(57)【要約】【課題】  本発明は、概して、相互侵入ポリマー網目を形成する合成ポリマー組成物に関する。【解決手段】この組成物は、ａ）１つのコアおよびｍ個の官能基Ｘを有する、第１多官能合成ポリマー；ｂ）ｎ個の官能基Ｙを有する多官能架橋剤；およびｃ）引張り強度増強剤；を含み、ここで、ａ）、ｂ）およびｃ）は、一緒に混合される場合、官能基Ｘと官能基Ｙの反応から、共有結合Ｚの形成を介して侵入網目構造を形成し；そして、このように形成された該相互侵入ポリマー網目構造は、同じ条件下で測定される場合、シアノアクリレートの引張り強度の少なくとも１０％を有する。好ましい実施形態において、この組成物は、引張り強度増強剤とともに、２つの多官能性基が活性化された合成ポリマーを含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの部分の反応性ポリエチレングリコールパウダーが組み込まれたコラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートを含む、組織を処置する際の使用のための生物適合性のポリマーデバイスであって、ここで、該反応性パウダーは、複数の求核基を有する第１のポリエチレングリコールおよび複数の求電子基を有する第２のポリエチレングリコールをさらに含み、ここで、該ポリエチレングリコールパウダーは高いｐＨの緩衝液と接触するまで未反応のままである、生物適合性のポリマーデバイス。
【請求項２】
明細書の発明の詳細な説明に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、組織に投与されるときに相互侵入ポリマー網目を形成する合成ポリマー組成物に関する。そのような組成物は、投与された材料の物理学的強度が重要である種々の医学用途において使用するのに特によく適合する。例えば、組織を一緒に接着させるために使用されるように設計される本発明の組成物は、縫合糸および医療用ステープルのような他の外科接着手段の有効な代替物を提供するに十分な強度である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ティッシュエンジニアリングにおけるポリマー組成物の使用は、特に合成ポリマーからなる組成物は今や広汎に認識されている。多くの天然に由来する組成物とは対照的に、合成ポリマー組成物は、ゲル強度のような所定の物理学的特性、および分解性のような生物学的特性を示すように処方され得る。
【０００３】
種々のティッシュエンジニアリング適用において、液体として投与され得るが、後に投与部位でヒドロゲルを形成する組成物を使用することが所望される。このようなインサイチュヒドロゲル形成組成物は、より簡便に使用される。なぜなら、それらは、種々の異なるデバイスから液体として投与され得るからである。そして、それらは、任意の部位に投与するためにより適合する。なぜなら、それらは予備形成されていないからである。インサイチュでのヒドロゲル形成を促進するために使用され得る多くの異なる機構が記載されている。例えば、水溶性コポリエステルプレポリマーおよびポリエチレングリコールの光活性可能な混合物は、ヒドロゲルバリアを形成することおよび薬物放出マトリクスを形成することが記載されている。別のアプローチにおいて、冷水中で溶解性であるが、体温では組織に接着する不溶性のヒドロゲルを形成するＰｌｕｒｏｎｉｃおよびＰｏｌｏｘａｍｅｒのブロックコポリマーは、設計されている（Ｌｅａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１６２：１３１７−１３１９（１９９０））。重合可能なシアノアクリレートもまた組織接着剤としての使用について記載されている（Ｅｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１９：６８−７２（１９９０））。さらに別のアプローチにおいて、２部合成ポリマー組成物が記載されている。これは、一緒に混合されるとき、互いにおよび露出した組織表面と共有結合を形成する（ＰＣＴ  ＷＯ９７／２２３７１）。２部組成物を含む類似のアプローチにおいて、タンパク質と二官能架橋剤との混合物は、組織接着剤としての使用について記載されている（米国特許第５，５８３，１１４号）。
【０００４】
他のティッシュエンジニアリング適用において、投与されるときにはその組成物が液体形態であることは必要でもなく所望もされない。事実、ゼラチン質であり、ペースト状のまたは予備形成さえされた固形移植片である組成物を適用することが、いくつかの状況において有利であり得る。なぜなら、これらの形態は、液体形態よりもより容易に投与後に定位置にとどまる傾向があるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多くのティッシュエンジニアリングについて、この組成物は、その意図する目的を達成するに十分に長い期間にわたり供される生物学的力および物理的力に抵抗するに十分強力なマトリクスを投与後に形成し得ることが重要である。強度は特に、その組成物が縫合糸にとっての部分的または全体のｔ代替として使用される場合重要である。さらに、組織への接着が重要である適用について、適切な接着強度を有することが処方物にとって必要である。シアノアクリレートは、強力なマトリクスを形成する高度に有効な接着剤であるが、内部で使用されるにはあまりに毒性であり、従ってそのような用途では承認されない。従って、本発明の課題は、毒性ではなく高度に強力な医療用シーラントを形成する提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、多官能性ポリマー含有組成物に関する。これは、特に、ある実施形態に関して卓越した強度を示すように設計される。その組成物は、ｍ多官能基を有する第一多官能性合成ポリマー、Ｘ；ｎ官能性基を有する多官能性架橋剤、Ｙ；および引張り強度増強剤を含有し、その結果、３つ全ての成分が一緒に混合される場合、ＸおよびＹが反応して共有結合した三次元で相互侵入ポリマー網目を形成する。さらに、引張り強度増強剤は、その網目の中で共有結合するようになり得るか、またはそれはその中で物理的に捕捉されるようになり得る。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、多官能性架橋剤は、第二の多官能性合成ポリマーである。
【０００８】
本発明の１つの局面は、引張り強度増強剤の含有であり、これは、本明細書の他に記載されるような適切な特性を有する構造を形成し得る種々の化合物からなり得る。そのような化合物はとりわけ、Ｖｉｃｒｙｌ、ガラスウール、プラスチック、樹脂および繊維を包含する。
【０００９】
官能基ＸおよびＹは、適切な条件下で共有結合Ｚを形成する反応性部分の任意の対であり得る（例えば、スルフヒドリル、スクシンイミジル、アクリレートおよびアミノ、これは、特定の順序にはとらわれることなく、エーテル、エステルまたはジスルフィドを形成する）。
【００１０】
相互侵入ポリマー網目の分解を増強または阻害するために、合成ポリマーコアは、さらに、鎖伸張剤を含み得る。例えば、αヒドロキシ酸、ポリ（ラクトン）、ポリ（オルトカルボネート）およびポリ（ホスホエステル）部分は、生体分解性を増強するように働き得る。さらに、この鎖伸張剤は、酵素基質であり得る。
【００１１】
本発明の別の局面において、その組成物はさらに、任意の成分（例えば、タンパク質、抗生物質、増殖（成長）因子および止血剤）を含む。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、その任意の成分は、剛性のナノ繊維（例えば、メチル化コラーゲンにより形成されるもの）の形態で存在する。
【００１３】
本発明のさらに別の局面において、ＸおよびＹは、より効率よい架橋を提供するために、各々４以上であり得る。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、一対の反応性ポリアルキレンオキシド、剛性ナノ繊維（例えば、メチル化コラーゲンおよび引張り強度増強剤）を含む。
【００１５】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）  相互侵入ポリマー網目構造を形成するための組成物であって、ここで、該組成物は以下：
ａ）１つのコアおよびｍ個の官能基Ｘを有する、第１多官能合成ポリマー；
ｂ）ｎ個の官能基Ｙを有する多官能架橋剤；および
ｃ）引張り強度増強剤；
を含み、ここで、ａ）、ｂ）およびｃ）は、一緒に混合される場合、官能基Ｘと官能基Ｙの反応から、共有結合Ｚの形成を介して侵入網目構造を形成し；ならびに
ここで、このように形成された該相互侵入ポリマー網目構造は、同じ条件下で測定される場合、シアノアクリレートの引張り強度の少なくとも１０％を有する、組成物。
（２）  前記多官能架橋剤が第２の多官能合成ポリマーである、請求項１に記載の組成物。
（３）  前記引張り強度増強剤が、９０：１０の割合のポリグリコリド：ポリ乳酸の、ガラスウール、プラスチック、樹脂および繊維からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
（４）  前記引張り強度増強剤がポリグリコリド繊維またはポリ乳酸繊維である、請求項１に記載の組成物。
（５）  ＸおよびＹのいずれかまたは両方が、スルフヒドリル、スクシンイミジル、アクリレートおよびアミノからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
（６）  Ｚが、エーテル結合、エステル結合またはジスルフィド結合である、請求項１に記載の組成物。
（７）  前記第１の多官能合成ポリマーまたは前記第２の多官能合成ポリマーの少なくとも１つが、鎖エキステンダーをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
（８）  前記鎖エキステンダーが、前記第１の多官能合成ポリマーおよび前記２の多官能合成ポリマーの両方のコアよりも、より生分解可能である、請求項７に記載の組成物。
（９）  前記鎖エキステンダーが、α−ヒドロキシ酸、ポリ（ラクトン）、ポリ（オルトカーボネート）またはポリ（ホスホエステル）である、請求項７に記載の組成物。
（１０）  前記鎖エキステンダーが、前記第１の多官能合成ポリマーおよび前記第２の多官能合成ポリマーの両方のコアよりも、より生分解可能でない、請求項７に記載の組成物。
（１１）  前記鎖エキステンダーが、酵素によって分解可能である、請求項７に記載の組成物。
（１２）  剛性ナノ繊維をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
（１３）  タンパク質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
（１４）  前記タンパク質がコラーゲンである、請求項１３に記載の組成物。
（１５）  前記コラーゲンがメチル化コラーゲンである、請求項１４に記載の組成物。
（１６）  抗生物質、増殖因子または止血剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
（１７）  ｍおよびｎがそれぞれ４以上である、請求項１に記載の組成物。
（１８）  相互侵入ポリマー網目構造を形成するための組成物であって、該組成物は以下：
ａ）ｎ個の求核基Ｘを有するポリアルキレンオキシド；
ｂ）ｎ個の求電子基Ｙを有するポリアルキレンオキシド；
ｃ）剛性ナノ繊維；および
ｄ）引張り強度増強剤；
を含み、ここで、ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は、一緒に混合される場合、ＸとＹの反応から、共有結合Ｚの形成を介してマトリックスを形成し；および
ここで、このように形成された該マトリックスは、シアノアクリレートの引張り強度の少なくとも１０％を有する、組成物。
（１９）  前記剛性ナノ繊維がメチル化コラーゲンを含む、請求項１８に記載の組成物。
（２０）  ２つの部分の反応性ポリエチレングリコールパウダーが組み込まれたコラーゲンスポンジまたはコラーゲンシートを含む、組織を処置する際の使用のための生物適合性のポリマーデバイスであって、ここで、該反応性パウダーは、複数の求核基を有する第１のポリエチレングリコールおよび複数の求電子基を有する第２のポリエチレングリコールをさらに含み、ここで、該ポリエチレングリコールパウダーは高いｐＨの緩衝液と接触するまで未反応のままである、生物適合性のポリマーデバイス。
【００１６】
本発明の他の局面は、本明細書において他の場所に記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つの実施形態に従って、組織部位に投与される場合に相互侵入ポリマー網目を形成する合成ポリマー組成物に関する。投与された後短い時間（３分未満）内に、高度の結合（「張力」）強度を用いて発達する網目をその組成物が形成する。これは、そのマトリクスが、シアノアクリレートの引張り強度の少なくとも１０％の、そしてより好ましくは２０％の引張り強度を有することを企図する。好ましい実施形態において、そのような網目は、６０Ｎ／ｃｍ２よりも高い引張り強度を示す。好ましい組成物は、種々の疾患状態または外科手順の結果として分離された組織をともに封入する機械的手段および／または化学的手段によって定位置に固定されるように設計される。従って、＞５０ｍｍＨｇ（すなわち、接着を脱離させ、そして漏れを生成するのに必要される破壊圧力）を超える接着強度を持つ網目を形成する組成物は、強力な組織接着が所望されるときの適用のために好ましい。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、噴霧された液体（開腹手術）よりもより迅速に適用され得る乾燥シート形態で予備形成されたマトリクスに関する。短い時間（３０秒）での非常に高いバースト強度の接着もまた、適用後直ぐにチャレンジされねばならない部位において活性シートの使用を可能にし得る（３０秒に対して３分）。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、以下の実施例４および５においてさらに記載されるような活性化コラーゲンスポンジおよびシートを包含する。
【００２０】
（定義）
以下の定義は、本発明の好ましい実施形態の種々の局面をさらに記載するために提供される。
【００２１】
用語「ゲル」とは、液体と固体との間の物質の状態をいう。それ自体「ゲル」は、いくらかの液体の特性（すなわち、その形状が弾力性でありかつ変形可能である）を有し、そしていくらかの固体の特性（すなわち、その形状が二次元表面上に３次元を維持するに十分離散している）を有する。従って、「ゲル化時間」は、本明細書において「ゲル時間」とも呼ばれ、組成物が最も緩和なストレスの下で流動可能でなくなるまでにかかる時間をいう。これは概して、ゲル強度を達成するとして示され、１分未満に１０２ダイン／ｃｍ２以上の弾性率Ｇ’として表現される。
【００２２】
用語「結合（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）強度」とは、物理的ストレスまたは環境条件下におかれた場合に本発明の組成物がインタクトな（無傷の）（すなわち、破裂も、破れも、破裂もしれいない）ままいる能力をいう。結合強度は、「引張り強度」の関数として本明細書において測定される。
【００２３】
用語「接着（ａｄｈｅｓｉｖｅ）強度」とは、物理的ストレスまたは環境条件下におかれた場合に本発明の組成物が投与された部位においてその組織に接着したままでいられる能力をいう。
【００２４】
用語「ポリマー」とは、個々の化学部分から成る分子をいう。この個々の化学部分は同じでも異なっていてもよいが、好ましくは同じであり、そしてともに結合している。本明細書において使用される用語「ポリマー」とは、末端と末端とが結合して直鎖分子を形成する個々の化学部分、ならびに分岐（例えば、「マルチアーム」または「星形」）の構造の形態で一緒に結合した個々の化学部分をいう。
【００２５】
用語「生体適合性」とは、本発明の組成物が有意な炎症または線維症を惹起することも、他の有害な組織応答も惹起することもなく、組織に適用される能力をいう。
【００２６】
用語「合成ポリマー」とは、天然に存在せず、そして化学的または組換え合成により生成されるポリマーをいう。それゆえ、天然に存在するタンパク質（例えば、コラーゲンおよび天然に存在するポリサッカリド（例えば、ヒアルロン酸））は、特に除外される。タンパク質（例えば、合成コラーゲン）および炭水化物（例えば、合成ヒアルロン酸）ならびにそれらの誘導体は包含される。
【００２７】
用語「活性化された合成ポリマー」とは、対応する反応パートナー（例えば、スルフヒドリル反応基）と反応して共有結合を形成し得る、少なくとも１つの官能基（例えば、スルフヒドリル基）を有するか、またはそのように化学的に改変された合成ポリマーをいう。用語「多官能活性化された」または「多官能性」とは、２つ以上の官能（通常求核性または求電子性）基を有する合成ポリマーをいう。多官能活性化された型の合成ポリマーは、二官能活性化されたポリマー、三官能活性化されたポリマー、四官能活性化されたポリマー、そして星形活性化されたポリマー（これは、４つ以上の官能基を有する）を包含する。
【００２８】
