(57)【要約】【課題】  毒性が低く優れた水溶性を有し、かつ、生体組織中を透過できる蛍光を放射し、腫瘍、癌及び／又は血管の特定の造影を可能にする腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤の提供及び該蛍光造影剤を用いた体外蛍光造影方法を提供することにある。【解決手段】  分子中に少なくとも２個の酸基を有する３Ｈ−ピロロピリジンを少なくとも母核の１つとして有するペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の少なくとも一種を含む腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子中に少なくとも２個の酸基を有する３Ｈ−ピロロピリジンを少なくとも母核の１つとして有するペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の少なくとも一種を含む腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項２】
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料が下記一般式（１）、（２）又は（３）で表される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【化１】
2005145819.tif 000015
〔式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5及びＲ6は各々アルキル基を表し、Ｒ1及びＲ4で表されるアルキル基は置換されていてもよい。Ｚ1及びＺ2は各々ピリジン環を形成するに必要な非金属原子群を表す。Ｙ1は環内に下記結合（１）を含むピリジン環を表し、Ｙ2は環内に下記結合（２）を含むジヒドロピリジン環を表し、Ｌはメチン基を表し、Ｘ-はアニオンを表す。ｍは３又は４の整数を表し、ｎは１又は２の整数を表す。ただし、ｍが３の場合、Ｒ1及びＲ4は置換アルキル基が好ましく、また、該染料が分子内塩を形成する時はｎは１である。〕
【化２】
2005145819.tif 000016
〔結合（１）又は結合（２）におけるＲ7及びＲ8は、前記一般式（１）、（２）又は（３）のＲ1、Ｒ4と同義である。〕
【請求項３】
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がスルホン酸基、カルボン酸基及び燐酸基から選択される基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項４】
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がスルホン酸基又はカルボン酸基から選択される基を含み、酸基の合計が２以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項５】
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基のうち、少なくとも２つがスルホン酸基であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項６】
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がナトリウムの塩であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項７】
前記腫瘍又は癌が、肉腫及び黒腫でなるグループから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光造影剤を生体内に導入し、前記生体に励起光を照射し、前記造影剤からの蛍光を検出することにより腫瘍又は癌を診断することを特徴とする体外蛍光造影方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍又は癌の診断に適した近赤外蛍光造影剤及び該近赤外蛍光造影剤を用いた体外蛍光造影方法による腫瘍又は癌の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
病気を治療する際に、病気の初期の段階においてその病気により生体内に引き起こされる形態変化を精密、迅速かつ簡便に検出することが要求される。
【０００３】
特に癌を治療する場合、初期の小さい病変の場所と大きさの確定が早期治療の上で必要不可欠である。この目的のために既に知られている方法として、内視鏡による生体検査、Ｘ線撮影、ＣＴ、ＭＲＩ及び超音波撮影等のような映像診断を挙げることができる。
【０００４】
生体検査は直接病変部を観察できるので確定診断として有効ではあるが、同時に被験者に痛みや苦痛を強いる。Ｘ線撮影及びＭＲＩは過度にすると有害となる放射線及び磁場を被験者にさらすものであり、時間的経過を追跡しようとするとその被爆時間は追跡時間に比例して増大してしまう。設備や装置も大掛かりになり、その設置と維持に多大の労力と費用が要求される。
