(57)【要約】【課題】  検出時間の短縮、簡易な検出装置及び方法の提供、そして、検出感度、特にグラム陰性細菌に対する感度の向上を図るものである。【解決手段】  本発明の微生物検出装置は、検出対象から試料を採りこむ試料採取部１０と、試料から微生物を濃縮する試料濃縮部２０と、微生物が存在すると色調が変化する試薬を試料に投入する試薬投入部３０と、試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出部４０と、を備え、試料から微生物を濃縮することで検出時間の短縮と検出感度の向上を図る。【選択図】      図１
2005318807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を検出する装置であって、
検出対象から試料を採りこむ試料採取部と、
前記試料採取部にて採りこまれた前記試料に存在する微生物を濃縮する試料濃縮部と、
前記微生物の存在により色調が変化する成分を有する試薬を前記試料濃縮部にて濃縮された試料に投入する試薬投入部と、
前記試薬投入部にて投入された前記試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出部と、
前記微生物検出部にて検出された検出結果を出力する検出結果出力部と、
前記試料採取部と前記試料濃縮部と前記試薬投入部と前記微生物検出部と前記検出結果出力部とを制御する制御部と、
を備えることを特徴とする微生物検出装置。
【請求項２】
前記試料濃縮部は、濾過膜により前記微生物を捕捉し、前記試料に存在する前記微生物の密度あるいは濃度を高める濾過手段を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物検出装置。
【請求項３】
前記試料濃縮部は、前記濾過手段により捕捉された前記微生物を、培養液によって増殖させる培養手段を含むことを特徴とする請求項２記載の微生物検出装置。
【請求項４】
前記試料濃縮部は、前記微生物検出部における特定の微生物の検出感度を向上させる検出感度向上手段を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項５】
前記検出感度向上手段は、加熱あるいは乾燥により、前記微生物の膜構造を破壊する膜破壊手段であることを特徴とする請求項４記載の微生物検出装置。
【請求項６】
前記試料濃縮部は、前記試料を所定の温度に保つ温度保持手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物検出装置。
【請求項７】
前記光学系は、可視光領域の波長を出力する光源を備えることを特徴とする請求項１〜６記載の微生物検出装置。
【請求項８】
微生物を検出する方法であって、
検出対象から試料を採りこむ試料採取ステップと、
前記試料採取ステップにて採りこまれた前記試料に存在する微生物を濃縮する試料濃縮ステップと、
前記微生物の存在により色調が変化する成分を有する試薬を前記試料濃縮ステップにて濃縮された試料に投入する試薬投入ステップと、
前記試薬投入ステップにて投入された前記試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出ステップと、
を含むことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項９】
前記試料濃縮ステップは、濾過膜により前記微生物を捕捉し、微生物の密度あるいは濃度を高める濾過処理を含むことを特徴とする請求項８記載の微生物検出方法。
【請求項１０】
前記試料濃縮ステップは、前記濾過処理により捕捉された微生物を、培養液によって増殖させる培養処理を含むことを特徴とする請求項９記載の微生物検出方法。
【請求項１１】
前記試料濃縮ステップは、前記微生物検出ステップにおける特定の微生物の検出感度を向上させる検出感度向上処理を含むことを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項１２】
前記検出感度向上処理は、加熱あるいは乾燥により、微生物の膜構造を破壊する膜破壊処理であることを特徴とする請求項１１記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の微生物を検出装置および方法に関し、詳細には、感染症診断、食品の微生物検査、環境中の微生物検出、半導体用洗浄水の品質管理などを行う際に利用される微生物検出装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、幹細胞を培養して、体内へ導入する医療器具表面に付与することで人体との拒絶反応を低減させる技術や、各機能を有する細胞に培養する技術などが、組織工学の発展により、急速に進歩してきている。このような細胞培養技術においては、体内に導入される細胞が微生物に汚染されていないことを確実に証明する必要があり、そのための微生物検出方法も組織工学の進歩とともに発展し、フェノール酸化酵素前駆体を用いた微生物検出方法も、このような微生物検出方法のひとつである（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平９−９８７９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来のフェノール酸化酵素前駆体を用いる方法では、微生物の検出感度、特にグラム陰性細菌に対する感度が低いという問題があった。
