(57)【要約】【課題】  販売用として取締当局により認可された非経口剤中に包含される成分のみを含む、医薬組成物で、向上したタンパク質安定性を提供すること。【解決手段】  ポリペプチド医薬及び、ポロキサマー界面活性剤単独、またはポロキサマー界面活性剤とポリソルベート界面活性剤との配合物を含む、安定性ならびに、凝集、粒子形成及び沈殿への抵抗性が改良された、ポリペプチド医薬組成物。安定化される好ましいポリペプチドは、殺菌性／浸透性増大（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）タンパク質、ＢＰＩの生物学的に活性を有する断片、ＢＰＩの生物学的に活性を有する類似体、及びＢＰＩの生物学的に活性を有する変異体である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリソルベート界面活性剤及びポロキサマー界面活性剤を配合して、ＢＰＩタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片、類似体もしくは変異体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９３年２月２日出願の、米国特許出願第０８／０１２，３６０号の、一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般には医薬組成物に関し、さらに詳細には、非経口用薬剤として用いるための、改良されたタンパク質及びポリペプチド医薬に関する。遺伝子工学技術の開発における近年の進歩により、多岐にわたる、生物学的に活性を有するポリペプチドを、薬剤として用いるために充分大量に入手することが可能となってきた。しかしながら、ポリペプチドは、種々の化学的手段及び、加熱または凍結に起因する変性を含む物理的手段によって、また、極端なｐＨに曝すことまたは他の化学的分解によって、特定の形態化（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を受けやすく、そして生物学的活性を喪失しやすい。
【０００３】
特定の形態化及び生物学的活性の喪失は、また、物理的振動ならびに、溶液中及び貯蔵バイアル瓶内における液−気境界面でのポリペプチド分子の相互作用の結果惹起こされることもありうる。ポリペプチド分子は、高次構造が破壊され（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）大気に疎水性基を出し、水相に親水性基を浸漬させて、気−液境界面に吸着すると考えられる。界面において一旦そのような配置となると、ポリペプチド分子は凝集、粒子形成及び沈殿をなしやすくなる。また、気−液及び固−液境界面に吸着したポリペプチド分子には、輸送やその他の行程中の振動により引き起こされるような、境界面の圧縮−伸張の際に、さらなるコンホメーション変化が惹起こされることもありうる。このような振動の結果、タンパク質が絡み合い、凝集し、粒子を形成しそして究極的には他の吸着されたタンパク質とともに沈殿することとなりうる。
【０００４】
界面における変性に起因する粒子形成は、貯蔵バイアル瓶の寸法を適切に選択することによって、及びそれらバイアル瓶内の空気の容量（頭部空間）を最小とすることによって、幾分かは制御することができる。このことに関連し、部分的に充填した容器の場合に揺動により誘導される沈殿について最悪の事例が示されるのである。
【０００５】
粒子形成は、溶液−気境界面での表面張力を低減するために、タンパク質を含有する組成物中に界面活性剤を組み込むことによって制御することも可能である。界面活性剤または乳化剤による医薬品の古典的な安定化法で、界面活性剤分子内に親水性及び疎水性の両方の性質を包含する分子群の両親媒性の性質に焦点が向けられてきている。かくして、先行技術により、相溶剤（ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｚｅｒ）として適切な界面活性剤を選択することにより、水中油型または油中水型などの、混和しない分子の安定な溶液を作製できることが教示されている。１つの例としては、ポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ社、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いたダイズ油の安定な乳化が挙げられる。他の例としては、脂溶性ビタミンＡ、Ｅ及びＫを、経口及び経管経路による投与用の水溶液中に乳化するための、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）の使用である。Ｋｒａｎｚら、「Ｓｕｇａｒ  Ａｌｃｏｈｏｌｓ‐ＸＸＶＩＩＩ、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ，Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ＴＷＥＥＮ  ８０，」、Ｂｕｌｌ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄ．，Ｕ．ｏｆ  ＭＤ．、３６巻、４８頁（１９５１）による研究は、ＵＳＰ／ＮＦ要件が米国Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ＸＸＩＩに確立されている薬剤成分として、ポリソルベート８０が掲載されることへと導く基盤となる研究となるものであった。
【０００６】
本発明にとって興味深いのは、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、４５巻、３号、１６０〜１６５頁（１９９１）に記載の、抗体をベースとした産物の製剤の安定化のためにポリソルベート８０を使用することに関する研究である。この研究では、安定化に必要な界面活性剤の量は、表面張力を減じるために必要な理論的最低値を越えることが開示された。この研究ではさらに、理論的最低値を越える過剰の界面活性剤が必要であることは、（１）無作意の振動の際に揺動する境界面上で完全な保護層を維持するのに必要な濃度、及び（２）緩くタンパク質と会合する界面活性剤及び容器壁につく界面活性剤、に寄与する可能性があることが示された。
【０００７】
