(57)【要約】      （修正有）【課題】  フラビウイルスに起因する疾病の治療に有用な組成物を提供する。【解決手段】  式：2005290015.tif 000012[式中,R,R1及びR2は独立的に水素,C1-14アルカノイル基,C1-14アルケノイル基,シクロヘキサンカルボニル基,C1-8アルコキシアセチル基,置換されているベンゾイル基などである]で示されるカスタノスペルピンエステルを配合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルス感染症の治療又は予防が必要な患者においてフラビウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物であって、
式：
2005290015.tif 000010
［式中、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、独立的に、水素、１〜１４個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１４個の炭素原子のアルケノイル基、シクロヘキサンカルボニル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、
2005290015.tif 000011
、ナフタレンカルボニル基、メチル又はハロゲンで置換されているナフタレンカルボニル基、フェニル（２〜６個の炭素原子のアルカノイル）基、フェニル（２〜６個の炭素原子のアルカノイル）基（フェニルはメチル又はハロゲンで置換されている）、シンナモイル基、ピリジンカルボニル基、メチル又はハロゲンで置換されているピリジンカルボニル基、ジヒドロピリジンカルボニル基、１〜１０個の炭素原子のアルキル基で置換されているジヒドロピリジンカルボニル基、チオフェンカルボニル基、メチル又はハロゲンで置換されているチオフェンカルボニル基、フランカルボニル基、又はメチル又はハロゲンで置換されているフランカルボニル基であり、
Ｙは、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲン、トリフルオロメチル基、１〜４個の炭素原子のアルキルスルホニル基、１〜４個の炭素原子のアルキルメルカプト基、シアノ基又はジメチルアミノ基であり、
Ｙ′は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲンであるか、又はＹと組み合わさって３，４−メチレンジオキシを与え、
Ｙ″は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基又はハロゲンであり、
Ｒ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一種であって二種以下が水素である］で示されるカスタノスペルピンエステル又はその薬理学的に受容可能な塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜１０個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１０個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基であり、Ｙは、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲン、トリフルオロメチル基、１〜４個の炭素原子のアルキルスルホニル基、１〜４個の炭素原子のアルキルメルカプト基、シアノ基又はジメチルアミノ基であり、Ｙ′は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲンであるか、又はＹと組み合わさって３，４−メチレンジオキシを与え、Ｙ″は、水素、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基又はハロゲンであり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一種であって二種以下が水素である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、ベンゾイル基、又はアルキル又はハロゲンで置換されているベンゾイル基であり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一種であって二種以下が水素である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、ベンゾイル基、又はメチル、臭素、塩素又はフッ素基で置換されているベンゾイル基であり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2の少なくとも一種であって二種以下が水素である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ1が、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１０個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、ベンゾイル基、又はアルキル又はハロゲン基で置換されているベンゾイル基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｒ1が、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、ベンゾイル基、又はメチル、臭素、塩素又はフッ素基で置換されているベンゾイル基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
カスタノスペルミンエステルが、
（ａ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ベンゾエート；
（ｂ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−ベンゾエート；
（ｃ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（４−メチルベンゾエート）；
（ｄ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−（４−ブロモベンゾエート）；
（ｅ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６，８−ジブタノエート；
（ｆ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエート；
（ｇ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（２−フランカルボノキシレート）；
（ｈ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−（２，４−ジクロロベンゾエート）；
（ｉ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（３−ヘキセノエート）；
（ｊ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−オクタノエート；
（ｋ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ペンタノエート；
（ｌ）Ｏ−ピバロイルエステル；
（ｍ）２−エチル−ブチリルエステル；
（ｎ）３，３−ジメチルブチリルエステル；
（ｏ）シクロプロパノイルエステル；
（ｐ）４−メトキシベンゾエートエステル；
（ｑ）２−アミノベンゾエートエステル；及び
（ｒ）（ａ）〜（ｑ）の任意の又は全ての混合物、
から選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエートである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ベンゾエートである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ペンタノエートである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（２−フランカルボノキシレート）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
フラビウイルスがペスチウイルス属、フラビウイルス属又はヘパチウイルス属のメンバーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
フラビウイルスが、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス及びダニ媒介脳炎ウイルスから選ばれる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
フラビウイルスが動物のウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動物のウイルスが、ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）、古典ブタコレラウイルス及びボーダー病ウイルスから選ばれる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
フラビウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
フラビウイルスが西ナイル熱ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
フラビウイルスがデング熱ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
フラビウイルスが黄熱病ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
