(57)【要約】【課題】  花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、植物の雄性不稔体を生産する技術を提供する。【解決手段】  花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとのキメラ遺伝子を植物細胞に導入して、上記転写因子と上記機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物細胞内で生産させる。該キメラタンパク質が花器形成に関与する遺伝子の発現を優性に抑制する結果、正常な花粉形成ができない、植物の雄性不稔体が生産される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項２】
上記植物の雄性不稔体は、少なくとも雄ずいの形成が阻害されていることを特徴とする、請求項１に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項３】
上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいることを特徴とする請求項１または２に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項４】
さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいることを特徴とする請求項１〜３に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項５】
上記転写因子が、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【請求項６】
上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることを特徴とする請求項３または４に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【請求項７】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物体の生産方法。
【請求項８】
上記機能性ペプチドが、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項９】
上記機能性ペプチドが、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１０】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１１】
上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１２】
上記機能性ペプチドが、配列番号２２〜３７、１３３〜１３６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１３】
上記機能性ペプチドが、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物の雄性不稔体の生産方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法により生産された、植物の雄性不稔体。
【請求項１５】
植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることを特徴とする請求項１４に記載の植物の雄性不稔体。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の生産方法を行うためのキットであって、
花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴とする植物の雄性不稔体生産キット。
【請求項１７】
さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含むことを特徴とする請求項１６に記載の植物の雄性不稔体生産キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術に関し、より詳細には、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することにより、植物の雄性不稔体を生産する生産方法およびこれを用いて得られる植物体、ならびにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
異なる品種間で交配させ、雑種を作ると、両親より優れた形質が子供に現れる。これを雑種強勢という。この雑種強勢を利用した交配により、農産物をハイブリッド化して優良品種を作出することが、現在、一般的になっている。例えば、主要な野菜や穀物の優良品種のほとんどは、こうした交配により品種改良されている。
【０００３】
雑種強勢の利益を受けるためには、互いに異なった品種間で交配させる必要がある。このため、交配を行う品種において、自家受粉が行われないようにする必要がある。ここで、トウモロコシなどの、雄花と雌花が離れた植物では、雄花を人為的に刈り取ることにより、自家受粉を避けることができる。しかし、この作業は、多大な人的労力を有し非常に手間となる。また、イネに代表される自殖性植物では、多数の花が集合していたり、雌しべと雄しべが花弁を包み込んでいたりする。そのため、人為的に雄花を刈り取ることすら困難であり、自家受粉を避けることは非常に難しい。
【０００４】
したがって、雑種強勢を利用した交配を行うためには、正常な花粉形成ができない、いわゆる雄性不稔体を利用することが望ましい。事実、これまで、トマトやキュウリなどの多くの植物において、雄性不稔体が得られ、品種改良に利用されてきた。
【０００５】
しかし、一方、雄性不稔体が確立されていない植物品種もまた、多数、存在することも事実である。これらの植物において、雄性不稔体を、突然変異によって新たに得る場合、成果を偶然性に委ねざるをえないため、長期にわたる交配が必要となる。したがって、労力もコストも多大に必要となり、現在の農業において、その取り組みは現実的に困難である。
【０００６】
そこで、遺伝子組み換え技術を利用して、人為的に雄性不稔体を確立する試みが、これまでいくつか為されている
非特許文献１には、核内遺伝子による雄性不稔を人為的に引き起こす技術が開示されている。この技術では、ペニチュアにカルコンシンターゼのアンチセンス遺伝子を導入して、カルコンシンターゼの活性を抑制する。これにより、フラボノイドの生合成的前駆体であるカルコンの生合成が抑えられ、形質転換されたペニチュアは雄性不稔体となる。
【０００７】
非特許文献２には、毒性物質によりタバコの葯を消失させることで、雄性不稔体を作出する技術が開示されている。この技術では、Ｎ−アセチル−Ｌ−オルニチンデアセチラーゼを転写・翻訳産物とする、ａｒｇＥ遺伝子を、タペート組織において特異的に機能するＴＡ２９プロモーターに類似するＤＮＡ配列に融合させた形で、タバコに導入する。次に、このタバコに、毒性のないＮ−アセチル−Ｌ−フォスフィノスリシンを投与する。すると、葯において発現されたＮ−アセチル−Ｌ−オルニチンデアセチラーゼによって、Ｎ−アセチル−Ｌ−フォスフィノスリシンが脱アセチル化され、毒性のある、Ｌ−フォスフィノスリシンとなる。この毒性物質によって、葯がネクローシスを起こして消失するため、形質転換されたタバコは、花粉が形成されない雄性不稔体となる。
【０００８】
また、非特許文献３には、細胞質雄性不稔を人為的に引き起こす技術が開示されている。この技術では、コムギ由来の、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアatp9遺伝子を、タバコ細胞に導入する。これにより、不活性のＡＴＰ９タンパク質が発現されて、ミトコンドリアに移行する。その結果、ミトコンドリアの機能が阻害されるため、形質転換されたタバコは雄性不稔体となる。
【０００９】
