(57)【要約】【課題】  フコース修飾のない糖鎖構造を有する糖鎖の機能解析やフコース修飾のない糖鎖構造を有する生理活性の高い糖蛋白質の生産することができる細胞が求められている。【解決手段】  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立した不死化細胞株および該細胞株の形質転換体、該不死化細胞株の用途および作製方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立された不死化細胞株。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスである請求項１に記載の不死化細胞株。
【請求項３】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、請求項１または２に記載の不死化細胞株。
【請求項４】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子の開始コドンを含むエクソン領域の部分が欠失した、請求項１〜３のいずれか１項に記載の不死化細胞株。
【請求項５】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の不死化細胞株。
【請求項６】
α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)または(b)から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、請求項５に記載の不死化細胞株。
(a) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNA；
(b) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【請求項７】
α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)〜(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項５に記載の不死化細胞株。
(a) 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(c) 配列番号６で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の不死化細胞株に糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体。
【請求項９】
糖蛋白質が抗体である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
抗体が、以下の(a)〜(d)からなる群から選ばれる、請求項９に記載の形質転換体。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a)または(b)のFc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。
【請求項１１】
抗体のクラスがIgGである、請求項９または１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項８に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれか1項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取し、精製する工程を含む、抗体組成物の製造方法。
【請求項１４】
N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である糖蛋白質または抗体組成物を生産することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
N-グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２、１４または１５のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の糖蛋白質を有効成分として含有する医薬。
【請求項１９】
請求項１７に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
【請求項２０】
医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、請求項１８または１９に記載の医薬。
【請求項２１】
請求項１８または２０に記載の医薬を製造するための、請求項１６に記載の糖蛋白質の使用。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載の医薬を製造するための、請求項１７に記載の抗体組成物の使用。
【請求項２３】
以下の(a)〜(c)の工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より臓器を摘出する工程；
(b) 摘出した臓器を非凝集状態の細胞集団とする工程；
(c) 非凝集状態の細胞集団を培養する工程。
【請求項２４】
以下の(a)〜(d)の工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より臓器を摘出する工程；
(b) 摘出した臓器を非凝集状態の細胞集団とする工程；
(c) 非凝集状態の細胞集団に癌遺伝子を導入する工程；
(d) 癌遺伝子を導入した細胞集団を培養する工程。
【請求項２５】
臓器が、以下の(a)〜(d)からなる群から選ばれる臓器である、請求項２３または２４に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a) 肝臓；
(b) 腎臓；
(c) 骨髄；
(d) 胎仔。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立された不死化細胞株および該細胞株の形質転換体に関する。本発明はまた、該不死化細胞株の用途および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は膜蛋白質や分泌蛋白質を修飾し、その機能を制御している。即ち、哺乳生物の生体内のシグナル伝達に関わる細胞外の蛋白質の機能は糖鎖の修飾により制御されており、糖鎖は生理的に非常に重要な役割を果たしている。
糖鎖は、糖蛋白質に付加する糖鎖の構造に変化を及ぼす酵素によって合成されている。糖蛋白質に付加する糖鎖の構造に変化を及ぼす酵素としては、β1,4-N-アセチルグルコサミン転移酵素III（以下、GnTIIIとも称する）、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（以下、FUT8とも称する）などが知られており、これらの糖転移酵素遺伝子を細胞に導入あるいは欠失して、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を変化させた糖蛋白質を生産し、糖鎖構造の変化が生理機能に及ぼす影響が解析されている（非特許文献１）。具体的には、糖蛋白質に付加する糖鎖の構造に変化を及ぼす酵素は、細胞の生育に影響を及ぼすことが知られている。N-グリコシド結合複合型糖鎖のトリマンノースコアのβマンノースにN-アセチルグルコサミンを付加する反応を触媒するGnTIIIの発現を増強させたラット副腎髄質由来褐色細胞であるPC12細胞では、成長因子受容体（TrkA）の機能低下により、神経成長因子（NGF）に由来する細胞増殖活性は低下する（非特許文献２）。
【０００３】
また、糖鎖の構造を変化させる手法として、糖蛋白質に付加する糖鎖の構造に変化を及ぼす酵素の阻害剤を添加して細胞を培養し、合成された糖鎖を解析する手法がある。糖鎖修飾の阻害剤であるツニカマイシンを用いて培養された細胞では、上皮増殖因子受容体（EGFR）のシグナル伝達系が異常となることが知られている（非特許文献１）。更にインスリン受容体においても修飾される糖鎖の構造の異常が、細胞増殖に影響を与えることが知られている（非特許文献３）。このように、細胞増殖に関与している成長因子受容体の多くは修飾を受ける糖鎖構造により影響を受けるため、糖蛋白質に付加する糖鎖の構造に変化を及ぼす酵素群の発現変化は、生体の成長に影響を与える。
【０００４】
さらに、糖転移酵素には、同じ転移反応を触媒する複数の酵素が存在する場合があり、複数の糖転移酵素が行う複雑な糖鎖修飾が蛋白質の機能の微妙な調節を行っている。
哺乳動物においてFUT8はN-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する唯一の酵素として知られている。該酵素は生体において重要な役割を果たしているものと考えられているが、その機能は依然不明な点が多い。
【０００５】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与するFUT8（非特許文献４）の遺伝子の構造は1996年に明らかにされている（非特許文献５、非特許文献６、特許文献１）。FUT8の酵素活性は多くの臓器で確認されているが、脳や小腸において比較的高い（非特許文献７、非特許文献８）。生理的な機能としては、網膜形成においてフコース修飾糖鎖が重要な役割を担っていることが指摘されており、FUT8の発現調節との関わりが注目されている（非特許文献９）。血液凝固においても血小板由来のFUT8の役割が注目されている（非特許文献１０）。また、免疫グロブリンIgG1の糖鎖構造へのフコースの修飾がFcγRIIIaとの結合に影響を及ぼし、抗体自身の抗体依存性細胞傷害活性が変化することも報告されている（非特許文献１１、非特許文献１２）。病態との関連においては、肝臓癌や嚢胞性繊維症などいくつかの疾病において、FUT8活性の上昇及び該酵素反応生成物の割合の増加が観察されている（非特許文献１３、非特許文献１４）。FUT8の過剰発現トランスジェニックマウスにおいては肝臓や腎臓での脂肪症様の変性が観察される（非特許文献１５）。また、FUT8をコードする遺伝子を欠失したマウスでは、ほとんどの個体は成長が不良であり生後２〜３週間で死亡してしまう（非特許文献１６，非特許文献１７）。従って、FUT8遺伝子を欠損したマウスの個体は細胞の増殖が不良になっており、該マウス由来の細胞株は今まで樹立されていない。
【特許文献１】WO92/27303
【非特許文献１】Molecular Medicine, 40, 1034 (2003)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 272, 9629 (1997)
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 267, 17415 (1992)
【非特許文献４】Biochem．Biophys. Res. Commun., 72, 909 (1976)
【非特許文献５】J. Biol. Chem., 271, 27817 (1996)
【非特許文献６】J. Biochem., 121, 626 (1997)
【非特許文献７】Int. J. Cancer, 72, 1117 (1997)
【非特許文献８】Biochim. Biophys. Acta., 1473, 9 (1999)
【非特許文献９】Glycobiology, 9, 1171 (1999)
【非特許文献１０】Biochem. Soc. Trans., 15, 603 (1987)
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 277, 26733 (2002)
【非特許文献１２】J. Biol. Chem., 278, 3466 (2003)
【非特許文献１３】Hepatology, 13, 683 (1991)
【非特許文献１４】Hepatology, 28, 944 (1998)
【非特許文献１５】Glycobiology, 11, 165, (2001)
【非特許文献１６】GlycoT2002,Third Internatioal Symposiumon Glycosyltransferases, Djuronaset, Stockholm, September 19-22, 2002, A MarcusWallenberg Symposium
【非特許文献１７】ゲノム情報を超えた生命のふしぎ, 糖鎖, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立された不死化細胞株および該細胞株の形質転換体を提供することにある。本発明の目的はまた、該不死化細胞株の用途及び製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の（１）〜（２５）に関する。
（１）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立された不死化細胞株。
（２）  非ヒト動物がマウスである（１）に記載の不死化細胞株。
（３）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、（１）または（２）に記載の不死化細胞株。
【０００８】
（４） N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子の開始コドンを含むエクソン領域の部分が欠失した、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の不死化細胞株。
（５）  N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α1,6-フコシルトランスフェラーゼである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の不死化細胞株。
（６）  α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)または(b)から選ばれるDNAがコードする蛋白質である、（５）に記載の不死化細胞株。
(a) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNA；
(b) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA。
【０００９】
（７）  α1,6-フコシルトランスフェラーゼが、以下の (a)〜(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、（５）に記載の不死化細胞株。
(a) 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
(b) 配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
(c) 配列番号６で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（８）  （１）〜（７）のいずれか１項に記載の不死化細胞株に糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した形質転換体。
（９）  糖蛋白質が抗体である、（８）に記載の形質転換体。
【００１０】
（１０）  抗体が、以下の(a)〜(d)からなる群から選ばれる、（９）に記載の形質転換体。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a)または(b)のFc領域を含む抗体断片；
(d) (a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。
（１１）  抗体のクラスがIgGである、（９）または（１０）に記載の形質転換体。
（１２）  （８）に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質の製造方法。
（１３）  （９）〜（１１）のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から抗体組成物を採取し、精製する工程を含む、抗体組成物の製造方法。
【００１１】
（１４）N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である糖蛋白質または抗体組成物を生産することを特徴とする、（１２）または（１３）に記載の方法。
（１５）N-グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、（１４）に記載の方法。
（１６）  （１２）、（１４）または（１５）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質。
（１７）  （１３）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【００１２】
（１８） （１６）に記載の糖蛋白質を有効成分として含有する医薬。
（１９） （１７）に記載の抗体組成物を有効成分として含有する医薬。
（２０）  医薬が、腫瘍を伴う疾患、アレルギーを伴う疾患、炎症を伴う疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に対する診断薬、予防薬又は治療薬である、（１８）または（１９）に記載の医薬。
（２１）  （１８）または（２０）に記載の医薬を製造するための、（１６）に記載の糖蛋白質の使用。
（２２）  （１９）または（２０）に記載の医薬を製造するための、（１７）に記載の抗体組成物の使用。
【００１３】
（２３）  以下の(a)〜(c)の工程を含む、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a)N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より臓器を摘出する工程；
(b) 摘出した臓器を非凝集状態の細胞集団とする工程；
(c) 非凝集状態の細胞集団を培養する工程。
【００１４】
（２４）  以下の(a)〜(d)の工程を含む、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a)N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より臓器を摘出する工程；
(b) 摘出した臓器を非凝集状態の細胞集団とする工程；
(c) 非凝集状態の細胞集団に癌遺伝子を導入する工程；
(d) 癌遺伝子を導入した細胞集団を培養する工程。
【００１５】
（２５）  臓器が、以下の (a)〜(d)からなる群から選ばれる臓器である、（２３）または（２４）に記載の不死化細胞株を樹立する方法。
(a) 肝臓；
(b) 腎臓；
(c) 骨髄；
(d) 胎仔。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の不死化細胞株により、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素によりフコース修飾を受ける糖蛋白質のフコース非修飾型体を取得することができる。得られた糖蛋白質は、それ自身が医薬としてあるいは医薬の標的分子として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の不死化細胞株とは、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物より樹立された不死化細胞株であれば、いかなる不死化細胞株またはその不死化細胞株の亜株も包含される。
本発明において、非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジなど、遺伝子組換え技術を使用することができるヒト以外の動物があげられるが、マウスが好ましく用いられる。
本発明において、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素とは、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（FUT8）などがあげられる。
本発明において、α1,6-フコシルトランスフェラーゼとしては、下記(a)または(b)のDNAがコードする蛋白質、または下記(c)、(d)または(e)の蛋白質があげられる。
(a) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号５で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
または、
(c)配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(d)配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠出、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
(e)配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
【００１８】
また、α1,6-フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするDNAとしては、配列番号５で表される塩基配列を有するDNA、配列番号５で表される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードするDNAなどがあげられる。
【００１９】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、例えば配列番号５で表される塩基配列を有するDNAなどのDNAまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1Mの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、DNA Cloning 1: Core Techniques, A PracticalApproach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、配列番号５で表される塩基配列と少なくとも60％以上の相同性を有するDNA、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
【００２０】
本発明において、配列番号６で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、NucleicAcids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質を意味する。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入および／または付加できる程度の数であり、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
【００２１】
また、本発明において、配列番号６で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性を有し、かつα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕やFASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上、最も好ましくは99％以上である蛋白質であることを意味する。
【００２２】
本発明の不死化細胞株としては、上述の酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたマウスより樹立した不死化細胞株または該不死化細胞株の亜株などが含まれる。
本発明において、N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたとは、該酵素の発現を欠失させるように該遺伝子の発現調節領域に変異を導入すること、あるいは該酵素の機能を欠失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することを意味する。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列の改変を行うことを意味する。ゲノム遺伝子がノックアウトされる具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除される例があげられる。
【００２３】
上述の酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物としては、目的とする酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物であれば、いずれの手法を用いて作製された非ヒト動物も包含される。
本発明の不死化細胞株は、N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物から樹立された不死化細胞株であればいかなる細胞株も包含される。不死化細胞株の樹立にはまとまった細胞集団が必要であり、まとまった細胞集団を得るためには、非ヒト動物の臓器などを不死化細胞株の樹立に用いることが好ましい。
【００２４】
非ヒト動物の臓器としては、不死化細胞株が樹立できる細胞を含む臓器または組織であればいかなるものも包含される。具体的には、上皮組織、結合組織、脂肪組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織、血液組織、骨髄、循環器、リンパ性器官、歯、消化管、肝臓、胆嚢、膵臓、呼吸器、泌尿器、生殖器、内分泌器官または感覚器などが用いられるが、好ましくは、肝臓、腎臓または生殖器などが、さらに好ましくは、血液組織、骨髄などが、最も好ましくは、骨髄が用いられる。生殖器としては、通常卵巣や精巣などが用いられる。また、発生過程にある胎仔なども本発明の不死化細胞株の樹立に用いることができる。
【００２５】
本発明の不死化細胞株は、in vitroにおいてフコース修飾のない糖鎖構造を有する糖鎖の機能解析や、フコース修飾のない糖鎖構造を有する生理活性の高い糖蛋白質の生産に利用することができる。
フコース修飾のない糖鎖構造を有することで高い生理活性を示す糖蛋白質としては、フコース修飾のない糖鎖構造を有することで受容体との親和性が向上する糖蛋白質、血中の半減期が長くなる糖蛋白質、血中投与後の組織分布が変化する糖蛋白質または薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用が向上する糖蛋白質などがあげられる。
【００２６】
本発明における糖蛋白質としては、N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされていない細胞株で生産した場合、その産生蛋白質の糖鎖構造にフコースの修飾がある糖蛋白質が好ましい。具体的には、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンIII、プロテインC、血液凝固因子VII、血液凝固因子VIII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（EGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（SCF）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン6、インターロイキン10、インターロイキン11、可溶性インターロイキン4受容体、腫瘍壊死因子α、DNAseI、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼなどがあげられる。
【００２７】
フコース修飾のない糖鎖構造を有することで、その生理活性が上昇する糖蛋白質としては、例えば、抗体があげられる。抗体の生理活性としては、抗体に特異的な抗原に結合する活性、抗原に結合した抗体のFc領域を介して該抗原が発現している細胞を除去する抗体依存性細胞傷害活性（以下、「ADCC活性」と表記する）または抗原に結合して、補体を介して細胞を傷害する活性（以下、「CDC活性」と表記する）などがあげられる。
