(57)【要約】【課題】  本発明は、クワシロカイガラムシ抵抗性を、その遺伝的情報を利用して簡易にかつ短時間で判別する方法を提供することを目的とする。【解決手段】  チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのプライマーセット；前記プライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーまたはｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別する方法；前記プライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なうことにより得られ、ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーまたはｅ−ＲＡＰＤマーカーとして用いられることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応生成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのプライマーであって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの中から選ばれる１種類のオリゴヌクレオチドであるプライマー。
【請求項２】
チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのプライマーセットであって、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１記載のプライマーを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別する方法。
【請求項４】
請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＥｍｐｈａｓｉｚｅｄ−ＲＡＰＤ（ｅ−ＲＡＰＤ）マーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別する方法。
【請求項５】
請求項１記載のプライマーを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより得られ、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーとして用いられることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応生成物。
【請求項６】
請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより得られ、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーとして用いられることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の識別方法に関し、詳しくは遺伝子ＭＳＲ−１識別用プライマーおよびプライマーセット、該プライマー又はプライマーセットを用いた遺伝子ＭＳＲ−１の識別方法、ならびに該識別方法により得られるポリメラーゼ連鎖反応生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クワシロカイガラムシ類（その近縁種を含む。）は多くの木本性作物において大きな被害を引き起こす重要害虫である。特にチャの栽培におけるクワシロカイガラムシの被害は大きく、樹冠内部に寄生するので薬剤がかかりにくく、防除適期も孵化直後に限られる。このため、樹冠内部に薬液がかかるように他の害虫に対する防除の約１０倍（１０００Ｌ／１０ａ）の薬剤が散布されている。そのため、クワシロカイガラムシ類の被害を防ぎつつ、使用する薬剤の量を減らすには、抵抗性品種の育成が急務である。
【０００３】
ここで、チャの育種におけるクワシロカイガラムシ抵抗性の確認は、クワシロカイガラムシによる被害の自然発生程度調査、およびクワシロカイガラムシの接種試験により行われてきた（例えば、非特許文献１および２参照）。
しかしながら、上記非特許文献１に記載されているクワシロカイガラムシの自然発生を利用する方法は、天候や天敵密度に大きく依存し、制御と均一化が困難であるといった問題点があった。
また、非特許文献２に記載されているクワシロカイガラムシの接種試験は、孵化直前のメス成虫を集め、その中の孵化直前卵を実態顕微鏡下で集めてチャの苗に寄生させ、その後の生育や増殖率を観察するといったものであるが、クワシロカイガラムシは数ミリメートルに満たない小さな虫であるので、その取り扱いは煩雑で熟練を要し、その後の観察も多大な労力を要する問題点があった。
【０００４】
ところで、病害虫の抵抗性をはじめとする遺伝解析には、ＲＡＰＤマーカー等のＤＮＡマーカーが広く利用されている。このＲＡＰＤマーカーは、不鮮明で再現性や信頼性が低いという問題があったが、本発明者らは、このような問題点を解消する方法として、ＲＡＰＤマーカーを鮮明で信頼性の高いマーカーに効率よく変換するＥｍｐｈａｓｉｚｅｄ−ＲＡＰＤ（ｅ−ＲＡＰＤ）法を既に報告している（非特許文献３参照）。
しかしながら、クワシロカイガラムシ抵抗性に関する遺伝的情報については、まだ解明されていないため、これらの手段を適用した解析ができなかった。
【０００５】
