(57)【要約】【課題】              検体溶液中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの有無や量を、迅速に精度良く検出する方法を提供することにあり、特に、一塩基多型や一塩基突然変異を検出する方法を提供すること。【解決手段】        毛細管状の流路内表面にプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスのプローブ固定部に、検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させ、次いでプローブ固定部を洗浄してプローブと結合しなかった検体溶液成分を除去した後、プローブ固定部の蛍光強度を測定するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法において、プローブが固定化された多孔質層の蛍光強度を測定する部位における波長６７０ｎｍの光の透過率が、１０〜６０％であり、かつ前記蛍光強度の測定が６５０ｎｍ以上の波長の蛍光強度測定であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛細管状の流路内表面に標的塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと特異的に結合するプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスのプローブ固定部に、検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させ、次いで前記プローブ固定部を洗浄して前記プローブと結合しなかった検体溶液成分を除去した後、前記検出対照のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドがプローブと結合したことに基づく前記プローブ固定部の蛍光強度を測定するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法において、前記プローブが固定化された多孔質層の蛍光強度を測定する部位における波長６７０ｎｍの光の透過率が、１０〜６０％であり、かつ前記蛍光強度の測定が６５０ｎｍ以上の波長の蛍光強度測定であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出が、塩基配列の１塩基の違いを選択的に検出するものである請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項３】
前記検体溶液と前記プローブ固定部とを接触させる温度が、前記プローブとそれに特異的に結合するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの融解温度以上で、かつ［該融解温度＋１０℃］以下である請求項１または２に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項４】
前記検体溶液と前記プローブ固定部とを接触させる温度が、７５〜１００℃の範囲にある請求項１または２に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項５】
前記検体溶液と前記プローブとを接触させる時間が、１〜１０分の範囲にある請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項６】
前記多孔質層の厚さが１〜２０μｍである請求項１〜５のいずれかに記載のヌクレオチドの検出方法。
【請求項７】
前記多孔質層が、屈折率が１．３〜１．４９の範囲にある素材で形成されたものである請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法。
【請求項８】
前記毛細管状の流路が、板状又はフィルム状の部材の内部に、その平面側表面に概平行に設けられており、前記プローブが固定された多孔質層が、前記部材の前記平面側表面から見た前記流路の対面側内表面であり、前記蛍光の測定が、前記部材の前記平面側表面方向から流路を通して前記多孔質層の表面側から測定するものである請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオチドの検出方法。
【請求項９】
毛細管状の流路内表面に検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと特異的に結合するプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスであって、前記多孔質層が、厚さが１〜２０μｍであり、水を充填した状態で、波長６７０ｎｍの光の透過率が１０〜６０％であり、かつ、前記流路断面における周の一部に形成されているマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記多孔質層が、屈折率が１．３〜１．４９の範囲にある素材で形成された請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記多孔質層が（メタ）アクリル系樹脂で形成された請求項９または１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記マイクロ流体デバイスが溝を有する板状又はフィルム状の部材と、該溝を有する部材の溝形成面に固着された板状又はフィルム状の蓋となる部材から成り、前記流路が前記溝と前記蓋となる部材によって形成され、前記多孔質層が、前記溝の底面若しくは前記蓋となる部材に形成されたものである請求項９〜１１のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを検出するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの分析方法に関し、毛細管状の流路内表面にプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスを用いた分析方法に関する。また、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの分析に使用するマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
検体溶液中の被検ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの検出目的の特定の塩基配列（以下、「標的塩基配列」と称する場合がある。）を有するか、標的塩基配列を有しないか、あるいは標的塩基配列を有するポリヌクレオチドの濃度や量はいくらか、といった特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドを検出する分析方法として、ＤＮＡチップ法が知られている（非特許文献１）。ＤＮＡチップ法は、検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと特異的に結合するプローブを固相に固定し、これに検体溶液中の該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを選択的に結合（ハイブリダイゼーション）させる方法であり、一度に多種の配列の検出が可能である上、操作が簡便なため、ＤＮＡの分析方法の中で最も多く使用されている。
【０００３】
