(57)【要約】      （修正有）【課題】  体毛、特に毛髪からＲＮＡを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法の提供。【解決手段】  哺乳動物や鳥類などの体毛からＲＮＡを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに液体窒素を用いて超低温に凍結し、次いでチオシアン酸グアニジンなどを含有するフェノールが用いられる、ＲＮＡ抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理することから成る、体毛からＲＮＡを抽出する方法の提供。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体毛からＲＮＡを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに凍結し、次いでＲＮＡ抽出用試薬液と接触させ、しかる後にボルテックス攪拌処理してＲＮＡを抽出することから成る方法。
【請求項２】
体毛を抜去してから１０秒以内に液体窒素で凍結される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体毛からＲＮＡを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織からＲＮＡを抽出する場合、組織を界面活性剤処理、酵素処理、超音波処理、物理的破壊、凍結破砕などにより破砕してから、ＲＮａｓｅ阻害剤などを含むＲＮＡ抽出試薬液中で抽出操作が行われる。毛髪や骨のような強固な構造をもった組織からの抽出の場合、細胞の破砕自体が困難であり、ＲＮＡの回収率は一般に低い。
【０００３】
毛髪からのＲＮＡの抽出は、例えば毛髪をＲＮＡ抽出試薬液中に入れ、室温にてホモジナイザーで破砕し、その後ボルテックス処理にかける操作が行われている（特開2000-300298）。骨等の硬質組織からのＲＮＡの抽出は、例えば液体窒素などの超低温環境において加圧容器及びプランジャーを用いて組織を押し潰すことで破砕し、ＲＮＡ抽出試薬液に移して抽出工程にかけるなどされている。前者のようにしても、毛髪の強固な構造のため、ＲＮＡの回収率は十分ではない。超低温環境での押し潰し破砕を頼りとする後者の場合、硬質組織が十分に破砕され、ＲＮＡが比較的高収率で獲得できるが、細胞塊がプランジャー（チューブ側）に付着するため、回収の操作が面倒であるといった欠点がある。従って、毛髪などの強固な構造を有する組織からのＲＮＡのより効率的な抽出方法の出現が所望される。
【０００４】
【特許文献１】特開2000-300298
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、体毛からＲＮＡを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は驚くべきことに、体毛を抜去してから直ちに液体窒素などで超低温凍結後、ＲＮＡ抽出用試薬液に入れ、次いでボルテックス処理するといった簡単な操作でＲＮＡを高収率で回収できることを見出した。体毛は比較的強固な構造を有する組織であるため、凍結してから単にボルテックス処理にかけるだけでＲＮＡを高収率で抽出できることは驚くべき事実である。
【０００７】
従って、本発明は、体毛からＲＮＡを抽出するための方法であって、体毛を抜去してから直ちに凍結し、次いでＲＮＡ抽出用試薬液と接触させ、しかる後ボルテックス処理してＲＮＡを抽出することをから成る方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従い、体毛、特に毛髪からＲＮＡを簡便な操作で、しかも高収量、高純度で回収することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は体毛からＲＮＡを効率よく回収する方法を提供する。
体毛は、哺乳動物、例えばヒト、サルなどの霊長類の他、ウシなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、イヌ、ネコなどの食肉類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類などといった如何なる動物の体毛であってもよい。さらには、体毛は鳥類の羽毛であってもよい。特に好ましくは、体毛はヒトの毛髪である。
【００１０】
本発明においては、ＲＮＡ抽出にかける体毛を抜去してから直ちに凍結しておく。抜去してから凍結するまでの時間は、ＲＮＡの分解を最小限に抑えるために可能な限り短いのがよく、好ましくは抜去してから３０秒以内、より好ましくは１０秒以内に凍結させる。凍結は、好ましくは液体窒素やドライアイスなどを用いて、あるいはディープフリーザー、例えば設定温度が−３０℃以下のディープフリーザーを用いて行う。特に好ましくは、凍結は液体窒素を用いて行う。次に、その凍結した体毛をＲＮＡ抽出用試薬に入れ、ボルテックスミキサーで攪拌し、抽出操作を行う。