【０００５】
近赤外蛍光造影撮影は、小型化が可能で運転の労力が軽減され、使用も簡便化される診断として近年近注目されている診断方法である。
【０００６】
近赤外光は７０％以上が水分から成る生体組織を容易に透過し、厚さ１０ｃｍ〜２０ｃｍまでを検査診断できるといわれている。そのため、臨床医学の分野で注目を集めつつ、近赤外ＣＴとする診断技術として開発されるようになった。
【０００７】
この方法は造影剤として生体の吸収の少ない７００ｎｍから１０００ｎｍの近赤外の波長を有する励起光の照射により蛍光を放射する化合物を生体中に投与し、身体の外側から近赤外の波長である励起光を照射し、体内の投与された化合物、所謂、蛍光造影剤から放射される蛍光を検出して、病変部を確定するものである。
【０００８】
このような蛍光造影剤として、例えば、腫瘍中に蓄積するポルフィリン化合物やヘマトポルフィルン化合物などが知られている。これらの化合物は、近赤外の光照射により励起され酸素分子が病変部の生体を酸化することが可能な３重項酸素を生成させ、癌のような病変部の細胞を死滅させて治療を可能にするが、病変部以外の組織を破壊してしまう危険性を孕んでいる。
【０００９】
一方、フルオレセインやフルオレサミンのような既知の蛍光色素を用いた造影法が米国特許第４，９４５，２３９号に開示されているが、これらの蛍光色素は生体の光透過が非常に低い青〜緑の光を発するもので、身体の奥の部分の病変の検出が充分にできない。
【００１０】
近赤外領域で蛍光を発するシアニン色素は、蛍光造影剤として期待され、各種のシアニン化合物が検討された。シアニン化合物の蛍光造影剤が報告されて以来、親水性、モル吸光係数、量子収率の高い化合物に改変すべく、各種周辺シアニン化合物を造影剤とする技術が下記の特許文献１、２、３に開示されている。
【００１１】
しかしながら、正常な組織を病変組織と識別する能力（造影力・病変組織との親和性）とともに、生体から造影後に生体内で完全に分解され無害となるか、又は完全に排出されることが必要で（非蓄積性）、両者を兼ねた安全な造影剤は見つかっていない。
【特許文献１】特開２０００−９５７５８号公報
【特許文献２】特表２００２−５２６４５８号公報
【特許文献３】特開２００３−１６０５５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、毒性が低く優れた水溶性を有し、かつ、生体組織中を透過できる蛍光を放射し、腫瘍、癌及び／又は血管の特定の造影を可能にする腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤の提供及び該蛍光造影剤を用いた体外蛍光造影方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の上記目的は、下記各構成により達成される。
（請求項１）
分子中に少なくとも２個の酸基を有する３Ｈ−ピロロピリジンを少なくとも母核の１つとして有するペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の少なくとも一種を含む腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項２）
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料が下記一般式（１）、（２）又は（３）で表される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
【００１４】
【化１】
2005145819.tif 000002
【００１５】
〔式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5及びＲ6は各々アルキル基を表し、Ｒ1及びＲ4で表されるアルキル基は置換されていてもよい。Ｚ1及びＺ2は各々ピリジン環を形成するに必要な非金属原子群を表す。Ｙ1は環内に下記結合（１）を含むピリジン環を表し、Ｙ2は環内に下記結合（２）を含むジヒドロピリジン環を表し、Ｌはメチン基を表し、Ｘ-はアニオンを表す。ｍは３又は４の整数を表し、ｎは１又は２の整数を表す。ただし、ｍが３の場合、Ｒ1及びＲ4は置換アルキル基が好ましく、また、該染料が分子内塩を形成する時はｎは１である。〕
【００１６】
【化２】
2005145819.tif 000003
【００１７】
〔結合（１）又は結合（２）におけるＲ7及びＲ8は、前記一般式（１）、（２）又は（３）のＲ1、Ｒ4と同義である。〕
（請求項３）
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がスルホン酸基、カルボン酸基及び燐酸基から選択される基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項４）
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がスルホン酸基又はカルボン酸基から選択される基を含み、酸基の合計が２以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項５）
