(57)【要約】      （修正有）【課題】アポトーシスのシグナル伝達系の調節剤を提供する。【解決手段】次式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４［Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤで表されるペプチドを除く。〕又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４  （Ｉ）
［式中、Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤ（配列番号１）で表されるペプチドを除く〕又はその塩。
【請求項２】
Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＤＮＬＤ（配列番号２）、ＤＥＮＤ（配列番号３）、ＤＥＬＤ（配列番号４）、ＱＱＰＤ（配列番号５）、ＤＱＩＤ（配列番号６）、ＤＱＰＤ（配列番号７）、ＥＥＶＤ（配列番号８）、ＴＥＬＤ（配列番号９）、ＤＤＬＤ（配列番号１０）又はＤＥＤＤ（配列番号１１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩。
【請求項３】
式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４  （Ｉ）
［式中、Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤ（配列番号１）で表されるペプチドを除く〕又はその塩を含有するアポトーシス調節剤。
【請求項４】
Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＤＮＬＤ（配列番号２）、ＤＥＮＤ（配列番号３）、ＤＥＬＤ（配列番号４）、ＱＱＰＤ（配列番号５）、ＤＱＩＤ（配列番号６）、ＤＱＰＤ（配列番号７）、ＥＥＶＤ（配列番号８）、ＴＥＬＤ（配列番号９）、ＤＤＬＤ（配列番号１０）又はＤＥＤＤ（配列番号１１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩を含有するアポトーシス調節剤。
【請求項５】
研究用試薬である、請求項３又は４記載のアポトーシス調節剤。
【請求項６】
医薬である、請求項３又は４記載のアポトーシス調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−３を介してアポトーシスを調節し得る新規ペプチド、当該ペプチドを含有するアポトーシス調節剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、一連のアポトーシス特異的な形態学的変化とゲノムＤＮＡのヌクレオソームＤＮＡ断片化により特徴付けられる細胞死の主要な形態である。システインアスパルチルプロテアーゼのファミリーであるカスパーゼは、アポトーシスの鍵となるエフェクタープロテアーゼである。カスパーゼは、通常、Ｎ末端プロドメイン、大サブユニット（−２０ｋＤａ）及び小サブユニット（−１０ｋＤａ）を含むプロエンザイム（３０−５０ｋＤａ）として発現する。それらの活性化は、大サブユニットと小サブユニットとの間のタンパク質分解性プロセシングにより調節されている。上流カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０）の自己プロセシングは、ＦＡＤＤ、Ａｐａｆ−１等のアダプタータンパク質により促進される。下流カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７）は、上流カスパーゼのタンパク質分解性プロセシングに続いて活性化され得る。活性化された下流カスパーゼは、基質タンパク質を選択的に切断し、細胞死を引き起こす。
【０００３】
現在までに、６０個を超えるタンパク質がカスパーゼの基質として同定されている。アポトーシスにおけるカスパーゼカスケードは、最初のアポトーシス刺激を維持・増幅することから、それらの調節不全は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌などの種々の疾患の発症につながると考えられる。カスパーゼはアポトーシスの開始、調節、実行にそのような重要な役割を果たしているので、抗アポトーシス試薬及び医薬の発見・開発のための重要な分子標的である。カスパーゼのペプチドインヒビターに関する研究は、炎症、哺乳動物のアポトーシスにおけるこれら酵素の中心的な役割の解明に役立っている。従って、基質切断配列に基づいて、カスパーゼの幾つかのペプチドインヒビターが報告されている (非特許文献１−４)。
【０００４】
カスパーゼの活性部位は、基質上の負に荷電したＰ１アスパルテート (aspartate) に結合する、正に荷電したＳ１部位を含む。このＳ１結合部位は、高度に保存されており、全てのカスパーゼはアスパルテート残基後を切断する。
【０００５】
また、切断部位における少なくとも４つのアミノ酸（Ｐ１−Ｐ４）の認識が効率的な触媒に必要とされる。Ｓ２−Ｓ４基質結合部位は有意に変動し、Ｐ２−Ｐ４位置に対する基質特異性の変動を生じる。これまで、基質タンパク質の切断部位の配列に基づいて、カスパーゼ−３の幾つかのペプチドインヒビターが同定されている（非特許文献１−３）。例えば、ＰＡＲＰ内のＤＥＶＤ（配列番号１）が、カスパーゼ−３により認識・切断されることが知られている (非特許文献２)。また、カスパーゼ及びグランザイムＢに対するペプチド基質特異性を同定するために、ポジショナルスキャニング合成コンビナトリアルライブラリー（ＰＳ−ＳＣＬ）を用いるコンビナトリアルアプローチが試験されているが (非特許文献５)、この手法によっても、カスパーゼ−３のペプチド基質の最適な認識配列がＤＥＶＤ（配列番号１）であるとして示されている (非特許文献５)。以上の知見より、カスパーゼ−３のインヒビターとして、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯが用いられている。
【０００６】
しかしながら、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、カスパーゼ−３のみならず、カスパーゼ−１、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−３に対しても同様の阻害活性を示すことが知られている（非特許文献６）。従って、このペプチドは、カスパーゼ−３のペプチドインヒビターとして必ずしも妥当ではない。
【非特許文献１】Takahashi A. et al., Oncogene 14: 2741-2752 (1997)
