(57)【要約】【課題】  固有振動数の低い分子を検出することが可能なＣＡＲＳ顕微鏡を提供する。【解決手段】  波長成分が異なるパルス光を発生させる第一及び第二のパルスレーザ発生手段１０１、１０２と、第一及び第二のパルス光を同時に標本１２０に照射する照射手段１１０と、標本１２０から発生した散乱光を集光する集光手段１３０と、集光された散乱光から少なくとも第一及び第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段１４０と、コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段１５０とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、波長帯域阻止手段１４０は分光手段を含む。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生される第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、前記波長帯域阻止手段は分光手段を含むことを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【請求項２】
第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、前記集光手段による集光位置を調節するための補正光学手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【請求項３】
第一の波長成分を持つ波長可変な第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ波長可変な第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光の波長が常に一定になるように前記第一のパルス光の波長と前記第二のパルス光の波長を同時に制御して走査する波長走査手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【請求項４】
第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記散乱光が前記散乱光検出手段に入射するように前記第二のパルス光の波長に同期して前記波長分散型分光手段を駆動する波長分散駆動手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コヒーレントラマン散乱顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学においては、生体内の分子、例えばＤＮＡやアミノ酸、タンパク質、細胞小器官等の活動を、生きたまま観察したいという需要が多い。従来の蛍光観察や多光子励起蛍光観察を用いても、生体内の分子を観察することはある程度可能だが、目標とする分子を蛍光色素で標識する必要がある。
【０００３】
しかし、生体を蛍光色素で染色することは、蛍光色素に毒性が存在することや、蛍光色素によって分子の自由な運動が妨げられる等、少なからず生体に影響を及ぼすと考えられるため、好ましくない。
【０００４】
最近、生体内の分子の３次元分布を無染色で顕微鏡観察する目的で、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いた顕微鏡（ＣＡＲＳ顕微鏡）法が種々提案されている。ＣＡＲＳ顕微鏡法を用いれば、無染色で、分子の固有振動を直接検出することができる。
【０００５】
以下、ＣＡＲＳ顕微鏡の装置構成と検出原理を、特許文献１の例を用いて説明する。ＣＡＲＳ顕微鏡の基本構成は、図５に示すように、ポンプ光を発生する第一のパルスレーザ発生装置２０１と、ポンプ光より波長の長いストークス光を発生する第二のパルスレーザ発生装置２０２と、ポンプ光とストークス光を同一光路上に結合させるダイクロイックミラー２１２と、結合されたポンプ光とストークス光を標本２２０内の一点に集光させるためのミラー２１３と対物レンズ２１１と、標本で発生したポンプ光よりも波長の短いアンチストークス光を含む散乱光を集光する集光レンズ２３０と、集光した散乱光からポンプ光とストークス光を取り除く長波長阻止フィルタ２４０と、検出器２５０とからなる。
【０００６】
ＣＡＲＳにおけるアンチストークス光の発生原理は、以下のように説明される。図６に示すように、ポンプ光３７２の振動数ωP とストークス光３７３の振動数ωS の差が、標本内の集光位置にある分子３７５の固有振動数ωV と一致したときに、基底状態３７０にある分子３７５が振動数ωV で共鳴振動をおこして励起状態３７１となる。そして、振動数ωP であるポンプ光の一部３７２’が分子３７５の固有振動数ωV のドップラー変調を受けて、振動数ωASのアンチストークス光３７４が発生する。このとき、
ωAS＝ωP ＋ωV ＝２ωP −ωS 
の関係がある。
【０００７】
したがって、ポンプ光３７２の振動数ωP を固定したままストークス光３７３の振動数ωS を走査すれば、分子３７５の固有振動スペクトルが観察される。その固有振動スペクトルは、分子の種類によって異なるため、複数種類の分子が同時に存在する場合においても、それぞれの分子の種類を特定することができる。
【０００８】
アンチストークス光の発生強度ＩASは、式（１）に示すように、ポンプ光の強度ＩP の二乗とストークス光の強度ＩS の積に比例する。
【０００９】
ＩAS∝ＩP 2 ＩS                                               ・・・（１）
このように、アンチストークス光３７４は、標本内におけるポンプ光とストークス光の集光位置においてのみ強く発生する。
【００１０】
また、アンチストークス光の発生強度ＩASは、分子３７５の局所的な存在量の二乗にも比例する。したがって、ポンプ光とストークス光の集光位置を標本内で空間的に走査することにより、特定の分子の標本内の空間分布を求めることが可能である。
【００１１】
ここで、長波長阻止フィルタ２４０は、以下に説明する特性が要求される。図７に示すように、ポンプ光の分光スペクトル４７２は、波長λP を中心とする鋭いピーク形状を示し、ストークス光の分光スペクトル４７３は、それより長い波長λS を中心とする鋭いピーク形状を示す。そして、アンチストークス光の分光スペクトル４７４は、ポンプ光の分光スペクトル４７２のピークに対して、ストークス光の分光スペクトル４７３のピークとほぼ対称な位置に波長λASを中心とするピークとなって現れる。
【００１２】
したがって、長波長阻止フィルタ２４０は、波長λAS付近の光を十分透過し、波長λP 以上の光を十分阻止する性能が要求される。アンチストークス光の強度は、ポンプ光やストークス光の強度より３〜４桁弱いことが多いので、長波長阻止フィルタ２４０の波長λP における透過率は、波長λASにおける透過率の１０-5倍以下であることが要求される。
【００１３】
さらに、ＣＡＲＳ観測時はストークス光のピーク波長λS が波長λP よりも長い波長領域で波長走査され、それに伴いアンチストークス光のピーク波長λASも波長λP よりも短い波長領域で移動する。したがって、長波長阻止フィルタ２４０の分光透過率４７６は、波長λP よりやや短い波長に、透過率が１０-5以下となるカットオフ波長λC を持つ、ショートパスフィルタの特性が要求される。
【００１４】
また、特許文献２には、偏光型アンチストークスラマン散乱顕微鏡が開示されている。偏光型アンチストークスラマン散乱顕微鏡においては、ポンプ光とストークス光を、それぞれ振動方向の異なる直線偏光に変換してから標本に照射して、さらに、散乱光から特定方向の直線偏光成分のみを取り出すことにより、背景雑音となる非共鳴ラマン散乱成分が除去できて、コヒーレントアンチストークスラマン散乱を高感度で検出することが可能である。
【特許文献１】米国特許第６，１０８，０８１号明細書
【特許文献２】米国特許公開第２００３／００１１７６５Ａ１号明細書
【特許文献３】特開２００１−９１７０１号公報
【特許文献４】特開平１１−２７１５４１号公報
【特許文献５】特開平７−５１０７号公報
【特許文献６】特開平１０−３３３１０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ところで、従来のＣＡＲＳ顕微鏡には以下に述べる困難が存在する。
つまり、従来の長波長阻止フィルタには、特許文献１や特許文献２に示されているように、干渉フィルタ又はガラスフィルタが用いられていた。
【００１６】
そのため、従来の長波長阻止フィルタでは、カットオフ波長λC から透過率８０％となる波長の立ち上がり幅４７７を、波長の５％程度よりも小さくすることが困難であった。よって、検出できるアンチストークスコヒーレント光の波長λASは、ポンプ光の波長λP に対して少なくとも５％以上短くなければならず、したがって、検出できる分子の固有振動数には下限値が存在した。
【００１７】
例えば、ポンプ光の波長が８００ｎｍの場合、検出できるアンチストークスコヒーレント光の波長はおよそ７６０ｎｍ以下であり、検出できる分子の固有振動数の下限値は、波数換算でおよそ７００ｃｍ-1となる。この場合は、７００ｃｍ-1よりも低い振動数の分子振動を検出することは不可能である。
【００１８】
