(57)【要約】【課題】微生物を計数しおよび特定するための方法を提供すること。【解決手段】液体サンプルにおける微生物を検出し、計数しおよび特定するための試験が教示される。この試験では、液体サンプルが通過してその上に液体中の生物が堆積するフィルターを用いる。次いで、一種以上の検出試薬を含む試薬を用いる増幅手段で処理する。その後、フィルターを生物が存在か／非存在かを調べる試験に付す。同じサンプルおよびフィルターを同時にまたは連続して検出試験に付して、標的化生物を特定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）微生物の保持に適する膜によって液体サンプルをろ過すること、（ｂ）一種以上の検出試薬を含む増幅工程でその膜を処理すること、および（ｃ）一種以上の微生物の存在／非存在、検出された数およびタイプを検出することを含む、微生物を検出し、計数し、および特定するための方法。
【請求項２】
液体サンプルが５０から１０００ミリリットルであり、膜が、疎水性の区画で隔てられた親水性の領域を有するＰＶＤＦ膜からなる群より選択され、約３０から約９０分間の期間に増幅工程が生じ、および単数（または複数）の選択された検出試薬に適する装置によって検出を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅が核酸に基づいた増幅システムであり、検出試薬が蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、およびデジタル画像化システムによって検出試薬が読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増幅が核酸に基づいた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の形式の増幅システムであり、検出試薬が蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、およびデジタル画像化システムによって検出試薬が読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
増幅が核酸に基づいた増幅システムであって試薬が標的ＤＮＡおよび標的ＲＮＡからなる群より選択されるものであり、検出試薬が蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、およびデジタル画像化システムによって検出試薬が読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
増幅が核酸に基づいた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の形式の増幅システムであって試薬が標的ＤＮＡおよび標的ＲＮＡからなる群より選択されるものであり、検出試薬が蛍光標識化核酸、ペプチド核酸プローブおよびそれらの混合物からなる群より選択され、およびデジタル画像化システムによって検出試薬が読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｘ線フィルム、膜上での比色反応による視覚的検出、蛍光性タグの視覚的検出からなる群より選択される方法によって、またはデジタル画像化によって検出試薬が読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）およびリンクドリニア増幅（ＬＬＡ）からなる群より選択され、およびサーマルサイクラーまたはその他の温度制御装置内で室温程度の２５℃から約９０℃の温度にて、膜のインキュベーションを約３０から約９０分間行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
増幅の前に、膜のインキュベーションを１から約４時間行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
試薬が蛍光性タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試薬が放射性タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
試薬が比色用タグである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
試薬が酵素タグである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を計数し特定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、存在する微生物の特定の成分を増幅し、次いで、増幅された成分の産物の検出に基づくインキュベーション時間を最小限度とするかまたは全く設けずに、単一の工程で膜装置上でそれらを計数するための方法に関する。さらに、この方法によって、存在する微生物を特定してもよい。
【背景技術】
【０００２】
水、ジュースなどの食品または医薬品といった液体において、微生物の存在または非存在を確認する従来の方法とは、液体に存在するあらゆる微生物をその膜の表面上に捕捉するのに適する膜で、その液体をろ過することであった。次いで、寒天またはその他の適切な培地で満たされたペトリ皿などの培地プレート上にこの膜を置き、その後に数日間のインキュベーションを行って、捕捉された生物のコロニーを生じさせた。
【０００３】