ヒト体内への注射用の非経口用組成物に組み込まれうる界面活性剤のタイプ及び特定の範疇は、取締要件のために限定される。歴史的に使用され、米国Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ＸＸＩＩに掲げられて一般に認可されている界面活性剤には、ポロキサマー及びポリソルベートポリマーが包含される。しかしながら、これらのいずれも単独で０．１％以下の濃度で用いた場合には、医薬組成物を完全に安定化するに至らないかもしれない。界面活性剤の濃度を上昇させると、毒性作用の危険性の増大、溶血の早期襲来、及び、両方とも血液補体活性化に関与する好中球及び血小板において観察される変化、が問われるかもしれない。認可された非経口用溶液中のポロキサマー１８８に対する最高安全濃度は、それが血液置換剤として限定した投与量用いる場合であって、血流中で少なくとも１０倍希釈される場合、２．７％である。同様に、ポリソルベート８０は、２０年にわたって非経口用溶液で認可されているのであるが、１００  ｍＬ以上の溶液量中、０．１％を越える濃度で用いられることはめったにない。Ｋｒａｎｔｚら（前出）は、０．１％のポリソルベート濃度で、イヌにおいて９０分で溶血が襲来することを認めている。１％を越える濃度でのポリソルベート８０の使用が、新生児死に関係している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、当該技術分野において、安全であると考えられていて、販売用として取締当局により認可された非経口剤中に包含される成分のみを含む、医薬組成物で、向上したタンパク質安定性を提供する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ポリペプチドの医薬組成物に関し、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）界面活性剤及びポロキサマー界面活性剤とポリソルベート界面活性剤との配合物によって、殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）、ＢＰＩの生物学的に活性を有する断片、ＢＰＩの生物学的に活性を有する類似体、及びＢＰＩの生物学的に活性を有する変異体（組み換え法または組み換えによらない方法のいずれかにより生産されたもの）の、水溶液中での可溶性／安定性が増大せしめられるという発見に関するものである。本発明は特に、ＢＰＩの生物学的に活性を有するアミノ末端断片またはその類似体及び変異体である、殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）の可溶化／安定化を提供する。ｒＢＰＩ２３と称したものまたはＢＰＩのおよそ最初の１９３からおよそ最初の１９９までのアミノ末端アミノ酸残基を含むいずれかのアミノ末端断片などの、ＢＰＩのアミノ末端断片は、水溶性溶液中で安定性を特に喪失しやすいと考えられている。
【００１０】
本発明は殊に、特定の２つのタイプの界面活性剤を配合することにより、いずれかの界面活性剤単独の場合に比して、医薬組成物におけるタンパク質の安定性の驚くばかりの向上が提供されるという発見に関するものである。特に、ポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体）界面活性剤とポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）界面活性剤との配合物を含む医薬組成物により、タンパク質医薬剤の安定性ならびに凝集、粒子形成及び沈殿への抵抗性が改良されることが見出されている。これら２つのタイプの界面活性剤の配合により、いずれかの界面活性剤単独の場合に比して、改良された安定性ならびに、界面における変性、凝集、粒子形成及び沈殿への改良された抵抗性が提供される。
【００１１】
ポロキサマー界面活性剤成分は、好ましくは、約０．０１重量％〜約１重量％の濃度で存在し、０．１重量％〜０．２重量％の濃度が、２  ｍｇ／ｍＬ以下のタンパク質を含むタンパク質溶液を安定化するためには好ましい。ポリソルベート界面活性剤成分は、好ましくは、約０．０００５重量％〜約１重量％の濃度で存在し、０．００２重量％の濃度が好ましい。最も好ましいのは、０．１重量％〜０．２重量％のポロキサマー１８８及び０．００２重量％のポリソルベート８０を含む配合である。この配合は、殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）などの、分解に対して極めて感受性の高いタンパク質の粒子形成を防ぐのに、特に有用であるが、他のポリペプチド医薬の安定性を促進するうえでも有用である。ポロキサマー及びポリソルベート界面活性剤の配合物は、それだけかまたは追加の界面活性剤と組み合わせて用いられてもよいことが、企図される。さらに、本発明は、単一のポロキサマー界面活性剤を単一のポリソルベート界面活性剤と配合することに限定せず、１または複数のポロキサマー界面活性剤を１または複数のポリソルベート界面活性剤と配合することが包含されうる。
【００１２】
本発明のさらなる特徴は、ＢＰＩタンパク質、またはＢＰＩタンパク質の生物学的に活性を有する断片、類似体、または変異体（組み換え法または組み換えによらない方法のいずれかにより生産されたもの）の水溶液を含む組成物の可溶化／安定化のために、ポロキサマー界面活性剤が特に有用であるという発見に関する。本発明は、このようなポリペプチドをポロキサマー界面活性剤に接触せしめることによりポリペプチドを可溶化／安定化する方法を提供する。本発明の理論によって縛られることなしに、ポロキサマー界面活性剤が、水溶液の表面張力を低下させることを包含する機構によってではなく、高温にて、高次構造が破壊したＢＰＩタンパク質分子及び部分的に高次構造が破壊したＢＰＩタンパク質分子を安定化することならびにこれらの分子の沈殿を妨げることによって、ＢＰＩタンパク質産物を安定化すると考えらる。
【００１３】
好ましいポロキサマー界面活性剤は、約１４よりも大であるＨＬＢ値、及び室温にて、０．１％の濃度の水溶液で測定した場合、１０〜７０  ｍＮ／ｍ  の間の表面張力であることによりその特徴が表される。より好ましいのは、約２５〜３５の間のＨＬＢ値を有し、室温にて、０．１％の濃度の水溶液で測定した場合、３０〜５２  ｍＮ／ｍ  の間の表面張力を有する、ポロキサマー界面活性剤である。最も好ましいのは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｄｏｔｔｅ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）として市販されているポロキサマー１８８であり、これは、５０  ｍＮ／ｍの表面張力により及び２９のＨＬＢ値により、その特徴が表される。
【００１４】
