(57)【要約】【課題】  安定で、生物学的に利用可能であり、生理学的に許容可能であり、かつ、実利的な、ピルベートの供給源を含む組成物を提供することを課題とする。【解決手段】  抗酸化物質組成物を製造する方法であって、以下の工程：(a) ネギ属の植物由来の組織を砕き、約30℃未満の温度で組織をインキュベートする工程；(b) 砕いた組織をアルカリヒドロキシド又はアルカリ土類ヒドロキシドで中和する工程；(c) 組織を乾燥する工程；(d) 組織を粉砕する工程；(e) 組織をエタノールで抽出する工程；及び(f) エタノールを蒸発させ、ピルベートを含む固形残留物を回収する工程、を含む、上記製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化物質組成物を製造する方法であって、以下の工程：
(a) ネギ属の植物由来の組織を砕き、約30℃未満の温度で組織をインキュベートする工程；
(b) 砕いた組織をアルカリヒドロキシド又はアルカリ土類ヒドロキシドで中和する工程；
(c) 組織を乾燥する工程；
(d) 組織を粉砕する工程；
(e) 組織をエタノールで抽出する工程；及び
(f) エタノールを蒸発させ、ピルベートを含む固形残留物を回収する工程、
を含む、上記製造方法。
【請求項２】
砕いた組織を、約25℃未満で、約5分又はそれより長くインキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
砕いた組織を約4℃で、約30分間インキュベートする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
砕いた組織を水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウムで中和する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組織を95％エタノール(v:v)で抽出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
乾燥した組織をヘキサンで脱脂し、残留へキサンを粉砕の前に蒸発させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
植物が、Allium cepa及びAllium sativumからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
植物が、Allium cepaである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法により調製されたピルベート強化植物抽出物。
【請求項１０】
ネギ属の植物由来の組織から誘導された植物抽出物であって、該抽出物のピルビン酸が少なくとも100％強化されている、上記抽出物。
【請求項１１】
クエルセチン及びケンフェロールをさらに含む、請求項１０に記載の植物抽出物。
【請求項１２】
植物が、Allium cepa及びAllium sativumからなる群より選ばれる、請求項１０に記載の植物抽出物。
【請求項１３】
植物が、Allium cepaである、請求項１２に記載の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タマネギの鱗茎から誘導された抗酸化物質抽出物、抗酸化物質抽出物の製造方法及び抗酸化物質抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、フリーラジカルの健康への負の作用に、かなりの注目が集まってきている。これらの不安定な反応性物質は、細胞構造に深刻な損傷を引き起こし得る。生物系の抗酸化能力を超えたフリーラジカル種の発生により、酸化的ストレスが生じる。酸化的ストレスは、心疾患、神経変性疾患、癌及び老化過程に役割を担うことが証明されている。従って、抗酸化物質の健全なレベルを維持することによる、身体組織における酸化的ストレスの低下により、これら疾患の発生を遅くするか又は防ぐことができる。さらに、抗酸化物質は、食品製造の間に防腐剤として使用され、食品脂質の過酸化を最小限にする。
【０００３】
