(57)【要約】【課題】  本発明は、ＲＮＡｉ法と同様の目的で使用することができ、特に、広く生物一般に適用可能な遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。【解決手段】  標的遺伝子の発現を制御する方法であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子を用意し、この変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドを、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させることを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現を制御する方法であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子を用意し、この変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドを、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記異常ｍＲＮＡが、プラスミドに担持された前記変異型遺伝子から転写される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記異常ｍＲＮＡが、染色体上に存在する前記変異型遺伝子から転写される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子及び／又は前記変異型遺伝子が、染色体上に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子を発現しうる細胞が、真核生物の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝子が、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質随伴因子（ＴＡＦ）１である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
標的遺伝子の発現が制御された細胞を製造する方法であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子を用意し、この変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドを、前記標的遺伝子を発現しうる細胞であって標的遺伝子の発現を制御すべき対象の細胞内に存在させることを特徴とする方法。
【請求項８】
標的遺伝子の発現が制御された細胞であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドが導入されている細胞。
【請求項９】
標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子核酸であって、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させた場合に、その標的遺伝子の発現の制御をもたらすことができる核酸。
【請求項１０】
前記標的遺伝子が、ＴＡＦ１である、請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
請求項９又は１０記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターによって形質転換された宿主。
【請求項１３】
標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子核酸の翻訳生成物に相当するポリペプチドであって、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させた場合に、その標的遺伝子の発現の制御をもたらすことができるポリペプチド。
【請求項１４】
前記標的遺伝子が、ＴＡＦ１である、請求項１２記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現を制御する方法、及びこの方法によって遺伝子発現を制御された細胞及びその製造方法、ならびにこの方法に使用する核酸、ベクター、形質転換された細胞及びポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物個体において遺伝子発現を制御する方法として、近年、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ）を用いたＲＮＡｉと呼ばれる方法が開発され、脚光を浴びている。この方法によれば、目的の遺伝子の破壊を伴わずにその遺伝子の発現を抑制することが可能である。しかし、効率よく遺伝子発現を抑制するためのｓｉＲＮＡの設計は、未だ試行錯誤の段階にある。また、ＲＮＡｉは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては機能しないことがわかっており、すべての生物においてこの手法を適用可能かどうかについても明らかになっていない（たとえば非特許文献１：Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，４５７−４６７  （２００３））。
【０００３】
真核生物の細胞においては、転写の開始には、基本転写因子と呼ばれる一群のタンパク質が必要である。これらの基本転写因子は、各ＲＮＡポリメラーゼごとに異なっており、たとえば、ＲＮＡポリメラーゼIIの系については、ＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨが知られている。
【０００４】
これらのうち、ＴＦIIＤは、プロモーターを構成するＴＡＴＡボックス配列のＤＮＡと直接結合する基本転写因子である。ＴＦIIＤは、それ自体ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）と、１４種類のＴＢＰ随伴因子（ＴＡＦ）とから構成される。ＴＡＴＡボックスへのＴＢＰの結合は、ＴＡＦ１、特にそのＮ末端に存在するＴＡＮＤ領域によって制御されている。
【０００５】
従来、転写因子による転写の活性化のメカニズムについては、転写因子がＤＮＡに結合することによりプロモーター近傍のＤＮＡの構造を変化させるという説が有力であったが、近年は、ＤＮＡに結合した転写因子がタンパク質−タンパク質相互作用を介してＲＮＡポリメラーゼに作用する可能性を支持する証拠が見出されている。
【０００６】
