(57)【要約】      （修正有）【課題】生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化すると共に、ハイブリダイズした生体高分子を読取り可能としたハイブリダイゼーション用基板、ハイブリダイゼーション装置およびハイブリダイゼーション方法を提供する。【解決手段】生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、この基板上に直流または交流の電源に接続される１対の２本の導電路が設置され、導電路上またはその近接部の近傍に生体高分子検出用のプローブ分子を固定化したマイクロアレイ用基板。基板上に設置された２本の導電路に交流電圧または直流電圧を印加して電界を発生させ、この電界に沿って試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳動させ得るように構成され、基板面に対抗して配置される透明材料のカバー基板を通して、ハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子を容易に読み取ることができるハイブリダイゼーション装置及びハイブリダイゼーション方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される１対の２本の導電路が設置され、その導電路のパターンの一部において２本の導電路をその導電路間の電界分布が局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、その近接部の導電路上またはその近接部の近傍に生体高分子検出用のプローブ分子を固定化したことを特徴とする生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項２】
生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される１対の２本の導電路が設置され、その導電路のパターンの一部において２本の導電路をその導電路間の電界分布が局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、前記基板に対向して配置された対向基板における前記近接部の導電路またはその近接部の近傍に対向した位置に生体高分子検出用プローブ分子を固定化したことを特徴とする生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項３】
前記近接部は２箇所以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項４】
前記基板はガラスまたはプラスチックまたはセラミックであり、前記２本の導電路をエッチングまたは印刷により基板上に形成したことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項５】
前記導電路は、前記プローブ分子を固定化した領域以外では溶液と絶縁されていることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項６】
前記導電路とは別に、ハイブリダイゼーション後にハイブリダイゼーションの有無を検出するための電極を持つことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の生体高分子のマイクロアレイ用基板。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体高分子マイクロアレイ用基板と、
前記基板上に設置された２本の導電路に交流電圧または直流電圧を印加するための電源を有し、
この電源から電圧を前記導電路に印加して電界を発生させ、この電界に沿って前記基板上の溶液中に含まれる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳動させ得るように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダイゼーション装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であって、
前記導電路が設置された基板面に対向して透明材料で形成されたカバー基板を設け、このカバー基板を通してハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を観測できるように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダイゼーション装置。
【請求項９】
請求項７に記載の装置であって、
前記導電路は透明材料で形成されたカバー基板上に形成され、このカバー基板の裏面からハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を観測できるように構成したことを特徴とする生体高分子のハイブリダイゼーション装置。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれかに記載の装置を用いて生体高分子のハイブリダイゼーションを行う方法であって、
