(57)【要約】【課題】  生物発光、化学発光，蛍光など微弱光スペクトルの測定において光検出器の波長感度特性のばらつきの補正、更には該微弱光スペクトルを光強度の絶対値である光子数を単位として測定・表示する。【解決手段】  発光、蛍光試料の光を入射する試料部、白色光源と基準光源とを切り替え照射する光源部、上記試料部からの光を集める集光部、この集めた光を分光する分光部、この分光された光の強度を計測する検出部及び該計測された相対光強度を補正・変換計算し表示する演算処理表示部とより測定装置を構成する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微弱光を発する試料の光スペクトル測定において、白色光源の光スペクトル形状を近似曲線で表し、該白色光源の光スペクトルを検出器で計測し、この計測値と上記近似曲線とにより上記検出器の波長感度特性を算出し、上記微弱光を発する試料の光スペクトルを上記検出器で相対光強度を単位として計測し、この計測で得られた相対光強度を上記波長感度特性のばらつきを除去するよう補正した相対光強度を得、次に同じ検出器を用いて波長とエネルギーとが既知の基準光の光スペクトルについても計測して更に相対光強度を得、この更なる相対光強度と上記既知の波長とエネルギーから算出した光子数との間の係数を求め、上記補正した相対光強度を光子数の単位に変換し、前述した微弱光を発する試料の光スペクトルの相対光強度を光子数を単位として得ることを特徴とする微弱光スペクトル測定方法。
【請求項２】
微弱光を発する試料の光スペクトル測定において、白色光源の光スペクトル形状を近似曲線で表し、該白色光源の光を減光して光スペクトルを検出器で計測し、この計測値と上記近似曲線とにより上記検出器の波長感度特性を算出し、上記微弱光を発する試料の光スペクトルを上記検出器で相対光強度を単位として計測し、この計測で得られた相対光強度を上記波長感度特性のばらつきを除去するよう補正した相対光強度を得、次に同じ検出器を用いて波長とエネルギーとが既知の減光した基準光の光スペクトルについても計測して更に相対光強度を得、この更なる相対光強度と上記既知の波長とエネルギーから算出した光子数との間の係数を求め、上記補正した相対光強度を光子数の単位に変換し、前述した微弱光を発する試料の光スペクトルの相対光強度を光子数を単位として得ることを特徴とする微弱光スペクトル測定方法。
【請求項３】
微弱光を発する試料の光スペクトル測定装置において、該試料を置くか測定対象とする光を入射する試料部、白色光源と基準光源とを切り替え照射する光源部、上記試料部からの光を集める集光部、この集められた光を分光する分光部、該分光された光の強度を計測する検出部及び該計測された相対光強度を補正・変換計算し表示する上記演算処理表示部とより成り、白色光源の光スペクトル形状を演算処理表示部で近似曲線で表し、上記光源部の光スペクトルを上記検出部で計測し、この計測値と上記近似曲線とにより上記検出部の波長感度特性を上記演算処理表示部で算出し、上記微弱光を発する試料の光スペクトルを上記検出部で相対光強度を単位として計測し、この計測で得られた相対光強度を上記波長感度特性のばらつきを除去するよう補正した相対光強度を得、次に同じ検出部を用いて波長とエネルギーとが既知の基準光の光スペクトルについても計測して更に相対光強度を得、この更なる相対光強度と上記既知の波長とエネルギーから算出した光子数との間の係数を上記演算処理表示部で求め、上記補正した相対光強度を光子数の単位に上記演算処理表示部で変換し、前述した微弱光を発する試料の光スペクトルの相対光強度を光子数を単位として得ることを特徴とする微弱光スペクトル測定装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は生物発光、化学発光、蛍光試料の発する微弱光スペクトル測定における検出器の波長感度特性のばらつきの補正、光スペクトルを光強度の絶対値である光子数を単位として測定・表示する方法およびその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】  ホタルの生物発光系は遺伝子からタンパク質が合成される遺伝子発現を可視化する手段として広く用いられている。この方法はルシフェラーゼアッセイ法と呼ばれ、細胞内で特定の検討対象遺伝子をホタル発光酵素ルシフェラーゼ遺伝子に置き換え、培養後発光基質ルシフェリンを加え、生じた総発光量から遺伝子発現の様子を推定しようとするものである。