さらに、真核生物においては、基本転写因子と転写因子及び／又は転写調節因子（コアクチベーター又はメディエーターと呼ばれる）との相互作用がより重要であり、特に、ＴＡＦが重要な役割を有していると考えられている。
【０００７】
しかし、真核生物における転写調節は未だ完全には解明されておらず、転写をトランスに制御する因子及び方法も知られていない。
【非特許文献１】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ，  Ｎｏｖｉｎａ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４，  Ｎｏ．６，  ｐｐ．４５７−４６７  （２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＲＮＡｉ法と同様の目的で使用することができ、特に、広く生物一般に適用可能な遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。換言すれば、本発明は、真核生物に共通する転写制御機構に基づいて、遺伝子の発現をトランスに制御する方法を提供することを目的とする。本発明は、さらに、この方法によって遺伝子発現が制御された細胞、及びこの方法に使用する核酸、ベクター、形質転換された宿主及びポリペプチドをも提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて研究を行った結果、プレマチュアターミネーションコドン（以下、「ＰＴＣ」と略称することがある）を有する変異型遺伝子あるいはこの遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドが存在することによって、正常な遺伝子の発現が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  標的遺伝子の発現を制御する方法であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子を用意し、この変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドを、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させることを特徴とする方法；
（２）  前記異常ｍＲＮＡが、プラスミドに担持された前記変異型遺伝子から転写される、前記（１）の方法；
（３）  前記異常ｍＲＮＡが、染色体上に存在する前記変異型遺伝子から転写される、前記（１）の方法；
（４）  前記標的遺伝子及び／又は前記変異型遺伝子が、染色体上に存在する、前記（１）の方法；
（５）  前記標的遺伝子を発現しうる細胞が、真核生物の細胞である、前記（１）〜（４）のいずれかの方法；
（６）  前記標的遺伝子が、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質随伴因子（ＴＡＦ）１である、前記（１）〜（５）のいずれかの方法；
（７）  標的遺伝子の発現が制御された細胞を製造する方法であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子を用意し、この変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドを、前記標的遺伝子を発現しうる細胞であって標的遺伝子の発現を制御すべき対象の細胞内に存在させることを特徴とする方法；
（８）  標的遺伝子の発現が制御された細胞であって、その標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子あるいはこの変異型遺伝子から生じうる異常ｍＲＮＡ及び／又はその翻訳生成物に相当するポリペプチドが導入されている細胞；
（９）  標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子核酸であって、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させた場合に、その標的遺伝子の発現の制御をもたらすことができる核酸；
（１０）  前記標的遺伝子が、ＴＡＦ１である、前記（９）の核酸；
（１１）  前記（９）又は（１０）の核酸を含むベクター；
（１２）  前記（１１）のベクターによって形質転換された宿主；
（１３）  標的遺伝子のオープンリーディングフレーム中にプレマチュアターミネーションコドンを有する変異型遺伝子核酸の翻訳生成物に相当するポリペプチドであって、前記標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させた場合に、その標的遺伝子の発現の制御をもたらすことができるポリペプチド；及び
（１４）  前記標的遺伝子が、ＴＡＦ１である、前記（１３）のポリペプチド、を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＲＮＡｉ法と同様の目的で使用することができる方法であって、その発現を制御すべき目的の遺伝子の発現を、その遺伝子自体を破壊したり、改変したりすることなく、特異的に抑制することができる方法が提供される。
【００１２】
本発明は、特に、ＲＮＡｉ法が機能しないことが知られている出芽酵母においても機能することがわかっている。出芽酵母は、真核細胞としての基本的配列構造及び機能を有しており、ヒトとほぼ同じ基本的な転写装置を有するので、出芽酵母を用いて得られた知見のほとんどは真核生物全般に適用可能と一般に考えられている。したがって、本発明によれば、酵母細胞はもちろん、他の真核生物の細胞においても、特定の遺伝子の発現をトランスに制御することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下において、出芽酵母を例として本発明を説明する。出芽酵母は、簡単な培養器で培養でき、交雑分離を通した遺伝学的解析や人工的な遺伝子操作が容易に行え、突然変異体の分離が容易であり、データベースが充実しているなどのメリットがある。
【００１４】
本発明の方法は、第一の工程として、発現を制御すべき標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」と略称することがある）中にＰＴＣを有する変異型遺伝子を用意することを要する。本発明に関して、「プレマチュアターミネーションコドン」とは、ある遺伝子の正常な終止コドンよりも前に存在するターミネーションコドンを意味する。
【００１５】
本発明において使用される変異型遺伝子は、自然に発生した突然変異体、人為的に誘発された突然変異体、又は設計に基づいて合成された変異体、のいずれであってもよい。
【００１６】
