(57)【要約】【課題】  本発明は、アミロイド−βペプチドに対して遊離末端特異的な組換え抗体の脳での安定な発現により、アルツハイマー病の発症を防止する又はアルツハイマー病の進行を抑制する新規な方法に有用な医薬組成物を提供する。【解決手段】  本発明は、遺伝子送達手段と結合した、中枢神経系中で発現されるプロモーターに作動可能に連結された、アミロイド−βペプチドの遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端に遊離末端特異的な組換え抗体分子をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子および医薬的に許容し得る賦形剤を含有する、アミロイド−βペプチドの蓄積および脳内でアミロイド沈着を形成する該ペプチドの凝集を防止するのに有用なアルツハイマー病の進行を防止または抑制するための医薬組成物であって、ニューロンの細胞外環境でのアミロイド−βペプチドの蓄積を防止する、該医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子送達手段と結合した、中枢神経系中で発現されるプロモーターに作動可能に連結された、アミロイド−βペプチドの遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端に遊離末端特異的な組換え抗体分子をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子および医薬的に許容し得る賦形剤を含有する、アミロイド−βペプチドの蓄積および脳内でアミロイド沈着を形成する該ペプチドの凝集を防止するのに有用なアルツハイマー病の進行を防止または抑制するための医薬組成物であって、
ニューロンの細胞外環境でのアミロイド−βペプチドの蓄積を防止する、
該医薬組成物。
【請求項２】
該抗体はアミロイド−βペプチドの遊離Ｎ末端に遊離末端特異的である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該抗体はアミロイド−βペプチドの遊離Ｃ末端に遊離末端特異的である、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系の細胞への遺伝子送達によりアルツハイマー病の進行を防止又は抑制する方法に関する。本発明はまた、中枢神経系の細胞中で組換え抗体を発現させる能力を持つプロモーターに作動可能に連結されたアミロイド−βペプチドに対して遊離末端特異的な組換え抗体分子をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子、およびその医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、関連出願のクロスリファレンスとして、米国特許法１１９条ｅ項に基づき、1997年4月9日に出願された米国仮出願第60／041,850号を基礎とする優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）の主な組織病理学的特徴は、扁桃体、海馬及び新皮質の実質組織中の神経炎性斑（neuritic plaque）と広汎性斑（diffuse plaque）内にアミロイド沈着が存在することである（Glenner及びWong, 1984；Mastersら, 1985；Sisodia及びPrice, 1995）。アミロイドとは共通のβプリーツ構造を持つ繊維状凝集体を表す総称である。これらの凝集体はコンゴーレッドと偏光の存在下に複屈折性を示す（Glenner及びWong, 1984）。広汎性斑は、反応性変性過程と強く関連すると思われる神経炎性斑とは対照的に、比較的良性であると考えられる（Dicksonら, 1988；Tagliaviniら, 1988；Yamaguchiら, 1989；Yamaguchiら, 1992）。神経炎性斑の主要成分は42アミノ酸残基のアミロイド−β（Aβ）タンパク質であり（Millerら, 1993；Roherら, 1993）、これははるかに大きいβ−アミロイド前駆体タンパク質βＡＰＰ（又はＡＰＰ）から誘導される（Kangら, 1987）。Ａβ１−４２は１−４０Ａβペプチドほど豊富には産生されないが（Haassら, 1992；Seubertら, 1992）、Ａβ１−４２の選択的沈着は、このＣＯＯＨ延長型が１−４０Ａβよりも不溶性であり、凝集して逆平行βプリーツ構造を形成しやすいという事実に由来する（Joachimら, 1989；Halversonら, 1990；Barrowら, 1992；Burdickら, 1992；Fabianら, 1994）。Ａβ１−４２はＡβ１−４０の凝集のシード（核）になりうる（Jarrett及びLansbury, 1993）。
【０００４】
ＡＰＰ遺伝子は配列決定され、２１番染色体上にコードされていることが見出された（Kangら, 1987）。ＡＰＰ遺伝子の発現は６９５、７５１及び７７０アミノ酸の各Ａβ含有イソ型を生成し、後者２つのβＡＰＰはＫｕｎｉｔｚ型セリンプロテアーゼインヒビターと構造的及び機能的相同性を持つドメインを含有する（Kangら, 1987；Kitaguchiら, 1988；Ponteら, 1988；Tanziら, 1988；Konigら, 1992）。βＡＰＰがニューロンの接着と成長の媒介に（Schubertら, 1989；Saitohら, 1994；Saitoh及びRoch, 1995）、またおそらくはＧタンパク質関連シグナル伝達経路に（Nishimotoら, 1993）ある役割を果たしているという証拠は増えつつあるが、神経系におけるβＡＰＰの機能はまだ明確ではない。培養細胞では、βＡＰＰは構成的分泌経路を通って成熟し（Weidemannら, 1989；Haassら, 1992；Sisodia, 1992）、一部の細胞表面結合型βAPPはα-セクレターゼと呼ばれる酵素によってＡβドメイン内で切断される（Eschら, 1990）（これはＡβアミロイド形成を排除する事象である）。いくつかの研究により、共にアミロイド形成性を持つさらに２つのβＡＰＰプロセッシング経路が描写されている。すなわち第一に、エンドソーム／リソソーム経路が複雑な一組のβＡＰＰ関連膜結合型断片を生成し、その一部は全Ａβ配列を含有する（Haassら, 1992；Goldeら, 1992）。第二に、詳細にはわかっていない機序により、Ａβ１−４０が馴化培養液中に分泌され、生体内ではそれが脳脊髄液中に存在する（Haassら, 1992；Seubertら, 1992；Shojiら, 1992；Busciglioら, 1993）。リソソーム分解がAβの産生にとって有意な寄与をするとはもやは考えられていない（Sisodia及びPrice, 1995）。それぞれβ及びγと呼ばれるＡβのＮＨ２末端とＣＯＯＨ末端における切断を担うタンパク質分解酵素は同定されていない。最近まで、Ａβは前駆体の異常代謝によって生成すると広く信じられていた。しかし、広範な種々の培養細胞の馴化培養液とヒト脳脊髄液中にＡβが存在することは、Ａβが細胞の正常な機能として産生されることを示している。
【０００５】
もしアミロイド沈着がＡＤを引き起こす律速因子であるなら、この疾患に関連する全ての因子はアミロイド沈着を促進するか、アミロイドによって誘発される病変を増強するだろう。ＡＰＰ遺伝子の余分なコピーが存在するトリソミー２１（ダウン症候群）では、ＡＰＰ発現量の増加と家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）関連突然変異により（Van Broeckhovenら, 1987；Chartier-Harlinら, 1991；Goateら, 1989；Goateら, 1991；Murrellら, 1991；Pericak-Vanceら, 1991；Schellenbergら, 1992；Tanziら, 1992；Hendricksら, 1992；Mullanら, 1992）、アミロイド沈着の可能性が高められる（Neveら, 1988；Rumbleら, 1989）。これらの突然変異の一部は、Ａβの総産生量の増加（Caiら, 1993；Citronら, 1992）又はより原線維発生性の高いペプチドの特異的過剰産生（Wisniewskiら, 1991；Clementsら, 1993；Susukiら, 1994）若しくは原線維形成を誘導する因子の発現量の増加（Maら, 1994；Wisniewskiら, 1994）と相関する。総合すると、これらの知見はアミロイド沈着がＡＤの発症に決定的な要素であるという仮説（Hardy,1992）に極めて有利であるが、もちろんそれらは、この疾患に関係する他の加齢性変化（例えばペアードヘリカルフィラメント）がアミロイド沈着の結果としてというよりむしろそれと並行して発生し、独立して痴呆に寄与するという可能性を排除するものではない。
【０００６】
研究者らの主な関心の的とＡＤ用薬剤の開発に携わる人々の主な目標は、中枢神経系（ＣＮＳ）中のＡβ沈着量を減少させることである。これらの活動は２つの一般分野に分類される。すなわちＡβの産生に影響を与える因子と、不溶性Ａβ原線維の形成に影響を与える因子である。第三の治療目標は、Ａβ神経毒性によって喚起される炎症反応を軽減することである。
【０００７】
