(57)【要約】【課題】  ＴＮＦ−α産生抑制物質を有効成分として含む新規なＴＮＦ−α産生抑制剤、エストロゲン様作用物質を有効成分として含む新規なエストロゲン様作用剤、及びそのＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とする。【解決手段】  ＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤に、ノビレチン；八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種若しくは２種以上の柑橘類抽出物；又は当該柑橘類抽出物を精製して得られるノビレチン精製物を有効成分として含有せしめる。皮膚外用剤には、そのＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤を含有せしめる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノビレチンを有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【請求項２】
八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種又は２種以上の柑橘類抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【請求項３】
八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種又は２種以上の柑橘類抽出物を精製して得られるノビレチン精製物を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【請求項４】
ノビレチンを有効成分として含有することを特徴とするエストロゲン様作用剤。
【請求項５】
八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種又は２種以上の柑橘類抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエストロゲン様作用剤。
【請求項６】
八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種又は２種以上の柑橘類抽出物を精製して得られるノビレチン精製物を有効成分として含有することを特徴とするエストロゲン様作用剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＴＮＦ−α産生抑制剤を配合したことを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれかに記載のエストロゲン様作用剤を配合したことを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患を予防又は改善することのできるＴＮＦ−α産生抑制剤、または皮膚の老化を予防又は改善することのできるエストロゲン様作用剤に関する。また、本発明は、そのＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤を配合した皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れを伴う各種皮膚疾患等の原因や発症機構は多種多様であるが、その原因の一つとして、主にマクロファージから産生される腫瘍壊死因子（以下「ＴＮＦ−α」という）によるものが知られている。
【０００３】
ＴＮＦ−αは、腫瘍を壊死させる因子として見出されたが、最近では腫瘍に対してだけでなく、正常細胞の機能を調節するメディエーター的な役割を担うサイトカインであると考えられている。ＴＮＦ−αは炎症の初発から終息までの過程において重要な役割を担っているが、その持続的かつ過剰な産生は、皮膚を含めた組織の障害を引き起こし、全身的には発熱やカケクシアの原因となり、炎症の悪化を引き起こす。そのような炎症としては、例えば、関節リューマチ、変形性関節症などの慢性炎症性疾患が代表的である。したがって、病的な炎症においてはＴＮＦ−αの過剰な産生を抑制することが重要となる。
【０００４】
そのためのＴＮＦ−α産生抑制剤については種々の提案がなされており、例えば、シソ抽出液（非特許文献１参照）、ヒガンバナ科アルカロイドのリコリン及びリコリシジノール（非特許文献２参照）などが挙げられる。
【０００５】
一方、加齢に伴う皮膚老化の一因は、女性ホルモンの一種であるエストロゲンの分泌が減退することにある。すなわち、エストロゲンは成人女性の健康維持に深く関わっており、その分泌不足は種々の内科的疾患を招くほか、肌の過敏症、弾力性低下、潤いの減少等、好ましくない肌の変化の原因となることが知られている。
【０００６】
そこで、エストロゲンの分泌が衰える更年期以降の女性に対して、エストロゲンと同様の作用を有する物質を配合した薬剤を、経皮的又は経口的に投与することが行われている。そのようなエストロゲン様作用剤としては、例えば、五斂子の葉部からの抽出物（特許文献１参照）、カエデ属に属する植物からの抽出物（特許文献２参照）、Microcos属に属する植物からの抽出物（特許文献３参照）、Sauropus属に属する植物からの抽出物（特許文献４参照）などが提案されている。
【特許文献１】特開２００２−２２６３２３号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３０６８号公報
【特許文献３】特開２００３−１２８５６２号公報
【特許文献４】特開２００３−１２８５６９号公報
【非特許文献１】「炎症」1993年，Vol.13，No.4，p.337〜340
【非特許文献２】「薬学雑誌」2001年，Vol.121，No.2，p.167〜171
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記抽出物において、ＴＮＦ−αの産生を抑制する具体的な化合物及びエストロゲンと同様の作用を発現する具体的な化合物は未だ特定されておらず、更なるＴＮＦ−α産生抑制作用又はエストロゲン様作用を有する、天然系のＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤が強く望まれているが、安全性及び生産性に優れ、かつ安価でありながら、高いＴＮＦ−α産生抑制作用を有するＴＮＦ−α産生抑制剤又は高いエストロゲン様作用を有するエストロゲン様作用剤に対する需要者の要望は極めて強く、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。
