(57)【要約】【課題】  チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない、チューリップモザイクウイルス株を提供すること。【解決手段】  本発明により、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない、チューリップモザイクウイルス株が提供される。さらに本発明により、このチューリップモザイクウイルス株に感染した植物またはその植物の子孫が提供される。さらに本発明は、チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法を提供する。この方法は、上記のチューリップモザイクウイルス株を植物に感染させる工程を包含する。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項２】
請求項１に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、チューリップモザイクウイルス強毒株に対して干渉作用を示す、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項３】
請求項１または２に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、該チューリップモザイクウイルス株が、チューリップモザイクウイルスＬＳＭ株に対して変異誘発処理をすることによって得られる、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項４】
請求項３に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、前記変異誘発処理が、線量４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２での紫外線照射処理である、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項５】
請求項３または４に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、前記変異誘発処理の後にさらに、該ウイルス株をチューリップ植物に感染させて、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を選抜することによって得られる、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、以下：
チューリップモザイクウイルス弱毒株１、チューリップモザイクウイルス弱毒株２、チューリップモザイクウイルス弱毒株３、チューリップモザイクウイルス弱毒株４、チューリップモザイクウイルス弱毒株５、チューリップモザイクウイルス弱毒株６、チューリップモザイクウイルス弱毒株７、チューリップモザイクウイルス弱毒株８、チューリップモザイクウイルス弱毒株９、チューリップモザイクウイルス弱毒株１０、チューリップモザイクウイルス弱毒株１１、チューリップモザイクウイルス弱毒株１２、チューリップモザイクウイルス弱毒株１３、チューリップモザイクウイルス弱毒株１４、チューリップモザイクウイルス弱毒株１５、チューリップモザイクウイルス弱毒株１６、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１、およびチューリップモザイクウイルス弱毒株１８
からなる群より選択される、チューリップモザイクウイルス株。
【請求項７】
チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を得る方法であって、該方法が、チューリップモザイクウイルスＬＳＭ株に対して変異誘発処理をする工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記変異誘発処理工程が、線量４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２で紫外線照射処理をする工程である、方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法であって、該方法がさらに、前記変異誘発処理工程の後に、前記ウイルス株をチューリップ植物に感染させて、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を選抜する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株に感染した、植物。
【請求項１１】
前記植物がチューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）である、請求項１０に記載の植物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の植物の子孫。
【請求項１３】
チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株を植物に感染させる工程を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記感染させる工程が、前記チューリップモザイクウイルス株を、植物の葉組織に感染させる工程を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法であって、該方法がさらに、前記感染させる工程によって得られた感染植物を栄養繁殖させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記植物がチューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の病害防除の分野に関する。詳細には、本発明は、チューリップモザイク病の防除の分野に関する。より詳細には、本発明は、弱毒化されたチューリップモザイクウイルス株およびこのチューリップモザイクウイルス株を得る方法に関する。さらに本発明は、このチューリップモザイクウイルス株を使用して、チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チューリップモザイク病は、チューリップ栽培において深刻なダメージをもたらす主要な病害の一つである。
【０００３】
チューリップモザイク病の歴史的経緯を述べると次の通りである。１７世紀のヨーロッパでは、チューリップの花の色割れ（斑入り）は、珍しい品種として、富裕階級の間で大変高い値段で広範に取り引きされていた。しかしその後、その斑入りの花はウイルスによって引き起こされる病気であることが判り、球根価格の大暴落が起きた。そのため、このウイルス病を防除するための手段が、長年にわたり研究されてきた。しかし今日まで、有効なチューリップモザイク病防除法は知られていない。
【０００４】
チューリップモザイク病に罹患し、花弁が色割れしたチューリップは、切り花として出荷する場合に商品価値が著しく低い。そのため、チューリップモザイク病に対する優れた防除法が強く所望されている。また、商業的なチューリップ栽培農家では、チューリップを密集栽培することが多いため、一つでもウイルスに感染した植物が存在すると、たちまち他の隣接したチューリップにウイルスが蔓延し、モザイク病の大発生を引き起こす。従って、チューリップモザイク病を完全に防除し得る卓効ある優れた方法が強く所望されている。
【０００５】
これまで、チューリップモザイク病の原因となる病原体のウイルスに対して直接効く農薬は見出されていない。そのため現在、チューリップ栽培においてチューリップモザイク病を防除するには、アブラムシの駆除と開花期の花の色割れを指標とした抜き取り以外、防除手段が存在しない。しかし、これらの防除手段は、完全にチューリップモザイク病を防除し得る卓効のある防除手段と言うには程遠い。アブラムシは、チューリップモザイクウイルスの媒介虫である。そのため、チューリップモザイク病の防除手段の一つとして、アブラムシの駆除が行われてきた。しかし、これはチューリップモザイク病を十分に防除し得ない。この理由は、アブラムシが、植物体をわずか数分間吸汁するのみでウイルスを伝搬してしまうので、殺虫剤を散布しても十分な効果が認められないからである。このように、従来の殺虫剤散布による防除手段では、効果が低く、そして多数回にわたって薬剤散布しても十分な効果が得られない。しかも、この殺虫剤散布による防除手段は、農業従事者の健康に悪影響を及ぼし、生産費も上昇させるなど、多くの問題を抱えている。
【０００６】
開花期の花の色割れを指標とした抜き取りもまた、有効な防除手段といえない。その理由は、薄色の品種（特に、白色品種および黄色品種）では、花の色割れ病徴が現れにくいので抜き取りの選抜が非常に困難であることと、開花に至らない小球では、抜き取りの選抜が不可能であるためである。さらに、チューリップモザイク病に罹患した個体の抜き取り作業の時期は、稲作の田植え時期と重なるため、農家に過度な労働力負担を課し、チューリップの球根生産拡大に影響を及ぼしている。
【０００７】
植物のウイルス病を防除するための手段として、弱毒化ウイルスの利用が知られている（非特許文献１）。これは、一つのウイルスに感染した植物は、同じウイルス種の他系統のウイルスまたは近縁のウイルス種に感染し難くなるという現象（この現象を、「干渉作用」という）を利用した、植物病害防除法である。この干渉作用は、一見すると、動物において知られている免疫機構を利用したワクチンの作用と似ている。しかし、植物には動物のような免疫機構が備わっていないため、植物における干渉作用は、動物におけるワクチンとは異なる機構によるものである。この植物において干渉作用を引き起こす具体的な機構については、いまだ十分には解明されていない。
【０００８】
弱毒化ウイルスの作出手法としては、自然界からの弱毒株の分離・選抜法、高温処理または低温処理法、亜硝酸処理法、紫外線照射処理法、分節ゲノムの置換法、サテライトＲＮＡの付加法、および遺伝子組換え法などの手法が知られている。しかし、これらの手法を用いて得られた弱毒株が、実際に実用化される段階にまで達することは非常に少ない。これは、実用的に有用な弱毒株となるためには、以下に列挙する６つの条件を備える必要があるにもかかわらず、これらの条件を備えた弱毒株が得られることが稀であるからである：（１）目的の作物および他の植物に、病徴をまったくあるいはほとんど生じさせない；（２）強毒株に対する干渉作用が高い；（３）他のウイルスとの混合感染により強い病徴を生じさせない（相乗作用がない）；（４）接種操作が容易で、弱毒性が安定している；（５）アブラムシなどの媒介昆虫により伝搬されない；および（６）対象となる作物病害を防止し、味覚／視覚的な作物品質を低下させず、弱毒ウイルスを利用しない場合に比べて相当の利益が得られる。