【非特許文献１】古野鶴吉・長友繁・野中寿之・重光雄・田中敏弘、チャにおけるクワシロカイガラムシ抵抗性の品種・系統間差異、日本国、茶業研究報告、２００１年、第９１巻５−１２
【非特許文献２】水田隆史、チャ樹におけるクワシロカイガラムシ  Pseudaulacaspis pentagona Targioniの発育と増殖の品種間差異、日本国、日本応用動物昆虫学会誌、２００３年、第４７巻第３号９１−９５
【非特許文献３】Tanaka and Taniguchi、Emphasized-RAPD（e-RAPD）：a simple and efficient technique to make RAPD bands clearer、日本国、Breeding Science、２００２年、５２巻、３号、２２５−２２９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題点に鑑みて、クワシロカイガラムシ抵抗性を、その遺伝的情報を利用して簡易にかつ短時間で判別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、クワシロカイガラムシ抵抗性品種‘さやまかおり’の後代を用いた遺伝解析により、この‘さやまかおり’に由来するクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１を検出した。ＭＳＲ−１は作用力が大きく、本遺伝子単独でクワシロカイガラムシに対する防除の必要がなくなるほどの効果が期待できる。
そこで、本発明者らは、遺伝子ＭＳＲ−１の有無を判別することができれば、クワシロカイガラムシの取り扱いの煩雑性を解消し、観察の労力が軽減されるとともに、クワシロカイガラムシ抵抗性を有するチャ品種の早期育成が可能となると考え、このＭＳＲ−１に連鎖するＤＮＡマーカーのＤＮＡ多型（ＲＡＰＤ）を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅するためのプライマーセットを開発した。また、ＲＡＰＤマーカーをｅ−ＲＡＰＤ法により、鮮明で安定したものとするためのプライマーセットをも設計し、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、請求項１記載の本発明は、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのプライマーであって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの中から選ばれる１種類のオリゴヌクレオチドであるプライマーである。
請求項２記載の本発明は、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのプライマーセットであって、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットである。
【０００９】
請求項３記載の本発明は、請求項１記載のプライマーを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別する方法である。
請求項４記載の本発明は、請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＥｍｐｈａｓｉｚｅｄ−ＲＡＰＤ（ｅ−ＲＡＰＤ）マーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別する方法である。
【００１０】
請求項５記載の本発明は、請求項１記載のプライマーを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより得られ、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーとして用いられることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応生成物である。
請求項６記載の本発明は、請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なうことにより得られ、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーとして用いられることを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応生成物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を簡易にかつ短時間で判別することができるので、クワシロカイガラムシの取り扱いの煩雑性を解消し、観察の労力が軽減されるとともに、早期の抵抗性品種育成が可能となる。
従って、本発明によれば、チャの各品種、特に、クワシロカイガラムシ抵抗性品種として知られる「さやまかおり」の後代から、クワシロカイガラムシ抵抗性個体を効率的に選抜することができ、チャの生産性の向上及び農薬使用量の低減につなげることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
請求項１に係る本発明のプライマーおよび請求項２に係る本発明のプライマーセットは、いずれもチャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するためのものである。
ここで、クワシロカイガラムシとは、クワシロカイガラムシの他、その近縁種（例えば、ウメシロカイガラムシ）も含むものとする。
【００１３】
