(57)【要約】      （修正有）【課題】  所望の特性をもつ表面を提供するための、適当な支持体表面に所望の分子を付着するのに有用な多機能性試薬の提供。【解決手段】  本発明に係る試薬は、テトラフエニルメタンのアシル化誘導体を含む制限された多官能性試薬である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラフェニルメタンのアシル化誘導体を含む制限された多官能性試薬。
【請求項２】
複数のアシル基が、当該基を支持体表面に付着させるために活性化されている、請求項１に記載の制限された多官能性試薬。
【請求項３】
複数のアシル基が、当該基を標的分子に付着させるために活性化されている、請求項１に記載の制限された多官能性試薬。
【請求項４】
複数のアシル基が、当該基を標的分子に付着させるために活性化されており、かつ、異なる複数の基が、当該異なる複数の基を支持体表面に付着させるために活性化されている、請求項１に記載の制限された多官能性試薬。
【請求項５】
前記標的分子が、合成ポリマー、炭水化物、タンパク質、脂質、核酸、医薬、ビタミン類、及び補因子類から成る群から選ばれ、かつ、前記表面が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニル・アルコール）、塩素含有ポリマー、例えば、ポリ（ビニル）クロライド、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、セルロース誘導体、シリコーン、及びゴム様プラスチックスから成る群から選ばれる支持体により提供される、請求項４に記載の制限された多官能性試薬。
【請求項６】
標的分子を支持体表面に付着させる方法であって、以下の工程：
（Ａ）化学的骨格と１以上のスペーサー鎖を含む多官能性試薬を用意し、ここで、上記骨格は、１つの炭素、珪素、窒素、及びリン原子から成る群から選ばれ、そして上記スペーサー鎖は、それに付着された、１以上の第１の潜在性光反応性基と１以上の第２の潜在性光反応性基をもち、但し、上記スペーサー鎖は、上記骨格と上記それぞれの光反応性基との間に５原子よりも長い線状領域をもたず、そして上記光反応性基は、各々、アリール・ケトン基を含み、かつ、上記第１と第２の潜在性光反応性基の合計は４を超えず、上記第１と第２の潜在性光反応性基のそれぞれが、支持体表面の存在下でその潜在性反応性基の活性化の間に、
（Ｉ）上記の第１の潜在性反応性基が上記支持体表面に共有結合することができ、そして
（II）上記表面への上記第１の潜在性反応性基の結合の間に、上記の第２の潜在性反応性基が上記骨格に付着されており、ここで；
（ａ）同一試薬分子のスペーサー、同一タイプの他の制限された試薬又は上記支持体表面との反応から立体的に制限され、
（ｂ）上記第２の潜在性反応性基の不活性状態に復帰することができ、そして
（ｃ）上記第２の潜在性反応性基の不活性状態に復帰する間に、標的分子にその後に結合するために再活性化されることができ、
（Ｂ）上記表面に上記第１の潜在性反応性基を共有結合させるために、上記支持体表面の存在下で上記第１の潜在性反応性基を活性化させ、そして
（Ｃ）上記標的分子に上記第２の潜在性反応性基を共有結合させるために、上記標的分子の存在下で、上記の第２の潜在性反応性基を活性化させ、それにより上記標的分子を上記表面に付着させる、
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記化学的骨格が単一の炭素原子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
４つの同一の潜在性光反応性基がそれぞれ、同一のジメチレンオキシ・スペーサー鎖を介して前記炭素原子に付着されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記潜在性光反応性基がベンゾフェノン基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的分子が前記試薬と一緒に、前記支持体表面及び前記標的分子への前記試薬の同時付着のために提供される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
標的分子を支持体表面に付着させるために有用なプライムされた表面の提供方法であって、以下の工程：
（Ａ）化学的骨格と１以上のスペーサー鎖を含む多官能性試薬を用意し、ここで、上記骨格は、１つの炭素、珪素、窒素、及びリン原子から成る群から選ばれ、そして上記スペーサー鎖は、それに付着された、１以上の第１の潜在性光反応性基と１以上の第２の潜在性光反応性基をもち、但し、上記スペーサー鎖は、上記骨格と上記それぞれの光反応性基との間に５原子よりも長い線状領域をもたず、そして上記光反応性基は、各々、アリール・ケトン基を含み、かつ、上記第１と第２の潜在性光反応性基の合計は４を超えず、上記第１と第２の潜在性光反応性基のそれぞれが、支持体表面の存在下でその潜在性反応性基の活性化の間に、
（Ｉ）上記の第１の潜在性反応性基が上記支持体表面に共有結合することができ、そして
（II）上記表面への上記第１の潜在性反応性基の結合の間に、上記の第２の潜在性反応性基が上記骨格に付着されており、ここで；
（ａ）同一試薬分子のスペーサー、同一タイプの他の制限された試薬又は上記支持体表面との反応から立体的に制限され、
（ｂ）上記第２の潜在性反応性基の不活性状態に復帰することができ、そして
（ｃ）上記第２の潜在性反応性基の不活性状態に復帰する間に、標的分子にその後に結合するために再活性化されることができ、
そして
（Ｂ）上記表面に上記第１の潜在性反応性基を結合させるために、上記支持体表面の存在下で、上記の第１の潜在性反応性基を活性化させ、それにより上記標的分子のその後の付着のために有用なプライムされた表面を提供する、
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記潜在性光反応性基が４つの同一の光反応性基であり、その各々が、同一のスペーサー鎖を介して単一の炭素原子骨格に付着されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬が式Ｘ（Ｙ）4 （Ｚ）4 ｛式中、Ｘは化学的骨格であり、各Ｙは個々にスペーサーであり、そして各Ｚは個々に潜在性光反応性基である。｝をもつ、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
Ｘが炭素原子である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
各Ｚがベンゾフェノンである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
各Ｙがジメチレンオキシ基である、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
各Ｚがベンゾフェノンである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイル安息香酸エステル）、及びテトラフェニルメタンのアシル化誘導体から成る群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的分子が、合成ポリマー、炭水化物、タンパク質、脂質、核酸、医薬、ビタミン類、及び補因子類から成る群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項２１】
前記支持体表面が、前記の活性化された基との共有結合のために好適な除去可能な水素を提供する、請求項６に記載の方法。
【請求項２２】
前記表面が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニル・アルコール）、塩素含有ポリマー、例えば、ポリ（ビニル）クロライド、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、及びシリコーンから成る群から選ばれる支持体により提供される、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記潜在性光反応性基が４つの同一の光反応性基であり、その各々が、同一のスペーサー鎖を介して単一の炭素原子骨格に付着されている、請求項11に記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬が式Ｘ（Ｙ）4 （Ｚ）4 ｛式中、Ｘは化学的骨格であり、各Ｙは個々にスペーサーであり、そして各Ｚは個々にベンゾフェノンを含む。｝をもつ、請求項11に記載の方法。
【請求項２５】
Ｘが炭素原子である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
Ｘが窒素原子である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
各Ｙがジメチレンオキシ基である、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
各Ｘが珪素原子である、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイル安息香酸エステル）、及びテトラフェニルメタンのアシル化誘導体から成る群から選ばれる、請求項11に記載の方法。
【請求項３０】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的分子が、合成ポリマー、炭水化物、タンパク質、脂質、核酸、医薬、ビタミン類、及び補因子類から成る群から選ばれる、請求項11に記載の方法。
【請求項３２】
前記支持体表面が、前記の活性化された基との共有結合のために好適な除去可能な水素を提供する、請求項11に記載の方法。
【請求項３３】