抗酸化物質は、幾つかの方法により食物及び膜脂質を保護することができるが、最も重要なのは、自己触媒連鎖反応を伝播するフリーラジカルを中和する能力である。中和は、抗酸化物質が、フリーラジカルに電子又は水素原子を供与する場合に生じる。この方法において、抗酸化物質それ自体はフリーラジカルになるが、遊離電子は、共鳴又は凝縮により安定化される。フラボノイド及びケト酸の両方は、これらの官能性を有する。
植物材料は、幾つかの異なる抗酸化性化合物を含む。植物由来の抗酸化物質、例えばトコフェロール、アスコルビン酸およびフラボノイドは、フリーラジカル介在疾患からヒトを保護するかもしれない重要な食餌性抗酸化物質である。タマネギは、ケト酸抗酸化物質、例えばピルビン酸及びフラボノイド、例えばクエルセチン及びケンフェロールの豊富な供給源である。
【０００４】
様々な植物由来抗酸化物質は、市販されている。これらとしては、ニンニク、イチョウ、ベリー(berries)、ローズマリー、セージ、タイム、ダイズ、チャ(tea)、オレガノ等の抽出物が挙げられる。さらに、様々なタイプのタマネギ抽出物が市販されているが、これらの抽出物は、矯味矯臭剤としての使用が意図されているのであり、それら抗酸化物質、主にピルベート、含有物を強化すること、又はこの含有物にそれらを適用することは、試みられていない。
【０００５】
かなりの研究が、ピルベートの抗酸化力に対して行われてきた。かつては、天然の抗酸化物質、例えばビタミンA、C、E及び様々なミネラルが、フリーラジカルと闘うのに大いに有望であると考えられていたが、今は、それらはわずかな効果しかないと考えられている。しかし、ピルベートは、哺乳類の研究においてフリーラジカルスカベンジャー及びインヒビターの両方であることが証明されている。これは重要なことであり、なぜなら、体内には、フリーラジカルスカベンジャーとしておそらく作用する様々な物質があるが、ピルベートは、これら反応性種の産生に、インヒビターとしても作用するという点が独特だからである。
【０００６】
ピルビン酸の主な機能はエネルギーの放出であり、それは、エネルギーに関する異化経路、例えばクレブス回路に即座に組み込まれる。実際、ピルベートは、エネルギーに関するグルコース代謝の中間生成物の一つであり、従って、実にグルコースよりも、より即時的なエネルギー供給源である。ピルベートのこの明らかな重要性の他に、その補足として、健康上の利益を与えることが報告されており、それは、例えば、眼の健康改善、持久力強化、体重減少、虚血性心及び腸損傷の阻害、骨粗鬆症の軽減、糖尿病における血中グルコース濃度の低下及び癌性腫瘍の阻害である。
ピルビン酸は、抗酸化活性を有する炭素数3のα-ケト酸であり、眼の健康、加齢に伴う疾患、例えば白内障及び緑内障の、特に予防及び治療に有効であることが示されてきた。それは、フリーラジカルの捕捉、網膜における脂質過酸化反応の予防、及び眼の水晶体の糖化の予防に有効であると信じられている。
【０００７】
白内障は、眼の水晶体が曇ることであり、それにより入ってくる光の量が減少し、その結果として視力が低下する。幾つかの因子は、視力及び白内障の発生に影響を及ぼし、それらとしては、例えば加齢、太陽光及び栄養が挙げられる。老化した水晶体は、代謝の変化を受け、それにより白内障が発生し易くなるかも知れない。このうちの幾つかは、酸素及び栄養の供給の低下により生じ、眼をフリーラジカルの損傷に脆弱にする。科学アカデミーからの1983レポートによると、白内障は、房水に見出されるフリーラジカル過酸化水素(free-radical hydrogen peroxide)により惹起される。フリーラジカル、例えば過酸化水素は、グルタチオンを酸化し、眼のエネルギー産生系を破壊し、水晶体にナトリウムを漏出させる。水がナトリウムに続き、白内障の浮腫の段階が始まる。その後、体温が眼中の水晶体タンパクを酸化（加熱調理）し、それが(卵タンパクと同様に)不透明及び不溶性になる。
【０００８】
フリーラジカルは、水性液体中に存在し、眼の水晶体を浸し、エネルギーを産生して細胞代謝を維持する酵素を破壊する。また、フリーラジカルは、膜及び水晶体繊維中の脂肪分子を分解し、よりフリーラジカルを発生させ、水晶体嚢内に積層様構造タンパクの架橋を作成する(変性又は分解)。水晶体嚢は、膨潤又は脱水する能力を有する。その際に、圧力の上昇及び/又は低下が、水晶体繊維膜に破損を生じ、その結果として、水及び組織片が存在する眼に微視的な空間を生じる。タンパクの糖化(グリコシル化)は、糖尿病性白内障形成及び網膜症の発生に顕著な役割を担うことが示されてきた。また、グリコシル化プロセスは、一般的な加齢の結果として生じる。このメカニズムは、加齢に伴う失明の主な原因である緑内障を引き起こし、それはまた、酸化的ストレスにより誘発される。
