(57)【要約】【課題】  簡単、かつ安価に得ることができるＴＮＦ−αに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供すると共に、上記ペプチド又はタンパク質を用いたＴＮＦ−α吸着体、ＴＮＦ−α検査薬及びＴＮＦ−α中和剤を提供する。【解決手段】  ＴＮＦ−αをターゲット物質として用い、ファージディスプレイ法によりスクリーニングを行い、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を同定する。このようにして得られた配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列を有するペプチドは容易に化学合成可能であり、例えば、ＴＮＦ−α吸着体、ＴＮＦ−α検査薬、ＴＮＦ−α中和剤等として利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有することを特徴とするペプチド又はタンパク質。
【請求項２】
配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化したことを特徴とするＴＮＦ−α吸着体。
【請求項３】
配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とするＴＮＦ−α検査試薬。
【請求項４】
配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α中和剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ−αに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質に関し、更には該ペプチド又はタンパク質を用いたＴＮＦ−α吸着体、ＴＮＦ−α検査試薬及びＴＮＦ−α中和剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）という因子群の一つであるＴＮＦ−αは、マクロファージ等から主に産生されるサイトカインであり、多種類の細胞に作用して多岐にわたる働きを発揮し、生体に対して腫瘍細胞や感染細胞を傷害する生体防御に重要な役割を果たす一方で、過剰な産生により、例えば、慢性関節リウマチ、敗血症、慢性炎症性疾患、糖尿病、アレルギー、虚血性心疾患等の様々な疾患に関わっていることが知られている。
【０００３】
そのため、上記のようなＴＮＦ−αが関与する疾患の治療薬として、ＴＮＦ−αの活性を阻害（中和）する作用を有する薬剤の開発が進められており、例えば、下記特許文献１には、ヒト腫瘍致死因子（ＴＮＦ）αを中和することが可能なモノクローナル抗体又はその結合フラグメントであって、ヒトＴＮＦαを沈殿させ高分子量抗原−抗体複合体を形成することが可能であることを特徴とするモノクローナル抗体が開示されている。
【０００４】
また、下記特許文献２、３には、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約５５ｋＤまたは７５ｋＤの分子量および特定の部分アミノ酸配列を含有するＴＮＦに結合する均質な形態の組換え不溶性タンパク質が開示されており、このタンパク質はＴＮＦが関与する疾病の治療及びＴＮＦの検出に使用されることが記載されている。
【特許文献１】特開平５−９６号公報
【特許文献２】特開平１０−９５８００号公報
【特許文献３】特開平１０−１１４７９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のモノクローナル抗体や組換え不溶性タンパク質は、その調製に手間がかかるとともに大量調製が難しく、コストがかかってしまうという問題があった。
【０００６】
また、上記のモノクローナル抗体や組換え不溶性タンパク質は、それ自身が抗原となったり、培養細胞や微生物に由来する夾雑物の混入等が懸念されるなど、安全性の面で問題があった。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、簡単、かつ安価に得ることができるＴＮＦ−αに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供すると共に、上記ペプチド又はタンパク質を用いたＴＮＦ−α吸着体、ＴＮＦ−α検査薬及びＴＮＦ−α中和剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の一つは、配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有することを特徴とするペプチド又はタンパク質を提供するものである。
【０００９】
上記発明によれば、ＴＮＦ−αに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供することができる。これらのペプチド又はタンパク質は容易に化学合成できるので、従来のモノクローナル抗体や組換えタンパク質に比べて簡単、かつ安価に得ることができ、夾雑物の混入等の心配がほとんどない。これらのペプチド又はタンパク質は、ＴＮＦ−α吸着体の素材、ＴＮＦ−α検査薬、ＴＮＦ−α中和剤等として利用することができる。
【００１０】
