(57)【要約】【課題】葉緑体ＮＤＨ活性を欠く変異体を提供すること、並びに前記変異体の原因遺伝子および当該遺伝子にコードされるタンパク質を提供すること。【解決手段】シロイヌナズナ（野生型）に変異原処理を行ない、変異原処理したシロイヌナズナ（野生型）の次世代の中から、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した個体を選抜することにより得られる、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有するシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４、並びに前記変異体の原因遺伝子である配列番号１に記載のＣＲＲ４遺伝子およびＣＲＲ４遺伝子にコードされる配列番号２に記載のＣＲＲ４タンパク質。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シロイヌナズナ（野生型）に変異原処理を行ない、変異原処理したシロイヌナズナ（野生型）の次世代の中から、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した個体を選抜することにより得られる、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有するシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
【請求項２】
シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した、シロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
【請求項３】
シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基にミスセンス変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
【請求項４】
シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基にナンセンス変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
【請求項５】
シロイヌナズナ（野生型）が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＣＲＲ４ゲノム遺伝子に有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（Ａ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２７３番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｂ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１１９０番目の塩基ＣがＴに置換した変異；
（Ｃ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２３５番目の塩基ＧがＡに置換した変異；および
（Ｄ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１３８４番目の塩基ＧがＡに置換した変異。
【請求項６】
以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
【請求項８】
以下の（ｃ）または（ｄ）の何れかの遺伝子。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項７または８に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項７または８に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ゲノムにコードされる遺伝情報を転写後にＲＮＡレベルで編集する機能を有する因子に関する。すなわち、本発明は、ＲＮＡ編集（ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ）機能を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子に関する。本発明の因子は、ゲノムの改変を伴わずに、転写により発現した遺伝情報を改変することが可能であるため、該因子を利用して、ＲＮＡ編集を人為的に制御可能にすることが期待される。
【０００２】
【従来の技術】
植物は、光を受けて光合成を行う。植物にとって光は、光合成を駆動するエネルギーであると同時に、それが過剰になると有害な活性酸素がつくられ、植物に光障害をもたらす。この光の効果の二面性に対応するために、植物は、光強度を認識し、光受容量を調節するためのさまざまな機構を有している。すなわち、弱光下で最大光合成活性を引き出し、強光下で逆に光合成活性を低下させ、過剰な光エネルギーを安全に捨てる機構を植物は有している。より具体的には、シロイヌナズナの野生株が、強光照射に反応して光受容量を調節し、過剰な光エネルギーの受容を回避することが報告されている。
【０００３】
また、このような過剰な光エネルギーの受容回避機構が機能しない変異株を用いて、この機構に関与する因子が報告されている。具体的には、過剰な光エネルギーを安全に捨てることにより活性酸素の発生を防ぐ葉緑体内の因子として、ＮＰＱ１（ｎｏｎ−ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  １）およびＮＰＱ４が報告されている（非特許文献１および非特許文献２）。また、これら因子の機能を制御する因子として、ＰＧＲ５（非特許文献３）や葉緑体ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（以下、葉緑体ＮＤＨあるいはＮＤＨという）（非特許文献４）が報告されている。
【０００４】
