(57)【要約】【課題】  カバーグラスおよび密閉容器を使用しないで簡便かつ確実にサンプル生体高分子とプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションする方法を提供する。【解決手段】  サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを行なうことを特徴とするハイブリダイゼーション方法、およびそれを用いるハイブリダイゼーション用マイクロアレイ、キット。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを行なうことを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
【請求項２】
サンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する溶液を入れた密閉容器中で行なうことを特徴とする請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項３】
その表面に、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域と、その周りのプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域とで構成されるスライドグラス上でハイブリダイゼーションを行なう、請求項１に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項４】
スライドグラスが、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されたマイクロアレイである、請求項３に記載のハイブリダイゼーション方法。
【請求項５】
複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなる、ハイブリダイゼーション用マイクロアレイ。
【請求項６】
複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなるマイクロアレイと、
前記マイクロアレイを収容し得る内部空間を有する密閉容器とを備える、ハイブリダイゼーション用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のサンプル生体高分子を同時にプローブ生体高分子とハイブリダイズさせるためのハイブリダイゼーション方法、およびハイブリダイゼーション用マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体内の分子を同定・分画するために、特に目的ＤＮＡの検出、あるいは遺伝子ＤＮＡの有無検出などのために、既知の配列をもつ核酸やタンパク質をプローブとして蛍光物質で標識したサンプルＤＮＡ（一般的にはサンプル生体高分子）とハイブリダイズさせる方法が多く用いられている。具体的には、スライドグラス上にプローブＤＮＡ（一般的にはプローブ生体高分子）を固定した、ＤＮＡチップ（一般的にはマイクロアレイ）を用いて行なう。
【０００３】
少ないサンプルＤＮＡ溶液で効率的にプローブＤＮＡとハイブリダイズさせるために、大別して次の２種類の方法が用いられる。第一の方法では、まずプローブＤＮＡを固定したスライドグラスの上に、蛍光物質を標識したサンプルＤＮＡを含む溶液を滴下し、次にその上にカバーグラスを被せる。これを保湿液とともにハイブリダイゼーションチャンバと呼ばれる密閉容器中に収納した後、８〜１６時間、６５℃程度に保つことによりハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡがプローブＤＮＡに結合すると、サンプルＤＮＡはプローブＤＮＡと一緒に固定されるので、スライドグラスを洗浄した後に、固定されたサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質を光源からの励起光で励起し、発光する蛍光を検出することで、ハイブリダイズしたサンプルＤＮＡを検出することができる。
【０００４】
第二の方法では、予め剥がすことが可能なプローブＤＮＡを固定したスライドグラスの上に溶液を注入できる容器を構成し、蛍光物質を標識したサンプルＤＮＡを含む溶液を注入し、注入口をふさいで容器を密閉した後、８〜１６時間、６５℃程度に保つことによりハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡがプローブＤＮＡに結合すると、サンプルＤＮＡはプローブＤＮＡと一緒に固定される。容器を剥がしてスライドグラスを洗浄した後に、固定されたサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質を光源からの励起光で励起し、発光する蛍光を検出することでハイブリダイズしたサンプルＤＮＡを検出することができる。
【特許文献１】特開２００２−６５２９９号公報
【特許文献２】特開２００２−２６７６６７号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来技術の第一の方法の場合、スライドグラスの上に滴下したサンプルＤＮＡを含む溶液の上にカバーグラスを載せる場合、カバーグラスとスライドグラスの間に気泡が混入されないように行なうことは経験と技術を要求するものである。気泡が混入した場合、正常にハイブリダイゼーションが行なわれないことがある。
【０００６】
また、スライドグラス上に載せたカバーグラスは、スライドグラスとハイブリダイゼーション溶液を介して密着しており、カバーグラスを動かすとプローブＤＮＡのスポットが傷つき、正常なスポットを検出できないことがある。しかしカバーグラスは極めて薄くて軽く、スライドグラスの上に滴下したサンプルＤＮＡを含む溶液の上の定位置に載せる作業は経験と技術を要求するものである。