次いでこのプレートを取り除き、存在するコロニー数が計数できるようにして視覚的に検査する。その数が十分に多い場合、さらに、どのような生物が存在するのかを正確に求める試験を行ってもよい（単に微生物が存在することそれ自体では、その液体が安全ではないことを意味しないことはよくあるので特異の生物を特定するためのさらなる作業が必要である。）。
【０００４】
生物、所定のインキュベーション時間および増殖速度、ならびにサンプルを作業日の間に取り出すとき、および利用可能な次の作業日に用意するときと同様に実施が必要な追加の特定試験に依存して、この方法には通常、２から１４日間以上を要する可能性がある。
【０００５】
最近になって、微生物性の汚染成分を検出し計数するための新たな試験が、試験に必要な時間を約２４時間に時にはそれ未満に減少させることに役立っている。たとえば、ＡＴＰバイオルミネセンスは、産物として光エネルギーを生む生物化学反応である；培地上で視覚的検出をするために必要な増殖時間の１／３で、微生物を検出し計数するために、この方法が用いられてきた。その他の技術は、種々のサンプルから微生物を膜上で迅速に検出するための蛍光性分子、またはその他の染色液を利用する。コロニーに増殖するよりも短時間にて、膜上で微生物を検出し計数するために、プローブハイブリッド形成技術も用いられてきた。これらのケースにおいては、短時間のうちに膜上で増殖した微生物は核酸プローブとハイブリッド形成し、および膜表面上に存在するあらゆる微細なコロニーを検出するための検出試薬で処理される。
【０００６】
特許文献１ではＡＴＰ試験が改良されている。膜上で微生物を捕捉し、数時間から一日間、培地上で生物のインキュベーションを行う。計数試験をまず最初に実施し（一般的なバイオルミネセンスＡＴＰ検出）、次いで同じサンプル上でＰＮＡプローブを第二の試験で用いて、見出された微生物の特定を行う。
【０００７】
しかしながら、これらの試験のうちのどれもが、複数の日数がかかる従来の視覚的試験と同様の正確さと特異性をもって、リアルタイム（数時間以内）で微生物を検出し、計数し、および特定する試験ではない。本発明は、膜表面上の微生物をおよそ数時間で検出して計数する一回検出の試験を提供し、および本発明によって、同じ手順によって、特定もおそらく同様に可能となる。
【特許文献１】米国出願２００３−０００３５４０−Ａ１号
【発明の開示】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、膜によるろ過、標的の増幅と、蛍光検出または比色検出などによる標的の検出を利用する、液体における微生物を検出し、計数し、および特定するための方法に関する。本方法の鍵となる特質は、存在する生物の迅速な検出、計数および特定を可能とする増幅工程である。増幅は、そのＤＮＡまたはＲＮＡなどの、生物における精選された分子を標的とし、標的分子が存在することを確認するために、いくつもの利用可能な検出技術によって検出が可能なレベルにまで、存在する分子を増加させる。増幅試薬には、単数（または複数）の標的分子の存在を示すための一種以上の検出試薬が含まれ、増幅試薬によって、種のレベルまたは属のレベルで、さらには門や界のレベルで選択された標的間の区別が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一つの目的は、微生物を計数しおよび特定するための方法であって：
ａ）微生物の保持に適する膜によって液体サンプルをろ過すること、
ｂ）一種以上の検出試薬を含む一種以上の試薬を用いる増幅工程で、その膜上の微生物を処理すること、および
ｃ）一種以上の保持された微生物の存在／非存在を求め、検出された数を計数し、および選択された検出試薬が存在することによって、存在する微生物のタイプを特定することを含む方法を提供することである。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、液体または粉末、塩、クリーム、錠剤などの可溶性の固体における微生物を迅速に検出し、計数しおよび特定するための方法に関する。このような液体としては、飲料水またはその他の水、牛乳などの乳製品、ビール、ワイン、ソフトドリンク、果汁、医薬品、輸液、バクテリアルエアーカウントなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１１】
最新の迅速な技術によって、寒天上または膜フィルター上で目に見えるコロニーにまで増殖させる従来の方法よりもはるかに短時間で、微生物の検出と計数が可能となっている。しかしながら、検出されるこれらの生物は特定されないままである。本発明のアイデアは、即座に検出し計数するシステムの必要性に向けられたものであり、本発明のアイデアによって、増幅反応において種もしくは属の分類にて特異的なプローブを用いて、またはより高いレベルの門もしくは網に特異的なプローブを用いて、検出された生物の特定が可能となる。
【００１２】
