(57)【要約】【課題】アミロイド線維化した微量のアミロイドβ蛋白質の核とテンプレート反応を起こしてアミロイド線維を形成し、線維を増量して増幅する天然ペプチドの探索、並びにそれに代り得る新たな人工ペプチドの設計、開発と、これらを用いたアミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法及びそれに用いる試薬、並びにアミロイドーシスに起因する疾病の検出方法及びそれに用いる試薬の提供。【解決手段】アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いるアミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法及びこれに用いる試薬、該ペプチドを含んでなる試薬を用いるアミロイドーシスに起因する疾病の検出方法及びこれに用いる試薬、並びにこれらに使用し得る新規な人工ペプチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［以下、Ａβ（１４−２３）と略す。］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化を増幅するための試薬。
【請求項２】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基の１乃至複数個が他の疎水性アミノ酸残基に置換されてなるペプチドである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基が全てＬｅｕに置換されるか、ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から３残基目或いは４残基目のＰｈｅを残して全てＬｅｕに置換されるか、又は疎水性部位のＮ末端側から３残基目がＡｌａに置換され、残りの疎水性残基が全てＬｅｕに置換されてなるペプチドである、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いることを特徴とする、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法。
【請求項５】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基の１乃至複数個が他の疎水性アミノ酸残基に置換されてなるペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基が全てＬｅｕに置換されるか、ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から３残基目或いは４残基目のＰｈｅを残して全てＬｅｕに置換されるか、又は疎水性部位のＮ末端側から３残基目がＡｌａに置換され、残りの疎水性残基が全てＬｅｕに置換されてなるペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる、アミロイドーシスに起因する疾病の検出用試薬。
【請求項８】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基の１乃至複数個が他の疎水性アミノ酸残基に置換されてなるペプチドである、請求項７に記載の検出用試薬。
【請求項９】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基が全てＬｅｕに置換されるか、ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から３残基目或いは４残基目のＰｈｅを残して全てＬｅｕに置換されるか、又は疎水性部位のＮ末端側から３残基目がＡｌａに置換され、残りの疎水性残基が全てＬｅｕに置換されてなるペプチドである、請求項７に記載の検出用試薬。
【請求項１０】
アミロイドーシスに起因する疾病がアルツハイマー病である請求項７〜９の何れかに記載の検出用試薬。
【請求項１１】
アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いることを特徴とする、アミロイドーシスに起因する疾病の検出方法。
【請求項１２】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基の１乃至複数個が他の疎水性アミノ酸残基に置換されてなるペプチドである、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドが、更に、ペプチド鎖内部の疎水性残基が全てＬｅｕに置換されるか、ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から３残基目或いは４残基目のＰｈｅを残して全てＬｅｕに置換されるか、又は疎水性部位のＮ末端側から３残基目がＡｌａに置換され、残りの疎水性残基が全てＬｅｕに置換されてなるペプチドである、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１４】
アミロイドーシスに起因する疾病がアルツハイマー病である請求項１１〜１３の何れかに記載の検出方法。
【請求項１５】
下記一般式［１］
Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ      −Ｒ’ ［１］
（式中、Ｒは、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＡｌａを表し、Ｙは、Ｌｅｕ又はＰｈｅを表し、Ｒ’は、ＯＨ又はＮＨ２を表す。）
