(57)【要約】【課題】安価な装置によって特定の細胞に対して選択的に薬剤を導入することができる薬剤導入方法及び薬剤導入装置を提供すること。【解決手段】生体組織に治療用遺伝子等の薬剤をシリンジにて注入して、薬剤を導入したい細胞の近傍に定位させておいて、その細胞近傍の色素（ヘモグロビンなど）をターゲットとしてパルス幅が100 ps以上のレーザー光を照射することにより細胞内へ薬剤導入を行う。レーザーパルスはその色素により選択的に吸収され（線形吸収）、温度上昇及び圧力波（熱弾性波）が誘起される。これらにより細胞膜の透過性を増大させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤を導入する細胞の近傍に該薬剤を定位させ、該細胞の近傍に存在する光吸収体に吸収される波長のレーザー光を照射して、ヒト以外の生物の細胞に薬剤を導入することを特徴とする薬剤導入方法。
【請求項２】
前記光吸収体がタンパク質である場合には前記波長は400 nm以下の紫外線領域のものであり、前記光吸収体が血液である場合には前記波長は400 - 600 nmであり、前記光吸収体が水である場合には前記波長は1500 nm以上の赤外線領域のものであることを特徴とする請求項１記載の薬剤導入方法。
【請求項３】
前記レーザー光は、0.1 mJ/cm2 - 10 J/cm2のレーザーフルエンスであることを特徴とする請求項１又は２記載の薬剤導入方法。
【請求項４】
前記レーザー光は、100 ps - 1 msのパルス幅のパルスレーザー光であることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の薬剤導入方法。
【請求項５】
400 - 600 nmの波長、及び100 ps - 1 msのパルス幅のパルスレーザー光を発生するレーザー発振器と、
該レーザー発振器からのレーザー光を導光する光ファイバと、
該光ファイバからのレーザー光を0.1 mJ/cm2 - 10 J/cm2のレーザーフルエンスで照射するレンズとを備え、ヒトを含む生物の細胞に薬剤を導入することを特徴とする薬剤導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤導入方法及び薬剤導入装置、特に特定の細胞に対して選択的に薬剤を導入することができる薬剤導入方法及び薬剤導入装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は薬剤輸送技術の適用が必要な代表的な治療法である。遺伝子治療を成功させるには、安全で効率的な遺伝子導入法の開発が必要不可欠である。現在導入効率が高いことからウイルスベクター法が用いられることが多いが、ウイルスを使用するという以上、安全性に問題がある。そのため化学的又は物理的遺伝子導入法の開発が注目を集めているが、これらの導入効率及び選択性は不十分である。特に物理的方法では体内での使用に問題が残る。たとえば電気せん孔法（electroporation）や超音波では電気エネルギーを必要とするので、心臓などの電気に感受性の高い臓器には不安が残る。遺伝子銃は開胸を必要とする上、エネルギー源であるアルゴンガスの体内での使用は認められていない。レーザーによる遺伝子導入法はこれまで報告例が少ないが、高い空間制御性や光ファイバの利用による内視鏡又はカテーテルへの適用が期待されている。
【０００３】
レーザーによる遺伝子導入法の具体例として、超短パルス（フェムト秒）レーザーを用いたin vivo遺伝子導入法が提案されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
この従来の提案では、生体組織にプラスミドＤＮＡをシリンジにて注入し、そこにパルス幅がフェムト秒のレーザーパルスを照射することにより細胞内へ遺伝子導入を行う。多光子吸収により細胞膜に光学的絶縁破壊を誘起させ、小孔を形成させる。そこを遺伝子が拡散することにより、細胞内へ導入される。多光子吸収とは、光の吸収体がｎ（ｎは２以上の自然数）個の光子（フォトン）を同時に吸収することにより、実際に照射した光のｎ倍のエネルギー（１／ｎの波長）に相当する吸収が生じる現象である。