請求項１に係る本発明のプライマーおよび請求項２に係る本発明のプライマーセットは、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応により識別するために用いられる。
ここで、遺伝的な適応範囲としては、さやまかおり、Ａ−３、ＡＮ３およびその後代のクワシロカイガラムシ抵抗性品種・系統・個体を交雑親に用いて育成された集団が想定される。
チャのゲノムＤＮＡは、チャの葉、茎、根、花等の植物体から、植物からゲノムＤＮＡを抽出する際に用いられる方法により抽出することが可能である。例えば、後述の実施例で用いる珪藻土とスピンフィルターを用いる方法（Tanaka and Ikeda、Rapid and Efficient DNA Extraction Method from Various Plant Species Using Diatomaceous Earth and a Spin Filter、Breeding Science、２００２年、５２巻、１５１−１５５）によれば、短時間でマーカー検出に耐え得る品質のゲノムＤＮＡを抽出することができるので好ましい。
【００１４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、請求項１に係る本発明のプライマーセットを用い、且つチャのゲノムＤＮＡを鋳型とするのであれば、その他の条件は通常のＰＣＲと同様とすることができ、特に限定されない。温度サイクルは、例えば、熱変性９３℃１分、再対合４２℃１分３０秒、鎖伸長７２℃１分で４０〜４５サイクルとすることができる。
【００１５】
請求項１に係る本発明のプライマーは、７種類のオリゴヌクレオチド、すなわち、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの中から選ばれる。これらのオリゴヌクレオチドは、米Ｏｐｅｒｏｎ社のランダムプライマーＫＩＴ−Ａ〜ＢＣ、全１１００種類の中から、ＭＳＲ−１が存在する場合にのみＲＡＰＤマーカー（バンド）が増幅されるように、本発明者らが選択したものである。
【００１６】
一方、請求項２に係る本発明のプライマーセットは、配列表の配列番号８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列表の配列番号９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＭＳＲ−１が存在する場合にのみ、マーカー（バンド）が集中かつ安定して増幅されると共に、バックグラウンドとなる他のバンドの増幅を抑制するように、請求項１に係る本発明のプライマーセットを構成する各プライマーの塩基配列の３´末端に塩基を付加する等して設計されたものである。
【００１７】
請求項２に係る本発明のプライマーセット、これらの２種類のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用いることにより、ＭＳＲ−１の有無をより明確に識別することができる。
両者の混合割合は、配列番号８記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを配列番号９記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドよりも若干多めにした方がより良い結果が得られる。具体的には、配列番号８記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド：配列番号９記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド＝０．８〜４：１、好ましくは１〜３：１、より好ましくは１〜２：１の割合で混合することが好ましい。
【００１８】
このような請求項１に係る本発明のプライマー、および請求項２に係る本発明のプライマーセットは、所定の塩基配列からなるように人工的に合成して得ることができる。市販のプライマー作成キット等を用いると簡便に調製することができる。
【００１９】
このように、請求項１に係る本発明のプライマー、および請求項２に係る本発明のプライマーセットは、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無の識別に有用である。
即ち、請求項３に記載するように、請求項１に係る本発明のプライマーを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーの有無を識別することにより、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別することができる。
一方、請求項４に記載するように、請求項２に係る本発明のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＥｍｐｈａｓｉｚｅｄ−ＲＡＰＤ（ｅ−ＲＡＰＤ）マーカーの有無を識別することを特徴とする、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別することができる。
【００２０】
請求項３および４に係る本発明の識別方法においては、所定のポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、それぞれ、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカー、Ｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ−ＲＡＰＤ（ｅ−ＲＡＰＤ）マーカーの有無を識別することができる。