さらに、非特許文献４には、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアａｔｐ９遺伝子のアンチセンス遺伝子を導入した別の形質転換タバコを作成し、これと、ＲＮＡエディティングが行われないミトコンドリアａｔｐ９遺伝子を導入した形質転換タバコとを交配することによって、次世代で稔性が回復する形質転換タバコを作出する技術が開示されている。
【００１０】
ここで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献５、６参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【特許文献１】特開２００１−２６９１７７公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献２】特開２００１−２６９１７８公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献３】特開２００１−２９２７７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献４】特開２００１−２９２７７７公報（平成１３年（２００１）１０月２３日公開）
【特許文献５】特開２００１−２６９１７６公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献６】特開２００１−２６９１７９公報（平成１３年（２００１）１０月２日公開）
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０３／０５５９０３号パンフレット（平成１５年（２００３）７月１０日公開）
【非特許文献１】Ingrid M. van der Meer, Maike E. Stam, Arjen J. van Tunen, Joseph N. M. Mol, and Antoine R. Stuitje. The Plant Cell, Vol 4, pp 253-262, March, 1992
【非特許文献２】G. Kriete, K. Niehaus, A.M. Perlick, A. Puehler and I. Broer, The Plant Journal, Vol 9, pp 809-818, 1996
【非特許文献３】Michel Hernould, Sony Suharsono, Simon Litvak, Alejandro Araya, and Armand Mouras., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 90, pp. 2370-2374, March, 1993
【非特許文献４】Eduardo Zabaleta, Armand Mouras, Michel Hernould, Suharsono, and Alejandro Araya., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, Vol 93, pp 11259-11263, October, 1996
【非特許文献５】Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
【非特許文献６】Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、従来、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する技術は知られていない。
【００１２】
本発明は、花器形成に関与する遺伝子の転写を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する、植物の雄性不稔体の生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子の１つであるＡＰＥＴＡＬ３タンパク質を転写抑制因子に転換することによって、花弁および雄ずいが形成されない雄性不稔植物体を生産できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法は、上記課題を解決すべく、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制することを特徴としている。上記生産方法では、植物の雄性不稔体は、少なくとも雄ずいの形成が阻害されたものであることが好ましい。
【００１５】
また、上記生産方法は、上記転写因子をコードする遺伝子と上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入する形質転換工程を含んでいてもよい。
【００１６】
また、上記生産方法は、さらに、上記組換え発現ベクターを構築する発現ベクター構築工程を含んでいてもよい。
【００１７】
上記転写因子は、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴としている。（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有するタンパク質。
【００１８】
また、上記転写因子をコードする遺伝子として、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載の遺伝子が用いられることが好ましい。（ｃ）配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子。
【００１９】
上記機能性ペプチドは、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２０】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
【００２１】
また、上記機能性ペプチドは、以下の（ｅ）又は（ｆ）記載のペプチドであってもよい。（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【００２２】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２３】
また、上記機能性ペプチドは、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ2はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。）
のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００２４】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２２〜３７、１３３〜１３６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２５】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号３８又は３９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。
【００２６】
また、本発明にかかる植物体は、上記生産方法により生産され、少なくとも雄ずいの形成が阻害された雄性不稔植物体であることを特徴としている。上記植物体には、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれることが好ましい。
【００２７】
また、本発明にかかる植物の雄性不稔体生産キットは、上記の生産方法を行うためのキットであって、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子をコードする遺伝子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを少なくとも含むことを特徴としている。上記植物の雄性不稔体生産キットは、さらに、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明にかかる植物の雄性不稔体の生産方法では、以上のように、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制することによって、植物の雄性不稔体を生産する。したがって、上記キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子で目的の植物を形質転換すれば雄性不稔植物を生産することができ、複雑な遺伝子組み替え技術を利用することなく、非常に簡便に目的の植物を雄性不稔化することができるという効果を奏する。
