(57)【要約】 【課題】ヒトを含む動物の放射線によるDNAの損傷とその修復機構を調べるために用いられるモデル動物を提供すること。【解決手段】放射性感受性遺伝子を有する遺伝子導入ラット、特に、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって樹立した、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラット。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性感受性遺伝子を有する遺伝子導入ラット。
【請求項２】
放射性感受性遺伝子が近交系ＬＥＣラットに由来する、請求項１記載の遺伝子導入ラット。
【請求項３】
放射性感受性遺伝子が近交系ＬＥＣラットの第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に位置する、請求項１又は２記載の遺伝子導入ラット。
【請求項４】
放射性感受性遺伝子をヘテロに有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子導入ラット。
【請求項５】
放射性感受性遺伝子をホモに有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子導入ラット。
【請求項６】
近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって樹立した、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラット。
【請求項７】
近交系ＬＥＣラットの放射性感受性遺伝物質が第４染色体由来である、請求項６記載のコンジェニックラット。
【請求項８】
近交系ＬＥＣラットの放射性感受性遺伝物質が第４染色体のD4Mgh7からD4Rat36 にかけての領域に由来する、請求項７記載のコンジェニックラット。
【請求項９】
近交系ＬＥＣラットの放射性感受性遺伝物質が第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に由来する、請求項８記載のコンジェニックラット。
【請求項１０】
近交系ＬＥＣラットの第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に位置する放射性感受性遺伝子を戻し交配で導入することにより樹立されたＦｉｓｃｈｅｒ３４４コンジェニックラット。
【請求項１１】
放射性感受性遺伝子をヘテロに有する、請求項１０記載のＦｉｓｃｈｅｒ３４４コンジェニックラット。
【請求項１２】
放射性感受性遺伝子をホモに有する、請求項１０記載のＦｉｓｃｈｅｒ３４４コンジェニックラット。
【請求項１３】
請求項６〜１０の何れか一項に記載のコンジェニックラットを兄妹交配させることにより、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質をホモで有する近交系ラットの樹立方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性感受性遺伝子を有する遺伝子導入ラット、特に、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって樹立した、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
LECラットは劇症肝炎が自然発症する突然変異ラットとして見つけられた。この肝炎の原因は体内の銅代謝に関係するATPアーゼ遺伝子（Atp7b）の突然変異により、肝臓に銅が蓄積し肝細胞を傷害することにより肝炎がおこるものであった。
【０００３】
このLECラットはさらに免疫不全を有すると共に、放射線感受性でもあり、毛色の変異もあるなど、多くの突然変異を有するラットである。放射線感受性はAtp7b遺伝子の変異により、銅が蓄積することにより細胞にＯＨラジカルが発生しやすいため、放射線感受性になるという考えが示唆された。
【０００４】
コンジェニック系統は、遺伝的方法によって作製される遺伝子導入動物の系統のことである。基本的には、導入を目的とする変異遺伝子をもつ個体又は系統に、特定の近交系１種類を用いて戻し交配を繰り返し行い作製する。戻し交配の各世代に変異遺伝子の表現型を指標に子孫を選抜し、１２世代以上経たものを正式な樹立系統とする。尚、樹立後は兄妹交配によって維持される。
【０００５】
特許文献１には、多動性障害モデルラット及び該ラットを別種ラットに戻し交配うることによって樹立したコンジェニック系統の多動性障害モデルラットが記載されている。
特許文献２には、インスリン非依存性糖尿病のコンジェニック動物が記載されている。
特許文献３には、ob(obese) 伝子を導入することにより作製されたコンジェニック系統マウスが記載されている。
【特許文献１】特開２００１−１８６８２８号公報
【特許文献２】特表２００３−５１２８５２号公報
【特許文献３】再公表公報（WO98/19523）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、LECラットの放射線感受性がAtp7b遺伝子変異と連鎖するか確かめた上、もし連鎖しないのであれば放射線感受性遺伝子を分離することを目的として、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４（Ｆ３４４）ラットに戻し交配することによって、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラットを樹立することに成功し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち、本発明は、以下の各態様の発明に係るものである。