ＲＡＰＤマーカーおよびｅ−ＲＡＰＤマーカーとも、ＤＮＡマーカーの一種であり、特にｅ−ＲＡＰＤマーカーは、通常のＲＡＰＤマーカー（例えば、請求項３に係る本発明の識別方法により得られるＲＡＰＤマーカー）と同じ位置に出現するが、より鮮明でかつ信頼性の高いバンドとして現れるＤＮＡマーカーである。
即ち、請求項４に係る本発明の識別方法においては、請求項２記載のプライマーセットを用いることにより、バックグラウンドであったバンドが増幅されない一方、ＲＡＰＤマーカーが集中かつ安定して増幅されるので、クワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無をより正確に識別することができる。
【００２１】
これらのＲＡＰＤマーカーおよびｅ−ＲＡＰＤマーカーは、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖する。言い換えれば、染色体上でＭＳＲ−１に隣接する位置にある、という意味であり、より詳細には、ＭＳＲ−１に「相引」または「相反」に連鎖する、という意味である。ここで、「相引」とは、同じ種類の染色体が二本細胞内に存在する際、「同じ染色体上に乗っている」ことを言い、一方、「相反」とは、「別の染色体に乗っている」ことを言い、両者は互いに反対語の関係にある。
ＭＳＲ−１に「相引」するＲＡＰＤマーカーは、請求項１に係る本発明のプライマーのうち、配列表の配列番号１記載のオリゴヌクレオチド、配列番号３記載のオリゴヌクレオチド、配列番号５記載のオリゴヌクレオチド、または配列番号７記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いることにより得ることができる。一方、ＭＳＲ−１に「相反」するＲＡＰＤマーカーは、請求項１に係る本発明のプライマーのうち、配列表の配列番号２記載のオリゴヌクレオチド、配列番号４記載のオリゴヌクレオチド、または配列番号６記載のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いることにより得ることができる。
また、請求項２に係る本発明のプライマーセットを用いると、ＭＳＲ−１に「相引」するｅ−ＲＡＰＤマーカーを得ることができる。
【００２２】
ＲＡＰＤマーカーおよびｅ−ＲＡＰＤマーカーと、ＭＳＲ−１との連鎖距離は、形質評価の解釈次第で変動するが、例えば、最も密接に連鎖する配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるプライマーにより得られるＲＡＰＤマーカー、および配列番号７記載の塩基配列からなるプライマーにより得られるもの８と９で得られるＲＡＰＤマーカーの場合、最小で０ｃＭ（センチモルガン）、最大で２．８ｃＭ程度である。
【００２３】
請求項３及び４に係る本発明の識別方法におけるＲＡＰＤマーカー、ｅ−ＲＡＰＤマーカーは、それぞれ請求項５及び６に記載するようなポリメラーゼ連鎖反応生成物として得られる。
これらのポリメラーゼ連鎖反応生成物は、アガロースゲル等を用いた電気泳動をはじめとする分子量による選別の後、染色やＵＶ照射によりバンドとして可視化され、ＭＳＲ−１検出のための識別用プローブとして有用である。
具体的には、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約４９０塩基長であり、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約１０００塩基長であり、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約５３０塩基長であり、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約３４０塩基長であり、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約６５０塩基長であり、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約４５０塩基長及び約８００塩基長の２種類であり、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約３００塩基長である。
このような、請求項５に係る本発明のポリメラーゼ連鎖反応生成物は、さらに増幅して蛍光等で標識することにより、より鮮明なＭＳＲ−１検出のためのプローブとして有用である。
【００２４】
また、配列表の配列番号８及び９記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、配列表の配列番号１０に示すような約３００塩基長のポリメラーゼ連鎖反応生成物が得られる。すなわち、このポリメラーゼ連鎖反応生成物は、既に説明したように配列番号７記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにより得られる生成物と同様であるが、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合よりも集中かつ安定して増幅されると共に、バックグラウンドとなる他のバンドの増幅が少なく、ｅ−ＲＡＰＤマーカーは鮮明な検出のためにより有用である。
【００２５】