【非特許文献２】Nicholson D.W. et al., Nature 376: 37-43 (1995)
【非特許文献３】Hirata H. et al., Journal of Experimental Medicine 187: 587-600 (1998)
【非特許文献４】Han Z. et al., Journal of Biological Chemistry 272: 13432-13436 (1997)
【非特許文献５】Thornberry, N. A. et al., Journal of Biological Chemistry 272: 17907-17911 (1997)
【非特許文献６】Garcia-Calvo M. et al., Journal of Biological Chemistry 273: 32608-32613 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、カスパーゼ−３に対して結合活性、特に強い結合活性及び／又は特異的な結合活性を有する化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アミノ酸位置適合性スコア（Amino acids Positional Fitness Score: ＡＰＦスコア）を用いてカスパーゼ−３に対して結合するペプチドを鋭意研究する中で、特定のアミノ酸組成を有するペプチドがカスパーゼ−３に対して結合し得ることを見出した。具体的には、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（Ｉ）（なお、ここでＸ４はアスパラギン酸である）において、Ｘ１としてはアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリンが好ましいこと、Ｘ２としてはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、バリンが好ましいこと、Ｘ３としてはアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、バリンが好ましいことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の通りである：
（１）式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４  （Ｉ）
［式中、Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤ（配列番号１）で表されるペプチドを除く。〕又はその塩；
（２）Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＤＮＬＤ（配列番号２）、ＤＥＮＤ（配列番号３）、ＤＥＬＤ（配列番号４）、ＱＱＰＤ（配列番号５）、ＤＱＩＤ（配列番号６）、ＤＱＰＤ（配列番号７）、ＥＥＶＤ（配列番号８）、ＴＥＬＤ（配列番号９）、ＤＤＬＤ（配列番号１０）又はＤＥＤＤ（配列番号１１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩；
（３）式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４  （Ｉ）
［式中、Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤ（配列番号１）で表されるペプチドを除く。〕又はその塩を含有するアポトーシス調節剤；
（４）Ｎ末端及び／又はＣ末端が未保護である又は保護されたＤＮＬＤ（配列番号２）、ＤＥＮＤ（配列番号３）、ＤＥＬＤ（配列番号４）、ＱＱＰＤ（配列番号５）、ＤＱＩＤ（配列番号６）、ＤＱＰＤ（配列番号７）、ＥＥＶＤ（配列番号８）、ＴＥＬＤ（配列番号９）、ＤＤＬＤ（配列番号１０）又はＤＥＤＤ（配列番号１１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその塩を含有するアポトーシス調節剤；
（５）研究用試薬である、上記（３）又は（４）のアポトーシス調節剤；
（６）医薬である、上記（３）又は（４）のアポトーシス調節剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチド又はその塩は、カスパーゼ−３への結合を通じてアポトーシスのシグナル伝達系を調節し得ることから、アポトーシスに関連する研究の試薬として有用である。また、本発明のペプチド又はその塩は、アポトーシスの誘導が所望される疾患に対する医薬として有用である。さらに、本発明のペプチド又はその塩は、カスパーゼ−３に対して強い結合活性及び／又は特異的結合活性を有するという特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４  （Ｉ）
［式中、Ｘ１は、Ｎ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン又はバリンを、Ｘ２はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン又はバリンを、Ｘ３はアスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン又はバリンを、Ｘ４は、Ｃ末端が未保護である又は保護されたアスパラギン酸を示す。］で表されるペプチド〔但し、ＤＥＶＤ（配列番号１）で表されるペプチドを除く。〕又はその塩を提供する。かかるアミノ酸組成を有するペプチドは、ＡＰＦスコアの結果より、カスパーゼ−３に結合し易い傾向が見出されている（図２参照）。
【００１２】
一般式（Ｉ）中、Ｘ１で示されるアミノ酸としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリンのいずれでもよいが、例えば、一つの目安として、高いＡＰＦ値を示すアミノ酸を用いることができる。このような観点では、例えば、Ｘ１で示されるアミノ酸として、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリンが好ましく、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、バリンがより好ましい。最も好ましくは、Ｘ１で示されるアミノ酸はアスパラギン酸、バリンである。
【００１３】