例えば、本発明の不死化細胞株は、N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされていない細胞株が生産する抗体組成物より、高いADCC活性を有する抗体組成物を生産することができる。
抗体組成物とは、N-グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる組成物をいう。
【００２８】
抗体分子は、重鎖、軽鎖の2種類のポリペプチド鎖がそれぞれ2分子ずつ会合した4量体である。重鎖のN末端側の約4分の1と軽鎖のN末端側の約2分の1（それぞれ100余アミノ酸）は可変領域と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。可変領域以外の部分の大半は定常領域と呼ばれる。抗体分子は定常領域の相同性によりIgG、IgM、IgA、IgD、IgEの各クラスに分類される。
またヒト抗体の場合、IgGクラスは定常領域の相同性により、さらにIgG1〜IgG4のサブクラスに分類される。
【００２９】
重鎖はN末端側よりVH、CH1、CH2、CH3の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、CH1とCH2の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、CH1とCH2とが区切られる。ヒンジ領域以降のCH2とCH3からなる構造単位はFc領域と呼ばれ、N-グリコシド結合糖鎖が結合している。また、この領域は、Fcレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第5版、2000年2月10日発行、南江堂版、抗体工学入門、1994年1月25日初版、地人書館）。
【００３０】
抗体分子のFc領域には、N-グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するN-グルコシド結合糖鎖としては、下記化学式（１）で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のN-グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。 
【００３１】
【化１】
2005224240.tif 000002
【００３２】
したがって、本発明の不死化細胞株を用いて製造される抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。本発明の不死化細胞株を用いて製造される抗体組成物として、好ましくは、N-グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物があげられる。
【００３３】
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がN-グリコシド結合複合型糖鎖のN-アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
上述のN-グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、N-グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物とは、後述の６.に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることを意味する。
【００３４】
ADCC活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体のFc領域とエフェクター細胞表面上に存在するFcレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を傷害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(MonoclonalAntibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., Capter 2.1 (1995)］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
【００３５】
N-グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体組成物からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法[生物化学実験法23―糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989）]を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をHPAED-PAD法[ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（J.Liq. Chromatogr.）, 6, 1577 (1983)］で分析することによっても決定することができる。
【００３６】
また、本発明において抗体としては、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であればよく、IgGクラスの抗体が好適に用いられる。
抗体分子としては、抗体のFc領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、抗体のFc領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
【００３７】
抗体としては、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に生産される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよいが、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマが分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された抗体産生細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
【００３８】
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はV領域としてHVまたはVHとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００３９】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００４０】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列を任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列に移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型CDR移植抗体を発現させ、製造することができる。
【００４１】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体生産トランスジェニック動物あるいはヒト抗体生産トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
【００４２】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化、挿入することにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒト抗体産生細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に蛋白質工学的手法により、2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子あるいは所望の抗体断片の形状を有する分子に変換することができる。
【００４３】
ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することもできる。ヒト抗体生産トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。
ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
【００４４】
また、本発明において、抗体の断片としては、上記抗体の少なくともFc領域の一部または全部を含んだ断片をいう。Fc領域とは、抗体のH鎖のC末端側の領域、CH2領域およびCH3領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともFc領域の一部とは、好ましくはCH2領域を含む断片、より好ましくはCH2領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。IgGクラスのFc領域は、カバット（Kabat）らのEUIndex[シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest）, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD. (1991)]のナンバリングで226番目のシステインからC末端、あるいは230番目のプロリンからC末端までを意味する。抗体の断片としては、具体的には、Fc領域の一部を含むポリペプチド鎖の単量体または2量体などがあげられる。
【００４５】
Fc領域を含む融合蛋白質としては、抗体のFc領域を含む抗体あるいは抗体の断片と、蛋白質とを融合させた物質（以下、Fc融合蛋白質と称す）であればいかなるものでもよい。
Fc融合蛋白質に含まれるFc領域と融合させる蛋白質としては、Fc領域と融合させて発現できる蛋白質であればいかなる蛋白質も包含する。具体的には、抗体、抗体の結合性断片、受容体のリガンド、可溶性の受容体、核酸結合蛋白質、細胞膜結合蛋白質、脂質結合蛋白質、脂肪酸結合蛋白質、糖あるいは糖鎖結合蛋白質、酵素の基質のドミナントネガティブ体および酵素のドミナントネガティブ体などがあげられる。
【００４６】
抗体の結合性断片としては、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Diabody、dsFvまたはCDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち (H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される)、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド結合(S-S結合) で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fabは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
【００４７】
F(ab')2は、IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち (H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される)、Fabがヒンジ領域のS-S結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
F(ab')2は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはS-S結合させ、作製することができる。
【００４８】
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のS-S結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Fab'は、F(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、Fab'をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００４９】
scFvは、1本のVHと1本のVLとを12残基以上の適当なペプチドリンカー (P) を用いて連結した、VH-P-VLないしはVL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
scFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５０】
Diabodyは、抗原結合特異性の同じまたは異なるscFvが2量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する2価の抗原結合活性または異なる抗原に対する2特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
Diabodyは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、3〜10残基のポリペプチドリンカーを有するscFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりDiabodyを発現させ、製造することができる。
【００５１】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ1アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のS-S結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法(Protein Engineering, 7, 697 (1994)) に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
dsFvは、抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００５２】
CDRを含むペプチドは、VHまたはVLのCDRの少なくとも1領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
CDRを含むペプチドは、抗体のVHおよびVLのCDRをコードするcDNAを構築し、該cDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法 (t-ブチルオキシカルボニル法) などの化学合成法によって製造することもできる。
以下、非ヒト動物としてマウスを用いた場合の本発明の不死化細胞株の製造方法について具体的に説明する。
【００５３】
１．N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの  １位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたマウスの作出方法
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明に用いるノックアウトマウスは、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、「α1,6-フコース修飾酵素」と表記する）の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。α1,6-フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6-フコシルトランスフェラーゼがあげられる。
【００５４】
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、相同組換え法、RDO法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
【００５５】
（ａ）相同組換え法による、本発明に用いるノックアウトマウスの作製
本発明に用いるノックアウトマウスは、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulatingthe Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press (1994)（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、GeneTargeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ8ジーンターゲッティング, ES細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995)（以下、「ES細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の染色体工学の手法を用い、例えば以下のように行うことができる。
α1,6-フコース修飾酵素のcDNAを取得する。
【００５６】
取得したcDNAの塩基配列に基づき、α1,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを調製する。
該ゲノムDNAの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、α1,6-フコース修飾酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択する。
選択した胚性幹細胞を公知の注入キメラ法あるいは集合キメラ法に従って、受精卵に導入し、導入した受精卵を偽妊娠雌性マウスの卵管あるいは子宮に移植することで生殖系列キメラを選択する。
【００５７】
選択した生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有する個体を選択する。
選択した個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有するホモ接合体を選択する。
得られたホモ接合体同士を交配させ、その子孫を得ることにより、本発明に用いるノックアウトマウスを作製することができる。
α1,6-フコース修飾酵素のcDNA及びゲノムDNAを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
【００５８】
cDNAの調製方法
改変を施したいマウスの細胞から全RNA又はmRNAを調製する。
調製した全RNA又はmRNAからcDNAライブラリーを作製する。
【００５９】
α1,6-フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法にて、α1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、cDNAライブラリーをスクリーニングし、α1,6-フコース修飾酵素をコードするcDNAを取得することができる。
【００６０】
マウスの細胞のmRNAは、市販のもの(例えばClontech社)を用いてもよいし、以下のごとく細胞から調製した全RNAから調製してもよい。細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology), 154,3 (1987)］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（AGPC）法［アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987); 実験医学、9, 1937 (1991)］などがあげられる。
【００６１】
また、全RNAからpoly(A)+ RNAとしてmRNAを調製する方法としては、オリゴ（dT）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社）、Quick Prep mRNA
Purification Kit（Pharmacia社）などのキットを用いることによりmRNAを調製することができる。
【００６２】
調製したマウスの細胞のmRNAからcDNAライブラリーを作製する。cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid Systemfor cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Life Technologies社）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE社）を用いる方法などがあげられる。
【００６３】
cDNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express［STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies), 5, 58(1992)］、pBluescript II SK(+)［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 17,9494 (1989)］、λZAP II（STRATAGENE社）、λgt10、λgt11［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ(DNA cloning, A PracticalApproach),1, 49 (1985)］、λTriplEx（Clontech社）、λExCell（Pharmacia社）、pT7T318U（Pharmacia社）、pcD2［モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)］およびpUC18［ジーン(Gene), 33, 103(1985)］等をあげることができる。
【００６４】
cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Escherichia coli XL1-Blue MRF'［STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies), 5, 81(1992)］、Escherichia coli C600［ジェネティクス(Genetics), 39, 440(1954)］、Escherichia coli Y1088［サイエンス(Science),222, 778(1983)］、Escherichia coli Y1090［サイエンス(Science), 222, 778(1983)］、Escherichia coli NM522［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166,1 (1983)］、Escherichia coli K802［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 16,118 (1966)］およびEscherichia coli JM105［ジーン(Gene), 38, 275(1985)］等が用いられる。
【００６５】
また、このcDNAライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長cDNAの割合を下げ、なるべく完全長cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン(Gene), 138, 171(1994); ジーン(Gene), 200, 149 (1997); 蛋白質核酸酵素, 41, 603 (1996); 実験医学, 11, 2491 (1993); cDNAクローニング(羊土社 )(1996); 遺伝子ライブラリーの作製法(羊土社) (1994)］を用いて調製したcDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
【００６６】
α1,6-フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の5'端および3'端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法［ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)］を用いてDNAの増幅を行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
【００６７】
取得した遺伝子断片がα1,6-フコース修飾酵素をコードするDNAであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABIPRISM377DNAシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【００６８】
該遺伝子断片をDNAプローブとして、改変を施したいマウスの細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素のDNAを取得することができる。
また、α1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、改変を施したいマウスの細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法を用いてスクリーニングを行うことにより、α1,6-フコース修飾酵素のDNAを取得することもできる。
【００６９】
取得したα1,6-フコース修飾酵素をコードするDNAの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABIPRISM377DNAシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定する。
【００７０】
決定したcDNAの塩基配列をもとに、BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、GenBank、EMBLおよびDDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でα1,6-フコース修飾酵素をコードしている遺伝子検索、使用することもできる。
上記の方法で得られるα1,6-フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号５に記載の塩基配列が挙げられる。
【００７１】
決定されたDNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のDNA合成機model 392等のDNA合成機で化学合成することにより、α1,6-フコース修飾酵素のcDNAを取得することもできる。
α1,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
【００７２】
ゲノムDNAの調製方法
ゲノムDNAを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems社）やUniversal GenomeWalkerTMKits（CLONTECH社）などを用いることにより、α1,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを単離することもできる。
上記の方法で得られるα1,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAの塩基配列は、上記方法で取得されたα1,6-フコース修飾酵素のcDNA中の塩基配列が含まれていることから確認できる。
【００７３】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ8 ジーンターゲッティング, ES細胞を用いた変異マウスの作製(羊土社)(1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
【００７４】