また、本発明のもう一つは、配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化したことを特徴とするＴＮＦ−α吸着体を提供するものである。
【００１１】
上記発明によれば、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を担体に固定化することにより、より安価なＴＮＦ−α吸着体を提供することができる。このＴＮＦ−α吸着体は、ＴＮＦ−αの除去や精製等に好適に用いることができる。
【００１２】
更に、本発明のもう一つは、配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することを特徴とするＴＮＦ−α検査試薬を提供するものである。
【００１３】
上記発明によれば、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有することにより、より安価で検出感度の高いＴＮＦ−α検査薬を提供することができる。
【００１４】
更にまた、本発明のもう一つは、配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有し、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有することを特徴とするＴＮＦ−α中和剤を提供するものである。
【００１５】
上記発明によれば、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有させることにより、より安価なＴＮＦ−α中和剤を提供することができる。このＴＮＦ−α中和剤は、ＴＮＦ−αが関与する疾患（例えば、慢性関節リウマチ、敗血症、慢性炎症性疾患、糖尿病、アレルギー、虚血性心疾患等）の治療薬等への応用が期待できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＴＮＦ−αに結合性を有する新規なペプチド又はタンパク質を提供することができる。このペプチド又はタンパク質は容易に化学合成できるので、従来のモノクローナル抗体や組換えタンパク質等に比べて安価に得ることができる。したがって、ＴＮＦ−α吸着体の素材、ＴＮＦ−α検査薬、ＴＮＦ−α中和剤等として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドであり、ペプチド中に配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものである。
【００１８】
本発明のペプチドは、上記の部分アミノ酸配列を有するものであれば、そのアミノ酸数は特に制限されないが、通常、アミノ酸数４〜５０個からなることが好ましく、アミノ酸数６〜２０個からなることがより好ましい。また、本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾（例えばアセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、糖鎖の付加等）、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失があってもよい。なお、本発明のペプチドは、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００１９】
本発明のペプチドは、ＴＮＦ−αをターゲット物質として、ファージディスプレイ法（Smith, G.P., Science, 288, 1315-1317 (1985)）によって得られたものであり、実施例に示すように分子間結合解析ソフト（商品名「BioPackage」、日立製作所製）を用いた解析によってもＴＮＦ−αとの結合を確認することができた。なお、ファージディスプレイ法は、ファージの外殻タンパク質に、ランダムなアミノ酸配列を有するペプチド（通常、アミノ酸数５〜１２個程度）を融合タンパク質として提示させたファージライブラリを用いて、ターゲット物質に結合するペプチドをスクリーニングする方法である。ファージライブラリは、例えば、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等に記載された方法にしたがって、ランダム化したＤＮＡを化学合成し、これをファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより調製することができる。また、ファージライブラリは市販されており、例えば、商品名「Phage Display Peptide Library Kit」、New England Biolab社製）等を用いることもできる。
【００２０】
そして、ファージディスプレイ法等により決定されたアミノ酸配列に基づいて、例えば、固相法、Ｆｍｏｃ法等の公知のペプチド合成法により、目的とするペプチドを簡単に合成することができる。
【００２１】