このように、請求項３や４に係る本発明の識別方法によれば、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を簡易にかつ短時間で判別することができるので、クワシロカイガラムシの取り扱いの煩雑性を解消し、観察の労力が軽減されるとともに、早期の抵抗性品種育成が可能となる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１（バンドの識別及びプライマーセットの設計）
請求項１に係る本発明のプライマーを用いて、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーの有無の識別を行った。
チャとして、表１に示すチャ系統適応性検定試験（以下系適試験）供試の８系統を用いた。本実施例で用いたチャ各品種については、系適試験によるクワシロカイガラムシ抵抗性評価が既になされており（表１参照）、クワシロカイガラムシ抵抗性か、或いは感受性かが予め明らかにされている。
【００２７】
チャからの全ゲノムＤＮＡの抽出には、珪藻土とスピンフィルターを用いる方法を用いた。即ち、上記チャの葉を破砕し、得られる植物組織を８％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ等を含む緩衝液に懸濁・抽出してから、遠心にて粗抽出液を得た。次に、４Ｍ  酢酸カリウム（ｐＨ４．８）により除タンパクを行い、スピンフィルター（Plasmid抽出キット（Quantum Prep KIT、BioRad社）に添付）上に移してカオトロピックイオンを含む溶液を加えて混和した。これに珪藻土（上記Plasmid抽出キットに添付）を懸濁してＤＮＡを吸着させ、スピンフィルターの遠心にて５０％  エタノールを含む緩衝液を用いて洗浄し、ＤＮＡ用緩衝液で抽出した。
【００２８】
こうして、チャから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なった。ＰＣＲは、酵素としてAmpli-Taq DNA Polymerase（Applied Biosystems社製）０．０５ｕｎｉｔ／μｌおよび添付の緩衝液を用い、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭおよびｄＮＴＰをそれぞれ０．１２５ｍＭ、鋳型としてのＤＮＡ  ２ｎｇ／μｌにて液量１０μｌとして行った。
プライマーとして、配列表の配列番号１〜７に記載の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチド９種類をそれぞれ使用するか、或いは配列表の配列番号８と９に記載の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用した。
【００２９】
配列表の配列番号１〜７に記載の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、ＭＳＲ−１に連鎖するプライマーとして、本発明者らが選択したものである。
すなわちまず、抵抗性品種‘さやまかおり’、感受性系統‘金−Ｃｋ１７’を交雑してＦ１集団を育成し、このＦ１集団（５４系統）と両親（抵抗性品種‘さやまかおり’及び感受性系統‘金−Ｃｋ１７’）の計５６種類のそれぞれから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、米Ｏｐｅｒｏｎ社のランダムプライマーＫＩＴ−Ａ〜ＢＣ、全１１００種類のプライマーを用いてＰＣＲと電気泳動による解析を実施し、何らかの多型（バンドパターンの違い）を生じる８７８種類のプライマーを選択した。
続いて、上記Ｆ１集団（５４系統）よりランダムに８系統を選び、これらのゲノムＤＮＡを鋳型に、前記の解析により選択された８７８種類のプライマーを用いてＰＣＲと電気泳動を実施し、遺伝的分離の認められるバンドを生じる５１７プライマーを選択した。
さらに、この５１７プライマーを用いて、最初のＰＣＲと同様にＦ１集団（５４系統）と両親の計５６種類のそれぞれから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして電気泳動を実施した。ここまでの段階において、５６ｘ５１７＝２８，９５２本のＰＣＲと電気泳動を行ったことになる。最終的に得られたバンド（１１８２バンド）の分離をデータベース化した。
一方、上記Ｆ１集団（５４系統）についてクワシロカイガラムシ抵抗性を調査し、統計手法によりクワシロカイガラムシ抵抗性に関連のある３７のバンド（マーカー）とそれらを生じる３７プライマーを選択した。この３７バンド（マーカー）の中から、想定されるクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子座（ＭＳＲ−１）に密接に連鎖するバンド（マーカー）として８種類を選択し、それらを生じる７プライマーを選択した。これらのプライマーについて再試によりマーカーバンドの安定性と連鎖を確認して、最終的に、配列表の配列番号１〜７に記載の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが選択された。
【００３０】
また、配列表の配列番号８及び９からなるオリゴヌクレオチドは、ＭＳＲ−１が存在する場合にのみ、マーカー（バンド）が集中かつ安定して増幅されると共に、バックグラウンドとなる他のバンドの増幅が少なくなるするように、配列表の配列番号７記載のプライマーの塩基配列の３´末端に塩基を付加する等して設計されたものである。