用語「医療用シーラント」とは、種々の疾患状態または外科手順の結果として分離された、組織をともに封入するための機械的手段および／または化学的手段によって定位置に固定されるようになる組成物をいう。例えば、医療用シーラントを用いて硬組織中の空隙を充填して血管および他の軟組織をともに結合し得、機械的バリアを提供して止血を促進し得、そして１つの組織表面が別の組織表面と接触および接着することを防ぐことにより組織接着を予防し得る。
【００２９】
用語「相互侵入（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ）ポリマー網目（「ＩＰＮ」）は、ＰＥＧのような反応性ポリマーもしくはポリマー、または重合化されたモノマーから形成されるマトリクスであって、無限の分子量を示し、そして異なる型の共反応体（例えば、高度の引張り強度繊維）を含み、ＰＥＧポリマー網目内に相互侵入して網目中に２つの連続する網目を形成するマトリクスを説明することが意図される。以下を参照のこと：Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ”，ｉｎ  ＰｏｌｙｍｅｒＮｅｔｗｏｒｋｓ，Ａ．Ｊ．Ｃｈｏｍｐｆｆ  ａｎｄ  Ｓ．Ｎｅｗｍａｎ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７１），ｐａｇｅｓ  ４３５−４４９。
【００３０】
用語「充填剤」とは、バルク剤、低有機化合物、ポリマー、繊維、樹脂などであって、種々の理由（本発明に最も関連のあるものは、引張り強度を増強するため）で化学組成物に添加されるものをいうために使用される。
【００３１】
（組成物成分）
本発明の組成物は、少なくとも１つの多官能性合成ポリマーを含有する。この多官能性合成ポリマーは、引張り強度増強剤、および他の必要に応じての組成物成分とともに、投与部位において、高強度マトリックスを形成し得る。このポリマーが、他のポリマーおよび／または他の組成物成分と架橋される場合、可撓性ポリマーの相互連結を介して、ポリマー成分は、「連続性ゲル相」を提供する。
【００３２】
組成物が単一の多官能性合成ポリマーを含有する場合、組成物は、投与されるまで、ポリマーが非反応性状態のままであるように設計される。組成物が、２つ以上の多官能性合成ポリマーを含有する場合、組成物は、投与部位において混合された場合に、お互いに反応する二液性組成物として、一般に設計される。あるいは、そのような二成分組成物はまた、非反応性状態において調製され、そしてその後、投与前、投与中、または投与後に活性化され得る。さらに、単一の合成ポリマー種および少量（すなわち、ポリマーのサイズの半分未満）の架橋剤を含有する二液性組成物を利用し得る。これらおよび他の組成物の形式が、以下に、より詳細に記載される。
【００３３】
好ましい実施形態において、組成物は、二液性組成物であり、その各々は、異なる多官能性の活性化された合成ポリマーを含有し、その結果、ポリマーは、投与部位においてお互いに反応し、ＩＰＮを形成する。そのようにして、組成物は、容易に別々に投与され得る。
【００３４】
そのような組成物は、一般に、以下のように式Ｉによって表され得る：
化合物１−Ｘｍ  ＋  化合物２−Ｙｎ  →  化合物１−Ｚ−化合物２  （Ｉ）
化合物１は、化合物２と反応する複数（ｍは２以上）の官能基（Ｘ）を有し、化合物２は複数（ｎは２以上）の官能基（Ｙ）を有し、その結果、官能基ＸとＹが適切な条件下において接触する場合、共有結合Ｚが形成される。従って、官能基ＸおよびＹはまた、お互いに「反応性パートナー」ともいわれ得、そして集合的に「反応対」ともいわれ得る。説明の目的のためのみに式Ｉにおいて示されるように、化合物１と化合物２との間に形成された結合は、１つだけである。しかし、ｍ＋ｎが５以上であり、そして２つの成分の適切な比が、本明細書の別の部分に記載されるように使用される場合、２つの化合物は、お互いに複数の結合を形成し、３次元のポリマーマトリクスを生じる。好ましくは、両方の化合物は、４つ以上の官能基を含む。なぜならそのような多官能性が全体としてのより大きな結合強度を有するゲルマトリクスを生じるからである。特定の好ましい実施形態において、化合物の各々は、４機能性に活性化される。
【００３５】
他の好ましい実施形態において、化合物の各々は、１２の官能基を有する。そのような化合物を、第１の４機能性活性化ポリマーを、第２の４機能性活性化ポリマーと反応させることによって形成し、ここで２つの化合物の各々の官能基は反応対であり、お互いに反応して、「１２のアーム（１２−ａｒｍ）」の機能的の活性なポリマーを形成する。そのような「１２のアーム」の化合物の例は、ドデカ−スルフヒドリル−ＰＥＧ（分子量５０，０００）であり、これは、４つの（外部）の４機能性スルフヒドリル−ＰＥＧ分子と結合した、コアである４機能性スクシンイミドエステルＰＥＧから構築される。そのようなポリマーは、４機能性の活性化されたポリマー開始物質の分子量に依存して、１０，０００より大きな分子量から１００，０００より大きな分子量にわたってサイズが変化する。
【００３６】
他のタイプの多官能性ポリマーは、慣用的な合成方法を利用して、容易に合成され得る。しかし、一貫したアームの長さを有する多数のアームの生成物を生成し、官能基の立体障害を避けるために、注意をしなければならない。従って、本発明における使用に適切な活性化されたポリマーは、多様な幾何学的な形態および配置を有し得る。
【００３７】
（ポリマーコア）
上記のように、化合物の各々は、複数の官能基であるＸおよびＹを有する。非反応性である化合物の残りは、その「コア」であると考えられる。強力なゲルマトリクスを形成するために、２つの化合物の少なくとも１つがポリマーコアを有する。化合物の１つがポリマーコアを含む場合、他の化合物は、複数の官能基を有する低有機分子であり得る。しかし、ほとんどの適用について、両方の化合物が同一のポリマーコアまたは異なるポリマーコアを有することが好ましい。
【００３８】
ポリマーコアは、合成ポリアミノ酸、多糖、または合成ポリマーであり得る。いくつかの適用について、好ましいポリマーコア物質は、合成の親水性ポリマーである。適切な合成の親水性ポリマーとしては、とりわけ、ポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレンオキシド（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）、ポリプロピレンオキシド（（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ）またはポリエチレン／ポリプロピレンオキシド混合物（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）ｎ）が挙げられる。特定の適用のために特に好ましい合成親水性ポリマーは、約１００〜約１００，０００の分子量（より好ましくは、約１，０００〜約２０，０００の分子量）の範囲内の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリマーコアがポリエチレングリコールである場合、ポリマーコアは、なおより好ましくは、一般には、約７，５００〜約２０，０００の分子量の範囲内の分子量を有する。もっとも好ましくは、ポリエチレングリコールは、約１０，０００の分子量を有する。
【００３９】
多官能性活性化ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）は、市販されており、そしてまた、公知の方法を使用して容易に調製される。例えば、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの第２２章：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）；およびＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｔａｌｏｇ，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ  （１９９７−１９９８）を参照のこと。組織シーラントとしての使用のために、活性化ポリマーの例示的な組み合わせは、以下のとおりである：４機能性ＰＥＧ、ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジルグルタレート（分子量１０，０００）；および４機能性ＰＥＧ、ペンタエリスリトールポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスルフヒドリル（分子量１０，０００）。両方の場合において、これら「４つのアーム」のＰＥＧは、ペンタエリスリトールのエトキシ化によって形成される。ここで、４つの鎖の各々は、分子量約２，５００であり、次に誘導体化され、４つのアームの各々に官能基を導入する。また好ましいのは、ペンタエリスリトールの代わりにジグリセロールから重合された類似のポリ（エチレングリコール）様の化合物である。
【００４０】
多官能性の活性化された化合物の１つのみが、ポリマーコアを含む場合、他の化合物は、多官能性の活性低有機分子である。そのような化合物としては、２機能性のジスクシンイミジルエステルおよびジマレイミジル（ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ）化合物、ならびに他の周知の市販の化合物（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）が挙げられる。さらに、当業者は、慣用的な有機化学技術を使用して低分子量の多官能性反応化合物を容易に合成し得る。そのような化合物の１つを、図９ａに示す。この化合物は、４つのグルタル酸に結合したペンタエリスリトールであり、各々のアームは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）で覆われる。類似の化合物が、イノシトール（放射状に広がる６つのアーム）、ラクチトール（ｌａｃｔｉｔｏｌ）（９つのアーム）、またはソルビトール（直鎖状の６つのアーム）から合成され得る。末端を覆われた反応性基は、ＮＨＳの代わりに、容易に、スルフヒドリル、マレイミジル、ビニル−スルホンなどであり得る。ポリマーまたは小分子は、これらが組成物中の反応対（例えば、ＮＨＳとＳＨ、マレイミドとＳＨなど）である限り、反応性の末端基のいずれかを有し得る。
【００４１】
ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリメチレン、ポリエチレンおよびポリプロピレン）に加え、他のポリマーもまた、本発明の実施におけるコア物質として有用である。例えば、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリカプロラクトン、ポリアルケン（例えば、ポリブタジエン）もまた、有用であると考えられる。これらの材料の多くは、医薬産業における広範囲の有用性を有する。例えば、ポリカプロラクトンは、ナイロン−６の成分であり；ポリプロピレンは、医用移植片の成分であり；ポリメタクリレートは、ポリメチル−メタクリレートおよびポリ−ヒドロキシ−メチル−メタクリレート中に見出され、医用移植片の成分であり；そしてポリブタジエンは、市販のゴム中に存在する。
【００４２】
例示的なポリアルキレンオキシドベースではない組成物は、２つの異なる成分からなり、その各々は、異なるペンタ−エリスリトールベースの化合物を含み、その結果、２つの化合物は、ともに混合された場合に、お互いに反応し、強力なマトリクスを形成する。第１の化合物は、ペンタ−エリスリトールテトラキス（３−メルカプト−プロピオネート）（「ＰＥＳＨ−Ｐ」）であり、第２の化合物は、ペンタ−エリスリトールテトラアクリレート（「ＰＥＴＡ」）である。広範に多様な類似の分子構造（４つのアームであり、放射状に対称的）が、ペンタ−エリスリトールに基づいて合成され得る。分子鎖の長さは、好ましくは、アルキオキシル（ａｌｋｙｏｘｙｌ）ではないセグメント（例えば、ポリエステル、ポリメチレン、ポリアミド、または公知の生体適合性ポリマーの成分である他の材料）を使用して、伸長され得る。
【００４３】
他の放射状の分岐する分子（例えば、グリセロールまたはラクチトール）を利用してゲル形成材料を構築し得る。所望の構造は、液体のままであるように、水と混和しない低分子量（分子量３５０〜約１２，０００）である。高分子のゲル形成構造もまた、意図される。そのような組成物が、送達のための液体媒体として、水の使用に適合性であるように、水と混和性であるか、または水に分散性であることが好ましい。
【００４４】
上記の分岐した分子に加え、本発明の組成物は、図４に示される直鎖状分子から形成され得る。そのような直鎖状分子は、図１に示されるように、生体分解性の元素（「Ｏ」）および十分な官能基（「Ｒ」）を有する限り、分子量１００，０００程度の分子量を有し得る。
【００４５】
（引張り強度増強剤）
マトリクス強度を増強するために、組成物に「引張り強度増強剤」を添加することが一般に望ましい。そのような引張り強度増強剤は、好ましくは、ミクロンサイズ（好ましくは、直径５〜４０ミクロン、および長さ２０〜５０００ミクロン）の高引張り強度の繊維（通常は、３７℃より十分に高いガラス転移温度を有する）を含む。
【００４６】
本発明による使用のための適切な引張り強度増強剤としては、とりわけ、コラーゲン繊維、ポリグリコリドおよびポリラクチド繊維、ならびに他の有機引張り強度増強剤および無機引張り強度増強剤が挙げられる。特に有用な引張り強度増強剤は、ビクリル（Ｖｉｃｒｙｌ）（ポリグリコリド：ポリラクチド、９０：１０）である。より広範な「充填剤」のカテゴリーの一部である引張り強度増強剤の使用は、周知である。例えば、ペルオキシドと架橋される場合、「シリコーンガム」は、弱く、かつ安っぽく、ほんの３４Ｎ／ｃｍ２のオーダーの引張り強度を有する。補強する充填剤を適切に混合する場合、これらのガムの引張り強度は、５０倍程度増加し得る。Ｌｉｃｈｔｅｎｗａｌｎｅｒ，Ｈ．Ｋ．およびＳｐｒｕｎｇ，Ｍ．Ｎ．（Ｍａｒｋ，Ｈ．Ｆ．，Ｇａｙｌｏｒｄ，Ｎ．Ｇ．，およびＢｉｋａｌｅｓ，Ｎ．Ｍ．編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐ．５３５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）。
【００４７】
適切な引張り強度増強剤は、固有の高引張り強度を有し、かつ重合化されたゲルネットワークと共有結合または非共有結合によって相互作用し得る増強剤である。引張り強度増強剤は、強度の補助を提供するために、機械的にか、または共有結合的にかのいずれかでゲルに結合する。ポリグリコリドの再吸収可能な縫合糸の引張り強度は、約８９，０００Ｎ／ｃｍ２であり；コラーゲン繊維の引張り強度は、５０００〜１０，０００Ｎ／ｃｍ２である（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃ．  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．，Ｔｓｕｒｕｔａ，Ｔ．ら編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３））。
【００４８】
（反応性基およびマトリクス結合）
本発明において、結合Ｚは、官能基ＸとＹがお互いに反応した場合に形成される共有結合を含む。官能基は、スルフヒドリル、スクシンイミジル、アクリレート、アミノなどであり得る。従って、連結は、エステル、エーテル、ジスルフィドなどであり得る。他の官能基、その反応性、およびそれによって形成される結合は、科学的文献において周知である。例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、２１〜３７頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｏｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；およびＬｕｎｄｂｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第２版，第６章，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ  （１９９１）を参照のこと。官能基の対のさらなる例としては、とりわけ、スルフヒドリル／アクリレート、スルフヒドリル／スクシンイミジル、アミノ／スクシンイミジルおよびアミノ／アクリレートが挙げられる。
【００４９】
チオエステル連結を形成するスルフヒドリル反応性化合物に加えて、他のタイプの連結を形成する種々の他の化合物を利用し得る。例えば、メチルイミデート（ｉｍｉｄａｔｅ）誘導体を含む化合物は、イミド−チオエステル結合をスルフヒドリル基と形成する。あるいは、スルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成するスルフヒドリル反応基を使用し得る（例えば、オルトピリジルジスルフィド、３−ニトロ−２−ピリデンスルフェニル（３−ｎｉｔｒｏ−２−ｐｙｒｉｄｅｎｅｓｕｌｆｅｎｙｌ）、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、メタン−チオ硫酸の誘導体、２，４−ジニトロフェニルシステイニルジスルフィド）。そのような場合、補助的な試薬（例えば、過酸化水素またはジ−ター−ブチルエステルまたはアゾジカルボン酸）を使用して、ジスルフィド結合形成を促進し得る。
【００５０】