【０００７】
また、カバーグラスはスライドグラス上のプローブＤＮＡが固定されている位置に正確に載せなければならないので、操作に支障をきたすほど小さなカバーグラスを使用できない。具体的には１スライドグラス上で２枚が限度である。このことはすなわち、１スライドグラス上では２サンプルしかハイブリダイゼーションできないことを意味する。また、保湿液の組成によってはハイブリダイゼーション溶液の体積が変化し、スライドグラス上の２サンプルがコンタミネーションを起こすことがある。
【０００８】
従来技術の第二の方法の場合、容器を溶液で完全に満たせずに容器内に空気が残存し、正常にハイブリダイゼーションが行なわれないことが多くある。
【０００９】
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、カバーグラスおよび密閉容器を使用しないで簡便かつ確実にサンプル生体高分子とプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションする方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、上記問題点に鑑み、簡便かつ確実に複数のサンプル生体高分子とプローブＤＮＡをハイブリダイゼーションする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを行なうことを特徴とするハイブリダイゼーション方法である。
【００１２】
ここにおいて、ハイブリダイゼーションは、サンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する溶液を収容した密閉容器中で行なうことが好ましい。なお、前記サンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する溶液の液量としては、密閉容器の体積を飽和状態にする水蒸気の液量に１００μＬ以上加えた量、または、サンプル生体高分子を含む溶液の液量の５倍量以上の、いずれか多い方を選択するのが好ましい。
【００１３】
また、本発明のハイブリダイゼーション方法は、その表面に、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域と、その周りのプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域とで構成されるスライドグラス上で行なうことが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明に用いるスライドガラスは、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されたマイクロアレイであることが好ましい。
【００１５】
また本発明は、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなる、ハイブリダイゼーション用マイクロアレイをも提供する。
【００１６】
本発明はさらに、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなるマイクロアレイと、前記マイクロアレイを収容し得る内部空間を有する密閉容器とを備える、ハイブリダイゼーション用キットも提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のハイブリダイゼーション方法によれば、カバーグラスなど、従来ハイブリダイゼーションを効果的に行なうために必要であったスライドグラス上の構成物を使用しないので、極めて簡便かつ確実にハイブリダイゼーションを行なうことができる。また、本発明のハイブリダイゼーション用マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション用キットを用いることで、複数種のサンプル生体高分子について同時に検出を行なう、同時多検体ハイブリダイゼーションを簡便かつ確実に行なうことができる。これにより、多数のサンプルについての処理時間および必要となるマイクロアレイ数および試薬量を、従来技術よりも著しく削減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のハイブリダイゼーション方法は、サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを行なうことを特徴とする。ここで、「スライドグラスのみに接触した状態」とは、従来ハイブリダイゼーションに必要とされていたカバーガラスなどに、サンプル生体高分子を含む溶液が接触しない状態を指す。すなわち、本発明は、従来技術で必要とされていたカバーガラスなどの、サンプル生体高分子に対して効率的にプローブ生体高分子とハイブリダイズさせるための構造物を一切必要とすることなくハイブリダイゼーションでき、これにより、極めて簡便かつ確実にハイブリダイゼーションを行なうことができる。
【００１９】
なお、本明細書において「サンプル生体高分子」は、ハイブリダイゼーションによって同定・分画可能な生体高分子を指し、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質などを包含する。
【００２０】
