(57)【要約】 【課題】ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく検出する方法を提供する。また、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出試薬キットを提供する。【解決手段】  ＫＲＡＳ遺伝子に作用し、塩基配列にミスマッチを導入した核酸増幅プライマーを含む核酸増幅用プライマーセット用いてＫＲＡＳ遺伝子を増幅する。【選択図】  図１
2005192420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出するために用いられる核酸増幅用プライマーであって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が特定の第１の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が特定の第２の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該核酸増幅用プライマー含む核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が、当該特定の第１の制限酵素にも当該特定の第２の制限酵素にも認識されることにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成することを特徴とする核酸増幅用プライマー。
【請求項２】
配列番号２で表され、前記特定の第１の制限酵素がＭｖａ１又はＢｓｔＮ１であり、前記特定の第２の制限酵素がＢｇｌ１であることを特徴とする請求項１記載の核酸増幅用プライマー。
【請求項３】
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出するために用いられる核酸増幅用プライマーセットであって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が前記特定の第１の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が前記特定の第２の制限酵素により認識されず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物が、当該特定の第１の制限酵素にも当該特定の第２の制限酵素にも認識されることにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成することを特徴とする核酸増幅用プライマーセット。
【請求項４】
配列番号２及び３で表される核酸増幅用プライマーを含み、前記特定の第１の制限酵素がＭｖａ１又はＢｓｔＮ１であり、前記特定の第２の制限酵素がＢｇｌ１であることを特徴とする請求項３記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項５】
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する方法であって、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することにより、
当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成し、
その制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出することを特徴とするＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項６】
請求項３又は４記載の核酸増幅用プライマーセットを使用し、前記特定の第１の制限酵素としてＭｖａ１又はＢｓｔＮ１を用い、前記特定の第２の制限酵素としてＢｇｌ１を用いることを特徴とする請求項５記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項７】
以下の工程からなるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法：
（１）第１の工程：第１の核酸増幅用プライマーセットを用いて当該ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第１の制限酵素又は特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（２）第２の工程：１）第１の工程において当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該特定の第１の制限酵素で処理した反応液に対して、第２の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第１の制限酵素で処理する工程と、
２）第１の工程において当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、第３の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（３）第３の工程：当該第２の工程で得られたＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物の制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出する工程とからなり、
当該第１の工程において、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することを特徴とするＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項８】
前記第２の工程において、前記ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識し、前記ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３以外の箇所を前記特定の第２の制限酵素が認識することを特徴とする請求項７記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項９】
前記第１の工程及び前記第２の工程における前記ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅に、ネステッドＰＣＲ法、セミネステッドＰＣＲ法、ダブルＰＣＲ法のいずれかを用い、当該第１の工程において配列番号２及び３で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該第１の工程において前記特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該第２の工程において、配列番号２及び４で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該第１の工程において前記特定の第２の制限酵素で処理した場合には、当該第２の工程において、配列番号２及び５で表される核酸増幅用プライマーセットを用い、