フラビウイルスが日本脳炎ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
フラビウイルスがセントルイス脳炎ウイルスである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
治療又は予防が、C型肝炎、黄熱病、デング熱、日本脳炎、マレーバレー脳炎、ロシオウイルス感染症、西ナイル熱、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎、ルーピング病ウイルス感染症、ポワッサンウイルス感染症、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウシ下痢症、古典ブタコレラ（ブタコレラ）、及びボーダー病から選ばれるフラビウイルス疾病の治療又は予防である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
フラビウイルス感染症の治療又は予防のための補助治療薬と組み合わせた、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のカスタノスペルミンエステルを含む事を特徴とする医薬組成物であって、
該補助治療薬が、
（ａ）フラビウイルスの結合及び／又はフラビウイルスによる細胞の感染を阻害する化合物、及び／又は、
（ｂ）ウイルスキャプシド由来のウイルスRNAの放出又はフラビウイルス遺伝子産物の機能を阻害する化合物、及び／又は、
（ｃ）フラビウイルスの複製を変更させる化合物、及び／又は、
（ｄ）免疫機能を変更させる化合物、及び／又は、
（ｅ）フラビウイルス感染症の症状を変更させる化合物、及び／又は、
（ｆ）フラビウイルス関連感染症を治療するための化合物、
から選ばれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
免疫機能を変更させる化合物がチモシン−αである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
免疫機能を変更させる化合物がインターフェロンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
インターフェロンがインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエートであり、補助治療薬がＩＦＮ−αである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ウイルスの複製を変更させる化合物がイノシン１リン酸デヒドロゲナーゼ阻害薬である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ウイルスの複製を変更させる化合物がミコフェノール酸である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ウイルスの複製を変更させる化合物がＶＸ４９７（メリメムポジブ）である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ウイルスの複製を変更させる化合物がリバビリンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエートであり、補助治療薬がリバビリンである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
フラビウイルス感染症の症状を変更させる化合物が酸化防止剤である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
酸化防止剤がフラビノイドである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
フラビウイルス関連B型肝炎ウイルス感染症を治療するための化合物が、ヌクレオチドRT阻害薬又は非ヌクレオシドRT阻害薬である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
カスタノスペルミンエステルが［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエートである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
薬理学的に受容可能な賦形剤を更に含む、請求項２３〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
組成物がキットの形態を取っている、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
フラビウイルス症の治療で使用する為のインストラクションを更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
カスタノスペルミン又はそのエステル及び／又は補助治療薬が単位投与量形態になっている、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
フラビウイルス症が、C型肝炎、黄熱病、テング熱、日本脳炎、マレーバレー脳炎、ロシオウイルス感染症、西ナイル熱、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎、ルーピング病ウイルス感染症、ポワッサンウイルス感染症、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウシ下痢症、古典ブタコレラ（ブタコレラ）、及びボーダー病から選ばれる、請求項３９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルスに起因する疾病の治療における或種のカスタノスペルミンエステルの使用に関し、特に、C型肝炎ウイルス（HCV)に起因する疾病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス
フラビウイルス属（フラビ・ウイルス科）は、フラビウイルス属、ペスチウイルス属及びヘパチウイルス属を含み、様々な人間の疾病の原因物質及び家畜業にとって著しい損失の原因となる様々な動物の疾病を含む。
フラビ・ウイルス科（そのメンバーをここではフラビウイルスと称する）は、フラビウイルス属（例えば、黄熱病ウイルス、テング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス及びダニ媒介脳炎ウイルス）、ペスチウイルス属（例えば、ウシウイルス下痢症、古典ブタコレラウイルス及びボーダー病ウイルス）、へパチウイルス属（C型肝炎ウイルス）及び現在未分類メンバーのフラビウイルス（例えば、GBウイルスのタイプA、B及びC)を含む。
【０００３】
フラビ・ウイルス科のメンバーの完全な一覧表は、ウイルスの分類学についての国際委員会で詳細に示されていて（現在認められている分類学的定義は、ウイルス分類学：ウイルスの分類及び命名法、ウイルスの分類学についての国際委員会第７回報告書（本）に述べられている（非特許文献１参照））、その内容は参照によってここに導入される。
然しながら、多分最も顕著なフラビウイルスはC型肝炎ウイルス（HCV)である。HCVは１９８９年に初めて特定され、以来、このウイルスは,輸血後の非A型、非B型肝炎の殆どの場合に応答可能である事が明らかと成っている。事実、HCVは、現在、慢性肝臓病の原因である最も一般的な感染症の一つとして認められており、世界保健機構は、１億７万人が慢性的に感染していると推定している。HCV感染は、感染した患者の８５％が慢性的感染であり、その凡そ２０〜３０％は肝硬変及び、しばしば肝細胞癌によって悪化する最終段階の肝臓病へと進む。
【０００４】
HCVの研究は細胞培養で効率的にウイルスを増殖させる事ができないために制限されてきた。然しながら、ヒトHCVの複製を支持する事のできる適当な細部培養系が存在しない場合では、BVDVが受容される細胞培養モデルである。HCVとBVDVは局所タンパクの相同性の重要な度合い、一般的な複製戦略及び多分ウイルスエンベロープの同じ細胞内配置を分け合っている。
HCVは、フラビ・ウイルス科に属する内包されたプラス−ストランドRNAウイルスであるが、別のヘパチウイルス属として分類される。HCVゲノムは、〜３０００のアミノ酸残基のポリタンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフレームから成る。このポリタンパク質は、二つのＮ−結合したグリコシル化タンパク質Ｅ１及びＥ２を含む少なくとも１０個の異なるタンパク質中に同時翻訳的に及び後翻訳的に加工される。
ゲノムは、５′及び３′末端に安定な二次及び三次構造を形成する非翻訳領域（ＮＴＲ）を運ぶ。５′ＮＴＲは、ＯＲＦの開始コドンに近接してリボソームの直接的結合を許す内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）を運ぶ。この様に、ＨＣＶのＲＮＡの翻訳は細胞ｍＲＮＡによって一般的に使用されるＣＡＰ−依存系よりはむしろＩＲＥＳによって媒介される。
【０００５】
ポリタンパク質内では、分解産物は次の様に整理される：核（Ｃ）、包膜タンパク質１（Ｅ１）、Ｅ２、ｐ７、非構造的タンパク質２（ＮＳ２）、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ。核タンパク質はヌクレオカプシドの主たる構成成分を形成する高度に塩基性のＲＮＡ結合タンパク質である。包膜タンパク質Ｅ１及びＥ２は、カルボキシ末端領域を介して固定された高度にグリコシル化されたタイプ１の膜タンパク質である。これらは、ウイルス粒子の脂質エンベロープ内に埋め込まれ結合して安定なヘテロダイマーを形成する。分解産物のｐ７は、未知の機能の小さな疎水性のペプチドである。非構造的タンパク質はウイルス複製中に含まれ、プロテアーゼ（ＮＳ２／ＮＳ３）、ヘリカーゼ（ＮＳ３）及びＲＮＡポリメラーゼ活性（ＮＳ５Ｂ）を保有する。
