(57)【要約】【課題】  既知のサイクロデキストラン（ＣＩ）よりも低分子またはより高分子のＣＩの開発、これらの新規なＣＩを産生する能力を有する微生物を探索し、当該微生物を用いた新規なＣＩの製造法の提供、これらの新規なＣＩ、並びにグルコースの重合度が様々なＣＩの混合物を用いる抗齲蝕剤の提供、並びに前記のＣＩを利用した水溶性環状オリゴ糖組成物や飲食物の提供。【解決手段】  グルコース５または６、もしくは１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる極低分子サイクロデキストランおよび極高分子サイクロデキストラン；パエニバチルス属微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から前記サイクロデキストランを採取する前記サイクロデキストランの製造方法；前記サイクロデキストランの生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０４）および同５９１Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０３）。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース５または６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストラン。
【請求項２】
グルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストラン。
【請求項３】
パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項４】
パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た培養上清をデキストランと反応させ、得られる反応物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項５】
パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た微生物を溶菌させたものをデキストランと反応させ、得られる反応物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項６】
グルコース５〜２３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０４）。
【請求項７】
グルコース７〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０３）。
【請求項８】
微生物として、請求項６記載のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株および／または請求項７記載のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株を用いることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項９】
請求項６記載のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株および／または請求項７記載のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株をデキストランを含む培地で培養し、培養物からグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランを採取することを特徴とするグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする抗齲蝕剤。
【請求項１１】
請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする包接能を有する水溶性環状オリゴ糖組成物。
【請求項１２】
請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる１種のサイクロデキストラン、或いは２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストラン、それらの製造方法およびそれに用いる微生物に関する。詳しくは、グルコース分子がα−１，６結合で結合した構造の新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストラン、その製造法およびそれに用いる新規微生物並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サイクロデキストラン（ＣＩ）生産菌はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｔ−３０４０（特許文献１参照）およびバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｕ−１５５（非特許文献１参照）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３３０Ｋ（特許文献２参照）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３５０Ｋ（特許文献２参照）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）３６０Ｋ（特許文献２参照）バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）８６０Ｋ（特許文献２参照）の６種類のみが報告されている。
このうち、Ｔ−３０４０およびＵ−１５５株は、グルコース７分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−７という。）、グルコース８分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−８という。）、グルコース９分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−９という。）等の比較的低分子のサイクロデキストランを生産することが知られている。
一方、３３０Ｋ、３５０Ｋ、３６０Ｋ、および８６０Ｋ株は、主にグルコース１０分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−１０という。）、グルコース１１分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−１１という。）、グルコース１２分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖（サイクロデキストラン）（以下、ＣＩ−１２という。）等の比較的高分子のサイクロデキストランを生産し、わずかにＣＩ−７、ＣＩ−８およびＣＩ−９も生産することが知られている。
【０００３】
環状オリゴ糖ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２は、抗齲蝕作用と弱い包接能を有し（特許文献２および特許文献３参照）、ＣＩ−１０は抗齲蝕作用と強い包接能を有していることが報告されている（特許文献２参照）。サイクロデキストランはその分子量の違いにより包接能の有無が異なるなど性質も変化することが示唆されているので、様々なグルコースの重合度を有するサイクロデキストランの製造法の確立が期待されているが、これまでＣＩ−７より低分子の、或いはＣＩ−１２より高分子のサイクロデキストランについての報告はない。
また、サイクロデキストランの抗齲蝕作用を利用した抗齲蝕剤が従来から報告されているが、それらはいずれも単体のサイクロデキストランを用いており、多種サイクロデキストラン混合物が用いられたものは知られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１９７７８３号公報
【非特許文献１】DDBJ/EMBL/Genbank DNAデータベース  アクセッション番号D88360
【特許文献２】特願２００２−３３７７４８
【特許文献３】特開平８−５９４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、これまで確認されたサイクロデキストランはＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２の６種類のみで、これらはすべて抗齲蝕性を有し、ＣＩ−１０は、抗齲蝕性のほかに高い包接能をも有することが知られている。このように、サイクロデキストランは、その分子量の違いにより性質が異なることから、グルコースの重合度が様々なサイクロデキストランの製造法の確立が期待される。
そこで、本発明は、従来知られているサイクロデキストランよりも低分子またはより高分子のサイクロデキストランを開発することを目的としている。
また、本発明は、従来知られているサイクロデキストランに加え、より低分子またはより高分子の新規なサイクロデキストランを産生する能力を有する微生物の探索と、当該微生物を用いた新規なサイクロデキストランの製造法を提供することをも目的とする。
さらに、本発明は、グルコースの重合度が様々なサイクロデキストランの混合物を用いる抗齲蝕剤を提供することをも目的とする。
そして、本発明は、前記従来知られているサイクロデキストランよりも低分子またはより高分子のサイクロデキストランを利用した水溶性環状オリゴ糖組成物や飲食物を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、市販の黒糖において採取したサンプルから、サイクロデキストランを産生する能力を有する微生物群を探索することに成功した。
そして、これらの微生物は、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）属に属していることを見出すと共に、該微生物が、デキストランから従来知られているサイクロデキストランに加え、グルコース５または６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストラン、そしてグルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランを生産する能力を有することを見いだして、本発明を完成するに至った。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、グルコース５または６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストランである。