【０００９】
また、上記のいずれかの弱毒化ウイルス作出手法を実施して、有用な弱毒化ウイルス得る際において、その条件設定の調節は非常に難しい。その理由は、変異を起こさせる条件が弱ければ、強毒性質のままとなって、有用な弱毒性が得られる可能性が低くなり、一方、変異を起こさせる条件が強ければ、有用な弱毒性が達成されても、ウイルスの感染能力自体が損なわれてしまうからである。また、上記の変異誘発手順によって、逆に、強毒化することがあることも知られている。そのため、感染能を損なわずに無病徴特性を付与する弱毒株は、容易には獲得され得ない。
【００１０】
これまでに、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）、およびダイズモザイクウイルス（ＳＭＶ）の３種類のウイルスの弱毒化ウイルスが実用化されている。キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の弱毒株は、ＲＮＡの付加法によって作出された。このＣＭＶ弱毒株は、トマトなどの食用作物の病害防除において利用されている。ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）の弱毒株は、低温処理法によって作出された。このＺＹＭＶ弱毒株は、キュウリなどの食用作物の病害防除において利用されている。ダイズモザイクウイルス（ＳＭＶ）は、低温処理法によって作出された。このＳＭＶ弱毒株は、黒ダイズなどの食用作物の病害防除において利用されている。しかし、これまで、チューリップモザイク病の防除に有効なチューリップモザイクウイルス弱毒株は見出されていない。さらにこれまで、紫外線照射処理法によって有用な弱毒化ウイルスは得られていない。
【非特許文献１】山田哲治ら著、「細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ８  分子レベルからみた植物の耐病性−植物と病原菌の相互作用に迫る−」、第１版、秀潤社、１９９７年１１月、１８８〜１９１頁
【非特許文献２】バイオコントロール研究会レポート  日本植物病理学会  ５（５）：３５−４４（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来の上記課題の解決を意図して創出されたものであり、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を提供すること、ならびに、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を得る方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は以下を提供する。
【００１３】
（１）  チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない、チューリップモザイクウイルス株。
【００１４】
（２）  項目１に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、チューリップモザイクウイルス強毒株に対して干渉作用を示す、チューリップモザイクウイルス株。
【００１５】
（３）  項目１または２に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、該チューリップモザイクウイルス株が、チューリップモザイクウイルスＬＳＭ株に対して変異誘発処理をすることによって得られる、チューリップモザイクウイルス株。
【００１６】
（４）  項目３に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、前記変異誘発処理が、線量４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２での紫外線照射処理である、チューリップモザイクウイルス株。
【００１７】
（５）  項目３または４に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、前記変異誘発処理の後にさらに、該ウイルス株をチューリップ植物に感染させて、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を選抜することによって得られる、チューリップモザイクウイルス株。
【００１８】
（６）  項目１〜５のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株であって、以下：
チューリップモザイクウイルス弱毒株１、チューリップモザイクウイルス弱毒株２、チューリップモザイクウイルス弱毒株３、チューリップモザイクウイルス弱毒株４、チューリップモザイクウイルス弱毒株５、チューリップモザイクウイルス弱毒株６、チューリップモザイクウイルス弱毒株７、チューリップモザイクウイルス弱毒株８、チューリップモザイクウイルス弱毒株９、チューリップモザイクウイルス弱毒株１０、チューリップモザイクウイルス弱毒株１１、チューリップモザイクウイルス弱毒株１２、チューリップモザイクウイルス弱毒株１３、チューリップモザイクウイルス弱毒株１４、チューリップモザイクウイルス弱毒株１５、チューリップモザイクウイルス弱毒株１６、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１、およびチューリップモザイクウイルス弱毒株１８
からなる群より選択される、チューリップモザイクウイルス株。
【００１９】
（７）  チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を得る方法であって、該方法が、チューリップモザイクウイルスＬＳＭ株に対して変異誘発処理をする工程を包含する、方法。
【００２０】
（８）  項目７に記載の方法であって、前記変異誘発処理工程が、線量４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２で紫外線照射処理をする工程である、方法。
【００２１】
（９）  項目７または８に記載の方法であって、該方法がさらに、前記変異誘発処理工程の後に、前記ウイルス株をチューリップ植物に感染させて、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないチューリップモザイクウイルス株を選抜する工程を包含する、方法。
【００２２】
（１０）  項目１〜６のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株に感染した、植物。
【００２３】
（１１）  前記植物がチューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）である、項目１０に記載の植物。
【００２４】
（１２）  項目１０または１１に記載の植物の子孫。
【００２５】
（１３）  チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法であって、項目１〜６のいずれか一項に記載のチューリップモザイクウイルス株を植物に感染させる工程を包含する、方法。
【００２６】
（１４）  項目１３に記載の方法であって、前記感染させる工程が、前記チューリップモザイクウイルス株を、植物の葉組織に感染させる工程を包含する、方法。
【００２７】
（１５）  項目１３または１４に記載の方法であって、該方法がさらに、前記感染させる工程によって得られた感染植物を栄養繁殖させる工程を包含する、方法。
【００２８】
（１６）  前記植物がチューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）である、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられている意味で用いられることが理解されるべきである。
【００３０】
一つの局面において、本発明は、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない、チューリップモザイクウイルス株に関する。
【００３１】
「チューリップモザイクウイルス」（Ｔｕｌｉｐ  ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）は、Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ属に属し、チューリップモザイク病の原因となるウイルスである。「チューリップモザイクウイルス」は、「ＴＢＶ」とも略され、本明細書中において、「チューリップモザイクウイルス」と「ＴＢＶ」とは交換可能に使用される。チューリップモザイクウイルスは、長さが約７５０ｎｍ、幅が約１２ｎｍのひも状粒子形態のウイルスである。チューリップモザイクウイルスは、汁液伝染およびアブラムシ伝染することが知られているが、土壌伝染はしないものとされている。寄生する宿主範囲は、これまでに知られている限りでは、ユリ科植物に限定されており、自然において感染する植物は、チューリップとユリのみとされている。チューリップモザイクウイルスは、感染した植物において、チューリップモザイク病を引き起こす。
【００３２】
チューリップモザイク病は、特徴的な病徴を提示する植物ウイルス病である。チューリップモザイク病に罹患した植物が示す特徴的な病徴としては、花弁の色割れ、葉組織のモザイク症状、および収量の低下が挙げられる。「花弁の色割れ」とは、当業者が通常理解し得る通り、花弁において、正常な状態とは異なり、部分的にまだらに濃色箇所と薄色箇所とが現れる症状をいう（例えば、図３（ｂ）の写真を参照のこと）。このような花弁の色割れは、美観を損ない、花卉植物としての商品価値を著しく低下させる。本明細書では、「花弁の色割れ」を単に「花の色割れ」ともいう。「葉組織のモザイク症状」とは、当業者が通常理解し得る通り、葉組織において、正常な状態とは異なり、部分的にまだらに濃色箇所と薄色箇所とが現れる症状をいう。花弁が薄色の品種（特に、白色品種および黄色品種）では、花弁の色割れ病徴が現れにくいので、抜き取りの選抜の際にはこの葉組織のモザイク症状が、モザイク病の指標として利用される。このような葉組織のモザイク症状も美観を損ない、やはり、花卉植物としての商品価値を著しく低下させる。「収量の低下」とは、植物全体の生体重量（ｇ）の減少をいい、特に、球根重量の減少をいう。
【００３３】