遺伝子中においてＰＴＣの存在する位置は、重要ではないが、比較的Ｎ末端に近い位置にあることが望ましい。ＰＴＣの位置は、好ましくは、標的遺伝子にコードされるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端側から７０％以内、それより好ましくはＮ末端側から５０％以内、それより好ましくはＮ末端側から３０％以内、最も好ましくはＮ末端側２０％以内である。たとえば、標的遺伝子にコードされるアミノ酸配列が１０００個のアミノ酸残基からなる場合、ＰＴＣの位置は、好ましくはアミノ酸番号１〜７００、それより好ましくは１〜５００、それより好ましくは１〜３００、最も好ましくは１〜２００の範囲内にある。
【００１７】
本発明に関して「異常ｍＲＮＡ」とは、ある遺伝子の正常な転写物であるｍＲＮＡと比較して、転写物のコード領域の長さが短いという点で異なるｍＲＮＡを指し、それ以外の異常（たとえばフレームシフト；コードされているアミノ酸の置換、付加、欠失等の有無；ポリＡ等の非コード領域の長さの変動等）はあってもなくてもよい。
【００１８】
本発明に関して「翻訳生成物に相当するポリペプチド」は、ｍＲＮＡの翻訳生成物そのものであってもよいが、たとえば化学的合成によって製造されたものでもよく、インビボ又はインビトロでの翻訳によって製造されるものに限らず、翻訳生成物と同じアミノ酸配列を有するものをすべて含む意味である。本発明に係る変異型遺伝子から生じうるｍＲＮＡの翻訳生成物に相当するポリペプチドは、標的遺伝子から転写・翻訳される生成物に関して、「短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」ポリペプチドである。
【００１９】
変異型遺伝子を宿主細胞内に存在させる手段は公知であるが、たとえば、これらをコードする変異型遺伝子の核酸を、プラスミド等のベクターに担持させた形態で、又は染色体（ゲノム）上に組込んだ形態で、宿主細胞内に導入することができる。好ましくは、変異型遺伝子は染色体上に導入する。
【００２０】
異常ｍＲＮＡ及び／又は翻訳生成物に相当するポリペプチドを、標的遺伝子を発現しうる細胞内に存在させる手段としては、たとえば、上記のように細胞に変異型遺伝子を導入し、この遺伝子からのｍＲＮＡの転写及び／又はポリペプチドの翻訳を起こさせることができる。あるいは、ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドを直接宿主細胞に導入してもよい。好ましくは、ベクター又はゲノム上の変異型遺伝子から発現させる。
【００２１】
標的遺伝子を発現しうる細胞は、真核生物又は原核生物のいずれの細胞であってもよいが、好ましくは真核生物の細胞である。ここで、「細胞」は、単細胞生物の細胞又は多細胞生物の細胞のいずれであってもよく、また、細胞培養（一次培養、樹立された株細胞を含む）、組織培養等の培養された細胞であっても、多細胞生物体中の組織を構成する細胞のような生体の細胞であってもよい。細胞としては、たとえば、大腸菌、酵母、昆虫、哺乳類動物、ヒト等の細胞、組織の細胞、生体の細胞が挙げられる。
【００２２】
したがって、本発明の方法により標的遺伝子の発現を制御されるべき対象又は本発明の核酸を含むベクターによって形質転換されるべき宿主は、上記のような細胞そのものであってもよく、そのような細胞を有する微生物、動物、植物等の生物体であってもよい。
【００２３】
本発明の方法に使用する核酸は、たとえば以下において実施例として詳細に説明するようにして作製することができる。概要を述べると、発現制御の目的である標的遺伝子に公知の方法で突然変異を導入し、得られた突然変異体の中で標的遺伝子のＯＲＦ内で正常な位置よりも前にターミネーション（ナンセンス）コドンが導入されているものを選択する。
【００２４】
さらに具体的には、本発明の核酸は、公知の標的遺伝子のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に基づいて、ＯＲＦ内の適当な位置にＰＴＣを導入した変異型の遺伝子を作製することにより得ることができる。
【００２５】
本発明の核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。
【００２６】
このような変異型遺伝子を、適切なベクターにクローニングし、このベクターで細胞を形質転換することによって標的細胞内で変異型遺伝子の異常ｍＲＮＡが転写されるようにするか、あるいは、インビトロで大量に発現させてその転写産物又はポリペプチドを回収できるようにする。このような目的のためのベクターの設計、構築等に関する個別の手法は当業者には公知であり、当業者であれば、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
以下の実施例において説明するＴＡＦ１遺伝子については、変異型遺伝子がベクター上に存在する場合は野生型遺伝子の抑制が弱い傾向が見られたが、このような場合には、変異型遺伝子をゲノム上で発現させる、強力なプロモーターの支配下に置く、及び／又は導入コピー数を増やす等の手段により発現を強化することができる。好ましくは、変異型遺伝子を、レトロウイルスベクター等を用いて染色体に組込む。
【００２８】
標的遺伝子としては任意のものを選択することができるが、具体的な一例としては、ＴＡＦ１遺伝子が挙げられる。たとえば、酵母については、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（データベース登録番号ＣＡＡ９７３０４；配列番号５）のほか、Ｓ．  ｂａｙａｎｕｓ（配列番号６）、Ｓ．  ｍｉｋａｔａｅ（配列番号７）、Ｓ．  ｐａｒａｄｏｘｕｓ（配列番号８）、Ｓ．  ｃａｓｔｅｌｌｉｉ（配列番号９）、Ｓ．  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（配列番号１０）、Ｓ．  ｐｏｍｂｅ（ＣＡＡ９１１７９；配列番号１１）についてＴＡＦ１の配列が知られている。また、その他の真核生物種としては、ヒト（データベース登録番号ＮＰ  ００４５９７；配列番号１２）、マウス（データベース登録番号ＡＡＨ４７４１８；配列番号１３）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ；データベース登録番号ＡＡＦ５４１０２；配列番号１４）、線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ；データベース登録番号ＣＡＣ１４４２５；配列番号１５）等についてＴＡＦ１の配列が知られている。これらの配列及び潜在的なその他の標的遺伝子のヌクレオチド又はアミノ酸配列は、公知のデータベースから入手することができる。