好ましいポリソルベート界面活性剤は、室温にて、０．１％の濃度の水溶液で測定した場合、好ましくは１０〜７０  ｍＮ／ｍ  の間の表面張力を有する。さらに好ましくは、ポリソルベート界面活性剤は、約１５の親水性／親油性平衡（ＨＬＢ）値により及び室温にて、０．１％の濃度の水溶液で測定した場合、４０〜５０  ｍＮ／ｍ  の間の表面張力であることにより、その特徴が表される。最も好ましいのは、ポリソルベート８０（ソルビタン  モノ−９−オクタデカノエート）であり、これはＴＷＥＥＮ  ８０（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）として市販されている。
【００１５】
従って、１つの局面において本発明は、ポリソルベート界面活性剤及びポロキサマー界面活性剤を配合して、BPIタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片、類似体もしくは変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
１つの実施形態において、前記ポロキサマー界面活性剤は、約14よりも大であるHLB値、及び室温にて、0.1％の濃度で測定した場合に10〜70mN/m の間の表面張力を有することによりその特徴が表される。
【００１７】
別の実施形態において、前記ポロキサマー界面活性剤はポロキサマー188である。
【００１８】
別の実施形態において、前記ポリソルベート界面活性剤は、約10よりも大であるHLB値、及び室温にて、0.1％の濃度で測定した場合に10〜70mN/m の間の表面張力を有することによりその特徴が表される。
【００１９】
別の実施形態において、前記ポリソルベート界面活性剤がポリソルベート80である。
【００２０】
別の実施形態において、前記ポロキサマー界面活性剤は、約0.01重量％〜約１重量％の濃度で存在する。
【００２１】
別の実施形態において、前記ポリソルベート界面活性剤は、約0.0005重量％〜約１重量％の濃度で存在する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、ポリソルベート界面活性剤及びポロキサマー界面活性剤を配合して、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するアミノ末端断片またはその類似体もしくは変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、ポロキサマー界面活性剤を配合して、BPIタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片、類似体もしくは変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
１つの実施形態において、前記ポロキサマー界面活性剤は、約14よりも大であるHLB値、及び室温にて、0.1％の濃度で測定した場合に10〜70mN/m の間の表面張力を有することによりその特徴が表される。
【００２５】
別の実施形態において、前記ポロキサマー界面活性剤はポロキサマー188である。
【００２６】
さらに別の局面において、本発明は、ポロキサマー界面活性剤を配合して、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するアミノ末端断片またはその類似体もしくは変異体を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明のさらなる詳細については後述する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、販売用として取締当局により認可された非経口剤中に包含される成分のみを含む、医薬組成物で、向上したタンパク質安定性を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（詳細な説明）
本発明は、ポリペプチド医薬の安定性を維持し、そのような生物学的に活性を有するポリペプチドの界面における変性を妨げるための、改良された方法及び材料を提供する。特に、本発明は、２つの特定のタイプの界面活性剤分子の配合によって、ポリペプチド医薬の界面における変性からの安定化を、共同的に改良することが提供されるという発見に関する。本発明はまた、ポロキサマー界面活性剤が、ＢＰＩ関連タンパク質の可溶化／安定化において独自の特性を有するという発見に関するものでもある。本発明の特定の実施態様は、特に変性及び粒子形成しやすい、殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）ならびにその生物学的に活性を有する断片及び／または類似体もしくは変異体の安定化に関するものであるが、本発明の用途はあらゆるタンパク質及びポリペプチド医薬に一般的に拡大されるものである。本発明を用いると有用なＢＰＩならびにその活性を有する断片及び類似体には、米国特許第５，１９８，５４１号明細書に記載のような、組み換えにより生産されたタンパク質が包含される。１９９２年５月１９日出願の米国特許出願第０７／８８５，９１１号の一部継続出願である、１９９３年５月１９日出願の、共有である、Ｔｈｅｏｆａｎらの同時係属出願、米国特許出願第０８／０６４，６９３号明細書は、アミノ末端で、ＢＰＩタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片を含み、ＢＰＩタンパク質の生物学的活性と同様の活性を保持している、ＢＰＩタンパク質の変異体である、ＢＰＩ−イムノグロブリン融合タンパク質を述べている。特に好ましいＢＰＩ材料には、「安定な殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）産物及びそれを含有する組成物（Ｓｔａｂｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ−Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ）」という発明の名称である、１９９３年２月２日出願の、共有である、Ｔｈｅｏｆａｎらの同時係属出願、米国特許出願第０８／０１３，８０１号明細書の方法に従って生産された組み換えにより生産したポリペプチドが包含される。好ましいＢＰＩ断片は、Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４巻、９５０５〜９５０９頁（１９８９）に記載の成熟ヒトＢＰＩ分子で、１８５位の残基がＧｒａｙにより特定されたリジンではなくグルタミン酸であることを除いては、前記ＢＰＩ分子のアミノ末端アミノ酸残基のおよそ１〜１９９位またはおよそ１〜１９３位により、その特徴が表される。ＢＰＩのアミノ酸の１〜１９９位をコードするＤＮＡの組み換え発現産物は、ｒＢＰＩ２３と称されている。ＢＰＩのアミノ酸の１〜１９３位をコードするＤＮＡの組み換え発現産物は、ｒＢＰＩ（１−１９３）と称されている。好ましいＢＰＩ断片類似体は、１８５位の残基がリジンではなくグルタミン酸であり、１３２位のシステインがアラニンなどのシステインではない残基で置換されていること���除いては、Ｇｒａｙに記載されている、最初の１９３アミノ酸残基を含むものである。このようなタンパク質は、ｒＢＰＩ２１ΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２と称される。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