スルフヒドリル反応基のなお別のクラスが、スルフヒドリル基とチオエーテル結合を形成する。そのような基としては、とりわけ、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミドおよび他のマレイミド（デキストランマレイミド、モノ−ブロモ−ビマンおよび関連する化合物、ビニルスルホネート、エポキシド、Ｏ−メチル−イソウレアの誘導体、エチレンイミン、アジリジン、および４−（アミノスルホニル−）７−フルオロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール）が挙げられる。
【００５１】
（鎖エキステンダー（Ｃｈａｉｎ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ））
官能基は、化合物コアに直接結合され得るか、または鎖エキステンダーを介して間接的に結合され得る。そのような鎖エキステンダーは、当業者に周知である。例えば、本発明の組成物中で鎖エキステンダーとしての使用に適切な「連結基」を記載するＰＣＴ  ＷＯ９７／２２３７１を参照のこと。鎖エキステンダーは、分子間の直接結合の形成に付随して時として問題となる立体障害の問題を避けるために有用である。あるいは、鎖エキステンダーを使用して、いくつかの多官能性活性化化合物をお互いに連結して、より長い分子を作製し得る。特定の好ましい実施形態において、鎖エキステンダーを使用して、投与後の組成物の分解特性および結果としてのゲル形成をも変化させ得る。例えば、鎖エキステンダーは、多官能性活性化ポリマーの一方または両方の中に採り込まれ、加水分解を促進し得るか、加水分解を妨げ得るか、または酵素分解部位を提供し得る。鎖エキステンダーはまた、スルフヒドリル基またはスルフヒドリル反応基の活性を、活性化するか、または抑制し得る。例えば、スルフヒドリル基の１つ以上の炭素内の電子吸引性基は、求核性を低下させることに起因して、結合の効率を減少することが予測される。二重結合炭素およびカルボニル炭素は、この効果を有することが予測される。いずれかのパートナーのかさ高い、隣接する基は、立体障害のために、結合速度を減少させることが予測される。グルタリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルの反応性のカルボニルに隣接する電子吸引性基は、このカルボニル炭素を、スルフヒドリルパートナーに対して、なおより反応性にすることが予測される。
【００５２】
鎖エキステンダーは、分解部位（すなわち、加水分解部位）を提供し得る。加水分解可能な鎖エキステンダーの例としては、とりわけ、α−ヒドロキシ酸（例えば、乳酸およびグリコール酸）；ポリ（ラクトン）（例えば、カプロラクトン、バレロラクトン（ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、γブチルラクトンおよびｐ−ジオキサノン（ｄｉｏｘａｎｏｎｅ）；ポリ（アミノ酸）；ポリ（無水物）（例えば、グルタラートおよびスクシナート）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（オルトカーボネート）（例えば、トリメチレンカーボネート）；ならびにポリ（ホスホエステル）が挙げられる。非分解性鎖エキステンダーの例としては、とりわけ、スクシンイミド、プロピオン酸およびカルボキシメチレートが挙げられる。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９９／０７４１７を参照のこと。酵素的分解可能な鎖エキステンダーの例としては、コラーゲンによって分解されるＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ；およびプラスミンによって分解されるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓが挙げられる。
【００５３】
本発明の組成物を設計する場合に考慮される他の一般的な原則は以下のとおりである：高分子量構造を使用する場合、好ましくは、上記の生分解性連結を有し、その結果、分子量２０，０００を超えるフラグメントは、生体での再吸収の間に生成されない。さらに、水との混和性および／または水への溶解度を促進するために、十分な電荷または親水性を付与することが望ましくあり得る。そのような親水性基は、３〜５倍を越えて膨張するゲルを生じず、かつ低引張り強度を有するゲルを生じない限り、公知の化学合成を使用して容易に導入され得る。特に、ポリアルコキシ部分が、ゲル強度を弱め得る。
【００５４】
（最適な組成物成分）
官能基が活性化されたポリマー化合物および引張り強度増強剤に加えて、本発明の組成物は、二成分組成物の１つの成分または両方の成分中に含まれ得るか、あるいは別々に投与され得る他の化合物もまた含み得る。２つの実施形態において、これらの化合物は、これらの化合物が混合された後に、官能基が活性化された化合物の一方または両方と架橋されるようになることによって、ＩＰＮ自体の中に共有結合的に取り込まれるようになり得る。別の実施形態において（例えば、化合物がいずれの官能基が活性化された化合物とも反応性でない場合）、化合物を、混合後に、物理的またはイオン的にマトリクス形成化合物と会合するようになるような様式において投与し、そうして、マトリクス自体の一部とし得る。
【００５５】
添加され得るさらなる化合物は、グリコサミノグリカンおよびタンパク質である。適切なグリコサミノグリカンとしては、とりわけ、ヒアルロン酸、キチン）、コンドロイチン硫酸Ａ、ＢまたはＣ、ケラチン硫酸、ケラト硫酸およびヘパリン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。別の実施形態において、タンパク質を種々の目的のために添加し得る。例えば、コラーゲンは、マトリクスの生体適合性（細胞のコロニー形成の可能性、創傷治癒の促進などを含む）を改善し得る。コラーゲンおよび任意のアミノ基を含有するタンパク質はまた、他のマトリクス成分とともにマトリクスに架橋されるようになることによって、マトリクスの構造の統合性に寄与する。特に、ＰＥＧスクシンイミジルエステルを使用する場合、コラーゲンとともに形成されるアミド結合は、スクシンイミジルエステルとスルフヒドリルとの反応によって形成される結合よりも、加水分解に対してより安定である。
【００５６】
適切なタンパク質としては、とりわけ、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、およびアルブミン、ならびにこれらのペプチドフラグメントが挙げられる。特に好ましいのは、コラーゲンであり、コラーゲンは、非繊維性の、ミクロフィブリルの、原線維のコラーゲンの形態であり得る。ウシ真皮またはヒト胎盤から単離されたＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲン、あるいは組換えＤＮＡ方法によって調製されたコラーゲンが適切である。適切なコラーゲンおよびコラーゲン誘導体の記載についてＰＣＴ  ＷＯ９０／０５７５５を参照のこと。コラーゲンを組成物に添加する場合、沈殿をさけるために、他の組成物成分の濃度を調節することが重要である。
【００５７】
組成物に添加され得るさらなる成分としては、抗生物質、増殖因子、止血性タンパク質（例えば、トロンビン、フィブリン、フィブリノーゲン、血液因子など）、細胞、遺伝子、ＤＮＡなどが挙げられる。
【００５８】
（最適な剛性ナノ繊維（Ｎａｎｏｆｉｂｅｒ））
上記の最適な組成物成分を、本発明のＩＰＮに、当業者に周知である種々の形態において添加し得る。例えば、ＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ジヌクレオチドなどの形態において添加し得る。同様にして、タンパク質性の構成成分を、ポリペプチド、天然のタンパク質、合成タンパク質、タンパク質フラグメントなどとして添加し得る。
【００５９】
本発明のＩＰＮに添加するために特に好ましい構造は、ナノ繊維である。上記の最適な成分の多く、そして特にメチル化コラーゲンは、そのような構造中に容易に形成され得る。用語「ナノ繊維」は、通常、長さがミクロン未満の繊維を意図する。ある場合には、これらの繊維は非常に小さいので、この形態のコラーゲンは、本質的に「非繊維性」であると考えられる。いずれにしても、可撓性ポリマーからなり、比較的低い（０未満）ガラス転移温度を有するＩＰＮ（例えば、ＰＥＧ）中に取り込まれる場合、比較的高い（２５℃を越える）ガラス転移温度を有する剛性ナノ繊維は、さらなる強度を与える。
【００６０】
コラーゲンは、水素結合によってお互いを保持する三重らせん中の３つのポリペプチド鎖から形成されるので、コラーゲンは、剛性ナノ繊維の良好な例であるが、他のポリマーもまた適切であり得る。例えば、桿状様の他の生体ポリマー（例えば、チューブリンおよびケラチン）の誘導体を、剛性ナノ繊維形態において製造し得る。構造がナノメータースケールの桿状ポリマーであり、水に適合性であり、好ましくは、極性基をその表面に有し、より好ましくは、アミノ基をその表面に有する限り、剛性ナノ繊維は、種々の異なる材料から作製され得る。例えば、Ｌｉｕ，Ｇ．ら、「Ｄｉｂｌｏｃｋ  Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２９：５５０８−５５１０（１９９６）を参照のこと。
【００６１】
（組成物処方）
本発明の組成物は、２つの別個の部分（または「成分」）を含み、これら成分は、液体形態であってもよいし、または固体形態であってもよい。好ましい実施形態において、両方の成分は、液体であり、その結果、各々が投与部位に別個に容易に適用され得るようになっている。従って、これら成分のうちの１つは、第２の成分（液体形態である）と、各々が組織上に別々に噴霧された場合にかまたは組織部位で混合することによって混合される、乾燥粉末の形態であり得る。粉末としてその部位に送達され、投与部位で緩衝液と混合される、両方の成分を有することもまた可能である。
【００６２】
代替的実施形態において、両方の成分は、それらが両方とも非反応性である単一の水性媒体（すなわち、例えば、低ｐＨ緩衝液）中でともに混合され得る。その後、それらは高ｐＨ緩衝液とともに組織部位上に噴霧され得、その後それらは迅速に反応してゲルを形成する。
【００６３】
この組成物成分の各々における反応性化合物の濃度は、多数の因子に必ず依存する。例えば、その組成物成分が各々４アームＰＥＧ（すなわち、ＰＥＧ−ＰＥＧ組成物）である場合、混合前のこの２つの成分の各々中の濃度２０〜２５重量％が、弾性係数（Ｇ’）約１０５〜１０６ｄｙｎｅ／ｃｍ２のゲルを混合後に生じ、この弾性係数は、外科用シーラントとしての使用に十分である。メチル化コラーゲンおよび４アームスクシンイミジルＰＥＧを使用すると、それぞれ、濃度２〜４％および０．２〜０．４％が、１０〜１５％のＰＥＧ−ＰＥＧゲルに匹敵する、結合力のゲルを生じる。アルブミンをその成分のうちの１つとして使用すると、濃度３０％以上が、同様の結合力を達成する。各成分中、この化合物および他の必要に応じた成分の適切な濃度、従って最終ゲルマトリックス中のマトリックス成分の相対的濃度は、慣用的実験を使用して、所望のゲル化時間およびゲル強度を達成するように容易に最適化され得る。上記の好ましい４アーム（４−ａｒｍ）ＰＥＧを使用すると、その合成ポリマーは、一般的に、濃度２〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１０〜２５％で存在する。しかし、その組成物の流動性が重要でない高強度マトリックスを必要とするいくつかの適用のために、より高濃度（例えば、５０〜７０％、より好ましくは６０％）でＰＥＧを使用することが所望される。
【００６４】
本発明の組成物の液体成分は、活性化合成ポリマー（乾燥形態でかまたは濃縮溶液として）液体媒体に添加することによって、各々別個に調製される。適切な液体媒体としては、濃度０．５〜３００ｍＭの水性緩衝溶液（例えば、一塩基性リン酸ナトリウム／二塩基性リン酸ナトリウム緩衝溶液、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝溶液、グルタミン酸緩衝溶液または酢酸緩衝液）が挙げられる。一般に、スルフヒドリル反応性ＰＥＧが、ｐＨ約５〜６で水または希釈緩衝液中にて調製される。スルフヒドリル−ＰＥＧ成分を調製するためのｐＫ約８〜１０．５の緩衝液が、スルフヒドリル−ＰＥＧ／ＳＧ−ＰＥＧの混合物を含む組成物の速いゲル化時間を達成するために有用である。これらとしては、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液およびＡＭＰＯ（３−［１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］２−ヒドロキシ−プロパン−スルホン酸）が挙げられる。対照的に、マレイミジルＰＥＧおよびスルフヒドリル−ＰＥＧの組み合わせを使用すると、ｐＨ約５〜９が、スルフヒドリルＰＥＧを調製するために使用される液体媒体にとって好ましい。活発に出血している組織部位への止血適用のために特に好ましい組成物は、第１の成分として、マレイミジルＰＥＧとスクシンイミジルＰＥＧとの混合物を含み、そして第２の成分として、スルフヒドリルＰＥＧを含む。このような組成物は、マレイミジルＰＥＧ単独またはスクシンイミジルＰＥＧ単独のみを有する組成物と比較した場合に、生分解性が上昇しそして優れたゲル時間であるゲルを生成する。
【００６５】
この２つ（またはそれ以上）の組成物成分の各々に使用される水性緩衝溶液のｐＨは、迅速なゲル化を招く最終ｐＨを達成するように慣用的最適化を使用して、送達プロセスを妨げる即時のゲル化を引き起こすことなく、調整されるべきである。例えば、アミノＰＥＧおよびスルフヒドリルＰＥＧの両方が、求核性を増強するために塩基性ｐＨを必要とする。ゲル時間に対するｐＨの効果は、下記実施例にて議論される。
【００６６】
（ゲル強度）
本発明の組成物は、優れた結合力を示すように処方される。これは、本発明の組成物が、シアノアクリレート「Ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ」の破裂強度の少なくとも１０％そして好ましくは２０％を示すことを、一般的に意味する。
【００６７】
（ＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲン、＋ガラスウールまたはＶｉｃｒｙｌから作製される例示的処方物）
ＰＥＧ処方物（例えば、下記実施例２に記載されるＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６）へのメチル化コラーゲンの付加は、ゲルを大いに強化し、そしてゲルが生理食塩水緩衝液または水中で膨張するのに抵抗させる。このゲルは膨張しないので、このゲルは、繊維状充填剤（例えば、ガラスウール、Ｖｉｃｒｙｌ糸または絹縫合糸）に結合されたままであるに十分な固有の引張り強度を有し続ける。
【００６８】
ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６とメチル化コラーゲンの組み合わせは、「相互侵入ポリマー網目」として考えられ得る。これは、このメチル化コラーゲンおよびＰＥＧ試薬がｐＨ４〜５でのゲル化の前に、均一な透明な溶液として存在するのが原因である。ＰＥＧおよび誘導体化されたコラーゲンがともに溶液中に共存する能力は、非常に予期せぬ発見であった。ゲル化（ｐＨを上げることにより誘発される）の時点で、ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６とは、これら各々の反応基を介して反応して、チオエステル結合が形成される。この結合は、ポリマーゲルの特徴である、無限の分子量の網目を生じる。ＣＯＨ１０２単独およびＣＯＨ２０６単独はゲルを形成するが、このようなゲルは、比較的弱い。メチル化コラーゲンが存在する場合、このコラーゲン上のアミノ基もまた、ＣＯＨ１０２と反応し得、アミド結合が形成され、そしてＰＥＧおよびコラーゲンの３方向（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ）ゲルを生じ、これは共有結合して網目になる。
【００６９】
このメチル化コラーゲンの添加は、繊維状充填剤を支持するに十分頑強なゲルを生成する。このゲルは繊維状充填剤を保持するに十分には強くないので、このゲルは、引っ張り負荷の下で離れ、そして高い引張り強度が達成されない。下記表１２は、他のポリマー性分子または粒子状分子がメチル化コラーゲンに代わって置き換わった場合に、その結合性能が減少することを、示す。従って、このメチル化コラーゲンは、比較的剛性の分子であり、比較的希釈されたＰＥＧヒドロゲルに上昇した強度を付与しうる。可撓性ポリマー（例えば、ヒアルロン酸、ポリリジン、およびキトサン）は、分子量が比較的高くそして比較的粘性の溶液を生成するが、同じ剛性を明らかに有さず、従って、引っ張り応力をより吸収できずそして繊維状充填剤へとこれらの応力を受け流す（ｐａｓｓ  ｏｆｆ）ことがよりできない。
【００７０】