第一の目標については、新たに合成されるβＡＰＰがどのようにしてプロセッシングされて原形質膜に挿入されるかを詳細に理解することと、成熟タンパク質中の切断部位に基づいて割り当てられた推定アミロイド形成性セクレターゼを同定することに主な努力が払われている。薬理学的見地からすれば、Ａβの産生量を低下させる最も直接的な方法は、β又はγセクレターゼの直接阻害による方法である。かなりの数の化合物がそれらの活性を間接的に阻害することが示されているが、現在のところ利用できる特異的阻害剤はない。例えばバフィロマイシンはＡβ産生を約５０ｎＭのＥＣ５０で阻害し（Knopsら, 1995；Haassら, 1995）、それはおそらくＡβセクレターゼと共に液胞中に局在する液胞Ｈ＋ＡＴＰアーゼの阻害剤としてのその作用によるのだろう。もう一つの化合物ＭＤＬ２８１７０は、高濃度で使用されると、γセクレターゼの活性を遮断するようである（Higakiら, 1995）。β又はγセクレターゼの同定はアミロイド形成性ペプチドの形成を遮断するための特異的プロテアーゼ阻害剤の合成につながるかもしれない。しかしこれらの酵素がβＡＰＰに特異的であるのか、あるいはそれらが他の重要な分泌機能を持つのかはわかっていない。同様に、βＡＰＰのプロセッシングがアミロイド形成経路に向けられるか非アミロイド形成経路に向けられるかを決定するであろうシグナル伝達経路に干渉しようとする試みは、いずれも標的とターゲッティング特異性の問題に遭遇することになる。さらにこれらのシグナル伝達機序を今から同定する必要がある。結論として、Ａβの過剰産生につながる複雑で変化に富んだ根本的分子機序に関する現在の理解では、薬理学的物質による選択的ターゲッティングにはほとんど希望を持てない。
【０００８】
神経毒性がＡβのβプリーツ凝集体と関係するようであることから、治療的アプローチの一つはＡβ凝集を阻害するか遅らせることである。このアプローチの利点は、Ａβの過剰産生を誘発する細胞内機序又はＡβによって細胞内で誘導される効果を詳細に理解する必要がないということである。Ａβに結合する種々の物質は試験管内でＡβ神経毒性を阻害でき、例えばＡβ結合性色素であるコンゴーレッドは培養ニューロンにおけるＡβ誘導毒性を完全に阻害する（Yanknerら, 1995）。同様に抗生物質リファンパシン（rifampacin）もＡβ凝集とその結果として生じる神経毒性を防止する（Tomiyamaら, 1994）。Ａβを直接的に結合するか（例えばヘキサデシル−Ｎ−メチルピペリジニウム（ＨＭＰ）ブロミド（Woodら, 1996））、若しくはＡβとＡβ沈着の形成に寄与する他の分子との相互作用を防止することによるこの過程の阻害剤として、他の化合物も開発中である。そのような分子の一例はヘパラン硫酸、又はすべてのアミロイドで同定されていて炎症関連アミロイド誘導の最初期に関係するヘパラン硫酸プロテオグリカン、すなわちパーレカンである。
【０００９】
ヘパラン硫酸はＡβペプチドと相互作用し、特有の二次及び三次アミロイド構造特徴を付与する。小分子陰イオン性サルフェートがＣＮＳに侵入するかどうかは明らかでないが、最近、これらの化合物がこの反応を妨害してアミロイド形成を予防又は制止することが示された（Kisilevsky, 1995）。パーレカン結合ドメインの配列に基づくペプチドはＡβとパーレカンの間の相互作用を阻害するようであり、Ａβ由来ペプチドの自己重合阻害能力は、ＡＤ用治療薬の開発につながる可能性を持つものとして調査されている。しかし、これらの化合物の試験管内での有効性は、多くの理由（とりわけ血液脳関門を慢性的に貫通する必要性）から、あまり大きくはないだろう。
【００１０】
Ａβ凝集を阻害する又は遅らせるもう一つの手段として、WO96/25435は、Ａβ１−４２ペプチドの遊離Ｃ末端に末端特異的であってＡβ１−４３ペプチドには特異的でないモノクローナル抗体を、Ａβ１−４２の凝集の防止に使用できる可能性を開示している。そのようなＡβ末端特異モノクローナル抗体の投与はＡβ１−４２の遊離Ｃ末端残基と相互作用し、それによってＡＤを発病させうる凝集を妨害し破壊することも開示されているが、それらＡβのＣ末端特異モノクローナル抗体がどのようにして治療的に使用されるかについて具体的開示はない。Ａβペプチド凝集に対する直接的又は間接的操作は魅力的な治療法に見えるが、この一般的アプローチの欠点として、この種の薬理学的化合物は、長期間にわたって投与する必要があり、それが脳組織に蓄積されて毒性が高くなることが考えられる。
【００１１】
ペプチドに基づくアプローチに代わる方法は、Ａβ神経毒性の細胞機序を解明し、それらの細胞標的にねらいを定めた治療薬を開発することである。関心の的はフリーラジカルによるニューロン損傷のカルシウム機能障害を制御することにあった。Ａβは細胞表面上のＲＡＧＥ（終末糖化産物（ＡＧＥ）のレセプター）に結合し、それによって細胞障害性の酸化刺激を生成しうる反応を誘発すると想像されている（Yanら, 1996）。細胞表面結合部位へのＡβの接近を遮断すれば、ＡＤにおけるニューロン損傷の進行が遅延するかもしれない。現在のところ、Ａβが誘導する神経毒性を遮断するための特異的な薬理学的物質はない。
【００１２】
薬理学的に活性な物質の直接投与による治療的アプローチの他に、WO89/01975は、ＩｇＭクラスの組換えポリマー型抗アセチルコリンエステラーゼ抗体を発現し分泌するように形質転換されたグリア細胞（脳内で誘導される活発に分泌する細胞）を移植する方法を開示している。WO89/01975の明細書では、アルツハイマー病に冒された人間の脳に移植された形質転換細胞によって分泌される抗体は、その疾患の症状を緩和又は排除するだろうと予想されている。これは中枢神経系の細胞が極めて効率よく抗体を分泌するという観察から生じた遺伝子治療的アプローチである（Cattaneo及びNeuberger, 1987）。Piccioliら（1991及び1995）は、後に、組織特異的で発生的に調節されるニューロンｖｇｆ遺伝子のプロモーターからの組換え抗体の異所性ニューロン発現を実証した。このように非リンパ球様細胞、とりわけ神経細胞は、機能的免疫グロブリンを分泌できることが見出された。
【００１３】
本明細書における文書の引用はいずれも、それらの文書が関連先行技術であるとか、本願の各請求の範囲の特許性にとって重大であるとの容認を意図するものではない。どの文書の内容又は日付に関する記述も出願人がその出願時に入手できた情報に基づくものであって、そのような記述の正確さに関する容認を構成するものではない。
【発明の開示】
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、アミロイド−βペプチドに対して末端特異的な組換え抗体の脳での安定な発現により、アルツハイマー病の発症を防止する又はアルツハイマー病の進行を抑制する新しい方法に関する。アミロイド−βペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的で異所的に発現されるこれらの組換え抗体分子は、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液でのアミロイド−βペプチドの蓄積と脳におけるそれらペプチドのアミロイド沈着への凝集を防止する。アミロイド−βの産生に寄与しうる数多くの考えうる機序と、慢性神経毒性を引き起こすことのできる細胞表面及び細胞外Ａβ結合性分子とＡβとの相互作用のはなはだしい多様性とを考慮して、本方法は、この異種病的カスケードの焦点として、冒されたニューロンの細胞外環境でのＡβペプチドの蓄積を防止することに向けられる。また本発明は、血液脳関門の慢性的貫通を必要とする薬理学的物質の反復投与に伴う問題を回避する。
【００１５】
したがって本発明の目的は、アルツハイマー病の進行を防止又は抑制する新しい方法を提供することにより、先行技術の不完全性を克服することである。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液でのアミロイド−βペプチドの蓄積と脳におけるそれらペプチドのアミロイド沈着への凝集を防止するために、アミロイド−βペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的な組換え抗体分子を脳内で異所的に発現させる能力を神経系の細胞に付与する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、アミロイド−β誘導神経毒性を媒介するアミロイド−βペプチドの相互作用を阻害し、アルツハイマー病に関係する炎症過程に関与するアミロイド−β誘導性の補体活性化とサイトカイン放出を抑制することにより、アルツハイマー病の進行をも防止又は抑制する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、アミロイド−βペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的な組換え抗体分子をコードし中枢神経系で発現されるプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子を提供することである。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの目的は、中枢神経系の細胞に前記組換えＤＮＡ分子を導入するためのベクターを提供することである。
【００２０】
本発明のさらにもう一つの目的は、アルツハイマー病の進行を防止又は抑制するための医薬組成物を提供することである。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
本発明の新規ＤＮＡ分子は、ＡβペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的な組換え抗体分子をコードする遺伝子を含有する。そのような組換え抗体分子はＡβペプチドと、それがタンパク質分解的に誘導される元となるβ−アミロイドタンパク質前駆体とを識別し、本明細書ではこれを「アンチセニリン（antisenilin）」ともいう。「アンチセニリン」とは、Ａβペプチドの末端／先端に特異的に結合することにより、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液におけるアミロイド−βペプチドの蓄積と老人性アミロイド沈着又は老人性アミロイド斑への凝集を減速又は防止し、またＡβの神経毒性に寄与する他の分子とＡβペプチドとの相互作用を遮断する分子を意味する。
【００２２】