【０００８】
そこで、本発明は、ＴＮＦ−α産生抑制物質を有効成分とする新規なＴＮＦ−α産生抑制剤及びそのＴＮＦ−α産生抑制剤を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とし、また、本発明は、エストロゲン様作用物質を有効成分とする新規なエストロゲン様作用剤及びそのエストロゲン様作用剤を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため、安全な数多くの植物類の中から、ＴＮＦ−α産生抑制作用又はエストロゲン様作用を有するものについて鋭意研究を重ねた結果、特定の柑橘類からの抽出物、特にその中に含まれるノビレチンが高いＴＮＦ−α産生抑制作用及びエストロゲン様作用を有すること、そして、それらを有効成分とすることにより、炎症性疾患などの予防・改善に有効なＴＮＦ−α産生抑制剤及び皮膚外用剤が得られること、並びに皮膚老化の予防・改善に有効なエストロゲン様作用剤及び皮膚外用剤が得られることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１０】
すなわち、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、ノビレチン；八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種若しくは２種以上の柑橘類抽出物（以下「特定柑橘類抽出物」という場合がある。）；又は当該特定柑橘類抽出物を精製して得られるノビレチン精製物（以下単に「ノビレチン精製物」という場合がある。）を有効成分として含有することを特徴とし、本発明のエストロゲン様作用剤は、ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物を有効成分として含有することを特徴とし、本発明の皮膚外用剤は、上記ＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤を配合したことを特徴としている。
【００１１】
なお、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤及びエストロゲン様作用剤の有効成分であるノビレチン、特定柑橘類抽出物及びノビレチン精製物が、ＴＮＦ−α産生抑制作用を有し、過剰な炎症反応を阻害・抑制することにより、炎症性疾患の予防又は治療に有効であること、及びエストロゲン様作用を有し、加齢に伴うエストロゲン分泌減退による皮膚のしわの形成や弾力性低下等の皮膚の老化の予防又は改善に有効であることは全く知られておらず、これらのことは本発明の新知見である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤によれば、ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物が有するＴＮＦ−α産生抑制作用により、過剰に産生されたＴＮＦ−αが関与する炎症を効果的に予防又は改善することができる。
【００１３】
また、本発明のエストロゲン様作用剤によれば、ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物が有するエストロゲン様作用により、皮膚のしわの形成や弾力性低下等の皮膚の老化現象を効果的に予防又は改善することができる。
【００１４】
さらに、上記ＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤を含有する本発明の皮膚外用剤によれば、皮膚の炎症を抑制し、又は皮膚を内部から活性化して若々しい状態に保つことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明について詳しく説明する。
〔ＴＮＦ−α産生抑制剤・エストロゲン様作用剤〕
本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤及びエストロゲン様作用剤は、ノビレチン；八朔からの抽出物、温州ミカンからの抽出物、グレープフルーツからの抽出物、バレンシアオレンジからの抽出物、シークアーサーからの抽出物、ポンカンからの抽出物、レモンからの抽出物、マーコットからの抽出物及び不知火からの抽出物の群から選ばれた１種若しくは２種以上の柑橘類抽出物；又は当該柑橘類抽出物を精製して得られるノビレチン精製物を有効成分として含むものである。
【００１６】
ここで、「ノビレチン精製物」には、ノビレチンの粗精製物も含まれる。
ノビレチンは、ポリメトキシフラボノイドの一種であり、合成によって製造することもできるが、下記柑橘類から抽出・精製して得られるもの（粗精製物を含む）を使用するのが好ましい。なお、ノビレチンの合成方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を利用することができる。
【００１７】
ノビレチンの原料となる柑橘類としては、八朔、温州ミカン、グレープフルーツ、バレンシアオレンジ、シークアーサー、ポンカン、レモン、マーコット及び不知火の１種又は２種以上を使用するのが好ましい。この場合におけるノビレチンは、２種以上の抽出原料を混合した上で、その混合された抽出原料を抽出処理により抽出し、該抽出処理による抽出物から精製したものであってもよく、さらに、１種の出発原料からそれぞれ抽出処理により抽出された各抽出物を混合し、その混合物を精製したものであってもよい。
【００１８】
また、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤が有効成分とする特定柑橘類抽出物は、上記柑橘類を抽出原料として得られるものであり、抽出方法は特に限定されるものではない。
【００１９】
なお、本発明において、「柑橘類抽出物」には、柑橘類を抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００２０】