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基のうち、少なくとも２つがスルホン酸基であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項６）
前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の分子が有する少なくとも２個の酸基がナトリウムの塩であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項７）
前記腫瘍又は癌が、肉腫及び黒腫でなるグループから選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤。
（請求項８）
請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光造影剤を生体内に導入し、前記生体に励起光を照射し、前記造影剤からの蛍光を検出することにより腫瘍又は癌を診断することを特徴とする体外蛍光造影方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係わる近赤外蛍光造影剤は、近赤外光によって励起され放射された蛍光が生物組織の透過性に優れるため、高い生体の病変の検出が可能で、さらに、水溶性及排出性が高いことから、安全性の高い、腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤及び体外蛍光造影方法を提供することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２０】
本発明の上記の目的は、分子中に少なくとも２個の酸基を有する３Ｈ−ピロロピリジンを少なくとも母核の１つとして有するペンタ又はヘプタメチンシアニン染料を少なくとも１種含有する蛍光造影剤により達成されるものである。
【００２１】
上記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料のうち蛍光造影剤に用いるのに好ましいものは、前記一般式（１）、（２）又は（３）で表される少なくとも一種である。
【００２２】
式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5及びＲ6は各々アルキル基を表し、Ｒ1及びＲ4で表されるアルキル基は置換されていてもよい。Ｚ1及びＺ2は各々ピリジン環を形成するに必要な非金属原子群を表す。
【００２３】
Ｙ1は環内に下記結合（１）を含むピリジン環を表し、Ｙ2は環内に下記結合（２）を含むジヒドロピリジン環を表し、Ｌはメチン基を表し、Ｘ-はアニオンを表す。ｍは３又は４の整数を表し、ｎは１又は２の整数を表す。ただし、ｍが３の場合、Ｒ1及びＲ4は置換アルキル基が好ましく、また、該染料が分子内塩を形成する時はｎは１である。
【００２４】
【化３】
2005145819.tif 000004
【００２５】
結合（１）及び結合（２）において、Ｒ7及びＲ8は、前記一般式（１）、（２）又は（３）のＲ1、Ｒ4と同義である。
【００２６】
前記一般式（１），（２）又は（３）で表される化合物は、分子中に少なくとも２個の酸基を有し、該酸基としてはスルホン酸基、カルボン酸基、燐酸基、ホスホン酸基等が挙げられ、これらの酸基は各々、その塩を包含する。塩としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、ピリジニウム等の有機アンモニウム塩を挙げることができる。
【００２７】
また、本発明に係わる蛍光造影剤として用いられる前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン色素分子において、また、特に上記一般式（１）、（２）又は（３）で表されるシアニン色素分子において、分子中に有する少なくとも２個の酸基について、好ましくは、スルホン酸基、カルボン酸基、燐酸基及びホスホン酸基から選択される酸基である。
【００２８】
しかしながら、更に好ましいのは、上記一般式（１）、（２）又は（３）に於いて、分子中の酸基がスルホン酸基又はカルボン酸基から選択される基を含み、且つ酸基の合計が２以上である場合である。
【００２９】
また、より好ましいのは、上記一般式（１）、（２）又は（３）に於いて、分子中の酸基の少なくとも２つがスルホン酸基である場合である。
【００３０】
上記一般式（１）、（２）又は（３）で表されるシアニン色素分子において、分子中に有する少なくとも２個の酸基は、塩を形成していることが好ましく、塩としてはナトリウム塩が好ましい。
【００３１】
又、前記一般式（１），（２）又は（３）で表される化合物は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＲ基を含んでもよい。Ｒは水素原子又はアルキル基を表す。Ｒで表されるアルキル基は炭素数４以下の低級アルキル基が好ましい。
