(57)【要約】【課題】  古来から食材として利用している担子菌類を原料として、担子菌類を蛋白分解酵素で分解することにより、体内消化酵素で分解されずに活性を維持したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を生成させ、その処理物を原料として使用することにより血圧降下作用を有する食品素材として提供すること。【解決手段】  担子菌類を蛋白質分解酵素で加水分解して得たアンジオテンシン変換酵素阻害物質。担子菌がヤマブシタケである。蛋白質分解酵素としてBacillus由来エンド型蛋白質分解酵素を用いる。Bacillus由来エンド型蛋白質分解酵素による人工消化液にも分解されない物質である。上記のいずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分として含有する食品素材、好ましくは血圧降下作用を有する食品素材。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌類を蛋白質分解酵素で加水分解して得たアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項２】
担子菌がヤマブシタケである請求項１のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項３】
蛋白質分解酵素としてBacillus由来エンド型蛋白質分解酵素を用いる請求項１または２のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項４】
Bacillus由来エンド型蛋白質分解酵素による人工消化液にも分解されない請求項１、２または３のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分として含有する食品素材。
【請求項６】
血圧降下作用を有する食品素材である請求項５の食品素材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血圧降下作用を有するヤマブシタケ蛋白質分解酵素分解物、詳しくは、ヤマブシタケを蛋白質分解酵素により分解したペプチドを含むアンジオテンシン変換酵素阻害物質、およびそれを含む食品素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、放置すると脳卒中や心筋梗塞などの原因となる動脈硬化を引き起こす疾患である。現在、日本では、６０歳以上のおよそ半分が高血圧症と診断される深刻な状況にある。近年、高血圧症を含む生活習慣病の増加や健康保険の個人負担が増えるに伴い、健康食品等によって自らの健康を増進しようとするセルフケア指向が高まってきている。この様な背景の下、高血圧症の改善のために多くの研究機関で降圧剤や血圧を調整する食品成分の開発が積極的に進められている。
【０００３】
高血圧症の発症にはレニンーアンジオテンシン系が密接に係わっていることがよく知られている。腎臓の傍糸球体細胞から循環血液中に分泌されたレニンは、肝臓で生合成された血液中に存在するアンジテンシノーゲンに働いて、アンジオテンシンＩを作る。アンジオテンシンＩは血管の内皮細胞にあるアンジオテンシン変換酵素によりＣ末端His-Leuを切断し、血管収縮などの強い血圧上昇作用を有するアンジオテンシンIIになる。アンジオテンシンIIは血管の平滑筋を非常に強く収縮させ、血圧を上昇させるほか、副腎皮質からアルドステロンの血液中の分泌を促進する。さらに腎臓の近位尿細管に働いて、糸球体でろ過されたナトリウムの再吸収を高める。これらの作用はいずれも血圧を上昇させる。一方、アンジオテンシン変換酵素は血管の平滑筋を拡張させる作用があるブラジキニンを分解して不活化する。
【０００４】
この様にアンジオテンシン変換酵素はレニンーアンジオテンシン系（昇圧系）の活性化と、カリクレインーキニン系（降圧系）の不活性化作用を同時に持っている昇圧系酵素である。このアンジオテンシン変換酵素の働きを阻害することにより高血圧症の治療を行うことが可能である。そこでアンジオテンシン変換酵素阻害物質を含む食品や医薬品の開発が行われている。
【０００５】
アンジテンシン変換酵素阻害物質は当初、ヘビ毒中からヘビ毒由来ペプチドをモデルとして合成されていたが、その後、ゼラチンや牛乳などの蛋白質をタンパク分解酵素によって加水分解した分解物にアンジオテンシン変換酵素阻害活性が見いだされてから、多くの動植物性蛋白質加水分解物、すなわちペプチドにその阻害活性が開示されるようになった。
【０００６】
動植物性蛋白質を酵素処理して得られたアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、牛乳カゼイン由来（特許文献１〜３）、卵白由来（特許文献４〜６）、トウモロコシ由来（特許文献７）、米由来（特許文献８）、魚肉由来（特許文献９〜１３）、酒粕由来（特許文献１４）、大豆蛋白質由来（特許文献１５）等が知られている。しかしながら、これらの中で実用化されているものは非常に少ない。その理由として、体内消化酵素によって分解を受けて効果が不足したり、味、臭いが食品として使用しにくい等が挙げられる。そこでアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有しながら優れた風味をもつ食品加工素材が求められている。
【０００７】