サンプル生体高分子を含む溶液における溶媒としては、当分野において従来より広く用いられている適宜の溶媒を、サンプル生体高分子の種類に応じて選択することができる。たとえばサンプル生来高分子がＤＮＡである場合には、界面活性剤と塩を含む水溶液が用いられ、中でも試薬の汎用性やハイブリダイゼーション反応の安定性から、界面活性剤としてＳＤＳを、塩を含む水溶液としてはＳＳＣを使用するのが好ましい。たとえば０．５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣが挙げられる。当該溶液における、サンプル生体高分子の濃度は、検出に十分な濃度が含まれているならば特に制限されるものではないが、サンプル生体高分子は貴重であることが多いので、１ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬの範囲内となるように調製されることが好ましい。
【００２１】
サンプル生体高分子は、通常、ハイブリダイゼーション後の検出のため、標識が施される。標識は、蛍光標識、有機色素標識、化学発光標識、放射性標識、抗体標識など、従来公知の適宜の標識が挙げられ、中でも、安全性および検出の簡便性の観点から、蛍光標識が好適である。
【００２２】
また、本明細書において「プローブ生体高分子」とは、サンプル生体高分子にハイブリダイゼーション可能であり、かつ、スライドグラス上に固定可能な生体高分子を指し、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドなどを包含する。
【００２３】
本発明において、プローブ生体高分子のスライドグラス上への固定は、当分野において従来より広く用いられている固定化剤をプローブ生体高分子の種類に応じて、適宜選択することができる。かかる固定化剤としては、ポリ−Ｌ−リジン、アミノシランなどが挙げられる。
【００２４】
本発明のハイブリダイゼーション方法において用いるスライドグラスとしては、ガラス製にものに限定されず、プラスチック製、金属製のものであってもよく、生化学活性のない材料で形成されたものであれば、なおさら好ましい。なお、その表面に後述する親水性領域、疎水性領域を容易に形成することができることから、スライドグラスは、ガラス製のものであるのが好ましい。
【００２５】
本発明のハイブリダイゼーション方法は、具体的には、サンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する溶液（以下、かかる溶液を「保湿液」と呼称する。）を収容した密閉容器中で行なわれる。すなわち、まず、サンプル生体高分子を含む溶液をスライドグラス上に滴下し、このスライドグラスを、サンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する保湿液が収容された密閉容器（ハイブリダイゼーション用チャンバ）内に入れて、ハイブリダイゼーションを行なう。なお、マイクロアレイは、サンプル生体高分子を含む溶液が保湿液に接触しないようにして、密閉容器内に収容する。保湿液の液量としては、密閉容器の体積を飽和状態にする水蒸気の液量に１００μＬ以上加えた量、または、サンプル生体高分子を含む溶液の液量の５倍量以上の、いずれか多い方を選択するのが好ましい。不揮発性溶質による溶媒の蒸気圧降下は溶質のモル濃度に比例するので、本発明でいう「同一の蒸気圧」とは「同一の溶質モル濃度」のことを指す。ここで、「同一の溶質モル濃度」とは、サンプル生体高分子を含む溶液に含まれる溶質のモル濃度と保湿液に含まれる溶質のモル濃度との差が−１０〜＋８％（より好適には−５〜＋５％）であることを指す。
【００２６】
上述したように保湿液としてサンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する保湿液を用いるためには、保湿液として、サンプル生体高分子が含まれることを除いて前記溶液と同組成の溶液を用いればよい。たとえば、サンプル生体高分子を含む溶液は、サンプル生体高分子がＤＮＡである場合には、上述したように０．５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣを含有する溶媒を用いるのが好ましいが、保湿液の組成についても０．５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣを含有するように調製することで、これらの蒸気圧を同一とすることができる。なお、サンプル生体高分子を含む溶液において、サンプル生体高分子の濃度は、当該溶液中の塩濃度と比較して極めて低いため、保湿液の塩濃度の調製においては上記同一の範囲内の差異に含まれ無視することができる程度のものである。
【００２７】
上述のようにサンプル生体高分子を含む溶液と同一の蒸気圧を有する保湿液が収容された密閉容器中でハイブリダイゼーションを行なうことによって、サンプル生体高分子を含む溶液がスライドグラス上で乾燥することなく、あるいは体積が増加してあふれてしまうことなく、ハイブリダイゼーションを完了することができる。なお、本発明のハイブリダイゼーション方法において、保湿液の蒸気圧がサンプル生体高分子を含む溶液の蒸気圧より著しく低いと、ハイブリダイゼーション中の蒸気拡散によりサンプル生体高分子を含む溶液の著しい液量減、もしくは該溶液の乾固が起こり、正常にハイブリダイゼーションが行なえない虞がある。また、保湿液の蒸気圧がサンプル生体高分子を含む溶液の蒸気圧より著しく高いと、サンプル生体高分子を含む溶液の著しい液量増加が起こり、当該溶液があふれてしまって正常にハイブリダイゼーションが行なえない虞がある。
【００２８】
本発明のハイブリダイゼーション方法は、前記スライドグラスが、その表面に、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域と、その周りのプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域とで構成されてなるのが、好ましい。これにより、スライドグラス上のプローブ生体高分子が固定されてなる親水性領域に滴下されたサンプル生体高分子を含む溶液は、疎水性領域へ流出してしまうことなく、親水性領域上に保持される。ここで、「親水性」とは、画像処理式接触角計（接触角計ＣＡ−Ｘ型、協和界面科学株式会社製）を用いて測定された水に対する液滴接触角（平面状の対象物表面に液滴を乗せたときの液滴と対象物表面との接触面の境界線における液滴表面の接線と前記対象物表面との間の角度）が９０度未満であることを指し、「疎水性」とは、前記液滴接触角が９０度以上であることを指す。