また、本発明のタンパク質は、ＴＮＦ−αに結合性を有するタンパク質であって、タンパク質中に配列番号１〜７のいずれか一つで表されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列においてＴＮＦ−αに対する結合性が損なわれない範囲で修飾、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失したアミノ酸配列から選ばれたアミノ酸配列を有するものであり、その分子量等は特に制限されないが、上記アミノ酸配列を有する部分が、ＴＮＦ−αと接触・結合できるように、タンパク分子上に提示されている必要がある。なお、本発明のタンパク質は、上記アミノ酸配列を複数個有していてもよい。
【００２２】
本発明のタンパク質としては、以下のようなものが例示できる。
【００２３】
(i)上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドを、HRP（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、AP（アルカリフォスファターゼ）、β-D-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素等の酵素に結合したもの。
【００２４】
このようなタンパク質は、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著  学会出版センター）等に記載された公知の方法にしたがって、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドと上記酵素とを結合させることにより得ることができる。
【００２５】
(ii)上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドを表面に提示したファージ。
【００２６】
このようなファージは、Smith, G. P., Science, 288, 1315-1317 (1985)、J. K. Scott and G. P. Smith, Science, 249, 386-390 (1990)等に記載されたファージライブラリの作製方法にしたがって得ることができる。すなわち、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドをコードするＤＮＡを化学合成し、このＤＮＡをファージラブラリを作製するときと同様の方法で、ファージＤＮＡの外殻タンパク質をコードする遺伝子に挿入し、このＤＮＡを大腸菌に導入することにより、所望のペプチドを表面に提示したファージを得ることができる。
【００２７】
(iii)上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドを所定の抗原に連結したものと、該抗原に対する抗体とを結合させた抗体。
【００２８】
このような抗体は、本出願人による特願2002-241688号に記載された方法によって得ることができる。例えば、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドと抗原となるペプチドとを連続した一つのペプチドとして合成し、前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応により結合させればよい。
【００２９】
次に、本発明のＴＮＦ−α吸着体について説明する。      
本発明のＴＮＦ−α吸着体は、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を適当な担体に結合させることにより得ることができる。このＴＮＦ−α吸着体は、例えば、血清等の体液に含まれるＴＮＦ−αの除去やＴＮＦ−αの精製等に用いる吸着体として利用することができる。
【００３０】
上記担体の素材としては、ペプチド又はタンパク質を物理的あるいは化学的に結合できる素材であればよく、例えば、アミノ基あるいはチオール基等の官能基を修飾したセファロース又はストレプトアビジンをコーティングした磁性体等からなるビーズ、織布、不織布等が挙げられる。
【００３１】
上記ペプチド又はタンパク質と担体との結合は、例えば、カルボキシル基を修飾した上記ペプチド又はタンパク質をN−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化し、アミノ基を修飾した担体とアミド結合により結合する方法、末端にシステインを付加した上記ペプチド又はタンパク質とチオール基を修飾した担体とをジスルフィド結合により結合する方法、又はビオチンを付加させた上記ペプチド又はタンパク質とストレプトアビジンをコーティングした担体とをビオチン−アビジン結合により結合する方法等によって行うことができる。
【００３２】
なお、上記ペプチド又はタンパク質を担体に結合させる際に、ペプチドの末端やタンパク質の適当な部分等に担体との結合に利用可能な適当なスペーサーを挿入してもよい。スペーサーとしては、例えば、アミノ酸、ペプチド（好ましくは、グリシンやセリンが数個（通常２〜１０個）ペプチド結合したペプチド等のフレキシブルリンカー等）、炭素数２〜１８の主鎖（主鎖中にエステル結合やエーテル結合を有していてもよい。）を有し、好ましくは水酸基等の親水性の官能基を有するもの（例えば、両末端に活性基を有するポリビニルアルコール、好ましくはビニルアルコール分子が２〜１０程度重合したもの）、２〜１０糖からなる糖鎖等が例示できる。例えば、スペーサーがアミノ酸やペプチドである場合は、スペーサーを挿入したペプチドを連続した一つのペプチドとして合成することができるので好ましい。