【００３２】
−ＣＨ2ＣＨ2ＯＲ基を含む置換基としては、例えばヒドロキシエチル基、ヒドロキシエトキシエチル基、メトキシエトキシエチル基、ヒドロキシエチルカルバモイルメチル基、ヒドロキシエトキシエチルカルバモイルメチル基、Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルカルバモイルメチル基、ヒドロキシエチルスルファモイルエチル基、メトキシエトキシエトキシカルボニルメチル基等を挙げることができる。
【００３３】
Ｚ1，Ｚ2，Ｙ1及びＹ2は前述した酸基及び−ＣＨ2ＣＨ2ＯＲ基の他に種々の置換基を有してもよいが、その他の置換基としては、ヒドロキシル基、シアノ基、アルキル基（例えば、メチル、エチル基等）、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ基等）、アリール基（例えばフェニル基）、ハロゲン原子（例えば、弗素、塩素、臭素原子等）等が挙げられる。Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5及びＲ6で表されるアルキル基は、好ましくは炭素数１〜８の低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル基等）を表し、前記の酸置換基又は−ＣＨ2ＣＨ2ＯＲ基以外の置換基を有してもよい。Ｌで表されるメチン基も置換基を有してもよく、置換基としては炭素数１〜５の置換又は無置換の低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、３−ヒドロキシプロピル、２−スルホエチル基等）、ハロゲン原子（例えば、弗素、塩素、臭素原子等）、アリール基（例えばフェニル基）、アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ基等）などが挙げられる。また、メチン基の置換基同士が結合して３つのメチン基を含む６員環（例えば４，４，４−ジメチルシクロヘキサン環）を形成してもよい。
【００３４】
Ｘ-で表されるアニオンは、特に制約されないが、好ましくはハロゲンイオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、エチル硫酸イオン等が挙げられる。
【００３５】
本発明の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるシアニン染料は、ｍ＝３のペンタメチンシアニン染料及びｍ＝４のヘプタメチンシアニン染料であるが、好ましくはｍ＝４のヘプタメチンシアニン染料である。
【００３６】
本発明の前記一般式（１）、（２）又は（３）で表される染料は、ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイェティ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）１８９頁（１９３３年）、米国特許第２，８９５，９５５号、特開昭６２−１２３４５４号及び特許２９６１５４９等を参考にして合成することができる。
【００３７】
本発明の前記一般式（１）、（２）又は（３）で表される染料の母核として用いられる化合物としては、以下の化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃが挙げられる。
【００３８】
【化４】
2005145819.tif 000005
【００３９】
化合物（Ａ）はＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２０２（１９５９）に記載の方法又は英国特許８７０，７５３号に記載の方法で合成することができる。化合物（Ｂ）はＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５８４（１９６１）に記載の方法で合成することができる。化合物（Ｃ）は英国特許８４１，５８８号に記載の方法で合成することができる。
【００４０】
これらの母核を用いて四級化、スルホン化等を必要に応じて行うことができ、また、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２０２（１９５９）及びＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，５８４（１９６１）に記載の合成法に準じてＮ−アルキル−Ｎ−ピリジルヒドラジンを合成しヒドラゾンを経て環化反応を行い、必要に応じ酸処理することにより１−アルキル置換−３Ｈ−ピロロピリジン誘導体を得、これを出発物質とすることもできる。
【００４１】
これらの四級化され、又、必要に応じてスルホン化された母核化合物を用いて、適当なメチン鎖供給体を反応させれば容易に本発明の化合物を得ることができる。
【００４２】
メチン鎖供給体としてグルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩を用いればヘプタメチン染料が得られる。
【００４３】
