(57)【要約】【課題】低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた特定重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含む低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供する。【解決手段】ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株（FERM P-19661）またはその変異株及びそれを用いた低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。【選択図】図１
2005318815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株（FERM P-19661）。
【請求項２】
低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株（FERM P-19661）の変異株。
【請求項３】
低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする請求項１または請求項２記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【請求項５】
低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする請求項４記載の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する新規な菌株及びそれを用いた特定重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含む低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合した高分子化合物である。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。これらの特徴により、ε−ポリ−Ｌ−リジンはトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途への展開が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。
【０００３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株を培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No.346-D株（微工研菌寄第3834号、以下、No.346-D株という。）（例えば特許文献１参照）、No.346-D株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である11011A-1株（微工研条寄第1109号）（例えば特許文献２参照）、No.346-D株のプラスミド増幅変異株である50833株（微工研条寄第1110号）（例えば特許文献３、４参照）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、11011A-1株の変異株であるB21021株（FERM BP-5926）（例えば特許文献５参照）、ストレプトマイセス・ノールセイ(Streptomyces noursei)に属する菌株（FERM P-9797）（例えば特許文献６参照）、ストレプトマイセスsp.SP-72株（FERM P-16810）（例えば特許文献７参照）、ストレプトマイセスsp.SP-66株（FERM P-17223）（例えば特許文献８参照）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) SP-13株（FERM P-17845）（例えば特許文献９参照）、ストレプトマイセス  アルブルス・サブスペシーズ(Streptomyces albulus subsp.) SP-25株（FERM P-17988）（例えば特許文献１０参照）及びストレプトマイセス・ラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)USE-53株（FERM P-18305）（例えば特許文献１１参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら前述の菌株を用いて生産したε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として使用する際、使用量の増加に応じて苦みが増す傾向があった。通常ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌として用いられるNo.346-D株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンの重合度は１３〜３５であるが、この苦みは主としてε−ポリ−Ｌ−リジンに含まれる重合度の高い成分に由来すると考えられる。そこで苦みを低減するため、重合度の高い成分の含有割合が低く、重合度が２０以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産する菌株並びに重合度が２０以下のε−ポリ−Ｌ−リジンの含有割合が極めて高いε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献２】特公平３−４２０７０号公報
【特許文献３】特公平３−４２０７５号公報
【特許文献４】特公平６−７５５０１号公報
【特許文献５】特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献６】特開平１−１８７０９０号公報
【特許文献７】特開２０００−０６９９８８号公報
【特許文献８】特開２００１−０１７１５９号公報
【特許文献９】特開２００２−９５４６６号公報
【特許文献１０】特開２００２−９５４６７号公報
【特許文献１１】特開２００３−９５４６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた特定重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含む低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は前述の従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた。その結果、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株（FERM P-19661）またはその変異株であれば、重合度が５〜２０で、特に重合度１０〜１８程度のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
尚、本発明において低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンとは、重合度が５〜２０であるε−ポリ−Ｌ−リジンをいう。
【０００８】
本発明は下記の（１）〜（４）の構成を有する。
（１）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株（FERM P-19661）。
（２）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株（FERM P-19661）の変異株。
（３）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする前記（１）または（２）項記載の菌株。