本発明で使用する柑橘類について以下説明する。
＜八朔＞
八朔（学名：Citrus hassaku Hort．）は、和歌山県等で栽培されているみかん科の常緑高木である。その果皮は、芳香性の健胃薬として腹痛、膨満感、便秘などの治療又は予防に使用され、また、咳又は痰を鎮めるためにも使用される。
【００２１】
＜温州ミカン＞
温州ミカン（学名：C.unshiu Marcov．）は、日本の中部、南部の暖地に広く栽培されているみかん科の常緑低木であり、その果皮は漢方に多用され、食欲不振、吐き気、瀉下、しゃっくり、胆石の治療又は予防に使用される。
【００２２】
＜グレープフルーツ＞
グレープフルーツ（学名：C.paradisii）は、アメリカ原産のみかん科の植物である。
【００２３】
＜バレンシアオレンジ＞
バレンシアオレンジ（学名：C.sinensis cv.Valencia）は、みかん科の植物であり、オレンジの中では最も産量が多く、世界各地で栽培されている。
【００２４】
＜シークアーサー＞
シークアーサー（学名：C.depressa Hayata）は、別名ヒラミレモンといわれ、沖縄原生のみかん科の植物である。
【００２５】
＜ポンカン＞
ポンカン（学名：Citrus reticulata Blanco）は、みかん科の常緑小高木であり、中国南部、台湾の他、インド、スリランカ、フィリピンなどで栽培され、日本においても鹿児島県、宮崎県、高知県などで栽培されている。
【００２６】
＜レモン＞
レモン（学名：C.limon(Linn.)Burm.）は、みかん科の植物であり、殺菌・消毒作用を有することが知られている。
【００２７】
＜マーコット＞
マーコットは、みかんとオレンジとの交雑種の一種であるみかん科の植物である。アメリカのフロリダが発祥地であり、日本においても長崎県、熊本県、佐賀県等で栽培されている。
【００２８】
＜不知火＞
不知火は、清見オレンジとポンカンとの交雑種であるみかん科の植物であり、熊本県、愛知県、鹿児島県、愛媛県等で栽培されている。不知火のうち、糖度１３度以上、酸味１．０％以下のものをデコポン（登録商標）という。
【００２９】
以下、上記柑橘類を原料とするノビレチンの好ましい精製方法について説明する。
【００３０】
抽出原料として使用できる上記柑橘類の部位としては、例えば、果実、果皮、葉等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を抽出原料として使用することができるが、果実又は果皮を抽出原料として使用することが好ましい。果実としては、果皮を含む果実全体を使用することが好ましい。果実又は果皮としては、未熟な果実（摘果果実）又はその果皮及び成熟した果実又はその果皮のいずれを使用してもよい。抽出原料には、切断、破砕、乾燥等の前処理を行うことができる。
【００３１】
抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどの親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができるが、中でも特にエタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液を用いるのが好ましい。そのエタノール水溶液において、エタノール濃度は０〜４０容量％の範囲内で適宜変更することができる。
【００３２】
なお、エタノール濃度が０容量％のエタノール水溶液とは、水を意味する。水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。
【００３３】
抽出処理は、上記柑橘類に含まれるノビレチンを抽出できる限り特に限定されず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の１〜２０倍量（質量比）の抽出溶媒に抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で０．１〜３時間抽出した後、濾過して残渣を除去することにより、ノビレチンを含有する抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、常法に従って濃縮してもよい。また、得られた抽出液は、脱色等を目的として活性炭処理してもよい。ここで得られる抽出液は、本発明における「柑橘類抽出物」となり得る。
【００３４】
抽出原料をエタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液で抽出した場合、その処理の前又は後に、抽出原料を熱水で抽出することが好ましい。これにより、抽出原料からのノビレチン収率を向上させることができる。
【００３５】
熱水の温度は通常４０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃である。エタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液で抽出する前に熱水で抽出する場合には、抽出原料を熱水で抽出し、濾過して、ノビレチンを含有する抽出液を得た後、残渣をエタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液で抽出し、濾過して、ノビレチンを含有する抽出液を得、両抽出液を混合する。エタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液で抽出した後に熱水で抽出する場合には、抽出原料をエタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液で抽出し、濾過して、ノビレチンを含有する抽出液を得た後、残渣を熱水で抽出し、濾過して、ノビレチンを含有する抽出液を得、両抽出液を混合する。
【００３６】
上記方法によって得られた抽出液、特にエタノール濃度が０〜４０容量％のエタノール水溶液を用いて得られた抽出液又はその抽出液と熱水を用いて得られた抽出液との混合液は、多孔性吸着樹脂に通液してノビレチンを多孔性吸着樹脂に吸着させた後、多孔性吸着樹脂に吸着したそのノビレチンを溶出させるのが好ましい。
【００３７】
多孔性吸着樹脂は、ノビレチンを吸着し得る限り特に限定されるものではない。多孔性吸着樹脂としては、例えば、合成吸着樹脂、活性炭等が挙げられ、これらのうち１種類又は２種類以上を使用することができるが、合成吸着樹脂を使用することが好ましい。