本実施例において、種々の界面活性剤系の試験を行って、ポリペプチド医薬（ｒＢＰＩ２３）の界面における安定化に対する有用性を確定した。ｒＢＰＩ２３は、クエン酸緩衝性生理食塩水（０．０２  Ｍクエン酸、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０）中に、１ｍｇ／ｍＬの濃度で供した。次いで、種々の界面活性剤を、これら界面活性剤の安定化剤としての有用性を確定するために、この調製物に添加した。
【００３１】
この試験では、成熟ヒトＢＰＩ分子の最初の１９９アミノ酸のおよそ１位からおよそ１９９位によりその特徴が表され、１９９３年２月２日出願の、Ｔｈｅｏｆａｎらの米国特許出願第０８／０１３，８０１号明細書の方法に従って生産された、ｒＢＰＩ２３［ＢＲ−１］を、６  ｍＬの密封した滅菌成形ガラスバイアル瓶（総取容量８．４  ｍＬ、Ｗｈｅａｔｏｎ）中、所望の製剤化用緩衝液の溶液とし、５  ｍＬを手作業で充填した。被検バイアル瓶は、平床（ｆｌａｔ  ｂｅｄ）振盪機（Ｓ／ＰローターＶ）上に水平に置き、テープで振盪機に固定した。次いでバイアル瓶を、室温にて１５０ｒｐｍで振動させた。      
【００３２】
０時間、２〜４時間、及び１８時間で、２１ゲージの針を取り付けた１  ｍＬのシリンジを用いて、バイオセイフティーキャビネット内で１５０μｌの試料を採取した。開始時、工程中、及び最終時点の、可溶性ｒＢＰＩ２３濃度を、イオン交換ＨＰＬＣ分析により定量し、溶液の濁度の目視による観察結果も記録した。結果を表１に示すが、ここで、容認しうる安定性は、振動試験後の目視による観察によって確定した。
【００３３】
単一の界面活性剤を含むタンパク質調製物の試験によると、オクトキシノール（ｏｃｔｏｘｙｎｏｌ）−９（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ）、ローレス（ｌａｕｒｅｔｈ）−４（ＢＲＩＪ  ３０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｎｓ）、ポロキサマー４０３（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｐ１２３、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ）及びテロメレ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）Ｂモノエーテルとポリエチレングリコール（ＺＯＮＹＬ  ＦＳＯ−１００、Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ）を使用した場合に、良好な結果が示された。これらの界面活性剤は表面張力を低いレベルに下げることができるものの、毒性作用が疑われるため及び生物学的適合性が未知であるために、認可されている非経口医薬には包含されていない。
【００３４】
表１に示す別の界面活性剤試験により、３５  ｍＮ／ｍ  を下回る表面張力を生み出す界面活性剤は、０．１％の界面活性剤濃度でｒＢＰＩを安定化することができることが示される。この実施例では、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ  ８０）及びポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８）のいずれもが、用いた振動試験の条件下で、単独ではタンパク質調製物を安定化することができなかったことがさらに示される。しかしながら、ポリソルベート８０を入れると、追加の可溶化剤の助けなしには容易に水に溶けないＢＲＩＪ  ３０の濁った溶液を透明にする作用があった。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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（実施例２）
本実施例においては、ｒＢＰＩ２３調製物を安定化すべく、単独で及び組み合わせて種々の界面活性剤を用いて、実施例１の方法に従いさらなる比較を実施した。結果を以下の表２に示すが、ここでは、振動試験の後に、目視による観察で容認しうる安定性を確定した。その結果、特に実験５２〜５８の結果から、ポロキサマー１８８及びポリソルベート８０の配合は、試験の条件下で、いずれの界面活性剤とも単独ではそれに匹敵するほどに安定化することができない濃度で、ｒＢＰＩ２３組成物を安定化するのに、予期せざるほど有用であることが示されている。実験により、その２つの界面活性剤の濃度を様々に組み合わせると、共同（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）作用を呈することが示されるが、１  ｍｇ／ｍＬ濃度のｒＢＰＩ２３に特に好ましい配合は、クエン酸緩衝性生理食塩水（０．０２  Ｍクエン酸、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０）中で０．１重量％ポロキサマー１８８及び０．００１重量％ポリソルベート８０を有するものであることが示される。０．００１％を下回る濃度でポリソルベート８０を用いた結果、１８時間の振動の後すぐに濁りが生じたが、イオン交換ＨＰＬＣ  ＭＡ７Ｃカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により定量したタンパク質の減少は、ごくわずかであった。それにかかわらず、濁りは外見上容認されえず、安定性の低減を示唆するものである。０．００５％以上の濃度でポリソルベート８０を用いて試験をすると、すべて１８時間の振動後まですぐれた安定性が得られ、ＨＰＬＣで測定するとタンパク質喪失の兆候もほとんどない。それでも、ポリソルベート８０をこのように高濃度用いると、４℃及び大気室温またはそれを上回るストレス温度で長期間貯蔵する間に、安定性が低下するかもしれない。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
