(57)【要約】【課題】  酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調製方法の提供。【解決手段】  実質的に他のいかなる生物も存在しない菌類培養物から酵素を単離する工程を包含する、酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調製方法であって、上記酵素は、この酵素によって分解されないゲルを使用して、単離および／または精製され得、このゲルが、デキストリンまたはその誘導体、好ましくはシクロデキストリン、より好ましくはβ−シクロデキストリンに基づき得、上記菌類は、Morchella costataまたはMorchella vulgarisであり得る、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素、特にα-1,4-グルカンリアーゼ(「GL」)酵素に関する。
【０００２】
本発明はまた同酵素を抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
FR-Ａ-2617502およびBauteら、(Phytochemistry [1988] vol.27 No.11 pp3401-3403)はMorchella vulgarisにおける1,5-D-アンヒドロフルクトース(「AF」)の見かけの酵素反応による産生について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。可能な酵素反応に言及しているのにもかかわらず、これらの２つの文献は、ヌクレオチド配列の情報はもちろんのこと、いかなる酵素についてのアミノ酸配列も示していない。これらの文献は、AFが抗生物質ピロンミクロテシン(pyrone microthecin)の調製のための前駆体になり得ることを報告する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Yuら、(Biochimica et Biophysica Acta [1993] vol 1156 pp313-320)は紅海藻からのGLの調製およびAFを生産するためにα-1,4-グルカンを分解するGLの使用について報告している。このAFの生産量は非常に少ない。GL酵素に言及するのにも関わらず、この文献は同酵素をコードする塩基配列の情報はもちろんのことその酵素についてのいかなるアミノ酸配列データも示していない。この文献はGLの供給源は藻類であることも示唆している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
項１.  実質的に他のいかなる生物も存在しない菌類培養物から酵素を単離する工程を包含する、酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調製方法。
項２.  前記酵素を、該酵素によって分解されないゲルを使用して、単離および／または精製する、項目１に記載の方法。
項３.  前記ゲルが、デキストリンまたはその誘導体、好ましくはシクロデキストリン、より好ましくはβ−シクロデキストリンに基づく、項目２に記載の方法。
項４． 前記菌類が、Morchella costataまたはMorchella vulgarisである、項目１から３のいずれかに記載の方法。
項５.  項目１から４のいずれかに記載の方法により調製される、GL酵素。
項６.  配列番号１または配列番号２、ならびにその任意の変異体のアミノ酸配列を含む酵素。
項７.  酵素α-1,4-グルカンリアーゼをコードし得る、ヌクレオチド配列。
項８.  前記配列がDNA配列である、項目７に記載のヌクレオチド配列。
項９.  前記DNA配列が、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的な相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を含む、項目８に記載のヌクレオチド配列。
項１０.  項目９に記載のヌクレオチド配列の発現を包含する、酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調製方法。
項１１．  酵素、好ましくはGLを精製するための、β-シクロデキストリンの使用。
項１２．  DNA配列が、少なくとも、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または適切なコドン置換を含む配列からなる、ヌクレオチド配列。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によって、菌類の培養物から酵素を単離することを含有する、酵素α-1,4 グルカンリアーゼの調製方法を提供が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明では、菌類の培養物から酵素を単離することを含有する、酵素α-1,4 グルカンリアーゼの調製方法を提供する。ここでの培養物は他の生物が実質上存在しない。
【０００８】
好ましくは、この酵素は単離され、および／またはその酵素によって分解しないゲルを用いてさらに精製される。
【０００９】
好ましくはそのゲルはデキストリンまたはその誘導体、好ましくは、シクロデキストリン、さらに好ましくは、β-シクロデキストリンに基づく。
【００１０】
本発明では、本発明の方法により調製されたGL酵素も提供する。
【００１１】