以下に、本発明の化合物を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
【化５】
2005145819.tif 000006
【００４５】
【化６】
2005145819.tif 000007
【００４６】
【化７】
2005145819.tif 000008
【００４７】
【化８】
2005145819.tif 000009
【００４８】
【化９】
2005145819.tif 000010
【００４９】
【化１０】
2005145819.tif 000011
【００５０】
【化１１】
2005145819.tif 000012
【００５１】
生体内で使用されることになる蛍光造影剤は、体内に蓄積されず、速やかに体外に排出されることが重要で、基本的に水溶性であることが必要条件である。水溶性を向上させる手段としては、分子中にアニオン系のカルボン酸や、スルホン酸を有することが好ましく、またこれらのカルボン酸やスルホン酸は塩を形成していることが好ましく、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、ピリジニウム等の有機アンモニウム塩を挙げることができる。
【００５２】
本発明の近赤外蛍光造影剤は上記化合物中に、前記の酸基のうちでも、２個以上のスルホン酸基を含有していることが好ましく、中でも、３個以上のスルホン酸基の導入により水溶性が顕著に改善される。優れた水溶性を得るには、さらに、スルホン酸基の数は４個以上であることが好ましい。合成を容易にするには、スルホン酸基の数は１０個以下、好ましくは８個以下である。
【００５３】
水溶性の尺度は各化合物の分配係数の測定、例えば分配係数を脂肪族アルコール、例えば、ブタノールと水の二相系で測定することにより調べることができる。
【００５４】
例えば、３個以上のスルホン酸基の導入によりｎ−ブタノール／水の分配係数ｌｏｇＰｏ／ｗは−１．００以下となる。
【００５５】
生体における水溶性の判断の方法としては、生理的食塩水に溶解し、３６℃において時間経過後も沈殿や析出のないことである。生体内に投与されて許容される塩は前記一般式（１）、（２）又は（３）の化合物と非毒性の塩を形成するものであるばよい。それらの例としては、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のようなアルカリ土類金属塩、トリプトファン、メチオニン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、アルギニン等の塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。特に好ましいのは生体内での毒性が低いナトリウム塩である。
【００５６】
本発明の蛍光造影剤に含まれるべき本発明に係わる化合物は７００−１３００ｎｍ、特に約７００−９００ｎｍの近赤外光領域に吸収及び蛍光を示し、１００，０００以上のモル吸光係数を有する。
【００５７】
本発明の蛍光造影剤は、生体内に蛍光造影剤を導入したのち、前記生体に励起光を照射し、前記造影剤からの蛍光を検出することにより腫瘍又は癌を診断する体外蛍光造影方法に用いられるものである。
【００５８】
体外蛍光造影方法により診断される腫瘍又は癌としては、脳、乳房、胸部、前立腺、結腸、肺臓、肝臓、すい臓、胃、リンパ節、子宮体部、子宮頸部、上下肢など各種の部位の肉腫及び黒腫でなるグループから選択されるものであ。
【００５９】
本発明に係わる体外蛍光造影方法に用いる蛍光造影剤は、具体的には、本発明に係わる前記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料の少なくとも一種を、注射用蒸留水、生理食塩水、又はリンゲル液等のような溶媒中に懸濁若しくは溶解させたものであり、必要に応じて、担体、賦形剤等のような薬理上許容しうる添加物を加えてもよい。これらの添加物としては、薬理上許容しうる電解質、バッファー、洗剤のような物質及び浸透圧を調整し安定性及び溶解性を改善するための物質（例えば、シクロデキストリン、リポソーム等）が挙げられる。関連分野で一般に使用される多様な添加物が使用できる。本発明に係わる蛍光造影剤は医薬用の場合は好ましくは滅菌処理を経て製造される。当該蛍光造影剤は、注射、噴射又は塗布、血管内（静脈、動脈）、経口、腹膜内、経皮、皮下、膀胱内又は気管支内投与によって前記生体部位に投与することができる。好ましくは、本造影剤は血管内に水剤、乳剤又は懸濁剤の形態で投与される。
【００６０】
本発明の蛍光造影剤の用量は、その用量によって最終的に診断すべき部位の検出が可能である限りは特に限定されず、使用される近赤外蛍光を放射する化合物の種類、年齢、体重及び投与対象の標的器官などによって適当に調整される。典型的には、用量は当該化合物の量として０．１−１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５−２０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明の造影剤はヒト以外の多様な動物に適宜使用することができる。投与の形態、経路及び用量は対象動物の体重及び状態によって適当に決定される。