【００３３】
このようなスペーサーを挿入することにより、担体との結合を行いやすくなる。また、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチド又はタンパク質とＴＮＦ−αとの立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチド又はタンパク質とＴＮＦ−αとの接触をより容易にすることができるので、吸着能力の向上を図ることも可能となる。
【００３４】
次に、本発明のＴＮＦ−α検査薬について説明する。      
本発明のＴＮＦ−α検査薬は、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を含有するものであり、具体的には、該ペプチド又はタンパク質に、例えば、酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープ等の標識物質を結合させることにより得ることができる（なお、上記(i)〜(iii)に例示したタンパク質はそのままでもＴＮＦ−αの検出試薬として利用することができる。）。このＴＮＦ−α検査薬は、例えば、血清等の体液中のＴＮＦ−α検出するための診断剤として使用できる。
【００３５】
上記酵素としては、上記(i)に例示した酵素が挙げられる。また、上記蛍光物質としては、FITC、GFP、Cy3、Cy5等が例示できる。
【００３６】
上記ペプチド又はタンパク質と標識物質、例えば、蛍光物質との結合は、例えば「超高感度酵素免疫測定法」（石川栄治著  学会出版センター）等に記載されている方法にしたがって行うことができる。
【００３７】
なお、上記ペプチド又はタンパク質と標識物質を結合させる場合には、上述したようにペプチドの末端やタンパク質の適当な部分等に標識物質との結合に利用可能な適当なスペーサーを挿入してもよい。スペーサーを挿入することにより、標識物質の結合を行いやすくなると共に、スペーサーの長さを調整することにより、上記ペプチド又はタンパク質とＴＮＦ−αとの立体的な結合阻害を回避して、上記ペプチド又はタンパク質とＴＮＦ−αとの接触をより容易にすることができるので、検出感度の向上を図ることも可能となる。
【００３８】
次に、本発明のＴＮＦ−α中和剤について説明する。      
本発明のＴＮＦ−α中和剤は、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド又はタンパク質を有効成分として含有するものであり、ＴＮＦ−αに強く結合することにより、ＴＮＦ−αの活性を阻害してＴＮＦ−αが関与する疾患（例えば、慢性関節リウマチ、敗血症、慢性炎症性疾患、糖尿病、アレルギー、虚血性心疾患等）の治療薬等への応用が期待できる。特に、上記ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドは、従来のモノクローナル抗体や組換えタンパク質に比べて、安価に大量調製することができるだけでなく、副作用のリスクも低減できると考えられる。
【００３９】
ＴＮＦ−α中和剤の具体的な態様としては、上記（iii）に例示したタンパク質（抗体医薬）のほか、上記ペプチドと、例えば、乳酸系ポリマー、シアノアクリレートポリマー、ポリエチレングリコール等の生分解性を有する高分子（ポリマー）とを混ぜて製剤化したもの等が例示できる。ペプチドは一般的に生体に投与すると、易分解性であるため血中でのペプチド濃度の維持が難しいとされており、ペプチドと上記のような生分解性を有する高分子とを混ぜて製剤化することにより、徐々に生体内で解け出る（徐放性）性質を付加することができる。
【００４０】
本発明のＴＮＦ−α中和剤の投与方法としては、血管内への投与が好ましく採用され、例えば、点滴静注等が挙げられる。本発明のＴＮＦ−α中和剤の製剤形態は特に限定されないが、血管内に投与する場合には、注射液や点滴液等の製剤形態、あるいは注射液や点滴液に容易に溶解できる製剤形態が好ましい。
【００４１】
本発明のＴＮＦ−α中和剤の有効投与量は、血管内投与の場合には、成人体重１ｋｇに対して、上記ペプチド又はタンパク質換算で０．３〜３００ｍｇであり、好ましくは３〜３０ｍｇである。
【００４２】
本発明のＴＮＦ−α中和剤は、ペプチド又はタンパク質からなり、比較的人体に安全で作用特異性が高いため、副作用のリスクを低減できると考えられる。
【実施例１】
【００４３】
ターゲット物質として、ＴＮＦ−α（peprotech社製）を用い、ファージディスプレイ法により、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドのスクリーニングを以下の（１）〜（７）のように行った。
【００４４】
なお、ファージディスプレイ法では、M13ファージの表面のマイナータンパクｐIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が１２個のペプチドライブラリ）を、Smith,G.P., Science,288,1315-1317（1985）、J.K.Scott and G.P.Smith, Science,249,386-390 (1990)等の記載に基づいて作製し、このペプチドライブラリを用いた。
【００４５】
（１）ＴＮＦ−αの固定化
