(57)【要約】      （修正有）【課題】シロイヌナズナの全ゲノム領域にわたって設計された、シロイヌナズナの系統を識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のセットを提供すること。【解決手段】シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のセットであって、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって設計された表１〜表３２に記載の特定の塩基配列を有するプライマー対の全セット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対の全セットであって、
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって設計された表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対の全セット。
【請求項２】
シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対であって、
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって設計された表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対から選択される何れか１のプライマー対。
【請求項３】
シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対から選択される複数のプライマー対から構成され、かつシロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって所定の間隔で設計されたプライマー対のサブセット。
【請求項４】
シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
以下の組み合わせから構成されるプライマー対のサブセット：
Ａ）シロイヌナズナ第一染色体のゲノムＤＮＡをａ個（ａは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第一染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１〜表１０に記載のプライマー番号１〜１０９のプライマー対を前記領域に対応させたａ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ａ個のプライマー対；
Ｂ）シロイヌナズナ第二染色体のゲノムＤＮＡをｂ個（ｂは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第二染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１１〜表１５に記載のプライマー番号１１０〜１６８のプライマー対を前記領域に対応させたｂ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｂ個のプライマー対；
Ｃ）シロイヌナズナ第三染色体のゲノムＤＮＡをｃ個（ｃは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第三染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１６〜表２０に記載のプライマー番号１６９〜２２８のプライマー対を前記領域に対応させたｃ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｃ個のプライマー対；
Ｄ）シロイヌナズナ第四染色体のゲノムＤＮＡをｄ個（ｄは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第四染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２１〜表２４に記載のプライマー番号２２９〜２７４のプライマー対を前記領域に対応させたｄ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｄ個のプライマー対；および
Ｅ）シロイヌナズナ第五染色体のゲノムＤＮＡをｅ個（ｅは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第五染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２５〜表３２に記載のプライマー番号２７５〜３６６のプライマー対を前記領域に対応させたｅ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｅ個のプライマー対。
【請求項５】
シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
以下の組み合わせから構成されるプライマー対のサブセット：
ａ）シロイヌナズナ第一染色体の北側領域に設計された表１〜表３に記載のプライマー番号１〜３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｂ)シロイヌナズナ第一染色体の中央領域に設計された表３〜表５に記載のプライマー番号３１〜６０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｃ）シロイヌナズナ第一染色体の南側領域に設計された表６〜表１０に記載のプライマー番号６１〜１０９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｄ）シロイヌナズナ第二染色体の北側領域に設計された表１１〜表１２に記載のプライマー番号１１０〜１３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｅ）シロイヌナズナ第二染色体の中央領域に設計された表１２〜表１４に記載のプライマー番号１３１〜１５０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｆ）シロイヌナズナ第二染色体の南側領域に設計された表１４〜表１５に記載のプライマー番号１５１〜１６８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｇ）シロイヌナズナ第三染色体の北側領域に設計された表１６〜表１７に記載のプライマー番号１６９〜１８８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｈ）シロイヌナズナ第三染色体の中央領域に設計された表１７〜表１９に記載のプライマー番号１８９〜２０８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｉ）シロイヌナズナ第三染色体の南側領域に設計された表１９〜表２０に記載のプライマー番号２０９〜２２８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｊ）シロイヌナズナ第四染色体の北側領域に設計された表２１〜表２２に記載のプライマー番号２２９〜２４３のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｋ）シロイヌナズナ第四染色体の中央領域に設計された表２２〜表２３に記載のプライマー番号２４４〜２５９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｌ）シロイヌナズナ第四染色体の南側領域に設計された表２３〜表２４に記載のプライマー番号２６０〜２７４のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｍ）シロイヌナズナ第五染色体の北側領域に設計された表２５〜表２７に記載のプライマー番号２７５〜３０５のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｎ）シロイヌナズナ第五染色体の中央領域に設計された表２７〜表３０に記載のプライマー番号３０６〜３３６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；および
ｏ）シロイヌナズナ第五染色体の南側領域に設計された表３０〜表３２に記載のプライマー番号３３７〜３６６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対。
【請求項６】
シロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、
（１）変異遺伝子を有するシロイヌナズナ変異体と、該変異体とは異なる系統の野生型シロイヌナズナとを交配し、第一世代を得る工程と、
（２）得られた前記第一世代を自家受粉させて複数の第二世代を得る工程と、
（３）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が劣性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記変異体の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が優性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記野生型の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程と、
（４）前記工程（３）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、請求項３〜５の何れか１項に記載のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットの各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（３）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（５）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記変異体の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記野生型の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、更に以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（６）表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対のなかから、前記工程（５）で決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に設計されているプライマー対を複数選択する工程と、
（７）前記工程（３）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記工程（６）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（３）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（８）前記工程（７）で同定された結果に基づいて、前記複数の第二世代が有する染色体のなかから、前記変異体の系統に由来する部位と前記野生型に由来する部位の両方を有するキメラ染色体を複数選択する工程と、
（９）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（７）で同定された結果から、前記キメラ染色体のそれぞれにおいて、前記野生型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（７）で同定された結果から、前記キメラ染色体のそれぞれにおいて、前記変異型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程と、
（10）前記複数のキメラ染色体において前記工程（９）で決定された各染色体領域の何れにも該当しない染色体領域に、変異遺伝子が存在すると決定する工程。
【請求項８】