【０００３】  現在では、細胞数や培養状態および発光条件を補正するためデュアルルシフェラーゼアッセイ法や発光色の異なる変異体や異なる生物系ルシフェラーゼも利用され、近年更にＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＢＲＥＴ）と呼ばれる手法も開発されつつある。ＦＲＥＴ、ＢＲＥＴは、タンパク質間、タンパク質と核酸の相互作用やタンパク質の修飾、切断、構造変化といった、機能解析の対象として重要な現象を発光色や蛍光色の波長変化により可視化する手段として注目されている。【０００４】  しかし、いずれの場合にも培養細胞中で発現した微量物質に依存した光を計測する為、光量は微弱で長時間安定した光を発することはない。このため従来の蛍光分光測定装置などの、測定範囲内の光強度を波長の順に走査し測定する走査型スペクトル測定装置では、試料である細胞や細胞内微量物質から発せられる総光強度が時間とともに変化する為、各波長の光強度は真の強度と時間による変化率の積として計測されることになり不安定な光強度の試料は光スペクトル測定には適用することができなかった。【０００５】  また、試料からの光は微弱で、この微弱な光強度の試料を測定しようとした場合には、走査時に波長毎の計測時間を検出が可能となるまで長く設定する必要があり、ひとつの試料の測定に長時間を要し、実際の測定は不可能であった。【０００６】  光通信の光源やファイバー減衰率測定に用いる光スペクトラムアナライザーもマイケルソン干渉計などを搭載し、波長精度の高いスペクトル測定装置ではあるが、測定方式はやはり走査型で長時間を要し、安定した光であってしかもレーザーパルスなど高輝度の試料を対象としており、微弱光には対応できていなかった。【０００７】  光計測に用いる検出器の波長感度特性は波長毎に異なり、全ての波長で同一ではなく異なった値を示す。このため測定された試料の光スペクトルは、補正を行わず表示を行った場合は、検出器の波長感度特性の影響を受けみかけのスペクトルとなってしまい、試料本来の真の光スペクトルは得られない。【０００８】  検出器の波長感度特性の影響を補正し、試料本来の真の光スペクトルを得るには、試料と波長感度特性を同条件で計測し補正演算を行う必要があるが、試料測定範囲波長全域の波長毎の波長感度特性を試料測定毎に入れ替えることは難しく、スペクトル測定装置に組み込まれる検出器の波長感度特性を事前に計測し、光スペクトル測定装置で試料の光スペクトルを測定後、事前に計測しておいた波長感度特性を用いて補正演算を行っていた。【０００９】  この補正方法では、試料と波長感度特性を同条件で計測していないため、検出器温度による波長感度特性の変動、試料��定波長と波長感度特性波長の不一致、各測定装置固有の特性などにより正確な補正は大変困難であった。
また、従来の光スペクトル測定装置では光の強度は測定装置固有の相対的な光強度として表され、装置間で強度を比較することは困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は上記した従来技術における欠点を解消するものであり、本発明では光スペクトル測定における波長感度特性の補正と測定する光強度単位を光子数とする微弱光スペクトル測定方法および装置を提起し、特に生命現象の解明に利用しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明光スペクトル測定装置は光源部１、試料部２、集光部３、分光部４、検出部５および演算処理表示部６よりなる（図１）。【００１２】  試料部２に置かれた試料から発せられた光、または試料部２にファイバーや鏡で入射された光は、集光部３のレンズ１３で分光部４の入射スリット１４に集められ、分光部４の回折格子１６で分光された後、検出部５で相対光強度を計測し、これにより得た相対光強度は演算処理表示部６で補正及び変換計算を行う。【００１３】  検出部の検出器には冷却ＣＣＤ１７を用い、光源部１にはフィルター機能を備え蛍光検出の励起光としても使用できる白色光源としてのハロゲン光源８と波長６３３ｎｍのレーザー光源を基準光源７とし、切り替え部１０で両光源７と８とを切り替えて使用できるよう設置した。【００１４】  微弱で時間経過とともに光強度が減少する生物・化学発光や蛍光を対象とする測定は、検出部に冷却ＣＣＤを使用して走査を行わず測定範囲全波長の計測を同時に行う。これにより計測中に総光強度が変動しても結果が計測時間により異なることなく、長時間計測が可能となる為、測定範囲全波長を同時に長時間計測し光スペクトルを測定する。