(57)【要約】【課題】            本発明の課題は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された酵素反応用反応器であって、効率的（高精度）な酵素反応を実現しうる反応器、及び、該反応器のうち、迅速な酵素反応が可能なマイクロ流体デバイスの簡便な製造方法を提供すること。【解決手段】        本発明は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器であって、該接触面の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持している酵素反応用反応器、及び、少なくとも一方が微少な深さの凹部を有する２つの部材のうちの少なくとも一方の、酵素反応の反応成分との接触面となす部位の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持させ、該部材同士を保持面を内側にして固着することにより、微細な流路を有するマイクロ流体デバイスの製造方法を提供する。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器であって、該接触面の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持していることを特徴とする酵素反応用反応器。
【請求項２】
前記酵素反応阻害抑制成分が界面活性剤、ポリペプチド及び多価アルコールの少なくとも一つである請求項１記載の酵素反応用反応器。
【請求項３】
前記界面活性剤がノニオン性界面活性剤であり、前記ポリペプチドがアルブミンであり、前記多価アルコールがグリセロールである請求項２記載の酵素反応用反応器。
【請求項４】
前記アルブミンが、ウシ血清アルブミン、ラクトアルブミン又はヒト血清アルブミンである請求項３記載の酵素反応用反応器。
【請求項５】
前記酵素反応用反応器が、内部に微細な流路を有するマイクロ流体デバイスである請求項１記載の酵素反応用反応器。
【請求項６】
前記酵素反応の反応成分と、前記活性エネルギー線硬化樹脂との接触面に、前記酵素反応阻害抑制成分が保持されている請求項１記載の酵素反応用反応器。
【請求項７】
前記酵素反応が核酸増幅反応である請求項１〜６のいずれかの請求項に記載の酵素反応用反応器。
【請求項８】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である請求項７記載の酵素反応用反応器。
【請求項９】
少なくとも一方が微少な深さの凹部を有する２つの部材のうちの少なくとも一方の、酵素反応の反応成分との接触面となす部位の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持させ、該部材同士を保持面を内側にして固着することにより、微細な流路を有するマイクロ流体デバイスを作製することを特徴とする請求項５に記載の酵素反応用反応器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応用の反応器およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（酵素反応器）
酵素反応は従来、ガラス製のフラスコや試験管あるいはプラスチック（活性エネルギー線硬化樹脂でない）製サンプルチューブ等の反応器で行われることが多かった。一方、活性エネルギー線硬化樹脂で構成された反応器は成形が容易で耐衝撃性に優れ、機械的強度にも優れているため、一般的形状の反応器に加え、任意の酵素反応を効率的に進めるのに特化した特殊形状の反応器として使用されることがあった。
【０００３】
（核酸増幅用反応器）
以下、酵素反応の一つである核酸増幅反応を例にとって述べる。代表的な核酸増幅反応であるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ポリメラーゼ連鎖反応）には従来、反応器としてポリプロピレン製やポリカーボネート製のサンプルチューブが用いられてきた。これに対し、より効率的に該反応を行うことができる反応器としてマイクロ流体デバイスやキャピラリーを用いたフロースルーＰＣＲ法が報告されている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。この方法は例えば図１に示したように、独立した複数のヒートブロックを各設定温度に調節し、これらを並べた上にマイクロ流体デバイスを密着させ、マイクロ流体デバイス内部の微細流路に反応液を流す方法である。
マイクロ流体デバイスの材質として当初用いられていたのは、ガラスあるいはガラスとシリコンゴムとを貼り合わせたものであった。しかし、これらのデバイス作製プロセスにはガラスの切削工程、高温高圧下で長時間かけてガラスを貼り合わせる工程、あるいはシリコンゴムの鋳型を作製する工程などが必要であり、手間やコストがかかっていた。更に、ガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスの場合には、その流路に高圧を加えるとガラスとシリコンゴムとがしばしば剥離してしまっていた。
そこで、成形が容易かつ耐衝撃性及び機械的強度に優れた活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスが提案された（例えば、特許文献２参照）。活性エネルギー線硬化樹脂は薄膜でも高い耐衝撃性を保持しているため、ヒートブロックと接触させるデバイス面の膜厚を薄く（３０μｍ程度）して熱伝導効率を高めることも可能であるし、内外圧により破損することも少ない。また、該活性エネルギー線硬化樹脂で構成されたマイクロ流体デバイスの作製においては、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術を利用することによって容易に微細な溝や流路を成形できるため特別な鋳型を必要とせず、手間やコストを省くことができ、また流路デザインも都度容易に変更可能という利点があった。
【０００４】
（酵素反応（核酸増幅反応）阻害と阻害抑制成分）
ところで、酵素反応の一例であり、最も代表的な核酸増幅反応であるＰＣＲは、増幅しようとする核酸を含む試料として例えば血液、唾液、体細胞のような生体試料を供した場合など、試料由来の夾雑物が反応液中に混在すると反応が強く阻害されることが広く知られている。そのため一般的には、核酸を含む試料に対してフェノール・クロロホルム抽出法などの夾雑物除去処理を施して核酸を精製した後、これをテンプレートとしてＰＣＲに用いるという工程が採用されている。
該核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、即ち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として、生体試料を含む反応液に界面活性剤またはアルブミン等を添加する核酸増幅法が提案されている（例えば、特許文献３および４参照）。しかしながら、該手法は主として生体試料由来の阻害因子に対してこれを抑制することを想定した手段であった。