ＴＮＦ−α（peprotech社製）が溶解しているバッファーを、限外ろ過チューブ（商品名「セントリコンYM-10」、MILLIPORE製）にて100mM 炭酸ナトリウムバッファーに交換した。ターゲットＴＮＦ−αは、商品名「sulfoNHS-LC-Biotin」（ピアース社製）を用いてビオチン標識し（主にリジン（Lys）のアミノ基がビオチン化される）、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズ（商品名「Dynabeads M280 streptavidin」、Dyanal社製）にビオチン−ストレプトアビジン結合によりＴＮＦ−αを固定化した。この磁気ビーズ（以下、ＴＮＦ−α固定化磁気ビーズという）は非特異的吸着を抑制するために2％スキムミルク/TBS（100mM Tris-HCl、140mM NaCl pH7.4）に懸濁してブロッキングを行った。
【００４６】
（２）パニング
上記ＴＮＦ−α固定化磁気ビーズ120μLを1.5mLのエッペンチューブにとり、TBS-Tバッファー（0.1% Tween20 in TBSバッファー、以下同じ）で６回洗浄した。そして、上記ペプチドライブラリー20μLを1%スキムミルク/TBS-Tバッファー1mLに加えて非特異的吸着低減処理を行い、これを上記ＴＮＦ−α固定化磁気ビーズに加えて６０分撹拌した後TBS-Tバッファーで５回洗浄した。この操作により、図１に示すように、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドを提示したファージのみが磁気ビーズに固定化されたＴＮＦ−αに結合し、その他のファージは除去される。
【００４７】
次に、Glycine−HClバッファー（0.2M Glycine−HCl/0.1% BSA、pH2.2）を100μL加えて７分間反応させてＴＮＦ−αに結合したファージを溶出させ、この上澄み液を0.5mLのエッペンチューブに移し、15μLのTris−HClバッファー（1M Tris−HCl、pH9.1）で中和し、ファージ溶出液とした。
【００４８】
（３）ファージ増幅
20mLのLB培地（バクトトリプトン（和光純薬）10g、イーストエキストラクト（和光純薬）5g、NaCl（和光純薬特級）5gをMilli-Q水にて1Lに調整）を入れた300mLの三角フラスコで大腸菌（ER2738）をOD600＝0.6になるまで振とう培養器（37℃）で培養し、上記（２）で得られたファージ溶出液を全量加えて大腸菌に感染させ、４．５時間振とう培養器（37℃）で培養し、ファージを増幅した。
【００４９】
増幅後、上記培地を50mL遠沈管に移し、遠心分離（10000rpm、4℃、10分間）して、その上澄み液を新しい50mL遠沈管に移し、PEG液（20% PEG#6000/2.5M NaCl、以下同じ）を4mL加えて4℃で８時間インキュベートした。
【００５０】
その後、遠心分離（10000rpm、4℃、15分間）して上澄みを捨て、そこへ1mLのTBSバッファーを加えて沈殿物（ファージ）を溶解した。その液を1.5mLエッペンチューブに移し、遠心分離（10000rpm、4℃、5分間）して、その上澄み液を新しい1.5mLエッペンチューブに移し、PEG液を200μL加えて氷中で６０分間インキュベートした。
【００５１】
その後、遠心分離（10000rpm、4℃、10分間）して上澄みをきれいに捨て、沈殿物（ファージ）を200μLのTBSバッファーに溶解した。
【００５２】
この精製したファージ100μLを使用して、再びパニング・増幅・精製の操作を同様にして３回繰り返して行い、４回目はパニング工程においてファージを溶出するところまで行い、ファージ溶出液を得た。
【００５３】
（４）タイター測定（プラークの形成）
1.5mLのエッペンチューブに、試験管にて5mLのLB培地で８時間培養しておいた大腸菌（ER2738）を200μLずつ入れ、そこへ４回目のパニングで得られたファージ溶出液をTBSバッファーで103、104、105倍希釈したファージ溶液をそれぞれ10μLずつ加え、２．５分間インキュベートした。
【００５４】
この溶液の全量を、アガローストップ（バクトトリプトン（和光純薬）5g、イーストエキストラクト（和光純薬）2.5g、NaCl（和光純薬特級）2.5g、アガロースS（和光純薬電気泳動用）3.5g、MgSO4・7H2O（関東化学特級）0.5gをMilli-Q水にて500mLに調整後、オートクレーブして15mLの遠沈管に分注し、45℃に暖めておいたもの）に加えてよく撹拌した。そして、このアガローストップ全量をLBプレート（LB培地1Lに15gのアガー（関東化学）を加え、オートクレーブ後70℃以下になったらIPTG/X-Gal（IPTG（和光純薬生化学用）0.5g、X-Gal（和光純薬生化学用）0.4g、ジメチルホルムアミド（関東化学特級）10mL）を1mL添加し滅菌シャーレにまき、37℃に暖めておいたもの）にまき、固化後、パラフィルムで封をして37℃で８時間インキュベートした。
【００５５】
（５）プラークからファージの増幅
LB培地70mL入れた300mLの三角フラスコで大腸菌（ER2738）をOD600＝0.6になるまで振とう培養器（37℃）で培養し、試験管に5mLずつ分注した。
【００５６】