で示されるペプチド。
【請求項１６】
式：Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は前記と同じ。）で示される請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
式：Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は前記と同じ。）で示される請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１８】
式：Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は前記と同じ。）で示される請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１９】
式：Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は前記と同じ。）で示される請求項１５に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド線維化したアミロイドβ蛋白質（以下、Ａβと略す。）の増幅方法とそのための試薬に関するもので、アルツハイマー病やプリオン病等のアミロイドーシスの予兆診断法の基盤となるものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は１９０７年にドイツの神経病理学者Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒによって報告された疾患である。発症年齢は初老以降であり、進行性の痴呆が症状の中核となる疾患である。痴呆とは正常であった知的機能が徐々に障害された結果、日常生活に障害をきたしてくる状態をいう。アルツハイマー病の場合に症状として最初に現れてくるものは、物忘れに代表されるような記憶力の障害である。さらに、失語、失認、失行などを含む様々な知的機能の障害も加わり、徐々に進行性の経過をとり、末期には寝たきり、失禁など高度の痴呆状態へと至る。病理学的には脳のび漫性の萎縮と神経細胞の脱落に加え、老人班、神経原線維変化と呼ばれる特徴的な構造物が数多く観察される。これらの変化は特に海馬において著しい傾向にある。
神経原線維変化はＡｌｚｈｅｉｍｅｒが初めて記載した変化で、神経細胞全体の嗜銀性の線維状構造物の蓄積を指す。その線維は特徴的な二重らせん構造をとっていることからＰａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦ）と名付けられた。しかしＰＨＦは多くの神経疾患で出現することが発見されたことから、現在ではＰＨＦの形成は神経細胞が変性していく過程における非特異的な反応様式であると考えられている。
老人班は元来、中心に密集したアミロイド線維があり、その周囲に変成しつつある神経突起、アストロサイトなどが集まった構造全体を定義していた。アミロイド線維は種々の溶媒に不溶であるので、この性質を利用してアルツハイマー病脳の髄膜血管および脳実質から精製され、その構成成分が分子量約４ｋＤの新しいペプチドであるアミロイドβ蛋白質（Ａβ）と同定された。分子量が小さいことからその前駆体の存在が予測され、ｃＤＮＡクローニングによりＡＰＰ（β Ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）が同定された。これは一回膜貫通型の膜蛋白質であり、ＡβはＡＰＰの細胞外ドメインから膜ドメインの内部２残基までであることが判った。
その後、単離されたＡβから抗Ａβ抗体が作製され、アルツハイマー病患者の脳を抗体染色したところ、以前から知られていた球状の老人班の他に多くの形態でのＡβの存在が観察され、アミロイド沈着はこれまでの考えよりも遙かに広範に渡っていることが明らかとなった。アミロイド沈着のなかにはその程度が軽く、変成神経突起を伴わないものがある。これはび慢性老人班と名付けられ、アルツハイマー病の初期病理像であると考えられ、アルツハイマー病に特異的なものとして広く支持されている。
近年、アルツハイマー病やプリオン病などの致死性のアミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ：アミロイドが細胞周囲や組織間隙に沈着し機能障害をおこす疾患）において、蛋白質のミスフォールド体形成やアミロイド線維形成が重要な段階であることが明らかになりつつあり、アミロイド線維を検出することはアミロイドーシスの診断において極めて重要である。
【０００３】
Ａβとはアミノ酸４０残基もしくは４２残基で構成されるペプチドで、それぞれＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）と呼ばれ、アルツハイマー病の発症過程において重要な役割を果たしていると考えられている。Ａβはアミノ酸６９５残基から７７０残基で構成される一回膜貫通蛋白質であるＡＰＰから酵素（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ，γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）によって切り出されて生成し、健康な人の脳内には０．１ｎＭ〜１０ｎＭ程度の濃度でモノマーのＡβ（１−４０）が存在しているとされ、α−ｓｅｃｒｅｔａｓｅによって分解され代謝される。