一般式（Ｉ）中、Ｘ２で示されるアミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、トリプトファン、バリンのいずれでもよいが、例えば、一つの目安として、高いＡＰＦ値を示すアミノ酸を用いることができる。このような観点では、例えば、Ｘ２で示されるアミノ酸として、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリンが好ましく、グルタミン酸、ロイシン、プロリンがより好ましい。最も好ましくは、Ｘ２で示されるアミノ酸はグルタミン酸である。
【００１４】
一般式（Ｉ）中、Ｘ３で示されるアミノ酸としては、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、バリンのいずれでもよいが、例えば、一つの目安として、高いＡＰＦ値を示すアミノ酸を用いることができる。このような観点では、例えば、Ｘ３で示されるアミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリンが好ましく、グルタミン酸、プロリン、バリンがより好ましい。最も好ましくは、Ｘ３で示されるアミノ酸はバリンである。
【００１５】
一般式（Ｉ）中、Ｘ４で示されるアミノ酸は、アスパラギン酸である。
【００１６】
別の局面では、本発明のペプチドは、ＤＮＬＤ（配列番号２）、ＤＥＮＤ（配列番号３）、ＤＥＬＤ（配列番号４）、ＱＱＰＤ（配列番号５）、ＤＱＩＤ（配列番号６）、ＤＱＰＤ（配列番号７）、ＥＥＶＤ（配列番号８）、ＴＥＬＤ（配列番号９）、ＤＤＬＤ（配列番号１０）又はＤＥＤＤ（配列番号１１）に関する。これらのペプチドは、本発明により提供されるペプチドの中でも、カスパーゼ−３との結合性が極めて高く、また、カスパーゼ−３特異的という特徴を有する。
【００１７】
カスパーゼ−３に特異的とは、他の任意のカスパーゼに対する結合活性よりも、カスパーゼ−３に対する結合活性が相対的に優れていることをいい特に限定されないが、例えば、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９に対する結合活性よりも、カスパーゼ−３に対する結合活性が優れることを意味する。
【００１８】
「Ｎ末端が未保護である」アミノ酸とは、Ｎ末端が−ＮＨ２、又はＮＨ３＋であるアミノ酸をいう。
【００１９】
「Ｎ末端が保護された」アミノ酸とは、Ｎ末端が−ＮＨ２、又は−ＮＨ３＋以外であるアミノ酸をいい、例えば、−ＮＨＲ１、−ＮＨ２Ｒ１＋、−ＮＲ１Ｒ２、−ＮＨＲ１Ｒ２＋であるアミノ酸であり得る。Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。具体的には、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ同一又は異なって、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、オキサリル基、スクシニル基、ピバロイル基、２−クロロアセチル基、２−ブロモアセチル基、２−ヨードアセチル基、２，２−ジクロロアセチル基、２，２，２−トリクロロアセチル基、２，２，２−トリフルオロアセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、ベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基、４−ニトロベンゾイル基、ナフチルカルボニル基、アダマンチルカルボニル基、フタロイル基、ピロリドンカルボニル基等のアシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、２−クロロエトキシカルボニル基、２−ヨードエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２，２，２−トリクロロ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル基、ビス−（４−メトキシフェニル）メトキシカルボニル基、フェナシルオキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基、２−トリフェニルシリルエトキシカルボニル基、フルオレニル−９−メトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基；ビニルオキシカルボニル基、２−プロペニルオキシカルボニル基、２−クロロ−２−プロペニルオキシカルボニル基、３−メトキシカルボニル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−メチル−２−プロペニルオキシカルボニル基、２−ブテニルオキシカルボニル基、シンナミルオキシカルボニル基等のアルケニルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル基、４−ブロモベンジルオキシカルボニル基、２−クロロベンジルオキシカルボニル基、３−クロロベンジルオキシカルボニル基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル基、フェネチルオキシカルボニル基等のアラルキルオキシカルボニル基；トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等の低級アルキルシリル基；エチレンビス（ジメチルシリル）基、プロピレンビス（ジメチルシリル）基、エチレンビス（ジエチルシリル）基等のアルキレンビス（ジアルキルシリル）基；メチルチオカルボニル基、エチルチオカルボニル基、ブチルチオカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルチオカルボニル基等のアルキルチオカルボニル基；ベンジルチオカルボニル基等のアラルキルチオカルボニル基；ジシクロヘキシルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基、ジベンジルホスホリル基、ジ−（４−ニトロベンジル）ホスホリル基、フェノキシフェニルホスホリル基等のホスホリル基；ジエチルホスフィニル基、ジフェニルホスフィニル基等のホスフィニル基；カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ベンジルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基、ピリジルカルバモイル基等のカルバモイル基であり得る。また、Ｒ１、Ｒ２としては、後述のＲ３、Ｒ４と同様のものを用いることもできる。
【００２０】
「Ｃ末端が未保護である」アミノ酸とは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当するアミノ酸をいう。