しかしながら、ポリヌクレオチドの一塩基多型（ＳＮＰ）や１塩基突然変異の分析のように、標的塩基配列とは一塩基のみ異なるような、塩基配列の差が小さいポリヌクレオチドを選択的に検出する場合には、標的塩基配列に対して僅かに例えば一塩基が異なるポリヌクレオチドも同様に該プローブとハイブリダイゼーション（ミスマッチを有するハイブリッド形成）してしまうため、検出が困難であった。この困難を避け、結合量の差を十分に大きくするためには、数時間以上のインキュベーションが必要であり、分析時間の長時間化を招いていた（非特許文献１参照。）。
【０００４】
一方、本発明者らの検討によれば、ハイブリダイゼーションの温度を高く、例えば、前記プローブとそれに相補的なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）以上、「Ｔｍ＋１０℃」以下にすることにより改善できたが、結合速度が低い上、飽和結合量も少なくなり、低感度化を招いて、やはり分析の信頼性が低下していた。
【０００５】
また、特許文献１には、野性型対立遺伝子に相補的な塩基配列のプローブが担持された担体を用いた、野生型と変異型の混合対立遺伝子試料からの突然変異対立遺伝子の検出方法が開示されている。該方法は野生型対立遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子を固定した充填流路に野生型と変異型の混合対立遺伝子試料を流し、ハイブリッド形成によって野生型対立遺伝子を選択的に流路に吸着させ、変異型対立遺伝子は吸着させずに流出させることで、変異型遺伝子を濃縮する方法である。
【０００６】
しかしながら、該方法は野生型対立遺伝子を該遺伝子に相補的な塩基配列を有する対立遺伝子とハイブリッド形成させることにより野生型対立遺伝子と変異型対立遺伝子を分離する方法であるため、一塩基多型や一塩基突然変異を検出できるような十分に高い選択性を実現するためには、前記ＤＮＡチップ法と同様に、長時間のインキュベーションが必要であった。
【０００７】
一方、疑似抗原を例えば厚み１００〜２００μｍのポリアミド多孔質膜に固定した免疫診断薬（イムノ・アッセイ）が知られている。疑似抗原の固定相として多孔質膜を使用することにより固定量を増し、発色剤標識物質の高感度検出を可能にしている。しかしながら、蛍光標識物質の蛍光を測定する場合には、固定層に多孔質膜を使用すると蛍光のバックグラウンドが著しく増加し、Ｓ／Ｎ比が低下して、かえって判定の精度を落とす結果となっていた。
【０００８】
また、本発明者らによる特許文献２に記載されているように、上記多孔質膜の代わりに、基板状に形成した薄い多孔質層に抗原や抗体などのプローブを固定する試みも成されていたが、蛍光強度で検出する場合には、バックグランドの抑制が不十分であり、信頼性も不十分であった。また励起光の散乱光が多くなり、これが蛍光に重なって測定されて、蛍光のバックグラウンドが高くなるため、ポリヌクレオチド（Ａ）の結合部と非結合部の蛍光強度の比が小さくなり、検出の信頼性が低下するという問題が発生していた。
【０００９】
【非特許文献１】大野典也，「ニュートン」，１９９９年，７月号，ｐ．６０−６１
【特許文献１】特表２００１−５１４５０４号公報
【特許文献２】特開２０００−００２７０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、検体溶液中の、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの有無や量を、迅速に精度良く検出する方法を提供することにあり、特に、一塩基多型や一塩基突然変異を検出する方法を提供することにある。また、該測定に使用するマイクロ流体デバイスを提供することにある。
【００１１】
即ち本発明は、毛細管状の流路内表面に標的塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと特異的に結合するプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスのプローブ固定部に、検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含有する検体溶液を接触させ、次いで前記プローブ固定部を洗浄して前記プローブと結合しなかった検体溶液成分を除去した後、前記検出対照のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドがプローブと結合したことに基づく前記プローブ固定部の蛍光強度を測定するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法において、前記プローブが固定化された多孔質層の蛍光強度を測定する部位における波長６７０ｎｍの光の透過率が、１０〜６０％であり、かつ前記蛍光強度の測定が６５０ｎｍ以上の波長の蛍光強度測定であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出方法を提供するものである。
【００１２】
さらに本発明は、毛細管状の流路内表面に検出対象のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと特異的に結合するプローブが固定化された多孔質層を有するマイクロ流体デバイスであって、前記多孔質層が、厚さが１〜２０μｍであり、水を充填した状態で、波長６７０ｎｍの光の透過率が１０〜６０％であり、かつ、前記流路断面における周の一部に形成されているマイクロ流体デバイスを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に於いては、多孔質層における特定波長の光透過率を特定の値とし、該特定波長の蛍光を測定することにより上記課題を解決した。即ち、多孔質層の光の透過率は、多孔質層の細孔に水を充填した状態における６７０ｎｍでの値を１０〜６０％、好ましくは１５〜５０％とすることにより、プローブの固定部に多孔質層を使用した場合でも、試料由来の蛍光強度と蛍光のバックグラウンドと比が増加し（即ち、Ｓ／Ｎ比が増加し）、精度良く、高い信頼性でポリヌクレオチドやオリゴヌクレオチドの検出が可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドの分析方法は、プローブの固定化量を高くでき、かつ多孔質層の細孔に水を充填した状態における６７０ｎｍの光の透過率が１０〜６０％である多孔質層を使用し、プローブとポリヌクレオチドとの結合により生じる６５０ｎｍ以上の蛍光を測定することにより、被検ポリヌクレオチド又は被検オリゴヌクレオチドの塩基配列が、標準とする塩基配列に対して僅かな違いであっても、短時間に、かつ高い信頼性で検出することができ、特に、標準とする塩基配列に対して一塩基のみ異なる塩基配列を好適に分析することができる。
【００１５】
さらに本発明の方法によると、検体溶液を毛細管状の流路中の微小な領域の固定プローブに接触させるため、少量の試料量でも乾燥することなく、精度良く分析が可能である。また、複数のプローブを１本の流路中の異なる領域に固定したり、複数の流路中にそれぞれ固定することにより、多検体、多項目の測定を同時に行うことができ、この場合にも、試料量が過大になることがない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の要部について詳細に説明する。
[標的塩基配列]