第一に、放射性感受性遺伝子をヘテロ又はホモに有する遺伝子導入ラットに係る。例えば、該放射性感受性遺伝子は近交系ＬＥＣラットに由来し、特に、近交系ＬＥＣラットの第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に位置する。
【０００８】
本発明の遺伝子導入ラットは当該技術分野で公知の任意の遺伝育種学的手法を用いて作製することが出来る。例えば、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによってコンジェニック系統として樹立することができる。又は、放射性感受性遺伝子を分子遺伝的手法により受精卵に導入する手段等によっても作製することが出来る。
【０００９】
第二の態様として、本発明は、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって樹立した、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラットに係る。ここで、「遺伝物質」とは、代表的にはゲノムDNA等の遺伝的情報を担う物質を意味する。該放射性感受性遺伝物質は、例えば、第４染色体由来であり、特に、第４染色体のD4Mgh7からD4Rat36 にかけての領域、より特定的には、第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に由来する。該放射性感受性遺伝物質の一具体例としては、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝子を挙げることが出来、該遺伝子の一具体例として、近交系ＬＥＣラットの第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に位置するものを挙げることが出来る。
【００１０】
従って、本発明は、近交系ＬＥＣラットの第４染色体のD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）にかけての約１Mb領域に位置する放射性感受性遺伝子を戻し交配で導入することにより樹立されたＦｉｓcｈｅｒ３４４コンジェニックラットにも係るものである。該コンジェニックラットはかかる放射性感受性遺伝子をヘテロ又はホモで有する。
【発明の効果】
【００１１】
放射性感受性遺伝子を有する遺伝子導入ラット、特に、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラットを樹立することに成功した。これらのコンジェニックラットを当業者に公知の方法で兄妹交配させることにより、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質をホモで有する近交系ラットを樹立することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はそれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１３】
材料と方法
LECラットとF344ラットは日本チャールスリバー社（横浜）から購入し、その後、放医研の動物飼育施設内で系統を維持した。飼料は市販のCE-2（日本CLEA、東京）あるいはMB-1（船橋農場、千葉）を与えた。飲料水として塩素（8〜13
ppm）と塩酸（pH 2.8〜3.2）添加水を与えた。放射線照射は、Ｘ線発生装置（信愛250またはパンタックHF320）からの200 kVp X線を用いて実施した。
【００１４】
LECラットの放射線感受性
４週齢の雌雄のLECラットとF344ラット、およびそれらの交配子（F1）ラットに種々の線量の放射線を照射し30日間生存率から50％致死線量を計算した。１線量当たり雌雄各20〜21匹を使用した。放射線の線量は、LECラットは2.0〜4.0 Gy、F344ラットとF1ラットでは5.0〜7.5 Gyである。この結果を図１と以下の表１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表１の結果は、LECラットは2.6Gyで50%の動物が死ぬのに対しF344ラットやF1ラットでは２倍以上の線量であり、LECラットは放射線感受性が高いことを示している。また図１に示されたように、LECラットは3.5Gy以上で100%死に、F１ラットやF344ラットでは５Gyを照射しても死亡しなかった。即ち、４Gyあるいは4.5Gyの照射ではLECラットは全例死亡し、F1ラットやF344ラットでは全例生存した。
【００１７】
放射線感受性とAtp7b遺伝子の連鎖解析
ラットは、雌F344ラットと雄LECラットを交配し、その得られた子供（Ｆ１ラット）をLEＣラットに戻し交配した世代を用いて解析を行った。遺伝子型は、ラットの尾の一部を摘除してDNAを抽出し、ヒトのウイルソン病遺伝子（Atp7b遺伝子）でLECラットでは欠失している３’領域を含むcDNAをプローブとして、サザンブロット法でLEC型かF344型かを解析した（Ogiu, T., Nishimura, M., Watanabe, F., Ukai, H., Ishii-Ohba, H.,
Shimada, Y., Tsuji, H., Sakurai, J., Hino, O.: Absence of Linkage Between
Radiosensitivity and the Predisposing Atp7b Gene Mutation for Heritable
Hepatitis in the LEC Rat.  Radiat. Res., 2000, 154:113-116）。