【００３８】
上記抽出液は、濃縮した後に多孔性吸着樹脂に通液することが好ましい。これにより、多孔性吸着樹脂への通液時間を短縮することができる。濃縮は、減圧濃縮等の常法に従って行うことができ、通常３〜１０倍、好ましくは４〜６倍に濃縮する。
【００３９】
抽出液の空間速度は通常０．１〜４、好ましくは０．８〜１．５である。なお、１時間当たり樹脂量の１倍量を通過させる速度を空間速度（Space Velocity；SV）＝１とする。
【００４０】
上記抽出液を多孔性吸着樹脂に通液し、その多孔性吸着樹脂から流出してくる液には、多孔性吸着樹脂に吸着しなかったノビレチンが含まれている可能性があるので、これを回収しておくことが好ましい。
【００４１】
多孔性吸着樹脂に吸着したノビレチンを溶出させることができる溶媒としては、例えば、エタノール水溶液、メタノール水溶液、イソプロパノール水溶液等が挙げられるが、これらのうちエタノール水溶液を使用することが好ましい。ノビレチンの溶出に使用するエタノール水溶液のエタノール濃度は、通常５５〜９５容量％、好ましくは６０〜９０容量％である。
【００４２】
多孔性吸着樹脂に吸着したノビレチンを溶出させる前に、多孔性吸着樹脂を洗浄し、多孔性吸着樹脂に吸着したノビレチン以外の成分を溶出させることが好ましい。多孔性吸着樹脂の洗浄液としては、例えば、水、エタノール水溶液、メタノール水溶液、イソプロパノール水溶液、水酸化ナトリウム水溶液等が挙げられるが、これらのうちエタノール水溶液を使用することが好ましい。多孔性吸着樹脂の洗浄に使用するエタノール水溶液のエタノール濃度は、通常１０〜５０容量％、好ましくは３０〜５０容量％である。
【００４３】
多孔性吸着樹脂からの溶出液を、減圧乾燥等の常法に従って乾燥することによりノビレチン粗精製物を得ることができる。多孔性吸着樹脂からの溶出液に、上記多孔性吸着樹脂洗浄液を混合し、この混合液を乾燥することによりノビレチン粗精製物を得ることもできる。
【００４４】
ノビレチン粗精製物には、通常、抽出原料に含まれるノビレチン以外のポリメトキシフラボノイド（例えば、タンゲレチン、ペンタメトキシフラボン、テトラメトキシフラボン、ヘプタメトキシフラボンなど）が含まれている。
【００４５】
上記柑橘類からの抽出物は、高いＴＮＦ−α産生抑制作用及びエストロゲン様作用を有しており、特に上記ノビレチン粗精製物は、極めて高いＴＮＦ−α産生抑制作用及びエストロゲン様作用を有しており、そのままあるいは他の活性物質や成形助剤と共に、常法に従って製剤化して粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形として提供することができ、外皮用剤、内服液剤、内服固形剤、注射剤、座剤等として使用することができる。
【００４６】
得られた柑橘類抽出物又はノビレチン粗精製物を製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加することができる。
【００４７】
なお、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤は、必要に応じて、ＴＮＦ−α産生抑制作用及び／又はエストロゲン様作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。この場合における配合割合の一例として、ノビレチン：天然抽出物＝１：０．０１〜１：５（質量比）を挙げることができる。
【００４８】
本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、有効成分であるノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物が有するＴＮＦ−α産生抑制作用を通じて、ＴＮＦ−αの産生を抑制することができる。したがって、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、過剰に産生されたＴＮＦ−αが関与する炎症性疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡の予防又は改善に有用である。
【００４９】
また、本発明におけるエストロゲン様作用剤は、有効成分であるノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物が有するエストロゲン様作用を通じて、皮膚のしわの形成や弾力性低下等に代表される皮膚の老化現象の予防又は治療に有用である。
【００５０】
さらに、これらの用途以外にも、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、ＴＮＦ−αの産生を抑制することに意義あるすべての用途に用いることができ、また、本発明のエストロゲン様作用剤は、エストロゲンと同様の作用を発揮することに意義あるすべての用途に用いることができる。
【００５１】
〔皮膚外用剤〕
本発明の皮膚外用剤は、上記ＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤（ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物のみからなるものを含む）を有効成分として含有するものである。
【００５２】
ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物は、ＴＮＦ−α産生抑制作用及び／又はエストロゲン様作用を有しており、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡等の炎症性疾患を予防及び／又は改善することができ、皮膚の老化を防止及び／又は改善することができると共に、外皮に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚外用剤に配合するのに好適である。この場合、ノビレチン、特定柑橘類抽出物又はノビレチン精製物をそのまま配合してもよいし、ノビレチン、特定柑橘類抽出物若しくはノビレチン精製物から製剤化したＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤を配合してもよい。