ポリマー用語において、ＰＥＧは、低いガラス転移温度（このポリマーが、弾性かつ硬い代わりに、可撓性である、温度）を有する可撓性ポリマー鎖であり；メチル化コラーゲンは、より高いガラス転移温度を有する（すなわち、メチル化コラーゲンは、約３３〜３５℃にてその剛性を失い、可撓性になり、この温度で、このメチル化コラーゲンは「融解」して、可撓性鎖分子であるゼラチンを形成する）。低いガラス転移温度のポリマー（ＰＥＧ）と高いガラス転移ポリマー（メチル化コラーゲン）との間で相互侵入ポリマー網目（ＩＰＮ）を形成するので、その結果は、後者による前者の補強である。ＰＥＧを、これもまた低いガラス転移温度を有する（すなわち、目的の温度で可撓性である）別の可撓性ポリマー（例えば、ヒアルロン酸）で補強しようとする場合、補強は達成されない。（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ａ．Ｊ．Ｃｈｏｍｐｆｆ，Ｓ．Ｎｅｔｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９７１、４３５頁中のＳｐｅｒｌｉｎｇ，Ｌ．Ｈ．、Ｈｕｅｌｃｋ，Ｖ．およびＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．、「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ」を参照のこと）。
【００７１】
最終処方物の上昇した結合強度は、明らかにいくつかの因子に依存する：１）ＰＥＧ試薬であるＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６が共有結合してヒドロゲルを形成し；このゲルもまた組織への優れた結合を示し、これは明らかに、組織上のアミノ基に結合し得る、ＣＯＨ１０２のスクシンイミジルエステルに起因する（表１４を参照のこと）；２）メチル化コラーゲンは、ＰＥＧゲル網目を含む相互侵入ポリマー網目を形成し、ＰＥＧゲル網目を補強し；そして３）繊維状充填剤（例えば、ポリラクチド／グリコリド線維またはガラスフィルター）へと引っ張り負荷を受け流す（ｐａｓｓ  ｏｆｆ）。従って、この繊維状充填剤の添加は、ゲル引張り強度の所望の最終レベルを達成することに重要である。
【００７２】
ｐＨ４〜７で可溶性（分子であり、繊維状でない）を維持する他のコラーゲン誘導体もまた、同じ所望の特性を付与し得ることが意図される。例えば、コラーゲンのカルボキシル基の他のエステル（例えば、エチル化コラーゲン、プロピル化コラーゲン、またはベンジル化コラーゲン）もまた、メチル化コラーゲンのように機能し得る。繊維状コラーゲンはより望まれない；なぜなら、これは、ゲル中でビーズ状、塊状のドメインを形成し、そして上昇した引張り強度を付与しないからである。ｐＨ４で可溶性でないかまたは遊離の反応性アミノ基を含まないかもしれない、コラーゲン誘導体（例えば、スクシニル化コラーゲン）もまた好ましい。なぜなら、これらは、所望の特性を提供しないからである。剛性を示す合成ポリマーは、ミクロンのスケールの塊として存在しかつ、必要なＰＥＧヒドロゲルと緊密な相互侵入網目を形成しない、ほぼ例外なく水不溶性の結晶構造である。
【００７３】
（使用および投与）
本発明の組成物は、その組成物の２つ（またはそれ以上）の個々の成分が、投与部位でかまたは投与直前に初めて互いに接触するような様式で、投与部位に一般的に送達される。従って、本発明の組成物は、好ましくは、その２つの成分を別個に送達させる装置を使用して、投与部位に送達される。このような送達系は、通常、２成分単一出口噴霧デバイスまたは２成分二重出口噴霧デバイスを含む。あるいは、この２つの成分は、任意の型の制御可能な排出系を使用して別個に送達され得るか、またはそれらは、別個のペースト、液体または乾燥粉末の形態で手で送達され得そして投与部位で手でともに混合され得る。２成分組織シーラント／止血剤の送達に適合される多くのデバイスが当該分野で周知であり、それらはまた、本発明の実施においても使用され得る。
【００７４】
本発明の組成物を送達するなお別の方法は、この２つの反応性成分（またはジルスフィド結合を形成するように設計されているスルフヒドリル含有成分の場合は単一の反応性成分）を不活性形態で、液体または粉末のいずれかとして調製することである。次いで、このような組成物は、組織部位への適用後またはその直前に、活性剤と適用することにより、活性化され得る。１つの実施形態において、この活性剤は、一旦それと混合されたらこの組成物を活性化するｐＨを有する、緩衝溶液である。投与まで低いｐＨで維持され、その後適用部位で高ｐＨ緩衝液と混合されてゲル化を開始するスルフヒドリル含有ＰＥＧ組成物の説明については、実施例７を参照のこと。
【００７５】
この組成物を送達するさらに別の方法は、予備形成されたシートを調製し、そしてこのシート自体を投与部位に適用することである（実施例を参照のこと）。
【００７６】
本発明の組成物は、種々の異なる薬学的適用において使用され得る。一般に、本明細書中に記載される組成物は、合成ゲルマトリックスが現在利用されている任意の組織操作適用における使用に適合され得る。例えば、本発明の組成物は、組織シーラントとして、組織増強において、組織修復において、止血剤として、組織接着の予防において、表面改変の提供において、そして薬物／細胞／遺伝子送達適用において、有用である。当業者は、本明細書中に記載される原理および周知の科学的原理に基づいて、既知のゲル強度およびゲル化時間を有する任意の組成物を用いる、使用するに適切な投与プロトコルを容易に決定し得る。いくつかの特定の適用のより詳細な説明が、下記に示される。
【００７７】
（組織シーラントおよび接着剤）
好ましい適用において、本明細書中に記載される組成物は、気体、液体または固体の漏出を防ぐためにコーティング層またはシーリング層を必要とする、医学的状況に使用され得る。この方法は、両方の成分を損傷した組織もしくは器官に適用して、１）血液の流れを停止もしくは最小にするために血管および／または他の組織もしくは器官をシールすること；２）空気の漏出を停止もしくは最小にするために胸組織をシールすること；３）糞便内容物もしくは組織内容物の漏出を停止もしくは最小にするために、胃腸管もしくは膵臓組織をシールすること；４）尿の漏出を停止もしくは最小にするために膀胱もしくは尿管をシールすること；５）ＣＳＦの漏出を停止もしくは最小にするために硬膜をシールすること；および６）漿液の漏出を停止するために皮膚もしくは漿膜組織をシールすることを伴う。
【００７８】
これらの組成物はまた、小さい脈管、神経または皮膚組織のような組織をともに接着するために使用され得る。この物質は、１）それを１つの組織の表面に適用し、次いで第２の組織がその第１の組織に対して迅速に押し付けられ得ることによってか、あるいは２）それら組織を近くに並置し次いでこの物質を適用することによって、使用され得る。さらに、この組成物は、疾患もしくは手術により生成された軟部組織および硬組織中の空間を充填するために使用され得る。
【００７９】
（外科的接着）
好ましい適用は、患者における外科的手順の後、接着の形成を減少する方法である。この方法は、両方の成分をともに噴霧することかまたは事前に混合した成分もしくは予備形成した固体移植片を適用することのいずれかによって、損傷した組織もしくは器官上にその物質を適用することを伴う。この成分は、ともに反応して、組織表面上に強いマトリックスを形成する。この医学的手順は、婦人科学的適用、腹部適用、神経外科的適用、心臓適用、および整形外科適用を含む。
【００８０】
（薬物送達）
好ましい適用は、生物学的に活性な物質を患者に局所適用する方法である。この活性物質は、２つの成分とともに、その物質がインサイチュで形成し得るように送達され得るか、またはこの活性物質は、予備形成された移植片の一部であり得る。この活性物質は、拡散制御されたプロセスを介して放出され得るか、または生じたヒドロゲルが分解するときにこの活性物質が放出されるようにその成分に共有結合され得るかのいずれかである。
【００８１】
この生物学的に活性な物質は、タンパク質、糖質、および核酸を含む、種々の有機物質および無機物質のいずれかであり得る。特定の例としては、酵素、抗生物質、抗腫瘍性薬剤、サイトカイン、局所麻酔薬、ホルモン、抗脈管形成薬物、抗体、神経伝達物質、精神活性薬物、生殖器官に影響する薬物、ならびに治療的オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００８２】
（移植片の改変）
好ましい適用は、移植片の表面特性に影響するかまたは組織表面に移植片を接着するのを助けるように、移植片にコーティングを適用する方法である。成分のコートは、１）これらのデバイスからの血液もしくは漿液の漏出を最小にするかもしくは停止するために血管移植片、ステントに適用され得；２）過度の線維症を減少もしくは停止するためにカテーテルもしくは胸部移植片に適用され得；３）過度の線維症を最小にしそして組織表面にその移植片を接着するのを助けるために人工パッチもしくはメッシュに適用され得る。
【００８３】
（細胞もしくは遺伝子の送達）
この組成物の好ましい適用は、細胞または遺伝子（これは、天然供給源由来の物質もしくは合成ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその個々のアンチセンス形態を含む）をカプセル化し、それによりそれらを所望の部位に送達することである。この細胞としては、間葉幹細胞、上皮細胞および神経外胚葉細胞が挙げられ得る。この細胞は、起源が同種異系または異種のいずれであってもよい。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（２成分ペンタ−エリトリトールベースの組織シーラント組成物の調製）
ペンタ−エリトリトールテトラキス（３−メルカプト−プロピオネート）（分子量４８９、図２ａの「ＰＥＳＨ−Ｐ」）１．０８ｇ、およびペンタ−エリトリトールテトラ−アクリレート（分子量３５２（図２ｂの「ＰＥＴＡ」）１．０ｇを、塩基として役立つ５〜１０ｇのポリ−オキシプロピレントリ−アミン（図２ｃの「Ｔ４０３」、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ，Ｔｅｘａｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）の存在下でともに混合する。
【００８５】
反応性種はすべて液体である。ＰＥＳＨ−ＰおよびＰＥＴＡは、水中で混和性でない。従って、ＰＥＴＡを、ＰＥＳＨ−ＰおよびＴ４０３を混合する前に、約４０℃に加温して液体を形成させる。混合後１〜５分以内に、Ｔ４０３のレベルに依存して、ゲル化が始まる。ＰＥＳＨ−ＰとＰＥＴＡとの間で形成される結合は、図３に示される。このゲルを、数時間硬化させ、その後、１時間３７℃で水和させる。その後、このゲルの引張り強度は、０．８８＋／−０．３ＭＰａである。このようなゲルを生理学的食塩水（ｐＨ６．７）中に放置した場合、これらゲルは、４０日間を超えて安定であり、そして約２０％しか膨張しない。破裂強度のデータは、研削物（ｇｒｉｎｄａｔｅ）を隠すための中程度の接着しか示さない。これは、予期される。なぜなら、ＰＥＴＡ−Ｐ／ＰＥＳＨ混合物を使用する、タンパク質へのスルフヒドリルもしくはアクリレートの化学結合は存在しないからである。破裂強度の３つの試験において、破裂圧力２０〜４０ｍｍＨｇが観察された。
【００８６】
（実施例２）
（種々の組成物の引張り強度）
（材料および方法）
ペンタ−エリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラ−チオール（分子量１０，０００）（「ＣＯＨ２０６」）、ペンタ−エリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラスクシンイミジル−グルタレート（分子量１０，０００）（「ＣＯＨ１０２」）、およびペンタ−エリトリトールポリエチレングリコールエーテルテトラアミノ（分子量１０，０００）（「ＣＯＨ２０４）を、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ．Ａｌａｂａｍａ）から購入した。シアノアクリレート「Ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ」を、小売り業者から購入した。ゼラチン（７０−１００  Ｂｌｏｏｍ）を、Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入した。スルホ−エチレングリコールビススクシンイミジルスクシネート（「Ｓ−ＥＧＳ」）、ジメチルスベルイミデート（「ＤＭＳ」）、およびジスクシンイミジルグルタレート（「ＤＳＧ」）を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから購入した。ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）（分子量２００）ジ−アクリレート（「ＰＥＧ−ジーアクリレート」）；ＰＥＧ（分子量１，０００）ジ−メタクリレート（「ＰＥＧ−ジ−メタクリレート」）；および２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート（「ＨＥＭＡ」）を、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから購入した。ポリプロピレン（「ＰＰＯ」）（分子量５４０）ジアクリレート（「ＰＰＯ−ジ−アクリレート」）；ＰＰＯ（分子量２３０）ビス−２−アミノプロピルエーテル（「ＰＰＯ−ジ−アミノ２，３０」）；ＰＰＯ（分子量２，０００）ビス−２−アミノプロピルエーテル（「ＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００」）；ポリテトラヒドロフランビス（３−アミノプロピル）（「ＰＴＭＯ」）（分子量３５０）（「ＰＴＭＯ３５０」）；ＰＴＭＯ（分子量１，１００）（「ＰＴＭＯ  １，１００」）；ＰＥＳＨ−Ｐ（分子量４８９）；ＰＥＴＡ（分子量３５２）；およびメタ−重亜硫酸カリウムを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから購入した。過硫酸アンモニウムを、Ｂｉｏｒａｄ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。メチル化コラーゲンを、米国特許第４，１６４，５５９号から改変した方法に従って、精製したウシ真皮コラーゲンから調製した（実施例７を参照のこと）。ＰＴＭＯ（ポリテトラメチレンオキシドジ−アミンともいう）、ＰＰＯジ−アクリレートおよびＰＰＯジ−アミンの構造を、それぞれ、図４ａ、４ｂおよび４ｃに示す。
【００８７】
ゲルを以下のように調製した：
（ａ．  ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６）１００ｍｇのＣＯＨ１０２を、０．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）４００μｌ中に溶解した。１００ｍｇのＣＯＨ２０６を、３００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）４００μｌ中に溶解した。この２つの溶液をビーカー中で混合し、そして約８×０．５×０．５ｃｍの型に注いだ。ゲル化が２〜３分で生じた。このサンプルを、乾燥するまで室温で放置した。乾燥したマトリックスを型から取り出し、そして引張り強度試験の前に３７℃で１時間水和させた。
【００８８】
（ｂ．ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０４）このサンプルを、ａに記載したように調製したが、但し、ＣＯＨ２０６をＣＯＨ２０４に置き換えた。
【００８９】
（ｃ．ＰＥＴＡ／ＰＥＳＨ−Ｐ）このサンプルを、実施例１に記載したように調製した。
【００９０】
（ｄ．ゼラチンゲル）リン酸ナトリウム／炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中２０％のゼラチンを、下記に示しａに記載するように異なる化合物と、ゼラチン１モル当たり活性アミノ１０〜２０モルと仮定し、そして他方の化合物の化学量論レベルを使用して、混合した。
【００９１】
（ｅ．ＣＯＨ１０２／ＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００／ＰＥＧ−ジ−アクリレート）６１５ｍｇのＣＯＨ１０２を９２３μｌのエタノールに溶解し、そしてａに記載したように２４６μｌのＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００および２４６μｌのＰＥＧ−ジ−アクリレートと混合した。
【００９２】
（ｆ．ＰＥＴＡ／ＰＰＯ−ジ−アミノ２３０／ＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００）５００μｌ  ＰＥＴＡ、６３０μｌのＰＰＯ−ジ−アミノ２３０および１５０μｌのＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００を、ａに記載したようにともに混合した。
【００９３】
（ｇ．ＣＯＨ１０２／ＰＴＭＯ）このゲルをｅに記載したように調製したが、ＰＰＯ−ジ−アミノ２，０００をＰＴＭＯ  １，１００に代えた。
【００９４】
（ｈ．シアノアクリレート）この接着剤を水上に押し出し、すぐに硬化させた。
【００９５】
（ｉ．ＨＥＭＡ）１．３ｍｌ  ＨＥＭＡおよび６４μｌのＰＥＧ−ジ−アクリレートを、１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）６００μｌ中に溶解し、そして１００μｌ水中で４０ｍｇの過硫酸アンモニウムと混合した。この混合物を、６０〜８０℃まで４時間加熱した。