【００６１】
本発明では、上記ペンタ又はヘプタメチンシアニン染料が腫瘍組織中に蓄積されることにより、本発明の蛍光造影剤を用いて腫瘍組織を特異的にイメージングすることができる。さらに、一連の当該化合物は血管内に長くとどまることができ、血管造影剤としても良好に機能することが期待される。
【００６２】
本発明の体外蛍光造影方法は本発明の蛍光造影剤の使用により特徴付けられる。この方法は公知の方法に準じて実施され、励起波長及び検出すべき蛍光波長のようなそれぞれのパラメーターは投与される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象により最適となるように適宜決定される。本発明の蛍光造影剤の測定対象への投与から本発明の蛍光イメージング法による測定開始までにかかる時間は使用される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象によって異なる。例えば、腫瘍イメージングを目的とした場合、消失時間は投与後およそ４−１２０時間と考えられる。消失時間が短すぎると、蛍光が強すぎて標的部位と他の部位を明確に分けることができない。長すぎると、当該造影剤が身体から排泄されてしまうことがある。血管造影が求められる場合には、投与直後又はその約３０分以内に検出する。
【００６３】
本方法においては、前記蛍光造影剤を検出標的に投与し、検出標的を励起光源からの励起光に露光する。次いで、近赤外蛍光造影剤から当該励起光により発生された蛍光を蛍光検出器で検出する。励起波長は使用される近赤外蛍光造影剤によって異なるが、当該化合物が近赤外領域に有効に蛍光を放射する範囲でさえあれば制限されない。好ましくは、優れた生物透過能を有する近赤外光が使用される。
【００６４】
検出すべき近赤外蛍光の波長も使用される造影剤によって異なる。一般的に言えば、６００−１０００ｎｍ、好ましくは７００−８５０ｎｍの波長を有する励起光を用い、７００−１０００ｎｍ、好ましくは７５０−９００ｎｍの波長領域の近赤外蛍光を検出する。この場合、励起光の光源は、種々のレーザー（例えば、イオンレーザー、色素レーザー及び半導体レーザー）、ハロゲン光源、キセノン光源等のような通常の励起光光源でよい。必要ならば、種々の光学フィルターを使用して最適な励起波長を得ることもできる。同様に、蛍光は種々の光学フィルターを使用して当該蛍光造影剤からの蛍光のみを捕らえて検出することもできる。
【００６５】
検出された蛍光を蛍光情報としてデータ処理し、記録可能な蛍光イメージを生成させるのに用いる。蛍光イメージは標的組織を含む広い領域に照射して、ＣＣＤカメラで蛍光を検出し、得られた蛍光情報をイメージ処理することにより生成させる。或いは、光学ＣＴ装置を使用したり、内視鏡を使用したり、眼底カメラを使用してもよい。本発明の蛍光イメージング法は全身性の疾患、腫瘍、血管などを生体を傷つけることなく可視化させることができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６７】
実施例１
（例示化合物３１の合成）
前述の文献に従って合成した化合物（Ｂ）を常法に従いプロパンサルトンで４級化した後、この４級化物５．０ｇを酢酸４０ｍｌに加温溶解し、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩１．０ｇ、無水酢酸９ｍｌ、ピリジン１３ｍｌを加えて浴温８０〜８５℃で３０分間加熱撹拌した。放冷後、イソプロピルエーテルを加えてデカンテーションした。更に、メチノール、アセトン及びイソプロピルエーテメを加えデカンテーションして精製し、更にらに飽和食塩水１００ｍｌを加えて精製後、化合物（３１）を得た。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）  ７３９ｎｍ。
【００６８】
（化合物例３２の合成）
前記の文献に従って合成した化合物（Ａ）を常法に従いプロパンサルトンで４級化した後、化合物（３１）と同様の反応条件で反応させた後、精製して化合物（３２）を得た。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）  ７３１ｎｍ。
【００６９】
（化合物例２０の合成）
前記の化合物（Ａ）をプロパンサルトンで４級化した後、濃硫酸と発煙硫酸でスルホン化を行った。スルホン化物２．６ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩１．０ｇ、ピリジン２ｍｌ、無水酢酸２ｍｌを加えて浴温約１００℃で２０分間加熱、撹拌した。反応混合物にイソプロピルエーテルを加え、デカンテーション後、精製して化合物（２０）を得た。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）  ７３７ｎｍ。
【００７０】
（化合物例３３の合成）