さらに、従来の透過型ＣＡＲＳ顕微鏡には、以下に述べる困難が存在する。つまり、透過型ＣＡＲＳ顕微鏡法においては、ポンプ光とストークス光を標本の内部で集光させ、その集光位置を透過検出するわけであるが、その標本に厚さの不均一性があったり屈折率の不均一性がある場合には、検出器上でのアンチストークス光のスポット位置がずれることがある。
【００１９】
このことを、図１５、図１６用いて説明する。図１５に示すように、カバーガラスの上に貼り付いている厚さ不均質の標本を透過観察する場合を考えると、カバーガラスの下から標本に入射したポンプ光及びストークス光は、標本内の光軸上で集光するが、標本の上面の不均一性により射出光線が屈折し、検出側においては、光軸から外れた位置に集光することとなる。また、図１６に示すように、標本内の集光位置の上方に、屈折率が周囲と異なる領域が存在すると、上方の検出側においては集光位置の深度が外れる。このように、標本の厚さが不均一だったり、標本の内部の屈折率が不均一な場合に、検出器上のアンチストークス光のスポット位置が一定せず、したがって検出感度の安定性を損ねることとなる。
【００２０】
また、従来のＣＡＲＳ顕微鏡において、検出光学系の中に分光素子を含めようとする場合には、ラマン振動数のスキャンに伴いストークス光の波長を変化させると、アンチストークス光の波長も変化するため、分光後のアンチストークス光の集光位置が移動することとなる。
【００２１】
このように、アンチストークス光の集光位置が移動する分光素子を含めたＣＡＲＳ顕微鏡では、検出感度が変化したり、検出器に光が届かなくなり、安定した計測をすることが難しいという問題点もある。
【００２２】
本発明は、従来技術のこのような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、固有振動数の低い分子を検出することが可能なＣＡＲＳ顕微鏡を提供することにある。
【００２３】
また、本発明のもう１つの目的は、標本に形状や屈折率の不均一性があっても、アンチストークス光の集光位置の移動がない透過型ＣＡＲＳ顕微鏡を提供することにある。さらに、本発明のさらにもう１つの目的は、ラマン分子振動数のスキャンを行っても、アンチストークス光の集光位置の移動がない透過型ＣＡＲＳ顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記目的を達成するための本発明の第１のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生される第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、前記波長帯域阻止手段は分光手段を含むことを特徴とするものである。
【００２５】
本発明の第２のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、前記集光手段による集光位置を調節するための補正光学手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを有することを特徴とするものである。
【００２６】
本発明の第３のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、第一の波長成分を持つ波長可変な第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ波長可変な第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光の波長が常に一定になるように前記第一のパルス光の波長と前記第二のパルス光の波長を同時に制御して走査する波長走査手段とを有することを特徴とするものである。
【００２７】
本発明の第４のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記散乱光が前記散乱光検出手段に入射するように前記第二のパルス光の波長に同期して前記波長分散型分光手段を駆動する波長分散駆動手段とを有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の第１のコヒーレントラマン散乱顕微鏡によれば、ポンプ光の波長とストークス光の波長をより近接させてもコヒーレントラマン散乱光を分離できるようになるので、固有振動数の低い分子を検出することが可能である。
【００２９】
本発明の第２のコヒーレントラマン散乱顕微鏡によれば、標本の屈折率分布や厚さの分布に伴う散乱光の集光位置や集光の乱れを常に補正することができるので、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。
【００３０】
本発明の第３のコヒーレントラマン散乱顕微鏡によれば、集光位置の移動による検出感度の変動を除去して、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。
【００３１】
本発明の第４のコヒーレントラマン散乱顕微鏡によれば、波長分散型分光手段により波長分離されたコヒーレントラマン散乱の集光位置を不動にすることができるので、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明の実施の形態については、まず、上記の目的を達成することができるコヒーレントラマン散乱顕微鏡の実施形態と、そのそれぞれの作用効果について説明する。そして、次に、それぞれの実施例を説明することにする。
【００３３】
本発明の第１のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、図１に構成を示すように、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生される第一のパルスレーザ発生手段１０１と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段１０２と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本１２０に照射する照射手段１１０と、前記標本１２０から発生した散乱光を集光する集光手段１３０と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段１４０と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段１５０とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、前記波長帯域阻止手段１４０は分光手段を含むことを特徴とする。
【００３４】
本発明の第１のコヒーレントラマン散乱顕微鏡においては、波長帯域阻止手段に分光手段を含めることにより、波長帯域阻止手段におけるカットオフ波長の立ち上がり幅を、従来のＣＡＲＳ顕微鏡で用いられていた長波長阻止フィルタよりも鋭くすることが可能である。したがって、従来のＣＡＲＳ顕微鏡では検出が不可能であった、ポンプ光の波長に近接した波長のアンチストークス光を検出することが可能になる。したがって、従来検出することが不可能であった低い固有振動数を持つ分子の検出が可能となる。
【００３５】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長帯域阻止手段は、阻止する波長帯域が可変であることを特徴とする。
【００３６】
本実施形態においては、波長帯域阻止手段の阻止する波長帯域を可変にしたことにより、検出するアンチストークス光に対するポンプ光のクロストークの量と、検出できる分子振動数の下限値との間のトレードオフを調整して、検出効率の最適化を行うことができるメリットがある。
【００３７】
この発明の好適一実施形態においては、前記分光手段は、空間的に波長を分散する波長分散手段と、空間的に光路を分割する光路分割手段とを含むことを特徴とする。
【００３８】
本実施形態においては、分光手段に、空間的に波長を分散する波長分散手段と、空間的に光路を分割する光路分割手段とを含むことにより、波長帯域阻止手段におけるカットオフ波長を容易に可変にすることができるメリットがある。
【００３９】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、波長分散の空間分布が可変であることを特徴とする。
【００４０】
本実施形態においては、波長帯域阻止手段における波長分散の空間分布を変えることにより、阻止する波長帯域の調整が容易にできるメリットがある。
【００４１】
この発明の好適一実施形態においては、前記光路分割手段は、光路分割の空間位置が可変であることを特徴とする。
【００４２】
本実施形態においては、波長帯域阻止手段における光路分割の空間位置を変えることにより、阻止する波長帯域の調整が容易にできるメリットがある。
【００４３】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、回折格子を含むことを特徴とする。
【００４４】
本実施形態においては、波長帯域阻止手段において波長に対し線形に空間分離することが可能であり、カットオフ波長の値を容易に設定できるメリットがある。
【００４５】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、波長分散プリズムを含むことを特徴とする。
