(57)【要約】    【課題】  この発明は、多くの種類のタンパク質について、その活性をより長く保持できる安定化剤及び安定化方法を提供することを目的とする。    【解決手段】  メソ−エリスリトール系縮合物及びそれを含有するタンパク質安定化剤を添加する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソ−エリスリトール系縮合物を含有するタンパク質安定化剤。
【請求項２】
タンパク質の保存、又は酵素反応に際して、メソ−エリスリトール系縮合物を添加する、タンパク質の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、タンパク質の安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、複数のアミノ酸がペプチド結合により連なったポリペプチドである。タンパク質がその特性を発現させるためには、各々のタンパク質固有の三次構造（立体構造）が重要である。しかし、これらのタンパク質の多くは、生体から抽出した状態では極めて不安定で失活し易く、乾燥、高温、凍結、圧力、ｐＨ変化、有機溶剤の添加等の環境的ストレスを加えると、その立体構造が変化し、その特性・活性を不可逆的に消失してしまうことが多い。このような環境変化に対して、タンパク質をいかに安定な状態に保つかが、タンパク質を扱う上で、常に課題となる。
【０００３】
このような問題点の解決策としては、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存したり、特許文献１に示すようにジオール類やグリセリン等の２価又は３価アルコールを活性安定化剤に用いて保存したりする方法が知られている。
【特許文献１】特開昭５５−８４３９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これらの方法は、適用できるタンパク質の種類が限定されることがあり、タンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があった。
【０００５】
そこでこの発明は、多くの種類のタンパク質について、その活性をより長く保持できる安定化剤及び安定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この発明は、メソ−エリスリトール系縮合物をタンパク質安定化剤として用いることによって上記の課題を解決したのである。
【０００７】
メソ−エリスリトール系縮合物を添加すると、多くの種類のタンパク質の活性を、従来の安定化剤よりも長期間に亘って保持することができる。さらに、この効果は酸緩衝溶液による保持効果と相乗させることもできる。
【発明の効果】
【０００８】
メソ−エリスリトール系縮合物を添加することにより、種々のタンパク質の活性を（高温条件下において）より長く維持し、安定させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、この発明を詳細に説明する。
【００１０】
この発明は、メソ−エリスリトール系縮合物を含有するタンパク質安定化剤と、メソ−エリスリトール系縮合物を利用したタンパク質の安定化方法である。
【００１１】
メソ−エリスリトール系縮合物とは、メソ−エリスリトールを含むポリオールを構成モノマーとし、このうちメソ−エリスリトールが５０ｍｏｌ％を占めており、この構成モノマー２〜１６分子を縮合により重合させた縮合物を主成分とするものである。
【００１２】
上記ポリオールは、水酸基を２個以上有する化合物をいい、メソ−エリスリトールの他に、その他のエリスリトール、エチレングリコール、グリセリン、スレイトール、リキシトール、リビトール、キシリトール、ソルビトール等が挙げられる。
【００１３】
なお、原料のメソ−エリスリトールは、合成または発酵後、除菌、脱色、脱塩、樹脂精製、又は／及び再結晶等により処理された高純度品はもとより、精製前の原料もそのまま使用できる。
【００１４】
上記縮合物の主成分の重合度は、２〜１６がよく、２〜１４が好ましく、２〜８がより好ましく、２〜６がさらに好ましい。構成モノマーが１個では、縮合物とならないからであり、一方、構成モノマーを１７個以上とする高分子化は、反応条件を過酷にしなければならず、ゲル状物の副生及び着色が著しいため、容易ではないからである。
【００１５】
この発明に用いるメソ−エリスリトール系縮合物は、次に示す方法で製造することができる。
【００１６】
すなわち、メソ−エリスリトールを５０ｍｏｌ％以上含む上記のポリオールを、触媒存在下、所定の温度及び圧力下で重合させることにより製造できる。上記ポリオールは、反応温度では液状なので、無溶媒で反応させることができる。上記触媒としては塩基性化合物がよく、その中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、酸化カルシウム、水素化ナトリウム等の塩基性を示すアルカリ金属化合物及びアルカリ土類金属化合物がより好ましく、塩基性のナトリウム化合物が更に好ましい。
【００１７】
上記触媒の使用量は、重合原料となる上記メソ−エリスリトールを含むポリオール総重量の０．００５〜１０重量％がよく、反応速度及び経済的観点から０．０５〜３重量％が好ましい。
【００１８】
上記の反応速度は、使用する構成モノマーの種類によって選択される。構成モノマーとして、メソ−エリスリトールと他のポリオールの１種又は２種以上とを組み合わせて使用する場合は、２００〜２６０℃がよい。また、構成モノマーとして、メソ−エリスリトールのみを使用する場合は、２００〜２５０℃が好ましく、２１０〜２４０℃がより好ましい。温度が高すぎると、着色、副生物の生成が著しく好ましくないからであり、一方、温度が低すぎると、重合反応が著しく遅れるからである。
【００１９】