宿主細胞への結合は、恐らく、Ｅ２又はＥ１／Ｅ２複合体と、細胞の表面に存在するレセプターとの相互反応を必要とする。
有効な細胞培養複製系の欠如によって、ＨＣＶ粒子アセンブリーの理解は極めて制限されている。然しながら、複合体グリカンの不存在、小包体（ＥＲ）における発現ＨＣＶ糖タンパク質の局在化および細胞表面におけるこれらのタンパク質の不存在は、初期ビリオン形態形成が、ＥＲから細胞内ベシクル中への出芽によって起される事を示唆する。更に、成熟したＥ１−Ｅ２ヘテロダイマーはＥＲを離れず、ＥＲ保持シグナルは、Ｅ１及びＥ２の両方のＣ−末端領域で同定されている。この場合、ウイルスは構成的分泌経路を経て搬出される。この推定に従って、複合体Ｎ−結合グリカンが、部分的に精製されたウイルス粒子の表面で見付かり、これはウイルスがゴルジ体を介して移行する事を示している。
【０００６】
最近まで、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）はＨＣＶ感染症の治療に有効な唯一の治療であった。ＩＦＮ−αの使用によって、患者の５０％までが治療に対して応答を示すが、これは大部分の患者にとっては耐えられるものではなく、著しい副作用が存在する。極最近、ヌクレオシド類似体のリバビリンと組合せたＩＦＮ−αの使用によって大きな成果が達成されたが、更に有効な抗ウイルス活性を有し且つ重篤な副作用のない治療的候補を確認する為には継続的な研究が必要である。
従って、一般的に、改善された抗フラビウイルス薬、特に抗ＨＣＶ薬の必要性が存在する。
糖タンパク質及びウイルスの発生
糖タンパク質は、タンパク質における糖とアミノ酸の間の結合によって二つの大きなクラスに分類される。タンパク質のアスパラギンとオリゴ糖のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基との間のＮ−グルコシド結合が最も一般的に且つ広範囲に研究されている。Ｎ−結合オリゴ糖は、ポリペプチドのバックボーンへの結合に続いて、小包体（ＥＲ）中で一連の特定酵素に加工され、この加工経路は十分に特徴付けられている。
ＥＲでは、α−グルコシダーゼは、前駆体のオリゴ糖からの末端α−１，２グルコース残基の除去に応答可能であり、α−グルコシダーゼＩＩは、マンノシダーゼ及び更に、様々なトランスフェラーゼを含む処理反応によるマンノース残基の除去の前に二つの残留α−１，３結合グルコース残基を除去する。これらのオリゴ糖「トリミング」反応は、糖タンパク質に、ゴルジ装置を介して運搬されるシャペロンタンパク質、例えばカルネキシン及びカルレチクリン(calreticulin) を正確に畳込ませて、相互作用をする事を可能とさせる。
【０００７】
このバイオ合成経路におけるキー酵素の阻害薬、特に、α−グルコシダーゼ及びα−マンノシダーゼをブロックする阻害薬は、幾つかの、膜に包まれたウイルスの複製を阻害する事を示した。その様な阻害薬は、ウイルス包膜糖タンパク質の畳込ませとの干渉によって、初期ウイルス−宿主細胞の相互反応又はその後の融合を阻害する様に作用するかも知れない。又、これらは、ウイルス膜の完成に必要な適当な糖タンパク質の構築を阻害してウイルスの複写を阻害するかも知れない。
例えば、非特異的グリコシル化阻害薬の２−デオキシ−Ｄ−グルコース及びβ−ヒドロキシ−ノルバリンは、ＨＩＶ糖タンパク質の発現を抑制し、融合細胞の形成をブロックする（非特許文献２参照）。これらの薬で処理されたＨＩＶ感染細胞のウイルス増殖は、恐らく、ウイルス膜の形成に必要な糖タンパク質が利用できない為に停止される。
その他の報告では、グリコシル化阻害薬の２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−マンノースが、ウイルス膜タンパク質のグリコシル化を阻害する事によって、インフルエンザに感染した細胞に対して抗ウイルス活性を示す事が分かった（非特許文献３参照）。又、この報告では、２−デオキシグルコースと２−デオキシ−２−フルオログルコースの抗ウイルス活性が研究され、それぞれが、異なるメカニズムによってウイルスタンパク質のグリコシル化を阻害する事が分かった。
【０００８】
ルー等は(Lu et al.)、Ｎ−結合グリコシル化は、Ｂ型肝炎ウイルスの分泌にとって必要である事の証拠を示し（非特許文献４参照）、一方、ブロック等は(Block et al.)、ヒトＢ型肝炎ウイルスの分泌はイミノ糖Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンで抑制される事を示した（非特許文献５参照）。又、特許文献１参照。
テイラー等(Taylor et al.)は、カスタノスペルミン又はその他の植物アルカロイドでの治療後のサイトメガロウイルスの感染力の減少及びこれが謎の糖タンパク質合成に関係する事を証明した（非特許文献６参照）。又、特許文献２参照。
テイラー等(Taylor et al.)は、６−０−ブタノイルカスタノスペルミンによる糖タンパク質加工酵素のα−グルコシダーゼの抑制は、ヒト免疫不全ウイルス−感染Ｔ−細胞に影響を持つ事を示し（非特許文献７参照）、一方、サンカラ等は(Sunkara et al.)、カスタノスペルミン類似体の活性を開示している（非特許文献８参照）。又、特許文献２参照。
特許文献３は、或種のカスタノスペルミンエステルの抗ヘルペス活性を開示している。
【０００９】
然しながら、多くのその他のグリコシル化阻害薬は、抗ウイルス活性を有しない事が分かっている。従って、一般的に、包膜化ウイルスに対する抗ウイルス活性、特に、グリコシル化阻害薬の抗フラビウイルス活性は全く予知不可能である。
グルコシダーゼ阻害薬
カスタノスペルミン及び或種のイミノ糖、例えば、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）は、ＥＲα−グルコシダーゼ阻害薬であり、両方共、糖タンパク質プロセッシングの初期段階を強力に抑制する。然しながら、それらの効果は、それらが適用される系に依存して実質的に異なり、それらは、全く異なる特異性を示し、カスタノスペルミンは比較的に、α−グルコシダーゼＩに特異的である。
カスタノスペルミンは、本来、カスタノスペルマムアウストラレ(Castanospermum australe)の種子から単離されたアルカロイドであり、次の様な式を有する。
【００１０】
【化１】
2005290015.tif 000002
【００１１】
系統的には、この化合物は幾つかの方法で次の様に命名する事ができる：［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリ−ジンテトロール又は［１Ｓ，（１Ｓ，６Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，８ａＲ）］−１，６，７，８−テトラヒドロキシ−インドリジジン又は１，２，４，８−テトラデオキシ−１，４，８−ニトリロ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−オクチトール。「カスタノスペルミン」と言う用語又は最初の系統的名前が以下の検討において使用される。
ブランザ−ニキータ等は(Branza-Nichita et al.)、イミノ糖Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンがペスチウイルスＢＶＤＶに対して抗ウイルス効果を有する事を示した（非特許文献９参照）。然しながら、この著者は、α−グルコシダーゼ阻害薬での治療は、このウイルス及びその他の包膜ウイルスの寿命に影響を及ぼすが、その効果は、ウイルスタンパク質によって使用される特別の畳み込み経路に決定的に依存するので、その他のウイルスに対して一般化する事は不可能である事を明らかにしている。
【００１２】
クラジオ等は(Courageot et al.)、α−グルコシダーゼ阻害薬のカスタノスペルミン及びＤＮＪが、in vitroのマウスモデルでテング熱ウイルスの産生を減少させる事を報告した（非特許文献１０参照）。然しながら、イミノ糖阻害薬ＤＮＪとカスタノスペルミンとの間の活性における実質的な差異は報告されていない。
特許文献２は、一般的に、α−グルコシダーゼ阻害薬の使用、とりわけＨＣＶ感染症の治療における使用を開示している。然しながら、特にこの点でのカスタノスペルミン（又はそのエステル又は誘導体）への言及はなされていない。その代わりに、この文献は様々なイミノ糖の活性に焦点を当てている。
【００１３】
チャウキ等は(Choukhi et al.)、ＨＣＶの糖タンパク質とそれらのシャペロンとの間の相互反応についてのカスタノスペルミンの効果を報告している（非特許文献１１参照）。カスタノスペルミンはＨＣＶの糖タンパク質とシャペロンのカルネキシン及びカルレチクリンとの間の相互反応を破壊しなかった。むしろ、カスタノスペルミンは、実際に、糖タンパク質のカルレチクリンへの結合を増加させた。この著者は、ＨＣＶの糖タンパク質プロセッシングは、糖タンパク質のトリミングの阻害薬（例えば、カスタノスペルミン）に対して感応性ではないことを示唆し、次の様に結論付けている。
「カルネキシン又はカルレチクリンへのＨＣＶ糖タンパク質の結合及びそれからの放出は、Ｎ−結合グリカンのトリミングとは無関係である。」（チャウキ等、３８５６頁、１欄）
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願公開第９９２９３２１号パンフレット。
【特許文献２】米国特許第５，００４，７４６号明細書。
【特許文献３】米国特許第５，３８５，９１１号明細書
【非特許文献１】The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (book). M．H．V．van Regenmortel, C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop, E.B. Carstens, M.K. Estes, S.M. Lemon, J. Maniloff, M.A. Mayo, D.J. McGeoch, C.R. Pringle, R.B. Wickner (2000). Virus Taxonomy, VIIth report of the ICTV. Academic Press, San Diego。