本明細書中において、「ウイルス強毒株」または「強毒株」とは、感染した植物に特徴的な病害症状（特に、重篤な病害症状）を引き起こすウイルスの分離株をいう。チューリップモザイクウイルスの場合、「ＴＢＶ強毒株」または「強毒株」とは、感染した植物に、チューリップモザイク病に特徴的な病害症状（特に、重篤なチューリップモザイク病害症状（例えば、花弁の強い色割れ、葉組織の強いモザイク症状、著しい収量低下））を引き起こすウイルスの分離株をいう。逆に、本明細書中において、「ウイルス弱毒株」または「弱毒株」とは、感染した植物に特徴的な病害症状を、ほとんどまたは全く引き起こさないウイルスの分離株をいう。チューリップモザイクウイルスの場合、「ＴＢＶ弱毒株」または「弱毒株」とは、感染した植物に、チューリップモザイク病に特徴的な病害症状（例えば、花弁の色割れ、葉組織のモザイク症状、収量低下））を、ほとんどまたは全く引き起こさないウイルスの分離株をいう。感染した植物に、チューリップモザイク病に特徴的な病害症状を全く引き起こさないＴＢＶウイルスの分離株はまた、ＴＢＶ無毒株とも呼ばれる。本明細書中において、ウイルスに関連して用いられる場合、「分離株」または「株」とは、当業者が通常理解し得る通り、ウイルスの一つの分類を意味し、そのウイルスが宿主に感染すると、他のウイルスが同じ種の宿主に感染した場合とは有意に異なる特徴的な病徴などを示すことにより、その他のウイルスと識別されるウイルスの分類をいう。
【００３４】
本明細書において、用語「干渉作用」とは、いったん一つのウイルスに植物が感染すると、次いで、同じウイルス種の他系統のウイルスまたは近縁のウイルス種がその植物に感染しようとしても感染し難くなるという現象をいう。従って、「あるウイルス株が干渉作用を示す」とは、そのウイルス株が植物に感染すると、その植物が同じウイルス種の他系統のウイルスまたは近縁のウイルス種に感染し難くなるという現象のこと、言い換えると、そのウイルス株が、上記のような現象を示す性質をその感染植物に付与する能力を有することを示す。従って、ＴＢＶ強毒株に対して干渉作用を示すＴＢＶ弱毒株を予め植物に感染させておくと、その感染植物は、その後にＴＢＶ強毒株に曝露されても、ＴＢＶ強毒株に感染しないのでチューリップモザイク病害症状を示さない。このように、ＴＢＶ強毒株に対して干渉作用を示すＴＢＶ弱毒株を予め接種した植物は、チューリップモザイク病に対する抵抗性を獲得する。
【００３５】
チューリップモザイク病の防除に使用するＴＢＶ弱毒株は、感染した植物に、チューリップモザイク病に特徴的な病害症状を全く引き起こさないウイルス株（すなわち、無毒株）であることが要求される。この理由は、弱度でも色割れした植物（特に、花卉植物）は、商品価値を損ない、そして収量も低下するからである。薄色の植物品種においては、花弁の色割れおよび／または葉のモザイク症状は目立たないため、弱度のモザイク病徴を引き起こすＴＢＶ弱毒株であっても弱毒化ウイルスワクチンとして利用不可能ではないが、やはり収量低下を引き起こすので好ましくない。また、弱度のモザイク病徴を引き起こすＴＢＶ弱毒株に感染した薄色品種は、濃色品種と近位で栽培できない。なぜなら、薄色品種に感染したウイルスが、隣接した濃色品種に伝搬し、濃色品種において目立つモザイク病徴を提示させて商品価値を損なわせるからである。このように、栽培品種を特定の薄色品種に限定させることは、商業的に農家にとって好ましくない。なお本明細書では、「ウイルス病の防除に使用するウイルス弱毒株」のことを、便宜上、「弱毒化ウイルスワクチン」とも言及する。
【００３６】
一つの実施形態では、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない本発明のチューリップモザイクウイルス株は、チューリップモザイクウイルスＬＳＭ株に対して変異誘発処理をすることによって得られる。ＬＳＭ株とは、本明細書の実施例１に記載されるように、天然において存在するチューリップモザイクウイルスの中から選抜された、チューリップモザイクウイルス弱毒株である。弱毒化ウイルスワクチンとして使用するウイルス弱毒株は、天然に存在するウイルス弱毒株またはそれに近いものが好ましい。なぜなら、天然に存在するウイルス弱毒株は自然選択を受けているので、形質が全体的に安定しているからである。強毒株に突然変異処理を施して、大幅に形質を変異させたウイルスは、形質が不安定であることが多く、さらなる変異を起こしやすいので好ましくない。本明細書中に記載の実験と並行して、本発明者は、強毒株に突然変異処理を施して弱毒化ウイルスワクチンを得る試みを行ったが、有用なＴＢＶ弱毒株は得られなかった（データは記載せず）。ＬＳＭ株は、弱度ではあるがなお花弁の色割れを引き起こす。従って、弱毒化ウイルスワクチンとして使用するには依然として好ましくない。この弱い色割れ症状を完全に無くすために、さらなる変異誘発処理が実施される。
【００３７】
この変異誘発処理は、ウイルスに変異を誘発する任意の処理であり得る。変異誘発処理の例としては、化学変異原物質処理（例えば、エチレンイミン（ＥＩ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルニトロソウレア（ＭＮＨ）などのアルキル化剤、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、亜硝酸（ＨＮＯ２）などの化学物質による処理）、ガンマ線照射処理、Ｘ線照射処理、熱中性子照射処理、速中性子照射処理、ベータ線照射処理、紫外線照射処理、イオン化粒子照射処理、高温処理、低温処理法、分節ゲノムの置換、遺伝子組換えなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、変異誘発処理は、紫外線照射処理である。特に好ましくは、変異誘発処理は、約４００００〜５００００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２の線量での紫外線照射処理であり、より好ましくは、約４４０００〜４６０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２の線量での紫外線照射処理であり、最も好ましくは、約４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２の線量での紫外線照射処理である。線量は、以下のようにして計算される：１ｃｍ２の試料（例えば、１ｃｍ２の面積を有する容器内に充填された試料）に対して、その試料から２０ｃｍ離れたところから、１５Ｗの紫外線ランプで６００秒間照射する場合、１５ワット（Ｗ）×６００秒（ｓ）×５倍（２０ｃｍの高さを１ｍに換算するため）＝４５０００Ｗ・ｓ・ｍ／ｃｍ２として算出される。好ましい実施形態では、このような紫外線照射処理は、１５Ｗの紫外線ランプ（例えば、殺菌ランプＧＬ１５−Ａ（東芝ライテック社製））を用いて実施される。特に好ましい実施形態では、１ｃｍ２の試料から約２０ｃｍの高さに、蛍光灯スタンドを用いて１５Ｗの紫外線ランプを設置し、約１０分間（すなわち、約６００秒間）にわたってこの紫外線ランプでこの試料を照射することにより、紫外線照射処理を実施する。
【００３８】
さらに好ましい実施形態では、上記の変異誘発処理の後に、目的とするＴＢＶ弱毒株を選抜する工程を行う。好ましくは、この選抜は、変異誘発処理を施したウイルス株を植物（好ましくは、チューリップ植物）に感染させて、植物にモザイク病徴を引き起こさないＴＢＶ株を選抜することによって行われる。好ましい実施形態では、上記の選抜において指標とするモザイク病徴は、花弁における色割れ病徴であるが、これに限定されない。
【００３９】
ウイルスを植物に感染させる方法は、当該分野で公知の任意の感染方法が使用され得る。例えば、任意の手段によって植物に傷をつけ、この傷口にウイルスを適用（例えば、塗布または噴霧）することによって感染させることが可能である。好ましい実施形態では、感染方法は、カーボランダム法または高圧噴霧法である。カーボランダム法または高圧噴霧法は、当該分野において周知である（例えば、植物病原性微生物研究法、脇本  哲著、ソフトサイエンス社、１７７−１７８，１９９３を参照のこと）。特に好ましい実施形態では、感染方法は、実施例において例示されるような、カーボランダム法である。
【００４０】
植物がウイルスに感染しているか否かの確認は、当該分野で公知の任意の手段によって行われ得る。例えば、植物がウイルスに感染しているか否かを確認する方法としては、抗ウイルス抗血清を用いた免疫学的方法、またはウイルス配列特異的なプローブおよび／もしくはプライマーを用いた遺伝学的方法（例えば、特開２０００−１８４８９２公報を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的方法としては、当該分野において周知であるＴＢＩＡ法（組織ブロットイムノアッセイ法）またはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ法）などが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、植物病原性微生物研究法、脇本  哲、ソフトサイエンス社、２７７−２９１，１９９３を参照のこと）。免疫学的方法において使用される抗ウイルス抗血清は、当該分野で周知の方法によって入手され得る（例えば、植物病原性微生物研究法、脇本  哲、ソフトサイエンス社、２４９−２６２，１９９３を参照のこと）。
【００４１】
ＴＢＶに感染した植物が、チューリップモザイク病の病徴を示すか否かの確認は、当業者によって経験的に、定性的および／または定量的に容易になされ得る。例えば、植物がチューリップモザイク病徴を示すか否かの確認は、上記に定義されたような花弁の色割れおよび／もしくは葉組織のモザイク症状が観察されるか否かを視覚的に判断すること、または、感染植物の生体重量（ｇ）と健全植物の生体重量（ｇ）とを比較することなどによって、容易になされ得る。本明細書では、花弁全体の面積における色割れ病徴を示す面積の割合が、約１０％以上の場合に、「強い色割れ」という。また、花弁全体の面積における色割れ病徴を示す面積の割合が、約１％〜約１０％未満の場合に、「弱い色割れ」という。花弁における色割れ病徴を疑われる面積の割合が全く存在しない場合かまたは存在したとしても約１％未満である場合に、「色割れなし」という。同様に、葉全体の面積におけるモザイク症状を示す面積の割合が、約１０％以上の場合に、「強いモザイク症状」という。また、葉全体の面積におけるモザイク症状を示す面積の割合が、約１％〜約１０％未満の場合に、「弱いモザイク症状」という。葉におけるモザイク症状を疑われる面積の割合が全く存在しない場合かまたは存在したとしても約１％未満である場合に、「モザイク症状なし」という。また、感染植物の生体重量が、健全植物の生体重量の約９２％未満の場合に、「強いモザイク病症状」という。また、感染植物の生体重量が、健全植物の生体重量の約９２％〜約９６％未満の場合に、「弱いモザイク病症状」という。感染植物の生体重量が、健全植物の生体重量とほぼ同じであるかまたは健全植物の生体重量の約９６％以上である場合に、「モザイク病症状なし」という。