【００２１】
「Ｃ末端が保護された」アミノ酸とは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、又はアルデヒド型（−ＣＨＯ）のいずれかに該当しないアミノ酸をいい、例えば、アミド（−ＣＯＮＨＲ３、−ＣＯＮＲ３Ｒ４）、カルボキシ（−ＣＯＲ３）、エステル（−ＣＯＯＲ３）であり得る。Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ、アミノ酸又はペプチド化学の分野において常用されている保護基を意味する。具体的には、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ同一又は異なって、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基及び当該Ｃ1-6アルキル基のハロゲン化物（例えば、−ＣＨ２Ｆなど）；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基及び当該Ｃ3-8シクロアルキル基のハロゲン化物；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基及び当該Ｃ6-12アリール基のハロゲン化物；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基及び当該Ｃ7-14アラルキル基のハロゲン化物；並びに経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。また、Ｒ３、Ｒ４としては、前述のＲ１、Ｒ２と同様のものを用いることもできる。
【００２２】
また、Ｃ末端への適切な保護基の導入により、本発明のペプチドを、カスパーゼ−３に対する不可逆的インヒビターとして用いることもできる。このような保護基としては、例えば、フルオロメチルケトン（ｆｍｋ）、クロロメチルケトン（ｃｍｋ）などが挙げられる。このような保護基を有する本発明のペプチドは、カスパーゼ−３の触媒部位と共有結合することで不可逆的インヒビターとして作用し得る。
【００２３】
さらに、Ｃ末端への適切な保護基の導入により、本発明のペプチドをカスパーゼ−３に対する特異的な基質として用いることもできる。このような保護基としては、例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）などが挙げられる。このような保護基を有する本発明のペプチドは、カスパーゼ−３に特異的に認識され、保護基が切断される。この切断された保護基の蛍光及び比色定量を行うことにより、カスパーゼ−３の活性測定を行うことができる。
【００２４】
本発明のペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２５】
本発明のペプチド又はその塩がカスパーゼ−３結合活性、例えば、カスパーゼ−３阻害活性を有するか否かは、バインディングアッセイ、in vitroカスパーゼ活性アッセイ（後述の試験例１参照）等の自体公知の方法により確認することができる。また、本発明のペプチド又はその塩が、カスパーゼ−３特異的結合活性、例えば、カスパーゼ−３特異的阻害活性を有するか否かは、例えば、in vitroカスパーゼ活性アッセイ（後述の試験例１、２参照）等の自体公知の方法により確認することができる。さらに、本発明のペプチド又はその塩がアポトーシス調節活性を有するか否かは、細胞の形態学的変化の観察、フローサイトメトリーによるＤＮＡ断片化の検出、ゲル電気泳動法による染色体ＤＮＡの断片化の検出などにより確認することができる。
【００２６】
本発明のペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、必要に応じて保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法、並びに保護基の導入方法及び脱離方法としては、例えば、M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966); Schroeder et al., The Peptide, Academic Press, New York (1965) に記載された方法が挙げられる。
【００２７】
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２８】
具体的には、本発明のペプチドは、下記の固相法によって合成が可能である。なお、本発明のペプチドの製造方法は、これらに限定されるものではない。
Ｌｉｂｒａ  ＴｕｂｅTM（島津総合科学研究所）を反応容器に用いた固相法による操作を行う。分取ＨＰＬＣによるペプチドの精製はギルソンＨＰＬＣシステム（ギルソン社）により行う。なお、ギルソンＨＰＬＣシステムは、ギルソン３０５ポンプ、ギルソン３０６ポンプ、ギルソン８１１Ｃダイナミックミキサー、ギルソン２１５リキッドハンドラー、ヒューレットパッカードＨＰ１１００フォトダイオードアレイ検出器により構成されたものである。システムの制御は、ＵｎｉＰｏｉｎｔTMシステムソフトウェア（バージョン2.10）を用いて行い、分取用ＨＰＬＣカラムは、ＹＭＣ  Ｃｏｍｂｉ  Ｐｒｅｐ  ＯＤＳ−Ａ（ワイエムシイ社、カラムサイズ：２０ｍｍ（i.d.）×５０ｍｍ、粒子径：５μｍ）を使用する。ペプチドの分析は、アジレント１１００シリーズＨＰＬＣシステム（アジレントテクノロジー社）とサーモクエストフィニガンＡＱＡ質量分析計より構成されるＬＣ−ＭＳシステムにより行う。ＨＰＬＣシステムの制御とデータ解析はケミステーションソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて行い、分析用ＨＰＬＣカラムは、Ｂｅｔａ−Ｂａｓｉｃ−１８（キイストーンサイエンティフィック社、カラムサイズ：２ｍｍ（i.d.）×５０ｍｍ、粒子径：５μｍ、ポアサイズ：１５０Ａ）を使用する。質量分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法により行い、質量電荷比（m/z）５００−１６３６の測定範囲で１価の正イオン(M+H)+又は２価の正イオン(M+2H)2+を検出する。質量分析計の制御とデータ解析はＸ−キャリバーソフトウェアを用いて行い、ペプチドの同定はモノアイソトピック質量のm/z実測値とモノアイソトピック質量で計算する(M+H)+又は(M+2H)2+の理論値と比較することにより行う。
【００２９】
Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  レジン（ノババイオケム社、１００−２００ｍｅｓｈ、ロード量０．４５ｍｍｏｌ／ｇ  ｒｅｓｉｎ）（１００ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を出発原料とし、以下の操作にしたがって合成することができる。Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の縮合は、レジンとＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（４当量、０．１８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２ｍｌ）中混合し、反応混合物を室温で２−１６時間振とうすることにより行う。縮合反応後ＤＭＦで洗浄したレジンに無水酢酸（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（８当量、０．３６ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍｌ）溶液を加え、室温で１０−２０分間放置することにより、縮合不完全で残存するレジン上のアミノ基をアセチル化する。Ｆｍｏｃ基の除去は、レジンを２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液（２ｍｌ）に膨潤し、室温で１５−３０分間放置することにより行う。各工程間のレジンの洗浄はすべてＤＭＦで行う。Ｇｌｕ（ＯＡｌ）のＡｌ基およびＬｙｓ（Ａｌｏｃ）のＡｌｏｃ基の除去は、レジンをクロロホルム／酢酸／ＮＭＭ（９５／５／２．５  ｖ／ｖ／ｖ）（４ｍｌ）に膨潤し、アルゴンガスを１５分間吹き込んだ後、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間振とうすることにより行う。Ｇｌｕ側鎖カルボン酸とＬｙｓ側鎖アミノ基の縮合によるラクタム環形成反応は、レジンとＰｙＢｏｐ（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（３当量、０．１３５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（９当量、０．４０５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（３ｍｌ）中混合し、反応混合物を室温で１６時間振とうすることにより行う。ペプチドのレジンからの切り出しと脱保護は、ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／ＴＩＳ（９５／５／２．５  ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍｌ）で室温３時間処理することにより行う。レジンを除いたろ液にエーテル／ヘキサン（１／１  ｖ／ｖ）（１４ｍｌ）を加えてペプチドを沈殿させ、遠心分離、デカント後、さらに沈殿をエーテル／ヘキサン（１／１  ｖ／ｖ）で２回洗浄する。沈殿をアセトニトリル／水（１／１  ｖ／ｖ）に溶解し、ワコーゲル５０Ｃ１８（和光純薬、粒子径３８−６３μｍ）を充填したカラム（充填容積：１０ｍｍ（i.d.）×１０ｍｍ）を通してろ過し、ろ液を凍結乾燥することにより粗ペプチド（２０−５０ｍｇ）を得る。粗ペプチドを３０ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリル／水（１／１  ｖ／ｖ）に溶解し、分取用ＨＰＬＣカラムに注入する。溶出は下記条件で行い、目的のペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥する。
分取ＨＰＬＣ溶出条件
・流速：１５ｍｌ／ｍｉｎ
・移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ
・移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ、９０％  ＣＨ3ＣＮ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ
・グラジエント：０−  ３ｍｉｎ  移動相Ｂ  ０％
３−１１ｍｉｎ  移動相Ｂ  ０％→７５％
【００３０】
合成したペプチドの分析はＬＣ−ＭＳシステムにより行う。純度は分析用ＨＰＬＣ（流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ、移動相Ａ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎ  Ｈ2Ｏ、移動相Ｂ：０．１％  ＴＦＡ  ｉｎＣＨ3ＣＮ、グラジエント：移動相Ｂ  ５％→９５％  ｉｎ  ９ｍｉｎ）で９０％以上であることを確認する。ペプチドの同定は主ピークのモノアイソトピック質量のm/z実測値とモノアイソトピック質量で計算する(M+H)+又は(M+2H)2+の理論値と比較することにより行う。
【００３１】
また、本発明は、上述した本発明のペプチドが複数集合してなるマルチマーを提供する。本発明のマルチマーは、土台となる物質に共有結合又は非共有結合（例えば、吸着）しているものであり得る。土台となる物質としては、リジンポリマー、例えば、ＭＡＰ（Multiple antigenic peptide）−４、ＭＡＰ−８、ＭＡＰ−１６（なお、ＭＡＰ−ＸのＸは付加が可能な最大のペプチド数を示す）などが挙げられる。例えば、ＭＡＰ−８の場合、リジン７個の骨格に本発明のペプチドを最大８個まで導入することができる。また、土台となる物質としては、金コロイド、リポソーム等を用いることができる。これら土台となる物質は、自体公知の方法により本発明のペプチドと結合させることができる。
【００３２】
本発明のマルチマー又はその塩がカスパーゼ−３結合活性、例えば、カスパーゼ−３阻害活性を有するか否かは、バインディングアッセイ、in vitroカスパーゼ活性アッセイ（後述の試験例１参照）等の自体公知の方法により確認することができる。また、本発明のマルチマー又はその塩が、カスパーゼ−３特異的結合活性、例えば、カスパーゼ−３特異的阻害活性を有するか否かは、例えば、in vitroカスパーゼ活性アッセイ（後述の試験例１、２参照）等の自体公知の方法により確認することができる。さらに、本発明のマルチマー又はその塩がアポトーシス調節活性を有するか否かは、細胞の形態学的変化の観察、フローサイトメトリーによるＤＮＡ断片化の検出、ゲル電気泳動法による染色体ＤＮＡの断片化の検出により確認することができる。
【００３３】