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3,133 (1990)］、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 84, 7413 (1987)］、インジェクション法[マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版]、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第2606856、特許第2517813］、DEAE−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ4―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編(1994)］、ウイルスベクター法[マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版]等をあげることができる。
【００７５】
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Gene Targeting, APractical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、バイオマニュアルシリーズ8 ジーンターゲッティング, ES細胞を用いた変異マウスの作製(羊土社)(1995)等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリA選択などの方法を用いることができる。具体的には、hprt遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、hprt遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、hprt遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をG418を含む培地で培養し、G418耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する（相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、DTの毒性により生育できない）ことにより、DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やPCR法［ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)］等があげられる。
【００７６】
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、LHRHと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。LHRHの類縁体としては、例えば[3,5-Dil-Tyr5]-LHRH、[Gln8]-LHRH、[D-Ala6]-LHRH、des-Gly10-[D-His(Bzl)6]-LHRHethylamide等があげられる。
【００７７】
（ｂ）RDO方法による本発明に用いるノックアウトマウスの作製
本発明に用いるノックアウトマウスは、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、RDO（RNA-DNA oligonucleotide）法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
【００７８】
α1,6-フコース修飾酵素のcDNAあるいはゲノムDNAを調製する。
調製したcDNAあるいはゲノムDNAの塩基配列を決定する。
決定したDNAの配列に基づき、α1,6-フコース修飾酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのRDOのコンストラクトを設計し合成する。
【００７９】
合成したRDOを胚性幹細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちα1,6-フコース修飾酵素に変異が生じた胚性幹細胞を選択する。
選択した胚性幹細胞を注入キメラ法あるいは集合キメラ法に従って、受精卵に導入し、導入した受精卵を偽妊娠雌性マウスの卵管あるいは子宮に移植することで生殖系列キメラを選択する。
【００８０】
選択した生殖系列キメラを交配させ、産まれた仔から、導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有する個体を選択する。
選択した個体同士を交配させ、産まれた仔から、両方の相同染色体において、導入したターゲットベクターが、α1,6-フコース修飾酵素をコードするゲノム上の遺伝子領域と相同組換えを起こして挿入された染色体を有するホモ接合体を選択する。
得られたホモ接合体同士を交配させ、その子孫を得ることにより、本発明にもちいるノックアウトマウスを作製することができる。
【００８１】
胚性幹細胞へのRDOの導入には、上記１の（１）の（ａ）に記載のターゲットベクターの導入方法を用いることができる。
α1,6-フコース修飾酵素のcDNAを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「cDNAの調製方法」などがあげられる。
α1,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムDNAの調製方法」などがあげられる。
【００８２】
DNAの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドに挿入し、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABIPRISM377DNAシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。RDOは、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。
RDOを胚性幹細胞に導入し、標的とした酵素であるα1,6-フコース修飾酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
【００８３】
RDOのコンストラクトは、サイエンス(Science), 273,1386, (1996); ネイチャー・メディシン(Nature Medicine), 4,285, (1998); へパトロジー(Hepatology), 25,1462, (1997); ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5,1960, (1999); ジーン・セラピー(Gene Therapy), 5,1960, (1999); ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン(J. Mol. Med.), 75,829, (1997); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.USA), 96, 8774, (1999); プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.USA), 96, 8768, (1999); ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nuc. Acids. Res.), 27,1323, (1999); インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー(Invest. Dematol.), 111,1172, (1998); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 16,1343, (1998); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18,43, (2000); ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 555, (2000)等の記載に従って設計することができる。
【００８４】
（ｃ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明に用いるノックアウトマウスの作製
本発明に用いるノックアウトマウスは、ネイチャー・ジェネティク(Nature Genet.)，25, 35, (2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、α1,6-フコース修飾酵素の突然変異体を選択することで作製することができる。
【００８５】
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
【００８６】
外来遺伝子としては、細胞のDNAに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
細胞への遺伝子の導入には、上記１の（１）の（ａ）に記載のターゲットベクターの導入方法を用いることができる。
【００８７】
（２）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明に用いるノックアウトマウスは、α1,6-フコース修飾酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望のマウスを選択する手法を用いることにより作製することができる。
α1,6-フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼがあげられる。
【００８８】
具体的には、突然変異誘発処理で処理した生殖細胞より出産した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、α1,6-フコース修飾酵素遺伝子に変異が生じた所望のマウスを選択する方法が挙げられる。
生殖細胞としては、精子や卵あるいは胚性幹細胞などの個体を形成しうる能力を有する細胞があげられる。
【００８９】
突然変異誘発処理としては、細胞のDNAに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起する処理であればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編(1996)、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genet.), 24, 314, (2000)等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の飼育を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。  
【００９０】
（３）目的とした遺伝子改変を施した細胞の核を用いたクローン個体の作製方法
本発明に用いるノックアウトマウスは、文献に記載されたクローンマウス［Nature, 394, 369 (1998)、Nature Genetics, 22, 127 (1999)］の作製方法を用い、例えば以下のように作製することができる。
上記１．の（１）または（２）に記載した方法を用い、マウスの任意の細胞の染色体上の、α1,6-フコース修飾酵素遺伝子に変異を導入する。
次に、得られた細胞の核を初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）する。
初期化した細胞の核を除核したマウスの未受精卵に注入することによって発生を開始させる。
【００９１】
発生を開始した卵を雌マウスに人工的に移植および着床させることによって、α1,6-フコース修飾酵素遺伝子に変異が導入されたヘテロ接合体を得る。
得られたヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得る。
得られたホモ接合体同士を交配し、その子孫を得ることにより、本発明に用いるノックアウトマウスを作製することができる。
細胞の核を初期化する方法は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なることが知れているが、マウスなどの場合は、同種の非ヒト哺乳動物の除核した未受精卵に、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入し数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することが好ましい。
【００９２】
初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法は、やはり、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なることが知られているが、マウスなどの場合は、外来性遺伝子を導入した細胞の核を注入した未受精卵を、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激し細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることが好ましい。
発生を開始した卵を雌マウスに人工的に移植および着床させる方法としては、上記１．の（１）の（ａ）に記載の方法などがあげられる。
【００９３】
２．不死化細胞株の作製
本発明の不死化細胞株は、上記１に記載の方法で作製されたα1,6-フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたマウスを用いて、例えば、以下のように作製することができる。
【００９４】
α1,6-フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたマウスより臓器を摘出する。
摘出した臓器を物理化学的処理により非凝集状態の細胞集団とする。
調製した非凝集状態の細胞集団を無菌的に少なくとも2ヶ月間連続培養をすることにより、本発明の不死化細胞株を得ることができる。
【００９５】
この際、調製した非凝集状態の細胞集団の不死化を促すために、癌遺伝子を導入してもよい。癌遺伝子としては、例えば、SV40大型T抗原、Ras、MycあるいはSrc等の既に初代培養細胞に導入することによって不死化を促すことが知られている公知の癌遺伝子があげられる。これら癌遺伝子を、後述の３に記載の適当な動物細胞用発現ベクターに組み込み、調製した非凝集状態の細胞集団に導入することで効率的に本発明の不死化細胞株を得ることができる。
【００９６】
マウスから臓器を摘出する方法としては、動物組織培養法, モダンバイオロジー・シリーズ23, 共立出版, (1974)、細胞培養マニュアル, 講談社サイエンティフィック, (1982)、Useof Isolated Liver Cells and Kidney Tubules in Metabolic Studies,Elaevier/North-Holland Publishing Co., New York・Amsterdam・Oxford, (1976)、図説 動物実験の手技手法,蛋白質核酸酵素 別冊No.24, (1981)、マウスラボマニュアル, 遺伝子の導入と解析を中心に,（財）東京都臨床医学総合研究所実験動物研究部門編, シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社,(1998)、マウスラボマニュアル[第２版], ポストゲノム時代の実験法,（財）東京都臨床医学総合研究所実験動物研究部門編, シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社,(2003)等に記載の公知の方法があげられる。
【００９７】
摘出した臓器を物理化学的処理により非凝集状態の細胞集団とする方法としては、第三版, 組織培養の技術[基礎編], 日本組織培養学会編, 朝倉書店, (1996)、第三版, 組織培養の技術[応用編], 日本組織培養学会編,朝倉書店, (1996)等に記載の公知の方法があげられる。具体的には、酵素消化による方法やメッシュ等を用いた物理的な分離方法などが好ましく用いられる。
【００９８】
非凝集状態の細胞集団とするとは、細胞同士の接着を解除した単一細胞状態にすることである。単一細胞状態とは、酵素消化やメッシュ等を用いた物理的な分離方法などの処理を施すことで細胞同士の接着がない、個々の細胞が分離した状態をいう。このような単一細胞状態の細胞集団を得るためには、例えば、摘出した臓器を可能な限りメスを用いて細断し、リン酸緩衝生理食塩水溶液（以下、「PBS」と略す）を用いて数回、好ましくは2〜3回洗浄し、摘出した臓器の消化に適した酵素消化液（例えば。1mM EDTA及び0.25%トリプシンを含むPBS）を加え、37℃で数十分間、好ましくは5〜20分間培養し、培養に用いる培地に消化した臓器を懸濁し、遠心分離（例えば、4℃、200×gで5分間）を行い、沈殿した細胞を培養に用いる培地に再び懸濁することにより、非凝集状態の細胞集団を得ることができる。
【００９９】
非凝集状態の細胞集団を無菌的に少なくとも２ヶ月間連続培養する方法としては、細胞を死滅させることなく培養を継続できる方法であればいかなる細胞培養方法を用いてもよい。具体的には、第三版, 組織培養の技術[基礎編], 日本組織培養学会編, 朝倉書店, (1996)、第三版, 組織培養の技術[応用編], 日本組織培養学会編,朝倉書店, (1996)等に記載の公知の方法があげられる。一般的な方法としては、フラスコやディッシュを用いた単層培養法があげられるが、高密度維持培養法、マイクロキャリア培養法、還流培養法、軟寒天培養法等を用いることもできる。
【０１００】
また、樹立したい不死化細胞株の種類によっては、該細胞株の栄養要求因子を培養期間中に供給し続けることが目的とする不死化細胞株の効率的な樹立に有効であり、フィーダー細胞を用いた共培養法やサイトカイン類を添加した培地での培養法を用いることができる。フィーダー細胞を用いた共培養法の具体的な例としては、NIH3T3細胞（J. Virol., 4, 549, 1969）、OP9細胞（Science, 272,722, 1996）、MC3T3-G2/PA6（J. Cell. Physiol., 112, 89, 1982）、STO細胞（Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981; Nature, 292,154, 1981）、マウス胎仔初代繊維芽細胞（マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル; Gene Targeting,A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); ES細胞を用いた変異マウスの作製）などの細胞をフィーダー細胞として用いた共培養法があげられる。サイトカイン類を添加した培地での培養法の具体的な例としては、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（EGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（SCF）、繊維芽細胞増殖因子（FGF）、神経成長因子（NGF）、インスリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン1〜16、可溶性インターロイキン4受容体、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、ケモカイン、エストロジェン、テストステロンなどを添加した培地を用いた培養法があげられる。
【０１０１】
少なくとも２ヶ月間の無菌連続培養に使用できる培養器としては、 生体組織から取り出した初代培養細胞の培養に使用できるものであればいかなる培養器でも用いることができるが、好ましくは細胞培養用に用いられる培養器が好ましい。細胞培養用の培養器としては、例えば、フラスコ、細菌培養用フラスコ、細胞培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、コンツアーディッシュ、パーマノックスディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、セパレートストリップウェル、テラサキプレート、組織培養用チャンバースライド、シャーレ、細胞培養用シャーレ、組織培養用チューブ、トレイ、細胞培養用トレイ、セルファクトリー、培養バッグ、テクノポット、ローラーボトル、スピンナー、フォローファイバー等があげられる。培養器と細胞との接着性を制御するために、培養器の細胞と接触する側の表面に人工的に処理を施すこともできる。培養器の表面を人工的に処理する例としては、コラーゲンコート、ゼラチンコート、ポリーＬ−リジンコート、フィブロネクチンコート、ラミニンコート、プロテオグリカンコート、グリコプロテインコート、マトリゲルコート、シリコンコート等が挙げられる。また、プライマリア（Primaria; Becton Dickinson社製）などのように負の電荷を持つように処理することもできる。これらの処理を施した培養器も、本発明の不死化細胞株を樹立するための培養に用いることができる。
【０１０２】
培養に用いる基礎培地としては、BME培地（Proc. Soc. Exp. Biol.Med., 89, 362, 1965）、BGJb培地（Exp. Cell Res., 25, 41, 1961）、CMRL1066培地（N. Y. Academy of Sciences, 5, 303, 1957）、Glasgow MEM培地（Virology, 16,147, 1962）、Improved MEM Zinc Option培地（J. National Cancer Inst., 49,1705, 1972）、IMDM培地（In Vitro, 9, 6, 1970）、Medium 199培地（Proc. Soc. Exp. Biol.Med., 73, 1, 1950）、Eagle MEM培地（Science, 130, 432, 1959）、Alpha MEM培地（NatureNew Biology, 230, 310, 1971）、Dulbecco MEM培地（Virology, 8, 396,1959）、ハム培地（Exp. Cell Res., 29, 515, 1963; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53,288, 1965）、RPMI 1640培地（J. A. M. A., 199, 519, 1967）、Fischer’s培地（Methods in Med. Res., 10, 1964）、McCoy’s培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 100, 115,1959）、ウイリアムスE培地（Exp. Cell Res., 69, 106, 1971; Exp. Cell Res., 89,139, 1974）およびこれらの基礎培地を混合した混合培地などの動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
【０１０３】
また、マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル、Methodsin Enzymology volume 225, Guide to Techniques in Mouse Development, AcademicPress (1993)、ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の胚培養のための培地、例えば、M2培地、M16培地、Whitten培地、体外受精用培地など、胚の培養に用いることのできる培地であればいずれも基礎培地として用いることができる。これらの培地は、胎仔からの不死化細胞株を樹立する際に用いることが好ましい。
これら基礎培地にウシ胎仔血清や上述のサイトカイン類を添加することで、培養に用いる培地を調製することができる。添加するウシ胎仔血清やサイトカイン類の濃度は、樹立する不死化細胞株に合わせて適宜定めればよいが、例えばウシ胎仔血清の添加量は、数〜数十％、好ましくは2〜40％、より好ましくは2〜20％である。
【０１０４】
さらに、上述の基礎培地に、血清代替物としての各種増殖因子を添加した培地、あるいは無蛋白培地であっても動物細胞や胚の培養が可能であるものであればいずれも用いることができる。その具体的例として、市販のKNOCKOUTTM SRを添加した無血清培地（Focus, 20, 8, 1998）、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地[例えば、CHO-S-SFMII（GIBCOBRL社製）、Hybridoma-SFM（GIBCOBRL社製）、eRDF Dry Powdered Media（GIBCOBRL社製）、UltraCULTURETM（BioWhittaker社製）、UltraDOMATM（BioWhittaker社製）、UltraCHOTM（BioWhittaker社製）、UltraMDCKTM（BioWhittaker社製）、ITPSG培地（Cytotechnology,5, S17, 1991）、ITSFn培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457, 1980）、mN3培地（Mech.Dev., 59, 89, 1996）など]、細胞由来の因子を添加した培地[例えば、多能性奇形癌腫細胞PSA1の培養上清を添加した培地（Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981）、無蛋白培地（例えば、CD-CHO（GIBCOBRL社製）、PFHM-II（GIBCOBRL社製）、UltraDOMA-PFTM（BioWhittaker社製）など）が挙げられる。これら培地にさらに上述のサイトカイン類を添加した培地を用いることもできる。
【０１０５】
不死化細胞株樹立の過程では、細胞の生存率が一時的に低下し細胞が死滅してしまうことがある。このため、細胞の生存率を戻し、あるいは高く維持するためには、培養培地への細胞接種時に細胞密度を1×104〜1×106細胞/ml、好ましくは5×104〜5×105細胞/mlとなるように接種することが好ましい。例えば、培地中に細胞を接種し、37℃、5％CO2インキュベーターでのバッチ培養等、通常の動物細胞の培養方法を用いて培養し、細胞飽和度が70〜90％、細胞濃度が5×104〜1×106細胞/mlに達したら、細胞濃度が2〜20倍希釈となるように新鮮な培地中に細胞を接種し、同様の条件で培養を繰り返してもよい。細胞の増殖性が悪い場合には、増殖性が回復するまで4〜7日おきに培地交換を繰り返す。このようにして少なく2ヶ月以上連続して培養を続けることで不死化細胞株が得られる。
【０１０６】
得られた不死化細胞株は、96ウェルプレートによる限界希釈方法、コロニー形成方法等を用いることにより、クローン（単一細胞）化した細胞株を調製することができる。
以下に、限界希釈法を用いたクローン化した細胞株を調製する方法を示す。
細胞懸濁液を希釈し、ひとつのウェルに１個以下の確率で細胞が入るように接種し、30〜40℃、5％CO2インキュベーター内で数週間培養する。培養終了後、細胞増殖の認められた細胞を選択する。
【０１０７】
コロニー形成方法を用いてクローン化する方法は以下のとおりである。
付着性細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、シャーレに細胞を接種して培養後、コロニーの形成を確認する。ペニシリンキャップ等のリングでコロニーを分離し、トリプシン等の酵素で細胞を分離後、適当な培養器に移し、所望の細胞株を選択する。
浮遊細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、軟寒天中に細胞を接種して培養し、生じたコロニーを顕微鏡下でピックアップした後、静置培養に戻して所望の細胞株を選択する。