当該特定の第１の制限酵素にＭｖａ１又はＢｓｔＮ１を用い、当該特定の第２の制限酵素にＢｇｌ１を用いることを特徴とする請求項７又は８記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項１０】
前記ＫＲＡＳ遺伝子が、血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液から選択されるいずれか１つに由来することを特徴とする請求項７から９のいずれか１項記載のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法。
【請求項１１】
配列番号２、３、４、及び５で表される核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットと、制限酵素Ｍｖａ１、ＢｔｓＮ１、Ｂｇｌ１と、ＤＮＡポリメラーゼを含むＫＲＡＳ遺伝子コドン１２及び１３の変異検出試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の臨床検査の分野において用いられる、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の突然変異（以下、適宜「変異」という。）の有無を一度の操作で判定する方法、これに用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を判定するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−ＭＡＰをカスケードとするリン酸化酵素の経路は、細胞の分化や成長、増殖を調節する重要な経路であることが知られている。ＲＡＳタンパク質をコードするＲＡＳ遺伝子は、ヒトの様々な腫瘍で突然変異が認められている遺伝子である。ＲＡＳ遺伝子に変異が起こると、細胞内のリン酸化が異常に亢進し、細胞の分化や成長、増殖等の調節機能が不全となることが知られている。ＲＡＳ遺伝子の変異は、ヒトの総ての腫瘍の１５％の頻度で起こっていることが報告されている。このように、ＲＡＳ遺伝子の変異は、ヒトの腫瘍の形成に深い関連があることが推測される。ＫＲＡＳ遺伝子の変異ではコドン１２及びコドン１３の変異は合わせて９０％以上を占めることが報告されている。従来、このコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法として、ダイレクトシーケンス法、ＭＡＳＡ法、ＲＦＬＰ法等が知られているが、いずれも、検出感度、検出に要する時間・コスト、その両方の点で問題がある。
また、近時、コドン１２の変異を再現性よく、高感度で検出する方法として、非特許文献１に記載される技術が知られている。
【非特許文献１】“Oncogene” 1991 Jun, 6 (6), 1079-1083
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上述の技術は、コドン１２の変異しか検出できず、コドン１３の変異を検出しようとすると、もう１回同様の検出操作が必要となり、検査の効率が低くなるという問題がある。そのため、コドン１２とコドン１３の変異を、同時に、再現性よく、高感度で検出する方法が求められている。
【０００４】
そこで、本発明の課題は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく検出する方法を提供することである。
さらに、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる実情において、本発明者は、ＫＲＡＳ遺伝子に作用し、塩基配列にミスマッチを導入した核酸増幅プライマーを含む核酸増幅用プライマーセット用いて、ネステッドＰＣＲ法、セミネステッドＰＣＲ法、ダブルＰＣＲ法のいずれかを用いてＫＲＡＳ遺伝子を増幅することにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく判定することができることを見出した。
【０００６】
即ち、この核酸増幅用プライマー、又はこの核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットによれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによるＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットによる当該ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識する。
【０００７】
そうすると、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、当該特定の第１の核酸増幅用プライマーセットが異なる配列のＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を生成することから、当該特定の第１の制限酵素は、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に基づいて、異なる長さの制限酵素断片を生成し、当該特定の第２の制限酵素は、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に基づいて、異なる長さの制限酵素断片を生成する。よって、その制限酵素断片を制限酵素断片長多型を用いて検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出でき、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で判定できる。
【０００８】
また、この核酸増幅用プライマーを用いたＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法では、
（１）第１の工程：第１の核酸増幅用プライマーセットを用いて当該ＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を前記特定の第１の制限酵素又は前記特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（２）第２の工程：１）第１の工程において当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、当該特定の第１の制限酵素で処理した反応液に対して、第２の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第１の制限酵素で処理する工程と、
２）第１の工程において当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、第３の核酸増幅用プライマーセットを用いてＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅を行い、その後、当該特定の第２の制限酵素で処理する工程と、
（３）第３の工程：当該第２の工程で得られたＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物の制限酵素断片を、制限酵素断片長多型を用いて検出する工程とを有し、