標的塩基配列は、検出目的の特定の塩基配列をいい、検出目的のポリヌクレオチドに特徴的な塩基配列部分を標的塩基配列とする。また、分析目的がポリヌクレオチドの１塩基の違いの判別である場合、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）や突然変異において、野生型（正常型）ポリヌクレオチドであるか、変異型（異常型）ポリヌクレオチドであるかの判定において、変異の生じる部分（ホットスポット）を含む塩基配列部分を標的塩基配列とする。この場合、標的塩基配列は、野生型の塩基配列であってもよいし、変異型の塩基配列であってもよいが、野生型の塩基配列を標的塩基配列とした後述のプローブと、変異型の塩基配列を標的塩基配列としたプローブの両者を用いることが、信頼性が高くなり好ましい。
【００１７】
［ポリヌクレオチド］
本発明の分析方法に供される検体溶液に含有される、検出対象であるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、被検ポリヌクレオチドという。また、説明の煩雑さを避けるため、特に区別する必要がない限り、本明細書で言う「ポリヌクレオチド」には、「オリゴヌクレオチド」も含めることとする。）は任意であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他、修飾ポリヌクレオチドなどであり得る。ＤＮＡは、例えば、全ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片等であり得る。これらの中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により増幅されたＤＮＡ断片であることが、特に有用であり好ましい。
【００１８】
ポリヌクレオチドの長さは、標的塩基配列の塩基数以上であること以外は任意であり、好ましくは、塩基数１０〜３０００、さらに好ましくは１５〜１０００、最も好ましくは２０〜５００である。この範囲とすることによって、選択性を高めると同時に分析時間の短縮が図れるため好ましい。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）や制限酵素により調製される場合には、プライマーや制限酵素の選択により、これらのポリヌクレオチドの塩基数を設定できる。
【００１９】
本発明の分析方法に供される検体溶液に含有される、被検ポリヌクレオチドは、標的塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドを「ポリヌクレオチド（Ａ）」という。）単独、標的塩基配列を有さないポリヌクレオチド（以下、該ポリヌクレオチドをポリヌクレオチド（Ｂ）という。）単独、またはこれらの混合物のいずれでもよい。また、一本鎖であっても二本鎖であっても良く、二本鎖であることが、生体サンプルを直接、又は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などにより増幅されたポリヌクレオチド生成物を被検ポリヌクレオチドとして使用できるため、特に有用であり好ましい。また、それぞれ複数の種類のポリヌクレオチド（Ａ）やポリヌクレオチド（Ｂ）を含有していてもよい。本発明においては、特に、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の総和に対するポリヌクレオチド（Ｂ）の割合が、概ね０、１／２、１のいずれかである場合、即ち、一塩基多型のホモ野生型、へテロ型、ホモ変異型の判定の場合に、判定の信頼性が高くなり、好ましい。勿論、分析の結果、検体溶液中にはポリヌクレオチド（Ａ）もポリヌクレオチド（Ｂ）も含有されなかったと判定される場合もあり得る。本発明では、これら検出方法を総称してポリヌクレオチドの検出方法と言う。
【００２０】
ここで、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、標的塩基配列を全く有しないポリヌクレオチドでもよいし、標的塩基配列とは僅かに異なる塩基配列、例えば１塩基異なる塩基配列を有するものであってもよい。上記僅かに異なる場合、配列の異なる場所は、置換、欠失、又は挿入によるものであってよい。上記配列の異なる場所は標的塩基配列の端であっても内部であってもよい。本発明においては、標的塩基配列とは１塩基異なる塩基配列を有するものである場合に、従来法に比べて特に効果が発揮される。
【００２１】
標的塩基配列と全く、若しくは大きく異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの例としては、病原体であるバクテリアとウィルスのＤＮＡを挙げることが出来る。また、標的塩基配列と１塩基異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドの例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）や突然変異遺伝子が挙げられる。また、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、各々一本鎖であるが、センス鎖、アンチセンス鎖のどちらであってもよい。
【００２２】
また、被検ポリヌクレオチドはプローブと結合した際に蛍光を生じることが必要である。このような蛍光を生じるには、蛍光性物質で標識されたポリヌクレオチドを使用するか、あるいは、検体溶液中に蛍光性のインターカレーターを使用すればよい。本発明においては、蛍光の波長が６５０ｎｍ以上のものを使用することによりプローブの固定部として、プローブの固定量を多くできる多孔質層を用いても、蛍光のバックグラウンドがそれほど増加することが無く、信頼性の高い分析を行うことが出来る。
【００２３】
[プローブ]
プローブは、標的塩基配列を有するポリヌクレオチドと特異的に結合するもの、すなわち、標的塩基配列に対して実質的に相補的な塩基配列を有するものを使用する。ここで、実質的に相補的とは、標的塩基配列に相補的な塩基配列を有するか、あるいは、標的塩基配列に相補的な塩基配列に対して相対的に少数の配列が異なる塩基配列部分を有するものの標的塩基配列の大部分に相補的な塩基配列を有することを言う。［以下、「（標的塩基配列に）相補的」であることを「（標的塩基配列と）完全マッチ」であると表現する場合がある、また、「［標的塩基配列に相補的な塩基配列に対してＮ個（但しＮは自然数）の］塩基の配列が異なる」ことを「（標的塩基配列とＮ塩基の）ミスマッチを生じる」と表現する場合がある］このようなプローブは、ポリヌクレオチド（Ａ）に対して、それより多くのミスマッチを生じるポリヌクレオチドより強くハイブリダイゼーションする。プローブが、標的塩基配列に対してミスマッチを生じる場合には、該ミスマッチを生じる部分は、置換、挿入、欠失のいずれであってもよいが、置換であることが、該ミスマッチを導入する効果が発揮されるため好ましい。
【００２４】
プローブは、標的塩基配列に対して少数のミスマッチを生じる塩基配列を有することも好ましい。該ミスマッチの数は標的塩基配列の長さに依存し、標的塩基配列の長さが長いほど多く設けることが好ましい。しかし、１〜５が好ましく、１〜４が更に好ましく、２〜３が最も好ましい。プローブが、標的塩基配列に対して少数のミスマッチを生じる塩基配列とすることにより、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）のプローブとのハイブリダイゼーションの形成量の差を増加させることができ、分析の信頼性が増す。
【００２５】
使用できるプローブとしては、例えば、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、糖部分や燐酸基部分が修飾或いは置換されたオリゴＤＮＡやオリゴＲＮＡ、その他の任意の化合物であり得る。このようなプローブは、合成可能であるし、また、マイクロアレイ用などとして市販されている。