【００１５】  本発明における波長感度特性補正は、測定対象波長全範囲の検出器の波長感度特性を、試料測定時に試料測定と同じ波長分解能、波長で算出し連続して試料の光スペクトルを補正することを特長とし、この補正には光スペクトルが可視波長から赤外波長まで連続して滑らかな光スペクトルを持ち安定した光強度が得られる白色光源を用い、この白色光源本来の真の光スペクトルと上記白色光源を計測した光スペクトルとの比率を波長感度特性として補正を行う。【００１６】  すなわち、波長感度特性補正は試料測定波長範囲の白色光源の本来の真の光スペクトル形状を光スペクトラムアナライザーでの計測、標準光源の使用、色温度既知電球の使用で得、上記光スペクトル形状を波長と相対光強度の近似式で表した後、この白色光を測定対象微弱光と同等まで減光後光スペクトルを計測し、同一波長の計測値と近似式から得られる値との比率を波長感度特性とし、この波長感度特性と試料の相対光強度とを波長毎に演算して補正を行う。【００１７】  また、試料測定を行う光路中にはレンズ・反射鏡・分光器などが配置されるが、白色光を試料測定と同じ光路で計測し、検出器だけではなく光路中に配置されたレンズ・反射鏡・分光器など全光路の光スペクトルに対する影響の補正を行う。【００１８】  試料の光スペクトルの光強度を光子数として測定するには、波長とエネルギーとが既知の減光した基準光源の光スペクトルを相対光強度で計測し、上記基準光源の波長とエネルギーから単位時間当りの光子数を算出し、上記計測された相対光強度と上記光子数との間の係数を算出し、この係数と波長感度特性の補正された試料の相対光強度とを演算して試料の光スペクトルの光強度単位を相対光強度から光子数へ変換を行う。【００１９】  光子数と相対光強度との間の係数は波長既知のレーザー基準光の光のワット数を冷却ＣＣＤ直前で光パワーメータで計測した後、透過率既知の減光フィルターで減光した基準光の光スペクトルを相対光強度で計測する。【００２０】  光パワーメー���で計測したワット数とフィルター透過率とから冷却ＣＣＤ面のワット数を算出して検出器面の一秒間の光子数を算出し、計測した基準光の相対光強度との間の係数を算出する。この係数は基準光の波長によって異なるが、波長感度特性の補正された試料の光スペクトルの相対光強度の光子数への単位変換には１種類の波長で良い。
【実施の形態】
【００２１】  光スペクトラムアナライザーによる白色光源の光の計測は、波長間の光強度比率を得ることが目的で、光強度単位は限定せず、計測後、試料測定に用いる波長範囲に合わせ３５０ｎｍ〜８５０ｎｍの白色光スペクトル形状を５次の多項近似曲線（次式Ｉ（λ）、図２）で表した。
【数１】
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【００２２】  また、上記の多項式以外にもプランクの公式による黒体放射エネルギーのスペクトル分布の式でも表すことができた。ただし光源温度は白色光源スペクトル形状と一致するように入力した。
【数２】
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【００２３】  次に白色光を減光フィルターで減光し、上記白色光スペクトルを相対光強度を単位として計測を行った（図３  Ｃ  ｌａｍｐ（λ））。ここで用いる減光フィルターは白色光スペクトル形状を変化させないことが必要で、透過率は計測する必要はない。
【００２４】  これにより、波長感度特性が得られ波長感度特性の補正係数（Ｒ  ｃｏｌｌｅｃｔ（λ））はＩ（λ）とＣ  ｌａｍｐ（λ）より下記のように求められる。
【数３】
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【００２５】  また、光子数を単位とする測定のための相対光強度と光子数の係数は以下のように決定できる。
基準光源は単一波長であることが必要であるが、波長は測定範囲波長内であれば良く、６３３ｎｍのレーザー光源を用い、ワット数の計測は光パワーメータを用いた。
【００２６】  複数枚よりなる減光フィルターの透過率は、実際に使用するフィルターへの入射エネルギーと透過したエネルギーとを１枚づつ光パワーメータで計測し、１枚づつの透過率を算出後、使用した全枚数の総透過率を算出した。
減光フィルターを使用しない場合の冷却ＣＣＤ直前のレーザー光のワット数は
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際の冷却ＣＣＤ面のレーザーエネルギー（Ｅ  ｓｔｄ）は
