(57)【要約】【課  題】  水可溶性のフェルラ酸エステルの新規製造方法の提供。【解決手段】  フェルラ酸低級アルキルエステルに、グリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類の存在下に、フェルラ酸エステラーゼを作用させてエステル交換反応させることを特徴とするフェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルの製造方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸低級アルキルエステルに、グリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類の存在下に、フェルラ酸エステラーゼを作用させてエステル交換反応させることを特徴とするフェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルの製造方法。
【請求項２】
フェルラ酸エステラーゼが、ペニシリニウム属に属する微生物由来のフェルラ酸エステラーゼである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
フェルラ酸エステラーゼが、ペニシリニウム・クリソゲナム３１Ｂ由来のフェルラ酸エステラーゼである請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
多価アルコール類または糖類がグリセロールである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
多価アルコール類または糖類がフラクトースである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
多価アルコール類または糖類がトレハロースである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法で得られるフェルラ酸エステル。
【請求項８】
フェルラ酸とフラクトースとのエステル。
【請求項９】
フェルラ酸とトレハロースとのエステル。
【請求項１０】
フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを有効成分とする紫外線吸収剤。
【請求項１１】
フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項１２】
請求項１０記載の紫外線吸収剤を含有する化粧品。
【請求項１３】
請求項１１記載の抗酸化剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルの新規製法に関する。また、本発明は、フェルラ酸とフラクトースおよびトレハロースから選ばれる糖類とのエステルに関する。
【背景技術】
【０００２】
フェルラ酸は植物細胞壁中に広く存在するフェノール化合物であり、抗酸化作用、紫外線吸収作用、種子の発芽抑制作用、抗菌作用、抗癌作用など多枝にわたる作用を有することが明らかにされており、化粧品、健康食品、医薬品などの産業利用が期待されている物質である。しかしながら、フェルラ酸は水に対する溶解度が低く、室温でフェルラ酸の結晶が析出するため、化粧品や食品の水相に含有させることが困難であるという問題がある。また、フェルラ酸は皮膚へ浸透させることが困難であるとか、熱安定性が充分でないなどの問題がある
【０００３】
これら問題を解決するために、例えばフェルラ酸に有機酸を配合する方法（特許文献１）、フェルラ酸に不揮発性ポリオールを添加する方法（特許文献２）、フェルラ酸またはそのエステルにジメチルイソソルバイドを配合する方法（特許文献３）、フェルラ酸を２−エチルヘキシルエステルとする方法（特許文献４）などが提案されている。
しかしながら、これらの方法はフェルラ酸以外の成分を添加しなければならなかったり、水溶性が充分でなかったり、抗酸化作用や紫外線吸収作用が弱かったりして必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００４】
一方、非特許文献１には、フェルラ酸とグリセロールとのエステル、すなわち１−モノフェルロイルグリセロール（フェルラ酸１−グリセリルエステル）が記載されており、フェルラ酸とグリセロールとをジメチルアミノピリジンの存在下に反応させることにより製造することができることが開示されている。
しかしながら、この合成方法は、溶媒としてジクロロメタンを使用しており、環境に悪影響を及ぼすという点で難点がある。
【０００５】
【特許文献１】特開昭６４−１３０１６号公報
【特許文献２】特表２００３−５０５４０８号公報
【特許文献３】特表２００２−５０７９７０号公報
【特許文献４】特開平９−４０６１３号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．１１（２０００），ｐｐ５４７６−５４８３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、水溶性の良好なフェルラ酸エステル、すなわち、フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルの新規製法を提供するものである。また、本発明は、新規化合物であるフェルラ酸とフラクトースおよびトレハロースから選ばれる糖類とのエステルを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、フェルラ酸の水溶性を高めるため種々研究を重ねた結果、フェルラ酸をグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルとすれば、水溶性が高まると共に、これらのエステルはフェルラ酸低級アルキルエステルに、グリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類の存在下に、フェルラ酸エステラーゼを作用させることにより好適に製造できることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）フェルラ酸低級アルキルエステルに、グリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類の存在下に、フェルラ酸エステラーゼを作用させてエステル交換反応させることを特徴とするフェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルの製造方法、