【００４２】
特に好ましい実施形態において、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない本発明のチューリップモザイクウイルス株は、以下の実施例に記載される、チューリップモザイクウイルス弱毒株１、チューリップモザイクウイルス弱毒株２、チューリップモザイクウイルス弱毒株３、チューリップモザイクウイルス弱毒株４、チューリップモザイクウイルス弱毒株５、チューリップモザイクウイルス弱毒株６、チューリップモザイクウイルス弱毒株７、チューリップモザイクウイルス弱毒株８、チューリップモザイクウイルス弱毒株９、チューリップモザイクウイルス弱毒株１０、チューリップモザイクウイルス弱毒株１１、チューリップモザイクウイルス弱毒株１２、チューリップモザイクウイルス弱毒株１３、チューリップモザイクウイルス弱毒株１４、チューリップモザイクウイルス弱毒株１５、チューリップモザイクウイルス弱毒株１６、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１（これは、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７ともいう）、またはチューリップモザイクウイルス弱毒株１８である。よりさらに好ましい実施形態において、チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさない本発明のチューリップモザイクウイルス株は、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１である。上記の１８個のチューリップモザイクウイルス弱毒株１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７−１および１８、ならびに天然に存在するチューリップモザイクウイルス弱毒株ＬＳＭ株は、富山県農業技術センター農業試験場（富山県富山市吉岡１１２４−１）に保存され、請求により分譲される。
【００４３】
一つの実施形態では、本発明は、本発明のチューリップモザイクウイルス株に感染した植物およびその子孫を提供する。好ましい実施形態において、本発明の植物およびその子孫は、花弁に色割れを示さない。より好ましい実施形態において、本発明の植物およびその子孫は、チューリップモザイクウイルス強毒株に対して干渉作用を示す。好ましくは、本発明の植物およびその子孫は、チューリップモザイク病に対する抵抗性を示す。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「植物」とは、他に特に示さない限り、完全な植物体のみではなく、その植物体を構成する植物細胞、組織、および器官をも含み得る。本明細書中に出てくる植物の構成要素を示す用語（例えば、根、茎、葉、花、花弁、雄しべ、葯、葯壁、花粉、花糸、雌しべ、柱頭、花柱、種子、花茎、球根、子球（主球、小球など）、塊茎、球根りん片、切花、プロトプラスト、およびカルスなど）は、当業者が通常理解し得る通りの構成物を表す。本明細書において、植物の「子孫」とは、当業者が通常理解し得る通り、その植物に由来する次世代以降の任意の個体をいう。例えば、植物の子孫としては、その植物から発生した種子および球根、ならびにその種子および球根から発生した植物体などが挙げられるが、これらに限定されない。子孫は、有性繁殖によって得られる子孫であっても、栄養繁殖によって得られる子孫であってもよい。
【００４５】
本発明に従って、チューリップモザイク病から防除される「植物」は、任意の植物種であり得る。好ましくは、本発明によりチューリップモザイク病から防除される植物は、単子葉植物または双子葉植物である。本発明によりチューリップモザイク病から防除される植物の例としては、チューリップ、ユリ、ネギ、ニンニクなどのユリ科植物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
好ましい植物は、チューリップである。チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ  ｓｐｐ．）は、ユリ科チューリップ属に属する多年性植物である。チューリップの栽培種は、Ｔｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ  Ｌ．とされ、これまでに約２０００種類知られている。チューリップの野生種は、Ｔｕｌｉｐａ  ｂａｋｅｒｉ  Ａ．Ｄ．Ｈａｌｌや、Ｔｕｌｉｐａ  ｌｉｎｉｆｏｌｉａ  Ｒｅｇａｌなどを含む約１５０種類が、これまでに知られている。野生種とは、人為的影響を受けていない種をいい、対照的に、栽培種とは、人がその必要を満たすため進化の過程に影響を与えた種をいう。本明細書において、チューリップとは、野生種および栽培種を含む。
【００４７】
さらなる実施形態において、本発明は、チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る方法を提供する。この方法は、上記の本発明のチューリップモザイクウイルス株を植物に感染させる工程を包含する。ウイルスを植物に感染させる工程は、本明細書中の上記で記載されたように、当該分野で公知の任意の感染方法（例えば、カーボランダム法など）によってなされ得る。特定の実施形態では、上記のチューリップモザイクウイルス株を植物に感染させる工程は、チューリップモザイクウイルス株を、植物の葉組織に感染させる工程を包含する。感染させる工程において使用されるウイルスは、感染可能な任意の形態であり得る。このウイルスの形態としては、純化精製されたウイルスの形態、ウイルスを含む感染組織の粗抽出物の形態、または、これらの形態のウイルスに受容可能なキャリアを添加した形態などが挙げられるが、これらに限定されない。受容可能なキャリアとは、本発明のウイルスの作用に影響を及ぼさず、また人体や家畜、環境への影響がほとんどまたは全くなく、植物の生育にも悪影響をほとんどまたは全く及ぼさない任意のキャリアをいう。
【００４８】
一つの実施形態において、チューリップモザイク病に抵抗性の植物を得る上記方法は、感染させる工程によって得られた感染植物を栄養繁殖させる工程を包含する。栄養繁殖は、当業者が通常理解し得る通り、植物体の一部分（例えば、葉、茎、根、球根など）から次世代の植物を発生させる繁殖方法をいう。栄養繁殖によって、次世代の植物の子孫が得られる。実施例において実証されるように、本発明のチューリップモザイクウイルスは、球根伝染を通して、次世代以降の子孫においても保存される（実施例７．１を参照のこと）。従って、代表的に、本発明の植物の次世代以降の子孫は、花弁に色割れを示さない。より好ましい実施形態において、本発明の植物の子孫は、チューリップモザイクウイルス強毒株に対して干渉作用を示す。好ましくは、本発明の植物の子孫はチューリップモザイク病に対する抵抗性を示す。上記方法の好ましい実施形態において、上記植物はチューリップである。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００５０】
（実施例１：ＴＢＩＡ法を用いた、ＴＢＶ弱毒株の選抜）
天然に存在するＴＢＶの弱毒株を、以下に説明するように、ＴＢＩＡ法を利用して選抜した。
【００５１】
１９９５〜１９９８年の間に、富山県内のチューリップ球根生産圃場において通常の栽培条件下で栽培された約８０，０００株のチューリップの外見健全株を、本実施例の選抜の母集団として使用した。この外見健全株は、チューリップモザイク病に罹患した植物に特徴的な病徴（例えば、花弁の色割れ、葉のモザイク症状など）をほとんど示さない。
【００５２】
この約８０，０００株のチューリップの外見健全株に対して、以下に説明するＴＢＩＡ法を実施した。まず、これらの外見健全株を、花茎部分または球根部分において切り落とし、花茎切片または球根切片を得た。次いで、これらの花茎切片または球根切片の切り口が乾燥する前に、この花茎切片または球根切片の切り口断面をニトロセルロース膜（バイオラッド社製；商品番号１６２−００９３）に押しつけ、各外見健全株の汁液をこのニトロセルロース膜に付着させた。このニトロセルロース膜を、無菌下で室温にて５〜３０分間放置することによって、膜上の各汁液を乾燥させた。この手順により、各外見健全株の汁液付着ニトロセルロース膜を得た。
【００５３】
ＴＢＩＡ法に使用する抗ＴＢＶ抗血清は、当該分野で周知の抗血清作製法に従って取得した。具体的には、まず、従来のウイルス純化手順により得られたＴＢＶ純化液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で０．５ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁し、ＴＢＶ懸濁液を得た。次いで、この懸濁液の１ｍｌを、注射器を用いてウサギに静脈内注射し、この最初の注射から２週間毎に、同じＴＢＶ懸濁液を用いて同様の静脈内注射操作を繰り返した。最初の注射から８週間後にウサギから全採血を行い、これを遠心分離に供して抗ＴＢＶ抗血清を取得した。
【００５４】
ＴＢＩＡ反応を行うため、上記の汁液付着ニトロセルロース膜を、ブロッキング液（３％スキムミルクを含むＴＢＳ溶液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に１５分間から１時間浸漬した。このニトロセルロース膜を浸漬したブロッキング液を時折撹拌することにより、ブロッキング液が均一にいきわたるようにした。次いで、このニトロセルロース膜を、ＴＢＳＢ溶液（０．２％  ＢＳＡを含むＴＢＳ溶液）で希釈した抗血清溶液（約２，０００〜８，０００倍希釈）もしくはＩｇＧ溶液（５，０００〜１０，０００倍希釈）中に室温で１〜３時間または約４℃で一晩浸漬して反応させた。この反応後、このニトロセルロース膜をＴＢＳＴ溶液中で５分間振盪することにより、三回洗浄した。この洗浄後、ＴＢＳ溶液で一回洗浄した。このニトロセルロース膜を、ＡＰ９．５溶液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）で５分間振盪することにより、一回洗浄した。次いで、このニトロセルロース膜を、基質溶液（ＮＢＴ：ＢＣＩＰ）に浸漬して発色させた。この基質溶液はニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（和光純薬製  １４４−０１９９３）２０ｍｇと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸二ナトリウム１．５水和物（ＢＣＩＰ）１０ｍｇをＡＰ９．５溶液に溶解させたものである。このニトロセルロース膜を、脱イオン水で十分に洗浄し、次いで、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に浸漬することにより、植物由来の色素を脱色させた。最後に、脱イオン水で再度洗浄し、次いで自然乾燥させた後、このニトロセルロース膜を暗黒下で保存した。