【００２９】
また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものである。そのため、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、本発明にかかるキメラタンパク質は、該当する転写因子が制御する、花器形成に関わる遺伝子の発現を、一様に抑制できる。したがって、遺伝子導入可能なあらゆる植物を、雄性不稔体に容易に形質転換できるという効果を奏する。
【００３０】
また、本発明で用いられる、花器形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられるため、特定のモデル植物で構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００３２】
本発明は、植物の雄性不稔体を生産する技術であって、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたキメラタンパク質を、植物体で生産させるものである。これによって得られる植物体では、正常な花粉形成ができないため、本発明により、雄性不稔植物体を生産できる。
【００３３】
ここで、正常な花粉形成ができなくなることは、次のようにして起こる。すなわち、上記キメラタンパク質における上記転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花器形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。上記転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、例えば雄ずいの形成が阻害されるなどして、正常な花粉形成ができない雄性不稔植物体を得ることが出来る。
【００３４】
本発明の生産方法で生産される植物の雄性不稔体（本雄性不稔体）は、正常な花粉形成ができないものである。すなわち、本雄性不稔体の例には、雄ずいの形成が阻害され、花粉がまったく形成されないものや、雄ずいは形成されるが、葯が形成されないために、花粉が形成されないものや、雄ずいも葯も形成されるが、形成される花粉の量が少なく、葯の開裂に至らないものや、形成された花粉が肥大化して互いにくっついてしまい、全く飛散しないもの、などがある。
【００３５】
なお、本雄性不稔体では、雌ずいは稔性を有している。このため、本雄性不稔体に他種の花粉を授粉できる。したがって、雑種強勢を利用した交配により、一代雑種を得ることが出来る。
【００３６】
また、本雄性不稔体では、正常な花粉形成ができなくなることに加えて、他の組織の形成が正常に行われなくなっていてもよい。例えば、本雄性不稔体は、花弁や萼などが通常とは異なる形に形成されるものや、あるいは全く形成されていないものでもよい。例えば、花弁や萼がまったく形成されなければ、雌ずいが露出するため、他種の花粉を授粉する際の手間（萼や花弁を除去する等）を簡略化できる。
【００３７】
以降の説明では、本発明にかかる雄性不稔植物体の生産方法に用いられるキメラタンパク質、本発明にかかる植物体の生産方法の一例、これにより得られる植物体とその有用性、並びにその利用について、それぞれ説明する。
【００３８】
（Ｉ）本発明で用いられるキメラタンパク質
上述したように、本発明で用いられるキメラタンパク質は、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子と、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドとを融合させたものである。
【００３９】
また、本発明で用いられるキメラタンパク質は、内在性の遺伝子に対して、優性に作用するものである。すなわち、本発明にかかるキメラタンパク質は、植物が二倍体や複二倍体であったり、あるいは植物に機能重複遺伝子が存在したりしても、該当する転写因子が制御する、花器形成に関わる遺伝子の発現を、一様に抑制できる。そのため、遺伝子導入可能なあらゆる植物を、雄性不稔体に容易に形質転換できる。
【００４０】
以下では、上記転写因子および機能性ペプチドそれぞれについて説明する。
【００４１】
（Ｉ−１）花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子
本発明で用いられる転写因子は、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であれば特に限定されるものではない。かかる転写因子は多くの植物に保存されている。したがって、本発明で用いられる転写因子には、種々の植物に保存されている同様の機能を有するタンパク質が含まれる。
【００４２】
このような転写因子としては、ＭＡＤＳ Ｂｏｘを含んだ転写因子であるＡＰＥＴＡＬ３タンパク質やＰＩＳＴＩＬＬＡＴＡタンパク質があるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明で用いられる転写因子の代表的な一例としては、例えば、ＡＰＥＴＡＬ３タンパク質を挙げることができる。ＡＰＥＴＡＬ３タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であり、上述したように、花器形成に関与する遺伝子の転写を促進する転写因子であることが知られている。また、シロイヌナズナでは、このＡＰＥＴＡＬ３タンパク質をコードする遺伝子（説明の便宜上、ＡＰＥＴＡＬ３遺伝子と称する）の変異株において、花弁と雄ずいの形成が阻害されることが知られている（Thomas Jack, Laura L. Brockman, and Elliot M. Meyerrowitz., Cell, Vol 68, pp 683-697, February, 1992を参照のこと）。本発明では、例えば、このＡＰＥＴＡＬ３タンパク質に後述する機能性ペプチドを融合させることにより、転写因子であるＡＰＥＴＡＬ３タンパク質を転写抑制因子に転換させる。
【００４４】
本発明で用いられる転写因子としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＡＰＥＴＡＬ３タンパク質に限定されるものではなく、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する機能を有する転写因子であればよい。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００４５】
また、本発明で用いられる、花器形成に関わる遺伝子の転写を促進する転写因子のアミノ酸配列は、種の異なる数多くの植物間において、保存性が高いものと考えられる。そのため、雄性不稔体を生産したい個々の植物体において、花器形成に関与する遺伝子の発現を促進する固有の転写因子やその遺伝子を、必ずしも単離する必要はない。すなわち、後述する実施例で示す、シロイヌナズナで構築したキメラタンパク質を、他の植物に導入することで、さまざまな種の植物において簡便に雄性不稔体を生産できると考えられる。
【００４６】
本発明で用いられるキメラタンパク質を生産させる際には、後述するように、公知の遺伝子組換え技術を好適に用いることができる。そこで、本発明にかかる植物体の生産方法には、上記転写因子をコードする遺伝子も好適に用いることができる。
【００４７】
上記転写因子をコードする遺伝子としては特に限定されるものではないが、具体的な一例としては、例えば、転写因子としてＡＰＥＴＡＬ３タンパク質を用いる場合には、このＡＰＥＴＡＬ３遺伝子を挙げることができる。ＡＰＥＴＡＬ３遺伝子の具体的な一例としては、例えば、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４８】