【００９６】
（ｊ．ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６／メチル化コラーゲン）２５ｍｇのメチル化コラーゲン、１００ｍｇのＣＯＨ１０２および１００ｍｇのＣＯＨ２０６を、０．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）１ｍｌ中に溶解した。
【００９７】
（引張り強度の測定）
乾燥したゲルの端を固定し、次いで全てのサンプルの中心領域を、試験前に３７℃の生理食塩水緩衝液（ｐＨ６.７）中で約１時間、再水和させた。次いで、マトリクスを、１００Ｎの負荷セルを取り付けたＩｎｓｔｒｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ４２０２試験装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）において切断点まで延伸させた。ピーク負荷を記録し、切断点でのサンプルの測定した断面積を使用して極限応力に変換した。データを、歪み＝ΔＬ／Ｌ０を使用して（応力）対（歪み）としてもプロットした。ここで、ΔＬは延伸部分であり、そしてＬ０は元のサンプルの長さである。
【００９８】
【表１】
2005329264.tif 000002
【００９９】
（実施例３）
（ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６とをベースにする高強度接着剤、ならびにＰＥＴＡ、ＰＥＳＨ−ＰおよびＧＬＹＣ−２０ＨＳから調製された接着剤との比較）
（要約）
いくつかの型のゲルを、可能性のある縫合糸代替処方物として調べた。ペンタ−エリトリトール誘導体をベースにするゲルは高い粘着性を示したが、接着強度は貧弱であった。３アームのスクシンイミジルグリセロール−ＰＥＧをベースにするゲルは、低い粘着強度を示したが、良好な接着強度を示した。６０％水性（ｗ／ｖ）ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６（これに種々の繊維状物質（例えば、繊維状不溶性コラーゲン、ポリグリコリド縫合糸およびガラスウール）が添加された）をベースにするゲルは、良好な粘着強度および良好な接着強度の両方を示した。
【０１００】
高強度医療用接着剤は、外科的切開の閉合において縫合糸代替物として関心の対象である。特に、ＰＥＴＡとＰＥＳＨ−Ｐとから形成されたゲルは、ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６との２０％（ｗ／ｖ）溶液から形成された引張り強度より、約１０倍大きい引張り強度を有することが示されていた。ＰＥＴＡ−ＰＥＳＨ−Ｐゲルが繊維状または微粒子状のポリマーを補充された場合、なおさらに高い引張り強度を有するゲルが観察された。
【０１０１】
この実験は、ＰＥＴＡ／ＰＥＳＨ−Ｐおよび関連するゲルの接着特性、ならびに、６０％（ｗ／ｖ）のＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６（これにコラーゲンおよび他のポリマーが添加される）との処方物の接着特性および引張り特性の両方を記載する。３アームグリセロールスクシンイミド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）および上記の試薬から形成されるゲルの特性もまた記載される。
【０１０２】
（材料および方法）
ＰＥＴＡ、ＰＥＳＨ−Ｐおよびペンタ−エリトリトールテトラキス（３メルカプトアセテート）（ＰＥＳＨ−Ａ）、ポリエチレン、表面活性化１８０μ粒子サイズ、およびポリブタジエン、エポキシ官能化、エポキシＥ．Ｗ．２６０は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入した。ＧＬＹＣ−２０ＨＳ（ポリ−オキシエチレングリセリルエーテル）スクシンイミジルスクシネート２６００ｍｗ）、ＤＥＰＡ−１０Ｈ（ポリ−オキシエチレンビス−アミン１０４０ｍｗ）を、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｊａｐａｎ）から入手した。ＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）の試薬等級であった。ポリエチレン−コ−アクリレート−スクシンイミデート（ＰＥ−ＡＣ−Ｓ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ）から購入したポリエチレン−コ−アクリレート（５％アクリレートを伴っておよその分子量４００Ｋ）から合成した。Ｋｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈ不溶性コラーゲン（Ｓｅｍｅｄ  Ｆ）をＫｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した。Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が不溶性２型コラーゲンを供給した。Ｐｒｏｌｅｎｅ  ７−０縫合糸はＥｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造された。粗繊維質コラーゲンシートは、Ｐｒｉｏｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｇ．，Ｈａｒｎｅｒ，Ａ．およびＰｏｗｅｒｓ，Ｎ．「Ａ  ｓｐｒａｙａｂｌｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｂｏｖｉｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ａｎｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｌａｓｍａ」，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒ．Ｓｕｒｇ．６８，４７９−４８５（１９９９）に記載されたバースト試験のために使用されたコラーゲンと同じ粗繊維質ウシ真皮コラーゲンから切り出された。これらコラーゲンシートを、さらなる研究のための組織モデルとして供した。より小さな繊維コラーゲンを、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により製造された、再沈澱ペプシン消化ウシ真皮コラーゲンから調製した。ガラスウールをＶＷＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ポリ−グリコリド縫合糸（被覆なし）（「Ｄｅｘｏｎ  Ｓ」）はＤａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｃｋ製であった。
【０１０３】
引張り強度の測定のためのゲル形成は、上記実施例１に記載されている。バースト試験のために、使用した装置はＷａｌｌａｃｅら（前出）に記載されている。約１ｍｌの総処方物を、粗繊維質コラーゲンシート基体上にスプレーするか、またはへらによって広げ、硬化させた。この処方物が比較的堅い弾性固相（もはや粘着性でない）構造（ｔｅｘｔｕｒｅ）に達した後、水圧を印加し、そしてシールを破裂させる圧力をｍｍＨｇとして記録した。
【０１０４】
ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６との６０％ゲルを以下のように調製した：ＣＯＨ１０２を６０％（ｖ／ｗ）でＳ−緩衝液（０.５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.０）に溶解し、そしてＣＯＨ２０６を６０％で３００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.５または８.９）に、あるいは１１７ｍＭリン酸ナトリウム、１８３ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９.６）（「ＰＣ緩衝液」）に溶解した。いくつかの場合、ホスフェートとカルボネートとの上記比率は、より速い硬化時間のためにｐＨ９.４４を与えるよう変化させた。それぞれの場合において使用したｐＨは、所望のゲル化速度によって決定した。このような基本の処方物に種々の添加剤を加えた。例えば、Ｋｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈおよびより小さな繊維サイズのコラーゲンを、１ｍｌの最終ゲルあたり２８ｍｇで加え；ガラスウールを２５ｍｇ／ｍｌで加え；そしてポリグリコリド縫合糸を４０ｍｇ／ｍｌで加えた。
【０１０５】
（結果および考察）
結果を以下に考察し、下記表２、３、および４に示した。６０Ｎ／ｃｍ２より大きい引張り強度を「強力」とみなす。５０ｍｍＨｇより大きいバースト強度を「良好な接着」とみなす。
【０１０６】
ＰＥＴＡとＰＥＳＨ−Ｐとのゲルが良好な引張り強度を示した（実施例１）。しかし、それらは、バースト試験で、水和した模擬組織（粗繊維質コラーゲンシート）への接着について試験した場合、貧弱な接着（＜５０ｍｍＨｇバースト圧）を示した。下記表２に示されるように、次いで、この処方物を、水溶性ＧＬＹＣ−２０ＨＳおよびＤＥＰＡ−１０Ｈ、またはＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６との対（これらは、水性媒質において単独で、コラーゲンシートに対して良好な接着を与えた）を含有するよう改変した。これらの物質は良好な引張り強度（手動による評価）を有したが、再びコラーゲンシートに対しては貧弱な接着性を有した。ＧＬＹＣ−２０ＨＳとＤＥＰＡ−１０Ｈとから形成したゲルもまた、その処方物中に水が存在しない場合、貧弱な接着性を有した。これらの試薬は水溶性であるので、水性緩衝液中に溶解される場合、異なる結果が観察され得る。
【０１０７】
しかし、ＧＬＹＣ−２０ＨＳが質量に基づいて主要な成分である場合、ゲルは弱いがバースト試験において良好な接着性を示した。これらの特定の組合せの成分を使用すれば、高い引張り強度または高接着性結合のいずれか（両方ではない）を達成し得るようであった。
【０１０８】
【表２】
2005329264.tif 000003
【０１０９】
スクシンイミジル誘導体化ポリエチレン（ＰＥ−ＡＣ−Ｓ）が、ＰＥＴＡ−ＰＥＳＨ−ＰゲルおよびＣＯＨ１０２／２０６ゲルのための有効な引張り強度増強剤として作用する能力もまた評価した（表３）。この物質は、恐らく、それが延伸されたフィラメントではなかった（すなわち、アスペクト比が十分には高くなかった）ので、これらのゲルの引張り強度を増大させなかった。
【０１１０】
【表３】
2005329264.tif 000004
【０１１１】
表４にもＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６＋Ｋｅｎｓｅ−Ｎａｓｈ微小繊維コラーゲン（これは、ＣＯＨ１０２／２０６単独の２０％および６０％（ｗ／ｖ）ゲルに対して増強した引張り強度を示した）の結果をまとめる。さらに、ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６／コラーゲン処方物は、コラーゲンシートに対する良好な接着性結合を有した。他の添加剤（例えば、皮膚研削物（ｈｉｄｅ  ｇｒｉｎｄａｔｅ）およびＰｒｏｌｅｎｅ  ７−０縫合糸）もまた、コントロールに対してゲル強度を増強した。いくつかの充填剤（例えば、小さな繊維コラーゲン、ポリエチレン、およびポリブタジエン）は、引張り強度増強特性を示さなかった。最後に、いくつかの充填剤またはそれらの組合せ（例えば、ガラスウールおよび不溶性コラーゲン＋ポリ−グリコリド縫合糸）は、シアノアクリレートで見られる引張り強度（３８５Ｎ／ｃｍ２）を超える引張り強度の顕著な増強を示した（実施例１）。限られたバースト強度データを集めたが、データは、これらＣＯＨ１０２／２０６（６０％）処方物のすべてが、コラーゲン表面に対して高度に接着性であり、したがって組織に対してもまた接着すると予測されることを確証している。
【０１１２】
表４に示されたように、Ｐ−ＨＥＭＡヒドロゲルはＳａｎｔｉｎ，Ｍ．ら、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）−ｇｅｌａｔｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １７，１４５９−１４６７に記載され；そしてゼラチン−ＰＥＧ−ジ−アクリレートはＮａｋａｙａｍａ，Ｙ．およびＭａｔｓｕｄａ，Ｔ．「Ｐｈｏｔｏｃｕｒａｂｌｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｇｌｕｅｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｅｌａｔｉｎ  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｍａｔ．Ｒｅｓ．（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．）４８，５１１−５２１（１９９９）に記載される。
【０１１３】
【表４】
2005329264.tif 000005
【０１１４】
図５は、ＣＯＨ１０２／２０６（６０％）＋２８ｍｇ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘコラーゲン＋４０ｍｇ／ｍｌ  Ｄｅｘｏｎ  Ｓ非被覆ポリグリコリド縫合糸（４−０）の切断片の引張り試験を示す。測定した引張り強度は、７００Ｎ／ｃｍ２より高かった。測定は、サンプルが試験デバイス（下方へ傾斜）から滑り始めたとき中断した。
【０１１５】
（実施例４）
（活性ＰＥＧを含有するコラーゲンシート複合体）
（要約）
ＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６は、反応することなく、エタノール中に一緒に溶解し得る。このエタノール溶液をエバポレートして乾燥すると、反応性ＰＥＧ粉末が残り得る。ＰＣ緩衝液（ｐＨ９.６）中に入れると、粉末は直ぐにゲル化する。この知見を、接着性シートを開発するために使用した。コラーゲンスポンジおよびスポンジで被覆した粗繊維質コラーゲンシートに、ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６とのエタノール溶液を含浸させた。乾燥後、この反応性ＰＥＧシートは、粗繊維質コラーゲンシートに結合可能であった。１０分後、ｐＨ７で、約３００ｍｍＨｇのバースト強度が観察された。
【０１１６】
コラーゲンスポンジが結合した（実施例３に記載されたように調製した）粗繊維質コラーゲン裏打ちからなる接着性シートもまた調製した。スポンジ層に反応性ＰＥＧ粉末を含浸させた。このようなシートを、ｐＨ９.６緩衝液で湿潤させた第２の粗繊維質コラーゲンシート上に置いて乾燥させると、強力な結合が３０秒ほどで形成された。第２のコラーゲンシートとの接着性シートの結合を、バースト試験により測定した。５００ｍｍＨｇまでのバースト強度が観察された。
【０１１７】
（材料および方法）
粗繊維質コラーゲンシートを本明細書に記載のとおりに調製した。再構成微小繊維コラーゲンのスラリーを頂部に押し出すことによって、このコラーゲンシートにコラーゲンスポンジを付着させた。期限切れのＺｙｄｅｒｍ  ＩＩコラーゲン（６５ｍｇ／ｍｌタンパク質、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｅｓｔｈｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を水で希釈して２０ｍｇ／ｍｌの分散物を達成することによって、再構成コラーゲンスラリーを調製した。１ｍｌのスラリーあたり、約７ｃｍ２のシートを覆った。コラーゲンスラリーを粗繊維質コラーゲンシート上に押し出した後、この複合体を冷凍し、次いで凍結乾燥した。凍結乾燥後、多孔性コラーゲンスポンジは、コラーゲンシートに対して接着性のままであった。乾燥スポンジに、ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６とのアルコール溶液を滴下して加えた。ＣＯＨ１０２とＣＯＨ２０６とのアルコール溶液は、２００ｍｇのＣＯＨ１０２および２００ｍｇのＣＯＨ２０６をそれぞれ、１.８ｍｌの無水エタノール（分子ふるい上で乾燥させた）に加えることによって調製した。エタノール中での両ＰＥＧ化合物の溶解を、緩やかな加温および攪拌（約４０℃まで）によって達成した。次いでこの２つの溶液を混合した。１ｍｌのエタノール溶液を使用して約１０ｃｍ２のシートを覆った。次いで、エタノール中のＰＥＧ溶液で湿潤させたスポンジ−コラーゲンシートを、減圧チャンバー中で短時間乾燥させた。バルク溶媒を飛ばし、シートを数時間凍結乾燥器に移して、溶媒残留物を除去した。乾燥シートを−２０℃で乾燥アルゴン下で貯蔵した。
【０１１８】