【００５３】
ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が含まれる。
【００５４】
本発明の皮膚外用剤の形態は特に限定されないが、その具体例として、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー、リップクリーム、口紅、入浴剤等、任意の形態が可能である。
【００５５】
皮膚外用剤中における有効成分の配合量は、使用目的、性別、症状等を考慮して適宜調整することができるが、ノビレチンに換算して約０．０００１〜１０質量％である。
【００５６】
皮膚外用剤は、上記ＴＮＦ−α産生抑制剤及び／又はエストロゲン様作用剤とともに、用途に応じた任意の生理活性物質や助剤、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤等を併用すれば、より一般性のある製品となる。また、それにより、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。
【００５７】
なお、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤及びエストロゲン様作用剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、所望の作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。例えば、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤又はエストロゲン様作用剤を、ドッグフード、キャットフードなどの愛玩動物や家畜の食餌に添加し、愛玩動物や家畜の炎症性疾患を予防・治療することもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、製造例、試験例、及び配合例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は、下記の各例に何ら限定されるものではない。
【００５９】
〔製造例１〕  ノビレチン粗精製物の製造
ポンカン摘果果実（果皮を含む果実全体）２５００ｋｇに抽出溶媒である３０容量％エタノール（水とエタノールとの質量比７：３）５０Ｌを加え、還流抽出器で８０℃、２時間加熱抽出し、熱時濾過した。得られた抽出液を減圧下に濃縮し、さらに乾燥して抽出物（以下「ノビレチン粗精製物Ａ」という。）を得た。得られたノビレチン粗精製物Ａ中のノビレチン含量は０．０８質量％であった。なお、ノビレチンの同定は、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定することにより行った（キャリアー：５０％アセトニトリル（０．１％リン酸），検出波長：３３４ｎｍ，カラム：ＷＡＫＯＳＩＬ−II ５Ｃ１８ＨＧ（和光純薬工業株式会社製））。
【００６０】
上記ノビレチン粗精製物Ａをカラムクロマトグラフィー（ダイヤイオンＨＰ−２０，三菱化学株式会社製）で処理した後、７０質量％含水メタノールで溶出し、分画物を得た。得られた分画物を活性炭処理し、さらに減圧下に濃縮後、乾燥してノビレチン粗精製物（以下「ノビレチン粗精製物Ｂ」という。）１．３ｋｇを得た。なお、ノビレチン粗精製物Ｂ中のノビレチン含量は４５．６質量％であった。
【００６１】
〔試験例１〕  ＴＮＦ−α産生抑制作用試験
製造例１で得られたノビレチン粗精製物について、下記の試験法によりＴＮＦ−α産生抑制作用を試験した。
【００６２】
マウスマクロファージ細胞（RAW264.7細胞；大日本製薬株式会社製）を、１０％牛胎児血清（FBS）を添加したDulbecco’s MEM（日水製薬株式会社製）培地にて前培養後、セルスクレーパーより細胞を集め、１ウェル当たり１×１０５/cells/１００μＬの密度で９６穴マイクロプレートに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間前培養した。
【００６３】
次いで、９６穴プレート中の培地を捨て、あらかじめ２％DMSOを含む培養液で溶解した試験試料を１００μＬ添加した後、リポポリサッカライド(LPS，終濃度１μｇ/ｍＬ，E.coli 0111;B4，DIFCO Laboratories製)を１００μＬ添加し、細胞を刺激した。その後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間の培養により産生したＴＮＦ−αの産生量を、下記サンドイッチELISA法を用いて測定した。
【００６４】
一次抗体であるラット抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体（Endogen Inc.製）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、その溶液１００μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、一夜、４℃でコーティングした。次いで、洗浄液（０．０５％Tween２０を含むリン酸緩衝液）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキングを行った。
【００６５】
洗浄液によって各ウェルを洗浄後、試験培地で培養上清を希釈し、その１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェルを洗浄した後、二次抗体として、０．３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液に２．５μｇ/ｍＬの濃度で溶解させたウサギ抗マウスＴＮＦ−αポリクローナル抗体（Endogen Inc.製）１００μＬを加え、３７℃で６０分間インキュベートしてから洗浄した。
【００６６】