Ａβ（１−４０）は生理的条件下においてランダムコイル状態で存在し、Ａβ（１−４０）が生成する場合は脳内に沈着することなくα−ｓｅｃｒｅｔａｓｅによって代謝される。しかしＡβ（１−４２）は生理的条件下において、ランダムコイル状態から集合化してα−ヘリックス構造を経由しβシート構造をとる。その後βシート構造のＡβは更に重合しアミロイド線維化してプロテアーゼ耐性を獲得する。そして不溶化して脳内に沈着し老人班を形成する。このことがアルツハイマー病発症過程において重要であると考えられている。しかしＡβ（１−４２）は稀にしか生成せず、その生成機構およびアミロイド線維化の機構も良く判っていない。
【０００４】
アルツハイマー病の診断は、初期段階ではＤＳＭ−４（米国精神医学協会から公示されたアルツハイマー病の診断基準）等を用いた精神医学的な手法が大部分を占めている。しかし精神医学的な手法ではアルツハイマー病初期段階における確定診断が難しく、またアルツハイマー病患者およびその家族がその症状に気付く頃にはその病状がかなり進行していることが多い。また、中期段階以降はＭＲＩにより脳の萎縮を判定することで診断が可能だが、ごく初期段階においては脳の萎縮が始まっていないので診断することは難しい。
またその他の診断法として低濃度のトロピカミド（アセチルコリン受容体アンタゴニスト；アルツハイマー病患者はアセチルコリン受容体が減少するのでアセチルコリン受容体アンタゴニストに対して過敏になる）点眼に対する瞳孔の散大、および固視による記憶力テスト（アルツハイマー病においては海馬の損傷が著しく、それをテストする）などがあるが、現時点では信頼性が低く、副次的な診断法としてしか用いられていない。現時点では、ごく初期段階のアルツハイマー病の診断は非常に難しく、そのことがアルツハイマー病の治療をより一層困難なものとしている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ａβのアミロイド線維沈着はアルツハイマー病に特異的であり、アルツハイマー病の他の症状に先行するので、アルツハイマー病のごく初期段階においてアミロイド線維化したＡβを検出することが可能となれば、アルツハイマー病の初期段階の確定診断が可能になると考えられる。しかし、アルツハイマー病の初期段階において、アミロイド線維化したＡβはごく微量であるため、現時点では検出が困難である。そこで、微量のアミロイド線維化したＡβを増幅することが可能となれば、初期段階でのアルツハイマー病検出に多大な応用が期待される。
本発明は、斯かる状況に鑑みなされたもので、アミロイド線維化した微量のＡβの核とテンプレート反応を起こしてアミロイド線維を形成し、線維を増量して増幅する天然ペプチドの探索、並びにそれに代り得る新たな人工ペプチドの設計、開発と、これらを用いたアミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法及びそれに用いる試薬、並びにアミロイドーシスに起因する疾病の検出方法及びそれに用いる試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［以下、Ａβ（１４−２３）と略す。］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化を増幅するための試薬に関する。
【０００７】
また、本発明は、アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いることを特徴とする、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法に関する。
【０００８】
更に、本発明は、アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる、アミロイドーシスに起因する疾病の検出用試薬に関する。
【０００９】
更にまた、本発明は、アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いることを特徴とする、アミロイドーシスに起因する疾病の検出方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、下記一般式［１］
Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ      −Ｒ’ ［１］
（式中、Ｒは、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＡｌａを表し、Ｙは、Ｌｅｕ又はＰｈｅを表し、Ｒ’は、ＯＨ又はＮＨ２を表す。）
で示されるペプチドに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る、アミロイドーシスに起因する疾病の検出用試薬によれば、体内にあるアミロイド線維の核を安全な人工ペプチドを利用して増幅し、検出不可能な原因蛋白質を予兆段階の検査において増幅して検出可能なレベルにすることが出来るので、アルツハイマー病やプリオン病（狂牛病やヒトのヤコブ病など）等のアミロイドーシスに起因する疾病を初期段階で検出することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において用いられる、Ａβ（１４−２３）としては、天然のものでも、ペプチド合成法の常法に従って合成したものでも何れでも良い。