さらに、反応圧力は、使用する構成モノマーの種類によって選択される。構成モノマーとして、メソ−エリスリトールと他のポリオールの１種又は２種以上とを組み合わせて使用する場合は、２〜７６０ｍｍＨｇがよい。また、構成モノマーとして、メソ−エリスリトールのみを使用する場合は、１０〜７６０ｍｍＨｇがよい。また、重合速度を重要視して短時間で反応を終了させたい場合には、１０〜４００ｍｍＨｇがよく、１５〜６０ｍｍＨｇがさらに好ましい。さらに、副生物の生成及びモノマーの気化を抑制し、高収率で縮合物を得たい場合には、４００〜７６０ｍｍＨｇがよく、６００〜７６０ｍｍＨｇが好ましい。
【００２０】
また、上記の反応において、モノマーや反応物の酸化を防止するため、次亜リン酸等のリン化合物やマグネシウム粉末等の酸化防止剤を添加してもよい。
【００２１】
上記の原料モノマーであるメソ−エリスリトールやポリオール、触媒等の仕込み方法としては、反応初期に一括して全てを仕込んでもよく、また、反応開始後に、原料モノマーと触媒の両方、または何れか一方を、分割又は継続的に添加してもよい。これらは操作性や生産性を考慮して選択される。
【００２２】
このようにして得られた縮合物を、通常、活性炭処理による脱色やイオン交換樹脂を通すことによって脱イオンを行い、無色粘調の液体である上記メソ−エリスリトール系縮合物として得られる。また、必要に応じて、高温、高真空にて、未反応ポリオールモノマー及び低分子物質を留去、またはアルコール等の有機溶媒を用いて抽出精製してもよい。
【００２３】
このようにして得られた上記メソ−エリスリトール系縮合物は、直鎖状の重合鎖以外に、環状の構造を有する重合鎖や、枝分かれ構造を有する重合鎖、環状及び枝分かれの両方の構造を有する重合鎖等を包含する。
【００２４】
この発明にかかるタンパク質安定化剤及び、タンパク質安定効果を得るためには、上記のようにして得られるメソ−エリスリトール系縮合物をそのまま用いてもよいし、また、モノマーであるメソ−エリスリトールを添加して見かけの平均重合度を低下させて使用してもよい。
【００２５】
この発明の効果により安定化されるタンパク質の種類は、特に限定されるものではなく、例えば、セルラーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ等のカルボヒドラーゼ、リパーゼ等のエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラーゼ等の酸化還元酵素、グルカノトランスフェラーゼ等の転移酵素、リアーゼ、ペクチンリアーゼ等の脱離酵素、グルコースイソメラーゼ等の異性化酵素、グルタミンシンテース等の合成酵素、プロテアーゼ、リゾチーム、リポキシゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ニトロゲナーゼ等の酵素、ヘモグロビン、ミオグロビン、血清アルブミン、チトクロムＣ等の輸送タンパク質、オボアルブミン、カゼイン、グリアジン等の貯蔵タンパク質、ミオシン、アクチン等の収縮タンパク質、抗体、補体、フィブリノーゲン、トロンビン等の血液中防御性タンパク質、蛇毒、リシン等の毒素、インシュリン、成長ホルモン等のホルモン、糖タンパク質、コラーゲン等の構造タンパク質、乳タンパク、乳清タンパク、卵白アルブミン、その他魚介類や鳥獣肉等由来の動物性タンパク、大豆タンパク、小麦タンパク等の植物性タンパクなどを挙げることができる。
【００２６】
この発明にかかるタンパク質安定化剤とタンパク質安定化方法とは、タンパク質にメソ−エリスリトール系縮合物を添加・配合することにより安定化させる方法であり、特に通常溶液又は懸濁状態では長期保存が難しい上記のタンパク質を溶解又は分散させたタンパク質含有液に適用可能なものである。タンパク質を溶解又は分散させる液は水又は水溶液等であることが望ましく、緩衝液であればより安定性が増して望ましい。なお、基本的には、この発明にかかるタンパク質安定化剤をタンパク質含有液に混合することによりそのタンパク質を安定化する効果が得られるが、使用方法はこれに限定されず、粉末、固体、ペースト状、その他の形態においても使用可能である。
【００２７】
上記タンパク質含有液に含有させる上記のタンパク質の含有量は、０．１〜３０重量％であることが望ましく、０．５〜１０重量％であればより望ましい。高濃度であるほど、安定化される上記タンパク質含有液の活性が高く望ましいが、一方で、高濃度になると沈殿物を生じやすくなり、３０重量％を超える高濃度の上記タンパク質含有液は取り扱い上好ましくない。
【００２８】
上記タンパク質含有液に添加する上記タンパク質安定化剤の望ましい添加量は、上記タンパク質含有液に含有されるタンパク質の含有量によって異なるが、例えば、上記のタンパク質を０．１〜３０重量％含有する上記タンパク質含有液に添加する上記タンパク質安定化剤の量は、０．０１〜８０重量％がよく、１〜５０重量％であれば望ましく、５〜３０重量％であればより望ましい。上記タンパク質安定化剤の濃度が８０重量％を超えても効果を発揮させることは可能であるが、高粘度になるため、操作上好ましくない。
【００２９】
上記のタンパク質を安定化させる際には、上記のメソ−エリスリトール系縮合物とともに、その他の安定化剤、希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤、防腐剤、塩類等を併用していてもよく、上記タンパク質安定化剤はこれらを含有していてもよい。
【００３０】
上記メソ−エリスリトール系縮合物とともに併用可能である、各タンパク質に適した上記安定化剤としては、例えば、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、天然系界面活性剤、糖類及びポリオール類等が挙げられる。
【００３１】
上記糖類及びポリオール類としては、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノース、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、マルチトール、トレハロース等が挙げられる。