【表５】
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【００４０】
【表６】
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【００４１】
【表７】
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【００４２】
【表８】
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【００４３】
【表９】
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【００４４】
【表１０】
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【００４５】
【表１１】
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【００４６】
【表１２】
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（実施例３）
本実施例では、Ｐｉｅｒｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．＆  Ｍｅｄ．１３３巻、７９０頁（１９７０）に従うアクチノマイシン−Ｄ感作マウスモデルにおける、本発明の好ましい製剤を用いて製剤化した場合と、製剤化しない場合で、ｒＢＰＩ２３の効果を比較するために研究を行った。本実施例においては、静脈注射によってＩＣＲマウスにアクチノマイシン−Ｄ（８００μｇ／ｋｇ）を投与した。その後即座に、成熟ヒトＢＰＩ分子の最初の１９９アミノ酸の、およそ１位からおよそ１９９位によりその特徴が表され、１９９３年２月２日出願のＴｈｅｏｆａｎらの米国特許出願第０８／０１３，８０１号明細書の方法に従って生産された、ｒＢＰＩ２３［ＢＲ−１］の、種々の投与量のうちいずれかの量を、クエン酸緩衝性生理食塩水（０．２  Ｍクエン酸、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０）中、１  ｍｇ／ｍＬの濃度にて、それぞれ１５匹のマウスの群に各々注射した。マウスへの注射は、０．０３、０．１、１．０及び３．０  ｍｇ／ｋｇの投与量で行った。コントロールとして、何匹かのマウスに、ポロキサマー及びポリソルベート界面活性剤を加えて、または加えないで製剤化用緩衝液を与えた。７日間にわたって死亡数を記録した。
【００４７】
結果を図１及び２に示す。図１には、緩衝液群及び３．０  ｍｇ／ｋｇのｒＢＰＩ２３処置群における、各研究日数での生残マウス数を示す。緩衝液群（ポロキサマー及びポリソルベート界面活性剤を加えたもの、または加えないもの）では双方とも、死亡率は全体を通すと８０％であった。対照的に、賦形剤存在下でのｒＢＰＩ２３では、緩衝液または賦形剤を加えないｒＢＰＩ２３のいずれよりも、格段に効能が示された。図２には、７日目の異なる投与量群についてのデータ（最終的な生残数）を要約する。０．１ｍｇ／ｋｇの投与量レベルに始まり、好ましい界面活性剤を含む製剤に製剤化されたｒＢＰＩ２３では、添加した賦形剤を加えなかったｒＢＰＩ２３の場合よりもＬＰＳの致死作用に対する防御能は有意に高かった（ｐ＜０．０５またはそれを凌ぐ）。
【００４８】
（実施例４）
本実施例では、本発明の好ましい界面活性剤製剤を加えた場合、または加えない場合の、種々のｒＢＰＩ含有医薬組成物の濁度を調べる実験を行った。ここで濁度とは、医薬組成物で高次構造が破壊される（すなわち、タンパク質の第３次構造を喪失する）こと及び／または粒子形成（個々のタンパク質間で相互作用してより大きな（＞  １０μｍ）粒子を形成する）することとなる傾向性を言及するものである。試験を行った医薬組成物は、クエン酸緩衝液（２０  ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ  ５．０）中または０．１％ポロキサマー１８８及び０．００２％ポリソルベート８０を含有するクエン酸緩衝液中のいずれかに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２、または、１９９３年２月２日出願の、共有であり同時係属出願である米国特許出願第０８／０１３，８０１号明細書に従って生産された、種々のｒＢＰＩ２３試料のいずれかを、含有するものであった。
【００４９】
試料を分析して、温度を高めつつ且つｐＨ  ７．０にて、全時間にわたり、濁度に対する抵抗性を調べた。分析前にすべての試料を、ｐＨ  ７．０の５０  ｍＭリン酸カリウム溶液で０．１  ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。再循環水浴につないだ温度制御キュベットホルダーを取り付けた、Ｓｈｉｍａｚｕ  ＵＶ−１６０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計用の石英のキュベットに試料を入れて、濁度を測定した。キュベットホルダーを５７℃に平衡化したうえで、２８０  ｎｍにおける吸光度を測定して、試料が正しい濃度に希釈されているか否かを確認した。これに続いて、１時間のあいだ、２分ごとに３５０  ｎｍにおける試料の吸光度を測定し、全時間にわたる吸光度の変化を調べた。
【００５０】
結果を図３に表すが、ここで、濁度の変化の割合がより低いと（すなわち、全時間にわたる吸光度の増大の割合がより低いと）、粒子形成に対しての安定性の増大を示唆することが示される。図３に示すように、界面活性剤の好ましい配合物を添加することで、試験を行った組成物すべての安定性（粒子形成に対する抵抗性）が増大せしめられる結果となった。さらに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２及びｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２は、野生型の組成物［ｒＢＰＩ２３］に比較して、大幅に改良された粒子形成に対する抵抗性を呈した。