【非特許文献２】Blough et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 141(1), 3-38(1986)。
【非特許文献３】McDowell et al., Biochemistry, 24(27), 8145-52(1985)。
【非特許文献４】Virology 213: 660-665(1995)。
【非特許文献５】PNAS 91: 2235-2239(1994)。
【非特許文献６】Antiviral Res. 10: 11-26(1988)。
【非特許文献７】Antimicrob. Ag. Chemother. 38: 1780-1787(1994)。
【非特許文献８】Lancet II 1206(1989)。
【非特許文献９】J. Virol. 75(8): 3527-3536(2001)。
【非特許文献１０】J. Virol. 74(1): 564-572 (2001)。
【非特許文献１１】J. Virol. 72(5): 3851-3858 (1998)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
その様な反対の教示にも拘わらず、本発明者は、驚くべき事に、カスタノスペルミンの或種のエステルが、事実、フラビ・ウイルス科のメンバー（ＨＣＶを含めた）に対して抗ウイルス活性を示す事を見出した。更に、それらは、治療指数が、イミノ糖クラス（そのエステルは比較的に高い抗ウイルス活性と比較的に低い毒性を示す）のα−グルコシダーゼ阻害薬によって示されるものよりも予測できない程に遥かに優れている事が分かった。如何なる理論にも拘束される積りはないが、カスタノスペルミンエステルのこれらの予期せぬ性質は糖タンパク質プロッセシング酵素（即ち、α−グルコシダーゼＩ）の特定のクラスに対するそれらの相対的な特異性を反映するものと推論する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明により、フラビウイルス感染症の治療方法であって、式：
【００１７】
【化２】
2005290015.tif 000003
【００１８】
［式中、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、独立的に、水素、１〜１４個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１４個の炭素原子のアルケノイル基、シクロヘキサンカルボニル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、
【００１９】
【化３】
2005290015.tif 000004
【００２０】
メチル又はハロゲンで任意に置換されているナフタレンカルボニル基、フェニル（２〜６個の炭素原子のアルカノイル）基（フェニルはメチル又はハロゲンで任意に置換されている）、シンナモイル基、メチル又はハロゲンで任意に置換されているピリジンカルボニル基、１〜１０個の炭素原子のアルキル基で任意に置換されているジヒドロピリジンカルボニル基、メチル又はハロゲンで任意に置換されているチオフェンカルボニル基、又はメチル又はハロゲンで任意に置換されているフランカルボニル基であり、Ｙは、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲン、トリフルオロメチル基、１〜４個の炭素原子のアルキルスルホニル基、１〜４個の炭素原子のアルキルメルカプト基、シアノ基又はジメチルアミノ基であり、Ｙ′は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲンであるか、又はＹと結合して３，４−メチレンジオキシを与え、Ｙ″は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基又はハロゲンであり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、それらの少なくとも一種であって二種以下が水素である様に選択される］のカスタノスペルミンエステル又はその薬理学的に受容可能な塩又は誘導体の有効量を、その治療を必要としている患者に投与する事を特徴とする方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
好ましくは、Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜１０個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１０個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基であり、Ｙは、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲン、トリフルオロメチル基、１〜４個の炭素原子のアルキルスルホニル基、１〜４個の炭素原子のアルキルメルカプト基、シアノ基又はジメチルアミノ基であり、Ｙ′は、水素、１〜４個の炭素原子のアルキル基、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基、ハロゲンであるか、又はＹと結合して３，４−メチレンジオキシを与え、Ｙ″は、水素、１〜４個の炭素原子のアルコキシ基又はハロゲンであり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、それらの少なくとも一種であって二種以下が水素である様に選択される。
【００２２】
Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基又はアルキル又はハロゲンで任意に置換されているベンゾイル基であり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、それらの少なくとも一種であって二種以下が水素である様に選択される。
Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、それぞれ独立的に、水素、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアルケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基、又はメチル、臭素、塩素又はフッ素基で任意に置換されているベンゾイル基であり、Ｒ、Ｒ1及びＲ2は、それらの少なくとも一種であって二種以下が水素である様に選択される。
好ましい実施態様では、カスタノスペルミンエステルは表１に示される構造を有する。
【００２３】
【表１】
2005290015.tif 000005
【００２４】
特に好ましいのは、Ｒ1が１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜１０個の炭素原子のアレケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基又は、任意に、アルキル又はハロゲン基で置換されているベンゾイル基であるカスタノスペルミンエステルである。
Ｒ1は、１〜８個の炭素原子のアルカノイル基、１〜８個の炭素原子のアレケノイル基、１〜８個の炭素原子のアルコキシアセチル基又は、任意に、メチル、臭素、塩素又はフッ素基で置換されているベンゾイル基であっても良い。
【００２５】
カスタノスペルミンエステルは、
（ａ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ベンゾエート；
（ｂ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−ベンゾエート；
（ｃ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（４−メチルベンゾエート）；
（ｄ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−（４−ブロモベンゾエート）；
（ｅ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６，８−ジブタノエート；
（ｆ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ブタノエート；
（ｇ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（２−フランカルボノキシレート）；
（ｈ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール７−（２，４−ジクロロベンゾエート）；
（ｉ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−（３−ヘキセノエート）；
（ｊ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−オクタノエート；
（ｋ）［１Ｓ−（１α，６β，７α，８β，８αβ）］−オクタヒドロ−１，６，７，８−インドリジンテトロール６−ペンタノエート；
（ｌ）Ｏ−ピバロイルエステル；
（ｍ）２−エチル−ブチリルエステル；
（ｎ）３，３−ジメチルブチリルエステル；
（ｏ）シクロプロパノイルエステル；
（ｐ）４−メトキシベンゾエートエステル；
（ｑ）２−アミノベンゾエートエステル；及び
（ｒ）（ａ）〜（ｑ）の任意の又は全ての混合物、
から選ばれても良い。
【００２６】
フラビウイルスは、例えば、ペスチウイルス属又はフラビウイルス属のメンバーであっても良い。