【００４６】
本実施形態においては、波長分散手段に波長分散プリズムを用いたことにより、光量損失を最低限に抑えることができて、高感度な検出が可能となるメリットがある。
【００４７】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、フォトニック結晶を含むことを特徴とする。
【００４８】
本実施形態においては、特許文献３、４で提案されているようなフォトニック結晶の特性である超高感度な波長分散を用いることにより、アンチストークス光に対するポンプ光のクロストークを高Ｓ／Ｎで分離することが可能となるメリットがある。
【００４９】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、ファイバーグレーティングを含むことを特徴とする。
【００５０】
本実施形態においては、特許文献６に示されているように、ファイバーグレーティングに熱を加えること等により、ファイバーグレーティングの格子定数を物理的に変化させて、ポンプ光やストークス光の波長を変化させた場合においても、それらを狭い波長範囲で選択的に排除することができるメリットがある。
【００５１】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散手段は、分散光ファイバーを含むことを特徴とする。
【００５２】
本実施形態においては、特許文献５で提案されているような分散光ファイバーの特性である時間的、空間的な波長分散を効率的に行うことが可能となるメリットがある。
【００５３】
この発明の好適一実施形態においては、前記光路分割手段は、遮蔽板であることを特徴とする。
【００５４】
本実施形態においては、波長分散手段によって空間的に波長分離された光の一部を遮蔽することにより、立ち上がり幅の鋭い波長帯域阻止手段が容易に実現できるメリットがある。
【００５５】
この発明の好適一実施形態においては、前記光路分割手段は、ミラーであることを特徴とする。
【００５６】
本実施形態においては、波長分割された光をミラーで正反射させることにより、波長分散手段を分散補償の手段と兼用できるメリットがある。
【００５７】
この発明の好適一実施形態においては、前記光路分割手段は、プリズムであることを特徴とする。
【００５８】
本実施形態においては、プリズムの光線屈曲作用を用いて、一部の波長帯域を遮蔽することが可能である。
【００５９】
この発明の好適一実施形態においては、前記光路分割手段は、ＭＥＭＳミラーであることを特徴とする。
【００６０】
本実施形態においては、ＭＥＭＳミラーのミラー要素の角度を電気駆動で切り替えることにより、遮蔽する波長帯域を高速に切り替えることができるメリットがある。
【００６１】
この発明の好適一実施形態においては、前記照明手段には、前記第一のパルス光の波長帯域を制限する第一の波長帯域制限手段を含むことを特徴とする。
【００６２】
本実施形態においては、第一のパルス光に僅かに含まれる、コヒーレントラマン散乱光と同一の波長成分を遮蔽することにより、コヒーレントラマン散乱光への第一のパルス光のクロストークを低減できるメリットがある。
【００６３】
この発明の好適一実施形態においては、前記第一の波長帯域制限手段と、前記波長帯域阻止手段は、それぞれを通過する波長帯域が互いに補間の関係にあることを特徴とする。
【００６４】
本実施形態においては、第一のパルス光の光量損失と、コヒーレントラマン光への第一のパルス光のクロストークを、最低限に抑えることができるメリットがある。
【００６５】
この発明の好適一実施形態においては、前記第一の波長帯域制限手段は、制限する波長帯域が可変であることを特徴とする。
【００６６】
本実施形態においては、第一のパルス光の光量損失とコヒーレントラマン散乱に対するポンプ光のクロストークのトレードオフを調節し、検出効率の最適化を図ることができるメリットがある。
【００６７】
この発明の好適一実施形態においては、前記第一の波長帯域制限手段と前記波長帯域阻止手段は、それぞれの阻止する波長域が、前記第一の波長と連動して可変であることを特徴とする。
【００６８】
本実施形態においては、第一のパルス光の波長が変化したときでも、波長帯域制限手段及び波長帯域阻止手段の阻止波長域を最適化することにより、常に効率の良い信号検出ができるメリットがある。
【００６９】
この発明の好適一実施形態においては、前記照明手段には、前記第二のパルス光の波長帯域を制限する第二の波長帯域制限手段を含むことを特徴とする。
【００７０】
本実施形態においては、第二のパルス光に僅かに含まれる、コヒーレントラマン散乱光と同一の波長成分を遮蔽することにより、コヒーレントラマン散乱光への第二のパルス光のクロストークを低減できるメリットがある。
【００７１】
この発明の好適一実施形態においては、前記第二の波長帯域制限手段と、前記波長帯域阻止手段は、それぞれを通過する波長帯域が互いに補間の関係にあることを特徴とする。
【００７２】
本実施形態においては、第二のパルス光の光量損失と、コヒーレントラマン散乱光への第二のパルス光のクロストークを、最低限に抑えることができるメリットがある。
【００７３】
この発明の好適一実施形態においては、前記第二の波長帯域制限手段は、制限する波長帯域が可変であることを特徴とする。
【００７４】
本実施形態においては、第二のパルス光の光量損失とコヒーレントラマン散乱に対するポンプ光のクロストークのトレードオフを調節し、検出効率の最適化を図ることができるメリットがある。
【００７５】
この発明の好適一実施形態においては、前記第二の波長帯域制限手段と前記波長帯域阻止手段は、それぞれの阻止する波長帯域が、前記第二の波長と連動して可変であることを特徴とする。
【００７６】
本実施形態においては、第二のパルス光の波長が変化したときでも、波長帯域制限手段及び波長帯域阻止手段の阻止波長域を最適化することにより、常に効率の良い信号検出ができるメリットがある。
【００７７】
この発明の好適一実施形態においては、前記コヒーレントラマン散乱は、前記コヒーレントラマン散乱の波長が前記第一の波長成分及び前記第二の波長成分よりも短いコヒーレントアンチストークスラマン散乱であることを特徴とする。
【００７８】
本実施形態においては、第一の波長及び第二の波長よりも短いコヒーレントアンチストークスラマン散乱を検出することにより、同時に発生する可能性のある蛍光の影響を排除することができるメリットがある。
【００７９】
次に、本発明の第２のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、図２に構成を示すように、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段１１０１と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段１１０２と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本１１２０に照射する照射手段１１１０と、前記標本１１２０を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段１１３０と、前記集光手段１１３０による集光位置を調節するための補正光学手段１１６０と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段１１４０と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段１１５０とを有することを特徴とする。
【００８０】
本発明の第２のコヒーレントラマン散乱顕微鏡においては、補正光学手段１１６０を用いることにより、標本の屈折率分布や厚さの分布に伴う散乱光の集光位置や集光の乱れを常に補正することができるので、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。
【００８１】
この発明の好適一実施形態においては、前記補正光学手段は、前記集光位置を検出する集光位置検出手段と、前記集光位置を補正するように動作する集光位置調節手段を有することを特徴とする。
【００８２】
本実施形態においては、前記補正光学手段が前記集光位置を検出しながらその位置を補正することにより、集光位置のフィードバックをかけることができるので、コヒーレントラマン散乱光の集光位置を安定させることができるメリットがある。
【００８３】
この発明の好適一実施形態においては、前記集光位置検出手段は前記集光位置の偏心を検出し、前記集光位置調節手段は前記集光位置の偏心を補正するように動作することを特徴とする。
【００８４】
本実施形態においては、標本の屈折率分布による透過光のふらつきを補正して、コヒーレントラマン散乱光の集光位置を安定させることができるメリットがある。
【００８５】
その集光位置検出手段としては、位置検出素子、分割ディテクタ、ラインセンサ、イメージセンサを用いることができる。
【００８６】
また、集光位置調節手段としては、反射角調整可能なミラーや偏向角調整可能なプリズムを用いることができる。あるいは、前記集光手段の全体又は一部の位置を調節するようにしてもよい。
【００８７】
