・オリゴヌクレオチドを導入してHRD1の発現を増加させる場合、当該センス・オリゴヌクレオチドは、HRD1遺伝子の全長に対応するものである必要はなく、HRD1遺伝子の発現機能を抑制する機能と実質的に同質な機能を保持する限りにおいて、例えば前記した改変体であっても、またそのような特定の機能を保持した一部配列からなる遺伝子であってもよい。
【０１４１】
センス・オリゴヌクレオチドのベクターへの組み込みおよび標的細胞染色体外維持の双方のための、所望遺伝子導入用ベクターとしては、当該分野において既に知られている各種のベクターをいずれも使用することができる。該ベクターは、例えば発現制御エレメントに連結したHRD1のセンス・オリゴヌクレオチドのコピーを含み、かつ標的細胞内で当該センス・オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。その具体例としては、例えば米国特許第5252479号明細書およびPCT国際公開WO93/07282号パンフレットに開示された発現ベクター(pWP-7A、pwP-19、pWU-1、pWP-8A、pWP-21および/またはpRSVL)、pRC/CMV(Invitrogen社製)などを用いて調製されたベクターを挙げることができる。好適なベクターは後述する各種ウイルス・ベクターである。
【０１４２】
なお、遺伝子導入治療において用いられるベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用することができる。
【０１４３】
その具体例としては、例えば、脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン、チロシンヒドロキシラーゼ膵臓ビリン、グルカゴン、ランゲルハンス島アミロイドポリペプチドなどを例示することができる。
【０１４４】
甲状腺に対しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示することができる。
【０１４５】
骨に対しては、α1コラーゲン、オステオカルシン、骨シアログリコプロティンなどを例示することができる。
【０１４６】
腎臓に対してはレニン、肝臓/骨/腎臓アルカリ性ホスフォターゼ、エリスロポエチンなどを例示することができる。
【０１４７】
膵臓に対しては、アミラーゼ、PAP1などを例示することができる。
【０１４８】
小腸に対しては、ビリン、ラクターゼ、アデノシンデアミダーゼ、カルビンディニン、小腸脂肪酸結合蛋白質、ナトリウムブドウ糖共輸送体などを例示することができる。
【０１４９】
大腸に対しては、コロンカルボン酸脱水素酵素などを例示することができる。
【０１５０】
肝臓に対しては、アルブミン、α-フェトプロティン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンなどを例示することができる。
【０１５１】
結腸に対しては、カルボン酸アンヒドラーゼI、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示することができる。
【０１５２】
子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマターゼサイトクロームP450、コレステロール側鎖切断P450、17アルファーヒドロキシラーゼP450などを例示することができる。
【０１５３】
前立腺に対しては、前立腺抗原、gp91-フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを例示することができる。
【０１５４】
乳房に対しては、erb-B2、erb-B3、β-カゼイン、β-ラクトグロビン、乳漿蛋白質などを例示することができる。
【０１５５】
肺に対しては、活性剤蛋白質Cウログロブリンなどを例示することができる。
【０１５６】
皮膚に対しては、K-14-ケラチン、ヒトケラチン1または6、ロイクリンなどを例示することができる。
【０１５７】
なお、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの製造において、導入されるセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子に対応する相補配列の全部または一部)は、HRD1遺伝子のDNA配列情報に基づいて、前記したように一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる。
【０１５８】
センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターの標的細胞への導入は、細胞にDNAを導入する当該分野において既に知られている各種の方法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入などに従って行うことができる。HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドで形質転換された細胞は、それ．自体単離状態でAPP産生を抑制するかまたはAβ産生抑制するための医薬品として、また治療研究のためのモデル系として利用することもできる。
【０１５９】
センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することにより、患者の標的細胞内に導入することができる。全身的投与によれば、HRD1mRNAが発現し得るいずれの細胞にも所望のベクターを到達させ得る。形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的に取り込まれないような場合には、該投与を定期的に繰り返すことができる。
【０１６０】
本発明の遺伝子治療方法は、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを直接体内に投与するインビボ(in vivo)法と、患者の体内より一旦標的とする細胞を取り出して、体外で遺伝子を導入し、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ(ex vivo)法の両者を包含する。
【０１６１】
本発明遺伝子治療は、特に脳神経細胞におけるAPP産生またはAβ蓄積により生じた身体障害を有する疾患患者を対象とするAPP産生またはAβ産生の抑制として利用されるのが好ましい。また、本発明遺伝子治療(処置)は、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病とそれらの合併症などの治療を対象とすることもできる。更に、本発明は、遺伝子治療に限らず、例えば遺伝子標識をその目的とすることもできる。
【０１６２】
センス・オリゴヌクレオチドを導入する標的細胞は、遺伝子治療(処置)の対象により適宜選択することができる。該標的細胞としては、HRD1の発現が認められる各種の細胞およびその集合体である組織、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、神経細胞、神経芽細胞、単核球の血液細胞、卵母細胞、胚細胞、肝臓、膵臓、肺、小腸組織、リンパ球、膵β細胞、脂肪細胞、肝細胞、繊維芽細胞、粘膜上皮細胞、造血幹細胞、表皮系細胞などを挙げることができる。
【０１６３】
遺伝子治療におけるセンス・オリゴヌクレオチドの導入方法には、ウイルス的導入方法と非ウイルス的導入方法が含まれる。
【０１６４】
ウイルス的導入方法としては、例えばHRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることができる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、HIV(human immunodeficiency virus)ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV, adeno-associated virus)、ヘルペスウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、エプスタイン-バーウイルス(EBV, Epstein-Barr virus)ベクターなどが挙げられる。
【０１６５】
非ウイルス的導入方法としては、リン酸カルシウム共沈法；DNAを封入したリポソームと予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイルスとを融合させて膜融合リポソームを作成し、これを細胞膜に直接融合させてDNAを細胞内に導入する膜融合リポソーム法〔Kato, K., et al., J. Biol. Chem., 266, 22071-22074 (1991)〕；プラスミドDNAを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にDNAを導入する方法〔Yang, N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 9568-9572 (1990)〕；プラスミドDNAを直接インビボで臓器や標的組織に注入するネイキッド(naked)DNA法〔Wolff, J. A., et al., Science, 247,1465-1467 (1990)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医学のあゆみ, Vol.175, No.9, 635-637 (1995)〕；特定細胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにするために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合するリガンドをDNAと結合させてそれを投与するリガンド-DNA複合体法〔Frindeis, et al., Trends Biotechnol., 11, 202 (1993); Miller, et al., FASEB J.,9,190 (1995)〕などを挙げることができる。