【０００４】
このような問題を鑑みて、本発明は、検出時間の短縮、簡易な検出装置及び方法の提供、そして、検出感度、特にグラム陰性細菌に対する感度の向上を図るものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の請求項１記載の微生物検出装置は、微生物を検出する装置であって、検出対象から試料を採りこむ試料採取部と、前記試料採取部にて採りこまれた前記試料に存在する微生物を濃縮する試料濃縮部と、前記微生物の存在により色調が変化する成分を有する試薬を前記試料濃縮部にて濃縮された試料に投入する試薬投入部と、前記試薬投入部にて投入された前記試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出部と、前記微生物検出部にて検出された検出結果を出力する検出結果出力部と、前記試料採取部と前記試料濃縮部と前記試薬投入部と前記微生物検出部と前記検出結果出力部とを制御する制御部と、を備えることを特徴とする。
【０００６】
本発明の請求項１によれば、簡易な装置で検出時間の短縮を図ることが可能となる。
【０００７】
本発明の請求項２は、請求項１記載の微生物検出装置において、前記試料濃縮部は、濾過膜により前記微生物を捕捉し、前記試料に存在する前記微生物の密度あるいは濃度を高める濾過手段を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の請求項２によれば、請求項１の効果に加え、検出感度を向上させることが可能となる。
【０００９】
本発明の請求項３は、請求項２記載の微生物検出装置において、前記試料濃縮部は、前記濾過手段により捕捉された前記微生物を、培養液によって増殖させる培養手段を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項３によれば、請求項２の効果に加え、更に検出感度を向上させることが可能となる。
【００１１】
本発明の請求項４は、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物検出装置において、前記試料濃縮部は、前記微生物検出部における特定の微生物の検出感度を向上させる検出感度向上手段を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項４によれば、請求項１〜３の効果に加え、特定の微生物の検出感度を向上させることが可能となる。
【００１３】
本発明の請求項５は、請求項４記載の微生物検出装置において、前記検出感度向上手段は、加熱あるいは乾燥により、前記微生物の膜構造を破壊する膜破壊手段であることを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項５によれば、請求項４の効果に加え、微生物の膜構造を破壊することにより検出感度が向上するグラム陰性細菌などの微生物の検出感度を向上させることが可能となる。
【００１５】
本発明の請求項６は、請求項１〜５のいずれかに記載の微生物検出装置において、前記試料濃縮部は、前記試料を所定の温度に保つ温度保持手段を備えることを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項６によれば、請求項１〜５の効果に加え、検出対象に含まれる微生物が非常に微量の場合であっても、短時間で検出可能なレベルまで微生物を濃縮することが可能となる。
【００１７】
本発明の請求項７は、請求項１〜６記載の微生物検出装置において、前記光学系は、可視光領域の波長を出力する光源を備えることを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項７によれば、請求項１〜６の効果に加え、試薬の色調の変化を容易に検出することが可能となる。
【００１９】
本発明の請求項８記載の微生物検出方法は、微生物を検出する方法であって、検出対象から試料を採りこむ試料採取ステップと、前記試料採取ステップにて採りこまれた前記試料に存在する微生物を濃縮する試料濃縮ステップと、前記微生物の存在により色調が変化する成分を有する試薬を前記試料濃縮ステップにて濃縮された試料に投入する試薬投入ステップと、前記試薬投入ステップにて投入された前記試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出ステップと、を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項８によれば、簡易な方法で検出時間の短縮を図ることが可能となる。
【００２１】
