(57)【要約】【課題】  真菌感染症の予防及び／又は治療のために有用な物質及び医薬を提供する。【解決手段】  下記の式（Ｉ）：【化１】2005145875.tif 000010で表される化合物又はその塩、及び該化合物又はその塩を有効成分として含む真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）：
【化１】
2005145875.tif 000008
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
下記の式（II）：
【化２】
2005145875.tif 000009
で表される化合物又はその塩。
【請求項３】
真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬であって、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩を有効成分として含む医薬。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の化合物又はその塩の製造方法であって、ノカルジア属に属する上記化合物の産生菌を培養し、得られた培養物から上記化合物又はその塩を分離・採取する工程を含む方法。
【請求項５】
上記産生菌がノカルジア・トランスバレンシスである請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗真菌作用を有する新規化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
深在性真菌症の発生頻度は易感染患者の増加とともに、ますます増加する傾向にあり、有効な治療薬が望まれている。現在、国内で上市されている深在性真菌症治療薬はわずか６剤のみであり、このうち３剤はアゾール系薬剤(ミコナゾール,フルコナゾール,イトラコナゾール)である。その代表であるフルコナゾールは作用が静菌的であることに加え、使用量の増加とともに耐性菌の出現も懸念されている。一方、殺菌効果の高いポリエン系抗生物質であるアムホテリシンＢは毒性も強く、必ずしも安全に使用できる薬剤ではない。これらの理由から、深在性真菌感染症での医療満足度は総じて低く、殺菌的かつ真菌選択的な新規薬剤への需要は依然として大きい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用な抗真菌性化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ノカルジア属に属する微生物の培養物に下記の式で表される新規な亜鉛キレート化合物が含まれており、この化合物が各種の真菌に対して強い抗菌力を有することを見出した。従来、抗真菌作用を有する亜鉛キレート化合物は全く知られておらず、この化合物は極めて特異的な構造と作用を有する化合物である。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００５】
すなわち、本発明により、下記の式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
2005145875.tif 000002
で表される化合物又はその塩が提供される。好ましい態様によれば、下記の式（II）：
【０００７】
【化２】
2005145875.tif 000003
で表される化合物又はその塩が提供される（式中の立体標記は絶対配置である）。
【０００８】
また、別の観点からは、真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬であって、上記の式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はその塩を有効成分として含む医薬が本発明により提供される。また、上記の医薬の製造のための上記の式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はその塩の使用；及び真菌感染症の予防及び／又は治療方法であって、上記の式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物又はその塩の予防及び／又は治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【０００９】
さらに別の観点からは、上記の式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、ノカルジア属に属する上記の式（Ｉ）で表される化合物の産生菌を培養し、得られた培養物から上記化合物を分離・採取する工程を含む方法が提供される。ノカルジア属に属する上記の式（Ｉ）で表される化合物の産生菌としては、ノカルジア・トランスバレンシスを用いることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、抗真菌作用を有する新規な化合物又はその塩が提供され、この化合物又はその塩を有効成分として含む医薬は、真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の化合物は上記の式（Ｉ）で表される化合物である。この化合物の任意の光学活性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体も本発明の範囲に包含される。純粋な形態の立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物やラセミ体なども本発明の範囲に包含される。本発明の化合物は塩の形態で存在する場合もあり、遊離形態の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。塩の種類は特に限定されないが、例えば塩酸塩などの鉱酸類の酸付加塩を形成する場合がある。本発明の化合物のうち、式（II）で表される化合物が好ましい。