【００２６】
プローブは、標的塩基配列と上記ミスマッチを生じる部分を有する場合も有しない場合も、標的塩基配列部分の端より外側に、無関係な塩基配列部分を有していてよい。この場合には、標的塩基配部分と前記実質的に相補的な部分のみがハイブリダイゼーションに寄与する。プローブ中の上記無関係な部分の長さは任意であるが、短いほど好ましく、ゼロ、即ち標的塩基配列部分のみとすることが、被検ポリヌクレオチドの未知の塩基配列部分が偶然ハイブリダイズする恐れがなく、分析の信頼性の向上面から好ましい。
【００２７】
プローブは、塩基配列でない部分を有していてもよい。例えば該プローブを固相合成する際に固相に固定するためのアミノ基などの官能基、塩基配列部分と前記固定用官能基の間のスペーサーとなるアルキレン基やポリエチレングリコール基、等を挙げることができる。
【００２８】
本発明に用いるプローブは１本鎖プローブであっても、２本鎖プローブであっても良く、目的に応じて選択できるが、１本鎖プローブであることが好ましい。被検ポリヌクレオチドが二本鎖である場合には、互いに相補的な塩基配列を有するプローブの両者をそれぞれ独立した領域に固定することも好ましい。その場合、該両領域は、相互距離が拡散混合が十分に生じる距離、例えば１００μｍ以下にすることが好ましい。
【００２９】
［マイクロ流体デバイス、流路］
本発明で用いるマイクロ流体デバイスの形状は、マイクロ流体デバイス外からプローブが固定された多孔質層（以下、「プローブ固定部」と称する）の蛍光を観察できれば、その外形は任意であり、例えば板状（シート状、フィルム状、リボン状などを含めることとする）、チューブ状、棒状、塊状などであって良いが、板状であることが、製造と使用が容易であり好ましい。
【００３０】
毛細管状の流路（以下、単に［流路］と称する場合がある）は、前記マイクロ流体デバイス内に形成されており、外からプローブ固定部の蛍光を観察できる位置に形成されていれば任意であるが、板状のマイクロ流体デバイスの平面側表面に概平行に形成されていることが、蛍光観察が容易であり好ましい。前記マイクロ流体デバイスは、溝を有する板状の部材と、該溝を有する部材の溝形成面に固着された板状の蓋となる部材から成り、前記流路が前記溝と前記蓋となる部材とで形成されていることも好ましい。また、前記溝を有する部材は、部材の表裏を貫通する欠損部を有する板状の部材が他の部材に積層固着された部材であって、該欠損部が溝を形成していてもよい。
【００３１】
該流路は、一つのマイクロ流体デバイス中に、その他の任意の機構、例えば、ポリヌクレオチドの抽出、濃縮、精製などの前処理を行う機構、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などのポリヌクレオチドを増幅する機構、などと共に形成されていて、これらの処理と本発明の分析を連続して実施することも好ましい。また複数の流路を有するマイクロ流体デバイスを用いて、多検体同時測定を行うことも好ましい。
【００３２】
マイクロ流体デバイスを構成する部材は、励起光照射と蛍光観察が可能なように透明であれば任意である。好ましく使用できる素材として、ガラス、石英などの結晶、有機重合体（ポリジメチルシロキサンなどの有機含有無機重合体も含む）を例示できる。勿論、プローブ固定部に面する流路壁が上記素材で形成されていれば、その他の部分は不透明であっても良い。
【００３３】
流路の断面形状は任意であり、例えば矩形、スリット状、三角形、台形、円、楕円などであり得るが、矩形、台形、または半円形であることが、製造、測定が共に容易であり好ましい。流路の断面積は１０μｍ２〜１０ｍｍ２が好ましく、さらに３０μｍ２〜１ｍｍ２であることがより好ましく、１００μｍ２〜０．３ｍｍ２μｍであることが最も好ましい。流路断面積を１０μｍ２より大きくすることによって、圧力損失の増加を防ぎ、流路に検体溶液を流すことが容易となる上、蛍光の検出感度も向上する。流路径を１０ｍｍ２より小さくすることによって、少量の検体溶液でも分析可能となる。
【００３４】
また、プローブが固定された多孔質層の表面から流路内壁の対向面までの距離は、好ましくは１〜３００μｍ、さらに好ましくは３〜１００μｍ、最も好ましくは５〜５０μｍである。この範囲とすることで、検体溶液中の被検ポリヌクレオチドは、固定プローブとの接触確率が高くなり、ハイブリダイゼーション工程の時間短縮が図れる。
【００３５】
［プローブ固定部］
前記流路内面に固着して多孔質層が形成されており、該多孔質層の細孔表面にプローブが固定されている（以下、プローブが固定された多孔質層部分を「プローブ固定部」と称する）。該多孔質層は、流路の内表面に、流路断面を塞がない形状で形成されている。多孔質体が流路断面を塞ぐ形状に形成されていても、検体溶液などの流体は細孔を通って流通するが、圧力損失が大きくなるため、マイクロ流体デバイスの耐圧性を上げる必要が生じる上、高圧の送液が可能な送液手段が必要となる。該多孔質層は、流路断面における周全体に形成されていても良いが、該周の一部に形成されていて、その対向面には形成されていないことが好ましい。これにより、流路を通して、該多孔質層の表面の蛍光を測定できるため、蛍光のバックグラウンドが低下して検出感度が向上し、定量的な信頼性が向上する。このとき、前記毛細管状の流路が、板状又はフィルム状の部材の内部に、その平面側表面に概平行に設けられており、前記プローブ固定部が、前記部材の前記平面側表面から見た前記流路の対面側内表面であることが、励起と蛍光測定が容易であり好ましい。さらに、前記マイクロ流体デバイスが、溝を有する板状の部材と、該溝を有する部材の溝形成面に固着された板状の蓋となる部材から成り、前記流路が前記溝と前記蓋となる部材とで形成されていて、前記多孔質層が、前記溝の底面若しくは前記蓋となる部材に形成されたものであることが、マイクロ流体デバイスの製造も容易であるため好ましい。
【００３６】
プローブを固定する固相を多孔質層の細孔表面とすることで表面積が増大し、見かけの面積あたりのプローブの固定密度が増えて、検出感度が増加する。また、ハイブリダイゼーションの飽和量に比べて少量、例えば数十分の一がハイブリダイズした段階で検出可能なため、ハイブリダイゼーション時間の短縮が図れる。
本マイクロ流体デバイスは、上記プローブ固定部の他に、プローブが固定されていない多孔質層部分を有していてもよく、このような部分を、蛍光のバックグラウンドの測定部とすることも好ましい。
【００３７】
しかしながら、多孔質層で形成されたプローブ固定部の蛍光を測定すると、完全にカットされない励起光の散乱光が、平滑な固相表面にプローブを固定した場合に比べて多くなり、これが蛍光に重なって測定されて、蛍光のバックグラウンド（測定対象の蛍光発光物質が存在しない場合の蛍光強度測定値）が高くなる。このため、ポリヌクレオチド（Ａ）の結合部と非結合部の蛍光強度の比が小さくなり、検出の信頼性が低下するという問題が発生していた。
【００３８】
本発明に於いては、多孔質層の光透過率を特定の値とすることによって、この問題を解決した。即ち、前記プローブが固定化された多孔質層の蛍光強度を測定する部位における波長６７０ｎｍの光の透過率が、多孔質層の細孔に水を充填した状態で１０〜６０％であり、好ましくは１５〜５０％である。透過率の測定はミクロデンシトメーターを用いて流路を通して直接測定できる。或いは、別途、基板上に広い面積で多孔質層を形成した測定用モデルを通常の分光光度計を用いて測定しても良い。光の透過率を上記下限以上とすることによって、試料由来の蛍光強度と蛍光のバックグラウンドと比が増加し（即ち、Ｓ／Ｎ比が増加し）、測定の精度と信頼性が増すと共に、測定時間の短縮が図れる。また、上記上限以下とすることによって、上記Ｓ／Ｎ比の悪化を少なくしつつ、プローブの固定量を十分高くすることが出来るため。検出感度が増加し、また、分析時間の短縮が図れる。