本発明に従ってアルツハイマー病の進行を防止又は抑制する方法では、アンチセニリン分子をコードする遺伝子を脳細胞中に送達し、アンチセニリンはそこで安定に発現され、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液中に分泌される。可溶性Ａβペプチドが存在する細胞外腔、間質液及び脳脊髄液へのアンチセニリンの分泌は、可溶性アンチセニリン−Ａβ複合体の形成を促進する。これら可溶性アンチセニリン−Ａβ複合体は、上矢状静脈洞のクモ膜絨毛による細胞外腔、間質液及び脳脊髄液の大血液循環への排液により、中枢神経系から清掃される。このようにして可溶性Ａβペプチドが細胞外腔、間質液及び脳脊髄液中に蓄積してアミロイド沈着を形成しかつ／または神経毒性を誘導することが防止される（図１）。さらに本発明による可溶性アミロイド−βペプチドの清掃は、例えばアミロイド−β誘導性の補体活性化とサイトカイン放出を阻害することによって、アルツハイマー病に見られる炎症過程を軽減し、またＲＡＧＥレセプターなどの細胞表面レセプターとＡβとの相互作用を遮断すると予想される。
【００２３】
本発明の組成物は、遺伝子送達手段と結合したアンチセニリン遺伝子含有組換えＤＮＡ分子を含み、ここに本組成物はアルツハイマー病の進行を防止又は抑制するための薬物としての使用に供しうる。
【００２４】
図１に示し（Schehr, 1994参照）、また背景技術の項でも述べたように、β−アミロイドタンパク質前駆体（βＡＰＰ）は、成長促進機能と神経保護機能を持つと思われるタンパク質分解産物、すなわち可溶性β−アミロイドタンパク質前駆体（ｓβＡＰＰ）の前駆体として働くと考えられる。中枢神経系におけるアンチセニリンの安定発現がＡβペプチドの形成とは関係しないβＡＰＰの正常な生物学的機能を妨害しないことは当業者には容易に認識されるだろう。本発明の新規組換えＤＮＡ分子において、アンチセニリン分子をコードする遺伝子は、少なくとも、末端特異モノクローナル抗体分子の抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含有する。したがって、モノクローナル抗体の抗原結合性部分を含有する組換え抗体分子であるアンチセニリン分子は、一本鎖抗体の他に、任意のイソ型のキメラ又はヒト化免疫グロブリン分子を包含するものとする。
【００２５】
キメラ抗体とは、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを持つものなど、異なる動物種に由来する異なる部分を持つ分子であると理解される。キメラ抗体とその製造法は当技術分野でよく知られている。例えば抗体の可変領域をコードするＤＮＡは、キメラ抗体を作成するために、他の抗体をコードするＤＮＡに挿入するか結合することができる（米国特許第4,816,567号；Orlandiら, 1989）。
【００２６】
アンチセニリンとしての一本鎖抗体も本発明に従って製造できる。これらの一本鎖抗体は、末端特異的Ａβペプチド結合能を持ち免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変領域に相同な又は類似する一対のアミノ酸配列を含んでなる一本鎖複合ポリペプチド（連結されたＶＨ−ＶＬ又は一本鎖Ｆｖ）でありうる。ＶＨとＶＬは両方が天然モノクローナル抗体配列をまねたものであってもよいし、それらの鎖の一方又は両方が米国特許第5,091,513号に記載されているタイプのＣＤＲ−ＦＲコンストラクトからなってもよい。軽鎖及び重鎖の可変領域に類似する分離したポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに保持される。そのような一本鎖抗体（例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、とりわけＶＨ鎖とＶＬ鎖の各ポリペプチド構造をコードするＤＮＡが、配列分析によって特徴づけられるもの又は容易に確かめられうるもの）の製造法は、例えば米国特許第4,946,778号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,096,815号、Bioccaら, 1993、Duanら, 1994、Mhashilkarら, 1995、Marascoら, 1993及びRichardsonら, 1995に記載の方法に従って行ないうる。図３のＡ〜Ｄ（Bioccaら, 1995から引用）は、完全な抗体（図Ａ）、Ｆａｂ断片（図Ｂ）、非共有結合的に連結された可変領域複合体からなるＦｖ断片（ＶＨ−ＶＬ）（図Ｃ）及び一本鎖Ｆｖ抗体（図Ｄ）の略図である。
【００２７】
アンチセニリン分子をコードする組換え遺伝子を構築するには、まず、アミロイド−βペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。ここに末端特異抗体とは、あるペプチドの遊離Ｎ末端又は遊離Ｃ末端を一義的に認識し、さらにそのペプチドとそれがタンパク質加水分解的に誘導される元となる前駆体とを識別できる抗体と定義される。免疫化とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作出に使用される免疫原ペプチドの設計は、Ａβの遊離アミノ又はカルボキシ末端を一義的に認識するモノクローナル抗体を生成するためにいくつかの研究室で既に使用されている類似のペプチドに基づく（Harringtonら, 1993；Iwatsuboら, 1994；Konigら, 1996；Murphyら, 1994；Gravinaら, 1995）。より長いペプチドを用いてＡβ末端特異抗体の生成に成功した例もいくつかあるが、Saidoとその共同研究者ら（1993；1994）は、与えられたどのペプチドについても、Ｎ末端にある特定の遊離アミノ基が新しい抗体によって認識されるエピトープの必須部分を構成することを保証する５アミノ酸の長さがあることを確立した。したがって免疫原ペプチドに対して生じるモノクローナル抗体を、Ａβペプチドの遊離のＮ又はＣ末端の認識に関するその抗体の選択性について評価する。Ａβの様々な領域及びβＡＰＰの細胞外ドメイン中のβ−セクレターゼ切断部位の直前の領域に対応するペプチドを用いた酸素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は免疫沈降による競争阻害測定法により、モノクローナル抗体の選択性を決定できる。アルツハイマー病の病因に関与するアミロイドペプチド、すなわちＡβ１−４０（配列番号１の残基５−４４に相当）、Ａβ１−４２（配列番号１の残基５−４６に相当）及びＡβ１−４３（配列番号１の残基５−４７に相当）のクリアランスが主な目的である場合、本モノクローナル抗体はそれらＡβペプチドに共通するＮ末端に末端特異的であることが好ましい。しかし他の場合、例えばアルツハイマー病発症後の患者を治療するために使用する場合などは、凝集のシードになるというＡβペプチドの能力、若しくはＡβ沈着のシーディングに寄与する又はＡβ誘導細胞毒効果を媒介する他の分子と相互作用するというＡβペプチドの能力をも妨害する抗体を選択することが好ましいだろう。末端特異抗Ａβ抗体と、アルツハイマー病の進行を防止又は抑制するこのタイプの選択的応用に供する医薬組成物で使用される組換えＡβ末端特異抗体（アンチセニリン）をコードするＤＮＡとを生成させるために、遊離のＮ末端か遊離のＣ末端を組み込んだ様々な長さの免疫原ペプチドを合成する。
【００２８】
担体タンパク質へのカップリングを容易にするために、上記免疫原ペプチドの、Ａβペプチドの遊離Ｎ末端又は遊離Ｃ末端に対応する末端とは反対の末端に、システイン残基を付加できることは、当業者には理解されるだろう。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、免疫原の担体として使用できるタンパク質の非限定的な例である。合成免疫原ペプチド上のＮ末端又はＣ末端システイン残基の存在は、マレイミド活性化タンパク質に共有結合するための遊離スルフヒドリル基を提供する。合成免疫原ペプチドを担体タンパク質に共有結合するには、Ｎ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルやｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）などのヘテロ二官能性試薬が使用される（例えばHartlow,Eら, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー,1988を参照されたい）。マレイミドで活性化された大きな担体タンパク質へのペプチドのカップリングに使用される市販のキットも容易に入手できる。
【００２９】
モノクローナル抗体は当業者に知られている方法によって得ることができる。例えばKohler及びMilstein, 1975、米国特許第4,376,110号、Ausubelら編, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience刊, ニューヨーク（1987,1992）、Harlowら, 前掲、Colliganら編, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience刊, ニューヨーク（1992-1997）を参照されたい（これらの文献の内容は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）。
【００３０】
モノクローナル抗体を生成させたら、その選択性と結合親和力（Ｋｄ）をＥＬＩＳＡによって評価することができ、それらの抗体に対してインビトロ生物検定を行なって、それらＡβ末端特異モノクローナル抗体がＡβ凝集及びＡβ誘導細胞毒性を遮断する効力を、下記実施例１に記述するように試験することができる。これらのモノクローナル抗体は特定のＡβペプチドに末端特異的な選択性を持つばかりでなく、高い結合親和力をも持つことが好ましい。ＡβペプチドのＮ末端又はＣ末端に末端特異的であって実施例１に記述するようにＡβ凝集とＡβ誘導細胞毒性を遮断する効力を示す抗体をコードするＤＮＡは、本発明に従って使用される組換えアンチセニリンコードＤＮＡ分子の作成に使用できると考えられる。例えば、WO96/25435に記載のＣ末端末端特異モノクローナル抗体は、本発明の組換えアンチセニリンコードＤＮＡ分子を得るために使用できる。