可視化された産物は膜に結合し、およびマサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入できるＭｉｃｒｏＳｔａｒ（登録商標）システムで用いられているような、疎水性のグリッドが付けられた親水性のドメインからなる膜に結合させる方法に基づくポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅反応の標的となるが、これに限定されるわけではない。これにはいくつかの構成部品がある：疎水性のグリッドで覆われた親水性の膜、核酸からなる標的とされた増幅を実施するための試薬、またはペプチド核酸プライマー、酵素、緩衝剤および界面活性剤、増幅カクテルに組み込まれた蛍光検出プローブからなる、ならびにそこで反応が行われることになるｍｙｌａｒもしくはプラスチック製のスリーブ（化学ルミネセンスまたは発色に基づく検出システムを採用してもよい）。必要な装置は、標的となる増幅反応を適切な温度に維持する温度制御システムである；たとえば、ＰＣＲ反応には温度サイクラーが必要となる。さらに、グリッドが付いた膜上の親水性のウェルを計測し、陽性のシグナルを示す検出装置も必要である。検出装置としては、手持ち式のＵＶライトのような簡単なもの、または、ＭｉｃｒｏＳｔａｒ装置のような複雑なものがあり得る。
【００１３】
次のようにして、生成物を用いることができる。微生物を含むサンプルをグリッドが付いた膜でろ過し、汚染成分の生物を捕捉する。すすぎ洗いを行った後、増幅試薬を膜表面に噴霧し、膜をＭｙｌａｒ（登録商標）フィルムスリーブ内に置いて密封する。次いで、膜および試薬と共に密封されたスリーブを装置内に置き、増幅反応の環境を制御する。たとえば、ＰＣＲ反応のためには、装置は温度サイクラーからなる。終了後、サンプルを検出装置内に置く。装置では、蛍光検出用プローブ、または同様の試薬によって生じる陽性のシグナルを含むこれらのウェルが検出される。陽性のシグナルは、標的となった汚染成分の微生物が存在することと一致する。細菌、酵母およびカビ、ウイルスならびに原生動物を含む、種、属またはグループのレベルで微生物を特定することができる試験である。たとえば、細菌のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの核酸、すべての真正なシュードモナス菌の核酸、もしくはより広く標的化してすべてのグラム陰性の細菌の核酸、またはすべての細菌の核酸を、この試験は標的とすることができる。これによって、試験サンプルにおける異なるタイプの生物の指標を得ることが可能であり、および使用者が目的とする、特定のあらゆる微生物を特定することができる。
【００１４】
図１は、本発明に従う第一の好ましい方法を示す。この方法において、最初の工程１として、診断される産物から液体のサンプルを得る。たとえば、上水道などの周囲の環境からのサンプリングにおいて、川、井戸または貯水池からの水のサンプルを得る。食品または医薬品については、ストックからサンプルを得る（通常は、たとえそれが必要でないといっても完成品のストックである）。液体の場合は、単純にそのまま用いればよく、または、必要に応じて、粘度を調整するために脱イオン水で希釈してもよい。固体の場合、適切な液体、通常は水またはアルコールで溶解させるかまたは分散させる。
【００１５】
次いで、サンプルを第二の工程２において膜フィルターでろ過し、その後に工程３において、選択された一種以上の検出試薬を含む増幅試薬でフィルターを処理する。次いでＰＣＲ増幅用のサーマルサイクラーなどの増幅装置内に、工程４において機械的なもしくは電気的な装置または目視のいずれかで検出し計数できるレベルにまでサンプルが十分に増幅できる時間、フィルターを置く。
【００１６】
図２は、最初にサンプル１０を得て、図１の実施態様のように、フィルター表面１２上に微生物が保持できるようにサンプルをろ過するという第二の方法を示す。図１の実施態様とは異なり、保持された個々の微生物から微細なコロニーの増殖が可能となり、その結果として増幅に利用できる生物の数が増加するように、本実施態様では増幅工程１６の前にインキュベーション工程１４を加える。増幅工程の次に、工程１８において、生物を計数および／または特定する。
【００１７】
フィルターを保持するための好ましい装置は、５０ｍｍの直径と１００ｍＬの保持能を有するＭＩＬＬＩＦＬＥＸ（商標）ろ過漏斗であり、マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。追加された親水性の膜上から底部まで形成された疎水性のグリッドを有するＳｔｅｒｉｔｅｓｔ（商標）またはＳｔｅｒｉｆｉｌ（登録商標）ろ過ユニットなどの、マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるその他の装置を用いてもよく、このものはすなわちガラス製またはステンレス製のフィルターホルダーあるいは漏斗などの膜ホルダーを用いてもよい。このような装置は周知であり、マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびペンシルベニア州ピッツバーグのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．を含む種々のメーカーから入手することができる。
【００１８】
好ましい膜はＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）フィルターであり、マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。このフィルターは、名目上の孔径が０．４５のＰＶＤＦフィルターであり、フィルターの最底部にまで達する疎水性の区画で隔てられた、一連の親水性の部分を有する。本発明において有用となり得るその他のフィルターも親水性であろうし、およびいくつかのタイプの疎水性の区画を含む。
【００１９】