前記導電路間に前記電源から出力された交流電圧または直流電圧を印加して電界を発生させ、溶液中に自然拡散している試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳動により導電路近傍に濃縮させてハイブリダイゼーションを行うようにすることを特徴とする生体高分子のハイブリダイゼーション方法。
【請求項１１】
前記試料生体高分子ターゲットは、ハイブリダイゼーション後に蛍光信号または電流値により検出することを特徴とする請求項１０に記載の生体高分子のハイブリダイゼーション方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡやＲＮＡなどの生体高分子のマイクロアレイ用基板、この基板を用いたハイブリダイゼーション装置およびこの装置を用いてハイブリダイゼーションを高速化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出などのように、ある種の核酸（ターゲット核酸）を検出する目的で、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションは広く利用されている。近年、多数のプローブ核酸を基板に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイが実用されるようになり、ハイブリダイゼーションはターゲット核酸の検出に使用されている。
【０００３】
生体高分子マイクロアレイ（例えばＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイ）の作製においては、基板にＤＮＡを多数スポットとして整列させ固定化する必要がある。なお、ＤＮＡの固定化方法には、例えば、チオールを一本鎖ＤＮＡに接合させ、チオール化した一本鎖ＤＮＡを例えば金属基板に固定化する方法がある。
そして、固定化されたＤＮＡに被検体であるターゲットＤＮＡを作用させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。ハイブリダイゼーションの有無は、例えば蛍光法を用いて、固定化ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）とハイブリダイズしたターゲットＤＮＡのスポットの蛍光を測定することにより検出することができる。
【０００４】
スポッティング型のＤＮＡマイクロアレイは、プローブＤＮＡを含む液滴を基板上に載せて乾燥させることによって作製される（非特許文献１参照）。そのため、安価に作製できるという利点がある反面、基板上に固定されるＤＮＡの均一さが保証されないという欠点がある。すなわち、ＤＮＡ検出スポット部の寸法や形状がばらつくという欠点がある。      
【０００５】
さらに、スポッティング型のＤＮＡマイクロアレイの場合、ＤＮＡ検出スポット部の周囲に付着した固相化剤の存在により、ターゲットＤＮＡが非特異的に基板上に吸着し、ノイズの上昇を引き起こし、Ｓ／Ｎ比を低下させるという問題もあった（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、蛍光測定時において、蛍光部分を特定するグリッディングという操作が行われる。グリッディングは、アレイ上のスポットの縦横の数やスポット間隔、スポットの直径の大きさを入力し、スポットを円で囲む操作をいう（非特許文献１参照）。しかし、スタンプ形状および位置が安定していないと、蛍光解析時のグリッディング操作に非常に時間がかかる上、正確な解析が困難となる。
【０００７】
また、グリッディングは、スポットの位置がずれているとスポットを正確に囲むことができないため、ソフトウエアに、自動で位置を補正する機能が付いている。しかるに、すべての操作が自動になっているわけではなく、手動でスポットの開始点の設定や目視によりすべてのスポットのグリッドを確認し補正する必要がある。この操作は非常に煩雑であり、ＤＮＡスポットの数が数千以上になると非常に時間がかかる作業となり、解析スピードを遅らせる要因となっている。
【０００８】
一方、基板上に固定化されたプローブＤＮＡと試料ターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるには、通常、十数時間を要し、しかも多量の試料ターゲットＤＮＡが必要とされる。そのため、ハイブリダイゼーション時間および大量の試料の調整に、莫大な時間と費用、労力が必要とされている。特に、低発現遺伝子の解析を行う場合、極めて多くのターゲット試料が必要となる。
【０００９】