請求項２記載の本発明は、グルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランである。
【０００８】
請求項３記載の本発明は、パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法である。
請求項４記載の本発明は、パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た培養上清をデキストランと反応させ、得られる反応物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法である。
請求項５記載の本発明は、パエニバチルス属に属し、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た微生物を溶菌させたものをデキストランと反応させ、得られる反応物から請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法である。
【０００９】
請求項６記載の本発明は、グルコース５〜２３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０４）である。
請求項７記載の本発明は、グルコース７〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの生産能を有するパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０３）である。
請求項８記載の本発明は、微生物として、請求項６記載のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株および／または請求項７記載のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株を用いることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランまたは請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランの製造方法である。
請求項９記載の本発明は、請求項６記載のパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株および／または請求項７記載のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株をデキストランを含む培地で培養し、培養物からグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランを採取することを特徴とするグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランの製造方法である。
【００１０】
請求項１０記載の本発明は、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする抗齲蝕剤である。
請求項１１記載の本発明は、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする包接能を有する水溶性環状オリゴ糖組成物である。
請求項１２記載の本発明は、請求項１記載の新規低分子サイクロデキストラン、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランおよびグルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなるサイクロデキストランからなる群から選ばれる１種のサイクロデキストラン、或いは２種以上のサイクロデキストランの混合物を有効成分として含有することを特徴とする飲食物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により新規な低分子サイクロデキストランおよび高分子サイクロデキストランが提供される。これらのサイクロデキストランは、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株を培養することにより得られる。
パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株は、従来の高分子サイクロデキストラン生産株と比べてより高分子のサイクロデキストランを生産するので、本発明の新規高分子サイクロデキストランの生産に適している。
パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株は、増殖が従来のサイクロデキストラン生産菌よりも２倍ほど良好で、従来のサイクロデキストラン高生産菌の半分の培養時間で著量のサイクロデキストランを生産するサイクロデキストラン高生産菌であり、また、従来のサイクロデキストラン生産菌よりも低分子のサイクロデキストランを生産するので、本発明の新規低分子サイクロデキストランの生産に適している。また、５９８株は、新規高分子のサイクロデキストランの他、既知のサイクロデキストランも著量生産するので、広範囲の分子量のサイクロデキストランの生産に適している。
【００１２】
しかも、本発明のパエニバチルス属菌株が生産する新規低分子サイクロデキストランや、新規高分子サイクロデキストランの他、これらと既知のサイクロデキストランとの混合物は、抗齲蝕剤の有効成分として利用できる。また、このようなサイクロデキストラン混合物は、分子量分画を行わなくとも包接能を持ち、かつ等量以下の水に溶解する高い水溶性であることから、食品、医薬品、化成品などに応用できる。
ＣＩ混合物の濃度を変えることにより目的の物質を包接する時間を調節することができるが、ＣＩ混合物の高い水溶性により、このような調節が容易である。また、サイクロデキストリンよりも極めて水溶性が高いために、不溶性物質の包接による可溶化の効果がサイクロデキストリンよりも高いことが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
請求項１記載のグルコース５〜６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストランおよび請求項２記載のグルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランは、請求項３〜５のいずれかに記載の方法によって製造することができる。
当該サイクロデキストラン生産菌は、いずれもパエニバチルス属に属する。これら微生物は、市販の黒糖から分離した菌株であり、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株などが挙げられる。
以下において本発明を詳しく説明する。
【００１４】
請求項１記載の新規低分子サイクロデキストランは、グルコース５分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる低分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−５という。）、グルコース６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる低分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−６という。）である。
また、請求項２記載の新規高分子サイクロデキストランは、グルコース１３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１３という。）、グルコース１４分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１４という。）、グルコース１５分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１５という。）、グルコース１６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１６という。）、グルコース１７分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１７という。）、グルコース１８分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１８という。）、グルコース１９分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１９という。）、グルコース２０分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２０という。）、グルコース２１分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２１という。）、グルコース２２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２２という。）、グルコース２３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２３という。）、グルコース２４分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２４という。）、グルコース２５分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２５という。）、グルコース２６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２６という。）、グルコース２７分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２７という。）、グルコース２８分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２８という。）、グルコース２９分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−２９という。）グルコース３０分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−３０という。）、グルコース３１分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−３１という。）、グルコース３２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−３２という。）、グルコース３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−３３という。）である。
【００１５】
