(57)【要約】      （修正有）【課題】  塩基配列ａｌｒ  ０９７５自体の又は塩基配列ａｌｒ  ０９７５がコードするタンパク質の用途。【解決手段】  以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子（ｃ）または（ｄ）が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物：（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）上記アミノ酸配列において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する酵素の活性を有するタンパク質。（ｃ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ；（ｄ）上記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は外来遺伝子の導入により酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物に関する。具体的には本発明はグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の導入により酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物に関する。さらに、本発明はかかる組換え植物の生産方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタチオンからγＥＣを生成する反応はファイトケラチン（ＰＣ）の生合成反応の一段階目の反応に相当する。ここで、ファイトケラチン（ＰＣ）は高等植物、酵母、藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであり、重金属と強く結合することによってこれを無毒化し、細胞内に蓄積する働きを有する。ＰＣの構造は（γＥＣ）ｎＧ（Ｅ＝グルタミン酸、Ｃ＝システイン、Ｇ＝グリシン、ｎ＝２〜１１）で表され、γＥＣを基本骨格とし、末端にグリシンが結合したペプチドである。
【０００３】
高等植物等においてＰＣはグルタチオン（γＥＣＧ）を基質としてＰＣ合成酵素が触媒する以下の二段階の酵素反応により生合成される。
（１）γＥＣＧ→γＥＣ＋Ｇ
（２）（γＥＣ）ｎＧ＋γＥＣ→（γＥＣ）ｎ＋１Ｇ
一段階目の反応が基質であるグルタチオンからグリシンを切り離してγＥＣを生成する反応である。このγＥＣを二段階目の反応においてアクセプターであるＰＣｎと結合させることによってＰＣｎ＋１が合成される。この二つの反応を繰り返すことにより、重合度の高いＰＣが生合成される。
【０００４】
ＰＣやＰＣ合成酵素は種々の真核生物でその存在が明らかになっているが、原核生物であるシアノバクテリア（ラン藻）がＰＣ合成酵素を有するという報告は現在までなされていない。
【０００５】
一方、最近かずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトにより数種のシアノバクテリアのゲノムが解読されている。本発明者らがこれらのシアノバクテリアのゲノムを分析したところ、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０のゲノム中に高等植物のＰＣ合成酵素遺伝子と類似した配列を有する塩基配列ａｌｒ  ０９７５が存在することが明らかになっている（特許文献１）。しかしながら、この塩基配列ａｌｒ  ０９７５がコードするタンパク質の機能についてはまだ未知の部分が多い。
【特許文献１】特願２００３−３７６００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は塩基配列ａｌｒ  ０９７５自体の又は塩基配列ａｌｒ  ０９７５がコードするタンパク質の産業上有用な用途を開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、塩基配列ａｌｒ  ０９７５を遺伝子組換えにより植物に導入してａｌｒ  ０９７５がコードするタンパク質を前記植物において発現させると、前記植物の酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が著しく向上することを見出し、遂に本発明を完成するに到った。
【０００８】
即ち、本発明の第１の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質。
【０００９】
また、本発明の第２の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子が導入され、かつ前記遺伝子が発現していることを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
また、本発明の第３の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質。
【００１１】
さらに、本発明の第４の態様によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列で植物を形質転換する工程を含むことを特徴とする酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物の生産方法が提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルタチオンからガンマグルタミルシステイン（γＥＣ）を生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物及びかかる組換え植物の生産方法を具体的に説明するが、特許請求の範囲から逸脱しない限り、これらに限定されるものではない。