【０００５】
【特許文献１】特開平０７−０７５５４４
【特許文献２】特開２００２−５８４７０
【特許文献３】特開２００１−００８６８５
【特許文献４】特開平１０−０８０２７９
【非特許文献１】マーティン  ユー  コップ、アンドリュー  ジェイ  ド  メロー、アンドレアス  マンツ（Martin U. Kopp, Andrew J. de Mello, Andreas Manz），「サイエンス（SCIENCE）」，１９９８年，第２８０巻，Ｐ．１０４６−１０４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された酵素反応用反応器を用いる酵素反応の例として、活性エネルギー線硬化樹脂からなるマイクロ流体デバイスを用いたフロースルーＰＣＲ法が既に提案されていたものの、本発明者らがそのマイクロ流体デバイスを用いてＰＣＲを行ったところ特異的増幅量が少なく、また非特異的増幅が多く発生することが分かり、酵素反応として必ずしも満足のいく精度ではなかった。そのため、高精度（高効率）な酵素反応を実現しうる活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器が切望されるに至った。
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された酵素反応用反応器であって、効率的（高精度）な酵素反応を実現しうる反応器を提供することにある。
また酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成され、迅速な酵素反応が可能なマイクロ流体デバイスの簡便な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、従来から用いられてきたポリプロピレン製あるいはポリカーボネート製のサンプルチューブ、及びガラス製あるいはガラスとシリコンゴムを貼り合わせたマイクロ流体デバイスでは見られなかった酵素反応（核酸増幅反応）阻害が、前記反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器を用いた場合には生じることを見いだした。その原因は未だ不明であるが、活性エネルギー線硬化樹脂中の残存モノマー、重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤、溶剤等のいずれかの成分が、反応液を加えた際に反応液中に溶出して酵素反応阻害を引き起こしてしまうのではないかと考えられた。
そこで上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、酵素反応阻害抑制成分を保持させた反応器を用いることで酵素反応時の阻害を抑制できること、例えばＰＣＲにおいては非特異的増幅を抑えた高精度な核酸増幅が可能となることを見出し、課題解決に至った。
【０００９】
すなわち本発明は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器であって、該接触面の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持している酵素反応用反応器を提供する。
【００１０】
また、少なくとも一方が微少な深さの凹部を有する２つの部材のうちの少なくとも一方の、酵素反応の反応成分との接触面となす部位の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持させ、該部材同士を保持面を内側にして固着することにより、微細な流路を有するマイクロ流体デバイスを作製するという酵素反応用反応器の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の酵素反応用反応器は、活性エネルギー線硬化樹脂に起因する酵素反応阻害を抑えることができ、特に核酸増幅の酵素反応において非特異的増幅を抑え高精度の核酸増幅を可能にする。更に本発明の酵素反応用反応器がマイクロ流体デバイスである場合には、迅速な酵素反応、例えば酵素反応が核酸増幅である場合には迅速な核酸増幅が可能である。また、本発明の製造方法によれば、酵素反応阻害抑制成分を反応器に容易に保持させることができるため、上記酵素反応用反応器を簡便に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器であって、該接触面の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持していることを特徴とする酵素反応用反応器である。
【００１３】
（反応器）
本発明において反応器とは、例えばサンプルチューブ等の反応容器や、微細な流路を内部に有するデバイス、所謂、マイクロ流体デバイスなどの反応流路を有する反応機器など、化学反応や生化学反応を行うことのできる反応容器、反応器具、反応機器などを指す。このうち、迅速な核酸増幅が可能なフロースルーＰＣＲに適した反応器として、マイクロ流体デバイスが挙げられる。
【００１４】
（マイクロ流体デバイス）
本発明におけるマイクロ流体デバイスとしては、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラボ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）などと呼ばれるものが挙げられる。すなわちマイクロ流体デバイスは内部に微細な流路を有し、該流路内に流体が温度変化をうける機構、濃度調整される機構、化学反応をうける機構、流動の流速、流動の分岐、混合若しくは分離などの制御をうける機構、又は電気的、光学的な測定をうける機構等を有する化学、生化学反応用の反応機器を指す。
【００１５】
本発明のマイクロ流体デバイスの形状や寸法、及び流路断面の形状や寸法等は従来公知と同じ範囲であれば特に限定されるものではなく任意である。例えば、本発明のマイクロ流体デバイスの形状としては、板状、シート状、フィルム状、ロール状、方形、円形、球形などが挙げられる。該マイクロ流体デバイスの厚さも特に限定されないが、例えば、フロースルーＰＣＲに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では温度をかける際の調節精度の観点から、ヒートブロック接触面と流路までを含めた部材の厚みを１０μｍ〜５ｍｍとすることが好ましく、１０μｍ〜３ｍｍとすることがより好ましい。また、流路の形状は直線、ジグザグ、波型などが挙げられる。流路の断面の寸法は、例えば、フロースルーＰＣＲに用いる場合には各ヒートブロックに相対する部分では、熱伝導度及び反応液の位相速度の観点から０．２５μｍ２〜９ｍｍ２程度であることが好ましく、さらに、１μｍ２〜１ｍｍ２程度であることがより好ましい。断面形状は矩形、スリット状、台形、円形、半円形などが挙げられる。
【００１６】
（反応器を構成する材料）