【非特許文献１】E. Zeira, 外9名, “Femtosecond infrared laser-An efficient and safe in vivo gene delivery system for prolonged expression”, Molecular Therapy, 2003年8月, vol.8, no.2, p.342-350.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、非特許文献１に記載されている発明の場合には、
・多光子吸収を用いているので、遺伝子導入の細胞選択性が乏しく、レーザーが照射された細胞ほぼすべてに遺伝子が導入されてしまう。
・多光子吸収を誘起するために、高価で大型の高強度フェムト秒パルスレーザー装置が必要である。
【０００６】
本発明は、上記問題点に鑑み、安価な装置によって特定の細胞に対して選択的に薬剤を導入することができる薬剤導入方法及び薬剤導入装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の薬剤導入方法は、薬剤を導入する細胞の近傍に該薬剤を定位させ、該細胞の近傍に存在する光吸収体に吸収される波長のレーザー光を照射して、ヒト以外の生物の細胞に薬剤を導入することを特徴とする。
【０００８】
また、前記光吸収体がタンパク質である場合には前記波長は400 nm以下の紫外線領域のものであり、前記光吸収体が血液である場合には前記波長は400 - 600 nmであり、前記光吸収体が水である場合には前記波長は1500 nm以上の赤外線領域のものであることで、体内の各細胞に選択的に薬剤を導入することができる。
【０００９】
また、前記レーザー光は、0.1 mJ/cm2 - 10 J/cm2のレーザーフルエンスであることで、細胞の組織損傷を引き起こさずに薬剤を導入することができる。
【００１０】
また、前記レーザー光は、100 ps - 1 msのパルス幅のパルスレーザー光であることで、効率的にレーザーエネルギーを音響エネルギーに変換することができる。
【００１１】
また、本発明の薬剤導入装置は、400 - 600 nmの波長、及び100 ps - 1 msのパルス幅のパルスレーザー光を発生するレーザー発振器と、該レーザー発振器からのレーザー光を導光する光ファイバと、該光ファイバからのレーザー光を0.1 mJ/cm2 - 10 J/cm2のレーザーフルエンスで照射するレンズとを備え、ヒトを含む生物の細胞に薬剤を導入することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、
・生体組織由来の吸収を利用するので、薬剤導入の細胞選択性が高い。このため、血管付近の細胞に選択的にVEGF(内皮細胞増殖因子)遺伝子等を導入することが可能であり、血管新生を促し閉塞性動脈硬化症などの治療に役立つ。
・線形吸収を利用するので、フェムト秒レーザーを用いた場合に比べ低強度のシステムが構築できる。
・装置が安価で小型になる。
・フェムト秒レーザー装置に比べ、動作が安定する。
・100 ps以上のレーザーパルスはファイバによる伝送が容易なので、内視鏡又はカテーテル的薬剤導入装置が実現できる。これにより虚血性心疾患、癌治療に応用ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
・パルス幅が100 ps以上のレーザー光を用いた薬剤導入方法
生体組織に治療用遺伝子等の薬剤をシリンジにて注入して、薬剤を導入したい細胞の近傍に定位させておいて、その細胞近傍の色素（ヘモグロビンなど）をターゲットとしてパルス幅が100 ps以上のレーザー光を照射することにより細胞内へ薬剤導入を行う。レーザーパルスはその色素により選択的に吸収され（線形吸収）、温度上昇及び圧力波（熱弾性波）が誘起される。これらにより細胞膜の透過性を増大させる。体温プラス数度（約42 ℃）への加熱は、細胞へのダメージが少なく、細胞膜の流動性を増加させる。また圧力上昇は細胞膜の透過性を増大させる。本実施例はこれらを同時に誘起させる。これらの作用を誘起するために薬剤を導入したい細胞の近傍の色素に適したレーザーの波長、強度、パルス幅等の選択が重要である。加熱・圧力上昇の過度の適用は、細胞死を招く。許容範囲内での条件設定が必要である。