請求項７に記載のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、更に以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（11）前記工程（10）で決定された染色体領域の範囲内で組換えを起こしたキメラ染色体を有する第二世代を、前記工程（１）および（２）により調製される第二世代のなかから複数選択する工程と、
（12）表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対のなかから、前記工程（10）で決定された染色体領域を挟むように設計されているプライマー対および前記工程（10）で決定された染色体領域内に設計されているプライマー対を複数選択する工程と、
（13）前記工程（11）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記工程（12）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（11）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（14）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（11）で選択された複数の第二世代のなかから、変異型の表現型を示す個体を複数選抜する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（11）で選択された複数の第二世代のなかから、野生型の表現型を示す個体を複数選抜する工程と、
（15）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（13）で同定された結果から、前記工程（14）で選抜された個体のキメラ染色体のそれぞれにおいて、前記野生型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（13）で同定された結果から、前記工程（14）で選抜された個体のキメラ染色体のそれぞれにおいて、前記変異型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程と、
（16）前記複数のキメラ染色体において前記工程（15）で決定された各染色体領域の何れにも該当しない染色体領域に、変異遺伝子が存在すると決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シロイヌナズナのマッピング用ＰＣＲプライマー対のセット、およびそれを用いた変異遺伝子のマッピング方法に関する。本発明のＰＣＲプライマー対のセットは、シロイヌナズナの新規変異株の原因遺伝子をマップベースでクローニングするときに有用であり、マッピングの操作を簡便に機械的に行うことを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
対象植物の種々の現象に関連する遺伝子を同定する際、まずシロイヌナズナの変異株を使って該当遺伝子を同定し、それと同等の機能を有する対象植物の遺伝子を、ホモロジーをもとに得ることが一般に行われている。そのため、シロイヌナズナの変異株の原因遺伝子について、その染色体上での位置（遺伝子座）をできるだけ早く正確に同定することが重要である。
【０００３】
近年、遺伝子の染色体上での位置を決定すること（すなわちマッピング）は、シロイヌナズナの２系統間でのＤＮＡ配列の多型を利用して行われている（非特許文献１（モデル植物の実験プロトコール  秀潤社）、非特許文献２（植物のゲノム研究プロトコール  秀潤社））。この手法において、多型は、シロイヌナズナの各系統を識別する情報を与えるとともに、染色体上での位置情報を与える役割を果たす。
【０００４】
しかし、従来、シロイヌナズナの変異株の原因遺伝子をマッピングする際、多型を検出するためのＰＣＲプライマーの設計がその都度行われていた。しかし、ここで行われるＰＣＲプライマーの設計は、あくまで個々の遺伝子に対応したものであり、同定したい遺伝子が変われば、ＰＣＲプライマーの設計から常にやり直す必要があった。
【０００５】
【非特許文献１】モデル植物の実験プロトコール  秀潤社
【０００６】
【非特許文献２】植物のゲノム研究プロトコール  秀潤社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、シロイヌナズナの全ゲノム領域にわたって設計された、シロイヌナズナの各系統をその多型に基いて識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のセットを提供することを目的とする。また本発明は、前記マッピング用ＰＣＲプライマー対のセットを用いた、迅速かつ簡便な変異遺伝子のマッピング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は、以下に記載の手段[１]〜[８]を提供する。
【０００９】
[１]  シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対の全セットであって、
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって設計された表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対の全セット。
[２]  シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対であって、
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって設計された表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対から選択される何れか１のプライマー対。
[３]  シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対から選択される複数のプライマー対から構成され、かつシロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって所定の間隔で設計されたプライマー対のサブセット。
【００１０】
[４]  シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
以下の組み合わせから構成されるプライマー対のサブセット：
Ａ）シロイヌナズナ第一染色体のゲノムＤＮＡをａ個（ａは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第一染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１〜表１０に記載のプライマー番号１〜１０９のプライマー対を前記領域に対応させたａ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ａ個のプライマー対；
Ｂ）シロイヌナズナ第二染色体のゲノムＤＮＡをｂ個（ｂは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第二染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１１〜表１５に記載のプライマー番号１１０〜１６８のプライマー対を前記領域に対応させたｂ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｂ個のプライマー対；
Ｃ）シロイヌナズナ第三染色体のゲノムＤＮＡをｃ個（ｃは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第三染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１６〜表２０に記載のプライマー番号１６９〜２２８のプライマー対を前記領域に対応させたｃ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｃ個のプライマー対；
Ｄ）シロイヌナズナ第四染色体のゲノムＤＮＡをｄ個（ｄは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第四染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２１〜表２４に記載のプライマー番号２２９〜２７４のプライマー対を前記領域に対応させたｄ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｄ個のプライマー対；および
Ｅ）シロイヌナズナ第五染色体のゲノムＤＮＡをｅ個（ｅは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第五染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２５〜表３２に記載のプライマー番号２７５〜３６６のプライマー対を前記領域に対応させたｅ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｅ個のプライマー対。
[５]  シロイヌナズナの各系統を、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物の差異により識別することが可能なマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットであって、
以下の組み合わせから構成されるプライマー対のサブセット：
ａ）シロイヌナズナ第一染色体の北側領域に設計された表１〜表３に記載のプライマー番号１〜３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｂ)シロイヌナズナ第一染色体の中央領域に設計された表３〜表５に記載のプライマー番号３１〜６０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｃ）シロイヌナズナ第一染色体の南側領域に設計された表６〜表１０に記載のプライマー番号６１〜１０９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｄ）シロイヌナズナ第二染色体の北側領域に設計された表１１〜表１２に記載のプライマー番号１１０〜１３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｅ）シロイヌナズナ第二染色体の中央領域に設計された表１２〜表１４に記載のプライマー番号１３１〜１５０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｆ）シロイヌナズナ第二染色体の南側領域に設計された表１４〜表１５に記載のプライマー番号１５１〜１６８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｇ）シロイヌナズナ第三染色体の北側領域に設計された表１６〜表１７に記載のプライマー番号１６９〜１８８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｈ）シロイヌナズナ第三染色体の中央領域に設計された表１７〜表１９に記載のプライマー番号１８９〜２０８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｉ）シロイヌナズナ第三染色体の南側領域に設計された表１９〜表２０に記載のプライマー番号２０９〜２２８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｊ）シロイヌナズナ第四染色体の北側領域に設計された表２１〜表２２に記載のプライマー番号２２９〜２４３のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｋ）シロイヌナズナ第四染色体の中央領域に設計された表２２〜表２３に記載のプライマー番号２４４〜２５９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｌ）シロイヌナズナ第四染色体の南側領域に設計された表２３〜表２４に記載のプライマー番号２６０〜２７４のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｍ）シロイヌナズナ第五染色体の北側領域に設計された表２５〜表２７に記載のプライマー番号２７５〜３０５のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｎ）シロイヌナズナ第五染色体の中央領域に設計された表２７〜表３０に記載のプライマー番号３０６〜３３６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；および