【００２９】
したがって、本発明の核酸の具体的な例としては、配列番号５〜１５のいずれか１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号５〜１５のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする核酸において、そのＯＲＦ内にＰＴＣを有する核酸、又はその開始メチオニンコドンからＰＴＣまでをコードする部分のみからなる、もしくはその部分を含む核酸が挙げられる。
【００３０】
以下において説明する本発明の実施例においては、配列番号５記載のアミノ酸配列をコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＡＦ１遺伝子を標的遺伝子として、この遺伝子の種々の変異型遺伝子が作製され、用いられている。したがって、実施例において説明した種々のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、及びこれらのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチドをコードする核酸も、変異型遺伝子として使用することができる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、上記のような本発明の核酸によってコードされるポリペプチドである。たとえば、具体例としては、配列番号５〜１５のいずれか１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５〜１５のいずれか１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列において、その開始メチオニンコドンから任意の位置のＰＴＣまでに相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。また、さらに具体的な例としては、実施例において説明したアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び実施例において説明したアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された配列を有するポリペプチド、が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
１．突然変異株の作製
出芽酵母ＴＭＹ４−２株（ＭＡＴａ  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ；以下、「ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ株」と略称する）を用いて、以下のようにして合成致死変異株を作製した。
【００３３】
ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ株は、野生型ＴＡＦ１遺伝子のアミノ酸番号１０〜７３の６４個のアミノ酸をコードする部分が欠失したＴＡＦ１遺伝子を有する株であって、温度感受性であり、常温では生育可能だが、３７℃では生育できない。しかし、この突然変異の転写への影響は少なく、３７℃で全ゲノム中約１５％の遺伝子のみが有意に変動するにすぎないという特徴を有する。
【００３４】
ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ株を、ｐＴＭ１７プラスミド（野生型ＴＡＦ１遺伝子の５．２ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片及びＡＤＥ３遺伝子の３．７ｋｂＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ断片がｐＲＳ３１６（ＵＲＡ３マーカー）のＳａｌＩ，ＸｂａＩ部位にクローニングされたもの）で酢酸リチウム法によって形質転換し、ＡＤＥ３遺伝子を持つ（ｐＴＭ１７プラスミドが存在する）ときは赤色細胞となり、ＡＤＥ３遺伝子を失うと白色細胞になる株を得た。
【００３５】
ＹＰＤプレート１枚当り４０００〜６０００個の細胞を播き、８ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ照射（生存率５％）後、２５℃で４〜５日間培養し、生育したコロニー（２００〜３００個／プレート；合計約４００００個）を、ベルベット布を用いてＹＰＤプレート及び５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）プレート上にレプリカした。これらのプレートを２５℃で４〜５日間培養し、５−ＦＯＡプレート上に生育しない（すなわちｐＴＭ１７がないと生育できない）コロニー（３０株）をＹＰＤプレートからピックアップした。合成致死株には、ＴＡＮＤ欠失変異及び合成致死性遺伝子の変異の両方が存在し、野生型のＴＡＦ１及びＡＤＥ３遺伝子を持つプラスミドが生育に必須であるため、赤いコロニーとなる。ピックアップしたコロニーをＹＰＤプレートで３回継代し、安定して赤色を呈するコロニー（２０株）を選択した。
【００３６】
なお、酵母の培養方法、培地の組成、形質転換等は、特に記載しない限り、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  （１９９４  ｅｄｉｔｉｏｎ）」、Ｃｈｒｉｓ  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｓｕｓａｎ  Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，  Ａａｒｏｎ  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ刊（ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４５１−３）、１３３〜１３４頁及び２１４〜２１５頁又はＬｕｎｄｂｌａｃｋ，  Ｖ．  （１９９８）  “１３．  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．，  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｄ．Ｄ．，  Ｓｅｉｄｍａｎ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ａ．＆Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．編）、Ｖｏｌ．２、ｐｐ．１３．０．１．〜１３．１３．９．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ刊）にしたがった。また、合成致死性株のスクリーニング（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｅｃｔｏｒｉｎｇ  ａｓｓａｙ）については、Ｋｒａｎｚ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍ  （１９９０）  “Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｂｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，６６２９−６６３３を参照されたい。