もちろん、本発明で用いられるＡＰＥＴＡＬ３遺伝子、または、転写因子をコードする遺伝子としては、上記の例に限定されるものではなく、配列番号２に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合することを意味する。
【００４９】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００５０】
上記転写因子をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法により、多くの植物から単離することができる。例えば、既知の転写因子の塩基配列に基づき作製したプライマー対を用いることができる。このプライマー対を用いて、植物のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記転写因子をコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００５１】
（Ｉ−２）任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド（説明の便宜上、転写抑制転換ペプチドと称する）としては、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチド（特許文献１〜７、非特許文献５・６等参照）であればよい。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
【００５２】
上記転写抑制転換ペプチドの一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
（Ｉ−２−１）式（１）の転写抑制転換ペプチド
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５３】
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、式（１）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５４】
同様に、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００５５】
上記式（１）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４０、４１に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列である。
【００５６】
（Ｉ−２−２）式（２）の転写抑制転換ペプチド
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００５７】
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、式（２）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
【００５８】
同様に、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドと同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
【００５９】
上記式（２）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４２、４３に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４３に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４４に示す。
【００６０】
（Ｉ−２−３）式（３）の転写抑制転換ペプチド
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
【００６１】
一方、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、上記式（１）の転写抑制転換ペプチドのＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
【００６２】
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、式（３）の転写抑制転換ペプチドを合成するときの容易さからみれば、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定される物ではない。
【００６３】
また、この式（３）で表される転写抑制転換ペプチド全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
【００６４】
上記式（３）の転写抑制転換ペプチドにおいて、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４５〜５３に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４５、４６または４７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４８、４９または５０に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５１、５２または５３に示すアミノ酸配列である。
【００６５】
（Ｉ−２−４）式（４）の転写抑制転換ペプチド
上記式（４）の転写抑制転換ペプチドは、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号７、１６、５４に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号７に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５４に示すアミノ酸配列である。
【００６６】
特に、本発明において用いられる転写抑制転換ペプチドは、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号７に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
【００６７】
（Ｉ−２−５）転写抑制転換ペプチドのより具体的な例
上述した各式で表される転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、例えば、配列番号３〜１９のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
【００６８】
さらに、上記転写抑制転換ペプチドの他の具体的な例として、次に示す（ｅ）又は（ｆ）記載のオリゴペプチドを挙げることができる。
（ｅ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【００６９】
上記配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＵＰタンパク質である。また、上記の「配列番号２０又は２１に示されるいずれかのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１個又は数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００７０】
上記アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記ペプチドをコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて異変が導入される。
【００７１】
また、上記機能性ペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列の全長配列を有するペプチドに限られず、その部分配列を有するペプチドであってもよい。