【００３１】
次に、Ａβペプチドの遊離Ｎ末端又は遊離Ｃ末端に選択的であると決定されたＡβ末端特異モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離できる。単離したハイブリドーマｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、免疫グロブリン重鎖のＶドメイン（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖のＶドメイン（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列の各末端にある保存された配列に基づくプライマーを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、そのＡβ末端特異モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列をクローニングすることができる。ＰＣＲプライマーの配列中に組み込まれた制限部位の存在は、適当な鎖の可変領域をコードするＰＣＲ増幅産物のクローニングを容易にする。
【００３２】
組換え一本鎖Ｆｖ抗体分子をコードする組換え遺伝子は、例えばＶＨドメインとＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列をペプチド鎖間リンカーをコードするヌクレオチド配列でつなぐか（Bioccaら, 1993；Duanら, 1994；Mhashilkarら, 1995；Marascoら, 1993；Richardsonら, 1995；米国特許第4,946,778号；米国特許第5,091,513号；米国特許第5,096,815号）、ヒト免疫グロブリン遺伝子中の可変ドメインをコードする対応配列を置換して組換えキメラ抗体をコードするように可変ドメインコードヌクレオチド配列を挿入する（Orlandiら, 1989；米国特許第4,816,567号）ことによって構築される。
【００３３】
組換えＤＮＡ技術の一般的原理を述べた標準的な参考文献には、Ausubelら編, Current Protocols In Molecular Biology, Green Publishing Assoc. and Wiley Interscience刊, ニューヨーク（1987-1997）、Watsonら, Molecular Biology of the Gene, I巻及びII巻, The Benjamin/Cummings Publishing Company社刊, カリフォルニア州メンロパーク（1987）、Darnellら, Molecular Cell Biology, Scientific American Books社刊, ニューヨーク州ニューヨーク（1986）、Lewin, Genes II, John Wiley & Sons刊, ニューヨーク州ニューヨーク（1985）、Oldら, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 第2版, University of California Press刊, カリフォルニア州バークレー（1981）、Maniatisら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールドスプリングハーバー研究所, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1989）、Bergerら, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods of Enzymology, 152巻, 1987, Academic Press社, カリフォルニア州サンディエゴがある。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３４】
組換え抗体（アンチセニリン）遺伝子を含有する本発明の組換えＤＮＡ分子は、好ましくは、その組換えアンチセニリン遺伝子に作動可能に連結された、そのアンチセニリン分子を脳細胞中で発現させる能力を持つプロモーターをも含有する。また、アンチセニリンを発現させる形質転換細胞からのアンチセニリン分子の分泌を容易にするために、Ｎ末端にリーダー又はシグナルペプチドも与えられることは理解されるだろう。
【００３５】
ＤＮＡ分子は、それが転写及び翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含有し、それらの配列がアンチセニリン分子などのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されているのであれば、そのポリヌクレオチドを「発現させることができる」とされる。作動可能な連結とは、調節ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡが遺伝子発現を可能にするような形でつながっている連結をいう。遺伝子発現に必要な調節領域には一般にプロモーター領域と、ＲＮＡに転写されたときにタンパク質合成の開始シグナルになるＤＮＡ配列とが含まれる。そのような領域には通常、転写と翻訳の開始に関与する５’非コード配列が含まれるだろう。
【００３６】
プロモーター領域は、そのプロモーターがＤＮＡ配列の転写を達成できるのであれば、そのＤＮＡ配列に作動可能に連結されているだろう。本明細書において「プロモーター配列」とは、ＤＮＡ上に見出され、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるプロモーターの配列をいう。したがってアンチセニリンを発現させるには、宿主細胞によって認識される転写及び翻訳シグナルが必要である。
【００３７】
アルツハイマー病の進行を防止又は抑制する本方法では、その必要がある患者に、中枢神経系の細胞への遺伝子送達手段と結合した組換えＤＮＡ分子を含む組成物を投与する。その組換えＤＮＡ分子はプロモーターに作動可能に連結されたアンチセニリン分子をコードする遺伝子を保持し、その作動可能な連結は脳におけるアンチセニリン分子の発現を可能にする。プロモーターは、アルツハイマー病におけるアミロイド沈着が最も優勢な海馬と大脳皮質で最も高い発現レベルを持つβＡＰＰの発現パターンにならうプロモーターであることが好ましい。アンチセニリン遺伝子に作動可能に連結される好ましいプロモーターの非限定的な例として、チミジンキナーゼ（Ｔｈｙ１）プロモーターは、脳におけるβＡＰＰの自然な発現を模倣して領域特異的にβＡＰＰの発現を推進することが示されている（Andraら, 1996）。シナプシンＩプロモーターに基づくキメラ導入遺伝子は、トランスジェニックマウスの脳で、βＡＰＰ発現を海馬のＣＡ亜領域及び梨状皮質に向かわせるために使用されている（Howlandら, 1995）。プリオンタンパク質プロモーターを用いて、トランスジェニックマウスの脳皮質における高レベルなβＡＰＰ発現が達成されている（Hsiaoら, 1996）。アンチセニリン遺伝子の発現にβＡＰＰ遺伝子プロモーターを使用することにより、数多くの利点が得られるだろう。具体的には、βＡＰＰプロモーターの制御下にあるアンチセニリン遺伝子は、βＡＰＰ遺伝子と同じ解剖学的及び生理学的発現パターンを持つだろう。ヒトβＡＰＰプロモーターについては多くのグループによって特徴づけられている（例えばSalbaumら, 1988；La Fauciら, 1989；Wirakら, 1991；Lahiri及びNall, 1995）。このプロモーターは、熱ショック配列と転写因子結合用の共通配列を含むいくつかの調節ドメインを持つ。したがって、βＡＰＰ遺伝子の制御下でのアンチセニリンの発現は、例えば増殖因子類、レチノイン酸、インターロイキン−１などといった多数の誘導物質のいずれかを適用することにより、脳の特定の領域で必要に応じて強化できる。プレプロエンケファリンプロモーターも、直接的生体内遺伝子導入後に、ラット成体脳における領域特異的な長期発現をもたらしたと報告されている（Kaplittら, 1994）。
【００３８】
プロモーターに作動可能に連結されたアンチセニリン遺伝子を運ぶ組換えＤＮＡ分子の中枢神経系細胞への導入を容易にするために、多くの様々な遺伝子送達手段を組換えＤＮＡ分子と結合して使用できる。「遺伝子送達手段」という用語は、血液脳関門を横切るＤＮＡ分子の送達及び／又は細胞膜を横切る経膜的送達に適した任意の技術を包含するものとする。遺伝子送達手段の非限定的な例はウイルスベクター（例えばアデノ随伴ウイルス系ベクター）、脂質／リポソーム、細胞表面レセプターのリガンドなどである。
【００３９】
アンチセニリン遺伝子を運ぶ組換えＤＮＡ分子は遺伝子送達手段と結合される。ここにその結合とは、例えばその遺伝子送達手段がウイルスベクターであって、アンチセニリン遺伝子がそのウイルスベクターのＤＮＡ中に組み込まれるか、そのウイルス粒子にパッケージングされる状態；遺伝子送達手段がリポソームであって、アンチセニリン遺伝子がそれと錯体を形成する状態；遺伝子送達手段が細胞表面レセプターのリガンドであって、アンチセニリン遺伝子がそれと接合又は他の方法で結合される状態などを包含するものとする。したがって「〜と結合した」という表現には、「〜への組み込み（又はパッケージング）」、「〜との錯化」、「〜への接合（又は結合）」及びアンチセリン遺伝子を遺伝子送達手段と結合させる他の任意の方法が含まれる。とりわけ組換えＤＮＡ分子が血液脳関門と脳細胞の細胞膜の両方を横切って送達されるべき場合は、組換えＤＮＡ分子を複数の遺伝子送達手段と結合させうることは理解されるだろう。