【０１６６】
リガンド-DNA複合体法には、例えば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法〔Wu, et al., J. Biol. Chem.,  266, 14338 (1991); Ferkol, et al., FASEB. J., 7, 1081-1091 (1993)〕、標的細胞が強く発現しているトランスフェリン・レセプターを標的としてトランスフェリンをリガンドとして用いる方法〔Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 87, 3410 (1990)〕などが含まれる。
【０１６７】
また、遺伝子導入法は、上記の如き各種の生物学的および物理学的遺伝子導入法を適宜組合せたものであってもよい。該組合せによる方法としては、例えばあるサイズのプラスミドDNAをアデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組合せる方法を例示できる。該方法によれば、得られる複合体がアデノウイルスベクターに結合し、かくして得られる三分子複合体を細胞に感染させることにより本発明センス・オリゴヌクレオチドの細胞内導入を行い得る。この方法では、アデノアイルスベクターにカップリングしたDNAが損傷される前に、効率的な結合、内在化およびエンドソーム分解が可能となる。また、リポソーム/DNA複合体は、直接インビボにて遺伝子導入を媒介できる。
【０１６８】
各遺伝子導入用ベクターは、公知の方法により作成することができる。例えばEBVベクターの製造は、清水らの方法に準じて実施できる〔清水則夫ら、細胞工学, 14(3), 280-287 (1995)〕。
【０１６９】
非ウイルス的導入方法は、組換えウイルスベクターを用いることなく所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的細胞に導入する方法である。該方法の一つである膜融合リポソームによる遺伝子導入法は、例えば中西らの方法によって行うことができる〔Nakanishi, M., et al., Exp. Cell Res., 159, 399-499 (1985); Nakanishi, M., et al., Gene introduction into animal tissues. In Trends and Future Perspectives in Peptide and Protein Drug Delivery (ed. by Lee, V. H. et al.), Harwood Academic Publishers Gmbh. Amsterdam, 1995, pp.337-349〕。
【０１７０】
本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的には2種類の方法が含まれる。
【０１７１】
その第1法は、治療対象とする患者から標的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロイキン-2(IL-2)などの添加の下で培養し、レトロウイルスベクターに含まれる目的とするHRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチドを導入した後、得られる細胞を再移植する手法(ex vivo法)である。
【０１７２】
第2法は、目的センス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を直接患者の体内や骨格筋などの標的部位に注入する遺伝子直接導入法(直接法)である。
【０１７３】
上記遺伝子治療の第1法は、より詳しくは、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から採取した単核細胞を血液分離装置によって単球から分取し、分取細胞をIL-2の存在下にAIM-V培地などの適当な培地で72時間程度培養し、導入すべきセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を含有するベクターを加える。センス・オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタミン存在下に32℃で1時間、2500回転にて遠心分離した後、37℃で10％炭酸ガス条件下において24時間培養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にIL-2存在下にAIM-V培地などで48時間培養し、細胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、センス・オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ PCRや、例えば所望の対象が本発明のようにAPP産生抑制作用乃至Aβ産生抑制作用の程度を測定することにより、あるいは小胞体ストレス誘導により生じたアポトーシスの抑制作用を測定することにより、目的センス・オリゴヌクレオチドの導入効果を確認する。
【０１７４】
また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイコプラズマの感染の有無、エンドトキシンの存在を検索するなどして、安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測される効果用量のセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入された培養細胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を、例えば数週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療が施される。ウイルスベクターの投与量は、導入する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価として、例えば標的細胞1×108細胞に対して1×103cfuから1×108cfuの範囲となる投与量を採用することが好ましい。
【０１７５】
上記第1法の別法として、目的センス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を含有するレトロウイルスベクターを含有するウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、目的とする細胞にセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)を導入する方法を採用することもできる。
【０１７６】
遺伝子治療の第2法(直接法)の実施に当たっては、遺伝子導入法によって実際に目的のセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入されるか否かを、体外における予備実験、例えばベクター遺伝子cDNAのPCRによる検索やin situPCRによって予め確認しておくか、あるいは目的センス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)の導入に基づく所望の治療効果であるAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用や標的細胞のAPP産生の減少、Aβ蓄積の減少などを予め確認しておくことが望ましい。また、ウイルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスなどの検索をPCRで行うか、逆転写酵素活性を測定するか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をPCRでモニターするなどにより、遺伝子治療に際してセンス・オリゴヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要である。
【０１７７】
本発明遺伝子治療において、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症などの患者の脳神経細胞を対象とする場合は、患者の骨髄から骨髄幹細胞(HRD1発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばレトロウイルスにて所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする培養された骨髄幹細胞(HRD1発現細胞)に導入し、G418細胞にてスクリーニングした後、IL-12などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施した後、該細胞を患者の脳に接種する方法を好ましい方法として挙げることができる。
【０１７８】