【００５１】
（実施例５）
本実施例では、Ｋｒｕｓｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｔｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ  Ｋ１０ＳＴ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｌａｔｅ  に述べられた手法に従って、ポリソルベート及びポロキサマー界面活性剤またはそれら界面活性剤の配合物の、ＢＰＩタンパク質産物ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの溶液中での表面張力を測定した。表面張力の減少は、界面活性剤の界面活性の増大を示唆するものであり、これが、界面活性剤がタンパク質を安定化する機構であると考えられている。これらの手法により、ポロキサマー界面活性剤が、前記とは異なり、予期せざる機構によって、有利な結果を提供することが確証された。
【００５２】
詳細には、非製剤化ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ（ロット３０２１６）の２  ｍｇ／ｍＬ溶液を、２０  ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ５．０を用いて希釈して１  ｍｇ／ｍＬ溶液とした。この溶液１５  ｍＬを、ミニ撹拌子を入れた５０  ｍＬのガラスビーカーに入れた。
【００５３】
界面活性剤ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０、または両者を配合した溶液を、上限０．１０％まで、増量しながら添加した。それぞれの表面張力を測定する前に、プラチナプレートを、ガスバーナーの還元帯（青色炎）の上でプレートが正しく赤変し始めるまで、加熱した。プラチナプレートは、裏返しながら約１０〜１５秒間加熱して、次いで、装置の中に戻して吊した。界面活性剤添加溶液はそれぞれ、磁力撹拌器を用いて穏やかに混合し、その溶液を、４．６℃に平衡化したサーモスタット容器上に２分間置いた。表面張力の値は、５分後に読み取った。
【００５４】
本実験の最初の第１部では、緩衝液中、界面活性剤単独の場合の界面活性を評価した。クエン酸生理食塩水緩衝液（２０  ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ  ５．０）をベースラインに用い、界面活性剤を増量しながら添加した。図４は界面活性剤濃度に対する表面張力の依存関係のプロットであり、それに対応するデータを表３に表す。白抜きの四角形は、ポロキサマー１８８の濃度を変動させた場合のクエン酸生理食塩水緩衝液についての結果を表し、一方黒塗りの円形は、ポリソルベート８０の濃度を変動させた場合の同様の緩衝液についての結果を表す。クエン酸生理食塩水緩衝溶液単独では、水に類似して、４．６℃にて約７５  ｍＮ／ｍの表面張力を有していた。界面活性剤の濃度を増大させるにつれ、緩衝溶液の表面張力は低減していった。０．１０％のポロキサマー１８８を用いると、溶液の表面張力は５５  ｍＮ／ｍであった。他方、０．１０％のポリソルベート８０を用いると、溶液の表面張力は４５  ｍＮ／ｍとなった。表面張力の低下は、界面活性剤の界面活性の増大を示唆する。すなわち、表面張力が低下するほど、界面活性は増大する。この結果から、ポロキサマー１８８よりもポリソルベート８０は、より界面活性が強いことが示唆される。
【００５５】
実験の第２部では、界面活性剤の存在下でのｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの界面活性を評価した。ｐＨ  ５．０のクエン酸生理食塩水緩衝液中、１  ｍｇ／ｍＬで、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓは界面活性を有し、その表面張力は４．６℃にて約５４  ｍＮ／ｍであった。０．０００５％までポリソルベート８０（ＰＳ８０）を単独で添加しても、いずれのｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の表面張力も変化しなかった（図４、黒塗りの三角形）。ポリソルベート８０の濃度が０．０００５％を越えると、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの表面張力は、ＰＳ８０単独の（ＢＰＩを含まない）緩衝液の場合に追随し、すなわち、ポリソルベート８０の濃度が徐々に増大するにつれて溶液の表面張力は低下する。ＰＳ８０単独の緩衝液については、ＰＳ８０濃度を０．０００５％から高めた場合に、５４  ｍＮ／ｍの表面張力に達した。これらの結果により、ＰＳ８０濃度が０．０００５％を下回る場合、溶液の界面活性はｒＢＰＩ２１Δｃｙｓが支配することが示唆される。他方、ＰＳ８０濃度が０．０００５％を上回ると、溶液の界面活性はポリソルベート８０により調節を受ける。ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓに、０．１０％までポロキサマー１８８（Ｆ６８）を単独で添加しても、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の界面活性は有意に変化しなかった（図４、白抜きの三角形）。
【００５６】
【表１３】
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【００５７】
【表１４】
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（実施例６）
分別熱量走査測定（ＤＳＣ）によりタンパク質試料を分析して、タンパク質の高次構造破壊（すなわち変性）を調べた。ＤＳＣ分析用の出発材料は、表面張力測定において用いた材料と同様であった。ポロキサマー１８８、ポリソルベート８０または両者の配合物の、界面活性剤濃度を変動させて、一連のｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液を調製し、緩衝液（２０  ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０  ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ  ５．０）で希釈して、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの最終濃度を１  ｍｇ／ｍＬとした。ＤＳＣに対するブランクとして利用するため、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の場合と同じ濃度の界面活性剤を用いて、一連の緩衝溶液も調製した。各溶液は濾過し、２  ｍＬの滅菌プラスチックバイアル瓶の中に入れた。この試料はＤＳＣ分析に付すまで、４℃の冷却箱に詰めておいた。