好ましい実施態様では、フラビウイルスはヘパチウイルス属のメンバーである。特に好ましい実施態様では、ヘパチウイルスはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。
その他のフラビウイルスの例としては、フラビウイルス属（例えば、黄熱病ウイルス、テング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス及びダニ媒介脳炎ウイルス）、ペスチウイルス属（ウシ下痢症ウイルス、古典ブタコレラウイルス及びボーダー病ウイルス）のメンバー及び現在未分類のフラビ・ウイルス科のメンバー（例えば、ＧＢウイルスのタイプA、B及びC)が挙げられる。
【００２７】
本発明のその他の観点では、フラビウイルスは動物のウイルス、例えば、ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、古典ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス及び豚コレラウイルスから任意に選ばれるペスチウイルスである。
本発明のその他の観点では、フラビウイルス感染症の治療又は予防で使用する薬剤の製造の為の、上述のカスタノスペルミンエステルの使用が用意される。
この様に、本発明は、上述のカスタノスペルミンエステルの使用（例えば、活性成分として）を特徴とする、フラビウイルス感染症の治療又は予防での使用の為の薬剤の製造方法に係る発明である。
この治療又は予防は、好ましくは、上述のウイルスによる感染症の治療又は予防である。特に、この治療又は予防は、Ｃ型肝炎、黄熱病、テング熱、日本脳炎、マレーバレー脳炎、ロシオウイルス感染症、西ナイル熱、セントルイス脳炎、ダニ媒介脳炎、ルーピング(Louping)病ウイルス感染症、ポワッサンウイルス感染症、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ウシ下痢症、古典ブタコレラ、ボーダー病及び豚コレラから選ばれる疾病の治療又は予防であっても良い。
【００２８】
又、本発明の薬剤は、本発明のカスタノスペルミンエステルと一緒に（例えば、混合物或いは共充填された状態で）補助治療薬を含んでも良い。補助治療薬は抗ウイルス化合物、例えば、抗−ＨＣＶ薬剤を含んでも良い。インターフェロン−α及び／又はリバビリンを含む補助治療薬が特に好ましい。
この様に、その他の観点では、本発明は、特許請求の範囲で定義されるカスタノスペルミンエステルと、（ａ）HCVの結合及び／又はHCVによる細胞の感染を阻害する化合物。これらの例としては、例えば、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２タンパク質に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体）及びグルコサミングリカン（例えば、ヘパラン硫酸及びスラミン）が挙げられる；（ｂ）ウイルスキャプシド由来のウイルスRNAの放出又はHCV遺伝子産物の機能を阻害する化合物。ＩＲＥＳの阻害薬、プロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ）阻害薬、ヘリカーゼ阻害薬及びウイルスポリメラーゼ／レプリカーゼの阻害薬が挙げられる；（ｃ）ウイルスの複製に含まれる細胞機能又は感染能力を混乱させる化合物。イノシン１リン酸デヒドロゲナーゼ阻害薬（例えば、リバビリン、ミコフェノール酸及びＶＸ４９７）及び、ＤＮＪ及びその誘導体の様な糖タンパク質プロセッシングの阻害薬が挙げられる；（ｄ）免疫機能を変更させる化合物（例えば、チモシンアルファ及びインターフェロン、例えば、α−及びβインターフェロン）及び（ｅ）HCV感染症の症状及び効力を調節する化合物（例えば、フラビノイドの様な耐酸化剤）との組合せを含む組成物を提供する。
【００２９】
更に、本発明は、特許請求の範囲で定義されたカスタノスペルミンエステルと、しばしば見出される同時感染症（例えば、B型肝炎ウイルスとヒト・レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルスのタイプ１と２及びヒトＴ−細胞リンパ増殖性ウイルスのタイプ１及び２）の治療で使用される化合物との組合せを含む組成物を提供する。その様な化合物の例としては、ヌクレオチドRT阻害薬（例えば、ラミブジン（３ＴＣ）、ジドブジン、スタブジン、ジダノシンアデフォビルジピボキシル及びアバカビル）、非ヌクレオチドRT阻害薬（例えば、ネビラピン）及びプロテアーゼ阻害薬（例えば、サキナビル、インジナビル及びリトナビル）が挙げられる。
上述の補助治療薬は、本発明のカスタノスペルミンエステルと一緒に投与する事ができる。或いは、カスタノスペルミンエステルと補助治療薬を順番に投与する事もできる。
好ましくは、インターフェロンはインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）であるが、その他のインターフェロンが使用されても良い（例えば、クローンヒトインターフェロン遺伝子の発現によって産生されたインターフェロン）。
上述の組成物は、任意に、更に、薬理学的に受容可能な賦形剤を含む。この様に、本発明は、又、上述の組成物を含む薬理学的組成物に係る発明である。
【００３０】
本発明の組成物は、治療又は予防、例えば、ここに開示される任意の治療又は予防法での使用が好ましい。
その他の観点では、本発明は、特許請求の範囲で定義されるカスタノスペルミンエステルと、上述の（ａ）HCVの結合及び／又はHCVによる細胞の感染を阻害する化合物；（ｂ）ウイルスキャプシド由来のウイルスRNAの放出又はHCV遺伝子産物の機能を阻害する化合物；（ｃ）ウイルスの複製に含まれる細胞機能又は感染能力を混乱させる化合物；（ｄ）免疫機能を変更させる化合物及び（ｅ）HCV感染症の症状及び効力を調節する化合物との組合せを含む部品の薬理学的キットを提供する。
又、このキットは、更に、フラビウイルス症（例えば、ここに開示されるフラビウイルス症）の治療で使用する為のインストラクションを含む。
カスタノスペルミンエステル及び補助治療薬は、単一投与量形態で同時充填されても良い。
本発明の組成物において、カスタノスペルミンエステル及び補助治療薬は、相補的或いは相乗的形態で作用しても良い。
【００３１】
本発明のカスタノスペルミンエステルと、HCV感染症の治療では相乗的形態で作用するインターフェロンの両方を含む組成物及び方法が特に好ましい。
前述の薬理学的組成物においては、本発明の組成物又はカスタノスペルミンエステルは単一投与量形態で存在しても良い。
この様に、又、本発明は、カスタノスペルミンエステルと補助治療薬が単一投与量形態にある上述定義のキットに係る発明である。
ここで使用される「フラビウイルス」と言う用語は、フラビ・ウイルス科の任意のメンバーを包含する事を意味する。
「薬理学的に受容可能な塩」と言う表現は、基体化合物の任意の非毒性有機又は無機酸の付加塩を意味する。
適当な塩を形成する無機酸の例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、及びリン酸及びナトリウム一水和物オルトリン酸塩及びカリウム水素硫酸塩が挙げられる。適当な塩を形成する有機酸の例としては、モノ、ジ及びトリカルボン酸が挙げられる。その様な酸の例としては、例えば、酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸及び２−フェノキシ安息香酸が挙げられる。適当な塩を形成するその他の有機酸は、メタンスルホン酸及び２−ヒドロキシエタンスルホン酸の様なスルホン酸である。
これらの塩及び基体化合物は水和形態或いは実質的に無水の形態で存在できる。酸塩は、水性溶液又は水性−アルコール溶液或いは適当な酸を含むその他の適当な溶媒に遊離の塩基を溶解し、溶液を蒸発させて単離するか、又は、塩が直接に分離するか又は溶液の濃縮によって得る事のできるいずれかの場合において、遊離の塩基を有機溶媒で反応させる様な一般的な方法によって調製される。
【００３２】
一般的に、本発明の化合物の酸付加塩は結晶物質であり、水中及び様々な親水性有機溶媒中で安定であり、それらの遊離形態と比較して、高い融点と増加した溶解性を示す。
「薬理学的に受容可能な誘導体」と言う表現は、加水分解及び増加した親油性に対して大きな抵抗性を有するエステルのプロドラッグを包含する事を意味する。その様なプロドラッグは、経口的に送達される時は、目標部位（例えば、肝臓）における活性薬剤の濃度を持続する「デポー効果」(depot effect)を与えながら胃腸管からの急速な移動を示す。
上述の１〜１４個の炭素原子のアルカノイル基は、直鎖又は分岐鎖又は環状である事ができ、例として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、シクロプロパンカルボニル、ヘキサノイル、オクタノイル及びデカノイルを挙げることができる。
上述の１〜１４個の炭素原子のアルケノイル基は、直鎖又は分岐鎖又は環状である事ができるが、少なくとも一個の炭素−炭素二重結合を有する。例としては、プロペノイル、ブテノイル、イソブテノイル、ヘキセノイル、オクテノイル及びデセノイルが挙げられる。
上述の１〜６個の炭素原子のアルコキシアセチル基は、メトキシアセチル、エトキシアセチル及びブトキシアセチルである事ができる。
【００３３】
上述のハロゲンの例としては、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を挙げることができる。
上述の２〜６個の炭素原子のアルカノイル基は、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル及びヘキサノイルである事ができる。
