(57)【要約】【課題】  凍結乾燥の間およびその後のＰＥＧ−インターフェロンα結合体の損失および損傷を予防する処方物を提供する。【解決手段】  本発明の処方物は、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体を、凍結乾燥プロセスの間の損失および分解、ならびに続く保存の間の分解から保護する。本発明の処方物は、様々な型の分解（生物学的活性の損失ならびに結合体の程度および／または性質における変化を含むがこれらに限定されない）からの、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の保護に適切である。本発明の処方物において保護可能な好ましいＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、インターフェロンα−２ｂ−ポリエチレングリコール（１２，０００）結合体である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−インターフェロンα結合体、緩衝液、安定化剤、凍結保護剤、および溶媒を含む、凍結乾燥の間およびその後のＰＥＧ−インターフェロンα結合体の安定化を可能にする処方物であって、該凍結保護剤がスクロースであり、そして該溶媒が水である、処方物。
【請求項２】
請求項１に記載の処方物を凍結乾燥する工程を包含する、凍結乾燥粉末を製造する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法によって製造される、凍結乾燥粉末。
【請求項４】
ＰＥＧインターフェロンα結合体の溶液を生成する方法であって：
ａ）請求項３に記載の凍結乾燥粉末を調製する工程；および
ｂ）該凍結乾燥粉末を水で再構成し、該溶液を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の凍結乾燥粉末を含む容器を備える、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示を通して、種々の刊行物、特許および特許出願が参照される。これらの刊行物、特許および特許出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、凍結乾燥の間およびその後のＰＥＧ−インターフェロンα結合体の安定化のための処方物、その生成および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
種々の天然および組換えタンパク質は、薬学的有用性を有する。一旦それらが精製され、分離され、そして処方されると、種々の治療的適応のために非経口投与され得る。しかし、非経口投与されるタンパク質は免疫原性であり得、比較的水に不溶性であり得、そして短い薬理学的半減期を有し得る。結果として、患者においてそのタンパク質の治療的に有用な血液レベルを達成することは困難であり得る。
【０００４】
これらの問題は、タンパク質を、ポリエチレングリコールのようなポリマーに結合体化することによって克服され得る。Ｄａｖｉｓら、米国特許第４，１７９，３３７号は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質（例えば、酵素およびインシュリン）に結合体化して、もとのタンパク質より少ない免疫原性効果を有し、かつ実質的な比率のその生理学的活性をなお維持する結合体を得ることを開示する。Ｖｅｒｏｎｅｓｅら（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，１１：１４１−１５２、１９８５）は、ポリエチレングリコールをフェニルクロロホルメートで活性化してリボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｍｕｔａｓｅ）を改変することを開示する。Ｋａｒｔｅら、米国特許第４，７６６，１０６号および同第４，９１７，８８８号もまた、タンパク質をポリマー結合体化によって可溶化することを開示する。同様に、ＰＥＧおよび他のポリマーは、組換えタンパク質に結合体化されて、免疫原性を減少しそして半減期を増加させ得る。Ｎｉｔｅｃｋｉら、米国特許第４，９０２，５０２号、Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２１３３、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、欧州特許出願第１５４，３１６号、およびＴｏｍａｓｉ，国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８５／０２５７２を参照のこと。例えば、インターフェロンα−２ｂは、腎臓細胞癌腫、ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫、慢性および急性Ｂ型肝炎、慢性および急性非Ａ型、非Ｂ／Ｃ型肝炎およびＣ型肝炎のような疾患状態の処置に有効であることが知られている。インターフェロンα−２ｂの薬理学的半減期の改良は、これらの状態の処置を改良する。
【０００５】
タンパク質−ポリマー結合体の調製は有益であるが、製造の間およびヘルスケア提供者への流通の間の長期間保存され得ない限りは、それらは実用的な様式では使用され得ない。しかし、いくつかのタンパク質−ポリマー結合体は、凍結溶液中でさえ、迅速に劣化する。凍結乾燥（フリーズドライとしてもまた公知）は、医薬品をこの欠点を克服し得る形態にし得るプロセスである。