ｏ）シロイヌナズナ第五染色体の南側領域に設計された表３０〜表３２に記載のプライマー番号３３７〜３６６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対。
【００１１】
[６]  シロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、
（１）変異遺伝子を有するシロイヌナズナ変異体と、該変異体とは異なる系統の野生型シロイヌナズナとを交配し、第一世代を得る工程と、
（２）得られた前記第一世代を自家受粉させて複数の第二世代を得る工程と、
（３）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が劣性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記変異体の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が優性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記野生型の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程と、
（４）前記工程（３）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記手段[３]〜[５]の何れか１に記載のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットの各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（３）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（５）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記変異体の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記野生型の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。
[７]  上記手段[６]に記載のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、更に以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（６）表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対のなかから、前記工程（５）で決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に設計されているプライマー対を複数選択する工程と、
（７）前記工程（３）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記工程（６）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（３）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（８）前記工程（７）で同定された結果に基づいて、前記複数の第二世代が有する染色体のなかから、前記変異体の系統に由来する部位と前記野生型に由来する部位の両方を有するキメラ染色体を複数選択する工程と、
（９）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（７）で同定された結果から、前記キメラ染色体のそれぞれにおいて、前記野生型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（７）で同定された結果から、前記キメラ染色体のそれぞれにおいて、前記変異型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程と、
（10）前記複数のキメラ染色体において前記工程（９）で決定された各染色体領域の何れにも該当しない染色体領域に、変異遺伝子が存在すると決定する工程。
[８]  上記手段[７]に記載のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法であって、更に以下の工程を含むことを特徴とする方法：
（11）前記工程（10）で決定された染色体領域の範囲内で組換えを起こしたキメラ染色体を有する第二世代を、前記工程（１）および（２）により調製される第二世代のなかから複数選択する工程と、
（12）表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対のなかから、前記工程（10）で決定された染色体領域を挟むように設計されているプライマー対および前記工程（10）で決定された染色体領域内に設計されているプライマー対を複数選択する工程と、
（13）前記工程（11）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記工程（12）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（11）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（14）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（11）で選択された複数の第二世代のなかから、変異型の表現型を示す個体を複数選抜する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（11）で選択された複数の第二世代のなかから、野生型の表現型を示す個体を複数選抜する工程と、
（15）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、前記工程（13）で同定された結果から、前記工程（14）で選抜された個体のキメラ染色体のそれぞれにおいて、前記野生型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、前記工程（13）で同定された結果から、前記工程（14）で選抜された個体のキメラ染色体のそれぞれにおいて、前記変異型の系統に由来する染色体領域（すなわち変異遺伝子が存在しない領域）を決定する工程と、
（16）前記複数のキメラ染色体において前記工程（15）で決定された各染色体領域の何れにも該当しない染色体領域に、変異遺伝子が存在すると決定する工程。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のマッピング方法に従って、ある変異株とそれとは異なる系統の野生株とを交配させ、得られた第一世代を自家受粉させ、作成した第二世代の数十個体からＤＮＡを回収し、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のセットの一部をつかってＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のサイズの違いあるいはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、変異株由来の染色体部位を同定し、第二世代の最も多くにおいて変異株由来の染色体部位と同定された部位を決定することにより、変異遺伝子の染色体上のおおよその位置を決めることができる。
【００１３】
更に、変異遺伝子の染色体上のおおよその位置が決定された後、この位置の近傍に設計されている本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対を用いて、更に変異遺伝子の位置を絞り込むことができる。
【００１４】
このように、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマーセットを利用すると、シロイヌナズナの新規変異株の原因遺伝子を、ごく短期間に染色体上の約４００ｋｂ以内にマッピングすることができる。４００ｋｂの範囲には、平均４０個の遺伝子が存在する可能性が高く、これら遺伝子のなかから原因遺伝子を同定することが可能となる。従って、本発明のマッピング方法を利用して迅速かつ簡便にシロイヌナズナの原因遺伝子を同定することにより、他の植物遺伝子の機能解析が早まることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
１．シロイヌナズナのマッピング用ＰＣＲプライマー対のセット
本発明のシロイヌナズナのマッピング用ＰＣＲプライマー対のセットは、以下に記載のとおり設計された。
【００１６】
シロイヌナズナの全ゲノム配列は、既に決められている。シロイヌナズナ研究に頻繁に用いられるのはコロンビア系統とランズバーグ系統であり、コロンビア系統はThe Arabidopsis Information Research (TAIR) によりその全ゲノム塩基配列が公開されている（http://www.arabidopsis.org）。また、ランズバーグ系統の配列解読も進められており、コロンビア系統とランズバーグ系統の間で多型が見られる位置が抽出されている。このような多型の抽出は、かつてCereon Genomics社によりおこなわれ、学術研究のために公開されていた。現在はMonsant社に移管され公開されている（http://www.arabidopsis.org/Cereon/index.html）。
【００１７】
本発明では、この多型情報をもとに、ＰＣＲ法に基づいた多型検出ができるようにプライマー対を設計した。本発明では、ゲノムＤＮＡの全領域にわたってほぼ一定間隔でプライマー対を設計し、プライマー対のセットとした。すなわち、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対は、該プライマー対を用いて異なる系統のシロイヌナズナゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際、得られるＰＣＲ産物の差異あるいはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの差異によりシロイヌナズナの系統を識別することが可能である。
【００１８】
プライマーの設計は、具体的には、多型を示す塩基を含む約200〜1500bpの領域を増幅できるようにプライマーの位置を決め、コロンビア系統のゲノム配列情報に基づいてプライマーを合成した。合成したプライマーを用いて、実際にコロンビア系統およびランズバーグ系統でもＰＣＲ行うことが可能であることを確認し、更に、ＰＣＲ産物の鎖長の違いあるいはＰＣＲ産物を制限酵素処理したときの鎖長の違いによって、両系統の間で多型検出が可能であることを確認した。
【００１９】
更に本発明では、研究によく使用されるシロイヌナズナのＷs系統が、上記プライマーを用いて、コロンビア系統との間で、並びにランズバーグ系統との間で多型検出が可能であることを確認した。
【００２０】
このようにして設計された３６６組のＰＣＲプライマー対のセットを、以下の表１〜３２に示す。
【００２１】
【表１】
2005192478.tif 000002
【００２２】
【表２】
2005192478.tif 000003
【００２３】
【表３】
2005192478.tif 000004
【００２４】
【表４】
2005192478.tif 000005
【００２５】
【表５】
2005192478.tif 000006
【００２６】
【表６】
2005192478.tif 000007
【００２７】
【表７】
2005192478.tif 000008
【００２８】
【表８】
2005192478.tif 000009
【００２９】
【表９】