当該第１の工程において、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を当該特定の第１の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異があれば、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を当該特定の第２の制限酵素が認識せず、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がなければ、当該第１の核酸増幅用プライマーセットによる増幅産物を、当該特定の第１の制限酵素も当該特定の第２の制限酵素も認識することにより、当該ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無により、異なる長さの制限酵素断片を生成し、  その制限酵素断片を制限酵素断片長多型を用いて検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で判定することができる。
【０００９】
さらに、この核酸増幅プライマーセットを用いたＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法では、
前記第２の工程において、前記第１の工程で用いる核酸増幅用プライマーのミスマッチとは異なるミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む前記第２の核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、当該第２の工程においてコドン１２の変異に有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識し、前記第２の工程において、前記第１の工程で用いる核酸増幅用プライマーのミスマッチとは異なるミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む前記第３の核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、当該第２の工程においてコドン１３の変異に有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３以外の箇所を前記特定の第１の制限酵素が認識する。
【００１０】
この第２の工程では、当該第１の工程で当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して生成される、異なる制限酵素断片長のＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を増幅し、前記第１の工程で当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して生成される、異なる制限酵素断片長の増幅産物を増幅することになる。
【００１１】
この第２の工程では、前記第１の工程で当該特定の第１の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して生成される、異なる長さの制限酵素断片を増幅することになる。その結果、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無に起因して、異なる長さの増幅産物が多量に生成される。
そして、第３の工程で、この増幅産物を制限酵素で切断した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無をさらに高精度で判定することができる。
また、前記第２の工程を経る場合には、第１の工程のみ行った場合よりも、検出感度がより高いことから、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。
【００１２】
また、この第２の工程では、前記第１の工程で当該特定の第２の制限酵素で処理した場合には、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して生成される、異なる長さの制限酵素断片を増幅することになる。その結果、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無に起因して、異なる長さの増幅産物が多量に生成される。
そして、第３の工程で、この増幅産物を制限酵素で切断した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出することで、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無をさらに高精度で判定することができる。
また、前記第２の工程を経る場合には、第１の工程のみ行った場合よりも、検出感度がより高いことから、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。
このように、本発明では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、高精度で判定することができる。
【００１３】
本発明では、上述の核酸増幅用プライマーセットと、制限酵素と、ＤＮＡポリメラーゼを含むキットにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で精度よく判定することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出キットによれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく検出することができ、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、簡便に、再現性よく、かつ、精度よく判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（検出原理）
前述の通り、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子に作用し、塩基配列にミスマッチを導入した核酸増幅用プライマーを含む核酸増幅用プライマーセットを用いることにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する。
核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入し、遺伝子の２箇所の（コドンの）変異を一度の操作で検出する方法の一例を示す。