これにより、全体の細胞集団の中からさらに増殖性の良いクローンを得ることができる。
【０１０８】
３．抗体組成物を例とした糖蛋白質の製造方法
抗体組成物の製造を例に、本発明の不死化細胞株を用いた糖蛋白質組成物の製造方法を以下に示す。
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies, A Laboratory manual, ColdSpring Harbor Laboratory, 1988（以下、アンチボディズと略す）、Monoclonal Antibodies: principlesand practice, Third Edition, Acad. Press, 1993（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、AntibodyEngineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように抗体分子をコードする遺伝子を本発明の不死化細胞株を宿主細胞として用いて発現させ、取得することができる。
抗体分子のcDNAを調製する。
調整した抗体分子の全長cDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのcDNA断片を調製する。
【０１０９】
該DNA断片、または全長cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、本発明の不死化細胞株に導入することにより、抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
cDNAは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「cDNAの調製方法」に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
【０１１０】
発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8（フナコシ社より市販）、pAGE107［特開平3-22979；サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3,133, (1990)］、pAS3-3［特開平2-227075］、pCDM8［ネイチャー(Nature), 329, 840,(1987)］、pcDNAI/Amp（Invitrogen社）、pREP4（Invitrogen社）、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochemistry),101, 1307 (1987)］、pAGE210等をあげることができる。
【０１１１】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１１２】
宿主細胞としては、上記２に記載の方法に従って樹立した、本発明のα1,6-フコース修飾酵素のノックアウト非ヒト動物より樹立した不死化細胞株をあげることができる。具体的には、LIV86株、LIV86-SV株、KID86株、KID86-SV株、Bom86株、Bom86-SV株、Fut8-/-株などの細胞株があげられる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3,133 (1990)］、リン酸カルシウム法［特開平2-227075］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 84, 7413 (1987)］、インジェクション法[マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版]、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第2606856、特許第2517813］、DEAE−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編(1994)］、ウイルスベクター法[マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版]等をあげることができる。
【０１１３】
抗体組成物の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Fc領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、本発明の不死化細胞株の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０１１４】
得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション(The Journal of theAmerican Medical Association),199, 519 (1967)］、EagleのMEM培地［サイエンス(Science),122, 501(1952)］、ダルベッコ改変MEM培地邊［ヴュウロロジー(Virology), 8, 396(1959)］、199培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Societyfor the Biological Medicine), 73, 1 (1950)］、Whitten培地[発生工学実験マニュアル-トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（1987）]またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等を添加した培地等を用いることができる。
【０１１５】
培養は、通常pH6〜8、30〜40℃、5％CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。フェドバッチ培養、フォローファイバー培養などの培養法を用いて1日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１１６】
上記のとおり、抗体分子をコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する本発明の不死化細胞株由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、本発明の不死化細胞株内に生産させる方法、本発明の不死化細胞株外に分泌させる方法、あるいは本発明の不死化細胞株外膜上に生産させる方法があり、使用する本発明の不死化細胞株の種類や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【０１１７】
抗体組成物が本発明の不死化細胞株内あるいは本発明の不死化細胞株外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)，264, 17619 (1989)］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 86, 8227 (1989); ジーン・デベロップメント(Genes Develop.), 4,1288（1990）］、または特開平05-336963、特開平06-823021等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を本発明の不死化細胞株外に積極的に分泌させることができる。
【０１１８】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするDNA、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするDNAを挿入し、該発現ベクターを本発明の不死化細胞株へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を本発明の不死化細胞株外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【０１１９】
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１２０】
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
【０１２１】
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のFc領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびFc融合蛋白質組成物の製造方法について記すが、他の糖蛋白質についても上述の方法および当該方法に準じて取得することができる。
【０１２２】
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子をそれぞれ挿入することにより構築することができる。
【０１２３】
ヒト抗体のC領域としては、任意のヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域があげられ、具体的には、ヒト抗体のH鎖のIgG1サブクラスのC領域（以下、hCγ1と表記する）及びヒト抗体のL鎖のκクラスのC領域（以下、hCκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。
【０１２４】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.), 101,1307 (1987)］、pHSG274［ジーン(Gene), 27, 223(1984)］、pKCR［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 78, 1527 (1981)］、pSG1βd2-4［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 4, 173 (1990)］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.),101,1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res.Commun.), 149, 960 (1987)］、免疫グロブリンH鎖のプロモーター［セル(Cell), 41, 479 (1985)］とエンハンサー［セル(Cell), 33, 717(1983)］等があげられる。
【０１２５】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖及びL鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖及びL鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J. Immunol. Methods), 167,271 (1994)］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１２６】
（２）ヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
【０１２７】
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のC領域部分或いはV領域部分をプローブとして用い、H鎖V領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びL鎖V領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAの全塩基配列を決定し、塩基配列よりH鎖及びL鎖V領域の全アミノ酸配列を推定する。
【０１２８】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.), 154,3 (1987)］、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング第２版］等があげられる。また、ハイブリドーマからmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia社製）等があげられる。
【０１２９】
cDNAの合成及びcDNAライブラリーの作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー］、或いは市販のキット、例えば、Super ScriptTM PlasmidSystem for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（GIBCO BRL社製）やZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）を用いる方法などがあげられる。
【０１３０】
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express［ストラテジーズ(Strategies), 5, 58(1992)］、pBluescript II SK(+)［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research), 17,9494 (1989)］、λZAP II（Stratagene社製）、λgt10、λgt11［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ(DNA Cloning: A PracticalApproach), I, 49 (1985)］、Lambda BlueMid（Clontech社製）、λExCell、pT7T3 18U（Pharmacia社製）、pcD2［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.), 3,280 (1983)］及びpUC18［ジーン(Gene), 33, 103(1985)］等が用いられる。
【０１３１】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF'［ストラテジーズ(Strategies), 5, 81 (1992)］、C600［ジェネティックス(Genetics), 39, 440 (1954)］、Y1088、Y1090［サイエンス(Science), 222, 778(1983)］、NM522［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166,1 (1983)］、K802［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 16,118 (1966)］及びJM105［ジーン(Gene)，38, 275 (1985)］等が用いられる。
【０１３２】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAクローンは、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング第２版］により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction［以下、PCR法と表記する；モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー］によりH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAを調製することもできる。
【０１３３】
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドに挿入し、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Sanger）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.), 74, 5463 (1977)］あるいはABIPRISM377DNAシークエンサー（PE Biosystems社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
【０１３４】
決定した塩基配列からH鎖及びL鎖V領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のH鎖及びL鎖V領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins ofImmunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991］と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のH鎖及びL鎖V領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１３５】
（３）ヒト以外の動物の抗体のV領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖V領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のH鎖及びL鎖V領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of ProteinsofImmunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びN末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、H鎖及びL鎖V領域の各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のH鎖及びL鎖V領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins ofImmunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991］と比較することによって見出すことができる。
【０１３６】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAを挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体H鎖及びL鎖V領域の3'末端側の塩基配列とヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域の5'末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを本項３のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１３７】
（５）ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域のCDRを移植するヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のフレームワーク（以下、FRと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のH鎖及びL鎖のV領域のFRの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins ofImmunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも60%以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
【０１３８】
次に、選択したヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域のCDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins ofImmunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991］を考慮してDNA配列に変換し、ヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を設計する。設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さの合成DNA数本に分けて合成し、合成したDNAをPCR法により連結する。この場合、PCRでの反応効率及び合成可能なDNAの長さから、H鎖およびL鎖についてそれぞれ6本の合成DNAを設計して、連結することが好ましい。
【０１３９】
また、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３のＡの（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易に挿入することができる。PCR後、増幅産物をpBluescript SK(-)（Stratagene社製）等のプラスミドに挿入し、本項３のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。
【０１４０】
（６）ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域のCDRのみをヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ/テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY),9, 266 (1991)］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のH鎖及びL鎖V領域では、CDRのみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がCDRの移植に伴い、ヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やCDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ/テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY),9, 266 (1991)］。
【０１４１】
ヒト型CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにX線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol. Biol.), 112, 535 (1977)］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング(ProteinEngineering), 7, 1501 (1994)］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
【０１４２】
ヒト抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成DNAを用いて本項３のＡの（５）に記載の方法により、達成できる。PCR後の増幅産物について本項３のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０１４３】
（７）ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
本項３のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子の上流に、本項３のＡの（５）及び（６）で構築したヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域をコードするcDNAを挿入し、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３のＡの（５）及び（６）でヒト型CDR移植抗体のH鎖及びL鎖V領域を構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のH鎖及びL鎖C領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するように挿入し、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１４４】
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３のＡの（４）及び（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型CDR移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
【０１４５】
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平2-257891; サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3 ,133 (1990)］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる本発明の不死化細胞株であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
【０１４６】
具体的には、本明細書の実施例に記載のLIV86株、LIV86-SV株、KID86株、KID86-SV株、Bom86株、Bom86-SV株、Fut8-/-株などの細胞株があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418硫酸塩（以下、G418と表記する；SIGMA社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地（日水製薬社製）、GIT培地（日本製薬社製）、EX-CELL302培地（JRH社製）、IMDM培地（GIBCO BRL社製）、Hybridoma-SFM培地（GIBCO BRL社製）、またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の各種添加物を添加した培地等をいることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ELISA法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold SpringHarbor Laboratory, Chapter 14, 1998、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【０１４７】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Antibodies: A LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies: Principles andPractice), Academic Press Limited, 1996］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、SDS-PAGEと表記する；ネイチャー(Nature), 227, 680 (1970)］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル(Antibodies: A LaboratoryManual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス(Monoclonal Antibodies: Principles andPractice), Academic Press Limited, 1996］等で測定することができる。