本発明の請求項９は、請求項８記載の微生物検出方法において、前記試料濃縮ステップは、濾過膜により前記微生物を捕捉し、微生物の密度あるいは濃度を高める濾過処理を含むことを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項９によれば、請求項８の効果に加え、検出感度を向上させることが可能となる。
【００２３】
本発明の請求項１０は、請求項９記載の微生物検出方法において、前記試料濃縮ステップは、前記濾過処理により捕捉された微生物を、培養液によって増殖させる培養処理を含むことを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項１０によれば、請求項９の効果に加え、更に検出感度を向上させることが可能となる。
【００２５】
本発明の請求項１１は、請求項８〜１０のいずれかに記載の微生物検出方法において、前記試料濃縮ステップは、前記微生物検出ステップにおける特定の微生物の検出感度を向上させる検出感度向上処理を含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明の請求項１１によれば、請求項８〜１０の効果に加え、特定の微生物の検出感度を向上させることが可能となる。
【００２７】
本発明の請求項１２は、請求項１１記載の微生物検出方法において、前記検出感度向上処理は、加熱あるいは乾燥により、微生物の膜構造を破壊する膜破壊処理であることを特徴とする。
【００２８】
本発明の請求項１２によれば、請求項１１の効果に加え、微生物の膜構造を破壊することにより検出感度が向上するグラム陰性細菌などの微生物の検出感度を向上させることが可能となる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、簡易な検出装置あるいは方法によって、確実に微生物の存在を検出することができるほか、検出時間の短縮、検出感度、特にグラム陰性細菌等の微生物に対する検出感度の向上を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図１は、本発明の微生物検出システム１００のシステム構成図である。微生物検出システム１００は、試料採取部１０、試料濃縮部２０、試薬投入部３０、微生物検出部４０からなり、試料濃縮部２０、試薬投入部３０、微生物検出部４０は恒温槽５０の中に配されている。そして、これら各部の動作及び環境設定を制御部６０が制御し、この制御部６０は微生物検出部４０からの検出結果を受信し、検出結果出力部７０に送信して微生物検出結果を出力するように構成されている。
【００３１】
試料採取部１０は、細胞培養用フラスコから培養液の交換時などに廃棄する細胞培養用の培養液を投入する。このとき、従来のように、検出用に培養液の一部を採取する方法ではなく、細胞培養用の培養液のほぼ全量を検出対象とすることにより、より正確な検出結果を得ることができる。この試料採取部１０は、微生物検出システム１００で最も外部から微生物侵入の恐れのある部分であるため、微生物検出システム１００自体を無菌室に設置することが望ましく、更には、試料採取部１０を無菌チャンバの中に配し、細胞培養用フラスコから微生物検出用試験管へ細胞培養用の培養液を自動的に移し替える構成をとることが望ましい。
【００３２】
試料濃縮部２０では、図２に示すように、試料採取部１０にて採取した細胞培養用の培養液中の検出対象微生物を増加、濃縮して検出感度をあげるため、まず微生物検出用試験管２２の下部の排液タンク２３に設けられた減圧ポンプ２４にて排液タンク２３内の空気を排気し、微生物検出用試験管２２の底部のフィルタ２６にて培養液中の微生物を捕集する。このフィルタ２６は、孔径が０．１〜１０μｍ、望ましくは０．２μｍ程度のものが良いが、本システムにおいては、ミリポア社製のウルトラフリーＭＣを使用する。
【００３３】
微生物検出用試験管２２から、微生物を捕集した後の培養液を、減圧ポンプ２４を用いて排出し排出バルブ２８を閉じた後、微生物検出用試験管２２の上部より微生物培養用の培養液を投入する。この微生物培養用の培養液としては、ブドウ糖・ペプトン液体培地（ＧＰ液体培地）を使用したが、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト液体培地（ＳＣＤ液体培地）、チオグリコール酸培地（ＴＧ培地）、サブロー・ブドウ糖培地、ブレインハートインフュージョン、ミューラーヒントン、普通ブイヨン、或いは、ブドウ糖ペプトンなどでも良い。また、予め微生物検出用試験管２２を複数本用意し、それぞれにおいて微生物を捕集した後、検出が予測される微生物に合わせて複数種類の微生物培養用の培養液を微生物検出用試験管２２に投入しても良い。
【００３４】
微生物検出用試験管２２に微生物培養用の培養液を投入した後、３〜１２時間、望ましくは、５〜８時間、３０〜４０℃の一定の温度下において、微生物を培養する。微生物は、図３に示すように、種類にもよるが約３０分間で２倍に数を増殖させる性質を有するので、増殖前に１個しか存在しなかった微生物でも５時間で１０００個以上に増殖する。