【００２９】
スライドグラス上に上記親水性領域および疎水性領域を形成する方法としては、たとえばスライドグラスがガラス製である場合、もともと表面が親水性であるので、所望の領域に親水性領域が形成されるように、疎水性領域を形成する。疎水性領域の形成は、たとえば撥水性フッ素樹脂インクの印刷による方法がある。このような撥水性フッ素樹脂インクの印刷を施したスライドガラスは、市販品として入手可能である（商品名：高撥水性印刷スライドグラス；松浪硝子工業株式会社製）。また疎水性領域を形成する方法は、上記撥水性フッ素樹脂インクを用いた方法に限られるものではなく、たとえば、シリコーン樹脂を塗布し硬化させることによって、疎水性領域を形成するようにしてもよい。
【００３０】
また、本発明に用いるスライドグラスは、親水性領域の表面に生体高分子の固定化剤が形成されており、その周りの疎水性領域には当該固定化剤が形成されていないのが好ましい。これにより、親水性領域にのみプローブ生体高分子を固定化することができる。固定化剤としては、上述したポリ−Ｌ−リジン、アミノシランなどが例示される。
【００３１】
本発明におけるスライドグラスは、上述した親水性領域および疎水性領域を少なくとも１個ずつ有していればよいが、好ましくは、親水性領域が複数配列されてなり、これら親水性領域を囲むようにして疎水性領域が形成されてなるマイクロアレイを用いるのが好ましい。このようなプローブ生体高分子が固定されてなる親水性領域が複数配列されてなるマイクロアレイを用いて本発明のハイブリダイゼーション方法を行なうことで、同一のスライドグラス上で複数種のサンプル生体高分子について、同時にハイブリダイゼーションを行なうことが可能となる。
【００３２】
図１は、本発明のハイブリダイゼーション方法に好適に用いられるマイクロアレイ１の一例を模式的に示す図である。図１に示すマイクロアレイ１は、２４個の親水性領域２と、これら親水性領域２を囲むようにして形成された疎水性領域３をその表面に有する。各親水性領域２には、複数個のプローブ生体高分子が固定されてなる（図１に示す例では、１個の親水性領域２に２４個のプローブ生体高分子がスポットされてなる）。本発明は、このようにスライドグラスの表面に、プローブ生体高分子が固定された複数の親水性領域２と、親水性領域２を囲む疎水性領域３とが選択的に形成されたマイクロアレイを用いて、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とのハイブリダイゼーションを行なうのが好ましい。
【００３３】
図２は、図１に示したマイクロアレイ１の親水性領域２に、サンプル生体高分子を含む溶液５を滴下した際の様子を模式的に示す図である。マイクロアレイ１上の任意の親水性領域上にサンプル生体高分子を含む溶液を滴下すると、該溶液は親水性領域に広がるものの、疎水性領域によって親水性領域を越えてさらに広がることが抑制されるので、互いに隣り合う親水性領域に滴下されたサンプル生体高分子を含む溶液が混合してしまうことはない。したがって、図１に示すようなマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行なうことによって、プローブ生体高分子が固定された親水性領域にサンプル生体高分子を含む溶液を滴下したとしても、当該溶液は親水性領域より流出しないため、親水性領域ごとに異なる種類のサンプル生体高分子を含む溶液を滴下したとしても、これらの溶液のコンタミネーションが起こることがない。結果、複数種（図１に示す例のマイクロアレイを用いる場合には最大２４種）の異なるサンプル生体高分子を含む溶液を、一枚のマイクロアレイ上にて選択的にハイブリダイゼーション反応させることができる。
【００３４】
図３は、本発明のハイブリダイゼーション方法を行なわしめるための密閉容器（ハイブリダイゼーション用チャンバ）の一例を模式的に示す図である。密閉容器は、たとえば、下部ハウジング７と、上部ハウジング８とを基本的に備え、上部ハウジング８と下部ハウジング７とを重ね合わせたときにこれらの間に密閉状態となるような内部空間が形成されるようなものを用いる。図３に示す例の密閉容器では、下部ハウジング７にゴム製のＯリング９が装着され、上部ハウジング８と下部ハウジング７とを重ね合わせたときにこれらによって形成される内部空間が密閉状態となるように構成される。
【００３５】
かかる密閉容器を用いたハイブリダイゼーション方法は、たとえば次のような手順で行なう。まず、上述したマイクロアレイの親水性領域に、サンプル生体高分子を含む溶液５を滴下する。マイクロアレイ１を、下部ハウジング７上に載置する。下部ハウジング７は、上記のように上部ハウジング８と重ね合わせた際に内部空間の一部を形成する凹部を有し、この凹部には上述したサンプル生体高分子を含む溶液５と同一の蒸気圧を有する保湿液６が収容されている。そして、上部ハウジング８を下部ハウジング７に重ね合わせ、マイクロアレイ１を内部空間に密閉する。そうした状態で、密閉容器を８〜１６時間、６５℃程度に保持することによって、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とをハイブリダイズさせる。サンプル生体高分子がプローブ生体高分子に結合すると、サンプル生体高分子はプローブ生体高分子と共にマイクロアレイ上に固定される。ハイブリダイズ後、マイクロアレイを密閉容器より取出し、そのままマイクロアレイを洗浄液（洗浄液の組成の例：０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ溶液および０．５×ＳＳＣ溶液）に浸漬するなどしてマイクロアレイを洗浄した後、マイクロアレイ上に固定されたサンプル生体高分子に標識されている蛍光物質を、たとえばマイクロアレイスキャナなどを用いて、光源からの励起光で励起し、発光する蛍光を検出することで、ハイブリダイズしたサンプル生体高分子を検出することができる。
