(57)【要約】【課題】  MJD（Machado-Joseph disease）等のポリグルタミン病における神経細胞死を抑制することができる治療薬を提供すること。【解決手段】  下記（１）又は（２）のアミノ酸配列からなるポリペプチドの治療薬である。（１）Val-Pro-X-Leu-Y（２）Pro-X-Leu-Y-Y（ただし、Xは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Pro、Phe、Trp、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cysから選ばれるいずれか１、Yは、Lys、Arg、His、Asp、Gluから選ばれるいずれか１である）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７５で表される下記のアミノ酸配列
Val-Pro-X-Leu-Y
（配列中、Xは、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、プロリン（Pro）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）、システイン（Cys）から選ばれるいずれか１、Yは、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）から選ばれるいずれか１）
からなるポリグルタミン病治療薬。
【請求項２】
配列番号７６〜４５０で表される下記のアミノ酸配列
Pro-X-Leu-Y-Y
（配列中、Xは、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、プロリン（Pro）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）、システイン（Cys）から選ばれるいずれか１、Yは、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）から選ばれるいずれか１）
からなるポリグルタミン病治療薬。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含有するポリグルタミン病治療薬。
（ａ）配列番号４５１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号４５１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつBaxを抑制するタンパク質。
【請求項４】
請求項３（ａ）記載のタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号４５２で表されるＤＮＡを含有するポリグルタミン病治療薬。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含有するポリグルタミン病治療薬。
（ａ）配列番号４５３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号４５３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつBaxを抑制するタンパク質。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を含有するポリグルタミン病治療薬。
（ａ）配列番号４５４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号４５４で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつBaxを抑制するタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の治療薬が、ポリグルタミン病の1つであるMJD（ Machado-Joseph病）を対象とすることを特徴とするポリグルタミン病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチドに関する。さらに詳しくは、MJD（Machado-Joseph disease）等の、異常伸長したポリグルタミンにより神経細胞死が引き起こされるポリグルタミン病の治療薬として有用な新規ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
MJD（Machado-Joseph disease）は遺伝性脊髄小脳変性症の中の１つで、日本でもっとも頻度の多い病型である。脊髄小脳変性症は神経変性疾患の中でアルツハイマー病、パーキンソン病に次いで頻度の多く、治療法の全くない難病である。MJDは主に成人期に歩行障害、構音障害で発症して、慢性に進行し、発症後10-15年で寝たきりになる。神経症状の基本は小脳性の運動失調で、主な責任病巣は小脳、脳幹、大脳基底核であり、これらは徐々に萎縮する。