【００１２】
本発明の化合物は、ノカルジア属に属する本発明の化合物の産生菌を培養することにより容易に製造することができる。また、合成的に、あるいは微生物の培養物から得られる化合物を製造中間体として用いることにより半合成的に本発明の化合物を製造することもできる。ノカルジア属に属する微生物としては、本発明の化合物の産生能力を有する微生物であれば特に種類は限定されないが、例えば、例えば、ノカルジア・トランスバレンシス(Nocardia transvalensis)などを好適に用いることができる。ノカルジア・トランスバレンシスとしては、例えば、ノカルジア・トランスバレンシス IMF10065株を用いることができる。
【００１３】
ノカルジア・トランスバレンシスIMF10065株は臨床材料より分離された菌株であり、平成15年11月4日付けで独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（日本国埼玉県和光市広沢２番１号）にJCM12242として寄託されており、出願人は本菌株の保存及び分譲を保証している。なお、本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１）に寄託することができない微生物に該当している。
【００１４】
ノカルジア・トランスバレンシス IMF10065株は以下の形態学的特徴を有する。本菌株を0.2％グルコースを含むミューラーヒントン寒天培地で培養した時、アクチノミセーテス（Actinomycetes）の一種に見られる様な、分岐した長い菌糸と、気中菌糸体を有している。培養を長くすることによって、気中菌糸の先端に数個の胞子が観察され、さらに栄養菌糸の断裂が観察された。栄養菌糸の断裂が観察されたことからも形態学的にはノカルジア属に属するものと推定された。
【００１５】
また、本菌株を2％グルコースを含むブレイン・ハート・インフュージョン液体培地中で、250rpm，30℃，72時間振とう培養後、生育した菌体をホルマリン殺菌し遠心分離（3000rpm×10分）で集め，蒸留水により2回洗浄し、次いで真空凍結乾燥により乾燥菌体とし、細胞壁成分（ジアミノピメリン酸、細胞壁構成、脂質組成）をBergey's manual of Determinative Bacteriology 9th ed, Williams & Willkins, Baltimore, 1993 に基づき分析したところ、アミノ酸分析結果によりメソ−ジアミノピメリン酸(meso-DAP)、糖分析結果よりアラビノース，ガラクトースが検出された。また、脂質の分析結果から、細胞壁脂質成分としてミコール酸の存在が確認され、そのタイプは、Nocardia Type（Rhodococcusを含む）であった。電子伝達系の成分であるイソプレノイド・キノンは主たる成分としてMK-8（H4，cycle）であることが明らかとなり、本菌株がノカルジア属に属する微生物であることが確認された。また、本菌株からゲノムDNAを抽出して16SｒDNAの配列の決定を行い、さらに相同性比較を行うことにより、16SｒDNA塩基配列に基づく系統解析(放線菌の同定実験法，日本放線菌研究会編，1985)を行ったところ、ノカルジア・トランスバレンシスに属することが確認された。
【００１６】
また、本菌株は下記の表１に示す生理生化学的性質を有していた。これらの結果から判断して、本菌株をノカルジア・トランスバレンシスと同定した。
【００１７】
【表１】
2005145875.tif 000004
ノカルジア属に属する本発明の化合物の産生菌を培養することにより、培養物中に本発明の化合物が蓄積されるので、培養物から容易に本発明の化合物を分離・採取することができる。上記の培養に用いる培地の種類は特に限定されず、炭素源、窒素源、及び無機塩などを適宜の割合で含有するものであれば合成培地又は天然培地のいずれでも好適に用いることができる。必要に応じて、ビタミン類又はその他栄養物質を適宜加えてもよい。
【００１８】
炭素源としては、例えば、グルコース、マルトース、フラクトース、シュークロース、デンプン等の糖類、グリセロール、マンニトール等のアルコール類、グリシン、アラニン、アスパラギン等のアミノ酸類、大豆油、又はオリーブ油等の油脂類等の一般的な炭素源を１種又は２種以上用いることができる。窒素源としては、例えば、大豆粉、コーンスチープリカー、ビーフエキス、ペプトン、酵母エキス、アミノ酸混合物、又は魚粉等の有機含窒素化合物、あるいはアンモニウム塩、硝酸塩等の無機窒素化合物など１種又は２種以上用いることができる。無機塩としては、例えば、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化コバルト、各種リン酸塩を必要に応じて添加すればよい。また、消泡剤、例えば植物脂、ポリプロピレンアルコール等は必要に応じて添加することができる。
【００１９】
