(57)【要約】【課題】高効率な生物電気化学的水素生産方法を提供する。【解決手段】  有機性基質を含む溶液中に、可逆的酸化還元が可能なメディエータ物質及び水素生産菌群を加え、メディエータを電子受容体とした呼吸を行わせて水素の原料となる還元力をより多く生産させて水素を生産する生物電気化学的水素生産方法。【選択図】 １【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物を用いて有機性基質含有液体から水素を生産する方法であって、該液体に電子受容体として可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を添加することを特徴とする、水素生産方法。
【請求項２】
還元型メディエータ物質を酸化型に再生する手段を含む、請求項１に記載の水素生産方法。
【請求項３】
還元型メディエータ物質を酸化型に再生する手段が陽極酸化であることを特徴とする、請求項２に記載の水素生産方法。
【請求項４】
メディエータ物質、及び／又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物群を、陽極上に固定化して用いることを特徴とする請求項３に記載の水素生産方法。
【請求項５】
陽極及び陰極を備え、かつ水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質、および有機性基質を含む水素発生系を有するとともに、上記電極間に電流を導通する手段を設けたことを特徴とする、水素生産装置。
【請求項６】
陽極及び陰極を隔膜により隔離して陽極槽及び陰極槽を形成するとともに、陽極槽側に上記水素発生系を形成させることを特徴とする、請求項５に記載の水素生産装置。
【請求項７】
陽極上に、メディエータ物質、及び又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物が固定化されていることを特徴とする、請求項５又は６に記載の水素生産装置。
【請求項８】
正極及び負極を備え、かつ水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質、および有機性基質を含む溶液を収容することを特徴とする、生物電池。
【請求項９】
正極及び負極を隔膜により隔離して正極槽及び負極槽を形成し、陽極槽側に水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、及び可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を含有させることを特徴とする、生物電池。
【請求項１０】
負極上に、メディエータ物質、及び／又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物が固定化されていることを特徴とする、請求項８又は９に記載の生物電池。
【請求項１１】
水素生産を伴うことを特徴とする、請求項８〜１０のいずれかに記載の生物電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物による水素生産に関わり、特に有機性基質から水素生産菌あるいは該微生物を含む混合菌による水素生産を行わせる方法及び装置、並びに生物電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石燃料に代替するエネルギー源として、水素エネルギーが注目されている。水素は燃焼した場合に炭酸ガスを放出せず、単位重量当たりの発熱量は石油の三倍である。従来、水素はナフサの熱分解や水の電気分解から生産されているが、化石燃料を用いない微生物を利用した水素生産方法が重要となっている。
【０００３】
微生物を利用した水素生産方法として、光合成微生物を利用するものと嫌気性微生物を利用するものがある。嫌気性微生物を利用した水素生産は、光合成微生物を利用した水素生産に比べて水素生産速度が速く、多様な基質を利用できるという利点を有している。
【０００４】
嫌気性微生物を利用した水素生産方法として、これまでに水理学的滞留時間の調節によるメタン発酵微生物群からの水素生産方法（特許文献１参照）、偏性嫌気性の従属栄養性水素生産菌であるクロストリジウム属の微生物群と水素生産性光合成微生物である紅色硫黄細菌クロマチウム属及び／又は藍藻オッシラトリア属の微生物群とを嫌気暗条件下で共存させて混合培養する水素生産方法（特許文献２参照）、有機性基質として予め炭素換算で供給される有機性基質の10〜30%に相当する量の乳酸又は乳酸とギ酸の混合物が存在するように調節した有機性基質を用いた水素生産方法（特許文献３参照）等が提案されている。
【０００５】
しかしながら、嫌気性微生物からの水素生産は水素収率が低く（1〜2 mol/molヘキソース）、副産物として多くの有機酸を生成する。そのために水素生産菌を用いて敢えて水素生産を行う利点が少なく、嫌気性微生物を用いた有機性基質からの水素生産技術の開発を阻んでいる。
【特許文献１】特開2002-272491号公報
【特許文献２】特開平8-294396号公報
