(57)【要約】【課題】タンパク質の混合液から目的タンパク質を迅速に回収することを可能とするグルタチオン固定化磁性微粒子およびそれを用いたタンパク質の分離、精製方法を提供すること。【解決手段】磁性微粒子とグルタチオンとが刺激応答性ポリマーを介して固定されているグルタチオン固定化磁性微粒子であって、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであることを特徴とするグルタチオン固定化磁性微粒子による。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性微粒子とグルタチオンとが刺激応答性ポリマーを介して固定されているグルタチオン固定化磁性微粒子であって、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであることを特徴とするグルタチオン固定化磁性微粒子。
【請求項２】
グルタチオン固定化磁性微粒子の平均粒子径が１〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１記載のグルタチオン固定化磁性微粒子。
【請求項３】
刺激応答性ポリマーが、熱応答性を示すポリマーであることを特徴とする請求項１または請求項２記載のグルタチオン固定化磁性微粒子。
【請求項４】
磁性微粒子とグルタチオンとが熱応答性を示すポリマーを介して固定されているグルタチオン固定化磁性微粒子であって、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであるグルタチオン固定化磁性微粒子を用いて、下記手順で微生物の細胞破砕懸濁液から目的のタンパク質を分離、精製する方法。
▲１▼目的のタンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を微生物に生産させる。
▲２▼微生物を破砕し、細胞破砕懸濁液を調製し、これにグルタチオン固定化磁性微粒子を混合し、融合タンパク質とグルタチオン固定化磁性微粒子との結合体を生成させる。
▲３▼前記細胞破砕懸濁液の温度を下限臨界溶液温度または上限臨界溶液温度に設定し、結合体を凝集させる。
▲４▼凝集した結合体を磁石で分離し、回収する。
▲５▼結合体からタンパク質を分離し、精製する。
【請求項５】
グルタチオン固定化磁性微粒子の平均粒子径が１〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項４記載のタンパク質の分離、精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルタチオン固定化磁性微粒子及びこれを用いた目的タンパク質の分離、精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
混合液から目的物質を分離する方法としては、カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが広く行われている。しかしながら、カラムクロマトグラフィーは、充填剤が充填されたカラムに混合液を通すことから、分離に時間がかかる。目的物質がタンパク質の場合には、タンパク質が分解を受け、収率が低下する恐れがある。
一方、リガンドが固定された粒子を混合液に添加し、目的物質を吸着した後、微粒子を回収し、目的物質を微粒子から分離、回収する方法が知られている。具体的には、ビオチン及びアビジンから選ばれた１種以上が下限臨界溶液温度（以下、「ＬＣＳＴ」と略す。）を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定された温度応答性磁性微粒子と磁石の磁力を用いた生体物質の分離方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、この方法を用いても微生物の細胞破砕懸濁液の中から目的のタンパク質を迅速に回収することはできなかった。
【０００３】
【特許文献１】
国際公開第０２／１６５７１号パンフレット
【０００４】
【本発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の課題は、タンパク質の混合液から目的タンパク質を迅速に回収することを可能とするグルタチオン固定化磁性微粒子及びそれを用いたタンパク質の分離、精製方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するため手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、以下の構成を採用することにより、本発明の課題を解決することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は以下の構成を有する。
（１）磁性微粒子とグルタチオンとが刺激応答性ポリマーを介して固定されているグルタチオン固定化磁性微粒子であって、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであることを特徴とするグルタチオン固定化磁性微粒子。
（２）グルタチオン固定化磁性微粒子の平均粒子径が１〜２００ｎｍであることを特徴とする前記（１）項記載のグルタチオン固定化磁性微粒子。
（３）刺激応答性ポリマーが、熱応答性を示すポリマーであることを特徴とする前記（１）項または前記（２）項記載のグルタチオン固定化磁性微粒子。