好ましくは菌類はMorchella costataまたはMorchella vulgarisである。
【００１２】
好ましくは酵素はアミノ酸配列、配列番号１、または配列番号２、またはその任意の変異体を含有する。
【００１３】
用語「その任意の変異体」は、生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、配列からの、または配列へのアミノ酸の置換(substitution)、多様性、修飾、置き換え(replacement)、欠失、付加を意味する。
【００１４】
本発明では、酵素α-1,4-グルカンリアーゼをコードするヌクレオチドを提供する。好ましくはここで配列はその天然環境にはない (すなわち、酵素を発現する細胞生物の天然のゲノムの一部を形成しない)。
【００１５】
好ましくはヌクレオチド配列はDNA配列である。
【００１６】
好ましくはDNA配列は、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的な相同性を有する、または任意の適切なコドン置換を含む配列を包含する。
【００１７】
表現「実質的な相同性」は、構造および／またはヌクレオチド成分および／または生物学的活性に関しての相同性を含有する。
【００１８】
表現「任意の適正なコドン置換を含む」は、生じる酵素がリアーゼ活性を有するという条件で、同じアミノ酸をコードする他のコドンとの任意のコドンの置き換えまたは置換、あるいはコドンの任意の付加または削除を包含する。
【００１９】
他の言葉で言えば、本発明はまた、その中で少なくとも１ヌクレオチドが欠失、置換または修飾される、あるいはその中で付加的な少なくとも１ヌクレオチドが挿入され、グルカンリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、修飾されたDNA配列を含有する。好ましくは酵素は、増加したリアーゼ活性を有する。
【００２０】
本発明では、本発明のヌクレオチド配列を発現することを含む酵素α-1,4-グルカンリアーゼの調整方法も提供する。
【００２１】
本発明では酵素、好ましくはGLを精製するためのβ-シクロデキストリンの使用を提供する。
【００２２】
本発明では、少なくともDNA配列が、配列番号３または配列番号４の任意のDNA配列に同一、または相補的、または実質的相同性を有する、または適切なコドン置換を含む配列からなる、ヌクレオチド配列を提供する。好ましくは配列は単離された形態である。
【００２３】
したがって本研究は、菌類からの酵素α-1,4-グルカンリアーゼの単離に関する。例えば、菌類は以下の任意のものであり得る。
【００２４】
【数１】
2005034156.tif 000002
好ましくは、菌類はMorchella costataまたはMorchella vulgarisである。
【００２５】
初めの酵素精製はYuら（前出）に記載の方法により行い得る。
【００２６】
しかし、好ましくは、初めの酵素精製は、精製工程で変質しない固体の支持体を用いる至適化した手順を含む。このゲル支持体はさらに、標準的な研究室のタンパク質精製設備に適合するという利点を有する。
【００２７】
この至適化した精製ストラテジーの詳細は後述する。精製は、タンパク質精製のための公知の標準的な技術によって終了する。
【００２８】
酵素の純度は補足的な電気泳動技術を用いて容易に確認され得る。
【００２９】
精製されたリアーゼGLはpI、至適温度、至適pHによって特性づけられている。
【００３０】
この点では、菌類のリアーゼは３〜９のpH勾配のゲルでの等電点電気泳動で測定すると5.4付近のpIを示す。８〜25%の勾配ゲルでのSDS-PAGEにより測定した分子量は110kDaであった。この酵素は至適pHを５〜７の範囲で示す。至適温度は30〜45℃の間にあることが見出された。
【００３１】
【数２】
2005034156.tif 000003
aグリコーゲンを基質として用い測定したパラメーター；他のパラメーターはアミロペクチンを基質として測定した。
【００３２】
好ましい実施態様では、α-1,4-グルカンリアーゼ酵素は菌類Morchella costataからβ-シクロデキストリンsepharoseのアフィニティークロマトグラフィーおよびMono Q HR5/5のイオン交換クロマトグラフィー、およびSuperose 12 カラムのゲル濾過によって精製した。
【００３３】
PAS染色によって菌類リアーゼはグリコシル化されていないことが示された。菌類の無細胞抽出物中には、電気泳動ゲル上の活性ゲル染色によって、1つの形態のα-1,4-グルカンリアーゼのみが検出された。
【００３４】
この酵素は、好ましくは精製を容易にするように分泌されるべきである。そのために成熟酵素をコードするDNAを、選択した宿主由来のシグナル配列、プロモーターおよびターミネーターに融合させる。
【００３５】
Aspergillus nigerにおける発現のため、gpdA(Aspergillus nidulansのグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ遺伝子由来) プロモーターおよびシグナル配列を成熟リアーゼをコードするDNA(例えば配列番号３または配列番号４)の5'末端に融合する。A. nigerのtrpC遺伝子のターミネーター配列をその遺伝子の3'末端におく (Punt, P.J.ら、(1991):J.Biotech. 17,19-34)。この構築物をE.coliのための複製オリジンおよび選択オリジンならびにA.nigerのための選択マーカーを含むベクターに挿入する。 A.nigerのための選択マーカーの例としては、amdS遺伝子、argB遺伝子、pyrG遺伝子、hygB遺伝子、BmlR遺伝子などがあり、すべて形質転換体の選択に用いられてきた。このプラスミドをA.nigerに形質転換し得、そして成熟リアーゼを形質転換体の培養液中から回収し得る。