【００５５】
上記ＴＢＩＡ法により、外見上は健全であるがＴＢＶ陽性反応を示す、５３個の株が明らかとなった。この外見健全株に感染しているＴＢＶが、他のチューリップ個体に感染してチューリップモザイク病を引き起こす強毒株であるのか、または他のチューリップ個体に感染してもチューリップモザイク病を引き起こさない弱毒株であるのかを調べた。具体的には、この５３個の株から得られた汁液を、ＴＢＶに感染していないことが既知のチューリップ健全株にカーボランダム法で接種し、その翌年に、この汁液接種植物の花弁を検定した。その結果、５１個の株に由来する汁液は、花弁に強い色割れを引き起こした。従って、これらの５１個の株に感染しているＴＢＶは、強毒株であることが明らかとなった。残りの２個の株に由来する汁液は、花弁に弱い色割れを引き起こした。この弱い色割れを引き起こす２個の株のうちの１株に含まれるＴＢＶを、本明細書中では、ＬＳＭ株と称する。花弁に色割れを引き起こさない有用なＴＢＶ弱毒株を得るために、以後の実験では、このＬＳＭ株を使用した。
【００５６】
（実施例２：ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子と、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子との間での塩基配列比較）
天然で見出されたＴＢＶ弱毒株ＬＳＭにおいて、どの部分で変異が生じているのかを調べるため、ＬＳＭ株とＴＢＶ強毒株であるＬＳ−Ｓ株との間で、遺伝子の塩基配列比較を行った。
【００５７】
このウイルスのゲノムの約１／１０にあたる外被タンパク質コード部分の塩基配列が決定された。ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列を、図１Ａ（配列番号１）として示し、ＴＢＶ強毒株であるＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列を、図１Ｂ（配列番号２）として示す。一般に、弱毒化ウイルスでは、外被タンパク質コード遺伝子部分に変異が生じていることが多い。しかし、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列と、ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列との間では、約９８％の同一性が示された（図２）。従って、他のウイルス種の弱毒化現象とは異なり、チューリップモザイクウイルスのＬＳＭ株で見られた弱毒化は、外被タンパク質をコードする遺伝子における変異に起因せず、他の部分の変異によるものであることが示唆された。
【００５８】
（実施例３：ＬＳＭ株の純化）
有用なＴＢＶ弱毒株を得るための以下の実験で使用するために、実施例１において得られたＬＳＭ株を、従来法により純化精製した。
【００５９】
ＬＳＭ株に感染したチューリップの感染葉１００ｇを、ＴＢＶ純化処理に供試した。まず、チタンカッター（ナショナル社製；商品番号  ＭＫ−Ｋ７５）を用いて、感染葉を粉砕した．この粉砕した１００ｇの感染葉に、１％Ｎａ２ＳＯ３を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・グリコール酸（ｐＨ９．０）溶液３００ｍｌを添加した。次いで、ホモジナイザー（日本精機社製；ホモジナイザーＭＳ−１１）で粉砕後、遠心分離機（日立工機社製；商品番ＣＲ−２１またはＲ１４Ａローター）で、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、滅菌処理した漏斗とキムワイプ（十條キンバリー社製；商品番号  ワイパーＬ−１００）を使用して、この懸濁液を濾過し、この濾過液を、７５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上澄み液を新たなチューブに移し、これに１／１０容量（すなわち、３５ｇ）のＨＣＰ（リン酸カルシウム水和物）を添加した。このＨＣＰは、０．２Ｍのリン酸二ナトリウム１２水塩（和光純薬社製；商品番号１９６−０２８３５）と、０．２Ｍ塩化カルシウム（和光純薬社製；商品番号０３６−００４８５）とを、各々１リットルずつ調整後に混合し、次いで、デカンテーション操作、イオン交換水添加および６０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離操作を、必要に応じて５〜６回繰り返すことによって得られる。次いで、このＨＣＰを添加した上澄み液を懸濁し、７５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上澄み液を新たなチューブに移し、そして３０ｍｌの２０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（最終濃度２％）を添加し、そして撹拌した。次いで、ローター（日立工機社製；商品番号ＲＰ４５Ｔ）を用いて、３２０００ｒｐｍで４℃にて９０分間超遠心分離した。次いで、４℃の低温室において、この超遠心分離によって生じたペレットを、１２ｍｌの０．０５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．０）中に懸濁し、そして３０分間撹拌した。この懸濁液を、１００００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離した。この上澄み液を新たなチューブに移し、１２ｍｌの２０％スクロースを添加した後、ローター（日立工機社製；商品番号ＲＰＳ４０ＡＴ）を用いて、４００００ｒｐｍで４℃にて９０分間超遠心分離した。次いで、この超遠心分離によって生じたペレットを、１％Ｎａ２ＳＯ３を含む０．０５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．５ｍｌ中に再懸濁した。最後に、この再懸濁液を１００００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離して、純化精製されたＴＢＶを含む上澄み液を得た。この上澄み液（ＴＢＶ純化ウイルス溶液）を、使用直前まで−８０℃で保存した。
【００６０】
純化操作によって得られたウイルスの量は、以下の計算式を用いて算出され得る：１．４５×（２８０ｎｍでの吸光度）−０．７４×（２６０ｎｍでの吸光度）。この計算式に従うと、本実施例において得られたＬＳＭ株の純化ウイルス溶液中のウイルス量は、０．２８ｍｇ／ｍｌであった。
【００６１】
（実施例４：紫外線照射処理）
上記の実施例において得られたＬＳＭ株は、他のチューリップ個体に感染すると、弱度であるがなお花弁の色割れ症状（チューリップモザイク病に典型的な症状）を引き起こす原因となる。弱度でも色割れした花卉植物は、商品価値を損ない、そして収量も低下するので、弱毒化ウイルスワクチンとしての使用には依然として好ましくない。この弱い色割れ症状を完全に無くすために、人為的にＬＳＭ株に紫外線照射処理を行い、ＬＳＭ株に変異誘発をおこさせた。
【００６２】
この変異誘発処理のため、まず、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）中に溶解したＬＳＭ株純化ウイルス溶液（濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを半径６ｃｍのシャーレにいれた。次いで、１５Ｗの紫外線ランプ（東芝ライテック社製；商品番号殺菌ランプＧＬ１５−Ａ）を用いて、このシャーレから２０ｃｍの距離で上から、１０分間、２０分間、または３０分間照射した（各処理にシャーレ１枚；従って、合計３枚）。
【００６３】
照射処理後、この変異誘発されたＬＳＭ株純化ウイルス溶液に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）を２０ｍｌ添加して、５倍希釈した。この希釈液を、以下の選抜手順において使用した。
【００６４】
（実施例５：チューリップ植物の花弁に色割れを引き起こさないＴＢＶ弱毒株についてのネガティブ選抜）
実施例４において得られた、変異誘発ＬＳＭ株（ＬＳＭ変異体）の純化ウイルス希釈液を用いて、チューリップ植物の花弁に色割れを全く引き起こさないＴＢＶ弱毒株について、ネガティブ選抜を行った。以下に具体的に記載されるように、３回ネガティブ選択を繰り返すことによって、チューリップモザイク病に弱いチューリップ品種ハロクロに接種しても、花弁に全く色割れを引き起こさないＴＢＶ弱毒株が得られた。
【００６５】
まず、上記の変異誘発ＬＳＭ株の純化ウイルス希釈液を、萌芽期の健全なチューリップ品種メントン６０株に対して、カーボランダム法で接種した。具体的には、このウイルス希釈液を綿球にしみこませ、あらかじめカーボランダム（６００メッシュ）をふりかけておいた健全なチューリップ植物体の葉２枚に、この綿球を擦り付けることにより接種した。このカーボランダム法では、葉の表面を上記の綿球で２〜３回擦り付けるだけで、ウイルス感染が成立することが公知である。ウイルス接種後直ちに、この葉の表面を水で洗い流した。
【００６６】
開花期に、この感染処理を施した植物の感染の成否と、花弁における色割れの有無とを調べた。感染の成否は、実施例１と同じようにＴＢＩＡ法により検定した。花弁の色割れは、目視により検定した。この結果を、以下の表１に示す。
【００６７】
【表１】
2005034111.tif 000002
上記の表１では、対照として、強毒株であることが既知のＬＳ−Ｓ株に実施例４と同じ手順で紫外線照射して得られたＬＳ−Ｓ変異体の結果も示した。表１から明らかなように、紫外線照射したＬＳＭ変異体およびＬＳ−Ｓ変異体の感染率（感染した株数／接種した総株数）は、大きく低下した。特に、３０分間紫外線照射したＬＳＭ変異体およびＬＳ−Ｓ変異体の感染率は、著しく低下した（それぞれ、３．３％および０％）。
【００６８】