【００３７】
この手法によって得られたいくつかの合成致死性を示す変異株のうち、「ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６」と名付けた株（以下、「Ａ６株」と略称することがある。また、この株の有する変異又は変異した遺伝子もしくはポリペプチドを「Ａ６」又は「ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６」と表すことがある。）は、一倍体の状態において、ＴＡＦ１遺伝子を含むプラスミド又はｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子を含むプラスミドのいずれかの存在下においては生育することができたこと等から、ＴＡＦ１遺伝子に変異を有することがわかった。
【００３８】
２．突然変異株の特徴づけ
２−１  優劣の決定
Ａ６株における突然変異が優性・劣性のいずれであるかを調べるために、二倍体を作製してスポットテストを行った。使用したサンプル及び結果を表１に示す。より具体的には、表１において「１ｎｄ」及び「２ｎｄ」と表す一倍体を通常の方法によって交配（ｍａｔｉｎｇ）させ、表１に示すプラスミドで形質転換し、その後、通常の方法でスポットアッセイによりプラスミドシャッフリングを行った。
【００３９】
【表１】
2005224116.tif 000002
【００４０】
表中、「染色体」の欄において、「ＷＴ」＝野生型（「１ｓｔ」についてはＣＨ１３０５株（ＭＡＴａ  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ＋ｐＴＭ１７）、「２ｎｄ」についてはＴＭＹ１６−２Ｃ株（ＭＡＴα  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１）を使用）；「Ａ６」＝ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６、すなわち（ＭＡＴａ  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６  ＋ｐＴＭ１７））；「ΔＴＡＮＤ」＝ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ、すなわちＴＭＹ１７−２Ｃ株（ＭＡＴα  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ）を表し、「プラスミド」の欄において、「ベクター」＝ｐＲＳ３１５；「ＷＴ」＝野生型（ＴＡＦ１遺伝子のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片（５．２ｋｂ）をｐＲＳ３１５のＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしたもの）；「ΔＴＡＮＤ」＝上記「ＷＴ」プラスミドのＴＡＦ１遺伝子のアミノ酸番号１０〜７３をコードする領域をＫｕｎｋｅｌ法により部位特異的変異によって欠失させたもの、をそれぞれ表す。
【００４１】
表１に示すように、５−ＦＯＡ培地上で、Ａ６株は、野生型との交配による二倍体（表１、サンプル３）は生育できたが、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ株との交配による二倍体（表１、サンプル４）は生育できなかった。また、さらに、Ａ６株とｔａｆ１ΔＴＡＮＤとの交配による二倍体に野生型ＴＡＦ１遺伝子又はｔａｆ１ΔＴＡＮＤを含むプラスミドを導入したもの（表１、それぞれサンプル６及び７）では生育が可能になった。
【００４２】
したがって、一倍体での結果によれば、Ａ６変異は、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤの致死性変異であり、野生型ＴＡＦ１遺伝子又はｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子のいずれかが存在すれば生育できるように見えるが、二倍体での結果によれば、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子が染色体上にある場合は生育できないため、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子に対しては優性を示す特殊な優性ネガティブ変異体であるかのようにふるまうことがわかった。
【００４３】
一方、染色体上のＴＡＦ１遺伝子を欠失させ、ＵＲＡ３マーカーを持つプラスミド上に野生型ＴＡＦ１遺伝子を、また、ＬＥＵ２マーカーを持つプラスミド上にｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子を、それぞれ有する一倍体に、ＴＲＰ１マーカーを持つプラスミド上のＴＡＦ１自身のプロモーターの支配下のｔａｆ１ΔＴＡＮＤ又はｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６を導入した場合には、５−ＦＯＡ培地上でＴＲＰ１プラスミド上にＡ６変異をもつ場合のみ生育できないという状態にはならなかった。これは、遺伝子のコピー数等の影響によるものと考えられる。
【００４４】
２−２  配列解析
次に、Ａ６株のＴＡＦ１遺伝子の塩基配列を決定して変異の位置及び性質を特定した。
【００４５】