【００３６】
この構築物を培養液中でのリアーゼのタンパク質分解を減少するためにプロテアーゼ欠損株に形質転換し得る (Archer D.B.ら、(1992):Biotechnol.Lett.14,357-362) 。
【００３７】
アミノ酸組成はBarholtおよびJensen（Anal Biochem (1989) vol 177 pp318-322)の方法によって確立し得る。精製したアミノ酸のアミノ酸分析のための試料は69μg/mlのタンパク質を含み得る。
【００３８】
本発明に従うGL酵素のアミノ酸配列を配列番号１および配列番号２に示す。
【００３９】
以下の試料はブダペスト条約に従って承認された受託機関であるThe National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Scotland,United Kingdom, AB2 1RYへ1994年10月3日に寄託した。
【００４０】
プラスミドpMC保有E. coli (NCIMB 40687)  （参照 DH5α-pMC)
プラスミドpMV1保有E. coli (NCIMB 40688)  （参照 DH5α-pMV1)および、
プラスミドpMV2保有E. coli (NCIMB 40689)  （参照 DH5α-pMV2)
プラスミドpMCは、Morchella costataより作製したゲノムライブラリーから単離した4.1kbのフラグメントを含むpBluescript II KSである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子を含む。
【００４１】
プラスミドpMV1は、Morchella vulgarisより作製したゲノムライブラリーから単離した2.45kbのフラグメントを含むpBluescript II KSである。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子の５'末端を含む。
【００４２】
プラスミドpMV2は、Morchella vulgarisより作製したゲノムライブラリーから単離した3.1kbのフラグメントを含むpPUC19である。このフラグメントはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子の３'末端を含む。
【００４３】
以下の考察において、MCはMorchella costataを示し、MVはMorchella vulgarisを示す。
【００４４】
記載したとおり、 Morchella vulgaris由来のGLをコードする配列は２つのプラスミド中に含まれていた。図５を参考にすると(後に考察する)pMV1は454位から2902位のヌクレオチドを含む；そしてpMV2は2897位から下流(および2897位を含む)ヌクレオチドを含む。図２および図３を参考にすると(後に考察する)、コード配列をライゲーションするためにpMV2を制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化し、目的のフラグメントを制限酵素EcoRIおよびBamHIで消化したpMV1に挿入し得る。
【００４５】
このように本発明の高度に好ましい実施態様は、寄託物NCIMB 40687、あるいは寄託物NCIMB 40688および寄託物NCIMB 40689のいずれかの対象であるプラスミド中に存在するGLコード配列の発現から取得可能なGL酵素を含む。
【００４６】
本発明はここで実施例によってのみ記載される。
【００４７】
付属の配列リストの中で：配列番号１はMorchella costataから得たGLのアミノ酸配列である；配列番号２はMorchella vulgarisから得たGLのアミノ酸配列である；配列番号３はMorchella costataから得たGLのヌクレオチドコード配列である；そして配列番号４はMorchella vulgarisから得たGLのヌクレオチドコード配列である。
【００４８】
配列番号１において全残基数は1066である。GL酵素は以下のアミノ酸組成を有する：
【００４９】
【数３】
2005034156.tif 000004
配列番号２において全残基数は1070である。 GL酵素は以下のアミノ酸組成を有する：
【００５０】
【数４】
2005034156.tif 000005
１.菌類Morechella costata由来のα-1,4-グルカンリアーゼの酵素精製および特徴付け
１.１  材料と方法
菌類Morchella costataはAmerican Type Culture Collection(ATCC)より得た。ATCCが推奨する培地を用いて25℃で振とう機で増殖させた。菌糸を濾過により回収し0.9% NaClで洗浄した。
【００５１】
菌類細胞をホモジナイゼーションによって破壊し、次いで氷上で6×3分間、50mMクエン酸-NaOH pH6.2(緩衝液A)中で超音波破砕_msoanchor_1[山本秀策1]_msoanchor_1 した。細胞破片(debris)は25,000×g、40分間遠心して取り除いた。この手順で得られた上清を無細胞抽出物とみなし、８〜25%の勾配ゲルで分離した後、活性染色およびウエスタンブロッティングに用いた。