前記表面が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニル・アルコール）、塩素含有ポリマー、例えば、ポリ（ビニル）クロライド、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、及びシリコーンから成る群から選ばれる支持体により提供される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
１以上の第１の潜在性光反応性基及び１以上の第２の潜在性光反応性基が共有結合されているところの多官能性試薬を担持する支持体表面であって、ここで、上記試薬の第１の潜在性光反応性基が事前に活性化され、かつ、上記表面に結合されており、かつ、上記第２の潜在性光反応性基が結合されておらず、かつ、上記表面に標的分子を付着させるために活性化されることができ、ここで、上記多官能性試薬は化学的骨格と１以上のスペーサー鎖を含み、上記骨格は、１つの炭素、珪素、窒素、及びリン原子から成る群から選ばれ、そして上記スペーサー鎖は、当該スペーサー鎖に付着された、１以上の第１の潜在性光反応性基と１以上の第２の潜在性光反応性基をもち、但し、上記スペーサー鎖は、上記骨格と上記それぞれの光反応性基との間に５原子よりも長い線状領域をもたず、そして上記光反応性基は、各々、アリール・ケトン基を含み、かつ、上記第１と第２の潜在性光反応性基の合計は４を超えない、前記支持体表面。
【請求項３５】
前記潜在性光反応性基が４つの同一の光反応性基であり、その各々が、同一のスペーサー鎖を介して単一の炭素原子骨格に付着されている、請求項34に記載の支持体。
【請求項３６】
前記試薬が式Ｘ（Ｙ）4 （Ｚ）4 ｛式中、Ｘは化学的骨格であり、各Ｙは個々にスペーサーであり、そして各Ｚは個々に潜在性光反応性基である。｝をもつ、請求項34に記載の支持体。
【請求項３７】
Ｘが炭素原子である、請求項36に記載の支持体。
【請求項３８】
各Ｚがベンゾフェノンである、請求項36に記載の支持体。
【請求項３９】
各Ｙがジメチレンオキシ基である、請求項37に記載の支持体。
【請求項４０】
各Ｚがベンゾフェノンである、請求項39に記載の支持体。
【請求項４１】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイル安息香酸エステル）、及びテトラフェニルメタンのアシル化誘導体から成る群から選ばれる、請求項34に記載の支持体。
【請求項４２】
前記試薬が、ペンタエリスリトールのテトラキス（４−ベンゾイルベンジル・エーテル）を含む、請求項41に記載の支持体。
【請求項４３】
前記表面が、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニル・アルコール）、塩素含有ポリマー、例えば、ポリ（ビニル）クロライド、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、及びシリコーンから成る群から選ばれる支持体により提供される、請求項34に記載の支持体。
【請求項４４】
前記標的分子が、合成ポリマー、炭水化物、タンパク質、脂質、核酸、医薬、ビタミン類、及び補因子類から成る群から選ばれる、請求項34に記載の支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、工業的及び医学的に重要な支持体の表面特性を化学的及び／又は物理的に改質することに関する。さらなる態様では、本発明は、特殊用途のためのバルク材料の表面特性を改質するのに有用な各種方法に関する。この態様では、本発明は、プラズマ蒸着法、放射線グラフト法、光重合グラフト法、イオン注入法、化学誘導法などの表面改質法に関する。
【背景技術】
【０００２】
所望の化学的及び／又は物理的特性を得るために表面を化学的に改質する方法が知られている。例えば、米国特許第 4,722,906号、同第 4,973,493号、同第 4,979,959号及び同第 5,002,582号明細書 (本明細書ではこれらの開示を参照することにより取り入れることとする) は、潜在的な反応性基を利用して生体分子や合成高分子のような試薬を各種の支持体へ共有結合することによる表面改質法に関するものである。好ましい潜在的反応性基は、適当なエネルギー源に暴露された場合に、不活性状態 (すなわち、基底状態) から、適当な物質と共有結合を形成することができる反応性中間体へ転換する光化学的に反応性である官能基 (すなわち、光反応性基) として記載されることが典型的である。
【０００３】
このような潜在的反応性基は、まず所望の化合物を (例えば、熱化学的に) 誘導した後、その誘導化合物を表面へ (光化学的に) 適用するために用いられると典型的には記載されている。このような逐次法は、多くの状況において好適な方法ではあるが、この方法は、例えば、最初の誘導体化が元々困難である標的分子に対しては、迅速さ、融通性、使い易さなどの特性に欠ける場合がある。
【０００４】
明らかに望まれているものは、適当な表面の誘導体化に必要な迅速さ、融通性及び使い易さが最適に組み合わされた反応性試薬、特に標的分子との同時適用に有用な試薬、或いは標的分子の適用前に表面を前処理するのに使用できる試薬である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
我々は、支持体表面の前誘導体化に有用な、又は標的分子の支持体への同時適用に有用な、新規の拘束された多官能性試薬を発見した。この試薬は、一つ以上の第一の潜在的反応性基と一つ以上の第二の潜在的反応性基が結合されている化学骨格を含む。この第一の潜在的反応性基と第二の潜在的反応性基は、支持体表面の存在下でこれらの潜在的反応性基を活性化した際に、
a)第一の潜在的反応性基は支持体表面に共有結合することができ、そして
b)第一の潜在的反応性基が表面に結合した際に、第二の潜在的反応性基は、
1)スペーサー又は支持体表面との反応が制限され、
2)それらの不活性状態へ戻ることができ、そして
3)それらの不活性状態へ戻った際に、後に標的分子を結合するために再活性化されることができ、よって標的分子を表面へ結合するように、化学骨格に結合されている。
【０００６】
特に好ましい実施態様では、このような多官能性試薬の化学骨格は単一の四面体炭素原子である。この実施態様では、中心の炭素に、光反応性基の形態にある４個の同じ潜在的反応性基がそれぞれ同じスペーサー鎖を介して結合されている。適当な光源に暴露されると、潜在的反応性基の各々は活性化を受ける。
【０００７】
試薬が自身に課す配座的拘束及び／又は立体的拘束 (このために「拘束された」としている) によって、すなわち、中心炭素の四面体性とスペーサー鎖自体の物理化学的性質 (例、鎖の長さ、反応性及び柔軟性) の両方によって、この試薬は、好ましい何らかの試薬分子に結合されている４個の活性化された潜在的反応性基のうち最大で３個が支持体表面に結合することができる。こうして、残りの未反応基は、それらの不活性状態へ戻ることができる。生じた構造体は、テーブルの上に放り投げられた四つまたの子供用ジャッキに似たものと想定することができる。三つのまたはテーブルの表面に載せられ、四番目のまたは上を向いてテーブルから離れている。
【０００８】
次の工程において、未反応基を標的分子の存在下で再活性化し、その標的分子を表面へ共有結合することができる。
本発明の試薬は、特に「前処理された」表面、すなわち標的分子に対して潜在的反応性を有する表面、を提供するのに用いることができるので、幅広い用途を有する。それゆえ、この試薬は、標的分子の利用可能な量に限りがある場合、標的分子の前誘導体化が不溶性又は不活性な生成物を創出してしまう場合、或いは、例えば、各種の標的分子と共に後で用いるために前処理済の表面を調製し保存しておきたい場合に有用である。
【０００９】
また、この試薬を用いて、潜在的反応性基により予め誘導体化しておいた標的分子を後に適用するための前処理済潜在的反応性表面を調製することもできる。すなわち、各々の拘束された試薬中に存在しうるもの以外の化合物によって潜在的反応性基が提供される。この方法は、表面と標的分子の間の結合部位を増加するのに有用となりうる。
【００１０】
さらに、この試薬は、表面の存在下、標的分子 (誘導体化されていないもの又はされているもの) との混合物として使用することで、表面改質工程において (上記の逐次適用法とは対照的に) 同時適用を可能にするというさらに別の利益を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明の試薬は、表面に結合することができる一つ以上の第一の潜在的反応性基と、固定化したい標的分子に結合することができる一つ以上の第二の潜在的反応性基とが結合されている化学骨格を含む。化学的に、第一及び第二の潜在的反応性基並びにそれぞれのスペーサーは、同じであっても異なっていてもよい。
【００１２】
すべての潜在的反応性基とスペーサーが化学的に又は少なくとも官能的に同じである状況では、第一の潜在的反応性基と第二の潜在的反応性基との区別は、第一の活性化工程の時に実際に行うことができる。すなわち、活性化されて表面に結合する基は「第一の」潜在的反応性基と見なされ、 (活性化されたかされなかったかには関わらず) 反応しないで残った基は「第二の」潜在的反応性基と見なされる。
【００１３】
第一及び第二の潜在的反応性基は、潜在的反応性基を支持体表面の存在下で活性化した際に第一の潜在的反応性基がその表面に共有結合することができるように、スペーサー鎖によって骨格に結合されることが好ましい。よって、第二の潜在的反応性基は、配座的に制限されており、このため、それらのスペーサー、同じ種類の他の制限試薬又は支持体表面のいずれとも反応しない。さらに、第一の活性化工程と活性化刺激 (例、照明源) の除去後には、第二の潜在的反応性基はそれらの不活性状態へ戻ることができ、その後、活性化 (又は場合によっては再活性化) されて標的分子を共有結合することができる。
【００１４】
以下の図式は、式Ｉで示された実験式 X(Y)4(Z)4に例示される好ましい四面体コア構造の概念を示すものである。
式Ｉ
式Ｉ中、X=化学骨格;