（４）前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（５）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする前記（４）項記載の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の菌株を用いれば、重合度が５〜２０で、特に重合度１０〜１８程度のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産することができる。該菌株を用いた本発明の製造法であれば、著量の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜１＞本発明の菌株
本発明の菌株は、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株（FERM P-19661）またはそのの変異株であり、重合度が５〜２０のε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「低重合度ポリリジン」という。）、特に重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産する性質を有する。
低重合度ポリリジンは、重合度が５〜２０であり、且つその平均分子量が１０００以上であることが好ましい。
尚、低重合度ポリリジンを生産するとは、採取可能な量の低重合度ポリリジンを生産することを意味する。
【００１１】
本発明の菌株は培養条件の操作により、低重合度ポリリジンを著量生産することができる。その結果、本菌株が生産する低重合度ポリリジンはNo.346-D株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンよりも平均重合度が相当低い。
培養液中の低重合度ポリリジンは、後記実施例１(1)(c)に記載した方法により検出し測定することができる。
【００１２】
本発明の菌株のストレプトマイセス・アウレオファシエンス  USE-82株（Streptomyces aureofaciuens）（以下、USE-82株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによって低重合度ポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。
【００１３】
国際ストレプトマイセス  プロジェクト(ISP)基準に基づいて調査したUSE-82株の菌学的性質は以下の通りである。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）上で２８℃、１〜２週間生育したUSE-82株の気菌糸及び基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。
胞子形成菌糸の分枝法及び形態：屈曲した直状(RF形)。
【００１４】
（２）各種培地における気菌糸、基生菌糸の色と溶解生色素の生産
下記表１に示す各種培地における２８℃で２週間培養後の観察結果である。また、いずれの培地においても溶解性色素の生産は見られない。
【００１５】
【表１】
2005318815.tif 000003
【００１６】
イースト・麦芽寒天(ISP 2)
1.0％      バクト・麦芽エキス（Bacto Malt Extract)
0.4％      バクト・酵母エキスBacto Yeast Extract)
0.4％      グルコース（Glucose）
2.0％      バクト・アガー（Bacto Agar)
pH  7.0
【００１７】
オートミール寒天(ISP 3)
2.4％      バクト・オートミールアガー、脱水品
（Bacto Oatmeal Agar,Dehydrated)
0.0001％   FeSO4・7H2O
0.0001％   MnCl2・4H2O
1.4％      バクト・アガー（Bacto Agar  Difco社製)
pH  6.0±0.2
【００１８】
スターチ・無機塩寒天(ISP 4)
1.0％      バクト・可溶性澱粉（Bacto Soluble Starch)
0.2％      CaCO3
0.2％      (NH4)2SO4
0.1％      K2HPO4
0.1％      MgSO4・7H2O
0.1％      NaCl
0.0001％   FeSO4・7H2O
0.0001％   MnCl2・4H2O
0.0001％   ZnSO4・7H2O
2.0％      バクト・アガー（Bacto Agar)
pH  7.0
【００１９】
グリセリン・アスパラギン寒天(ISP 5)
1.0％      グリセロール（Glycerol）
0.114％    Ｌ−アスパラギン・H2O（L-Asparagine ・H2O）
0.1％      K2HPO4
0.0001％   FeSO4・7H2O
0.0001％   MnCl2・4H2O
0.0001％   ZnSO4・7H2O
2.0％      バクト・アガー（Bacto Agar)
pH  7.2
【００２０】
（３）生理的性質
(a)細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック(Staneck)らの方法(アプライド・マイクロバイオロジー（Applied Microbiology）第２８巻第２２６頁(1974年)参照)により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
(b)各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上）を表２に示した。
【００２１】
【表２】
2005318815.tif 000004
注）＋：同化する、−：同化しない。
【００２２】
(c)メラニン様色素の生成：
チロシン寒天培地：あり、ペプトン・イースト鉄寒天：なし。
【００２３】
チロシン寒天 
1.5％       グリセロール（Glycerol）
0.05％      Ｌ−チロシン（L-Tyrosine）
0.114％     Ｌ−アスパラギン・H2O（L-asparagine・H2O）
0.05％      K2HPO4
0.05％      MgSO4・H20
0.05％      NaCl
0.001136％  FeSO4・7H2O
0.000285％  H3BO3
0.00018％   MnCl2・4H2O
0.00021％   (+)−酒石酸ナトリウム２水和物
（Sodium(+)-tartrate・2H2O）
0.000004％  CoCl2・6H2O
0.0000027％ CuCl2・2H2O
0.0000025％ Na2Mo4O4・2H2O
0.000002％  ZnCl2
2.0％       バクト・アガー（Bacto Agar  Difco社製）
pH  7.2
【００２４】
ペプトン・イースト鉄寒天
1.5％     バクト・ペプトン（Bacto Peptone)
0.5％     バクト・プロテオーゼ・ペプトン
（Bacto Proteose Peptone)
0.1％     K2HPO4
0.1％     バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
0.05％    クエン酸アンモニウム鉄(III)−褐色
（Ammonium Iron(III)Citrate,Brown）
0.0126％  Na2S2O3・5H2O
1.5％     バクト・アガー（Bacto Agar)
pH  7.2
【００２５】
