(57)【要約】【課題】  導入遺伝子が所望の形質を発現させる部位にのみ存在し、導入遺伝子の存在が望ましくない部位においては導入遺伝子が存在しない植物体を作出する方法を提供する。【解決手段】  有用形質を発現させる導入遺伝子を有する軽質転換された植物体を他の植物体に接ぎ木することによって、有用形質を発現させる導入遺伝子を組換え植物の特定の部位に局在させ、組換え植物の他の部位における導入遺伝子の望ましくない発現を抑制することを特徴とする、導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法及び該方法によって作出されている導入遺伝子の発現を制御した組換え植物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を組換え植物の特定の部位にのみ局在させることによって、組換え植物の形質転換されていない他の植物部位における前記導入遺伝子の望ましくない発現を制御することを特徴とする組換え植物の作出方法。
【請求項２】
前記有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を組換え植物の特定の部位にのみ局在させる手段が、有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位と形質転換されていない他の植物部位のいずれか一方を台木とし他方を穂木として接ぎ木する手段であることを特徴とする請求項１記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項３】
前記組換え植物における形質転換されていない他の植物部位が組換え植物の花粉部位であることを特徴とする請求項１又は２に記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項４】
前記接ぎ木する手段は、有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を台木とし、形質転換されていない植物部位を穂木とした接ぎ木であることを特徴とする請求項２又は３に記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項５】
前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位が、ユーカリ属、アカシア属、ポプラ属、マツ科、スギ科、ヒノキ科、ブナ科のいずれかに属する植物から得られる植物部位である請求項２〜４のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項６】
前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位がユーカリ属植物の植物部位であることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項７】
前記台木を形成する植物部位は、根に有用形質を付与する遺伝子が導入されて形質転換されている植物部位であることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項８】
前記根に有用形質を付与する遺伝子が、リン酸トランスポーター遺伝子、クエン酸合成酵素遺伝子、リンゴ酸チャネル遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝、プロリン合成遺伝子、ベタイン合成遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子、β−カロテン（１５，１５'）ジオキシゲナーゼ遺伝子、カロテノイド生合成経路に関わる酵素を発現する遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、脱塩素酵素遺伝子、芳香環分解酵素遺伝子、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、エクイスタチン遺伝子から選ばれる遺伝子であることを特徴とする（７）記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法によって作出されている導入遺伝子の望ましくない発現が制御されている組換え植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え植物の作出方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、植物において新しく導入した遺伝子の拡散を制限した組換え植物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子組換え技術の進歩によって、植物への組換え遺伝子の導入が多くの植物種で可能となり、選抜・交雑等の従来育種法では不可能な遺伝形質の植物体への付与が精力的に試みられている。遺伝子組換え技術によって付与された新規かつ変更された形質を有する植物は、いまや農作物バイオテクノロジー産業の礎石とみなされている。
【０００３】
しかし、現状では導入した遺伝子の発現を完全に制御できているわけではなく、有用形質を付与した植物部位以外においても、導入遺伝子の発現が起こっている場合が多い。本来不必要な部位における外来遺伝子の発現は、植物の生育などに悪影響を与える場合もある上、多くの遺伝子組換え作物のパブリックアクセプタンス(ｐｕｂｌｉｃ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ)の観点からも決して望ましいものではない。
【０００４】