【０００３】
原因はMJD1遺伝子上の３塩基配列CAGの繰り返し配列（CAGリピート）の異常伸長であることは判明しており（非特許文献１）、正常ではCAGリピート数が13〜36であるのに対して患者で62〜82と増加している。CAGはアミノ酸のグルタミンをコードしており翻訳された異常伸長したポリグルタミンが神経細胞死を引き起こすと考えられている(非特許文献２)。そして、このような異常伸長したポリグルタミンが原因で起こる遺伝性の疾患をポリグルタミン病（CAGリピート病）と称している。
【０００４】
MJDなどの神経変性疾患では中枢神経の神経細胞死が起こるが、遺伝子異常が原因で起こる場合、これらはプログラムされた細胞死と考えられている。その細胞死の機序としてアポトーシスか否かが議論になっている。アポトーシスは形態的に細胞の核の断片化を特徴とした、エネルギーを使った能動的な自殺細胞死と考えられる。アポトーシスには主に２つの経路がありFasなどの死受容体を介した早い細胞死の経路とミトコンドリアを介した遅い細胞死の経路がある。複数のカスパーゼ（caspase）がいずれの経路においてもその情報伝達に中核的な役割を果しており、アポトーシスはカスパーゼ依存性細胞死とほぼ同義に用いられている。
【０００５】
神経変性疾患の神経細胞死はその進行が遅いことなどよりミトコンドリア経路によるアポトーシスが疑われている。ミトコンドリアに細胞死のシグナルが入力されるとミトコンドリアからチトクロームCが細胞質に遊離してカスパーゼ９、カスパーゼ３を順に活性化して核が断片化して細胞死に至る。ミトコンドリアからチトクロームCを遊離させる代表的なイニシエーター分子としてBaxが知られている。放射線、酸化ストレス、抗癌剤などの刺激が入るとBaxはその立体構造を変えて細胞質から核に移動する。この移動によってミトコンドリアからチトクロームCが遊離される。最近、松山らは通常状態でBaxに接着しているKU70という分子を発見した（非特許文献３）。KU70が接着しているとBaxは不活性化され細胞質に留まっているが、放射線などの細胞死刺激が入るとBaxからKU70が離れ、Baxが細胞質からミトコンドリアに移動する。すなわちKU70はBaxの活性化を抑制する分子であることが判明した。さらにKU70の分子構造の中でBaxに直接接着する５つのアミノ酸を同定した。この５つのアミノ酸からなるペプチドはそれだけでBaxの活性化を抑制することが可能で、Bax inhibiting peptide（BIP）と名付けられた（非特許文献４）。すなわちBIPはBaxの阻害剤となることが判明したのである。
【０００６】
しかしながら、本発明の対象疾患であるMJDの神経細胞死がアポトーシスかどうかは分かっておらず、したがって、MJDの神経細胞死におけるBaxの関与を明らかにすると共にMJDにおけるBIPの治療薬としての可能性について検討する必要があった。
【０００７】
【非特許文献１】Kawaguchi, Y. et al. CAG expansions in a novel gene for Machado-Joseph disease at chromosome 14q32.1. Nature Genet. 8, 221-228 (1994).
【非特許文献２】Ikeda, H. et. al. Expanded polygutamine in the Machado-Joseph disease   protein induces cell death in vitro and in vivo. Nature Genet. 13, 196-202 (1996).
【非特許文献３】Sawada, M. et al. Ku70 suppresses the apoptotic translocation of Bax to mitochondria. Nature Cell Biol. 5, 320-329 (2003).
【非特許文献４】Sawada, M. et al. Cytoprotective membrane-permeable peptides designed from the Bax-binding domain of Ku70. Nature Cell Biol. 5, 352-357(2003).
【非特許文献５】Hirabayashi, M. et. al. VCP/p97 in abnormal protein aggregates, cytoplasmic     vacuoles, and cell death, phenotypes relevant to neurodegeneration. Cell Death Differ. 8, 977-984 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、上記従来の状況に鑑み、培養細胞における変異MJDタンパク（Q79）発現により起こされる細胞死に対するBIPの効果を正常MJDタンパク（Q22）と比較することで、MJDの神経細胞死におけるBaxの関与を明らかにし、その知見に基づいてMJD等のポリグルタミン病における神経細胞死を抑制し得るBIPの治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は、請求項１、２として、配列番号１〜７５で表される下記（１）のアミノ酸配列、又は配列番号７６〜４５０で表される下記（２）のアミノ酸配列からなるポリグルタミン病治療薬を提供するものである。