【００３６】
本発明において、上記密閉容器は、たとえば、アルミダイキャスト製の上部ハウジング８、下部ハウジング７を備えるものが例示できるが、マイクロアレイを密閉し得るような容器であればよく、たとえば、食品保存用のキッチンタッパーのようなものを密閉容器として用いてもよい。
【００３７】
本発明は、また、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなる、ハイブリダイゼーション用マイクロアレイを提供する。上述したマイクロアレイは、新規なものであり、ハイブリダイゼーション用として特に好適に使用することができる。
【００３８】
本発明はさらに、複数のプローブ生体高分子が固定されている親水性領域が複数配列されてなり、この複数配列された親水性領域の周りにプローブ生体高分子が固定されていない疎水性領域が形成されてなるマイクロアレイと、前記マイクロアレイを気密に収容し得る内部空間を有する密閉容器とを備える、ハイブリダイゼーション用キットも提供する。すなわち、上述した本発明のハイブリダイゼーション方法に好適に用いられ得るマイクロアレイと密閉容器との組み合わせを、キットの形態にて提供することができる。かかるキットを用いることで、サンプル生体高分子を含む溶液、保湿液を上述のように好適に組み合わせて、本発明のハイブリダイゼーション方法を行なうことができる。なお、本発明のキットは、容器に予め収容され得る保湿液をさらに有していてもよく、かかる保湿液にサンプル生体高分子を溶解して当該サンプル生体高分子を含む溶液を適宜調製し得るように実現されても、勿論よい。
【００３９】
以下、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
【００４０】
＜実施例１＞
１×１０6個のＨｅＬａ細胞より、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて１０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。調製した１０μｇのＨｅＬａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、Ｌａｂｅｌｓｔａｒ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とＣｙ３−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＣｙ３標識ＨｅＬａ  ｃＤＮＡを調製し、これをサンプル生体高分子とした。サンプル生体高分子を０．５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ溶液を用いて、液量１２０μＬに調製した（サンプル生体高分子を含む溶液の溶質モル濃度：１．６７ｍｏｌ／Ｌ）。
【００４１】
このように調製したサンプル生体高分子を含む溶液を、２４個の親水性領域と、これら親水性領域を囲むようにして形成された疎水性領域をその表面に有し、各親水性領域に４個ずつのプローブ生体高分子が固定化されてなるマイクロアレイの、親水性領域上に滴下した。なお、親水性領域に固定化されたプローブ生体高分子としては、配列表の配列番号１〜４に示す塩基配列をそれぞれ有する、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｇ、ｐＵ１８、Ｌａｍｂｄａ  ｐｈａｇｅ  ＤＮＡの７０ｍｅｒプローブ（ＤＮＡ合成機にて合成）を用いた。
【００４２】
サンプル生体高分子を含む溶液を滴下した後のマイクロアレイを、図３に示した、下部ハウジング７と上部ハウジング８とを備える密閉容器（ハイブリダイゼーション用チャンバ）の下部ハウジング７上に載置した。下部ハウジング７の凹部には、保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：１．６７ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：±０％）を予め収容しておいた。上部ハウジング８を下部ハウジング７に重ね合わせてマイクロアレイ１を内部空間に密閉し、密閉容器を１４時間、６５℃に保持し、サンプル生体高分子とプローブ生体高分子とをハイブリダイズさせた。
【００４３】
ハイブリダイズ後、マイクロアレイを密閉容器より取り出し、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも５．５μＬ減少しており、液量の変化は４．６％であった。その後、マイクロアレイを洗浄液（０．１％ＳＤＳを含有する０．２×ＳＳＣ溶液および０．５×ＳＳＣ溶液）に浸漬してマイクロアレイを洗浄した後、マイクロアレイ上に固定されたサンプル生体高分子に標識されているＣｙ３を、マイクロアレイスキャナを用いて光源からの励起光で励起し発光する蛍光を検出したところ、ハイブリダイズされた生体高分子を検出することができた。このように、サンプル生体高分子を含む溶液がマイクロアレイ上で乾燥してしまうことなく、サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、ハイブリダイゼーションを完了することができた。
【００４４】