また、遺伝子組換え植物においては、導入した遺伝子が天然において交配和合性のある植物への受粉によって広がる可能性が憂慮されている。例えば、昆虫耐性を発現する組換え植物は、野生種の植物と交雑して昆虫耐性を発現する雑草を作成することが考えられる。この場合、昆虫耐性形質が天然の植物個体群に広がると、重大な生態学的問題が生じる可能性がある。特に、多年生植物については、樹木の寿命が長く、土地固有の野生類縁種が存在している上に、風による広範な受粉に特に適している多量の花粉を生産する。また、組換え植物が野生類縁種と雑種を形成することによって、天然の生態系を乱すことも考えられる。従って、組換え植物の野生類縁種への遺伝子の流れを制御し、導入遺伝子の拡散を防ぐために導入遺伝子を含む花あるいは花粉を選択的に除去する機構が必要となる。
【０００５】
現在用いられている、花粉トラップとして働くボーダーロウ(ｂｏｒｄｅｒ ｒｏｗｓ)と組み合わせた物理的隔離は、研究中及び開発中の組換え植物を格納するために採用されている。しかしながら、この方法は、広汎な栽培には実用的でない。さらに、様々なトランスジェニックタイプの数が増加し、それらの生産及び分布が増加すると、遺伝子の拡散の可能性は急激に増加する。
【０００６】
導入遺伝子の外部拡散を防ぐために、稔性の制御を中心として多くの研究が行われてきた。植物における花芽形成を制御する方法（特許文献１）、花粉に特異的なプロモーターを使用して花粉を形質転換して植物における稔性を制御する方法（特許文献２）、ＲＮＡ分解酵素を葯特異的に発現させて雄性不稔にする方法（特許文献３）等が試みられている。
【０００７】
また、組換えＤＮＡによって導入された新規形質を含む植物を特異的に除去し又は同定する方法の開発も試みられてきた。例えば、条件致死遺伝子、すなわち、一定条件下で植物細胞を死滅させる遺伝子の使用が、特定の組換えＤＮＡを含む植物細胞を選択的に殺す手段として試みられている（特許文献４、特許文献５）。
【０００８】
しかしながら、これらの手法を用いるには、部位特異的に発現するプロモーターを適用する植物体ごとに得る必要があるうえ、稔性を抑制する遺伝子が遺伝子組換えによって導入されると、その導入遺伝子の発現は完全に制御しうるものではなく、したがって、遺伝子拡散を完全に遮断することができない点が問題視されている。
【特許文献１】ＷＯ  ９５／２４４８７
【特許文献２】ＷＯ  ９４／４２５８７
【特許文献３】特開２００１−９５４０６
【特許文献４】ＷＯ  ９４／０３６１９
【特許文献５】ＷＯ  ００／３７６６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、導入遺伝子が所望の形質を発現させる部位にのみ存在し、導入遺伝子の存在が望ましくない部位においては導入遺伝子が存在しない植物体を作出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明は、植物における有用な形質を発現させる部位のみを形質転換植物体とすることにより、安全上、導入遺伝子の存在が望ましくない花芽などの部位への遺伝子の移入を遮断したり、不必要な植物部位における導入遺伝子の発現を抑えることができる方法であり、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を組換え植物の特定の部位にのみ局在させることによって、組換え植物の形質転換されていない他の植物部位における前記導入遺伝子の望ましくない発現を制御することを特徴とする組換え植物の作出方法。
【００１２】
（２）前記有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を組換え植物の特定の部位にのみ局在させる手段が、有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位と形質転換されていない他の植物部位のいずれか一方を台木とし他方を穂木として接ぎ木する手段であることを特徴とする（１）記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１３】
（３）前記組換え植物における形質転換されていない他の植物部位が組換え植物の花粉部位であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１４】
（４）前記接ぎ木する手段は、有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を台木とし、形質転換されていない植物部位を穂木とした接ぎ木であることを特徴とする（２）又は（３）に記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１５】
（５）前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位が、ユーカリ属、アカシア属、ポプラ属、マツ科、スギ科、ヒノキ科、ブナ科のいずれかに属する植物から得られる植物部位である（２）〜（４）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１６】
（６）前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位がユーカリ属植物の植物部位であることを特徴とする（２）〜（４）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１７】
（７）前記台木を形成する植物部位は、根に有用形質を付与する遺伝子が導入されて形質転換されている植物部位であることを特徴とする（２）〜（６）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１８】
（８）前記根に有用形質を付与する遺伝子が、リン酸トランスポーター遺伝子、クエン酸合成酵素遺伝子、リンゴ酸チャネル遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝、プロリン合成遺伝子、ベタイン合成遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子、β−カロテン（１５，１５'）ジオキシゲナーゼ遺伝子、カロテノイド生合成経路に関わる酵素を発現する遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、脱塩素酵素遺伝子、芳香環分解酵素遺伝子、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、エクイスタチン遺伝子から選ばれる遺伝子であることを特徴とする（７）記載の導入遺伝子の発現を制御した組換え植物の作出方法。