次いで、５００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（CHEMICON Inc.製）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェルを洗浄した後、発色用緩衝液（２０ｍＭ硫酸マグネシウム含有トリス塩酸緩衝液，ｐＨ８．０）１００ｍＬにｐ−ニトロフェニルリン酸５０ｍｇを溶解してなる基質溶液１５０μＬをウェルに添加し、３７℃で２０〜３０分間酵素反応を行って発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、リコビナントマウスＴＮＦ−α（Endogen Inc.製）標準液より作成した標準曲線から、培養上清中のＴＮＦ−α量（ｐｇ/ｍＬ）を求めた。試験試料のＴＮＦ−α産生抑制率は以下の式に基づいて算出した。
【００６７】
ＴＮＦ−α産生抑制率（％）＝{(Ｂ−Ａ)/Ｂ}×１００
上記式中、「Ａ」は「試料添加時のＴＮＦ−α量」、「Ｂ」は「試料無添加時のＴＮＦ−α量」を表す。
【００６８】
ＴＮＦ−α産生抑制率は、試料５０ｐｐｍ（μｇ／ｍＬ）添加時の値を算出したものである。結果を表１に示す。
【００６９】
[表１]
試  料                 ＴＮＦ−α産生抑制率（％）
ノビレチン粗精製物Ａ（０．０８％）              ８．３
ノビレチン粗精製物Ｂ（４５．６％）            ９８．５
【００７０】
表１の結果から、ノビレチン粗精製物、特にノビレチン粗精製物Ｂには優れたＴＮＦ−α産生抑制作用が認められた。このように、ノビレチン粗精製物中におけるノビレチン含量の増加に伴ってＴＮＦ−α産生抑制率が増加していることから、ノビレチンが優れたＴＮＦ−α産生抑制作用を有すると考えられる。
【００７１】
〔試験例２〕  エストロゲン様作用試験
製造例１によるノビレチン粗精製物について、エストロゲン依存性細胞の増殖に対する影響を調べるThomasらの方法（In Vitro Cell.Dev.Biol.28A，595-602，1992）に準拠して、以下のようにしてエストロゲン様作用の試験を行った。
【００７２】
ヒト乳ガン由来のＭＣＦ−７細胞を８０ｃｍ２フラスコでコンフルエント様になるまで培養し、トリプシン処理によりこのＭＣＦ−７細胞を集め、１０％ＦＢＳ（活性炭処理済み）、１％ＮＥＡＡ及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含みフェノールレッドを含まないＭＥＭ培地（以下「ＭＥＭ培地」という。）を用いて、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。
【００７３】
調製したＭＣＦ−７細胞を２４穴プレートに０．９ｍＬずつ播種し、これを定着させるために３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で培養した。６時間後（０日日）、ＭＥＭ培地で終濃度の１０倍の濃度（３１．２５ｐｐｍ；μｇ／ｍＬ）に調製した試料溶液１００μＬを上記プレートに添加し、培養を続けた。
【００７４】
培養開始から６日目、培地を０．９７ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＴＴを含むＭＥＭ培地に交換し、２時間培養した後、培地をイソプロパノールに交換して細胞内に生成したブルーホルマザンを抽出した。抽出したブルーホルマザンを含有するイソプロパノールについて、ブルーホルマザンの吸収極大点がある５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７５】
なお、付着細胞の影響を補正するため、同時に６５０ｎｍの吸光度も測定し、両吸光度の差をもってブルーホルマザンの生成量に比例する値とした（下記の計算式における吸光度はこの補正済み吸光度である）。陽性対照としては、０．０２ｐｐｍエチニルエストラジオールを使用した。エストロゲン様作用（エストロゲン依存性増殖作用）の強さは、試料無添加時の吸光度を１００％として次式により算出した。
【００７６】
エストロゲン様作用（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただし、上記式中、「Ａ」は「試料添加の場合の吸光度」を、「Ｂ」は「試料無添加の場合の吸光度」を表す。
この試験の結果を表２に示す。
【００７７】
[表２]
試  料                 エストロゲン様作用率（％）
ノビレチン粗精製物Ａ（０．０８％）              １０５
ノビレチン粗精製物Ｂ（４５．６％）              １３６
【００７８】
表２の結果から、ノビレチン粗精製物、特にノビレチン粗精製物Ｂには優れたエストロゲン様作用が認められた。このように、ノビレチン粗精製物中におけるノビレチン含量の増加に伴ってエストロゲン様作用率が増加していることから、ノビレチンが優れたエストロゲン様作用を有すると考えられる。
【００７９】
〔試験例３〕  カミソリ負け防止効果試験
製造例１によって得られたノビレチン粗精製物Ｂを含有するローション状の塗布液ａ及びノビレチン粗精製物を含有しない以外は塗布液ａと同じ組成の塗布液ｂ（対照）を調製し、それらについてカミソリ負け防止効果を試験した。なお、カミソリ負けとは、ひげ等の毛を剃った後、皮膚が赤くなりヒリヒリ痛んだり、腫れて熱を持ったり痒くなったりする症状であり、カミソリでひげ等の毛を剃った後の皮膚に細かい切り傷ができ、その切り傷から細菌が感染することによって生じるものである。各塗布液の組成は以下の表３の通りである。
【００８０】
[表３]
塗布液ａ     塗布液ｂ   
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）  １．０ｇ          無し
１，３−ブチレングリコール        ５．０ｇ        ５．０ｇ
グリセリン                        １．０ｇ        １．０ｇ
エタノール                        ６．０ｇ        ６．０ｇ
非イオン性界面活性剤              ０．５ｇ        ０．５ｇ
精製水                              残部            残部
（塗布液ａ及び塗布液ｂともに全量を１００ｇとする）
【００８１】
カミソリ負けする男性被験者２０名を１０名ずつ２群に分け、一方の群には塗布液ａを、他方の群には塗布液ｂをひげ剃り直後の皮膚に塗布し、以下の判定基準でカミソリ負け防止（改善）効果を評価した。
【００８２】