Ａ６変異部分と通常の（Ａ６変異を有さない）ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子の対応部分との比較を図１に示す。Ａ６株においては、１塩基置換（１６９Ａ→Ｔ）と２塩基挿入（１７３Ｔの後にＴＴ）との２箇所の変異が生じていた。その結果、通常のΔＴＡＮＤ株では、１００２アミノ酸のポリペプチドが生じるのに対し、Ａ６株では、フレームシフトによって５７番目のイソロイシン以降が７８残基からなる無意味なアミノ酸配列及びストップコドンに変わっており、１１４アミノ酸の短縮型ポリペプチド及び／又はそれをコードする異常ｍＲＮＡが生じることがわかった。このポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号１及び３にそれぞれ示す。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号３のヌクレオチド配列は、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６遺伝子にコードされるアミノ酸配列のＮ末端からＰＴＣの前までの部分配列及びそれに対応するｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６遺伝子の部分配列にそれぞれ相当する。
【００４６】
３．  Ａ６タイプの変異を有する各種遺伝子の構築
Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｚａｋｏｕｒ，  “Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７）１５４、３６７−８２）にしたがって、野生型ＴＡＦ１遺伝子及びｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子のヌクレオチド配列のそれぞれ３６６番目及び１７４番目の位置に「ＴＴ」を挿入して、人為的に突然変異を導入した。具体的には、まず、プラスミドＭ１１６９（ＴＡＦ１遺伝子のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片（５．２ｋｂ）のＣ末端にＦＬＡＧエピトープ１個及びＨＡエピトープ４個を挿入したものをｐＲＳ３１４のＳｍａＩ，ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしたもの）及びプラスミドＭ１００１（プラスミドＭ１１６９のＴＡＮＤ領域（アミノ酸番号１０〜７３に相当する部分）をＫｕｎｋｅｌ法によって取り除いたもの）を用いてｕＤＮＡを取得した。得られたｕＤＮＡに対して、オリゴヌクレオチドＴＫ５４４４（ＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧ）を用いてＫｕｎｋｅｌ法による部位特異的突然変異誘発を行い、Ｍ１１６９からＭ４３４３（ｔａｆ１Ａ６／ｐＲＳ３１４）、Ｍ１００１からＭ４３４１（ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６／ｐＲＳ３１４）をそれぞれ得た（以下、得られた株及び変異をそれぞれ「ｔａｆ１Ａ６’」及び「ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６’」と呼ぶ）。
【００４７】
この結果、ｔａｆ１Ａ６’及びｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６’においては、それぞれ１７９番目及び１１５番目のコドンがストップコドンとなり、１７８アミノ酸残基及び１１４アミノ酸残基の短縮型ポリペプチド及び／又はそれをコードする異常ｍＲＮＡが生じる。
【００４８】
さらに、上記で得たプラスミドＭ４３４１及び４３４３からｕＤＮＡを取得し、オリゴヌクレオチドＴＫ５５３３（ＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＴＡＴＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣ）を用いてＫｕｎｋｅｌ法による部位特異的突然変異誘発を行った。その結果、Ｍ４３４１からＭ４３４６（ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６ＳＴＯＰ／ｐＲＳ３１４）、Ｍ４３４３からＭ４３４８（ｔａｆ１Ａ６ＳＴＯＰ／ｐＲＳ３１４）を得た（以下、得られた株又は変異をそれぞれｔａｆ１Ａ６−ｓｔｏｐ及びｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６−ｓｔｏｐと呼ぶ）。これらは、上記で得られたｔａｆ１Ａ６’又はｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６’を含むプラスミドから、ＴＴの挿入によって生じるＰＴＣ以降のコード領域をそれぞれ欠失させたものに相当し、これらの変異型遺伝子も、上記と同様の短縮型ポリペプチド及び／又はそれをコードする異常ｍＲＮＡを生じる。ｔａｆ１Ａ６−ｓｔｏｐのポリペプチドのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２及び４にそれぞれ示す。
【００４９】
また、図２に、これらの人為的に作製された「Ａ６タイプ」の変異を有する変異型遺伝子を、野生型ＴＡＦ１、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ、及びｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６の各遺伝子と比較して模式的に示す。
【００５０】
これらの「Ａ６タイプ」の変異を有する変異型遺伝子は、いずれも、上記のような実験においてｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６と同様の挙動を示した（データは示していない）。
【００５１】
４．  ウェスタンブロッティングによるＴＡＦ１遺伝子の発現の確認
表２に示す各株を、上記で説明したような交配及び／形質転換によって作製し、それらの株をそれぞれ５ｍｌのＹＰＤ培地（１％（Ｗ／Ｖ）イースト・エキストラクト、２％（Ｗ／Ｖ）ペプトン、２％（Ｗ／Ｖ）グルコース）中で、２５℃で旋回培養した（４０ｒｐｍ）。対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．７付近）に達した後（培養開始から約７２時間後）、１．５ｍｌマイクロチューブに移して、６０００ｒｐｍで３分間、４℃で遠心を繰り返し、集菌した。
【００５２】
【表２】
2005224116.tif 000003
【００５３】
表中、染色体１の「Ａ６変異」は、ＵＶ照射によって得たＡ６株、プラスミドの「ＷＴ」は野生型ＴＡＦ１遺伝子のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片（５．２ｋｂ）をｐＲＳ３１５のＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしたもの、プラスミドの「ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ」は前記のＷＴプラスミド内のＴＡＦ１遺伝子の１０〜７３アミノ酸残基をコードする領域をＫｕｎｋｅｌ法により部位特異的変異によって欠失させたもの、をそれぞれ意味する。