【００１９】
（９）有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位が組換え植物の特定の部位にのみ局在しており、組換え植物の形質転換されていない他の植物部位における前記導入遺伝子の望ましくない発現が制御されている組換え植物。
【００２０】
（１０）有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位と形質転換されていない他の植物部位のいずれか一方を台木とし他方を穂木として接ぎ木されていることを特徴とする（９）記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２１】
（１１）前記組換え植物における形質転換されていない他の植物部位が組換え植物の花粉部位であることを特徴とする（９）又は（１０）に記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２２】
（１２）有用形質を発現させる導入遺伝子を有する形質転換された植物部位を台木とし、形質転換されていない植物部位を穂木として接ぎ木されていることを特徴とする（１０）又は（１１）に記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２３】
（１３）前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位が、ユーカリ属、アカシア属、ポプラ属、マツ科、スギ科、ヒノキ科、ブナ科のいずれかに属する植物から得られる植物部位である（１０）〜（１２）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２４】
（１４）前記台木及び穂木を形成する形質転換されているか又は形質転換されていない植物部位がユーカリ属植物の植物部位であることを特徴とする（１０）〜（１３）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２５】
（１５）前記台木を形成する植物部位は、根に有用形質を付与する遺伝子が導入されて形質転換されている植物部位であることを特徴とする（１０）〜（１４）のいずれかに記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【００２６】
（１６）前記根に有用形質を付与する遺伝子が、リン酸トランスポーター遺伝子、クエン酸合成酵素遺伝子、リンゴ酸チャネル遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子、カタラーゼ遺伝子、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝、プロリン合成遺伝子、ベタイン合成遺伝子、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子、β−カロテン（１５，１５'）ジオキシゲナーゼ遺伝子、カロテノイド生合成経路に関わる酵素を発現する遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、脱塩素酵素遺伝子、芳香環分解酵素遺伝子、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、エクイスタチン遺伝子から選ばれる遺伝子であることを特徴とする（１５）記載の導入遺伝子の発現が制御されている組換え植物。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法により得られる組換え植物は、通常の組換え植物を産業上利用するにあたって技術的及び社会的に問題となる点を解決する。すなわち、通常の組換え植物では、しばしば有用な形質の付与を図った部位以外の植物部位において導入遺伝子の発現が起こることによって生育が阻害されるが、本発明の方法で得られる組換え植物は、有用な形質を付与したい植物部位のみに導入遺伝子が存在しているために、不必要な導入遺伝子の発現が避けられる。さらに、野生型の植物を穂木にすることによって、花粉や果実への導入遺伝子の流入を避けることができる。本発明によって、形質転換植物に導入された遺伝子の望ましくない発現及び野生型系列への導入遺伝子の拡散を防止することが可能になった。従って、遺伝子組換え植物の安全性を確保することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、特に形質転換植物組織と非形質転換植物組織の接ぎ木を利用する方法に関するものである。
【００２９】
本発明における導入遺伝子としては、特に限定されず、植物の特定の組織に有用形質を付与する遺伝子が含まれるが、台木に形質転換組織を用いた場合、根に有用形質を付与する遺伝子が望ましい。例えば、無機栄養素の取り込みに関するリン酸トランスポーター遺伝子、クエン酸合成酵素遺伝子、リンゴ酸チャネル遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子等がある。
【００３０】
また、重金属やイオンストレスを排除するか、あるいは耐性を付与する遺伝子としては、メタロチオネイン遺伝子、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子等がある。
【００３１】
さらに、根に生じる活性酸素を消去する遺伝子としては、カタラーゼ遺伝子、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ遺伝子等や、適合溶質の合成に関わるプロリン合成遺伝子、ベタイン合成遺伝子、ポリアミンの合成に関わる遺伝子等がある。