【００１８】
この方法では、LECラット由来の遺伝子のみを有する個体ではバンドが出現せず、F344ラット由来遺伝子を持つ個体はバンドが出現する。本発明において、放射線感受性は、４週齢時にＸ線を４Gyまたは4.5Gy照射した後30日間観察し、その間に死亡するか否かで検定した。これら両者の表現型の組合せを持つラット個体の数を集計した結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
a 放射線感受性は 4.0 または 4.5 GyのX線を照射した後３０日間観察した結果から判定した。
b遺伝子型はサザンブロット法で決定した（LEC：LEC遺伝子型、F344：F344遺伝子型）
【００２１】
表２の結果は、放射線感受性動物の約半数がLEC型を、約半数がF344型を示し、放射線抵抗性動物でも約半数がLEC型を、約半数がF344型を示す（放射線感受性を有する動物が必ずしもLEC遺伝子型を示す訳ではない）ことから、放射線感受性表現型と遺伝子型の間には連鎖が無いと判断された。このことは、放射線感受性遺伝子とAtp7b遺伝子が同じものではなく、また近傍に存在するものでもないことを示している。
【００２２】
F344ラットへのLECラット由来放射線感受性遺伝子の導入方法
放射線感受性遺伝子導入過程のラット（ここではNxラットと標記する。Ｘは交配世代数を表す）とF344ラットへの戻し交配２世代〜７世代の間では、（１）Nx ラットとLECラットを交配し、得られた子供が４週齢になった時に4.5Gy のＸ線を照射し、約半数が死亡した場合には遺伝子が入っていると判定し、（２）そのNxラットにF344ラットを交配して次世代のN(x＋1)ラットを得た。
【００２３】
一方、F344ラットへの戻し交配８世代以降は、（１）３週齢Nx (♀/♂)ラットの尾からDNAを抽出して遺伝子の存在領域を解析し、（２）LEC型の場合には、そのNxラットとF344ラットを交配して次世代のラットを得た後、（３）NxラットとLECラットを交配し、得られた子供が４週齢になった時に4.5Gy
のＸ線を照射し、遺伝子が入っていることを確認した。放射線感受性の判定が困難な場合には次世代の子は遺伝子導入系統から外した。以上の結果を図２にまとめて示した。
【００２４】
放射線感受性遺伝子の存在領域のマッピング
第7世代及び第8世代のコンジェニックラットで、全染色体を対象としたゲノムスクリーニングを行った。遺伝子型判定は、常法に従い、マーカーをPCR増幅後、４％アガロースゲルまたは10％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。その結果、第４染色体のD4Mgh7からD4Rat36にかけてLECラット由来の染色体領域を持っているラットは放射線高感受性であった。そこで、この領域の詳細な遺伝学的地図を放射線ハイブリッド（Radiation Hybrid）パネルを使用して作成した。
【００２５】
上記マーカーに関しては以下の文献を参照することが出来る：
（１）Watanabe TK, Bihoreau MT, McCarthy LC, Kiguwa SL, Hishigaki
H, Tsuji A, Browne J, Yamasaki Y, Mizoguchi-Miyakita A, Oga K, Ono T, Okuno S,
Kanemoto N, Takahashi E, Tomita K, Hayashi H, Adachi M, Webber C, Davis M, Kiel
S, Knights C, Smith A, Critcher R, Miller J, James MR, et al. A radiation
hybrid map of the rat genome containing 5,255 markers. Nat Genet. 1999
May;22(1):27-36.
（２）Steen RG, Kwitek-Black AE, Glenn C, Gullings-Handley J, Van Etten W,
Atkinson OS, Appel D, Twigger S, Muir M, Mull T, Granados M, Kissebah M, Russo
K, Crane R, Popp M, Peden M, Matise T, Brown DM, Lu J, Kingsmore S, Tonellato
PJ, Rozen S, Slonim D, Young P, Jacob HJ, et al. A high-density integrated
genetic linkage and radiation hybrid map of the laboratory rat. Genome Res.
1999 Jun;9(6):AP1-8
【００２６】
又、放射線ハイブリッド法に関しては、以下の文献を参照することが出来る：
（１）McCarthy LC, Bihoreau MT, Kiguwa SL, Browne J, Watanabe TK,
Hishigaki H, Tsuji A, Kiel S, Webber C, Davis ME, Knights C, Smith A, Critcher
R, Huxtall P, Hudson JR Jr, Ono T, Hayashi H, Takagi T, Nakamura Y, Tanigami A,
Goodfellow PN, Lathrop GM, James MR. A whole-genome radiation hybrid panel and
framework map of the rat genome. Mamm Genome. 2000 Sep;11(9):791-795.