【非特許文献１】「必ずデータが出るＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル  基本原理、チップ作成技術からバイオインフォマティクスまで」、第１版、羊土社、２００２年１２月１日、Ｐ．１９−２１、３５、１０６−１０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、このような点を解決するもので、平面電極に交流または直流の電圧を印加して電界を発生させることにより誘電泳動または電気泳動により生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化すると共に、ハイブリダイズした生体高分子をレーザなどにより読取り可能とした生体高分子のハイブリダイゼーション用基板、生体高分子のハイブリダイゼーション装置およびハイブリダイゼーション方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような課題を達成するために、本発明の請求項１に記載の発明は、
生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される１対の２本の導電路が設置され、その導電路のパターンの一部において２本の導電路をその導電路間の電界分布が局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、その近接部の導電路上またはその近接部の近傍に生体高分子検出用のプローブ分子を固定化したことを特徴とする。
【００１２】
また、請求項２に記載の発明は、
生体高分子検出用マイクロアレイ基板において、
この基板上に直流または交流の電源に接続される１対の２本の導電路が設置され、その導電路のパターンの一部において２本の導電路をその導電路間の電界分布が局所的に強くなる程度に近接して配置すると共に、前記基板に対向して配置された対向基板における前記近接部の導電路またはその近接部の近傍に対向した位置に生体高分子検出用プローブ分子を固定化したことを特徴とする。
【００１３】
このような構成によれば、導電路間に交流または直流電圧を印加して、近接配置された導電路間に局所的に強くなる分布の電界を発生させることにより、その導電路配置部に生体高分子を誘電泳動または電気泳動させて容易に濃縮させることができる。
【００１４】
この場合、請求項３のように、導電路の近接部は、２箇所以上に設けることができる。
また、基板は、請求項４のように、ガラスまたはプラスチックまたはセラミックが用いられ、前記導電路をエッチングまたは印刷によりガラス基板上に形成したものである。
【００１５】
導電路は、請求項５のように、プローブ分子を固定化した領域以外では溶液と絶縁されている。また、請求項６のように、導電路とは別に、ハイブリダイゼーション後にハイブリダイゼーションの有無を検出するための電極を持たせることも可能である。
【００１６】
また、請求項７に記載のハイブリダイゼーション装置は、
請求項１ないし６のいずれかに記載の生体高分子マイクロアレイ用基板と、
前記基板上に設置された２本の導電路に交流電圧または直流電圧を印加するための電源を有し、
この電源から電圧を前記導電路に印加して電界を発生させ、この電界に沿って前記基板上の溶液中に含まれる試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳動させ得るように構成したことを特徴とする。
【００１７】
このような構成によれば、電源より導電路間に交流または直流電圧を印加して、近接配置された導電路間に局所的に強くなる分布の電界を発生させることにより、その導電路配置部に生体高分子を誘電泳動または電気泳動させて濃縮させることができ、ハイブリダイゼーションの高速化を図り得るハイブリダイゼーション装置を容易に実現することができる。
【００１８】
この場合、請求項８に記載のように、前記導電路が設置された基板面に対向して透明材料で形成されたカバー基板を設けることにより、このカバー基板を通してハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光観測を可能にする。
また、請求項９のように、前記導電路を透明材料で形成されたカバー基板上に形成し、このカバー基板の裏面からハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を観測できるように構成することもできる。
【００１９】
また、請求項１０に記載のハイブリダイゼーション方法は、
前記導電路間に前記電源から出力された交流電圧または直流電圧を印加して電界を発生させ、溶液中に自然拡散している試料生体高分子ターゲットを誘電泳動または電気泳動により導電路近傍に濃縮させてハイブリダイゼーションを行うようにすることを特徴とする。
この方法によれば、ハイブリダイゼーションを容易に高速化できる。
【００２０】
この場合、請求項１１のように、試料生体高分子ターゲットは、ハイブリダイゼーション後に蛍光信号または電流値により検出することができる。
【発明の効果】
【００２１】
以上説明したように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）基板上に設けた互いに近接した２極の導電路（以下この導電路部分を平面電極と称する）間に、交流または直流電圧を印加して平面電極近傍に電界を発生させ、これにより、平面電極近傍に生体高分子を濃縮することのできる生体高分子のマイクロアレイ用基板、およびこのマイクロアレイ基板を用いたハイブリダイゼーション装置、ならびにハイブリダイゼーションを高速化する方法を、それぞれ容易に実現することができる。