（４）磁性微粒子とグルタチオンとが熱応答性を示すポリマーを介して固定されているグルタチオン固定化磁性微粒子であって、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであるグルタチオン固定化磁性微粒子を用いて、下記手順で微生物の細胞破砕懸濁液から目的のタンパク質を分離、精製する方法。
▲１▼目的のタンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を微生物に生産させる。
▲２▼微生物を破砕し、細胞破砕懸濁液を調整し、これにグルタチオン固定化磁性微粒子を混合し、融合タンパク質とグルタチオン固定化磁性微粒子との結合体を生成させる。
▲３▼前記細胞破砕懸濁液の温度を下限臨界溶液温度または上限臨界溶液温度に設定し、結合体を凝集させる。
▲４▼凝集した結合体を磁石で分離し、回収する。
▲５▼結合体からタンパク質を分離し、精製する。
（５）グルタチオン固定化磁性微粒子の平均粒子径が１〜２００ｎｍであることを特徴とする前記（４）項記載のタンパク質の分離、精製方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のグルタチオン固定化磁性微粒子は、磁性微粒子とグルタチオンとが刺激応答性ポリマーを介して固定されており、その平均粒子径が、１〜１０００ｎｍであり、好ましくは、１〜２００ｎｍである。
【０００８】
本発明に用いられる磁性微粒子は、磁石で回収できる強磁性体であり、その平均粒径が、０．９以上、１０００ｎｍ未満であれば、特に制限なく使用することができる。目的タンパク質の認識性を高めるためには、磁性微粒子の平均粒径が、０．９以上、２００ｎｍ未満であることが好ましい。磁性微粒子の素材は、例えば、マグネタイト粒子の他、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石の微粒子及びヘマタイトである。これら磁性微粒子の調製方法は特に限定はないが、例えば、オレイン酸とドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いて、マグネタイトを二重のミセルとし、水溶液中に分散させる、マグネタイトの調製方法を挙げることができる（バイオカタライシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁）。
本発明に用いられる磁石の好ましい磁力は、用いる磁性微粒子の磁力によって異なるが、具体例としてマグナ社製ネオジ磁石を挙げることができる。
【０００９】
また磁性微粒子の回収率を高めるために磁性微粒子の表面に刺激応答性ポリマーが固定されている必要がある。刺激応答性ポリマー固定化磁性微粒子は、磁性微粒子存在下で刺激応答性ポリマーを重合する方法で得ることができる（アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）（１９９４）４１：９９−１０５やジャーナルオブファーメンテーションアンドバイオエンジニアリング（Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ）（１９９７）８４；３３７−３４１に記載されている）。刺激応答性ポリマーは、分散状態では回収困難な磁性微粒子を特定の条件において回収可能な大きさに凝集させる能力を有していれば何れでもよい。刺激は、熱、ｐＨ、塩濃度、光、電気等が挙げられる。刺激応答性ポリマーは、刺激のコントロールが容易な熱応答性を示すポリマーが好ましい。熱応答性を示すポリマーは、例えば、下限臨界溶液温度を示すポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドや、特開平１１−１７１９２８において開示されている上限臨界溶液温度を示すＮアセチルアクリルアミドとアクリルアミドの共重合ポリマーである。
【００１０】
本発明では、グルタチオンを磁性微粒子に固定することで、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略す。）を有する目的タンパク質と特異的に結合できる。このようなＧＳＴ含有タンパク質の調製は当技術分野で周知の方法に従えばよい。磁性微粒子に固定された刺激応答性ポリマーに、グルタチオンを固定する方法としては、国際公開第０１／０９１４１号パンフレットにあるように、重合性を持つようにモノマー化されたリガンドを用いて、ポリマーの重合時に共重合させる方法やポリマーの重合時にカルボン酸やアミノ基、エポキシ基等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、当技術分野で周知の方法に従い、リガンドをポリマー上に固定化する方法が利用できる。
【００１１】
本発明のグルタチオン固定化磁性微粒子を用い、下記手順で微生物の細胞破砕懸濁液から目的のタンパク質を分離、精製することができる。
▲１▼目的のタンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を微生物に生産させる。
▲２▼微生物を破砕し、細胞破砕懸濁液を調整し、これにグルタチオン固定化磁性微粒子を混合し、融合タンパク質とグルタチオン固定化磁性微粒子との結合体を生成させる。