本発明において用いられる、Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドとしては、例えば、Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドであって、更にペプチド鎖内部の疎水性残基の１乃至複数個が他の疎水性アミノ酸残基に置換されてなるペプチドが、好ましいものとして挙げられる。置換し得る他の疎水性アミノ酸残基としては、例えば、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）等のアミノ酸残基が挙げられる。
そのようなペプチドの好ましい具体例としては、例えば、Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドであって、更に、ｉ）ペプチド鎖内部の疎水性残基が全てＬｅｕに置換された形のもの、ii）ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から３残基目或いは４残基目のＰｈｅを残して全てＬｅｕに置換された形のもの、或いは、iii）疎水性部位のＮ末端側から３残基目がＡｌａに置換され、残りの疎水性残基が全てＬｅｕに置換された形のもの等が挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明に係る、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化を増幅するための試薬、及び本発明に係る、アミロイドーシスに起因する疾病の検出用試薬は、上記した如きＡβ（１４−２３）又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる点に特徴を有する。
また、本発明に係る、アミロイドβ蛋白質のアミロイド線維化増幅方法、及び本発明に係る、アミロイドーシスに起因する疾病の検出方法は、上記した如きＡβ（１４−２３）又は該ペプチドの正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドを含んでなる試薬を用いる点に特徴を有する。
【００１４】
本発明に係る、Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドの好ましい具体例を一般式で示すと、例えば、以下のようになる。
Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ      −Ｒ’ ［１］
（式中、Ｒは、水素原子又はアミノ基の保護基を表し、Ｘは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＡｌａを表し、Ｙは、Ｌｅｕ又はＰｈｅを表し、Ｒ’は、ＯＨ又はＮＨ２を表す。）
【００１５】
上記一般式［１］で示されるペプチドの好ましい具体例としては、例えば、下記の如きものが挙げられる。
１）Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ      −Ｇｌｕ−Ｒ’
２）Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ      −Ｇｌｕ−Ｒ’
３）Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ      −Ｇｌｕ−Ｒ’
４）Ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ      −Ｇｌｕ−Ｒ’
（上記式中のＲ及びＲ’は前記と同じ。）
上記１）〜４）に示されるペプチドは何れも新規化合物である。
【００１６】
上記一般式［１］において、Ｒで表されるアミノ基の保護基としては、例えば、アセチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンゾイル基等のアシル基や、フルオレッセイン基、オレゴングリーン基等の蛍光性アシル基などが挙げられるが、より簡便なアセチル基が好ましい。
なお、上記１）〜４）に示されるペプチドにおけるＲもこれと全く同様である。
【００１７】
本発明において用いられる、Ａβ（１４−２３）の正電荷側鎖アミノ酸が全てＬｙｓに置換され、且つ負電荷側鎖アミノ酸が全てＧｌｕに置換された形のペプチドの好ましい具体例としては、上記一般式［１］で示されるものの他に、例えば、一般式［１］において、Ｘが、ペプチド鎖内部の疎水性部位のＮ末端側から１残基目、２残基目、或いは５残基目の位置にあるものや、一般式［１］におけるＬｅｕがＩｌｅに置き換わったもの、或いは一般式［１］におけるＸやＹがＩｌｅに置き換わったもの等々が挙げられる。
【００１８】
これら本発明に係るペプチド類は、何れも、ペプチド合成器を用いたＢｏｃ固相合成法やＦｍｏｃ固相合成法等の常法により容易に合成し得る。
【００１９】
本発明に係る、アミロイドーシスに起因する疾病の検出用試薬、或いはアミロイドーシスに起因する疾病の検出方法により検出可能な疾病としては、先ず第一にアルツハイマー病が挙げられる。また、例えば、狂牛病やヒトのヤコブ病などのプリオン病も同様に検出可能である。その他、アミロイドーシスに起因する各種疾病が同様に検出し得る。
これらアミロイドーシスに起因する各種疾病は、本発明に係るペプチドを含んでなる検出試薬を用いることにより、予兆段階、初期段階において、感度良く検出することが出来る。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（１）ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２［ペプチド（１０−４Ｆ）］の合成