上記の図２の実施態様に関して検討してきたように、ろ過されたサンプルをインキュベーション工程１４で処理してもよい。種々の寒天培地または液体培地などの培地と接触したフィルターを置くことによって達成することが好ましい。インキュベーションは短時間、通常約１から約８時間、好ましくは約１から約４時間である。とりわけ生物における標的の増幅が難しい場合に、インキュベーションによって、検出をより速くより簡単にする増幅のために、膜上に捕捉された単一の微生物をより多い数の微生物に分割することが可能となる。
【００２０】
フィルターを増幅工程で短時間、通常は１から５時間処理する。時間の長さは、試験によって必要な正確性、選択された増幅技術についての増幅速度、選択された単数（または複数）の検出試薬、試薬を検出するための方法（機械的または肉眼）、検出される生物のタイプ、望まれる試験の速度対試験結果の正確性およびその他のこのような因子によって決まる。
【００２１】
適切な増幅方法としては、汚染細胞中に含まれるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が増幅試薬によって増幅されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの核酸に基づいたシステムが挙げられる。ＰＣＲは通常、増幅される生物を含む基質（この場合はフィルター）を置き、およびサーマルサイクラー内で約３０から９０分間の期間、温度を上昇させるサイクルの間に増幅試薬で処理することによって実施される。ＰＣＲ増幅工程を実施するための市販されているキットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．またはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手できる。サーマルサイクラーはこれらと同じ会社から入手できる。
【００２２】
可能性のあるその他の増幅技術としては、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘから入手できる核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎから入手できるストランド置換増幅（ＳＤＡ）、またはＢｉｏｒａｄから入手できるリンクドリニア増幅（ＬＬＡ）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＥＰ  １４０７０５０Ａ２も参照すること。
【００２３】
本明細書において、とりわけインキュベーション工程を採用する場合、増幅工程を伴うこのアッセイは、単一の細胞上、または膜上で捕捉された単一の細胞から増殖した微生物の微細なコロニー上のいずれかで行われること、すなわち、個々の生物を直接検出するよりも、むしろこれらの同じ単一の生物から増幅される標的分子を検出することによって試験サンプルにおける単一の生物の数を計数することを理解すべきである。
【００２４】
増幅工程において、フィルターに適切な時間の経過後、フィルターを取り除き、および計数工程４で処理する。
【００２５】
好ましい計数試験は、増幅された標的を蛍光によって検出することである。次いで、蛍光性タグ、放射性タグ、比色用タグなどの増幅試薬に組み込まれた検出試薬を介して、標的分子を検出する。次いで、試薬を視覚的に、またはイメージプロセッサーを備えたＣＣＤカメラなどの画像化装置を介してデジタル式にて読み取る。このようなシステムの一つは、ＭｉｃｒｏＳｔａｒ（商標）システムとして販売されており、マサチューセッツ州ビルリカのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手することができる。どのような手段を用いても、微生物のコロニーの数と位置を検出することができる。
【００２６】
計数試験の間に、標的生物のための特定試験でサンプルを処理することもできる。単一の種のみかまたは属の全体が特異的にハイブリッド形成するように設計してもよい。検出試薬は、酵素、ハプテン、フルオロフォアまたは放射性同位体などの、サンプル中でそれらの存在を示すタグを含む。このような試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓを含む種々のメーカーから入手することができ、およびこのような試薬は、分子ビーコン、二重標識化蛍光プローブ、または蛍光プローブを描く蛍光標識化プローブから構成されてもよいが、化学ルミネセンス、比色または放射線検出システムも同様に用いてもよい。
【００２７】
一種以上のタイプの生物を検出するために、一種以上のこのような試薬を選択してもよい。大腸菌またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓなどの個々の生物について、いくつかの試薬が存在する一方、その他の試薬はより普遍的で、単に細菌の属が存在するかどうか、または捕捉された生物が単に細菌か、酵母かまたはカビかどうかを検出する。選択する試薬に依存して、Ｘ線フィルム、蛍光検出もしくは比色検出、または生物のＤＮＡまたはＲＮＡなどの標的分子と共に増幅される試薬のタグが存在するかどうかを検出するその他のそのような装置を用いることができ、それによって、存在するそれぞれの標的生物の数とタイプを特定する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施態様のブロック図を示す。
【図２】図２は、本発明の第二の好ましい実施態様のブロック図を示す。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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