【００１１】
ＲＮＡ抽出用試薬としては、好ましくは一般によく使用されるＲＮＡ抽出用試薬、好ましくはＲＮａｓｅ阻害剤、例えばチオシアン酸グアニジンなどのグアニジン系試薬を含有するフェノールが用いられる。特に好ましいＲＮＡ抽出用試薬はニッポンジーン社より製品名「ＩＳＯＧＥＮ」で市販されているものである。
【００１２】
ボルテックスミキサーによる攪拌処理は、１，５００〜５，０００ｒｐｍ、より好ましくは２，０００〜４，０００ｒｐｍ、最も好ましくは約２，５００ｒｐｍの回転数において、例えば０．５〜２分、好ましくは約１分かけて行うのことが好ましい。攪拌は室温で行ってよく、必要であれば低温、例えば２〜１０℃で行ってもよい。ボルテックスミキサーとしては市販のもの、例えばアズワン（株）ＨＭ−１ＯＨが使用できる。
【００１３】
好適な態様においては、上記のようにして調製したＲＮＡ含有試料を例えば以下のようにして更に処理し、ＲＮＡを高純度で含む試料を調整する。
上記ＲＮＡ含有試料に好ましくはクロロフォルムを加えて再度ボルテックスミキサーを用い攪拌処理を行い、遠心分離（例えば１５，０００ｒｐｍ、１５分間）し、ＲＮＡを含む水相を回収する。回収した溶液に、例えば酢酸ナトリウムとニッポンジーン社製のエタ沈メイトを添加して十分に攪拌し、さらにイソプロパノールを加えて攪拌し、遠心分離（例えば１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、全ＲＮＡを沈殿させる。上清を捨てた後にエタノール（例えば７５％エタノール）を加え、再び遠心分離する。上清を捨てて沈殿を風乾させ、nuclease free waterに溶解させる。最後に、ＤＮａｓｅＩ処理により混在するゲノムＤＮＡを除去し、再度エタノール沈殿により全ＲＮＡを回収して、nuclease free waterに溶解させる。
【００１４】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
実験１：抜去毛髪検体からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ 調製法
１）ボルテックスミキサーによるｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製（本発明に係る「液体窒素−ボルテックス法」）
毛髪を抜去してから直ちに（１０秒以内に）液体窒素中で凍結し、直ちにＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン)１ｍｌの入った１．５ｍｌチューブに入れ、ボルテックスミキサー（アズワン製）を用い、室温（約２５℃）にて回転数２，５００ｒｐｍで１分間攪拌を行った。これをＲＮＡ粗調製品１とした。
【００１６】
２）ガラスホモジナイザーによるｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製（「液体窒素−ガラスホモジナイザー法」）
毛髪を抜去してから直ちに（１０秒以内）液体窒素中で凍結し、ＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ  １ｍｌに移し入れ、ガラスマイクロホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ社製；容量０．１ｍｌ）を用い、氷上にて手作業により可能な限り細かくホモジナイズした。これをＲＮＡ粗調製品２とした。
【００１７】
３）クライオプレスによるｔｏｔａｌ ＲＮＡの調整（クライオプレス法）
クライオプレス(マイクロテック・ニチオン社製)のマイクロチューブ用プレスセルを液体窒素で冷却し、さらに２．０ｍｌマイクロチューブを装着してその内部に液体窒素を入れ、抜去した毛髪を直ちに（抜去してから１０秒以内）この中で凍結した。マイクロチューブ用のプランジャーを付けて、上からエアコンプレッサーの圧力０．４ＭＰａを加えて毛髪を粉砕した。プランジャーをＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ  １ｍｌの入った５０ｍｌチューブに移して、プランジャーに付着したサンプルを回収した。抽出液が融解した後１．５ｍｌチューブに移し、ボルテックスミキサー（アズワン社製）にて十分に攪拌して溶解させた。セルに付着したサンプルはスパチュラにて掻きとり、１．５ｍｌチューブ中のＲＮＡ抽出液ＩＳＯＧＥＮ１ｍｌに分散させ、ボルテックスミキサー（アズワン社製）を用い、室温（約２５℃）にて回転数２，５００ｒｐｍで１分間攪拌を行った。これをＲＮＡ粗調製品３とした。
【００１８】
実験２：ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