【００２２】
（２）また、このようなハイブリダイゼーション装置では、平面電極面を設けた基板面に対向して配置されるカバー基板が透明な材料で形成されており、カバー基板を通して、ハイブリダイズした蛍光標識付き生体高分子の蛍光を従来のレーザ等による読取装置で容易に読取ることができ、従来の読取装置がそのまま利用できるという利点がある。
【００２３】
（３）本発明の基板は従来の基板に平面電極を取り付けるだけであり、製造コストの低い生体高分子マイクロアレイ（ＤＮＡチップなど）を容易に作製できる。
（４）この平面電極のパターンは、金属で、反射率が高いため、反射像を測定することにより容易にグリッディングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図１は本発明に係る生体高分子ハイブリダイゼーション装置の一部を示す実施例構成図であり、ハイブリダイズした生体高分子の蛍光標識を読取るための読取装置に設けられた対物レンズも併せて示してある。
なお、実施例では、生体高分子としてＤＮＡを例にとって説明する。
【００２５】
図１において、１は生体高分子ハイブリダイゼーション装置、２０は読取装置の対物レンズである。生体高分子ハイブリダイゼーション装置１は、基板２と、基板２上面に取付けられた導電路部の特に近接配置された２極の導電路部である平面電極３，４と、透明な材料で形成されたカバー基板５と、平面電極３，４の間に電界を印加するための電源１０を備える。
【００２６】
平面電極３，４の上面にはプローブＤＮＡ６が固定化され、基板２とカバー基板５に挟まれた空間には試料ターゲットＤＮＡ７を含む溶液８が満たされる。なお、基板２とカバー基板５とは側壁（図示せず）に囲まれて密閉状の容器に形成され、溶液８が流出しない構造となっている。また、図では１つのサイトに係る平面電極３，４とプローブＤＮＡ６を示してあるが、１つのＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイにはこのような平面電極が複数サイト分所定の間隔で配置されている。
【００２７】
平面電極３，４は、基板２上でその２極が互いに接触しないように近接した位置に配置されており、その形状は例えば図２の（ａ）〜（ｃ）に示すようなものが使用可能である。
図２の（ａ）は、円形状の電極とそれを取り巻く円環状の電極からなる平面電極であり、その円形状の電極３１と円環状の電極４１はそれぞれリード線３ａ，４ａを介して電源１０に接続される。また、図２の（ｂ）は互いに入れ子状に配置された櫛の歯状の平面電極であり、各電極３２，４２はそれぞれリード線３ａ，４ａを介して電源１０に接続される。また、図２の（ｃ）は互いに渦巻き状に形成された電極であり、各電極３３，４３はそれぞれリード線３ａ，４ａを介して電源１０に接続される。
【００２８】
このような形の平面電極は、基板２表面に取付けられるが、例えば次のようにして作製することもできる。基板２として表面研磨したスライドガラスを用いる。そのガラス表面に真空蒸着により金を蒸着する。その上にレジストを塗布してベーキングした後、紫外線露光装置により、フォトマスクを通して上記スライドガラスに紫外光を照射する。照射後、現像を行い、図２に示すような電極形状のレジストパターンを金表面上に形成する。
【００２９】
レジストパターン以外の表面の金は金エッチャントによりエッチングする。このようにして、フォトマスク通りの電極形状の金パターンを有するガラス基板を作製することができる。なお、リード線もパターン化して同様に作製できる。
【００３０】
このような構成における動作を次に説明する。予めプローブＤＮＡ６を電極面上にスタンプし固定化しておく。例えば、図２（ａ）では、電極３１の円形部分にプローブＤＮＡをスポットし、この円形電極上に固定化しておく。基板２とカバー基板５に挟まれた空間に蛍光標識した試料ターゲットＤＮＡ７を含む溶液８を満たした後、電源１０より平面電極３１，４１の間に交流電圧を印加する。これにより電極３１，４１間の電界密度が高まり、溶液８中に自然拡散している負電荷を有する試料ターゲットＤＮＡ７は誘電泳動によって電極部３１，４１近傍に引き寄せられ濃縮する。
【００３１】
これにより、電極部に固定化されたプローブＤＮＡ６と、試料ターゲットＤＮＡ７とのハイブリダイズを促進させることができる。このような交流電圧による促進効果については、例えば、第２６回日本分子生物学会年会  神戸国際展示場において平成１５年１２月１０日−１３日に発表された「次世代ＤＮＡマイクロアレイシステムの開発−MESA型アレイにおけるハイブリッド形成の増進効果−」（発表者：葛西耕平、畠山哲、島村貴之、近藤恭光、田代朋子、田代英夫）より明らかである。
【００３２】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしない試料ターゲットＤＮＡは溶液８と共に洗い流し、プローブＤＮＡとハイブリダイズした試料ターゲットＤＮＡ７に、透明窓のカバー基板５を通して読取装置側から励起光（例えばレーザ光）を照射する。蛍光標識から発光した蛍光はカバー基板５を通して対物レンズ２０に入り、読取装置で読取られる。このようにしてプローブＤＮＡにハイブリダイズした試料ターゲットＤＮＡ７を計測することができる。