葉緑体ＮＤＨは、タバコ葉緑体形質転換を利用したノックアウトにより、光化学系Ｉ循環的電子伝達に関わることが明らかになっている。この電子伝達は、チラコイド膜を介したプロトンの勾配を形成する。これによってもたらされるチラコイドルーメンの酸性化が、ＮＰＱ１、ＮＰＱ４を介し、過剰光エネルギーの受容回避の反応を引き起こすことが報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｎｉｙｏｇｉ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ａ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ，  Ｏ．  （１９９８）．  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，  １１２１−１１３４．
【非特許文献２】
Ｌｉ，  Ｘ．−Ｐ．，  Ｂｊｏｒｋｍａｎ，  Ｏ．，  Ｓｈｉｈ，  Ｃ．，  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ａ．Ｒ．，  Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ，  Ｍ．，  Ｊａｎｎｓｓｏｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｎｉｙｏｇｉ，  Ｋ．Ｋ．  （２０００）．  Ａ  ｐｉｇｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，  ３９１−３９５．
【非特許文献３】
Ｍｕｎｅｋａｇｅ，  Ｙ．，  Ｈｏｊｏ，  Ｍ．，  Ｍｅｕｒｅｒ，  Ｊ．，  Ｅｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｔａｓａｋａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｋａｎａｉ，  Ｔ．  （２００２）  ＰＧＲ５  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｆｌｏｗ  ａｒｏｕｎｄ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  １１０，  ３６１−３７１．
【非特許文献４】
Ｓｈｉｋａｎａｉ，  Ｔ．，  Ｅｎｄｏ，  Ｔ．，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｙ．，  Ａｓａｄａ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｙｏｋｏｔａ，  Ａ．  （１９９８）  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｎｄｈＢ  ｇｅｎｅ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｃｙｃｌｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｆｌｏｗ  ａｒｏｕｎｄ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  ９７０５−９７０９．
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、葉緑体ＮＤＨの活性を指標として、この活性を欠く変異体を提供することを目的とする。また本発明は、前記変異体の原因遺伝子を明らかにすることにより、当該遺伝子を提供すること、並びに当該遺伝子にコードされる特定の機能を有するタンパク質を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、葉緑体ＮＤＨの活性を指標として、この活性を欠く変異株の作製を試み、当該変異株の原因遺伝子を明らかにした。当該遺伝子が、「葉緑体ＮＤＨの一つのサブユニットをコードするＲＮＡの編集に関与する因子」をコードしていることを本発明者らは新たに見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の手段を提供する。
【０００８】
（１）  シロイヌナズナ（野生型）に変異原処理を行ない、変異原処理したシロイヌナズナ（野生型）の次世代の中から、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した個体を選抜することにより得られる、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有するシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（２）  シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した、シロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（３）  シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基にミスセンス変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（４）  シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基にナンセンス変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（５）  シロイヌナズナ（野生型）が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＣＲＲ４ゲノム遺伝子に有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下したシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４。
（Ａ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２７３番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｂ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１１９０番目の塩基ＣがＴに置換した変異；