上記タイターしたLBプレートを観察して、隣接していない大きなプラークを１２クローン選んで楊枝で突付き、それぞれ楊枝ごと上記試験管に入れて４．５時間振とう培養器（37℃）で培養して各ファージを増幅した。
【００５７】
各ファージは増幅後、50mL遠沈管に移し、遠心分離（10000rpm、4℃、10分間）して、その上澄み液を新しい50mL遠沈管に移し、PEG液を1mL加えて4℃で８時間インキュベートした。
【００５８】
その後、遠心分離（10000rpm、4℃、15分間）して上澄みを捨て、そこへ1mLのTBSバッファーを加えて沈殿物（ファージ）を溶解した後、1.5mLエッペンチューブに移し、遠心分離（10000rpm、4℃、5分間）して、その上澄み液を新しい1.5mLエッペンチューブに移し、PEG液を200μL加えて氷中で６０分間インキュベートした。
【００５９】
その後、遠心分離（10000rpm、4℃、10分間）して上澄みをきれいに捨て、沈殿物（ファージ）を200μLのTBSバッファーに溶解し、各クローン（ファージ）を精製した。
【００６０】
（６）ELISAによる得られたペプチドのＴＮＦ−αに対する結合性の確認
９６穴プレートの上から２列目にＴＮＦ−αを2μg/ウエルになるように添加し、更に炭酸水素ナトリウムバッファーを添加して全量100μLになるように調整して、4℃で８時間インキュベートした。
【００６１】
インキュベート後、ウエル中の溶液を捨て、上から２列目（ＴＮＦ−α固定化列）と最上列（ＴＮＦ−αを固定化していないブランク列）に2%スキムミルク/PBSバッファー（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO4 0.24gをMilli-Q水で1Lにメスアップ後、pH7.4に調整）を１ウエル当り300μL入れて６０分間撹拌した後、液を捨て、１ウエル当り200μLの洗浄液（0.1%Tween−PBSバッファー、以下同じ）で５回洗浄した。
【００６２】
そして、上記各精製ファージ（単クローン）16μLに、それぞれ2%スキムミルク/PBSバッファーを64μL、PBSバッファーを120μL加えて非特異的吸着低減処理を行った後、各列の１２個のウエルに各精製ファージを加え、６０分間撹拌した後、液を捨てて１ウエル当り200μLの洗浄液で５回洗浄した。
【００６３】
次に、商品名「HRP Anti-M13Monoclonal Conjugate」（Amersham Biosciences製）を１ウエル当り0.04μL、2%スキムミルク/PBSバッファーを200μL加えて６０分間撹拌した後、液を捨てて１ウエル当り200μLの洗浄液で６回洗浄した。
【００６４】
次に、１ウエル当り、ABTS（和光純薬製）を44μg、30%過酸化水素水を0.35μL、0.05Mクエン酸バッファー（0.05Mクエン酸、pH4.0）を200μL入れ、３０分後の吸光度（405nm）をマイクロタイタープレートリーダー（商品名「ARVO.SX」、ワラック社製）で測定し、ブランク列（最上列）の吸光度（Ａ）とＴＮＦ−α固定化列（上から２列目）の吸光度（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）を求めた。そして、吸光度比（Ｂ／Ａ）の高いクローン、すなわち、ＴＮＦ−αに対する特異的な結合があるクローン（吸光度比6.85）を選択した。
【００６５】
（７）ペプチドのアミノ酸配列確認
上記（６）で選択したクローン（ファージ）に提示されているペプチドのアミノ酸配列を調べるために、シークエンス用のCy5蛍光標識プライマーとして配列番号８に示すプライマーを用いて、商品名「Thrme Sequenase Labelled Primer Cycle Sequencing kit with 7-deaza-dGTP」（Amersham Biosciences社製）でシークエンス反応を行い、商品名「ALFexpressII」（Amersham Bio sciences社製）で配列決定を行った。その結果、配列番号１に示すペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【実施例２】
【００６６】
実施例１の（１）〜（５）と同様にして、呈示されるランダムアミノ酸数が１２個のペプチドライブラリを用いてファージディスプレイ法を再度行い、１２クローン（ファージ）を選択した。
【００６７】
そして、９６穴プレートに固定化するＴＮＦ−αを0.02μg/ウエルとした以外は、実施例１の（６）と同様にして上記１２クローン（ファージ）のELISAを行い、ブランク列の吸光度（Ａ）とＴＮＦ−α固定化列の吸光度（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）を求め、吸光度比（Ｂ／Ａ）の高いクローン、すなわちＴＮＦ−αに対する特異的な結合があるクローン（吸光度比1.24）を選択した。なお、本実施例における吸光度比が実施例１の場合に比べて低いのは、プレートに固定化したＴＮＦ−αの量が異なる（実施例１の方が多い）ためである。
【００６８】
そして、実施例１の（７）と同様にして、選択したクローン（ファージ）に提示されているペプチドのアミノ酸配列を調べ、配列番号２に示すペプチドのアミノ酸配列を同定した。
【実施例３】
【００６９】