（１）Val-Pro-X-Leu-Y
（２）Pro-X-Leu-Y-Y
【００１０】
なお、上記アミノ酸配列中、Xは非極性側鎖を持つアミノ酸(amino acids with non-polar side chains)あるいは電荷を持たない極性側鎖を持つアミノ酸(amino acids with uncharged polar residue)、Yは電荷を有する極性側鎖を持つアミノ酸（amino acids with charged polar residue)である。
具体的には、非極性側鎖を持つアミノ酸とはグリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、プロリン（Pro）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）を意味し、電荷を持たない極性側鎖を持つアミノ酸とはセリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）、システイン（Cys）を意味する。また、電荷を有する極性側鎖を持つアミノ酸とはリジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）を意味する。
【００１１】
また本発明は、請求項３〜６として、配列番号４５１、配列番号４５３、配列番号４５４で表されるタンパク質、あるいはこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含有するポリグルタミン病治療薬を提供するものである。配列番号４５２は、配列番号４５１のタンパク質をコードするDNAである。
ここで、配列番号４５１に係るタンパク質はBaxを不活性化するKu70であり、６０９個のアミノ酸から構成される。また、配列番号４５３、配列番号４５４に係るタンパク質は、それぞれKu70におけるカルボキシル末端の３２３〜６０９アミノ酸の断片、４９６〜６０９アミノ酸の断片である。これらのタンパク質を、目的細胞または目的組織において発現させることにより、Baxを抑制することが可能となる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の治療薬によれば、MJDの細胞死をほぼ完全に抑えることができる。また、後述するように、MJDが引き起こす細胞死は、caspase依存性の経路と非依存性の経路とがあるが、いずれにも本発明の治療薬が有効であることが明らかとなった。
さらに、請求項１、２によれば、本発明に係る治療薬は5アミノ酸からなるペプチドであるため、容易に細胞膜を通過して、神経細胞に到達することができる。したがって、MJD等のポリグルタミン病における有望な治療薬として期待される。
【００１３】
なお本発明は、BIPがMJDの細胞死に極めて有効であることを発見した点、カスパーゼ非依存性細胞死は他に報告があるが、カスパーゼ非依存性細胞死の阻害剤はじめて発見した点で新規性を有しており、産業上の利用性は極めて大である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリグルタミン病治療薬は、上記に示した通り、５アミノ酸からなる直鎖状のポリペプチド（BIP）、又はこれを含むタンパク質（Ku70もしくはその断片）である。BIPのアミノ酸数は、４つであると神経細胞死の抑制効果が得られず、また６つであると細胞中に導入することが困難となるため、発明の効果を奏するための特異な数である。
【００１５】
最初に開発したBIPは、ヒトのKu70のアミノ酸配列を元にしている。BIPは、Ku70におけるBax結合部位である６アミノ酸の配列（VPMLKE）の内、その前後の５アミノ酸（VPMLKあるいはPMLKE）から構成されている。また、マウス、ラットのKu70における６アミノ酸からなるBax結合部位は、それぞれVPTLDEとVPALRDである。そこで、VPTLKEおよびVPALREを元にして、５アミノ酸よりなるVPTLKおよびVPALRのペプチドを作成し、ヒト培養細胞（HeLa 細胞）における細胞死抑制効果を確認したところ、ヒト型VPMLKとほぼ同様の効果が得られた。これらのことは、VPMLKEからなるBax結合部位は、その３、５、６番目に可変性があることを示している。すなわち、３番目のアミノ酸は、少なくともM、T、Aのどれでも構わないということになる。