【００７２】
その部分配列を有するペプチドとしては、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列（ＳＵＰタンパク質の１７５から２０４番目のアミノ酸配列）を有するペプチドが挙げられ、その部分配列を有するペプチドとしては、上記（３）で表されるペプチドが挙げられる。
【００７３】
（Ｉ−３）転写抑制転換ペプチドの他の例
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ1は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。
【００７４】
なお、上記一般式（５）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β2−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β1−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α2は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β1は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β2はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β3は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ2は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＡｓｐを示す。
【００７５】
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドのより具体的な例としては、配列番号２２〜３７、１３３〜１３６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２９、３０、３２又は３４のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２５、３５、３６又は３７のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２６、２７、２８、３１、又は３３のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号２３又は２４のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
【００７６】
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも配列番号３８または３９で表されるアミノ酸配列を有する転写抑制転換ペプチドを用いることもできる。
【００７７】
（Ｉ−４）キメラタンパク質の生産方法
上記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）で説明した各種転写抑制転換ペプチドは、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子と融合してキメラタンパク質とすることにより、当該転写因子を転写抑制因子とすることができる。したがって、本発明では、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、転写因子をコードする遺伝子とのキメラ遺伝子を得れば、キメラタンパク質を生産させることができる。
【００７８】
具体的には、上記転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、転写抑制転換ポリヌクレオチドと称する）と上記転写因子をコードする遺伝子とを連結することによりキメラ遺伝子を構築して、植物細胞に導入する。これによりキメラタンパク質を生産させることができる。なお、キメラ遺伝子を植物細胞に導入する具体的な方法については、後述する（ＩＩ）の項で詳細に説明する。
【００７９】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されるものではなく、遺伝暗号に基づいて、上記転写抑制転換ペプチドのアミノ酸配列に対応する塩基配列を含んでいればよい。また、必要に応じて、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドは、転写因子遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含んでいてもよい。さらに、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドのアミノ酸読み枠と転写因子遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
【００８０】
上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３７、１３９、１４１又は１４３に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。また、配列番号６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３８，１４０，１４２，１４４に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。また、上記転写抑制転換ポリヌクレオチドの他の具体例としては、例えば、配列番号９５、９６に示されるポリヌクレオチドを挙げることができる。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように配列番号３〜３９、１３３〜１３６に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
本発明で用いられるキメラタンパク質は、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結した上記キメラ遺伝子から得ることができる。したがって、上記キメラタンパク質は、上記転写因子の部位と、上記転写抑制転換ペプチドの部位とが含まれていればよく、その構成は特に限定されるものではない。例えば、転写因子と転写抑制転換ペプチドとの間をつなぐためのリンカー機能を有するポリペプチドや、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のようにキメラタンパク質をエピトープ標識するためのポリペプチド等、各種の付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。さらに上記キメラタンパク質には、必要に応じて、ポリペプチド以外の構造、例えば、糖鎖やイソプレノイド基等が含まれていてもよい。
【００８３】
（ＩＩ）本発明にかかる植物体の生産方法の一例
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を植物体で生産させ、花器形成に関与する遺伝子の発現を抑制する過程を含んでいれば特に限定されるものではないが、本発明にかかる植物体の生産方法を具体的な工程で示せば、例えば、発現ベクター構築工程、形質転換工程、選抜工程等の工程を含む生産方法として挙げることができる。このうち、本発明では、少なくとも形質転換工程が含まれていればよい。以下、各工程について具体的に説明する。
【００８４】
（ＩＩ−１）発現ベクター構築工程
本発明において行われる発現ベクター構築工程は、上記（Ｉ−１）で説明した転写因子をコードする遺伝子と、上記（Ｉ−４）で説明した転写抑制転換ポリヌクレオチドと、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築する工程であれば特に限定されるものではない。
【００８５】