【００３９】
上記光透過率は、多孔質層に固定するプローブが蛍光測定波長に吸収帯を有する場合には、プローブが未固定の状態で測定する。それが不可能な場合には、該吸収帯の長波長側に於ける、吸収のない最短波長で測定するものとする。なお、光透過率の測定を多孔質層の細孔に水を充填した状態で行う理由は、乾燥状態では透過率が著しく低くなって測定誤差が無視できないほど増加するためである。ちなみに、細孔に水を充填した状態での６７０ｎｍにおける光の透過率が１０〜６０％である場合には、乾燥状態における蛍光測定と水（或いは緩衝液）を充填した状態での蛍光測定で、前記Ｓ／Ｎ比にさほど大きな違いは生じない。
【００４０】
光の透過率を上記範囲にする方法は任意であり、例えば、多孔質層の厚みを１〜２０μｍ、好ましくは２〜１０μｍとする方法、多孔質層の平均孔径を０．１μｍ未満、又は１０μｍ以上にする方法、多孔質層の孔径分布を狭くして、０．２〜３μｍの孔径部分を減少させる方法、多孔質層の細孔の形状を、蛍光測定方向に向いた筒状にする方法、多孔質層を構成する素材に、屈折率の低い素材、好ましくは屈折率が１．３〜１．４９の素材を使用する方法、などを採ることが出来る。もちろん、これらを同時に実施することも好ましい。これらの中で、多孔質層の厚みを調節する方法、及び、多孔質層を低屈折率の素材で形成する方法が好ましい。
【００４１】
上記、多孔質層の厚みを特定の値にする方法においては、多孔質層を流路内壁に固着して形成することで、自立不能なほど薄い多孔質層が形成可能であり、多孔質層を薄くすることで、蛍光測定に於いて、励起光の散乱強度を低下させ、蛍光のバックグラウンドを低くすることが出来るため、測定の信頼性が向上する。また、ハイブリダイゼーション工程や、該ハイブリダイゼーション工程の後の、プローブと結合しなかった成分を洗浄除去する工程に於いて、短時間で所定の処理を行うことができ、分析の迅速化が計れる。
【００４２】
前記多孔質層は、例えば水銀圧入法で測定した孔径分布が０．０３〜３μｍの範囲にピークを有するものであることが、プローブの固定量を多くし、また、被検ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度を増すことができるため好ましい。これに対し、例えばガラスやポリスチレンの表面をサンドブラスト法などで荒らして凹凸を形成した表面は、表面積の増加が不十分であり、プローブ固定量の増加効果は小さい。このような凹凸を有する表面は、前記孔径分布が前記範囲に明確なピークを有しない。
【００４３】
上記、多孔質層を低屈折率の素材で形成すると、多孔質層の光透過率を上記範囲とするときに、多孔質層の孔径や厚みの許容範囲が広くなる。そのため、プローブの固定量をまし、また、被検ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度を増すような孔径や厚みを選択することができ、かつ、製造も容易となる。屈折率を１．３以上とすることで、透明性、硬度、親水性などの好ましい物性を有する素材の選択が容易になり、１．４９以下とすることで、十分なＳ／Ｎ比の向上が図れる。
【００４４】
屈折率が上記範囲であるような素材としては、例えば、石英ガラスなどのガラス、ホタル石などの結晶、（メタ）アクリル系樹脂、ポリ酢酸ビニル、シリコン樹脂、ポリ四フッ化エチレンなどのフッ素系樹脂などの有機重合体が挙げられる。これらの中で（メタ）アクリル系樹脂が、多孔質層の形成が容易であること、親水性の調節が容易であること、プローブの固定が容易であることなどの理由により、最も好ましい。（メタ）アクリル系樹脂は熱可塑性樹脂であっても、熱硬化性樹脂であっても良い。なかでも、紫外線硬化性樹脂が、流路の形成や多孔質層の形成が容易で、プローブの固定も容易であるため好ましい。
【００４５】
前記多孔質層を、流路の内表面の複数の形成し、各多孔質層部にそれぞれプローブを固定することもできる。前記多孔質層を互いに独立した複数の領域として形成することにより、異なる種類のプローブを相互にコンタミネーションすることなく固定することが容易になる。このとき、分析の目的によって、１つの流路中に複数の領域として形成されたプローブ固定部にそれぞれ異なるプローブを固定したり、並列に形成された複数の流路中のプローブ固定部にそれぞれ別々にプローブを固定しても良い。また、バックグラウンド測定部、ネガティブコントロール測定部、ポジティブコントロール測定部と成すプローブ固定部を設けることも好ましい。
【００４６】
本発明に用いるプローブをプローブ固定部に固定する方法は任意であるが、固定したプローブがハイブリダイゼーション温度において実質的に固相から脱離しないことが必要である。そのような固定方法としては、例えばビオチン−アビジンなどの蛋白質を介する結合や、共有結合による固定が挙げられるが、結合が強く固相からのプローブの脱離が起こりにくいことから共有結合による固定であることが好ましい。
【００４７】
［検出方法］
本発明の検出方法は、まず、検体溶液を流路に流して、プローブを固定している多孔質層に接触させ、該検体溶液に含有される被検ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションにより固定プローブに結合させる（以下、「ハイブリダイゼーション工程」と称する場合がある）。本工程は、ポリヌクレオチド（Ａ）が選択的にプローブとハイブリダイゼーションする条件で実施する。
【００４８】
ハイブリダイゼーション工程の温度は、前記プローブと前記ヌクレオチド（Ａ）とのハイブリッドが形成可能な温度であれば任意であるが、分析がポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの塩基配列の１塩基の違いを判別するものである場合には、前記プローブと前記ヌクレオチド（Ａ）とのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）以上、［Ｔｍ＋１０℃］以下であることが好ましい。標的塩基配列を、好ましい長さである２０〜２５塩基とし、プローブにミスマッチを導入しない場合には、ハイブリダイゼーション工程の温度は７５〜１００℃であることが好ましい。
【００４９】
これに対し、従来のＤＮＡチップ法では、ハイブリダイゼーション工程は一般に、［前記プローブと前記ヌクレオチド（Ａ）とのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）−３５℃］〜［該Ｔｍ−１５℃］の範囲、例えば５０〜７０℃で行われる。
【００５０】
本発明の分析方法は、従来技術では使用できなかった、上記のような高いハイブリダイゼーション温度を使用することが可能である。これは、本発明に於いては、プローブ固定部に多孔質層を使用してプローブ結合量を大幅に増加させることが出来るため、少量の、例えば飽和結合量の１／３０程度のポリヌクレオチド（Ａ）の結合によって、十分な感度で検出可能であるため、飽和結合量は低いが選択性が高い温度を採用できるためである。また、上記のような高温でハイブリダイゼーション工程を行うことは、従来のスライドグラス型のＤＮＡチップ法では乾燥してしまうため実施できなかったが、流路中でのハイブリダイゼーションでは問題なく実施できることによる。
【００５１】