【数４】
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と計算できる。
【００２７】  使用したレーザー波長６３３ｎｍの光子１個のエネルギー（Ｅ  ｐｈｏｔｏｎ）は次式により求められる。
【数５】
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【００２８】  冷却ＣＣＤ面のエネルギー（Ｗ）と光子１個のエネルギー（Ｊ）から、Ｗ＝Ｊ／ｓｅｃであるので、１秒間の冷却ＣＣＤ面の光子数（Ｎ  ｓｔｄ）は
【数６】
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となる。光子数が小数で算出されたが、以後の計算のためそのままの数値を使用した。
【００２９】  減光フィルターで減光した６３３ｎｍレーザー光を計測した１秒間の相対光強度（Ｃ  ｓｔｄ）は４８８５７８（ｃｏｕｎｔ）であり、相対光強度１カウント当りの光子数（Ｎ  ｐｈｏｔｏｎ（ｓｔｄ））は
【数７】
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となった。
【００３０】  更に、Ｎ  ｐｈｏｔｏｎ（ｓｔｄ）算出の為に用いるＣ  ｓｔｄへの波長感度特性の影響を補正するためにＣ  ｌａｍｐ（λ）およびＩ（λ）からの基準光源の波長６３３ｎｍに対応する値を抽出し、基準光源波長の波長感度特性の補正値  Ｒ（ｓｔｄ）を求めた。
【数８】
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【００３１】  試料はホタルルシフェリンとホタルルシフェラーゼをそれぞれ２０μｌずつ等量混合し、混合後すぐに計測した。
波長感度特性補正を行わず、光子数単位とする前の相対光強度での試料計測結果（Ｃ  ｓａｍｐｌｅ（λ））を図４に示した。
【００３２】  Ｃ  ｓａｍｐｌｅ（λ）は演算処理表示部で以下の計算式で演算を行い、波長感度特性の影響を補正し、光子数を単位として表すことができた。
【数９】
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図５に試料の各波長における測定時間当りの光子数、すなわち波長感度特性を補正し、光強度単位を光子数としたホタルルシフェリン−ルシフェラーゼ発光スペクトル（Ｎ  ｓａｍｐｌｅ（λ））を示した。
【発明の効果】
【００３３】  本発明は特定の波長ではなく測定範囲全域にエネルギーを持つ白色光源を用いて検出器の波長感度特性の影響を補正することで、光スペクトルのより正確な波長感度特性補正が可能となり、併せて波長とエネルギーとが既知の基準光源を用いることで、光強度の絶対値である光子数を単位として光スペクトルを測定することが可能な光スペクトル測定方法と装置を提供する。また、検出部に冷却ＣＣＤを用いたため、計測時間の影響を受けずに長時間の計測が行え、微弱な光でも高感度で測定可能となった。
【００３４】  これにより生物発光・化学発光や蛍光による遺伝子発現解析や複数の発光・蛍光色を用いる生体内制御機構の解析が可能となり、生命現象の解明に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明スペクトル測定装置の概略図である。
【図２】本発明における白色光源光スペクトル形状を表す５次多項近似曲線である。
【図３】本発明スペクトル測定装置で白色光源光を計測した結果を示すグラフである。
【図４】本発明装置で計測したホタルルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光の相対光強度の計測結果のグラフである。
【図５】本発明装置で測定したホタルルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光の光強度単位を光子数とした測定結果のグラフである。
【符号の説明】
【００３６】１…光源部、２…試料部、３…集光部、４…分光部、５…検出部、６…演算処理表示部、７…基準光源、８…白色光源、９…光ファイバー、１０…切り替え部、１１…フィルター、１２…試料、１３…レンズ、１４…スリット、１５…鏡、１６…回折格子、１７…ＣＣＤ、１８…演算処理部、１９…表示部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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