培養温度は、微生物が成育し、かつ本発明の化合物が効率的に産生される範囲で適宜変更できるが、好ましくは２０〜３７℃程度であり、さらに好ましくは２７℃程度である。培養開始時のｐＨは中性付近が望ましい。培養時間は特に限定されないが、通常は５日〜８日程度である。一般的には、本発明の化合物の生産量が採取可能な量に達したとき、好ましくは最高に達したときに培養を終了すればよい。培養法は特に限定されず、固層培養、通常攪拌培養等の通常用いられる方法であればいかなる方法を採用してもよい。
【００２０】
培養物から本発明の化合物を分離・採取する方法も特に限定されず、微生物培養物中から低分子化合物を分離・採取するために通常用いられる方法を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、アルミナ若しくはシリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーを用いた分離方法、あるいは結晶化、減圧濃縮、又は凍結乾燥の手段を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００２１】
本発明の化合物は各種の真菌に対して抗菌作用を有しており、真菌感染症の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として有用である。本発明の医薬としては、上記式（Ｉ）で表される化合物及びその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質を用いることができる。２種以上の物質を組み合わせて用いてもよい。本発明の医薬としては、有効成分である上記の物質をそのまま投与してもよいが、有効成分である上記の物質と製剤用添加物とを含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
【００２２】
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができるが、真菌感染症の予防及び／又は治療に際して最も効果的な経路を適宜選択することが望ましい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、カプセル剤、散剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、乳剤、シロップ剤、溶液剤、懸濁剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、吸入剤、噴霧剤、直腸内投与剤、注射剤、点滴剤、軟膏、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、テープ剤、貼付剤などを挙げることができるが、本発明の医薬の形態はこれらに限定されることはない。
【００２３】
経口投与に適する医薬組成物のうち、例えば乳剤及びシロップ剤などの液体製剤は、水；蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類などの製剤用添加物を用いて製造することができる。カプセル剤、錠剤、散剤、及び顆粒剤などの固形製剤は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等を用いて製造することができる。
【００２４】
非経口投与に適する医薬組成物のうち、注射剤、点滴剤、点眼剤などの形態の液体製剤は、好ましくは滅菌された等張の液体製剤として調製することができる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体を用いて調製することができる。直腸内投与剤は、例えばカカオ脂、水素化脂肪又は水素化カルボン酸等の担体を用いて、通常は座剤の形態として調製することができる。また、噴霧剤の調製には、有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させて吸収を容易にする非刺激性の担体を用いることができる。このような担体として、例えば、乳糖、グリセリン等を挙げることができ、製剤の形態としてはエアロゾルやドライパウダー等の形態を選択することが可能である。もっとも、本発明の医薬の製造に用いられる製剤用添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者に利用可能なものであればいかなるものを用いてもよい。
【００２５】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、真菌感染症の種類や重篤度、基礎疾患の有無、患者の年齢、体重などの条件などに応じて、適宜の投与量を選択することが可能である。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
【００２７】
例１
50ml容三角フラスコにグリセロール1％、グルコース1％、ブレイン・ハートインフュージョンブロスからなる基本培地を25ml分注し、121℃で15分オートクレーブにより高圧滅菌し、冷却後にノカルジア・トランスバレンシス IMF10065 株を接種した。30℃で5日間振とう培養(250rpm)して、これを前培養とした。
500ml容三角フラスコに、グルコース 3％、ファーマメディア 0.6％、日清ソーヤフラワーFT 0.75％、K2HPO4 0.1％、CaCO3 0.55％、(NH4)2SO4 0.5％からなる本培養培地100mlを分注し、同様に滅菌した後、1％v/vで前記前培養液を20本に接種した。培養は31℃で7日間振とう培養(250rpm)することにより行い、この操作を４回繰り返した。