第２の粗繊維質コラーゲンシートへの結合を試験するため、バースト試験を行った。コラーゲンの試験シートを、ＰＣ緩衝液（ｐＨ９.６）で湿らせ、サンプルセル中に確保した。追加の緩衝液（０.１〜０.２ｍｌ）をシートに適用した。次いで、活性ＰＥＧスポンジシート（上記のように調製；１.２×１.２ｃｍ）を、試験コラーゲンシート上にスポンジ側を下にして置いた（デフェクトのサイズ（ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｄｅｆｅｃｔ）：２ｍｍ）。この２つのシートを２〜３秒間手で適所に保持して、活性ＰＥＧシートの良好な接触および水和を確実にした。次いで、この２つのシートを、水圧が下から印加されるまで放置して室温でインキュベートした。シールを破裂するために必要な圧力を記録した。
【０１１９】
（結果）
表５は、活性成分を含まないコントロールシートと比較して、非常に高い結合強度がｐＨ９.６で達成され得ることを示す。短時間でさえ高結合強度が観察される。この結合の長期間安定性を定性的に試験した。結合したシートの対をバースト試験装置から取り出し、そして１００ｍｌの水（３３℃）中に置いた。結合は、３０時間後でさえ、なお完全であり、そして明らかに強力であった。
【０１２０】
【表５】
2005329264.tif 000006
【０１２１】
表６は、水和緩衝剤のｐＨを低下させる効果を示す。結合の強度は、ｐＨ二依存し、そしてはるかに弱い結合がｐＨ７．５において観察された。しかし、より低いｐＨでの結合強度は、より長い（３〜１０分）結合形成をさせることにより改善された。これは、特定の適用について受容可能であり得る。
【０１２２】
失敗の形態は、常に明らかというわけではなかった。いくつかの場合において、試験シートは、試験クランプから、結合を損傷させずに取り除かれた。これらの結果は報告されていない。試験シートがしっかりクランプされていた場合、それは、活性シートと試験シートとの間に失敗があったようであった。いくつかの場合においてこの活性シートが持ち上げられ、そして水が穴から噴出した。他の場合において、水は、試験セルの縁に現れたが、供給源は明かではなかった。
【０１２３】
【表６】
2005329264.tif 000007
【０１２４】
＊ｐＨ８．９緩衝液は、３００ｍＭリン酸ナトリウムであった；ｐＨ７．５緩衝液は３００ｍＭリン酸ナトリウムであった。
【０１２５】
（実施例５：活性ＰＥＧを含む接着シートに関するさらなる研究）
（まとめ）
接着シートを、ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６、Ｚｙｄｅｒｍコラーゲン、およびＫｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈ（Ｓｅｍｅｎ  Ｆ）コラーゲンから調製した。そのようなシートは粗繊維性コラーゲンシートに結合される場合、良好なバースト強度を示した。
【０１２６】
剪断不全結合試験を開発した。この試験において、活性ＰＥＧ接着シートの結合強度はシアノアクリレート（ＳＵＰＥＲＧＬＵＥ）に匹敵した。この実験は、移植等級のＫｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈ  コラーゲンを含む、生体適合性材料からの接着シートの調製を記載する。本明細書においてはまた、剪断不全試験における種々の処方物の比較結果を報告する。
【０１２７】
（材料および方法）
実施例４において記載されるように、粗繊維性コラーゲンシート、再構成コラーゲンならびにＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６から活性シートを調製した。
【０１２８】
Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈコラーゲンからの活性シートは、以下のように調製した：コラーゲン（４ｇ）をＨＣｌでｐＨ２に調整した２００ｍｌの脱イオン水に加えた。オーバーヘッドインペラーを用いた攪拌を６日間維持した。繊維は膨潤しそして分散し、ほとんど結合性の塊を形成した。スラリーを９ｃｍ直径の平方ポリスチレン重量ボートに注いだ（底を覆うために１ボート当たり約１５ｍｌ）。注がれたスラリーを、３３〜３７℃でインキュベーター中で放置して乾燥させた。シートは、重量ボートの表面で形成された。いくつかの場合、そのようなシートをＺｙｄｅｒｍコラーゲンで（水中２０ｍｇ／ｍｌのスラリー）コーティングし、凍結し、そして凍結乾燥した。次いで、Ｚｙｄｅｒｍコラーゲンの薄いスポンジ様層でコーティングされたそのような乾燥したシート  をＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６（各々の成分は１０％ｗ／ｖ濃度であった）で活性化した。これらを、「酸性ＫＮシート」と称した。代替の手順は、Ｚｙｄｅｒｍコラーゲンシートで一回コーティングされ、そして水中で３時間インキュベートされてｐＨ９−１０に調整された、乾燥したＳｅｍｅｄＦシート（酸性スラリーから乾燥した）を利用した。さらなる水酸化ナトリウムを、必要に応じてｐＨ９−１０で溶液およびシートを保持するために加えた。このシートを溶液から回収し、そして３７℃で一晩乾燥した。次いで、このシートを１２ｍｇ／ｍｌでのＺｙｄｅｒｍコラーゲンで再コーティングし、凍結し、凍結乾燥し、そして最後に、エタノール中の活性ＰＥＧに浸積して、乾燥した活性サンプルを得、これを「塩基性ＫＮシート」と称した。
【０１２９】
活性シートについての剪断不全試験を、図６に示したデバイスを用いて開発した。ＰＥＧで活性化したか、または破壊試験のために通常通りに調製したかのいずれかである粗繊維性コラーゲンシートを１×３ｃｍのサイズに切断した（「ストリップ」と称した）。プラスチックタブまたは接着テープを一方の末端にわたって固定し、そのストリップの１ｃｍ平方の面積を覆った。このプラスチックタブを皮膚研削ストリップ（ｈｉｄｅ  ｇｒｉｎｄａｔｅ  ｓｔｒｉｐ）に対してシアノアクリレートのりを用いて固定した。直径が約２ｍｍの穴を、そのプラスチックタブまたはそのテープにおいて開けた。コラーゲンシートの１平方ｃｍの面積にわたって、ｐＨ９．６のＰＣ緩衝液を約４００μｌ配置した。次いで、活性ＰＥＧ／コラーゲンシートを緩衝液でしめらせた皮膚研削物に配置し、そして３０秒間軽い圧力に保持した。このようにして、結合した表面は１平方ｃｍであった。次いで、フックを各々のストリップの末端の穴を通じて配置し、そして結合したストリップを適切な支持体にひっかけた。より低いフックには、金属ワッシャー（１ワッシャーあたりの平均重量は１．６３ｇ）を加えて結合した表面における剪断力を増分的に増加した。結合した表面を引っ張って離すために必要な重量を記録した。結合表面の性質および結合処方物における変動を研究した。これには、表面上にコラーゲンスポンジを含むが活性ＰＥＧを含まないコントロールストリップを用いることおよびシアノアクリレートと皮膚研削ストリップを結合することが包含される。
【０１３０】
１セットのサンプルは、１つの未処置の皮膚研削ストリップの、コラーゲンスポンジコーティングされたストリップへの（活性ＰＥＧを含まない）結合を包含した。別のセットのサンプルを、同じ対のストリップを用いて行ったが、今回は、ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６混合物と併置させたストリップに加え、そしてゲル化させた。ゲル化混合物は以下のようであった：
１０ｍｇ  ＣＯＨ１０２および４０μｌ  ｐＨ６．０、０．５ｍＭリン酸緩衝剤
１０ｍｇ  ＣＯＨ２０６および４０μｌ  ｐＨ８．９、３００ｍＭリン酸緩衝剤。
【０１３１】
そのような混合物は、約１５秒間でゲル化し、これを、ゲル混合物を１つのストリップに加え、その上に第二のストリップをプレスし、そして３０秒待ってゲル化が生じるのに十分な時間放置した。
【０１３２】
シアノアクリレートでのストリップの結合について、試験ストリップは、ＰＣ緩衝液でまずしめらせた（１平方ｃｍの面積につき２００μｌ）。次いで、シアノアクリレートでコーティングした第二のストリップを第一のストリップの上にプレスした。活性ＰＥＧシートと同じように、緩和な圧力のみを用いて、３０秒間の結合時間の間並置を維持させた。
【０１３３】
（結果）
酸性ＫＮシートおよび塩基性ＫＮシートを破壊試験に供した：１平方ｃｍの片をＰＣ緩衝液ですでにしめらせた試験皮膚研削シートの上に配置した。酸性ＫＮシートは、非常に低いバースト強度（２ｍｍＨｇおよび４ｍｍＨｇ）を示した。塩基性ＫＮシートは、コーティングされたコラーゲンシートでも以前に結果に類似した結果を与えた（３２４ｍｍＨｇ、２８６ｍｍＨｇおよび３１１ｍｍＨｇ）。
【０１３４】
剪断不全方法を用いていくつかの条件下でコラーゲンシートの結合を比較した（表７）。ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６により結合するシートについて、非常に貧弱な結合強度が観察された。活性ＰＥＧシートは、シアノアクリレートで観察された強度に類似する強度を示した。
【０１３５】
【表７】
2005329264.tif 000008
【０１３６】
＊最終の結合強度は決定されず；両方の場合において、コラーゲンシートは破壊されたか、またはフックの固定に失敗し、結合領域もそうではなかった。  
【０１３７】
（実施例６：高強度の生体接着剤の合成のための方法）
この実施例は、ペンダントＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）のコポリマーの合成を記載する。
【０１３８】
（スキーム１（図７））
種々の分子量の二官能性ＰＥＧを選択し、そして制御された開環重合によりＰＣＬに結合させて、固定および選択された分子量のＰＣＬに加える（Ｈｅｄｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９８，３１，８６９１−８７０５）。ＰＣＬにおける末端ＯＨ基をグルタリルスクシンイミジルに変換した（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８４，７，１７５−１８０）。リジンエチルエステルを付加して反復ＰＥＧ、ＰＣＬおよびリジンセグメントを有する直鎖ポリマーを与えた。リジンセグメントは、ペンダントカルボキシルエステルを有する。このエステルを加水分解して遊離カルボキシル基を与える（Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １９９２，２５，４４７６−４４８４）。次いで、このカルボキシル基をグルタリルスクシンイミジルに変換する（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ）。
【０１３９】
このスキームは、ペンダント反応基（ＮＨＳ）を伴い、分解性の連結（ＰＣＬ）を有し、水溶性の基（ＰＥＧ）を有する直鎖を生成した。ポリマーの堅さは、短いＰＥＧエレメントに対して長いＰＣＬエレメントを加えることにより増加させ得る。しかし、ＰＥＧは、水溶性を確保するために十分長くなければならない。これは、経験的に決定され得る。
【０１４０】
（スキーム２（図８））
ペンダント反応基を有するが、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）反復セグメントを有する類似の直鎖。変動するが選択された分子量の二官能性ＰＥＧを２−ブロモ−２−メチルプロピオニルＢｒで活性化し、そしてＰＭＭＡの制御されたセグメントを各末端で成長させた。末端は、Ｂｒ基を含有し、これは、標準的な有機化学方法により−ＯＨ基に変換され得、そしてさらにグルタリルＮＨＳへと誘導体化され得、スキーム１におけるようにリジンエチルエステルと反応され得、そして最後にペンダントカルボキシエチルエステルを加水分解してカルボキシレートへと遊離させ、そしてグルタリルＮＨＳへと誘導体化し、そして異なる物理的特性を有する類似のコポリマーを再び与えた（例えば、ＰＭＭＡは、高い引張り強度を有することが知られる）。十分なＰＥＧ官能性が水溶性のために提供され得る。ＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＭＭＡ−ｌｙｓ反復ユニットを構築し、その結果ＰＣＬが必要な生体分解性結合を提供することが必要であり得る。そのようなセグメントの構築は、Ｈｅｄｒｉｃｋに記載されている。
【０１４１】
ポリマーを強化するための別のアプローチは、Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２９：５５０８（１９９６）に記載されている。．２−シナモイルエチルメタクリレート（ＣＥＭ）のようなモノマーを含むＰＭＭＡブロックが合成され得る。以下の構造は例示である：水溶性ブロック（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ））ならびにいくつかのアミノおよびカルボキシ含有モノマー（例えば、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭ）およびモノ−２−（アクリロイル）エチルスクシネート（ＡＲＳ））、および水溶性ブロック（例えば、ポリＭＭＡ−コ−ＣＥＭ）を含むジブロックポリメタクリレートを合成する。このポリマーを水中または極性媒体中に存在させるとき、ＭＭＡ  ＣＥＭブロックは、水を回避し、そして別個の領域へと会合する。Ｌｉｅ，ｅｔ  ａｌ．に概説されるように、ポリマー中の水溶性ブロックと非水溶性ブロックとの比率を変更して、異なる領域の構造を得ることが可能である。会合し、水を回避する領域は、ミセル形状（球状）、ロッド様形状またはプレート様形状を採り得る。なぜなら、ポリマー鎖中に非水溶性ブロックを複数含むからである。ロッド形状のポリＭＭＡ−ＣＥＭブロックについて精確な条件が見出される場合、適切な波長および強度の光によりこれらのブロックを架橋し得る。次いで、このロッドを固定し、そして水溶性ポリマーブロック（この場合ポリＨＥＭＡ−ＡＥＭ−ＡＲＳ）は、そのロッドを取り囲む。次いで、反応性アミノ基を有するナノメートルスケールのロッドが得られ得る。そのようなロッドの寸法は、１−３０ｎｍの直径および数百ｎｍから数千ｎｍの長さであることが期待される。そのようなロッドはまた、ポリマーゲル網目を強化するように機能するはずである。なぜなら、メチル化コラーゲンは、本願において他に記載されるようなＰＥＧ網目を強化すると考えられるからである。
【０１４２】
Ｈｅｄｒｉｃｋは、制御されたサイズであるが反応性基を有せず、そして複数のペンダント反応性基を有する直鎖のＰＥＧ−ＰＣＬ−ＰＭＭＡセグメントを作製する方法を記載する。Ｎａｔｈａｎは、ＰＥＧとリジンとを結合させて反応性ペンダント基を有する（が、分解性のエステル結合はなく、そして強度のためにＰＣＬおよびＰＭＭＡの付加しない）反復ポリマーを与える方法を記載する。Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉは、グルタリルスクシンイミジルＰＥＧを作製するための方法を与える。ＷＯ９９／１７４１７およびそこで引用される参考文献は、光ラジカルプロセスおよびフリーラジカルプロセスにより重合されるべきＰＥＧポリラクチド−アクリレートを記載する。これらの材料は、強度のためにＰＭＭＡを付加することを記載しない。しかも、これらは、共有結合（フリーラジカルにより駆動されない）のためのペンダントＮＨＳにも他の基にも言及していない。
【０１４３】
（実施例７：ＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲンおよび繊維性充填剤ガラスウールまたはＶｉｃｒｙｌ）
（材料）
（ａ．メチル化コラーゲン）
メチル化コラーゲンを、Ｍｉｙａｔａ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第  ４，１６４，５５９号の手順の改変により調製した。０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．１３Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．２のウシペプシン化再構成コラーゲンの分散剤（３％  ｗ／ｖ）（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．５，１１９−１３５，１９８５の方法により調製した）を、室温で、薄層におけるガラス表面上に押し出し、そして乾燥させた。メタノール性ＨＣｌは、１０４ｇの無水硫酸ナトリウムおよび１０．７ｍｌの濃ＨＣｌを１３００ｍｌの無水メタノールに加えることにより調製し、そして２日間強固にキャップして放置した。乾燥したコラーゲンを１×５ｃｍのストリップに切断し、そして封入した容器中にメタノール性ＨＣｌ（２００ｍｌメタノール性ＨＣｌ：１ｇ乾燥コラーゲン）に加えて、そして３日間２０℃で穏やかに振盪した。メタノール性ＨＣｌを慎重にデカントして除き、そしてそのコラーゲンを焼成ガラス漏斗上で濾過して残りのメタノールを除去した。完全なメタノール除去は、減圧下で一晩で完了させた。メチル化コラーゲンを蒸留水中で再溶解し、そしてｐＨは約４〜６に調整した。水量を計算して約３１ｍｇ／ｍｌの最終のタンパク質濃度を達成させた。より低いタンパク質濃度で溶解したメチル化コラーゲンのサンプルを、短い凍結乾燥により再濃縮して水を除去した。溶解したメチル化コラーゲンを完全に透明な材料であり、繊維もオパール光彩も含まず、粘性ゲル様の粘稠度を有した。（コラーゲンの不完全なメチル化に起因して）かすんでいたか不溶性の成分をなおも含んでいた調製物は、接着処方物において貧弱に振る舞い、過度に多く膨潤し、そして貧弱な結合強度を示したゲルを生成した。
【０１４４】
（ｂ．充填剤なしの接着剤）
