(57)【要約】【課題】  捕酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を利用できるイソクエン酸脱水素酵素を提供する。【課題を解決するための手段】 デイノコッカス・ラディデュランスよりイソクエン酸脱水素酵素遺伝子を単離するとともに、該遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により、捕酵素としてＮＡＤを利用しうるイソクエン酸脱水素酵素製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する、蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質。
【請求項３】
配列番号２で表されるＤＮＡであることを特徴とする、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養してＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素を製造することを特徴とするＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソクエン酸脱水素酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した形質転換体、および該形質転換体を用いたイソクエン酸脱水素酵素の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソクエン酸脱水素酵素は、マグネシウムなどの二価金属及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）あるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とし、基質イソクエン酸を酸化的に脱炭酸し、２‐オキソグルタル酸、還元型補酵素（ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ）、二酸化炭素、水素イオンを生成する反応を触媒する酵素である。イソクエン酸やマグネシウムイオンの定量等、研究用試薬、臨床診断試薬として使用されている（特許文献１〜３参照）。しかしながら、従来知られているイソクエン酸脱水素酵素は、ＮＡＤＰを補酵素として利用するものが多く、ＮＡＤを用いる場合に比べて高価であり、かつ安定性に欠ける等の問題があった。                  
【特許文献１】特開平９‐２６６７９７号公報
【特許文献２】特開２０００‐１６６５９６号公報
【特許文献３】特開平１１‐３４６７８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記に鑑み、本発明の目的は、ＮＡＤを効率的に利用できるイソクエン酸脱水素酵素を提供するとともに、該酵素を高生産量で生産すべく、その生産手段となるイソクエン酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、該遺伝子ＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換した形質転換体、および該形質転換体を用いたイソクエン酸脱水素酵素の製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、以上のような課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、デイノコッカス・ラディデュランスより、ＮＡＤを効率的に利用できるイソクエン酸脱水素酵素遺伝子を単離・構造決定するとともに、遺伝子工学的手法によりイソクエン酸脱水素酵素の組換え酵素を効率的に生産することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は補酵素としてＮＡＤを効率的に利用できるイソクエン酸脱水素酵素活性を有する新規蛋白質、及びこれをコードする遺伝子に関するものであり、上記課題を解決するための具体的構成は以下の（１）〜（６）に示すとおりである。
（１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する、蛋白質。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質。
（３）配列番号２で表されるＤＮＡであることを特徴とする、上記（２）に記載のＤＮＡ。
（４）上記（２）又は（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）上記（４）に記載の組換えベクターで形質転換した形質転換体。
（６）上記（５）に記載の形質転換体を培養してＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素を製造することを特徴とするＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、新規なイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によるイソクエン酸脱水素酵素の製造法が提供される。
本発明のイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質は、特にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を捕酵素とすることが可能であり、ＮＡＤＰを捕酵素とするものに比べ、安価な試験系を構築でき、例えば生体試料中の金属イオンの定量剤、あるいは該試料中のアンモニアの消去剤等として、臨床試験等において極めて有用な酵素試薬である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質はデイノコッカス・ラディデュランス由来のもので、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるが、この配列番号１で示されるアミノ酸において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であっても、ＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質も本発明に含まれる。
【０００８】
また、本発明のイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質を作製するために使用する遺伝子ＤＮＡは、上記配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡであるか、あるいは該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質を蛋白質コードするＤＮＡであれば、どのような配列であってもよい。
本発明のイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの具体的な塩基配列は、配列番号２に示される。該配列を有する遺伝子ＤＮＡ は、以下の（１）および（２）に示す配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