アルツハイマー病患者を対象とする場合は、患者の骨髄から骨髄幹細胞(HRD1発現細胞)を採取後、酵素処理などを施して培養細胞を樹立した後、例えばリポソームにて所望のセンス・オリゴヌクレオチドを標的とする培養された骨髄幹細胞(HRD1発現細胞)に導入し、G418細胞にてスクリーニングした後、IL-12などの発現量を測定(in vivo)し、次いで放射線処理を施した後、該細胞を患者の骨髄に接種する方法を好ましい方法として挙げることができる。
【０１７９】
(9)  遺伝子治療剤の調製
本発明は、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターまたはセンス・オリゴヌクレオチド(HRD1遺伝子のセンス・オリゴヌクレオチド)が導入された細胞を活性成分とし、それらの薬学的有効量を、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有する医薬組成物または医薬製剤(遺伝子治療剤)を提供する。
【０１８０】
本発明の医薬組成物(医薬製剤)に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用できる。
【０１８１】
本発明医薬製剤の投与単位形態としては、前記(7)項で詳述したものと同様のものを挙げることができる。これは治療目的に応じて各種の形態から適宜選択することができる。
【０１８２】
例えば、センス・オリゴヌクレオチド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリポソームに包埋された形態あるいは所望のセンス・オリゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製される。
【０１８３】
これらは、リン酸緩衝生理食塩液(pH7.4)、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態などに調製することもでき、またプロタミンなどの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。
【０１８４】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。
【０１８５】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。
【０１８６】
一般には、医薬製剤としての所望センス・オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与量は、1日当り体重1kg当り、例えばレトロウイルスの力価として約1×103pfuから1×1015pfu程度とするのがよい。
【０１８７】
また所望の導入用センス・オリゴヌクレオチドが導入された細胞の場合は、1×104細胞/bodyから1×1015細胞/body程度の範囲から選ばれるのが適当である。
【０１８８】
該製剤は1日に1回または数回に分けて投与することもでき、1から数週間間隔で間欠的に投与することもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投与することができる。
【０１８９】
(10)  HRD1遺伝子の検出
本発明は、標的細胞におけるAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するHRD1蛋白質およびこれをコードする遺伝子の存在を検出する方法を提供する。
【０１９０】
該方法は、血液または血清のごとき生物学的試料を調製し、所望により該試料から核酸を抽出し、これら試料または核酸中にHRD1蛋白質に対する感受性遺伝子が存在する否かを分析するものである。
【０１９１】
また、本発明は、HRD1遺伝子の検出によって、細胞または組織におけるHRD1活性のレベル(APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用、特に脳神経組織おいてAPP産生またはAβ産生抑制作用、HRD1mRNAの発現レベルなど)を測定し、APP産生またはAβ産生(蓄積)の程度あるいはAPP産生またはAβ産生によって生じた神経細胞変性(Aβ蓄積細胞の増加)の進行の程度、APP産生細胞またはAβ産生細胞(Aβ蓄積細胞)の増加の程度または予後を判定する方法を提供する。該方法は、細胞にAPP産生またはAβ産生(蓄積)が生じている神経細胞変性を起こす生物学的試料を調製し、該試料中にHRD1遺伝子が存在するか否かを分析するか、あるいはHRD1遺伝子のmRNAの量を分析することをその基本的操作とする。
【０１９２】
本発明HRD1遺伝子の検出方法の実施によって、細胞または組織におけるAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を知ることが可能であり、かくして、HRD1mRNAの発現レベル、APP産生またはAβ産生によって生じた神経細胞変性(Aβ蓄積細胞の増加)の進行の程度または予後の指標を得ることが可能である。また、例えばAPP産生またはAβ産生の亢進あるいはAβ蓄積細胞の増加によって生じた神経細胞変性(Aβ蓄積細胞)、細胞死などの診断、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの治療効果の判定乃至予後の予測が可能となる。
【０１９３】
該検出方法においては、先ず標的細胞においてAPP産生またはAβ産生の亢進あるいはAβ蓄積細胞の増加によって生じた神経変性(Aβ蓄積細胞)細胞または変性した細胞の試料より得られたHRD1遺伝子に関する情報を基に、HRD1遺伝子のスクリーニングおよび/またはその増幅に利用できるように設計したDNA断片を作成する。より具体的には、例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノーザンブロット法などに利用できるプローブとしての性質を有するDNA断片を作成する。このDNA断片は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用いるプローブとしての性質を有するものであってもよい。
【０１９４】
次いで、例えばHRD1遺伝子の部分配列を持つプライマーをスクリーニング用プローブとして用いて、生物学的試料(核酸試料)と反応させて、試料中のHRD1遺伝子の存在を確認する。該試料は、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。
【０１９５】
HRD1遺伝子の存在確認のためのスクリーニング方法は、特にPCRを用いるのが感度の点から好ましい。該方法は、HRD1遺伝子断片をプライマーとして用いて、従来公知の方法(Science, 230, 1350-1354(1985))や新たに開発された或いは将来使用されるPCRの変法(例えば榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共立出版(株), 35(17)(1990))に従い実施することができる。
【０１９６】
プライマーとして使用されるDNA断片は、本発明遺伝子(HRD1遺伝子)を特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り特に制限はない。これは化学合成したオリゴDNAでよい。該オリゴDNAの合成は、自動DNA合成装置など、例えばDNA合成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマシア社製)を使用して行い得る。合成されるプライマー(センス・ライマーまたはアンチセンス・ライマー)の長さは約10-50ヌクレオチド程度であるのが好ましく、より好ましくは15-30ヌクレオチド程度である。また、合成されるプライマーは、特に他の公知の類似するDNA配列を区別できる配列であるのが好ましい。
【０１９７】
上記スクリーニング方法に用いられるプローブは、通常、標識されるのが普通であるが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、当該技術分野で知られており、例えばニック・トランスレーション、ランダム・プライミング、キナーゼ処理のような方法に従うことができる。標識剤としても、例えば放射性標識剤、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体などのいずれをも利用することかできる。
【０１９８】
検出のために用いるPCRは、例えばRT-PCR〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕が好ましいが、当該分野で用いられる種々の方法を適宜応用することも勿論可能である。該方法としては、例えば、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ RT-PCR〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、NASBA法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法を挙げることができる。
【０１９９】
(11)  HRD1遺伝子検出用および診断用キット
本発明に従う前記検出法は、キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明は、HRD1遺伝子のDNA断片を含有するHRD1遺伝子の検出用キットをも提供する。
【０２００】