【００５２】
１.２  β-シクロデキストリンSepharoseゲルによる分離
無細胞抽出物をあらかじめ緩衝液Aで平衡化したβ-シクロデキストリンSepharoseゲル4Bカラム( 2.6×18cm )に直接かけた。このカラムを３倍量の緩衝液Aおよび1M NaClを含む２倍量の緩衝液Aで洗浄した。α-1,4-グルカンリアーゼを緩衝液A中の2% デキストリンを用いて溶出した。活性のある画分をプールし、緩衝液を20mM ビス-トリスプロパン-HCl (pH 7.0, 緩衝液B )に変えた。
【００５３】
活性のある画分をあらかじめ緩衝液Bで平衡化したMono Q HR 5/5カラムにかけた。菌類のリアーゼを0.3Ｍ NaClの直線勾配で緩衝液Bを用いて溶出した。
【００５４】
β-シクロデキストリンSepharoseクロマトグラフィーの後に得られたリアーゼ調製物は、あるいは150μlに濃縮し、FPLC条件下で操作されたSuperose12カラムにかけた。
【００５５】
１.３  α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイならびに基質特異性、至適pH、および至適温度決定のための条件
α-1,4-グルカンリアーゼ活性のアッセイのための反応混合液は10mg/mlアミロペクチンおよび25mM Mes-NaOH (pH 6.0)を含んだ。
【００５６】
反応は30℃で30分間行い、3,5-ジニトロサリチル酸試薬を加えて停止した。光学密度は、室温で10分間おいた後に550nmで測定した。無細胞抽出物を用いる場合は10mM EDTAをアッセイ混合液に添加した。
【００５７】
アッセイ混液内の基質アミロペクチンは、他の基質に置き換え得る。そして反応温度は本文に記載したとおり変化し得る。
【００５８】
至適pHの研究において、反応混液は40mMの緩衝液中に10mg/mlのアミロペクチンまたはマルトテトラオースを含んだ。用いた緩衝液はグリシン-NaOH (pH 2.0〜3.5)、HoAc-NaoAc (pH 3.5〜5.5)、Mes-NaOH (pH 5.5〜6.7)、Mops-NaOH (6.0〜8.0)およびbicine-NaOH (7.6〜9.0)であった。反応は30℃で30分間行った。至適温度の研究における反応条件は、全ての実験でMops-NaOH(pH6.0)を用いた以外は上記と同じである。反応温度は本文に記載したとおり変化し得る。  
【００５９】
SDS-PAGE、ネイティブ-PAGEおよび等電点電気泳動は、8〜25%勾配ゲルおよび３〜９のpH勾配ゲルそれぞれを用いて、PhastSystem(Pharmacia Sweden)で行った。電気泳動の後、ゲルを製造業者(Pharmacia)が推奨する手順に従って銀染色により染色した。糖タンパク質は、PhastSystemに適応してPASによって染色した。活性染色のために、電気泳動はネイティブな条件下、６℃で行った。
【００６０】
電気泳動の後、ゲルを１%の可溶性デンプン存在下、30℃１晩インキュベートした。菌類リアーゼの活性バンドはI2/KI溶液で染色することによって明らかにした。
【００６１】
１.４ 結果
1.4.1  α-1,4-グルカンリアーゼの精製、分子量および等電点
菌類リアーゼが、β-シクロデキストリンSepharose、デンプンおよびRed Sepharoseで充填したカラムに吸着することが見出された。β-シクロデキストリンSepharose 4Bゲルおよびデンプンで充填したカラムを精製の目的のために用いた。
【００６２】
この工程で得られたリアーゼ調製物は菌類リアーゼよりも高い分子量を有するごく少量の混入タンパクを含んでいた。この不純物は、Mono Q HR 5/5でのイオン交換クロマトグラフィーまたは、より効果的にはSuperose 12でのゲル濾過のいずれによっても取り除かれた。
【００６３】
精製された酵素は無色に見え、可視光領域では吸光度を示さなかった。分子量はSDS-PAGEによって見積もり、110kDaと測定された。
【００６４】
精製された菌類リアーゼはpH勾配３〜９のゲル上での等電点電気泳動によって測定したところ、pI 5.4の等電点を示した。ネイティブ電気泳動ゲル中で、酵素は１本のシングルバンドに見えた。活性染色によって検出されたようにこのバンドはデンプン分解活性を示した。酵素を抽出した培養物の新旧によって、ネイティブおよび等電点電気泳動上の酵素は、同じ移動度とpIを有してシャープなバンドとして、または拡散したバンドとして検出された。
【００６５】
1.4.2  菌類リアーゼ触媒反応の至適pHおよび至適温度
菌類リアーゼ触媒反応の至適pH範囲はpH5とpH7の間であることが見出された。
【００６６】
1.4.3  基質特異性
精製された菌類リアーゼはマルトースからマルトヘプタオースへとマルトサッカリドを分解した。しかしながらその分解度は様々であった。マルトテトラオースで最も高い活性が達成され（活性100%とする)、次いでマルトヘキサオース（97%)、マルトヘプタオース(76%)、マルトトリオース(56%)、そして最も低い活性はマルトース(2%)で観察された。
【００６７】
アミロペクチン、アミロースおよびグリコーゲンは菌類リアーゼによって分解された(%は今後決定する) 。 菌類リアーゼは、p-ニトロフェニルα-D-マルトヘプタオースは分解するが還元末端をブロックしたp-ニトロフェニルα-D-マルトヘプタオースを分解しないので、エキソリアーゼでありエンドリアーゼではなかった。
【００６８】