2005192478.tif 000010
【００３０】
【表１０】
2005192478.tif 000011
【００３１】
【表１１】
2005192478.tif 000012
【００３２】
【表１２】
2005192478.tif 000013
【００３３】
【表１３】
2005192478.tif 000014
【００３４】
【表１４】
2005192478.tif 000015
【００３５】
【表１５】
2005192478.tif 000016
【００３６】
【表１６】
2005192478.tif 000017
【００３７】
【表１７】
2005192478.tif 000018
【００３８】
【表１８】
2005192478.tif 000019
【００３９】
【表１９】
2005192478.tif 000020
【００４０】
【表２０】
2005192478.tif 000021
【００４１】
【表２１】
2005192478.tif 000022
【００４２】
【表２２】
2005192478.tif 000023
【００４３】
【表２３】
2005192478.tif 000024
【００４４】
【表２４】
2005192478.tif 000025
【００４５】
【表２５】
2005192478.tif 000026
【００４６】
【表２６】
2005192478.tif 000027
【００４７】
【表２７】
2005192478.tif 000028
【００４８】
【表２８】
2005192478.tif 000029
【００４９】
【表２９】
2005192478.tif 000030
【００５０】
【表３０】
2005192478.tif 000031
【００５１】
【表３１】
2005192478.tif 000032
【００５２】
【表３２】
2005192478.tif 000033
【００５３】
表１〜表１０は、第一染色体上に設計されたプライマー対を、染色体の北側領域（染色体ＤＮＡの５’端）から順に示す。同様に、表１１〜表１５は、第二染色体上に設計されたプライマー対を染色体の北側領域（染色体ＤＮＡの５’端）から順に示し、表１６〜表２０は、第三染色体上に設計されたプライマー対を染色体の北側領域（染色体ＤＮＡの５’端）から順に示し、表２１〜表２４は、第四染色体上に設計されたプライマー対を染色体の北側領域（染色体ＤＮＡの５’端）から順に示し、表２５〜表３２は、第五染色体上に設計されたプライマー対を染色体の北側領域（染色体ＤＮＡの５’端）から順に示す。
【００５４】
これらの表において、「ＳＳＬＰ（Simple Sequence Length Polymorphism）」は、該当するプライマー対を使用しコロンビア系統およびランズバーグ系統それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、各系統間の多型により各増幅断片の長さが異なることを意味する。すなわち、「ＳＳＬＰ」と記載されたプライマー対を使用すれば、各増幅断片の長さの違いにより、当該プライマー対が増幅可能な染色体上の部位が、どちらのシロイヌナズナの系統に由来するか決定することができる。また、「ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）」は、該当するプライマー対を使用しコロンビア系統およびランズバーグ系統それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その増幅断片を所定の制限酵素（当該表に記載）で切断した場合、各系統間の多型により各切断断片のパターン（切断断片の数および長さ）が異なることを意味する。すなわち、「ＣＡＰＳ」と記載されたプライマー対を使用すれば、各切断断片のパターンの違いにより、当該プライマー対が増幅可能な染色体上の部位が、どちらのシロイヌナズナの系統に由来するか決定することができる。ここで使用される制限酵素は、表中に「制限酵素」として記載される。
【００５５】
また、表中「Col」は、ＳＳＬＰの場合、コロンビア系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際の増幅断片のサイズ（ｂｐ）を示し、ＣＡＰＳの場合、コロンビア系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い得られた増幅断片を所定の制限酵素で切断した際の切断断片のサイズ（ｂｐ）を示す。同様に、表中「Ler」は、ＳＳＬＰの場合、ランズバーグ系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際の増幅断片のサイズ（ｂｐ）を示し、ＣＡＰＳの場合、ランズバーグ系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い得られた増幅断片を所定の制限酵素で切断した際の切断断片のサイズ（ｂｐ）を示す。同様に、表中「ＷＳ」は、ＳＳＬＰの場合、Ｗｓ系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った際の増幅断片のサイズ（ｂｐ）を示し、ＣＡＰＳの場合、Ｗｓ系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い得られた増幅断片を所定の制限酵素で切断した際の切断断片のサイズ（ｂｐ）を示す。
【００５６】
なお、表中に記載される断片サイズ（ｂｐ）は、実験により得られたおおよその鎖長を表している。ここで断片サイズ（ｂｐ）は、正確な鎖長を表すために表示したのではなく、各系統の間で断片サイズのパターンに差が生じることを示す目的で表示した。
【００５７】
表１〜３２に記載の各プライマー対は、これを使用してシロイヌナズナの各系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うだけで、あるいはＰＣＲを行った後に必要に応じて各ＰＣＲ産物を制限酵素で処理するだけで、各系統間の多型を検出することが可能である。
【００５８】
また、本発明では、表１〜３２に記載の３６６組のプライマー対の全セットのなかから任意のプライマー対を選抜し、サブセットを作成してもよく、この任意の組み合わせのプライマー対から構成されるサブセットも本発明の範囲に包含される。
【００５９】
すなわち、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットとは、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡの全領域にわたって所定の間隔で設計された、表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対の全セットから選択される複数のプライマー対をいう。ここで、所定の間隔とは、ゲノムＤＮＡの全領域に万遍なく散在して、プライマー対が設計されていることを意味する。所定の間隔とは、必ずしも各プライマー対がゲノムＤＮＡ上に一定の間隔で設計されていることを意味しないが、ほぼ一定の間隔で各プライマー対が設計されていることが好ましい。
【００６０】
本発明において、サブセットに含まれるプライマー対は、例えば１０〜５０個のプライマー対とすることができる。より具体的には、サブセットに含まれるプライマー対は、第一染色体から第五染色体の各々に２〜１０個ずつ、計１０〜５０個のプライマー対とすることができる。例えば、プライマー対のサブセットとしては、プライマー番号１１、４３、９３、１１１、１４１、１６８、１６９、２０２、２２８、２３２、２５２、２６８、２８７、３２８、３６６を一組のセットとしたものが挙げられる。
【００６１】
より具体的には、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットは、以下のＡ）〜Ｅ）の組み合わせのプライマー対から構成することができる：
Ａ）シロイヌナズナ第一染色体のゲノムＤＮＡをａ個（ａは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第一染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１〜表１０に記載のプライマー番号１〜１０９のプライマー対を前記領域に対応させたａ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ａ個のプライマー対；
Ｂ）シロイヌナズナ第二染色体のゲノムＤＮＡをｂ個（ｂは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第二染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１１〜表１５に記載のプライマー番号１１０〜１６８のプライマー対を前記領域に対応させたｂ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｂ個のプライマー対；
Ｃ）シロイヌナズナ第三染色体のゲノムＤＮＡをｃ個（ｃは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第三染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表１６〜表２０に記載のプライマー番号１６９〜２２８のプライマー対を前記領域に対応させたｃ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｃ個のプライマー対；
Ｄ）シロイヌナズナ第四染色体のゲノムＤＮＡをｄ個（ｄは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第四染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２１〜表２４に記載のプライマー番号２２９〜２７４のプライマー対を前記領域に対応させたｄ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｄ個のプライマー対；および
Ｅ）シロイヌナズナ第五染色体のゲノムＤＮＡをｅ個（ｅは２以上の整数）のほぼ均等な領域に分けることにより、第五染色体のゲノムＤＮＡ上に設計された表２５〜表３２に記載のプライマー番号２７５〜３６６のプライマー対を前記領域に対応させたｅ個のグループに分類し、各グループから一つずつプライマー対を選択することにより得られる計ｅ個のプライマー対。
【００６２】
ここで、ａ〜ｅの整数は、それぞれ２以上の整数であり、一般には２〜１０の整数であり、それぞれ異なっていても同じでもよい。例えば、ａ＝４、ｂ＝３、ｃ＝３、ｄ＝３、ｅ＝４とすることができる。ａ〜ｅがこのような値であるとき、各染色体の各領域から選択されたプライマー対Ａ〜Ｑを、図１に模式的に示す。
【００６３】
ａ〜ｅの各整数は、大きくなればそれだけプライマー対の数が多くなり、これらプライマー対をマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットとして使用した場合、マッピング精度は高くなる。しかし、プライマー対の数が多いため、ＰＣＲの反応数が多くなり、マッピング操作の手間が増える。一方、ａ〜ｅの各整数は、小さくなればそれだけプライマー対の数が少なくなり、これらプライマー対をマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットとして使用した場合、マッピング精度は低くなるが、ＰＣＲの反応数が少なくなるためマッピング操作は簡便になる。
【００６４】
後述の実施例では、ａ〜ｅはそれぞれ３とし、各染色体ＤＮＡをほぼ均等な３つの領域（すなわち、染色体ＤＮＡの５’端側の北側領域、中央領域、染色体ＤＮＡの３’端側の南側領域）に分け、各領域から一つずつプライマー対を選択した。
【００６５】
すなわち、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットは、以下のａ）〜ｏ）の組み合わせのプライマー対から構成することができる：