Y1,Y2,Y3,Y4=任意のスペーサー; 及び
Z1,Z2,Z3,Z4=潜在的反応性基
【００１５】
本明細書中の「化学骨格」とは、潜在的反応性基又はスペーサーが結合されるものであって、同じ化学骨格に結合された基又はスペーサー間に所望の立体的、配座的制限を少なくとも部分的に提供する原子又は他の分子構造を意味する。用語「コア分子」は、化学骨格と結合された何らかのスペーサーとの組合せ (すなわち、上記式Ｉ中の"X+Y")、すなわち潜在的反応性基を除いた部分をさすために用いられている。
【００１６】
用語「潜在的反応性基」は、以下に詳細に説明するが、スペーサーに結合された活性化可能な基であって、支持体表面との結合 (「第一の」潜在的反応性基) 又は標的分子との結合 (「第二の」潜在的反応性基) に用いられる基を意味する。用語「活性な」とは、適当な部分で共有結合を形成することができるようにするために適当な何らかの刺激を受けた潜在的反応性基を意味する。用語「不活性な」とは、活性化前の潜在的反応性基、又は活性化及び不活性状態への回復のサイクルを一回以上経た後の潜在的反応性基のいずれかを意味する。用語「標的分子」は、一般にはその結合によって伝達される所望の特性を提供するために、試薬を介して、表面に結合されることが予定される分子をさすために用いられる。
【００１７】
特に好ましい実施態様では、本発明は、中心の四面体炭素原子にスペーサーとして結合されたジメチレンオキシ基(-CH2-O-CH2-) を４個含有するコア分子を提供する。この場合、炭素原子が化学骨格として働く。本明細書では、簡易化のため、骨格、スペーサー及び潜在的反応性基を本発明の試薬の別々の部分であるとして記載している。しかしながら、試薬の化学合成において、これらの部分が三種の独立した前駆体として提供されることは稀である。代わりに、またほとんどの場合に、本明細書中のスペーサーとされる部分は、コア分子を含有する分子と潜在的反応性基を含有する別の分子との二種の分子間の反応の結果として形成される。
【００１８】
光反応性基及びメチレン基スペーサーの物理的及び化学的特性と共に四面体炭素骨格によって提供される配座的制限によって、本発明の試薬は、光活性化の際にその光反応性基の最大で３個までを表面に結合させることができる。配座的に制限されていて、支持体表面又はスペーサーとの相互作用ができないために、残りの光反応性基は、光を除いた際にそれらの不活性状態へ戻ることができ、また後の照明によって再度活性化されることができる。
【００１９】
中心炭素原子を含有する特に好ましい実施態様の試薬の他に、本発明の試薬は、ケイ素、窒素、リン及びその他互いに平面上にない四つ以上の結合をもった原子を使用するものをはじめとする適当な化学的（例、有機及び／又は無機）骨格構造を有するものとして調製することができる。
【００２０】
また、配座的に制限された環構造を有する分子（例えば、イノシトール、すなわちヘキサヒドロキシシクロヘキサン）を、本明細書中でペンタエリトリトールについて記載した方法と同様にして潜在的反応性基で誘導体化し、アキシャル位とエカトリアル位の両方に潜在的反応性基を提供することもできる。単糖類、二糖類及びシクロデキストリンのような他のポリヒドロキシル化化合物についても、様々な配置、濃度の潜在的反応性基を有する他の多置換試薬を作り出す別の機会を提供する点で好適である。
【００２１】
支持体表面との接触と潜在的反応性基の活性化により、１個以上の潜在的反応性基を介した共有結合が形成されるが、他の潜在的反応性基の１個以上は配座的に制限されているためにその表面では反応することができない。
【００２２】
本発明の試薬に有用なスペーサーは、四面体原子に結合されることができ、また適当ないずれの長さ及び構造を有することができる。「スペーサー」とは、試薬における潜在的反応性基と化学骨格との間の領域をさす。スペーサーの使用は任意であって、例えば、式IIに示した構造を有するテトラフェニルメタンのアシル化誘導体のような化合物では必ずしも必要ではない。
式II
【００２３】
機能的には、スペーサーは、所期の目的に対して試薬を無用にしてしまうほどに、活性化された潜在的反応性基 (同じ試薬分子又は別の試薬分子に関わらず) に物理的に接近可能であり且つこれらと化学的に反応しうる基又は原子をもたないことが特に好ましい。少なくとも、スペーサーは、所期の標的に対する潜在的反応性基の結合と速度論的に競合する原子又は基を有するべきではない。例えば、好ましいスペーサーは、典型的には、接近可能な「引抜き可能な水素」原子、すなわち、活性化された選ばれた潜在的反応性基に接近可能で且つこれと反応しうる水素原子、を有するべきではない。
【００２４】
当業者であれば利用可能であり且つその技術範囲内にある分子設計技法を使用して、潜在的反応性基が反応しないように配座的に制限しておくために必要なスペーサーの最適な長さや構造を決定することができる。典型的には、スペーサーは、原子約５個分（すなわち、結合６個分）、好ましくは４個分（結合５個分）よりも長い線状領域を有することはない。特定の試薬内のスペーサーが化学的に同じである必要はないが、単一の試薬分子において異なるスペーサーを使用することは、一般により多くの合成工程を要し且つその調製においてより複雑な化学分離工程が必要となりうるため、一般に好ましくはない。
【００２５】
スペーサーの構成原子は線状に配列される必要はない。例えば、（先に定義したように）引抜き可能な水素原子をもたない芳香族環を、水素原子の引抜きにより共有結合の形成を開始することによって潜在的反応性基が機能するような試薬におけるスペーサー設計の一部として含めることができる。その前駆体形態（すなわち、潜在的反応性基の結合前）では、スペーサーは、常用のカップリング化学などの適当な化学反応によって潜在的反応性基を結合させるのに好適なヒドロキシル、アミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基のような適当な官能価を末端基とすることができる。
【００２６】
本明細書中の「潜在的反応性基」とは、活性種を発生させて隣接する化学構造体に共有結合させるために印加された外部エネルギー源に応答する化学基（例、引抜き可能な水素）をさす。好ましい基は、それらがこのような特性を保持する条件下で保存されるに十分に安定である。例えば、米国特許第 5,002,582号明細書を参照されたい。本明細書ではこの開示を参照することにより取り入れることとする。潜在的反応性基は、電磁スペクトルの各種部分に応答するように選ぶことができるが、中でも、スペクトルの紫外部分及び可視部分に応答する（本発明明細書では「光反応性」とする）ものが特に好ましい。
【００２７】
アセトフェノンやベンゾフェノン又はそれらの誘導体のような光反応性アリールケトンが好ましい。というのは、これらの官能基は、典型的には、本明細書に記載した活性化／不活性化／再活性化サイクルを容易に達成できるからである。ベンゾフェノンが特に好ましい光反応性基であるが、これは、最初に励起一重項状態が形成して項間交差により三重項状態になる光化学励起が可能だからである。励起された三重項状態は、（例えば、支持体表面からの）水素原子の引抜きによって炭素−水素結合中に挿入され、よってラジカル対を創出することができる。続いて起こるラジカル対の崩壊により、新たな炭素−炭素結合が形成する。反応性結合（例、炭素−水素）が結合に利用されない場合には、ベンゾフェノン基の紫外線誘導励起は可逆的であって、その分子はエネルギー源を取り除くことにより基底状態のエネルギーレベルに戻る。このため、光反応性アリールケトンが特に好ましい。
【００２８】
本発明の方法は、上記の試薬の利用による支持体表層への標的分子の付加を包含する。以降により詳しく説明する通り、この試薬は所望の結果を達せしめるための数多くの様々な方法において使用できる。
【００２９】
本発明の方法は下記の工程を含んで成る。
A. １または複数の第一潜在的反応性基及び１または複数の第二潜在的反応性基が付加されている化学主鎖を含んで成る多価試薬を用意する。ここで、この第一及び第二潜在的反応性基はその主鎖に、支持体表層の存在下において、この潜在的反応性基の活性化に基づき、以下の状況で付加されている：
(1) その第一潜在的反応性基がこの表層に共有結合可能である、並びに
(2) この表層へのこの第一潜在的反応性基の結合に基づき、この第二潜在的反応性基が、
a. スペーサー又はこの支持体表層との反応からコンホメーション的に制約されている、
b. その不活性化状態へと復帰可能である、及び
c. その不活性化状態への復帰により、表層に標的分子を付加するようこの標的分子を後に捕促するために再活性化可能である。
B．この支持体表層の存在下においてこの第一潜在的反応性基を、その表層にこの第一潜在的反応性基を結合させるために、活性化させる。そして、
C. この標的分子の存在下で、この第二潜在的反応性基をこの標的分子に結合させ、この標的分子をこの表層に付加するために、活性化させる。
【００３０】
この方法のこれらの工程は任意の適当な順序で行ってよい。例えば、上記の多価試薬の疎水性相互作用によって適当な支持体表層に単独で物理吸着できる。イルミネーションに基づき、その光反応性基（例えばベンゾフェノン基）は上記のメカニズムにより支持体表層において共有結合を形成する。四面体結合コア原子のコンホメーション的制約により、４個の光反応性基のうちの少なくとも１個、そして３個までがこの表層との結合を形成する。残りの未結合の光反応性基の近くに引抜可能な水素がないことにより、及びイルミネーション源の排除により、励起状態のベンゾフェノンはその基底状態エネルギーに復帰する。これにより残りの基は、固定化を意図する標的分子が存在しているとき、及び処理表層が別のラウンドのイルミネーション曝露されたときに再活性化可能となる。この方法は「二工程」手法として記載し、ここではその光反応性試薬を潜在的反応性表層を作り上げるために適用し、そして第二工程において、この標的分子を活性化表層への付加のために添加している。
【００３１】