【００２８】
得られた培養物8Lを遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体にメタノールを加え抽出し、ろ紙により菌体を除去した。この抽出液をエバポレーターにより濃縮乾固した。この濃縮物に１：１の割合で水と酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を回収した。酢酸エチル抽出物は、エバポレーターにより濃縮乾固を行い、シリカゲルクロマトグラフィーに供した。シリカゲルとしてシリカゲルFL100D（富士シリシア）を使用し、カラムサイズは3.5×20cmとした。クロロホルム：メタノール＝1：0、9：1、3：１、2：1、1：１、0：1の溶出液各300mlで溶出した。1：0溶出画分についてエバポレーターで濃縮した。濃縮物を再びシリカゲルクロマトグラフィーに供した。ゲルはシリカゲルFL100Dを使用した。トルエン：酢酸エチル＝3：1により溶出し、5.0mlずつフラクションにわけ回収し、Trichophyton mentagrophytesに対する生育阻害活性を指標として、活性画分を回収した。回収された活性画分は、薄層クロマトグラフィーによる分取を行った。薄層クロマトグラフィーとしてはPLCプレート20×20cmシリカゲル60F254、0.5mm（メルク）を使用し、トルエン：酢酸エチル＝3：１を展開溶媒として使用した。UV254に吸収がある部分を回収し、回収した物をゲルろ過クロマトグラフィーに供した。担体としてはSephadex LH-20（アマシャム）を用い、カラムサイズは1.5×40cmとした。クロロホルム：メタノール＝1：1の溶媒にて溶出した。3mlを1フラクションとして集め、上記のアッセイ法により活性画分を回収し濃縮した。
【００２９】
得られた濃縮物を高速液体クロマトグラフィーに２回供し、精製を行った。１回目の精製はカラムとしてODS 10mm×250mm(日本分光)を用い、溶媒としてアセトニトリル：水の混合物を用いて、アセトニトリル35〜65％の濃度勾配溶出（流速：5ml/min，３０分間）の条件で溶出を行い、活性画分を上記のアッセイ法により得た。２回目の精製は上記の活性画分を使用し、カラムとしてODS 10mm×250mm(日本分光)、溶媒としてメタノールを用い、流速：5ml/minにて溶出を行ない活性画分を上記のアッセイ法により得た。活性画分はエバポレーターにより濃縮乾固を行い、精製品として本発明の化合物（上記式（II）で表される化合物） 7.2mgを得た。
【００３０】
得られた化合物の物理化学的データを以下に示す。1H-NMRスペクトルの内部標準はクロロホルムのピークをδ7.24として用い、13C-NMRスペクトルの内部標準は重クロロホルムの中央のピークをδ77.0として用いた。
UV (メタノール) λmax (logε) 225 (4.47), 251 (4.05), 358 (3.65) nm.
FAB-MS m/z 655 [M (37Cl, 66Zn) + H]+, 653 [M (37Cl, 64Zn / 35Cl, 66Zn) + H]+, 651 [M (35Cl, 64Zn) + H]+, 637, 635, 633 (M - 17), 307, 289, 176, 154, 136.
FAB-MS (+ KI) m/z 693 [M (37Cl, 66Zn) + K]+, 691 [M (37Cl, 64Zn / 35Cl, 66Zn) + K]+, 689 [M (35Cl, 64Zn) + K]+, 637, 635, 633 (M - 17), 580, 578, 576, 344.5, 306, 288, 191, 154, 136.
ESI-MS (CH3OH-CH3CN-H2O = 70:20:5) m/z 718 [M (37Cl, 66Zn) + Na + CH3CN]+, 716 [M (37Cl, 64Zn / 35Cl, 66Zn) + Na + CH3CN]+, 714 [M (35Cl, 64Zn) + Na + CH3CN]+. 
IR νmax (KBr) cm-1 3400 (sh), 3190, 2835, 1660, 1625, 1595 (infl.), 1520, 1460, 1365, 1340, 1235, 1150, 1085, 980, 965, 595.
CD (c 1.2×10-4 mol/L, メタノール) [θ] (nm) + 24000 (217), + 9900 (238), 0 (244), - 11000 (254), - 16000 (276), 0 (317), + 1900 (347), 0 (387).
【００３１】
【表２】
2005145875.tif 000005
【００３２】
【化３】
2005145875.tif 000006
例２
例１で得られた本発明の化合物の抗真菌作用を調べた。抗真菌作用は医真菌学会の標準化方法（日本医真菌学会雑誌, 43, pp.107-123, 2002）に従って測定した。培地としてはBHI(Difco, U.S.A.）を用い、Trichophyton mentagrophytesについては72時間で判定し、それ以外の菌株については48時間で判定した。結果を最小発育阻止濃度（μg/ml)として以下の表３に示す。
【００３３】
【表３】
2005145875.tif 000007