（Ｃ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２３５番目の塩基ＧがＡに置換した変異；および
（Ｄ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１３８４番目の塩基ＧがＡに置換した変異。
【０００９】
（６）  以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（７）  以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質。
（８）  以下の（ｃ）または（ｄ）の何れかの遺伝子。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９）  （７）または（８）に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１０）  （７）または（８）に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は本発明を説明するためのものであって本発明を限定するためのものではない。
【００１１】
［シロイヌナズナ変異体］
本発明のシロイヌナズナ変異体ｃｒｒ４（以下、変異体ｃｒｒ４ともいう）は、シロイヌナズナ（野生型）に変異原処理を行ない、変異原処理したシロイヌナズナ（野生型）の次世代の中から、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した個体を選抜することにより得られる、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）に変異を有する変異体である。
【００１２】
別の側面に従えば、本発明の変異体ｃｒｒ４は、シロイヌナズナ（野生型）が、配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）に変異を有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した変異体である。なお、本発明の変異体ｃｒｒ４は、低いＮＤＨ活性を有する以外はすべて野生型と同じ性質を有する。
【００１３】
本発明において変異とは、当該変異が、シロイヌナズナ（野生型）が本来有する正常な葉緑体ＮＤＨ複合体の量を低下させ、ＮＤＨ活性を低下させることが可能であれば、任意の変異が含まれる。例えば、少なくとも一の塩基の置換、欠失、付加を意味し、具体的に、変異には、ミスセンス変異およびナンセンス変異が含まれる。ミスセンス変異とは、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、あるアミノ酸を指定するコドンが別のアミノ酸を指定するコドンに置換する変異である。また、ナンセンス変異とは、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、アミノ酸を指定していたコドンが終止コドンに置換する変異である。
【００１４】
本発明で実際に作製された変異体ｃｒｒ４の例は、シロイヌナズナ（野生型）が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＣＲＲ４ゲノム遺伝子に有することにより、シロイヌナズナ（野生型）と比較してＮＤＨ活性が低下した変異体である。
（Ａ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２７３番目の塩基ＧがＡに置換した変異。この変異により、配列番号２に記載のＣＲＲ４タンパク質の４２５番目のグリシンがアルギニンに置換される。
（Ｂ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１１９０番目の塩基ＣがＴに置換した変異。この変異により、配列番号２に記載のＣＲＲ４タンパク質の３９７番目のアラニンがバリンに置換される。
（Ｃ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１２３５番目の塩基ＧがＡに置換した変異。この変異により、配列番号２に記載のＣＲＲ４タンパク質の４１２番目のトリプトファンが終止コドンに置換される。
（Ｄ）配列番号１に記載のＣＲＲ４ゲノム遺伝子の１３８４番目の塩基ＧがＡに置換した変異。この変異により、配列番号２に記載のＣＲＲ４タンパク質の４６２番目のグルタミン酸がリジンに置換される。
【００１５】
前記（Ａ）〜（Ｄ）の変異を有する変異体は、それぞれ、変異体ｃｒｒ４−１、ｃｒｒ４−２、ｃｒｒ４−３、ｃｒｒ４−４と称される。
【００１６】
本発明の変異体ｃｒｒ４の作製に使用されるシロイヌナズナ（野生型）（以下、単に野生型ともいう）は、種子会社：Ｌｅｈｌｅ  ｓｅｅｄｓ  （Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ  ＴＸ  ７８６８１  ＵＳＡ）  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｃｏｍ／  から入手可能である。シロイヌナズナ（野生型）として、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｇｌ１（他の種子の混入を除くためのマーカーとしてｇｌ１が入っている）と称されるものを使用することができる。また、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理を行った野生型種子も同種子会社から購入可能である。シロイヌナズナ（野生型）は、ＮＤＨ活性を有する。なお、ＮＤＨは、本願出願時に基質（電子供与体）が明らかにされていないため、ＮＤＨ活性を定量的に表すことは困難である。
【００１７】
変異体ｃｒｒ４の作製は、まず、シロイヌナズナ（野生型）に変異原処理を施す。変異原処理を施す野生型として、種子、植物体、カルス等を用いることができる。本発明において変異原処理は、公知の手法を用いることができ、変異原として、ＤＮＡの塩基をアルキル化するアルキル化剤等の化学的変異原、紫外線、Ｘ線等のＤＮＡ損傷を起こす電磁波、または放射性物質を用いることができる。あるいは、変異原処理は、公知のアグロバクテリウム感染法により、Ｔ−ＤＮＡの両端に存在する一対の２５塩基対の配列に挟まれた領域のＤＮＡを、野生型のゲノムＤＮＡのランダムな位置に挿入することにより行ってもよい。好ましくは、化学的変異原（例えば、エチルメタンスルホン酸）を０．２〜０．３重量％の濃度で含有する溶液に野生型の種子を１２〜１６時間浸漬することにより、変異原処理を行う。野生型として種子を用いた場合、その後、野生型（種子）を植物体へと成長させる。