ａ）シロイヌナズナ第一染色体の北側領域に設計された表１〜表３に記載のプライマー番号１〜３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｂ)シロイヌナズナ第一染色体の中央領域に設計された表３〜表５に記載のプライマー番号３１〜６０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｃ）シロイヌナズナ第一染色体の南側領域に設計された表６〜表１０に記載のプライマー番号６１〜１０９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｄ）シロイヌナズナ第二染色体の北側領域に設計された表１１〜表１２に記載のプライマー番号１１０〜１３０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｅ）シロイヌナズナ第二染色体の中央領域に設計された表１２〜表１４に記載のプライマー番号１３１〜１５０のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｆ）シロイヌナズナ第二染色体の南側領域に設計された表１４〜表１５に記載のプライマー番号１５１〜１６８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｇ）シロイヌナズナ第三染色体の北側領域に設計された表１６〜表１７に記載のプライマー番号１６９〜１８８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｈ）シロイヌナズナ第三染色体の中央領域に設計された表１７〜表１９に記載のプライマー番号１８９〜２０８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｉ）シロイヌナズナ第三染色体の南側領域に設計された表１９〜表２０に記載のプライマー番号２０９〜２２８のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｊ）シロイヌナズナ第四染色体の北側領域に設計された表２１〜表２２に記載のプライマー番号２２９〜２４３のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｋ）シロイヌナズナ第四染色体の中央領域に設計された表２２〜表２３に記載のプライマー番号２４４〜２５９のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｌ）シロイヌナズナ第四染色体の南側領域に設計された表２３〜表２４に記載のプライマー番号２６０〜２７４のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｍ）シロイヌナズナ第五染色体の北側領域に設計された表２５〜表２７に記載のプライマー番号２７５〜３０５のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；
ｎ）シロイヌナズナ第五染色体の中央領域に設計された表２７〜表３０に記載のプライマー番号３０６〜３３６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対；および
ｏ）シロイヌナズナ第五染色体の南側領域に設計された表３０〜表３２に記載のプライマー番号３３７〜３６６のプライマー対からなる群より選択される何れか１のプライマー対。
【００６６】
例えば、上記ａ）〜ｏ）の組み合わせのプライマー対のサブセットとしては、プライマー番号１５、６０、８０、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２５０、２７０、２９０、３２５、３５０を一組のセットとしたものが挙げられる。
【００６７】
以上述べたとおりほぼ均等な領域に分けられた各染色体ＤＮＡの各領域からプライマー対を一つずつ選抜し、サブセットとすることができる。ここで、プライマー対を選抜する際、各プライマー対の染色体上の設計位置は互いに近接していないことが望ましい。例えば、各染色体ＤＮＡをほぼ均等な３つの領域（染色体ＤＮＡの５’端側の北側領域、中央領域、染色体ＤＮＡの３’端側の南側領域）に分けた場合、北側領域からは、染色体ＤＮＡの５’端に近い領域に設計されたプライマー対を選抜し、南側領域からは、染色体ＤＮＡの３’端に近い領域に設計されたプライマー対を選抜し、中央領域からは、領域の中央に設計されたプライマー対を選抜することが好ましい。
【００６８】
２．本発明のＰＣＲプライマーセットを用いた変異遺伝子のマッピング方法
本発明は更に、上述の表１〜表３２に記載のプライマー番号１〜３６６のプライマー対から選抜された上記プライマー対のサブセットを用いて、シロイヌナズナの変異遺伝子の染色体上の位置を決定する方法を提供する。
【００６９】
本発明のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法は、
（１）変異遺伝子を有するシロイヌナズナ変異体と、該変異体とは異なる系統の野生型シロイヌナズナとを交配し、第一世代を得る工程と、
（２）得られた前記第一世代を自家受粉させて複数の第二世代を得る工程と、
（３）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が劣性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記変異体の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合（すなわち、変異遺伝子が優性遺伝子である場合）、得られた前記第二世代のなかから前記野生型の表現型を示す複数の第二世代を選択する工程と、
（４）前記工程（３）で選択された複数の第二世代のうちの一個体のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットの各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、各系統間の多型に基くＰＣＲ産物のサイズの違いまたはＰＣＲ産物の切断断片のパターンの違いにより、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかをそれぞれ同定する工程であって、該ＰＣＲおよび同定が、前記工程（３）で選択された前記複数の第二世代の全個体の各ゲノムＤＮＡに対してそれぞれ行われる工程と、
（５）（i）前記第一世代が前記野生型の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記変異体の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程、あるいは（ii）前記第一世代が前記変異体の表現型を示す場合、選択された前記複数の第二世代の最多数において前記野生型の系統に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定し、ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する工程と
を具備する。
【００７０】
本発明の方法は、変異遺伝子が劣性遺伝子である場合、優性遺伝子である場合の何れも、染色体上の位置を決定することができる。また、本発明の方法は、変異遺伝子が複数個ある場合もそれらの染色体上の位置を決定することは可能であるが、一つの変異遺伝子の染色体上の位置を決定する際に本発明の方法は好適に用いられる。
【００７１】
２．１  原理
まず、本発明のシロイヌナズナの変異遺伝子をマッピングする方法の原理を図２および３を参照して説明する。図２および３には、変異遺伝子の存在する染色体（すなわち１組の相同染色体）のみを模式的に示す。図２において、変異遺伝子の存在する位置を“mutation”として表示する。
【００７２】
本発明のマッピング方法では、変異遺伝子を有するシロイヌナズナ変異体と、該変異体とは異なる系統の野生型シロイヌナズナとを使用する。図２では、劣性の変異を有するコロンビア系統（Col）のシロイヌナズナ変異体と、ランズバーグ系統（Ler）の野生型シロイヌナズナとを使用する。以下、これら系統を用いた場合を例に説明する。これら系統を交配させて得られる第一世代（Ｆ１世代）は、図２に示すとおり、Col系統とLer系統から１本ずつ由来する２本の相同染色体を有する。次いで、このＦ１世代が生殖細胞を形成するときに減数分裂がおこり、相同染色体の間で組換えが起こる。したがって、Ｆ１世代を自家受粉させ第二世代（Ｆ２世代）を得ると、Ｆ２世代のなかには、Col系統に由来する染色体領域とLer系統に由来する染色体領域とから構成されるキメラ染色体を有する個体が含まれる。変異体表現型（mutant phenotype）を示すＦ２世代について、変異遺伝子の存在する染色体（１組の相同染色体）を模式的に示すと、図２に示すようなキメラ染色体の例が挙げられる。すなわち、変異体表現型（mutant phenotype）を示すＦ２世代において、変異遺伝子の存在する染色体領域は、Col系統に由来する。よって、多数のＦ２世代を作製し、そのなかから変異型の表現型を示す多数のＦ２世代を選抜し、選抜された多数のＦ２世代について、Col系統由来の染色体領域を探すことにより、変異遺伝子をマッピングすることができる。すなわち、すべてのＦ２世代に共通してCol系統に由来すると同定された染色体領域に変異遺伝子が位置すると決定することができる。
【００７３】
ここでCol系統由来の染色体領域を探す手法として、Col系統とLer系統の間の遺伝的多型（genetic polymorphism）を利用して、Ｆ２世代のゲノムＤＮＡ全体にわたって、各領域がCol系統由来の領域であるかLer系統由来の領域かを調査する。具体的には、図３に示すとおり、ＰＣＲを用いた手法、すなわちＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）やＳＳＬＰ（Simple Sequence Length Polymorphism）と呼ばれる手法を使用することができる。各系統間の多型が、制限酵素の認識部位であるか否かに関与する場合、その部位を含む領域をＰＣＲで増幅し、制限酵素で切断することによって、増幅されたゲノムＤＮＡの領域が何れの系統に由来するか決定することができる（ＣＡＰＳ）。一方、各系統間の多型が、繰り返し配列の長さの違いである場合、その繰り返し配列を含む領域をＰＣＲで増幅することによって、増幅されたゲノムＤＮＡの領域が何れの系統に由来するか決定することができる（ＳＳＬＰ）。図３では、ＰＣＲで使用するプライマー対をP-fw、P-revで表示する。図３に示すとおり、ある染色体領域が、２本の相同染色体ともCol系統に由来する場合、２本の相同染色体ともLer系統に由来する場合、１本はCol系統に由来し１本はLer系統に由来するヘテロである場合、それぞれの場合を断片サイズの違いによって識別することができる。具体例として、Col系統が、増幅されるＤＮＡ領域に制限酵素切断部位を含み、Ler系統が、制限酵素切断部位を含まないために電気泳動のバンドパターンに違いを生じる場合を図３は示す（ＣＡＰＳ）。また、図３は、Col系統よりLer系統の方が繰り返し配列の長さが長い部位を、増幅されるＤＮＡ領域に含むために電気泳動のバンドパターンに違いを生じる場合を示す（ＳＳＬＰ）。
【００７４】
２．２  各工程の説明
以下、各工程（１）〜（５）を詳細に説明するが、本発明を限定するものではない。
【００７５】
[工程（１）]
変異遺伝子をマッピングしたい目的の変異体（例えばコロンビア系統）とそれとは異なる系統（例えばランズバーグ系統）の野生型植物の間で交配を行い、第一世代（Ｆ１世代）を得る。
【００７６】
ここで、変異遺伝子をマッピングしたい目的の変異体は、自然突然変異により得られた変異体であってもよいし、突然変異誘発により得られた変異体であってもよい。突然変異誘発は、以下に記載のとおり行うことができる。すなわち、ある系統のシロイヌナズナ野生株に変異原処理を行ない、変異原処理したシロイヌナズナ植物体を自家受粉させて得た次世代の中から、シロイヌナズナ（野生型）と比較して、表現型に変異を生じた個体（変異遺伝子をホモ接合で有する個体）を選抜することにより調製することができる。変異原処理を施す野生型として、種子、植物体、カルス等を用いることができる。本発明において変異原処理は、公知の手法を用いることができ、変異原として、ＤＮＡの塩基をアルキル化するアルキル化剤等の化学的変異原、紫外線、Ｘ線等のＤＮＡ損傷を起こす電磁波、または放射性物質を用いることができる。あるいは、変異原処理は、公知のアグロバクテリウム感染法により、Ｔ−ＤＮＡの両端に存在する一対の２５塩基対の配列に挟まれた領域のＤＮＡを、野生型のゲノムＤＮＡのランダムな位置に挿入することにより行ってもよい。好ましくは、化学的変異原（例えば、エチルメタンスルホン酸）を0.2〜0.3重量％の濃度で含有する溶液に野生型の種子を12〜16時間浸漬することにより、変異原処理を行う。