【００４０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は最初は組織培養汚染物質として分離され、後に小児のアデノウイルス集団発生時に非病原性の同時感染物質として見出された（Blacklowら, 1968）。これは４．７ｋｂのゲノムを持つパルボウイルス群の一本鎖ＤＮＡウイルスである。最も小さいヒトＤＮＡウイルスの一つとしてＡＡＶがその生活環を完結するには効率のよい複製のためにヘルパーウイルスとの同時感染が必要である（Carter, 1990）。ヘルパーウイルス感染がない場合、ＡＡＶは潜伏性になり、しばしば１９番染色体上の特定部位に、高い頻度で安定に組み込まれる（Kotinら, 1990；1991；1992；Samulskiら, 1991）。ＡＡＶゲノムは配列決定されていて、ＡＡＶベクターの組込みに必要な唯一の配列は末端の１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）にあり、したがってクローニング能力はほぼ４．７ｋｂになることが見出された（Muzyczka, 1992）。このウイルスは非病原性であり、宿主細胞域が広く、天然の機序を利用した高頻度の組込みが可能なことから、ＡＡＶは細胞への遺伝子送達／導入用ベクターとしてとりわけ好適である。そのうえ、従来のレトロウイルスはゲノムＤＮＡ合成を必要とするが、ＡＡＶベクターは非分裂細胞又は休止細胞に外来遺伝子を導入できるという独特な能力を持っている。哺乳類の脳での遺伝子発現にこれらの特徴を利用する例はふえつつあり、アルツハイマー病に関係するいくつかの遺伝子がＡＡＶベクターを用いて脳内で発現されている（Makimuraら, 1996）。Duら（1996）による最近の研究は、ＡＡＶベクターが外来遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）を有糸分裂後のヒトニューロンに効率よく形質導入し、そこで安定に発現させることを示している。神経細胞における外来遺伝子の発現はＡＡＶ系プラスミドのリポソームによるトランスフェクションでも報告されている（Meyerら, 1995；Wuら, 1994, 1995）。
【００４１】
Lowらの米国特許第5,108,921号には、レセプターが媒介するエンドサイトーシス活性の機構によるタンパク質や核酸などの分子の経膜的送達法が概説されている。これらのレセプター系にはガラクトース、マンノース、マンノース−６−ホスフェート、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質、トランスコバラミン（ビタミンＢ１２）、α−２マクログロブリン、インシュリン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）などの他のペプチド成長因子類を認識するものが含まれる。またLowらは、ほとんどの細胞の膜表面にビオチン及び葉酸レセプターが多数存在し、レセプターが媒介する経膜的輸送過程を伴うことから、細胞膜を横切る輸送を強化するために、ビオチンや葉酸のレセプターなどといった栄養素レセプターを有利に使用できることを示している。すなわち、細胞質に送達しようとする化合物と、ビオチン又は葉酸などのリガンドとの間に形成された複合体を、ビオチン又は葉酸レセプターを保持する細胞膜と接触させて、レセプター媒介経膜的輸送機序を開始させ、それによってその細胞への所望の化合物の侵入を可能にする。
【００４２】
ビオチンリガンドは、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Karger, B. D., 1989）を使って市販のビオチニル化デオキシヌクレオチド三リン酸（例：Life Technologies社（メリーランド州ゲーサーズバーグ）のビオチン−１４−ｄＡＴＰ又はビオチン−１４−ｄＣＴＰ）を組み込むことにより、ＤＮＡ分子に結合できる。ビオチン−１４−ｄＡＴＰはプリン塩基の６位に１４−原子リンカーを介して結合したビオチンを持つｄＡＴＰ類似体であり、ビオチン−１４−ｄＣＴＰはピリミジン塩基のＮ４位に１４−原子リンカーを介して結合したビオチンを持つｄＣＴＰ類似体である。
【００４３】
ウイルスへのパッケージング用のウイルス系ベクター又はプラスミドベクターに組み込むか、カチオン性脂質又はカチオン性リポソームと錯形成させるか、他の適当な遺伝子送達手段と結合させるかにかかわらず、プロモーターに作動可能に連結されたアンチセニリンをコードする組換えＤＮＡ分子は、注射によって対象に投与される。ウイルスパッケージ型又はリガンド結合型組換えＤＮＡ分子を脳細胞を取り囲む細胞外環境（例えば脳脊髄液）に直接送達し、それに続いて細胞内への経膜的送達を行なうには、確立された座標を使用した様々な脳領域への定位微量注射法を使用できる。
【００４４】
脳への直接注射は侵襲的処置であるので、ウイルスパッケージ型又はリガンド結合型組換えＤＮＡ分子は静脈内又は動脈内注射によって投与されることが好ましい。ウイルスパッケージ型又はリガンド結合型組換えＤＮＡ分子は、血液脳関門を横切って中枢神経系への遺伝子送達を達成するために、さらに他の遺伝子送達手段と結合させることができる。Zhuら（1993）は、カチオン性脂質−プラスミドＤＮＡ複合体が脳を含む全ての組織に全身的に送達されうることを示した。最近、動脈内投与されたチミジンキナーゼ遺伝子含有カチオン性リポソームが、脳腫瘍のラットモデルで好結果を示し、明白な毒性や組織学的損傷を伴わずに退縮が達成されることも示された（Laineら, 1995）。リポソームによる遺伝子送達は科学文献と特許公報で詳しく扱われており、またLasic, D. D.がLiposomes in Gene Delivery（CRC Press, フロリダ州ボカラトン, 1997；これは参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）で詳細に論じている。
【００４５】
脳に送達されると、ウイルスパッケージ型組換えＤＮＡ分子は、リガンド結合型であれ他の適当な遺伝子送達手段と結合したものであれ、脳細胞を形質転換し、次いでその脳細胞はアンチセニリン分子（Ａβペプチドに末端特異的な組換え抗体分子）を発現させ、発現したアンチセニリンを細胞外腔、間質液及び脳脊髄液中に分泌する。次いで、分泌されたアンチセニリンは、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液中で、それらが末端特異性を示すＡβペプチドと可溶性複合体を形成する。これらの可溶性アンチセニリン−Ａβペプチド複合体は、細胞外腔、間質液及び脳脊髄液の大血液循環（そこではそれらがプロテアーゼ消化によって排除されるだろう）への排出を通じてＡβペプチドを中枢神経系から清掃することにより、Ａβペプチドのアミロイド沈着への凝集を防止し、Ａβ誘導神経毒性を防止する。したがって、アミロイド沈着とＡβ誘導神経毒性の原因である新たに分泌される可溶性Ａβペプチドの蓄積が防止される。
【００４６】
アルツハイマー病の進行を防止又は抑制する本方法は、主として、遺伝的に明らかにアルツハイマー病を発生しやすい患者への使用が意図されているが、このような一般的で消耗性の疾患の発生に対抗するために、集団全体を「免疫する」ために予防的にも使用できる。好ましい投与経路は静脈内又は動脈内である。ただし、脳の領域への直接的な微量注射の侵襲性にもかかわらず、この投与経路は本発明の範囲に包含されるものとする。具体的には、その素因ゆえにアルツハイマー病を発症すると予期されるダウン症候群又は家族性アルツハイマー病関連突然変異を持つ患者又は既にアルツハイマー病にかかっている患者を、脳への直接微量注射によって処置できる。この処置の利益は、脳への注射などの侵襲的技術の危険性を上回ると予想される。
【００４７】
遺伝子送達手段と結合した、アンチセニリン遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子は、薬剤／医薬組成物の調製又は製造に使用できる。本医薬組成物は意図した目的を達成するのに有効な量の組換えＤＮＡ分子を含有する。例えば、遺伝子送達手段がＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである場合は、定位的に微量注射される医薬組成物中のウイルス粒子の好適な投与量は約５×１０４〜１×１０１１粒子の範囲にある。ビオチンなどのリガンドを脳への直接的投与による遺伝子送達手段として使用する場合は、約０．５〜１００μｇの範囲のリガンド結合型ＤＮＡ分子を使用するとよい。このようなリガンド結合型ＤＮＡ分子については、中枢神経系内の細胞の細胞外環境でそれらの分子を保護するために、そのＤＮＡ分子を予め濃縮しておくことが好ましい。カチオン性脂質又はカチオン性リポソームと錯形成したＤＮＡ分子の医薬組成物と投与量は上記の文献Lasic（1997）で議論されている。また本医薬組成物は、当技術分野でよく知られているような製薬上許容できる適当な賦形剤を含有しうる。
【実施例１】
【００４８】
本発明を広く説明し終えたので、下記の預言的実施例を参照することにより、本発明がより容易に理解されるだろう。ただし、これらの実施例は例示のために記載するのであって、本発明の限定を意図するものではない。
【００４９】
アミロイド−βペプチドに末端特異的な組換えアンチセニリン抗体分子をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡ分子の開発に使用する戦略とプロトコールを以下に説明する。
【００５０】
モノクローナルＡβ末端−特異抗体の作成
免疫原ペプチドの合成
遊離のＮ末端又は遊離のＣ末端を組み込んだ様々な長さを持つ数種類のペプチドをApplied Biosystems製ペプチドシンセサイザー（４３０Ａ）で調製する。その合成ペプチドをＨＰＬＣで精製し、アミノ酸組成分析とＮＨ２末端微量配列分析で特徴づける。
【００５１】
ペプチドＮ１／５ Ａβ１−４０／４２（モノクローナル抗体「アンチセニリンＮ１／５」）
Ａβ（１−４０及び１−４２）の最初の５アミノ酸に相当するペプチド（図２に該当する線分で図示）を合成する。このペプチドはＣ末端にシステイン残基を含み、配列番号２の配列を持つ（図１参照）。
【００５２】
