(57)【要約】【課題】捕捉用核酸プローブに対するハイブリダイゼーション効率が高く、簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＰＣＲ産物及び該ＰＣＲ産物の製造方法を提供すること。【解決手段】核酸プローブを用いて検出対象である核酸を検出する方法を適用するための標的核酸サンプルであって、標的鎖と、該標的鎖に対して相補的な相補鎖と、前記標的鎖における、前記核酸プローブに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部に対して相補的で、且つ前記標的鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＡと、前記標的核酸における、前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＢとを具備する核酸断片を含んでなる標的核酸サンプル。【選択図】    図１
2005034007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プローブを用いて検出対象である核酸を検出する方法を適用するための標的核酸サンプルであって、
標的鎖と、
該標的鎖に対して相補的な相補鎖と、
前記標的鎖における、前記核酸プローブに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部に対して相補的で、且つ前記標的鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＡと、
前記標的核酸における、前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記標的核酸鎖の相補鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＢと
を具備する核酸断片を含んでなる標的核酸サンプル。
【請求項２】
オリゴマーＡおよびＢの３’末端での伸張反応が阻害されている、請求項１に記載の標的核酸サンプル。
【請求項３】
オリゴマーＡおよび／またはＢが、ＰＮＡ、又はその類似体である、請求項１に記載の標的核酸サンプル。
【請求項４】
オリゴマーＡおよび／またはＢがオリゴヌクレオチドであり、その３’末端での伸長反応が、リン酸基、ビオチン、アミノ基、チオール基、ジゴキシゲニン、蛍光色素、及びこれらの誘導体又は類似体から選択される少なくとも１種が結合していることにより阻害されている、請求項１に記載の標的核酸サンプル。
【請求項５】
検出対象である核酸、および該核酸の増幅反応に必要なプライマーを用いて核酸増幅反応を行なうことにより、核酸プローブを用いて前記検出対象である核酸を検出する方法を適用するための標的核酸サンプルを調製する方法であって、
前記検出対象である核酸は、前記核酸プローブに対して相補的な標的鎖および該標的鎖に対して相補的な相補鎖からなることと、
前記核酸プローブがハイブリダイズする領域以外の前記標的鎖の領域の全部または一部にハイブリダイズし、且つその３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＡ、並びに前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の前記標的核酸領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたときに３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＢを、前記核酸増幅反応の溶液中に添加することとを特徴とする方法。
【請求項６】
オリゴマーＡおよび／またはＢが、ＰＮＡ、又はその類似体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オリゴマーＡおよび／またはＢがオリゴヌクレオチドであり、その３’末端での伸長反応が、リン酸基、ビオチン、アミノ基、チオール基、ジゴキシゲニン、蛍光色素、及びこれらの誘導体又は類似体から選択される少なくとも１種が結合していることにより阻害されている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
請求項５乃至７のいずれか１項に記載の方法を用いて調製された標的核酸サンプル。
【請求項９】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の標的核酸サンプルを核酸プローブにハイブリダイズすることにより、前記検出対象である核酸を検出する方法。
【請求項１０】
請求項５乃至７のいずれか１項に記載の方法を用いて調製された標的核酸サンプルを核酸プローブにハイブリダイズすることにより、前記検出対象である核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の検出技術に関し、詳しくは、核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより検出対象である核酸を検出する方法に好適に用い得る標的核酸サンプル及びその製造方法に係るものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では遺伝子による病気の診断や予防が可能となっている。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変異を検出することで、病気の発症前もしくは極めて初期の段階で診断や予測ができる。また、ヒトゲノムの解読と共に、遺伝子型と疾病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。したがって、遺伝子の検出、遺伝子型の決定を簡便に行うことは非常に重要である。