前記の文献に準じて２，３，３−トリメチル−５−ヨード−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｂ］ピリジンを合成した。これを常法に従いプロパンサルトンで４級化した後、４級化物０．４１ｇを酢酸３ｍｌに溶かし、グルタコンアルデヒドジアニル塩酸塩０．１９ｇ、無水酢酸０．７ｍｌ、ピリジン１ｍｌを加え浴温９０〜１０５℃で１時間加熱、撹拌した。放冷後、反応液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌後、濾過して黄緑色固体として化合物（３３）０．３６ｇを得た。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）  ７４７ｎｍ。
【００７１】
（化合物例３４の合成）
前記の文献に準じて２，３，３−トリメチル−５−ヒドロキシエトキシ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｂ］ピリジンを合成した。これを化合物（３３）の合成と同様に４級化した後、縮合して化合物（３４）を得た。λｍａｘ（ＭｅＯＨ）  ７６７ｎｍ。
【００７２】
実施例２
（乳癌発癌モデルマウスの作出）
老化促進マウス（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ）ＳＡＭ系の１系統であるＳＡＭＰ６／Ｔａ系マウスに乳癌を発症させるため、発癌物質７，１２−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚ［ａ］ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ（ＤＭＢＡ）を投与して乳癌発癌モデルマウスを作出した。
【００７３】
マウスの発癌方法は、特開２００３−３３１２５号に準じて行った。ＳＡＭＰ６／Ｔａ系マウスを各２０匹に、ＤＭＢＡを０．５ｍｇ／マウス／週で計６回投与した。飼料としては高タンパク質高カロリーのＣＡ−１固形（日本クレア社製）を与えた。発癌物質の第６回目の投与の後、第１回目投与から起算して第２０週迄までを休薬期間とした。乳癌および乳癌の肺転移を病理組織学的に検索した。ＤＭＢＡを１週間隔で６回投与し、その後の投与開始より第２０週目まで休薬し、乳癌発生したマウス（乳癌発生率７５％）を使用した。
（蛍光造影試験）
マウス乳癌の腫瘍組織断片（２ｍｍ×２ｍｍ角辺）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５週齢、クレアジャパン社）の左胸部の乳房部皮下に移植した。１０日後、腫瘍が直径約５ｍｍに成長した時点で上記マウスを試験に供した。蛍光励起光源としてチタンサファイアレーザーを使用した。照射の分散が２％以内になるようにリングタイプの光ガイド（住田光学グラス社）を用いて試験用マウスにレーザー光を均一に照射した。照射出力はマウスの皮膚表面付近で約３６μＷ／ｃｍ2になるように調整した。蛍光は各化合物の最大励起波長で励起させ、マウスからの蛍光放射をＣＣＤカメラ（Ｃ４８８０，浜松フォトニクス社）を用いて短波長カットオフフィルターを通して検出及び造影した。カットオフフィルターは化合物の励起波長（８００ｎｍ〜９００ｎｍ）に適合するように選択した。照射時間は各化合物の蛍光強度によって調整した。
【００７４】
蛍光造影剤として、各試験化合物は蒸留水に溶解し（０．５ｍｇ／ｍｌ）、マウスに乳管及び線葉から投与した。用量は各１ｍｇ／ｋｇであった。化合物投与の１２分後にマウスをジエチルエーテルで麻酔し、マウス全身の蛍光イメージを造影した（実験番号１０１〜１１１）。センサーは蛍光光度計（日本分光ＦＰ−６６００）のフォトダイオード（波長範囲２２０〜１１００ｎｍ）を使用した。
【００７５】
蛍光感度は、基準に対する発生蛍光量の対数で表し、実験番号１０１（比較）を１００とする相対感度で表した。
【００７６】
造影剤の体外排出量は、造影剤投与後の化合物の体内量を１００とし、３週間後の膀胱及び腎臓からのカテーテルによる蓄積排出量を合算し、液体クロマトグラフ２０１０Ａ（島津製作所社製）から体外排出量を算出し、初期濃度に対する排出率を求めた。
【００７７】
尚、特開２００３−１６０５５８号に記載の化合物を比較化合物として使用した。
【００７８】
化合物の水溶性試験は、０．９％の生理的食塩水１ｍｌに０．５ｍｇを溶解し、３６℃２週間静置放置し、析出、沈殿物を確認した。全くないレベルを◎、わずかヘイズがかかって見られるが、攪拌により消失してしますレベルを○、ヘイズがかかっているが、攪拌では消失しないレベルを△、析出してしまうレベルを×として評価した。
【００７９】
【化１２】
2005145819.tif 000013
【００８０】
これらの結果をまとめて表１に示した。
【００８１】
【表１】
2005145819.tif 000014
【００８２】
表１より、本発明の一般式（１）、（２）又は（３）で表されるシアニン色素を含有する腫瘍又は癌の診断のための蛍光造影剤は、比較蛍光造影剤に比して水溶性、蛍光感度、体外排出率において優れていることが分かる。