１.５  Morchella Vulgaris
Morchella Vulgarisから得られたα-1,4-グルカンリアーゼの酵素精製および特徴付けのプロトコルは上で述べたMorchella Costataと同様である(結果も同様であった。上記の結果を参照のこと)。
【００６９】
２.  菌類由来のα-1,4-グルカンリアーゼのアミノ酸配列決定
２.１  リアーゼのアミノ酸配列決定
リアーゼをClostridium histolyticum由来のエンドプロティナーゼArg-CまたはLysobacter enzymogenes由来のエンドプロティナーゼLys-Cのいずれかでで消化した。いずれも配列決定用グレードであり、Boehringer Mannheim, Germanyから購入した。エンドプロティナーゼArg-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの10M尿素、50mM メチルアミン、0.1M Tris-HCl、pH7.6に溶解した。N2で覆い、10μlの50mM DTTおよび5mM EDTAを添加し、N2下50℃で10分間、タンパク質を変性および還元させた。続いて、10μlの50mM Tris-HCl、pH 8.0中の1μgのエンドプロティナーゼArg-Cを添加し、N2で覆い、消化を37℃で6時間行った。
【００７０】
次のシステインの誘導体化のために、12.5μlの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下、暗所で室温、15分間インキュベートした。
【００７１】
エンドプロティナーゼLys-Cでの消化のために、凍結乾燥したリアーゼ(0.1mg)を50μlの8M尿素、0.4M NH4HCO3、pH8.4に溶解した。 N2で覆い、5μlの45mM DTTを添加した後、N2下50℃で15分間、タンパク質を変性および還元させた。室温まで冷却した後、5μlの100mM ヨードアセトアミドを添加して、N2下、暗所で室温、15分間システインを誘導体化した。次いで、90μlの水および50μlの50mM tricineおよび10mM EDTA、pH 8.0中の5μgのエンドプロティナーゼLys-Cを添加し、消化をN2下37℃24時間行った。
【００７２】
この結果生じたペプチドを溶媒A(水中の0.1% TFA)および溶媒B(アセトニトリル中の0.1% TFA)を用いて、VYDAC C18カラム(0.46×15cm; 10μm; The Separations Group ; California)上の逆相HPLCに分離した。選択したペプチドをパルス化高速液体サイクル(pulsed-liquid fast cycles)を用いてApplied Biosystems 476A シーケンサーによって配列決定する前に、Develosil C18 カラム(0.46×10cm; 3μm; Dr.Ole Schou, Novo Nordisk, Denmark)で再クロマトグラフした。
【００７３】
菌類Morchella costata由来の酵素のアミノ酸配列情報を図７に示す。
【００７４】
菌類Morchella vulgaris由来の酵素のアミノ酸配列情報を図８に示す。
【００７５】
３.  菌類由来のα-1,4-グルカンリアーゼをコードする遺伝子のDNA基配列決定
３.１  分子生物学のための方法
DNAをDellaporteらに記載のとおり(1983-Plant Mol Biol Rep vol1 pp19-21)単離した。
【００７６】
３.２ PCR
目的のDNAの調製は、Gene Amp DNA Amplification Kit(Perkin Elmer Cetus, USA)を使用し、Taq ポリメラーゼを後に加え(PCRサイクルを参照のこと)、温度サイクルを以下のように変更した以外は製造業者の使用説明書に従い行った：
【００７７】
【数５】
2005034156.tif 000006
３.３  PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントは製造業者の使用説明書に従いpT7Blue(Novagen)にクローニングした。
【００７８】
３.４  DNA配列決定
二本鎖DNAはSangerら(1979)のジデオキシ法に本質的に従い、Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia)およびPharmacia LKB A.L.F.DNA シーケンサー(参考： Sanger,F., Nicklen,S. およびCoulson,A.R.(1979). 鎖終結インヒビターを用いたDNA配列の決定 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467.)を用いて配列決定を行った。
【００７９】
３.５  ライブラリーのスクリーニング
Stratageneより得た、λZapライブラリーのスクリーニングを、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを2×SSC、0.1% SDS、10×Denhardt'sおよび100μg/ml変性サケ精子DNA中で行った以外は製造者の使用説明に従って行った。
【００８０】
ハイブリダイゼーション溶液に32Pで標識した変性プローブを添加した。ハイブリダイゼーションは55℃で１晩行った。フィルターを２×SSC、0.1% SDS中で２回、および１×SSC、0.1% SDS中で２回洗浄した。
【００８１】