カミソリ負けが消失した場合には「著効あり」、カミソリ負けが弱くなった場合には「有効」、カミソリ負けがやや弱くなった場合には「やや有効」、カミソリ負けに変化が認められない場合には「無効」と判定し、「無効」と判定した被験者が２０％未満である場合には「Ａ」、２０％以上５０％未満である場合には「Ｂ」、５０％以上８０％未満である場合には「Ｃ」、８０％以上である場合には「Ｄ」と評価した。
【００８３】
その結果、塗布液ａのカミソリ負け防止効果は「Ａ」と評価され、塗布液ｂのカミソリ負け防止効果は「Ｄ」と評価された。なお、上記試験を行うとともに、肌に対する刺激（ヒリヒリ感）の程度について被験者に対して感想を求めたところ、全ての被験者が両塗布液とも刺激を感じないと答えた。
【００８４】
この結果によって、ノビレチン粗精製物がカミソリ負け防止作用、すなわち抗炎症作用を有することが示された。
【００８５】
〔試験例４〕  肌荒れ改善作用試験
製造例１で得られたノビレチン粗精製物Ｂを配合した乳液（以下「実施例乳液」という）を常法に従って調製した。実施例乳液の組成を以下に示す。
【００８６】
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）                      １．０ｇ
セチルアルコール                                      ０．５ｇ
ミツロウ                                              ２．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（10E.0.）      １．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル                            １．０ｇ
ヒアルロン酸                                          ０．１ｇ
プロピレングリコール                                  ５．０ｇ
エタノール                                            ３．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                              ０．３ｇ
香料                                                  ０．０３ｇ
精製水                              残部（全量を１００ｇとする）
【００８７】
実施例乳液、及びノビレチン粗精製物を含まない以外は実施例乳液と同じ組成の比較例乳液について、以下の評価試験を行った。
【００８８】
２３〜４２歳の女性多数の中から、皮溝・皮丘が消え、広範囲の角質がめくれている（表４に示す評点が１）又は皮溝・皮丘が不鮮明であり角質が部分的にめくれている（表４に示す評点が２）と判定された者２０名を選抜して被験者とし、各被験者に、顔の右半分には実施例乳液を、左半分には比較例乳液を、朝夕各1回、３０日間塗布させた。
【００８９】
判定１：肌荒れ改善効果
塗布試験終了後、シルフロ（FLEXICL DEVELOPMENTS LTD製）を用いたレプリカ法によって顔のレプリカをとり、５０倍の顕微鏡で皮紋の状態及び角質剥離状態を観察し、表４に示す評価基準で肌の状態を判定した。判定結果を表５に示す。
【００９０】
［表４］
評  点                         評  価                              
１      皮溝・皮丘が消え、広範囲の角質がめくれている（肌荒れ状態）
２      皮溝・皮丘が不鮮明。角質が部分的にめくれている（肌荒れ状態）
３      皮溝・皮丘が認められるが平坦である（普通肌）
４      皮溝・皮丘が鮮明である（比較的美しい肌）
５      皮溝・皮丘がきわめて鮮明で整っている（美しい肌）
【００９１】
［表５］
評  点   試験開始前     実施例乳液塗布部     比較例乳液塗布部  
１            ９名              ０名                  ８名
２          １０名              ０名                  ８名
３            １名              ７名                  ３名
４            ０名            １１名                  １名
５            ０名              ２名                  ０名
【００９２】
表５に示されるように、実施例乳液を塗布した領域は、比較例乳液を塗布した領域に比べて顕著に肌荒れ（皮膚の老化）が改善された。
【００９３】
判定２：官能評価
使用感と肌への効果について、実施例乳液と比較例乳液とを比較した場合の優劣を被験者全員に質問した。回答の集計結果を表６に示す。
【００９４】
［表６］
評価項目       実施例乳液が良い 比較例乳液が良い 優劣なし
肌へのなじみ                １６名              ２名          ２名
しっとり感                  １７名              １名          ２名
肌へののび                  １４名              ２名          ４名
肌荒れ改善の満足感          １７名              １名          ２名
肌色改善の満足感            １３名              ２名          ５名
シワの数と深さの改善        １８名              １名          １名
【００９５】
表６に示される結果より、官能評価によっても上記判定１と同様の効果と優れた使用感が確認された。
【００９６】
判定１及び判定２の結果より、ノビレチン粗精製物を配合した皮膚外用剤が皮膚の老化の防止・改善作用（肌荒れ改善作用）を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れていることが確認された。