（１−１）試薬、機器・装置
Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体および固相担体としての樹脂は、ノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社より購入し、そのまま用いた。他の試薬は市販品のものをそのまま使用した。
ペプチドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）固相法により手動で合成した。ペプチド鎖の手動合成容器にはポリプロピレン製エンプティーカラム（ファルマシア バイオテック社製）を用いた。吸収スペクトルは、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＢｉｏＳｐｃ−１６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）には、ＨＩＴＡＣＨＩ ７０００ ｓｙｓｔｅｍを用いた。ＨＰＬＣ溶媒として、Ａ液：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ液：０．０８％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮの混合溶媒を用い、３０分間でＡ液とＢ液の直線勾配により溶出した。逆相カラムとして分析にはＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−２（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）（４．６×１５０  ｍｍ）を流速１ｍｌ／ｍｉｎで使用した。ペプチドの精製にはＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ−２（ナカライ テスク）（１０×２５０  ｍｍ）を流速３ｍｌ／ｍｉｎで使用した。検出波長には２２０ｎｍを用いた。飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）はＳＨＩＭＡＤＺＵ ＫＲＡＴＯＳ ＭＡＬＤＩ ＩＩＩを用いて行い、マトリックスとして３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）を用いた。蛍光プレートリーダーは、ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｔｗｉｎｋｌｅ ＬＢ９７０を用いた。
【００２２】
（１−２）ペプチド（１０−４Ｆ）の合成
１０−４Ｆの合成はＦｍｏｃ固相法により２０μｍｏｌスケールで行った。樹脂はＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ ｒｅｓｉｎを用いた。各アミノ酸残基のカップリングは樹脂上のアミノ基に対して３当量のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ）を用いて反応を完全に進行させるようにした。本実施例ではＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨとしてＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ-Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、（ｔ-Ｂｕ：ｔｅｒｔ−ブチル、Ｔｒｔ：トリチル、Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）を使用した。カップリング試薬として、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（３当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ−Ｈ２Ｏ）（３当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（６当量）を用いた。反応溶媒としてＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）を使用した。Ｆｍｏｃ基の除去には２０％ピペリジン（ＰＰＤ）／ＮＭＰを使用した。アミノ酸誘導体をカルボキシル末端から順次カップリングした。反応中は適宜ボルテックスで攪拌し、カップリングの終了をＫａｉｓｅｒ Ｔｅｓｔ（ＫＴ）により確認した。全てのアミノ酸をカップリング後、アミノ末端のアミノ酸のＦｍｏｃ基を除去した後、ＮＭＰ中で無水酢酸（１０等量）を用いてペプチドのＮ末端のアミノ基をアセチル化した。その後、樹脂をＮＭＰ、クロロホルムで順次洗浄し、４時間減圧乾燥した。
減圧乾燥した樹脂を５０ｍｌナスフラスコに取り、ｍ−クレゾール（０．１３ｍｌ）、チオアニソール（０．３８ｍｌ）及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（５ｍｌ）を順次加え室温で１時間攪拌し反応させた。エバポレーターを用いてＴＦＡを除去した後、約３０  ｍｌのジエチルエーテルを加えてペプチド（１０−４Ｆ）を沈殿させた。遠心分離器（３０００ｒｐｍ、５分）にかけデカンテーションを５回繰り返した後、ジエチルエーテルを窒素気流下で気化させた。沈殿を減圧乾燥し、粗ペプチド（１０−４Ｆ）を得た。得られた粗ペプチド（１０−４Ｆ）を逆相ＨＰＬＣにより精製し、ＣＨ３ＣＮをエバポレーターで除去した後、凍結乾燥し回収した。収率３５％。得られたペプチド（１０−４Ｆ）はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを用いて同定した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ：