【００３５】
また、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  Ａｌｂｉｃａｎｉｓ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・クルゼイ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  Ｇｌａｂｒａｔａ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニュウモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｉｓｔｉｓ  Ｃａｒｉｎｉｉ）などの真菌類は３０℃前後の温度域において増殖を活発化させるのに対し、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・パイオジェン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・チフムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｂｏｎｇｏｒｉ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）、シュードモナス・エルジノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などの細菌類は３７℃前後の温度域において増殖を活発化させるので、予め微生物検出用試験管２２を複数本用意し、それぞれにおいて微生物を捕集した後、検出が予測される微生物に合わせて複数種類の温度域で微生物を培養しても良い。
【００３６】
更に、試薬として和光純薬工業株式会社製のＳＬＰ試薬（試薬Ａ）を使用する場合には、グラム陰性細菌に対する検出感度が他の真菌、細菌に比べて低いので、微生物検出用試験管２２にて微生物を培養した後、乾燥、加熱、超音波、或いは、界面活性剤などを用いて微生物を破壊してもよい。図４に示すように、グラム陰性細菌９０は、試薬Ａと反応するペプチドグリカン９２が外膜９４の内側に存在するため、試薬Ａによる検出感度が低い。そこで、上記の方法により微生物の外膜９４あるいは細胞質膜９６を破壊することによって、グラム陰性細菌９０の外膜９４と細胞質膜９６の間に存在していたペプチドグリカン９２が外部へ露出し、試薬Ａと反応しやすくする。
【００３７】
試料濃縮部２０において、以上のような微生物の検出感度を向上させるための微生物の培養を行い、微生物培養用の培養液を排出し、微生物の破壊などで感度をさらに向上させる処理を行った後、試薬投入部３０において、微生物検出用試験管２２に試薬を投入する。この試薬としては、試薬Ａを使用したが、和光純薬工業株式会社製のリムルス試薬（試薬Ｂ）などでも良い。また、予め微生物検出用試験管２２を複数本用意し、それぞれにおいて微生物を捕集した後、検出が予測される微生物に合わせて複数種類の試薬を微生物検出用試験管２２に投入しても良い。
【００３８】
試薬投入部３０にて試薬Ａを投入した後、微生物検出部４０にて微生物の有無を光学的に検出する。微生物検出部４０は、図５に示すように、微生物検出用試験管２２の設置ステージ４２、光源（６３０ｎｍ）４４、ハーフミラー４６とミラー４７ａ、４７ｂ、受光素子４８ａ、４８ｂからなり、遮光チャンバ４９内に各部品が配置される。微生物検出用試験管２２に試薬Ａを投入し、微生物検出用試験管２２内の色調が安定するまで１２０分間ほど反応を待ち、微生物検出用試験管２２を微生物検出部４０の微生物検出用試験管設置ステージ４２に設置する。設置ステージ４２は試薬の反応に適した温度、例えば、試薬Ａを用いる場合は３０℃、試薬Ｂを用いる場合は３７℃に設定される。設置ステージ４２へ微生物検出用試験管２２の設置が終了すると、光源から６３０ｎｍの光が照射され、受光素子４８ａ、４８ｂにて透過光が検出される。受光素子４８ａ、４８ｂからの受光量の信号は、制御部６０へ送信され、制御部６０において、受光素子４８ａからの信号を参照信号として、受光素子４８ｂの透過光量、即ち、微生物検出用試験管２２内の試薬の吸光度が計算される。これらの計測結果及び計算結果は、制御部６０から検出結果出力部７０へ送信され、検出結果出力部７０からデータとして出力される。
【００３９】
次に、実施例及びグラム陰性細菌高感度化実験を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
図６を用いて実施例１の微生物検出方法について説明する。
【００４１】
Ｓｔｅｐ１：試料採取部２０において、細胞培養用フラスコから微生物検出用試験管２２へ細胞培養に用いた培養液を移し替え、試料を採取する（Ｓ１１）。
【００４２】
Ｓｔｅｐ２：排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、試料を採取した微生物検出用試験管２２の下部より細胞培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する。これにより、細胞培養用の培養液中に微生物が存在すれば、フィルタ２６上に微生物が残留する（Ｓ１２）。