なお、本発明において酸化ストレスとは植物細胞内に生成された酸素ラジカルや過酸化水素などの活性酸素によるストレスをいう。これらの活性酸素は例えば植物が強光、乾燥、塩、低温、高温、浸透圧、重金属、環境汚染物質などの物理化学的ストレスや植物病原菌感染などの生物学的ストレスを受けることにより生成されるものである（蛋白質核酸酵素１９９９年１１月号増刊第２１４７頁〜第２２５９頁に記載の論文「環境応答・適応の分子機構」を参照）。従って、本発明によれば植物に酸化ストレスに対する耐性を付与することにより、これらの物理化学的ストレスや生物学的ストレスに対する耐性も向上させることができる。また、本発明において、重金属ストレスとは植物が生育する土壌や植物に与えられる水に含まれる重金属（カドミウム、銅、亜鉛、マンガンなど）によるストレスをいう。
【００１３】
本発明の酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物において植物に導入される遺伝子は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又は配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子である。
【００１４】
配列番号１の遺伝子はかずさＤＮＡ研究所のゲノムプロジェクトによりゲノム解読された数種のシアノバクテリアのうち、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０のゲノム中の塩基配列ａｌｒ  ０９７５に相当し、グルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能を有する。上記ゲノムプロジェクトはゲノムの全塩基配列を解読することを目的とするものであり、解読された個々の塩基配列の機能までは明らかにしていない。配列番号１の遺伝子であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０の塩基配列ａｌｒ  ０９７５の機能（即ち、グルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としての機能）は本発明者らの上述の特許出願（特願２００３−３７６００１）により初めて明らかにされたものである。なお、配列番号１の遺伝子の由来生物であるシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０はフランスのパスツール研究所からＰＣＣ  ７１２０のカタログ番号で一般に購入することができる。
【００１５】
本発明の組換え植物に導入される遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０の塩基配列ａｌｒ  ０９７５に相当する配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子であることもできる。また、本発明の組換え植物に導入される遺伝子はシアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０の塩基配列ａｌｒ  ０９７５がコードするアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子のみならず配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子であることもできる。これは遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質を発現することが多いからである。
【００１６】
これらのいわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は、対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっており、かつデータベースに登録されている場合、かかるデータベースを用いて配列検索することにより得ることができるであろう。
【００１７】
実際、本発明者がＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）を用いて配列検索したところ、シアノバクテリアＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈｒａｅｕｍ  ＩＭＳ１０１，及びＰｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  ＭＩＴ９３１３においても配列番号１の遺伝子に類似する遺伝子が存在することが見出された（図１参照）。図１に示す通り、ａｌｒ  ０９７５タンパク質とこれらの三つの遺伝子によりコードされる推定されるタンパク質は真核生物のＰＣ合成酵素のＮ末端領域と相同性が高く、かつ五つの保存的システインのうち一つしか有していないという共通の性質を有する。従ってこれらの三つの遺伝子もグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が極めて高く、本発明の組換え植物に導入される遺伝子に包含されうるものである。
【００１８】
対象とする遺伝子源生物のゲノム配列が公知となっていない場合、いわゆる均等の範囲に含まれる遺伝子は以下の手順により得ることができるであろう。
【００１９】
即ち、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子であって、前記遺伝子によってコードされるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、配列番号１の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えばある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００２０】