【０１４８】
Ｂ．Fc融合蛋白質の製造
（１）Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子を挿入することにより構築することができる。
ヒト抗体のFc領域としては、CH2とCH3領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、CH1の一部が含まれるものも包含される。またCH2またはCH3の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入され、実質的にFcγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
【０１４９】
ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエクソンとイントロンから成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。それら遺伝子とFc領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、PCR法(レキュラー・クローニング第2版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー, Supplement 1-34) を行うことがあげられる。
【０１５０】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)］、pAGE103［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー (J.Biochem.), 101, 1307 (1987)］、pHSG274［ジーン (Gene), 27, 223 (1984)］、pKCR[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78,1527 (1981)]、pSG1βd2-4 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 4, 173 (1990)] 等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.), 101, 1307 (1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)］、免疫グロブリンH鎖のプロモーター［セル(Cell), 41, 479 (1985)］とエンハンサー［セル (Cell), 33, 717 (1983)］等があげられる。
【０１５１】
（２）ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質をコードするDNAの取得
ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質をコードするDNAは以下のようにして取得することができる。
目的のFcと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０１５２】
細胞や組織から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン-トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.), 154, 3 (1987)]、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(モレキュラー・クローニング第２版) 等があげられる。また、細胞や組織からmRNAを調製するキットとしては、FastTrack mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製) 等があげられる。
cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法(モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー)、或いは市販のキット、例えば、SuperScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCOBRL社製) やZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製) を用いる方法などがあげられる。
【０１５３】
cDNAライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAPExpress［ストラテジーズ(Strategies), 5, 58 (1992)]、pBluescript II SK(+)［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(NucleicAcids Research), 17, 9494 (1989)]、λZAPII (Stratagene社製)、λgt10、λgt11 [ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ(DNA Cloning: A Practical Approach), I, 49 (1985)]、Lambda BlueMid(Clontech社製)、λExCell、pT7T3 18U (Pharmacia社製)、pcD2 [モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー (Mol.Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] 及びpUC18 [ジーン (Gene), 33, 103 (1985)]等が用いられる。
【０１５４】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-BlueMRF'［ストラテジーズ (Strategies), 5, 81 (1992)]、C600［ジェネティックス (Genetics), 39,440 (1954)]、Y1088、Y1090［サイエンス (Science), 222, 778 (1983)]、NM522［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)]、K802［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー (J. Mol.Biol.), 16, 118 (1966)]及びJM105［ジーン (Gene)，38, 275 (1985)]等が用いられる。
【０１５５】
cDNAライブラリーからの目的の蛋白質をコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法(モレキュラー・クローニング第２版) により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法により目的の蛋白質をコードするcDNAを調製することもできる。
【０１５６】
目的の蛋白質をコードするcDNAをヒト抗体のFc領域をコードするcDNAと融合させる方法としては、PCR法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の5'側と3'側に任意の合成オリゴDNA(プライマー)を設定し、PCR法を行いPCR産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のFc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、PCR産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のPCR産物の3'側とFc領域のPCR産物の5'側には同じ制限酵素認識部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた2種類のPCR断片を用いてさらにPCRを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後に連結反応を行うことでも連結することができる。
【０１５７】
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、pBluescriptSK(-) (Stratagene社製) 等のプラスミドに挿入し、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー (Sanger) らのジデオキシ法 [プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製) 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からFc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含むFc融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１５８】
（３）Fc融合蛋白質の安定的生産
前記の (1) 項に記載のFc融合蛋白質発現ベクターを適当な宿主動物細胞に導入することによりFc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのFc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平2-257891;サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990)］ 等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Fc融合蛋白質を生産させることができる本発明の不死化細胞株であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、本明細書の実施例に記載のLIV86株、LIV86-SV株、KID86株、KID86-SV株、Bom86株、Bom86-SV株、Fut8-/-株などの細胞株があげられる。
【０１５９】
Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、Fc融合蛋白質組成物を安定に生産する形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地(日水製薬社製)、GIT培地 (日本製薬社製)、EX-CELL302培地 (JRH社製)、IMDM培地 (GIBCO BRL社製)、Hybridoma-SFM培地(GIBCO BRL社製)、またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にFc融合蛋白質組成物を生産蓄積させることができる。培養上清中のFc融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はELISA法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、dhfr遺伝子増幅系等を利用してFc融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
【０１６０】
Fc融合蛋白質組成物は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムやプロテインGカラムを用いて精製することができる(アンチボディズ, Chapter 8、モノクローナル・アンティボディズ)。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したFc融合蛋白質分子全体の分子量は、SDS-PAGE[ネイチャー (Nature), 227, 680 (1970)] やウエスタンブロッティング法 (アンチボディズ, Chapter 12、モノクローナル・アンティボディズ)等で測定することができる。
【０１６１】
以上、本発明の不死化細胞株を用いた抗体組成物およびFc融合蛋白質組成物の製造方法を例として示したが、上述したように、本発明の不死化細胞株は、これら以外の糖蛋白質組成物の製造にも用いることができる。
既に、抗体分子等の糖蛋白質を発現する能力を有している不死化細胞株の場合には、該細胞株を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物や糖蛋白質組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物や糖蛋白質組成物を製造することができる。
【０１６２】
４．糖蛋白質組成物の活性評価
精製した糖蛋白質組成物の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液投与後の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を測定する方法としては、Current Protocols In Protein Science, John Wiley& Sons Inc., (1995)、日本生化学会編 新生化学実験講座19 動物実験法, 東京化学同人 (1991)、日本生化学会編 新生化学実験講座8 細胞内情報と細胞応答, 東京化学同人 (1990)、日本生化学会編 新生化学実験講座9 ホルモンIペプチドホルモン, 東京化学同人 (1991)、実験生物学講座3 アイソトープ実験法, 丸善株式会社 (1982)、Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss,Inc., (1995)、酵素免疫測定法 第３版, 医学書院 (1987)、改訂版 酵素抗体法, 学際企画 (1985)等に記載の公知の方法を用いることができる。
【０１６３】
その具体的な例としては、精製した糖蛋白質組成物をラジオアイソトープなどの化合物で標識し、標識した糖蛋白質組成物の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合反応の強さを定量的に測定する方法があげられる。また、Biacore社のBIAcoreシリーズなどの各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる（J. Immnunol. Methods, 145, 229 (1991)、実験医学別冊 バイオマニュアルUPシリーズ 蛋白質の分子間相互作用実験法, 羊土社(1996)）。
標識した糖蛋白質組成物を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血液投与後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検出する方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応を組み合わせた系が好ましい。
【０１６４】
５．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はELISA法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol. Immunother.), 36,373 (1993)］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、CDC活性、ADCC活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(CancerImmunol. Immunother.), 36, 373 (1993)］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
【０１６５】
６．糖蛋白質組成物や抗体組成物の糖鎖の分析
本発明の不死化細胞株で発現させた糖蛋白質組成物や抗体組成物の糖鎖構造は、通常の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、IgG分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、N-アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０１６６】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
糖蛋白質組成物や抗体組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
【０１６７】
具体的な方法として、Dionex社製糖組成分析装置（BioLC）を用いる方法が挙げられる。BioLCはHPAEC-PAD（highperformance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（J.Liq.Chromatogr.）,6,1577 (1983)］によって糖組成を分析する装置である。
また、2-アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agruc.Biol.Chem.),55(1),283-284 (1991)］に従って酸加水分解した試料を2-アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、HPLC分析して組成比を算出することができる。
【０１６８】
（２）糖鎖構造解析
糖蛋白質組成物や抗体組成物の糖鎖の構造解析は、2次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）, 171,73 (1988)、生物化学実験法23−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（1989年）］により行うことができる。2次元糖鎖マップ法は、例えば、X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【０１６９】
具体的には、糖蛋白質組成物や組成物をヒドラジン分解して糖鎖を遊離し、2-アミノピリジン（以下、PAと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J.Biochem.）,95, 197 (1984)］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のPA化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、2次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（TaKaRa社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）, 171, 73 (1988)］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のMALDI-TOF-MSなどの質量分析を行い、2次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０１７０】
７．本発明の糖蛋白質組成物の利用
本発明の抗体組成物等の糖蛋白質組成物は、フコース修飾のない糖鎖構造を有しており、例えば、受容体との親和性の向上、血中半減期の延長、血中投与後の組織分布の改善、または薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用の向上などの効果が期待でき高い生理活性を示す。特に、本発明の不死化細胞株から製造される抗体組成物は、高いエフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害活性を有している。これら生理活性の高い糖蛋白質組成物、あるいは高いADCC活性を有する抗体組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
【０１７１】
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス(Science), 280, 1197, 1998］、本発明の抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
【０１７２】
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
【０１７３】
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
【０１７４】
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗GD2抗体（Anticancer Res., 13, 331, 1993）、抗GD3抗体（Cancer Immunol.Immunother., 36, 260, 1993）、抗GM2抗体（Cancer Res., 54, 1511, 1994）、抗HER2抗体（Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285, 1992）、抗CD52抗体（Nature, 332, 323,1988）、抗MAGE抗体（British J. Cancer, 83, 493, 2000）、抗HM1.24抗体（MolecularImmunol., 36, 387, 1999）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（PTHｒP）抗体（Cancer, 88, 2909,2000）、抗FGF8抗体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911, 1989）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗FGF8受容体抗体（J.Biol. Chem., 265, 16455, 1990）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（J.Neurosci. Res., 40, 647, 1995）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（J. Neurosci. Res., 40,647, 1995）、抗PMSA抗体（J. Urology, 160, 2396, 1998）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（CancerRes., 57, 4593, 1997）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Oncogene, 19, 2138, 2000）、抗CA125抗体、抗17-1A抗体、抗インテグリンαvβ3抗体、抗CD33抗体、抗CD22抗体、抗HLA抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗EGF受容体抗体（ImmunologyToday, 21, 403, 2000）、抗CD10抗体（American Journal of Clinical Pathology, 113,374, 2000）などがあげられる。
【０１７５】
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Immunol. Rev., 127, 5, 1992）、抗インターロイキン6受容体抗体（MolecularImmunol., 31, 371, 1994）、抗インターロイキン5抗体（Immunol. Rev., 127, 5, 1992）、抗インターロイキン5受容体抗体、抗インターロイキン4抗体（Cytokine,3, 562, 1991）、抗インターロイキン4受容体抗体（J. Immunol. Meth., 217, 41, 1998）、抗腫瘍壊死因子抗体（Hybridoma,13, 183, 1994）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Molecular Pharmacol., 58, 237, 2000）、抗CCR4抗体（Nature,400, 776, 1999）、抗ケモカイン抗体（J. Immunol. Meth., 174, 249, 1994）、抗ケモカイン受容体抗体（J.Exp. Med., 186, 1373, 1997）、抗IgE抗体、抗CD23抗体、抗CD11a抗体（Immunology Today, 21,403, 2000）、抗CRTH2抗体（J. Immunol., 162, 1278, 1999）、抗CCR8抗体（WO99/25734）、抗CCR3抗体（US6207155）などがあげられる。
【０１７６】
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗GpIIb/IIIa抗体
（J.Immunol., 152, 2968, 1994）、抗血小板由来増殖因子抗体（Science, 253, 1129, 1991）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（J.Biol. Chem., 272, 17400, 1997）または抗血液凝固因子抗体（Circulation, 101,1158, 2000）などがあげられる。
自己免疫疾患（具体的な例としては、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己DNA抗体（Immunol. Letters, 72, 61, 2000）、抗CD11a抗体、抗ICAM3抗体、抗CD80抗体、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗インテグリンα4β7抗体、抗CD40L抗体、抗IL-2受容体抗体（ImmunologyToday, 21, 403, 2000）などが挙げられる。
【０１７７】
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗gp120抗体（Structure, 8, 385, 2000）、抗CD4抗体（J. Rheumatology, 25,2065, 1998）、抗CCR5抗体、抗ベロ毒素抗体（J. Clin. Microbiol., 37, 396, 1999）などが挙げられる。
上記抗体は、ATCC(The AmericanType Culture Collection）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、R&DSYSTEMS社、PharMingen社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
以下に、本発明の上記の抗体以外の結合性蛋白質と抗体Fc領域の融合抗体の具体例を述べる。
【０１７８】