【００２７】
第16世代までのコンジェニックラットの遺伝子型と放射線感受性の関係からD4Got85からESTのBF397922の染色体領域に放射線感受性遺伝子が存在することが明らかとなった。BF397922とRpn1の遺伝子型判定はシークエンスにより一塩基多型を検出して決定した。ラットゲノムシークエンスより、この領域はD4Got85（第121,569,138塩基）からBF397922（第122,528,167塩基）の間に存在することから、放射線感受性遺伝子は、約1Mbの領域に存在することが明らかとなった（図３）。
【００２８】
F344ラットにLECラット由来放射線感受性遺伝子を導入したコンジェニックラット系統の樹立
上記の方法により、放射線感受性遺伝子をヘテロに持つ個体を選別し、F344ラットへの戻し交配を続けている。現在17世代まで来ており、更に、ヘテロマウス同志の交配によりコンジュニックラット系統が樹立された。
【００２９】
更に、N16mA01という個体でこの領域がさらに短縮したために、16世代動物から兄妹交配によりR290からG83までを含む領域をホモに有する系統（F344.LEC-xhs1/1Nrs）と、17世代動物から兄妹交配によりR290からR182までを含む領域をホモに有する系統（F344.LEC-xhs1/2Nrs）の２系統の樹立を進めている（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明で提供される放射性感受性遺伝子を有する遺伝子導入ラット、特に、近交系ＬＥＣラットを近交系Ｆｉｓcｈｅｒ３４４ラットに戻し交配することによって樹立した、近交系ＬＥＣラット由来の放射性感受性遺伝物質を有するコンジェニックラットは、ヒトを含む動物の放射線によるDNAの損傷とその修復機構を調べるために用いられるモデル動物として有用である。尚、本発明に係る各種ラットは独立行政法人放射線医学総合研究所より分与可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】LECラット、F344ラット、それらのF1ラットにおける線量と死亡率曲線：１線量当たり雌雄各20〜21匹を使用し、LECラットには2.0〜4.0 Gyの、F344ラットとF1ラットには5.0〜7.5 GyのＸ線を照射し、30日間観察して死亡率を求めた。
【図２】各世代における放射線感受性遺伝子領域の解析：７世代以降の遺伝子領域のパターンを示す。ここで、Nxとしたものは、同世代の個体で検索した結果、大多数の動物でLEC由来遺伝子領域が同じパターンを示した場合を示す。Nxf/mA001：は、Ｘ世代の雌(f)または雄(m)＋個体番号を表す。図の中の標記は、H：LEC/F344ヘテロ遺伝子型,  F：F344/F344ホモ遺伝子型である。また、図最上段の記号は、以下の括弧内のマイクロサテライトマーカー名の省略である：M7（D4Mgh7）、W1（D4Wox1）、M6（D4Mgh6）、R106（D4Rat106）、R176（D4Rat176）、R290（D4Rat290）、G87（D4Got87）、W18（D4Wox18）、R47（D4Rat47）、R45（D4Rat45）、G84（D4Got84）、R182（D4Rat182）、G148（D4Got148）、G83（D4Got83）、R38（D4Rat38）、R36（D4Rat36）、R75（D4Rat75）。感受性の項目は、＋：感受性、−：抵抗性を意味する。
【図３】ラットの第４番染色体地図におけるLECラット由来ゲノム領域と、ラット個体の放射線感受性との関連性：コンジェニックラットの遺伝子型と放射線感受性の関係から、D4Got85からBF397922までの約1Mbの領域に放射線感受性遺伝子があることが明らかとなった。
【図４−１】コンジェニックラット作製過程：左のカラムのNxはＸ世代を表し、個体のｆ／ｍは雌または雄を表す。また同腹の子供は同じアルファベットを付し、二桁の個体番号を振った。系統樹立過程で10世代までは雌のみを使用したが、11世代以降は雌雄両性を使っている。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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