【００９７】
〔配合例１〕
下記の組成の乳液を常法により製造した。
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）                        １ｇ
ホホバオイル                                            ４ｇ
オリーブオイル                                          ２ｇ
スクワラン                                              ２ｇ
セタノール                                              ２ｇ
モノステアリン酸グリセリル                              ２ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（20E.0.）              ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0.）        ２ｇ
１，３−ブチレングリコール                              ３ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                ０．１５ｇ
香料                                                    ０．０５ｇ
精製水                                残部（全量を１００ｇとする）
【００９８】
〔配合例２〕
下記組成の化粧水を常法により製造した。
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）                        ２ｇ
グリセリン                                              ３ｇ
１，３−ブチレングリコール                              ３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0.）        ０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                ０．１５ｇ
クエン酸                                                ０．１ｇ
クエン酸ソーダ                                          ０．１ｇ
香料                                                    ０．０５ｇ
精製水                                残部（全量を１００ｇとする）
【００９９】
〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）                        １ｇ
流動パラフィン                                          ５ｇ
サラシミツロウ                                          ４ｇ
セタノール                                              ３ｇ
スクワラン                                            １０ｇ
ラノリン                                                ２ｇ
ステアリン酸                                            １ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.0.）        １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル                              ３ｇ
１，３−ブチレングリコール                              ６ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                                １．５ｇ
香料                                                    ０．１ｇ
精製水                                残部（全量を１００ｇとする）
【０１００】
〔配合例４〕
下記組成のパックを常法により製造した。
ノビレチン粗精製物Ｂ（製造例１）                        ５ｇ
ポリビニルアルコール                                  １５ｇ
ポリエチレングリコール                                  ３ｇ
プロピレングリコール                                    ７ｇ
エタノール                                            １０ｇ
パラオキシ安息香酸エチル                                ０．０５ｇ
香料                                                    ０．０５ｇ
精製水                                残部（全量を１００ｇとする）
【０１０１】
なお、上記配合例１〜４による皮膚外用剤は、いずれも良好な保存安定性を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明に係るＴＮＦ−α産生抑制剤は、過剰なＴＮＦ−αの産生が関与する炎症性疾患等の予防又は治療に、本発明に係るエストロゲン様作用剤は、皮膚のしわの形成や弾力性低下等に代表される皮膚の老化現象の予防又は治療に大きく貢献できる。