０．５ｍｌの接着剤について、５０ｍｇの乾燥粉末化したＣＯＨ１０２（４アーム化テトラグルタリルスクシンイミジルポリエチレングリコール、１０Ｋ、図９ａ）および５０ｍｇの乾燥粉末化したＣＯＨ２０６（４アーム化テトラチオールポリエチレングリコール、１０Ｋ；図１０ｂ）を３１ｍｇタンパク質／ｍｌで４００ｍｇのメチル化コラーゲンと混合した。両方のＰＥＧ成分は、コラーゲン水溶液中に溶解し、透明な粘性液体を得た。溶液を、スパーテルで組織部位に広げ、それを重力の下でほとんど流れない。接着剤を硬化するために、２０〜５０μｌの緩衝液（１３４ｍＭリン酸ナトリウム、１６６ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ８．９；またはＰＣ緩衝剤、ｐＨ９．６のいずれか）を、その表面に加えた。その緩衝液は、そのゲルを希釈しなかったが、ゆっくりと浸出した。３〜５分で、そのゲルの表面は認知可能に硬化した。
【０１４５】
水和した条件下で結合強度の研究について、ゲルおよび基質は、ベンチ上で２０分間にわたり硬化させ、次いで、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７、３７℃で２時間以上にわたって浸した。結合強度の試験は、張力装置において実施した。
【０１４６】
（ｃ．充填剤を有する接着剤）
Ｖｉｃｒｙｌは、グリコール酸と乳酸との（９０：１０の）コポリマーであり、Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０；Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から移植可能なメッシュとして販売されている。
【０１４７】
このメチル化コラーゲンに、移植可能なＶｉｃｒｙｌメッシュからほどいた１９ｍｇの１−２ｃｍ長のＶｉｃｒｙｌ糸を加えた。いくつかの場合において、０．３ｃｍほどの短さのＶｉｃｒｙｌ繊維もまた使用した。糸および粘性ゲルを混和させ、次いで、上記のようにＰＥＧ成分を加えた。その組織への適用および硬化は上記の通りであった。他の充填剤および０．５ｍｌの接着剤へ加えられたそれらのそれぞれの量は以下のとおりであった：ガラスウール９ｍｇ；繊維性コラーゲン（Ｓｅｍｅｄ  Ｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ，Ｋｅｎｓｅｙ−Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）８ｍｇ；Ｄｅｘｏｎ  Ｓ（ポリグリコリドラクチド縫合糸「４−０」）、１０片１ｃｍ長；エラスチン繊維（ウシ頸部靱帯、０．２５〜１０ｍｍ，Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ，Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ，ＭＯ）、  ４０ｍｇ；スレンレス鋼繊維（Ｂｅｋａｅｒｔ  Ｆｉｂｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＧＡ）、１４−２８ｍｇ（繊維は、水または１Ｎ  ＨＣｌで洗浄してポリビニルアルコールコーティングで除去した）；ポリラクチド／グリコリド（６５；３５、４０−７５，０００分子量、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｏｍｓｂｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．１５，７６３−７６７（１９９９）の方法によって調製される２−４直径の微粒子、２５ｍｇ）から調製されるポリラクチド／グリコリド微粒子。
【０１４８】
（ｄ．別の薬剤により置換されるメチル化コラーゲンを有する接着剤）
種々の長鎖分子を試験した（例えば、ヒアルロン酸（ルースターコーム、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、キトサン（Ｓｉｇｍａ）、およびポリリジン（Ｓｉｇｍａ））。ヒアルロン酸について、式は以下であった：ＣＯＨ１０２、５０ｍｇ，ＣＯＨ２０６、５０ｍｇ、Ｖｉｃｒｙｌ、１４ｍｇ、および４００μｌのヒアルロン酸、水中の２％（ｗ／ｖ）、キトサンについて４に合わせたｐＨ；キトサンについて、同じ式で、水中、ｐＨ４−５中に１％キトサン（ｗ／ｖ）４００μｌを用いた。ポリリジンについて、ＣＯＨ１０２、４０ｍｇ、ＣＯＨ２０６、３０ｍｇは、５０μｌの水中に一緒に溶解した；ポリリジン臭化水素酸、３３０Ｋ、４０ｍｇを６０μｌの水中に溶解した；２つの溶液を一緒に混合し、そして７ｍｇのＶｉｃｒｙｌフィブリルを添加した。さらに、上記のように調製されたポリラクチド／グリコリド粒子をメチル化コラーゲンについての代替物として試験し；１６．５ｍｇの粒子を３００μｌの水中に懸濁し、そして５０ｍｇ  ＣＯＨ１０２，５０ｍｇ、ＣＯＨ２０６、および１４ｍｇ  Ｖｉｃｒｙｌと混合させた。全てのゲルを、上記のようにｐＨ９．６緩衝液の重層で硬化させた。
【０１４９】
（ｅ．充填剤なしかつメチル化コラーゲンなしでの接着剤）
ＣＯＨ１０２を２０％（ｗ／ｖ）で水中に溶解し；ＣＯＨ２０６で２０％でｐＨ８．９緩衝液中に溶解した。この２つの溶液を迅速に混合し、そしてその部位へと押し出した。ゲル化を乾燥中で行った。
【０１５０】
（機械試験）
接着剤処方物の結合強度を、図１０に示される３つの型の組織または組織代替物に適用した。コラーゲン膜（図１０ａ；ソーセージ包装；Ｔｈｅ  ＳａｕｓａｇｅＭａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）をイソプロピルアルコールおよび水で洗浄して、脂質および塩の不純物を除去し、そして乾燥した。１−３ｍｍの重複および１ｃｍの幅を有する膜の結合を、そのシートの上に接着剤を広げることによって行った。接着剤を、ベンチ上で２０分間硬化させ、次いで３７℃で３０分間から２時間浸し、その後、１００Ｎロードセルを用いてＩｎｓｔｒｏｎモデル４２０２試験装置（Ｃａｎｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）中で引っ張って離した。ブタ頸動脈（１０ｂ、Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ａｒｋａｎｓａｓ）の結合はまた、末端同士の構造中で行った。切断した頸動脈セグメントを隣接させ（４６ｍｍ直径）、そして接着剤を広げた；支持縫合糸は適用しなかった。インキュベーションおよび試験は、コラーゲン膜について記載したものと同じであった。
【０１５１】
牛皮ストリップ（１０ｃ）の結合のために、除毛したウシ皮膚片を、Ｓｐｅａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｑｕａｋｅｒｔｏｗｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから購入した。片を２−３ｍｍの厚さでほぼ均一であった。ストリップ０．４ｃｍの幅を、単一末端レーザーブレードを用いて皮膚研削片（ｈｉｄｅ  ｐｉｅｃｅ）から切断した。切断ストリップは末端同士で隣接させ、そして０．２５ｍｌの「ＣＴ００３」接着剤または数滴のシアノアクリレートを広げることによって結合させた。インキュベーションおよび試験は、コラーゲン膜について記載されたものと同じであった。以下の図８は、コラーゲン膜において試験した場合、ＣＯＨ１０２／ＣＯＨ２０６／メチル化コラーゲンは、ガラスウール（式ｃ）を充填したときに、充填していない式ａおよびｂよりも結合強度において優れていたことを示した。事実、結合強度は、市販のシアノアクリレート接着剤（表９）を用いて得られたものに匹敵した。医療等級のシアノアクリレート（Ｄｅｒｍａｂｏｎｄ）は、コラーゲン膜とでさえより強力な結合を形成した（７回の測定について５．２±１．９Ｎの力）
【０１５２】
【表８】
2005329264.tif 000009
【０１５３】
＊コラーゲン膜は破れたが、シーラント結合はなおも無傷であった。
【０１５４】
【表９】
2005329264.tif 000010
【０１５５】
以下の表１０は、異なる充填剤、Ｖｉｃｒｙｌ糸を、ＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲンへの添加についてのデータを提示する。牛皮または頸動脈のような基材を用いると、その基材は破れず、そして結合強度値は、接着結合それ自体の強度についての代表値であった。代表的に、これらの結合は接着させなかった。すなわち、接着ゲル自体の引張り強度は、無傷のままであり、そして制限因子ではなかった。３７℃で生理食塩水中で観察された結合強度はまた、組織基材の同じセットを結合することについてシアノアクリレートを用いてみられるものに匹敵した（表９）。
【０１５６】
【表１０】
2005329264.tif 000011
【０１５７】
＊牛皮ストリップ、０．５ｃｍの幅、ブタ頸動脈、０．３−０．５ｃｍ直径、コラーゲン膜：ソーセージ包装、０．２ｍｍ厚、１ｃｍ。
【０１５８】
（異なる充填剤の硬化）
表１１は、種々の充填剤材料の結果を提示する。試験は、牛皮ストリップ上で行い、２時間生理食塩水中で３７℃で浸した。繊維状材料は、球状粒子より有効であったようであった。充填剤のゲルに対する結合は、強度の改善にとって非常に重要であった。コラーゲンポリエチレングリコールフィラメントは蝋状であり、そしてゲルには接着しなかった。従って、それらの高度なアスペクト比にも拘わらず、それらは有効な充填剤ではなかった。
【０１５９】
【表１１】
2005329264.tif 000012
【０１６０】
（他のポリマー分子でメチル化コラーゲンを置換することの効果）
表１２は、メチル化コラーゲンを含む処方物に匹敵する結合強度を与えた試験材料はなかったことを示す。
【０１６１】
【表１２】
2005329264.tif 000013
【０１６２】
（架橋結合の効果）
下記の表１３は、他の型の架橋反応からそのゲルを形成した場合、その接着強度および結合強度は、３７℃でインキュベーション後に牛皮に対して試験したときに影響を受けていたことを示す。材料１は、ＣＯＨ２０６および過酸化水素から形成された。これは、隣接するスルフヒドリル基を酸化させて、ジスルフィド結合にする。ゲルは迅速に形成され、そしてそのゲルは、メチル化コラーゲンおよびＶｉｃｒｙｌが補充され得るが、しかし、生理食塩水緩衝液中で数時間後、そのゲルは非常に弱くなる。このＶｉｃｒｙｌ繊維は、容易に引き出される。材料２は、ＣＯＨ２０６からのスルフヒドリル基と、ＰＥＧ（１０Ｋ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ；図１１）の４アームビニルスルホン誘導体の二重結合との反応を利用する。予測される反応であるＭｉｃｈａｅｌ型付加は、チオエーテル結合を形成した。そのようなゲルは、適切な引張り強度を有したが、生理食塩水中のインキュベーション後に牛皮に対して貧弱な接着を有していた。材料３および４は、ＣＯＨ２０４（４アーム、テトラ官能アミノＰＥＧ、１０Ｋ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）を含んでいた；アミノ官能基は、おそらく、ＣＯＨ１０２のスクシンイミジルエステルと反応して、アミド結合を形成する（図１２）。これらのゲルは、ＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６から形成されるゲルに対して性能が匹敵していた。（メチル化コラーゲンの存在下での適切な反応のために、ＣＯＨ２０４は、試薬の混合の間ｐＨ２−４に滴定しなければならなかった；硬化緩衝液の添加の際に、そのｐＨは増加し、アミノ基の反応が可能となる）。スクシンイミジルエステルの存在は、組織基材に対して最高の接着を達成するため、およびそのゲルの良好な引張り強度のために重要であったようであった。アミンと反応する他の基（例えば、アルデヒド（多重アームＰＥＧと結合体化したアルデヒド）はまた、有効な接着剤形成試薬であると予測される。
【０１６３】
【表１３】
2005329264.tif 000014
【０１６４】
（水和条件下での結合の持続）
表１４は、ＣＯＨ１０２、ＣＯＨ２０６そしてまたＣＯＨ２０４から形成される接着剤が、生理食塩水緩衝液（３７℃）における長期間の浸漬の間、持続する牛革を使用する結合を形成することを示す。このようなストリンジェントな加水分解条件は、インビボ環境を模倣する。結合の減衰を加水分解の１００時間を超えた後で観察した。結合強度の減衰は、カルボキシル−エステルおよびチオ−エステル（図１３）網目結合の加水分解に起因すると考えられた。ＣＯＨ１０２は、グルタリルスクシニミジルエステルであり；スクシニミジルエステルの末端カルボキシルとの反応後でさえも、グルタリル部分を主要なＰＥＧ鎖に結合しているカルボキシルエステルは残っており；この結合およびチオエステル結合は加水分解し得た。
【０１６５】
【表１４】
2005329264.tif 000015
【０１６６】
（スクシニミジルエステルおよびアミノまたはチオール反応基を有する低分子量化合物と関連する式）
表１５は、接着する際の低分子量ＰＥＧ誘導体の牛革ストリップ上での結合強度、ならびにコラーゲンおよびＶｉｃｒｙｌを補充された場合の結合強度を示す。ＧＬＹＣ−２０ＨＳは、グリセロールコアから形成された３アームド（ａｒｍｅｄ）ＰＥＧの三官能性スクシニミジルスクシネート（２６００モル重量）である（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）。ＣＯＨ２０１は、テトラ−アミノ（４アームドＰＥＧ，２０００モル重量）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）である。このポリマーは、結合強度に対して小さな効果を有するようである、Ｖｉｃｒｙｌ充填であった。以下の比率を使用した：メチル化コラーゲン、５００μｌ（水中２２ｍｇ／ｍｌ、２７０７−３０Ｂ）；ＧＬＹＣ−２０ＨＳ、４８ｍｇ；ＣＯＨ２０１、６Ｍ  ＨＣｌでｐＨ１〜２に滴定した６０μｌの６０％水溶液；Ｖｉｃｒｙｌ糸、２６ｍｇ。
【０１６７】
【表１５】
2005329264.tif 000016
【０１６８】
（コラーゲンディスク上および頚動脈内のスリット欠損上でのバースト試験）
外科的適用においての使用が意図される粘着性の能力は、しばしば流体の漏れを密閉する能力によって測定される。漏れまたは流体の圧力試験の２つの型を使用した：
（ａ．コラーゲンディスク上のバースト試験）
図１５に描かれる装置を使用して、コラーゲンマットを真鍮プラットフォーム上にマウントし、そして第１の真鍮リングを通すように第２の真鍮リングで確保した。低いほうの真鍮プラットフォームに穴をあけ、そして水で満たしたラインに連結した。水を５ｍｌ／ｍｉｎ．でシリンジポンプにより押し流した。シャントラインを、圧力計に接続した。試験コラーゲンマットにもまた、穴をあけた（２ｍｍ直径穴）。接着性の調製物を、穿孔を覆うようにマットに塗った。接着剤を３分（固いゴムへの硬化をもたらす必要がある場合、それより長く）硬化し得、次いで水圧を働かせた。その密閉を破裂させるのに必要な圧力を記録した。シアノアクリレートの代わりに、コラーゲンマットの小（４×４ｍｍ）片を、低いほうの穴をあけられたマットに接着した。
【０１６９】
（ｂ．頚動脈上のスリット欠損）
図１６に、圧力をかけられた頚動脈モデルを図解する。ブタの動脈（Ｐｅｌ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｒｏｇｅｒｓ，Ａｒｋａｎｓａｓ）を、水ラインに連結した。蠕動ポンプにより水を押し流した。ラインの端は、１０ｐｓｉまでおよびそれより大きい圧力を、ポンプ速度を増加することによってラインに賦課し得るように、ラインの端上に配置されたフロー制限を有した。第１のインタクト動脈を、システム中に配置し、そして漏れなしに所望の圧力に耐えることを確実にするため水圧に供した。側枝のない動脈の区画を好ましく；時には漏れている枝を、漏れを止めるためクランプで閉めた。約２ｍｍ長のスリットを、動脈において４つの区画で円周に対して横向きに切った（図１６）。次いで、切断した動脈を用いて縫合をまねて、その縫合には、支持縫合（ｓｔａｙ  ｓｕｔｕｒｅ）を適用した。次いで、切断部位を、それらを密封する試みで、いたるところで接着した。接着剤を適用する直前に、緩衝液（１３４ｍＭリン酸ナトリウムおよび１６６ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ８．９）を動脈組織に適用した。接着魂を、ゲルを硬化するためさらに少量のこの緩衝液で洗浄した。８分の硬化時間後、接着した接合箇所を、水圧に供した。圧力を、１ｐｓｉ増加で増加し、そしてさらに増加する前に１分間各圧力で保持した。１０秒ごとに１滴より早く滴る場合、漏れを陽性と記録した。
【０１７０】
表１６は、種々の直径の穴に対するＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲン／Ｖｉｃｒｙｌのバースト強度を示す（８分の硬化時間でのコラーゲン膜に対する；ｐＨ８．９の緩衝液で硬化した；へらを用いて穴全体に０．５ｍｌサンプルを広げた）。５ｍｍの直径を有する穴は、外科適用において考慮され得る最も大きな欠陥である。なぜなら、支持縫合を使用して、この最も大きい欠陥を閉じ、そしてこのような縫合間の最も大きい間隔が、５ｍｍであると見積もられたからである。このような大きい穴でさえ、この接着剤は、高血圧患者において予測される最大値（すなわち、４ｐｓｉ）付近または最大値より大きい圧力を維持し得た。第３のデータ入力は、ゲルとコラーゲンディスクの界面での良好なゲル硬化を有することの必要性を強調する。適用前のこの表面に対する硬化緩衝液の添加は、この短期での結合を改善する。