なお、蛍光標識ＤＮＡの読取には、スキャン型の共焦点顕微鏡、スキャンレス型のマルチビーム式の読取装置などを用いることができる。
【００３３】
なお、電極３，４に印加する電圧は、交流でも直流でもよい。上記実施例のように交流電圧を印加する場合は、低周波数では試料ターゲットＤＮＡ７を含む溶液が電気分解により気泡等が発生しやすいため高周波の交流を用いるのが好ましい。
【００３４】
一方、直流電圧を印加する場合は、高電圧をかけると、試料ターゲットＤＮＡ７を含む溶液が高電圧により電気分解し、気泡等が発生しやすい懸念があるため、低電圧を使用するのが好ましい。負に帯電している試料ターゲットＤＮＡ７は正極側の電極の方に集まってくる。
なお、電源１０は、印加する電圧が交流か直流かに応じて、交流電源または直流電源を用いる。あるいは、設定により交流電圧または直流電圧のいずれかを選択的に出力できる電源を用いてもよい。
【００３５】
なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。
例えば、図２にある近接電極部は基板上に複数アレイ状に設置することができる。これによって多数のＤＮＡの解析を同時に行うことができる。
【００３６】
また、図３に示すように、１つの近接電極部に複数種類の生体高分子のスポットをそれぞれ分離してスポットしてもよい。
また、図４に示すように、プローブＤＮＡ６５，６６，６７，…６nは平面電極上ではなく、平面電極の近傍にスポットしてもよい。この場合でも、電極の近傍にはターゲットＤＮＡ７が高濃度で存在しているためハイブリダイゼーションは加速される。
【００３７】
また、図５に示すように、蛍光を読取るための透明なカバー基板５側に平面電極３，４とプローブＤＮＡ６を設置してもよい。この場合、プローブＤＮＡ６は透明な平面電極に固定化される。
また、図６に示すように、平面電極の近傍にプローブＤＮＡ６を設置してもよい。この場合は、平面電極は透明でなくてもよい。
【００３８】
また、図７あるいは図８に示すような配置としてもよい。いずれの図においても、基板２としては、平板上に、上面が平坦な円柱状または四角柱状の凸型突起部２ａを持つ構造の基板２を用いる。そして、平面電極とプローブＤＮＡを対向する面に配置する。すなわち、図７では、凸型突起部２ａの上面に平面電極３，４が取付けられ、プローブＤＮＡ６が透明なカバー基板５の下面に固定化されている。図８では、平面電極３，４が透明なカバー基板５の下面に取付けられ、プローブＤＮＡ６が凸型突起部２ａの上面に取付けられている。
【００３９】
この場合のギャップａ、すなわち、図７におけるカバー基板５と平面電極３，４の間のギャップａと、図８における平面電極３，４と凸型突起部２ａの上面との間のギャップａは狭い方が望ましい。
【００４０】
また、近接部以外の導線からも電気分解が生じる可能性があるが、これに対しては、生体高分子を固定化した領域以外（固定部位以外）を非導電性の膜で覆うなどの構造により溶液と絶縁すればよい。
【００４１】
また、検出は、予め蛍光標識したターゲットＤＮＡなどを使用する以外に、ハイブリダイゼーション後にインターカレータ型の試薬を二本鎖の間に挿入し、蛍光信号や電流値で検出する方法でもよい。また、蛍光ではなく、吸収やりん光でもよい。
また、電流検出の場合、ハイブリダイゼーション用の導電路とは別に、検出用の専用電極と検出回路を別途設置してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明に係る生体高分子ハイブリダイゼーション装置の一部を示す実施例構成図である。
【図２】平面電極の形状を示す図である。
【図３】生体高分子のスポット例を示す図である。
【図４】生体高分子の他のスポット例を示す図である。
【図５】平面電極とプローブＤＮＡの他の設置例を示す図である。
【図６】平面電極とプローブＤＮＡの更に他の設置例を示す図である。
【図７】平面電極とプローブＤＮＡの更に他の設置例を示す図である。
【図８】平面電極とプローブＤＮＡの更に他の設置例を示す図である。
【符号の説明】
【００４３】
１  生体高分子のハイブリダイゼーション装置
２  基板
３，３１，３２，３３  平面電極
４，４１，４２，４３  平面電極
３ａ，４ａ  リード線
５  カバー基板
６  プローブＤＮＡ
６１，６２，６３，６４  生体高分子のスポット
７  試料ターゲットＤＮＡ
８  溶液
１０  電源
２０  読取装置の対物レンズ
【図１】
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【図２】
2005249407.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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