元々ある遺伝子を増幅する核酸増幅用のプライマーがある場合、その塩基配列の１又は２以上の塩基を変換する。そして、当該核酸増幅用のプライマーを含む核酸増幅用プライマーセット（第１の核酸増幅用プライマーセット）を用いて当該遺伝子を増幅したときに、当該遺伝子の特定の第１のコドンに変異があれば、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴った塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。また、当該核酸増幅用のプライマーを含む核酸増幅用プライマーセットを用いて当該遺伝子を増幅したときに、当該遺伝子の特定の第２のコドンに変異があれば、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴った塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。一方、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンにも当該特定の第２のコドンにも変異がなければ、当該核酸増幅用のプライマーセットは、その変異を伴わない塩基配列に基づいて当該遺伝子を増幅するようにする。
そうすると、当該特定の第１のコドンの変異の有無及び、当該特定の第２のコドンの変異の有無に基づいて、当該遺伝子の増幅産物は、塩基配列を異にするようになる。
【００１６】
次いで、こうして得られた当該遺伝子の増幅産物に対し、特定の第１の制限酵素又は特定の第２の制限酵素を作用させる。
このとき、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、ある特定の第１の制限酵素は認識せず、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第１の１箇所の回文構造を、当該特定の第１の制限酵素が認識するようになる。
【００１７】
そうすると、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は１つになるが、当該遺伝子の当該第１の特定のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この２つの断片の合計の断片長は、上の１つの断片長とほぼ等しくなる。
同様に、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、ある特定の第２の制限酵素は認識せず、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第２の１箇所の回文構造を、当該特定の第２の制限酵素が認識するようになる。
【００１８】
そうすると、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は１つになるが、当該遺伝子の当該第２の特定のコドンに変異がある場合には、その遺伝子の増幅産物の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この２つの断片の合計の断片長は、上の１つの断片長とほぼ等しくなる。
こうして、この遺伝子の特定の第１のコドンと特定の第２のコドンの２箇所の変異を一度の操作で検出でき、この遺伝子の特定の第１のコドンと特定の第２のコドンの２箇所の変異の有無を一度の操作で判定することができる。
【００１９】
（２次ＰＣＲ）
本発明では、上記のようにして、前記遺伝子の前記特定の第１のコドン、又は前記特定の第２のコドンのコドンに変異がある場合には、１つの長い制限酵素断片を生成し、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンにも当該特定の第２のコドンのコドンにも変異がない場合には、２つの短い制限酵素断片を生成するが、これらの制限酵素断片を、別の組み合わせの核酸増幅用プライマーセットを用いて増幅する。このとき、通常は、前記特定の第１の制限酵素で処理した制限酵素断片を増幅するための核酸増幅用プライマーセット（第２の核酸増幅用プライマーセット）と、前記特定の第２の制限酵素で処理した制限酵素断片を増幅するための核酸増幅用プライマーセット（第３の核酸増幅用プライマーセット）とは、異なる核酸増幅用プライマーセットとする。
【００２０】
前記第２の核酸増幅用プライマーセットの１の核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入する。今回は、その遺伝子の特定の第１のコドンの変異の有無によらず、前記特定の第１の制限酵素が、その増幅産物の中の前記特定の第１の１箇所とは別の１箇所の回文構造を認識するように、ミスマッチを導入する。
同様に、前記第３の核酸増幅用プライマーセットの１の核酸増幅用プライマーにミスマッチを導入する。今回は、その遺伝子の特定の第２のコドンの変異の有無によらず、前記特定の第２の制限酵素が、その増幅産物の中の前記特定の第２の１箇所とは別の１箇所の回文構造を認識するように、ミスマッチを導入する。
【００２１】
そうすると、前記遺伝子の前記特定の第１のコドンに変異がある場合には、当該遺伝子の増幅産物の前記特定の第１の制限酵素による断片は３つになるが、当該遺伝子の当該特定の第１のコドンに変異がない場合には、当該遺伝子の増幅産物の当該特定の第１の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この３つの断片の合計の断片長は、上の２つの断片長とほぼ等しくなる。
同様に、前記遺伝子の前記特定の第２のコドンに変異がある場合には、当該遺伝子の増幅産物の前記特定の第２の制限酵素による断片は３つになるが、当該遺伝子の当該特定の第２のコドンに変異がない場合には、当該遺伝子の増幅産物の当該特定の第２の制限酵素による断片は２つになる。このとき、この３つの断片の合計の断片長は、上の２つの断片長とほぼ等しくなる。
【００２２】
この方法では、もとの遺伝子の特定の第１のコドンの変異の割合、もとの遺伝子の特定の第２のコドンの変異の割合によらず、変異の有無に基づいて生成される、異なる制限酵素断片を多量に増幅する。
従って、もとの遺伝子の特定のコドンの変異の割合が低くても、当該遺伝子の特定のコドンの変異の有無に基づく、増幅産物の差異が顕著になり、当該遺伝子の特定のコドンの変異を高感度で検出できる。
そのため、癌の細胞、組織を直接採取する以外にも、癌細胞の比率が比較的低い、患者の血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等を由来とする細胞や組織を採取して、当該遺伝子の第１のコドン及び第２のコドンの変異の有無を判定することができる。そのため、低侵襲の（患者への負担が小さい）診断が可能になる。
さらに、これら特定の第１のコドンの変異と、特定の第２のコドンの変異とを一度の操作で検出でき、これら特定の第１のコドンの変異の有無と、特定の第２のコドンの変異の有無とを一度の操作で判定できる。
【００２３】
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異、及びコドン１３の変異を一度の操作で検出する方法の一例を図１に示す。