実測値（Ｍ＋Ｈ＋）１３０１.６。
計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１３０２.５。
【００２３】
（２）ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２［ペプチド（１０−３Ｌ）］、ペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２［ペプチド（１０−３Ｆ］）及びペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−ＮＨ２［ペプチド（１０−３Ａ）］の合成。
上記（１）で用いたと同じ試薬及び機器・装置を用い、上記（１）に記載の方法と同様の方法でペプチド合成及び逆相ＨＰＬＣによる精製を行ない、ペプチド（１０−３Ｌ）、ペプチド（１０−３Ｆ）及びペプチド（１０−３Ａ）をそれぞれ合成した。
得られた、これらペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを以下に示す。
ペプチド（１０−３Ｌ）：実測値（Ｍ＋Ｈ＋）１２９０.１
計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１２９０.６
ペプチド（１０−３Ｆ）：実測値（Ｍ＋Ｈ＋）１３０２.２。
計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１３０２.５。
ペプチド（１０−３Ａ）：実測値（Ｍ＋Ｎａ＋）１２２６.２。
計算値（Ｍ＋Ｎａ＋）１２２６.５。
【００２４】
（３）Ａβ（１４−２３）及びＡβ（１０−３５）の合成
上記（１）で用いたと同じ試薬及び機器・装置を用い、上記（１）に記載の方法と同様にして、アミロイドβペプチドの１４残基から２３残基からなるペプチド［Ａβ（１４−２３）］、及びアミロイド線維の核として、疎水性残基に富み線維形成能が高いことが知られている、アミロイドβペプチドの１０残基から３５残基からなるペプチド［Ａβ（１０−３５）］を合成した。
得られたこれらペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを以下に示す。
Ａβ（１４−２３）：実測値（Ｍ＋Ｈ＋）１２７４.８
計算値（Ｍ＋Ｈ＋）１２７４.４
Ａβ（１０−３５）：実測値（Ｍ＋Ｈ＋）２９４６.５
計算値（Ｍ＋Ｈ＋）２９４５.３
本実施例で合成した各ペプチドについて、２５℃でＣＤスペクトルの測定を行った結果を図１に示す。図１中、（１）はインキュベーション前（＝０日）、（２）はインキュベーション（１日）後の測定結果をそれぞれ示す。
【実施例２】
【００２５】
（１）人工ペプチド単独でのアミロイド線維形成
実施例１で合成したペプチド（１０−４Ｆ）、（１０−３Ｌ）、（１０−３Ｆ）、（１０−３Ａ）、Ａβ（１４−２３）及びＡβ（１０−３５）単独の水溶液中でのアミロイド線維形成能を評価した。ＣＤスペクトルを用いて二次構造を調べ、アミロイド線維に特異的に結合して蛍光を発する色素チオフラビンＴ（ＴｈＴ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて線維形成能を評価した。
【００２６】
（１−１） ＣＤスペクトルを用いたペプチドの二次構造測定
合成した各ペプチドについて、［ペプチド］＝２ｍＭのトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）溶液を作製し、それぞれ原料溶液とした。それを２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中へと希釈し、ペプチドの終濃度を１００μＭとして常温でインキュベートし、２５℃でＣＤスペクトルの測定を行った（図１）。
その結果、１０−４Ｆ、１０−３Ｌ、１０−３Ｆ及びＡβ（１０−３５）は初めから２１８ｎｍ付近に負の極大を持ち、２０５ｎｍ付近に正の極大を持つβ−シート構造に特有のスペクトルを取り、更に、時間経過と共にシグナルが増大し、β−シート性が強まったことから、アミロイド線維形成の進行が示唆された。また、１０−３Ａ及びＡβ（１４−２３）は何れもランダムコイル状態に特有のスペクトルを示し、経時的なスペクトルの変化は示さなかった。
人工ペプチドのうち、疎水性の低いＡｌａを導入したペプチドがランダムコイル状態で、それ以外のペプチドがβ−シート構造をとったことから、ペプチド鎖内部の疎水性がアミロイド線維化には重要であることが示唆された。
【００２７】
（１−２）ＴｈＴを用いたＡβ（１０−３５）のアミロイド線維化条件選定
ＴｈＴ（λｅｘ＝４４０ｎｍ、λｅｍ＝４８２ｎｍ）を用いてＡβ（１０−３５）のアミロイド線維化を追跡し、アミロイド線維の核として用いるＡβ（１０−３５）のインキュベーション条件を選定した（図２）。
インキュベーション条件
・使用原料溶液：［Ａβ（１０−３５）］＝２ｍＭ ＴＦＥ溶液
・濃度：［Ａβ（１０−３５）］＝１００μＭ トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．          ４）
・温度：室温
測定条件