【００５８】
大気温から約９０℃まで、毎分１℃の割合で徐々に溶液の温度を高めるにつれて、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの挙動を評価した。温度が高まるにつれ、２つのイベントが起こる。第１のイベントは高次構造破壊反応であり、この反応は吸熱性であって、走査線中、上向きのピークによって表される。第２のイベントは沈殿であり、これは発熱性であって、走査線中、下向きのピークによって表される。図５、６及び８〜１０に表す走査線において、データの分析を容易にするために、各走査線を並置している（ｏｆｆｓｅｔ）。界面活性剤を含有しないｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液においては（図５、走査線１）、６５℃におけるタンパク質の高次構造破壊に続き、その直後に第２のイベントであるタンパク質の沈殿が６６〜６７℃で生じている。
０．００１％〜０．０１％の範囲の低い濃度でポロキサマー１８８（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８）を用いると、高次構造破壊及び沈殿のイベントは、界面活性剤を含まないｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の場合に類似しており（図５、走査線２〜５）、すなわち、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓで高次構造が破壊されると直ちに沈殿が生じる。ポロキサマー１８８を０．０５％を越える濃度で用いると、やはり６５℃にてｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの高次構造破壊は起こるが、８５℃の温度に達するまで沈殿は生じない（図５、走査線６）。図６では、ポロキサマー１８８濃度が０．０１％〜０．０５％の間では、高次構造が破壊したＢＰＩの沈殿が徐々に遅延するよう移行していく。これらの結果より、ポロキサマー１８８が０．０１％より高濃度である場合、高次構造が破壊したｒＢＰＩ２１Δｃｙｓは安定化されえ、沈殿の発生は遅延することが示唆される。図７に、界面活性剤（ポロキサマー１８８）濃度に対する変性及び沈殿温度の、依存関係のプロットを示す。ポロキサマー１８８の作用は、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓが沈殿するのをより高温にまで遅延させることであり、Ｔｍ（変性温度）及びΔＨ（変性のエネルギー）は変化しなかったので、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの本来の構造を安定化することではないようである。
１％までの濃度でポリソルベート８０を用いて製剤化したｒＢＰＩ２１Δｃｙｓを、同様に分析した。等温曲線は、界面活性剤を加えないｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液のものと類似していた（図８：走査線１及び８〜１３、図９：走査線１１、１２）。ポリソルベート８０は高温で溶液中のｒＢＰＩ２１Δｃｙｓを維持しなかった。従って、高次構造が破壊したｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの安定化は、ポロキサマー１８８において独自のものであった。
ポロキサマー１８８及びポリソルベート８０を配合して用いた、２つの製剤、すなわち、０．１％Ｆ６８／０．００１％ＰＳ８０及び０．１％Ｆ６８／０．００２％ＰＳ８０は、０．０５％及び０．１％のＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８を含有するｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの場合と同様の走査線プロファイルを示し、６５℃で高次構造が破壊し、８５℃で沈殿した（図８：走査線１４、１５）。
ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの崩壊の挙動（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調べることに加えて、高次構造破壊が可逆的なプロセスであるか否かを調べるために、０．０５％及び０．１０％のポロキサマー１８８を含有するｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ製剤を用いて再走査を行った。ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の温度は、まず、７５℃（変性／高次構造破壊後であるが沈殿前の温度）に上げ、その後、走査を繰り返すために冷却した。図１０に、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓにポロキサマー１８８を添加することによって高次構造破壊が可逆的とはならないことが示される。プロファイルＡ５，１及びＡ６，１は、７５℃までの走査を示し、一方プロファイルＡ５，２及びＡ６，２は７５℃から系を冷却した後繰り返して行った走査を示す。高次構造破壊が可逆的なプロセスであれば、６及び７の走査プロファイルが得られるはずである。
前記の実験結果により、ポロキサマー界面活性剤単独で、溶液中のＢＰＩ関連ポリペプチドを安定化すること及び、水溶液の表面張力の調節に関わるものではないと考えられる機構により沈殿の発生を遅延させることができるということが、立証される。ポリソルベート８０などの他の界面活性剤は沈殿の現象に影響を及ぼさず、水溶液の表面張力の調節に関わるのであるから、前記したポロキサマーの特性はポロキサマー独自のものである。
【００５９】
（実施例７）