（１）上流：５’-ＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣ-３’
（２）下流：５’-ＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＧＡＴＧ-３’
デイノコッカス・ラディデュランスの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅し得られたものである。
【０００９】
本発明においては、上述したように配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつイソクエン酸脱水素酵素活性を有する蛋白質を含むが。このような変異酵素蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡは、例えば、配列番号２に示される遺伝子ＤＮＡに、部位特定変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，ｐ６４８７-６５００，１９８２を参照）やランダム変異（例えば、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｖｏｌ．１，ｐ１１-１５，１９８９を参照）等のそれ自体周知の方法を適用することにより得ることができる。
【００１０】
本発明において、イソクエン酸脱水素酵素蛋白質を製造するには、上記したイソクエン酸脱水素酵素蛋白質あるいはその変異蛋白質をコードするＤＮＡを、ベクターに挿入して組み換えベクターを調製する。次いで該組み換えベクターを用いて宿主を形質転換して、得られた形質転換体を培地に培養し、該形質転換体あるいは培養物等の処理物から、定法の蛋白質の採取、精製法を用いて、当該酵素蛋白質を採取、精製することができる。
【００１１】
本発明の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するイソクエン酸脱水素酵素蛋白質は、その特性として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を捕酵素として利用できる点に特徴を有する。また、イソクエン酸、ＮＡＤ、カリウムイオン、マグネシウムイオンに濃度依存的であり、しかもこれらの濃度依存性は比例的でかつ安定性を有するので、これらの定量には極めて有効である。また、特にマグネシウム、イソクエン酸、ＮＡＤ濃度には極めて低濃度でも、活性に影響を生じるから、生体試料中のこれらの定量に適している。
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１２】
〔イソクエン酸脱水素酵素遺伝子のクローニング〕
遺伝子のクローニングは、デイノコッカス・ラディデュランス由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＫＯＤ-ｐｌｕｓ-ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲ増幅により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、上流：５’-ＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＴＴＧＴＣＴＣ-３’、下流：５’-ＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＧＡＴＧ-３’である。増幅反応は、９４℃で２分間保温後、９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １分からなる温度サイクルを２５回繰り返すことにより行った。
【００１３】
〔イソクエン酸脱水素酵素の発現プラスミドの構築〕
上記ＰＣＲにより得られた反応産物を定法に従いアガロースゲル電気泳動により分離し、約１０００塩基対からなるＤＮＡ断片をゲルより切り出し、キアゲン社製ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製し、さらに宝酒造社製の制限酵素ＮｃοＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化産物を、再度ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットにより精製し、ｐＴＤ-ｔａｃＮ（Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９０，１４１-１４４，１９９０）をＮｃοＩおよびＨｉｎｄＩＩＩであらかじめ消化し、直鎖状となったプラスミドと定法に従いライゲーション反応を行った。反応液の一部を大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡社製）に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートで生育してくるコロニーからプラスミドを調製し、該組換えプラスミドをｐＤｒａＨ１と命名した。
【００１４】
〔塩基配列の決定〕
次に、上記工程で得られた組換えプラスミドｐＤｒａＨ１のインサート領域について塩基配列を決定した。シーケンシング反応は、アプライドバイシステムズ社製ビッグダイ・バージョン３キットを用い、ダイデオキシ法により行った。塩基配列の解析は、アプライドバイシステムズ社製ＤＮＡシーケンサー（プリズム３１０）により行った。決定した塩基配列を配列表の配列番号２に、および推定アミノ酸配列を配列表の配列番号１にそれぞれ示す。ｐＤｒａＨ１プラスミド全体の塩基配列を配列表の配列番号3に示した。こうして塩基配列の決定されたｐＤｒａＨ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１９４２１として寄託されている。こうしてイソクエン酸脱水素酵素の高発現プラスミドが構築された。
【００１５】
〔組換えイソクエン酸脱水素酵素遺伝子の発現〕
ｐＤｒａＨ１を東洋紡社製の大腸菌コンピテントセルＪＭ１０９に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム）寒天プレート上、３７℃で培養した。単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ液体培地（１．６％  トリプトン、１％  酵母エキス、０．５％  塩化ナトリウム）10mlに植菌し、３７℃で１４時間、振とう培養した。次に、本培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴ液体培地（２リットル）にうつし、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達したところで、終濃度０．５ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを加え、３７℃でさらに１２時間、振とう培養した。
【００１６】
〔組換えイソクエン酸脱水素酵素の精製〕