上記温度範囲でハイブリダイゼーション工程を行うことによって、上記１塩基の違いを短時間で分析する場合に、従来法のようにポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の結合量の比が小さくなることがなく、また、ポリヌクレオチド（Ａ）の結合量が低下して感度が低下することもない。分析が例えば３塩基以上の塩基配列の違いを判別するものである場合には、上記範囲より低い温度を採用して、分析時間を更に短縮することもできる。
【００５２】
融解温度（Ｔｍ）は、標的塩基配列の塩基数、ＧＣ含有率、プローブに導入したミスマッチ数、および溶媒の組成などに依存するが、例えば「遺伝子工学キーワードブック」（３５５頁「変成」、緒方宣邦、野島博、１９９６年、羊土社）に記載された方法で測定することができる。また、融解温度の簡易的な計算方法は、例えば「バイオ実験イラストレイテッド、（３）本当にふえるＰＣＲ」（中山広樹著、２００３年、秀潤社）に記載されている。
【００５３】
ハイブリダイゼーション工程に於ける、検体溶液のポリヌクレオチド固定部との接触時間は任意であるが、十分な感度で検出可能な範囲で短時間であることが好ましく、この観点から、１〜１０分が好ましく、２〜６分がさらに好ましい。
【００５４】
プローブを固定部に検体溶液を接触させる方法は任意であり、前記流路に検体溶液を一方向に或いは往復して流動させた状態、或いは滞留させた状態で接触させることが出来るが、流動させた状態が、接触時間を短縮できるため好ましい。
【００５５】
前記検体溶液中のポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドである場合には、本ハイブリダイゼーション工程に先立って、検体溶液を加熱し、被検ポリヌクレオチドを海里させた状態としてハイブリダイゼーション工程に供すること、或いはプローブと接触させた状態で検体溶液を加熱して解離させ、その後上記のハイブリダイゼーション工程温度にて所定時間保持することが好ましい。
【００５６】
［洗浄工程］
前記ハイブリダイゼーション工程の後に、流路に洗浄液を流して、プローブと結合しなかった検体溶液成分を除去する（これを洗浄工程と称する）。洗浄液は任意であるが、プローブに結合したポリヌクレオチド（Ａ）を過度に除去しないものである必要が有る。このような液体は、例えばホルムアミドや水酸化ナトリウム溶液のように、ポリヌクレオチドを強く変性させる液体として知られているものが挙げられる。洗浄液がプローブと結合したポリヌクレオチド（Ａ）を過度に除去するかどうかは、実験によって確認することが出来る。その際の基準となる液体は検体溶液の溶媒である。好ましく使用できる洗浄液は、検体溶液の溶媒の他、水又は緩衝液である。勿論該洗浄液体は、検出を妨害しないものである必要がある。例えば、蛍光測定波長に蛍光を発しないものである必要があるし、蛍光励起波長に強い吸収を持たないものである必要がある。
【００５７】
［検出工程］
前記洗浄工程の後に、前記プローブにポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが結合したときに発する蛍光を測定し、その強度から、結合の有無や結合量を測定する（これを検出工程と称する）。即ち、プローブ固定部へのポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの結合量に応じて蛍光強度が変化する。勿論、標識蛍光色素に複数の蛍光色素を使用した場合には、蛍光の色やスペクトルから判定することも出来るが、この場合にも、特定波長の蛍光強度の測定の変形である。
【００５８】
蛍光の測定は、プローブ固定部の蛍光強度を測定して、該部位に結合しているポリヌクレオチドの結合量を測定するものであれば、対象となる蛍光発光物質や、測定方法は任意である。例えば、前記被検ポリヌクレオチドに蛍光標識ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを使用する方法、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド自体の蛍光を測定する方法、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとプローブで形成されたハイブリッドの二本鎖にインターカレートして、蛍光発光収率が変化する、或いは蛍光スペクトルが変化する蛍光性インターカレーターを添加する方法、などを挙げることができる。これらの中で、蛍光標識ポリヌクレオチドの使用が、測定感度、測定精度共に高く好ましい。それに次いで、二本鎖にインターカレートして、蛍光発光収率が増加する蛍光性インターカレーターの使用が好ましい。
【００５９】
上記蛍光強度の測定は、前記プローブ固定部の多孔質層を、任意の位置から測定することが出来るが、流路を通して、検体溶液と接触する多孔質層の表面側から測定するものであることが、感度が高く好ましい。蛍光強度の測定は、複数のプローブ固定部の測定であって良いし、その場合、複数のプローブ固定部を同時に測定してもよいし、走査することにより順次測定してもよい。検体溶液と接触させないプローブ固定部の蛍光強度をバックグラウンドとして、測定部の蛍光強度から差し引くことや、プローブを固定しない多孔質部に検体溶液を接触させてハイブリダイゼーション工程を行い、その部分の蛍光強度をネガティブコントロールとして測定部の蛍光強度から差し引くことも好ましい。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例の範囲に限定されるものではない。なお、本実施例に於いて、「部」は「質量部」を、又混合比に関する「％」は「質量％」をそれぞれ表す。
【００６１】
（紫外線ランプ１による照射）
３０００Ｗメタルハライドランプを光源とするアイグラフィックス株式会社製のＵＥ０３１−３５３ＣＨＣ型ＵＶ照射装置を用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００６２】
（紫外線ランプ２による照射）
２５０Ｗ高圧水銀ランプを光源とするウシオ電機株式会社製のマルチライト２５０Ｗシリーズ露光装置用光源ユニットを用い、３６５ｎｍにおける紫外線強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を、特に指定が無い限り室温、窒素雰囲気中で照射した。
【００６３】
（蛍光強度測定方法）
富士写真フィルム株式会社製のプレートリーダーＦＬＡ−３０００Ｇを用いて測定した。Ｄｙ５を標識色素とした場合の測定は、励起波長６３３ｎｍ（レーザー励起）、検出波長は６７５ｎｍ以上（カットオフ波長６７５ｎｍのカットフィルターによる）とした。ＦＩＴＣを標識色素とした場合の測定は、励起波長４８０ｎｍ（レーザー励起）、検出波長５２０ｎｍ以上（カットオフ波長５２０ｎｍのカットフィルターによる）とした。
【００６４】
（実施例１）
［製膜液（Ｙ１）の調製］
エネルギー線重合性化合物（ｂ）として、平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」（大日本インキ化学工業株式会社製）７２部、ジシクロペンタニルジアクリレート「Ｒ−６８４」（日本化薬株式会社製）１８部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０部、貧溶剤（Ｒ）としてデカン酸メチル（和光純薬工業株式会社製）を１８０部、揮発性の良溶剤としてアセトンを１０部、紫外線重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）３部を、均一に混合して製膜液（Ｙ１）を調製した。
【００６５】
［組成物（Ｘ１）の調製］