M13ファージの表面のマイナータンパクｐIIIにペプチドがランダムに呈示されるライブラリ（呈示されるランダムアミノ酸数が７個のペプチドライブラリ）を、Smith,G.P., Science,288,1315-1317（1985）、J.K.Scott and G.P.Smith, Science,249,386-390 (1990)等の記載に基づいて作製し、このペプチドライブラリを用いて実施例１の（１）〜（５）と同様にしてファージディスプレイ法を行い、１２クローン（ファージ）を選択した。
【００７０】
そして、実施例２と同様にして上記１２クローン（ファージ）のELISAを行い、ブランク列の吸光度（Ａ）とＴＮＦ−α固定化列の吸光度（Ｂ）の比（Ｂ／Ａ）を求め、吸光度比（Ｂ／Ａ）の高いクローン、すなわちＴＮＦ−αに対する特異的な結合があるクローン（吸光度比1.24〜1.35）を選択した。
【００７１】
そして、実施例１の（７）と同様にして、選択したクローン（ファージ）に提示されているペプチドのアミノ酸配列を調べ、配列番号３〜７に示すペプチドのアミノ酸配列を同定した。ちなみに、配列番号３に示すペプチドを提示したクローンの吸光度比（Ｂ／Ａ）は1.35、配列番号４に示すペプチドを提示したクローンの吸光度比（Ｂ／Ａ）は1.27、配列番号５に示すペプチドを提示したクローンの吸光度比（Ｂ／Ａ）は1.24、配列番号６に示すペプチドを提示したクローンの吸光度比（Ｂ／Ａ）は1.24、配列番号７に示すペプチドを提示したクローンの吸光度比（Ｂ／Ａ）は1.25であった。
【実施例４】
【００７２】
配列番号１に示すペプチド（以下、ペプチドＡという）を合成（合成はシグマジェノシス社に依頼）し、ＴＮＦ−αとの結合力を商品名「BIACORE2000」（BIACORE社製）を用いて測定した。
【００７３】
具体的には、ＴＮＦ−α（peprotech社製）が溶解しているバッファーを、限外ろ過チューブ（商品名「セントリコンYM-10」、MILLIPORE製）にて10mM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.5）に交換し、このＴＮＦ−αを、商品名「BIACOREセンサーチップCM5」（BIACORE社製）のカルボキシル基をNHS化させたところに接触させてＴＮＦ−αの主にリジン（Lys）基のアミノ基とアミド結合にて固定化させた。
【００７４】
そのセンサーチップに、濃度が（１）32μM、（２）16μM、（３）8μM、（４）4μM、（５）2μMのペプチドＡ溶液を順次流し、SPRの原理にて結合親和性を測定した。その結果、ペプチドＡとＴＮＦ−αの解離定数は2.0e-9[M]であり、ＴＮＦ−αに強く結合することが分かった（図２参照）。ちなみに、ＴＮＦ−αが関与する疾患の治療薬として用いられている人−マウスキメラ抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体である商品名「infliximab」（Centocor社製）は解離定数5.0e-10[M]である（Molecular Medicine May2001 vol.38 No.5号参照）。
【００７５】
また、ペプチドＡとＴＮＦ−αとの結合を分子間結合解析ソフト（商品名「BioPackage」、日立製作所製）を用いてシミュレーションした結果を図３に示す。図３からペプチドＡがＴＮＦ−αに結合している様子が確認できた。
【００７６】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号２：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号３：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号４：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号５：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号６：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号７：ファージディスプレイ法によって得られた、ＴＮＦ−αに結合性を有するペプチド。
配列番号８：ファージ上に提示されたＴＮＦ−αに結合性を有するペプチドのアミノ酸配列を決定するために用いたプライマー。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明のペプチド又はタンパク質は、ＴＮＦ−αに強い結合性を有するので、ＴＮＦ−α吸着体の素材、ＴＮＦ−α検査薬、ＴＮＦ−α中和剤等として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ファージディスプレイ法によるＴＮＦ−α結合性ペプチドのスクリーニング方法の説明図である。
【図２】配列番号１に示すペプチドとＴＮＦ−αとの結合力を測定した結果を示す図である。
【図３】配列番号１に示すペプチドとＴＮＦ−αとの結合様式を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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