本発明の酵素反応用反応器（以下、単に反応器と言うことがある）は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されたものであれば、接触面はもとより反応器の一部が活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料により構成されていてもよい。活性エネルギー線硬化樹脂以外の材料としては、活性エネルギー線硬化樹脂以外の樹脂、金属、ガラス、セラミックなど従来公知のもとであれば任意のものが挙げられる。ただし、本発明の反応器が微細な流路を有するマイクロ流体デバイスの場合、酵素反応の反応成分との接触面、すなわち流路はフォトリソグラフィー技術が適用可能な活性エネルギー線硬化樹脂により構成されていることが好ましい。
【００１７】
（活性エネルギー線硬化樹脂）
本発明で用いる活性エネルギー線硬化樹脂は、活性エネルギー線硬化性樹脂組成物を、重合開始剤の存在下、あるいは非存在下で活性エネルギー線により硬化して得られる。
本発明で使用する活性エネルギー線硬化性樹脂組成物には、公知慣用の重合性モノマーを使用することができるが、なかでも、重合性基を２個以上有する多官能モノマーを使用することが好ましい。重合性基としては、（メタ）アクリロイル基、ビニルオキシ基、エポキシ基、アクリルアミド基、マレイミド基等が挙げられるが、中でも、反応性の高い（メタ）アクリロイル基、ビニルオキシ基や、光重合開始剤の不存在下でも硬化するマレイミド基などが特に好ましい。該重合性化合物は単独で、あるいは二種以上を混合して使用することができる。活性エネルギー線硬化性の組成物には、光重合開始剤、重合遅延剤、重合禁止剤などを添加してもよい。
【００１８】
（活性エネルギー線）
照射する活性エネルギー線としては、紫外線、可視光線、赤外線、レーザー光線、放射光などの光線；エックス線、ガンマ線、放射線などの電離放射線；電子線、イオンビーム、ベータ線、重粒子線などの粒子線が挙げられる。これらの中でも、取り扱い性や硬化速度の面から紫外線及び可視光が好ましく、紫外線が特に好ましい。硬化速度を速め、硬化を完全に行う目的で、活性エネルギー線の照射を低酸素濃度雰囲気で行うことが好ましい。低酸素濃度雰囲気としては、窒素気流中、二酸化炭素気流中、アルゴン気流中、真空又は減圧雰囲気中が好ましい。
【００１９】
（酵素反応阻害抑制成分の保持方法）
本発明に用いる酵素反応阻害抑制成分は、酵素反応の反応成分との接触面の少なくとも一部に保持されており、反応液が接触する際、反応液と混和しうる状態となっていればよい。ここで本発明において「酵素反応の反応成分との接触面」とは、酵素反応の反応成分と接触しうる反応器の内面全体を指し、特に、反応器が内部に微細な流路を有するマイクロ流体デバイスの場合には、流路内面全体を指す。また、本発明における「保持」とは、反応器に酵素反応阻害抑制成分が化学的または物理吸着的に付着している状態、もしくは反応器に付着していない場合でも反応器内に酵素反応阻害抑制成分の貯蔵室などを設け、該成分を留保させた状態を指すものとする。但し、簡便な方法であることから物理吸着的に反応器に付着させることが好ましい。従って、マイクロ流体デバイスに貯蔵室を設けるには、(1)反応液が通過する際に反応液と混和するよう反応液が通過する流路の途上に形成する方法や、(2)反応液が通過する流路の途上以外の場所に設け、流路により反応液が通過する流路と接続するよう形成する方法などが挙げられる。なお、(2)の場合には、貯蔵室内にある酵素反応阻害抑制成分を空気やバッファーなどで反応液が通過する流路へ移動させればよい。
【００２０】
また、活性エネルギー線硬化樹脂から溶出した成分等が酵素反応阻害の要因となっていると考えられることから、反応器と酵素反応の反応成分との接触面のうち活性エネルギー線硬化樹脂により構成された表面に、酵素反応阻害抑制成分が保持されていることが好ましい。
【００２１】
具体的には、反応器がサンプルチューブ等の反応容器の場合には、予め前記酵素反応阻害抑制成分を溶媒に溶解させて溶液とし、該溶液を反応成分との接触面の一部若しくは全体に塗工した後、適宜乾燥させ、付着させておく方法などが挙げられる。
【００２２】
また、反応器がマイクロ流体デバイスであれば、(i)予め前記酵素反応阻害抑制成分を溶媒に溶解させて溶液とし、該溶液を反応液に先立って流路に流すことにより流路内壁に付着させる方法や、(ii)該酵素反応阻害抑制成分を留保する貯蔵室を設けておき、反応液が通過する際に該反応液と混和するように保持する方法などが挙げられる。
【００２３】
以下、本発明の酵素反応用反応器がマイクロ流体デバイスである場合の酵素反応阻害抑制成分の保持方法、即ち本発明のマイクロ流体デバイスの製造方法について説明する。まず、通常のマイクロ流体デバイス製造工程は次の通り。
（１）支持体に活性エネルギー線硬化性組成物を塗工して未硬化塗膜を形成する工程、
（２）上記（１）の工程で形成した未硬化塗膜上にフォトマスクをし、その上から活性エネルギー線を照射して流路と成すべき箇所以外の部分を半硬化して半硬化塗膜を形成する工程、
（３）上記（２）の工程で形成された半硬化塗膜から未硬化の組成物を除去して流路となる凹部を露出させる工程、
（４）蓋となる部材と上記（３）の工程で形成された凹部を有する半硬化塗膜とを積層、固着して前記凹部を空洞状の流路を形成する工程、
（５）流路に送液される液体の入口及び出口となる開口部を取り付ける工程。
ここで、酵素反応阻害抑制成分をマイクロ流体デバイスに保持させ、本発明のマイクロ流体デバイスとするためには、例えば上記（１）〜（５）の工程や光造形法など公知慣用の方法によってマイクロ流体デバイスを製造した後、該成分を流路に流し付着させればよい。
【００２４】
また、本発明のマイクロ流体デバイスの製造方法は上記方法に限られるものではなく、少なくとも一方が微少な深さの凹部を有する２つの部材のうちの少なくとも一方の、酵素反応の反応成分との接触面となす部位の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持させ、該部材同士を保持面を内側にして固着することにより、微細な流路を有するマイクロ流体デバイスを作製することもできる。例えば、前記（１）〜（３）工程の後に、凹部を有する半硬化塗膜に酵素反応阻害抑制成分を塗工、塗布、流延するなどの方法で保持させる工程を加え、その後前記（４）、（５）工程を行うことによっても製造することができる。即ち、表面に微少な深さ（０．５〜３０００μｍ程度）の凹部を有する部材（Ａ）および該凹部の蓋となって流路を形成する部材（Ｂ）の少なくとも一方の部材の少なくとも一部に酵素反応阻害抑制成分を保持させ、該部材（Ａ）と部材（Ｂ）とを、酵素反応阻害抑制成分を保持した面を内側にして固着することにより、酵素反応阻害抑制成分を流路に保持したマイクロ流体デバイスを製造することができる。
【００２５】
（酵素反応阻害抑制成分）
本発明の発明者らは、酵素反応の反応成分が反応器の活性エネルギー線硬化樹脂により構成された部分と接することにより、酵素反応の阻害が起こることを見いだした。特に酵素反応が核酸増幅反応である場合には、核酸が増幅しない、あるいは企図しない非特異的な増幅が起こるなどの問題が生じる場合があった。