上記新規低分子サイクロデキストランおよび新規高分子サイクロデキストラン生産菌であるパエニバチルス属菌株は、例えば特許文献２に記載された方法を応用して取得することができる。
その概要は以下の通りである。まず、市販の黒糖に滅菌水を添加し、懸濁液を作成する。次いで、０．２％のブルーデキストランを含む平板培地（ｐＨ７．０）に塗抹し、該平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解による透明なハローを形成しているコロニーを取得する。
取得したコロニーについて、さらに選抜試験を行って多分岐デキストラン水解酵素（以下ＨＢＤａｓｅという）により分解されない環状オリゴ糖であって、しかも既知の環状オリゴ糖であるＣＩ−７よりも低分子、あるいはＣＩ−１２よりも高分子のものを生産することのできる菌株を選抜する。
【００１６】
上記特許文献２に記載された方法を応用した本発明に係るパエニバチルス属菌株の取得方法の工程を要約すると、以下の通りである。
（１）自然界よりブルーデキストラン平板培地上でハローを形成する菌の分離、（２）デキストランを含む液体培養液で培養後、培養上清、あるいは溶菌液に再びデキストランを加えてインキュベートし、オリゴ糖を生産する菌の分離、（３）反応液中のオリゴ糖を逆相Ｃ１８カラムに吸着させ、２０％エタノールで溶出する菌の分離、（４）前記２０％エタノール溶出画分からＨＢＤａｓｅで分解されない環状オリゴ糖液を生産する菌の分離、（５）前記環状オリゴ糖をＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いてＨＰＬＣ分析したとき、ＣＩ−７が溶出するリテンションタイムよりも前に検出される低分子サイクロデキストラン、あるいはＣＩ−１２よりも後ろに検出される高分子サイクロデキストランを生産する株を選抜する。
【００１７】
上記特許文献２に記載された方法を応用した本発明に係るパエニバチルス属菌株の取得方法の詳細について、以下説明する。
市販の黒糖２０ｇを１００ｍＬの滅菌水に溶解し、該液を０．２ｍＬをとって、１リットル中にブルーデキストラン（ファルマシア社製）２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整し、寒天１５ｇを加えた平板培地に塗抹し、平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解によるハローを形成しているコロニーをデキストラナーゼ生産株として一次スクリーニングする。
【００１８】
次に、選抜菌株を１リットル中にデキストラン４０（名糖産業社製）またはデキストランＴ４０（ファルマシア社製）５ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で一晩から２日間振盪培養した後に、菌体を集め凍結して、これに界面活性剤Ｂ−ＰＥＲＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加えて溶菌し、これを粗酵素液とする。
この粗酵素液にデキストラン４０（名糖産業社製）またはデキストランＴ４０（ファルマシア社製）、１０ｍＭ  塩化カルシウムを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で４０℃で２４〜４８時間緩やかに振盪しながら反応を行う。
なお、粗酵素液として菌体を取り除いた培養液を用いることもできる。この場合は、菌体を取り除いた培養液に、最終濃度が２％になるようにデキストラン４０（名糖産業社製）またはデキストランＴ４０（ファルマシア社製）を、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを、さらに、４０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、４０℃で２４〜４８時間緩やかに振盪しながら反応を行うこともできる。
【００１９】
これにＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０℃で一晩反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖またはデキストランをすべてグルコースまで分解する。ＨＢＤａｓｅは、特開平１０−２２９８７６号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー  Ｖ−５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また、特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。
この反応液をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）などの逆相カラムに通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖またはデキストランを除いて、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出する。
なお、逆相カラム処理とＨＢＤａｓｅ処理の順番は入れ換えてもよい。
【００２０】
このエタノール濃縮画分について、常法によりエタノールを取り除き、次いで凍結乾燥させた後、５０％アセトニトリルに溶かしてさらに遠心し、ごみを取り除いて、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５０％アセトニトリルにより流速１ｍＬ／分で分離し、噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）および分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて分析する。その結果、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖のピークがＣＩ−７が溶出するリテンションタイムよりも前に検出されれば極低分子環状オリゴ糖（新規低分子サイクロデキストラン）生産菌で、ＣＩ−１２が溶出するリテンションタイムよりも後ろに検出されれば極高分子環状オリゴ糖（新規高分子サイクロデキストラン）生産菌と推定できる。
【００２１】
後述の実施例１で示すように、本発明者らは上記の取得方法を実施した結果、分解されないオリゴ糖のピークがＣＩ−１２が溶出するリテンションタイムよりも後ろに検出される２つの菌株を取得した。そして、このうちの１つは、ＣＩ−７が溶出するリテンションタイムよりも前に検出された。したがって、２つの菌株はいずれも極高分子環状オリゴ糖（新規高分子サイクロデキストラン）生産能を有する菌であり、このうちの１つは極低分子環状オリゴ糖（新規低分子サイクロデキストラン）生産能をも有することが明らかとなった。
【００２２】
これらの２菌株は、後記する菌学的性質を有しており、さらに菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより１６ＳリボソーマルＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の特定領域を増幅し、塩基配列を決定して既知の配列との相同性を検索した結果、いずれの菌株もＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に帰属することが判明したので、本発明者らは、２つの菌株のうち、極高分子環状オリゴ糖（新規高分子サイクロデキストラン）生産能を有する菌株をパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、極低分子環状オリゴ糖（新規低分子サイクロデキストラン）および極高分子環状オリゴ糖（新規高分子サイクロデキストラン）生産能をも有する菌株をパエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株と命名した。
これらパエニバチルス属菌株２株は、いずれも新菌種と認められ、独立行政法人産業技術総合研究所  特許微生物寄託センターに寄託されており、受託番号は、それぞれパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０３、同５９８Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９６０４である。
【００２３】
次に、本発明に係る、グルコース５または６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストランまたはグルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランの製造方法について述べる。
本発明の製造方法は、請求項３に記載するように、パエニバチルス属に属し、上記新規低分子サイクロデキストランまたは上記新規高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から所望のサイクロデキストランを採取することによる。
【００２４】
当該サイクロデキストラン生産菌としては、上記のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株などが挙げられ、新規低分子サイクロデキストランを製造したい場合は５９８Ｋ株を、新規高分子サイクロデキストランを製造したい場合は５９８Ｋ株の他、５９１Ｋ株を用いることができる。
【００２５】
サイクロデキストランの採取は、上記微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物にさらにデキストランを加えることによってサイクロデキストランを多量に生産し、所望のサイクロデキストランを採取することによる。ここで、デキストランを含む培地における培養は、前記の菌の取得方法において挙げたブルーデキストラン平板培地で行うことができる。
培養物からの採取は、詳しくは請求項４に記載するように、培養上清をデキストランと反応させ、得られる反応物から所望のサイクロデキストランを採取することにより行うことができる。さらに、微生物を溶菌させたものをデキストランと反応させることによっても、サイクロデキストランを採取することができる。
具体的には例えば、上記のパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株をデキストランを含む培地で培養し、培地中に生育したコロニーの中から、デキストランの分解によるハローを形成しているコロニー（すなわち、微生物）をサイクロデキストラン高生産菌として選抜し、このコロニーを、上述のようなデキストランを含む液体培養液で培養後、培養上清、あるいは溶菌液に再びデキストランを加えてインキュベートし、目的とする新規低分子サイクロデキストランまたは新規高分子サイクロデキストランの生産を行うことができると同時に、グルコース７〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる既知のサイクロデキストランの生産を行うことができる。