古くから担子菌類は、特有の食感や風味を有し食品素材として広く用いられてきたが、近年、免疫賦活活性等の健康増進機能の面で注目されつつある。特に担子菌類に含まれるβグルカンの抗腫瘍活性が報告されてからは、その需要は日増しに高まってきている。担子菌類にはβグルカンだけでなく、健康を増進する上で有用な成分が数多く含まれており、例えば、循環器系の疾患を予防する血小板凝集阻害活性物質や抗酸化活性物質をはじめ、免疫系の疾患抑制作用を有する抗アレルギー活性物質、さらには抗変異原性物質等が挙げられる。従って、これらの機能成分の適量を健康食品素材として日常的に摂取すれば、手軽に健康を増進することができる。
【０００８】
上述の機能成分のなかでも、担子菌類が有する血圧降下作用についての研究例は少ないが、シイタケ（Lentinus edodes）の抽出物から得られた血圧降下作用を有する物質（特許文献１６）やヒラタケ(Pleurotus ostreatus)から得られた血圧降下剤および血圧降下作用を有する食品（特許文献１７）、また担子菌類から得られる生理活性物質（特許文献１８）としてヒラタケ科ヒラタケ属に属するホウビタケ（Pleurotus sajor-caju(Fr.)Sing.）及びそのアンジオテンシン阻害剤含有物の製造方法として、担子菌類由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有物の製造方法（特許文献１９）、並びにブナシメジ（Lyophyllum ulmarium）とエノキタケ（Flammulina velutipes）担子菌類から得られるアンジオテンシン変換酵素阻害剤含有物（特許文献２０）等の特許出願がある。また近年では、マイタケ（Grifola frondosa）の有するエンドペプチダーゼ活性を利用して食品中の蛋白質の一部を分解し、アンジオテンシン変換酵素を阻害する成分を生成する特許出願、すなわちマイタケを用いた高機能食品の製造法（特許文献２１）があるが、食品加工素材の製造を目的とした出願は少ない。
【０００９】
【特許文献１】特開昭６１−３６２２６号公報
【特許文献２】特開昭６１−３６２２７号公報
【特許文献３】特開平４−１５４７９７号公報
【特許文献４】特開平３−２８０８３５号公報
【特許文献５】特開平４−１５２８９２号公報
【特許文献６】特開平５―３３１１９０号公報
【特許文献７】特開平４−１６４０９４号公報
【特許文献８】特開平５−７０３５５号公報
【特許文献９】特開平５−１１２４６５号公報
【特許文献１０】特開平５−２４４９７９号公報
【特許文献１１】特開平５−２７１２９７号公報
【特許文献１２】特開平５−３３１９９１号公報
【特許文献１３】特開平５−３３１１９２号公報
【特許文献１４】特開平５−２９４８４４号公報
【特許文献１５】特開平５−３３９１６６号公報
【特許文献１６】特開昭５８―２６８２０号公報
【特許文献１７】特開平２−７２１２１号公報
【特許文献１８】特開平７−１２６２７６号公報
【特許文献１９】特開平７−２３８０３２号公報
【特許文献２０】特開平８−９９８９５号公報
【特許文献２１】特開２００１−３３３７３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
日本を初めとした先進国においては高齢化社会を迎え、医療費の増大が深刻な問題となっている。高血圧症は、放置すると脳卒中や心筋梗塞などの原因となる動脈硬化を引き起こす疾患であり、現在、日本では、６０歳以上のおよそ半分が高血圧症と診断される深刻な状況にある。この様な背景の下、健康食品等によって自らの健康を増進しようとするセルフケア指向が高まってきている。
【００１１】
本発明は古来から食材として利用している担子菌類を原料として、担子菌類を蛋白分解酵素で分解することにより、体内消化酵素で分解されずに活性を維持したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を生成させ、その処理物を原料として使用することにより血圧降下作用を有する食品素材として提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題に対して、担子菌類を各種蛋白分解酵素により分解処理を行ったところ、Bacillus 属の産生するエンド型の酵素群が体内消化酵素でも分解させずに、高いアンジオテンシン変換酵素阻害物質生産活性を有することを見いだし、該アンジオテンシン変換酵素阻害物質およびその製造方法に関する発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の(１)ないし(４)のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を要旨とする。
(１) 担子菌類を蛋白質分解酵素で加水分解して得たアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
(２)担子菌がヤマブシタケである上記(１)のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
(３) 蛋白質分解酵素としてBacillus 由来エンド型蛋白質分解酵素を用いる上記(１)または(２)のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
(４) Bacillus 由来エンド型蛋白質分解酵素による人工消化液にも分解されない上記(１)、(２)または(３)のアンジオテンシン変換酵素阻害物質。
【００１４】
また、本発明は以下の(５)または(６)のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を要旨とする。