「一工程」法と呼ぶことのできる別の態様においては、本発明の試薬を溶液の中で標的分子と混合して二成分組成物を作り、そしてこの組成物を単一イルミネーション工程において材料を表層改質するために用いている。この場合において、イルミネーションは潜在的反応性基と材料表層との共有結合形成を誘引するのみならず、この表層上にある隣接の標的分子との共有結合形成をも同時に誘引する。しかしながら、この過程中、この試薬は、コンホメーション制約により及び／又は引抜可能な水素原子の欠如により、その他の試薬分子との結合が実質的に妨げられている。
【００３２】
更なる別の態様において、本発明は、それ自体が潜在的反応基により官能化されている分子の適用及び結合の前に支持体表層を予備処理するための多価試薬の利用方法を提供する。この方法は、特に困難な支持体が最大のコーティング耐久性を要求する状況において有用である。この状況において、この支持体表層と潜在的反応性基により誘導化された標的分子との間で形成された共有結合の数は一般に、所望の潜在的反応性基含有標的分子のみによる表層改質に比べて増大しうる。この手法は、例えば、分子の溶解性又は機能活性の如きの特性が損なわれるであろう点に至るまで標的分子の潜在的反応性基含量を上昇させることなく、表層への所望の分子の結合の強度を高める点で有意義な利点を供する。
【００３３】
本開示の観点において、本発明の試薬は慣用の合成法に従って調製できる。好適な試薬は例えば下記のプロトコールに従って調製できる：コア分子（例えばペンタエリスリトール）と過剰量の潜在的反応性（例えば4-ブロモメチルベンゾフェノン）の誘導体との混合物を適当な試薬の中に溶解し、そしてアルコキシドアニオン発生可能な塩基の存在下で還流にかける。その生成物、ペンタエリスリトールのテトラキス（4-ベンゾイルベンジルエーテル）は、調製クロマトグラフィーにより精製できる。この生成物は式III に示す構造を有する。
式III
【００３４】
任意の適当なカップリング試薬が潜在的反応性基をコア分子に付加させるのに使用できうる。例えば、エステルカップリング基は4-ベンゾイルベンゾイルクロリドとペンタエリスリトールとの、適当な溶媒及び酸スキャベンジャーを用いる反応によって調製できる。同様に、ウレタンカップリング基は4-ベンゾフェノンイソシアネートとペンタエリスリトールとの反応により作ることができる。また、四面体コア分子が、例えばヒドロキシル基でなく、アミン官能基で停止したスペーサーを含む場合、潜在的反応性基は、酸クロリド又はＮ−オキシスクシニミドエステルを用い、アミド官能基を介して導入することができる。
【００３５】
同様に、もしコア分子スペーサーがスルフヒドリル基で停止している場合、マレイミド置換化潜在的反応性基をカップリング反応において用いることができる。コア分子（例えばペンタエリスリトール）と潜在的反応性基とのカップリング反応は、非反応性であるか、又はこの潜在的反応性基との反応について立体障害されている分子に基づき、ペンタエリスリトール前駆体のみならずスペーサー伸長部をも含むコア分子の合成により進行させることができる。
【００３６】
本発明の試薬は任意の適当な表層を改質するのに利用できる。この試薬の潜在的反応性基が好適なタイプの光反応性基であるとき、その表層が、活性化基との共有結合にとって適当な引抜可能な水素原子を供することが特に好適である。
【００３７】
プラスチック、例えばポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メチル）メタクリレート、ポリアクリレート、ポリ（ビニルアセテート）、ポリ（ビニルアルコール）、塩素含有ポリマー、例えばポリ（ビニル）クロリド、ポリオキシメチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、フェノール樹脂、アミノ−エポキシ樹脂、ポリエステル、セルロース誘導体、シリコーン及びゴム状プラスチック全てが、その表層が本明細書に記載の通りに改質できうることを条件に、支持体として利用することができる。一般的には、その開示内容を引用することで本明細書に組入れる、「Plastics」頁 462-464, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering , Kroschwitz編、John Wiley and Sons, 1990 を参照のこと。更に、熱分解炭素及びシリル化材料、例えばガラスセラミック又は金属の如きの支持体が表層改質にとって適当である。
【００３８】
支持体表層への付加のための、本発明における使用にとって適当な標的分子は様々な群の物質を含む。標的分子は未誘導形態又は予め誘導された形態のいづれでも使用できる。更に、標的分子は、単独で、又はその他のタイプの標的分子と組合せて固定化することができる。更に、標的分子は、表層への本多価試薬の付加の後（例えば逐次的に）又は最中（例えば同時に）に表層に固定化できる。
【００３９】
一般に、標的分子は、表層に、及び／又はその表層を担持している装置もしくは物品に特定の所望の特性を授けるように選ぶことができる。適当な標的分子及びそれらが但うのに一般に利用される表層特性の例は、以下の限定でない一覧表により代表される：
【００４０】
標的分子                                        機能活性
合成ポリマー
スルホン酸置換化ポリアクリルアミド            潤滑性、負帯電表層、親水性
ポリアクリルアミド                            潤滑性、タンパク質反撥性、親水性
ポリエチレングリコール                        潤滑性、細胞及びタンパク質反撥性
親水性
ポリエチレンイミン                            正帯電表層
ポリ乳酸                                      バイオ食用表層
ポリビニルアルコール                          潤滑性、親水性
ポリビニルピロリドン                          潤滑性、親水性
四級アミン置換化ポリアクリルアミド            潤滑性、正帯電表層
シリコーン                                    潤滑性、疎水性
導性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン、    導電性
ポリアセチレン、ポリピロル）
【００４１】
炭水化物
アルギニン酸                                  潤滑性、親水性
セルロース                                    潤滑性、親水性、生分解性
キトサン                                      正帯電表層、親水性
グリコーゲン                                  親水性、生分解性グルコース源
ヘパリン                                      抗血栓性、親水性、細胞付着性
ヒアルロン酸                                  潤滑性、負帯電表層
ペクチン                                      潤滑性、親水性
単、二糖類                                    親水性
デキストランスルフェート                      クロマトグラフィー媒体
【００４２】
タンパク質
抗体                                          抗原結合
抗血栓剤（例えばアンチトロンビンIII)          抗血栓表層
アルブミン                                    非トロンボゲン形成表層
付加タンパク質／ペプチド（コラーゲン）        細胞付着
酵素                                          触媒表層
細胞外マトリックスタンパク質／ペプチド        細胞付着及び増殖
成長因子、タンパク質／ペプチド                細胞増殖
ヒルジン                                      抗血栓表層
血栓溶解タンパク質（例えばストレプト          血栓溶解活性
キナーゼ、プラスミン、ウロキナーゼ）
【００４３】
脂質
脂肪酸                                        疎水性、生体適合性
モノ−、ジ−及びトリ−グリセリド              疎水性、潤滑性、生分解性脂肪酸源
リン脂質                                      疎水性、潤滑性、生分解性
プロスタグランジン／リューコトリエン          非トロンボゲン形成表層
表層／固定化                                  メッセンジャー
【００４４】
核酸
DNA                               ヌクレアーゼのための支持体／アフィニティー結合
RNA                               ヌクレアーゼのための支持体／アフィニティー結合
ヌクレオシド、ヌクレオチド        プリン、ピリミジンの起源
酵素                              補因子
【００４５】
薬剤／ビタミン／補因子
酵素補因子                        固定化酵素
ヘム化合物                        グロブリン結合／表層酸素化
薬剤                              薬剤活性
【００４６】
非ポリマー材料
染料（例えばアゾ染料）                  着色剤
蛍光化合物（例えばフルオレセイン）      蛍光剤
【００４７】