【０００６】
凍結乾燥は、凍結された後に水が組成物から昇華されるプロセスである。このプロセスにおいて、一定の期間にわたって水溶液中で比較的不安定である医薬品および生物製剤は、容易にプロセスされた液体状態で投薬容器に配置され、熱損傷を使用せずに乾燥され、そして長期間乾燥状態で保存され得る。
【０００７】
各用量中の活性物質の低い総質量に起因して、ほとんどの医薬品および生物製剤の処方物（タンパク質−ポリマー結合体を含む）は、凍結乾燥プロセスの間に活性成分を保護するためにさらなる成分を必要とする。例えば、投薬容器に低濃度の水溶液として充填された医薬品は、凍結乾燥真空プロセスまたは容器に対する吸着の間の物理的損失に感受性であり得る。凍結乾燥された処方物は、しばしば、バルキング成分を含む。この成分は、固体材料ならびに凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）および他の安定化剤の量を増加させて、活性成分を損傷から保護する。しかし、どの特定の処方物が所定の型の医薬品を保護するかは、経験的に決定されなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質−ポリマー結合体、および特に、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体を、凍結乾燥の間の損傷から保護するに適した処方物の必要性が存在する。このような処方物は、ＰＥＧ−インターフェロンα−ポリマー結合体が、長期間にわたって、その生物学的活性、物理的安定性および化学的安定性を維持することを可能にするべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、凍結乾燥の間および後の、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の安定化を可能にする処方物を提供する。
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は、ＰＥＧ−インターフェロン結合体、緩衝剤、安定化剤および凍結保護剤を含む、水性処方物を提供する。本発明はまた、安定な水性処方物溶液を調製するためのプロセスを意図し、このプロセスは、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の有効量を、緩衝剤、安定化剤、凍結保護剤および溶媒と混合する工程を包含する。本発明のプロセスの好ましい局面において、この処方物が調製され、そして実質的に溶存酸素を含まないように維持され、そして上記の処方物の不活性雰囲気のヘッドスペースは、約４％未満の容量値の酸素で維持される。
【００１１】
本発明は、溶液成分について特定の化学物質に限定されない。しかし、好ましい実施態様において、緩衝剤はリン酸ナトリウムであり、安定化剤はポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体であり、凍結保護剤はスクロースであり、そして溶媒は水である。このような実施態様において、リン酸ナトリウムは、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物とともに二塩基性リン酸ナトリウム無水物を含み得る。
【００１２】
本発明はまた、本発明の処方物の成分の濃度によって限定されない。１つの実施態様において、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の濃度は、好ましくは１ｍｌあたり０．０３〜２．０ｍｇのインターフェロンαであり、一方リン酸ナトリウムの濃度は、好ましくは０．００５〜０．１モル濃度であり、ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体の濃度は、好ましくは０．０１〜１．０ｍｇ／ｍｌであり、そしてスクロースの濃度は、好ましくは２０〜１００ｍｇ／ｍｌである。特に好ましい実施態様において、ＰＥＧ−インターフェロン結合体の質量はインターフェロンα０．１ｍｇであり、二塩基性リン酸ナトリウムの質量は０．７５ｍｇであり、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物の質量は０．７５ｍｇであり、スクロースの質量は４０ｍｇであり、ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体の質量は０．０５ｍｇであり、そして水の容量は０．５ｍｌである。あるいは、成分の比は、インターフェロンαの質量によって測定された０．０８％重量の上記のＰＥＧ−インターフェロンα結合体、３．６％重量のリン酸ナトリウム、０．１２％重量のポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体、および９６．２％重量のスクロースである。
【００１３】