上記組換え発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐBluescript、ｐBluescriptＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。
【００８６】
上記プロモーターは、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、アクチンプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニットプロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターまたはアクチンプロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、得られる組換え発現ベクターでは、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００８７】
上記プロモーターは、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結したキメラ遺伝子を発現しうるように連結され、ベクター内に導入されていればよく、組換え発現ベクターとしての具体的な構造は特に限定されるものではない。
【００８８】
上記組換え発現ベクターは、上記プロモーターおよび上記キメラ遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００８９】
ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。
【００９０】
上記形質転換ベクターにおいては、ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成したり、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数の減少させたりするような現象の発生を防止することができる。
【００９１】
上記選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００９２】
上記翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記キメラ遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記形質転換ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００９３】
上記組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、転写因子をコードする遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、転写因子をコードする遺伝子と転写抑制転換ポリヌクレオチドとを連結してキメラ遺伝子を構築し、次に、このキメラ遺伝子とプロモーターと（必要に応じてターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。
【００９４】
キメラ遺伝子の構築および発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記キメラ遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、組換え発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。
【００９５】
また、上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
【００９６】
（ＩＩ−２）形質転換工程
本発明において行われる形質転換工程は、上記（ＩＩ−１）で説明した組換え発現ベクターを植物細胞に導入して、上記（Ｉ）で説明したキメラタンパク質を生産させるようになっていればよい。
【００９７】
上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接、植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)を用いることができる。
【００９８】
組換え発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００９９】
上記組換え発現ベクターが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。
【０１００】
ここで、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記組換え発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な組換え発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。すなわち、本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記（Ｉ−１）で説明した組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１０１】
（ＩＩ−３）その他の工程、その他の方法
本発明にかかる植物体の生産方法においては、上記形質転換工程が含まれていればよく、さらに上記組換え発現ベクター構築工程が含まれていてもよいが、さらに他の工程が含まれていてもよい。具体的には、形質転換後の植物体から適切な形質転換体を選抜する選抜工程等を挙げることができる。
【０１０２】
選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、成長した植物体において、正常な花粉形成ができないことを基準として選抜してもよい。
【０１０３】
本発明にかかる植物体の生産方法では、上記キメラ遺伝子を植物体に導入するため、該植物体から、有性生殖または無性生殖により、花器形成に関与する遺伝子の発現が抑制された子孫を得ることが可能となる。また、該植物体やその子孫から植物細胞や、種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に該植物体を量産することも可能となる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、選抜後の植物体を繁殖させる繁殖工程（量産工程）が含まれていてもよい。
【０１０４】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体と見なす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。したがって、本発明にかかる植物体の生産方法では、植物細胞から植物体を再生させる再生工程が含まれていてもよい。
【０１０５】
また、本発明にかかる植物体の生産方法は、組換え発現ベクターで形質転換する方法に限定されるものではなく、他の方法を用いてもよい。具体的には、例えば、上記キメラタンパク質そのものを植物体に投与してもよい。その際、キメラタンパク質の投与方法も特に限定されるものではなく、公知の各種方法を用いればよい。
【０１０６】
（ＩＩＩ）本発明により得られる植物体とその有用性、並びにその利用
本発明にかかる植物体の生産方法は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子を植物体で発現させることによる。当該キメラタンパク質における転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインが、花器形成に関与すると推定される標的遺伝子に結合する。転写因子は転写抑制因子に転換され、標的遺伝子の転写が抑制される。これにより、花器形成に変異が生じ、花粉形成が正常に行われなくなる雄性不稔性の植物体を得ることができる。したがって、本発明には、上記植物体の生産方法により得られる雄性不稔植物体も含まれる。
【０１０７】
（ＩＩＩ−１）本発明にかかる植物体の具体例