任意の適当な技術を表層への試薬付加のために利用でき、そしてかかる技術は各材料、プロセス又は装置に関して選ばれ、且つ最適化されうる。この多価試薬はこの反応性試薬の溶液のスプレー、浸漬又はブラッシコーティングによって上記の清浄材料表層に有効に適用する。典型的な適用においては、コーティングを意図する支持体をまず適当な溶媒（例えばイソプロピルアルコール）で希釈した試薬溶液の中に浸漬する。次にこの試薬コート化支持体をその材料表層での共有結合形成を促進するために紫外光に曝露する。全ての未結合試薬を除去するために洗浄した後、固定化を意図する分子の付加、それに続く第二UVイルミネーションは、標的分子による表層改質をもたらす。
【００４８】
所望するとき、本発明の試薬を用い、表層改質のためにその他の手法を利用してよい。例えば、この潜在的反応性試薬は固定化を意図する分子に直接混合してよい。ペンタエリスリトールのテトラキス（4-ベンゾイルベンジルエーテル) 0.1mg/mLは、40mg/ml のニトロセルロースと混合したときに、単一イルミネーション工程によりポリビニルジフルオリド膜を表層改質するのに利用できる。別の実験手法において、これらの合成及び天然分子の光反応性誘導体は、ペンタエリスリトールのテトラキス（4-ベンゾイルベンジルエーテル) の如きの多価試薬で予備処理した表層に適用することもできる。この手法は、慣用の化学品を用いてはその支持体が改質しにくいとき、又は表層上の標的分子の異常な耐久性及び安定性を必要とするような状況のときに特に有用である。
【００４９】
本発明は、広域たる適当な標的分子を用いての、医学、科学及び工業的に重要な様々な装置の表層特性を改変するのに有用な試薬及び方法を提供する。
【００５０】
本発明を以下の実施例を参考に説明する。当業者は本発明の範囲を逸脱することなくあらゆる変更をとり入れることができることを理解する。従って、本発明は本願に記載の態様に限定されず、本願の請求の範囲によってのみ特定される。
【実施例】
【００５１】
実施例１
ペンタエリトリトールのテトラキス（4-ベンゾイルベンジルエーテル）の調製（テトラ-BBE-PET)
ペンタエリトリトール[Aldrich](2.0g、14.71 ミリモル、60℃の１ｍｍＨｇで１時間乾燥）、4-ブロモメチルベンゾフェノン(20.0g、72.7ミリモル、4-メチルベンゾフェノン[Aldrich] のフリーラジカル臭素化によって調製）、鉱油[Aldrich] 中の80重量％水素化ナトリウム(NaH 1.23g、41.0ミリモル）、及びテトラヒドロフラン(THF 120ml) をアルゴン雰囲気中で34時間還流した。次いで追加の80％NaH(2.95g, 98.3 ミリモル) を反応混合物に添加し、混合物をアルゴン中でさらに７時間還流した。8ml の氷酢酸(HOAc)を添加することにより反応をクエンチした。THF の不溶物の除去を容易にするため、クエンチした反応を遠心した。
【００５２】
この液体をデカントし、不溶物を50mlのクロロホルム(CHCl3) で３回洗浄した。デカントした液体（主としてTHF)とCHCl3 洗浄物を混合し、蒸発させ、生の黄色い半固体の残存物を18.7g 得た。一部の生の成分(2g)を、次の表によるCHCl3 とジエチルエーテル(Et2O)で溶離した直径40mm(1.58 インチ) ×長さ200mm(８インチ) のシリカゲルカラムを用いてフラッシュクロマトグラフィにより精製した（明記がなければ比は全て体積比）。
【００５３】
【表１】
2005145979.tif 000002
【００５４】
画分81-105の混合と蒸発によって、薄黄色のオイル状生成物(0.843g, 59 ％の理論収率）が得られた（理論上、カラムに存在する生の生成物の2.0gから1.43g のテトラ-BBE-PETの収率が期待できよう）。Beckman Acculab 2 赤外(IR)スペクトロメーターとVarian FT-80 NMRスペクトロメーターを用い、精製した薄黄色の生成物を確認した。3500cm-1のピークがないことは、ヒドロキシ官能基がないことを示した。核磁気共鳴分析(1H NMR(CDCl3)) は所望の生成物に一致しており、テトラメチルシラン内部標準に対して脂肪系メチレンδ 3.6(s,8H)、ベンジルのメチレンδ 4.5(s,8H)、芳香系δ 7.15-7.65(m,36H) であった。
【００５５】
したがって、本発明の態様の所望の物理的・化学的特性を有する化合物が調製できることが明らかである。この化合物は、例３〜13に開示の表面を支持するための各種の標的分子をカップリングするために使用した。
【００５６】
実施例２
ペンタエリトリトールのテトラキス（4-ベンゾイルベンゾエートエーテル）の調製（テトラ-BBE-PET)
ペンタエリトリトール[Aldrich](136mg,１ミリモル）、4-ベンゾイルベンゾイルクロリド(1.0g, 4.09 ミリモル、チオニルクロリドと4-ベンゾイル安息香酸[Aldrich] の反応により調製）、トリメチルアミン[Aldrich](696ml, 5ミリモル）、及びクロロホルムを室温にて終夜で攪拌した。反応混合物を氷点の塩酸(0.5M, 11ml)の中に入れ、１分間充分に混合した。クロロホルム層を分離し、硫酸ナトリウムの上で乾燥し、蒸発させ、黄色の残留物を得た(1.13g) 。この残留物を、クロロホルム／アセトニトリルの96:4 (体積比）で溶離した直径40mm(1.57 インチ）×長さ180mm(７インチ）のシリカゲルカラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーで精製した。72本の13ml画分を収集した。画分37〜61を混合し、蒸発させて白い固体を得た(322mg, 理論値の33％）。Varian FT-80 NMRスペクトロメーターでの分析は所望の生成物に一致しており、核磁気共鳴分析(1H NMR(CDCl3)) において、テトラメチルシラン内部標準に対して脂肪系メチレンδ 4.7(s,8H)、芳香系δ 7.15-8.10(m,36H) であった。
【００５７】
したがって、結合としてエステル基を有する束縛された多官能性化合物が調製できることが理解できる。この化合物は、例14で示したようなポリビニルピロリドン(PVP) への適用のためのポリメチルメタクリレート(PMMA)の改質に使用した。
【００５８】
実施例３
テトラ-BBE-PETとポリビニルピロリドン(PVP) の連続的適用によるポリメチルメタクリレート(PMMA)の表面改質
先ずイソプロピルアルコール(IPA) を浸したテッシュを用い、４cm(1.57 インチ) ×２cm(0.78 インチ) ×２mm(0.08 インチ）の透明なPMMA板状試験片(Rohm & Hass) をぬぐい、その後 IPA中のテトラ-BBE-PETの0.1mg/ml溶液を、板状試験片の半分にブラシで塗布した。周囲条件下で５分間そのコーティングを空気乾燥した後、150mm(6 インチ）の距離で100 ワットのショートアーク水銀蒸気電球から30秒間照射した。全ての未結合のテトラ-BBE-PETを除去するため、過剰のIPA で洗い流した後、次に脱イオン(DI)水中で板状試験片の全体にPVP(分子量160000, GAF Chemical社）の10mg/ml 溶液をブラシでコーティングした。PVP を空気乾燥した（約５分間）後、同じ光源の前で板状試験片に再び30秒間照射した。次いでPVP コーティングの信頼性をチェックするため、DI水の流れの下で板状試験片を広い範囲でこすった。
【００５９】
この洗浄の後、テトラ-BBE-PETでコーティングしていた板状試験片の半分は、PVP のみをコーティングした半分よりも、顕著に湿潤性で触感ですべすべしていた。テトラ-BBE-PETでコーティングした半分に結合したPVP の存在は、DI水中のコンゴーレッド(Sigma) の35％溶液で汚れることによって確かめられた。
【００６０】
実施例４
テトラ-BBE-PETと混合物の光誘導ポリマー(1：1)の連続的適用によるポリエチレンチューブ(PE)の表面改質
先ずIPA 中のテトラ-BBE-PETの1.0mg/ml溶液を用い、１本のPEチューブ(25cm(9.8 インチ))×( 外径1.0mm(0.04インチ) を浸漬コーティングした。そのコーティングを空気乾燥した後（約３分間）、400 ワットの金属ハライド／水銀蒸気の電球の間の２つの向かい合ったELC-4000ランプの91cm(36 インチ）を用い、それらの中間に位置するテトラ-BBE-PETコーティングのチューブを照射した。全ての未結合のテトラ-BBE-PETを除去するために過剰のIPA で洗浄した後、15mg/ml の感光性ポリマー[(アクリルアミド)-コ-(2-アクリルアミド-2- メチルプロパンスルホン酸)]( フォト-PA-AMPS) と水中の15mg/ml のフォトPVP を含む溶液中にチューブを浸し、1.5cm(0.59インチ)/秒の速度で連続的に取り出した。
【００６１】
感光性-PA-AMPSは、アクリルアミド、2-アクリルアミド-2- メチルプロパンスルホン酸(AMPS)、及びN-(3- アミノプロピル）メタクリルアミド(APMA)の共重合、次いでSchotten-Baumann条件下での4-ベンゾイルベンゾイルクロリドを用いたポリマーの光誘導によって調製した。感光性PVP は、1-ビニル-2- ピロリドンとAPMAの共重合、次いで前記のような光誘導によって調製した。コーティングした溶液を乾燥(55 ℃(151°F)で約５分間）した後、再びチューブを３分間照射した。
【００６２】
感光性PVP と感光性-PA-AMPSの単独でコーティングしたチューブは、コーティングのフレーキングに結びつくことがある顕微鏡的クラックを示した。対照的に、前記のように、先ずテトラ-BBE-PETでコーティングし、次いで感光性PVP と感光性-PA-AMPSでコーティングしたチューブは殆ど又は全くクラックを示さなかった。
【００６３】
実施例５
テトラ-BBE-PETと混合物の感光性-PA-AMPSと感光性-PVP(2：1)の連続的適用によるPEチューブの表面改質（湿式照射)