本発明は、特定のＰＥＧ−インターフェロンα結合体に限定されないが、１つの実施態様において、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、単一のインターフェロン分子に結合体化した単一のＰＥＧ分子を含む。このような実施態様において、このインターフェロンα分子は、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα２ｃ、およびコンセンサスインターフェロンからなる群より選択され得る。好ましい実施態様において、このインターフェロン分子は、インターフェロンα−２ｂである。同様に、本発明は、特定のＰＥＧ分子に限定されないが、１つの実施態様において、ポリエチレングリコールはＰＥＧ12000である。特に好ましい実施態様において、インターフェロンα−２ｂ分子は、ウレタン結合でＰＥＧ12000に連結される。
【００１４】
特定の特徴に限定されないが、単一のインターフェロンα分子が単一のポリマー分子に連結される場合、本発明は、生じたＰＥＧ−インターフェロンα結合体が位置異性体の混合物を含み得ることを意図する。好ましい実施態様において、位置異性体の１つは、インターフェロンα−２ｂ分子であり、このインターフェロンα−２ｂ分子は、この分子上のヒスチジン残基でＰＥＧ12000分子に連結されている。
【００１５】
本発明はまた、凍結乾燥のプロセスを意図し、このプロセスは、上記の処方物を凍結乾燥させて凍結乾燥粉末を作成する工程を包含する。好ましい実施態様において、このプロセスはさらに、凍結乾燥粉末を水または他の水性希釈剤（例えば、注射のためのベンジルアルコール含有静菌水）で再構成して、再構成溶液を作製する工程を包含する（Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｏｔｔ
Ｐａｒｋ，ＩＬ）。
【００１６】
本発明はまた、上記の処方物の凍結乾燥によって生成される凍結乾燥粉末を意図する。好ましい実施態様において、この凍結乾燥粉末は、０．０８％重量の上記のＰＥＧ−インターフェロンα結合体、３．６％重量の上記のリン酸ナトリウム、０．１２％重量の上記のポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体、および９６．２％重量の上記のスクロースを含む。
【００１７】
同様に、有効量のこのような凍結乾燥粉末を含むシリンジまたはバイアルを含む、製品が意図される。好ましい実施態様において、この製品はさらに、この粉末の再構成のための容量の水を含む。特に好ましい実施態様において、この粉末は、静菌水で再構成される。さらに好ましい実施態様において、この凍結乾燥粉末は、凍結乾燥の間に凍結乾燥溶液から除去された容量と同じ容量の水で再構成される。
【００１８】
本発明はまた、動物における疾患を処置するためのプロセスを意図する。１つの実施態様において、このプロセスは、再構成した溶液を、疾患を有する動物に導入する工程を包含する。１つの実施態様において、この動物はヒトである。好ましい実施態様において、ヒトは、Ｃ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルスに感染している。別の好ましい実施態様において、ヒトは癌を有する。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
「ＰＥＧ−インターフェロンα結合体」は、ＰＥＧ分子に共有結合されたインターフェロンα分子である。好ましい実施態様において、本発明のＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、インターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、インターフェロンα  ２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、インターフェロンα−２ｃ（Ｂｅｒｏｆｏｒ  Ａｌｆａ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）または天然に存在するインターフェロンαのコンセンサス配列の決定により規定されるようなコンセンサスインターフェロン（Ｉｎｆｅｒｇｅｎ，Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）を含む。
【００２０】
一方、ポリマーは、共有結合された繰り返し化学単位を有する分子である。しばしば、このポリマーのおよその分子量は、繰り返される化学単位の名前に続く数で表される。例えば、「ＰＥＧ12000」または「ポリエチレングリコール（１２，０００）」は、約１２，０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールのポリマーをいう。ＰＥＧ12000ポリマーにおいて、このポリマーにおいて繰り返されるポリエチレングリコール単位の数は、約２７３である。これらの意味は、ポリマーが平均分子量を与える鎖長の分布を有する混合物の形態で製造されていることとほぼ同じであること、そしてしばしば、正確かつ均一の分子量または数の反復される単位を有するポリマーを製造することが不可能であることが理解される。様々な他のポリマーおよびそれらを生成するための方法は当該分野で周知である。
【００２１】
タンパク質−ポリマー結合体を作製するための方法もまた、当該分野で公知である。例えば、Ｃａｌｌｓｔｒｏｍらに対する米国特許第５，６９１，１５４号、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎらに対する米国特許第５，６８６，０７１号、Ｃａｌｌｓｔｒｏｍらに対する米国特許第５，６３９，６３３号、Ｃａｌｌｓｔｒｏｍらに対する米国特許第５，４９２，８２１号、Ｌａｎｇらに対する米国特許第５，４４７，７２２号、およびＢｒａａｔｚらに対する米国特許第５，０９１，１７６号は全て、タンパク質−ポリマー結合体を生成するための方法を提供する。