【００７７】
工程（１）において、ある系統の変異体とそれとは異なる系統の野生型とを交配する。ここで、変異体の系統がコロンビア系統である場合、野生型としてランズバーグ系統を用いることができ、変異体の系統がランズバーグ系統である場合、野生型としてコロンビア系統を用いることができる。各系統のシロイヌナズナは、ＬＥＨＬＥ seedから入手可能である。
【００７８】
第一世代（Ｆ１世代）は、マッピングしたい変異遺伝子が劣性遺伝子である場合、すべて野生型の表現型を示す。一方、マッピングしたい変異遺伝子が優性遺伝子である場合、すべて変異型の表現型を示す。このように、Ｆ１世代の表現型をみることにより、マッピングしたい変異遺伝子が劣性遺伝子であるか優性遺伝子であるか判別することができる。
【００７９】
[工程（２）]
工程（１）で得られた第一世代（Ｆ１世代）を自家受粉させて第二世代（Ｆ２世代）を多数用意する。Ｆ２世代は、例えば100〜200個、好ましくは500〜1000個用意する。
【００８０】
Ｆ１世代では、変異体および野生型の両系統の相同染色体を1本ずつ受け継いでいる。この植物体（Ｆ１世代）が生殖細胞を形成する時、減数分裂時に相同染色体間で組換えが起こる。よって、Ｆ１世代がつくる生殖細胞には、変異体の系統に由来する染色体と野生型の系統に由来する染色体とのキメラ染色体を含むものが存在する。そのため、自家受粉により得られたＦ２世代には両系統のキメラ染色体を持つ個体が含まれる。
【００８１】
目的の変異遺伝子が劣性遺伝子である場合、Ｆ２世代のうち、変異体の表現型を示すものはすべて、当該変異遺伝子の近傍の染色体領域は、２本の相同染色体とも変異体の系統（例えばコロンビア系統）であるはずである。そこで、多数のＦ２世代の変異体について、すべてに共通して変異体の系統（例えばコロンビア系統）に由来する染色体領域を探すことにより、変異遺伝子の位置を知ることができる。
【００８２】
一方、目的の変異遺伝子が優性遺伝子である場合、Ｆ２世代のうち、野生型の表現型を示すものはすべて、当該変異遺伝子の近傍の染色体領域は、２本の相同染色体とも野生型の系統（例えばランズバーグ系統）であるはずである。そこで、多数のＦ２世代の変異体について、すべてに共通して野生型の系統（例えばランズバーグ系統）に由来する染色体領域を探すことにより、変異遺伝子の位置を知ることができる。
【００８３】
以下、本発明の詳細な説明全体にわたって、マッピングしたい変異遺伝子が劣性遺伝子である場合を例に説明する。なお、マッピングしたい変異遺伝子が優性遺伝子である場合も本願発明の範囲に包含され、変異遺伝子が優性遺伝子である場合も以下の説明に従って同様にマッピングを行うことができる。以下、多数のＦ２世代の変異体について、すべてに共通して変異体の系統に由来する染色体領域を探す手法を詳説する。
【００８４】
[工程（３）]
まず、第一世代を自家受粉させて得られた第二世代のなかから変異体の表現型を示す第二世代を複数選択する。上述のとおり、ここで選択された変異体は、目的の変異遺伝子をホモ接合で有するため、変異遺伝子の近傍の染色体領域は、２本の相同染色体とも変異体の系統に由来する。
【００８５】
[工程（４）]
次いで、工程（３）で選択された前記複数の第二世代のすべての個体に対して下記ＰＣＲおよび同定を行う。すなわち、選択された第二世代のゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のマッピング用ＰＣＲプライマー対のサブセットの各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、前記変異体の系統に由来する部位であるか前記野生型の系統に由来する部位であるかを同定する。
【００８６】
ここである染色体領域がどの系統に由来するかを調べるためには、上述のとおり、系統間の多型を検出することができる本発明のプライマー対を利用することができる。多型を検出する方法として、上述のＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）やＳＳＬＰ（Simple Sequence Length Polymorphism）が便利で、いずれもＰＣＲを用いた手法である。何れの手法も、Ｆ２世代の植物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、多型を含むゲノム領域をＰＣＲで増幅する。次いで、ＣＡＰＳの場合はＰＣＲ産物を制限酵素で切断し切断断片のパターン（切断断片の数および長さ）を比較することで、その領域がどの系統に由来するか同定される。また、ＳＳＬＰの場合はＰＣＲ産物の長さを比較することで、その領域がどの系統に由来するか同定される。
【００８７】
このような同定を、工程（３）で選択した複数の第二世代すべてに対して行う。それぞれの第二世代は、各染色体を２本ずつ相同染色体として有しているため、ここでの同定は、各染色体ごとに行われる。
【００８８】
これにより、選択された第二世代すべてのゲノムセットの各ＤＮＡ部位が、変異体の系統に由来するか野生型の系統に由来するか決定される。具体的には、選択された第二世代の植物個体数がｎ個体の場合、２ｎ個のゲノムセットの各ＤＮＡ部位（本発明のプライマー対により増幅される各ＤＮＡ部位）が、変異体の系統に由来するか野生型の系統に由来するか決定される（後述の実施例の表３３参照）。
【００８９】
従って、本発明のマッピング方法でマッピングを進めるには、各系統間の多型を確実に検出できるＰＣＲマーカー（プライマー対）が多数ゲノム上に分散して存在すると、遺伝子座位の絞り込みを速やかに実行することができる。言い換えると、本発明のＰＣＲプライマー対をＰＣＲマーカーとして用いてゲノムＤＮＡを増幅することにより、増幅されたゲノムＤＮＡ領域がどの系統に由来するか速やかに決定することができる。
【００９０】
ここで、本発明のＰＣＲプライマー対の全セットをすべてＰＣＲマーカーとして使用してもよいが、操作を簡便にするためには、本発明のＰＣＲプライマー対の全セットのうちから選択された幾つかのプライマー対をＰＣＲマーカーとして使用することが好ましい。すなわち、上述の本発明のＰＣＲプライマー対のサブセットをＰＣＲマーカーとして使用することが好ましい。例えば、後述の実施例で記載するように、各染色体を北側領域（染色体ＤＮＡの５’端領域）、中央領域、南側領域（染色体ＤＮＡの３’端領域）の３領域にわけ、各領域に設計されたＰＣＲプライマー対からそれぞれ一のプライマー対を選択して合計１５のＰＣＲプライマー対をＰＣＲマーカーとして使用することができる。
【００９１】
１５のＰＣＲプライマー対を用いた各ＰＣＲの反応は、工程（３）で選択された第二世代のゲノムＤＮＡを抽出し、抽出されたゲノムＤＮＡ溶液を、１５のサンプル容器に分注し、各容器内で行うことができる。
【００９２】
[工程（５）]
工程（４）において、第二世代すべてのゲノムセットの各ＤＮＡ部位が、前記変異体の系統に由来するか前記野生型の系統に由来するか決定され、この結果に基づいて、最多数の第二世代（時にはほとんどすべて）において変異体に由来すると同定されたゲノムＤＮＡの部位を決定する。ここで決定されたゲノムＤＮＡの部位の近傍に変異遺伝子が存在すると決定する。
【００９３】
２．３  好ましい態様
２．３．１  第二次マッピング
上記工程（５）において、変異遺伝子が存在するおおよその部位が決定された後、更に変異遺伝子が存在する位置を絞り込むために、以下の第二次マッピングを行うことが好ましい。以下、第二次マッピングについて、マッピングしたい変異遺伝子が劣性遺伝子である場合を例に説明する。なお、マッピングしたい変異遺伝子が優性遺伝子である場合も本願発明の範囲に包含され、変異遺伝子が優性遺伝子である場合も以下の説明に従って同様に第二次マッピングを行うことができる。
【００９４】
[工程（６）]
まず、上記工程（５）において変異遺伝子が存在すると決定された部位（後述の実施例ではプライマー番号287のMAC12により増幅されるゲノムＤＮＡの部位）の近傍に設計されている本発明のプライマー対を、表１〜３２に記載のプライマー対のなかから、複数選択する。このようなプライマー対として、後述の実施例では、プライマー番号275のF7J8、プライマー番号283のMAH20、プライマー番号287のMAC12、プライマー番号291のMRG7、プライマー番号300のK18P6を選択した。
【００９５】
ここで「変異遺伝子が存在すると決定された部位の近傍に設計されているプライマー対」とは、変異遺伝子が存在すると決定された部位を増幅するプライマー対の番号をｎ番とすると、例えば、(ｎ−15)番のプライマー対〜(ｎ＋15)番のプライマー対のなかから選択された３〜１０組のプライマー対を意味する。
【００９６】
[工程（７）]
次いで、上記工程（６）で選択された各プライマー対を用いて、上記工程（３）で選択された複数の第二世代のすべての個体に対して下記ＰＣＲおよび同定を行う。すなわち、選択された第二世代のゲノムＤＮＡを鋳型として、工程（６）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行う。その後、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、変異体の系統に由来するか野生型の系統に由来するか、上述のとおりＣＡＰＳ法もしくはＳＳＬＰ法で同定する（後述の実施例の表３４参照）。
【００９７】
[工程（８）]
上記工程（７）で同定された結果に基づいて、前記複数の第二世代のなかから、変異体の系統に由来する部位と野生型に由来する部位の両方を有するキメラ染色体を選択する。ここで選択されるキメラ染色体の具体例を模式的に図４に示す。図４において、ＰＣＲマーカーＡ〜Ｆは、上記工程（６）で選択されたプライマー対を示す。ＰＣＲマーカーＡ〜Ｆのキメラ染色体上の位置は、ＰＣＲマーカーを示す直線とキメラ染色体とが交差する位置で示される。
【００９８】
[工程（９）]
上記工程（７）で同定された結果から、各キメラ染色体において、野生型の系統に由来する染色体領域（図４では黒く塗りつぶした領域）を決定する。ここで野生型の系統に由来する染色体領域に、変異遺伝子は存在しない。例えば、図４に示されるキメラ染色体１は、ＰＣＲマーカーＡで増幅されるキメラ染色体のＤＮＡ部位が野生型に由来し、ＰＣＲマーカーＢ〜Ｆで増幅されるキメラ染色体の各ＤＮＡ部位が変異型に由来することが上記工程（７）で同定されている。この結果から、キメラ染色体１では、図４で黒く塗りつぶした領域（ＰＣＲマーカーＡにより増幅されるＤＮＡ部位より左側の領域）が、野生型の系統に由来する染色体領域であると決定され、この染色体領域以外の領域（白抜きの領域）が、変異型の系統に由来する領域であると決定される。
【００９９】
[工程（10）]
複数のキメラ染色体において野生型の系統に由来すると決定された各染色体領域の何れにも該当しない染色体領域（図４ではＰＣＲマーカーＣとＤの間の領域）に、変異遺伝子が存在すると決定する。これにより、変異遺伝子が存在するＤＮＡの領域を更に絞り込むことができる。
【０１００】
この工程では、多くの第二世代を用意するとともに、上記工程（５）で変異遺伝子が存在するとおおよそ決定された部位の近傍に密に配置された多数のプライマーを使用すれば、変異遺伝子をより絞り込まれた領域にマッピングすることができる。例えば250〜1000個の第二世代を用意すれば、約80kbの領域内に、変異遺伝子をマッピングすることができる。
【０１０１】
２．３．２  第三次マッピング
上述のとおり、第二次マッピングで、変異遺伝子の存在する位置が更に絞り込まれた後、更に変異遺伝子が存在する位置を絞り込むために、以下の第三次マッピングを行うことが好ましい。以下、第三次マッピングについて、マッピングしたい変異遺伝子が劣性遺伝子である場合を例に説明する。なお、マッピングしたい変異遺伝子が優性遺伝子である場合も本願発明の範囲に包含され、変異遺伝子が優性遺伝子である場合も以下の説明に従って同様に第三次マッピングを行うことができる。
【０１０２】
[工程（11）]