▲３▼前記細胞破砕懸濁液の温度を下限臨界溶液温度または上限臨界溶液温度に設定し、結合体を凝集させる。
▲４▼凝集した結合体を磁石で分離し、回収する。
▲５▼結合体からタンパク質を分離し、精製する。
なお、タンパク質の分離、精製には、グルタチオン固定化磁性微粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍであることが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されることはない。
なお、実施例、比較例中における物性の測定方法、用いた材料の組成は以下の通りである。
【００１３】
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：アクリルアミド、ビスアクリルアミドから作られた１０重量％のポリアクリルアミドゲルを備えた電気泳動装置を用いて、２５ｍＡの電流で電気泳動を行った。なお、マーカーは、アマシャムバイオサイエンス社製タンパク質電気泳動用有色分子量マーカーを使用した。電気泳動を行った後、０．５重量％のクーマシーブリリアントブルー溶液にポリアクリルアミドゲルを浸すことによって、該ゲル中のタンパク質の染色を行った。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なう際に、変性処理を行うが、この処理で目的タンパクはグルタチオン固定化磁性微粒子から外れる。
・精製されたＧＳＴの量：ＧＳＴのバンドをスキャナで取り込み、濃淡を数値化することで算出した。
・グルタチオン固定化磁性微粒子の粒径：粒径は、大塚電子社製ＥＬＳ−８０００ＳＤ型「光散乱光度計」によって測定した。
・ＯＤ：島津製作所社製ＵＶ−１２００型「分光光度計」を用いて、測定を行った。
・ＬＢ培地：酵母エキス（２．５ｇ）、塩化ナトリウム（２．５ｇ）、トリプトン（ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ：５ｇ）を蒸留水（５００ｍｌ）にて懸濁し、滅菌を行った。
【００１４】
磁性微粒子の調製
１Ｌ容のフラスコに硫酸第一鉄・７水和物（８３．４ｇ）、亜硝酸ナトリウム（１０．４ｇ）及び蒸留水（５００ｍｌ）を入れ、４０℃で２０分間撹拌した。
その後、濃アンモニウム（１２５ｍｌ）を添加し、生成した不溶物を濾過により集め、蒸留水で２回洗浄し、マグネタイトを得た。得られたマグネタイトを１Ｌ容のフラスコに入れ、蒸留水（５００ｍｌ）を添加した後、加熱し、溶液の温度を８０℃とした後、オレイン酸ナトリウム（７．５ｇ）を添加し、同温度で２０分間撹拌した。その後、１Ｎ塩酸でｐＨを５．５に調整し、得られた不溶物を濾過により集め、蒸留水で２回洗浄し、オレイン酸の層を有するマグネタイトを得た。これを１Ｌ容のフラスコに入れ、蒸留水（５００ｍｌ）を添加した後、加熱し、溶液の温度を７０℃とした後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（７．５ｇ）を添加し一晩撹拌し、磁性微粒子を得た。
【００１５】
グルタチオンモノマーの調製
還元型グルタチオンの塩酸塩（３０７ｍｇ）、１，４ブタンジオールグリシジルエーテル（１０１０ｍｇ）、ｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（５００μｌ）及び０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（５５０μｌ）の混合物の容量が計５ｍｌになるように蒸留水で調整し、混合した後、室温で１時間反応させた。反応液に等量のアセトンを添加し、生成した析出物を分離し、過剰量の１，４ブタンジオールグリシジルエーテルを除去した。析出物（５０ｍｇ）、ジチオスレイトール（１５ｍｇ）及びｐＨ８．０の０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（５０μｌ）の混合物の容量が計５００μｌになるように蒸留水で調整し、混合した後、室温で１時間反応させた。この反応液にアセトン（５ｍｌ）を添加し、生じた析出物を分離後、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（５００μｌ）に懸濁し、さらにグリシジルメタクリレート（１１．４μｌ）を添加した。室温で１時間放置することで反応させた後、アセトン（５ｍｌ）を添加し析出物を分離後、逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、重合性グルタチオンモノマーを得た。
【００１６】
グルタチオン固定化磁性微粒子の調製は、以下の方法で行った。
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（４８８ｍｇ）、調製したグルタチオンモノマー（５μｇ）、調製した磁性微粒子（５０ｍｇ）に蒸留水を加え、２５ｍｌの溶液とした。これに過硫酸アンモニウム（２５ｍｇ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルメチレンジアミン（１０μｌ）を添加し、窒素置換下で、６時間攪拌を行いながら反応を進行させた。得られたグルタチオン固定化磁性微粒子の粒径は光散乱光度計により約１００ｎｍであることが確認された。またこの粒子はＬＣＳＴを２９℃に有し、ＬＣＳＴ未満の水溶液中では完全に分散し、磁石での回収は困難であったが、溶液をＬＣＳＴ以上とすると直ちに凝集し、磁石で容易に回収するとが可能であった。