【０００３】
通常、生物個体から直接採取されたサンプル中に含まれる、検出の対象となる標的核酸は、検出に十分な濃度、量で存在しておらず、なんらかの方法で標的核酸を増幅する必要がある。現在、主に用いられている増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法であり、該方法により増幅された標的核酸（以下において、「ＰＣＲ産物」とも称する。）は、それと相補的な配列を有するプローブ等で、その存在を検出することができる。この場合、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率が高いほど、感度が高く、より優れた検出系が得られることになる。
【０００４】
ここで、ＰＣＲ産物は互いに相補的な二本鎖を形成しており、プローブとハイブリダイズする側の鎖（標的鎖）と、該標的鎖に対して相補的な配列を持つもう一方の鎖（相補鎖）が存在する。このため、プローブと標的鎖とのハイブリダイズ反応の際、プローブと相補鎖とが競合し、十分なハイブリダイゼーション効率が得られないといった問題があった。
【０００５】
かかる問題点を解決するために、ＰＣＲにより得られた２本鎖産物の１本鎖化、相補鎖が標的鎖にハイブリダイズすることを阻害するオリゴヌクレオチドの添加などの方法が度々用いられている（例えば、特許文献１参照）。しかし、これらの方法はいずれも、ＰＣＲ反応後、溶液の混合、試薬の添加など複雑なプロセスを必要とし、さらに試料の調製・検査等にある程度の時間を要する、といった問題があり、安いランニングコストで、簡便且つ短時間で核酸を検出できる技術の開発が望まれているのが実情である。
【０００６】
【特許文献１】
特開平６−７０７９９号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決すべく開発されたものであり、捕捉用核酸プローブに対するハイブリダイゼーション効率が高く、簡便且つ短時間での核酸検出を可能とするＰＣＲ産物及び該ＰＣＲ産物の製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、ＰＣＲによる増幅の際、核酸プローブがハイブリダイズする領域以外の標的鎖の領域の配列に対する相補鎖オリゴマーであって、３’末端での伸長反応が阻害されているオリゴマーと、核酸プローブおよび前記オリゴマーに対して相補的な領域以外の前記標的核酸の領域と同じ配列を有し、且つ３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーの２種類を添加することにより、ハイブリダイゼーション効率の高いＰＣＲ産物が得られることを見出し本発明を完成するに至った。該ＰＣＲ産物は、核酸検出に先立ち一本鎖調製の工程を経ることなく、なお且つ試薬の添加等を要することなくハイブリダイゼーションサンプルとして使用することができるため、簡便且つ短時間での核酸検出が可能となる。
【０００９】
すなわち、本発明により、
核酸プローブを用いて検出対象である核酸を検出する方法を適用するための標的核酸サンプルであって、
標的鎖と、
該標的鎖に対して相補的な相補鎖と、
前記標的鎖における、前記核酸プローブに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部に対して相補的で、且つ前記標的鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＡと、
前記標的核酸における、前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＢと
を具備する核酸断片を含んでなる標的核酸サンプルが提供される。
【００１０】
また、本発明により、検出対象である核酸、および該核酸の増幅反応に必要なプライマーを用いて核酸増幅反応を行なうことにより、核酸プローブを用いて前記検出対象である核酸を検出する方法を適用するための標的核酸サンプルを調製する方法であって、
前記検出対象である核酸は、前記核酸プローブに対して相補的な標的鎖および該標的鎖に対して相補的な相補鎖からなることと、
前記核酸プローブがハイブリダイズする領域以外の前記標的鎖の領域の全部または一部にハイブリダイズし、且つその３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＡ、並びに前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の前記標的核酸領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたときに３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＢを、前記核酸増幅反応の溶液中に添加することとを特徴とする方法が提供される。
【００１１】