＜実施例２＞
保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する４．５×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：１．５０ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：−１０％）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイズ後、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも４．９μＬ増加しており、液量の変化は４．１％であった。このように、サンプル生体高分子を含む溶液の体積が増加して当該溶液が親水性領域からあふれてしまうことなく、サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、ハイブリダイゼーションを完了することができた。
【００４５】
＜実施例３＞
保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する５．４×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：１．８０ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：＋８％）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイズ後、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも１２．０μＬ減少しており、液量の変化は１０．０％であった。このように、サンプル生体高分子を含む溶液がマイクロアレイ上で乾燥してしまうことなく、サンプル生体高分子を含む溶液がプローブ生体高分子が固定されているスライドグラスのみに接触した状態で、ハイブリダイゼーションを完了することができた。
【００４６】
＜比較例１＞
保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する４×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：１．３３ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：−２０％）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイズ後、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも１７．４μＬ増加しており（液量の変化：１４．５％）、サンプル生体高分子を含む溶液の著しい液量増加により、当該溶液があふれてしまって、正常にハイブリダイゼーションが行なえていなかった。
【００４７】
＜比較例２＞
保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する５．５×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：１．８３ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：＋１０％）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイズ後、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも１４．３μＬ減少しており（液量の変化：１１．９％）、ハイブリダイゼーション中の蒸気拡散によりサンプル生体高分子を含む溶液の著しい液量減が起こり、正常にハイブリダイゼーションが行なえていなかった。
【００４８】
＜比較例３＞
保湿液として、０．５％ＳＤＳを含有する６×ＳＳＣを６００μＬ（保湿液の溶質モル濃度：２．００ｍｏｌ／Ｌ、サンプル生体高分子を含む溶液との溶質モル濃度の差異：＋２０％）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイズ後、サンプル生体高分子を含む溶液の液量を測定したところ、滴下した時点よりも２１．９μＬ減少しており（液量の変化：１８．２％）、ハイブリダイゼーション中の蒸気拡散によりサンプル生体高分子を含む溶液の著しい液量減が起こり、正常にハイブリダイゼーションが行なえていなかった。
【００４９】
上述した実施例１〜３、比較例１〜３の結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2005249421.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のハイブリダイゼーション方法に好適に用いられるマイクロアレイ１の一例を模式的に示す図である。
【図２】図１に示したマイクロアレイ１の親水性領域２に、サンプル生体高分子を含む溶液５を滴下した際の様子を模式的に示す図である。
【図３】本発明のハイブリダイゼーション方法を行なわしめるための密閉容器の一例を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
１  マイクロアレイ、２  親水性領域、３  疎水性領域、４  プローブ生体高分子、５  サンプル生体高分子を含む溶液、６  保湿液、７  上部ハウジング、８  下部ハウジング、９  Ｏリング。
【図１】
2005249421.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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