３.６  プローブ
クローン化したPCRフラグメントを、適切な制限酵素を用いた消化により、pT7blueベクターから単離した。フラグメントをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、フラグメントをAgarase (Boehringer Mannheim)によってアガロースから精製した。フラグメントはわずか90〜240 bpの長さであったので単離したフラグメントをPrime-It random primer Kit (Stratagene)またはReady to Go DNA labelling kit (Pharmacia)を用いて32P-dCTPで標識する前にライゲーション反応に曝した。
【００８２】
３.７  結果
3.7.1  α-1,4-グルカンリアーゼをコードするPCR DNAフラグメントの生成
α- 1,4-グルカンリアーゼ由来の、３つの重複するトリプシンペプチドのアミノ酸配列(下に示す)を、混合オリゴヌクレオチドを生成するために用いた。このオリゴヌクレオチドはMCおよびMVの両方から単離したDNAを増幅するためのPCRプライマーとして用いられ得た。
【００８３】
【数６】
2005034156.tif 000007
第１のPCR増幅においてプライマーA1/A2 (下記参照)を上流側のプライマーとして用い、プライマーB1/B2 (下記参照)を下流側のプライマーとして用いた。
【００８４】
【数７】
2005034156.tif 000008
PCR産物を2%LMTアガロースで分析し、予想されたサイズのフラグメントはゲルから切り取り、そしてAgarase (Boehringer Manheim)で処理してpT7blueベクター(Novagen)にクローン化して配列決定した。
【００８５】
PCR増幅からクローン化されたフラグメントは配列決定されたペプチド(前記参照)に相当するアミノ酸をコードしており、いずれの場合も２つのイントロンが付加されていた。MCについては、PCRで増幅されたDNA配列は、図４を参考にすると、1202位から1522位に示される配列に相当する。MVについては、PCRで増幅されたDNA配列は、図５を参考にすると、1218位から1535位に示される配列に相当する。
【００８６】
3.7.2  クローン化されたPCRフラグメントを用いたゲノムライブラリーのスクリーニング
上記したクローンを用いたライブラリーのスクリーニングによりいずれの供給源についても２クローンずつが得られた。MCについては２つのクローンを組み合わせて、図４(下記参照)に示す配列を形成した。 MVについては上記の方法で２つのクローンを組み合わせて、図５に示す配列を形成した。
以下のオリゴヌクレオチドを上流側のプライマーとして使用し：
AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT
図４中のbp 1297〜1318の相補的配列を含むプライマーを下流のプライマーとして使用して、 MCクローンATG開始コドンの直前にPstI、PvuII、AscIおよびNcoI制限酵素部位を付加するためにさらなるPCRを行った。
【００８７】
ゲノムクローンの１つ(第１のクローン)からのBglII-EcoRIフラグメントとして遺伝子の5'末端を、pBluescript II KS+ベクター(Stratagene)のBamHI-EcoRI部位にクローニングすることによって完全なMCの配列を生成させた。次に、他のゲノムクローン(第２クローン)のNspV(平滑末端化、Amersham InternationalのDNA blunting kit を使用)-EcoRIフラグメントを、修飾したpBluescript II KS+ベクターをEcoRI-EcoRVで消化した後にライゲーションして、遺伝子の3'末端を修飾したpBluescript II KS+ベクターにクローン化した。そして遺伝子の中間部分は、EcoRIで消化したさらに修飾されたpBluescript II KS+ベクターに、第１のクローンからのEcoRIフラグメントとして、そのフラグメントをライゲーションすることによってさらに修飾されたpBluescript II KS+ベクターにクローン化した。
４.  GL遺伝子の微生物での発現
GLをコードするDNA配列は、高い比活性で、大量に酵素を産生するために微生物中に導入され得る。
【００８８】
これに関して、MC遺伝子(図４)をPichia pastorisで発現させるために (Invitrogenにより供給されるPichia Expression Kit中に記載のプロトコールに従って)Pichia 発現ベクターpHIL-D2(AOX1プロモーターを含有する)をEcoRIで消化し平滑末端化(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)したものに、XbaI-XhoI平滑末端化(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)フラグメントとしてクローン化した。
【００８９】