先ずIPA 中の化合物0.1mg/ml溶液を用い、１本のPEチューブ(25cm,9.8 インチ）×（外径1.0mm, 0.04 インチ）にテトラ-BBE-PETをコーティングした。テトラ-BBE-PETをコーティングしたチューブは、直ちに例４の記載の方法で、金属ハライド／水銀蒸気の電球の中間で乾燥するまで照射した（約３分間）。未結合の全てのテトラ-BBE-PETを除去するために過剰のIPA で洗浄した後、チューブを、例４に記載の仕方で調製した10mg/ml の感光性-PA-AMPSと、15％IPA 水溶液中の5mg/mlの感光性-PVPを含む溶液に浸し、次いで１cm(0.39 インチ)/秒の速度で引き上げた。チューブが乾燥するまで再び照射した（３分間）。
【００６４】
光学顕微鏡で検査すると、テトラ-BBE-PETのない同様なチューブでの結果と対照的に、先ずテトラ-BBE-PETでコーティングし、次いで感光性-PVPと感光性-PA-AMPSでコーティングしたチューブは殆ど又は全くクラックを示さなかった。
【００６５】
実施例６
テトラ-BBE-PETと混合物の感光性-PA-AMPSと感光性-PVP(2：1)の連続的適用によるシリコーンチューブの表面改質（湿式照射)
先ずIPA 中のテトラ-BBE-PETの0.1mg/mlの溶液を用い、１本のシリコーンチューブ(38cm,15インチ) × (外径5mm,0.20インチ)(Dow Corning)を浸漬コーティングした。テトラ-BBE-PETコーティングしたチューブを直ちに、51cm(20 インチ) 離れた400 ワットの金属ハライド／水銀蒸気の電球を備えた２つの向かい合ったDymax PC-2ランプの中間で、乾燥するまで照射した。未結合の全てのテトラ-BBE-PETを除去するためにIPA で洗浄した後、チューブを、例４に記載の仕方で調製した10mg/ml の感光性-PA-AMPSと、15％IPA 水溶液中の5mg/mlの感光性-PVPを含む溶液に浸し、次いで１cm(0.39 インチ)/秒の速度で引き上げた。乾燥するまで再びチューブを照射した（３分間）。
【００６６】
指で表面を広範囲に洗浄し、こすると、なめらかな感光性-PA-AMPS／感光性-PVPの強く接着した層が示された。また、表面に結合したPVP の存在は、DI水中のコンゴーレッドの35％溶液で汚れることによって確かめられた。
感光性-PVPと感光性-PA-AMPSのみでコーティングシリコーンチューブのコンゴーレッドの汚れはまだらに見え、コーティングが表面に結合しておらず、したがってこすり落とされた箇所を示した。しかしながら、先ずテトラ-BBE-PETでコーティングし、次いで感光性-PVPと感光性-PA-AMPSでコーティングしたチューブはなめらかで均質に見え、PVP とPAのコーティングの強度と連続性の増加にテトラ-BBE-PETが有用であることを示した。
【００６７】
実施例７
テトラ-BBE-PETを用いたポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜上のPVP の固定
通常と非常に疎水性であるPVDF膜を、テトラ-BBE-PETで処理し、次いで未改質のPVP に接触させることにより親水性にした。
PVDF Immobilion(商標)P転写膜(Millipore) を、MeOH中の0.2mg/mlのテトラ-BBE-PET溶液中に30分間浸漬した。この膜をBBE-PET 溶液から取り出し、５分間空気乾燥した。この膜を、向かい合ったDymax PC-2ランプ(51cm(20インチ）離れた）の中間に配置し、２分間照射した。Dymax PC-2ランプは400 ワットの金属ハライド／水銀蒸気の電球を備えた。膜を100ml のMeOHで３回洗浄し、未結合のテトラ-BBE-PETを除去した。最後の洗浄の後、膜を放置して５分間空気乾燥した。
【００６８】
テトラ-BBE-PETでプライマー処理した膜を、MeOH中の種々の濃度(0〜40mg/ml)のPVP(Sigma,平均分子量360000) 溶液に30分間浸した。膜をPVP 溶液から取り出し、自然に５分間空気乾燥した。前記と同様にし、51cm(20 インチ）離れて向かい合ったDymax PC-2ランプの中間に膜を配置し、２分間照射した。100ml のMeOH中で攪拌しながら、膜を30分間洗浄した。MeOH洗浄液を捨て、この洗浄操作を３回繰り返した。最後の洗浄の後、膜を取り出し、５分間空気乾燥した。
【００６９】
PVDF膜の親水性は、DI水で満たしたビーカーに膜を浸し、水を吸収する性能を評価することにより試験した。テトラ-BBE-PETで処理し、10mg/ml 以上PVP に接触させたPVDF膜は、水で満たしたビーカーに入れると直ぐに水を吸収した。それらは半透明になり、ビーカーの底に沈んだ。未処理のPVDF膜は、ビーカーの水の中に入れたときに全く水を吸収せず、不透明のままであり、いつまでも水の表面上に浮かんでいた。
【００７０】
実施例８
テトラ-BBE-PETを使用したPVDF上のニトロセルロースの固定化
PVDF膜上のニトロセルロース(Hercules)の取り込みを、テトラ-BEE-PETによる上記膜の処理、その後の非修飾ニトロセルロースに晒すことにより行った。
PVDFImmobilon TM-P Transfer Membranes(Millipore)をMeOH中のテトラ-BEE-PETの0.2mg/ml溶液中に30分間浸漬した。この膜をそのテトラ-BEE-PETから除去し、そして5 分間風乾した。この膜を向かい合ったDymax ランプ間の中央で、51cm(20in.) 離して、垂らし、そして2 分間照射した。このDymax ランプは、実施例7 中に記載したものと同一のバルブを取り込んでいた。この膜を100ml MeOHにより3 回洗浄して未結合テトラ-BEE-PETを除去した。最後の洗浄の後、その膜を5 分間風乾した。
【００７１】
このテトラ-BEE-PET下塗り膜を40mg/ml ニトロセルロース溶液中で30分間浸漬した。使用したニトロセルロースは24cps の粘度をもつType RS グレード18-25 であった。この膜をニトロセルロース溶液から取り出し、そして5 分間風乾した。この膜をDymax ランプ間に垂らし、そして先に記載したように2 分間照射した。この膜を100ml MeOH中で30分間攪拌しながら洗浄した。MeOHを捨て、そして上記洗浄手順を3 回繰り返した。最後の洗浄後、その膜を取り出し、そして5 分間風乾した。
【００７２】
上記下塗り膜のタンパク質結合特性を生来のニトロセルロース(Schleicher-Schell) 及び非下塗りPVDF膜の特性と(Easy-Titer ELIFA Septum Instructions, Pierce から改良した) 単純ドット- ブロット結合性検定により比較した。
【００７３】
ウシ血清アルブミン("BSA", 分子量=66,000 ダルトン) をホスフェート・バッファー生理食塩水(PBS) 中に溶解し、そして逐次的に希釈した。10マイクロリッターのそれぞれの希釈物を2 連で上記ドット- ブロット・マニホルドのウェル内にピペットで入れた。真空をそのマニホルドに適用して14ml/ 分の流速を得た。タンパク質の存在を強化コドイド状金染色(Collodal Gold Total Protein Stain-Catalog No. 170-6527 及びGold Enhancement Kit-Catalog No. 170-6538, Bio-Rad) により測定した。テストしたすべての膜が16ngのタンパク質( この検定の限界) を検出したが、肉眼観察により評価されるように、このハイブリッド膜上に生成されたシグナルは、ニトロセルロース又は非修飾PVDF膜のいずれかの上のものよりも強かった。これは、このハイブリッド膜がより感度の高い検定マトリックスを提供することができることを示唆している。さらに、より強いシグナルの生成がタンパク質結合のより決定的な評価を許容する。これらの結果は、このハイブリッド膜上の16ngのタンパク質がニトロセルロース膜上の約125ng のタンパク質と強度において等価なシグナルを与えたことを示した。非修飾PVDFは、63ngのタンパク質において等価なシグナルを与えた。
【００７４】
低分子量のタンパク質( アプロチニン、分子量=6,500 D) を使用した場合、このハイブリッド膜はニトロセルロースと同じ感度であった。両方がほとんど等価な強度のシグナルにより400ng のタンパク質を検出した。これに反し、PVDFの感度の限界は、たった1.6 μg であった。さらに、PVDF上1.6 μg により生成されたシグナルの強度は、ハイブリッド膜上の強度よりもかなり低かった( そのハイブリッド膜上400ng により生成されたシグナルとほとんど等価でった。) 。
【００７５】
実施例９
テトラ-BBE-PETを使用したPVDF膜上のニトロセルロースの同時- 固定化
MeOH中40mg/ml においてニトロセルロース(24cpsの粘度をもつType RS グレード18-25, Hercules Inc.) 及び0.1mg/mlにおけるテトラ-BBE-PETを溶解することによりコーティング溶液を調製した。PVDF ImmobilonTM-P転移膜(Millipore) をこのコーティング溶液中に30分間浸漬させた。この膜を取り出し、そして直ちに向かい合ったDymax ランプ間の中央で、51cm(20in.) 離して、垂らし、そして2 分間照射した。使用したDymax ランプは、上述のもの( 実施例7)と同一の仕様をもっていた。この膜を100ml MeOHにより攪拌しながら3 回洗浄した。最後の洗浄の後、その膜を5 分間風乾した。
コーティングがその膜の肉眼観察により見られた。このハイブリッド膜のタンパク質結合特性を生来のニトロセルロース及びPVDF膜の特性と(Easy-Titer ELIFA Septum Instructions, Pierce から改良した) 単純ドット- ブロット結合性検定により比較した。
【００７６】