ハイブリダイゼーションの手順としては、先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
【００２１】
また、配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、前記アミノ酸配列からなるタンパク質がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。得られた遺伝子がグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば得られた遺伝子を大腸菌に導入し、形質転換体中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
【００２２】
配列番号１の遺伝子がコードするタンパク質又は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質はグルタチオンからγＥＣを生成する反応を触媒する酵素の活性を有する。これはグルタチオンからのファイトケラチン（ＰＣ）の生合成反応の前半部分のみを触媒する酵素に相当する。
【００２３】
ファイトケラチン（ＰＣ）は高等生物、酵母、藻類などの真核生物に広く存在する重金属抱合ペプチドであり、重金属と強く結合することによってこれを無毒化し、細胞内に蓄積する働きを有する。ＰＣの構造は（γＥＣ）ｎＧ（Ｅ＝グルタミン酸、Ｃ＝システイン、Ｇ＝グリシン、ｎ＝２〜１１）で表され、γＥＣを基本骨格とし、末端にグリシンが結合したペプチドである。
【００２４】
高等植物等においてＰＣはグルタチオン（γＥＣＧ）を基質としてＰＣ合成酵素が触媒する以下の二段階の酵素反応により生合成される。
（１）γＥＣＧ→γＥＣ＋Ｇ
（２）（γＥＣ）ｎＧ＋γＥＣ→（γＥＣ）ｎ＋１Ｇ
一段階目の反応は基質であるグルタチオンからグリシンを切り離してγＥＣを生成する反応である。このγＥＣを二段階目の反応においてアクセプターであるＰＣｎと結合させることによってＰＣｎ＋１が合成される。この二つの反応を繰り返すことにより、重合度の高いＰＣが生合成される。
【００２５】
高等植物等において従来分離されているＰＣ合成酵素はこのように一つの酵素タンパク質が二つの反応を触媒するため、一段階目の反応で生成したγＥＣは直ちに二段階目の反応でＰＣｎと結合させるために用いられてしまう。従って、高等植物等においては、反応中間体であるγＥＣが細胞内に多量に蓄積することはない。
【００２６】
これに対し、配列番号１の遺伝子がコードするタンパク質又は配列番号２のアミノ酸配列からなる酵素タンパク質は本発明者らの先願で示した通り、ＰＣ生合成反応の二段階の反応のうち、一段階目の反応を触媒する活性は高いが二段階目の反応を触媒する活性は極めて低く、実質的に一段階目の反応のみを触媒する。従って、配列番号１の遺伝子又は配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を植物に導入して発現させると、一段階目の反応で生成されるγＥＣはＰＣ合成に用いられることなく蓄積し、本来ＰＣ生合成反応の中間体であるγＥＣが植物細胞内に多量に蓄積した状態を作り出すことができる。
【００２７】
本発明の組換え植物において酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上する理由は今だ完全には明らかになっていないが、前記遺伝子が植物で発現されることによりＰＣ生合成反応の前半部分のみが進行して反応中間体であるγＥＣが植物細胞内に多量に蓄積され、植物細胞内のチオール化合物（γＥＣやグルタチオン）の総量が増大することによるものと考えられる。
【００２８】
本発明の組換え植物の生産方法においては植物の形質転換に用いる塩基配列は上述の遺伝子に加えて前記遺伝子の発現を制御する制御配列も含む。かかる制御配列は前記遺伝子を植物細胞内で効果的に発現させる役割を有するものであり、例えば前記遺伝子の５′末端側に連結されるプロモーターであることができる。プロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ＯＣＳプロモーターなどの構成的に発現するプロモーターを用いることができる。制御配列は前記遺伝子の３´末端側に連結されるターミネーターも含むことが効果的な発現のため好ましい。ターミネーターとしてはＮＯＳターミネーター、３５Ｓターミネーターなどを用いることができる。なお、配列番号１の遺伝子は原核生物であるシアノバクテリア由来の遺伝子であるので、配列番号１の遺伝子を植物に導入する場合は、植物で使用されている遺伝暗号に応じて配列番号１の遺伝子がコードするタンパク質が適切に発現されるように配列番号１の遺伝子を改変することが望ましい。具体的には配列番号１の塩基配列のうち開始コドンＧＴＧをＡＴＧに置換することが望ましい。
【００２９】
本発明の組換え植物の生産方法においては、前記遺伝子及び前記遺伝子の発現を制御する制御配列を含む塩基配列を用いた植物の形質転換は従来公知の外来遺伝子導入方法により行うことができる。これらの方法にはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などがあるが、双子葉植物細胞を対象とする場合はアグロバクテリウム属細菌を用いる方法が確実さの点で好ましい。アグロバクテリウム属細菌を用いた形質転換法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法（大野哮司（１９８６）ベクターの開発−Ｔｉプラスミド、現代化学増刊５「植物バイオテクノロジー」、山田泰之、岡田吉美編、ｐ．１９７−２１３の第２０７〜２１２頁：内宮博文（１９８９）トランスジェニック植物、「植物遺伝情報の交換」、秀潤社、岡田吉美ら編ｐ２６１−２７６）が周知である。このようにして得られた形質転換植物が前記遺伝子を発現しているかどうかは例えば形質転換植物中のγＥＣの蓄積をクロマトグラフィーなどにより測定することにより確認することができる。