【特許文献３】特開平8-28093号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、このような従来法の問題点を解決することを目的とするものであり、特に嫌気性の水素生産菌に多くの還元力（ＮＡＤＨ等）を生産させ、その還元力から水素を効率良く生産させることをその課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意研究の結果、水素生産菌及び有機基質を含有する水素発生系に可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を存在せしめることにより、水素生産が効率的に行われることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）の構成を伴う。
（１）  水素生産菌あるいは該水素生産菌を含有する混合微生物を用いて有機性基質含有液体から水素を生産する方法であって、該液体に電子受容体として可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を添加することを特徴とする、水素生産方法。
（２）  還元型メディエータ物質を酸化型に再生する手段を含む、上記（１）に記載の水素生産方法。
（３）  還元型メディエータ物質を酸化型に再生する手段が陽極酸化であることを特徴とする、上記（２）に記載の水素生産方法。
（４）メディエータ物質、及び／又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物群を、陽極上に固定化して用いることを特徴とする、上記（３）に記載の水素生産方法。
（５）  陽極及び陰極を備え、かつ水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質、および有機性基質を含む水素合成系を有するとともに、上記電極間に電流を導通する手段を設けたことを特徴とする、水素生産装置。
（６）  陽極及び陰極を隔膜により隔離して陽極槽及び陰極槽を形成するとともに、陽極槽側に上記水素発生系を形成させることを特徴とする、上記（５）に記載の水素生産装置。
（７）  陽極上に、メディエータ物質、及び／又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物が固定化されていることを特徴とする、上記（５）又は（６）に記載の水素生産装置。
（８）  正極及び負極を備え、かつ水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質、および有機性基質を含む溶液を収容したことを特徴とする、生物電池。
（９）  正極及び負極を隔膜により隔離して正極槽及び負極槽を形成し、陽極槽側に水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物、及び可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を含有せしめたことを特徴とする、上記（８）に記載の生物電池。
（１０） 負極上に、メディエータ物質、及び／又は水素生産菌あるいは水素生産菌を含有する混合微生物が固定化されていることを特徴とする、上記（８）又は（９）に記載の生物電池。
（１１）水素生産を伴うことを特徴とする、（８）〜（１０）のいずれかに記載の生物電池。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を水素生産菌の最終的な電子受容体とすることにより、水素生産菌による水素収率を大幅に増大することができる。また、メディエータ物質の使用により効率的な水素生産装置、及び生物電池を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、人工的なメディエータ物質を水素生産菌あるいは該水素生産菌を含有する混合微生物と共存させ、水素生産菌にメディエータ物質を電子受容体とした呼吸を行わせることをその基本的な構成とするものである。
これをさらに具体的に説明する。例えば水素生産菌として代表的な、エンテロバクター属等の通性嫌気性菌による水素生産は、無酸素あるいは低酸素条件下で行うため、酸素を最終受容体とする電子伝達系が働かず、またこの電子伝達系の電子供与体であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の主な供給手段であるＴＣＡサイクルも充分機能しておらず、嫌気性菌は主として解糖系（発酵）により、有機性基質から必要なエネルギーを取り出している。このため、還元力（ＮＡＤＨ等））の産生量は少く、有機性基質の化学エネルギーの多くは有機酸の生成に使われてしまい、水素生産のエネルギー効率は低い。
【００１０】
すなわち、水素生産菌の嫌気性条件下での水素生産は、グルコースを基質としたとき、以下の反応式で示され、理論上、１分子のグルコースから４分子の水素しか産生されない。
【化１】
2005034044.tif 000002
これに対して、本発明においては、水素生産菌に、電子伝達系の最終電子受容体である酸素の代わりに可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質を用いて呼吸を行わせることにより、電子伝達系を働かせてＴＣＡサイクルを有効に機能させることを特徴とするものである。そして、このＴＣＡサイクルにより、多くの還元力（ＮＡＤＨ等）を生成させ、該還元力から、ヒドロゲナーゼの作用を介して、水素（Ｈ２）産生させるものであり、これにより水素生産のエネルギー効率は大幅に向上する。