配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３を含む領域（ＫＲＡＳ遺伝子の４５４番目の塩基から６１３番目の１６０塩基で、コドン１の１番目の塩基からコドン５４の１番目の塩基）を２つの核酸増幅用プライマーからなる核酸増幅用プライマーセットで増幅する（図１（ａ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、配列番号２で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合し、ａ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｍｖａ１（エム・ブイ・エー・ワン）は認識せず、ｂ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｂｇｌ１（ビー・ジー・エル・ワン）は認識せず、ｃ）ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２にもコドン１３にも変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、その増幅産物の特定の第１の１箇所の回文構造（ＫＲＡＳ遺伝子の４８４番目から４８８番目のＣＣＷＧＧ／ＧＧＷＣＣ）を、制限酵素Ｍｖａ１が認識するように設計され、その増幅産物の特定の第２の１箇所の回文構造（ＫＲＡＳ遺伝子の４８２番目から４９２番目のＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ／ＣＧＧＮＮＮＮＮＣＣＧ）を、制限酵素Ｂｇｌ１が認識するように設計されている。
【００２４】
具体的には、１２＆１３ＳＰのうち、ＫＲＡＳ遺伝子の４８４番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号２のプライマーの２８番目の塩基）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子の４８３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号２のプライマーの２７番目の塩基）に変換している。
前者の変換により、コドン１２の変異の有無に伴う増幅産物の相違をＭｖａ１（又はＢｓｔＮ１（ビー・エス・ティー・エヌ・ワン））で識別でき、後者の変換により、コドン１３の変異の有無に伴う増幅産物の相違をＢｇｌ１で識別することができる。
また、ＷｉｌｄＡＳは、配列番号３で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合する（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、、ＷｉｌｄＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＫＲＡＳ遺伝子を増幅する。
【００２５】
そうすると、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１２０ｂｐの１つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、２９ｂｐと、９１ｂｐの２つの制限酵素断片が生成される（図１（ｂ））。
一方、このＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物を制限酵素Ｂｇｌ１で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１２０ｂｐの１つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、３２ｂｐと、８８ｂｐの２つの制限酵素断片が生成される（図１（ｃ））。
【００２６】
（第１の制限酵素による断片の増幅）
次いで、前記の工程により、制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したことにより生成された、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の１つの制限酵素断片と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の２つの制限酵素断片を、前記の核酸増幅用プライマーセットとは異なる核酸増幅用プライマーセット（（００１７）の段落の「第２の核酸増幅用プライマーセット」に相当）で増幅する（図１（ｄ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、前述の配列番号２で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合する。
一方、１２ｍｔＡＳは、配列番号４で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合し（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）が前記特定の第１の１箇所とは違う１箇所の回文構造を認識するように設計されている。
【００２７】
具体的には、１２ｍｔＡＳのうち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号３のプライマーの２１番目の塩基）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子の１０４番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号３のプライマーの２０番目の塩基）に変換している。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、１２ｍｔＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＢＲＡＦ遺伝子を増幅する。
【００２８】
そうすると、増幅産物を制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、９９ｂｐと、２１ｂｐの２つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、２９ｂｐと、６０ｂｐと、２１ｂｐの３つの制限酵素断片が生成される（図１（ｆ））。
これらの制限酵素断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）を用いて検出すると、変異がない試料においては、６０ｂｐの制限酵素断片が検出され、変異がある試料においては、９９ｂｐの制限酵素断片が検出され、この相違に基づいて、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の変異の有無を判定することができる（図２（ａ））。
また、上記コドン１２に変異があるバンドについて塩基配列を調べると、コドン１２に変異があるものは、コドン１２の２番目のグアニンがアデニンに変換していることが分かる（図２（ｂ））。
【００２９】
（第２の制限酵素による断片の増幅）