本発明において酵素反応阻害抑制成分とは、反応器の活性エネルギー線硬化樹脂に起因する酵素反応阻害を抑制することができる成分を指す。具体的には、界面活性剤、ポリペプチド及び多価アルコールが挙げられる。
既述したように、従来から核酸精製工程を省略するため、生体試料そのままから直接、すなわち夾雑物を多く含んだ反応系での核酸増幅を可能とする手法として界面活性剤又はアルブミンを添加して核酸増幅を行う方法が知られていた。しかしながら、これは血液等の動物体液中の蛋白質や糖、色素などの生体試料に起因する酵素阻害因子を抑制するものであって、活性エネルギー線硬化樹脂に起因する阻害因子との関連性は全くなかった。従って、活性エネルギー線硬化樹脂により構成された反応器で酵素反応を行った場合に酵素阻害が起こることを連想させるものではなく、さらに、このような反応器で酵素反応を行った場合に、界面活性剤やアルブミンが活性エネルギー線硬化樹脂に起因する酵素阻害因子に対して抑制効果があることを連想させるものでもなかった。
【００２６】
（ポリペプチド）
本発明において核酸増幅反応阻害抑制成分として用いることができるポリペプチドとしては、アルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチンなどが挙げられ、このうちアルブミンが好ましく挙げられる。さらにアルブミンとしては特にその種類は限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と言うことがある）やラクトアルブミンやヒト血清アルブミンなどが好ましいものとして挙げられる。アルブミン含有率が高く、これを分解する酵素を含んでいないことから和光純薬社製「アルブミン  プロテアーゼ不含（ウシ血清由来）」が好ましいものとして例示される。
【００２７】
ポリペプチドを反応液に先立って反応容器に付着もしくはマイクロ流体デバイスの流路に流す場合は、濃度が０．１質量％〜１０質量％となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。ポリペプチドを保持させる必要量は、保持させる方法、反応液の量、流速、温度によっても影響を受けるため一概には言えないが、反応容器の内壁または流路壁面積１ｍｍ２あたり１ｎｇ〜２０μｇとすることが好ましい。また、ポリペプチドを流路の一部に保持しておき、反応液が通過する際に該反応液と混和するようにしても良い。その場合には、反応液中のポリペプチド濃度が０．０１質量％〜５質量％となるよう考慮された保持量及び濃度としておけば良い。また、該ポリペプチドを予め反応液と混合しておき、酵素反応阻害抑制成分が付着した反応器に添加することも可能である。その場合には、反応液中に含まれるポリペプチド濃度が０．０１質量％〜５質量％となるようにすることが好ましい。更に、ポリペプチドは下記多価アルコールや界面活性剤と併用することも可能である。
【００２８】
（多価アルコール）
本発明において酵素反応阻害抑制成分として用いることができる多価アルコールとしては、グリセロール、エチレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられ、このうちグリセロールが好ましく挙げられる。
【００２９】
多価アルコールを反応液に先立って反応容器に付着もしくはマイクロ流体デバイスの流路に流す場合は、濃度が５質量％〜５０質量％となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。多価アルコールを保持させる必要量は、保持させる方法、反応液の量、流速、温度によっても影響を受けるため一概には言えないが、反応容器の内壁もしくは流路壁面積１ｍｍ２あたり１ｎｇ〜１００μｇとすることが好ましい。また、多価アルコールを流路の一部に保持しておき、反応液が通過する際に該反応液と混和するようにしても良い。その場合には、反応液中の多価アルコール濃度が５質量％〜３０質量％となるよう考慮された保持量及び濃度としておけば良い。また、該多価アルコールを予め反応液と混合しておき、酵素反応阻害抑制成分が付着した反応器に添加することも可能である。その場合には、反応液中に含まれる多価アルコール濃度が５質量％〜３０質量％となるようにすることが好ましく、特に１０質量％〜２０質量％が好ましい。更に、多価アルコールは上記ポリペプチドや下記界面活性剤と併用することも可能である。
【００３０】
（界面活性剤）
本発明において核酸増幅反応抑制成分として用いることができる界面活性剤としては特に限定されることなく挙げられるが、具体的には
ノニオン界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレート等のポリオキシエチレンアルキルエステル類、例えばポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ  ９７）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル類、例えばオクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド等のメチルグルカミド誘導体、例えばｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド等のアルキル糖誘導体等）、
アニオン界面活性剤（例えばラウリルベンゼンスルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンドデシルサルフェイト（Ｔｒｉｓ  ＤＳ）等）、
カチオン界面活性剤（例えばオクタデシルアミン酢酸塩，テトラデシルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩、ラウリルアミン酢酸塩、ラウリルジエタノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化オクタデシルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、メチル硫酸アリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ラウリルジメチルベンジルアンモニウム等の第４級アンモニウム塩、例えば塩化ラウリルピリジニウム、塩化ステアリルアミドメチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等）、
両性界面活性剤（例えば３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネイト、３−［（３−コラミドアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネイト等）、
天然の界面活性剤（例えばサポニン（大豆由来）、ジギトニン等）