これらのプライマーを、それぞれ濃度２μＭにて使用した。反応にはGeneAmp 9700（Applied Biosystems）を用い、反応温度は熱変性９３℃１分，再対合４２℃１分３０秒，鎖伸長７２℃１分で４０サイクルとした。なお、上記４０サイクルに先立ち熱変性を完全にするため、９３℃５分の反応を加えるとともに、上記４０サイクルの後に二本鎖化を完全にするため、７２℃１０分の反応を加えた。
【００３１】
得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロマイドにて染色した。各個体群について各プライマーにより得られたバンドを比較して、ＭＳＲ−１が存在する場合にのみ、集中かつ安定して増幅される７種類のバンドを選択した。これらのバンドは、それぞれ配列表の配列番号１〜７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーにより増幅されるものであり、具体的には、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約４９０塩基長であり、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約１０００塩基長であり、配列表の配列番号３記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約５３０塩基長であり、配列表の配列番号４記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約３４０塩基長であり、配列表の配列番号５記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約６５０塩基長であり、配列表の配列番号６記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約４５０塩基長及び約８００塩基長の２種類であり、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合、約３００塩基長であった。
これらのバンドは、ＭＳＲ−１に連鎖するＲＡＰＤマーカーとして有用と考えられた。
【００３２】
また、配列表の配列番号８および９記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにより得られるマーカーと同様であったが、配列表の配列番号７記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合よりも集中かつ安定して増幅されると共に、バックグラウンドとなる他のバンドが増幅されないことが明らかとなった。
配列表の配列番号８及び９記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて得られる約３００塩基長のオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列を解析した結果、配列表の配列番号１０に示す通りであった。
表１に、各個体群における８種類のバンドの出現の有無と各バンドを増幅するプライマーの番号を、系適試験の結果と共に示す。なお、系適試験は、品種候補を系適４試験地（茨城、京都、高知、熊本）に加えて１０以上の県立の試験地における試作を行ない、その結果を持ち寄り品種候補の特性や地域への適応性について調査する試験である。系適試験による抵抗性評価は、クワシロカイガラムシの寄生が少ないとされたものを抵抗性（Ｒ）、そうでないものを感受性（Ｓ）とした。
尚、さやまかおりの後代にあたる品種候補（育成系統）がこれまでに系適試験に供試されており、その結果が明らかとなっている。
【００３３】
【表１】
2005224102.tif 000002
【００３４】
実施例２（ｅ−ＲＡＰＤによる識別）
請求項２に係る本発明のプライマーセットを使用して、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無の識別を行った。
【００３５】
チャとして、ＫＭ６２（金−Ｃｋ１７×さやまかおり）×宮崎２０号のＦ１個体群１６種を用いた。チャからの全ゲノムＤＮＡの抽出には、実施例１と同様に、珪藻土とスピンフィルターを用いる方法を用いた。
【００３６】
こうして、チャから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行なった。ＰＣＲは、酵素としてAmpli-Taq DNA Polymerase（Applied Biosystems社製）０．０５ｕｎｉｔ／μｌおよび添付の緩衝液を用い、ＭｇＣｌ２２．５ｍＭおよびｄＮＴＰをそれぞれ０．１２５ｍＭ、鋳型としてのＤＮＡ  ２ｎｇ／μｌにて液量１０μｌとして行った。
プライマーとして、配列表の配列番号８記載の塩基配列からなるプライマーおよび配列表の配列番号９記載の塩基配列からなるプライマーを、それぞれ濃度２μＭにて使用した。反応にはGeneAmp 9700（Applied Biosystems）を用い、反応温度は熱変性９３℃１分，再対合４２℃１分３０秒，鎖伸長７２℃１分で４０サイクルとした。なお、上記４０サイクルに先立ち熱変性を完全にするため、９３℃５分の反応を加えるとともに、上記４０サイクルの後に二本鎖化を完全にするため、７２℃１０分の反応を加えた。
【００３７】
得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロマイドにて染色し、得られたバンドを比較した。図１に、電気泳動の結果を示す。尚、図１中一番左側のレーンは分子量マーカー（φＸ１７４／Ｈｉｎｃ  ＩＩ分解産物）を示し、右側から１６列のレーンは、それぞれＦ１個体群の結果を示す。