【００２２】
タンパク質へのポリマーの結合体化は、タンパク質に結合体化した単一のポリマー分子、または単一のタンパク質への複数のこのような結合体を生じ得る。結合体化の程度は、反応条件および所望の結果に依存する。好ましい実施態様において、本発明の処方物中のＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、単一のＰＥＧ12000に結合体化した単一のインターフェロンα−２ｂを含む。特に好ましい実施態様において、このインターフェロンα−２ｂ分子は、ウレタン結合でＰＥＧ12000分子に連結される。このタンパク質−ポリマー結合体を生成するための試薬および方法は、Ｚａｌｉｐｓｋｙに対する米国特許第５，６１２，４６０号およびＧｉｌｂｅｒｔらに対する米国特許第５，７１１，９４４号に見出され得る。このようなタンパク質−ポリマー結合体が本発明の処方物溶液に利用される場合、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の好ましい濃度は、１ｍｌあたりインターフェロンα０．０３〜２．０ｍｇである。
【００２３】
単一のインターフェロンα分子が単一のポリマー分子に連結される場合、得られるＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、単一の位置異性体の形態であってもよいし、位置異性体の混合物であってもよい。「位置異性体の混合物」は、個々のＰＥＧ−インターフェロンα結合体が異なるインターフェロンα分子の異なる部位に連結され得ることを示す。例えば、本発明の１つの実施態様において、ＰＥＧ−インターフェロンα混合物は、そのインターフェロンα分子のヒスチジン残基で連結された少なくとも１つのＰＥＧ−インターフェロンα結合体を含み、一方、別のＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、そのインターフェロンα分子の別の部位（例えば、アミノ末端）で連結される。
【００２４】
上記のように、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の保存は、凍結乾燥によって達成され得る。凍結乾燥は、組成物をフリーズドライするプロセスであり、このプロセスで冷凍水性混合物を処理して水を除去する。一般に、このプロセスは、通常は減圧条件下での、冷凍水性溶液からの水の昇華を含む。凍結乾燥の後、このＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、長期間貯蔵され得る。
【００２５】
しかし、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、凍結乾燥の間および後に損傷を受ける。ＰＥＧ−インターフェロンα結合体に対する損傷は、タンパク質の損失、生物学的活性の損失、またはインターフェロンαの結合体化の程度および／または性質の変化によって特徴づけられ得る。例えば、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、遊離のＰＥＧおよびインターフェロンαに分解して、結合体化の程度の低下を生じ得る。同様に、生じた遊離のＰＥＧは、別のインターフェロンαへの結合体化に利用可能になり、潜在的に、その標的分子における結合体化の程度の増加を生じ得る。同様に、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体は、ある結合部位から同じ分子内の別の結合部位へのＰＥＧの分子内シフトを受け、それによりこのインターフェロンαの結合体化の性質が変化し得る。
【００２６】
本発明は、凍結乾燥の間および後の損傷を予防する処方物中にＰＥＧ−インターフェロンα結合体を含むことによって、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体を損傷から保護する。本発明は特定の処方物に限定されないが、好ましい実施態様において、この方法は、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体に加えて、緩衝剤、安定化剤、凍結保護剤および溶媒を利用する。
【００２７】
緩衝剤は、この処方物のｐＨを、４．５〜７．１の範囲、好ましくは６．５〜７．１、および最も好ましくは６．８に維持するのに適している。二塩基性リン酸ナトリウムと一塩基性リン酸ナトリウムの緩衝剤系の使用が好ましい。二塩基性リン酸ナトリウム無水物／一塩基性二水和物系が利用される場合、この系は、０．００５〜０．１モル濃度の好ましい全濃度で、一塩基性二水和物に対して等質量の二塩基二水和物が好ましい。所望のｐＨ範囲を維持するための他の適切な緩衝剤系としては、クエン酸ナトリウム／クエン酸、および酢酸ナトリウム／酢酸が挙げられる。
【００２８】