該キットは、少なくとも配列番号：2で示されるDNA配列もしくはその相補的DNA配列の一部または全てにハイブリダイズするDNA断片を必須構成成分として含むことが重要である。該キットは、他に通常のこの種試薬キットと同様に、例えば標識剤、PCRに必須の試薬(例えばTaqDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマー)などを含むことができる。
【０２０１】
標識剤としては、放射性同位元素、蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられる、これらの標識剤を含ませる代わりに、前記DNA断片自身を予めこれらの標識剤とコンジュゲートした結合体をキットの構成成分として利用することもできる。更に当該試薬キットには、測定の実施における便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などを含ませることもできる。
【０２０２】
本発明HRD1遺伝子検出用キットの利用によれば、HRD1遺伝子の測定、検出ができるのみならず、この検出結果に基づいて、APP産生またはAβ産生の亢進あるいはAβ蓄積細胞の増加によって生じた細胞障害の程度をも検出できる。従って、本発明はAPP産生またはAβ産生の亢進あるいはAβ蓄積細胞の増加による細胞障害を診断するための診断用キットをも提供する。
【０２０３】
また、本発明に従う検出方法では、被検試料から得られるHRD1遺伝子のDNA配列を直接的もしくは間接的に配列決定することができ、これにより野生型HRD1遺伝子と相同性の高い相同物である新たなHRD1遺伝子に関連する関連遺伝子を見出すこともできる。本発明はかかる測定、検出と被検試料中のHRD1遺伝子DNA配列の決定によって、被検試料中のヒトHRD1遺伝子に関連する関連遺伝子のスクリーニング方法をも提供する。
【０２０４】
(12)  本発明ポリペプチドに対する抗体
本発明は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド(発現物)に結合する抗体(ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体)を提供する。該抗体は、配列番号：1で示されるヒトHRD1遺伝子がコードするポリペプチド(発現物)または配列番号：1において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド或いは該ポリペプチドの断片を抗原として利用して製造することができる。
【０２０５】
抗体の製造法および精製法は、当業者によく理解されているところであり、本発明においてもこれらの常法を適当に採用することができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編(1986)など参照〕。
【０２０６】
得られる抗体は、例えばHRD1などの本発明ポリペプチドの精製およびその免疫学的手法による測定、識別などに利用することができる。より具体的には、本発明遺伝子の発現は脳神経細胞、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、神経細胞、神経芽細胞、単核球の血液細胞、卵母細胞、胚細胞などの組織において確認されていることから、該抗体は、これら組織中でのHRD1濃度の測定に利用することができる。
【０２０７】
本発明は、本発明ポリペプチドに結合する抗体を利用した野生型HRD1および/または変異型HRD1の測定法をも提供する。
【０２０８】
該測定法によって、HRD1の活性の程度、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の程度、ひいてはこれらの抑制作用による細胞障害改善の程度、APP産生またはAβ産生(蓄積)に基づく細胞変性死の程度などを、野生型HRD1の変化に基づいて、検出することも可能である。本発明抗体を利用した該測定法の具体例としては、例えばHRD1抗体を用いて、ヒトより採取した生体材料試料を含有する溶液からHRD1蛋白質を免疫沈降させる方法、或いは生体材料試料を含有する溶液中のHRD1蛋白質を直接ポリアクリルアミドゲルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でHRD1抗体と反応させる方法を挙げることができる。また、HRD1抗体を用いて、免疫組織化学的技術に従いパラフィンまたは凍結組織切片中のHRD1を検出することもできる。
【０２０９】
野生型HRD1または変異型HRD1を測定するより好ましい方法には、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ法(ELISA)、放射線免疫検定法(RIA)、免疫放射線検定法(IRMA)および免疫酵素法(IEMA)が含まれる。
【０２１０】
(13)  APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を促進(亢進)する物質のスクリーニング
本発明は、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を促進(亢進)する物質をスクリーニングする方法をも提供する。
【０２１１】
該方法は、被験物質の存在下および非存在下に、(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは(b)該ポリペプチドのアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制作用を増強する物質を選択することを特徴とする。
【０２１２】
ここで、本発明ポリペプチドのAPP産生抑制作用の程度は、標的細胞におけるAPP発現量の低下として、またAβ産生抑制作用の程度は、標的細胞におけるAβ産生量の低下として求められる。
【０２１３】
上記スクリーニング方法は、また、本発明ポリペプチドの代わりに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現物を利用することによっても実施できる。即ち、本発明は、被験物質の存在下および非存在下に、(c)配列番号：2で示されるDNA配列からなるポリヌクレオチド、(d)該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現可能なポリヌクレオチド、または(e)該ポリヌクレオチドと80％以上相同するDNA配列からなり且つAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を発現可能なポリヌクレオチドの発現物のAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の程度を測定し、被験物質の存在下における測定値を被験物質の非存在下における測定値と対比して、該抑制の程度を増強する物質を選択することを特徴とする、APP産生作用またはAβ産生作用を抑制する作用を増強する物質のスクリーニング方法を提供する。
【０２１４】
ここで、発現物のAPP産生抑制作用の程度は、標的細胞におけるAPP発現量の低下として、またAβ産生抑制作用の程度は、標的細胞におけるAβ産生量の低下として求められる。
【０２１５】
本発明スクリーニング方法において、APP産生抑制作用およびその程度は、例えば前述したように、ウェスタン・ブロッティング分析法によって検出することができる。また、Aβ産生抑制作用およびその程度は、前述したように、ELISA法などによって検出することができる。
【０２１６】
本発明スクリーニング方法の好ましい一実施態様は、以下の(1)〜(5)の工程を含んでいる。
(1)本発明ポリペプチドをコードする遺伝子および標識したAPPをコードする遺伝子のそれぞれの発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞のAPP発現量の低下または標的細胞のAβ産生量の低下を、それぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPP発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１７】
また、ポリヌクレオチドを利用する本発明スクリーニング方法の好ましい一実施態様は、以下の(1)〜(5)の工程を含んでいる。
(1) 本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび標識したAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における標的細胞のAPP発現量または標的細胞のAβ産生量を、それぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下における上記APP発現量またはAβ産生量を、候補物質の存在下における同APP発現量または同Aβ産生量とそれぞれ対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPP発現量およびAβ産生量の少なくとも一つが、非存在下において求められたそれらに比して低下している場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１８】
更に、本発明スクリーニング方法の好ましい一実施態様は、以下の(1)〜(5)の工程を含むものである。
(1)本発明ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびAPPをコードするポリヌクレオチドのそれぞれを含む発現ベクターで形質転換した標的細胞を準備する工程、
(2)候補物質の存在下または非存在下に、(1)のそれぞれの標的細胞を培養する工程、