本発明のマルチマーは、アポトーシスのシグナル伝達系の研究用試薬、アポトーシスの調節が所望される疾患に対する医薬などとして有用である。
【００３４】
本発明はまた、本発明のペプチド若しくはそのマルチマーを含有する組成物を提供する。例えば、当該組成物は、研究試薬用組成物、又は医薬組成物であり得る。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチド若しくはそのマルチマーと、薬学的に許容され得る担体とを含有する。薬学的に許容され得る担体とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができるが、好ましくは非経口投与される。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤、外用液剤、坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【００３６】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（ペプチド、マルチマーなど）の種類などにより異なるが、例えば、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg （あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【００３７】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に0.1μg／ml担体〜10mg／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、例えば、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
【００３８】
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
【００３９】
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、アポトーシスの誘導又は抑制が所望される任意の疾患の治療、並びに該疾患に伴う病状を軽減するための医薬として有用である。アポトーシスの誘導が所望される疾患としては、例えば、癌（例えば、卵巣癌）、自己免疫疾患などが挙げられる。一方、アポトーシスの抑制が所望される疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患、エイズ、肝炎などが挙げられる。
【００４１】
なお、本願明細書または図面においてアミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字あるいは一文字は、各々次に示すアミノ酸を意味する。
（Gly／G）グリシン、（Ala／A）アラニン、（Val／V）バリン、（Leu／L）ロイシン、（Ile／I）イソロイシン、（Ser／S）セリン、（Thr／T）スレオニン、（Asp／D）アスパラギン酸、（Glu／E）グルタミン酸、（Asn／N）アスパラギン、（Gln／Q）グルタミン、（Lys／K）リジン、（Arg／R）アルギニン、（Cys／C）システイン、（Met／M）メチオニン、（Phe／F）フェニルアラニン、（Tyr／Y）チロシン、（Trp／W）トリプトファン、（His／H）ヒスチジン、（Pro／P）プロリン。また、アミノ酸は天然のαアミノ酸であり、Ｌ体、Ｄ体であり得るがＬ体が好ましい。
【００４２】
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明は、以下の特定の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
参考例１．計算スクリーニング戦略
本発明者らによる計算スクリーニング戦略の特徴は、カスパーゼ-3に対するアミノ酸位置適合性スコア (Amino acid Positional Fitness Score: APFスコア) の構築である。このスコアは、カスパーゼ-3と阻害ペプチドとの間のΔGbindを迅速に予測することを可能にする。本発明者らのスクリーニング戦略は、以下の５工程を含んでいた（図１）。
【００４４】
１．１．スクリーニング戦略
１．１．１．ペプチドライブラリーの構築（工程１）
各カスパーゼのP2-P4優先度 (preference) を同定するため、本発明者らは、P1にアスパラギン酸を固定した解析用ライブラリを構築し、P2-P4のアミノ酸を無作為化した。P4-P3-P2-Dモチーフを包括的に解析するためには、8000通りの組合せを解析する必要がある。このシステムでは、全ての組合せの5%に相当する400個のペプチドを無作為に抽出し、360個のペプチドからなる解析用ライブラリ、40個のペプチドからなる予測用ライブラリを用意した。解析用ライブラリ、予測用ライブラリにおいてペプチドに対する初期コンフォメーションを生成するため、結晶構造における阻害ペプチドの主鎖座標を使用し、側鎖を追加した。さらに、側鎖のVDW接触を排除するため、TINKERソフトウェアパッケージ (Ponder J.W. et al., J. Comput. Chem. 8: 1016-1014 (1987)) を使用し、そしてAmber94力場を用いてエネルギー最小化を行った。最小化の間に、主鎖の原子を固定し、RMSD勾配限界は0.01であった。Kollman原子電荷を割り当て、ペプチドの回転結合をAutoTors (Morris, G.M. et al., J. Comput. Chem. 19: 1639-1662 (1998)) を用いて規定した。
【００４５】
１．１．２．フレキシブルリガンドドッキングを用いる結合自由エネルギーの算出（工程２）
400個の無作為抽出ペプチドとカスパーゼ-3とのΔGbindを算出した。AutoDock 3.0パッケージ (Morris, G.M. et al., J. Comput. Chem. 19: 1639-1662 (1998)) を、フレキシブルリガンドドッキング、ΔGbind算出に使用した。AutoDock 3.0は、迅速なグリッドベース検索方法をエネルギー評価に使用している。相互作用エネルギーグリッドの使用は、ドッキングシミュレーションの計算要求を劇的に低下させつつ、洗練された経験的自由エネルギー力場の使用を可能にする。遺伝的アルゴリズムと局所検索アルゴリズムとを組み合せるLamarck遺伝的アルゴリズムを検索方法として使用した。AutoDock 3.0により算出されたΔGbind値をΔGcalcと表わした。カスパーゼ-3の座標をタンパク質データバンク (コード, 1PAU) から入手した。結晶構造中の水分子を排除し、TINKERソフトウエアパッケージ (Ponder J.W. et al., J. Comput. Chem. 8: 1016-1014 (1987)) を用いるエネルギー最小化を、カスパーゼ／ペプチドインヒビターの複合体に対して行った。極性水素、Kollman統合原子電荷を、AutoDockツール (Morris, G.M. et al., J. Comput. Chem. 19: 1639-1662 (1998)) によりカスパーゼに割り当てた。