安定化剤は、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体を含む処方物を作製および貯蔵するために使用される装置のステンレス鋼表面およびガラス表面へのＰＥＧ−インターフェロンα結合体の吸着を予防するのに有用である。１つの例として、ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体は、安定化剤として有用である。モノ−９−オクタデカノエート（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏａｔｅ）ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）誘導体（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）は好ましい安定化剤である。Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０が利用される場合、好ましい濃度は、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌである。
【００２９】
凍結保護剤（凍結保護薬剤または凍結保護化合物としてもまた公知である）は、化学化合物、細胞、または組織を、凍結の有害効果（例えば、凍結乾燥に通常付随するもの）から保護する薬剤である。ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の場合、凍結保護剤は、それらを、凍結乾燥において利用される真空に由来する損傷、吸着および損失から保護し得る。
【００３０】
本発明は、特定の凍結保護剤に限定されないが、例としては、炭水化物（例えば、糖類、スクロース）、糖アルコール（例えば、マンニトール）、表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、ならびにグリセロールおよびジメチルスルホキシドが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい凍結保護剤は炭水化物である。好ましい炭水化物は、単糖類または二糖類である。好ましい二糖類はスクロースである。
【００３１】
同様に、本発明は、使用される凍結保護剤のいかなる特定の量にも限定されない。１つの実施態様において、凍結保護剤は、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体が凍結乾燥されるのを可能にするのに十分な量で存在する。このような実施態様において、凍結保護剤は、ＰＥＧ−インターフェロンα溶液の総重量に基づいて、０．０５％〜９０％の量、好ましくは０．０５％〜５０％の量、および最も好ましくは約０．１５％〜約１０％の量で存在し得る。スクロースが使用される場合、好ましい濃度は、２０〜１００ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
有効量の生物学的に活性なＰＥＧ−インターフェロンα結合体を含む処方物は、疾患状態の処置に有用であり、好ましくは注射用水性溶液として有用である。有効量とは、処方物または粉末が、動物における疾患状態を処置するために適切な濃度の生物学的に活性な成分を有することを意味する。例えば、好ましいインターフェロンα−２ｂ−ＰＥＧ12000結合体は、以下のような疾患状態の処置に適している：腎細胞癌、ＡＩＤＳ関連カポージ肉腫、慢性および急性Ｂ型肝炎、慢性および急性非Ａ型、非Ｂ／Ｃ型肝炎およびＣ型肝炎。有効量のこのＰＥＧ−インターフェロンα結合体を含む１つの溶液は、タンパク質質量によって測定される０．０３〜２．０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ12000−インターフェロンα−２ｂ結合体を含む。
【実施例】
【００３３】
（実施例）
この実施例は、本発明の処方物、ならびに凍結乾燥および貯蔵の間のあるＰＥＧ−インターフェロンα結合体の保護の記載を提供する。このＰＥＧ−インターフェロン結合体を、凍結乾燥処方物に導入し、凍結乾燥し、そして乾燥粉末として貯蔵する。この処方物の成分は、以下の通りである：
【００３４】
【表１】
2005104985.tif 000002
【００３５】
凍結乾燥の後、得られた粉末を貯蔵し、そして６ヶ月にわたって、サンプルを分析のために水で再構成する。再構成した溶液を、タンパク質質量含量、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体の結合体化の程度、生物活性、および視覚的清澄性について分析する。この結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2005104985.tif 000003
【００３７】
この結果は、総タンパク質質量含量が、９ヶ月にわたって比較的安定であることを示す。さらに、モノペグ化インターフェロンα−２ｂの程度における変化（すなわち、遊離のインターフェロンおよびポリマーへの分解、またはジペグ化インターフェロンの生成）は無視できる。細胞ベースの抗ウイルスアッセイによって測定される生物活性は、本質的に変化しないのままである。再構成した溶液は、６ヶ月を通して、透明、無色、および可視粒子を含まないままである。このことは、凍結乾燥および続く貯蔵の間の、驚くべき高安定性を実証する。
【００３８】
上記から、本発明は、ＰＥＧ−インターフェロンα結合体を、凍結乾燥の間、および続く貯蔵の間の損傷から保護するのに適した処方物を提供することが明らかである。