【００５４】
ペレットを５００μｌのクラッキング緩衝液（２回蒸留水中に８Ｍ  尿素、５％（Ｗ／Ｖ）  ＳＤＳ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＢＰＢを含有するストック溶液１ｍｌに対して、１０ｍｌの２−メルカプトエタノール（ＭＥ）、１０μｌのＢＢＰＬ（×１００倍ストック液；終濃度は、３５０ｎｇ／ｍｌ  ベスタチン、２ｍＭ  ベンズアミジン、４００ｎｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、５００ｎｇ／ｍｌ  ロイペプチン）、５０μｌのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオリド；×２０倍ストック液；終濃度は１ｍＭ）を直前に加えて使用する）に懸濁させ、７秒間×７回、ソニケーションして細胞を破壊した。
【００５５】
この溶液を、９５℃で３分間ボイルして、６％のポリアクリルアミドを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、１レーンあたり２０μｌの溶液をロードして１２０Ｖで約１時間、電気泳動した（移動距離約７ｃｍ）。
【００５６】
電気泳動の終了後、ウェットトランスファー装置（Ｂｉｏｒａｄ社、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ、カタログ番号１７０−３９３０）を用いて、１００Ｖで６０分間、電気的にニトロセルロース膜に転写した。
【００５７】
このニトロセルロース膜を、５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含む１×ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の中で１０分間ブロッキングした。１×ＴＢＳで３〜５回ゆすいだ後、一次抗体（１×ＴＢＳで１：１０００に希釈したもの）溶液中で、室温で１時間処理した。１×ＴＢＳで３〜５回ゆすいだ後、二次抗体（１×ＴＢＳで１：５０００に希釈したもの）溶液中で、室温で１時間処理した。これを、１×ＴＢＳで３〜５回ゆすいだ後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｈ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、３３０μｇ／ｍｌ  ニトロブルーテトラゾリウム、１６５μｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）中で発色させた。
【００５８】
なお、一次抗体として使用したポリクローナル抗体は、以下のようにして調製した。ＴＡＦ１のアミノ酸番号２８８〜４８９に相当するポリペプチドを抗原として、ウサギ２羽にそれぞれ１回当り２５０μｇを皮内に注射して免疫した。免疫スケジュールは、１回目の注射の後、２週間置きに２〜６回目の注射を行った。１回目の注射においてのみ完全アジュバントを使用し、２回目以降の注射においては不完全アジュバントを使用した。最後（６回目）の注射の３週間後に全採血し、抗血清を得た。二次抗体としては、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）、カタログ番号１１１−０５５−００３）を使用した。
【００５９】
結果を図３に示す。一倍体の場合、Ａ６変異を有するアレルがゲノム上に存在しても、プラスミド上のｔａｆ１ΔＴＡＮＤ及び野生型ＴＡＦ１遺伝子の発現は影響を受けない（レーン１、２）。これは、二倍体であっても、プラスミド上にｔａｆ１ΔＴＡＮＤが存在し、第２の染色体上にｔａｆ１ΔＴＡＮＤが存在する場合（レーン４）には同様である（ただし、この場合、染色体上のｔａｆ１ΔＴＡＮＤは抑制される）。プラスミド上に野生型ＴＡＦ１遺伝子、第２の染色体上にｔａｆ１ΔＴＡＮＤが存在する場合（レーン３、５）には、野生型遺伝子は発現するが、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子の発現は抑制される。すなわち、優性致死性を示す組合せの場合には、ゲノム上のアレルの発現がＡ６変異の存在によって抑制されることが示されており、このことが観察された優性致死性の原因であると考えられることがわかった。
【００６０】
この結果から、細胞内にＡ６変異型遺伝子又はその転写もしくは翻訳産物を存在させることによって、ゲノム上の対立遺伝子の発現を抑制することができることが明らかになった。
【００６１】
５．  ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ量の比較
５−１  酵母総ＲＮＡの調製
表３に示す各株を液体培養し、得られた菌体から、ホットフェノール法（Ｉｙｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ  （１９９６）  “Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３（１１）：５２０８−１２参照）にしたがって総ＲＮＡを抽出した。概要を述べると、菌体を溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）に懸濁し、酸性フェノールを４００μｌ加え、６５℃、２５分間加熱後、ボルテックスミキサーに１分間×４回かけた。この生成物を遠心し、回収した上清に酸性フェノール処理、酸性クロロホルム処理を行い、イソプロパノール沈殿を行った。ペレットを８０％エタノールでリンスし、風乾した後、二回蒸留水に懸濁し、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ処理を行った。続いて再度酸性フェノール処理、酸性クロロホルム処理を行い、イソプロパノール沈殿を行った。このペレットを風乾し、二回蒸留水に懸濁し、一部は電気泳動用のサンプルとして使用した。
【００６２】
【表３】
2005224116.tif 000004
【００６３】