まず、上記工程（10）で決定された染色体領域の範囲内で組換えを起こしたキメラ染色体を有する第二世代を、上記工程（１）および（２）により調製される第二世代のなかから複数選択する。この選択には、好ましくは、FIRE法（fast isolation of recombinants）を利用する（細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ14植物のゲノム研究プロトコール、p.95-103）。FIRE法について以下説明する。
【０１０３】
FIRE法には、第二次マッピングにより変異遺伝子が存在すると決定された領域（図４ではＰＣＲマーカーＣとＤとの間の領域）を挟むように当該領域の両端に位置する２組のＰＣＲマーカー（図４ではＰＣＲマーカーＣとＤ）を利用する。すなわち、FIRE法では、上記工程（10）で決定された染色体領域の両端に位置する２組のＰＣＲマーカーの間で組換えを起こした個体を複数選択する。
【０１０４】
Ｆ２世代の種子（発芽前なので表現型は不明であり、野生型および変異型の両表現型を含む）を多数発芽させ、その芽生えすべてについて、それぞれからＤＮＡを抽出する。抽出されたＤＮＡに対して、変異遺伝子を挟む上記２組のＰＣＲマーカー（以下、プライマー対Ｃ、Ｄともいう）を用いてＰＣＲを行う。各々のＦ２世代が有する２本の相同染色体について、各ＰＣＲマーカーにより増幅されるＤＮＡ断片が、野生型であるか変異型であるかを調べる。
【０１０５】
プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ断片が、２本の相同染色体ともに変異型である遺伝子型を「変異型遺伝子型」と称し、２本の相同染色体のうち１本の染色体が野生型であり１本の染色体が変異型である遺伝子型を「ヘテロ型遺伝子型」と称し、２本の相同染色体ともに野生型である遺伝子型を「野生型遺伝子型」と称する。同様に、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ断片が、２本の相同染色体ともに変異型である遺伝子型を「変異型遺伝子型と称し、２本の相同染色体のうち１本の染色体が野生型であり１本の染色体が変異型である遺伝子型を「ヘテロ型遺伝子型」と称し、２本の相同染色体ともに野生型である遺伝子型を「野生型遺伝子型」と称する。
【０１０６】
プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ断片とプライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ断片との間の遺伝子型が異なる個体（Ｆ２世代）を選抜する。すなわち、２組のＰＣＲマーカーの間で組換えを起こした個体を選抜する。ここで各ＰＣＲマーカーの示す遺伝子型が異なる個体には、以下の６タイプが挙げられる。
Ｉ）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「変異型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「ヘテロ型遺伝子型」であるタイプ。
II）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「変異型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「野生型遺伝子型」であるタイプ。
III）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「ヘテロ型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「変異型遺伝子型」であるタイプ。
IV）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「ヘテロ型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「野生型遺伝子型」であるタイプ。
Ｖ）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「野生型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「変異型遺伝子型」であるタイプ。
VI）プライマー対Ｃにより増幅されたＤＮＡ領域が「野生型遺伝子型」で、プライマー対Ｄにより増幅されたＤＮＡ領域が「ヘテロ型遺伝子型」であるタイプ。
【０１０７】
このようにして選抜された、２組のＰＣＲマーカーの間で組換えを起こした第二世代の個体のみを表現型がわかるまで育てる。
【０１０８】
[工程（12）]
２組のＰＣＲマーカーの間で組換えを起こした選抜された第二世代の個体に対してＰＣＲを行い、変異遺伝子のマッピングを行う。ここでＰＣＲに使用するプライマー対としては、表１〜３２に記載の本発明のプライマー対のなかから、上記２組のＰＣＲマーカー（プライマー対ＣとＤ）およびその間に設計されているプライマー対（あわせて例えば３〜１０のプライマー対）を選択する。すなわち、上記工程（10）で決定された染色体領域を挟むように設計されている本発明のプライマー対および上記工程（10）で決定された染色体領域内に設計されている本発明のプライマー対を選択する。後述の実施例では、上記工程（10）で決定された染色体領域を挟むように設計されている本発明のプライマー対として、プライマー番号275のF7J8とプライマー番号283のMAH20を選択し、並びにその領域内に設計されている本発明のプライマー対として、プライマー番号276のT7H20、プライマー番号277のF15A17、プライマー番号279のMED24、プライマー番号280のMUK11、プライマー番号281のMJJ3sを選択した。
【０１０９】
[工程（13）]
上記工程（12）で選択された各プライマー対を用いて、上記工程（11）で選択された複数の第二世代のすべての個体に対して下記ＰＣＲおよび同定を行う。すなわち、選択された第二世代のゲノムＤＮＡを鋳型として、工程（12）で選択された各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行う。その後、各プライマー対が増幅したゲノムＤＮＡの各部位が、変異体の系統に由来するか野生型の系統に由来するか、上述のとおりＣＡＰＳ法もしくはＳＳＬＰ法で同定する（後述の実施例の表３５参照）。
【０１１０】
[工程（14）]
上記工程（13）で同定された結果に基づいて、変異遺伝子の存在する位置を染色体上に決定することができる。まず、上記工程（11）で選択された複数の第二世代のなかから、変異型の表現型を示す第二世代を更に選抜し、この第二世代が有する相同染色体のうち、キメラ染色体に着目する。
【０１１１】
[工程（15）]
次いで、上記工程（13）で同定された結果から、上記工程（14）で着目したキメラ染色体のそれぞれにおいて、野生型の系統に由来する染色体領域（変異遺伝子が存在しない領域）を決定する。ここで変異遺伝子が存在しない領域は、図４で黒塗りの領域として示される。例えば、図４に示されるキメラ染色体２は、ＰＣＲマーカーＡおよびＢで増幅されるキメラ染色体の各ＤＮＡ部位が野生型に由来し、ＰＣＲマーカーＣ〜Ｆで増幅されるキメラ染色体の各ＤＮＡ部位が変異型に由来することが上記工程（13）で同定されている。この結果から、キメラ染色体２では、図４で黒く塗りつぶした領域（ＰＣＲマーカーＢにより増幅されるＤＮＡ部位より左側の領域）が、野生型の系統に由来する染色体領域であると決定され、この染色体領域以外の領域（白抜きの領域）が、変異型の系統に由来する領域であると決定される。
【０１１２】
[工程（16）]
上記工程（14）で着目したキメラ染色体すべてにおいて、野生型の系統に由来すると決定されなかった染色体領域に、変異遺伝子が存在すると決定する。ここで変異遺伝子が存在する領域は、図４ではＰＣＲマーカーＣとＤの間の領域である。
【０１１３】
このように第三次マッピングでは、第二次マッピングで変異遺伝子が存在すると決定された染色体領域内で組換えを起こした第二世代を多数準備する。これにより、変異遺伝子が存在するＤＮＡの領域を更に絞り込むことができる。
【０１１４】
２．４  ゲノムＤＮＡの抽出およびＰＣＲ条件について
上述の工程において、ＰＣＲの鋳型として使用される第二世代のゲノムＤＮＡは、以下に記載のとおり抽出することができる。また、当該ゲノムＤＮＡと本発明のプライマーを用いて以下に記載の反応条件でＰＣＲを行うことができる。
【０１１５】
（ｉ）ゲノムDNAの抽出
マイクロチューブ内で子葉一枚程度の葉をすりつぶす。DNA抽出液（200mM Tris-HCl (pH7.5), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS）を200ml加え撹拌する。更に400mlのエタノールを加えて撹拌し、15000rpmで5分遠心する。沈殿物を200mlのTEに溶解し、1mlをPCRに供する。
【０１１６】
（ii）ＰＣＲの反応液
ＰＣＲ反応液の組成は、１サンプルあたり
0.05μl TaKaRa Ex Taq（宝酒造株式会社）
1μl dNTP Mixture（TaKaRa Ex Taqに添付）
1μl 10x Ex Taq Buffer（TaKaRa Ex Taqに添付）
0.25μl Marker primer (forward)
0.25μl Marker primer (reverse)
6.45μl H2O
に、サンプルのＤＮＡ溶液を１μｌ加えたものである。
【０１１７】
（iii）ＰＣＲの反応条件
ＰＣＲ反応の条件は増幅するDNA長やプライマーによって若干異なるが、基本的には以下の条件で行う。
第一サイクル
１サイクル
９４℃  １分
第二サイクル
３２サイクル
９２℃  ３０秒
５５℃  ３０秒
７２℃  ３０秒
第三サイクル
１サイクル
７２℃  １分
【０１１８】
３．実施例
本発明のプライマー対のサブセットを用いて変異遺伝子のマッピングを行った例を以下に記載する。本実施例では、変異遺伝子SGR9のマッピングを行った。変異遺伝子SRG9が存在する染色体上の位置が徐々に絞られていく様子を図５に示す。
【０１１９】
１）第一次マッピング
変異遺伝子SGR9を有するsgr9-1変異体（ＬＥＨＬＥ seedから入手）の系統はコロンビアである。そのため、まず、コロンビア系統とは異なるランズバーグ系統の野生株（ＡＢＲＣから入手）とsgr9-1変異体とを交配して種子（Ｆ１種子）を得た。Ｆ１種子を発芽、生育させたところ、Ｆ１世代はすべて野生型の表現型を示した。Ｆ１世代を自家受粉させてＦ２種子を得た。sgr9-1変異体は花茎の重力屈性異常をしめし、これは劣性の遺伝形質である。そこで、Ｆ２種子を播種し、花茎が重力屈性異常を示した植物体を14個選び出した。ここで14個の植物体は、各染色体を２本ずつ相同染色体として有するため、28染色体（すなわち28のゲノムセット）について以下調査される。選抜された植物体ごとにＤＮＡを抽出し、以下に記す本発明のプライマー対のサブセットを用いてSGR9遺伝子のマッピングを行った。
【０１２０】
使用されたプライマー対は、コロンビア系統とランズバーグ系統との間の多型を検出可能なものであり、表１〜表３２に記載されるものである。本発明のプライマー対のサブセットとして、シロイヌナズナの各染色体の北側、中央、南側の各領域に設計された１５のプライマー対を使用した。
【０１２１】
（ａ）第一染色体の北側領域
プライマー名：F10K1（プライマー番号１１に記載のプライマー対）
（ｂ）第一染色体の中央領域
プライマー名：F28H19（プライマー番号４９に記載のプライマー対）
（ｃ）第一染色体の南側領域
プライマー名：F17O7（プライマー番号９３に記載のプライマー対）
（ｄ）第二染色体の北側領域
プライマー名：F2I9（プライマー番号１１１に記載のプライマー対）
（ｅ）第二染色体の中央領域
プライマー名：T9J22（プライマー番号１４１に記載のプライマー対）
（ｆ）第二染色体の南側領域
プライマー名：T9J23（プライマー番号１６８に記載のプライマー対）
（ｇ）第三染色体の北側領域
プライマー名：T4P13（プライマー番号１６９に記載のプライマー対）
（ｈ）第三染色体の中央領域
プライマー名：K17E12（プライマー番号２０２に記載のプライマー対）
（ｉ）第三染色体の南側領域
プライマー名：MAA21（プライマー番号２２８に記載のプライマー対）
（ｊ）第四染色体の北側領域
プライマー名：T5J8（プライマー番号２３２に記載のプライマー対）
（ｋ）第四染色体の中央領域
プライマー名：FCA8（プライマー番号２５２に記載のプライマー対）