この発明の好適一実施形態においては、前記集光位置検出手段は前記集光位置の深度を検出し、前記集光位置調節手段は前記集光位置の深度方向の位置を補正するように動作することを特徴とする。
【００８８】
本実施形態においては、標本の厚みの分布による集光位置の深度方向の移動を補正して、コヒーレントラマン散乱光の集光位置を安定させることができるメリットがある。
【００８９】
その集光位置検出手段としては、一般のオートフォーカスにおける焦点位置検出と同様に、波面検出手段（位相検出手段）、差動検出手段を用いることができる。
【００９０】
また、集光位置調節手段としては、曲率可能なデフォーマブルミラー、屈折力可変な可変焦点レンズを用いることができる。あるいは、前記集光手段の全部又は一部の位置を調整するようにしてもよい。
【００９１】
この発明の好適一実施形態においては、前記補正光学手段は、前記標本を透過した前記第一のパルスレーザあるいは前記第二のパルスレーザあるいは前記散乱光の波面を検出する波面検出手段と、前記散乱光の透過波面を補正するための波面補正手段を有することを特徴とする。
【００９２】
本実施形態においては、波面検出手段により集光前の波面を検出して、偏心方向と深度方向の集光位置及び集光における収差を求め、それをもとに波面補正手段により波面を補正することにより、集光位置を偏心方向及び深度方向に一度に補正でき、さらに、標本を透過したことによる波面の乱れも補正することができるので、前記コヒーレントラマン散乱の集光位置及び集光のスポットの形状を安定化し、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことができるメリットがある。
【００９３】
その波面検出手段としては、シャックハルトマンセンサを用いたり、波面干渉装置を用いたりすることができる。
【００９４】
また、波面補正手段として、ＭＥＭＳミラーを用いたり、デフォーマブルミラーを用いたり、空間光変調器を用いたりすることができる。
【００９５】
本発明の第３のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、図３に構成を示すように、第一の波長成分を持つ波長可変な第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段１２０１と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ波長可変な第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段１２０２と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本１２２０に照射する照射手段１２１０と、前記標本１２２０を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段１２３０と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段１２４０と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段１２５０と、前記コヒーレントラマン散乱光の波長が常に一定になるように前記第一のパルス光の波長と前記第二のパルス光の波長を同時に制御して走査する波長走査手段１２７０とを有することを特徴とする。
【００９６】
本発明の第３のコヒーレントラマン散乱顕微鏡においては、波長走査手段１２７０を用いることにより、コヒーレントラマン散乱光の波長を常に一定に保ち、したがって、波長分散型分光手段によるコヒーレントラマン散乱光の集光位置を不動にすることができるので、集光位置の移動による検出感度の変動を除去して、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。さらに、通常波長が異なるコヒーレントラマン散乱光の集光位置を固定するために必要だった、波長分散型分光手段の後方に配置する分散補償手段を省略することができるというメリットがある。
【００９７】
この発明の好適一実施形態においては、前記波長分散型分光手段は、波長分散素子と遮蔽板を有することを特徴とする。
【００９８】
本実施形態においては、波長分散素子と遮蔽板を用いることにより、前記波長分散型分光素子は、第一のパルス光及び第二のパルス光をほぼ完全に排除しながらコヒーレントラマン散乱を高効率透過させることができるので、ＣＡＲＳ信号の高Ｓ／Ｎ比検出が実現できるメリットがある。
【００９９】
その波長分散素子として、回折格子やフォトニック結晶や分散ファイバーを用いると、高分解能で波長分離ができるので、コヒーレントラマン散乱光の波長が第一及び第二のパルス光と近い場合でも、コヒーレントラマン散乱光のみを高効率で検出することができる。
【０１００】
本発明の第４のコヒーレントラマン散乱顕微鏡は、図４に構成を示すように、第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段１３０１と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段１３０２と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本１３２０に照射する照射手段１３１０と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本１３２０から発生した散乱光を集光する集光手段１３３０と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段１３４０と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段１３５０と、前記散乱光が前記散乱光検出手段１３５０に入射するように前記第二のパルス光の波長に同期して前記波長分散型分光手段を駆動する波長分散駆動手段１３８０とを有することを特徴とする。
【０１０１】
本発明の第４のコヒーレントラマン散乱顕微鏡においては、波長分散駆動手段を用いることにより、波長分散型分光手段により波長分離されたコヒーレントラマン散乱の集光位置を不動にすることができるので、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことが可能となる。
【０１０２】
波長分散型分光手段に回折格子が含まれる場合においては、波長分散駆動手段としてその回折格子の入射角を制御することにより、波長分離されたコヒーレントラマン散乱の集光位置を不動にすることができる。
【０１０３】
波長分散型分光手段に音響光学素子が含まれる場合においては、波長分散駆動手段としてその音響光学素子の駆動周波数を制御することにより、波長分離されたコヒーレントラマン散乱の集光位置を不動にすることができる。
【０１０４】
波長分散型分光手段に波長分散プリズムが含まれる場合においては、波長分散駆動手段としてその波長分散プリズムの入射角を制御することにより、波長分離されたコヒーレントラマン散乱の集光位置を不動にすることができる。
【０１０５】
以下に、図面を用いて本発明の実施例について説明する。
【０１０６】
〔実施例１〕
本発明による第一実施例の落射検出型ＣＡＲＳ顕微鏡について説明する。
【０１０７】
図８に示すように、ポンプ光を発生させるためのポンプ光レーザ光源５０１と、ストークス光を発生させるためのストークス光レーザ光源５０２と、ポンプ光レーザ光源５０１とストークス光レーザ光源５０２を同時に励起するための励起レーザ５０３と、ポンプ光とストークス光のパルスの同期をとるための同調器５０４と、パルス光及びストークス光の繰り返し周波数を調整するための一対のパルス選択器５０５と、パルス光とストークス光が同時に標本５２０を照射するよう光路長差を調整するための光路長調整器５０６と、パルス光及びストークス光のパルス幅を計測するためのオートコリレータ５０７と、パルス光及びストークス光の波長を監視するための波長モニタ５０８と、ポンプ光の波長より短い波長領域を阻止するための分光フィルタユニットＢ５６０と、ポンプ光及びストークス光を標本保持台５３４に保持された標本５２０内に集光するための対物レンズ５１１を含む落射型顕微鏡本体５１０と、ポンプ光及びストークス光の標本５２０内の集光位置をガルバノミラーｘ５２６とガルバノミラーｙ５２７を用いて空間的に走査するための走査ユニット５２５と、標本５２０で発生した後方散乱光からポンプ光とストークス光を除去してアンチストークス光のみ透過させるための分光フィルタユニットＡ５４０と、アンチストークス光の強度を検出するための光検出器５５０とからなる。
【０１０８】
分光フィルタユニットＡ５４０は、標本５２０より発生した散乱光を波長によって空間的に分離するための分散素子Ａ５４１と、散乱光を波長毎に異なる位置に集光させるための分散投影レンズＡ５４２と、ポンプ光の波長以上の波長成分を遮蔽するための遮光板Ａ５４３と、ポンプ光の波長より波長の短い散乱成分を光検出器５５０に集光させるための分散補償レンズＡ５４４とからなる。また、分散素子Ａ５４１より手前の光路上には、遮光板Ａ５４３を含む平面上において、異なる波長間のクロストークを最小にするためのピンホールＡ５４７を含むビームエキスパンダＡ５４６が配置されている。
【０１０９】