（２）フェルラ酸エステラーゼが、ペニシリニウム属に属する微生物由来のフェルラ酸エステラーゼである前記（１）記載の製造方法、
（３）フェルラ酸エステラーゼが、ペニシリニウム・クリソゲナム３１Ｂ由来のフェルラ酸エステラーゼである前記（１）記載の製造方法、
（４）多価アルコール類または糖類がグリセロールである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法、
（５）多価アルコール類または糖類がフラクトースである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法、
（６）多価アルコール類または糖類がトレハロースである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法、
（７）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法で得られるフェルラ酸エステル、
（８）フェルラ酸とフラクトースとのエステル、および
（９）フェルラ酸とトレハロースとのエステル、
である。
【０００９】
また、本発明は、
（１０）フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを有効成分とする紫外線吸収剤、
（１１）フェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを有効成分とする抗酸化剤、
（１２）前記（１０）記載の紫外線吸収剤を含有する化粧品、および
（１３）前記（１１）記載の抗酸化剤を含有する飲食品
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、フェルラ酸低級アルキルエステルからフェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを、工業的有利に製造することができる。また、本発明の製造方法で得られるフェルラ酸エステルは水に可溶性であるため、紫外線吸収剤としてあるいは抗酸化剤として、化粧品や食品に広く適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において基質として使用されるフェルラ酸低級アルキルエステルとしては、たとえば、フェルラ酸メチルエステル、フェルラ酸エチルエステル、フェルラ酸プロピルエステル、フェルラ酸ブチルエステルなどが挙げられる。これらは、特開平９−４０６１３号公報に記載されている方法により製造することができ、例えば、フェルラ酸とＣ１−４低級アルカノールとを適当な溶媒中、酸触媒（例えば、硫酸、塩酸、パラトルエンスルホン酸など）あるいは塩基（たとえば、トリスイソプロパノールアミンなど）の存在下に反応させることにより容易に製造することができる。
【００１２】
酵素源であるフェルラ酸エステラーゼは、フェルラ酸低級アルキルエステルとグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類との間でエステル交換反応を生じさせるものであれば特に限定されない。このような酵素は、アスペルギルス（Aspergillu）属、ペニシリウム（Penicillium）属、バチルス（Bacillus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ネオカリマスチクス（Neocallimastix）属、ニューロスポラ（Neurospora）属に属する微生物に由来するものが挙げられるが、特にペニシリニウム属に属する微生物、例えばペニシリニウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）３１Ｂに由来するフェルラ酸エステラーゼが好適である。ペニシリニウム・クリソゲナム（Pecicillium chrysogenum）３１Ｂは、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３として寄託されている。
【００１３】
上記微生物由来のフェルラ酸エステラーゼは、微生物の培養液であってもよく、該培養液の上清、該上清から精製した酵素、培養液から採取した生菌体の処理物（例えば、超音波処理物など）、あるいは該処理物から精製した酵素のいずれであってもよい。また、酵素を固定化したものでもよい。
本明細書中では、フェルラ酸エステラーゼがある微生物に「由来する」とは、その微生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その微生物を遺伝子組換えや紫外線等の照射線や変異原性物質による突然変異誘発によるなどの慣用技術を利用することによりフェルラ酸エステラーゼが得られることをいう。例えば、ペニシリニウム・クリソゲナム３１Ｂのフェルラ酸エステラーゼ遺伝子をクローニングし、クローン化された該遺伝子を他の宿主微生物（例えば、大腸菌）に導入し、得られた形質転換体からフェルラ酸エステラーゼを単離する場合も、そのフェルラ酸エステラーゼはペニシリニウム・クリソゲナム３１Ｂに「由来する」という。ペニシリニウム・クリソゲナム３１Ｂからのフェルラ酸エステラーゼ遺伝子のクローン化、クローン化されたフェルラ酸エステラーゼ遺伝子での宿主微生物の遺伝子組み換えは、当業者に周知の方法に従って行われ得る。
【００１４】