【００１８】
次いで、変異原処理した野生型（植物体）を自家受粉し、次世代を作製する。作製された次世代の中から、野生型と比較してＮＤＨ活性が低下した個体（すなわち、変異原処理による変異をホモ接合で有する個体）を選抜する。ここで、「野生型と比較してＮＤＨ活性が低下した」とは、野生型のＮＤＨ活性を１００％としたときの活性が、０〜１０％であることをいい、好ましくは、完全に欠いていることをいう。なお、前述のようにＮＤＨ活性を定量化することは困難であるため、ここでいう活性は、活性に依存するクロロフィル蛍光変化、サブユニットタンパク質の蓄積量から、おおよそ見積もった活性である。
ＮＤＨ活性の測定の仕方の詳細については、後述の実施例を参照されたい。
【００１９】
この段階で選抜された個体は、野生型と比較してＮＤＨ活性が低下した変異体であり、本発明の「変異体ｃｒｒ４」である。本発明では、変異体ｃｒｒ４として４種類の系統（ｃｒｒ４−１、ｃｒｒ４−２、ｃｒｒ４−３、ｃｒｒ４−４）が選抜された。４種類の系統はすべて、同一の遺伝子（以下、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子ともいう）の領域内に変異を有する個体であることが見出された。
【００２０】
なお、４種類の系統でみられるこれら変異は、劣性でメンデル遺伝するため、葉緑体ゲノムにコードされるＮＤＨのサブユニット遺伝子に直接変異が入ったものではない。また、本発明の変異体ｃｒｒ４にＣＲＲ４野生型遺伝子を導入すると、正常なＮＤＨ活性が回復するので、これらの変異は当該遺伝子（ＣＲＲ４ゲノム遺伝子）に存在する変異によると結論付けられる（後述の実施例３参照）。
【００２１】
従って、本発明の変異体ｃｒｒ４の作製は、以下に記載のとおり再現可能である。すなわち、変異原処理した野生型を自家受粉し、得られた次世代のなかから、野生型と比較してＮＤＨ活性が低下した個体を選抜し、好ましくは、選抜された個体が、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子内の塩基配列に変異を有することを確認する。
【００２２】
本発明の変異体ｃｒｒ４は、ＲＮＡ編集のメカニズムを分子レベルで研究する際に有用である。
【００２３】
［ＣＲＲ４遺伝子およびＣＲＲ４遺伝子によりコードされるタンパク質］
本発明では、変異体ｃｒｒ４において変異を起こした原因遺伝子（ＣＲＲ４遺伝子）を、後述の実施例２に記載のとおり同定した。
ＣＲＲ４ゲノム遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。塩基配列およびアミノ酸配列は、変異を有していないものを表示する。
【００２４】
ＣＲＲ４ゲノム遺伝子が変異を有すると、シロイヌナズナ（野生型）は、葉緑体遺伝子ｎｄｈＤのＲＮＡの成熟化（ＲＮＡ編集による翻訳開始コドンの作成）に支障をきたすことが、本発明において明らかになった（実施例４参照）。従って、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子にコードされるタンパク質は、葉緑体遺伝子ｎｄｈＤのｍＲＮＡを編集し、翻訳開始コドンをつくる際に機能していることが本発明において見出された。より具体的には、ＣＲＲ４タンパク質が、葉緑体の特定のＲＮＡの配列を認識し、特定の塩基シトシンをウラシルに置換するＲＮＡ編集に関わることが明らかになった。また、本発明のＣＲＲ４遺伝子は、葉緑体でＲＮＡの成熟化に関与すると考えられるＰＣＭＰファミリーのメンバーをコードしていることが、本発明において見出された。
【００２５】
従って、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子であって、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードしている限り、配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２６】
また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質をコードしている限り、該タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２７】
更に本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質を提供する。前記タンパク質は、ＲＮＡ編集機能を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２８】
［ＣＲＲ４遺伝子を含む組換えベクターおよび形質転換体］
１．組換えベクター
本発明のＣＲＲ４遺伝子を含む組換えベクターは、適切なベクターに本発明のＣＲＲ４遺伝子を挿入することにより得ることができる。本発明のＣＲＲ４遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、たとえば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター並びに植物ウイルスベクターを用いることもできる。ベクターに本発明のＣＲＲ４遺伝子を挿入するには、精製したＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、適切なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２９】
具体的には、後述の実施例に記載のとおり、本発明のＣＲＲ４遺伝子を、ｐＢＩ１０１などのバイナリーベクター内に組み込まれた恒常的カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に挿入することによって作製することができる。
【００３０】
２．形質転換体