【００２６】
こうしてサイクロデキストランの生産を行った後、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（２１．５ｍｍ×３００ｍｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速６ｍＬ／分で溶出し、溶出液を６ｍＬずつ分取分画する。それぞれのフラクション（画分）を１０μＬ〜５０μＬずつとり、再び高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルにより流速１ｍＬ／分で分離し、噴霧蒸発発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）と分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖（ＣＩと推定される。）を含むフラクションがどれであるかを、図１〜５のピーク５〜３３（それぞれＣＩ−５〜３３に相当する。）を参照しながら分析する。それぞれのフラクションにつきおのおの遠心濃縮機またはロータリエバポレーターによりアセトニトリルを除去し、次いで凍結乾燥して、目的のサイクロデキストランを単離することができる。
なお、上記した本発明に係る新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストランおよび既知のサイクロデキストランの製造方法は、１例であり、この方法に限定されるものではない。
【００２７】
本発明に係る新規低分子サイクロデキストランＣＩ−５およびＣＩ−６、ならびに新規高分子サイクロデキストランＣＩ−１３〜ＣＩ−３３から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物は、グルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害作用を有しているので、当該物質を有効成分として含有させて抗齲蝕剤として用いることができる。
また、既知のサイクロデキストランであるＣＩ−７〜ＣＩ−１２についても、従来から抗齲蝕作用があることが知られていることから、上記新規低分子サイクロデキストラン、上記新規高分子サイクロデキストランおよびＣＩ−７〜ＣＩ−１２からなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物（ＣＩ混合物）も、抗齲蝕剤の有効成分として用いることができる。
上記新規低分子サイクロデキストラン、上記新規高分子サイクロデキストランおよびＣＩ−７〜ＣＩ−１２からなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物（ＣＩ混合物）は、（Ａ）上記新規低分子サイクロデキストラン（ＣＩ−５およびＣＩ−６のいずれか、あるいは両方）と既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜１２のいずれか、あるいは２種類以上）；（Ｂ）上記新規高分子サイクロデキストラン（ＣＩ−１３〜３３のいずれか、あるいは２種類以上）と既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜１２のいずれか、あるいは２種類以上）；（Ｃ）上記新規低分子サイクロデキストラン（ＣＩ−５およびＣＩ−６のいずれか、あるいは両方）と上記新規高分子サイクロデキストラン（ＣＩ−１３〜３３のいずれか、あるいは２種類以上）と既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜１２のいずれか、あるいは２種類以上）、の組み合わせが挙げられる。
【００２８】
このようなＣＩ混合物は、前記本発明の製造方法によって得られるＣＩ単品を適宜混合して調製することができるが、上記（Ｃ）の組み合わせのＣＩ混合物を所望する場合は、前記本発明の製造方法で説明したＨＰＬＣの前段階であるＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジに通しただけのＣＩ標品を用いることができる。このＣＩ標品には、極低分子から極高分子まで様々な分子量のＣＩが混合しており、ごくわずかの直鎖のオリゴ糖も含まれている。
【００２９】
これらのサイクロデキストラン混合物の抗齲蝕作用は、例えば、後述の実施例に示すように、ｐＨ７．０、温度３７℃の条件下、０．２％もしくはそれ以上の濃度で、ショ糖１０％存在下における齲蝕菌であるミュータンス連鎖球菌のグルコシルトランスフェラーゼが歯垢の原因となるグルカンを合成する作用を阻害することによって明らかである。
このように、当該新規低分子サイクロデキストランから新規高分子サイクロデキストランまでの幅広い分子量のサイクロデキストランからなる混合物を、抗齲蝕剤の有効成分として利用することができる。
【００３０】
さらに、塩基性顔料であるビクトリアブルーに対する包接試験の結果、本発明に係る新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストラン、および既知のサイクロデキストランであるＣＩ−７〜ＣＩ−１２からなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物（ＣＩ混合物）は、有効にビクトリアブルーを包接する作用を有する。しかも、これらのサイクロデキストランは、等量以下の水に溶解する極めて高い水溶性を示す。
これらのＣＩ混合物の包接能は、例えば、後述の実施例に示すように、２５℃下、０．１％もしくはそれ以上の濃度で、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の０．３２ｍＭの濃度のビクトリアブルーの青色の褪色を抑制することができることによって明らかである。
尚、ＣＩ混合物の濃度を変えることにより目的の物質を包接する時間を調節することができる。例えば、ＣＩ混合物の濃度を１０倍とすることにより、ビクトリアブルーを包接する時間を４〜５倍程度変えることができる。このような濃度の変化による包接時間の調節は、ＣＩ混合物の高い水溶性により、容易となるものである。
このように、新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストラン、および既知のサイクロデキストランであるＣＩ−７〜ＣＩ−１２からなる群から選ばれる２種以上のサイクロデキストランの混合物（ＣＩ混合物）は、包接能を有する水溶性環状オリゴ糖組成物の有効成分として利用することができる。
【００３１】
以上説明したように、本発明に係る新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストランは、これらの混合物、或いは既知のサイクロデキストランとの混合物として優れた抗齲蝕作用および包接能を有することから、食品、医薬品、化成品に応用することができる。
【００３２】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
以下の手順により、新規低分子サイクロデキストランや新規高分子サイクロデキストランを生産する菌株を取得した。
市販の黒糖を入手し、５ｇを滅菌水４５ｍＬに懸濁させた。該懸濁液を１リットル中にブルーデキストラン（ファルマシア社製）２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、寒天（バクト社製）１５ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した平板培地に滅菌コンラージ棒で塗抹して３０℃で１晩から３日間培養し、平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解によるハローを形成しているコロニーをデキストラナーゼ生産株として一次スクリーニングした。
上記のようにして取得したコロニーを白金耳で採り、再び新鮮な上記の０．２％ブルーデキストラン平板培地に塗抹し、３０℃で１晩から２日間培養する操作をさらに２回繰り返して目的とする菌株を純粋分離した。
【００３４】
試験管に、０．５％デキストランＴ４０（ファルマシア社製）、０．５％酵母エキス（バクト社製）、１％トリプトン（バクト社製）、１％ＮａＣｌ、２％寒天を加えた組成の培地を加え、１２１℃で２０分オートクレーブした後、斜めに静置し、室温で固めて調製した保存培地とした。この保存培地に上記で得られた菌株を白金耳を用いて画線した。これを３０℃で２日間培養し、保存菌株とした。
この保存菌株の１白金耳を、上記の０．５％デキストランＴ４０（ファルマシア社製）を含む液体培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌したものに接種し、振盪しながら３０℃で２４時間培養した。
【００３５】
次いで、上記菌株を、１リットル中にデキストランＴ４０（ファルマシア社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で一晩から２日間振盪培養した後に、菌体を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）で２０分間）で集め、得られた菌体をいったん−８０℃で凍結し、これに界面活性剤Ｂ−ＰＥＲＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）３ｍＬを加えて溶菌し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液に、最終濃度が４％になるようにデキストランＴ４０（ファルマシア社製）１．６ｇを、最終濃度が２０ｍＭになるようにＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１２ｇを、さらに最終濃度が８０ｍＭとなるように酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、全量が４０ｍＬになるように調整し、４０℃で２４〜４８時間緩やかに振盪しながら反応を行った。
【００３６】
１００℃で１０分間加熱して反応を終了させた後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の２培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。
【００３７】