別の実施様態では、MC遺伝子１(前述したようにPCRにより修飾し制限酵素部位を導入した以外は図４と同じ)は、Aspergillus nigerで発現させるために (Pallら、(1993)Fungal Genet Newslett. vol 40 pages 59-62) 、Aspergillus発現ベクターpBARMTE1 (Neuropera crassa由来のメチルトリプトファン耐性プロモーターを含有する)をSmaIで消化したものに、PvuII-XhoI平滑末端化フラグメント(Amersham InternationalのDNA blunting kitを使用)としてクローン化した。プロトプラストはDaboussiら(Curr Genet(1989) Vol 15 pp 453-456)に従って溶解(lysing)酵素Sigma L-2773およびリティカーゼ(lyticase)Sigma L-8012を使用して調製した。プロトプラストの形質転換はBuxtonら(Gene (1985) vol 37 pp 207-214)に記載のプロトコルに従ったが、形質転換したプロトプラストのプレーティングに関しては、0.6%の浸透圧安定化トップアガロースを使用した以外はPuntら(Methods in Enzymology (1992) vol 216 pp 447-457)により立案されたプロトコールに従った。
【００９０】
結果として、形質転換したPichia pastorisおよびAspergillus nigerにおいてリアーゼ活性が観察された。これらの実験を以下に記載する。
Pichiaリアーゼ形質転換体およびAspergillusリアーゼ形質転換体の分析
一般的方法
無細胞抽出物の調製。
【００９１】
細胞は9000rpm、5分間遠心することによって回収し、0.9%NaClで洗浄し、破砕(breaking)緩衝液(1mM EDTA 、および5% グリセロール含有50mM K-リン酸、pH7.5)に再懸濁した。細胞はガラスビーズおよびボルテックス処理を用いて破砕した。破砕緩衝液は1mMのPMSF(プロテアーゼインヒビター)を含有した。リアーゼ抽出物(上清)を、9000rpmで５分間遠心し、次いで20,000×gで５分間遠心後得た。
アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬(DNS)によるリアーゼ活性のアッセイ
リアーゼ抽出物の１倍量を等量の4%アミロペクチン溶液と混合した。反応混合液は制御された温度でインキュベートし、そして試料は特定の間隔で取り出しAFについて分析した。
【００９２】
リアーゼ活性はまた、放射活性方法を使用して分析した。
【００９３】
反応混合液は、10μlの14C-デンプン溶液(1μCi; Sigma Chemicals Co.)および10μlのリアーゼ抽出物を含有した。反応混合液は25℃で１晩おき、その後通常のTLC系で分析した。生成された放射活性AF産生量はInstant Imager(Pachard Instrument Co.,Inc.,Meriden,CT)を用いて検出した。
電気泳動およびウェスタンブロッティング
SDS-PAGEは8〜25%勾配ゲルおよびPhastSystem(Pharmacia)を使用して行った。ウェスタンブロッティングもPhastSystemのSemidry transfer unitで実施した。 Qingdao(China)で採取された紅海藻から精製されたリアーゼに対してもたらされた１次抗体を1:100に希釈して使用した。アルカリホスファターゼ(Dako A/S, Glostrup, Denmark)に結合したブタ抗ウサギIgGを２次抗体として使用し、1:1000に希釈して使用した。                      
【００９４】
パートI、前記構築物を含有するPichia形質転換体の分析
【００９５】
【数８】
2005034156.tif 000009
＊比活性は、25℃におけるAF産生のnmol/分/mgタンパク質で定義される。
【００９６】
パートII、Aspergilus形質転換体
結果
I.  リアーゼ活性は、５日間のインキュベーション(0.2% カゼイン酵素的加水分解産物を含む最少培地)の後、アルカリ性3,5-ジニトロサリチル酸試薬による分析で測定した。
【００９７】
【数９】
2005034156.tif 000010
＊比活性は25℃におけるAF産生のnmol/分/mgタンパク質で定義される。
【００９８】
結果はMC-リアーゼがA.nigerにおいて細胞内で発現したことを示す。
【００９９】
宿主としてAspergillus nigerの代わりに、良好な発現系として公知の他の工業的に重要な微生物も使用され得る；それらの例としては以下が挙げられる：
【０１００】
【数１０】
2005034156.tif 000011
本発明の他の好ましい実施態様は、以下のすべてを含む : 本明細書に記載のDNA配列を導入した結果AF産生能力を有する形質転換された宿主生物； 微生物であるこのような形質転換された宿主生物-好ましくはここで宿主生物は細菌、糸状菌、菌類および酵母からなる群から選択される；好ましくは宿主生物は以下の生物からなる群から選択される：
【０１０１】
【数１１】
2005034156.tif 000012
；同上の配列をコードするヌクレオチド配列を含有する形質転換された宿主生物によって発現される酵素α-1,4-グルカンリアーゼとα-1,4-グルカン(例えば デンプン)の接触工程を包含する糖1,5-D-アンヒドロフルクトースの調製方法、好ましくは、ここでヌクレオチド配列はDNA配列であり、好ましくはここでDNA配列は、本明細書中で先に記載の配列の１つである ; 本明細書が先に記載のヌクレオチド配列を含有するベクター、好ましくは、ここでベクターは複製ベクターである、好ましくは、ここでベクターはプロモーター配列から下流にヌクレオチド配列を含有する発現ベクターである、好ましくは、ベクターはマーカー(例えば 耐性マーカー)を含有する ; このようなベクターで形質転換された細胞性生物、または細胞系、; 産物α-1,4-グルカンリアーゼを産生する方法あるいはα-1,4-グルカンリアーゼをコードする任意のヌクレオチド配列、またはその部分、これは、このようなベクターで形質転換されたこのような生物(または細胞系由来の細胞)の培養および産物の回収を包含する。