BSA(分子量=66,000 ダルトン) をPBS 中に溶解し、そして逐次的に希釈した。10マイクロリッターのそれぞれの希釈物を2 連で上記ドット- ブロット・マニホルドのウェル内にピペットで入れた。真空をそのマニホルドに適用して14ml/ 分の流速を得た。タンパク質の存在を強化コドイド状金染色(Collodal Gold Total Protein Stain-Catalog No. 170-6527 及びGold Enhancement Kit-Catalog No. 170-6538, Bio-Rad) により測定した。
【００７７】
同様に、テストしたすべての膜が16ngのタンパク質( この検定の限界) を検出したが、肉眼観察により評価されるように、このハイブリッド膜上に生成されたシグナルは、ニトロセルロース又は非修飾PVDF膜のいずれかの上のものよりも強かった。これは、再び、このハイブリッド膜がより感度の高い検定マトリックスを提供することができることを示唆している。さらに、より強いシグナルの生成がタンパク質結合のより決定的な評価を許容する。これらの結果は、このハイブリッド上の16ngのタンパク質のシグナルがPVDF上の16ngにより生成されたシグナルよりも強いが、PVDF上31ngにより生成されたシグナル程強くはないことを証明した。このハイブリッド膜上の約16ngのタンパク質により生成されたシグナルの強度は、ニトロセルロース上63ngのものとほとんど等価であった。
【００７８】
低分子量のタンパク質( アプロチニン、分子量=6,500 D) を使用した場合、このハイブリッド膜はニトロセルロースと同じ感度であった。両方がほとんど等価な強度のシグナルにより400ng のタンパク質を検出した。PVDFの感度の限界はたった1.6 μg であった。さらに、PVDF上1.6 μg により生成されたシグナルの強度は、ハイブリッド膜上の強度よりもかなり低かった( そのハイブリッド膜上400ng により生成されたシグナルとほとんど等価であった。) 。
【００７９】
実施例10
テトラ-BBE-PETを使用したマイクロタイター・プレート上のヒト・ガンマ・グロブリン(HGG) の固定化
ポリスチレン・マイクロタイター・プレート上へのHGG の共有結合性固定化をを、テトラ-BBE-PETによるそのプレートの前処理、その後のHGG 溶液への暴露により行った。
96ウェル破壊性ポリスチレン・マイクロタイター・プレート(Labsystems Inc.) をウェル当たり200 μl MeOHを使用して前洗浄した。テトラ-BBE-PETの溶液を0 〜0.5mg/mlのレンジの濃度によりMeOH中で調製した。このマイクロタイター・プレートをそれぞれのセクションが異なる濃度のテトラ-BBE-PETを受容するようにセクションに分割した。100 μl の溶液をそれぞれのウェルにピペットで入れた。この溶液をそのプレート内で室温において1 時間インキュベートした。インキュベーションの後、テトラ-BBE-PET溶液を吸引によりそのプレートから除去した。このプレートを30分間風乾した。このプレートを、ELC-4000ランプの下48cm(19in.) に置き、そして2 分間照射した。ELC ランプは、400 ワットの金属ハライド/ 水銀蒸気電球を使用している。プレートをウェル当たり200 μl MeOHにより洗浄して、未結合テトラ-BBE-PETを除去した。このプレートを30分間風乾させた。
【００８０】
テトラ-BBE-PET活性化プレートを、次に、PBS pH 7.2中の[ 3 H]-HGGの溶液に晒した。トリチル化HGG を、NaB[ 3 H] 4 及びホルムアルデヒドによるHGG の還元的メチル化により調製した(Jentoft, N. and D. G. Dearborn,J. of Biol. Chem. 254:4359(979))。[ 3 H]-HGGの溶液は、0 〜20mg/ml の濃度のレンジ内にあった。100 マイクロリッターの[ 3 H]-HGGの溶液をそれぞれのウェルに添加した。この溶液をプレート内で15分間室温においてインキュベートした。このプレートを、ELC-4000ランプの下48cm(19in.) に置き、そして4 分間照射した。この溶液をプレートから吸引し、そしてそれらのプレートをウェル当たり0.05% TWEEN 20を含む200 μl のPBS により6 回洗浄した。
【００８１】
プレートを引き離し、そしてそれぞれのウェルを2ml のテトラフラン(THF) 中に溶解した。ウェルの溶解が完結した後、5ml の液体シンチレーション・カクテル(Aquasol-2, Dupont) をそれぞれのバイアルに添加し、そしてそれらのバイアルを液体シンチレーション・アナライザー(Packard 1900 CA) 上で読んだ。各バイアル中にあった全放射能から、各ウェルに結合した[ 3 H]-HGGの量を計算することができる。テトラ-BBE-PETにより前処理されたウェルは、非処理ウェルよりも有意に大きな量の[ 3 H]-HGG結合を示した。これは、より高いタンパク質濃度においてより真実である。20mg/ml の[ 3 H]-HGG濃度を使用する場合、テトラBBE-PET により前処理されたウェルは、0.1 、0.2 及び0.5mg/mlのテトラ-BBE-PET濃度においてそれぞれ非処理ウェルを37% 、52% そして56% 上回る[ 3 H]-HGG結合性の増加を示した。
【００８２】
実施例11
テトラ-BBE-PET及びコラーゲンIV型の逐次的適用によるポリスチレンの表面修飾
【００８３】
【表２】
2005145979.tif 000003
【００８４】
96- ウェル・ポリスチレン破壊性プレート(Dynatech Immulon I,内径8.71mm(0.343インチ))からのポリスチレン・ウェルをメタノール中0.1mg/mlにおいてテトラ-BBE-PETによりコートした( グループ1 及び2)。すべてのウェルをParafilm・(American Can Company, Greenwick, CT) によりカバーして蒸発を防ぎ、そして室温において1 時間インキュベートした。インキュベーションの後、テトラ-BBE-PET溶液をウェルから吸引し、そしてウェルを5 分間風乾させた。
【００８５】
グループ1 からのウェルをDymax PC-2ランプから20cm(8インチ) で90秒間照射した。使用したDymax ランプは、400 ワットの金属ハライド/ 水銀蒸気電球を含んでいた。グループ2 内のウェルをこの点において照射しなかった。グループ1 内のウェルをメタノールにより3 回濯いだ。非コート・ポリスチレン・ウェルの他のセット( グループ3)を先に記載したように照射した。NaB[ 3 H] 4 及びホルムアルデヒドによるHGG の還元的メチル化(Jentoft and Dearborn,前記) によりコラーゲンIV(Sigma C-7521)から調製した[ 3 H]コラーゲンIVを、PBS 中0.1mg/mlに希釈し、そしてグループ1 、2 、3 、4 、及び5 のウェルに添加した。
【００８６】
還元的メチル化( 実施例10参照) によりコラーゲンIV(Sigma C-7521)から調製し、その後米国特許第4,973,493 号の実施例1-3B中に記載した方法を使用して光誘導体化した光誘導体化[ 3 H]コラーゲンIVを、PBS 中0.1mg/mlに希釈し、そしてグループ6 のウェルに添加した。すべてのウェルをパラフィルムによりカバーして蒸発を防ぎ、そして室温において1 時間インキュベートした。インキュベーション後、上記試薬をウェルから吸引し、そしてウェルを10分間風乾させた。グループ1 、2 、4 、5 及び6 を先に記載したように90秒間照射した。
【００８７】
全グループが3 回の1 時間洗浄、1% Tween 20/PBS 中の一夜洗浄、その後の3 回のPBS 中の1 時間濯ぎを経験した。シンチレーション・カウンターの準備において、各ウェルをTHF 中に溶解し、そしてシンチレーション・カクテルと混合した。最後に、各サンプルにより作り出された1 分当たりの崩壊数(DPM's) をPackard 1900CA Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzer を使用して測定した。作り出されたDPMsの数は、各片の表面上に存在する[ 3 H]コラーゲンIV又は光[ 3 H]コラーゲンIVの量を示していた。
【００８８】
それぞれの条件( グループ1-6)下の固定化された[ 3 H]コラーゲンIVのレベルは、以下のようであった: グループ1=725ng/cm2 ; グループ2=789ng/cm2 ; グループ3=81ng/cm 2 ; グループ4=64ng/cm 2 ; グループ5=331ng/cm 2 ;及びグループ6=751ng/cm 2。表面上のコラーゲンIVの単層が約500ng/cm 2を必要とするであろうことが計算された。グループ1 及び2 において固定化された[ 3 H]コラーゲンIVのレベルは、このようなコラーゲンIVの単層を作り出すのに十分である。
【００８９】
それ故、テトラ-BBE-PET( グループ1 及び2)が、非修飾表面への吸着( グープ4)、照射裸表面への吸着( グループ3)、又はテトラ-BBE-PETの非存在における[ 3 H]コラーゲンIVの照射( グループ6)により達成されるレベルを上回って[ 3 H]コラーゲンIV固定化レベルを増加させることは明らかである。光[ 3 H]コラーゲンIV( グループ6)の使用は、グループ1 及び2 において見られるものとほとんど等価な負荷をもたらしたが、このコラーゲンIVは、使用前に光誘導体化され、これ故、テトラ-BBE-PETの使用は、先の光誘導体化の必要性を取り除くことができる。
【００９０】
実施例12
テトラ-BBE-PETを使用したポリスチレン上のdDNAの固定化
2 本鎖デオキシリボ核酸("dDNA")の固定化をテトラ-BBE-PETによるポリスチレン・マイプレの処理、その後のdDNAによるその修飾表面の暴露により行った。