本発明の一態様において、前記オリゴマーＡおよびＢは、その３’末端での伸張反応が阻害されている。該オリゴマーＡおよび／またはオリゴマーＢは、ＰＮＡ、又はその類似体であり得、あるいは、オリゴヌクレオチドでありその３’末端での伸長反応が、リン酸基、ビオチン、アミノ基、チオール基、ジゴキシゲニン、蛍光色素、及びこれらの誘導体又は類似体から選択される少なくとも１種が結合している。
【００１２】
さらに、本発明により、前記標的核酸サンプルを核酸プローブにハイブリダイズすることにより、前記検出対象である核酸を検出する方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより検出対象である核酸を検出する方法に好適に用い得る標的核酸サンプルを提供するものであり、該標的核酸サンプルは、図１にその一態様が概念的に示された核酸断片を含むものである。
【００１４】
すなわち、本発明の標的核酸サンプルが含有する核酸断片は、標的鎖１（核酸プローブにハイブリダイズする側の鎖）と、該標的鎖に対して相補的な相補鎖２と、前記標的鎖における、前記核酸プローブに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部に対して相補的で、且つ前記標的鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＡと、前記標的核酸における、前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたオリゴマーＢとを含んでなり、２種類のオリゴマーＡ及びオリゴマーＢを具備することを特徴とする。本発明において、オリゴマーＡ及びオリゴマーＢは、その３’末端でのポリメラーゼによる伸長反応が阻害されるように合成されている。
【００１５】
図２は、本発明の核酸断片が核酸プローブにハイブリダイズする一態様を説明するための概念図である。核酸プローブと検出対象である標的核酸サンプルとのハイブリダイゼーションにおいて、オリゴマーＡの存在により、標的鎖１１の立体構造が安定化され、またオリゴマーＢの存在により、標的鎖１１に対して相補的な相補鎖１２が核酸プローブに対するコンペティターとなることが防止され、ハイブリダイゼーション効率が向上する。
【００１６】
図１及び図２において、オリゴマーＡ及びオリゴマーＢは、その３’末端がリン酸基３、１３で標識されているが、ポリメラーゼによる伸長反応が阻害され得る物質であればリン酸基に限らず用いることができ、リン酸基以外に例えば、ビオチン、アミノ基、チオール基、ジゴキシゲニン、蛍光色素、これらの誘導体又は類似体等を挙げることができる。あるいは、オリゴマーＡ及びオリゴマーＢは、ＰＮＡ、又はその類似体であってもよい。
【００１７】
本発明の標的核酸サンプルは、上述の通り、核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより検出対象である核酸を検出する方法において用いられるものであり、検出対象である核酸、および該核酸の増幅反応に必要なプライマーを用いて核酸増幅反応を行なうことにより調製され、オリゴマーＡ及びオリゴマーＢを核酸増幅反応の溶液中に添加することを特徴とするものである。すなわち、前記核酸プローブがハイブリダイズする領域以外の前記標的鎖の領域の全部または一部にハイブリダイズし、且つその３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＡ、並びに前記核酸プローブおよび前記オリゴマーＡに対して相補的な領域以外の前記標的核酸領域の全部または一部と同じ配列を有し、且つ前記相補鎖にハイブリダイズしたときに３’末端での伸張反応が阻害されているオリゴマーＢを、前記核酸増幅反応の溶液中に添加することとを特徴とする。
【００１８】
核酸増幅反応としてはＰＣＲ法を利用することができ、ＰＣＲにおける増幅の際の反応溶液中へのオリゴマーＡ及びオリゴマーＢの添加時期としては、特に限定されるものではなく、反応溶液調製時であってもいいし、あるいは増幅後であってもよい。
【００１９】
前記方法により調製されたＰＣＲ産物は、ハイブリダイゼーション法による核酸検出に供するに際し、磁気ビーズなどを用いて一本鎖に精製する工程を経ることなくそのままハイブリダイゼーションサンプルとして使用することができ、また、その際に試薬等を添加することも要しないため、核酸プローブを用いて検出対象である核酸を検出するハイブリダイゼーション法の標的核酸サンプルとして用いた場合、安いランニングコストで、簡便且つ短時間で核酸を検出することが可能となる。
【００２０】
【実施例】
以下に、本発明による核酸検出方法を実施例を用いてより具体的に説明する。
（実施例１）標的核酸サンプルの製造
本実施例では、３’リン酸標識核酸鎖を用い、増幅法としてＰＣＲ法を利用した。
【００２１】
（Ｉ）合成オリゴヌクレオチド
本実施例で用いた合成オリゴヌクレオチドを以下に示す。
【００２２】
プライマー
順方向プライマー：  ＧＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣ
逆方向プライマー：  ＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＣ。
【００２３】
３’リン酸化核酸鎖１
５’ＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＧＧＣ  ３’
３’リン酸化核酸鎖２
５’ＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＣ  ３’。
【００２４】
（ＩＩ）ＰＣＲ反応溶液