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患に関連する蛋白質と抗体Fc領域の融合蛋白質の具体例としては、sTNFRIIと抗体Fc領域との融合蛋白質であるetanercept（USP5605690）、抗原提示細胞上に発現しているLFA-3とFc領域との融合蛋白質であるalefacept(USP5914111)、CytotoxicT Lymphocyte-associated antigen-4（CTLA-4）と抗体Fc領域との融合蛋白質（J. Exp. Med., 181,1869,1995）、インターロイキン-15と抗体Fc領域との融合蛋白質 (J. Immunol., 160, 5742, 1998)、ファクターVIIと抗体Fc領域との融合蛋白質(Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 98, 12180, 2001)、インターロイキン10と抗体Fc領域との融合蛋白質（J. Immunol.,154, 5590, 1995）、インターロイキン2と抗体Fc領域との融合蛋白質（J. Immunol., 146, 915, 1991）、CD40と抗体Fc領域との融合蛋白質（Surgery.132, 149, 2002）、Flt−3(fms-like tyrosine kinase)と抗体Fc領域との融合蛋白質（Acta. Haemato.,95, 218, 1996）およびOX40と抗体Fc領域との融合蛋白質（J. Leu. Biol., 72, 522, 2002）などがあげられる。これらの他にも、各種ヒトCD分子[CD2、CD30（TNFRSF8）、CD95（Fas）、CD106(VCAM-1)、CD137]や接着分子[ALCAM(Activatedleukocyte cell adhesion molecule)、Cadherins、ICAM（Intercellular adhesionmolecule）-1、ICAM-2、ICAM-3]、サイトカイン受容体(以下、受容体をRと表記する)（IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-9R、IL-10R、IL-12R、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-15R、IL-21R）、ケモカイン、細胞死誘導シグナル分子[B7-H1、DR6(Deathreceptor 6)、PD-1(Programmed death-1)、TRAIL R1、]、共刺激分子[B7-1、B7-2、B7-H2、ICOS(Induciblecostimulator)]、増殖因子（ErbB2、ErbB3、ErbB4、HGFR）あるいは分化誘導因子（B7-H3）、活性化因子（NKG2D）、シグナル伝達分子（gp130）および該結合蛋白質の受容体やリガンドと抗体Fc領域との融合蛋白質等があげられる。
【０１７９】
本発明の糖蛋白質組成物あるいは抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
【０１８０】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０１８１】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０１８２】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、糖蛋白質組成物あるいは抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０１８３】
また、噴霧剤は糖蛋白質組成物あるいは抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ糖蛋白質組成物あるいは抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。糖蛋白質組成物あるいは抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０１８４】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり10μg/kg〜20mg/kgである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、CDC活性測定法、ADCC活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
CDC活性、ADCC活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(CancerImmunology Immunotherapy), 36, 373 (1993)；キャンサー・リサーチ(Cancer Research), 54,1511 (1994)］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１８５】
α1,6-フコシルトランスフェラーゼ両対立遺伝子を欠失したトランスジェニックマウスの作出
α1,6-フコシルトランスフェラーゼ（以下、FUT8とも呼ぶ）両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失したマウスの作出を以下のように行った。
【０１８６】
１．マウスFUT8遺伝子翻訳開始コドンを含むゲノム領域の単離
ブタFUT8 cDNA全長[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー［J.Biol. Chem., 271,  27810 (1996) ］のうち、5‘側非翻訳領域39bpから翻訳領域373bpを含む断片（412bp）を制限酵素SacI消化により調製した。これをプローブとして、モレキュラー・クローニング第２版に記載の公知の方法に従い、129SVJ系統マウス由来λ-ファージゲノムライブラリー（STRATEGENE社）よりマウスFUT8翻訳開始コドンの位置するエクソンを含む13.9Kbのゲノムクローンを単離した（図１）。
【０１８７】
次に、取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化した後、上記ブタFUT8 cDNA部分断片412bpをプローブとして、モレキュラー・クローニング 第２版に記載の公知の方法に従いサザンブロットを行った。その結果陽性を示した制限酵素断片のうち、翻訳開始コドンの位置するエクソンおよび上流イントロン領域をコードする約3.0KbのXbaI-XbaI断片、および翻訳開始コドンの位置するエクソンおよび下流イントロン領域をコードする約6.3KbのSacI-SacI断片を選択し、pBluescriptIIKS(+)（Strategene社）へ各々挿入した（図１）。
【０１８８】
２．マウスFUT8遺伝子翻訳開始コドンを破壊するためのターゲティングベクタープラスミドの構築
本実施例第１項で得た約3.0KbのXbaI-XbaI領域のうち、5’側の2.6KbのXbaI-SacI領域を5’側相同領域とする一方、本実施例第１項で得た約6.3KbのSacI-SacI領域のうち、3’側のHindIII-XhoI領域(約6.1Kb)を3’側相同領域として各々配置することにより、翻訳開始コドンを含むSacI-HindIII領域(184bp)を欠失したターゲティングベクタープラスミドを構築した。以下にその詳細を示す。
【０１８９】
まず、プラスミドpMC1DTpA［トランスジェニック・リサーチ(TransgenicResearch), 8, 215 (1999) ］を制限酵素XhoIおよびNotIで消化し、得られたジフテリア毒素A鎖(DT-A)遺伝子を含む1.5Kbの断片にNotI-XhoIアダプターを連結することにより、両端をXhoI認識部位に置換した。一方、本実施例第１項で得たFUT8遺伝子3’側の約6.3KbのSacI-SacI領域を含むpBluescriptIIKS(+)に対し制限酵素XhoIを反応させ、約6.1KbのHindIII-XhoI領域を含む約8.3Kbの断片を得た。約8.3Kbの該断片およびDT-A遺伝子を含む1.5KbのXhoI-XhoI断片(1.5Kb)を連結し、プラスミドIを構築した。
【０１９０】
次に、pGT1.8IresBgeo［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 91, 4303 (1994) ］を制限酵素SalIで完全消化した後、さらに制限酵素SacIで部分消化することにより、内部リボソーム翻訳開始部位(以下、IRESと称す)、β‐ガラクトシダーゼ遺伝子(以下、LacZと称す)、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、Neorと称す)およびポリA付加シグナル(以下、pAと称す)を連結させた薬剤選抜用発現ユニット(以下、IRES-LacZ-Neor-pAカセットと称す)を含む4.9Kbの断片を得た。
【０１９１】
一方、本実施例第１項で得たマウスFUT8遺伝子の5’側の約2.9KbのXbaI-XbaI領域を含むpBluescriptIIKS(+)を制限酵素SacIおよびSalIで消化し、約2.6KbのXbaI-SacI領域を含む約5.3Kbの断片を得た。上記で得たマウスFUT8遺伝子の5’側相同領域を含む約5.3KbのSacI-SalI断片およびIRES-LacZ-Neor-pAカセットを含む約4.9KbのSacI-SalI断片を連結して、プラスミドIIを構築した。
最後に、プラスミドIを制限酵素NotIおよびSalIで消化して得られる約9.4Kbの断片へ、プラスミドIIを制限酵素NotIおよびSalIで消化して得られる約7.6Kbの断片を連結して、図２に示したマウスFUT8遺伝子破壊用ターゲティングベクタープラスミドを構築した。
【０１９２】
３．マウス胚性幹細胞におけるFUT8遺伝子ゲノム領域の相同組換え
（１）フィーダー細胞の調製
相同組換えに用いるマウス胚幹細胞は、マウス初代繊維芽細胞（以下、EMFI細胞と称す）をフィーダーとして用い培養維持した。胚性幹細胞の培養維持に用いた該フィーダー細胞は以下の記述に従って調製した。
【０１９３】
まず、ジーン・ターゲティング［GeneTargeting ,IRL PRESS at Oxford University Press (1993)］の記載に従って、8週齢以上の雌のネオマイシン耐性遺伝子導入マウス［カルメジン（calmegin）ノックアウトマウス、Nature,  387, 607, (1997)］より受精後13.5日から15.5日の胎仔を摘出し、これを材料として初代繊維芽細胞（EMFI細胞）を調製した後、マイトマイシンC処理により増殖能を不活化させた。続いてマイトマイシンC処理したEMFI細胞をFM培地［10％ウシ胎仔血清（Invitrogen社）、55μM β-メルカプトエタノール（Invitrogen社）、1mM MEMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、0.1mMMEM非必須アミノ酸（Invitrogen社）、3mM アデノシン（SIGMA社）、3mM グアノシン（SIGMA社）、3mM シチジン（SIGMA社）、3mMウリジン（SIGMA社）、1mM チミジン（SIGMA社）、2mM L-グルタミン（Invitrogen社）、100単位/ml ペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（Invitrogen社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Invitrogen社）］に2.5×105個/mlとなるように懸濁した後、0.1% ゼラチンコート処理済み細胞培養用ディッシュ（6cm径、10cm径；旭テクノグラス社）または0.1%ゼラチンコート処理済み平底プレート（96穴、24穴、6穴；旭テクノグラス社）に播種し、5%  CO2、37℃の条件下で24時間培養することによりフィーダープレートを作製した。作製したフィーダープレートは作製後１週間以内に用いた。なお、フィーダー細胞としては、必ずしも上述のフィーダー細胞を用いる必要はなく、例えば、ライフテックオリエンタル株式会社販売のNeo耐性初代培養細胞（カタログ番号YE9284100）を用いることも可能である。
【０１９４】
（２）胚性幹細胞へのターゲティングベクターの導入
マウス胚性幹細胞D3（名古屋大学医学部・村松喬教授より供与され、大阪大学遺伝情報実験センターにて維持）の培養は、ESM培地［20％ ウシ胎仔血清（Invitrogen社）、55μM β-メルカプトエタノール（Invitrogen社）、1mMMEMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、0.1mM MEM非必須アミノ酸（Invitrogen社）、3mM アデノシン（SIGMA社）、3mM グアノシン（SIGMA社）、3mMシチジン（SIGMA社）、3mM ウリジン（SIGMA社）、1mM チミジン（SIGMA社）、2mM L-グルタミン（Invitrogen社）、100単位/mlペニシリンおよび100μg/ml ストレプトマイシン（Invitrogen社）、1000単位/ml ESGROTM（マウス組換え型白血病阻害因子；SIGMA Invitrogen社）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM;Invitrogen社）］を用いて行った。まず、6cm径ディッシュを用いて作製したフィーダープレートへ凍結融解したD3細胞を播種し、5%  CO2、37℃の条件下で培養した。24時間後、10cm径ディッシュを用いて作製したフィーダープレート3枚へD3細胞を継代した。
【０１９５】
本実施例第２項で得たターゲティングベクタープラスミドのD3細胞への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990)］に準じて以下の手順で行った。
まず、ターゲティングベクタープラスミド 20μgを制限酵素NotIで消化することにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、1μg/μl溶液とした。一方、10cm径ディッシュへの継代培養後48時間経過したD3細胞より培養上清を除去し、新鮮なESM培地へ交換した。D3細胞が70%コンフレントに達したことを確認した後、PBS緩衝液（Invitrogen社）に懸濁して1×107個/mlとした。細胞懸濁液800μl（8×106個）を上記線状化プラスミド 20μgと混和した後、細胞−DNA混和液の全量をGenePulser Cuvette(電極間距離4mm；BIO-RAD社)へ移し、細胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧250V、電気容量500μFの条件で遺伝子導入を行った。導入後、細胞懸濁液をESM培地40mlに懸濁し、10cm径ディッシュを用いて作製したフィーダープレート3枚および6cm径ディッシュを用いて作製したフィーダープレート2枚へ播種した。5%  CO2、37℃の条件下で16時間以上培養した後、培養上清を除去し、150μg/mlのG418（Invitrogen社）を添加したESM培地へ交換した。この培地交換作業をほぼ毎日繰り返しながら8日間の培養を行い、薬剤耐性株を取得した。なお、マウス胚性幹細胞としては、必ずしも上述のマウス胚性幹細胞を用いる必要はなく、129系統マウス由来の胚性幹細胞、例えば、ATCCより購入可能なマウス胚性幹細胞D3（CRL-11632）、米国Cell& Technologies社やDNX Transgenic Sciences社市販の129系統マウス由来の胚性幹細胞を用いることもできる。
【０１９６】
（３）ターゲティングベクター導入株の取得
本項（２）で得た薬剤耐性株より任意の343個のコロニーを以下の手順で採取した。
薬剤耐性クローンのコロニーが出現したディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液を注入した後、実体顕微鏡で観察しながら、ピペットマン（GILSON社）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底96ウェルプレートへ採取した。トリプシン処理を行った後、平底24ウェルプレートを用いて作製したフィーダープレートへ各クローンを播種し、ESM培地を用いてコンフレントになるまで培養した。培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行って総量を350μlとした。このうち300μlを等量の凍結培地［20%DMSO、80% FM培地］と混和してマスタープレートとし、凍結保存に供した。残りの細胞懸濁液50μlはゼラチンコート処理済み平底24ウェルプレート（旭テクノグラス社）へ播種してレプリカプレートとし、ESM培地を用いて細胞がコンフレントになるまで培養した。
【０１９７】
（４）FUT8ゲノム領域5’側プローブを用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（３）で取得した343クローンに対し、以下の手順で5’末端側のプローブを用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
まず、本項（３）で作製したレプリカプレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)］に従って各クローンのゲノムDNAを調製し、TE緩衝液(pH8.0)［10mM Tris-HCl、1mM EDTA］に溶解した。
一方、本実施例第１項で得た、FUT8翻訳開始コドンを含むゲノムクローン（13.9Kb）より、5’末端側の制限酵素XbaI認識部位から上流約500bpの断片を調製した（図２）。
ゲノムDNAを制限酵素PstIで消化した後、上記のFUT8遺伝子の5’末端側の約500bpの断片をプローブとして、モレキュラー・クローニング第２版に記載の公知の方法に従いサザンブロットを行った。
【０１９８】
制限酵素PstI処理により、野生型FUT8対立遺伝子から約7.5KbのDNA断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約11KbのDNA断片が生じる（図２）。
本法により、4クローンより調製したゲノムDNAにおいて、約7.5Kbおよび約11.0Kbの特異的断片が見出された。両断片の量比が1:1であったことから、本クローンは、片方のFUT8対立遺伝子がベクター配列に置換された相同組換え体であることが確認された。
【０１９９】
（５）FUT8ゲノム領域3’側プローブを用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（３）で取得した343クローンに対し、以下の手順で3’側プローブを用いたゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
まず、本実施例第１項で得られた約6.3KbのSacI-SacI領域より、3’末端側の制限酵素SacI認識部位から、5’末端側に約500bpに位置する制限酵素EcoRV認識部位を含む断片を調製した。
本項（４）で調製したゲノムDNAを制限酵素SacIで消化した後、上記のFUT83’末端側の約500bpの断片をプローブとして、モレキュラー・クローニング第２版に記載の公知の方法に従いサザンブロットを行った。
【０２００】
制限酵素SacI処理により、野生型FUT8対立遺伝子から約6.6KbのDNA断片が生じる。一方、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約8.6KbのDNA断片が生じる（図２）。
本法により、本項（４）で陽性を示した4クローンのゲノムDNAにおいて、約6.6Kbおよび約8.6Kbの特異的断片が見出された。両断片の量比が1:1であったことから、本クローンは、片方のFUT8対立遺伝子がベクター配列に置換された相同組換え体であることが確認された。
【０２０１】
４． FUT8遺伝子を破壊したマウスの取得
（１）FUT8両対立遺伝子の片方を破壊した胚性幹細胞を用いたキメラマウスの取得
本実施例第３項で樹立した片方のFUT8対立遺伝子が破壊された胚性幹細胞4クローンに対し、公知の方法［マニュピレーティング・ザ・マウス・エンブリオ(Manupirating the Mouse Embryo), Cold Spring Harbor laboratory Press (1994)］に従い、正常な核型が維持されている3クローンを選択した。次に、ガイド・ツー・テクニックス・イン・マウス・ディベロプメント［Guideto Technuques in Mouse Development, Methods in Enzymology, Volume 225, AcademicPress (1993)］などの記載の注入キメラ法に従って、C57BL/6系統の雌マウスより取得した胚盤胞腔へ上記の胚性幹細胞3クローンをそれぞれ顕微注入し、偽妊娠させたMCH系統の雌マウスの子宮内へ移植し着床させた。
【０２０２】
黒色の被毛の中に茶褐色の被毛が顕れた雄のキメラ個体のうちキメラ率が50%を超える個体は、注入した胚性幹細胞が同等のレベルで生殖細胞系列へ寄与しているものと判定し、C57BL/6系統の雄マウスとの交配を行った。その結果、2クローンの胚性幹細胞を用いて作出したキメラ個体の中に生殖系列キメラが存在していることが確認できた。
【０２０３】
（２）FUT8対立遺伝子を1コピー破壊したヘテロ接合体マウスの取得
本項（１）で得た生殖系列キメラを8週齢まで飼育した後、性成熟したC57BL/6系統の雌個体と交配し産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾より、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(NucleicAcids Research), 3, 2303, (1976)］に従ってゲノムDNAを調製し、本実施例第３項（４）記載の方法に従ってサザンブロットを行った。
【０２０４】
ヘテロ接合体のゲノムDNAは、制限酵素PstI処理により、野生型FUT8対立遺伝子特異的な約7.5Kbの断片および相同組換えの起こった対立遺伝子特異的な約11Kbの断片を生じる（図２）。図３に示されるサザンブロットの結果から、本項（１）において生殖系列への寄与が認められた胚性幹細胞2クローンいずれに由来するキメラ個体からも、上記の約7.5Kbの断片および約11Kbの断片が1:1の量比であるヘテロ接合体を取得したことを確認した。該ヘテロ接合体マウスは、FUT8の片方の対立遺伝子が破壊されたマウスである。以下、該マウスをFUT8KOヘテロ接合体マウスと称す。
【０２０５】
（３）FUT8両対立遺伝子を破壊したホモ接合体マウスの取得
本項（２）で得たヘテロ接合の雄個体および雌個体を8週齢まで飼育した後、交配させ産仔を得た。該産仔のうち、茶褐色の被毛を有する個体の尾より、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(NucleicAcids Research), 3, 2303, (1976)］に従って各クローンのゲノムDNAを調製し、実施例第３項（４）記載の方法に従ってサザンブロットを行った。
ホモ接合体のゲノムDNAは、制限酵素PstI処理により相同組換えの起こった対立遺伝子特異的な約11Kbの断片のみを生じる（図２）。図３に示されるようにサザンブロットの結果、産仔の中に上記基準を満たすホモ接合体が含まれていることを確認した。該ホモ接合体マウスは、FUT8両対立遺伝子が破壊されたダブルノックアウトマウスである。以下、該マウスをFUT8KOホモ接合体マウスと称す。
【実施例２】
【０２０６】
FUT8 KOマウスからの細胞株樹立
１．FUT8 KOホモ接合体マウスの取得
実施例１第４項で得たFUT8 KOへテロ接合体マウスの交配によって得られた産仔について以下の手順で遺伝子型の判定を行った。
まず、産仔の尾より公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976)］に従ってゲノムDNAを調製し、各々TE-RNase緩衝液(pH8.0)（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、200μg/ml RNase A） 300μlに一晩溶解した。また、マウスFUT8遺伝子翻訳開始コドンの位置するエクソンの内部配列に結合するフォワードプライマー（配列番号１）、同エクソンのうち実施例１第３項記載の相同組換えにより欠失した配列に結合するリバースプライマー（配列番号２）、実施例１第２項記載のターゲティングベクター内のIRES配列に結合するフォワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を各々設計した。
【０２０７】
DNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社)を用いて、上記で調製したゲノムDNA溶液を各々1.25μl含む20μlの反応液[ExTaqbuffer(宝酒造社)、0.1mM dNTPs、0.1μM 上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１、２、３、４）]を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。PCRは、94℃で2分間の加熱の後、94℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で30秒間からなる反応を１サイクルとした35サイクルの条件で行った。
上記PCRにより、FUT8野生型対立遺伝子からは翻訳開始コドンを含む領域特異的な240bpの増幅断片が、相同組換えが起こった対立遺伝子からはターゲティングベクター内のIRES配列特異的な約380bpの断片が各々増幅される。PCR後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、IRES配列特異的な約380bpの断片の増幅のみが認められるものをFUT8KOホモ接合体マウスと判定した。
【０２０８】
生後10〜14日目の産仔137匹について、遺伝子型の判定を行った結果、FUT8KOホモ接合体マウスと判定された産仔は5匹であり、そのうち2匹は生後2〜3週目に死亡した。残りの3匹のうち、1匹を本実施例第３項（１）記載の肝臓由来細胞株の樹立および本実施例第３項（３）記載の骨髄由来細胞株の樹立に、異なる1匹を本実施例第３項（２）記載の腎臓由来細胞株の樹立および本実施例第３項（３）記載の骨髄由来細胞株の樹立に、さらに異なる1匹であり成獣へと至ったFUT8KOホモ接合体マウスを本実施例第３項（３）記載の骨髄由来細胞株の樹立に用いた。
【０２０９】
２．SV40 T抗原発現ベクターの構築
（１）プラスミドpMoAHの構築
以下の手順で蛋白質発現ベクターpMoAHを構築した。
まず、プラスミドpKANTEX93［モレキュラー・イムノロジー（Mol.Immunol.）, 37, 1035 （2000）］を鋳型として制限酵素AatII認識配列を含む領域をPCRにより増幅し、増幅したDNA断片をpKANTEX93の制限酵素MluIサイトへ挿入した。続いて、アンピシリン耐性遺伝子コード領域を、pKANTEX93を鋳型としたPCRにより増幅し、増幅したDNA断片を上記で作製したプラスミドのAatII断片（11.7kb）と結合させた。さらに、制限酵素SalIおよびNotIの認識配列を両末端に含む領域を、pKANTEX93を鋳型としたPCRにより増幅し、増幅したDNA断片を、上記で作製したプラスミドの11.9kbのSalI-NotI断片と結合させた。本プラスミドを以下pKANTEX93’と称す。
【０２１０】
続いて、プラスミドpKANTEX93’より、抗体発現ユニットを含むEcoRI-BamHI断片を除去し、得られたEcoRI-BamHI断片（8.8kb）を、制限酵素EcoRIおよびBamHIの認識配列を両末端に持つ合成DNA断片と結合させ、マルチクローニングサイトを導入した。本プラスミドを以下pPAHと称す。
さらに、プラスミドpPAHより、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr) 遺伝子およびG418耐性遺伝子コード領域を含むMluI-HindIII断片を除去し、得られた5.3kb のMluI-HindIII断片の両末端を平滑化した自己結合させた。本プラスミドを以下、pMoAHと称す。
各プラスミドの塩基配列は、DNAシークエンサー377（ParkinElmer社）およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Parkin Elmer社）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、挿入DNA及び結合部の配列が、目的の配列と一致することを確認した。
【０２１１】
（２）SV40大型T抗原および小型t抗原コード領域の取得
以下の手順で、SV40大型T抗原および小型t抗原のコード領域を有するプラスミドpBlu-SV40Tagを構築した(図４)。