【００３２】
上記非イオン界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド等が挙げられる。
【００３３】
上記の陰イオン界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホコハク酸エステル塩等が挙げられる。
【００３４】
上記の天然系界面活性剤としては、例えば、レシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、アミノ酸等が挙げられる。
【００３５】
上記ポリオキシエチレンソルビタン類としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ポリソルベート８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）等が挙げられる。
【００３６】
上記アミノ酸としては、例えば、Ｄ−、Ｌ−及びＤＬ−体のロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、アセチルトリプトファン、グリシンベタイン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、及び、Ｌ−リジンやそれらの塩が挙げられ、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、及び、Ｌ−リジン、並びにそれらの塩がより望ましい。
【００３７】
上記メソ−エリスリトール系縮合物とともに併用可能である、上記防腐剤としては、安息香酸及びその塩、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、塩化ベンザルコニウム、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン酸、１，２−ベンゾチアゾリン酸等が挙げられる。
【００３８】
上記メソ−エリスリトール系縮合物とともに併用可能である、上記含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
【００３９】
上記メソ−エリスリトール系縮合物とともに併用可能である、上記酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アルコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル、あるいは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤等が挙げられる。
【００４０】
上記メソ−エリスリトール系縮合物溶液には、溶液製剤に通常添加される塩類を含んでいてもよく、例えば塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩等の無機塩、クエン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩等の有機塩が挙げられる。
【００４１】
なお、上記の「塩」、「その塩」又は「それらの塩」とあるのは、例えば、列挙した化合物のナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、イミダゾール塩等をいう。
【００４２】
上記メソ−エリスリトール系縮合物又は上記タンパク質安定化剤は、単に保存の際に活性を保持しようとするために添加するだけではなく、上記酵素の反応を起こさせる際に添加して、酵素反応を持続又は強化させるように用いてもよい。これらの効果は、高温によってタンパク質の活性が失われやすい環境において、特に有用に効果を発揮する。
【実施例１】
【００４３】
以下、実施例によりこの発明をより詳細に説明する。まず、メソ−エリスリトール系縮合物であるメソ−エリスリトール脱水縮合物の作製方法について説明する。
【００４４】
［メソ−エリスリトール脱水縮合物の作成］
（縮合物１）
メソ−エリスリトール（日研化学（株）製）１００．０ｇと水酸化ナトリウム（ナカライテスク（株）製：特級）１．０ｇとを、窒素気流下の常圧、２４０℃の環境で７時間反応させた。得られた反応物に水１５０ｍｌを加え、活性炭（武田薬品（株）製：カルボラフィン）で脱色した後、カチオン交換樹脂（三菱化学（株）製：ダイアイオンＰＫ−２１２）、アニオン交換樹脂（三菱化学（株）製：ダイアイオンＰＡ−４０８）の順に通液し、脱イオン処理を行った。得られた水溶液から水を留去して、無色粘性の液体８３．３ｇ（含水率３重量％  平均重合度３）を得た。以下、これを「縮合物１」と表記する。
【００４５】
（縮合物２）
上記の縮合物１の作製において、水酸化ナトリウムを１．０ｇから０．２ｇに減量し、窒素気流下の常圧環境を窒素置換した後に３０ｍｍＨｇまで減圧した環境に変更し、反応時間を７時間から６時間に短縮した以外は縮合物１と同様の手順により、無色粘性の液体８１．８ｇ（含水率２重量％  平均重合度２．５）を得た。以下、これを「縮合物２」と表記する。
【００４６】
［グルコアミラーゼの溶液安定性］
（実施例１）
グルコアミラーゼ（２０１００ｕ／ｇ，ＥＣ３．２．１．３，ＳＩＧＭＡ）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）に溶解して酵素活性２．０ｕ／ｍｌとし、この酵素溶液に上記縮合物１又は２を所定濃度となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を５０℃で所定時間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００４７】
このグルコアミラーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。可溶性デンプン（ナカライテスク（株）製：特級）水溶液２．４ｇ／１００ｍｌを基質とし、試験管に、その基質１ｍｌ、２０ｍＭ酢酸緩衝液（上記に同じ）１ｍｌ、及び、所定時間放置した上記の酵素液０．５ｍｌを混合し、５０℃の恒温浴中で、３０分間反応させた後、沸騰水中に入れて１０分間加熱し、水浴で冷却した。この溶液を、メンブランフィルターで濾過し、その溶液中のグルコース濃度を、グルコースアナライザー（ＴＯＡ  ＧＬＵ−７７）で測定した。またこれとは別に、安定化剤を含まない酵素溶液を調製して、その調製直後におけるグルコースの産生量を１００％と定義して、安定化剤を入れて放置した酵素の残存活性を比較算出した。その結果を表１に示す。
【００４８】
（比較例１）
実施例１の手順において、上記縮合物１又は２を、無添加とし、又は、エチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、デカグリセリンに代えた以外は実施例１と同様に行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
2005034078.tif 000002
【００５０】
［セルラーゼの溶液安定性］
（実施例２）
セルラーゼ（１０００ｕ／ｍｇ，ＥＣ３．２．１．４，和光純薬工業（株）製）を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解して酵素活性３００００ｕ／ｍｌとし、この酵素溶液に縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を５０℃で２週間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００５１】
このセルラーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。試験管に、セルロース（レンゴー（株）製：ビスコパールミニＰＤ−７００２２）０．５ｇ、２０ｍＭ酢酸緩衝液（上記に同じ）３０ｍｌ、及び、所定時間放置した上記の酵素液１ｍｌを混合し、４０℃の恒温浴中で、２４時間反応させた後、グラスフィルター（ＨＡＲＩＯ社製：１Ｇ４）で濾過し、残査の重量を測定して可溶化率を測定した。また、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における可溶化率を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表２に示す。
【００５２】
（比較例２）
実施例２の操作において、上記縮合物２を無添加とし、又はグリセリンに代えた以外は、実施例２と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。それぞれの結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2005034078.tif 000003
【００５４】
［α−アミラーゼの溶液安定性］
（実施例３）
細菌α−アミラーゼ（大和化成（株）製：クライスターゼＥ５）に上記縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を７５℃で６０分間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００５５】
このα−アミラーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。生デンプン（日本コーンスターチ（株）製：平均重合度３７６）の２０重量％溶液を作製し、これを２５％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７として、基質を得た。この基質３００ｍｌと上記の放置後の酵素液２０μｌとを混合し、７０℃の恒温浴中で、１５分間反応させた後、沸騰水中に入れて１０分間加熱し、水浴で冷却した。この溶液中に生成した還元糖の量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法で測定し、活性の変化を調べた。なお、この場合の酵素活性１ユニットは、１分間に１μｍｏｌのグルコース当量の還元糖を遊離させる酵素量と定義した。さらに、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における酵素活性を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表３に示す。
【００５６】
（比較例３）
実施例３の操作において、上記縮合物２を無添加とし、それ以外は実施例３と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2005034078.tif 000004
【００５８】
［リパーゼの溶液安定性］
（実施例４）
リパーゼ（天野製薬（株）製：ＡＫ）を、１００μｇ／ｍｌとなるように、蒸留水に溶解させた。この酵素溶液に上記縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を３７℃で２日間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００５９】
このリパーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。オリーブ油（ナカライテスク（株）製：一級）１．０ｍｌ、上記の放置後の酵素液１．０ｍｌ、及びトリス塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）５ｍｌを混合し、３７℃の恒温浴中で、３０分間反応させた後、アセトン−エタノール（１：１）２０ｍｌを加えて反応を停止させた。この溶液を、フェノールフタレインを指示薬として０．１Ｎ水酸化カリウム溶液で滴定した。なお、この場合の酵素活性１ユニットは、１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させる酵素量と定義した。また、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における酵素活性を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表４に示す。