ペプチドＮ１／７ Ａβ1-40/42（モノクローナル抗体「アンチセニリンＮ１／７」）
Ａβ（１−４０及び１−４２）の最初の７アミノ酸に相当するペプチド（図２に該当する線分で図示）を合成する。このペプチドはＣ末端にシステイン残基を含み、配列番号３の配列を持つ。
【００５３】
ペプチドＣ３４／４０ Ａβ1-40（モノクローナル抗体「アンチセニリンＣ３４／４０」）
Ａβ（１−４０）の最後の７アミノ酸に相当するペプチド（図２に該当する線分で図示）を合成する。このペプチドはＮ末端にシステイン残基を含み、配列番号４の配列を持つ。
【００５４】
ペプチドＣ３６／４２ Ａβ1-42（モノクローナル抗体「アンチセニリンＣ３６／４２」）
Ａβ（１−４２）の最後の７アミノ酸に相当するペプチド（図２に該当する線分で図示）を合成する。このペプチドはＮ末端にシステイン残基を含み、配列番号５の配列を持つ。
【００５５】
ペプチドの接合
精製したペプチドを、１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−ベンゼンスルホン酸のＮ−マレイミド−６−アミノカプロイルエステルを用いてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に接合する。
【００５６】
免疫化とハイブリドーマモノクローナル抗体生産
第一段階：各組１０匹のＢａｌｂ／ｃマウス４組を、標準的な免疫化プロトコール（Taggert及びSamloff,1983）を用いて上述の精製ＢＳＡ接合ペプチドで免疫する。
【００５７】
第二段階：免疫化プロトコールの完了後に、過免疫されたマウスから得られる脾細胞と、適当な骨髄腫細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ATCC CRL 1581）、ＮＳ−１（ATCC TIB18）又は同等の株とを用いて、融合処置を行なう。この処置はポリエチレングリコールを使って行なわれ、成功した融合産物の選択はＨＡＴ培地を使って達成される。生存可能なハイブリドーマコロニーを９６ウェルプレート中で生じさせる。
【００５８】
第三段階：成功した融合産物を含有するすべてのウェルを、次の項に記載のＥＬＩＳＡにより、ペプチド抗原でスクリーニングする。数ウェルから得た上清を後述するようにインビトロ生物検定法でもスクリーニングする。
【００５９】
第四段階：ＥＬＩＳＡアッセイの結果と生物検定の結果による評価とに基づいて、選択したコロニーに対して限界希釈法によるサブクリーニングを行なう。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ検出と親和力決定
Ａβ１−４２、Ａβ１−４０ならびにＡβペプチドとそれらの派生源であるβＡＰＰ中に見出される残基１−５２、１−１１、−２[ＫＭ]−１１、−１[Ｍ]−１１、１−２８、３５−４０、３５−４２及び３５−４４に対応する一組の合成ペプチドを使用して、モノクローナル抗体の特異性と結合親和力（Ｋｄ）をＥＬＩＳＡアッセイ（Engvall及びPerlmann, 1971）で評価する。また、ＡβペプチドのＮ末端又はＣ末端に対応し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）や卵白アルブミンなどの異なる担体タンパク質に接合した免疫原ペプチド配列を使用して、得られたモノクローナル抗体がＡβペプチドに末端特異的でありかつ担体タンパク質又はシステイン架橋には非特異的であるかどうかを決定する。
【００６１】
モノクローナル抗体を生成するために次に使用するプロトコールを検証するため、Ａβペプチドの遊離Ｎ末端に特異的な高親和性ポリクローナル抗体（これらの抗体は制限ペプチドＨ２Ｎ−配列番号６−アミノヘキサン酸−Ｃ−アミドを用いて生じさせた）を作成した。各ペプチドを固相Ｆｍｏｃ法で合成した。次にそれらのペプチドを切断し、質量分析法と高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣによる精製は、Ａ：Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡとＢ：ＣＨ３ＣＮ／０．０８％ＴＦＡの緩衝液系で、Ｃ−１８ＹＭＣカラム（充填剤１０μ、ポアサイズ１２０Ａ、１０×２５０ｍｍ）を用いて行なった。適当なフラクションをプールし、凍結乾燥し、再び質量分析法とＨＰＬＣ分析にかけた。そのペプチドを免疫化についてはＫＬＨ、ＥＬＩＳＡ検出についてはＢＳＡに、架橋剤ＭＢＳで結合した。ウサギを三週間間隔で免疫化し、アセタール−配列番号７−Ａｈｘ−Ｃ−アミドを用いるＥＬＩＳＡによって力価を評価した。このペプチドはＡβペプチドの遊離Ｎ末端を与える０−１スプライス部位をまたぐアミノ酸残基の配列に相当する。この貫通型ペプチドをチオールカップリングゲルにそれらのシステイン残基を介して結合させ、遊離アミン−Ａｓｐの存在に依存しない全ての抗体を前もって吸収除去するために使用した。次にＮ末端ペプチドを用いて抗体を精製し、収集した。粗血清は貫通型ペプチドに対してかなりの活性を示すが、いったんアフィニティー精製すると、得られた抗体には全域ペプチドとの反応性がなく、Ｎ末端ペプチドとの反応性だけがあった。
【００６２】
ＡβペプチドのＮ末端に特異的なモノクローナル抗体を作成するために、ＢＳＡに接合したＨ２Ｎ−配列番号６−アミノヘキサン酸−Ｃ−アミド（ポリクローナル抗体の調製について記述したように調製）を用いて、マウスを三週間間隔で免疫化する。各マウスにおける力価も上述のようにＥＬＩＳＡで評価する。最も高い力価を含むマウスの脾細胞融合後に、いくつかのクローンを単離し、全域ペプチドＥＬＩＳＡ検出法でスクリーニングする。
【実施例２】
【００６３】
Ａβ末端−特異抗体のＡβ凝集及びＡβ誘導細胞毒性遮断能力を試験するためのインビトロ生物検定
Ａ）Ａβ原線維形成に対する効果：Jarrettら（1993）によって示されたように、Ａβのカルボキシ末端は、アルツハイマー病でアミロイド斑形成速度が著しく加速される原因であろうアミロイド形成の「シーディング」にとって重要である（Yankner及びMesulam, 1991）。Ａβ１−４０などの速度論的に可溶なペプチドによるアミロイド形成は、重要なＣ末端残基４１（Ｉｌｅ）と４２（Ａｌａ）を含むＡβ１−４２などのペプチドを核又は「シード」とすることができる。本願が優先権の恩典を主張する米国仮出願の出願日である1997年4月9日より後で、Solomonら（1997）とFrenkelら（1997）はその抄録に、彼らの研究は、Ａβペプチドの位置１−１６のＮ末端領域に対する抗体が、形成された原線維に結合し脱凝集をもたらすことを示すと報告した。このような抗体の抗凝集性エピトープは、まさに残基位置３〜６の４つのアミノ酸Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ（配列番号８）内にあると報告された。配列番号８のこれら４つのアミノ酸残基は、すべてＡβのＮ末端用の免疫ペプチド中に存在する。Ｃ端又はＮ端末端特異Ａβ抗体がＡβ１−４２によるシーディングを遮断する能力又はアミロイドペプチドの凝集を防止する能力は、標準的な凝集試験法（Woodら, 1996）を用いて試験される。Ａβ１−４０ペプチドを1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−２−プロパノールに５ｍｇ／ｍＬになるように溶解する。そのペプチドを濃縮乾固し、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に最終濃度が２３０μＭになるように再溶解する。Ａβ１−４２（２０μＭ）の溶液を３日間撹拌し、３０分間超音波処理して，アミロイド原線維を生成させる。Ａβ１−４０の凝集を誘起するために、前もって凝集させた２ｎＭ濃度のＡβ１−４２を過飽和状態のｐＨ７．４保温液に加える。マイクロタイタープレートに調製した各試料の濁度をマイクロタイタープレート読取装置を使って４０５ｎｍでモニターすることにより、各Ａβ末端特異モノクローナル抗体の不在下及び存在下での凝集体形成を決定する。この反応は、Woodら（1996）に記述されているように、チオフラビン−Ｔ蛍光でもモニターされる。Ｎ末端特異抗体がアミロイドペプチド原線維の脱凝集を促進する能力は、９６ウェルマイクロタイタープラスチック被覆プレート上にコーティングされた非凝集ペプチドを含有するコラーゲンマトリックスからの［125Ｉ］標識アミロイド凝集ペプチドの脱離を調べることによって試験される。加えて、Ｎ末端特異抗体がＡβ誘導性損傷からニューロンを保護する能力が、トリパンブルー排除法、細胞内カルシウム濃度測定、走査型及び透過型電子顕微鏡法及び共焦点顕微鏡法によって評価される。
【００６４】
Ｂ）Ａβ誘導神経毒性：終末糖化産物のレセプター（ＲＡＧＥ）はニューロンと小グリア細胞に対するＡβの神経毒効果の一部を媒介する（Yanら, 1996）。末端特異抗体を、それらが競争阻害によってそのレセプター媒介性の神経毒性を阻害する能力について試験する。抗体は、精製ＲＡＧＥレセプター調製物を使って試験されると共に、Ａβ誘導性の細胞オキシダントストレスに対するそれらの効果を測定することによっても試験される。
【００６５】