【００４３】
Ｓｔｅｐ３：細胞培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、微生物検出用試験管２２の上部より微生物培養用の培養液を注入する。微生物培養用の培養液の注入が終了した後、恒温槽５０内にて３７℃で５時間安置し、微生物を培養する（Ｓ１３）。
【００４４】
Ｓｔｅｐ４：再び、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、微生物検出用試験管２２の下部より微生物培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ１４）。
【００４５】
Ｓｔｅｐ５：微生物培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、恒温槽５０を１００℃に設定し、２０分間加熱する。これにより、微生物の細胞膜が破壊される（Ｓ１５）。
【００４６】
Ｓｔｅｐ６：恒温槽５０での加熱処理が終了した後、微生物検出用試験管２２の上部より試薬Ａを投入する（Ｓ１６）。
【００４７】
Ｓｔｅｐ７：微生物検出用試験管２２を微生物検出部４０の設置ステージ４２に設置し、微生物検出用試験管２２内の試薬Ａの吸光度を測定する。これにより、細胞培養用の培養液中に微生物が存在したか否かを検出することができる（Ｓ１７）。
【実施例２】
【００４８】
次に、図７を用いて実施例２の微生物検出方法について説明する。
【００４９】
Ｓｔｅｐ１：微生物検出用試験管２２を２本用意し、試料採取部２０において、細胞培養用フラスコから微生物検出用試験管２２へ細胞培養に用いた培養液を移し替え、試料を２本採取する（Ｓ２１）。
【００５０】
Ｓｔｅｐ２：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、試料を採取した微生物検出用試験管２２の下部より細胞培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ２２）。
【００５１】
Ｓｔｅｐ３：細胞培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、微生物検出用試験管２２の上部より微生物培養用の培養液を注入する。微生物培養用の培養液の注入が終了した後、一方の微生物検出用試験管２２は恒温槽５０を３０℃に設定し、他方の微生物検出用試験管２２は恒温槽５０を３７℃に設定してそれぞれ５時間安置し、微生物を培養する（Ｓ２３）。
【００５２】
Ｓｔｅｐ４：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、再び、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、微生物検出用試験管２２の下部より微生物培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ２４）。
【００５３】
Ｓｔｅｐ５：微生物培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、更に、他方の微生物検出用試験管２２は、恒温槽５０を１００℃に設定し、２０分間加熱する。一方の微生物検出用試験管２２については、この加熱処理を行う必要はないので、本実施例では行わない（Ｓ２５）。
【００５４】
Ｓｔｅｐ６：他方の微生物検出用試験管２２についての加熱処理が終了した後（一方の微生物検出用試験管２２についてはＳｔｅｐ４が終了した後）、２本の微生物検出用試験管２２それぞれの上部より試薬として試薬Ａを投入する（Ｓ２６）。
【００５５】
Ｓｔｅｐ７：２本の微生物検出用試験管２２それぞれを微生物検出部４０の設置ステージ４２に設置し、微生物検出用試験管２２内の試薬Ａの吸光度を測定する。これにより、細胞培養用の培養液中に微生物が存在したか否か、更には、真菌或いは細菌が存在したか否かを検出することができる（Ｓ２７）。
【実施例３】
【００５６】
次に、図８を用いて実施例３の微生物検出方法について説明する。
【００５７】
Ｓｔｅｐ１：微生物検出用試験管２２を２本用意し、試料採取部２０において、細胞培養用フラスコから微生物検出用試験管２２へ細胞培養に用いた培養液を移し替え、試料を２本採取する（Ｓ３１）。
【００５８】
Ｓｔｅｐ２：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、試料を採取した微生物検出用試験管２２の下部より細胞培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ３２）。
【００５９】