次いで、前記の工程により、制限酵素Ｂｇｌ１で処理したことにより生成された、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の１つの制限酵素断片と、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の２つの制限酵素断片を、前記の核酸増幅用プライマーセットとは異なる核酸増幅用プライマーセット（（００１７）の段落の「第３の核酸増幅用プライマーセット」に相当）で増幅する（図１（ｅ））。ここに、１２＆１３ＳＰは、前述の配列番号２で表される核酸増幅用プライマーでり、ＫＲＡＳ遺伝子の４５７番目から４８６番目に対応する部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列に対応する部位（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２とコドン１３を含む領域の４番目から３３番目の配列の相補鎖の部位）に結合する。
一方、１３ｍｔＡＳは、配列番号５で表される核酸増幅用プライマーであり、ＫＲＡＳ遺伝子の５４９番目から５７６番目の部位、即ち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の９６番目から１２３番目の部位に結合し（実際には配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目から１２３番目の配列の部位であって、配列番号３の１番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の１２３番目に結合し、配列番号３の２８番目の塩基が配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子領域の９６番目に結合する）、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無によらず、ＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物に対しては、制限酵素Ｂｇｌ１が前記特定の第２の１箇所とは違う１箇所の回文構造を認識するように設計されている。
【００３０】
具体的には、１３ｍｔＡＳのうち、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１１３番目の塩基に対応する塩基をグアニン（配列番号５のプライマーの１１番目の塩基）に変換し、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０５番目の塩基に対応する塩基をグアニン（配列番号５のプライマーの１９番目の塩基）に変換し、配列番号１で表されるＫＲＡＳ遺伝子の１０３番目の塩基に対応する塩基をシトシン（配列番号５のプライマーの２１番目の塩基）に変換している。
そして、１２＆１３ＳＰによるヌクレオチド（塩基）の連結は上流から下流に向かって行われ、１３ｍｔＡＳによるヌクレオチド（塩基）の連結は下流から上流に向かって行われ、ＰＣＲ反応によりＫＲＡＳ遺伝子を増幅する。
【００３１】
そうすると、増幅産物を制限酵素Ｂｇｌ１で処理したときに、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がある場合の遺伝子の増幅産物に対しては、１０６ｂｐと、１４ｂｐの２つの制限酵素断片が生成され、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３に変異がない場合の遺伝子の増幅産物に対しては、３２ｂｐと、７４ｂｐと、１４ｂｐの３つの制限酵素断片が生成される（図１（ｇ））。
これらの制限酵素断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ）を用いて検出すると、変異がない試料においては、７４ｂｐの制限酵素断片が検出され、変異がある試料においては、１０６ｂｐの制限酵素断片が検出され、この相違に基づいて、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１３の変異の有無を判定することができる（図２（ｃ））。
また、上記コドン１３に変異があるバンドについて塩基配列を調べると、コドン１３に変異があるものは、コドン１３２の２番目のグアニンがアデニンに変換していることが分かる（図２（ｄ））。
【００３２】
（検査方法）
本発明における検査方法は、試料の準備、ＫＲＡＳ遺伝子の抽出、プライマーを用いた遺伝子増幅、増幅産物の制限酵素による切断、ＫＲＡＳ遺伝子の制限酵素断片の検出の過程からなる。
【００３３】
（検査用試料・病理検体の準備）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はＫＲＡＳタンパク質をコードする遺伝子（ＫＲＡＳ遺伝子）を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織が挙げられ、手術により切除した癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。その他、血液、膵液、血清、糞便、精液、唾液、喀痰、脳脊髄液等も試料として挙げられる。
【００３４】
（ＫＲＡＳ遺伝子の抽出）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＫＲＡＳ遺伝子を抽出し、検査用試料として用いる。
【００３５】
（遺伝子・核酸増幅）
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法が挙げられる。
【００３６】
（ネステッドＰＣＲ法）
本発明において、第１の工程と、第２の工程において、ＰＣＲで核酸を増幅する場合のＰＣＲは、ネステッドＰＣＲ法という。
ネステッドＰＣＲでは、外側のプライマーと内側のプライマーを使って２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域から最初のＰＣＲ産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー位置より、両方とも内側にプライマーを設定して行う。
ＰＣＲは、２つのプライマー対が適当な間隔で向き合って存在することによる特異性に基づいて特定の断片を増幅する手法であるが、プライマーの類似配列によってミススプライシングがときどき起こり、標的配列の増幅とともに非特異的な増幅が起こってしまう。この非特異的断片を含むＰＣＲ生成物を鋳型にしてネステッドＰＣＲを行うと、非特異的な断片のなかにネステッドプライマーに類似した配列が存在する確立が極めて低くなるため、非特異的増幅の“ノイズの海”から標的配列のみをうまく拾い出してくることが可能になる。したがって、ネステッドＰＣＲ法は、バックグラウンドが出やすいＰＣＲの場合に有効な方法である。
ネステッドＰＣＲ法において、検出したい点変異を含むＰＣＲ領域を第１の工程で増幅するものは、エンリッチＰＣＲ法ともいう。
本発明においては、ネステッドＰＣＲの他、セミネストテッドＰＣＲ、ダブルＰＣＲを用いても良い。
【００３７】
（制限酵素）
前記ＫＲＡＳ遺伝子増幅による増幅産物は、コドン１２の変異の検出には制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）により処理する。Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）の至適温度は３７℃付近である。コドン１３の変異の検出には制限酵素Ｂｇｌ１（又はＢｓｔＮ１）により処理する。Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）の至適温度は３７℃付近である。