上記方法で得た反応液にＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にて３０℃で１２時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖またはデキストランをすべてグルコースまで分解した。尚、ＨＢＤａｓｅは、特開２００１−０５４３８２号記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１０）の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体の培養物から得られたものを使用した。
これを１００℃で１０分間加熱後冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。
このようにして得た遠心上清を逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖またはデキストランを取り除いた。次いで、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。
【００３８】
このエタノール濃縮画分から遠心濃縮機またはロータリーエバポレーターによってエタノールを取り除き、次いで凍結乾燥させた後、５０％アセトニトリルに溶かして１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ごみを取り除いた。
【００３９】
遠心後の反応液を、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５０％アセトニトリルにより流速１ｍＬ／分で分離し、噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）および分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて分析し、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖のピークがＣＩ−７よりも前に溶出する、またはＣＩ−１２よりも後ろに溶出するものを選抜することにより取得した。
【００４０】
上記の取得方法を実施した結果、本発明者らは、下記の２菌株を取得した。
第一の菌株が生産するＨＢＤａｓｅ非分解性オリゴ糖の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による測定結果を図１及び２に示す。図１及び２から明らかなように、第一の菌株についてはＣＩ−１２よりも後ろのリテンションタイムにオリゴ糖ピーク１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３が観察できることから、この菌株は、グルコース１３〜３３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランの生産能を有することが明らかとなった。
【００４１】
一方、第二の菌株が生産するＨＢＤａｓｅ非分解性オリゴ糖の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による測定結果を図３及び４に示す。図３及び４から明らかなように、第二の菌株についてはＣＩ−１２よりも後ろのリテンションタイムにオリゴ糖ピーク１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３が観察できることから、この菌株は、グルコース１３〜２３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規高分子サイクロデキストランの生産能を有することが明らかとなった。
また、第二の菌株について図３及び４に痕跡程度観察できるピーク５と６を集め、Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いてＨＰＬＣにより５５％アセトニトリルで溶出すると、図５に示すようにＣＩ−７を示すピーク７よりも早いリテンションタイムに２つのピーク５と６が検出される。このことから、この菌株は、グルコース５または６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる新規低分子サイクロデキストランの生産能を有することが明らかとなった。
そこで、第一の菌株を５９１Ｋ株、第二の菌株を５９８Ｋ株として、以下の実施例に供した。
【実施例２】
【００４２】
実施例１で得られた２菌株について、それぞれ寒天平板培地上でのコロニー形態、顕微鏡観察による細胞形態、グラム染色、胞子の有無、鞭毛による運動の有無およびカタラーゼ、オキシダーゼ、ブドウ糖の酸化発酵（ＯＦ）などの観察・試験（細菌同定第一段階試験）を行った。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
2005192510.tif 000002
【００４４】
表１から明らかなように、グラム染色陽性、カタラーゼ反応陽性、好気条件下での生育性を示す有芽胞桿菌で、Ｂａｃｉｌｌｕｓに類似の性状を示すと考えられ、いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｇｒｏｕｐ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍであると分類同定した。
【００４５】
上記２菌株をそれぞれＬＢ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＮＪ，ＵＳＡ）＋寒天培地に植菌し、３０℃で１日培養した。培養物より採取した菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＰｒｅｐＭａｎ  Ｍｅｔｈｏｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｗｅｂｓｉｔｅ／ｊｐ／ｈｏｍｅ／ｉｎｄｅｘ＿ｇ．ｊｓｐ）を使用した。
抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより１６Ｓ  リボソーマルＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５´末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、塩基配列をシーケンスして解析に使用した。ＰＣＲ産物の精製、サイクルシーケンスには、ＭｉｃｒｏＳｅｑ  ５００  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
サーマルサイクラーには、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＤＮＡシーケンサーには、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
また、ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの操作に関しては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３０８１３２  Ｒｅｖ．Ａ）に従った。
【００４６】
得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率の上位１０株を決定した。さらに検索された上位１０株と検体の１６Ｓ  ｒＤＮＡを用いて近隣接合法により分子系統樹を作成し、検体の近縁種および帰属分類群の検討を行った。相同性検索および系統樹の作成には、Ｍｉｃｒｏｓｅｑ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１）を、相同性検索を行う際のデータベースとしてＭｉｃｒｏｓｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＭｉｃｒｏＳｅｑ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙでの相同率が９７％以下であった場合は、ＢＬＡＳＴを用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対して相同性検索を行った。
配列表の配列番号１に５９１Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号２に５９８Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列をそれぞれ示す。
【００４７】
Ｍｉｃｒｏｓｅｑを用いた解析の結果、５９１Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列は相同率８６．８０％でＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡに最も高い相同性を、５９８Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列は相同率８３．５８％でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｅｈｉｍｅｎｓｉｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡに最も高い相同性を示した。
【００４８】
ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋに対する相同性検索の結果、５９１Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは９７．４％でＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＪ０１１３２７株の１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示し、５９８Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは９８．４％でＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ  ＡＰ−３７株に対し最も高い相同性を示した。
一方、分子系統樹では、図６に示す通り、５９１Ｋ株はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａの１６Ｓ  ｒＤＮＡとクラスターを形成したが、帰属種の推定に有効な近縁種は示されなかった。また、５９８Ｋ株は単独で枝を形成した。
以上の結果から、現時点では、５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡと一致する塩基配列は登録されていないと考えられる。これら２株はいずれもＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に帰属する菌株とすることが妥当であると結論された。