などの界面活性剤が挙げられるが、反応時の酵素等への影響を考慮すると、中でもノニオン界面活性剤が好ましく挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
界面活性剤を反応液に先立って反応容器に付着もしくはマイクロ流体デバイスの流路に流す場合は、濃度が０．５質量％〜５０質量％となるように溶媒に溶解して用いるのが好ましい。溶媒としては、水や緩衝液などが挙げられ、緩衝液としては例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられる。界面活性剤を保持させる必要量は、保持させる方法、反応液の量、流速、温度によっても影響を受けるため一概には言えないが、反応容器の内壁もしくは流路壁面積１ｍｍ２あたり１ｎｇ〜１００μｇとすることが好ましい。また、界面活性剤を流路の一部に保持しておき、反応液が通過する際に該反応液と混和するようにしても良い。その場合には、反応液中の界面活性剤濃度が０．５質量％〜２５質量％となるよう考慮された保持量及び濃度としておけば良い。また、該界面活性剤を予め反応液と混合しておき、酵素反応阻害抑制成分が付着した反応器に添加することも可能である。その場合には、反応液中に含まれる界面活性剤濃度が０．５質量％〜２５質量％となるようにすることが好ましく、特に５質量％〜２５質量％が好ましい。更に、界面活性剤は上記ポリペプチドや多価アルコールと併用することも可能である。
【００３２】
（反応器の使用方法）
本発明の反応器を用いた酵素反応は、常法に従って行えばよい。例えば、本発明の反応器がサンプルチューブ等の反応容器であり、該反応容器を用いた酵素反応としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う場合は、該反応容器に反応液を加え反応液の温度を２又は３段階の設定温度に各々所望の時間だけ維持するサイクルを繰り返すことにより、反応液中に含まれるテンプレートとプライマーからポリメラーゼ酵素の働きで目的とするヌクレオチド（核酸）断片を増幅すればよい。また、本発明の反応器が、内部に微細な流路を有し、該流路の少なくとも一部が活性エネルギー線硬化樹脂により構成されているマイクロ流体デバイスであり、該反応器を用いた酵素反応がＰＣＲである場合には、該デバイスの流路に反応液を流し、反応液の温度を２又は３段階の設定温度に各々所望の時間だけ維持されるサイクルを繰り返すことにより、目的とするヌクレオチド（核酸）断片を増幅すればよい。
【００３３】
（酵素反応）
本発明の反応器を用いて行う酵素反応としては、いずれの酵素を使った反応であっても良く、特に限定されることはないが、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルカナーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウレアーゼなどを用いた、核酸増幅反応、加水分解反応、酸化還元反応などが挙げられる。このうち、本発明の反応器は核酸増幅反応において特に有効である。
【００３４】
（核酸増幅反応）
本発明において最も代表的な酵素反応である核酸増幅反応に関して更に詳しく述べる。核酸増幅反応にはＰＣＲあるいはその変法、転写を基本とする増幅法など原理の異なる各種核酸増幅法があるが、本発明の反応器は酵素を使った公知慣用のいずれの核酸増幅反応であっても適用可能である。例えば、核酸（テンプレート）、プライマー、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸及び緩衝液を用いた通常のＰＣＲの他に、Nested ＰＣＲ法、インバースＰＣＲ法、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法、degenerate ＰＣＲ法などの各種ＰＣＲの応用法や、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ｇａｐＬＣＲ法、ＳＤＡ法、Ｑβ replicase amplification法、ＴＡＳ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法等に適用可能であり、このうちＰＣＲ法において特に有用である。
【００３５】
（核酸（テンプレート））
前記核酸増幅反応においてテンプレートとして用いる核酸としては、生体由来試料（動物由来（皮膚、毛髪、唾液、血液、尿、糞）、植物由来試料（根、茎、葉、種、果肉、花））および環境試料（土、水、空気）から抽出・精製されたもの、およびそれらをＰＣＲ法等にて一旦増幅したものを使用することが可能である。
【００３６】
（核酸（テンプレート）の精製方法）
増幅しようとする核酸が夾雑物を多く含む生体由来試料等中に存在する場合には、増幅反応に先立って、混在する夾雑物の除去を目的とした核酸精製処理を行う必要がある。具体的な精製方法としては、公知の方法がいずれも使用でき、例えば、フェノール／クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿法が挙げられる。更にイオン交換樹脂、ガラスビーズ等を使用したカラム、ガラスフィルターあるいはタンパク質凝集作用を有する試薬を使用して精製度を上げることができる。より夾雑物濃度を低減するため、複数の方法を同時にまたは順次行うことができる。
【００３７】
また、いわゆるＰＣＲ等の核酸増幅法により既に増幅した核酸や、合成した核酸を使用する場合は、上記のような試料由来の夾雑物がない、若しくは非常に少ないので上記の精製処理を必ずしも行う必要がないこともある。
【００３８】
（核酸（テンプレート）の精製度）
いずれの試料の場合にも代表的な夾雑物としてはタンパク質が挙げられ、核酸増幅反応に供する反応液中に含まれる夾雑物が、タンパク質濃度を測定した場合に０．５ｍｇ／ｍｌ以下に抑制されていることが好ましい。ただし、本発明に用いる酵素反応阻害抑制成分がポリペプチドの場合には、該ポリペプチド自身もタンパク質であるので、ポリペプチドのみを除いた反応液中におけるタンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ以下に抑制されていることが好ましい。
【００３９】
尚、本発明中で示されているタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素結合法に基づく方法（日本バイオラッドラボラトリーズ社製Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ使用）により算出した。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例により説明する。
（実施例１）
（ＢＳＡ含有ＶＨデバイス１の作製）
以下の操作によりマイクロ流体デバイスを作製した。その断面図を図２に示す。上面からの外観は図１を参照。
【００４１】
［活性エネルギー線硬化性組成物（i）の調製］