【００３８】
（ＫＲＡＳ遺伝子の制限酵素断片の検出）
前記制限酵素で処理した断片は、制限酵素断片長多型を用いて検出する。
【００３９】
（変異検出試薬・変異検出試薬キット）
本発明はまた、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出のための方法に用いられる変異検出試薬及び変異検出試薬キットを含む。変異検出試薬としては、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３を含む領域を増幅する核酸増幅用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレア−ゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。
【００４０】
また、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出のための方法に用いられる変異検出試薬キットは、本発明の検出方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであればよい。また、蛍光標識をプローブしたＤＮＡも本キットに含めてもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
大腸癌患者の外科手術より得られた癌部及び正常粘膜部より抽出・精製したゲノム遺伝子を準備した。
【００４３】
ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を検出する１次ＰＣＲでは、図１中の１２＆１３ＳＰ（配列番号２）とＷｉｌｄＡＳ（配列番号３）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
ＷｉｌｄＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡ
この実施例では、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２より４塩基上流に存在するＡ（アデニン）に対応する部分の１２＆１３ＳＰのプライマーをＣ（シトシン）に変換し、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２より３塩基上流に存在するＧ（グアニン）に対応する部分の１２＆１３ＳＰのプライマーをＣ（シトシン）に変換するミスマッチを導入することにより、コドン１２に変異がない遺伝子増幅産物の制限酵素Ｍｖａ１（又はＢｓｔＮ１）による認識部位を作り出し、コドン３に変異がない遺伝子増幅産物の制限酵素Ｂｇｌ１による認識部位を作り出すこととした。
【００４４】
この１次ＰＣＲによる遺伝子増幅産物を、コドン１２及びコドン１３の変異検出用にそれぞれ５μｌ用いて、コドン１２の変異検出用にはＭｖａ１により、最初の制限酵素処理（１次制限酵素処理）を行い、コドン１３の変異検出用にはＢｇｌ１により、最初の制限酵素処理（１次制限酵素処理）を行った。
【００４５】
次に２次ＰＣＲでは、コドン１２の変異検出用には、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と１２ｍｔＡＳ（配列番号４）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
１２ｍｔＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡ
コドン１３の変異検出用には、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と１３ｍｔＡＳ（配列番号５）のプライマーを用いた：
１２＆１３ＳＰ：ＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴ
１３ｍｔＡＳ：ＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＡ
本実施例では、セミネステッドＰＣＲ又はダブルＰＣＲを用いた。この実施例では、コドン１２の変異検出用には、１２ｍｔＡＳの１９番目と２０番目の塩基をＣ（シトシン）にに変換するミスマッチを導入することにより、コドン１２の変異の有無によらず、コドン１２以外の部位で遺伝子増幅産物の制限酵素Ｍｖａ１よる認識部位を作り出すこととした。これにより、１次ＰＣＲの増幅産物が増幅されるので、コドン１２の変異の有無がより顕著に判定でき、かつ、制限酵素反応を確認することができる。また、この実施例では、コドン１３の変異検出用には、１３ｍｔＡＳの１１番目と１９番目の塩基をＧ（グアニン）に、２１番目の塩基をＣ（シトシン）に変換するミスマッチを導入することにより、コドン１３の変異の有無によらず、コドン１３以外の部位で遺伝子増幅産物の制限酵素Ｂｇｌ１よる認識部位を作り出すこととした。これにより、１次ＰＣＲの増幅産物が増幅されるので、コドン１３の変異の有無がより顕著に判定でき、かつ、制限酵素反応を確認することができる。
【００４６】
（１次ＰＣＲ）
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭのＷｉｌｄＡＳ（配列番号３）、１．２５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とほぼ１００ｎｇのＫＲＡＳ遺伝子（ＤＮＡ）を用いＰＣＲ溶液を２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５８℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを３０回繰り返して遺伝子を増幅した。その結果、１２０ｂｐの増幅産物が得られた（図１（ａ））。
【００４７】
上記ＰＣＲにより得られた増幅産物の含まれる増幅産物液２５μｌのうち５μｌを用いて、コドン１２の変異検出用には制限酵素Ｍｖａ１（Ｔａｋａｒａ社）による切断を行い、コドン１３の変異検出用には制限酵素Ｂｇｌ１（Ｔａｋａｒａ社）による切断を行った。
【００４８】
（コドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ２μｌ、制限酵素Ｍｖａ１（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、蒸留水３．５μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれる遺伝子増幅液２５μｌのうち５μｌを用い合計２０μｌとした。切断反応はＭｖａ１の至適温度である３７℃で２時間行った（図１（ｂ））。
【００４９】
（コドン１３の変異検出のための１次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ２μｌ、制限酵素Ｂｇｌ１（５Ｕ／μｌ）０．５μｌ、蒸留水３．５μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれる遺伝子増幅液２５μｌのうち５μｌを用い合計２０μｌとした。切断反応はＢｇｌ１の至適温度である３７℃で２時間行った（図１（ｃ））。