単独で又はアルコキシ基の一部としての上述の１〜４個の炭素原子のアルキル基、アルキルスルホニル又はアルキルメルカプト基は、４個までの炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基である事ができる。様々なその様な基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、ブトキシ、メチルスルホニル、エチルスルホニルメチルメルカプト及びエチルメルカプトが挙げられる。
上述のフェニル（２〜６個の炭素原子のアルカノイル）基はベンゼンアセチル及びベンゼンプロピオニルである事ができる。
上述の様々なナフタレンカルボニル、ピリジンカルボニル、チオフェンカルボニル及びフランカルボニル基の例としては、様々な位置の異性体が挙げられ、それらは、ナフタレン−１−カルボニル、ナフタレン−２−カルボニル、ニコチノイル、イソニコチノイル、Ｎ−メチル−ジヒドロ−ピリジン−３−カルボニル、チオフェン−２−カルボニル、チオフェン−３−カルボニル、フラン−２−カルボニル及びフラン−３−カルボニルである事ができる。
【００３４】
ナフタレン、ピリジン、チオフェン及びフラン基は、任意に、更に、上で示した様に置換できる。
本発明の好ましい化合物は、Ｒ、Ｒ1及びＲ2が、１又は２個のアルカノイル、アルケノイル、又は、上述のＹ、Ｙ′及びＹ″で置換されているベンゾイルを持つベンゾイル基、特に、１〜４個の炭素原子のアルカノイル又は、任意にアルキル又はハロゲンで置換されているベンゾイルである化合物である。
更に好ましい化合物は、Ｒ、Ｒ1及びＲ2の一種が、アルカノイル又はベンゾイル、特に、１〜８個の炭素原子のアルカノイル、１〜８個の炭素原子のアルケノイル、又は、アルキル又はハロゲンで任意に置換されているベンゾイルであり、その外が水素である式１の化合物である。
尚更に好ましい化合物は、Ｒ、Ｒ1及びＲ2の一種が、１〜８個の炭素原子のアルカノイル、１〜８個の炭素原子のアルケノイル、又は、アルキル又はハロゲン、特にメチル、臭素、塩素又はフッ素基で任意に置換されているベンゾイルであり、その外が水素である式１の化合物である。
【００３５】
最も好ましい化合物は、Ｒ1が１〜８個の炭素原子のアルカノイル、１〜８個の炭素原子のアルケノイル、又は、アルキル又はハロゲン、特にメチル、臭素、塩素又はフッ素基で、更にパラ位置においてメチル、臭素、塩素又はフッ素基で任意に置換されているベンゾイルであり、Ｒ及びＲ2がそれぞれ水素である式１の化合物である。
本発明のエステルは、不活性溶媒中でカスタノスペルミンと適当な酸塩化物又は無水物との反応によって調製される。ハロゲン化物は塩化物又は臭化物である事ができ、無水物としては混合無水物が挙げられる。使用される酸ハロゲン化物又は無水物の相対量、溶媒の相対量、温度及び反応時間は、全て、アクリル化される水酸基の数を最小にする様に調節される。この様に、酸誘導体の限定された過剰分だけが使用され、これはアクリル化剤の約３倍の過剰分までを意味する。
相対的に多量のの溶媒の使用は、反応剤の希釈に役立ち、形成する高いアクリル化生成物の量を抑制する。使用される溶媒は、好ましくは使用される反応剤をそれらと反応せずに溶解する溶媒である。
更に、反応過程において形成される酸と反応して除去する第三級アミンの存在下で反応を行う事が好ましい。第三級アミンは混合物に添加する事もできれば、それ自身過剰に使用して溶媒として役立たせることができる。これに関してはピリジンが好ましい溶媒である。上で示した様に、時間と温度は生起するアクリル化の量を制限する為に同様に調節される。
【００３６】
好ましくは、反応は、モノエステルを得る為には約１６時間、若し、ジエステルを必要とする場合は更に長時間、例えば７日の反応時間で、氷浴中で冷却しながら行われる。反応は、実際には高温で行う事ができ、含まれる様々な要因が適切に調節される限り加熱も使用できる。
反応が開示された様に行われる場合、最終の反応混合物は、未だかなりの量の未反応カスタノスペルミンを含む。この未反応物質は反応混合物から回収されて次の反応に再循環する事ができるので、エステルへ転化されるカスタノスペルミンの全体量を増加させる事ができる。この再循環は、特に、反応が、モノエステルの単離がし易い条件下で行われる時に重要である。
上述の方法は、一般的に、６−又は７−モノエステル又は６，７−又は６，８−ジエステルを与える。その他の異性体は保護基の適当な使用によって得る事ができる。従って、例えば、カスタノスペルミンは２−（ジブロモメチル）ベンゾイルクロライドと反応して６，７−ジエステルを与える事ができる。このジエステルは、次いで、適当な酸塩化物又は無水物と反応して相当する８−エステルを与える。二つの保護基は、次いで、二つのジブロモメチル基をホルミル基に転化し（水性アセトン中で、過塩素酸銀と２，４，６−コリジンを使用して）、次いで、モルホリンと水酸化物イオンを使用して得られるホルミル安息香酸の加水分解によって容易に除去される。
【００３７】
表示の方法は、同様の方法でジエステル異性体を与えるのに使用できる。
通常のエステル化方法において、１，８−Ｏ−イソプロピリデンカスタノスペルミン又は１，８−シクロヘキシリデンカスタノスペルミンと酸塩化物との反応は、殆ど独占的に６−エステルの形成である。イソプロピリデン又はシクロヘキシリデン基は、次いで、４−トルエンスルホン酸の様な酸での処理によって除去される。出発物質のケタール化合物はカスタノスペルミン６，７−ジベンゾエートを形成する。このジベンゾエートは２−メトキシプロペン又は１−メトキシシクロヘキセン及び酸と反応して１，８−Ｏ−イソプロピリデン又は１，８−Ｏ−シクロヘキシリデン基を導入し、この二つのベンゾエートエステルは、水酸化ナトリウムの様な塩基での加水分解により、或いは、触媒としてナトリウム又はカリウムアルコキシドを使用するエステル転移反応によって除去される。
【００３８】
医療用途
本発明は、医学、例えば、治療及び／又は予防法での用途を見出す。この方法は獣医学用途も含む。
ここで使用される「フラビウイルス感染症の治療法」と言う用語は、フラビウイルスに感染している患者（人間又は動物）の治療を意味する。この治療法は、本発明の組成物又は薬剤の抗ウイルス性有効量を前記患者に投与する事を含む。
ここで使用される「フラビウイルス感染症」と言う用語は、細胞又は前記患者の体に存在するフラビウイルスを含む（例えば、フラビウイルスに原因する、悪化する或いは特徴付けられる）状態又は条件を意味する。
ここで使用される「患者」と言う用語は、人間、ヒツジ、馬、ウシ、豚、犬、猫、ネズミ及びマウスを含めた霊長類の様な哺乳類を意味するのに使われる。
【００３９】
薬量学
本発明で使用される薬剤は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣及び局所（口腔及び舌下を含む）投与を含めて、経口又は非経口ルートで投与する事ができる。
投与されるカスタノスペルミンエステルの量は、使用される特定の投与量単位、治療期間、治療を受ける患者の年齢及び性別、治療される疾病の性質及び範囲、及び選択される特定のカスタノスペルミンエステルによって広範囲に変える事ができる。
更に、カスタノスペルミンエステルは、フラビウイルス感染症（上述の）の治療で使用される公知のその他の薬剤と一緒に使用する事ができ、その様な実施態様においては、投与量はそれに応じて調整されても良い。
【００４０】
加水分解と増加した親油性に対して大きな抵抗性を示す本発明のカスタノスペルミンエステルプロドラッグ誘導体を導入する実施態様では少ない投与量が使用されても良い。上で説明した様に、その様なプロドラッグは、経口的に送達される時は、目標部位（例えば、肝臓）における活性薬剤の濃度を持続する「デポー効果」(depot effect)を与えながら胃腸管からの急速な移動を示す。
この様に、投与されるカスタノスペルミンエステルの有効量は、一般的に、約１５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲である。単一投与量は２５〜５００ｍｇのカスタノスペルミンエステルを含んでも良く、１日当り１回以上投与できる。カスタノスペルミンエステルは、以下に述べる様に、経口、非経口又は局所的に、通常の投与量の単一形態を使用して薬理学的キャリヤーと一緒に投与する事ができる。
投与の好ましいルートは経口投与である。一般的に、適当な投与量は、１日当り受容者の体重の１ｋｇ当り０．１〜３００ｍｇの範囲、好ましくは、１日当り体重の１ｋｇ当り６〜１５０ｍｇの範囲、最も好ましくは、１日当り体重の１ｋｇ当り１５〜１００ｍｇの範囲である。
【００４１】
望ましい投与量は、好ましくは、１日を通して適当な間隔で投与される２、３、４、５又は６或いはそれ以上の補助投与量として与えられる。これらの補助投与量は、単一投与量形態で、例えば、単一投与量形態当り活性成分の１０〜１５００ｍｇ、好ましくは２０〜１０００ｍｇ、最も好ましくは５０〜７００ｍｇを含む単一投与量形態で投与されても良い。
製剤
本発明の組成物は、薬理学的に受容可能な賦形剤と組合せて用意されても良い。例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香料添加剤、着色剤及び保存剤を含めて、適当な賦形剤が使用されても良い。適当な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム及びラクトースが挙げられるが、コーンスターチ及びアルギン酸は適当な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンが挙げられるが、潤滑剤は、若し存在する場合は、一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。
薬理学的組成物は適当な形態であっても良く、例えば、錠剤、エリキシル、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、顆粒及びエアロゾルが挙げられる。
薬理学的組成物は部品のキットの形態を取っても良く、キットは、単一投与量形態において、使用の為のインストラクション及び／又は複数の異なる成分と一緒に本発明の組成物を含んでも良い。
【００４２】