（ｌ）第四染色体の南側領域
プライマー名：F3L17（プライマー番号２６８に記載のプライマー対）
（ｍ）第五染色体の北側領域
プライマー名：MAC12（プライマー番号２８７に記載のプライマー対）
（ｎ）第五染色体の中央領域
プライマー名：K5J14（プライマー番号３２８に記載のプライマー対）
（ｏ）第五染色体の南側領域
プライマー名：LA522（プライマー番号３６６に記載のプライマー対）
【０１２２】
変異体の表現型を示す選抜された第二世代のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記各プライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物が変異体タイプ（コロンビア型）を示すのか、野生株タイプ（ランズバーグ型）を示すのか、それぞれ調べた。その結果を以下の表に示す。
【０１２３】
【表３３】
2005192478.tif 000034
【０１２４】
14個体（28染色体）の第二世代について調べたところ、第5染色体の北側に設計されたプライマー対MAC12を用いて増幅されたＰＣＲ産物は、27/28が変異体のタイプ（コロンビア型）を示した。すなわち、「プライマー対MAC12が増幅したゲノムＤＮＡの領域」が、選択された第二世代の染色体（２８）の最多数（２７）において、変異体に由来すると同定された。これによりSGR9遺伝子が第5染色体の北側に座上することが明らかになった。
【０１２５】
２）第二次マッピング
更に、この近傍に設計されたプライマー対：F7J8（プライマー番号２７５）、MAH20（プライマー番号２８３）, MAC12（プライマー番号２８７）, MRG7（プライマー番号２９１）, K18P6（プライマー番号３００）を使い、SGR9遺伝子が、F7J8とMAH20の間に位置することを確認した。
【０１２６】
すなわち、変異体の表現型を示す選抜された第二世代（上述の14個体を含む23個体）のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物が変異体タイプ（コロンビア型）を示すのか、野生型タイプ（ランズバーグ型）を示すのか、それぞれ調べた。その結果を以下の表に示す。
【０１２７】
【表３４】
2005192478.tif 000035
【０１２８】
表３４において、３、４、８、１１、１２、１４、１９、２０、２１番の第二世代がキメラ染色体（変異体の系統に由来する部位と野生型の系統に由来する部位の両方を有する染色体）を有する。表３４に示される結果から、これら第二世代のキメラ染色体それぞれにおいて、「野生型の系統に由来する領域」を、変異遺伝子が存在しない領域として決定した。ここで「野生型の系統に由来する領域」を、図６に黒塗りの領域として示す。この領域の何れにも該当しない領域（すなわちF7J8とMAH20のＰＣＲマーカーの間の領域）に、変異遺伝子（SGR9遺伝子）が位置すると決定された。
【０１２９】
３）第三次マッピング
次いで、このF7J8（プライマー番号２７５）とMAH20（プライマー番号２８３）のＰＣＲマーカーを使って、第二世代180個体についてFIRE法を行い、この２組のＰＣＲマーカー間で染色体の組換えを示した３２個体を選抜した。
【０１３０】
この３２個体について、２組のＰＣＲマーカーに加えて２組のＰＣＲマーカー間に位置するPCRマーカー：T7H20（プライマー番号２７６）, F15A17（プライマー番号２７７）, MED24（プライマー番号２７９）, MUK11（プライマー番号２８０）, MJJ3s（プライマー番号２８１）を用いてさらに調べ、SGR９遺伝子座がT7H20とF15A17の間にあることが分かった（組換え体は9個体）。
【０１３１】
具体的には、FIRE法で選抜された第二世代（32個体）のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記各プライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物が変異体タイプ（コロンビア型）を示すのか、野生型タイプ（ランズバーグ型）を示すのか、それぞれ調べた。その結果を以下の表３５に示す。なお表３３〜表３６において、選択された第二世代の個体番号は、同一個体には同じ番号を付した。
【０１３２】
【表３５】
2005192478.tif 000036
【０１３３】
表３５に示される結果から、変異型の表現型を示す第二世代（個体番号８、２０、７６、１０２、１２３、１２６、１３５、１５５）のキメラ染色体それぞれにおいて、「野生型の系統に由来する領域」を変異遺伝子が存在しない領域として決定した。ここで「野生型の系統に由来する領域」を、図７に黒塗りの領域として示す。この領域の何れにも該当しない領域（すなわちT7H20とF15A17の間の領域）に、変異遺伝子（SGR9遺伝子）が位置すると決定した。
【０１３４】
ここで、T7H20（プライマー番号２７６）とF15A17（プライマー番号２７７）の間の距離は約350kbであった。以上第一次マッピングから第三次マッピングは、本発明のＰＣＲプライマー対のセットのデータベースを利用した。
【０１３５】
なお、本実施例の第三次マッピングにおいては、変異型の表現型を示す第二世代（個体番号８、２０、７６、１０２、１２３、１２６、１３５、１５５）を用いたＰＣＲの結果（表３５および図７参照）のみに着目して、「野生型の系統に由来する領域」を変異遺伝子が存在しない領域として決定し、この領域に該当しない領域に変異遺伝子の遺伝子座を絞り込むことができた。
しかし、変異型の表現型を示す第二世代の結果のみを用いて、遺伝子座を十分絞り込むことができないときは、Ｃ−Ｈタイプの野生型を示す第二世代（個体番号１３８）およびＨ−Ｃタイプの野生型を示す第二世代（個体番号３９、５１、１６０、１７１、１７３、１７４）を用いたＰＣＲの結果（表３５）にも着目して、「野生型の系統に由来する領域」を変異遺伝子が存在する領域として決定して、更に遺伝子座を絞り込んでもよい。ここでは便宜的に、表３５に記載される結果が、左から順にＣ→Ｈである野生型を「Ｃ−Ｈタイプの野生型」と称し、左から順にＨ→Ｃである野生型を「Ｈ−Ｃタイプの野生型」と称する。
【０１３６】
しかし、上記結果を用いても未だ遺伝子座を十分に絞り込むことができないときは、Ｌ−Ｈタイプの野生型を示す第二世代（個体番号２７、４０、８１、９４、１１６、１４３、１４７、１８３、１９２）およびＨ−Ｌタイプの野生型を示す第二世代（個体番号４２、９２、１２９、１４９、１５６、１５９）に着目して、変異遺伝子の遺伝子座の絞り込みを行ってもよい（上述のとおり、表３５に記載される結果が、左から順にＬ→Ｈである野生型を「Ｌ−Ｈタイプの野生型」と称し、左から順にＨ→Ｌである野生型を「Ｈ−Ｌタイプの野生型」と称する）。ただし、ここで着目したＬ−Ｈタイプの野生型およびＨ−Ｌタイプの野生型については、そのＰＣＲの結果（表３５）のみからでは、変異遺伝子の位置を絞り込むことはできないため、第三世代を作成する必要がある。すなわち、Ｌ−Ｈタイプの野生型を示す第二世代（個体番号２７、４０、８１、９４、１１６、１４３、１４７、１８３、１９２）およびＨ−Ｌタイプの野生型を示す第二世代（個体番号４２、９２、１２９、１４９、１５６、１５９）について、第三世代（Ｆ３世代）を作成し、その表現型を調べることにより、遺伝子座の絞り込みを行うことができる。作成した第三世代から変異型の表現型を示す個体が得られず、第三世代が全て野生型の表現型を示す場合には、変異遺伝子は、第二世代の染色体において「野生型の系統に由来する領域」がホモである領域に存在すると決定する。あるいは、作成した第三世代のおよそ１/４に変異型の表現型が現れる場合には、変異遺伝子は、第二世代の染色体において「野生型の系統に由来する領域」と「変異型の系統に由来する領域」がヘテロである領域に存在すると決定する。
【０１３７】
４）第四次マッピング
これ以上更に詳細に遺伝子座を特定するために、T7H20（プライマー番号２７６）とF15A17（プライマー番号２７７）の間に４組のＰＣＲマーカー（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）を独自に作成し、最終的に距離にして約70kb、遺伝子数にして24遺伝子中にSGR9が含まれることが分かった。図５において、４組のＰＣＲマーカーをｗ、ｘ、ｙ、ｚで示し、24遺伝子の各々を「→」で示す。
【０１３８】
４組のＰＣＲマーカーｗ、ｘ、ｙ、ｚを以下に記す。
ＰＣＲマーカーｗ：
w-forward; GTGTGCATGAAGCACAGACC（配列番号733）
w-reverse; ACCAAGTGATCATGCAAGCC（配列番号734）
ＰＣＲマーカーｘ：
x-forward; AGAAGGCTACCAAGTTCCAGCC（配列番号735）
x-reverse; TGTTTGTTGTCGACATGTCATC（配列番号736）
ＰＣＲマーカーｙ：
y-forward; CTGCATTAGGTGTATCGTGTC（配列番号737）
y-reverse; TGGTAAAGTGACGGTGGTGG（配列番号738）
ＰＣＲマーカーｚ：
z-forward; GGTTTAAATCGAACGAGTCAC（配列番号739）
z-reverse; TAAATTTCTTTGTGGTTCCCTAC（配列番号740）
【０１３９】
ここでの第四次マッピングは、第三次マッピングと同様に行った。すなわち、第三次マッピングで選抜した第二世代３２個体のなかから、T7H20とF15A17の間で染色体の組換えを起こした個体（個体番号８、３９、４２、５１、７６、９２、１０２．１４７．１６７）を選抜した（表３５参照）。選抜された第二世代のゲノムＤＮＡを鋳型として、T7H20（プライマー番号２７６）とF15A17（プライマー番号２７７）と上記４組のＰＣＲマーカーのプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物が変異体タイプ（コロンビア型）を示すのか、野生型タイプ（ランズバーグ型）を示すのか、それぞれ調べた。その結果を以下の表３６に示す。
【０１４０】
【表３６】
2005192478.tif 000037
【０１４１】
表３６に示される個体番号８の結果から、変異遺伝子はT7H20とＰＣＲマーカーｙの間に位置すると決定することができ、個体番号１６７の結果から、変異遺伝子はＰＣＲマーカーｘとF15A17の間に位置すると決定することができた。よって、変異遺伝子（SGR9遺伝子）は、ＰＣＲマーカーｘとｙの間に位置すると決定した。
【０１４２】
ＰＣＲマーカーｘとｙの間に存在する24遺伝子についてデータベースの情報に基づいて詳しく検討し、SGR9である可能性が高いと考えられる遺伝子について、変異体と野生株の塩基配列の比較を行った。候補として挙げた5遺伝子について、塩基配列の確認を行い、うち1遺伝子のORF中で変異が見つかった。
【０１４３】
この遺伝子が間違いなくSGR9遺伝子であるかどうかは、相補性試験により確認することができる。すなわち、変異遺伝子として決定された１遺伝子を含むゲノムＤＮＡを野生型植物からクローニングし、これを変異遺伝子SGR9を有するsgr9-1変異体に導入して、その表現型を野生型に回復できることを確認する。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明のプライマー対のサブセットの一例の、染色体上の位置を模式的に示した図。
【図２】マッピングの原理を説明する図。
【図３】マッピングの原理を説明する図（図２のつづき）。
【図４】各キメラ染色体における変異遺伝子が存在しない領域（黒塗りの領域）に基いて、変異遺伝子が存在する領域を決定する様子を示す図。
【図５】本発明のマッピング方法により変異遺伝子（SGR９遺伝子）の位置を決定する過程を示す図。
【図６】第二次マッピングの結果を示す図。
【図７】第三次マッピングの結果を示す図。
【図１】
2005192478.tif 000038
【図２】
2005192478.tif 000039
【図３】
2005192478.tif 000040
【図４】
2005192478.tif 000041
【図５】
2005192478.tif 000042
【図６】
2005192478.tif 000043
【図７】
2005192478.tif 000044
【配列表】
2005192478000001.app