ＲＡＧＥレセプターはオクチル−β−グルコシド（１％）とフェニルメチルスルホニルフルオリド（２ｎｍ）を含むトリス緩衝食塩水に溶解したウシ肺抽出物から精製し、ヘパリン・ハイパーＤカラム（Biosepra社）にかける。そのカラムをＮａＣｌの勾配で溶出し、１２５Ｉ−標識Ａβの結合量が最大であるフラクションを同定する。それらのフラクションをプールし、ヒドロキシアパタイト・ウルトラゲル（Biosepra社）にのせ、リン酸濃度を増加させて溶出する。１２５Ｉ−標識Ａβの結合量が最大であるフラクションを調製用非還元ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（１０％）にかける。ＲＡＧＥレセプタータンパク質Ｍｒ５０，０００をクーマシーブルー染色法で同定し、隣接するレーンのその領域を切断し、溶出する。ＲＡＧＥレセプターへの１２５Ｉ−標識Ａβ（１−４０／１−４２）の結合に対する末端特異抗体による競争的阻害は、いくつかの方法で決定される：（１）様々な量（０〜１５０μｇ）の精製タンパク質をマイクロタイターウェルに固定化し、１００ｎＭ１２５Ｉ−標識Ａβ（１−４０／１−４２）と共にインキュベートする；（２）様々な量（０〜２５０ｎＭ）の１２５Ｉ−標識Ａβ（１−４０／１−４２）を５μｇの精製ＲＡＧＥレセプターで前もってコーティングしてあるマイクロタイターウェルでインキュベートする；（３）様々な量（０〜５００μｇ／ｍＬ）のＡβ（１−４０／１−４２）をマイクロタイターウェルに固定化し、５０ｎＭの１２５Ｉ−標識ＲＡＧＥレセプターと共にインキュベートする。各アッセイでは、様々な量の抗体の存在下でウェルに結合するリガンドの量を、ガンマ−シンチレーションカウンターで各ウェルの放射活性量をカウントすることによって決定する。
【００６６】
様々な末端特異Ａβモノクローナル抗体の、Ａβ誘導性の細胞オキシダントストレスの阻害剤としての効力を評価するために、培養マウス脳微小血管内皮細胞（Breitnerら, 1994）を、様々な量の抗体の存在下で０．２５μＭ Ａβと共にインキュベートし、先に記述したようなＴＢＡＲＳ測定法（Denneryら, 1990；Yanら, 1996）でチオバルビツール酸反応性物質の用量依存的生成を測定することにより、細胞のオキシダントストレスを評価する。並行アッセイ系（Khouryら, 1996が開発したもの）で、Ｎ９マウス小グリア細胞におけるＡβ誘導酸素反応性種の生成に対する各抗体の阻害効果を試験する。Ｎ９細胞（５×１０４）を、Ａβペプチドでコーティングした多スポットスライド上で、１μＭ  Ｈ２ＤＣＦ（２’,７’−ジクロロフルオレセインジアセテート；酸化時に蛍光を発する色素（Wanら, 1993））を含有する５０μＬのＰＤ−ＢＳＡ（二価カチオンを欠き１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水）中、様々な量の抗体の存在下に３７℃でインキュベートする。様々な時点で培養培地の一部を採取し、その蛍光を蛍光プレート読取装置（Cytofluor II）で測定する。
【００６７】
Ｃ）プロテオグリカンとの相互作用に対する効果：血管細胞由来のヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパーレカンは全てのアミロイド沈着物中に同定されており、Ａβとの高親和性結合相互作用による炎症関連アミロイド誘導の最初期段階に関係している（Snowら, 1989；1995）。Ａβに対するパーレカンの結合は、その相互作用を妨害する分子がアミロイド形成を防止又は停止しうることを示唆する二次及び三次アミロイド構造特徴を付与する。
【００６８】
ＡβペプチドのＮ末端に対応する様々な長さのペプチドに対して作成された末端特異Ａβモノクローナル抗体を、ＡβのＮ末端領域中のパーレカン結合部位に対するパーレカンの結合を遮断する能力について評価する（Snowら, 1995）。これらの評価は、Snowら（1995）に詳述されているように、子ウシ胸部大動脈から調製される培養内皮細胞から単離されたパーレカンを用いる固相結合試験法に基づく。ポリビニル製マイクロタイターウェルを１００μＬのニトロセルロース溶液でコーティングし、乾燥させる。次に、非標識パーレカンを用いて１ウェルあたり０．２８μｇのパーレカン結合量になるように室温で終夜コーティングし、２００μＬの５％脱脂粉乳を使って室温で終夜遮断する。１００μＬのＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳＴ）に希釈した様々な量の１２５Ｉ−Ａβ（７０００ｃｐｍ／ｐＭ）をそれぞれ３つのウェルに添加し、軌道式振盪機上室温にて２．５時間インキュベートする。そのインキュベーション時間の最後に、ＴＢＳＴによる６回の洗浄で遊離の１２５Ｉ−Ａβを除去する。結合した１２５Ｉを１００μＬの１Ｎ水酸化ナトリウムに抽出し、「結合型」と「遊離型」の放射活性を液体シンチレーション計数によって定量する。増加する量のモノクローナル抗体の存在下で１２５Ｉ−Ａβをインキュベートした後、スキャッチャード解析を行う。
【実施例３】
【００６９】
組換え遺伝子のクローニングと組み立て
ハイブリドーマからのｍＲＮＡ単離とｃＤＮＡ合成
GriffithsとMilstein（1985）が記述しているように５×１０８個のハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製する。標準的な方法（Maniatisら, 1989）に従って第一鎖ｃＤＮＡ合成を行なった。
【００７０】
ＰＣＲ増幅、可変抗原結合領域のクローニング及び一本鎖抗体の構築
ポリメラーゼ連鎖反応を使ってゲノムＤＮＡとｃＤＮＡから免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする技術は既に開発されている（Orlandiら, 1989；Wardら, 1989；Richardsonら, 1995）。また、マウス免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）とκ軽鎖（ＶＫ）のＶドメインをコードするヌクレオチド配列の各末端にある保存された配列に基づくプライマーは、各鎖の可変領域を含有する増幅産物の強制クローニングを可能にする制限部位も組み込む。これらのプライマーはマウスレパートリーの大部分の免疫グロブリンｍＲＮＡを増幅することができる。
【００７１】
図４に示すように、ハイブリドーマ細胞からのｃＤＮＡに対するＰＣＲは、Richardsonら（1995）に記載のプライマーを用いて行なわれる。Richardsonら（1995）に記述されているように、ｓｃＦｖアンチセニリン遺伝子をＶＨ及びＶＬ領域に対応する増幅ＤＮＡと鎖間リンカーから組み立て、大腸菌で発現させ、ＶＬの３’末端に停止コドンを組み込むプライマーを使ったＰＣＲにより再増幅する。組換えＡＡＶベクターの構築に備えて、組換えｓｃＦｖ遺伝子を再増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーには、下記ＡＡＶプラスミドベクターｐＳＳＶへのその挿入が容易になるように、ＸｂａＩ制限部位が組み込まれる。
【００７２】
脳におけるｓｃＦｖαＡβ遺伝子の局所発現用の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの構築
組み立てたＳｃＦｖαＡβ遺伝子を、ＡＡＶプラスミドｐＳＳＶ９（ｐｓｕｂ２０１）中、ヒトβＡＰＰプロモーター（ｈｕβＡＰＰＰ）の制御下に連結する。プラスミドｐＳＳＶ９は修飾全長２型ＡＡＶゲノムクローンである。また、ｈｕβＡＰＰＰが好ましいのではあるが、上述のように、Ｔｈｙ−１、シナプシンＩ、プリオンなどといった他の好適なプロモーターも使用できる。
【００７３】
図５に示すように、２つの隣接するＸｂａＩ部位の切断により、ウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）だけを残してＡＡＶコード配列の全てを切除する。これらのＩＴＲは複製とＡＡＶベクターへのパッケージングに必要な認識シグナルを含有する。ＡＡＶコード配列をｈｕβＡＰＰＰＨ／ＫＡβコード配列で置換する。ＡＡＶ／ｈｕβＡＰＰＰＨ／ＫＡβの新しいコード配列には、ＳＶ４０初期領域ポリアデニル化シグナルが続く。
【００７４】
パッケージングされたｈｕβＡＰＰＰＨ／ＫＡβＡＡＶベクターの調製
アデノウイルス形質転換ヒト胚腎臓細胞株２９３（ATCC CRL-1573）を用いて、ｈｕβＡＰＰＰＨ／ＫＡβＡＡＶベクターを、Samulskiら（1989）が（Samulskiら, 1987, 1989）。トランスフェクションには、標準的なリン酸カルシウム沈殿法（Wiglerら, 1979）を使用し、トランスフェクション効率を向上させるためにクロロキン二リン酸を添加して行なう（Luthmanら, 1983）。終夜インキュベートした後、トランスフェクション溶液を、１５％ウシ胎仔血清を含む新しい培地で置換する。感染の三日後に細胞を収集し、１０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化し、それを凍結−融解サイクルにかけて細胞に付随したウイルス粒子を放出させる。混入しているＡｄ５は溶解液を５６℃に加熱することによって失活される。次にその溶解液を遠心分離によって浄化し、残存するプラスミドＤＮＡを完全に除去するために、２５単位／ｍｌのＲＮアーゼ・フリー・ＤＮアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。
【００７５】
ＡＡＶ／ｈｕβＡＰＰＰＨ／Ｋベクターの発現を試験するためのヒトニューロンの形質導入
潜在的ベクターとしてのＡＡＶの有用性はDuら（1996）によりヒトＮＴニューロンで明確に確立されている（Pleasureら, 1993）。これらのニューロンの前駆体は、レチノイン酸に被曝するとニューロンに最終分化するヒト奇形癌細胞ＮＴ２の亜系統である（Leeら, 1994；Pleasureら, 1993）。選択的播直しを行ないながら４週間のレチノイン酸処理で、ほぼ純粋な＞９５％のニューロン集団が得られる。これらの成熟ニューロンは培養中で何週間も生存可能でありつづける。明瞭な形態学的様相と数多くのニューロンマーカーの発現に加えて、ヒトＮＴニューロンは、天然ＣＮＳニューロンと類似するアミロイド前駆体タンパク質パターンを持ち、Ａβペプチドを産生する（Wertkinら, 1993）。
【００７６】