ＰＣＲ反応溶液は以下の組成とした。
2005034007.tif 000003
【００２５】
（ＩＩＩ）温度サイクル
ＰＣＲの温度サイクルは、以下の条件で、サーマルサイクラーを使用して行った。
【００２６】
（ｉ）    ９５℃
（ｉｉ）  ９５℃
（ｉｉｉ）  ６０℃
（ｉｖ）  ７２℃
（ｖ）      ４℃
（ｉｉ）〜（ｉｖ）を４０サイクル。
【００２７】
（ＩＶ）標的核酸の増幅確認
上記の方法で増幅したＰＣＲ産物をアガローズゲル電気泳動で確認した。その結果を図３に示す。
図３において、（１）はマーカー、（２）は通常のＰＣＲ産物、（３）は３’リン酸化核酸鎖１のみを添加した場合のＰＣＲ産物、（４）は３’リン酸化核酸鎖１及び３’リン酸化核酸鎖２を添加した場合のＰＣＲ産物（本発明例）である。３’リン酸化核酸鎖を添加したＰＣＲ産物（３）及び（４）は、これを添加していないＰＣＲ産物（２）と比較して、ほぼ同程度の目的増幅物量が得られ、非特異的は増幅も見られなかった。このことから、３’リン酸化核酸鎖をＰＣＲ反応溶液に当初から添加しＰＣＲを施した場合も、増幅された標的核酸が得られることが確認された。
【００２８】
上記のＰＣＲ法で得られる増幅断片の配列を以下に示す。
【００２９】
ＰＣＲ産物配列
Ａｌｌｅｌｅ  Ｇ
ＧＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＣ
Ａｌｌｅｌｅ  Ｔ
ＧＡＧＣＴＡＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＣ。
【００３０】
（実施例２）核酸の検出
核酸プローブを用い、実施例１で得られた本発明例であるＰＣＲ産物（４）をハイブリダイズすることにより、核酸の検出を行った。
【００３１】
（Ｉ）核酸プローブ固定化電極の作製
核酸プローブの塩基配列を以下に示す。
Ｇ−プローブ：  ＴＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＡＡＡＣ
Ｔ−プローブ：  ＴＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＣ
Ｎ−プローブ：  ＣＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＡ
Ｇ−プローブ及びＴ−プローブは、ＰＣＲ増幅産物に相補的な配列を持ち、互いに一塩基異なる配列を有する。一方、Ｎ−プローブは、ネガティブコントロールとして使用したプローブであり、上記２つのプローブとは異なる配列を有する。また、上記の核酸プローブはそれぞれ３’末端をＳＨ基で標識されているものを用いた。この標識プローブを含むプローブ溶液を金電極上にスポットし、１時間静置してから、超純水で洗浄した後風乾し、プローブ固定化電極とした。
【００３２】
（ＩＩ）核酸プローブへのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション
核酸サンプルは、実施例１で得られた本発明例であるＰＣＲ産物（４）を用いた。これを含むバッファ中に、前記（Ｉ）で作製した核酸プローブ固定化電極を浸漬し、３５℃で１０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。その後、バッファで洗浄を行った。この電極を、挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を、各プローブを固定した電極における電流値増加量として図４に示す。通常のＰＣＲ産物を反応させた電極では、標的核酸のハイブリダイズに由来する電流値増加が見られなかった。これに対し、３’リン酸化核酸鎖を添加し増幅した本発明例のＰＣＲ産物（４）を反応させた電極では、標的核酸のハイブリダイズに由来する電流値増加が確認された。ここで得られた電流値増加は、Ｎ−プローブ固定化電極では確認されず、さらに、プローブ配列中に含まれる１塩基変異が識別され、上記電流値増加が増幅された核酸の配列に特異的であることが示された。
【００３３】
なお、本発明は上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより、種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。さらに、異なる実施形態にわたる構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明により提供されるＰＣＲ産物は、ハイブリダイゼーション効率が高く、核酸検出におけるハイブリダイゼーションサンプルとして一本鎖調製の工程を経ることなく、なお且つ試薬の添加等を要することなく使用することができるため、簡便且つ短時間での核酸検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸断片の一態様を説明するための概念図。
【図２】本発明の核酸断片が核酸プローブにハイブリダイズする一態様を説明するための概念図
【図３】ＰＣＲ産物についての電気泳動の結果を示す写真。
【図４】各核酸プローブ固定化電極における電流値増加量を示すグラフ。
【符号の説明】
１、１１・・・標的鎖、２、１２・・・相補鎖、３、１３・・・リン酸基
【図１】
2005034007.tif 000004
【図２】
2005034007.tif 000005
【図３】
2005034007.tif 000006
【図４】
2005034007.tif 000007