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（たとえば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（たとえば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれであってもよい。形質転換に用いられる植物としては、任意の植物が含まれるが、例えば、イネ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単子葉植物、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。
【００３１】
形質転換体の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いることができる。たとえば上記組換えベクターを、通常の形質転換方法、たとえばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に導入することができる。
【００３２】
植物の組織や器官、培養細胞を形質転換の対象として用いた場合には、公知の植物組織培養法を用い、適切な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を投与することによって植物体を再生させることもできる。
【００３３】
本発明のＣＲＲ４遺伝子は、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌等の細菌、酵母、動物細胞、あるいは昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできるが、これらに限定されるものではない。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列から構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３４】
本発明のＣＲＲ４遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。たとえば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＣＲＲ４遺伝子特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって形質転換されたことを確認できる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００３５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１：  ＣＲＲ４劣性変異を有する変異体ｃｒｒ４の作製
シロイヌナズナ（野生型）の種子（６０００個）を、０．３％  エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）溶液に１６時間浸すことにより、変異原処理を行なった。変異体ｃｒｒ４は、変異原処理した種子（Ｍ１種子）の次世代（５０，０００個体）の中から、葉緑体ＮＤＨ活性を指標に単離された。具体的には、葉緑体ＮＤＨ活性は、以下に記載のとおり測定した。
【００３７】
１５分間以上暗馴化させたシロイヌナズナ芽生えに１００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎ  ｍ−２  ｓｅｃ−１の白色光を５分間照射する。白色光照射直後１〜２分間に生じる一過的なクロロフィル蛍光の上昇をＣＣＤカメラあるいはＰＡＭ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙを用いて観察する。この一過的なクロロフィル蛍光の上昇は、ＮＤＨ活性を表す。
【００３８】
測定されたＮＤＨ活性が、野生型を１００とした場合、１０以下である個体（即ち、クロロフィル蛍光がほとんど観察されない個体）を選抜した。ここで選抜された個体が有する性質（低いＮＤＨ活性）が次世代にも安定に遺伝することが確認された後に、変異体ｃｒｒ４と名付けた。本実施例では、４系統の変異体ｃｒｒ４（ｃｒｒ４−１、ｃｒｒ４−２、ｃｒｒ４−３、ｃｒｒ４−４）を選抜した。
【００３９】
更に、変異体ｃｒｒ４のゲノムＤＮＡが、ＣＲＲ４遺伝子に変異を有していることを塩基配列を解析することにより確認した。この確認は、以下に示すプライマーを用いて、ＣＲＲ４遺伝子を増幅することにより行った。ＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物の全塩基配列を決定し、野生型のＣＲＲ４遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と比較した。
５’−ＡＴＡＡＡＣＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号３）
５’−ＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＧＧ−３’（配列番号４）
【００４０】
その結果、変異体ｃｒｒ４−１、ｃｒｒ４−２、ｃｒｒ４−４では、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子のミスセンス変異によるＣＲＲ４タンパク質のアミノ酸置換が生じていた。また変異体ｃｒｒ４−３では、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子のナンセンス変異によるＣＲＲ４タンパク質Ｃ末の脱落が生じていた。４系統とも、このような変異により、ＣＲＲ４タンパク質の機能が減少、あるいは失われていた。
【００４１】
実施例２：ＣＲＲ４遺伝子の単離
各変異体ｃｒｒ４の原因遺伝子ＣＲＲ４は、ポジショナルクローニングにより単離、同定された。
すなわち、変異体ｃｒｒ４−１（エコタイプ；ｃｏｌｕｍｂｉａ）を野生型（エコタイプ；Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ）と交配し、Ｆ２世代でＮＤＨ活性を欠く個体を集めた。これらの個体の染色体を分子マーカーで解析し、ｃｒｒ４遺伝子座が存在するすべてｃｏｌｕｍｂｉａ由来の領域を特定した。さらのこの領域に存在する葉緑体移行シグナルを有する遺伝子の塩基配列をｃｒｒ４−１〜ｃｒｒ４−４で決定し、これら遺伝子の塩基配列を野生型と比較した。これにより、原因遺伝子ＣＲＲ４が、単離、同定された。