白内障の予防及び軽減におけるピルベートの抗酸化活性及びその有効性は、幾つかの動物実験及び研究室での研究により証明されてきた。
【０００９】
ピルベートは、カプセル及び粉末の形態、また、バー(bar)及びドリンクにおいて、市販されている。技術的専門知識及び最新式の設備機器を要求する製造方法としては、バイオ発酵(biofermentation)及びバイオ化学合成が挙げられる。また、最終産物におけるピルベートの安定性及びバイオアベイラビリティは、重要であり、考慮するのに重要な因子である。純粋なピルビン酸は、非常に不安定であり、強酸性である。塩の形態のピルビン酸は、より安定で中性である。
【００１０】
ピルビン酸のバイオアベイラビリティは、遊離酸の形態において低い。また、ピルビン酸の精製塩は、生理学的に適していない。ピルベートを含有するアミノ化合物、例えばピルビルグリシンは、過剰な窒素負荷を導く。また、グリシンを含んで流れる血漿(flooding plasma)は、血液脳関門を通る幾つかのアミノ酸の運搬を妨げるかも知れない。従って、これらのピルベート化合物は、in vivoで器官を治療する適性が低く、より生理学的に許容され得るピルベート運搬化合物を提供する必要性があることが認識されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、安定で、生物学的に利用可能であり、生理学的に許容可能であり、かつ、実利的な、ピルベート(pyruvate)の供給源を含む組成物が、当技術分野において必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
【００１３】
本発明において、植物抽出物のピルベート含有量は強化したが、全体的な精製は試みておらず、そのため、それがより生物学的に利用可能でありかつ安定かも知れない場合に、その自然環境に存在することができる。また、他の抗酸化物質、例えばフラボノイド、クエルセチン及びケンフェロールの存在は、抗酸化活性を強化するであろう。植物抽出物中のピルベート含有量を強化するこの方法は、新規であり、また、これらの抽出物は、栄養補助食品又は機能性食品の成分のいずれか又はその両方として、消費者に安価にピルベートを送達するために使用され得る。
【００１４】
従って、一つの態様において、本発明は、抗酸化物質組成物を製造する方法を含んでいてもよく、それは、以下の工程：
(a) ネギ(Allium)属の植物由来の組織を砕く工程及び約30℃未満の温度で組織をインキュベートする工程；
(b) 砕いた組織をアルカリヒドロキシド又はアルカリ土類ヒドロキシドで中和する工程；
(c) 組織を乾燥する工程；
(d) 組織を粉砕する工程；
(e) 組織をエタノールで抽出する工程；及び
(f) エタノールを蒸発させ、ピルベートを含む固形残留物を回収する工程、
を含む。
【００１５】
好ましくは、植物は、Allium cepa(タマネギ)及びAllium sativum(ニンニク)からなる群より選ばれる。その組織は、適切な溶媒、例えばヘキサンを使用して、乾燥後に脱脂してもよい。
他の態様において、本発明は、ここに記載又は請求した方法により製造されるような、ピルベート強化植物抽出物を含んでいてもよい。
他の態様において、本発明は、ピルビン酸が少なくとも100％に強化されたネギ属の植物の組織由来の植物抽出物を含んでいてもよい。
本発明は、添付の簡素化した図表のノンスケール図に関連して、例示的な態様により記載されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ネギ属の植物由来の抽出物中の抗酸化物質レベルを強化する方法を提供する。本発明を記載する場合、ここに定義しない全ての用語は、それらが一般的に、当技術分野に認識されている意味を有する。ここに使用する場合、「ピルビン酸」及び「ピルベート」は、交換できるように使用されており、以下の構造を有する炭素数3の有機酸を意味する：
【化１】
2005060397.tif 000002