ＴＢＶ感染が成立していることが示された各感染チューリップ株における、花弁の色割れの有無を、表１の右欄に示す。結果、１０分間紫外線照射したＬＳ−Ｓ変異体では、７個の株中４個において色割れを示し、そして２０分間紫外線照射したＬＳ−Ｓ変異体では、６個の株中３個において色割れを示した。一方、１０分間または３０分間紫外線照射して得られたＬＳＭ変異体は、感染が成立したすべての個体において色割れが見られなかった（それぞれ、５個の株中５個、または２個の株中２個）。
【００６９】
上記の実験において、ＴＢＶに感染しているが色割れが認められなかった合計１３個の株を再度植えて栽培し、翌春の開花期に、上記と同様にして感染の成否と花弁における色割れの有無とを調べた。この結果を、以下の表２に示す。
【００７０】
【表２】
2005034111.tif 000003
各感染チューリップ株における翌春の花弁の色割れ程度を、表２の右欄に示す。この表２において、「＋」は、強い色割れが観察されたことを示し、「＋−」は、弱い色割れが観察されたことを示し、そして「−」は、色割れが全く観察されなかったことを示す。表２から明らかなように、強毒株であるＬＳ−Ｓ株に紫外線照射して得られたＬＳ−Ｓ変異体は、翌春の花弁に強い色割れを引き起こすことが示された。従って、ＴＢＶ強毒株に紫外線照射しても、弱毒化ウイルスワクチンとして使用可能なＴＢＶ弱毒株は得られないことが示された。
【００７１】
一方、１０分間紫外線照射して得られたＬＳＭ変異体に感染した３個の株、および３０分間紫外線照射して得られたＬＳＭ変異体に感染した２個の株は、翌春の花弁に弱い色割れを引き起こすことが示された。驚くべきことに、１０分間紫外線照射して得られたＬＳＭ変異体に感染した２個の株は、翌春の花弁においても全く色割れ病徴を生じさせないことが明らかとなった。この２つのＬＳＭ変異体を、それぞれ、ＬＳＭ１０−１株およびＬＳＭ１０−２株と命名する。
【００７２】
この感染しても色割れを全く引き起こさないＬＳＭ１０−１株またはＬＳＭ１０−２株に感染した各チューリップ植物の葉組織１．５ｇをすりつぶし、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）１３．５ｍｌを加えて懸濁した。この懸濁液を、チューリップ品種ハルクロの健全株１８株に、上記と同じようにカーボランダム法で接種した。翌春の開花期に、この接種した株における花弁の色割れ程度を検定した。この結果を、以下の表３に示す。
【００７３】
【表３】
2005034111.tif 000004
各感染チューリップ株における花弁の色割れ程度を、表３の右欄に示す。この表３において、＋は、強い色割れが観察されたことを示し、＋−は、弱い色割れが観察されたことを示し、そして−は、色割れが全く観察されなかったことを示す。表３に示されるように、ＬＳＭ１０−１に感染した１８個の株の中で２個の株において、花弁の色割れは全く観察されなかった。この２個のＬＳＭ変異体を、それぞれ、ＬＳＭ１０−１−１株およびＬＳＭ１０−１−２株と命名する。
【００７４】
次いで、この感染しても色割れを全く引き起こさないＬＳＭ１０−１−１株またはＬＳＭ１０−１−２株に感染した各チューリップ植物の葉組織１．５ｇをすりつぶし、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）１３．５ｍｌを加えて懸濁した。この懸濁液を、チューリップ品種ラッキーストライクの健全株１８株に、上記と同じようにカーボランダム法で接種した。翌春の開花期に、この接種した株における花弁の色割れ程度を検定した。この結果を、以下の表４に示す。
【００７５】
【表４】
2005034111.tif 000005
各感染チューリップ株における花弁の色割れ程度を、表４の右欄に示す。この表４において、＋は、強い色割れが観察されたことを示し、＋−は、弱い色割れが観察されたことを示し、そして−は、色割れが全く観察されなかったことを示す。驚くべきことに、ＬＳＭ１０−１−１に感染した１８個の株すべてにおいて、花弁の色割れは全く観察されなかった。このＬＳＭ１０−１−１に感染した１８個の各々の株に感染しているＴＢＶを、チューリップモザイクウイルス弱毒株１（ＴＢＶ弱毒株１）、チューリップモザイクウイルス弱毒株２（ＴＢＶ弱毒株２）、チューリップモザイクウイルス弱毒株３（ＴＢＶ弱毒株３）、チューリップモザイクウイルス弱毒株４（ＴＢＶ弱毒株４）、チューリップモザイクウイルス弱毒株５（ＴＢＶ弱毒株５）、チューリップモザイクウイルス弱毒株６（ＴＢＶ弱毒株６）、チューリップモザイクウイルス弱毒株７（ＴＢＶ弱毒株７）、チューリップモザイクウイルス弱毒株８（ＴＢＶ弱毒株８）、チューリップモザイクウイルス弱毒株９（ＴＢＶ弱毒株９）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１０（ＴＢＶ弱毒株１０）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１１（ＴＢＶ弱毒株１１）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１２（ＴＢＶ弱毒株１２）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１３（ＴＢＶ弱毒株１３）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１４（ＴＢＶ弱毒株１４）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１５（ＴＢＶ弱毒株１５）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１６（ＴＢＶ弱毒株１６）、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１（ＴＢＶ弱毒株１７−１）、およびチューリップモザイクウイルス弱毒株１８（ＴＢＶ弱毒株１８）と命名する。
【００７６】
この１８個の各株を、チューリップ品種ラッキーストライクに接種して観察された特徴を、以下の表５にまとめる。
【００７７】
【表５】
2005034111.tif 000006
１８個の株はいずれも、全く色割れを引き起こさないという点で共通していた。しかし、花姿において、チューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１に感染したチューリップは、当業者による経験的な判断（例えば、花の形態や色調や大きさなどに基づく）により、顕著に優れた花姿を示すことが明らかとなった。従って、以後の実験では、この優れた花姿特性をも付与し得るチューリップモザイクウイルス弱毒株１７−１についてより詳細に調べた。
【００７８】
（実施例６：ＴＢＶ弱毒株１７−１の無病徴特性および感染能）
実施例５で得られたＴＢＶ弱毒株１７−１を、チューリップに接種感染させて、その病徴について調べ、そしてＴＢＶ強毒株をチューリップに接種感染させた場合の病徴と比較した。
【００７９】
具体的には、実施例５において優れた花姿を示した、ＴＢＶ弱毒株１７−１感染チューリップ植物の葉組織１ｇをすりつぶし、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）９ｍｌを加えて懸濁した。このＴＢＶ弱毒株１７−１懸濁液を、チューリップ品種ラッキーストライクの健全株に、カーボランダム法で接種した。比較のために、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓに感染したチューリップ個体の葉組織１ｇをすりつぶし、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）９ｍｌを加えて懸濁した。このＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓ懸濁液も上記と同様に、チューリップ品種ラッキーストライクの健全株に、カーボランダム法で接種した。開花期に、これらの接種したチューリップ株における花弁の色割れを検定した。
【００８０】
この検定写真を図３に示す。この図３（ａ）の写真は、ＴＢＶ弱毒株１７−１を感染させたチューリップの花の写真である。図３（ｂ）の写真は、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓを感染させたチューリップの花の写真である。対照として、何も感染していない健全株のチューリップの写真を、図３（ｃ）に示す。図３を見て明らかなように、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓ感染チューリップは、その花弁において強い色割れを生じた。一方、ＴＢＶ弱毒株１７−１感染チューリップには、色割れ症状が全く認められず、対照の健全株に勝るとも劣らない、優れた花姿を示した。
【００８１】
次いで、ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染能を検定した。上記で得られたＴＢＶ弱毒株１７−１懸濁液およびＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓ懸濁液を用いて、それらが種々の検定植物に感染し得るか否か、そして感染する場合には、それらがモザイク症状を引き起こすか否かを調べた。検定植物としては、以下の表６に列挙された６科１４種の植物を使用した。各懸濁液の接種方法は、上記と同じように実施した。
【００８２】
【表６】
2005034111.tif 000007
表６において、−は全身感染しないことを示し、＋は全身感染するが外見上は無病徴であることを示し、そしてＭは全身感染してモザイク病徴を提示することを示す。表６に示されるように、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓも、ＴＢＶ弱毒株１７−１も、ユリ科以外の植物に対しては感染能を有さなかった。ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓは、ユリ科のＬｉｌｉｕｍ  ｆｏｒｍｏｓａｎｕｍ、Ｌ．ｃｏｎｃｏｌｏｒおよびＴｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａにおいて全身感染し、そしてＴｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａではモザイク症状を引き起こした。一方、ＴＢＶ弱毒株１７−１は、Ｔｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａ以外のユリ科の供試植物には感染せず、そしてＴｕｌｉｐａ  ｇｅｓｎｅｒｉａｎａにおいては、感染しても無病徴であることが示された。このことから、ＴＢＶ弱毒株１７−１は、チューリップにのみ全身感染し、そして花弁にも葉にもモザイク病徴を全く引き起こさないことが明らかとなった。