【００４６】
この工程では、ペプチドの主鎖を固定し、側鎖をフレキシブルにした。各ペプチドのカスパーゼとの予測結合位置を調べ、結合位置が適切なものであるか否かを決定した。カスパーゼ活性部位に対して官能基 (例えば、fmk又はCHO) を配置するためには、適切なペプチド位置が重要である。従って、結晶構造でのペプチドインヒビターと比較して2Å以上のRMSDを有するペプチドを、カスパーゼに結合しないものとして規定した。
【００４７】
１．１．３．APFスコアの算出（工程３）
解析用ライブラリにおいて、P4、P3、P2の各位置での20個のアミノ酸の出現頻度に基づくAPFスコアを生成した。位置jでのアミノ酸iのAPFスコアは、下記の方程式［１］により算出される
【００４８】
【表１】
2005213161.tif 000002
【００４９】
APFスコアを用いることで、ペプチドとカスパーゼとの結合親和性を示す適合性の算出が可能となる。適合性は、下記の方程式［４］により算出される。
【００５０】
【表２】
2005213161.tif 000003
【００５１】
解析用ライブラリにあるペプチドの適合性及びΔGcalcの相関解析を行った。適合性とΔGcalcとの間で相関性が高ければ、適合性を用いてΔGcalcを予測することが可能となる。適合性とΔGcalcの間の相関係数が最大となるように閾値 (ΔGth) を設定した。
次いで、予測用ライブラリにあるペプチドの適合性とΔGcalcとの間の相関解析を行った。ここで、適合性は、解析用ライブラリから生成したAPFスコアを用いて算出し、予測性を検証した。
【００５２】
１．１．４．APFスコアの使用による濃縮 (enrich) ライブラリの構築（工程４）
強力なペプチドインヒビターは、包括的なペプチドライブラリ中に無秩序に分布していると推定される。この包括的ペプチドライブラリ中の全てのペプチドの適合性の値を、解析用ライブラリから生成したAPFスコアを用いて算出した。適合性の高い値は高い結合親和性を反映するので、包括的ペプチドライブラリにおけるペプチドを、適合性の値の順位に従い並べ替えを実施した。この操作は、ライブラリ全体に分布する高親和性を示すペプチドをライブラリの上位に濃縮することを可能とする。濃縮ライブラリは、包括的ペプチドライブラリの5%と規定した。
【００５３】
１．１．５．高親和性 (potent) ペプチドライブラリの構築（工程５）
濃縮ライブラリ中の400個のペプチドとカスパーゼ-3とのΔGcalcを、AutoDock 3.0 (Morris, G.M. et al., J. Comput. Chem. 19: 1639-1662 (1998)) を用いて算出した。この工程では、ペプチドの全ての回転結合をフレキシブルにした。濃縮ライブラリ中のペプチドを、ΔGcalc順位に従い分類した。最後に、高親和性ペプチドライブラリを、濃縮ライブラリの2.5%と規定した。高親和性ペプチドライブラリは、10個の強力なペプチドインヒビターを含んでいた。
【００５４】
１．２．結果
１．２．１．APFスコアの構築
この作業の目標の1つは、結合親和性の予測のための単純且つ迅速なスコアリング関数の開発である。初めての試みとして、カスパーゼ-3についてのAPFスコアを構築した。APFスコアはP2-P4優先度を示し（図２）、APFスコアから誘導された適合性とΔGcalcとの間に高い相関係数が確認される場合、適合性は、カスパーゼ-3と任意のペプチドとの間のΔGcalcの迅速な予測が可能となる。図３は、解析用ライブラリ、予測用ライブラリにおける適合性対ΔGcalcの散布図を示す。カスパーゼ-3のAPFスコアは、P4:D、V>Q、P3: E>L>P、P2: V>E>Pの優先度を示した（図２）。この結果は、この酵素に対する最も好ましい認識モチーフが(D/V)EVDであることを示す。DEVD（配列番号１）は、PARP内の切断部位であり、また、PS-SCLにより同定された最適な認識配列である (Thornberry N.A. et al., J. Biol. Chem. 272: 17907-17911)。カスパーゼ-3解析用ライブラリの相関係数は0.71であった（図３）。APFスコアの予測性を検証するため、40個のペプチドを含む予測用ライブラリを用いて相関解析を行なった。相関係数は0.64であった（図３）。結果的に、APFスコアがΔGcalcを予測し得ることが明らかとなった。
【００５５】
１．２．２．濃縮ライブラリの構築
包括的ペプチドライブラリ中の全てのペプチドの適合性の値を、カスパーゼ-3のAPFスコアを用いて算出した。包括的ペプチドライブラリ中のペプチドを、適合性の値の順位に従って並べ替えを実施した。この工程では、並べ替えされた包括的ペプチドライブラリの上から5% (400個のペプチド) を濃縮ライブラリと規定した。カスパーゼ-3の切断部位である配列DEVD（配列番号１）、DEPD（配列番号１２）、DELD（配列番号４）、DGPD（配列番号１６）が濃縮ライブラリに含まれていることで、濃縮ライブラリには高親和性且つ新規な配列が含まれていること、また、切断部位のこれらの配列がカスパーゼ-3に対して高い結合親和性を有することが期待される (なお、DEVD（配列番号１）は、阻害ペプチドAc-DEVD-CHOなどとして既に知られている)。同時に、カスパーゼ-9、カスパーゼ-8、カスパーゼ-1の最適な認識配列（それぞれLEHD（配列番号１３）、IETD（配列番号１４）、WEHD（配列番号１５））は濃縮ライブラリに含まれてないことから、カスパーゼ-9、カスパーゼ-8、カスパーゼ-7の適合性の値は、カスパーゼ-3の切断部位の値よりも低い。この結果は、高親和性且つ新規な配列が濃縮ライブラリに含まれることを支持する。
【００５６】
１．２．３．高親和性ペプチドライブラリの構築、及びAc-DNLD-fmkの設計
濃縮ライブラリ中のペプチドに対してスクリーニングを行なう目的は、カスパーゼ-3に対して高親和性をもつペプチドインヒビターの小さな部分集合を選択することにある。AutoDock 3.0を用いることで、濃縮ライブラリ中の400個のペプチドをカスパーゼ-3の活性部位にドッキングさせ、それらの予測Ki値を算出した。低い予測Ki値を有する10個のペプチドを表３に示す。これら、10個のペプチドの部分集合を高親和性ペプチドライブラリと命名する。