微生物の培養は、常法に従って、炭素源、窒素源を含む培地中で好気的に培養することにより容易に実施することができる。炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、でんぷん、糖蜜、ビート糖（シュガービートパルプ）、フスマ、グリセリンなどが挙げられる。また、窒素源としては、たとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸などが挙げられる。これらの他に、適宜、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸水素カリウム、塩化カリウム、食塩、硫酸鉄、マンガン、モリブデンなどの無機質、さらには各種ビタミン類などが添加される。培養は、ｐH４〜６、好ましくはｐH４．５〜５．５、温度２５〜３５℃、好ましくは温度２８〜３２℃で好適に実施される。かくして得られる培養液はそのまま酵素源として使用することもできるが、培養液より遠心分離により上澄を集め、必要により更にイオン交換樹脂などで処理して得られる精製された酵素も使用することができる。
【００１５】
本発明の酵素反応は、基質であるフェルラ酸低級アルキルエステルとグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とを適当な緩衝液（たとえば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液など）、あるいは有機溶媒（例えばジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなど）と前記緩衝液との混合物に溶解もしくは懸濁させ、これに酵素（フェルラ酸エステラーゼ）を加えて静置、あるいは攪拌することにより実施することができる。
【００１６】
フェルラ酸低級アルキルエステルの添加量は、反応液全体に対して０．０１〜５０重量％が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましい。
【００１７】
グリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類の添加量は、反応液全体に対して１〜９９重量％が好ましく、１０〜９０重量％がより好ましい。
【００１８】
酵素反応の温度は、３０〜５５℃が好ましく、４０〜５０℃がとくに好ましい。また、酵素反応のｐHは、４〜７．５が好ましく、５〜７がより好ましい。反応時間はとくに制限されないが、通常０．５時間〜２４時間が好ましい。
【００１９】
反応液中にフェルラ酸と多価アルコール類または糖類とのエステルが所望量に達したのち、加熱によって反応を停止し、反応液を適当な樹脂を用いて精製処理することにより、目的とするフェルラ酸エステルを採取することができる。
【００２０】
エステル交換反応により得られた本発明にかかるフェルラ酸エステルは、紫外線吸収剤として使用することができ、たとえば、サンオイル、サンケアクリーム、サンスクリーンローション、ヘアスプレー、リキッドファンデーション、アンチリンクルエッセンス、オーデコロン、アフターシェービングローションなどの化粧品に使用することができる。本発明に係るフェルラ酸エステルの化粧品基材への添加量は、化粧品の種類によっても異なるが、通常、化粧品全体に対して０．０１〜２重量％であるのが好ましい。
又、本発明に係るフェルラ酸エステルは、抗酸化作用を有しているので、抗酸化剤として飲食品（たとえば、ジュースなどの飲料、ロースハム、シフォンケーキ、ラード、ビスケットなどの食品など）に添加することもできる。フェルラ酸エステルの食品原料への添加量は、食品の種類によっても異なるが、通常、食品全体に対して０．００１〜２重量％であるのが好ましい。
【実施例１】
【００２１】
［フェルラ酸メチルエステルの合成］
アセトン１０ｍｌにフェルラ酸（シグマ社製）５．９ｇと硫酸ジメチル３．８３４ｇとトリスイソプロパノールアミン６．９９２ｇを混合し、油浴中で６５℃に加熱しながら、１時間反応させた。反応が終了したことをＴＬＣ（展開溶媒、ベンゼン：酢酸エチル＝２０：１）で確認した後、トルエンで抽出し、抽出液をエバポレーターにより濃縮乾固することにより，フェルラ酸メチルエステル５．６４ｇ（収率：８９％）を得た。
【００２２】
［フェルラ酸エステラーゼの調製］
ペニシリウム・クリソゲナム３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を、シュガービートパルプを唯一の炭素源とした培地（ＮＨ４ＮＯ３  ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＫＣｌ  ０．０５％、ＦｅＳＯ４  ０．００１％、ペプトン  ０．１％、シュガービートパルプ  ２．０％）（ｐＨ５．０）に接種し、３０℃で１０日間振とう培養し、その培養上清を粗酵素液とした。
上記の粗酵素液を限外ろ過、硫安分画、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｒｓｅ  Ｓ）、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｒｓｅ  Ｑ）、再度陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｓ）、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ  Ｑ）、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）（すべてＦＰＬＣシステム、ファルマシア社製）により、精製した。得られた酵素の比活性は３．２Ｕ／ｍｇであった。
【００２３】
［酵素活性測定法］
０．１％フェルラ酸メチルエステル溶液１００μｌ（フェルラ酸メチルエステル５０ｍｇをジメチルスルホキシド５００μｌに溶解させ、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５）を２．５ｍｌ加えた後、水で全量５０ｍｌに調整することにより調製）に２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）９５μｌ、酵素液５μｌを加え混合させた後、３７℃で６０分間反応させた。反応は加熱によって終了させ、生成したフェルラ酸をＨＰＬＣ（カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ）（関東化学社製）；溶媒：メタノール／０．２％酢酸溶液＝５／５；流速：０．７ｍｌ／分）により定量した。フェルラ酸エステラーゼの酵素活性は、１分間に１μｍｏｌのフェルラ酸を遊離する酵素量を１Ｕとした。