【００８３】
（実施例７：ＴＢＶ弱毒株１７−１の保存性検定）
（実施例７．１：継代保存性検定）
ＴＢＶ弱毒株１７−１が、長期間にわたる継代において保存され得るか否かを検定した。
【００８４】
チューリップ品種ハルクロに、ＴＢＶ弱毒株１７−１を、上記のカーボランダム法により接種感染させた。この感染植物から得られた球根を、４年間にわたり継代した。この検定期間の間、毎年開花期に、花弁における色割れ病徴を調べた。この色割れ病徴を確認する際に、同時に、検定植物がＴＢＶ弱毒株１７−１に感染していることも、上記のＴＢＩＡ法によって確認した（ＴＢＶ１７−１の感染が確認されたことを、表７において記号＋で示す）。この結果を、以下の表７にまとめる。
【００８５】
【表７】
2005034111.tif 000008
色割れ病徴の検定に供試した植物はすべて、確かにＴＢＶ弱毒株１７−１に感染していることが示された。そして、４年間に及ぶ長期間の継代期間にわたって、花弁には全く色割れが認められなかった。さらに、葉のモザイク症状についても同時に調べたところ、この検定に供試したすべての植物の葉においてモザイク症状は認められなかった。このことから、ＴＢＶ弱毒株１７−１が、長期間にわたる継代において安定して保存されることが明らかとなった。
【００８６】
（実施例７．２：低温保存性検定）
ＴＢＶ弱毒株１７−１が、低温条件下で保存された場合に、その無病徴特性および感染能を保存し得るか否かを検定した。
【００８７】
チューリップ品種ハルクロに、ＴＢＶ弱毒株１７−１を、上記のカーボランダム法により接種感染させた。この感染植物から得られた葉組織を採取し、−８０℃で凍結保存した。保存してから１年後、２年後、および３年後に、無菌条件下で、この低温保存された感染葉をすりつぶし、これに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）９ｍｌを加えて懸濁した。このＴＢＶ弱毒株１７−１懸濁液を、チューリップ品種ラッキーストライクの健全株に、カーボランダム法で接種した。接種した植物が、ＴＢＶ弱毒株１７−１が感染したか否かを、上記のＴＢＩＡ法によって確認した。ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染が認められた植物の個体数を、接種した全個体数で除算し、これに１００を乗算することによって、感染率（％）を算出した。そして開花期に、これらの接種したチューリップ株における花弁の色割れを検定した。この結果を、以下の表８にまとめる。
【００８８】
【表８】
2005034111.tif 000009
表８に示されるように、−８０℃にて１年間、２年間、または３年間保存された後においても、ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染率は１００％であり、安定して感染能が保持され得ることが明らかとなった。そして、−８０℃で１年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、−８０℃で２年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、−８０℃で３年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、すべて、花弁に色割れを全く引き起こさなかった。このことから、ＴＢＶ弱毒株１７−１が、長期間にわたって低温で保存された後でも、その無病徴特性および感染能を安定して保持し得ることが明らかとなった。
【００８９】
（実施例７．３：凍結乾燥保存性検定）
ＴＢＶ弱毒株１７−１が、凍結乾燥して保存された場合に、その無病徴特性および感染能を保存し得るか否かを検定した。
【００９０】
チューリップ品種メントンに、ＴＢＶ弱毒株１７−１を、上記のカーボランダム法により接種感染させた。この感染植物から得られた葉組織を採取した。このＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した葉組織０．１ｇを細かく砕き、アンプル（１７ｃｍ長、容量５ｍｌ）へ入れて、−４０℃で一晩冷却した。翌日に、あらかじめ稼働させておいた凍結乾燥機（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社製；ＬＹＰＨ／ＬＯＣＫ１Ｌ）にこのアンプルを装着し、２〜３日間吸引させた。完全に乾燥したのを確認した後、このアンプルをバーナーで切断し、そして冷蔵庫に保存した。この操作によって、凍結乾燥させた葉組織を得た。凍結乾燥させて保存してから１年後、２年後、および３年後に、無菌条件下で、この凍結乾燥保存された感染葉をすりつぶし、これに０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）１ｍｌを加えて懸濁した。このＴＢＶ弱毒株１７−１懸濁液を、チューリップ品種ハルクロの健全株に、カーボランダム法で接種した。接種した植物が、ＴＢＶ弱毒株１７−１が感染したか否かを、上記のＴＢＩＡ法によって確認した。ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染が認められた植物の個体数を、接種した全個体数で除算し、これに１００を乗算することによって、感染率（％）を算出した。そして開花期に、これらの接種したチューリップ株における花弁の色割れを検定した。この結果を、以下の表９にまとめる。
【００９１】
【表９】
2005034111.tif 000010
表９に示されるように、凍結乾燥させて１年間、２年間、または３年間保存された後においても、ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染率は１００％であり、安定して感染能が保持され得ることが明らかとなった。そして、凍結乾燥させて１年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、凍結乾燥させて２年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、凍結乾燥させて３年間保存したＴＢＶ弱毒株１７−１も、すべて、花弁に色割れを全く引き起こさなかった。このことから、ＴＢＶ弱毒株１７−１が、長期間にわたって凍結乾燥保存された後でも、その無病徴特性および感染能を安定して保持し得ることが明らかとなった。
【００９２】
上記の実施例７で得られた結果から、ＴＢＶ弱毒株１７−１は、長期間保存された後においても感染率の低下が生じず、かつ強毒株への変異も起こらないことが示された。
【００９３】
（実施例８：ＴＢＶ弱毒株１７−１の球根伝染率）
植物に感染したＴＢＶ弱毒株１７−１が、その感染した親植物自体のみならず、次世代である子孫植物においても感染しているか否かを調べた。
【００９４】
まず、チューリップ植物に、ＴＢＶ弱毒株１７−１を、上記のカーボランダム法により接種感染させた。この感染植物から発生した球根を採取し、そしてこの球根を、感染親植物とは隔離した土壌に植付けた。翌年、この球根より発生した植物の子球を採取し、この子球におけるＴＢＶ弱毒株１７−１の感染を上記のＴＢＩＡ法により検定して、球根伝染率を調べた。
【００９５】
この結果を、図４に示す。上段は、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した球根より発生した主球から小球を、左から順にブロットし、ＴＢＩＡ法によってＴＢＶ感染を検定した図である。下段は対照実験であり、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓを用いて同様の実験を行った結果を示す。最下段の右端の角にあるブロットは、ポジティブコントロールを示す。図４から明らかなように、すべての子球がＴＢＶ弱毒株１７−１に感染しており、ＴＢＶ弱毒株１７−１の球根伝染率は１００％であることが実証された。
【００９６】
（実施例９：ＴＢＶ強毒株に対する干渉効果）
ＴＢＶ弱毒株１７−１が、ＴＢＶ強毒株に対して、干渉効果を示し得るか否かを調べた。
【００９７】
ＴＢＶに感染していないことが既知の健全なチューリップ品種メントンに対して、萌芽期に、一次ウイルスとしてＴＢＶ弱毒株１７−１を上記のカーボランダム法により接種感染させた。開花期に、この感染植物の花弁に色割れ病徴が認められないことを目視により確認した。この感染植物より発生した球根を採取し、この球根を、翌年の強毒株への干渉実験に供試した。まず、この球根がＴＢＶ弱毒株１７−１に感染していることを、上記のようなＴＢＩＡ法によって確認した。ＴＢＶ弱毒株１７−１の感染が認められた球根を土壌に植付け、その萌芽期に、二次ウイルスとしてＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓをカーボランダム法によって接種感染させた。対照実験として、一次ウイルスとしてＬＳＭ株（実施例１で得られた、天然に存在する（すなわち、紫外線照射処理を施していない）ＴＢＶの弱毒株）を接種したもの、または、一次ウイルスを接種しなかったものを用いて、同様の実験を並行して実施した。この結果を以下の表１０にまとめる。
【００９８】
【表１０】
2005034111.tif 000011
表１０の「一次ウイルス」欄および「二次ウイルス」欄において、「−」は、ウイルスを接種しなかったことを示す。「花弁の病徴」欄において、「＋」は、強い色割れが観察されたことを示し、「＋−」は、弱い色割れが観察されたことを示し、そして「−」は、色割れが全く観察されなかったことを示す。その結果、一次ウイルスとしてＴＢＶ弱毒株１７−１を接種したすべてのチューリップ個体において、花弁の色割れは全く観察されなかった。一方、一次ウイルスとしてＬＳＭ株を接種したチューリップ個体（１２個体）では、少数（２個体）において花の色割れが観察されなかったものの、大半（１０個体）において弱い色割れが観察された。一次ウイルスを接種しなかったチューリップ個体では、すべての個体において強い色割れが観察された。この結果から、ＴＢＶ弱毒株１７−１は、ＴＢＶ強毒株に対して１００％の干渉効果を示し得ることが明らかとなった。従って、ＴＢＶ弱毒株１７−１を予め接種した植物は、チューリップモザイク病に対して抵抗性を示し得ることが実証された。
【００９９】
（実施例１０：ＴＢＶ弱毒株１７−１が、植物の生育および収量に及ぼす影響）
ＴＢＶ弱毒株１７−１が、植物の生育および収量に対して、どのような影響を及ぼすかについて検定した。
【０１００】