(3)候補物質存在下および非存在下における上記標的細胞の本発明ポリペプチド産生量を、該ポリペプチドに対する抗体を用いて、それぞれ求める工程、
(4)候補物質の非存在下において求められたポリペプチド産生量と、候補物質の存在下において求められたポリペプチド産生量とを対比する工程、
(5)候補物質の存在下において求められたAPP産生量が、非存在下において求められたそれに比して増大している場合に、該候補物質を選択する工程。
【０２１９】
上記スクリーニング方法において、本発明ポリペプチド(例えばHRD1もしくはHRD1遺伝子発現物、以下、これらを単に「HRD1」という)の発現量乃至産生量は、該ポリペプチドに対する抗体を、被験物質を含む被検液中で標識化されたHRD1と競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたHRD1の割合として測定することができる。また、被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された別の異なる抗HRD1抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによっても、被検液中のHRD1を定量することが可能である。
【０２２０】
本発明スクリーニング方法によれば、HRD1とリガンドとの結合を、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物中で評価することができる。
【０２２１】
本発明方法によって選択される候補物質は、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用の促進剤乃至は亢進剤として有用である。これらの促進剤乃至亢進剤は、天然の基質またはリガンドであってもよく、それらの構造的または機能的模擬体であってもよい。
【０２２２】
本発明スクリーニング方法においては、ハイスループットスクリーニング技術を応用することができる。この技術の応用によれば、例えば、APP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤に関するスクリーニングにおいては、合成反応混合物、細胞画分、例えば細胞質、小胞体、膜、細胞エンベロープ、細胞壁またはこれらのいずれかの調製物(HRD1と該ポリペプチドの標識リガンドを含むもの)を、スクリーニングされる候補化合物の存在下または不存在下でインキュベートする。該候補化合物がHRD1を作動させるかまたはHRD1作用を助長するかは、該標識リガンドの結合の減少により検出することができる。HRD1の活性レベルの検出は、比色標識など(これに限定されるものではない)のレポーター系を利用して、またポリヌクレオチドまたはポリペプチド活性の変化に応答するレポーター遺伝子の組込みおよび当技術分野で公知の結合アッセイによって、実施することができる。
【０２２３】
HRD1およびその他のAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤を、それらに結合する化合物と組合せる競合アッセイも、APP産生抑制促進剤またはAβ産生抑制促進剤としての候補化合物のスクリーニングに用いることができる。
【０２２４】
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質(候補化合物)は、HRD1の活性を増強する物質、特にAPP産生抑制物質またはAβ産生抑制物質である。即ち、このような増強物質は、本発明スクリーニング系において、その存在によって測定されるHRD1の活性を上昇させる物質である。
【０２２５】
これら被験物質の具体例には、例えばオリゴペプチド、蛋白質、抗体、RNA分子、siRNA、非ペプチド性化合物(合成化合物)、発酵生産物、細胞抽出液(植物抽出液、動物組織抽出液など)、血漿などが含まれる。これらの物質は新たに開発されたものであっても、既知物質であってもよい。
【０２２６】
APP産生抑制物質またはAβ産生抑制物質には、HRD1に結合してその活性を増加する無機または有機の低分子化合物、天然もしくは合成のまたは遺伝子組換え技術により調製されたペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。また、生体内に直接にまたは組換えベクターに挿入された形態で投与されるHRD1 DNAに対するセンスDNA分子も含まれる。
【０２２７】
本発明スクリーニング方法に従ってスクリーニングされるHRD1活性を活性化または阻害する作用を有する候補物質の評価は、次の如くして行うことができる。即ち、HRD1活性がコントロール(被験物質非存在)の場合に比べて、約20％以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上促進している場合、該候補物質はHRD1活性を促進する化合物として選択することができる。
【０２２８】
HRD1は、特に脳神経細胞、特に小脳、大脳皮質、脳下垂体、神経細胞、神経芽細胞、単核球の血液細胞、卵母細胞、胚細胞などの組織細胞にその発現が見られることから、これらの細胞に誘導されたAPP産生またはAβ産生(組織にAβ蓄積 )作用によって生じた細胞変性、特に神経細胞、神経芽細胞などの脳神経細胞変性に関連する疾患に対して、HRD1活性の促進剤は有用である。例えば、大脳、小脳、大脳皮質、中脳および下垂体組織内のHRD1活性を促進する化合物は、APP産生またはAβ産生(組織にAβ蓄積 )を抑制することにより、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病患者の病態改善または進展を阻害すると考えられる。
【０２２９】
本発明スクリーニング方法により得られるHRD1活性を促進する物質は、細胞のHRD1濃度を増加し、細胞におけるAPP産生の抑制またはAβ蓄積量を低下させると考えられることから、HRD1増量剤として医薬品分野をはじめとする各種の分野で有用である。
【０２３０】
該HRD1増量剤は、特にAPP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤として、例えば(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症
ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病患者の病態改善または進展を阻害する治療・予防のための医薬として有効に利用することができる。
【０２３１】
上記HRD1増量剤、APP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤は、それぞれの作用を示す有効量を適当な製剤学的担体と共に含有する医薬組成物として、上記各疾患に適用することができる。
【０２３２】
該医薬組成物(医薬製剤)において有効成分として利用するHRD1促進物質は、医薬的に許容される塩とすることができる。この塩の種類、その調製法、医薬組成物の調製法、医薬組成物に利用される希釈剤、賦形剤などの医薬担体、医薬組成物の投与単位形態、投与経路、投与方法などは、前記本発明ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物において詳述したそれらと、略同様のものとすることができる。
【０２３３】
医薬製剤中に含有させるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般には、投与量は、1日当り体重1kg当り、約0.01μg-10mg程度、好ましくは約0.1μg-1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1-数回に分けて投与することができる。
【０２３４】
(14)  スクリーニング用キット
本発明は、HRD1のHRD1活性を促進または阻害(低下)する物質をスクリーニングするためのスクリーニング用キットを提供する。
【０２３５】
本発明スクリーニング用キットの一具体例は、本発明ポリペプチド(例えば、配列番号：1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド)または本発明発現物(例えば、配列番号：2で示されるDNA配列のポリヌクレオチドの発現物)と、標識したAPPをコードする遺伝子の発現産物とを必須構成成分として含むことが重要であって、他はこの種スクリーニング用キットと同様とすることができる。例えば、HRD1活性を有するHRD1および標識されたAPPと共に、任意成分として、細胞培養液、反応希釈液、染色剤、緩衝液、固定液、洗浄剤などの各種試薬類を含むキットを挙げることができる。
【０２３６】
本発明キットの具体例としては、次の構成1-4または1-5からなるものを挙げることができる。
構成1.  標的細胞(標的HRD1発現細胞)、即ち、測定対象とする細胞であって、HRD1遺伝子およびflagエピトープで標識されたAPP遺伝子の導入によって形質転換された細胞)を、0.5-1×105細胞／ウエルでダルベッコ修飾イーグルズ培地などを用いて60mmディッシュで5%炭酸ガス下に37℃で培養したもの、
構成2.  細胞溶解液、
構成3.  抗flagエピトープ抗体、抗myc抗体(ウェスタン・ブロット解析用)、
構成4.  免疫沈降用緩衝液(2×SDS, 6%2-メルカプトエタノール(2-Mercaptoethanol), 10%グリセロール(Glycerol), 0.005%ブロモフェノールブルー(Bromophenol blue; BPBなど)、
構成5.  観察のための検出用泳動装置。