【００４２】
実施例３：変異体ｃｒｒ４においてＮＤＨ活性を回復させた実験
変異体ｃｒｒ４−１およびｃｒｒ４−２に、野生型ＣＲＲ４遺伝子のゲノム配列を導入したところ、ＮＤＨ活性は回復した。
【００４３】
まず、野生型ＣＲＲ４遺伝子のクローニングは、以下のとおり行った。野生型ＣＲＲ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プライマー：５’−ＣＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲにより調製した。調製されたＰＣＲ産物をＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩで切断後、ベクターｐＢＩＮ１９にクローニングした。結果として下記配列番号７、８の間の配列がクローン化された。
【００４４】
このようにして、ＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＴＴ（配列番号７）及びＣＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号８）で挟まれる３．８ｋｂのシロイヌナズナのゲノム断片（ＣＲＲ４ゲノム遺伝子の配列とその上流１．７ｋｂ及び下流０．３ｋｂを含む）を、ベクターｐＢＩＮ１９にクローニングし、アグロバクテリウムＭＰ９０を介して、変異体ｃｒｒ４−１及びｃｒｒ４−２それぞれに形質転換した。形質転換体はカナマイシン耐性を指標に選抜した。カナマイシン耐性を有する形質転換体において、ＮＤＨ活性は回復していた。ここで、ＣＲＲ４ゲノム遺伝子を含む３．８ｋｂのゲノム断片は、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより調製された。
【００４５】
また、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターでＣＲＲ４を発現するベクターを、ｃｒｒ４−１およびｃｒｒ４−２に導入した場合も、ＮＤＨ活性は回復した。
以上の結果から、本発明の変異体は、ＣＲＲ４遺伝子に変異が有するものであることが証明された。
【００４６】
実施例４：ＣＲＲ４タンパク質がＲＮＡ編集に関与していることを確認した実験
本発明においてＣＲＲ４遺伝子は、葉緑体でＲＮＡの成熟化に関与すると考えられるＰＣＭＰファミリーのメンバーをコードしていることが見出されている。変異体ｃｒｒ４は、葉緑体ＮＤＨ活性を特異的に欠き、ＮＤＨのサブユニットをコードする１１の葉緑体のＲＮＡ  の成熟化にダメージを受けていると考えられる。
【００４７】
そこで、変異体ｃｒｒ４−１〜ｃｒｒ４−４からそれぞれＲＮＡを抽出し、１１のＮＤＨサブユニット遺伝子をプローブにノザン解析を行ったが、野生型との差は見られなかった。そこでＲＮＡ  編集が報告されているｎｄｈＢ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ（ＮＤＨ複合体のサブユニットコードする遺伝子）のＲＮＡ  配列を、ＲＴ−ＰＣＲ産物を直接シークエンスすることで調べた。
【００４８】
ｎｄｈＢ、ｎｄｈＤ、ｎｄｈＦ（ＮＤＨ複合体のサブユニットコードする遺伝子）の転写産物であるＲＮＡを増幅するために、以下のプライマーを使用した。
（ｎｄｈＢ  ５’側）：５’−ＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＡＡＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１０）；
（ｎｄｈＢ  ３’側）：５’−ＣＧＴＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１１）及び５’−ＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＡＡＴＣＧ−３’（配列番号１２）；
（ｎｄｈＤ）：５’−ＴＴＧＡＧＴＡＣＧＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１３）及び５’−ＡＡＴＡＧＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号１４）；
（ｎｄｈＦ）：５’−ＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＡＧＣＡＴＴＣＧＣＴＧＣＡＡＴＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号１６）
【００４９】
その結果、すべての変異株において、唯一ｎｄｈＤの翻訳開始コドンを作るＲＮＡ編集が、完全に阻害されていることが明らかになった。
野生型でみられる、ＲＮＡ編集後のｎｄｈＤ  のコード領域のＲＮＡ配列を、配列番号１７に示す。配列番号１７のＲＮＡ配列において、２番目のウラシル（Ｕ）は、シトシン（Ｃ）がＲＮＡ編集により置換された塩基である。一方、変異体ｃｒｒ４では、このＲＮＡ編集が起こらないため、２番目のウラシル（Ｕ）はシトシン（Ｃ）のままである。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明は、ＮＤＨ活性を欠く変異体ｃｒｒ４を提供する。本発明の変異体ｃｒｒ４の原因遺伝子がコードするタンパク質は、ＲＮＡ編集機能を有することが、本発明において新たに見出された。従って本発明は、ＲＮＡ編集機能を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子を提供する。
本発明の変異体および遺伝子を利用して、ＲＮＡ編集の研究をすすめることにより、ＲＮＡ編集を人為的に制御することが期待される。また、将来的には、発現した遺伝情報を、ＲＮＡ編集により転写後に改変し、癌細胞の特異的な殺傷や遺伝病治療に利用することが期待される。
【００５１】
【配列表】
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