【００６０】
（比較例４）
実施例４の操作において、上記縮合物２を無添加とした以外は、実施例４と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
2005034078.tif 000005
【００６２】
［プロテアーゼの溶液安定性］
（実施例５）
プロテアーゼ（ナガセケムテックス（株）製：ビオプラーゼＡＬ−１５ＦＧ）１００ｍｇを、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５ｍｌに溶解させた。この酵素溶液に上記縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を５０℃で１日間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００６３】
このプロテアーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。０．６重量％乳性カゼイン（ナカライテスク（株）製：試薬）溶液（４０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．５）５ｍｌに、上記の放置後の酵素液１．０ｍｌを混合し、３０℃の恒温浴中で、１０分間反応させた際、１分間に１μｇのチロシンに相当するフォリン発色をＴＣＡ可溶性成分として遊離する活性を１ｕと定義して、その酵素活性を、波長６６０ｎｍでの吸光度を分光光度計により計測することで測定した。また、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における酵素活性を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表５に示す。
【００６４】
（比較例５）
実施例５の操作において、上記縮合物２を無添加とした以外は、実施例５と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表５に示す。
【００６５】
【表５】
2005034078.tif 000006
【００６６】
［ラッカーゼの溶液安定性］
（実施例６）
放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ  ＲＥＮ−７由来の耐熱性ラッカーゼ（レンゴー（株）製）１０ｍｇに蒸留水１００ｍｌを加えた。この酵素溶液に上記縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を５０℃で１週間放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００６７】
このラッカーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。上記の放置後の酵素液０．１ｍｌと５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ８）１．９ｍｌとを混合し、３０℃に保温し、５２．２ｐｐｍのシリングアルダジン溶液０．１ｍｌを添加して、５３０ｎｍの吸光度を分光光度計により測定した。なお、この場合の酵素活性１ユニットは、１分間に１μｍｏｌのシリングアルダジンを酸化させる酵素量と定義した。また、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における酵素活性を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表６に示す。
【００６８】
（比較例６）
実施例６の操作において、上記縮合物２を無添加とし、それ以外は実施例６と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表６に示す。
【００６９】
【表６】
2005034078.tif 000007
【００７０】
［カタラーゼの溶液安定性］
（実施例７）
カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６，和光純薬工業（株）製）１ｍｇを、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに溶解させた。この酵素溶液に上記縮合物２を２０％（ｗ／ｖ）となるように添加して酵素液を得た。この酵素液を４０℃で１ヶ月放置した後の残存活性を調べ、酵素安定性能を比較した。
【００７１】
このカタラーゼの残存活性の測定は、以下のように行った。３０重量％の過酸化水素（三徳化学工業（株）製）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、ＵＶ240nm ＝０．５００に調製した過酸化水素液３．０ｍｌをセルに入れ、続いてこれに上記の酵素液を５０μｌ添加して、２５℃で反応を開始させ、２４０ｎｍでの１分間あたりの吸光度変化率を測定した。また、上記縮合物２を含まない酵素液を別に調製し、その調製直後における吸光度変化率を１００％と定義して、縮合物２が存在する場合の残存活性を算出した。その結果を表７に示す。
【００７２】
（比較例７）
実施例７の操作において、上記縮合物２を無添加とした以外は、実施例７と同様の操作を行い、酵素の残存活性を調べた。その結果を表７に示す。
【００７３】
【表７】
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