平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー（大日本インキ化学工業株式会社製の「ユニディックＶ−４２６３」）８０質量部、及び１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「ニューフロンティアＨＤＤＡ」）を２０質量部、光重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン（チバ・スペシャリティ・ケミカルズ社製の「イルガキュア１８４」）５質量部を均一に混合して組成物（i）を調製した。
【００４２】
［活性エネルギー線硬化性組成物（ii）の調製］
活性エネルギー線硬化性化合物として、「ユニディックＶ−４２６３」を６０質量部、「ニューフロンティアＨＤＤＡ」４０質量部、光重合開始剤として「イルガキュア１８４」５質量部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５質量部を均一に混合して組成物（ii）を調製した。
【００４３】
［塗膜層の形成］
下基材（７）としてポリアクリレート製の板（１２ｃｍ×３ｃｍ×１ｍｍ；三菱レイヨン社製の「アクリライトL 000番」）を用い、これに２０００ｒｐｍ、５０秒間条件のスピンコーターにて組成物（i）を塗布した。下記紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射してこれを半硬化させ、厚さ１０μｍの塗膜（８）を形成した。
【００４４】
［凹部（流路）の形成］
塗膜（８）の上に、５００ｒｐｍ、３０秒間のスピンコーターにて組成物（ii）を塗工し、該組成物（ii）の未硬化塗膜を形成した。流路形成部を黒色で描画したフォトマスクを通して下記紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒間行い、組成物（ii）からなる厚さ８０μｍの半硬化塗膜（９）を形成した。非照射部分の未硬化の組成物（ii）をエタノールで除去して、塗膜（８）が底面に露出した幅２００μｍの凹部状の塗膜（９）を形成した。
【００４５】
［ＢＳＡ付着］
塗膜（９）の上から５質量％のＢＳＡ（和光純薬社製「アルブミン  プロテアーゼ不含（ウシ血清由来）」）水溶液を全面に塗布し、１時間室温にて静置した。静置後、余剰の液を５００ｒｐｍ、１０秒間のスピンコーターにて除去し、再び室温静置にて風乾した。
【００４６】
[蓋の固着]
組成物（i）を、一時的な支持体である１２ｃｍ×５ｃｍ×３０μｍのポリプロピレンフィルム（二村化学工業社製の「二軸延伸ポリプロピレンフィルム「太閤」FOR 30番」）のコロナ放電処理された面上に、１２７μｍのバーコーターにて塗工した。該組成物（i）の未硬化塗膜に、紫外線ランプ１により紫外線を３秒照射し、半硬化塗膜（１０）を形成した。これを蓋として前記凹部状塗膜（９）に張り合わせ、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒間照射して完全に硬化させ、流路（１１）を形成した。その後、不要となったポリプロピレンフィルムを剥離し、除去した。
【００４７】
［開口部の形成］
この後、前記工程において凹部に張り合わせ完全に硬化した塗膜（１０）上に組成物（i）を塗布して塗膜（１２）を形成し、さらにその上に上基材（１３）として、下基材（７）と同じポリアクリレート製の板（三菱レイヨン社製の「アクリライトＬ 000番」）を重ね合わせ、紫外線ランプ１により塗膜全面に紫外線を４０秒間照射し、塗膜（１２）を硬化させた。これにより塗膜（１０）上に塗膜（１２）および上基板（１３）が接着一体化された。
【００４８】
次いで、上基板（１３）、塗膜（１２）および塗膜（１０）を通過し流路（１１）に通じる直径１ｍｍの孔を、ドリルを使用して流路の両末端に形成し、さらにこれら２つの孔にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して開口部（５）（６）とした。
【００４９】
［紫外線ランプ１照射条件］
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００５０】
［紫外線ランプ２照射条件］
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００５１】
（実施例２）
（ＢＳＡ含有ＶＨデバイス２の作製）
ＢＳＡの付着処理を開口部の形成工程が終了した後に行った以外は、実施例１と同様の方法にてマイクロ流体デバイスを作製した。但し、ＢＳＡの付着処理は以下の方法にて行った。
５質量％のＢＳＡ水溶液をシリンジを用いて開口部からマイクロ流体デバイスに流し込み、流路全体を該溶液で満たした。この状態で約１時間室温静置することによりＢＳＡを流路内壁に付着させた。その後、同様の手法で空気を送り込み余剰の該溶液を排出した。
【００５２】
（実施例３）
（グリセロール含有ＶＮデバイスの作製）
実施例２と同様の操作を行い、マイクロ流体デバイスを作製した。但し、１，６−ヘキサンジオールジアクリレートの代わりにノニルフェノキシポリエチレングリコールアクリレート（第一工業製薬株式会社製の「Ｎ−１７７Ｅ」）を、ＢＳＡの代わりに５０質量％のグリセロール水溶液を使用した。
【００５３】
（実施例４）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス３の作製）
界面活性剤ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」）を蒸留水で希釈し、２５質量％の水溶液を調製した。ＢＳＡ水溶液の代わりに該水溶液を用いた以外は実施例２と同様の方法にてマイクロ流体デバイスを作製した。
【００５４】
（実施例５）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス４の作製）
実施例４と同様の操作を行い、マイクロ流体デバイスを作製した。但し、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ＩＣＮ社製「Ｔｗｅｅｎ  ２０」）を使用した。
【００５５】
（実施例６）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス５の作製）
実施例４と同様の操作を行い、マイクロ流体デバイスを作製した。但し、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＩＣＮ社製の「Ｔｗｅｅｎ  ８０」）を使用した。
【００５６】
（実施例７）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス６の作製）
実施例４と同様の操作を行い、マイクロ流体デバイスを作製した。但し、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」）の代わりにポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル（ＩＣＮ社製の「ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０」）を使用した。