M、T、Aに共通する性質は、酸性あるいは塩基性の強い電荷を持たないアミノ酸であると言う点であり、これらは、非極性側鎖を持つアミノ酸（amino acids with non-polar residue）あるいは電荷を持たない極性側鎖を持つアミノ酸（amino acids with uncharged polar residue）に分類される。これらのアミノ酸には、グリシン（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、メチオニン（Met）、プロリン（Pro）、フェニルアラニン（Phe）、トリプトファン（Trp）、およびセリン（Ser）、トレオニン（Thr）、アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、チロシン（Tyr）、システイン（Cys）が含まれる。また、５番目、６番目のアミノ酸については、K、R、E、Dのどれでも構わないと考えられる。これら４アミノ酸は、全て、電荷を有する極性側鎖を持つアミノ酸（amino acids with charged residue）に分類されており、このグループにはリジン（Lys）、アルギニン（Arg）、ヒスチジン（His）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）が含まれる。
これらの可変アミノ酸を考慮に入れることにより、VPMLKおよびPMLKEを最初期BIPとして、請求項１、２に記載のBIPのアミノ酸配列を見出した。
【００１６】
上記５アミノ酸のペプチドは、公知のペプチドの合成法により適宜製造することができる。具体的には、固相合成法、液相合成法等を挙げることができる。すなわち、本発明に係るペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくは対応するアミノ酸を縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
例えば、固相合成法により合成する場合には、架橋ポリスチレン等の不溶性支持体上に、合成するペプチドのC末端のアミノ酸を固定し、それを起点として、市販の合成装置を用いることによりN-α-t-ブトキシカルボニル化アミノ酸（Boc-アミノ酸）又はN-α-9-フルオレニルメトキシカルボニル化アミノ酸（Fmoc-アミノ酸）に対し適宜に保護基を除去して順にペプチド鎖を伸長させることによって得ることができる。あるいは、分子生物学的手法により、遺伝子鋳型情報をもとに構築したプラスミドを組み込み適当な宿主中で発現させて得ること等もできるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００１７】
そして、上記BIPからなる治療薬の投与経路は、主に、静脈内投与などの非経口投与により行なわれる。注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物等の、薬理学的に許容され得る担体を適宜用いて薬剤を調製することができる。
【００１８】
なお、生体（in vivo）への投与法（drug delivery）については、BIPからなる治療薬が透過性であることから、非分裂細胞である神経細胞へも導入可能と考えられる。中枢神経への投与法の問題は血液脳関門の通過である。BIPは疎水性で分子量も小さいのでそれ自体で血液脳関門を通過できる可能性はある。もしその通過性に問題があるときは、HIVのTATアミノ酸配列を付加することにより血液脳関門を通過する方法等を適宜採用することができる。
【００１９】
また、上記BIP以外にも、Ku70もしくはその断片自体をポリグルタミン病治療薬として用いることもできる。このようなKu70タンパク質の作成、精製方法としては、例えば、Ku70遺伝子とカラム親和性タンパク質遺伝子を融合させ、培養細胞株などに安定的に発現させて、親和性カラムにて精製することが容易であり、この場合、Ku70の大量生産が可能である。
【００２０】
Ku70の遺伝子を治療薬に用いる場合は、投与後、目的細胞においてKu70が発現されるように、当該遺伝子を発現ベクターに組み込むとよい。発現したKu70タンパク質が神経細胞に導入できるようにTAT配列を負荷しても良い。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、目的細胞中で発現可能なベクターであって人体に安全なものであればよい。さらに、こうしてKU70遺伝子が組み込まれたベクターを、適当な外被タンパク質やリポソーム、ウィルス粒子などに内包させてもよい。これにより、上記と同様、目的細胞または目的組織に特異的にKU70遺伝子を送り込み、KU70を発現させることが可能である。
【実施例】
【００２１】
次に、実験例を示して本発明の効果を証明する。
（実験例１）
まず、患者剖検脳からクローニングしたMJD cDNAからCAGリピート部分を含むカルボキシル末端372塩基（79CAGリピートを含む）と240塩基（22CAGリピートを含む）をサブクローニングしてそのアミノ末端にマーカー遺伝子としてHA遺伝子を融合させ、CMVプロモーター下にプラスミド発現ベクター(pQ79、pQ22)を構築した（非特許文献２）。