(1).波長：細胞選択性に重要である。薬剤を導入したい細胞の近傍に存在する色素に特異的な吸収を示す波長が望ましい。たとえば、タンパク質を利用する場合には400 nm以下の紫外線領域のレーザー光、血液を利用する場合には波長400 - 600 nmのレーザー光、水を利用する場合には波長1500 nm以上の赤外線領域のレーザー光が適している。
(2).強度：主に導入効率に影響を与える。光熱的・機械的作用（温度上昇・圧力上昇）はレーザーの波長、強度に依存する。一般にレーザー波長は自由に選択するのが困難であるため、所望の効果を期待する場合、主にレーザーフルエンスを制御する。しかし過剰な光エネルギーの照射は組織損傷を引き起こしてしまう。そのため本方法では、0.1 mJ/cm2 - 10 J/cm2のレーザーフルエンスが適している。
(3).パルス幅：主に導入効率に影響を与える。加熱による細胞死の割合は温度上昇×加熱時間に依存する。また特に重要なのが光機械的作用への影響である。効率的にレーザーエネルギーを音響エネルギーに変換するためには、100 ps - 1 msのパルス幅が望ましい。
【００１４】
一例：
ラット皮膚に遺伝子を導入したい場合には、真皮内の血液に選択的に吸収される400 - 600 nmの波長のレーザー光が望ましい。導入効率及び細胞生存率を高くするためには、強度105 - 109 W/cm2（エネルギー約1 mJ - 100 mJ）、パルス幅1 ns - 100 ns、パルス数1 - 1000が望ましい。これらを満たす光源の一つとして、Q-スイッチNd:YAGレーザーの第二高調波が挙げられる。
【００１５】
本方法により、ラット皮膚へルシフェラーゼ遺伝子（プラスミド）の導入を試みた。ルシフェラーゼ（ホタルの発光器官よりクローニング）をコードした遺伝子50 μgをラット皮膚にシリンジで注入後、Q-スイッチNd:YAGレーザーの第二高調波を照射した。結果を図１に示す。縦軸は遺伝子が導入されることにより発現したタンパク質の発光を分光光度計により定量化し、バックグラウンド値を引いた値、横軸はレーザーフルエンスである。直線はレーザーパルスを１００発照射したとき、点線は１０発照射したときの値を示す。０パルスは非レーザー適用群である。レーザーフルエンス0.14 J/cm2のレーザーパルスを１００発照射したとき、非レーザー適用群に比べて遺伝子の発現レベルが２桁以上増大していることがわかる。また別の実験から、遺伝子の発現部位はレーザー光が照射された場所に限定されることがわかった。さらに真皮内の血管付近に導入されることがわかった。
・パルス幅が100 ps以上のレーザーを用いた薬剤導入装置
図２は、本発明の実施例による薬剤導入装置の構成を示す図である。上記方法を実現するために、本薬剤導入装置は、パルスレーザー発振器１０、レーザー光を光ファイバへ入射させるためのレンズ２０、レーザー光を任意の場所に導光させる光ファイバ３０、及び照射面積を制御するレンズ４０を備える。パルスレーザー発振器１０は上記の波長及びパルス幅のパルスレーザーを発振して出射する。レンズ４０によって上記の強度のパルスにして照射する。
【００１６】
本方法は超短パルスレーザーを用いた場合と異なり、レーザーパルスのファイバ伝送が可能である。
【００１７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
上記実施例は生体組織内に薬剤を注入しておいてからレーザー光を照射するものであるが、外皮の上に薬剤を塗布するなどして定位させておいて、その上に黒い色素を混ぜた薄い材料を固定して、その材料の上からレーザー光を照射してもよい。この場合には、レーザー光の波長は任意のものでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】遺伝子発現レベルのレーザーフルエンス依存性を示す図である。
【図２】本発明の実施例による薬剤導入装置の構成を示す図である。
【符号の説明】
【００２０】
１０  パルスレーザー発振器
２０  レンズ
３０  光ファイバ
４０  レンズ
【図１】
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【図２】
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