Ｓｔｅｐ３：細胞培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、微生物検出用試験管２２の上部より、一方の微生物検出用試験管２２には微生物培養用の培養液としてＧＰ液体培地を、他方の微生物検出用試験管２２には微生物培養用の培養液としてＳＣＤ液体培地を注入する。微生物培養用の培養液の注入が終了した後、双方の微生物検出用試験管２２を３５℃に設定した恒温槽５０で培養しても良いが、一方の微生物検出用試験管２２は恒温槽５０を３０℃に設定し、他方の微生物検出用試験管２２は恒温槽５０を３７℃に設定してそれぞれ５時間安置し、微生物を培養するとより感度良く測定することができる（Ｓ３３）。
【００６０】
Ｓｔｅｐ４：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、再び、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、微生物検出用試験管２２の下部より微生物培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ３４）。
【００６１】
Ｓｔｅｐ５：微生物培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、更に、他方の微生物検出用試験管２２は、恒温槽５０を１００℃に設定し、２０分間加熱する。一方の微生物検出用試験管２２については、この加熱処理を行う必要はないので、本実施例では行わない（Ｓ３５）。
【００６２】
Ｓｔｅｐ６：他方の微生物検出用試験管２２についての加熱処理が終了した後（一方の微生物検出用試験管２２についてはＳｔｅｐ４が終了した後）、２本の微生物検出用試験管２２それぞれの上部より試薬として試薬Ａを投入する（Ｓ３６）。
【００６３】
Ｓｔｅｐ７：２本の微生物検出用試験管２２それぞれを微生物検出部４０の設置ステージ４２に設置し、微生物検出用試験管２２内の試薬Ａの吸光度を測定する。これにより、細胞培養用の培養液中に微生物が存在したか否か、更には、真菌或いは細菌が存在したか否かを更に感度良く検出することができる（Ｓ３７）。
【実施例４】
【００６４】
最後に、図９を用いて実施例４の微生物検出方法について説明する。
【００６５】
Ｓｔｅｐ１：微生物検出用試験管２２を２本用意し、試料採取部２０において、細胞培養用フラスコから微生物検出用試験管２２へ細胞培養に用いた培養液を移し替え、試料を２本採取する（Ｓ４１）。
【００６６】
Ｓｔｅｐ２：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、試料を採取した微生物検出用試験管２２の下部より細胞培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ４２）。
【００６７】
Ｓｔｅｐ３：細胞培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、微生物検出用試験管２２の上部より微生物培養用の培養液を注入する。微生物培養用の培養液の注入が終了した後、双方の微生物検出用試験管２２を３５℃に設定した恒温槽５０で５時間安置し、微生物を培養する（Ｓ４３）。
【００６８】
Ｓｔｅｐ４：２本の微生物検出用試験管２２それぞれにおいて、再び、排出バルブ２８を開き、減圧ポンプ２４を起動させて、微生物検出用試験管２２の下部より微生物培養用の培養液を、フィルタ２６を介して排出する（Ｓ４４）。
【００６９】
Ｓｔｅｐ５：微生物培養用の培養液の排出が終了した後、減圧ポンプ２４を停止し、排出バルブ２８を閉じ、一方の微生物検出用試験管２２の上部より試薬Ａを投入し、他方の微生物検出用試験管２２には上部より試薬Ｂを投入する（Ｓ４６）。
【００７０】
Ｓｔｅｐ６：２本の微生物検出用試験管２２それぞれを微生物検出部４０の設置ステージ４２に設置し、微生物検出用試験管２２内の各試薬の吸光度を測定する。これにより、加熱など細胞膜を破壊する処理を行うことなく、細胞培養用の培養液中に微生物が存在したか否かを検出することができる（Ｓ４７）。
【００７１】
＜グラム陰性細菌高感度化実験＞
グラム陰性細菌のサンプルとしてエシェリキア・コリ（ＩＦＯ３３０１）、グラム陽性細菌のサンプルとしてバチルス・ズブチルス（ＩＦＯ３０３５）、そして真菌のサンプルとしてアスペルギウス・ニガー（ＩＦＯ６３４１）を用いて実験を行った。
【００７２】
実験はまず、各微生物の１０倍希釈系列の試料を作成し、それぞれの試料について５０μＬずつ３枚（真菌については１枚）のマイクロプレートに分注し、特に処理を行うことなく（未処理）試薬Ａと混合するグループ、加熱処理を行った後に試薬Ａと混合するグループ、乾燥処理を行った後に試薬Ａと混合するグループの３グループに分けた。各試料を試薬Ａと混合した後、ＴＥＣＡＮ社製のマイクロプレートリーダ（サンライズサーモ）を用いて、６３０ｎｍ吸光度変化を３０秒間隔で計測し、吸光度変化が１０ｍＯＤとなる値を閾値として、変化時間を計測した。
【００７３】
各希釈系列の細菌（生菌）数は各希釈系列の平板培養とそこから得られる検量線により確定した。加熱処理のグループは試料を１００℃で２０分間加熱したもの、乾燥処理のグループは試料を真空吸引しながら４０℃で２時間乾燥させたものに適宜水を入れて調整し、試薬Ａと混合した。
【００７４】
実験結果を表１に示す。
【表１】