【実施例３】
【００４９】
本実施例３では、上記実施例２でパエニバチルス属に帰属する菌株であることが明らかとなったパエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株を用いて新規低分子サイクロデキストラン、新規高分子サイクロデキストランを含むサイクロデキストランの生産を行った。
【００５０】
（１）実施例１の（１）において取得した保存菌株、すなわち、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株の各保存菌株の１白金耳を、それぞれ実施例１で用いたのと同様の、０．５％デキストランＴ４０（ファルマシア社製）を含む液体培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌したものに接種し、振盪しながら３０℃で２４時間培養した。
【００５１】
（２）次いで、上記菌株を、１リットル中にデキストランＴ４０（ファルマシア社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で一晩から２日間振盪培養した後に、菌体を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）で２０分間）で集め、得られた菌体をいったん−８０℃で凍結し、これに界面活性剤Ｂ−ＰＥＲＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）３ｍＬを加えて溶菌し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液に、最終濃度が４％になるように、デキストランＴ４０（ファルマシア社製）１．６ｇおよび最終濃度が２０ｍＭになるように、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１２ｇおよび８０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、全量が４０ｍＬになるように調整し、４０℃で２４〜４８時間緩やかに振盪しながら反応を行った。
さらに、粗酵素液として菌体を取り除いた培養液も用意した。この粗酵素液については、最終濃度が２％になるようにデキストランＴ４０（ファルマシア社製）を、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを、さらに、４０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、４０℃で２４〜４８時間緩やかに振盪しながら反応を行って前記反応液と合わせた。
【００５２】
次いで、１００℃で１０分間加熱して反応を終了させた後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清に体積の２培量のエタノールを加え、よく攪拌した後、再び８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清のエタノールをロータリーエバポレーターによって取り除いた。
【００５３】
（３）上記方法で得た反応液にＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にて３０℃で１２時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖またはデキストランをすべてグルコースまで分解した。尚、ＨＢＤａｓｅは、特開２００１−０５４３８２号記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１０）の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体の培養物から得られたものを使用した。
これを１００℃で１０分間加熱後冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【００５４】
（４）このようにして得た遠心上清を逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖またはデキストランを取り除いた。次いで、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。これを遠心濃縮機またはロータリーエバポレーターによってエタノールを取り除き、次いで凍結乾燥させた後、５０％アセトニトリルに溶かして１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ごみを取り除いた。
【００５５】
（５）上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（２１．５ｍｍ×３０ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルにより流速６ｍＬ／分で分離し、フラクションコレクターＤＣ１５００（東京理科機器社製）で６ｍＬずつ分取分画した。それぞれのフラクション（画分）を高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルにより流速１ｍＬ／分で分離し、噴霧蒸発発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）と分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖（ＣＩと推定される。）を含むフラクションがどれであるかを、図１〜５を参照しながら探した。
その結果、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株については、ピーク１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７（それぞれ順にＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２、ＣＩ−１３、ＣＩ−１４、ＣＩ−１５、ＣＩ−１６、ＣＩ−１７を含むと推定される）の各フラクションを、同５９８Ｋ株についてはこれらのピークの他、ピーク７、８、および９（それぞれ順にＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９を含むと推定される。）の各フラクションを集めて、ロータリーエバポレーターで濃縮し、次いで凍結乾燥して、各フラクションに含まれるオリゴ糖を得た。
【００５６】
こうして得られたオリゴ糖がＣＩであるかどうかを確認するため、１３Ｃ  ＮＭＲにより構造を解析した。
具体的には、各オリゴ糖を、１〜１．５ｍｇ／０．６ｍＬの濃度のオリゴ糖溶液になるように重水（Ｄ２Ｏ）（アルドリッチ社製）に溶かし、指標として０．０２５％３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＳＳ）を加え、６００ＭＨｚのＮＭＲ装置（ＤＲＸ６００）（Ｂｒｕｋｅｒ社製）により２９８Ｋで、完全でカップリングの条件で１３Ｃ一次元スペクトルを測定した。
対照として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ３５０Ｋ株（特許文献２参照）が生産するＣＩ−１０について、同じ条件で１３Ｃ  ＮＭＲにより解析した。尚、この３５０Ｋ株が生産するＣＩ−１０については、既に構造解析がなされ、その結果、１０個のグルコースがα−１，６結合で環状に結合した構造をしていることが明らかとなっている。
パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株および同５９８Ｋ株の１３Ｃ  ＮＭＲの結果を、それぞれ図７および図８に示す。
【００５７】
図７に示すように、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するオリゴ糖のうち、ピーク１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６の各フラクションに含まれるものに含まれるものについては、対照であるＣＩ−１０と全く同様のα−１，６結合のグルコースを示すシグナルのみ現れた。
また、図８に示すように、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するオリゴ糖のうち、ピーク７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６の各フラクションに含まれるものについては、対照であるＣＩ−１０と全く同様のα−１，６結合のグルコースを示すシグナルのみ現れた。
以上の結果から、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株および同５９８Ｋ株が生産するオリゴ糖は、グルコース分子がα−１，６結合により結合した環状オリゴ糖、すなわちサイクロデキストランであることが明らかになった。
【実施例４】
【００５８】
次に、前記実施例３で得られた各オリゴ糖の質量分析を行った。
各オリゴ糖の凍結乾燥標品それぞれ０．１ｍｇ以下をメタノール／Ｈ２Ｏ／酢酸＝４９／４９／２の割合に溶解し、ブルカー・ダルトニクス社製ＡｐｅｘＩＩ  ７０ｅを用いてＳＥＭ法で質量分析を行った。
パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するオリゴ糖のうち、ピーク１０、１１、１２、１３、１４、および１５の各フラクションに含まれるものの質量分析の結果を図９〜１１に、５９８Ｋ株が生産するオリゴ糖のうち、ピーク７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の各フラクションに含まれるものの質量分析の結果を図１２〜１７に示す。
【００５９】
サイクロデキストランは、同じグルコース分子よりなる直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもＨ２Ｏ分子が１分子少ないことから、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、ＣＩ−７が１１３４、ＣＩ−８が１２９６、ＣＩ−９が１４５８、ＣＩ−１０が１６２０、ＣＩ−１１が１７８２、ＣＩ−１２が１９４４、ＣＩ−１３が２１０６、ＣＩ−１４が２２６８、ＣＩ−１５が２４３０、ＣＩ−１６が２５９２、ＣＩ−１７が２７５４と計算される。