放射標識されたDNA 表面テネシティー実験を、このテトラ-BBE-PET処理表面と" 生"(すなわち、未処理) ポリスチレンとを比較することにより行った。96ウェルの標準的な培地- 結合性ポリスチレン・マイクロタイター・ストリップ・プレートのそれぞれにメタノール中0.5mg/mlテトラ-BBE-PETの100 μl を添加した。このプレートを、400 ワットの金属ハライド/ 水銀蒸気電球を含むDymax PC-2ランプから25cm(10 in.)に1.5 分間置いた( 非処理対照ウェルをこのように処理しなかった。) 。各ウェルを次に300 μl のメタノールにより3 回濯ぎ、そしてプレートを風乾に供した。
【００９１】
100 μl の容量の、ホスフェート・バッファー生理食塩水, pH 3.0中の 32 P-標識付けLambda DNA( ウェル当たり50kb dDNA バクテリオファージ、35pg DNA、ウェル当たり24nCi)を、非処理又は( テトラ-BBE-PET) 処理ポリスチレン・マイクロタイター・プレートのそれぞれのウェルに添加し、周囲温度において1 時間インキュベートし、次に冷蔵キャビネット内で上記Dymax ランプから25cm(10 in.)の距離で4 分間照射した(1の非処理プレート及び1 の処理プレートを照射しなかった。) 。次にこれらのプレートを2 のプロトコールを使用して洗浄して非- 共有結合性吸収cDNAを除去した:
【００９２】
ハイブリダイゼーション前溶液-50%ホルムアルデヒド、5 倍Denhardt's溶液(50 倍保存液; 5g Ficoll, 5g PVP, 5g BSA, 500ml H 2 Oから) 、5 倍"SSPE"(20 倍保存液: 174g NaCl, 27.6g NaH3 PO4 - H 2 O , 7.4g EDTA, 1リッターH 2 O , pH 7.4から) 、0.1% SDS; ウェル当たり4 x 200 μl 、その後、40℃において60分間1 x 300 μl 、又は
変性溶液-0.4 N NaOH 、0.25% SDS;ウェル当たり4 x 200 μl 、その後、40℃において15分間1 x 300 μl 。
【００９３】
上記洗浄処理後、相対量の固定化DNA を96ウェルのそれぞれを引き裂き、それぞれを1.5ml THF 中に溶解し、5ml のシンチレーション・カクテル(Aquasol-2, Dupont) を添加し、そしてPackard 1900CA液体シンチレーション・アナライザー上で分析することにより測定した。結果を以下に。
【００９４】
ポリスチレン・マイクロタイター・プレート上の固定化cDNAの平均DPM ±標準偏差
【００９５】
【表３】
2005145979.tif 000004
【００９６】
表から分かるように、テトラ-BBE-PETを使用したDNA の固定化は、前ハイブリダイゼーション溶液を使用した非処理ポリスチレンを上回って26倍増加し、そして変性洗浄方法を使用した非処理ポリスチレンを上回って46倍増加した。この増加は非処理ポリスチレン上のDNA の光照射に一部起因することができるので、テトラ-BBE-PETを使用したポリスチレン上のDNA の共有結合性の固定化だけによる増加は、ハイブリダイゼーション前洗浄を使用してのDNA における22% 増加、そして変性洗浄を使用しての44% により示される。これらの結果は、テトラ-BBE-PETによるポリスチレンの表面修飾その後のdDNAの添加及び光照射が本支持体表面へのDNA の固定化の有効な方法であることを明確に証明している。
【００９７】
実施例13
テトラ-BBE-PETを用いるPS±へのウマチトクロームｃの固定化
ウマチトクロームｃ（「Cyto c」) は免疫化学試験にとってのモデル系として一般に利用されるタンパク質(MW 約12,400) である。Cyt c の構造、例えばそのタンパク質配列、三次構造、特異的な免疫原エピトープのコンホメーション、及び固相表層に収着したときに生ずる構造変化はかなり研究されている。この球状タンパク質は未処理ポリスチレンに対して制約された付着力を示すことが知られ、そして収着に基づきタンパク質変性が伴うものと考えられている（例えば、Jemmerson, R. の「Antigenicity and Native Structure of Globular Proteins: Low Frequency of Peptide Reactive Antibodies」Proc.Nat.Acad.Sci.USA , 84: 9180, 1987; Stevens, F.J. の「Considerations of the Interpretation of the Specificity of Monoclonal Antibodies Determined in Solid-Phase Immunoassays 」Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, J.E. Butler,編、CRC Press, 233, 1991; 及びJemmerson,R.の「Multiple Overlapping Epitopes in the Three Antigenic Regions of Horse Cytochrome c」J.Immunol. 138 : 213, 1987 を参照のこと）。
Cyt c の固定化は、テトラ-BBE-PETによるポリスチレンマイクロタイタープレートの処理、それに続くCyt c への改質表層の逐次的な曝露により行われる。
【００９８】
実験は、未処理ポリスチレンをテトラ-BBE-PET処理表層と対比するためにトリチウム−ラジオラベル化Cyt c を用いて行った。標準媒体−結合性ポリスチレンマイクロタイターストリッププレート(Costar, Inc.)を、96ウェルそれぞれにおいて、メタノール中の0.4mg/mlのテトラ-BBE-PET 200μl で改質せしめた（未処理コントロールウェルはコートを施さなかった）。150 μl の容量を直ちに各ウェルから取出し、そしてそのプレートを実施例12に記載の通りにDymax PC-2ランプから25cm(10 in) 離して２分間放置した。
各ウェルの中身を自動プレートウォッシャーを用いて直ちに吸引し、そしてそのプレートをウェル当り300 μl のIPA ですすいだ。このテトラ-BBE-PET処理プレートを更なる試験の前に15％の温度にコントロールされた環境の中で風乾した。0.05M の炭酸−炭酸水素バッファー、pH 9.6中の容量100 μl の3H- ラベル化ウマCyt c 4.2 μg/ml(0.34 μCi/ ウェル) を未処理又は処理ポリスチレンに加え、37℃の温度で200rpmにおいて２時間回転するようにセットした周囲シェカー上でインキュベートし、次いで400 ワットのハロゲン化金属／水銀蒸気灯を用い、Dymax ランプから25cm(10 in) の距離においてイルミネーションに付した（一枚の未処理プレート及び一枚の処理プレートはイルミネーションに付さなかった）。
【００９９】
このプレートをアスピレートに付し、そして以下の通りに洗った：200 μl/ウェルづつで、50mMのトリス、150mM のNaCl及び0.05％(v/v) のTween-20, pH 7.5 (「TNT 」) で４回洗い、続いて200 μl のTNT/ウェルにより37℃で２時間200rpmで回転する周囲シェーカー上でインキュベートし、そして最後に300 μl づつのTNT で３回洗う。最後の洗浄後、ポリスチレンウェルを分断し、1.5ml のTHF の中に溶かし、そして５mlのシンチレーションフラワーを用い、実施例12に記載の通りにして液体シンチレーション光度計によりカウントした。得られる壊変／分（「dpm 」）を平均ngタンパク質／ウェルに変換した。この実験の結果は以下の通りである：
【０１００】
テトラ-BBE-PET処理ポリスチレンに対するチトクロームｃの固定化
【０１０１】
【表４】
2005145979.tif 000005
【０１０２】
上からわかる通り、この光試薬を介するポリスチレンへのCyt c の共有結合による表層改質は、未処理ポリスチレンに対する収着に対して24倍の上昇、未処理ポリスチレンに対するUV光強化収着に対して２倍の上昇、そして表層に対するCyt c の光固定化（イルミネーション）抜きでのテトラ-BBE-PET処理ポリスチレンに対して1.4 倍の上昇をもたらした。これらの結果は、テトラ-BBE-PET処理ポリスチレン表層が、この固相支持体マトリックスへのタンパク質の共有固定にとって有用であることを明示する。
【０１０３】
実施例14
テトラ-BBE-PET及びポリビニルピロリドン(PVP) の逐次適用によるポリエチルメタクリレート(PMMA)の表層改質
透明なPMMAクーポン(Rohm & Haas) 4cm(1.57 in.×2cm(0.78 in.) ×2mm(0.08 in.) をIPA 浸漬ティッシュでふき、その後、このクーポンの半分をメタノール中のテトラ-BBE-PETの0.08mg/ml の溶液でブラッシした。このコーティングを通常の実験室条件下で５分間風乾した後、クーポン全体を100 ワットのショートアーク水銀蒸気灯から150mm(6 in.)離して30秒間イルミネーションに付した。未結合のテトラ-BBE-PETを除くために過剰量のIPA ですすいだ後、クーポン全体をDI水中の10mg/ml のPVP(160,000 の平均分子量；GAF Chemical Corp.) でブラッシコートした。PVP を風乾後 (約５分）、そのクーポンを再び同一の光源から150mm(６インチ) 離して同じようにして30秒間イルミネーションに付した。次にこのクーポンをDI水の流れのもとで指の間で強くこすり (約１分）、PVP コーティングの耐久性をチェックした。
【０１０４】
すすぎ後、テトラ-BBE-PETでコートされた半分は、PVP のみでコートしたクーポン側に比べ、顕著に湿潤性且つ肌ざわりが滑らかであり続けた。テトラ-BBE-PETコート側上の結合PVP の存在はDI水中のコンゴレッド(Sigma) の0.35％の溶液による染色によって確認した。