表中、「染色体」の欄において、「ＷＴ」＝野生型（「１ｓｔ」についてはＣＨ１３０５株（ＭＡＴａ  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ＋ｐＴＭ１７）、「２ｎｄ」についてはＴＭＹ１６−２Ｃ株（ＭＡＴα  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１）を使用）；「Ａ６」＝ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６、すなわち（ＭＡＴａ  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６  ＋ｐＴＭ１７））；「ΔＴＡＮＤ」＝ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ、すなわちＴＭＹ１７−２Ｃ株（ＭＡＴα  ａｄｅ２  ａｄｅ３  ｌｅｕ２  ｕｒａ３  ｌｙｓ２  ｃａｎ１  ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ）を表し、「プラスミド」の欄において、「ＷＴ」＝野生型（ＴＡＦ１遺伝子のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片（５．２ｋｂ）をｐＲＳ３１５のＳｍａＩ、ＰｓｔＩ部位にサブクローニングしたもの）；「ΔＴＡＮＤ」＝上記「ＷＴ」プラスミドのＴＡＦ１遺伝子のアミノ酸番号１０〜７３をコードする領域をＫｕｎｋｅｌ法により部位特異的変異によって欠失させたもの、をそれぞれ表す。
【００６４】
２−２  ＲＴ−ＰＣＲ
上記のように得た総ＲＮＡ（１反応当り１００ｎｇ）を鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。この合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、ＴＡＦ１遺伝子のＴＡＮＤ領域をはさむ領域を増幅するように設計されたＴＫ５９７７（ＧＣＧＡＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧ）及びＴＫ１１５（ＧＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＣＣＡＡ）のプライマーセットを用いて、Ｑｕｉａｇｅｎ社のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭ  ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  キット（カタログ番号２０４２４３）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、５０℃で３０分間の後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で１分間のサイクルを２５回、２８回又は３１回繰り返し、その後７４℃で７分間、であった。これらのプライマーセットを用いると、ＴＡＦ１のｍＲＮＡからは７３０ｂｐ、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤのｍＲＮＡからは５３８ｂｐの断片が、ＰＣＲ産物としてそれぞれ増幅されることになる。これらのＰＣＲ産物の増加を経時的に観察することにより、最初の総ＲＮＡに含まれていたｍＲＮＡの量を推定した。
【００６５】
結果を表４に示す。
【００６６】
【表４】
2005224116.tif 000005
【００６７】
表中、「ＷＴ」は野生型ＴＡＦ１遺伝子由来のＰＣＲ産物（７３０ｂｐ）、「ΔＴＡＮＤ」はｔａｆ１ΔＴＡＮＤ由来のＯＣＲ産物（５３８ｂｐ）をそれぞれ示す。相対的なＰＣＲ産物の量（推定されるｍＲＮＡの量）は、少量から大量に向かって、「±」、「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」の４段階で表す。
【００６８】
生育のためにＴＡＦ１をプラスミド上に保持するＡ６株（サンプル１）において、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６由来のｍＲＮＡがＴＡＦ１由来のものと同程度検出された。したがって、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６は正常に転写されていると解釈される。また、Ａ６とΔＴＡＮＤとの二倍体株（サンプル３）においてもΔＴＡＮＤ型のｍＲＮＡは存在していた。したがって、少なくともｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６とｔａｆ１ΔＴＡＮＤとが共存することによって両アレルからの発現が停止することはないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ａ６株のＴＡＦ１遺伝子内の変異を説明する図である。パネル（ａ）は、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子の構造と、Ａ６変異の存在位置との関係を示す図である。パネル（ｂ）は、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子のヌクレオチド配列の一部（上段）と、対応するｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６遺伝子のヌクレオチド配列の部分（下段）とを対比する図である。パネル（ｃ）は、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の一部（上段）と、対応するｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の部分（下段）とを対比する図である。下線部は、Ａ６変異の存在の結果、変更されたアミノ酸配列の部分を示す。
【図２】野生型ＴＡＦ１、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤ、ｔａｆ１ΔＴＡＮＤＡ６の各遺伝子及び種々の「Ａ６タイプ」の変異を有する変異型遺伝子の構造を模式的に示す図である。白い四角の部分は変異のある部分を示し、「ＴＡＮＤ」はＴＡＮＤ領域（アミノ酸番号１０〜７３）の欠失、「ＴＴ」はＴＴジヌクレオチドの挿入、「Ａ−Ｔ」はＡからＴへの１塩基置換、をそれぞれ表す。
【図３】酵母細胞ライセートのＳＤＳゲル電気泳動後、抗ＴＡＦ１抗体を用いたウェスタンブロッティングによって検出されたバンドを示す図である。レーン１〜７の試料は表２に示すとおりである。
【図１】
2005224116.tif 000006
【図２】
2005224116.tif 000007
【図３】
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【配列表】
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