分光フィルタユニットＢ５６０は、ポンプ光及びストークス光を光の波長によって空間的に分離するための分散素子Ｂ５６１と、ポンプ光及びストークス光を波長毎に異なる位置に集光させるための分散投影レンズＢ５６２と、ポンプ光の波長より短い波長成分を遮蔽するための遮光板Ｂ５６３と、ポンプ光の波長以上の波長成分を再び集光させるための分散補償レンズＢ５６４と、分散素子Ｂ５６１により生じた波長分散を解消させるための補償素子Ｂ５６５とからなる。また、分散素子Ｂ５６１より手前の光路上には、遮光板Ｂ５６３を含む平面上において、異なる波長間のクロストークを最小にするためのピンホールＢ５６７を含んだビームエキスパンダＢ５６６が配置されている。
【０１１０】
以下に、分光フィルタユニットＡ５４０及び分光フィルタユニットＢ５６０の詳細を説明し、その波長分解能を算出する。分光フィルタユニットＡ５４０及び分光フィルタユニットＢ５６０に用いられている分散素子Ａ５４１及び分散素子Ｂ５６１は、どちらも１ｍｍ当たり１０００本の回折格子である。この回折格子による一次回折光の波長分散は、１ｎｍ当たりおよそ１０-3ラジアンである。分散投影レンズＡ５４２及び分散投影レンズＢ５６２は、どちらも焦点距離１００ｍｍの結像レンズであり、その焦点面上には、１ｍｍ当たり１０ｎｍの波長分散で、ピンホールＡ５４７及びピンホールＢ５６７の像が分光されて投影される。直径がそれぞれ５μｍのピンホールＡ５４７及びピンホールＢ５６７の単色像は、遮光板Ａ５４３及び遮光板Ｂ５６３を含む平面上に、それぞれ直径１０μｍで投影されるように設計されているので、波長分散の分解能は０．１ｎｍ程度と算出される。
【０１１１】
このように、本実施例の落射検出型ＣＡＲＳ顕微鏡においては、それぞれ波長分解能が０．１ｎｍ程度の分光フィルタユニットＢ５６０と分光フィルタユニットＡ５４０とを組み合わせて用いている。したがって、ポンプ光の波長よりも０．２ｎｍ短いアンチストークス光まで、ポンプ光のクロストークなしに検出することが可能である。例えば、ポンプ光の波長が８００ｎｍならば、アンチストークス光は波長７９９．８ｎｍまで検出可能であり、このとき分子振動の検出の下限は、約３ｃｍ-1である。
【０１１２】
なお、ポンプ光及びストークス光の分光スペクトルの波長幅が十分狭い場合においては、分光フィルタユニットＢ５６０は不要であることは言うまでもない。
【０１１３】
〔実施例２〕
本発明による第二実施例の透過偏光検出型ＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。
【０１１４】
図９に示すように、ポンプ光を発生させるためのポンプ光レーザ光源６０１と、ストークス光を発生させるためのストークス光レーザ光源６０２と、ポンプ光レーザ光源６０１とストークス光レーザ光源６０２を同時に励起するための励起レーザ６０３と、ポンプ光とストークス光のパルスの同期をとるための同調器６０４と、パルス光とストークス光それぞれの波長バンド領域を制限するための分光フィルタユニットＢ６６０及び分光フィルタユニットＣ６７０と、パルス光とストークス光が同時に標本６２０を照射するよう光路長差を調整するための光路長調整器６０６と、パルス光とストークス光をそれぞれ異なる角度の直線偏光に変換するための一対の偏光子６０９と、パルス光及びストークス光の繰り返し周波数を低減するためのパルス選択器６０５と、パルス光及びストークス光のパルス幅を計測するためのオートコリレータ６０７と、パルス光及びストークス光の波長を監視するための波長モニタ６０８と、ポンプ光及びストークス光を標本保持台６２１に保持された標本６２０内に集光するための対物レンズ６１１及び標本６２０で発生した前方散乱光を集光するための集光レンズ６３０及び標本保持台６２１に機械的に接続されて標本６２０をポンプ光及びストークス光の標本６２０内の集光位置に対して空間的に走査するための標本位置走査装置６２２とを含む透過型顕微鏡本体６１０と、標本６２０で発生した前方散乱光からノイズとなる非共鳴散乱光を取り除くための検光子６３１と、さらに、ポンプ光とストークス光を除去してアンチストークス光のみ透過させるための分光フィルタユニットＡ６４０と、アンチストークス光の強度を検出するための光検出器６５０とからなる。
【０１１５】
分光フィルタユニットＢ６６０は、図１０にその立体構造を示すように、ポンプ光を分散素子Ｂ６６１に向かって折り返すための導入ミラーＢ６６８と、異なる波長間のクロストークを最小にするためのピンホールＢ６６７を含んだビームエキスパンダＢ６６６と、ポンプ光を光の波長によって空間的に分離するための分散素子Ｂ６６１と、ポンプ光を波長毎に異なる位置に集光させるための分散投影レンズＢ６６２と、その集光位置に配置されポンプ光の波長帯域を制限するための遮光スリットＢ６６３と、遮光スリットＢ６６３により波長帯域を制限されたポンプ光及びストークス光を折り返して分散素子Ｂ６６１によって分散補償させるための反射板Ｂ６６４と、分散素子Ｂ６６１で分散補償された光を導出するための導出ミラーＢ６６９とからなる。
【０１１６】
分光フィルタユニットＣ６７０は、上述の分光フィルタユニットＢ６６０と同様の構成である。ただし、分光フィルタユニットＣ６７０の分散素子Ｃ６７１にはガルバノ走査装置Ｃ６７５が取り付けられていて、分散素子Ｃ６７１の角度を振ることにより、分光フィルタユニットＣ６７０の透過波長帯域をストークス光の波長に合わせて走査させることができる。
【０１１７】
ポンプ光とストークス光を除去してアンチストークス光のみ透過させるための分光フィルタユニットＡ６４０の内部構造については、第一実施例における分光フィルタユニットＡ５４０のそれと同様である。
【０１１８】
本実施例においては、第一実施例と同様に約３ｃｍ-1までの分子振動の検出が可能である。
【０１１９】
さらに、本実施例においては、分光フィルタユニットＢ６６０及び分光フィルタユニットＣ６７０の遮光スリットＢ６６３及び遮光スリットＣ６７３のスリット幅を変えることにより、ポンプ光とストークス光の波長帯域を調整することができ、分子振動スペクトルの検出感度と分解能のトレードオフを調整し、検出効率の最適化を図ることができる。
【０１２０】
さらに、本実施例においては、分光フィルタユニットＣ６７０の透過波長帯域を、ストークス光の波長に合わせて走査することができるので、分光フィルタユニットＣ６７０の透過波長帯域の中心を常にストークス光の波長の中心に合わせながら、ストークス光の波長を走査することができるので、安定したアンチストークス光の信号強度を得ることができる。
【０１２１】
〔実施例３〕
本発明による第三実施例の透過検出型ＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。
【０１２２】
図１１に示すように、ポンプ光を発生させるためのポンプ光レーザ光源４０１と、ストークス光を発生させるためのストークス光レーザ光源４０２と、ポンプ光レーザ光源４０１とストークス光レーザ光源４０２を同時に励起するための励起レーザ４０３と、ポンプ光とストークス光のパルスの同期をとるための同調器４０４と、パルス光及びストークス光の繰り返し周波数を調整するための一対のパルス選択器４０５と、パルス光とストークス光が同時に標本４２０を照射するよう光路長差を調整するための光路長調整器４０６と、パルス光及びストークス光のパルス幅を計測するためのオートコリレータ４０７と、パルス光及びストークス光の波長を監視するための波長モニタ４０８と、波長モニタ４０８からの情報をもとにポンプ光レーザ光源４０１とストークス光レーザ光源４０２の発振波長を制御する波長制御装置４７０と、ポンプ光及びストークス光を標本保持台４２１に保持された標本４２０内に集光するための第一の対物レンズ４１２を有する透過型顕微鏡本体４１０と、ポンプ光及びストークス光の標本４２０内の集光位置を空間的に走査するために標本保持台４２１の位置を駆動する走査ユニット４２２と、標本４２０で発生した前方散乱光を集光するための第二の対物レンズ４３０と、集光された前方散乱光からポンプ光とストークス光を除去してアンチストークス光のみ透過させるための分光フィルタユニット４４０と、アンチストークス光の強度を検出するための光検出器４５０と、分光フィルタユニット４４０内のアンチストークス光の集光位置を制御する適応光学系４６０とからなる。
【０１２３】
分光フィルタユニット４４０は、標本４２０より発生した散乱光を波長によって空間的に分離するための分散素子４４１と、散乱光を波長毎に異なる位置に集光させるための分散投影レンズ４４２と、アンチストークス光の波長成分以外を遮蔽するための遮光板４４３とからなる。また、分散素子４４１より手前の光路上には、遮光板４４３を有する平面上において、異なる波長間のクロストークを最小にするためのピンホール４４７を有するビームエキスパンダ４４６が配置されている。
【０１２４】
波長制御装置４７０は、アンチストークス光の波長、言い換えれば振動数が常に一定になるように、ポンプ光レーザ光源４０１とストークス光レーザ光源４０２の発振波長を制御する。アンチストークス光の振動数をωAS、ポンプ光の振動数をωP 、ストークス光の振動数をωS 、分子の固有振動数をωV とすると、それらの振動数の間には次の関係式が成立する。
【０１２５】
ωP ＝ωAS−ωV 
ωS ＝ωAS−２ωV 
したがって、波長制御装置４７０は、ωASを一定値のままωP とωS を上式に従うように、ポンプ光レーザ光源４０１とストークス光レーザ光源４０２の発振波長を同時に制御する。