(５) 上記(１)ないし(４)のいずれかのアンジオテンシン変換酵素阻害物質を有効成分として含有する食品素材。
(６) 血圧降下作用を有する食品素材である上記(５)の食品素材。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ヤマブシタケをBacillus由来のエンド型酵素で分解して得られる分解物を使用することで、キノコの風味を生かした体内消化酵素にも分解されないアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する食品素材を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明において担子菌類の酵素分解に用いる蛋白分解酵素はBacillus属の生産する酵素群であり、特にBacillus stearothermophilusの生産するエンド型の酵素が高いアンジオテンシン変換酵素阻害活性物質の生産性を有している。
他の植物由来蛋白分解酵素やAspergillus属、Rhizopus属の蛋白分解酵素並びに各種糖質分解酵素では、本発明で示すような強いアンジオテンシン変換酵素阻害物質の生産は認められない。
【００１７】
上記の特許文献１９に記載されているホウビタケのペプシンまたはトリプシン分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性は強い部類に入るものの、担子菌類から蛋白質を抽出することが必要であり、食品素材としての利用性は低いと考えられる。学術的な研究においては、生理活性物質を特定し単離精製して用いることが重要であるが、また食品としての利用を考えた場合は、経済性等の点から単離精製して利用することは、必ずしも産業上実用的であるとはいえない。そこで実用性の高い血圧降下作用を有する食品素材を提供するため、ヤマブシタケ子実体を直接、蛋白質分解酵素で処理し、血圧降下作用を有する分解物を得ることにした。また体内においてアンジオテンシン変換酵素阻害物質が分解されないことを人工消化液を用いて確認した。
【００１８】
食用キノコであるヤマブシタケを使用するため、高い安全性が保証される。以下、本発明について、実施例をもって詳細に説明する。本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末１gを水２０mlに懸濁分散させ、１００℃、５分間処理した。放冷後、各種酵素剤１０mgを加えて所定の温度及びpＨによって１８時間酵素分解処理を行った。pＨの調整には水酸化ナトリウムと塩酸を使用した。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液について、可溶性全窒素含量並びにアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。アンジテンシン変換酵素阻害活性は次の方法で行った。
【００２０】
「アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法」
基質溶液：６.２５mM ヒブリル-L-ヒスチジル-L-ロイシン〔(株)ペプチド研究所製〕    ヒブリル-L-ヒスチジル-L-ロイシン１４０mgをpＨ８.３の１１４mM リン酸緩衝液（３４２mM ＮaＣlを含む）５０mlに溶解した溶液。
アンジオテンシン変換酵素溶液：３００mU/mlアンジオテンシン変換酵素（シグマ社製）  アンジオテンシン変換酵素０.３UをpＨ８.３の１１４mM リン酸緩衝液（３４２mM ＮaＣlを含む）１mlに溶解した溶液。遠心分離によって得られた蛋白分解酵素処理液３０mlを試験管に採り、これにアンジオテンシン変換酵素溶液２０mlを加え、３７℃で５分間保持した。その後、基質溶液２００mlを添加し３７℃で３０分間反応した後、０.７５mlの３％メタリン酸溶液を加えて反応を停止させ、１００００xg、５分間遠心分離することによって上澄み液を採取した。この上澄み液中のヒプリル酸含量をHoriuchiらの方法〔J.Chromatography,233(1982)123-130〕に基づいて高速液体クロマトグラフ（HPLC）で測定した。
HPLCの分析条件を次に示す。：
カラム：Wako pack C18 AR(4.6x250mm和光純薬工業株式会社製)
溶離液：メタノール：１０mM リン酸１カリウム溶液(１：１)リン酸でpＨ３.０に調整
流速：０.６ml/min
カラム温度：６０℃
検出：２２８nmの紫外部吸収
【００２１】
「アンジオテンシン変換酵素阻害率の算出」
阻害率は次の式より算出した。
阻害率＝（Ａ−Ｂ）/Ａ×１００（％）
ここで、Ａ：阻害剤を含まない場合のヒプリル酸のピーク面積、Ｂ：阻害剤添加の場合のヒプリル酸のピーク面積、また上記阻害率が５０％になる分解物濃度をIC50値で表した。表１に試験に供した２２種類の酵素とその起源、表２に酵素処理条件（温度及びpＨ）、可溶性全窒素とアンジオテンシン変換酵素阻害活性（％）を示した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
【表２】
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【実施例２】