【００５７】
（調製例１）
（ＰＣＲ用反応液１の調製）
ＤＮＡポリメラーゼとしてジーンタック（株式会社ニッポンジーン製）を使用し、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰ混合液は該酵素に添付のものを使用した。２０μｌのＰＣＲ用緩衝液（１０倍濃縮）、１６μｌのｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ  各２．５ｍＭ）、１０μｌのプライマー（１）（primer (1)）（１０μＭ；配列番号１）、１０μｌのプライマー（２）（primer (2)）（１０μＭ；配列番号２）、１μｌの５ユニット/μｌジーンタック、テンプレートとして２μlのｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙ（１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号３）、さらに滅菌水を加えて２００μｌとし、ＰＣＲ用反応液（１）を調製した。なお、ｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙ（１ｎｇ；タカラバイオ株式会社製；配列番号３）のタンパク質濃度を後述の参考例２により測定したところ０．０ｍｇ／ｍｌであった。
【００５８】
（調製例２）
（ＰＣＲ用反応液２の調製）
調製例１と同様にしてＰＣＲ用反応液（２）を準備した。但し、プライマー（１）及びプライマー（２）の代わりにプライマー(３)(primer (3))（１０μＭ；配列番号４）及びプライマー(４)(primer (4))（１０μＭ；配列番号５）を用いた。
（調製例３）
（ＰＣＲ（Ｃｅｌｌ  ｄｉｒｅｃｔ）用反応液３の調製）
調製例２と同様の方法でＰＣＲ用反応液（３）を準備した。但し、ｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙの代わりに１０μｌの細胞懸濁液を用いた。細胞懸濁液は頬の内側から掻き取ったヒト頬粘膜細胞を蒸留水で洗浄し遠心分離で回収した後、再び蒸留水に懸濁して調製した。なお、前記細胞懸濁液のタンパク質濃度を後述の参考例２により測定したところ１．０ｍｇ／ｍｌであった。
【００５９】
（反応例１）
（ＢＳＡ含有ＶＨデバイス１を用いたＰＣＲ）
実施例１で作製したマイクロ流体デバイスを３つのヒートブロックから成るヒーター上に、図１に示す位置に固定した。ヒートブロック（Ａ）を９０℃、ヒートブロック（Ｂ）を７２℃、ヒートブロック（Ｃ）を５５℃に設定した。
調製例１のＰＣＲ用反応液（１）２５μlをデバイスの開口部（入口）に注入し、さらに該開口部にマイクロシリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＩＣ３２００）を接続し、５μｌ/分にて送液した。これにより、該ＰＣＲ用反応液はヒートブロック（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｂ）、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）・・・という順序でその上を通過した。
反応の結果、核酸が増幅されたことを常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図３）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６０】
（反応例２）
（ＢＳＡ含有ＶＨデバイス２を用いたＰＣＲ）
実施例２で作製したマイクロ流体デバイスを用い、反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図４）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６１】
（反応例３）
（グリセロール含有ＶＮデバイスを用いたＰＣＲ）
実施例３で作製したマイクロ流体デバイスを用い、反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図５）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６２】
（反応例４）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス３を用いたＰＣＲ）
実施例４で作製したマイクロ流体デバイス及び調製例２のＰＣＲ用反応液（２）を用いた以外は反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図６）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６３】
（反応例５）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス４を用いたＰＣＲ）
実施例５で作製したマイクロ流体デバイス及び調製例２のＰＣＲ用反応液（２）を用いた以外は反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図７）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６４】
（反応例６）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス５を用いたＰＣＲ）
実施例６で作製したマイクロ流体デバイス及び調製例２のＰＣＲ用反応液（２）を用いた以外は反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図８）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６５】
（反応例７）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス６を用いたＰＣＲ）
実施例７で作製したマイクロ流体デバイス及び調製例２のＰＣＲ用反応液（２）を用いた以外は反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。結果は常法に従いアガロースゲル電気泳動によって検証した。核酸増幅を示すバンドが検出され（図９）、よって該マイクロ流体デバイスを用いた酵素反応が正常に進行したことが確認された。
【００６６】
（比較例１）
（未処理ＶＨデバイスを用いたＰＣＲ）
ＢＳＡの付着処理を行わなかったこと以外は実施例２と同様にして作製したマイクロ流体デバイスと調製例１のＰＣＲ用反応液（１）２５μlとを用い、反応例１と同様の方法にてＰＣＲ及びその結果解析を行った。バンドは全く検出されず（図１０）、核酸増幅の酵素反応は阻害を受け進行していなかった。
【００６７】
（比較例２）
（未処理ＶＮデバイスを用いたＰＣＲ）