質量分析の結果、分子量の小さいピーク（５９１Ｋ株についてはピーク１０および１１の、５９８Ｋ株についてはピーク７、８、９、１０および１１）の各フラクションに含まれるオリゴ糖は、１価イオン［Ｍ＋Ｈ］＋（分子量より水素１分子が多い値を示す）が観察された。一方、分子量の大きい（５９１Ｋ株についてはピーク１２、１３、１４および１５の、５９８Ｋ株についてはピーク１２、１３、１４、１５および１６）に含まれる各オリゴ糖については、１価イオンは観察されなかったが、２価イオン［Ｍ＋２Ｈ］＋（分子量より水素２分子が多い値の半分の値を示す）が観察された。５９８Ｋ株のピーク１７については、１価のイオンは観察されなかったが、２価のＮａイオン［Ｍ＋２Ｎａ］＋（分子量よりナトリウム２分子が多い値の半分の値を示す）が観察された。
【００６０】
これらを踏まえると、図９〜１７から明らかなように、いずれの菌株においてもピーク７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の各フラクションに含まれる各オリゴ糖の質量分析による推定分子量は、ピーク７がＣＩ−７、ピーク８がＣＩ−８、ピーク９がＣＩ−９、ピーク１０がＣＩ−１０、ピーク１１がＣＩ−１１、ピーク１２がＣＩ−１２、ピーク１３がＣＩ−１３、ピーク１４がＣＩ−１４、ピーク１５がＣＩ−１５、ピーク１６がＣＩ−１６、ピーク１７がＣＩ−１７の分子量に一致した。
【００６１】
前記実施例３の１３Ｃ  ＮＭＲ分析、および前記実施例４の質量分析の結果、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するピーク１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６の各フラクションに含まれるオリゴ糖、および同５９８Ｋ株が原料のデキストランより生産するピーク７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７の各フラクションに含まれるオリゴ糖は、すべてグルコースがα−１，６結合で環状に結合した環状イソマルトオリゴ糖、すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることが判明した。
ピーク７  ：  Ｃ４２Ｈ７０Ｏ３５
ピーク８  ：  Ｃ４８Ｈ８０Ｏ４０
ピーク９  ：  Ｃ５４Ｈ９０Ｏ４５
ピーク１０：  Ｃ６０Ｈ１００Ｏ５０
ピーク１１：  Ｃ６６Ｈ１１０Ｏ５５
ピーク１２：  Ｃ７２Ｈ１２０Ｏ６０
ピーク１３：  Ｃ７８Ｈ１３０Ｏ６５
ピーク１４：  Ｃ８４Ｈ１４０Ｏ７０
ピーク１５：  Ｃ９０Ｈ１５０Ｏ７５
ピーク１６：  Ｃ９６Ｈ１６０Ｏ８０
ピーク１７：  Ｃ１０２Ｈ１７０Ｏ８５
【００６２】
尚、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖は、直鎖構造ではなく（ＨＢＤａｓｅは全ての直鎖オリゴ糖を分解する）、α−１，６グルカン（デキストラン）から合成される極めて水溶性の高いオリゴ糖であるという観点から、サイクロデキストランであると考えられるので、１３Ｃ  ＮＭＲ分析および上記の質量分析を行っていないピーク（すなわち、５９８Ｋ株の場合はピーク５および６、ならびに各フラクションもサイクロデキストランであると推定できる。
以上の結果から、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株はＣＩ−７からＣＩ−３３超のサイクロデキストラン、すなわち既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜ＣＩ−１２）および新規高分子サイクロデキストラン（ＣＩ−１３以上）を生産する能力を有すること、および、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株はＣＩ−５からＣＩ−２３超のサイクロデキストラン、すなわち、新規低分子サイクロデキストラン（ＣＩ−５、ＣＩ−６）、既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜ＣＩ−１２）、および新規高分子サイクロデキストラン（ＣＩ−１３以上）を生産する能力を有する、新規のパエニバチルス属菌株であることが明らかになった。
【実施例５】
【００６３】
本実施例５では、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株および同５９８Ｋ株と、既知のサイクロデキストラン生産菌バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株（特許文献１）およびバチルス・エスピー３３０Ｋ株（特許文献２）との間で、生育および既存のサイクロデキストラン（既知のサイクロデキストラン（ＣＩ−７〜ＣＩ−１２））の生産性の比較を行った。
【００６４】
まず、各菌株の生育の比較を行った。
実施例１の（１）において取得した保存菌株、すなわち、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株の各保存菌株の１白金耳を、それぞれ１リットル中にブルーデキストラン（ファルマシア社製）２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、寒天（バクト社製）１５ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した平板培地に塗抹して３０℃で１晩から３日間培養した。
一方、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の各保存培地より、１白金耳を採取し、同様に培養した。
平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解によるハローを形成しているコロニーをそれぞれの菌株につき１つ採り、１リットル中にデキストランＴ−４０（ファルマシア社製）２０ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地５ｍＬに白金耳で塗抹して３０℃で２日間振盪培養し、これを前培養とした。
５０ｍＬの上記の組成の新しい培地に前培養を１％接種し、３０℃で４日間振盪培養した。１日毎に少量をサンプリングし、分光光度計で６００ｎｍの吸光度を測定した。各菌株の増殖曲線を図１８に示す。
【００６５】
図１８から明らかなように、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株の増殖は、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株、バチルス・エスピー３３０Ｋ株と同等のレベルであったが、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株の増殖は良好で、定常期の吸光度は他の株の２倍以上であった。
【００６６】
次に、各菌株のサイクロデキストラン生産性の比較を行った。
さらに、上記の各培養液を培養１日後および２日後にサンプリングし、各サンプルについて１００℃で１０分間加熱後冷却し、遠心して沈殿を取り除いた。上清にＨＢＤａｓｅを加えて最終濃度２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）とし、３０℃で１晩直鎖オリゴ糖およびデキストランの分解反応を行った後１００℃で１０分間加熱し、遠心し、沈殿を取り除いた。上清に最終濃度５０％アセトニトリルで、サンプリングした培養液から４倍希釈になるように調整した後遠心してゴミを取り除き、高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルにより流速１ｍＬ／分で分離し、噴霧蒸発光散乱検出器ＥＬＳＤ−ＬＴ（島津社製）および分析ソフトウェアＣＬＡＳＳ−ＶＰ（島津社製）を用いて分析し、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖のピークを検出した。
図１９に、各菌株における培養１日後と２日後のサイクロデキストランＣＩ−７，ＣＩ−８，ＣＩ−９，ＣＩ−１０，ＣＩ−１１，ＣＩ−１２の生産量を示す。
【００６７】
図１９から明らかなように、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株は培養１日後ではほとんどＣＩを生産しないのに比べ、パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株は著量のＣＩを生産した。また、５９８Ｋ株は、培養２日後でも抗齲蝕能が強いＣＩ−７や包接能が強いＣＩ−１０の生産量はＴ−３０４０株よりも勝っていた。
一方、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株は、高分子サイクロデキストラン生産株であるバチルス・エスピー３３０Ｋ株よりも、高分子サイクロデキストラン（ＣＩ−１０，ＣＩ−１１およびＣＩ−１２）を多量に生産し、しかも３３０Ｋ株ではほとんど生産されなかった低分子サイクロデキストラン（ＣＩ−７，ＣＩ−８およびＣＩ−９）を生産することが明らかとなった。
【実施例６】
【００６８】
次に、本発明に係るサイクロデキストラン（ＣＩ）およびそれらと既知のサイクロデキストランとの混合物（ＣＩ混合物）の機能について調べた。
はじめに、抗齲蝕能について調べた。実施例３におけるＣＩ精製法では、逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖またはデキストランを取り除いたのち、ＨＰＬＣによって直鎖のオリゴ糖を完全に取り除くと同時に分子量分画を行ったが、本実施例６では、実施例３におけるＨＰＬＣの前段階のＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ−１８カートリッジに通しただけのＣＩ標品（極低分子から極高分子まで様々な分子量のＣＩが混じった全ＣＩ混合物。ごくわずかの直鎖のオリゴ糖も含まれる。）を凍結乾燥したものについて、ストレプトコッカス・ミュータンス菌由来のグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）阻害効果について調べた。
また、この凍結乾燥標品を、さらに高速液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＤＶＰ（島津社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（２１．５ｍｍ×３００ｍｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速６ｍＬ／分で分画し、ＣＩ−７より前に溶出する画分（ＣＩ−７＞ＣＩ混合物）、ＣＩ−１２より後に溶出する画分（ＣＩ−１２＜ＣＩ混合物）も濃縮して同様にＧＴＦ阻害効果について調べた。
さらに、既知のサイクロデキストランＣＩ−９〜１２混合物についても、同様にＧＴＦ阻害効果を調べた。