本発明にかかる雄性不稔植物体の具体的な種類は特に限定されるものではなく、雄性不稔性を獲得することによりその有用性が高まる植物を挙げることができる。かかる植物は、被子植物であってもよいし裸子植物であってもよい。裸子植物としては、例えば、スギ目のスギ科、マツ科、ヒノキ科の植物やマキ科の植物を挙げることができる。また、被子植物としては、単子葉植物であってもよいし、双子葉植物であってもよい。双子葉植物としては、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科、マメ科、チャ等のツバキ科等の植物を挙げることができる。また、単子葉植物としては、イネ、トウモロコシ、ムギ等のイネ科、ホシクサ科等の植物を挙げることができる。
【０１０８】
また、本発明にかかる雄性不稔植物体は、果実や種子を商品とする植物、花や植物体そのものを商品とする観葉植物（花卉植物）であってもよい。したがって、本発明にかかる雄性不稔植物体の具体例をさらに挙げると、ナタネ、ジャガイモ、ホウレンソウ、大豆、キャベツ、レタス、トマト、カリフラワー、さやいんげん、かぶ、めかぶ、大根、ブロッコリー、メロン、オレンジ、スイカ、ネギ、ゴボウなどの各種の食用植物、あるいはバラ、キク、あじさい、カーネーションなどの観葉植物がある。
【０１０９】
（ＩＩＩ−２）本発明の有用性
本発明は、植物体に雄性不稔性を付与することにより一定の効果がある分野に有用性がある。具体例を以下にいくつか挙げるが、本発明の有用性は、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
まず、本発明の技術により、正常な花粉形成ができない雄性不稔植物体を作出でき、雑種強勢を利用した交配による品種改良に利用できる。本発明の雄性不稔植物体では、正常な花粉形成ができないため、イネ等の自殖性植物であっても、自家受粉が行われない。そのため、他種の花粉を授粉することで、種間の交配を簡便に行える。これにより、雑種強勢を利用した、優良品種の一代雑種の探索を簡便かつ効率的に行うことができる。
【０１１１】
また、本発明の技術は、トウモロコシ等の他殖性植物にも適用できる。他殖性植物では、現在、人力で雄しべを刈り取る作業（除雄作業）により自家受粉を回避し、他品種の花粉を授粉して品種改良を行っている。これに対し、本発明の技術で雄性不稔植物体を生産すれば、このような労力を必要としなくなるため、品種改良に必要な時間やコスト、あるいは優良品種の栽培に必要な手間を、現状に比較して大幅に低減することができる。
【０１１２】
また、本発明の技術は、タマネギやジャガイモなど、地下茎を商品とする植物にも応用できる。この種の植物では、受粉が起こると、地下茎の成長が著しく阻害され、商品価値が下がることが知られている。そのため、現在、受粉を回避するために除雄作業が必要となり、そのための手間やコストが非常に大きい。本発明の技術により、地下茎を商品とする植物の雄性不稔体が得られるため、除雄作業を必要とせず、受粉を回避できる。そのため、植物体を育成して商品を生産する際のコストや時間を、現状に比較して大幅に低減できる。
【０１１３】
本発明の技術は、果実や花を商品としない植物体にも好適に応用できる。その一例を挙げると、花粉症の予防がある。すなわち、花粉症の原因となる花粉を大量に撒き散らす植物、例えば、スギ、ヒノキ、サワラなどの樹木、カモガヤ、オオアワガエリ、ナガハグサなどのイネ科植物、ブタクサ、ヨモギ、カナムグラなどの雑草類において、本発明の技術により雄性不稔体を生産すれば、正常な花粉形成ができないため、これらの植物体から花粉が飛散する恐れがない。そのため、これらの雄性不稔体を、自然界の野生型植物体と置き換えてやれば、花粉症の原因となる花粉の飛散が抑えられるため、花粉症を予防できる。
【０１１４】
また、本発明の技術により、花粉を経由するウイルスの感染が原因となる、植物の病気を予防できる。ある種の植物ウイルスは、病的植物の花粉内に存在し、雄ずいを通じて健全植物に伝染して病気を引き起こすことが知られている。本発明の技術により、正常な花粉形成ができない植物体を生産すれば、花粉を媒介するウイルス感染が行われないため、かかる植物の病気を予防できる。
【０１１５】
本発明の技術により、遺伝子改変植物体の自然界への望ましくない拡散を防止できる。一例を挙げると、パルプの原料であるユーカリでは、遺伝子操作により、耐塩性や耐寒性に優れ、樹木が巨大化するなどの、より優れた形質を導入された遺伝子改変植物体が創出され、野外環境下における導入形質の検証実験が行われている。しかし、このような遺伝子改変植物体を野外環境下で育てると、風や昆虫等を媒体とした花粉の拡散を通じて、遺伝子改変植物体が自然界へ広く拡散していき、自然環境が改変される恐れがある。そのため、かかる問題に対処するために、遺伝子改変植物の検証実験を、外界から完全に隔離された、特殊な環境下で行う必要がある。
【０１１６】
しかし、本発明の技術を用いて、遺伝子改変植物体を、正常な花粉形成ができない雄性不稔体に形質転換させておけば、花粉の撒布による遺伝子改変植物体の自然界への拡散は起こらない。そのため、現状に比較して、実際の野外環境下により近い条件で、遺伝子改変植物体の検証試験を行うことができる。これにより、遺伝子改変植物体に導入した形質を、より自然な環境下で検証できる。
【０１１７】
また、本発明の技術を用いれば、萼や雄ずいなど、花器の一部が欠損したり、あるいは変形したりした植物体を生産することができる。これにより、従来には存在しなかった特異な形状の花器を有する植物体を生産できるため、これまでにない、新たな観賞植物を得ることが出来る。
【０１１８】
（ＩＩＩ−３）本発明の利用の一例
本発明の利用分野、利用方法は特に限定されるものではないが、一例として、本発明にかかる植物体の生産方法を行うためのキット、すなわち植物の雄性不稔体化キットを挙げることができる。
【０１１９】
この雄性不稔体化キットの具体例としては、上記転写因子をコードする遺伝子と上記転写抑制転換ポリヌクレオチドとからなるキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを少なくとも含んでいればよく、上記組換え発現ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。上記試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材を添付してもよい。
【０１２０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を実施例及び図１に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２２】
以下の実施例においては、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）（配列番号１９）をコードするポリヌクレオチドを、ＡＰＥＴＡＬ３遺伝子と結合し、さらに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流につないで、組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
【０１２３】
（１）植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２の構築
クローンテック社製（Clontech 社、USA）のプラスミドｐ３５Ｓ−ＧＦＰを制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨIで切断し、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し回収した。
【０１２４】
米国ミシガン州立大学より譲渡された植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ−ＨＹＧ（Becker, D. 1990 Nucleic Acid Research, 18:203）を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＳｓｔIとで切断し、アガロースゲル電気泳動によってＧＵＳ遺伝子を除いたＤＮＡ断片を得た。