上記の菌学的性質、特に形態学的性質及び細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、USE-82株はストレプトマイセス属に属すると判定される。Ｅ.キュスター(E.Kuester)のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Intern. J. Syst. Bacteriol.)第２２巻第１３９−１４８頁(1972年)並びにP.ケムファー(P.Kaempher)らのジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー(J.Gen.Microbiol.)第１３７巻第１８３１−１８９１頁(1991年)を参照して類縁菌種を検索し、更にバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)第２４５２−２４９２頁並びにＥ．Ｂ．シーリング(E. B. Shirling)及びＤ．ゴットリーブ(D. Gottlieb)のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Intern. J. Syst. Bacteriol.)第２２巻第２７１−２７３頁(1972年)を参照して類縁菌種を検索したところ、本発明菌株はストレプトマイセス・ミサキエンシス（Streptomyces misakiensis ）クラスター（クラスターNo.22-24）に属し、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）あるいはストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor)と同定されたが、そのどちらであるのかは菌学的性質からだけでは決定が困難であった。
【００２６】
そこで本発明菌株の16S rRNAの部分遺伝子配列を分析した。すなわち、本発明菌株の16S rRNAをPCRで増幅し、初めから５００番目までの塩基配列を決定した。次いでドイツの菌株保存・分譲機関DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)のストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）のタイプカルチャーであるDSM 40127T 及び同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) のタイプカルチャーであるDSM 40123Tの16S rRNAの５００塩基までの部分遺伝子配列と比較した。
【００２７】
その結果、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）のタイプカルチャーとは９９．８％の相同性を示し、同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) のタイプカルチャーとは１００％の相同性を示した。しかし、ストレプトマイセス属の場合は他の多くの細菌の場合と異なり、この方法で種のレベルまで同定することは不可能であることが知られている。本発明菌株の場合もそうであると思われる。
【００２８】
そこで次に、本発明菌株のリボソームのRNAをコードしている遺伝子の制限酵素による切断パターン（リボプリント）を比較検討した。その結果、本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と０．７１という高い相関性を有していた。同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor)との相関性は０．４９という低い値であった。以上全ての結果を総合して、本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と同定し、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株と命名した。ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株は、独立行政法人  産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号FERMP-19661が付与されている。
【００２９】
また、本発明菌株には低重合度ポリリジンをUSE-82株と同等以上に生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の好ましい性質）を有する限り、USE-82株の変異株も包含される。USE-82株の変異株とは、USE-82株に変異処理をして誘導することのできる低重合度ポリリジン生産性変異株またはUSE-82株の自然突然変異株を意味する。
【００３０】
USE-82株の変異株は、USE-82株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やUSE-82株の自然突然変異株を、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「ポリリジン」ということがある）を生産する性質等を指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質等を指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。
【００３１】
＜２＞本発明の製造法
本発明の製造法は、本発明の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低重合度ポリリジンを採取することを特徴とする。本発明の菌株は、好ましくは、USE-82株である。
【００３２】
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセロールを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。
【００３３】
培養は、好気的条件下で振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜９が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明の菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常0.1〜５％である。このような培養により、培養液中に低重合度ポリリジンが生成蓄積する。
【００３４】
培養液中に著量生成蓄積した低重合度ポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法により低重合度ポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、更にカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより低重合度ポリリジンが得られる。
【実施例１】
【００３５】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
低重合度ポリリジン生産菌の取得
(1)低重合度ポリリジン生産菌のスクリーニング
(a)土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（10ml）に懸濁し、３０℃で振とう（200rpmで10分間）、静置（30分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。これを２８℃で２週間程度培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
【００３６】
(b)低重合度ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（30℃、30時間）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、３０℃で振とう培養した。
【００３７】
(c)低重合度ポリリジンの検出・測定