ネギ属の植物は、様々な品種のタマネギ(onions)、Allium cepa、及びニンニク(garlic)、Allium sativaを含む。タマネギは、高いピルベートレベルを有することが報告されており、抗酸化物質の好ましい供給源である。ニンニクの鱗茎は、比較的高いピルベートレベルを有することが知られており、また、抗酸化物質に富んでいる。原形のタマネギの鱗茎組織において、低レベルのピルビン酸は、自然に存在しており、実際それは解糖系の中間体である。しかし、タマネギの組織において、主なピルビン酸産生は、アリイナーゼの活性により、組織の損傷に応答して(例えば、砕き(maceration))酵素的に起こる。そのように産生されたピルビン酸の量は、酵素活性の程度に直接的に依存し、従って、これら酵素に適切な条件を提供することにより最大化することができる。その後、濃縮技術を使用し、生成率を増してもよい。
【００１７】
図１は、Allium植物からの抗酸化物質の抽出に関するスキームを示している。剥皮したタマネギ鱗茎を砕き、インキュベートする。好ましい態様において、砕いた組織を、周囲温度またはそれ未満で、少なくとも約5分間インキュベートする。一つの態様において、組織を4℃で30分間インキュベートする。インキュベーションの間、ピルベートは酵素活性により産生される。インキュベーションの後、砕いたタマネギをアルカリ又はアルカリ土類ヒドロキシドで中和し、乾燥し、脱脂し、粉砕する。その後、乾燥したタマネギの粉末を、95％エタノールで約60℃を超えない温度で、約2時間まで抽出する。エタノール性抽出物をロータリーエバポレートし、残留物を蒸留水中に懸濁させた。この「粗抽出物」を吸引ろ過し、さらに膜精密ろ過にかける。
【００１８】
抽出工程により、濃縮抽出物を生成し、それは、水溶性で、ABTS(2-2'-アジノ-ビス(3-エチルベンザチアゾリン-6-スルホン酸)フリーラジカルの形成を終了し、予め形成したABTSラジカルを減少し、酸素ラジカル吸収力を有する。また、その抽出物は、抗酸化活性を有し、それは、マウス肝細胞腫細胞においてキノンリダクターゼの導入によりin vitroにおいて検出される。
【００１９】
新鮮なタマネギは、タマネギのkg当たり0.25〜0.50gのピルベート含量をもつことが知られている。砕き及びインキュベーションの後、ピルベート含量は、少なくとも約0.70g/kgまで増加する。従って、新鮮なタマネギを超える、抽出物中のピルベートの強化は、少なくとも約100％、好ましくは約140％、より好ましくは250％と同じかそれより高くてもよい。抽出物は、約1〜7質量％のピルベート含量により特徴付けられる。存在するフラボノイド(0.2〜0.3％)としては、クエルセチン及びケンフェロールが挙げられる。抽出物の他の公知の構成成分としては、たんぱく質10.5％及び糖分53％が挙げられる。
【００２０】
ここに使用する場合、「ピルビン酸が強化された」とは、新鮮なタマネギの組織が加工される前に有していたよりも多いピルビン酸を、抽出物が含むことを意味する。例えば、ピルビン酸0.25gを含む新鮮なタマネギ1kgが、ピルビン酸0.50gを含む抽出物になる場合、そこでその抽出物は100％強化されている。
安定性決定のための試験により、この形態のピルベートがピルビン酸よりも安定していることを確認した。結果は、過酸化水素を添加した場合及びしなかった場合のピルビン酸に関して観察された損失は、それぞれ11％及び26％であるのに比較して、過酸化水素を添加しても又はしなくても、ピルベートの損失は3％であることを示した。
【００２１】
フリーラジカルの形成を阻害する抽出物の能力は、ABTSラジカルを減少させるその能力により示される。抽出物は、454μg/mLの試験濃度で34％の阻害効果を示す。予め形成したABTSラジカルを消失させる抽出物の能力は、同様の試験濃度で41％である。分析系中に産生された35％の酸素ラジカルは、生物活性抽出物により中和することができた。
マウス肝細胞腫において、抗酸化物質酵素、キノンリダクターゼ、細胞防衛システムの代表的な生物マーカーの導入を、in vitroにおいて測定した。10000細胞当たり509μgの量での生物活性抽出物は、抗酸化物質がないコントロールに比べて酵素活性を、6倍より多く増加した。この量において、抽出物の細胞毒性は、許容され得る限度内であった(細胞生存率＞50％)。
【００２２】