グリセロールの付着処理を行っていないこと以外は実施例３と同様にして作製したマイクロ流体デバイスと調製例１のＰＣＲ用反応液（１）２５μlとを用い、反応例１と同様の方法にてＰＣＲ及びその結果解析を行った。バンドは検出されたものの、その分子量は目的とするものとは異なり（図１１）、核酸増幅の酵素反応は阻害を受け正常に進行していなかった。
【００６８】
（比較例３）
（界面活性剤含有ＶＨデバイス３を用いたＣｅｌｌ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ）
実施例４で作製したマイクロ流体デバイス及び調製例３のＰＣＲ用反応液（３）を用いた以外は反応例１と同様の方法にてＰＣＲを行った。その結果、特異的増幅（１０７ｂｐ）を示すバンドは検出されず（図１２）、核酸増幅の酵素反応は進行しなかったことが判明した。
【００６９】
（参考例１）
（未処理ガラス製マイクロ流体デバイスを用いたＰＣＲ）
本発明で用いる酵素反応阻害抑制成分が付着していないガラス製マイクロ流体デバイスを常法に従って作製した。このガラス製マイクロ流体デバイス及び調製例２のＰＣＲ用反応液（２）２５μlを用いた以外は反応例１と同様にしてＰＣＲを行った。その結果、特異的増幅を示すバンドが検出された（図１３）。これにより、ガラス製マイクロ流体デバイスを用いた場合には、阻害物質溶出などに起因する反応阻害問題は起きず、正常に酵素反応が進行することが確認された。
【００７０】
（参考例２）
（タンパク質濃度測定）
日本バイオラッドラボラトリーズ社製Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを使用して測定した。測定手順は、該キット商品に添付されている説明書４〜６頁（Ｓｅｃｔｉｏｎ２  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ２．１〜２．３）を参考にした。
調製例１記載のｒａｓ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｓｅｔ  ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ  ｃｏｄｏｎ１２  Ｇｌｙ溶液（試料Ａ）は蒸留水で３倍希釈し（試料Ｂ）、Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを参考に測定した。即ち、
１．サンプルチューブに試料Ｂ２０μlとＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ液（薬液Ａ）５μlを加え、撹拌した。
２．室温にて約１０分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて５９５ｎｍの吸収を測定した。
３．同様の操作で予め作成した検量線（標準物質として牛血清アルブミンを使用）を基に試料Ｂのタンパク質濃度を算出した。これを３倍し、試料Ａの値とした。
その結果、試料Ａのタンパク質濃度は０．０ｍｇ／ｍｌと判明した。
調製例３記載の細胞懸濁液（試料Ｃ）は蒸留水で３倍希釈し（試料Ｄ）、Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅで測定した。即ち、
１．Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ液（薬液Ａ）を蒸留水で５倍希釈し、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ＃１）で濾過した（薬液Ｂ）。
２．試験管に前記試料Ｄ１００μlと前記薬液Ｂ５ｍｌを加え、撹拌した。
３．室温にて約１０分間インキュベートした後、その一部を取って分光光度計にて５９５ｎｍの吸収を測定した。
４．同様の操作で予め作成した検量線（標準物質として牛血清アルブミンを使用）を基に試料Ｄのタンパク質濃度を算出した。これを３倍し、試料Ｃの値とした。
その結果、試料Ｃのタンパク質濃度は１．０ｍｇ／ｍｌと判明した。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】マイクロ流体デバイスを用いたフロースルーＰＣＲ法の模式図である。
【図２】実施例１のマイクロ流体デバイスの断面模式図である。
【図３】反応例１で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー（タカラバイオ（株）の20bp DNA Ladder）。
【図４】反応例２で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図５】反応例３で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図６】反応例４で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図７】反応例５で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図８】反応例６で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図９】反応例７で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図１０】比較例１で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図１１】比較例２で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図１２】比較例３で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【図１３】参考例１で行ったＰＣＲの結果をアガロースゲル電気泳動で解析した写真である（右列側）。左列側はマーカー。
【符号の説明】
【００７２】
１  変性温度に設定したヒートブロック（Ａ）
２  伸長反応温度に設定したヒートブロック（Ｂ）
３  アニーリング温度に設定したヒートブロック（Ｃ）
４  マイクロ流体デバイス
５  開口部（入口）
６  開口部（出口）
７  下基材
８，９，１０，１２  塗膜
１１  流路
１３  上基材
【図１】
2005192555.tif 000003
【図２】
2005192555.tif 000004
【図３】
2005192555.tif 000005
【図４】
2005192555.tif 000006
【図５】
2005192555.tif 000007
【図６】
2005192555.tif 000008
【図７】
2005192555.tif 000009
【図８】
2005192555.tif 000010
【図９】
2005192555.tif 000011
【図１０】
2005192555.tif 000012
【図１１】
2005192555.tif 000013
【図１２】
2005192555.tif 000014
【図１３】
2005192555.tif 000015
【配列表】
2005192555000001.app