【０１２６】
適応光学系４６０は、第二の対物レンズ４３０を透過したポンプ光又はストークス光又はアンチストークス光の集光位置を検出する集光位置センサ４６１と、集光位置センサ４６１に電気的に接続され第二の対物レンズ４３０の焦点位置を補正する焦点位置補正装置４６２と、集光位置センサ４６１に電気的に接続され分光フィルタユニット４４０内でのアンチストークス光の集光位置を制御するガルバノミラーからなる集光位置補正装置４６３とからなる。集光位置センサ４６１は、図１２に示すように、結像レンズ４６１１と、結像レンズ４６１１による結像光束を２分割するハーフミラー４６１２と、結像レンズ４６１１の焦点位置に対してその前後に配置されたエリアセンサ４６１３Ａ、４６１３Ｂと、二つのエリアセンサ４６１３Ａ、４６１３Ｂの信号から結像レンズ４６１１による集光位置を算出し、集光位置のずれ量をもとに焦点位置補正装置４６２と集光位置補正装置４６３の駆動信号を出力する制御装置４６１４からなる。
【０１２７】
このように、本実施例の透過検出型ＣＡＲＳ顕微鏡においては、適応光学系４６０を用いることにより、標本の形状や屈折率の不均一性にかかわらず、常にアンチストークス光を検出器４５０の開口部に集光することができるので、検出感度の変動が少なく、高精度な計測が可能となる。さらに、本実施例においては、波長制御装置４７０を用いることにより、検出するコヒーレントラマン振動数によらずに、常にアンチストークス光を一箇所に集光することができるので、通常分光フィルタユニット４４０の後方に配置される分光補償光学系を省略し、コンパクトな装置を実現することができる。
【０１２８】
なお、集光位置センサ４６１としては、位置検出素子、分割ディテクタ、ラインセンサ、イメージセンサ等を用てもよく、集光位置の偏心を補正するように動作するものであってもよく、何れも標本４２０の屈折率分布による透過光のふらつきを補正して、散乱光の集光位置を安定させることができる。
【０１２９】
また、集光位置補正装置４６３としては、反射角調整可能なミラーや偏向角調整可能なプリズムを用いることができる。あるいは、第二の対物レンズ４３０の全体又は一部の位置を調節するようにしてもよい。
【０１３０】
〔実施例４〕
本発明による第四実施例の透過検出型ＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。
【０１３１】
図１３に示すように、ポンプ光を発生させるためのポンプ光レーザ光源１５０１と、ストークス光を発生させるためのストークス光レーザ光源１５０２と、ポンプ光レーザ光源１５０１とストークス光レーザ光源１５０２を同時に励起するための励起レーザ１５０３と、ポンプ光とストークス光のパルスの同期をとるための同調器１５０４と、パルス光及びストークス光の繰り返し周波数を調整するための一対のパルス選択器１５０５と、パルス光とストークス光が同時に標本１６２０を照射するよう光路長差を調整するための光路長調整器１５０６と、パルス光及びストークス光のパルス幅を計測するためのオートコリレータ１５０７と、パルス光及びストークス光の波長を監視するための波長モニタ１５０８と、ポンプ光及びストークス光を標本保持台１６２１に保持された標本１６２０内に集光するための第一の対物レンズ１６１１を有する透過型顕微鏡本体１６１０と、ポンプ光及びストークス光の標本１６２０内の集光位置を空間的に走査するために標本保持台１６２１の位置を駆動する走査ユニット１６２２と、標本１６２０で発生した前方散乱光を集光するための第二の対物レンズ１６３０と、標本１６２０を透過し第二の対物レンズ１６３０で集光された前方散乱光の波面を検出する波面検出器１６６０と、その前方散乱光の透過波面を補正するための波面補正器１６７０と、波面補正器１６７０で波面が補正された前方散乱光からポンプ光とストークス光を除去してアンチストークス光のみ透過させるための分光フィルタユニット１６４０と、アンチストークス光の強度を検出するための光検出器１６５０と、波長モニタ１５０８からの情報をもとに分光フィルタユニット１６４０内の分散素子１６４１の角度をガルバノ走査装置１６７５により振ってアンチストークス光が常に光検出器１６５０に入射するように制御する波長分散駆動器１５８０とからなる。
【０１３２】
ここで、波面検出器１６６０はシャックハルトマンセンサからなる例であり、図１４に示すように、この波面検出器１６６０は、マイクロレンズアレイ１６６１と、その焦点面に配置されたイメージセンサとしてのＣＣＤ１６６２と、ＣＣＤ１６６２からの点列間の間隔をもとに波面の形状を計算する波面計算器１６６３とからなり、波面が基準波面からずれていると、そのずれに応じてＣＣＤ１６６２上に得られる点列間の間隔もずれるので、その点列間の間隔のずれ量に基づいて波面計算器１６６３で波面形状を計算して出力するものである。
【０１３３】
波面補正器１６７０は、透過型の空間位相変調器からなり、波面検出器１６６０で検出された波面形状を補正するように空間位相変調するものである。
【０１３４】
この実施例では、波面検出器１６６０により集光前の波面を検出して、その偏心方向と深度方向の集光位置及び集光における収差を求め、それをもとに波面補正器により波面を補正することにより、集光位置を偏心方向及び深度方向に一度に補正でき、さらに、標本１６２０を透過したことによる波面の乱れも補正することができるので、アンチストークス光の集光位置及び集光のスポットの形状を安定化し、ＣＡＲＳ信号の測定精度を常に安定に保つことができる。
【０１３５】
なお、波面検出器１６６０としては、シャックハルトマンセンサ以外に、波面干渉装置を用いたりすることができる。
【０１３６】
また、波面補正器１６７０としては、空間位相変調器以外に、ＭＥＭＳミラー、デフォフォーマブル（形状可変ミラー）等を用いてもよい。
【０１３７】
なお、以上は本発明のコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡に対する適用例のみ記述してきたが、ストークス光よりも波長の長いコヒーレントストークスラマン散乱光を検出するコヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ）顕微鏡についても、本発明の適用により、従来検出不可能であった固有振動数の低い分子を検出することが可能となることは、明らかである。
【０１３８】
また、本明細書には以下に示す発明が記載されている。
【０１３９】
１．第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生される第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長帯域阻止手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを含むコヒーレントラマン散乱顕微鏡において、前記波長帯域阻止手段は分光手段を含むことを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４０】
２．前記波長帯域阻止手段は、阻止する波長帯域が可変であることを特徴とする、上記１記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４１】
３．前記分光手段は、空間的に波長を分散する波長分散手段と、空間的に光路を分割する光路分割手段とを含むことを特徴とする、上記１記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４２】
４．前記波長分散手段は、波長分散の空間分布が可変であることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４３】
５．前記光路分割手段は、光路分割の空間位置が可変であることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４４】
６．前記波長分散手段は、回折格子を含むことを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４５】
７．前記波長分散手段は、波長分散プリズムを含むことを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４６】
８．前記波長分散手段は、フォトニック結晶を含むことを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４７】
９．前記波長分散手段は、ファイバーグレーティングを含むことを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４８】
１０．前記光路分割手段は、遮蔽板であることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１４９】
１１．前記光路分割手段は、ミラーであることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５０】
１２．前記光路分割手段は、プリズムであることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５１】