【００５７】
【表３】
2005213161.tif 000004
【００５８】
最も親和性の高いペプチド配列は、D4-GDP解離インヒビターの切断部位 (Goldberg Y.P. et al., Nat. Genet. 13: 442-449 (1996))であるDELD（配列番号４）であると予測され (Ki=1.19E-11)、10個のペプチドはDEVD（配列番号１）よりも5-10倍強力であると予測された。
次いで、10個のペプチドの予測結合親和性はカスパーゼ-3に対して十分な効力を有すると考えられたことから、本発明者らは、10個のペプチドにおいてカスパーゼ-3に対して最も特異的なペプチドの同定を試みた。特異性は、既知の14個のカスパーゼのうち、結晶構造が決定されている4個のカスパーゼ (カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9) について決定した。カスパーゼ-3、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9に対する10個のペプチドの予測Ki値を、AutoDock 3.0を用いて算出した。この研究では、本発明者らは、特異的スコアを下記の通り定義した：
【００５９】
【表４】
2005213161.tif 000005
【００６０】
カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9に対する10個のペプチドについて特異性スコア評価の結果を以下の表５に示す。
【００６１】
【表５】
2005213161.tif 000006
【００６２】
特異性スコア評価の結果は、DNLD（配列番号２）が高親和性ペプチドライブラリにおいてカスパーゼ-3に対する最も特異的なペプチドであることを示す。DNLD（配列番号２）は、カスパーゼの切断部位として知られておらず、特に、P3のAsnはカスパーゼの既知の切断部位のP3に含められていなかった。DNLD（配列番号２）はペプチドインヒビターの新規配列として非常に有用であると期待される。
【００６３】
試験例１：Ac-DNLD-fmkの阻害効力の測定
次いで、高親和性をもつ不可逆的カスパーゼ-3インヒビターとしてAc-DNLD-fmkを合成し、カスパーゼ-3に対するAc-DNLD-fmkの阻害効力を測定するため、in vitroカスパーゼ活性アッセイを行った。カスパーゼ-3の活性は、基質としてAc-DEVD-pNAを用いて測定した。1単位の活性組換えヒトカスパーゼ-3を、96ウェルアッセイプレート (CORNING) において、攪拌しながら25℃ 1時間、アッセイ緩衝液 (100 mM NaCl, 50 mM HEPES, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% グリセロール, 0.1% CHAPS, pH 7.4) 中、ペプチドインヒビターと共にインキュベートした。次いで、100μM Ac-DEVD-pNAを各ウェルに添加し、96ウェルプレートリーダー Wallac 1420 ARVOsx (PerkinElmer) を用いて、60分間1分間隔にて25℃での405 nm吸光度を測定した。なお、不可逆的カスパーゼ−３インヒビターであるAc-DNLD-fmkは、Merck, Incにより合成、提供された。z-DEVD-fmkは、R&D Systems Inc.から購入した。Ac-DEVD-pNA、組換えヒトカスパーゼ-3は、CALBIOCHEMから購入した。結果を図４に示す。
その結果、Ac-DNLD-fmkは、カスパーゼ-3活性をIC50値 1.4 nM で阻害した。また、Ac-DNLD-fmkの効力を周知のペプチドインヒビターZ-DEVD-fmkの効力と比較したところ、Ac-DNLD-fmkは、Z-DEVD-fmkよりも10倍強力であった（図４）。
以上より、DNLD（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが非常に強い結合活性を有することが明らかとなった。また、当該ペプチドのみならず、表５に示される他のペプチドについても非常に強い結合活性を有することが示唆された。
【００６４】
試験例２：Ac-DNLD-fmkの阻害特異性の測定
次に、カスパーゼ-3に対するAc-DNLD-fmkの阻害特異性を検証するため、試験例１と同様の方法により、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9を用いてin vitroカスパーゼ活性アッセイを行った。結果を以下の表６に示す。
【００６５】
【表６】
2005213161.tif 000007
【００６６】
その結果、Ac-DNLD-fmkのカスパーゼ-3に対するIC50値は、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9に対するものよりも1桁低い値を示した。
以上より、DNLD（配列番号２）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはカスパーゼ-3特異的に作用することが明らかとなった。また、当該ペプチドのみならず、表５に示される他のペプチドについてもカスパーゼ-3特異的に作用することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明のペプチド又はその塩は、カスパーゼ−３への結合を通じてアポトーシスのシグナル伝達系を調節し得ることから、アポトーシスに関連する研究の試薬として有用である。また、本発明のペプチド又はその塩は、アポトーシスの誘導が所望される疾患に対する医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】計算スクリーニング戦略の概要を示す図である。
【図２】ＡＰＦスコアを示す図である。なお、本図面は、図１の「工程３：ＡＰＦスコアの構築」の拡大図に相当する。
【図３】解析用ライブラリ、予測用ライブラリにおける相関解析を示す図である。
【図４】カスパーゼ−３に対するAc-DNLD-fmk、Z-DEVD-fmkの用量依存的阻害効力を示す図である。
【図１】
2005213161.tif 000008
【図２】
2005213161.tif 000009
【図３】
2005213161.tif 000010
【図４】
2005213161.tif 000011
【配列表】
2005213161000001.app