【００１７】
実施例１
ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）と目的タンパク質との融合タンパク質の精製を以下の方法で行った。
プラスミド  ｐＧＥＸ６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）で形質転換した大腸菌Ｎｏｖａｂｌｕｅ株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＬＢ培地（５ｍｌ）で３７℃にて一晩培養した後、ＬＢ培地（１００ｍｌ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．３となるまで３７℃で培養を行った。そこに５０μＭとなるようにイソプロピルチオガラクトシドを添加しＧＳＴを誘導した。２時間後、遠心分離器により、集菌し菌体を破砕しＧＳＴを含む細胞破砕懸濁液を得た。この細胞破砕懸濁液（５０μｌ）、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（８５０μｌ）及び調製したグルタチオン固定化磁性微粒子溶液（２．０重量％、１００μｌ）を混合し、インキュベーションを室温で３０分行った後、溶液の温度を３０℃にして該グルタチオン固定化磁性微粒子を凝集させた。凝集した前記グルタチオン固定化磁性微粒子を磁石で回収した。前記溶液の上澄みを捨て、そこに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０００μｌ）を添加し、粒子を分散後、再度、溶液の上澄みを捨て、そこに５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１０００μｌ）を添加し、粒子を分散する洗浄工程を３度繰り返した後、分散させた、前記グルタチオン固定化磁性微粒子溶液（２０μｌ）を取り出しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図１）。
インキュベーション時間を１〜６０分の間に変えて、同様にＧＳＴの精製を行なった。得られたＧＳＴを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。得られたＧＳＴのバンドをスキャナで取り込み、精製されたＧＳＴの量を算出した。
【００１８】
実施例２
ｐＧＥＸ６ｐ−１のマルチクローニングサイト内のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩサイトにプロテインＡのＺＺドメインを挿入したプラスミドｐＧＥＸＺＺを大腸菌Ｎｏｖａｂｌｕｅ株に同様に形質転換し、融合タンパク質を発現させ、その大腸菌の細胞破砕懸濁液を用いた以外は、実施例１の方法に準拠して、融合タンパク質の精製を行った。
【００１９】
図１から、調製したグルタチオン固定化磁性微粒子により、ＧＳＴ及びＧＳＴとＺＺドメインの融合タンパク質が特異的に精製されたことが明らかである。
【００２０】
図１に精製したタンパク質の電気泳動の結果を示した。
レーン１は、分子量マーカー（上から分子量２２００００，９７４００，６６０００，４６０００，３００００，２１５００，１４３００を示す）、レーン２は、ＧＳＴを発現させた大腸菌の細胞破砕懸濁液、レーン３は、調整したグルタチオン固定化磁性微粒子を用いて、実施例１において精製したＧＳＴ、レーン４は、実施例２において、ＧＳＴとＺＺの融合タンパク質を発現させた大腸菌の細胞破砕懸濁液、レーン５は、調整したグルタチオン固定化磁性微粒子を用いて、実施例２において精製したＧＳＴとＺＺの融合タンパク質である。
これらの結果から、発現したＧＳＴ（分子量２５０００）及びＧＳＴ−ＺＺ（分子量３５０００）が単一に精製されていることがわかった。
【００２１】
比較例１
インキュベーション時間を１〜６０分の間に変えて、グルタチオン固定化磁性微粒子の代わりに、ＧＳＴセファロース１０μｌを用いた以外は、実施例１と同様にＧＳＴの精製を行なった。得られたＧＳＴを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
得られたＧＳＴのバンドをスキャナで取り込み、精製されたＧＳＴの量を算出した。
【００２２】
各粒子へのＧＳＴ結合量の経時的変化を図２に示した。
図２の結果より、実施例１で得られたグルタチオン固定化磁性微粒子は、比較例１で用いたアマシャムバイオサイエンス製グルタチオンセファロース（商品名）よりも短時間で目的とするタンパク質と結合することができることがわかった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のグルタチオン磁性微粒子は、細胞破砕懸濁液等のタンパク質の混合液から目的タンパク質を迅速に回収することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動写真。
【図２】各磁性微粒子へのＧＳＴ結合量の経時的変化のグラフ。
【図１】
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【図２】
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