【００１１】
本明細書でいう「可逆的酸化還元能を有するメディエータ物質」とは、生物の基質や生物反応には直接関与してない化学物質であり、かつ、酸化反応及び還元反応を行うことができ、可逆的に酸化型あるいは還元型の形態をとり得る化学物質をいう（以下、単にメディエータ物質という。）。
【００１２】
本発明において用いられる代表的なメディエータ物質としては、ジクロロフェノールインドフェノール（2,6-Dichlorophenol-indophenol）、チオニン（Thionin）、サフラニンO（Safranin O）、メチレンブルー（Methylene Blue）、鉄(III)イオン等がある。
【００１３】
本明細書でいう「水素生産菌」とは、水素を生産することができる微生物をいい。代表的なバクテリアとしては、例えば、Enterobacter aerogenes、等の通性嫌気性の水素生産菌が挙げられる。また、本発明における微生物は、単一の分離菌を使用してもよいが、これに限らず、少なくとも一種以上の水素分離菌を含む混合微生物を用いてもよい（以下、この混合微生物を含めて水素生産菌という。）。このような混合微生物としては、エンテロバクタ属菌及びクロストリジウム属菌等からなる混合菌、あるいは汚泥の調製物等が挙げられる。
【００１４】
本発明の水素合成系は、少なくとも、水素生産菌、この水素生産菌に資化されうる有機性基質及びメデイエーター物質を含む。例えば、本発明における水素生産は、水素生産菌を、この水素生産菌に資化されうる有機性基質及びメディエータ物質を含有する水性溶液中で培養することにより行われる。この溶液中には、窒素源、あるいは他の微量栄養源を添加できる。本発明の有機基質としては、例えば、グルコース等の糖類、多糖類、グリセロール等が挙げられるが、これらを含む有機性廃棄物あるいは廃水等も利用できる。
【００１５】
また、本発明の方法においては、上記メディエータ物質を、水素生産菌の電子伝達系の最終段階において、酸素の代わりに電子受容体とするものであり、酸化型のメディエータ物質が電子受容体となり、電子の授与により還元型に変換される。
したがって、この還元型のメディエータ物質を再び酸化型に戻す酸化手段を設けることが効率的であり、このため例えば、上記水素合成系を含む溶液を収容する水素発生槽に、電極を設け、陽極においていわゆる陽極酸化を行い、酸化型メディエータ物質を再生するのが好ましい。
【００１６】
このような電極を用いる場合においては、陰極側（後記する電池の場合は正極）で生じた物質が陽極若しくはメディエータ物質に作用するのを防止するために、陰極と陽極の間にイオン交換膜等の隔膜を設けることが好ましい。
また、メディエータ物質及び水素生産菌を装置外に流出させずに高濃度に維持するために、水素生産菌又はメディエータ物質、あるいはその両方を陽極上に固定化することが好ましい。これは、連続的な水素生産を行う場合に有利である。メディエータ物質及び／又は水素生産菌を陽極上に固定するためには、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリ−スチレンスルフォネート等のポリイオンを有する樹脂、水素生産菌の菌体および／又はメディエータ物質を混合し、陽極表面上に塗布することにより、上記菌体及び／又はメディエータ物質が陽極上のポリイオン膜中に固定化された固定化電極を得ることができる。
【００１７】
本発明の方法を実施するための水素生産装置について、図１の装置を例に以下説明する。
図１の装置においては、陽極２と陰極３が密閉可能な水素発生槽内に設けられ、水素発生槽においては陽極と陰極の間に隔膜１１を設け、陽極槽と陰極槽に仕切られている。陽極槽においては、溶液１３中に、有機性基質のほか、水素生産菌９及びメディエータ物質１０が懸濁、溶解され、該溶液はｐＨ制御装置６により水素生産菌に好適なｐＨに維持される。また、水素発生槽においては、攪拌手段７、溶液サンプル取り出し口８、ガス取り出し口５、及び参照電極４が設けられ、参照電極４は電源であるポテンショスタット１に接続している。
【００１８】
次に本装置の作動について説明する。
水槽発生槽の陽極槽において、撹拌棒７によって溶液を混合しながらpH制御装置６で適当なpHに溶液を保ちながら水素生産菌を培養する。水素生産菌９は、酸化型のメディエータ物質を電子受容体として呼吸を行い。ＴＣＡサイクルにより多量の還元力（ＮＡＤＨ）を生成して、水素を発生するが、この呼吸により電子が供与されたメディエータ物質は還元型となる。
【００１９】
一方、ポテンショスタット１により参照電極４を介して、陽極に電位をかけ、電極間に電流を導通する。還元型に変換されたメディエータ物質１０は、この陽極２により陽極酸化されて酸化型に再生され、再び電子受容体として使用される。水素生産菌およびメディエータ物質は、隔膜により陰極槽への移動が制限され、陽極槽にとどまるが、この隔膜は、陰極からの電子供与により、競合的に水素生産菌からのメディエータ物質への電子供与が妨げられることにより、電子伝達系が不活化するのを防止するとともに、酸化型に変換されたメディエータ物質１０が陰極の電子放出により還元され、電子受容体となる酸化型メディエータ物質が減少することを防止するものである。このような機能は水素生産菌及び／またはメディエータ物質を固定化することによっても達成される。