【００２４】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末１gを水２０mlに懸濁分散させ、１００℃、５分間処理した。放冷後、水酸化ナトリウム溶液を用いてpＨを８.０に調整し、蛋白質分解酵素Ｓ「アマノ」Ｇを１０mgを加えて３７℃及び７０℃によって所定時間酵素分解処理を行った。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液について、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。測定結果を表３（アンジオテンシン変換酵素阻害活性に及ぼす反応温度の影響）に示した。
【００２５】
【表３】
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【実施例３】
【００２６】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末１gを水２０mlに懸濁分散させ、１００℃、で５分間処理した。放冷後、水酸化ナトリウム溶液を用いてpＨを８.０に調整し蛋白質分解酵素Ｓ「アマノ」Ｇをそれぞれ２０mg及び５mgを加えて７０℃によって所定時間酵素分解処理を行った。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液について、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。測定結果を図１（酵素反応時間と阻害率の変遷）に示した。
【実施例４】
【００２７】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末１gを水２０mlに懸濁分散させ、１００℃で０、５、３０、６８そして１００分処理した。放冷後、水酸化ナトリウム溶液を用いてpＨを８.０に調整し、蛋白質分解酵素Ｓ「アマノ」Ｇを１０mgを加えて７０℃によって１時間酵素分解処理を行った。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液について、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。測定結果を表４（アンジオテンシン変換酵素阻害活性に及ぼすヤマブシタケ予備加熱時間の影響）に示した。
【００２８】
【表４】
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【実施例５】
【００２９】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末１gを水２０mlに懸濁分散させ、１００℃で５分間処理した。放冷後、重炭酸水素アンモニウムを用いてpＨを８.０に調整し、蛋白質分解酵素Ｓ「アマノ」Ｇを１０mgを加えて７０℃で１時間酵素分解処理を行った。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液を凍結乾燥し、蒸留水１０mlに溶解した。この溶液を適宜希釈してアンジオテンシン変換酵素阻害活性が５０％になる濃度、すなわちIC50値を求めた。IC50は１１.８mg/mlとなった。
【実施例６】
【００３０】
凍結乾燥したヤマブシタケ子実体を、高速粉砕機で粉砕し、３０メッシュ以下とした粉末３gを水９０mlに懸濁分散させ、１００℃で５分間処理した。放冷後、重炭酸水素アンモニウムを用いてpＨを８.０に調整し、蛋白質分解酵素Ｓ「アマノ」Ｇを３０mgを加えて７０℃で１時間酵素分解処理を行った。酵素分解後、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液を得た。この上澄み液を凍結乾燥し、蒸留水９０mlに溶解した。この溶液について、アンジオテンシン変換酵素阻害物質の人工消化液での残存活性を瀧口らの方法（腸内細菌学雑誌14,11-18,2000）に基づいて調べた。人工胃液におけるアンジオテンシン変換酵素阻害活性残存性は、上述の溶液９０mlを１０mlずつに分注し、それぞれ塩酸によってpＨ１.０及び３.０に調整し、ペプシン〔和光純薬工業(株)製〕８mgを加えて３７℃で３時間酵素分解処理を行った。また人工腸液におけるアンジオテンシン変換酵素阻害活性残存性は、上述の溶液１０mlに胆汁末を０.１g及び０.０１g添加した後、パンクレアチン〔和光純薬工業(株)製〕及びトリプシン〔和光純薬工業(株)製〕をそれぞれ２mgずつ加え、３７℃で２０時間酵素分解処理を行った。それぞれの人工消化液での酵素分解後、分解液のpＨを水酸化ナトリウムで７.０に調整し、１００℃で１０分間煮沸処理し酵素を失活させ、放冷後１００００xgで１０分間遠心分離し、上澄み液におけるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を測定した。測定結果を表５（アンジオテンシン変換酵素阻害活性に及ぼす人工消化液の影響）に示した。
【００３１】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３２】
古来から食材として利用しており、また近年βグルカンなど健康を増進する上で有用な成分が数多く含まれてことで注目されている担子菌類に属するヤマブシタケ子実体を原料として、ヤマブシタケ子実体を直接、蛋白質分解酵素で処理し分解することにより、体内消化酵素で分解されずに活性を維持したアンジオテンシン変換酵素阻害物質を生成させ、その処理物を原料として使用する実用性の高い血圧降下作用を有する食品素材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】酵素反応時間と阻害率の変遷
【図１】
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