図１中矢印で示すように、材料として用いたチャのうち、クワシロカイガラムシ抵抗性を実際に示すことが明らかな８品種にのみバンドが出現したことから、これらの８品種はＭＳＲ−１を持つと想定されると共に、出現したバンドはｅ−ＲＡＰＤマーカーであることが明らかである。
【００３８】
実施例３
表２〜４に示すチャ品種のそれぞれを用いた他は、実施例２と同様に行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無の識別を行った。本実施例で用いたチャ各品種については、クワシロカイガラムシ抵抗性評価が既になされている。
ｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無を、クワシロカイガラムシ抵抗性評価と共に表２〜４に示す。尚、表２〜４中、Ｒは強い抵抗性あり（Resistant）、Ｍは中程度の抵抗性あり（Medium）、Ｓは抵抗性ほとんどなし（Susceptible）、＋はｅ−ＲＡＰＤマーカーが観察される、−はｅ−ＲＡＰＤマーカーが見られない、を示す。なお、クワシロカイガラムシ抵抗性評価は、鹿児島県茶業試験場と宮崎県総合農業試験場茶支場における接種試験、野菜茶業研究所枕崎茶業研究拠点圃場における自然発生程度から総合的に評価したものである。
【００３９】
【表２】
2005224102.tif 000003
【００４０】
【表３】
2005224102.tif 000004
【００４１】
【表４】
2005224102.tif 000005
【００４２】
表２〜４の結果から明らかなように、チャの各品種のクワシロカイガラムシ抵抗性は、ｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無と対応していることが分かる。
このことから、請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無を識別することにより、実際にクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別することができることが明らかとなった。
【００４３】
実施例４
表５及び６に示す系統名のチャを用いた他は、実施例２と同様に行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無の識別を行った。
一方、各系統について、水田隆史、チャ樹におけるクワシロカイガラムシ  Pseudaulacaspis pentagona Targioniの発育と増殖の品種間差異、日本国、日本応用動物昆虫学会誌、２００３年、第４７巻第３号９１−９５に従い、クワシロカイガラムシ抵抗性の評価を行った。すなわち、各系統１０個体の苗にメスのクワシロカイガラムシ幼虫を温室内で１０月に接種し、翌１月に産卵数、メス成虫内の卵の数、及びそれらの合計数を算出して、各系統ごとに平均値を算出した（総卵数）。そして、総卵数の値に応じてクワシロカイガラムシ抵抗性指数を判断した。すなわち、総卵数５０以上の場合は１、３０以上５０未満の場合は２、１７．５以上３０未満の場合は３、１０以上１７．５未満の場合は４、１０未満の場合は５と判断した。
ｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無を、総卵数及びクワシロカイガラムシ抵抗性指数と共に表５及び６に示す。
【００４４】
【表５】
2005224102.tif 000006
【００４５】
【表６】
2005224102.tif 000007
【００４６】
表５及び６の結果から明らかなように、チャの各品種のクワシロカイガラムシ抵抗性は、ｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無と対応していることが分かる。
このことから、請求項２記載のプライマーセットを使用して、チャのゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行ない、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーの有無を識別することにより、実際にクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を識別することができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１の有無を簡易にかつ短時間で判別することができるので、クワシロカイガラムシの取り扱いの煩雑性を解消し、観察の労力が軽減されるとともに、早期の抵抗性品種育成が可能となる。
従って、本発明によれば、チャの各品種、特に、クワシロカイガラムシ抵抗性品種として知られる「さやまかおり」の後代から、クワシロカイガラムシ抵抗性個体を効率的に選抜することができ、チャの生産性の向上及び農薬使用量の低減につなげることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１の結果を示す電気泳動図である。
【符号の説明】
【００４９】
図１中の矢印は、チャのクワシロカイガラムシ抵抗性遺伝子ＭＳＲ−１に連鎖するｅ−ＲＡＰＤマーカーを示す。
【図１】
2005224102.tif 000008
【配列表】
2005224102000001.app