上記のように構成した装置により生成した水素は、ガス取り出し口５から採取する。
【００２０】
一方、メディエータ物質の使用は、生物電池を得る上でも有用である。
この生物電池は、例えば、密閉型の水素発生槽とその内部に配置した正極、負極となる電極からなり、この水素発生槽に、少なくとも水素生産菌、メディエータ物質及び有機性基質を、他の栄養源とともに懸濁あるいは溶解して収容したものである。この装置においては、正極と負極を隔てる隔膜を設けるかことが望ましく、また負極に水素生産菌及びメディエータ物質を固定化することが好ましい。すなわち、基本的には、上記した水素生産装置から、上記水素生産装置からポテンショスタット及び参照電極等からなる電流導通手段を除くことによっても構成することができる。
【００２１】
この電池の作動について説明すると、水素生産菌は、酸化型のメディエータ物質を電子受容体として呼吸を行い、ＴＣＡサイクルにより多量の還元力（ＮＡＤＨ）を生成して、水素を発生するが、この呼吸により電子が供与されたメディエータ物質は還元型となる。
この還元型のメディエータ物質は溶液に溶解または負極上に固定化されており、それ自身は負極に電子を与え、酸化型に戻る。このとき電池の正極としては酸素電極が好ましいが、負極側のメディエータ物質よりも高い酸化還元を持った反応を行わせてもよい。
【００２２】
この還元型メディエータ物質から負極に対する電子供与により、負極と正極間に電流が流れ、生物電池となる。この生物電池においては、水素を生産しながら、電流を発生させることが可能であり、水素生産装置と生物電池が組み合わされた装置ということができる。ただし、この装置の水素生産と、得られる電流は、競合関係にあり、電流を取り出ししすぎれば、水素生産量は減少する。
メディエータは負極溶液中に溶解し、負極と生物内の反応との間の電子の運搬を繰り返し行うことができる。したがって、長期間安定なメディエータを用いることにより、メディエータが系外に流出しない限り、運転途中で新たにメディエータを添加する必要はない。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は特に実施例に限定されるものではない。      
【実施例１】
【００２３】
本実施例においては、酸素の代わりの電子受容体となるメディエータ物質を水素生産菌群と共存させることにより、水素ガス生産量が増大することを確認するため、図２に示すバッチ式リアクターを用いて実験を行った。この実験に用いたバッチ式リアクターは、密閉可能な容器１４と、該容器で発生したガスを貯留するサンプルガスバック１５とからなり、該バック１５中のガスはガスクロマトグラフ１６により分析可能に構成されている。
本実験では、水素生産菌としてEnterobacter aerogenes NBRC12010を用いた。また反応溶液として蒸留水中にポリペプトン 2.5 g、酵母エキス 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.25 g、グルコース 3.75 g及び種々のメディエータ0.1 mMを加えてpH 7.0に調整した250 mlの溶液を用いた。該溶液をリアクターの容器１に収容し、インキュベーター内でリアクターを30℃に保ち、20 時間静置した。
【００２４】
20時間静置した後、ガスサンプルバック１５からガスを引き抜いてガスクロマトグラフ１６によりガス成分を分析するとともにガス生成量を測定した。表１に、メディエータを加えない場合（Controlと表記する）の水素生産量とメディエータ物質（0.1 mM）としてジクロロフェノールインドフェノール（DCPIPと略す）、チオニン（THと略す）、サフラニンO（SOと略す）を添加した場合の水素生産量を示す。水素生産量は５回の測定を平均したものである。
【００２５】
表１  種々の条件下での水素生産量
条件 水素生産量（ml）
Control      20.4
DCPIP        66.2
TH           26.9
SO           29.5
【００２６】
表１から明らかなように、これらのメディエータ物質を添加することによって水素生産量が増大した。特にDCPIPを添加した場合はControlに比べて３倍以上の水素が生産された。表１では0.1 mMの濃度のメディエータを添加した場合の測定結果を示したが、メディエータ物質によって水素生産量が最大となる濃度が異なることが実験から見いだされている。
なお、本実施例ではバッチ式を示したが、連続的に有機性基質を供給することにより連続水素生産を行わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の水素生産装置の一例を示す図である。
【図２】本実施例に使用した水素生産装置（バッチ式リアクター）を示す図である。
【符号の説明】
【００２８】
１．  ポテンショスタット等の電源
２．  陰極
３．  陽極
４． 参照電極
５． サンプルガス取り出し口
６． pH制御装置
７． 撹拌棒
８． 溶液サンプル取り出し口
９． 水素生成菌群
１０． メディエータ
１１． 隔膜等
１２． 気相部
１３． 液相部
１４． 密閉可能な容器
１５． ガスサンプルバック
１６． ガスクロマトグラフ
【図１】
2005034044.tif 000003
【図２】
2005034044.tif 000004