エネルギー線重合性化合物（ａ）として平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」（大日本インキ化学工業株式会社製）７０部、ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」（第一工業製薬株式会社製）３０部、光重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）３部、及び重合遅延剤として２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン（関東化学株式会社製）０．５部を混合して、組成物（Ｘ１）を調製した。
【００６６】
［蓋用組成物の調製］
エネルギー線重合性化合物として平均分子量２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」（大日本インキ化学工業株式会社製）８０部、ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」（第一工業製薬株式会社製）２０部、光重合開始剤として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）２部を混合して、蓋用組成物を調製した。
【００６７】
［標的塩基配列、プローブ、ポリヌクレオチド（Ａ）、ポリヌクレオチド（Ｂ）］
〔標的塩基配列〕
表１に示した２５塩基の塩基配列を標的塩基配列とした。
【００６８】
〔プローブ（ＰＲ０）〕
５’末端にアミノ修飾した前記標的塩基配列に相補的な塩基配列を有する長さ２５塩基のオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）をプローブ（ＰＲ０）とした（表１）。
【００６９】
〔プローブ（ＰＲ１）〕
前記標的塩基配列の１３番目のグアニンをアデニンに置換したこと以外はプローブ（ＰＲ０）と同様のオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）をプローブ（ＰＲ１）とした（表１）。
【００７０】
〔被検ポリヌクレオチド（Ｆ０）〕
５’末端を蛍光物質「Ｃｙ５」にて修飾し、プローブ（ＰＲ０）に相補的な塩基配列部分を持つ長さ２５塩基のオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）を被検ポリヌクレオチド（Ｆ０）とした（表１）。オリゴＤＮＡ（Ｆ０）は、プローブ（ＰＲ０）に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）であり、プローブ（ＰＲ１）に対しては、一塩基ミスマッチを生じるポリヌクレオチド（Ｂ）である。
【００７１】
〔被検ポリヌクレオチド（Ｆ１）〕
５’末端を蛍光物質「Ｃｙ５」にて修飾し、プローブ（ＰＲ１）に相補的な塩基配列部分を持つ長さ２５塩基のオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）を被検ポリヌクレオチド（Ｆ１）とした（表１）。オリゴＤＮＡ（Ｆ１）は、プローブ（ＰＲ０）に対して一塩基ミスマッチを生じるポリヌクレオチド（Ｂ）であり、プローブ（ＰＲ１）に対しては、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（Ａ）である。
【００７２】
〔被検ポリヌクレオチド（Ｆ０’）〕
標識蛍光物質が「ＦＩＴＣ」であること以外は被検ポリヌクレオチド（Ｆ０）と同じオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）を被検ポリヌクレオチド（Ｆ０’）とした（表１）。
【００７３】
〔被検ポリヌクレオチド（Ｆ１’）〕
標識蛍光物質が「ＦＩＴＣ」であること以外は被検ポリヌクレオチド（Ｆ１）と同じオリゴＤＮＡ（エスペックオリゴサービス株式会社製）を被検ポリヌクレオチド（Ｆ１’）とした（表１）。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
［マイクロ流体デバイスの作製］
〔溝と固定部を有する部材の形成〕
厚さ１ｍｍのアクリル板を支持体（１）として使用し、該支持体（１）上にスピンコーターを用いて、製膜液（Ｙ１）を塗工し、該製膜液（Ｙ１）に紫外線ランプ１により紫外線を４０秒照射して製膜液（Ｙ１）を硬化させると同時に相分離させ、ｎ−ヘキサンで貧溶剤（Ｒ）を洗浄除去して、白色を呈する多孔質層（２）を形成した。
【００７６】
上記多孔質層（２）の上に、スピンコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工し、該組成物（Ｘ１）を前記多孔質層（２）の細孔に充填し、フォトマスクを通して、固定部（５）と成すべき部分以外の部分に紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒行って、照射部の前記組成物（Ｘ１）を硬化させ、非照射部分の細孔に充填されている未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで除去して、多孔質状の固定部（５ａ）、（５ｂ）、（５ｃ）［以下この三者を併せて、固定部（５）と称する］を支持体上に形成した。即ち、固定部（５）以外の多孔質層（２）は、細孔に組成物（Ｘ１）の硬化物が充填されて透明となっている。
【００７７】
上記処理をした多孔質層（２）の上に、スピンコーターを用いて組成物（Ｘ１）を塗工し、フォトマスクを通して、溝（６）と成すべき部分以外の部分に紫外線ランプ２による紫外線照射を１２０秒行って、照射部が半硬化した塗膜（３）を形成し、非照射部分の未硬化の組成物（Ｘ１）をエタノールで除去して、それぞれ固定部（５ａ）、（５ｂ）、（５ｃ）が底面に露出した、溝（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）の三本に分岐した溝（６）を形成した。
【００７８】
〔プローブの固定〕
上記工程２で作製した溝（６）全体に５％ポリアリルアミン（分子量１５０００、日東紡株式会社製）の５％水溶液を配し、カバーブラス（図示せず）を乗せて、６０℃にて１時間静置し、ポリアリルアミン中の一部のアミノ基を多孔質層中のエポキシ基と反応させた後、流水で１５分洗浄して、固定部（５）へのアミノ基の導入を行った。
【００７９】
上記アミノ基を導入した固定部（５）を有する部材を５％のグルタルアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）水溶液中に入れ、５０℃、２時間静置し、ポリアリルアミン中のほぼ全てのアミノ基をグルタルアルデヒド中の片方のアルデヒド基と反応させた後、流水で１０分洗浄することにより、固定部（５）へのアルデヒド基の導入を行った。
【００８０】
次いで、固定部（５）の一つである固定部（５ａ）に、５’末端にアミノ修飾したプローブ（ＰＲ０）の５０μＭ水溶液を２μＬを配し、また、固定部（５ｂ）には、プローブ（ＰＲ１）の５０μＭ水溶液を２μＬ配し、他の部分に移動しないように、マスキングテープ（図示せず）で保護し、カバーグラス（図示せず）を乗せて、湿度１００％、５０℃にて１５時間静置して、ＤＮＡの末端アミノ基を多孔質層のアルデヒド基と反応させた。その後、該部材を０．２％のテトラヒドロ硼酸ナトリウム水溶液中に浸漬して、５分間還元反応させ、次いで、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液でリンスし、次に、０．２×ＳＳＣでリンスし、更に蒸留水でリンスし、自然乾燥させて、固定部（５ａ）にプローブとしてＤＮＡ（ＰＲ０）を、固定部（５ｂ）にプローブとしてＤＮＡ（ＰＲ１）をそれぞれ固定した。固定部（５ｃ）にはプローブは固定されていない。（ここで、０．２×ＳＳＣは０．０３ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液であり、０．１％ＳＤＳは０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液である。）