１３．前記光路分割手段は、ＭＥＭＳミラーであることを特徴とする、上記２記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５２】
１４．前記照明手段には、前記第一のパルス光の波長帯域を制限する第一の波長帯域制限手段を含むことを特徴とする、上記１記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５３】
１５．前記第一の波長帯域制限手段と、前記波長帯域阻止手段は、それぞれを通過する波長帯域が互いに補間の関係にあることを特徴とする、上記１４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５４】
１６．前記第一の波長帯域制限手段は、制限する波長帯域が可変であることを特徴とする、上記１４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５５】
１７．前記第一の波長帯域制限手段と前記波長帯域阻止手段は、それぞれの阻止する波長域が、前記第一の波長と連動して可変であることを特徴とする、上記１５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５６】
１８．前記照明手段には、前記第二のパルス光の波長帯域を制限する第二の波長帯域制限手段を含むことを特徴とする、上記１記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５７】
１９．前記第二の波長帯域制限手段と、前記波長帯域阻止手段は、それぞれを通過する波長帯域が互いに補間の関係にあることを特徴とする、上記１４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５８】
２０．前記第二の波長帯域制限手段は、制限する波長帯域が可変であることを特徴とする、上記１４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１５９】
２１．前記第二の波長帯域制限手段と前記波長帯域阻止手段は、それぞれの阻止する波長域が、前記第二の波長と連動して可変であることを特徴とする、上記１５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６０】
２２．前記コヒーレントラマン散乱は、前記コヒーレントラマン散乱の波長が前記第一の波長成分及び前記第二の波長成分よりも短いコヒーレントアンチストークスラマン散乱であることを特徴とする、上記１〜２１記載のコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡。
【０１６１】
２３．第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、前記集光手段による集光位置を調節するための補正光学手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する検出手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６２】
２４．前記補正光学手段は、前記集光位置を検出する集光位置検出手段と、前記集光位置を補正するように動作する集光位置調節手段を有することを特徴とする、上記２３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６３】
２５．前記集光位置検出手段は前記集光位置の偏心を検出し、前記集光位置調節手段は前記集光位置の偏心を補正するように動作することを特徴とする、上記２４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６４】
２６．前記集光位置検出手段は位置検出素子を有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６５】
２７．前記集光位置検出手段は分割ディテクタを有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６６】
２８．前記集光位置検出手段はラインセンサを有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６７】
２９．前記集光位置検出手段はイメージセンサを有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６８】
３０．前記集光位置調節手段は反射角調整可能なミラーを有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１６９】
３１．前記集光位置調節手段は偏向角調整可能なプリズムを有することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７０】
３２．前記集光位置調節手段は前記集光手段の全体又は一部の位置を調節することを特徴とする、上記２５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７１】
３３．前記集光位置検出手段は前記集光位置の深度を検出し、前記集光位置調節手段は前記集光位置の深度方向の位置を補正するように動作することを特徴とする、上記２４記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７２】
３４．前記集光位置検出手段は波面検出手段を有することを特徴とする、上記３３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７３】
３５．前記集光位置検出手段は差動検出手段を有することを特徴とする、上記３３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７４】
３６．前記集光位置調節手段は曲率可変なデフォーマブルミラーを有することを特徴とする、上記３３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７５】
３７．前記集光位置調節手段は屈折力可変な可変焦点レンズを有することを特徴とする、上記３３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７６】
３８．前記集光位置調節手段は前記集光手段の全体又は一部の位置を調節することを特徴とする、上記３３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７７】
３９．前記補正光学手段は、前記標本を透過した前記第一のパルスレーザあるいは前記第二のパルスレーザあるいは前記散乱光の波面を検出する波面検出手段と、前記散乱光の透過波面を補正するための波面補正手段を有することを特徴とする、上記２３記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７８】
４０．前記波面検出手段は、シャックハルトマンセンサを有することを特徴とする、上記３９記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１７９】
４１．前記波面検出手段は、波面干渉装置を有することを特徴とする、上記３９記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８０】
４２．前記波面補正手段は、ＭＥＭＳミラーを有することを特徴とする、上記３９記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８１】
４３．前記波面補正手段は、デフォーマブルミラーを有することを特徴とする、上記３９記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８２】
４４．前記波面補正手段は、空間光変調器を有することを特徴とする、上記３９記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８３】
４５．第一の波長成分を持つ波長可変な第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ波長可変な第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記コヒーレントラマン散乱光の波長が常に一定になるように前記第一のパルス光の波長と前記第二のパルス光の波長を同時に制御して走査する波長走査手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８４】
４６．前記波長分散型分光手段は、波長分散素子と遮蔽板を有することを特徴とする、上記４５記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８５】
４７．前記波長分散素子は、回折格子を有することを特徴とする、上記４６記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８６】
４８．前記波長分散素子は、フォトニック結晶を有することを特徴とする、上記４６記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８７】