【０１０２】
本発明の他の修飾は、本発明の範囲内からそれることなく当業者に明白である。
【０１０３】
以下の実施例において、添付する以下の図に言及する：
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１はpMCのプラスミド地図を示す；
【図２】図２はpMV1のプラスミド地図を示す；
【図３】図３はpMV２のプラスミド地図を示す；
【図４−１】図４はMorchella costataより得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'非翻訳領域の一部を示す；より詳細には、図４において、全塩基数は4726であり、DNA配列組成は：1336A ; 1070C ; 1051G ; 1269Tである。ATG開始コドンを太字で示す。イントロンには下線を付す。終止コドンを斜体で示す。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図５−１】図５はMorchella vulgarisより得られたゲノムDNAのGLコード配列ならびに5'および3'非翻訳領域の一部を示す；  図５において、全塩基数は4670であり、DNA配列組成は：1253 A ; 1072 C ; 1080 G ; 1265 Tである。 ATG開始コドンを太字で示す。イントロンには下線を付す。終止コドンを斜体で示す。
【図５−２】図５−１の続き。
【図５−３】図５−２の続き。
【図６−１】図６はMorchella costataおよびMorchella vulgaris由来の、GLコード配列および非翻訳領域の比較を示す；  図６において、２つの並べられた(aligned)配列はMC(全残基数：1066)およびMV(全残基数1070)から得た配列である。使用した比較マトリックスは構造-遺伝子的マトリックス(structure-genetic matrix)(Open gap cost:10；Unit gap cost:2)である。この図の中で、二つの並べられた残基が同一であるという記号は「：」である。二つの並べられた残基が類似であることを示す記号は「.」である。類似であるといわれるアミノ酸はA,S,T ; D,E; N,Q ; R,K ; I,L,M, ; F,Y,W である。全体で：同一：920(86.30%); 類似：51(4.78%)である。MC内に挿入されるギャップ数は１であり、MVに挿入されるギャップ数は１である。
【図６−２】図６−１の続き。
【図７】図７は配列番号１として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定されたペプチドフラグメントの位置を示す；
【図８】図８は配列番号２として表されるアミノ酸配列を示し、配列決定されたペプチドフラグメントの位置を示す。
【０１０５】
（配列表）
【化１−１】
2005034156.tif 000013
【０１０６】
【化１−２】
2005034156.tif 000014
【０１０７】
【化１−３】
2005034156.tif 000015
【０１０８】
【化１−４】
2005034156.tif 000016
【０１０９】
【化１−５】
2005034156.tif 000017
【０１１０】
【化１−６】
2005034156.tif 000018
【０１１１】
【化１−７】
2005034156.tif 000019
【０１１２】
【化１−８】
2005034156.tif 000020
【０１１３】
【化１−９】
2005034156.tif 000021
【０１１４】
【化１−１０】
2005034156.tif 000022
【０１１５】
【化１−１１】
2005034156.tif 000023
【０１１６】
【化１−１２】
2005034156.tif 000024
【０１１７】
【化１−１３】
2005034156.tif 000025
【０１１８】
【化１−１４】
2005034156.tif 000026
【０１１９】
【化１−１５】
2005034156.tif 000027
【０１２０】
【化１−１６】
2005034156.tif 000028
【０１２１】
【化１−１７】
2005034156.tif 000029
【０１２２】
【化１−１８】
2005034156.tif 000030
【図１】
2005034156.tif 000031
【図２】
2005034156.tif 000032
【図３】
2005034156.tif 000033
【図４−１】
2005034156.tif 000034
【図４−２】
2005034156.tif 000035
【図４−３】
2005034156.tif 000036
【図５−１】
2005034156.tif 000037
【図５−２】
2005034156.tif 000038
【図５−３】
2005034156.tif 000039
【図６−１】
2005034156.tif 000040
【図６−２】
2005034156.tif 000041
【図７】
2005034156.tif 000042
【図８】
2005034156.tif 000043