【００３２】
根や塊茎に有用物質（二次代謝物質を含む）を生産させる、又は生産能を向上させる遺伝子としては、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（特許公開公報２００３−３４７０２）、β−カロテン（１５，１５'）ジオキシゲナーゼ遺伝子（特許公表公報２００３−５１８３８２）、カロテノイド生合成経路に関わる酵素を発現する遺伝子（特許公表公報２００２−５３７８４１）等がある。ファイトレメディエーションに利用できる遺伝子としては、ペルオキシダーゼ遺伝子、脱塩素酵素遺伝子、芳香環分解酵素遺伝子、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼがある。組織特異的な病害に対する抵抗性を付与する遺伝子として、エクイスタチン遺伝子等の線虫抵抗性を誘導する遺伝子（特許公開公報２００２−０３４５８２、特許公表公報２０００−５０７１０３、特許公表公報２００１−５００００６、特許公表公報２００１−５０３９７２）がある。その他産業上有用な遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
台木として遺伝子が導入される植物としては、特に制限はないが、例えば、草本性単子葉植物として、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、タマネギ、トウモロコシ、モロコシ等が挙げられ、草本性双子葉植物としては、ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等のマメ科植物、タバコ、トマト、ジャガイモ等のナス科植物、ナタネ、キャベツ、カラシナ等のアブラナ科植物、メロン、キュウリ、カボチャ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、シロイヌナズナ等が挙げられ、木本性植物としては、ユーカリ、アカシア、ポプラ、マツ、スギ、ヒノキ、ブナ等の木本性植物等が挙げられる。
【００３４】
形質転換植物は、公知の遺伝子導入法により組換えＤＮＡを導入して作成する。公知の導入方法としては、アグロバクテリウム属細菌の感染を利用する方法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、バーティクルガン法、ウィルスをベクターとして用いる方法、マイクロインジェクション法、リポソーム法及びこれらに準じた方法が挙げられ、導入する植物の種類に応じて最適なものを選択すればよい。
【００３５】
接ぎ穂として供される非形質転換体の植物としては、特に制限はなく、接ぎ木に用いることができるすべての植物が含まれる。
【００３６】
接ぎ木法としては、特に限定されないが、切接法、割接法、合接法が望ましい（小野陽太郎、図説接ぎ木繁殖法、朝倉書店、１９５３参照）。接ぎ木の形態としては、形質転換された台木と形質転換されていない穂木を接ぎ木する形態、形質転換されていない台木と形質転換された穂木を接ぎ木する形態及びある遺伝子を形質転換された台木と異なる遺伝子を形質転換された穂木を接ぎ木する形態を含む。
【００３７】
台木及び穂木における導入した遺伝子が組み込まれていることの検出及び確認は、植物組織（例えば葉や根）からＤＮＡを常法に従って抽出し、公知のＰＣＲ法、サザン法及びウエスタン法等を用いて行うことができる。
【００３８】
以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
本実施例では、供試植物としてユーカリ・グランディス(Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ Ｇｒａｎｄｉｓ)とユーカリ・ユーロフィラ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）の交雑種（ｇ×ｕ）を用いた。（ｇ×ｕ）に導入する遺伝子として、人参（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）のミトコンドリア型ＣＳ遺伝子を有するｐＤｃＣＳ−Ｈｍ（Ｔａｋｉｔａら、Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，４５，１９７−２０５頁、１９９９参照）を用いた。
【００４０】
屋外に生育している３年生の（ｇ×ｕ）の茎頂を含む組織を採取し、殺菌・洗浄後、Ｂ５基本培地に対して１％ショ糖を含有する液体培地に移植し、竪型回転培養にて早生分枝を誘導した。ＣＳ遺伝子の導入は、安定的に増殖する早生分枝の茎頂を含む組織片に対してアグロバクテリウム法によって行った（特許公開公報２０００−３１６４０３参照）。早生分枝をアグロバクテリウム培養液に浸け、Ｂ５基本培地に２ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．２ｍｇ／ｌ  １−（２−クロロ−４−ピリジル）−３−フェニル尿素（４−ＰＵ）、１ｍＭがラクトース、０．０１ｍＭアセトシリンゴン、３％ショ糖と０．２％ゲランガムを含有する感染培地に置床して感染させた。感染後、アグロバクテリウム菌を完全に除菌した組織片を、Ｂ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ  ４−ＰＵ、３％ショ糖、及び抗生物質ハイグロマイシンを１０ｍｇ／ｌで含有する液体培地で培養して形質転換苗条原基を得た。苗条原基はＢ５基本培地に０．０２ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌ  ベンジルアデニン、１％ショ糖、０．２％ゲランガム及び１０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含有する苗化培地に移植して苗条を再生させ、得られた苗条をＢ５基本培地に０．０１ｍｇ／ＮＡＡ、１％ショ糖、０．３５％寒天及び１０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含有する発根培地に移植することによって、完全な植物体を得た。