【０２３７】
本発明スクリーニング用キットを利用したスクリーニング方法においては、供試化合物(被験物質、薬剤候補化合物)を加えたレーン単位視野当たりのAPP量をカウントし、供試化合物を加えていないコントロールのレーン単位視野当たりのAPP量との有意差検定を行えばよい。また、Aβ産生抑制の場合は、上記以外に、例えばHRD1遺伝子およびAPP遺伝子が導入されて形質転換された細胞を培養後、培養上清を回収し、Aβ1-40またはAβ1-42  ELISAキットを用いて、細胞からのAβの産生量を測定し、このAβ産生量の測定結果を、例えばリアルタイムPCRにより決定されたAPPmRNA量で補正し、供試化合物(被験物質、薬剤候補化合物)を加えた場合のAβ産生量と、供試化合物を加えていないコントロールのAβ産生量との有意差検定を実施すればよい。これらの測定、評価自体は、常法に従って実施することができる。
【発明の効果】
【０２３８】
以上詳述したとおり、本発明は、APP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を有するポリペプチド(ヒトHRD1)を含む医薬組成物を提供する。本発明組成物は、HRD1遺伝子およびその産物が関与する各種の疾患(APP産生またはAβ蓄積(産生)によって生じた神経細胞変性などに関連する疾患)、例えば、(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの処置のために、APP産生抑制剤またはAβ産生抑制剤、神経細胞変性改善剤などとして有用である。
【０２３９】
本発明によって見出されたHRD1(HRD1遺伝子発現物)とAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用との関連の解明は、神経細胞、神経芽細胞などのAPP産生またはAβ蓄積によって発症するとされる神経細胞変性などに生じたAPP産生またはAβ蓄積に起因する各種病理状態、例えば(家族性または孤発性)アルツハイマー病(アルツハイマー型老年性痴呆)、パーキンソン病、ダウン症、ハンチントン病、ポリグルタミン病、虚血性脳障害(脳虚血)、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、HIV関連性神経障害、びまん性レビー小体病、I型糖尿病、II型糖尿病、うつ病、躁うつ病などの解明、把握、診断、予防、治療などに関する有用な情報乃至手段を与える。
【０２４０】
また本発明は、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子(HRD1遺伝子)の発現物もしくは本発明ポリペプチド(本発明遺伝子発現物)の有するAPP産生抑制作用またはAβ産生抑制作用を促進する新薬の開発のための候補物質のスクリーニング技術をも提供する。
【０２４１】
更に本発明は、個体或は組織における本発明ポリペプチドの発現の検出技術、該発現のための遺伝子の変異(欠失や点変異)乃至発現異常の検出技術をも提供する。かかる検出技術は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ダウン症、ポリグルタミン病、糖尿病、うつ病、躁うつ病などの病態の解明、診断に好適に利用できる。
【０２４２】
更に本発明は、HRD1センス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子導入用ベクター、該ベクターを導入した細胞などを提供する。これらは遺伝子治療に有用である。
【０２４３】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２４４】
1. 野生型、変異型HRD1タンパク哺乳細胞発現ベクターの構築
HEK293細胞(ATCC Accession No: CRL-1573)から抽出したmRNAを逆転写してcDNAを得、該cDNAを鋳型として、配列番号:4に示す配列のプライマーと配列番号:5に示す配列のプライマーとを用いてPCRにてHRD1の終止コドンのみを除く全コーディング領域を含む配列を増幅した。
【０２４５】
増幅断片を制限酵素Kpn IとXho Iとを用いて消化させた後、挿入配列のC末端でMyc(c-Myc)およびポリヒスチジン(6×His)エピトープを発現するpcDNA6-Myc/Hisベクター(インビトロジェン社製：Invitrogen)のKpn I/Xho I部位に上記で得られた消化物を挿入して、HRD1を発現する発現ベクターpcDNA6-Myc/His-HRD1wtを得た。
【０２４６】
また、同様のcDNAを鋳型として、配列番号:6に示す配列のプライマーと配列番号:7に示す配列のプライマーとを用いてPCRにてHRD1タンパクC末端に存在するRING-Fingerモチーフを欠損した領域を含む配列を増幅した。
【０２４７】
増幅断片を制限酵素Kpn IとXho Iとを用いて消化させた後、挿入配列のC末端でMyc(c-Myc)およびポリヒスチジン(6×His)エピトープを発現するpcDNA6-Myc/Hisベクター(インビトロジェン社製：Invitrogen)のKpn I/Xho I部位に上記で得られた消化物を挿入して、RING fingerモチーフ欠損型HRD1発現ベクター、pcDNA6-Myc/His-ΔRING-HRD1を得た。
【０２４８】
尚、HEK293細胞は、37℃、5%炭酸ガス中において、10%(v/v)熱不活性化された牛胎児血清、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコ修飾イーグルズ培地(Dulbecco's modified Eagle's medium；以下DMEMと略す)に維持した。
2. アミロイド前駆体タンパク哺乳細胞発現ベクターの構築
pcDNA3.1(インビトロジェン社製：Invitrogen)のXba I/Apa I部位にflag配列を挿入し、挿入配列のC末端でflagエピトープを発現する哺乳細胞発現ベクター(pcDNA3.1-flagベクターと命名)を作製した。
【０２４９】
SH-SY5Y細胞(ATCC Accession No: CRL-2266)から抽出したmRNA を逆転写してcDNAを得、該cDNAを鋳型として、配列番号:8に示す配列のプライマーと配列番号:9に示す配列のプライマーとを用いてPCRにてAPPの終止コドンのみを除く全コーディング領域を含む配列を増幅した。
【０２５０】
増幅断片を制限酵素Nhe IとNot Iとを用いて消化させた後、pcDNA3.1-flagベクターのNhe I/Not I部位に上記で得られた消化物を挿入して、flagエピトープ標識アミロイド前駆体タンパク発現ベクター、pcDNA3.1-APPを得た。
【０２５１】
尚、HEK293細胞は、37℃、5%炭酸ガス中において、10%(v/v)熱不活性化された牛胎児血清、100U/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシンを添加したDMEMに維持した。
3. APP-HRD1の相互作用
直径6cmの培養皿で培養1日後の80%コンフルエントとなったHEK293細胞に、Mycエピトープで標識した野生型HRD1を発現するpcDNA6-Myc/His-HRD1の10μgとflagエピトープで標識したAPPを発現するpcDNA3.1-APPの10μg をリン酸カルシウム法によりトランスフェクトした。
【０２５２】
トランスフェクション操作をする3時間前に、抗生物質を含まないDMEMを用いて培地交換を行い、ついで以下の二つの溶液を調製した。
(1)プラスミドDNA20μgに50μLの2.5M CaCl2を加え、滅菌精製水で全量を490mLとした溶液、
(2)500mLの2×Hebs buffer(42mM HEPES，290mM NaCl，1.4mM NaHPO4，pH7.05)に10μLの70mM Na2HPO4を加えた溶液、
上記(2)の溶液を穏やかに撹拌しながら、該液中に上記(1)の溶液を滴下し、混合溶液を30 分間、室温で静置した。その後、0.5mLの混合物をHEK293細胞と混合して細胞内に遺伝子を導入した。
【０２５３】
なお、トランスフェクション操作の16時間後に、DMEMで培地交換を行った。該細胞を1日培養後、400μLのlysis buffer(20mM Hepes-NaOH(pH 7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，1%glycerol，1%Triton X-100，10μg/mL aprotinin，10μg/mL leupeptin，1μM PMSF)にて溶解し、細胞溶解物を得た。
【０２５４】
回収した細胞溶解液を抗flag抗体(SIGMA社製; M2)を用いてAPPを免疫沈降(immunoprecipitation; IP)後、その沈降物を、2×SDS sample buffer(50 mM Tris-HCl(pH 6.8)，2%SDS，6% 2-メルカプトエタノール，10%グリセロール，0.005%BPB)に再溶解した。
【０２５５】
該溶解物13μLを用いて8%SDS-PAGEを行い、ニトロセルロースメンブレンに転写後、抗myc抗体(Oncogene社製; 9E10)を用いてHRD1タンパク質の有無をウェスタン・ブロッティング(western blotting：WB)法により検討した。
【０２５６】
得られた結果を図1に示す。
【０２５７】