【００３０】
以上の手順により、酸化ストレス耐性及び／又は重金属ストレス耐性が向上した組換え植物を生産することができる。かかる植物は酸化ストレスや重金属ストレスに対して強い耐性を有するので、酸化ストレスや重金属ストレスの下でも生育できる農作物としてまたは環境改善用植物として極めて有用である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
【００３２】
（１）ａｌｒ  ０９７５遺伝子を用いた形質転換による組換えシロイヌナズナの作成
カリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーターＣａＭＶ  ３５Ｓによって制御されるバイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）に目的遺伝子であるａｌｒ  ０９７５を組み込み、これをエレクトロポレーション法により土壌細菌アクロバクテリウム  チューメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ｐＧＶ３１０１に導入して形質転換した。
この菌をｆｌｏｒａｌ  ｄｉｏ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｃｌｏｕｇｈ  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１６，７３５−７４３，１９９８）によりシロイヌナズナヘ感染させ、形質転換を行った。この方法は、菌の培養液に植物の地上部を浸し、これを適当な容器に入れてポンプで減圧し、その後一気に大気圧に戻すことによって、菌の感染を行わせるものである。
この植物を微弱光もしくは暗所で２４時間培養後、長角果が茶色になり乾くまで栽培し、種子を採取した。
この種子を適当な方法で無菌化し、目的遺伝子と同時に導入した薬剤耐性形質を指標に、目的遺伝子の組換え体を選抜した。
【００３３】
（２）組換えシロイヌナズナの酸化ストレス耐性および重金属ストレス耐性の評価
（１）で作成した組換えシロイヌナズナを常法により栽培して成植物を得、これから種子を採取し、これを発芽させて幼植物を得た。この実施例では酸化ストレスの直接的原因となる活性酸素として過酸化水素を用い、代表的な重金属ストレスとしてカドミウム（塩化カドミウム）を用いた。過酸化水素あるいは塩化カドミウムを指定した濃度になるように添加した水２０ｍｌを入れたシャーレに、各群２０個体の組換え植物あるいは非組換え植物を植え、白色蛍光灯連続照射下、２５℃で１週間栽培した。何も添加しない対照群と同程度の生育が認められた個体を生存した個体、枯れて葉が褐色化あるいは脱色した個体および生育が著しく阻害された個体を生存しなかった個体として、各条件における生存率を求めた（表１および表２）。なお、組換え植物および非組換え植物の対照群（過酸化水素濃度０ｍＭまたはカドミウム濃度０μＭ）の生存率は、いずれも１００％であった。
【００３４】
その結果、過酸化水素の場合、１〜５ｍＭにおける組換え植物の生存率は、非組換え植物の２〜３倍高くなった。また、カドミウムについては、１００〜５００μMにおける組換え植物の生存率は、非組換え植物の２倍〜４倍になった。
これらの結果から、ａｌｒ  ０９７５を植物体へ導入することによって、酸化ストレス耐性および重金属ストレス耐性を有意に向上させることが可能であることが示された。
【００３５】
【表１】
2005224132.tif 000002
【００３６】
【表２】
2005224132.tif 000003
【００３７】
次に、組換え植物および非組換え植物について、酸化ストレス耐性や重金属ストレス耐性を担うと考えられるチオール化合物、グルタチオン（ＧＳＨ）およびγ−グルタミルシステイン（γＥＣ）の含量を以下の方法で測定した。まず、組換え植物あるいは非組換え植物の幼植物を先に示した条件で、過酸化水素およびカドミウムを加えずに１週間栽培した。この植物を凍結粉砕した後、常法によりチオール化合物の抽出を行い、この試料を常法にしたがって高速液体クロマトグラフィーによって分析することにより、植物中のＧＳＨおよびγＥＣ含量を求めた。
【００３８】
その結果、ＧＳＨ含量については組換え植物と非組換え植物の間に大きな差はなかった。一方γＥＣについては、組換え植物でＧＳＨ含量の約半分の含量が得られたが、非組換え植物ではほとんど検出されなかった（表３）。したがって、酸化ストレス耐性や重金属ストレス耐性を担うと考えられるＧＳＨとγＥＣの総量は、組換え植物の方が非組換え植物よりも１．５倍高く、これが本発明の組換え植物が非組換え植物よりも有意に向上した酸化ストレス耐性および重金属ストレス耐性を示すことの理由と考えられる。
【００３９】
【表３】
2005224132.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、ファイトケラチンの生合成反応の前半部分のみを触媒する酵素タンパク質をコードする遺伝子を組換え植物において発現させることにより、ファイトケラチン生合成の反応中間体であり通常は細胞内に多量に蓄積することがないγＥＣを細胞内に多量に蓄積した状態を作り出すことができる。これにより本発明の組換え植物は著しく増大したチオール化合物含量を有し、その結果酸化ストレス耐性や重金属ストレス耐性の向上を示す。従って、本発明の組換え植物は酸化ストレスや重金属ストレスの下でも生育できる農作物としてまたは環境改善用植物として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ａｌｒ  ０９７５の配列と他のシアノバクテリアからの３種の遺伝子の配列とのアラインメント結果を示す。
【図１】
2005224132.tif 000005
【配列表】
2005224132000001.app