2005318807.tif 000003
表１に示すように、グラム陽性細菌では未処理のものと加熱或いは乾燥処理したものとでは検出の感度に差は見られないが、グラム陰性細菌では未処理のものでは検出できなかった細菌数であっても、加熱或いは乾燥処理を行うことによって検出感度が向上し、グラム陽性細菌や真菌と同レベルまで検出感度が向上している。
従って、加熱或いは乾燥などの細胞膜を破壊する処理を行うことにより、試薬Ａ一種類で微生物の存在を確認することが可能であることが明らかになった。
【００７５】
＜そのほかの事項＞
本実施の形態では、細胞培養用の培養液中に含まれる微生物の検出方法について説明したが、微生物を検出する対象は細胞培養用の培養液に限定されるものではなく、食品の加工工程で用いられる洗浄水、ジュース、酒類など液体の食品、飲料物、衛生管理される環境中の空気（空気が流通するフィルタ）或いは、半導体用の洗浄水などでも良い。
【００７６】
また、試料濃縮部２０での微生物の捕集にエンドフロータイプのフィルタリング装置を用いたが、微生物の捕集には、平膜を用いても良いし、この平膜に炭素からなる多孔質電極を取り付けて電流を流すことにより、より効率的な微生物捕集も可能になる。このようなフィルタによる方法以外にも、遠心分離による方法、ビーズなどを用いた吸着による方法などでも微生物の捕集は可能である。
【００７７】
微生物培養用の培養液としては、ＧＰ液体培地を使用したが、ＳＣＤ液体培地、ＴＧ培地、サブロー・ブドウ糖培地、ブレインハートインフュージョン、ミューラーヒントン、普通ブイヨン、或いは、ブドウ糖ペプトンなどでも良い。ＧＰ液体培地、ＳＣＤ液体培地、ＴＧ培地、ミューラーヒントンなどの培養液を用いた場合には、微生物を培養した培養液を排出した後、微生物検出用試験管に純水を注入し、微生物検出用試験管を洗浄する工程を、試薬を投入する前に挿入した方が、より正確に検出することが可能となる。
【００７８】
真菌及び細菌についてもいくつか例を挙げたが、これ以外にも、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウモシスチス属、マラセジア属、デバリオマイセス属などに属する真菌、及び、バチスル属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、エシェリキア属、スタフィロコッカス属、レブシエラ属、セラチア属、シゲラ属、ビブリオ属、キャンピロバクター属、クロストリジウム属、エルシニア属などに属する細菌であれば、検出は十分可能である。
【００７９】
微生物検出部は、６３０ｎｍの光源を用いて試薬の吸光度を測定する装置としたが、光源の波長は試薬の色調変化を測定できる帯域であれば６３０ｎｍに限定されず、測定方法も吸光度に限らず、蛍光度、或いは、反射光を測定する方法でも良い。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、細胞培養用の培養液中に含まれる微生物の検出のみならず、食品の加工工程で用いられる洗浄水、ジュース、酒類など液体の食品、飲料物、衛生管理される環境中の空気（空気が流通するフィルタ）或いは、半導体用の洗浄水など、微生物の検出が望まれるあらゆる流体（液体、気体）中から、短時間かつ高感度で検出することができる汎用的な微生物検出装置および検出方法である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】微生物検出システムのシステム概念図である。
【図２】試料濃縮部の装置構成を示す模式図である。
【図３】微生物の増殖過程を示すグラフである。
【図４】グラム陰性細菌の表層構造を示す模式図である。
【図５】微生物検出部の装置構成を示す模式図である。
【図６】本発明の実施例１における微生物検出方法を示すフローチャートである。
【図７】本発明の実施例２における微生物検出方法を示すフローチャートである。
【図８】本発明の実施例３における微生物検出方法を示すフローチャートである。
【図９】本発明の実施例４における微生物検出方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００８２】
１０    試料採取部
２０    試料濃縮部
２２    微生物検出用試験管
２３    排液タンク
２４    減圧ポンプ
２６    フィルタ
２８    排出バルブ
３０    試薬投入部
４０    微生物検出部
４２    設置ステージ
４４    光源
４６    ハーフミラー
４７    ミラー
４８    受光素子
４９    遮光チャンバ
５０    恒温槽
６０    制御部
７０    検出結果出力部
９０    グラム陰性細菌
９２    ペプチドグリカン
９４    外膜
９６    内膜（細胞質膜）
１００  微生物検出システム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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