次に、神経系培養細胞であるNeuro2a（24 well）にBIP（VPMLK、Val-Pro-Met-Leu-Lys）またはそのコントロールペプチドであるIPMlKを2時間作用させた後に、0.5 ug のpQ79、pQ22をリポフェクション法（非特許文献２）を用いて導入した。そして、24時間、48時間後にトリパンブルー法と培養上清中のLDH濃度を測定することで、細胞死を評価した。その結果（図１）、正常のQ22を発現した場合細胞死は起こらないが、変異タンパクであるQ79を発現した細胞は著明な細胞死を示し、200uMのBIPはその細胞死のほとんどを防ぐことが判明した。
【００２２】
（実験例２）
Q79のBaxの活性化に対する影響を検討するために、培養細胞(human epithelial kidney cell line 293T cell)から非特許文献３の方法に従い細胞質と粗ミトコンドリア分画を分離してウエスタンブロッティングを行った。通常の状態（control）ではBaxは細胞質に存在するが、Q79が発現するとそのほとんどが粗ミトコンドリア分画に移動する（図２左）。これに200uMのBIPを加えるとQ79によるBaxの移動が完全に抑制された（図２右）。これは、Q79がBaxを活性化することと、そのBaxの活性化をBIPが防ぐことを分子レベルで示している。なお、図２中、F1alphaはミトコンドリアのマーカータンパク質である。
【００２３】
（実験例３）
さらに、Q79による細胞死におけるBaxの関与の程度を検索するために、Baxのプロモーターに変異があってBaxを発現できずBaxが欠損した培養細胞であるDU145を用いて細胞死の実験を行った。DU145 に細胞死を起こさない程度の本来の内因性に相当する少量のBaxを発現させた場合、Q79による細胞死は起こり、この細胞死はBIPにより減少するが、Baxが欠損したままではQ79をいくら発現させても（24 wellでpQ79 2ugまで導入）細胞死は起こらなかった（図３）。このことは、Q79による細胞死の機序にはBaxの活性化が必要不可欠であることを示している。
【００２４】
（実験例４）
Q79による細胞死におけるカスパーゼの関与を明らかにするために、総てのカスパーゼの活性化を阻害するペプチドである200uMのzvadの作用をアポトーシスの評価法である核の断片化を画像化する細胞のヘキスト染色とカスパーゼ３活性の評価を行った。200uMのBIPもzvadのいずれもがQ79の発現によって誘導される核の断片化とカスパーゼ３活性を抑制した。しかし、細胞膜の損傷によるトリパンブルー法では200uMのBIPは細胞死を防いだが、200uMのzvadはトリパンブルー法による細胞死を防げなかった（図４）。なお、図４中、MockはpcDNA３プラスミドであり、controlペプチドはIPMIKである。
【００２５】
（実験例５）
ミトコンドリアからのチトクロームC遊離を防ぐ分子であるbcl-xlの発現でも同様にトリパンブルー法による細胞死を防げなかった（図５）。すなわち、図５左の黒棒データはこの実験系でbcl-xlが確かにミトコンドリアでBaxによる細胞死を防いでいることを示しているが、bcl-xl はQ79の発現による細胞死を抑制できないことがわかる（図５右）。
【００２６】
上記結果より、Q79による細胞死にはカスパーゼ３の活性化と核の断片化が生じ、これらの変化はカスパーゼ阻害剤であるzvadで抑制されることから、Q79の発現によりカスパーゼ依存性に核の断片化を示すアポトーシスが誘導されることは確かである。しかし、Q79発現により核の形態変化に加えて細胞質に空胞変性することが知られており（非特許文献５）、zvadやbcl-xlでは最終的に細胞死自体を防げないことから、Q79による細胞死にはミトコンドリア経由のカスパーゼ依存性に核の断片化を示すアポトーシスに加えて、カスパーゼ非依存性に細胞質に空胞化をきたして細胞死を至らしめるもう１つの未知の細胞死の経路があると考えられる。そしてカスパーゼ依存性とカスパーゼ非依存性の両者の上流に相当する扇の要の位置にBaxが存在し、この抑制剤である本発明のBIPがQ79による細胞死全体を抑制すると考えられる（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実験例１における結果を示すグラフである。
【図２】実験例２における結果を示す図である。
【図３】実験例３における結果を示すグラフである。
【図４】実験例４における結果を示すグラフである。
【図５】実験例５における結果を示すグラフである。
【図６】細胞死の流れと、本発明に係る治療薬（BIP）の役割を説明するための図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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