輸送の際のｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの沈殿の程度を、水平振盪機の速度を調整することにより、実験室でシミュレートした。陸上輸送を５サイクル行う間に、非製剤化（界面活性剤を含まない）ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの約７０％が沈殿した。その後も、平床振盪機の速度（ｒｐｍ）を変えることで振動試験を継続し、その結果、振動試験に付された非製剤化ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの７０〜９０％が沈殿した。４℃にて１８時間、１１０  ｒｐｍ以下で平床振盪機上で非製剤化産物を振動させた場合、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓは沈殿しなかった。１４０  ｒｐｍでの振動で（実施例１及び２における１５０  ｒｐｍでの振動よりむしろ）、陸上輸送を５サイクル行う間に起きる揺れ（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）に最も近い状態がシミュレートされる。バイアル瓶内での液体フローの動力学における変化が、１４０  ｒｐｍと１５０  ｒｐｍとでは実質的に異なる。種々の濃度で界面活性剤を配合して含有する組成物を、１４０  ｒｐｍの振動条件を用いてスクリーニングした。そこで得られた結果を表４に示す。沈殿からの保護のために至適な界面活性剤濃度は、０．２％ポロキサマー１８８に加えて０．００２％ポリソルベート８０、及び０．１５％ポロキサマー１８８に加えて０．００５％ポリソルベート８０であることが確定された。
【００６０】
【表１５】
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【００６１】
【表１６】
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前記データに基づけば、４℃にて貯蔵される、２  ｍｇ／ｍＬのｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ用の好ましい製剤は、５  ｍＭクエン酸、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、０．２％ポロキサマー１８８及び０．００２％ポリソルベート８０を含有するものであろう。４℃にて貯蔵される、２  ｍｇ／ｍｌのｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ用の、それに代わる製剤は、５  ｍＭクエン酸、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０、０．１５％ポロキサマー１８８及び０．００５％ポリソルベート８０を含有するものであろう。
【００６２】
要約すると、凝集／沈殿はタンパク質の不安定性の主たる原因の１つであって、気−液境界面にあるタンパク質で高次構造が破壊し、疎水性ドメインを曝す際に生じうるものである。保護されないままであれば、タンパク質は、曝された疎水性ドメインの相互作用を介して自己会合し、その結果凝集及び／または沈殿が生じる。本発明の界面活性剤及び界面活性剤の配合物を用いれば、タンパク質は２つの経路で安定化されうる。第１に、気−液境界面で曝された疎水性領域が、ポロキサマー界面活性剤により防護（ｓｈｉｅｌｄ）される。第２に、溶液の界面活性を通例のように調節することを介して、ポリソルベート界面活性剤により付加的な安定化が提供されうる。
【００６３】
当業者であれば、前記した発明に数多くの修飾や変更を想到することが予期される。従って、本発明には、添付の特許請求の範囲に表した限定のみ、課されるべきであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、アクチノマイシン−Ｄ感作マウスモデルの、経時的な生残の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、アクチノマイシン−Ｄマウスモデルにおける、ＢＰＩ投与量に従う生残の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の好ましい界面活性剤を用いてまたは用いないで、種々のＢＰＩタンパク質の濁度を測定した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）及びポロキサマー１８８（Ｆ６８）の界面活性剤濃度を変動させて、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ溶液の表面張力を測定した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、種々の濃度の界面活性剤ポロキサマー１８８（Ｆ６８）を用いた、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの分別熱量走査測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）の結果を表す、一連のグラフである。
【図６】図６は、種々の濃度のポロキサマー１８８（Ｆ６８）を用いた、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの分別熱量走査測定の結果を表す、別の一連のグラフである。
【図７】図７は、界面活性剤ポロキサマー１８８（Ｆ６８）の濃度を変動させた場合の、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの変性及び沈殿温度のプロットである。
【図８】図８は、種々の濃度のポリソルベート８０（ＰＳ８０）単独または、０．１重量％のポロキサマー１８８（Ｆ６８）を配合して用いた、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの分別熱量走査測定の結果を表す、一連のグラフである。
【図９】図９は、２の異なる濃度で界面活性剤ポリソルベート８０（ＰＳ８０）を用いた、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓの分別熱量走査測定の結果を表すグラフの組である。
【図１０】図１０は、ｒＢＰＩ２１Δｃｙｓ及びポロキサマー１８８（Ｆ６８）の溶液を、変性／高次構造破壊の温度より高いが、沈殿温度よりは低い温度にまで加熱し、次いで走査を反復するために冷却した後の、分別熱量走査測定の結果を表すグラフの組である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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