菌体を遠心分離（５、０００ｇ、１０分）により回収し（湿菌体重量１３．９ｇ）、ノバジェン社製のバグバスター溶液７０ｍｌ、及びベンゾナーゼ溶液７０μｌを加えた。ピペッティングにより菌体をよく懸濁し、室温にて２０分間撹拌した。沈澱を遠心分離により除去（２０、０００ｇ、２０分）した。次に、本蛋白質溶液に３０％硫酸ストレプトマイシン溶液を容積比５％加え（終濃度１．５％）、氷上で１時間放置した。沈殿物を遠心分離により除去（２０、０００ｇ、２０分）し、上精を２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）に対して４℃で透析（分画分子量８，０００）した。沈殿物を遠心分離により除去（２０、０００ｇ、２０分）した。上精を２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）で平衡化したアマシャム社製のＨｉ-Ｔｒａｐ  Ｑ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（５ｍｌ）カラムに添加し、塩化ナトリウムの濃度勾配（０→０．4Ｍ）により吸着蛋白質を溶出した。ＮＡＤ依存性のイソクエン酸脱水素酵素の活性を示す画分を回収し、終濃度１．５Ｍの硫酸アンモニウムを加えた。次に、２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムで平衡化したアマシャム社製のＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｈｅ（５ｍｌ）カラムに添加し、硫酸アンモニウムの濃度勾配（１．５→０Ｍ）により吸着蛋白質を溶出した。ＮＡＤ依存性のイソクエン酸脱水素酵素の活性を示す画分を回収し、２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）に対して透析した。
【００１７】
〔蛋白質定量〕
精製酵素の濃度は、牛血清アルブミンを標準蛋白質として、ピアース社製ＢＣＡ蛋白質定量キットを用いてを決定した。
【００１８】
〔酵素の諸性質〕
イソクエン酸脱水素酵素活性の酵素活性の測定は３０℃で行い、３４０ｎｍにおける吸光度の変化を１分間モニターすることにより反応初速度を決定した。なお、イソクエン酸はＤ、Ｌ体の混合物（シグマ社製）であり、表記の濃度はＤ体としての濃度である。活性の測定は一つの測定点あたり３回行った。
【００１９】
（１）一価カチオンに対する濃度依存性
５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（Ｎ-２ーヒドロキシエチルピペラジンーＮ‘ー３ープロパンスルホン酸、ｐＨ７．８）、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  イソクエン酸、１ｍＭ  ＮＡＤ、０ー１Ｍの各種一価カチオンを含む溶液（総量は５００μｌ）に対し、酵素０．５μｇを加え３０℃で反応させた。その結果（図１）、本酵素は一価カチオンの非存在下では活性が検出されず、本酵素が一価カチオン要求性であることが判明した。とくにカリウムイオン及びアンモニウムイオンにより顕著に活性化されることが判明した。また、カリウムイオンの場合は０．２-０．３Ｍの濃度範囲で最大活性をもち、アンモニウムイオンでは０．１Ｍで最大活性をもつことが判明した。ナトリウムイオンの活性化の程度は低く、カリウムイオンの場合と比較して５％程度の活性向上効果しか示さなかった。
【００２０】
（２）二価金属イオンに対する濃度依存性
５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ  塩化カリウム、１ｍＭ  イソクエン酸、１ｍＭ  ＮＡＤ、０‐１０ｍＭの各種二価金属イオン（塩化マンガンあるいは塩化マグネシウム）を含む溶液（総量は５００μｌ）に対し、酵素０．５μｇを加え３０℃で反応させた。その結果（図２）、二価金属イオンの非存在下では活性が検出されず、本酵素が二価金属イオン要求性であることが判明した。また、塩化マンガンの方が塩化マグネシウムよりも低濃度で高い活性を示した。塩化マンガンに対しては０‐０．1ｍＭの濃度範囲で定量が可能であり、０．２-０．６ｍＭに至適濃度にもつことが判明した。また、塩化マグネシウムに対しては０‐1ｍＭの濃度範囲で定量が可能であり、２-１０ｍＭに至適濃度にもつことが判明した。
【００２１】
（３）イソクエン酸に対する濃度依存性
５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ  塩化カリウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＮＡＤ、０‐５ｍＭのイソクエン酸を含む溶液（総量は５００μｌ）に対し、酵素０．５μｇを加え３０℃で反応させた。その結果、図３のようにイソクエン酸の濃度依存的に活性が検出され、０‐０．４ｍＭの濃度範囲でイソクエン酸の定量が可能であることが判明した。
【００２２】
（４）ＮＡＤに対する濃度依存性
５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ  塩化カリウム、０．２ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  イソクエン酸、０‐５ｍＭのＮＡＤを含む溶液（総量は５００μｌ）に対し、酵素０．５μｇを加え３０℃で反応させた。その結果、図４のようにＮＡＤの濃度依存的に活性が検出され、０‐2ｍＭの濃度範囲で定量が可能であることが判明した。
【００２３】
（５）ＮＡＤＰに対する反応性
５０ｍＭ  ヘペス緩衝液（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ  塩化カリウム、０．２ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  イソクエン酸、０‐５ｍＭのＮＡＤＰを含む溶液（総量は５００μｌ）に対し、酵素０．５μｇを加え３０℃で反応させた。その結果、いずれのＮＡＤＰ濃度においても活性が認められず、本酵素の補酵素特異性がＮＡＤ特異的であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】デイノコッカス・ラディデュランス由来イソクエン酸脱水素酵素活性の一価カチオン濃度依存性を測定した結果を示すグラフである。●は塩化カリウム、○は塩化ナトリウム、△は塩化アンモニウムに対するプロット。
【図２】デイノコッカス・ラディデュランス由来イソクエン酸脱水素酵素活性の二価カチオン濃度依存性を測定した結果を示すグラフである。●は塩化マンガン、○は塩化マグネシウムに対するプロット。
【図３】デイノコッカス・ラディデュランス由来イソクエン酸脱水素酵素活性のイソクエン酸濃度依存性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】デイノコッカス・ラディデュランス由来イソクエン酸脱水素酵素活性のＮＡＤ濃度依存性を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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