分離・取得株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ポリリジンの検出・測定を行った。ポリリジンの検出はイツアキ(Itzhaki)（アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)第50巻第569頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液０．５mlと１mMメチルオレンジ及び５０mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0)の水溶液２mlとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（470nm）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジン量を求めた。
【００３８】
上記培地１〜４の組成を下記に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。
培地１：放線菌分離用培地（Glycerol-Czapek培地）
グリセロール           0.3％
NaNO3                  0.2％
K2HPO4（pH 7.0）       0.1％
KCl                    0.05％
MgSO4・7H2O            0.05％
FeSO4・7H2O            0.001％
寒天                   1.5％
シクロヘキシミド      50μg/ml
ナイスタチン          50μg/ml
【００３９】
培地２：酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ISP 2）
酵母エキス              0.4％
麦芽エキス              1.0％
グルコース              0.4％
寒天                    1.5％
ｐＨ 7.2
【００４０】
培地３：生育培地
グリセロール            2.0％
酵母エキス              0.5％
MgSO4・7H2O             0.05％
KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.8） 1/50Ｍ
【００４１】
培地４：生産培地
グリセロール            3.0％
クエン酸・H2O（pH 4.5） 1.0％
（NH4)2SO4              1.0％
L-リジン・HCl          0.2％
【００４２】
上記の検出方法によりポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、滋賀県大津市山地の土壌より、低重合度ポリリジンを生産する菌株を分離・取得した。
【００４３】
(2)取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態及び生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。また、類縁菌種を検索したところ本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と同定した。本菌株は、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）  USE-82株と命名され、独立行政法人  産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号  FERM P-19661が付与されている。
【００４４】
(3)USE-82株の生産物の確認
USE-82株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養ろ液をメタノール：アセトン（３：１）の混合液で沈殿させ回収した（４０〜６７％画分）。次に回収したメタノール：アセトン（３：１）の混合液沈殿画分を陽イオン交換カラム（TSKgel  CM-5PW）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を６M塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってDABS（dimethylaminoazobenzenesulfonyl-）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
【００４５】
アミノ酸分析の結果、USE-82株の生産物はＬ−リジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
また、USE-82株の生産するポリリジンの重合度を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（TSKgel ODS-80Ts）を用いて、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定した。その結果、USE-82株の生産するポリリジンは、８、９量体から２０量体程度の低重合度で１０量体から１０数量体程度の低重合度ポリリジンを高い分率で含有する低重合度ポリリジンであった。結果を重合度検定の基準とするために化学合成して得た５量体及び１０量体のε−ポリ−Ｌ−リジンのピーク位置を基準にしてＸ軸（横軸）を定め、図１に示す。
【００４６】
更に、USE-82株の生産する低重合度ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解するタンパク質分解酵素（Aspergillus oryzae由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解され、α−ポリアミド結合したα−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。
【００４７】
USE-82株の生産するポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるBacillus brevis(IFO 3331)及びグラム陰性細菌であるEscherichia coli K-12（IFO 3301）に対してStreptomyces albulus No.346-D株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。
【実施例２】
【００４８】
USE-82株の低重合度ポリリジン生産性
USE-82株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で２８時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４）に移し、坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液の低重合度ポリリジン濃度を前記の方法により測定した。
７日間の培養では、USE-82株は３．９g/lの生産性を示した。
【実施例３】
【００４９】
USE-82株の低重合度ポリリジン生産性
実施例２と全く同様に生育培養し、回収、洗浄した菌体を培地４のクエン酸・H2Oの代わりにα-ケトグルタル酸を用いた生産培地（培地４'）に写し、実施例２と同様にして７日間培養後、培養上澄液の低重合度ポリリジン濃度を同様にして測定したところ、４．９g/lの生産性を示した。
培地４'：生産培地
グリセロール                3.0％
α-ケトグルタル酸（pH 4.5） 1.0％
（NH4）2SO4                 1.0％
L-リジン・HCl               0.2％
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】USE-82株が生産する低重合度ポリリジンのイオン会合クロマトグラムの結果
【図１】
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