したがって、この生物活性抽出物は、アンチエイジング(anti-aging)疾患、及び他の病気であって、基本的に破壊的メカニズムが酸化プロセスにより生じるものに適用され得る。それは、カプセルの形態において、栄養補助食品として、又は、機能性食品の成分として、例えばマヨネーズ、バー又は他の食品に配合され得る。
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、それは、例を示すことを意図するものであって、本発明の請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２３】
実施例I：抽出物の調製
(a) 現場でのピルベート生成物の強化
タマネギ(1kg)を、一晩冷蔵し、剥皮し、半分に切り、フードプロセッサーで破砕した。破砕したタマネギを氷浴(4℃)中及び25℃で異なる期間インキュベートした。水酸化ナトリウムを加えてスラリーを中和し、十分に混合し、20℃で48時間乾燥した。その後、乾燥したタマネギを、ヘキサンを使用して脱脂し、残留ヘキサンを蒸発させた。その後、脱脂したタマネギを粉砕して微細な粉末にし、95％(v/v)エタノールを用いて50℃で2時間抽出した。液体抽出物を吸引ろ過した。得られたエタノール性ろ液を、ロータリーエバポレートし、残留したピルベート濃縮物を測定した。
【００２４】
表１に、異なるインキュベーション条件下で得られた残留物のピルベート収量を示した。ピルベート収量において約2〜3倍の強化が、4℃、30分間のインキュベーションにより得られた。
【表１】
2005060397.tif 000003
【００２５】
(b) 抽出溶媒及び時間の作用
脱脂したタマネギを上記(a)のように製造し、粉砕して微細な粉末にし、100又は95％(v/v)エタノールを用いて50℃で様々な時間で抽出した。液体抽出物を吸引ろ過した。エタノール性ろ液を、ロータリーエバポエートし、抽出物を濃縮した。
表２に、異なる抽出条件を用いて得られた残留物のピルベート収量を示した。
【表２】
2005060397.tif 000004
【００２６】
(c) 中和剤の作用
エタノール性ろ液を、上記(a)のように、グークオリティ(Gouw Quality)白タマネギから、別々のバッチの中和用の1.005 N 水酸化ナトリウム及び1.0 N 水酸化カルシウムを使用して製造した。これを、40℃でロータリーエバポレーションし、エタノールを除去し、その後、ナルゲン(Nalgene)酢酸セルロース膜ユニットを用いて希釈した残留物を吸引下で、精密ろ過した。得られた透過液(permeate)を、再び、50℃で、ロータリーエバポレーションし、過剰な水を除去した。その残留物を、ここでは、「タマネギ抽出物」と呼ぶ。
【００２７】
異なる試薬を用いた中和の結果を、表３に示した。ピルベート収量は同じであったが、水酸化カルシウムを使用した時に比べてピルベート濃度は高かったにもかかわらず、得られた抽出物の量は、水酸化ナトリウムを使用した場合は少なかった。
【表３】
2005060397.tif 000005
【実施例２】
【００２８】
実施例II：抽出物の特性
(a) 全ピルベート含量
溶液を、タマネギ抽出物を水に溶解することにより調製した。ピルビン酸を0、0.026、0.052、0.104、0.207、0.414、0.829及び1.66mg/mL含有する一連の水性標準溶液を使用し、標準曲線(standard curve)を決定した。
【００２９】
各溶液から0.5mLを、50mL遠心チューブに別々に移し、10分間静置した。水性トリクロロ酢酸(TCA、5％、W/V)のアリコート1.5mLを、各チューブに加え、ボルテックスし、これに蒸留水18mLをさらに加えた。チューブをボルテックスし、アリコート1mLをスクリューキャップ試験チューブに移した。その後、0.0125％ 2,4-ジニトロフェニルヒドラジン1mLを、各チューブに、蒸留水1mLと加え、ボルテックスした。その後、チューブを、10分間、37℃で加熱した。0.6 N 水酸化ナトリウム5mLを、各チューブに加え、ボルテックスし、得られた赤レンガ色の合成物の吸光度を420nmで測定した。
【００３０】
サンプルの吸光度値を、標準の値と比較し、サンプルの濃度を計算した。最適化した加工スキームにより、最初のタマネギと比較して、2〜3倍の収量のピルベートが、最終抽出物中に得られた。一般的な標準曲線を図２に示した。
【００３１】
(b) フラボノイドの測定