上記ＲＮＡ調製品１〜３（１ｍｌ）それぞれにクロロフォルム２００μｌを加えて再度ボルテックスミキサーを用い、室温（約２５℃）にて回転数２，５００ｒｐｍで１分間攪拌を行ったに、小型微量遠心分離機により遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）し、ＲＮＡを含む水相約５００μｌを回収した。回収した溶液に５０μｌの３M酢酸ナトリウムと１μｌのエタ沈メイト(ニッポンジーン)を添加して十分に攪拌した。さらに１ｍｌのイソプロパノールを加えて攪拌し、小型微量遠心分離機により遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分間）して、全RNAを沈殿させた。上清を捨てた後に７５％エタノールを加え、再び小型微量遠心分離機により遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）した。上清を捨てて沈殿を風乾させ、２０μｌのnuclease free waterに溶解させた。NanoDrop（Technologies, Inc．）によりＲＮＡの濃度と純度を測定した。
次に、ＤＮａｓｅＩ処理により混在するゲノムDNAを除去し、再度エタノール沈殿により全ＲＮＡを回収して、２０μｌのnuclease free waterに溶解させた。NanoDropによりＲＮＡの濃度を測定した。
【００１９】
図１は、各試料中のＲＮＡの絶対量（ｎｇ／μｌ）及びＲＮＡの純度を示す。ＲＮＡの純度は、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの紫外線吸収の比を求めることにより算出した。この比が「２」に近いほど、ＲＮＡの純度は高いことを示す（ラボマニュアル遺伝子工学増補版  村松正實編１９９Ｃ、丸善（株）Ｐ３４）。
【００２０】
図１から、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法により毛髪からＲＮＡを抽出することで、液体窒素−ガラスホモジナイザー法やクライオプレス法と比べ、ＲＮＡを最も高収量且つ高純度で獲得できることが明らかとなった。特に興味深いことに、本発明の方法は、ＲＮＡの抽出法として一般に好適とされるクライオプレス法と比べ、ＲＮＡの収量の点でも、明らかに優れた結果を示した。従って、毛髪などの体毛からＲＮＡを抽出する場合には、クライオプレスなどを使わず、単に体毛を抜去後すばやく凍結し、ＲＮＡ抽出液中でボルテックス攪拌処理するだけでＲＮＡを簡単な操作で高収量、高純度で獲得できることが判った。
【００２１】
図２は、抜去毛５本分について、上記と同様にし、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法（ＶＴ）又はクライオプレス法（ＣＰ）によりＲＮＡ抽出を行ってからＤＮａｓｅ処理することで得たＲＮＡの収量結果を、ｔ−検定による統計学的分析結果と共に示す。この結果から、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法（ＶＴ）によるＲＮＡ抽出法は、クライオプレス法（ＣＰ）と比べ、ＲＮＡの収量において有意に優れることが明らかである。
【００２２】
図３は、同一人物由来の抜去毛５本の１本、１本について、上記と同様にし、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法によりＲＮＡ抽出を行ってからＤＮａｓｅ処理することで得たＲＮＡの収量結果を示す。この結果から、抜去毛それぞれから回収されるＲＮＡの収量は概ね同等であることがわかる。従って、本発明に従えば、体毛、特に毛髪からのＲＮＡの回収における操作間差も小さくなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、クライオプレス法や液体窒素−ガラスホモジナイザー法と比べ、簡単且つ高収量でのＲＮＡの回収を可能とする。これにより、例えば体毛、特に毛髪が１本さえあれば、ＲＮＡを調製するのに十分とすることができるようになる。従って、本発明は体毛、特に毛髪からのｍＲＮＡの定量、定性が通常実施されるあらゆる産業、例えば臨床検査産業、医薬品産業、化粧品産業、獣医学・獣医薬産業、土壌・河川検査産業、法医学産業などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】各ＲＮＡ抽出方法に従い、毛髪からＲＮＡを抽出した結果を示す。
【図２】抜去毛５本についての、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法（ＶＴ）及びクライオプレス法（ＣＰ）によるＲＮＡ抽出結果を示す。
【図３】同一人物由来の抜去毛５本それぞれについての、本発明に係る液体窒素−ボルテックス抽出法によるＲＮＡ抽出結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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