【０２１２】
プラスミドSVori-8-16(ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク；資源番号VG025)を、制限酵素BamHI(NewEngland Biolabs社)およびStuI(宝酒造社)で一晩消化した後、該液をアガロースゲル電気泳動に供し、SV40大型T抗原および小型t抗原のコード領域を含む約2.6Kbの断片を精製した。
一方、プラスミドpBluescriptIIKS(+)（Strategene社）を制限酵素BamHIおよびEcoRV(New England Biolabs社)を加えて37℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該液を1.0%(w/v)アガロースゲル電気泳動に供し、約2.9KbのDNA断片を精製した。
上記で得たプラスミドSVori-8-16由来の約2.6KbのStuI-BamHI断片、プラスミドpBluescriptIIKS(+)由来の約2.9KbのEcoRV-BamHI断片を連結し、pBlu-SV40Tagを構築した。
【０２１３】
（３）SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの構築
本項（１）で得たpMoAHおよび本項（２）で得たプラスミドpBlu-SV40Tagを用いて、以下の手順でSV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagを構築した(図５)。
プラスミドpBlu-SV40Tagを制限酵素BamHIおよび制限酵素SalIを用いて消化した後、該液をアガロースゲル電気泳動に供し、SV40大型T抗原および小型t抗原のコード領域を含む約2.6KbのDNA断片を精製した。
【０２１４】
一方、プラスミドpMoAHを制限酵素BamHIおよび制限酵素SalIを用いて消化反応した後、該液をアガロースゲル電気泳動に供し、約5.3KbのDNA断片を精製した。
上記で得たプラスミドpBluescriptIIKS(+)-SV40Tag由来の約2.6KbのSalI-BamHI断片、プラスミドpMoAH由来の約5.3KbのSalI-BamHI断片を連結しSV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagを構築した。
構築したSV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの塩基配列は、DNAシークエンサー377（Parkin Elmer社）およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FSReady Reaction Kit（Parkin Elmer社）を使用して決定し、方法は添付マニュアルに従った。本法により、挿入DNAが、SV40ゲノムDNA配列[GenBankJ02400]の大型T抗原および小型t抗原コード領域を含む配列と一致することを確認した。
【０２１５】
３．FUT8 KOホモ接合体マウスからの細胞株の樹立
上記第２項で得たFUT8 KOホモ接合体マウスから、肝臓、腎臓、肺、心臓、腹筋、脳、頭蓋筋、皮膚、骨髄、脾臓、胸腺の各臓器を摘出して臓器毎に初代培養に供した。これらの初代培養に供した臓器由来の細胞のうち、骨髄、脾臓、胸腺の各臓器由来の細胞は、初代培養時に生育が不良であったため、細胞株の樹立には至らなかった。また、初代培養に供した臓器由来の細胞のうち、検鏡での観察で他の細胞株と比較して増殖性が良好であった肝臓および腎臓から、以下の通りに細胞株の樹立を行った。加えて、哺乳細胞による物質生産において高い頻度で使用されている骨髄由来の細胞についても、以下の通りに細胞株の樹立を行った。
【０２１６】
（１）肝臓由来細胞株の樹立
本実施例第１項で得たFUT8KOホモ接合体マウスより、以下の手順で肝臓由来不死化細胞株を樹立した。
まず、FUT8 KOホモ接合体マウスの肝臓より、以下の手順で初代培養細胞を調製した。
生後2週齢のFUT8 KOホモ接合体マウスより、肝臓を摘出し、ダルベッコPBS(Invitrogen社)で洗浄後、トリプシン-EDTA(Invitrogen社)溶液2mLを入れた2cmディッシュ（Falcon社）内で細切したのち、5% CO2、37℃の条件下で15分間インキュベートした。継代培養用培地[10％ウシ胎仔血清(Invitrogen社)および50μg/mLゲンタマイシン硫酸塩溶液(ナカライテスク社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)]4mLと混和後、15mLチューブ（Falcon社）に回収しピペッティングを行った。5分間程度静置して組織塊を沈殿させ、上清約5mLを別の15mLチューブにとり、1000rpmで５分間遠心分離し細胞を回収した。細胞数を計数したところ生細胞数は約6×106個であった。そこで細胞密度が約3×105個/mLとなるように継代培養用培地に懸濁し、T75フラスコ(Greiner社)2本に10mLずつ細胞浮遊液を分注した後、5%CO2、37℃の条件下で培養を開始した。本初代培養細胞を以下FUT8KO-LIV細胞と称す。
【０２１７】
FUT8KO-LIV細胞を24時間培養後、検鏡したところ、死細胞が多く観察され、フラスコへの接着が認められた生細胞は全細胞の10％以下であった。そこで、培養上清を除去し、ダルベッコPBS(Invitrogen社)で洗浄することにより死細胞を除去した後、新たな継代培養用培地を10mLずつ分注した。この培地交換作業を2日毎に繰り返し行った。培養開始から7日後、接着細胞の細胞密度が80％コンフルエントに達した時点で細胞数を計数したところ、全生細胞数は約7×105個であり、細胞密度が約2倍希釈となるように細胞の継代を行った。その後も、細胞の増殖が悪かったため、培地交換作業を3〜4日毎に行い、検鏡により細胞密度が70〜80%コンフルエントとなった時点で細胞密度が約2倍希釈となるように細胞の継代を行うという作業を繰り返した。細胞の継代時には細胞数を計数し、FUT8KO-LIV細胞の培養開始時からの世代数を算出した。培養開始から2ヶ月が経過した頃から徐々に増殖性の良い細胞の出現が認められたことから、継代時の細胞密度の希釈を5〜10倍となるようにし、さらに4ヶ月間にわたり、3〜4日毎の培地交換作業あるいは継代作業を繰り返し継続して行った。培養開始から6ヶ月後、世代数は約120世代に達し、倍加時間が約25時間の安定した細胞増殖を示す不死化細胞株が得られた。本不死化細胞株を以下、LIV86株と称す。
【０２１８】
一方、FUT8KO-LIV細胞の培養開始から17日後、一部の細胞に対して、以下の手順で、本実施例第２項（２）で構築したSV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの遺伝子導入を行った。SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40TagのFUT8KO-LIV細胞への遺伝子導入は、lipofectamineTM reagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により以下の手順で行った。
【０２１９】
まず、FUT8KO-LIV細胞を、遺伝子導入の18時間前に、細胞密度が約2×104個/mLとなるようにT75フラスコ2本に10mlずつ播種し、5% CO2、37℃の条件下で培養後、遺伝子導入の直前に無血清DMEM培地(Invitrogen社)6.4mL/T75フラスコに培地交換した。一方、SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagは、制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.5μg/μL水溶液とした。該線状化ベクター溶液16μL(8μg)を無血清DMEM培地 0.8mLと混和した後、該液にlipofectamineTM reagent 50μLと無血清DMEM培地 0.8mLとの混和液を混合した。室温で15分間静置した後、該液1.6mLを上記のT75フラスコに加え、FUT8KO-LIV細胞を5%CO2、37℃、DNA-liposomecomplex共存の条件下で6時間培養した。培養後、20％ウシ胎仔血清(Invitrogen社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社) 8mLを添加し、5%CO2、37℃の条件下で培養した。24時間培養後、上清を除去し、新たな継代培養用培地を15mLずつ分注し、さらに5日間培養後、細胞密度が約２倍希釈となるように継代を行った。さらに4日間培養したところ、細胞密度が約80％コンフルエント、全生細胞数は約2×106個に達し、SV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの遺伝子導入を行っていない細胞と比較して、細胞の増殖速度の増大が認められた。その後、培地交換作業を2〜4日毎に繰り返し行い、検鏡により細胞密度が70-80%コンフルエントとなった時点で、細胞密度が約10〜100倍希釈となるように細胞の継代を行った。この培地交換および細胞の継代作業を約3ヶ月間継続して行った。世代数は約120世代に達し、倍加時間が約12時間の安定した細胞増殖を示す不死化細胞株が得られた。本不死化細胞株を以下、LIV86-SV株と称す。
【０２２０】
（２）腎臓由来細胞株の樹立
本実施例第１項で得たFUT8KOホモ接合体マウスより、以下の手順で腎臓由来不死化細胞株を樹立した。
まず、FUT8 KOホモ接合体マウスの腎臓より、以下の手順で初代培養細胞を調製した。
生後2週齢のFUT8 KOホモ接合体マウスより、腎臓を摘出し、ダルベッコPBS(Invitrogen社)で洗浄後、トリプシン-EDTA(Invitrogen社)溶液1mLを入れた2cmディッシュ（Falcon社）内で細切したのち、5% CO2、37℃の条件下で10分間インキュベートした。さらにトリプシン-EDTA溶液 2mLを加え、5%CO2、37℃の条件下で10分間インキュベートした後、継代培養用培地10mLと混和後、50mLチューブ（Falcon社）に回収しピペッティングを行った。5分間程度静置して組織塊を沈殿させ、上清約12mLを15mLチューブ（Falcon社）にとり、800rpmで5分間遠心分離し細胞を回収した。細胞数を計数したところ生細胞数は約3×106個であった。そこで、細胞密度が約2×105個/mLとなるように継代培養用培地に懸濁し、T75フラスコ(Greiner社)1本に15mL細胞浮遊液を分注した後、5%CO2、37℃の条件下で培養を開始した。本初代培養細胞を以下FUT8KO-KID細胞と称す。
【０２２１】
FUT8KO-KID細胞を24時間培養後、検鏡したところ、死細胞が多く観察されたが、増殖性の良い接着性の生細胞が多数観察された。そこで、培養上清を除去し、ダルベッコPBS(Invitrogen社)で洗浄することにより死細胞を除去した後、新たな継代培養用培地を10mLずつ分注した。培養開始から3日後、生細胞の細胞密度が80％コンフルエントに達した。この時点で細胞数を計数したところ、全生細胞数は約9×106個であり、細胞密度が約6倍希釈となるように細胞の継代を行った。その後、培地交換作業を3〜4日毎に行い、検鏡により細胞密度が70〜80%コンフルエントとなった時点で細胞密度が約2〜5倍希釈となるように細胞の継代を行うという作業を繰り返し行った。細胞の継代時には細胞数を計数し、FUT8KO-KID細胞の培養開始時からの世代数を算出した。培養開始から3週間経過した頃から、細胞の増殖性が悪化し、その後約1ヶ月間は、3〜4日毎の培地交換作業のみを行った。培養開始から2ヶ月が経過した頃から徐々に増殖性の良い細胞の出現が認められたことから、検鏡により細胞密度が70〜80%コンフルエントとなった時点で細胞密度が約2〜5倍希釈となるように細胞の継代を行うという作業を繰り返し行った。さらに4ヶ月間、3〜4日毎の培地交換作業あるいは継代作業を繰り返し継続して行った。培養開始から6ヶ月後、世代数は約100世代に達し、倍加時間が約18時間の安定した細胞増殖を示す不死化細胞株が得られた。本不死化細胞株を以下、KID86株と称す。
【０２２２】
一方、FUT8KO-KID細胞の培養開始から5日後、一部の細胞に対して以下の手順で、本実施例第２項（２）で構築したSV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの遺伝子導入を行った。
SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40TagのFUT8KO-KID細胞への遺伝子導入は、lipofectamineTM reagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により以下の手順で行った。
【０２２３】
まず、FUT8KO-KID細胞を、遺伝子導入の18時間以上前に、細胞密度が約1×105個/mLとなるようにT25フラスコ(Greiner社)1本に5mL播種し、5% CO2、37℃の条件下で培養した。一方、SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagは、制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.5μg/μL水溶液とした。該線状化ベクター溶液10μL(5μg)を無血清DMEM培地 0.3mLと混和した後、該液にlipofectamineTM reagent 30μLと無血清DMEM培地 0.3mLとの混和液を混合した。室温で15分間静置した後、該液を無血清DMEM培地2.4mLと混和した。該液を上記のT25フラスコに、培養上清を除去した後に加え、5% CO2、37℃、DNA-liposome complex共存の条件下で6時間培養した後、継代培養用培地に交換し、5%CO2、37℃の条件下で培養した。24時間培養後、上清を除去し、新たな継代培養用培地を4mL分注した。さらに4日間培養後、細胞密度が約6倍希釈となるように継代を行った。その後、培地交換作業を3〜4日毎に行い、検鏡により細胞密度が70〜80%コンフルエントとなった時点で細胞密度が約2〜5倍希釈となるように細胞の継代を行うという作業を繰り返し行った。遺伝子導入から2週間後頃から、細胞の増殖性の悪化が認められたため、その後約2週間は、3〜4日毎の培地交換作業のみを行った。遺伝子導入から約1ヶ月経過した頃から、増殖型コロニーの出現が認められたことから、継代作業を再開した。その後、約3ヶ月間、3〜4日毎の培地交換作業あるいは継代作業を繰り返し継続して行った。培養開始から4ヶ月後、世代数は約110世代に達し、倍加時間が約16時間の安定した細胞増殖を示す不死化細胞株が得られた。本不死化細胞株を以下、KID86-SV株と称す。
【０２２４】
（３）骨髄由来細胞株の樹立
本実施例第１項で得たFUT8KOホモ接合体マウスより、以下の手順で骨髄由来不死化細胞株を樹立した。
まず、FUT8 KOホモ接合体マウスの骨髄細胞より、以下の手順で初代培養細胞を調製した。
【０２２５】
FUT8 KOホモ接合体マウスより、大腿骨を摘出した。大腿骨の両端を切断し、注射針（テルモ社）を一方の端から骨内に挿入し、RPMI1640培地(Invitrogen社)を10mL流し込んで骨髄細胞を流出させ、15mLチューブ(Falcon社)に回収した。800rpmで5分間遠心分離し細胞を回収した後、細胞数を計数し、細胞密度が1〜10×105個/mLとなるように継代培養用培地[10％ウシ胎仔血清(Invitrogen社)および50μg/mLゲンタマイシン硫酸塩溶液(ナカライテスク社)を添加したRPMI1640培地(Invitrogen社)]に懸濁した。該細胞懸濁液をT75フラスコ(旭テクノグラス)に10〜15mLずつ分注し、5%CO2、37℃の条件下で培養を開始した。本実施例第１項で得たFUT8KOホモ接合体マウスのうち1匹については、得られた骨髄細胞数が約1×106個と少なく、培養開始から1ヶ月間、3〜4日毎に培地交換作業を繰り返し行ったが、全細胞が死滅に至った。
【０２２６】
また、別のFUT8 KOホモ接合体マウス1匹から調製した骨髄細胞は、初代培養時の細胞数は約7×106個であった。骨髄細胞それを3系統に分岐した後、継代用培地、IL-3添加培地[200pMrecombinant murine IL-3(ぺプロテック社)を添加した継代用培地]、あるいはIL-3添加X-VIVO15培地[200pMrecombinant murine IL-3(ぺプロテック社)、10％ウシ胎仔血清(Invitrogen社)および50μg/mLゲンタマイシン硫酸塩溶液(ナカライテスク社)を添加したX-VIVO15培地(BioWhittaker社)]を用いて培養し、3〜4日毎に培地交換作業を繰り返し行ったが、培養開始から約1ヵ月後、全細胞が死滅に至った。
【０２２７】
さらに、本実施例第１項で得たFUT8KOホモ接合体マウスのうち、成獣へと至った１匹から骨髄由来細胞株の樹立を行った。該マウスから調製した骨髄細胞のは、初代培養時の細胞数は約2×107個であった。本初代培養細胞を以下FUT8KO-Bom細胞と称す。FUT8KO-Bom細胞を24時間培養後、IL-3添加培地を用いて細胞培養液を2倍希釈した。その後、3〜7日毎に、細胞懸濁液を50mLチューブ(Falcon社)に回収し、800rpmで5分間遠心分離し細胞を回収した後、培養上清の3分の１量〜半量を新たなIL-3添加培地に交換した。培養開始から約3ヶ月間は、細胞の増殖が悪く、死細胞の割合が多かったが、その後、徐々に死細胞の割合が減少し、増殖性の良い細胞の割合が増加した。そこで、3〜7日毎に培地交換作業を継続し、細胞の増殖性が良く、かつ細胞密度が1×106個/mLを超えた場合は、細胞密度が約2〜10倍希釈となるように細胞の継代を行ったが、この場合も、培養上清を培養液量の3分の1量〜半量添加した。この培地交換および継代作業を4〜7日毎に繰り返し行い、約6ヶ月間の長期継代培養を行った。安定した細胞増殖を示す不死化細胞が得られた。本不死化細胞株を以下Bom86株と称す。
【０２２８】
一方、FUT8KO-Bom細胞の培養開始から6日後、一部の細胞に対して以下の手順で、本実施例第２項（２）で構築したSV40T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの遺伝子導入を行った。
SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40TagのFUT8KO-Bom細胞への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology),3, 133 (1990)］に準じて以下の手順で行った。
【０２２９】
まず、SV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagは、制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.5μg/μl水溶液とした。一方、FUT8KO-Bom細胞をRPMI1640培地に懸濁して7×106個/mlとした。細胞懸濁液800μl（5.6×106個）を上記線状化ベクター20μl（10μg）と混和した後、細胞−DNA混和液の全量をGene Pulser Cuvette(電極間距離4mm)(BIO-RAD社)へ移し、細胞融合装置GenePulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧300V、電気容量500μFの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液をIL-3添加培地 10mLに懸濁し、T75フラスコ(旭テクノグラス)へ播種した。5% CO2、37℃の条件下で24時間培養後、細胞懸濁液を50mLチューブ(Falcon社)に回収し、800rpmで5分間遠心分離し細胞を回収した後、培養上清の半量を新たなIL-3添加培地に交換した。その後、3〜7日毎に、細胞懸濁液を50mLチューブ(Falcon社)に回収し、800rpmで5分間遠心分離し細胞を回収した後、培養上清の3分の１量〜半量を新たなIL-3添加培地に交換した。培養開始から約3ヶ月間は、細胞増殖が悪く、死細胞の割合が多かったが、その後、徐々に死細胞の割合が減少し、増殖性の良い細胞の割合が増加した。そこで、3〜7日毎に培地交換作業を継続し、細胞の増殖性が良く、かつ細胞密度が1×106個/mLを超えた場合は、細胞密度が約2〜10倍希釈となるように細胞の継代を行ったが、この場合も、培養上清を培養液量の3分の1量〜半量添加した。この培地交換および継代作業を4〜7日毎に繰り返し行い、約6ヶ月間の長期継代培養を行った。安定した細胞増殖を示す不死化細胞が得られた。本不死化細胞株を以下Bom86-SV株と称す。
【実施例３】
【０２３０】
FUT8 KO接合体マウス由来樹立細胞株を用いた抗体組成物の発現
１．抗CD20キメラ抗体組成物の発現
（１）LIV86-SV株を用いた抗CD20キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（１）で樹立したLIV86-SV株に対し、WO03/55993記載の抗CD20キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2B8Pおよびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗CD20キメラ抗体組成物の安定発現株を作製した。pAGE249は、pAGE248［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.  Chem.,  269,  14730  (1994)）］の誘導体であり、pAGE248よりジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（dhfr）発現ユニットを含む2.7KbのSphI-SphI断片を除去したベクターである。
【０２３１】
ベクターpKANTEX2B8PおよびベクターpAGE249のLIV86-SV株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology),3, 133 (1990)］に準じて以下の手順で行った。まず、ベクターpKANTEX2B8Pを制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μl水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μl水溶液とした。
【０２３２】
一方、LIV86-SV株をK-PBS緩衝液［137mMKCl、2.7mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、4mMMgCl2］に懸濁して8×106個/mlとした。細胞懸濁液200μL（1.6×106個）を上記線状化ベクター 各4μL（4.4μg）と混和した後、細胞−DNA混和液の全量をGenePulser Cuvette(電極間距離2mm)(BIO-RAD社)へ移し、細胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧350V、電気容量250μFの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に懸濁し、接着細胞培養用96ウェルプレート（Greiner社）へ播種した。5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および300μg/mlハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら8日間の培養を行い、薬剤耐性株を取得した。その後、薬剤耐性株を24ウェルプレート（Greiner社）へ拡大し、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および50nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で2週間培養した。さらに、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および250nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で２週間培養し、抗CD20キメラ抗体安定発現株LIV86-SV-CD20を取得した。なお、取得したLIV86-SV-CD20株は、平成15年3月4日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば市東1丁目1番地 中央第6) にFERM BP-8314として寄託されている。
【０２３３】
（２）KID86-SV株を用いた抗CD20キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（２）で樹立したKID86-SV株に対し、WO03/55993記載の抗CD20キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2B8Pおよびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗CD20キメラ抗体組成物の安定発現株を作製した。
ベクターpKANTEX2B8PおよびベクターpAGE249のKID86-SV株への遺伝子導入はlipofectamineTM reagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により以下の手順で行った。まず、KID86-SV株を、遺伝子導入の18時間以上前に、細胞密度が約1×105個/mLとなるようにT25フラスコ(Greiner社)に播種し、5% CO2、37℃の条件下で培養した。一方、ベクターpKANTEX2B8Pを制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μL水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μL水溶液とした。線状化ベクター溶液各5μL(5.5μg)を無血清DMEM培地 0.3mLと混和した後、該液にlipofectamineTM reagent 30μLと無血清DMEM培地 0.3mLとの混和液を混合した。
【０２３４】
室温で15分間静置した後、該液を無血清DMEM培地2.4mLと混和した。該液を上記のT25フラスコに、培養上清を除去した後に加え、5% CO2、37℃、DNA-liposome complex共存の条件下で6時間培養した後、10%ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に交換した。5% CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および400μg/mlハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら14日間の培養を行い、抗CD20キメラ抗体安定発現株KID86-SV-CD20を取得した。なお、取得したKID86-SV-CD20株は、平成15年3月４日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (茨城県つくば市東1丁目1番地 中央第6) にFERM BP-8315として寄託されている。
【０２３５】
３．抗ガングリオシドGD3キメラ抗体組成物の発現
（１）  LIV86-SV株を用いた抗ガングリオシドGD3キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（１）で樹立したLIV86-SV株に対し、WO00/61739記載の抗GD3キメラ抗体発現ベクターpChi641LHGM4およびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗ガングリオシドGD3キメラ抗体組成物の安定発現株を作製した。