【０１７１】
（表１６：ＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲン／Ｖｉｃｒｙｌのバースト強度）
【０１７２】
【表１６】
2005329264.tif 000017
【０１７３】
表１７は、頸動脈における大きいスリット欠陥（４〜６ｍｍ直径の動脈上に切り込まれた４×２ｍｍのスリット）の閉鎖についてのデータを示す。ＣＯＨ１０２／２０６／メチル化コラーゲン／Ｖｉｃｒｙｌ処方は、性能において、シアノアクリレートに匹敵する。より低圧で伸びるより細い動脈に対して、より乏しい結果が観察されることに留意する。
【０１７４】
（表１７：ブタ頸動脈に対するバースト強度試験）
【０１７５】
【表１７】
2005329264.tif 000018
【０１７６】
（実施例８）
（チオールおよびアクリレートで官能基化されたペンタ−エリトリトールおよびトリ−メチロールプロパンの誘導体、＋充填剤（例えば、Ｖｉｃｒｙｌ））
この種類の接着剤を、水で稀釈していない液体試薬（水性緩衝液を添加していない）から調製した。アクリレートの活性化二重結合へのチオール基の付加を含んだカップリング反応を、図１７に示す。下記表１９は、反応性の対であるＴＰＥＴＡ（トリ−メチロールプロパンエトキシレートトリ−アクリレート（分子量９１２）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．；図１８）およびＴＭＰＥ−ＳＨ（トリ−メチロール−プロパンエトキシレートトリ−チオール（分子量１１４０）（図１９）（トリメチロール−プロパンエトキシレート（分子量１１００）、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から合成した））に関する結合強度のデータを示す。この反応を駆動するために、チオールをチオレートアニオンへと変換するために、塩基が必要であった。Ｔ４０３（トリ−アミノ  ３−アームプロピレンオキシド（分子量９７０）（Ｔｅｘａｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、図２ｃ）を使用した。形成されたゲルは、十分に強力であり、Ｖｉｃｒｙｌのみを充填剤として添加した。メチル化コラーゲンは添加しなかった（メチル化コラーゲン（水中に溶解）は、水で稀釈していない液体のＴＰＥＴＡおよびＴＭＰＥとともに溶液のままでありそうではなかった）。この処方は以下の通りであった：
（表１８）
（ＴＰＥＴＡ／ＴＭＰＥ−ＳＨ／Ｔ４０３／Ｖｉｃｒｙｌ）
【０１７７】
【表１８】
2005329264.tif 000019
【０１７８】
ＴＭＰＥ−ＳＨおよびＴ４０３をともに混合し、その後、Ｖｉｃｒｙｌ糸を添加し、最後に、ＴＰＥＴＡを添加し、そして他の成分と混合した。この混合物を、上記のように、スパチュラを用いて湿った試験基質上に広げた。この混合物は、約３分間で粘着性になり、そして５分間で固いゲルであった。この後、試験混合物を、上記のように２０分後に生理食塩水に浸漬した。ゲル時間は、添加したＴ４０３の量により自由に制御可能であった。
【０１７９】
表１９は、結合が３つすべての組織基質に対して達成されたが、その結合強度がＣＯＨ１０２／２０６処方物よりも低かったことを示す。結合の失敗は常に接着剤であった−これらのゲルは、高い引っ張り強さを示したが、組織に対しては十分に接着しなかった。しかし、特定の臨床適用において、組織に対する強力な接着は必要ではない。この特徴は、コラーゲン膜に対して特に明らかであった。この化学的カップリング反応は明らかに、ＣＯＨ１０２を用いる場合（スクシンイミジルエステルが、原則として、組織上のアミノ基と反応し得る）のような、組織への共有結合に適切な機構を提供しない。組織タンパク質上の遊離のスルフヒドリル基は、ＴＰＥＴＡのアクリレート基と反応し得るが、このような基は、タンパク質上で比較的まれである。
【０１８０】
【表１９】
2005329264.tif 000020
【０１８１】
表２０は、ＴＰＥＴＡ／ＴＭＰＥＳＨ処方物を示すが、生理食塩水への浸漬の後に持続的な結合を示すにもかかわらず、これらは３７℃での生理食塩水への長時間の浸漬の間、牛革の小片に対して緩やかな結合しか示さない。これは、ＣＯＨ１０２／２０６ゲル中に存在する結合と比較して、チオ−エーテル結合の相対安定性に起因していると考えられる。使用した材料のモル比は、０．５９：０．５２：０．０３１であり、ＴＰＥＴＡ：ＴＭＰＥ−ＳＨ：Ｔ４０３：Ｖｉｃｒｙｌについて１５ｍｇ、ｍｇ／０．３９ｍｌであった。
【０１８２】
【表２０】
2005329264.tif 000021
【０１８３】
（実施例９）
（水和化接着材料の引張り強度）
本明細書中に記載される接着処方物は、通常、接着性を欠き−その接着強さは、制限因子ではないと思われる。以下のデータは、他の接着剤およびヒドロゲルへのこの接着剤自体の引張り強度を比較する。
【０１８４】
（３７℃の生理食塩水への２時間の浸漬後の引張り強度の測定）
この接着剤は、おおよそ円柱状の形状に形成され、そしてポリスチレン秤量ボートの上で室温で約２０分間硬化される。次いで、このサンプルを３７℃で水に２〜２１／２時間浸漬した。このサンプルを水から除去し、瓶詰めし、そしてシアノアクリレート接着剤を用いて、テープをいずれかの端に貼り付けた。次いで、このサンプルをＩｎｓｔｒｏｎ引張り試験機に取り付け、テープでいずれかの端をグリップし、そして破損するまで伸ばした。破損した点でのサンプルの断面積に関して、最終的な引張り強度をＮ／ｃｍ２で示した。いくつかの場合、応力−ひずみ曲線を、ひずみとしてΔＬ／Ｌ０を用いて算出した（ここで、ΔＬ＝Ｌ−Ｌ０であり、Ｌは時間ｔでのサンプル長さであり、そしてＬ０は本来のサンプルの長さである）。シアノアクリレート単独からなるコントロールサンプルを調製するために、シアノアクリレートを、牛の肝臓上に画線した。約２０分後、このシアノアクリレートは小片に硬化した。これを肝臓からはがし（これは非常に脆弱な組織である）、そして残った肝臓の粒子を除去した。このようにして、きれいな、比較的均一に硬化したシアノアクリレートポリマー小片を得た。
【０１８５】
表２１に示されるデータは、引張り強度増強剤を含む接着剤が、このような増強剤なしのヒドロゲルより高い引張り強度を示すことを示す。Ｖｉｃｒｙｌを含むアクリレートチオールクラスの接着剤（例えば、ＴＰＴ−ＳＨ：トリメチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオネート）、図２０）は、シアノアクリレート単独より高い引張り強度を有した。引張り強度増強剤なしの処方物は、約８〜２０Ｎ／ｃｍ２の引張り強度を有した。ＣＯＨ１０２／２０６（２０％）は、単純なヒドロゲルである。これは、メチル化コラーゲンおよびＶｉｃｒｙｌを含む対応する処方物より非常に低い引張り強度を有した。生理食塩水中、３７℃で２時間浸漬した後に測定を行った。
【０１８６】
【表２１】
2005329264.tif 000022
【０１８７】
（実施例１０：ペンダント反応基を有する直鎖状コポリマー）
この実験の目的は、図１に示されるペンダント反応基を有する直鎖状ポリマーを合成するための手段を見出すことであった。さらなる目的は、ペンダント反応基だけでなく、ポリマーから形成されたゲルにねばり強さを付与し得るモノマーサブユニットまたはポリマーブロックもまた直鎖状ポリマー鎖に挿入し得ることであった。このように、この実験は、上記実施例６の拡張である。
【０１８８】
調製したポリマー全ては、ポリ−アクリレート／メタクリレートファミリーであった。Ｓｕｎ，Ｙ−Ｍら「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｓ  ｒａｔｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １８，５２７−５３３，１９９７に概説された手順に従って、直鎖状ポリマーを調製した。この重合化に含まれるモノマーは、ＨＥＭＡ（ヒドロキシ−エチル−メタクリレート）、ＭＭＡ（メチルメタクリレート）、ＡＲＳ（モノ−２（アクリルオキシ）エチルスクシネート）、およびＡＥＭ（２−アミノ−エチル−メタクリレート）（図１４）であった。
【０１８９】
カルボキシルおよびアミノ側鎖を有するポリＨＥＭＡを形成するための重合を、以下の成分：ＨＥＭＡ、１２６０μｌ；ＡＲＳ、２４０μｌ；ＡＥＭ、３４８ｍｇ；アゾビス−イソブチロ−ニトリル、５４ｍｇ；および乾性エタノール、３４ｍｌを使用して、７５℃で４時間行なった。沈殿反応を乾性石油エーテルを使用して行なった。
【０１９０】
力強く撹拌し、乾性エタノール中で、アゾビス−イソブチロ−ニトリルを使用して、重合を開始した。ＡＥＭ（エタノール中で十分に可溶性でない）を水中で最初に溶解し（５０％ｗ／ｖ）、溶液をＨＣｌを使用してｐＨ２〜４に調製し、そして、エタノール中に他の成分の溶液を添加した。全体の反応物を、窒素でフラッシュし、そして、水槽中でねじ込み式キャップビン中で伝導した。ＨＥＭＡおよびＭＭＡにおける遊離基インヒビターを、反応混合物に添加するすぐ前に、ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｏｘｉｄｅ  ９０（Ａｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｔｒａｌ，ａｃｔｉｖｉｔｙ  １，７０−２３０  ｍｅｓｈ，ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）のカラムを通してこれらの試薬を通過させることによって除去した。７０〜８０℃で４時間後、溶液を冷却し、不溶性ＡＥＭおよび他の微粒子を除去するためにろ過し、そして、ポリマーを１０ｍｌの石油エーテルを添加することによって沈殿させた。ポリマーはガラスビーカーの表面に凝析し、そして使用されたエタノール溶液を移した。このポリマーを数日間減圧下で乾燥した。
【０１９１】
表２２は、ポリマーが見かけ上獲得され、そして、表中の最初の２つのサンプルについて、ＣＯＨ１０２と共に迅速にゲルを形成することを示し、ポリマー鎖におけるＡＥＭ部分の存在を示唆する。初期のポリマー調製の場合では、ポリマー上のアミノ官能基およびカルボキシル官能基の相対量は、滴定曲線より推測された。それぞれ２０ＨＥＭＡユニットについて、約１つのＡＥＭサブユニットおよび２つのＡＲＳサブユニットが、鎖に沿って存在した。図２３を参照のこと。
【０１９２】
ＣＯＨ１０２およびＣＯＨ２０６のみから形成されたヒドロゲルよりもより硬いポリマーゲルは形成されなかった。ＭＭＡが高いコポリマーは、壊れやすく（ｃｈａｌｋｙ）、簡単に砕ける。ｐＭＭＡ自身は硬く、水不溶性ポリマーであるので、ＭＭＡは元来選択された。従って、ペンダント反応基を有するこれらのクラスのポリマー鎖は、明らかに本発明の用途に適していない。これらのアクリル酸／メタクリル酸モノマーの割合のさらなる改変、またはアルリル酸ファミリーの他のモノマーの導入は、所望の性質を有するポリマーを生じ得、そして、このような最適化研究は、本明細書中の教示を用いて簡単に実行し得る。
【０１９３】
（表２２）
（合成されたポリアクリル酸／メタクリル酸ポリマーの性質）
【０１９４】
【表２２】
2005329264.tif 000023
【０１９５】
１．ｐＨ  ９．６緩衝液におけるポリマーの約５０％（ｗ／ｖ）溶液または分散（上記記載）を、水中でＣＯＨ１０２の５０％（ｗ／ｖ）溶液と混合した。秒から時間のゲルの形成を、「＋」としてスコアした。
２．１．０ｍｌ／分流速におけるジメチルホルムアミド溶媒における、ｐＭＭＡ基準、直列型ＰＬゲル上のＨＰＬＣ、分子ふるいカラムと比較した分子量。
【０１９６】
多数の改変を、その基本的教示から逸脱することなく、上記のシステムに対して行ない得る。本発明は、１つ以上の特異的な実施形態を参照して、有意に詳細に記載されているが、当業者は、この出願において具体的に開示された実施例に対して変更が行なわれることを理解するが、なおこれらの改変および改善は、上記の請求の範囲に示されるように、本発明の範囲および趣旨の範囲内である。この明細書中で開示された、全ての出版物、特許、および特許出願は、このような出版物、特許、または特許出願が参考として本明細書中に援用されるように特異的におよび個別に示されるように、参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】図１は、生体分解性結合（「Ｏ」）およびそれに結合する官能基（「Ｒ」）を有する直鎖および分岐したポリマーの構造を示す。
【図２ａ】図２ａは、ペンタエリトリトールテトラキス（トリメルカプトプロピオネート、「ＰＥＳＨ−Ｐ」）の構造を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ペンタエリトリトールテトラアクリレート（「ＰＥＴＡ」）鋸有象を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＣＯＨ１０２またはアクリレートに結合した、Ｔ４０３の構造を示す。
【図３】図３は、ＰＥＳＨ−ＰとＰＥＴＡとの間の結合形成を示す。
【図４ａ】図４ａは、ＣＯＨ１０２またはアクリレートに結合するポリテトラメチレンオキシドジアミンの構造を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、チオール基またはアミノ基に結合するポリプロピレンオキシドジアクリレートの構造を示す。
【図４ｃ】図４ｃは、ＣＯＨ１０２またはアクリレートに結合するポリプロピレンオキシドジアミノの構造を示す。
【図５】図５は、実施例３の結果を示す。
【図６】図６は、実施例５の剪断不全試験のための装置を示す。
【図７Ａ】図７は、実施例６の合成スキームを示す。
【図７Ｂ】図７は、実施例６の合成スキームを示す。
【図８Ａ】図８は、実施例６の合成スキームを示す。
【図８Ｂ】図８は、実施例６の合成スキームを示す。
【図９】図９は、ＣＯＨ１０２（９ａ）およびＣＯＨ２０６（ｂ）の構造を示す。
【図１０】図１０は、引張り強度を測定するために有用なデバイスの型を示す。
【図１１】図１１は、ＰＥＧの４アームビニルスルホン誘導体の構造を示す。
【図１２】図１２は、スクシンイミジル−グルタリル−ＰＥＧおよびアミノＰＥＧからのアミドおよびカルボキシエステル結合ＰＥＧ結合体の形成を示す。
【図１３】図１３は、スクシンイミジルＰＥＧおよびチオールＰＥＧからチオエステル結合ＰＥＧ結合体の形成を示す。
【図１４】図１４は、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、ＭＭＡ（メチルメタクリレート）、モノ−２−（アクリルオキシ）エチルスクシネートおよび２−アミノエチルメタクリレートの構造を示す。
【図１５】図１５は、コラーゲン膜のバースト強度を試験するに有用であるデバイスを示す。
【図１６】図１６は、修復された動脈スリット欠陥のバースト強度を試験するに有用であるデバイス（圧縮される頸動脈モデル）を示す。
【図１７】図１７は、アクリレートとチオールとの反応からのチオエーテル結合の形成を示す。
【図１８】図１８は、ＴＰＥＴＡ（トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート）の構造を示す。
【図１９】図１９は、ＴＭＰＥ−ＳＨ（トリメチロールプロパンエトキシレートトリチオール）の構造を示す。
【図２０】図２０は、ＴＰＴ−ＳＨ（トリ−メチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオネート）の構造を示す。
【図２１】図２１は、グリセロール−ジメタクリレートの構造を示す。
【図２２】図２２は、ポリヒドロキシエチルメタクリレート−コ−アミノエチルメタクリレート−コ−モノ−２−（アクリルオキシ）エチルスクシネートの構造を示す。
【図２ａ】
2005329264.tif 000024
【図２ｂ】
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【図２ｃ】
2005329264.tif 000026
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
2005329264.tif 000030
【図５】
2005329264.tif 000031
【図６】
2005329264.tif 000032
【図７Ａ】
2005329264.tif 000033
【図７Ｂ】
2005329264.tif 000034
【図８Ａ】
2005329264.tif 000035
【図８Ｂ】
2005329264.tif 000036
【図９】
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【図１０】
2005329264.tif 000038
【図１１】
2005329264.tif 000039
【図１２】
2005329264.tif 000040
【図１３】
2005329264.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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