図中、HRD1-mycおよびAPP-flagにおける−印は、左に示すpcDNA6-Myc/His-HRD1 (HRD-1-mycと表示), pcDNA3.1-APP(APP-flagと表示)発現ベクターをトランスフェクションしていないことを示し、＋印はトランスフェクションしたことを示す。縦軸の150, 100および75kDaは、分子量マーカーを用いた分子量(kDa)を示し、左図(IP:flag, WB:myc)は、抗flag抗体によりIPを行い、その沈殿物を用いてWBを行い、抗myc抗体により検出を行った結果を示す図であり、中央図(Input, WB:myc)は、左図と同様の細胞溶解物(Input)を用いてWBを行い、抗myc抗体により検出を行った結果を示す図であり、右図(IP:flag, WB:flag)は、抗flag抗体によりIPを行い、その沈殿物を用いてWBを行い、抗flag抗体により検出を行った結果を示す図である。また、各図の左端に矢印を付して示した位置は、それぞれflag標識APPタンパク(APP-flagと表示)およびmyc標識HRD1タンパク(HRD1-mycと表示)の予想される分子量である。
【０２５８】
図1に示される結果より、次のことがわかる。即ち、図1の左図の左から三番目のレーンに示すように、HRD1-mycの分子量と一致するmyc抗体と反応するタンパクが検出され、HRD1はAPPと共免疫沈降されることが明らかとなった。図1の中央図において、pcDNA6-Myc/His-HRD1をトランスフェクションした細胞の溶解物(+と表示)において、抗myc抗体と反応するHRD1-mycタンパクを確認でき、トランスフェクションを行っていない細胞の溶解物(-と表示)においては、該タンパクの発現は見られないことから、pcDNA6-Myc/His-HRD1発現ベクターからのHRD1-mycタンパクの発現を確認した。また、右図において、同様にpcDNA3.1-APPをトランスフェクションした細胞の溶解物(+と表示)において、抗flag抗体と反応するAPP-flagタンパクを確認でき、トランスフェクションを行っていない細胞の溶解物(+と表示)においては、該タンパクの発現は見られないことから、pcDNA3.1-APP発現ベクターから、APP-flagが発現していることを確認した。
【０２５９】
同様の細胞溶解物を用いて抗Myc抗体(Oncogene社製; 9E10)を用いてHRD1を免疫沈降(IP)後、その沈降物を、2×SDS sample buffer(50mM Tris-HCl(pH 6.8)，2%SDS，6% 2-メルカプトエタノール，10% グリセロールおよび0.005%BPB)に再溶解した。
【０２６０】
該溶解物13μLを用いて7％SDS-PAGEを行い、ニトロセルロースメンブレンに転写後、抗flag抗体(SIGMA社製; M2)を用いてAPPタンパク質の有無をウェスタン・ブロッティング法(WB)により検討した。
【０２６１】
得られた結果を図1と同様にして、図2に示す。
【０２６２】
図中、HRD1-mycおよびAPP-flagにおける-印は、左に示すpcDNA6-Myc/His-HRD1  (HRD1-mycと表示), pcDNA3.1-APP（APP-fragと表示）発現ベクターをトランスフェクションしていないことを示し、+印はトランスフェクションしたことを示す。縦軸の150, 100および75kDaは、分子量マーカーを用いた分子量(kDa)を示し、左図(IP:myc, WB:flag)は、抗myc抗体によりIPを行い、その沈殿物を用いてWBを行い、抗flag抗体により検出を行った図であり、中央図(Input, WB:flag)は、左図と同様の細胞溶解物(Input)を用いてWBを行い、抗flag抗体により検出を行った図であり、右図(IP:myc, WB:myc)は、抗myc抗体によりIPを行い、その沈殿物を用いてWBを行い、抗myc抗体により検出を行った図である。また、各図の左端に矢印を付して示した位置は、それぞれflag標識APPタンパク(APP-flagと表示)およびmyc標識HRD1タンパク(HRD1-mycと表示)の予想される分子量である。
【０２６３】
図2に示される結果より、次のことがわかる。即ち、図2の左図の左から三番目のレーンに示すようにAPP-flagの分子量と一致するflag抗体と反応するタンパクが検出され、APPはHRD1と共免疫沈降されることが再確認された。図2の中央図においてpcDNA3.1-APPをトランスフェクションした細胞の溶解物(+と表示)において、抗flag抗体と反応するAPP-flagタンパクを確認でき、トランスフェクションを行っていない細胞の溶解物(-と表示)においては、該タンパクの発現は見られないことから、pcDNA3.1-APP発現ベクターからのAPP-flagタンパクの発現を確認した。また、右図において、同様にpcDNA6-Myc/His-HRD1をトランスフェクションした細胞の溶解物(+と表示)において、抗myc抗体と反応するHRD1-mycタンパクを確認でき、トランスフェクションを行っていない細胞の溶解物(-と表示)においては、該タンパクの発現は見られないことから、pcDNA6-Myc/His-HRD1発現ベクターから、HRD1-mycが発現していることも確認できた。
【０２６４】
これらの結果より、APP-flagとHRD1-mycとは免疫沈降により共沈殿することが明らかとなり、APPとHRD1が相互作用していることが確認できた。
【実施例２】
【０２６５】
HRD1によるAPP産生抑制効果
直径6cmの培養皿で培養1日後の80%コンフルエントとなったHEK293細胞に、Mycエピトープで標識した野生型HRD1を発現するpcDNA6-Myc/His-HRD1の10μgとflagエピトープで標識したAPPを発現するpcDNA3.1-APPの10μgとをリン酸カルシウム法によりトランスフェクトした。
【０２６６】
トランスフェクション操作をする3時間前に、抗生物質を含まないDMEMを用いて培地交換を行い、ついで以下の二つの溶液を調製した。
(1)プラスミドDNA 20μgに50μLの2.5 M CaCl2を加え、滅菌精製水で全量を490mLとした溶液、
(2) 500mLの2×Hebs buffer(42mM HEPES，290mM NaCl，1.4mM NaHPO4，pH7.05)に10μLの70mM Na2HPO4を加えた溶液、
上記(2)の溶液を穏やかに撹拌しながら、この中に上記(1)の溶液を滴下し、混合溶液を30 分間、室温で静置した。その後、0.5mLの混合物をHEK293細胞と混合して細胞内に遺伝子を導入した。
【０２６７】
なお、トランスフェクション操作の16時間後に、DMEMで培地交換を行った。
【０２６８】
該細胞を1日培養後、最終濃度8μg/mLとなる量のBlasticidin (ブラストサイジン：インビトロジェン社製：Invitrogen)を添加したDMEM(10%(v/v)熱不活性化された牛胎児血清、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン含有)を用いて、遺伝子導入細胞を選抜し、HRD1安定発現株2株を樹立した。樹立した発現株をそれぞれwt-HRD1#3およびwt-HRD1#4と命名した。
【０２６９】
Mycエピトープで標識した変異型HRD1を発現するpcDNA6-Myc/His-ΔRING-HRD1を細胞に導入し、同様の選抜を行い、変異型HRD1安定発現株を樹立し、この株をΔRING-HRD1と命名した。
【０２７０】
flagエピトープで標識したAPPを発現するpcDNA-APP-flagの8μgとリポフェクタミン(Lipofectamine)TM2000 (インビトロジェン社製：Invitrogen)20μLとを混合し、20分間室温で放置後、混合物を2種のwt-HRD1-mycを安定的に発現するHEK293細胞(wt-HRD1#3およびwt-HRD1#4と表示)、HRD1タンパクC末部にあるRING-fingerモチーフを欠損させたΔRING-HRD1-mycを安定的に発現するHEK293細胞(ΔRING-HRD1と表示)および何も発現させていないHEK293細胞(APPと表示) と、それぞれ混合して、細胞内に遺伝子を導入した。
【０２７１】
遺伝子導入13時間および37時間後にそれぞれ回収した細胞溶解物を用いて、抗flag抗体ウェスタン・ブロッティングにより細胞内のAPP量を観察した。陰性対象としてwt-HRD1-myc, ΔRING-HRD1-myc69vおよびAPP-flagの何れも発現させていない細胞の溶解物(Mockと表示)を用いた。また、遺伝子導入後に、プロテアソーム阻害剤であるMG132(ペプチド研究所)を培地に最終濃度10μMで添加し、タンパクのユビキチン依存性分解を抑制したものを同時に作製し、APPタンパクの37時間時点での総量を観察した。
【０２７２】
得られた結果を図3に示す。
【０２７３】
図中、wt-HRD1#3/APPは、HRD1-myc安定発現株(#3株)にpcDNA3.1-APPをトランスフェクションした細胞からのサンプルを示し、wt-HRD1#4/APPは、HRD1-myc安定発現株(#4株)にpcDNA3.1-APPをトランスフェクションした細胞からのサンプルを示し、また、ΔRING-HRD1/APPは、RING-finger欠損型ΔRING-HRD1-myc安定発現株にpcDNA3.1-APPをトランスフェクションした細胞からのサンプルを示す。MG132 (10μM)における+印および-印は、それぞれプロテアソーム阻害剤MG132の培地への添加の有(+)および無(-)を示し、APP-FLAGは、抗flag抗体により検出されたAPP-flagを示し、HRD1-Mycは、抗myc抗体により検出されたHRD1-mycタンパクを示し、またΔRING-HRD1-Mycは抗myc抗体により検出されたΔRING-HRD1-mycタンパクを示す。一過性に発現させた細胞内APP量は、抗flag抗体により検出されるタンパク量(バンドの濃さ)として確認できる(図中、APP-FLAGと表示)。