新鮮なタマネギジュース及びピルベート強化抽出物を酸加水分解し、フラボノイドグリコシドからの結合フラボノイド(bound flavonoid)の遊離を促進した。
スクリューキャップバイアル中の抽出物(1.5mL)を、6N 塩酸0.5mLと混合し、95℃で30分間加熱し、蒸留水1mLを加えた。酢酸エチル(1mL)をバイアルに加え、ボルテックスし、有機層を分離した。これをさらに二回繰り返した。プールした酢酸エチル層を、窒素流で乾燥し、残留物を50％(v/v)アセトニトリル3mL中に溶解し、0.2μmカートリッジろ過し(cartridge filtered)、HPLCにかけた。抽出物中のクエルセチン及びケンフェロールを、標準のクエルセチン及びケンフェロールについて製造した標準曲線を使用して定量した。
新鮮なタマネギジュース及び精密ろ過した抽出物中のクエルセチン含量は、それぞれ0.05及び0.20(％w/w)であったが、ケンフェロールの含量は、それぞれ0.003及び0.02(％w/w)であった。
【実施例３】
【００３２】
実施例III：抗酸化物質活性
(a) ABTSラジカル産生阻害率(％)
この分析に使用したすべての試薬は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10mM、pH 7.4)において調製した。サンプル溶液をPBSにおいて調製した。
【００３３】
2.5mM ABTS(2-2'-アジノ-ビス(3-エチルベンザチアゾリン-6-スルホン酸) 100μL、50μM メトミオグロビン180μL、PBS 790μL及びタマネギ抽出物10μL(最終分析濃度454μg/mL)を、使い捨て可能なキュベット中で混合した。反応は、10mM 過酸化水素120μLの添加により誘発した。反応混合物の吸光データは、734nmにセットした分光光度計使用して、10分後に記録した。クエルセチンを、参照の抗酸化物質として使用した。
ABTSラジカル産生阻害率(％)を、以下の方程式を使用して計算した：
【数１】
2005060397.tif 000006
表IVに、標準クエルセチン及びタマネギ抽出物について得られた一般的なデータを示した。
【表４】
2005060397.tif 000007
*  濃度は0.005mg/mLであった。
【００３４】
(b)全還元力
ABTSラジカルは、水性ABTS溶液(7mM)5mLと過硫酸カリウム溶液(140mM)88μLを混合することにより産生し、その後暗所に6時間静置した。この原液(1.1mL)をPBS(pH 7.4)で90mLに希釈し、吸光度を0.83に調整した。試験溶液(10μL、最終分析濃度454μg/mL)及びPBS(pH 7.4、190μL)を、使い捨て可能なキュベットに移し、分析を、予め生成したABTSラジカル1mLの添加により始めた。734nmでの吸光度を10分後に測定した。クエルセチンは、参照抗酸化物質として使用した。全還元力(TRP、％)を、以下の方程式を使用して計算した：
【数２】
2005060397.tif 000008
一般的な結果を、表５に示した。
【表５】
2005060397.tif 000009
*  濃度は0.005mg/mLであった。
【００３５】
(c) 酸素ラジカル吸収力(ORAC)
2,2'-アゾビス-(2-アミジノプロパン)ジヒドロクロライド(AAPH、0.5M)の溶液を、脱気した蒸留水において調製し、β-カロテン溶液を、アセトン10mL中のβ-カロテン10mgの遠心分離、その後、同溶媒での上清の1倍希釈により調製した。β-カロテン(60μL)及び0.3％(w/v)リノール酸を含む0.6％(w/v)リン酸緩衝Tween20(120μL)を、石英(quartz)キュベット中、PBS 935μLと混合し、2分間、50℃でインキュベートした。サンプル溶液10μL(最終分析濃度454μg/mL)及びAAPH(25μL)をキュベットに加え、反応を、452nmにセットした分光光度計を使用して、10分間モニターした。クエルセチンを、参照抗酸化物質として使用した。測定値を取るときを除いて、キュベットは、全時間、50℃に維持した。β-カロテン保持の百分率を、以下の方程式を使用して計算した：
【数３】
2005060397.tif 000010
一般的な結果を表６に示した。
【表６】
2005060397.tif 000011
*  濃度は、0.005mg/mLであった。
【実施例４】