４９．前記波長分散素子は、分散ファイバーを有することを特徴とする、上記４６記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８８】
５０．第一の波長成分を持つ第一のパルス光を発生させる第一のパルスレーザ発生手段と、前記第一の波長成分と異なる第二の波長成分を持つ第二のパルス光を発生させる第二のパルスレーザ発生手段と、前記第一のパルス光と前記第二のパルス光を同時に標本に照射する照射手段と、前記標本を透過した前記第一のパルス光及び前記第二のパルス光と前記標本から発生した散乱光を集光する集光手段と、集光された前記散乱光から少なくとも前記第一の波長成分と前記第二の波長成分を阻止しコヒーレントラマン散乱光を通過させる波長分散型分光手段と、前記コヒーレントラマン散乱光を検出する散乱光検出手段と、前記散乱光が前記散乱光検出手段に入射するように前記第二のパルス光の波長に同期して前記波長分散型分光手段を駆動する波長分散駆動手段とを有することを特徴とするコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１８９】
５１．前記波長分散型分光手段は回折格子を有し、前記波長分散駆動手段は前記回折格子の入射角を制御することを特徴とする、上記５０記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１９０】
５２．前記波長分散型分光手段は音響光学素子を有し、前記波長分散駆動手段は前記音響光学素子の駆動振動数を制御することを特徴とする、上記５０記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【０１９１】
５３．前記波長分散型分光手段は波長分散プリズムを有し、前記波長分散駆動手段は前記波長分散プリズムの入射角を制御することを特徴とする、上記５０記載のコヒーレントラマン散乱顕微鏡。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】本発明の第１のコヒーレントラマン散乱顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図２】本発明の第２のコヒーレントラマン散乱顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図３】本発明の第３のコヒーレントラマン散乱顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図４】本発明の第４のコヒーレントラマン散乱顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図５】従来のＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図６】従来のＣＡＲＳにおけるポンプ光、ストークス光、アンチストークス光と分子の振動数の関係を説明するための図である。
【図７】従来のポンプ光、ストークス光、及びアンチストークス光の分光スペクトルと、長波長素子フィルタの分光透過率を説明するための図である。
【図８】本発明の第一実施例の落射検出型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図９】本発明の第二実施例の透過偏光検出型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図１０】本発明の第二実施例の分光阻止フィルタＢの立体構造を説明するための図である。
【図１１】本発明の第三実施例の透過検出型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図１２】本発明の第三実施例の集光位置センサの構成の一例を説明するための図である。
【図１３】本発明の第四実施例の透過検出型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成を説明するための図である。
【図１４】本発明の第四実施例の波面検出器の構成の一例を説明するための図である。
【図１５】標本による透過結像位置の偏心を説明するための図である。
【図１６】標本による焦点深度ずれを説明するための図である。
【符号の説明】
【０１９３】
１０１…第一のパルスレーザ発生手段
１０２…第二のパルスレーザ発生手段
１１０…照明手段
１２０…標本
１３０…集光手段
１４０…波長帯域阻止手段
１５０…検出手段
２４０…長波長阻止フィルタユニット
３７０…基底状態レベル
３７１…振動状態レベル
３７２…ポンプ光のエネルギー
３７３…ストークス光のエネルギー
３７４…アンチストークス光のエネルギー
３７５…分子振動のエネルギー
４０１…ポンプ光レーザ光源
４０２…ストークス光レーザ光源
４０３…励起レーザ
４０４…同調器
４０５…パルス選択器
４０６…光路長調整器
４０７…オートコリレータ
４０８…波長モニタ
４１０…透過型顕微鏡本体
４１２…第一の対物レンズ
４２０…標本
４２１…標本保持台
４２２…走査ユニット
４３０…第二の対物レンズ
４４０…分光フィルタユニット
４４１…分散素子
４４２…分散投影レンズ
４４３…遮光板
４４６…ビームエキスパンダ
４４７…ピンホール
４５０…光検出器
４６０…適応光学系
４６１…集光位置センサ
４６２…焦点位置補正装置
４６３…集光位置補正装置
４７０…波長制御装置
４７２…ポンプ光のスペクトル
４７３…ストークス光のスペクトル
４７４…アンチストークス光のスペクトル
４７６…長波長阻止手段の分光透過率
４７７…長波長阻止手段の立ち上がり幅
５０１…ポンプ光レーザ光源
５０２…ストークス光レーザ光源
５０３…励起レーザ
５０５…パルス選択器
５０６…光路長調整器
５１０…落射型顕微鏡本体
５２５…走査ユニット
５２６…ガルバノミラーｘ
５２７…ガルバノミラーｙ
５４０…分光フィルタユニットＡ
５４１…分散素子Ａ
５４２…分散投影レンズＡ
５４３…遮光板Ａ
５４４…分散補償レンズＡ
５４６…ビームエキスパンダＡ
５４７…ピンホールＡ
５６０…分光フィルタユニットＢ
５６１…分散素子Ｂ
５６２…分散投影レンズＢ
５６３…遮光板Ｂ
５６４…分散補償レンズＢ
５６５…補償素子Ｂ
５６６…ビームエキスパンダＢ
５６７…ピンホールＢ
６０１…ポンプ光レーザ光源
６０２…ストークス光レーザ光源
６０３…励起レーザ
６０５…パルス選択器
６０６…光路長調整器
６０９…偏光子
６１０…透過型顕微鏡本体
６２２…標本位置走査装置
６３１…検光子
６４０…分光フィルタユニットＡ
６６３…遮光スリットＢ
６６４…反射板Ｂ
６６６…ビームエキスパンダＢ
６６７…ピンホールＢ
６６８…導入ミラーＢ
６６９…導出ミラーＢ
６７０…分光フィルタユニットＣ
６７１…分散素子Ｃ
６７２…分散投影レンズＣ
６７３…遮光スリットＣ
６７４…反射板Ｃ
６７５…ガルバノ走査装置Ｃ
６７６…ビームエキスパンダＣ
６７７…ピンホールＣ
１１０１…第一のパルスレーザ発生手段
１１０２…第二のパルスレーザ発生手段
１１１０…照射手段
１１３０…集光手段
１１２０…標本
１１４０…波長分散型分光手段
１１５０…散乱光検出手段
１１６０…補正光学手段
１２０１…第一のパルスレーザ発生手段
１２０２…第二のパルスレーザ発生手段
１２１０…照射手段
１２２０…標本
１２３０…集光手段
１２４０…波長分散型分光手段
１２７０…波長走査手段
１３０１…第一のパルスレーザ発生手段
１３０２…第二のパルスレーザ発生手段
１３１０…照射手段
１３２０…標本
１３３０…集光手段
１３４０…波長分散型分光手段
１３５０…散乱光検出手段
１３８０…波長分散駆動手段
１５０１…ポンプ光レーザ光源
１５０２…ストークス光レーザ光源
１５０３…励起レーザ
１５０４…同調器
１５０５…パルス選択器
１５０６…光路長調整器
１５０７…オートコリレータ
１５０８…波長モニタ
１５８０…波長分散駆動器
１６１０…透過型顕微鏡本体
１６１１…第一の対物レンズ
１６２０…標本
１６２１…標本保持台
１６２２…走査ユニット
１６３０…第二の対物レンズ
１６４０…分光フィルタユニット
１６４１…分散素子
１６５０…光検出器
１６６０…波面検出器
１６６１…マイクロレンズアレイ
１６６２…ＣＣＤ
１６６３…波面計算器
１６７０…波面補正器
１６７５…ガルバノ走査装置
４６１１…結像レンズ
４６１２…ハーフミラー
４６１３Ａ、４６１３Ｂ…エリアセンサ
４６１４…制御装置
【図１】
2005062155.tif 000003
【図２】
2005062155.tif 000004
【図３】
2005062155.tif 000005
【図４】
2005062155.tif 000006
【図５】
2005062155.tif 000007
【図６】
2005062155.tif 000008
【図７】
2005062155.tif 000009
【図８】
2005062155.tif 000010
【図９】
2005062155.tif 000011
【図１０】
2005062155.tif 000012
【図１１】
2005062155.tif 000013
【図１２】
2005062155.tif 000014
【図１３】
2005062155.tif 000015
【図１４】
2005062155.tif 000016
【図１５】
2005062155.tif 000017
【図１６】
2005062155.tif 000018