経口使用の為の錠剤は、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香料添加剤、着色剤及び保存剤の様な薬理学的に受容可能な賦形剤と混合された活性成分を含んでも良い。適当な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム及びラクトースが挙げられるが、コーンスターチ及びアルギン酸は適当な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンが挙げられるが、潤滑剤は、若し存在する場合は、一般的に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。必要であれば、錠剤をグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートの様な物質で被覆して胃腸管での吸収を遅らせても良い。
経口使用の為のカプセルとしては、カプセル中で活性成分が固体希釈剤と混合される硬質ゼラチンカプセル及び、カプセル中で活性成分が水又は、落花生油、液体パラフィン或いはオリーブ油の様な油と混合される軟質ゼラチンカプセルが挙げられる。
直腸内投与の為の製剤は、例えば、ココアバター又はサリシレートを含む適当なベースを持つ坐薬として与えられても良い。
【００４３】
膣投与の為の適当な製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又は、活性成分に加えて、当該技術分野において適当なものとして知られているキャリヤーを含むスプレー製剤として与えられても良い。
筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内使用の為には、本発明の化合物は一般的に、適当なｐＨと等張性に緩衝された無菌水溶液又は懸濁液で与えられる。
適当な水性ビヒクルとしては、リンガー溶液及び等張食塩水が挙げられる。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン及びトラガカントゴムの様な懸濁剤及び、レシチンの様な湿潤剤を含んでも良い。水性懸濁液用の適当な保存剤としては、エチル及びｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートが挙げられる。
【００４４】
又、本発明の化合物はリポソーム製剤として与えられても良い。
経口投与の為には、カスタノスペルミンエステルは、固体又は液体製剤、例えば、カプセル、ピル、錠剤、トローチ、トローチ剤、メルト、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、分散液又はエマルションとする事ができる（溶液、懸濁液、分散液又はエマルションは水性又は非水性であっても良い）。固体の単一投与量形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤及び、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチの様な充填剤を含む硬質又は軟質殻化ゼラチンタイプのカプセルである事ができる。
その他の実施態様では、本発明の化合物は、通常の錠剤ベース、例えば、ラクトース、スクロース及びコーンスターチを、結合剤、例えば、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン、投与後の錠剤の崩壊と溶解を手助けする為の崩壊剤、例えば、ポテトデンプン、アルギン酸、コーンスターチ及びガーゴム、錠剤顆粒の流動を改善し且つ錠剤金型及びポンチの表面への錠剤材料の接着を防ぐ為の潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、染料、着色剤、錠剤の審美性を高め且つ患者がより受け入れ易くする為の香料添加剤と組合せて錠剤化する事ができる。
【００４５】
経口液体投与量形態で使用する為の適当な賦形剤としては、薬理学的に受容可能な界面活性剤、懸濁剤又は乳化剤を添加した或いは添加しない、水及びアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールの様なアルコールの様な希釈剤が挙げられる。
本発明のカスタノスペルミンエステル誘導体は、又、非経口的に、即ち、皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内投与されても良い。
その様な実施態様においては、薬剤は、無菌液体又は液体混合物である薬理学的キャリヤーを伴う生理学的希釈剤中の化合物の注射用投与量として用意される。適当な液体としては、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール又はヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール）、グリセロールケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル（例えば、ポリ（エチレン−グリコール）４００）、油、脂肪酸、脂肪酸エステル又はグリセリド又はアセチル化脂肪酸グリセリドが挙げられ、薬理学的に受容可能な界面活性剤（例えば、石鹸又は洗浄剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルホーマー(carhomer)、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロース）、又は乳化剤及びその他の薬理学的アジュバントが添加されてもされなくても良い。
【００４６】
本発明の非経口製剤で使用できる油の例としては、石油、動物、植物又は合成油、例えば、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ペトロラタム及び鉱油が挙げられる。
適当な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。適当な脂肪酸エステルとしては、例えば、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。
適当な石鹸としては、脂肪アルカリ金属、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩が挙げられる、適当な洗浄剤としてはカチオン性洗浄剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライド及びアルキルアミンアセテート；アニオン性洗浄剤、例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリドスルフェート及びスルホスクシネート；非イオン性洗浄剤、例えば、脂肪族アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレン−ポリプロピレンコポリマー；及び両性洗浄剤、例えば、アルキル−β−アミノプロピオネート及び２−アルキルイミダゾリン第四級アンモニウム塩及びそれらの混合物が挙げられる。
【００４７】
本発明の非経口組成物は、一般的に、溶液中に、式１のカスタノスペルミンエステル誘導体を約０．５質量％〜約２５質量％含む。又、保存剤及び緩衝剤は有利に使用されても良い。注射の場所の刺激を最小にする又は無くする為に、その様な組成物は、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤を含んでも良い。その様な製剤中の界面活性剤の量は約５質量％〜約１５質量％の範囲である。界面活性剤は上記のＨＬＢを有する単独成分である事もできるし、所望のＨＬＢを有する二種以上の成分の混合物であることもできる。経口製剤で使用される界面活性剤の例としては、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルのクラス、例えば、ソルビタンモノオレエート及び、エチレンオキシドと、プロピレンオキシドとプロピレングリコールの縮合によって形成される疎水性塩基との高分子量付加物が挙げられる。
又、本発明のカスタノスペルミンエステル誘導体は、局所投与しても良く、その場合は、キャリヤーは、溶液、軟膏又はゲルベースを適当に含んでも良い。このベースは、例えば、一種以上の次のものを含んでも良い：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水及びアルコールの様な希釈剤及び乳化剤並びに安定剤。局所製剤はカスタノスペルミンエステル又はその薬理学的塩を約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（単位容量当りの質量）の濃度で含んでも良い。
【００４８】
本発明は以下の例示的実施態様によって説明されるが、これは全く例示であって決して限定を意図するものではない。本発明の範囲内にある内容についての変更が行われても良い事は理解されるであろう。
【実施例１】
【００４９】
細胞、ウイルス及び阻害薬
ウシの腎臓由来のＭＤＢＫ細胞（ＮＢＬ−１）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２２）及び細胞壊死性（ｃｐ）ＢＶＤＶ（ＮＡＤＬ株）ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３４）は、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から入手した。
ＭＤＢＫ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたダルベッコ変性イーグル媒体（ＤＭＥＭ）（Sigma, Poole, Dorset)中に維持された。
【００５０】