【００６９】
ＧＴＦ阻害試験は、以下のようにして行った。
まず、反応液２００μｌ中に終濃度５％のスクロースを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）または２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にＣＩ標品を最終濃度０．２〜１％になるように添加した。これにＧＴＦを加え、３７℃で１８時間酵素反応を行った後、生じた不溶性グルカンを遠心で集めて該グルカンの量をフェノール硫酸法で全糖量を定量することにより測定した。
一方、対照として、実施例３で得られたＣＩ−８について、同様にＧＴＦ阻害効果を調べた。
なお、ここで用いたストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓを培養することによって得られたものである。
上記の極低分子から極高分子まで様々な分子量のＣＩが混じった全ＣＩ混合物、ＣＩ−７より低分子のＣＩ−７＞ＣＩ混合物、ＣＩ−１２より高分子のＣＩ−１２＜ＣＩ混合物、既知のサイクロデキストランＣＩ−７〜１２混合物ならびに対照としてのＣＩ−８によるＧＴＦ阻害試験の結果を図２０に示す。
【００７０】
図２０から明らかなように、全てのＣＩ混合物は、純品のＣＩ−８と同様に、０．２％もしくはそれ以上の濃度で、生成するグルカンの減少が見られたことから、ＧＴＦがグルカンを合成する作用を阻害することが分かる。
このことから、ＣＩ混合物は、極低分子から極高分子まで様々な分子量のＣＩからなるものであっても、また、低分子ＣＩ又は高分子ＣＩからなるものであっても、また、既知のＣＩのみからなるものであっても、既知のサイクロデキストランと同様に抗齲蝕性を有することが明らかである。
【００７１】
次に、ビクトリアブルーに対する包接試験により、本発明に係るサイクロデキストランおよびＣＩ混合物の包接能を調べた。
すなわち、反応液５０μｌ中に終濃度０．３２ｍＭのビクトリアブルーＢ（ワコー社製）、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、実施例３で得られたＣＩ−１３、ＣＩ−１４、ＣＩ−１５、またはＣＩ−１６を１．２ｍＭ、あるいはＣＩ混合物０．１％または１％を加え、室温で保持して６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ６２０）を測定した。
【００７２】
その結果、図２１に示したように、ＣＩ−１３、ＣＩ−１４、ＣＩ−１５、およびＣＩ−１６については、無添加の場合に比べてわずかな吸光度減少の抑制しか見られなかったが、ＣＩ混合物は０．１％で７０分以上、１％では１８０分経過した後も、反応開始時に比較して６０％以上の吸光度を示した。ＣＩ−１０については、既にビクトリアブルーに対する包接能が報告されているが（特許文献２）、ＣＩ混合物も有効に包接物質として利用できることが明らかとなった。しかも、添加するＣＩの濃度を高くすることにより、ビクトリアブルーの退色を抑制する時間を長くできることから、ＣＩ混合物の濃度を変えることにより、包接する時間の調整が可能であることが分かった。
このようにＣＩ混合物が包接能を有する理由は分からないが、ＣＩ混合物中にこれまで知られていなかった極低分子および極高分子のＣＩが含まれていることから、これらの中に包接能を有するＣＩが存在し、ＣＩ−１０同様ＣＩ混合物の包接能に関与している可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明により新規な低分子サイクロデキストランおよび高分子サイクロデキストランが提供される。これらのサイクロデキストランは、パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株を培養することにより得られる。
パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株は、従来の高分子サイクロデキストラン生産株と比べてより高分子のサイクロデキストランを生産するので、本発明の新規高分子サイクロデキストランの生産に適している。
パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株は、増殖が従来のサイクロデキストラン生産菌よりも２倍ほど良好で、従来のサイクロデキストラン高生産菌の半分の培養時間で著量のサイクロデキストランを生産するサイクロデキストラン高生産菌であり、また、従来のサイクロデキストラン生産菌よりも低分子のサイクロデキストランを生産するので、本発明の新規低分子サイクロデキストランの生産に適している。また、５９８株は、新規高分子のサイクロデキストランの他、既知のサイクロデキストランも著量生産するので、広範囲の分子量のサイクロデキストランの生産に適している。
【００７４】
しかも、本発明のパエニバチルス属菌株が生産する新規低分子サイクロデキストランや、新規高分子サイクロデキストランの他、これらと既知のサイクロデキストランとの混合物は、抗齲蝕剤の有効成分として利用できる。また、このようなサイクロデキストラン混合物は、分子量分画を行わなくとも包接能を持ち、かつ等量以下の水に溶解する高い水溶性であることから、食品、医薬品、化成品などに応用できる。
ＣＩ混合物の濃度を変えることにより目的の物質を包接する時間を調節することができるが、ＣＩ混合物の高い水溶性により、このような調節が容易である。また、サイクロデキストリンよりも極めて水溶性が高いために、不溶性物質の包接による可溶化の効果がサイクロデキストリンよりも高いことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。（ａ）は分析開始後０〜１２０分の結果を、（ｂ）は同０〜１５分の結果を示す。
【図２】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。（ａ）は分析開始後８〜２５分の結果を、（ｂ）は同２０〜１２０分の結果を示す。
【図３】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。（ａ）は分析開始後０〜１２０分の結果を、（ｂ）は同０〜１１分の結果を示す。
【図４】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。（ａ）は分析開始後０〜２３分の結果を、（ｂ）は同１９〜１２０分の結果を示す。
【図５】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖のうち、リテンションタイムがＣＩ−７と同じもの（（ｃ）：ピーク７）およびこれより早いオリゴ糖（（ａ）：ピーク５、（ｂ）：ピーク６）を示すＨＰＬＣ分析の図である。
【図６】（ａ）パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株ならびに（ｂ）同５９８Ｋ株の分子系統樹を示す図である。
【図７】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖ピーク１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および既知のサイクロデキストランＣＩ−１０について１３Ｃ  ＮＭＲ分析した結果を示す図である。
【図８】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖ピーク７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６について１３Ｃ  ＮＭＲ分析した結果を示す図である。
【図９】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１０、（ｂ）ピーク１１について質量分析した結果を示す図である。
【図１０】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１２、（ｂ）ピーク１３について質量分析した結果を示す図である。
【図１１】パエニバチルス・エスピー５９１Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１４、（ｂ）ピーク１５について質量分析した結果を示す図である。
【図１２】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク７、（ｂ）ピーク８について質量分析した結果を示す図である。
【図１３】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク９、（ｂ）ピーク１０について質量分析した結果を示す図である。
【図１４】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１１、（ｂ）ピーク１２について質量分析した結果を示す図である。
【図１５】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１３、（ｂ）ピーク１４について質量分析した結果を示す図である。
【図１６】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖（ａ）ピーク１５、（ｂ）ピーク１６について質量分析した結果を示す図である。
【図１７】パエニバチルス・エスピー５９８Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖ピーク１７について質量分析した結果を示す図である。
【図１８】パエニバチルス５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の増殖曲線を示す図である。
【図１９】パエニバチルス５９１Ｋ株、同５９８Ｋ株、バチルス・サーキュランスＴ−３０４０株、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の培養液中のサイクロデキストラン生産量を示す図である。（ａ）は１日培養上清の結果を、（ｂ）は２日培養上清の結果を示す。
【図２０】（ａ）既知サイクロデキストランＣＩ−８、（ｂ）全ＣＩ混合物、（ｃ）ＣＩ−７＞ＣＩ混合物、（ｄ）ＣＩ−１２＜ＣＩ混合物、及び（ｅ）ＣＩ−７〜１２混合物のそれぞれのＧＴＦ阻害作用を示した図である。
【図２１】ＣＩ−１３、ＣＩ−１４、ＣＩ−１５、およびＣＩ−１６、並びに既知サイクロデキストランと新規低分子サイクロデキストラン・新規高分子サイクロデキストランの混合物のビクトリアブルーの包接能を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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