【００２４】
［エステル交換反応］
フェルラ酸メチルエステル１００ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍｌに溶解し、これに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）２．５ｍｌを加えたのち、水で全量５０ｍｌに調整して基質溶液（０．２％フェルラ酸メチルエステル溶液）とした。この基質溶液２５ｍｌに、フェルラ酸エステラーゼ０．２Ｕ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）１ｍｌ、およびグリセリン１５ｍｌを加え、水で全量を５０ｍｌとした。この反応液を４０℃で３時間静置して酵素反応を行った。
【００２５】
酵素反応を加熱によって停止後、反応液を逆相カラム（ＹＭＣ  Ｄｉｓｐｏ  ＳＰＥ（ＹＭＣ社製））に供し、フェノール性化合物を吸着させた。吸着物質の溶出は１０−１００％アセトニトリルをステップワイズにカラムに流すことにより行った。フェルラ酸１−グリセリルエステルを含む画分（１０％および２０％アセトニトリル溶出画分）を濃縮乾固し、ＨＰＬＣ（溶媒：メタノール／０．２％酢酸溶液＝５／５；流速：３．５ｍｌ／分）を用いた分取用逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ、２５×２５０ｍｍ：ナカライテスク社製）により精製し、フェルラ酸１−グリセリルエステル１０．５ｍｇを得た。本品の核磁気共鳴スペクトルは下記の通りである。また、本品１０．５ｍｇを水１０μｌに室温で解けることから、本品は水に対する溶解度が良いことがわかる。なお、上記画分（１０％および２０％アセトニトリル溶出画分）には、主生成物であるフェルラ酸１−グリセリルエステル以外に、フェルラ酸２−グリセリルエステルが含有されていることをＨＰＬＣチャートで確認した。
【００２６】
核磁気共鳴スペクトル（Ｈ  ＮＭＲ（重メタノール）：δ
７．１９（１Ｈ、ｄ、Ａｒ−Ｈ（Ｃ２））、７．０７（１Ｈ、ｄｄ、Ａｒ−Ｈ（Ｃ５））、６．８０（１Ｈ、ｄ、Ａｒ−Ｈ（Ｃ６））、３．８９（３Ｈ、ｓ、−ＯＣＨ３）、７．６５（１Ｈ、ｄ、＝ＣＨ−ＣＯ）、６．３９（１Ｈ、ｄ、Ａｒ−ＣＨ＝）、４．１６、４．２６（２Ｈ、ｄｄ、−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）−）、３．９２〜３．８５（１Ｈ、ｍ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ）、３．５９、３．６１（２Ｈ、ｄｄ、−ＣＨ２ＯＨ）
【００２７】
（試験例１）
フェルラ酸および実施例１で得られたフェルラ酸１−グリセリルエステルの紫外線吸収スペクトルは図１の通りである。この図１から、フェルラ酸とフェルラ酸１−グリセリルエステルとの紫外線吸収スペクトルはほぼ同じであることがわかる。このことから、フェルラ酸１−グリセリルエステルはフェルラ酸と同様に機能、すなわち紫外線吸収作用があることがわかる。
【実施例２】
【００２８】
フェルラ酸メチルエステル１００ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍｌに溶解し、これに１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）２．５ｍｌを加えたのち、水で全量５０ｍｌに調整して基質溶液（０．２％フェルラ酸メチルエステル溶液）とした。この基質溶液２００μｌにフラクトース２００ｍｇを溶解し、これにフェルラ酸エステラーゼ１ｍＵを加えて混合した。この溶液を４０℃で３０分間静置して酵素反応を行った。加熱によって反応を終了させ、反応終了液をＨＰＬＣ（カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ２５０−４．６（５μｍ）（関東化学社製）；溶媒：メタノール／０．２％酢酸溶液＝５／５；流速：０．７ｍｌ／分）に付し、３２０ｎｍでの吸収を測定した。その結果は、図２の通りであり、ａにフェルラ酸とフラクトースとのエステルのピークが、ｂにフェルラ酸のピークが、ｃにフェルラ酸メチルエステルのピークが現れた。このチャートからフェルラ酸とフラクトースとのエステルの生成量を算出したところ、０．２２ｍｇ／ｍｌであった。
上記で得られたエステルは、フェルラ酸とフラクトースとが等モルで結合したモノエステルである。
【実施例３】
【００２９】
実施例２において、フラクトースの代わりにトレハロースを用いる以外は、実施例２と同様に酵素反応を行った。反応液を実施例２と同様にＨＰＬＣに付し、３２０ｎｍでの吸収を測定した。その結果は、図３の通りであり、ａにフェルラ酸とトレハロースとのエステルのピークが、ｂにフェルラ酸のピークが、ｃにフェルラ酸メチルエステルのピークが現れた。このチャートからフェルラ酸とトレハロースとのエステルの生成量を算出したところ、０．１９ｍｇ／ｍｌであった。
上記で得られたエステルは、フェルラ酸とトレハロースとが等モルで結合したモノエステルである。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によれば、水に可溶性のフェルラ酸とグリセロール、フラクトースおよびトレハロースから選ばれる多価アルコール類または糖類とのエステルを効率よく製造することができ、得られたフェルラ酸エステルは抗酸化剤あるいは紫外線吸収剤として食品あるいは化粧品に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フェルラ酸とフェルラ酸１−グリセリルエステルの紫外線吸収スペクトルである。
【図２】実施例２で得られた酵素反応液のＨＰＬＣスペクトルである。
【図３】実施例３で得られた酵素反応液のＨＰＬＣスペクトルである。
【図１】
2005224177.tif 000002
【図２】
2005224177.tif 000003
【図３】
2005224177.tif 000004