【０１２５】
以下の配列を有するＤＮＡを合成し、７０℃で１０分、加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。このＤＮＡ断片は、５’末端から、ＢａｍＨI制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、制限酵素部位ＳｍａI、および制限酵素部位ＳａｌIとＳｓｔＩとをこの順に有する。
5'-GATCCACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACAGATCCCGGGGGTACCGTCGACGAGCT-3'（配列番号５９）
5'-CGTCGACGGTACCCCCGGGATCTGTAATTGTAATGTTGTTTGTTGTTTGTTGTTGTTGGTAATTGTG-（配列番号６０）
次に、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター領域を含むＤＮＡ断片と、合成した２本鎖ＤＮＡとを、ＧＵＳ遺伝子を除いたｐＢＩＧ−ＨＹＧのＨｉｎｄIII、ＳｓｔI部位に挿入し、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧ２を得た。
【０１２６】
（２）組換え発現ベクターｐＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸの構築
＜ＡＰＥＴＡＬ３ｃＤＮＡの単離＞
シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーより、以下のプライマーを用いて終止コドンを除くＡＰＥＴＡＬ３のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲを用いて増幅し、アガロースゲル電気泳動により分離し回収した。ＰＣＲの条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして２５サイクル行った。
5’プライマー
5’- GATGGCGAGAGGGAAGATCCAGATCAAG - 3’（配列番号５７）
3’プライマー
5’- TTCAAGAAGATGGAAGGTAATGATG - 3’（配列番号５８）
ＡＰＥＴＡＬ３遺伝子のｃＤＮＡおよびコードするアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および１に示す。
【０１２７】
＜転写抑制転換ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードするポリヌクレオチドの合成＞
１２アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンTAAを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分、加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
5’-CTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAAG-3’（配列番号５５）
5’-CTTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAG-3’（配列場号５６）
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記で得たＡＰＥＴＡＬ３遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むＤＮＡ断片と転写抑制転換ペプチドＳＲＤＸのコード領域を含むＤＮＡ断片とを、制限酵素ＳｍａIで切断した上記ｐＢＩＧ２に挿入し、順方向にクローニングされているものを単離し、組換え発現ベクターであるプラスミドｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸを得た。
【０１２８】
（３）組換え発現ベクターｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸにより形質転換した植物体の作成
ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸによるシロイヌナズナの形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸを、土壌細菌Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (C58C1Rifr) pMP90 (Gmr)(koncz and Schell 1986)株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Infiltration medium、下表２）に懸濁した。
【０１２９】
【表２】
2005192483.tif 000003
【０１３０】
この溶液に、１４日間生育したシロイヌナズナを１分間浸し、感染させた後、再び生育させて結種させた。回収した種子を５０％ブリーチ、０．０２％Triton X-100溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
【０１３１】
【表３】
2005192483.tif 000004
【０１３２】
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体を選抜し、成長させた。このようにして、ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸで形質転換された、成長した植物体を１５ライン取得した。植物体の一例を図１に示す。
【０１３３】
図１（ａ）に示すように、ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸで形質転換された植物体では、全ての花器において、花弁と雄ずいが形成されていないかった。その一方で、雌ずいは正常に形成されていた。
【０１３４】
また、図１（ｂ）に示す、植物体の拡大図からわかるように、花器では、雌しべの柱頭が露出し、花弁と雄ずいが欠損していた。さらに、図１（ｃ）に示す花器の拡大図からわかるように、花弁および雄ずいが明白に欠損していた。このような花器の正常でない形状は、ＡＰＥＴＡＬ３遺伝子の変異株における花器の形状と、同一なものであった。なお、以上の結果は、得られた１５ラインの形質転換植物体の全てにおいて、同様なものであった。
【０１３５】
このように、ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、萼および雄ずいが欠損した、正常な花粉形成が行われない変異体であった。なお、この植物体の雌しべに、野生型の植物体の花粉を授粉すると、種子が形成された。このことから、ｐ３５Ｓ::ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸで形質転換された植物体は、雌ずいが稔性を有した雄性不稔体であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明によれば、正常な花粉形成が行われないが、雌ずいは稔性を有している、いわゆる雄性不稔植物体を、広範囲の植物で生産できる。それゆえ、本発明は、各種農業や林業、アグリビジネス、さらには農産物を加工する産業や食品産業等に利用可能であり、しかも非常に有用であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】実施例で組換え発現ベクターｐ３５Ｓ：：ＡＰＥＴＡＬ３ＳＲＤＸにより形質転換されたシロイヌナズナの成長した植物体を示す図であり、（ａ）は植物体の全体を示す図、（ｂ）は植物体の先端を拡大した図、（ｃ）は花器を拡大した図である。
【図１】
2005192483.tif 000005
【配列表】
2005192483000001.app