チューリップ植物に、ＴＢＶ弱毒株１７−１を、上記のカーボランダム法により接種感染させた。比較のために、実施例１で得られた天然に存在するＴＢＶの弱毒株ＬＳＭも、同様にして、チューリップ植物に接種感染させた。平成１２年秋に富山県農業試験場圃場において、これらの感染植物を、１０ｃｍ間隔で縦７球、横６球ずつ２反復で植付け、通常の栽培条件下で栽培した。対照として、ＴＢＶに感染させていない健全チューリップ植物とＬＳＭも、上記の感染植物の同じ畝に１０ｃｍ間隔で縦７球、横６球ずつ２反復で植付け、同一条件下で栽培した。この実験結果を、以下の表１１にまとめる。
【０１０１】
【表１１】
2005034111.tif 000012
表１１において、各実験区の供試個体数は４２球（２反復）であり、数値は、一株あたりの平均値を示す。数値の右側に同一のアルファベットを伴う数値の間には、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ検定で有意差（５％）が無いことを示す。表１１に示されるように、ＴＢＶ弱毒株１７−１を接種した感染植物と、ＴＢＶに感染していない健全植物との間では、草丈においても、葉長においても、球根重においても有意差は認められなかった。従って、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した植物は、健全植物と同等の生育および収量を示すことが明らかとなった。このように、ＴＢＶ弱毒株１７−１は、植物の生育・収量に悪影響を及ぼさず、有用な弱毒化ウイルスワクチンとして使用され得ることが実証された。
【０１０２】
上記の表１１に記載のデータをさらに確証付けるため、別の圃場（富山県滑川市球根栽培圃場）において、同じ実験を繰り返した。ＴＢＶ弱毒株１７−１を感染させたチューリップ球根、ＬＳＭ株を感染させたチューリップ球根、およびＴＢＶに感染していない健全なチューリップ球根を、平成１３年秋に１０ｃｍ間隔で縦１０球、横６球ずつ３反復で同じ畝に植付け、通常の栽培条件下で栽培した。この実験結果を、以下の表１２にまとめる。
【０１０３】
【表１２】
2005034111.tif 000013
表１２において、各実験区の供試個体数は６０球（３反復）であり、数値は、一株あたりの平均値を示す。数値の右側に同一のアルファベットを伴う数値の間には、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ検定で有意差（５％）が無いことを示す。表１１に示された結果と同様に、本実験において、ＴＢＶ弱毒株１７−１を接種した感染植物と、ＴＢＶに感染していない健全植物との間では、草丈においても、葉長においても、球根重においても有意差は認められなかった。また、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した植物において、花弁の色割れ病徴および葉のモザイク病徴は観察されなかった。従って、ＴＢＶ弱毒株１７−１が、有用な弱毒化ウイルスワクチンとして使用され得ることがさらに確証付けられた。
【０１０４】
（実施例１１：花弁の色割れ比較）
本発明のＴＢＶ弱毒株１７−１もしくはＴＢＶ強毒株を感染させた植物、またはＴＢＶに感染していない健全植物について、花弁の色割れを比較した。
【０１０５】
この結果を、図５Ａ〜５Ｃ、図６Ａ〜６Ｄおよび図７Ａ〜７Ｃに示す。
【０１０６】
図５Ａ〜５Ｃは、チューリップ品種ハロクロに、ＴＢＶ弱毒株１７−１（図５Ａ）およびＴＢＶ強毒株（図５Ｂ）を感染させた植物、ならびに、ＴＢＶに感染していない健全植物（図５Ｃ）の花の写真である。品種ハロクロは、チューリップモザイク病に特に弱いことが知られている。図５Ａ〜５Ｃに示されるように、ＴＢＶ強毒株に感染した植物は強い花の色割れを示したのに対し、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した植物は、まったく花の色割れを示さず、健全植物と同等の外観を示した。
【０１０７】
図６Ａ〜６Ｄは、チューリップ品種バレリーナに、ＴＢＶ弱毒株１７−１（図６Ａ）、ＬＳＭ株（図６Ｂ）およびＴＢＶ強毒株（図６Ｃ）を感染させた植物、ならびに、ＴＢＶに感染していない健全植物（図６Ｄ）の花の写真である。品種バレリーナはチューリップモザイク病に特に弱いことが知られている。図６Ａ〜６Ｄに示されるように、ＴＢＶ強毒株に感染した植物は強い花の色割れを示したのに対し、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した植物は、まったく花の色割れを示さず、健全植物と同等の外観を示した。ＬＳＭ株に感染した植物は、花弁において斜めに筋模様が入り、弱い花の色割れを示した。
【０１０８】
図７Ａ〜７Ｃは、チューリップ品種ラッキーストライクに、ＴＢＶ弱毒株１７−１（図７Ａおよび７Ｂ）およびＴＢＶ強毒株（図７Ｃ）を感染させた植物の花の写真である。ラッキーストライクは覆輪の品種（花弁の縁に帯状の模様が入る品種）であるので色割れがわかりやすいことが知られている。図７Ａ〜７Ｃに示されるように、ＴＢＶ強毒株に感染した植物は強い花の色割れを示したのに対し、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染した植物は、まったく花の色割れを示さず、健全植物と同等の外観を示した。
【０１０９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示したが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本明細書に記載のように、健全植物に、本発明のチューリップモザイクウイルス株を接種することによって、チューリップモザイク病を防除することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＢＶ強毒株であるＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】図２は、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号１）と、ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号２）との間での核酸配列比較を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号１）と、ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号２）との間での核酸配列比較を示す。
【図２Ｃ】図２は、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号１）と、ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号２）との間での核酸配列比較を示す。
【図２Ｄ】図２は、ＬＳＭ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号１）と、ＬＳ−Ｓ株の外被タンパク質コード遺伝子配列（配列番号２）との間での核酸配列比較を示す。
【図３】図３は、チューリップ花弁の色割れに対する弱毒株の効果を示す写真である。図３ａは、ＴＢＶ弱毒株１７−１を感染させたチューリップの花の写真である。図３ｂは、ＴＢＶ強毒株ＬＳ−Ｓを感染させたチューリップの花の写真である。図３ｃは、ＴＢＶに感染していない健全株のチューリップの花の写真である。
【図４】図４は、ＴＢＩＡ法によってＴＢＶ弱毒株１７−１の球根伝染率を検定した写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染させたチューリップ品種ハロクロの花の写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＴＢＶ強毒株に感染させたチューリップ品種ハロクロの花の写真である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＴＢＶに感染していない健全なチューリップ品種ハロクロの花の写真である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染させたチューリップ品種バレリーナの花の写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＴＢＶ弱毒株ＬＳＭに感染させたチューリップ品種バレリーナの花の写真である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＴＢＶ強毒株に感染させたチューリップ品種バレリーナの花の写真である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＴＢＶに感染していない健全なチューリップ品種バレリーナの花の写真である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染させたチューリップ品種ラッキーストライクの花の写真である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＴＢＶ弱毒株１７−１に感染させたチューリップ品種ラッキーストライクの花の写真である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＴＢＶ強毒株に感染させたチューリップ品種ラッキーストライクの花の写真である。
【図１Ａ】
2005034111.tif 000014
【図１Ｂ】
2005034111.tif 000015
【図２Ａ】
2005034111.tif 000016
【図２Ｂ】
2005034111.tif 000017
【図２Ｃ】
2005034111.tif 000018
【図２Ｄ】
2005034111.tif 000019
【図３】
2005034111.tif 000020
【図４】
2005034111.tif 000021
【図５Ａ】
2005034111.tif 000022
【図５Ｂ】
2005034111.tif 000023
【図５Ｃ】
2005034111.tif 000024
【図６Ａ】
2005034111.tif 000025
【図６Ｂ】
2005034111.tif 000026
【図６Ｃ】
2005034111.tif 000027
【図６Ｄ】
2005034111.tif 000028
【図７Ａ】
2005034111.tif 000029
【図７Ｂ】
2005034111.tif 000030
【図７Ｃ】
2005034111.tif 000031
【配列表】
2005034111000001.app