６−０−ブタノイルカスタノスペルミン(ブカスト; Celgosivir; VIR-222; MDL 28,574A)が前述の様にして合成され(Liu, P.S., Hoekstra, W.J. and King, C.H.R. (1990). Synthesis of potent anti-HIV agents: esters of castanospermine. Tetrahedron Lett. 31: 1535-1549)、アベンティス(Aventis)（以前はMarion Merrel Dowとして知られている）によって提供された。カスタノスペルミン（１Ｓ、６Ｓ、７Ｒ、８Ｒ、８ａＲ−１，６，７，８テトラヒドロキシインドリジジン）は、前述の様に、モートン湾チェスナットの種子、カスタノスペルマムアウストラレ(Castanospermum australe)から単離され(Lui, P.S. and Rhinehart, B.L. (1986). Isolation of castanospermine and its use as an anti-diabetic agent. ヨーロッパ特許第２０２６６１号）、アベンティスから入手した。Ｎ−ブチル−デオキシノジリマイシン（Ｎブチル−ＤＮＪ）及びＮ−ノニル−デオキシノジリマイシン（ＮＮ−ＤＮＪ）は、トロントレサーチケミカルス（Toronto Research Chemicals(Canada)）から購入され、ブカスト、カスタノスペルミン及びＮ−ブチル−ＤＮＪは水中の１００ｍＭ原液として製造されている。ＮＮ−ＤＮＪはＤＭＳＯの１００ｍＭ原液として製造されている。原液は−２０℃で貯蔵された。
【００５１】
プラーク減少アッセイ
ＭＤＢＫ細胞は、６−ウェル細胞培養プレート(Nunclo, Nunc, Denmark)中に播種され、
集密に増殖させた。この細胞は、温リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄され、次いで、１％のウマ血清と１ｍＭＭｇＣｌ2を含む０．２５ｍｌＰＢＳ中でＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ（１５０ｐｆｕ／ウエル）で感染させられた。細胞培養プレートは、次いで、３７℃で１時間、５％ＣＯ2で培養され、プレートは１５〜２０分毎に振動が加えられた。次いで、ウイルスの種菌は除去され、５％ウシ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補充された、異なる濃度のテスト化合物を含む或いは含まないＤＭＥＭ中で希釈された５％低ゲル化温度アガロースの上層の３．０ｍｌで置換えられた。少なくとも二通り又は三通りのウエルが、それぞれの濃度のテスト化合物の為に使用された。アガロースは室温で１５分間で固化され、次いで、３７℃で５％ＣＯ2で培養された。３日の培養後に、寒天の上層に１０％ホルムアルデヒド溶液の１．５ｍｌを添加して細胞を固定し一夜放置した。寒天をウエルから静かに除去し、細胞は、ＰＢＳ中の０．３％メチレンブルーで１０分間、室温で染色された。過剰のステインは除去され、細胞は、プレートの乾燥及びウイルスプラークを顕微鏡で数える前にＰＢＳで洗浄された。用量応答線は、存在するプラークの平均数対化合物の濃度の対数からプロットされた。５０％阻害濃度(IC50)は、線形回帰分析後にコンピュータで計算された。
【００５２】
ＸＴＴ細胞壊死性アッセイ
ＭＤＢＫ細胞は、９６−ウェル細胞培養プレート(Costar（登録商標） 3596, Corning Incorp., USA)中に播種され、集密に増殖させた。この細胞は、温リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄され、次いで、５％のウマ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭの１００μｌ中でＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ（１００ｐｆｕ／ウエル）で感染させられた。幾つかのウエルは、対照として行動させる為に模擬感染された。更に、異なる濃度のテスト化合物を含む又は含まない、上述の様に補充されたＤＭＥＭの１００μｌがそれぞれのウエルに添加された。三通りのウエルが、それぞれの化合物濃度の為に使用された。平行して、非感染細胞が、細胞壊死性を評価する為に化合物で処理された。次いで、プレートは、３７℃で５％ＣＯ2で培養された。６日後に、２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）の１ｍｇ／ｍｌの２５μｌ／２５μＭフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液（ＸＴＴ及びＰＭＳはSigma, Poole, Dorset, UKから購入した)がそれぞれのウエルに添加され、プレートは、２時間、３７℃で５％ＣＯ2で培養された。次いで、４５０ｎｍにおける吸収が決定された。データは、Ｏ．Ｄ対化合物の濃度の対数としてプロットされ、５０％阻害濃度(IC50)がコンピュータで計算された。
【００５３】
抗ウイルス活性
ＭＤＢＫ細胞におけるプラーク減少アッセイを使用した結果、カスタノスペルミンとブカストは共に、薬物依存法においてＢＶＤＶの形成を阻害した（図１参照）。ブカストは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する活性に関して以前に記録された様に、カスタノスペルミンよりも凡そ１３倍も強力であった。ブカストの平均IC50は、カスタノスペルミンの平均IC50の２１６．６μＭ±５５．０μＭに比べて、１６．２５μＭ±７．５μＭであった（表２）。
【００５４】
表２
プラーク減少アッセイで決定されたα−グルコシダーゼの抗ＢＶＤＶ活性
2005290015.tif 000006
【００５５】
細胞単層の顕微鏡試験で判定された様に、１０００μＭまでの濃度では細胞毒性の徴候は存在しない。平行のプラーク減少実験では、α−グルコシダーゼＩ阻害薬のＮ−ブチル−ＤＮＪとＮ−ノニル−ＤＮＪは、それぞれ、＞１００μＭと＞３００μＭの濃度で部分的な阻害を示しただけであった。Ｎ−ノニル−ＤＮＪは、３００μＭの濃度では細胞に対して明らかに細胞毒性であった。
同様の結果は、ＸＴＴの細胞壊死性アッセイが、平行して、抗ＢＶＤＶ効果及びα−グルコシダーゼ阻害薬の細胞毒性の決定の為に使用された時に得られた。図２で示される通り、ブカストとカスタノスペルミンは共にウイルスで誘発される細胞死に対してＭＤＢＫ細胞を保護し、非感染処理された細胞に対して細胞毒性を示さなかった。同じ実験では、Ｎ−ブチル−ＤＮＪもＮ−ノニル−ＤＮＪも、ＢＶＤＶの細胞壊死性効果に対して何らの保護も示さなかった。プラーク減少実験で先に観察された様に、Ｎ−ブチル−ＤＮＪは細胞毒性を示さなかったが、Ｎ−ノニル−ＤＮＪはＭＤＢＫ細部に対して明らかに細胞毒性であった。Ｎ−ノニル−ＤＮＪの計算された５０％細胞毒性濃度は１２０μＭであった。凡そ０．０１の感染効率（ＭＯＩ）を使用すると、この細胞壊死性アッセイにおけるブカストとカスタノスペルミンの平均ＩＣ50値は、それぞれ、３６μＭ±２２μＭと４００μＭであった（表３）。
【００５６】
表３
ＸＴＴ細胞壊死性アッセイで決定されたα−グルコシダーゼＩ阻害薬の抗ＢＶＤＶ活性及び細胞毒性
2005290015.tif 000007
*ＭＯＩ＝０．０１．
【００５７】
一つの実験では、Ｎ−ノニル−ＤＮＪは幾分抗ウイルス活性を示したが、選択指数は２倍に過ぎなかった。
ブカストの抗ＢＶＤＶ活性におけるウイルスＭＯＩの効果の研究は、感染ウイルス：細胞数の低い比が使用される時に一層強力であったことを示した（図３及び表４参照）。
【００５８】
表４
ＸＴＴ細胞壊死性アッセイで決定された異なる感染効率でのブカストとＮ−ブチル−ＤＮＪの抗ＢＶＤＶ活性
2005290015.tif 000008
【００５９】
幾らかの抗ウイルス効果は、非常に低いＭＯＩが使用される時にＮ−ブチル−ＤＮＪで得る事ができるが、この阻害薬はブカストより１０倍も低い効き目であった。
ＸＴＴ細胞壊死性アッセイは、ＭＤＢＫ細胞上のＢＶＤＶの細胞壊死性効果を阻害する、ヒト白血球インターフェロン（インターフェロンα）の能力をアッセイする為に使用され、１ウエル当りの１．３インターフェロン抵抗子（ＩＲＵ）のＩＣ50値が証明された。更なる実験は、インターフェロンαのＩＣ50値が、ブカストとインターフェロンαとの組合せでは減少した事を証明した。ブカストのＩＣ50値も又、この組合せを使用して減少した。組合せ指数(combination index)（ＣＩ）はスーネル(Suhnel)(Antivial Trsearch, 13, 23-40)の式を使用して計算された。１未満のＣＩ値は相乗作用を示し、０．８未満の値は統計的に有意の結果を示すものと考えられる。インターフェロンαとブカストの組合せは０．２８〜０．４６の範囲のＣＩ値を与えた。これらの結果は、従って、ブカストがインターフェロンαの存在下で使用される時は相乗効果を示す。
これらのデータは表５に纏められる。
【００６０】
表５
ＸＴＴにより決定されたインターフェロンαとの組合せにおけるブカストの抗ＢＶＤＶ活性
2005290015.tif 000009
【００６１】
均等性
前述の記述は、本発明の現に好ましい実施態様を詳述するものである。それらについての多くの変更および変化は、これらの記述を考慮した当業者の心の中に起きる事が予想される。それらの変更及び変化はここに添付された特許請求の範囲内に包含されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＭＤＢＫ細胞におけるプラーク減少アッセイによるブカストとカスタノスペルミンの抗ＢＶＤＶ活性の比較を示す。
【図２】ＸＴＴ細胞壊死性アッセイにより決定されたα−グルコシダーゼＩ阻害薬の抗ＢＶＤＶ活性と細胞毒性を示す。
【図３】ＸＴＴ細胞壊死性アッセイにより決定された、異なる感染効率でのブカスト及びＮ−ブチル−ＤＮＪの抗ＢＶＤＶ活性を示す。
【図１】
2005290015.tif 000013
【図２】
2005290015.tif 000014
【図３】
2005290015.tif 000015