【００５０】
（コドン１２の変異検出のための２次ＰＣＲ）
コドン１２の変異検出のための１次ＰＣＲの増幅産物を増幅するプライマーとして、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と、１２ｍｔＡＳ（配列番号４）を用いた。
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭの１２ｍｔＡＳプライマー（配列番号４）、１．２５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とコドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理による切断された増幅産物を鋳型にして（１μｌ）、ＰＣＲ溶液を合計２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５３℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを２６〜３０回繰り返して遺伝子を増幅した（図１（ｄ））。
【００５１】
（コドン１３の変異検出のための２次ＰＣＲ）
コドン１３の変異検出のための１次ＰＣＲの増幅産物を増幅するプライマーとして、１２＆１３ＳＰ（配列番号２）と、１３ｍｔＡＳ（配列番号５）を用いた。
１０倍濃度のＰＣＲ緩衝溶液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、０．２μＭの１２＆１３ＳＰ（配列番号２）、０．２μＭの１３ｍｔＡＳプライマー（配列番号５）、１．２５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ−ＴａｑＧｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とコドン１２の変異検出のための１次制限酵素処理による切断された増幅産物を鋳型にして（１μｌ）、ＰＣＲ溶液を合計２５μｌとした。ＰＣＲの温度条件は９５℃で１１分の後、９５℃で３０秒→５３℃で３０秒→７２℃で３０秒のサイクルを２６〜３０回繰り返して遺伝子を増幅した（図１（ｅ））。
【００５２】
（コドン１２の変異検出のための２次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ３μｌ、制限酵素Ｍｖａ１（５Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水１μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれるコドン１２の変異検出のための２次ＰＣＲによる遺伝子増幅液２５μｌを用い合計３０μｌとした。切断反応はＭｖａ１の至適温度である３７℃で６時間以上行った（図１（ｆ））。
【００５３】
（コドン１３の変異検出のための２次制限酵素処理）
１０倍濃度のＮＥｂｕｆｆｅｒ３μｌ、制限酵素Ｂｇｌ１（５Ｕ／μｌ）１μｌ、蒸留水１μｌ、１次ＰＣＲで得られた増幅産物の含まれるコドン１３の変異検出のための２次ＰＣＲによる遺伝子増幅液２５μｌを用い合計３０μｌとした。切断反応はＢｇｌ１の至適温度である３７℃で６時間以上行った（図１（ｇ））。
【００５４】
上記、制限酵素で処理した制限酵素断片を制限酵素断片長多型により検出した。
【００５５】
（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１２の変異の検出）
２次制限酵素処理により、コドン１２に変異がない場合には、６０ｂｐ、２９ｂｐ、２１ｂｐの３種類の断片が検出される。一方、総てのコドン１２に変異がある場合は、９９ｂｐ、２１ｂｐの２種類の断片が検出されるが、実際には、総てのコドン１２のうちの一部に変異があることが殆んどであり、この場合、９９ｂｐ、６０ｂｐ、２９ｂｐ、２１ｂｐの４種類の断片が検出される。実際には、１２０ｂｐ、９１ｂｐの断片も認められる場合があるが、これは、制限酵素処理が不良であるか、鋳型量が過剰の場合である。
基本的に、９９ｂｐの断片が６０ｂｐの断片と同等か、より強く認められた場合に、コドン１２に変異があると判定する。
結果を図２（ａ）に示す。
【００５６】
この例によれば、右から２から４番目のレーンには９９ｂｐ、６０ｂｐの断片が検出され、コドン１２の変異ありと判定され、最右のレーンでは６０ｂｐの断片のみが検出され、コドン１２の変異なしと判定された。
【００５７】
（ＫＲＡＳ遺伝子コドン１３の変異の検出）
２次制限酵素処理により、コドン１３に変異がない場合には、７４ｂｐ、３２ｂｐ、１４ｂｐの３種類の断片が検出される。一方、総てのコドン１３に変異がある場合は、１０６ｂｐ、１４ｂｐの２種類の断片が検出されるが、実際には、総てのコドン１３のうちの一部に変異があることが殆んどであり、この場合、１０６ｂｐ、７４ｂｐ、３２ｂｐ、１４ｂｐの４種類の断片が検出される。実際には、１２０ｂｐ、８８ｂｐの断片も認められる場合があるが、これは、制限酵素処理が不良であるか、鋳型量が過剰の場合である。
基本的に、１０６ｂｐの断片が７４ｂｐの断片と同等か、より強く認められた場合に、コドン１３に変異があると判定する。
結果を図２（ｃ）に示す。
【００５８】
この例によれば、右から３から４番目のレーンには１０６ｂｐ、７４ｂｐの断片が検出され、コドン１３の変異ありと判定され、最右のレーンでは７４ｂｐの断片のみが検出され、コドン１３の変異なしと判定された。
【００５９】
このように、本実施例によれば、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異を一度の操作で行うことにより、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の有無を一度の操作で、再現性よく、精度よく行うことができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出試薬キットの製造は、製薬業界、バイオテクノロジーの分野などで利用することができる。本発明のＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法、この検出方法に用いるための核酸増幅用プライマー、核酸増幅用プライマーセット、及びＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異検出試薬キットは、医療業において有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明に係るＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出方法の概要を示す模式図である。
【図２】本発明によるＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２及びコドン１３の変異の検出を示す図である。
【図１】
2005192420.tif 000003
【図２】
2005192420.tif 000004
【配列表】
2005192420000001.app