【００３６】
実施例IV：マウス肝細胞における生物活性及び毒性
この分析では、二つの96穴マイクロタイタープレートに培養したHepa 1c1c7マウス肝細胞腫細胞を使用した。一つのプレートは、キノンレダクターゼ(QR)分析用であり、他は総タンパク測定用であった。最小必須培養液(MEM)-穴(-well)に10,000細胞含有する各プレートを24時間インキュベートし、空にし(emptied)、その後、MEM中の連続的に希釈したタマネギ抽出物(最終濃度0〜1108μg/穴)200μLを、その穴に加えた。各プレートには、細胞のないブランクと、試験材料の細胞のコントロールに充てた穴の二つのレーンがあった。これら二つのレーン中の穴は、試験材料の場所にMEMを含んでいた。48時間のインキュベートの後、一つのプレートの穴を空にし、細胞を、0.08％(w/v)水性ジギトニン溶液50μLを使用して溶解した。その後、そのプレートをシェーカーインキュベーター中、37℃で20分間インキュベートし、インキュベーターから取り出した。ウシ胎児血清(0.066％；w/v)、トリス-Cl(2.5％、v/v)、Tween20(0.67％、v/v)、フラビン-アデニンジヌクレオチド(FAD、0.67％、v/v)、グルコース-6-リン酸(0.1％w/v)、ニコチンアミドアデノシン二リン酸(NADP;0.002％w/v)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(0.0007％w/v)、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5 ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT、0.03％w/v)、メナジオン(0.0008％w/v)及びアセトニトリル(0.1％v/v；メナジオン溶液を調製するために使用した)を含む水性分析試薬のアリコート150μLを、各穴に加えた。還元型テトラゾリウム色素の吸光度を、490nmにセットした光学マイクロタイタープレートスキャナーを使用して、5分後に測定した。
【００３７】
第二のプレートを空にし、クリスタルバイオレット200μL溶液を各穴に移した。10分後、プレートを水道水で濯ぎ、過剰な染色液を除去した。0.5％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液(50％水性エタノールで調製した)のアリコート200μLを、各穴に加え、プレートを、37℃にセットしたシェーカーインキュベーター中で1時間インキュベートした。プレートを取り出し、クリスタルバイオレットの吸光度を、562nmで測定した。クリスタルバイオレットの吸光度の値により反映された染色の程度を、細胞密度の尺度として使用した。
【００３８】
所定の試験材料に関し、試験化合物により誘導されるQR比活性を、QR分析における5分間の吸光度の値及びクリスタルバイオレット分析の吸光度の値の両方を使用して計算した。QR比活性の比は、処理とコントロールとの比であった。
一般的な結果を表７に示した。タマネギ抽出物は、509μgの投与量で安全と考えられ、1108μg投与量で毒性となった。濃度依存様式において、数倍のQRの発現が誘導された。LD50は、2.545mg/mLと測定され、それは、ピルベート及びフラボノイド濃度0.819mg/mL及び0.0056mg/mLにそれぞれ相当する。
【表７】
2005060397.tif 000012
・5％以内の誤差での8複製の平均値
【００３９】
当業者に明らかなように、上記の明確な開示の様々な変更、適応及び修飾は、ここに請求した本発明の範囲内から外れることなく、行うことができる。記載した本発明の様々な特徴及び要素は、本発明の範囲から外れることなしに、ここに記載又は請求した組み合わせとは異なった方法において、組み合わせてもよい。
【００４０】
参考文献
以下の参考文献は、それらが全体として再現されるように、参考としてここに含まれるものとする。
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の一つの態様の概略図である。
【図２】サンプルにおける公知の量のピルベートの標準カーブである。
【図１】
2005060397.tif 000013
【図２】
2005060397.tif 000014