ベクターpChi641LHGM4およびベクターpAGE249のLIV86-SV株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology),3, 133 (1990)］に準じて以下の手順で行った。まず、ベクターpChi641LHGM4を制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μL水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μL水溶液とした。
【０２３６】
一方、LIV86-SV株をK-PBS緩衝液［137mMKCl、2.7mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、4mMMgCl2］に懸濁して8×106個/mLとした。細胞懸濁液200μL（1.6×106個）を上記線状化ベクター 各4μL（4.4μg）と混和した後、細胞−DNA混和液の全量をGenePulser Cuvette(電極間距離2mm)(BIO-RAD社)へ移し、細胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧350V、電気容量250μFの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に懸濁し、接着細胞培養用96ウェルプレート（Greiner社）へ播種した。5%CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および300μg/mLハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら8日間の培養を行い、薬剤耐性株を取得した。その後、薬剤耐性株を24ウェルプレート（Greiner社）へ拡大し、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および50nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で２週間培養した。さらに、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および250nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で２週間培養し、抗ガングリオシドGD3キメラ抗体安定発現株LIV86-SV-2871を取得した。
【０２３７】
（２）KID86-SV株を用いた抗ガングリオシドGD3キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（２）で樹立したKID86-SV株に対し、WO00/61739記載の抗GD3キメラ抗体発現ベクターpChi641LHGM4およびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗ガングリオシドGD3キメラ抗体組成物の安定発現株を作製した。
ベクターpChi641LHGM4およびベクターpAGE249のKID86-SV株への遺伝子導入はlipofectamineTM reagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により以下の手順で行った。まず、KID86-SV株を、遺伝子導入の18時間以上前に、細胞密度が約1×105個/mLとなるようにT25フラスコ(Greiner社)に播種し、5% CO2、37℃の条件下で培養した。一方、ベクターpChi641LHGM4を制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μL水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μL水溶液とした。線状化ベクター溶液各5μL(5.5μg)を無血清DMEM培地 0.3mLと混和した後、該液にlipofectamineTM reagent 30μLと無血清DMEM培地 0.3mLとの混和液を混合した。室温で15分間静置した後、該液を無血清DMEM培地2.4mLと混和した。該液を上記のT25フラスコに、培養上清を除去した後に加え、5% CO2、37℃、DNA-liposome complex共存の条件下で6時間培養した後、10%ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に交換した。5% CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および400μg/mLハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら14日間の培養を行い、抗ガングリオシドGD3キメラ抗体安定発現株KID86-SV-2871を取得した。
【０２３８】
４．抗CCR4キメラ抗体組成物の発現
（１）LIV86-SV株を用いた抗CCR4キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（１）で樹立したLIV86-SV株に対し、WO01/64754記載の抗CCR4キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2160およびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗CCR4キメラ抗体の安定発現株を作製した。
ベクターpKANTEX2160およびベクターpAGE249のLIV86-SV株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー(Cytotechnology),3, 133 (1990)］に準じて以下の手順で行った。まず、ベクターpKANTEX2160を制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μL水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μL水溶液とした。
【０２３９】
一方、LIV86-SV株をK-PBS緩衝液［137mMKCl、2.7mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、4mMMgCl2］に懸濁して8×106個/mlとした。細胞懸濁液200μl（1.6×106個）を上記線状化ベクター 各4μL（4.4μg）と混和した後、細胞−DNA混和液の全量をGenePulser Cuvette(電極間距離2mm)(BIO-RAD社)へ移し、細胞融合装置Gene Pulser(BIO-RAD社)を用いてパルス電圧350V、電気容量250μFの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を10%ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に懸濁し、接着細胞培養用96ウェルプレート（Greiner社）へ播種した。5%  CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および300μg/mLハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら8日間の培養を行い、薬剤耐性株を取得した。その後、薬剤耐性株を24ウェルプレート（Greiner社）へ拡大し、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および50nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で2週間培養した。さらに、10%ウシ胎仔透析血清(Invitrogen社)および250nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)で2週間培養し、抗CCR4キメラ抗体安定発現株LIV86-SV-2760を取得した。
【０２４０】
（２）KID86-SV株を用いた抗CCR4キメラ抗体組成物の発現
実施例２第３項（２）で樹立したKID86-SV株に対し、WO01/64754記載の抗CCR4キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2160およびハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクターpAGE249を導入し、抗CCR4キメラ抗体組成物の安定発現株を作製した。
ベクターpKANTEX2160およびベクターpAGE249のKID86-SV株への遺伝子導入はlipofectamineTM reagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により以下の手順で行った。まず、KID86-SV株を、遺伝子導入の18時間以上前に、細胞密度が約1×105個/mLとなるようにT25フラスコ(Greiner社)に播種し、5% CO2、37℃の条件下で培養した。一方、ベクターpKANTEX2160を制限酵素AclIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを1μg/μL水溶液とした。また、ベクターpAGE249を制限酵素XhoIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを0.1μg/μL水溶液とした。線状化ベクター溶液各5μL(5.5μg)を無血清DMEM培地 0.3mLと混和した後、該液にlipofectamineTM reagent 30μLと無血清DMEM培地 0.3mLとの混和液を混合した。室温で15分間静置した後、該液を無血清DMEM培地2.4mLと混和した。該液を上記のT25フラスコに、培養上清を除去した後に加え、5% CO2、37℃、DNA-liposome complex共存の条件下で6時間培養した後、10%ウシ胎仔血清（Invitrogen社）を添加したDMEM培地（Invitrogen社）に交換した。5% CO2、37℃の条件下で24時間培養した後、培養上清を除去し、10% ウシ胎仔血清（Invitrogen社）および400μg/mLハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)に培地交換した。この培地交換作業を3〜4日毎に繰り返しながら14日間の培養を行い、抗CCR4キメラ抗体安定発現株KID86-SV-2760を取得した。
【０２４１】
４．抗体組成物の精製
本実施例第１項（１）で得た抗CD20キメラ抗体発現株LIV86-SV-CD20を、10%Ultra-low IgGウシ胎仔血清（Invitrogen社）および250nM MTX(SIGMA社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)へ3×104個/mlの密度で懸濁後、接着細胞培養用T182フラスコ（Greiner社）40本へ計1L播種した。37℃の5%CO2インキュベーター内で７日間培養後、細胞懸濁液を回収した。また、本実施例第１項（２）で得た抗CD20キメラ抗体発現株KID86-SV-CD20を、10% Ultra-low IgGウシ胎仔血清（Invitrogen社）および400μg/mLハイグロマイシンB(和光純薬)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)へ3×104個/mlの密度で懸濁後、接着細胞培養用T182フラスコ（Greiner社）40本へ計1L播種した。37℃の5%  CO2インキュベーター内で８日間培養後、細胞懸濁液を回収した。
【０２４２】
回収した各細胞懸濁液に対し3000rpm、4℃の条件で10分間の遠心分離を行って上清を回収した後、0.22μm孔径500mL容PES Membrane（旭テクノグラス社）を用いて濾過した。
0.8cm径のカラムにPROSEP-AHigh Capacity(MILLIPORE社) 0.5mLを充填し、1Mグリシン−0.15M NaCl緩衝液（pH8.6）3mlを通筒した。さらに、0.1Mクエン酸緩衝液（pH3.5） 2mlおよび1Mグリシン−0.15M NaCl緩衝液（pH8.6）2mlで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清500mlをカラムに通筒した後、1Mグリシン−0.15M NaCl緩衝液（pH8.6）20mlで洗浄した。洗浄後、0.1M クエン酸緩衝液（pH3.5）1.25mlを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。初めに溶出する250μlの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分1mLを回収して2M Tris-HCl(pH8.5)200μLと混合して中和した。取得した溶出液に対し、10mM クエン酸−0.15MNaCl緩衝液（pH6.0）を用いて4℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、0.22μm孔径Millex GV（MILLIPORE社）を用いて滅菌濾過した。
【実施例４】
【０２４３】
FUT8ノックアウトマウス由来細胞が産生する抗体組成物のin vitro細胞傷害活性（ADCC活性）
（１） 標的細胞溶液の調製
実施例３第４項で精製した抗CD20キメラ抗体組成物のinvitro細胞傷害活性を評価するため、以下の記述に従いADCC活性を測定した。
【０２４４】
RPMI1640-FCS(10) 培地(FCSを10％含むRPMI1640培地(GIBCO BRL社製))で培養したヒトBリンパ球培養細胞株Raji細胞(JCRB9012)を遠心分離操作および懸濁によりRPMI1640-FCS(5)培地（FCSを5％含むRPMI1640培地(GIBCOBRL社製)）で洗浄した後、RPMI1640-FCS(5) 培地によって、2×105細胞/mLに調製し、標的細胞溶液とした。
【０２４５】
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血50mLを採取し、ヘパリンナトリウム (清水製薬社製) 0.5mLを加え穏やかに混ぜた。これをLymphoprepTM (AXIS SHIELD社製) を用いて使用説明書に従い、遠心分離（800g、20分間）して単核球層を分離した。RPMI1640-FCS(5)培地で3回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて4×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
【０２４６】
（３）ADCC活性の測定
96ウェルＵ字底プレート (Falcon社製) の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の50μL (1×104細胞/ウェル) を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を50μL(2×105細胞/ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は20:1となる)添加した。更に、各種抗CD20キメラ抗体を各最終濃度0.3〜3000ng/mLとなるように加えて全量を150μLとし、37℃で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性を、CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity AssayTM（Promega社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了45分前に15μLの9％Triton X-100溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のLDH活性を測定することにより求めた。これらの値を用いて、ADCC活性は次式により求めた。
【０２４７】
【数１】
2005224240.tif 000003
【０２４８】
図６に各抗CD20キメラ抗体のADCC活性を示した。FUT8ノックアウトマウス由来細胞LIV86-SVおよびKID86-SVより得た抗体は、いずれの抗体濃度においてもRituxanTMより高いADCC活性を示し、最高細胞傷害活性値も高かった。
以上の結果より、宿主細胞として本発明の不死化細胞株を用いることにより、高いADCC活性を示す抗体組成物の生産ができることが確認された。
【実施例５】
【０２４９】
FUT8ノックアウトマウス由来細胞が産生する抗体組成物の単糖組成分析
実施例３で取得した抗CD20抗体組成物、抗GD3抗体組成物および抗CCR4抗体組成物に対し、公知の方法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー(Journalof Liquid Chromatography), 6, 1577, (1983)］に従って単糖組成分析を行った。その結果、FUT8ノックアウトマウス由来細胞株LIV86-SV株およびKID86-SV株より得た抗体組成物は、全てフコース含量が検出限界以下であった。
以上の結果より、本発明の不死化細胞株では、N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN-アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する機能が欠失していることが示された。
【実施例６】
【０２５０】
FUT8 KOマウスの胎仔からの細胞株の樹立
１．ゼオシンによる選抜が可能なSV40T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTの構築
以下の手順でゼオシンによる選抜が可能なSV40 T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTを構築した(図7)。
プラスミドSVori-8-16(ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク；資源番号VG025)を制限酵素BamHI(NewEngland Biolabs社)およびStuI(New England Biolabs社)で消化した後、該液をアガロースゲル電気泳動に供し、SV40大型T抗原および小型t抗原のコード領域を含む約2.6Kbの断片を回収した。
【０２５１】
一方、プラスミドpcDNA3.1/Zeo(Invitrogen社)を制限酵素BamHIおよびEcoRV(NewEngland Biolabs社)で消化した後、該液をアガロースゲル電気泳動に供し、約5Kbの断片を回収した。
上記で得たプラスミドSVori-8-16由来の約2.6KbBamHI-StuI断片およびプラスミドpcDNA3.1/Zeo由来の約5kbpのBamHI-EcoRV断片を連結し、SV40大型T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTを構築した。
【０２５２】
構築したSV40大型T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTの塩基配列は、DNAシークエンサー377（Parkin Elmer社製）およびBigDye Terminator v3.0 CycleSequencing Kit（Applied Biosytems社製）を用いて、添付マニュアルに従い決定した。本法により、挿入DNAが、SV40ゲノムDNA配列[GenBankJ02400]の大型T抗原コード領域を含む配列と一致することを確認した。
【０２５３】
２．FUT8 KOホモ接合体マウス胎仔線維芽細胞の採取
実施例１第４項で得たFUT8KOヘテロ接合体マウスを交配させた。胎齢18.5日の胎仔より、以下の手順で胎仔線維芽細胞を採取した。
【０２５４】
胎齢18.5日にあたる妊娠したFUT8KOヘテロ接合体雌マウスから、無菌的に子宮を取り出した。子宮を切開して胎仔を取り出し、ダルベッコPBS(Invitrogen社)で洗浄したのち、実体顕微鏡下で頭部と内臓を除去した。各胎仔別にそれぞれ0.05%トリプシン(Invitrogen社)、0.53mMEDTA(和光純薬社)および40μg/mL DNase(Invitrogen社)を添加したダルベッコPBS(Invitrogen社)を入れたディッシュに移し、メスを用いて細切したのち、5% CO2、37℃の条件で30分間インキュベートした。インキュベート後、各ディッシュに継代培養用培地[10％ウシ胎児血清(Invitrogen社)および50μg/mLゲンタマイシン硫酸塩溶液(ナカライテスク社)を添加したDMEM培地(Invitrogen社)]を添加後混和した。各ディッシュの内容物を15mLチューブ（Falcon社）にそれぞれ回収し、ピペッティングにより混合した後、5分間静置して組織塊を沈殿させ、上清を別の15mLチューブにとり、1000rpmで５分間遠心分離し細胞を回収した。回収した細胞をそれぞれ継代培養用培地に懸濁し、10cmディッシュ(Falcon社)に播種し、5%CO2、37℃の条件下で培養を開始した。該細胞を初代培養マウス胎仔線維芽細胞として、以下の検討に用いた。
【０２５５】
３．初代培養マウス胎仔線維芽細胞のジェノタイプチェック
本実施例第２項で採取した初代培養マウス胎仔線維芽細胞について、実施例２第１項に記載の方法でジェノタイプチェックを行った。
PCRにより、FUT8野生型対立遺伝子より翻訳開始コドンを含む領域特異的な240bpの増幅断片が、相同組換えが起こった対立遺伝子からはターゲティングベクター内のIRES配列特異的な約380bpの断片が各々増幅される。PCR後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、IRES配列特異的な約380bpの増幅のみが認められた初代培養マウス胎仔線維芽細胞をFUT8 KOホモ接合体マウスの胎仔由来線維芽細胞と判定した。該初代培養マウス胎仔線維芽細胞を以下、FUT8KO-MEF細胞と称す。一方、FUT8野生型対立遺伝子より翻訳開始コドンを含む領域特異的な240bpの増幅のみが認められるものを野生型マウス胎仔由来線維芽細胞と判定した。
【０２５６】
４．FUT8 KOホモ接合体マウス胎仔由来線維芽細胞からの不死化細胞株の樹立
本実施例第３項のジェノタイプチェックによりFUT8 KOホモ接合体マウスの胎仔由来線維芽細胞と判定したFUT8KO-MEF細胞より、以下の手順で不死化細胞株を樹立した。
【０２５７】
FUT8 KO-MEF細胞へ、本実施例第１項で構築したSV40大型T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTの遺伝子導入を行った。ベクターpcDNA-SV40largeTは、制限酵素ScaIにより線状化した後、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化ベクターを滅菌水に溶解したものを遺伝子導入に供した。遺伝子導入は、lipofectamineTMreagent(Invitrogen社)を用いたリポフェクション法により、添付のマニュアルに従って行った。
【０２５８】
遺伝子導入から１〜２日後、400μg/mLの濃度でゼオシン(Invitrogen社)を含む継代培養用培地に交換し5%CO2、37℃の条件下で培養した。その後、培地交換作業を3〜4日毎に行い、検鏡により細胞密度が70〜80%コンフルエントとなった時点で細胞密度が約2〜5倍希釈となるように細胞の継代を行うという作業を繰り返し行った。ゼオシンを含む継代培養用培地での培養開始から約１ヵ月経過した頃から、細胞増殖が安定して認められるようになり、さらに約１ヶ月間培養を継続した結果、安定した細胞増殖を示す不死化細胞株（以下、Fut8-/-細胞と称す）が得られた。
同様にして、Fut8-/-細胞の対照用細胞株として、本実施例第３項のジェノタイプチェックにより野生型マウス胎仔由来線維芽細胞と判定した初代培養線維芽細胞から、不死化細胞株（以下、Fut8+/+細胞と称す）を樹立した。
【０２５９】
５．FUT8ノックアウトホモ接合体マウス胎仔由来不死化細胞株のAAL染色性解析
本実施例第4項において樹立したFut8-/-細胞およびFut8+/+細胞について、α1,6-フコースを特異的に認識するレクチンであるAALによる染色性を以下の手順で解析した。
【０２６０】
サブコンフルエント状態にあるFut8-/-細胞およびFut8+/+細胞を、0.2%EDTAを用いてディッシュから剥離させた後、細胞数を計数し、5×106細胞を1000rpm、5分間の遠心分離により回収した。回収した細胞をダルベッコPBS(Invitrogen社)を用いて懸濁した後、細胞を1000rpm、5分間の遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞を、2μg/mLの濃度でAAL-FITC（生化学工業社）を含むダルベッコPBS(Invitrogen社)に懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を氷冷したダルベッコPBS(Invitrogen社)を用いて２回洗浄し、細胞を回収した。回収した細胞をダルベッコPBS(Invitrogen社)500μLに懸濁し、FACS解析に供した。また、同様にAAL染色の陰性対照として、AAL-FITCによる染色を行わない非染色細胞もFACS解析に用いた。FACS解析は、FACScanTMおよびCELLQuestTM(Becton Dickinson社)を用いて行い、結果を図8に示した。
Fut8-/-細胞のAALによる染色性は、Fut8+/+細胞のそれと比較して顕著に低く、非染色細胞の蛍光強度と同程度であった。従って、Fut8-/-細胞では、糖蛋白質のN-グリコシド結合糖鎖へのα1,6フコースが付加できなくなっていることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】マウスFUT8遺伝子の翻訳開始コドンの位置するエクソンを含むゲノム領域を示した図である。
【図２】マウスFUT8遺伝子破壊用ターゲティングベクターの構造およびサザンブロットの判定法を示した図である。
【０２６２】
【図３】FUT8対立遺伝子を破壊したマウスのゲノムサザンブロットを示した図である。
【図４】作製したSV40大型T抗原および小型t抗原のコード領域を有するSV40T抗原発現ベクターpBlu-SV40Tagの作製の概略を示した図である。
【図５】作製したSV40 T抗原発現ベクターpMo-SV40Tagの作製の概略を示した図である。
【０２６３】
【図６】精製した二種類の抗CD20キメラ抗体の抗体濃度を変化させて測定したADCC活性を示した図である。横軸に抗体濃度を、縦軸に各抗体濃度における細胞傷害率を示す。□はLIV86-SV細胞産生抗体、■はKID86-SV細胞産生抗体、○はCHO細胞で生産した抗体である市販抗体RituxanTMを用いたときの細胞傷害活性をそれぞれ示す。
【０２６４】
【図７】作製したゼオシンによる選抜が可能なSV40T抗原発現ベクターpcDNA-SV40largeTの作製の概略を示した図である。
【図８】Fut8+/+細胞およびFut8-/-細胞のα1,6フコースに特異的なレクチンであるAALによる染色性を示した図である。横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をそれぞれ示す。実線はAAL-FITCによる染色の結果を、点線は非染色細胞の結果をそれぞれ示す。
【図１】
2005224240.tif 000004
【図２】
2005224240.tif 000005
【図３】
2005224240.tif 000006
【図４】
2005224240.tif 000007
【図５】
2005224240.tif 000008
【図６】
2005224240.tif 000009
【図７】
2005224240.tif 000010
【図８】
2005224240.tif 000011
【配列表】
2005224240000001.app