未分化前駆体ＮＴ２細胞をStratagene社（カリフォルニア州ラホーヤ）から入手し、５％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＳ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ（GIBCO BRL、メリーランド州ゲーサーズバーグ）中、５％ＣＯ２下に３７℃で培養する。Ｔ７５フラスコ１つあたり２×１０６個のＮＴ２細胞を１０μＭレチノイン酸で４週間処理した後、６つのＴ７５フラスコに低密度で播直しする。分化した細胞を含む上層を機械的に取り除き、２４ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０６細胞の密度で播直しする。ウェルとガラス製カバーグラスを０．０１％ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした後、１：２０ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（Collaborative Research, マサチューセッツ州ベッドフォード）で覆う。細胞を、１０％ＦＢＳ、ＰＳ及び有糸分裂抑制剤を含有するＤＭＥＭ高グルコース／Ｌ−グルタミンで３週間培養する。濃縮されたニューロンをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ＰＳ中、３７℃、５％ＣＯ２で維持する。
【００７７】
成長培地を除き、無血清培地で１回洗浄し、無血清ＤＭＥＭで希釈したベクター保存液を添加することにより、ＮＴニューロン（１ウェルあたり約１０５個）をＡＡＶ／ｈｕβＡＰＰＰＨ／ＫＡβベクターで形質導入する。３７℃で９０分間インキュベートした後、１０％ＦＢＳを含む１ｍＬのＤＭＥＭを各ウェルに加える。各培養には２日後とそれ以降の毎週２回、培地交換を施す。
【実施例４】
【００７８】
細胞生存度測定
細胞の生存度は、コントロールとｈｕβＡＰＰＰＶＨ／ＫＡβＡＡＶベクター形質導入細胞のミトコンドリア機能に基づいて評価される。ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性のレベルを３−(４,５−ジメチルチアゾール−３−イル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを基質として比較した。デヒドロゲナーゼによる紫色のホルマザン生成物へのその切断を、分光測光的に５７０ｎｍで定量する。
【００７９】
結合親和定数の検出と決定
分泌された組換え抗体（アンチセニリン）が、元のハイブリドーマ分泌抗体の結合特性を保っていることを確認するために、ＮＴ２形質導入細胞の培養培地を用いて、この実施例で前述したようにＥＬＩＳＡアッセイを行なう。
【００８０】
Ａβ機能の阻害を試験するための生物検定
分泌された抗体を、形質導入ＮＴ２細胞を培養した培養培地から単離する。生成した抗体と培養培地そのものを、Ａβ凝集又はＡβ誘導細胞毒性の阻害剤として、上記インビトロ生物検定の項に記述したように試験する。
【００８１】
一本鎖アンチセニリン抗体を脳内で発現させるトランスジェニックマウスの作出
ＳｃＦｖアンチセニリン遺伝子を、ＰｒＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がアンチセニリン遺伝子ＯＲＦで置換されるように、ハムスタープリオンタンパク質（ＰｒＰ）コスミドベクターに挿入する。Brinsterら（1981）、Harbersら（1981）、Wagnerら（1981）、Gordonら（1976）、Stewartら（1982）、Palmiterら（1983）及び米国特許第4,870,009号などの広く使用されている方法のいずれかに従い、Ｃ５７Ｂ６ＳＪＬマウスの受精１細胞卵への微量注射によってトランスジェニックマウスを作出するために、上記導入遺伝子を使用する。得られた子孫（ＴＧＳｃＦｖＡ）を標準的なＰＣＲ増幅法を使った遺伝子型判別によって調べる。
【００８２】
αβ抗体のアンチセニリンとしての潜在的治療能力を確証するための動物モデル
インビボ抗Ａβ抗体の発現について試験し、それらがアミロイド斑の蓄積を減速させる可能性を示して脳におけるＡＤ様病変の発生を防止するかどうかを決定するには、動物モデルが必要である。ＡＤはヒト独自の疾患であるが、ヒトβＡＰＰを過剰発現させるいくつかのトランスジェニックマウスが有望である。
【００８３】
斑負荷量と関連ＡＤ病理トランスジェニックマウスに対する慢性Ａβ枯渇の効果
Ｌｙｓ６７０からＡｓｎ及びＭｅｔ６７１からＬｅｕへの突然変異を含有するアルツハイマーβＡＰＰの６９５アミノ酸イソ型（Hsiao, K., 1996，米国特許第08/664,872号）を過剰発現させるトランスジェニック動物マウスモデルで、組換えＡβ末端特異抗体のアンチセニリン機能を試験する。これらのトランスジェニックマウス（ＴＧ２５７６）におけるアルツハイマー病の行動的、生化学的及び病理学的異常の相関的出現は、この疾患のＡβ誘導性の病態生理を減速又は防止する薬剤の有用性を探索する機会を与える。
【００８４】
アンチセニリン遺伝子に関して同型接合の雌性トランスジェニックマウス（ＴＧＳｃＦｖＡ）を繁殖用ＴＧ２５７６雄性マウスと交配する。アンチセニリン遺伝子と変異型ＡＰＰ遺伝子の両方を発現させる子孫を、行動的、生化学的及び病理学的異常に関してＴＧ２５７６マウスと比較する。
【００８５】
本発明を完全に説明し終えたので、本発明の思想と範囲から逸脱することなく、また必要以上の実験を行なうことなく、広範囲にわたる等価なパラメーター、濃度及び条件で本発明を実施できることは当業者には理解されるだろう。
【００８６】
本発明を特定の態様に関して説明したが、さらなる変更が可能なことは理解されるだろう。本願は全体として本発明の原理に従うあらゆる変形、使用又は適応を、本発明が属する技術分野で既知又は慣例の実施に含まれることになるような及び下記請求の範囲に記載する基本的特徴に当てはまりうるような本明細書からの逸脱を含めて、包含するものとする。
【００８７】
雑誌の記事又は抄録、公表済又は未公表の米国又は他国の特許出願、発行された米国又は他国の特許又は他の任意の文献など、本明細書で引用した全ての文献は、引用文献に記載の全てのデータ、表、図及び本文を含めて、参照によりそのままここに組み込まれる。また本明細書で引用した文献で引用されている文献の全内容も参照によりそのまま組み込まれる。以下、本明細書中に引用する文献を、表１〜８中にまとめて記載する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００８８】
既知の工程、従来の工程、既知の方法又は従来の方法への言及は、決して、本発明の何らかの側面、説明及び態様が関連技術に開示、教示又は示唆されていることを容認するものではない。
【００８９】
上述した特定態様の説明は本発明の一般的性質を完全に明らかにするだろうから、当技術分野の知見（ここに引用した文献の内容を含む）を応用することにより、誰でも容易に、不必要な実験を行なうことなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定態様を変更しかつ／または様々な応用に適応させることができる。したがってそのような適応や変更は、ここに記載した教示内容と指針に基づいて、開示した態様の均等物の意味と範囲内にあるものと解釈される。本明細書における表現や用語は説明のためであって限定のためではないと理解されるべきであり、したがって当業者は本明細書の用語や表現を、当業者の知識と共に、ここに記載した教示内容と指針に照らして解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）と、α−、β−及びγ−セクレターゼ切断の各産物を表す略図である。様々なドメインの一般的位置をセクレターゼ切断部位（α、β、γ）と共に示す。図１には、ＣＮＳにおける異所性Ａβ末端特異抗体の安定な発現と分泌が、可溶性β−アミロイド前駆体タンパク質の生物学的機能に影響を与えることなく、（１）Ａβペプチドの蓄積と（２）アミロイド沈着の神経毒性的結果を抑制することも図示されている。
【図２】図２は、βＡＰＰ中にあってそこからβ−アミロイドペプチド（Ａβ）が派生する領域のアミノ酸配列（配列番号１）である。矢印はα−、β−又はγ−セクレターゼ切断部位を示し、免疫原として使用される合成ペプチドに対応するアミノ酸残基を配列の下に線分で示す。
【図３】図３は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を持つ抗体全体（Ａ）、Ｆａｂ断片（Ｂ）、Ｆｖ断片（Ｃ）及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（Ｄ）の各構造を示す略図である。図Ｂに示すＦａｂ断片は、ジスルフィド架橋で連結された重鎖可変ドメインＶＨ、軽鎖可変ドメインＶＬ及び第一定常ドメイン（ＣＨ１及びＣＬ）からなる。図Ｃに示すＦｖ断片は、非共有結合的に連結された可変領域複合体（ＶＨ−ＶＬ）によって形成される抗体の抗原結合性部分を表し、図Ｄに示す一本鎖Ｆｖでは可変重鎖ＶＨがペプチドリンカーを介して可変軽鎖ＶＬに結合していることを表す。
【図４】図４は、末端特異抗Ａβモノクローナル抗体の可変領域をプライマーＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを使ったＰＣＲ増幅法でクローニングし、次に可変重鎖ＶＬと可変軽鎖ＶＬを鎖間ペプチドリンカー（ＩＣＬ）で互いに連結することによるｓｃＦｖ抗体の構築を表す略図である。陰影をつけた領域は抗原結合部位の超可変領域を表し、ＬＰは重鎖及び軽鎖のリーダーペプチドを意味する。
【図５】図５は、表示の、逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ヒトβＡＰＰプロモーター（ＨｕβＡＰＰＰ）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）を持つＡＡＶ  ＳｃＦｖαＡβベクターの略図である。プラスミド主鎖はｐＳＳＶ９である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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