【０２７４】
図3に示すように、HRD1安定発現細胞株(wt-HRD1#3/APP、wt-HRD1#4/APPと表示)において、一過性に発現させた細胞内APP量は、変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1/APPと表示)、APPを発現させたHRD1非発現細胞(APPと表示)と比し、13時間、37時間後(13、37と表示)において、wt-HRD1#3/APP、wt-HRD1#4/APPでは、明らかにAPP-flag量が減少していることが確認できた。
【０２７５】
また、遺伝子導入17時間後、これらの細胞にプロテアソ−ムタンパク分解の阻害剤MG132 10μMを添加し、20時間(37℃のCO2インキュベーター内)インキュベート後に回収した細胞溶解物を用いて解析を行った結果、変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1/APPと表示)、APPを発現させたHRD1非発現細胞(APPと表示)において、一過性に発現させた細胞内APP量(37, MG132+と表示)は、同一インキュベーション時間のMG132無添加(37, MG132-と表示)と比して、抗flag抗体に反応する100kDaより大きな分子量のタンパク量に大きな差を認めないのに対して、HRD1安定発現細胞株(wt-HRD1#3/APP、wt-HRD1#4/APPと表示)において、一過性に発現させた細胞内APP量(37, MG132+と表示)は、同一インキュベーション時間のMG132無添加(37, MG132-と表示)と比して、抗flag抗体に反応する100kDaより大きな分子量のタンパク量の増大の程度が亢進していることが判り、HRD1タンパクの高発現により、APPタンパクのユビキチン−プロテアソーム分解系による分解が亢進していることが確認できた。HRD1は、APPをユビキチン化し、ユビキチン化APPは、ユビキチン−プロテアソーム分解系により分解されることにより、その細胞内APP量の減少を行っていることが確認できた。尚、抗flag抗体により認識されるAPP-FLAGの分子量が広く分布していることは、APPタンパクが多段階において糖鎖修飾を受けることによる。
【０２７６】
図3の最下段は、該溶解物を用いて抗Myc抗体によりHRD1およびΔRING-HRD1タンパクの発現を確認したものである。
【０２７７】
HRD1安定発現細胞株(wt-HRD1#3/APP、wt-HRD1#4/APPと示す)においては、約75kDaの位置にHRD1-Mycの発現を確認できた。また変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1/APPと示す)においては、約30kDaの位置にRING-finger欠損型RING-HRD1-mycの発現を確認した。
【実施例３】
【０２７８】
HRD1によるAβ産生抑制効果
発現ベクターpcDNA3.1-APPを、HRD1を発現させていないHEK293細胞(293-normalと表示)、wt-HRD1-#3細胞株、wt-HRD1-#4細胞株およびΔRING-HRD1細胞株のそれぞれにトランスフェクションした後、10時間後に各細胞の培養培地をOpti-MEM (Invitrogen社)に置換し、更にそれぞれ3時間および27時間インキュベーション後、培養上清を回収し、上清中のAβ産生量を、Aβ1-40 ELISA kitおよびAβ1-42 ELISA kit(共に免疫生物研究所社製)を用いて測定した。これらのキットは、アルツハイマー病における老人班の主要構成AβペプチドであるAβ1-40およびAβ1-42をそれぞれ測定するキットである。
【０２７９】
また、細胞内におけるAPPの発現量を測定するため、上清回収後の細胞にTRI-reagent (SIGMA)を添加し、細胞を溶解後、総RNAを回収した。回収した2μgの総RNAを反応液 [100 U SuperScript II RNase H- reverse transcriptase (Invitrogen); 0.25μg oligo(dT)12-18 primer (Invitrogen); 10mM DTT; 0.5μM 4dNTPおよび1×first strand buffer (invitrogen)]中で、逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
【０２８０】
合成したcDNAを64倍希釈して鋳型として用いた。APP(F)(配列番号:10)およびAPP(R)(配列番号:11)を用いて、ABI7700TM (Applied Biosystems)を用いたリアルタイムPCRにより各細胞におけるAPP mRNA量を測定し、その値を用いて遺伝子導入効率の補正を行った。
【０２８１】
リアルタイムPCRは、反応液[5μL cDNA, 200nM APP(F), 200nM APP(R), 1×TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1×SYBER Green (TAKARA)]を用い、95℃で10分加熱後、95℃、10秒-60℃、1分の40サイクルにて反応を行い、増幅物を解析した。
【０２８２】
また、各細胞のAPP mRNAの補正は、GAPDH(F)(配列番号:12)およびGAPDH(R)(配列番号:13)を用いて、ABI7700TM (Applied Biosystems)を用いたリアルタイムPCRを実施（同条件）することにより行った。
【０２８３】
ELISAにより、得られた培養上清中のAβ1-40およびAβ1-42ペプチドの濃度値は、リアルタイムPCRにより決定したAPP mRNA量を用いて補正し、それぞれの細胞のAβ1-40またはAβ1-42ペプチド産生量を決定した。実験はそれぞれ同一操作を3回繰り返し行った。
【０２８４】
得られた結果を図4(Aβ1-40ペプチド量、13時間培養後)、図5(Aβ1-40ペプチド量、綾時間培養後)および図6(Aβ1-42ペプチド量、37時間培養後)に示す。
【０２８５】
各図中、縦軸は任意単位(arbitary Unit)および横軸は各細胞を示す。
【０２８６】
図4に示すように、Aβ1-40ペプチド量は、pcDNA3.1-APPを細胞に導入後、13時間において、2種の野生型HRD1安定発現HEK293株(wt-HRD1-#3およびwt-HRD1-#4と表示)において、変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1と表示)に比し、有意に低下することが明らかとなった。
【０２８７】
また図5に示すように、2種の野生型HRD1安定発現HEK293株(wt-HRD1-#3およびwt-HRD1-#4と表示)では、変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1と表示)に比して、pcDNA3.1-APPを細胞に導入後、37時間においても、同様に、Aβ1-40ペプチド量の有意な抑制効果が確認できた。
【０２８８】
さらに図6に示すように、Aβ1-42ペプチドの産生に関しても、pcDNA-APPを細胞に導入後、37時間において、2種の野生型HRD1安定発現HEK293株(wt-HRD1-#3, wt-HRD1-#4と表示)において、変異型HRD1安定発現細胞株(ΔRING-HRD1と表示)に比して、有意にその産生量の低下を示すことが明らかとなった。
【０２８９】
以上の結果は、HRD1蛋白質の機能亢進が、神経細胞において高度に毒性を示すAβの産生を顕著に抑制することを示している。このことから、HRD1の発現亢進、安定化などの機能促進を担う物質は、アルツハイマー病に対して有効な処置効果を奏し得ることを証明するものである。
【０２９０】
また、前述した本発明の各実施例を参考にすれば、HRD1の発現亢進やHRD1のAPP産生抑制作用またはHRD1のAβ産生抑制作用を促進する物質をスクリーニングする方法は、当業者には自明である。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】実施例1に従う試験において、HRD1とAPPとを一過性に共発現させた細胞におけるウェスタン・ブロッティングによる各発現物の免疫沈降の結果を示す図である。
【図２】実施例1に従う試験において、HRD1とAPPとを一過性に共発現させた細胞におけるウェスタン・ブロッティングによる各発現物の免疫沈降の結果を示す図である。
【図３】実施例2に示す試験におけるHRD1のAPP産生抑制効果を示すウェスタン・ブロッティングによる結果を示す図である。
【図４】実施例3に示す試験におけるHRD1のAβ1-40ペプチド産生抑制効果を示すグラフである。
【図５】実施例3に示す試験におけるHRD1のAβ1-40ペプチド産生抑制効果を示すグラフである。
【図６】実施例3に示す試験におけるHRD1のAβ1-42ペプチド産生抑制効果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２９２】
配列番号：5〜14は、それぞれPCRのためのプライマー配列を示す。
【図１】
2005330231.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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