・濃度：［Ａβ（１０−３５）］＝５μＭ、［ＴｈＴ］＝６μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
・温度：室温
・攪拌条件：試料サンプリング前にパスツールピペットで全量を充分に撹拌
セル内でパスツールピペットを用い全量を充分に撹拌
・励起波長：４４０ｎｍ、検出波長：４８２ｎｍ
【００２８】
結  果
Ａβ（１０−３５）はＴｈＴの存在下で４８２ｎｍ付近の蛍光強度を経時的に増大させ、グラフにプロットすると、シグモイド型の変化を示した。これは、アミロイド性タンパク質に特徴的な自己複製、自己触媒反応を示唆する。また、蛍光強度の変化が終了したサンプルをＴＥＭを用いて観察したところ、線維が観察された（図３）。
変化は大体２４時間から３０時間の間に終了し、アミロイド線維化終了時の蛍光強度および終了までの時間の再現性が良好なことから、核としてこの条件で３０時間以上インキュベートし、ＴｈＴ存在下の蛍光強度が７００〜１０００程度の値を示したものをＡβの核として使用することとした。
【００２９】
（１−３）ＴｈＴを用いた人工ペプチド単体でのアミロイド線維形成能評価
ＴｈＴを用いて、実施例１で得られた人工ペプチド単体でのアミロイド線維形成能を評価した。
インキュベーション条件
・使用原料溶液：［ペプチド］＝２ｍＭ ＴＦＥ溶液
・濃度：［ペプチド］＝２００μＭ トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４）
・温度：室温又は４０℃
測定条件
・濃度：［ペプチド］＝５μＭ、［ＴｈＴ］＝６μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
・温度：室温
・攪拌条件：試料サンプリング前にパスツールピペットで全量を充分に撹拌
セル内でパスツールピペットを用い全量を充分に撹拌
・励起波長：４４０ｎｍ、検出波長：４８２ｎｍ
【００３０】
結  果
（ｉ）室温（常温）でインキュベーションを行った場合
人工ペプチド１０−３Ｌ、１０−３Ｆ、１０−４Ｆでは時間経過と共に顕著な蛍光強度増大を示し、人工ペプチド単体でアミロイド線維を形成する能力があることが示唆された。また１０−３Ａはまったく蛍光強度増大を示さなかった。蛍光強度増大が終了するまでにかかった時間は１０−３Ｌが３日間と一番短く、１０−３Ｆ、１０−４Ｆは６日間かかった。また終点での蛍光強度は、１０−３Ｌと１０−４Ｆが同程度で、１０−３Ｆは、１０−３Ｌ、１０−４Ｆの半分弱だったことから、単体でのアミロイド線維形成能は１０−３Ｌ、１０−４Ｆが高く、１０−３Ｆは低いことが判った。
各人工ペプチドの蛍光強度増大前後における蛍光強度の比較を図４に示す。
【００３１】
（ii）４０℃でインキュベーションを行った場合
次に、常温では線維化が遅く、経時変化を追跡しづらいので、線維形成が早まると考えられる４０℃の高温での人工ペプチド単体での線維形成能を評価した。
Ａβ（１４−２３）、１０−３Ｌは顕著に線維化終了が早まり、１０−３Ｆ、１０−４Ｆは線維化終了までの時間はほぼ変化しなかった。１０−３Ａはほとんど蛍光強度増大を見せなかった。また、全体的に線維化終了時の蛍光強度が低下した。
各人工ペプチドの蛍光強度増大終了時における蛍光強度の比較を図５に示す。
また、蛍光強度変化が終了した後のこれらのサンプルをＴＥＭにより観察したところ、１０−３Ｌ、１０−４Ｆに線維が観察された（図６）。このことから、１０−３Ｌ、１０−４Ｆが繊維を形成することが確認された。
【００３２】
上記の結果をまとめると、殆ど全ての条件において、１０−３Ｌ、１０−３Ｆ、１０−４Ｆが蛍光強度増大を示し、特に１０−３Ｌ、１０−４Ｆが顕著であることが判る。このことから、１０−３Ｌと１０−４Ｆは高いアミロイド線維形成能を持つことが示唆された。
また、疎水性の低いＡｌａを導入した１０−３Ａがランダムコイル状態のスペクトルを示し、ＴｈＴでも全く蛍光強度増大を示さなかったことから、ペプチド鎖内部の疎水性がβ−シート構造形成およびアミロイド線維形成に際して重要であることが示唆される。
【００３３】
（２）人工ペプチドを用いた線維化Ａβ（１０−３５）の線維化増幅（ＴｈＴを用いた線維化増幅の追跡）
実施例１で合成した人工ペプチドを用いてアミロイド線維化したＡβ（１０−３５）の線維化増幅を試みた。人工ペプチド溶液に上記（１−２）の条件で線維化させたＡβ（１０−３５）を少量添加し、ＴｈＴを用いて線維化増幅を追跡した。
インキュベーション条件
・使用原料溶液：［ペプチド］＝２ｍＭ ＴＦＥ溶液
・濃度：［ペプチド］＝２００μＭ、［Ａβ（１０−３５）（核）］＝１０μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
＊Ａβ（１０−３５）（核）は希釈前に１時間ソニケーションし、均一化した。
・温度：室温
測定条件
・濃度：［ペプチド］＝５μＭ、［ＴｈＴ］＝６μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
・温度：室温
・攪拌条件：試料サンプリング前にパスツールピペットで全量を充分に撹拌
セル内でパスツールピペットを用い全量を充分に撹拌
・励起波長：４４０ｎｍ、検出波長：４８２ｎｍ
【００３４】
結  果
結果を図７に示す。
図７から明らかなように、ペプチド単独でのアミロイド線維形成能が高かった１０−３Ｌと１０−４Ｆが核存在下で顕著な蛍光強度増大を示した。特に１０−３Ｌは室温で核を添加したものが核を添加していないものの２倍程度の蛍光強度を示したことから、核を増幅する能力が高いことが示唆される。単独でのアミロイド線維形成能が低かった１０−３Ｆ及び１０−３Ａは核添加、核非添加両方とも蛍光強度増大を示さず、線維増幅能も線維形成能同様低いことが示唆された。