【００８１】
〔蓋の固着〕
蓋用組成物を、片面がコロナ放電処理された厚さ３０μｍの２軸延伸ポリプロピレンフィルム（二村化学株式会社製）（図示せず）の上に、塗布厚１５０μｍのバーコーターを用いて塗工した。該未硬化塗膜（図示せず）に、紫外線ランプ１により紫外線を２秒照射し、前記組成物の半硬化塗膜（図示せず）を形成し、上記で作製した部材の溝（６）形成面に積層して蓋となる樹脂層（４）となし、紫外線ランプ１により、紫外線を４０秒照射して、該樹脂層（４）を含む全ての層を完全に硬化させて、溝（６）を流路（６）として、マイクロ流体素子を製造した。
【００８２】
この後、流路の両末端に、支持体（１）及び多孔質層（２）を貫通し、流路（６）に通じる直径０．７ｍｍの孔（７ａ）、（７ｂ）、（７ｃ）、（８）をドリルを使用して形成し、更に、該孔（７ａ）、（７ｂ）、（７ｃ）、（８）にそれぞれ内径３ｍｍ、高さ５ｍｍのポリ塩化ビニル管を接着して入口側開口部（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、及び出口側開口部（１０）を形成し、マイクロ流体デバイスを作製した。
【００８３】
［特性の測定］
〔各部の寸法〕
作製したマイクロ流体デバイスの各部の寸法は以下のようであった。外形は７５ｍｍ×２５ｍｍ×約１．２ｍｍ、流路（６）は出口側の端付近で（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）の三本に分岐しており、それぞれ幅が約５００μｍ、高さ（深さ）が約１００μｍ、長さが約５０ｍｍである。蓋となる樹脂層（４）の厚みは約１００μｍであった。固定部（５ａ）、（５ｂ）、（５ｃ）は、それぞれ流路（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）の中央部に設けられ、いずれも幅５００μｍ、流路方向の長さがそれぞれ約３ｍｍであった。
【００８４】
〔多孔質層〕
多孔質層（２）の表面を走査型電子顕微鏡にて観察したところ、直径約０．５μｍの凝集粒子の間隙として、平均孔径約０．７μｍの細孔が形成されていた。また、多孔質層（２）の厚みは約６μｍであった。
前記製造工程の途中の、支持体（１）に多孔質層（２）を形成した段階で、多孔質層（２）に蒸留水を充填し、波長６７０μｍにおける光透過率を測定したところ、透過率は約２８％であった。
【００８５】
また、多孔質層（２）を形成する樹脂のモデルとして、製膜液（Ｙ１）から相分離剤を除いた成分、即ち、「ユニディックＶ−４２６３」（７２部、「Ｒ−６８４」１８部、メタクリル酸グリシジル（和光純薬工業株式会社製）１０部、「イルガキュアー１８４」３部の均一混合液を調製し、これを、片面がコロナ放電処理された厚さ３０μｍの２軸延伸ポリプロピレンフィルム（二村化学株式会社製）（図示せず）の上にバーコーターを用いて塗工し、紫外線ランプ１により紫外線を６０秒照射して硬化させた後、剥離して、厚み約１００μｍのフィルムを得た。アッベ屈折率計を用いて測定したこのフィルムの屈折率は１．４８であった。
【００８６】
〔検体溶液の調製〕
プローブ（ＰＲ０）に相補的な塩基配列部分を持つ、蛍光物質「Ｃｙ５」にて標識したオリゴＤＮＡ（Ｆ０）の５００μＭ溶液を１μＬ、０．２×ＳＳＣ溶液を４９９μＬ、均一に混合して、濃度１μＭのＤＮＡ溶液を調製した。さらに、このＤＮＡ溶液を５０μＬ、０．２×ＳＳＣ溶液５０μＬと混合して、濃度０．５μＭの測定用検体溶液（ＳＦ０）とした。
また、オリゴＤＮＡ（Ｆ０）の代わりに、プローブ（ＰＲ１）に相補的な塩基配列部分を持つオリゴＤＮＡ（Ｆ１）を用いたこと以外は上記と同様にして、測定用検体溶液（ＳＦ１）を調製した。
【００８７】
［検体溶液（ＳＦ０）の測定］
流路型マイクロ流体デバイス（Ｄ）の蓋（４）側にヒーターブロック（図示せず）を接触させて、マイクロ流体デバイス（Ｄ）を８５℃に調節した。
次いで、マイクロ流体デバイス（Ｄ）の入口側開口部（９ａ）、（９ｂ）に測定用検体溶液（ＳＦ０）をそれぞれ２０μL入れ、入口側開口部（９ｃ）には緩衝液を２０μL入れて、マイクロ流体デバイス（Ｄ１）の出口側開口部（１０）から、マイクロシリンジポンプを用いて、入り口開口部（９ａ）、（９ｂ）内の検体溶液（ＳＦ０）と（９ｃ）内の緩衝液が全部出口側開口部（１０）へ移動するまで、１５μＬ／分の速度で吸引した。次いで、該マイクロ流体デバイス（Ｄ）を室温まで自然冷却し、各２０μＬの０．２×ＳＳＣ溶液で流路（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）内を洗浄して、さらに、０．２×ＳＳＣ溶液で流路（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）内に充満したまま、蛍光測定に供した。
【００８８】
蛍光測定は、固定部（５ａ）［プローブ（ＰＲ０）固定部］、固定部（５ｂ）［プローブ（ＰＲ１）固定部］、および  固定部（５ｃ）［プローブ比固定部。バックグラウンド］について行った。測定結果を表１にまとめた。表１から分かるように、ハイブリダイゼーション工程の接触時間が約５分と、従来法の数時間に比べて非常に短時間であるにもかかわらず、プローブ（ＰＲ０）固定部とプローブ（ＰＲ１）固定部の蛍光強度比は約９．７（バックグラウンドを差し引いた値の比）と大きく、また、バックグラウンド［固定部（５ｃ）］の値は十分に小さく、信頼性の高い結果が得られた。
【００８９】
［検体溶液（ＳＦ１）の測定］
検体溶液として、検体溶液（ＳＦ１）を使用したこと以外は、上記「検体溶液（ＳＦ０）の測定」の場合と同様にし測定を行った。結果を表１に示した。
表１から分かるように、ハイブリダイゼーション工程の接触時間が約５分と非常に短時間であるにもかかわらず、プローブ（ＰＲ０）固定部とプローブ（ＰＲ１）固定部の蛍光強度比は約２．７（バックグラウンドを差し引いた値の比）と大きく、また、バックグラウンドも十分に小さく、信頼性の高い結果が得られた。
【００９０】
【表２】
2005224110.tif 000004
【００９１】
［比較例］
ＤＮＡの蛍光標識色素として、「Ｃｙ５」の代わりに「ＦＩＴＣ」を使用したこと、励起波長をと測定波長を前記ＦＩＴＣ用の波長としたこと以外は、実施例１と同様の実験を行った。結果を表２にまとめた。
この場合には、ポリヌクレオチド（Ａ）とポリヌクレオチド（Ｂ）の蛍光強度の差が非常に小さい上、バックグラウンド［固定部（５ｃ）］の値が高く、信頼性に乏しいことが分かる。
【００９２】
【表３】
2005224110.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】実施例に使用した本発明のクロマトグラフィー用流路の模式図である。
【符号の説明】
【００９４】
１    ・・・支持体
２    ・・・多孔質層
３    ・・・塗膜、樹脂層
４    ・・・樹脂層、蓋となる部材
５、５ａ、５ｂ、５ｃ  ・・・固定部
６、６ａ、６ｂ、６ｃ  ・・・溝、流路
７ａ、７ｂ、７ｃ、８  ・・・孔
９ａ、９ｂ、９ｃ  ・・・入り口側開口部
１０  ・・・出口側開口部
【図１】
2005224110.tif 000006