【００４１】
ＣＳ遺伝子導入植物体及び野生株は温室にて葉数が約６は（平均値で、草丈５．３ｃｍ、茎径１．８ｍｍ）になるまで育苗して、接ぎ木に供した。苗木は基部より１．５ｃｍのところで切断し、ＣＳ遺伝子を形質転換したｇ×ｕを台木に、野生株のｇ×ｕを穂木として接ぎ木を行った。
【００４２】
接ぎ木は割接法によって行った。台木の接部を水平に切断し、その断面の中央部から縦に１ｃｍほど割目を入れた。穂木の接部は水平に切断して、鋭利な小刀でその両側を１ｃｍ内外クサビ形に削る。穂作りした穂木は、直ちに台木の切り口に挿し込み、両者の形成層のうち一側は必ず合致させて巻縛した。
【００４３】
接ぎ木した植物体について、１ヶ月培養後の接ぎ木効率を調査した。その結果、８９％（３４／３８個体）の高い効率で接ぎ木が認められ、通常の接ぎ木植物体と変わりなく接ぎ木植物体を得ることができた。
【００４４】
順化した接ぎ木植物体について、台木に導入した遺伝子の接ぎ木による穂木への移行性を検定した。接ぎ木1ヶ月後及び３ヶ月培養後の接ぎ木植物体の台木及び穂木からＣＴＡＢ法によって抽出したＤＮＡについて、ＣＳ遺伝子の存在をＰＣＲで調査した。台木及び穂木は接ぎ木部より上下１ｃｍの部分を除いた組織を試料とした。各試料は液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した。新鮮重量で５０−１００ｍｇとなる試料を０．１ｍｌの洗浄バッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３５ｍＭ  ソルビトール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール）、５％ＰＶＰ  Ｋ３０（ポリビニルピロリドン）、２％ｂｅｔａ−メルカプトエタノール〕で洗浄した。洗浄後、洗浄バッファーを除いた試料に、０．２８ｍｌの抽出バッファー〔３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭソルビトール、１８ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２８％ｂｅｔａ−メルカプトエタノール、０．８５％サルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム）、０．７ｍＮａＣｌ、０．８６％ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）〕を加え、６５℃で２０分間加熱した。室温まで冷却後、０．１５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて攪拌し、遠心分離した。水層を分取し、イソプロピルアルコール沈殿及びエタノール沈殿によってＤＮＡを得た。
【００４５】
得られたＤＮＡについてＰＣＲ法によってＣＳ遺伝子の存在を調べたところ、１ヶ月後及び３ヶ月後のいずれの植物体においても、形質転換した台木には導入したＣＳ遺伝子の存在が認められたが、野生株である穂木部分についてはＣＳ遺伝子の存在が認められなかった。３ヶ月後の植物体におけるＰＣＲ法によるＣＳ遺伝子の存在確認結果は、図１のレーン２〜５及びレーン７〜１０に示されている。図１からも明らかなように、形質転換植物体である台木と非形質転換植物体である穂木との接ぎ木植物体の場合、形質転換植物体である台木部分には導入遺伝子の存在が確認できるが、野生株部分である接ぎ木植物上部には導入遺伝子が存在しないことを確認できる。
【実施例２】
【００４６】
本実施例では供試植物として実施例１と同様にを用いた。ｇ×ｕに導入する遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いた。
【００４７】
ＧＦＰ遺伝子を形質転換したｇ×ｕ及び野生株のｇ×ｕは実施例１と同様の方法で育苗し、ＧＦＰ遺伝子を形質転換したｇ×ｕを台木として野生株のｇ×ｕを穂木としたもの及び野生株のｇ×ｕを台木としてＧＦＰ遺伝子を形質転換したｇ×ｕを穂木としたものについて接ぎ木を行った。対照試験として、台木及び穂木のいずれも野生株のｇ×ｕを用いたものについても接ぎ木を行った。接ぎ木法についても実施例１と同様に割接法を用いた。
【００４８】
接ぎ木１ヶ月後及び３ヶ月後の台木及び穂木についてＧＦＰ遺伝子の発現を調査した。その結果、１ヶ月後及び３ヶ月後のいずれの植物体においても、形質転換した組織は台木及び穂木に関わらずＧＦＰの発現が認められた。一方、非形質転換組織については台木及び穂木に関わらず発現が認められなかった。
【００４９】
この結果は、図２に示されている。図２の（Ａ）は台木及び穂木のいずれも非形質転換植物体からなる植物である。図２の（Ｂ）は、台木のみが形質転換植物体である例である。この（Ｂ）では、非形質転換植物体である穂木部分は（Ａ）と同じ状態であるが、形質転換植物体である台木部分は（Ａ）とは異なる状態である。また、図２の（Ｃ）では形質転換組織である穂木部分は（Ａ）と異なる状態となっており、非形質転換組織である台木部分は（Ａ）と同様の状態である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、植林事業に利用できる。特に、根部分を形質転換体とすることにより乾燥地、寒冷地、酸性土壌などの悪環境に対応できる植物を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】接ぎ木した植物体の台木及び穂木について、導入したＣＳ遺伝子のＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図２】接ぎ木した植物体の台木及び穂木について、導入したＧＦＰ遺伝子の発現の状態の写真を示す図である。
【図１】
2005034062.tif 000002
【図２】
2005034062.tif 000003