【実施例３】
【００３５】
実施例２の（２）で実施した、本発明に係る人工ペプチドを用いたアミロイド線維化したＡβ（１０−３５）の線維化増幅テストを、プレートリーダーを使用して試みた。
［プレートリーダーを使用した測定］
インキュベーション条件
・使用原料：［ペプチド］＝５ｍＭ ＤＭＳＯ溶液
・濃度：［ペプチド］＝２０μＭ、［Ａβ（１０−３５）（核）］＝２．５μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
＊Ａβ（１０−３５）（核）は希釈前に１時間ソニケーションし、均一化した。
・温度：４０℃
測定条件
・濃度：［ペプチド］＝１８μＭ、［ＴｈＴ］＝２５μＭ
（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ溶液（ｐＨ７．４））
・サンプル量：２００μｌ
・温度：３０℃
・攪拌条件：測定前にサンプル全量をｖｏｌｔｅｘで２秒間に３回
ウェル内でマイクロピペットを用い１００μｌ×２
・励起波長：４４０ｎｍ、測定波長：４９０ｎｍ
・励起出力：３００００
【００３６】
結  果
結果を図８に示す。
本発明に係る人工ペプチドは、何れも核存在下で蛍光強度を増大させ、何れも３０時間程度で蛍光強度増大が終了した。核非存在下では１０−４Ｆのみ蛍光強度増大を示し、その他のペプチドは蛍光強度増大を示さなかった。この結果から、本発明に係る人工ペプチドは全て線維増幅能を持つことが判り、アミロイド線維化Ａβ（１０−３５）の増幅に成功した。
線維増幅前後の蛍光強度増加度を核存在下及び非存在下について棒グラフに示した（図８）。核を添加したものの中で１０−４Ｆがもっとも大きな蛍光強度増大を示し、１０−４Ｆ、１０−３Ｌ、１０−３Ｆ、１０−３Ａの序列を示した。核を添加したもの、添加しなかったものについて蛍光強度変化終了時の差をとると１０−３Ｌが一番大きく、以降１０−４Ｆ、１０−３Ｆ、１０−３Ａの序列を示した。核添加、非添加で蛍光強度の差が大きいほうが検出系への応用が容易であると考えられるので、線維増幅能は１０−３Ｌ、１０−４Ｆ、１０−３Ｆ、１０−３Ａの序列である。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明に係る人工ペプチドは、体内にあるアミロイド線維の核を増幅し、検出不可能な原因蛋白質を予兆段階の検査において増幅して検出可能なレベルにするための試薬として有用である。当該試薬を用いることによりアルツハイマー病やプリオン病（狂牛病やヒトのヤコブ病など）等のアミロイドーシスに起因する疾病を初期段階（予兆段階）で検出することが出来るので、本発明は斯業に貢献するところ極めて大なるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１で合成した各ペプチドについて、２５℃でＣＤスペクトルの測定を行った結果を示す。図１中、（１）はインキュベーション前（＝０日）、（２）はインキュベーション（１日）後の測定結果をそれぞれ示す。
【図２】Ａβ（１０−３５）存在下でのＴｈＴの経時的な蛍光スペクトルの変化（Ａ）と、４８２ｎｍにおける蛍光強度のタイムコース（Ｂ）を示す。［実施例２の（１−２）］
【図３】実施例２の（１−２）において、蛍光強度の変化が終了したサンプルをＴＥＭを用いて観察した結果を示す。
【図４】本発明に係る各ペプチド存在下でのＴｈＴの４８２ｎｍにおける蛍光強度を、それぞれインキュベーション（室温）の前と後について測定、比較したものであり、□はインキュベーション前、■はインキュベーション後の結果をそれぞれ示す。［実施例２の（１−３）］
【図５】本発明に係る各ペプチド存在下でのＴｈＴの４８２ｎｍにおける蛍光強度を、それぞれインキュベーション（４０℃）の前と後について測定、比較したものであり、□はインキュベーション前、■はインキュベーション後の結果をそれぞれ示す。［実施例２の（１−３）］
【図６】実施例２の（１−３）において、人工ペプチド（１０−３Ｌ）を用い、４０℃でインキュベーションを行ない、蛍光強度変化が終了した後のサンプルをＴＥＭにより観察した結果を示す。
【図７】本発明に係る各ペプチド存在下でのＴｈＴの４８２ｎｍにおける蛍光強度を、線維化させたＡβ（１０−３５）（核）を添加、非添加のそれぞれの場合について測定、比較したものである。図７中、□は核無し（１日後）、■は核１０μＭ添加（１日後）の結果をそれぞれ示す。［実施例２の（２）］
【図８】図８は、線維化させたＡβ（１０−３５）（核）を添加した場合と添加したかった場合の、本発明に係る各ペプチド存在下でのＴｈＴの４９０ｎｍにおける蛍光強度の増加の程度を示したものである。図８中、□はＡβ（１０−３５）無添加の場合、■はＡβ（１０−３５）を添加した場合の結果をそれぞれ示す。［実施例３］
【図１】
2005060336.tif 000002
【図２】
2005060336.tif 000003
【図４】
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【図５】
2005060336.tif 000005
【図７】
2005060336.tif 000006
【図８】
2005060336.tif 000007
【図３】
2005060336.tif 000008
【図６】
2005060336.tif 000009
【配列表】
2005060336000001.app